[RU]

В настоящем изобретении предложены ингибиторы С5а для применения при лечении пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложено применение ингибиторов С5а для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложены способы лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии, включающие этап введения терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом.

(57) Реферат / Формула:

В настоящем изобретении предложены ингибиторы С5а для применения при лечении пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложено применение ингибиторов С5а для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложены способы лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии, включающие этап введения терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом.

---

Евразийское (21) 201691481 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K14/47 (2006.01)
2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.03.20
(54) ИНГИБИТОРЫ C5a ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ПНЕВМОНИИ
(31) 14160947.9
(32) 2014.03.20
(33) EP
(86) PCT/EP2015/055947
(87) WO 2015/140304 2015.09.24
(71) Заявитель: ИНФЛАРКС ГМБХ (DE)
(72) Изобретатель:
Гуо Ренфенг (US), Ридеманн Нильс Кристоф (DE)
(74) Представитель:
Нилова М.И. (RU) (57) В настоящем изобретении предложены ингибиторы С5а для применения при лечении пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложено применение ингибиторов С5а для получения фармацевтической композиции, предназначенной для лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложены способы лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии, включающие этап введения терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом.
ИНГИБИТОРЫ С5А ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ПНЕВМОНИИ
В настоящем изобретении предложены ингибиторы С5а для применения при лечении пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложено применение ингибиторов С5а для получения фармацевтической композиции, 5 предназначенной для лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии. В настоящем изобретении также предложены способы лечения пневмонии, в особенности вирусной пневмонии, включающие этап введения терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом.
10 Уровень техники
С5а
Пептид С5а отщепляется от С5 при активации комплемента. Из всех продуктов активации комплемента С5а является одним из наиболее активных провоспалительных
15 пептидов с широким спектром функций (Guo RF, and Ward PA. 2005. Annu. Rev. Immunol. 23:821-852). C5a представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 11,2 кДа, который присутствует в крови здоровых людей. Полипептидная часть С5а содержит 74 аминокислоты, молекулярная масса которых составляет 8,2 кДа, в то время как углеводная часть составляет приблизительно 3 кДа. С5а действует посредством
20 высокоаффинных рецепторов С5а (C5aR и C5L2) (Ward РА. 2009. J. Mol. Med. 87(4):375-378). C5aR принадлежит к семейству рецепторов, связанных с G-белком, родопсинового типа с семью трансмембранными сегментами; C5L2 аналогичен C5aR, но не связан с G-белком. В настоящее время полагают, что С5а выполняет свои биологические функции в первую очередь за счет взаимодействия C5a-C5aR, поскольку для взаимодействия С5а-
25 C5L2 было обнаружено лишь несколько видов биологического ответа. C5aR широко экспрессируется на миелоидных клетках, включая нейтрофилы, эозинофилы, базофилы и моноциты, а также на немиелоидных клетках во многих органах, в частности, в легких и печени, что указывает на важность передачи сигналов с участием C5a/C5aR. С5а обладает множеством биологических функций (Guo and Ward, 2005, см. выше). С5а является
30 сильным хемоаттрактантом для нейтрофилов, а также обладает хемотаксической активностью в отношении моноцитов и макрофагов. С5а вызывает окислительный взрыв (потребление О2) в нейтрофилах и усиливает фагоцитоз и высвобождение ферментов из гранул. Также было установлено, что С5а обладает сосудорасширяющим действием. Было показано, что С5а участвует в модуляции экспрессии цитокинов в различных типах клеток
35 для усиления экспрессии молекул адгезии на нейтрофилах. Было установлено, что С5а
оказывает крайне нежелательное действие при чрезмерной выработке при патологических состояниях, поскольку он является сильным индуктором и стимулятором воспалительных ответов, который функционирует на более ранних этапах цепочки воспалительных реакций. Высокие дозы С5а могут привести к неспецифичной хемотаксической 5 "десенсибилизации" нейтрофилов, вызывая тем самым обширное нарушение функций (Huber-LangMetal. 2001. J. Immunol. 166(2): 1193-1199).
Как сообщалось, С5а вызывает многочисленные провоспалительные ответы. Например, С5а стимулирует синтез и высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-6, ИЛ-8, и ингибирующего миграцию макрофагов фактора
10 (MIF) из лейкоцитов человека (Hopken U et al. 1996. Eur J Immunol 26(5): 1103-1109; Riedemann NC et al. 2004. J Immunol 173(2): 1355-1359; Strieter RM et al. 1992. Am J Pathol 141(2):397-407). C5a совместно с ЛПС оказывает сильное синергетическое действие на выработку ФНО-а, макрофагального воспалительного белка (М1Р)-2, цитокин-индуцированного хемоаттрактанта нейтрофилов (CINC)-l и ИЛ-ip в клетках эпителия
15 альвеол (Riedemann NC et al. 2002. J. Immunol. 168(4): 1919-1925; Rittirsch D et al. 2008. Nat Rev Immunol 8(10):776-787).
Также было доказано, что блокада С5а приводит к защитному эффекту в экспериментальных моделях сепсиса и во многих других моделях воспаления, таких как повреждение в результате ишемии/реперфузии, заболевание почек, отторжение
20 трансплантата, малярия, ревматоидный артрит, инфекционное заболевание кишечника, воспалительное заболевание легких, аутоиммунные заболевания, сходные с волчанкой, нейродегенеративное заболевание и т.д., у животных различных видов, которые частично рассматриваются в Klos A. et al (Klos A. et al. 2009. Mol Immunol 46(14):2753-2766) и Allegretti M. et al (Allegretti M et al. 2005. Curr Med Chem 12(2):217-236). Также недавно
25 было установлено, что блокада С5а обеспечивает значительный терапевтический эффект в модели опухоли у мышей (Markiewski MM et al. 2008. Nat Immunol 9(11): 1225-1235). Вирус птичьего гриппа
Новый вирус птичьего гриппа H7N9 появился в Китае в феврале 2013 года, и в общей сложности до ноября 2013 года достоверно известно про 139 пациентов с 45
30 смертельными случаями (ВОЗ. Инфицирование человека вирусом птичьего гриппа А (H7N9) - обновленная информация http://www.who.int/csr/don/2013_ll_06/en/ index.html (по состоянию на 16 ноября 2013 года)). Наиболее тяжелые клинические случаи инфицирования вирусом H7N9 сопровождались симптомами вирусной пневмонии с острым повреждением легких (ОПЛ), с последующим развитием тяжелой дыхательной
35 недостаточности и острого респираторного дистресс-синдрома (РДС), при этом
патофизиология была аналогична патофизиологии у пациентов, инфицированных ВШИ (высокопатогенным вирусом птичьего гриппа) H5N1, или вирусом, вызывающим тяжелый острый респираторный синдром (SARS) (Beigel JH et al. 2005. N Engl J Med 353:1374-1385; Ip WK, et al. 2005. J Infect Dis 191:1697-1704). До настоящего времени не было найдено 5 терапевтических стратегий для эффективного лечения перечисленных заболеваний. Накопленные результаты исследований позволяют предположить, что у пациентов с тяжелой инфекцией вирусом гриппа происходила активация комплемента, которая была тесно связана с уровнями провоспалительных медиаторов и повреждением легких. Сообщалось, что у пациентов с тяжелой инфекцией вирусом pdmHINI (пандемический
10 вирус гриппа H1N1) происходила сильная системная активация комплемента с увеличенной выработкой провоспалительных медиаторов (Berdal JE et al. 2011. J. Infect. 63(4):308-16; Ohta R et al. 2011. Microbiol. Immunol. 55(3): 191-8). Помимо этого, предыдущие исследования авторов настоящего изобретения выявили, что уровни продуктов активации комплемента в срезах ткани легких и образцах плазмы крови были в
15 значительной степени увеличены в модели инфекции H5N1 у мышей, и что патофизиология ОПЛ может быть обусловлена, по меньшей мере частично, активацией комплемента и сопутствующими продуктами активации, такими как СЗа и С5а (Sun, S. et al. 2013. Am J Respir Cell Mol Biol 49: 221-230).
Система комплемента является центральной частью иммунной системы при защите
20 организма хозяина от вторжения патогенов и при выведении потенциально вредных продуктов разрушения клеток. Однако чрезмерная активация комплемента может быть вредной, поскольку это может способствовать протеканию неконтролируемых воспалительных реакций и привести к повреждению тканей (Daniel Ricklin & John D Lambris. 2013 J Immunol 190(8):3831-8). Комплемент стал интересной и перспективной
25 мишенью для лечения различных клинических состояний, таких как повреждение при ишемии/реперфузии (I/R), реакции при трансплантации и аутоиммунные заболевания (Lu F. et al. 2013. Cardiovasc. Pathol. 22:75-80; Tillou, X. et al. 2010. Kidney Int. 78:152-159; Manderson AP, et al. 2004. Annu Rev Immunol 22:431-456). Поскольку роль активации комплемента в клиническом исходе патоген-индуцированных заболеваний может быть
30 более сложной вследствие разнообразия биологических характеристик патогенов, включая их распространение и патогенность, а также потенциальной "двойной роли" активации комплемента при патоген-индуцированных иммунных ответах, то для разработки ингибиторов комплемента, предназначенных для лечения патоген-ассоциированных воспалительных заболеваний, важно рассмотреть вопрос о сохранении
функции выведения патогена при одновременном ингибировании воспаления и повреждения ткани.
Продукт активации комплемента С5а оказывает главным образом провоспалительное действие и опосредует сильные провоспалительные и модулирующие 5 сигналы во многих моделях заболеваний (Klos A. et al. 2009, см. выше). В настоящее время многие терапевтические соединения, нацеленные на С5а или C5aR, такие как ингибитор С5а, С5аГР, антагонисты C5aR, РМХ53 и ССХ168, были испытаны в доклинических моделях и продемонстрировали многообещающие терапевтические преимущества при трансплантации, сепсисе, артрите, васкулите почек и раке (Woodruff,
10 Т.М. et al. 2011. Mol. Immunol. 48:1631-1642; Okada, N. et al. 2012. Clin. Exp. Pharmacol. 2:114; Tokodai, K. et al. 2010. Transplantation 90:1358-1365; Kohl, J. 2006. Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 529-538). Также было показано, что блокада рецепторов С5а или С5а с помощью антител подавляла чрезмерные иммунные ответы в модели инфекции Plasmodium berghei ANKA (РЬА) у мышей (Patel, S.N. et al. 2008. J. Exp. Med. 205:1133-1143). Аналогичным
15 образом, предыдущее исследование авторов настоящего изобретения с использованием модели вирусной пневмонии HPAI H5N1 у мышей выявило, что лечение с применением агента против С5а значительно ослабляло повреждение легких и улучшало выживаемость (Sun, S. et al. 2013, выше). Поскольку мембрано-атакующий комплекс (MAC) играет существенную роль в ответах врожденной иммунной системы на вторжение патогенов,
20 как представляется, целесообразно применять стратегию блокады С5а для ингибирования воспалительных ответов, вызванных инфекцией патогеном, не нарушая при этом образование MAC.
ТЕХНИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ, ЛЕЖАЩИЕ В ОСНОВЕ НАСТОЯЩЕГО 25 ИЗОБРЕТЕНИЯ
Одна из проблем, лежащих в основе настоящего изобретения, заключалась в
обеспечении терапевтических подходов для лечения вирусной пневмонии, в частности для
лечения вирусной пневмонии, вызванной новым вирусом птичьего гриппа H7N9.
30 До сих пор не были проведены исследования эффективности лечения вирусной
пневмонии, вызванной новым вирусом птичьего гриппа H7N9, с применением агентов, направленных против С 5 а. Предыдущие исследования были сосредоточены на других типах вируса птичьего гриппа (H5N1; ср. Sun, S. et al. 2013, см. выше) и проводились с применением только модели на мышах для исследования вирусной пневмонии, вызванной
вирусом птичьего гриппа. Положительные результаты, полученные с помощью модели на мышах, не всегда могут быть получены при фактическом лечении пациентов-людей.
Авторы настоящей заявки применили IFX-1, высокоэффективное нейтрализующее моноклональное антитело (МАТ) к С5а человека, которое в настоящее время находится в 5 процессе клинической разработки, в модели инфекции вирусом H7N9 у обезьян, чтобы изучить терапевтический потенциал ингибирования комплемента при лечении тяжелой пневмонии, индуцированной вирусом H7N9. Насколько известно авторам настоящего изобретения, лечение вирусной пневмонии с применением агента против С5а впервые было исследовано в рамках настоящего изобретения в модели заболевания у обезьян.
10 Данные в экспериментальной части, приведенной ниже, свидетельствуют о том, что
при инфицировании H7N9 происходит избыточная активация комплемента и это связано с развитием ОПЛ (острого повреждения легких) и системного воспаления.
Авторы настоящего изобретения установили, что лечение с применением терапии, направленной против С5а, у Н7М9-инфицированных обезьян в значительной степени
15 ослабляло ОПЛ и привело к сильному снижению повреждения легких, на основании оценок гистопатологических исследований, а также снижению инфильтрации макрофагов и нейтрофилов в легкие по сравнению с инфицированными африканскими зелеными мартышками (АЗМ), не получавшими лечения. Помимо этого, тяжесть инфекционного SIRS (синдрома системного воспалительного ответа), вызванного H7N9, была заметно
20 снижена в результате лечения с применением IFX-1, о чем свидетельствует значительное снижение повышения температуры тела и уровней воспалительных медиаторов в плазме крови. Титры вируса в инфицированных легких африканских зеленых мартышек неожиданно уменьшились в результате лечения с применением IFX-1. Полученный результат был неожиданным, поскольку не известен механизм, который указывал бы на
25 участие С5а в репликации вируса.
Полученные результаты позволяют предположить, что ингибирование комплемента является весьма перспективной стратегией для дополнительного лечения тяжелой вирусной пневмонии. Терапевтическое действие, связанное с введением ингибитора С5а, является настолько выраженным, что монотерапия вирусной пневмонии на основе
30 ингибитора С5а также, по-видимому, является возможной.
Приведенный выше обзор не обязательно описывает все преимущества настоящего изобретения и задачи, которые можно решить с его помощью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно первому аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для применения в уменьшении вирусной нагрузки или уменьшении острого повреждения 5 легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для применения в лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный ингибитор предназначен для использования в качестве монотерапии.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для 10 применения в лечении вирусной пневмонии у субъекта, причем вирусная пневмония у субъекта вызвана вирусом H7N9.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для применения в лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный субъект является приматом, предпочтительно человекообразной 15 обезьяной, более предпочтительно человеком.
Краткое описание изобретения, приведенное выше, не обязательно описывает все признаки настоящего изобретения.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Определения
Несмотря на то, что настоящее изобретение будет подробно описано ниже, следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено конкретной методологией, протоколами и реагентами, описанными в настоящем документе, поскольку они могут
25 варьироваться. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящем документе, предназначена для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, которое будет ограничено только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют те же
30 значения, которые обычно понятны специалисту в данной области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.
Предпочтительно термины, используемые в настоящем документе, определены в соответствии с описанием, приведенным в "А multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations))), Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Kolbl, H. eds. (1995),
3 5 Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland).
В описании и формуле настоящего изобретения, которые представлены ниже, если из контекста не следует иное, слово "содержать" и его варианты, такие как "содержит" и "содержащий", подразумевают включение указанного целого числа или этапа, или группы целых чисел или этапов, но не исключение любого другого целого числа или 5 этапа, или группы целых чисел или этапов.
Несколько документов (например: патенты, заявки на патенты, научные публикации, спецификации производителя, инструкции, номера доступа в GenBank, представления последовательностей и т.д.) упомянуты в тексте настоящего описания. Содержание настоящего документа не должно быть истолковано как допущение того, что изобретение
10 не имеет полномочий датировать задним числом такое раскрытие на основании предшествующего изобретения. Некоторые из документов, упомянутых в настоящем документе, описаны как "включенные посредством ссылки". В случае противоречия между определениями или принципами включенных ссылок и определениями или принципами, перечисленными в настоящем описании, текст настоящего описания имеет
15 приоритет.
Последовательности: все последовательности, упомянутые в настоящем документе, описаны в прилагаемом списке последовательностей, который является частью данного описания, включая его полное содержание и раскрытие.
В настоящей заявке термин "С5а человека" относится к 74 аминокислотному
20 пептиду ниже:
TLQKKIEEIA AKYKHSVVKK CCYDGACVNN DETCEQRAARISLGPRCIKA FTECCVVASQ LRANISHKDM QLGR (SEQ ID NO: 1).
В настоящей заявке термин "С5а человека" относится к гликозилированным формам и дегликозилированным формам указанного 74 аминокислотного пептида. В настоящей
25 заявке термины "С5а человека" и "hC5a" используются как взаимозаменяемые.
В настоящей заявке термин "ингибитор С5а" относится к соединению, которое ингибирует биологическую активность С 5 а. Термин "ингибитор С 5 а", в частности, относится к соединению, которое препятствует связыванию С5а с рецепторами С5а, C5aR и C5L2; особенно к соединению, которое препятствует связыванию С5а с C5aR.
30 Соответственно, термин "ингибитор С 5 а" включает соединения, которые специфично связываются с С5а и ингибируют связывание С5а с C5aR, а также соединения, которые специфично связываются с C5aR и ингибируют связывание С5а с C5aR. Типичные ингибиторы С5а включают ингибиторный пептид С5а (С5а1Р), селективные антагонисты рецепторов С5а, РМХ53 и ССХ168, а также антитела к С5а, раскрытые в публикации WO
35 2011/063980 А1 (также опубликованной как патент США 2012/0231008 А1). В настоящей
заявке термины "ингибитор С5а" и "С5а ингибитор" используются как взаимоз аменяемые.
В настоящей заявке термин "связывающая молекула" относится к любой молекуле или части молекулы, которая может специфично связываться с молекулой-мишенью или 5 эпитопом-мишенью. Предпочтительные связывающие молекулы, применительно к настоящей заявке, представляют собой: (а) антитела или их антигеневязывающие фрагменты; (Ь) олигонуклеотиды; (с) антителоподобные белки; или (d) пептидомиметики. Типичные "связывающие молекулы", которые являются особенно подходящими для реализации настоящего изобретения, способны связываться с конформационным
10 эпитопом С5а человека, который образован двумя аминокислотными последовательностями NDETCEQRA (SEQ ID N0: 2) и SHKDMQL (SEQ ID NO: 3). Дополнительные типичные "связывающиемолекулы", которые являются особенно подходящими для реализации настоящего изобретения, способны связываться с конформационным эпитопом С5а человека, который образован двумя аминокислотными
15 последовательностями DETCEQR (SEQ ГО N0: 4) и HKDMQ (SEQ ГО N0: 5).
В настоящей заявке первое соединение (например, антитело), как полагают, "связывается" со вторым соединением (например, антигеном, таким как белок-мишень), если оно имеет константу диссоциации Kd в отношении указанного второго соединения 1 мМ или менее, предпочтительно 100 мкМ или менее, предпочтительно 50 мкМ или
20 менее, предпочтительно 30 мкМ или менее, предпочтительно 20 мкМ или менее, предпочтительно 10 мкМ или менее, предпочтительно 5 мкМ или менее, более предпочтительно 1 мкМ или менее, более предпочтительно 900 нМ или менее, более предпочтительно 800 нМ или менее, более предпочтительно 700 нМ или менее, более предпочтительно 600 нМ или менее, более предпочтительно от 500 нМ или менее, более
25 предпочтительно 400 нМ или менее, более предпочтительно от 300 нМ или менее, более предпочтительно от 200 нМ или менее, еще более предпочтительно 100 нМ или менее, еще более предпочтительно 90 нМ или менее, еще более предпочтительно 80 нМ или менее, еще более предпочтительно 70 нМ или менее, еще более предпочтительно 60 нМ или менее, еще более предпочтительно 50 нМ или менее, еще более предпочтительно 40
30 нМ или менее, еще более предпочтительно 30 нМ или менее, еще более предпочтительно 20 нМ или менее, и еще более предпочтительно 10 нМ или менее.
Термин "связывание" в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно относится к специфичному связыванию. Термин "специфичное связывание" означает, что связывающая молекула (например, антитело) связывается прочнее с мишенью, такой как
35 эпитоп, в отношении которой она специфична, по сравнению со связыванием с другой
мишенью. Связывающая молекула связывается сильнее с первой мишенью по сравнению со второй мишенью, если она связывается с первой мишенью с константой диссоциации (Kd), которая ниже константы диссоциации для второй мишени. Предпочтительно константа диссоциации (Kd) для мишени, с которой связывающая молекула специфично 5 связывается, более чем в 10 раз, предпочтительно более чем в 20 раз, более предпочтительно более чем в 50 раз, еще более предпочтительно более чем в 100 раз, 200 раз, 500 раз или 1000 раз ниже константы диссоциации (Kd) для мишени, с которой связывающая молекула не связывается специфично.
В настоящей заявке термин "Kd" (обычно измеряется в "моль/л", иногда сокращенно
10 обозначается "М") предназначен для обозначения равновесной константы диссоциации конкретного взаимодействия связывающей молекулы (например, антитела или его фрагмента) и молекулы-мишени (например, антигена или эпитопа). Применительно к настоящей заявке значение "Kd" определяют методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore(tm)) при комнатной температуре (25 °С).
15 "Эпитоп", также известный как антигенная детерминанта, является частью
макромолекулы, которая распознается иммунной системой, в частности, антителами, В-клетками или Т-клетками. В настоящей заявке "эпитоп" является частью макромолекулы, способной связываться со связывающей молекулой (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом), как описано в настоящем документе. Применительно
20 к эпитопу, термин "связывание" предпочтительно относится к специфичному связыванию. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты, или боковых цепей Сахаров, и, как правило, имеют специфичные трехмерные структурные характеристики, а также специфичные характеристики зарядов. Конформационные и неконформационные эпитопы
25 можно различать на основании того факта, что связывание с первым вариантом, но не последним вариантом теряется в присутствии денатурирующих растворителей.
В настоящей заявке термин "конформационный эпитоп" относится к эпитопу линейной макромолекулы (например, полипептида), который образован трехмерной структурой указанной макромолекулы. Применительно к настоящей заявке,
30 "конформационный эпитоп" представляет собой "прерывистый эпитоп", то есть конформационный эпитоп на макромолекуле (например, на полипептиде), который образуется из по меньшей мере двух отдельных участков в первичной последовательности макромолекулы (например, аминокислотной последовательности полипептида). Другими словами, эпитоп считается "конформационным эпитопом", применительно к настоящему
35 изобретению, если эпитоп состоит из по меньшей мере двух отдельных участков в
первичной последовательности, с которыми связывающая молекула согласно настоящему изобретению (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается одновременно, причем указанные по меньшей мере два отдельных участка прерваны одним или более участками в первичной последовательности, с которыми связывающая 5 молекула согласно настоящему изобретению не связывается. Предпочтительно указанный "конформационный эпитоп" присутствует на полипептиде, и два отдельных участка в первичной последовательности представляют собой две отдельные аминокислотные последовательности, с которыми связывается связывающая молекула согласно настоящему изобретению (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент),
10 причем указанные по меньшей мере две отдельные аминокислотные последовательности прерваны одной или более аминокислотными последовательностями в первичной последовательности, с которыми связывающая молекула согласно настоящему изобретению не связывается. Предпочтительно прерывающая аминокислотная последовательность представляет собой непрерывную аминокислотную
15 последовательность, содержащую две или более аминокислот, с которыми связывающая молекула не связывается. Указанные по меньшей мере две отдельные аминокислотные последовательности, с которыми связывается связывающая молекула согласно настоящему изобретению, не имеют конкретных ограничений в отношении их длины. Подходящая отдельная аминокислотная последовательность может состоять только из
20 одной аминокислоты до тех пор, пока общее количество аминокислот в указанных по меньшей мере двух отдельных аминокислотных последовательностях достаточно велико для осуществления специфичного связывания между связывающей молекулой и конформационным эпитопом.
"Паратоп" является частью антитела, которая связывается с эпитопом.
25 Применительно к настоящему изобретению "паратоп" является частью связывающей молекулы (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента), описанной в настоящем документе, который связывается с эпитопом.
Термин "антитело", как правило, относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, соединенные между собой
30 дисульфидными связями, или к его антигенсвязывающей части. Термин "антитело" также включает все рекомбинантные формы антител, в частности антитела, описанные в настоящем документе, например, антитела, экспрессированные у прокариот, негликозилированные антитела, антитела, экспрессированные у эукариот (например, в клетках СНО), гликозилированные антитела, а также любые антигенсвязывающие
35 фрагменты антител и их производные, описанные ниже. Каждая тяжелая цепь состоит из
вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе VH или VH) И константной области тяжелой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе СН или Сн). Константная область тяжелой цепи может быть далее подразделена на три части, называемые CHI, СН2 и СНЗ (или Сн1, Сн2 и СнЗ). Каждая 5 легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе VL или VL) И константной области легкой цепи (сокращенно обозначенной в настоящем документе CL или CL). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на участки гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплиментарность (CDR), перемежающиеся с участками, которые
10 являются более консервативными, так называемыми каркасными участками (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание
15 иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
В настоящей заявке термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела (или просто "связывающая часть") относится к одному или более фрагментам антитела, которые
20 сохраняют способность специфично связываться с антигеном. Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена фрагментами полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, которые включены в термин "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) фрагменты Fab, моновалентные фрагменты, состоящие из областей VL, VH, CL и СН; (ii) фрагменты
25 F(ab')2, двухвалентные фрагменты, содержащие два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ш) фрагменты Fd, состоящие из областей VH и СН; (iv) фрагменты Fv, состоящие из областей VL и VH одного плеча антитела, (v) фрагменты dAb (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), которые состоят из области VH; (vi) выделенные участки, определяющие комплиментарность (CDR), и (vii) комбинации
30 двух или более выделенных CDR, которые необязательно могут быть соединены синтетическим линкером. Помимо этого, несмотря на то, что две области фрагмента Fv, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены, с использованием рекомбинантных способов, синтетическим линкером, который позволяет получить их в виде одной белковой цепи, в которой области VL и VH спариваются с образованием
35 одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv), см., например, Bird et
al. (1988) Science 242: 423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 58795883). Указанные одноцепочечные антитела также включены в термин "антигенсвязывающий фрагмент" антитела. Другой пример включает гибридный белок связывающей области и части иммуноглобулина, содержащий (i) полипептид 5 связывающей области, который гибридизован с полипептидом шарнирной области иммуноглобулина, (ii) константную область СН2 тяжелой цепи иммуноглобулина, гибридизованную с шарнирной областью, и (ш) константную область СНЗ тяжелой цепи иммуноглобулина, гибридизованную с константной областью СН2. Полипептид связывающей области может представлять собой вариабельную область тяжелой цепи или
10 вариабельную область легкой цепи. Гибридные белки, содержащие связывающую область и часть иммуноглобулина, подробно описаны в патентах США 2003/0118592 и 2003/0133939. Указанные фрагменты антител получают с использованием стандартных методик, известных специалистам в данной области техники, и фрагменты подвергают скринингу для оценки их полезных свойств аналогичным способом, как и интактные
15 антитела. Другие примеры "антигенсвязывающих фрагментов" включают так называемые микроантитела, которые получены из отдельных CDR. Например, в работе Heap et al., 2005, описано микроантитело, содержащее 17 аминокислотных остатков, полученное из участка CDR3 тяжелой цепи антитела, направленного к гликопротеину оболочки gpl20 ВИЧ-1 (Heap С.J. et al. (2005) Analysis of a 17-amino acid residue, virus-neutralizing
20 microantibody. J. Gen. Virol. 86:1791-1800). Другие примеры включают небольшие миметики антител, содержащие два или более участков CDR, которые гибридизованы друг с другом, предпочтительно с помощью когнатных каркасных участков. Такой небольшой миметик антител, содержащий CDR1 VH и CDR3 VL, связанные когнатным участком FR2 VH, был описан Qiu et al., 2007 (Qiu X.-Q. et al. (2007) Small antibody
25 mimetics comprising two complementary-determining regions and a framework region for tumor targeting. Nature biotechnology 25(8):921-929).
Следовательно, в настоящей заявке термин "антитело или его антигенсвязывающий фрагмент" относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным частям молекул иммуноглобулинов, то есть молекулам, которые содержат сайт
30 связывания антигена, который иммунологически специфично связывается с антигеном. Термин также включает иммуноглобулинподобные белки, которые отобраны с помощью методик, включающих, например, фаговый дисплей, чтобы специфично связать молекулу-мишень или эпитоп-мишень, например, конформационный эпитоп С5а человека, образованный аминокислотными последовательностями в соответствии с SEQ Ш NO: 2 и
35 SEQ Ш NO: 3; или конформационный эпитоп С5а человека, образованный
аминокислотными последовательностями DETCEQR (SEQ Ш NO: 4) и HKDMQ (SEQ Ш NO: 5). Молекулы иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению могут принадлежать к любому типу (например, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и МГГ), классу (например, IgGl, IgG2, предпочтительно IgG2a и IgG2b, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2) или 5 подклассу молекул иммуноглобулинов.
Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, пригодные для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены из любого животного, включая птиц и млекопитающих. В предпочтительном варианте антитела или фрагменты получены от человека, шимпанзе, грызунов (например, мышей, крыс, морских свинок или
10 кроликов), курицы, индейки, свиньи, овцы, козы, верблюда, коровы, лошади, осла, кота или собаки. В особенно предпочтительном варианте антитела получены от человека или мыши. Антитела согласно настоящему изобретению также включают химерные молекулы, в которых константная область антитела, полученная из одного вида, предпочтительно человека, комбинирована с антигенсвязывающим сайтом, полученным
15 из другого вида, например, мыши. Также антитела согласно настоящему изобретению включают гуманизированные молекулы, в которых антигенсвязывающие сайты антитела, полученного из вида, отличного от человека (например, мыши), комбинированы с константными областями или каркасными участками, полученными от человека.
В качестве примера, антитела согласно настоящему изобретению могут быть
20 получены непосредственно из гибридом, которые экспрессируют антитела, или могут быть клонированы и рекомбинантно экспрессированы в клетке-хозяине (например, клетке СНО или лимфоцитарной клетке). Другие примеры клеток-хозяев включают микроорганизмы, такие как E.coli, и грибки, такие как дрожжи. В другом варианте, антитела согласно настоящему изобретению могут быть получены рекомбинантным
25 способом в трансгенных животных или растениях.
Термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых одна часть каждой из аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей гомологична соответствующим последовательностям в антителах, полученных из конкретного вида или принадлежащих к конкретному классу, в то время как оставшийся сегмент цепи
30 гомологичен соответствующим последовательностям другого вида или класса. Как правило, вариабельная область легкой и тяжелой цепей имитирует вариабельные области антител, полученных из одного вида млекопитающих, тогда как константные участки гомологичны последовательностям антител, полученных из другого вида. Одним из очевидных преимуществ таких химерных форм является то, что вариабельная область
35 может быть удобно получена из известных в настоящее время источников с
использованием легкодоступных В-клеток или гибридом из организмов-хозяев, отличных от человека, в комбинации с константными областями, полученными из, например, препаратов клеток человека. В то время как преимуществом вариабельной области является легкость получения и ее специфичность не зависит от источника, константная 5 область человека менее вероятно вызовет иммунный ответ у субъекта-человека при инъекции антител, чем константная область из источника, отличного от человека. Однако определение не ограничено указанным конкретным примером.
Термин "гуманизированное антитело" относится к молекуле, содержащей антигенсвязывающий сайт, который по существу получен из иммуноглобулина из вида,
10 отличного от человека, при этом оставшаяся иммуноглобулиновая структура молекулы основана на структуре и/или последовательности иммуноглобулина человека. Антигенсвязывающий сайт может содержать полноразмерные вариабельные области, гибридизованные с константными областями, или только участки, определяющие комплиментарность (CDR), привитые на соответствующие каркасные участки в
15 вариабельных областях. Антигенсвязывающие сайты могут быть дикого типа или могут быть модифицированы путем замены одной или более аминокислот, например, модифицированы, чтобы больше соответствовать иммуноглобулинам человека. Некоторые формы гуманизированных антител сохраняют последовательности всех CDR (например, гуманизированное антитело мыши, которое содержит все шесть CDR из
20 антитела мыши). Другие формы имеют один или более CDR, которые изменены относительно исходного антитела.
Различные способы гуманизации антител известны специалистам в данной области техники, см. обзор Almagro & Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience, 13:1619-1633, содержание которого полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки. В
25 обзорной статье Almagro & Fransson кратко описан патент США 2012/0231008 А1, который соответствует национальной фазе международной заявки на патент WO 2011/063980 А1. Содержание патента США 2012/0231008 А1 и WO 2011/063980 А1 полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
В настоящей заявке термин "антитела человека" включает антитела, содержащие
30 вариабельные и константные области, полученные из последовательностей иммуноглобулина зародышевой линии человека. Антитела человека согласно настоящему изобретению могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями иммуноглобулина зародышевой линии человека (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфичного мутагенеза в условиях in
35 vitro или путем соматической мутации в условиях in vivo). Антитела человека согласно
настоящему изобретению включают антитела, выделенные из библиотек
иммуноглобулинов человека или из животных, трансгенных по одному или более
иммуноглобулинам человека и не экспрессирующих эндогенные иммуноглобулины, как
описано, например, Kucherlapati & Jakobovits в патенте США №5939598.
5 В настоящей заявке термин "моноклональное антитело" относится к препарату
антител, имеющих аналогичный молекулярный состав. Моноклональные антитела проявляют уникальную специфичность связывания и аффинность в отношении конкретного эпитопа. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения моноклональные антитела вырабатываются гибридомой, которая включает В-клетку,
10 полученную из животного, не относящегося к человеку, например мыши, гибридизованную с иммортализованной клеткой.
В настоящей заявке термин "рекомбинантное антитело" включает все антитела, которые получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, например, (а) антитела, выделенные из животного (например, мыши), которое
15 является трансгенным или трансхромосомным в отношении генов иммуноглобулинов, или гибридомы, полученной из указанного животного, (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител, и (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные
20 любыми другими способами, которые включают соединение последовательностей генов иммуноглобулинов с другими последовательностями ДНК.
В настоящей заявке термин "трансфектома" включает рекомбинантные эукариотические клетки-хозяева, экспрессирующие антитела, такие как клетки СНО, клетки NS/0, клетки НЕК293, клетки НЕК293Т, клетки растений или грибков, включая
25 клетки дрожжей.
В настоящей заявке термин "гетерологичное антитело" относится к трансгенному организму, вырабатывающему указанное антитело. Термин относится к антителам, содержащим аминокислотную последовательность или кодирующую нуклеиновую последовательность, соответствующую последовательности, которая встречается в
30 организме, отличном от трансгенного организма, и которая в целом получена из вида, отличного от трансгенного организма.
В настоящей заявке термин "гетерогибридное антитело" относится к антителу, содержащему легкие и тяжелые цепи, полученные из различных организмов. Например, антитело, содержащее тяжелую цепь человека, связанную с легкой цепью мыши,
35 представляет собой гетерогибридное антитело.
Соответственно, "антитела и их антигенсвязывающие фрагменты", пригодные для
применения согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими,
поликлональные, моноклональные, одновалентные, биспецифичные,
гетероконъюгированные, полиспецифичные, рекомбинантные, гетерологичные, 5 гетерогибридные, химерные, гуманизированные (в частности, CDR-привитые), деиммунизированные антитела или антитела человека, фрагменты Fab, фрагменты Fab', фрагменты F(ab')2, фрагменты, полученные с помощью библиотеки экспрессии Fab, Fd, Fv, Fv, связанные дисульфидными связями (dsFv), одноцепочечные антитела (например, scFv), димеры или тетратела (Holliger P. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90(14), 10 6444-6448), нанотела (также известные как однодоменные антитела), антиидиотипические (анти-Id) антитела (включая, например, антиидиотипические антитела к антителам согласно настоящему изобретению), а также эпитопсвязывающие фрагменты любого из указанных выше.
Антитела, описанные в настоящем документе, предпочтительно являются
15 выделенными. В настоящей заявке термин "выделенное антитело" предназначен для обозначения антитела, которое по существу не содержит других антител, имеющих различные виды антигенной специфичности (например, выделенное антитело, которое специфично связывается с С5а, которое по существу не содержит антител, специфично связывающихся с антигенами, отличными от С5а). Выделенное антитело, которое
20 специфично связывается с эпитопом, изоформой или вариантом С5а человека, может, однако, иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, из других видов (например, с видовыми гомологами С5а, такими как С5а крысы). Помимо этого выделенное антитело может по существу не содержать другой клеточный материал и/или химические вещества. Согласно одному варианту реализации
25 настоящего изобретения комбинация "выделенных" моноклональных антител относится к антителам, имеющим различные виды специфичности и комбинированным в строго определенной композиции.
В настоящей заявке термин "природный", применительно к объекту, относится к тому факту, что объект может быть найден в природе. Например, полипептидная или
30 полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которая может быть выделена из природного источника и которая не была намеренно модифицирована человеком в лабораторных условиях, является природной.
В настоящей заявке термин "аптамер нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была модифицирована с помощью повторных циклов
35 отбора в условиях in vitro или SELEX (систематическое выделение лигандов путем
экспоненциального обогащения) для связывания с молекулой-мишенью (для обзора см.: Brody E.N. and Gold L. (2000), Aptamers as therapeutic and diagnostic agents. J. Biotechnol. 74(1):5-13). Аптамер нуклеиновой кислоты может представлять собой молекулу ДНК или РНК. Аптамеры могут содержать модификации, например, модифицированные 5 нуклеотиды, такие как 2'-фторзамещенные пиримидиновые нуклеотиды.
В настоящей заявке термин "антителоподобный белок" относится к белку, который был модифицирован (например, путем мутагенеза петель), чтобы специфично связываться с молекулой-мишенью. Как правило, подходящий антителоподобный белок содержит по меньшей мере одну вариабельную пептидную петлю, прикрепленную обоими концами к
10 белковому остову. Упомянутое двойное структурное ограничение значительно увеличивает аффинность связывания антителоподобного белка до уровней, сравнимых с таковыми для антитела. Длина вариабельной пептидной цепи, как правило, составляет от 10 до 20 аминокислот. Белковый остов может представлять собой любой протеин, обладающий хорошей растворимостью. В предпочтительном варианте белковый остов
15 представляет собой небольшой глобулярный белок. Антителоподобные белки включают, но не ограничиваются ими, аффитела, антикалины и модифицированные белки, содержащие анкириновые повторы (для обзора см.: Binz Н.К. et al. (2005) Engineering novel binding proteins from nonimmunoglobulin domains. Nat. Biotechnol. 23(10): 1257-1268). Антителоподобные белки могут быть получены из больших библиотек мутированных
20 вариантов, например, могут быть получены из больших фаговых библиотек и могут быть выделены способами, аналогичными таковым для выделения обычных антител. Помимо этого антителоподобные связывающие белки могут быть получены путем комбинаторного мутагенеза экспонированных на поверхности остатков в глобулярных белках. Антителоподобные белки иногда называют "пептидные аптамеры".
25 В настоящей заявке "пептидомиметик" представляет собой небольшую
белокподобную цепь, имитирующую пептид. Пептидомиметики, как правило, получают в результате модификации существующего пептида для того чтобы изменить свойства молекулы. Например, пептидомиметики могут быть получены в результате модификации для изменения стабильности или биологической активности молекулы. Подходящие
30 модификации могут быть использованы при разработке соединений, подобных лекарственным препаратам, из существующих пептидов. Указанные модификации включают изменения в пептиде, которые не встречаются в природе (например, измененные остовы и встраивание неприродных аминокислот).
"Консервативные замены" могут быть сделаны, например, на основе сходства
35 полярности, заряда, размера, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или
амфипатической природы вовлеченных остатков аминокислот. Аминокислоты могут быть сгруппированы в следующие шесть стандартных групп аминокислот:
(1) гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
5 (3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro; и
(6) ароматические: Тгр, Туг, Phe.
В настоящей заявке "консервативные замены" определены как замены
10 аминокислоты другой аминокислотой, перечисленной в той же самой группе из шести
стандартных групп аминокислот, приведенных выше. Например, обмен Asp на Glu
сохраняет один отрицательный заряд в полипептиде, модифицированном таким способом.
Помимо этого глицин и пролин могут быть заменены друг другом в зависимости от их
способности нарушать структуру альфа-спиралей. Некоторые предпочтительные
15 консервативные замены в пределах вышеуказанных шести групп представляют собой
замены в следующих подгруппах: (i) Ala, Val, Leu и He; (ii) Ser и Thr; (iii) Asn и Gin; (iv)
Lys и Arg; и (v) Туг и Phe. С учетом известного генетического кода, а также методик
получения рекомбинантных и синтетических ДНК, специалист может легко
сконструировать ДНК, кодирующие консервативные варианты аминокислот.
20 В настоящей заявке "неконсервативные замены" или "неконсервативные обмены
аминокислот" определены как обмены одной аминокислоты на другую аминокислоту, перечисленную в другой группе из шести стандартных групп аминокислот с (1) по (6), приведенных выше.
В настоящей заявке выражение "содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, 25 предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот" подразумевает, что аминокислотная последовательность, модифицированная указанным способом, содержит не более 3 замен аминокислот (предпочтительно консервативных замен аминокислот), не более 3 делеций аминокислот и не более 3 вставок аминокислот. Следовательно, аминокислотная 30 последовательность, охарактеризованная таким способом, содержит максимум 9 модификаций аминокислот (3 замены + 3 делеции + 3 вставки). Соответственно, вышеуказанное выражение является законченным выражением, хотя в других вариантах контекста термин "содержит" подразумевает открытое выражение.
В настоящей заявке термин "биологическая активность" относится к любому виду 35 активности, который может проявлять полипептид, включая, но не ограничиваясь ими:
ферментативную активность; связывающую активность с другим соединением (например, связывание с другим полипептидом, в частности, связывание с рецептором, или связывание с нуклеиновой кислотой); ингибиторную активность (например, активность, направленную на ингибирование фермента); активирующую активность (например, 5 активность, направленную на активацию фермента); или токсическое действие. В отношении вариантов и производных полипептида, вариант или производное не обязательно должно проявлять указанный вид активности в степени, аналогичной таковой для исходного полипептида. Вариант рассматривают как вариант, применительно к настоящей заявке, если он обладает соответствующей активностью, величина которой
10 составляет по меньшей мере 10% (например, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%) от активности исходного полипептида. Аналогичным образом, производное рассматривают как производное, применительно к настоящей заявке, если оно обладает соответствующей биологической активностью, величина которой составляет по меньшей мере 10% от активности
15 исходного полипептида. Особенно значимая "биологическая активность", применительно к настоящему изобретению, представляет собой связывающую активность с конформационным эпитопом С5а человека, образованным аминокислотными последовательностями в соответствии с SEQ Ш NO: 2 и SEQ Ш NO: 3. В предпочтительном варианте соответствующая "биологическая активность",
20 применительно к настоящему изобретению, представляет собой связывающую активность с конформационным эпитопом С5а человека, образованным аминокислотными последовательностями, DETCEQR (SEQ Ш NO: 4) и KDM. Количественные исследования для определения связывающей активности известны специалисту в данной области техники и включают количественные исследования методами твердофазного
25 иммуноферментного анализа (ИФА) и поверхностного плазмонного резонанса.
В настоящей заявке термин "пациент" означает любое млекопитающее или птицу, которые могут получить пользу от лечения с применением ингибитора С5а, описанного в настоящем документе. В предпочтительном варианте "пациент" выбран из группы, состоящей из лабораторных животных (например, мыши или крысы), домашних
30 животных (включая, например, морскую свинку, кролика, курицу, индейку, свинью, овцу, козу, верблюда, корову, лошадь, осла, кошку или собаку), или приматов, включая обезьян (например, африканских зеленых мартышек, шимпанзе, бонобо, горилл) и человека. В особенно предпочтительном варианте "пациент" является человеком. Термины "пациент" и "субъект, подлежащий лечению" (или просто: "субъект") используются в настоящем
35 документе как взаимозаменяемые.
В настоящей заявке термин "обезьяна" относится к любому млекопитающему
примату, отличному от человека, если из контекста не следует иное. Например, в разделе
"примеры" ниже термин "обезьяна", как правило, используется как сокращение для
"африканская зеленая мартышка".
5 В настоящей заявке термин "человекообразная обезьяна" относится к
человекообразным млекопитающим Старого Света, принадлежащим к биологическому надсемейству Hominoidea и, соответственно, включает гиббонов (семейство Hilobatidae), орангутанов (род Pongo), горилл (род Gorilla), шимпанзе (род Pan) и человека (род Homo). В настоящей заявке термин "лечить", "лечащий" или "лечение" заболевания или
10 расстройства означает выполнение одного или более из следующих действий: (а) снижение степени тяжести и/или продолжительности заболевания; (Ь) ограничение или предотвращение развития симптомов, характерных для расстройств(а), подлежащих лечению; (с) ингибирование ухудшения симптомов, характерных для расстройств(а), которые лечат; (d) ограничение или предотвращение рецидивов расстройств(а) у
15 пациентов, которые ранее имели расстройство(а); и (е) ограничение или предотвращение рецидива симптомов у пациентов, которые ранее имели симптомы расстройств(а).
В настоящей заявке термин "предотвращать", "предотвращающий", "предотвращение" или "профилактика" заболевания или расстройства означает предотвращение возникновения расстройства у субъекта в течение определенного
20 промежутка времени. Например, если ингибитор С5а, описанный в настоящем документе (например, антитело к С5а или его антигенсвязывающий фрагмент), вводят субъекту для предотвращения заболевания или расстройства, то развитие указанного заболевания или расстройства предотвращено по меньшей мере в день введения и предпочтительно также на один или более дней (например, на период от 1 до 30 дней или от 2 до 28 дней, или от 3
25 до 21 дня, или от 4 до 14 дней, или от 5 до 10 дней) после дня введения.
В настоящей заявке термин "введение" включает введение в условиях in vivo, а также введение непосредственно в ткань в условиях ex vivo, например, с помощью венозных шунтов.
"Фармацевтическая композиция" в соответствии с настоящим изобретением может 30 быть представлена в виде композиции, в которой различные активные ингредиенты и разбавители и/или носители смешаны, или может принимать форму комбинированного препарата, в котором активные ингредиенты присутствуют в частично или полностью дискретной форме. Примером такой комбинации или комбинированного препарата является составной набор.
Термин "эффективное количество" означает количество терапевтического агента, достаточное для достижения поставленной цели. Эффективное количество конкретного терапевтического агента будет варьироваться в зависимости от таких факторов как характер агента, путь введения, размер и вид субъекта, который получит терапевтический 5 агент, и цель введения. Эффективное количество в каждом конкретном случае может быть определено эмпирически специалистом в данной области техники в соответствии со стандартными в данной области способами.
В настоящей заявке термин "дополнительная терапия" относится к комбинированной терапии, при которой пациенту вводят по меньшей мере два различных
10 лекарственных препарата. Указанные по меньшей мере два различных лекарственных препарата могут быть изготовлены в виде одной фармацевтической композиции, содержащей оба лекарственных препарата. В другом варианте, каждый лекарственный препарат может быть изготовлен в виде отдельной фармацевтической композиции, и фармацевтические композиции вводят пациенту по отдельности (например, в различных
15 временных точках и/или различными путями введения). В последнем варианте (по меньшей мере) два различных лекарственных препарата могут присутствовать в виде составного набора. В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения предложена терапия с применением ингибитора С5а в качестве дополнительной терапии к противовирусной терапии с применением противовирусного агента.
20 В настоящей заявке термин "противовирусный агент" включает, но не
ограничивается ими: ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир для пероральных ингаляций или озельтамивир для приема внутрь) и антитела, специфичные в отношении вируса.
"Фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом 25 федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее
США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более
конкретно у человека.
В настоящей заявке термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту,
вспомогательному веществу или носителю, с которым вводят терапевтический агент. 30 Подходящие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные
жидкости, такие как солевые растворы в воде и маслах, включая те, которые получены из
нефти или имеют животное, растительное или синтетическое происхождение, такие как
арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное.
Солевой раствор является предпочтительным носителем, если фармацевтическую 35 композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и
глицерина также могут быть использованы в качестве жидких носителей, в частности, для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рисовую муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое 5 обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиция, при необходимости, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или рН-забуферивающих агентов. Подходящие композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и т.п. Композиция может быть изготовлена в
10 виде суппозитория с традиционными связующими веществами и носителями, такими как триглицериды. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть изготовлены в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные со свободными аминогруппами, такие как соли, полученные с соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислотами и т.д., и соли, образованные со
15 свободными карбоксильными группами, такие как соли, полученные с натрием, калием, аммонием, кальцием, гидроксидами железа, изопропиламином, триэтиламином, 2-этиламиноэтанолом, гистидином, прокаином и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны Е. W. Martin в "Remington's Pharmaceutical Sciences)). Подходящие композиции будут содержать терапевтически эффективное
20 количество соединения, предпочтительно в очищенной форме, совместно с подходящим количеством носителя, чтобы обеспечить форму для надлежащего введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения. Общеизвестные и используемые способы в области молекулярной биологии, методики в области клеточной биологии, химии белков и антител полностью описаны в постоянно обновляемых изданиях
25 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", (Sambrook et al., Cold Spring Harbor); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Protein Science (J. E. Colligan et al. Eds., Wiley & Sons); Current Protocols in Cell Biology (J. S. Bonifacino et al., Wiley & Sons) и Current Protocols in Immunology (J. E. Colligan et al., Eds., Wiley & Sons). Известные методики, относящиеся к культуре клеток и
30 культуральным средам, описаны в "Large Scale Mammalian Cell Culture (D. Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8:148-153, 1997); "Serum free Media" (K. Kitano, Biotechnol. 17:73-106, 1991); и "Suspension Culture of Mammalian Cells" (J.R. Birch et al. Bioprocess Technol. 10:251-270, 1990).
Варианты реализации настоящего изобретения
Настоящее изобретение будет более подробно описано далее. Различные аспекты настоящего изобретения будут определены более подробно в нижеследующих частях текста. Каждый аспект, определенный ниже, может быть объединен с любым другим аспектом или аспектами, если четко не указано иное. В частности, любой признак, 5 указанный как предпочтительный или обеспечивающий преимущество, может быть объединен с любым другим признаком или признаками, указанными как предпочтительные или преимущественные.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложено создание ингибитора С5а для применения в уменьшении вирусной нагрузки и/или уменьшении 10 острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонией.
Согласно другому варианту первый аспект настоящего изобретения относится к применению ингибитора С5а в получении фармацевтической композиции для уменьшения вирусной нагрузки и/или уменьшения острого повреждения легких (ОПЛ) у 15 субъекта, страдающего вирусной пневмонией, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонией.
Согласно другому варианту первый аспект настоящего изобретения относится к способу уменьшения вирусной нагрузки и/или уменьшения острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией, в частности HxNx-опосредованной 20 вирусной пневмонией, причем указанный способ включает этап введения терапевтического количества ингибитора С5а указанному субъекту.
Согласно второму аспекту настоящее изобретение относится к созданию ингибитора С5а для применения в лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный 25 ингибитор предназначен для применения в виде монотерапии.
Согласно другому варианту второй аспект настоящего изобретения относится к применению ингибитора С5а в получении фармацевтической композиции для лечения пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанная фармацевтическая композиция 30 предназначена для применения в виде монотерапии.
Согласно другому варианту второй аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонии), причем указанный способ включает этап введения терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом, причем 35 указанный ингибитор вводят в виде монотерапии.
Согласно третьему аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для применения в лечении вирусной пневмонии у субъекта, причем вирусная пневмония у субъекта вызвана вирусом H7N9.
Согласно другому варианту третий аспект настоящего изобретения относится к 5 применению ингибитора С5а в приготовлении фармацевтической композиции, предназначенной для лечения вирусной пневмонии у субъекта, причем указанная вирусная пневмония у субъекта вызвана вирусом H7N9.
Согласно другому варианту третий аспект настоящего изобретения относится к способу лечения вирусной пневмонии, причем указанный способ включает этап введения 10 терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом, при этом указанная вирусная пневмония у указанного субъекта вызвана вирусом H7N9.
Согласно четвертому аспекту настоящее изобретение относится к ингибитору С5а для применения в лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный 15 субъект является приматом, предпочтительно человекообразной обезьяной, более предпочтительно человеком.
Согласно другому варианту четвертый аспект настоящего изобретения относится к применению ингибитора С5а в получении фармацевтической композиции для лечения пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной 20 вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный субъект является приматом, предпочтительно человекообразной обезьяной, более предпочтительно человеком.
Согласно другому варианту четвертый аспект настоящего изобретения относится к способу лечения пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии, в частности HxNx-опосредованной вирусной пневмонии), причем указанный способ включает этап введения 25 терапевтического количества ингибитора С5а субъекту, нуждающемуся в этом, причем указанный субъект является приматом, предпочтительно человекообразной обезьяной, более предпочтительно человеком.
Согласно одному варианту реализации второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения ингибитор С5а предназначен для применения в уменьшении 30 вирусной нагрузки и/или уменьшении острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией, или, в другом варианте, фармацевтическая композиция предназначена для уменьшения вирусной нагрузки и/или уменьшения острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией, или, в другом варианте, способ предназначен для уменьшения вирусной нагрузки и/или уменьшения 35 острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией.
Согласно одному варианту реализации первого, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения ингибитор С5а предназначен для применения в виде монотерапии или, в другом варианте, фармацевтическая композиция предназначена для применения в виде монотерапии, или, в другом варианте, ингибитор С5а вводят в виде 5 монотерапии.
Согласно другому варианту реализации первого, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения ингибитор С5а предназначен для применения в качестве дополнительной терапии с противовирусным агентом, или, в другом варианте, фармацевтическая композиция предназначена для применения в качестве дополнительной
10 терапии с противовирусным агентом, или, в другом варианте, способ дополнительно включает этап введения терапевтического количества противовирусного агента указанному субъекту. Противовирусные агенты, подходящие для применения в указанной дополнительной терапии, включают, но не ограничивается ими: ингибиторы нейраминидазы (например, занамивир для пероральной ингаляции или озельтамивир для
15 приема внутрь) и антитела, специфичные в отношении вируса.
Согласно одному варианту реализации первого, второго или четвертого аспектов настоящего изобретения пневмония у субъекта вызвана вирусом HxNx. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения вирус HxNx выбран из группы, состоящей из H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7
20 и H10N8. Согласно конкретным вариантам реализации первого, второго или четвертого аспектов настоящего изобретения вирус HxNx представляет собой H7N9.
Согласно одному варианту реализации первого, второго или третьего аспектов настоящего изобретения субъект представляет собой примата, предпочтительно человекообразную обезьяну, более предпочтительно человека.
25 В настоящем изобретении также предложены комбинации четырех аспектов,
определенных выше. Например, согласно одному варианту реализации признаки первого, второго и третьего аспектов настоящего изобретения могут быть объединены. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения признаки первого, второго и четвертого аспектов настоящего изобретения могут быть объединены. Согласно другому
30 варианту реализации настоящего изобретения признаки первого, третьего и четвертого аспектов настоящего изобретения могут быть объединены. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения признаки второго, третьего и четвертого аспектов настоящего изобретения могут быть объединены. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения признаки первого, второго, третьего и четвертого аспектов
35 настоящего изобретения могут быть объединены.
Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения ингибитор С5а выбран из группы, состоящей из (i) соединений (связывающих молекул), которые специфично связываются с С5а и ингибируют связывание С5а с C5aR; и (ii) соединений (связывающих молекул), которые 5 специфично связываются с C5aR и ингибируют связывание С5а с C5aR. Типичные соединения, которые специфично связываются с С5а, включают ингибирующий С5а пептид (С5а1Р) и антитела к С5а, такие как антитела к С5а, раскрытые в WO 2011/063980 А1 (также опубликованной как патент США 2012/0231008 А1). Типичные соединения, которые специфично связываются с C5aR, включают селективные антагонисты рецептора
10 С5а, РМХ53 и ССХ168.
Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения ингибитор С5а представляет собой связывающую молекулу, которая специфично связывается с С5а человека. Согласно другому варианту реализации указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из:
15 (а) антител или их антигенсвязывающих фрагментов;
(b) олигонуклеотидов;
(c) антителоподобных белков; и
(d) пептид омиметиков.
Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого
20 аспектов настоящего изобретения связывающая молекула специфично связывается с
конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностями
NDETCEQRA (SEQ ID NO: 2) и SHKDMQL (SEQ ГО NO: 3) С5а человека. Связывание с
конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностями в
соответствии с SEQ ГО NO: 2 и 3, означает, что связывающая молекула связывается с по
25 меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности в
соответствии с SEQ ГО NO: 2 и по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной
последовательности в соответствии с SEQ ГО NO: 3. Последовательность, представленная
в SEQ ГО NO: 2, соответствует аминокислотам 30-38 С5а человека. Последовательность,
представленная в SEQ ID NO: 3, соответствует аминокислотам 66-72 С5а человека.
30 Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула связывается с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности в соответствии с DETCEQR (SEQ ГО NO: 4). Последовательность, представленная в SEQ ГО NO: 4, соответствует аминокислотам 31-37 С5а человека.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула связывается с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности в соответствии с HKDMQ (SEQ Ш N0: 5), более предпочтительно с по меньшей мере одной 5 аминокислотой в аминокислотной последовательности KDM. Последовательность, представленная в SEQ Ш N0: 5, соответствует аминокислотам 67-71 С5а человека; последовательность KDM соответствует аминокислотам 68-70 С5а человека.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула связывается с по
10 меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности DETCEQR (SEQ Ш N0: 4) и с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности HKDMQ (SEQ ID N0: 5).
Согласно особенно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула
15 связывается с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности DETCEQR (SEQ ГО NO: 4) и с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности KDM.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения две последовательности, образующие
20 конформационный эпитоп (например, пары последовательностей в соответствии с SEQ ГО N0: 2 и 3; SEQ ГО N0: 4 и 5, или SEQ ГО N0: 4 и последовательность KDM) отделены друг от друга 1-50 смежными аминокислотами, которые не участвуют в связывании со связывающей молекулой согласно настоящему изобретению. В дальнейшем указанные аминокислоты, которые не участвуют в связывании со связывающей молекулой согласно
25 настоящему изобретению, будут называться "несвязывающиеся аминокислоты". Две последовательности, образующие конформационный эпитоп, предпочтительно разделены 6-45 смежными несвязывающимися аминокислотами, более предпочтительно 12-40 смежными несвязывающимися аминокислотами, более предпочтительно 18-35 смежными несвязывающимися аминокислотами, более предпочтительно 24-30 смежными
30 несвязывающимися аминокислотами, более предпочтительно 25-29 смежными несвязывающимися аминокислотами, еще более предпочтительно 26-28 смежными несвязывающимися аминокислотами и наиболее предпочтительно 27 смежными несвязывающимися аминокислотами.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
35 четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула имеет константу
связывания с С5а человека со значением Kd, составляющим 10 нМ или менее, предпочтительно 9 нМ или менее, более предпочтительно 8 нМ или менее, более предпочтительно 7 нМ или менее, более предпочтительно 6 нМ или менее, более предпочтительно 5 нМ или менее, более предпочтительно 4 нМ или менее, более 5 предпочтительно 3 нМ или менее, более предпочтительно 2 нМ или менее и еще более предпочтительно 1 нМ или менее.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения константа диссоциации KD ДЛЯ связывающей молекулы и С5а человека находится в диапазоне от 1 пМ (пикомолярный
10 диапазон) до 5 нМ (наномолярный диапазон), более предпочтительно от 2 пМ до 4 нМ, более предпочтительно от 5 пМ до 3 нМ, более предпочтительно от 10 пМ до 2 нМ, более предпочтительно от 50 пМ до 1 нМ, более предпочтительно от 100 пМ до 900 пМ, более предпочтительно от 200 пМ до 800 пМ, более предпочтительно от 300 пМ до 700 пМ, и еще более предпочтительно от 400 пМ до 600 пМ.
15 Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения одна связывающая молекула проявляет по меньшей мере 75% блокирующую активность, предпочтительно по меньшей мере 80% блокирующую активность, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующую активность, более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующую активность,
20 более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующую активность в отношении биологических эффектов, индуцированных одной молекулой С5а, в частности, С5а человека. Перечисленные предпочтительные виды блокирующей активности относятся к тем вариантам реализации, в которых связывающая молекула содержит один паратоп связывания с С5а, предпочтительно С5а человека. В тех вариантах, где связывающая
25 молекула содержит два или более С5а-специфичных паратопа, указанные виды блокирующей активности, составляющей по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85% и т.д., могут быть достигнуты в том случае, когда одна единственная связывающая молекула вступает в контакт с числом молекул С5а, равным числу С5а-специфичных паратопов,
30 присутствующих в указанной связывающей молекуле. Иными словами, в тех случаях, когда паратопы связывающей молекулы, описанной в настоящем документе, и С5а присутствуют в эквимолярных концентрациях, связывающая молекула проявляет по меньшей мере 75% блокирующую активность, предпочтительно по меньшей мере 80% блокирующую активность, более предпочтительно по меньшей мере 85% блокирующую
35 активность, более предпочтительно по меньшей мере 90% блокирующую активность и
более предпочтительно по меньшей мере 95% блокирующую активность в отношении биологических эффектов, индуцированных С5а. Предпочтительное биологическое действие, которое будет заблокировано, представляет собой С5а-индуцированное высвобождение лизоцима из клеток цельной крови человека. Количественные 5 исследования для определения С5а-индуцированного выброса лизоцима и его блокирования описаны, например, в WO 2011/063980 А1.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула не ингибирует активность СН50 в плазме крови человека. Количественные исследования для
10 определения активности СН50 известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в WO 2011/063980 А1.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула не проявляет блокирующую активность в отношении по меньшей мере одного С5Ь-индуцированного
15 биологического эффекта; предпочтительно связывающая молекула не проявляет блокирующую активность в отношении любого С5Ь-индуцированного биологического эффекта.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула способна уменьшать
20 выработку ИЛ-8, индуцированную Е. coli, в цельной крови человека. Количественные исследования для измерения выработки ИЛ-8 в цельной крови известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в WO 2011/063980 А1.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой
25 антитело, причем указанное антитело выбрано из группы, состоящей из поликлональных антител, моноклональных антител, моновалентных антител, биспецифичных антител, гетероконъюгатных антител, полиспецифичных антител, деиммунизированных антител, химерных антител, гуманизированных (в частности, CDR-привитых) антител и антител человека.
30 Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антигенсвязывающий фрагмент антитела, причем указанный фрагмент выбран из группы, состоящей из фрагментов Fab, фрагментов Fab', фрагментов F(ab')2, фрагментов Fd, фрагментов Fv, фрагментов Fv, связанных дисульфидными связями (dsFv), однодоменных
35 антител (также известных как нанотела) и одноцепочечных фрагментов Fv (scFv).
Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: 5 (i) последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 6; или (ii) последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 7;
при этом указанная последовательность CDR3 тяжелой цепи необязательно
содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены
аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
10 Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого
аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(ш) последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 8;
15 или
(iv) последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 9;
при этом указанная последовательность CDR3 легкой цепи необязательно содержит
1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1,
2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
20 Согласно некоторым вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(i) последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 6, и
25 последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 8; или
(ii) последовательность CDR3 тяжелой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 7, и
последовательность CDR3 легкой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 9;
при этом указанная последовательность CDR3 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены 30 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом указанная последовательность CDR3 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
Согласно одному варианту реализации первого, второго, третьего или четвертого 35 аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антитело
или его антигенсвязывающий фрагмент, причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:
(v) последовательность CDR2 тяжелой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 10;
5 (vi) последовательность CDR2 тяжелой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 11;
(vii) последовательность CDR2 легкой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 12;
(viii) последовательность CDR2 легкой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 13;
(ix) последовательность CDR1 тяжелой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 14;
(x) последовательность CDR1 тяжелой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 15;
10 (xi) последовательность CDR1 легкой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 16; или
(xii) последовательность CDR1 легкой цепи в соответствии с SEQ Ш N0: 17;
при этом указанная последовательность CDR2 тяжелой цепи необязательно
содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены
аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
15 при этом указанная последовательность CDR2 легкой цепи необязательно содержит
1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом указанная последовательность CDR1 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены 20 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом указанная последовательность CDR1 легкой цепи необязательно содержит
I, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1,
2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
В предпочтительном варианте общее количество необязательных изменений, 25 указанных выше, в каждой из аминокислотных последовательностей в соответствии с SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:
II, SEQ Ш NO: 13, SEQ Ш NO: 14, SEQ Ш NO: 15, SEQ Ш NO: 16 и SEQ Ш NO: 17, то
есть общее количество замен, делеций и вставок в каждой последовательности составляет
1 или 2.
30 В предпочтительном варианте общее количество замен, делеций и вставок,
суммированных для всех CDR, присутствующих в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, находится в диапазоне от 1 до 5 (например, 1, 2, 3, 4 или 5).
В предпочтительных вариантах реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент содержит один из наборов последовательностей CDR3 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR1 тяжелой цепи, которые перечислены ниже в таблице 1,
при этом каждая указанная последовательность CDR3 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены 5 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот, и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом каждая указанная последовательность CDR2 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот, и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом каждая указанная последовательность CDR1 тяжелой цепи необязательно 10 содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот, и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот:
15 четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит один из следующих наборов последовательностей CDR3 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR1 легкой цепи, перечисленных в таблице 2,
при этом каждая указанная последовательность CDR3 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены 20 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом каждая указанная последовательность CDR2 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом каждая указанная последовательность CDR1 легкой цепи необязательно 5 содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот:
15 Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит один из наборов CDR тяжелой цепи А-Н, перечисленных выше в таблице 1, и один из наборов CDR легкой цепи I-IV, перечисленных выше в таблице 2, т.е. одну из следующих комбинаций наборов: A-I, А-П, А-Ш, A-IV, B-I, В-П, В-Ш, B-IV, C-I,
20 С-П, С-Ш, C-IV, D-I, D-II, D-III, D-IV, E-I, Е-П, Е-Ш, E-IV, F-I, F-II, F-III, F-IV, G-I, G-II, G-III, G-IV, H-I, Н-П, Н-Ш или H-IV (при этом комбинации A-I и H-IV являются особенно предпочтительными),
при этом каждая указанная последовательность CDR3 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены
25 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот, и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом каждая указанная последовательность CDR2 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот, и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом каждая указанная последовательность CDR1 тяжелой цепи необязательно 5 содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом каждая указанная последовательность CDR3 легкой цепи необязательно
содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены
аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
10 при этом каждая указанная последовательность CDR2 легкой цепи необязательно
содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом каждая указанная последовательность CDR1 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены 15 аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или
четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент содержит область VH, которая содержит, по существу состоит или состоит из (i)
области VH IFX-1 или (ii) области VH INab708.
20 Последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, определяющие
области VH из IFX-1 и INab708, приведены ниже в таблице 3.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область VL, которая содержит, по существу состоит или состоит из (i) 25 области VL IFX-1 или (ii) области VL INab708.
Последовательности FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4, определяющие области VL из IFX-1 и INab708, приведены ниже в таблице 3.
Таблица 3: Последовательности CDR и FR антител IFX-1 и INab708 (классификация в соответствии с системой Chothia)
IFX-1: INab708:
Тяжелая цепь:
FR1: QVQLQQSGPQLVRPGTSVKIS (= SEQ ID N0: 18)
CDR1: CKASGYSFTTFWMD (= SEQ ID N0: 14)
FR2: WVKQRPGQGLEWIGR (SEQ Ш N0: 19)
CDR2: ШРSDSESRLDQ (= SEQ Ш N0: 10)
FR3:
RFKDRATLT VDKS S ST VYMQLS SPT SED S AVYY
(SEQ ID N0: 20)
CDR3: CARGNDGYYGFAY (= SEQ ID N0: 6)
FR4: WGQGTLVTVSS (SEQ ID N0: 21)
Легкая цепь:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ Ш N0: 22)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMK (= SEQ ID N0: 16)
FR2: WYQQKPGQPPKLL (SEQ Ш N0: 23)
CDR2: IYAASNL
(= SEQ ID N0: 12)
FR3:
QSGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAA TYY
(SEQ Ш N0: 24)
Тяжелая цепь:
FR1: VQLLESGAELMKPGASVKIS (SEQ Ш N0: 26)
CDR1: CKATGNTFSGYWTE (= SEQ ID N0: 15)
FR2: WVKQRPGHGLEWIGE (SEQ Ш N0: 27)
CDR2: ILPGSGSTNYNE (= SEQ ID N0: 11)
FR3:
KFKGKATLT ADT S SNT AYMQLS SLT SED S AVYY
(SEQ ID N0: 28)
CDR3: CTRRGLYDGSSYFAY (= SEQ ID N0: 7)
FR4: WGQGTLVTVSA (SEQ Ш N0: 29)
Легкая цепь:
FR1: DIVLTQSPASLAVSLGQRATIS (SEQ Ш N0: 30)
CDR1: CKASQSVDYDGDSYMN (= SEQ ID N0: 17)
FR2: WYQQKPGQPPKLL (SEQ ID N0: 31)
CDR2: IYAASNL
(= SEQ ID N0: 13)
FR3:
GSGIPARF SGSGSGTDFTLNIHPVEEEVAA TYY
(SEQ Ш N0: 32)
5 цепи и ту же вариабельную область легкой цепи, что и INab308. INab708 представляет собой моноклональное антитело мыши, нацеленное по существу к аналогичному конформационному эпитопу, что и INab308 и IFX-1, и также описано в WO 2011/063980 А1.
Согласно другим предпочтительным вариантам реализации первого, второго, 10 третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит область VH и область VL, причем
(i) указанная область VH содержит, по существу состоит или состоит из области VH IFX-1 и указанная область VL содержит, по существу состоит или состоит из области VL IFX-1; или
15 (ii) указанная область VH содержит, по существу состоит или состоит из области VH
INab708 и указанная область VL содержит, по существу состоит или состоит из области VL INab708.
Согласно предпочтительным вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения антитело или его антигенсвязывающий 20 фрагмент, содержащий один или более участков CDR, набор участков CDR или комбинацию наборов CDR, описанную в настоящем документе, содержит указанные CDR в каркасном участке антитела человека.
Упоминание в настоящем документе антитела, содержащего, по отношению к его тяжелой цепи, конкретную цепь или конкретный участок или последовательность, 25 предпочтительно относится к ситуации, при которой все тяжелые цепи указанного антитела содержат указанную конкретную цепь, участок или последовательность. Это относится, соответственно, к легкой цепи антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой 30 олигонуклеотид. В указанных вариантах реализации олигонуклеотид также
предпочтительно представляет собой аптамер нуклеиновой кислоты, такой как аптамер ДНК или аптамер РНК, или смешанный аптамер, содержащий нуклеотиды ДНК и РНК. Согласно некоторым вариантам реализации один или более нуклеотидов могут быть заменены модифицированными нуклеотидами, такими как 2'-фторзамещенные 5 пиримидиновые основания. Аптамеры нуклеиновых кислот также могут быть конъюгированы с молекулами флуоресцентных репортеров, аффинными метками и/или макромолекулами. Например, конъюгирование аптамера с полиэтиленгликолем (ПЭГ) или сходной макромолекулой увеличит биологический период полувыведения аптамера.
Согласно некоторым вариантам реализации первого, второго, третьего или 10 четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой антителоподобный белок, например, антителоподобный белок, описанный выше в разделе "Определения".
Согласно некоторым вариантам реализации первого, второго, третьего или четвертого аспектов настоящего изобретения связывающая молекула представляет собой
15 пептидомиметик. Пептидомиметики, пригодные для реализации настоящего изобретения, предпочтительно основаны на антителоподобных белках, описанных выше.
Принципы, изложенные в настоящем документе в отношении специфичных нуклеиновых и аминокислотных последовательностей, например, тех, которые представлены в перечне последовательностей, должны быть истолкованы, как
20 относящиеся к модификациям указанных конкретных последовательностей, которые приводят к получению последовательностей, которые функционально эквивалентны указанным специфичным последовательностям, например, аминокислотным последовательностям, проявляющим свойства, которые идентичны или аналогичны таковым конкретных аминокислотных последовательностей и последовательностей
25 нуклеиновых кислот, кодирующих аминокислотные последовательности, проявляющие свойства, которые идентичны или аналогичны таковым для аминокислотных последовательностей, кодируемых специфичными последовательностями нуклеиновых кислот. Одним из важных свойств является сохранение связывания антитела с его мишенью или поддержание эффекторных функций антитела. В предпочтительном
30 варианте последовательность, модифицированная по отношению к конкретной последовательности, если она замещает специфичную последовательность в антителе, сохраняет связывание указанного антитела с С5а, в частности, с конформационным эпитопом С5а, выявленным в настоящем документе, и предпочтительно сохраняет функции указанного антитела, описанные в настоящем документе, например,
35 блокирование С5а-индуцированного высвобождения лизоцима из клеток цельной крови
человека и/или уменьшение выработки ИЛ-8, индуцированной E.coli, в цельной крови человека.
Специалист в данной области техники поймет, что, в частности, последовательности CDR гипервариабельных и вариабельных областей могут быть модифицированы без 5 потери способности связываться с С5а. Например, участки CDR будут идентичны или высокогомологичны участкам, указанным в настоящем документе. Термин "высокогомологичный" подразумевает, что от 1 до 5, предпочтительно от 1 до 4, например, от 1 до 3, или 1 или 2 замены, в частности, консервативные замены, делеции и/или вставки, могут быть сделаны в участках CDR. Помимо этого гипервариабельные и
10 вариабельные области могут быть модифицированы так, что они проявляют существенную гомологию с областями, конкретно описанными в настоящем документе.
В соответствии с настоящим изобретением желательной также может быть модификация аминокислотных последовательностей, описанных в настоящем документе, в частности, последовательностей константных областей тяжелой цепи человека, чтобы
15 адаптировать последовательность к желаемому аллотипу, например, аллотипу, который встречается в популяции европеоидов или популяции китайцев.
Настоящее изобретение дополнительно включает антитела, в которых изменения были сделаны в области Fc, чтобы изменить функциональные или фармакокинетические свойства антител. Указанные изменения могут привести к уменьшению или увеличению
20 связывания с Clq и CDC или связывания с FcyR и ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности). Замены, например, могут быть выполнены в одном или более остатках аминокислот в константной области тяжелой цепи, вызывая тем самым изменение эффекторной функции, при сохранении способности связываться с антигеном, по сравнению с модифицированным антителом, ср. патент США №5624821 и патент США
25 №5648260.
Период полувыведения антител в условиях in vivo может быть улучшен путем модификации эпитопа рецептора реутилизации константной области Ig или Ig-подобной константной области так, что молекула не содержит интактной области СН2 или интактной области Fc Ig, ср. патент США №6121022 и патент США №6194551. Период
30 полувыведения в условиях in vivo также может быть увеличен путем введения мутаций в область Fc, например, путем замены треонина лейцином в положении 252, путем замены треонина серином в положении 254 или путем замены треонина фенилаланином в положении 256, ср. патент США №6277375.
Характер гликозилирования антител также может быть модифицирован, чтобы
35 изменить эффекторные функции антител. Например, антитела могут быть
экспрессированы в трансфектоме, которая не присоединяет остаток фукозы, который обычно прикреплен к Asn в положении 297 области Fc, чтобы повысить аффинность области Fc в отношении рецепторов Fc, что, в свою очередь, приведет к увеличению ADCC (антитело-зависимой клеточной цитотоксичности) антител в присутствии NK-5 клеток, ср. Shield et al. (2002) J. Biol. Chem., 277:26733-40. Характер галактозилирования также может быть модифицирован для изменения CDC (комплемент-зависимой цитотоксичности).
В качестве альтернативы, в другом варианте мутации могут быть введены случайным образом на всем протяжении полноразмерной кодирующей
10 последовательности антитела к С5а или ее части, например, с помощью насыщающего мутагенеза, и полученные в результате модифицированные антитела к С5а могут быть подвергнуты скринингу для определения активности связывания.
При реализации любого аспекта настоящего изобретения, фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, или ингибитор С5а (например, связывающая
15 молекула, специфично связывающаяся с С5а, в частности, с hC5a, как описано в настоящем документе), может быть введен пациенту любым путем, общепринятым в данной области техники, который обеспечивает достаточный уровень ингибитора С5а в организме пациента. Введение можно осуществлять системно или местно. Введение можно осуществлять парентерально, через слизистую оболочку, например, перорально,
20 интраназально, ректально, интравагинально, сублингвально, под слизистую оболочку, трансдермально или путем ингаляции. В предпочтительном варианте введение осуществляют парентерально, например, с помощью внутривенной или внутрибрюшинной инъекции, включая, но не ограничиваясь ими, внутриартериальное, внутримышечное, внутрикожное и подкожное введение. Если фармацевтическую
25 композицию согласно настоящему изобретению вводят местно, то указанная композиция может быть введена непосредственно в орган или ткань, подлежащую обработке.
Фармацевтические композиции, приспособленные для перорального введения, могут быть обеспечены в виде капсул или таблеток; в виде порошков или гранул; в виде растворов, сиропов или суспензий (в водных или неводных жидкостях); в виде съедобных
30 пен или кремов; или в виде эмульсий. Таблетки или твердые желатиновые капсулы могут содержать лактозу, крахмал или его производные, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлозу, карбонат магния, стеариновую кислоту или ее соли. Мягкие желатиновые капсулы могут содержать растительные масла, воски, жиры, полутвердые или жидкие полиолы и т.д. Растворы и сиропы могут содержать воду, полиолы и сахара.
Активный агент, предназначенный для перорального введения, может быть покрыт или смешан с материалом, который задерживает разрушение и/или всасывание активного агента в желудочно-кишечном тракте (например, может быть использован моностеарат глицерина или дистеарат глицерина). Следовательно, пролонгированное высвобождение 5 активного агента может быть достигнуто в течение нескольких часов и, при необходимости, активный агент может быть защищен от разрушения в желудке. Фармацевтические композиции для перорального введения могут быть изготовлены так, чтобы облегчить высвобождение активного агента в конкретном месте желудочно-кишечного тракта благодаря специфичному значению показателя рН или
10 ферментативным условиям.
Фармацевтические композиции, приспособленные для трансдермального введения, могут быть обеспечены в виде отдельных пластырей, которые остаются в тесном контакте с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения, могут быть обеспечены в виде
15 мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, растворов, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Для местного нанесения на кожу, рот, глаз или другие наружные ткани предпочтительно используют мази или кремы для местного применения. Если фармацевтическая композиция изготовлена в виде мази, активный ингредиент может быть использован с парафиновой основой или смешиваемой с водой мазевой основой. В другом
20 варианте активный ингредиент может быть изготовлен в виде крема с основой типа масло-в-воде или основой типа вода-в-масле. Фармацевтические композиции, приспособленные для местного введения в глаз, включают глазные капли. В указанных композициях активный ингредиент может быть растворен или суспендирован в подходящем носителе, например, в водном растворителе. Фармацевтические композиции,
25 приспособленные для местного введения в рот, включают лепешки, пастилки и жидкости для полоскания рта.
Фармацевтические композиции, приспособленные для назального введения, могут содержать твердые носители, такие как порошки (предпочтительно имеющие размер частиц в диапазоне от 20 до 500 мкм). Порошки могут быть введены путем вдыхания
30 через нос, то есть путем быстрого вдоха через нос порошка из контейнера, подносимого близко к носу. В другом варианте композиции, приспособленные для назального введения, могут содержать жидкие носители, например, назальные спреи или капли для носа. Подходящие композиции могут включать водные или масляные растворы активного ингредиента. Композиции для введения путем ингаляции могут быть обеспечены в
35 специально приспособленных устройствах, включая, но не ограничиваясь ими, аэрозоли
под повышенным давлением, распылители или инсуффляторы, которые могут быть
сконструированы так, чтобы обеспечить предварительно определенные дозы активного
ингредиента. В предпочтительном варианте реализации фармацевтические композиции
согласно настоящему изобретению вводят через носовую полость в легкие.
5 Фармацевтические композиции, приспособленные для парентерального введения,
включают водные и неводные стерильные растворы или суспензии для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические агенты и растворенные вещества, которые делают композицию по существу изотонической по отношению к крови предполагаемого реципиента. Другие компоненты, которые могут присутствовать в
10 указанных композициях, включают воду, спирты, полиолы, глицерин и растительные масла, например. Композиции, предназначенные для парентерального введения, могут быть обеспечены в однодозовых или многодозовых контейнерах, например, запечатанных ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном замораживанием (лиофилизованном) состоянии, при котором необходимо только добавление стерильного
15 жидкого носителя, например, стерильного физиологического раствора для инъекций, непосредственно перед использованием. Растворы и суспензии для инъекций для немедленного введения могут быть приготовлены из стерильных порошков, гранул и таблеток.
В предпочтительном варианте реализации композиция изготовлена в соответствии со
20 стандартными методиками в виде фармацевтической композиции, приспособленной для внутривенного введения человеку. Как правило, композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. Если необходимо, композиция также может содержать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции. Обычно
25 ингредиенты поставляются раздельно или в смеси в виде стандартной лекарственной формы, например, в виде сухого лиофилизованного порошка или безводного концентрата в герметически закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композиция предназначена для введения путем инфузии, она может быть налита в инфузионный флакон, содержащий стерильную воду
30 фармацевтической чистоты или физиологический раствор. Если композицию вводят путем инъекции, ампула стерильного физиологического раствора может быть обеспечена так, что ингредиенты могут быть смешаны перед введением.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения, например, лекарственный препарат, такой как ингибитор С5а, описанный в настоящем документе,
35 может быть доставлен в системе с контролируемым высвобождением. Например,
ингибитор может быть введен с помощью внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. Согласно одному варианту реализации может быть использован насос (см. Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-240; Buchwald et al. (1980) Surgery 88:5075 516; Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321:574-579). В другом варианте реализации соединение может быть доставлено в везикуле, в частности, в липосоме (см. R. Langer (1990) Science 249:1527-1533; Treat et al. (1989) в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, N.Y., 353-365; WO 91/04014; патент США №4704355). В другом варианте реализации могут быть использованы
10 полимерные материалы (см. Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61; см. также Levy et al. (1985) Science 228:190; During et al. {\9%9) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105).
15 Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения система с
контролируемым высвобождением может быть помещена вблизи терапевтической мишени, т.е. клетки-, ткани- или органа-мишени, при этом требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, vol. 2). Другие системы с контролируемым высвобождением
20 обсуждаются в обзоре Langer (1990, Science 249: 1527-1533).
В конкретном варианте реализации настоящего изобретения желательным может быть введение фармацевтических композиций или ингибиторов С5а согласно настоящему изобретению локально в область, нуждающуюся в лечении; введение может быть достигнуто, например, но не ограничиваясь перечисленными, с помощью местной
25 инфузии во время хирургического вмешательства, местного применения, например, в сочетании с раневой повязкой после хирургического вмешательства, путем инъекции, с помощью катетера, с помощью суппозитория, или с помощью имплантата, причем указанный имплантат изготовлен из пористого, непористого или желатинового материала, включая мембраны, такие как силастические мембраны, или волокна.
30 Выбор предпочтительной эффективной дозы будет определен специалистом в
данной области техники на основании рассмотрения нескольких факторов, которые будут известны обычному специалисту в данной области техники. Указанные факторы включают конкретную форму фармацевтической композиции, например, полипептид или вектор, и ее фармакокинетические параметры, такие как биодоступность, метаболизм,
35 период полувыведения и т.д., которые будут установлены в ходе обычных процедур
разработки, обычно используемых при получении одобрения регулирующих органов для фармацевтического соединения. Другие факторы, которые следует учитывать при определении дозы, включают состояние или заболевание, которое предотвращают и/или лечат, или пользу, которую получит нормальный индивидуум, массу тела пациента, 5 возраст пациента, путь введения, является ли введение острым или долговременным, сопутствующее лечение, и другие факторы, которые, как хорошо известно, влияют на эффективность вводимых фармацевтических агентов. Следовательно, точная дозировка должна быть определена в соответствии с оценкой лечащего врача и обстоятельств для каждого пациента, например, в зависимости от состояния и иммунного статуса отдельного 10 пациента, а также в соответствии со стандартными клиническими методиками.
Фигуры и примеры ниже приведены исключительно для описания настоящего изобретения и не должны быть истолкованы, как ограничивающие каким-либо образом объем настоящего изобретения, как указано в прилагаемой формуле изобретения.
15 КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фигура 1. Биологические характеристики IFX-1.
Фигуры 1А и 1В: Блокирующую активность ГГХ-1 в отношении еС5а человека (фиг. 1А) и обезьяны (фиг. 1В) определяли в количественном исследовании ZAP-CDllb. 20 Данные представляют результаты 3-х отдельных экспериментов с использованием различных доноров.
Фигура 1С: Концентрации ГГХ-1 измеряли в образцах плазмы крови обезьян через 0, 1, 3, 5, и 7 дней после инфицирования и введения антитела (п=4 для 0, 1, 3-го дня; п=2 для 5, 7-го дня).
25 Фигура 2. Активация комплемента в легких АЗМ после инфицирования
вирусом H7N9.
Фигуры 2А, 2В и 2С: Количественное исследование методом ОТ-ШГР для C3aR (фиг. 2А), C5aR (фиг. 2В) и MASP2 (фиг. 2С) выполняли на 18 (группа A/H7N9) и 6 (контрольная группа) образцах, собранных из всех долей легких на 3-й день после 30 инфицирования. Данные представляют относительное изменение (среднее ± SEM) по сравнению с контролем.
Фигуры 2D. 2Е и 2F: Концентрации СЗа (фиг. 2D), С5а (фиг. 2Е) и С5Ь-9 (фиг. 2F) в образцах плазмы крови АЗМ, инфицированных A/H7N9, измеряли с помощью количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). Данные
представлены как среднее значение ± SEM в указанной временной точке (п=6 в 0, 1 и 3 день; п=3 в 5 день). ***Означает.Р <0,001 по сравнению с 0-вым днем.
Фигура 3. Облегчение ОПЛ после инфицирования вирусом A/H7N9 в результате лечения с применением антитела к С5а.
5 Фигура ЗА: Полуколичественное гистопатологическое исследование на 3-й день
выявило облегчение повреждения легких у АЗМ, получавших IFX-1, по сравнению с АЗМ, инфицированными A/H7N9 и не получавшими лечения (2 АЗМ в группе, получавшей IFX-1, и 3 АЗМ в контрольной группе в каждой временной точке).
Фигура ЗВ: Изменение температуры тела (среднее значение ± SEM) в указанных
10 временных точках после инфекции A/H7N9. Представленные данные были рассчитаны путем вычитания температуры, измеренной на 0-й день (6 АЗМ в группе, инфицированной A/H7N9, и 4 АЗМ в группе A/H7N9 + IFX-1 на 0-й день и 3-й день после инфицирования; 3 и 2 АЗМ были оставлены в соответствующих группах на 5-й день и 7-й день). *Означает Р <0,05 по сравнению с группой A/H7N9.
15 Фигура ЗС: Титр вируса в ткани легких на 3-й день после инфицирования
определяли в гомогенизированных образцах, собранных со всех долей легких (п=18 в группе A/H7N9, состоящей из трех АЗМ, и п=12 в группе A/H7N9 + IFX-1, состоящей из двух АЗМ). Данные выражали как ТСШ50 на грамм легочной ткани (среднее значение ± SEM), и пунктирная линия указывает на предел детектирования.
20 Фигура 4. Уменьшение воспалительных ответов у африканских зеленых
мартышек после инфицирования вирусом H7N9 в результате лечения с применением антитела к С5а.
Фигуры 4A-4F: Количественные исследования методом ИФА проводили для измерения концентраций ИЛ-IP; (фиг. 4А), ИЛ-6 (фиг. 4В), ГР-10 (фиг. 4С), ИФН-у (фиг.
25 4D), ФНО-а (фиг. 4Е) и МСР-1 (фиг. 4F) в образцах сыворотки крови АЗМ. Приведенные данные представляют собой концентрации (среднее значение ± SEM) цитокина и хемокина в указанной временной точке, п=6 в группе A/H7N9 (закрашенный круг) и п=4 в группе A/H7N9 + IFX-1 (открытый круг) на 0, 1 и 3-й день после инфицирования; 3 и 2 АЗМ оставлены в соответствующих группах на 5-й день). * и *** означают Р <0,05 и
30 Р <0,001, соответственно, по сравнению с группой A/H7N9.
Фигуры 4G и 4Н: Полуколичественное исследование содержания макрофагов (фиг. 4G) и нейтрофилов (фиг. 4Н) в легких на 3-й день после инфицирования (п=3 в группе A/H7N9 и п=2 в группе A/H7N9 + ГЕХ- 1).
ПРИМЕРЫ
1. Материалы и методы
1.1 Заявление об этических принципах
Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Центром лабораторных 5 животных (Государственная центральная лаборатория патогенов и биозащиты, Пекинский институт микробиологии и эпидемиологии IACUC) (номер разрешения BIME 2013-15). Исследование животных проводили в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных.
1.2 Модель инфицирования вирусом H7N9 у африканских зеленых мартышек
10 В данном исследовании использовали двенадцать молодых взрослых африканских
зеленых мартышек (АЗМ) в возрасте 2-4 лет, и все эксперименты с использованием живых вирусов и биологических образцов с потенциальным загрязнением живым вирусом проводили в лаборатории с уровнем биологической безопасности 3. После анестезии с помощью внутрибрюшинной (в/б) инъекции кетамина (5 мг/кг) десяти АЗМ
15 интратрахеально инокулировали вирус A/Anhui/1/2013 (H7N9) (106 ТСШ50), и двум АЗМ интратрахеально инокулировали аналогичный объемом фосфатно-солевого буфера (ФСБ) в качестве отрицательного контроля. Четыре из десяти АЗМ, которым инокулировали вирус, получали моноклональное антитело к С5а (IFX-1, 5 мг/кг) внутривенно через 30 мин после инокуляции вируса (группа H7N9 + антитело к С5а). Шесть из десяти
20 африканских зеленых мартышек получали ФСБ в качестве контроля (группа H7N9 + ФСБ). Образцы от трех обезьян в группе H7N9 + ФСБ и двух обезьян в группе H7N9 + антитело к С5а собирали на 3-й и 7-й день после инфицирования, соответственно. Образцы для нормального контроля собирали на 3-й день. Образцы плазмы и сыворотки крови, содержащие в качестве антикоагулянта гепарин, собирали на 0, 1, 3, 5, 7-й день у
25 всех животных, хранили при -70 °С до исследования и использовали для оценки уровней продуктов активации комплемента или цитокинов.
Животных подвергали эвтаназии на 3-й день после инфицирования путем кровопускания под анестезией кетамином. После применения анестезии контролировали температуру тела африканских зеленых мартышек, и у животных брали мазки из носа и
30 глотки и помещали в 1 мл среды Игла в модификации Дульбекко, дополненной 100 ME пенициллина/мл и 100 мкг стрептомицина/мл. Тампоны с мазком хранили при -70°С до проведения оценки ТСШ50. Вскрытия выполняли в соответствии со стандартным протоколом. Для полуколичественной оценки макропатологии процент пораженной легочной ткани при аутопсии из каждой доли легкого рассчитывали на основании области
35 консолидации и исчезновения темно-красного окрашивания в каждой доле, чтобы
определить макропатологическую оценку. Образцы для П1 IP с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) хранили в жидкости для хранения РНК (Tiangen Biotech Co., Ltd) при 4°C в течение ночи, а затем хранили при -70°С до проведения ОТ-ШГР. Для проведения гистопатологического исследования трахею, ткани легких из краниальной, медиальной и 5 каудальной долей, печень, селезенку, почки, кишечник, головной мозг и лимфатические узлы суспендировали в 10% нейтральном забуференном формалине в течение ночи и заливали парафином, разрезали на срезы толщиной 4 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином (Г/Э) и использовали для иммуногистохимического исследования.
1.3 Гистопатологическое исследование повреждения легких
10 Легкие собирали, и готовили образцы краниальной, медиальной и каудальной долей
легких с помощью стандартной методики. Срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином (Г/Э) и исследовали методом световой микроскопии. Поражение трахеи и бронхов оценивали по степени дистрофии эпителия и инфильтрации воспалительных клеток в подслизистую оболочку. Повреждение паренхимы исследовали
15 на основании степени дистрофии эпителия, дегенерации и некроза альвеолярных пневмоцитов, инфильтрации воспалительных клеток и расширения паренхимальной стенки, кровоизлияния и интерстициального отека (Sun, S. et al. 2011, Am J Respir Cell Mol Biol;18:834-842). Совокупные оценки размера и степени тяжести дегенерации или воспаления позволили получить общий балл на одно животное, и среднее значение
20 получали как общий балл для этой группы.
1.4 Иммуногистохимическое окрашивание макрофагов и нейтрофилов
Срезы легких, фиксированные формалином и залитые парафином, извлекали из парафина с помощью ксилола и гидрировали с использованием градуированных спиртов. Инфильтрацию макрофагов, нейтрофилов и Т-лимфоцитов оценивали, используя антитела
25 к CD68 и миелопероксидазе (МРО) (Beijing Zhongshan Biotechnology Co., Ltd., China). Антитела детектировали с помощью стандартной системы детектирования стрептавидин-биотин (Beijing Zhongshan Biotechnology Co., Ltd., Beijing, China) в соответствии с инструкциями изготовителя.
Для полуколичественной оценки инфильтрации макрофагов и нейтрофилов в каждом
30 срезе легких произвольно выбирали 30-50 полей наблюдения паренхимы легких для 40-кратного объектива и исследовали с помощью световой микроскопии, чтобы определить присутствие макрофагов или нейтрофилов слепым способом. Совокупные баллы для каждого животного выражали в виде числа положительных полей на 100 полей (%) (Sun, S. et al. 2013, выше).
1.5 Измерение концентраций IFX-1 и количественное исследование CDllb
Уровни IFX-1 в образцах плазмы крови обезьян измеряли с помощью набора для стандартного иммуноферментного анализа (ИФА), поставляемого InflaRx GmbH, Германия. Количественное исследование CDllb использовали для оценки блокирующей 5 активности антитела IFX-1 у человека и обезьян. В общих чертах, кровь человека или обезьян стимулировали с использованием плазмы или зимозан-активированой плазмы (ZAP, содержащей эндогенный С5а - еС5а). Различные концентрации IFX-1 и контрольного антитела IgG4 человека (Sigma, Висконсин, США) добавляли в исследовании, чтобы определить блокирующую активность IFX-1 без предварительной
10 инкубации антитела и еС5а, и уровни еС5а измеряли с помощью набора для ИФА, поставляемого InflaRx GmbH, Германия. После стимуляции вносили FITC-конъюгированное антитело к CDllb мыши или моноклональные антитела для контроля изотипа (BD Bioscience, Нью-Джерси, США) и инкубировали. Немедленно после этапа лизирования эритроцитов экспрессию CDllb на пропущенных гранулоцитах исследовали
15 на проточном цитометре BD FACSCanto(tm) П. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) FITC-меченых гранулоцитов использовали для изучения уровня экспрессии CD1 lb.
1.6 Измерение уровней воспалительных цитокинов и СЗа, С5а, С5Ь-9 в плазме крови
Образцы сыворотки или плазмы крови инфицированных АЗМ собирали в указанное
20 время и хранили при -70°С перед измерением. Уровни цитокинов ИЛ-1, ИЛ-6, ИФН-у, ФНО-а, МСР-1 и IP-10 измеряли с использованием наборов для проведения ИФА в образцах, полученных от обезьян, доступных от U-CyTech biosciences или Uscn life science Inc. Уровни СЗа и C5b-9 измеряли с использованием наборов для проведения ИФА в образцах, полученных от человека, доступных от BD Biosciences, и набор для ИФА С5а
25 был получен от InflaRx GmbH, Йена, Германия. В общих чертах, 100 мкл разведенной сыворотки или плазмы крови АЗМ вносили в планшеты, предварительно покрытые антителами, специфичными для отдельных цитокинов АЗМ, МРО, СЗа, С5а и С5Ь-9, и инкубировали при 4 °С в течение ночи. После промывания добавляли связанные с ферментом специфичные антитела и инкубировали при 37 °С в течение 1 часа. После
30 промывания планшетов добавляли раствор субстрата и инкубировали при 37 °С в течение 30 минут. Окрашивание в планшетах для количественных исследований проявляли с использованием ТМВ, и реакцию останавливали добавлением 1 н H2SO4. Оптическую плотность при 450 нм измеряли с помощью планшет-ридера для ИФА (Synergy 2, Bio Тек), и количество цитокинов или СЗа, С5а и С5Ь-9 у АЗМ определяли с помощью
35 стандартной кривой, полученной при измерении.
1.7 Детектирование мРНК C3aR, мРНК C5aR и экспрессии MASP2
Общую РНК выделяли из ткани краниальной, медиальной и каудальной долей легких африканских зеленых мартышек и проводили сравнительное исследование методом ОТ-ШГР в режиме реального времени. Данные по относительному уровню 5 экспрессии C3aR, C5aR и маннозосвязывающей белок-ассоциированной сериновой протеазы 2 (MASP2) обрабатывали с использованием метода 2"ААСт (Л Livak, К.J. & Schmittgen T.D. 2001. Methods 25:402-408).
1.8 Определение титра вируса в тканях
Бронхи и шесть частей образцов тканей краниальной, медиальной и каудальной 10 долей правого и левого легких, соответственно, собирали у каждой из инфицированных АЗМ в указанные моменты времени и гомогенизировали с использованием гомогенизатора OMNI BEAD RUPTOR 24 (OMNI International, Inc.) в минимальной поддерживающей среде (MEM) с добавлением антибиотиков, чтобы получить 10% (масс./об.) суспензию. Титры вируса в тканях определяли как 50% инфекционную дозу в 15 культуре ткани (ТСШЬо), как описано (Zhao, G. et al. 2010. Virology Journal, 7:151-156). В общих чертах, монослои клеток MDCK инокулировали десятикратными последовательными разведениями гомогенатов органов африканских зеленых мартышек с четырьмя повторами. Через два часа после инокуляции супернатант удаляли и заменяли MEM с добавлением антибиотиков и 2 мкг/мл ТРСК-трипсина (Sigma). После наблюдения 20 цитопатического действия вируса (СРЕ) в течение 3 дней, инфицирование клеток выявляли по гемагглютинирующей активности с использованием 0,5% эритроцитов индейки. Титры вируса в тканях вычисляли по методу Рида и Мюнх и выражали в виде LogioTCID5o/r ткани.
1.9 Статистический анализ
25 Т-тест Стьюдента с коррекцией Уэлша использовали для сравнения данных в
исследовании методом ОТ-ШГР, полуколичественном гистопатологическом исследовании, детектировании титра вируса в легких и полуколичественном исследовании содержания макрофагов и нейтрофилов. Данные по концентрациям СЗа, С5а и С5Ь-9 в плазме крови и блокирующей активности IFX-1 к еС5а человека сравнивали
30 с помощью однофакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Даннетта. Различия в изменениях температуры тела и уровнях воспалительных цитокинов и хемокинов между группами в указанных временных точках сравнивали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с использованием апостериорного критерия Бонферрони. Значение Р ниже 0,05 рассматривали как статистически значимое.
Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего. Обработку данных выполняли в GraphPad Prism, версия 5.01. 2. Результаты
2.1 Исследование IFX-1 и его биологической активности
5 IFX-1 представляет собой химерное моноклональное антитело IgG4 человека/мыши,
разработанное InflaRx GmbH, Германия. Антитело представляет собой антитело IgG4 каппа-типа, вырабатываемое клетками СНО (клетки яичника китайского хомяка), и состоит из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой каппа-цепи мыши (VH и VL) и константных областей тяжелой гамма-цепи 4 и легкой каппа-цепи человека. Как раскрыто
10 InflaRx GmbH, IFX-1 изучали в токсикологическом исследовании на обезьянах и в клиническом исследовании фазы I с участием людей, при этом указанное антитело проявило хороший профиль безопасности для дальнейших клинических исследований.
Блокирующую активность IFX-1 изучали с помощью количественного исследования CDllb и эндогенного С5а (еС5а), полученного из образцов ZAP человека от 8 различных
15 доноров. Как показано на фигуре 1А, IFX-1 значительно снижало экспрессию CDl lb на гранулоцитах человека более чем на 80% при молярном соотношении антитело:антиген 0,5:1. Блокирующая активность IFX-1 в отношении еС5а-индуцированной активации экспрессии CDllb доходила до 98%, если применяли молярное соотношение антитело: антиген 1:1 и 2:1.
20 Блокирующую активность в отношении С5а обезьян также изучали с помощью
количественного исследования ZAP-CDllb с использованием ZAP обезьян и цельной крови обезьян. Антитело IFX-1 способно блокировать ZAP-индуцированную активацию экспрессии CDllb на гранулоцитах обезьян на 100% (фиг. 1В), это указывает на то, что IFX-1 представляет собой полностью функциональное блокирующее антитело к еС5а
25 обезьян.
В модели инфекции вирусом H7N9 у обезьян антитело IFX-1 в дозе 5 мг/кг вводили внутривенно для лечения четырех инфицированных обезьян, и уровни антитела затем контролировали с помощью исследования фармакокинетики. Приблизительно 40 мкг/мл IFX-1 обнаружили у четырех обработанных обезьян через 1 день после обработки, и 30 уровень IFX-1 упал до приблизительно 10 мкг/мл у двух оставшихся обезьян на 7-й день (фиг. 1С). Полученные данные указывают на то, что IFX-1 является полностью функциональным антителом, способным блокировать еС5а обезьян, и доза, использованная для лечения, является достаточной в указанной модели.
2.2 Патофизиология у африканских зеленых мартышек (АЗМ), инфицированных вирусом H7N9
Для изучения патофизиологии вируса H7N9 и иммунных ответов организма хозяина на вирусную инфекцию, восемь АЗМ инфицировали вирусом H7N9 (AH1/H7N9), и двум 5 АЗМ вводили ФСБ в качестве контроля. Трех животных умерщвляли на 3-й день, еще трех животных подвергали эвтаназии на 7-й день, и двух оставшихся животных подвергали эвтаназии на 14-й день после инфицирования. Легкие, трахею, сердце, печень, почки, селезенку, головной мозг и кишечник собирали у АЗМ, инфицированных вирусом H7N9, и гомогенизировали для выделения вируса. Вирус может быть выделен из легких и
10 трахеи, но не из гомогенатов других тканей на 3-й день после инфицирования (таблица 4). На 7-й и 14-й день вирус не поддавался выделению ни в одной из собранных тканей. Титры, вызывающие ингибирование гемагглютинации (HI) в сыворотке крови АЗМ, детектировали через 7 дней после инфицирования, и титры HI на 14-й день варьировались от 1:80 до 1:160 (таблица 4). Результаты вирусологических и серологических
15 исследований доказали, что АЗМ были эффективно инфицированы вирусом H7N9.
20 группой, которая получала ФСБ, в инфицированных легких наблюдали мультифокальный аденит трахеи и бронхов, который характеризовался дистрофией эпителия и умеренной
инфильтрацией лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и случайных эозинофилов в подслизистую оболочку трахеи. Повреждения, обнаруженные в легких, инфицированных вирусом H7N9, представляли собой острое экссудативное диффузное повреждение легких, которое характеризовалось дистрофичным и разрушенным эпителием бронхиол и 5 терминальных бронхиол, диффузными и утолщенными альвеолярными перегородками с инфильтрацией лимфоцитов, макрофагов и нейтрофилов, дистрофичными и разрушенными пневмоцитами, а также мультифокальным кровоизлиянием в интерстициальное пространство легких, экссудатами и тяжелым отеком. Эндотелий был дистрофичным с большим количеством прикрепленных воспалительных клеток и
10 поврежденной базальной мембраной. Наблюдение ультраструктуры выявило разрушенные эпителиальные клетки легких с набухшими митохондриями и разрушенным эндоплазматическим ретикулумом, поврежденным альвеолярно-капиллярным барьером с остатками клеток, попавшими в альвеолярное пространство, и инфильтрацией воспалительных клеток в интерстициальный отек (данные не приведены).
15 Среди всех других исследованных органов, включая головной мозг, сердце,
кишечник, селезенку и почки, селезенка была единственным органом, имеющим определенный уровень гистологических изменений после инфицирования вирусом H7N9 с незначительно повышенным количеством фагоцитов в красной пульпе и артериальной муфте селезенки, а также гиперемией и локальным кровоизлиянием в красной пульпе
20 (данные не приведены). В других органах, таких как мозг, кишечник и почки, повреждения не были обнаружены.
2.3 Активация комплемента в легких после инфицирования вирусом H7N9 Несмотря на то, что активация комплемента играет ключевую роль в защите от вторжения патогенов, накопленные результаты исследований выявили, что чрезмерная
25 активация комплемента была связана с целым рядом аутоиммунных и воспалительных заболеваний (Klos, A. et al. 2009, выше). Результаты данного исследования методом ОТ-ПЦР в реальном времени выявили, что транскрипционные уровни C3aR, C5aR и уровень экспрессии MASP2 были значительно повышены на 1-й день инфицирования вирусом H7N9 (фиг. 2А, В и С). Помимо этого уровни основных продуктов активации
30 комплемента СЗа, С5а и С5Ь-9 в образцах плазмы крови африканских зеленых мартышек были заметно повышены после инфицирования вирусом H7N9. Высокие уровни СЗа и С5Ь-9 сохранялись во всех временных точках с 1 по 5 день, в то время как уровень С5а был значительно повышен на 1-й день и 3-й день и практически вернулся к начальному уровню на 5-й день (фиг. 2D, Е и F). Помимо этого повышенная экспрессия белка C3aR и
35 C5aR в срезах легких, особенно в эпителии бронхиол и тканях с тяжелым воспалением,
была выявлена с помощью иммуногистохимического окрашивания после инфицирования вирусом H7N9 (данные не приведены). Окрашивание СЗс, другого индикатора активации комплемента, также выявило повышенный уровень отложений в легких АЗМ на 3-й день после инфицирования вирусом H7N9 (данные не приведены). Полученные данные 5 указывают на то, что система комплемента интенсивно активируется в кровотоке, а также в легких после инфицирования вирусом H7N9.
2.4 Лечение с применением антитела к С5а облегчало клинические признаки ОПЛ, индуцированного инфекцией вирусом H7N9
Для изучения роли активации комплемента в патофизиологии повреждения легких,
10 индуцированного инфекцией вирусом H7N9, антитело к С 5 a, IFX-1 (5 мг/кг), вводили внутривенно инфицированным африканским зеленым мартышкам сразу после инфицирования вирусом. Результаты макропатологических исследований выявили, что инфицированные легкие АЗМ имели мультифокальную консолидацию и обесцвечивание темно-красного окрашивания, которое было наиболее распространено на спинной
15 поверхности легких, в то время как легкие от инфицированных АЗМ, получавших антитело к С5а, имели практический нормальный вид с очень незначительным обесцвечиванием темно-красного окрашивания (данные не приведены). Результаты гистопатологического исследования выявили, что все инфицированные АЗМ имели определенную степень повреждения легких с легкой или мультифокальной
20 бронхоинтерстициальной пневмонией. Тем не менее, гистопатологические показатели в легких очевидным образом улучшились в легких инфицированных АЗМ, получавших лечение с применением антитела к С5а. На 3-й день после инфицирования АЗМ, не получавшие лечения, имели крупные и мультифокальные поражения легких с десквамацией бронхиолярных эпителиальных клеток, дегенерацией и некрозом
25 альвеолярного эпителия, выраженным интерстициальным отеком, мультифокальным кровоизлиянием и сильной инфильтрацией воспалительных клеток, в то время как инфицированные АЗМ, получавшие лечение с применением антитела к С 5 а, имели легкое или умеренное расширение паренхимальной стенки с менее выраженным интерстициальным отеком, значительно меньшее количество инфильтратов
30 воспалительных клеток и заметно более низкую степень повреждения легких (данные не приведены). Несмотря на то, что повреждение легких, по-видимому, было более низкой степени тяжести на 7-й день, чем на 3-й день в обеих обработанных и необработанных группах, разрушение бронхиолярных эпителиальных клеток и пневмоцитов, интерстициальный отек, особенно вокруг кровеносных сосудов, были более тяжелыми на
3 5 7-й день у африканских зеленых мартышек, не получавших лечения, по сравнению с теми,
которые получили лечение (данные не приведены). Полуколичественное гистологическое
исследование легких АЗМ, полученных через 3 дня после инфицирования, выявило, что
гистологическая оценка повреждения легких была значительно снижена в результате
лечения с применением IFX-1 (фиг. ЗА).
5 АЗМ, получавшие антитело IFX-1, имели меньший диапазон колебаний температуры
тела после инфицирования вирусом H7N9, по сравнению с АЗМ, не получавшими лечения (фиг. ЗВ). Неожиданным фактом явилось то, что результаты оценки титров вируса в гомогенизированных тканях легких выявили, что среднее значение титра вируса в легких АЗМ, получавших лечение, было ниже на величину приблизительно l,81og, чем у АЗМ, не
10 получавших лечения (р <0,01) (фиг. ЗС), это указывает на то, что репликация вируса была каким-то образом снижена после лечения с применением антитела к С5а.
2.5 Лечение с применением антитела к С5а уменьшало воспалительные ответы, инициируемые инфекцией вирусом H7N9, у АЗМ
Для дальнейшего определения роли активации комплемента в воспалительных
15 ответах, инициированных инфекцией вирусом H7N9, у африканских зеленых мартышек, уровни воспалительных цитокинов и хемокинов, а также инфильтрацию макрофагов и нейтрофилов оценивали у африканских зеленых мартышек, инфицированных вирусом H7N9, после лечения с применением антитела IFX-1 и без лечения. Как показано на фигуре 4, уровни всех медиаторов воспаления, изученных в данном исследовании, были
20 значительно повышены после инфицирования. Максимальная экспрессия ИЛ-ip, ГР-10 и МСР-1 была достигнута уже на 1-й день после инфицирования, в то время как максимальную экспрессию ИЛ-6, ФНО-а и ИФН-у регистрировали на 3-й день, при этом уровни всех медиаторов снижались на 5-й день. Общие уровни экспрессии указанных медиаторов воспаления, по всей видимости, значительно блокированы у обезьян,
25 получавших лечение с применением антитела к С5а.
Инфильтрацию макрофагов и нейтрофилов измеряли с помощью иммуногистохимического окрашивания CD68 и оценки экспрессии МРО в срезах ткани легких африканских зеленых мартышек, приготовленных на 3-й день после инфицирования (данные не приведены). Полученные данные выявили, что количество
30 нейтрофилов и макрофагов заметно увеличивалось в инфицированных легких, и степень инфильтрации положительно коррелировала с поражением легких. Однако количество воспалительных инфильтратов, особенно нейтрофилов, значительно уменьшилось в легких обезьян, получавших IFX-1, по сравнению с АЗМ, не получавшими лечения (фиг. 4G, Н). В совокупности полученные данные подтвердили, что лечение с применением
антитела к С5а оказывает эффективное терапевтическое действие на ОПЛ и системное воспаление, инициированное инфекцией вирусом H7N9.
ОТКРЫТЫЙ ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ПРЕДСТАВЛЕННЫЙ В
ТЕКСТОВОЙ ФОРМЕ
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO:
SEQ
NO.
SEQ
NO:
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи IFX-1 CDR3 тяжелой цепи INab708 CDR3 легкой цепи IFX-1 CDR3 легкой цепи INab708 CDR2 тяжелой цепи IFX-1 CDR2 тяжелой цепи INab708 CDR2 легкой цепи IFX-1 CDR2 легкой цепи INab708 CDR1 тяжелой цепи IFX-1 CDR1 тяжелой цепи INab708 CDR1 легкой цепи IFX-1 CDR1 легкой цепи INab708 FR1 тяжелой цепи IFX-1 FR2 тяжелой цепи IFX-1 FR3 тяжелой цепи IFX-1 FR4 тяжелой цепи IFX-1 FR1 легкой цепи IFX-1 FR2 легкой цепи IFX-1 FR3 легкой цепи IFX-1 FR4 легкой цепи IFX-1 FR1 тяжелой цепи INab708 FR2 тяжелой цепи INab708 FR3 тяжелой цепи INab708 FR4 тяжелой цепи INab708 FR1 легкой цепи FNab708 FR2 легкой цепи INab708 FR3 легкой цепи ESfab708 FR4 легкой цепи INab708
Перечень последовательностей
<110> InflaRx GmbH
<12 0> ИНГИБИТОРЫ C5A ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ВИРУСНОЙ ПНЕВМОНИИ
<130> 680-6 PCT
<150> EP 14160947.9
<151> 2014-03-20
<160> 33
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 74
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala Lys Tyr Lys His Ser
1 5 10 15
Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys Val Asn Asn Asp Glu
20 25 30
Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu Gly Pro Arg Cys Ile
35 40 45
Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser Gln Leu Arg Ala Asn
50 55 60
Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg 65 70
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala 1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser His Lys Asp Met Gln Leu 1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg
1 5
<210> 5
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
His Lys Asp Met Gln 1 5
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR3 heavy chain
<400> 6
Cys Ala Arg Gly Asn Asp Gly Tyr Tyr Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 7
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 CDR3 heavy chain
<400> 7
Cys Thr Arg Arg Gly Leu Tyr Asp Gly Ser Ser Tyr Phe Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR3 light chain
<400> 8
Cys Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Tyr Thr
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 CDR3 light chain
<400> 9
Cys Gln Gln Asn Asn Glu Asp Pro Leu Thr
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR2 heavy chain
<400> 10
Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Ser Arg Leu Asp Gln
1 5 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 CDR2 heavy chain
<400> 11
Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu
1 5 10
12 7
PRT
<210> <211> <212>
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR2 light chain <400> 12
Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu 1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> INab708 CDR2 light chain
<400> 13
Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu 1 5
<210> 14
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR1 heavy chain
<400> 14
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Phe Trp Met Asp
1 5 10
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 CDR1 heavy chain
<400> 15
Cys Lys Ala Thr Gly Asn Thr Phe Ser Gly Tyr Trp Ile Glu
1 5 10
<210> 16
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 CDR1 light chain
<400> 16
Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Lys
1 5 10 15
<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 CDR1 light chain
<400> 17
Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 18 <211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR1 heavy chain
<400> 18
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR2 heavy chain
<400> 19
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1 5 10 15
<210> 20
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR3 heavy chain
<400> 20
Arg Phe Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
1 5 10 15
Val Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
20 25 30
Tyr
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR4 heavy chain
<400> 21
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR1 light chain
<400> 22
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR2 light chain
<400> 23
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 24
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR3 light chain
<400> 24
Gln Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
1 5 10 15
Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr
25 10
<210> <211> <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IFX-1 FR4 light chain
<400> 25
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 26
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR1 heavy chain
<400> 26
Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala Ser
1 5 10 15
Val Lys Ile Ser
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR2 heavy chain
<400> 27
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu
1 5 10 15
<210> 28
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR3 heavy chain
<400> 28
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr
1 5 10 15
Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
20 25 30
Tyr
<210> 29
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR4 heavy chain
<400> 29
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 30
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR1 light chain
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser 20
<210> 31
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR2 light chain
<400> 31
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu
1 5 10
<210> 32
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR3 light chain
<400> 32
Gly Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
1 5 10 15
Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Val Ala Ala Thr Tyr
20 25 30
Tyr
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INab708 FR4 light chain
<400> 33
Phe Gly Ala Gly Thr Leu Leu Glu Leu Lys
1 5 10
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Ингибитор С5а для применения при уменьшении вирусной нагрузки и/или уменьшении острого повреждения легких (ОПЛ) у субъекта, страдающего вирусной пневмонией,
причем указанный ингибитор С5а представляет собой связывающую молекулу, специфично связывающуюся с С5а человека,
при этом указанная связывающая молекула выбрана из группы, состоящей из:
a) , антител или их антигенсвязывающих фрагментов;
b) . олигонуклеотидов;
c) , антителоподобных белков; и
d) . пептидомиметиков.
2. Ингибитор С5а для применения при лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный ингибитор предназначен для применения в виде монотерапии.
3. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-2, отличающийся тем, что указанная пневмония у указанного субъекта вызвана вирусом HxNx.
4. Ингибитор С5а по п. 3, отличающийся тем, что указанный вирус HxNx выбран из группы, состоящей из H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7 HH10N8.
5. Ингибитор С5а для применения при лечении вирусной пневмонии у субъекта, причем указанная вирусная пневмония у указанного субъекта вызвана вирусом H7N9.
6. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-5, отличающийся тем, что указанный субъект является приматом, предпочтительно человекообразной обезьяной, более предпочтительно человеком.
7. Ингибитор С5а для применения при лечении пневмонии (предпочтительно вирусной пневмонии) у субъекта, причем указанный субъект является приматом, предпочтительно человекообразной обезьяной, более предпочтительно человеком.
8. Ингибитор С5а по п. 7, отличающийся тем, что указанная пневмония у указанного субъекта вызвана вирусом HxNx.
9. Ингибитор С5а по п. 8, отличающийся тем, что указанный вирус HxNx выбран из группы, состоящей из H1N1, H1N3, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H7N9, H9N2, H10N7 иНЮШ.
10. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-9,
причем указанная связывающая молекула специфично связывается с конформационным эпитопом, образованным аминокислотными последовательностями NDETCEQRA (SEQ ID N0: 2) и SHKDMQL (SEQ ГО N0: 3) С5а человека, и
при этом указанная связывающая молекула связывается с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности SEQ ГО N0: 2 и с по меньшей мере одной аминокислотой в аминокислотной последовательности SEQ ГО N0: 3.
11. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанная связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент,
причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:
(i) последовательность CDR3 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 6; или
(ii) последовательность CDR3 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 7;
при этом указанная последовательность CDR3 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
12. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанная связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент,
причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: (ш) последовательность CDR3 легкой цепи SEQ ГО N0: 8; или
(iv) последовательность CDR3 легкой цепи SEQ ГО N0: 9;
при этом указанная последовательность CDR3 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.
13. Ингибитор С5а по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что указанная связывающая молекула представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент,
причем указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит по меньшей мере одну из следующих последовательностей:
(v) последовательность CDR2 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 10;
(vi) последовательность CDR2 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 11;
(vii) последовательность CDR2 легкой цепи SEQ ГО N0: 12;
(viii) последовательность CDR2 легкой цепи SEQ ГО N0: 13;
(ix) последовательность CDR1 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 14;
(x) последовательность CDR1 тяжелой цепи SEQ ГО N0: 15;
(ix)
(xi) последовательность CDR1 легкой цепи SEQ Ш NO: 16; или
(xii) последовательность CDR1 легкой цепи SEQ Ш NO: 17;
при этом указанная последовательность CDR2 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом указанная последовательность CDR2 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот;
при этом указанная последовательность CDR1 тяжелой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот; и
при этом указанная последовательность CDR1 легкой цепи необязательно содержит 1, 2 или 3 замены аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, 1, 2 или 3 делеции аминокислот и/или 1, 2 или 3 вставки аминокислот.