[RU]

В данном документе предложен новый О-полисахарид Е. coli. - O25В. В данном документе также предложены прокариотические клетки-хозяева, содержащие ферменты (например гликозилтрансферазы), используемые в получении O25В. Клетки-хозяева, предложенные здесь, продуцируют биоконъюгаты O25В, которые содержат O25В, связанный с белком-носителем. Кроме того, здесь предложены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие O25В, и/или биоконъюгаты, содержащие O25В. Такие композиции могут быть использованы в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС (внекишечные патогенные Е. coli) и могут дополнительно содержать один или более дополнительных биоконъюгатов.

(57) Реферат / Формула:

В данном документе предложен новый О-полисахарид Е. coli. - O25В. В данном документе также предложены прокариотические клетки-хозяева, содержащие ферменты (например гликозилтрансферазы), используемые в получении O25В. Клетки-хозяева, предложенные здесь, продуцируют биоконъюгаты O25В, которые содержат O25В, связанный с белком-носителем. Кроме того, здесь предложены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие O25В, и/или биоконъюгаты, содержащие O25В. Такие композиции могут быть использованы в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС (внекишечные патогенные Е. coli) и могут дополнительно содержать один или более дополнительных биоконъюгатов.

---

Евразийское (21) 201691478 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/02 (2006.01)
2017.02.28 C07K14/24 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.02.23
(54) НОВЫЙ ПОЛИСАХАРИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/943,710
(32) 2014.02.24
(33) US
(86) PCT/EP2015/053739
(87) WO 2015/124769 2015.08.27
(71) Заявитель: ГЛИКОВАКСИН АГ (CH)
(72) Изобретатель:
Коварик Михель Т., Веттер Михель Л., Кеммлер Стэфан Дж., Хойптле Миха А., Гамбиллара Вероника, Малли Мануэла (CH)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) В данном документе предложен новый О-по-лисахарид Е. coli. - 025В. В данном документе также предложены прокариотические клетки-хозяева, содержащие ферменты (например гликози-лтрансферазы), используемые в получении 025В. Клетки-хозяева, предложенные здесь, продуцируют биоконъюгаты 025В, которые содержат 025В, связанный с белком-носителем. Кроме того, здесь предложены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие 025В, и/или биоконъюгаты, содержащие 025В. Такие композиции могут быть использованы в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС (внекишечные патогенные Е. coli) и могут дополнительно содержать один или более дополнительных биоконъюгатов.
РСТ/ЕР2015/053739 МПК: А61К 39/02 (2006.01) С07К 14/24 (2006/01)
НОВЫЙ ПОЛИСАХАРИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
В данном документе раскрыта структура антигена 025В Е. coli, а также применения 025В, способы получения 025В и биоконъюгаты, содержащие 025В. Заявители идентифицировали кластер генов Е. coli, ответственный за продуцирование 025В, и полностью охарактеризовали структуру антигена 025В. Соответственно, в данном описании изобретения предложены нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В в клетках-хозяевах. Также в данном описании изобретения предложены клетки-хозяева, например рекомбинантно сконструированные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В. Такие клетки-хозяева можно использовать для получения биоконъюгатов, содержащих 025В, связанный с белком-носителем, которые можно использовать, например, в приготовлении лекарственных препаратов (например вакцин). Антиген 025В, описанный в данном документе, также полезен в получении антител, которые можно использовать, например, в терапевтических способах, таких как пассивная иммунизация субъектов. Кроме того, в данном описании изобретения предложены композиции, содержащие 025В, один или в комбинации с другими антигенами Е. coli (например 01, 02 и 06 и их субсеротипами), для применения в терапевтических способах, например в вакцинации хозяев против инфекции Е. coli (например внекишечными патогенными, такими как уропатогенные, Е. coli).
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Внекишечные патогенные Е. coli (ЕхРЕС) вызывают широкий спектр инфекций, которые приводят к существенной заболеваемости, смертности и ежегодным расходам. Инфекции мочевыводящих путей являются одними из наиболее частых заболеваний, вызванных ЕхРЕС у людей. Однако опасные для жизни состояния, такие как менингит и сепсис, также вызваны ЕхРЕС.
Устойчивость бактерий к антибиотикам является серьезной проблемой в борьбе с бактериальной инфекцией, и штаммы Е. coli с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) становятся все более и более
распространенными. См. Schito et al., 2009, Int. J. Antimicrob. Agents 34(5):407-413; и Pitout et al., 2012, Expert Rev. Anti. Infect. Ther. 10(10): 1165-1176. Таким образом, требуется разработка эффективных вакцин против ЕхРЕС.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать раскрытый в данном описании изобретения новый полисахарид 025В Е. coli. В данном описании изобретения также предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать другие антигены Е. coli, например 025А, 01, 02 и Об и их субсеротипы. Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут естественным образом экспрессировать нуклеиновые кислоты, специфичные в отношении продуцирования представляющего интерес О-антигена, или клетки-хозяева, можно получить так, чтобы они экспрессировали такие нуклеиновые кислоты, то есть в некоторых воплощениях указанные нуклеиновые кислоты являются гетерологичными для клеток-хозяев. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие дополнительные ферменты, принимающие активное участие в /V-гликозилировании белков, например, клетка-хозяин, предложенная в данном описании изобретения, может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарил-трансферазу, или нуклеиновые кислоты, кодирующие другие гликозилтрансферазы. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель, например белок, к которому олигосахариды и/или полисахариды могут быть присоединены с образованием биоконъюгата. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli. См. Раздел 5.3.
В конкретном воплощении предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая кластер генов Е. coli lib (upec138) (SEQ ID NO: 12) или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов Е. coli
/Yfo(upec138) (SEQ ID NO: 12). В конкретном воплощении прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая кластер генов /Yfo(upec163) Е. coli или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов /fb(upec163) Е coli. В конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая кластер генов rfb(upec177) Е coli или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов /fb(upec177) Е coli. В конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом
конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин, рекомбинантно
сконструированная так, чтобы содержать (например путем введения одного или
более векторов/плазмид в клетку-хозяина) один, два, три, четыре или более из
следующих генов (или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей
мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или
гомологична одному из следующих генов): rmlB (SEQ ID NO: 1), rmID (SEQ ID
NO: 2), rmlA (SEQ ID NO: 3), rmIC (SEQ ID NO: 4), wzx (SEQ ID NO: 5), wekA
(SEQ ID NO: 6), wekB (SEQ ID NO: 7), wzy (SEQ ID NO: 8), wbbJ (SEQ ID NO: 9),
wbbK (SEQ ID N0:10) и/или wbbL (SEQ ID N0:11). В другом конкретном
воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную
последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу (например
гетерологичную олигосахарил-трансферазу). В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин рекомбинантно
сконструированная так, чтобы содержать (например путем введения одного или более векторов/плазмид в клетку-хозяина) один, два, три, четыре или более из
следующих: (1) с1ТОР-Глюкозо-4,6-дегидратаза; (2) аТОР-б-Дезокси-О-глюкозо-
3,5-эпимераза; (3) Глюкозо-1-фосфат-тимидилилтрансфераза; (4) dTDP-4-
дегидрорамнозо-3,5-эпимераза; (5) О-антиген-флиппаза; (6) dTDP-Rha:Glc-
Rha(Ac)-GlcNAc-UPP-a-1,3-рамнозилтрансфераза; (7) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-
UPP-a-1,3-гликозилтрансфераза; (8) О-антиген-полимераза; (9)
О-ацетилтрансфераза; (10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP-a-1,3-
гликозилтрансфераза; и/или (11) dTDP-Rha:GlcNAc-UPP-a-1,3-рамнозилтрансфераза. В конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу (например гетерологичную олигосахарил-трансферазу). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В некоторых воплощениях прокариотические клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, имеют делецию или функциональную инактивацию одного или более генов. См. Раздел 5.3.1. В конкретном воплощении один или более из гена waaL, гена gtrA, гена gtrB, гена gtrS или кластера генов rfb (или ген или гены в кластере rfb) удалены или функционально инактивированы в геноме прокариотической клетки-хозяина, предложенной в данном описании изобретения.
Белки-носители, экспрессируемые прокариотическими клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения, могут быть выбраны из любого белка-носителя, известного специалистам в данной области, например детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА; см., например Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксифицированного гемолизина А из S. aureus, фактора
агглютинации А, фактора агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильного энтеротоксина Е. coli, детоксифицированных вариантов термолабильного энтеротоксина Е. coli, В-субъединицы холерного токсина (СТВ), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, белка Sat Е. coli, домена-пассажира белка Sat Е. coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, АсгА С. jejuni и природных гликопротеинов С. jejuni. В конкретном воплощении белок-носитель, экспрессируемый прокариотической клеткой-хозяином, предложенной в данном описании изобретения, представляет собой детоксифицированный экзотоксин Pseudomonas (ЕРА). В некоторых воплощениях белок-носитель клетки-хозяина, предложенный в данном описании изобретения, содержит сигнальную последовательность для нацеливания белка-носителя в периплазматическое пространство клетки-хозяина. В конкретном воплощении сигнальная последовательность происходит из DsbA Е. coli, порина А внешней мембраны (OmpA) Е. coli, мальтозосвязывающего белка (MalE) Е. coli, пектатлиазы (PelB) Erwinia carotovorans, Fig I, NikA или эндоксиланазы (XynA) Bacillus sp, термолабильного энтеротоксина LTIIb E. coli, эндоксиланазы XynA Bacillus или флагеллина (Flgl) E. coli. В некоторых воплощениях нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, экспрессируемую клетками-хозяевами, полученными в данном изобретении, конструировали (например рекомбинантными способами) так, чтобы она кодировала одну или более консенсусных последовательностей Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); и/или консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-SenThr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В некоторых воплощениях белки-носители, экспрессируемые клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения, содержат два, три, четыре, пять или более указанных консенсусных последовательностей. См. Раздел 5.3.2.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложен способ получения /V-гликозилированного белка-носителя (также называемого в данном описании изобретения биоконъюгат), который содержит белок-носитель
(например ЕРА), Л/-связанный с О-антигеном Е. coli (например 025В Е. coli), где указанный способ включает культивирование клетки-хозяина, описанной в данном описании изобретения, в условиях, подходящих для получения белков, и очистку Л/-гликозилированного белка-носителя. Способы получения белков с использованием клеток-хозяев, например Е. coli, и выделение белков, продуцируемых клетками-хозяевами, хорошо известны в данной области техники. См. Раздел 5.3.
В другом аспекте предложены биоконъюгаты, продуцируемые клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), /V-связанный с 025В Е. coli. См. Раздел 5.4.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В, представленной ниже: D-GIc
Ў 1
> D-GIc > L-Rha2Ac > D-GlcNAc >
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В', представленной ниже:
D-GIc
P 6 ?
D-GIc
A 1.3
L-Rha
L-Rha2Ac
1,3
-> D-GlcNAc-
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В'.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма ЕхРЕС Е. coli, где указанный штамм продуцирует 025В. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec138. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec163. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec177. См. Раздел 5.2.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена совокупность выделенных макромолекул формулы 025В, представленной ниже:
D-GIc
• D-GIc A
-> L-Rha2Ac
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении п по меньшей мере у 80% макромолекул в группе составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20
до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена совокупность выделенных макромолекул формулы 025В', представленной ниже:
D-GIc
а а
> D-GIc L-Rha2Ac " я " D-GlcNAc ¦
А 1,3 1,3
а 3 L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении п по меньшей мере у 80% макромолекул в группе составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы получения анти-025В антител, с использованием 025В и/или биоконъюгата, содержащего 025В. Кроме того, в данном описании изобретения предложены антитела, продуцируемые согласно таким способам. См. Раздел 5.5.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены композиции, например фармацевтические композиции, содержащие биоконъюгаты, предложенные в данном описании изобретения, и/или макромолекулы (или их совокупности), предложенные в данном описании изобретения. См. Раздел 5.6.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая макромолекулу, содержащая структуру формулы 025В:
D-GIc
D-GIc A
L-Rha2Ac ¦
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая макромолекулу, имеющую структуру формулы 025В':
D-GIc
D-GIc
1.3
а а
> L-Rha2Ac , . " D-GlcNAc-
А 1.3
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, описанный в данном описании изобретения, где указанный биоконъюгат содержит белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В, представленной ниже: D-GIc
D-GIc А
L-Rha2Ac ¦
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В'.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, описанный в данном описании изобретения, где указанный биоконъюгат содержит белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В', представленной ниже: D-GIc
а а L-Rha2Ac
А 1.3
D-GlcNAc-
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В'.
В некоторых воплощениях фармацевтические композиции, предложенные в данном описании изобретения, содержат один или более дополнительных О-антигенов Е. coli, где указанные антигены не являются 025В (например формулы 025В или формулы 025В'), например О-антигены Е. coli (например ЕхРЕС), отличные от антигенов серотипа 025В Е. coli, и/или один или более биоконъюгатов, содержащих белок-носитель, связанный с О-антигеном Е. coli, где указанный антиген не является 025В (например формулы 025В или формулы 025В'). Такие композиции могут содержать одну или более дополнительных макромолекул, содержащих О-антиген ЕхРЕС, и/или один или более дополнительных биоконъюгатов, например макромолекулу 01, 02 и/или 06, и/или биоконъюгат 01 А, 02 и/или 06.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая одну или
более дополнительных макромолекул, содержащих О-антиген ЕхРЕС и/или один или более дополнительных биоконъюгатов, в дополнение к макромолекуле 025В (например макромолекуле, имеющей формулу 025В или формулу 025В') и/или биоконъюгату 025В (например биоконъюгату, содержащему белок-носитель, связанный с формулой 025В или формулой 025В'), где указанные дополнительные макромолекулы содержат структуру, выбранную из группы, состоящей из: а. Формула 025А D-GIc
D-GIc > L-FucNAc
D-GlcNAc-
L-Rha
б. Формула 01А
-L-Rha > L-Rha-
L-Rha
D-GlcNAc-
D-ManNAc
Формула 01В
L-Rha > L-Rha -
D-Gal
-> D-GlcNAc
D-ManNAc
г. Формула 01С
L-Rha A
¦> L-Rha-
D-Gal
D-GlcNAc
D-ManNAc
д. Формула 06Glc
D-Gal N Ас
D-Man-
D-Man
D-GlcNAc
D-GIc
е. Формула 06GlcNAc
D-Gal N Ac
D-Man-
D-Man
D-GlcNAc
L-Rha > L-Rha -
L-Rha > D-GlcNAc
D-Fuc3NAc
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая один, два, три, четыре, пять, шесть или семь макромолекул или биоконъюгатов, содержащих указанные макромолекулы в дополнение к макромолекуле 025В (например макромолекуле, содержащей формулу 025В или формулу 025В') и/или биоконъюгату 025В (например биоконъюгату, содержащему белок-носитель, связанный с формулой 025В или с формулой 025В'), где указанные дополнительные макромолекулы имеют структуру, выбранную из группы, состоящей из:
а. Формула 025А' D-GIc
-> D-GIc
А 1.3
• L-FucNAc
1,3
D-GlcNAc-
L-Rha
Формула 01 А'
а а Р
L-Rha > L-Rha-L-Rha --> D-GlcNAc-
1,3 1,3 1,4
D-ManNAc
Формула 01 В'
а а а
- L-Rha > L-Rha , п *" D-Gal л п " D-GlcNAc ¦
Д 1,2 1,2 1,3
D-ManNAc
Формула 01С
а а а
> L-Rha > L-Rha-D-Gal л п *- D-GlcNAc
А 1,2 1,3 1,3
Р 2
D-ManNAc
Формула 06Glc'
а Р Р
- D-Gal N Ас > D-Man > D-Man > D-GlcNAc
1,3 А 1,4 1,3
p|l,2 D-GIc
Формула 06GlcNAc'
a P P
- D-Gal N Ac > D-Man > D-Man > D-GlcNAc
1,3 A 1,4 1,3
p|l,2 D-GlcNAc
Формула 02'
a a p
- L-Rha > L-Rha--> L-Rha л л *• D-GlcNAc
A 1,2 1,3 1,4
a 2
D-Fuc3NAc
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 01 или биоконъюгат, содержащий 01. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная 01-макромолекула представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная 01-макромолекула представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная 01-макромолекула представляет собой 01 С.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 02 или биоконъюгат, содержащий 02. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид (06Glc) или разветвленный GlcNAc-моносахарид (06GlcNAc)) или биоконъюгат, содержащий 06. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид (06Glc).
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере два из следующих: (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В); (2) макромолекулу 01 или биоконъюгат, содержащий 01; (3) 02 или биоконъюгат, содержащий 02; и/или (4) макромолекулу 06 (например
макромолекулу Об, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид) или биоконъюгат, содержащий Об. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 С. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид (также упоминаемый в данном описании изобретения как 06Glc).
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая макромолекулу 025В, макромолекулу 01 А, макромолекулу 02 и макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид. В некоторых воплощениях указанные макромолекулы конъюгированы с белками-носителями.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы предупреждения заражение субъекта, например человека, ЕхРЕС, включающие введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиции (например иммунологической композиции), описанной в данном описании изобретения. См. Раздел 5.7.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы лечения инфекции у субъекта, например у человека, где субъект инфицирован ЕхРЕС, включающие введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиции (например иммунологической композиции), описанной в данном описании изобретения. См. Раздел 5.7.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы индукции иммунного ответа против ЕхРЕС у субъекта, например у человека, включающие введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиции (например иммунологической композиции), описанной в данном описании изобретения. См. Раздел 5.7.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы индукции продуцирования опсонофагоцитирующих антител против ЕхРЕС у
субъекта, например у человека, включающие введение субъекту фармацевтически эффективного количества композиции (например иммунологической композиции), описанной в данном описании изобретения. См. Раздел 5.7.
Термины и сокращения:
OPS: О-полисахарид; О-антиген грамотрицательных бактерий. OPS также упоминается в данном описании изобретения как О-антиген.
кластер rfb: кластер генов (например кластер генов Е. coli), который кодирует ферментативный механизм, способный синтезировать структуру остова О-антигена. Термин "кластер rfb" может применяться к любому биосинтетическому кластеру О-антигена, включая кластер бактерий, не принадлежащих к роду Escherichia.
waaL: ген лигазы О-антигена, кодирующий связанный с мембраной фермент с активным сайтом, локализованным в периплазме. Кодируемый фермент переносит ундекапренилфосфат(11РР)-связанный О-антиген к ядру липида А, образуя липополисахарид.
wecA: первый ген, кодируемый в кластере wee. Кодируемый белок катализирует перенос GlcNАс-фосфата от UDP-GlcNAc к UPP с образованием UPP-связанного GlcNAc.
ЕСА: общий энтеробактериальный антиген.
RU: повторяющаяся единица. При использовании в данном описании изобретения RU соответствует биологической повторяющейся единице, BRU. BRU описывает RU О-антигена, как она синтезируется in vivo. UPP: ундекапренилпирофосфат. LLO: липид-связанный олигосахарид. 2АВ: 2-амино-бензамид. MS: масс-спектроскопия. 025В: термин 025В относится к антигену 025В из Е. coli, определенному в настоящем документе (субсеротип серотипа 025 Е. coli). Ссылка на 025В в данном описании изобретения включает формулу 025В и формулу 025В', как они определены выше.
025А: термин 025А относится к антигену 025А Е. coli (субсеротип серотипа 025 Е. coli). Ссылка на 025А в данном описании изобретения включает формулу 025А и формулу 025А, как они определены выше.
01 А: термин 01А относится к антигену 01А Е. coli (субсеротип серотипа 01 Е coli). Ссылка на 01А в данном описании изобретения включает формулу 01А и формулу 01 А', как они определены выше.
01В: термин 01В относится к антигену 01В Е coli (субсеротип серотипа 01 Е coli). Ссылка на 01В в данном описании изобретения включает формулу 01В и формулу 01 В', как они определены выше.
01 С: термин 01С относится к антигену 01С Е. coli (субсеротип серотипа 01 Е. coli). Ссылка на 01С в данном описании изобретения включает формулу 01С и формулу 01 С, как они определены выше.
02: термин 02 относится к антигену 02 Е coli (серотипа 02 Е coli). Ссылка на 02 в данном описании изобретения включает формулу 02 и формулу 02', как они определены выше.
06: термин 06 относится к антигену 06 Е coli (серотипа 06 Е coli). Ссылка на 06 в данном описании изобретения включает формулу 06 и формулу 06', как они определены выше.
Биоконъюгат: термин биоконъюгат относится к конъюгату белка (например белка-носителя) и антигена, например О-антигена (например 025В), полученному в клетке-хозяине, где механизм клетки-хозяина связывает антиген с белком (например образует N-связь). Гликоконъюгаты включают биоконъюгаты, а также конъюгаты сахарный антиген (например олиго- и полисахариды)-белок, полученные другим образом, например посредством химического связывания белка и сахарного антигена.
Термин "примерно", при использовании в сочетании с числом, относится к любому числу в пределах ±1, ±5 или ±10% от указанного числа.
При использовании в данном описании изобретения термин "эффективное количество" в контексте введения терапевтического средства (например композиции, описанной в данном документе) субъекту, относится к количеству терапевтического средства, которое обеспечивает профилактический и/или терапевтический эффект(ы). В некоторых воплощениях "эффективное количество" относится к количеству
терапевтического средства, которое достаточно для достижения одного, двух, трех, четырех или более следующих эффектов: (1) уменьшение или ослабление тяжести инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (2) уменьшение продолжительности инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (3) предупреждение развития инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (4) индукция регрессии инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (5) предупреждение развития или начала инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ней; (6) предупреждение повторного возникновения инфекции ЕхРЕС или симптома, связанного с ним; (7) снижение функциональной недостаточности органов, связанной с инфекцией ЕхРЕС; (8) уменьшения уровня госпитализации субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (9) уменьшение продолжительности госпитализации субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (10) увеличение выживаемости субъекта с инфекцией ЕхРЕС; (11) ликвидация инфекции ЕхРЕС у субъекта; (12) подавление или снижение репликации ЕхРЕС у субъекта; и/или (13) усиление или улучшение профилактического(их) или терапевтического(их) эффекта(ов) другой терапии.
При использовании в данном описании изобретения термин "в комбинации" в контексте введения двух или более терапевтических средств субъекту, относится к применению более чем одного терапевтического средства. Применение термина "е комбинации" не ограничивает порядок, в котором терапевтические средства вводят субъекту. Например, первое терапевтическое средство (например композицию, описанную в данном документе) можно вводит до (например за 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель), одновременно с, или после (например через 5 минут, 15 минут, 30 минут, 45 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 96 часов, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель, 6 недель, 8 недель или 12 недель) введения второго терапевтического средства субъекту.
При использовании в данном описании изобретения термин "субъект" относится к животному (например к птицам, рептилиям и млекопитающим). В другом воплощении субъект представляет собой млекопитающее, в том числе
не являющееся приматом (например верблюда, осла, зебру, корову, свинью, лошадь, козу, овцу, кошку, собаку, крысу и мышь) и являющееся приматом (например обезьяну, шимпанзе и человека). В некоторых воплощениях субъект представляет собой животное, не являющееся человеком. В некоторых воплощениях субъект представляет собой сельскохозяйственное животное или домашнее животное (например собаку, кошку, лошадь, козу, овцу, свинью, осла или курицу). В другом воплощении субъект представляет собой человека. В другом воплощении субъект представляет собой человеческого младенца. В другом воплощении субъект представляет собой человеческого ребенка. В другом воплощении субъект представляет собой взрослого человека. В другом воплощении субъект представляет собой пожилого человека. В другом воплощении субъект представляет собой недоношенного человеческого младенца. Термины "субъект" и "пациент" могут быть использованы в данном описании изобретения взаимозаменяемо.
При использовании в данном описании изобретения термин "недоношенный человеческий младенец" относится к человеческому младенцу, рожденному ранее 37 недель внутриутробного возраста.
При использовании в данном описании изобретения термин "человеческий младенец" относится к новорожденному младенцу до 1 года.
При использовании в данном описании изобретения термин "человеческий ребенок преддошкольного возраста" относится к человеку в возрасте от 1 до 3 лет.
При использовании в данном описании изобретения термин "человеческий ребенок" относится к человеку в возрасте от 1 года до 18 лет.
При использовании в данном описании изобретения термин "взрослый человек" относится к человеку в возрасте 18 лет или старше.
При использовании в данном описании изобретения термин "пожилой человек" относится к человеку в возрасте 65 лет или старше.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1: Путь биосинтеза 025А. Стрелки указывают отдельные ферментативные превращения, указаны названия ферментов. Нуклеотид-активированные сахара получают в цитоплазме либо посредством ферментов, представленных в кластере О-антигена, либо посредством ферментов
"домашнего хозяйства" (housekeeping) грамотрицательной клетки-хозяина. Гликозилфосфат-трансфераза (WecA) добавляет D-GlcN Ас-фосфат к ундекапренил-фосфату (UP), образуя GlcNAc-UPP. Затем конкретные гликозилтрансферазы удлиняют молекулу UPP-GlcNAc путем добавления моносахаридов, образуя биологическую повторяющуюся единицу (BRU) олигосахарида (WekABC WbuB). Указанный порядок ферментов не относится к последовательности событий во время синтеза BRU (обозначен как < > ). Затем BRU перемещается в периплазматическое пространство с помощью Wzx. Wzy линейно полимеризует периплазматические BRU с образованием О-антигенного полисахарида. Длина полимера контролируется с помощью Wzz. Многие бактериальные олиго-и полисахариды собираются на UPP и затем перемещаются к другим молекулам, то есть UPP является общей платформой построения олиго- и полисахарида в бактериях. В Е. coli и в большинстве других грамотрицательных бактерий О-антиген переносится от UPP к ядру липида А посредством фермента WaaL из Е. coli с образованием липополисахарида (LPS).
Фиг. 2: кластер rfb, его структура и путь wzx/wzy-зависимого синтеза 0-антигена на примере кластере rfb 025А Е. coli и О-антигена. А. Показана структура кластера rfb штамма Е47а Е. coli, локализованного между генами ga/Fand gnd. Гены показаны как стрелки и закрашивание указано в соответствии с функцией генных продуктов: черными являются гены биосинтеза нуклеотид-активированного моносахарида, которые не являются частью репертуара "домашнего хозяйства" Е. coli (которые закодированы в другом месте генома), черно-белые диагональные полосы представляют гликозилтрансферазы, ответственные за добавление отдельных моносахаридных единиц к BRU, флиппазу wzx и полимеразу wzy. В. Химическая структура BRU О-антигена 025А, как предложено (см. Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41,4).
Фиг. 3. А. Структуры BRU 025A, 025В и 016. В. Сравнение кластера биосинтеза О-антигена (кластер rfb) у 025А, 025В и 016. Закрашенные черным гены представляют собой гены, вовлеченные в биосинтез нуклеотид-активированного моносахарида, диагональные полосы представляют собой прогнозируемые гены гликозилтрансфераз, гены, закрашенные серым,
указывают на гены процессинга и перемещения BRU, а вертикальные полосы показывают гомологию О-ацетилтрансфераз. Серые прямоугольники указывает величины гомологии между генами выше 25%; указаны точные значения. Тонкие черные и серые стрелки показывают места отжига олигонуклеотидов ПЦР-типирования для wzy (025А- и 025В-специфические) и З'-области 025В (025В-специфический).
Фиг. 4. Распределение серотипов в эпидемиологическом исследовании. О-антигенные серотипы Е. coli, идентифицированные в образцах внебольничных UTI (инфекции мочеполовых путей) были сгруппированы в соответствии с распространенностью.
Фиг. 5. Окрашивание серебром и анализ посредством вестерн-блоттинга LPS из клинических изолятов с 025-положительным фенотипом агглютинации. Номера штаммов указаны выше гелевых полос. Выращивали отдельные клоны и нормализованную по 0D (оптическая плотность) биомассу собирали с помощью центрифугирования. Осадки растворяли в Lammli буфере для SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфат натрием) и обрабатывали протеиназой К, чтобы гидролизовать все белки в образце. Стандартное окрашивание серебром применяли к гелю PAGE, как показано на Фиг. 5А, и анализ нитроцеллюлозных мембран, содержащих вещество, перенесенное электрическим током с гелей с одинаковым пробегом, с помощью коммерческой антисыворотки для 025-агглютинации, показан на Фиг. 5В.
Фиг. 6. 2АВ HPLC пики образцов 025А и 025В. Были приготовлены 2АВ-меченные LLO-образцы из штаммов ирес138 (пунктирная линия) и ирес436 (сплошная линия). Собирали пики и соответствующие структуры BRU, выведенные из картины MS/MS-фрагментации (тандемная масс-спектрометрия), представленной на Фиг. 7, показаны стрелками.
Фиг. 7. Серии ионов MS/MS-фрагментации, полученные из пиков, указанных на Фиг. 6 со временем элюирования 50' и 62' материнских ионов с m/z (масса/заряд)=1022 (А; из штамма ирес138) или m/z=1021 (В; из ирес_436). Серии ионов показаны по отношению к изображению предполагаемого BRU.
Фиг. 8. Деацетилирование 2АВ-меченного LLO-образца, полученного из 025В положительного клинического изолята. 025В-специфический пик при времени элюирования 50', полученный от 2АВ-меченных LLO клинического
изолята с генотипом 025В, собирали и анализировали посредством нормально-фазовой HPLC после обработки (сплошная линия) или без обработки (пунктирная линия) NaOH для гидролиза О-ацетильных групп ND Cal's Special Patent Program.
Фиг. 9. Анализ моносахаридного состава биоконъюгатов 025А и 025В. Биоконъюгаты 025 получали, очищали и обрабатывали для анализа моносахаридного состава. Показаны пики образцов на С18 HPLC. Полученные из 025А (сплошная) и 025В (пунктирная) образцы сравнивали со смесью моносахаридов из торговых источников (Glc, GlcNAc, Rha, FucNAc). Время элюирования моносахаридов показано стрелками.
Фиг. 10. Характеристика биоконъюгатов 025А. Очищенную конечную массу биоконъюгатов 4S-EPA-025A анализировали с помощью SDS PAGE и визуализировали посредством непосредственного окрашивания Кумасси (С) и Вестерн-блоттинга с использованием анти-ЕРА антисыворотки или анти-025 антисыворотки.
Фиг. 11. Характеристика биоконъюгатов 025В. Очищенную конечную массу биоконъюгатов 4S-EPA-025B анализировали посредством SDS PAGE и визуализировали посредством непосредственного окрашивания Кумасси (С) и Вестерн-блоттинга с использованием анти-ЕРА антисыворотки или анти-025 антисыворотки.
Фиг. 12. Генетический биосинтез и химическая структура О-антигена 01. А. Показан кластер rfb и фланкирующие гены 01А штамма G1632 Е. coli (учетный номер GU299791). Черные, серые и полосатые обозначения являются такими же, как для фиг. 2, описанной выше. В. Показаны химические структуры BRU субсеротипов 01.
Фиг. 13. Анализ LPS из клинических изолятов с фенотипом 01-положительной агглютинации. А. Окрашивание серебром и В. Вестерн-блоттинг с использованием анти-01 антисыворотки.
Фиг. 14. Определение 01А в клинических изолятах 01. 2АВ-меченные LLO-образцы из клинических изолятов 01 анализировали посредством метода идентификационных отпечатков LLO. А. Показаны пики нормально-фазовой HPLC от 60' и далее. Базовый уровень для каждого образца был смещен, чтобы визуализировать совместно мигрирующие пики. Номер ирес указывает
клинический штамм. В. Серии ионов MS/MS-фрагментации m/z=1849,6 (Na+ аддукт). Изображение определяет картину фрагментации ионов и возможные разрывы гликозидной связи в олигосахариде из 2 BRU из 01А.
Фиг. 15. Биоконъюгаты 01. Мелкомасштабный анализ экспрессии гликопротеина ЕРА-01 клетками Е. coli (W3110 A/ffo016::/fb01 AwaaL), трансформированными экспрессионной плазмидой ЕРА (pGVXN659) и пятью разными экспрессионными плазмидами pgIB: А, р114: экспрессия кодон-неоптимизированной, содержащей НА-метку pgIB; В, р939: кодон-оптимизированная, содержащая НА-метку pgIB; С, р970: кодон-оптимизированная, с удаленной НА-меткой pgIB; D, кодон-оптимизированная, содержащая НА-метку, с удаленным сайтом природного гликозилирования N534Q pgIB; и Е, кодон-оптимизированная, с удаленной НА-меткой, с удаленным сайтом природного гликозилирования N534Q pgIB. Клетки выращивали и индуцировали арабинозой и IPTG (изопропилтиогалактозид), после ночной инкубации при 37°С клетки собирали и получали экстракты периплазматических белков. Затем экстракты разделяли с помощью SDS PAGE, переносили на нитроцеллюлозные мембраны посредством электроблоттинга и иммунологически выявляли, используя анти-ЕРА сыворотку.
Фиг. 16. Биоконъюгаты, описанные на Фиг. 15, обнаруженные с помощью анти-01 сыворотки.
Фиг. 17. Генетическая и химическая структура 06. А. Биосинтез 0-антигенного кластера (кластер rfb) и фланкирующих генов Е. coli CFT073 (Genbank АЕ014075.1). Показаны предположительные функции генов согласно BLAST и указаны гены, специфичные для биосинтеза О-антигена 06. В. Химические структуры описанных структур 06 BRU (Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994)217-225).
Фиг. 18. Идентификация 06 с разветвленным Glc. 2АВ-меченные образцы LLO из клинических изолятов 06 анализировали посредством метода идентификационных отпечатков LLO. А. Показаны пики нормально-фазовой HPLC от 60' и далее. Экстракты получали из эталонных штаммов CCUG11309 (тонкая сплошная линия) и 11311 (прерывистая), содержащих ветви Glc и GlcNAC. Наложение показывает четкие различия во времени элюирования
указанных BRU. В. Экстракты из клинических изолятов, указанных номером ирес, сравнивают с эталонными штаммами из А.
Фиг. 19. Генетический биосинтез и химические структуры О-антигена 02. А. Биосинтез кластера (rfb кластер) О-антигена и фланкирующих генов штамма Е. coli G1674 (учетный номер GU299792). Черные, серые и полосатые обозначения являются такими же, как описано в предыдущих фигурах (например Фиг. 2). В. Химическая структура BRU антигена 02.
Фиг. 20. Анализ LPS из клинических изолятов с фенотипом 02-положительной агглютинации. А. Окрашивание серебром. В. Вестерн-блоттинг с использованием анти-02 антисыворотки.
Фиг. 21. OPS анализ из штамма W3110 AwaaL ArfbW3110::rfbO2 AwekS. Показана хроматограмма анализа 2АВ-меченного LLO посредством нормально-фазовой HPLC.
Фиг. 22. Распознавание LPS 025А и 025В посредством анти-025А and анти-025В МВР(мальтозосвязывающий белок)-антисыворотки в анализе Вестерн-блоттинга. Две нитроцеллюлозные мембраны, которые были получены после электропереноса образцов LPS, полученных из upec436 (025А) и upec138 (025В) и разделенных посредством SDS-PAGE. Картина загрузки была одинаковой для обеих мембран, левая дорожка: LPS 025А из ирес438, средняя дорожка: LPS 025В из ирес 138. МВР биоконъюгаты использовали для иммунизации кроликов. Левая панель: анти 025В-МВР антисыворотка; правая панель: анти 025А-МВР антисыворотка.
Фиг. 23. MS/MS-спектр BRU OPS 02. MS/MS-спектр Na+ аддукта с m/z=989,4 из пика элюирования при 43,5 мин из 2АВ-меченных LLO-экстрактов штамма CCUG25. Показано изображение BRU 02 и ассоциированные Y-ионные серии, подтверждающие ожидаемую последовательность моносахаридов.
Фиг. 24. Биоконъюгаты ЕРА, содержащие антигены 01 А, 02 и 06, используемые в доклиническом исследовании. OPS-гликаны были произведены, очищены и проанализированы посредством SDS PAGE и визуализированы с помощью окрашивания Кумасси.
На Фиг. 25 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных 01А-ЕРА (G1), одним белком-носителем(СЮ), TBS (G11) или тетравалентной композиции, содержащей ЕРА-01А, 02, 06Glc и
025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого 01A-LPS, очищенного из штамма ирес032.
На Фиг. 26 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных 02-ЕРА (G4), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей ЕРА-01А, 02, 06Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого 02-LPS, очищенного из штаммов CCUG25.
На Фиг. 27 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных 06Glc-EPA (G7), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей ЕРА-01А, 02, 06Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого 06GIC-LPS, очищенного из штамма CCUG11309.
На Фиг. 28 показаны средние титры ELISA, полученные с сывороткой из крыс, иммунизированных 025В-ЕРА (G9), одним белком-носителем (G10), TBS (G11) или тетравалентной композицией, содержащей 01 А, 02, 06Glc и 025В (G12), испытанных против планшета ELISA, покрытого 025B-LPS, очищенного из штамма ирес177.
Фиг. 29: Показатели опсонизации сывороток, полученных от крыс до иммунизации (незакрашенные кружки) по сравнению с 42 сутками после иммунизации (закрашенные квадраты) с одной примирующей дозой и двумя бустерными дозами указанных доз моновалентной вакцины. (А) иммунизация 02-ЕРА; (В) иммунизация 06-ЕРА; (С) иммунизация 025В-ЕРА.
Фиг. 30: Титры ELISA, полученные с сывороткой от людей, вакцинированных тетравалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli 01 А, 02, 06Glc и 025В. Значительное увеличение титров ELISA после (через 30 суток после инъекции) по сравнению с титрами до инъекции (сутки 1) наблюдалось только в вакцинированных группах (*, представляет статистическую значимость).
Фиг. 31: Опсонический индекс (01), полученный с сывороткой у людей, вакцинированных тетравалентной вакциной, содержащей антигены Е. coli 01 А, 02, 06Glc и 025В. Иммунный ответ показан как 01 против плацебо и компонентов тетравалентной вакцины (01А-ЕРА (31А), 02-ЕРА (31В), 06Glc-ЕРА (31 С) и 025В-ЕРА (31D)) до и после инъекции. Момент времени до
инъекции, определенный как сутки 1, представлен как V2 (визит 2), и момент времени после инъекции, определенный как сутки 30, представлен как V4 (визит 4). Значительное увеличение OI в промежутке времени между моментом времени после инъекцией и моментом времени до инъекции (обозначенное как *, где несколько * представляет повышенную степень значимости) наблюдали только в вакцинированных группах. NS-нет значимой разницы.
Фиг. 32: Титры ELISA (выраженные как значения ЕС50) сыворотки из вакцинированных субъектов к LPS 025А (черные полоски) и LPS 025В (серые полоски) в сутки 1 (до вакцинации) и через 30 суток (после вакцинации). Статистически значимое увеличение титров ELISA между моментом времени после инъекции (через 30 суток после инъекции) и моментом времени до инъекции (сутки 1) наблюдалось для обоих серотипов: LPS 025А (черные полоски) и LPS 025В (серые полоски).
Фиг. 33: Реакционная способность сыворотки от вакцинированных субъектов в отношении 025А- (черные линии) и 025В- (серые линии) экспрессирующих штаммов Е. coli. Пунктирная серая линия: штамм серотипа 075, отрицательный контроль. На Фиг. 33 показано, что индуцируемые вакциной сывороточные lgG-антитела из вакцинированных субъектов имеют сильную реакцию на штаммы 025А и 025В.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе раскрыта структура антигена 025В Е. coli, а также применения 025В, способы получения 025В, и биоконъюгаты, содержащие 025В. Заявители идентифицировали кластер генов Е. coli, ответственный за продуцирование 025В и полностью охарактеризовали структуру антигена 025В. Соответственно, в данном описании изобретения предложены нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В в клетках-хозяевах. Также в данном описании изобретения предложены клетки-хозяева, например рекомбинантно сконструированные клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, способные продуцировать 025В. Такие клетки-хозяева можно использовать для получения биоконъюгатов, содержащих 025В, связанный с белком-носителем, которые можно использовать, например, в изготовлении лекарственных препаратов (например вакцин). Антиген 025В, описанный в данном документе также может быть использован в получении
антител, которые можно использовать, например, в терапевтических способах, таких как пассивная иммунизация субъектов. Кроме того, в данном описании изобретения предложены композиции, содержащие 025В, отдельно или в комбинации с другими антигенами Е. coli (например 01, 02 и 06, а также их субсеротипами) для применения в терапевтических способах, например в вакцинации хозяев против инфекции Е. coli (например уропатогенными Е. coli). 5.1 Нуклеиновые кислоты и белки
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены выделенные нуклеиновые кислоты, связанные с продуцированием 025В, например нуклеиновые кислоты, кодирующие один или более белков кластера rfb 025В Е. coli. Специалистам в данной области техники понятно, что из-за вырожденности генетического кода, белок, имеющий определенную последовательность аминокислот, может быть закодирован с помощью нескольких разных нуклеиновых кислот. Таким образом, специалистам в данной области техники понятно, что нуклеиновая кислота, предложенная в данном описании изобретения, может быть изменена таким образом, что ее последовательность отличается от последовательности, предложенной в данном описании изобретения, без влияния на аминокислотную последовательность белка, кодируемого этой нуклеиновой кислотой.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb 025В Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов /Yfo(upec138) Е. coli (SEQ ID NO: 12). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID N0: 12. Upec138 является примером штамма Е coli. серотипа 025В Специалисту понятно, что другие штаммы этого серотипа теперь могут быть легко получены из клинических изолятов в соответствии со способами, описанными в данном документе, и примерами таких других штаммов являются ирес177 и ирес163. Таким образом, везде, где в данном документе упоминаются кластер генов rfb или отдельные гены из такого кластера таких 025В-штаммов, подразумевается включение соответствующих генных
кластеров или генов из других 025В-штаммов. Также предложенные последовательности могут быть найдены посредством секвенирования кластеров генов rfb или, при необходимости, отдельных генов из таких других изолятов и будут представлять гомологичные последовательности, кодирующие гомологичные белки, такие как кластер генов или ген. В любых воплощениях, где упоминается гомологичный кластер генов или ген со ссылкой на кластер генов или ген с определенным процентом, такая гомологичная последовательность предпочтительно кодирует белок(и) с той же функцией, что и относящиеся к эталонному штамму или последовательности.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb 025В Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов /Yfo(upec163) Е coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов rfb (upec163) Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер rfb 025В Е coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов /Yfo(upec177) Е coli. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая кластер генов, который примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов /fb(upec177) Е coli.
В другом воплощении в данном описании изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая белки кластера rfb 025В Е coli.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 1, гена rmlB кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на
75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 1.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 2, гена rmID кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 2.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 3, гена rmlA кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 3.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 4, гена rmIC кластера rfb 025В Е coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ог 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 4.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 5, гена wzx кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 5.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 6, ген wekA кластера rfb 025В Е coli. В
другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 6.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е. coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 7, гена wekB кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 7.
В конкретном воплощении, нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 8, гена wzy кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 8.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID NO: 9, гена wbbJ кластера rfb 025В Е coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 9.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения содержит или состоит из SEQ ID NO: 10, гена wbbK кластера rfb 025В Е coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 10.
В конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е. coli, предложенного в данном описании изобретения, содержит или состоит из SEQ ID N0: 11, гена wbbL кластера rfb 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении нуклеиновая кислота, кодирующая белок кластера rfb 025В Е coli, предложенного в данном описании изобретения, на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID N0: 11.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены белки,
кодируемые нуклеиновыми кислотами, предложенными в данном описании
изобретения. В конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена а!ТОР-глюкозо-4,6-дегидратаза, кодируемая SEQ ID N0: 1. В
другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена
а!ТОР-6-дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимераза, кодируемая SEQ ID N0: 2. В другом
конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена глюкозо-
1-фосфат-тимидилилтрансфераза, кодируемая SEQ ID N0: 3. В другом
конкретном воплощении предложена а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимераза,
кодируемая SEQ ID N0: 4. В другом конкретном воплощении предложена 0-
антиген-флиппаза, кодируемая SEQ ID N0: 5. В другом конкретном воплощении
предложена dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансфераза,
кодируемая SEQ ID N0: 6. В другом конкретном воплощении предложена UDP-
Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID
N0: 7. В другом конкретном воплощении предложена О-антиген-полимераза,
кодируемая SEQ ID N0: 8. В другом конкретном воплощении предложена
О-ацетилтрансфераза, кодируемая SEQ ID N0: 9. В другом конкретном
воплощении предложена UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-
гликозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID N0: 10. В другом конкретном воплощении предложена dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансфераза, кодируемая SEQ ID N0: 11.
5.2 О-Антигены Е. coli
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены выделенные антигены Е. coli серотипов 025, 01, 02 и 06.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec138. В другом конкретном
воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec163. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный О-антиген из штамма Е. coli upec177.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный антиген 025В Е coli с формулой 025В: D-GIc
D-GIc А
-*-L-Rha2Ac-
D-GlcNAc-
L-Rha
B другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен выделенный антиген 025В Е coli с формулой 025В':
D-GIc
-> D-GIc
1,3
а а
> L-Rha2Ac , . " D-GlcNAc-
А 1.3
L-Rha
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена группа выделенных макромолекул формулы 025В, представленной ниже:
D-GIc
D-GIc А
-> L-Rha2Ac
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении, п по меньшей мере для 80% макромолекул в этой группе
составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена группа выделенных макромолекул с формулой 025В', представленной ниже:
D-GIc
а а -> L-Rha2Ac
А 1,3
D-GlcNAc-
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении, п по меньшей мере для 80% макромолекул в группе составляет от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
Другие антигены Е. coli, используемые в композициях, описанных в данном документе (например в терапевтических композициях, например в вакцинах; см. Раздел 5.6), включают антигены 025А, а также 01, 02 и Об, и их субсеротипы.
В одном воплощении антиген 025А (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025В)). В конкретном воплощении антиген 025А имеет формулу 025А:
D-GIc
D-GIc A
• L-FucNAc
D-GlcNAc
L-Rha
В другом конкретном воплощении антиген 025А имеет формулу 025А': D-GIc
-> D-GIc
А 1.з
• L-FucNAc
1,3
D-GlcNAc-
L-Rha
В одном воплощении антиген 01А (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025В)). В конкретном воплощении антиген 01А имеет формулу 01 А:
L-Rha > L-Rha -
L-Rha
-> D-GlcNAc-
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении антиген 01А имеет формулу 01 А':
Р | а
К" L-Rha > L-Rha-
з| А 1,3
D-ManNAc
а р
> L-Rha > D-GlcNAc-
1,3 1,4
В одном воплощении антиген 01В (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025В)). В конкретном воплощении антиген 01В имеет формулу 01 В:
L-Rha-A
L-Rha-
D-Gal
-> D-GlcNAc
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении антиген 01В имеет формулу 01 В':
L-Rha-
А 1.2
L-Rha
1,2
D-Gal > D-GlcNAc
1,3
D-ManNAc
В одном воплощении антиген 01С (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025В)). В конкретном воплощении антиген 01С имеет формулу 01 С:
L-Rha-А
-> L-Rha -
D-Gal
D-GlcNAc
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении антиген 01С имеет формулу 01 С:
а а
L-Rha > L-Rha --
А 1.2 1.3
D-Gal > D-GlcNAc
1,3
D-ManNAc
В одном воплощении антиген 02 (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим 025В антиген)). В конкретном воплощении антиген 02 имеет формулу 02:
L-Rha
-> L-Rha -
L-Rha
-> D-GlcNAc
D-Fuc3NAc
-> D-GlcNAc
В другом конкретном воплощении антиген 02 имеет формулу 02':
Р I а а р
а а
L-Rha > L-Rha--> L-Rha л л
1,2 1,3 1,4
а|2
D-Fuc3NAc
В одном воплощении антиген 06 (например в выделенной форме или как часть биоконъюгата) используют в композиции, предложенной в данном описании изобретения (например в комбинации с антигеном 025В (или биоконъюгатом, содержащим антиген 025В)). В конкретном воплощении антиген 06 имеет формулу 06К2 (также упоминаемую в данном описании изобретения, как 06Glc):
D-Gal N Ас
D-Man-
D-Man
D-GlcNAc
D-GIc
В другом конкретном воплощении антиген 06 имеет формулу 06К2' (также упоминаемую в данном описании изобретения, как 06Glc'):
1,4
а Р
D-Gal N Ас > D-Man --
1,3 А 1,4
D-Man
1,3
D-GlcNAc
1,2
D-GIc
В другом конкретном воплощении антиген 06 имеет формулу 06К54 (также упоминаемую в данном описании изобретения, как 06GlcNAc):
> D-GalNAc > D-Man-
-> D-Man ¦
D-GlcNAc
D-GlcNAc
В другом конкретном воплощении антиген 06 имеет формулу 06К54' (также упоминаемую в данном описании изобретения, как 06GlcNAc'):
1,4
> D-Gal N Ас
1,3
> D-Man
1,4
> D-Man
1,3
> D-GlcNAc
Р 1,2 D-GlcNAc
5.3 Клетки-хозяева
В данном документе предложены клетки-хозяева, например прокариотические клетки-хозяева, способные продуцировать О-антигены Е. coli, и биоконъюгаты, содержащие такие О-антигены Е. coli. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат (например естественным образом или посредством генной инженерии) одну или более нуклеиновых кислот, описанных в данном документе. См. Раздел 5.1. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, продуцируют один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и/или продуцируют биоконъюгаты, содержащие один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе. См. Раздел 5.2.
В одном аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, содержащая нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать новый полисахарид, раскрытый в данном описании изобретения, 025В Е. coli. В данном документе также предложены клетки-хозяева, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие ферменты (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать другие антигены Е. coli, например 025А, 01, 02 и 06 и их субсеротипы (см. Раздел 5.2). Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут естественно экспрессировать нуклеиновые кислоты, способные продуцировать представляющий интерес О-антиген, или клетки-хозяева могут быть сконструированы, чтобы экспрессировать такие нуклеиновые кислоты, то есть в некоторых воплощениях указанные нуклеиновые кислоты гетерологичны клеткам-хозяевам и введены в клетки-хозяева с использованием генетических подходов, известных в данной области. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат
нуклеиновые кислоты, кодирующие дополнительные ферменты, проявляющие активность в Л/-гликозилировании белков, например, клетка-хозяин, предложенная в данном описании изобретения, может дополнительно содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую олигосахарил-трансферазу или нуклеиновые кислоты, кодирующие другие гликозилтрансферазы. См., например, Раздел 5.3.3. В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белок-носитель, например белок, к которому могут быть присоединены олиго- и полисахариды с образованием биоконъюгата. См., например, Раздел 5.3.2 для описания белков-носителей и Раздел 5.4 для описания биоконъюгатов. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Upec138 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном
описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025В, и кластер rfb
генов этого штамма (и штаммов серотипа 025В в целом) был идентифицирован
в данном описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые
продуцируют новый полисахарид 025В Е. coli. В конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
содержащая кластер генов rfb (upec138) Е. coli (SEQ ID NO: 12) или кластер
генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 12. В
конкретном воплощении кластер генов rfb (upec138) Е coli (SEQ ID NO: 12)
вводят в клетку-хозяина с помощью генетических манипуляций (например
кластер генов экспрессируется на плазмиде или плазмидах или интегрирован в
геном клетки-хозяина (см., например международная заявка на патент
РСТ/ЕР2013/068737)). В другом конкретном воплощении прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-
Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены rfb кластера гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Upec163 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном
описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025В, а кластер генов
rfb штамма (и штаммов серотипа 025В в целом) был и идентифицирован в
данном описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые
продуцируют новый полисахарид 025В Е. coli. В другом конкретном
воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая
клетка-хозяина, содержащая кластер генов rfb (upec163) Е. coli или кластер
генов, которые примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%,
96%, 97%, 98% или 99% идентичны или гомологичны кластеру генов rfb
(upec163) Е. coli. В конкретном воплощении кластер генов rfb (upec163) Е. coli
вводят в клетку-хозяина с помощью генетических манипуляций (например,
кластер генов экспрессируется на плазмиде или на плазмидах, или
интегрирован в геном клетки-хозяина (см., например, международную заявку на
патент РСТ/ЕР2013/068737)). В другом воплощении прокариотическая клетка-
хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В еще одном конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены кластера rfb гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В
другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Upec177 представляет собой штамм Е. coli, определенный в данном
описании изобретения, как принадлежащий к серотипу 025В, а кластер генов
rfb штамма (и штаммов серотипа 025В в целом) идентифицирован в данном
описании изобретения впервые, как содержащий гены, которые продуцируют
новый полисахарид 025В Е. coli. В другом конкретном воплощении в данном
описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
содержащая кластер генов rfb (upec177) Е. coli или кластер генов, который
примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%
или 99% идентичен или гомологичен кластеру генов rfb (upec177) Е. coli. В
конкретном воплощении кластер генов rfb (upec177) Е. coli введен в клетку-
хозяина с помощью генетических манипуляций (например кластер генов
экспрессируется на плазмиде или плазмидах, или введен в геном клетки-
хозяина (см., например, международную заявку на патент
РСТ/ЕР2013/068737)). В другом воплощении прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены кластера rfb гетерологичны по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK и/или wbbL. Такие клетки-хозяева могут быть сконструированы с использованием рекомбинантных подходов так, чтобы содержать одной или более плазмид, содержащих гены rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK и/или wbbL. В некоторых воплощениях указанные одна или более плазмид интегрированы в геном клетки-хозяина. В конкретном воплощении указанный rmlB содержит SEQ ID N0: 1 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 1. В конкретном воплощении указанный rmID содержит SEQ ID NO: 2 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 2. В конкретном воплощении указанный rmlA содержит SEQ ID NO: 3 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 3. В конкретном воплощении указанный rmIC содержит SEQ ID NO: 4 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 4. В конкретном воплощении указанный wzx содержит SEQ ID NO: 5 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 5. В конкретном воплощении указанный wekA содержит SEQ ID NO: 6 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 6. В конкретном воплощении указанный wekB содержит SEQ ID NO: 7 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 7. В конкретном воплощении указанный wzy содержит SEQ ID NO: 8 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 8. В конкретном воплощении указанный wbbJ содержит SEQ ID NO: 9 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 9. В конкретном воплощении указанный wbbK содержит SEQ ID NO: 10 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен
или гомологичен SEQ ID NO: 10. В конкретном воплощении указанный wbbL содержит SEQ ID NO: 11 или состоит из нее, или на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все гены, rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK, и wbbL гетерологичны no отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит один, два, три, четыре или более, например все, из следующих генов (или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична одному из следующих генов и предпочтительно кодирует белок с такой же функцией): rmlB (SEQ ID NO: 1), rmID (SEQ ID NO: 2), rmlA (SEQ ID NO: 3), rmIC (SEQ ID NO: 4), wzx (SEQ ID NO: 5), wekA (SEQ ID NO: 6), wekB (SEQ ID NO: 7), wzy (SEQ ID NO: 8), wbbJ (SEQ ID NO: 9), wbbK (SEQ ID NO: 10) и/или wbbL (SEQ ID NO: 11). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка
хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно
сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность rmlB (SEQ ID NO: 1). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с 025В антигеном Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует dTDP-глюкозо-
4,6-дегидратазу, например а!ТОР-глюкозо-4,6-дегидратазу, которую кодирует
rmlB. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В
и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В
Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая примерно
или по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%,
90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ
ID NO: 1. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель,
содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно
сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность rmID (SEQ ID NO: 2). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует dTDP-6-дезокси-
0-глюкозо-3,5-эпимеразу, например а!ТОР-6-дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимеразу,
которую кодирует rmID. В другом конкретном воплощении в данном описании
изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная
продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель,
связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным
образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую
кислоту, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична SEQ ID NO: 2. В другом конкретном воплощении, прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок
носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно
сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность rmlA (SEQ ID NO: 3). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В, и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую глюкозо-1-фосфат-
тимидилилтрансферазу, например глюкозо-1 -фосфат-тимидилилтрансферазу,
которую кодирует rmlA. В другом конкретном воплощении в данном описании
изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная
продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель,
связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным
образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую
кислоту, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична SEQ ID NO: 3. В другом конкретном воплощении прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за
исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно
сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность rmIC (SEQ ID NO: 4). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую dTDP-4-
дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу, например а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-
эпимеразу, которую кодирует rmIC. В другом конкретном воплощении в данном
описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная
продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель,
связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным
образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую
кислоту, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентична SEQ ID NO: 4. В другом конкретном воплощении прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wzx (SEQ ID NO: 5). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую О-антиген-флиппазу, например О-антиген-флиппазу, которую кодирует wzx. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В, и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID N0:5. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность wekA (SEQ ID NO: 6). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
рамнозилтрансферазу, например dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу, которую кодирует wekA. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или разработан для того, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID N0:6. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wekB (SEQ ID NO: 7). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность, которая кодирует wekB-гликозилтрансферазу, например UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансферазу, которую кодирует wekB. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновую кислоту, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID N0:7. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wzy (SEQ ID NO: 8). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую О-антиген-
полимеразу, например О-антиген-полимеразу, которую кодирует wzy. В другом
конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена
прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или
биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В
Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по
меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID
NO: 8. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wbbJ (SEQ ID NO: 9). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
О-ацетилтрансферазу, например О-ацетилтрансферазу, которую кодирует
wbbJ. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В
и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В
Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по
меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID
NO: 9. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную последовательность wbbK (SEQ ID NO: 10). В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую гликозилтрансферазу,
например UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу, которую
кодирует wbbK. В другом конкретном воплощении в данном описании
изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная
продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель,
связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным
образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые
кислоты, которые по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%,
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентичны SEQ ID NO: 10. В другом конкретном воплощении прокариотическая
клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность,
кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения
предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно
сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать
025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном
025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или
сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновокислотную
последовательность wbbL (SEQ ID NO: 11). В другом конкретном воплощении в
данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин,
способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-
носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин
естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
рамнозилтрансферазу, например dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3
рамнозилтрансферазу, которую кодирует wbbL. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать нуклеиновые кислоты, которые по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны SEQ ID NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать 025В и/или биоконъюгат 025В (то есть белок-носитель, связанный с антигеном 025В Е. coli), где указанная клетка-хозяин естественным образом содержит или сконструирована так, чтобы содержать по меньшей мере один, два, три, четыре или более, например все, из следующих: (1) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 1; (2) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 2; (3) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична SEQ ID NO: 3; (4) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 4; (5) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 5; (6) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 6; (7) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 7; (8) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 8; (9) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 9; (10) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 10; и/или (11) нуклеиновокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична SEQ ID NO: 11. В конкретном воплощении указанная клетка-хозяин была разработана так, чтобы включать каждую из указанных последовательностей, то есть указанные последовательности являются гетерологичными по отношению к указанной клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность
Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит по меньшей мере два из следующих объектов (1) wbbJ (SEQ ID NO: 9) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 9; (2) wbbK (SEQ ID NO: 10) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID NO: 10; и/или (3) wbbL (SEQ ID NO: 11) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID N0:11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит каждый из (1) wbbJ (SEQ ID NO: 9) или нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%,
80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ
ID NO: 9; (2) wbbK (SEQ ID NO: 10) или нуклеиновую кислоту, которая примерно
или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%
идентична или гомологична SEQ ID NO: 10; и (3) wbbL (SEQ ID NO: 11) или
нуклеиновую кислоту, которая примерно или по меньшей мере на 75%, 80%,
85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична или гомологична SEQ ID
NO: 11. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащую консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025В, где указанная клетка-хозяин содержит (1) а!ТОР-глюкозо-4,6-дегидратазу; (2) а!ТОР-6-дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимеразу; (3) глюкозо-1-фосфат-тимидилилтрансферазу; (4) а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу; (5) О-антиген-флиппазу; (6) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу; (7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансферазу; (8) О-антиген-полимеразу; (9) О-ацетилтрансферазу; (10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и/или (11) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу. В конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X
может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14), или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В другом конкретном воплощении некоторые или все из (1) а!ТОР-глюкозо-4,6-дегидратазы; (2) сГТОР-6-дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимеразы; (3) глюкозо-1-фосфат тимидилилтрансферазы; (4) а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразы; (5) О-антиген-флиппазы; (6) dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазы; (7) UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансферазы (8) О-антиген-полимеразы; (9) О-ацетилтрансферазы; (10) UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазы и/или (11) dTDP-Rha: GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазы являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична по отношению к клетке-хозяину. В другом конкретном воплощении указанный белок-носитель гетерологичен по отношению к клетке-хозяину. В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 025А Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать 025А Е. coli (см., например Фиг. 3). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена
прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная
прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует 01 Е. coli, то есть
указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать 01
Е. coli (см., например Фиг. 12). В конкретном воплощении в данном описании
изобретения предложена клетка-хозяин, которая продуцирует 01А Е. coli. В
конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-
хозяин, которая продуцирует 01В Е. coli. В конкретном воплощении в данном
описании изобретения предложена клетка-хозяин, которая продуцирует 01С
Е. coli. В другом конкретном воплощении, прокариотическая клетка-хозяин
содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую
олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении
прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит
нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин) которая продуцирует 02 Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать 02 Е. coli (см., например Фиг. 19). В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной
аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), которая продуцирует Об Е. coli, то есть указанная клетка-хозяин содержит ферменты, способные синтезировать Об Е. coli (см., например Фиг. 17). В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, которая продуцирует Об Е. coli, содержащий разветвленный Glc-моносахарид, или Об-антиген, содержащий разветвленный GlcNAc-моносахарид. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli.
Кроме того, в данном описании изобретения предложена прокариотическая клетка-хозяин (например рекомбинантно сконструированная прокариотическая клетка-хозяин), способная продуцировать более одного типа О-антигенов Е. coli. В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, способная продуцировать по меньшей мере два из следующих типов: 025В, 025А, 01 (например 01 А, 01В, 01 С), 02 и 06. В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена клетка-хозяин, способная продуцировать 025В и один или более из 025А, 01 (например 01 А, 01В, 01 С), 02 и 06. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую олигосахарил-трансферазу. В другом конкретном воплощении прокариотическая клетка-хозяин дополнительно содержит нуклеиновокислотную последовательность, кодирующую белок
носитель, содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). В конкретном воплощении клетка-хозяин представляет собой Е. coli. 5.3.1 Генетический фон
Все клетки-хозяева, известные специалисту в данной области, можно использовать для получения О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (например 025В), и биоконъюгатов, содержащих О-антигены Е. coli, описанные в данном документе (например 025В), в том числе археи, прокариотические клетки-хозяева и эукариотические клетки-хозяева. Типичные прокариотические клетки-хозяева для применения в продуцировании О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих О-антигены Е. coli, описанных в данном документе, включают без ограничения ими, виды Escherichia, виды Shigella, виды Klebsiella, виды Xhantomonas, виды Salmonella, виды Yersinia, виды Lactococcus, виды Lactobacillus, виды Pseudomonas, виды Corynebacterium, виды Streptomyces, виды Streptococcus, виды Staphylococcus, виды Bacillus и виды Clostridium. В конкретном воплощении клетка-хозяин, используемая для продуцирования О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе, и биоконъюгатов, содержащих О-антигены Е. coli, описанных в данном документе, представляет собой Е. coli.
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, используемые для получения О-антигенов Е coli и биоконъюгатов, описанных в данном документе, сконструированы так, чтобы содержать гетерологичные нуклеиновые кислоты, например гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или более белков-носителей, и/или гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют один или более белков, например гены, кодирующие один или более белков. В конкретном воплощении гетерологичные нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки, участвующие в путях гликозилирования (например прокариотических и/или эукариотических путях гликозилирования), могут быть введены в клетки-хозяева, описанные в данном документе. Такие нуклеиновые
кислоты могут кодировать белки, включающие, без ограничения ими, олигосахарил-трансферазы и/или гликозилтрансферазы. Гетерологичные нуклеиновые кислоты (например нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки-носители, и/или нуклеиновые кислоты, которые кодируют другие белки, например белки, вовлеченные в гликозилирование) могут быть введены в клетки-хозяева, описанные в данном документе, с использованием любых методов, известных специалистам в данной области, например электропорации, химической трансформации посредством теплового шока, естественной трансформации, фаговой трансдукции и конъюгации. В конкретных воплощениях гетерологичные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в данном документе, используя плазмиду, например гетерологичные нуклеиновые кислоты экспрессируются в клетках-хозяевах с помощью плазмиды (например экспрессионного вектора). В другом конкретном воплощении гетерологичные нуклеиновые кислоты вводят в клетки-хозяева, описанные в данном документе, используя способ введения, описанный в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/068737.
В некоторых воплощениях могут быть введены дополнительные модификации (например с использованием рекомбинантных методов) в клетки-хозяева, описанные в данном документе. Например нуклеиновые кислоты клетки-хозяина (например гены), которые кодируют белки, составляющие часть возможно конкурирующего или интерферирующего пути гликозилирования (например конкурирующие или интерферирующие с одним или более гетерологичным генам, вовлеченным в гликозилирование, которые рекомбинантно введены в клетки-хозяева), могут быть удалены или модифицированы в фоне клетки-хозяина (геноме) способом, который делает их неактивными/дисфункциональными (то есть нуклеиновые кислоты клетки-хозяина, которые удалены/модифицированы, не кодируют функциональный белок или не кодируют никакого белка). В некоторых воплощениях, когда нуклеиновые кислоты делетированы из генома клеток-хозяев, предложенных в данном описании изобретения, их замещают нужной последовательностью, например последовательностью, которую можно использовать для получения гликопротеина.
Типичные гены, которые могут быть делетированы в клетках-хозяевах (и в некоторых случаях замещены другими нужными последовательностями нуклеиновых кислот), включают гены клеток-хозяев, вовлеченные в биосинтез гликолипидов, такие как waaL (см., например Feldman et al., 2005, PNAS USA 102:3016-3021), кластер биосинтеза ядра липида A (waa), кластер галактозы (да/), кластер арабинозы (ага), кластер колановой кислоты (wo), кластер капсульного полисахарида, гены биосинтеза ундекапренола-р (например uppS, иррР), гены рециклинга und-P, метаболические ферменты, вовлеченные в биосинтез нуклеотид-активированного сахара, кластер энтеробактериального общего антигена и кластеры модификации О-антигена профага, такие как кластер gtrABS. В конкретном воплощении клетки-хозяева, описанные в данном документе, модифицированы таким образом, что они не продуцируют никаких О-антигенов, отличных от необходимого О-антигена из ЕхРЕС, например 025В. В конкретном воплощении один или более из кластеров гена waaL, гена gtrA, гена gtrB, гена gtrS или гена rfb делетирован или функционально инактивирован в геноме прокариотической клетки-хозяина, предложенной в данном описании изобретения. В одном воплощении клетка-хозяин, используемая в данном описании изобретения, представляет собой Е. coli, которая продуцирует антиген 025В, где ген waaL, ген gtrA, ген gtrB и ген gtrS делетированы или функционально инактивированы в геноме клетки-хозяина. В другом воплощении клетка-хозяин, используемая в данном описании изобретения, представляет собой Е. coli, которая продуцирует антиген 025В, где ген waaL и ген gtrS делетированы или функционально инактивированы в геноме клетки-хозяина.
В некоторых воплощениях модифицированные клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут быть использованы для гликозилирования белка. Гликозилирование белка может быть предназначено для получения биоконъюгатов для применения в вакцинных композициях, например в вакцинах, которые содержат полисахаридный(е) антиген(ов) Е. coli, например 025 (например 025В), 01, 02 и 06.
5.3.2 Белки-носители
Любой белок-носитель, подходящий для применения в продуцировании конъюгатных вакцин (например биоконъюгатов для применения в вакцинах),
может быть использован в данном описании изобретения, например нуклеиновые кислоты, кодирующие белок-носитель, могут быть введены в хозяина, предложенного в данном описании изобретения, для получения биоконъюгата, содержащего белок-носитель, связанный с антигеном ЕхРЕС (например 025В). Типичные белки-носители включают, без ограничения ими, детоксифицированный экзотоксин А из P. aeruginosa (ЕРА; см., например Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61), CRM197, мальтозосвязывающий белок (MBP), дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, детоксифицированный гемолизин А из S. aureus, фактор агглютинации А, фактор агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильный энтеротоксин Е. coli, детоксифицированные варианты термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицу В холерного токсина (СТВ), холерный токсин, детоксифицированные варианты холерного токсина, белок Sat Е. coli, домен-пассажир белка Sat Е. coli, пневмолизин Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированные варианты, АсгА С. jejuni и природные гликопротеины С. jejuni. Различные детоксифицированные варианты белка ЕРА описаны в литературе и могут быть использованы в качестве белков-носителей.
В некоторых воплощениях белки-носители, используемые в получении биоконъюгатов, описанных в данном документе, являются модифицированными, например модифицированными таким образом, что белок является менее токсичным и/или более чувствительным к гликозилированию. В конкретном воплощении белки-носители, используемые в получении биоконъюгатов, описанных в данном документе, являются модифицированными так, что число сайтов гликозилирования в белках-носителях максимизировано таким образом, который делает возможным введение более низкой концентрации белка, например в иммуногенной композиции, в его биоконъюгатной форме.
В некоторых воплощениях белки-носители, описанные в данном документе, модифицированы так, чтобы включать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более сайтов гликозилирования, которые обычно ассоциированы с белком-носителем (например, относительно числа сайтов гликозилирования, ассоциированных с белком-носителем в его нативном/природном состоянии, например в состоянии "дикого типа"). В конкретных воплощениях введение
сайтов гликозилирования осуществляется путем введения консенсусных последовательностей гликозилирования (например Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987)) в любом месте первичной структуры белка. Введение таких сайтов гликозилирования может быть осуществлено посредством, например, добавления новых аминокислот к первичной структуре белка (то есть добавлены сайты гликозилирования, полностью или частично) или посредством мутаций существующих аминокислот в белке так, чтобы образовались сайты гликозилирования (то есть аминокислоты не добавляют к белку, а выбранные аминокислоты белка подвергнуты мутации так, чтобы образовались сайты гликозилирования). Специалистам в данной области техники понятно, что аминокислотная последовательность белка может быть легко модифицирована с использованием подходов, известных в данной области, например рекомбинантных подходов, которые включают модификацию нуклеиновокислотной последовательности, кодирующей белок. В конкретных воплощениях консенсусные последовательности гликозилирования вводят в определенные области белка-носителя, например в поверхностные структуры белка, на N- или С-конце белка, и/или в петли, которые стабилизированы дисульфидными мостиками в основе белка. В некоторых воплощениях классическая консенсусная последовательность гликозилирования из 5 аминокислот может быть удлинена с помощью остатков лизина для более эффективного гликозилирования и, таким образом, вставленная консенсусная последовательность может кодировать 5, 6 или 7 аминокислот, которые должны быть вставлены или которые замещают аминокислоты акцепторного белка. В одном конкретном воплощении белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА, содержащий 4 консенсусные последовательности гликозилирования Asp/Glu-X-Asn-Z-Ser/Thr (SEQ ID NO: 15), и имеют аминокислотную последовательность, как представлено в SEQ ID NO: 13.
В некоторых воплощениях белки-носители, используемые в образовании биоконъюгатов, описанных в данном документе, содержат "метку", то есть последовательность аминокислот, которая позволяет выделить и/или
идентифицировать белок-носитель. Например, добавление метки к белку-носителю, описанному в данном документе, может быть полезным в очистке такого белка и, следовательно, очистки конъюгатных вакцин, содержащих меченый белок-носитель. Типичные метки, которые можно использовать в данном изобретении, включают, без ограничения ими, гистидиновые (HIS) метки (например гексагистидиновую метку или 6XHis-Tag), FLAG-TAG и НАметки. В некоторых воплощениях метки, используемые в настоящем документе, являются удаляемыми, например их удаляют с помощью химических агентов или ферментативными средствами, когда они больше не нужны, например, после того как белок был очищен.
В некоторых воплощениях белки-носители, описанные в данном документе, содержат сигнальную последовательность, которая направляет белок-носитель в периплазматическое пространство клетки-хозяина, экспрессирующей белок-носитель. В конкретном воплощении сигнальная последовательность происходит из DsbA Е. coli, порина А внешней мембраны Е. coli (OmpA), мальтозосвязывающего белка (MalE) Е. coli, пектат-лиазы Erwinia carotovorans (PelB), Flgl, NikA или эндоксиланазы (XynA)Bacillus sp., термолабильного энтеротоксина LTIIb E. coli, эндоксиланазы XynA Bacillus или флагеллина (Flgl) E. coli.
5.3.3 Механизм гликозилирования
Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат, и/или могут быть модифицированы так чтобы включать, нуклеиновые кислоты, которые кодируют генетический механизм (например гликозилтрансферазы), способный продуцировать О-антигены из ЕхРЕС, например антигены 025 (например 025В), 01, 02, и/или 06. См. Раздел 5.1.
Гликозилтрансферазы
Клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антигены ЕхРЕС, например О-антиген из Е. coli серотипа 025 (например 025А или 025В, см. Фиг. ЗВ), 01 (см. Фиг. 12), 02 (см. Фиг. 19) и 06 (например серотип 06, продуцирующий 06-антиген, содержащий разветвленный Glc-моносахарид, или 06-антиген, содержащий разветвленный GlcNAc-моносахарид, см. Фиг. 17). Типичные нуклеиновые кислоты описаны в
Разделе 5.1. В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген ЕхРЕС, естественно экспрессируются клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения (например нуклеиновые кислоты присутствуют в фоне клетки-хозяина "дикого типа"). В некоторых воплощениях некоторые или все нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген ЕхРЕС, в естественных условиях не экспрессируются клетками-хозяевами, предложенными в данном описании изобретения, то есть некоторые или все нуклеиновые кислоты являются гетерологичными по отношению к клетке-хозяину. Клетки-хозяева могут быть сконструированы так, чтобы содержать конкретные нуклеиновые кислоты, например нуклеиновые кислоты, описанные в Разделе 5.1, с использованием способов, известных в данной области, например способов, описанных в Разделе 5.3.
В конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 025В, то есть 025В-антиген, описанный в данном документе. В конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из ирес138 (SEQ ID N0: 12) или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен SEQ ID NO: 12.
В конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из ирес163 или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру rfb из ирес163. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты кодируют кластер rfb из ирес177 или кластер генов, который примерно или по меньшей мере на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичен или гомологичен кластеру rfb из ирес177.
В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген серотипа 025В Е. coli, представляют собой гены серотипа 025В, где указанные гены представляют собой rmlB (SEQ ID NO: 1), rmID (SEQ ID NO: 2) rmlA (SEQ
ID NO: 3), rmIC (SEQ ID NO: 4), wzx (SEQ ID NO: 5), wekA (SEQ ID NO: 6), wekB (SEQ ID NO: 7), wzy (SEQ ID NO: 8), wbbJ (SEQ ID NO: 9), wbbK (SEQ ID NO: 10) и wbbL (SEQ ID NO: 11). См. таблицы 3 и 9.
В конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать О-антиген серотипа 025А Е. coli, то есть антиген 025А, описанный в данном документе. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют белки (например гликозилтрансферазы), способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 025А, представляют собой гены серотипа 025, где указанные гены представляют собой rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekA, wekB, wekC, wzy, fnIA, fnIB, fnIC, wbuB, и/или wbuC. См. Wang, et al. (2010) J Clin Microbiol 48, 2066-2074; GenBank GU014554; и Таблицу 2.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 02. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 02, представляют собой гены серотипа 02, где указанные гены представляют собой rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekP, wekQ, wekR, wzy, fdtA, fdtB, и/или fdtC. См. Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 7177; Fratamico, et al., 2010, Canadian Journal of Microbiology 56, 308-316; и Таблицу 5.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 06. См. Welch et al., 2002, PNAS USA 99(26): 17020-17024; Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225 и Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283. В конкретном воплощении указанный серотип Об содержит разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli
серотипа 01. В конкретном воплощении указанный серотип 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанные нуклеиновые кислоты, которые кодируют гликозилтрансферазы, способные продуцировать О-антиген Е. coli серотипа 01 представляют собой гены серотипа 01, где указанные гены представляют собой rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, mnaA, wekM, wzy, wekN и/или wekO.
Олигосахарил-трансферазы
Олигосахарил-трансферазы переносят липид-связанные олигосахариды на остаток аспарагина образующихся полипептидных цепей, которые содержат консенсусный мотив /V-гликозилирования, например Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15) (см. WO 2006/119987). См., например WO 2003/074687 and WO 2006/119987, описания которых включены в данное описание посредством ссылки во всей их полноте.
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, содержат нуклеиновую кислоту, которая кодирует олигосахарил-трансферазу. Нуклеиновая кислота, которая кодирует олигосахарил-трансферазу, может быть природной для клетки-хозяина или может быть введена в клетку-хозяина с использованием генетических подходов, как описано выше. Олигосахарил-трансфераза может происходить из любого источника, известного в данной области. В конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу из Campylobacter. В другом конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу из Campylobacter jejuni (то есть pgIB; см., например, Wacker et al., 2002, Science 298:1790-1793; см. также, например, NCBI Gene ID: 3231775, учетный номер. 086154 UniProt). В другом конкретном воплощении олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу из Campylobacter lari (см., например, NCBI Gene ID: 7410986).
5.4 Биоконъюгаты
В некоторых воплощениях клетки-хозяева, описанные в данном документе, могут быть использованы для получения биоконъюгатов,
содержащих О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (например 025В; см. Раздел 5.2), связанный с белком-носителем. Способы получения таких биоконъюгатов с использованием клеток-хозяев известны в данной области. См., например WO 2003/074687 и WO 2006/119987.
Альтернативно, гликоконъюгаты могут быть получены посредством химического синтеза, то есть получены вне клеток-хозяев (in vitro). Например, О-антигены Е. coli, описанные в данном документе, например 025В, могут быть конъюгированы с белками-носителями с использованием способов, известных специалистам в данной области, включая использование активации реакционноспособных групп в полисахариде/олигосахариде, а также в белке-носителе. См., например Pawlowski et al., 2000, Вакцина 18:1873-1885; и Robbins, et al., 2009, Proc Natl Acad Sci USA 106:7974-7978), описания которых включены в данное описание изобретения посредством ссылки. Такие подходы включают экстракцию антигенных полисахаридов/олигосахаридов из клеток-хозяев, очистку полисахаридов/олигосахаридов, химическую активацию полисахаридов/олигосахаридов и конъюгацию полисахаридов/олигосахаридов с белком-носителем.
Биоконъюгаты, описанные в данном документе, обладают более полезными свойствами по сравнению с гликоконъюгатами, например для изготовления биоконъюгатов требуется меньше химических веществ, и они являются более совместимыми с точки зрения полученного конечного продукта. Таким образом, биоконъюгаты являются более предпочтительными по сравнению с химически получаемыми гликоконъюгатами.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложены биоконъюгаты, содержащие белок-носитель, связанный с О-антигеном ЕхРЕС, описанным в данном документе. См. Раздел 5.2.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), /V-связанный с 025В Е. coli.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В, представленной ниже:
D-GIc
D-GIc A
-> L-Rha2Ac ¦
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В, то есть 025В связан с остатком Asn белка-носителя, содержащего последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14); или белка-носителя, содержащего консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с соединением формулы 025В', представленной ниже: D-GIc
-> D-GIc
1,3
а а
> L-Rha2Ac , . " D-GlcNAc-
А 1.3
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20. В конкретном воплощении, белок-носитель Л/-связан с О-антигеном формулы 025В'.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном 025А. В конкретном воплощении указанный антиген 025А содержит формулу 025А:
D-GIc
D-GIc
-> L-FucNAc
-> D-GlcNAc-
L-Rha
или 025A':
D-GIc Э
P Г
1,3
• L-FucNAc > D-GlcNAc ¦ 1 ,o
a 3
L-Rha
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном 01. В конкретном воплощении указанный антиген 01 представляет собой 01 А, например указанный антиген имеет формулу 01 А:
L-Rha > L-Rha -
L-Rha
-> D-GlcNAc-
D-ManNAc
или 01A':
P [ a a
-L-Rha > L-Rha--
3[ A 1,3 1,3
D-ManNAc
L-Rha > D-GlcNAc-
1,4
В другом конкретном воплощении указанный 01-антиген представляет собой 01 В, например указанный антиген имеет формулу 01 В:
L-Rha-A
L-Rha-
D-Gal
-> D-GlcNAc
a a a
> L-Rha > L-Rha л n *" D-Gal л n *" D-GlcNAc
A 1,2 1,2 1,3
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении указанный 01-антиген представляет собой 01 С, например указанный антиген имеет формулу 01 С:
L-Rha А
-> L-Rha -
D-Gal
D-GlcNAc
а а
L-Rha > L-Rha --
А 1.2 1.3
D-Gal
1,3
-> D-GlcNAc
D-ManNAc
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном 02. В конкретном воплощении указанный антиген 02 имеет формулу 02:
L-Rha-А
L-Rha -
L-Rha
-> D-GlcNAc
D-Fuc3NAc
или 02'
а а
a | /
L-Rha > L-Rha--
1,2 1,3
L-Rha > D-GlcNAc
1,4
D-Fuc3NAc
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен биоконъюгат, содержащий белок-носитель (например ЕРА), связанный с антигеном Об. В конкретном воплощении указанный антиген Об имеет формулу 06Glc:
D-Gal N Ас
D-Man-
D-Man
D-GlcNAc
D-Gal N Ac
D-Man-
D-Man
D-GlcNAc
D-GlcNAc
06Glc': a
1,4
D-Gal N Ac
1,3
D-Man-
p|l,2 D-GIc
1,4
D-Man
1,3
D-GlcNAc
или 06GlcNAc' a
a P P
1.4
D-Gal N Ac > D-Man > D-Man > D-GlcNAc
1,3 i 1,4 1,3
1.2
D-GlcNAc
Биоконъюгаты, описанные в данном документе, могут быть очищены любым способом очистки белка, известным в данной области техники, например посредством хроматографии (например ионообменной,
анионообменной, аффинной и гель-фильтрационной хроматографии), центрифугирования, дифференциальной растворимости или посредством любого другого стандартного метода очистки белков. См., например, Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 1-18); см. также способы, описанные в WO 2009/104074. Кроме того, биоконъюгаты могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом, известным в данной области, для облегчения очистки. Фактические условия, используемые для очистки конкретного биоконъюгата, зависят, в частности, от стратегии синтеза (например синтетического получения или рекомбинантного получения), а также от таких факторов, как суммарный заряд, гидрофобность и/или гидрофильность биоконъюгата, и понятны специалистам в данной области техники. 5.5 Антитела против 025В
Антиген 025В, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), и/или биоконъюгаты, содержащие антиген 025В, описанные в данном документе (см. Раздел 5.4), могут быть использованы для индукции нейтрализующих антител против ЕхРЕС. В конкретном воплощении антиген 025В, описанный в данном документе, и/или биоконъюгаты, содержащие антиген 025В, описанные в данном документе, можно вводить субъекту (например человеку, мыши, кролику, крысе, морской свинке и т.д.) для индукции иммунного ответа, который включает продуцирование антител. Такие антитела могут быть выделены с использованием методов, известных специалисту в данной области (например иммуноаффинной хроматографии, центрифугирования, осаждения и т.п.).
Кроме того, антиген 025В, описанный в данном документе, может быть использован для скрининга антител из библиотек антител. Например, выделенный 025В может быть иммобилизован на твердом носителе (например силикагеле, смоле, дериватизированной пластмассовой пленке, стеклянном шарике, хлопке, пластмассовом шарике, шарике из полистирола, геле оксида алюминия или полисахариде, магнитном шарике) и подвергнут скринингу на связывание с антителами. Альтернативно, антитела для скрининга могут быть иммобилизованы на твердом носителе и подвергнуты скринингу на связывание с 025В. Любой скрининговый анализ, такой как пэннинг-анализ, ELISA ((иммуноферментный твердофазный анализ), поверхностный плазмонный
резонанс или другой скрининговый анализ антител, известный в данной области техники, может быть использован для скрининга антител, которые связываются с 025В. Библиотека антител для скрининга может быть имеющейся в продаже библиотекой, in vitro полученной библиотекой или библиотекой, полученной посредством идентификации и клонирования выделенных антител из субъекта, инфицированного ЕХРЕС. Библиотеки антител могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области. В конкретном воплощении библиотека антител получена посредством клонирования антител и использования их в библиотеках фагового дисплея или библиотеке фагмидного дисплея.
Антитела, идентифицируемые или индуцируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, могут включать молекулы иммуноглобулина и иммунологически активные части молекул иммуноглобулина, то есть молекулы, которые содержат антигенсвязывающий сайт, который специфически связывается с 025В. Иммуноглобулиновые молекулы могут быть любого типа (например IgG, IgE, IgM, IgD, IgA и IgY), класса (например IgG-i, lgG2, lgG3, lgG4, IgA-i and lgA2) или субкласса иммуноглобулиновых молекул. Антитела включают, без ограничения ими, моноклональные антитела, поливалентные антитела, человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, одноцепочечные Fvs (scFv), одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, Р(аЬ')-фрагменты, дисульфид-связанные Fvs (sdFv) и антиидиотипические (анти-ld) антитела (включая, например, анти-ld антитела к антителам, индуцируемым или идентифицируемым с использованием способа, описанного в данном документе) и эпитопсвязывающие фрагменты любого из вышеперечисленных. В конкретном воплощении антитело, индуцируемое или распознаваемое с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, представляет собой человеческое или гуманизированное моноклональное антитело.
Антитела, индуцируемые или идентифицируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, можно использовать для определения эффективности терапии и/или развития заболевания. Любая система иммуноанализа, известная в данной области, может быть использована для этой цели, включая, без ограничения ими, конкурентные и неконкурентные
системы анализа с использованием таких способов, как радиоиммуноанализ, ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), "сэндвич"-иммуноанализ, реакции преципитации, реакции диффузной преципитации в геле, иммунодиффузные анализы, иммунорадиометрические анализы, флуоресцентные иммунологические анализы, иммуноанализы с протеином А и иммуноэлектрофоретические анализы.
Антитела, индуцируемые или идентифируемые с использованием 025В и/или биоконъюгата 025В, могут быть использованы для детекции штаммов 025В Е. coli, например из множества штаммов Е. coli, и/или для диагностики инфекции штаммом 025В Е. coli.
5.6 Композиции
5.6.1 Композиции, содержащие клетки-хозяева
В одном аспекте в данном описании изобретения предложены композиции, содержащие клетки-хозяева, описанные в данном документе. Такие композиции могут быть использованы в способах получения биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4), например композиции можно культивировать в условиях, подходящих для получения белков. Затем биоконъюгаты могут быть выделены из указанных композиций с использованием способов, известных в данной области техники.
Композиции, содержащие клетки-хозяева, предложенные в данном описании изобретения, могут содержать дополнительные компоненты, подходящие для поддержания и выживания клеток-хозяев, описанных в данном документе, и могут дополнительно содержать дополнительные компоненты, необходимые или полезные для получения белков клетками-хозяевами, например индукторы индуцибельных промоторов, такие как арабиноза, IPTG (изопропилтиогалактозид).
5.6.2 Композиции, содержащие антигены и/или биоконъюгаты
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены композиции (например фармацевтические композиции), содержащие один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), и композиции (например фармацевтические композиции), содержащие один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). В конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании
изобретения, содержит один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2). В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит один или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), и один или более биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4). Композиции, описанные в данном документе, полезны для лечения и предупреждения инфекции субъектов (например людей) внекишечными патогенными Е. coli (ЕхРЕС). См. Раздел 5.7.
В некоторых воплощениях в дополнение к содержащемуся О-антигену Е. coli, описанному в данном документе (см. Раздел 5.2), и/или биоконъюгату, описанному в данном документе (см. Раздел 5.4), композиции (например фармацевтические композиции), описанные в данном документе, содержат фармацевтически приемлемый носитель. При использовании в данном описании изобретения термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или зарегистрированный в фармакопее США или в других общепризнанных фармакопеях для применения у животных и более конкретно для применения у людей. Термин "носитель" при использовании в данном описании изобретения в контексте фармацевтически приемлемого носителя, относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или наполнителю, с которым вводят фармацевтическую композицию. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицеролмоностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и т.п.. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в "Remington's Phrmaceutical Sciences" E.W. Martin.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, содержащая белок-носитель (например белок-носитель,
описанный в Разделе 5.3.2), связанный с антигеном, описанным в данном документе, например с О-антигеном ЕхРЕС, описанный в Разделе 5.2.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 025В Е. coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 025А Е. coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 01 Е coli (см. Раздел 5.2). В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 С.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 02 Е coli (см. Раздел 5.2).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 06 Е coli (см. Раздел 5.2). В конкретном воплощении, указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В), или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 01 или биоконъюгат, содержащий 01. См. Раздел 5.2. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой
макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 С.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 02 или биоконъюгат, содержащий 02. См. Разделы 5.2 и 5.4. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В), и (2) макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид), или биоконъюгат, содержащий 06. См. Разделы 5.2 и 5.4. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая 025В Е. coli (см. Раздел 5.2), или биоконъюгат, содержащий 025 (см. Раздел 5.4), и по меньшей мере один из следующих: (1) 01 Е. coli или биоконъюгат, содержащий 01 (см. Разделы 5.2 и 5.4); (2) 02 Е. coli или биоконъюгат, содержащий 02 (см. Разделы 5.2 и 5.4); и/или (3) 06 Е. coli или биоконъюгат, содержащий 06 (см. Разделы 5.2 и 5.4). В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанный 01 представляет собой 01 С. В другом конкретном воплощении указанный 06 представляет собой 06, содержащий разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере два из следующих: (1) макромолекулу 025 (например 025А или 025В) или биоконъюгат, содержащий 025 (например 025А или 025В); (2) макромолекулу 01 или биоконъюгат, содержащий 01; (3) макромолекулу 02 или биоконъюгат, содержащий 02; и/или (4) макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид), или биоконъюгат, содержащий 06. В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 С. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 01А Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 01В Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 01С Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 02 Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении в данном описании изобретения предложена композиция, например фармацевтическая композиция, содержащая биоконъюгат, содержащий 025В Е. coli, и биоконъюгат, содержащий 06 Е. coli. Такие биоконъюгаты описаны в Разделе 5.4.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с 025В Е. coli (см. Раздел 5.2), (2) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа 01, например 01А (см. Раздел 5.2), (3) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.1.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е coli серотипа 02 (см. Раздел 5.2) и (4) белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа 06 (см. Раздел 5.2).
В некоторых воплощениях вышеуказанные композиции содержат белок-носитель (например белок-носитель, описанный в Разделе 5.3.2, например ЕРА или МВР), связанный с О-антигеном Е. coli серотипа, не являющегося 01, 02, 06 или 025. Другие применимые серотипы Е coli описаны, например, в Примере 1 и в Таблице 1 ниже.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 025 (например 025А или 025В).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 01 (например 01 А, 01В или 01С).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 02.
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид).
В другом конкретном воплощении композиция, предложенная в данном описании изобретения, содержит макромолекулу 025 (например 025А или
025В), макромолекулу 01, макромолекулу 02 и макромолекулу 06 (например макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид или разветвленный GlcNAc-моносахарид). В конкретном воплощении указанная макромолекула 025 представляет собой макромолекулу 025В. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении указанная макромолекула 06 представляет собой макромолекулу 06, содержащую разветвленный Glc-моносахарид.
Композиции, предложенные в данном описании изобретения, могут быть использованы для индукции иммунного ответа у хозяина, которому вводят композицию, то есть они являются иммуногенными. Таким образом, композиции, описанные в данном документе, можно использовать в качестве вакцин против инфекции ЕхРЕС или можно использовать в лечении инфекции ЕхРЕС и можно, соответственно, приготовить в виде фармацевтических композиций. См. Раздел 5.7.
Композиции, содержащие биоконъюгаты и/или макромолекулы, описанные в данном документе, могут содержать любые дополнительные компоненты, подходящие для применения при фармацевтическом введении. В конкретных воплощениях композиции, описанные в данном документе, являются моновалентными композициями. В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, являются мультивалентными композициями, например бивалентными, трехвалентными и тетравалентными композициями. Например, мультивалентная композиция содержит более одного биоконъюгата или О-антигена Е. coli, описанных в данном документе. См. описание 0-антигенов Е. coli и биоконъюгатов в разделах 5.2 и 5.4, соответственно. В конкретном воплощении композиция, описанная в данном документе, представляет собой тетравалентную композицию, содержащую макромолекулу или биоконъюгат, где указанные валентности обусловлены О-антигенами Е. coli серотипов/субсеротипов 025В, 01 А, 06 и 02.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат консервант, например производное ртути тимеросал. В конкретном воплощении фармацевтические композиции, описанные в данном документе, содержат от 0,001% до 0,01% тимеросала. В других воплощениях
фармацевтические композиции, описанные в данном документе, не содержат консервант.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе (например иммуногенные композиции), содержат или вводят в комбинации с адъювантом. Адъювант для введения в комбинации с композицией, описанной в данном документе, можно вводить до введения, одновременно с введением или после введения указанной композиции. В некоторых воплощениях термин "адъювант" относится к компоненту, который при введении в комбинации с композицией, описанной в данном документе, или как часть этой композиции дополняет, усиливает и/или поддерживает иммунный ответ на биоконъюгат, но при введении одного этого компонента, он не индуцирует иммунный ответ на биоконъюгат. В некоторых воплощениях адъювант вызывает иммунный ответ на полипептид биоконъюгата и не вызывает аллергии или других побочных реакций. Адъюванты могут усилить иммунный ответ посредством нескольких механизмов, включающих, например, рекрутмент лимфоцитов, стимуляцию В-и/или Т-клеток и стимуляцию макрофагов.
Конкретные примеры адъювантов включают, без ограничения ими, соли алюминия (квасцы) (такие как гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия и сульфат алюминия), З-де-О-ацилированный монофосфориллипид A (MPL) (см. патент Великобритании GB2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), полисорбат 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), имидазопиридиновые соединения (см. международную заявку PCT/US2007/064857, опубликованную как международная публикация WO2007/109812), имидазохиноксалиновые соединения (см. международную заявку PCT/US2007/064858, опубликованную как международная публикация WO2007/109813) и сапонины, такие как QS21 (см. Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); патент US 5057540). В некоторых воплощениях адъювант представляет собой адъювант Фрейнда (полный или неполный). Другие адъюванты представляют собой эмульсии масло-в-воде (такие как сквален или арахисовое масло), возможно в комбинации с иммуностимуляторами, такими как монофосфориллипид А (см. Stoute et al., N. Engl. J. Med. 336, 86-91 (1997)). Другой адъювант представляет собой CpG (Bioworld Today, Nov. 15, 1998).
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, готовят в виде препарата, подходящего для предполагаемого пути введения субъекту. Например, композиции, описанные в данном документе, могут быть приготовлены в виде препарата, подходящего для подкожного, парентерального, перорального, внутрикожного, трансдермального, колоректального, внутрибрюшинного и ректального введения. В конкретном воплощении фармацевтическая композиция может быть приготовлена в виде препарата для внутривенного, перорального, внутрибрюшинного, интраназального, внутритрахеального, подкожного, внутримышечного, местного, внутрикожного, транскожного или легочного введения.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат один или более буферов, например фосфатный буфер и сахарозо-фосфатно-глутаматный буфер. В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, не содержат буфер.
В некоторых воплощениях композиции, описанные в данном документе, дополнительно содержат одну или более солей, например хлорид натрия, хлорид кальция, фосфат натрия, мононатрия глутамат, и соли алюминия (например гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия, квасцы (алюмосульфат калия) или смесь таких солей алюминия). В других воплощениях композиции, описанные в данном документе, не содержат солей.
Композиции, описанные в данном документе, могут быть включены в контейнер, пакет или дозатор вместе с инструкциями по введению.
Композиции, описанные в данном документе, можно хранить перед использованием, например, композиции можно хранить замороженными (например примерно при -20°С или примерно при -70°С); хранить в охлажденном состоянии (например примерно при 4°С); или хранить при комнатной температуре.
5.7 Профилактические и терапевтические применения
В данном описании изобретения предложены способы лечения и предупреждения инфекции внекишечной Е. coli (ЕхРЕС) субъекта, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4) или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В
конкретном воплощении композиции, описанные в данном документе (см. Раздел 5.6.2) используют для предупреждения ЕхРЕС-инфекции субъекта (например людей), то есть композиции, описанные в данном документе, используют для вакцинации субъекта против ЕхРЕС-инфекции. В другом конкретном воплощении композиции, описанные в данном документе (см. Раздел 5.6.2), используют в лечении субъекта, который инфицирован ЕхРЕС.
В данном описании изобретения также предложены способы индукции иммунного ответа у субъекта против ЕхРЕС, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В одном воплощении указанный субъект инфицирован ЕхРЕС во время введения. В другом воплощении указанный субъект не инфицирован ЕхРЕС во время введения.
В данном описании изобретения также предложены способы индукции продуцирования опсонофагоцитирующих антител против ЕхРЕС у субъекта, включающие введение субъекту О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2). В одном воплощении указанный субъект инфицирован ЕхРЕС во время введения. В другом воплощении указанный субъект не инфицирован ЕхРЕС во время введения.
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен способ предупреждения инфекции Е. coli (например ЕхРЕС) субъекта, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, описанной в Разделе 5.6.2. Способы предупреждения инфицирования ЕхРЕС субъекта, предложенные в данном описании изобретения, приводят к индукции иммунного ответа у субъекта, и включают введение субъекту композиции, описанной в Разделе 5.6.2. Специалисту в данной области понятно, что способы индукции иммунного ответа у субъекта, описанного в данном документе, приводят к вакцинации субъекта против инфекции штаммами ЕхРЕС, О-антигены которых присутствуют в композиции(ях).
В конкретном воплощении в данном описании изобретения предложен способ лечения инфекции Е. coli (например ЕхРЕС) субъекта, где указанный способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции, описанной в Разделе 5.6.2.
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции ЕхРЕС, вызванной любым серотипом, субсеротипом или штаммом ЕхРЕС. В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является более эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции ЕхРЕС, чем один серотип ЕхРЕС.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа 025. В конкретном воплощении указанный серотип 025 представляет собой 025В. В конкретном воплощении указанный серотип 025 представляет собой 025А.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа 01. В конкретном воплощении указанный серотип 01 представляет собой 01 А. В другом конкретном воплощении, указанный серотип 01 представляет собой 01В. В другом конкретном воплощении, указанный серотип 01 представляет собой 01 С.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа 02.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной Е. coli серотипа 06.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е. coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной двумя или более из следующих серотипов Е. coli: 025 (например 025В и 025А), 01 (например 01 А, 01В и 01 С), 02 и/или 06.
В конкретном воплощении иммунный ответ, индуцированный О-антигеном Е coli, описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной каждым из следующих серотипов Е. coli: 025 (например 025В и 025А), 01 (например 01 А, 01В и 01 С), 02 и 06.
Для того чтобы лечить субъекта, имеющего ЕхРЕС-инфекцию, или иммунизировать субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить одну композицию, описанную в данном документе, где указанная композиция содержит один, два, три, четыре или более антигенов Е coli, описанных в данном документе. См. Раздел 5.2. Альтернативно, чтобы лечить субъекта, имеющего ЕхРЕС-инфекцию или иммунизировать субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить несколько биоконъюгатов, описанных в
данном документе, например субъекту можно вводить два, три, четыре или более биоконъюгатов, описанных в Разделе 5.4. Альтернативно, для лечения субъекта с ЕхРЕС-инфекцией или иммунизации субъекта против ЕхРЕС-инфекции, субъекту можно вводить несколько композиций, описанных в данном документе, например субъекту можно вводить две, три, четыре или более композиций, описанных в Разделе 5.6.2.
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для уменьшения симптомов, вызванных ЕхРЕС-инфекцией. Симптомы ЕхРЕС-инфекции могут варьироваться в зависимости от природы инфекции и могут включать, без ограничения ими: дизурию, повышение частоты мочеиспускания или неотложный позыв, пиурию, гематурию, боль в спине, боль при мочеиспускании, лихорадку, озноб и/или тошноту (например у субъектов с инфекциями мочевых путей, вызванными ЕхРЕС); высокую температуру, головную боль, ригидность затылочных мышц, тошноту, рвоту, судороги, сонливость и/или светочувствительность (например у субъектов с менингитом, вызванным ЕхРЕС); лихорадку, увеличение частоты сердечных сокращений, увеличение частоты дыхания, снижение диуреза, снижение количества тромбоцитов, боль в животе, затруднение дыхания и/или нарушение функции сердца (например у субъектов с сепсисом, вызванным ЕхРЕС).
В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцированный у субъекта после введения О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является эффективным для снижения вероятности госпитализации субъекта, страдающего от ЕхРЕС-инфекции. В некоторых воплощениях иммунный ответ, индуцируемый у субъекта после введения О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе
(см. Раздел 5.6.2), является эффективным для сокращения продолжительности госпитализации субъекта, страдающего от ЕхРЕС-инфекции.
В другом аспекте в данном описании изобретения предложены способы предупреждения и/или лечения ЕхРЕС-инфекции у субъекта, вызванной Е. coli серотипа 025В, путем введения антитела, описанного в данном документе, то есть анти-025В антитела, описанного в данном документе. В конкретных воплощениях нейтрализующее антитело представляет собой моноклональное антитело.
5.7.1 Комбинированные терапевтические средства
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанная в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в комбинации с одним или более другими терапевтическими средствами (например антибактериальными или иммуномодулирующими терапевтическими средствами). Одно или более других терапевтических средства могут быть полезными в лечении или предупреждении ЕхРЕС-инфекции или могут улучшить симптом или состояние, связанное с ЕхРЕС-инфекцией. В некоторых воплощениях один или более других терапевтических средств представляют собой обезболивающие или жаропонижающие терапевтические средства. В некоторых воплощениях терапевтические средства вводят с интервалом менее 5 минут, с интервалом менее 30 минут, с интервалом менее 1 часа, с интервалом примерно 1 час, с интервалом от примерно 1 до примерно 2 часов, с интервалом от примерно 2 часов до примерно 3 часов, с интервалом от примерно 3 часов до примерно 4 часов, с интервалом от примерно 4 часов до примерно 5 часов, с интервалом от примерно 5 часов до примерно 6 часов, с интервалом от примерно 6 часов до примерно 7 часов, с интервалом примерно 7 часов до примерно 8 часов, с интервалом примерно 8 часов до примерно 9 часов, с интервалом примерно 9 часов до примерно 10 часов, с интервалом от примерно 10 часов до примерно 11 часов, с интервалом от примерно 11 часов до примерно 12 часов, с интервалом от примерно 12 часов до 18 часов, с интервалом от 18 часов до 24 часов, с интервалом от 24 часов до 36 часов, с интервалом от 36 часов до 48 часов, с интервалом от 48 часов до 52 часов, с интервалом от 52 часов до 60
часов, с интервалом от 60 часов до 72 часов, с интервалом от 72 часов до 84 часов, с интервалом от 84 часов до 96 часов или с интервалом от 96 часов до 120 часов.
Любые антибактериальные агенты, известные специалистам в данной
области, могут быть использованы в комбинации с О-антигеном Е. coli,
описанным в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатом, описанным в
данном документе (см. Раздел 5.4), или композицией, описанной в данном
документе (см. Раздел 5.6.2). Неограничивающие примеры антибактериальных
агентов включают Амикацин, Амоксициллин, Амоксициллин-клавулановая
кислота, Амфотерицин-В, Ампициллин, Ампициллин-сульбактам, Апрамицин,
Азитромицин, Азтреонам, Бацитрацин, Бензилпенициллин, Каспофунгин,
Цефаклор, Цефадроксил, Цефалексин, Цефалотин, Цефазолин, Цефдинир,
Цефепим, Цефиксим, Цефменоксим, Цефоперазон, Цефоперазон-сульбактам,
Цефотаксим, Цефокситин, Цефпиром, Цефподоксим, Цефподоксим-
клавулановая кислота, Цефподоксим-сульбактам, Цефпрозил, Цефкином,
Цефтазидим, Цефтибутен, Цефтиофур, Цефтобипрол, Цефтриаксон,
Цефуроксим, Хлорамфеникол, Флорфеникол, Ципрофлоксацин,
Кларитромицин, Клинафлоксацин, Клиндамицин, Клоксациллин, Колистин,
Котримоксазол (Триметоприм/сульфаметоксазол), Далбаванцин,
Дальфопристин/Хинупристин, Даптомицин, Дибекацин, Диклоксациллин, Дорипенем, Доксициклин, Энрофлоксацин, Эртапенем, Эритромицин, Флуклоксациллин, Флуконазол, Флуцитозин, Фосфомицин, фусидовая кислота, Гареноксацин, Гатифлоксацин, Гемифлоксацин, Гентамицин, Имипенем, Итраконазол, Канамицин, Кетоконазол, Левофлоксацин, Линкомицин, Линезолид, Лоракарбеф, Мециллинам (амдиноциллин), Меропенем, Метронидазол, Мезлоциллин, Мезлоциллин-сульбактам, Миноциклин, Моксифлоксацин, Мупироцин, Налидиксовая кислота, Неомицин, Нетилмицин, Нитрофурантоин, Норфлоксацин, Офлоксацин, Оксациллин, Пефлоксацин, Пенициллин V, Пиперациллин, Пиперациллин-сульбактам, Пиперациллин-тазобактам, Рифампицин, Рокситромицин, Спарфлоксацин, Спектиномицин, Спирамицин, Стрептомицин, Сульбактам, Сульфаметоксазол, Тейкопланин, Телаванцин, Телитромицин, Темоциллин, Тетрациклин, Тикарциллин,
Тикарциллин-клавулановая кислота, Тигециклин, Тобрамицин, Триметоприм, Тровафлоксацин, Тилозин, Ванкомицин, Виргиниамицин и Вориконазол.
В некоторых воплощениях комбинированная терапия включает введение двух или более О-антигенов Е. coli, описанных в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгатов, описанных в данном документе (см. Раздел 5.4), и/или композиций, описанных в данном документе (см. Раздел 5.6.2).
5.7.2 Группы пациентов
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят "наивному" субъекту, то есть субъекту, который не имеет ЕхРЕС-инфекции или не имел ранее ЕхРЕС-инфекции. В одном воплощении О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят "наивному" субъекту, у которого есть риск инфицирования ЕхРЕС.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, у которого диагностирована ЕхРЕС-инфекция. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, инфицированному ЕхРЕС, до появления симптомов или до того, как симптомы становятся серьезными (например до того, как пациенту потребуется госпитализация).
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, у которого диагностирована UPEC-инфекция. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят
субъекту, страдающему от рецидивов инфекции мочевыводящих путей. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, страдающему от рецидивов инфекции мочевыводящих путей, но здоровому в момент лечения. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту, имеющему бактериемию или сепсис или рискующему их приобрести.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой животное. В некоторых воплощениях животное представляет собой птицу. В некоторых воплощениях животное представляет собой собаку. В некоторых воплощениях животное представляет собой кошку. В некоторых воплощениях животное представляет собой лошадь. В некоторых воплощениях животное представляет собой корову. В некоторых воплощениях животное представляет собой млекопитающее, например лошадь, свинью, мышь или примата. В конкретном воплощении субъект представляет собой человека.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой взрослого человека. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой взрослого человека в возрасте старше 50 лет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой пожилого человека.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой ребенка. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой младенца. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой недоношенного младенца. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой ребенка преддошкольного возраста. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или вводят композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), не является младенцем младше 6 месяцев.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является беременным. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой женщину, которая родила на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель раньше срока.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой субъекта с повышенным риском ЕхРЕС (например иммунокомпрометированного или
иммунодефицитного субъекта). В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой субъекта, находящегося в близком контакте с субъектом, имеющим ЕхРЕС-инфекцию, или с повышенным риском ЕхРЕС-инфекции.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), является медицинским работником (например врачом или медсестрой). В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), представляет собой иммунокомпрометированного (например страдающего от HIV-инфекции) или иммуносупрессированного субъекта.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеет диабет. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеет рассеянный склероз.
В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеют состояние, требующее использования катетера. В некоторых воплощениях субъект, которому вводят О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), имеет повреждение спинного мозга.
5.7.3 Доза и частота введения
Количество О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), которое является эффективным для лечения и/или предупреждения ЕхРЕС-инфекции, зависит от природы заболевания и может быть определено стандартными клиническими методами. Введение О-антигена, биоконъюгата и/или композиции может быть выполнено различными путями, известными клиницисту, например подкожно, парентерально, внутривенно, внутримышечно, местно, перорально, внутрикожно, чрескожно, интраназально и т.п. В одном воплощении введение осуществляется посредством внутримышечной инъекции.
Точная доза для использования в композиции также зависит от пути введения и серьезности инфекции и должна быть определена в соответствии с оценкой лечащего врача и состоянием каждого субъекта. Например эффективные дозы также могут варьироваться в зависимости от средств введения, места введения, физиологического состояния пациента (включая возраст, массу тела, состояние здоровья), независимо от того, является пациент человеком или животным, от других введенных терапевтических средств и от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. Лечебные дозы оптимально титруют для оптимизации безопасности и эффективности.
В некоторых воплощениях используют анализ in vitro, чтобы способствовать определению оптимальных диапазонов доз. См. Раздел 5.8. Эффективные дозы могут быть экстраполированы из кривых доза-ответ, полученных in vitro или на животных модельных аналитических системах.
В некоторых воплощениях типичные дозы вакцин на основе гликоконъюгатов (например композиций, содержащих биоконъюгаты), варьируются примерно от 0,1 мкг до 400 мкг углевода на дозу. В других воплощениях примерные дозы вакцин на основе гликоконъюгатов (например композиций, содержащих биоконъюгаты), варьируются примерно от 0,1 мкг до 4000 мкг белка(ов) на дозу. В некоторых воплощениях типичная доза вакцины на основе гликоконъюгата (например композиции, содержащей биоконъюгаты) содержит 0,1, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 мкг углевода(ов) на дозу. В некоторых воплощениях примерная доза вакцины на основе гликоконъюгата (например композиции, содержащей биоконъюгаты) содержит 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мкг белка(ов) на дозу. В некоторых типичных воплощениях доза для введения человеку соответствует 0,5 мл, содержащим примерно 1-10, например примерно 2-6, например примерно 4 мкг полисахарида на каждый включенный гликоконъюгат.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту однократно в виде единичной дозы. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде единичной дозы, за которой следует вторая доза через 3-6 недель. В соответствии с этими воплощениями бустерные введения могут быть введены субъекту с интервалами от 6 до 12 месяцев после второго введения. В некоторых воплощениях в бустерных введениях можно использовать разные О-антигены Е. coli, биоконъюгаты или композиции. В некоторых воплощениях введение одного и того же О-антигена Е coli, биоконъюгата или композиции можно повторять и эти введения могут быть разделены по меньшей мере 1 сутками, 2 сутками, 3 сутками, 5 сутками, 7 сутками, 10 сутками, 15 сутками, 30 сутками, 45 сутками, 2 месяцами, 75 сутками, 3 месяцами или по меньшей мере 6 месяцами. В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде единичной дозы один раз в год.
В некоторых воплощениях О-антиген Е. coli, описанный в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгат, описанный в данном документе (см. Раздел 5.4), или композицию, описанную в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту в виде 2, 3, 4, 5 или более доз с интервалом 2 недели, 3 недели, 4 недели, 5 недель или 6 недель. В некоторых воплощениях 2, 3, 4, 5
или более доз О-антигена Е. coli, описанного в данном документе (см. Раздел 5.2), биоконъюгата, описанного в данном документе (см. Раздел 5.4), или композиции, описанной в данном документе (см. Раздел 5.6.2), вводят субъекту с интервалом 2, 3, 4, 5 или 6 недель в дозе от 0,1 мкг до 0,5 мг, от 0,1 мкг до 0,4 мг, от 0,1 мкг до 0,3 мг, от 0,1 мкг до 0,2 мг или от 0,1 мкг до 0,1 мг углеводного содержимого. В некоторых воплощениях введенные О-антиген Е. coli, биоконъюгат или композицию каждый раз являются одними и теми же. В некоторых воплощениях введенные О-антиген Е. coli, биоконъюгат или композиция каждый раз являются разными.
Для пассивной иммунизации антителом (например анти-025В антителом) доза может варьироваться примерно от 0,0001 до 100 мг антитела на кг массы тела или от 0,01 до 5 мг антитела на кг массы тела. Например, доза может составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг или, другими словами, 70 мг или 700 мг или в диапазоне 70-700 мг, соответственно, для пациента с массой тела 70 кг. Типичный режим лечения включает введение один раз каждые две недели, или один раз в месяц, один раз каждые 3-6 месяца в течение одного года или нескольких лет или с интервалами в несколько лет. Интервалы могут быть неодинаковыми и изменяться в зависимости от уровня антитела в крови пациента.
5.8 Анализы
Анализ для определения способности биоконъюгатов индуцировать иммунный ответ
Способность биоконъюгатов/композиций, описанных в данном документе, индуцировать иммунный ответ у субъекта, может быть определена с использованием подхода, известного специалисту в данной области или описанного в данном документе. В некоторых воплощениях способность биоконъюгата индуцировать иммунный ответ у субъекта может быть определена путем иммунизации субъекта (например мыши) или группы субъектов биоконъюгатом, описанным в данном документе, и иммунизации дополнительного субъекта (например мыши) или группы субъектов контролем (PBS). Затем этих субъектов или группу субъектов можно провокационно инфицировать ЕхРЕС и определить способность ЕхРЕС вызывать заболевание (например UTI) у этих субъектов или группы субъектов. Специалистам в данной
области понятно, что если субъект или группа субъектов, иммунизированных контролем, страдает(ют) от заболевания после провокационного инфицирования ЕхРЕС, а субъект или группа субъектов, иммунизированных биоконъюгатом(ами) или их композицией, описанной в данном документе, страдает в меньшей степени или не страдает от заболевания, тогда биоконъюгат способен индуцировать иммунный ответ у субъекта. Способность биоконъюгата(ов) или их композиции, описанных в данном документе, индуцировать образование антисыворотки, которая перекрестно реагирует с О-антигеном из ЕхРЕС, может быть проанализирована посредством, например, иммунного анализа, такого как ELISA.
Бактериальные анализы in vitro
Способность биоконъюгатов, описанных в данном документе, индуцировать иммунный ответ у субъекта, можно оценить с использованием сывороточного бактерицидного теста (SBA) или опсоно-фагоцитарного киллинг-анализа (ОРК), который представляет собой общепризнанный и принятый способ, который был использован для получения одобрения вакцин на основе гликоконъюгатов. Такие анализы хорошо известны в данной области техники и, в нескольких словах, включают стадии получения и выделения антител против интересующей мишени (например О-антигена, например 025В, Е. coli), путем введения субъекту (например мыши) соединения, которое вызывает такие антитела. Затем бактерицидную способность антител можно определить посредством, например, культивирования рассматриваемых бактерий (например Е. coli релевантного серотипа) в присутствии указанных антител и комплемента и - в зависимости от анализа - нейтрофилов и анализа способности антител убивать и/или нейтрализовать эти бактерии, например с использованием стандартных микробиологических подходов.
5.9 НАБОРЫ
В данном описании изобретения предложен фармацевтическая упаковка или набор, содержащие один или более контейнеров, заполненных одним или более ингредиентами композиций, описанных в данном документе (см. Раздел 5.6.2), такими как один или более антигенов Е. coli (см. Раздел 5.2) и/или биоконъюгатов (см. Раздел 5.4), предложенных в данном описании изобретения. С таким контейнером(ами) при необходимости может быть
связано уведомление в форме, предписанной правительственным учреждением, регулирующим изготовление, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, которое отражает одобрение этим учреждением изготовления, применения или продажи для введения человеку. Наборы, включенные в данное изобретение, могут быть использованы в вышеописанных способах лечения и иммунизации субъектов.
6. ПРИМЕРЫ
МЕТОДЫ
Агглютинация
Процесс, в котором клетки или лизированную клеточную массу смешивают с антисывороткой, содержащей антитела, специфичные к полимерной структуре, например к О-антигену. Когда антисыворотка распознает клеточные структуры, образуются видимые, нерастворимые агрегаты. Этот метод обычно используют для идентификации серотипов О, К и Н. См. DebRoy, et al., (2011) Animal health research reviews/Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169-185
Получение образца LPS для анализа посредством SDS PAGE
LPS грамотрицательных клеток состоит из липида А в качестве основы, модифицированного коровым олигосахаридом, обеспечивающим присоединение О-антигена. Для анализа LPS клинических изолятов, клетки выращивали в стандартной среде LB (Лурия-Бертани) при 37°С в течение 24 ч и биомассу, соответствующую 1 мл культуры, с OD600 равной 2, собирали и лизировали в 1х буфере Lammli для образцов и инкубировали при 95°С в течение 10 минут. Экстракты затем обрабатывали в течение 1 часа при 65°С для удаления какого-либо сигнала белка с использованием 1 г/л протеиназы К. Обработанные экстракты разделяли с помощью SDS PAGE, и LPS визуализировали посредством окрашивания серебром или Вестерн-блоттинга с использованием подходящей антисыворотки.
LPS препарат для покрытия планшетов ELISA
LPS получали с использованием способа, описанного у Apicella, (2008) Methods Mol Biol 431, 3-13, и затем очищали, как описано у Perdomo and Montero, (2006) Biotecnologfa Aplicada 23:124-129.
2AB OPS HPLC: 'LLO-метод идентификационных отпечатков'
Этот метод используют для анализа структуры UPP-связанного OPS.
Для экстракции UPP-связанных гликанов, клетки Е. coli промывали 0,9% NaCI и лиофилизировали. Высушенные клетки экстрагировали органическим растворителем (метанол:вода (M:W = от 17:3 до 19:1, об/об) и/или смесями хлороформ:метанол:вода с оптимизированным соотношением (например Х:М:В = 10:10:3 об/об/об)). Экстракты сушили под потоком N2 и ресуспендировали в C:M:W=3:48:47. Для очистки экстрагированных гликолипидов ресуспендирующую смесь 3:48:47 пропускали через картридж tC-is Sep-PAK. Картридж кондиционировали 10 мл метанола, затем уравновешивали 10 мл 3:48:47 (C:M:W). После нанесения образца картридж промывали 10 мл 3:48:47 (C:M:W) и элюировали 5 мл метанола и 5 мл 10:10:3 (Х:М:В). Объединенные элюаты сушили в атмосфере N2. Образцы гликолипида гидролизовали путем растворения высушенных образцов в 2 мл смеси Ы-пропанол:2 М трифторуксусной кислоты (1:1), нагревали до 50°С в течение 15 мин, и затем выпаривали досуха в атмосфере N2 (Glover, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102(40): 14255-9). Высушенные образцы еще раз ресуспендировали в 3:48:47 и пропускали через картридж Ю18, и поток сушили в атмосфере N2. Мечение с помощью 2-АВ и очистку гликана проводили, используя метод бумажных дисков, как описано (Bigge, et al., Anal Biochem 230(2): 229-38; Merry, et al., Anal Biochem 304(1): 91-9).
2-АВ меченые гликаны разделяли с помощью HPLC с использованием нормально-фазовой колонки GlycoSep-N согласно Royle et al., но модифицированной к системе из трех растворителей (Royle, et al., Anal Biochem 304(1): 70-90). Растворителем А был 10 мМ формиат аммония, рН 4,4, в 80% ацетонитриле. Растворителем В был 30 мМ формиат аммония, рН 4,4, в 40% ацетонитриле. Растворителем С была 0,5% муравьиная кислота. Температура колонки составляла 30°С и 2-АВ-меченые гликаны обнаруживали по флуоресценции (возбуждение Аех = 330 нм, испускание Лет = 420 нм). Градиентные условия представляли собой линейный градиент от 100% А до 100% В в течение 160 мин при скорости потока 0,4 мл/мин, затем 2 мин от 100% В до 100% С при увеличении скорости потока до 1 мл/мин. Колонку промывали в течение 5 мин 100% С, возвращались к 100% А за 2 мин и пропуская образец
в течение 15 мин при 100% А при скорости потока 1 мл/мин, затем возвращая скорость потока до 0,4 мл/мин за 5 мин. Образцы вводили в воде. Анализ деацетилирования:
Эквивалент 2-АВ меченого гликана сушили при 30°С, ресуспендировали в 50 мкл воды с (образец) или без (имитация) 200 мМ NaOH (рН ~ 14) и инкубировали в течение 25 часов при 37°С. Раствор затем доводили до комнатной температуры и нейтрализовали добавлением раствора 200 мМ HCI (рН"1). После скоростной вакуумной сушки при 30°С образец перемаркировали 2АВ и анализировали с помощью HPLC.
Гидразинолиз посредством HPLC
Тот же самый метод нормально-фазовой HPLC, описанный выше, использовали для отделения OPS, высвобождаемого из биоконъюгатов после гидразинолиза. Перед гидразинолизом биоконъюгаты, соответствующие 1 мг белка, полностью сушили под потоком N2. Высвобождение полисахарида осуществляли, используя набор Ludger Liberate Hydrazinolysis Glycan Release kit (Ludger #LL-HYDRAZ-A2) в соответствии с инструкциями изготовителя. В кратком изложении, 450 мкл гидразина добавляли к высушенным образцам под слоем N2 и инкубировали в течение 16 часов при температуре 85°С .Гидразин удаляли выпариванием в атмосфере N2 при 45°С. Повторное N-ацетилирование полисахаридов выполняли посредством инкубации в 471 мкл 4,5% уксусного ангидрида в 1 М бикарбонате натрия в течение двух часов на льду. Затем добавляли 600 мкл 5% раствора TFA (трифторуксусная кислота) и образцы гидролизовали в течение еще одного часа на льду. Очистку проводили на колонке ЕВ20 с использованием соответствующих буферов ЕВ20 А и В.
Высвобожденные и очищенные полисахариды метили с помощью 2-АВ и анализировали посредством НФ-HPLC, как описано для образцов LLO. Интересующие пики собирали и идентифицировали посредством MS/MS.
MS (масс-спектрометрия) и MS/MS (тандемная масс-спектрометрия) пиков HPLC
Для анализа моносахаридной последовательности интересующей молекулы OPS выполняли масс-спектрометрический анализ. Высушенные, собранные фракции, соответствующие конкретным пикам HPLC,
ресуспендировали в 5 мкл 10% ацетонитрила (ACN), 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA) и смешивали 1:1 с матричным раствором (40 мг/мл DHB в 50% ACN, 0,1% TFA) на целевом планшете. Данные MS и MS/MS были получены вручную в режиме сканирования положительных ионов на масс-спектрометре Ultraflex-ll MALDI-ToF/ToF (Bruker Daltonik GmbH, Bremen, Germany). MS/MS получали с использованием метода LIFT. Стандартную смесь пептидов (Bruker Daltonik GmbH) использовали для внешней калибровки. Спектры экспортировали с использованием программного обеспечения Flex Analysis (Bruker Daltonik GmbH) и анализировали вручную. Клетки-хозяева
Биоконъюгаты получали с помощью рекомбинантных клеток Е. coli, экспрессирующих посредством плазмид(ы) белок(и)-носитель(и) и олигосахарил-трансферазу из С. jejuni (PgIB), и OPS из космид или мутантов с хромосомными вставками.
Генетически детоксифицированный ЕРА (Экзотоксин А из Pseudomonas aeruginosa, содержащий мутации L552V, ДЕ553) использовали в качестве белка-носителя и модифицировали так, чтобы он включал 2 или 4 сайтов гликозилирования (упоминаются в данном описании изобретения как 2S-EPA и 4S-EPA, соответственно) и С-концевую HIS-метку, и экспрессировали с использованием полученной на основе pBR322, арабиноза-индуцибельной плазмиды (см. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61).
МВР (мальтозосвязывающий белок), нативный периплазматический, растворимый белок Е. coli экспрессировали с помощью pGVXN579. pGVXN579 представляет собой модифицированную плазмиду pMAL-p2X (New England Biolabs), кодирующую три бактериальные консенсусные последовательности N-гликозилирования, расположенные в ряд, с последующим тэгом Мус-Tag, слитым на С-конце с ORF (открытая рамка считывания) мальтозосвязывающего белка, кодируемой плазмидой. Такое расположение обеспечивало возможность аффинной очистки МВР биоконъюгата независимо от HIS-метки. Индукция экспрессии контролируется промотором tac и индуцируется IPTG (изопропилтиогалактозид).
Белок PgIB, экспрессируемый с помощью плазмиды рЕХТ21 (фрагмент EcoRIIBamHI из pMAF10 (Feldman et al., 2005, PNAS USA 102(8):3016-3021),
клонировали в рЕХТ21 с С-терминально слитой НА-меткой. Вариантами экспрессионной плазмиды являются оптимизация кодонов (pGVXN939), оптимизация кодонов с делецией сайта гликозилирования (pGVXN948), и удаленной НА-Тметкой (pGVXN970) и оптимизация кодонов и делеция НАметки (pGVXN971).
Клинические изоляты анализировали на их способность синтезировать некоторые OPS с использованием агглютинации, Вестерн-блоттинга, окрашивания серебром, идентификационных отпечатков LLO, ПЦР-серотипирования или подобных методов, которые позволяют идентифицировать структурные характеристики OPS, и также на их фенотип резистентности к антибиотикам. В некоторых клинических изолятах был удален фрагмент хромосомы для фермента лигазы, WaaL, для увеличения доступности OPS для гликозилирования белка или OPS анализа.
Для дополнительного анализа клинических изолятов, кластер rfb лабораторного штамма W3110 заменяли кластером rfb, клонированным из клинических изолятов, и анализировали биосинтез OPS. Удаляли ген waaL для повышения эффективности получения биоконъюгата.
Обмен кластеров и делеции waaL осуществляли посредством гомологичной рекомбинации, используя оптимизированный метод (см. международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/068737) или опубликованные методики (Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645). Для обмена кластера OPS, интересующий кластер rfb из клинического изолята клонировали в плазмиду контрселекции pDOC-C, наряду с кассетой резистентности к антибиотикам, для последующей интеграции в локус rfb штамма W3110 Е. coli (Kuhlman and Сох, 2010, Nucleic acids research 38, e92; Lee et al, 2009, BMC Microbiol 9, 252). Гомологичную рекомбинацию больших интересующих кластеров rfb выполняли, используя фланкирующую ДНК последовательность кодирования кластера rfb из W3110 длиной от 0,5 до 1,5 т.п.н. и линеаризацию in vivo вставки ДНК из плазмиды, несущей rfb. Полученный штамм, содержащий замененный кластер rfb (с кассетой резистентности к антибиотикам и без нее), то есть в кластере rfb из W3110 молекула ДНК между генами gale и gnd была заменена на аналогичный участок, выделенный из клинического изолята Е. coli.
В некоторых экспериментах штаммы W3110, содержащие космиду, кодирующую кластер rfb данного серотипа Е. coli, использовали в качестве штаммов-хозяев.
Для получения рекомбинантно экспрессированных биоконъюгатов в штаммах на основе W3110, удаляли находящиеся в W3110 гены, которые мешают рекомбинантному продуцированию OPS. Например, для получения клеткой-хозяином биоконъюгатов 025В, удаляли из W3110 кластер gtrABS. Для достижения этой цели использовали гомологичную рекомбинацию в соответствии с опубликованным способом (Bloor АЕ, Cranenburgh RM. Appl Environ Microbiol. 2006 Apr;72(4):2520-5.), используя гомологичные фланкирующие последовательности выше гена gtrA и ниже гена gtrS.
Для сборки продуцирующих штаммов, штамм-хозяин трансформировали pgIB и плазмидой для экспрессии носителя, посредством трансформации. См. Wackeret al., 2002, Science 298:1790-1793.
Получение биоконъюгата
Получение биоконъюгата осуществляли путем выращивания клеток-хозяев и очистки биоконъюгатов, продуцируемых в периплазматическом пространстве. Культивирование происходило либо во встряхиваемых колбах, либо в периодическом процессе ферментации с подпиткой промышленного масштаба.
Культивирование во встряхиваемых колбах выполняли при 37°С, используя среду, состоящую из соответствующих антибиотиков в среде ТВ (terrific broth), иногда с добавлением 5 мМ МдСЬ. В среду высевали ночную культуру при значении OD, равном 0,05, из свежетрансформированных продуцирующих клеток, выращенных до середины фазы логарифмического роста, индуцированной 0,2% арабинозой и 1 мМ IPTG, дополнительно культивировали и собирали после 20 часов выращивания.
Периодические ферментации с подпиткой
Аликвоту из банка продуцирующей клеточной линии использовали для инокуляции встряхиваемой колбы, содержащей соевую LB среду с соответствующими антибиотиками. Встряхиваемую колбу инкубировали при 180 об./мин, 37°С, в течение приблизительно 12 часов. Среды для серии опытов без добавок стерилизовали непосредственно внутри биореактора (33
мин при > 121°С), охлаждали и добавляли добавки. 4 М КОН или 25% фосфорную кислоту присоединяли к ферментеру для регулирования рН, и рН доводили до рН 7. Выполняли инокуляцию биореактора и периодической культуры из предварительной культуры с получением исходного значения OD600, равного 0,005. рН стабильно поддерживали путем добавления 4 М КОН или 25% фосфорной кислоты. Поддерживают давление растворенного кислорода (DO). Максимальное давление поддерживали при 600 мбар (60 кПа). Образование продукта индуцировали L-арабинозой (0,1%) и/или IPTG (1 мМ). Немедленно после индукции начинали подпитку путем добавления питательной среды, содержащей 2,5% арабинозы и IPTG. Через 24±2 часа после индукции биореактор охлаждали до 25°С, подпитку прекращали и осуществляли сбор биомассы посредством фильтрации в тангенциальном потоке или центрифугирования.
Биомассу лизировали в 0,5% Triton Х-100 посредством разрушения в течение 4 циклов гомогенизации под высоким давлением при 800 бар (80 МПа).
Биоконъюгаты очищали посредством колоночной хроматографии. Различные хроматографические методы были использованы для получения биоконъюгатов, в основном IMAC (аффинная хроматография на иммобилизованных ионах металла), анионообменная хроматография на основе Q-смолы (АЕС) и эксклюзионная хроматография (SEC). Описание таких методов см., например, в Saraswat et al., 2013, Biomed. Res. Int. ID#312709 (p. 118) и WO 2009/104074.
Получение биоконъюгата для доклинических экспериментов
Из предварительной культуры определенное количество было перенесено в биореактор, содержащий обогащенную среду при 35±0,2°С. Поддерживали рН и давление растворенного кислорода. Скорость перемешивания достигала 700 оборотов в минуту.
Когда плотность клеток достигала значения OD600 = 40±5, образование продукта индуцировали L-арабинозой (0,1%) и IPTG (1 мм). Подпитку начинали через 24±2 часа после индукции и биореактор охлаждали. Как только температура достигала 25°С, подпитку прекращали и собирали клетки.
Гомогенизация при высоком давлении
Биомассу, соответствующую 50 л при сборе, оттаивали в течение 1 суток при 2-8°С. Затем в контейнер добавляли 2,5 л буфера для лизиса и осветления. Добавляли Triton Х-100 до конечной концентрации 0,5%, и полностью оттаявшие клетки разрушали посредством 4 циклов гомогенизации при высоком давлении при 800 бар (80 МПа). Клетки собирали и промывали с использованием стандартных методов.
Анализ моносахаридного состава:
Биоконъюгаты, содержащие приблизительно 8 мкг полисахарида, гидролизовали в течение шести часов в 104 мкл 3 М TFA при 99°С. TFA удаляли путем выпаривания и образцы промывали один раз 500 мкл 2-пропанола. Полученные моносахариды суспендировали в 100 мкл меченной смеси, содержащей 87,1 мг/мл 1-фенил-3-метил-5-пиразолона (РМР), 50% МеОН и 150 мМ NaOH. Мечение выполняли в течение 60 минут при 70°С. Образцы нейтрализовали добавлением 50 мкл 300 мМ HCI и 20 мкл 100 мМ Tris/HCI рН 7,0. РМР-меченные моносахариды очищали посредством экстракции, один раз 1 мл дибутилового эфира и три раза 1 мл СНСЬ.
РМР-дериватизированные моносахариды разделяли посредством RP-HPLC (Merck-Hitachi) на колонке С18 Inertsil ODS-3 (GL Sciences), оснащенной предварительной колонкой. Применяли двухступенчатый градиент от 100% буфера А (13% ацетонитрил, 87% Н20 (0,045% КН2Р04, 0,05% триэтиламин, рН 7,0) до 50% буфера А/50% буфера В (21% ацетонитрила, 79% Н20 (0,045% КН2Р04, 0,05% триэтиламина, рН 7,0) в течение 4 минут до 100% буфера В в течение 47 минут при 35°С и скорости потока 1 мл/мин. Объем инъекции составлял 50 мкл и элюирование контролировали посредством онлайн УФ-определения при 250 нм. Отдельные пики идентифицировали путем наложения хроматограмм имеющихся в продаже стандартов моносахаридов D-глюкозы (Sigma-Aldrich #G7528), L-рамнозы (Sigma-Aldrich #R3875), Ы-ацетил-D-глюкозамина (Sigma-Aldrich #A8625) и Ы-ацетил-1_-фукозамина (Omicron Biochemicals #FUC-006).
Пример 1: Эпидемиология
Для определения распределения серотипов Е. coli, вызывающих инфекцию мочевыводящих путей (UTI), выполняли эпидемиологическое
исследование. Более 1800 изолятов Е. coli из образцов мочи человека собирали от субъектов в Швейцарии и О-антигенные серотипы (OPS) из каждого образца анализировали с использованием классических методов агглютинации. См. Фиг. 4
Отдельные образцы человеческой мочи анализировали для опознания патогенов и определения картины их резистентности к антибиотикам. Изоляты Е. coli получали из образцов после анализа. Изоляты Е. coli идентифицировали посредством классических микробиологических стратегий исключения и включения, включающих рост на хроме (CPS3) и на агаре Мак-Конки. Изоляты Е. coli кроме того анализировали с использованием анализа агглютинации для определения их О-антигенного серотипа. См. DebRoy et al. (2011) Animal health research reviews / Conference of Research Workers in Animal Diseases 12, 169185. Изоляты из тех же О-антигенных серогрупп дополнительно анализировали для определения химической структуры О-цепи каждого изолята. См. Таблицу 1А. Было определено, что некоторые выделенные штаммы Е. coli являются резистентными к антибиотикам, включая идентификацию фторхинолон-резистентных штаммов и штаммов, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра действия (ESBL).
Таблица 1А: Распределение наиболее распространенных UTI-ассоциированных серотипов Е. coli из коллекции 1841 образцов мочи, собранных в Швейцарии в 2012. Показано распределение серотипов образцов из релевантных субпопуляций из 671 субъекта и распределение из всех** образцов.
Наиболее распространенные серотипы Е. coli, ассоциированные с UTI
О-серотип
Внебольничная UTIв возрасте 18-70 лет (п=671)
О-серотип
Внебольничная и больничная UTI для всех возрастов** (п=1871)
10,75%
8,75%
9,55%
8,47%
6,87%
8,37%
5,52%
4,56%
5,37%
4,29%
4,78%
3,86%
3,43%
3,53%
3,28%
3,26%
3,28%
2,39%
2,24%
2,17%
2,24%
1,85%
1,94%
1,68%
Серотипы 01, 02, 04, 06, 07, 08, 016, 018, 025, 073 и 075 выделяли из субъектов, независимо от местоположения, времени выделения, симптомов и целевой группы, предполагая, что они являлись преобладающими серотипами уропатогенных Е. coli (UPEC). Соответственно, определение наиболее распространенных О-антигенных серотипов указывает, что О-антиген-специфические вакцины могут быть ограничены подмножеством серотипов, а именно тех, которые в наибольшей степени ассоциированы с заболеванием, как определено в исследовании, описанном в данном примере.
Ретроспективный анализ UTI серотипов в 1323 изолятах за последние три десятилетия в США, полученных из центра регистрации Е. coli (ECRC), обеспечивает возможность тщательного сравнения с литературой и с текущими данными из Швейцарии. Преобладание верхних 20 серотипов было обнаружено независимо от местоположения, времени выделения, симптомов или целевой группы и предлагает преобладающие серотипы, связанные с UPEC (см. Таблицу 1 В).
Таблица 1В: Преобладание наиболее распространенных ассоциированных с UTI серотипов из выбранных литературных данных за 19872011 годы и из ретроспективно проанализированных данных для США за 20002011 (ECRC).
ОБОЗНАЧЕНИЕ
ОБЩАЯ UTI
ЦИСТИТ
ПИЕЛОНЕФРИТ
США 2000-2010
имеющиеся данные из 1860 изолятов
имеющиеся данные из 1089 изолятов
имеющиеся данные из 373 изолятов
315 (все образцы
UTI кроме фекальных, всех возрастов, Ж+М) Количество нетипируемых было недоступно
Серотип
4,8%
4,1%
5,4%
7,0%
7,1%
4,9%
15,3%
14,0%
7,8%
6,0%
3,2%
3,2%
16,9%
16,3%
7,8%
18,7%
3,3%
2,4%
2,4%
1,9%
1,7%
3,2%
0,8%
3,5%
015
0,6%
1,5%
0,8%
1,3%
016
4,3%
3,2%
7,2%
1,9%
018
7,0%
7,1%
6,7%
7,0%
021
1,3%
022
0,6%
0,6%
0,5%
0,0%
025
3,0%
4,8%
0,5%
8,6%
075
7,5%
6,0%
8,6%
3,8%
083
1,9%
0,7%
0,5%
1,3%
О20
1,6%
077
2,2%
082
1,9%
другие и
нетипируемые/не доступны
33,3%
39,2%
40,2%
другие О-типы (NT не доступны)
21,0%
Изоляты из описанных серотипов рассчитывали как процент от общего количества изолятов (Andreu et al., 1997, J Infect Dis 176:464-469; Blanco et al., 1996, Eur J Epidemiol 12:191-198; Fathollahi et al., 2009, Iranian Journal of Clinical Infectious Diseases 4:77-81; Johnson et al., 2005, J Clin Microbiol 43:6064-6072;
Molina-Lopez et al., 2011, Journal of infection in developing countries 5:840-849; Sandberg et al., 1988, J Clin Microbiol 26:1471-1476; K. L. 2007, The Journal of infection 55:8-18; Terai et al., 1997, Int J Urol 4:289-294.) В некоторых случаях конкретные данные не были доступны; поэтому значения в процентах могут только дать указание на общее распределение серотипов в разных изолятах UTI в описанных исследованиях и должны рассматриваться с осторожностью. Однако другие описанные идентифицированные, но менее распространенные серотипы (015, О20, 021, 022, 077 и 082) также включены.
Из всей информации, полученной из эпидемиологического анализа, взятой вместе, 10 преобладающих серотипов могут охватывать примерно 6080% инфекций Е. coli, предполагая охват части нетипируемых штаммов. Кроме того, данные показывают неожиданное значение 025 серотипа в эпидемиологическом исследовании, проведенном в Швейцарии, по сравнению с литературными данными и последними данными из США. См. Таблицы 1А и В.
О-антигенные серотипы Е. coli часто состоят из подтипов, которые являются неодинаковыми, но структурно и антигенно похожими. Чтобы идентифицировать неизвестные/незарегистрированные подтипы среди собранных клинических изолятов и идентифицировать наиболее распространенные подтипы О-антигена, химические структуры О-антигенов наиболее распространенных серотипов анализировали более подробно.
Пример 2: 025 Е. coli
В последние годы наблюдается повышенное распространение 025-положительных штаммов (см. George and Manges (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690), и об этом свидетельствуют исследование, описанное в Примере 1, где было обнаружено, что серотип 025 является одним из четырех главных серотипов Е. coli с точки зрения распространенности.
025А
Структура единицы повтора О-антигена Е. coli серотипа 025 была опубликована ранее (см. Kenne et al., 1983, Carbohydrate Research 122, 249-256; и Fundin et al., 2003, Magnetic Resonance in Chemistry 41, 4) и представлена на Фиг. 2В. Кластер rfb, относящийся к О-антигену 025 штамма Е47 Е. coli, является общедоступным (GenBank GU014554) и представлен на Фиг. 2А.
E. coli Е47а используется в качестве эталонного штамма для серотипирования 025. Кроме того, информация о последовательности кластера rfb доступна из последовательности генома штамма, вызывающего бессимптомную бактериурию, Е. coli 83972. (см. Zdziarskief а/., 2010, PLoS Pathog 6, е1001078). Хотя фенотипическая экспрессия 025 не была подтверждена, последовательности кластера rfb Е. coli Е47а и 83972 являются на 99,49% идентичными, убедительно свидетельствуя о том, что они кодируют один и тот же О-антиген.
О-антиген штаммов 83972 и Е47а Е. coli обозначен в данном описании изобретения как "025А," потому что, как описано ниже, новый О-антиген Е. coli, обозначенный "025В," был идентифицирован на основе анализа клинических изолятов, полученных в эпидемиологическом исследовании, описанном в Примере 1 выше.
Были предложены функциональные свойства прогнозируемых генных продуктов штаммов 83972 и Е47а Е. coli. См. Таблицу 2; GenBank GU014554; и Szijarto, et al. (2012) FEMS Microbiol Lett 332, 131-136.
Название гена
Предполагаемая функция
Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
а-1,3- рамнозилтрансфераза (Е. со//), WP_000639414.1, 99%
wekB
Гликозилтрансфераза
WcmS; UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6- гликозилтрансфераза (Е coli 0158), ADN43874.1, 40%
Wzy
О-антиген-полимераза
Wzy (Е coli), ADR74237.1, 30%
wekC
Гликозилтрансфераза
WfbF; UDP-Glc:FucNAc-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансфераза (E. coli), ABG81807.1, 46%
fnIA
UDP-N-ацетилглюкозамин-
4,6-дегидратаза/5-
эпимераза
1ЮР-1\1-ацетилглюкозамин-4,6-дегидратаза/5-эпимераза (E coli), WP_001556096.1, 95%
fnIB
UDP-2-ацетамид о-2,6-
дидезокси-бета-1_-талоза-4-
дегидрогеназа
FnIB (E coli), AAY28261.1, 97%
fnIC
1ЮР-1М-ацетилглюкозамин-2-эпимераза
1ЮР-1\1-ацетилглюкозамин-2-эпимераза (E coli) WP_000734424.1, 98%
wbuB
Гликозилтрансфераза
UDP-L-FucNAc: GlcNAc-UPP
a-1,3- N-Ацетилфукозаминилтрансфераза
(E coli) P12b, 026], YP_006169152.1, 73%
wbuC
Усеченная
гликозилтрансфераза
WbuC (E coli), AAV74548.1, 72%
Сравнения структуры и кластера генов предполагают, что все функции, необходимые для сборки OPS 025А, кодируются в кластере rfb, расположенным между galE и gnd. Функции различных ферментов генного кластера rfb (см. Фиг. 2А) являются следующими:
RmlBDAC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза dTDP-L-рамнозы, которая является субстратом для добавления ветви L-Rha к единице повтора OPS.
FnlABC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза UDP-L-FucNAc, который является субстратом-донором для добавления L-FucNAc к повтору 025 OPS.
WekABC и wbuBC представляют собой гликозилтрансферазы согласно анализу гомологии. Однако wbuC оказалась короткой и усеченной и, по-видимому, нефункциональной. Таким образом, скорее всего функциональный комментарий указывает на то, что имеются четыре гликозилтрансферазы, образующие четыре связи для сборки единицы повтора.
Wzx и Wzy необходимы для переноса BRU в периплазматическое пространство и их полимеризации на Und-PP.
Все функции, необходимые для синтеза опубликованной структуры единицы повтора 025А, кодируются кластерами rfb Е47а и 83972 Е. coli. Таким образом, был сделан вывод о том, что кластер rfb отвечает за кодирование 025А OPS.
025В
В 2009 году клинические изоляты Е. coli из испанского стационара были охарактеризованы для определения клональных групп. См. Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141. Выполняли характеристику а) типа ESBL, б) О-серотипа, в) генов вирулентности, г) мультилокусное типирование последовательности (MLST), и д) типирование с помощью гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE). Результаты показали, что примерно 20% всех изолятов можно отнести к тому же клону: Серотип и MLST 025:Н4 ST131, ESBL тип СТХ-М15, филогруппа В2, кодирующая специфический набор генов вирулентности. Анализ компонентов кластера rfb репрезентативных клинических изолятов показал неизвестную З'-последовательность, при сравнении с последовательностью типированного штамма из штамма Е47а, и также из клинических изолятов, идентифицированных посредством метода аллель-специфического ПЦР-типирования (См. Clermont et al., 2008, J Antimicrob Chemother. 61 (5): 1024-8.; Clermont et al., Diagn. Microbiol Infect Dis. 2007, 57(2): 129-36.; и Li, et al., 2010, J Microbiol Methods 82, 71-77. В 2013 году Phan et al. опубликовали последовательность генома клона 025b:Н4 ST131, подтверждая, что этот клон представляет собой производное К-12 в соответствии со структурой его кластера генов waa, как сообщалось ранее. См.
Phan et al., 2013, PLOS Genetics 9(10): 1-18 (e1003834). Все вместе данные свидетельствуют, что появился новый 025-агглютинирующий клон Е. coli, выделенный в больничных условиях и что этот клон имеет специфические ESBL, MLST и PFGE фенотипы и содержит измененный О-антигенный кластер генов.
ПЦР типирование
Для того, чтобы определить, присутствует ли серотип 025В среди выделенных штаммов Е. coli, идентифицированных в эпидемиологическом исследовании, описанном в Примере 1, положительные в отношении 025-агглютинации штаммы анализировали посредством типирующей ПЦР в отношении 025 и 025В. ПЦР выполняли с использованием колоний, собранных с чашек Петри в качестве источника матричной ДНК и разных олигонуклеотидных праймеров. Были использованы 025-специфические праймеры, основанные на амплификации wzy Е47а 025 и описанные в Li, et al. (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77. Также были использованы 025В-специфические праймеры, описанные в Blanco, et al. (2009) J Antimicrob Chemother 63, 1135-1141, которые специфичны к неопределенной З'-части кластера rfb 025b (LNB220). Согласно Phan et al., 2013, эта 025В-специфическая олигонуклеотидная пара отжигается в З'-части кластера rfb 025В.
Из 24 проанализированных клинических изолятов с положительным фенотипом 025-агглютинации, 20 были отнесены к серотипу 025В посредством ПЦР-типирования, в то время как остальные 4 были положительно идентифицированы, как принадлежащие к серотипу 025А, посредством ПЦР-типирования. Таким образом, неожиданно, штаммы серотипа 025В были определены, как встречающиеся среди анализируемых штаммов чаще, чем штаммы серотипа 025А.
Секвенирование кластера
Для генетического анализа секвенировали кластер rfb 025В ПЦР-положительного штамма, обозначенного как "ирес138". Идентифицированные гены и их наиболее близкие релевантные белковые гомологи вместе с предлагаемой номенклатурой приведены в Таблице 3 ниже. Гены, специфичные для 025В и отсутствующие в 025А, обозначены звездочкой.
рамнозилтрансфераза
Состав кластера rfb показывает четкие различия с составом кластера 025А. Гены в 5'-части кластера являются близкими гомологами друг друга (rmID и wzy; Е47а и 83972 Е. coli). Это не является неожиданным для генов rml, которые являются гомологичными во многих штаммах Е. coli, синтезирующих L-рамнозу. Гомология генных продуктов 025А и В достигается в гене wekC (025А), до того как она снижается до уровня ниже 25% идентичности, что указывает на неродственность белковых последовательностей. См. Фиг. ЗВ. Кроме того, было установлено, что гены биосинтеза UDP-N-ацетилглюкозамина 025А отсутствуют в штамме upec138 (025В), также как и две гликозилтрансферазы ниже fnlABC. См. Фиг. ЗВ. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что штаммы 025В не способны синтезировать UDP-L-FucNAc, за исключением тех случае когда гены биосинтеза L-FucNAc могут быть закодированы вне кластера rfb. Тем не менее, нет ни одного случая сообщения о наличии локуса fnlABC вне кластера rfb, когда L-FucNAc присутствует в BRU О-антигена. Таким образом, маловероятно, что штамм 138 способен синтезировать опубликованную основную повторяющуюся единицу (BRU) 025А.
Гены, идентифицированные в кластере rfb 025В, которые отсутствуют в кластере rfb серотипа 025А, кодируют две гликозилтрансферазы и О-ацетилтрансферазу. Эти три гена имеют одинаковую организацию с генами wbbJKL, обнаруженными и охарактеризованными в штаммах К-12 Е. coli с генотипом кластера rfb 016, и кодируемые белки имеют высокую гомологию. См. Фиг. ЗВ. В соответстии с генетическим сходством между 025В и 016 серотипами номенклатура генов rfb 016, wbbJKL, была применена к гомологичным генам, идентифицированным в кластере rfb 025В.
Структура 016 BRU известна и функции генов wbbJKL были определены. См. Steveneson et al., (1994) J Bacterid. 176(13):4144-56. WbbJKL отвечают за ацетилирование L-рамнозы, перенос остатка D-GIc на L-Rha-D-Glc-UndPP и перенос L-Rha на D-GlcNAc-UPP, который образован с помощью wecA из кластера ЕСА. На основании гомологии с 016 WbbJKL и известных функций 016 WbbJKL был сделан вывод, что кластер rfb 025В синтезирует структуру,
содержащую частично 016- и частично 025А-элементы совместно. Предполагалось, что весьма вероятно WbbJKI_o25B синтезирует такую же структуру, что и WbbJKLoie, то есть a-D-Glc-1,3-a-L-Rha(2Ac)-1,3-a-D-GlcNAc. Эта трисахаридная структура идентична неразветвленному "коровому" остову 025А с единственным исключением, что L-Rha(2Ac) заменяет L-FucNAc. Замена является, соответственно, консервативной, так как и D-FucNAc, и L-RhaOAc представляют собой моносахариды с 6-дезокси- и 2-ацетил-функцией. Единственным отличием является конформация, так как фукоза относится к галактозе, а рамноза к маннозе, что приводит к разной ориентации группы ОН в положении 3 и метильной группы в положении 5. Связи между моносахаридами будут идентичными (все а-1,3), указывая на то, что эти структуры будут аналогичными по форме и химическим характеристикам. По аналогии, белки, кодируемые в восходящей части 025А и В кластеров rfb (rmlDCAB и wekAB) разветвляют BRU из 025А или В путем присоединения разветвленного D-GIc и L-Rha к любому "коровому" трисахариду-остову. Это означает, что они принимают любой остов (с L-FucNAc или L-Rha(2Ac)) в качестве субстрата.
Присутствие L-Rha в качестве второго моносахарида из восстанавливающего конца 025В BRU объясняет, почему биосинтез L-FucNAc может отсутствовать в 025В. UDP-L-FucNAc не требуется, так как он заменен генами биосинтеза dTDP-L-Rha, которые присутствуют на 5'-конце кластера (rmlDBAC).
Phan et al., 2013 проделали подобный генетический анализ на клиническом изоляте 025В, но пришли к другому выводу. Они также секвенировали весь геном, чтобы найти кластер генов биосинтеза UDP-FucNAc; однако они утверждают, что механизм для UDP-L-FucNAc в штамме 025В:Н4 ST131 ЕС958 отсутствует не только в кластере rfb 025В, но и во всем штамме. Однако Phan пришел к выводу, что UDP-L-FucNAc должен синтезироваться другим образом, при условии что 025В:Н4 ST131 ЕС958 создает такую же структуру О-антигена, что и Е47а, то есть 025А. Вместо этого в данном описании изобретения раскрыто, что наиболее вероятный сценарий заключается в том, что штаммы 025В не могут создавать L-FucNAc, но вместо этого заменяют второй остаток BRU остатком О-ацетилированной L-рамнозы и
гены, необходимые для этого изменения, кодируются исключительно в кластере rfb.
Кроме того, присутствие гомолога О-ацетилтрансферазы в кластере 025В позволяет предположить О-ацетилирование в 025В BRU, модификацию, отсутствующую в 025А. Соответственно, было установлено, что структуры антигена 025 из серотипов 025А и 025В должны быть разными.
Структурный анализ 025В
Для подтверждения гипотезы о другой структуре антигена 025, анализировали химический состав и организацию О-антигенов клинических изолятов 025, описанных в Примере 1. Для более подробной характеристики структур 025 OPS использовали несколько методов.
Прежде всего, структуру О-антигена анализировали посредством SDS PAGE. Липополисахарид (LPS) из клинических изолятов анализировали по разнице в электрофоретической подвижности, используя разные методы окрашивания после SDS PAGE. Для визуализации количеств LPS выполняли окрашивание серебром и проводили анти-025 специфический Вестерн-блоттинг. См. Фиг. 5, где изображены результаты анализа 10 изолятов. Данные показывают, что аналогичные интенсивности сигналов получены при окрашивании серебром разных препаратов LPS. В отличие от этого, анализ со специфической антисывороткой показывает более сильные интенсивности сигналов в 3 из 10 образцов (изоляты upec436, upec767, ирес827). Полагают, что разные интенсивности сигналов возникают из-за различий в структуре OPS.
Для подробного прояснения структуры 025В применяли разные аналитические методы. Клинический изолят ирес138 был положительным по 025В согласно анализу ПЦР и демонстрировал более слабое распознавание 025-агглютинирующей антисывороткой, чем штаммы 025А. См. Фиг. 5. Кроме того, штамм является ESBL, но чувствителен к FOS, IPM и TZP и устойчив к AM, СХМ, NOR и CIP. Другой клинический изолят, штамм ирес436 был отрицательным по 025В согласно ПЦР, но положительным по общему 025 (025А) согласно ПЦР. Также было обнаружено, что штамм ирес436 сильнее взаимодействует с 025-агглютинирующей антисывороткой, когда его LPS анализировали посредством Вестерн-блоттинга. См. Фиг. 5. LLO из обоих штаммов экстрагировали, метили с помощью 2АВ и анализировали
посредством нормально-фазовой HPLC. См. Фиг. 6; LLO из ирес138 и ирес436, 9,079 и 9,081). Профили элюирования показали четкие различия между двумя экстрактами. MS/MS-анализ штамм-специфических пиков идентифицировал сигналы, совместимые с ожидаемыми структурами BRU.
Сигналы в штамме ирес436 (9.081): Пик при времени элюирования 62' анализировали посредством MS и обнаружили, что он содержит в качестве главной массы молекулу с m/z=1021 Да, то есть молекулу, соответствующую ожидаемой массе полной 025А OPS BRU. При MS/MS получали картину фрагментации, совместимую с последовательностью моносахарида 025А (Фиг. 7А; MS/MS m/z=1021).
Сигналы в штамме ирес138: Главную массу пика при времени элюирования 50' составляла молекула с m/z 1022 Да, то есть на один дальтон более чем полная единица повтора 025А. MS/MS анализ (Фиг. 7В; MS/MS 025В) показал характер фрагментации, почти идентичный единице повтора 025А, и отнес разницу 1 дальтон ко 2"ому моносахариду от восстанавливающего конца (идентифицированному путем фрагментации иона Y с m/z=551 в MS/MS 025А, и m/z=552 в штамме ирес138). Дополнительный пик, элюированный при 60', показал аналогичную фрагментацию, но с разницей 42 Да в массе материнского иона (m/z=980), который локализован в том же моносахариде (m/z=510), то есть втором от восстанавливающего конца. Интерпретация этих результатов приведена ниже.
Процедуры экстракции OPS, гидролиза и 2АВ-мечения включают кислотную обработку для удаления Und-PP из OPS. Было показано, что в условиях обработки частично удаляется О-ацетилирование, но не /V-ацетилирование. Таким образом, вполне вероятно, что пик при 60' представляет массу деацитилированного BRU, появляющегося при химическом гидролизе вещества в пике 50'. Взятые вместе, эти данные показывают, что в 025В имеется О-ацетилирование в том же моносахаридном положении, что и /V-ацетилирование в L-FucNAc из 025А.
Для химического подтверждения того, что ацетилирование второго остатка от восстанавливающего конца является О-связанным, выполняли анализ деацетилирования. Собирали 025В-специфический пик из 2АВ LLO HPLC со временем элюирования 50' из 025В ПЦР-положительного штамма и
обрабатывали щелочью, как описано в разделе "Методы". Повторный анализ посредством HPLC приводил к пику со временем элюирования 60', как идентифицировано в пике 025В из Фиг. 6, содержащему основную массу с m/z=979, с MS/MS-картиной фрагментации ионов, сопоставимой с 025В BRU, потерявшей свою О-ацетильную группу. /V-ацетильные группы являются стабильными при щелочном воздействии, как показано с помощью оставшейся N-ацетильной группы на восстанавливающем конце D-GlcNAc в той же молекуле.
В заключение было установлено, что типичный 025В штамм ирес138 структурно и генетически родственней OPS 025А и 016 (Фиг. ЗА и В) из Е. coli. 025В отличается от 025А тем, что имеет структуру единицы повтора, содержащую О-ацетильную группу вместо /V-ацетильной группы на втором моносахариде единицы повтора, который представляет собой остаток L-Rha, а не D-FucNAc. Эти изменения, скорее всего, вызваны заменой механизма биосинтеза UDP-FucNAc и трансферазы D-FucNAc участком ДНК, кодирующим две гликозилтрансферазы и О-ацетилтрансферазу. Эти гены относятся к кластеру генов 016 на основании гомологии и анализа функциональности. Конечные структуры отличаются, но похожи, что объясняет перекрестную реактивность, наблюдаемую с 025-агглютинирующей антисывороткой.
Как обсуждалось выше, был сделан вывод и предположение на основании анализа их кластеров rfb, что OPS 025А содержит L-FucNAc, в то время как эта структура отсутствует в 025В. Чтобы исследовать, отсутствует ли FucNAc в 025В, выполняли анализ моносахаридного состава ЕРА-биоконъюгатов, продуцируемых в штаммах 025А и 025В (Фиг. 9), используя метод РМР-мечения и метод анализа посредством HPLC, описанные выше. Для получения биоконъюгатов клинические изоляты Е. coli с фенотипами 025А и 025В были приготовлены и модифицированы с целью оптимального продуцирования биоконъюгатов. Как часть этой модификации, гены waaL из штаммов upec_436 (025А) и uepc_138 (025В) были удалены, как описано ранее (см. Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645), исходя из информации, полученной методом определения типа кора (см. Amor, et al., (2000) Infect Immun 68, 1116-1124). Полученные штаммы трансформировали экспрессионными плазмидами для 4S-EPA (pGVXN659) и
олигосахарил-трансферазой, PgIB (pGVXN939), для продуцирования 025А; и pGVXN114 и pGVXN539 (продуцирующих 2S-EPA) для получения 025В-биоконъюгата. 025В-биоконъюгаты получали в 2 л встряхиваемой колбе с последующей аффинной очисткой из периплазматических экстрактов посредством IMAC. 025А-конъюгаты получали посредством периодической ферментации с подпиткой и очищали посредством двухстадийного способа очистки, начиная с осветления цельноклеточного гомогената, полученного посредством гомогенизации под высоким давлением, как выше описано в разделе "Методы". Анализ моносахаридного состава выполняли, как описано выше.
Результаты подтверждают отсутствие сигнала FucNAc в происходящих от 025В биоконъюгатах, в то время как 025А-содержащие биоконъюгаты показывают пик при ожидаемом времени элюирования, как определено путем воздействия на смесь моносахаридов того же самого процесса обработки, что и в случае контроля. Таким образом было подтверждено, что предполагаемая структура 025В, как и ожидалось на основе анализа кластера rfb, представляет собой L-FucNAc-less.
Полную структуру единицы повтора (RU) О-антигенного полисахарида (0-PS) из О-антигена 025В Escherichia coli определяли с помощью ядерного магнитного резонанса биоконъюгата после частичного ферментативного расщепления группировки белок-носителя ЕРА. Анализ подтверждает, что 025В 0-PS состоит из пентасахаридной RU. Сигналы 1Н и 13С были установлены посредством методов корреляции 2D ЯМР, которые подтвердили, что структура 025В 0-PS RU отличается от опубликованной структуры 025А 0-PS RU (Кеппе, L, et al. 1983. Carbohydr. Res. 122:249-256; Fundin, J., et al. 2003. Magn. Reson. Chem. 41:202-205) заменой остатка а-3-FucpNAc остатком а-3-Rhap, при этом более чем 90% этого остатка О-ацетилированы по положению С2. Полная 025В O-PS RU показана ниже (025В'):
D-GIc
P 6 f
D-GIc
A 1.3
a 3
+~ L-Rha2Ac
1,3
D-GlcNAc
L-Rha
Получение и характеристика биоконъюгата
Для дополнительного анализа полисахаридных антигенов 025А и 025В, получали больше вещества биоконъюгата. Для 025А очищенную партию 025А-ЕРА, полученную выше, использовали для экспериментов по дополнительным характеристикам. Для получения 025В-ЕРА конструировали штамм с геномно интегрированным кластером 025В: W3110 AwaaL AgtrABS A/fb016::/fb(upec138), с плазмидами pGVXN1076 и pGVXN970. Этот штамм был сконструирован, начиная с W3110 посредством методов Datsenko и Wanner и способа гомологичной рекомбинации для сайт-направленной интеграции больших вставок в бактериальные хромосомы (см. международную заявку на патент РСТ/ЕР2013/071328).
Полученные 025В-биоконъюгаты были охарактеризованы с использованием стандартных анализов выделения и характеристики. Биоконъюгаты очищали с использованием двух последовательных стадий анионообменной и гель-проникающей хроматографии, с получением 97,2 и 98,1% чистых 025А и 025В препаратов биоконъюгата, соответственно. Количественное определение посредством SDS PAGE использовали для анализа чистоты. См. Фиг. 10 (025А) и Фиг. 11 (025В). Отношение сахара к белку рассчитывали на основе количественного определения посредством антронового анализа (см. Laurentin and Edwards, (2003) Anal Biochem 315, 143145) и ВСА анализа концентрации белка, что приводило к 40,2 и 26,6% для биоконъюгатов 025А и 025В. Аналитическая гель-проникающая хроматография показала мономерное состояние частиц в соответствии с ожидаемым гидродинамическим радиусом ЕРА с присоединенными гликановыми цепями.
Применения
Для определения иммуногенного потенциала структуры 025В, выполняли несколько доклинических экспериментов с использованием биоконъюгатов 025В и 025А. Как показано на Фиг. 5, все клинические изоляты, идентифицированные, как 025-положительные в Примере 1 (то есть изоляты и 025А, и 025В), были положительными с 025А-антисывороткой, обычно используемой для выявления серотипов 025 (типирующие сыворотки из 025А-штамма Е47а) посредством Вестерн-блоттинга. Таким образом, анти-025А антисыворотка, по-видимому, перекрестно реагирует с LPS из штаммов 025В. Для подробного анализа антительного ответа и перекрестной реактивности были получены биоконъюгаты 025. Мальтозосвязывающий белок (МВР) использовали в качестве белка-носителя, и этот белок-носитель был связан с 025А или 025В. В Таблице 4 показаны штаммы, использованные для получения белка. Использованные штаммы был идентифицированы посредством ПЦР в отношении их генотипа 025А или В. Экспрессию выполняли в среде ТВ и белковый продукт очищали из периплазматических экстрактов.
Иммунизации с использованием полученных биоконъюгатов выполняли с использованием стандартных протоколов иммунизации кроликов (28-дневный ускоренный протокол Eurogentech). 50 мкг полисахарида, связанного с МВР, инъецировали в сутки 0, 7, 8 и 18 с патентованным иммуностимулирующим компонентом без адъюванта Фрейнда. Конечную, полученную на 28 сутки после первой иммунизации, антисыворотку из крови тестировали на ее
специфичность к LPS 025А или 025В. На Фиг. 22 показано сравнение реактивности антисыворотки к соответствующему LPS (025А или 025В). LPS получали из ирес436 и ирес138 посредством переваривания протеиназой К цельноклеточных образцов в SDS-PAGE Lammli буфере. Одинаковое количество LPS наносили на два геля SDS-PAGE, с последующим электропереносом на нитроцеллюлозные мембраны и определением с использованием 025А- и 025В-антисыворотки. Результаты показывают, что 025А-антисыворотка узнает LPS 025А лучше, чем LPS 025В, в то время как антисыворотка 025В узнает LPS 025В лучше, чем LPS 025А. Этот результат показывает, что аутологичный антиген делает лучший антиген. Таким образом, включение антигена 025В в вакцину обеспечивает лучшую защиту против преобладающих клинических штаммов 025В группы 025, чем антиген 025А. Пример 3: Е. со//01
Список структурных баз данных разных структур субсеротипа Е. coli 01. В частности, 01 А, 01А1, 01В, 01 С. 01А и 01А1 являются структурно идентичными и, как полагают, они связаны с заболеванием, хотя и не сообщалось, что 01В и С являются патогенными (см. Gupta, et al., (1992) J Bacterid 174, 7963-7970) и представляют собой меньшинство среди изолятов 01. Структура 01 А/01 А1, 01В и 01С показана на Фиг. 12В. Для анализа распределения субсеротипа 01 в эпидемиологическом исследовании UPEC из Примера 1 детально анализировали структуры О-антигенов из нескольких клинических изолятов из исследования. Во-первых, структуру LPS 12 штаммов, определенную, как положительная в отношении 01 посредством анализа агглютинации, анализировали посредством SDS PAGE. См. Фиг. 13: окрашивание серебром и вестерн-блоттинг 01.
Окрашивание серебром показало типичные LPS сигналы во всех линиях, содержащих экстракты из клинических изолятов 01. Сильное окрашивание электрофоретической подвижности примерно при 10-15 кДа соответствует ядру липида А, и лестницеобразные сигналы с более медленными подвижностями, представляют ядро липида А, модифицированное углеводными полимерами, состоящими из разного количества О-антигенных единиц повтора. При сравнении LPS из разных изолятов выявляются различия в распределении модальной длины, электрофоретической подвижности отдельных бэндов и
лестницеобразной картины. На основании этих наблюдений могут быть идентифицированы три группы: (1) большинство изолятов (ирес002, иресОЮ, ирес032, ирес140, ирес108, ирес143, ирес276, ирес399 и ирес425) демонстрируют неразличимую электрофоретическую подвижность отдельных бэндов, отличающуюся только интенсивностью сигнала и средней длиной цепи (распределение модальной длины); (2) два изолята (ирес119 и ирес256), по-видимому, имеют немного более быструю подвижность каждого бэнда единицы повтора LPS, что предлагает другую структуру, например другую модификацию ядра липида А; и (3) сигналы, полученные из изолята ирес1096, появляются в виде мазка, а не лестницы, указывая на другую структуру OPS. См. Фиг. 13А.
Анализ с помощью Вестерн-блоттинга и обнаружение с использованием анти-01 антисыворотки показало, что все LPS, кроме ирес1096, определяются при помощи специфических 01-антител, что указывает на перекрестно-реактивные молекулы LPS. Это означает, что 11 из изолятов представляют собой 01 и что ирес1096, скорее всего, не является 01-изолятом (то есть он является ложным положительным в анализе агглютинации).
Для подробного анализа структурного сходства 01-антигенов, использовали 2АВ-мечение LLO и метод нормально-фазовой HPLC с высоким разрешением, как описано выше. На Фиг. 14А показано наложение хроматограмм, полученных для 5 из 11 клинических изолятов. Область идентификационных отпечатков OPS появилась при времени удерживания от 110 до 150 минут. Профили показывают, что во всех образцах сигналы возникают в то же время удерживания, что указывает на идентичные молекулярные структуры. Наблюдаемыми различиями были распределение интенсивности, то есть время элюирования среднего максимального сигнала, и интенсивности общего сигнала. Остальные 6 экстрактов приводят к пикам в то же время элюирования с различиями в интенсивности. Только образец иресЮЭб отличается по отношению к картине пиков, что подтверждает структурное отличие, отмеченное выше.
MS/MS-анализ содержания отдельного пика посредством анализа MALDI-
TOF/TOF (время-пролётная ионизация лазерной десорбцией с использованием
матрицы/времяпролётный) использовали для определения
последовательности моносахаридов в образцах 01 (См. Фиг. 14В). MS-анализ
проводили из образцов, извлеченных не из клинических изолятов, а из штамма W3110 AwaaL, содержащего космиду с кластером rfb из ирес032. Пики, элюированные в 50, 80, 96 и 108 минут времени элюирования, содержали основные массы m/z=1021,4, 1849,6, 2693,9, 3540,4. Серии фрагментационных ионов, полученные после MS/MS, согласовывались с 1, 2, 3 и 4 единицами повтора HexNAc, тремя дезоксигексозами и разветвленным HexNAc. Эти данные могут быть объяснены только структурой субсеротипа 01 А. Описанные серии пиков представляют собой 01 OPS, прикрепленные к UPP в клинических изолятах, и каждый последующий пик отличается от предыдущего одной единицей повтора.
Эти данные подтверждают утверждение из литературы, что предложенная структура 01 О-серотипа Е. coli в клинических изолятах UTI из исследования, описанного в Примере 1, представляет собой подтип 01 А.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид 01 А, штаммы W3110 Е. coli конструировали для экспрессии OPS 01А. Полученными штаммами были W3110 A/Yfo016::/fb01 AwaaL, содержащие кластер rfb положительного клинического изолята 01 (GU299791* кластер в пределах rmlB-wekO). OPS 01А-экспрессирующие штаммы-хозяева конструировали при помощи гомологичной рекомбинации. Кластер rfb клинического изолята 01А амплифицировали с использованием ПЦР-олигонуклеотидов, которые отжигают с ДНК, фланкирующей кластер rfb. Амплифицированную ДНК затем использовали для замены эндогенного О-антигенного кластера хорошо охарактеризованного лабораторного штамма W3110 посредством гомологичной рекомбинации, описанной в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей pGVXN659 и для PgIB (pGVXN114, 939, 970, 971) были встроены посредством трансформации и экспрессии 01 была подтверждена (См. Фиг. 15 и Фиг. 16).
В независимом эксперименте клинический 01 изолят ирес032 конструировали для получения биоконъюгатов. При конструировании требовалось учитывать фенотип чувствительного к антибиотику клинического изолята. Upec032 AwaaL был сконструирован и трансформирован pGVXN939 и pGVXN579 для получения биоконъюгата с использованием МВР в качестве белка-носителя. Преимущество использования МВР и ЕРА в качестве белков
носителей заключается в возможности индуцировать образование антисыворотки, где они оба приводят к антисывороткам, которые перекрестнореактивны к полисахаридному компоненту, но не к носителю. Такие антисыворотки являются полезными инструментами для оценки доклинических экспериментов, например в качестве покрывающих агентов для разработки полисахарид-специфических ELISA анализов. Пример 4: Е. со//Об
Е. coli серотипа Об представляет собой наиболее распространенный ЕхРЕС, зарегистрированный на сегодняший день (George, D. В., and Manges, А. R. (2010) Epidemiol Infect 138, 1679-1690). Не только исследование, описанное в Примере 1, но и данные, взятые из литературы, подтверждают, что серотип Об является одним из четырех ведущих серотипов во многих проявления, вызванных ЕхРЕС (См. Фиг. 4).
Две структуры OPS Об были описаны в литературе (см. Jann et al., Carbohydr. Res. 263 (1994) 217-225, и Jansson et al., Carbohydr. Res. 131 (1984) 277-283). Структуры описанных 06-антигенов показаны на Фиг. 17В. Они идентичны за исключением разветвленного моносахарида каждого из них, который представляет собой либо Glc, либо GlcNAc. Однако в литературе не определена преобладающая 06-структура в клинических изолятах, вовлеченных в UTI.
Чтобы выбрать наиболее типичную структуру антигена Об для вакцины, определяли структуры OPS 06-агглютинирующих положительных клинических изолятов Е. coli из исследования Примера 1 с использованием того же подхода, как описано выше для серотипов 01. Окрашивание серебром и Вестерн-блоттинг с использованием анти-06 антисыворотки идентифицировало один из 12 клинических изолятов, невзаимодействующих с анти-06 сывороткой, хотя LPS был окрашен серебром во всех образцах (не показано), что указывает на ложный положительный результат агглютинации. Однако, вполне вероятно, что различия Glc или GlcNAc не будут обнаружены по сдвигу электрофоретической подвижности на гелях.
Для подробного анализа структуры использовали идентификационные отпечатки LLO. В качестве эталона для каждой из двух описанных структур, в анализ включали экстракты штаммов с описанными разветвленными Glc
(CCUG11309) и GlcNAc (CCUG11311). Сравнения двух кривых HPLC показывает серии пиков, которые элюируются в 70,8, 103,3 и 122,2' для полученных от CCUG11309 образцов и серии 68,8, 100,3 и 118,3 для образцов CCUG11311. См. Фиг. 18А. Пики анализировали с помощью MS в отношении основных масс, присутствующих в пиках, и с помощью MS/MS в отношении моносахаридной последовательности этих основных масс. Данные, подтвержденные для серии пиков, полученных от CCUG11311, m/z=1094,4, 2027,6 и 2962 (MS0154), как и ожидалось, соответствуют GlcNAc-разветвленным полимерам с 1, 2 и 3 BRU. m/z=1053.4, 1945.7 и 2836.9 с разветвленным Glc были идентифицированы ранее в экстрактах из штамма W3110, экспрессирующего клонированный кластер rfb клинического изолята CFT Об, имеющего такие же значения времени элюирования пика 2АВ-идентификационных отпечатков, что и CCUG11309 (MS0138). Когда хроматограммы, полученные из 12 клинических изолятов, сравнивали с эталонными штаммами, 11 сигналов содержали серии пиков, указывающие на OPS Об с разветвленным остатком Glc. Пять из этих 11 хроматограмм показаны на Фиг. 18В. Один образец, не генерирующий сигналы при Об-специфических временах элюирования, не являлся Об, то есть он, наиболее вероятно являлся ложноположительным на основании теста агглютинации. Таким образом, OPS
06 с разветвлением Glc (Фиг. 17В, верхняя часть) имеет наиболее типичной
структурой среди Об-серотипов, выделенных из эпидемиологии, описанной в
Примере 1.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид 06Glc, были сконструированы штаммы W3110 Е. coli для экспрессии OPS Об посредством замены кластера rfb W3110 кластером rfb из штамма CCUG11309. См. Таблицы
7 и 13. Полученные штаммы представляли собой W3110 A/fb016::/fbCCUG11309 AwaaL, содержащие кластер rfb Об-положительного штамма Е. coli с описанным Glc-разветвлением в BRU (см. выше). Штамм-хозяин, экспрессирующий 06Glc OPS, был сконструирован посредством гомологичной рекомбинации. Кластер rfb амплифицировали, используя ПЦР-олигонуклеотиды, которые отжигаются с ДНК, фланкирующей кластер rfb. Амплифицированную ДНК затем использовали для замены эндогенного О-антигенного кластера хорошо охарактеризованного лабораторного штамма
W3110 посредством гомологичной рекомбинации, описанной в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей и для PgIB были введены посредством трансформации и экспрессию ожидаемого OPS на ЕРА подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга. Пример 5; Е. coli 02
Структура единицы повтора 02-полисахарида была известна с 1987 (Jansson, et al., (1987) Carbohydrate research 161, 273-279). Это показано на Фиг. 19В. Две последовательности генных кластеров О-антигена 02 имеются в общедоступной базе данных (GenBank EU549863 и GU299792). Был сделан сравнительный анализ и предполагались гликозилтрансферазные активности (Таблица 5; Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316; и Li, et al., (2010) J Microbiol Methods 82, 71-77).
Таблица 5. Прогнозы генов кластера О-антигена 02, исходя из кластера rfb, опубликованного Li, et al. и Fratamico, et al., как указано в скобках.
Название гена
Предполагаемая функция
Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
rmlB
сП"ОР-Глюкозо-4,6-дегидратаза
dTDP-l~niOK030-4,6-flerHflpaTa3a
(Е. coli IAI39), YP_002406996.1, 98%
rmID
ЬТОР-6-Дезокси-0-глюкоза 3,5-
эпимераза
dTDP-6-fle30Kcn-L-маннозадегидрогеназа (E. coli), ACA24825.1, 97%
rmlA
Гл юкозо-1 -фосфат-тимидилилтрансфераза
Глюкозо-1-фосфат-
тимидилилтрансфераза
(E. coli IAI39), YP_002406998.1, 99%
fdtA
1\ЮР(нуклеозиддифосфат)-гексоза-изомераза
NDP-гексоза-изомераза (Yersinia intermedia ATCC 29909), ZP_04635116.1, 67%
fdtC
WxcM-подобный белок
Гипотетический белок PROVRETT_01740 {Providencia rettgeri DSM 1131), ZP_03638653.1, 71%
fdtB
Аминотрансфераза
белок WblQ {Photorhabdus luminescens
subsp. laumondiiJJO^), NP_931971.1,
Название гена
Предполагаемая функция
Наиболее значимая гомология /Белок[организм], учетный номер, макс, идентичность (BLAST)
65%
Wzx
О-антиген-флиппаза
белок биосинтеза полисахаридов (Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum PC1), YP_003016888.1, 50%
wekP (wegQ)
Гликозилтрансфераза (GT)
Гипотетический белок FIC_01940 (Flavobacteriaceae
bacterium 3519-10), YP_003096444.1,
29%
rmIC
dTDP-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимераза
RmIC (E. coli), ACA24796.1, 70%
Wzy
О-антиген-полимераза
Гипотетический белок Gura_3055 (Geobacter uraniireducens Rf4), YP_001231799.1, 26%
wekQ (wegR)
Гликозилтрансфераза
Гликозилтрансфераза, предполагаемая, gt2D (Cellvibrio japonicus Ueda107), ref|YP_001983904.1, 31%
wekR
Гликозилтрансфераза
Гликозилтрансфераза, группа 1 (Shewanella
frigidimarina NCIMB 400), YP_751504.1, 57%
wekS (wegW)
Сульфатаза
Предполагаемый белок трансмембранной сульфатазы (Stenotrophomonas maltophilia K279a), YP_001970541.1, 39%
Сравнение гомологии структуры и генов указывает на то, что присутствуют все функции для биосинтеза полимера:
rmlBDAC кодирует ферменты, необходимые для биосинтеза dTDP-L-рамнозы, которая является субстратом для добавления L-Rha к остову с помощью гликозилтрансфераз wekPOR;
fdtABC обеспечивает dTDP-D-Fuc3NAc для разветвленных гликозилтрансфераз;
гомологи wzy и wzx, ответственные за перенос Und-PP-связанной единицы повтора из цитоплазмы в периплазму; и
wekPOR представляют собой прогнозируемые гликозилтрансферазы и, по-видимому, образуют гликозидные связи 02 BRU (три L-Rha и одну L-FucNAc).
Ген wekS, обнаруженный в опубликованных последовательностях кластера rfb 02, является прогнозируемой связанной с мембраной сульфатазой и, таким образом, скорее всего, не участвует в образовании BRU. Это означает, что - если принять за правило, что один фермент означает одну связь - тогда один фермент в группе wekPOR должен быть бифункциональным, чтобы обеспечить четырех гликозидные связи.
То, что правило - один фермент соответствует одной связи - не является абсолютным, было показано во многих примерах, где известно гликозилтрансфераз меньше чем связей, например в Shigella flexneri Y, S. flexneri 6, С. jejuni и E. coli 01 А. В этих примерах мультифункциональные гликозилтрансферазы отвечают за образование более одной гликозидной связи, то есть они являются "би-" или "мульти-функциональные". Всегда это тот же самый моносахарид, который добавляют несколько раз. Повторные остатки рамнозы - как обнаружено в серотипе 02 - часто связаны с такими мультифункциональными ферментами.
Благодаря наличию усеченных элементов транспозона, фланкирующих последовательность wekS, было сделано предположение, что локус wekS был встроен в кластер rfb посредством рекомбинации ДНК (см. Fratamico et al., 2010, Canadian journal of microbiology 56, 308-316). Транспозон-опосредованная вставка локуса wekS предполагает, что биосинтез OPS 02 ранее действительно осуществлялся без присутствия wekS и, соответственно, wekS не требуется для синтеза полимера OPS 02. Для подтверждения этой гипотезы образование OPS 02 было воссоздано в рекомбинантной экспрессионной системе на "чистом" геномном фоне, содержащем кластер rfb 02, не имеющий гена wekS. Чтобы достичь этого, кластер О-антигена из штамма W3110 был заменен кластером rfb из 02-положительного штамма ирес116, не имеющего
ДНК wekS. Хромосомная замена была сделана посредством гомологичной рекомбинации, как описано в международной заявке на патент РСТ/ЕР2013/071328. Полученный штамм представлял собой W3110 AwaaL ArfbW3110::/fbO2 AwekS. OPS получали и анализировали с помощью 2АВ-мечения и нормально-фазовой HPLC и определения флуоресценции, как это делали для OPS 01А и Об (см. выше), и анализировали с помощью нормально-фазовой HPLC (Фиг. 21) и сравнивали с сигналами от штамма дикого типа CCUG25. Анализ приводил к серии перекрывающихся пиков от 40 до 140 минут времени элюирования.
MS-анализ серии пиков, зависимой от кластера rfb 02, показал основные массы с такими же различиями между последовательными пиками (то есть единичную RU 02).
MS-анализ молекул, собранных в соответствующих пиках, выполняли, чтобы проанализировать структуру OPS. Пики, полученные при 43,5, 73,1, 81,4 и 90' из штамма дикого типа CCUG25, собирали и анализировали посредством MS и MS/MS. Были найдены массы и серии ионов Y-фрагмента, сопоставимые с ожидаемыми 1, 2 и 3 единицами повтора молекул OPS 02, (m/z=989,4 (Фиг. 23), 1817,8, 2646,1, все Ыа+-аддукты).
Для подтверждения OPS 02 из клинических изолятов, в 12 клонах анализировали их структуру OPS, как описано выше для серотипа 01. Во-первых, получали LPS для анализа посредством окрашивания серебром и Вестерн-блоттинга. Результаты изображены на Фиг. 20. Все образцы показывали лестницеобразный характер полос с двумя явными разными средними длинами лестниц. Анти-02 антисыворотка идентифицировала все LPS образцы, указывая на то, что агглютинация правильно идентифицирует все изоляты, как серотипы 02.
Для получения биоконъюгата, несущего полисахарид 02, использовали W3110 AwaaL ArfbW3110::/YfoO2 AwekS. Экспрессионные плазмиды для белков-носителей и для PgIB вставляли посредством трансформации и экспрессию ожидаемого OPS на ЕРА подтверждали с помощью Вестерн-блоттинга. См. Таблицы 7 и 13 и выше.
Пример 6; Иммунологический анализ разных О-антигенов
Для оценки иммунологического потенциала биоконъюгатов, содержащих выбранные антигенные полисахариды, выполняли доклиническое исследование. Биоконъюгаты 01А-ЕРА, 02-ЕРА, 06GIC-EPA и 025В-ЕРА были получены, очищены и охарактеризованы, как описано выше и в разделе методов.
Очищенные биоконъюгаты использовали для иммунизации самок крыс Sprague Dawley в возрасте 9 недель. 100 мкл растворов такой же дозы вводили внутримышечно (в/м) на 1, 22 и 43 сутки крысам, у которых в заключение на 56 день отбирали кровь и которых умерщвляли.
Разные группы крыс получали разные вакцины: всегда в чистом виде, содержащую биоконъюгаты отдельно или в комбинации, как указано в Таблице 6. Планшеты ELISA, покрытые когнатными LPS, продуцируемыми положительным штаммов waaL, использовали для измерения иммуногенности в форме титра ELISA сыворотки крыс во время терминального отбора крови на 56 сутки после первой инъекции (Фиг. 25-28). В целом, статистически значимая иммуногенность наблюдалась во всех вакцинированных группах, при измерении по сравнению с контролями (негликозилированный ЕРА или TBS буфер). Таким образом, биоконъюгаты, выбранные и полученные, представляют собой полезные соединения-кандидаты для вакцин.
Для всех протестированных конъюгатов О-антиген-ЕРА статистически значимую иммуногенность наблюдали для всех вакцинированных групп, при измерении по сравнению с контролями (негликозилированный ЕРА или TBS буфер). Таким образом, биоконъюгаты, выбранные и полученные, представляют собой полезные соединения-кандидаты для индукции О-антиген-специфических антител.
Пример 7: Физико-химическая характеристика биоконъюгатов
Четыре биоконъюгата, описанные в примерах выше (О-антиген 025В, 01 А, 02 и 06, соответственно конъюгированных с ЕРА в качестве белка-носителя) были приготовлены в виде моновалентных партий (активные фармацевтические ингредиенты, API) или объединены в одном препарате в виде поливалентной вакцины против ЕхРЕС. Были получены различные группы: доклинические группы, группы для изучения токсичности и клинические группы. В Таблице 7 указаны штаммы-хозяева, используемые для получения конъюгатов.
Таким образом, четыре моновалентные npe-GMP партии и негликозилированный ЕРА эталон анализировали посредством гель-фильтрационной хроматографии с многоугловым рассеянием лазерного света (SEC-MALS), для того чтобы количественно оценить степень моно- и ди-гликозилирования отдельных биоконъюгатов и для определения молекулярной массы (ММ) белка-носителя и О-PS, присоединенного к нему. Образцы разделяли на колонке TSKgel-G3000 SWxl в фосфатном буфере (рН 7,0; 50 мМ NaCI, 150 мМ фосфата натрия) и контролировали с помощью УФ (214 и 280 нм), показателя преломления (RI) и многоуглового рассеяния лазерного света (MALS).
Для негликозилированного белка-носителя ЕРА была определена ММ, равная 63-67 кДа (теоретическая ММ составляет 70,5 кДа, на основании аминокислотной последовательности). В биоконъюгатах обнаруживали только ЕРА при 280 нм, позволяя выделять его ММ из общей ММ, измеренной с помощью RI и MALS: в биоконъюгатах измеренная ММ группировки ЕРА составляла 65-71 кДа.
Анализ стандартов продукта npe-GMP API показан в Таблице 8, он указывает на присутствие моно- и ди-гликозилированных конъюгатов с ММ в диапазоне 75-79 кДа и 87-91 кДа соответственно. Части O-PS имели ММ 16-24 кДа для ди-гликозилированных разновидностей и 8-14 кДа для моногликозилированных разновидностей соответственно. Учитывая MM RU
каждого серотипа, было определено среднее число 10-16 RU на полисахаридную цепь, что хорошо согласуется сданными гидразинолиза и MS.
Анализ методом кругового дихроизма (CD) партии биоконъюгата 025В, приготовленной в Трис-солевом буфере (TBS), показал, что композиции при рН от 6,8 до 7,4 имеют спектр, аналогичный спектру негликозилированного белка-носителя ЕРА, со смесью альфа-спиральных и бета-складчатых структур, как ожидалось на основе опубликованной кристаллической структуры ЕРА. Таким образом, на основе этих CD-анализов можно предположить, что гликозилирование цепями 025В О-PS не влияет на вторичную структуру белка-носителя ЕРА.
Анализ посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) композиции партии биоконъюгата 025В в TBS при рН от 6,8 до 7,4 и в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) при рН от 7,1 до 7,8, показал кривые плавления, сравнимые с кривыми негликозилированного ЕРА, с температурой плавления приблизительно 52°С. Этот результат показал, что биофизическая характеристика белка-носителя ЕРА не меняется при модификации цепями 025В 0-PS.
Пример 8: Стабильность моновалентных нерасфасованных партий и тетравалентных вакцинных препаратов
Перед крупномасштабным изготовлением состоятельность процесса изготовления оценивали в малом масштабе. Партии для оценки состоятельности оценивали в широкоохватных исследованиях стабильности, которые включали условия ускоренного старения и стрессовые условия хранения для определения путей ухудшения характеристик. Стабильность четырех моновалентных вакцинных компонентов (API) тестировали в течение периода 3 месяца.
Анализ данных по стабильности доклинических API показал стабильность в течение по меньшей мере 3 месяцев при хранении при -75 ±15°С (нормальные условия хранения). Никаких статистически значимых тенденций не наблюдалось при предполагаемых условиях хранения при статистическом линейном регрессионном анализе. Также при ускоренных (+5 ±3°С) и стрессовых условиях хранения (+25±5°С) продукт был стабильным в течение по меньшей мере 3 месяцев, о чем свидетельствует низкая изменчивость показателей стабильности. Данные для 01А доклинических API показаны в Таблице 9. Три других серотипа (02, 06, 025В) продемонстрировали аналогичные данные по стабильности.
Таблица 9: Данные по стабильности партии 01А доклинического API
S/P
S/P
Чистота
Чистота
3 мес
3 мес
-75±15°С
19,8
97,6%
+5 ±3°С
19,3
20,9
98,1%
98,6%
+25 ±5°С
21,3
98,3%
S/P: отношение сахара к белку, определенное с помощью антронового и ВСА анализов соответственно.
Чистота: как определено посредством обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC).
Стабильность тетравалентной вакцинной композиции (биоконъюгаты 025В, 01 А, 02 и 06) определяли в течение 3-х месячного периода. Исследования включали условия ускоренного старения и условия стрессового хранения для определения путей ухудшения характеристик. Полученные данные считаются релевантными для первоначального обоснования срока
хранения GMP IMP (исследовательский лекарственный продукт, тетравалентная вакцинная композиция ЕхРЕС).
Анализ данных по стабильности доклинической партии тетравалентной вакцины ЕхРЕС указывает на стабильность в течение по меньшей мере 3 месяцев при хранении при +5 ±3°С (нормальные условия хранения), как показано в Таблице 10. Никаких статистически значимых тенденций не было обнаружено при предполагаемых условиях хранения посредством статистического линейного регрессионного анализа. Также при ускоренных условиях хранения (+25±5°С) продукт был стабильным, о чем свидетельствует низкая вариабельность показателей стабильности. Таблица 10: Данные по стабильности партии доклинической тетравалентной вакцины
Чистота
Чистота
3 мес.
3 мес.
5±3°С
302 & 192
294 & 188 кДа
98,3%
98,7%
25 ±5°С
кДа
297 & 191 кДа
98,2%
ММ (распределение молекулярного размера): два основных пика продукта (то есть моно- и ди-гликозилированные разновидности), как определено посредством эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (SE-HPLC).
Чистота: как определено посредством обращено-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии (RP-HPLC).
Все вместе эти исследования показывают, что API и тетравалентная вакцинная композиция ЕхРЕС были стабильны в течение по меньшей мере трех месяцев и, таким образом, являются подходящими вакцинными композициями в отношении стабильности.
Пример 9: Исследование токсичности тетравалентного вакцинного препарата
Оценивали токсичность и местную переносимость тетравалентного вакцинного препарата (биоконъюгаты 025В, 01 А, 02 и 06) после двух внутримышечных введений (для воздействия была выбрана четырехглавая мышца бедра) крыс Sprague Dawley в 1 и 14 сутки. Обратимость, сохранение или отсроченное возникновение каких-либо изменений оценивали после восстановительного 14-суточного периода на 28 сутки. Вскрытие животных в основных группах (10 самцов и 10 самок и для вакцинированной, и для контрольной группы) производили на 17 сутки и в группах восстановления (5 самцов и 5 самок и для вакцинированной, и для контрольной группы) на 28 сутки (после 14-суточного периода восстановления). Это не было связано с какими-либо эффектами, рассматриваемыми как неблагоприятные, которые могли бы быть приписаны лечению. Вводимую дозу, то есть полную человеческую дозу, равную 4 мкг на О-антиген (16 мкг общего О-антигена для тетравалентной вакцины), вводимую на 1 и 14 сутки, рассматривали как уровень, не вызывающую обнаруживаемого неблагоприятного эффекта (NOAEL) для тетравалентной вакцины ЕхРЕС в условиях этого исследования. Кроме того, иммуногенность тетравалентной вакцины ЕхРЕС была подтверждена и для суток 17 и для суток 28, после оценки образцов сыворотки. Высокие титры анти-01А, анти-02, анти-06 и анти-025В lgG-антител были индуцированы в вакцинированной группе по сравнению контролями, которые получали только буфер, используемый для приготовления препарата (25 мМ Tris, 130 мМ NaCI, 2,7 мМ KCI, рН 7,4).
Эти данные подтверждают, что тетравалентная вакцина ЕхРЕС обладает соответствующим профилем токсичности для введения в качестве вакцины и индуцирует антитела по меньшей мере ко всем четырем серотипам 0-антигенов Е. coli, присутствующих в вакцине (то есть 025В, 01А, 02 и 06).
Пример 10: Эпидемиология О-серотипов, связанных с бактериемией
Для определения распределения О-серотипов среди внекишечной Е. coli, вызывающей бактериемию у пожилых людей, было проведено эпидемиологическое исследование на панели изолятов крови Е. coli, собранных
у пациентов старше 60 лет. В общей сложности 860 изолятов крови за период 2011-2013 гг собрали у субъектов в США, Великобритании, Германии, Испании и Нидерландах и проанализировали посредством классической 0-агглютинации. Как показано в Таблице 11, распределение О-серотипов изолятов с бактериемией напоминает распределение О-серотипов, обнаруженное у пациентов, страдающих от инфекции мочевыводящих путей (UTI, см. Таблица 1А). Серотип 025 был наиболее распространен в исследованной группе с бактериемией; субтипирование пятидесяти семи изолятов посредством ПЦР показало, что пятьдесят шесть (98%) серотипов 025 представляли собой 025В. В обеих целевых группах (UTI и бактериемия), серотипы 01, 02, 06 и 025 были идентифицированы, как четыре наиболее распространенных серотипа. В целом, эти данные подтверждают, что распределение серотипов среди изолятов, как с инфекцией мочевых путей, так и с бактериемией очень похоже и не зависит от географического расположения, времени выделения и показания.
Таблица 11: Распределение наиболее распространенных ассоциированных с бактериемией О-серотипов Е. со// из коллекции 860 изолятов крови, собранных в США и Европейском союзе за период 20112013 гг. Указано относительное распределение О-серотипов в образцах.
Функциональность антител, индуцированных после вакцинации моновалентной и тетравалентной вакцинными композициями, описанными выше, исследовали с помощью опсонофагоцитирующего киллинг-анализа (ОРК) in vitro. Этот тип анализа был принят в качестве коррелята защиты для конъюгатной вакцины против Streptococcus pneumoniae (Prevenar(r)). ОРК-анализ определяет способность сыворотки содействовать опсонофагоцизу и гибели разных серотипов Е. coli. В 96-луночных планшетах, в каждой лунке, инкубировали определенные разведения образца сыворотки с: бактериями одной из четырех вакцино-специфических серотипов Е. coli, определенным количеством клеток HL60 и комплементом крольчонка. После инкубации часть смеси наносили на триптиказо-соевый агар (TSA) и подсчитывали число бактериальных колоний. Способность антител связываться с бактериальными клетками и активировать отложение комплемента и опосредовать захват и уничтожение бактерий клетками HL60 выражали в виде опсонического титра. Опсонический титр или индекс опсонизации (01) соответствует разведению сыворотки, уничтожающему 50% бактериальных клеток. Предложены опсониченские индексы для до- и послеиммунной сыворотки. Значимым считается более чем 4-кратное увеличение 01 между показателями для до- и послеиммунной сывороткой. Были установлены анализы ОРК для трех серотипов 02, 06Glc и 025В.
Функциональность антительных ответов, индуцированных моновалентными вакцинами
Для оценки функциональной активности индуцированных вакциной антительных ответов на биоконъюгаты 025В, 01 А, 02 и 06Glc, сыворотку вакцинированных крыс анализировали, используя анализы опсонофагоцитирующего киллинга (ОРК), в которых определяют in vitro комплемент- и антитело-зависимый фагоцитоз и уничтожение бактерий, например Е. coli. Е. coli предварительно опсонизировали разведениями сыворотки вакцинированных крыс, инкубированной с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60), и определяли колониеобразующие единицы (КОЕ). Далее рассчитывали максимальный % гибели и индексы опсонизации (01: разведение сыворотки, вызывающее гибель
50% E. coli). Е. coli, выбранные для ОРК-тестирования представляли собой ОС 24453 (серотип 02), ОС 24781 (серотип 06Glc) и ОС 24176 (серотип 025В). Как показано на Фиг. 29, наблюдался надежный функциональный иммунный ответ на 02-ЕРА (Фиг. 29А), 06GIC-EPA (Фиг. 29В) и 025В-ЕРА (Фиг. 29С).
Полученные данные показывают, что компоненты вакцины, описанные в данном документе, индуцируют антительные ответы против серотипов Е. coli, О-антигены которых включены в вакцину и, что такие антительные ответы участвуют в гибели Е. coli этих серотипов.
Функциональность антительных ответов, индуцированных тетравалентной вакциной
В Таблице 12 показаны общие титры OI для О-антигенов 02, 06Glc и 025В из животных, иммунизированных тетравалентной вакциной либо 0,4, либо 4 мкг на О-антиген. Титры определяли в двух независимых экспериментах. Доза 0,4 мкг индуцировала значительные OI у всех животных в отношении серотипов 02 и 06Glc. В отношении 025В 3/8 животных показали значительное увеличение 01 после иммунизации дозой 0,4 мкг. По сравнению с дозой 0,4 мкг, доза 4 мкг индуцировала меньшее увеличение OI в отношении 02 у всех животных. 3/8 животных продемонстрировали увеличения OI, когда сыворотку из группы дозы 4 мкг тестировали на 025В Е. coli. Эти данные подтверждают, что тетравалентная вакцина способна вызвать О-антиген-специфические опсонические антитела против 02, 06Glc и 025В.
Эти данные показывают, что компоненты вакцины, описанные в данном документе, индуцируют антительный ответ против серотипов Е. coli, О-антигены которых включены в вакцину и, что такие антительные ответы участвуют в гибели Е. coli этих серотипов.
Таблица 12: OI против 02, 06 и 025. 01 отдельных сывороток до вакцинации и после 3 вакцинаций из двух независимых экспериментов показаны для всех
животных.
Индексы опсонизации (OI) тетравалентной ЕРА крысиной сывороткой
02 ?
со//'
06 ?
со//'
0 25 ?. со//
Пппп П Л ...,г-
Животное
и,ч- мм
*+ ММ
Доза 0,4 мкг
*+ ММ
Доза 0,4 мкг
Доза 4 мкг
Ехр.1
Ехр.2
Ехр.1
Ехр.2
Exp. 1
Ехр.2
Ехр.1
Ехр.2
Ехр.1
Ехр.2
Ехр.1
Ехр.2
-1 :пре-вак
2 '4 0 4
2-082
пост-вак
> 1 6 3 8 4
Г476
293
202
226
2 '0 4 5
2-821
Г847
Г578
;2:пре-вак
пост-вак
1Г148
> 1 6 3 8 4
150
120
436
475
10 '2 6 2
11-460
;3: пре-вак
пост-вак
11 '0 7 3
> 1 6 3 8 4
7'959
8-597
355
197
4: пре-вак
пост-вак
> 1 6 3 8 4
108
116
2" 18 9
4'488
!5: пре-вак
пост-вак
10"413
7 "05 0
105
108
> 16,3 8 4
12 "6 7 2
3" 10 7
7'564
105
(6: пре-вак
299
164
269
154
пост-вак
17 25
1 '475
540
896
i7: пре-вак
пост-вак
> 1 6 3 8 4
> 1 6 3 8 4
109
Г249
Г863
160
143
1-130
630
f8: пре-вак
пост-вак
5 '0 5 8
4 "2 01
6'590
3 '8 2 6
288
656
3-336
1'986
|пре-вак Av
334
280
|пост-вак
10 "8 6 7
7747
103
3'349
2 '5 8 6
3 "319
4'578
790
524
Рассчитаны максимальный % гибели и индексы опсонизации (01: разведение сыворотки, вызывающее гибель 50% Е. coli). Е. coli, выбранные для ОРК-анализа, представляли собой ОС 24453 (серотип 02), ОС 24781 (серотип 06Glc) и ОС 24176 (серотип 025В). Наблюдался сильный функциональный иммунный ответ на 02-ЕРА, 06GIC-EPA и 025В-ЕРА.
Пример 12: Оценка вакцины-кандидата против уропатогенных Escherichia coli у женщин с историей болезни рецидивирующей инфекцией мочевыводящих путей (RUTI)
Биоконъюгатная вакцина Е. coli используется на I фазе клинического исследования. Вакцина содержит четыре биоконъюгата в солевом буферном растворе. Четыре биоконъюгата представляют собой: (1) 01А Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, (2) 02 Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, (3) 06Glc Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА, и (4) 025В Е. coli, конъюгированный с белком-носителем ЕРА.
Исследуемая группа включает 194 здоровых женщин в возрасте более и равном 18-70 лет с историей болезни рецидивирующей инфекцией
Ср пре-вак Ср пост-вак
мочевыводящих путей (RUTI), которая определена как более или ровно 3 независимых эпизода за предыдущие 12 месяцев или более или ровно 2 эпизода за последние 6 месяцев. По меньшей мере один из эпизодов инфекции мочевыводящих путей (UTI) был вызван Е. coli (в качестве единственного патогена или части полимикробной инфекции) и эта причина была подтверждена культивированием и задокументирована. Для исследования UTI определяют по наличию по меньшей мере одного определенного симптома UTI (дизурия, неотложный позыв к мочеиспусканию, частота мочеиспускания, боль в боку, болезненность мочевого пузыря, надлобковая боль, лихорадка, тошнота, рвота) наряду с количеством бактерий (КОЕ) составляющим более или ровно 103 КОЕ/мл уропатогена в средней порции мочи.
Исследование включает две группы: (1) вакцина-кандидат и (2) плацебо. Исследование представляет собой последовательное, рандомизированное, простое слепое, плацебо-контролируемое многоцентровое исследование здоровых женщин с историей RUTI.
Предполагаемый период включения в исследование составляет 4 месяца с последующим наблюдением врача продолжительностью девять месяцев для каждого субъекта.
Цель исследования состоит в оценке безопасности, иммуногенности и эффективности биоконъюгатной вакцины Е. coli. Дизайн исследования
За субъектами наблюдали в течение 9 месяцев после инъекции и только за субъектами с инъекциями наблюдали в течение всего периода исследования. Субъекты участвовали в общей сложности в 5 запланированных визитах: скрининговом (первый визит), в сутки 1 (второй визит), в сутки 7, сутки 30 и сутки 270. Субъекты получали 4 телефонных звонка в качестве последующего наблюдения на 2 сутки, 90 сутки, 150 сутки и на 210 сутки.
Любые незапланированные визиты из-за возникновения UTI включали в себя стандартную медицинскую помощь с унифицированными вариантами лечения. Анализы мочи и крови (если это возможно) собирали для диагностики и серотипирования. Спонтанно сообщаемые побочные явления (АЕ) и тяжелые побочные явления (SAE) регистрировали в течение исследования, тогда как
запрашиваемые нежелательные АЕ регистрировали в течение 7 суток после инъекции.
В каждый визит субъекту давали новый дневник пациента и обсуждали предыдущий.
Дозирование и введение
Во время первого визита подходящих субъектов, которые дали информированное согласие, подвергали скринингу и подтверждали их соответствие критериям включения/исключения. Отбирали кровь и собирали мочу.
Во время 2 визита (1 сутки) каждый субъект получал одну внутримышечную инъекцию 0,5 мл раствора (вакцина-кандидат или плацебо) в дельтовидную мышцу. Уменьшенная доза вакцины-кандидата содержит 1 мкг каждого полисахарида (всего 4 мкг полисахарида). Целевая доза вакцины-кандидата содержит 4 мкг каждого полисахарида (всего 16 мкг полисахарида).
Цели
Основная цель заключается в оценке возникновения, интенсивности, взаимосвязи и длительности запрашиваемых и спонтанно сообщаемых нежелательных явлений (АЕ), а также серьезных побочных явлений (SAE) после инъекции вакцины-кандидата по сравнению с группой плацебо на протяжении всего периода исследования.
Вторичные цели заключаются (1) в сравнении изменения гематологических и биохимических конечных точек безопасности перед инъекцией (в начале скрининга и на 1 сутки) и после инъекции (на 7 и 30 сутки) вакцины-кандидата по сравнению с группой плацебо; (2) в оценке иммунного ответа вакцины-кандидата между исходным уровнем (1 сутки) и после инъекции (30 сутки и 270 сутки); (3) в сравнении количества случаев симптоматической инфекции мочевыводящих путей (UTI), вызванных вакцинными-серотипами Е. coli, в двух группах, инъецированных вакциной-кандидатом или плацебо во время всего периода исследования, как наиболее релевантной конечной точки эффективности; (4) в оценке степени появления специфической Е. coli UTI вакцинного серотипа в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо в течение всего исследования; и (5) в оценке интенсивности и
продолжительности клинических симптомов UTI Е. coli серотипов, специфических для вакцины, в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования.
Целями исследования являлись (1) сравнение интенсивности возникновения UTI, вызванных любым Е. coli серотипом, в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования; и (2) сравнение интенсивности возникновения UTI, вызванных любым патогенном в группе обработки вакциной по сравнению с группой плацебо во время всего исследования.
Критерии включения
Критериями включения в исследование являются следующие: (1) женщины с историей рецидивирующей UTI, которая определяется как более или ровно 3 независимых эпизодов UTI в предыдущие 12 месяцев или более или ровно 2 эпизода UTI за последние 6 месяцев; по меньшей мере один UTI в течение последних 5 лет был вызван Е. coli (в качестве единственного патогена или части мультимикробной инфекции) и был подтвержден в культуре и задокументирован; (2) Возраст > 18 и < 70 лет; (3) здоровые субъекты без продолжающегося или подозреваемой симптоматической UTI момент скриннингового визита и в сутки инъекции (визит 2); (4) общее хорошее состояния здоровья, без клинически значимой истории болезни, результаты физического осмотра или клинико-лабораторные нарушения по клинической оценке исследователя; и (5) готовность участвовать в исследовании после того, как все аспекты протокола были объяснены и полностью поняты и получена письменная форма информированного согласия.
Критерии исключения
Критериями исключения из исследования являются следующие: (1) история более чем 10 рецидивирующих случаев UTI в год до скринингового визита; (2) применение любого кратковременного мочевого катетера в пределах 7 суток до скрининга; (3) применение любого постоянного катетера в пределах 30 суток перед скринингом; (4) история любых заболеваний/нарушений мочевыводящих путей, вызывающих диагностические
трудности; (5)симптом нарушения иммунной функции; (6) значимые заболевания и/или недостаточность сердечно-сосудистой системы, печени и почек; (7) неконтролируемый сахарный диабет; (8) значительные отклонения в результатах скрининга в отношении гематологии, биохимического анализа сыворотки и анализа мочи; (9) положительный тест на ВИЧ-инфекцию и/или симптом гепатита В или гепатита С; (10) BMI (индекс массы тела) более 34; (11) предшествующая иммуностимулирующая терапии для профилактики UTI (такая как Urovaxom(r), Strovac(r) или Urovac(r)) в течение последних 3 месяцев или планируемое применение в течение периода исследования; (12) текущее применение любого лекарственного средства, известного как влияющего на иммунную функцию (например кортикостероиды > 0,5 мг/кг масса тела/сутки); (13) применение UTI-ассоциированного вагинального эстрогенового лечения, вновь начавшегося менее чем за 6 месяцев до инъекции и продолжающегося во время исследования или планируемого начала в течение активного периода исследования; (14) применение любой антибиотической терапии в пределах 1 недели до инъекции; (15) планируемое применение посткоитальных антибиотиков для профилактики UTI в течение периода исследования; (16) любая вакцинация, планируемая в пределах 30 суток до и 30 суток после инъекции; (17) участие в других клинических исследованиях в течение 60 суток до включения в исследование и на протяжении всего исследования; (18) предшествующая обработка иммуноглобулинами или продуктами крови в течение 3 месяцев до инъекции; (19) известная гиперчувствительность к любому компоненту вакцины; (20) наличие определенного медицинского или психиатрического состояния, которое, по мнению исследователя, исключает участие в исследовании; (21) острое заболевание во время инъекции; (22) женщины детородного возраста, которые либо имеют положительный тест на беременность или отказываются от использования эффективной контрацепции; (23) кормящие женщины в любое время исследования; (24) субъекты с плановым хирургическим вмешательством во время исследования; и (25) любой другой значимый вывод, который, по мнению исследователя, увеличит риск возникновения неблагоприятного исхода при участии в исследовании. Статистические методы и анализ
Описательные статистические данные (п, среднее, стандартное отклонение, медиана и диапазоны для непрерывных переменных, частоты и проценты для категориальных переменных) предоставляются по группе лечению и/или визиту, как применимо. Все данные приведены по субъекту, группе лечения и, где применимо, визиту. Все субъекты из группы В, получающие плацебо, объединяют с образованием группы лечения плацебо.
Пример 13: Результаты фазы I клинического исследования
В этом примере представлены некоторые результаты промежуточного анализа фазы I клинического исследования, описанного в Примере 12.
12.1: Безопасность
Возникновение побочных явлений и тяжелых побочных явлений было сопоставимо в группе плацебо и вакцинированной группе. Было зарегистрировано десять тяжелых побочных явлений и ни одно не было связано с исследуемым лекарственным средством.
12.2: Иммуногенность
Для оценки иммуногенности компонентов вакцины, получали сыворотку от женщин, участвующих в клиническом исследовании, и анализировали ее посредством ELISA для количественного определения IgG против четырех разных О-антигенов, включенных в тетравалентную вакцину (Е. coli 01, Е. coli 02, Е. coli 06 и Е. coli 025В).
Сыворотку от вакцинированных женщин инкубировали в планшетах, покрытых 01А, 02, 06Glc и 025B-LPS, а также ЕРА. Затем планшеты инкубировали со вторичными антителами, мечеными HRP (пероксидаза хрена) (против человеческого IgG). Связанные антитела обнаруживали с помощью ТМ В-субстрата и измеряли оптическую плотность. Значения ЕС50 вычисляли посредством аппрокисмации к 4-параметрической логистической модели.
Как показано на Фиг. 30, повышенный иммунный ответ к 01А-ЕРА, 02-ЕРА, 06GIC-EPA и 025В-ЕРА наблюдался у большинства вакцинированных женщин.
Эти данные демонстрируют иммуногенность каждого компонента тетравалентной вакцины.
12.3: Функциональный антительный ответ Анализы ОРК, в которых измеряют in vitro комплемент- и антитело-зависимый фагоцитоз и гибель бактерий Е. coli, использовали для оценки функционального антительного ответа у женщин, участвующих в клиническом исследовании.
У участников исследования собирали сыворотку. Е. coli предварительно опсонизировали разведениями сыворотки от вакцинированных женщин, инкубированной с комплементом и фагоцитами (дифференцированные клетки HL60) и определяли оставшиеся колониеобразующие единицы (КОЕ). Затем рассчитывали максимальный процент гибели и индексы опсонизации (OI: разведение сыворотки, вызывающее гибель 50% Е. coli). Е. coli, выбранные для ОРК-тестирования, представляли собой ОС 24452 (серотип 01 А), ОС 24453 (серотип 02), ОС 24454 (серотип 06Glc) и ОС 24176 (серотип 025В).
Как показано на Фиг. 31, наблюдался устойчивый функциональный иммунный ответ на 01А-ЕРА (Фиг. 31 А), 02-ЕРА (Фиг. 31В), 06GIC-EPA (Фиг. 31 С) и 025В-ЕРА (Фиг. 31D).
Эти данные показывают, что каждый компонент тетравалентной вакцины индуцирует серотип-специфический антительный ответ и, что такие антительные ответы являются функциональными в гибели Е. coli этих серотипов. Таким образом, вакцинные композиции, описанные в данном документе, являются функциональными у людей.
12.4: Иммунизация тетравалентным О-антигенным конъюгатом, содержащим 025В-ЕРА, вызывает образование 025А/025В-перекрестных IgG-антител у людей
Для определения уровня перекрёстной реактивности индуцированных вакциной сывороточных lgG-антител к двум известным подсеротипам Е. coli 025, 025А и 025В, серийные разведения сыворотки, полученной от вакцинированных субъектов, инкубировали с очищенными LPS 025А, LPS 025В или интактными бактериальными клетками и тестировали с помощью ELISA.
Как показано на Фиг. 32, при анализе реакционной способности в отношении LPS 025А (черные полоски) и LPS 025В (серые полоски) через
тридцать суток после вакцинации наблюдались аналогичные значения ЕС50. В целом эти данные свидетельствуют о том, что биоконъюгат 025В работает хорошо и в отношении 025В, и в отношении 025А, но в большинстве случаев/протестированных субъектов 025В работает немного лучше с точки зрения антительного ответа на 025В по сравнению с 025А. Этот результат свидетельствует о том, что при возникновении какой-то естественной изменчивости тетравалентная вакцина индуцирует антитела, которые узнают LPS и 025А, и 025В. Чтобы проверить, распространяется ли это на целые бактериальные клетки и многочисленные штаммы 025А/025В, проверяли реакционную способность к набору клинических изолятов 025А или 025В, полученных из крови или мочи. В этом случае штамм серотипа 075, не представленного в тетравалентной вакцине, использовали в качестве отрицательного контроля (пунктирная серая линия на Фиг. 33). Как показано на Фиг. 33, индуцированные вакциной сывороточные lgG-антитела продемонстрировали сильный ответ на каждый из отдельных штаммов 025. Несмотря на очевидные изменения между штаммами, наблюдалась реактивность в отношении штаммов 025А (черные линии) и 025В (серые линии). Эти данные демонстрируют, что компонент 025В тетравалентной вакцины вызывает образование антител, которые узнают очищенные LPS и 025А и 025В, а также штаммы 025А и 025В Е. coli.
В таблицах 13 и 14 ниже представлены подробности для некоторых штаммов и плазмид, соответственно, используемых в вышеуказанных примерах.
Наименование
Описание
Примечания
pGVXN150
экспрессионная плазмида на основе pBR322 для генетически детоксифицированного EPA-his6, кодирующая 2 сайта гликозилирования
См. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61
pGVXN659
экспрессионная плазмида на основе pBR322 для генетически детоксифицированного ЕРА,
pGVXN150 была модифицирована так, чтобы кодировать
Наименование
Описание
Примечания
кодирующая 4 сайта гликозилирования
дополнительные N- и С-концевые сайты гликозилирования
pGVXN1076
pGVXN659 AampR/.kanR
pGVXN579
вектор на основе pMAL-p2X для экспрессии МВР с С-концевым гибким линкером, за которым следуют последовательности трех сайтов гликозилирования и туе эпитоп
Позволяет быструю очистку
биоконъюгатов без метки his
pGVXN114
экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PgIB с НА-меткой
См. Ihssen, et al., (2010) Microbial cell factories 9, 61
pGVXN939
экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PgIB с НА-меткой, кодон-оптимизированная
pGVXN970
экспрессионная плазмида на основе рЕХТ21 для PgIB без метки, кодон-оптимизированная
pGVXN539
экспрессионная плазмида на основе рАСТЗ для генетически детоксифицированной, кодон-оптимизированной, меченной гистидином ЕРА, кодирующая 2 сайта гликозилирования, как PGVXN150
Замена устойчивости к хлорамфениколу устойчивостью к канамицину из PGVXN161 (олиго: #1399/#1400)
pGVXN161
pKD4
См. Datsenko and Wanner, (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
rmlB (ирес138)
GTGAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTG
GTTCTGCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAA
GATAGTGTTGTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCG
GAAACCTGGAATCACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGA
ACGCTATTTCTTTGAACATGCGGATATTTGTGATGCA
GCTGCAATGGCACGGATTTTTGCTCAGCATCAGCCG
GATGCAGTGATGCACCTGGCAGCTGAAAGCCATGTT
GACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGAAA
CCAATATTGTGGGTACTTATGTCCTTTTAGAAGCGGC
TCGGAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAAA
AAAAACTTCCGTTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGT
GTATGGTGACTTACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGC
AATGAAACGTTGCCGCTATTTACGGAAACGACAGCAT
ACGCGCCAAGTAGTCCATATTCTGCTTCTAAAGCTTCC
AGCGATCATTTGGTTCGCGCATGGAAACGTACTTATG
GTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCGAACAACTAT
GGTCCTTATCATTTCCCGGAAAAGCTTATTCCACTGG
TTATTCTTAATTCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATT
TATGGCAAAGGAGATCAGATCCGCGACTGGTTGTAT
GTAGAGGATCATGCTCGAGCGTTATATACCGTCGTA
ACCGAAGGTAAAGCGGGCGAAACTTATAACATTGGT
GGACACAACGAAAAGAAAAACATCGACGTAGTGTTC
ACTATTTGTGATTTGTTGGATGAGATAGTCCCGAAAG
AGAAATCTTACCGCGAGCAAATTACTTATGTTACCGA
TCGTCCGGGACACGATCGCCGTTATGCGATTGATGCT
GAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCACAG
GAAACGTTTGAGAGTGGGATTCGTAAAACGGTGGA
ATGGTACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATG
TGAAAAGTGGTGCCTATCAATCGTGGATTGAACAG
AACTATGAGGGCCGCCAGTAA
rmID (ирес138)
ATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTA
GGTTGGGAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGT
AATTTGATTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTG
TGGTGATTTTAGTAATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACC
GTAAGAAGCATTCGGCCTGATATTATTGTCAACGCA
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
GCCGCTCACACCGCAGTAGACAAAGCAGAATCAGA
ACCGAAGTTTGCACAATTACTGAACGCGACGAGTGT
CGAAGCGATCGCGAAAGCAGCCAATGAAGTCGGCG
CCTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCC
GGGGACCGGTGAAATACCATGGCAGGAGGAGGATG
CAACCGCACCGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGT
TAGCGGGAGAAAAAGCATTACAAGAGCATTGTGCG
AAGCACCTTATTTTCCGGACCAGCTGGGTCTATGCA
GGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAAACAATGTTGCG
TCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTATTAA
TGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCAGAGTTACT
GGCTGATTGTACGGCACATGCTATTCGTGTGGCACT
GAATAAACCGGAAGTCGCAGGCTTGTACCATCTGGT
AGCTAGTGGTACCACAACGTGGCACGATTATGCTG
CGCTGGTTTTTGAAGAGGCGCGCAAAGCAGGCATT
CCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACGCAGTACCAAC
AACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCACATA
ACTCTCGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAA
CTTTGCGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCG
TGAAACGAATGCTTAACGAATTATTTACGACTACA
GCAATTTAA
rmlA
(upecl38)
ATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTGGCGGGTGG
TTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTGACGATGGCCGTC
AGTAAACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGAT
GATCTATTACCCGCTCTCTACACTGATGTTAGCGGG
TATTCGCGATATTCTGATTATCAGTACACCACAGGA
TACTCCTCGTTTTCAACAACTGCTGGGTGACGGGAG
CCAGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAGTGCAAC
CGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCGTTTATTATCG
GTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGG
TACTTGGTGATAATATCTTCTACGGCCACGACCTGC
CGAAGTTAATGGACGTAGCTGTTAACAAAGAAAGT
GGTGCAACGGTATTTGCCTATCACGTTAATGATCCT
GAACGTTATGGTGTCGTGGAGTTTGATAATAACGG
TACTGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCTGGAAC
CAAAAAGTAACTATGCGGTTACTGGGCTTTATTTCTA
TGACAATGACGTTGTGGAAATGGCGAAAAACCTTA
AGCCTTCTGCCCGAGGTGAACTGGAAATTACCGATA
TTAACCGTATTTATATGGAACAAGGACGTTTGTCTG
TCGCTATGATGGGGCGTGGCTATGCATGGCTGGATA
CAGGGACGCATCAAAGTCTTATTGAAGCAAGCAAC
TTCATTGCCACCATTGAAGAGCGCCAGGGACTAAAG
GTTTCCTGTCCGGAAGAAATTGCTTATCGTAAAGGG
TTTATTGATGCTGAGCAGGTAAAAGTATTAGCCGAA
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
CCGTTGAAGAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTC AAAATGATTAAAGGTTATTAA
rmIC (upecl38)
ATGAACGTAATTAAAACTGAAATTCCTGATGTGCTG
ATTTTTGAACCAAAAGTTTTTGGGGATGAACGTGGCT
TCTTTTTTGAGAGTTTTAATCAGAGGATTTTTGAAGA
AGCAGTAGGTCGTAAGGTTGAGTTTGTTCAGGATAA
CCATTCTAAGTCCAGTAAAGGTGTTTTACGTGGTCTT
CATTATCAGTTAGAACCTTATGCTCAAGGAAAACTGG
TGCGCTGTGTTGTTGGCGAGGTTTTTGATGTTGCGGTT
GATATTCGTAAATCGTCACCTACATTTGGGAAATGG
GTTGGGGTGAATTTGTCTGCTGAGAATAAGCGTCAG
TTGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTTTTTTGG
TGCTGAGTGATTTAGCAGAAGTTTTATATAAAACGA
ATCAATATTATGCTCCATCACATGAAAAAAATATTAT
ATGGAATGACCTCTTGCTTAATATTAAATGGCCGAGC
ACAGCACTGATCACTCTGTCTGATAAGGATGCAAA
TGGGGAAAGATTTGAACTAAGTGAGTTTTGA
wzx
(upecl38)
ATGTCTCTCTTAAAACATAGTATATGGAATGTTGCGG
GCTACTTTATACCAACATTAATTGCAATTCCCGCCTTT
GGATTAATTGCGAGGAAAATTGGTGTAGAACTATTTG
GTTTGTATACGTTAGCAATGATTTTTATAGGGTATGCA
AGTATATTTGATGCTGGGTTAACAAGAGCTGTTGTGCG
TGAAATAGCATTACTAAAAAACAGAGTGGACGATTGT
AATACGATAATAGTAACTTCTATTATCGCTGTGATATT
TTTAGGGTTTATCGGAGGCGGGGGAGTGTTTCTGCTTA
AAGGCGATATTATTGAACTGTTAAATATCTCACCAATA
TATTACGCCGATTCGATAAAGTCTCTAGTATTATTATCA
TCTCTGATACCTGTATTCTTAGTCACGCAAATACTATTA
GCAGAGCTTGAGGGTCGGGAATATTTTGGGATTCTAAA
TATACAAAAAAGTGTAGGGAATTCTTTAATTGCAGGGT
TACCTGCATTATTTGTTTTAATTAATCAAACGCTTTTTTC
TGCAATTATTGGTGTAGCGATTGCAAGAGTTATATGCTT
GTGGTTAAGCTACATTATGAGCAGGGAAAGAATAACTA
TCGATATCTCATTTTTTTCAATAACTGTTTTAAAGCGGTT
ATTTAGATATGGCGGGTGGGTAACTATAAGTAACATAA
TATCTCCTATATTAGCGAGTATGGATAGATTTATTCTATC
CCATATCCAGGGAGCATCAAAAATATCATTCTATACAGT
CCCTAATGAGCTGGTAACTAGGCTTGGAATAGTTCCAGG
CTCTCTTGGGAAAGCTGTTTTTCCAAAATTAAGT
CATGCAAGGAATTTTACAGCGTCATATGCAGAGCAAAA
AAAAGCTTATATATTAATGACTGTCATTGTAATGCCTTT
GGTTTTATTTGTATATTATTACGCAAAGTTTATTTTAACA
TTGTGGATGGGGGCTGAGTATGCAGGGATTTCGGTCGA
AATATTACGGATTATGCTTATAGGGTATATTTTTAACTGT
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
TATTCACAAATCTCTTTTGCCAACATACAGGCCTTTGGA
AAAGCAAAATACACTGCATACATCCATATGATGGAATT
TATTCCTTATTTGATAATGTTATATATAATTTCAAAGGAA
TATGGGGTTATTGGTGTTGCGTGGTTATGGACAATTCGA
GTAATAATTGATTTTTTGATGCTTTTATATATGAGTTATC
GTTGTAATAATCTTATGAAAAAAGGGTAG
wekA (upecl38)
ATGATATATATTGTGGTATTAAATTGGAATGGGGCTA
TAGATACCATTAATTGTGTTAAAAGTTTAATGGATTT
AAATGTTAGCGATTATAAAATTATCATTGTTGATAAC
TGTTCTATGGATAACTCATATGATACTATAAAAGAAA
ATCTTAATTCATTATATATTGCTGATAAAAGTATCATT
GAGGTGAAGTATGAGGATAGAAATAAATATAAAACC
TTAGAAAACGATAAAATCATATTAATACAATCTCCGC
AAAATAATGGGTACGCAAGTGGTAATAATATTGGCAT
AGAGTTCGCTCTTAATCAGGAGAATATGAAATACGTC
TGGGTTCTGAATAATGATACTGAAGTGGATAAAGAGG
CTTTAACTCATTTAATTAGTAAATGTGATTCAGATAAA
AGTATAGGGATTTGCGGTTCTCGTTTAGTCTATTTTGCC
GACAGAGAGATGCAGCAAGGACTAGGTGGGGTGCATA
ACAAATGGTTATGCACTACAAAAAATTATGAAATGGG
AAGATTAGTTTCCAAAAAATATGATGATGAAGTCATTA
GTAATGATATAGATTATATAATTGGCGCATCGATGTTTT
TCTCTAGAGAATGTTTGGAAACAGTTGGATTGATGAAT
GAAGAATATTTTTTATACTATGAAGAGTTAGATATTTGC
CTCAGAGCAAAAGCAAAGAACTTTAAATTAGGTATTTG
CTCAGAAAGTTTGGTTTATCATAAAATAGGTGCAAGTA
CTGATGGGGGAAAGAGCATGATGGCTGATCTTTGCTCA
ATAAAAAATAGGCTGGTCATTACAGAAAGGTTTTATCC
CCAATATTATTGGACGGTATGGTTGTCACTTTTTGTTGTA
GCATTTAACCGTGCTAGAAGAGGTGAGTTTAATAAGAT
GAAAAGATGTTTGAATGTTATGTTTAACTTCAAACGAAA
CAAAGGTAGCAAATGCCATTAG
wekB (upecl38)
ATGAAAGTGGCTTTTTTATCTGCTTATGATCCACTATCTA
CATCCAGTTGGTCTGGCACACCTTATTATATGCTAAAGG
CATTATCGAAGAGAAATATTTCCATTGAAATATTAGGAC
CGGTAAATAGCTATATGATATACATGTTAAAAGTATATA
AATTAATATTAAGGTGTTTCGGAAAAGAATATGATTATA
GTCATTCGAAGTTGCTTTCCAGGTATTACGGTAGAATATT
CGGTAGGAAATTAAAAAAAATTGATGGTTTGGATTTTATT
ATCGCACCTGCAGGTTCCTCACAAATTGCTTTTTTAAAAA
CAACCATACCAATAATATATCTATCGGATACAACATATGA
TCAATTAAAAAGCTATTATCCGAATTTAAATAAAAAAAC
AATTATAAATGATGAGGATGCAAGTTTAATCGAACGCAA
GGCTATTGAAAAAGCAACAGTAGTATCTTTCCCATCTAAA
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
TGGGCAATGGATTTTTGCAGGAATTATTACAGATTAGATT
TTGATAAATTAGTTGAAATACCATGGGGGGCTAATTT
ATTTGATGATATTCACTTTGCTAATAAAAATATAATTC
AAAAGAATAGTTATACTTGTCTTTTCTTGGGAGTTGAT
TGGGAAAGAAAAGGTGGGAAAACAGCCTTGAAAGCA
ATTGAATATGTAAGGCAGTTATATGGGATCGATGTTAG
ACTAAAAATTTGTGGATGTACTCCGAATCAAAAGATTT
TACCTACTTGGGTTGAATTAATTGATAAAGTAGATAAA
AATAACGTTGACGAATATCAGAAATTCATCGATGTGTT
ATCTAACGCTGATATACTTCTTTTACCAACCATTGCTGA
ATGTTATGGAATGGTATTTTGTGAAGCTGCTGCTTTTGG
ATTGCCTGTTGTCGCTACAGATACAGGTGGAGTCAGTT
CTATAGTTATCAACGAAAGGACGGGGATATTAATTAAA
GACCCGTTAGACTATAAGCACTTTGGAAATGCAATTCA
TAAAATAATTAGTTCCGTAGAGACTTATCAAAACTACTC
CCAAAACGCAAGAATTAGATATAATAATATATTGCATTG
GGACAATTGGGCTAAAAAGATAATTGAGATTATGTATG
AGCATAAGAATAGAAGAATCAAATAG
wzy
(upecl38)
ATGAGCATAAGAATAGAAGAATCAAATAGCACAAAAAG
AATTATATGTTTATTTATACTTTTTCTTGTTTTCCCTGATTT
TTTGTTTTATACATTAGGGGTTGATAATTTTAGCATTTCAA
CGATAATCTCAATTACATTGCTTTTTGTTTTTTTAAGAGCT
AAAAATATTTGCAAAGATAATTTTCTAATAATAGTAGCG
TTATTCATATTGTTGTGTTTTAACTGTTTGTTAAGTATGCTA
TTTAATATTGAACAGGCTTTAACATTTAAAGTTGTACTTTC
AATATATAGCATCTTAATAATGGCATACGTCTCCTCTTGTT
ATGCACAGACGTTGTGGTTATGTTCTGAAGAAATACTTAA
GAGATCCGTCTTTTATTTGTTCGCATTTCTTTGCCTTATTGG
CATTATAAGTATTCTTTTACAGAAGACTGAGATTATACATG
ATAAAAGTATGATTCTTTTTCCTGAACCATCAGCATTTGCA
TTGGTTTTTATACCTATCTTTTCATTTTGTTTATACTATACAA
GAGGGGGGGGGC T AC T ATTGCTC TAT AT ATT АТС TTTGGGT
ATTGCGTTAGGTATCCAGAATTTAACAATGTTGGTAGGCAT
TGTGATTAGTGTTTTTGTGATGAAAAAAATAACTATAAGGC
AAACTATTGTTATACTTTTGGGGGCATGGATTTTTTCCATGA
TATTAAGTGATTTAGACATTTCTTACTATACATCGCGGCTTG
ATTTTAAAAATACTACGAACCTATCAGTGCTTGTATATCTTT
CAGGAATTGAAAGAGCTTTCTTGAATTTTATTACAAGTTATG
GTCTTGGTATTGGTTTTCAACAAATGGGAGTGAATGGGGAG
ATAGGAATATATCAACAAATTTTAGCTGAACTTGATGCCCC
TATGTTAAATATATACGATGGCTCATTTATTTCTTCTAAGTTA^
TATCTGAGTTTGGGGTTATTGGTGCATTAATGTGTATT
TTCTATTTTTTTTATTTTTCCCGATTTTATCTGCGTTTCAA
AAAAAGTAAGAGATATTCACCGCAGTATATTTTAGCAT
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
ATAGCTTCTACATGTGTTTCTTCATCCCTCTTTTTATACG TGGTGCTGGTTATATAAACCCCTATGTGTTTATGTTATTT TCATCAATATTTTTGTGCAAATATCACGCTAAAAATATCT TGATGAAATCTAATGTCCAGATAGCTATATAA
wbbJ (upecl38)
ATGTGCATTAAAAAAAAACTTAAGTTAATTAAACGATA
TGGCCTTTATGGTGGTCTTAGGCTTCTTAAAGATATATTC
TTAACAAAATTTTTATTTTGTTCAAATGTTAGGATTATTA
GATTTCCATGTTATATTAGAAAAGATGGAAGTGTTAGTTT
TGGAAAAGGTTTTACATCAGGTGTAGGATTACGAGTTGA
TGCATTTATGGATGCCGTAGTTTCCATTGGAGAAAATGTT
CAAATTAATGACTATGTTCACATCGCGGCTATTAATAATG
TCATTATTGGTAGAGATACATTAATAGCAAGTAAAGTATT
TATTAGTGATCATAATCATGGTATTTTTTCTAAATCCGATA
TCCATAGTTCACCAACTATTATTCCTTCGTCTAGGCCCCTT
GAATCTGCACCTGTGTATATTGGAGAGCGTGTGTGGATTG
GCGAAAATGTGACAATATTACCAGGTGCGTGTATAGGTAA
TGGTGTAGTTATTGGCGCAAACAGTGTTGTTCGTGGTGAG
ATTCCTAATAATGTGATCATTGCTGGTGTTCCAGCTAAAA
TTGTTAAAAAATATAACTATGAGCGTATGCAATGGGAAA
GAATATAG
wbbK (upecl38)
ATGGGAAAGAATATAGTTGTAATATCGGCTGTTAATTTT
ACAACCGGAGGCCCCTTTACCGTACTAAAAAATGTGCT
TACAGCAACTAAAGATAGAGCCGAATGTAAATTTATTG
CACTGGTTCATAGCTCTGCTGAACTAATGGAATTATTTC
CGTGGGTTGAATTTATAGAGTATCCAGAAGTCAAGTCTT
CGTGGGTTAAAAGATTATATTTCGAATATATAACTTGCAA
TAGATTATCTAAGGTGATTAAGGCAACTCATTGGGTATG
CTTACATGATATTACAGCAAATGTTAGTGTACCCTATAG
ATTTGTTTATTGCCACAATCCTGCACCGTTCTATAAATAT
TTAAGCTATCGAGATATTATAGGAGAACCTAAATTTTAT
CTTTTTTATCTTTTTTATGGGCTTTTATACAATATCAATAT
AAAAAAGAACACAGCAGTTTTTGTTCAGCAGCAGTGGCT
AAAAAAAGAATTCGAAAAAAAATATAAGTTAAAGAATG
TTGTTGTTAGTCGCCCTGAAGATATTTGCCCTTTTGAAAG
TGATGGTTTGGTAAGAAATAATAATAAAAAGGATGTGAG
GATATTTTACCCAGCAGTGCCCCGTATATTTAAAAACTTT
GAAGTTATCATACGTGCTGCACAAATATTACAAGATAAA
AATATTCATTTTTATCTTACTTTTGATGGTACTGAAAA
TAAGTATGCAAAAAGAATATATAAATTAGCTTCCGA
ACTGAAAAATGTACATTTCCTCGGTTACCTTAATGCA
ACCGAGATGGTTAACTTTTATCAAGATTCAGATATTA
TTTGTTTCCCATCGAAACTAGAAACGTGGGGATTACC
ATTATCAGAAGCTAAAACATACAAAAAATGGATATTT
GCGGCAGACTTACCTTATGCTCATGAAGTTTTATATAA
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
CTATTCAAAAACTAGATATTTTCCATTTGACGATGAG
AAAATACTTGTTCGCTACATATTAGAGTACACAAGTA
AAAATATGCATGAAGATATAAAAAATAGTAGGGTGA
ATTTTAATAATGATGCATTGACTGGTTTTGAACAGTTTA
TTGAATATATCCTCAAGGGGAACTGA
wbbL (upecl38)
ATGATTATGAATAATGATTATTTTCTCTTTCTTAACCCC
GATGTATTCATAACCAGTGAAAGTTTGATTAATTATGT
TGATTATATAATTAGTAATGATTATAAGTTTAGCACAT
TATGTCTTTATCGAGATTTTACTAAAAGCAAACATGAT
TATTCAATACGGAGTTTTCCAACTTTATATGATTTTCTTT
GTTCTTTTTTATTGGGGGTGAATAAAAGTAAAATTAAG
AAGGAAAATATACTTTCTGATACTGTAGTTGATTGGTG
TGCTGGCTCATTTATGCTTATTCATGCTTTAAGTTTCTTA
AATGTGAATGGTTTTGATCAAAAATATTTTATGTATTGT
GAAGATATTGACCTTTGTATGCGTTTAAAATTAAGTGG
AGTAGATCTTTACTATACTCCCCATTTTGATGCTATTCA
TTATGCGCAGCATGAAAATAGAAGAATATTTACTAAAG
CATTTCGATGGCATATAAGGAGTATTACGCGCTACATA
TTACGGAAACCAATTCTTTCTTATAAAAACTATAGAAA
AATTACATCCGAACTGGTAAAGTGA
кластер генов rfb Е. coli (upecl38)
GTGAAGATACTTGTTACTGGTGGCGCAGGATTTATTGGTTCT
GCTGTTGTTCGTCACATAATAAATAATACGCAAGATAGTGTT
GTTAATGTCGATAAATTAACATACGCCGGAAACCTGGAATC
ACTTGCAGATGTTTCTGATTCTGAACGCTATTTCTTTGAACAT
GCGGATATTTGTGATGCAGCTGCAATGGCACGGATTTTTGCT
CAGCATCAGCCGGATGCAGTGATGCACCTGGCAGCTGAAAG
CCATGTTGACCGTTCAATTACAGGCCCTGCGGCATTTATTGA
AACCAATATTGTGGGTACTTATGTCCTTTTAGAAGCGGCTCG
GAATTATTGGTCTGGTCTGGATGATGAAAAGAAAAAAAACT
TCCGTTTTCATCATATTTCTACTGATGAGGTGTATGGTGACTT
ACCCCATCCGGATGAAGTAAATAGCAATGAAACGTTGCCGC
TATTTACGGAAACGACAGCATACGCGCCAAGTAGTCCATAT
TCTGCTTCTAAAGCTTCCAGCGATCATTTGGTTCGCGCATGG
AAACGTACTTATGGTTTACCGACCATTGTGACTAATTGCTCG
AACAACTATGGTCCTTATCATTTCCCGGAAAAGCTTATTCCA
CTGGTTATTCTTAATTCACTGGAAGGTAAGGCATTACCTATT
TATGGCAAAGGAGATCAGATCCGCGACTGGTTGTATGTAGA
GGATCATGCTCGAGCGTTATATACCGTCGTAACCGAAGGTA
AAGCGGGCGAAACTTATAACATTGGTGGACACAACGAAAAG
AAAAACATCGACGTAGTGTTCACTATTTGTGATTTGTTGGAT
GAGATAGTCCCGAAAGAGAAATCTTACCGCGAGCAAATTAC
TTATGTTACCGATCGTCCGGGACACGATCGCCGTTATGCGAT
TGATGCTGAGAAGATTGGTCGCGAATTGGGATGGAAACCAC
AGGAAACGTTTGAGAGTGGGATTCGTAAAACGGTGGAATGG
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
TACCTGTCCAATACAAAATGGGTTGATAATGTGAAAAGTGG
TGCCTATCAATCGTGGATTGAACAGAACTATGAGGGCCGCC
AGTAATGAATATCCTCCTTTTTGGCAAAACAGGGCAGGTAG
GTTGGGAACTACAGCGTGCTCTGGCACCTCTGGGTAATTTGA
TTGCTCTTGATGTTCACTCCACTGATTACTGTGGTGATTTTAG
TAATCCTGAAGGTGTAGCTGAAACCGTAAGAAGCATTCGGC
CTGATATTATTGTCAACGCAGCCGCTCACACCGCAGTAGACA
AAGCAGAATCAGAACCGAAGTTTGCACAATTACTGAACGCG
ACGAGTGTCGAAGCGATCGCGAAAGCAGCCAATGAAGTCGG
CGCCTGGGTTATTCACTACTCTACTGACTACGTATTTCCGGG
GACCGGTGAAATACCATGGCAGGAGGAGGATGCAACCGCAC
CGCTAAATGTTTACGGTGAAACCAAGTTAGCGGGAGAAAAA
GCATTACAAGAGCATTGTGCGAAGCACCTTATTTTCCGGACC
AGCTGGGTCTATGCAGGTAAAGGAAATAACTTCGCCAAAAC
AATGTTGCGTCTGGCAAAAGAGCGTGAAGAATTAGCCGTTA
TTAATGATCAGTTTGGTGCGCCAACTGGCGCAGAGTTACTGG
CTGATTGTACGGCACATGCTATTCGTGTGGCACTGAATAAAC
CGGAAGTCGCAGGCTTGTACCATCTGGTAGCTAGTGGTACC
ACAACGTGGCACGATTATGCTGCGCTGGTTTTTGAAGAGGC
GCGCAAAGCAGGCATTCCCCTTGCACTCAACAAGCTCAACG
CAGTACCAACAACAGCCTATCCTACACCAGCTCGTCGTCCAC
ATAACTCTCGCCTTAATACAGAAAAATTTCAGCAGAACTTTG
CGCTTGTCTTGCCTGACTGGCAGGTTGGCGTGAAACGAATGC
TTAACGAATTATTTACGACTACAGCAATTTAATAGTTTTTGC
ATCTTGTTCGTAATGGTGGAGCAAGATGTATTAAAAGGAAT
GATGAAATGAAAACGCGTAAAGGTATTATTTTGGCGGGTGG
TTCTGGTACTCGTCTTTATCCTGTGACGATGGCCGTCAGTAA
ACAGCTGTTACCGATTTATGATAAACCGATGATCTATTACCC
GCTCTCTACACTGATGTTAGCGGGTATTCGCGATATTCTGAT
TATCAGTACACCACAGGATACTCCTCGTTTTCAACAACTGCT
GGGTGACGGGAGCCAGTGGGGCCTGAATCTTCAGTACAAAG
TGCAACCGAGTCCGGATGGTCTTGCGCAGGCGTTTATTATCG
GTGAAGAGTTTATTGGTGGTGATGATTGTGCTTTGGTACTTG
GTGATAATATCTTCTACGGCCACGACCTGCCGAAGTTAATGG
ACGTAGCTGTTAACAAAGAAAGTGGTGCAACGGTATTTGCC
TATCACGTTAATGATCCTGAACGTTATGGTGTCGTGGAGTTT
GATAATAACGGTACTGCAATTAGCCTGGAAGAAAAACCGCT
GGAACCAAAAAGTAACTATGCGGTTACTGGGCTTTATTTCTA
TGACAATGACGTTGTGGAAATGGCGAAAAACCTTAAGCCTT
CTGCCCGAGGTGAACTGGAAATTACCGATATTAACCGTATTT
ATATGGAACAAGGACGTTTGTCTGTCGCTATGATGGGGCGT
GGCTATGCATGGCTGGATACAGGGACGCATCAAAGTCTTAT
TGAAGCAAGCAACTTCATTGCCACCATTGAAGAGCGCCAGG
GACTAAAGGTTTCCTGTCCGGAAGAAATTGCTTATCGTAAAG
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
GGTTTATTGATGCTGAGCAGGTAAAAGTATTAGCCGAACCG
TTGAAGAAAAATGCTTATGGTCAGTATCTGCTCAAAATGATT
AAAGGTTATTAATAAGATGAACGTAATTAAAACTGAAATTC
CTGATGTGCTGATTTTTGAACCAAAAGTTTTTGGGGATGAAC
GTGGCTTCTTTTTTGAGAGTTTTAATCAGAGGATTTTTGAAG
AAGCAGTAGGTCGTAAGGTTGAGTTTGTTCAGGATAACCATT
CTAAGTCCAGTAAAGGTGTTTTACGTGGTCTTCATTATCAGT
TAGAACCTTATGCTCAAGGAAAACTGGTGCGCTGTGTTGTTG
GCGAGGTTTTTGATGTTGCGGTTGATATTCGTAAATCGTCAC
CTACATTTGGGAAATGGGTTGGGGTGAATTTGTCTGCTGAGA
ATAAGCGTCAGTTGTGGATTCCTGAGGGATTTGCACATGGTT
TTTTGGTGCTGAGTGATTTAGCAGAAGTTTTATATAAAACGA
ATCAATATTATGCTCCATCACATGAAAAAAATATTATATGGA
ATGACCTCTTGCTTAATATTAAATGGCCGAGCACAGCACTGA
TCACTCTGTCTGATAAGGATGCAAATGGGGAAAGATTTGAA
CTAAGTGAGTTTTGAAATGTCTCTCTTAAAACATAGTATATG
GAATGTTGCGGGCTACTTTATACCAACATTAATTGCAATTCC
CGCCTTTGGATTAATTGCGAGGAAAATTGGTGTAGAACTATT
TGGTTTGTATACGTTAGCAATGATTTTTATAGGGTATGCAAG
TATATTTGATGCTGGGTTAACAAGAGCTGTTGTGCGTGAAAT
AGCATTACTAAAAAACAGAGTGGACGATTGTAATACGATAA
TAGTAACTTCTATTATCGCTGTGATATTTTTAGGGTTTATCGG
AGGCGGGGGAGTGTTTCTGCTTAAAGGCGATATTATTGAACT
GTTAAATATCTCACCAATATATTACGCCGATTCGATAAAGTC
TCTAGTATTATTATCATCTCTGATACCTGTATTCTTAGTCACG
CAAATACTATTAGCAGAGCTTGAGGGTCGGGAATATTTTGG
GATTCTAAATATACAAAAAAGTGTAGGGAATTCTTTAATTGC
AGGGTTACCTGCATTATTTGTTTTAATTAATCAAACGCTTTTT
TCTGCAATTATTGGTGTAGCGATTGCAAGAGTTATATGCTTG
TGGTTAAGCTACATTATGAGCAGGGAAAGAATAACTATCGA
TATCTCATTTTTTTCAATAACTGTTTTAAAGCGGTTATTTAGA
TATGGCGGGTGGGTAACTATAAGTAACATAATATCTCCTATA
TTAGCGAGTATGGATAGATTTATTCTATCCCATATCCAGGGA
GCATCAAAAATATCATTCTATACAGTCCCTAATGAGCTGGTA
ACTAGGCTTGGAATAGTTCCAGGCTCTCTTGGGAAAGCTGTT
TTTCCAAAATTAAGTCATGCAAGGAATTTTACAGCGTCATAT
GCAGAGCAAAAAAAAGCTTATATATTAATGACTGTCATTGT
AATGCCTTTGGTTTTATTTGTATATTATTACGCAAAGTTTATT
TTAACATTGTGGATGGGGGCTGAGTATGCAGGGATTTCGGTC
GAAATATTACGGATTATGCTTATAGGGTATATTTTTAACTGT
TATTCACAAATCTCTTTTGCCAACATACAGGCCTTTGGAAAA
GCAAAATACACTGCATACATCCATATGATGGAATTTATTCCT
TATTTGATAATGTTATATATAATTTCAAAGGAATATGGGGTT
ATTGGTGTTGCGTGGTTATGGACAATTCGAGTAATAATTGAT
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
TTTTTGATGCTTTTATATATGAGTTATCGTTGTAATAATCTTA
TGAAAAAAGGGTAGCCTGATGATATATATTGTGGTATTAAA
TTGGAATGGGGCTATAGATACCATTAATTGTGTTAAAAGTTT
AATGGATTTAAATGTTAGCGATTATAAAATTATCATTGTTGA
TAACTGTTCTATGGATAACTCATATGATACTATAAAAGAAAA
TCTTAATTCATTATATATTGCTGATAAAAGTATCATTGAGGT
GAAGTATGAGGATAGAAATAAATATAAAACCTTAGAAAACG
ATAAAATCATATTAATACAATCTCCGCAAAATAATGGGTAC
GCAAGTGGTAATAATATTGGCATAGAGTTCGCTCTTAATCAG
GAGAATATGAAATACGTCTGGGTTCTGAATAATGATACTGA
AGTGGATAAAGAGGCTTTAACTCATTTAATTAGTAAATGTGA
TTCAGATAAAAGTATAGGGATTTGCGGTTCTCGTTTAGTCTA
TTTTGCCGACAGAGAGATGCAGCAAGGACTAGGTGGGGTGC
ATAACAAATGGTTATGCACTACAAAAAATTATGAAATGGGA
AGATTAGTTTCCAAAAAATATGATGATGAAGTCATTAGTAAT
GATATAGATTATATAATTGGCGCATCGATGTTTTTCTCTAGA
GAATGTTTGGAAACAGTTGGATTGATGAATGAAGAATATTTT
TTATACTATGAAGAGTTAGATATTTGCCTCAGAGCAAAAGC
AAAGAACTTTAAATTAGGTATTTGCTCAGAAAGTTTGGTTTA
TCATAAAATAGGTGCAAGTACTGATGGGGGAAAGAGCATGA
TGGCTGATCTTTGCTCAATAAAAAATAGGCTGGTCATTACAG
AAAGGTTTTATCCCCAATATTATTGGACGGTATGGTTGTCAC
TTTTTGTTGTAGCATTTAACCGTGCTAGAAGAGGTGAGTTTA
ATAAGATGAAAAGATGTTTGAATGTTATGTTTAACTTCAAAC
GAAACAAAGGTAGCAAATGCCATTAGAATATGCACTTAATC
ATGGTGTTAATAAATCTATAGTTTGATATGTTATTAAAGGGT
ATTTAATGAAAGTGGCTTTTTTATCTGCTTATGATCCACTATC
TACATCCAGTTGGTCTGGCACACCTTATTATATGCTAAAGGC
ATTATCGAAGAGAAATATTTCCATTGAAATATTAGGACCGGT
AAATAGCTATATGATATACATGTTAAAAGTATATAAATTAAT
ATTAAGGTGTTTCGGAAAAGAATATGATTATAGTCATTCGAA
GTTGCTTTCCAGGTATTACGGTAGAATATTCGGTAGGAAATT
AAAAAAAATTGATGGTTTGGATTTTATTATCGCACCTGCAGG
TTCCTCACAAATTGCTTTTTTAAAAACAACCATACCAATAAT
ATATCTATCGGATACAACATATGATCAATTAAAAAGCTATTA
TCCGAATTTAAATAAAAAAACAATTATAAATGATGAGGATG
CAAGTTTAATCGAACGCAAGGCTATTGAAAAAGCAACAGTA
GTATCTTTCCCATCTAAATGGGCAATGGATTTTTGCAGGAAT
TATTACAGATTAGATTTTGATAAATTAGTTGAAATACCATGG
GGGGCTAATTTATTTGATGATATTCACTTTGCTAATAAAAAT
ATAATTCAAAAGAATAGTTATACTTGTCTTTTCTTGGGAGTT
GATTGGGAAAGAAAAGGTGGGAAAACAGCCTTGAAAGCAA
TTGAATATGTAAGGCAGTTATATGGGATCGATGTTAGACTAA
AAATTTGTGGATGTACTCCGAATCAAAAGATTTTACCTACTT
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
GGGTTGAATTAATTGATAAAGTAGATAAAAATAACGTTGAC
GAATATCAGAAATTCATCGATGTGTTATCTAACGCTGATATA
CTTCTTTTACCAACCATTGCTGAATGTTATGGAATGGTATTTT
GTGAAGCTGCTGCTTTTGGATTGCCTGTTGTCGCTACAGATA
CAGGTGGAGTCAGTTCTATAGTTATCAACGAAAGGACGGGG
ATATTAATTAAAGACCCGTTAGACTATAAGCACTTTGGAAAT
GCAATTCATAAAATAATTAGTTCCGTAGAGACTTATCAAAAC
TACTCCCAAAACGCAAGAATTAGATATAATAATATATTGCAT
TGGGACAATTGGGCTAAAAAGATAATTGAGATTATGTATGA
GCATAAGAATAGAAGAATCAAATAGCACAAAAAGAATTATA
TGTTTATTTATACTTTTTCTTGTTTTCCCTGATTTTTTGTTTTA
TACATTAGGGGTTGATAATTTTAGCATTTCAACGATAATCTC
AATTACATTGCTTTTTGTTTTTTTAAGAGCTAAAAATATTTGC
AAAGATAATTTTCTAATAATAGTAGCGTTATTCATATTGTTG
TGTTTTAACTGTTTGTTAAGTATGCTATTTAATATTGAACAG
GCTTTAACATTTAAAGTTGTACTTTCAATATATAGCATCTTA
ATAATGGCATACGTCTCCTCTTGTTATGCACAGACGTTGTGG
TTATGTTCTGAAGAAATACTTAAGAGATCCGTCTTTTATTTG
TTCGCATTTCTTTGCCTTATTGGCATTATAAGTATTCTTTTAC
AGAAGACTGAGATTATACATGATAAAAGTATGATTCTTTTTC
CTGAACCATCAGCATTTGCATTGGTTTTTATACCTATCTTTTC
ATTTTGTTTAT АСТАТ ACAAGAGGGGGGGGGCTACTATTGCT
CTATATATTATCTTTGGGTATTGCGTTAGGTATCCAGAATTT
AACAATGTTGGTAGGCATTGTGATTAGTGTTTTTGTGATGAA
AAAAATAACTATAAGGCAAACTATTGTTATACTTTTGGGGGC
ATGGATTTTTTCCATGATATTAAGTGATTTAGACATTTCTTAC
TATACATCGCGGCTTGATTTTAAAAATACTACGAACCTATCA
GTGCTTGTATATCTTTCAGGAATTGAAAGAGCTTTCTTGAAT
TTTATTACAAGTTATGGTCTTGGTATTGGTTTTCAACAAATG
GGAGTGAATGGGGAGATAGGAATATATCAACAAATTTTAGC
TGA AC TTGATGCC СС Т ATGTT A A AT AT AT AC GATGGC ТС ATT
TATTTCTTCTAAGTTAATATCTGAGTTTGGGGTTATTGGTGCA
TTAATGTGTATTTTCTATTTTTTTTATTTTTCCCGATTTTATCT
GCGTTTCAAAAAAAGTAAGAGATATTCACCGCAGTATATTTT
AGCATATAGCTTCTACATGTGTTTCTTCATCCCTCTTTTTATA
CGTGGTGCTGGTTATATAAACCCCTATGTGTTTATGTTATTTT
CATCAATATTTTTGTGCAAATATCACGCTAAAAATATCTTGA
TGAAATCTAATGTCCAGATAGCTATATAATAGTAGATTATAT
TATCATTATCACGTAAATTACATATTAATAGCATATATGATA
ACTAGGACATAAATAATGTGCATTAAAAAAAAACTTAAGTT
AATTAAACGATATGGCCTTTATGGTGGTCTTAGGCTTCTTAA
AGATATATTCTTAACAAAATTTTTATTTTGTTCAAATGTTAG
GATTATTAGATTTCCATGTTATATTAGAAAAGATGGAAGTGT
TAGTTTTGGAAAAGGTTTTACATCAGGTGTAGGATTACGAGT
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
TGATGCATTTATGGATGCCGTAGTTTCCATTGGAGAAAATGT
TCAAATTAATGACTATGTTCACATCGCGGCTATTAATAATGT
CATTATTGGTAGAGATACATTAATAGCAAGTAAAGTATTTAT
TAGTGATCATAATCATGGTATTTTTTCTAAATCCGATATCCA
TAGTTCACCAACTATTATTCCTTCGTCTAGGCCCCTTGAATCT
GCACCTGTGTATATTGGAGAGCGTGTGTGGATTGGCGAAAA
TGTGACAATATTACCAGGTGCGTGTATAGGTAATGGTGTAGT
TATTGGCGCAAACAGTGTTGTTCGTGGTGAGATTCCTAATAA
TGTGATCATTGCTGGTGTTCCAGCTAAAATTGTTAAAAAATA
TAACTATGAGCGTATGCAATGGGAAAGAATATAGTTGTAAT
ATCGGCTGTTAATTTTACAACCGGAGGCCCCTTTACCGTACT
AAAAAATGTGCTTACAGCAACTAAAGATAGAGCCGAATGTA
AATTTATTGCACTGGTTCATAGCTCTGCTGAACTAATGGAAT
TATTTCCGTGGGTTGAATTTATAGAGTATCCAGAAGTCAAGT
CTTCGTGGGTTAAAAGATTATATTTCGAATATATAACTTGCA
ATAGATTATCTAAGGTGATTAAGGCAACTCATTGGGTATGCT
TACATGATATTACAGCAAATGTTAGTGTACCCTATAGATTTG
TTTATTGCCACAATCCTGCACCGTTCTATAAATATTTAAGCT
ATCGAGATATTATAGGAGAACCTAAATTTTATCTTTTTTATC
TTTTTTATGGGCTTTTATACAATATCAATATAAAAAAGAACA
CAGCAGTTTTTGTTCAGCAGCAGTGGCTAAAAAAAGAATTC
GAAAAAAAATATAAGTTAAAGAATGTTGTTGTTAGTCGCCC
TGAAGATATTTGCCCTTTTGAAAGTGATGGTTTGGTAAGAAA
TAATAATAAAAAGGATGTGAGGATATTTTACCCAGCAGTGC
CCCGTATATTTAAAAACTTTGAAGTTATCATACGTGCTGCAC
AAATATTACAAGATAAAAATATTCATTTTTATCTTACTTTTG
ATGGTACTGAAAATAAGTATGCAAAAAGAATATATAAATTA
GCTTCCGAACTGAAAAATGTACATTTCCTCGGTTACCTTAAT
GCAACCGAGATGGTTAACTTTTATCAAGATTCAGATATTATT
TGTTTCCCATCGAAACTAGAAACGTGGGGATTACCATTATCA
GAAGCTAAAACATACAAAAAATGGATATTTGCGGCAGACTT
ACCTTATGCTCATGAAGTTTTATATAACTATTCAAAAACTAG
ATATTTTCCATTTGACGATGAGAAAATACTTGTTCGCTACAT
ATTAGAGTACACAAGTAAAAATATGCATGAAGATATAAAAA
ATAGTAGGGTGAATTTTAATAATGATGCATTGACTGGTTTTG
AACAGTTTATTGAATATATCCTCAAGGGGAACTGACGTGGTT
TATATTATAATCGTTTCACATGGCCATGATGACTATATAGAA
AATCTTTTATTAAATTTAAAGTTGCCCTCTGGAAGATTTAAA
ATAATAGTTCGTGATAACAAAAGTTCAATGGTTTTAAAAAA
AACATGCGAAAAAAATTGCGTAACCTATTTGCATGGAGGGC
AATATGGATTTGGACATAATAATAACATAGCAGTGTCATAT
ATAATTAATAACTTCATGATTATGAATAATGATTATTTTCTCT
TTCTTAACCCCGATGTATTCATAACCAGTGAAAGTTTGATTA
ATTATGTTGATTATATAATTAGTAATGATTATAAGTTTAGCA
Описание
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
SEQ ID NO.
CATTATGTCTTTATCGAGATTTTACTAAAAGCAAACATGATT
ATTCAATACGGAGTTTTCCAACTTTATATGATTTTCTTTGTTC
TTTTTTATTGGGGGTGAATAAAAGTAAAATTAAGAAGGAAA
ATATACTTTCTGATACTGTAGTTGATTGGTGTGCTGGCTCATT
TATGCTTATTCATGCTTTAAGTTTCTTAAATGTGAATGGTTTT
GATCAAAAATATTTTATGTATTGTGAAGATATTGACCTTTGT
ATGCGTTTAAAATTAAGTGGAGTAGATCTTTACTATACTCCC
CATTTTGATGCTATTCATTATGCGCAGCATGAAAATAGAAGA
ATATTTACTAAAGCATTTCGATGGCATATAAGGAGTATTACG
CGCTACATATTACGGAAACCAATTCTTTCTTATAAAAACTAT
AGAAAAATTACATCCGAACTGGTAAAGTGA
Детоксифицированный ЕРА-белок, содержащий 4 оптимизированные последовательности N-гликози-лирова-ния
GSGGGDQNATGSGGGKLAEEAFDLWNECAKACVLDLKDGVR
SSRMSVDPAIADTNGQGVLHYSMVLEGGNDALKLAroNALSIT
SDGLTIRLEGGVEPNKPVRYSYTRQARGSWSLNWLVPIGHEKP
SNIKVFIHELNAGNQLSHMSPIYTIEMGDELLAKLARDATFFVR
AHESNEMQPTLAISHAGVSVVMAQAQPRREKRWSEWASGKVL
CLLDPLDGVYNYLAQQRCNLDDTWEGKIYRVLAGNPAKHDLD
IKDNNNSTPTVISHRLHFPEGGSLAALTAHQACHLPLEAFTRHR
QPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALAS
PGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAG
AASADVVSLTCPVAKDQNRTKGECAGPADSGDALLERNYPTG
AEFLGDGGDVSFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGY
HGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYA
QDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRWSLPGFYRTGLTLAAPEAAG
EVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRVTILGWPLAERTVVIPSAIP
TDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPREDLKLGS
GGGDQNAT
Консенсусная последовательность N-гликози-лирова-ния
Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой, за исключением Pro
Консенсусная последовательность N-гликози-лирова-ния
Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro
Воплощения, описанные в данном документе, являются лишь иллюстративными и специалистам в данной области понятны или они могут установить, используя не более чем обычные эксперименты, многочисленные эквиваленты конкретных операций, описанных в данном документе. Все такие эквиваленты считаются входящими в объем настоящего изобретения и охвачены следующей формулой изобретения.
Все ссылки (включая патентные заявки, патенты и публикации), указанные в данном описании изобретения, включены в данное описание посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, или патент, или патентная заявка патент была конкретно и независимо указана как включенная посредством ссылки во всей своей полноте и для всех целей.
7. ВОПЛОЩЕНИЯ
Воплощения 1:
1. Прокариотическая клетка-хозяин, содержащая:
а. кластер генов rfb (uped38) (SEQ ID NO: 12), кластер генов rfb
(uped 63) или кластер генов rfb (uped 77);
б. нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил-
трансферазу; и
в. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель,
содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может
быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14).
2. Прокариотическая клетка-хозяин, содержащая:
а. rmlB, rmID, rmlA, rmIC, wzx, wekA, wekB, wzy, wbbJ, wbbK и wbbL;
б. нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил-
трансферазу;
в. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель,
содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может
быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14).
3. Прокариотическая клетка-хозяин, содержащая:
а. нуклеотидную последовательность, кодирующую: 1. сТОР-Глюкозо-4,6-дегидратазу;
2. с1ТОР-6-Дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимеразу;
3. Глюкозо-1 -фосфат-тимидилилтрансферазу;
4. с1ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу;
5. О-антиген-флиппазу;
6. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
7. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансферазу;
8. О-антиген-полимеразу;
9. О-ацетилтрансферазу;
10. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и
11. dTDP-Rha: GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
б. нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил-
трансферазу;
в. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель,
содержащий консенсусную последовательность Asn-X-Ser(Thr), где X может
быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14).
4. Клетка-хозяин по аспекту 0, где:
а. dTDP-niK> K030-4,6-flerHflpaTa3a содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична dTDP-mK> K030-4,6-flernflpaTa3e, кодируемой SEQ ID
NO: 1;
б. dTDP-6-fle30KCH-D-mK> K030-3,5-3nnMepa3a содержит
аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична dTDP-6-fle30KCH-D-^tOK030-3,5-
эпимеразе, кодируемой SEQ ID NO: 2;
в. Глюкозо-1-фосфат-тимидилилтрансфераза содержит
аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%,
82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична глюкозо-1-фосфат-
тимидилилтрансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 3;
г. сТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимераза содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразе, кодируемой
SEQ ID NO: 4;
д. О-антиген-флиппаза содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична О-антиген-флиппазе, кодируемой SEQ ID NO: 5;
е. рамнозил-трансфераза (11) содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична рамнозил-трансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 6;
ж. гликозилтрансфераза (12) содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична гликозилтрансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 7;
з. О-антиген-полимераза содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична О-антиген-полимеразе, кодируемой SEQ ID NO: 8;
и. О-ацетилтрансфераза содержит аминокислотную
последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% или 100% идентична О-ацетилтрансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 9;
к. гликозилтрансфераза (10) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична гликозилтрансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 10: и
л. рамнозилтрансфераза (11) содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична рамнозилтрансферазе, кодируемой SEQ ID NO: 11.
5. Клетка-хозяин по любому из аспектов 1-0, которая представляет собой Escherichia coli.
6. Клетка-хозяин по аспекту 0, где по меньшей мере один из: гена waaL, гена gtrA, гена gtrB, гена gtrS и кластер rfb удален или функционально инактивирован в геноме клетки-хозяина.
7. Клетка-хозяин по любому из аспектов 1-0, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из Р. aeruginosa (ЕРА), CRM197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксифицированного гемолизина А из S. aureus, фактора агглютинации А, фактора агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильного энтеротоксина Е. coli, детоксифицированных вариантов термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, белка Sat Е. coli, домена-пассажира белка Sat Е. coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, АсгА С. jejuni и природных гликопротеинов С. jejuni.
8. Клетка-хозяин по любому из аспектов 1-7, где белок-носитель содержит оптимизированную консенсусную последовательность N-гликозилирования, Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
9. Клетка-хозяин по любому из аспектов 1-8, где белок-носитель содержит одну или более рекомбинантно введенных консенсусных последовательностей.
10. Клетка-хозяин по любому из аспектов 1-9, где белок-носитель содержит сигнальную последовательность для нацеливания белка-носителя в периплазматическое пространство клетки-хозяина.
11. Клетка-хозяин по аспекту 0, где сигнальная последовательность выбрана из группы, состоящей из сигнальной последовательности из DsbA Е. coli, порина А внешней мембраны (OmpA) Е. coli, мальтозосвязывающего белка (MalE) Е. coli, пектатлиазы (PelB) Erwinia carotovorans, Flgl, NikA или
5.
эндоксиланазы (XynA) Bacillus sp, термолабильного энтеротоксина LTIIb E. coli, эндоксиланазы XynA Bacillus или флагеллина (Flgl) E. coli.
12. Способ получения /V-гликозилированного белка-носителя, включающий:
а. культивирование клетки-хозяина по любому из аспектов 1 -0; и
б. очистку /V-гликозилированного белка-носителя.
13. /V-гликозилированный белок-носитель, полученный способом по аспекту 0.
14. /V-гликозилированный белок-носитель по аспекту 0, содержащий соединение формулы 025В:
D-GIc
¦ D-GIc A
L-Rha2Ac ¦
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
15. /V-гликозилированный белок-носитель по аспекту 0, содержащий соединение формулы 025В': D-GIc
D-GIc А 1.3
а а -> L-Rha2Ac . _ " D-GlcNAc-
1,3
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
16. Выделенный О-антиген из штамма 025В, такого как uped 38, uped 63 или uped 77.
17. Белок-носитель, Л/-связанный с О-антигеном по аспекту 0.
18. Группа выделенных макромолекул, содержащая структуру формулы 025В:
D-GIc
¦ D-GIc A
L-Rha2Ac ¦
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
19. Группа выделенных макромолекул, содержащих структуру формулы 025В':
D-GIc
D-GlcNAc-
D-GIc А 1-3
р|6
1,3
-*-L-Rha2Ac-
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
20. Фармацевтическая композиция, содержащая макромолекулу, имеющую структуру формулы 025В:
D-GIc
D-GIc A
L-Rha2Ac ¦
¦^D-GlcNAc-
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
21. Фармацевтическая композиция, содержащая макромолекулу, имеющую структуру формулы 025В': D-GIc
D-GIc
а а
1,3
L-Rha2Ac , . " D-GlcNAc-
А 1-3
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30, от 1 до 20, от 1 до 15, от 1 до 10, от 1 до 5, от 10 до 30, от 15 до 30, от 20 до 30, от 25 до 30, от 5 до 25, от 10 до 25, от 15 до 25, от 20 до 25, от 10 до 20 или от 15 до 20.
22. Фармацевтическая композиция по аспекту 20, где структура формулы 025В ковалентно связана с остатком Asn в белке-носителе.
23. Фармацевтическая композиция по аспекту 21, где струкутура формулы 025В' ковалентно связана с остатком Asn в белке-носителе.
24. Фармацевтическая композиция по аспекту 0 или 21, где остаток Asn находится в консенсусной последовательности Asn-X-Ser(Thr), где X может быть любой аминокислотой за исключением Pro (SEQ ID NO: 14).
25. Прокариотическая клетка-хозяин по любому из аспектов 1-11, где указанная олигосахарил-трансфераза гетерологична клетке-хозяину.
22.
26. Прокариотическая клетка-хозяин по любому из аспектов 1-11, где указанная олигосахарил-трансфераза представляет собой олигосахарил-трансферазу pgIB из С. jejuni.
27. Прокариотическая клетка-хозяин по любому из аспектов 1-11, где указанный белок-носитель гетерологичен клетке-хозяину.
28. Прокариотическая клетка-хозяин по любому из аспектов 1-11, 25, 26 или 27, где указанный белок-носитель не является белок Е. coli.
29. Способ получения олигосахарида, содержащего L-Rha(2Ac), включающий инкубирование сахарида или олигосахарида с рамнозил-трансферазой, содержащей SEQ ID N0:11, где сахарид или олигосахарид содержит концевой D-GlcNAc.
30. Способ по аспекту 29, где L-Rha(2Ac) и D-GlcNAc связаны с помощью альфа-1,3-связи.
31. Способ по аспекту 29, где указанная инкубация происходит in vitro.
32. Способ по аспекту 29, где указанный олигосахарид получают в клетке-хозяина, которая рекомбинантно экспрессирует рамнозил-трансферазу, содержащую SEQ ID NO: 11.
Воплощения 2:
1. Композиция, содержащая (1) биоконъюгат 025В, содержащий антиген 025В Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, (2) биоконъюгат 01 А, содержащий антиген 01А Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, (3) биоконъюгат 02, содержащий антиген 02 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, и (4) биоконъюгат 06, содержащий антиген 06 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя.
2. Композиция по аспекту 1, где антиген 025В, антиген 01 А, антиген 06 и антиген 02 содержат следующие формулы, соответственно:
а Формула 025В'
D-GIc Р 6 f
-D-GIc
А 1.3
а 3
L-Rha2Ac ¦
1,3
-> D-GlcNAc-
L-Rha
Формула 01 А'
Р Г а а
-h** L-Rha > L-Rha--
з[ А 1,3 1,3
р[2 D-ManNAc
в. Формула 06Glc'
L-Rha > D-GlcNAc-
1,4
1,4
D-Gal N Ac
1,3
1,4
D-Man
1,3
D-GlcNAc
-> D-GlcNAc
Формула 02'
a a
¦ L-Rha > L-Rha-L-Rha ---
A 1,2 1,3 1,4
a\2
D-Fuc3NAc
3. Композиция по аспекту 1 или 2, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА), CRM197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксифицированного гемолизина А из S. aureus, фактора агглютинации А, фактора агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильного энтеротоксина Е. coli, детоксифицированных вариантов термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, белка Sat Е. coli, домена-пассажира белка Sat Е. coli, пневмолизина
Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, АсгА С. jejuni и природных гликопротеинов С. jejuni.
4. Композиция по аспекту 3, где белок-носитель представляет собой детоксифицированные ЕРА, CRM197 или МВР.
5. Композиция по любому из аспектов 1-4, где остаток Asn белка-носителя расположен в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID NO: 15).
6. Способ лечения у субъекта инфекции внекишечной патогенной Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиция по любому из аспектов 1-5.
7. Способ предупреждения у субъекта инфекции внекишечной патогенной Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиция по любому из аспектов 1-5.
8. Способ индукции у субъекта иммунного ответа против внекишечной патогенной Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиция по любому из аспектов 1-5.
9. Способ индукции у субъекта продуцирования опсонофагоцитирующих антител, специфичных к внекишечной патогенной Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиция по любому из аспектов 1-5.
10. Способ по аспекту 6, 8 или 9, где у субъекта диагностирована инфекция мочевых путей.
11. Способ по аспекту 7, 8 или 9, где субъект имеет риск развития инфекции мочевых путей.
12. Способ по аспекту 6, 8 или 9, где у субъекта диагностирована бактериемия.
13. Способ по аспекту 7, 8 или 9, где субъект имеет риск развития бактериемии.
14. Способ по аспекту 6, 8 или 9, где у субъекта диагностирован сепсис.
15. Способ по аспекту 7, 8 или 9, где субъект имеет риск развития сепсиса.
4.
16. Способ по любому из аспектов 6-16, где субъект представляет собой человека.
Перечень последовательностей
<110> GlycoVaxyn AG
<12 0> НОВЫЙ ПОЛИСАХАРИД И ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 13064-042
<140> TBA
<141> та же дата подачи
<150> 61/943,710
<151> 2014-02-24
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1086
<212> ДНК
<213> E. Coli
<223> rmlB (upec138)
<210> 2
<211> 900
<212> ДНК
<213> E. Coli
<220>
<223> rmlD (upec138)
<210> 3
<211> 879
<212> ДНК
<213> E. Coli
<220>
<223> rmlA (upec138)
<400> 3
atgaaaacgc
gtaaaggtat
tattttggcg
ggtggttctg
gtactcgtct
ttatcctgtg
acgatggccg
tcagtaaaca
gctgttaccg
atttatgata
aaccgatgat
ctattacccg
120
ctctctacac
tgatgttagc
gggtattcgc
gatattctga
ttatcagtac
accacaggat
180
actcctcgtt
ttcaacaact
gctgggtgac
gggagccagt
ggggcctgaa
tcttcagtac
240
aaagtgcaac
cgagtccgga
tggtcttgcg
caggcgttta
ttatcggtga
agagtttatt
300
ggtggtgatg
attgtgcttt
ggtacttggt
gataatatct
tctacggcca
cgacctgccg
360
aagttaatgg
acgtagctgt
taacaaagaa
agtggtgcaa
cggtatttgc
ctatcacgtt
420
aatgatcctg
aacgttatgg
tgtcgtggag
tttgataata
acggtactgc
aattagcctg
480
gaagaaaaac
cgctggaacc
aaaaagtaac
tatgcggtta
ctgggcttta
tttctatgac
540
aatgacgttg
tggaaatggc
gaaaaacctt
aagccttctg
cccgaggtga
actggaaatt
600
accgatatta
accgtattta
tatggaacaa
ggacgtttgt
ctgtcgctat
gatggggcgt
660
ggctatgcat
ggctggatac
agggacgcat
caaagtctta
ttgaagcaag
caacttcatt
720
gccaccattg
aagagcgcca
gggactaaag
gtttcctgtc
cggaagaaat
tgcttatcgt
780
aaagggttta
ttgatgctga
gcaggtaaaa
gtattagccg
aaccgttgaa
gaaaaatgct
840
tatggtcagt
atctgctcaa
aatgattaaa
ggttattaa
879
<210> 4 <211> 543 <212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> rmlC (upec138)
<400> 4
atgaacgtaa
ttaaaactga
aattcctgat
gtgctgattt
ttgaaccaaa
agtttttggg
gatgaacgtg
gcttcttttt
tgagagtttt
aatcagagga
tttttgaaga
agcagtaggt
120
cgtaaggttg
agtttgttca
ggataaccat
tctaagtcca
gtaaaggtgt
tttacgtggt
180
cttcattatc
agttagaacc
ttatgctcaa
ggaaaactgg
tgcgctgtgt
tgttggcgag
240
gtttttgatg
ttgcggttga
tattcgtaaa
tcgtcaccta
catttgggaa
atgggttggg
300
gtgaatttgt
ctgctgagaa
taagcgtcag
ttgtggattc
ctgagggatt
tgcacatggt
360
tttttggtgc
tgagtgattt
agcagaagtt
ttatataaaa
cgaatcaata
ttatgctcca
420
tcacatgaaa
aaaatattat
atggaatgac
ctcttgctta
atattaaatg
gccgagcaca
480
gcactgatca
ctctgtctga
taaggatgca
aatggggaaa
gatttgaact
aagtgagttt
540
tga
543
<210> 5 <211> 1260 <212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> wzx
(upec138)
<400> 5
atgtctctct
taaaacatag
tatatggaat
gttgcgggct
actttatacc
aacattaatt
gcaattcccg
cctttggatt
aattgcgagg
aaaattggtg
tagaactatt
tggtttgtat
120
acgttagcaa
tgatttttat
agggtatgca
agtatatttg
atgctgggtt
aacaagagct
180
gttgtgcgtg
aaatagcatt
actaaaaaac
agagtggacg
attgtaatac
gataatagta
240
acttctatta tcgctgtgat atttttaggg tttatcggag gcgggggagt gtttctgctt 300
aaaggcgata ttattgaact gttaaatatc tcaccaatat attacgccga ttcgataaag 360
tctctagtat tattatcatc tctgatacct gtattcttag tcacgcaaat actattagca 420
gagcttgagg gtcgggaata ttttgggatt ctaaatatac aaaaaagtgt agggaattct 480
ttaattgcag ggttacctgc attatttgtt ttaattaatc aaacgctttt ttctgcaatt 540
attggtgtag cgattgcaag agttatatgc ttgtggttaa gctacattat gagcagggaa 600
agaataacta tcgatatctc atttttttca ataactgttt taaagcggtt atttagatat 660
ggcgggtggg taactataag taacataata tctcctatat tagcgagtat ggatagattt 720
attctatccc atatccaggg agcatcaaaa atatcattct atacagtccc taatgagctg 780
gtaactaggc ttggaatagt tccaggctct cttgggaaag ctgtttttcc aaaattaagt 840
catgcaagga attttacagc gtcatatgca gagcaaaaaa aagcttatat attaatgact 900
gtcattgtaa tgcctttggt tttatttgta tattattacg caaagtttat tttaacattg 960
tggatggggg ctgagtatgc agggatttcg gtcgaaatat tacggattat gcttataggg 1020
tatattttta actgttattc acaaatctct tttgccaaca tacaggcctt tggaaaagca 1080
aaatacactg catacatcca tatgatggaa tttattcctt atttgataat gttatatata 1140
atttcaaagg aatatggggt tattggtgtt gcgtggttat ggacaattcg agtaataatt 1200
gattttttga tgcttttata tatgagttat cgttgtaata atcttatgaa aaaagggtag 1260
<210> 6 <211> 966 <212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> wekA (upec138) <400> 6
atgatatata ttgtggtatt aaattggaat ggggctatag ataccattaa ttgtgttaaa 60
agtttaatgg atttaaatgt tagcgattat aaaattatca ttgttgataa ctgttctatg 120
gataactcat atgatactat aaaagaaaat cttaattcat tatatattgc tgataaaagt 180
atcattgagg tgaagtatga ggatagaaat aaatataaaa ccttagaaaa cgataaaatc 240
atattaatac aatctccgca aaataatggg tacgcaagtg gtaataatat tggcatagag 300
ttcgctctta atcaggagaa tatgaaatac gtctgggttc tgaataatga tactgaagtg 360
gataaagagg ctttaactca tttaattagt aaatgtgatt cagataaaag tatagggatt 420
tgcggttctc gtttagtcta ttttgccgac agagagatgc agcaaggact aggtggggtg 480
cataacaaat ggttatgcac tacaaaaaat tatgaaatgg gaagattagt ttccaaaaaa 540
tatgatgatg aagtcattag taatgatata gattatataa ttggcgcatc gatgtttttc 600
tctagagaat gtttggaaac agttggattg atgaatgaag aatatttttt atactatgaa 660
gagttagata tttgcctcag agcaaaagca aagaacttta aattaggtat ttgctcagaa 720
agtttggttt atcataaaat aggtgcaagt actgatgggg gaaagagcat gatggctgat 780
ctttgctcaa taaaaaatag gctggtcatt acagaaaggt tttatcccca atattattgg 840
acggtatggt tgtcactttt tgttgtagca tttaaccgtg ctagaagagg tgagtttaat 900
aagatgaaaa gatgtttgaa tgttatgttt aacttcaaac gaaacaaagg tagcaaatgc 960
cattag 966
<210> 7 <211> 1149 <212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> wekB (upec138) <400> 7
atgaaagtgg cttttttatc tgcttatgat ccactatcta catccagttg gtctggcaca 60
ccttattata tgctaaaggc attatcgaag agaaatattt ccattgaaat attaggaccg 120
gtaaatagct atatgatata catgttaaaa gtatataaat taatattaag gtgtttcgga 180
aaagaatatg attatagtca ttcgaagttg ctttccaggt attacggtag aatattcggt 240
aggaaattaa aaaaaattga tggtttggat tttattatcg cacctgcagg ttcctcacaa 300
attgcttttt taaaaacaac cataccaata atatatctat cggatacaac atatgatcaa 360
ttaaaaagct attatccgaa tttaaataaa aaaacaatta taaatgatga ggatgcaagt 420
ttaatcgaac gcaaggctat tgaaaaagca acagtagtat ctttcccatc taaatgggca 480
atggattttt gcaggaatta ttacagatta gattttgata aattagttga aataccatgg 540
ggggctaatt tatttgatga tattcacttt gctaataaaa atataattca aaagaatagt 600
tatacttgtc ttttcttggg agttgattgg gaaagaaaag gtgggaaaac agccttgaaa 660
gcaattgaat atgtaaggca gttatatggg atcgatgtta gactaaaaat ttgtggatgt 720
actccgaatc aaaagatttt acctacttgg gttgaattaa ttgataaagt agataaaaat 780
aacgttgacg aatatcagaa attcatcgat gtgttatcta acgctgatat acttctttta 840
ccaaccattg ctgaatgtta tggaatggta ttttgtgaag ctgctgcttt tggattgcct 900
gttgtcgcta cagatacagg tggagtcagt tctatagtta tcaacgaaag gacggggata 960
ttaattaaag acccgttaga ctataagcac tttggaaatg caattcataa aataattagt 1020
tccgtagaga cttatcaaaa ctactcccaa aacgcaagaa ttagatataa taatatattg 1080
cattgggaca attgggctaa aaagataatt gagattatgt atgagcataa gaatagaaga 1140
atcaaatag 1149
<210> 8 <211> 1218 <212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> wzy (upec138)
<400> 8
atgagcataa gaatagaaga atcaaatagc acaaaaagaa ttatatgttt atttatactt 60
tttcttgttt tccctgattt tttgttttat acattagggg ttgataattt tagcatttca 120
acgataatct caattacatt gctttttgtt tttttaagag ctaaaaatat ttgcaaagat 180
aattttctaa taatagtagc gttattcata ttgttgtgtt ttaactgttt gttaagtatg 240
ctatttaata ttgaacaggc tttaacattt aaagttgtac tttcaatata tagcatctta 300
ataatggcat acgtctcctc ttgttatgca cagacgttgt ggttatgttc tgaagaaata 360
cttaagagat ccgtctttta tttgttcgca tttctttgcc ttattggcat tataagtatt 420
cttttacaga agactgagat tatacatgat aaaagtatga ttctttttcc tgaaccatca 480
gcatttgcat tggtttttat acctatcttt tcattttgtt tatactatac aagagggggg 540
gggctactat tgctctatat attatctttg ggtattgcgt taggtatcca gaatttaaca 600
atgttggtag gcattgtgat tagtgttttt gtgatgaaaa aaataactat aaggcaaact 660
attgttatac ttttgggggc atggattttt tccatgatat taagtgattt agacatttct 720
tactatacat cgcggcttga ttttaaaaat actacgaacc tatcagtgct tgtatatctt 780
tcaggaattg aaagagcttt cttgaatttt attacaagtt atggtcttgg tattggtttt 840
caacaaatgg gagtgaatgg ggagatagga atatatcaac aaattttagc tgaacttgat 900
gcccctatgt taaatatata cgatggctca tttatttctt ctaagttaat atctgagttt 960
ggggttattg gtgcattaat gtgtattttc tatttttttt atttttcccg attttatctg 1020
cgtttcaaaa aaagtaagag atattcaccg cagtatattt tagcatatag cttctacatg 1080
tgtttcttca tccctctttt tatacgtggt gctggttata taaaccccta tgtgtttatg 1140
ttattttcat caatattttt gtgcaaatat cacgctaaaa atatcttgat gaaatctaat 1200
gtccagatag ctatataa 1218
<210> 9
<211> 606
<212> ДНК
<213> E. Coli
<220>
<223> wbbJ (upec138)
<400> 9
atgtgcatta aaaaaaaact taagttaatt aaacgatatg gcctttatgg tggtcttagg 60
cttcttaaag atatattctt aacaaaattt ttattttgtt caaatgttag gattattaga 120
tttccatgtt atattagaaa agatggaagt gttagttttg gaaaaggttt tacatcaggt 180
gtaggattac gagttgatgc atttatggat gccgtagttt ccattggaga aaatgttcaa 240
attaatgact atgttcacat cgcggctatt aataatgtca ttattggtag agatacatta 300
atagcaagta aagtatttat tagtgatcat aatcatggta ttttttctaa atccgatatc 360
catagttcac caactattat tccttcgtct aggccccttg aatctgcacc tgtgtatatt 420
ggagagcgtg tgtggattgg cgaaaatgtg acaatattac caggtgcgtg tataggtaat 480
ggtgtagtta ttggcgcaaa cagtgttgtt cgtggtgaga ttcctaataa tgtgatcatt 540
gctggtgttc cagctaaaat tgttaaaaaa tataactatg agcgtatgca atgggaaaga 600
atatag 606
<210> 10 <211> 1101
<212> ДНК <213> E. Coli
<220>
<223> wbbK (upec138)
<400> 10
atgggaaaga atatagttgt aatatcggct gttaatttta caaccggagg cccctttacc 60
gtactaaaaa atgtgcttac agcaactaaa gatagagccg aatgtaaatt tattgcactg 120
gttcatagct ctgctgaact aatggaatta tttccgtggg ttgaatttat agagtatcca 180
gaagtcaagt cttcgtgggt taaaagatta tatttcgaat atataacttg caatagatta 240
tctaaggtga ttaaggcaac tcattgggta tgcttacatg atattacagc aaatgttagt 300
gtaccctata gatttgttta ttgccacaat cctgcaccgt tctataaata tttaagctat 360
cgagatatta taggagaacc taaattttat cttttttatc ttttttatgg gcttttatac 420
aatatcaata taaaaaagaa cacagcagtt tttgttcagc agcagtggct aaaaaaagaa 480
ttcgaaaaaa aatataagtt aaagaatgtt gttgttagtc gccctgaaga tatttgccct 540
tttgaaagtg atggtttggt aagaaataat aataaaaagg atgtgaggat attttaccca 600
gcagtgcccc gtatatttaa aaactttgaa gttatcatac gtgctgcaca aatattacaa 660
gataaaaata ttcattttta tcttactttt gatggtactg aaaataagta tgcaaaaaga 720
atatataaat tagcttccga actgaaaaat gtacatttcc tcggttacct taatgcaacc 780
gagatggtta acttttatca agattcagat attatttgtt tcccatcgaa actagaaacg 840
tggggattac cattatcaga agctaaaaca tacaaaaaat ggatatttgc ggcagactta 900
ccttatgctc atgaagtttt atataactat tcaaaaacta gatattttcc atttgacgat 960
gagaaaatac ttgttcgcta catattagag tacacaagta aaaatatgca tgaagatata 1020
aaaaatagta gggtgaattt taataatgat gcattgactg gttttgaaca gtttattgaa 1080 tatatcctca aggggaactg a 1101
<210> 11
<211> 564
<212> ДНК
<213> E. Coli
<220>
<223> wbbL (upec138) <400> 11
atgattatga ataatgatta ttttctcttt cttaaccccg atgtattcat aaccagtgaa 60
agtttgatta attatgttga ttatataatt agtaatgatt ataagtttag cacattatgt 120
ctttatcgag attttactaa aagcaaacat gattattcaa tacggagttt tccaacttta 180
tatgattttc tttgttcttt tttattgggg gtgaataaaa gtaaaattaa gaaggaaaat 240
atactttctg atactgtagt tgattggtgt gctggctcat ttatgcttat tcatgcttta 300
agtttcttaa atgtgaatgg ttttgatcaa aaatatttta tgtattgtga agatattgac 360
ctttgtatgc gtttaaaatt aagtggagta gatctttact atactcccca ttttgatgct 420
attcattatg cgcagcatga aaatagaaga atatttacta aagcatttcg atggcatata 480
aggagtatta cgcgctacat attacggaaa ccaattcttt cttataaaaa ctatagaaaa 540
attacatccg aactggtaaa gtga 564
<210> 12
<211> 10653
<212> ДНК
<213> E. Coli
<220>
<223> кластер генов rfb(upec138) E.coli
<400> 12
gtgaagatac ttgttactgg tggcgcagga tttattggtt ctgctgttgt tcgtcacata 60
ataaataata cgcaagatag tgttgttaat gtcgataaat taacatacgc cggaaacctg 120
gaatcacttg cagatgtttc tgattctgaa cgctatttct ttgaacatgc ggatatttgt 180
gatgcagctg caatggcacg gatttttgct cagcatcagc cggatgcagt gatgcacctg 240
gcagctgaaa gccatgttga ccgttcaatt acaggccctg cggcatttat tgaaaccaat 300
attgtgggta cttatgtcct tttagaagcg gctcggaatt attggtctgg tctggatgat 360
gaaaagaaaa aaaacttccg ttttcatcat atttctactg atgaggtgta tggtgactta 420
ccccatccgg atgaagtaaa tagcaatgaa acgttgccgc tatttacgga aacgacagca 480
tacgcgccaa gtagtccata ttctgcttct aaagcttcca gcgatcattt ggttcgcgca 540
tggaaacgta cttatggttt accgaccatt gtgactaatt gctcgaacaa ctatggtcct 600
tatcatttcc cggaaaagct tattccactg gttattctta attcactgga aggtaaggca 660
ttacctattt atggcaaagg agatcagatc cgcgactggt tgtatgtaga ggatcatgct 720
cgagcgttat ataccgtcgt aaccgaaggt aaagcgggcg aaacttataa cattggtgga 780
cacaacgaaa agaaaaacat cgacgtagtg ttcactattt gtgatttgtt ggatgagata 840
gtcccgaaag agaaatctta ccgcgagcaa attacttatg ttaccgatcg tccgggacac 900
gatcgccgtt atgcgattga tgctgagaag attggtcgcg aattgggatg gaaaccacag 960
gaaacgtttg agagtgggat tcgtaaaacg gtggaatggt acctgtccaa tacaaaatgg 1020
gttgataatg tgaaaagtgg tgcctatcaa tcgtggattg aacagaacta tgagggccgc 1080
cagtaatgaa tatcctcctt tttggcaaaa cagggcaggt aggttgggaa ctacagcgtg 1140
ctctggcacc tctgggtaat ttgattgctc ttgatgttca ctccactgat tactgtggtg 1200
attttagtaa tcctgaaggt gtagctgaaa ccgtaagaag cattcggcct gatattattg 1260
tcaacgcagc cgctcacacc gcagtagaca aagcagaatc agaaccgaag tttgcacaat 1320
tactgaacgc gacgagtgtc gaagcgatcg cgaaagcagc caatgaagtc ggcgcctggg 1380
ttattcacta ctctactgac tacgtatttc cggggaccgg tgaaatacca tggcaggagg 1440
aggatgcaac cgcaccgcta aatgtttacg gtgaaaccaa gttagcggga gaaaaagcat 1500
tacaagagca ttgtgcgaag caccttattt tccggaccag ctgggtctat gcaggtaaag 1560
gaaataactt cgccaaaaca atgttgcgtc tggcaaaaga gcgtgaagaa ttagccgtta 1620
ttaatgatca gtttggtgcg ccaactggcg cagagttact ggctgattgt acggcacatg 1680
ctattcgtgt ggcactgaat aaaccggaag tcgcaggctt gtaccatctg gtagctagtg 1740
gtaccacaac gtggcacgat tatgctgcgc tggtttttga agaggcgcgc aaagcaggca 1800
ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcag taccaacaac agcctatcct acaccagctc 1860
gtcgtccaca taactctcgc cttaatacag aaaaatttca gcagaacttt gcgcttgtct 1920
tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgcttaacga attatttacg actacagcaa 1980
tttaatagtt tttgcatctt gttcgtaatg gtggagcaag atgtattaaa aggaatgatg 2040
aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttgg cgggtggttc tggtactcgt ctttatcctg 2100
tgacgatggc cgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga taaaccgatg atctattacc 2160
cgctctctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct gattatcagt acaccacagg 2220
atactcctcg ttttcaacaa ctgctgggtg acgggagcca gtggggcctg aatcttcagt 2280
acaaagtgca accgagtccg gatggtcttg cgcaggcgtt tattatcggt gaagagttta 2340
ttggtggtga tgattgtgct ttggtacttg gtgataatat cttctacggc cacgacctgc 2400
cgaagttaat ggacgtagct gttaacaaag aaagtggtgc aacggtattt gcctatcacg 2460
ttaatgatcc tgaacgttat ggtgtcgtgg agtttgataa taacggtact gcaattagcc 2520
tggaagaaaa accgctggaa ccaaaaagta actatgcggt tactgggctt tatttctatg 2580
acaatgacgt tgtggaaatg gcgaaaaacc ttaagccttc tgcccgaggt gaactggaaa 2640
ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aaggacgttt gtctgtcgct atgatggggc 2700
gtggctatgc atggctggat acagggacgc atcaaagtct tattgaagca agcaacttca 2760
ttgccaccat tgaagagcgc cagggactaa aggtttcctg tccggaagaa attgcttatc 2820
gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtaa aagtattagc cgaaccgttg aagaaaaatg 2880
cttatggtca gtatctgctc aaaatgatta aaggttatta ataagatgaa cgtaattaaa 2940
actgaaattc ctgatgtgct gatttttgaa ccaaaagttt ttggggatga acgtggcttc 3000
ttttttgaga gttttaatca gaggattttt gaagaagcag taggtcgtaa ggttgagttt 3060
gttcaggata accattctaa gtccagtaaa ggtgttttac gtggtcttca ttatcagtta 3120
gaaccttatg ctcaaggaaa actggtgcgc tgtgttgttg gcgaggtttt tgatgttgcg 3180
gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg ttggggtgaa tttgtctgct 3240
gagaataagc gtcagttgtg gattcctgag ggatttgcac atggtttttt ggtgctgagt 3300
gatttagcag aagttttata taaaacgaat caatattatg ctccatcaca tgaaaaaaat 3360
attatatgga atgacctctt gcttaatatt aaatggccga gcacagcact gatcactctg 3420
tctgataagg atgcaaatgg ggaaagattt gaactaagtg agttttgaaa tgtctctctt 3480
aaaacatagt atatggaatg ttgcgggcta ctttatacca acattaattg caattcccgc 3540
ctttggatta attgcgagga aaattggtgt agaactattt ggtttgtata cgttagcaat 3600
gatttttata gggtatgcaa gtatatttga tgctgggtta acaagagctg ttgtgcgtga 3660
aatagcatta ctaaaaaaca gagtggacga ttgtaatacg ataatagtaa cttctattat 3720
cgctgtgata tttttagggt ttatcggagg cgggggagtg tttctgctta aaggcgatat 3780
tattgaactg ttaaatatct caccaatata ttacgccgat tcgataaagt ctctagtatt 3840
attatcatct ctgatacctg tattcttagt cacgcaaata ctattagcag agcttgaggg 3900
tcgggaatat tttgggattc taaatataca aaaaagtgta gggaattctt taattgcagg 3960
gttacctgca ttatttgttt taattaatca aacgcttttt tctgcaatta ttggtgtagc 4020
gattgcaaga gttatatgct tgtggttaag ctacattatg agcagggaaa gaataactat 4080
cgatatctca tttttttcaa taactgtttt aaagcggtta tttagatatg gcgggtgggt 4140
aactataagt aacataatat ctcctatatt agcgagtatg gatagattta ttctatccca 4200
tatccaggga gcatcaaaaa tatcattcta tacagtccct aatgagctgg taactaggct 4260
tggaatagtt ccaggctctc ttgggaaagc tgtttttcca aaattaagtc atgcaaggaa 4320
ttttacagcg tcatatgcag agcaaaaaaa agcttatata ttaatgactg tcattgtaat 4380
gcctttggtt ttatttgtat attattacgc aaagtttatt ttaacattgt ggatgggggc 4440
tgagtatgca gggatttcgg tcgaaatatt acggattatg cttatagggt atatttttaa 4500
ctgttattca caaatctctt ttgccaacat acaggccttt ggaaaagcaa aatacactgc 4560
atacatccat atgatggaat ttattcctta tttgataatg ttatatataa tttcaaagga 4620
atatggggtt attggtgttg cgtggttatg gacaattcga gtaataattg attttttgat 4680
gcttttatat atgagttatc gttgtaataa tcttatgaaa aaagggtagc ctgatgatat 4740
atattgtggt attaaattgg aatggggcta tagataccat taattgtgtt aaaagtttaa 4800
tggatttaaa tgttagcgat tataaaatta tcattgttga taactgttct atggataact 4860
catatgatac tataaaagaa aatcttaatt cattatatat tgctgataaa agtatcattg 4920
aggtgaagta tgaggataga aataaatata aaaccttaga aaacgataaa atcatattaa 4980
tacaatctcc gcaaaataat gggtacgcaa gtggtaataa tattggcata gagttcgctc 5040
ttaatcagga gaatatgaaa tacgtctggg ttctgaataa tgatactgaa gtggataaag 5100
aggctttaac tcatttaatt agtaaatgtg attcagataa aagtataggg atttgcggtt 5160
ctcgtttagt ctattttgcc gacagagaga tgcagcaagg actaggtggg gtgcataaca 5220
aatggttatg cactacaaaa aattatgaaa tgggaagatt agtttccaaa aaatatgatg 5280
atgaagtcat tagtaatgat atagattata taattggcgc atcgatgttt ttctctagag 5340
aatgtttgga aacagttgga ttgatgaatg aagaatattt tttatactat gaagagttag 5400
atatttgcct cagagcaaaa gcaaagaact ttaaattagg tatttgctca gaaagtttgg 5460
tttatcataa aataggtgca agtactgatg ggggaaagag catgatggct gatctttgct 5520
caataaaaaa taggctggtc attacagaaa ggttttatcc ccaatattat tggacggtat 5580
ggttgtcact ttttgttgta gcatttaacc gtgctagaag aggtgagttt aataagatga 5640
aaagatgttt gaatgttatg tttaacttca aacgaaacaa aggtagcaaa tgccattaga 5700
atatgcactt aatcatggtg ttaataaatc tatagtttga tatgttatta aagggtattt 5760
aatgaaagtg gcttttttat ctgcttatga tccactatct acatccagtt ggtctggcac 5820
accttattat atgctaaagg cattatcgaa gagaaatatt tccattgaaa tattaggacc 5880
ggtaaatagc tatatgatat acatgttaaa agtatataaa ttaatattaa ggtgtttcgg 5940
aaaagaatat gattatagtc attcgaagtt gctttccagg tattacggta gaatattcgg 6000
taggaaatta aaaaaaattg atggtttgga ttttattatc gcacctgcag gttcctcaca 6060
aattgctttt ttaaaaacaa ccataccaat aatatatcta tcggatacaa catatgatca 6120
attaaaaagc tattatccga atttaaataa aaaaacaatt ataaatgatg aggatgcaag 6180
tttaatcgaa cgcaaggcta ttgaaaaagc aacagtagta tctttcccat ctaaatgggc 6240
aatggatttt tgcaggaatt attacagatt agattttgat aaattagttg aaataccatg 6300
gggggctaat ttatttgatg atattcactt tgctaataaa aatataattc aaaagaatag 6360
ttatacttgt cttttcttgg gagttgattg ggaaagaaaa ggtgggaaaa cagccttgaa 6420
agcaattgaa tatgtaaggc agttatatgg gatcgatgtt agactaaaaa tttgtggatg 6480
tactccgaat caaaagattt tacctacttg ggttgaatta attgataaag tagataaaaa 6540
taacgttgac gaatatcaga aattcatcga tgtgttatct aacgctgata tacttctttt 6600
accaaccatt gctgaatgtt atggaatggt attttgtgaa gctgctgctt ttggattgcc 6660
tgttgtcgct acagatacag gtggagtcag ttctatagtt atcaacgaaa ggacggggat 6720
attaattaaa gacccgttag actataagca ctttggaaat gcaattcata aaataattag 6780
ttccgtagag acttatcaaa actactccca aaacgcaaga attagatata ataatatatt 6840
gcattgggac aattgggcta aaaagataat tgagattatg tatgagcata agaatagaag 6900
aatcaaatag cacaaaaaga attatatgtt tatttatact ttttcttgtt ttccctgatt 6960
ttttgtttta tacattaggg gttgataatt ttagcatttc aacgataatc tcaattacat 7020
tgctttttgt ttttttaaga gctaaaaata tttgcaaaga taattttcta ataatagtag 7080
cgttattcat attgttgtgt tttaactgtt tgttaagtat gctatttaat attgaacagg 7140
ctttaacatt taaagttgta ctttcaatat atagcatctt aataatggca tacgtctcct 7200
cttgttatgc acagacgttg tggttatgtt ctgaagaaat acttaagaga tccgtctttt 7260
atttgttcgc atttctttgc cttattggca ttataagtat tcttttacag aagactgaga 7320
ttatacatga taaaagtatg attctttttc ctgaaccatc agcatttgca ttggttttta 7380
tacctatctt ttcattttgt ttatactata caagaggggg ggggctacta ttgctctata 7440
tattatcttt gggtattgcg ttaggtatcc agaatttaac aatgttggta ggcattgtga 7500
ttagtgtttt tgtgatgaaa aaaataacta taaggcaaac tattgttata cttttggggg 7560
catggatttt ttccatgata ttaagtgatt tagacatttc ttactataca tcgcggcttg 7620
attttaaaaa tactacgaac ctatcagtgc ttgtatatct ttcaggaatt gaaagagctt 7680
tcttgaattt tattacaagt tatggtcttg gtattggttt tcaacaaatg ggagtgaatg 7740
gggagatagg aatatatcaa caaattttag ctgaacttga tgcccctatg ttaaatatat 7800
acgatggctc atttatttct tctaagttaa tatctgagtt tggggttatt ggtgcattaa 7860
tgtgtatttt ctattttttt tatttttccc gattttatct gcgtttcaaa aaaagtaaga 7920
gatattcacc gcagtatatt ttagcatata gcttctacat gtgtttcttc atccctcttt 7980
ttatacgtgg tgctggttat ataaacccct atgtgtttat gttattttca tcaatatttt 8040
tgtgcaaata tcacgctaaa aatatcttga tgaaatctaa tgtccagata gctatataat 8100
agtagattat attatcatta tcacgtaaat tacatattaa tagcatatat gataactagg 8160
acataaataa tgtgcattaa aaaaaaactt aagttaatta aacgatatgg cctttatggt 8220
ggtcttaggc ttcttaaaga tatattctta acaaaatttt tattttgttc aaatgttagg 8280
attattagat acatcaggtg aatgttcaaa gatacattaa tccgatatcc gtgtatattg ataggtaatg gtgatcattg tgggaaagaa tactaaaaaa ttcatagctc aagtcaagtc ctaaggtgat taccctatag gagatattat atatcaatat tcgaaaaaaa ttgaaagtga cagtgccccg ataaaaatat tatataaatt agatggttaa ggggattacc cttatgctca agaaaatact aaaatagtag atatcctcaa tatatagaaa cgtgataaca ttgcatggag aataacttca accagtgaaa ttccatgtta taggattacg ttaatgacta tagcaagtaa atagttcacc gagagcgtgt gtgtagttat ctggtgttcc tatagttgta tgtgcttaca tgctgaacta ttcgtgggtt taaggcaact atttgtttat aggagaacct aaaaaagaac atataagtta tggtttggta tatatttaaa tcatttttat agcttccgaa cttttatcaa attatcagaa tgaagtttta tgttcgctac ggtgaatttt ggggaactga atcttttatt aaagttcaat ggcaatatgg tgattatgaa gtttgattaa tattagaaaa agttgatgca tgttcacatc agtatttatt aactattatt gtggattggc tggcgcaaac agctaaaatt atatcggctg gcaactaaag atggaattat aaaagattat cattgggtat tgccacaatc aaattttatc acagcagttt aagaatgttg agaaataata aactttgaag cttacttttg ctgaaaaatg gattcagata gctaaaacat tataactatt atattagagt aataatgatg cgtggtttat aaatttaaag ggttttaaaa atttggacat taatgattat ttatgttgat gatggaagtg tttatggatg gcggctatta agtgatcata ccttcgtcta gaaaatgtga agtgttgttc gttaaaaaat ttaattttac atagagccga ttccgtgggt atttcgaata gcttacatga ctgcaccgtt ttttttatct ttgttcagca ttgttagtcg ataaaaagga ttatcatacg atggtactga tacatttcct ttatttgttt acaaaaaatg caaaaactag acacaagtaa cattgactgg attataatcg ttgccctctg aaaacatgcg aataataaca tttctctttc tatataatta ttagttttgg ccgtagtttc ataatgtcat atcatggtat ggccccttga caatattacc gtggtgagat ataactatga aaccggaggc atgtaaattt tgaatttata tataacttgc tattacagca ctataaatat tttttatggg gcagtggcta ccctgaagat tgtgaggata tgctgcacaa aaataagtat cggttacctt cccatcgaaa gatatttgcg atattttcca aaatatgcat ttttgaacag tttcacatgg gaagatttaa aaaaaaattg tagcagtgtc ttaaccccga gtaatgatta aaaaggtttt cattggagaa tattggtaga tttttctaaa atctgcacct aggtgcgtgt tcctaataat gcgtatgcaa ccctttaccg attgcactgg gagtatccag aatagattat aatgttagtg ttaagctatc cttttataca aaaaaagaat atttgccctt ttttacccag atattacaag gcaaaaagaa aatgcaaccg ctagaaacgt gcagacttac tttgacgatg gaagatataa tttattgaat ccatgatgac aataatagtt cgtaacctat atatataatt tgtattcata taagtttagc
8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200
acattatgtc tttatcgaga ttttactaaa agcaaacatg attattcaat acggagtttt 10260
ccaactttat atgattttct ttgttctttt ttattggggg tgaataaaag taaaattaag 10320
aaggaaaata tactttctga tactgtagtt gattggtgtg ctggctcatt tatgcttatt 10380
catgctttaa gtttcttaaa tgtgaatggt tttgatcaaa aatattttat gtattgtgaa 10440
gatattgacc tttgtatgcg tttaaaatta agtggagtag atctttacta tactccccat 10500
tttgatgcta ttcattatgc gcagcatgaa aatagaagaa tatttactaa agcatttcga 10560
tggcatataa ggagtattac gcgctacata ttacggaaac caattctttc ttataaaaac 10620
tatagaaaaa ttacatccga actggtaaag tga 10653
<210> 13
<211> 652
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> детоксифицированный белок EPA, содержащий 4 оптимизированных последовательности N-гликозилирования
<400> 13
Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr Gly Ser Gly Gly Gly Lys
1 5 10 15
Leu Ala Glu Glu Ala Phe Asp Leu Trp Asn Glu Cys Ala Lys Ala Cys
20 25 30
Val Leu Asp Leu Lys Asp Gly Val Arg Ser Ser Arg Met Ser Val Asp
35 40 45
Pro Ala Ile Ala Asp Thr Asn Gly Gln Gly Val Leu His Tyr Ser Met
50 55 60
Val Leu Glu Gly Gly Asn Asp Ala Leu Lys Leu Ala Ile Asp Asn Ala
65 70 75 80
Leu Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Thr Ile Arg Leu Glu Gly Gly Val
85 90 95
Glu Pro Asn Lys Pro Val Arg Tyr Ser Tyr Thr Arg Gln Ala Arg Gly
100 105 110
Ser Trp Ser Leu Asn Trp Leu Val Pro Ile Gly His Glu Lys Pro Ser
115 120 125
Asn Ile Lys Val Phe Ile His Glu Leu Asn Ala Gly Asn Gln Leu Ser
130 135 140
His Met Ser Pro lie Tyr Thr lie Glu Met Gly Asp Glu Leu Leu Ala
145 150 155 160
Lys Leu Ala Arg Asp Ala Thr Phe Phe Val Arg Ala His Glu Ser Asn
165 170 175
Glu Met Gln Pro Thr Leu Ala Ile Ser His Ala Gly Val Ser Val Val
180 185 190
Met Ala Gln Ala Gln Pro Arg Arg Glu Lys Arg Trp Ser Glu Trp Ala
195 200 205
Ser Gly Lys Val Leu Cys Leu Leu Asp Pro Leu Asp Gly Val Tyr Asn
210 215 220
Tyr Leu Ala Gln Gln Arg Cys Asn Leu Asp Asp Thr Trp Glu Gly Lys
225 230 235 240
Ile Tyr Arg Val Leu Ala Gly Asn Pro Ala Lys His Asp Leu Asp Ile
245 250 255
Lys Asp Asn Asn Asn Ser Thr Pro Thr Val Ile Ser His Arg Leu His
260 265 270
Phe Pro Glu Gly Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ala His Gln Ala Cys
275 280 285
His Leu Pro Leu Glu Ala Phe Thr Arg His Arg Gln Pro Arg Gly Trp
290 295 300
Glu Gln Leu Glu Gln Cys Gly Tyr Pro Val Gln Arg Leu Val Ala Leu
305 310 315 320
Tyr Leu Ala Ala Arg Leu Ser Trp Asn Gln Val Asp Gln Val Ile Arg
325 330 335
Asn Ala Leu Ala Ser Pro Gly Ser Gly Gly Asp Leu Gly Glu Ala Ile
340 345 350
Arg Glu Gln Pro Glu Gln Ala Arg Leu Ala Leu Thr Leu Ala Ala Ala
355 360 365
Glu Ser Glu Arg Phe Val Arg Gln Gly Thr Gly Asn Asp Glu Ala Gly
370 375 380
Ala Ala Ser Ala Asp Val Val Ser Leu Thr Cys Pro Val Ala Lys Asp
385 390 395 400
Gin Asn Arg Thr Lys Gly Glu Cys Ala Gly Pro Ala Asp Ser Gly Asp
405 410 415
Ala Leu Leu Glu Arg Asn Tyr Pro Thr Gly Ala Glu Phe Leu Gly Asp
420 425 430
Gly Gly Asp Val Ser Phe Ser Thr Arg Gly Thr Gln Asn Trp Thr Val
435 440 445
Glu Arg Leu Leu Gln Ala His Arg Gln Leu Glu Glu Arg Gly Tyr Val
450 455 460
Phe Val Gly Tyr His Gly Thr Phe Leu Glu Ala Ala Gln Ser Ile Val
465 470 475 480
Phe Gly Gly Val Arg Ala Arg Ser Gln Asp Leu Asp Ala Ile Trp Arg
485 490 495
Gly Phe Tyr Ile Ala Gly Asp Pro Ala Leu Ala Tyr Gly Tyr Ala Gln
500 505 510
Asp Gln Glu Pro Asp Ala Arg Gly Arg Ile Arg Asn Gly Ala Leu Leu
515 520 525
Arg Val Tyr Val Pro Arg Trp Ser Leu Pro Gly Phe Tyr Arg Thr Gly
530 535 540
Leu Thr Leu Ala Ala Pro Glu Ala Ala Gly Glu Val Glu Arg Leu Ile
545 550 555 560
Gly His Pro Leu Pro Leu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Gly Pro Glu Glu
565 570 575
Glu Gly Gly Arg Val Thr Ile Leu Gly Trp Pro Leu Ala Glu Arg Thr
580 585 590
Val Val Ile Pro Ser Ala Ile Pro Thr Asp Pro Arg Asn Val Gly Gly
595 600 605
Asp Leu Asp Pro Ser Ser Ile Pro Asp Lys Glu Gln Ala Ile Ser Ala
610 615 620
Leu Pro Asp Tyr Ala Ser Gln Pro Gly Lys Pro Pro Arg Glu Asp Leu
625 630 635 640
Lys Leu Gly Ser Gly Gly Gly Asp Gln Asn Ala Thr 645 650
<210> 14
<211> 3
<212> PRT
<220>
^ о о -> ^
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> вариант <222> (2)
^ О О -> ^
<223> консенсусная последовательность N-гликозилирования
<223> Xaa = любая аминокислота
<220>
(3)..(3)
<221> вариант
<222> (3)..(3)
^ О О О ^
<223> Xaa = Ser или Thr
<400> 14
Asn Xaa Xaa
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<223> консенсусная последовательность N-гликозилирования
<220>
(1)..(1)
<221> вариант
<222> (1)..(1)
^ О О О ^
<223> Xaa = Asp или Glu
<223> Xaa = независимо выбрана из любой аминокислоты, за исключением Pro
<220>
<221> вариант
<222> (4)..(4)
<223> Xaa = независимо выбрана из любой аминокислоты, за исключением Pro
<220>
(5)..(5)
<221> вариант
<222> (5)..(5)
^ О О О ^
<223> Xaa = Ser или Thr
<400> 15
Xaa Xaa Asn Xaa Xaa 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, содержащая биоконъюгат антигена 025В Е. coli, ковалентно связанный с белком-носителем, где антиген 025В Е. coli содержит структуру формулы 025В: D-GIc
-> D-GIc
L-Rha2Ac
D-GlcNAc
L-Rha
где n представляет собой целое число от 1 до 30.
2. Композиция по п. 1, где антиген 025В Е. coli содержит структуру формулы 025В':
D-GIc
D-GIc А
1,3
-*-L-Rha2Ac
1,3
-> D-GlcNAc-
L-Rha
где п представляет собой целое число от 1 до 30.
3. Композиция по п. 1 или 2, где антиген 025В Е. coli ковалентно связан с остатком Asn в белке-носителе.
4. Композиция по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащая (1) биоконъюгат 01 А, содержащий антиген 01А Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, (2) биоконъюгат 02, содержащий антиген 02 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя, и (3) биоконъюгат 06, содержащий антиген 06 Е. coli, ковалентно связанный с остатком Asn белка-носителя.
5. Композиция по п. 4, где антиген 01А, антиген 06 и антиген 02 содержат следующие формулы, соответственно:
а. Формула 01 А'
> L-Rha
А 1.3
L-Rha
1,3
L-Rha
1,4
D-GlcNAc-
1,4
D-ManNAc
Формула 06Glc'
1,4
1,3
а Р Р
> D-Gal N Ас > D-Man > D-Man > D-GlcNAc
1,3
1,2
D-GIc
Формула 02' > L-Rha а *• L-Rha-
А 1.2
1,3
L-Rha
1,4
D-GlcNAc
D-Fuc3NAc
6. Композиция по любому из пп. 1-5, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА), CRM197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксифицированного гемолизина А из S. aureus, фактора агглютинации А, фактора агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильного энтеротоксина Е. coli, детоксифицированных вариантов термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, белка Sat Е. coli, домена-пассажира белка Sat Е. coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, АсгА С. jejuni и природных гликопротеинов С. jejuni.
7. Композиция по п. 6, где белок-носитель представляет собой детоксифицированный ЕРА.
8. Композиция по любому из пп. 3-7, где остаток Asn белка-носителя находится в консенсусной последовательности Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты за исключением Pro (SEQ ID N0:15).
6.
9. Способ вакцинации субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по любому из пп. 1-8.
10. Способ индукции иммунного ответа у субъекта против внекишечных патогенных Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по любому из пп. 1-8.
11. Способ индукции образования опсонофагоцитирующих антител у субъекта, которые являются специфичными к внекишечным патогенным Escherichia coli, включающий введение субъекту эффективного количества композиции по любому из пп. 1-8.
12. Способ по любому из пп. 9-11, где субъект имеет риск развития инфекции мочевыводящих путей.
13. Способ по любому из пп. 9-11, где субъект имеет риск развития бактериемии.
14. Способ по любому из пп. 9-11, где субъект имеет риск развития сепсиса.
15. Способ по любому из пп. 9-14, где субъект представляет собой человека.
16. Прокариотическая клетка-хозяин, содержащая:
а. нуклеотидную последовательность, кодирующую:
1. сГЮР-глюкозо-4,6-дегидратазу;
2. сГЮР-6-дезокси-0-глюкозо-3,5-эпимеразу;
3. глюкозо-1 -фосфат-тимидилилтрансферазу;
4. а!ТОР-4-дегидрорамнозо-3,5-эпимеразу;
5. О-антиген-флиппазу;
6. dTDP-Rha:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
7. UDP-Glc:Glc-Rha(Ac)-GlcNAc-UPP (3-1,6-гликозилтрансферазу;
8. О-антиген-полимеразу;
9. О-ацетилтрансферазу;
10. UDP-Glc:Rha-GlcNAc-UPP а-1,3-гликозилтрансферазу и
11. dTDP-Rha:GlcNAc-UPP а-1,3-рамнозилтрансферазу;
б. нуклеотидную последовательность, кодирующую олигосахарил-
трансферазу; и
в. нуклеотидную последовательность, кодирующую белок-носитель, содержащий консенсусную последовательность Asp(Glu)-X-Asn-Z-Ser(Thr), где X и Z независимо выбраны из любой природной аминокислоты, за исключением Pro (SEQ ID N0:15).
17. Клетка-хозяин по п. 16, где по меньшей мере один из гена waaL, гена
gtrA, гена gtrB, гена gtrS или кластера rfb удален или функционально
инактивирован в геноме клетки-хозяина.
18. Клетка-хозяин по п. 16 или 17, где белок-носитель выбран из группы, состоящей из детоксифицированного экзотоксина А из P. aeruginosa (ЕРА), CRM197, мальтозосвязывающего белка (МВР), дифтерийного анатоксина, столбнячного анатоксина, детоксифицированного гемолизина А из S. aureus, фактора агглютинации А, фактора агглютинации В, FimH Е. coli, FimHC Е. coli, термолабильного энтеротоксина Е. coli, детоксифицированных вариантов термолабильного энтеротоксина Е. coli, субъединицы В холерного токсина (СТВ), холерного токсина, детоксифицированных вариантов холерного токсина, белка Sat Е. coli, домена-пассажира белка Sat Е. coli, пневмолизина Streptococcus pneumoniae и его детоксифицированных вариантов, АсгА С. jejuni и природных гликопротеинов С. jejuni.
19. Клетка-хозяин по любому из пп. 16-18, представляющая собой клетку-хозяина Е. coli.
20. Способ получения /V-гликозилированного белка-носителя,
содержащего антиген 025В Е. coli, включающий:
а. культивирование клетки-хозяина по любому из пп. 16-19; и
б. очистку /V-гликозилированного белка-носителя, который содержит
антиген 025В Е. coli.
Фиг. 1
Кластер rfb О-антигена (г/2Ю25Л)
ga/F rmlBrmiDrmlArmlCwzx wekA wekB wzy wekC fnIA fnIB fnIC wbuB wbuC gnd
D-Olc
Я.ОО//025А
D-Ole
1,3
L-PuoNAo.
1,3
D-OkNAo
L-Rha
Фиг. 2
E. cell 025А
D-GIc
L-FucNAc
D-GlcNAc
D-GIc
D-GlcNAc
L-Rha
D-GIc
Е. coll 016
1,2
D-Galf
D-GIc
1,3
a. I 6 ¦*> D-GlcNAc
1,3
Фиг. ЗА
025Л
96% 96% 96% 92% %':¦ -> l 92% 79%
grfF rmB тЮ пЫА nrtiC vox mkA mkB my ИОД Ш ИШ. gnf
025B -j
016
gaF гтй гтЮ rmlA miC wzx ф wzy nbbl vfcbJ wbbK wbbL gnd
Фиг. ЗВ
о и
о К
о а
Увеличение мультивалентности ->
I N=371 из 1654 группы -N=371 из 1654 группы
MSU F 18-60 MSU F 18-60
о ф
о о ф
о ш о ф
о ф
о о ф
=1 о го о ф
о о ф
о го о ф
о и
о го о ф
о о ф
о го о ф
=1 о о ф
о го о ф
о о ф
о о ф
о го о ф
=1 о о ф
о ч
80%
сг сг о" су
о oN о о
серотип Фиг. 4
& & О4 <$> & 0* 0Ф О* ^ <$> ^ ^ & <ф> гф
серебро
ПИНИИ
ли^ А а А л
1а-025
Фиг. 5 А-В
I 800 FLUfl(tm) uped 38 ("")
160 FLIH(tm) up§c436 (-)
Фиг. 7А
2000
1800
i 1S00
¦е- 1400
I 1200 о
? iooo
800
s soo
400
200 0
я о
3 я
660 600 550 500 450 400 ? 350 300 250 200 150 100 50 0
Glc FucNAc
025А - 025В
GlcNAc Rha
1 1 1
,",nl^L.
i i
i i - i
I i ..... i ,...= .. i i f I
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
минуты
Фиг. 9
К о со сг
я CD
3 я
кДа fSMT : кДа
кумасси а ЕРА а 025
Фиг. 10
Кластер О-антигена 01
I
oa/F ляВ лшо тИ паю wzx лиаЧ vnW my wetoV waftO pxf
&CO//01A.01A1
L-Rha
% ft
L-Rha ^L-Rha D-OlcNAc
1,3
1,3
1,4
D-ManNAc
&00//01B
L-Rha
1 i
1 2
L-Rha a . D-Oal a P-OfcNAc
1,3
Јco//01C
D-ManNAc
L4№a
1 2
1,3
L-Rha , D-Gal .CMMcHAc
1,3
cr Sc
я о
ta Я о
X s"
43 Я
p-ManNAc
Фиг. 12
¦~i О
2 а Я п> я я
црес140
- ирее002
60 70 80 80 100110120130140
минуты
Фиг. 14А
Кластер О-антигена Об (rfM
1
gaF с209в С2864 С2863С2862 С2061 C2B0Q С2ВВ9 С2008 таяв (wzy)
Фиг. 17А
ftcotfotoicmc(".9. ttrtbieeuoiisn)
1,4
p|.2
D-CHeNAc
1,4"
1,3
¦"D-0HcHAO
Фиг. 17B
250
200
150
2BRUs
to to
1 BRU
100
SBRUs
я о
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140
минуты
3 я
Фиг. 18A
A -i
ga/F rmlB m?/D nniA fdtAfdtC fdtB wzx wekPrmlC wzy wekQwekR wekS grid
L-Rha 1 <2 * L"Rha
1,3
L-Rha
1.4
¦* D-GlcNAc
X о
D-Fuc3NAc
Фиг. 19 A-B
s n>
3 я
CD Я CD Я
////////////
55 - -
^ ^ ^
lil1*
¦¦-.'.'.""w-v
W ^ ^ й ^
'IslB ЩИР- ЯНВ lliB ЯВЯт ШЯШ ШШШш*
' '?Т!1Ш 'Щ9тШ'. ШШШш ЗЩрй - ^^^^В;' ''ЧИР?' ЯВВЕ
2 о
& Ф О
3 О
Фиг. 20 А-В
40 50 60 70 80 90 100110120130140150
минуты
Фиг. 21
кДа
iV 8ш
а МВР-025В а МВР-025А
Фиг. 22
p=n.s.
р=0.0008*** р=0.0008*
I I I I
О ОООО
ООО
1 1 1 1-
св-
ерит. 25
р= n.s.
р= 0.0010*
р= 0.0009*
ООО
тттттт
Фиг. 26
p=n.s.
р=0.0018** р=0.0010**
I II
Q IS J
з- п О • Ў
¦8 J
Q (О
9? А &>
Фиг. 27
р = 0.0007***
р= 0.0005
р = 0.0063
оооооо
•••***
.О*
Фиг. 28
0.004 мкг 0.04 мкг 0.4 мкг
Доза
4 мкг
Фиг. 29 А
0,004 мкг 0,04 мкг 0,4 мкг
Доза
4 мкг
Фиг. 29В
Моновалентная: до иммунизации Моновалентная: после иммунизации
о о
ст.
7000п
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0,004 мкг 0,04 мкг 0,4 мкг
Доза
4 мкг
Фиг. 29С
IgG титр анти-01 антигена
IgG титр анти-02 антигена
1000000
1ооооо1
10000
о юоо ш
100 10
иг ^г:
П_Сутки 1 П_Сутки 30 В_Сутки 1 В_Сутки 30
1000000' 100000-
1000С 1000
1"'
3 F===3
П_Сутки 1 П_Сутки 30 В_Сутки 1 В_Сутки 30
IgG титр анти-06 антигена
IgG титр анти-025Ь антигена
1000000
1ооооо
J ^3 ТГ
10000
I юоо^ [
100| 10'
П_Сутки 1 П_Сутки 30 В_Сутки 1 В_Сутки 30
I Ш
1000000
10000 1000
1" 10
х, л:
П_Сутки 1 П_Сутки 30 В_Сутки 1 В_Сутки 30
Фиг. 30
100000
I 1
****
I 1
О О
1000
L Л
ст.
100
uVuV
V2 V4
V2 V4
Плацебо
Вакцина
Фиг. 31А
о о
ст.
1000-
100-
X, J
.VMVMVMVM
Плацебо Фиг. 31В
Вакцина
о о
ст.
10000-
1000
100
Плацебо
Фиг. 31С
Вакцина
025В
о ю
6000-
о) 2000Н
d0 d30 d0 d30 dO d30 dO d30
Вакцина
Плацебо
Вакцина
Плацебо
025А
025В
Фиг. 32
109
112
112
113
113
114
114
123
123
123
123
134
137
137
172
172
172
172
172
172
172
172
173
173
173
173
174
174
174
174
174
174
174
174
176
176
176
176
176
176
176
176
176
176
176
176
176
176
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
8 Новый полисахарид и его применения
8 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
12 Новый полисахарид и его применения
12 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
25 Новый полисахарид и его применения
25 Новый полисахарид и его применения
26 Новый полисахарид и его применения
26 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
30 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
32 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
34 Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения
Новый полисахарид и его применения