[RU]

В настоящем описании представлены композиции и способы для формирования иммуногенного ответа в организме человека. Такие композиции содержат иммуногенный биологический агент, заключенный в агент (ii), который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку человека, при этом агент (ii) представляет собой энтеросолюбильное покрытие (например, Eudragit ®), которое обладает пороговыми значениями рН 5,8-6,8. Кроме того, представлены способы для разработки таких композиций, например, для вакцин.

(57) Реферат / Формула:

В настоящем описании представлены композиции и способы для формирования иммуногенного ответа в организме человека. Такие композиции содержат иммуногенный биологический агент, заключенный в агент (ii), который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку человека, при этом агент (ii) представляет собой энтеросолюбильное покрытие (например, Eudragit ®), которое обладает пороговыми значениями рН 5,8-6,8. Кроме того, представлены способы для разработки таких композиций, например, для вакцин.

---

Евразийское (2D 201691458 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/00 (2006.01)
2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.02.20
(54) СОСТАВЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ В ТОНКУЮ КИШКУ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
61/942,386 2014.02.20
PCT/US2015/016921
WO 2015/127278 2015.08.27
Заявитель:
ВЭКСАРТ, ИНК. (US)
Изобретатель:
Такер Шон, Трагер Джордж (US)
Представитель: Нилова М.И. (RU)
(57) В настоящем описании представлены композиции и способы для формирования иммуно-генного ответа в организме человека. Такие композиции содержат иммуногенный биологический агент, заключенный в агент (ii), который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку человека, при этом агент (ii) представляет собой энтеросолюбильное покрытие (например, Eudragit(r)), которое обладает пороговыми значениями рН 5,8-6,8. Кроме того, представлены способы для разработки таких композиций, например, для вакцин.
<1
СОСТАВЫ ДЛЯ ДОСТАВКИ В ТОНКУЮ КИШКУ
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/942386, поданной 20 февраля 2014 г., раскрытие которой полностью 5 включено в настоящую заявку.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Вакцины являются важными средствами для предотвращения и/или лечения ряда заболеваний и расстройств (например, вирусной инфекции, бактериальной инфекции и рака). Многократную вакцинацию обычно проводят с применением инъекции, что снижает участие 10 в вакцинации в связи с тем, что к пункту вакцинации необходимо ехать, а также в связи с неприязнью к инъекциям. Более того, инъекция вакцин требует применения стерильного набора, такого как шприцы и иглы, а также практикующего специалиста для введения.
[0003] В случае вакцины против гриппа ежегодно проводятся крупномасштабные кампании для получения достаточного количества оплодотворенных яиц для осуществления сбора и
15 обработки достаточного количества вируса в целях удовлетворения потребностей рынка. Клеточная культура или гемагглютинин (НА) растительного происхождения могут снизить нагрузку от процесса получения и обработки яиц, однако данные подходы до сих пор требуют дорогостоящего процесса стерильного розлива и обработки для производства индивидуальных игл для шприцев, которые необходимо утилизировать как биологически опасные вещества. Во
20 время пандемии могут закрываться школы и может быть введен мандат на социальное дистанцирование, и в тоже время массовая иммунизация против гриппа, как правило, требует образования очередей из субъектов в медицинских клиниках за инъекциями. Пероральные вакцины против гриппа или других патогенов можно отправлять посредством почты, таким образом избегая большинства контактов от человека к человеку. Кроме того, таблетирование
25 является быстрым санитарным процессом, который не требует дорогостоящего процесса стерильного розлива и обработки, который требуется для инъецируемых вакцин.
[0004] Вакцины, которые могут быть доставлены непарентеральным способом, например, перорально или через слизистую оболочку описаны в патенте США № 8222224.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 5 [0001] В настоящем описании представлены способы и композиции для более эффективной вакцинации субъекта (человека или не человека), включая доставку иммуногенного биологического агента исключительно к подвздошной кишке субъекта. Таким образом в раскрытии настоящего изобретения предложены более эффективные и действенные вакцины, а также представлена их эффективность в организме человека.
10 [0002] В настоящем описании представлены иммуногенные композиции для продуцирования иммунного ответа у субъекта, содержащие иммуногенный биологический агент, заключенный в агент, который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку субъекта. В некоторых вариантах реализации субъектом является человек. В некоторых вариантах реализации субъект представляет собой животное,
15 не являющееся человеком, например, примата, мышь, крысу, кролика, лошадь, собаку, кошку или птицу. В некоторых вариантах реализации иммуногенный биологический агент выбран из иммуногенного полипептида (например, вирусоподобной частицы, гликопротеина, фосфопротеина), углевода и липида.
[0003] В некоторых вариантах реализации иммуногенный биологический агент представляет 20 собой вектор экспрессии, кодирующий иммуногенный полипептид. В некоторых вариантах реализации вектор экспрессии представляет собой вирусный вектор (например, аденовирусный, AAV, ретровирусный или лентивирусный). В некоторых вариантах реализации вирусный вектор является ослабленным или репликативно несостоятельным. В некоторых вариантах реализации вектор экспрессии содержит промотор (например, CMV, 25 ранний или поздний SV40, Р-актин и т.д.), функционально связанный с последовательностью, кодирующей иммуногенный полипептид. В некоторых вариантах реализации вектор экспрессии дополнительно кодирует двухцепочечную РНК (дсРНК). В некоторых вариантах реализации последовательность, кодирующая дсРНК, функционально связана с промотором, например, либо с тем же промотором (с применением Участка Внутренней Посадки Рибосомы 30 (УВПР)), либо с другим промотором, таким как промотором, функционально связанным с последовательностью, кодирующей иммуногенный полипептид.
[0004] В некоторых вариантах реализации иммуногенная композиция дополнительно содержит по меньшей мере один адъювант, например, агонист TLR3. В некоторых вариантах реализации агонист TLR3 представляет собой дсРНК или миметик дсРНК.
[0005] В некоторых вариантах реализации по меньшей мере 50% иммуногенного 5 биологического агента доставляется (высвобождается) в подвздошную кишку, например, по меньшей мере 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% или более иммуногенного биологического агента присутствует во введенной композиции. В некоторых вариантах реализации агент, который направляет доставку (например, энтеросолюбильное покрытие или матрица), начинает растворяться до того, как иммуногенная композиция достигает подвздошной кишки, 10 однако удерживает по меньшей мере 50% иммуногенного биологического агента до тех пор, пока иммуногенная композиции не достигнет подвздошной кишки. В некоторых вариантах реализации агент, который направляет доставку, удерживает иммуногенный биологический агент при прохождении через желудок, двенадцатиперстную кишку, тощую кишку, но высвобождает иммуногенный биологический агент в подвздошной кишке.
15 [0006] В некоторых вариантах реализации агент, который направляет доставку, представляет собой энтеросолюбильное покрытие. То есть, иммуногенный биологический агент покрыт энтеросолюбильным покрытием. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие разлагается при значениях рН > 5, например, при 5,2, 5,5, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 7,0, 5,5-6,8, 5,8-6,8 и т.д. В некоторых вариантах реализации
20 энтеросолюбильное покрытие выбрано из группы, состоящей из сополимера метакриловой кислоты и этилакрилата (например, 1:1) типа А; сополимера метакриловой кислоты типа С; смеси метакриловых сополимеров типа А и С; и Time Clock(r). В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие не включает фталат ацетата целлюлозы (ФАЦ). В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие имеет толщину, которая в
25 результате приводит к высвобождению иммуногенного биологического агента в подвздошной кишке. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие представляет собой покрытие на основе сополимера метакриловой кислоты со степенью покрытия в 5,5-10 миллиграмм на квадратный сантиметр. В некоторых вариантах реализации агент, который направляет доставку, представляет собой радиоуправляемую капсулу.
30 [0007] В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит поли(метилакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1. В некоторых вариантах реализации
энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100, триэтилцитрат и тальк, например, 1, 2, 3, 4 или 1-4 части Eudragit(r) L-100, 1-2 части триэтилцитрата и 1-2 части талька. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит смесь поли(метакриловая 5 кислота-со-метилметакрилат) 1:1 и поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1. В некоторых вариантах реализации отношение поли(метилакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 к поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1 составляет от 1:4 до 4:1, например, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)L100-55. В некоторых вариантах
10 реализации энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)Ll00-55, триэтилцитрат и тальк, например, 1-4 части Eudragit(r)L-100 и Eudragit(r)Ll00-55, 1-2 части триэтилцитрата и 1-2 части талька. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 и поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2. В некоторых вариантах реализации отношение
15 поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 к поли(метакриловая кислота-со-метилакрилат) 1:2 составляет от 1:2 до 2:1. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r)L-100 и Eudragit(r)S100. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)S100, триэтилцитрат и тальк, например, 1-4 части Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)S 100,
20 1-2 части триэтилцитрата и 1-2 части талька. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит смесь поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2 и поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1. В некоторых вариантах реализации отношение поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2 к поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1 составляет от 1:4 до 4:1, например, 1:3, 1:2,
25 1:1, 2:1 или 3:1. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r) L-100-5 5 и Eudragit(r) S100. В некоторых вариантах реализации энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100-55 и Eudragit(r)S 100, триэтилцитрат и тальк, например, 1-4 части Eudragit(r) L-100-55 и Eudragit(r)S 100, 1-2 части триэтилцитрата и 12 части талька.
30 [0008] В некоторых вариантах реализации иммуногенная композиция представлена в форме таблетки или капсулы, например, в форме прессованной таблетки, покрытой энтеросолюбильным покрытием. В некоторых вариантах реализации иммуногенную
композицию заключают в полимерную капсулу, содержащую желатин, гидроксипропилметилцеллюлозу, крахмал или пуллулан. В некоторых вариантах реализации иммуногенная композиция представлена в форме микрочастиц менее 2 мм в диаметре, например, каждую микрочастицу покрывали энтеросолюбильным покрытие как описано в 5 настоящем описании.
[0009] Дополнительно предложен способ доставки иммуногенной композиции в подвздошную кишку субъекта, включающий пероральное введение иммуногенной композиции как описано выше (то есть иммуногенного биологического агента, заключенного в агент, который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную
10 кишку субъекта, необязательно содержащего адъювант) субъекту. В некоторых вариантах реализации субъектом является человек. В некоторых вариантах реализации субъектом является животное, не являющееся человеком. В некоторых вариантах реализации способ приводит к иммунному ответу у субъекта, который по меньшей мере на 10% выше, например, по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 100% или более иммунного ответа
15 у субъекта (либо у того же субъекта в различное время, либо у различного субъекта), получающего такую же иммуногенную композицию не напрямую в подвздошную кишку. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ у субъекта по меньшей мере в 1,5 раза выше (например, в 2 раза, 2,5 раза, 5 раз или более) иммунного ответа у субъекта (либо у того же субъекта в различное время, либо у различного субъекта), получающего такую же
20 иммуногенную композицию не напрямую в подвздошную кишку. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой увеличение антител, специфичных к иммуногенному биологическому агенту. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой клеточный иммунный ответ, например, увеличение цитокинов, таких как IFN-y. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой иммунизацию
25 (например, субъект является устойчивым к инфицированию вирусом, бактерией и т.д., от которых получили иммуногенный биологический агент).
[0010] Дополнительно предложены способы продуцирования повышенного иммунного ответа у субъекта, включающие пероральное введение иммуногенной композиции как описано выше (то есть иммуногенного биологического агента, заключенного в агент, который 30 направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку субъекта, необязательно содержащего адъювант) субъекту, например, человеческому субъекту. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ увеличивается по меньшей мере на 10%,
например, по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 100% или более по сравнению с иммунным ответом у субъекта (либо у того же субъекта в различное время, либо у различного субъекта), получающего такую же иммуногенную композицию не напрямую в подвздошную кишку. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ у субъекта 5 увеличен по меньшей мере в 1,5 раза (например, в 2 раза, 2,5 раза, 5 раз или более) по сравнению с иммунным ответом у субъекта (либо у того же субъекта в различное время, либо у различного субъекта), получающего такую же иммуногенную композицию не напрямую в подвздошную кишку. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой увеличение антител, специфичных к иммуногенному биологическому агенту. В некоторых 10 вариантах реализации иммунный ответ представляет собой клеточный иммунный ответ, например, увеличение цитокинов, таких как IFN-y. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ представляет собой иммунизацию (например, субъект является устойчивым к инфицированию вирусом, бактерией и т.д., от которых получили иммуногенный биологический агент).
15 КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[ООН] Фигура 1. Секретирующие Антитела Клетки (САК), специфичные к НА, измеряли в периферической крови через 7 дней после того, как субъекты получали радиоуправляемую капсулу, содержащую rAd-HA-дсРНК. Субъектов распределяли по группам случайным образом для того, чтобы высвобождение вакцины происходило у них либо в подвздошной
20 кишке, либо в тощей кишке. (N=12 в каждой группе). Результаты показывают, что 12 из 12 субъектов с вакциной, доставленной в подвздошную кишку, были способны вырабатывать секретирующие антитела В-клетки, которые распознают НА, в то время как только 9 из 12 субъектов, которые получали вакцину в тощую кишку, были способны вырабатывать антиген-специфичные В-клетки. Среднее количество клеток, секретирующих иммуноглобулин А и G
25 (IgA и IgG САК), было значительно выше в подвздошной кишке, нежели чем в тощей кишке.
[0012] Фигура 2. Т-клеточный ответ на rAd-HA-дсРНК определяли посредством обнаружения уровней IFN-y через 7 дней после введения. Все индивидуумы в группе с доставкой в подвздошную кишку показали более высокие уровни IFN-y по сравнению с 75% группы с доставкой в тощую кишку. Средний уровень IFN-y также был значительно выше в 30 группе с доставкой в подвздошную кишку.
[0013] Фигура 3. Образования микронейтрализующих антител (МН) к гриппу А/СА/07/2009 измеряли на нулевой день и 28-й день после иммунизации. Кратное увеличение в титрах МН наносили на график для отдельных субъектов, у которых исходный титр МН был меньше или равен 40. Результаты показали, что доставка в подвздошную кишку приводила к высокому 5 проценту субъектов (9 из 10) с увеличенными титрами МН после иммунизации по сравнению с доставкой в тощую кишку (6 из 10).
[0014] Фигура 4. Таблетки изготавливали с применением микрокристаллической целлюлозы и крахмала с 10% сульфата бария в качестве рентгеноконтрастного материала. Данные таблетки представляли собой таблетки с энтеросолюбильным покрытием Eudragit L100(r), и их 10 получали самки яванских макак при помощи перорального желудочного зонда. Рентгенографии делали через время после введения. А. Таблетка в желудке, где стрелка указывает в сторону таблетки. Б. Через час таблетку можно увидеть в кишечнике, белое пятно слева от позвоночника со стрелкой, направленной в его сторону. Она растворяется в кишечнике в течение следующих двух часов и не может быть видна.
15 [0015] Фигура 5. Число САК, зарегистрированное на 7 и 35 день, через 7 дней после каждой иммунизации. Фоновые содержания САК на нулевой и 28 день были очень незначительны, и их не наносили на график. Средние значения ответов для 7 дня показаны для каждой группы, получающей лечение, при помощи горизонтальной линии.
[0016] Фигура 6. Кратное увеличение в титрах МН для отдельных субъектов. Затемненные 20 столбцы указывают, где титры росли между 28 и 56 днем, в то время как светлые столбцы представляют ответ после начальной иммунизации. Линия показана для двукратных увеличений в МН для того, чтобы показать, у каких субъектов было обнаруживаемое образование нейтрализующих антител. В контрольной группе ни у одного субъекта не было ответа, в то время как у 3 субъектов в группе с низкой дозой и 7 субъектов в группе с высокой 25 дозой было двукратное или более значительное образование нейтрализующих антител к гриппу после иммунизации. Плацебо N=10, низкая доза и высокая доза N=11.
[0017] Фигура 7. Образования антител после однократной пероральной иммунизации. А. Титры антител HAI (ингибирование гемагглютинации) до и после иммунизации (день 0 и 28 соответственно) представлены для отдельных субъектов. Б. Значения средних геометрических 30 титров (СГТ) HAI ко времени. Титры HAI измеряли на нулевой, 3 и 6 месяцы после иммунизации для того, чтобы оценить устойчивость образования антител. В. Титры МН до и
после иммунизации представлены для отдельных субъектов. Г. Ответы САК после иммунизации. Число IgG и IgA САК (на 106 мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК)), зарегистрированное через 7 дней после иммунизации.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 5 [0018] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что доставка иммуногенного биологического агента к конкретной части тонкой кишки, т.е. подвздошной кишке, в результате приводит к гораздо большему терапевтическому ответу чем тогда, когда агент не является направленным или направленным на иное место. Это позволяет разрабатывать более эффективные вакцины, снижать затраты на материалы и снижать побочные эффекты для 10 реципиента.
I. Определения
[0019] Термин "иммуногенный" относится к способности агента вызывать у хозяина либо гуморальный, либо опосредованный клетками иммунный ответ. Пммуногенные агенты являются, как правило, "чужеродными" к хозяину, например, от различных видов или от 15 бактерий, вирусов или грибков. Нечужеродный агент может быть иммуногенным, например, в случае аутоиммунного ответа. Конкретные агенты, специфичные к раковым клеткам, могут быть использованы в качестве иммуногенных агентов, что позволяет иммунной системе хозяина бороться с раком.
[0020] Термин "биологический агент" относится к нуклеиновой кислоте, полипептиду, 20 гликопротеину, углеводу, липиду или их модифицированной форме (например,
метилированной, гликозилированной, помеченной меткой, поддающейся обнаружению).
Биологические агенты отличаются от небольших молекул лекарственных средств тем, что они
могут быть созданы посредством биологических процессов (в том числе рекомбинантными
методами) вместо химического синтеза. Биологические агенты, тем не менее, могут быть 25 химически модифицированными или включать нуклеотиды или аминокислоты, не
встречающиеся в природе. Биологические агенты также могут быть не встречающимися в
природе, например, рекомбинантными или химерными объектами.
[0021] В контексте настоящего описания термин "иммуногенный биологический агент" относится к агенту, который действует непосредственно как антиген (например, распознается 30 Т-клеточным рецептором или антителом) или как агент, который, однажды экспрессировавшись в клетке, действует в качестве антигена. К примеру, иммуногенный
биологический агент может включать вектор экспрессии, кодирующий иммуногенный полипептид.
[0022] Термин "антиген" относится к полипептиду, гликопротеину, липопротеину, липиду, углеводу или другому агенту, связанному (например, распознаваемому как "чужеродный") 5 посредством Т-клеточного рецептора и/или антитела. Антигены обычно получают из бактериальных, вирусных или грибковых источников. Термин "полученный из" указывает на то, что антиген представляет собой по существу то, как он существует в своем естественном антигенном контексте, или что он был модифицирован для того, чтобы экспрессироваться при определенных условиях, чтобы включать в себя только самую иммуногенную часть или чтобы 10 удалять другие потенциально вредные, связанные с ним компоненты и т.д.
[0023] "Иммуногенно эффективная доза или количество" композиции как описано в настоящем описании представляет собой количество, которое вызывает или модулирует иммунный ответ, специфичный для антигена, выбранного для вакцинации. Иммунные ответы включают в себя гуморальные иммунные ответы и иммунные ответы, опосредованные 15 клетками. Иммуногенную композицию можно применять терапевтически или профилактически для лечения или предотвращения заболевания на любой стадии.
[0024] "Гуморальный иммунный ответ" опосредован свободными клеточными компонентами крови, например, плазмой или сывороткой; перенос сыворотки или плазмы крови от одного индивидуума к другому передает гуморальный иммунитет. Гуморальный 20 иммунный ответ, как правило, опосредован В-клетками, например, выработка антител.
[0025] "Опосредованные клетками иммунные ответы" опосредованы антиген-специфичными лимфоцитами; перенос антиген-специфичных лимфоцитов от одного индивидуума к другому передает иммунитет. Опосредованные клетками иммунные ответы опосредованы по меньшей мере частично при помощи Т-клеток и могут быть обнаружены, 25 например, посредством обнаружения цитокинов, специфичных к Т-клеткам, или увеличения роста Т-клеток.
[0026] "Подвздошная кишка" является самым длинным из трех сегментов, которые образуют тонкую кишку наряду с двенадцатиперстной кишкой и тощей кишкой. Она формирует терминальный отдел между тощей и слепой кишкой.
[0027] Энтеросолюбильное покрытие представляет собой барьер, применяемый для пероральных лекарственных средств, который защищает внутри терапевтический агент от переваривания в среде желудка и двенадцатиперстной кишки с низким значением рН (~ рН 3).
[0028] Говорят, что агент, такой как энтеросолюбильное покрытие, матрица или капсула, 5 удерживает заключенный или внедренный терапевтический агент, когда по меньшей мере 60%, например, по меньшей мере примерно 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% от первоначального введенного количества терапевтического агента остается заключенным или встроенным внутрь агента. Агент, например, энтеросолюбильное покрытие или матрица, как правило, разработаны для распада при определенных условиях и высвобождения
10 терапевтического агента. Распад может быть постепенным, например, в случае более толстого или химически более сложного покрытия. Говорят, что энтеросолюбильное покрытие "распадается" после того, как уменьшается толщина покрытия по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 25%, 50%, или 75% по сравнению с введенной исходной толщиной. Распад не является абсолютным термином, так как это может происходить в
15 течение различного времени, что, конечно, зависит от условий. К примеру, покрытие, которое разработано для того, чтобы распадаться в течение 5 минут при значении рН 6,5 может распадаться, хотя и медленно, при значении рН 6 (например, в течение 1 часа). Распад не обязательно означает, что происходит высвобождение заключенного или внедренного терапевтического агента. Терапевтический агент может, тем не менее, начать высвобождаться
20 до того, как полностью распадется энтеросолюбильное покрытие или матрица.
[0029] Термин "гибридный" или "рекомбинантный" в контексте настоящего описания со ссылкой, например, на нуклеиновую кислоту, белок или вектор, указывает на то, что нуклеиновая кислота, белок или вектор модифицировали посредством введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или изменения нативной нуклеиновой 25 кислоты или белка. Таким образом, к примеру, гибридные и рекомбинантные вектора содержат последовательности нуклеиновых кислот, которые не обнаруживаются в нативной (негибридной или нерекомбинантной) форме вектора. Гибридный вирусный вектор экспрессии относится к вирусному вектору экспрессии, содержащему последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный (например, иммуногенный) полипептид.
30 [0030] "Вектор экспрессии" представляет собой рекомбинантную или синтетическую конструкцию нуклеиновой кислоты со серией специфических элементов нуклеиновых кислот,
которые допускают транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Вектор экспрессии может быть частью плазмиды, вируса или фрагмента нуклеиновой кислоты. Как правило, вектор экспрессии содержит нуклеиновую кислоту для транскрипции, функционально связанную с промотором. Вирусные вектора экспрессии, как правило, 5 обеспечивают некомпетентную или ослабленную репликацию. Полученный из вируса вектор может содержать компоненты вектора экспрессии, необходимого для экспрессии желаемой последовательности, но не содержит тех компонентов, которые участвуют, например, в процессе репликации или других патогенных эффектах.
[0031] Термины "промотор" и "последовательность контроля экспрессии" в контексте 10 настоящего описания относится к контрольной последовательности нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательности промотора, как правило, расположены вблизи сайта инициации транскрипции, такого как элемент TATA в случае промотора полимеразы II типа. Промотор может также содержать дистальный энхансер или элементы репрессора, которые могут быть расположены на расстоянии до нескольких 15 тысяч пар нуклеотидов от сайта инициации транскрипции. Промоторы содержат конститутивные и индуцируемые промоторы. "Конститутивный" промотор представляет собой промотор, который активен в большинстве условий окружающей среды и экспериментальных условиях. "Индуцируемый" промотор представляет собой промотор, который активен при регулировании окружающей среды и экспериментальном регулировании. 20 Термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между последовательностью контроля экспрессии нуклеиновой кислоты (такой как промотор или набор сайтов связывания факторов транскрипции) и второй последовательностью нуклеиновой кислоты, где последовательность контроля экспрессии направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты, соответствующей второй последовательности.
25 [0032] Термин "гетерологичный" при применении в отношении к частям нуклеиновой кислоты указывает на то, что нуклеиновая кислота содержит две или более подпоследовательности, которые в природе не обнаруживаются состоящими в родстве друг к другу. Например, нуклеиновая кислота, полученная, как правило, рекомбинантным способом, содержит две или более последовательности из неродственных генов, расположенных таким
30 образом, чтобы образовать новую функциональную нуклеиновую кислоту, например, промотор из одного источника, а кодирующую область из другого источника. Аналогичным образом, гетерологичные участки белка указывают на то, что белок содержит две или более
подпоследовательности, которые в природе не обнаруживаются состоящими в родстве друг к другу (например, белок слияния). Гетерологичная нуклеиновая кислота или белок представляет собой то, что не обнаруживают в конкретной среде в природе, например, гетерологичный белок мыши в человеческой клетке.
5 [0033] В контексте настоящего описания термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид" являются взаимозаменяемыми и относятся к полимерам дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов либо в одно-, либо в двухцепочечной форме. Термины охватывают гены, кДНК, РНК и олигонуклеотиды (короткие полинуклеотиды). Термины охватывают нуклеиновые кислоты, содержащие известные нуклеотидные аналоги или модифицированные
10 остатки или сцепления остова, которые являются синтетическими, встречающимися и не встречающимися в природе, которые обладают связывающими свойствами, сходными с референсной нуклеиновой кислотой, и которые метаболизируются сходным с референсными нуклеотидами способом. Примеры таких аналогов включают без ограничения фосфоротиоаты, фосфороамидаты, метилфосфонаты, хирал-метилфосфонаты, 2-О-метилрибонуклеотиды,
15 пептид-нуклеиновые кислоты (ПНК). Термин "нуклеотид", как правило, относится к мономеру нуклеиновой кислоты.
[0034] Если не указано иное, конкретная последовательность нуклеиновой кислоты также охватывает их консервативно модифицированные варианты (например, замены вырожденных кодонов) и комплементарные последовательности, также как и явно выраженную 20 последовательность. В частности, замены вырожденных кодонов можно осуществить путем получения последовательностей, в которых третье положение одного или нескольких выбранных (или всех) кодонов заменено смешанным основанием и/или остатками дезоксиинозина (Batzer и др., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka и др., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolim и др., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)).
25 [0035] Как описано в настоящем описании, "терапевтическая доза" или "терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" композиции представляет собой количество, которое предотвращает, облегчает, смягчает или уменьшает тяжесть симптомов заболеваний и расстройств, связанных с источником антигена, выбранного для вакцинации (например, вирусом, бактерией, паразитом или раком).
30 [0036] Термин "антитело" относится к полипептиду, кодируемому геном иммуноглобулина или его фрагментами, которое специфически связывается и распознает антиген.
Последовательности иммуноглобулина содержат каппа, лямбда, альфа, гамма, дельта, эпсилон и мю последовательности константной областей, также как и бесчисленное множество последовательностей вариабельной области иммуноглобулина. Легкие цепи классифицируются либо как каппа, либо как лямбда. Тяжелые цепи классифицируются как 5 гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон-цепи, которые, в свою очередь, определяют классы иммуноглобулинов IgG, IgM, IgA, IgD и IgE соответственно.
[0037] Т-клетки относятся к конкретному классу лимфоцитов, которые экспрессируют специфический рецептор (Т-клеточный рецептор), кодируемый посредством семейства генов. Распознаваемые гены Т-клеточного содержат включают альфа, бета, дельта и гамма-локусы, а
10 Т-клеточные рецепторы, как правило, (но не повсеместно) распознают комбинацию главного комплекса гистосовместимости (МНС) совместно с коротким пептидом. Т-клетки, как правило, широко классифицируют на Т-хелперы (CD4+) и цитотоксические Т-клетки (CD8+). Антитела естественным образом вырабатываются В-клетками, например, секретирующими антитела клетками (САК). Зрелые В-клетки могут быть интактными, В-клетками плазмы
15 (активированными и вырабатывающими антитело), памяти, В-1, В-клетками маргинальной зоны, фолликулярными В-клетками и регуляторными В-клетками.
[0038] Адаптивный иммунный ответ относится к Т-клеточному и/или В-клеточному распознаванию и/или распознаванию антителом антигена.
[0039] Антиген представляющие клетки (АПК) представляют собой клетки, которые 20 способны презентировать иммуногенные пептиды или их фрагменты Т-клеткам для того, чтобы активировать или улучшать иммунный ответ. АПК включают дендритные клетки, макрофаги, В-клетки, моноциты и другие клетки, которые могут быть созданы методами генетической инженерии, чтобы быть эффективными АПК. Такие клетки могут, но не обязательно, быть генетически модифицированы для того, чтобы увеличивать способность для 25 презентации антигена, улучшать активацию и/или поддержание Т-клеточного ответа, по существу обладать противоопухолевыми эффектами и/или быть иммунологически совместимыми с получателем (т.е. совпадающий HLA гаплотип). АПК можно выделить из любых различных биологических жидкостей и органов, включая костный мозг, периферическую кровь, опухоли и перитуморальные ткани, и могут представлять собой 30 аутологичные, аллогенные, сингенные или ксеногенные клетки. АПК, как правило,
используют рецептор из локуса главного комплекса гистосовместимости (МНС) для того, чтобы презентовать короткие полипептиды Т-клеткам.
[0040] Адъювант представляет собой ген-усилитель неспецифического иммунного ответа. Подходящие адъюванты включают, например, холерный токсин, монофосфориллипид А 5 (MPL), полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, Quil А и А1(ОН). Адъюванты также могут представлять собой те вещества, которые вызывают активацию АПК и улучшают презентацию Т-клеткам посредством вторичных сигнальных молекул подобных Toll-подобным рецепторам, например, двухцепочечной РНК (дсРНК), миметиков дсРНК, бактериального жгутика, липополисахарида (LPS), CpG ДНК и бактериального липопептида 10 (в последнее время рассмотренные в работах [Abreu и др., J Immunol, 174(8), 4453-4460 (2005)]).
[0041] В контексте настоящего описания термины "полипептид", "пептид" и "белок" являются взаимозаменяемыми и относятся к полимеру аминокислот. Термины применяют к аминокислотным полимерам, в которых один или более аминокислотный остаток представляет 15 собой искусственный химический миметик соответствующей встречающейся в природе аминокислоты, также как и к встречающимся в природе аминокислотным полимерам и к не встречающемуся в природе аминокислотному полимеру.
[0042] Термин "аминокислота" относится к встречающимся в природе и синтетическим аминокислотам, также как и к аминокислотным аналогам и аминокислотным миметикам,
20 которые функционируют аналогично аминокислотам, встречающимся в природе. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой те аминокислоты, которые кодируются генетическим кодом, а также те, которые впоследствии будут модифицированы, например, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аминокислотные аналоги относятся к соединениям, которые имеют такую же базовую химическую структуру, что и
25 встречающаяся в природе аминокислота, т.е. углерод, который связан с водородом, карбоксильную группу, аминогруппу и R-группу, например, гомосерин, норлейцин, метионилсульфоксид, метионин-метил-сульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, однако сохраняют ту же базовую химическую структуру, что и встречающаяся в природе
30 аминокислота. Аминокислотный миметик относится к химическим соединениям, которые
обладают структурой, отличной от общей химической структуры аминокислоты, но который функционирует способом, подобному встречающейся в природе аминокислоте.
[0043] В настоящем описании аминокислоты могут упоминаться либо через их общеизвестные трехбуквенные символы, либо через однобуквенные символы, 5 рекомендованные Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Аналогичным образом нуклеотиды могут упоминаться через их общепринятые односимвольные кода.
[0044] "Консервативно модифицированные варианты" применяют как к аминокислотной последовательности, так и последовательности нуклеиновых кислот. Что касается конкретных последовательностей нуклеиновых кислот, консервативно модифицированные варианты
10 относятся к тем нуклеиновым кислотам, которые кодируют идентичные или по существу идентичные аминокислотные последовательности, или где нуклеиновая кислота не кодирует аминокислотную последовательность, по существу, идентичные последовательности. Из-за вырожденности генетического кода, большое число функционально идентичных нуклеиновых кислот кодирует любой рассматриваемый белок. К примеру, все кодоны GCA, GCC, GCG и
15 GCU кодируют аминокислоту аланин. Таким образом, в каждом положении, где аланин определяется кодоном, кодон может быть заменен на любой из соответствующих кодонов, описанных без изменения кодируемого полипептида. Такие вариации нуклеиновых кислот представляют собой "молчащие вариации", которые являются одним из видов консервативно модифицированных вариаций. В настоящем описании каждая последовательность
20 нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, также описывает каждую возможную молчащую вариацию нуклеиновой кислоты. Специалисту будет понятно, что каждый кодон в нуклеиновой кислоте (за исключением AUG, который обычно является единственным кодоном для метионина, и TGG, который обычно является единственным кодоном для триптофана) может быть модифицирован с образованием функционально идентичной молекулы.
25 Соответственно, каждая молчащая вариация нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептид, является имплицитной в каждой описанной последовательности.
[0045] Что касается аминокислотных последовательностей, специалисту будет понятно, что отдельные замены, делеции или добавления в нуклеиновую кислоту, пептид, полипептид или белковую последовательность, которая приводит к замене, добавлению или удалению 30 одиночной аминокислоты или небольшого процента аминокислот в кодированный последовательности, представляет собой "консервативно модифицированный вариант", где
замена приводит в результате к замещению аминокислоты химически аналогичной аминокислотой. Консервативные подстановочные таблицы, обеспечивающие функционально аналогичными аминокислотами, хорошо известны в данной области техники. Такие консервативно модифицированные варианты представляют собой дополнение и не исключают 5 полиморфные варианты, межвидовые гомологи и аллели согласно настоящему изобретению.
[0046] Каждая из следующих восьми групп содержит аминокислоты, которые являются консервативными заменами друг для друга: 1) Аланин (А), Глицин (G); 2) Аспарагиновая кислота (D), Глутаминовая кислота (Е); 3) Аспарагин (N), Глутамин (Q); 4) Аргинин I, Лизин (К); 5) Изолейцин (I), Лейцин (L), Метионин (М), Валин (V); 6) Фенилаланин (F), Тирозин (Y), 10 Триптофан (W); 7) Серии (S), Треонин (Т); и 8) Цистеин (С), Метионин (М) (см, например, Creighton, Proteins (1984)).
[0047] Фраза "селективно (или специфически) гибридизуется с" относится к связыванию, образованию дуплекса или гибридизации комплементарных (или в значительной степени комплементарных) нуклеотидов в сложной смеси (например, суммарной клеточной или 15 библиотечной ДНК или РНК).
[0048] Полинуклеотиды могут содержать нативную последовательность (т.е. эндогенную последовательность, которая кодирует индивидуальный полипептид или дсРНК или их участок), или может содержать вариант такой последовательности. Варианты полинуклеотидов могут содержать одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или
20 вставок, так что не происходит снижения по меньшей мере одной биологической активности кодируемого полипептида (например, иммуногенности) по отношению к полипептидам, содержащим нативные антигены. Варианты полинуклеотидов могут содержать одну или несколько замен, добавлений, делеций и/или вставок, так что не происходит снижения активности адъюванта кодируемой дсРНК по отношению к дсРНК, которая не содержит
25 замещений, добавлений, делеций и/или вставок. Варианты предпочтительно обнаруживают по меньшей мере примерно 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичность последовательности с полинуклеотидной последовательностью, которая кодирует нативный полипептид или его участок или дсРНК.
[0049] Термины "идентичный" или процент "идентичности" в контексте двух или более 30 полинуклеотидных или полипептидных последовательностей относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые являются одинаковыми или
имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е., 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% , 98%, 99% или более идентичности в определенной области) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в окне сравнения, или обозначенной области, 5 измеренной с применением одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей или путем ручного выравнивания и визуального осмотра. Далее говорят, что такие последовательности "по существу идентичны." Данное определение также относится к комплементу исследуемой полинуклеотидной последовательности. Идентичность необязательно присутствует в области, которая содержит по меньшей мере примерно от 10 до 10 примерно 100, примерно от 20 до примерно 75, примерно от 30 до примерно 50 аминокислот или нуклеотидов в длину.
[0050] "Контрольный" образец или значение относится к образцу, который служит в качестве стандарта, обычно известного стандарта, для сравнения с исследуемым образцом. Например, исследуемый образец можно получить из условия испытания, например, в
15 присутствии исследуемого соединения или лечения, и сравнить с образцами, полученными в известных условиях, например, в отсутствии исследуемого соединения (отрицательный контроль), или в присутствии известного соединения (положительный контроль). В контексте настоящего изобретения примером отрицательного контроля был бы биологический образец от известного здорового (неинфицированного) индивидуума, а примером положительного
20 контроля служил бы биологический образец от известного инфицированного пациента. Контроль также может представлять собой среднее значение или диапазон, полученный из ряда исследований или результатов. Специалисту в данной области техники будет понятно, что контроли можно разрабатывать для оценки любого числа параметров. К примеру, контроль можно разработать для того, чтобы сравнивать терапевтическое действие на основе
25 фармакологических данных (например, половине жизни) или терапевтических измерений (например, сравнение положительного эффекта и/или побочных эффектов). Контроли можно разрабатывать для применения in vitro. Специалисту в данной области будет понятно, какие контроли важны для рассматриваемой ситуации, и он будет иметь возможность анализировать данные на основе сравнений с контрольными значениями. Контроли также важны для
30 определения значимости данных. К примеру, если значения для рассматриваемого параметра широко варьируются в контрольной группе, различия в исследуемых образцах не следует рассматривать как значимые.
[0051] Термин "диагностика" относится к относительной вероятности того, что у субъекта есть такие расстройства, как инфекция или рак. Аналогичным образом, термин "прогноз" относится к относительной вероятности того, что определенный будущий исход может случиться с субъектом. Термины не предназначены для того, чтобы быть абсолютными, как 5 будет оценено любым специалистом в данной области медицинской диагностики.
[0052] Термины "терапия", "лечение" и "облегчение" относятся к любому снижению выраженности симптомов. В контексте инфекции, лечение может относиться к снижению инфекционного агента, снижению симптомов и т.д. В случае лечения рака, лечение может относиться, например, к уменьшению размера опухоли, количества раковых клеток, скорости
10 роста, метастатической активности, уменьшению клеточной смерти нераковых клеток и т.д. Термины "лечить" и "предотвращать" не предназначены для того, чтобы быть абсолютными терминами. Лечение и предотвращение может относиться к любому сравнительному снижению или очевидному отсутствию инфекционного агента, задержке дебюта, облегчению симптомов, улучшению выживаемости пациентов, увеличению продолжительности жизни или
15 доле выживших и т.д. Лечение и предотвращение может быть полным (неопределяемый уровень инфекционного агента или опухолевых клеток) или частичным, так что у пациента обнаруживают меньшее количество инфекционного агента или опухолевых клеток, чем если бы это происходило без описываемых в настоящее время иммуногенных биологических агентов. Эффект от лечения можно сравнивать у индивидуума или пула индивидуумов, не
20 получающих лечение, или у того же пациента до начала лечения или в различное время на протяжении лечения. В некоторых аспектах тяжесть инфекции или заболевания уменьшается по меньшей мере на 10% по сравнению, например, с индивидуумом перед введением или контрольным индивидуумом, не проходящим лечение. В некоторых аспектах тяжесть инфекции или заболевания уменьшается по меньшей мере на 25%, 50%, 75%, 80% или 90%,
25 или в некоторых случаях больше не обнаруживается с применением стандартных методов диагностики.
[0053] "Субъект", "пациент", "индивидуум" и подобные термины применяют в качестве взаимозаменяемых и относятся к, за исключением случаев, где это указано, млекопитающим, таким как люди и приматы, не являющиеся человеком, также как и к кроликам, крысам, 30 мышам, козам, свиньям и другим видам млекопитающих. Термин не обязательно означает, что субъекту был поставлен диагноз конкретного заболевания, однако, как правило, относится к индивидууму под медицинским наблюдением. Пациентом может быть индивидуумом,
который находится в поиске лечения, мониторинга, корректировки или изменения существующего режима лечения и т.д.
П. Иммуногенные биологические агенты
[0054] Иммуногенный биологический агент представляет собой любой биологический агент, 5 который вызывает иммунный ответ у хозяина, например, человека хозяина. Таким образом, иммуногенный биологический агент может представлять собой полипептид (например, гликопротеин, фосфопротеин или другую модифицированную форму), углевод, липид, полинуклеотид (например, хроматин, метилированный полинуклеотид или другую модифицированную форму). В некоторых вариантах реализации иммуногенный
10 биологический агент непосредственно вызывает иммунный ответ, например, сам по себе является целевым иммуногеном (антигеном). В некоторых вариантах реализации иммуногенный биологический агент представляет собой полинуклеотид, кодирующий целевой иммуноген. К примеру, если полинуклеотид, кодирующий антиген-мишень, экспрессируется в антиген представляющей клетке (АПК), иммунный ответ устанавливается
15 против экспрессируемого антигена. Иммуногенный биологический агент можно вводить отдельно, в комбинации со вторым, третьим и/или четвертым иммуногенным биологическим агентом (например, в случае мультицелевой профилактической вакцины), и/или в комбинации с адъювантом для увеличения иммунного ответа.
А. Векторы экспрессии
20 [0055] Векторы экспрессии для применения, как описано в настоящем описании, могут содержать полученные из вирусов векторы, например, векторы рекомбинантного аденоассоциированного вируса (AAV), ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, векторы модифицированной осповакцины Анкара (MVA) и лентивирусные (например, полученные из HSV-1) векторы (см., например, Brouard и др. (2009) British J. Pharm 157:153).
25 Полученные из вирусов векторы для терапевтического применения, как правило, обеспечивают некомпетентную или ослабленную репликацию. К примеру, в случае аденовирусного вектора, аденовирусный геном можно модифицировать для того, чтобы удалить гены Е1 и ЕЗ. Для получения вектор, дефицитный по репликации, можно вводить в клетку, которая экспрессирует ген Е1, так что рекомбинантный аденовирус (rAd)
30 продуцируется клеткой. Можно осуществлять сбор данного rAd и применять для одноэтапного инфицирования для того, чтобы доставить трансгенную композицию в другую клетку
организма млекопитающего с целью продуцирования иммунного ответа на кодируемый полипептидный антиген.
[0056] Примеры подходящих вирусных векторов содержат аденовирус 5, в том числе, к примеру, Ad5 с делецией областей Е1/ЕЗ и Ad5 с делецией области Е4. Другие подходящие 5 аденовирусные векторы содержат штаммы 2, перорально исследуемые штаммы 4 и 7, энтеральные аденовирусы 40 и 41, а также другие штаммы (например, Ad34, Ad26 или Ad35), которых достаточно для доставки антигена и продуцирования адаптивного иммунного ответа на трансгенный антиген [Lubeck и др., Proc Natl Acad Sci USA, 86(17), 6763-6767 (1989); Shen и др., J Virol, 75(9), 4297-4307 (2001); Bailey и др., Virology, 202(2), 695-706 (1994)].
10 Необязательно, чтобы вирусный вектор был выделен из организмов человека, однако он может происходить от не человека, такой как аденовирус 3 шимпанзе (ChAd3) (см., например, Colloca и др. (2012) Sci. Transl. Med. 4:115; Stanley и др. (2014) Nat. Med. doi:10.1038/nm.3702). В некоторых вариантах реализации аденовирусный вектор представляет собой живой, некомпетентный по репликации аденовирусный вектор (такой как rAd5 с удаленными Е1 и ЕЗ),
15 живой и ослабленный аденовирусный вектор (такие как вирусы с делецией Е1В55К) или живой аденовирусный вектор с репликацией дикого типа.
[0057] Транскрипциональные и трансляционные контрольные последовательности в векторах экспрессии для применения как описано в настоящем описании можно получить из вирусных источников. Например, широко применяемые промоторы и энхансеры получают,
20 например, из бета-актина, аденовируса, вируса обезьян (SV40) и цитомегаловируса человека (CMV). К примеру, являются подходящими векторы, обеспечивающие экспрессию белков под контролем промотора CMV, раннего промотора SV40, позднего промотора SV40, промотора металлотионеина, промотора вируса опухоли молочных желез у мышей, промотора вируса саркомы Роуса, промотора клетки-трансдуктора или других промоторов, представляющихся
25 эффективными для экспрессии в клетках млекопитающих. Дополнительный вирусный и невирусный промотор, контрольные и/или сигнальные последовательности можно применять при условии, что такие контрольные последовательности совместимы с клетками-хозяевами для трансфекции.
Б. Иммуногены
30 [0058] Иммуногены для применения как описано в настоящем описании можно получить из антигенов, таких как, например, вирусных антигенов, бактериальных антигенов, раковых
антигенов, грибковых антигенов или антигенов паразитов (см., например, патент США № 8222224 для списка антигенов, которые можно применять как описано в настоящем описании). [0059] Конкретные примеры антигенов, которые можно применять как описано в настоящем описании представляют собой те, которые получают из вируса гриппа (например, НА, NA, Ml, 5 NP), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, например, gag, pol, env и т.д.), вируса папилломы человека (ВПЧ, например, капсидных белков, таких как L1), вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ), вируса Эпштейна-Барр, вируса простого герпеса (ВПГ), вируса герпеса человек, риновирусов, вирусов Коксаки, энтеровирусов, гепатитов А, В, С, Е и G(HAV, HBV, HCV, HEV, HGV, например, поверхностного антигена), вируса эпидемического 10 паротита, вируса краснухи, вируса кори, вируса полиомиелита, вируса оспы, вируса бешенства и вирус ветряной оспы.
[0060] Подходящие вирусные антигены также содержат вирусные неструктурные белки, например, белки, кодируемые вирусной нуклеиновой кислотой, которая не кодирует структурные полипептиды, по сравнению с теми, которые образуют капсид или белок, 15 окружающий вирус. Неструктурные белки содержат те белки, которые способствуют репликации вирусной нуклеиновой кислоты, экспрессии вирусного гена или посттранляционной обработке, такие как, например, неструктурные белки 1, 2, 3, и 4 (NS1, NS2, NS3, и NS4 соответственно) из вируса венесуэльского энцефалита лошадей (ВЭЛ), восточного конского энцефалита (ВКЭ) или леса Семлики.
20 [0061] Бактериальные антигены можно получить из, например, золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), эпидермального стафилококка (Staphylococcus epidermis), Helicobacter pylori, стрептококка группы D (Streptococcus bovis), пиогенного стрептококка (Streptococcus pyogenes), стрептококка пневмонии (Streptococcus pneumonia), Listeria monocytogenes, микобактерии туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis), Mycobacterium leprae, дифтерийной
25 палочки (Corynebacterium diphtheriae), Borrelia burgdorferi, бациллы сибирской язвы (Bacillus anthracis), Bacillus cereus, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, сальмонеллы брюшного тифа (Salmonella typhi), холерного вибриона (Vibrio chloerae), палочки Пфайфера (Haemophilus influenzae), палочки коклюша (Bordetella pertussis), чумной палочки (Yersinia pestis), гонококка (Neisseria gonorrhoeae), бледной спирохеты (Treponema pallidum), микоплазм (Mycoplasm sp.),
30 Legionella pneumophila, Rickettsia typhi, Chlamydia trachomatis и Shigella dysenteriae, холерного вибриона (Vibrio cholera) (например, холерного токсина субъединицы В, холерных тоскин-корегулирующих пилей (TCP)); Helicobacter pylorii (например, вакуолизирующего
цитотоксина A (VacA), цитотоксин-ассоциированного гена A (CagA), активирующего нейтрофилы белка (NAP), пурпуры Шейнлейна-Геноха (Hsp), каталазы, уреазы); кишечной палочки (например, термолабильного энтеротоксина, фимбриальных антигенов).
[0062] Антигены паразитов можно получить из, например, лямблии кишечной (Giardia 5 lamblia), лейшманий (Leishmania sp.), трипаносом (Trypanosoma sp.), трихомонад (Trichomonas sp.), плазмодий (Plasmodium sp.) (например, поверхностных белковых антигенов P. falciparum, таких как pfs25, pfs28, pfs45, pfs84, pfs 48/45, pfs 230, Pvs25 и Pvs28); шистосом (Schistosoma sp.); палочки Коха (Mycobacterium tuberculosis) (например, Ag85, MPT64, ESAT-6, CFP10, R8307, MTB-32 MTB-39, CSP, LSA-1, LSA-3, EXP1, SSP-2, SALSA, STARP, GLURP, MSP-1, 10 MSP-2, MSP-3, MSP-4, MSP-5, MSP-8, MSP-9, AMA-1, интегрального мембранного белка типа 1, RES А, ЕВА-175 и DBA).
[0063] Грибковые антигены можно получить из, например, Tinea pedis, Tinea corporus, Tinea cruris, Tinea unguium, Cladosporium carionii, Coccidioides immitis, Candida sp., Aspergillus fumigatus и Pneumocystis carinii.
15 [0064] Раковые антигены содержат, например, антигены, экспрессированные или сверхэкспрессированные в раке толстой кишки, раке желудка, раке поджелудочной железы, раке легкого, раке яичников, раке простаты, раке молочной железы, раке кожи (например, меланоме), лейкозе или лимфоме. Иллюстрирующие раковые антигены содержат, например, ВПЧ L1, ВПЧ L2, ВПЧ Е1, ВПЧ Е2, плацентарную щелочную фосфатазу, AFP, BRCA1,
20 Her2/neu, СА 15-3, СА 19-9, СА-125, СЕА, Hcg, урокиназный активатор плазминогена (УАП), ингибитор активатора плазминогена, CD53, CD30, CD25, С5, CDlla, CD33, CD20, ErbB2, CTLA-4. См. Sliwkowski и Mellman (2013) Science 341:6151 для дополнительных раковыхмишен ей.
В. Адъюванты
25 [0065] В некоторых вариантах реализации композиции дополнительно содержат по меньшей мере один адъювант. Подходящие адъюванты содержат, например, липиды и нелипидные соединения, холерный токсин (XT), субъединицу В XT, КТ производное СТК63, термолабильный энтеротоксин кишечной палочки (LT), LT-производное LTK63, А1(ОН)з и полиионные органические кислоты, как описано, например, в WO2004/020592, Anderson и
30 Crowle, Infect. Immun. 31 (1):413-418 (1981), Roterman и др., J. Physiol. Pharmacol., 44(3):213-32 (1993), Arora и Crowle, J. Reticuloendothel. 24(3):271-86 (1978) и Crowle и May, Infect. Immun.
38(3):932-7 (1982). Подходящие полиионные органические кислоты содержат, например, 6,6'-[3,3'-диметил[1,Г-дифенил]-4,4'-диил]бис(азо)бис[4-амино-5-гидрокси-1,3-нафталин-дисульфокислоту] (Эванс синий) и 3,3'-[1,Г-бифенил]-4,4'-диилбис(азо)бис[4-амино-1-нафталинсульфоновую кислоту] (Конго красный). Специалистам в данной области техники 5 будет понятно, что полиионные органические кислоты можно применять для любого способа вакцинации на основе нуклеиновой кислоты в сочетании с любым типом введения.
[0066] Также можно применять TLR-3-агонисты (например, дсРНК и ее миметики, такие как поли1:С, полиА:11 и поли1:полиС). TLR-3-агонисты содержат, например, короткие шпилечные РНК, полученные из вируса РНК, короткие сегменты РНК, которые могут образовывать
10 двухцепочечные или короткие шпилечные РНК и короткие интерферирующие РНК (сиРНК). В некоторых вариантах реализации TLR-3-агонист представляет собой полученную из вируса дсРНК, например, дсРНК, полученную из вируса Синдбис или дсРНК вирусных промежуточных продуктов (Alexopoulou и др. (2001) Nature 413:732). В некоторых вариантах реализации TLR-3-агонист представляет собой короткую шпилечную РНК.
15 Последовательности коротких шпилечных РНК, как привило, содержат две комплементарные последовательности, соединенные линкерной последовательностью. Конкретная линкерная последовательность не является существенным аспектом настоящего изобретения. Любую подходящую линкерную последовательность можно применять до тех пор, пока она не препятствует связыванию двух комплементарных последовательностей с образованием
20 дсРНК. TLR-3-агонисты в итоге могут привести к высвобождению провоспалительных цитокинов (например, интерлейкина 6 (IL-6), интерлейкина 8 (IL-8), фактора некроза опухолей (ФНО) альфа, интерферона-альфа, интерферона-бета), когда происходит контакт с иммунореактивной клеткой (например, дендритной клеткой, мононуклеарной клеткой периферической крови или макрофагом) in-vitro или in-vivo.
25 [0067] Другие подходящие адъюванты содержат местнодействующие иммуномодуляторы, такие как, члены семьи имидазохинолина, такие как, например, имиквимод и резиквимод (см., например, Hengge и др., Lancet Infect. Dis. 1(3): 189-98 (2001).
[0068] Дополнительные подходящие адъюванты являются коммерчески доступными, как, например, дополнительные адъюванты на основе квасца (например, гидроокись алюминия, 30 Rehydragel, фосфат алюминия, Algammulin); вспомогательные вещества на масляной основе (неполный и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Detroit, Mich), Specol, RIBI,
TiterMax, Montanide ISA50 или Seppic Montanide ISA 720); адъюванты на основе неинного блок-сополимера, цитокины (например, GM-CSF или FlatS-лиганд); Merck адъювант 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.); AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.); соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; 5 катионно или анионно дериватизированные полисахариды; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфориллипид А и Квил А. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12, также являются подходящими адъювантами. Гемоцианины (например, гемоцианин улитки) и гемоэритрины также можно применять в качестве адъювантов. Полисахаридные адъюванты, такие как, например, хитин, хитозан и
10 деацетилированный хитин, также являются пригодными в качестве адъювантов. Другие подходящие адъюванты содержат мурамил-дипептид (МДП, М-ацетилмурамил-Ь-аланил-О-изоглутамин) бактериальных пептидогликанов и его производные (например, треонил-МДП и МТРРЕ). Палочку Кальметта-Герина (BCG) и скелет клеточной клетки BCG (CWS) можно применять в качестве адъювантов с добавлением или без димиколата трегалозы. Димиколат
15 трегалозы можно применять сам по себе (см., например, патент США № 4579945). Детоксифицированные эндотоксины также являются подходящими в качестве самостоятельных адъювантов или в комбинации с другими адъювантами (см., например, патенты США №№ 4866034;. 4435386; 4505899; 4436727; 4436728; 4505900 и 4520019). Сапонины QS21, QS17, QS7 являются также подходящими в качестве адъювантов (см.,
20 например, патент США № 5057540; ЕР 0362 279, WO 96/33739 и WO 96/11711). Другие подходящие адъюванты содержат Montanide ISA 720 (Seppic, Франция), SAF (Chiron, Калифорния, США), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), серию SBAS адъювантов (например, SBAS-2, SBAS- 4 или SBAS-6 или их варианты, доступные от SmithKline Beecham, Риксенсарт, Бельгия), Detox (Corixa, Гамильтон, Mont.) и RC-529 (Corixa, Гамильтон, Mont.).
25 [0069] В настоящем изобретении также предложены суперантигены для применения в качестве адъювантов. Суперантигены содержат экзобелки стафилококков, такие как альфа, бета, гамма и дельта энтеротоксины от золотистого стафилококка и эпидермального стафилококка, и альфа, бета, гамма и дельта экзотоксины кишечной палочки. Общераспространенные энтеротоксины стафилококков известны как стафилококковый
30 энтеротоксин А (СЭА) и стафилококковый энтеротоксин В (СЭВ) с будучи описанными энтеротоксинами через Е (СЭЕ) (Rott и др., 1992). Также можно применять пиогенный стрептококк В (ПСВ), энтеротоксин энтеритной клостридии (Clostridium perfringens) (Bowness
и др., 1992), цитоплазматически мембран-ассоциированный белок (ЦАБ) из ПСВ (Sato и др., 1994) и токсин 1 синдрома токсического шока (ТСТШ 1) из золотистого стафилококка (Schwab и др., 1993).
[0070] Для предложенных в настоящем описании фармацевтических композиций, адъювант 5 (-ы) могут быть разработаны для того, чтобы вызывать, например, иммунный ответ преимущественно типа ТЫ или Th2. Высокие уровни цитокинов типа ТЫ (например, интерферон-гамма, ФНО альфа, IL-2 и IL-12) обладают тенденцией способствовать индукции клеточно-опосредованных иммунных ответов на вводимый антиген. В противоположность этому, высокие уровни цитокинов типа Th2 (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) обладают 10 тенденцией способствовать индукции гуморальных иммунных ответов. Последующая преоральная доставка композиции, содержащей иммуногенный полипептид, в соответствии с настоящим описанием, как правило, будет вызывать иммунный ответ, который содержит ответы типа ТЫ и Th2.
III. Системы направленной доставки
15 [0071] Описываемые в настоящее время композиции и способы для доставки в подвздошную кишку могут основываться на соответствующих покрытиях, матрицах и устройствах, таких как те, которые описаны ниже.
А. Энтеросолюбильные покрытия, матрицы и устройства
20 [0072] Энтеросолюбильные покрытия применяют для защиты веществ от среды желудка с низким значением рН и задержки высвобождения вложенного вещества до тех пор, пока оно позже не достигнет желаемой цели в желудочно-кишечном тракте. Энтеросолюбильные покрытия известны и коммерчески доступны. Примеры включают рН-чувствительные полимеры, биоразлагаемые полимеры, гидрогели, системы отсроченного высвобождения и
25 системы осмотической доставки (см., например, Chourasia & Jain (2003) J. Pharm. Pharmaceutical Sci. 6:33).
[0073] Значение рН желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) изменяется от очень кислого в желудке (рН ~ 2) до более нейтрального в подвздошной кишке (рН ~ 5.8-7.0). Можно применять рН-чувствительные покрытия, которые растворяются в подвздошной кишке или 30 непосредственно перед подвздошной кишкой. Примеры включают Eudragit(r) L и S полимеры
(пороговое значение рН колеблется от 5,5-7,0); фталат поливинилацетата (рН 5,0), фталат гидроксипропилметилцеллюлозы 50 и 55 (рН 5,2 и 5,4 соответственно) и фталат ацетата целлюлозы (рН 5,0). Thakral и др. (2013) Expert Opin. Drug Deliv. 10:131 проводят обзор составов Euragit(r) для доставки в подвздошную кишку, в частности, комбинаций L и S, которые 5 обеспечивают доставку при значении рН <7,0. Crotts и др. (2001) Eur. J Pharm. Biol. 51:71 описывают составы Eudragit(r) с соответствующими дезинтегрирующими свойствами. Vijay и др. (2010) J. Mater. Sci. Mater. Med. 21:2583 проводят обзор акриловой кислоты (АА)-метилметакрилата (ММА) на основе сополимеров для доставки в подвздошную кишку при значении рН 6,8.
10 [0074] Для доставки в подвздошную кишку полимерное покрытие, как правило, растворяется при значении рН примерно 6,8 и обеспечивает полное внутреннее высвобождение в течение примерно 40 минут (см., например, Huyghebaert и др. (2005) Int. J. Pharm 29Ъ:26). Для достижения данной цели терапевтическое вещество можно покрывать слоями различных покрытий, например, таким образом, что самый верхний наружный слой защищает вещество
15 при низких значениях рН, и он растворяется тогда, когда таблетка покидает желудок, и по меньшей мере растворяется один внутренний слой, когда таблетка переходит в повышающиеся значения рН. Примеры наслоенных покрытий для доставки в дистальную подвздошную кишку описаны, например, в WO2013148258.
[0075] Биоразлагаемые полимеры (например, пектин, азо-полимеры), как правило, 20 основываются на ферментативной активности микрофлоры, живущей в ЖКТ. В подвздошной кишке находится большее количество бактерий, чем в предыдущих участках, в том числе лактобацилл и энтеробактерий.
[0076] Системы пероральной доставки с осмотически-контролируемым высвобождением (OROS(r); Alza) представляют собой пример осмотической системы, которая разлагается с 25 течением времени в водных условиях. Такие материалы можно комбинировать с другими покрытиями или варьировать по толщине для того, чтобы конкретно осуществить доставку в подвздошную кишку (см., например, Conley и др. (2006), Curr. Med. Res. Opin. 22:1879).
[0077] Комбинированные полимеры для доставки в подвздошную кишку представлены в WO2000062820. Примеры включают Eudragit(r) L100-55 (25 мг на капсулу) с триэтилцитратом 30 (2,4 мг на капсулу) и Povidon К-25 (20 мг на таблетку), сопровождаемый Eudragit(r) FS30D (30 мг/таблетка). рН-чувствительные полимеры можно применять для доставки в подвздошную
кишку, как описано выше, например, сополимеры метакриловой кислоты (например, поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1), фталат ацетата целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, сукцинат ацетата гидроксипропилметилцеллюлозы, фталат поливинилацетата, тримеллитат ацетата целлюлозы, карбоксиметилэтилцеллюлозу, шеллак 5 или другой подходящий полимер(-ы). Слой покрытия может также состоять из пленкообразующих полимеров, являющихся чувствительными к другим люминальным компонентам, нежели чем рН, таким как бактериальное разложение, или компонента, который обладает такой же чувствительностью при его смешивании с другим пленкообразующим полимером. Примерами таких компонентов, обеспечивающих отсроченное высвобождение в 10 подвздошной кишке, являются полимеры, содержащие азосвязь(-и), полисахариды, такие как пектин и его соли, галактоманнаны, амилоза и хондроитин, дисульфидные полимеры и гликозиды.
[0078] Компоненты с различными значениями рН, водной и ферментативной чувствительностями можно применять в комбинации для нецеливания терапевтической 15 композиции в подвздошную кишку. Толщину покрытия также можно применять для того, чтобы контролировать высвобождение. Компоненты также можно применять для того, чтобы формировать матрицу, в которую встраивают терапевтическую композицию. В целом смотреть Frontiers in Drug Design & Discovery (Bentham Science Pub. 2009) vol. 4.
Б. Частотно или радиоуправляемые капсулы
[0079] В качестве альтернативы растворяющимся покрытиям и матрицам, сайт-специфическую доставку можно осуществить посредством капсул, которые высвобождаются от внешне сгенерированного сигнала. Ранние модели выпускали для высокочастотного (ВЧ)
25 сигнала, как описано в Digenis и др. (1998) Pharm. Sci. Tech. Today 1:160. С тех пор первоначальную концепцию ВЧ капсулы обновили, а результат представили на рынке как InteliSite(r). Обновленная капсула представляет собой систему доставки, которая активируется радиочастотой и не распадается. Радиомечение капсулы позволяет определить местоположение капсулы в специфической области желудочно-кишечного тракта при помощи
30 гаммасцинтиграфии. Когда капсула достигает желаемого местоположения в желудочно
кишечном тракте, внешняя активация открывает серию окон в депо капсулы лекарственного средства.
[0080] В некоторых вариантах реализации можно заключать иммуногенный биологический агент в радиоуправляемую капсулу, таким образом капсулу отслеживают и подают ей сигнал 5 как только она достигает подвздошной кишки. В некоторых вариантах реализации капсуле подают сигнал в определенный момент времени после введения, который соответствует тому времени, когда, как ожидается, капсула достигнет подвздошной кишки с обнаружением или без.
В. Составы
10 [0081] Фармацевтические композиции можно применять для профилактических и терапевтических целей как описано в настоящем документе. Как было объяснено выше фармацевтические композиции можно приготовить для защиты от разложения в желудке, так что введенный иммуногенный биологический агент достигнет желаемого местоположения. Способы микрокапсулирования ДНК и лекарственных средств для перорального введения
15 описаны, например, в US2004043952.
[0082] Иммуногенная фармацевтическая композиция может содержать фармацевтически приемлемые соли иммуногенного биологического агента (например, иммуногенный полипептид или полинуклеотид, кодирующий иммуногенный полипептид). Такие соли можно получить из фармацевтически приемлемых нетоксичных оснований, в том числе органических 20 оснований (например, соли первичных, вторичных и третичных аминов и основных аминокислот) и неорганических оснований (например, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция и магния). Некоторые конкретные примеры солей включают фосфатный буферный физиологический раствор и физиологический раствор (например, для приема внутрь, назальной доставки или инъекции).
25 [0083] Покрытие с отсроченным высвобождением или дополнительное покрытие состава может содержать иные пленкообразующие полимеры, являющиеся нечувствительными к люминальным условиям по техническим причинам или хронографическому контролю высвобождения лекарственного средства. Материалы, применяемые для такой цели, включают в себя, но не ограничиваются ими, сахар, полиэтиленгликоль, поливинилпирролидон,
30 поливиниловый спирт, поливинилацетат, гидроксипропилцеллюлозу, метилцеллюлозу,
этилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу и другие, применяемые по отдельности или в виде смесей.
[0084] Добавки, такие как диспергирующие добавки, красители, пигменты, дополнительные полимеры, например, поли(этилакрилат, метилметакрилат), противосклеивающие и 5 антипенные агенты, можно включать в слой покрытия. Другие соединения можно добавлять для того, чтобы увеличить толщину пленки и уменьшить диффузию кислых желудочных соков в наполнитель. Слои покрытия могут также содержать фармацевтически приемлемые пластификаторы с целью получения желаемых механических свойств. Такие пластификаторы, например, представляют собой, но не ограничиваются ими, триацетин, эфиры лимонной 10 кислоты, эфиры фталевой кислоты, дибутилсебацат, цетиловый спирт, полиэтиленгликоли, моноэфиры глицерина, полисорбаты или другие пластификаторы и их смеси. Количество пластификатора можно оптимизировать для каждого состава и в соответствии с выбранным полимером(-ами), выбранным пластификатором(-ами) и применяемым количеством указанного полимера(-ов).
15 [0085] Другие подходящие фармацевтические ингредиенты, известные в данной области техники, можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению. Подходящие носители включают, например, воду, физиологический раствор, спирт, жир, воск, буфер, твердый носитель, такой как маннит, лактозу, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлозу, глюкозу, сахарозу и карбонат магния или
20 биоразлагаемые микросферы (например, полилактат-полигликолат). Подходящие биоразлагаемые микросферы описаны, например, в патентах США №№ 4897268; 5075109; 5928647; 5811128; 5820883. Иммуногенный полипептид и/или носитель вектора экспрессии можно инкапсулировать в биоразлагаемую микросферу или связать с поверхностью микросферы.
25 [0086] Такие композиции могут также содержать неиммуногенные буферы (например, нейтральный забуференный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор), углеводы (например, глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны), маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, бактериостатические агенты, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион,
30 адъюванты (например, гидроксид алюминия), суспендирующие агенты, загустители и/или консерванты. В качестве альтернативы, композиции согласно настоящему изобретению можно
приготовить в виде лиофилизата. Соединения также можно инкапсулировать в липосомы, применяя хорошо известную технологию.
IV. Иммунные ответы и вакцины
[0087] Фармацевтические композиции для доставки в подвздошную кишку как описано в 5 настоящем документе разработаны для того, чтобы вызывать иммунный ответ у индивидуума, который является специфичным для иммуногенного биологического агента, содержащегося в фармацевтической композиции. Фармацевтическую композицию можно применять профилактически или терапевтически в качестве вакцины для того, чтобы избежать или уменьшить вирусную инфекцию, бактериальную инфекцию, паразитарную инфекцию, 10 грибковую инфекцию или рак. Фармацевтические композиции можно применять для лечения на любой стадии, например, в предварительной стадии рака, раковой или метастатической стадии или для предотвращения заболевания или инфекции.
[0088] К примеру, композиции, описанные в настоящем описании, можно применять для предотвращения или лечения инфекции, такой как грипп, гепатитов или ВИЧ, или для
15 предотвращения или лечения рака. В данных способах фармацевтические композиции, как правило, вводят индивидууму, который может или не может страдать от заболевания, расстройства или инфекции. В некоторых вариантах реализации заболевание, расстройство или инфекцию диагностируют перед введением, например, применяя общепризнанные в данной области техники критерии. К примеру, вирусную инфекцию можно диагностировать
20 путем измерения титра вируса в образце, взятом у пациента, бактериальную инфекцию можно диагностировать путем обнаружения бактерий в образце, взятом у пациента, а рак можно диагностировать путем обнаружения присутствия злокачественной опухоли. Фармацевтические композиции можно вводить либо до, либо после хирургического удаления первичной опухоли и/или лечения, такого как проведение радиационной терапии или введение
25 обычных химиотерапевтических лекарственных средств.
[0089] Иммунотерапия, как правило, представляет собой активную иммунотерапию, в которой лечение основано на стимуляции in vivo эндогенной иммунной системы хозяина для оказания сопротивления, например, опухолям или бактериально или вирусно инфицированным клеткам, с введением, модифицирующих иммунный ответ агентов 30 (например, иммуногенных биологических агентов).
[0090] Частота введения профилактических или терапевтических композиций, описанных в настоящем документе, также как и дозировка, будет варьироваться от индивидуума к индивидууму, и ее можно легко установить при помощи стандартных методик. Как правило, примерно от 1 до 52 дозы можно вводить в течение 52-недельного периода. В некоторых 5 вариантах реализации вводят 3 дозы с интервалами в 1 месяц, или 2-3 дозы вводят каждые 2-3 месяца. В некоторых вариантах реализации комбинацию более одного антигена можно вводить одновременно или последовательно, например, ежегодную вакцину против гриппа, которая содержит отдельные компоненты, направленные на каждый подтип гриппа или многочисленные клады внутри подтипа. В некоторых вариантах реализации интервалы 10 составляют скорее один раз в год, например, ежегодные вакцины против гриппа на основе конкретного распространенного штамма. Впоследствии ревакцинацию можно проводить периодически. Альтернативные протокола могут быть подходящими для отдельных пациентов и конкретных заболеваний и расстройств.
[0091] Подходящая доза представляет собой количество иммуногенного биологического 15 агента, которое при введении как описано выше способно стимулировать, например, противоопухолевый, антивирусный или антибактериальный иммунный ответ и которое по меньшей мере на 15-50 % выше базального (до лечения) уровня или по меньшей мере на 5-50% (например, 5%, 10%, 20%, 30%, 50%, в 1,5 раза, 2 раза или выше) выше уровня от лечения направленного не на подвздошную кишку действия. Такой ответ можно отслеживать 20 посредством измерения противоопухолевых антител у пациента или посредством вакцин-зависимого поколения цитолитических Т-клеток, способных убивать, например, опухолевые клетки пациента, клетки пациента, инфицированные вирусом, или бактериально инфицированные клетки пациента in vitro. Такие вакцины также могут формировать иммунный ответ, который приводит к улучшенному клиническому результату (например, 25 полная или частичная, или более длительная выживаемость без признаков заболевания, пониженные вирусные титры) у вакцинных пациентов по сравнению с невакцинными пациентами или пациентами, получающими лечение направленного не на подвздошную кишку действия.
[0092] В общем случае соответствующая дозировка и схема лечения обеспечивает активное 30 соединение(-я) в количестве, достаточном для обеспечения терапевтического и/или профилактического эффекта. Такой ответ можно отслеживать посредством установления улучшенного клинического результата (например, пониженный или отрицательный вирусный
титр, более частые ремиссии, полная или частичная, или более длительная выживаемость без признаков заболевания) у пациентов, получавших лечение, по сравнению с пациентами, получавших лечение направленного не на подвздошную кишку действия, или пациентами, неполучавших лечение. Такие иммунные ответы в целом можно оценивать, применяя 5 классическую пролиферацию, анализы на цитотоксичность или цитокины, описанные выше, которые можно выполнять с применением образцов, полученных от пациента до и после лечения.
[0093] К примеру, обнаружение иммунных комплексов, образованных между иммуногенным полипептидом и антителами в биологической жидкости, которые являются
10 специфическими для иммуногенного полипептида, можно применять для мониторинга эффективности терапии, например, для заболевания или расстройства, с которым связывают иммуногенный полипептид. Образцы биологической жидкости, взятой от индивидуума до и после начала терапии (например, терапии, направленной на подвздошную кишку) можно анализировать для иммунокомплексов с применением известных способов. Вкратце,
15 сравнивают число иммунокомплексов, обнаруженных в обоих образцах. Существенное изменение числа иммунных комплексов во втором образце (после направленной терапии) по отношению к первому образцу (до направленной терапии) отображает успешную терапию.
V. Примеры
[0094] Известны фармацевтические способы для доставки малых молекул в кишечник, 20 однако способность доставлять большую биологическую молекулу в кишечник для надлежащего иммунного распознавания изучена мало. Мыши не способны глотать таблетки, так что тяжело проводить исследования с таблетками в экспериментальных моделях на животных. Кроме того, положение наилучшего места для доставки вакцинного вектора для того, чтобы вызвать ответ на трансгенный антиген в организме человека, охарактеризовано не 25 было. На овцах было показано, что тощая кишка является наиболее эффективной мишенью для продуцирования иммунного ответа на кодируемый аденовирусом трансгенный антиген (Mutwari и др. (1999) Immunology 97:455). В данном случае авторы настоящего изобретения представляют результат исследований нескольких человеческих или нечеловеческих приматов с улучшенными человеческими пероральными лекарственными формами для доставки 30 биологических агентов.
Пример 1
[0095] Для того, чтобы определить, какая область тонкой кишки является наиболее активной для индукции иммунного ответа на антиген, проводили исследования на людях. Радиоуправляемые капсулы получали здоровые нормальные добровольцы с вакциной либо 5 высвобождаемой в начале тонкой кишки (тощей кишке), либо позже в тонкой кишке (подвздошной кишке). Было описано применение радиоуправляемых капсул для доставки низкомолекулярных лекарственных средств, однако не для доставки вакцины (Digenis и др. (1991) Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 7:309).
[0096] Вакцина состоит из рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего антиген 10 гриппа НА из А/СА/04/2009 (rAd-HA-дсРНК) (см., например, US2012/0244185). В общей сложности 1011 инфекционных единиц (ПЕ) давали каждому субъекту на нулевой день. Число циркулирующих в периферической крови преплазматических В-клеток измеряли при помощи анализа секретирующих антитела клеток (САК) на нулевой и 7 день после введения вакцины. Результаты определяют только число САК, которые распознают антиген НА.
15 [0097] Результаты показывают, что САК можно измерить через 7 дней после иммунизации в каждой группе, получавшей лечение (Фигура 1). Средние значения ответов были выше в группе с вводимой дозой в подвздошную кишку, чем в группе с вводимой дозой в тощую кишку. Фоновые содержания САК на нулевой день были незначительными. Для подвздошной кишки на 7 день наблюдали среднее значение 340 +/- 111 (стандартная ошибка) IgG и 74 +/- 18
20 IgA САК. Для тощей кишки средние значения ответов и стандартные ошибки составляли 118 +/- 30 IgG и 28 +/- 8 IgA САК. Подвздошнокишечная группа значимо отличалась от контрольной группы (Р=0,03 на 7-й день для IgA САК и имела тенденцию на увеличение для IgG САК Р=0,07). В противоположность результатам на овцах, результаты на людях показывают, что доставка в подвздошную кишку является более эффективной при
25 продуцировании образования антител IgG или IgA, чем доставка в тощую кишку.
[0098] Т-клеточные ответы также определяли путем обнаружения высвобождения интерферона-гамма (IFN-y) с применением метода иммуноферментных пятен (ELISPOT(r)). Фигура 2 показывает, что 12/12 в группе с вводимой дозой в подвздошную кишку имели повышенные уровни IFN-y по сравнению с 8/12 в группе с вводимой дозой в тощую кишку 30 через 7 дней после введения. Кроме того, уровни IFN-y были значимо выше в группе с вводимой дозой в подвздошную кишку, нежели чем в группе с вводимой дозой в тощую кишку.
[0099] Измеряли титры микронейтрализующих (МН) антител к гриппу А/СА/07/2009. Повышенные уровни МН антител указывают на образование нейтрализующих антител. После исключения субъектов, у которых первоначальное образование нейтрализующих антител было больше 40 (Faix и др. (2012) PLoS One 7:е34581), для отдельных субъектов наносили на график 5 кратные увеличения в титрах МН. Число субъектов с положительным ростом составляло 9 из 10 для вакцины, доставляемой в подвздошную кишку, по сравнению с 6 из 10 для вакцины, доставляемой в тощую кишку (Фигура 3). Средние геометрические титров (СГТ) были схожими между двумя группами, с ростом СГТ в группе с подвздошной кишкой с 22 до 92 по сравнению с ростом СГТ в группе с тощей кишкой с 18 до 90. Результаты показывают, что 10 высвобождение в подвздошной кишке является более надежным при индукции образований нейтрализующих антител к гриппу, возможно приводящее к более значительному проценту субъектов, защищенных от гриппа.
Пример 2
[0100] Таблетки изготавливали вручную с применением микрокристаллической целлюлозы
15 (РН-101, FMC) и крахмала (Крахмал 1500, Colorcon), содержащего 10% сульфата бария в качестве рентгеноконтрастного материала, содержащего пирогенный диоксида кремния в качестве агента для повышения текучести и стеарат магния в качестве таблеточного лубриканта. Таблетки диаметром в 7,14 мм и массой 150 мг покрывали Eudragit(r) L-100 в дражировочном котле, применяя 10% увеличение массы твердых веществ для покрытия в
20 качестве ориентира, несмотря на то, добавляли энтеросолюбильное покрытие; Твердые вещества для покрытия содержали 4 части полимера Eudragit(r) на одну часть триэтилцитрата и 1 часть талька. В качестве исходного исследования характеристик энтеросолюбильного покрытия, четырем яванским макакам давали таблетки, применяя пероральный желудочный зонд. Пероральный желудочный зонд является твердым и жестким, однако он полый до
25 середины низа для закапывания жидкостей. На ведущем конце жесткой трубки у него находится гибкая силиконовая трубка, которая может удерживать небольшую таблетку на месте. Трубочный и таблеточный аппарат крутящими движениями вводили в пищевод привязанных обезьян до тех пор, пока ведущий конец не проходил через кардиальный сфинктер и в желудок. Для вытеснения таблетки в желудок применяли промывку
30 апельсиновым соком. Рентгенографии брали в заданных временных точках, и исследовали на местоположение и растворение таблетки. Результаты обобщены в Таблице 1.
Таблица 1: характеристики покрытия L-100
Животное
Время и местоположение таблетки
1 час
2 часа
3 часа
4 часа
желудок
желудок
желудок
кишечник
желудок
кишечник
кишечник
растворилась
кишечник
кишечник
растворилась
растворилась
желудок
желудок
кишечник
растворилась
[0101] На Фигуре 4 показано, что таблетки были полностью неповреждены в условиях среды желудка с низким значением рН; не было никаких признаков преждевременного растворения таблеток. Будучи крупными для обезьяны, таблетки были способны нетронутыми проходить 5 через желудок в кишечник. В кишечнике они растворялись с умеренной скоростью и полностью растворялись у 3 из 4 обезьян. У 4-й обезьяны, таблетка покинула желудок через некоторое время после 3 часов, и таблетка не растворилась во время последней рентгенографии. В целом, таблетки подействовали приемлемым образом, и покрытие Eudragit(r) L-100 выбрали для будущих исследований на человеке.
10 Пример 3
[0102] Фаза 1 последовательно регистрируемого клинического исследования с рандомизированной и плацебо-контролируемой когортой для оценки безопасности и иммуногенности рекомбинантного Ad серотипа 5 (rAd5) на основе пероральной вакцины против сезонного гриппа HI была завершена. Вектор rAd5 (rAd-HA-дсРНК с НА от
15 А/СА/04/2009) было описан в Примере 1. Исследование имело приблизительно 3-х месячную активную фазу, и его проводили в соответствии с действующими руководящими принципами надлежащей клинической практики, Кодексом федеральных правил США и Международной конференцией по гармонизации руководящих принципов. От всех субъектов было получено информированное согласие после обсуждения рисков. Институциональный Наблюдательный
20 Совет (IRB) дал одобрение до введения дозы субъектам.
[0103] Оцененный по надлежащей практике организации производства (GMP) rAd-HA-дсРНК производили в мешках Wave(r) (GE Healthcare, Waukesha, WI) на Lonza Biologicals (Houston, TX). Очистку проводили при помощи ионообменной хроматографии с последующим буферным обменом. Очищенный вектор смешивали со вспомогательными веществами, 25 лиофилизировали, а затем таблетировали на Lonza с применением микрокристаллической целлюлозы и крахмала в качестве наполняющих веществ для таблеток. Таблетки покрывали
энтеросолюбильным покрытием с Eudragit(r) L 100 (Evonik Industries, Darmstadt, Germany), применяя покрытие Vector HiCoater(r) LDCS-5 (Vector Freund, Cedar Rapids, IA). Конечный продукт выпустили в одной партии и титровали при помощи стандартного анализа ИЕ. Плацебо изготавливали в виде аналогичных по размеру и форме таблеток, содержащих 150 мг 5 микрокристаллической целлюлозы без энтеросолюбильного покрытия. В исследовании сравнивали субъекты, получавшие лечение с 109 ИЕ, 1010 ИЕ и плацебо, на способность вызывать иммунный ответ на трансген. Субъекты получали таблетки на нулевой и 28 день.
[0104] Число циркулирующих преплазматических В-клеток в периферической крови измеряли при помощи анализов САК на нулевой и 7 день после начальной дозы и на 28 и 35
10 день после второй дозы (вторую дозу доставляли на 28 день). Результаты показывают, что значения САК могли быть измерены через 7 дней после каждой иммунизации в группах, получавших лечение, но не в контрольной группе (Фигура 5). Средние значения ответов были выше на 7 день и выше в группе с высокой дозой, нежели чем в группе с низкой дозой. Фоновые содержания САК на нулевой и 28 день были незначительными, и незначительными в
15 контрольной группе во всех временных точках. Для группы с высокой дозой было обнаружено в среднем 105 +/- 33 и 27 +/- 12 САК для 7 и 35 дня соответственно. Для группы с низкой дозой средние значения САК составляли 41 +/- 32 и 14 +/- 8 для 7 и 35 дня соответственно. В контрольной группе в среднем имелось 0,3 +/- 0,3 и 0 для 7 и 35 дня соответственно. Группа с высокой дозой была значимо выше, чем контрольная группа (Р=0,01 и 0,05 для 7 и 35 дня
20 соответственно.)
[0105] Образования нейтрализующих антител к гриппу измеряли при помощи анализа МН. Результаты показывают зависимое от дозы увеличение в титрах МН в группах, получавших лечение, по сравнению с плацебо-контролем (Фигура 6). Частота МН респондеров с по меньшей мере 2-кратным увеличением в группе с высокой дозой была значимо отличной от
25 контрольной группы (Р=0,003 согласно точному критерию Фишера), в то время как группа с низкой дозой имела тенденцию на увеличение, но не была значимо выше по сравнению с плацебо (Р=0,2). После исключения субъектов, у которых титры МН были больше 40, средние геометрические титры (СГТ) вычисляли у остальных субъектов (Таблица 2). Также подсчитывали геометрическую кратность ответа титра 56 дня (ГКОТ) (Таблица 2). Данные
30 результаты показывают, что титры нейтрализующих антител к гриппу формируются при помощи пероральной иммунизации с более, чем с 3-кратным увеличением в СГТ после
иммунизации в группе с высокой дозой. Данные результаты показывают, что таблетки с L 100 покрытием можно применять для доставки вакцины в кишечник.
Таблица 2: Изменения СГЗТ в титрах МН для субъектов с МН < 40
Группа
СГТО дня
СГТ 28 дня
СГТ 56 дня
ГКОТ
Контрольная
14,1
14,1
14,1
Низкая доза
12,3
14,1
16,2
1,3
Высокая доза
15,6
36,2
53,8
3,4
Пример 4
5 [0106] Авторы настоящего изобретения исследовали параметры энтеросолюбильного покрытия in vitro для того, чтобы определить времена растворения с изменяющимся рН и процентом покрытия. Данные предлагают рекомендации для доставки в подвздошную кишку, сопровождающейся гастрической экспозицией при низком значении рН (как в желудке) и последующим транзитом через увеличивающийся градиент рН (как это обнаруживается в 10 двенадцатиперстной кишке и тощей кишке) до достижения подвздошной кишки.
[0107] Исследование распада таблетки осуществляли со 150 мг таблеток, приготовленными согласно описанию выше, и покрывали с 8, 10 или 12% увеличением массы твердых веществ, используя Eudragit(r) L100, Eudragit(r) LI00-55 или 1:1 (масс/масс) смесь полимеров L100 и L100-55, применяемых в качестве суспензии органического растворителя. В двух экземплярах,
15 таблетки, приготовленные с каждым полимером для покрытия и на каждом уровне нанесения покрытия, подвергались предварительной обработке искусственным желудочным соком USP (SGF, рН 1,6 без пепсина) в течение 120 минут в аппарате для исследования растворимости с поршневым цилиндром Vankel Bio-Dis III при температуре 37 °С со скоростью возвратно-поступательных движений 10 погружений в минуту (ПМ). Далее таблетки переносили в
20 искусственный желудочный сок USP (SIF, рН 6,8 без панкреатина). Наблюдали за распадом таблеток и регистрировали время полного распада обеих таблеток с точностью до 5 минут. Эти данные указывают на то, что на время распада оказывает влияние как полимерная композиция, так и толщина, и предлагают рекомендацию в отношении надлежащего выбора композиции для покрытия, чтобы оказывать влияние на поведение покрытий после выхода таблеток из
25 желудка.
Полимер для покрытия
Время на распад при указанном содержании покрытия
(минуты)
10%
12%
L100
L100/L100-55
L100-55
[0108] Исследование воздействия рН на время распада осуществляли со 150 мг таблеток, покрытых до 10% увеличения массы твердых веществ или с Eudragit(r) L100, или с Eudragit(r) L100-55. Готовили серию буферов путем доведения рН USP SIF (без панкреатина) до значений, 5 охватывающих спецификацию USP 6,8. Таблетки подвергали воздействию USP SGF (без пепсина) в течение 120 минут при 37 °С и 10 ПМ, далее переносили в рН-модифицированные растворы USP SIF. Наблюдали за распадом таблеток и регистрировали время полного распада с точностью до 5 минут. Эти данные указывают на то, что на скорость распада оказывает влияние значение рН среды и отличия между двумя полимерами. В этом же случае результаты 10 можно применять для надлежащего выбора композиции для покрытия для достижения удержания лекарственного средства в желудок и верхней части тонкой кишки.
Значение рН SIF
Время распада для полимера при значении рН (минуты)
Eudragit L100
Eudragit L100-55
5,4
250
145
6,4
Пример 5
[0109] Авторы настоящего исследования проводили 1-ую фазу последовательно регистрируемого исследования с рандомизированной и плацебо-контролируемой когортой для
15 оценки безопасности и иммуногенности рекомбинантного Ad серотипа 5 (rAd5) на основе пероральной вакцины против сезонного гриппа HI. Таблетки, содержащие вакцину, покрывали согласно настоящему описанию для растворения в подвздошной кишке. Данные показывают, что пероральная таблетка вакцины будет способна конкурировать с существующими вакцинами с точки зрения продуцирования образований нейтрализующих
20 антител к гриппу.
[ОНО] Реакции ингибирования гемагглютинации (HAI) измеряли на нулевой и 28 день (Фигура 7А). Ни у одного из субъектов, получавших лечение с плацебо, не произошло
видоизменения серологической специфичности, однако один контрольный субъект прошел через скрининг и имел высокое значение на нулевой день. Ни у одного из вакцинных субъектов не было исходного титра HAI > 20. После иммунизации, девять субъектов в вакцинной группе достигли серопротективных уровней (HAI > 40) (Фигура 7А). Средний геометрический титр 5 (СГТ) для группы составил 61,1 (95% ДП: 30 - 124), 7,7-кратное среднее геометрическое повышение (СГП) по сравнению с первоначальным СГП 7,9 (95% ДП: 6 - 11). Из одиннадцати 4-кратных повышений (92%), у девяти видоизменялась серологическая специфичность (СС) с другими 2 субъектами, демонстрирующими 4-кратное повышение титра HAI от 5 до 20. В вакцинной группе было статистически значимое увеличение в числе 4-кратных респондеров 10 по сравнению с контрольной (11 против 0, при Р <0,0000 при помощи точного критерия Фишера). Контрольные субъекты имели СГТ 11,9 (95% ДП: 6 - 25) на 28 день по сравнению с СГТ 11,0 в нулевой день (95% ДП: 5 - 23).
[0111] Продолжительность гуморального иммунного ответа измеряли путем анализа реакций HAI через 180 дней после иммунизации. В вакцинно-иммунизированной группе 75% 15 (9 из 12) субъектов были серологически защищены на 28-й день и 75% (9 из 12) оставались серологически защищенными на 180 день. СГТ HAI наносили на график (Фигура 7В), и было установлено 28% снижение в СГТ между 28 и 180 днем после иммунизации.
[0112] Нейтрализующий гуморальный иммунный ответ на грипп измеряли при помощи МН анализа. Наблюдали значимое увеличение титров МН в группе, получавшей лечение, по 20 сравнению с плацебо-контролем (Фигура 7С). Частота 4-кратных МН респондеров в группе, получавших лечение с вакциной, значимо отличалась от контрольной группы, проявляясь у 11 субъектов в группе, получавшей лечение вакциной, против 0 в контрольной группе (Р <0,0000 при помощи точного критерия Фишера).
[0113] После исключения субъектов с исходным уровнем титра МН (и титра HAI) больше 25 40, средние геометрические титры (СГТ) подсчитывали у оставшихся субъектов на нулевой и 28 день как показано в следующей таблице. СГТ для вакцинной группы возросло до 247 (95 ДП: 89-685) по сравнению с отсутствием роста в контрольной группе с СГТ 9,6 (95 ДП: 5-18) на 28 день. Данные вычисления не оказали никакого влияния на вакцинную группу, поскольку ни один из субъектов не имел высоких исходных титров МН или HAI. Данные результаты 30 показывают, что титры нейтрализующих антител к гриппу формируются посредством
пероральной иммунизации с более, чем 20-кратным увеличением в СГТ после иммунизации в группе, получавшей лечение с вакциной.
Анализ
ГРУППА
СГТ на день 0
СГТ на день 28
гкот
HAI
Контрольная
8,3
8,8
1,1
Вакцинная
7,9
61,1
7,7
75%
Контрольная
9,3
9,6
1,0
н/д
Вакцинная
8,6
247
н/д
[0114] В целях измерения общих образований антител к НА, число циркулирующих 5 преплазматических В-клеток в периферической крови измеряли при помощи анализа САК на нулевой и 7 день после иммунизации. Результаты показывают, что САК можно достоверно измерить на 7 день в группе, получавшей лечение с вакциной (Фигура 7D). Фоновое содержание САК в целом было пренебрежимо малым на нулевой день. Для группы, получавшей лечение с вакциной, на 7 день в среднем обнаружили 992 (+/- станд. ошиб. 209,
10 95% ДП: 532-1452) IgG САК и 337 IgA САК (+/- станд. ошиб. 104, 95 % ДП: 117-580) каждого на 1 х 106 РВМС с только одним субъектом из 12, не имеющим определяемого ответа САК. В контрольной группе не было пятен IgA на 7 день, однако один субъект имел высокое фоновое размытие и измеряемый ответ IgG САК с меньшими пятнами, чем наблюдаемые обычно. Группа, получавшая лечение с вакциной, значимо отличалась от контрольной группы с точки
15 зрения способности вызывать ответ IgG или IgA САК на 7 день (Р=0,0007 и Р=0,008 соответственно при помощи t-критерия).
[0115] У субъектов ретроспективно замеряли их антивекторные титры до и после иммунизации. После пероральной иммунизации, несколько субъектов, получавших лечение с вакциной, имели увеличение в ответах нейтрализующий антител к Ad5, что приводило к 2,620 кратному увеличению СГ титра нейтрализующих антител по сравнению с 1,0-кратным СГ увеличением в группе, получавшей плацебо. В вакцинной группе, ответы HAI и МН обладали одинаковой тенденцией для отдельных субъектов. Восемь субъектов были Ad5-отрицательными перед иммунизацией, и четыре были Ad5-пoлoжитeльными перед иммунизацией. У одного субъекта, который был Ad5-пoлoжитeльным, не было видоизменения 25 серологической специфичности HAI, тем не менее, у одного Ad5-пoлoжитeльнoгo субъекта, было наивысшее увеличение в титрах HAI (64 раза), чем у любого из субъектов в исследовании. Данный субъект обладал 362-кратным увеличением в титрах МН без какого
либо увеличения в титрах Ad5 нейтрализующих антител до и после иммунизации. Корреляции между начальными титрами Ad5 и кратными ответами МН (или ответами HAI) для субъектов, иммунизированных таблеткой вакцины, не наблюдали.
[0116] Более того, раскрытая в настоящее время таблетка вакцины является стабильной при 5 комнатной температуре в течение более 270 дней, и может выдерживать кратковременные колебания при более высоких температурах, что делает данный подход технически осуществимым.
Пример 5 Обсуждение
[0117] Американские военные проводили независимое исследование по измерению влияния 10 сезонных кампаний по вакцинированию на образование нейтрализующих антител у военнослужащих, и сообщили о ГКОТ титра МН в 5,6 после инъекции трехвалентной инактивированной вакцины (ТПВ) и ГКОТ в 2,2 после интраназального введения живой аттенюированной вакцины против гриппа (ЖАВ111 ) после начала подсчета субъектов с титрами МН выше 40 (Faix и др. (2012) PLoS One 7:е34581). В другом исследовании была 15 установлена 45% степень SC для H1N1 для одной инъекции 45 мкг белка НА (без адъюванта) (Gordon и др. (2012) Vaccine 30:5407), в то время как в другом исследовании, вакцина H1N1 являлась высоко иммуногенной с 78% степенью SC, наблюдаемой после 1 дозы сплит-вакцины (Greenberg и др. (2009) 361:2405).
[0118] В отличие от переменных результатов, наблюдаемых с инъецированными вакцинами, 20 в настоящем исследовании ГКОТ МН был рассчитан при 29 для 12 субъектов, получавших лечение с вакциной, с 92% субъектами, показывающими больше, чем 4-кратное увеличение титров МН. В настоящем исследовании таблетки, степень SC HAI среди пациентов, получавших лечение с вакциной, составляла 75% с более, чем 92% пациентов, имеющими 4-кратное увеличение титров HAI (Фигура 7А). Титры МН были выше, чем титры НАГ Вполне 25 возможно, что анализ МН является более чувствительным, или что пероральная вакцина на основе rAd вызывает более сильные нейтрализующие ответы вне головной области, нежели чем белковые инъецированные вакцины.
[0119] Ответы HAI продуцируют инъекционными коммерческими вакцинами, однако известно, что титры HAI ослабевают. К примеру, у не ВИЧ-инфицированных добровольцев 30 было 67% снижение в СГТ титрах HAI между 1 до 6 месяцем после иммунизации (Cram-Cianflone и др. (2011) Vaccine 29:3183). Аналогичным образом, процент серопротективных
субъектов снизился с 75% до 56% для ВИЧ-отрицательных субъектов, включенных в исследование с сероотрицательными титрами HAI ( <1:10). Исследования с применением вакцин против пандемического гриппа также показали снижение в сроке службы. В исследовании вакцины против птичьего гриппа AS03, СГТ достигло 563 после 2 доз вакцины, 5 однако через 6 месяцев после иммунизации СГТ снизилось до 18, 96% снижение (Leroux-Roels и др (2010) Vaccine 28:849). В настоящем исследовании таблетки вакцины, процент серопротективных субъектов оставался на постоянном уровне в 75% на 1 и 6 месяц после иммунизации, а падение СГТ титра HAI было менее радикальным, показывая только 28% снижение (Фигура 7В). Одним из возможных вариантов является то, что срок службы лучше 10 для векторных вакцин в связи с улучшенными Т-клеточными ответами.
Пример 5. Материалы и способы
[0120] Клинический протокол и включение в исследование. Субъектов предварительно обследовали на титры ингибирования гемагглютинации (HAI) в течение 45 дней после включения в исследование. Для того, чтобы иметь право на участие в исследовании, субъекты 15 должны были иметь исходный титр HAI <1:20, быть возраста 18-49 лет и иметь удовлетворительное состояние. Активная фаза исследования была через 28 день, с последующей фазой для мониторинга безопасности для продолжения в течение 1 года.
[0121] В исследование включили 24 субъекта. Все субъекты, которых включили в исследование, прошли оценки безопасности и иммуногенности через активную фазу и через 20 180 день фазы мониторинга.
[0122] Рандомизация и маскирование. Исследование разработали для оценки вакцины (VXA-А1,1) у 12 субъектов с однократной дозой в 1 х 1011 инфекционных единиц (ИЕ) с 12 субъектами, получавших плацебо-контроль. Присутствовало 3 последовательно включенных сигнальных субъекта, получавших лечение с вакциной, при этом каждому субъекту вводили
25 дозу не чаще, чем один раз каждые 24 часа. После недели отслеживания связанной с вакциной токсичностью, оставшихся субъектов в когорте, получавшей лечение (9), распределили в группы случайным образом совместно с 12 плацебо-контролями. Рандомизацию проводили при помощи компьютерного распределения, а исследуемое лекарственное средство распространяли со скрытым идентификационными характеристиками среди маскированного
30 персонала через демаскированного фармацевтического работника. Весь относящийся к исследованию персонал, также как и группа лиц, непосредственно вовлеченная в
иммунологические анализы или оценку клинической безопасности, оставались ослепленными к распределению в группы лечения. В исследовании все субъекты были ослепленными.
[0123] Вакцина. Вектор rAd (нереплицируемый Ad5) несет ДНК, которая кодирует трансген НА (А/СА/04/2009), чья экспрессия направляется промотором CMV и молекулярной шпилькой 5 дсРНК, направляемой отдельным промотором. Вещество лекарственного средства по GMP производили в мешках Wave (GE Healthcare, Waukesha, WI) на Lonza Biological (Houston, TX). Очистку проводили при помощи ионообменной хроматографии с последующим буферным обменом. Очищенный вектор смешивали со вспомогательными веществами, лиофилизировали, а затем таблетизировали на Lonza, применяя микрокристаллическую
10 целлюлозу и крахмал в качестве наполняющих веществ для таблеток. Таблетки покрывали энтеросолюбильным покрытием с Eudragit L100(r) (Evonik Industries, Darmstadt, Germany) с использованием системы Vector Hi-Coater (Vector Freund, Cedar Rapids, IA). Конечный продукт выпустили в одной партии и титровали при помощи стандартного анализа ИЕ на Lonza. Плацебо изготавливали в виде аналогичных по размеру и форме таблеток, содержащих 150 мг
15 микрокристаллической целлюлозы без энтеросолюбильного покрытия.
[0124] Ожидаемые результаты. Первоначальным ожидаемым результатом является безопасность, и вторичным ожидаемым результатом является иммуногенность на протяжении активной фазы, в первую очередь титров HAI и сероконверсий HAI. Дополнительные иммуногенные ожидаемые результаты включают титры МН и САК. Было 5 нежелательных 20 явлений в контрольной группе и 4 в группе с вакциной, которые все были 1 -й степени тяжести. В исследовании не было отмечено серьезных нежелательных явлений.
[0125] Выделение МКПК и криоконсервация. Кровь собирали в пробирки Кз ЭДТА Vacutainer(r) (BD, Franklin Lakes, Ш) и МКПК выделяли в тот же день при помощи пробирок Lymphoprep(tm) (Axis-Shield, Norway). МКПК замораживали и размораживали, применяя 25 свободные от сыворотки реагенты в соответствии с инструкциями изготовителя (Cellular Technology Ltd [CTL], Shaker Heights, OH).
[0126] Секретирующие антитела клетки (САК). Наборы иммуносорбентов с иммобилизированными ферментами (ELISpot) для IgG и IgA секретирующих В-клеток были представлены в соответствии с инструкциями производителя (Mabtech, Mariemont, ОН). 30 Клетки культивировали (между 1,5 х 104до 5 х 105 клеток на лунку) в трех лунках на среде CTL-test для оптимизации пятен. Белок НА (Protein Sciences Corp, Meriden, CT)
биотинилировали и проводили количественный анализ, применяя набор для биотинилирования (Pierce, Rockford, IL).
[0127] Анализы антител. Титры HAI и микронейтрализующих (МН) антител представили и измерили против соответственно А/СА/07/2009, полученного из MDCK, и А/СА/07/2009, полученного из яйца. Титры HAI и МН менее 10 отмечали как 5 как это было предложено регулирующим советом.
[0128] Статистический анализ. Непарные t-критерии Стьюдента проводили для исследования значимых различий между группами. Двухсторонний точный критерий Фишера применяли для того, чтобы определить, были ли наблюдаемые частоты отличны для некоторых анализов как указано в тексте. Для обоих тестов р-значения <0,05 считались значимыми. Для измеренных значений брали 95-процентный доверительный интервал (95 ДИ).
[0129] Понятно, что описанные в настоящем описании примеры и варианты реализации представлены только в качестве иллюстрации, и что их различные модификации или их изменения будут предложены специалистам в данной области техники и должны быть включены в сущность и сферу действия данной заявки и объема прилагаемой формулы изобретения. Все публикации, патенты, патентные заявки, веб-сайты и прикрепленные базы приводимых данных, процитированных в настоящем описании, полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки для всех целей.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Иммуногенная композиция для продуцирования иммунного ответа у человека, содержащая:
(i) иммуногенный биологический агент, заключенный в агент (ii), который направляет доставку иммуногенного биологического агента в подвздошную кишку человека, при этом агент (ii) представляет собой энтеросолюбильное покрытие, которое имеет пороговые значения рН 5,8-6,8.
2. Иммуногенная композиция по п.1, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие имеет пороговое значение рН 6,0.
3. Иммуногенная композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что распад энтеросолюбильного покрытия происходит по меньшей мере на 75% по сравнению с его первоначальной толщиной за 110 минут при значениях рН 5,8-6,8.
4. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1.
5. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100.
6. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)Ll00-55.
7. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит Eudragit(r) L-100, триэтилцитрат и тальк.
8. Иммуногенная композиция по п. 7, содержащая 1-4 части Eudragit(r) L-100, 12 части триэтилцитрата и 1 -2 части талька.
9. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит смесь поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 и поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1.
10. Иммуногенная композиция по п. 9, отличающаяся тем, что отношение поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 к поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1 составляет от 1:4 до 4:1.
2.
11. Иммуногенная композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 и поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2.
12. Иммуногенная композиция по п. 11, отличающаяся тем, что отношение поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 к поли(метакриловая кислота-со-метилакрилат) 1:2 составляет от 1:2 до 2:1.
13. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-3, 11 и 12, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r) L-100 и Eudragit(r)S100.
14. Иммуногенная композиция по любому из пп.11-13, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит от 1 до 4 частей поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:1 и поли(метакриловая кислота-со-метилакрилат) 1:2; от 1 до 2 частей триэтилцитрата и от 1 до 2 частей талька.
15. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит смесь поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2 и поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1.
16. Иммуногенная композиция по п. 15, отличающаяся тем, что отношение поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2 к поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:1 составляет от 1:4 до 4:1.
17. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-3, 15 и 16, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит смесь Eudragit(r) L-100-55 и Eudragit(r)S100.
18. Иммуногенная композиция по любому из пп.15-17, отличающаяся тем, что энтеросолюбильное покрытие содержит от 1 до 4 частей поли(метакриловая кислота-со-метилметакрилат) 1:2 и поли(метакриловая кислота-со-этилакрилат) 1:2; от 1 до 2 частей триэтилцитрата и от 1 до 2 частей талька.
19. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-18, отличающаяся тем, что иммуногенный биологический агент представляет собой иммуногенный полипептид.
20. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-19, отличающаяся тем, что иммуногенный биологический агент представляет собой вектор экспрессии, кодирующий иммуногенный полипептид.
21. Иммуногенная композиция по п.20, отличающаяся тем, что вектор представляет собой аденовирусный вектор.
2.
22. Иммуногенная композиция по п. 20 или 21, отличающаяся тем, что вектор экспрессии также кодирует дсРНК.
23. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-22, отличающаяся тем, что композиция представляет собой форму прессованной таблетки.
24. Способ доставки иммуногенной композиции в подвздошную кишку человека, включающий пероральное введение иммуногенной композиции по любому из пп. 1-23 человеку.
25. Способ продуцирования иммунного ответа у человека, включающий введение композиции по любому из пп.1-23 человеку, отличающийся тем, что иммунный ответ является специфичным для иммуногенного биологического агента.
26 . Способ по п.25, отличающийся тем, что иммуногенный биологический агент представляет собой иммуногенный полипептид, и иммунный ответ является специфичным для указанного иммуногенного полипептида.
27. Способ по п.25, отличающийся тем, что иммуногенный биологический агент представляет собой вектор экспрессии, кодирующий иммуногенный полипептид, и иммунный ответ является специфичным для указанного иммуногенного полипептида.
28. Способ по п.27, отличающийся тем, что вектор экспрессии представляет собой аденовирусный вектор.
29. Способ по любому из пп. 24-28, отличающийся тем, что указанное введение приводит к выработке нейтрализующих антител человеком.
27.
27.
27.
27.
27.
Клетки САК, секретирующие
иммуноглобулин G
Плацебо Низкая доза Высокая доза
Плацебо Низкая доза Высокая доза
Значения средних геометрических титров (СГТ) д. Титры ингибирования гемагглютинации (HAI) до и после иммунизации В. ИНГибирования гемагглютинации (HAI) ко времени
ФИГУРА 1
ФИГУРА 1
ФИГУРА 2
ФИГУРА 2
ФИГУРА 3
ФИГУРА 3
ФИГУРА 4
ФИГУРА 4
ФИГУРА 5
ФИГУРА 5
ФИГУРА 6
ФИГУРА 6
ФИГУРА 7
ФИГУРА 7