EA201691498A1 20170228 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201691498 Полный текст описания [**] EA201691498 20150129 Регистрационный номер и дата заявки EP14153017.0 20140129 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2015/051856 Номер международной заявки (PCT) WO2015/114062 20150806 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21702 Номер бюллетеня [**] НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА Название документа [8] A61K 38/03, [8] A61P 3/04, [8] A61P 3/08, [8] A61P 3/10 Индексы МПК [FR] Марион Венсан, [AU] Петровски Николай Сведения об авторах [FR] ЮНИВЕРСИТЕ ДЕ СТРАЗБУР, [FR] ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ, [AU] ВАКСИН ПТИ ЛТД. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201691498a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через GLUT4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью αPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание αPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание αPKC c ALMS1.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через GLUT4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью αPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание αPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание αPKC c ALMS1.


Евразийское (21) 201691498 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.01.29
(51) Int. Cl.
A61K38/03 (2006.01) A61P3/04 (2006.01) A61P3/08 (2006.01) A61P3/10 (2006.01)
(54) НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА
(31) 14153017.0
(32) 2014.01.29
(33) EP
(86) PCT/EP2015/051856
(87) WO 2015/114062 2015.08.06
(71) Заявитель: ЮНИВЕРСИТЕ ДЕ СТРАЗБУР; ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (FR); ВАКСИН ПТИ ЛТД. (AU)
(72) Изобретатель:
Марион Венсан (FR), Петровски Николай (AU)
(74) Представитель:
Фелицына С.Б. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через ОШТ4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью aPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание aPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание aPKC c ALMS1.
1611146
НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к области медицины. Более конкретно, оно относится к диабету.
Предшествующий уровень техники
Сахарный диабет или диабет представляет собой группу метаболических заболеваний, при которых человек имеет высокий уровень сахара в крови, либо потому, что поджелудочная железа не вырабатывает достаточное количество инсулина, либо потому, что клетки не реагируют на вырабатываемый инсулин.
Существуют три основных типа диабета:
- тип 1 приводит к неспособности организма вырабатывать инсулин, и в настоящее время требует, чтобы индивидуум вводил инсулин или носил инсулиновый насос;
- тип 2 является результатом резистентности к инсулину, состоянию, при котором клетки не используют инсулин должным образом;
- третий называется гестационным диабетом и случается у беременных женщин. Показатели сахарного диабета 2 типа заметно выросли с 1960 года параллельно с
ростом ожирения: По состоянию на 2010 год насчитывалось около 285 миллионов людей с заболеванием по сравнению с около 30 миллионами в 1985 году. Долгосрочные осложнения от высокого уровня сахара в крови могут включать болезни сердца, инсульт, диабетическую ретинопатию, хроническую почечную недостаточность, которая может потребовать диализ, и плохое кровообращение в конечностях, приводящее к ампутациям. Может произойти некетотическая гиперосмолярная кома.
Сообщалось, что гипергликемия принимает участие в возникновении и в прогрессирующем усилении сахарного диабета, т.е. имеется в виду теория токсичности глюкозы. А именно, хроническая гипергликемия ведет к уменьшению секреции инсулина и далее к снижению чувствительности к инсулину, а в результате, концентрация глюкозы в крови повышается таким образом, что сахарный диабет самообостряется. Поэтому при лечении гипергликемии цикл вышеупомянутого самообострения прерывается таким образом, что становятся возможными профилактика или лечение сахарного диабета.
К сожалению, существующим методам лечения не удается восстановить нормогликемию в долгосрочной перспективе, так как с течением времени снижается функция бета-клеток. Кроме того, в настоящее время не существует ни одного препарата,
который способен полностью изменить все аспекты этого заболевания.
Прогрессирующий характер сахарного диабета 2 типа означает, что многим пациентам в конечном итоге потребуется сочетание перорального гипогликемического препарата, возможно, вместе с инъекциями инсулина и/или экзенатида. Антидиабетические агенты были разработаны для того, чтобы противодействовать основным механизмам, вовлеченным в сахарный диабет 2 типа: устойчивости к инсулину (бигуаниды и тиазолидиндионы) и секреции инсулина (сульфонилмочевины, глиниды, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, 1 агонисты рецептора глюкагон-подобного пептида), агенты, которые задерживают поглощение глюкозы в желудочно-кишечном тракте или способствуют потере массы и новые агенты, которые способствуют выведению глюкозы в почечных канальцах. Тем не менее, большинство из этих препаратов, как было показано, имеют пагубные побочные эффекты, такие как увеличение массы, периферические отеки или застойная сердечная недостаточность и существует серьезная проблема с потерей эффективности этих агентов при долгосрочном применении. Таким образом, несмотря на растущее число терапевтических возможностей для контроля гликемии, существует потребность в альтернативных и улучшенных препаратах для лечения диабета и связанных с ним состояний.
Сущность изобретения
Авторы настоящего изобретения идентифицировали новую цель для лечения диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Их новаторской находкой является ALMS 1 (белок синдрома Ал стрёма 1), который участвует в регуляции инсулином поглощения глюкозы зрелыми адипоцитами посредством его взаимодействий при связывании с ключевыми молекулами, участвующими в регуляции глюкозы. Вкратце, они показали, что когда инсулин связывается со своим рецептором, то около Almsl образуется и активируется белковый комплекс (ALMSoMa), что приводит к активации Н+-насоса, транслокации рецептора GLUT4 и поглощению глюкозы адипоцитами. Они также показали, что в отсутствии Almsl, и в следствии этого предотвращении сборки ALMSoMbi, глюкоза не может транспортироваться в клетки из-за невозможности слияния GLUT4 с клеточной мембраной. Следовательно, они показали, что модуляция комплексообразования ALMS1 может быть использована для регулирования транспорта глюкозы и, таким образом, может быть использована для обхода резистентности к инсулину, и для лечения диабета 2 типа.
Более конкретно, авторы изобретения идентифицировали два белка, участвующих в регуляции транспорта глюкозы с помощью ALMS1, а именно TBC1D4 (4 представитель
семейства с ТВС1 -доменом) и аРКС (РКСа или протеинкиназа С альфа-типа). Более конкретно, участки связывания этих двух регулирующих глюкозу белков с ALMS1 настолько близки, что одновременное связывание обоих белков не представляется возможным из-за стерических препятствий. TBC1D4, через его взаимодействие с белками (т.е. RablO, Rabl4 и т.д.) и ALMS1, регулирует транслокацию рецепторов GLUT4 к клеточной мембране. С другой стороны, аРКС, при связывании с ALMS1, блокирует сайт связывания TBC1D4 и, тем самым, отрицательно регулирует транслокацию рецепторов GLUT4 к клеточной мембране, уменьшая клеточное поглощение глюкозы. Кроме того, они продемонстрировали, что нацеленное воздействие на взаимодействие ALMS1 и аРКС достаточно для того, чтобы вызвать всасывание глюкозы адипоцитами, независимо от наличия INS. Соответственно, новые терапевтические стратегии, продемонстрированные в данном изобретении, заключаются в повышении клеточной абсорбции глюкозы и уменьшении гипергликемии путем блокирования связывания аРКС с ALMS1. Наиболее предпочтительно, связывание аРКС с ALMS1 ингибируется таким образом, чтобы связывание TBC1D4 с ALMS1 не изменялось или даже усиливалось.
Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS 1, для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирении и гиперинсулинемии. Оно также относится к применению такой молекулы для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Оно также относится к способу лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, у объекта, нуждающегося в этом, при котором вводится терапевтически эффективное количество молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1, тем самым увеличивая поглощение глюкозы, индуцированное инсулином. В предпочтительном воплощении молекула не препятствует связыванию TBC1D4 с ALMS1. Предпочтительно, если молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов или полипептидов или пептидомиметиков, антител, фрагментов или их производных, аптамеров, шпигельмеров и химических соединений. Более
предпочтительно, если молекула представляет собой пептид длиной менее чем из 50 аминокислот, предпочтительно - менее чем из 20 аминокислот.
В первом предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ ID NO: : 1). Предпочтительно, если молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1, в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. В наиболее конкретном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий или состоящий из одной из следующих последовательностей:
- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5);
- DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6);
- QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7);
- QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8);
- PADQMTDTP (SEQ ID NO:: 9);
- HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10);
- SCIFLEQ (SEQ ID NO:: 11), и
- их фрагмента, включающего 6 смежных аминокислот.
Во втором предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ Ш N0: 4). Предпочтительно, если молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС, в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации молекул, пригодных для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в котором анализируют способность молекулы предотвращать связывание аРКС с ALMS1 и отбирают молекулы, способные предотвращать это связывание. Способ может дополнительно включать стадию, на которой тестируется способность выбранной молекулы мешать связыванию
TBC1D4 с ALMS1 и на которой отбирают молекулы, которые не мешают этому связыванию. Предпочтительно, если связывание определяется в клеточной системе, респонсивной на инсулин. Необязательно, связывание определяется в присутствие и/или в отсутствие инсулина.
Еще одна терапевтическая стратегия, выявленная в данном изобретении, заключается в повышении клеточного поглощения глюкозы путем усиления связывания TBC1D4 с ALMS1. Еще одна терапевтическая стратегия, выявленная в данном изобретении, заключается в повышении клеточного поглощения глюкозы путем положительной регуляции экспрессии ALMS 1.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к молекуле, способной усиливать связывание TBC1D4 с ALMS1 или повышать экспрессию ALMS1 для применения при лечении или задержке прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, гиперинсулинемии и, в частности, сахарного диабета 2 типа. Оно также относится к применению такой молекулы для получения лекарственного средства для лечения, или замедления прогрессирования, или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в частности, сахарного диабета 2 типа. Оно также относится к способу лечения, или замедления прогрессирования, или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирению и гиперинсулинемии, в частности, сахарного диабета 2 типа, у объекта, нуждающегося в этом, в котором вводят терапевтически эффективное количество молекулы, способной усиливать связывание TBC1D4 с ALMS1 или повышать экспрессию ALMS1, тем самым увеличивая поглощение глюкозы, индуцированное инсулином. В предпочтительном воплощении молекула также ингибирует связывание аРКС с ALMS1.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации молекулы, пригодной для применения при лечении диабета, в котором анализируют способность молекулы повышать экспрессию ALMS1 и выбирают молекулы, способные к положительной регуляции ALMS1. Оно также относится к способу идентификации молекулы, пригодной для применения при лечении диабета, в котором анализируют способность молекулы увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1 и отбирают молекулы,
способные увеличивать этот параметр связывания. Необязательно, способ дополнительно включает определение способности молекулы, предотвратить связывание аРКС с ALMS1 анализируют и отбор молекул, способных предотвращать это связывание.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения идентифицировали ALMS1 как недостающий ключевой игрок, участвующий в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы посредством ОЬиТ4-сортировочных везикул в адипоцитах.
В настоящее время признано, что даже если жировая ткань ответственна за около 20% абсорбции глюкозы, дисфункция в этой ткани может привести к возникновению диабета. Таким образом, любые средства, способные регулировать инсулин-опосредованное поглощение глюкозы в адипоцитах должны быть в состоянии задержать, обратить, или предотвратить возникновение сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, и гиперинсулинемии.
Активность ALMS1 отрицательно регулируется при связывании с аРКС, и активируется при связывании с TBC1D4. Также было показано, что участки связывания этих двух белков на ALMS1 настолько близки, что одновременное связывание обоих белков не допускается из-за стерических затруднений. Таким образом, этот механизм регулирования является новой мишенью для лечения или замедления прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии и изобретатели предлагают использовать молекулу способную предотвращать связывание аРКС с ALMS1 при этих терапевтических показаниях.
Определения
ALMS1, белок синдрома Альстрёма 1, представляет собой белок, кодируемый геном ALMS1. Было обнаружено, что мутации в гене ALMS1 ответственны за синдром Альстрёма. Они описаны в нескольких базах данных, а именно UniProt Ш No Q8TCU4; Gene Ш No 7840, HGNG ID No 428. Эталонные последовательности представлены в Genbank под учетным номером NM_015120.4 для мРНК и NP_055935,4 для белка. Белковая последовательность человеческого ALMS1 описана в SEQ ID NO: 1.
TBC1D4 (4 представитель семейства ТВС1 -домена), также в настоящее время называемый As 160, предполагаемо действует в качестве ОТРаза-активирующего белка для RAB2A, RAB8A, RAB10 и RAB14. Он описан в нескольких базах данных, а именно
UniProt Ш No 060343, Gene Ш No 9882, HGNG ID No 19165. Эталонные последовательности описаны в Genbank под NM_014832,3 для мРНК и NP_055647.2 для белка (для изоформы 1, выбранных в качестве канонических последовательностей). Изоформа 2, которая отличается от изоформы по отсутствующим аминокислотам в положениях 678-740, представлена в UniProt как No О60343-2, стимулирует транслокацию инсулин-индуцированного переносчика глюкозы SLC2A4/GLUT4 на плазматическую мембрану, тем самым увеличивая поглощение глюкозы. Белковая последовательность человеческого TBC1D4 (изоформа 1) представлена в SEQ ID NO: 2. Белковая последовательность человеческого TBC1D4 (изоформа 2) представлена в SEQ ID NO: 3.
Протеинкиназа С альфа типа, также называемая аРКС, РКС-А или РКС-альфа, принадлежит к семейству серии- и треонинспецифических протеинкиназ, которые могут быть активированы с помощью кальция и вторичного мессенджера диацилглицерина. Она описана в нескольких базах данных, а именно UniProt Ш No PI7252, Gene ID No 9393, HGNG ID No 5578. Эталонные последовательности описаны в Genbank с NM_02737.2 для мРНК и NP 002728.1 для белка. Белковая последовательность человеческого аРКС описана в SEQ ID N0: 4.
Методы скрининга
Настоящее изобретение относится к in vitro или ex vivo способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1. Способ включает определение влияния молекулы(ул) на связывание аРКС с ALMS1, и отбор молекулы(ул), если связывание аРКС с ALMS1 уменьшается или предотвращается. Предпочтительно, если способ дополнительно включает определение влияния молекулы(л) на связывание TBC1D4 с ALMS1, и устранение молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 уменьшается или предотвращается. Необязательно, этот способ может включать стадию выбора молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается.
Настоящее изобретение также относится к in vitro или ex vivo способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной усиливать или увеличивать связывания TBC1D4 с ALMS1. Способ включает определение влияния молекулы(л) на связывание TBC1D4 с ALMS1, и выбор молекулы (л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается. Необязательно, способ дополнительно включает определение влияния молекулы (л) на связывание аРКС с ALMS1, и выбор молекулы(л), если связывание аРКС с ALMS 1 уменьшается или предотвращается.
Для того чтобы определить влияние молекулы на связывание аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1, может быть осуществлена любая технология, известная специалистам в данной
области, в частности, любой способ, пригодный для определения белковых взаимодействий. Например, рекомбинантный или очищенный нативный ALMS1 или аРКС может быть связан с чипом для поверхностного плазмонного резонанса, а другая молекула может протекать над чипом для оценки аффинности связывания, например, в устройстве Biacore (General Electric, США). Такой же подход может быть использован для измерения аффинности связывания ALMS1 и TBC1D4 или ALMS1 и аРКС.
Влияние молекулы(л) на связывание аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1 заключается в определении путем измерения связывания аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1 в отсутствие и в присутствие тестируемой молекулы и путем сравнения связывания аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1.
Кроме того, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способных связываться с ALMS1. В самом деле, может быть выгодно, чтобы молекула предотвращающая взаимодействия между ALMS1 и аРКС, действовала непосредственно в месте связывания ALMS1 с аРКС.
В качестве альтернативы, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способной связываться с аРКС. В самом деле, также может быть выгодным, чтобы молекула, предотвращающая взаимодействия между ALMS1 и аРКС действовала непосредственно в месте связывания аРКС с ALMS1.
Кроме того, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способной связываться с TBC1D4.
В предпочтительном воплощении для идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1, способ скрининга по настоящему изобретению дополнительно включает определение влияния молекулы(л), в частности, выбранной молекулы(л), на связывание TBC1D4 с ALMS1 и отбор молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 не уменьшается или не предотвращается молекулой(ами). Более того, способ может включать стадию выбора молекулы(л), если TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается молекулой(ами).
В предпочтительном воплощении для идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной повышать связывание TBC1D4 с ALMS1, способ скрининга по настоящему изобретению дополнительно включает определение влияния молекулы(л), в частности, выбранной молекулы(л), на связывание аРКС с ALMS1 и отбор молекулы(л), если связывание аРКС с ALMS1 уменьшается или предотвращается молекулой(ами).
Из-за большого размера партнеров по связыванию, в частности ALMS1 и TBC1D4, изобретатели предпочитают использовать клеточные системы для способов скрининга. Предпочтительно, если клеточная система связи является клеточной системой,
реагирующей на инсулин. Например, клеточная система может быть выбрана из множества линий мезенхимальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, жировых мезенхимальных стволовых клеток, преадипоцитов и адипоцитов. Предпочтительно, если клетка представляет собой клетку человека.
Далее определения связывания можно проводить в присутствии или в отсутствие инсулина. Предпочтительно, в присутствии инсулина для связывания аРКС с ALMS1 и в присутствии инсулина для связывания TBC1D4 с ALMS1.
В первом аспекте, может быть осуществлен анализ иммунопреципитации с использованием ALMS1 в качестве приманки, в частности, как подробно описано в экспериментальном разделе. Например, анализ может проводиться с клетками, в частности адипоцитами, культивируемыми в отсутствие и/или в присутствие инсулина, предпочтительно, в отсутствие инсулина. Тестируемые молекулы добавляются в культуральную среду. Затем аРКС подвергается иммунодетекции. Необязательно, TBC1D4 также может быть подвергнут иммунодетекции. Этот способ описан подробно в разделе Примеры.
В предпочтительном воплощении, количество аРКС, связанное с ALMS1, определяется и по сравнению с количеством в отсутствие тестируемых молекул, в частности, в отсутствие инсулина. Если количество аРКС, связанной с ALMS1, уменьшается в присутствии тестируемой молекулы, то молекула отбирается.
Количество TBC1D4, связанного с ALMS1, определяется и сравнивается с количеством в отсутствие тестируемых молекул, в частности, в присутствии инсулина или как в присутствие, так и в отсутствие инсулина. Если количество TBC1D4, связанного с ALMS1, уменьшается в присутствии тестируемой молекулы, то молекула отвергается. Если количество TBC1D4, связанного с ALMS1, возрастает в присутствие тестируемой молекулы, то молекула отбирается.
Во втором аспекте, аффинная очистка в сочетании с масс-спектрометрией, может быть осуществлена, в частности, после химического перекрестного сшивания. Например, клетки могут быть выращены в среде, лишенной метионина и лейцина, но включающей фотоактивируемый метионин и лейцин. Затем клетки облучаются УФ для стабилизации белковых комплексов и белковые комплексы анализируются с помощью масс-спектрометр ии.
Другие способы доступны специалисту в данной области, например, комплементация бимолекулярной флуоресценции, тандемная аффинная очистка и тому подобное. В частности, в WO2012/117245 описан способ идентификации молекул, способных предотвращать взаимодействие между двумя белками: WO2012/117245 (для
идентификации малых молекул). В W012174489 также раскрыты способы разработки молекул, пригодных для предотвращения взаимодействия между двумя белками.
Кроме того, подходящие молекулы также могут быть спроектированы с помощью молекулярного моделирования. Такие способы, например, подробно описаны в разделе примеров.
В конкретном аспекте, настоящее изобретение относится к модели структурной гомологии ALMS1 и ее применению в качестве in silico способа для идентификации молекул, способных ингибировать или стимулировать функцию ALMSoMbi, в частности, для ингибирования взаимодействия между ALMS1 и аРКС и/или для увеличения взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4.
Оно также относится к модели структурной гомологии TBC1D4 и ее использования в способе in silico для идентификации молекул, способных ингибировать или стимулировать функцию ALMSoMbi, в частности, увеличивать взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4.
Настоящее изобретение также относится к способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной положительно регулировать ALMS1 на уровне генов и белков. Способ включает определение влияния молекулы(л) на экспрессию ALMS1, и отбор молекулы(л), если экспрессия ALMS1 увеличивается. Для того чтобы определить влияние молекулы на экспрессию ALMS1, может быть осуществлена любая технология, известная специалисту в данной области.
Различные методы, известные в данной области, могут быть использованы для обнаружения или количественного определения экспрессии ALMS1, включая секвенирование, гибридизацию, амплификацию и/или связывание со специфическими лигандами (например, антителами). Подходящие способы включают саузерн-блоттинг (для ДНК), блоттинг (для РНК), флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), миграцию в геле, ELISA, радиоиммунологические анализы (RIA) и иммуно-ферментативные анализы (IEMA).
"Увеличенный", "увеличение" или "усиление" предназначены обозначения связывания, увеличенного, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению со связыванием, измеренным в отсутствие тестируемой молекулы в тех же самых условиях. "Сниженный" или "снижение" предназначен для обозначения к снижения связывания, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению со связыванием, измеренным в отсутствие тестируемой молекулы в тех же условиях.
Кроме того, способы скрининга по настоящему изобретению могут включать анализ
моделей на животных. Тестируемые молекулы могут быть введены в модели на животных, и может быть оценено влияние молекул на поглощение глюкозы или диабета. Например, модели на животных могут быть мышами или крысами с резистентностью к инсулину, сахарным диабетом или гипергликемией. Влияние молекулы может быть оценено путем измерения уровня глюкозы в крови. Молекулы
Молекулы, способные предотвращать или блокировать связывание аРКС с ALMS1, могут быть любыми лигандами, способными связывать либо аРКС, либо ALMS1 и, таким образом, предотвращать или блокировать связывание аРКС с ALMS 1.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая предотвращает или блокирует связывание аРКС с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков ALMS1, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. В ином аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая предотвращает или блокирует связывание аРКС с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков аРКС, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667.
Молекулами, способными усиливать или увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1 могут быть любые лиганды, способные связываться либо TBC1D4, либо ALMS1 и, тем самым повышать или увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1.
В первом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая усиливает или увеличивает связывание TBC1D4 с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков ALMS1, выбранных из перечня, состоящего из Н65, L66 и S2879. В ином аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая усиливает или увеличивает связывание TBC1D4 с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков TBC1D4, выбранных из перечня, состоящего из G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82HI83.
Настоящее изобретение относится к таким молекулам, фармацевтической композиции, содержащей такие молекулы, и применению таких молекул в качестве лекарственного средства или для изготовления лекарственного средства.
Эти молекулы могут быть пептидами или полипептидами или миметиками пептидов, антителами, фрагментами или их производными, аптамерами, шпигельмерами или химическими соединениями. Эти молекулы могут быть выбраны с помощью способов скрининга, известных в данной области или как описано выше, и могут быть
спроектированы любым удобным in silico способом моделирования.
В предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид. В предпочтительном воплощении пептид может иметь от 5 до 50 аминокислот. Более предпочтительно, она имеет от 5 до 20 аминокислот. Более предпочтительно, пептид или полипептид содержит менее чем 50 аминокислот, более предпочтительно, менее чем 40, 30, 20, 15 или 10 аминокислот.
В первом аспекте, молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ ID NO: 1). В предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС. В частности, эти остатки выбирают из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. Более предпочтительно если эти остатки выбирают из перечня, состоящего из D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, TI088, DI089, AII69, QII70, F2882, L2883 и Е2884. D58, S59, G62, Н65 и L66 образуют первый сегмент взаимодействия. Т737 и Е738 определяют второй сегмент взаимодействия. D828 и S829 определяют третий сегмент взаимодействия. Т1088 и D1089 определяют четвертый сегмент взаимодействия. А1169 и Q1170 определяют пятый сегмент взаимодействия. F2882, L2883 и Е2884 определяют шестой сегмент взаимодействия.
В очень конкретном аспекте, пептид или полипептид содержит или состоит из одной из следующих последовательностей:
- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5), нацеленной на первый сегмент взаимодействия;
- DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6), нацеленной на второй сегмент взаимодействия;
- QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7);
- QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8), нацеленной на третий сегмент взаимодействия;
- PADQMTDTP (SEQ ID NO:: 9), ориентированных на четвертый сегмент взаимодействия;
- HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10), ориентированных на пятый сегмент взаимодействия;
- SCIFLEQ (SEQ ID N 11), ориентированных на шестой сегмент взаимодействия,
- их фрагмент, содержащий 6 смежных аминокислот.
Во втором аспекте, молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ ID NO: 4). В
предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1. В частности, эти остатки выбраны из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. F114, D116, С118 и L121 могут определить первый сегмент взаимодействия. N138, Q142, 1145 и Р148 могут определить второй сегмент взаимодействия. Е545, S562 и S566 могут определить третий сегмент взаимодействия. F597, D601, W602, К604 и Е606 определяют четвертый сегмент взаимодействия. V664 и 1667 могут определить пятый сегмент взаимодействия.
Необязательно, пептид или полипептид может включать один, два, три, четыре или пять аминокислотных замен по сравнению с эталонной последовательностью, то есть последовательностью SEQ ID NO:: 1 для пептидов, полученных из ALMS1, SEQ Ш N0: 4 для пептидов, полученных из аРКС, и SEQ ID N0:: 2 или 3 для пептидов, полученных из TBCID4.
Пептид или полипептид может дополнительно содержать часть, облегчающую его поглощение клеткой или вход в клетку, в частности, PTD (домен белковой трансдукции). PTD обычно содержит определенную последовательность из 10-20 аминокислот (Matsushita and Matsui, (2005), J Mol Med 83, 324-328; Vives et al, Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). PTD в основном состоит из основных аминокислот, таких как аргинин или лизин, и типичные примеры PTD включают аргинин-богатые пептиды, такие как полиЯ8 (RRRRRRRR) или (RRPRRPRRPRRPRRP), пептид антеннапедия или пенетратин, такой как (RQIKIWFQNRRMKWKK) или HIV-Tat (YGRKKRRQRRR).
В конкретном аспекте, молекула представляет собой антитело, фрагмент или его производное.
Пептид или полипептид может содержать природные аминокислоты и/или неприродные аминокислот. "Неприродные аминокислоты" предназначены для обозначения аналога или производного природной аминокислоты (то есть, Ala, Val, Gly, Leu, He, Lys, Arg, Glu, Gin, Asp, Asn, His, Tyr, Phe, Trp, Ser, Pro, Thr, Cys, Met). Они имеют модифицированную боковую цепь, например, более короткую, длинную или с другими функциональными группами. Рассматриваются изомеры D и L, в частности, потому, что изомеры D не чувствительны к действию протеаз. Кроме того, модификации некоторых или всех пептидных связей, также рассматриваются для увеличения сопротивлению протеолиза, в частности, с помощью (-CO-NH-) с помощью (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-СН2-0-), (-CH2-S-), (-СН2-СН2-), (-СО-СН2-), (-СНОН-СН2-), (-N=N-), и/или (-СН=СН-). Пептид
может представлять карбоксильный С-конец (-СОО") и амидный конец (-CONH2). Пептид также может быть последовательностью D-ретро-инверсо пептида, описанного в данном документе. N-конец может быть изменен, в частности ацетильным радикалом. Необязательно, пептид или полипептид может быть пегилированным для повышения стабильности. В качестве альтернативы, этот пептид может быть модифицирован для того, чтобы сделать из него сшитый пептид. Термин "сшитый пептид", используемый в данном описании, относится к искусственно модифицированному пептиду, в котором структура стабилизирована одним или несколькими искусственными молекулярными мостиками (перекрестные связи), которые соединяют прилегающие витки альфа-спиралей в пептиде. Методики получения сшитых пептидов, были широко рассмотрены, например, в Verdine & Hilinski (2012, Methods Enzymol, 503, 3-33), WO10033617 и WO10011313, описание которых включено в данный документ в виде ссылки).
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид, определенный выше, и фармацевтически приемлемый носитель/эксципиент. Оно также относится к пептиду, определенному выше, для применения в качестве лекарственного средства или к применению пептида, определенному выше, для изготовления лекарственного средства.
В ином воплощении молекула представляет собой антитело, его фрагмент, или его производное. Используемый в данном описании термин "антитело" и "иммуноглобулин" имеют одинаковое значение и используются одинаково в настоящем изобретении. Термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина, то есть молекулам, которые содержат антиген-связывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном. Антитела включают любые антитела, предпочтительно, моноклональные. Они могут быть, например, IgG (иммуноглобулин G) или VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела из верблюдовых). Антитела, их фрагменты или производные включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, ScFv, (ScFv)2, Dab, фрагменты гипервариабельных участков (CDR), линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител, минитела, димеры, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
Антитела, фрагменты или производные могут блокировать взаимодействие между ALMS1 и аРКС. Предпочтительно, если они не оказывают никакого влияния на взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4 или оказывают влияние, усиливающее взаимодействие.
В первом воплощении изобретения антитело является специфическим к ALMS1. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из остатков ALMS1,
вовлеченных во взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884.
В ином случае, антитело является специфическим для аРКС. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из числа остатков аРКС, участвующих во взаимодействии с ALMS1, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142,1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667.
Такие антитела могут быть получены иммунизацией млекопитающих, не являющихся человеком, иммуногенными пептидами или белками, содержащими один или несколько остатков, определенных в качестве участвующих во взаимодействии между ALMS1 и аРКС. В качестве альтернативы, может быть получена и подвергнута скринингу библиотека антител. Полученные антитела, фрагменты или производные затем подвергают скринингу на предмет их способности связывать один из взаимодействующих партнеров и/или их способности предотвращать, ингибировать или блокировать взаимодействие между ALMS1 и аРКС. Кроме того, как ранее указано, антитела, фрагменты или производные могут быть дополнительно подвергнуты скринингу на их способность модулировать взаимодействие между TBC1D4 и ALMS1, и отобраны, если они увеличивают или усиливают взаимодействие.
Антитела, фрагменты или производные могут усилить взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Предпочтительно, они оказывают блокирующее влияние на взаимодействие между ALMS1 и аРКС.
В первом воплощении изобретения антитело является специфическим к ALMS1. В частности, эпитоп антитела включает один или несколько из остатков ALMS1, участвующих во взаимодействии с TBC1D4, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из Н65, L66 и S2879.
В ином случае, антитело является специфическим к TBC1D4. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из остатков TBC1D4, вовлеченных во взаимодействие с ALMS1, в частности один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82 и 183.
Такие антитела могут быть получены иммунизацией млекопитающих, отличных от человека, иммуногенными пептидами или белками, содержащими один или несколько остатков, определенных в качестве участвующих во взаимодействии между ALMS1 и TBC1D4. В качестве альтернативы, может быть представлена и подвергнута скринингу библиотека антител. Полученные антитела, фрагменты или производные затем
подвергают скринингу на предмет их способности связывать один из взаимодействующих партнеров и/или их способности усиливать или увеличивать взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Кроме того, как ранее указано, антитела, фрагменты или производные могут быть дополнительно подвергнуты скринингу на их способность модулировать взаимодействие между аРКС и ALMS1, и отобраны, если они уменьшают или блокируют взаимодействие.
Получение моноклональных или поликлональных антител хорошо известно в данной области, и любые из множества доступных методов могут быть использованы (см, например, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Методы получения одноцепочечных антител (патент США No. 4946778), могут быть адаптированы для получения антител к искомым полипептидам. Кроме того, трансгенные мыши или другие организмы, такие как другие млекопитающие, могут быть использованы для экспрессии гуманизированных, химерных, или аналогичным образом модифицированных антител. В качестве альтернативы, может быть использована технология фагового дисплея для идентификации антител и гетеромерных фрагментов Fab, специфически связывающихся с выбранными антигенами (см, например, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).
Для аптамеров и шпигельмеров, подобные способы могут быть использованы для отбора аптамеров и шпигельмеров. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области.
Используемый в данном документе термин "аптамеры" означает молекулу нуклеиновой кислоты или пептид, способные связывать ALMS1, аРКС или TBC1D4. Она относится к классу молекул, который представляет собой альтернативу антител в области молекулярного распознавания. Аптамеры являются олигонуклеотидными или олигопептидными последовательностями, обладающими способностью распознавать практически любой класс молекул-мишеней с высоким сродством и специфичностью.
Такие лиганды могут быть выделены с помощью Систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) из библиотеки случайных последовательностей, как описано в Tuerk С. and Gold L., Science, 1990, 249(4968):505-10. Библиотека случайных последовательностей может быть получена путем комбинаторного химического синтеза ДНК. В этой библиотеке каждый элемент представляет собой линейный олигомер, в конечном счете, химически модифицированный, с уникальной последовательностью. Возможные модификации, применения и преимущества этого класса молекул были рассмотрены в Jayasena S.D., Clin. Chem., 1999, 45(9): 1628-50.
Пептидные аптамеры состоят из вариабельной области антитела с зафиксированной конформацией, экспонируемой белковой платформой, такой как тиоредоксин A E.coli, которые выбраны из комбинаторных библиотек, дигибридными способами (Colas et al., Nature, 1996,380, 548-50).
Шпигельмеры были описаны, например, в публикации WO 98/08856. Они представляют собой молекулы, подобные аптамерам. Однако шпигельмеры состоят полностью или в основном из L-нуклеотидов, а не D-нуклеотидов в отличие от аптамеров. В других отношениях, в частности, в отношении возможных длин шпигельмеров, к шпигельмерам относится то же, что и описанное для аптамеров.
Химические соединения относятся к молекулам менее чем около 1500 дальтон, 1000 дальтон, 800 дальтон, или даже менее чем около 500 дальтон, в частности к органическим или неорганическим соединениям. Структурный дизайн в области химии должен помочь найти такую молекулу. Молекула может быть идентифицирована с помощью способа скрининга, описанного в настоящем изобретении.
Синтетические библиотеки соединений коммерчески доступны от ряда компаний, в том числе Maybridge Chemical Со. (Тревиллет, Корнуэл, Великобритания), Comgenex (Принстон, Нью-Джерси), Brandon Associates (Мерримак,Нью-Гемпшир), и Microsource (Нью-Милфорд, Коннектикут). Комбинаторные библиотеки доступны или могут быть получены в соответствии с известными методами синтеза. В ином случае библиотеки природных соединений в виде экстрактов бактерий, грибов, растений и животных можно приобрести, например, у Pan Laboratories (Ботелл, Вашингтон) и MycoSearch (Северная Каролина), можно либо легко получить способами, хорошо известными в данной области.
Кроме того, природные и синтетически произведенные библиотеки и соединения могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных химических и биохимических методов.
Молекула может быть ковалентно или нековалентно связана с группой, нацеленной на соответствующие ткани, предпочтительно на жировую ткань, или с группой, облегчающей проникновение молекулы в клетки.
Терапевтические показания
Авторы предлагают использовать молекулы, описанные в данном документе, для увеличения поглощения глюкозы, в частности, адипоцитами, посредством чего будет осуществляться регуляция и контроль уровень глюкозы в крови. В этом случае молекулы пригодны для лечения или замедления прогрессирования, или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулин}', диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину,
гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
Сахарный диабет характеризуется гипергликемией. Более конкретно, диабет 2 типа характеризуется гипергликемией и резистентностью к инсулину. Ожирение считается главной причиной диабета 2 типа у людей, которые генетически предрасположены к этому заболеванию. Диабетическая ретинопатия, диабетическая невропатия, диабетическая нефропатия хорошо известные расстройства, связанные с диабетом и резистентностью к инсулину.
В этом случае уменьшением гликемии за счет увеличения потребления глюкозы может лечить или замедлять прогресс или предотвращать возникновение этих заболеваний.
Настоящее изобретение относится также к молекулам по настоящему изобретению для применения для снижения дозы инсулина или прекращения приема инсулина, при использовании для лечения диабета у объекта, для применения молекул по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для снижения дозы инсулина или прекращения приема инсулина, при использовании для лечения диабета у объекта, или к способу лечения диабета у объекта, в котором терапевтически эффективное количество молекулы по изобретению вводят объекту с пониженной дозой инсулина или в отсутствии приема инсулина. В более общем смысле, его можно применять для снижения дозы антидиабетических препаратов.
"Лечить" или "лечение" подразумевают, что болезнь подвергается лечению, облегчению или замедлению. Это включает профилактическое или радикальное лечение. Термин лечение означает, в частности, коррекцию, задержку, или восстановление нарушенного гомеостаза глюкозы. Термин "лечение" также означает улучшение усвоения глюкозы (например, захват глюкозы адипоцитами). В контексте настоящего изобретения, термины "контроль за уровнем глюкозы в крови" или "контроль уровня глюкозы в крови", относятся к нормализации или регуляции уровня глюкозы в крови или плазме у объекта-млекопитающего, имеющего аномальные уровни (например, уровни которые находятся ниже или выше известного эталона, медианы, или среднего значения для соответствующего объекта-млекопитающего с нормальным гомеостазом глюкозы).
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому или ветеринарному применению молекулы. Соответственно, объект может быть любым млекопитающим, предпочтительно, человеком, например, взрослым или ребенком. В конкретном воплощении объектом является объект, страдающий от ожирения. Необязательно, объект не имеет выявляемых антиостровковых антител, и ультразвуковое исследование не выявляет у него панкреатических нарушений. В контексте ветеринарного применения,
объект может быть животным, предпочтительно, млекопитающим, в частности домашним животным, например, собакой, кошкой или лошадью.
Молекулы в соответствии с изобретением могут быть использованы в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными препаратами, предпочтительно, антидиабетическими лекарственными средствами, в частности, для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу по настоящему изобретению, а также одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетическое лекарственное средство.
Оно также относится к продукту или набору, содержащему молекулу по изобретению, и одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетических лекарственных средств, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения, или в виде комбинированного препарата, который содержит молекулу согласно по настоящему изобретению и одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетических препаратов, для одновременного, раздельного или последовательного применения, в частности, для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
Оно относится к молекуле по настоящему изобретению для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными лекарственными средствами, предпочтительно антидиабетическими лекарственными средствами.
Оно также относится к применению молекулы по изобретению и одного или нескольких дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетические лекарственных средств, для получения лекарственного средства, в частности, для лечения или задержки прогрессирования или отсрочки возникновения
сахарного диабета, резистентности к инсулин}', диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
И, наконец, настоящее изобретение относится к способу лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в котором терапевтически эффективное количество молекулы по настоящему изобретению вводят в комбинации с терапевтическим или субтерапевтическим эффективным количеством одного или нескольких дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно антидиабетических лекарственных средств. "Субтерапевтический" предназначен для обозначения количества, которое может составлять, например, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% от обычной терапевтической дозы (в частности, для тех же показаний и для тех же путей введения).
В частности, дополнительное активное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, используемое для лечения или замедления прогрессирования, или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Например, дополнительное лекарственное средство может быть антидиабетическим лекарственным средством, таким как гипогликемическое средство или антигипергликемический агент. Оно может быть выбрано из неисчерпывающего перечня, включающего инсулин, метформин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид, ацетогексамид, толазамид, хлорпропамид, глибенкламид (также называемый глибенкламид), глимепирид, глипизид, гликлазид, гликопирамид и глихидон, ингибиторы альфа-глюкозидазы, такие как акарбоза, миглитол и воглибоза, тиазолидиндионы, такие как пиоглитазон и розиглитазон, меглитинид, такой, как репаглинид и натеглинид, инкретиновый миметики, аналоги и агонисты глюкагон-подобного пептида, такие как эксенатид, таспоглютид и лираглютид, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, такие как вилдаглиптин, ситаглиптин, саксаглиптин, линаглиптин, аллоглиптин и септаглиптин, аналоги амилина, такие как памлинтид, ингибиторы SGLT2, такие как канаглифлозин и дапаглифлозин, или любой их комбинации.
Форма фармацевтических композиций, способ введения, дозировка и режим, естественно, зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, возраста, массы и пола пациента и т.д.
Фармацевтические или терапевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазного введения и т.д.
Молекула, используемая в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, присутствует в терапевтически эффективном количестве. Термин "терапевтически эффективное количество", используемое в настоящей заявке, означает то количество терапевтического средства, вводимого пациенту, которого достаточно для лечения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, гиперинсулинемии, как это определено выше.
Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу, формулируется в соответствии со стандартной фармацевтической практикой (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 19881999, Marcel Dekker, New York), известной специалисту в данной области.
Для перорального введения композиция может быть приготовлена в виде обычных пероральных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы и жидкие препараты, такие как сиропы, эликсиры и концентрированные капли. Могут быть использованы нетоксичные твердые носители или разбавители, которые включают, например, фармацевтические сорта маннита, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния, и тому подобное. Для прессованных таблеток, связующие вещества, которые представляют собой агенты, придающие когезионные свойства порошковым материалам, также необходимы. Так, например, крахмал, желатин, сахара, такие как лактоза или декстроза, и природные или синтетические смолы могут быть использованы в качестве связующих веществ. Разрыхлители также необходимы в таблетках для облегчения разламывания таблетки. Разрыхлители включают крахмалы, глины, целлюлозы, альгины, камеди и поперечно-сшитые полимеры. Кроме того, смазочные материалы и вещества, способствующие скольжению, также включают в таблетки для того, чтобы предотвратить прилипание таблеточного материала к поверхности в процессе производства и для улучшения характеристик текучести порошкового материала в процессе производства. Коллоидный диоксид кремния, наиболее часто используется в качестве вещества, способствующего скольжению, а соединения, такие как тальк или стеариновая кислота наиболее часто используются в качестве смазочных материалов.
Для чрескожного введения, композиция может быть приготовлена в виде мази, крема или гелевой формы и соответствующие проникающие вещества или детергенты
могут быть использованы для облегчения проникновения, например, диметилсульфоксид, диметилацетамид и диметилформамид.
Для введения через слизистую могут быть использованы назальные спреи, ректальные или вагинальные суппозитории. Активное соединение может быть включено в любую из известных основ для суппозиториев, способами, известными в данной области. Примеры таких основ включают масло какао, полиэтиленгликоль (карбовоски), полиэтилен сорбитан моностеарат, а также их смеси с другими совместимыми материалами для модификации температуры плавления или скорости растворения.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для высвобождения активного лекарственного средства по существу немедленно после введения или в любое заранее определенное время или период времени после введения.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать одну или несколько молекул по настоящему изобретению, связанных с фармацевтически приемлемыми наполнителями и/или носителями. Эти вспомогательные вещества и/или носители выбираются в соответствии с формой введения, как описано выше.
В конкретном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит от 0,001 мг до 10 г молекулы по изобретению. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит от 0,01 мг до 1 г молекулы по изобретению.
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Метаболические характеристики мышей Almsfoz/foz
(А) Средняя масса тела самцов мышей дикого типа и Almsf°z/f°z (п= 6-8 мышей на генотип). (В) Фотография висцеральной жировой ткани у дикого типа и Almsfoz/foz. Масштабная метка: 25 мкм. (С) Тест на толерантность к инсулину (ITT) проводили на мышах дикого типа и Almdoz/foz мышах и соответствующая гистограмма, демонстрирует площадь под кривой (AUC) для каждого генотипа (п= 6-8 мышей на группу), р <0,001).
(D) Средняя масса тела самцов мышей дикого типа и Almsf°z/f°z (п= 6-8 мышей на генотип).
(E) Фотография висцеральной жировой ткани из соответствующих мышей дикого типа и Almsfoz/foz-. Масштабная метка: 25 мкм. (F), тест на толерантность к инсулину выполняли на мышах дикого типа и Almsiozlioz-Mbimsx. и соответствующая гистограмма демонстрирует AUC для каждого генотипа (п= 6-8 мышей на группу). *** Означает р-значение <0,001. (G) Иммуноблоты для указанных белков в инсулинчувствительных тканях из нестрадающих ожирением мышеи дикого типа и AlmsSozJSoz. (Н) Подсчет радиоактивных
(D)
сигналов в различных целевых тканях после инъекции радиоактивной дезоксиглюкозы мышам дикого типа и мышам Alm^oz№oz (п = 5 мышей на генотип). * означает р-значение = 0,05.
Фигура 2. Сайленс-эффект ALMS1 в зрелых адипоцитах человека (А) Фотографии, демонстрирующие отсутствие поглощения 2-NBDG (зеленый) в контрольных (shCTRL кшРНК) или лишенных ALMS1 адипоцитах (ALMS1 кшРНК) подвергнутых сайленсингу зрелых адипоцитах в отсутствии INS. (В) Фотографии, демонстрирующие отсутствие поглощения 2-NBDG в ALMS1 кшРНК по сравнению с CTRLKIIIPHK. Ядра окрашены с помощью DAPI, DIC: изображения дифференциального интерференционного контраста. (С) ЗБ-изображения CTRLKIIIPHK- ИЛИ ALMSIKIIIPHK-зрелых адипоцитов окрашенных по внутриклеточным триглицеридам (TG), плазматической мембране-красный (РМ) и ядрам-синий (DAPI). (D) Измерения уровней флуоресценции, коррелирующих с количеством внутриклеточных Tg в зрелых адипоцитах (п= 16 лунок на каждое измеренное условие) * р-значение = 0,05. (E-F) Иммунодетекция АКТ и pS473-AKT в CTRLKIIIPHK- И ALMSlKiiiPHK-обработанных зрелых адипоцитах в присутствие и отсутствие INS. (G) ЗБ-изображения CTRLKIIIPHK- И ALMSIKIIIPHK-зрелых адипоцитов, демонстрирующие клеточную локализацию рецептора инсулина (IR-красный) и GLUT4 (зеленый) в отсутствие Ins. Изображения в сечении, отображающие динамику локализации GLUT4 в отсутствие Ins. (Н), через 30 мин. стимуляции INS. (I), и с 30 мин. стимуляцией INS. с последующим 2-х часовым отсутствием INS. (J) в CTRLKIIIPHK- И ALMS 1кшРНК-зрелых адипоцитах. Масштабная метка: 25 мкм в А, В, С и 5 мкм в GJ.
Фигура 3. Прогнозируемые участки взаимодействия на белке ALMS1 и моделирование его партнера TBC1D4. (А) Спрогнозированная ЗБ-структура белка ALMS1 со спиралями и петлями. (В) Спрогнозированная ЗБ-структура белка ALMS1 с потенциальными участками взаимодействия, представленными красными точками. (С) Первичная последовательность белка TBC1D4 с указанной локализации участков связывания или взаимодействующих доменов. (D) Спрогнозированная 3D структура белка TBC1D4.
Фигура 4. ALMS1 требуется для клеточной направленной миграции TBC1D4 (A) In silico спрогнозированная ЗБ-структура, показывающая пространственное взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4 с увеличенным видом участка взаимодействия, в котором выделены спрогнозированные взаимодействующие аминокислотные остатки (L66, Y61 и S2879) белка ALMS1. (В) ЗБ-изображение иммуноокрашиванных зрелых адипоцитов, отображающее колокализацию TBC1D4 (зеленый) и ALMS1 (красный). Ядра
докрашены с помощью DAPI (синий). (CD) Иммуноблоты указанных белков на клеточных лизатах (50 мкг общего количества белка загружали на одну дорожку) для CTRLKIIIPHK- И ALMS 1 кшРНК-зрелых адипоцитов, обработанных или не обработанных инсулином. ЗО-изображения иммунофлюоресцентных экспериментов, выполненных либо на CTRLKIIIPHK-, либо на ALMSIKIIIPHK-, либо на ТВСШ4кшРНК-зрелых адипоцитах, отображающие клеточную локализацию GLUT4 в отсутствие инсулина (-INS) (Е) или в присутствие INS. (F). РМ: плазматическая мембрана, ядра докрашены с помощью DAPI. ЗО-изображения иммунофлюоресцентных экспериментов, выполненных либо на CTRLKIIIPHK-, либо на ALMSlKiiiPHK-адипоцитах, демонстрирующие клеточную локализацию GLUT4 (зеленый) и TBC1D4 в отсутствии INS(G) или через 30 мин. после обработки INS. (Н). Масштабные метки: 10 мкм.
Фигура 5. TBC1D4 не является единственным взаимодействующим партнером ALMS1, играющим роль в биологии адипоцитов
(А-С) Фотографии, демонстрирующие поглощение 2-NBDG в либо CTRLKIIIPHK-, либо ALMSIKIIIPHK-, либо ТВСШ4кшРНК-депривированными адипоцитами после 30 мин. стимуляции INS. (D-F) ЗО-изображения, полученные с использованием непермеабилизованных зрелых адипицитов, стимулированных INS. с последующей иммунодетекцией мембраносвязванного GLUT4 (зеленый). Плазматическая мембрана (РМ) была окрашена с помощью Image-iT (красный), а ядра были докрашены с помощью DAPI. (G) Иммуноблоты 2 субъединиц протонного насоса (ATP6V0D1 и ATP6V1A), идентифицированных с помощью масс-спектрометрии в IP-экспериментах с использованием ALMS1 в качестве приманки (Фиг. S4), аРКС, GLUT4 и бета-тубулин в клеточных экстрактах из белой жировой ткани (WAT) и почек, 50 мкг общего белка загружено на одну дорожку. (Н) Фотография положительного сигнала Duolink, обнаруженного в адипоцитах с использованием антител против ALMS1 и АТР6. (I) Иммунофлуоресцентные изображения, демонстрирующие клеточные локализации ATP6V0D1 и ALMS1 и объединенное изображение в зрелых адипоцитах при стимуляции INS. (J) In silico спрогнозированные участки связывания TBC1D4 (красный) и РКС (желтый), которые находятся всего в 20 ангстрем друг от друга в ЗО-структуре ALMS1. (K-L) Иммунодетекция аРКС, TBC1D4 и альфа-актинина в иммунопреципитатах с использованием ALMS1 в качестве приманки в адипоцитах, культивируемых в отсутствие или в присутствие INS.
Фигура 6. Восстановление ацидификации в ALMSl-депривированных адипоцитах восстанавливает всасывание глюкозы
(А-В) Изображения серийной съемки с интервалом были выполнены либо на
контрольных, либо на ALMSl-депривированных адпипоцитах, окрашенных акридиновым оранжевым и стимулированных INS. (C-D) Изображения серийной съемки с интервалом были выполнены либо на контрольных, либо на ALMSl-депривированных адпипоцитах, окрашенных акридиновым оранжевым и стимулированных электронейтральным ионофором-обменником К+/Н+, нигерицином (NIG.).(E) Сверху вниз: Изображения контрольных адипоцитов, полученные сканирующей электронной микроскопией (SEM), стимулированных либо без INS, либо с INS. либо с NIG. Белые стрелки показывают разбухшие везикулы. (F), Изображения, полученные просвечивающей электронной микроскопией (ТЕМ), соответствующие представленным в (Е), демонстрируют слияние везикул с плазматической мембраной в присутствие INS. и NIG. (G) Сверху вниз: SEM фотографии ALMS 1-депривирвоанных адипоцитов, стимулированных либо без INS, либо с INS. либо с NIG. (Н) Изображения ТЕМ, соответствующие представленным в (G), демонстрирующие слияние везикул с плазматической мембраной только в присутствии NIG. (I) Фотографии, демонстрирующие внутриклеточное содержание 2-NBDG (зеленый) в контрольных зрелых адипоцитах либо в отсутствии INS. (верхняя панель) либо после 30 минутстимуляции INS. (средняя панель) либо после 30 мин. стимуляции NIG. (нижняя панель). (J) Фотографии, демонстрирующие внутриклеточное содержание 2-NBDG (зеленый) в ALMSl-депривированных зрелых адипоцитах либо в отсутствии INS. (верхняя панель) либо после 30 минут стимуляции INS. (средняя панель) либо после 30 мин. стимуляции NIG. (нижняя панель). Масштабная метка: 20мкм за исключением F и Н: 500 нм.
Фигура 7. Направленная миграция GLUT4 требует белковый комплекс ALMSoMbi (А) ЗО-изображения, полученные с использованием непермеабилизованных фиксированных зрелых адипоцитов, стимулированных NIG. с последующей иммунодетекцией мембраносвязанного GLUT4 (зеленый). Плазматическая мембрана (РМ) была окрашена Image-It (красный), а ядра были докрашены с помощью DAPI. (В) Фотографии, демонстрирующие содержание внутриклеточных TG через 24 часа после обработки NIG. (С) Схематическое представление клеточной локализации ALMS1 и белка-партнера в отсутствие стимуляции INS. в зрелом адипоците. (D) Схематическое представление динамики ALMS1 и белковых партнеров послестимуляции INS. в зрелом адипоците.
Фигура 8. Поглощение глюкозы инициируется в отсутствие INS посредством специфической интерференции с участком связывания аРКС в ALMSoMe
(А) Фотографии, демонстрирующие поглощение 2-NBDG в присутствие или в отсутствие INS в адипоцитах, инфицированных либо лентивирусными частицами CTRL,
либо лентивирусными частицами с доменом аРКС. (В) Количественное определение внутриклеточного аналога глюкозы 2-NB в присутствие либо лентивирусных частиц CTRL, либо лентивирусных частиц с доменом аРКС (п= 8 на группу). Фигура 9. Описание конструкции min-aPKC-FLAG в адипоцитах Верхняя панель: Иммунодетекция min-aPKC-FLAG с использованием анти-FLAG антитела в зрелых адипоцитах через 48 часов после инфекции лентивирусом. 2-я и 3-я панели: ЗО-изображение адипоцитов, демонстрирующее перинуклеарную локализацию min-aPKC-FLAG. Последняя панель: Схематическое представление экспериментальных подходов, используемых для оценки влияния min-aPKC-FLAG на поглощение глюкозы.
ПРИМЕРЫ
Синдром Альстрёма (ALMS) является редким аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся несколькими клиническими признаками, включающими ожирение и раннее возникновение диабета. Это происходит из-за мутации в гене, кодирующем 460 кДа белок ALMS 1.
До сих пор была неизвестны функция гена ALMS1 и то, как он вызывает фенотип синдрома Альстрёма, исследования его функции тормозит чрезвычайно большой размер кодируемого белка и его низкие уровни экспрессии.
Синдром Альстрёма (ALMS) является редким моногенным синдром детского ожирения, для которого существует только один причинный мутантный ген, идентифицированный к настоящему времени, ген ALMSL ALMS классифицируется как представитель расстройств цилиопатии, которые включают синдром Барде-Бидля, группу синдромных расстройств, возникающих из-за мутаций в большом количестве различных белков, которые вместе играют важную роль в функции первичной реснички. Almsl кодирует 461 кДа белок ALMS 1, который первоначально был описан как имеющий чисто центриолярную локализацию, хотя более поздние данные также предположили цитоплазматическую локализацию ALMS 1.
ALMS клинически отождествлен с совокупным мультисистемным фенотипом, который как предполагается, отражает убиквитарную тканевую экспрессию ALMS1, близко имитируя многие из фенотипических особенностей BBS. Общие клинические признаки ALMS включают дегенерацию сетчатки, потерю слуха, детское ожирение, раннее начало сахарного диабета 2 типа (T2DM), дилатационную кардиомиопатию, почечную и печеночную дисфункцию, гипотиреоз, низкорослость, гиперлипидемию и органный фиброз. У детей с ALMS развивается ожирение в раннем детстве, что связано с ранним возникновением T2DM примерно в 16 лет, с гораздо более высокой общей
распространенностью раннего возникновения T2DM при ALMS, чем наблюдаемые с другими синдромами детского ожирения, дающими похожий индекс массы тела (ИМТ) в том числе BBS. Причина этого склонности к T2DM у детей с ALMS, которая не пропорциональна их степени ожирения, остается неясной.
Авторы настоящего изобретения исследовали роль белка ALMS1 в адипогенном процессе дифференцировки и обнаружили, что уровни экспрессии белка ALMS1 растут в ходе адипогенеза. Супрессия ALMS1 в адипогенных дифференцирующихся мезенхимальных стволовых клетках ингибирует анти-адипогенные каскады, но, на удивление, не в пользу адипогенеза.
Кроме того, авторы показали, что белковый комплекс ALMS1 также необходим в зрелых адипоцитах для эффективного удержания GLUT4 в его инсулин-респонсивном компартменте и для его способности сливаться с плазматической мембраной в ответ на стимуляцию инсулином. Инактивация ALMS1 уменьшает количество глюкозы, которое способны поглотить зрелые адипоциты при стимуляции инсулином, способствуя таким образом гипергликемии и возникновению диабета.
Предыдущие исследования на спонтанном мутанте AlmsPoz/foz и нокаутной по Almsl мышиной модели ALMS, полученной введением вставки внутрь гена, подтвердили, что у этих мышей, подобно страдающим от болезни детям, развивается ожирение в раннем подростковом возрасте из-за гиперфагии, а также проявляют нарушенная толерантность к глюкозе, гиперинсулинемия и островковая гипертрофия, что соответствует тяжелой резистентности к инсулину, хотя происхождение ткани или механизм для этой резистентности к инсулину ранее не были охарактеризованы. Ранее опубликованные in vitro исследования на мышиной фибробластной линии клеток 3T3-L1 показали, что ингибирование экспрессии гена ALMS1 приводит к умеренному нарушению адипогенеза, но сообщалось, что не оказывается никакого влияния на инсулиновый сигнальный путь в полученных зрелых адипоцитах, что было измерено по инсулин-опосредованному фосфорилированию АКТ. Эти данные уводят в сторону от изобретения, представленного в данном документе, в котором Alms 1 действительно играет критическую, неизвестную до настоящего времени роль в сигнальном пути инсулина и в ОШТ4-опосредованном транспорте глюкозы.
Действительно, несмотря на ранее опубликованных противоречащие данные, авторы при тщательном изучении фенотипа мышиной модели ALMS Fat Aussie (Almslf°z/f°z) определили, что резистентность к инсулину в этой модели предшествует, а не следует за развитием ожирения. Кроме того, они идентифицировали жировую ткань как конкретный участок, управляющий резистентностью к инсулину, и последующим развитием
толекартности к глюкозе и T2DM при ALMS. Они подтвердили, что сигнальный путь инсулина в адипоцитах AlmsPoz/foz был интактным по всему пути вниз до фофорилирования TBC1D4, последнего известного представителя пути инсулинопосредованного поглощения глюкозы, и затем в ходе последующей серии исследований были определен белковый комплекс, который они назвали ALMSoMoft, состоящий из нескольких ключевых белков, которые связываются с ALMS1, и которые вместе необходимы для прикрепления и слияния ОШТ4-везикул с плазматической мембраной (РМ) адипоцитов в ответ на сигнал инсулина. ALMSoMa, таким образом, представляет собой до сих пор неизвестную последнюю стадию инсулинопосредованного поглощения глюкозы адипоцитами, с резистентностью к инсулину при ALMS из-за нарушения функции ALMSoMbi, ведущей к выходу из строя ОШТ4-опосредованного слияния мембран и, таким образом, блокировке транспортировки глюкозы в адипоцитах. ПРИМЕР 1
Мыши Almslf°z/f°z демонстрируют сильную специфическую резистентность к инсулину в жировой ткани даже при отсутствии ожирения Содержание животных
Мышей AlmsPoz/f°z и однопометников Almsl+/+ (дикий тип) поддерживали в окружении C57BL/6J в виварии с 12 часовым циклом свет/темнота. Мыши имели свободный доступ ad libitum к воде и либо к нормальному корму, содержащему 5,4% жира, с содержание энергии 12 МДж/кг (пелеты Гордона для содержания мышей и крыс, Gordon's specialty stockfeeds, Австралия) либо к корму с высоким содержанием жиров (HFD), содержащему 23% жира, высоким уровнем простых углеводов, 0,19% холестерина, с содержанием энергии 20 МДж/кг (SF03-020, Specialty feeds, Австралия). Для ПЦР-генотипирования были использованы праймеры, фланкирующие мутацию foz: прямой АСА ACT ТТТ CAT GGC ТСС AGT (SEQ ID NO: 13); обратный TTG GCT С AG AGA CAG TTG AAA (SEQ Ш NO: 14).
Шестимесячных страдающих ожирением и молодых (в возрасте <60дней) без ожирения AlmsPozlioz мышей и однопометников дикого типа (WT) использовали для исследования первичных метаболических нарушений приводящих мышей A AlmsPozltm к развитию T2DM. Шестимесячные Almsl**1*(tm) мыши страдали от ожирения со средней массой тела 45,5 г ± 1,7 г по сравнению с 26,4 г ± 1,3 г для однопометников дикого типа (Фиг. 1А) и, как было показано ранее, имели гипергликемию натощак и нарушенную толерантность к глюкозе с повышенными баллами НОМА. Тест на толерантность к инсулину (ITT) показал, что в отличие от WT (Фиг. 1В) и гетерозиготных однопометников, гликемия у страдающих ожирением AlmsPoz/foz-мышей была невосприимчива к введению
инсулина (Фиг. 1В), даже когда вводимые дозы инсулина достигали 20 Ед./кг (Фиг. 1С). Ожирение Almslf°z/f°z-мышей возникло из-за сильной гипертрофии адипоцитов (Фиг. IB), а не гиперплазии адипоцитов, как правило, наблюдаемой у BBS-мышей с ожирением. Для того, чтобы определить, какой первичный дефект, вызывает нарушение толерантности к глюкозе у AlmsPoz/foz мышей, были изучены молодые худые AlmsPoz/foz мыши для того, чтобы удалить смешанное воздействие ожирения на респонсивность на инсулин. В возрасте 2 месяцев, самцы WT и Almsl f°z/f°z имели аналогичную среднюю массу тела ~ 24 г (Фиг. ID). ITT у этих мышей показало, что молодые без ожирения AlmsPoz/foz самцы тем не менее уже демонстрируют значительно уменьшенную респонсивность на инсулин (Фиг. 1е), в соответствии с резистентностью к инсулину, предшествующей ожирению в этой модели. Иммунодетекция IRAP, Akt, р-АКТ, GLUT4, С/ЕВР-а и GAPDH осуществленная на инсулин-чувствительных тканях, а именно, сердце, печени, скелетных мышцах и белой жировой ткани (WAT) из 6-месячных не голодавших AlmsPoz/foz и WT не показали никаких существенных различий в уровнях белка, за исключением последовательного увеличения р-АКТ относительно общего АКТ в WAT, что согласуется с парадоксальным увеличением, а не снижением активации восходящих участников сигнального пути инсулина у AlmsPoz/foz мышей с нетолерантностью к глюкозе (Фиг. 1G). Для того, чтобы определить, какие ткани по отдельности или вместе могут быть основным источником резистентности к инсулину, наблюдаемой у мышей Almsl f°z/f°z^ распределение по тканям поглощения инсулинопосредованной дезоксиглюкозы (DOG) сравнивали у WT и Almsl foz/foz мышей. Это подтверждает, что серьезно ослабленное поглощение DOG было ограничено WAT из мышей AlmsPoz/foz с компенсаторным увеличением поглощения DOG в инсулинреспонсивных икроножной и камбаловидной мышцах по сравнению с мышами дикого типа.
Эти исследования показывают, что, хотя Almsl f°z/f°z мыши становятся тучными и у них развивается с возрастом прогрессирующий T2DM, основным изначальным дефектом, способствующим резистентности к инсулину и гипергликемии является нарушение в отсутствие, функционального ALMS1 поглощения глюкозы жировой тканью в ответ на передачу сигналов инсулина и этот дефект предшествует развитию ожирения.
ПРИМЕР 2
Сайленсинг Almsl в адипоцитах человека блокирует поглощение глюкозы из-за нарушение клеточной сортировки GLUT4
Материалы: От Molecular Probes, Invitrogen: акридиновый оранжевый, набор для окрашивания плазматических мембран и ядер "Image-iT (r) LIVE Plasma Membrane and Nuclear Staining Labeling Kit", 2-NBDG (2- (К-7-нитробенз-2-окса-1,3-тиадиазол-4-ил)
амино)-2-дезоксиглюкоза), Hoechst 33258 и Cell Light (tm) Early Endosomes-RFP * BacMam 2.0*; Каталожный номер#: A3568, 134406, N13195, H3569 и C10587. От Lonza: реактив "AdipoRed ТМ Assay Reagent" (Catalog #: PT-7009). Лентивирумные частицы от Santa Cruz Biotechnology, Inc.: ALMS1 лентивирусные частицы кшРНК (h), лентивирусные частицы TBC1D4 кшРНК (h) и лентивирусные частицы-А с контрольными кшРНК; Каталожный номер #: SC-72345-V, SC-61654-V и SC-108080 соответственно. От Tocris Biosciences: натриевая соль нигерицина (Каталожный номер #: 4312).
Биохимические тесты. Мышей испытывали на устойчивость к инсулину с помощью теста на толерантность к инсулину (ITT) и теста на толерантность к глюкозе (внутрибрюшинный IPGTT). Для ITT мышей не кормили в течение 4 часов, без доступа к продуктам питания, но со свободным доступом к воде. Мышей взвешивали и инсулин (Humulin R, Eli Lilly, США) вводили внутрибрюшинно по 0,75 ед./кг массы тела в 0,9% -ном солевом растворе для инъекций (Pfizer, США). Получали кровь из хвоста и определяли уровень глюкозы в плазме для каждой мыши с помощью глюкометра (Optium Xceed, Abbott, США) и полосок для тестирования глюкозы в крови (Optium point of care, Abbott, США) в момент 0, 15, 30 и 60 мин. после инъекции инсулина. Для IPGTT, мышей не кормили в течение 18 часов и вводили в 2 мг/г массы тела D-глюкозы (Analar, VWR, США) в 0,9%-ном солевом растворе для инъекций. Уровень глюкозы в плазме определяли для каждой мыши с помощью глюкометра с отбором проб через хвостовую вену в момент 0, 15, 30, 60 и 120 мин. после инъекции глюкозы. Для измерения инсулина в плазме отбирали кровь у бодрствующих животных посредством кровоизвлечения из щеки. После сбора пробы крови держали на льду и центрифугировали при 17000 g, 10 мин. при 4 °С. Уровни инсулина анализировали с помощью коммерческого ультрачувствительного к мышиному инсулину набора для ELISA (Crystal Chem Inc., США). Гомеостатическую модель оценки резистентности к инсулину (НОМА-ГО.) рассчитывали с использованием уровней инсулина натощак и глюкозы натощак у индивидуальной мыши. Использовалась следующая формула: НОМА-ГО = [глюкоза натощак (мг/дл) х инсулин натощак #/Ед/мл)]/405.
Культура клеток. Были приобретены человеческие белые висцеральные преадипоциты (Каталожный номер #: С-12732; PromoCell) и мезенхимальные стволовые клетки человека (Каталожный номер #: С-12974; PromoCell), полученные из здорового костного мозга. Преадипоциты рассевали в соответствии с протоколом производителя и культивировали в среде для роста преадипоцитов (Каталожный номер #: С-27410; PromoCell) до конфлуентности. За один день до индукции конечного адипогенеза, клетки инфицировали специфическими лентивирусными частицами, состоящими из пула 3
мишень-специфичных конструкций кшРНК, приобретенных у Santa Cruz Biotechnology, и на следующий день, адипогенную дифференцировку индуцировали путем замены среды на среду для дифференцировки преадипоцитов (Каталожный номер #: С-27436; PromoCell) на 2 дня. После стадии дифференцировки, среду окончательно заменяли на среду Adipocyte Nutrition (Каталожный номер #: С-27438; PromoCell). Для культуры без инсулина, среду "Adipocyte Basal Medium" (Каталожный номер #: С-2431; PromoCell) без инсулина дополняли 5 г/л дезоксиглюкозы, 8 мкг/мл d-биотина, 40С^/мл дексаметазона. В случае hMSCs, их культивировали в ростовой среде для мезенхимальных стволовых клеток (каталожный номер #: С-28010; PromoCell) до конфлуэнтности. hMSC трансфицировали конкретными миРНК, как описано выше, и на следующий день липогенную дифференцировку индуцировали путем замены среды на среду "MSC Adipogenic Differentiation Medium" (Каталожный номер #: С28011; Promocell).
Выделение РНК, синтез кДНК, количественная ПЦР и Taqman. Тотальную РНК получали из различных тканей и клеток с помощью набора RiboPure(tm) (Каталожный номер #: AMI924; Ambion) с последующей обработкой ДНКазой с TURBO DNA-free(tm) (Каталожный номер #: AM 1907; Ambion). Целостность РНК оценивали с помощью гель-электрофореза и концентрацию РНК определяли с помощью Eppendorf Biophotometer Plus с кюветой Cell Hellma(r) Tray (Каталожный номер #: 105,810-UVS; Hellma). Обратную транскрипцию 1 мкг тотальной РНК в кДНК осуществляли с использованием набора для синтеза кДНК BioRad iScript(tm) (Каталожный номер #: 170-8891; BioRad). В режиме реального времени количественную амплификацию полимеразной цепной реакцией проводили в режиме реального времени в системе BioRad CFX96(tm) с помощью IQ(tm) SYBR(r) Green Supermix (Каталожный номер #: 170-8886; BioRad) и набора праймеров, оптимизированных для тестируемых мишеней для ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green для ПЦР в реальном времени. Анализ Taqman проводили со специфическим генным анализом с помощью "TaqMan(r) Fast Advanced Master Mix" (Каталожный номер #: 4444557; Applied Biosystems). Нормализованную кратную экспрессию гена-мишени рассчитывали с использованием метода сравнительного порогового цикла (Ct), нормализуя Ст целевой мРНК к таковой для GAPDH с помощью CFX Manager Software Version 1.5 и проверяли с помощью программы Lin-Reg.
Вестерн-блоты и иммунофлюоресцентная микроскопия. Самцов AlmsP0Z,*0Z и однопометников дикого типа анестезировали. Следующие инсулин-чувствительные ткани: печень, сердце, мышечную и жировую ткани собирали и непосредственно помещали в RIPA-буфер (Трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, 0,1% SDS, 1% Тритон-ХЮО), дополненный полным коктейлем ингибиторов мини-протеаз и коктейлем ингибиторов
фосфатаз PhosSTOP (Roche, Швейцария). Образцы обрабатывали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин. при 17000G, 4°С 30 мин. Концентрацию белка анализировали с помощью ВСА-анализа (Thermo Fisher Scientific, США). Клеточные белки из клеток получали преципитацией трихлоруксусной кислотой и проводили иммуноблот-анализы с использованием 30-50 мкг общего белка. Связывание специфического антитела визуализировали с помощью субстрата "SuperSignal(r) West Femto Maximum Sensitivity Substrate" (Каталожный номер #: LA45954, Pierce) в системе визуализации BioRad Versadoc(tm) или имеджере ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Великобритания). Неспецифические белки, окрашенные Ponceau S, использовали в качестве контролей загрузки для нормализации сигнала, полученного после специфической иммунодетекции представляющего интерес белка с помощью программы "Bio-Rad Quantity Опе". Для иммунофлюоресцентных экспериментов клетки высевали в системе "регтапох 8-wells Lab-Tek II Chamber Slide" (Каталожный номер #: 177445; Nunc). Клетки обрабатывали, как указано. Затем клетки и криосрезы тканей обрабатывали для детекции белков после фиксации метанолом и пермеабилизации с помощью 0,1% тритона Х-100. Микроскопические препараты монтировали для детекции с помощью среды для заливки Vectashield Mounting Medium (Каталожный номер #: Н-1200; Vector Laboratories). Для просмотра ассоциированных с мембранами белки, клетки фиксировали в формалине в течение 15 мин. и напрямую блокировали, а затем подвергали иммуноокрашиванию и съемке с использованием вертикального микроскопа Zeiss Axiolmager Z2. Анализ изображений, ЗО-реконструирование и эксперименты с серийной съёмкой с временным интервалом и эксперименты по отслеживанию эндосом осуществляли либо с помощью программы Zeiss AxioVision с соответствующими модулями 3D и Tracking Zeiss или с помощью платформы для получения изображений Zeiss Zen 2012.
Измерение флюоресценции. Преадипоциты культивировали в 96-луночном планшете и 12 лунок инфицировали либо лентивирусными частицами с ALMS1 кшРНК, либо лентивирусными частицами с CTRL кшРНК, и подвергали дифференцировке на следующий день в зрелые адипоциты. Через 3 недели, внутриклеточные триглицериды окрашивали с помощью красителя AdipoRed в соответствии с процедурой изготовителя и измеряли флуоресценцию на монохроматоре Tecan Infinite 200 QUAD4 (Тесап, Лион, Франция) на длине волны 520 нм. Полученные данные затем анализировали с помощью программного обеспечения Тесап Magellan Data Analysis с использованием в качестве контроля неокрашенных адипоцитов.
Эксперименты по коиммунопреципитации. Для экспериментов по
коиммунопреципитации мы использовали набор "Dynabeads(r) Antibody Coupling kit" (Каталожный номер #: 143.1 ID, Invitrogen) в комбинации с набором "Dynabeads(r) со-immunprecipitation kit" (Каталожный номер #: 143.21D, Invitrogen). hMSC культивировали до конфлуэнтности и адипогенную дифференцировку вызывали сменой среды. Через 7 дней после адипогенной дифференцировки, инициированной сменой среды, адипоциты, культивировали с или без Ins. за 24 ч до лизиса, затем лизировали в нативных условиях и использовали согласно набору. После иммунопреципитации и высвобождения с гранул, образцы загружали на гель "NuPAGE 3-8% TrisAcetate" (каталожный N: ЕА0375ВОХ, Invitrogen), с белковым стандартом "Hi Mark(tm) Prestained HMW Protein Standard)) (Каталожный номер #: LC5699, Invitrogen).
Белковый препарат и идентификация с помощью масс-спектрометрии. Гидролиз в геле: Процедуру гидролиза в геле проводили, как описано Rabilloud et al. (ссылка). Приготовление кусков геля до гидролиза трипсином осуществляли с помощью жидкостного робота-обработчика (QuadZ215, Gilson International, Франция). Вкратце, гелевые полосы промывали поочередно 100 мкл 25 мМ NH4HCO3, а затем 100 мкл 50% ацетонитрила (ACN) (3 мин. промывка при встряхивании и жидкость сливали перед добавлением следующего растворителя). Этот цикл увлажнения/дегидратации повторяли дважды и кусочки геля сушили в течение 20 мин. перед восстановлением (10 мМ ДТТ / 25 мМ NH4HCO3 буфер при 56 °С в течение 45 мин.) и алкилированием (25 мМ йодацетамид / 25 мМ NH4HCO3 буфер в течение 45 мин, при комнатной температуре). После этого пятна на геле снова промывали 3 циклами 25 мМ NH4HCO3/ACN поочередно. После 20 мин. стадии сушки кусочки геля подвергали регидратации тремя объемами трипсина (Promega, V5111) 12,5 нг/мкл в 25 мМ NH4HCO3 буфере (свежеразбавленном) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Трипсинизированные пептиды экстрагировали из геля путем энергичного встряхивания в течение 30 мин. в адаптированном объеме 35% Н2О/60% ACN/5% НСООН и стадией обработки ультразвуком в течение 15 мин.
MALDI-TOF (/TOF) масс-спектрометрия и поиск в базах данных. Измерение MALDI проводили на Autoflex III SmartBeam (Bruker-Daltonik GmbH, Бремен, Германия) матричном лазерном с десорбцией/ионизацией времяпролетном масс-спектрометре (MALDI-TOF TOF), используемом в рефлекторном положительном режиме. Мишень "Prespotted Anchorchip" (система РАС от Bruker Daltonik, Техническое примечание TN011) с матрицей НССА использовали для анализа триптических гидролизатов. Полученные данные масс фингерпринтинга пептидов (PMF) и данные фингерпринтинга пептидных фрагментов (PFF) объединяли с помощью программного обеспечения Biotools
3.2 (Bruker Daltonik) и переносили интранет-версию в поисковую систему MASCOT (Matrix Science, Лондон, Великобритания). Вариабельные модификации (N-концевое белковое ацетилирование, окисление метионина и карбамидометилирование цистеина) и одно пропущенное трипсином расщепление приняли во внимание и ошибку пептидной массы ограничили до 50 частей на миллион. Белки идентифицировали с помощью функции поиска данных против неизбыточной базы данных белковых последовательностей NCBI, а затем против базы данных, ограниченной человеческими последовательностями. Во всех результатах, вероятностные баллы были выше, чем балл установленный как значимый с р-значением равным 0,05. NanoLC-MSMS масс-спектрометрия и поиск в базах данных: Для анализа nanoLC-MS/MS, пептиды были перенесены в стеклянные вставки, совместимые с системой LC-автосамплера (nanoLC-U3000, Dionex, США). Система ЖХ была соединена с масс-спектрометром ESI-Q-TOF (MicroTOFQ-II, Bruker, Германия). Метод заключался в 60 мин. прогоне при скорости потока 300 нл/мин. с использованием градиента двух растворителей: А (99,9% воды: 0,1% муравьиной кислоты) и В (99,92% ацетонитрил: 0,08% муравьиной кислоты). Система включает: колонку ЗООцт X 5 mm РерМар С18, используемую для преконцентрирования пептидов и колонку 75 цт X 150тт С18, используемую для элюирования пептидов. Анализатор TOF калибровали каждый день: данные получали и обрабатывали автоматически с использованием программного обеспечения Hystar 2.8 и DataAnalysis 2.6. Последовательные поиски вначале в базе данных NCBInr, а затем против базы данных, ограниченной человеком, осуществляли для каждого образца с использованием локальной версии Mascot 2.2 (MatrixScience, Великобритания) и ProteinScape 2.0 (Bruker, Германия). Относительное число ложноположительных сигналов (FPR) для идентификации белков оценивали с использованием базы данных обратных ловушек (reverse decoy): валидацию белка проводили с использованием FPR ниже 1%. Кроме того, белки, идентифицированные только по 1 пептиду, проверяли вручную: MS/MS спектры были проверены в соответствии с обычными правилами фрагментации.
In situ анализ близкого лигирования (PLA). Набор Duolink для in situ PLA с антимышиным ПЛЮС зондом и анти-кроличьим МИНУС зондом (Каталожные номера #: 90701 и 90602; OLink Bioscience) использовали в комбинации с соответствующими первичными антителами согласно методике производителя. Человеческие первичные преадипоциты и зрелые адипоциты культивировали в 8-луночном "Lab-Тек II chamber slide" (Nunc) и обрабатывали как для иммунофлуоресцентной микроскопии до стадии первичной инкубации с антителом. После промывки клетки декорировали PLA ПЛЮС и МИНУС зондами (разведение 1:20) в течение 2 часов при температуре 37 °С.
Гибридизацию и лигирование зондов, амплификацию, и конечную промывку SSC проводили в соответствии с методикой производителя. Перенос флуоресценции на основании белок-белковых взаимодействий визуализировали с использованием набора обнаружения Duolink 613 (OLink Bioscience) и получали изображения.
Статистика. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., США). Результаты представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение. Значимость результатов определяли с помощью двустороннего критерия Стьюдента или теста непараметрического U-критерия Манна-Уитни для статистического сравнения данных BMI и AUC. Значение Р <0,05 учитывалось при определении статистической значимости и отмечено звездочкой.
С помощью первичных преадипоцитов человека в качестве модели in vitro, авторы локализовали ALMS1 преимущественно в цитоплазматическом, а не как ранее сообщалось, центросомном пуле. ALMS1 был подвергнут сайленсу во время адипогенеза и хотя наблюдалось значительное снижение анти-адипогенного фактора Pref-1, не было обнаружено никаких значительных различий в уровнях экспрессии проадипогенных факторов транскрипции, таких как cEBPs и PPARy.
После сайленсинга ALMS1 в 2-недельных зрелых адипоцитах, способность поглощения глюкозы оценивали с использованием меченого аналога глюкозы (2-NBDG). При отсутствии стимуляции инсулином, в подвергнутых сайленгингу по ALMS1 и контрольных зрелых адипоцитах поглощение 2-NBDG не детектировалось (Фиг. 2а). С другой стороны, стимуляция инсулином приводит к повышенному потреблению 2-NBDG в контрольных зрелых адипоцитах человека (Фиг. 2В, верхняя панель), но не в клетках, под ер гнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 2В, нижняя панель). В дополнение к снижению поглощения глюкозы в адипоцитах, подвергнутых сайленгсингу по ALMS1, авторы наблюдали уменьшение внутриклеточных триглицеридов (TG) в этих клетках уже через неделю (Фиг.2С-0). Следует отметить, что это сниженное поглощение глюкозы в ALMS 1-дефицитных адипоцитах не было связано со снижением фосфорилирования АКТ, ниже по сигнальному пути инсулина, так как уровни pS473-AKT после 30-минутной инкубации с инсулином были похожи как на уровни контрольных, так и подвергнутых сайленсингу по ALMS 1 человеческих адипоцитов (Фиг. 2E-F), что соответствует уровням фосфорилирования АКТ от нормальных до повышенных, наблюдавшихся ранее в мышиных адипоцитах AlmsPoz/foz (Фиг. 1G).
Авторы далее исследовали динамику GLUT4 в адипоцитах человека в отсутствие ALMS1. Клеточная локализация инсулинового рецептора (IR), в плазматической мембране не нарушалась после сайленсинга ALMS1 и детектировалась вблизи
плазматической мембраны (РМ) в отсутствие инсулина. (Фиг. 2G, верхняя панель). В отличие от этого, в ALMS 1-дефицитных адипоцитах в отсутствие инсулина GLUT4 утратил свою перинуклеарную локализацию и детектировался рассредоточено по всей цитоплазме клетки, а не в своей предполагаемой обычной перинуклеарной локализации. (Фиг. 2G, средние и нижние панели и 2Н). При стимуляции инсулином, наблюдалось движение GLUT4 к РМ в пределах актиновой сетки (Фиг. 21) как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. Через два часа после стимуляции инсулином, в отсутствие инсулина, GLUT4 все еще обнаруживался рассредоточенным по всей цитоплазме подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов, тогда как у контрольных адипоцитов GLUT4 соответствующим образом релокализовался в перинуклеарном области (Фиг. 2J). Поскольку существует равновесие между экзоцитозом и эндоцитозом СЫЛЧ-везикул в РМ и из РМ, авторы проверили, для исключения возможности, не из-за дефектного ли эндоцитоза GLUT4 происходит ли нарушение сортировки GLUT4 в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. При исследовании динамина, ключевой молекулы эндоцитоза, не было выявлено различий в уровне белка, или клеточной локализации после сайленсинга ALMS1 в адипоцитах. Кроме того, средние скорости меченых эндосом были похожи между подвергутыми сайленсингу по ALMS1 и контрольными адипоцитами, что является доводом против дефекта эндоцитоза, вызывающего сниженное наличие GLUT4 в РМ в ответ на передачу сигналов инсулина.
ПРИМЕРЗ
ALMS1 требуется для направленной миграции TBC1D4 в РМ в ответ на сигнал инсулина
Для того чтобы понять молекулярный механизм, лежащий в основе влияния инактивации ALMS1 на локализацию GLUT4, авторы определили взаимодействие партнеров ALMS1 в человеческих адипоцитах. Иммунопреципитацию (IP) с использованием ALMS1 в качестве приманки проводили с использованием молодых зрелых человеческих адипоцитов (4 дня после переключения дифференцировки) с последующей идентификацией взаимодействующих с ALMS1 партнеров масс-спектрометр ией. Среди белков, иммунопреципитированных с ALMS1, был TBC1D4, известная GTPa3a субстрата АКТ, требуемая для правильного удержания GLUT4 в СШТ4-сортировочньгх везикулах (GSV) и для транслокации GLUT4 к клеточной мембране для внутриклеточного поглощения глюкозы.
ПРИМЕР 4
Разработка Модели структурной гомологии для ALMS1, TBC1D4 и аРКС.
Поскольку кристаллическая структура Almsl еще не получена, использовали in silico структурное моделирование гомологии для прогнозирования ЗБ-структуры ALMS1 и идентификации структурных мотивов, которые могут связывать потенциальные взаимодействующие лиганды (Фиг. ЗА-С).
Структурная модель ALMS1. Модель ALMS1 была построена с использованием метода моделирования фрагментов с помощью программы гомологичного моделирования, Modeller. Последовательность аминокислот для каждого экзона ALMS1 была направлена в профилированный поточный алгоритм, доступный на сервере PISRED на основании чего были идентифицированы подходящие шаблоны. Затем эти идентифицированные шаблонные белки выравнивали с соответствующими экзонными последовательностями и каждый экзон моделировали отдельно с помощью Modeller. Оптимизацию энергии и выбор моделей проводили на основании балла энергии дискретного оптимизированного белка. И, наконец, модели собирали для того, чтобы построить структуру полноразмерного ALMS1 и полноразмерный белок был расслаблен и минимизирован с помощью программы симуляции молекулярной динамики NAMD.
Структурная модель РТР-связывающего домена TBC1D4. РТР-связывающий домен TBC1D4 находится в пределах первых 160 остатков. Надежная структура гомологов, моделирующая структуру между РТР-связывающим доменом и Rab-связывающим доменом, не была определена. Кристаллическую структуру РТР-домена мышиного Disabled-1 (Dab-1), 1NU2 (Е-значение = 5.2е-17), которая была идентифицирована на основании НММ-поиска по шаблону в швейцарской модели, использовали в качестве шаблона для построения РТР-связывающего домена TBC1D4.
Домен РТР из TBC1D4 взаимодействует с ALMS-1. Макромолекулярная стыковка была осуществлена с использованием алгоритма ClusPro 2.0. Остатки, расположенные на поверхности взаимодействия с перекрытием > = 0,4 ангстрем рассматривались как взаимодействующие остатки. Interproscan показал, что ALMS-1 содержит WD40-подобный домен в пределах первых 3871 остатков. Белки, содержащие домен WD40, представляют собой семейство белков, функционирующих как каркасы для макро-молекулярных взаимодействий.
РТР-связывающий домен TBC1D4 взаимодействует с ALMS1. Вначале РТР-связывающий домен и RabGTP-связывающий домен TBC1D4 соединяли с моделью ALMS1 с помощью сервера Cluspro 2, для определения наиболее вероятного участка взаимодействия. Затем оба домена соединяли с их соответствующими участками взаимодействия в ALMS1 с использованием AutoDock 4.2 и рассчитывали их аффинности связывания. На основании сродства РТР-связывающий домен TBC1D4 связывает ALMS1
с ~ 100 раз более высоким сродством по сравнению с RabGTP-связывающим доменом. Следовательно, авторы настоящего изобретения спрогнозировали, что РТР-связывающий домен может иметь более высокую вероятность взаимодействия с молекулой ALMS1 по сравнению с RabGTP-связывающим доменом.
Моделирование РТР-домена из TBC1D4. Домен связывания фосфотирозина в TBC1D4 смоделировали после идентификации подходящего шаблона из алгоритма идентификации шаблона швейцарской модели.
Стыковка РТР-домена и RabGTP-связывающего домена из TBC1D4 с ALMS1. Вначале РТР-связывающий домен и RabGTP-связывающий домен TBC1D4 соединяли с ALMS1 с использованием сервера Cluspro 2 и идентифицировали участок взаимодействия. Затем оба домена соединяли с их соответствующими участками взаимодействия с
помощью AutoDock 4.2 и рассчитывали их аффинности связывания.
Прогнозируемые номера остатков ALSM-1 с потенциалом взаимодействия с другим лигандом
65,66,69,72,73,74,75,76,77,78,80,87,2875,2876,2877,2878,2879,2880,2881,2882,2883,2884,2885,2887,2888,28 89,2890,2892,2893,2894,2895,2897,2909,2910,2912,2929,2931,2932,2933,2934,2935,3557,3558,4131,144,145, 146,147,148,149,150,151,193,194,195,198,199,200,201,205,208,211,214,226,227,229,233,234,235,236,239,242 ,243,246,248,249,250,251,252,314,319,321,986,1341,1344,2269,113,114,115,116,123,126,127,128,1340,1438,1 439Д440Д441,1442,1443,1444Д446Д447Д448Д449Д450Д451,1452,1453,1454Д457Д458Д459Д478Д915Д 918,1919,1920,1922,1923,1930,2041,2042,2043,2257,2267,2483,2484,3866,218,219,220,221,222,223,224,277, 278,279,282,285,286,287,288,686,688,689,690,691,699,1856,1858,1859,1861,1862,1863,1864,1865,1866,1867, 1868,1869,1870,1871,1872,1949,1968,1969,1971,1974,1979,1980,1981,1982,1983,1984,2104,2107,2111,2870, 2872,2874,2915,3285,3286,3287,793,795,796,797,1285,1314,1408,1409,1422,1423,1425,1426,1427,1430,1431, 1671,1672,1794,1797,2538,2539,2540,2555,2556,2557,2563,2564,2565,2567,2568,2588,2591,2599,2603,2699, 2701,2702,3108
Прогнозируемые остатки ALMS1, опосредующие взаимодействие с аРКС
Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883, Е2884
Прогнозируемые номера остатков аРКС, опосредующие взаимодействие с ALMS1
F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, T631,V664,1667
Прогнозируемые остатки TBC1D4, опосредующие взаимодействие с ALMS1
G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82,183
Прогнозируемые остатки ALMS1, опосредующие взаимодействие с TBC1D4
Н65, L66, S2879
Модель гомологии показала, что Almsl предположительно имеет структуру типа яблочный огрызок с большим количеством участков связывания с потенциальными лигандами, сосредоточенными вокруг сердевины. Кристаллическая структура TBC1D4 аналогичным образом не была получена, и, поэтому авторы использовали подход гомологичного моделирования для предсказания структуры РТР-связывающего домена TBC1D4 (Фиг. 3 C-D). Затем проводили in silico исследования по стыковке, которые спрогнозировали высокое сродство связывания TBC1D4 с ALMS1 через водородные связи остатков TBC1D4 G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82, 183 которые взаимодействуют с остатками Н65, L66, S2879 в Almsl (Фиг. 4А). Колокализацию ALMS1 и TBC1D4 затем подтверждали в адипоцитах человека иммунофлюоресцентными исследованиями (Фиг. 4
В). Далее тестировали уровни экспрессии GLUT4, TBC1D4 и IRAP в адипоцитах с сайленсингом ALMS1 с или без стимуляции инсулином, но никаких существенных различий не обнаружили (Фиг. 4С). После фосфорилирования активированным АКТ, фосфорилированный TBC1D4 (р-ТВСШ4) в адипоцитах направленно воздействует на RAB-белки, такие как RAB14 и RAB10, перед направленной миграцией GSV в РМ. Тем не менее, при стимуляции инсулином подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов, в уровнях TBC1D4, р-ТВСШ4, RAB14 и RAB10 не было обнаружено никакой разницы (Фиг. 4). Авторы затем сфокусировались на клеточной локализации GLUT4. При отсутствии стимуляции инсулином, сайленсинг TBC1D4 воспроизводит влияние сайленсинга ALMS1 в зрелых адипоцитах, т.е. нарушенная локализация GLUT4 по всей цитоплазме (Фиг. 4Е). В ответ на стимуляцию инсулином, в контрольных адипоцитах GLUT4 высвобождается из перинуклеарной области, распространяется по всей цитоплазме адипоцитов (Фиг. 4F), таким образом, воспроизводя картину распределения GLUT4, наблюдаемую в адипоцитах с сайленсингом по ALMS1 и TBC1D4 в отсутствие (Фиг. 4Е) и присутствие (Фиг. 4F) инсулина. Авторы изобретения в дальнейшем исследовали влияние сайленсинга ALMS1 на клеточную динамику TBC1D4 в ответ на инсулин. В отсутствии инсулина, TBC1D4 локализуется в перинуклеарной области как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 4G), но, что примечательно, в ответ на инсулин, TBC1D4 транспортировался в РМ только в контрольных, но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 4Н). ПРИМЕР 5
ALMS1 формирует динамический белковый комплекс, ALMSojuy, необходимый для инсулин-стимулированного транспорта глюкозы в зрелых адипоцитах человека
Хотя авторы изобретения показали, что сайленсинг ALMS1 предотвращает таргетирование TBC1D4 в РМ, по прежнему необъяснимо, объясняет ли это нарушение серьезное снижение потребления глюкозы, наблюдаемое в ALMS 1-дефицитных адипоцитах. Поэтому авторы изобретения сравнили клеточное поглощение 2-NBDG при стимуляции инсулином в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 или TBC1D4 или контрольных адипоцитах и обнаружили отсутствие поглощения 2-NBDG в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах по сравнению с контрольными адипоцитами (Фиг. 5А-В), при этом сниженное, по сравнению с контролем, фактическое количество 2-NBDG все еще поглощалось адипоцитами, подвергнутыми сайленсингу по TBC1D4 (Фиг. 5С). Последующие анализы связывания антитела к GLUT4 либо в адипоцитах с сайленсингом ALMS1 либо с сайленсингом TBC1D4, либо контрольных адипоцитах после 30 минут стимуляции инсулином показали высокую долю GLUT4 в РМ в контрольных адипоцитах
и в адипоцитах с сайленсингом TBC1D4, но не клетках с сайленсингом ALMS1 (Фиг. 5D-F), что указывает на то, что вторичный дефект при направленной миграции TBC1D4 в РМ в клетках с сайленсингом Almsl сам по себе не объясняет очень серьезный дефект транспорта глюкозы и экспрессии GLUT4 РМ в ALMSl-дефицитных клетках. Дальнейшее изучение IP-данных по Almsl выявило несколько субъединиц V типа АТРазных протонных (Н+) насосов (А, В, D1 и G2), которые, как затем показали авторы, экспрессировались в зрелых адипоцитах (Фиг. 5G) вместе с аРКС, активирующей киназой Н+-насосов под контролем инсулина. С помощью метода in situ PLA Duolink, нацеленного на ALMS1 и субъединицы Al и D1 протонных насосов (Фиг. 5Н), а также с помощью коиммуноокрашивания ALMS1, А1 и D1 субъединиц V-АТРазы и аРКС (Фиг. 5Н, I), авторы настоящего изобретения подтвердили, что ALMS1 находился в непосредственной близости к V-АТФазным Н+-насосам в зрелых адипоцитах в присутствии инсулина. ALMS1 колокализован с субъединицей V0D1 протонного насоса (Фиг. 51), которая встроена в мембрану GSV, что указывает на то, что в адипоците ALMS 1 транспортируется вместе с протоными насосами, локализованными в GSV. С помощью структурной in silico модели партнеров взаимодействующих с ALMS1 авторы определили мотив связывания РКС с Almsl. Сайты связывания для TBC1D4 и аРКС на Almsl находились так близко, что модель показала, что одновременное присоединение обоих белков на Almsl не представлялось возможным из-за стерических затруднений (Фиг. 5J). В следствие этого авторы выдвинули гипотезу. Чтобы проверить свою гипотезу о том, что в адипоцитах связывание ALMS1 с аРКС или в ином случае с TBC1D4 находится под обратным контролем сигнального пути инсулина, авторы провели дополнительные IP, с использованием ALMS1 в качестве приманки, но на этот раз с применением зрелых адипоцитов человека, культивируемых в присутствие или в отсутствие инсулина, при этом провели иммуноблоттинг IP как по аРКС, так и по TBC1D4. Результаты показали, что аРКС осаждается только посредством Almsl и детектируется иммуноблоттингом в экстрактах адипоцитов, инкубированных в отсутствие инсулина (Фиг. 5 К), тогда как TBC1D4 осаждается ALMS1 и детектируется в экстрактах адипоцитов, инкубированных в присутствии инсулина, в соответствии с авторской моделью реципроктного инсулин-регулируемого связывания Almsl (Фиг. 5L). ПРИМЕР 6
ALMSomu требуется для подкисления GSV перед доставкой GLUT4 в плазматическую мембрану
Хотя было известно, что фосфорилирование TBC1D4 с помощью АКТ в некоторых случаях приводит к направленной миграции GLUT4, конечная стадия слияния GSV-PM
является инсулин-регулируемым АКТ-независимым событием, которое требует осмотического набухания GSV под действием уАТРазных Н+-насосов. Тем не менее, отсутствовала информация о фактическом сигнале и механизме активации Н+-насосов инсулином. Авторы протестировали возможность предотвращения подкисления GSV при инактивации ALMS1 и, в следствие этого, химио-осмотического высвобождения GLUT4 в РМ, с помощью ацидотрофного красителя акридинового оранжевого, который испускает зеленую флуоресценцию при низкой концентрации и оранжево-красную флуоресценцию при высоких концентрации в лизосомах, в которых акридиновый оранжевый протонируется и секвестрируется. В отсутствие инсулина в адипоцитах не была обнаружена оранжево-красная флуоресценция. Напротив, инсулин вызывал быстрое появление красного цвета в контрольных зрелых адипоцитах человека (Фиг. 6А), но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6В), что служит указанием потери инсулинопосредованного подкисления лизосом в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1.
Изобретатели затем проверили, действительно ли подкисление адипоцитов с сайленсингом по ALMS1 с помощью нигерицина (NIG.), электронейтрального ионофора К +/Н + обмена, о котором известно, что он вызывает осмотическое набухание GSV, может обойти Almsl-ассоциированный дефект слияния GLUT4 и поглощении глюкозы. Обработка NIG. привела к быстрому подкислению как контрольных, так и подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов (Фиг. 6C-D), что привело к активации набухания и слияния внутриклеточных везикул. Параллельно с этим, анализ электронной микроскопией показал везикулы, расположенные рядом с РМ без слияния в отсутствие инсулина как в контрольных адипоцитах, так и в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 6E-F, верхние панели). Обработка инсулином вызывала набухание везикул (Фиг. 6Е, средние панели), ассоциированное со слиянием везикул с РМ, для поглощения глюкозы только в контрольных адипоцитах (Фиг. 6Е, средние панели), но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6F, средние панели). Однако NIG. индуцировал везикулярное набухание и слияние с РМ как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6E-F, нижние панели). Обработка NIG восстанавливала поглощение глюкозы в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. В то время как инсулин оказывает незначительное влияние на стимуляцию поглощения 2-NBDG в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 6G-H, верхняя и средняя панели), NIG не только восстановил слияние везикул, но и, как показано, восстановил поглощение 2-NBDG в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, до уровней, наблюдаемых в контрольных клетках (Фиг. 6G-H, нижние панели).
Этот восстановленный транспорт глюкозы в обработанных NIG адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, коррелировал с восстановленным GLUT4-слиянием с РМ (Фиг. 7А), но не с направленной миграцией TBC1D4 к РМ (фиг.7В); и привел к восстановлению TG-наполнения адипоцитов, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, через 24 часа после обработки NIG. ПРИМЕР 7
Идентификация пептидных ингибиторов связывания РКС с Almsl
После того, как участок связывающего взаимодействия между двумя белками стал известен, стало возможно применить информацию о конформации и аминокислотах каждого белка, вовлеченных в опосредование данного взаимодействия, в компьютерных моделях для разработки пептидов или низкомолекулрных лекарственных веществ, которые при связывании с участком взаимодействия способны стерически или иным способом воспрепятствовать связывающему взаимодействию. Таким образом, авторы стремились идентифицировать пептиды, которые ингибируют взаимодействие ALMS1 и аРКС или TBC1D4 с использованием их ранее описанных в примере 4 структурных моделей ALMS1, TBC1D4 и аРКС. Спрогнозированные с помощью этого способа пептиды для блокировки взаимодействия между аРКС и ALMS1, включают следующие последовательности: LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ IDNO: 5), DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6), QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7), QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8). PADQMTDTP (SEQ ID NO: 9), HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10) или SCIFLEQ (SEQ Ш NO: 11). Пептид идентифицированный с помощью этого способа для блокировки взаимодействия между TBC1D4 и ALMS1 имел последовательность GCGAPAAREVILVL (SEQ ID N 12).
ПРИМЕР 8
Экспрессия специфического ALMSl-взаимодействующего домена аРКС в зрелых адипоцитах вызывает поглощение глюкозы в отсутствие инсулина.
Далее авторы проверили гипотезу о том, что инсулин опосредует высвобождение альфа РКС из комплекса ALMSoMbi для индукции поглощения глюкозы. Для этого они клонировали взаимодействующий домен аРКС (SEQ Ш N0:: 14 и 15) в лентивирусный вектор вместе с Flag-меткой. Выбранная последовательность была минимальной последовательностью аРКС (min-aPKC-FLAG), не имеющей стерических затруднений с участком взаимодействия TBC1D4 с ALMS1. Экспрессированный в адипоцитах min-aPKC-FLAG конкурирует с эндогенным аРКС, предотвращая его связывание с ALMSoMoft и, тем самым, благоприятствуя инсулин-опосредованному связыванию TBC1D4 с ALMSoMoft. Далее зрелые адипоциты инфицировали либо контрольными, либо min-aPKC-лентивирусными частицами для оценки влияния min-aPKC-FLAG на
поглощение глюкозы. Через 48 часов после заражения, min-aPKC-FLAG иммунодетектировали с использованием антитела против FLAG-метки (Фиг. 9). Для in vitro доказательства, мы обрабатывали зрелые адипоциты, как описано (Фиг. 9), и затем инкубировали обработанные зрелые адипоциты с 2-NBDG для оценки влияния min-aPKC-FLAG на поглощение глюкозы. Интересно, что 2-NBDG поглощалась а в обработанных min-aPKC-FLAG адипоцитах в отсутствие INS (Фиг. 8а, левая колонка), что соответствовало 3,5 -кратному увеличению по сравнению с контролем (Фиг. 8В).С другой стороны, никакой существенной разницы не наблюдалось в присутствие INS (фиг. 8А, правый столбец и 8В). Эти данные свидетельствуют о том, что направленное воздействие на взаимодействие ALMS1 и аРКС достаточно для того, чтобы вызвать всасывание глюкозы в адипоцитах, независимо от наличия INS.
Получение лентивирусного вектора, несущего домен аРКС
ALMS 1-взаимодействующий домен человеческого РКСа амплифицировали из кДНК
человеческих клеток НЕК293 с N-концевой FLAG-меткой с помощью прямого 5'-3
'gtacGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCTCACGGACTTCAAT
ТТССТС (SEQ ID N0: 16) и обратного 5'-
tagcGGATCCTCATACTGCACTCTGTAAGATGGG- 3' (SEQ ID NO: 17) праймеров и клонировали в лентивирусный вектор PCDH-EFl-MCS-IRES-Puro (System Biosciences). Для получения вируса, РКСа-лентивирусные векторы трансфицировали в клетки 293TN (System Biosciences) вместе с упаковывающими плазмидами psPAX2 и pMD2. G (Addgene) с массовым соотношением 3: 2: 1, соответственно, и с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Через сорок восемь часов после трансфекции, надосадочную жидкость культуры собирали центрифугированием при 500 х g в течение 10 минут, с последующей фильтрацией через 0,45 мкм шприцевой фильтр с PES-мембраной (Sartorius). Раствор вируса затем концентрировали путем добавления Уг объема холодного 30% (масса/объем) PEG6000, растворенного в 0,5 М NaCl, и инкубировали в течение ночи при 4 °С с периодическим перемешиванием. Смесь затем центрифугировали при 3000 х г в течение 15 мин. при температуре 4 °С. Затем осадок, содержащий лентивирусные частицы, ресуспендировали в 1 мл DMEM среде и хранили при -80 °С до инфицирования клеток-мишеней.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЮНИВЕРСИТЕ ДЕ СТРАЗБУР et al.
<12 0> НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА
<130> B1768PC
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4169
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 1
Met Glu Pro Glu Asp Leu Pro Trp Pro Gly Glu Leu Glu Glu Glu Glu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Ala Ala Ala Asn Val Asp Asp Val Val Val Val Glu Glu Val Glu
35 40 45
Glu Glu Ala Gly Arg Glu Leu Asp Ser Asp Ser His Tyr Gly Pro Gln
50 55 60
His Leu Glu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu Ala Lys Ala Trp
65 70 75 80
Leu Gln Ala His Pro Gly Arg Ile Leu Pro Pro Leu Ser Pro Pro Gln
85 90 95
His Arg Tyr Ser Glu Gly Glu Arg Thr Ser Leu Glu Lys Ile Val Pro
100 105 110
Leu Thr Cys His Val Trp Gln Gln Ile Val Tyr Gln Gly Asn Ser Arg
115 120 125
Thr Gln Ile Ser Asp Thr Asn Val Val Cys Leu Glu Thr Thr Ala Gln
130 135 140
Arg Gly Ser Gly Asp Asp Gln Lys Thr Glu Ser Trp His Cys Leu Pro
145 150 155 160
Gln Glu Met Asp Ser Ser Gln Thr Leu Asp Thr Ser Gln Thr Arg Phe
165 170 175
Asn Val Arg Thr Glu Asp Thr Glu Val Thr Asp Phe Pro Ser Leu Glu
180
185
190
Glu Gly Ile Leu Thr Gln Ser Glu Asn Gln Val Lys Glu Pro Asn Arg
195 200 205
Asp Leu Phe Cys Ser Pro Leu Leu Val Ile Gln Asp Ser Phe Ala Ser
210 215 220
Pro Asp Leu Pro Leu Leu Thr Cys Leu Thr Gln Asp Gln Glu Phe Ala
225 230 235 240
Pro Asp Ser Leu Phe His Gln Ser Glu Leu Ser Phe Ala Pro Leu Arg
245 250 255
Gly Ile Pro Asp Lys Ser Glu Asp Thr Glu Trp Ser Ser Arg Pro Ser
260 265 270
Glu Val Ser Glu Ala Leu Phe Gln Ala Thr Ala Glu Val Ala Ser Asp
275 280 285
Leu Ala Ser Ser Arg Phe Ser Val Ser Gln His Pro Leu Ile Gly Ser
290 295 300
Thr Ala Val Gly Ser Gln Cys Pro Phe Leu Pro Ser Glu Gln Gly Asn
305 310 315 320
Asn Glu Glu Thr Ile Ser Ser Val Asp Glu Leu Lys Ile Pro Lys Asp
325 330 335
Cys Asp Arg Tyr Asp Asp Leu Cys Ser Tyr Met Ser Trp Lys Thr Arg
340 345 350
Lys Asp Thr Gln Trp Pro Glu Asn Asn Leu Ala Asp Lys Asp Gln Val
355 360 365
Ser Val Ala Thr Ser Phe Asp Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ala Thr Lys
370 375 380
Arg Ser Asp His Phe Asp Ala Ala Arg Ser Tyr Gly Gln Tyr Trp Thr
385 390 395 400
Gln Glu Asp Ser Ser Lys Gln Ala Glu Thr Tyr Leu Thr Lys Gly Leu
405 410 415
Gln Gly Lys Val Glu Ser Asp Val Ile Thr Leu Asp Gly Leu Asn Glu
420 425 430
Asn Ala Val Val Cys Ser Glu Arg Val Ala Glu Leu Gln Arg Lys Pro
435
440
445
Thr Arg Glu Ser Glu Tyr His Ser Ser Asp Leu Arg Met Leu Arg Met
450 455 460
Ser Pro Asp Thr Val Pro Lys Ala Pro Lys His Leu Lys Ala Gly Asp
465 470 475 480
Thr Ser Lys Gly Gly Ile Ala Lys Val Thr Gln Ser Asn Leu Lys Ser
485 490 495
Gly Ile Thr Thr Thr Pro Val Asp Ser Asp Ile Gly Ser His Leu Ser
500 505 510
Leu Ser Leu Glu Asp Leu Ser Gln Leu Ala Val Ser Ser Pro Leu Glu
515 520 525
Thr Thr Thr Gly Gln His Thr Asp Thr Leu Asn Gln Lys Thr Leu Ala
530 535 540
Asp Thr His Leu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Val Thr Ala Ile Pro Glu
545 550 555 560
Pro Ala Asp Gln Lys Thr Ala Thr Pro Thr Val Leu Ser Ser Ser His
565 570 575
Ser His Arg Gly Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Gly Leu Pro Asp
580 585 590
Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Ala Pro Gly Leu
595 600 605
Ala Asp Gln Thr Thr Gly Met Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Tyr Ser
610 615 620
His Arg Glu Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Gln Glu Leu Pro Glu Ser
625 630 635 640
Asn Leu Thr Glu Glu Pro Leu Glu Val Ser Ala Ala Pro Gly Pro Val
645 650 655
Glu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Thr Val Ser Ser Thr Ser His Ser His
660 665 670
Val Glu Asp Leu Leu Phe Phe Tyr Arg Gln Thr Leu Pro Asp Gly His
675 680 685
Leu Thr Asp Gln Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Gly Pro Ala Asp
690 695 700
Gln Lys Thr Gly Thr Ala Thr Val Leu Ser Thr Pro His Ser His Arg
705 710 715 720
Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr Gln Gln Glu Phe Ala Asp Ser His Gln
725 730 735
Thr Glu Glu Thr Leu Thr Lys Val Ser Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asp
740 745 750
Gln Lys Thr Glu Ile Pro Ala Val Gln Ser Ser Ser Tyr Ser Gln Arg
755 760 765
Glu Lys Pro Ser Ile Leu Tyr Pro Gln Asp Leu Ala Asp Ser His Leu
770 775 780
Pro Glu Glu Gly Leu Lys Val Ser Ala Val Ala Gly Pro Ala Asp Gln
785 790 795 800
Lys Thr Gly Leu Pro Thr Val Pro Ser Ser Ala Tyr Ser His Arg Glu
805 810 815
Lys Leu Leu Val Phe Tyr Gln Gln Ala Leu Leu Asp Ser His Leu Pro
820 825 830
Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Gly Pro Ala Asp Gly Lys
835 840 845
Thr Gly Thr Pro Ala Val Thr Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Leu
850 855 860
Gly Glu Lys Pro Ser Ala Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Pro Asn Ser His
865 870 875 880
Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Pro Gly Pro Gly Asp
885 890 895
Gln Lys Thr Gly Ile Pro Ser Ala Pro Ser Ser Phe Tyr Ser His Arg
900 905 910
Glu Lys Pro Ile Ile Phe Ser Gln Gln Thr Leu Pro Asp Phe Leu Phe
915 920 925
Pro Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Val Leu Ala Ala Gln
930 935 940
Lys Thr Gly Thr Pro Thr Val Ser Ser Asn Ser His Ser His Ser Glu
945
950
955
960
Lys Ser Ser Val Phe Tyr Gln Gln Glu Leu Pro Asp Ser Asp Leu Pro
965 970 975
Arg Glu Ser Leu Lys Met Ser Ala Ile Pro Gly Leu Thr Asp Gln Lys
980 985 990
Thr Val Pro Thr Pro Thr Val Pro Ser Gly Ser Phe Ser His Arg Glu
995 1000 1005
Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Glu Trp Pro Asp Ser Tyr Ala
1010 1015 1020
Thr Glu Lys Ala Leu Lys Val Ser Thr Gly Pro Gly Pro Ala Asp
1025 1030 1035
Gln Lys Thr Glu Ile Pro Ala Val Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Gln
1040 1045 1050
Arg Glu Lys Pro Ser Val Leu Tyr Pro Gln Val Leu Ser Asp Ser
1055 1060 1065
His Leu Pro Glu Glu Ser Leu Lys Val Ser Ala Phe Pro Gly Pro
1070 1075 1080
Ala Asp Gln Met Thr Asp Thr Pro Ala Val Pro Ser Thr Phe Tyr
1085 1090 1095
Ser Gln Arg Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Pro
1100 1105 1110
Glu Ser His Leu Pro Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ser Val Ala Pro
1115 1120 1125
Gly Leu Ala Asp Gln Lys Thr Gly Thr Pro Thr Val Thr Ser Thr
1130 1135 1140
Ser Tyr Ser Gln His Arg Glu Lys Pro Ser Ile Phe His Gln Gln
1145 1150 1155
Ala Leu Pro Gly Thr His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys Val Ser
1160 1165 1170
Ala Val Thr Gly Pro Gly Asn Gln Lys Thr Trp Ile Pro Arg Val
1175 1180 1185
Leu Ser Thr Phe Tyr Ser Gln Arg Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr
1190
1195
1200
Gln Gln Thr Leu Pro Gly Ser His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys
1205 1210 1215
Val Ser Pro Val Leu Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Thr Pro
1220 1225 1230
Thr Pro Thr Ser Ala Ser Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Gly Ile
1235 1240 1245
Phe Tyr Gln Gln Val Leu Pro Asp Asn His Pro Thr Glu Glu Ala
1250 1255 1260
Leu Lys Ile Ser Val Ala Ser Glu Pro Val Asp Gln Thr Thr Gly
1265 1270 1275
Thr Pro Ala Val Thr Ser Thr Ser Tyr Ser Gln Tyr Arg Glu Lys
1280 1285 1290
Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Ser Leu Pro Ser Ser His Leu Thr
1295 1300 1305
Glu Glu Ala Lys Asn Val Ser Ala Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln
1310 1315 1320
Lys Thr Val Ile Pro Ile Leu Pro Ser Thr Phe Tyr Ser His Thr
1325 1330 1335
Glu Lys Pro Gly Val Phe Tyr Gln Gln Val Leu Pro His Ser His
1340 1345 1350
Pro Thr Glu Glu Ala Leu Lys Ile Ser Val Ala Ser Glu Pro Val
1355 1360 1365
Asp Gln Thr Thr Gly Thr Pro Thr Val Thr Ser Thr Ser Tyr Ser
1370 1375 1380
Gln His Thr Glu Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Ser Leu Pro
1385 1390 1395
Gly Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Val Ser Ala Val Pro
1400 1405 1410
Gly Pro Gly Asp Arg Lys Thr Gly Ile Pro Thr Leu Pro Ser Thr
1415 1420 1425
Phe Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Gly Ser Phe Tyr Gln Gln Val
1430
1435
1440
Leu Pro His Ser His Leu Pro Glu Glu Ala Leu Glu Val Ser Val
1445 1450 1455
Ala Pro Gly Pro Val Asp Gln Thr Ile Gly Thr Pro Thr Val Thr
1460 1465 1470
Ser Pro Ser Ser Ser Phe Gly Glu Lys Pro Ile Val Ile Tyr Lys
1475 1480 1485
Gln Ala Phe Pro Glu Gly His Leu Pro Glu Glu Ser Leu Lys Val
1490 1495 1500
Ser Val Ala Pro Gly Pro Val Gly Gln Thr Thr Gly Ala Pro Thr
1505 1510 1515
Ile Thr Ser Pro Ser Tyr Ser Gln His Arg Ala Lys Ser Gly Ser
1520 1525 1530
Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Leu Gly Ser Gln Ile Pro Glu Glu Ala
1535 1540 1545
Leu Arg Val Ser Ser Ala Pro Gly Pro Ala Asp Gln Thr Thr Gly
1550 1555 1560
Ile Pro Thr Ile Thr Ser Thr Ser Tyr Ser Phe Gly Glu Lys Pro
1565 1570 1575
Ile Val Asn Tyr Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly His Leu Pro Glu
1580 1585 1590
Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Ser Gly Pro Thr Glu Lys Lys
1595 1600 1605
Thr Asp Ile Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ser Ser Ala Leu Gly Glu
1610 1615 1620
Lys Pro Ile Thr Phe Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Asp Ser Pro Leu
1625 1630 1635
Asn Lys Glu Val Val Lys Val Ser Ala Ala Pro Gly Pro Ala Asp
1640 1645 1650
Gln Lys Thr Glu Thr Leu Pro Val His Ser Thr Ser Tyr Ser Asn
1655 1660 1665
Arg Gly Lys Pro Val Ile Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Ser Asp Ser
1670
1675
1680
His Leu Pro Glu Glu Ala Leu Lys Val Pro Pro Val Pro Gly Pro
1685 1690 1695
Asp Ala Gln Lys Thr Glu Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Leu Tyr
1700 1705 1710
Ser Tyr Arg Glu Lys Pro Ile Val Phe Tyr Gln Gln Ala Leu Pro
1715 1720 1725
Asp Ser Glu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Pro
1730 1735 1740
Gln Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Leu Ser Thr Val Thr Ser Ser
1745 1750 1755
Phe Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Asn Ile Ser Tyr Gln Gln Glu
1760 1765 1770
Leu Pro Asp Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Asn
1775 1780 1785
Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Val Ser Thr Val Thr
1790 1795 1800
Ser Thr Ser Tyr Ser His Arg Glu Lys Pro Ile Val Ser Tyr Gln
1805 1810 1815
Arg Glu Leu Pro His Phe Thr Glu Ala Gly Leu Lys Ile Leu Arg
1820 1825 1830
Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Ile Asn Ile Leu Pro
1835 1840 1845
Ser Asn Ser Tyr Pro Gln Arg Glu His Ser Val Ile Ser Tyr Glu
1850 1855 1860
Gln Glu Leu Pro Asp Leu Thr Glu Val Thr Leu Lys Ala Ile Gly
1865 1870 1875
Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Ile Gln Ile Ala Ser
1880 1885 1890
Ser Ser Ser Tyr Ser Asn Arg Glu Lys Ala Ser Ile Phe His Gln
1895 1900 1905
Gln Glu Leu Pro Asp Val Thr Glu Glu Ala Leu Asn Val Phe Val
1910
1915
1920
Val Pro Gly Gln Gly Asp Arg Lys Thr Glu Ile Pro Thr Val Pro
1925 1930 1935
Leu Ser Tyr Tyr Ser Arg Arg Glu Lys Pro Ser Val Ile Ser Gln
1940 1945 1950
Gln Glu Leu Pro Asp Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val
1955 1960 1965
Ser Pro Val Ser Ile Pro Ala Glu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Ile
1970 1975 1980
Gly Leu Ser Ser Ser Tyr Ser His Ser His Lys Glu Lys Leu Lys
1985 1990 1995
Ile Ser Thr Val His Ile Pro Asp Asp Gln Lys Thr Glu Phe Pro
2000 2005 2010
Ala Ala Thr Leu Ser Ser Tyr Ser Gln Ile Glu Lys Pro Lys Ile
2015 2020 2025
Ser Thr Val Ile Gly Pro Asn Asp Gln Lys Thr Pro Ser Gln Thr
2030 2035 2040
Ala Phe His Ser Ser Tyr Ser Gln Thr Val Lys Pro Asn Ile Leu
2045 2050 2055
Phe Gln Gln Gln Leu Pro Asp Arg Asp Gln Ser Lys Gly Ile Leu
2060 2065 2070
Lys Ile Ser Ala Val Pro Glu Leu Thr Asp Val Asn Thr Gly Lys
2075 2080 2085
Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Phe His Arg Glu Lys Ser Asn
2090 2095 2100
Ile Phe Ser Pro Gln Glu Leu Pro Gly Ser His Val Thr Glu Asp
2105 2110 2115
Val Leu Lys Val Ser Thr Ile Pro Gly Pro Ala Gly Gln Lys Thr
2120 2125 2130
Val Leu Pro Thr Ala Leu Pro Ser Ser Phe Ser His Arg Glu Lys
2135 2140 2145
Pro Asp Ile Phe Tyr Gln Lys Asp Leu Pro Asp Arg His Leu Thr
2150
2155
2160
Glu Asp Ala Leu Lys Ile Ser Ser Ala Leu Gly Gln Ala Asp Gln
2165 2170 2175
Ile Thr Gly Leu Gln Thr Val Pro Ser Gly Thr Tyr Ser His Gly
2180 2185 2190
Glu Asn His Lys Leu Val Ser Glu His Val Gln Arg Leu Ile Asp
2195 2200 2205
Asn Leu Asn Ser Ser Asp Ser Ser Val Ser Ser Asn Asn Val Leu
2210 2215 2220
Leu Asn Ser Gln Ala Asp Asp Arg Val Val Ile Asn Lys Pro Glu
2225 2230 2235
Ser Ala Gly Phe Arg Asp Val Gly Ser Glu Glu Ile Gln Asp Ala
2240 2245 2250
Glu Asn Ser Ala Lys Thr Leu Lys Glu Ile Arg Thr Leu Leu Met
2255 2260 2265
Glu Ala Glu Asn Met Ala Leu Lys Arg Cys Asn Phe Pro Ala Pro
2270 2275 2280
Leu Ala Arg Phe Arg Asp Ile Ser Asp Ile Ser Phe Ile Gln Ser
2285 2290 2295
Lys Lys Val Val Cys Phe Lys Glu Pro Ser Ser Thr Gly Val Ser
2300 2305 2310
Asn Gly Asp Leu Leu His Arg Gln Pro Phe Thr Glu Glu Ser Pro
2315 2320 2325
Ser Ser Arg Cys Ile Gln Lys Asp Ile Gly Thr Gln Thr Asn Leu
2330 2335 2340
Lys Cys Arg Arg Gly Ile Glu Asn Trp Glu Phe Ile Ser Ser Thr
2345 2350 2355
Thr Val Arg Ser Pro Leu Gln Glu Ala Glu Ser Lys Val Ser Met
2360 2365 2370
Ala Leu Glu Glu Thr Leu Arg Gln Tyr Gln Ala Ala Lys Ser Val
2375 2380 2385
Met Arg Ser Glu Pro Glu Gly Cys Ser Gly Thr Ile Gly Asn Lys
2390
2395
2400
Ile Ile Ile Pro Met Met Thr Val Ile Lys Ser Asp Ser Ser Ser
2405 2410 2415
Asp Ala Ser Asp Gly Asn Gly Ser Cys Ser Trp Asp Ser Asn Leu
2420 2425 2430
Pro Glu Ser Leu Glu Ser Val Ser Asp Val Leu Leu Asn Phe Phe
2435 2440 2445
Pro Tyr Val Ser Pro Lys Thr Ser Ile Thr Asp Ser Arg Glu Glu
2450 2455 2460
Glu Gly Val Ser Glu Ser Glu Asp Gly Gly Gly Ser Ser Val Asp
2465 2470 2475
Ser Leu Ala Ala His Val Lys Asn Leu Leu Gln Cys Glu Ser Ser
2480 2485 2490
Leu Asn His Ala Lys Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu
2495 2500 2505
Ser Arg Val Arg Ala His Ala Trp Asn Met Lys Phe Asn Leu Ala
2510 2515 2520
His Asp Cys Gly Tyr Ser Ile Ser Glu Leu Asn Glu Asp Asp Arg
2525 2530 2535
Arg Lys Val Glu Glu Ile Lys Ala Glu Leu Phe Gly His Gly Arg
2540 2545 2550
Thr Thr Asp Leu Ser Lys Gly Leu Gln Ser Pro Arg Gly Met Gly
2555 2560 2565
Cys Lys Pro Glu Ala Val Cys Ser His Ile Ile Ile Glu Ser His
2570 2575 2580
Glu Lys Gly Cys Phe Arg Thr Leu Thr Ser Glu His Pro Gln Leu
2585 2590 2595
Asp Arg His Pro Cys Ala Phe Arg Ser Ala Gly Pro Ser Glu Met
2600 2605 2610
Thr Arg Gly Arg Gln Asn Pro Ser Ser Cys Arg Ala Lys His Val
2615 2620 2625
Asn Leu Ser Ala Ser Leu Asp Gln Asn Asn Ser His Phe Lys Val
2630
2635
2640
Trp Asn Ser Leu Gln Leu Lys Ser His Ser Pro Phe Gln Asn Phe
2645 2650 2655
Ile Pro Asp Glu Phe Lys Ile Ser Lys Gly Leu Arg Met Pro Phe
2660 2665 2670
Asp Glu Lys Met Asp Pro Trp Leu Ser Glu Leu Val Glu Pro Ala
2675 2680 2685
Phe Val Pro Pro Lys Glu Val Asp Phe His Ser Ser Ser Gln Met
2690 2695 2700
Pro Ser Pro Glu Pro Met Lys Lys Phe Thr Thr Ser Ile Thr Phe
2705 2710 2715
Ser Ser His Arg His Ser Lys Cys Ile Ser Asn Ser Ser Val Val
2720 2725 2730
Lys Val Gly Val Thr Glu Gly Ser Gln Cys Thr Gly Ala Ser Val
2735 2740 2745
Gly Val Phe Asn Ser His Phe Thr Glu Glu Gln Asn Pro Pro Arg
2750 2755 2760
Asp Leu Lys Gln Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe Lys Met His
2765 2770 2775
Ser Asn Ser Gln Asp Lys Glu Val Thr Ile Leu Ala Glu Gly Arg
2780 2785 2790
Arg Gln Ser Gln Lys Leu Pro Val Asp Phe Glu Arg Ser Phe Gln
2795 2800 2805
Glu Glu Lys Pro Leu Glu Arg Ser Asp Phe Thr Gly Ser His Ser
2810 2815 2820
Glu Pro Ser Thr Arg Ala Asn Cys Ser Asn Phe Lys Glu Ile Gln
2825 2830 2835
Ile Ser Asp Asn His Thr Leu Ile Ser Met Gly Arg Pro Ser Ser
2840 2845 2850
Thr Leu Gly Val Asn Arg Ser Ser Ser Arg Leu Gly Val Lys Glu
2855 2860 2865
Lys Asn Val Thr Ile Thr Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu
2870
2875
2880
Glu Gln Arg Glu Leu Phe Glu Gln Ser Lys Ala Pro Arg Ala Asp
2885 2890 2895
Asp His Val Arg Lys His His Ser Pro Ser Pro Gln His Gln Asp
2900 2905 2910
Tyr Val Ala Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln Arg
2915 2920 2925
Glu Leu Phe Glu Gln Cys Lys Ala Pro Tyr Val Asp His Gln Met
2930 2935 2940
Arg Glu Asn His Ser Pro Leu Pro Gln Gly Gln Asp Ser Ile Ala
2945 2950 2955
Ser Asp Leu Pro Ser Pro Ile Ser Leu Glu Gln Cys Gln Ser Lys
2960 2965 2970
Ala Pro Gly Val Asp Asp Gln Met Asn Lys His His Phe Pro Leu
2975 2980 2985
Pro Gln Gly Gln Asp Cys Val Val Glu Lys Asn Asn Gln His Lys
2990 2995 3000
Pro Lys Ser His Ile Ser Asn Ile Asn Val Glu Ala Lys Phe Asn
3005 3010 3015
Thr Val Val Ser Gln Ser Ala Pro Asn His Cys Thr Leu Ala Ala
3020 3025 3030
Ser Ala Ser Thr Pro Pro Ser Asn Arg Lys Ala Leu Ser Cys Val
3035 3040 3045
His Ile Thr Leu Cys Pro Lys Thr Ser Ser Lys Leu Asp Ser Gly
3050 3055 3060
Thr Leu Asp Glu Arg Phe His Ser Leu Asp Ala Ala Ser Lys Ala
3065 3070 3075
Arg Met Asn Ser Glu Phe Asn Phe Asp Leu His Thr Val Ser Ser
3080 3085 3090
Arg Ser Leu Glu Pro Thr Ser Lys Leu Leu Thr Ser Lys Pro Val
3095 3100 3105
Ala Gln Asp Gln Glu Ser Leu Gly Phe Leu Gly Pro Lys Ser Ser
3110
3115
3120
Leu Asp Phe Gln Val Val Gln Pro Ser Leu Pro Asp Ser Asn Thr
3125 3130 3135
Ile Thr Gln Asp Leu Lys Thr Ile Pro Ser Gln Asn Ser Gln Ile
3140 3145 3150
Val Thr Ser Arg Gln Ile Gln Val Asn Ile Ser Asp Phe Glu Gly
3155 3160 3165
His Ser Asn Pro Glu Gly Thr Pro Val Phe Ala Asp Arg Leu Pro
3170 3175 3180
Glu Lys Met Lys Thr Pro Leu Ser Ala Phe Ser Glu Lys Leu Ser
3185 3190 3195
Ser Asp Ala Val Thr Gln Ile Thr Thr Glu Ser Pro Glu Lys Thr
3200 3205 3210
Leu Phe Ser Ser Glu Ile Phe Ile Asn Ala Glu Asp Arg Gly His
3215 3220 3225
Glu Ile Ile Glu Pro Gly Asn Gln Lys Leu Arg Lys Ala Pro Val
3230 3235 3240
Lys Phe Ala Ser Ser Ser Ser Val Gln Gln Val Thr Phe Ser Arg
3245 3250 3255
Gly Thr Asp Gly Gln Pro Leu Leu Leu Pro Tyr Lys Pro Ser Gly
3260 3265 3270
Ser Thr Lys Met Tyr Tyr Val Pro Gln Leu Arg Gln Ile Pro Pro
3275 3280 3285
Ser Pro Asp Ser Lys Ser Asp Thr Thr Val Glu Ser Ser His Ser
3290 3295 3300
Gly Ser Asn Asp Ala Ile Ala Pro Asp Phe Pro Ala Gln Val Leu
3305 3310 3315
Gly Thr Arg Asp Asp Asp Leu Ser Ala Thr Val Asn Ile Lys His
3320 3325 3330
Lys Glu Gly Ile Tyr Ser Lys Arg Val Val Thr Lys Ala Ser Leu
3335 3340 3345
Pro Val Gly Glu Lys Pro Leu Gln Asn Glu Asn Ala Asp Ala Ser
3350
3355
3360
Val Gln Val Leu Ile Thr Gly Asp Glu Asn Leu Ser Asp Lys Lys
3365 3370 3375
Gln Gln Glu Ile His Ser Thr Arg Ala Val Thr Glu Ala Ala Gln
3380 3385 3390
Ala Lys Glu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Asp Thr Ala Asp Ser Ser
3395 3400 3405
Ala Ala Ala Ala Ala Glu His Ser Ala Gln Val Gly Asp Pro Glu
3410 3415 3420
Met Lys Asn Leu Pro Asp Thr Lys Ala Ile Thr Gln Lys Glu Glu
3425 3430 3435
Ile His Arg Lys Lys Thr Val Pro Glu Glu Ala Trp Pro Asn Asn
3440 3445 3450
Lys Glu Ser Leu Gln Ile Asn Ile Glu Glu Ser Glu Cys His Ser
3455 3460 3465
Glu Phe Glu Asn Thr Thr Arg Ser Val Phe Arg Ser Ala Lys Phe
3470 3475 3480
Tyr Ile His His Pro Val His Leu Pro Ser Asp Gln Asp Ile Cys
3485 3490 3495
His Glu Ser Leu Gly Lys Ser Val Phe Met Arg His Ser Trp Lys
3500 3505 3510
Asp Phe Phe Gln His His Pro Asp Lys His Arg Glu His Met Cys
3515 3520 3525
Leu Pro Leu Pro Tyr Gln Asn Met Asp Lys Thr Lys Thr Asp Tyr
3530 3535 3540
Thr Arg Ile Lys Ser Leu Ser Ile Asn Val Asn Leu Gly Asn Lys
3545 3550 3555
Glu Val Met Asp Thr Thr Lys Ser Gln Val Arg Asp Tyr Pro Lys
3560 3565 3570
His Asn Gly Gln Ile Ser Asp Pro Gln Arg Asp Gln Lys Val Thr
3575 3580 3585
Pro Glu Gln Thr Thr Gln His Thr Val Ser Leu Asn Glu Leu Trp
3590
3595
3600
Asn Lys Tyr Arg Glu Arg Gln Arg Gln Gln Arg Gln Pro Glu Leu
3605 3610 3615
Gly Asp Arg Lys Glu Leu Ser Leu Val Asp Arg Leu Asp Arg Leu
3620 3625 3630
Ala Lys Ile Leu Gln Asn Pro Ile Thr His Ser Leu Gln Val Ser
3635 3640 3645
Glu Ser Thr His Asp Asp Ser Arg Gly Glu Arg Ser Val Lys Glu
3650 3655 3660
Trp Ser Gly Arg Gln Gln Gln Arg Asn Lys Leu Gln Lys Lys Lys
3665 3670 3675
Arg Phe Lys Ser Leu Glu Lys Ser His Lys Asn Thr Gly Glu Leu
3680 3685 3690
Lys Lys Ser Lys Val Leu Ser His His Arg Ala Gly Arg Ser Asn
3695 3700 3705
Gln Ile Lys Ile Glu Gln Ile Lys Phe Asp Lys Tyr Ile Leu Ser
3710 3715 3720
Lys Gln Pro Gly Phe Asn Tyr Ile Ser Asn Thr Ser Ser Asp Cys
3725 3730 3735
Arg Pro Ser Glu Glu Ser Glu Leu Leu Thr Asp Thr Thr Thr Asn
3740 3745 3750
Ile Leu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Val Glu Ser Asp Ile Leu Thr
3755 3760 3765
Gln Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu His Glu Arg Ser Ser Ser Val
3770 3775 3780
Ser Thr Ile Asp Thr Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Gly His Glu
3785 3790 3795
Arg Val Cys Leu Ser Pro Arg Arg Ile Lys Leu Tyr Ser Ser Ile
3800 3805 3810
Thr Asn Gln Gln Arg Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Ser Lys His Ser
3815 3820 3825
Lys Lys Val Leu Asn Thr Gly His Pro Leu Val Thr Ser Glu His
3830
3835
3840
Thr Arg Arg Arg His Ile Gln Val Ala Asn His Val Ile Ser Ser
3845 3850 3855
Asp Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ser Ser Phe Leu Ser Ser Asn Ser
3860 3865 3870
Thr Phe Cys Asn Lys Gln Asn Val His Met Leu Asn Lys Gly Ile
3875 3880 3885
Gln Ala Gly Asn Leu Glu Ile Val Asn Gly Ala Lys Lys His Thr
3890 3895 3900
Arg Asp Val Gly Ile Thr Phe Pro Thr Pro Ser Ser Ser Glu Ala
3905 3910 3915
Lys Leu Glu Glu Asn Ser Asp Val Thr Ser Trp Ser Glu Glu Lys
3920 3925 3930
Arg Glu Glu Lys Met Leu Phe Thr Gly Tyr Pro Glu Asp Arg Lys
3935 3940 3945
Leu Lys Lys Asn Lys Lys Asn Ser His Glu Gly Val Ser Trp Phe
3950 3955 3960
Val Pro Val Glu Asn Val Glu Ser Arg Ser Lys Lys Glu Asn Val
3965 3970 3975
Pro Asn Thr Cys Gly Pro Gly Ile Ser Trp Phe Glu Pro Ile Thr
3980 3985 3990
Lys Thr Arg Pro Trp Arg Glu Pro Leu Arg Glu Gln Asn Cys Gln
3995 4000 4005
Gly Gln His Leu Asp Gly Arg Gly Tyr Leu Ala Gly Pro Gly Arg
4010 4015 4020
Glu Ala Gly Arg Asp Leu Leu Arg Pro Phe Val Arg Ala Thr Leu
4025 4030 4035
Gln Glu Ser Leu Gln Phe His Arg Pro Asp Phe Ile Ser Arg Ser
4040 4045 4050
Gly Glu Arg Ile Lys Arg Leu Lys Leu Ile Val Gln Glu Arg Lys
4055 4060 4065
Leu Gln Ser Met Leu Gln Thr Glu Arg Asp Ala Leu Phe Asn Ile
4070
4075
4080
Asp Arg Glu Arg Gln Gly His Gln Asn Arg Met Cys Pro Leu Pro
4085 4090 4095
Lys Arg Val Phe Leu Ala Ile Gln Lys Asn Lys Pro Ile Ser Lys
4100 4105 4110
Lys Glu Met Ile Gln Arg Ser Lys Arg Ile Tyr Glu Gln Leu Pro
4115 4120 4125
Glu Val Gln Lys Lys Arg Glu Glu Glu Lys Arg Lys Ser Glu Tyr
4130 4135 4140
Lys Ser Tyr Arg Leu Arg Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Arg Val Thr
4145 4150 4155
Asn Gln Leu Leu Gly Arg Lys Val Pro Trp Asp 4160 4165
<210> 2
<211> 1298
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Met Glu Pro Pro Ser Cys Ile Gln Asp Glu Pro Phe Pro His Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Glu Pro Gly Val Ser Ala Gln Pro Gly Pro Gly Lys Pro Ser
20 25 30
Asp Lys Arg Phe Arg Leu Trp Tyr Val Gly Gly Ser Cys Leu Asp His
35 40 45
Arg Thr Thr Leu Pro Met Leu Pro Trp Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg
50 55 60
Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ala Gly Gly Cys Gly Ala Pro Ala Ala Arg
65 70 75 80
Glu Val Ile Leu Val Leu Ser Ala Pro Phe Leu Arg Cys Val Pro Ala
85 90 95
Pro Gly Ala Gly Ala Ser Gly Gly Thr Ser Pro Ser Ala Thr Gln Pro
100 105 110
Asn Pro Ala Val Phe Ile Phe Glu His Lys Ala Gln His Ile Ser Arg
115 120 125
Phe Ile His Asn Ser His Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Tyr Leu Ile Lys
130 135 140
Ala Gln Pro Asp Asp Pro Glu Ser Gln Met Ala Cys His Val Phe Arg
145 150 155 160
Ala Thr Asp Pro Ser Gln Val Pro Asp Val Ile Ser Ser Ile Arg Gln
165 170 175
Leu Ser Lys Ala Ala Met Lys Glu Asp Ala Lys Pro Ser Lys Asp Asn
180 185 190
Glu Asp Ala Phe Tyr Asn Ser Gln Lys Phe Glu Val Leu Tyr Cys Gly
195 200 205
Lys Val Thr Val Thr His Lys Lys Ala Pro Ser Ser Leu Ile Asp Asp
210 215 220
Cys Met Glu Lys Phe Ser Leu His Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ile Gln
225 230 235 240
Gly Glu Gln Arg Gly Pro Asp Pro Gly Glu Asp Leu Ala Asp Leu Glu
245 250 255
Val Val Val Pro Gly Ser Pro Gly Asp Cys Leu Pro Glu Glu Ala Asp
260 265 270
Gly Thr Asp Thr His Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ser Gln Pro Ala
275 280 285
Leu Thr Ser Ser Arg Val Cys Phe Pro Glu Arg Ile Leu Glu Asp Ser
290 295 300
Gly Phe Asp Glu Gln Gln Glu Phe Arg Ser Arg Cys Ser Ser Val Thr
305 310 315 320
Gly Val Gln Arg Arg Val His Glu Gly Ser Gln Lys Ser Gln Pro Arg
325 330 335
Arg Arg His Ala Ser Ala Pro Ser His Val Gln Pro Ser Asp Ser Glu
340 345 350
Lys Asn Arg Thr Met Leu Phe Gln Val Gly Arg Phe Glu Ile Asn Leu
355 360 365
Ile Ser Pro Asp Thr Lys Ser Val Val Leu Glu Lys Asn Phe Lys Asp
370 375 380
Ile Ser Ser Cys Ser Gln Gly Ile Lys His Val Asp His Phe Gly Phe
385 390 395 400
Ile Cys Arg Glu Ser Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gln Tyr Ile Cys Tyr
405 410 415
Val Phe Gln Cys Ala Ser Glu Ser Leu Val Asp Glu Val Met Leu Thr
420 425 430
Leu Lys Gln Ala Phe Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gln Ser Ala Lys Thr
435 440 445
Gln Ile Lys Leu Cys Glu Ala Cys Pro Met His Ser Leu His Lys Leu
450 455 460
Cys Glu Arg Ile Glu Gly Leu Tyr Pro Pro Arg Ala Lys Leu Val Ile
465 470 475 480
Gln Arg His Leu Ser Ser Leu Thr Asp Asn Glu Gln Ala Asp Ile Phe
485 490 495
Glu Arg Val Gln Lys Met Lys Pro Val Ser Asp Gln Glu Glu Asn Glu
500 505 510
Leu Val Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Cys Glu Ala Lys Gln Lys Thr
515 520 525
His Val His Ile Gly Glu Gly Pro Ser Thr Ile Ser Asn Ser Thr Ile
530 535 540
Pro Glu Asn Ala Thr Ser Ser Gly Arg Phe Lys Leu Asp Ile Leu Lys
545 550 555 560
Asn Lys Ala Lys Arg Ser Leu Thr Ser Ser Leu Glu Asn Ile Phe Ser
565 570 575
Arg Gly Ala Asn Arg Met Arg Gly Arg Leu Gly Ser Val Asp Ser Phe
580 585 590
Glu Arg Ser Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Asp Tyr Ser Pro Gly Asp
595 600 605
Ser Pro Pro Gly Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gln
610 615 620
Thr Phe Pro Glu Glu Asp Ser Asp Ser Pro Gln Phe Arg Arg Arg Ala
625 630 635 640
His Thr Phe Ser His Pro Pro Ser Ser Thr Lys Arg Lys Leu Asn Leu
645 650 655
Gln Asp Gly Arg Ala Gln Gly Val Arg Ser Pro Leu Leu Arg Gln Ser
660 665 670
Ser Ser Glu Gln Cys Ser Asn Leu Ser Ser Val Arg Arg Met Tyr Lys
675 680 685
Glu Ser Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Leu His Thr Ser Phe Ser
690 695 700
Ala Pro Ser Phe Thr Ala Pro Ser Phe Leu Lys Ser Phe Tyr Gln Asn
705 710 715 720
Ser Gly Arg Leu Ser Pro Gln Tyr Glu Asn Glu Ile Arg Gln Asp Thr
725 730 735
Ala Ser Glu Ser Ser Asp Gly Glu Gly Arg Lys Arg Thr Ser Ser Thr
740 745 750
Cys Ser Asn Glu Ser Leu Ser Val Gly Gly Thr Ser Val Thr Pro Arg
755 760 765
Arg Ile Ser Trp Arg Gln Arg Ile Phe Leu Arg Val Ala Ser Pro Met
770 775 780
Asn Lys Ser Pro Ser Ala Met Gln Gln Gln Asp Gly Leu Asp Arg Asn
785 790 795 800
Glu Leu Leu Pro Leu Ser Pro Leu Ser Pro Thr Met Glu Glu Glu Pro
805 810 815
Leu Val Val Phe Leu Ser Gly Glu Asp Asp Pro Glu Lys Ile Glu Glu
820 825 830
Arg Lys Lys Ser Lys Glu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Lys Ala Ile His
835 840 845
Gln Gln Ile Leu Leu Leu Arg Met Glu Lys Glu Asn Gln Lys Leu Glu
850 855 860
Ala Ser Arg Asp Glu Leu Gln Ser Arg Lys Val Lys Leu Asp Tyr Glu
865 870 875 880
Glu Val Gly Ala Cys Gln Lys Glu Val Leu Ile Thr Trp Asp Lys Lys
885 890 895
Leu Leu Asn Cys Arg Ala Lys Ile Arg Cys Asp Met Glu Asp Ile His
900 905 910
Thr Leu Leu Lys Glu Gly Val Pro Lys Ser Arg Arg Gly Glu Ile Trp
915 920 925
Gln Phe Leu Ala Leu Gln Tyr Arg Leu Arg His Arg Leu Pro Asn Lys
930 935 940
Gln Gln Pro Pro Asp Ile Ser Tyr Lys Glu Leu Leu Lys Gln Leu Thr
945 950 955 960
Ala Gln Gln His Ala Ile Leu Val Asp Leu Gly Arg Thr Phe Pro Thr
965 970 975
His Pro Tyr Phe Ser Val Gln Leu Gly Pro Gly Gln Leu Ser Leu Phe
980 985 990
Asn Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Tyr Cys
995 1000 1005
Gln Gly Ile Ser Phe Val Ala Gly Val Leu Leu Leu His Met Ser
1010 1015 1020
Glu Glu Gln Ala Phe Glu Met Leu Lys Phe Leu Met Tyr Asp Leu
1025 1030 1035
Gly Phe Arg Lys Gln Tyr Arg Pro Asp Met Met Ser Leu Gln Ile
1040 1045 1050
Gln Met Tyr Gln Leu Ser Arg Leu Leu His Asp Tyr His Arg Asp
1055 1060 1065
Leu Tyr Asn His Leu Glu Glu Asn Glu Ile Ser Pro Ser Leu Tyr
1070 1075 1080
Ala Ala Pro Trp Phe Leu Thr Leu Phe Ala Ser Gln Phe Ser Leu
1085 1090 1095
Gly Phe Val Ala Arg Val Phe Asp Ile Ile Phe Leu Gln Gly Thr
1100 1105 1110
Glu Val Ile Phe Lys Val Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ser Gln Glu
1115 1120 1125
Thr Leu Ile Met Glu Cys Glu Ser Phe Glu Asn Ile Val Glu Phe
1130 1135 1140
Leu Lys Asn Thr Leu Pro Asp Met Asn Thr Ser Glu Met Glu Lys
1145 1150 1155
Ile Ile Thr Gln Val Phe Glu Met Asp Ile Ser Lys Gln Leu His
1160 1165 1170
Ala Tyr Glu Val Glu Tyr His Val Leu Gln Asp Glu Leu Gln Glu
1175 1180 1185
Ser Ser Tyr Ser Cys Glu Asp Ser Glu Thr Leu Glu Lys Leu Glu
1190 1195 1200
Arg Ala Asn Ser Gln Leu Lys Arg Gln Asn Met Asp Leu Leu Glu
1205 1210 1215
Lys Leu Gln Val Ala His Thr Lys Ile Gln Ala Leu Glu Ser Asn
1220 1225 1230
Leu Glu Asn Leu Leu Thr Arg Glu Thr Lys Met Lys Ser Leu Ile
1235 1240 1245
Arg Thr Leu Glu Gln Glu Lys Met Ala Tyr Gln Lys Thr Val Glu
1250 1255 1260
Gln Leu Arg Lys Leu Leu Pro Ala Asp Ala Leu Val Asn Cys Asp
1265 1270 1275
Leu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Cys Asn Pro Asn Asn Lys Ala Lys
1280 1285 1290
Ile Gly Asn Lys Pro
1295
<210> 3
<211> 1235
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Met Glu Pro Pro Ser Cys Ile Gln Asp Glu Pro Phe Pro His Pro Leu
1 5 10 15
Glu Pro Glu Pro Gly Val Ser Ala Gln Pro Gly Pro Gly Lys Pro Ser
20 25 30
Asp Lys Arg Phe Arg Leu Trp Tyr Val Gly Gly Ser Cys Leu Asp His
35 40 45
Arg Thr Thr Leu Pro Met Leu Pro Trp Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg
50 55 60
Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ala Gly Gly Cys Gly Ala Pro Ala Ala Arg
65 70 75 80
Glu Val Ile Leu Val Leu Ser Ala Pro Phe Leu Arg Cys Val Pro Ala
85 90 95
Pro Gly Ala Gly Ala Ser Gly Gly Thr Ser Pro Ser Ala Thr Gln Pro
100 105 110
Asn Pro Ala Val Phe Ile Phe Glu His Lys Ala Gln His Ile Ser Arg
115 120 125
Phe Ile His Asn Ser His Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Tyr Leu Ile Lys
130 135 140
Ala Gln Pro Asp Asp Pro Glu Ser Gln Met Ala Cys His Val Phe Arg
145 150 155 160
Ala Thr Asp Pro Ser Gln Val Pro Asp Val Ile Ser Ser Ile Arg Gln
165 170 175
Leu Ser Lys Ala Ala Met Lys Glu Asp Ala Lys Pro Ser Lys Asp Asn
180 185 190
Glu Asp Ala Phe Tyr Asn Ser Gln Lys Phe Glu Val Leu Tyr Cys Gly
195 200 205
Lys Val Thr Val Thr His Lys Lys Ala Pro Ser Ser Leu Ile Asp Asp
210 215 220
Cys Met Glu Lys Phe Ser Leu His Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ile Gln
225 230 235 240
Gly Glu Gln Arg Gly Pro Asp Pro Gly Glu Asp Leu Ala Asp Leu Glu
245 250 255
Val Val Val Pro Gly Ser Pro Gly Asp Cys Leu Pro Glu Glu Ala Asp
260 265 270
Gly Thr Asp Thr His Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ser Gln Pro Ala
275 280 285
Leu Thr Ser Ser Arg Val Cys Phe Pro Glu Arg Ile Leu Glu Asp Ser
290 295 300
Gly Phe Asp Glu Gln Gln Glu Phe Arg Ser Arg Cys Ser Ser Val Thr
305 310 315 320
Gly Val Gln Arg Arg Val His Glu Gly Ser Gln Lys Ser Gln Pro Arg
325 330 335
Arg Arg His Ala Ser Ala Pro Ser His Val Gln Pro Ser Asp Ser Glu
340 345 350
Lys Asn Arg Thr Met Leu Phe Gln Val Gly Arg Phe Glu Ile Asn Leu
355 360 365
Ile Ser Pro Asp Thr Lys Ser Val Val Leu Glu Lys Asn Phe Lys Asp
370 375 380
Ile Ser Ser Cys Ser Gln Gly Ile Lys His Val Asp His Phe Gly Phe
385 390 395 400
Ile Cys Arg Glu Ser Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gln Tyr Ile Cys Tyr
405 410 415
Val Phe Gln Cys Ala Ser Glu Ser Leu Val Asp Glu Val Met Leu Thr
420 425 430
Leu Lys Gln Ala Phe Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gln Ser Ala Lys Thr
435 440 445
Gln Ile Lys Leu Cys Glu Ala Cys Pro Met His Ser Leu His Lys Leu
450 455 460
Cys Glu Arg Ile Glu Gly Leu Tyr Pro Pro Arg Ala Lys Leu Val Ile
465 470 475 480
Gln Arg His Leu Ser Ser Leu Thr Asp Asn Glu Gln Ala Asp Ile Phe
485 490 495
Glu Arg Val Gln Lys Met Lys Pro Val Ser Asp Gln Glu Glu Asn Glu
500 505 510
Leu Val Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Cys Glu Ala Lys Gln Lys Thr
515 520 525
His Val His Ile Gly Glu Gly Pro Ser Thr Ile Ser Asn Ser Thr Ile
530 535 540
Pro Glu Asn Ala Thr Ser Ser Gly Arg Phe Lys Leu Asp Ile Leu Lys
545 550 555 560
Asn Lys Ala Lys Arg Ser Leu Thr Ser Ser Leu Glu Asn Ile Phe Ser
565 570 575
Arg Gly Ala Asn Arg Met Arg Gly Arg Leu Gly Ser Val Asp Ser Phe
580 585 590
Glu Arg Ser Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Asp Tyr Ser Pro Gly Asp
595 600 605
Ser Pro Pro Gly Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gln
610 615 620
Thr Phe Pro Glu Glu Asp Ser Asp Ser Pro Gln Phe Arg Arg Arg Ala
625 630 635 640
His Thr Phe Ser His Pro Pro Ser Ser Thr Lys Arg Lys Leu Asn Leu
645 650 655
Gln Asp Gly Arg Ala Gln Gly Val Arg Ser Pro Leu Leu Arg Gln Ser
660 665 670
Ser Ser Glu Gln Cys Ser Asp Gly Glu Gly Arg Lys Arg Thr Ser Ser
675 680 685
Thr Cys Ser Asn Glu Ser Leu Ser Val Gly Gly Thr Ser Val Thr Pro
690 695 700
Arg Arg Ile Ser Trp Arg Gln Arg Ile Phe Leu Arg Val Ala Ser Pro
705 710 715 720
Met Asn Lys Ser Pro Ser Ala Met Gln Gln Gln Asp Gly Leu Asp Arg
725 730 735
Asn Glu Leu Leu Pro Leu Ser Pro Leu Ser Pro Thr Met Glu Glu Glu
740 745 750
Pro Leu Val Val Phe Leu Ser Gly Glu Asp Asp Pro Glu Lys Ile Glu
755 760 765
Glu Arg Lys Lys Ser Lys Glu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Lys Ala Ile
770 775 780
His Gln Gln Ile Leu Leu Leu Arg Met Glu Lys Glu Asn Gln Lys Leu
785 790 795 800
Glu Ala Ser Arg Asp Glu Leu Gln Ser Arg Lys Val Lys Leu Asp Tyr
805 810 815
Glu Glu Val Gly Ala Cys Gln Lys Glu Val Leu Ile Thr Trp Asp Lys
820 825 830
Lys Leu Leu Asn Cys Arg Ala Lys Ile Arg Cys Asp Met Glu Asp Ile
835 840 845
His Thr Leu Leu Lys Glu Gly Val Pro Lys Ser Arg Arg Gly Glu Ile
850 855 860
Trp Gln Phe Leu Ala Leu Gln Tyr Arg Leu Arg His Arg Leu Pro Asn
865 870 875 880
Lys Gln Gln Pro Pro Asp Ile Ser Tyr Lys Glu Leu Leu Lys Gln Leu
885 890 895
Thr Ala Gln Gln His Ala Ile Leu Val Asp Leu Gly Arg Thr Phe Pro
900 905 910
Thr His Pro Tyr Phe Ser Val Gln Leu Gly Pro Gly Gln Leu Ser Leu
915 920 925
Phe Asn Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Tyr
930 935 940
Cys Gln Gly Ile Ser Phe Val Ala Gly Val Leu Leu Leu His Met Ser
945 950 955 960
Glu Glu Gln Ala Phe Glu Met Leu Lys Phe Leu Met Tyr Asp Leu Gly
965 970 975
Phe Arg Lys Gln Tyr Arg Pro Asp Met Met Ser Leu Gln Ile Gln Met
980 985 990
Tyr Gln Leu Ser Arg Leu Leu His Asp Tyr His Arg Asp Leu Tyr Asn
995 1000 1005
His Leu Glu Glu Asn Glu Ile Ser Pro Ser Leu Tyr Ala Ala Pro
1010 1015 1020
Trp Phe Leu Thr Leu Phe Ala Ser Gln Phe Ser Leu Gly Phe Val
1025 1030 1035
Ala Arg Val Phe Asp Ile Ile Phe Leu Gln Gly Thr Glu Val Ile
1040 1045 1050
Phe Lys Val Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ser Gln Glu Thr Leu Ile
1055 1060 1065
Met Glu Cys Glu Ser Phe Glu Asn Ile Val Glu Phe Leu Lys Asn
1070 1075 1080
Thr Leu Pro Asp Met Asn Thr Ser Glu Met Glu Lys Ile Ile Thr
1085 1090 1095
Gln Val Phe Glu Met Asp Ile Ser Lys Gln Leu His Ala Tyr Glu
1100 1105 1110
Val Glu Tyr His Val Leu Gln Asp Glu Leu Gln Glu Ser Ser Tyr
1115 1120 1125
Ser Cys Glu Asp Ser Glu Thr Leu Glu Lys Leu Glu Arg Ala Asn
1130 1135 1140
Ser Gln Leu Lys Arg Gln Asn Met Asp Leu Leu Glu Lys Leu Gln
1145 1150 1155
Val Ala His Thr Lys Ile Gln Ala Leu Glu Ser Asn Leu Glu Asn
1160 1165 1170
Leu Leu Thr Arg Glu Thr Lys Met Lys Ser Leu Ile Arg Thr Leu
1175 1180 1185
Glu Gln Glu Lys Met Ala Tyr Gln Lys Thr Val Glu Gln Leu Arg
1190 1195 1200
Lys Leu Leu Pro Ala Asp Ala Leu Val Asn Cys Asp Leu Leu Leu
1205 1210 1215
Arg Asp Leu Asn Cys Asn Pro Asn Asn Lys Ala Lys Ile Gly Asn
1220 1225 1230
Lys Pro
1235
<210> 4
<211> 672
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val
1 5 10 15
Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His
20 25 30
Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr
35 40 45
Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly
50 55 60
Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu
65 70 75 80
Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp
85 90 95
Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro
100 105 110
Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln
115 120 125
Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val
130 135 140
Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly
145 150 155 160
Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr
165 170 175
Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser
180 185 190
Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser
195 200 205
Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn
210 215 220
Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu
225 230 235 240
Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met
245 250 255
Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser
260 265 270
Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val
275 280 285
Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys
290 295 300
Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro
305 310 315 320
Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu
325 330 335
Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys
340 345 350
Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys
355 360 365
Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr
370 375 380
Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu
385 390 395 400
Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val
405 410 415
Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val
420 425 430
Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser
435 440 445
Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu
450 455 460
Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala
465 470 475 480
Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg
485 490 495
Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr
500 505 510
Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu
515 520 525
Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp
530 535 540
Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser
545 550 555 560
Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His
565 570 575
Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg
580 585 590
Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg
595 600 605
Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu
610 615 620
Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro Pro
625 630 635 640
Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe
645 650 655
Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val
660 665 670
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Peptide 1
<400> 5
Leu Asp Ser Asp Ser His Tyr Gly Pro Gln His Leu Glu Ser Ile Asp
1 5 10 15
Asp
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Peptide 2
<400> 6
Asp Ser His Gln Thr Glu Glu Thr Leu
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> peptide 3
<400> 7
Gln Gln Thr Leu Pro Glu Ser His Leu Pro
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> peptide 4
<400> 8
Gln Ala Leu Leu Asp Ser His Leu Pro Glu
1 5 10
<210> <211> <212>
9 9
PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> peptide 5
<400> 9
Pro Ala Asp Gln Met Thr Asp Thr Pro
1 5
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> peptide 6
<400> 10
His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys Val Ser Ala Val
1 5 10
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
11 7
PRT
<213> artificial sequence
<223> peptide 7
<400> 11
Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln 1 5
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
acaacttttc atggctccag t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 13
ttggctcaga gacagttgaa a 21
<210> 14
<211> 337
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> PKCalpha domain
<400> 14
Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly
1 5 10 15
Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile
20 25 30
Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys
35 40 45
Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe
50 55 60
Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe
65 70 75 80
Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln
85 90 95
Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile
100 105 110
Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp
115 120 125
Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile
130 135 140
Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr
145 150 155 160
Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala
165 170 175
Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu
180 185 190
Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu
195 200 205
Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys
225 230 235 240
His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val
245 250 255
Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn
260 265 270
Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala
275 280 285
Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro
290 295 300
Pro Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly
305 310 315 320
Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala
325 330 335
Val
<210> 15
<211> 1014
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> PCKalpha domain
ctcacggact
tcaatttcct
catggtgttg
ggaaagggga
gttttggaaa
ggtgatgctt
gccgacagga
agggcacaga
agaactgtat
gcaatcaaaa
tcctgaagaa
ggatgtggtg
120
attcaggatg
atgacgtgga
gtgcaccatg
gtagaaaagc
gagtcttggc
cctgcttgac
180
aaacccccgt
tcttgacgca
gctgcactcc
tgcttccaga
cagtggatcg
gctgtacttc
240
gtcatggaat
atgtcaacgg
tggggacctc
atgtaccaca
ttcagcaagt
aggaaaattt
300
aaggaaccac
aagcagtatt
ctatgcggca
gagatttcca
tcggattgtt
ctttcttcat
360
aaaagaggaa
tcatttatag
ggatctgaag
ttagataacg
tcatgttgga
ttcagaagga
420
catatcaaaa
ttgctgactt
tgggatgtgc
aaggaacaca
tgatggatgg
agtcacgacc
480
aggaccttct
gtgggactcc
agattatatc
gccccagaga
taatcgctta
tcagccgtat
540
ggaaaatctg
tggactggtg
ggcctatggc
gtcctgttgt
atgaaatgct
tgccgggcag
600
cctccatttg
atggtgaaga
tgaagacgag
ctatttcagt
ctatcatgga
gcacaacgtt
660
tcctatccaa
aatccttgtc
caaggaggct
gtttctatct
gcaaaggact
gatgaccaaa
720
cacccagcca
agcggctggg
ctgtgggcct
gagggggaga
gggacgtgag
agagcatgcc
780
ttcttccgga
ggatcgactg
ggaaaaactg
gagaacaggg
agatccagcc
accattcaag
840
cccaaagtgt
gtggcaaagg
agcagagaac
tttgacaagt
tcttcacacg
aggacagccc
900
gtcttaacac
cacctgatca
gctggttatt
gctaacatag
accagtctga
ttttgaaggg
960
ttctcgtatg
tcaaccccca
gtttgtgcac
cccatcttac
agagtgcagt
atga
1014
<210> 16
<211> 64
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> Primer
<400> 16
gtacgaattc gccaccatgg attacaagga tgacgacgat aagctcacgg acttcaattt 60 cctc 64
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> artificial sequence
<223> primer
<400> 17
tagcggatcc tcatactgca ctctgtaaga tggg 34
<210> <211> <212>
PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> arginine rich peptide
<400> 18
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> arginine rich peptide
<400> 19
Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro
1 5 10 15
<210> 20
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> antennapedia peptide
<400> 20
Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys
1 5 10 15
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> HIV-Tat
<400> 21
Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg
1 5 10
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Молекула, предотвращая связывание аРКС (протеинкиназа С альфа типа) с ALMS1 (белок синдрома Альстрёма 1), для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
2. Молекула для применения по п. 1, отличающаяся тем, что молекула предназначена для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета 2 типа.
3. Молекула для применения по п. 1 или 2, отличающийся тем, что молекула не препятствует связыванию TBC1D4 с ALMS1.
4. Молекула для применения по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов или полипептидов или пептидомиметиков, антител, их фрагментов или производных, аптамеров, шпигельмеров и химических соединений.
5. Молекула для применения по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид длиной менее, чем 50 аминокислот, предпочтительно, менее, чем 20 аминокислот.
6. Молекула для применения по п. 5, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ IDNO: 1).
7. Молекула для применения по п. 6, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1, включающий один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884.
8. Молекула для применения по п. 6 или 7, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий или состоящий из одной из следующих последовательностей:
- LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5);
- DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6);
- QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7);
- QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8);
- PADQMTDTP (SEQ ID NO: 9);
- HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10);
- SCIFLEQ (SEQ ID NO: 11), и
- их фрагмента, содержащего 6 смежных аминокислот.
9. Молекула для применения по п. 5, отличающаяся тем, что молекула представляет
собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ
ID NO: 4).
10. Молекула для применения по п. 9, отличающаяся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС, включающую один или несколько из числа остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1, в частности, один или несколько из числа остатков выбранных из списка, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667.
11. Способ in vitro или ex vivo идентификации молекул, подходящих для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, отличающийся тем, что тестировали способность молекулы предотвращать связывание аРКС с ALMS1 и отбирали молекулы, способные предотвращать это связывание.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что способ дополнительно включает стадию, в которой тестируется способность выбранной молекулы мешать связыванию TBC1D4 с ALMS1 и в которой отбираются молекулы, которые не мешают связыванию.
13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что связывание определяют в клеточной системе в ответ на инсулин.
14. Способ по любому одному из пп. 11-13, отличающийся тем, что связывание определяют в присутствии и/или в отсутствие инсулина.
15. Молекула по любому из пп. 6-8 и 10 для применения в качестве лекарственного средства.
16. Молекула, увеличивающая экспрессию ALMS1 или усиливающая связывание TBC1D4 с ALMS1 для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии.
10.
го о о го
о; х
окрашенные
адипоциты
окрашенные адипоциты
го с;
о> н-
го о о го
те о;
2-х месячные самцы
д. т.
6-ти месячные
самцы
сердце печень мышцы жиробвеаляа?кань
*////
Ж •# ////
3-х недельные зрелые адипоциты
к , чг кшРНК \ Ms] кшРНК
ШШш,
уровни
флуоресценции
(r)*ш
CTRL.KLLlPHK
L\S -INS (30 МИН)
5 1
AS'!
1J ¦ И
О- (tm) - (tm)
CTRL -ALMSl кшРНК кшРНК
АК'1
ALM5I КШРНК
-t\s (30 МИН)
АКТ
6/13 CTRL. КШРНК
ALMS1 КШРНК
-INS.
HNS 30 МИН. -INS. flNS. 30 МИН.
IRA
¦ ¦* - "* wil
B-TUB
- as
TBC1D4I
.pJBCID
DYNAMTN RAR14
'RAHJti
l\s 30 мин
ТВСШ4
^^^^^^^^^^^^^^^
- -- - -
lllellllillil
альфа-актинин
ннн ИГ. О (продолжение)
Фиг 6
в отсутствие инсулина
глюкоза
.1 /Т6
". ±4-
микротрубо^ка
СаРКС*
P0KV2 актиноЕ
*" филамс *
в присутствие инсулина
глюкоза
' , 1 | •
?йд|"*т липогенез *
гликем~ '.
глюкоза'
<ь> -
/г -
/ / 7
микротрубочка
5*0412 - *
актиновыи филамент
культуральная среда культуралыная +/- 30 мин.
+ INS / лентивирусная среда - INS перед тестами
инфекция , ,
т Ў т
дни
(19)
(19)
(19)
<220>
<220>
<220>
<220>
1/13
1/13
Фиг. 1
Фиг. 1
1/13
1/13
Фиг. 1
Фиг. 1
1/13
1/13
Фиг. 1
Фиг. 1
1/13
1/13
Фиг. 1
Фиг. 1
2/13
2/13
Фиг. 2
Фиг. 2
2/13
2/13
Фиг. 2
Фиг. 2
2/13
2/13
Фиг. 2
Фиг. 2
2/13
2/13
Фиг. 2
Фиг. 2
ФИГ. 2 (продолжение)
ФИГ. 2 (продолжение)
4/13
4/13
Фиг. 3
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 4
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
ФИГ. 4 (продолжение)
7/13
7/13
8/13
8/13
8/13
8/13
8/13
8/13
9/13
9/13
11/13
11/13
ФИГ. 7 (продолжение)
ФИГ. 7 (продолжение)
11/13
11/13
ФИГ. 7 (продолжение)
ФИГ. 7 (продолжение)
11/13
11/13
ФИГ. 7 (продолжение)
ФИГ. 7 (продолжение)
11/13
11/13
ФИГ. 7 (продолжение)
ФИГ. 7 (продолжение)
11/13
11/13
ФИГ. 7 (продолжение)
ФИГ. 7 (продолжение)
12/13
12/13
13/13
13/13
Фиг. 9
Фиг. 9