|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через GLUT4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью αPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание αPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание αPKC c ALMS1.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула: Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через GLUT4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью αPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание αPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание αPKC c ALMS1. Евразийское (21) 201691498 (13) A1 патентное ведомство (12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ (43) Дата публикации заявки 2017.02.28 (22) Дата подачи заявки 2015.01.29 (51) Int. Cl. A61K38/03 (2006.01) A61P3/04 (2006.01) A61P3/08 (2006.01) A61P3/10 (2006.01) (54) НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА (31) 14153017.0 (32) 2014.01.29 (33) EP (86) PCT/EP2015/051856 (87) WO 2015/114062 2015.08.06 (71) Заявитель: ЮНИВЕРСИТЕ ДЕ СТРАЗБУР; ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ САНТЭ Э ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ МЕДИКАЛЬ (FR); ВАКСИН ПТИ ЛТД. (AU) (72) Изобретатель: Марион Венсан (FR), Петровски Николай (AU) (74) Представитель: Фелицына С.Б. (RU) (57) Настоящее изобретение относится к идентификации ALMS1 как недостающего игрока, участвующего в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы через ОШТ4-сортировочные везикулы, и к отрицательной регуляции ALMS1 с помощью aPKC. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание aPKC с ALMS1 для применения при лечении или профилактике сахарного диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Кроме того, настоящее изобретение относится к способу идентификации молекулы, способной предотвращать связывание aPKC c ALMS1. 1611146 НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА Область техники, к которой относится изобретение Настоящее изобретение относится к области медицины. Более конкретно, оно относится к диабету. Предшествующий уровень техники Сахарный диабет или диабет представляет собой группу метаболических заболеваний, при которых человек имеет высокий уровень сахара в крови, либо потому, что поджелудочная железа не вырабатывает достаточное количество инсулина, либо потому, что клетки не реагируют на вырабатываемый инсулин. Существуют три основных типа диабета: - тип 1 приводит к неспособности организма вырабатывать инсулин, и в настоящее время требует, чтобы индивидуум вводил инсулин или носил инсулиновый насос; - тип 2 является результатом резистентности к инсулину, состоянию, при котором клетки не используют инсулин должным образом; - третий называется гестационным диабетом и случается у беременных женщин. Показатели сахарного диабета 2 типа заметно выросли с 1960 года параллельно с ростом ожирения: По состоянию на 2010 год насчитывалось около 285 миллионов людей с заболеванием по сравнению с около 30 миллионами в 1985 году. Долгосрочные осложнения от высокого уровня сахара в крови могут включать болезни сердца, инсульт, диабетическую ретинопатию, хроническую почечную недостаточность, которая может потребовать диализ, и плохое кровообращение в конечностях, приводящее к ампутациям. Может произойти некетотическая гиперосмолярная кома. Сообщалось, что гипергликемия принимает участие в возникновении и в прогрессирующем усилении сахарного диабета, т.е. имеется в виду теория токсичности глюкозы. А именно, хроническая гипергликемия ведет к уменьшению секреции инсулина и далее к снижению чувствительности к инсулину, а в результате, концентрация глюкозы в крови повышается таким образом, что сахарный диабет самообостряется. Поэтому при лечении гипергликемии цикл вышеупомянутого самообострения прерывается таким образом, что становятся возможными профилактика или лечение сахарного диабета. К сожалению, существующим методам лечения не удается восстановить нормогликемию в долгосрочной перспективе, так как с течением времени снижается функция бета-клеток. Кроме того, в настоящее время не существует ни одного препарата, который способен полностью изменить все аспекты этого заболевания. Прогрессирующий характер сахарного диабета 2 типа означает, что многим пациентам в конечном итоге потребуется сочетание перорального гипогликемического препарата, возможно, вместе с инъекциями инсулина и/или экзенатида. Антидиабетические агенты были разработаны для того, чтобы противодействовать основным механизмам, вовлеченным в сахарный диабет 2 типа: устойчивости к инсулину (бигуаниды и тиазолидиндионы) и секреции инсулина (сульфонилмочевины, глиниды, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, 1 агонисты рецептора глюкагон-подобного пептида), агенты, которые задерживают поглощение глюкозы в желудочно-кишечном тракте или способствуют потере массы и новые агенты, которые способствуют выведению глюкозы в почечных канальцах. Тем не менее, большинство из этих препаратов, как было показано, имеют пагубные побочные эффекты, такие как увеличение массы, периферические отеки или застойная сердечная недостаточность и существует серьезная проблема с потерей эффективности этих агентов при долгосрочном применении. Таким образом, несмотря на растущее число терапевтических возможностей для контроля гликемии, существует потребность в альтернативных и улучшенных препаратах для лечения диабета и связанных с ним состояний. Сущность изобретения Авторы настоящего изобретения идентифицировали новую цель для лечения диабета, в частности сахарного диабета 2 типа. Их новаторской находкой является ALMS 1 (белок синдрома Ал стрёма 1), который участвует в регуляции инсулином поглощения глюкозы зрелыми адипоцитами посредством его взаимодействий при связывании с ключевыми молекулами, участвующими в регуляции глюкозы. Вкратце, они показали, что когда инсулин связывается со своим рецептором, то около Almsl образуется и активируется белковый комплекс (ALMSoMa), что приводит к активации Н+-насоса, транслокации рецептора GLUT4 и поглощению глюкозы адипоцитами. Они также показали, что в отсутствии Almsl, и в следствии этого предотвращении сборки ALMSoMbi, глюкоза не может транспортироваться в клетки из-за невозможности слияния GLUT4 с клеточной мембраной. Следовательно, они показали, что модуляция комплексообразования ALMS1 может быть использована для регулирования транспорта глюкозы и, таким образом, может быть использована для обхода резистентности к инсулину, и для лечения диабета 2 типа. Более конкретно, авторы изобретения идентифицировали два белка, участвующих в регуляции транспорта глюкозы с помощью ALMS1, а именно TBC1D4 (4 представитель семейства с ТВС1 -доменом) и аРКС (РКСа или протеинкиназа С альфа-типа). Более конкретно, участки связывания этих двух регулирующих глюкозу белков с ALMS1 настолько близки, что одновременное связывание обоих белков не представляется возможным из-за стерических препятствий. TBC1D4, через его взаимодействие с белками (т.е. RablO, Rabl4 и т.д.) и ALMS1, регулирует транслокацию рецепторов GLUT4 к клеточной мембране. С другой стороны, аРКС, при связывании с ALMS1, блокирует сайт связывания TBC1D4 и, тем самым, отрицательно регулирует транслокацию рецепторов GLUT4 к клеточной мембране, уменьшая клеточное поглощение глюкозы. Кроме того, они продемонстрировали, что нацеленное воздействие на взаимодействие ALMS1 и аРКС достаточно для того, чтобы вызвать всасывание глюкозы адипоцитами, независимо от наличия INS. Соответственно, новые терапевтические стратегии, продемонстрированные в данном изобретении, заключаются в повышении клеточной абсорбции глюкозы и уменьшении гипергликемии путем блокирования связывания аРКС с ALMS1. Наиболее предпочтительно, связывание аРКС с ALMS1 ингибируется таким образом, чтобы связывание TBC1D4 с ALMS1 не изменялось или даже усиливалось. Соответственно, настоящее изобретение относится к молекуле, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS 1, для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирении и гиперинсулинемии. Оно также относится к применению такой молекулы для получения лекарственного средства, предназначенного для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Оно также относится к способу лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, у объекта, нуждающегося в этом, при котором вводится терапевтически эффективное количество молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1, тем самым увеличивая поглощение глюкозы, индуцированное инсулином. В предпочтительном воплощении молекула не препятствует связыванию TBC1D4 с ALMS1. Предпочтительно, если молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов или полипептидов или пептидомиметиков, антител, фрагментов или их производных, аптамеров, шпигельмеров и химических соединений. Более предпочтительно, если молекула представляет собой пептид длиной менее чем из 50 аминокислот, предпочтительно - менее чем из 20 аминокислот. В первом предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ ID NO: : 1). Предпочтительно, если молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1, в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. В наиболее конкретном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий или состоящий из одной из следующих последовательностей: - LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5); - DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6); - QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7); - QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8); - PADQMTDTP (SEQ ID NO:: 9); - HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10); - SCIFLEQ (SEQ ID NO:: 11), и - их фрагмента, включающего 6 смежных аминокислот. Во втором предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ Ш N0: 4). Предпочтительно, если молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС, в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации молекул, пригодных для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в котором анализируют способность молекулы предотвращать связывание аРКС с ALMS1 и отбирают молекулы, способные предотвращать это связывание. Способ может дополнительно включать стадию, на которой тестируется способность выбранной молекулы мешать связыванию TBC1D4 с ALMS1 и на которой отбирают молекулы, которые не мешают этому связыванию. Предпочтительно, если связывание определяется в клеточной системе, респонсивной на инсулин. Необязательно, связывание определяется в присутствие и/или в отсутствие инсулина. Еще одна терапевтическая стратегия, выявленная в данном изобретении, заключается в повышении клеточного поглощения глюкозы путем усиления связывания TBC1D4 с ALMS1. Еще одна терапевтическая стратегия, выявленная в данном изобретении, заключается в повышении клеточного поглощения глюкозы путем положительной регуляции экспрессии ALMS 1. Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится к молекуле, способной усиливать связывание TBC1D4 с ALMS1 или повышать экспрессию ALMS1 для применения при лечении или задержке прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, гиперинсулинемии и, в частности, сахарного диабета 2 типа. Оно также относится к применению такой молекулы для получения лекарственного средства для лечения, или замедления прогрессирования, или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в частности, сахарного диабета 2 типа. Оно также относится к способу лечения, или замедления прогрессирования, или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирению и гиперинсулинемии, в частности, сахарного диабета 2 типа, у объекта, нуждающегося в этом, в котором вводят терапевтически эффективное количество молекулы, способной усиливать связывание TBC1D4 с ALMS1 или повышать экспрессию ALMS1, тем самым увеличивая поглощение глюкозы, индуцированное инсулином. В предпочтительном воплощении молекула также ингибирует связывание аРКС с ALMS1. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации молекулы, пригодной для применения при лечении диабета, в котором анализируют способность молекулы повышать экспрессию ALMS1 и выбирают молекулы, способные к положительной регуляции ALMS1. Оно также относится к способу идентификации молекулы, пригодной для применения при лечении диабета, в котором анализируют способность молекулы увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1 и отбирают молекулы, способные увеличивать этот параметр связывания. Необязательно, способ дополнительно включает определение способности молекулы, предотвратить связывание аРКС с ALMS1 анализируют и отбор молекул, способных предотвращать это связывание. Подробное описание изобретения Авторы изобретения идентифицировали ALMS1 как недостающий ключевой игрок, участвующий в регуляции инсулин-опосредованного поглощения глюкозы посредством ОЬиТ4-сортировочных везикул в адипоцитах. В настоящее время признано, что даже если жировая ткань ответственна за около 20% абсорбции глюкозы, дисфункция в этой ткани может привести к возникновению диабета. Таким образом, любые средства, способные регулировать инсулин-опосредованное поглощение глюкозы в адипоцитах должны быть в состоянии задержать, обратить, или предотвратить возникновение сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, и гиперинсулинемии. Активность ALMS1 отрицательно регулируется при связывании с аРКС, и активируется при связывании с TBC1D4. Также было показано, что участки связывания этих двух белков на ALMS1 настолько близки, что одновременное связывание обоих белков не допускается из-за стерических затруднений. Таким образом, этот механизм регулирования является новой мишенью для лечения или замедления прогрессирования или отсрочке возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии и изобретатели предлагают использовать молекулу способную предотвращать связывание аРКС с ALMS1 при этих терапевтических показаниях. Определения ALMS1, белок синдрома Альстрёма 1, представляет собой белок, кодируемый геном ALMS1. Было обнаружено, что мутации в гене ALMS1 ответственны за синдром Альстрёма. Они описаны в нескольких базах данных, а именно UniProt Ш No Q8TCU4; Gene Ш No 7840, HGNG ID No 428. Эталонные последовательности представлены в Genbank под учетным номером NM_015120.4 для мРНК и NP_055935,4 для белка. Белковая последовательность человеческого ALMS1 описана в SEQ ID NO: 1. TBC1D4 (4 представитель семейства ТВС1 -домена), также в настоящее время называемый As 160, предполагаемо действует в качестве ОТРаза-активирующего белка для RAB2A, RAB8A, RAB10 и RAB14. Он описан в нескольких базах данных, а именно UniProt Ш No 060343, Gene Ш No 9882, HGNG ID No 19165. Эталонные последовательности описаны в Genbank под NM_014832,3 для мРНК и NP_055647.2 для белка (для изоформы 1, выбранных в качестве канонических последовательностей). Изоформа 2, которая отличается от изоформы по отсутствующим аминокислотам в положениях 678-740, представлена в UniProt как No О60343-2, стимулирует транслокацию инсулин-индуцированного переносчика глюкозы SLC2A4/GLUT4 на плазматическую мембрану, тем самым увеличивая поглощение глюкозы. Белковая последовательность человеческого TBC1D4 (изоформа 1) представлена в SEQ ID NO: 2. Белковая последовательность человеческого TBC1D4 (изоформа 2) представлена в SEQ ID NO: 3. Протеинкиназа С альфа типа, также называемая аРКС, РКС-А или РКС-альфа, принадлежит к семейству серии- и треонинспецифических протеинкиназ, которые могут быть активированы с помощью кальция и вторичного мессенджера диацилглицерина. Она описана в нескольких базах данных, а именно UniProt Ш No PI7252, Gene ID No 9393, HGNG ID No 5578. Эталонные последовательности описаны в Genbank с NM_02737.2 для мРНК и NP 002728.1 для белка. Белковая последовательность человеческого аРКС описана в SEQ ID N0: 4. Методы скрининга Настоящее изобретение относится к in vitro или ex vivo способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1. Способ включает определение влияния молекулы(ул) на связывание аРКС с ALMS1, и отбор молекулы(ул), если связывание аРКС с ALMS1 уменьшается или предотвращается. Предпочтительно, если способ дополнительно включает определение влияния молекулы(л) на связывание TBC1D4 с ALMS1, и устранение молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 уменьшается или предотвращается. Необязательно, этот способ может включать стадию выбора молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается. Настоящее изобретение также относится к in vitro или ex vivo способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной усиливать или увеличивать связывания TBC1D4 с ALMS1. Способ включает определение влияния молекулы(л) на связывание TBC1D4 с ALMS1, и выбор молекулы (л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается. Необязательно, способ дополнительно включает определение влияния молекулы (л) на связывание аРКС с ALMS1, и выбор молекулы(л), если связывание аРКС с ALMS 1 уменьшается или предотвращается. Для того чтобы определить влияние молекулы на связывание аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1, может быть осуществлена любая технология, известная специалистам в данной области, в частности, любой способ, пригодный для определения белковых взаимодействий. Например, рекомбинантный или очищенный нативный ALMS1 или аРКС может быть связан с чипом для поверхностного плазмонного резонанса, а другая молекула может протекать над чипом для оценки аффинности связывания, например, в устройстве Biacore (General Electric, США). Такой же подход может быть использован для измерения аффинности связывания ALMS1 и TBC1D4 или ALMS1 и аРКС. Влияние молекулы(л) на связывание аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1 заключается в определении путем измерения связывания аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1 в отсутствие и в присутствие тестируемой молекулы и путем сравнения связывания аРКС и/или TBC1D4 с ALMS1. Кроме того, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способных связываться с ALMS1. В самом деле, может быть выгодно, чтобы молекула предотвращающая взаимодействия между ALMS1 и аРКС, действовала непосредственно в месте связывания ALMS1 с аРКС. В качестве альтернативы, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способной связываться с аРКС. В самом деле, также может быть выгодным, чтобы молекула, предотвращающая взаимодействия между ALMS1 и аРКС действовала непосредственно в месте связывания аРКС с ALMS1. Кроме того, способ скрининга может включать предварительную стадию отбора молекулы(л), способной связываться с TBC1D4. В предпочтительном воплощении для идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной предотвращать связывание аРКС с ALMS1, способ скрининга по настоящему изобретению дополнительно включает определение влияния молекулы(л), в частности, выбранной молекулы(л), на связывание TBC1D4 с ALMS1 и отбор молекулы(л), если связывание TBC1D4 с ALMS1 не уменьшается или не предотвращается молекулой(ами). Более того, способ может включать стадию выбора молекулы(л), если TBC1D4 с ALMS1 увеличивается или усиливается молекулой(ами). В предпочтительном воплощении для идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной повышать связывание TBC1D4 с ALMS1, способ скрининга по настоящему изобретению дополнительно включает определение влияния молекулы(л), в частности, выбранной молекулы(л), на связывание аРКС с ALMS1 и отбор молекулы(л), если связывание аРКС с ALMS1 уменьшается или предотвращается молекулой(ами). Из-за большого размера партнеров по связыванию, в частности ALMS1 и TBC1D4, изобретатели предпочитают использовать клеточные системы для способов скрининга. Предпочтительно, если клеточная система связи является клеточной системой, реагирующей на инсулин. Например, клеточная система может быть выбрана из множества линий мезенхимальных клеток, мезенхимальных стволовых клеток, жировых мезенхимальных стволовых клеток, преадипоцитов и адипоцитов. Предпочтительно, если клетка представляет собой клетку человека. Далее определения связывания можно проводить в присутствии или в отсутствие инсулина. Предпочтительно, в присутствии инсулина для связывания аРКС с ALMS1 и в присутствии инсулина для связывания TBC1D4 с ALMS1. В первом аспекте, может быть осуществлен анализ иммунопреципитации с использованием ALMS1 в качестве приманки, в частности, как подробно описано в экспериментальном разделе. Например, анализ может проводиться с клетками, в частности адипоцитами, культивируемыми в отсутствие и/или в присутствие инсулина, предпочтительно, в отсутствие инсулина. Тестируемые молекулы добавляются в культуральную среду. Затем аРКС подвергается иммунодетекции. Необязательно, TBC1D4 также может быть подвергнут иммунодетекции. Этот способ описан подробно в разделе Примеры. В предпочтительном воплощении, количество аРКС, связанное с ALMS1, определяется и по сравнению с количеством в отсутствие тестируемых молекул, в частности, в отсутствие инсулина. Если количество аРКС, связанной с ALMS1, уменьшается в присутствии тестируемой молекулы, то молекула отбирается. Количество TBC1D4, связанного с ALMS1, определяется и сравнивается с количеством в отсутствие тестируемых молекул, в частности, в присутствии инсулина или как в присутствие, так и в отсутствие инсулина. Если количество TBC1D4, связанного с ALMS1, уменьшается в присутствии тестируемой молекулы, то молекула отвергается. Если количество TBC1D4, связанного с ALMS1, возрастает в присутствие тестируемой молекулы, то молекула отбирается. Во втором аспекте, аффинная очистка в сочетании с масс-спектрометрией, может быть осуществлена, в частности, после химического перекрестного сшивания. Например, клетки могут быть выращены в среде, лишенной метионина и лейцина, но включающей фотоактивируемый метионин и лейцин. Затем клетки облучаются УФ для стабилизации белковых комплексов и белковые комплексы анализируются с помощью масс-спектрометр ии. Другие способы доступны специалисту в данной области, например, комплементация бимолекулярной флуоресценции, тандемная аффинная очистка и тому подобное. В частности, в WO2012/117245 описан способ идентификации молекул, способных предотвращать взаимодействие между двумя белками: WO2012/117245 (для идентификации малых молекул). В W012174489 также раскрыты способы разработки молекул, пригодных для предотвращения взаимодействия между двумя белками. Кроме того, подходящие молекулы также могут быть спроектированы с помощью молекулярного моделирования. Такие способы, например, подробно описаны в разделе примеров. В конкретном аспекте, настоящее изобретение относится к модели структурной гомологии ALMS1 и ее применению в качестве in silico способа для идентификации молекул, способных ингибировать или стимулировать функцию ALMSoMbi, в частности, для ингибирования взаимодействия между ALMS1 и аРКС и/или для увеличения взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Оно также относится к модели структурной гомологии TBC1D4 и ее использования в способе in silico для идентификации молекул, способных ингибировать или стимулировать функцию ALMSoMbi, в частности, увеличивать взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Настоящее изобретение также относится к способу идентификации, скрининга или отбора молекулы, способной положительно регулировать ALMS1 на уровне генов и белков. Способ включает определение влияния молекулы(л) на экспрессию ALMS1, и отбор молекулы(л), если экспрессия ALMS1 увеличивается. Для того чтобы определить влияние молекулы на экспрессию ALMS1, может быть осуществлена любая технология, известная специалисту в данной области. Различные методы, известные в данной области, могут быть использованы для обнаружения или количественного определения экспрессии ALMS1, включая секвенирование, гибридизацию, амплификацию и/или связывание со специфическими лигандами (например, антителами). Подходящие способы включают саузерн-блоттинг (для ДНК), блоттинг (для РНК), флуоресцентную гибридизацию in situ (FISH), миграцию в геле, ELISA, радиоиммунологические анализы (RIA) и иммуно-ферментативные анализы (IEMA). "Увеличенный", "увеличение" или "усиление" предназначены обозначения связывания, увеличенного, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению со связыванием, измеренным в отсутствие тестируемой молекулы в тех же самых условиях. "Сниженный" или "снижение" предназначен для обозначения к снижения связывания, по меньшей мере, на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90% по сравнению со связыванием, измеренным в отсутствие тестируемой молекулы в тех же условиях. Кроме того, способы скрининга по настоящему изобретению могут включать анализ моделей на животных. Тестируемые молекулы могут быть введены в модели на животных, и может быть оценено влияние молекул на поглощение глюкозы или диабета. Например, модели на животных могут быть мышами или крысами с резистентностью к инсулину, сахарным диабетом или гипергликемией. Влияние молекулы может быть оценено путем измерения уровня глюкозы в крови. Молекулы Молекулы, способные предотвращать или блокировать связывание аРКС с ALMS1, могут быть любыми лигандами, способными связывать либо аРКС, либо ALMS1 и, таким образом, предотвращать или блокировать связывание аРКС с ALMS 1. В первом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая предотвращает или блокирует связывание аРКС с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков ALMS1, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. В ином аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая предотвращает или блокирует связывание аРКС с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков аРКС, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. Молекулами, способными усиливать или увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1 могут быть любые лиганды, способные связываться либо TBC1D4, либо ALMS1 и, тем самым повышать или увеличивать связывание TBC1D4 с ALMS1. В первом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая усиливает или увеличивает связывание TBC1D4 с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков ALMS1, выбранных из перечня, состоящего из Н65, L66 и S2879. В ином аспекте настоящее изобретение относится к молекуле, которая усиливает или увеличивает связывание TBC1D4 с ALMS1 путем взаимодействия с одним или несколькими из остатков TBC1D4, выбранных из перечня, состоящего из G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82HI83. Настоящее изобретение относится к таким молекулам, фармацевтической композиции, содержащей такие молекулы, и применению таких молекул в качестве лекарственного средства или для изготовления лекарственного средства. Эти молекулы могут быть пептидами или полипептидами или миметиками пептидов, антителами, фрагментами или их производными, аптамерами, шпигельмерами или химическими соединениями. Эти молекулы могут быть выбраны с помощью способов скрининга, известных в данной области или как описано выше, и могут быть спроектированы любым удобным in silico способом моделирования. В предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид. В предпочтительном воплощении пептид может иметь от 5 до 50 аминокислот. Более предпочтительно, она имеет от 5 до 20 аминокислот. Более предпочтительно, пептид или полипептид содержит менее чем 50 аминокислот, более предпочтительно, менее чем 40, 30, 20, 15 или 10 аминокислот. В первом аспекте, молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ ID NO: 1). В предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС. В частности, эти остатки выбирают из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. Более предпочтительно если эти остатки выбирают из перечня, состоящего из D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, TI088, DI089, AII69, QII70, F2882, L2883 и Е2884. D58, S59, G62, Н65 и L66 образуют первый сегмент взаимодействия. Т737 и Е738 определяют второй сегмент взаимодействия. D828 и S829 определяют третий сегмент взаимодействия. Т1088 и D1089 определяют четвертый сегмент взаимодействия. А1169 и Q1170 определяют пятый сегмент взаимодействия. F2882, L2883 и Е2884 определяют шестой сегмент взаимодействия. В очень конкретном аспекте, пептид или полипептид содержит или состоит из одной из следующих последовательностей: - LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5), нацеленной на первый сегмент взаимодействия; - DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6), нацеленной на второй сегмент взаимодействия; - QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7); - QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8), нацеленной на третий сегмент взаимодействия; - PADQMTDTP (SEQ ID NO:: 9), ориентированных на четвертый сегмент взаимодействия; - HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10), ориентированных на пятый сегмент взаимодействия; - SCIFLEQ (SEQ ID N 11), ориентированных на шестой сегмент взаимодействия, - их фрагмент, содержащий 6 смежных аминокислот. Во втором аспекте, молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ ID NO: 4). В предпочтительном воплощении молекула представляет собой пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС в том числе один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1. В частности, эти остатки выбраны из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. F114, D116, С118 и L121 могут определить первый сегмент взаимодействия. N138, Q142, 1145 и Р148 могут определить второй сегмент взаимодействия. Е545, S562 и S566 могут определить третий сегмент взаимодействия. F597, D601, W602, К604 и Е606 определяют четвертый сегмент взаимодействия. V664 и 1667 могут определить пятый сегмент взаимодействия. Необязательно, пептид или полипептид может включать один, два, три, четыре или пять аминокислотных замен по сравнению с эталонной последовательностью, то есть последовательностью SEQ ID NO:: 1 для пептидов, полученных из ALMS1, SEQ Ш N0: 4 для пептидов, полученных из аРКС, и SEQ ID N0:: 2 или 3 для пептидов, полученных из TBCID4. Пептид или полипептид может дополнительно содержать часть, облегчающую его поглощение клеткой или вход в клетку, в частности, PTD (домен белковой трансдукции). PTD обычно содержит определенную последовательность из 10-20 аминокислот (Matsushita and Matsui, (2005), J Mol Med 83, 324-328; Vives et al, Biochimic et Biophysica Acta, 2008, 1786, 126-138). PTD в основном состоит из основных аминокислот, таких как аргинин или лизин, и типичные примеры PTD включают аргинин-богатые пептиды, такие как полиЯ8 (RRRRRRRR) или (RRPRRPRRPRRPRRP), пептид антеннапедия или пенетратин, такой как (RQIKIWFQNRRMKWKK) или HIV-Tat (YGRKKRRQRRR). В конкретном аспекте, молекула представляет собой антитело, фрагмент или его производное. Пептид или полипептид может содержать природные аминокислоты и/или неприродные аминокислот. "Неприродные аминокислоты" предназначены для обозначения аналога или производного природной аминокислоты (то есть, Ala, Val, Gly, Leu, He, Lys, Arg, Glu, Gin, Asp, Asn, His, Tyr, Phe, Trp, Ser, Pro, Thr, Cys, Met). Они имеют модифицированную боковую цепь, например, более короткую, длинную или с другими функциональными группами. Рассматриваются изомеры D и L, в частности, потому, что изомеры D не чувствительны к действию протеаз. Кроме того, модификации некоторых или всех пептидных связей, также рассматриваются для увеличения сопротивлению протеолиза, в частности, с помощью (-CO-NH-) с помощью (-CH2-NH-), (-NH-CO-), (-СН2-0-), (-CH2-S-), (-СН2-СН2-), (-СО-СН2-), (-СНОН-СН2-), (-N=N-), и/или (-СН=СН-). Пептид может представлять карбоксильный С-конец (-СОО") и амидный конец (-CONH2). Пептид также может быть последовательностью D-ретро-инверсо пептида, описанного в данном документе. N-конец может быть изменен, в частности ацетильным радикалом. Необязательно, пептид или полипептид может быть пегилированным для повышения стабильности. В качестве альтернативы, этот пептид может быть модифицирован для того, чтобы сделать из него сшитый пептид. Термин "сшитый пептид", используемый в данном описании, относится к искусственно модифицированному пептиду, в котором структура стабилизирована одним или несколькими искусственными молекулярными мостиками (перекрестные связи), которые соединяют прилегающие витки альфа-спиралей в пептиде. Методики получения сшитых пептидов, были широко рассмотрены, например, в Verdine & Hilinski (2012, Methods Enzymol, 503, 3-33), WO10033617 и WO10011313, описание которых включено в данный документ в виде ссылки). Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей пептид, определенный выше, и фармацевтически приемлемый носитель/эксципиент. Оно также относится к пептиду, определенному выше, для применения в качестве лекарственного средства или к применению пептида, определенному выше, для изготовления лекарственного средства. В ином воплощении молекула представляет собой антитело, его фрагмент, или его производное. Используемый в данном описании термин "антитело" и "иммуноглобулин" имеют одинаковое значение и используются одинаково в настоящем изобретении. Термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулина, то есть молекулам, которые содержат антиген-связывающий сайт, который иммуноспецифически связывается с антигеном. Антитела включают любые антитела, предпочтительно, моноклональные. Они могут быть, например, IgG (иммуноглобулин G) или VHH (вариабельный домен тяжелой цепи антитела из верблюдовых). Антитела, их фрагменты или производные включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')2, ScFv, (ScFv)2, Dab, фрагменты гипервариабельных участков (CDR), линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител, минитела, димеры, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела, фрагменты или производные могут блокировать взаимодействие между ALMS1 и аРКС. Предпочтительно, если они не оказывают никакого влияния на взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4 или оказывают влияние, усиливающее взаимодействие. В первом воплощении изобретения антитело является специфическим к ALMS1. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из остатков ALMS1, вовлеченных во взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. В ином случае, антитело является специфическим для аРКС. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из числа остатков аРКС, участвующих во взаимодействии с ALMS1, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142,1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. Такие антитела могут быть получены иммунизацией млекопитающих, не являющихся человеком, иммуногенными пептидами или белками, содержащими один или несколько остатков, определенных в качестве участвующих во взаимодействии между ALMS1 и аРКС. В качестве альтернативы, может быть получена и подвергнута скринингу библиотека антител. Полученные антитела, фрагменты или производные затем подвергают скринингу на предмет их способности связывать один из взаимодействующих партнеров и/или их способности предотвращать, ингибировать или блокировать взаимодействие между ALMS1 и аРКС. Кроме того, как ранее указано, антитела, фрагменты или производные могут быть дополнительно подвергнуты скринингу на их способность модулировать взаимодействие между TBC1D4 и ALMS1, и отобраны, если они увеличивают или усиливают взаимодействие. Антитела, фрагменты или производные могут усилить взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Предпочтительно, они оказывают блокирующее влияние на взаимодействие между ALMS1 и аРКС. В первом воплощении изобретения антитело является специфическим к ALMS1. В частности, эпитоп антитела включает один или несколько из остатков ALMS1, участвующих во взаимодействии с TBC1D4, в частности, один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из Н65, L66 и S2879. В ином случае, антитело является специфическим к TBC1D4. В частности, эпитоп антитела содержит один или несколько из остатков TBC1D4, вовлеченных во взаимодействие с ALMS1, в частности один или несколько остатков, выбранных из перечня, состоящего из G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82 и 183. Такие антитела могут быть получены иммунизацией млекопитающих, отличных от человека, иммуногенными пептидами или белками, содержащими один или несколько остатков, определенных в качестве участвующих во взаимодействии между ALMS1 и TBC1D4. В качестве альтернативы, может быть представлена и подвергнута скринингу библиотека антител. Полученные антитела, фрагменты или производные затем подвергают скринингу на предмет их способности связывать один из взаимодействующих партнеров и/или их способности усиливать или увеличивать взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4. Кроме того, как ранее указано, антитела, фрагменты или производные могут быть дополнительно подвергнуты скринингу на их способность модулировать взаимодействие между аРКС и ALMS1, и отобраны, если они уменьшают или блокируют взаимодействие. Получение моноклональных или поликлональных антител хорошо известно в данной области, и любые из множества доступных методов могут быть использованы (см, например, Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp. 77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Методы получения одноцепочечных антител (патент США No. 4946778), могут быть адаптированы для получения антител к искомым полипептидам. Кроме того, трансгенные мыши или другие организмы, такие как другие млекопитающие, могут быть использованы для экспрессии гуманизированных, химерных, или аналогичным образом модифицированных антител. В качестве альтернативы, может быть использована технология фагового дисплея для идентификации антител и гетеромерных фрагментов Fab, специфически связывающихся с выбранными антигенами (см, например, McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)). Для аптамеров и шпигельмеров, подобные способы могут быть использованы для отбора аптамеров и шпигельмеров. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области. Используемый в данном документе термин "аптамеры" означает молекулу нуклеиновой кислоты или пептид, способные связывать ALMS1, аРКС или TBC1D4. Она относится к классу молекул, который представляет собой альтернативу антител в области молекулярного распознавания. Аптамеры являются олигонуклеотидными или олигопептидными последовательностями, обладающими способностью распознавать практически любой класс молекул-мишеней с высоким сродством и специфичностью. Такие лиганды могут быть выделены с помощью Систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) из библиотеки случайных последовательностей, как описано в Tuerk С. and Gold L., Science, 1990, 249(4968):505-10. Библиотека случайных последовательностей может быть получена путем комбинаторного химического синтеза ДНК. В этой библиотеке каждый элемент представляет собой линейный олигомер, в конечном счете, химически модифицированный, с уникальной последовательностью. Возможные модификации, применения и преимущества этого класса молекул были рассмотрены в Jayasena S.D., Clin. Chem., 1999, 45(9): 1628-50. Пептидные аптамеры состоят из вариабельной области антитела с зафиксированной конформацией, экспонируемой белковой платформой, такой как тиоредоксин A E.coli, которые выбраны из комбинаторных библиотек, дигибридными способами (Colas et al., Nature, 1996,380, 548-50). Шпигельмеры были описаны, например, в публикации WO 98/08856. Они представляют собой молекулы, подобные аптамерам. Однако шпигельмеры состоят полностью или в основном из L-нуклеотидов, а не D-нуклеотидов в отличие от аптамеров. В других отношениях, в частности, в отношении возможных длин шпигельмеров, к шпигельмерам относится то же, что и описанное для аптамеров. Химические соединения относятся к молекулам менее чем около 1500 дальтон, 1000 дальтон, 800 дальтон, или даже менее чем около 500 дальтон, в частности к органическим или неорганическим соединениям. Структурный дизайн в области химии должен помочь найти такую молекулу. Молекула может быть идентифицирована с помощью способа скрининга, описанного в настоящем изобретении. Синтетические библиотеки соединений коммерчески доступны от ряда компаний, в том числе Maybridge Chemical Со. (Тревиллет, Корнуэл, Великобритания), Comgenex (Принстон, Нью-Джерси), Brandon Associates (Мерримак,Нью-Гемпшир), и Microsource (Нью-Милфорд, Коннектикут). Комбинаторные библиотеки доступны или могут быть получены в соответствии с известными методами синтеза. В ином случае библиотеки природных соединений в виде экстрактов бактерий, грибов, растений и животных можно приобрести, например, у Pan Laboratories (Ботелл, Вашингтон) и MycoSearch (Северная Каролина), можно либо легко получить способами, хорошо известными в данной области. Кроме того, природные и синтетически произведенные библиотеки и соединения могут быть дополнительно модифицированы с помощью обычных химических и биохимических методов. Молекула может быть ковалентно или нековалентно связана с группой, нацеленной на соответствующие ткани, предпочтительно на жировую ткань, или с группой, облегчающей проникновение молекулы в клетки. Терапевтические показания Авторы предлагают использовать молекулы, описанные в данном документе, для увеличения поглощения глюкозы, в частности, адипоцитами, посредством чего будет осуществляться регуляция и контроль уровень глюкозы в крови. В этом случае молекулы пригодны для лечения или замедления прогрессирования, или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулин}', диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Сахарный диабет характеризуется гипергликемией. Более конкретно, диабет 2 типа характеризуется гипергликемией и резистентностью к инсулину. Ожирение считается главной причиной диабета 2 типа у людей, которые генетически предрасположены к этому заболеванию. Диабетическая ретинопатия, диабетическая невропатия, диабетическая нефропатия хорошо известные расстройства, связанные с диабетом и резистентностью к инсулину. В этом случае уменьшением гликемии за счет увеличения потребления глюкозы может лечить или замедлять прогресс или предотвращать возникновение этих заболеваний. Настоящее изобретение относится также к молекулам по настоящему изобретению для применения для снижения дозы инсулина или прекращения приема инсулина, при использовании для лечения диабета у объекта, для применения молекул по настоящему изобретению для получения лекарственного средства для снижения дозы инсулина или прекращения приема инсулина, при использовании для лечения диабета у объекта, или к способу лечения диабета у объекта, в котором терапевтически эффективное количество молекулы по изобретению вводят объекту с пониженной дозой инсулина или в отсутствии приема инсулина. В более общем смысле, его можно применять для снижения дозы антидиабетических препаратов. "Лечить" или "лечение" подразумевают, что болезнь подвергается лечению, облегчению или замедлению. Это включает профилактическое или радикальное лечение. Термин лечение означает, в частности, коррекцию, задержку, или восстановление нарушенного гомеостаза глюкозы. Термин "лечение" также означает улучшение усвоения глюкозы (например, захват глюкозы адипоцитами). В контексте настоящего изобретения, термины "контроль за уровнем глюкозы в крови" или "контроль уровня глюкозы в крови", относятся к нормализации или регуляции уровня глюкозы в крови или плазме у объекта-млекопитающего, имеющего аномальные уровни (например, уровни которые находятся ниже или выше известного эталона, медианы, или среднего значения для соответствующего объекта-млекопитающего с нормальным гомеостазом глюкозы). Настоящее изобретение относится к фармацевтическому или ветеринарному применению молекулы. Соответственно, объект может быть любым млекопитающим, предпочтительно, человеком, например, взрослым или ребенком. В конкретном воплощении объектом является объект, страдающий от ожирения. Необязательно, объект не имеет выявляемых антиостровковых антител, и ультразвуковое исследование не выявляет у него панкреатических нарушений. В контексте ветеринарного применения, объект может быть животным, предпочтительно, млекопитающим, в частности домашним животным, например, собакой, кошкой или лошадью. Молекулы в соответствии с изобретением могут быть использованы в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными препаратами, предпочтительно, антидиабетическими лекарственными средствами, в частности, для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Таким образом, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей молекулу по настоящему изобретению, а также одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетическое лекарственное средство. Оно также относится к продукту или набору, содержащему молекулу по изобретению, и одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетических лекарственных средств, в виде комбинированного препарата для одновременного, раздельного или последовательного применения, или в виде комбинированного препарата, который содержит молекулу согласно по настоящему изобретению и одно или несколько дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетических препаратов, для одновременного, раздельного или последовательного применения, в частности, для лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Оно относится к молекуле по настоящему изобретению для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии в комбинации с одним или несколькими дополнительными активными лекарственными средствами, предпочтительно антидиабетическими лекарственными средствами. Оно также относится к применению молекулы по изобретению и одного или нескольких дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно, антидиабетические лекарственных средств, для получения лекарственного средства, в частности, для лечения или задержки прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулин}', диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. И, наконец, настоящее изобретение относится к способу лечения или замедления прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, в котором терапевтически эффективное количество молекулы по настоящему изобретению вводят в комбинации с терапевтическим или субтерапевтическим эффективным количеством одного или нескольких дополнительных активных лекарственных средств, предпочтительно антидиабетических лекарственных средств. "Субтерапевтический" предназначен для обозначения количества, которое может составлять, например, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 или 10% от обычной терапевтической дозы (в частности, для тех же показаний и для тех же путей введения). В частности, дополнительное активное лекарственное средство представляет собой лекарственное средство, используемое для лечения или замедления прогрессирования, или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. Например, дополнительное лекарственное средство может быть антидиабетическим лекарственным средством, таким как гипогликемическое средство или антигипергликемический агент. Оно может быть выбрано из неисчерпывающего перечня, включающего инсулин, метформин, сульфонилмочевины, такие как толбутамид, ацетогексамид, толазамид, хлорпропамид, глибенкламид (также называемый глибенкламид), глимепирид, глипизид, гликлазид, гликопирамид и глихидон, ингибиторы альфа-глюкозидазы, такие как акарбоза, миглитол и воглибоза, тиазолидиндионы, такие как пиоглитазон и розиглитазон, меглитинид, такой, как репаглинид и натеглинид, инкретиновый миметики, аналоги и агонисты глюкагон-подобного пептида, такие как эксенатид, таспоглютид и лираглютид, ингибиторы дипептидилпептидазы-4, такие как вилдаглиптин, ситаглиптин, саксаглиптин, линаглиптин, аллоглиптин и септаглиптин, аналоги амилина, такие как памлинтид, ингибиторы SGLT2, такие как канаглифлозин и дапаглифлозин, или любой их комбинации. Форма фармацевтических композиций, способ введения, дозировка и режим, естественно, зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, возраста, массы и пола пациента и т.д. Фармацевтические или терапевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для местного, перорального, парентерального, интраназального, внутривенного, внутримышечного, подкожного или внутриглазного введения и т.д. Молекула, используемая в фармацевтической композиции по настоящему изобретению, присутствует в терапевтически эффективном количестве. Термин "терапевтически эффективное количество", используемое в настоящей заявке, означает то количество терапевтического средства, вводимого пациенту, которого достаточно для лечения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения, гиперинсулинемии, как это определено выше. Фармацевтическая композиция, содержащая молекулу, формулируется в соответствии со стандартной фармацевтической практикой (Lippincott Williams & Wilkins, 2000 and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 19881999, Marcel Dekker, New York), известной специалисту в данной области. Для перорального введения композиция может быть приготовлена в виде обычных пероральных лекарственных форм, таких как таблетки, капсулы, порошки, гранулы и жидкие препараты, такие как сиропы, эликсиры и концентрированные капли. Могут быть использованы нетоксичные твердые носители или разбавители, которые включают, например, фармацевтические сорта маннита, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу, карбонат магния, и тому подобное. Для прессованных таблеток, связующие вещества, которые представляют собой агенты, придающие когезионные свойства порошковым материалам, также необходимы. Так, например, крахмал, желатин, сахара, такие как лактоза или декстроза, и природные или синтетические смолы могут быть использованы в качестве связующих веществ. Разрыхлители также необходимы в таблетках для облегчения разламывания таблетки. Разрыхлители включают крахмалы, глины, целлюлозы, альгины, камеди и поперечно-сшитые полимеры. Кроме того, смазочные материалы и вещества, способствующие скольжению, также включают в таблетки для того, чтобы предотвратить прилипание таблеточного материала к поверхности в процессе производства и для улучшения характеристик текучести порошкового материала в процессе производства. Коллоидный диоксид кремния, наиболее часто используется в качестве вещества, способствующего скольжению, а соединения, такие как тальк или стеариновая кислота наиболее часто используются в качестве смазочных материалов. Для чрескожного введения, композиция может быть приготовлена в виде мази, крема или гелевой формы и соответствующие проникающие вещества или детергенты могут быть использованы для облегчения проникновения, например, диметилсульфоксид, диметилацетамид и диметилформамид. Для введения через слизистую могут быть использованы назальные спреи, ректальные или вагинальные суппозитории. Активное соединение может быть включено в любую из известных основ для суппозиториев, способами, известными в данной области. Примеры таких основ включают масло какао, полиэтиленгликоль (карбовоски), полиэтилен сорбитан моностеарат, а также их смеси с другими совместимыми материалами для модификации температуры плавления или скорости растворения. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены для высвобождения активного лекарственного средства по существу немедленно после введения или в любое заранее определенное время или период времени после введения. Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут содержать одну или несколько молекул по настоящему изобретению, связанных с фармацевтически приемлемыми наполнителями и/или носителями. Эти вспомогательные вещества и/или носители выбираются в соответствии с формой введения, как описано выше. В конкретном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит от 0,001 мг до 10 г молекулы по изобретению. В предпочтительном воплощении фармацевтическая композиция по настоящему изобретению содержит от 0,01 мг до 1 г молекулы по изобретению. Краткое описание чертежей Фигура 1. Метаболические характеристики мышей Almsfoz/foz (А) Средняя масса тела самцов мышей дикого типа и Almsf°z/f°z (п= 6-8 мышей на генотип). (В) Фотография висцеральной жировой ткани у дикого типа и Almsfoz/foz. Масштабная метка: 25 мкм. (С) Тест на толерантность к инсулину (ITT) проводили на мышах дикого типа и Almdoz/foz мышах и соответствующая гистограмма, демонстрирует площадь под кривой (AUC) для каждого генотипа (п= 6-8 мышей на группу), р <0,001). (D) Средняя масса тела самцов мышей дикого типа и Almsf°z/f°z (п= 6-8 мышей на генотип). (E) Фотография висцеральной жировой ткани из соответствующих мышей дикого типа и Almsfoz/foz-. Масштабная метка: 25 мкм. (F), тест на толерантность к инсулину выполняли на мышах дикого типа и Almsiozlioz-Mbimsx. и соответствующая гистограмма демонстрирует AUC для каждого генотипа (п= 6-8 мышей на группу). *** Означает р-значение <0,001. (G) Иммуноблоты для указанных белков в инсулинчувствительных тканях из нестрадающих ожирением мышеи дикого типа и AlmsSozJSoz. (Н) Подсчет радиоактивных (D) сигналов в различных целевых тканях после инъекции радиоактивной дезоксиглюкозы мышам дикого типа и мышам Alm^oz№oz (п = 5 мышей на генотип). * означает р-значение = 0,05. Фигура 2. Сайленс-эффект ALMS1 в зрелых адипоцитах человека (А) Фотографии, демонстрирующие отсутствие поглощения 2-NBDG (зеленый) в контрольных (shCTRL кшРНК) или лишенных ALMS1 адипоцитах (ALMS1 кшРНК) подвергнутых сайленсингу зрелых адипоцитах в отсутствии INS. (В) Фотографии, демонстрирующие отсутствие поглощения 2-NBDG в ALMS1 кшРНК по сравнению с CTRLKIIIPHK. Ядра окрашены с помощью DAPI, DIC: изображения дифференциального интерференционного контраста. (С) ЗБ-изображения CTRLKIIIPHK- ИЛИ ALMSIKIIIPHK-зрелых адипоцитов окрашенных по внутриклеточным триглицеридам (TG), плазматической мембране-красный (РМ) и ядрам-синий (DAPI). (D) Измерения уровней флуоресценции, коррелирующих с количеством внутриклеточных Tg в зрелых адипоцитах (п= 16 лунок на каждое измеренное условие) * р-значение = 0,05. (E-F) Иммунодетекция АКТ и pS473-AKT в CTRLKIIIPHK- И ALMSlKiiiPHK-обработанных зрелых адипоцитах в присутствие и отсутствие INS. (G) ЗБ-изображения CTRLKIIIPHK- И ALMSIKIIIPHK-зрелых адипоцитов, демонстрирующие клеточную локализацию рецептора инсулина (IR-красный) и GLUT4 (зеленый) в отсутствие Ins. Изображения в сечении, отображающие динамику локализации GLUT4 в отсутствие Ins. (Н), через 30 мин. стимуляции INS. (I), и с 30 мин. стимуляцией INS. с последующим 2-х часовым отсутствием INS. (J) в CTRLKIIIPHK- И ALMS 1кшРНК-зрелых адипоцитах. Масштабная метка: 25 мкм в А, В, С и 5 мкм в GJ. Фигура 3. Прогнозируемые участки взаимодействия на белке ALMS1 и моделирование его партнера TBC1D4. (А) Спрогнозированная ЗБ-структура белка ALMS1 со спиралями и петлями. (В) Спрогнозированная ЗБ-структура белка ALMS1 с потенциальными участками взаимодействия, представленными красными точками. (С) Первичная последовательность белка TBC1D4 с указанной локализации участков связывания или взаимодействующих доменов. (D) Спрогнозированная 3D структура белка TBC1D4. Фигура 4. ALMS1 требуется для клеточной направленной миграции TBC1D4 (A) In silico спрогнозированная ЗБ-структура, показывающая пространственное взаимодействие между ALMS1 и TBC1D4 с увеличенным видом участка взаимодействия, в котором выделены спрогнозированные взаимодействующие аминокислотные остатки (L66, Y61 и S2879) белка ALMS1. (В) ЗБ-изображение иммуноокрашиванных зрелых адипоцитов, отображающее колокализацию TBC1D4 (зеленый) и ALMS1 (красный). Ядра докрашены с помощью DAPI (синий). (CD) Иммуноблоты указанных белков на клеточных лизатах (50 мкг общего количества белка загружали на одну дорожку) для CTRLKIIIPHK- И ALMS 1 кшРНК-зрелых адипоцитов, обработанных или не обработанных инсулином. ЗО-изображения иммунофлюоресцентных экспериментов, выполненных либо на CTRLKIIIPHK-, либо на ALMSIKIIIPHK-, либо на ТВСШ4кшРНК-зрелых адипоцитах, отображающие клеточную локализацию GLUT4 в отсутствие инсулина (-INS) (Е) или в присутствие INS. (F). РМ: плазматическая мембрана, ядра докрашены с помощью DAPI. ЗО-изображения иммунофлюоресцентных экспериментов, выполненных либо на CTRLKIIIPHK-, либо на ALMSlKiiiPHK-адипоцитах, демонстрирующие клеточную локализацию GLUT4 (зеленый) и TBC1D4 в отсутствии INS(G) или через 30 мин. после обработки INS. (Н). Масштабные метки: 10 мкм. Фигура 5. TBC1D4 не является единственным взаимодействующим партнером ALMS1, играющим роль в биологии адипоцитов (А-С) Фотографии, демонстрирующие поглощение 2-NBDG в либо CTRLKIIIPHK-, либо ALMSIKIIIPHK-, либо ТВСШ4кшРНК-депривированными адипоцитами после 30 мин. стимуляции INS. (D-F) ЗО-изображения, полученные с использованием непермеабилизованных зрелых адипицитов, стимулированных INS. с последующей иммунодетекцией мембраносвязванного GLUT4 (зеленый). Плазматическая мембрана (РМ) была окрашена с помощью Image-iT (красный), а ядра были докрашены с помощью DAPI. (G) Иммуноблоты 2 субъединиц протонного насоса (ATP6V0D1 и ATP6V1A), идентифицированных с помощью масс-спектрометрии в IP-экспериментах с использованием ALMS1 в качестве приманки (Фиг. S4), аРКС, GLUT4 и бета-тубулин в клеточных экстрактах из белой жировой ткани (WAT) и почек, 50 мкг общего белка загружено на одну дорожку. (Н) Фотография положительного сигнала Duolink, обнаруженного в адипоцитах с использованием антител против ALMS1 и АТР6. (I) Иммунофлуоресцентные изображения, демонстрирующие клеточные локализации ATP6V0D1 и ALMS1 и объединенное изображение в зрелых адипоцитах при стимуляции INS. (J) In silico спрогнозированные участки связывания TBC1D4 (красный) и РКС (желтый), которые находятся всего в 20 ангстрем друг от друга в ЗО-структуре ALMS1. (K-L) Иммунодетекция аРКС, TBC1D4 и альфа-актинина в иммунопреципитатах с использованием ALMS1 в качестве приманки в адипоцитах, культивируемых в отсутствие или в присутствие INS. Фигура 6. Восстановление ацидификации в ALMSl-депривированных адипоцитах восстанавливает всасывание глюкозы (А-В) Изображения серийной съемки с интервалом были выполнены либо на контрольных, либо на ALMSl-депривированных адпипоцитах, окрашенных акридиновым оранжевым и стимулированных INS. (C-D) Изображения серийной съемки с интервалом были выполнены либо на контрольных, либо на ALMSl-депривированных адпипоцитах, окрашенных акридиновым оранжевым и стимулированных электронейтральным ионофором-обменником К+/Н+, нигерицином (NIG.).(E) Сверху вниз: Изображения контрольных адипоцитов, полученные сканирующей электронной микроскопией (SEM), стимулированных либо без INS, либо с INS. либо с NIG. Белые стрелки показывают разбухшие везикулы. (F), Изображения, полученные просвечивающей электронной микроскопией (ТЕМ), соответствующие представленным в (Е), демонстрируют слияние везикул с плазматической мембраной в присутствие INS. и NIG. (G) Сверху вниз: SEM фотографии ALMS 1-депривирвоанных адипоцитов, стимулированных либо без INS, либо с INS. либо с NIG. (Н) Изображения ТЕМ, соответствующие представленным в (G), демонстрирующие слияние везикул с плазматической мембраной только в присутствии NIG. (I) Фотографии, демонстрирующие внутриклеточное содержание 2-NBDG (зеленый) в контрольных зрелых адипоцитах либо в отсутствии INS. (верхняя панель) либо после 30 минутстимуляции INS. (средняя панель) либо после 30 мин. стимуляции NIG. (нижняя панель). (J) Фотографии, демонстрирующие внутриклеточное содержание 2-NBDG (зеленый) в ALMSl-депривированных зрелых адипоцитах либо в отсутствии INS. (верхняя панель) либо после 30 минут стимуляции INS. (средняя панель) либо после 30 мин. стимуляции NIG. (нижняя панель). Масштабная метка: 20мкм за исключением F и Н: 500 нм. Фигура 7. Направленная миграция GLUT4 требует белковый комплекс ALMSoMbi (А) ЗО-изображения, полученные с использованием непермеабилизованных фиксированных зрелых адипоцитов, стимулированных NIG. с последующей иммунодетекцией мембраносвязанного GLUT4 (зеленый). Плазматическая мембрана (РМ) была окрашена Image-It (красный), а ядра были докрашены с помощью DAPI. (В) Фотографии, демонстрирующие содержание внутриклеточных TG через 24 часа после обработки NIG. (С) Схематическое представление клеточной локализации ALMS1 и белка-партнера в отсутствие стимуляции INS. в зрелом адипоците. (D) Схематическое представление динамики ALMS1 и белковых партнеров послестимуляции INS. в зрелом адипоците. Фигура 8. Поглощение глюкозы инициируется в отсутствие INS посредством специфической интерференции с участком связывания аРКС в ALMSoMe (А) Фотографии, демонстрирующие поглощение 2-NBDG в присутствие или в отсутствие INS в адипоцитах, инфицированных либо лентивирусными частицами CTRL, либо лентивирусными частицами с доменом аРКС. (В) Количественное определение внутриклеточного аналога глюкозы 2-NB в присутствие либо лентивирусных частиц CTRL, либо лентивирусных частиц с доменом аРКС (п= 8 на группу). Фигура 9. Описание конструкции min-aPKC-FLAG в адипоцитах Верхняя панель: Иммунодетекция min-aPKC-FLAG с использованием анти-FLAG антитела в зрелых адипоцитах через 48 часов после инфекции лентивирусом. 2-я и 3-я панели: ЗО-изображение адипоцитов, демонстрирующее перинуклеарную локализацию min-aPKC-FLAG. Последняя панель: Схематическое представление экспериментальных подходов, используемых для оценки влияния min-aPKC-FLAG на поглощение глюкозы. ПРИМЕРЫ Синдром Альстрёма (ALMS) является редким аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся несколькими клиническими признаками, включающими ожирение и раннее возникновение диабета. Это происходит из-за мутации в гене, кодирующем 460 кДа белок ALMS 1. До сих пор была неизвестны функция гена ALMS1 и то, как он вызывает фенотип синдрома Альстрёма, исследования его функции тормозит чрезвычайно большой размер кодируемого белка и его низкие уровни экспрессии. Синдром Альстрёма (ALMS) является редким моногенным синдром детского ожирения, для которого существует только один причинный мутантный ген, идентифицированный к настоящему времени, ген ALMSL ALMS классифицируется как представитель расстройств цилиопатии, которые включают синдром Барде-Бидля, группу синдромных расстройств, возникающих из-за мутаций в большом количестве различных белков, которые вместе играют важную роль в функции первичной реснички. Almsl кодирует 461 кДа белок ALMS 1, который первоначально был описан как имеющий чисто центриолярную локализацию, хотя более поздние данные также предположили цитоплазматическую локализацию ALMS 1. ALMS клинически отождествлен с совокупным мультисистемным фенотипом, который как предполагается, отражает убиквитарную тканевую экспрессию ALMS1, близко имитируя многие из фенотипических особенностей BBS. Общие клинические признаки ALMS включают дегенерацию сетчатки, потерю слуха, детское ожирение, раннее начало сахарного диабета 2 типа (T2DM), дилатационную кардиомиопатию, почечную и печеночную дисфункцию, гипотиреоз, низкорослость, гиперлипидемию и органный фиброз. У детей с ALMS развивается ожирение в раннем детстве, что связано с ранним возникновением T2DM примерно в 16 лет, с гораздо более высокой общей распространенностью раннего возникновения T2DM при ALMS, чем наблюдаемые с другими синдромами детского ожирения, дающими похожий индекс массы тела (ИМТ) в том числе BBS. Причина этого склонности к T2DM у детей с ALMS, которая не пропорциональна их степени ожирения, остается неясной. Авторы настоящего изобретения исследовали роль белка ALMS1 в адипогенном процессе дифференцировки и обнаружили, что уровни экспрессии белка ALMS1 растут в ходе адипогенеза. Супрессия ALMS1 в адипогенных дифференцирующихся мезенхимальных стволовых клетках ингибирует анти-адипогенные каскады, но, на удивление, не в пользу адипогенеза. Кроме того, авторы показали, что белковый комплекс ALMS1 также необходим в зрелых адипоцитах для эффективного удержания GLUT4 в его инсулин-респонсивном компартменте и для его способности сливаться с плазматической мембраной в ответ на стимуляцию инсулином. Инактивация ALMS1 уменьшает количество глюкозы, которое способны поглотить зрелые адипоциты при стимуляции инсулином, способствуя таким образом гипергликемии и возникновению диабета. Предыдущие исследования на спонтанном мутанте AlmsPoz/foz и нокаутной по Almsl мышиной модели ALMS, полученной введением вставки внутрь гена, подтвердили, что у этих мышей, подобно страдающим от болезни детям, развивается ожирение в раннем подростковом возрасте из-за гиперфагии, а также проявляют нарушенная толерантность к глюкозе, гиперинсулинемия и островковая гипертрофия, что соответствует тяжелой резистентности к инсулину, хотя происхождение ткани или механизм для этой резистентности к инсулину ранее не были охарактеризованы. Ранее опубликованные in vitro исследования на мышиной фибробластной линии клеток 3T3-L1 показали, что ингибирование экспрессии гена ALMS1 приводит к умеренному нарушению адипогенеза, но сообщалось, что не оказывается никакого влияния на инсулиновый сигнальный путь в полученных зрелых адипоцитах, что было измерено по инсулин-опосредованному фосфорилированию АКТ. Эти данные уводят в сторону от изобретения, представленного в данном документе, в котором Alms 1 действительно играет критическую, неизвестную до настоящего времени роль в сигнальном пути инсулина и в ОШТ4-опосредованном транспорте глюкозы. Действительно, несмотря на ранее опубликованных противоречащие данные, авторы при тщательном изучении фенотипа мышиной модели ALMS Fat Aussie (Almslf°z/f°z) определили, что резистентность к инсулину в этой модели предшествует, а не следует за развитием ожирения. Кроме того, они идентифицировали жировую ткань как конкретный участок, управляющий резистентностью к инсулину, и последующим развитием толекартности к глюкозе и T2DM при ALMS. Они подтвердили, что сигнальный путь инсулина в адипоцитах AlmsPoz/foz был интактным по всему пути вниз до фофорилирования TBC1D4, последнего известного представителя пути инсулинопосредованного поглощения глюкозы, и затем в ходе последующей серии исследований были определен белковый комплекс, который они назвали ALMSoMoft, состоящий из нескольких ключевых белков, которые связываются с ALMS1, и которые вместе необходимы для прикрепления и слияния ОШТ4-везикул с плазматической мембраной (РМ) адипоцитов в ответ на сигнал инсулина. ALMSoMa, таким образом, представляет собой до сих пор неизвестную последнюю стадию инсулинопосредованного поглощения глюкозы адипоцитами, с резистентностью к инсулину при ALMS из-за нарушения функции ALMSoMbi, ведущей к выходу из строя ОШТ4-опосредованного слияния мембран и, таким образом, блокировке транспортировки глюкозы в адипоцитах. ПРИМЕР 1 Мыши Almslf°z/f°z демонстрируют сильную специфическую резистентность к инсулину в жировой ткани даже при отсутствии ожирения Содержание животных Мышей AlmsPoz/f°z и однопометников Almsl+/+ (дикий тип) поддерживали в окружении C57BL/6J в виварии с 12 часовым циклом свет/темнота. Мыши имели свободный доступ ad libitum к воде и либо к нормальному корму, содержащему 5,4% жира, с содержание энергии 12 МДж/кг (пелеты Гордона для содержания мышей и крыс, Gordon's specialty stockfeeds, Австралия) либо к корму с высоким содержанием жиров (HFD), содержащему 23% жира, высоким уровнем простых углеводов, 0,19% холестерина, с содержанием энергии 20 МДж/кг (SF03-020, Specialty feeds, Австралия). Для ПЦР-генотипирования были использованы праймеры, фланкирующие мутацию foz: прямой АСА ACT ТТТ CAT GGC ТСС AGT (SEQ ID NO: 13); обратный TTG GCT С AG AGA CAG TTG AAA (SEQ Ш NO: 14). Шестимесячных страдающих ожирением и молодых (в возрасте <60дней) без ожирения AlmsPozlioz мышей и однопометников дикого типа (WT) использовали для исследования первичных метаболических нарушений приводящих мышей A AlmsPozltm к развитию T2DM. Шестимесячные Almsl**1*(tm) мыши страдали от ожирения со средней массой тела 45,5 г ± 1,7 г по сравнению с 26,4 г ± 1,3 г для однопометников дикого типа (Фиг. 1А) и, как было показано ранее, имели гипергликемию натощак и нарушенную толерантность к глюкозе с повышенными баллами НОМА. Тест на толерантность к инсулину (ITT) показал, что в отличие от WT (Фиг. 1В) и гетерозиготных однопометников, гликемия у страдающих ожирением AlmsPoz/foz-мышей была невосприимчива к введению инсулина (Фиг. 1В), даже когда вводимые дозы инсулина достигали 20 Ед./кг (Фиг. 1С). Ожирение Almslf°z/f°z-мышей возникло из-за сильной гипертрофии адипоцитов (Фиг. IB), а не гиперплазии адипоцитов, как правило, наблюдаемой у BBS-мышей с ожирением. Для того, чтобы определить, какой первичный дефект, вызывает нарушение толерантности к глюкозе у AlmsPoz/foz мышей, были изучены молодые худые AlmsPoz/foz мыши для того, чтобы удалить смешанное воздействие ожирения на респонсивность на инсулин. В возрасте 2 месяцев, самцы WT и Almsl f°z/f°z имели аналогичную среднюю массу тела ~ 24 г (Фиг. ID). ITT у этих мышей показало, что молодые без ожирения AlmsPoz/foz самцы тем не менее уже демонстрируют значительно уменьшенную респонсивность на инсулин (Фиг. 1е), в соответствии с резистентностью к инсулину, предшествующей ожирению в этой модели. Иммунодетекция IRAP, Akt, р-АКТ, GLUT4, С/ЕВР-а и GAPDH осуществленная на инсулин-чувствительных тканях, а именно, сердце, печени, скелетных мышцах и белой жировой ткани (WAT) из 6-месячных не голодавших AlmsPoz/foz и WT не показали никаких существенных различий в уровнях белка, за исключением последовательного увеличения р-АКТ относительно общего АКТ в WAT, что согласуется с парадоксальным увеличением, а не снижением активации восходящих участников сигнального пути инсулина у AlmsPoz/foz мышей с нетолерантностью к глюкозе (Фиг. 1G). Для того, чтобы определить, какие ткани по отдельности или вместе могут быть основным источником резистентности к инсулину, наблюдаемой у мышей Almsl f°z/f°z^ распределение по тканям поглощения инсулинопосредованной дезоксиглюкозы (DOG) сравнивали у WT и Almsl foz/foz мышей. Это подтверждает, что серьезно ослабленное поглощение DOG было ограничено WAT из мышей AlmsPoz/foz с компенсаторным увеличением поглощения DOG в инсулинреспонсивных икроножной и камбаловидной мышцах по сравнению с мышами дикого типа. Эти исследования показывают, что, хотя Almsl f°z/f°z мыши становятся тучными и у них развивается с возрастом прогрессирующий T2DM, основным изначальным дефектом, способствующим резистентности к инсулину и гипергликемии является нарушение в отсутствие, функционального ALMS1 поглощения глюкозы жировой тканью в ответ на передачу сигналов инсулина и этот дефект предшествует развитию ожирения. ПРИМЕР 2 Сайленсинг Almsl в адипоцитах человека блокирует поглощение глюкозы из-за нарушение клеточной сортировки GLUT4 Материалы: От Molecular Probes, Invitrogen: акридиновый оранжевый, набор для окрашивания плазматических мембран и ядер "Image-iT (r) LIVE Plasma Membrane and Nuclear Staining Labeling Kit", 2-NBDG (2- (К-7-нитробенз-2-окса-1,3-тиадиазол-4-ил) амино)-2-дезоксиглюкоза), Hoechst 33258 и Cell Light (tm) Early Endosomes-RFP * BacMam 2.0*; Каталожный номер#: A3568, 134406, N13195, H3569 и C10587. От Lonza: реактив "AdipoRed ТМ Assay Reagent" (Catalog #: PT-7009). Лентивирумные частицы от Santa Cruz Biotechnology, Inc.: ALMS1 лентивирусные частицы кшРНК (h), лентивирусные частицы TBC1D4 кшРНК (h) и лентивирусные частицы-А с контрольными кшРНК; Каталожный номер #: SC-72345-V, SC-61654-V и SC-108080 соответственно. От Tocris Biosciences: натриевая соль нигерицина (Каталожный номер #: 4312). Биохимические тесты. Мышей испытывали на устойчивость к инсулину с помощью теста на толерантность к инсулину (ITT) и теста на толерантность к глюкозе (внутрибрюшинный IPGTT). Для ITT мышей не кормили в течение 4 часов, без доступа к продуктам питания, но со свободным доступом к воде. Мышей взвешивали и инсулин (Humulin R, Eli Lilly, США) вводили внутрибрюшинно по 0,75 ед./кг массы тела в 0,9% -ном солевом растворе для инъекций (Pfizer, США). Получали кровь из хвоста и определяли уровень глюкозы в плазме для каждой мыши с помощью глюкометра (Optium Xceed, Abbott, США) и полосок для тестирования глюкозы в крови (Optium point of care, Abbott, США) в момент 0, 15, 30 и 60 мин. после инъекции инсулина. Для IPGTT, мышей не кормили в течение 18 часов и вводили в 2 мг/г массы тела D-глюкозы (Analar, VWR, США) в 0,9%-ном солевом растворе для инъекций. Уровень глюкозы в плазме определяли для каждой мыши с помощью глюкометра с отбором проб через хвостовую вену в момент 0, 15, 30, 60 и 120 мин. после инъекции глюкозы. Для измерения инсулина в плазме отбирали кровь у бодрствующих животных посредством кровоизвлечения из щеки. После сбора пробы крови держали на льду и центрифугировали при 17000 g, 10 мин. при 4 °С. Уровни инсулина анализировали с помощью коммерческого ультрачувствительного к мышиному инсулину набора для ELISA (Crystal Chem Inc., США). Гомеостатическую модель оценки резистентности к инсулину (НОМА-ГО.) рассчитывали с использованием уровней инсулина натощак и глюкозы натощак у индивидуальной мыши. Использовалась следующая формула: НОМА-ГО = [глюкоза натощак (мг/дл) х инсулин натощак #/Ед/мл)]/405. Культура клеток. Были приобретены человеческие белые висцеральные преадипоциты (Каталожный номер #: С-12732; PromoCell) и мезенхимальные стволовые клетки человека (Каталожный номер #: С-12974; PromoCell), полученные из здорового костного мозга. Преадипоциты рассевали в соответствии с протоколом производителя и культивировали в среде для роста преадипоцитов (Каталожный номер #: С-27410; PromoCell) до конфлуентности. За один день до индукции конечного адипогенеза, клетки инфицировали специфическими лентивирусными частицами, состоящими из пула 3 мишень-специфичных конструкций кшРНК, приобретенных у Santa Cruz Biotechnology, и на следующий день, адипогенную дифференцировку индуцировали путем замены среды на среду для дифференцировки преадипоцитов (Каталожный номер #: С-27436; PromoCell) на 2 дня. После стадии дифференцировки, среду окончательно заменяли на среду Adipocyte Nutrition (Каталожный номер #: С-27438; PromoCell). Для культуры без инсулина, среду "Adipocyte Basal Medium" (Каталожный номер #: С-2431; PromoCell) без инсулина дополняли 5 г/л дезоксиглюкозы, 8 мкг/мл d-биотина, 40С^/мл дексаметазона. В случае hMSCs, их культивировали в ростовой среде для мезенхимальных стволовых клеток (каталожный номер #: С-28010; PromoCell) до конфлуэнтности. hMSC трансфицировали конкретными миРНК, как описано выше, и на следующий день липогенную дифференцировку индуцировали путем замены среды на среду "MSC Adipogenic Differentiation Medium" (Каталожный номер #: С28011; Promocell). Выделение РНК, синтез кДНК, количественная ПЦР и Taqman. Тотальную РНК получали из различных тканей и клеток с помощью набора RiboPure(tm) (Каталожный номер #: AMI924; Ambion) с последующей обработкой ДНКазой с TURBO DNA-free(tm) (Каталожный номер #: AM 1907; Ambion). Целостность РНК оценивали с помощью гель-электрофореза и концентрацию РНК определяли с помощью Eppendorf Biophotometer Plus с кюветой Cell Hellma(r) Tray (Каталожный номер #: 105,810-UVS; Hellma). Обратную транскрипцию 1 мкг тотальной РНК в кДНК осуществляли с использованием набора для синтеза кДНК BioRad iScript(tm) (Каталожный номер #: 170-8891; BioRad). В режиме реального времени количественную амплификацию полимеразной цепной реакцией проводили в режиме реального времени в системе BioRad CFX96(tm) с помощью IQ(tm) SYBR(r) Green Supermix (Каталожный номер #: 170-8886; BioRad) и набора праймеров, оптимизированных для тестируемых мишеней для ПЦР в реальном времени на основе SYBR Green для ПЦР в реальном времени. Анализ Taqman проводили со специфическим генным анализом с помощью "TaqMan(r) Fast Advanced Master Mix" (Каталожный номер #: 4444557; Applied Biosystems). Нормализованную кратную экспрессию гена-мишени рассчитывали с использованием метода сравнительного порогового цикла (Ct), нормализуя Ст целевой мРНК к таковой для GAPDH с помощью CFX Manager Software Version 1.5 и проверяли с помощью программы Lin-Reg. Вестерн-блоты и иммунофлюоресцентная микроскопия. Самцов AlmsP0Z,*0Z и однопометников дикого типа анестезировали. Следующие инсулин-чувствительные ткани: печень, сердце, мышечную и жировую ткани собирали и непосредственно помещали в RIPA-буфер (Трис 50 мМ, NaCl 150 мМ, 0,1% SDS, 1% Тритон-ХЮО), дополненный полным коктейлем ингибиторов мини-протеаз и коктейлем ингибиторов фосфатаз PhosSTOP (Roche, Швейцария). Образцы обрабатывали ультразвуком и центрифугировали в течение 30 мин. при 17000G, 4°С 30 мин. Концентрацию белка анализировали с помощью ВСА-анализа (Thermo Fisher Scientific, США). Клеточные белки из клеток получали преципитацией трихлоруксусной кислотой и проводили иммуноблот-анализы с использованием 30-50 мкг общего белка. Связывание специфического антитела визуализировали с помощью субстрата "SuperSignal(r) West Femto Maximum Sensitivity Substrate" (Каталожный номер #: LA45954, Pierce) в системе визуализации BioRad Versadoc(tm) или имеджере ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare, Великобритания). Неспецифические белки, окрашенные Ponceau S, использовали в качестве контролей загрузки для нормализации сигнала, полученного после специфической иммунодетекции представляющего интерес белка с помощью программы "Bio-Rad Quantity Опе". Для иммунофлюоресцентных экспериментов клетки высевали в системе "регтапох 8-wells Lab-Tek II Chamber Slide" (Каталожный номер #: 177445; Nunc). Клетки обрабатывали, как указано. Затем клетки и криосрезы тканей обрабатывали для детекции белков после фиксации метанолом и пермеабилизации с помощью 0,1% тритона Х-100. Микроскопические препараты монтировали для детекции с помощью среды для заливки Vectashield Mounting Medium (Каталожный номер #: Н-1200; Vector Laboratories). Для просмотра ассоциированных с мембранами белки, клетки фиксировали в формалине в течение 15 мин. и напрямую блокировали, а затем подвергали иммуноокрашиванию и съемке с использованием вертикального микроскопа Zeiss Axiolmager Z2. Анализ изображений, ЗО-реконструирование и эксперименты с серийной съёмкой с временным интервалом и эксперименты по отслеживанию эндосом осуществляли либо с помощью программы Zeiss AxioVision с соответствующими модулями 3D и Tracking Zeiss или с помощью платформы для получения изображений Zeiss Zen 2012. Измерение флюоресценции. Преадипоциты культивировали в 96-луночном планшете и 12 лунок инфицировали либо лентивирусными частицами с ALMS1 кшРНК, либо лентивирусными частицами с CTRL кшРНК, и подвергали дифференцировке на следующий день в зрелые адипоциты. Через 3 недели, внутриклеточные триглицериды окрашивали с помощью красителя AdipoRed в соответствии с процедурой изготовителя и измеряли флуоресценцию на монохроматоре Tecan Infinite 200 QUAD4 (Тесап, Лион, Франция) на длине волны 520 нм. Полученные данные затем анализировали с помощью программного обеспечения Тесап Magellan Data Analysis с использованием в качестве контроля неокрашенных адипоцитов. Эксперименты по коиммунопреципитации. Для экспериментов по коиммунопреципитации мы использовали набор "Dynabeads(r) Antibody Coupling kit" (Каталожный номер #: 143.1 ID, Invitrogen) в комбинации с набором "Dynabeads(r) со-immunprecipitation kit" (Каталожный номер #: 143.21D, Invitrogen). hMSC культивировали до конфлуэнтности и адипогенную дифференцировку вызывали сменой среды. Через 7 дней после адипогенной дифференцировки, инициированной сменой среды, адипоциты, культивировали с или без Ins. за 24 ч до лизиса, затем лизировали в нативных условиях и использовали согласно набору. После иммунопреципитации и высвобождения с гранул, образцы загружали на гель "NuPAGE 3-8% TrisAcetate" (каталожный N: ЕА0375ВОХ, Invitrogen), с белковым стандартом "Hi Mark(tm) Prestained HMW Protein Standard)) (Каталожный номер #: LC5699, Invitrogen). Белковый препарат и идентификация с помощью масс-спектрометрии. Гидролиз в геле: Процедуру гидролиза в геле проводили, как описано Rabilloud et al. (ссылка). Приготовление кусков геля до гидролиза трипсином осуществляли с помощью жидкостного робота-обработчика (QuadZ215, Gilson International, Франция). Вкратце, гелевые полосы промывали поочередно 100 мкл 25 мМ NH4HCO3, а затем 100 мкл 50% ацетонитрила (ACN) (3 мин. промывка при встряхивании и жидкость сливали перед добавлением следующего растворителя). Этот цикл увлажнения/дегидратации повторяли дважды и кусочки геля сушили в течение 20 мин. перед восстановлением (10 мМ ДТТ / 25 мМ NH4HCO3 буфер при 56 °С в течение 45 мин.) и алкилированием (25 мМ йодацетамид / 25 мМ NH4HCO3 буфер в течение 45 мин, при комнатной температуре). После этого пятна на геле снова промывали 3 циклами 25 мМ NH4HCO3/ACN поочередно. После 20 мин. стадии сушки кусочки геля подвергали регидратации тремя объемами трипсина (Promega, V5111) 12,5 нг/мкл в 25 мМ NH4HCO3 буфере (свежеразбавленном) и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Трипсинизированные пептиды экстрагировали из геля путем энергичного встряхивания в течение 30 мин. в адаптированном объеме 35% Н2О/60% ACN/5% НСООН и стадией обработки ультразвуком в течение 15 мин. MALDI-TOF (/TOF) масс-спектрометрия и поиск в базах данных. Измерение MALDI проводили на Autoflex III SmartBeam (Bruker-Daltonik GmbH, Бремен, Германия) матричном лазерном с десорбцией/ионизацией времяпролетном масс-спектрометре (MALDI-TOF TOF), используемом в рефлекторном положительном режиме. Мишень "Prespotted Anchorchip" (система РАС от Bruker Daltonik, Техническое примечание TN011) с матрицей НССА использовали для анализа триптических гидролизатов. Полученные данные масс фингерпринтинга пептидов (PMF) и данные фингерпринтинга пептидных фрагментов (PFF) объединяли с помощью программного обеспечения Biotools 3.2 (Bruker Daltonik) и переносили интранет-версию в поисковую систему MASCOT (Matrix Science, Лондон, Великобритания). Вариабельные модификации (N-концевое белковое ацетилирование, окисление метионина и карбамидометилирование цистеина) и одно пропущенное трипсином расщепление приняли во внимание и ошибку пептидной массы ограничили до 50 частей на миллион. Белки идентифицировали с помощью функции поиска данных против неизбыточной базы данных белковых последовательностей NCBI, а затем против базы данных, ограниченной человеческими последовательностями. Во всех результатах, вероятностные баллы были выше, чем балл установленный как значимый с р-значением равным 0,05. NanoLC-MSMS масс-спектрометрия и поиск в базах данных: Для анализа nanoLC-MS/MS, пептиды были перенесены в стеклянные вставки, совместимые с системой LC-автосамплера (nanoLC-U3000, Dionex, США). Система ЖХ была соединена с масс-спектрометром ESI-Q-TOF (MicroTOFQ-II, Bruker, Германия). Метод заключался в 60 мин. прогоне при скорости потока 300 нл/мин. с использованием градиента двух растворителей: А (99,9% воды: 0,1% муравьиной кислоты) и В (99,92% ацетонитрил: 0,08% муравьиной кислоты). Система включает: колонку ЗООцт X 5 mm РерМар С18, используемую для преконцентрирования пептидов и колонку 75 цт X 150тт С18, используемую для элюирования пептидов. Анализатор TOF калибровали каждый день: данные получали и обрабатывали автоматически с использованием программного обеспечения Hystar 2.8 и DataAnalysis 2.6. Последовательные поиски вначале в базе данных NCBInr, а затем против базы данных, ограниченной человеком, осуществляли для каждого образца с использованием локальной версии Mascot 2.2 (MatrixScience, Великобритания) и ProteinScape 2.0 (Bruker, Германия). Относительное число ложноположительных сигналов (FPR) для идентификации белков оценивали с использованием базы данных обратных ловушек (reverse decoy): валидацию белка проводили с использованием FPR ниже 1%. Кроме того, белки, идентифицированные только по 1 пептиду, проверяли вручную: MS/MS спектры были проверены в соответствии с обычными правилами фрагментации. In situ анализ близкого лигирования (PLA). Набор Duolink для in situ PLA с антимышиным ПЛЮС зондом и анти-кроличьим МИНУС зондом (Каталожные номера #: 90701 и 90602; OLink Bioscience) использовали в комбинации с соответствующими первичными антителами согласно методике производителя. Человеческие первичные преадипоциты и зрелые адипоциты культивировали в 8-луночном "Lab-Тек II chamber slide" (Nunc) и обрабатывали как для иммунофлуоресцентной микроскопии до стадии первичной инкубации с антителом. После промывки клетки декорировали PLA ПЛЮС и МИНУС зондами (разведение 1:20) в течение 2 часов при температуре 37 °С. Гибридизацию и лигирование зондов, амплификацию, и конечную промывку SSC проводили в соответствии с методикой производителя. Перенос флуоресценции на основании белок-белковых взаимодействий визуализировали с использованием набора обнаружения Duolink 613 (OLink Bioscience) и получали изображения. Статистика. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., США). Результаты представлены в виде средних значений ± стандартное отклонение. Значимость результатов определяли с помощью двустороннего критерия Стьюдента или теста непараметрического U-критерия Манна-Уитни для статистического сравнения данных BMI и AUC. Значение Р <0,05 учитывалось при определении статистической значимости и отмечено звездочкой. С помощью первичных преадипоцитов человека в качестве модели in vitro, авторы локализовали ALMS1 преимущественно в цитоплазматическом, а не как ранее сообщалось, центросомном пуле. ALMS1 был подвергнут сайленсу во время адипогенеза и хотя наблюдалось значительное снижение анти-адипогенного фактора Pref-1, не было обнаружено никаких значительных различий в уровнях экспрессии проадипогенных факторов транскрипции, таких как cEBPs и PPARy. После сайленсинга ALMS1 в 2-недельных зрелых адипоцитах, способность поглощения глюкозы оценивали с использованием меченого аналога глюкозы (2-NBDG). При отсутствии стимуляции инсулином, в подвергнутых сайленгингу по ALMS1 и контрольных зрелых адипоцитах поглощение 2-NBDG не детектировалось (Фиг. 2а). С другой стороны, стимуляция инсулином приводит к повышенному потреблению 2-NBDG в контрольных зрелых адипоцитах человека (Фиг. 2В, верхняя панель), но не в клетках, под ер гнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 2В, нижняя панель). В дополнение к снижению поглощения глюкозы в адипоцитах, подвергнутых сайленгсингу по ALMS1, авторы наблюдали уменьшение внутриклеточных триглицеридов (TG) в этих клетках уже через неделю (Фиг.2С-0). Следует отметить, что это сниженное поглощение глюкозы в ALMS 1-дефицитных адипоцитах не было связано со снижением фосфорилирования АКТ, ниже по сигнальному пути инсулина, так как уровни pS473-AKT после 30-минутной инкубации с инсулином были похожи как на уровни контрольных, так и подвергнутых сайленсингу по ALMS 1 человеческих адипоцитов (Фиг. 2E-F), что соответствует уровням фосфорилирования АКТ от нормальных до повышенных, наблюдавшихся ранее в мышиных адипоцитах AlmsPoz/foz (Фиг. 1G). Авторы далее исследовали динамику GLUT4 в адипоцитах человека в отсутствие ALMS1. Клеточная локализация инсулинового рецептора (IR), в плазматической мембране не нарушалась после сайленсинга ALMS1 и детектировалась вблизи плазматической мембраны (РМ) в отсутствие инсулина. (Фиг. 2G, верхняя панель). В отличие от этого, в ALMS 1-дефицитных адипоцитах в отсутствие инсулина GLUT4 утратил свою перинуклеарную локализацию и детектировался рассредоточено по всей цитоплазме клетки, а не в своей предполагаемой обычной перинуклеарной локализации. (Фиг. 2G, средние и нижние панели и 2Н). При стимуляции инсулином, наблюдалось движение GLUT4 к РМ в пределах актиновой сетки (Фиг. 21) как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. Через два часа после стимуляции инсулином, в отсутствие инсулина, GLUT4 все еще обнаруживался рассредоточенным по всей цитоплазме подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов, тогда как у контрольных адипоцитов GLUT4 соответствующим образом релокализовался в перинуклеарном области (Фиг. 2J). Поскольку существует равновесие между экзоцитозом и эндоцитозом СЫЛЧ-везикул в РМ и из РМ, авторы проверили, для исключения возможности, не из-за дефектного ли эндоцитоза GLUT4 происходит ли нарушение сортировки GLUT4 в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. При исследовании динамина, ключевой молекулы эндоцитоза, не было выявлено различий в уровне белка, или клеточной локализации после сайленсинга ALMS1 в адипоцитах. Кроме того, средние скорости меченых эндосом были похожи между подвергутыми сайленсингу по ALMS1 и контрольными адипоцитами, что является доводом против дефекта эндоцитоза, вызывающего сниженное наличие GLUT4 в РМ в ответ на передачу сигналов инсулина. ПРИМЕРЗ ALMS1 требуется для направленной миграции TBC1D4 в РМ в ответ на сигнал инсулина Для того чтобы понять молекулярный механизм, лежащий в основе влияния инактивации ALMS1 на локализацию GLUT4, авторы определили взаимодействие партнеров ALMS1 в человеческих адипоцитах. Иммунопреципитацию (IP) с использованием ALMS1 в качестве приманки проводили с использованием молодых зрелых человеческих адипоцитов (4 дня после переключения дифференцировки) с последующей идентификацией взаимодействующих с ALMS1 партнеров масс-спектрометр ией. Среди белков, иммунопреципитированных с ALMS1, был TBC1D4, известная GTPa3a субстрата АКТ, требуемая для правильного удержания GLUT4 в СШТ4-сортировочньгх везикулах (GSV) и для транслокации GLUT4 к клеточной мембране для внутриклеточного поглощения глюкозы. ПРИМЕР 4 Разработка Модели структурной гомологии для ALMS1, TBC1D4 и аРКС. Поскольку кристаллическая структура Almsl еще не получена, использовали in silico структурное моделирование гомологии для прогнозирования ЗБ-структуры ALMS1 и идентификации структурных мотивов, которые могут связывать потенциальные взаимодействующие лиганды (Фиг. ЗА-С). Структурная модель ALMS1. Модель ALMS1 была построена с использованием метода моделирования фрагментов с помощью программы гомологичного моделирования, Modeller. Последовательность аминокислот для каждого экзона ALMS1 была направлена в профилированный поточный алгоритм, доступный на сервере PISRED на основании чего были идентифицированы подходящие шаблоны. Затем эти идентифицированные шаблонные белки выравнивали с соответствующими экзонными последовательностями и каждый экзон моделировали отдельно с помощью Modeller. Оптимизацию энергии и выбор моделей проводили на основании балла энергии дискретного оптимизированного белка. И, наконец, модели собирали для того, чтобы построить структуру полноразмерного ALMS1 и полноразмерный белок был расслаблен и минимизирован с помощью программы симуляции молекулярной динамики NAMD. Структурная модель РТР-связывающего домена TBC1D4. РТР-связывающий домен TBC1D4 находится в пределах первых 160 остатков. Надежная структура гомологов, моделирующая структуру между РТР-связывающим доменом и Rab-связывающим доменом, не была определена. Кристаллическую структуру РТР-домена мышиного Disabled-1 (Dab-1), 1NU2 (Е-значение = 5.2е-17), которая была идентифицирована на основании НММ-поиска по шаблону в швейцарской модели, использовали в качестве шаблона для построения РТР-связывающего домена TBC1D4. Домен РТР из TBC1D4 взаимодействует с ALMS-1. Макромолекулярная стыковка была осуществлена с использованием алгоритма ClusPro 2.0. Остатки, расположенные на поверхности взаимодействия с перекрытием > = 0,4 ангстрем рассматривались как взаимодействующие остатки. Interproscan показал, что ALMS-1 содержит WD40-подобный домен в пределах первых 3871 остатков. Белки, содержащие домен WD40, представляют собой семейство белков, функционирующих как каркасы для макро-молекулярных взаимодействий. РТР-связывающий домен TBC1D4 взаимодействует с ALMS1. Вначале РТР-связывающий домен и RabGTP-связывающий домен TBC1D4 соединяли с моделью ALMS1 с помощью сервера Cluspro 2, для определения наиболее вероятного участка взаимодействия. Затем оба домена соединяли с их соответствующими участками взаимодействия в ALMS1 с использованием AutoDock 4.2 и рассчитывали их аффинности связывания. На основании сродства РТР-связывающий домен TBC1D4 связывает ALMS1 с ~ 100 раз более высоким сродством по сравнению с RabGTP-связывающим доменом. Следовательно, авторы настоящего изобретения спрогнозировали, что РТР-связывающий домен может иметь более высокую вероятность взаимодействия с молекулой ALMS1 по сравнению с RabGTP-связывающим доменом. Моделирование РТР-домена из TBC1D4. Домен связывания фосфотирозина в TBC1D4 смоделировали после идентификации подходящего шаблона из алгоритма идентификации шаблона швейцарской модели. Стыковка РТР-домена и RabGTP-связывающего домена из TBC1D4 с ALMS1. Вначале РТР-связывающий домен и RabGTP-связывающий домен TBC1D4 соединяли с ALMS1 с использованием сервера Cluspro 2 и идентифицировали участок взаимодействия. Затем оба домена соединяли с их соответствующими участками взаимодействия с помощью AutoDock 4.2 и рассчитывали их аффинности связывания. Прогнозируемые номера остатков ALSM-1 с потенциалом взаимодействия с другим лигандом 65,66,69,72,73,74,75,76,77,78,80,87,2875,2876,2877,2878,2879,2880,2881,2882,2883,2884,2885,2887,2888,28 89,2890,2892,2893,2894,2895,2897,2909,2910,2912,2929,2931,2932,2933,2934,2935,3557,3558,4131,144,145, 146,147,148,149,150,151,193,194,195,198,199,200,201,205,208,211,214,226,227,229,233,234,235,236,239,242 ,243,246,248,249,250,251,252,314,319,321,986,1341,1344,2269,113,114,115,116,123,126,127,128,1340,1438,1 439Д440Д441,1442,1443,1444Д446Д447Д448Д449Д450Д451,1452,1453,1454Д457Д458Д459Д478Д915Д 918,1919,1920,1922,1923,1930,2041,2042,2043,2257,2267,2483,2484,3866,218,219,220,221,222,223,224,277, 278,279,282,285,286,287,288,686,688,689,690,691,699,1856,1858,1859,1861,1862,1863,1864,1865,1866,1867, 1868,1869,1870,1871,1872,1949,1968,1969,1971,1974,1979,1980,1981,1982,1983,1984,2104,2107,2111,2870, 2872,2874,2915,3285,3286,3287,793,795,796,797,1285,1314,1408,1409,1422,1423,1425,1426,1427,1430,1431, 1671,1672,1794,1797,2538,2539,2540,2555,2556,2557,2563,2564,2565,2567,2568,2588,2591,2599,2603,2699, 2701,2702,3108 Прогнозируемые остатки ALMS1, опосредующие взаимодействие с аРКС Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883, Е2884 Прогнозируемые номера остатков аРКС, опосредующие взаимодействие с ALMS1 F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, T631,V664,1667 Прогнозируемые остатки TBC1D4, опосредующие взаимодействие с ALMS1 G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82,183 Прогнозируемые остатки ALMS1, опосредующие взаимодействие с TBC1D4 Н65, L66, S2879 Модель гомологии показала, что Almsl предположительно имеет структуру типа яблочный огрызок с большим количеством участков связывания с потенциальными лигандами, сосредоточенными вокруг сердевины. Кристаллическая структура TBC1D4 аналогичным образом не была получена, и, поэтому авторы использовали подход гомологичного моделирования для предсказания структуры РТР-связывающего домена TBC1D4 (Фиг. 3 C-D). Затем проводили in silico исследования по стыковке, которые спрогнозировали высокое сродство связывания TBC1D4 с ALMS1 через водородные связи остатков TBC1D4 G75, А76, Р77, А78, R80, Е81, V82, 183 которые взаимодействуют с остатками Н65, L66, S2879 в Almsl (Фиг. 4А). Колокализацию ALMS1 и TBC1D4 затем подтверждали в адипоцитах человека иммунофлюоресцентными исследованиями (Фиг. 4 В). Далее тестировали уровни экспрессии GLUT4, TBC1D4 и IRAP в адипоцитах с сайленсингом ALMS1 с или без стимуляции инсулином, но никаких существенных различий не обнаружили (Фиг. 4С). После фосфорилирования активированным АКТ, фосфорилированный TBC1D4 (р-ТВСШ4) в адипоцитах направленно воздействует на RAB-белки, такие как RAB14 и RAB10, перед направленной миграцией GSV в РМ. Тем не менее, при стимуляции инсулином подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов, в уровнях TBC1D4, р-ТВСШ4, RAB14 и RAB10 не было обнаружено никакой разницы (Фиг. 4). Авторы затем сфокусировались на клеточной локализации GLUT4. При отсутствии стимуляции инсулином, сайленсинг TBC1D4 воспроизводит влияние сайленсинга ALMS1 в зрелых адипоцитах, т.е. нарушенная локализация GLUT4 по всей цитоплазме (Фиг. 4Е). В ответ на стимуляцию инсулином, в контрольных адипоцитах GLUT4 высвобождается из перинуклеарной области, распространяется по всей цитоплазме адипоцитов (Фиг. 4F), таким образом, воспроизводя картину распределения GLUT4, наблюдаемую в адипоцитах с сайленсингом по ALMS1 и TBC1D4 в отсутствие (Фиг. 4Е) и присутствие (Фиг. 4F) инсулина. Авторы изобретения в дальнейшем исследовали влияние сайленсинга ALMS1 на клеточную динамику TBC1D4 в ответ на инсулин. В отсутствии инсулина, TBC1D4 локализуется в перинуклеарной области как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 4G), но, что примечательно, в ответ на инсулин, TBC1D4 транспортировался в РМ только в контрольных, но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 4Н). ПРИМЕР 5 ALMS1 формирует динамический белковый комплекс, ALMSojuy, необходимый для инсулин-стимулированного транспорта глюкозы в зрелых адипоцитах человека Хотя авторы изобретения показали, что сайленсинг ALMS1 предотвращает таргетирование TBC1D4 в РМ, по прежнему необъяснимо, объясняет ли это нарушение серьезное снижение потребления глюкозы, наблюдаемое в ALMS 1-дефицитных адипоцитах. Поэтому авторы изобретения сравнили клеточное поглощение 2-NBDG при стимуляции инсулином в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 или TBC1D4 или контрольных адипоцитах и обнаружили отсутствие поглощения 2-NBDG в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах по сравнению с контрольными адипоцитами (Фиг. 5А-В), при этом сниженное, по сравнению с контролем, фактическое количество 2-NBDG все еще поглощалось адипоцитами, подвергнутыми сайленсингу по TBC1D4 (Фиг. 5С). Последующие анализы связывания антитела к GLUT4 либо в адипоцитах с сайленсингом ALMS1 либо с сайленсингом TBC1D4, либо контрольных адипоцитах после 30 минут стимуляции инсулином показали высокую долю GLUT4 в РМ в контрольных адипоцитах и в адипоцитах с сайленсингом TBC1D4, но не клетках с сайленсингом ALMS1 (Фиг. 5D-F), что указывает на то, что вторичный дефект при направленной миграции TBC1D4 в РМ в клетках с сайленсингом Almsl сам по себе не объясняет очень серьезный дефект транспорта глюкозы и экспрессии GLUT4 РМ в ALMSl-дефицитных клетках. Дальнейшее изучение IP-данных по Almsl выявило несколько субъединиц V типа АТРазных протонных (Н+) насосов (А, В, D1 и G2), которые, как затем показали авторы, экспрессировались в зрелых адипоцитах (Фиг. 5G) вместе с аРКС, активирующей киназой Н+-насосов под контролем инсулина. С помощью метода in situ PLA Duolink, нацеленного на ALMS1 и субъединицы Al и D1 протонных насосов (Фиг. 5Н), а также с помощью коиммуноокрашивания ALMS1, А1 и D1 субъединиц V-АТРазы и аРКС (Фиг. 5Н, I), авторы настоящего изобретения подтвердили, что ALMS1 находился в непосредственной близости к V-АТФазным Н+-насосам в зрелых адипоцитах в присутствии инсулина. ALMS1 колокализован с субъединицей V0D1 протонного насоса (Фиг. 51), которая встроена в мембрану GSV, что указывает на то, что в адипоците ALMS 1 транспортируется вместе с протоными насосами, локализованными в GSV. С помощью структурной in silico модели партнеров взаимодействующих с ALMS1 авторы определили мотив связывания РКС с Almsl. Сайты связывания для TBC1D4 и аРКС на Almsl находились так близко, что модель показала, что одновременное присоединение обоих белков на Almsl не представлялось возможным из-за стерических затруднений (Фиг. 5J). В следствие этого авторы выдвинули гипотезу. Чтобы проверить свою гипотезу о том, что в адипоцитах связывание ALMS1 с аРКС или в ином случае с TBC1D4 находится под обратным контролем сигнального пути инсулина, авторы провели дополнительные IP, с использованием ALMS1 в качестве приманки, но на этот раз с применением зрелых адипоцитов человека, культивируемых в присутствие или в отсутствие инсулина, при этом провели иммуноблоттинг IP как по аРКС, так и по TBC1D4. Результаты показали, что аРКС осаждается только посредством Almsl и детектируется иммуноблоттингом в экстрактах адипоцитов, инкубированных в отсутствие инсулина (Фиг. 5 К), тогда как TBC1D4 осаждается ALMS1 и детектируется в экстрактах адипоцитов, инкубированных в присутствии инсулина, в соответствии с авторской моделью реципроктного инсулин-регулируемого связывания Almsl (Фиг. 5L). ПРИМЕР 6 ALMSomu требуется для подкисления GSV перед доставкой GLUT4 в плазматическую мембрану Хотя было известно, что фосфорилирование TBC1D4 с помощью АКТ в некоторых случаях приводит к направленной миграции GLUT4, конечная стадия слияния GSV-PM является инсулин-регулируемым АКТ-независимым событием, которое требует осмотического набухания GSV под действием уАТРазных Н+-насосов. Тем не менее, отсутствовала информация о фактическом сигнале и механизме активации Н+-насосов инсулином. Авторы протестировали возможность предотвращения подкисления GSV при инактивации ALMS1 и, в следствие этого, химио-осмотического высвобождения GLUT4 в РМ, с помощью ацидотрофного красителя акридинового оранжевого, который испускает зеленую флуоресценцию при низкой концентрации и оранжево-красную флуоресценцию при высоких концентрации в лизосомах, в которых акридиновый оранжевый протонируется и секвестрируется. В отсутствие инсулина в адипоцитах не была обнаружена оранжево-красная флуоресценция. Напротив, инсулин вызывал быстрое появление красного цвета в контрольных зрелых адипоцитах человека (Фиг. 6А), но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6В), что служит указанием потери инсулинопосредованного подкисления лизосом в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1. Изобретатели затем проверили, действительно ли подкисление адипоцитов с сайленсингом по ALMS1 с помощью нигерицина (NIG.), электронейтрального ионофора К +/Н + обмена, о котором известно, что он вызывает осмотическое набухание GSV, может обойти Almsl-ассоциированный дефект слияния GLUT4 и поглощении глюкозы. Обработка NIG. привела к быстрому подкислению как контрольных, так и подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитов (Фиг. 6C-D), что привело к активации набухания и слияния внутриклеточных везикул. Параллельно с этим, анализ электронной микроскопией показал везикулы, расположенные рядом с РМ без слияния в отсутствие инсулина как в контрольных адипоцитах, так и в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 6E-F, верхние панели). Обработка инсулином вызывала набухание везикул (Фиг. 6Е, средние панели), ассоциированное со слиянием везикул с РМ, для поглощения глюкозы только в контрольных адипоцитах (Фиг. 6Е, средние панели), но не в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6F, средние панели). Однако NIG. индуцировал везикулярное набухание и слияние с РМ как в контрольных, так и в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах (Фиг. 6E-F, нижние панели). Обработка NIG восстанавливала поглощение глюкозы в подвергнутых сайленсингу по ALMS1 адипоцитах. В то время как инсулин оказывает незначительное влияние на стимуляцию поглощения 2-NBDG в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1 (Фиг. 6G-H, верхняя и средняя панели), NIG не только восстановил слияние везикул, но и, как показано, восстановил поглощение 2-NBDG в адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, до уровней, наблюдаемых в контрольных клетках (Фиг. 6G-H, нижние панели). Этот восстановленный транспорт глюкозы в обработанных NIG адипоцитах, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, коррелировал с восстановленным GLUT4-слиянием с РМ (Фиг. 7А), но не с направленной миграцией TBC1D4 к РМ (фиг.7В); и привел к восстановлению TG-наполнения адипоцитов, подвергнутых сайленсингу по ALMS1, через 24 часа после обработки NIG. ПРИМЕР 7 Идентификация пептидных ингибиторов связывания РКС с Almsl После того, как участок связывающего взаимодействия между двумя белками стал известен, стало возможно применить информацию о конформации и аминокислотах каждого белка, вовлеченных в опосредование данного взаимодействия, в компьютерных моделях для разработки пептидов или низкомолекулрных лекарственных веществ, которые при связывании с участком взаимодействия способны стерически или иным способом воспрепятствовать связывающему взаимодействию. Таким образом, авторы стремились идентифицировать пептиды, которые ингибируют взаимодействие ALMS1 и аРКС или TBC1D4 с использованием их ранее описанных в примере 4 структурных моделей ALMS1, TBC1D4 и аРКС. Спрогнозированные с помощью этого способа пептиды для блокировки взаимодействия между аРКС и ALMS1, включают следующие последовательности: LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ IDNO: 5), DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6), QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7), QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8). PADQMTDTP (SEQ ID NO: 9), HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10) или SCIFLEQ (SEQ Ш NO: 11). Пептид идентифицированный с помощью этого способа для блокировки взаимодействия между TBC1D4 и ALMS1 имел последовательность GCGAPAAREVILVL (SEQ ID N 12). ПРИМЕР 8 Экспрессия специфического ALMSl-взаимодействующего домена аРКС в зрелых адипоцитах вызывает поглощение глюкозы в отсутствие инсулина. Далее авторы проверили гипотезу о том, что инсулин опосредует высвобождение альфа РКС из комплекса ALMSoMbi для индукции поглощения глюкозы. Для этого они клонировали взаимодействующий домен аРКС (SEQ Ш N0:: 14 и 15) в лентивирусный вектор вместе с Flag-меткой. Выбранная последовательность была минимальной последовательностью аРКС (min-aPKC-FLAG), не имеющей стерических затруднений с участком взаимодействия TBC1D4 с ALMS1. Экспрессированный в адипоцитах min-aPKC-FLAG конкурирует с эндогенным аРКС, предотвращая его связывание с ALMSoMoft и, тем самым, благоприятствуя инсулин-опосредованному связыванию TBC1D4 с ALMSoMoft. Далее зрелые адипоциты инфицировали либо контрольными, либо min-aPKC-лентивирусными частицами для оценки влияния min-aPKC-FLAG на поглощение глюкозы. Через 48 часов после заражения, min-aPKC-FLAG иммунодетектировали с использованием антитела против FLAG-метки (Фиг. 9). Для in vitro доказательства, мы обрабатывали зрелые адипоциты, как описано (Фиг. 9), и затем инкубировали обработанные зрелые адипоциты с 2-NBDG для оценки влияния min-aPKC-FLAG на поглощение глюкозы. Интересно, что 2-NBDG поглощалась а в обработанных min-aPKC-FLAG адипоцитах в отсутствие INS (Фиг. 8а, левая колонка), что соответствовало 3,5 -кратному увеличению по сравнению с контролем (Фиг. 8В).С другой стороны, никакой существенной разницы не наблюдалось в присутствие INS (фиг. 8А, правый столбец и 8В). Эти данные свидетельствуют о том, что направленное воздействие на взаимодействие ALMS1 и аРКС достаточно для того, чтобы вызвать всасывание глюкозы в адипоцитах, независимо от наличия INS. Получение лентивирусного вектора, несущего домен аРКС ALMS 1-взаимодействующий домен человеческого РКСа амплифицировали из кДНК человеческих клеток НЕК293 с N-концевой FLAG-меткой с помощью прямого 5'-3 'gtacGAATTCGCCACCATGGATTACAAGGATGACGACGATAAGCTCACGGACTTCAAT ТТССТС (SEQ ID N0: 16) и обратного 5'- tagcGGATCCTCATACTGCACTCTGTAAGATGGG- 3' (SEQ ID NO: 17) праймеров и клонировали в лентивирусный вектор PCDH-EFl-MCS-IRES-Puro (System Biosciences). Для получения вируса, РКСа-лентивирусные векторы трансфицировали в клетки 293TN (System Biosciences) вместе с упаковывающими плазмидами psPAX2 и pMD2. G (Addgene) с массовым соотношением 3: 2: 1, соответственно, и с использованием Lipofectamine 2000 (Life Technologies). Через сорок восемь часов после трансфекции, надосадочную жидкость культуры собирали центрифугированием при 500 х g в течение 10 минут, с последующей фильтрацией через 0,45 мкм шприцевой фильтр с PES-мембраной (Sartorius). Раствор вируса затем концентрировали путем добавления Уг объема холодного 30% (масса/объем) PEG6000, растворенного в 0,5 М NaCl, и инкубировали в течение ночи при 4 °С с периодическим перемешиванием. Смесь затем центрифугировали при 3000 х г в течение 15 мин. при температуре 4 °С. Затем осадок, содержащий лентивирусные частицы, ресуспендировали в 1 мл DMEM среде и хранили при -80 °С до инфицирования клеток-мишеней. СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЮНИВЕРСИТЕ ДЕ СТРАЗБУР et al. <12 0> НОВАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ДИАБЕТА <130> B1768PC <160> 21 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4169 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Pro Glu Asp Leu Pro Trp Pro Gly Glu Leu Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Ala Ala Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Ala Asn Val Asp Asp Val Val Val Val Glu Glu Val Glu 35 40 45 Glu Glu Ala Gly Arg Glu Leu Asp Ser Asp Ser His Tyr Gly Pro Gln 50 55 60 His Leu Glu Ser Ile Asp Asp Glu Glu Asp Glu Glu Ala Lys Ala Trp 65 70 75 80 Leu Gln Ala His Pro Gly Arg Ile Leu Pro Pro Leu Ser Pro Pro Gln 85 90 95 His Arg Tyr Ser Glu Gly Glu Arg Thr Ser Leu Glu Lys Ile Val Pro 100 105 110 Leu Thr Cys His Val Trp Gln Gln Ile Val Tyr Gln Gly Asn Ser Arg 115 120 125 Thr Gln Ile Ser Asp Thr Asn Val Val Cys Leu Glu Thr Thr Ala Gln 130 135 140 Arg Gly Ser Gly Asp Asp Gln Lys Thr Glu Ser Trp His Cys Leu Pro 145 150 155 160 Gln Glu Met Asp Ser Ser Gln Thr Leu Asp Thr Ser Gln Thr Arg Phe 165 170 175 Asn Val Arg Thr Glu Asp Thr Glu Val Thr Asp Phe Pro Ser Leu Glu 180 185 190 Glu Gly Ile Leu Thr Gln Ser Glu Asn Gln Val Lys Glu Pro Asn Arg 195 200 205 Asp Leu Phe Cys Ser Pro Leu Leu Val Ile Gln Asp Ser Phe Ala Ser 210 215 220 Pro Asp Leu Pro Leu Leu Thr Cys Leu Thr Gln Asp Gln Glu Phe Ala 225 230 235 240 Pro Asp Ser Leu Phe His Gln Ser Glu Leu Ser Phe Ala Pro Leu Arg 245 250 255 Gly Ile Pro Asp Lys Ser Glu Asp Thr Glu Trp Ser Ser Arg Pro Ser 260 265 270 Glu Val Ser Glu Ala Leu Phe Gln Ala Thr Ala Glu Val Ala Ser Asp 275 280 285 Leu Ala Ser Ser Arg Phe Ser Val Ser Gln His Pro Leu Ile Gly Ser 290 295 300 Thr Ala Val Gly Ser Gln Cys Pro Phe Leu Pro Ser Glu Gln Gly Asn 305 310 315 320 Asn Glu Glu Thr Ile Ser Ser Val Asp Glu Leu Lys Ile Pro Lys Asp 325 330 335 Cys Asp Arg Tyr Asp Asp Leu Cys Ser Tyr Met Ser Trp Lys Thr Arg 340 345 350 Lys Asp Thr Gln Trp Pro Glu Asn Asn Leu Ala Asp Lys Asp Gln Val 355 360 365 Ser Val Ala Thr Ser Phe Asp Ile Thr Asp Glu Asn Ile Ala Thr Lys 370 375 380 Arg Ser Asp His Phe Asp Ala Ala Arg Ser Tyr Gly Gln Tyr Trp Thr 385 390 395 400 Gln Glu Asp Ser Ser Lys Gln Ala Glu Thr Tyr Leu Thr Lys Gly Leu 405 410 415 Gln Gly Lys Val Glu Ser Asp Val Ile Thr Leu Asp Gly Leu Asn Glu 420 425 430 Asn Ala Val Val Cys Ser Glu Arg Val Ala Glu Leu Gln Arg Lys Pro 435 440 445 Thr Arg Glu Ser Glu Tyr His Ser Ser Asp Leu Arg Met Leu Arg Met 450 455 460 Ser Pro Asp Thr Val Pro Lys Ala Pro Lys His Leu Lys Ala Gly Asp 465 470 475 480 Thr Ser Lys Gly Gly Ile Ala Lys Val Thr Gln Ser Asn Leu Lys Ser 485 490 495 Gly Ile Thr Thr Thr Pro Val Asp Ser Asp Ile Gly Ser His Leu Ser 500 505 510 Leu Ser Leu Glu Asp Leu Ser Gln Leu Ala Val Ser Ser Pro Leu Glu 515 520 525 Thr Thr Thr Gly Gln His Thr Asp Thr Leu Asn Gln Lys Thr Leu Ala 530 535 540 Asp Thr His Leu Thr Glu Glu Thr Leu Lys Val Thr Ala Ile Pro Glu 545 550 555 560 Pro Ala Asp Gln Lys Thr Ala Thr Pro Thr Val Leu Ser Ser Ser His 565 570 575 Ser His Arg Gly Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Gly Leu Pro Asp 580 585 590 Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Ala Pro Gly Leu 595 600 605 Ala Asp Gln Thr Thr Gly Met Ser Thr Leu Thr Ser Thr Ser Tyr Ser 610 615 620 His Arg Glu Lys Pro Gly Thr Phe Tyr Gln Gln Glu Leu Pro Glu Ser 625 630 635 640 Asn Leu Thr Glu Glu Pro Leu Glu Val Ser Ala Ala Pro Gly Pro Val 645 650 655 Glu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Thr Val Ser Ser Thr Ser His Ser His 660 665 670 Val Glu Asp Leu Leu Phe Phe Tyr Arg Gln Thr Leu Pro Asp Gly His 675 680 685 Leu Thr Asp Gln Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Gly Pro Ala Asp 690 695 700 Gln Lys Thr Gly Thr Ala Thr Val Leu Ser Thr Pro His Ser His Arg 705 710 715 720 Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr Gln Gln Glu Phe Ala Asp Ser His Gln 725 730 735 Thr Glu Glu Thr Leu Thr Lys Val Ser Ala Thr Pro Gly Pro Ala Asp 740 745 750 Gln Lys Thr Glu Ile Pro Ala Val Gln Ser Ser Ser Tyr Ser Gln Arg 755 760 765 Glu Lys Pro Ser Ile Leu Tyr Pro Gln Asp Leu Ala Asp Ser His Leu 770 775 780 Pro Glu Glu Gly Leu Lys Val Ser Ala Val Ala Gly Pro Ala Asp Gln 785 790 795 800 Lys Thr Gly Leu Pro Thr Val Pro Ser Ser Ala Tyr Ser His Arg Glu 805 810 815 Lys Leu Leu Val Phe Tyr Gln Gln Ala Leu Leu Asp Ser His Leu Pro 820 825 830 Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Gly Pro Ala Asp Gly Lys 835 840 845 Thr Gly Thr Pro Ala Val Thr Ser Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser Leu 850 855 860 Gly Glu Lys Pro Ser Ala Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Pro Asn Ser His 865 870 875 880 Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Pro Gly Pro Gly Asp 885 890 895 Gln Lys Thr Gly Ile Pro Ser Ala Pro Ser Ser Phe Tyr Ser His Arg 900 905 910 Glu Lys Pro Ile Ile Phe Ser Gln Gln Thr Leu Pro Asp Phe Leu Phe 915 920 925 Pro Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Ser Val Leu Ala Ala Gln 930 935 940 Lys Thr Gly Thr Pro Thr Val Ser Ser Asn Ser His Ser His Ser Glu 945 950 955 960 Lys Ser Ser Val Phe Tyr Gln Gln Glu Leu Pro Asp Ser Asp Leu Pro 965 970 975 Arg Glu Ser Leu Lys Met Ser Ala Ile Pro Gly Leu Thr Asp Gln Lys 980 985 990 Thr Val Pro Thr Pro Thr Val Pro Ser Gly Ser Phe Ser His Arg Glu 995 1000 1005 Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Glu Trp Pro Asp Ser Tyr Ala 1010 1015 1020 Thr Glu Lys Ala Leu Lys Val Ser Thr Gly Pro Gly Pro Ala Asp 1025 1030 1035 Gln Lys Thr Glu Ile Pro Ala Val Gln Ser Ser Ser Tyr Pro Gln 1040 1045 1050 Arg Glu Lys Pro Ser Val Leu Tyr Pro Gln Val Leu Ser Asp Ser 1055 1060 1065 His Leu Pro Glu Glu Ser Leu Lys Val Ser Ala Phe Pro Gly Pro 1070 1075 1080 Ala Asp Gln Met Thr Asp Thr Pro Ala Val Pro Ser Thr Phe Tyr 1085 1090 1095 Ser Gln Arg Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Pro 1100 1105 1110 Glu Ser His Leu Pro Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ser Val Ala Pro 1115 1120 1125 Gly Leu Ala Asp Gln Lys Thr Gly Thr Pro Thr Val Thr Ser Thr 1130 1135 1140 Ser Tyr Ser Gln His Arg Glu Lys Pro Ser Ile Phe His Gln Gln 1145 1150 1155 Ala Leu Pro Gly Thr His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys Val Ser 1160 1165 1170 Ala Val Thr Gly Pro Gly Asn Gln Lys Thr Trp Ile Pro Arg Val 1175 1180 1185 Leu Ser Thr Phe Tyr Ser Gln Arg Glu Lys Pro Gly Ile Phe Tyr 1190 1195 1200 Gln Gln Thr Leu Pro Gly Ser His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys 1205 1210 1215 Val Ser Pro Val Leu Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Thr Pro 1220 1225 1230 Thr Pro Thr Ser Ala Ser Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Gly Ile 1235 1240 1245 Phe Tyr Gln Gln Val Leu Pro Asp Asn His Pro Thr Glu Glu Ala 1250 1255 1260 Leu Lys Ile Ser Val Ala Ser Glu Pro Val Asp Gln Thr Thr Gly 1265 1270 1275 Thr Pro Ala Val Thr Ser Thr Ser Tyr Ser Gln Tyr Arg Glu Lys 1280 1285 1290 Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Ser Leu Pro Ser Ser His Leu Thr 1295 1300 1305 Glu Glu Ala Lys Asn Val Ser Ala Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln 1310 1315 1320 Lys Thr Val Ile Pro Ile Leu Pro Ser Thr Phe Tyr Ser His Thr 1325 1330 1335 Glu Lys Pro Gly Val Phe Tyr Gln Gln Val Leu Pro His Ser His 1340 1345 1350 Pro Thr Glu Glu Ala Leu Lys Ile Ser Val Ala Ser Glu Pro Val 1355 1360 1365 Asp Gln Thr Thr Gly Thr Pro Thr Val Thr Ser Thr Ser Tyr Ser 1370 1375 1380 Gln His Thr Glu Lys Pro Ser Ile Phe Tyr Gln Gln Ser Leu Pro 1385 1390 1395 Gly Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Lys Asn Val Ser Ala Val Pro 1400 1405 1410 Gly Pro Gly Asp Arg Lys Thr Gly Ile Pro Thr Leu Pro Ser Thr 1415 1420 1425 Phe Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Gly Ser Phe Tyr Gln Gln Val 1430 1435 1440 Leu Pro His Ser His Leu Pro Glu Glu Ala Leu Glu Val Ser Val 1445 1450 1455 Ala Pro Gly Pro Val Asp Gln Thr Ile Gly Thr Pro Thr Val Thr 1460 1465 1470 Ser Pro Ser Ser Ser Phe Gly Glu Lys Pro Ile Val Ile Tyr Lys 1475 1480 1485 Gln Ala Phe Pro Glu Gly His Leu Pro Glu Glu Ser Leu Lys Val 1490 1495 1500 Ser Val Ala Pro Gly Pro Val Gly Gln Thr Thr Gly Ala Pro Thr 1505 1510 1515 Ile Thr Ser Pro Ser Tyr Ser Gln His Arg Ala Lys Ser Gly Ser 1520 1525 1530 Phe Tyr Gln Leu Ala Leu Leu Gly Ser Gln Ile Pro Glu Glu Ala 1535 1540 1545 Leu Arg Val Ser Ser Ala Pro Gly Pro Ala Asp Gln Thr Thr Gly 1550 1555 1560 Ile Pro Thr Ile Thr Ser Thr Ser Tyr Ser Phe Gly Glu Lys Pro 1565 1570 1575 Ile Val Asn Tyr Lys Gln Ala Phe Pro Asp Gly His Leu Pro Glu 1580 1585 1590 Glu Ala Leu Lys Val Ser Ile Val Ser Gly Pro Thr Glu Lys Lys 1595 1600 1605 Thr Asp Ile Pro Ala Gly Pro Leu Gly Ser Ser Ala Leu Gly Glu 1610 1615 1620 Lys Pro Ile Thr Phe Tyr Arg Gln Ala Leu Leu Asp Ser Pro Leu 1625 1630 1635 Asn Lys Glu Val Val Lys Val Ser Ala Ala Pro Gly Pro Ala Asp 1640 1645 1650 Gln Lys Thr Glu Thr Leu Pro Val His Ser Thr Ser Tyr Ser Asn 1655 1660 1665 Arg Gly Lys Pro Val Ile Phe Tyr Gln Gln Thr Leu Ser Asp Ser 1670 1675 1680 His Leu Pro Glu Glu Ala Leu Lys Val Pro Pro Val Pro Gly Pro 1685 1690 1695 Asp Ala Gln Lys Thr Glu Thr Pro Ser Val Ser Ser Ser Leu Tyr 1700 1705 1710 Ser Tyr Arg Glu Lys Pro Ile Val Phe Tyr Gln Gln Ala Leu Pro 1715 1720 1725 Asp Ser Glu Leu Thr Gln Glu Ala Leu Lys Val Ser Ala Val Pro 1730 1735 1740 Gln Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Leu Ser Thr Val Thr Ser Ser 1745 1750 1755 Phe Tyr Ser His Thr Glu Lys Pro Asn Ile Ser Tyr Gln Gln Glu 1760 1765 1770 Leu Pro Asp Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val Ser Asn 1775 1780 1785 Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Val Ser Thr Val Thr 1790 1795 1800 Ser Thr Ser Tyr Ser His Arg Glu Lys Pro Ile Val Ser Tyr Gln 1805 1810 1815 Arg Glu Leu Pro His Phe Thr Glu Ala Gly Leu Lys Ile Leu Arg 1820 1825 1830 Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Ile Asn Ile Leu Pro 1835 1840 1845 Ser Asn Ser Tyr Pro Gln Arg Glu His Ser Val Ile Ser Tyr Glu 1850 1855 1860 Gln Glu Leu Pro Asp Leu Thr Glu Val Thr Leu Lys Ala Ile Gly 1865 1870 1875 Val Pro Gly Pro Ala Asp Gln Lys Thr Gly Ile Gln Ile Ala Ser 1880 1885 1890 Ser Ser Ser Tyr Ser Asn Arg Glu Lys Ala Ser Ile Phe His Gln 1895 1900 1905 Gln Glu Leu Pro Asp Val Thr Glu Glu Ala Leu Asn Val Phe Val 1910 1915 1920 Val Pro Gly Gln Gly Asp Arg Lys Thr Glu Ile Pro Thr Val Pro 1925 1930 1935 Leu Ser Tyr Tyr Ser Arg Arg Glu Lys Pro Ser Val Ile Ser Gln 1940 1945 1950 Gln Glu Leu Pro Asp Ser His Leu Thr Glu Glu Ala Leu Lys Val 1955 1960 1965 Ser Pro Val Ser Ile Pro Ala Glu Gln Lys Thr Gly Ile Pro Ile 1970 1975 1980 Gly Leu Ser Ser Ser Tyr Ser His Ser His Lys Glu Lys Leu Lys 1985 1990 1995 Ile Ser Thr Val His Ile Pro Asp Asp Gln Lys Thr Glu Phe Pro 2000 2005 2010 Ala Ala Thr Leu Ser Ser Tyr Ser Gln Ile Glu Lys Pro Lys Ile 2015 2020 2025 Ser Thr Val Ile Gly Pro Asn Asp Gln Lys Thr Pro Ser Gln Thr 2030 2035 2040 Ala Phe His Ser Ser Tyr Ser Gln Thr Val Lys Pro Asn Ile Leu 2045 2050 2055 Phe Gln Gln Gln Leu Pro Asp Arg Asp Gln Ser Lys Gly Ile Leu 2060 2065 2070 Lys Ile Ser Ala Val Pro Glu Leu Thr Asp Val Asn Thr Gly Lys 2075 2080 2085 Pro Val Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Phe His Arg Glu Lys Ser Asn 2090 2095 2100 Ile Phe Ser Pro Gln Glu Leu Pro Gly Ser His Val Thr Glu Asp 2105 2110 2115 Val Leu Lys Val Ser Thr Ile Pro Gly Pro Ala Gly Gln Lys Thr 2120 2125 2130 Val Leu Pro Thr Ala Leu Pro Ser Ser Phe Ser His Arg Glu Lys 2135 2140 2145 Pro Asp Ile Phe Tyr Gln Lys Asp Leu Pro Asp Arg His Leu Thr 2150 2155 2160 Glu Asp Ala Leu Lys Ile Ser Ser Ala Leu Gly Gln Ala Asp Gln 2165 2170 2175 Ile Thr Gly Leu Gln Thr Val Pro Ser Gly Thr Tyr Ser His Gly 2180 2185 2190 Glu Asn His Lys Leu Val Ser Glu His Val Gln Arg Leu Ile Asp 2195 2200 2205 Asn Leu Asn Ser Ser Asp Ser Ser Val Ser Ser Asn Asn Val Leu 2210 2215 2220 Leu Asn Ser Gln Ala Asp Asp Arg Val Val Ile Asn Lys Pro Glu 2225 2230 2235 Ser Ala Gly Phe Arg Asp Val Gly Ser Glu Glu Ile Gln Asp Ala 2240 2245 2250 Glu Asn Ser Ala Lys Thr Leu Lys Glu Ile Arg Thr Leu Leu Met 2255 2260 2265 Glu Ala Glu Asn Met Ala Leu Lys Arg Cys Asn Phe Pro Ala Pro 2270 2275 2280 Leu Ala Arg Phe Arg Asp Ile Ser Asp Ile Ser Phe Ile Gln Ser 2285 2290 2295 Lys Lys Val Val Cys Phe Lys Glu Pro Ser Ser Thr Gly Val Ser 2300 2305 2310 Asn Gly Asp Leu Leu His Arg Gln Pro Phe Thr Glu Glu Ser Pro 2315 2320 2325 Ser Ser Arg Cys Ile Gln Lys Asp Ile Gly Thr Gln Thr Asn Leu 2330 2335 2340 Lys Cys Arg Arg Gly Ile Glu Asn Trp Glu Phe Ile Ser Ser Thr 2345 2350 2355 Thr Val Arg Ser Pro Leu Gln Glu Ala Glu Ser Lys Val Ser Met 2360 2365 2370 Ala Leu Glu Glu Thr Leu Arg Gln Tyr Gln Ala Ala Lys Ser Val 2375 2380 2385 Met Arg Ser Glu Pro Glu Gly Cys Ser Gly Thr Ile Gly Asn Lys 2390 2395 2400 Ile Ile Ile Pro Met Met Thr Val Ile Lys Ser Asp Ser Ser Ser 2405 2410 2415 Asp Ala Ser Asp Gly Asn Gly Ser Cys Ser Trp Asp Ser Asn Leu 2420 2425 2430 Pro Glu Ser Leu Glu Ser Val Ser Asp Val Leu Leu Asn Phe Phe 2435 2440 2445 Pro Tyr Val Ser Pro Lys Thr Ser Ile Thr Asp Ser Arg Glu Glu 2450 2455 2460 Glu Gly Val Ser Glu Ser Glu Asp Gly Gly Gly Ser Ser Val Asp 2465 2470 2475 Ser Leu Ala Ala His Val Lys Asn Leu Leu Gln Cys Glu Ser Ser 2480 2485 2490 Leu Asn His Ala Lys Glu Ile Leu Arg Asn Ala Glu Glu Glu Glu 2495 2500 2505 Ser Arg Val Arg Ala His Ala Trp Asn Met Lys Phe Asn Leu Ala 2510 2515 2520 His Asp Cys Gly Tyr Ser Ile Ser Glu Leu Asn Glu Asp Asp Arg 2525 2530 2535 Arg Lys Val Glu Glu Ile Lys Ala Glu Leu Phe Gly His Gly Arg 2540 2545 2550 Thr Thr Asp Leu Ser Lys Gly Leu Gln Ser Pro Arg Gly Met Gly 2555 2560 2565 Cys Lys Pro Glu Ala Val Cys Ser His Ile Ile Ile Glu Ser His 2570 2575 2580 Glu Lys Gly Cys Phe Arg Thr Leu Thr Ser Glu His Pro Gln Leu 2585 2590 2595 Asp Arg His Pro Cys Ala Phe Arg Ser Ala Gly Pro Ser Glu Met 2600 2605 2610 Thr Arg Gly Arg Gln Asn Pro Ser Ser Cys Arg Ala Lys His Val 2615 2620 2625 Asn Leu Ser Ala Ser Leu Asp Gln Asn Asn Ser His Phe Lys Val 2630 2635 2640 Trp Asn Ser Leu Gln Leu Lys Ser His Ser Pro Phe Gln Asn Phe 2645 2650 2655 Ile Pro Asp Glu Phe Lys Ile Ser Lys Gly Leu Arg Met Pro Phe 2660 2665 2670 Asp Glu Lys Met Asp Pro Trp Leu Ser Glu Leu Val Glu Pro Ala 2675 2680 2685 Phe Val Pro Pro Lys Glu Val Asp Phe His Ser Ser Ser Gln Met 2690 2695 2700 Pro Ser Pro Glu Pro Met Lys Lys Phe Thr Thr Ser Ile Thr Phe 2705 2710 2715 Ser Ser His Arg His Ser Lys Cys Ile Ser Asn Ser Ser Val Val 2720 2725 2730 Lys Val Gly Val Thr Glu Gly Ser Gln Cys Thr Gly Ala Ser Val 2735 2740 2745 Gly Val Phe Asn Ser His Phe Thr Glu Glu Gln Asn Pro Pro Arg 2750 2755 2760 Asp Leu Lys Gln Lys Thr Ser Ser Pro Ser Ser Phe Lys Met His 2765 2770 2775 Ser Asn Ser Gln Asp Lys Glu Val Thr Ile Leu Ala Glu Gly Arg 2780 2785 2790 Arg Gln Ser Gln Lys Leu Pro Val Asp Phe Glu Arg Ser Phe Gln 2795 2800 2805 Glu Glu Lys Pro Leu Glu Arg Ser Asp Phe Thr Gly Ser His Ser 2810 2815 2820 Glu Pro Ser Thr Arg Ala Asn Cys Ser Asn Phe Lys Glu Ile Gln 2825 2830 2835 Ile Ser Asp Asn His Thr Leu Ile Ser Met Gly Arg Pro Ser Ser 2840 2845 2850 Thr Leu Gly Val Asn Arg Ser Ser Ser Arg Leu Gly Val Lys Glu 2855 2860 2865 Lys Asn Val Thr Ile Thr Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu 2870 2875 2880 Glu Gln Arg Glu Leu Phe Glu Gln Ser Lys Ala Pro Arg Ala Asp 2885 2890 2895 Asp His Val Arg Lys His His Ser Pro Ser Pro Gln His Gln Asp 2900 2905 2910 Tyr Val Ala Pro Asp Leu Pro Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln Arg 2915 2920 2925 Glu Leu Phe Glu Gln Cys Lys Ala Pro Tyr Val Asp His Gln Met 2930 2935 2940 Arg Glu Asn His Ser Pro Leu Pro Gln Gly Gln Asp Ser Ile Ala 2945 2950 2955 Ser Asp Leu Pro Ser Pro Ile Ser Leu Glu Gln Cys Gln Ser Lys 2960 2965 2970 Ala Pro Gly Val Asp Asp Gln Met Asn Lys His His Phe Pro Leu 2975 2980 2985 Pro Gln Gly Gln Asp Cys Val Val Glu Lys Asn Asn Gln His Lys 2990 2995 3000 Pro Lys Ser His Ile Ser Asn Ile Asn Val Glu Ala Lys Phe Asn 3005 3010 3015 Thr Val Val Ser Gln Ser Ala Pro Asn His Cys Thr Leu Ala Ala 3020 3025 3030 Ser Ala Ser Thr Pro Pro Ser Asn Arg Lys Ala Leu Ser Cys Val 3035 3040 3045 His Ile Thr Leu Cys Pro Lys Thr Ser Ser Lys Leu Asp Ser Gly 3050 3055 3060 Thr Leu Asp Glu Arg Phe His Ser Leu Asp Ala Ala Ser Lys Ala 3065 3070 3075 Arg Met Asn Ser Glu Phe Asn Phe Asp Leu His Thr Val Ser Ser 3080 3085 3090 Arg Ser Leu Glu Pro Thr Ser Lys Leu Leu Thr Ser Lys Pro Val 3095 3100 3105 Ala Gln Asp Gln Glu Ser Leu Gly Phe Leu Gly Pro Lys Ser Ser 3110 3115 3120 Leu Asp Phe Gln Val Val Gln Pro Ser Leu Pro Asp Ser Asn Thr 3125 3130 3135 Ile Thr Gln Asp Leu Lys Thr Ile Pro Ser Gln Asn Ser Gln Ile 3140 3145 3150 Val Thr Ser Arg Gln Ile Gln Val Asn Ile Ser Asp Phe Glu Gly 3155 3160 3165 His Ser Asn Pro Glu Gly Thr Pro Val Phe Ala Asp Arg Leu Pro 3170 3175 3180 Glu Lys Met Lys Thr Pro Leu Ser Ala Phe Ser Glu Lys Leu Ser 3185 3190 3195 Ser Asp Ala Val Thr Gln Ile Thr Thr Glu Ser Pro Glu Lys Thr 3200 3205 3210 Leu Phe Ser Ser Glu Ile Phe Ile Asn Ala Glu Asp Arg Gly His 3215 3220 3225 Glu Ile Ile Glu Pro Gly Asn Gln Lys Leu Arg Lys Ala Pro Val 3230 3235 3240 Lys Phe Ala Ser Ser Ser Ser Val Gln Gln Val Thr Phe Ser Arg 3245 3250 3255 Gly Thr Asp Gly Gln Pro Leu Leu Leu Pro Tyr Lys Pro Ser Gly 3260 3265 3270 Ser Thr Lys Met Tyr Tyr Val Pro Gln Leu Arg Gln Ile Pro Pro 3275 3280 3285 Ser Pro Asp Ser Lys Ser Asp Thr Thr Val Glu Ser Ser His Ser 3290 3295 3300 Gly Ser Asn Asp Ala Ile Ala Pro Asp Phe Pro Ala Gln Val Leu 3305 3310 3315 Gly Thr Arg Asp Asp Asp Leu Ser Ala Thr Val Asn Ile Lys His 3320 3325 3330 Lys Glu Gly Ile Tyr Ser Lys Arg Val Val Thr Lys Ala Ser Leu 3335 3340 3345 Pro Val Gly Glu Lys Pro Leu Gln Asn Glu Asn Ala Asp Ala Ser 3350 3355 3360 Val Gln Val Leu Ile Thr Gly Asp Glu Asn Leu Ser Asp Lys Lys 3365 3370 3375 Gln Gln Glu Ile His Ser Thr Arg Ala Val Thr Glu Ala Ala Gln 3380 3385 3390 Ala Lys Glu Lys Glu Ser Leu Gln Lys Asp Thr Ala Asp Ser Ser 3395 3400 3405 Ala Ala Ala Ala Ala Glu His Ser Ala Gln Val Gly Asp Pro Glu 3410 3415 3420 Met Lys Asn Leu Pro Asp Thr Lys Ala Ile Thr Gln Lys Glu Glu 3425 3430 3435 Ile His Arg Lys Lys Thr Val Pro Glu Glu Ala Trp Pro Asn Asn 3440 3445 3450 Lys Glu Ser Leu Gln Ile Asn Ile Glu Glu Ser Glu Cys His Ser 3455 3460 3465 Glu Phe Glu Asn Thr Thr Arg Ser Val Phe Arg Ser Ala Lys Phe 3470 3475 3480 Tyr Ile His His Pro Val His Leu Pro Ser Asp Gln Asp Ile Cys 3485 3490 3495 His Glu Ser Leu Gly Lys Ser Val Phe Met Arg His Ser Trp Lys 3500 3505 3510 Asp Phe Phe Gln His His Pro Asp Lys His Arg Glu His Met Cys 3515 3520 3525 Leu Pro Leu Pro Tyr Gln Asn Met Asp Lys Thr Lys Thr Asp Tyr 3530 3535 3540 Thr Arg Ile Lys Ser Leu Ser Ile Asn Val Asn Leu Gly Asn Lys 3545 3550 3555 Glu Val Met Asp Thr Thr Lys Ser Gln Val Arg Asp Tyr Pro Lys 3560 3565 3570 His Asn Gly Gln Ile Ser Asp Pro Gln Arg Asp Gln Lys Val Thr 3575 3580 3585 Pro Glu Gln Thr Thr Gln His Thr Val Ser Leu Asn Glu Leu Trp 3590 3595 3600 Asn Lys Tyr Arg Glu Arg Gln Arg Gln Gln Arg Gln Pro Glu Leu 3605 3610 3615 Gly Asp Arg Lys Glu Leu Ser Leu Val Asp Arg Leu Asp Arg Leu 3620 3625 3630 Ala Lys Ile Leu Gln Asn Pro Ile Thr His Ser Leu Gln Val Ser 3635 3640 3645 Glu Ser Thr His Asp Asp Ser Arg Gly Glu Arg Ser Val Lys Glu 3650 3655 3660 Trp Ser Gly Arg Gln Gln Gln Arg Asn Lys Leu Gln Lys Lys Lys 3665 3670 3675 Arg Phe Lys Ser Leu Glu Lys Ser His Lys Asn Thr Gly Glu Leu 3680 3685 3690 Lys Lys Ser Lys Val Leu Ser His His Arg Ala Gly Arg Ser Asn 3695 3700 3705 Gln Ile Lys Ile Glu Gln Ile Lys Phe Asp Lys Tyr Ile Leu Ser 3710 3715 3720 Lys Gln Pro Gly Phe Asn Tyr Ile Ser Asn Thr Ser Ser Asp Cys 3725 3730 3735 Arg Pro Ser Glu Glu Ser Glu Leu Leu Thr Asp Thr Thr Thr Asn 3740 3745 3750 Ile Leu Ser Gly Thr Thr Ser Thr Val Glu Ser Asp Ile Leu Thr 3755 3760 3765 Gln Thr Asp Arg Glu Val Ala Leu His Glu Arg Ser Ser Ser Val 3770 3775 3780 Ser Thr Ile Asp Thr Ala Arg Leu Ile Gln Ala Phe Gly His Glu 3785 3790 3795 Arg Val Cys Leu Ser Pro Arg Arg Ile Lys Leu Tyr Ser Ser Ile 3800 3805 3810 Thr Asn Gln Gln Arg Arg Tyr Leu Glu Lys Arg Ser Lys His Ser 3815 3820 3825 Lys Lys Val Leu Asn Thr Gly His Pro Leu Val Thr Ser Glu His 3830 3835 3840 Thr Arg Arg Arg His Ile Gln Val Ala Asn His Val Ile Ser Ser 3845 3850 3855 Asp Ser Ile Ser Ser Ser Ala Ser Ser Phe Leu Ser Ser Asn Ser 3860 3865 3870 Thr Phe Cys Asn Lys Gln Asn Val His Met Leu Asn Lys Gly Ile 3875 3880 3885 Gln Ala Gly Asn Leu Glu Ile Val Asn Gly Ala Lys Lys His Thr 3890 3895 3900 Arg Asp Val Gly Ile Thr Phe Pro Thr Pro Ser Ser Ser Glu Ala 3905 3910 3915 Lys Leu Glu Glu Asn Ser Asp Val Thr Ser Trp Ser Glu Glu Lys 3920 3925 3930 Arg Glu Glu Lys Met Leu Phe Thr Gly Tyr Pro Glu Asp Arg Lys 3935 3940 3945 Leu Lys Lys Asn Lys Lys Asn Ser His Glu Gly Val Ser Trp Phe 3950 3955 3960 Val Pro Val Glu Asn Val Glu Ser Arg Ser Lys Lys Glu Asn Val 3965 3970 3975 Pro Asn Thr Cys Gly Pro Gly Ile Ser Trp Phe Glu Pro Ile Thr 3980 3985 3990 Lys Thr Arg Pro Trp Arg Glu Pro Leu Arg Glu Gln Asn Cys Gln 3995 4000 4005 Gly Gln His Leu Asp Gly Arg Gly Tyr Leu Ala Gly Pro Gly Arg 4010 4015 4020 Glu Ala Gly Arg Asp Leu Leu Arg Pro Phe Val Arg Ala Thr Leu 4025 4030 4035 Gln Glu Ser Leu Gln Phe His Arg Pro Asp Phe Ile Ser Arg Ser 4040 4045 4050 Gly Glu Arg Ile Lys Arg Leu Lys Leu Ile Val Gln Glu Arg Lys 4055 4060 4065 Leu Gln Ser Met Leu Gln Thr Glu Arg Asp Ala Leu Phe Asn Ile 4070 4075 4080 Asp Arg Glu Arg Gln Gly His Gln Asn Arg Met Cys Pro Leu Pro 4085 4090 4095 Lys Arg Val Phe Leu Ala Ile Gln Lys Asn Lys Pro Ile Ser Lys 4100 4105 4110 Lys Glu Met Ile Gln Arg Ser Lys Arg Ile Tyr Glu Gln Leu Pro 4115 4120 4125 Glu Val Gln Lys Lys Arg Glu Glu Glu Lys Arg Lys Ser Glu Tyr 4130 4135 4140 Lys Ser Tyr Arg Leu Arg Ala Gln Leu Tyr Lys Lys Arg Val Thr 4145 4150 4155 Asn Gln Leu Leu Gly Arg Lys Val Pro Trp Asp 4160 4165 <210> 2 <211> 1298 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Glu Pro Pro Ser Cys Ile Gln Asp Glu Pro Phe Pro His Pro Leu 1 5 10 15 Glu Pro Glu Pro Gly Val Ser Ala Gln Pro Gly Pro Gly Lys Pro Ser 20 25 30 Asp Lys Arg Phe Arg Leu Trp Tyr Val Gly Gly Ser Cys Leu Asp His 35 40 45 Arg Thr Thr Leu Pro Met Leu Pro Trp Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg 50 55 60 Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ala Gly Gly Cys Gly Ala Pro Ala Ala Arg 65 70 75 80 Glu Val Ile Leu Val Leu Ser Ala Pro Phe Leu Arg Cys Val Pro Ala 85 90 95 Pro Gly Ala Gly Ala Ser Gly Gly Thr Ser Pro Ser Ala Thr Gln Pro 100 105 110 Asn Pro Ala Val Phe Ile Phe Glu His Lys Ala Gln His Ile Ser Arg 115 120 125 Phe Ile His Asn Ser His Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Tyr Leu Ile Lys 130 135 140 Ala Gln Pro Asp Asp Pro Glu Ser Gln Met Ala Cys His Val Phe Arg 145 150 155 160 Ala Thr Asp Pro Ser Gln Val Pro Asp Val Ile Ser Ser Ile Arg Gln 165 170 175 Leu Ser Lys Ala Ala Met Lys Glu Asp Ala Lys Pro Ser Lys Asp Asn 180 185 190 Glu Asp Ala Phe Tyr Asn Ser Gln Lys Phe Glu Val Leu Tyr Cys Gly 195 200 205 Lys Val Thr Val Thr His Lys Lys Ala Pro Ser Ser Leu Ile Asp Asp 210 215 220 Cys Met Glu Lys Phe Ser Leu His Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ile Gln 225 230 235 240 Gly Glu Gln Arg Gly Pro Asp Pro Gly Glu Asp Leu Ala Asp Leu Glu 245 250 255 Val Val Val Pro Gly Ser Pro Gly Asp Cys Leu Pro Glu Glu Ala Asp 260 265 270 Gly Thr Asp Thr His Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ser Gln Pro Ala 275 280 285 Leu Thr Ser Ser Arg Val Cys Phe Pro Glu Arg Ile Leu Glu Asp Ser 290 295 300 Gly Phe Asp Glu Gln Gln Glu Phe Arg Ser Arg Cys Ser Ser Val Thr 305 310 315 320 Gly Val Gln Arg Arg Val His Glu Gly Ser Gln Lys Ser Gln Pro Arg 325 330 335 Arg Arg His Ala Ser Ala Pro Ser His Val Gln Pro Ser Asp Ser Glu 340 345 350 Lys Asn Arg Thr Met Leu Phe Gln Val Gly Arg Phe Glu Ile Asn Leu 355 360 365 Ile Ser Pro Asp Thr Lys Ser Val Val Leu Glu Lys Asn Phe Lys Asp 370 375 380 Ile Ser Ser Cys Ser Gln Gly Ile Lys His Val Asp His Phe Gly Phe 385 390 395 400 Ile Cys Arg Glu Ser Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gln Tyr Ile Cys Tyr 405 410 415 Val Phe Gln Cys Ala Ser Glu Ser Leu Val Asp Glu Val Met Leu Thr 420 425 430 Leu Lys Gln Ala Phe Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gln Ser Ala Lys Thr 435 440 445 Gln Ile Lys Leu Cys Glu Ala Cys Pro Met His Ser Leu His Lys Leu 450 455 460 Cys Glu Arg Ile Glu Gly Leu Tyr Pro Pro Arg Ala Lys Leu Val Ile 465 470 475 480 Gln Arg His Leu Ser Ser Leu Thr Asp Asn Glu Gln Ala Asp Ile Phe 485 490 495 Glu Arg Val Gln Lys Met Lys Pro Val Ser Asp Gln Glu Glu Asn Glu 500 505 510 Leu Val Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Cys Glu Ala Lys Gln Lys Thr 515 520 525 His Val His Ile Gly Glu Gly Pro Ser Thr Ile Ser Asn Ser Thr Ile 530 535 540 Pro Glu Asn Ala Thr Ser Ser Gly Arg Phe Lys Leu Asp Ile Leu Lys 545 550 555 560 Asn Lys Ala Lys Arg Ser Leu Thr Ser Ser Leu Glu Asn Ile Phe Ser 565 570 575 Arg Gly Ala Asn Arg Met Arg Gly Arg Leu Gly Ser Val Asp Ser Phe 580 585 590 Glu Arg Ser Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Asp Tyr Ser Pro Gly Asp 595 600 605 Ser Pro Pro Gly Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gln 610 615 620 Thr Phe Pro Glu Glu Asp Ser Asp Ser Pro Gln Phe Arg Arg Arg Ala 625 630 635 640 His Thr Phe Ser His Pro Pro Ser Ser Thr Lys Arg Lys Leu Asn Leu 645 650 655 Gln Asp Gly Arg Ala Gln Gly Val Arg Ser Pro Leu Leu Arg Gln Ser 660 665 670 Ser Ser Glu Gln Cys Ser Asn Leu Ser Ser Val Arg Arg Met Tyr Lys 675 680 685 Glu Ser Asn Ser Ser Ser Ser Leu Pro Ser Leu His Thr Ser Phe Ser 690 695 700 Ala Pro Ser Phe Thr Ala Pro Ser Phe Leu Lys Ser Phe Tyr Gln Asn 705 710 715 720 Ser Gly Arg Leu Ser Pro Gln Tyr Glu Asn Glu Ile Arg Gln Asp Thr 725 730 735 Ala Ser Glu Ser Ser Asp Gly Glu Gly Arg Lys Arg Thr Ser Ser Thr 740 745 750 Cys Ser Asn Glu Ser Leu Ser Val Gly Gly Thr Ser Val Thr Pro Arg 755 760 765 Arg Ile Ser Trp Arg Gln Arg Ile Phe Leu Arg Val Ala Ser Pro Met 770 775 780 Asn Lys Ser Pro Ser Ala Met Gln Gln Gln Asp Gly Leu Asp Arg Asn 785 790 795 800 Glu Leu Leu Pro Leu Ser Pro Leu Ser Pro Thr Met Glu Glu Glu Pro 805 810 815 Leu Val Val Phe Leu Ser Gly Glu Asp Asp Pro Glu Lys Ile Glu Glu 820 825 830 Arg Lys Lys Ser Lys Glu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Lys Ala Ile His 835 840 845 Gln Gln Ile Leu Leu Leu Arg Met Glu Lys Glu Asn Gln Lys Leu Glu 850 855 860 Ala Ser Arg Asp Glu Leu Gln Ser Arg Lys Val Lys Leu Asp Tyr Glu 865 870 875 880 Glu Val Gly Ala Cys Gln Lys Glu Val Leu Ile Thr Trp Asp Lys Lys 885 890 895 Leu Leu Asn Cys Arg Ala Lys Ile Arg Cys Asp Met Glu Asp Ile His 900 905 910 Thr Leu Leu Lys Glu Gly Val Pro Lys Ser Arg Arg Gly Glu Ile Trp 915 920 925 Gln Phe Leu Ala Leu Gln Tyr Arg Leu Arg His Arg Leu Pro Asn Lys 930 935 940 Gln Gln Pro Pro Asp Ile Ser Tyr Lys Glu Leu Leu Lys Gln Leu Thr 945 950 955 960 Ala Gln Gln His Ala Ile Leu Val Asp Leu Gly Arg Thr Phe Pro Thr 965 970 975 His Pro Tyr Phe Ser Val Gln Leu Gly Pro Gly Gln Leu Ser Leu Phe 980 985 990 Asn Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Tyr Cys 995 1000 1005 Gln Gly Ile Ser Phe Val Ala Gly Val Leu Leu Leu His Met Ser 1010 1015 1020 Glu Glu Gln Ala Phe Glu Met Leu Lys Phe Leu Met Tyr Asp Leu 1025 1030 1035 Gly Phe Arg Lys Gln Tyr Arg Pro Asp Met Met Ser Leu Gln Ile 1040 1045 1050 Gln Met Tyr Gln Leu Ser Arg Leu Leu His Asp Tyr His Arg Asp 1055 1060 1065 Leu Tyr Asn His Leu Glu Glu Asn Glu Ile Ser Pro Ser Leu Tyr 1070 1075 1080 Ala Ala Pro Trp Phe Leu Thr Leu Phe Ala Ser Gln Phe Ser Leu 1085 1090 1095 Gly Phe Val Ala Arg Val Phe Asp Ile Ile Phe Leu Gln Gly Thr 1100 1105 1110 Glu Val Ile Phe Lys Val Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ser Gln Glu 1115 1120 1125 Thr Leu Ile Met Glu Cys Glu Ser Phe Glu Asn Ile Val Glu Phe 1130 1135 1140 Leu Lys Asn Thr Leu Pro Asp Met Asn Thr Ser Glu Met Glu Lys 1145 1150 1155 Ile Ile Thr Gln Val Phe Glu Met Asp Ile Ser Lys Gln Leu His 1160 1165 1170 Ala Tyr Glu Val Glu Tyr His Val Leu Gln Asp Glu Leu Gln Glu 1175 1180 1185 Ser Ser Tyr Ser Cys Glu Asp Ser Glu Thr Leu Glu Lys Leu Glu 1190 1195 1200 Arg Ala Asn Ser Gln Leu Lys Arg Gln Asn Met Asp Leu Leu Glu 1205 1210 1215 Lys Leu Gln Val Ala His Thr Lys Ile Gln Ala Leu Glu Ser Asn 1220 1225 1230 Leu Glu Asn Leu Leu Thr Arg Glu Thr Lys Met Lys Ser Leu Ile 1235 1240 1245 Arg Thr Leu Glu Gln Glu Lys Met Ala Tyr Gln Lys Thr Val Glu 1250 1255 1260 Gln Leu Arg Lys Leu Leu Pro Ala Asp Ala Leu Val Asn Cys Asp 1265 1270 1275 Leu Leu Leu Arg Asp Leu Asn Cys Asn Pro Asn Asn Lys Ala Lys 1280 1285 1290 Ile Gly Asn Lys Pro 1295 <210> 3 <211> 1235 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 3 Met Glu Pro Pro Ser Cys Ile Gln Asp Glu Pro Phe Pro His Pro Leu 1 5 10 15 Glu Pro Glu Pro Gly Val Ser Ala Gln Pro Gly Pro Gly Lys Pro Ser 20 25 30 Asp Lys Arg Phe Arg Leu Trp Tyr Val Gly Gly Ser Cys Leu Asp His 35 40 45 Arg Thr Thr Leu Pro Met Leu Pro Trp Leu Met Ala Glu Ile Arg Arg 50 55 60 Arg Ser Gln Lys Pro Glu Ala Gly Gly Cys Gly Ala Pro Ala Ala Arg 65 70 75 80 Glu Val Ile Leu Val Leu Ser Ala Pro Phe Leu Arg Cys Val Pro Ala 85 90 95 Pro Gly Ala Gly Ala Ser Gly Gly Thr Ser Pro Ser Ala Thr Gln Pro 100 105 110 Asn Pro Ala Val Phe Ile Phe Glu His Lys Ala Gln His Ile Ser Arg 115 120 125 Phe Ile His Asn Ser His Asp Leu Thr Tyr Phe Ala Tyr Leu Ile Lys 130 135 140 Ala Gln Pro Asp Asp Pro Glu Ser Gln Met Ala Cys His Val Phe Arg 145 150 155 160 Ala Thr Asp Pro Ser Gln Val Pro Asp Val Ile Ser Ser Ile Arg Gln 165 170 175 Leu Ser Lys Ala Ala Met Lys Glu Asp Ala Lys Pro Ser Lys Asp Asn 180 185 190 Glu Asp Ala Phe Tyr Asn Ser Gln Lys Phe Glu Val Leu Tyr Cys Gly 195 200 205 Lys Val Thr Val Thr His Lys Lys Ala Pro Ser Ser Leu Ile Asp Asp 210 215 220 Cys Met Glu Lys Phe Ser Leu His Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ile Gln 225 230 235 240 Gly Glu Gln Arg Gly Pro Asp Pro Gly Glu Asp Leu Ala Asp Leu Glu 245 250 255 Val Val Val Pro Gly Ser Pro Gly Asp Cys Leu Pro Glu Glu Ala Asp 260 265 270 Gly Thr Asp Thr His Leu Gly Leu Pro Ala Gly Ala Ser Gln Pro Ala 275 280 285 Leu Thr Ser Ser Arg Val Cys Phe Pro Glu Arg Ile Leu Glu Asp Ser 290 295 300 Gly Phe Asp Glu Gln Gln Glu Phe Arg Ser Arg Cys Ser Ser Val Thr 305 310 315 320 Gly Val Gln Arg Arg Val His Glu Gly Ser Gln Lys Ser Gln Pro Arg 325 330 335 Arg Arg His Ala Ser Ala Pro Ser His Val Gln Pro Ser Asp Ser Glu 340 345 350 Lys Asn Arg Thr Met Leu Phe Gln Val Gly Arg Phe Glu Ile Asn Leu 355 360 365 Ile Ser Pro Asp Thr Lys Ser Val Val Leu Glu Lys Asn Phe Lys Asp 370 375 380 Ile Ser Ser Cys Ser Gln Gly Ile Lys His Val Asp His Phe Gly Phe 385 390 395 400 Ile Cys Arg Glu Ser Pro Glu Pro Gly Leu Ser Gln Tyr Ile Cys Tyr 405 410 415 Val Phe Gln Cys Ala Ser Glu Ser Leu Val Asp Glu Val Met Leu Thr 420 425 430 Leu Lys Gln Ala Phe Ser Thr Ala Ala Ala Leu Gln Ser Ala Lys Thr 435 440 445 Gln Ile Lys Leu Cys Glu Ala Cys Pro Met His Ser Leu His Lys Leu 450 455 460 Cys Glu Arg Ile Glu Gly Leu Tyr Pro Pro Arg Ala Lys Leu Val Ile 465 470 475 480 Gln Arg His Leu Ser Ser Leu Thr Asp Asn Glu Gln Ala Asp Ile Phe 485 490 495 Glu Arg Val Gln Lys Met Lys Pro Val Ser Asp Gln Glu Glu Asn Glu 500 505 510 Leu Val Ile Leu His Leu Arg Gln Leu Cys Glu Ala Lys Gln Lys Thr 515 520 525 His Val His Ile Gly Glu Gly Pro Ser Thr Ile Ser Asn Ser Thr Ile 530 535 540 Pro Glu Asn Ala Thr Ser Ser Gly Arg Phe Lys Leu Asp Ile Leu Lys 545 550 555 560 Asn Lys Ala Lys Arg Ser Leu Thr Ser Ser Leu Glu Asn Ile Phe Ser 565 570 575 Arg Gly Ala Asn Arg Met Arg Gly Arg Leu Gly Ser Val Asp Ser Phe 580 585 590 Glu Arg Ser Asn Ser Leu Ala Ser Glu Lys Asp Tyr Ser Pro Gly Asp 595 600 605 Ser Pro Pro Gly Thr Pro Pro Ala Ser Pro Pro Ser Ser Ala Trp Gln 610 615 620 Thr Phe Pro Glu Glu Asp Ser Asp Ser Pro Gln Phe Arg Arg Arg Ala 625 630 635 640 His Thr Phe Ser His Pro Pro Ser Ser Thr Lys Arg Lys Leu Asn Leu 645 650 655 Gln Asp Gly Arg Ala Gln Gly Val Arg Ser Pro Leu Leu Arg Gln Ser 660 665 670 Ser Ser Glu Gln Cys Ser Asp Gly Glu Gly Arg Lys Arg Thr Ser Ser 675 680 685 Thr Cys Ser Asn Glu Ser Leu Ser Val Gly Gly Thr Ser Val Thr Pro 690 695 700 Arg Arg Ile Ser Trp Arg Gln Arg Ile Phe Leu Arg Val Ala Ser Pro 705 710 715 720 Met Asn Lys Ser Pro Ser Ala Met Gln Gln Gln Asp Gly Leu Asp Arg 725 730 735 Asn Glu Leu Leu Pro Leu Ser Pro Leu Ser Pro Thr Met Glu Glu Glu 740 745 750 Pro Leu Val Val Phe Leu Ser Gly Glu Asp Asp Pro Glu Lys Ile Glu 755 760 765 Glu Arg Lys Lys Ser Lys Glu Leu Arg Ser Leu Trp Arg Lys Ala Ile 770 775 780 His Gln Gln Ile Leu Leu Leu Arg Met Glu Lys Glu Asn Gln Lys Leu 785 790 795 800 Glu Ala Ser Arg Asp Glu Leu Gln Ser Arg Lys Val Lys Leu Asp Tyr 805 810 815 Glu Glu Val Gly Ala Cys Gln Lys Glu Val Leu Ile Thr Trp Asp Lys 820 825 830 Lys Leu Leu Asn Cys Arg Ala Lys Ile Arg Cys Asp Met Glu Asp Ile 835 840 845 His Thr Leu Leu Lys Glu Gly Val Pro Lys Ser Arg Arg Gly Glu Ile 850 855 860 Trp Gln Phe Leu Ala Leu Gln Tyr Arg Leu Arg His Arg Leu Pro Asn 865 870 875 880 Lys Gln Gln Pro Pro Asp Ile Ser Tyr Lys Glu Leu Leu Lys Gln Leu 885 890 895 Thr Ala Gln Gln His Ala Ile Leu Val Asp Leu Gly Arg Thr Phe Pro 900 905 910 Thr His Pro Tyr Phe Ser Val Gln Leu Gly Pro Gly Gln Leu Ser Leu 915 920 925 Phe Asn Leu Leu Lys Ala Tyr Ser Leu Leu Asp Lys Glu Val Gly Tyr 930 935 940 Cys Gln Gly Ile Ser Phe Val Ala Gly Val Leu Leu Leu His Met Ser 945 950 955 960 Glu Glu Gln Ala Phe Glu Met Leu Lys Phe Leu Met Tyr Asp Leu Gly 965 970 975 Phe Arg Lys Gln Tyr Arg Pro Asp Met Met Ser Leu Gln Ile Gln Met 980 985 990 Tyr Gln Leu Ser Arg Leu Leu His Asp Tyr His Arg Asp Leu Tyr Asn 995 1000 1005 His Leu Glu Glu Asn Glu Ile Ser Pro Ser Leu Tyr Ala Ala Pro 1010 1015 1020 Trp Phe Leu Thr Leu Phe Ala Ser Gln Phe Ser Leu Gly Phe Val 1025 1030 1035 Ala Arg Val Phe Asp Ile Ile Phe Leu Gln Gly Thr Glu Val Ile 1040 1045 1050 Phe Lys Val Ala Leu Ser Leu Leu Ser Ser Gln Glu Thr Leu Ile 1055 1060 1065 Met Glu Cys Glu Ser Phe Glu Asn Ile Val Glu Phe Leu Lys Asn 1070 1075 1080 Thr Leu Pro Asp Met Asn Thr Ser Glu Met Glu Lys Ile Ile Thr 1085 1090 1095 Gln Val Phe Glu Met Asp Ile Ser Lys Gln Leu His Ala Tyr Glu 1100 1105 1110 Val Glu Tyr His Val Leu Gln Asp Glu Leu Gln Glu Ser Ser Tyr 1115 1120 1125 Ser Cys Glu Asp Ser Glu Thr Leu Glu Lys Leu Glu Arg Ala Asn 1130 1135 1140 Ser Gln Leu Lys Arg Gln Asn Met Asp Leu Leu Glu Lys Leu Gln 1145 1150 1155 Val Ala His Thr Lys Ile Gln Ala Leu Glu Ser Asn Leu Glu Asn 1160 1165 1170 Leu Leu Thr Arg Glu Thr Lys Met Lys Ser Leu Ile Arg Thr Leu 1175 1180 1185 Glu Gln Glu Lys Met Ala Tyr Gln Lys Thr Val Glu Gln Leu Arg 1190 1195 1200 Lys Leu Leu Pro Ala Asp Ala Leu Val Asn Cys Asp Leu Leu Leu 1205 1210 1215 Arg Asp Leu Asn Cys Asn Pro Asn Asn Lys Ala Lys Ile Gly Asn 1220 1225 1230 Lys Pro 1235 <210> 4 <211> 672 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Ala Asp Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Thr Ala Ser Gln Asp Val 1 5 10 15 Ala Asn Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val His 20 25 30 Glu Val Lys Asp His Lys Phe Ile Ala Arg Phe Phe Lys Gln Pro Thr 35 40 45 Phe Cys Ser His Cys Thr Asp Phe Ile Trp Gly Phe Gly Lys Gln Gly 50 55 60 Phe Gln Cys Gln Val Cys Cys Phe Val Val His Lys Arg Cys His Glu 65 70 75 80 Phe Val Thr Phe Ser Cys Pro Gly Ala Asp Lys Gly Pro Asp Thr Asp 85 90 95 Asp Pro Arg Ser Lys His Lys Phe Lys Ile His Thr Tyr Gly Ser Pro 100 105 110 Thr Phe Cys Asp His Cys Gly Ser Leu Leu Tyr Gly Leu Ile His Gln 115 120 125 Gly Met Lys Cys Asp Thr Cys Asp Met Asn Val His Lys Gln Cys Val 130 135 140 Ile Asn Val Pro Ser Leu Cys Gly Met Asp His Thr Glu Lys Arg Gly 145 150 155 160 Arg Ile Tyr Leu Lys Ala Glu Val Ala Asp Glu Lys Leu His Val Thr 165 170 175 Val Arg Asp Ala Lys Asn Leu Ile Pro Met Asp Pro Asn Gly Leu Ser 180 185 190 Asp Pro Tyr Val Lys Leu Lys Leu Ile Pro Asp Pro Lys Asn Glu Ser 195 200 205 Lys Gln Lys Thr Lys Thr Ile Arg Ser Thr Leu Asn Pro Gln Trp Asn 210 215 220 Glu Ser Phe Thr Phe Lys Leu Lys Pro Ser Asp Lys Asp Arg Arg Leu 225 230 235 240 Ser Val Glu Ile Trp Asp Trp Asp Arg Thr Thr Arg Asn Asp Phe Met 245 250 255 Gly Ser Leu Ser Phe Gly Val Ser Glu Leu Met Lys Met Pro Ala Ser 260 265 270 Gly Trp Tyr Lys Leu Leu Asn Gln Glu Glu Gly Glu Tyr Tyr Asn Val 275 280 285 Pro Ile Pro Glu Gly Asp Glu Glu Gly Asn Met Glu Leu Arg Gln Lys 290 295 300 Phe Glu Lys Ala Lys Leu Gly Pro Ala Gly Asn Lys Val Ile Ser Pro 305 310 315 320 Ser Glu Asp Arg Lys Gln Pro Ser Asn Asn Leu Asp Arg Val Lys Leu 325 330 335 Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly Lys 340 345 350 Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile Lys 355 360 365 Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys Thr 370 375 380 Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe Leu 385 390 395 400 Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe Val 405 410 415 Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln Val 420 425 430 Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile Ser 435 440 445 Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp Leu 450 455 460 Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala 465 470 475 480 Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg 485 490 495 Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr 500 505 510 Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu 515 520 525 Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp 530 535 540 Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser 545 550 555 560 Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His 565 570 575 Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg 580 585 590 Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg 595 600 605 Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala Glu 610 615 620 Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro Pro 625 630 635 640 Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly Phe 645 650 655 Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala Val 660 665 670 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 5 Leu Asp Ser Asp Ser His Tyr Gly Pro Gln His Leu Glu Ser Ile Asp 1 5 10 15 Asp <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 6 Asp Ser His Gln Thr Glu Glu Thr Leu 1 5 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide 3 <400> 7 Gln Gln Thr Leu Pro Glu Ser His Leu Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide 4 <400> 8 Gln Ala Leu Leu Asp Ser His Leu Pro Glu 1 5 10 <210> <211> <212> 9 9 PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide 5 <400> 9 Pro Ala Asp Gln Met Thr Asp Thr Pro 1 5 <210> 10 <211> 12 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> peptide 6 <400> 10 His Ile Pro Glu Glu Ala Gln Lys Val Ser Ala Val 1 5 10 <210> <211> <212> ? О 1 О ^ 11 7 PRT <213> artificial sequence <223> peptide 7 <400> 11 Ser Cys Ile Phe Leu Glu Gln 1 5 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 12 acaacttttc atggctccag t 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer <400> 13 ttggctcaga gacagttgaa a 21 <210> 14 <211> 337 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> PKCalpha domain <400> 14 Leu Thr Asp Phe Asn Phe Leu Met Val Leu Gly Lys Gly Ser Phe Gly 1 5 10 15 Lys Val Met Leu Ala Asp Arg Lys Gly Thr Glu Glu Leu Tyr Ala Ile 20 25 30 Lys Ile Leu Lys Lys Asp Val Val Ile Gln Asp Asp Asp Val Glu Cys 35 40 45 Thr Met Val Glu Lys Arg Val Leu Ala Leu Leu Asp Lys Pro Pro Phe 50 55 60 Leu Thr Gln Leu His Ser Cys Phe Gln Thr Val Asp Arg Leu Tyr Phe 65 70 75 80 Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Asp Leu Met Tyr His Ile Gln Gln 85 90 95 Val Gly Lys Phe Lys Glu Pro Gln Ala Val Phe Tyr Ala Ala Glu Ile 100 105 110 Ser Ile Gly Leu Phe Phe Leu His Lys Arg Gly Ile Ile Tyr Arg Asp 115 120 125 Leu Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile 130 135 140 Ala Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr 145 150 155 160 Arg Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala 165 170 175 Tyr Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu 180 185 190 Leu Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu 195 200 205 Asp Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys 225 230 235 240 His Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val 245 250 255 Arg Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn 260 265 270 Arg Glu Ile Gln Pro Pro Phe Lys Pro Lys Val Cys Gly Lys Gly Ala 275 280 285 Glu Asn Phe Asp Lys Phe Phe Thr Arg Gly Gln Pro Val Leu Thr Pro 290 295 300 Pro Asp Gln Leu Val Ile Ala Asn Ile Asp Gln Ser Asp Phe Glu Gly 305 310 315 320 Phe Ser Tyr Val Asn Pro Gln Phe Val His Pro Ile Leu Gln Ser Ala 325 330 335 Val <210> 15 <211> 1014 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> PCKalpha domain ctcacggact tcaatttcct catggtgttg ggaaagggga gttttggaaa ggtgatgctt gccgacagga agggcacaga agaactgtat gcaatcaaaa tcctgaagaa ggatgtggtg 120 attcaggatg atgacgtgga gtgcaccatg gtagaaaagc gagtcttggc cctgcttgac 180 aaacccccgt tcttgacgca gctgcactcc tgcttccaga cagtggatcg gctgtacttc 240 gtcatggaat atgtcaacgg tggggacctc atgtaccaca ttcagcaagt aggaaaattt 300 aaggaaccac aagcagtatt ctatgcggca gagatttcca tcggattgtt ctttcttcat 360 aaaagaggaa tcatttatag ggatctgaag ttagataacg tcatgttgga ttcagaagga 420 catatcaaaa ttgctgactt tgggatgtgc aaggaacaca tgatggatgg agtcacgacc 480 aggaccttct gtgggactcc agattatatc gccccagaga taatcgctta tcagccgtat 540 ggaaaatctg tggactggtg ggcctatggc gtcctgttgt atgaaatgct tgccgggcag 600 cctccatttg atggtgaaga tgaagacgag ctatttcagt ctatcatgga gcacaacgtt 660 tcctatccaa aatccttgtc caaggaggct gtttctatct gcaaaggact gatgaccaaa 720 cacccagcca agcggctggg ctgtgggcct gagggggaga gggacgtgag agagcatgcc 780 ttcttccgga ggatcgactg ggaaaaactg gagaacaggg agatccagcc accattcaag 840 cccaaagtgt gtggcaaagg agcagagaac tttgacaagt tcttcacacg aggacagccc 900 gtcttaacac cacctgatca gctggttatt gctaacatag accagtctga ttttgaaggg 960 ttctcgtatg tcaaccccca gtttgtgcac cccatcttac agagtgcagt atga 1014 <210> 16 <211> 64 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 gtacgaattc gccaccatgg attacaagga tgacgacgat aagctcacgg acttcaattt 60 cctc 64 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> artificial sequence <223> primer <400> 17 tagcggatcc tcatactgca ctctgtaaga tggg 34 <210> <211> <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> arginine rich peptide <400> 18 Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> arginine rich peptide <400> 19 Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro 1 5 10 15 <210> 20 <211> 16 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> antennapedia peptide <400> 20 Arg Gln Ile Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys 1 5 10 15 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> HIV-Tat <400> 21 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Молекула, предотвращая связывание аРКС (протеинкиназа С альфа типа) с ALMS1 (белок синдрома Альстрёма 1), для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. 2. Молекула для применения по п. 1, отличающаяся тем, что молекула предназначена для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета 2 типа. 3. Молекула для применения по п. 1 или 2, отличающийся тем, что молекула не препятствует связыванию TBC1D4 с ALMS1. 4. Молекула для применения по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что молекула выбрана из группы, состоящей из пептидов или полипептидов или пептидомиметиков, антител, их фрагментов или производных, аптамеров, шпигельмеров и химических соединений. 5. Молекула для применения по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид длиной менее, чем 50 аминокислот, предпочтительно, менее, чем 20 аминокислот. 6. Молекула для применения по п. 5, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1 (SEQ IDNO: 1). 7. Молекула для применения по п. 6, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента ALMS1, включающий один или несколько из остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с аРКС, в частности, один или несколько из остатков, выбранных из перечня, состоящего из Е17, D58, S59, G62, Н65, L66, Q736, Т737, Е738, D828, S829, Т1088, D1089, А1169, Q1170, F2882, L2883 и Е2884. 8. Молекула для применения по п. 6 или 7, отличающийся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий или состоящий из одной из следующих последовательностей: - LDSDSHYGPQHLESIDD (SEQ ID NO: 5); - DSHQTEETL (SEQ ID NO: 6); - QQTLPESHLP (SEQ ID NO: 7); - QALLDSHLPE (SEQ ID NO: 8); - PADQMTDTP (SEQ ID NO: 9); - HIPEEAQKVSAV (SEQ ID NO: 10); - SCIFLEQ (SEQ ID NO: 11), и - их фрагмента, содержащего 6 смежных аминокислот. 9. Молекула для применения по п. 5, отличающаяся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС (SEQ ID NO: 4). 10. Молекула для применения по п. 9, отличающаяся тем, что молекула представляет собой пептид, содержащий аминокислотную последовательность фрагмента аРКС, включающую один или несколько из числа остатков, которые, согласно прогнозам, опосредуют взаимодействие с ALMS1, в частности, один или несколько из числа остатков выбранных из списка, состоящего из F114, D116, С118, L121, N138, Q142, 1145, Р148, G433, Е545, S562, S566, F597, D601, W602, К604, Е606, G620, Т631, V664 и 1667. 11. Способ in vitro или ex vivo идентификации молекул, подходящих для применения при лечении или замедлении прогрессирования или отсрочки возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии, отличающийся тем, что тестировали способность молекулы предотвращать связывание аРКС с ALMS1 и отбирали молекулы, способные предотвращать это связывание. 12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что способ дополнительно включает стадию, в которой тестируется способность выбранной молекулы мешать связыванию TBC1D4 с ALMS1 и в которой отбираются молекулы, которые не мешают связыванию. 13. Способ по п. 11 или 12, отличающийся тем, что связывание определяют в клеточной системе в ответ на инсулин. 14. Способ по любому одному из пп. 11-13, отличающийся тем, что связывание определяют в присутствии и/или в отсутствие инсулина. 15. Молекула по любому из пп. 6-8 и 10 для применения в качестве лекарственного средства. 16. Молекула, увеличивающая экспрессию ALMS1 или усиливающая связывание TBC1D4 с ALMS1 для применения при лечении или задержке развития или возникновения сахарного диабета, резистентности к инсулину, диабетической ретинопатии, диабетической невропатии, диабетической нефропатии, резистентности к инсулину, гипергликемии, ожирения и гиперинсулинемии. 10. го о о го о; х окрашенные адипоциты окрашенные адипоциты го с; о> н- го о о го те о; 2-х месячные самцы д. т. 6-ти месячные самцы сердце печень мышцы жиробвеаляа?кань *//// Ж •# //// 3-х недельные зрелые адипоциты к , чг кшРНК \ Ms] кшРНК ШШш, уровни флуоресценции (r)*ш CTRL.KLLlPHK L\S -INS (30 МИН) 5 1 AS'! 1J ¦ И О- (tm) - (tm) CTRL -ALMSl кшРНК кшРНК АК'1 ALM5I КШРНК -t\s (30 МИН) АКТ 6/13 CTRL. КШРНК ALMS1 КШРНК -INS. HNS 30 МИН. -INS. flNS. 30 МИН. IRA ¦ ¦* - "* wil B-TUB - as TBC1D4I .pJBCID DYNAMTN RAR14 'RAHJti l\s 30 мин ТВСШ4 ^^^^^^^^^^^^^^^ - -- - - lllellllillil альфа-актинин ннн ИГ. О (продолжение) Фиг 6 в отсутствие инсулина глюкоза .1 /Т6 ". ±4- микротрубо^ка СаРКС* P0KV2 актиноЕ *" филамс * в присутствие инсулина глюкоза ' , 1 | • ?йд|"*т липогенез * гликем~ '. глюкоза' <ь> - /г - / / 7 микротрубочка 5*0412 - * актиновыи филамент культуральная среда культуралыная +/- 30 мин. + INS / лентивирусная среда - INS перед тестами инфекция , , т Ў т дни (19) (19) (19) <220> <220> <220> <220> 1/13 1/13 Фиг. 1 Фиг. 1 1/13 1/13 Фиг. 1 Фиг. 1 1/13 1/13 Фиг. 1 Фиг. 1 1/13 1/13 Фиг. 1 Фиг. 1 2/13 2/13 Фиг. 2 Фиг. 2 2/13 2/13 Фиг. 2 Фиг. 2 2/13 2/13 Фиг. 2 Фиг. 2 2/13 2/13 Фиг. 2 Фиг. 2 ФИГ. 2 (продолжение) ФИГ. 2 (продолжение) 4/13 4/13 Фиг. 3 Фиг. 3 Фиг. 4 Фиг. 4 ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) ФИГ. 4 (продолжение) 7/13 7/13 8/13 8/13 8/13 8/13 8/13 8/13 9/13 9/13 11/13 11/13 ФИГ. 7 (продолжение) ФИГ. 7 (продолжение) 11/13 11/13 ФИГ. 7 (продолжение) ФИГ. 7 (продолжение) 11/13 11/13 ФИГ. 7 (продолжение) ФИГ. 7 (продолжение) 11/13 11/13 ФИГ. 7 (продолжение) ФИГ. 7 (продолжение) 11/13 11/13 ФИГ. 7 (продолжение) ФИГ. 7 (продолжение) 12/13 12/13 13/13 13/13 Фиг. 9 Фиг. 9
|