(57) Реферат / Формула:
Авторы изобретения идентифицировали остатки в варианте 2 и варианте 3 менингококкового fHbp, которые могут быть модифицированы для увеличения его стабильности.
Евразийское (21) 201691429 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2015.02.27
(51) Int. Cl.
A61K 39/095 (2006.01) C07K14/22 (2006.01) C07K14/095 (2006.01)
(54) МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp
(31) 14157399.8; 14177566.8
(32) 2014.02.28; 2014.07.17
(33) EP
(86) PCT/EP2015/054174
(87) WO 2015/128480 2015.09.03
(71) Заявитель: ГЛАКСОСМИТКЛАЙН БАЙОЛОДЖИКАЛС СА (BE)
(72) Изобретатель:
Боттомлей Мэттью, Малито Энрико, Мартинелли Мануэле, Скарселли Мария (IT)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Авторы изобретения идентифицировали остатки в варианте 2 и варианте 3 менингококково-го fHbp, которые могут быть модифицированы для увеличения его стабильности.
РСТУЕР2015/054174
МПК: А61К39/095 (2006.01) С07К14/095 (2006.01)
С07К14/22 (2006.01)
МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp
В данной заявке на изобретение заявлено преимущество заявок на Европейский патент 14157399.8 (поданной 28 февраля 2014 года) и 14177566.8 (поданной 17 июля 2014 года), полные содержания которых для всех задач включены здесь путем ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к области белковой инженерии, в частности к менингококковому белку, связывающему фактор Н (fHbp), который, как известно, представляет собой полезный вакцинный иммуноген.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Neisseria meningitidis представляет собой грамотрицательную инкапсулированную бактерию, которая колонизирует верхние дыхательные пути у приблизительно 10% населения. Существуют конъюгированные вакцины против серогрупп А, С, W135 и Y, но единственная вакцина, которая доступна для защиты против серогруппы В в схеме с двумя дозами, представляет собой продукт BEXSERO(tm), одобренный в 2013 году.
Одним из защитных иммуногенов в BEXSERO(tm) представляет собой fHbp, который также известен как белок "741" (SEQ ID NO: 2536 в источнике 1; здесь последовательность SEQ ID NO: 1), "NMB1870", "GNA1870" [2-4], "Р2086", "LP2086" или ORF2086" [5-7]. Трехмерная структура этого белка известна [8, 9], и белок имеет две (3-бочки, связанные коротким линкером. Во множестве публикаций сообщается о защитной эффективности этого белка в менингококковых вакцинах, например, смотри источники 10-14. Липопротеин fHbp экспрессируется в различных штаммах во всех серогруппах. Последовательности fHbp сгруппированы в три варианта [2] (названные в настоящем описании как v1, v2 и v3), и в общем обнаружили, что сыворотка, полученная против данного варианта, является бактерицидной против штаммов, которые экспрессируют этот вариант, но не активна против штаммов, которые экспрессируют один из двух других вариантов, т.е. существует перекрестная защита в пределах варианта, но нет перекрестной защиты между
вариантами (за исключением некоторой перекрестной реактивности между v2 и v3).
Для увеличения перекрестной реактивности между семействами сконструирована последовательность fHbp, содержащая специфические черты для всех трех вариантов [15]. Белковую инженерию также использовали для удаления взаимодействия fHbp с сидерофорами [15] и с фактором Н [17-25]. О нарушении взаимодействия с fH сообщали для всех трех вариантов, и предполагается получение улучшенного вакцинного иммуногена [22, 26]. Тем не менее, для полипептидов v2 в источниках 23 и 24 сообщается о неизбежной нестабильности, которая также обнаружена у мутантов с нарушенным связыванием fH. Нестабильность, по-видимому, возникает от N-концевого домена в виде (3-бочки, и в источнике 23 предостерегают о том, что любые замены в этой бочке могут способствовать нестабильности.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить дополнительные мутанты fHbp v2 и v3, обладающие повышенной стабильностью.
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Полноразмерный fHbp из штамма 2996 в v2 имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 2):
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
Зрелый липопротеин не содержит первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 2 (подчеркнутые; образуется последовательность SEQ ID NO: 4), и форма AG последовательности SEQ ID NO: 2 не содержит первые 26 аминокислот (SEQ ID NO: 5).
Полноразмерный fHbp из штамма М1239 в v3 имеет следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 3):
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKD KGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAF
NQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAEL KADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
Зрелый липопротеин не содержит первые 19 аминокислот последовательности SEQ ID NO: 3 (подчеркнутые; образуется последовательность SEQ ID NO: 40), и форма AG последовательности SEQ ID NO: 3 не содержит первые 31 аминокислоты (SEQ ID NO: 17).
Авторы изобретения идентифицировали остатки в последовательностях SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, которые могут быть модифицированы для увеличения стабильности полипептида. Эти остатки, как правило, представлены в последовательностях v2 и v3, и, таким образом, их модификация может привести к последовательностям v2 и v3 fHbp, обладающим повышенной стабильностью. Более того, авторы изобретения продемонстрировали, что наряду с увеличением стабильности мутация этих остатков благоприятным образом может уменьшать связывание с человеческим фактором Н (fH). Тем не менее, дополнительно раскрытые здесь мутации могут быть комбинированы с другими мутациями, например, для уменьшения связывания с человеческим фактором Н (fH), для которого несколько мутаций уже известны в области техники.
Таким образом, в общем, в изобретении предложен мутант v2 или v3 fHbp, который обладает повышенной стабильностью по сравнению с fHbp дикого типа (например, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2 или 3) и который возможно обладает более низкой аффинностью в отношении человеческого фактора Н по сравнению с fHbp дикого типа (например, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 2 или 3). Увеличение стабильности и возможное уменьшение аффинности fH предпочтительно возникает в результате той(тех) же самой(ых) мутации(й), но в некоторых воплощениях они могут возникать в результате отдельных действий комбинированных мутаций. Предпочтительны мутантные белки fHbp, обладающие как повышенной стабильностью, так и сниженной аффинностью в отношении fH.
В первом воплощении изобретения предложен полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2, где: (а) аминокислотная последовательность имеет к% идентичность
последовательности SEQ ID NO: 5 и/или содержит фрагмент последовательности SEQ ID NO: 5; но (б) аминокислотная последовательность отличается от последовательности SEQ ID NO: 5 по одному или более чем одному из следующих остатков: S32, V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, Н239 и/или Е240.
Когда признак (а) относится к фрагменту, тогда этот фрагмент включает по меньшей мере один из остатков, перечисленных в (б), но этот остаток отличается по сравнению с соответствующим остатком последовательности SEQ ID NO: 5. Фрагмент (а), как правило, имеет длину по меньшей мере 7 аминокислот, например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 последовательных аминокислот или больше последовательности SEQ ID NO: 5. Фрагмент, как правило, включает по меньшей мере один эпитоп последовательности SEQ ID NO: 5. Идентификация и картирование эпитопа подтверждены для fHbp [11, 27-31]. Наличие одинаковых по меньшей мере 30 последовательных аминокислот с последовательностью SEQ ID NO: 5 является типичным, и обычно мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает несколько (например 2, 3, 4, 5 или более) фрагментов последовательности SEQ ID NO: 5. В общем, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 может иметь по меньшей мере к% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5 и включать несколько фрагментов последовательности SEQ ID NO: 5.
Величина к может быть выбрана из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или более. Предпочтительно, она равна 90 (т.е. мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5) и более предпочтительно равна 95.
Полипептид после введения животному-хозяину может вызывать образование антител, которые распознают менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 4. Эти антитела в идеале являются бактерицидными (смотри ниже). Эти антитела могут включать некоторые антитела, которые не распознают полипептид v1 или v3 (например, менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 46, и менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из
последовательности SEQ ID NO: 40), хотя они также могут включать некоторые антитела, обладающие перекрестной реактивностью с полипептидами v1 и/или v3.
Заявленный полипептид в одинаковых экспериментальных условиях обладает более высокой стабильностью, чем такой же полипептид, но без отличия(ий) последовательности (б), например, более высокой стабильностью чем менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 4. Повышение стабильности может быть оценено при использовании дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), например, как обсуждается в источниках 32 и 33. DSC ранее использовали для оценки стабильности v2 fHbp [24]. При подходящих условиях для DSC для оценки стабильности могут использовать 20 мкМ полипептид в забуференном растворе (например 25 мМ Tris) с рН от 6 до 8 (например 7-7,5) с 100-200 мМ NaCI (например 150 мМ).
В некоторых воплощениях полипептид по изобретению усечен по
сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 5. По сравнению со зрелой
последовательностью дикого типа SEQ ID NO: 5 уже усечена по N-концу и
включает полиглициновую последовательность (сравнение
последовательностей SEQ ID NO: 4 и 5), но последовательность SEQ ID NO: 5 может быть усечена по С-концу и/или дополнительно усечена по N-концу.
Повышение стабильности в идеале составляет по меньшей мере 5°С например по меньшей мере 10°С, 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или более чем на 35°С. Эти температуры относятся к увеличению срединной точки температурного перехода (Тт), оцениваемой при помощи DSC. fHbp дикого типа демонстрирует два пика DSC во время развертывания (один для N-концевого домена и один для С-концевого домена), и когда полипептид по изобретению включает оба таких домена, тогда увеличение относится к стабильности N-концевого домена, для которого развертывание может происходить при температуре даже ниже 40°С для последовательностей v2 дикого типа [24] (тогда как С-концевые домены могут иметь Тт 80°С или больше). Таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 по изобретению предпочтительно имеет N-концевой домен с Тт по меньшей мере 45°С, например выше или равно 50°С, выше или равно 55°С, выше или
равно 60°С, выше или равно 65°С, выше или равно 70°С, выше или равно 75°С или даже выше или равно 80°С.
Во втором воплощении изобретения предложен полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3, где: (а) аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере j% идентичность последовательности SEQ ID NO: 17, и/или содержит фрагмент последовательности SEQ ID NO: 17; но (б) аминокислотная последовательность отличается от последовательности SEQ ID NO: 17 по одному или более чем одному из следующих остатков: S32, I33, L39, L41, F72, V103, Т116, F125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, Н242 и/или Е243.
Когда признак (а) относится к фрагменту, тогда фрагмент включает по меньшей мере один из остатков, перечисленных в (б), но этот остаток отличается при сравнении с соответствующим остатком в последовательности SEQ ID NO: 17. Фрагмент (а), как правило, имеет длину по меньшей мере 7 аминокислот, например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60 последовательных аминокислот или более из последовательности SEQ ID NO: 17. Фрагмент как правило включает по меньшей мере один эпитоп последовательности SEQ ID NO: 17. Идентификация и картирование эпитопа подтверждены для fHbp [11; 27-31]. Наличие одинаковых по меньшей мере 30 последовательных аминокислот с последовательностью SEQ ID NO: 17 является типичным, и обычно мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает несколько (например 2, 3, 4, 5 или более чем 5) фрагментов последовательности SEQ ID NO: 17. В общем, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 может иметь по меньшей мере j% идентичность последовательности SEQ ID NO: 17 и включать несколько фрагментов последовательности SEQ ID NO: 17.
Величина j может быть выбрана из 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или больше. Предпочтительно она равна 90 (т.е. мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 17) и более предпочтительно равна 95.
Заявленный полипептид после введения животному-хозяину может вызывать образование антител, которые распознают менингококковый
полипептид, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 40. Эти антитела в идеале являются бактерицидными (смотри ниже). Эти антитела могут включать некоторые антитела, которые не распознают полипептид v1 или v2 (например, менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 46, и менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 4), хотя они также могут включать некоторые антитела, обладающие перекрестной реактивностью с полипептидами v1 и/или v2.
Заявленный полипептид в одинаковых экспериментальных условиях обладает более высокой стабильностью, чем такой же полипептид, но не имеющий отличия(ий) последовательности (б), например, более высокой стабильностью, чем менингококковый полипептид дикого типа, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 40. Повышение стабильности может быть оценено с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC), например, как обсуждается в источниках 32 и 33. DSC ранее использовали для оценки стабильности v3 fHbp [23]. При подходящих условиях для DSC для оценки стабильности можно использовать 20 мкМ полипептида в забуференном растворе (например 25 мМ Tris) с рН от 6 до 8 (например 7-7,5) с 100-200 мМ NaCI (например 150 мМ).
В некоторых воплощениях полипептид по изобретению усечен по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 17. По сравнению со зрелой последовательностью дикого типа последовательность SEQ ID NO: 17 уже усечена по N-концу и включает полиглициновую последовательность (сравнение последовательностей SEQ ID NO: 40 и 17), но последовательность SEQ ID NO: 17 может быть усечена по С-концу и/или дополнительно усечена по N-концу.
Увеличение стабильности в идеале составляет по меньшей мере 5°С например по меньшей мере 10°С, 15°С, 20°С, 25°С, 30°С, 35°С или больше. Эти температуры относятся к увеличению срединной точки температурного перехода (Тт), оцениваемой при помощи DSC. fHbp дикого типа демонстрирует два пика DSC во время развертывания (один для N-концевого домена и один для С-концевого домена) и, когда полипептид по изобретению включает оба таких домена, тогда увеличение относится к стабильности N-концевого домена,
для которого развертывание может происходить при температуре приблизительно 60°С или меньше для последовательностей v3 дикого типа [24] (тогда как С-концевые домены могут иметь Тт 80°С или больше). Таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 по изобретению предпочтительно имеет N-концевой домен с Тт по меньшей мере 65°С, например выше или равно 70°С, выше или равно 75°С или даже выше или равно 80°С.
Мутации по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 5
Полипептиды в соответствии с первым воплощением изобретения содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере к% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5, и/или содержит фрагмент последовательности SEQ ID NO: 5. Тем не менее, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 5 эта аминокислотная последовательность имеет модификацию по одному или более аминокислотных остатков S32, V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, Н239 и/или Е240, например, по 2, 3, 4, 5 или более из этих 17 остатков. Эти остатки пронумерованы в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 5; для того, чтобы соответствовать последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 2) на стадии роста цепи, нумерация должна изменяться на +26 (т.е. Ser-32 последовательности SEQ ID NO: 5 представляет собой Ser-58 последовательности SEQ ID NO: 2), и для того, чтобы соответствовать зрелой последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 4), нумерация должна изменяться на +7 (что также обеспечит легкое сравнение с источником 25, на который ссылаются).
Предпочтительные для мутации остатки представляют собой S32, V100, L123, V124, S125, G126, L127, G128, Н239 и/или Е240. Мутации по этим остаткам позволяют получать белки, обладающие хорошей стабильностью по сравнению с v2 дикого типа. В пределах данного подмножества предпочтительные остатки представляют собой S32, L123, V124, S125, G126, L127 и/или G128. Наиболее предпочтительные позиции представляют собой S32, L123, V124, S125, G126, L127 и/или G128, где остатки S32 и/или L123 являются особенно предпочтительными, например S32V и/или L123R. Когда один или более чем один из V100, S125 и/или G126 подвергался мутации, тогда
предпочтительно, чтобы остаток за пределами этого трио тоже подвергался бы мутации.
Конкретный остаток может подвергаться делеции, но предпочтительно заменен на отличающуюся аминокислоту. Например, Ser-32 может быть заменен на любую из других 19 встречающихся в природе аминокислот. При осуществлении замены заменяющая аминокислота в некоторых воплощениях может представлять собой простую аминокислоту, такую как глицин или аланин. В других воплощениях заменяющая аминокислота представляет собой консервативную замену, например, она осуществляется в пределах следующих четырех групп: (1) кислотные, т.е. аспартат, глутамат; (2) основные, т.е. лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, т.е. аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, т.е. глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. В других воплощениях замена является не консервативной. В некоторых воплощениях в замене не используется аланин.
Предпочтительные замены по конкретным остаткам представляют собой следующие: S32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125G или S125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; Е240Н.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по Е240, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только Е240 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка Е240 и Н239 подвергаются мутации. В идеале не только Е240 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по Е240 также должна включать замену по второму остатку, например, по Е240 и Н239 (смотри мутанты #1 и #11).
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по F122, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только F122 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка F122 и S151 подвергаются мутации. В идеале не только F122 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная
аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по F122 также должна включать замену по второму остатку. Когда F122 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы S151 также подвергался замене, например, оба подвергаются замене на цистеин, для того, чтобы обеспечить образование дисульфидной мостиковой связи (смотри мутант #10).
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по L123, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только L123 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка L123 и S32 подвергаются мутации. Если мутации подвергается исключительно L123, тогда замена на аргинин является предпочтительной (например, смотри мутант #4). Тем не менее, в некоторых воплощениях не только L123 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по L123 может также включать замену по второму остатку. Когда L123 подвергается замене, тогда может быть предпочтительно, чтобы: (1) S32 также подвергался замене, как видно в мутанте #3, и возможно S125 также подвергался замене, как видно в мутантах #20 и #22; или (2) один или более чем один из остатков 124-128 также подвергался(лись) замене, например, как видно в мутанте #12.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по V124, тогда предпочтительно, чтобы эта замена не представляла собой замену на аланин, если только V124 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если один или более чем один из остатков 123128 также подвергался(лись) мутации. Если мутации подвергается исключительно V124, тогда замена на изолейцин является предпочтительной. В идеале, однако, не только V124 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по V124 может также включать замену по второму остатку. Когда V124 подвергается замене, тогда может быть предпочтительно, чтобы один или более чем один из остатков 124-128 также подвергался(лись) замене, например, как видно в мутанте #12.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по L127, то предпочтительно, чтобы эта замена не представляла бы собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно L127, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если один или более чем один из остатков 123-128 также подвергся(лись) мутации. Если мутации подвергся исключительно L127, тогда предпочтительна замена на изолейцин. Тем не менее, в идеале не только L127 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по L127 должна также включать замену по второму остатку. Когда L127 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы один или более чем один из остатков 124-128 также подвергался(лись) замене, например, как видно в мутанте #12.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по S32, тогда предпочтительно, чтобы эта замена не представляла бы собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно S32, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если мутации подвергаются оба остатка L123 и S32. Если мутации подвергается исключительно S32, то предпочтительна замена на валин. Тем не менее, в идеале не только S32 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 с заменой по S32 также должна включать замену по второму остатку. Когда S32 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы (1) L123 также подвергался замене, например, как видно в мутанте #3, и возможно S125 также подвергался замене, как видно в мутантах #20 и #22; или (2) S125 также подвергался замене, например, как видно в мутантах #19 и #21.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по 1113, тогда эта замена не представляла бы собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно 1113, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б). Если мутации подвергается исключительно 1113, то предпочтительна замена на серии, например, как видно в мутанте #7.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по V33, то она предпочтительно не представляет собой замену на
изолейцин. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по 1113, тогда она предпочтительно не представляет собой замену на треонин или на аланин. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по S151, тогда она предпочтительно не представляет собой замену на фенилаланин. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по Н239 и Е240, тогда она предпочтительно не преставляет собой замену на R239 и Q240.
Когда осуществляют более чем одну замену, тогда они могут быть выбраны из групп 2А - 20 в соответствии со следующим: 2А: остатки 239 и 240, например мутант #1. 2Б: остатки 32 и 123, например мутант #3. 2В: остатки 125 и 126, например мутант #5. 2Г: остатки 100, 125 и 126, например мутант #6. 2Д: остатки 33 и 39, например мутант #8. 2Е: остатки 41 и 69, например мутант #9. 2Ж: остатки 122 и 151, например мутант #10. 23: остатки 100, 125, 126, 239 и 240, например мутант #11. 2И: остатки 32 и 125, например мутанты #19 и #21. 2К: остатки 32, 123 и 125, например мутанты #20 и #22. 2Л: остатки 33 и 39, оба заменены на Cys, например мутант #8. 2М: остатки 41 и 69, оба заменены на Cys, например мутант #9. 2Н: остатки 122 и 151, оба заменены на Cys, например мутант #10. 20: остатки 123, 124, 125, 126, 127 и 128, например мутант #12. 2П: остатки 32, 123, 124, 125, 126, 127 и 128.
Таким образом, например, если должен быть заменен остаток 239, то предпочтительный второй остаток для замены представляет собой 240 (т.е. группа 2А); кроме того, остатки 100, 125 и 126 также могут быть модифицированы (т.е. группа 23, которая представляет собой комбинацию групп 2А и 2Г). В группах 2А - 20 и 2П предпочтительные замены в указанных позициях представляют собой замены, перечисленные выше. Для групп 2Л, 2М и 2Н в изобретение должна быть введена дисульфидная мостиковая связь. В пределах групп 2А-20 предпочтительные мутанты представляют собой 2А, 2Б,
2В, 2Г, 2И, 2К и 20. Более предпочтительными являются 2В, 2И и 20, причем 20 является особенно предпочтительной. В группе 2Б предложены наиболее предпочтительные мутации, и в частности S32V и L123R (например, последовательности SEQ ID N0: 20 и 45). Группа 2П представляет собой еще один предпочтительный набор мутаций, которые комбинируют 2Б, 2В и три другие мутации (например, для получения последовательности SEQ ID N0: 58).
Аминокислотные остатки, указанные для мутации в последовательности v2, нумеруются в соответствии с последовательностью SEQ ID N0: 5, полученной из штамма 2996. Соответствующие аминокислотные остатки в v2 fHbp из любого другого штамма, могут быть легко идентифицированы при помощи выравнивания последовательностей, например, представлять собой аминокислоту, которая при выравнивании с последовательностью SEQ ID N0: 5 с использованием алгоритма попарного выравнивания (например, алгоритма глобального выравнивания Нидлемана-Вунша, подробно описанного ниже), оказывается выровненной с упомянутой здесь аминокислотой. Часто аминокислота является той же самой, как видно в последовательности SEQ ID N0: 5 (например, остаток 32 представляет собой серии), но выравнивание легче осуществлять в ином случае.
Помимо мутации(й), указанных выше, которые служат для повышения стабильности, полипептид по изобретению может включать одну или более чем оду дополнительную мутацию, например, для нарушения взаимодействия полипептида с сидерофорами или, более предпочтительно, для нарушения способности полипептида связываться cfH.
В источниках 19 и 25 сообщается о том, что взаимодействие между fH и v2 fHbp может быть нарушено при помощи мутаций по остаткам R80, D211, Е218, Е248, Т220+Н222 (двойная мутация) и G236. Будучи пронумерованными в соответствии с последовательностью SEQ ID N0: 5, эти остатки представляют собой R73, D203, Е210, Е240, Т213+Н215 и G228. Из этих позиций предпочтительны полипептиды, подвергшиеся мутации по D203, Е210 или Т213+Н215, поскольку в источнике 25 не сообщается о повреждении важных эпитопов у этих мутантов. Специфические замены, исследованные в источнике 25, представляли собой R73A, D203A, Е210А, Т213А+Н215А, G228I и Е240А; эти замены подходят для применения в соответствии с изобретением.
В источнике 24 сообщается о том, что взаимодействие между fH и v2 fHbp может быть нарушено посредством мутаций по остаткам R145, S193, F194, L195, А265, Е267, К268, V272, I273, L274, Е283, Т286, Н288, F292, Т304 и Е313, и Е283+Т304 (двойная мутация). Будучи пронумерованными в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 5, эти остатки представляют собой R73, S121, F122, L123, А192, Е194, К195, V199, I200, L201, Е210, Т213, Н215, F219, Т231 и Е240, и Е210+Т231. Четыре из них перекрываются с источником 25 (Е210, Т213, Н215, Е240). Специфические замены, исследованные в источнике 24, использовали аланин (за исключением А265Р и Т304Е), и эти замены подходят для применения в соответствии с изобретением.
В источнике 24 сообщается о том, что некоторые замены в v2 могут повышать аффинность к fH, что необходимо избегать в том случае, если предполагается нарушить связывание с fH, например, Е85 в последовательности SEQ ID NO: 5 (остаток 157 в источнике 24).
Остатки, которые взаимодействуют с сидерофорами, могут подвергаться мутации с использованием руководства, приведенного в источниках 16 и 34, например, путем выравнивания последовательности SEQ ID NO: 5 с последовательностью SEQ ID NO: 4 из источника 16 для идентификации остатков, которые могут взаимодействовать с сидерофорами, например, с катехолатами, гидроксаматами или карбоксилатами.
Другие остатки, которые могут подвергаться мутации, включают S23, L24, D30, Q31, R34, D95 и/или L102, но не ограничиваются ими, например, с использованием мутаций, предложенных в источнике 27.
Полипептид в соответствии с первым воплощением может содержать любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-36. Аналогично, принимая во внимание мутацию 'AG' (т.е. усечение N-конца на стадии роста цепи и включение нативной последовательности поли-Gly), полипептид в соответствии с первым воплощением может содержать любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-36, за исключением аминокислот 1-26 в ней. Например, полипептид в соответствии с первым воплощением может содержать последовательность SEQ ID NO: 45 или может содержать последовательность SEQ ID NO: 58.
Рассматривая возможность дополнительных точечных мутаций (например, для нарушения взаимодействий с сидерофорами и/или fH),
полипептид в соответствии с первым воплощением может содержать любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-36 (или любую из последовательностей SEQ ID NO: 18-36 за исключением их аминокислот 1-26, такую как последовательность SEQ ID NO: 45), но быть модифицирован путем единичных изменений аминокислот в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичных аминокислотных замен, делеций и/или вставок), при условии, что модифицированная последовательность может после введения животному-хозяину вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46. Такие изменения аминокислот не должны изменять мутации в этих последовательностях на противоположные относительно последовательности дикого типа, например, последовательность SEQ ID NO: 45 не должна подвергаться мутации по остатку V32 или R123.
В изобретении также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность fHbp v2, где аминокислотная последовательность v2 идентична аминокислотной последовательности v2 дикого типа за исключением мутации по аминокислотной позиции, соответствующей Leu-123 в последовательности SEQ ID NO: 5, при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин). Например, полипептид может содержать последовательность SEQ ID NO: 5, но с мутацией (отличающейся от L123A) по L123.
Последовательности SEQ ID NO: 59 и 60 представляют собой два дополнительных примера мутантов v2, а именно, зрелую форму мутантов #3 и #4 для штамма 8047.
Мутации по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 17 Полипептиды в соответствии со вторым воплощением изобретения содержат аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере j% идентичность последовательности SEQ ID NO: 17, и/или содержат фрагмент последовательности SEQ ID NO: 17. Тем не менее, по сравнению с последовательностью SEQ ID NO: 17, эта аминокислотная последовательность имеет модификацию по одному или более чем одному из аминокислотных остатков S32, I33, L39, L41, F72, V103, Т116, F125, L126, V127, S128, G129,
L130, G131, S154, Н242 и/или Е243, например, по 2, 3, 4, 5 или более из 17 остатков. Эти остатки пронумерованы в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 17; для того, чтобы соответствовать последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 3) на стадии роста цепи, нумерацию следует изменять на +31 (т.е. Ser-32 в последовательности SEQ ID NO: 17 представляет собой Ser-63 в последовательности SEQ ID NO: 3), и для того, чтобы соответствовать зрелой последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 40), нумерация должна изменяться на +12.
Предпочтительные остатки для мутации представляют собой S32, V103, L126, V127, S128, G129, L130, G131, Н242 и/или Е243. В этой подгруппе предпочтительные остатки представляют собой S32, L126, V127, S128, G129, L130 и/или G131. Наиболее предпочтительные позиции представляют собой S32, L126, V127, S128, G129, L130 и/или G131, где остатки S32 и/или L126 являются особенно предпочтительными, например S32V и/или L126R.
Конкретный остаток может подвергаться делеции, но предпочтительно заменен на отличающуюся аминокислоту. Например, Ser-32 может быть заменен на любую из других 19 встречающихся в природе аминокислот. При осуществлении замены заменяющая аминокислота в некоторых воплощениях может представлять собой простую аминокислоту, такую как глицин или аланин. В других воплощениях заменяющая аминокислота представляет собой консервативную замену, например, она осуществляется в пределах следующих четырех групп: (1) кислотные, т.е. аспартат, глутамат; (2) основные, т.е. лизин, аргинин, гистидин; (3) неполярные, т.е. аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан; и (4) незаряженные полярные, т.е. глицин, аспарагин, глутамин, цистеин, серии, треонин, тирозин. В других воплощениях замена является не консервативной. В некоторых воплощениях в замене не используется аланин.
Предпочтительные замены по конкретным остаткам представляют собой следующие: S32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128G или S128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; Е243Н.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по Е243, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только Е243 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин,
если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка Е243 и Н242 подвергаются мутации. В идеале не только Е243 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по Е243 также должна включать замену по второму остатку, например, по обоим Е243 и Н242.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по F125, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только F125 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка F125 и S154 подвергаются мутации. В идеале не только F125 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по F125 также должна включать замену по второму остатку. Когда F125 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы S154 также подвергался замене, например, оба подвергаются замене на цистеин, для того, чтобы дать возможность для образования дисульфидной мостиковой связи.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по L126, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если только L126 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если оба остатка L126 и S32 подвергаются мутации. Если мутации подвергается исключительно L126, тогда замена на аргинин является предпочтительной. Тем не менее, в некоторых воплощениях не только L126 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по L126 может также включать замену по второму остатку. Когда L126 подвергается замене, тогда может быть предпочтительно, чтобы: (1) S32 также подвергался замене, и возможно S128 также подвергался замене; или (2) один или более чем один из остатков 127131 также подвергался(лись) замене.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по V127, тогда предпочтительно, чтобы эта замена не представляла собой замену на аланин, если только V127 подвергается мутации, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота,
перечисленная в (б), например, если один или более чем один из остатков 126131 также подвергается мутации. Если мутации подвергается исключительно V127, тогда замена на изолейцин является предпочтительной. Тем не менее, в идеале не только V127 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по V127 также должна включать замену по второму остатку. Когда V127 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы один или более чем один из остатков 127-131 также подвергался(лись) замене.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по L130, то предпочтительно, чтобы эта замена не представляла собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно L130, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если один или более чем один из остатков 126-131 также подвергся(лись) мутации. Если мутации подвергся исключительно L130, тогда предпочтительна замена на изолейцин. Тем не менее, в идеале не только L130 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по L130 должна также включать замену по второму остатку. Когда L130 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы один или более чем один из остатков 127-131 также подвергался(лись) замене.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по S32, тогда предпочтительно, чтобы эта замена не представляла собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно S32, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б), например, если мутации подвергаются оба остатка L126 и S32. Если мутации подвергается исключительно S32, то предпочтительна замена на валин. Тем не менее, в идеале не только S32 подвергается мутации, и, таким образом, мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 с заменой по S32 должна также включать замену по второму остатку. Когда S32 подвергается замене, тогда предпочтительно, чтобы (1) L126 также подвергался замене, и возможно S128 также подвергался замене; или (2) S128 также подвергался замене.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по Т113, тогда эта замена не представляет собой замену на аланин, если мутации подвергается исключительно Т113, хотя замена может быть на аланин, если замене подвергается еще одна аминокислота, перечисленная в (б). Если мутации подвергается исключительно Т113, то предпочтительна замена на серии.
Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по I33, то она предпочтительно не представляет собой замену на валин. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по Т116, то она предпочтительно не представляет собой замену на изолейцин. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по G129, то она предпочтительно не представляет собой замену на серии. Когда мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по Н242 и Е243, тогда она предпочтительно не преставляет собой замену на R242 и Q243.
Когда осуществляют более чем одну замену, тогда они могут быть выбраны из групп ЗА - 30 в соответствии со следующим: ЗА: остатки 242 и 243. ЗБ: остатки 32 и 126. ЗВ: остатки 128 и 129. ЗГ: остатки 103, 128 и 129. ЗД: остатки 33 и 39. ЗЕ: остатки 41 и 72. ЗЖ: остатки 125 и 154. 33: остатки 103, 128, 129, 242 и 243. ЗИ: остатки 32 и 128. ЗК: остатки 32, 126 и 128. ЗЛ: остатки 33 и 39, оба заменены на Cys. ЗМ: остатки 41 и 72, оба заменены на Cys. ЗН: остатки 125 и 154, оба заменены на Cys. 30: остатки 126, 127, 128, 129, 130 и 131. ЗП: остатки 32, 126, 127, 128, 129, 130 и 131.
Таким образом, например, если должен быть заменен остаток 242, то предпочтительный второй остаток для замены представляет собой 243 (т.е. группа ЗА); кроме того, остатки 103, 128 и 129 также могут быть модифицированы (т.е. группа 33, которая представляет собой комбинацию групп ЗА и ЗГ). В группах ЗА - 30 и ЗП предпочтительные замены в указанных позициях представляют собой замены, перечисленные выше. Для групп ЗЛ, ЗМ и ЗН в изобретение должна быть введена дисульфидная мостиковая связь. В пределах групп ЗА-ЗО предпочтительные мутанты представляют собой ЗА, ЗБ, ЗВ, ЗГ, ЗИ, ЗК и 30. Более предпочтительными являются ЗВ, ЗИ и 30, причем 30 является особенно предпочтительной. В группе ЗБ предложены наиболее предпочтительные мутации, и, в частности, S32V и L126R (например, содержащая последовательность SEQ ID N0: 44). Группа ЗП представляет собой еще один предпочтительный набор мутаций, которые комбинируют ЗБ, ЗВ и три другие мутации (например, для получения последовательности SEQ ID N0: 61). Мутация L126R также обеспечивает получение последовательности SEQ ID N0: 53.
Аминокислотные остатки, указанные для мутации в последовательности v3, нумеруются в соответствии с последовательностью SEQ ID N0: 17, полученной из штамма М1239. Соответствующие аминокислотные остатки в v3 fHbp из любого другого штамма могут быть легко идентифицированы посредством выравнивания последовательностей, например, представлять собой аминокислоту, которая при выравнивании с последовательностью SEQ ID N0: 17 с использованием алгоритма попарного выравнивания (например, алгоритма глобального выравнивания Нидлемана-Вунша, подробно описанного ниже), оказывается выровненной с упомянутой здесь аминокислотой. Часто аминокислота является той же самой, как видно в последовательности SEQ ID N0: 17 (например, остаток 32 представляет собой серии), но выравнивание легче осуществлять не в этом случае.
Помимо мутации(й), указанных выше, которые служат для повышения стабильности, полипептид по изобретению может включать одну или более чем одну дополнительную мутацию, например, для нарушения взаимодействия полипептида с сидерофорами или, более предпочтительно, для нарушения способности полипептида связываться cfH.
В источнике 24 сообщается о том, что взаимодействие между fH и v3 fHbp может быть нарушено посредством мутаций по остаткам Q107, 1147, L156, А157, L195, V196, V272, Е283, Т286, Т304, V311, Е313 и Е283+Т304 (двойная мутация). Будучи пронумерованными в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 17, эти остатки представляют собой Q35, I78, L87, А88, L126, V127, V202, Е213, Т216, Т234, V241, Е243 и Е213+Т234. В специфических заменах, исследованных в источнике 24, использовали аланин (за исключением А157Е и Т231Е), и эти замены подходят для применения в соответствии с изобретением. Об остатках Т216 и Е243 также сообщали в источнике 23. В источнике 27 сообщается о том, что взаимодействие между fH и v3 fHbp может быть нарушено путем мутаций по остаткам Н288 и G318 (нумерация Н218 и G248 в соответствии с последовательностью SEQ ID NO: 17), и эти замены подходят для применения в соответствии с изобретением, например, H218R, G248D.
В источнике 24 сообщается о том, что некоторые замены в v3 могут повышать аффинность к fH, и последнего необходимо избегать в том случае, если предполагается нарушить связывание с fH, например, Р44 в последовательности SEQ ID NO: 17 (остаток 106 в источнике 24).
Остатки, которые взаимодействуют с сидерофорами, могут подвергаться мутации с использованием руководства, приведенного в источниках 16 и 34, например, путем выравнивания последовательности SEQ ID NO: 17 с последовательностью SEQ ID NO: 4 из источника 16 для идентификации остатков, которые могут взаимодействовать с сидерофорами, например, с катехолатами, гидроксаматами или карбоксилатами.
Полипептид в соответствии со вторым воплощением может содержать любую из последовательностей SEQ ID NO: 41-44. Рассматривая возможность дополнительных точечных мутаций (например, для нарушения взаимодействий с сидерофорами и/или fH), полипептид в соответствии с первым воплощением может содержать любую из последовательностей SEQ ID NO: 41-44, но быть модифицирован путем единичных изменений аминокислот в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичных аминокислотных замен, делеций и/или вставок), при условии, что модифицированная последовательность может после введения животному-хозяину вызывать образование антител, которые
связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40. Такие изменения аминокислот не должны изменять мутации в этих последовательностях на противоположные относительно последовательности дикого типа, например, последовательность SEQ ID NO: 44 не должна подвергаться мутации по остатку V32 или R126.
В изобретении также предложен полипептид, содержащий аминокислотную последовательность fHbp v3, где аминокислотная последовательность v3 идентична аминокислотной последовательности v3 дикого типа за исключением мутации по аминокислотной позиции, соответствующей Leu-126 в последовательности SEQ ID NO: 17, при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин). Например, полипептид может содержать последовательность SEQ ID NO: 17, но с мутацией (отличающейся от L126A) по L126.
Полипептиды
Полипептиды по изобретению могут быть получены различными способами, например, путем химического синтеза (по меньшей мере частично), путем расщепления более длинных полипептидов с использованием протеаз, путем трансляции с РНК, путем очистки из культуры клеток (например, из культуры рекомбинантных экспрессирующих клеток или из культуры N. meningitidis) и т.д. Предпочтительным путем экспрессии является гетерологическая экспрессия в хозяине Е. coli.
Полипептиды по изобретению теоретически имеют длину, составляющую по меньшей мере 100 аминокислот, например, 150ак, 175ак, 200ак, 225ак или длиннее. Они включают мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2 и/или v3, и мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 или v3 аналогично должна иметь длину, составляющую по меньшей мере 100 аминокислот, например, 150ак, 175ак, 200ак, 225ак или длиннее.
fHBP является природным липопротеином N. meningitidis. Также обнаружено, что он липидизируется при экспрессии в Е. coli с нативной лидерной последовательностью или с гетерологичными лидерными последовательностями. Полипептиды по изобретению могут иметь N-концевой
остаток цистеина, который может быть липидизирован, например, содержать группу пальмитоила, обычно с образованием трипальмитоил-S-глицерилцистеина. В других воплощениях полипептиды не липидизированы.
Полипептиды предпочтительно получают в по существу чистой или по существу выделенной форме (т.е. в форме, по существу не содержащей других полипептидов Neisseria или клеток-хозяев). Как правило, полипептиды предложены в неприродном окружении, например, они отделены от природной окружающей среды. В некоторых воплощениях полипептид представлен в композиции, которая обогащена полипептидом по сравнению с исходным материалом. Таким образом, предложен очищенный полипептид, при этом очищенный означает, что полипептид представлен в композиции, которая по существу не содержит других экспрессированных полипептидов, при этом по существу не содержащий означает, что более чем 50% (например 75% и более, 80% и более, 90% и более, 95% и более или 99% и более) от всех полипептидов в композиции представляют собой полипептид по изобретению.
Полипептиды могут принимать различные формы (например, нативную, слитые, гликозилированную, негликозилированную, липидизированную, с дисульфидными мостиковыми связями и т.д.).
Последовательности SEQ ID NO 4, 5, 17 и 40 не включают N-концевой метионин. Если полипептид по изобретению получают путем трансляции в биологическом хозяине, то требуется стартовый кодон, который будет обеспечивать наличие N-концевого метионина у большинства хозяев. Таким образом, полипептид по изобретению будет по меньшей мере на стадии роста цепи включать остаток метионина, расположенный выше относительно указанной последовательности SEQ ID NO.
Отщепление последовательностей на стадии роста цепи означает, что мутантная аминокислотная последовательность v2 или v3 сама может представлять N-конец полипептида. Тем не менее, в других воплощениях полипептид по изобретению может включать N-концевую последовательность, расположенную выше относительно мутантной аминокислотной последовательности fHbp v2 или v3. В некоторых воплощениях полипептид имеет один метионин на N-конце, непосредственно за которым следует мутантная аминокислотная последовательность v2 или v3; в других
воплощениях может быть использована более длинная расположенная выше последовательность. Такая расположенная выше последовательность может быть короткой (например, 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают лидерные последовательности для направления транспортирования белка или короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, гистидиновая концевая метка, т.е. Hisn, где п=4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более чем 10). Другие подходящие N-концевые аминокислотные последовательности будут понятны для специалистов в данной области техники, например, нативные расположенные выше последовательности, представленные в последовательности SEQ ID NO: 2 или последовательности SEQ ID NO: 3.
Полипептид по изобретению также может включать аминокислоты, расположенные ниже концевой аминокислоты мутантной аминокислотной последовательности fHbp v2 или v3. Такие С-концевые удлинения могут быть короткими (например 40 или меньше аминокислот, т.е. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Примеры включают последовательности для управления транспортированием белков, короткие пептидные последовательности, которые облегчают клонирование или очистку (например, содержащие гистидиновую концевую метку, т.е. Hisn, где п=3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более чем 10), или последовательности, которые повышают стабильность полипептида. Другие подходящие С-концевые аминокислотные последовательности будут понятны специалистам в данной области техники.
В некоторых воплощениях в изобретении исключены полипептиды, которые включают гистидиновую концевую метку (смотри источники 24 и 25), и, в частности, гексагистидиновую концевую метку по С-концу.
Термин "полипептид" относится к аминокислотным полимерам любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может прерываться остатками, отличными от аминокислотных. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом
или в результате вмешательства; например, путем образования дисульфидной мостиковой связи, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфорилирования или путем любой другой обработки или модификации, такой как конъюгирование с агентом мечения. Также в указанное определение включены, например, полипептиды, содержащие один или более чем один аналог аминокислот (включающий, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в области техники. Полипептиды могут существовать в виде единичных цепей или ассоциированных цепей.
Полипептиды по изобретению могут быть связаны или иммобилизованы на твердом носителе.
Полипептиды по изобретению могут содержать регистрируемую метку, например, радиоактивную метку, флуоресцирующую метку или биотиновую метку. Такие полипептиды особенно полезны в способах иммуноанализа.
Как раскрыто в источнике 164, fHbp могут быть разделены на три домена, названные А, В и С. В отношении последовательности SEQ ID NO: 1 три домена представляют собой (А) 1-119, (В) 120-183 и (С) 184-274:
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQS LTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLIT LESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPE GGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDG KRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
Зрелую форму домена "А" от Cys-20 на его N-конце до Lys-119 называют
"Д - " ^зрелый ¦
Известно множество последовательностей fHBP, и их можно легко выравнивать, используя стандартные способы. Путем таких выравниваний специалист в данной области техники может идентифицировать (а) домены "А" (и "Азрелый"), "В" и "С" в любой заданной последовательности fHBP путем сравнения с координатами в последовательности МС58, и (б) единичные остатки в множественных последовательностях fHBP, например, для идентификации замен. Тем не менее, для упрощения ссылок домены определены ниже:
- Домен "А" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с
последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Met-1 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1
Домен "Азрелый" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Cys-20 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Lys-119 последовательности SEQ ID NO: 1.
- Домен "В" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Gln-120 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gly-183 последовательности SEQ ID NO: 1.
- Домен "С" в данной последовательности fHBP представляет собой фрагмент такой последовательности, который при выравнивании с последовательностью SEQ ID NO: 1 с использованием алгоритма попарного выравнивания начинается с аминокислоты, выравниваемой с Lys-184 последовательности SEQ ID NO: 1, и заканчивается аминокислотой, выравниваемой с Gln-274 последовательности SEQ ID NO: 1.
Предпочтительным алгоритмом попарного выравнивания для определения доменов является алгоритм глобального выравнивания Нидлемана-Вунша [158] с использованием параметров по умолчанию (например, с использованием штрафа на внесение делеции в выравнивание =10,0 и штрафа на продолжение делеции = 0,5, используя матрицу подсчета EBLOSUM62). Такой алгоритм удобно реализован в инструменте needle в пакете EMBOSS [159].
В некоторых воплощениях мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 или v3 по изобретению усечена для удаления ее домена А. Тем не менее, как правило, тогда предпочтительно, чтобы мутантная
аминокислотная последовательность fHbp v2 или v3 должна была включать как N-концевую (3-бочку, так и С-концевую (3-бочку.
В некоторых воплощениях полипептид содержит описанную выше аминокислотную последовательность за исключением того, что 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) по N-концу и/или до 10 аминокислот (т.е. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) по С-концу удалены.
Полипептиды по изобретению, как правило, состоят из искусственной аминокислотной последовательности, а именно последовательности, которая не представлена у природных менингококков.
Аффинность к фактору Н может быть количественно определена с использованием поверхностного плазмонного резонанса, например, раскрытого в источниках 18 и 21-24 с иммобилизованным человеческим fH. Предпочтительны мутации, которые приводят к уменьшению аффинности (т.е. увеличению константы диссоциации Ко) по меньшей мере в 10 раз, и в идеале по меньшей мере в 100 раз (при измерении в тех же самых экспериментальных условиях относительно того же самого полипептида, но без мутации).
Нуклеиновые кислоты
В изобретении предложена нуклеиновая кислота, кодирующая определенный выше полипептид по изобретению.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут быть получены различными способами, например, путем химического синтеза (например, путем фосфорамидитного синтеза ДНК) полностью или частично, путем расщепления более длинных нуклеиновых кислот с использованием нуклеаз (например, ферментов рестрикции), путем связывания более коротких нуклеиновых кислот или нуклеотидов (например, с использованием лигаз или полимераз), из библиотек геномной или кДНК и т.д.
Нуклеиновые кислоты по изобретению могут принимать различные формы, например, одноцепочечные, двухцепочечные, векторы, праймеры, зонды, меченые, немеченые и т.д.
Нуклеиновые кислоты по изобретению предпочтительно находятся в выделенной или по существу выделенной форме.
Термин "нуклеиновая кислота" включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как аналоги, содержащие модифицированные скелеты, а также пептидные нуклеиновые кислоты (ПНК) и т.д.
Нуклеиновая кислота по изобретению может быть меченой, например, при помощи радиоактивной или флуоресцентной метки.
В изобретении также предложены векторы (такие как плазмиды), содержащие нуклеотидные последовательности по изобретению (например, клонирующие или экспрессирующие векторы, такие как векторы, подходящие для иммунизации нуклеиновыми кислотами) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.
Бактерицидные ответы
Предпочтительные полипептиды по изобретению могут вызывать ответы в виде антител, которые являются бактерицидными по отношению к менингококкам. Образование бактерицидных антител обычно измеряют у мышей, и они являются стандартным показателем эффективности вакцины (например, смотри заключительное примечание 14 в источнике 37; также источник 38).
Полипептиды в соответствии с первым воплощением изобретения могут предпочтительно вызывать ответы в виде антител, которые являются бактерицидными по отношению к штамму N.meningitidis, который экспрессирует последовательность v2 fHbp, например одному или более чем одному из штаммов 961-5945, 2996, 96217, 312294, 11327, а22, gb013 (=М01 -240013), е32, m1090, m4287, 860800, 599, 95N477, 90-18311, с11, m986, т2671, 1000, m1096, m3279, bz232, dk353, т3697, ngh38, и/ или L93/4286. Бактерицидные ответы могут быть определены, например, против var2 штамма М2091 (АТСС (Американская коллекция типовых культур) 13091).
Предпочтительные полипептиды в соответствии с первым воплощением изобретения могут вызывать образование у мышей антител, которые являются бактерицидными против штамма М2091 в бактерицидном анализе на сыворотке крови.
Полипептиды в соответствии со вторым воплощением изобретения могут предпочтительно вызывать ответы в виде антител, которые являются бактерицидными по отношению к штамму N.meningitidis, который экспрессирует
последовательность v3 fHbp, например одному или более чем одному из штаммов М1239, 16889, gb355 (=М01 -240355), т3369, т3813, пдр165. Например, бактерицидные ответы могут быть определены в отношении var3 штамма М01-240355, который представляет собой референсный штамм Neisseria MLST (идентификационный номер 19265 в источнике 27), который был полностью секвенирован (смотри EMBL ID СР002422 [27])
Предпочтительные полипептиды в соответствии со вторым воплощением изобретения могут вызывать образование у мышей антител, которые являются бактерицидными против штамма М01-240355 в бактерицидном анализе на сыворотке крови.
Например, иммуногенная композиция, содержащая эти полипептиды, может обеспечивать бактерицидный титр в сыворотке крови не меньше 1:4 с использованием анализа Гольшнайдера с человеческим комплементом [27-28, 29] и/или обеспечивать бактерицидный титр в сыворотке крови не меньше 1:128 с использованием комплемента крольчонка.
Иммунизация
Полипептиды по изобретению могут быть использованы в качестве активного ингредиента иммуногенных композиций, и, таким образом, в изобретении предложена иммуногенная композиция (например, вакцина), содержащая полипептид по изобретению.
В изобретении также предложен способ для индуцирования антительного ответа у млекопитающего, включающий введение млекопитающему иммуногенной композиции по изобретению. Антительный ответ предпочтительно представляет собой ответ в виде защитного и/или бактерицидного антитела. В изобретении также предложены полипептиды по изобретению для применения в таких способах.
В изобретении также предложен способ защиты млекопитающего от инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), включающий введение млекопитающему иммуногенной композиции по изобретению.
В изобретении предложены полипептиды по изобретению для применения в качестве лекарственных средств (например, в качестве иммуногенных композиций или в качестве вакцин) или в качестве
диагностических реагентов. В изобретении также предложено применение нуклеиновой кислоты или полипептида по изобретению в изготовлении лекарственного средства для предупреждения инфекции, вызванной Neisseria (например, менингококковой инфекции), у млекопитающего.
Млекопитающее предпочтительно представляет собой человека. Человек может представлять собой взрослого человека или предпочтительно ребенка. В том случае, когда вакцина предназначена для профилактического применения, тогда человек предпочтительно представляет собой ребенка (например, ребенка раннего возраста или новорожденного); в том случае, когда вакцина предназначена для терапевтического применения, тогда человек предпочтительно представляет собой взрослого человека. Вакцина, предназначенная для детей, также может быть введена взрослым людям, например для оценки безопасности, дозы, иммуногенности и т.д.
Применения и способы особенно полезны для предупреждения/лечения заболеваний, включая менингит (в частности, бактериальный, такой как менингококковый менингит) и бактериемию, но не ограничивающихся ими. Например, они подходят для активной иммунизации индивидов против инвазивного менингококкового заболевания, вызванного N.meningitidis (например, в серогруппе В).
Эффективность терапевтического лечения можно проверить при помощи мониторинга вызванной Neisseria инфекции после введения композиции по изобретению. Эффективность профилактического лечения можно тестировать посредством мониторинга иммунных ответов против fHBP после введения композиции. Иммуногенность композиций по изобретению можно определить путем их введения тестируемым субъектам (например, детям в возрасте 12-16 месяцев или в моделях на животных) и последующего определения стандартных параметров, включающих бактерицидные антитела сыворотки крови (SBA) и титры ELISA (ииммуноферментный анализ) (GMT). Эти иммунные ответы, как правило, можно определить приблизительно через 4 недели после введения композиции и сравнить со значениями, определенными до введения композиции. Предпочтительным является увеличение SBA по меньшей мере в 4 раза или 8 раз. При введении более одной дозы композиции можно осуществить более одного определения после введения.
Предпочтительные композиции по изобретению могут приводить к титру антител у пациента, который превосходит критерий серологической защиты в отношении каждого антигенного компонента для приемлемой процентной доли людей. Хорошо известны антигены с ассоциированным титром антител, выше которых хозяина рассматривают как сероконвертированного против антигена, и такие титры публикуются такими организациями, как ВОЗ (Всемирная Организация Здравоохранения). Предпочтительно сероконвертированными являются более чем 80% статистически значимых образцов субъектов, более предпочтительно более чем 90%, еще более предпочтительно более чем 93% и наиболее предпочтительно 96-100%.
Композиции по изобретению, как правило, можно будет непосредственно вводить пациенту. Прямую доставку можно осуществлять путем парентеральной инъекции (например, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно, внутримышечно или в интерстициальное пространство ткани) или путем ректального, перорального, вагинального, местного, трансдермального, интраназального, глазного, ушного, легочного или другого введения через слизистую оболочку. Предпочтительным является внутримышечное введение в бедро или плечо. Инъекцию можно осуществлять посредством иглы (например, иглы для подкожных инъекций), но альтернативно можно использовать безыгольную инъекцию. Типичная внутримышечная доза составляет приблизительно 0,5 мл.
Изобретение можно использовать для того, чтобы вызвать системный и/или мукозный иммунитет.
Лечение при помощи доз может быть осуществлено по схеме с разовой дозой или по схеме с использованием дробных доз. Дробные дозы можно использовать в схеме первичной иммунизации и/или в схеме бустер-иммунизации. После схемы введения первичных доз может следовать схема введения бустер-доз. Подходящий период времени между возбуждающими дозами (например, от 4 до 16 недель) и между примированием и реиммунизацией можно определить стандартными способами.
Иммуногенная композиция по изобретению, как правило, будет включать фармацевтически приемлемый носитель, который может представлять собой любое вещество, которое само по себе не вызывает продукцию антител,
опасных для пациента, получающего композицию, и которое можно вводить, не опасаясь чрезмерной токсичности. Фармацевтически приемлемые носители могут включать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы, вещества рН-буферов и т.п, также могут быть представлены в таких разбавителях. Всестороннее обсуждение подходящих носителей приведено в источнике 27.
Инфекции, вызванные Neisseria, поражают различные области организма и, следовательно, композиции по изобретению могут быть приготовлены в различных формах. Например, композиции могут быть приготовлены в виде инъецируемых препаратов, либо в виде жидких растворов или суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких разбавителях перед инъекцией. Композиция может быть приготовлена для местного введения, например в виде мази, крема или порошка. Композиция может быть приготовлена для перорального введения, например в виде таблетки или капсулы, или в виде сиропа (возможно с корригентами). Композиция может быть приготовлена для легочного введения, например в виде ингалятора с использованием тонкодисперсного порошка или спрея. Композиция может быть приготовлена в виде суппозитория или пессария. Композиция может быть приготовлена для назального, ушного или глазного введения, например, в виде капель. Наиболее предпочтительны композиции, подходящие для парентеральной инъекции.
Композиция предпочтительно является стерильной. Предпочтительно, композиция является апирогенной. Предпочтительно, она забуферена, например при рН от 6 до 8, как правило приблизительно при рН 7. В том случае, когда композиция содержит соль гидроксида алюминия, предпочтительно используют гистидиновый буфер [27]. Композиции по изобретению могут быть изотоничными для людей.
Иммуногенные композиции содержат иммунологически эффективное количество иммуногена, а также, при необходимости, любые другие определенные компоненты. Под "иммунологически эффективным количеством" подразумевают, что введение такого количества индивиду или в разовой дозе, или в виде части серий доз, является эффективным для лечения или
предупреждения. Термин "предупреждение" означает, что прогресс заболевания уменьшается и/или устраняется, или что устраняется возникновение заболевания. Например, иммунная система субъекта может быть примирована (например, путем вакцинации) для запуска иммунного ответа и подавления инфекции, таким образом, что устраняется возникновение заболевания. Таким образом, вакцинируемый субъект может быть инфицирован, но обладает более хорошей способностью бороться с инфекцией по сравнению с контрольным субъектом. Такое количество варьирует в зависимости от состояния здоровья и физического состояния пациента, которого лечат, возраста, таксономической группы пациента, которого лечат (например, примата, отличающегося от человека, примата и т.д.), способности иммунной системы индивида синтезировать антитела, степени желаемой защиты, композиции вакцины, оценки медицинской ситуации лечащим врачом и других релевантных факторов. Ожидают, что количество будет оказываться в относительно широком диапазоне, который может быть определен в стандартных испытаниях. Лечение при помощи доз может быть осуществлено по схеме с использованием разовой дозы или по схеме с использованием дробных доз (например, включающей бустер-дозы). Композицию можно вводить в сочетании с другими иммунорегулирующими агентами.
Адъюванты, которые могут быть использованы в композициях по изобретению, включают нерастворимые соли металлов, эмульсии масло-в-воде (например, MF59 или AS03, обе содержат сквален), сапонины, нетоксичные производные LPS (липополисахаридов) (такие как монофосфориллипид А или З-О-деацилированный MPL), иммуностимулирующие олигонуклеотиды, обезвреженные бактериальные АДФ-рибозилирующие токсины, микрочастицы, липосомы, имидазохинолоны или их смеси, но не ограничиваются ими. Другие вещества, которые действуют в качестве иммуностимулирующих агентов, раскрыты в главе 7 источника 46.
Особенно предпочтительно применение адъюванта на основе гидроксида алюминия и/или фосфата алюминия, и полипептиды, как правило, адсорбированы на этих солях. Эти соли включают оксигидроксиды и гидроксифосфаты (например, смотри главы 8 и 9 в источнике 46). Соли могут
принимать любую подходящую форму (например, гель, кристаллическую форму, аморфную форму и т.п.).
Дополнительные антигенные компоненты
Композиции по изобретению включают мутантную последовательность v2 и/или v3 fHbp. Полезно, если композиция не включает сложные или неопределенные смеси антигенов, например, предпочтительно не включать везикулы наружной мембраны в композицию. Полипептиды по изобретению предпочтительно экспрессируют рекомбинантно в гетерологичном хозяине и затем очищают.
Наряду с включением полипептида fHbp, композиция по изобретению также может включать один или более чем один дополнительный иммуноген Neisseria, так как вакцина, которая направлена против более чем одного иммуногена бактерии, уменьшает вероятность селекции "ускользнувших" мутантов. Таким образом, композиция может включать второй полипептид, который при введении млекопитающему вызывает ответ в виде антител, которые являются бактерицидными против менингококка. Второй полипептид может представлять собой менингококковый fHbp, но часто не представляет собой fHbp, например, он может представлять собой последовательность NHBA, последовательность NadA и т.п.
Любой такой дополнительный иммуноген Neisseria может быть представлен в виде полипептида, отдельного от мутанта v2 или v3 fHbp по изобретению, или может быть представлен в виде слитого полипептида с модифицированным fHbp. Например, известно слияние менингококкового полипептида 936 и полипептидов fHbp [55, 56]. Особенно предпочтительны слитые белки, содержащие последовательность SEQ ID NO: 44 и/или последовательность SEQ ID NO: 45, возможно когда последовательности SEQ ID NO: 44 и/или 45 модифицирована(ы) единичными аминокислотными заменами в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичных аминокислотных замен, делеций и/или вставок), как здесь описано.
Композиция по изобретению может включать антиген NHBA. Антиген NHBA включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамма МС58 [27] как ген NMB2132 (идентификационный номер GenBank GL7227388; здесь последовательность
SEQ ID NO: 6). С того момента были опубликованы последовательности антигена NHBA из многих штаммов. Например, аллельные формы NHBA можно увидеть на Фиг. 5 и 15 источника 27, и в примере 13 и фиг. 21 источника 1 (в нем SEQ ID с 3179 по 3184). Также сообщалось о различных иммуногенных фрагментах антигена NHBA. Предпочтительные 287 антигенов для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую 50% или более чем 50% идентичность (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более чем 99,5%) с последовательностью SEQ ID NO: 6; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 6, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитопы последовательности SEQ ID NO: 6. Наиболее полезные антигены NHBA по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6. Благоприятные антигены NHBA для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиция по изобретению может включать антиген NadA. Антиген NadA включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB1994 (идентификационный номер GenBank GL7227256; здесь последовательность SEQ ID NO: 7). С тех пор были опубликованы последовательности антигена NadA из многих штаммов, и хорошо документирована белковая активность в качестве адгезина Neisseria. Также сообщалось о различных иммуногенных фрагментах NadA. Предпочтительные антигены NadA для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую 50% или более чем 50% идентичность (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более чем 99,5%) с последовательностью SEQ ID NO: 7; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 7, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30,
35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 7. Наиболее полезные антигены NadA по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7. Благоприятные антигены NadA для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка. Последовательность SEQ ID NO: 15 представляет собой один такой фрагмент.
Композиция по изобретению может включать антиген NspA. Антиген NspA включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB0663 (идентификационный номер GenBank GL7225888; здесь последовательность SEQ ID NO: 8). Этот антиген ранее был известен из источников 49 и 50. С того момента были опубликованы последовательности антигена NspA из многих штаммов. Также сообщалось о различных иммуногенных фрагментах NspA. Предпочтительные антигены NspA для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую 50% или более чем 50% идентичность (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или более чем 99,5%) с последовательностью SEQ ID NO: 8; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 8, где 'п' равен 7 или более чем 7 (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 8. Наиболее полезные антигены NspA по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. Благоприятные антигены NspA для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиции по изобретению могут включать менингококковый антиген HmbR. Полноразмерная последовательность HmbR включена в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы
В штамм МС58 [47] как ген NMB1668 (здесь последовательность SEQ ID NO: 9). В изобретении может использоваться полипептид, который содержит полноразмерную последовательность HmbR, но часто используется полипептид, который содержит частичную последовательность HmbR. Таким образом, в некоторых воплощениях последовательность HmbR, используемая по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере идентичность последовательности /% с последовательностью SEQ ID NO: 9, где величина / равна 50, 60, 70, 80, 90, 95, 99 или больше. В других воплощениях последовательность HmbR, используемая по изобретению, может содержать фрагмент по меньшей мере j последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 9, где величина у равна 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше. В других воплощениях последовательность HmbR, используемая по изобретению, может содержать аминокислотную последовательность, (1) имеющую по меньшей мере идентичность последовательности /% с последовательностью SEQ ID NO: 9, и/или (2) содержащую фрагмент по меньшей мере j последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 9. Предпочтительные фрагменты j аминокислот содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 9. Такие эпитопы обычно содержат аминокислоты, которые располагаются на поверхности HmbR. Полезные эпитопы включают эпитопы с аминокислотами, вовлеченными в связывание HmbR с гемоглобином, так как антитела, которые связываются с этими эпитопами, могут блокировать способность бактерии связываться с гемоглобином хозяина. Топологию HmbR и его критические функциональные остатки исследовали в источнике 51. Наиболее полезные антигены HmbR по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. Благоприятные антигены HmbR для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиция по изобретению может включать антиген NhhA. Антиген NhhA включен в опубликованную последовательность генома для
менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB0992 (идентификационный номер GenBank GL7226232; здесь последовательность SEQ ID NO: 10). С того момента были опубликованы последовательности антигена NhhA из многих штаммов, например источники 48 и 52, и сообщалось о различных иммуногенных фрагментах NhhA. Он также известен как Hsf. Предпочтительные антигены NhhA для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую идентичность последовательности 50% или больше (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше) с SEQ ID NO: 10; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 10, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 10. Наиболее полезные антигены NhhA по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Благоприятные антигены NhhA для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиция по изобретению может включать антиген Арр. Антиген Арр включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB1985 (идентификационный номер GenBank GL7227246; здесь последовательность SEQ ID NO: 11). С того момента были опубликованы последовательности антигена Арр из многих штаммов. Также сообщалось о различных иммуногенных фрагментах Арр. Предпочтительные антигены Арр для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую идентичность последовательности 50% или больше (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше) с SEQ ID NO: 11; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 11, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70,
80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 11. Наиболее полезные антигены Арр по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. Благоприятные антигены Арр для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиция по изобретению может включать антиген Отр85. Антиген Отр85 включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB0182 (идентификационный номер GenBank GL7225401; здесь последовательность SEQ ID NO: 12). С того момента были опубликованы последовательности антигена Отр85 из многих штаммов. Дополнительную информацию о Отр85 можно найти в источниках 53 и 54. Также сообщалось о различных иммуногенных фрагментах Отр85. Предпочтительные антигены Отр85 для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую идентичность последовательности 50% или боьше (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше) с SEQ ID NO: 12; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 12, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 12. Наиболее полезные антигены Отр85 по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. Благоприятные антигены Отр85 для применения в изобретении могут после введения субъекту вызывать образование бактерицидных антител против менингококка.
Композиция по изобретению может включать антиген 936. Антиген 936 включен в опубликованную последовательность генома для менингококковой серогруппы В штамм МС58 [47] как ген NMB2091 (здесь последовательность
SEQ ID NO: 13). Предпочтительные антигены 936 для применения в изобретении содержат аминокислотную последовательность: (а) имеющую идентичность последовательности 50% или больше (например 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% или больше) с SEQ ID NO: 13; и/или (б) содержащую фрагмент по меньшей мере 'п' последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 13, где 'п' равен 7 или больше (например 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 или больше). Предпочтительные фрагменты (б) содержат эпитоп последовательности SEQ ID NO: 13. Наиболее полезные антигены 936 по изобретению могут вызывать образование антител, которые после введения субъекту могут связываться с менингококковым полипептидом, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13. Антиген 936 представляет собой хороший партнер для слияния с fHbp (например, смотри источники 55 и 56).
Композиция может содержать: полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 14; полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 15; и полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2 и SEQ ID NO: 13 (смотри источники 55 и 56).
Композиция может содержать: полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 14; полипептид, содержащий последовательность SEQ ID NO: 15; и полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3 и SEQ ID NO: 13 (смотри источники 55 и 56).
В некоторых воплощениях полипептид по изобретению комбинирован с другой менингококковой последовательностью fHbp. В частности, полипептид v2 может быть комбинирован с полипептидом v1 и/или v3 для увеличения спектра покрытия штаммов [162]. Таким образом, композиция может содержать: (1) полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2; и (2) полипептид v1 fHbp и/или полипептид v3 fHbp. В других воплощениях полипептид по изобретению может содержать (1) мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2 и (2) аминокислотную последовательность v1 fHbp и/или аминокислотную последовательность v3
fHbp. Таким образом, последовательности v1 и/или v3 могут быть комбинированы с мутантной последовательностью v2 в виде отдельных единиц в композиции или в слитом полипептиде.
Аналогично, полипептид v3 может быть комбинирован с полипептидом v1 и/или v2 для увеличения спектра покрытия штаммов [162]. Таким образом, композиция может содержать: (1) полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3; и (2) полипептид v1 fHbp и/или полипептид v2 fHbp. В других воплощениях полипептид по изобретению может содержать (1) мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3 и (2) аминокислотную последовательность v1 fHbp и/или аминокислотную последовательность v2 fHbp. Таким образом, последовательности v1 и/или v2 могут быть комбинированы с мутантной последовательностью v3 в виде отдельных сущностей в композиции или в слитом полипептиде.
Кроме того, мутантные полипептиды v2 и v3 могут быть комбинированы друг с другом для увеличения покрытия штаммов. Таким образом, композиция может содержать: (1) полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2; (2) полипептид по изобретению, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3; и (3) полипептид fHbp v1. В других воплощениях полипептид по изобретению может содержать (1) мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2 (2) мутантную аминокислотную последовательность v3 fHbp и (3) аминокислотную последовательность fHbp v1. Таким образом, мутантные последовательности v2 и v3 могут быть комбинированы с последовательностью v1 в виде отдельных единиц в композиции или в слитом полипептиде. Последовательность v1 может представлять собой последовательность дикого типа или мутантную последовательность.
v1 fHbp может содержать (а) аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере идентичность к% с последовательностью SEQ ID NO: 16, и/или (б) фрагмент последовательности SEQ ID NO: 16. Информация о 'к' и фрагментах приведена выше. Фрагмент, как правило, включает по меньшей мере один эпитоп последовательности SEQ ID NO: 16, и полипептид v1 fHbp включает по меньшей мере один эпитоп, который не представлен в
аминокислотной последовательности v2 или v3 по изобретению, таким образом, что антитела, образование которых вызывается v1 fHbp, могут распознавать штаммы v1. В идеале, v1 fHbp могут вызывать образование антител, которые являются бактерицидными против штаммов v1, например против штамма МС58 (доступен в АТСС как 'ВАА-335'). v1 fHbp может включать аминокислотную мутацию, которая нарушает его способность связываться cfH.
v2 fHbp может содержать (а) аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере идентичность к% с последовательностью SEQ ID NO: 5, и/или (б) фрагмент последовательности SEQ ID NO: 5. Информация о 'к' и фрагментах приведена выше. Фрагмент, как правило, включает по меньшей мере один эпитоп последовательности SEQ ID NO: 5, и полипептид v2 fHbp включает по меньшей мере один эпитоп, который не представлен в аминокислотной последовательности v3 по изобретению, таким образом, что антитела, образование которых вызывается v2 fHbp, могут распознавать штаммы v2. В идеале, v2 fHbp могут вызывать образование антител, которые являются бактерицидными против штаммов v2, например против штамма М2091 (АТСС 13091). v2 fHbp может представлять собой полипептид в соответствии с первым воплощением.
v3 fHbp может содержать (а) аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере идентичность к% с последовательностью SEQ ID NO: 17, и/или (б) фрагмент последовательности SEQ ID NO: 17. Информация о 'к' и фрагментах приведена выше. Фрагмент, как правило, включает по меньшей мере один эпитоп последовательности SEQ ID NO: 17, и полипептид v3 fHbp включает по меньшей мере один эпитоп, который не представлен в аминокислотной последовательности v2 по изобретению, таким образом, что антитела, образование которых вызывается v3 fHbp, могут распознавать штаммы v3. В идеале v3 fHbp может вызывать образование антител, которые являются бактерицидными против штаммов v3, например против штамма М01-240355. v3 fHbp может представлять собой полипептид в соответствии со вторым воплощением.
Таким образом, например, в изобретении предложен полипептид, содержащий в единой полипептидной цепи каждый из: (1) аминокислотной последовательности fHbp v1; (2) мутантной аминокислотной
последовательности fHbp v2; и (3) мутантной аминокислотной последовательности fHbp v3. Этот полипептид может после введения животному-хозяину вызывать образование антител, которые связываются с каждым из: менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46; менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40. Последовательность (1) может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере к% идентичность последовательности SEQ ID NO: 16. Последовательность (2) может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере к% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5, но отличается от последовательности SEQ ID NO: 5 по одному или более чем одному из следующих остатков: S32, V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, Н239 и/или Е240. Последовательность (3) может содержать аминокислотную последовательность, которая имеет по меньшей мере к% идентичность последовательности SEQ ID NO: 17, но отличается от последовательности SEQ ID NO: 17 по одному или более чем одному из следующих остатков: S32, I33, L39, L41, F72, V103, Т116, F125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, Н242 и/или Е243. В предпочтительном воплощении: последовательность (1) содержит последовательность SEQ ID NO: 16, возможно модифицированную единичными аминокислотными изменениями в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками); последовательность (2) содержит последовательность SEQ ID NO: 45, возможно модифицированную единичными аминокислотными изменениями в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками), при условии, что такие аминокислотные изменения не изменяют мутации в этих последовательностях на противоположные относительно последовательности дикого типа; и последовательность (3) содержит последовательность SEQ ID NO: 44, возможно модифицированную до 5 единичными аминокислотными изменениями (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, например с
получением последовательности SEQ ID NO: 53), при условии, что такие аминокислотные изменения не изменяют мутации в этих последовательностях на противоположные относительно последовательности дикого типа. Аминокислотные последовательности (1), (2) и (3) могут быть расположены в любом порядке от N- к С-концу в полипептиде, но предпочтительно в порядке (2), затем (3), затем (1). Например, в изобретении предложен полипептид формулы -А-В-С- где: А содержит последовательность SEQ ID NO: 45, возможно модифицированную единичными аминокислотными заменами в количестве до 3; В содержит последовательность SEQ ID NO: 44, возможно модифицированную единичными аминокислотными заменами в количестве до 3; и С содержит последовательность SEQ ID NO: 16, возможно модифицированную единичными аминокислотными заменами в количестве до 3 (например, замена(ы) для нарушения связывания с fH). Предпочтительный С содержит последовательность SEQ ID NO: 49, где остаток Агд-34 подвергнут мутации до Ser, как сообщается для мутации 'R41S' в источнике 21.
Особенно предпочтительный полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47. Эта последовательность включает от N-концу к С-концу: мутант v2 (SEQ ID NO: 45); мутант v3 (SEQ ID NO: 44); и мутант v1 (SEQ ID NO: 49). Между этими тремя мутантными последовательностями fHbp в каждом случае находится связывающая последовательность SEQ ID NO: 50. В одном из воплощений полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, которая имеет N-концевой метионин, затем последовательность SEQ ID NO: 37 и затем последовательность SEQ ID NO: 47.
Последовательность SEQ ID NO: 47 (сама по себе или в последовательности SEQ ID NO: 48) возможно может быть модифицирована единичными аминокислотными изменениями в количестве до 5 (т.е. 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками), при условии, что такие аминокислотные изменения не изменяют мутации в последовательностях v1, v2, и v3 на противоположные относительно последовательности дикого типа, т.е. аминокислотные остатки V32, R123, V285, R379 и S543 последовательности SEQ ID NO: 47 не должны подвергаться мутации до S32, L123, S285, L379, и R543. Тем не менее, в одном из
исключительных воплощений V285 может изменяться назад до S285, и/или V32 может изменяться назад до S32.
Слияние мутантных последовательностей может в идеале вызывать образование антител, которые связываются с каждым из следующих: менингококковым полипептидом дикого типа v1 fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46; менингококковым полипептидом дикого типа v2 fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и менингококковым полипептидом дикого типа v3 fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40.
Помимо полипептидных антигенов Neisseria композиция может включать антигены для иммунизации против других заболеваний или инфекций. Например, композиция может включать один или более чем один из следующих дополнительных антигенов:
- сахаридный антиген N.meningitidis серогрупп А, С, W135 и/или Y, такой как сахарид, раскрытый в источнике 57 из серогруппы С (смотри также источник 58) или в источнике 59;
- сахаридный антиген Streptococcus pneumoniae [например 60, 61, 62];
- антиген вируса гепатита А, такой как инактивированный вирус [например 63, 64];
- антиген вируса гепатита В, такой как поверхностные и/или ядерные антигены [например 64, 65];
- дифтерийный антиген, такой как дифтерийный анатоксин [например глава 3 из источника 66], например мутант CRM197 [например 67];
- столбнячный антиген, такой столбнячный анатоксин [например, глава 4 из источника 66];
- антиген Bordetella pertussis, такой как коклюшный холотоксин (РТ) и филаментный гемаглютинин (FHA) из В.pertussis, возможно также в комбинации с пертактином и/или агглютиногенами 2 и 3 (например, источники 68 и 69);
- сахаридный антиген Haemophilus influenzae В [например 58];
- полиовирусный(е) антиген(ы) (например 70, 71], такой как IPV;
- антигены кори, свинки и/или краснухи (например главы 9, 10 и 11 из источника 66);
-
- антиген(ы) гриппа (например, глава 19 из источника 66), такие как поверхностные белки гемаглютинин и/или нейраминидаза;
- антиген Moraxella catarrhalis [например 72];
- белковый антиген Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В) [например, 73, 74];
- сахаридный антиген Streptococcus agalactiae (стрептококк группы В);
- антиген Streptococcus pyogenes (стрептококк группы А) [например, 74, 75, 76];
- антиген Staphylococcus aureus [например 77].
Композиция может содержать один или более чем один из этих дополнительных антигенов.
Токсичные белковые антигены при необходимости могут быть обезврежены (например, обезвреживание коклюшного токсина при помощи химических и/или генетических способов [69]).
В том случае, когда в композицию включен дифтерийный антиген, тогда предпочтительно также включать столбнячный антиген и коклюшные антигены. Аналогично, когда включен столбнячный антиген, тогда предпочтительно также включать дифтерийный и коклюшный антигены. Аналогично, когда включен коклюшный антиген, тогда предпочтительно также включать дифтерийный и столбнячный антигены. Таким образом, предпочтительны комбинации DTP.
Сахаридные антигены предпочтительно находятся в форме конъюгатов. Белки-носители для конъюгатов более подробно обсуждаются ниже.
Антигены в композиции как правило будут представлены в концентрации, составляющей по меньшей мере1 мкг/мл для каждого. В общем, концентрация любого данного антигена будет достаточной для того, чтобы вызвать иммунный ответ против такого антигена.
Иммуногенные композиции по изобретению можно применять терапевтически (т.е. для лечения существующей инфекции) или профилактически (т.е. для предотвращения будущей инфекции).
В качестве альтернативы применению белковых антигенов в иммуногенных композициях по изобретению можно использовать нуклеиновую кислоту (которая может представлять собой РНК, такую как
самореплицирующаяся РНК, или ДНК, такая как плазмида), кодирующую антиген.
В некоторых воплощениях композиция по изобретению содержит кроме последовательности fHBP конъюгированные капсульные сахаридные антигены из 1, 2, 3 или 4 менингококковых серогрупп А, С, W135 и Y. В других вариантах композиция по изобретению содержит кроме последовательности fHBP по меньшей мере один конъюгированный пневмококковый капсульный сахаридный антиген
Менингококковые серогруппы Y, W135, С и А
Современные вакцины серогруппы С (Menjugate(tm) [57,78], Meningitec(tm) и NeisVac-C(tm)) включают конъюгированные сахариды. Menjugate(tm) и Meningitec(tm) имеют олигосахаридные антигены, конъюгированные с носителем CRM197, тогда как для NeisVac-C(tm) используют полный полисахарид (де-О-ацетилированный), конъюгированный с носителем в виде столбнячного анатоксина. Вакцина Menactra(tm) содержит конъюгированные капсульные сахаридные антигены из каждой из серогрупп Y, W135, С и А.
Композиции по настоящему изобретению могут включать капсульные сахаридные антигены из одной или более чем одной серогруппы менингококков Y, W135, С и А, где антигены конъюгированы с белком-носителем (белками-носителями) и/или представляют собой олигосахариды. Например, композиция может включать капсульный сахаридный антиген из: серогруппы С; серогрупп А и С; серогрупп А, С и W135; серогрупп А, С и Y; серогрупп С, W135 и Y; или из всех четырех серогрупп А, С, W135 и Y.
Типичное количество каждого менингококкового сахаридного антигена на дозу составляет от 1 мкг до 20 мкг, например, приблизительно 1 мкг, приблизительно 2,5 мкг, приблизительно 4 мкг, приблизительно 5 мкг или приблизительно 10 мкг (выраженное в расчете на сахарид).
Когда смесь содержит капсульные сахариды из обеих серогрупп А и С, тогда соотношение (масс/масс.) сахарид МепА:сахарид МепС может быть больше 1 (например 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше). Когда смесь содержит капсульные сахариды из серогруппы Y и одной или обеих серогрупп С и W135, тогда соотношение (масс/масс.) сахарид Men У:сахарид MenW135 может быть больше 1 (например 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 или выше) и/или такое соотношение
(масс/масс.) сахарид MenY:сахарид МепС может быть меньше 1 (например 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 или ниже). Предпочтительные соотношения (масс/масс.) для сахаридов серогрупп A:C:W135:Y составляют: 1:1:1:1; 1:1:1:2; 2:1:1:1; 4:2:1:1; 8:4:2:1; 4:2:1:2; 8:4:1:2; 4:2:2:1; 2:2:1:1; 4:4:2:1; 2:2:1:2; 4:4:1:2 и 2:2:2:1. Предпочтительные соотношения (масс/масс.) сахаридов из серогрупп C:W135:Y составляют: 1:1:1; 1:1:2; 1:1:1; 2:1:1; 4:2:1; 2:1:2; 4:1:2; 2:2:1 и 2:1:1. Предпочтительно использование по существу равных масс каждого сахарида.
Капсульные сахариды можно использовать в форме олигосахаридов. Они обычно образуются при фрагментации очищенного капсульного полисахарида (например, путем гидролиза), после которой обычно следует очистка фрагментов желаемого размера.
Фрагментацию полисахаридов предпочтительно осуществляют, получая конечную среднюю степень полимеризации (DP) в олигосахариде менее чем 30 (например, от 10 до 20, предпочтительно приблизительно 10 для серогруппы А; от 15 до 25 для серогрупп W135 и Y, предпочтительно приблизительно 15-20; от 12 до 22 для серогруппы С; и т.д.). DP обычно можно измерить с использованием ионообменной хроматографии или с помощью колориметрических анализов [79].
Если осуществляют гидролиз, то гидролизат, как правило, будет подвергнут сортировке по размеру, чтобы удалить короткие олигосахариды [58]. Это можно осуществить различными путями, такими как ультрафильтрация с последующей ионообменной хроматографией. Олигосахариды со степенью полимеризации меньше или равной приблизительно 6 предпочтительно удаляют в случае серогруппы А, и со степенью полимеризации меньше чем приблизительно 4 предпочтительно удаляют в случае серогрупп W135 и Y.
Предпочтительные сахаридные антигены МепС раскрыты в источнике 78, такие как используемые в Menjugate(tm).
Сахаридный антиген может быть химически модифицирован. Последнее особенно полезно для восстанавливающего гидролиза в случае серогруппы А [80]. Может быть осуществлено де-О-ацетилирование менингококковых сахаридов. В случае олигосахаридов модификация может происходить до или после деполимеризации.
Когда композиция согласно изобретению включает сахаридный антиген МепА, тогда антиген предпочтительно представляет собой модифицированный сахарид, в котором одна или более чем одна гидроксильная группа нативного сахарида заменена блокирующей группой [80]. Такая модификация повышает устойчивость к гидролизу.
Ковалентная конъюгация
Капсульные сахариды в композициях по изобретению обычно могут быть конъюгированы с белком-носителем (белками-носителями). Как правило, конъюгирование усиливает иммуногенность сахаридов, так как превращает их из Т-независимых антигенов в Т-зависимые антигены, таким образом, обеспечивая примирование иммунологической памяти. Конъюгирование особенно полезно для педиатрических вакцин и представляет собой хорошо известный способ.
Типичные белки-носители представляют собой бактериальные токсины, такие как дифтерийный или столбнячный токсины, или анатоксины или их мутанты. Полезен мутант дифтерийного токсина CRM197 [81], и он является носителем в продукте PREVNAR(tm). Другие подходящие белки-носители представляют собой комплекс белков наружной мембраны N. meningitidis [82], синтетические пептиды [83,84], белки теплового шока [85,86], коклюшные белки [87,88], цитокины [89], лимфокины [89], гормоны [89], факторы роста [89], искусственные белки, содержащие множественные эпитопы Т-клеток С04+человека из различных полученных из патогенов антигенов [90], такие как N19 [91], белок D из Н. influenzae [92-94], пневмолизин [95] или его нетоксичные производные [96], пневмококковый поверхностный белок PspA [97], белки, связывающие железо [98], токсин А или В из С. difficile [99], рекомбинантный экзобелок А P. aeruginosa (гЕРА) [100] и т.д.
Можно использовать любую подходящую реакцию конъюгирования, при необходимости с любым подходящим линкером.
Сахарид обычно может быть активирован или функционализирован перед конъюгированием. Для активации можно использовать, например, цианилирующие реагенты, такие как CDAP (например, 1-циано-4-диметиламинопиридиний тетрафторборат [101, 102 и т.п.]). В других подходящих способах используют карбодиимиды, гидразиды, активные
сложные эфиры, норборан, пара-нитробензойную кислоту, N-
гидроксисукцинимид, S-NHS, EDC (1-этил-3-[3-
диметиламинопропил]карбодиимид), TSTU (0-(Ы-сукцинимидил)-1,1,3,3-тетраметилуроний тетрафторборат) и т.д.
Связывание через линкерную группу может быть осуществлено с использованием любого известного способа, например способов, описанных в источниках 103 и 104. Один из типов связывания заключается в восстановительном аминировании полисахарида, связывании полученной аминогруппы с одним концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты и затем связывании белка с другим концом линкерной группы на основе адипиновой кислоты [105, 106]. Другие линкеры включают В-пропионамидогруппу [107], нитрофенилэтиламин [108], галоацилгалогениды [109], гликозидные связи [110], 6-аминокапроновую кислоту [111], ADH [112], группировки С4-С12 [113] и т.п. В качестве альтернативы использованию линкера можно использовать прямое связывание. Прямое связывание с белком может включать окисление полисахарида с последующим восстановительным аминированием с использованием белка, как описано, например, в источниках 114 и 115.
Предпочтительным является способ, включающий введение аминогрупп в сахарид (например, путем замены концевых =0-групп на группу -NH2) с последующей дериватизацией сложными диэфирами адипиновой кислоты (например, сложным N-гидроксисукцинимидодиэфиром адипиновой кислоты) и путем взаимодействия с белком-носителем. В другой предпочтительной реакции используют активацию CDAP белком-носителем D, например, в случае МепА или МепС.
Везикулы наружной мембраны
Некоторые композиции по изобретению не включают сложные или неопределенные смеси антигенов, которые представляют собой типичные характеристики OMV (везикул наружной мембраны). Тем не менее, изобретение может быть использовано в сочетании с OMV, так как обнаружили, что fHbp усиливает их эффективность [4], в частности, в результате сверхэкспрессии полипептидов по изобретению в штаммах, используемых для получения OMV. Также смотри ниже.
Данный подход в общем можно применять для улучшения препаратов микровезикул N. meningitidis серогруппы В [116], "нативных OMV" [117], пузырьков или везикул наружной мембраны [например источники 118-123 и т.д.]. Они могут быть получены из бактерий, с которыми были проведены генетические манипуляции [124-127], например для увеличения иммуногенности (например, сверхэкспрессия иммуногенов), для уменьшения токсичности, для ингибирования синтеза капсульных полисахаридов, для понижающей регуляции экспрессии РогА и т.д. Везикулы могут быть получены из штаммов со сверхпузырением (hyperblebbing strains) [128-131]. Могут быть включены везикулы из непатогенных Neisseria [132]. OMV могут быть получены без применения детергентов [133, 134]. Они могут экспрессировать белки, отличающиеся от белков Neisseria на своей поверхности [135]. Они могут быть истощены по LPS (липополисахаридам). Они могут быть смешаны с рекомбинантными антигенами [118, 136]. Можно использовать везикулы из бактерий с разными подтипами белков наружной мембраны класса I, например шестью разными подтипами [137, 138], используя две разных популяции генетически сконструированных везикул, каждая из которых презентирует три подтипа, или девятью разными подтипами, используя три разных популяции генетически сконструированных везикул, каждая из которых презентирует три подтипа, и т.д. Полезные подтипы включают Р1.7,16, Р1.5-1,2-2, Р1.19,15-1, Р1.5-2.10, Р1.12-1,13, Р1.7-2,4, Р1.22,14, Р1.7-1.1, Р1.18-1,3,6.
Клетки-хозяева
В изобретении предложена бактерия, которая экспрессирует полипептид по изобретению. Бактерия может представлять собой менингококк или E.coli. Бактерия может конститутивно экспрессировать полипептид, но в некоторых воплощениях экспрессия может быть под контролем индуцируемого промотора. Бактерия может сверхэкспрессировать полипептид (смотри источник 139). Экспрессия полипептида в идеале может не варьировать в зависимости от фазы.
В изобретении также предложены везикулы наружной мембраны, полученные из бактерии по изобретению (в частности из менингококка). В изобретении также предложен способ получения везикул из бактерии по изобретению. Везикулы, полученные из этих штаммов, предпочтительно
включают полипептид по изобретению, который должен находиться в везикулах в иммунодоступной форме, т.е. антитело, которое может связываться с очищенным полипептидом по изобретению, также должно быть способно связываться с полипептидом, который присутствует в везикулах.
Эти везикулы наружной мембраны включают любую протеолипосомную везикулу, полученную при разрушении или пузырении наружной мембраны менингококка с образованием из нее везикул, которые включают белковые компоненты наружной мембраны. Таким образом, термин включает OMV (иногда называемые "пузырьками"), микровезикулы (MV [1116]) и "нативные OMV" ("NOMV"[117]).
MV и NOMV представляют собой природные мембранные везикулы, которые образуются спонтанно во время роста бактерий и высвобождаются в культуральную среду. MV могут быть получены в результате выращивания Neisseria в бульонной культуральной среде, отделения целых клеток от меньших по размеру MV в бульонной культуральной среде (например путем фильтрования или низкоскоростного центрифугирования для того, чтобы осадить только клетки, а не меньшие по размеру везикулы), и затем сбора MV из обедненной клетками среды (например путем фильтрования, путем дифференциального осаждения или путем агрегации MV, путем высокоскоростного центрифугирования для осаждения MV). Штаммы для применения при получении MV как правило могут быть выбраны на основе количества MV, продуцируемых в культуре, например в источниках 130 и 131 описаны Neisseria с высокой продукцией MV.
OMV получают искусственно из бактерий, и они могут быть получены с использованием обработки детергентом (например дезоксихолатом), или при помощи недерегентных средств (например, смотри источник 134). Способы образования OMV заключаются в обработке бактерий детергентом на основе солей желчных кислот (например солей литохолевой кислоты, хенодезоксихолевой кислоты, урсодезоксихолевой кислоты, дезоксихолевой кислоты, холевой кислоты, урсохолевой кислоты и т.д., при этом дезоксихолат натрия [140 и 141] является предпочтительным для обработки Neisseria) при рН, достаточно высоком для того, чтобы не осаждать детергент [142]. Другие способы могут быть осуществлены по существу в отсутствие детергента [134] с
использованием таких способов, как обработка ультразвуком, гомогенизация, микрофлюидизация, кавитация, осмотический шок, измельчение, френч-пресс, смешивание и т.д. Способы без использования детергента или с использованием низкой концентрации детергента могут сохранять полезные антигены, такие как NspA и fHbp [134]. Таким образом, в способе можно использовать буфер для экстракции OMV, содержащий приблизительно 0,5% дезоксихолата или меньше, например приблизительно 0,2%, приблизительно 0,1%, меньше 0,05% или не содержать дезоксихолат.
Полезный способ получения OMV описан в источнике 143 и включает ультрафильтрацию неочищенных OMV вместо высокоскоростного центрифугирования. Способ может включать стадию ультрацентрифугирования после ультрафильтрации. OMV также могут быть очищены с использованием двухстадийного способа гель-фильтрации, описанного в источнике 154.
Везикулы для применения в изобретении могут быть получены из любого менингококкового штамма. Обычно везикулы получают из штамма серогруппы В, но их можно получать из других серогрупп, отличающихся от серогруппы В (например, в источнике 142 описан способ для серогруппы А), таких как А, С, W135 или Y. Штамм может иметь любой серотип (например, 1, 2а, 2Ь, 4, 14, 15, 16 и т.д.), любой сероподтип и любой иммунотип (например, L1; L2; L3; L3,3,7; L10 и т.д.). Менингококки могут быть из любой подходящей линии, включая гиперинвазивные и гипервирулентные линии, например из любой из следующих семи гипервирулентных линий: подгруппа I; подгруппа III; подгруппа IV-1; комплекс ЕТ-5; комплекс ЕТ-37; кластер А4; линия 3.
Бактерии по изобретению, кроме кодирования полипептида по изобретению, могут иметь одну или несколько дополнительных модификаций. Например, они могут иметь модифицированный ген far [144]. Экспрессия nspA может подвергаться повышающей регуляции при сопутствующем нокауте рогА и cps. Дополнительные нокаутированные мутанты N. meningitidis для получения OMV раскрыты, например, в источнике 150. В источнике 145 раскрыто конструирование везикул из штаммов, модифицированных для экспрессии шести разных подтипов РогА. Также можно использовать мутант Neisseria с низкими уровнями эндотоксина, достигаемыми в результате нокаута ферментов, вовлеченных в биосинтез LPS [146, 147]. В изобретении может
быть использован мутант Neisseria, сконструированный для уменьшения или отключения экспрессии по меньшей мере одного гена, вовлеченного в придание токсичности фрагменту липида А в LPS, в частности гена /рх/1 [148]. Аналогично, в изобретении может быть использован мутант Neisseria, сконструированный для уменьшения или отключения экспрессии по меньшей мере одного гена, вовлеченного в синтез или экспорт капсульного полисахарида, в частности генов synX и/или ctrA. Все эти или другие мутанты можно использовать в изобретении.
Таким образом, штамм, используемый в изобретении, в некоторых воплощениях может экспрессировать более одного подтипа РогА. Ранее были сконструированы 6-валентные и 9-валентные по РогА штаммы. Штамм может экспрессировать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 подтипов РогА: Р1.7,16; Р1.5-1,2-2; Р1.19,15-1; Р1.5-2.10; Р1.12-1,13; Р1.7-2,4; Р1.22.14; Р1.7-1,1 и/или Р1.18-1,3,6. В других воплощениях штамм может быть подвергнут понижающей регуляции в отношении экспрессии РогА, например при которой количество РогА уменьшается по меньшей мере на 20% (например не менее 30%, не менее 40%, не менее 50%, не менее 60%, не менее 70%, не менее 80%, не менее 90%, не менее 95% и т.п.), или он даже нокаутирован по сравнению с уровнями дикого типа (например, по сравнению со штаммом Н44/76).
В некоторых воплощениях штамм может сверхэкспрессировать (по сравнению с соответствующим штаммом дикого типа) некоторые белки. Например, штаммы могут сверхэкспрессировать NspA, белок 287 [118], fHBP [139], TbpA и/или TbpB [136], Си,7п-супероксиддисмутазу, HmbR и т.д.
Ген, кодирующий полипептид по изобретению, может быть интегрирован в бактериальную хромосому или может присутствовать в эписомной форме, например в плазмиде.
Благоприятным образом для получения везикул, менингококк может быть генетически сконструирован так, чтобы гарантировать то, что экспрессия полипептида не подвергнется фазовым вариациям. Способы уменьшения или устранения фазовой вариабельности генной экспрессии у менингококков раскрыты в источнике 149. Например, ген может быть помещен под контроль конститутивного или индуцируемого промотора, или может быть удален или заменен на мотив ДНК, который ответственен за его фазовую вариабельность.
В некоторых воплощениях штамм может включать одну или более чем одну мутацию в результате нокаута и/или связанных со сверхэкспрессией мутаций, раскрытых в источниках 122, 124, 128 и 150. Например, в соответствии с руководством и номенклатурой в этих четырех источниках полезные гены для понижающей регуляции и/или нокаута включают: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, и/или TbpB; (6) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Opc, PhoP, PilC, PmrE, PmrF, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, и/или TbpB; (в) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE, LbpA, LpbB, Opa, Opc, PilC, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, и/или TbpB; или (г) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorB, SiaD, SynA, SynB, SynX и/или SynC.
В случае использования мутантного штамма в некоторых воплощениях он может иметь одну или более чем одну, или все следующие характеристики: (1) пониженная регуляция или нокаут LgtB и/или GalE для усечения LOS (липоолигосахарид) менингококка; (2) повышенная регуляция TbpA; (3) повышенная регуляция NhhA; (4) повышенная регуляция Отр85; (5) повышенная регуляция LbpA; (6) повышенная регуляция NspA; (7) нокаут РогА; (8) пониженная регуляция или нокаут FrpB; (9) пониженная регуляция или нокаут Ора; (10) пониженная регуляция или нокаут Орс; (11) подвергнутый делеции комплекс генов cps. Усеченный LOS может представлять собой LOS, который не включает эпитоп сиалиллакто^-неотетраозы, например, он может представлять собой дефицитный по галактозе LOS. LOS может не иметь а-цепь.
В зависимости от менингококкового штамма, используемого для получения везикул, они могут содержать или не включать антиген нативного fHBP данного штамма [151].
В одном из предпочтительных воплощений менингококк не экспрессирует функциональный белок MltA. Как обсуждается в источниках 152 и 153, нокаут MltA (связанной с мембраной литической трансгликозилазы, также известной как GNA33) у менингококка приводит к бактериям, которые спонтанно высвобождают большие количества мембранных везикул в культуральную среду, из которой они легко могут быть очищены. Например, везикулы могут быть очищены с использованием двухстадийного способа фильтрования по
размеру в соответствии с источником 154, включающего: (1) первую стадию фильтрования, на которой везикулы отделяют от бактерий на основе различия их размеров, причем везикулы проходят в фильтрат; и (2) вторую стадию фильтрования, на которой везикулы остаются в концентрате. Мутацию MltA (понижающая регуляция или нокаут) используют в вакцинах 'GMMA' [155], и она для удобства может быть комбинирована с дополнительной понижающей регуляцией или нокаутом в частности по меньшей мере одного гена, вовлеченного в придании токсичности фрагменту липида А в LPS, в частности 1рх11, и/или по меньшей мере одного гена, вовлеченного в синтез или экспорт капсульного полисахарида, в частности генов synX и/или ctrA. GMMA (генерализованные модули для мембранных антигенов) генетически обезвреживают OMV, которые получают из менингококковых штаммов, сконструированных для высвобождения GMMA, обладающих уменьшенной реакционностью и увеличенной иммуногенностью. GMMA индуцируют меньше провоспалительных цитокинов, чем OMV при тестировании в тесте активации моноцитов (МАТ).
Предпочтительный менингококковый штамм для вакцины 'GMMA' с использованием этого подхода экспрессирует мутант v2 fHbp и/или мутант v3 fHbp по изобретению, и экспрессия может управляться сильными промоторами. Везикулы, высвобождаемые этим штаммом, включают мутантные белки v2 и/или v3 fHbp в иммуногенной форме, и введение везикул может обеспечивать бактерицидный антибактериальный ответ, как обсуждается в источнике 155. Штамм также может экспрессировать v1 fHbp, или вместо этого v1 fHbp может быть предложен в виде отдельного рекомбинантного белка в растворимой форме (и v1 fHbp может быть дикого типа или представлять собой мутантную последовательность, например подвергнутую мутации для нарушения ее способности связываться с fH, как обсуждается выше). В изобретении предложены такие штаммы, и также предложены везикулы, которые высвобождают эти штаммы, например очищенные из культуральных сред после роста штаммов. Предпочтительный для экспрессии в этих штаммах мутант v2 имеет мутацию по S32 и/или L123 в соответствии с обсуждаемым здесь, и предпочтительный для экспрессии в этих штаммах мутант v3 имеет мутацию по S32 и/или L126 в соответствии с обсуждаемым здесь. Таким
образом, везикулы, полученные из менингококков, экспрессирующих эти мутантные последовательности v2 и v3 fHbp, представляют собой особенно предпочтительные иммуногены для применения в вакцинах по изобретению. Таким образом, полезная для мутагенеза последовательность дикого типа v2 содержит SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 54 (содержащая форму AG SEQ ID NO: 55), и, таким образом, полезная для мутагенеза последовательность дикого типа v3 содержит SEQ ID NO: 52.
Полезные для использования в таких штаммах промоторы включают промоторы, обсуждаемые в источниках 156 и 157. Например, промотор может представлять собой: (а) промотор гена порина, предпочтительно рогА или рогВ, в частности из N. meningitidis; или (б) промотор гена рРНК (такого как ген 16S рРНК), в частности из N.meningitidis. Когда используют менингококковый промотор порина, тогда он предпочтительно получен из рогА, и более конкретно область -10 менингококкового промотора гена рог А и/или область -35 менингококкового промотора гена рог А (предпочтительно, где область -10 и область -35 разделены промежуточной последовательностью из 12-20 нуклеотидов, и где промежуточная последовательность или не содержит последовательность поли-G, или включает последовательность поли-G, имеющую не более чем восемь последовательных нуклеотидов G). Когда используют промотор гена рРНК, тогда он может содержать в частности (1) область -10 менингококкового промотора гена рРНК и/или (2) область -35 менингококкового промотора гена рРНК. Также возможно использовать гибрид (а) и (б), например имеющий область -10 промотора рог А и область -35 промотора рРНК (которая может представлять собой консенсусную область -35). Таким образом, полезный промотор может представлять собой промотор, который включает или (1) область -10 (в частности менингококкового) гена рРНК и область -35 (в частности менингококкового) гена рогА, или (2) область -10 (в частности менингококкового) гена рогА и область -35 (в частности менингококкового) гена рРНК.
Если в везикуле присутствуют LOS, то можно обрабатывать везикулу таким образом, чтобы связывать его LOS и белковые компоненты (конъюгация "внутри везикулы" [150]).
Общая информация
Термин "содержащий" охватывает "включающий", а также "состоящий", например, композиция, "содержащая" X, может состоять исключительно из X или может что-то включать дополнительно, например, X+Y. Ссылки на "содержащий" (или "содержит" и т.п) могут возможно быть заменены на "состоящий из" (или "состоит из" и т.п.). Термин "по существу состоящий из" ограничивает объем формулы изобретения конкретными материалами или стадиями "и теми, которые не влияют существенно на основную(ые) и новую(ые) характеристику(и)" заявленного изобретения.
Термин "приблизительно" в отношении численного значения х является дополнительным и означает, например, х±10%.
Слово "по существу" не исключает "полностью", например композиция, которая "по существу не содержит" Y, может совсем не содержать Y. При необходимости слово "по существу" может быть исключено из определения по изобретению.
"Идентичность последовательностей" может быть определена при помощи алгоритма поиска гомологии Смита-Ватермана, реализованного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), с использованием поиска аффинного пропуска с параметрами штрафа на внесение делеции в выравнивание^ 2 и штрафа на продолжение делеции =1, но предпочтительно определена при помощи алгоритма глобального выравнивания Нидлемана-Вунша [158] с использованием параметров по умолчанию (например, штрафа на внесение делеции в выравнивание = 10,0 и штрафа на продолжение делеции = 0,5, используя матрицу подсчета EBLOSUM62). Этот алгоритм удобно реализован в инструменте needle в пакете EMBOSS [159]. Когда применение относится к идентичности последовательности к конкретной SEQ ID, тогда идентичность должна рассчитываться по всей длине этой SEQ ID.
Термин "фрагмент" в отношении полипептидных последовательностей означает, что полипептид представляет собой фракцию полноразмерного белка. Такие фрагменты могут оказывать качественную биологическую активность, такую же как полноразмерный белок, например фрагмент может содержать или кодировать один или более чем один эпитоп, такой как иммунодоминантные эпитопы, которые дают возможность для возникновения
похожего иммунного ответа на фрагмент, а также на полноразмерную последовательность. Полипептидные фрагменты как правило имеют делецию по N-концевому фрагменту и/или С-концевому фрагменту по сравнению с нативным белком, но где оставшаяся аминокислотная последовательность фрагмента идентична аминокислотной последовательности нативного белка. Полипептидные фрагменты могут содержать, например: пример 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 24, 26, 28, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262 последовательных аминокислот, включая все целочисленные значения между ними, референсной полипептидной последовательности, например от 50 до 260, от 50 до 255, от 50 до 250, от 50 до 200, от 50 до 150 последовательных аминокислот референсной полипептидной последовательности. Термин фрагмент однозначно исключает полноразмерные полипептиды fHbp и их зрелые липопротеины.
После определения серогруппы классификация менингококков включает серотип, сероподтип и затем иммунотип, и стандартная номенклатура указывает на серогруппу, серотип, сероподтип и иммунотип, каждые из которых отделены двоеточием, например В:4:Р1.15:L3,7,9. В серогруппе В некоторые линии часто вызывают заболевание (гиперинвазивные), некоторые линии вызывают более тяжелые формы заболевания, чем другие (гипервирулентные), и другие совсем редко вызывают заболевание. Идентифицировано семь гипервирулентных линий, а именно подгруппы I, III и IV-1, комплекс ЕТ-5, комплекс ЕТ-37, кластер А4 и линия 3. Такие линии определены с использованием мультилокусного ферментативного электрофореза (MLEE), но для классификации менингококков также использовали мультилокусное типирование последовательностей (MLST). Четыре основных гипервирулентных кластера представляют собой комплексы ST32, ST44, ST8 и ST11.
В общем, изобретение не охватывает различные последовательности fHbp, в частности раскрытые в источниках 2, 3, 5, 6, 7, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166 и 167.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
Фиг. 1 демонстрирует отличающуюся чувствительность вариантов fHbp к расщеплению химотрипсином. Стрелка демонстрирует положение полноразмерных белков fHbp.
Фиг. 2 демонстрирует анализ путем вестерн-блоттинга мутантов v2 мутанты. Дорожки представляют собой: (1 и 2) рекомбинантный очищенный v2 дикого типа; (4) лизат v2 дикого типа; (5) мутант #1; (6) мутант #2; (7) мутант #4; (8) мутант #5; (9) мутант #7; (10) мутант #8; (11) мутант #12; (12) мутант #14 (13) мутант #15; (14) контроль fHbp var2 NAG-trx, т.е. белок v2, где N-концевая последовательность GPDSDRLQQRR (SEQ ID NO: 37) заменена на GSKDISS (SEQ ID NO: 38). Дорожки 2-14 включали химотрипсин. М представляет собой молекулярные маркеры.
Фиг. 3 демонстрирует дополнительный анализ путем вестерн-блоттинга мутантов v2. Дорожки представляют собой: (1 и 2) мутант #3; (3 и 4) мутант #6; (5 и 6) мутант #9; (7 и 8) мутант #10; (9 и 10) мутант #13; (11 и 12) Ддопо; (13 и 14) v2 дикого типа; (15 и 16) мутант #22. Нечетные дорожки относятся к белкам, которые были инкубированы без химотрипсина, тогда как четные дорожки относятся к белкам, которые были инкубированы с химотрипсином. Белок 'Ддопо' представляет собой рекомбинантный v2, где N-концевая последовательность (SEQ ID NO: 37) удалена.
Фиг. 4 демонстрирует дополнительный анализ путем вестерн-блоттинга для мутантов v2. Дорожки представляют собой: (1 и 2) мутант #11; (3 и 4) N-trx; (5-7) мутант #19; (8 и 9) мутант #20; (10 и 11) мутант #21. Дорожки 2, 4, 7, 9 и 11 для белков, которые инкубировали с химотрипсином, тогда как другие дорожки были без химотрипсина. Белок 'N-trx' представляет собой рекомбинантный v2, где N-концевая последовательность (SEQ ID NO: 37) заменена на SEQ ID NO: 39.
Фиг. 5 демонстрирует результаты DSC для v2 fHbp дикого типа и мутанта S58V/L149R. На С-концевой домен не влияла мутация, но Тт N-концевого домена увеличивалась на > 20°С (обозначена стрелкой). Ось у демонстрирует Ср (ккал/моль/°С), а ось х демонстрирует температуру (°С).
Фиг. 6 демонстрирует ответ в SPR (поверхностном плазмоном резонансе) для v2 fHbp дикого типа (сплошная линия) и мутанта (пунктирная линия).
Фиг. 7 демонстрирует ответ в SPR для v3 fHbp, как дикого типа (сверху) или с различными мутациями.
Фиг. 8 демонстрирует результаты DSC для тройного слитого белка SEQ ID NO: 48. Оси являются такими как на Фиг.5.
КОНКРЕТНЫЕ ВОПЛОЩЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В изобретении предложены следующие конкретные пронумерованные воплощения:
1. Мутант v3 или v2 fHbp, который обладает повышенной стабильностью по сравнению с fHbp дикого типа и, предпочтительно, также обладает меньшей аффинностью в отношении человеческого фактора Н, чем fHbp дикого типа;
например:
(А) полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2, где: (а) аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5 и/или содержит фрагмент SEQ ID NO: 5, длина которого составляет по меньшей мере 7 аминокислот и который содержит по меньшей мере один из остатков, указанных в (б); но (б) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 5 по одному или более из следующих остатков: 32, 33, 39, 41, 69, 100, 113, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 151,239, и/или 240; при условии, что:
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 32, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 113, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б).
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 122, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену по остатку 123, то либо эта замена не представляет собой
•
замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 124, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 127, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б); и
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену только по остатку 240, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б).
или (Б) полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3, где: (а) аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 17 и/или содержит фрагмент SEQ ID NO: 17, длина которого составляет по меньшей мере 7 аминокислот и который содержит по меньшей мере один из остатков, перечисленных в (б); но (б) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 17 по одному или более чем одному из следующих остатков: 32, 33, 39, 41, 72, 103, 116, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 154, 242, и/или 243; при условии, что:
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по остатку 32, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по остатку 113, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б).
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену только по остатку 125, то либо эта замена не представляет
•
собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по остатку 126, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по остатку 127, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б);
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену по остатку 130, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б); и
• если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену только по остатку 243, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо заменен по меньшей мере один дополнительный остаток, перечисленный в (б).
2. Полипептид в соответствии с воплощением 1(Б), где аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 17 заменой по одному или более чем одному из остатков, перечисленных в (б); например, где замена(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из: S32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128G или S128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; и Е243Н.
3. Полипептид в соответствии с воплощением 1(Б) или воплощением 2, содержащий более чем одну замену по остаткам, перечисленным в (б), и выбранную из групп ЗА-ЗП, как указано выше.
4. Полипептид в соответствии с воплощением 1(A), где аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 5 заменой по одному или более чем одному из остатков, перечисленных в (б); например, когда замена(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из: S32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125G или S125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; и Е240Н.
2.
5. Полипептид в соответствии с воплощением 1 (А) или воплощением 4, содержащий более чем одну замену по остаткам, перечисленным в (б), и выбранную из групп 2А-2П, как указано выше.
6. Полипептид в соответствии с любым из воплощений 1-5, также включающий одну или более чем одну дополнительную(ые) мутацию(и), которая(ые) нарушает(ют) способность полипептида связываться с человеческим фактором Н; например, v2, включающий замену по одному или более чем одному из R73, D203, Е210, G228, S121, F122, L123, А192, Е194, V199, I200, L201, Т213, Н215, F219, Т231, и Е240, или v3, включающий замену по одному или более чем одному из Q35, 1178, L87, А88, L126, V127, V202, Е213, Т216, Т234, V241, и Е243.
7. Полипептид, содержащий:
• аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44 с 1, 2 или 3 единичными аминокислотными заменами), но без мутации по остатку V32 или R126;
• аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45 с 1, 2, или 3 единичными аминокислотными заменами), но без мутации по остатку V32 или R123;
• аминокислотная последовательность fHbp v3, которая идентична аминокислотной последовательности v3 дикого типа, за исключением мутации по аминокислотному положению, соответствующему Leu-126 в SEQ ID NO: 17, при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин);
• аминокислотная последовательность fHbp v2, которая идентична аминокислотной последовательности v2 дикого типа, за исключением мутации
•
по аминокислотному положению, соответствующему Leu-123 в SEQ ID NO: 5, при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин); или
• аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 47, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с каждым из: менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46; менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и менингококкового полипептида fHbp, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 (например, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48).
8. Плазмида или другая нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид в соответствии с любым из воплощений 1-7.
9. Клетка-хозяин, трансформированная плазмидой в соответствии с воплощением 8; например где клетка представляет собой бактерию менингококк, такую как бактерия менингококк, имеющую понижающую регуляцию или нокаут гена mltA и также возможно имеющую понижающую регуляцию или нокаут: (1) по меньшей мере одного гена, вовлеченного в придание токсичности фрагменту липида А в LPS, в частности гена 1рх11; и/или (2) по меньшей мере одного гена, вовлеченного в синтез или экспорт капсульного полисахарида или, в частности synX и/или ctrA.
10. Мембранные везикулы, полученные из клетки-хозяина в соответствии с воплощением 9, которые включают полипептид в соответствии с любым из воплощений 1-7.
11. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид в соответствии с любым из воплощений 1-7, или везикулу в соответствии с воплощением 10.
12. Композиция в соответствии с воплощением 11, дополнительно содержащая второй полипептид, который при введении млекопитающему вызывает ответ в виде антител, которые являются бактерицидными в отношении менингококка.
8.
13. Композиция в соответствии с воплощением 11 или 12, дополнительно содержащая (1) конъюгированный капсульный сахарид N.meningitidis серогруппы А, С, W135 и/или Y, и/или (2) конъюгированный капсульный сахарид S.pneumoniae.
14. Способ индуцирования антительного ответа у млекопитающего, включающий введение иммуногенной композиции в соответствии с любым из воплощений 11-13.
СПОСОБЫ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ Мутации fHbp
Считается, что v2 fHbp является нестабильным. Для анализа лежащих в основе этого нежелательного свойства структурных причин с намерением сконструировать последовательность для улучшения стабильности, авторы изобретения проанализировали выравнивание последовательности и 3D структуры полипептидов fHbp. Одна из областей конкретного интереса представляла собой структурную границу между N-концевым и С-концевым доменами [168].
Авторы изобретения идентифицировали мутации, разъясняемые в таблице 1. Три из положений, идентифицированных для мутации, перекрываются с источниками 24 и 25, но изобретение не охватывает полипептиды, о которых сообщалось в предшествующем уровне техники, т.е. когда полипептиды включают замены исключительно по этим положениям на аланин. Например, Е240 может быть заменен на гистидин для того, чтобы соответствовать v1, и предпочтительно находится в сочетании с заменой по остатку Н239 (мутанты #1 и #11). Аналогично, если F122 заменен, то он предпочтительно находится в сочетании с заменой по S151, оба с цистеином для того, чтобы дать возможность для образования дисульфидной мостиковой связи (мутант #10). Кроме того, если L123 заменен, то он может быть заменен на аргинин (нежели чем на аланин), или он может находиться в сочетании с заменой по другим остаткам, например по S32 (смотри мутант #3), по S125 (смотри мутанты #20 и #22), или с заменой по остаткам 124-128 (смотри мутант #12).
Исследования стабильности
Нестабильные белки имеют тенденцию к меньшему сворачиванию и по этой причине предрасположены к расщеплению и деградации протеазами. Фиг. 1 демонстрирует, что v2 fHbp более чувствителен к деградации химотрипсином, нежели чем v1 и v3, и, таким образом, этот тест может быть использован для оценки стабильности мутантных белков.
Для Фиг. 1, v1, v2 и v3 fHbp дикого типа готовили в концентрации 0,5 мг/мкл в 50 мМ Tris-HCI, 150 мМ NaCI, рН 8. Химотрипсин добавляли в отношении 1:100 (масс/масс). Образцы инкубировали при 24°С в объеме 50 мл без встряхивания. Образцы экстрагировали и кипятили в течение 0, 1, 3 или 6 часов; затем анализировали на 12% геле бис-Tris (буфер MES). Полоса слева, обозначенная *, указывает на образец, инкубируемый в течение 6 часов без протеазы.
Клеточные лизаты Е. coli, экспрессирующей рекомбинантные белки, инкубировали с химотрипсином в отношении 1:100 масс/масс, в течение 3 часов при 25°С. Картину деградации анализировали при помощи вестерн-блоттинга с последующей инкубацией с иммунной поликлональной сывороткой крови, образующейся у кролика против всех трех вариантов fHbp. Присутствие продуктов расщепления с меньшей кажущейся молекулярной массой (Фиг. 2-4) интерпретируется как показатель нестабильности, тогда как присутствие полосы, соответствующей кажущейся MW приблизительно 30 кДа интерпретируется как показатель увеличенной стабильности. Все мутанты #1 -6, #12 и #22 продемонстрировали увеличенную устойчивость к расщеплению химотрипсином по сравнению с диким типом v2.
DSC использовали в качестве независимого подхода для оценки действии мутаций в отношении стабильности очищенных рекомбинантных белков fHbp v2. Tm (температура плавления), измеренная при помощи DSC, соответствует температуре, при которой анализируемый белок на 50% находится в свернутом состоянии и на 50% в развернутом состоянии. Изменения, которые стабилизируют конформацию белка, увеличивают Тт, тогда как дестабилизирующие изменения уменьшают Тт. Как видно на Фиг. 3D в источнике 24, профиль DSC для v2 fHbp дикого типа демонстрирует два значения Tm: Tmi при приблизительно 40°С, которая соответствует
температуре плавления N-концевого домена, и Тт2 при приблизительно 80°С, соответствующая температуре плавления С-концевого домена. Значения Tmi и Тт2 для анализируемых мутантов представлены в таблице 1. Мутанты #2, #4, #5, #12, #19 и #21 демонстрировали уменьшенную Тт для N-концевого домена по сравнению с белком дикого типа, и это действие было более значительным для мутантов #2, #4 и #12.
Гель-фильтрационную хроматографию (SEC) использовали для оценки процента мономерного белка, и результаты также представлены в таблице 1.
Мутанты #2, #3 и #4
Мутант #3 (группа 2Б) продемонстрировал самые лучшие суммарные результаты в исследованиях стабильности v2. Этот белок (SEQ ID NO: 20) включает мутации по Ser-58 (S32 в SEQ ID NO: 5) и Leu-149 (L123 в SEQ ID NO: 5), с заменами на Val и Arg, соответственно. Мутантный белок v2 (SEQ ID NO: 20, содержащий SEQ ID NO: 45) анализировали при помощи DSC и, по сравнению с последовательностью дикого типа, Тт для его N-концевого домена была более чем на 20°С выше (Фиг. 5).
В бактерицидном анализе сыворотки крови этот мутант v2 может конкурировать за связывание с человеческими антителами, которые возникают при использовании последовательности v2 дикого типа.
Хотя мутации S58V и L149R введены для улучшения стабильности и действительно достигли этой цели, Фиг. 6 демонстрирует, что мутантный полипептид v2 (пунктирная линия) неожиданно демонстрировал намного уменьшенное связывание с fH по сравнению с последовательностью v2 дикого типа (сплошная линия) при измерении при помощи поверхностного плазмонного резонанса против иммобилизированного fH. Сама мутация S58V оказывает небольшое воздействие на связывание fH, и двойной мутант S58V/L149R демонстрировал более высокое связывание с fH чем с fHbp, несущем только мутант L149R.
Когда мутант #3 дополнительно комбинировали с мутацией 'Е313А в v2, тогда обнаружена полная потеря связывания fH, измеряемая при помощи SPR.
Эквивалентные мутации вводили в последовательность v3 (SEQ ID NO: 17) с получением мутанта v3 SEQ ID NO: 44. Действия индивидуальных мутаций S58V и L149R на связывание fH исследовали в v3 (т.е. эквиваленты v3
мутантов v2 #2 и #4). Таким образом, пронумерованную в соответствии с SEQ ID NO: 17 мутацию S32V или L126R вводили в последовательность v3. Эти два мутанта сравнивали с двумя отличающимися последовательностями v3 дикого типа, и также с мутантом 'Е313А', который, как известно, нарушает связывание с fH в v3 [23].
Как представлено на Фиг. 7, v3 дикого типа связывается с fH (две верхние полосы). Мутация S58V, которая была сконструирована для улучшения стабильности, уменьшала величину пика SPR приблизительно в 2 раза. Самое неожиданное то, что мутация L149R (опять же сконструированная для улучшения стабильности) уменьшала аффинность fH на уровень, близкий к уровню для известного мутанта Е313А (нижние две полосы).
Мутации S58V и L149R в v3 также исследовали при помощи DSC, и обнаружили, что они увеличивают Тт для N-конца на 5,5°С (S58V) или на 6,7°С (L149R) по сравнению с диким типом. Тт для обоих мутантов была выше, чем обнаруженная в двойном мутанте v2 (63,5°С - смотри таблицу 1). Мутант L149R v3 также демонстрировал более высокое значение Тт для своего С-концевого домена, тогда как почти отсутствовал сдвиг для мутанта S58V v3. SPR продемонстрировал, что связывание с fH мутанта #2 уменьшалось приблизительно вдвое, но для мутанта #4 аффинность к fH уменьшалась до уровня, близкого к известному мутанту Е313А (в соответствии с также обнаруженным для v2). Когда комбинировали две мутации (т.е. мутант #3), тогда Тт увеличение по сравнению с диким типом составило 11,2°С. Когда мутацию 'Е313А добавляли к мутанту #3, тогда связывание с fH полностью устранялось, хотя Тт для N-концевого домена также уменьшалась на 2,9°С при сравнении с мутантом #3 (оставаясь на 8,3°С выше чем для v3 дикого типа). Сама мутация 'Е313А' была гораздо менее стабильной, чем дикий тип, демонстрируя уменьшение Тт на 6,3°С.
Таким образом, мутации #2 и #4 могут быть использованы сами по себе или в комбинации (т.е. мутант #3), возможно с дополнительными мутациями для стабилизации v2 или v3 fHbp, а также для нарушения аффинности к fH.
Бактерицидный анализ с сывороткой использовали для оценки иммуногенной эффективности мутантов #3 и #4 в v2 и v3. Кроме того, мутант 'Е313А также тестировали в v2 и v3, сам по себе или в комбинации с
мутациями #3. Для сравнения, также тестировали v2 и v3 fHbp дикого типа. Белки вводили в количестве 20 мкг/дозу с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта, и образующуюся в результате сыворотку крови тестировали в отношении бактерицидной активности против панели семи штаммов (четыре штамма v2, три штамма v3), включающих штаммы, которые экспрессируют тот же самый fHbp, как исходные последовательности fHbp дикого типа (т.е. последовательность v2 2.16 и последовательность v3 3.42).
Результаты для белков v2 также были следующими (SEQ ID для формы AG; * = гомологичный fHbp):
Белок
SEQ ID
SBA против штаммов v2
SBA против штаммов v3
v2.16*
V2.19
V2.21
V2.24
v3.42*
V3.28
V3.30
Дикий тип
32768
1024
> 32768
<16
32768
<16
<16
128
1024
<16
4096
<16
<16
> 32768
128
<16
#3+Е313А
4096
<16
<16
> 32768
<16
<16
Е313А
128
<16
<16
4096
<16
<16
Результаты для белков v3 были следующими:
Белок
SEQ ID
SBA против штаммов v3
SBA против штаммов v2
v3.42*
V3.28
V3.30
v2.16*
V2.19
V2.21
V2.24
Дикий тип
> 32768
512
1024
1024
256
1024
<16
<16
<16
128
4096
4096
<16
#3+Е313А
256
<16
<16
<16
Е313А
4096
256
8192
128
Комбинация мутантов #2 и #12
Каждый из мутантов #2 и #12 демонстрировал улучшения в стабильности v2, таким образом, эти два мутанта комбинировали в одном fHbp (SEQ ID NO: 58, форма AG). По сравнению с мутантом #12 Тт для N-конца этого комбинированного мутанта увеличивалась на дополнительные 4,2°С, приводя к самой высокой Тт для любого из тестируемых мутантных белков v2. Кроме того, мутант продемонстрировал значительно уменьшенное связывание с fH (величина пика SPR уменьшалась приблизительно в 8 раз).
Мутантный слитый белок
Мутантные последовательности v2 и v3 были слиты через линкер GSGGGG (SEQ ID NO: 50), также с мутантной последовательностью v1 с получением SEQ ID NO: 48. Эта последовательность включает мутации S58V и L149R для обоих v2 и v3, и мутацию R41S [21] для v1. SEQ ID NO: 47 включает
от N-конца к С-концу: мутант v2 #3 (SEQ ID NO: 45); мутант v3 #3 (SEQ ID NO: 44); и мутант v1 'R41S' (SEQ ID NO: 49), связанные обогащенной глицином линкерной последовательностью SEQ ID NO: 50. Слитый белок для удобства может экспрессироваться путем добавления по N-концу последовательности Met-[SEQ ID NO: 37]-, таким образом, обеспечивая получение зрелого белка SEQ ID NO: 48.
Таким образом, этот слитый белок обладает преимуществом, заключающимся в том, что обнаружили, что мутант #3 придает обоим v2 и v3 значительное увеличение стабильности (Тт) и значительное уменьшение аффинности к fH. Для v1 мутация R41S оказывает незначительное влияние на температурную стабильность, но значительно уменьшает связывание с fH.
Исследования при помощи DSC тройного слитого белка (Фиг. 8) демонстрируют, что три N-концевых перехода оказываются вместе в пределах широкого пика, имеющего центр при 68°С. Три С-концевых перехода также оказывались вместе. UPLC (сверхэффективная жидкостная хроматография) продемонстрировала, что белок был на 94,9% чистым, и анализ при помощи HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) продемонстрировал меньше 1,5% олигомеров.
Мутантные белки, экспрессируемые в мембранных везикулах 'GMMA'
Менингококковый штамм v1 получали с нокаутами по генам mltA, IpxLI и synX с получением генетического фона для гиперэкспрессии липопротенов v2 и v3 fHbp под контролем промотора 'ST2' [157] в вакцине 'GMMA'. Гены v2 встраивали в геном по подвергнутому делеции локусу IpxLI, тогда как гены v3 встраивали по локусу synX. Кроме того, нативный ген v1 fHbp подвергали делеции таким образом, что v2 и v3 могли быть исследованы без взаимного влияния.
Мутанты #3 и #4 тестировали для v2, и мутант #4 тестировали для v3. Кроме того, получали штамм с обоими мутантами v2 и v3 #4. Для этих бактерий экспрессия fHbp и связывание fH оценивали при помощи FACS (клеточного сортера с активацией флуоресценцией).
Для штаммов, экспрессирующих только v2 fHbp, FACS продемонстрировал, что различные белки экспрессировались с похожими
уровнями, причем с уровнями на 2 логарифма выше, чем базовый штамм Afhbp. Тем не менее, с точки зрения связывания fH мутанты #3 и #4 демонстрироввали гораздо меньшее связывание, причем связывание в мутанте #4 было лишь слегка выше фонового. Эти результаты отражают данные SPR, полученные с рекомбинантными белками v2.
Для штамма, экспрессирующего мутант v3 #4, FACS продемонстрировал полную экспрессию fHbp, но его связывание с fH устранялось (соответствуя связыванию fH, обнаруженному для мутации 'H222R' [19,25]).
Для штамма, экспрессирующего мутант #4 из v2 и v3, оба белка fHbp могут быть обнаружены при помощи FACS, но связывание с fH было лишь слегка выше, чем обнаруженное для базового штамма Afhbp.
Анализ путем вестерн-блоттинга использовали для тестирования стабильности экспрессии fHbp у этих бактерий, выращиваемых в жидкой культуре в течение 6 суток. Экспрессия мутантных белков v2 оставалось стабильной с течением времени, даже когда коэкспрессировался v3. Экспрессия мутантных белков v3 также оставалось стабильной за исключением штамма, экспрессирующего оба мутанта v2 и v3, где экспрессия v3 уменьшалась с течением времени.
Понятно, что изобретение описано выше исключительно в качестве примера, и модификации могут быть осуществлены, оставаясь в объеме и сущности изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:
> SEQ ID NO: 1 [МС58, v1]
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQS LTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLIT LESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPE GGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGK RHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
> SEQ ID NO: 2 [2996, v2]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA
EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ > SEQ ID NO: 3 [M1239, v3]
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKD KGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIE VDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAF NQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAEL KADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 4 [зрелый 2996]
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQ GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWA LQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKL TYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYH LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 5 [2996 AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQIDNO: 6 [NHBA]
MFKRSVIAMACIFALSACGGGGGGSPDVKSADTLSKPAAPWSEKETEAKED APQAGSQGQGAPSAQGSQDMAAVSEENTGNGGAVTADNPKNEDEVAQNDMPQN AAGTDSSTPNHTPDPNMLAGNMENQATDAGESSQPANQPDMANAADGMQGDDP SAGGQNAGNTAAQGANQAGNNQAAGSSDPIPASNPAPANGGSNFGRVDLANGVLI DGPSQNITLTHCKGDSCSGNNFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDKFVG LVADSVQMKGINQYIIFYKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGE AVSLTGHSGNIFAPEGNYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPAKGEMLAGAAVYNG EVLHFHTENGRPYPTRGRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDDLHMGTQKFKAAIDGNGF KGTWTE N G SG DVS G KFYG PAG E EVAG KYS YR PTD AE KG G FGVF AG KKE Q D
> SEQIDNO: 7 [NadA]
MSMKHFPSKVLTTAILATFCSGALAATSDDDVKKAATVAIVAAYNNGQEINGF KAGETIYDIGEDGTITQKDATAADVEADDFKGLGLKKWTNLTKTVNENKQNVDAKV
KAAESEIEKLTTKLADTDAALADTDAALDETTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKL E AVADTVD KH AE AF N DI AD S L D ETN TKAD E AVKTAN E AKQTAE ETKQ N VD AKVKAA ETAAGKAEAAAGTANTAAD KAEAVAAKVTDIKADIATN KADIAKN SARI DS LD KNVAN LRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVGRFNVTAAVGGYKSESAVAIGTGFRFTENFAA KAGVAVGTSSGSSAAYHVGVNYEW > SEQ ID NO: 8 [NspA]
MKKALATLIALALPAAALAEGASGFYVQADAAHAKASSSLGSAKGFSPRISAG YRINDLRFAVDYTRYKNYKAPSTDFKLYSIGASAIYDFDTQSPVKPYLGARLSLNRAS VDLGGSDSFSQTSIGLGVLTGVSYAVTPNVDLDAGYRYNYIGKVNTVKNVRSGELS AGVRVKF
> SEQ ID NO: 9 [HmbR]
M KPLQM LP IAALVGSIFGN PVLAADEAATETTPVKAEIKAVRVKGQRNAPAAV ERVNLNRIKQEMIRDNKDLVRYSTDVGLSDSGRHQKGFAVRGVEGNRVGVSIDGV NLPDSEENSLYARYGNFNSSRLSIDPELVRNIEIVKGADSFNTGSGALGGGVNYQTL QGRDLLLDDRQFGVMMKNGYSTRNREWTNTLGFGVSNDRVDAALLYSQRRGHET ESAGNRGYAVEGEGSGANIRGSARGIPDSSKHKYNHHALGKIAYQINDNHRIGASL NGQQGHNYTVEESYNLTASSWREADDVNRRRNANLFYEWMPDSNWLSSLKADFD YQKTKVAAVNNKGSFPMDYSTWTRNYNQKDLDEIYNRSMDTRFKRFTLRLDSHPL QLGGGRHRLSFKTFVSRRDFENLNRDDYYFSGRWRTTSSIQHPVKTTNYGFSLSD QIQWNDVFSSRAGIRYDHTKMTPQELNAECHACDKTPPAANTYKGWSGFVGLAAQ LNQAWRVGYDITSGYRVPNASEVYFTYNHGSGNWLPNPNLKAERSTTHTLSLQGR SEKGMLDANLYQSNYRNFLSEEQKLTTSGTPGCTEENAYYGICSDPYKEKLDWQM KNIDKARIRGIELTGRLNVDKVASFVPEGWKLFGSLGYAKSKLSGDNSLLSTQPLKVI AG I DYES PS EKWGVFSRLTYLGAKKVKDAQYTVYE N KGWGTPLQKKVKDYPWLNK SAYVFDMYGFYKPAKNLTLRAGVYNLFNRKYTTWDSLRGLYSYSTTNAVDRDGKG LDRYRAPGRNYAVSLEWKF
> SEQ ID NO: 10 [NhhA]
M N Kl YRIIWN SALN AWVWS ELTRN HTKRASATVKTAVLATLLFATVQASAN N EEQEEDLYLDPVQRTVAVLIVNSDKEGTGEKEKVEENSDWAVYFNEKGVLTAREITL KAGDNLKIKQNGTNFTYSLKKDLTDLTSVGTEKLSFSANGNKVNITSDTKGLNFAKE TAGTNGDTTVHLNGIGSTLTDTLLNTGATTNVTNDNVTDDEKKRAASVKDVLNAGW NIKGVKPGTTASDNVDFVRTYDTVEFLSADTKTTTVNVESKDNGKKTEVKIGAKTSVI KEKDGKLVTGKDKGENGSSTDEGEGLVTAKEVIDAVNKAGWRMKTTTANGQTGQA
D KF ETVTS GTN VTF AS G KGTTATVS KD D QG NITVM YDVN VG DAL N VN Q LQ N S GWN LDSKAVAGSSGKVISGNVSPSKGKMDETVNINAGNNIEITRNGKNIDIATSMTPQFSS VSLGAGADAPTLSVDGDALNVGSKKDNKPVRITNVAPGVKEGDVTNVAQLKGVAQ NLNNRIDNVDGNARAGIAQAIATAGLVQAYLPGKSMMAIGGGTYRGEAGYAIGYSSI SDGGNWIIKGTASGNSRGHFGASASVGYQW > SEQ ID NO: 11 [App]
M KTTD KRTTETH RKAP KTGRIRFS PAYLAICLS FGILPQAWAG HTYFGINYQY YRD FAE N KG KFAVGAKDIEVYN KKG E LVG KSMTKAP MID FS WS RN GVAALVG DQY IVSVAHNGGYNNVDFGAEGRNPDQHRFTYKIVKRNNYKAGTKGHPYGGDYHMPRL HKFVTDAEPVEMTSYMDGRKYIDQNNYPDRVRIGAGRQYWRSDEDEPNNRESSY HIASAYSWLVGGNTFAQNGSGGGTVNLGSEKIKHSPYGFLPTGGSFGDSGSPMFIY DAQKQKWLINGVLQTGNPYIGKSNGFQLVRKDWFYDEIFAGDTHSVFYEPRQNGK YSFNDDNNGTGKINAKHEHNSLPNRLKTRTVQLFNVSLSETAREPVYHAAGGVNSY RPRLNNGENISFIDEGKGELILTSNINQGAGGLYFQGDFTVSPENNETWQGAGVHIS EDSTVTWKVNGVANDRLSKIGKGTLHVQAKGENQGSISVGDGTVILDQQADDKGK KQAFSEIGLVSGRGTVQLNADNQFNPDKLYFGFRGGRLDLNGHSLSFHRIQNTDEG AMIVNHNQDKESTVTITGNKDIATTGNNNSLDSKKEIAYNGWFGEKDTTKTNGRLNL VYQPAAEDRTLLLSGGTNLNGNITQTNGKLFFSGRPTPHAYNHLNDHWSQKEGIPR GEIVWDNDWINRTFKAENFQIKGGQAWSRNVAKVKGDWHLSNHAQAVFGVAPHQ SHTICTRSDWTGLTNCVEKTITDDKVIASLTKTDISGNVDLADHAHLNLTGLATLNGN LSANGDTRYTVSHNATQNGNLSLVGNAQATFNQATLNGNTSASGNASFNLSDHAV QNGSLTLSGNAKANVSHSALNGNVSLADKAVFHFESSRFTGQISGGKDTALHLKDS EWTLPSGTELGNLNLDNATITLNSAYRHDAAGAQTGSATDAPRRRSRRSRRSLLSV TPPTSVESRFNTLTVNGKLNGQGTFRFMSELFGYRSDKLKLAESSEGTYTLAVNNT GNEPASLEQLTWEGKDNKPLSENLNFTLQNEHVDAGAWRYQLIRKDGEFRLHNPV KEQELSDKLGKAEAKKQAEKDNAQSLDALIAAGRDAVEKTESVAEPARQAGGENV GIMQAEEEKKRVQADKDTALAKQREAETRPATTAFPRARRARRDLPQLQPQPQPQ PQRDLISRYANSGLSEFSATLNSVFAVQDELDRVFAEDRRNAVWTSGIRDTKHYRS QDFRAYRQQTDLRQIGMQKNLGSGRVGILFSHNRTENTFDDGIGNSARLAHGAVF GQYGIDRFYIGISAGAGFSSGSLSDGIGGKIRRRVLHYGIQARYRAGFGGFGIEPHIG ATRYFVQKADYRYENVNIATPGLAFNRYRAGIKADYSFKPAQHISITPYLSLSYTDAA SGKVRTRVNTAVLAQDFGKTRSAEWGVNAEIKGFTLSLHAAAAKGPQLEAQHSAGI KLGYRW
> SEQ ID NO: 12 [Omp85]
MKLKQIASALMMLGISPLALADFTIQDIRVEGLQRTEPSTVFNYLPVKVGDTY NDTHGSAIIKSLYATGFFDDVRVETADGQLLLTVIERPTIGSLNITGAKMLQNDAIKKN LESFGLAQSQYFNQATLNQAVAGLKEEYLGRGKLNIQITPKVTKLARNRVDIDITIDE GKSAKITDIEFEGNQWSDRKLMRQMSLTEGGIVVTWLTRSNQFNEQKFAQDMEKV TDFYQNNGYFDFRILDTDIQTNEDKTKQTIKITVHEGGRFRWGKVSIEGDTNEVPKA ELEKLLTMKPGKWYERQQMTAVLGEIQNRMGSAGYAYSEISVQPLPNAETKTVDFV LHIEPGRKIYVNEIHITGNNKTRDEWRRELRQMESAPYDTSKLQRSKERVELLGYF DNVQFDAVPLAGTPDKVDLNMSLTERSTGSLDLSAGWVQDTGLVMSAGVSQDNLF GTGKSAALRASRSKTTLNGSLSFTDPYFTADGVSLGYDVYGKAFDPRKASTSIKQY KTTTAGAGIRMSVPVTEYDRVNFGLVAEHLTVNTYNKAPKHYADFIKKYGKTDGTD GSFKGWLYKGTVGWGRNKTDSALWPTRGYLTGVNAEIALPGSKLQYYSATHNQT WFFPLSKTFTLMLGGEVGIAGGYGRTKEIPFFENFYGGGLGSVRGYESGTLGPKVY DEYGEKISYGGNKKANVSAELLFPMPGAKDARTVRLSLFADAGSVWDGKTYDDNS SSATGGRVQNIYGAGNTHKSTFTNELRYSAGGAVTWLSPLGPMKFSYAYPLKKKPE DEIQRFQFQLGTTF
> SEQ ID NO: 13 [NMB2091]
MVSAVIGSAAVGAKSAVDRRTTGAQTDDNVMALRIETTARSYLRQNNQTKG YTPQISWGYDRHLLLLGQVATEGEKQFVGQIARSEQAAEGVYNYITVASLPRTAGD lAGDTWNTSKVRATLLGISPATRARVKIVTYGNVTYVMGILTPEEQAQITQKVSTTVG VQKVITLYQNYVQR
> SEQ ID NO: 14 [слияние NHBA]
MASPDVKSADTLSKPAAPWSEKETEAKEDAPQAGSQGQGAPSAQGGQDM AAVSEENTGNGGAAATDKPKNEDEGAQNDMPQNAADTDSLTPNHTPASNMPAGN MENQAPDAGESEQPANQPDMANTADGMQGDDPSAGGENAGNTAAQGTNQAEN NQTAGSQNPASSTNPSATNSGGDFGRTNVGNSWIDGPSQNITLTHCKGDSCSGN NFLDEEVQLKSEFEKLSDADKISNYKKDGKNDGKNDKFVGLVADSVQMKGINQYIIF YKPKPTSFARFRRSARSRRSLPAEMPLIPVNQADTLIVDGEAVSLTGHSGNIFAPEG NYRYLTYGAEKLPGGSYALRVQGEPSKGEMLAGTAVYNGEVLHFHTENGRPSPSR GRFAAKVDFGSKSVDGIIDSGDGLHMGTQKFKAAIDGNGFKGTWTENGGGDVSGK FYGPAGEEVAGKYSYRPTDAEKGGFGVFAGKKEQDGSGGGGATYKVDEYHANAR FAIDHFNTSTNVGGFYGLTGSVEFDQAKRDGKIDITIPVANLQSGSQHFTDHLKSADI
FDAAQYPDIRFVSTKFNFNGKKLVSVDGNLTMHGKTAPVKLKAEKFNCYQSPMAKT EVCGGDFSTTID RTKWGVDYLVNVGMTKSVRIDIQIEAAKQ > SEQ ID NO: 15 [фрагмент NadA]
ATN DD DVKKAATVAIAAAYN N GQ EIN G F KAG ETI YD ID E DGTITKKDATAADV EAD DF KG LG LKKWTN LTKTVN E N KQ NVD AKVKAAE S EIE KLTTKLADTDAALADTD AALDATTNALNKLGENITTFAEETKTNIVKIDEKLEAVADTVDKHAEAFNDIADSLDET NTKAD EAVKTAN EAKQTAE ETKQ N VD AKVKAAETAAG KAE AAAGTANTAAD KAEAV AAKVTDIKADIATNKDNIAKKANSADVYTREESDSKFVRIDGLNATTEKLDTRLASAE KSIADHDTRLNGLDKTVSDLRKETRQGLAEQAALSGLFQPYNVG
> SEQ ID NO: 16 [MC58, AG]
VAADI GAG LAD ALTAP LDHKDKGLQSLTLDQSVRKNE KL KLAAQ GAE KTYG N GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQD SEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDF AAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGG KAQEVAGS AEVKTVN GIRHIG LAAKQ
> SEQ ID NO: 17 [M1239, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQ EI AGS ATVKIG E KVH EIGI AG KQ
> SEQ ID NO: 18 [МУТАНТ #1
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 19 [МУТАНТ #2]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 20 [МУТАНТ #3]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGK AEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHA VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 21 [МУТАНТ #4]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGK AEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHA VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 22 [МУТАНТ #5]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 23 [МУТАНТ #6]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 24 [МУТАНТ #7]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKSDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGK AEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHA VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 25 [МУТАНТ #8]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSCRKNEKCKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL
ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ > SEQ ID NO: 26 [МУТАНТ #9]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRCDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 27 [МУТАНТ #10]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSCDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHA VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 28 [МУТАНТ #11]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGDLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVRHIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 29 [МУТАНТ #12]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 30 [МУТАНТ #13]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAVTALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 31 [МУТАНТ #14]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKCAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 32 [МУТАНТ #15]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSCLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 33 [МУТАНТ #19]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVTGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 34 [МУТАНТ #20]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVTGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 35 [МУТАНТ #21]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVGGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 36 [МУТАНТ #22]
MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL
ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVGGLGGEHTAFNQLPDGK
AEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHA
VILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 37
GPDSDRLQQRR
> SEQ ID NO: 38
GSKDISS
> SEQ ID NO: 39
GSKDISSGGGG
> SEQ ID NO: 40 [зрелый M1239]
CSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLT LSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQ NHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSS DDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGS E E KGTYH LAL FG D RAQ EI AG SATVKIG E KVH EIGI AG KQ
> SEQ ID NO: 41 [v3(M1239), E243A, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 42 [v3(M1239), S32V+E243A, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 43 [v3(M1239), S32V+L126R+E243A, AG] VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 44 [v3, S32V + L126R, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQ EI AGS ATVKIG E KVH EIGI AG KQ
> SEQ ID NO: 45 [v2 МУТАНТ #3 S32V + L123R, AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 46 [зрелый MC58, v1]
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQ GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTA FQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAG GKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKG SYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
> SEQ ID NO: 47 [мутантный слитый v2-v3-v-1]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSL TLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTI TLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPG GKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEK SHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGG GVAADI GAG LAD ALTAP LDHKDKGLQSLTLDQ S VS KN E KL KLAAQ G AE KTYG N G D S LNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHS GKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQ GNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQE VAGS AEVKTVN GIRHIG LAAKQ
> SEQ ID NO: 48 [мутантный слитый, с ливерной последовательностью v2-v3-v-1]
MGPDSDRLQQRRVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKL KLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDH SAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDD AGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEE KGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQGSGGGGVAADIGTGLADALT APLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAGDKDNSLNTGKLKNDKISR FDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKINNPDKTDSLINQRSFRVSGL GGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNV ELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEI GIAGKQGSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVSKNEKLKLAAQ GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTA FQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAG GKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKG SYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
> SEQ ID NO: 49 [MC58, AG, мутация 'R41S']
VAADI GAG LAD ALTAP L D H KD KG LQ S LTL DQ S VS KN E KL KLAAQ GAE KTYG N GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQD SEHSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDF AAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGG KAQ EVAGS AEVKTVN GIRHIG LAAKQ
> SEQ ID NO: 50 [линкер]
GSGGGG
> SEQ ID NO: 51 [последовательность v2 дикого типа, например для подхода GMMA]
VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 52 [последовательность v3 дикого типа, например для подхода GMMA]
VAADI GAG LAD ALTAP LDHKDKGLQSLTLDQSVRKNE KL KLAAQ GAE KTYG N GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGKLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQVQD SEDSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPKGGSATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDF AAKQGHGKIEHLKSPELNVELATAELKADEKSHAVILGDTRYGGEEKGTYHLALFGD RAQ EI AGS ATVKI RE KVH EIGI AG KQ
> SEQ ID NO: 53 [m1239, мутация L126R]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDF TKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGD RAQ EI AGS ATVKI G E KVH EIGI AG KQ
> SEQ ID NO: 54 [v2, штамм 8047 дикого типа]
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSL TLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITL ESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKA EYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAV ILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 55 [v2, штамм 8047, AG]
VAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 56 [v2, мутант 'E313A', AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 57[v2, мутант #3 + 'E313A', AG]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAK QGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRA QEIAGSATVKIGEKVHAIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 58 [МУТАНТ #2 + #12]
VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKLKLAAQGAEKTYGN GDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWALQIEKINNP DKIDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQ GHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQE IAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 59 [v2, штамм 8047, мутант #4, зрелый] CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQ GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWA LQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKL TYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYH LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 60 [v2, штамм 8047, мутант #3, зрелый] CSSGGGGVAADIGARLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQWRKNEKLKLAAQ GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAWA LQIEKINNPDKIDSLINQRSFRVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKL TYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYH LALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ
> SEQ ID NO: 61 [v3, мутант #2 + #12, AG]
VAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDVIPQNGTLTLSAQGAEKTFKAG DKDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAWALQIEKIN NPDKTDSLINQRSFRIGDIAGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFT KKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDR AQ EI AGS ATVKI G E KVH EIGI AG KQ
ЛИТЕРАТУРНЫЕ ИСТОЧНИКИ: [1] WO99/57280.
[2] Masignani et al. (2003) J Exp Med 197:789-799.
[3] Welsch et al. (2004) J Immunol 172:5605-15.
[4] Hou et al. (2005) J Infect Dis 192(4):580-90.
[5] WO03/063766.
[6] Fletcher et al. (2004) Infect Immun 72:2088-2100.
[7] Zhu et al. (2005) Infect Immun 73(10):6838-45.
[8] Cendron et al. (2011) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun.
67:531-5.
[9] Mascioni et al. (2009) J Biol Chem 284:8738-46.
[10] Pizza et al. (2008) Vaccine 26 Suppl 8:146-8.
[11 ] Malito et al. (2013) PNAS USA 110:3304-9.
[12] Marshall et al. (2012) Pediatr Infect Dis J 31:1061 -8.
[13] McNeil et al. (2013) Microbiol Mol Biol Rev 77:234-52.
[14] Serruto ef a/. (2012) Масс/ле 30 Suppl 2: B87-97.
[15] Scarselli et al. (2011) Sci Transl Med 3:91 ra62.
[16] WO2011/051893.
[17] WO2010/046715.
[18] Schneider et al. (2009) Nature 458:890-5.
[19] WO2011/126863.
[20] Beernink et al. (2010) Clin Vaccine Immunol 17:1074-8.
[21 ] Beernink et al. (2011) J Immunol 186:3606-14.
[22] Rossi et al. (2013) Vaccine 31:5451 -7.
[23] van der Veen et al. (2014) wfecf Immun PMID 24379280.
[24] Johnson et al. (2012) PLoS Pathogen 8:e1002981.
[25] Pajon et al. (2012) Infect Immun 80:2667-77.
[26] Granoff et al. (2013) Clin Vaccine Immunol 20:1099-107.
[27] Beernink et al. (2008) Infect Immun 76:4232-40.
[28] Scarselli et al. (2009) J Mol Biol 386:97-108.
[29] Giuntini etal. (2012) PLoS One 7:e34272.
[30] Vu et al. (2012) Sci Rep 2:341.
[31] Faleri ef a/. (2013) FASEB Jfj. 13-239012.
[32] Johnson (2013) /4rcft Biochem Biophys 531:100-9.
[33] Bruylants et al. (2005) Current Medicinal Chemistry 12:2011 -20.
[34] Veggi ef al. (2012) Biochemistry 51:9384-93.
[35] WO2014/030003.
[36] Jongerius et al. (2013) PLoS Pathog 9(8): e1003528.
[37] Pizza et al. (2000) Science 287:1816-1820.
[38] WO2007/028408.
[39] http://pubmlst. org/ neisseria/
[40] Budroni et al. (2011) PNAS USA 108:4494-99.
[41] Goldschneider et al. (1969) J. Exp. Med. 129:1307-26.
[42] Santos et al. (2001) Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:616-23.
[43] Frasch et al. (2009) Vaccine 27S:B112-6.
[44] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th
edition, ISBN: 0683306472.
[45] WO03/009869.
[46] Vaccine Design... (1995) eds. Powell & Newman. ISBN: 030644867X.
Plenum.
[47] Tettelin et al. (2000) Science 287:1809-1815.
[48] WO00/66741.
[49] Martin et al. (1997) J Exp Med 185(7): 1173-83.
[50] W096/29412.
[51 ] Perkins-Balding et al. (2003) Microbiology 149:3423-35.
[52] WO01/55182.
[53] WO01/38350.
[54] WO00/23595.
[55] Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA. 103:10834-9.
[56] WO2004/032958.
[57] Costantino et al. (1992) Vaccine 10:691 -698.
[58] Costantino et al. (1999) Vaccine 17:1251 -1263.
[59] WO03/007985.
[60] Watson (2000) Pediatr Infect Dis J 19:331 -332.
[61 ] Rubin (2000) Pediatr Clin North Am 47:269-285, v.
[62] Jedrzejas (2001) Microbiol Mol Biol Rev 65:187-207.
[63] Bell (2000) Pediatr Infect Dis J 19:1187-1188.
[64] Iwarson (1995) APMIS 103:321 -326.
[65] Gerlich et al. (1990) Vaccine 8 Suppl:S63-68 & 79-80.
[66] Vaccines (1988) eds. Plotkin & Mortimer. ISBN 0-7216-1946-0.
[67] Del Guidice et al. (1998) Molecular Aspects of Medicine 19:1 -70.
[68] Gustafsson et al. (1996) N. Engl. J. Med. 334:349-355.
[69] Rappuoli ef al. (1991) TIBTECH 9:232-238.
[70] Sutter ef al. (2000) Pediatr Clin North Am 47:287-308.
[71] Zimmerman & Spann (1999) Am Fam Physician 59:113-118, 125-126.
[72] McMichael (2000) Vaccine 19 Suppl 1:S101-107.
[73] Schuchat (1999) Lancet 353(9146):51 -6.
[74] WO02/34771.
[75] Dale (1999) Infect Dis Clin North Am 13:227-43, viii.
[76] Ferretti et al. (2001) PNAS USA 98: 4658-4663.
[77] Kuroda ef al. (2001) Lancet 357(9264): 1225-1240; смотри также страницы
1218-1219.
[78] Jones (2001) Curr Opin Investig Drugs 2:47-49.
[79] Ravenscroft ef al. (1999) Vaccine 17:2802-2816.
[80] WO03/080678.
[81] Research Disclosure, 453077 (Jan 2002).
[82] EP-A-0372501.
[83] EP-A-0378881.
[84] EP-A-0427347.
[85] W093/17712.
[86] WO94/03208.
[87] W098/58668.
[88] EP-A-0471177.
[89] WO91/01146.
[90] Falugi et al. (2001) Eur J Immunol 31:3816-3824.
[91 ] Baraldo ef al. (2004) Infect Immun 72(8):4884-7.
[92] EP-A-0594610.
[93] Ruan ef al. (1990) J Immunol 145:3379-3384.
[94] WO00/56360.
[95] Kuo ef al. (1995) Infect Immun 63:2706-13.
[96] Michon etal. (1998) Vaccine. 16:1732-41.
[97] WO02/091998.
[98] WO01/72337.
[99] WO00/61761.
[100] WO00/33882
[101 ] Lees et al. (1996) Vaccine 14:190-198.
[102] WO95/08348.
[103] патент США 4882317
[104] патент США 4695624
[105] Рогго ef al. (1985) Mol Immunol 22:907-919.s
[106] EP-A-0208375
[107] WO00/10599
[108] Gever et al. Med. Microbiol. Immunol, 165 : 171-288 (1979).
[109] патент США 4057685.
[110] патенты США 4673574; 4761283; 4808700.
[111] патент США 4459286.
[112] патент США 4965338
[113] патент США 4663160.
[114] патент США 4761283
[115] патент США 4356170
[116] WO02/09643.
[117] Katial ef al. (2002) Infect Immun 70:702-707.
[118] WO01/52885.
[119] Европейский патент 0301992.
[120] Bjune et al. (1991) Lancet 338(8775): 1093-1096.
[121] Fukasawa etal. (1999) Vaccine 17:2951-2958.
[122] WO02/09746.
[123] Rosenqvist etal. (1998) Dev. Biol. Stand. 92:323-333.
[124] WO01/09350.
[125] Европейский патент 0449958.
[126] EP-A-0996712.
[127] EP-A-0680512.
[128] WO02/062378.
[129] W099/59625.
[130] патент США 6180111.
[131] WO01 /34642.
[132] WO03/051379.
[133] патент США 6558677.
[134] WO2004/019977.
[135] WO02/062380.
[136] WO00/25811.
[137] Peeters et al. (1996) Vaccine 14:1008-1015.
[138] Vermont et al. (2003) Infect Immun 71:1650-1655.
[139] WO2006/081259.
[140] Европейский патент 0011243.
[141 ] Fredriksen et al. (1991) NIPH Ann. 14(2):67-80.
[142] WO01/91788.
[143] WO2005/004908.
[144] WO98/56901.
[145] Claassen etal. (1996) 14(10): 1001-8.
[146] WO99/10497.
[147] Steeghs et al. (2001) The EMBO Journal 20:6937-6945.
[148] Fisseha et al. (2005) Infect Immun 73:4070-80.
[149] WO2004/015099.
[150] WO2004/014417.
[151] WO2004/046177.
[152] WO2006/046143.
[153] Adu-Bobie et al. (2004) Infect Immun 72:1914-19.
[154] WO2011/036562.
[155] Koeberling etal. (2014) Vaccine 32:2688-95.
[156] WO2013/033398.
[157] WO2013/113917.
[158] Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453.
[159] Rice et al. (2000) Trends Genet 16:276-277.
[160] WO01/64920.
[161] WO03/020756.
[162] WO2004/048404.
[163] WO2004/094596
[164] WO2006/024954.
[165] WO2007/060548.
[166] WO2009/104097.
[167] WO2013/132452.
[168] Krissinel & Henrick (2007) J. Mol. Biol. 372:774-97
F122
Частичный мутант #10. Обнаружена некоторая агрегация.
Нет
84,4
16,63
S32+S125
V, Т
N-концевой домен. Дополнительное увеличение гидрофобности по сравнению с #2
Нет
50,6
83,5
81,3
S32+S125+L1 23
V, Т, R
Комбинация #4 + #19
Нет
S32+S125
V, G
N-концевой домен. Дополнительное увеличение гидрофобности по сравнению с #2
Нет
52,8
75,3
S32+S125+L1 23
V, G, R
Комбинация #4 + #21
S32+L123-G128
RIGDIAS
Комбинация #2 + #12
66,3
84,7
39.
* Пронумерованы в соответствии с SEQ ID NO: 5; добавлены +26 для того, чтобы соответствовать SEQ ID NO:
** Устойчивость к расщеплению химотрипсином. *** % мономерная форма
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> NOVARTIS AG
<12 0> МОДИФИЦИРОВАННЫЕ МЕНИНГОКОККОВЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ fHbp
<130> PAT056080-WO-PCT
<140> PCT/EP2015/
<141> 2015-02-27
<150> EP-14157399.8
<151> 2014-02-28
<150> EP-14177566.8
<151> 2014-07-17
<160> 61
<170> SeqWin2010, версия 1.0
274
<210> <211> <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 1
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe
115 120 125
Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala
130 135 140
Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe
145 150 155 160
Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe
165 170 175
Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
180 185 190
Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu
195
200
205
Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His
210 215 220
Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser
245 250 255
Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala
260 265 270
Lys Gln
<210> 2 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 2
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 3
<211> 281
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 3
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val
20 25 30
Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu
35 40 45
Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile
50 55 60
Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr
65 70 75 80
Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys
85 90 95
Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp
100 105 110
Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln
115 120 125
Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro
130 135 140
Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly
145 150 155 160
Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala
165 170 175
Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu
180 185 190
His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu
195 200 205
His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu
210 215 220
Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr
225 230 235 240
Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg
245 250 255
Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val
260 265 270
His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 275 280
<210> 4
<211> 254
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 4
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 5
<211> 247 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis <400> 5
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 6 <211> 488 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 6
Met Phe Lys Arg Ser Val Ile Ala Met Ala Cys Ile Phe Ala Leu Ser
1 5 10 15
Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp
20 25 30
Thr Leu Ser Lys Pro Ala Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu
35 40 45
Ala Lys Glu Asp Ala Pro Gln Ala Gly Ser Gln Gly Gln Gly Ala Pro
50 55 60
Ser Ala Gln Gly Ser Gln Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr
65 70 75 80
Gly Asn Gly Gly Ala Val Thr Ala Asp Asn Pro Lys Asn Glu Asp Glu
85 90 95
Val Ala Gln Asn Asp Met Pro Gln Asn Ala Ala Gly Thr Asp Ser Ser
100 105 110
Thr Pro Asn His Thr Pro Asp Pro Asn Met Leu Ala Gly Asn Met Glu
115 120 125
Asn Gln Ala Thr Asp Ala Gly Glu Ser Ser Gln Pro Ala Asn Gln Pro
130 135 140
Asp Met Ala Asn Ala Ala Asp Gly Met Gln Gly Asp Asp Pro Ser Ala
145 150 155 160
Gly Gly Gln Asn Ala Gly Asn Thr Ala Ala Gln Gly Ala Asn Gln Ala
165 170 175
Gly Asn Asn Gln Ala Ala Gly Ser Ser Asp Pro Ile Pro Ala Ser Asn
180 185 190
Pro Ala Pro Ala Asn Gly Gly Ser Asn Phe Gly Arg Val Asp Leu Ala
195 200 205
Asn Gly Val Leu Ile Asp Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His
210 215 220
Cys Lys Gly Asp Ser Cys Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val
225 230 235 240
Gln Leu Lys Ser Glu Phe Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser
245 250 255
Asn Tyr Lys Lys Asp Gly Lys Asn Asp Lys Phe Val Gly Leu Val Ala
260 265 270
Asp Ser Val Gln Met Lys Gly Ile Asn Gln Tyr Ile Ile Phe Tyr Lys
275 280 285
Pro Lys Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg
290 295 300
Arg Ser Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Val Asn Gln Ala Asp
305 310 315 320
Thr Leu Ile Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly
325 330 335
Asn Ile Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala
340 345 350
Glu Lys Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gln Gly Glu Pro
355 360 365
Ala Lys Gly Glu Met Leu Ala Gly Ala Ala Val Tyr Asn Gly Glu Val
370 375 380
Leu His Phe His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Tyr Pro Thr Arg Gly Arg
385 390 395 400
Phe Ala Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly Ile Ile
405 410 415
Asp Ser Gly Asp Asp Leu His Met Gly Thr Gln Lys Phe Lys Ala Ala
420 425 430
Ile Asp Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Ser Gly
435 440 445
Asp Val Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly
450 455 460
Lys Tyr Ser Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val
465 470 475 480
Phe Ala Gly Lys Lys Glu Gln Asp 485
<210> 7 <211> 364
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 7
Met Ser Met Lys His Phe Pro Ser Lys Val Leu Thr Thr Ala Ile Leu
1 5 10 15
Ala Thr Phe Cys Ser Gly Ala Leu Ala Ala Thr Ser Asp Asp Asp Val
20 25 30
Lys Lys Ala Ala Thr Val Ala Ile Val Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gln
35 40 45
Glu Ile Asn Gly Phe Lys Ala Gly Glu Thr Ile Tyr Asp Ile Gly Glu
50 55 60
Asp Gly Thr Ile Thr Gln Lys Asp Ala Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala
65 70 75 80
Asp Asp Phe Lys Gly Leu Gly Leu Lys Lys Val Val Thr Asn Leu Thr
85 90 95
Lys Thr Val Asn Glu Asn Lys Gln Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala
100 105 110
Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp
115 120 125
Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Asp Glu Thr Thr Asn Ala
130 135 140
Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Ile Val Lys Ile Asp Glu Lys Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr
165 170 175
Val Asp Lys His Ala Glu Ala Phe Asn Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp
180
185
190
Glu Thr Asn Thr Lys Ala Asp Glu Ala Val Lys Thr Ala Asn Glu Ala
195 200 205
Lys Gln Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gln Asn Val Asp Ala Lys Val Lys
210 215 220
Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gly Lys Ala Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala
225 230 235 240
Asn Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala Val Ala Ala Lys Val Thr Asp
245 250 255
Ile Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys Ala Asp Ile Ala Lys Asn Ser
260 265 270
Ala Arg Ile Asp Ser Leu Asp Lys Asn Val Ala Asn Leu Arg Lys Glu
275 280 285
Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu Phe Gln
290 295 300
Pro Tyr Asn Val Gly Arg Phe Asn Val Thr Ala Ala Val Gly Gly Tyr
305 310 315 320
Lys Ser Glu Ser Ala Val Ala Ile Gly Thr Gly Phe Arg Phe Thr Glu
325 330 335
Asn Phe Ala Ala Lys Ala Gly Val Ala Val Gly Thr Ser Ser Gly Ser
340 345 350
Ser Ala Ala Tyr His Val Gly Val Asn Tyr Glu Trp 355 360
<210> 8 <211> 174
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 8
Met Lys Lys Ala Leu Ala Thr Leu Ile Ala Leu Ala Leu Pro Ala Ala
1 5 10 15
Ala Leu Ala Glu Gly Ala Ser Gly Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ala Ala
20 25 30
His Ala Lys Ala Ser Ser Ser Leu Gly Ser Ala Lys Gly Phe Ser Pro
35 40 45
Arg Ile Ser Ala Gly Tyr Arg Ile Asn Asp Leu Arg Phe Ala Val Asp
50 55 60
Tyr Thr Arg Tyr Lys Asn Tyr Lys Ala Pro Ser Thr Asp Phe Lys Leu
65 70 75 80
Tyr Ser Ile Gly Ala Ser Ala Ile Tyr Asp Phe Asp Thr Gln Ser Pro
85 90 95
Val Lys Pro Tyr Leu Gly Ala Arg Leu Ser Leu Asn Arg Ala Ser Val
100 105 110
Asp Leu Gly Gly Ser Asp Ser Phe Ser Gln Thr Ser Ile Gly Leu Gly
115 120 125
Val Leu Thr Gly Val Ser Tyr Ala Val Thr Pro Asn Val Asp Leu Asp
130 135 140
Ala Gly Tyr Arg Tyr Asn Tyr Ile Gly Lys Val Asn Thr Val Lys Asn
145 150 155 160
Val Arg Ser Gly Glu Leu Ser Ala Gly Val Arg Val Lys Phe
165 170
<210> 9 <211> 792 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 9
Met Lys Pro Leu Gln Met Leu Pro Ile Ala Ala Leu Val Gly Ser Ile
1 5 10 15
Phe Gly Asn Pro Val Leu Ala Ala Asp Glu Ala Ala Thr Glu Thr Thr
20 25 30
Pro Val Lys Ala Glu Ile Lys Ala Val Arg Val Lys Gly Gln Arg Asn
35 40 45
Ala Pro Ala Ala Val Glu Arg Val Asn Leu Asn Arg Ile Lys Gln Glu
50 55 60
Met Ile Arg Asp Asn Lys Asp Leu Val Arg Tyr Ser Thr Asp Val Gly
65 70 75 80
Leu Ser Asp Ser Gly Arg His Gln Lys Gly Phe Ala Val Arg Gly Val
85 90 95
Glu Gly Asn Arg Val Gly Val Ser Ile Asp Gly Val Asn Leu Pro Asp
100 105 110
Ser Glu Glu Asn Ser Leu Tyr Ala Arg Tyr Gly Asn Phe Asn Ser Ser
115 120 125
Arg Leu Ser Ile Asp Pro Glu Leu Val Arg Asn Ile Glu Ile Val Lys
130 135 140
Gly Ala Asp Ser Phe Asn Thr Gly Ser Gly Ala Leu Gly Gly Gly Val
145 150 155 160
Asn Tyr Gln Thr Leu Gln Gly Arg Asp Leu Leu Leu Asp Asp Arg Gln
165 170 175
Phe Gly Val Met Met Lys Asn Gly Tyr Ser Thr Arg Asn Arg Glu Trp
180 185 190
Thr Asn Thr Leu Gly Phe Gly Val Ser Asn Asp Arg Val Asp Ala Ala
195 200 205
Leu Leu Tyr Ser Gln Arg Arg Gly His Glu Thr Glu Ser Ala Gly Asn
210 215 220
Arg Gly Tyr Ala Val Glu Gly Glu Gly Ser Gly Ala Asn Ile Arg Gly
225 230 235 240
Ser Ala Arg Gly Ile Pro Asp Ser Ser Lys His Lys Tyr Asn His His
245 250 255
Ala Leu Gly Lys Ile Ala Tyr Gln Ile Asn Asp Asn His Arg Ile Gly
260 265 270
Ala Ser Leu Asn Gly Gln Gln Gly His Asn Tyr Thr Val Glu Glu Ser
275 280 285
Tyr Asn Leu Thr Ala Ser Ser Trp Arg Glu Ala Asp Asp Val Asn Arg
290 295 300
Arg Arg Asn Ala Asn Leu Phe Tyr Glu Trp Met Pro Asp Ser Asn Trp
305 310 315 320
Leu Ser Ser Leu Lys Ala Asp Phe Asp Tyr Gln Lys Thr Lys Val Ala
325 330 335
Ala Val Asn Asn Lys Gly Ser Phe Pro Met Asp Tyr Ser Thr Trp Thr
340 345 350
Arg Asn Tyr Asn Gln Lys Asp Leu Asp Glu Ile Tyr Asn Arg Ser Met
355 360 365
Asp Thr Arg Phe Lys Arg Phe Thr Leu Arg Leu Asp Ser His Pro Leu
370 375 380
Gln Leu Gly Gly Gly Arg His Arg Leu Ser Phe Lys Thr Phe Val Ser
385 390 395 400
Arg Arg Asp Phe Glu Asn Leu Asn Arg Asp Asp Tyr Tyr Phe Ser Gly
405 410 415
Arg Val Val Arg Thr Thr Ser Ser Ile Gln His Pro Val Lys Thr Thr
420 425 430
Asn Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Asp Gln Ile Gln Trp Asn Asp Val Phe
435 440 445
Ser Ser Arg Ala Gly Ile Arg Tyr Asp His Thr Lys Met Thr Pro Gln
450 455 460
Glu Leu Asn Ala Glu Cys His Ala Cys Asp Lys Thr Pro Pro Ala Ala
465 470 475 480
Asn Thr Tyr Lys Gly Trp Ser Gly Phe Val Gly Leu Ala Ala Gln Leu
485 490 495
Asn Gln Ala Trp Arg Val Gly Tyr Asp Ile Thr Ser Gly Tyr Arg Val
500 505 510
Pro Asn Ala Ser Glu Val Tyr Phe Thr Tyr Asn His Gly Ser Gly Asn
515 520 525
Trp Leu Pro Asn Pro Asn Leu Lys Ala Glu Arg Ser Thr Thr His Thr
530 535 540
Leu Ser Leu Gln Gly Arg Ser Glu Lys Gly Met Leu Asp Ala Asn Leu
545 550 555 560
Tyr Gln Ser Asn Tyr Arg Asn Phe Leu Ser Glu Glu Gln Lys Leu Thr
565 570 575
Thr Ser Gly Thr Pro Gly Cys Thr Glu Glu Asn Ala Tyr Tyr Gly Ile
580 585 590
Cys Ser Asp Pro Tyr Lys Glu Lys Leu Asp Trp Gln Met Lys Asn Ile
595 600 605
Asp Lys Ala Arg Ile Arg Gly Ile Glu Leu Thr Gly Arg Leu Asn Val
610 615 620
Asp Lys Val Ala Ser Phe Val Pro Glu Gly Trp Lys Leu Phe Gly Ser
625 630 635 640
Leu Gly Tyr Ala Lys Ser Lys Leu Ser Gly Asp Asn Ser Leu Leu Ser
645 650 655
Thr Gln Pro Leu Lys Val Ile Ala Gly Ile Asp Tyr Glu Ser Pro Ser
660 665 670
Glu Lys Trp Gly Val Phe Ser Arg Leu Thr Tyr Leu Gly Ala Lys Lys
675 680 685
Val Lys Asp Ala Gln Tyr Thr Val Tyr Glu Asn Lys Gly Trp Gly Thr
690 695 700
Pro Leu Gln Lys Lys Val Lys Asp Tyr Pro Trp Leu Asn Lys Ser Ala
705 710 715 720
Tyr Val Phe Asp Met Tyr Gly Phe Tyr Lys Pro Ala Lys Asn Leu Thr
725 730 735
Leu Arg Ala Gly Val Tyr Asn Leu Phe Asn Arg Lys Tyr Thr Thr Trp
740 745 750
Asp Ser Leu Arg Gly Leu Tyr Ser Tyr Ser Thr Thr Asn Ala Val Asp
755 760 765
Arg Asp Gly Lys Gly Leu Asp Arg Tyr Arg Ala Pro Gly Arg Asn Tyr
770 775 780
Ala Val Ser Leu Glu Trp Lys Phe 785 790
<210> 10 <211> 591
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 10
Met Asn Lys Ile Tyr Arg Ile Ile Trp Asn Ser Ala Leu Asn Ala Trp
1 5 10 15
Val Val Val Ser Glu Leu Thr Arg Asn His Thr Lys Arg Ala Ser Ala
20 25 30
Thr Val Lys Thr Ala Val Leu Ala Thr Leu Leu Phe Ala Thr Val Gln
35 40 45
Ala Ser Ala Asn Asn Glu Glu Gln Glu Glu Asp Leu Tyr Leu Asp Pro
50 55 60
Val Gln Arg Thr Val Ala Val Leu Ile Val Asn Ser Asp Lys Glu Gly
65 70 75 80
Thr Gly Glu Lys Glu Lys Val Glu Glu Asn Ser Asp Trp Ala Val Tyr
85 90 95
Phe Asn Glu Lys Gly Val Leu Thr Ala Arg Glu Ile Thr Leu Lys Ala
100 105 110
Gly Asp Asn Leu Lys Ile Lys Gln Asn Gly Thr Asn Phe Thr Tyr Ser
115 120 125
Leu Lys Lys Asp Leu Thr Asp Leu Thr Ser Val Gly Thr Glu Lys Leu
130 135 140
Ser Phe Ser Ala Asn Gly Asn Lys Val Asn Ile Thr Ser Asp Thr Lys
145 150 155 160
Gly Leu Asn Phe Ala Lys Glu Thr Ala Gly Thr Asn Gly Asp Thr Thr
165 170 175
Val His Leu Asn Gly Ile Gly Ser Thr Leu Thr Asp Thr Leu Leu Asn
180 185 190
Thr Gly Ala Thr Thr Asn Val Thr Asn Asp Asn Val Thr Asp Asp Glu
195 200 205
Lys Lys Arg Ala Ala Ser Val Lys Asp Val Leu Asn Ala Gly Trp Asn
210 215 220
Ile Lys Gly Val Lys Pro Gly Thr Thr Ala Ser Asp Asn Val Asp Phe
225 230 235 240
Val Arg Thr Tyr Asp Thr Val Glu Phe Leu Ser Ala Asp Thr Lys Thr
245 250 255
Thr Thr Val Asn Val Glu Ser Lys Asp Asn Gly Lys Lys Thr Glu Val
260 265 270
Lys Ile Gly Ala Lys Thr Ser Val Ile Lys Glu Lys Asp Gly Lys Leu
275 280 285
Val Thr Gly Lys Asp Lys Gly Glu Asn Gly Ser Ser Thr Asp Glu Gly
290 295 300
Glu Gly Leu Val Thr Ala Lys Glu Val Ile Asp Ala Val Asn Lys Ala
305 310 315 320
Gly Trp Arg Met Lys Thr Thr Thr Ala Asn Gly Gln Thr Gly Gln Ala
325 330 335
Asp Lys Phe Glu Thr Val Thr Ser Gly Thr Asn Val Thr Phe Ala Ser
340 345 350
Gly Lys Gly Thr Thr Ala Thr Val Ser Lys Asp Asp Gln Gly Asn Ile
355 360 365
Thr Val Met Tyr Asp Val Asn Val Gly Asp Ala Leu Asn Val Asn Gln
370 375 380
Leu Gln Asn Ser Gly Trp Asn Leu Asp Ser Lys Ala Val Ala Gly Ser
385 390 395 400
Ser Gly Lys Val Ile Ser Gly Asn Val Ser Pro Ser Lys Gly Lys Met
405 410 415
Asp Glu Thr Val Asn Ile Asn Ala Gly Asn Asn Ile Glu Ile Thr Arg
420 425 430
Asn Gly Lys Asn Ile Asp Ile Ala Thr Ser Met Thr Pro Gln Phe Ser
435 440 445
Ser Val Ser Leu Gly Ala Gly Ala Asp Ala Pro Thr Leu Ser Val Asp
450 455 460
Gly Asp Ala Leu Asn Val Gly Ser Lys Lys Asp Asn Lys Pro Val Arg
465 470 475 480
Ile Thr Asn Val Ala Pro Gly Val Lys Glu Gly Asp Val Thr Asn Val
485 490 495
Ala Gln Leu Lys Gly Val Ala Gln Asn Leu Asn Asn Arg Ile Asp Asn
500 505 510
Val Asp Gly Asn Ala Arg Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile Ala Thr Ala
515 520 525
Gly Leu Val Gln Ala Tyr Leu Pro Gly Lys Ser Met Met Ala Ile Gly
530 535 540
Gly Gly Thr Tyr Arg Gly Glu Ala Gly Tyr Ala Ile Gly Tyr Ser Ser
545 550 555 560
Ile Ser Asp Gly Gly Asn Trp Ile Ile Lys Gly Thr Ala Ser Gly Asn
565 570 575
Ser Arg Gly His Phe Gly Ala Ser Ala Ser Val Gly Tyr Gln Trp
580 585 590
<210> 11 <211> 1457
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 11
Met Lys Thr Thr Asp Lys Arg Thr Thr Glu Thr His Arg Lys Ala Pro
1 5 10 15
Lys Thr Gly Arg Ile Arg Phe Ser Pro Ala Tyr Leu Ala Ile Cys Leu
20 25 30
Ser Phe Gly Ile Leu Pro Gln Ala Trp Ala Gly His Thr Tyr Phe Gly
35 40 45
Ile Asn Tyr Gln Tyr Tyr Arg Asp Phe Ala Glu Asn Lys Gly Lys Phe
50 55 60
Ala Val Gly Ala Lys Asp Ile Glu Val Tyr Asn Lys Lys Gly Glu Leu
65 70 75 80
Val Gly Lys Ser Met Thr Lys Ala Pro Met Ile Asp Phe Ser Val Val
85 90 95
Ser Arg Asn Gly Val Ala Ala Leu Val Gly Asp Gln Tyr Ile Val Ser
100 105 110
Val Ala His Asn Gly Gly Tyr Asn Asn Val Asp Phe Gly Ala Glu Gly
115 120 125
Arg Asn Pro Asp Gln His Arg Phe Thr Tyr Lys Ile Val Lys Arg Asn
130 135 140
Asn Tyr Lys Ala Gly Thr Lys Gly His Pro Tyr Gly Gly Asp Tyr His
145 150 155 160
Met Pro Arg Leu His Lys Phe Val Thr Asp Ala Glu Pro Val Glu Met
165 170 175
Thr Ser Tyr Met Asp Gly Arg Lys Tyr Ile Asp Gln Asn Asn Tyr Pro
180 185 190
Asp Arg Val Arg Ile Gly Ala Gly Arg Gln Tyr Trp Arg Ser Asp Glu
195 200 205
Asp Glu Pro Asn Asn Arg Glu Ser Ser Tyr His Ile Ala Ser Ala Tyr
210 215 220
Ser Trp Leu Val Gly Gly Asn Thr Phe Ala Gln Asn Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Val Asn Leu Gly Ser Glu Lys Ile Lys His Ser Pro Tyr Gly
245 250 255
Phe Leu Pro Thr Gly Gly Ser Phe Gly Asp Ser Gly Ser Pro Met Phe
260 265 270
Ile Tyr Asp Ala Gln Lys Gln Lys Trp Leu Ile Asn Gly Val Leu Gln
275 280 285
Thr Gly Asn Pro Tyr Ile Gly Lys Ser Asn Gly Phe Gln Leu Val Arg
290 295 300
Lys Asp Trp Phe Tyr Asp Glu Ile Phe Ala Gly Asp Thr His Ser Val
305 310 315 320
Phe Tyr Glu Pro Arg Gln Asn Gly Lys Tyr Ser Phe Asn Asp Asp Asn
325 330 335
Asn Gly Thr Gly Lys Ile Asn Ala Lys His Glu His Asn Ser Leu Pro
340 345 350
Asn Arg Leu Lys Thr Arg Thr Val Gln Leu Phe Asn Val Ser Leu Ser
355 360 365
Glu Thr Ala Arg Glu Pro Val Tyr His Ala Ala Gly Gly Val Asn Ser
370 375 380
Tyr Arg Pro Arg Leu Asn Asn Gly Glu Asn Ile Ser Phe Ile Asp Glu
385 390 395 400
Gly Lys Gly Glu Leu Ile Leu Thr Ser Asn Ile Asn Gln Gly Ala Gly
405 410 415
Gly Leu Tyr Phe Gln Gly Asp Phe Thr Val Ser Pro Glu Asn Asn Glu
420 425 430
Thr Trp Gln Gly Ala Gly Val His Ile Ser Glu Asp Ser Thr Val Thr
435 440 445
Trp Lys Val Asn Gly Val Ala Asn Asp Arg Leu Ser Lys Ile Gly Lys
450 455 460
Gly Thr Leu His Val Gln Ala Lys Gly Glu Asn Gln Gly Ser Ile Ser
465 470 475 480
Val Gly Asp Gly Thr Val Ile Leu Asp Gln Gln Ala Asp Asp Lys Gly
485 490 495
Lys Lys Gln Ala Phe Ser Glu Ile Gly Leu Val Ser Gly Arg Gly Thr
500 505 510
Val Gln Leu Asn Ala Asp Asn Gln Phe Asn Pro Asp Lys Leu Tyr Phe
515 520 525
Gly Phe Arg Gly Gly Arg Leu Asp Leu Asn Gly His Ser Leu Ser Phe
530 535 540
His Arg Ile Gln Asn Thr Asp Glu Gly Ala Met Ile Val Asn His Asn
545 550 555 560
Gln Asp Lys Glu Ser Thr Val Thr Ile Thr Gly Asn Lys Asp Ile Ala
565 570 575
Thr Thr Gly Asn Asn Asn Ser Leu Asp Ser Lys Lys Glu Ile Ala Tyr
580 585 590
Asn Gly Trp Phe Gly Glu Lys Asp Thr Thr Lys Thr Asn Gly Arg Leu
595 600 605
Asn Leu Val Tyr Gln Pro Ala Ala Glu Asp Arg Thr Leu Leu Leu Ser
610 615 620
Gly Gly Thr Asn Leu Asn Gly Asn Ile Thr Gln Thr Asn Gly Lys Leu
625 630 635 640
Phe Phe Ser Gly Arg Pro Thr Pro His Ala Tyr Asn His Leu Asn Asp
645 650 655
His Trp Ser Gln Lys Glu Gly Ile Pro Arg Gly Glu Ile Val Trp Asp
660 665 670
Asn Asp Trp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Ala Glu Asn Phe Gln Ile Lys
675 680 685
Gly Gly Gln Ala Val Val Ser Arg Asn Val Ala Lys Val Lys Gly Asp
690 695 700
Trp His Leu Ser Asn His Ala Gln Ala Val Phe Gly Val Ala Pro His
705 710 715 720
Gln Ser His Thr Ile Cys Thr Arg Ser Asp Trp Thr Gly Leu Thr Asn
725 730 735
Cys Val Glu Lys Thr Ile Thr Asp Asp Lys Val Ile Ala Ser Leu Thr
740 745 750
Lys Thr Asp Ile Ser Gly Asn Val Asp Leu Ala Asp His Ala His Leu
755 760 765
Asn Leu Thr Gly Leu Ala Thr Leu Asn Gly Asn Leu Ser Ala Asn Gly
770 775 780
Asp Thr Arg Tyr Thr Val Ser His Asn Ala Thr Gln Asn Gly Asn Leu
785 790 795 800
Ser Leu Val Gly Asn Ala Gln Ala Thr Phe Asn Gln Ala Thr Leu Asn
805 810 815
Gly Asn Thr Ser Ala Ser Gly Asn Ala Ser Phe Asn Leu Ser Asp His
820 825 830
Ala Val Gln Asn Gly Ser Leu Thr Leu Ser Gly Asn Ala Lys Ala Asn
835 840 845
Val Ser His Ser Ala Leu Asn Gly Asn Val Ser Leu Ala Asp Lys Ala
850 855 860
Val Phe His Phe Glu Ser Ser Arg Phe Thr Gly Gln Ile Ser Gly Gly
865 870 875 880
Lys Asp Thr Ala Leu His Leu Lys Asp Ser Glu Trp Thr Leu Pro Ser
885 890 895
Gly Thr Glu Leu Gly Asn Leu Asn Leu Asp Asn Ala Thr Ile Thr Leu
900 905 910
Asn Ser Ala Tyr Arg His Asp Ala Ala Gly Ala Gln Thr Gly Ser Ala
915 920 925
Thr Asp Ala Pro Arg Arg Arg Ser Arg Arg Ser Arg Arg Ser Leu Leu
930 935 940
Ser Val Thr Pro Pro Thr Ser Val Glu Ser Arg Phe Asn Thr Leu Thr
945 950 955 960
Val Asn Gly Lys Leu Asn Gly Gln Gly Thr Phe Arg Phe Met Ser Glu
965 970 975
Leu Phe Gly Tyr Arg Ser Asp Lys Leu Lys Leu Ala Glu Ser Ser Glu
980 985 990
Gly Thr Tyr Thr Leu Ala Val Asn Asn Thr Gly Asn Glu Pro Ala Ser
995 1000 1005
Leu Glu Gln Leu Thr Val Val Glu Gly Lys Asp Asn Lys Pro Leu Ser
1010 1015 1020
Glu Asn Leu Asn Phe Thr Leu Gln Asn Glu His Val Asp Ala Gly Ala
1025 1030 1035 1040
Trp Arg Tyr Gln Leu Ile Arg Lys Asp Gly Glu Phe Arg Leu His Asn
1045 1050 1055
Pro Val Lys Glu Gln Glu Leu Ser Asp Lys Leu Gly Lys Ala Glu Ala
1060 1065 1070
Lys Lys Gln Ala Glu Lys Asp Asn Ala Gln Ser Leu Asp Ala Leu Ile
1075 1080 1085
Ala Ala Gly Arg Asp Ala Val Glu Lys Thr Glu Ser Val Ala Glu Pro
1090 1095 1100
Ala Arg Gln Ala Gly Gly Glu Asn Val Gly Ile Met Gln Ala Glu Glu
1105 1110 1115 1120
Glu Lys Lys Arg Val Gln Ala Asp Lys Asp Thr Ala Leu Ala Lys Gln
1125 1130 1135
Arg Glu Ala Glu Thr Arg Pro Ala Thr Thr Ala Phe Pro Arg Ala Arg
1140 1145 1150
Arg Ala Arg Arg Asp Leu Pro Gln Leu Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln
1155 1160 1165
Pro Gln Arg Asp Leu Ile Ser Arg Tyr Ala Asn Ser Gly Leu Ser Glu
1170 1175 1180
Phe Ser Ala Thr Leu Asn Ser Val Phe Ala Val Gln Asp Glu Leu Asp
1185
1190
1195
1200
Arg Val Phe Ala Glu Asp Arg Arg Asn Ala Val Trp Thr Ser Gly Ile
1205 1210 1215
Arg Asp Thr Lys His Tyr Arg Ser Gln Asp Phe Arg Ala Tyr Arg Gln
1220 1225 1230
Gln Thr Asp Leu Arg Gln Ile Gly Met Gln Lys Asn Leu Gly Ser Gly
1235 1240 1245
Arg Val Gly Ile Leu Phe Ser His Asn Arg Thr Glu Asn Thr Phe Asp
1250 1255 1260
Asp Gly Ile Gly Asn Ser Ala Arg Leu Ala His Gly Ala Val Phe Gly
1265 1270 1275 1280
Gln Tyr Gly Ile Asp Arg Phe Tyr Ile Gly Ile Ser Ala Gly Ala Gly
1285 1290 1295
Phe Ser Ser Gly Ser Leu Ser Asp Gly Ile Gly Gly Lys Ile Arg Arg
1300 1305 1310
Arg Val Leu His Tyr Gly Ile Gln Ala Arg Tyr Arg Ala Gly Phe Gly
1315 1320 1325
Gly Phe Gly Ile Glu Pro His Ile Gly Ala Thr Arg Tyr Phe Val Gln
1330 1335 1340
Lys Ala Asp Tyr Arg Tyr Glu Asn Val Asn Ile Ala Thr Pro Gly Leu
1345 1350 1355 1360
Ala Phe Asn Arg Tyr Arg Ala Gly Ile Lys Ala Asp Tyr Ser Phe Lys
1365 1370 1375
Pro Ala Gln His Ile Ser Ile Thr Pro Tyr Leu Ser Leu Ser Tyr Thr
1380 1385 1390
Asp Ala Ala Ser Gly Lys Val Arg Thr Arg Val Asn Thr Ala Val Leu
1395 1400 1405
Ala Gln Asp Phe Gly Lys Thr Arg Ser Ala Glu Trp Gly Val Asn Ala
1410 1415 1420
Glu Ile Lys Gly Phe Thr Leu Ser Leu His Ala Ala Ala Ala Lys Gly
1425 1430 1435 1440
Pro Gln Leu Glu Ala Gln His Ser Ala Gly Ile Lys Leu Gly Tyr Arg
1445 1450 1455
Trp
<210> 12
<211> 797
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 12
Met Lys Leu Lys Gln Ile Ala Ser Ala Leu Met Met Leu Gly Ile Ser
1 5 10 15
Pro Leu Ala Leu Ala Asp Phe Thr Ile Gln Asp Ile Arg Val Glu Gly
20 25 30
Leu Gln Arg Thr Glu Pro Ser Thr Val Phe Asn Tyr Leu Pro Val Lys
35 40 45
Val Gly Asp Thr Tyr Asn Asp Thr His Gly Ser Ala Ile Ile Lys Ser
50 55 60
Leu Tyr Ala Thr Gly Phe Phe Asp Asp Val Arg Val Glu Thr Ala Asp
65 70 75 80
Gly Gln Leu Leu Leu Thr Val Ile Glu Arg Pro Thr Ile Gly Ser Leu
85 90 95
Asn Ile Thr Gly Ala Lys Met Leu Gln Asn Asp Ala Ile Lys Lys Asn
100 105 110
Leu Glu Ser Phe Gly Leu Ala Gln Ser Gln Tyr Phe Asn Gln Ala Thr
115 120 125
Leu Asn Gln Ala Val Ala Gly Leu Lys Glu Glu Tyr Leu Gly Arg Gly
130 135 140
Lys Leu Asn Ile Gln Ile Thr Pro Lys Val Thr Lys Leu Ala Arg Asn
145 150 155 160
Arg Val Asp Ile Asp Ile Thr Ile Asp Glu Gly Lys Ser Ala Lys Ile
165 170 175
Thr Asp Ile Glu Phe Glu Gly Asn Gln Val Tyr Ser Asp Arg Lys Leu
180 185 190
Met Arg Gln Met Ser Leu Thr Glu Gly Gly Ile Trp Thr Trp Leu Thr
195 200 205
Arg Ser Asn Gln Phe Asn Glu Gln Lys Phe Ala Gln Asp Met Glu Lys
210 215 220
Val Thr Asp Phe Tyr Gln Asn Asn Gly Tyr Phe Asp Phe Arg Ile Leu
225 230 235 240
Asp Thr Asp Ile Gln Thr Asn Glu Asp Lys Thr Lys Gln Thr Ile Lys
245 250 255
Ile Thr Val His Glu Gly Gly Arg Phe Arg Trp Gly Lys Val Ser Ile
260 265 270
Glu Gly Asp Thr Asn Glu Val Pro Lys Ala Glu Leu Glu Lys Leu Leu
275 280 285
Thr Met Lys Pro Gly Lys Trp Tyr Glu Arg Gln Gln Met Thr Ala Val
290 295 300
Leu Gly Glu Ile Gln Asn Arg Met Gly Ser Ala Gly Tyr Ala Tyr Ser
305 310 315 320
Glu Ile Ser Val Gln Pro Leu Pro Asn Ala Glu Thr Lys Thr Val Asp
325 330 335
Phe Val Leu His Ile Glu Pro Gly Arg Lys Ile Tyr Val Asn Glu Ile
340 345 350
His Ile Thr Gly Asn Asn Lys Thr Arg Asp Glu Val Val Arg Arg Glu
355 360 365
Leu Arg Gln Met Glu Ser Ala Pro Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Gln Arg
370 375 380
Ser Lys Glu Arg Val Glu Leu Leu Gly Tyr Phe Asp Asn Val Gln Phe
385 390 395 400
Asp Ala Val Pro Leu Ala Gly Thr Pro Asp Lys Val Asp Leu Asn Met
405 410 415
Ser Leu Thr Glu Arg Ser Thr Gly Ser Leu Asp Leu Ser Ala Gly Trp
420 425 430
Val Gln Asp Thr Gly Leu Val Met Ser Ala Gly Val Ser Gln Asp Asn
435 440 445
Leu Phe Gly Thr Gly Lys Ser Ala Ala Leu Arg Ala Ser Arg Ser Lys
450 455 460
Thr Thr Leu Asn Gly Ser Leu Ser Phe Thr Asp Pro Tyr Phe Thr Ala
465 470 475 480
Asp Gly Val Ser Leu Gly Tyr Asp Val Tyr Gly Lys Ala Phe Asp Pro
485 490 495
Arg Lys Ala Ser Thr Ser Ile Lys Gln Tyr Lys Thr Thr Thr Ala Gly
500 505 510
Ala Gly Ile Arg Met Ser Val Pro Val Thr Glu Tyr Asp Arg Val Asn
515 520 525
Phe Gly Leu Val Ala Glu His Leu Thr Val Asn Thr Tyr Asn Lys Ala
530 535 540
Pro Lys His Tyr Ala Asp Phe Ile Lys Lys Tyr Gly Lys Thr Asp Gly
545 550 555 560
Thr Asp Gly Ser Phe Lys Gly Trp Leu Tyr Lys Gly Thr Val Gly Trp
565 570 575
Gly Arg Asn Lys Thr Asp Ser Ala Leu Trp Pro Thr Arg Gly Tyr Leu
580 585 590
Thr Gly Val Asn Ala Glu Ile Ala Leu Pro Gly Ser Lys Leu Gln Tyr
595 600 605
Tyr Ser Ala Thr His Asn Gln Thr Trp Phe Phe Pro Leu Ser Lys Thr
610 615 620
Phe Thr Leu Met Leu Gly Gly Glu Val Gly Ile Ala Gly Gly Tyr Gly
625 630 635 640
Arg Thr Lys Glu Ile Pro Phe Phe Glu Asn Phe Tyr Gly Gly Gly Leu
645 650 655
Gly Ser Val Arg Gly Tyr Glu Ser Gly Thr Leu Gly Pro Lys Val Tyr
660 665 670
Asp Glu Tyr Gly Glu Lys Ile Ser Tyr Gly Gly Asn Lys Lys Ala Asn
675 680 685
Val Ser Ala Glu Leu Leu Phe Pro Met Pro Gly Ala Lys Asp Ala Arg
690 695 700
Thr Val Arg Leu Ser Leu Phe Ala Asp Ala Gly Ser Val Trp Asp Gly
705
710
715
720
Lys Thr Tyr Asp Asp Asn Ser Ser Ser Ala Thr Gly Gly Arg Val Gln
725 730 735
Asn Ile Tyr Gly Ala Gly Asn Thr His Lys Ser Thr Phe Thr Asn Glu
740 745 750
Leu Arg Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Val Thr Trp Leu Ser Pro Leu Gly
755 760 765
Pro Met Lys Phe Ser Tyr Ala Tyr Pro Leu Lys Lys Lys Pro Glu Asp
770 775 780
Glu Ile Gln Arg Phe Gln Phe Gln Leu Gly Thr Thr Phe
785 790 795
<210> 13 <211> 180
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 13
Met Val Ser Ala Val Ile Gly Ser Ala Ala Val Gly Ala Lys Ser Ala
1 5 10 15
Val Asp Arg Arg Thr Thr Gly Ala Gln Thr Asp Asp Asn Val Met Ala
20 25 30
Leu Arg Ile Glu Thr Thr Ala Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Asn Asn Gln
35 40 45
Thr Lys Gly Tyr Thr Pro Gln Ile Ser Val Val Gly Tyr Asp Arg His
50 55 60
Leu Leu Leu Leu Gly Gln Val Ala Thr Glu Gly Glu Lys Gln Phe Val
65 70 75 80
Gly Gln Ile Ala Arg Ser Glu Gln Ala Ala Glu Gly Val Tyr Asn Tyr
85 90 95
Ile Thr Val Ala Ser Leu Pro Arg Thr Ala Gly Asp Ile Ala Gly Asp
100 105 110
Thr Trp Asn Thr Ser Lys Val Arg Ala Thr Leu Leu Gly Ile Ser Pro
115 120 125
Ala Thr Arg Ala Arg Val Lys Ile Val Thr Tyr Gly Asn Val Thr Tyr
130 135 140
Val Met Gly Ile Leu Thr Pro Glu Glu Gln Ala Gln Ile Thr Gln Lys
145 150 155 160
Val Ser Thr Thr Val Gly Val Gln Lys Val Ile Thr Leu Tyr Gln Asn
165 170 175
Tyr Val Gln Arg 180
<210> 14 <211> 644 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 14
Met Ala Ser Pro Asp Val Lys Ser Ala Asp Thr Leu Ser Lys Pro Ala
1 5 10 15
Ala Pro Val Val Ser Glu Lys Glu Thr Glu Ala Lys Glu Asp Ala Pro
20 25 30
Gln Ala Gly Ser Gln Gly Gln Gly Ala Pro Ser Ala Gln Gly Gly Gln
35 40 45
Asp Met Ala Ala Val Ser Glu Glu Asn Thr Gly Asn Gly Gly Ala Ala
50 55 60
Ala Thr Asp Lys Pro Lys Asn Glu Asp Glu Gly Ala Gln Asn Asp Met
65 70 75 80
Pro Gln Asn Ala Ala Asp Thr Asp Ser Leu Thr Pro Asn His Thr Pro
85 90 95
Ala Ser Asn Met Pro Ala Gly Asn Met Glu Asn Gln Ala Pro Asp Ala
100 105 110
Gly Glu Ser Glu Gln Pro Ala Asn Gln Pro Asp Met Ala Asn Thr Ala
115 120 125
Asp Gly Met Gln Gly Asp Asp Pro Ser Ala Gly Gly Glu Asn Ala Gly
130 135 140
Asn Thr Ala Ala Gln Gly Thr Asn Gln Ala Glu Asn Asn Gln Thr Ala
145 150 155 160
Gly Ser Gln Asn Pro Ala Ser Ser Thr Asn Pro Ser Ala Thr Asn Ser
165 170 175
Gly Gly Asp Phe Gly Arg Thr Asn Val Gly Asn Ser Val Val Ile Asp
180 185 190
Gly Pro Ser Gln Asn Ile Thr Leu Thr His Cys Lys Gly Asp Ser Cys
195 200 205
Ser Gly Asn Asn Phe Leu Asp Glu Glu Val Gln Leu Lys Ser Glu Phe
210 215 220
Glu Lys Leu Ser Asp Ala Asp Lys Ile Ser Asn Tyr Lys Lys Asp Gly
225 230 235 240
Lys Asn Asp Gly Lys Asn Asp Lys Phe Val Gly Leu Val Ala Asp Ser
245 250 255
Val Gln Met Lys Gly Ile Asn Gln Tyr Ile Ile Phe Tyr Lys Pro Lys
260 265 270
Pro Thr Ser Phe Ala Arg Phe Arg Arg Ser Ala Arg Ser Arg Arg Ser
275 280 285
Leu Pro Ala Glu Met Pro Leu Ile Pro Val Asn Gln Ala Asp Thr Leu
290 295 300
Ile Val Asp Gly Glu Ala Val Ser Leu Thr Gly His Ser Gly Asn Ile
305 310 315 320
Phe Ala Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Tyr Leu Thr Tyr Gly Ala Glu Lys
325 330 335
Leu Pro Gly Gly Ser Tyr Ala Leu Arg Val Gln Gly Glu Pro Ser Lys
340 345 350
Gly Glu Met Leu Ala Gly Thr Ala Val Tyr Asn Gly Glu Val Leu His
355 360 365
Phe His Thr Glu Asn Gly Arg Pro Ser Pro Ser Arg Gly Arg Phe Ala
370 375 380
Ala Lys Val Asp Phe Gly Ser Lys Ser Val Asp Gly Ile Ile Asp Ser
385 390 395 400
Gly Asp Gly Leu His Met Gly Thr Gln Lys Phe Lys Ala Ala Ile Asp
405 410 415
Gly Asn Gly Phe Lys Gly Thr Trp Thr Glu Asn Gly Gly Gly Asp Val
420 425 430
Ser Gly Lys Phe Tyr Gly Pro Ala Gly Glu Glu Val Ala Gly Lys Tyr
435 440 445
Ser Tyr Arg Pro Thr Asp Ala Glu Lys Gly Gly Phe Gly Val Phe Ala
450 455 460
Gly Lys Lys Glu Gln Asp Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Tyr Lys
465 470 475 480
Val Asp Glu Tyr His Ala Asn Ala Arg Phe Ala Ile Asp His Phe Asn
485 490 495
Thr Ser Thr Asn Val Gly Gly Phe Tyr Gly Leu Thr Gly Ser Val Glu
500 505 510
Phe Asp Gln Ala Lys Arg Asp Gly Lys Ile Asp Ile Thr Ile Pro Val
515 520 525
Ala Asn Leu Gln Ser Gly Ser Gln His Phe Thr Asp His Leu Lys Ser
530 535 540
Ala Asp Ile Phe Asp Ala Ala Gln Tyr Pro Asp Ile Arg Phe Val Ser
545 550 555 560
Thr Lys Phe Asn Phe Asn Gly Lys Lys Leu Val Ser Val Asp Gly Asn
565 570 575
Leu Thr Met His Gly Lys Thr Ala Pro Val Lys Leu Lys Ala Glu Lys
580 585 590
Phe Asn Cys Tyr Gln Ser Pro Met Ala Lys Thr Glu Val Cys Gly Gly
595 600 605
Asp Phe Ser Thr Thr Ile Asp Arg Thr Lys Trp Gly Val Asp Tyr Leu
610 615 620
Val Asn Val Gly Met Thr Lys Ser Val Arg Ile Asp Ile Gln Ile Glu
625 630 635 640
Ala Ala Lys Gln
<210> 15
<211> 327
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 15
Ala Thr Asn Asp Asp Asp Val Lys Lys Ala Ala Thr Val Ala Ile Ala
1 5 10 15
Ala Ala Tyr Asn Asn Gly Gln Glu Ile Asn Gly Phe Lys Ala Gly Glu
20 25 30
Thr Ile Tyr Asp Ile Asp Glu Asp Gly Thr Ile Thr Lys Lys Asp Ala
35 40 45
Thr Ala Ala Asp Val Glu Ala Asp Asp Phe Lys Gly Leu Gly Leu Lys
50 55 60
Lys Val Val Thr Asn Leu Thr Lys Thr Val Asn Glu Asn Lys Gln Asn
65 70 75 80
Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala Glu Ser Glu Ile Glu Lys Leu Thr
85 90 95
Thr Lys Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala Leu Ala Asp Thr Asp Ala Ala
100 105 110
Leu Asp Ala Thr Thr Asn Ala Leu Asn Lys Leu Gly Glu Asn Ile Thr
115 120 125
Thr Phe Ala Glu Glu Thr Lys Thr Asn Ile Val Lys Ile Asp Glu Lys
130 135 140
Leu Glu Ala Val Ala Asp Thr Val Asp Lys His Ala Glu Ala Phe Asn
145 150 155 160
Asp Ile Ala Asp Ser Leu Asp Glu Thr Asn Thr Lys Ala Asp Glu Ala
165 170 175
Val Lys Thr Ala Asn Glu Ala Lys Gln Thr Ala Glu Glu Thr Lys Gln
180 185 190
Asn Val Asp Ala Lys Val Lys Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gly Lys Ala
195 200 205
Glu Ala Ala Ala Gly Thr Ala Asn Thr Ala Ala Asp Lys Ala Glu Ala
210 215 220
Val Ala Ala Lys Val Thr Asp Ile Lys Ala Asp Ile Ala Thr Asn Lys
225 230 235 240
Asp Asn Ile Ala Lys Lys Ala Asn Ser Ala Asp Val Tyr Thr Arg Glu
245 250 255
Glu Ser Asp Ser Lys Phe Val Arg Ile Asp Gly Leu Asn Ala Thr Thr
260 265 270
Glu Lys Leu Asp Thr Arg Leu Ala Ser Ala Glu Lys Ser Ile Ala Asp
275 280 285
His Asp Thr Arg Leu Asn Gly Leu Asp Lys Thr Val Ser Asp Leu Arg
290 295 300
Lys Glu Thr Arg Gln Gly Leu Ala Glu Gln Ala Ala Leu Ser Gly Leu
305 310 315 320
Phe Gln Pro Tyr Asn Val Gly 325
<210> 16
<211> 248
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 16
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys
180 185 190
Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala
210 215 220
Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245
<210> 17 <211> 250 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 17
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 18 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 18
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val Arg His Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 19 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 19
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val Arg His Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 20 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 20
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 21
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 21
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 22 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 22
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Gly Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 23
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 23
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Thr Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Gly Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 24
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 24
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ser Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195
200
205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 25 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 25
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Cys Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Cys Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 26
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 26
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Cys Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Cys Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 27
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 27
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Cys Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Cys Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260
265
270
Gln
<210> 28 <211> 273 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis <400> 28
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Thr Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Gly Asp Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val Arg His Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 29
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 29
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 30 <211> 273 <212> ПРТ
<213>
Neisseria meningitidis
<400> 30
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Thr Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 31
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 31
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Cys Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 32
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 32
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Cys Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 33 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 33
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Thr Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 34
<211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 34
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Arg Val Thr Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 35 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 35
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Gly Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 36 <211> 273
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 36
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Ala Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Arg Val Gly Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 37
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-концевая последовательность
<400> 37
Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-концевая последовательность
<400> 38
Gly Ser Lys Asp Ile Ser Ser
1 5
<210> 39
<211> 11
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-концевая последовательность
<400> 39
Gly Ser Lys Asp Ile Ser Ser Gly Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 40
<211> 262
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 40
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Pro Gln Asn
35 40 45
Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala
50 55 60
Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys
65 70 75 80
Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr
85 90 95
Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser
100 105 110
Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr
115 120 125
Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly
130 135 140
Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His
145 150 155 160
Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser
165 170 175
Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys
180 185 190
Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp
195 200 205
Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu
210 215 220
Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu
225 230 235 240
Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile
245 250 255
Gly Ile Ala Gly Lys Gln 260
<211> 250
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis <400> 41
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Ala Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 42 <211> 250 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 42
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Ala Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 43 <211> 250 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 43
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Ala Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 44 <211> 250
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 44
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 45 <211> 247
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 45
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 46 <211> 255 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 46
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu
100 105 110
Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln
115 120 125
Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu
130 135 140
Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp
180 185 190
Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile
195 200 205
Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu
210 215 220
Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val
225 230 235 240
Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln
245 250 255
<210> 47 <211> 757 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> слитой мутант v2-v3-v1
<400> 47
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala
245 250 255
Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His
260 265 270
Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Ile Pro Gln
275 280 285
Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys
290 295 300
Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
305 310 315 320
Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln
325 330 335
Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His
340 345 350
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
355 360 365
Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly
370 375 380
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr
385 390 395 400
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr
405 410 415
Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu
420 425 430
Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
435 440 445
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
450 455 460
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
465 470 475 480
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
485 490 495
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala
500 505 510
Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His
515 520 525
Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys
530 535 540
Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly
545 550 555 560
Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser
565 570 575
Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr
580 585 590
Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu
595 600 605
Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys
610 615 620
Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His
625 630 635 640
Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly
645 650 655
Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile
660 665 670
Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser
675 680 685
Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly
690 695 700
Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu
705 710 715 720
Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val
725 730 735
Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly
740 745 750
Leu Ala Ala Lys Gln 755
<210> 48 <211> 769
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> слитой мутант v2-v3-v1
<400> 48
Met Gly Pro Asp Ser Asp Arg Leu Gln Gln Arg Arg Val Ala Ala Asp
1 5 10 15
Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys
20 25 30
Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn
35 40 45
Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn
50 55 60
Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg
65 70 75 80
Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu
85 90 95
Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val
100 105 110
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu
115 120 125
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
130 135 140
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
145 150 155 160
Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe
165 170 175
Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu
180 185 190
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
195 200 205
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
210 215 220
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
225 230 235 240
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
245 250 255
Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr
260 265 270
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
275 280 285
Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu
290 295 300
Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys
305 310 315 320
Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg
325 330 335
Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu
340 345 350
Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asn His Ser Ala Val Val
355 360 365
Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu
370 375 380
Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr
385 390 395 400
Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala
405 410 415
Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe
420 425 430
Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile Glu His Leu Lys Thr Leu Glu
435 440 445
Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser
450 455 460
His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly
465 470 475 480
Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly
485 490 495
Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala
500 505 510
Gly Lys Gln Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala
515 520 525
Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly
530 535 540
Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Ser Lys Asn Glu Lys Leu
545 550 555 560
Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser
565 570 575
Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe
580 585 590
Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly
595 600 605
Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln
610 615 620
Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His Ser Gly Lys Met Val Ala Lys
625 630 635 640
Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His Thr Ser Phe Asp
645 650 655
Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly
660 665 670
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
675 680 685
Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn
690 695 700
Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys Pro Asp Gly Lys Arg His Ala
705 710 715 720
Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr
725 730 735
Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala
740 745 750
Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg His Ile Gly Leu Ala Ala Lys
755 760 765
Gln
<210> 49
<211> 248
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 49
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Ser Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Phe Gln Thr Glu Gln Ile Gln Asp Ser Glu His
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Glu Gly Gly Arg Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly Asn Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Ala Ala Asp Ile Lys
180 185 190
Pro Asp Gly Lys Arg His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn
195 200 205
Gln Ala Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Gly Lys Ala
210 215 220
Gln Glu Val Ala Gly Ser Ala Glu Val Lys Thr Val Asn Gly Ile Arg
225 230 235 240
His Ile Gly Leu Ala Ala Lys Gln 245
<210> 50 <211> 6 <212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Линкер
<400> 50
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 51
<211> 247
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 51
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 52 <211> 248
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 52
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Lys
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His
85 90 95
Ser Ala Leu Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Val Gln Asp Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Gly Lys Met Val Ala Lys Arg Gln Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Gly Gly Ser Ala Thr
130 135 140
Tyr Arg Gly Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr
145 150 155 160
Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His
165 170 175
Leu Lys Ser Pro Glu Leu Asn Val Glu Leu Ala Thr Ala Glu Leu Lys
180 185 190
Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly
195 200 205
Gly Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala
210 215 220
Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His
225 230 235 240
Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 53 <211> 250
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 53
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165 170 175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 54 <211> 273 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 54
Met Asn Arg Thr Ala Phe Cys Cys Leu Ser Leu Thr Thr Ala Leu Ile
1 5 10 15
Leu Thr Ala Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly
20 25 30
Ala Arg Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys
35 40 45
Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys
50 55 60
Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp
65 70 75 80
Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp
85 90 95
Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser
100 105 110
Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu
115 120 125
Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn
130 135 140
Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe
145 150 155 160
Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser
165 170 175
Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala
180 185 190
Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn
195 200 205
Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala
210 215 220
Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr
225 230 235 240
His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala
245 250 255
Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys
260 265 270
Gln
<210> 55 <211> 247
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 55
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 56 <211> 247 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 56
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Ala
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 57
<211> 247
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 57
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Ala
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 58 <211> 247 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 58
Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val
20 25 30
Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp
50 55 60
Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln
65 70 75 80
Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His
85 90 95
Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys
100 105 110
Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala
115 120 125
Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr
130 135 140
His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr
145 150 155 160
Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu
165 170 175
Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala
180 185 190
Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser
195 200 205
Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln
210 215 220
Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu
225 230 235 240
Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245
<210> 59 <211> 254
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 59
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 60 <211> 254
<212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 60
Cys Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Arg Leu
1 5 10 15
Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu Gln
20 25 30
Ser Leu Thr Leu Asp Gln Val Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys Leu
35 40 45
Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu Asn
50 55 60
Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile Arg
65 70 75 80
Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu Phe
85 90 95
Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu
100 105 110
Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser
115 120 125
Phe Arg Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu
130 135 140
Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp
145 150 155 160
Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly
165 170 175
His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu Leu
180 185 190
Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu
195 200 205
Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala
210 215 220
Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys
225 230 235 240
Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
<210> 61 <211> 250 <212> ПРТ
<213> Neisseria meningitidis
<400> 61
Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro
1 5 10 15
Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val
20 25 30
Ile Pro Gln Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys
35 40 45
Thr Phe Lys Ala Gly Asp Lys Asp Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu
50 55 60
Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val
65 70 75 80
Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys
85 90 95
Gln Asn His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn
100 105 110
Pro Asp Lys Thr Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg Ser Phe Arg Val Ser
115 120 125
Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln Leu Pro Gly Gly Lys
130 135 140
Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp Asp Pro Asn Gly Arg
145 150 155 160
Leu His Tyr Ser Ile Asp Phe Thr Lys Lys Gln Gly Tyr Gly Arg Ile
165
170
175
Glu His Leu Lys Thr Leu Glu Gln Asn Val Glu Leu Ala Ala Ala Glu
180 185 190
Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg
195 200 205
Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp
210 215 220
Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Lys Ile Gly Glu Lys
225 230 235 240
Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln 245 250
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Мутантный v3 или v2 белок, связывающий фактор Н (fHbp), представляющий собой:
(А) полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v2, где: (а) аминокислотная последовательность имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности SEQ ID NO: 5 и/или содержит фрагмент SEQ ID NO: 5, длина которого составляет по меньшей мере 7 аминокислот и который содержит S32 из SEQ ID NO: 5; но (б) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 5 по остатку S32, при условии, что если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v2 включает замену исключительно по остатку 32, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо по меньшей мере один из следующих остатков заменен: V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, Н239 и/или Е240;
или
(Б) полипептид, содержащий мутантную аминокислотную последовательность fHbp v3, где: (а) аминокислотная последовательность обладает по меньшей мере 80% идентичностью последовательности SEQ ID NO: 17 и/или содержит фрагмент SEQ ID NO: 17, длина которого составляет по меньшей мере 7 аминокислот и который содержит S32 из SEQ ID NO: 17; но (б) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 17 по остатку S32, при условии, что если мутантная аминокислотная последовательность fHbp v3 включает замену исключительно по остатку 32, то либо эта замена не представляет собой замену на аланин, либо по меньшей мере один из следующих остатков заменен: I33, L39, L41, F72, V103, Т116, F125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, Н242 и/или Е243.
2. Полипептид по п. 1, где: (А) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 5 заменой по S32 и одному или более чем одному из V33, L39, L41, F69, V100, 1113, F122, L123, V124, S125, G126, L127, G128, S151, Н239 и/или Е240; например, когда замена(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из: S32V; V33C; L39C; L41C; F69C; V100T; I113S; F122C; L123R; V124I; S125G или S125T; G126D; L127I; G128A; S151C; H239R; Е240Н; или (Б) аминокислотная последовательность отличается от SEQ ID NO: 17 заменой по
2.
S32 и одному или более чем одному из 133, L39, L41, F72, V103, Т116, F125, L126, V127, S128, G129, L130, G131, S154, Н242 и/или Е243; например, когда замена(ы) выбрана(ы) из группы, состоящей из: S32V; I33C; L39C; L41C; F72C; V103T; T116S; F125C; L126R; V127I; S128G или S128T; G129D; L130I; G131A; S154C; H242R; и Е243Н.
3. Полипептид по п. 1(A), содержащий замены по множеству остатков, которые выбраны из групп 2Б, 2И, 2К или 2П следующим образом:
2Б: остатки 32 и 123;
2И: остатки 32 и 125;
2К: остатки 32, 123 и 125; или
2П: остатки 32, 123, 124, 125, 126, 127 и 128.
4. Полипептид по п. 3, содержащий замены S32V и L123R по сравнению с SEQ ID NO: 5; возможно дополнительно содержащий замены V124I, S125G, G126D, L127I, G128A; например, содержащий SEQ ID NO: 20, или SEQ ID NO: 45, или SEQ ID NO: 58.
5. Полипептид по п. 1(Б), содержащий замены по множеству остатков, которые выбраны из групп ЗБ, ЗИ, ЗК или ЗП следующим образом:
ЗБ: остатки 32 и 126;
ЗИ: остатки 32 и 128;
ЗК: остатки 32, 126 и 128; или
ЗП: остатки 32, 126, 127, 128, 129, 130 и 131.
6. Полипептид по п. 5, содержащий замены S32V и L126R по сравнению с SEQ ID NO: 17; возможно дополнительно содержащий замены V127I, S128G, G129D, L130I, G131A; например, содержащий SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 61.
7. Полипептид по любому из пп. 1-6, также включающий одну или более чем одну дополнительную(ые) мутацию(и), которая(ые) нарушает(ют) способность полипептида связываться с человеческим фактором Н; например v2, включающий замену по одному или более чем одному из остатков R73, D203, Е210, G228, S121, F122, А192, Е194, V199, I200, L201, Т213, Н215, F219, Т231 и Е240, или v3, включающий замену по одному или более чем одному из остатков Q35, 1178, L87, А88, V127, V202, Е213, Т216, Н218, Т234, V241, Е243 и G248.
6.
8. Полипептид, содержащий:
- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45 с 1, 2 или 3 единичными аминокислотными заменами), но не имеющую мутации по остатку V32 или R123;
- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44 с 1, 2 или 3 единичными аминокислотными заменами), но не имеющую мутации по остатку V32 или R126;
- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 с 1, 2 или 3 единичными аминокислотными заменами), но не имеющую мутации по остатку V32;
- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 (например, содержащим аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61 с 1, 2 или 3 единичными аминокислотными заменами), но не имеющую мутации по остатку V32;
- аминокислотную последовательность fHbp v3, которая идентична аминокислотной последовательности v3 дикого типа, за исключением мутации по аминокислотному положению, соответствующему Leu-126 в SEQ ID NO: 17,
при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин);
- аминокислотную последовательность fHbp v2, которая идентична аминокислотной последовательности v2 дикого типа, за исключением мутации по аминокислотному положению, соответствующему Leu-123 в SEQ ID NO: 5, при условии, что мутация не представляет собой замену на аланин (например, когда мутация представляет собой замену на аргинин); или
- аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, возможно с 1, 2, 3, 4 или 5 единичными аминокислотными заменами, делециями и/или вставками, где полипептид может вызывать образование антител, которые связываются с каждым из следующих: менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 46; менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; и менингококковым полипептидом fHbp, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 40 (например, состоящим из последовательности SEQ ID NO: 48).
9. Плазмида или другая нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп. 1-8.
10. Клетка-хозяин, трансформированная плазмидой по п. 9; например, когда клетка представляет собой бактерию менингококк, такую как бактерию менингококк, имеющую понижающую регуляцию или нокаут гена mltA и также возможно имеющую понижающую регуляцию или нокаут: (1) по меньшей мере одного гена, участвующего в придании токсичности фрагменту липида А в липополисахариде (LPS), в частности 1рх11; и/или (2) по меньшей мере одного гена, участвующего в синтезе или экспорте капсульного полисахарида, в частности synX и/или ctrA.
11. Мембранные везикулы, полученные из клетки-хозяина по п. 9, которые включают полипептид по любому из пп. 1-8.
12. Иммуногенная композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 1 -8 или везикулу по п. 11.
9.
13. Композиция по п. 12, дополнительно содержащая второй полипептид, который при введении млекопитающему вызывает ответ в виде антител, которые являются бактерицидными в отношении менингококка.
14. Композиция по п. 12 или п. 13, дополнительно содержащая (1) конъюгированный капсульный сахарид из N.meningitidis серогруппы А, С, W135 и/или Y, и/или (2) конъюгированный капсульный сахарид из S.pneumoniae.
15. Способ индуцирования антительного ответа у млекопитающего, включающий введение иммуногенной композиции по любому из пп. 12-14.
9.
Фиг. 1
1ч Зч 6ч 0 1ч 2ч 6ч
1ч Зч 6ч
Фиг. 2
2 М 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 М
Фиг. 3
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 М 13 14 15 16
jtmam^J^^^^^A^^^^ ^^^^^ _^^gjgju.
Вестерн блоттинг: детекция ЭХЛ
Фиг. 4
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
(19)
(19)
(19)
(19)
(19)
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
Модифицированные менингококковые полипептиды fhbp
