|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Описаны антитела, которые связывают KLB и FGFR1, а также способы применения указанных антител. В некоторых вариантах воплощения антитело в соответствии с настоящим описанием включает биспецифическое антитело, которое связывает эпитоп, присутствующий на FGFR1, и связывает эпитоп, присутствующий на KLB. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Описаны антитела, которые связывают KLB и FGFR1, а также способы применения указанных антител. В некоторых вариантах воплощения антитело в соответствии с настоящим описанием включает биспецифическое антитело, которое связывает эпитоп, присутствующий на FGFR1, и связывает эпитоп, присутствующий на KLB.
(19) ,^^^v Евразийское (2D 201691321 <13> А1
патентное ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K39/395 (2006.01)
2017.02.28 C07K14/71 (2006.01)
C07K16/18 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки C07K16/28 (2006.0l)
2014.12.23 C07K16/46 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) 61/920,396; 62/081,435
(32) 2013.12.23; 2014.11.18
(33) US
(86) PCT/US2014/072245
(87) WO 2015/100366 2015.07.02
(71) Заявитель: ДЖЕНЕНТЕК, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Чэнь Юнмэй, Эрнст Джеймс, Ким Хок Сеонь, Сонода Юничиро (US), Шписс Кристоф (DE), Ставицки Скотт, У Янь
(US)
(74) Представитель:
Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Гизатуллина Е.М., Глухарёва А.О., Дементьев В.Н., Карпенко О.Ю., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(57) Описаны антитела, которые связывают KLB и FGFR1, а также способы применения указанных антител. В некоторых вариантах воплощения антитело в соответствии с настоящим описанием включает биспецифическое антитело, которое связывает эпитоп, присутствующий на FGFR1, и связывает эпитоп, присутствующий на KLB.
АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ПРИТЯЗАНИЕ НА ПРИОРИТЕТ
Эта заявка испрашивает приоритет согласно предварительной патентной заявке США номер 61/920,396, поданной 23 декабря 2013 г., и предварительной патентной заявке США номер 62/081,435, поданной 18 ноября 2014, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и включен в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте. Указанная копия ASCII, созданная 22 декабря 2014 года, имеет название 00B206.0170_SL.txt и размер 155,738 байт.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с бета-Клото (KLB), рецептором фактора роста фибробластов 1 (FGFR1) или с тем и другим, и способам их применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фактор роста фибробластов 21 (FGF21) и его ближайший гомолог FGF19 являются членами надсемейства FGF. Для осуществления сигналинга FGF21 необходимо присутствие изоформ FGF-рецептора (FGFR) и мембраносвязанного корецептора бета-Клото (KLB) (Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007); US2010/0184665). Также показано, что FGF19 осуществляет сигналинг через изоформы FGFR, находящиеся в комплексе с KLB (Wu et al. J. Biol. Chem. 282(40): 29069-29072 (2007)). Из 7 основных изоформ FGFR, присутствующих у млекопитающих (lb, 2b, 3b, lc, 2c, Зс и 4), только три изоформы - FGFRlc, 2с и Зс - способны передавать сигнал и от FGF19, и от FGF21 в случае связывания с корецептором KLB, который преимущественно экспрессируется в печени, жировой ткани и поджелудочной железе (Goetz and Mohammadi, Nature reviews. Molecular Cell Biology 14, 166-180 (2013)). Из этих рецепторов FGFRlc, по-видимому, играет ведущую роль в опосредовании метаболического эффекта FGF21. Не желая быть связанными какой-либо теорией, авторы полагают, что FGF21 действует, вызывая гомодимеризацию изоформ FGFR в присутствии мембраносвязанного корецептора KLB. В отличие от других FGF-лигандов,
FGF21 демонстрирует очень низкое сродство к любому из FGFR. Тем не менее, высокое сродство связывания с KLB через С-концевую область привлекает FGF21 к комплексу FGFR/KLB, позволяя FGF21 взаимодействовать с рецептором FGFR, несмотря на низкое сродство только к FGFR.
FGF21 был идентифицирован как сильнодействующий модифицирующий заболевания белковый агент, позволяющий лечить такие заболевания как ожирение и диабет типа 2 в моделях заболеваний на животных (Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005)). Было показано, что рекомбинантный FGF21 приводил к снижению уровня липидов в печени, повышал чувствительность к инсулину и нормализовывал гликемический контроль у мышей, дефитных по сигналингу лептина (ob/ob или db/db), или у мышей с диетой с высоким содержанием жиров (HFD). Снижение уровня глюкозы в крови и улучшения в показателях различных факторов сердечнососудистого риска также наблюдались у страдающих ожирением и диабетом макак-резусов, получавших ежедневно рекомбинантный FGF21. Было показано, что FGF21 и FGF19 активируют функцию термогенина в жировой ткани, положительной по разобщающему белку 1 (UCP1) (коричневая и бежевая жировые ткани; ВАТ) у грызунов, страдающих ожирением (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)).
Хотя клиническое применение рекомбинантных аналогов FGF21 или FGF19 в настоящее время находится на стадии испытаний для лечения метаболических заболеваний, их разработка для терапевтического вмешательства оказалось сложной задачей. Так, например, для приматов, не включающих человека, время полувыведения FGF21 в сыворотке крови составляет примерно 2 часа и является слишком коротким для практического клинического применения, а оставшийся в кровяном русле белок FGF21 может быстро инактивироваться путем протеолитического расщепления. Были предприняты попытки улучшить эти свойства с помощью белковой инженерии, но такие изменения могут усилить иммуногенность и другие побочные эффекты, характерные для модификации. Другой серьезной проблемой является возможное возникновение долгосрочных побочных эффектов от хронической терапии FGF21. Например, сообщалось, что FGF21 способен индуцировать резистентность печени к гормону роста путём индукции SOCS2, ингибитора сигналинга рецептора гормона роста (Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)). У человека резистентность к гормону роста или его недостаток ассоциированы с низкой костной массой у детей и взрослых, а трансгенная сверхэкспрессии FGF21 или введение мышам в течение двух недель рекомбинантного
FGF21 приводят к значительной потере минеральной плотности костной ткани. Еще не было показано, что связанные с костной тканью побочные эффекты FGF21 могут быть отделены от его полезных метаболических эффектов. Кроме того, трансгенная сверхэкспрессия FGF19 может привести к гепатоцеллюлярному канцерогенезу через активацию рецептора FGF (FGFR) 4 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)).
Рекомбинантные моноклональные антитела (Ab) могут выступать в качестве мощного терапевтического средства, так как могут обеспечить высокую селективность к мишени, превосходный фармакокинетический профиль и другие свойства, важные для фармацевтического агента (Chan and Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)). Например, было показано, что антитело-антагонист, специфичное к FGFRlc, способно вызывать потерю веса у мышей и обезьян (WO2005/037235), а опосредованная антителом-антагонистом селективная активация FGFRlc является достаточной для восстановления чувствительности к инсулину FGF21 у мышей с диабетом (WO2012/158704; Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)). Антитела, которые связываются с комплексом KLB/FGFRlc, были предложены в качестве активаторов/терапевтических агентов (US 7,537,903; WO2011/071783; WO2012/158704). Другими авторами были предложены два альтернативных подхода для избирательной активации комплекса FGFRlc/KLB: с использованием анти-KLB антитела с высокой аффинностью mimAbl (Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ral53 (2012)) и биспецифического полипептида авимера С3201 против FGFR1/KLB, связанного с человеческим сывороточным альбумином (HSA) (US 8,372,952).
Поскольку FGF19 и FGF21 имеют значительное влияние на метаболизм глюкозы, то в данной области сохраняется потребность в разработке терапевтических молекул и способов модулирования опосредованной FGF19 или FGF21 активности.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к антителам, которые связываются с KLB, антителам, которые связываются с FGFR1, и биспецифическим антителам, которые связываются с KLB и FGFR1, и способам их применения. Настоящее изобретение основано, частично, на обнаружении биспецифических антител, которые связываются с KLB и FGFR1, избирательно активируют рецепторный комплекс FGFRlc/KLB и индуцируют полезные метаболические изменения, ожидаемые при FGF21-подобной активности, в том числе снижение веса и улучшение метаболизма глюкозы и липидов
без существенного влияния на печень и без потери костной массы.
В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело представляет собой
биспецифическое антитело. Для примера, а не в качестве ограничения, выделенное
антитело по настоящему изобретению может связываться с бета-Клото (KLB) и
рецептором фактора роста фибробластов 1 (FGFR1), причём антитело связывается с С-
концевым доменом KLB. Для примера, но не в качестве ограничения, выделенное
антитело по настоящему изобретению связывается с KLB и FGFRlc. В некоторых
вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с фрагментом KLB,
содержащим аминокислотную последовательность
SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142). В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с эпитопом внутри фрагмента FGFR1, включающим аминокислотную последовательность KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID N0: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ГО N0: 144).
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению активирует комплекс KLB/FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению снижает уровень глюкозы в крови in vivo. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело не оказывает существенного влияния на плотность костной ткани. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не оказывает существенного влияния на печень. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело индуцирует значительно более низкие уровни фосфорилирования ERK и МЕК в печени по сравнению FGF21. В некоторых
вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с KLB с Kd от 10" М до 10"
М. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению
-8 -13
может связываться с белком FGFR1 с Kd от 10"° М до 10"13 М. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может связываться с FGFRlc с Kd
-8 -13
от 10" М до 10" М. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с KLB с Kd < 10 нМ и с FGFRlc с Kd > 300 нМ. В некоторых вариантах осуществления изобретения, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl может включать плечо анти-FGFRl, которое имеет Kd приблизительно от 10 нМ до 10 мкМ.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению связывается с эпитопом, присутствующим в KLB. Для примера, а не в качестве ограничения, настоящее изобретение предусматривает анти-KLB антитело, которое связывает тот же эпитоп, что и антитело, показанное на Фигурах ЗА и В. В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело по настоящему изобретению связывает тот же эпитоп, что и антитела 12А11 или 8С5. В некоторых вариантах осуществления,
анти-KLB антитело связывается с эпитопом в пределах С-концевого домена KLB. В
некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело связывается с фрагментом
KLB с аминокислотной последовательностью
SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению включает первое антитело или его антигенсвязывающую часть, которая включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 128, и вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 130. В некоторых вариантах осуществления, второе антитело или его антигенсвязывающая часть включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 132, и вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 134.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению включает первое антитело или его антигенсвязывающую часть, которая включает область тяжелой цепи и область легкой цепи, где область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 129, и область легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 131. В некоторых вариантах осуществления, второе антитело или его антигенсвязывающая часть включает область тяжелой цепи и область легкой цепи, где область тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 133, и область легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, представленной в SEQ Ш N0: 135.
Настоящее изобретение также относится к анти-KLB антителу, которое включает: (а) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 1-15, (b) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность,
выбранную из группы SEQ Ш N0 : 79-93, и (с) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 16-31.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анти-KLB антитело включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 1-15, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 16-31, и (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID N0: 32-47.
В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело дополнительно содержит (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 48-62, (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ ID N0: 63-78, и (с) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы SEQ Ш N0: 79-93.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анти-KLB антитело включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 12, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 28, (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 44, (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 59, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 75, и (1) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 90.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анти-KLB антитело включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 15, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 31, (с) HVR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 47, (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 62, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 78, и (1) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 93.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анти-KLB антитело включает (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 128, и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 130. В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит (а) тяжелую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 129, и (Ь) легкую цепь, включающую аминокислотную последовательность SEQ IDNO: 131.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает анти-KLB антитело, включающее (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую, по меньшей мере, 95% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 128; (b) вариабельную область легкой цепи, имеющую, по меньшей мере, 95% идентичность аминокислотной последовательности с SEQ Ш N0: 130; и (с) вариабельную область тяжелой цепи, как описано в (а), и вариабельную область легкой цепи, как описано в (Ь).
Настоящее изобретение также относится к антителам, которые связываются с FGFR1, например, FGFRlc. Для примера, а не в качестве ограничения, антитело по настоящему изобретению содержит вариабельный домен, который связывается с FGFR1. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с фрагментом FGFR1, имеющим аминокислотную последовательность KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ Ш N0: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ Ш N0: 144). В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 136, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 137, (с) HVR-H3, содержающую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 138, (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 139, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 140, и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 141. В некоторых вариантах осуществления, антитело содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 132, и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 134. В некоторых вариантах осуществления, антитело включает (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 133, и (Ь) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 135. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ Ш N0: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело имеет пониженную эффекторную функцию.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к выделенной нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело по настоящему изобретению. В некоторых
вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению, в результете чего образуется антитело. В некоторых вариантах осуществления, этот способ дополнительно включает выделение антитела из клетки-хозяина.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтической лекарственной форме, которая включает одно или несколько антител по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая лекарственная форма содержит дополнительный терапевтический агент.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает антитело по
изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых
вариантах осуществления, антитело предназначается для применения в лечении
метаболических нарушений, например, синдрома поликистозных яичников (PCOS),
метаболического синдрома (МЕТ), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH),
неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии, артериальной
гипертензии, диабета 2 типа, диабета не 2 типа, диабета 1 типа, латентного
аутоиммунного диабета (LAD) и диабета взрослого типа у молодых (MODY). В
некоторых вариантах осуществления, антитело предназначается для применения в
лечении диабета 2 типа. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело
предназначается для применения в лечении ожирения. В некоторых вариантах
осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело для применения в
лечении синдрома Барде-Бидля, синдрома Прадера-Вилли, синдрома Альстрёма,
синдрома Коэна, наследственной остеодистрофии Олбрайта
(псевдогипопаратиреоидизма), синдрома Карпентера, синдрома МОМО, синдрома Рубинштейна-Тейби, синдрома ломкой Х-хромосомы и синдрома Бёрьесона-Форсмана-Лемана. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело для использования в активации рецепторного комплекса KLB/FGFR1, например, рецепторного комплекса KLB/FGFRlc.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела, раскрытого в настоящем описании, для получения лекарственного средства для лечения нарушений обмена веществ, например, синдрома поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (МЕТ), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии,
артериальной гипертензии, диабета 2 типа, диабета не 2 типа, диабета 1 типа, латентного аутоиммунного диабета (LAD) и диабета взрослого типа у молодых (MODY), а также старения и связанных с ним заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, метаболическое нарушение является диабетом 2 типа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, метаболическое нарушение является ожирением. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, получение лекарственного средства представляет собой получение лекарственного средства для активации рецепторного комплекса KLB/FGFRlc.
В другом своем аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения
индивидуума, имеющего заболевание, выбранное из группы, состоящей из синдрома
поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (МЕТ), ожирения,
неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени
(NAFLD), гиперлипидемии, артериальной гипертензии, диабета 2 типа, диабета не 2
типа, диабета 1 типа, латентного аутоиммунного диабета (LAD) и диабета взрослого
типа у молодых (MODY), а также старения и связанных с ним заболеваний, таких как
болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS, где указанный способ включает
введение индивидууму эффективного количества одного или более антител согласно
настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего
изобретения, заболевание является диабетом, например, диабетом 2 типа. В некоторых
вариантах осуществления настоящего изобретения, заболевание является ожирением. В
некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает способ
лечения индивидуума, имеющего заболевание и/или расстройство, выбранное из группы,
состоящей из синдрома Барде-Бидля, синдрома Прадера-Вилли, синдрома Альстрёма,
синдрома Коэна, наследственной остеодистрофии Олбрайта
(псевдогипопаратиреоидизма), синдрома Карпентера, синдрома МОМО, синдрома Рубинштейна-Тейби, синдрома ломкой Х-хромосомы и синдрома Бёрьесона-Форсмана-Лемана. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение индивидууму дополнительного терапевтического средства. В некоторых вариантах осуществления, способ с использованием одного или нескольких антител по настоящему изобретению не влияет на функцию печени у индивидуума. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает способ индуцирования потери веса, включающий введение индивидууму эффективного количества одного или более антител по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает способ активации
рецепторного комплекса KLB-FGFRlc у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по настоящему изобретению.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фигуре 1А представлена агонистическая активность анти-FGFRl антител и фрагментов таких антител.
На Фигуре 1В представлены результаты экспериментов по конкурентному связыванию с использованием анти-FGFRl антител.
На Фигуре 1С представлены аминокислотные остатки FGFR1, важные для связывания анти-FGFRl антител, представленных в настоящем описании. На Фигуре 1С приведены SEQ ID N0: 159, 159, 143 и 144, соответственно, в порядке перечисления.
На Фигуре 1D представлены результаты сайт-специфического мутагенеза для определения аминокислотных остатков, важных для связывания анти-FGFRl антител, представленных в настоящем описании.
На Фигуре 1Е представлены результаты сайт-специфического мутагенеза для определения аминокислотных остатков, важных для связывания анти-FGFRl антител, представленных в настоящем описании.
На Фигуре 1F представлены важные для связывания остатки на пространственной модели FGFR1.
На Фигуре 2А представлены значения аффинности двух анти-FGFRl антител к FGFRlb и FGFRlc.
На Фигуре 2В представлено связывание анти-FGFRl антитела с различными
FGFR.
На Фигуре 2С представлено анти-FGFRl антитело, которое выступает в качестве специфического агониста для FGFR1 в люциферазном анализе GAL-ELK1 (ETS-подобный фактор транскрипции 1) в клетках L6.
На Фигуре 2D представлено анти-FGFRl антитело, которое выступает в качестве специфического агониста для FGFR1 в люциферазном анализе GAL-ELK1 в клетках НЕК293.
На Фигуре 2Е показано, что анти-FGFRl антитело приводит к нормализации уровней глюкозы в крови при его введении мышам с диабетом ob/ob.
На Фигуре ЗА представлены последовательности вариабельной области легкой цепи для 17 анти-KLB антител. Последовательности CDR-L1 включают по порядку SEQ ID NO: 48-62; последовательности CDR L2 включают по порядку SEQ ID NO: 63-78; и последовательности CDH L3 включают по порядку SEQ ГО N0: 79-93.
Последовательности вариабельной области легкой цепи включают по порядку SEQ ID NO: 111-127.
На Фигуре ЗВ представлены последовательности вариабельной области тяжелой цепи для 17 анти-KLB антител. Последовательности CDR-H1 для антител включают по порядку (11F1-8C5) SEQ ID NO: 1-15; последовательности CDR Н2 включают по порядку SEQ ID NO: 16-31; последовательности CDR НЗ включают по порядку SEQ ID NO: 32-47. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи для антител включают по порядку SEQ ID NO: 94-110.
На Фигуре 4 представлена медиана сдвига, наблюдаемого на диаграмме FACS при измерении степени связывания 0,8 мкг/мл различных анти-KLB антител с клетками 293, экспрессирующими hKLB.
На Фигуре 5 представлено относительное связывание различных анти-KLB антител с белком hKLB-ECD-HIS.
На Фигуре 6А представлена схема, изображающая антитела, представленные в настоящем описании, и модель образования комплекса биспецифического антитела с KLB/FGFRlc для активации сигнала.
На Фигуре 6В представлена модель образования комплекса FGFRlc-KLB-FGF21, активирующего сигналинг.
На Фигуре 6С представлены результаты люциферазного анализа GAL-ELK1 для FGF21 и биспецифического антитела (BsAb) 17 с использованием дефицитных по FGFR1 клеток НЕК293. Клетки трансфицировали для экспрессии указанных рецепторов.
На Фигуре 6D представлен вестерн-блот-анализ первичных человеческих адипоцитов, обработанных указанным белком (FGF21 (100 нМ) или IgG (33 нМ)) в течение 1 ч. Образцы были продублированы для каждой обработки.
На Фигуре 7А представлены результаты индукции различными биспецифическими антителами с плечами анти-FGFRl и анти-KLB в люциферазном анализе GAL-ELK1. Следует отметить, что биспецифические антитела с плечом RlMAbl проявили значительную KLB-независимую активность предположительно из-за агонистической активности RlMAbl Fab. Подобной активности не было выявлено в случае биспецифических антител с плечами RlMAb2 или RlMAb3.
На Фигуре 7В показано, что индукция сигналинга с помощью различных биспецифических антител с плечами анти-FGFRl и анти-KLB зависит от FGFRlc и KLB.
На Фигуре 7С представлено биспецифическое антитело с плечами анти-FGFRl и анти-KLB, которое индуцирует активность люциферазы в зависимости от дозы в клетках, экспрессирующих рекомбинантный hFGFRlc и hKLB, но не в клетках без
экспрессии KLB.
Фигура 8А представляет собой схематическое изображение трех вариантов биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRlc антител. Синий - человеческая последовательность, красный - мышиная последовательность. Примерное положение олигосахаридной цепи при N297 в (1) обозначено как А. Варианты, не являющиеся эффекторами ((2) и (3)), не имеют олигосахаридных цепей из-за мутации N297G. Звездочками в (2) указано примерное положение мутации D265A. Ориентация "выступ-во-впадину" также показана на Фигуре. (1) представляет собой BsAblO; (2) представляет собой BsAb20; и (3) представляет собой BsAbl7.
На Фигуре 8В представлены результаты анализа MSD pERK в первичных человеческих адипоцитах, обработанных BsAblO и его производными, контрольным IgG или FGF21 в течение 10 мин. Данные представляют собой средние значения ± SEM (N = 3). bFKBl (1) представляет собой BsAblO; bFKBl (2) представляет собой BsAb20; и bFKBl (3) представляет собой BsAbl7.
На Фигуре 9А представлен люциферазный анализ GAL-ELK1 в миобластах крысы L6. Клетки котрансфицировали экспрессионным вектором для указанных рецепторов. Трансфицированные клетки инкубировали с различными концентрациями BsAblO или положительным контролем, FGF21, FGF19 или RlMAbl в течение 6 ч перед люциферазным анализом.
На Фигуре 9В представлены результаты люциферазных анализов GAL-ELK1, аналогичных представленному на Фигуре 9А. Трансфицированные клетки L6 обрабатывали комбинациями FGF21 и BsAbl7, как указано на Фигуре. N = 4.
На Фигуре 9С представлены результаты люциферазных анализов GAL-ELK1, аналогичных представленным на Фигуре 9А. Трансфицированные клетки L6 обрабатывали комбинациями FGF21 и BsAbl7, как указано на Фигуре. N = 4.
На Фигуре 9D представлено связывание анти-FGFRl антитела и биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRl антител, BsAB9 и BsAblO с клетками, экспрессирующими KLB, FGFRlc или оба белка.
На Фигуре 10А представлено связывание биспецифичного антитела с плечами анти-FGFRl и анти-KLB и анти-FGFRl антитела с клетками, экспрессирующими FGFRlc, KLB или оба белка.
На Фигуре 10В представлены Kd связывания BsAblO с клетками НЕК293, экспрессирующими различные комбинации человеческого и мышиного KLB/FGFR1.
На Фигуре 11 представлен анализ связвания BsAblO или предварительно сформированных комплексов BsAblO/KLB в концентрации 200 нм, 100 нм, 50 нМ, 25
нМ, 12,5 нМ, 6,25 нМ со слитым белком FGFRl-ECD-Fc, который был иммобилизованным на чипе. Для создания предварительно сформованных комплексов BsAblO/KLB белок BsAblO и рекомбинантный белок KLB-ECD предварительно инкубировали при соотношении 1:1. Следует отметить, что скорость диссоциации для комплекса BsAblO/KLB была ниже по сравнению со скоростью диссоциации только для BsAblO, но только в том случае, когда на чипе был связан FGFRlc, а не FGFRlb, что указывало на образование тройного комплекса.
На Фигуре 12А представлена схема эксперимента TR-FRET.
На Фигуре 12В представлена интенсивность TR-FRET клеток COS7, экспрессирующих SNAP-меченый белкок FGFRlc совместно с немеченым KLB или без него, через 15 минут после добавления указанных лигандов. BsAbl7, FGF21, FGF1 и FGF2 использовались в концентрации 67 нМ, 50 нМ, 62,5 нМ, 12 нМ, соответственно. Данные представлены как отношение интенсивности сигнала FRET при 665 нм к интенсивности излучения донора при 620 нм (отношение FRET), и приведены средние значения ± SEM трех независимых экспериментов (N = 3). р <0,05 (*), <0,01 (**), <0,0001 (***) по сравнению с контролем PBS.
На Фигуре 13 А приведены результаты экспериментов по определению того, какая часть KLB имеет важное значение для связывания двух анти-KLB антител. Схема структуры белка KLB показана в верхней части. Каждый из столбцов представляет человеческий KLB, человеческий KLA, кроличий KLB, крысиный KLB, мышиный KLB или химерные конструкции, что обозначено цветом. В правой части показано связывание на основе данных FACS KLBmAbl и контрольного KLBmAb2 с клетками НЕК293, временно экспрессирующими каждую из конструкций. Следует отметить, что KLBmAbl не связывается с кроличьим KLB, но замена фрагмента из 34 аминокислот (аминокислоты 805-838) на соответствующую человеческую последовательность делает связывание возможным.
На Фигуре 13В представлена аминокислотная последовательность сегмента человеческого белка KLB с сигнальной последовательностью, соответсвующего положениям 857-890 (что соответствует положениям 805-838 аминокислотной последовательности белка KLB, который не включает сигнальную последовательность) и соответствующие последовательности у различных указанных видов. На Фигуре 13В представлены SEQ ID NO: 160-164, соответственно, в порядке перечисления.
На Фигуре 14А представлено связывание FGF21 и FGF19 с комплексом BsAblO/KLB по данным SPR. BsAblO был связан с чипом, а белок KLB-ECD и белок FGF (0,2, 0,8 или 2 мкМ) вводили последовательно.
На Фигуре 14В представлены результаты люциферазного анализа GAL-ELK1 в миобластах крысы L6. Клетки были котрансфицированы экспрессионными векторами, сожержащими FGFR4 и KLB. Трансфицированные клетки инкубировали с различными концентрациями указанных белков в течение 6 ч перед началом люциферазного анализа.
На Фигуре 14С представлен вестерн-блот, который был проведён для оценки фосфорилирования ERK в клетках гепатомы H4IIE. Следует отметить, что BsAbl7 не блокировал способность FGF19 активировать комплекс FGFR4/KLB (Фиг. 14В) или индуцировать фосфорилирование ERK в клетках гепатомы H4IIE (Фиг. 14С).
На Фигуре 15А представлены значения уровеней глюкозы в крови (день 7), % изменения массы тела (день 7) и ежедневного потребления пищи (дни 0-3) у мышей C57BL/6 на диете с низким уровнем жира и мышей db/db (п = 7) после однократной внутрибрюшинной инъекции BsAbl7 или контрольного IgG в дозе 3 мг/кг (мыши на диете с низким уровнем жира) или 5 мг/кг (мыши db/db).
На Фигуре 15В представлены уровни массы тела и глюкозы в крови мышей с индуцированным диетой ожирением (DIO), которым вводили внутрибрюшинные инъекции указанного IgG (BsAb20) в дозе 3 мг/кг в дни 0 и 6 (стрелки). N = 9.
На Фигуре 15С представлены результаты теста на толерантность к глюкозе с теми же мышами и антителами, данные по которым указаны на Фигуре 15В, на 14-й день.
На Фигуре 15D представлен уровень печеночных триглицеридов, а также маркеры в сыворотке животных, данные по которым указаны на Фигурах 15В-С, на 17-й день.
На Фигуре 15Е представлено потребление глюкозы всем организмом, измеренное во время гиперинсулинемических-эугликемических фиксаций для мышей DIO через 5 дней после одной внутрибрюшинной инъекции указанного IgG (BsAbl7) в количестве 10 мг/кг (N = 12). Горизонтальная ось отражает уровень инсулина в сыворотке крови. Стрелки указывают направление изменений от базального уровня к уровню после стимуляции инсулином, р <0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) по сравнению с контролем.
На Фигуре 15F представлена эндогенная выработка глюкозы, измеренная во время гиперинсулинемических-эугликемических фиксаций у мышей DIO через 5 дней после одной внутрибрюшинной инъекции указанного IgG (BsAbl7) в количестве 10 мг/кг (N = 12). Горизонтальная ось отражает уровень инсулина в сыворотке крови. Стрелки указывают направление изменений от базального уровня к уровню после стимуляции инсулином, р <0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) по сравнению с контролем.
На Фигуре 15G представлено поглощение глюкозы в тканях после стимуляции инсулином, измеренное во время гиперинсулинемических-эугликемических фиксаций у мышей DIO через 5 дней после одной внутрибрюшинной инъекции указанного IgG (BsAbl7) в количестве 10 мг/кг (N = 12). р <0,05 (*), <0,005 (**), <0,0001 (***) по сравнению с контролем.
Фигура 16А представляет N-концевую аминокислотную последовательность мышиного KLB (SEQ Ш N0: 165), а также соответствующую аминокислотную последовательность, кодируемую аллелем ЫЬ у мышей КО (SEQ Ш N0: 166). Миссенс-мутация в гене ЫЬ приводит к сдвигу рамки считывания после второго аминокислотного остатка в аллеле КО, что показано красным шрифтом.
На Фигуре 16В представлена экспрессия белка KLB в эпидидимальной белой жировой ткани мышей дикого типа (+/+) и нокаутных по ЫЬ мышей (-/-).
Фигура 16С иллюстрирует важную роль KLB для влияния BsAb20 на метаболизм глюкозы. Тест на толерантность к глюкозе (GTT) у мышей DIO, которые получили четыре еженедельные инъекции BsAb20 или контрольного IgG в дозе 3 мг/кг. GTT был проведен на 23-й день, через три дня после последней инъекции. Мыши находились в условиях HFD в течение 20 недель до GTT. *р <0,05.
На Фигуре 16D представлены параметры сыворотки мышей DIO на 7-й день после внутрибрюшинной инъекции биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRl антител или RlMAbl в дозе 50 мг/кг, или носителя. N = 6.
На Фигуре 17 представлено количество FGF23 и неорганического фосфора в сыворотке мышей DIO на 7-й день после внутрибрюшинной инъекции BsAbl7 в дозе 50 мг/кг. N = 6. *** Р <0,0005.
На Фигуре 18А представлено количество отклонений уровня глюкозы в артериальной крови в процессе эксперимента по фиксации. Мыши DIO получили BsAbl7 или контроль IgG в дозе 10 мг/кг за 5 дней до проведения эксперимента по фиксации.
На Фигуре 18В представлен вес тела в день проведения эксперимента по фиксации.
На Фигуре 18С представлена скорость инфузии глюкозы во время эксперимента по фиксации, р <0,05 (*), <0,001 (**) по сравнению с контролем.
На Фигуре 19А представлены потребление энергии (ЕЕ) (сверху) и дыхательный коэффициент (RQ) (снизу) у мышей DIO, получивших одну внутрибрюшинную инъекцию 10 мг/кг IgG в указанное время при 21-22° С. N = 7.
На Фигуре 19В представлены ЕЕ (вверху) и RQ (внизу) у мышей на диете с
низким уровнем жира, получивших одну внутрибрюшинную инъекцию 10 мг/кг IgG в указанное время. Мышей содержали при 21-22° С, после чего температура в клетках была изменена до термонейтральной (29-30° С) на 6 день после инъекции IgG. N = 6 ~ 7.
На Фигуре 19С представлено поглощение тканями фтордезоксиглюкозы (FDG) у мышей DIO через 40 ч после однократной внутрибрюшинной инъекции указанного IgG в дозе 10 мг/кг. N = 8. Мыши голодали в течение ночи перед измерением поглощения FDG.
На Фигуре 19D представлен вестерн-блот-анализ ingWAT, собранных на 7-й день после одной внутрибрюшинной инъекции (BsAbl7 или контрольного IgG при дозе 10 мг/кг) и хирургической имплантации осмотического насоса (CL316,243 (0,75 нмоль/ч) или носитель).
На Фигуре 19Е представлена экспрессия мРНК UCP1 в первичных подкожных адипоцитах человека, обработанных указанным белком в концентрации 30 нМ в течение 48 часов. N = 3.
На Фигуре 19F представлена температура тела мышей DIO, получавших 10 мг/кг BsAbl7 или контрольного IgG. N = 7 ~ 8.
На Фигуре 19G представлен профиль экспрессии генов в iBAT у мышей DIO, получивших однократно 10 мг/кг IgG и FGF21 два раза в день в дозе 2 мг/кг/сут или контрольный PBS в течение 5 дней. Представлены все гены, экспрессия которых значительно отличались в образцах после обработки BsAbl7 и контролем или FGF21 и контролем.
На Фигуре 19Н представлены ЕЕ (слева) и RQ (справа) у мышей на диете с низким уровнем жира, которые получили однократную внутрибрюшинную инъекцию биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRl антител или контрольного IgG в дозе 10 мг/кг и которым хирургически имплантировали осмотический насос (CL-316,243 в количестве 0,5 нмоль/ч или носитель) в день 0. Показаны средние значения в течение указанных 24 ч.
На Фигуре 20А представлены значения V02 (вверху), VC02 (посередине) и общая активность мышей DIO, описанных на Фигуре 19А. Значения V02 и VC02 нормированы на значения веса тела, измеренные в моменты времени, указанные как #. Мышам DIO вводили 10 мг/кг BsAbl7 или контрольного IgG.
На Фигуре 20В представлены значения V02 (вверху), VC02 (посередине) и общая активность мышей DIO, описанных на Фигуре 19В. Значения V02 и VC02 нормированы на значения веса тела, измеренные в моменты времени, указанные как #. Мышам DIO вводили 10 мг/кг BsAb 17 или контрольного IgG.
На Фигуре 21А представлено среднее значение ЕЕ по данным непрямой калориметрии. Величина среднего увеличения указана под графиками. DIO 21° С: Среднее значение ЕЕ в течение D3-D6 после инъекции IgG в эксперименте, представленном на Фиг. 19А. Мыши на диете с низким уровнем жира 21° С: среднее значение ЕЕ в течение D3-D6 после инъекции IgG в эксперименте, показанном на Фиг. 19В. Мыши на диете с низким уровнем жира после повышения температуры до 30° С: средние значения ЕЕ в течение D6-D9 после инъекции IgG (т.е. 3 дня после изменения температуры) в эксперименте, показанном на Фиг. 19В. DIO 30° С: среднее значение ЕЕ в течение D3-D6 после инъекции IgG у мышей DIO, акклиматизированных к термонейтральным условиям.
На Фигуре 21В представлены изменения ЕЕ у мышей DIO в термонейтральных условиях. Мышей DIO акклиматизировали к термонейтральным условиям в течение 2-х недель перед однократной внутрибрюшинной инъекцией (показано стрелкой) BsAbl7 или контрольного IgG в дозе 10 мг/кг. N = 3 ~ 4.
На Фигуре 21С представлены средние значения ЕЕ и RQ у мышей DIO при нормальной температуре лаборатории (21° С) в течение D3-5 после хирургической имплантации осмотического насоса и инъекции препарата. В DO мыши получили внутрибрюшиную инъекцию BsAbl7 или контрольного IgG в дозе 10 мг/кг. Группа FGF21 также получила болюс 2 мг/кг FGF21 путём внутрибрюшинной инъекции в DO. Каждой мыши также подкожно имплантировали осмотический насос в DO для инфузии FGF21 при дозе 60 мкг/сут или контрольного PBS.N = 8~9. **Р <0,005.
На Фигуре 22 представлены данные, показанные на Фиг. 19F, и представленные в другом масштабе, чтобы показать соответствующую разницу в центральной температуре тела в течение исследования у мышей DIO, получавших 10 мг/кг BsAbl7, и мышей DIO, получавших 10 мг/кг контрольного IgG. Черная линия представляет собой расчетную разницу, и синие линии являются 95%-ными точечными доверительными интервалами для разницы. IgG вводили на 13-й день (стрелка). N = 7 ~ 8.
На Фигуре 23 показано, что FGF21 и BsAb20 индуцируют примерно одинаковый уровень фосфорилирования ERK и МЕК в эпидидимальной жировой ткани, паховой жировой ткани (ingWAT), межлопаточной бурой жировой ткани (iBAT) и ткани поджелудочной железы. Ткани получали через 1 ч (печень, поджелудочная железа и эпидидимальная белая жировая ткань (eWAT)) или через 2 ч (iBAT или ingWAT) после внутрибрюшинной инъекции мышам C57BL/6 на диете с низким уровнем жира в количестве 10 мг/кг (BsAb20) или 1 мг/кг (FGF21). Тотальные ERK и МЕК служат в качестве контроля количества нанесенного образца.
На Фигуре 24А представлены изменения веса тела и уровни высокомолекулярного адипонектина в сыворотке крови мышей DIO (N = 6), которые получили однократную внутрибрюшинную инъекцию BsAbl7 в указанной дозе (мг/кг).
На Фигуре 24В показаны изменения веса тела и уровни высокомолекулярного адипонектина в сыворотке крови макак (N = 3), которые получили однократную внутрибрюшинную инъекцию BsAbl7 в указанной дозе (мг/кг).
На Фигуре 24С представлен ЕЕ мышей DIO (слева: дикий тип, справа: adipoq КО), которые получили однократную внутрибрюшинную инъекцию указанного IgG (BsAbl7) в дозе 10 мг/кг (стрелка). N = 5 ~ 6.
На Фигуре 24D представлены различные метаболические параметры мышей дикого типа (+/+) и adipoq КО (-/-) DIO, которые получили однократную внутрибрюшинную инъекцию указанного IgG (BsAbl7) в дозе 10 мг/кг. N = 6. AUC: площадь под кривой в GTT или ITT (Т = 0 ~ 2 ч). р <0,1 (#), <0,05 (*), <0,005 (**) по сравнению с контролем.
На Фигуре 25 представлена тотальная РНК, которую получили от мышей, описанных на Фиг. 19G, с помощью qPCR.
На Фигуре 26 представлен уровень фосфорилирования ERK под действием BsAbl7 в мышиных тканях. Ткани получали через 1 ч после внутрибрюшинной инъекции мышам C57BL/6 на диете с низким уровнем жира BsAbl7 или контрольного IgG в количестве 10 мг/кг, и обрабатывали иммуногистохимически с использованием антител, специфических к фосфорилированному ERK. Репрезентативные изображения, полученные от 2-х животных, показаны для каждой группы. (1) Поджелудочная железа, (2) корональный участок мозга, содержащий супрахиазматические ядра (стрелка), (3) корональный участок мозга, содержащий area postrema (треугольные скопления окрашенных клеток) и центральный канал (стрелка) и (4) корональный участок мозга, содержащий срединное возвышение (стрелка). Следует отметить, что индуцированный BsAbl7 сигнал был ожидаем в ацинарных клетках поджелудочной железы, но не в любом из участков головного мозга.
На Фигуре 27 представлена нормализация HFD-индуцированной пролиферации гепатоцитов под действием BsAb20. Поглощение BrdU печенью у мышей DIO, получавших BsAb20 (1 или 3 мг/кг/неделю) или контрольный IgG (3 мг/кг/неделю) в течение 8 недель или у контрольных мышей C57BL/6 на диете с низким уровнем жира. * р <0,05 по сравнению с мышами DIO, получавшими IgG (N = 5 ~ 8).
На Фигуре 28А представлена схема эксперимента, результаты которого показаны на Фигуре 28В. Мыши DIO получали BsAb20 (1 или 3 мг/кг/неделю) или контрольный
IgG (1 мг/кг/неделю) в течение 6 недель, как указано на Фигуре. Контрольные мыши C57BL/6 на диете с низким уровнем жира оставались без обработки.
На Фигуре 28В представлен костный фенотип после обработки BsAb20. Бедро и голень препарировали и подвергали анализу дСТ. (N = 7 ~ 8). Следует отметить, что не наблюдалось никаких отрицательных эффектов по различным параметрам костной ткани в трабекулярной и кортикальной кости, за исключением возможного утолщения кортикальной кости, которое показало тенденцию к снижению при обработке 3 мг/кг/нед BsAb20, хотя значения и не достигли статистической значимости. Так как было показано уменьшение толщины кортикальной кости в отсутствие влияния на плотность трабекулярной костной ткани у мышей на низкокалорийной диете (11), наблюдаемый эффект может быть связан с потерей веса, р <0,001 (***), <0,01 (**), <0,05 (*), <0,1 (#), <0,2 ($) по сравнению с мышами DIO, обработанными контрольным IgG. N = 7 ~ 8.
На Фигуре 29 представлены уровни кортикостерона у мышей после обработки BsAbl7. Уровни сывороточного кортикостерона были измерены при экспериментальном времени (ZT) = 3 после эвтаназии путем декапитации. Контрольные (CTRL) мыши на диете с низким уровнем жира не получали никакой обработки. Липополисахариды (LPS) вводили внутрибрюшинно мышам на диете с низким уровнем жира в дозе 1 мг/кг за 3 ч до эвтаназии (ZT = 0) в качестве положительного контроля (12). IgG вводили внутрибрюшинно мышам DIO в дозе 5 или 25 мг/кг за 5 дней до эвтаназии, как указано. Указаннный статистический анализ был проведен без группы LPS. N = 12.
На Фигуре 30 представлено связывание различных биспецифических антител с плечами анти-FGFRl и анти-KLB с клетками, экспрессирующими FGFRlc или FGFRlc и KLB.
На Фигуре 31 представлено связывание производных YW182.5 и YW182.5 с белками FGFR1, показанное методом ELISA.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для большей ясности, но не в качестве ограничения подробное описание раскрытого предмета разделено на следующие подразделы. I. Определения П. Антитела
III. Способы применения
IV. Фармацевтические лекарственные формы и
V. Изделия.
III.
I. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
"Каркасная область человеческого акцептора" для целей настоящего изобретения представляет собой структуру, содержащую аминокислотную последовательность каркасной области вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасной области вариабельного домена тяжелой цепи (VH), полученных из каркасной области человеческого иммуноглобулина или каркасной области человеческой консенсусной последовательности, которые определены ниже. Каркасная область человеческого акцептора, "полученная из" каркасной области человеческого иммуноглобулина или каркасной области человеческой консенсусной последовательности, может содержать ту же аминокислотную последовательность, или она может содержать изменения аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления, количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее, или 2, или менее. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, каркасная область человеческого акцептора VL идентична последовательности каркасной области VL человеческого иммуноглобулина или последовательности каркасной области человеческой консенсусной последовательности.
"Аффинность" относится к силе суммы всех нековалентных взаимодействий между одним участком связывания молекулы (например, антитела) и его партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в настоящем описании, "аффинность связывания" относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к её партнеру Y в общем случае может быть представлено константой диссоциации (Kd). Аффинность может быть измерено обычными способами, известными в данной области, в том числе теми, которые представлены в настоящем описании. Конкретные иллюстративные примеры вариантов осуществления измерения аффинности связывания описаны ниже.
Антитело со "зрелой аффинностью" относится к антителу с одним или несколькими изменениями в одной или нескольких гипервариабельных областях (HVR) по сравнению с исходным антителом, которое не обладает такими изменениями, приводящими к улучшению аффинности антитела к антигену.
"Клото-бета", "KLB" и "бета-Клото", как они использованы в настоящем описании, относятся к любому нативному бета-Клото из любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Термин охватывает
"полноразмерный", непроцессированный KLB, а также любую форму KLB, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также включает встречающиеся в природе варианты KLB, например, варианты сплайсинга или аллельные варианты. Неограничивающий пример аминокислотной последовательности человеческого KLB, которая является мишенью антитела по настоящему изобретению, за исключением сигнальной последовательности, выглядит следующим образом:
FS GDGRAIWS KNPNFTPVNES QLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGS WKKDGKGPSIW
DHFIHTHLKN VS S TNGS S DS YIFLEKDLS ALDFIG VS F YQFS IS WPRLFPD GIVT V AN АК
GLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQM
FGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHN
YNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYP
EGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREA
LNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSRVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYT
AWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPD
VQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRP
AQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSE
GLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVK
LWITINEPNRLS DIYNRS GNDT YG A AHNLLV АН ALA WRLYDRQFRPS QRG A VS LS LH А
DWAEPANPY ADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGD YPA AMRE YIAS KHRRGLS S S
ALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPT
RLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKA
YLIDKVRIKGYYAFKLAEEKS KPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVIS S RGFPFENS S SRCS Q
TQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKK
GKRVVS (SEQ ID NO: 145).
В некоторых вариантах осуществления, белок KLB может включать N-концевую сигнальную последовательность, имеющую аминокислотную последовательность MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTG (SEQ ID NO: 157).
Термин "С-концевой домен KLB" относится к карбокси-концевому гликозидаза-подобному домену KLB. Например, С-концевой домен примера белка KLB, представленный в последовательности SEQ Ш N0: 145, содержит следующую аминокислотную последовательность:
FPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTD FVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGI SAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINE
PNRLS DIYNRS GNDT YG A AHNLLV AH ALA WRLYDRQFRPS QRG A VS LS LH AD W AEPA
NPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTE
AERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPW
GVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVR
IKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSR (SEQ Ю NO:
155).
Термины "анти-KLB антитело" и "антитело, которое связывается с KLB" относятся к антителу, которое способно связываться с KLB с достаточной аффинностью таким образом, что антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на KLB. В одном варианте осуществления степень связывания анти-KLB антитела с неродственными, не относящимися к KLB белками составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с KLB, что измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). В некоторых вариантах осуществления, антитело, которое связывается с KLB имеет константы диссоциации (Kd) < 1 мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ
-8 -8 -13
или < 0,001 нМ (например, 10" М или менее, например, от 10" М до 10" М, например,
-9 -13
от 10" М до 10" М). В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело связывается с эпитопом KLB, который является консервативным для KLB из различных видов. В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело связывается с эпитопом KLB, который находится в С-концевой части белка.
Термин "рецептор фактора роста фибробластов 1" или "FGFR1", используемый в настоящем описании, относится к любому нативному FGFR1 из любого позвоночного животного, включая млекопитающих, таких как приматы (например, человек) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. Термин охватывает "полноразмерный", непроцессированный FGFR1, а также любую форму FGFR1, которая является результатом процессинга в клетке. Термин также включает встречающиеся в природе варианты FGFR1, например, варианты сплайсинга или аллельные варианты, в том числе FGFRlc. Не ограничивающий пример аминокислотной последовательности человеческого FGFRlc приведён ниже:
MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRL
RDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFS
VNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKETDNTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTV
KFKCPSSGTPNPTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIV
ENEYGSINHTYQLDVVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWL
KHIEVNGSKIGPDNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIG
LSHHSAWLTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSD
FHS QM A VHKLAKSIPLRRQ VT VS ADS S AS MNS G VLLVRPS RLS S S GTPMLAG VS E YEL
PEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATE
KDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPG
LEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVM
KIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFT
LGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLV
EDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHP
AQLANGG LKRR (SEQ ID NO: 146).
Термин "анти-FGFRl с антитело" относится к антителу, которое способно связываться с FGFRlc достаточной аффинностью таким образом, что антитело является полезным в качестве диагностического и/или терапевтического средства для целенаправленного воздействия на FGFRlc. В одном варианте осуществления степень связывания анти-FGFRl антитела с неродственным, не относящимся к FGFRlc белком составляет менее чем приблизительно 10% от связывания антитела с FGFRlc, что измерено, например, с помощью радиоиммуноанализа (RIA). В некоторых вариантах осуществления, антитело, которое связывается с FGFRlc, имеет константы диссоциации (Kd) < 1 М, < 100 мМ, < 10 мМ, < 1 мМ, < 100 мкМ, < 10 мкМ, < 1 мкМ, < 100 нМ, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ, или < 0,001 нМ. В некоторых вариантах осуществления, Kd антитела, которое связывается с FGFRlc, описанным в настоящем
-3 -8 -8
описании, может быть 10" М или менее, или 10" М или менее, например, от 10" М до
-13 -9 -13
10" М, например, от 10" М до 10" М. В некоторых вариантах осуществления, анти-FGFRl антитело связывается с эпитопом FGFRlc, который является консервативным среди FGFRlc из различных видов.
Термин "антитело" в настоящем описании используется в самом широком смысле и включает различные структуры антитела, включая, без ограничения, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют желаемую антигенсвязывающую активность.
"Фрагмент антитела" относится к молекуле, кроме интактного антитела, которое содержит часть интактного антитела, которая связывается с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; диатела; линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител (например, scFv); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.
"Антитело, которое конкурирует за связывание" с контрольным антителом, относится к антителу, которое блокирует связывание контрольного антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более, и, наоборот, референсное антитело блокирует связывание антитела с его антигеном в конкурентном анализе на 50% или более. Пример конкурентного анализа описан в разделе "Антитела", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).
Термин "химерные" антитела относится к антителам, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи получена из одного источника или вида, в то время как остальная часть тяжелой и/или легкой цепи, получена из другого источника или вида.
"Класс" антитела относится к типу константного домена или константной области, которым обладает его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно подразделены на подклассы (изотипы), например, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl и IgA2. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам иммуноглобулинов, называются а, 8, s, у и \х, соответственно.
Термин "цитотоксический агент", используемый в настоящем описании, относится к веществу, которое ингибирует или предотвращает клеточную функцию и/или вызывает гибель клеток или их разрушение. Цитотоксические агенты включают,
211 131 125 90 186 188
без ограничения, радиоактивные изотопы (например, At ,1 ,1 , Y , Re , Re ,
153 * 212 32 212
Sm , Bi , P , Pb и радиоактивные изотопы Lu); химиотерапевтические агенты или лекарственные средства (например, метотрексат, адриамицин, алкалоиды барвинка (винкристин, винбластин, этопозид), доксорубицин, мелфалан, митомицин С, хлорамбуцил, даунорубицин или другие интеркалирующие агенты); агенты, ингибирующие рост; ферменты и их фрагменты, такие как нуклеолитические ферменты; антибиотики; токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты; и различные противоопухолевые или противораковые средства, описанные ниже.
"Эффекторные функции" относятся к таким видам биологической активности, относимых к Fc-области антитела, которые изменяются с изотипом антитела. Примеры эффектор ных функций антитела включают связывание Clq и опосредованную комплементом цитотоксичность (CDC); связывание Fc-рецептора; антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и
активацию В-клеток.
"Эффективное количество" агента, например, фармацевтической лекарственной формы, относится к количеству, эффективному при необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Для примера, а не в качестве ограничения, "эффективное количество" может относиться к количеству антитела, раскрытого в настоящем описании, которое может облегчить, свести к минимуму и/или предотвратить симптомы заболевания и/или расстройства, продлить выживаемость и/или продлить период до рецидива заболевания и/или расстройства.
Термин "Fc-область" в настоящем описании используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит, по меньшей мере, часть константной области. Термин включает нативную последовательность Fc-областей и варианты Fc-областей. В некоторых вариантах осуществления, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG располагается в пределах от Cys226 или от Рго230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Тем не менее, С-концевой лизин (Lys447) Fc-области может присутствовать или может не присутствовать. Если не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области находится в соответствии с системой нумерации EU, также называемой EU-индексом, как это описано в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.
"Каркасная область" или "FR" относится к аминокислотным остаткам вариабельного домена, отличным от аминокислотных остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно присутствуют в следующем порядке в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
Термины "полноразмерное антитело", "интактное антитело" и "целое антитело" используются в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу, подобную нативной структуре антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, как определено в настоящем описании.
Термины "клетка-хозяин", "линия клеток-хозяев" и "культура клеток-хозяев", которые используются в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, в том числе к потомству таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты" и "трансформированные клетки",
которые включают первичную трансформированную клетку и её потомков без учета числа пассажей. Потомки могут быть не полностью идентичными родительской клетке по содержащимся нуклеиновым кислотам, но могут содержать мутации. Мутантные потомки, которое имеют ту же функцию или биологическую активность, на которые был направлен скрининг или отбор первоначально трансформированных клеток, включены в настоящее описание.
"Человеческое антитело" является антителом, которое имеет аминокислотную последовательность, которая соответствует антителу, образующемуся в организме человека или клетках человека или полученному из отличного от человека источника, который использует репертуары антител человека или другие кодирующие антитела человеческие последовательности. Это определение человеческого антитела специально исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.
"Каркасная область человеческой консенсусной последовательности" является каркасной областью, которая представляет собой наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки при отборе последовательностей каркасных областей VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, отбор последовательностей VL или VH человеческого иммуноглобулина производится из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. В общем случае, подгруппа последовательностей является такой подгруппой, которая указана в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3. В некоторых вариантах осуществления, для VL подгруппа является подгруппой каппа I, как это указано в Kabat et al. выше. В некоторых вариантах осуществления, для VH подгруппа является подгруппой III, как это указано в Kabat et al. выше.
"Гуманизированное" антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, отличных от человеческих, и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из, по меньшей мере, одного, а обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все HVR (например, CDR) соответствуют таковым из антитела, отличного от человеческого антитела, и все или по существу все FR соответствуют таковым в человеческом антителе. Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать, по меньшей мере, часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. "Гуманизированная форма" антитела, например, отличного от человеческого антитела, относится к антителу, которое подверглось гуманизации.
Термин "гипервариабельная область" или "HVR", используемый в настоящем описании, относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности ("определяющие комплементарность области" или "CDR") и/или образуют структурно определенные петли ("гипервариабельные петли"), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки ("контакт с антигеном"). Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) пронумерованы в настоящем описании в соответствии с Kabat et al., выше. Как правило, антитела содержат шесть HVR: три в VH (HI, Н2, НЗ) и три в VL (LI, L2, L3). Примеры HVR в настоящем описании, включают:
(a) гипервариабельные петли, соответствующие аминокислотным остаткам 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (HI), 53-55 (Н2) и 96-101 (НЗ) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) CDR, соответствующие аминокислотным остаткам 24-34 (LI), 50-56 (L2), 8997 (L3), 31-35b (HI), 50-65 (H2) и 95-102 (НЗ) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD(1991));
(c) контакт с антигеном, соответствующий аминокислотным остаткам 27с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (HI), 47-58 (Н2) и 93-101 (НЗ) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); а также
(d) комбинации (a), (b) и/или (с), включая аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (HI), 26-35b (HI), 49-65 (H2), 93-102 (НЗ), и 94-102 (НЗ).
В некоторых вариантах осуществления, остатки HVR включают остатки, которые определены на Фигуре ЗА или ЗВ или в другом месте данного описания.
"Иммуноконъюгат" относится к антителам, конъюгированным с одной или несколькими гетерологичными молекулами, включая цитотоксический агент, но не ограничиваясь им.
Термины "индивидуум" или "субъект", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к млекопитающим. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак, лошадей), приматов (например, людей и приматов, отличных от человека, таких, как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления, индивидуум или субъект является человеком.
"Выделенное" антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонентов его естественного окружения. В некоторых вариантах осуществления,
антитело очищают до более чем 95% или 99% чистоты, что определяется, например, электрофоретически (например, SDS-PAGE, изоэлектрическим фокусированием (IEF), капиллярным электрофорезом) или хроматографически (например, ионообменной HPLC или HPLC с обращенной фазой). Для обзора способов оценки чистоты антител, см., например, Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).
"Выделенная" нуклеиновая кислота относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая была отделена от компонентов её природного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу нуклеиновой кислоты, но молекула нуклеиновой кислоты присутствует экстрахромосомно или в хромосомной локализации, которая отличается от естественной локализации в хромосоме.
"Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело" (в том числе относящаяся к специфическим антителам, например, анти-KLB антителу) относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), в том числе такой молекуле нуклеиновой кислоты (таким молекулам нуклеиновых кислот) в одном векторе или в отдельных векторах и такой молекуле нуклеиновой кислоты (таким молекулам нуклеиновых кислот), которая присутствует (которые присутствуют) в одном или нескольких местах в клетке-хозяине.
Термин "моноклональное антитело", используемый в настоящем описании, относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих естественные мутации или мутации, возникающие в процессе получения препарата моноклонального антитела; такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, термин "моноклональный" указывает на характер антитела, полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должен быть истолкован как требующий получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые должны использоваться в соответствии с раскрытым в настоящем описании изобретением, могут быть получены с помощью различных методов, включая, но не ограничиваясь методом гибридомы, методом рекомбинантных ДНК, методом фагового дисплея и методами, предусматривающими использование трансгенных животных,
содержащих все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, такие способы и другие примеры способов получения моноклональных антител приведены в настоящем описании.
"Голое антитело" относится к антителу, которое не конъюгировано с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим остатком) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической лекарственной форме.
"Нативные антитела" относятся к встречающимся в природе молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Так, например, нативные антитела IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером около 150000 дальтон, состоящие из двух одинаковых легких цепей и двух одинаковых тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными мостиками. От N- к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которая также называется тяжёлым вариабельным доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, а затем три константных домена (CHI, СН2 и СНЗ). Аналогичным образом, от N- к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), называемую также лёгким вариабельным доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которым следует константный лёгкий (CL) домен. Легкая цепь антитела может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (к) и лямбда (к), согласно аминокислотной последовательности её константного домена.
Термин "вкладыш в упаковку", используемый в настоящем описании, относится к инструкциям, обычно включаемым в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях, касающихся применения таких терапевтических продуктов.
"Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности" по отношению к референсной последовательности полипептида определяется как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности референсного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения разрывов, если это необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета любых консервативных замен как части идентичности последовательности. Выравнивания в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно достичь различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign
(DNASTAR). Специалисты в данной области могут определить соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Для целей настоящего изобретения, однако, значения идентичности последовательности аминокислот в % были получены с использованием компьютерной программы для сравнения последовательностей ALIGN-2. Компьютерная программа для сравнения последовательностей ALIGN-2 разработана Genentech, Inc., и ее исходный код был зарегистрирован с пользовательской документацией в Бюро охраны авторских прав США, Вашингтон, округ Колумбия, 20559, где он зарегистрирован для охраны авторских прав США с регистрационным номером № TXU510087. Программа ALIGN-2 находится в открытом доступе от Genentech, Inc., Южный Сан Франциско, Калифорния, или может быть скомпилирована из исходного кода. Программа ALIGN-2 должна быть скомпилировна для использования в операционной системе UNIX, включая цифровой UNIX V4.0D. Все параметры сравнения последовательностей установлены программой ALIGN-2 и не меняются.
В тех ситуациях, где ALIGN-2 используется для сравнения аминокислотных последовательностей, % идентичности аминокислотной последовательности данной аминокислотной последовательности А по отношению к данной аминокислотной последовательности В, по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В или против данной аминокислотной последовательности В (что в качестве альтернативы может быть сформулировано как данная аминокислотная последовательность А, которая имеет определенный % идентичности аминокислотной последовательности по отношению к данной аминокислотной последовательности В, по сравнению с данной аминокислотной последовательностью В или против данной аминокислотной последовательности В) рассчитывают следующим образом:
100 умножить на дробь X/Y, где X представляет собой количество аминокислотных остатков, оцененных программой выравнивания ALIGN-2 как идентичные совпадения при программном выравнивании А и В, и где Y представляет общее количество аминокислотных остатков в В. Следует понимать, что там, где длина аминокислотной последовательности А не равна длине аминокислотной последовательности В, % идентичности аминокислотной последовательности А по отношению к В, не будет равен % идентичности аминокислотной последовательности В по отношению к А. Если специально не указано иное, то все значения % идентичности аминокислотных последовательностей, используемые в настоящем описании, получают, как описано в предыдущем абзаце с
использованием компьютерной программы ALIGN-2.
Термин "фармацевтическая лекарственная форма" относится к препарату, который находится в форме, способной обеспечить биологическую активность активного ингредиента, содержащегося в нем, для его эффективности, и который не содержит дополнительных компонентов, которые неприемлемо токсичны для субъекта, которому будут вводить лекарственную форму.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель", используемый в настоящем описании, относится к ингредиенту в фармацевтической лекарственной форме, который отличается от активного ингредиента, и который не токсичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает буфер, наполнитель, стабилизатор или консервант, но не ограничивается ими.
Используемый в настоящем описании термин "лечение" (и его грамматические варианты, такие как "лечить" или "терапия") относится к клиническому вмешательству в попытке изменить естественное течение состояния индивидуума, подвергаемого лечению, и которое может быть выполнено как с целью профилактики, так и при клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают предотвращение возникновения или рецидива заболевания, ослабление симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное облегчение болезненного состояния, ремиссию или улучшение прогноза, но не ограничиваются ими. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению могут быть использованы для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.
Термин "вариабельная область" или "вариабельный домен" относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела, как правило, имеют аналогичные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). (Смотри, например, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) Один домен VH или VL может быть достаточным для придания антигенсвязывающей специфичности. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, могут быть выделены с использованием домена VH или VL из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных доменов VL или VH, соответственно. См., например, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
Термин "вектор", как он используется в настоящем описании, относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной к переносу другой нуклеиновой кислоты, с которой он связан. Термин включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он внедрен. Некоторые векторы способны направлять экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Такие векторы в настоящем описании называются "экспрессионными векторами".
П. АНТИТЕЛА
В одном из аспектов настоящее изобретение основано, частично, на обнаружении биспецифических антител, которые связываются с KLB и FGFRlc и избирательно активируют рецептор ный комплекс FGFRlc/KLB и индуцируют полезные метаболические изменения, ожидаемые от FGF21 -подобной активности, в том числе потерю веса и улучшение метаболизма глюкозы и липидов, без существенного влияния на печень и без потери костной массы.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрены антитела, которые связываются с KLB. Настоящее изобретение также относится к анти-FGFRl антителам, например, анти-FGFRlc антителам. Настоящее изобретение также обеспечивает биспецифические антитела, которые связываются с KLB и FGFR1 (называемые в настоящем описании биспецифические анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела). В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению связывается с KLB и FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, антитела по настоящему изобретению включают антитела, которые не блокируют связывание и/или взаимодействие FGF лигандов, например FGF19 и FGF21, с комплексом KLB/FGFRlc.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не оказывает существенного влияния на печень, например, на функции печени. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией, авторы предполагают, что антитело по настоящему изобретению не приводит к активации рецепторного комплекса FGFRlc/KLB в печени. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не модулирует активность рецепторного комплекса FGFR/KLB в печени по сравнению с модуляцией рецепторного комплекса FGFR/KLB в печени белком FGF21. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не приводит к ингибированию комплекса FGFR4/KLB и/или не приводит к превышению уровня ферментов печени, таких как ALT, AST, ALP и GLDH, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не
функционирует как агонист комплекса FGFR2c/KLB и/или комплекса FGFR3c/KLB в печени, которые могут активировать сигналинг МАРК и/или изменять экспрессию Spry4 и Dusp6 в печени. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не приводит к активации сигналинга МАРК в печени по сравнению с активацией сигналинга МАРК с помощью белка FGF21. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не функционирует в качестве агониста комплекса FGFR4/KLB в печени.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может быть гуманизированным. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению включает каркасную область человеческого акцептора, например, каркасную область иммуноглобулина человека или структуру человеческой консенсусной последовательности.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может представлять собой моноклональное антитело, в том числе химерное, гуманизированное или человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может представлять собой фрагмент антитела, например, Fv, Fab, Fab', scFv, диантитело или F(ab')2. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело представляет собой полноразмерное антитело, например, интактное антитело IgGl, или антитело другого класса или изотипа, как определено в настоящем описании. В определенных вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может включать любой из признаков, по отдельности или в комбинации, как подробно описано ниже в разделах 1-7.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть использованы, например, для диагностики или лечения метаболических нарушений. Неограничивающие примеры метаболических расстройств включают синдром поликистозных яичников (PCOS), метаболический синдром (MetS), ожирение, неалкогольный стеатогепатит (NASH), неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), гиперлипидемию, артериальную гипертензию, диабет 2 типа, диабет не 2 типа, диабет 1 типа, латентный аутоиммунный диабет (LAD), диабет взрослого типа у молодых (MODY), а также старение и связанные с ним заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS.
А. Примеры анти-KLB антител
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным антителам, которые связываются с белком KLB. В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело по настоящему изобретению связывается с С-концевым доменом KLB. В
некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело по настоящему изобретению связывается с фрагментом KLB, который включает аминокислотную последовательность, SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142). В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело связывается с тем же эпитопом, что и анти-KLB антитело, например, 8С5, представленное в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело по настоящему изобретению содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1-15, например, 12 или 15; (b) HVR-H2, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 16-31, например, 28 или 31; (с) HVR-H3, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 32-47, например, 44 или 47; (d) HVR-L1, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 48-62, например, 49 или 62; (е) HVR-L2, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63-78, например, 75 или 78; и (f) HVR-L3, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 79-93, например, 90 или 93.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает анти-KLB антитело, содержащее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2, содержащей последовательность SEQ ID NO: 28; (с) HVR-H3, содержащей последовательность SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1, содержащей SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2, содержащей SEQ ID NO: 75; и (f) HVR-L3, содержащей SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает анти-KLB антитело, содержащее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащей SEQ ID NO: 31; (с) HVR-H3, содержащей последовательность SEQ Ш NO: 47; (d) HVR-L1, содержащей SEQ ID NO: 62; (e) HVR-L2, содержащей SEQ ID NO: 78; и (f) HVR-L3, содержащей SEQ ID NO: 93.
Настоящее изобретение также относится к анти-KLB антителу, которое содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющую, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 128. В некоторых вариантах осуществления, последовательность VH, имеющая, по меньшей
мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены, что раскрыто ниже), инсерции или делеции по отношению к референсной последовательности, но анти-KLB антитело, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с KLB. В некоторых вариантах осуществления, в SEQ ID NO: 128 в общей сложности были замещены, вставлены и/или удалены от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, замены, вставки или делеции возникают в областях вне HVR (то есть в FR). В качестве альтернативы или дополнительно, анти-KLB антитело включает последовательность VH с SEQ ID NO: 128, включая посттрансляционные модификации этой последовательности, что описано ниже. В некоторых вариантах осуществления, VH содержит одну, две или три HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 31, и (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 47.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает анти-KLB антитело, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 130. В некоторых вариантах осуществления, последовательность VL, имеющая, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%), 97%), 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены) инсерции или делеции по отношению к референсной последовательности, но анти-KLB антитело, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связывать KLB. В некоторых вариантах осуществления, в SEQ ID NO: 130 в общей сложности были замещены, вставлены и/или удалены от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, замены, вставки или делеции возникают в областях вне HVR (то есть, в FR). В качестве альтернативы или дополнительно, анти-KLB антитело содержит последовательность VL с SEQ ID NO: 130, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В некоторых вариантах осуществления, VL содержит одну, две или три HVR, выбранные из (a) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 62; (b) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 78; и (с) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 93.
Настоящее изобретение также относится к анти-KLB антителу, где антитело содержит VH, как описано в любом из вариантов осуществления, приведенных выше, и VL, как описано в любом из вариантов осуществления, приведенных выше. В некоторых
вариантах осуществления изобретения, антитело содержит последовательности VH и VL с SEQ Ш N0: 128 и SEQ Ш N0: 130, соответственно, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело связывается с фрагментом KLB, состоящим из аминокислотной последовательности SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).
В. Примеры анти-FGFRl антител
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к выделенным антителам, которые связываются с белком FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, анти-FGFRl антитело по настоящему изобретению связывается с FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает анти-FGFRl антитело, содержащее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из: (a) HVR-H1, содержащей SEQ ID NO: 136; (b) HVR-H2, содержащей SEQ ID NO: 137; (с) HVR-H3, содержащей SEQ ID NO: 138; (d) HVR-L1, содержащей SEQ ID NO: 139; (e) HVR-L2, содержащей SEQ ID NO: 140; и (f) HVR-L3, содержащей SEQ ID NO: 141.
В некоторых вариантах осуществления, анти-FGFRl антитело по настоящему изобретению содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющую, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 132. В некоторых вариантах осуществления, последовательность VH, имеющая, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по отношению к референсной последовательности, но анти-FGFRl антитело, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, в SEQ ID NO: 132 в общей сложности были замещены, вставлены и/или удалены от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, замены, вставки или делеции возникают в областях вне HVR (то есть в FR). В качестве альтернативы или дополнительно, анти-FGFRl антитело включает последовательность VH с SEQ ID NO: 132, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В некоторых вариантах осуществления, VH содержит одну, две или три HVR, выбранные из: (a) HVR-H1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 137, и (с) HVR-H3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 138.
Настоящее изобретение также относится к антителу анти-FGFRl, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи (VL), имеющий, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ Ш N0: 134. В некоторых вариантах осуществления, последовательность VL, имеющая, по меньшей мере, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции по отношению к референсной последовательности, но анти-FGFRl антитело, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, в SEQ ID NO: 134 в общей сложности, были замещены, вставлены и/или удалены от 1 до 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления, замены, вставки или делеции, присутствуют в областях вне HVR (то есть в FR). В качестве альтернативы или дополнительно, анти-FGFRl антитело содержит последовательность VL с SEQ ID NO: 134, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. В конкретном варианте осуществления, VL содержит одну, две или три HVR, выбранные из (a) HVR-L1, содержащей аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 139; (b) HVR-L2, содержащей аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 140; и (с) HVR-L3, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 141.
В другом аспекте предусмотрено анти-FGFRl антитело, которое содержит VH, как в любом из вариантов осуществления, приведенных выше, и VL, как в любом из вариантов осуществления, приведенных выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения, анти-FGFRl антитело содержит последовательности VH и VL с SEQ ID NO: 132 и SEQ ID NO: 134, соответственно, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.
В некоторых вариантах осуществления, антитело FGFR1 по настоящему изобретению связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ Ш NO: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).
С. Примеры биспецифических анти-КХВ/анти-FGFRl антител
Настоящее изобретение также обеспечивает биспецифические антитела, которые связываются с KLB и FGFR1 (т.е. биспецифические анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела). Биспецифическое антитело имеет две различных специфичности связывания, см., например, патенты США №№ 5922845 и 5837243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:12461252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cancer Res. 57:40084014. Для примера, а не в качестве ограничения, в настоящем описании предусмотрены
биспецифические антитела, имеющие один участок связывания (например, участок связывания антигена) для первого эпитопа, присутствующего на KLB, и второй участок связывания для второго эпитопа, присутствующего на FGFR1. Для примера, а не в качестве ограничения, настоящее изобретение относится к антителу, в котором одно плечо связывается с KLB и включает любую из последовательностей анти-KLB антител, представленных в настоящем описании, и второе плечо связывается с FGFR1 и включает любую из последовательностей анти-FGFRl антител, представленных в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению имеет один участок связывания первого эпитопа, присутствующий на KLB, и второй участок связывания второго эпитопа, присутствующего на FGFRlc.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, представленное в настоящем описании, относится к антителу, которое модулирует активность комплекса KLB/FGFRlc. Например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело может функционировать в качестве агониста и активировать комплекс KLB/FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl представляет собой антитело, которое увеличивает активность комплекса KLB/FGFRlc, по меньшей мере, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% или 99,9%. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl может представлять собой антитело, которое приводит к фосфорилированию последовательно активируемых мишеней комплекса KLB/FGFRlc, например, МАРК и/или ERK.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, представленное в настоящем описании, относится к антителу, которое модулирует активность комплекса KLB/FGFRlc и не блокирует взаимодействие и/или связывание нативных лигандов FGF, например FGF19 и FGF21, с комплексом KLB/FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, представленное в настоящем описании, относится к антителу, которое не блокирует активность и/или связывание нативных лигандов FGF с рецептором FGF в отсутствие KLB. Для примера, а не в качестве ограничения, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению не блокирует взаимодействие нативных лигандов FGF с комплексом FGFR1/KLA и/или только FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, представленное в настоящем описании, относится к антителу, которое не блокирует активность и/или связывание нативных лигандов FGF с KLB в отсутствие FGFR1. Для
примера, а не в качестве ограничения, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl по настоящему изобретению не блокирует взаимодействие нативных лигандов FGF с комплексом FGFR4/KLB, комплексом FGFR2c/KLB и/или комплексом FGFR3c/KLB.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl, например, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl с или его антигенсвязывающия часть, включает области тяжелой цепи и легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, полноразмерная тяжелая цепь включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, полноразмерная легкая цепь включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 131. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, полноразмерная тяжелая цепь содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 129. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, полноразмерная легкая цепь включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 131.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl, например, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl с или его антигенсвязывающая часть, включает вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 128. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область легкой цепи включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 130. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 128. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот, представленную в SEQ ID NO: 130.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ Ш NO: 1-15, например, 12 или 15; (b) HVR-H2,
содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ Ш N0: 16-31, например, 28 или 31; (с) HVR-H3, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 32-47, например, 44 или 47; (d) HVR-L1, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из из SEQ ID NO: 48-62, например, 49 или 62; (е) HVR-L2, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 63-78, например, 75 или 78; и (f) HVR-L3, содержащей любую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 79-93, например, 90 или 93.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, например, биспецифическое антитело aHTH-KLB/aHTH-FGFRlc, содержит, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей SEQ Ш N0: 12; (b) HVR-H2, содержащей SEQ Ш N0: 28; (с) HVR-H3, содержащей SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1, содержащей SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2, содержащей SEQ ID NO: 75; и (f) HVR-L3, содержащей SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает анти-KLB антитело, содержащее, по меньшей мере, одну, две, три, четыре, пять или шесть HVR, выбранных из (a) HVR-H1, содержащей SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2, содержащей SEQ ID NO: 31; (с) HVR-H3, содержащей последовательность SEQ Ш NO: 47; (d) HVR-L1, содержащей SEQ ID NO: 62; (e) HVR-L2, содержащей SEQ ID NO: 78; и (f) HVR-L3, содержащей SEQ ID NO: 93.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl с антитело включает вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR1 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1-15. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR2 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16-31. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR3 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 32-47. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR1 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 48-62. В некоторых вариантах
осуществления, домен CDR2 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ГО N0: 63-78. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR3 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 79-93.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, например, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRlc, включает вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3, и вариабельную область легкой цепи, которая содержит домены CDR1, CDR2 и CDR3. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR1 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1-15. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR2 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 16-31. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR3 вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 32-47. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR1 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48-62. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR2 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 63-78. В некоторых вариантах осуществления, домен CDR3 вариабельной области легкой цепи включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 79-93.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, например, биспецифическое антитело aHTH-KLB/aHTH-FGFRlc, включает домен CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 15; домен CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ГО NO: 31; домен CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ГО NO: 47; домен CDR1 вариабельной области лёгкой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 62; домен CDR2 вариабельной области лёгкой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ГО NO: 78; и домен CDR3 вариабельной области лёгкой цепи, имеющий последовательность, представленную в SEQ ID NO: 93.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-КЬВ/анти-FGFRl включает первое антитело или его антигенсвязывающую часть, и включает второе антитело или его антигенсвязывающую часть, где первое антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с эпитопом, присутствующим на KLB, а второе антитело или его антигенсвязывающая часть связываются с эпитопом, присутствующим на FGFR1, например, на FGFRlc. Для примера, а не в качестве ограничения, первое антитело или его антигенсвязывающая часть может включать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи; и второе антитело или его антигенсвязывающая часть может включать вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи первого антитела или его антигенсвязывающей части включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 128. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, вариабельная область легкой цепи первого антитела или его антигенсвязывающей части включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 130. В некоторых вариантах осуществления, вариабельная область тяжелой цепи второго антитела или его антигенсвязывающей части включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 132. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, вариабельная область легкой цепи второго антитела или его антигенсвязывающей части включает аминокислоты, последовательность которых, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 134.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-KLB антитело, предусмотрено в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления, предусмотрено, что биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-KLB антитело, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 128, и последовательность VL из SEQ ID NO: 130. В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с фрагментом KLB, состоящим из
аминокислотной последовательности SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с фрагментом KLB с аминокислотной последовательностью, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 142.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-KLB антитело, предусмотренное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления, предусмотрено, что биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-KLB антитело, содержащее полноразмерную тяжелую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 129 и полноразмерную легкую цепь с последовательностью SEQ ID NO: 131.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-FGFRl антитело, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления, предусмотрено, что биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-FGFRl антитело, содержащее последовательность VH из SEQ ID NO: 132 и последовательность VL из SEQ Ш N0: 134. В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено, что биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с фрагментом последовательности FGFRlc, содержащим аминокислотную последовательность KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с тем же эпитопом, что и анти-FGFRl антитело, представленное в настоящем описании. Например, в некоторых вариантах осуществления, предусмотрено, что биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl связывается с тем же эпитопом, что и анти-FGFRl антитело, содержащее последовательность тяжелой цепи из SEQ ID NO: 133 и последовательность легкой цепи из SEQ ID NO: NO: 135.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична
последовательности, представленной в SEQ ID NO: 143.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl по настоящему изобретению связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 144.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с фрагментом KLB, имеющим аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 142, и связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности, представленной в SEQ ID NO: 143 или 144.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое связывается с фрагментом KLB, имеющим аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 142, и связывается с фрагментом FGFRlc, имеющим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 143 или 144.
1. Аффинность антитела
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может иметь константу диссоциации (Kd) < 1 М, < 100 мМ, < 10 мм, < 1 мМ, < 100 мкМ, < 10 мкМ, < 1 мкм, < 100 нм, < 10 нМ, < 1 нМ, < 0,1 нМ, < 0,01 нМ или < 0,001 нМ. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может
-3 -8 -8
иметь Kd приблизительно 10" или менее, или 10" М или менее, например, от 10" М до 10"13 М, например, от 10"9М до 10"13 М.
В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl может включать плечо анти-FGFRl, которое имеет Kd приблизительно от 10 нМ до 10 мкМ. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl с плечом FGFR1, которое имеет низкую аффинность, может снизить риск прочного связывания биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела с FGFR1 в отсутствие KLB и риск предотвращения связывания и/или активации FGFR1 другими лигандами FGF, такими как FGF1, FGF2, FGF8 и FGF23, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах осуществления, плечо FGFR1 с низкой аффинностью делает возможным присутствие более высоких уровней примесей анти-FGFRl, включая, но не
ограничиваясь ими, половина анти-FGFRl антитела, несущая выступ, нековалентные димеры анти-FGFRl, ковалентное димеры анти-FGFRl и высокомолекулярные варианты, которые не приводят к клинически значимым побочным эффектам. Например, в некоторых вариантах осуществления, в препарате биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела по настоящему изобретению могут присутствовать примерно 2% высокомолекулярных антител и 1,5% половин анти-FGFRl антител, несущих выступ, не приводя к неблагоприятным биологическим эффектам.
В некоторых вариантах осуществления, Kd может быть измерена с помощью анализа связывания радиоактивно меченого антигена (RIA). В некоторых вариантах осуществления, RIA может быть выполнен с Fab-версией интересующего антитела, и его антигеном. Для примера, а не в качестве ограничения, определение аффинности связывания Fab с антигеном производят посредством уравновешивания Fab с
125
минимальной концентрацией ( Г)-меченного антигена в присутствии серийных разведений немеченого антигена с последующим захватом связанного антигена на планшете, покрытом анти-Fab антителом (смотри, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Для создания условий анализа многолуночные планшеты MICROTITER(r) (Thermo Scientific) покрывали в течение ночи антителом захвата анти-Fab в концентрации 5 мкг/мл (Cappel Labs) в 50 мМ растворе карбоната натрия (рН 9,6), а затем блокировали 2% (вес/объем) раствором бычьего сывороточного альбумина в PBS в течение двух-пяти часов при комнатной температуре (приблизительно 23° С). В
1^5
неадсорбирующем планшете (Nunc # 269620) смешивали 100 пМ или 26 пМ [ " I]-антигена с серийными разведениями интересующего Fab (например, в соответствии с оценкой для анти-VEGF антитела, Fab-12, в Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). Интересующий Fab затем инкубировали в течение ночи; тем не менее, инкубирование можно продолжать в течение более длительного периода (например, около 65 часов), чтобы гарантировать достижение состояния равновесия. После этого смеси переносили на планшет захвата для инкубации при комнатной температуре (например, в течение одного часа). Затем раствор удаляли, и планшет промывали восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20(r)) в PBS. После высыхания планшетов в каждую лунку вносили по 150 мкл сцинтиллятора (MICROSCINT-20(tm); Packard), и анализировали планшеты на гамма-счетчике TOPCOUNT(tm) (Packard) в течение десяти минут. Концентрации каждого Fab, которые давали 20% от максимального связывания или менее, были отобраны для анализа конкурентного связывания.
В некоторых вариантах осуществления, Kd может быть измерена с помощью анализа поверхностного плазмонного резонансного BIACORE(r). Для примера, а не в
качестве ограничения, анализ использованием BIACORE(r)-2000 или BIACORE(r)-3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) проводят при температуре 25° С на чипах с иммобилизованным антигеном СМ5 при ~ 10 единицах отклика (RU). В некоторых вариантах осуществления, карбоксиметилированные декстрановые биосенсорные чипы (СМ5, Biacore, Inc.) активируют гчГ-этил-1Ч'(3-диметиламинопропил) карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями производителя. Антиген разбавляют 10 мМ растовором ацетата натрия, рН 4,8, до концентрации 5 мкг/мл (~ 0,2 мкМ) перед инъекцией при скорости потока 5 мкл/мин до достижения приблизительно 10 единиц отклика (RU) связанного белка. После инъекции для блокирования непрореагировавших групп антигена инъецируют 1 М этаноламин. Для измерений кинетики двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 нМ до 500 нМ) инъецируют в PBS с 0,05% поверхностно-активного вещества полисорбата 20 (TWEEN-20(tm)) (PBST) при 25° С со скоростью потока приблизительно 25 мкл/мин. Скорости ассоциации (kon) и скорости диссоциации (k0ff) вычисляют с помощью простой модели связывания Ленгмюра один к одному (BIACORE(r) Evaluation Software version 3.2) путём одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесная константа диссоциации (Kd) может быть вычислена как отношение k0ff/kon. См, например, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Если по данным поверхностного плазмонного резонансного скорость ассоциации превышает 106 М_1с-1, то скорость ассоциации может быть определена с помощью метода тушения флюоресценции, который измеряет увеличение или уменьшение интенсивности излучения флуоресценции (возбуждение = 295 нм; эмиссия = 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25° С от 20 нМ анти-антиген антитела (форма Fab) в PBS, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, которые измеряют на спектрометре, таком как спектрометр остановленного потока (Aviv Instruments) или спектрофотометр SLM-AMINCO(tm) 8000 серии (ThermoSpectronic) с перемешиваемой кюветой.
2. Фрагменты антител В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой фрагмент антитела. Фрагменты антител включают, без ограничения, фрагменты Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv и scFv, а также другие фрагменты, описанные ниже. Для обзора некоторых фрагментов антител см. Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Для обзора фрагментов scFv см., например, Pluckthiin, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); см. также WO 93/16185; и патенты США №№ 5571894 и 5587458. Для обзора Fab и Р(аЬ')2-фрагментов, содержащих остаточный эпитоп связывания рецептора
и увеличенное время полувыведения in vivo, см. патент США № 5,869,046.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может быть диантителом. Диантитела являются фрагментами антител с двумя антигенсвязывающими участками, которые могут быть бивалентными или биспецифическими. См., ЕР 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Триантитела и тетраантитела также описаны в Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может представлять собой однодоменное антитело. Однодоменные антитела являются фрагментами антител, которые содержат полный вариабельный домен тяжелой цепи, или его часть, или полный вариабельный домен легкой цепи антитела, или его часть. В некоторых вариантах осуществления, однодоменное антитело является человеческим однодоменным антителом (Domantis, Inc., Waltham, MA; см., напрмер, патент США № 6,248,516 В1).
Фрагменты антител могут быть получены различными методами, включая протеолитическое расщепление интактного антитела, а также получение из рекомбинантных клеток-хозяев (например, E.coli или фага), как раскрыто в настоящем описании, но не ограничиваясь этим.
3. Химерные и гуманизированные антитела
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению представляет собой химерное антитело. Определенные химерные антитела описаны, например, в патенте США № 4816567; и Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). В некоторых вариантах осуществления, химерное антитело по настоящему изобретению содержит вариабельную область, отличную от человеческой (например, вариабельную область, полученную от мыши, крысы, хомяка, кролика или примата, не являющегося человеком, такого как обезьяна), и человеческую константную область. В еще одном примере химерное антитело может быть антителом "переключенного класса", в котором класс или подкласс был изменен по сравнению с исходным антителом. Химерные антитела включают их антигенсвязывающие фрагменты.
В некоторых вариантах осуществления, химерное антитело по настоящему изобретению может представлять собой гуманизированное антитело. Как правило, антитело, отличное от человеческого, гуманизируют для снижения иммуногенности для человека, сохраняя при этом специфичность и аффинность исходного, отличного от человеческого антитела. Как правило, гуманизированное антитело содержит один или
несколько вариабельных доменов, в которых HVR, например, CDR (или их части), получены из отличного от человеческого антитела, и FR (или их части) получены из последовательностей человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно также будет содержать, по меньшей мере, часть человеческой константной области. В некоторых вариантах осуществления, некоторые остатки FR гуманизированного антитела замещены соответствующими остатками из отличного от человеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела.
Гуманизированные антитела и способы их получения рассматриваются, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), и далее описаны, напрмер, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патенты США №№ 5,821,337, 7,527,791, 6,982,321 и 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (описание перестановки определяющих специфичность областей (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (описание "замены поверхности"); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (описание "перестановки FR"); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (описание подхода "направленной селекции" при перестановке FR).
Человеческие каркасные области, которые могут быть использованы для гуманизации, включают, без ограничения, каркасные области, выбранные методом "наилучшего соответствия" (см., например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител определенной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепей (см., например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); зрелые человеческие (соматически мутированные) каркасные области или человеческие каркасные области зародышевой линии (см., например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и каркасные области, получены путём скрининга библиотек FR (см, например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. Человеческие антитела
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может представлять собой человеческое антитело. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных способов, известных в данной области техники. Человеческие антитела в целом описаны van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) и Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
Человеческие антитела могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, который был модифицирован для получения интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на введение антигена. Такие животные, как правило, содержат весь локус человеческого иммуноглобулина, или его часть, которые заменяют эндогенные локусы иммуноглобулинов, или которые присутствуют экстрахромосомно или интегрированы случайным образом в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей эндогенные локусы иммуноглобулинов, как правило, инактивируют. Для обзора способов получения человеческих антител из трансгенных животных см. Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). См. также, например, патенты США №№ 6075181 и 6150584, описывающие технологию XENOMOUSE(tm); патент США № 5770429, описывающий технологию HUMAB(r); патент США № 7041870, описывающий технологию К-М MOUSE(r), и опубликованную патентную заявку США № US 2007/0061900, описывающую технологию VELOCIMOUSE(r). Человеческие вариабельные области интактных антител, полученные от таких животных, могут быть дополнительно модифицированы, например, путем объединения с другой человеческой константной областью.
Человеческие антитела также могут быть получены методами гибридом. Были описаны клеточные линии миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для получения моноклональных человеческих антител. (См, например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные методом гибридомы В-клеток человека, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-3562 (2006). Дополнительные способы включают способы, описанные, например, в патенте США № 7,189,826 (описание получения моноклональных человеческих антител IgM из гибридомных клеточных линий) и в Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (описание гибридом человека-человека). Технология человеческой гибридомы (триомная технология) также описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005).
Человеческие антитела также могут быть получены путем выделения клонов последовательности Fv вариабельного домена, выбранных из библиотек фагового дисплея человеческого происхождения. Такие последовательности вариабельного домена можно затем объединить с желаемой человеческой константной областью.
Способы отбора человеческих антител из библиотек антител описаны ниже.
5. Антитела, полученные из библиотек
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть выделены путем скрининга комбинаторных библиотек для отбора антител с желаемой активностью или активностями. Например, в данной области известны различные способы получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на наличие антител, обладающих желательными характеристиками связывания. Такие способы рассмотрены, например, в Hoogenboom et al. в Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и дополнительно раскрыты, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); и Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
В некоторых способах фагового дисплея репертуары генов VH и VL клонируют отдельно с помощью полимеразной цепной реакции (PCR) и рекомбинируют случайным образом в фаговых библиотеках, которые затем могут быть подвергнуты скринингу на антигенсвязывающий фаг, как описано в Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Фаг обычно содержит фрагменты антител в виде одноцепочечных Fv (scFv) фрагментов или в виде Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получить антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости создания гибридом. В качестве альтернативы, можно клонировать наивный репертуар (например, человека), чтобы обеспечить единый источник антител к широкому спектру чужеродных, а также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). В некоторых вариантах осуществления, наивные библиотеки могут также быть сделаны синтетически путём клонирования сегментов неперестроенных V-генов из стволовых клеток, а также с использованием праймеров для PCR, содержащих случайную последовательность для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и осуществления перегруппировки in vitro, как описано Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, описывающие фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например, патент США № 5750373 и патентные публикации США №№ 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 и 2009/0002360.
Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих
антител, считаются человеческими антителами или фрагментами человеческих антител в настоящем описании.
6. Мультиспецифические антитела
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может представлять собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. Мультиспецифические антитела представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении, по меньшей мере, двух различных эпитопов. В некоторых вариантах осуществления, одной из специфичностей связывания является эпитоп, присутствующий на KLB, а другой -эпитоп на любом другом антигене. В некоторых вариантах осуществления, одной из специфичностей связывания является эпитоп, присутствующий на FGFR1, а другой -эпитоп на любом другом антигене. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело по настоящему изобретению может связываться с эпитопом KLB и может связываться с эпитопом FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело по настоящему изобретению может связываться с эпитопом KLB и может связываться с эпитопом FGFRlc. Биспецифические антитела могут быть получены в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.
Способы получения мультиспецифических антител включают, без ограничения, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелой цепи и легкой цепи иммуноглобулина, имеющих различные специфичности (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, и Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991), и конструирование "выступ-во-впадину" (смотри, например, патент США № 5731168). Мультиспецифические антитела могут быть также получены путём создания электростатических направляющих эффектов для получения Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004А1); сшивания двух или более антител или их фрагментов (см., например, патент США № 4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); с использованием лейциновых молний для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); с помощью технологии "диантител" для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); и с использованием одноцепочечных димеров Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как это описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Сконструированные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими учасками, включая антитела-"осьминоги", также включены в
настоящее описание (см., например, US 2006/0025576А1).
7. Варианты антител
Настоящее описание дополнительно предусматривает варианты аминокислотных последовательностей раскрытых антител. Например, может быть желательным улучшение аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотных последовательностей антитела могут быть получены путем внесения соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела, но не ограничиваются ими. Для получения конечной конструкции может быть произведена любая комбинация делеций, вставок и замен, при условии, что конечное антитело, т.е. модифицированное антитело, обладает требуемыми характеристиками, например, в отношении связывания антигена.
а) Варианты, содержащие замену, вставку и делецию
В некоторых вариантах осуществления, варианты антител могут иметь одну или несколько аминокислотных замен. Участки, представляющие интерес для мутагенеза путем введения замен, включают HVR и FR. Неограничивающие примеры консервативных замен показаны в Таблице 1 под заголовком "предпочтительные замены". Неограничивающие примеры более существенных изменений представлены в Таблице 1 под заголовком "примеры замен", и, как дополнительно описано ниже, замены разделены в соответствии с классом боковой цепи аминокислоты. Аминокислотные замены могут быть введены в интересующее антитело, и продукты могут быть подвергнуты скринингу на желательную активность, например, сохранившееся/усиленное связывание антигена, снижение иммуногенности или улучшение комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) или антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC).
(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, lie;
(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;
(3) кислотные: Asp, Glu;
(4) основные: His, Lys, Arg;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;
(6) ароматические: Trp, Туг, Phe.
В некоторых вариантах осуществления, неконсервативные замены означают замену представителя одного из этих классов на представителя из другого класса.
В некоторых вариантах осуществления, один из вариантов введения замен включает замещение одного или нескольких остатков гипервариабельной области исходного антитела, например, гуманизированного или человеческого антитела. Как правило, полученный вариант (полученные варианты), который отбирают для
дальнейшего исследования, характеризуется измененными, например, улучшенными определенными биологическими свойствами, такими как, например, повышенная аффинность, сниженная иммуногенность, по сравнению с исходным антителом, и/или по существу сохраняют некоторые биологические свойства исходного антитела. Неограничивающим примером варианта с заменой является антитело со зрелой аффинностью, которое удобно получать, например, с использованием способов созревания аффинности на основе фагового дисплея, таких как способы, которые представлены в настоящем описании. Коротко, один или несколько остатков HVR мутируют и варианты антитела подвергают скринингу с использованием фагового дисплея для обнаружения конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).
В некоторых вариантах осуществления, изменения (например, замены) могут быть введены в HVR, например, для улучшения аффинности антитела. Такие изменения могут быть введены в "горячие точки" HVR, то есть по аминокислотным остаткам, кодируемым кодонами, которые подвергаются мутациям с высокой частотой в ходе процесса соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), и/или остаткам, которые контактируют с антигеном, и полученные варианты VH или VL могут быть проанализированы на аффинность связывания. Созревание аффинности путем конструирования и повторного отбора из вторичных библиотек описано, например, в Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:137 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). В некоторых вариантах созревания аффинности множество вариантов последовательности разных генов, выбранных для созревания, может быть получено с помощью любого из множества способов (например, ПНР с ошибками, перетасовки участков цепи или олигонуклеотид-направленного мутагенеза). Затем создаётся вторичная библиотека. Далее эту библиотеку скринируют для идентифицикации любых вариантов антител с желаемой аффинностью. Другой способ получения множества вариантов последовательности включает HVR-направленные подходы, в которых рандомизируют несколько остатков HVR (например, 4-6 остатков за один раз). Остатки HVR, вовлеченные в связывание с антигеном, могут быть идентифицированы, например, с использованием аланин-сканирующего мутагенеза или моделирования. CDR-H3 и CDR-L3, в частности, часто становятся мишенью мутагенеза.
В некоторых вариантах осуществления, замены, вставки или делеции могут быть введены в один или несколько HVR при условии, что изменения не приведут к существенному снижению способности антитела связывать антиген. Например, в HVR
могут быть введены консервативные изменения (например, консервативные замены, как это предусмотрено в настоящем описании), которые существенно не снижают аффинность связывания. Такие изменения, например, могут быть ввежены вне контактирующих с антигеном остатков в HVR. В некоторых вариантах последовательностей VH и VL, указанных выше, каждая HVR либо остаётся неизменной, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.
Полезный способ идентификации остатков или областей антитела, которые могут быть использованы для мутагенеза, называется "аланин-сканирующий мутагенез", как описано в Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. В этом способе остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как Arg, Asp, His, Lys и Glu) идентифицируют и заменяют нейтральной или отрицательно заряженной аминокислотой (например, аланином или полиаланином), чтобы определить, влияет ли остаток или группа остатков на взаимодействие антитела с антигеном. В места расположения аминокислот, проявляющих функциональную чувствительность к начальным заменам, могут быть введены дополнительные замены. В качестве альтернативы или дополнительно, кристаллическая структура комплекса антиген-антитело может быть использована для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки могут быть выбраны для мутагенеза или исключены из кандидатов на проведение мутагенеза. Варианты могут быть подвергнуты скринингу, чтобы определить, обладают ли они желаемыми свойствами.
Вставки аминокислотных последовательностей включают слитые с амино- и/или карбокси-концом полипептиды длиной от одного остатка до ста или более остатков, а также вставки внутрь последовательности одного или множества аминокислотных остатков. Примеры концевых вставок включают антитело с N-концевым остатком метионина. Другие инсерционные варианты молекулы антитела включают слияние N-или С-конца антитела с ферментом (например, для антитело-направленной ферментативной пролекарственной терапии (ADEPT)) или полипептидом, который увеличивает время полувыведения антитела в сыворотке.
Ъ) Варианты гликозилирования
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению может быть изменено для увеличения или уменьшения степени его гликозилирования. Добавление или удаление участков гликозилирования к антителу может быть легко достигнуто путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, чтобы ввести или удалить один или несколько участков гликозилирования.
В некоторых вариантах осуществления, где антитело содержит Fc-область, может быть изменен присоединенный к нему углеводный фрагмент. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный, двуветвистый олигосахарид, который, как правило, прикреплен через N-связь к Asn297 в СН2-домене Fc-области. См., например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетил-глюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, прикрепленную к GlcNAc в "основании" двуветвистой структуры олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления, модификации олигосахаридов антитела по настоящему изобретению могут быть осуществлены для создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрены варианты антител с углеводной структурой, в которой отсутствует прикреплённая к области Fc фукоза (прямо или косвенно). Например, количество фукозы в таких антителах может составлять от примерно 1% до примерно 80%, от примерно 1% до примерно 65%, от примерно 5% до примерно 65% или от примерно 20% до примерно 40%, включая промежуточные значения.
В некоторых вариантах осуществления, количество фукозы может быть определено путем вычисления среднего количества фукозы в углеводной цепи при Asn297 по отношению к сумме всех углеводных структур, прикрепленных к Asn 297 (например, сложные, гибридные структуры и структуры с высоким содержанием маннозы), что определяется методом масс-спектрометрии MALDI-TOF, как, например, описано в публикации WO 2008/077546. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному примерно в положении 297 в области Fc (Eu нумерация остатков области Fc); тем не менее, Asn297 также может быть расположен на расстоянии ± 3 аминокислот до или после положения 297, то есть между позициями 294 и 300, из-за незначительных вариаций последовательности антител. Такие варианты фукозилирования могут иметь улучшенную функцию ADCC. См., например, патентные публикации США US 2003/0157108 (Presta, L.); 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Примеры публикаций, относящихся к "дефукозилированным" или "фукоза-дефицитным" вариантам антител, включают US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).
Дефукозилированные антитела могут быть получены в любой клеточной линии, которая является дефицитной по белку фукозилирования. Не ограничивающие примеры клеточных линий включают клетки Lecl3 СНО, дефицитные по белку фукозилирования (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); заявка США US 2003/0157108 Al, Presta, L; и WO 2004/056312 Al, Adams et al., особенно Пример 11) и нокаутные клеточные линии, такие как клетки СНО с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO2003/085107).
Также предусмотрены варианты антител с двуветвистыми олигосахаридами, например, в которых двуветвистый олигосахарид, присоединенный к области Fc антитела, делится на две части посредством GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженное фукозилирование и/или улучшенную функцию ADCC. Не ограничивающие примеры таких вариантов антител описаны, например, в заявке WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); патенте США 6,602,684 (Umana et al.); и US 2005/0123546 (Umana et al.). Также предусмотрены варианты антител, по меньшей мере, с одним остатком галактозы в олигосахариде, прикрепленном к Fc-области. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); и WO 1999/22764 (Raju, S.).
с) Варианты области Fc
В некоторых вариантах осуществления, в область Fc антитела, представленного в настоящем описании, могут быть введены одна или несколько модификаций аминокислот, что ведёт к созданию варианта области Fc. Вариант области Fc может содержать человеческую последовательность области Fc (например, человеческих областей Fc IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), содержащую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких положениях аминокислот.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его желательным кандидатом для тех применений, где период полувыведения антитела in vivo является важным, но некоторые эффекторные функции (такие как комплемент и ADCC) не являются нужными или полезными. Для подтверждения уменьшения/устранения активности CDC и/или ADCC может быть проведен анализ цитотоксичности in vitro и/или in vivo. Например, чтобы гарантировать, что антитело не имеет связывания FcyR (следовательно, скорее всего, не имеет
активности ADCC), но при этом сохраняет активность связывания FcRn, может быть проведен анализ связывания рецептора Fc (FcR). Первичные клетки для опосредования ADCC, NK-клетки, экспрессируют только FcyRIII, тогда как моноциты экспрессируют FcyRI, FcyRII и FcyRIII. Экспрессия FcR в гемопоэтических клетках приведена в Таблице 3 на странице 464 в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). He ограничивающие примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC представляющей интерес молекулы описаны в патенте США № 5500362 (см., например, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) и Hellstrom, I et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (см. Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). В качестве альтернативы, могут быть использованы нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности АСТГ(tm) для проточной цитометрии (Cell Technology, Inc. Mountain View, Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CYTOTOX 96(r) (Promega, Madison, Висконсин). Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и натуральные киллеры (NK). В качестве альтернативы или дополнительно, активность ADCC представляющей интерес молекулы может быть оценена in vivo, например, в модели на животных, такой как модель, описанная в Clynes et al. Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 95:652656 (1998). Для подтверждения отсутствия способности антитела связывать Clq и, следовательно, отсутствия активности CDC также могут быть выполнены анализы связывания Clq. См., например, анализ связывания Clq и СЗс методом ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть выполнен контроль CDC (см., например, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); и Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Анализ связывания FcRn и определение клиренса/полувыведения in vivo также могут быть выполнены с использованием способов, известных в данной области (см., например Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)). В некоторых вариантах осуществления, в Fc-область могут быть введены изменения, которые приводят к изменению (т.е. либо усилению, либо ослаблению) связывания Clq и/или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США № 6,194,551, WO 99/51642, и Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).
Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких остатков, выбранных из остатков 238, 265, 269, 270, 297, 327 и
329 в области Fc (патент США № 6737056). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутанты с заменами в двух или более аминокислотных положениях, выбранных из 265, 269, 270, 297 и 327, в том числе так называемый "DANA" Fc-мутант с заменой остатков 265 и 297 на аланин (патент США № 7332581).
Описаны некоторые варианты антител с усиленным или ослабленным связыванием с FcR. См., например, патент США № 6737056; WO 2004/056312 и Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).
В некоторых вариантах осуществления, вариант антитела по настоящему изобретению включает область Fc с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые улучшают ADCC, например, заменами в положениях 298, 333 и/или 334 в области Fc (нумерация остатков EU).
В некоторых вариантах осуществления, изменение, внесенное в область Fc антитела, например, биспецифического антитела, представленного в настоящем описании, может произвести вариант антитела с увеличенным периодом полувыведения и улучшенным связыванием с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) и Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), как описано в US2005/0014934A1 (Hinton et al.). Эти антитела содержат область Fc с одной или несколькими заменами, которые улучшают связывание области Fc с FcRn. Такие варианты Fc включают замены по одному или нескольким из остатков области Fc, выбранным из остатков 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 или 434, например, замену остатка 434 в области Fc (патент США № 7371826).
См. также Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821; и WO 94/29351, касающиеся других примеров вариантов области Fc.
d) Варианты антител с введенным остатком цистеина
В некоторых вариантах осуществления, может быть желательно создать варианты антител с введенным цистеином, например, "thioMAb", в которых один или несколько остатков антитела замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах осуществления, замещенные остатки встречаются в доступных участках антитела. При замене этих остатков цистеином активные тиольные группы, таким образом, оказываются расположенными в доступных местах антитела и могут быть использованы для конъюгации антитела с другими группами, такими как молекулы лекарственного средства или линкерные участки лекарственного средства, для создания иммуноконъюгата, как описано далее в настоящем описании. В некоторых вариантах
осуществления, один или несколько из следующих остатков могут быть заменены цистеином: V205 (нумерация Kabat) легкой цепи; А118 (нумерация EU) тяжелой цепи; и S400 (нумерация EU) тяжелой цепи области Fc. Антитела с введенным цистеином могут быть получены, как описано, например, в патенте США № 7,521,541. е) Производные антител
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению
может быть дополнительно модифицировано для включения в него дополнительных
небелковых фрагментов, которые известны в данной области и легко доступны.
Фрагменты, подходящие для получения производных антитела, включают
водорастворимые полимеры, но не ограничиваются ими. Неограничивающие примеры
водорастворимых полимеров включают полиэтиленгликоль (PEG), сополимеры
этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый
спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поликристаллический 1,3,6-триоксан,
этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо
статистические сополимеры), декстран или поли^-
винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси, но не ограничиваются вышеперечисленными. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущества в производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может быть любой молекулярной массы, и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и, если присоединено более одного полимера, то они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В целом, количество и/или тип полимеров, используемых для получения производных, могут быть определены на основе соображений, включающих, без ограничения, конкретные свойства или функции антитела, которые будут улучшены, возможность применения производного антитела в терапии при определенных условиях и т.д.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрены конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, которые могут быть селективно нагреты при воздействии излучения. В одном варианте осуществления, небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). В некоторых вариантах осуществления, излучение может быть любой длины волны, и включает, без ограничения, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой ближайшие к антителу-небелковому фрагменту клетки гибнут.
D. Способы получения антител
Антитела, представленные в настоящем описании, могут быть получены с использованием любого подхода, доступного или известного в данной области техники.В качетсве примера, но не в качестве ограничения, антитела могут быть получены с использованием рекомбинантных способов и композиций, например, как описано в патенте США № 4816567. Процедуры получения антител подробно описаны в приведенных ниже примерах.
В настоящем описании дополнительно предусмотрена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, раскрытое в настоящем описании. Например, выделенная нуклеиновая кислота может кодировать аминокислотную последовательность, которая включает VL, и/или аминокислотную последовательность, которая включает VH антитела, например, легкие и/или тяжелые цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления изобретения, выделенная нуклеиновая кислота может включать нуклеотидную последовательность, которая кодирует последовательность аминокислот вариабельной области тяжелой цепи, представленную в SEQ Ш N0: 128, и/или нуклеотидную последовательность, которая кодирует последовательность аминокислот вариабельной области легкой цепи, представленную в SEQ ID N0: 130.
В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота может присутствовать в одном или более векторах, например, в экспрессионных векторах. Используемый в настоящем описании термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов векторов является "плазмида", которая относится к кольцевой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Некоторые векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальный сайт инициации репликации, и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) интегрируются в геном клетки-хозяина при введении в клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. Более того, некоторые векторы, экспрессионные векторы, способны регулировать экспрессию генов, с которыми они функционально связаны. В общем случае, экспрессионные векторы, используемые в методах рекомбинантных ДНК, часто находятся в виде плазмид (векторов). Тем не менее, раскрытый предмет изобретения
предназначен для включения и других форм экспрессионных векторов, таких как вирусные векторы (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и адено-ассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции.
В некоторых вариантах осуществления, нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по настоящему изобретению, и/или один или несколько векторов, включающих нуклеиновые кислоты, могут быть введены в клетку-хозяина. В некоторых вариантах осуществления, введение нуклеиновой кислоты в клетку может быть осуществлено любым способом, известным в данной области, включая, но не ограничиваясь трансфекцией, электропорацией, микроинъекцией, инфекцией вирусным вектором или вектором бактериофага, содержащим последовательности нуклеиновых кислот, слиянием клеток, хромосома-опосредованным переносом генов, опосредованным микроклетками переносом генов, слиянием сферопластов и т.д. В некоторых вариантах осуществления, клетка-хозяин может включать, например, быть трансформированной: (1) вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела, или (2) первым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VL антитела, и вторым вектором, содержащим нуклеиновую кислоту, которая кодирует аминокислотную последовательность, содержащую VH антитела. В некоторых вариантах осуществления, клетка-хозяин является эукариотической клеткой, например, клеткой яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидной клеткой (например, клетки YO, NSO, SP20).
В некоторых вариантах осуществления, способы получения анти-KLB или анти-FGFRl с антитела могут включать культивирование клетки-хозяина, в которую была введена нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и, необязательно, выделение антитела из клетки-хозяина и/или из среды для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело извлекают из клетки-хозяина с помощью хроматографических способов.
Для получения рекомбинантного антитела по настоящему изобретению нуклеиновая кислота, кодирующая антитело, например, как это описано выше, может быть выделена и вставлена в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такая нуклеиновая кислота может быть легко выделена и отсеквенирована с использованием общепринятых способов (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).
Подходящие клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов, кодирующих антитело, включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антитела могут быть получены в бактериях, в частности, когда гликозилирование и эффекторные функции Fc не являются нужными. Для экспрессии фрагментов антител и полипептидов в бактериях см., например, патенты США №№ 5,648,237, 5,789,199 и 5,840,523. (См. также Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254, описывающие экспрессию фрагментов антител в E.coli.) После экспрессии антитело может быть выделено из клеточной бактериальной массы в растворимой фракции и может быть дополнительно очищено.
Кроме прокариот подходящими клонирующими или экспрессирующими хозяевами для кодирующих антитело векторов являются эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, в том числе грибы и штаммы дрожжей, у которых пути гликозилирования были "гуманизированы", что позволяет получать антитела с частично или полностью человеческим характером гликозилирования. См. Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), и Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела могут быть также получены из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было идентифицировано множество бакуловирусных штаммов, которые могут быть использованы в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного антитела также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было идентифицировано множество бакуловирусных штаммов, которые могут быть использованы в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.
В некоторых вариантах осуществления, в качестве клеток-хозяев могут быть использованы культуры растительных клеток. См., например, патенты США №№ 5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES(tm) для получения антител в трансгенньгх растениях).
В некоторых вариантах осуществления, в качестве хозяев также могут быть использованы клетки позвоночных. Для примера, а не в качестве ограничения, могут быть использованы клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в
суспензии. Неограничивающие примеры используемых линий клеток-хозяев млекопитающих включают линии клеток почки обезьяны СVI, трансформированные SV40 (COS-7); клетки эмбриональной почки человека (293 или клетки 293, как описано, например, в Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977); клетки почки детёныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (клетки ТМ4, как описано, например, в Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); клетки почек обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки крысы линии Buffalo (BRL ЗА); клетки легких человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); клетки MRC5, а также клетки FS4. Другие полезные линии клеток-хозяев млекопитающих включают линии клеток яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки DHFR" СНО, см. Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, пригодных для продуцирования антител, см., например, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003).
В некоторых вариантах осуществления, способы получения биспецифических и/или мультиспецифических антител включают рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, имеющих различные специфичности (см. Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983), патентную заявку РСТ WO 93/08829 и Traunecker др, EMBO J. 10:. 3655 (1991)), и инженерии методом "выступ-во-впадину" (см., например, патент США № 5731168), но не ограничиваются ими. Биспецифические антитела также могут быть получены путём создания направляющих электростатических эффектов для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (WO 2009/089004А1); сшивания двух или более антител или их фрагментов (см., например, патент США № 4676980, и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); с использованием лейциновой молнии для получения биспецифических антител (см., например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)); с помощью технологии "диантитела" для получения фрагментов биспецифических антител (см., например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)); и с использованием димеров одноцепочечных Fv (sFv) (см., например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); также могут быть получены триспецифичные антитела, как это описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).
Биспецифические и мультиспецифические молекулы настоящего изобретения
также могут быть получены с использованием химических методов (см., например, Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), с помощью технологии "полидомы" (см., например, патент США 4474893), или рекомбинантных ДНК. Биспецифические и мультиспецифические молекулы, раскрытые в настоящем описании, также могут быть получены путем конъюгации составляющих специфичности связывания, например, специфичности связывания первого эпитопа и второго эпитопа, с использованием способов, которые известны в данной области и представлены в настоящем описании. Для примера, а не в качестве ограничения, каждая специфичность связывания биспецифической и мультиспецифической молекулы может быть получена по отдельности и затем конъюгирована с другой. Если специфичность связывания опосредована белком или пептидом, то могут быть использованы разнообразные агенты для сочетания или сшивающие агенты для ковалентной конъюгации. Неограничивающие примеры сшивающих агентов включают белок А, карбодиимид, ТчГ-сукцинимидил-З-ацетил-тиоацетат (SATA), М-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) и сульфосукцинимидил 4-^-малеимидометил) циклогексан-1-карбоновую кислоту (сульфо-SMCC) (см., например, Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Другие способы включают способы, которые описаны Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Если специфичности связывания опосредованы антителами (например, двумя гуманизированными антителами), они могут быть конъюгированы через сульфгидрильную связь между С-концевыми шарнирными областями двух тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления изобретения, шарнирная область может быть модифицирована, чтобы содержать нечетное число сульфгидрильных остатков, например, по одному сульфгидрильному остатку, до конъюгирования.
В некоторых вариантах осуществления, обе специфичности связывания биспецифичного антитела могут быть закодированы в одном векторе и экспрессированы и собраны в одной клетке-хозяине. Этот способ особенно удобен в использовании, когда биспецифическая и мультиспецифическая молекула является слитым белком MAb х MAb, МАЬ х Fab, Fab х F(ab')2 или лиганд х Fab. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое антитело по настоящему изобретению может быть одноцепочечной молекулой, такой как одноцепочечное биспецифическое антитело, одноцепочечной биспецифической молекулой, содержащей одну цепь антитела и детерминанту связывания, или одноцепочечной биспецифической молекулой, содержащей две детерминанты связывания. Биспецифические и мультиспецифические молекулы могут
быть также одноцепочечными молекулами или могут содержать, по меньшей мере, две отдельные цепи в молекуле. Способы получения би- и мультиспецифических молекул описаны, например, в патенте США № 5,260,203; патенте США № 5455030; патенте США № 4881175; патенте США № 5132405; патенте США № 5091513; патенте США № 5476786; патенте США № 5013653; патенте США № 5258498; и в патенте США № 5482858. Искусственно созданные антитела с тремя или более функциональными антигенсвязывающими участками (например, участками связывания эпитопа), включая антитела-"осьминоги", также включены в настоящее описание (см., например, US 2006/0025576А1).
Настоящее изобретение также предусматривает триспецифические, например, трифункциональные, антитела. Для примера, а не в качестве ограничения, триспецифическое антитело по настоящему изобретению может связываться и/или взаимодействовать с эпитопом, присутствующим наКЬВ, эпитопом, присутствующем на FGFR1, и эпитопом или антигеном, присутствующим на третьем белке, включая, но не ограничиваясь ими, PCSK9, GCGR, AdipoR, ZnT8, ApoLl, MSTN, InsR или FABP4.
В некоторых вариантах осуществления, для получения антитела по настоящему изобретению может быть использована система, в которой применяются животные. Одна такая система, в которой для получения гибридом применяются животные, является мышиной системой. Получение гибридом в мыши является очень хорошо отработанной процедурой. Протоколы иммунизации и способы выделения иммунизированных спленоцитов для слияния известны в данной области. Партнеры для слияния (например, клетки мышиной миеломы) и процедуры слияния также известны (см., например, Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York).
E. Анализы
Антитела согласно настоящему изобретению, представленному в настоящем описании, могут быть идентифицированы, проскринированы или охарактеризованы по их физическим/химическим свойствам и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области техники и приведенных в настоящем описании.
1. Анализы связывания и другие анализы
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению можно тестировать на его активность связывания антигена известными способами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), радиоиммуноанализ (RIA) или вестерн-блот-анализ. Каждый из этих анализов, как правило, обнаруживает
присутствие интересующих комплексов белок-антитело путём использования меченого реагента (например, антитела), специфичного для комплекса, представляющего интерес. Например, комплексы антитело-KLB могут быть обнаружены, например, с использованием сшитого с ферментом антитела или фрагмента антитела, которые распознают и специфически связываются с комплексом антитело-KLB. В качестве альтернативы, комплексы могут быть обнаружены с помощью любого из множества других иммунологических анализов. Например, антитело может быть радиоактивно помечено и использовано в радиоиммуноанализе (RIA) (см., например, Weintraub, В., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, где документ включен посредством ссылки в настоящее описание). Радиоактивный изотоп может быть обнаружен с помощью таких средств, как счетчик Гейгера или сцинтилляционный счетчик или с помощью авторадиографии.
В некоторых вариантах осуществления, для идентификации антитела, которое конкурирует с антителом анти-KLB по настоящему изобретению, например, 12А11 или 8С5, за связывание с KLB, могут быть использованы конкурентные анализы. В некоторых вариантах осуществления, такое конкурирующее антитело связывается с тем же эпитопом (например, линейным или конформационным эпитопом), который связывает 12А11 или 8С5. Подробные примеры способов выявления эпитопа, с которым связывается антитело, представлены в Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).
В неограничивающем примере конкурентного анализа, иммобилизованный KLB можно инкубировать в растворе, содержащем первое меченое антитело, которое связывается с KLB (например, 12А11 или 8С5), и второе не меченое антитело, которое подвергается проверке на его способность конкурировать с первым антителом за связывание с KLB. Второе антитело может присутствовать в супернатанте гибридомы. В качестве контроля иммобилизованный KLB инкубируют в растворе, содержащем первое меченое антитело, но не второе не меченое антитело. После инкубации в условиях, делающих возможным связывание первого антитела с KLB, избыток несвязанного антитела удаляют, и измеряют количество метки, связанной с иммобилизованным KLB. Если количество метки, соответствующей иммобилизованному KLB, существенно снижается в тестируемом образце по сравнению с контрольным образцом, то это указывает на то, что второе антитело конкурирует с первым антителом за связывание с KLB. См. Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
2. Анализы активности
Настоящее изобретение предусматривает анализы для выявления анти-KLB антител, обладающих биологической активностью. Биологическая активность может включать, например, активацию рецепторного комплекса KLB/FGFRlc. Также предусмотрены антитела, имеющие такую биологическую активность in vivo и/или in vitro. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анализы могут включать связывание антител по настоящему изобретению с клетками, например, клетками 293Т, экспрессирующими KLB, и анализ активности и/или состояния фосфорилирования одной или нескольких последующих мишеней рецепторного комплекса KLB-FGFRlc, например, ERK. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, анализ может включать введение антитела по настоящему изобретению субъекту, например, отличному от человека животному, и анализ влияния антитела на уровень глюкозы у субъекта.
F. Иммуноконъюгаты
В настоящем описании дополнительно предусмотрены иммуноконъюгаты, содержащие антитело, раскрытое в настоящем описании, конъюгированное с одним или несколькими цитотоксическими агентами, такими как химиотерапевтические средства или лекарственные средства, ингибирующие рост агенты, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибного, растительного или животного происхождения или их фрагменты), или радиоактивные изотопы. Например, антитело или его антигенсвязывающий участок согласно настоящему изобретению могут быть функционально связаны (например, путем химического связывания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или иным образом) с одним или несколькими другими связывающими молекулами, такими как другое антитело, фрагмент антитела, пептид или миметик связывания.
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгируют с одним или несколькими лекарственными средствами, включая, но не ограничиваясь ими, мейтансиноид (см. патенты США №№ 5,208,020, 5,416,064 и европейский патент ЕР 0 425 235); ауристатин, такой как фрагменты монометилауристатина DE и DF (ММАЕ и MMAF) (см. патенты США №№ 5,635,483, 5,780,588 и 7,498,298.); доластатин; калихеамицин или его производные (см. патенты США №№ 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 и 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); и Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); антрациклин, такой как дауномицин или доксорубицин (см. Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523
(2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); и патент США 6,630,579); метотрексат; виндезин; таксан, такой как доцетаксел, паклитаксел, лоротаксел, тесетаксел и ортатаксел; трихотецен и СС1065.
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь ими, цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из синегнойной палочки), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантины, белки Phytolaca Americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор из Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор из Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.
В некоторых вариантах осуществления, иммуноконъюгат содержит антитело, представленное в настоящем описании, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Множество радиоактивных изотопов доступны для получения радиоконъюгатов. Неограничивающие примеры включают At211, I131,1125, Y90,
186 188 153 212 32 212
Relou, Re100, Sm1JJ, Bizlz, PJZ, Pbz" ' и радиоактивные изотопы Lu. Если для обнаружения используется радиоконъюгат, он может включать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, Тс99ш или I123 или спиновую метку для ядерно-магнитной резонансной томографии (NMR) (также известной как магнитно-резонансная томография, MRI), такие как йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод -13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.
Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием множества бифункциональных связывающих белки агентов, таких как N-сукцинимидил-З -(2-пиридилд итио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(^ малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (например, диметиладипимидат НС1), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаровый альдегид), бис-азидо-соединения (такие как бис(п-азидобензоил)гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис(п-диазонийбензоил)этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол-2,6-диизоцианат) и бис-активные фторированные соединения (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).
Например, иммунотоксин рицина может быть получен, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-З-метилдиэтилентриаминопентаацетиновая кислота (MX-DTPA) является примером хелатирующего агента для конъюгации радионуклида с антителом. См. WO94/11026. Линкер может представлять собой "расщепляемый линкер", облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, могут быть использованы кислото-чувствительный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США № 5208020).
В настоящем описании иммуноконъюгаты или ADC специально включают, но не ограничиваются конъюгатами, полученными с использованием поперечно-сшивающих реагентов, включающих, без ограничения, BMP, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC, а также сульфо-SMPB и SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., США).
III. СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящее описание также относится к способам применения описанных антител, например, биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антителас. В некоторых вариантах осуществления, способы направлены на терапевтическое применение раскрытых в настоящем описании антител. В некоторых вариантах осуществления, способы направлены на применение описанных антител в способах диагностики.
А. Способы диагностики и детекции
В некоторых вариантах осуществления, любое антитело, раскрытое в настоящем описании, которое имеет специфичность к KLB, например, анти-KLB антитело и/или биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, раскрытые выше, может быть полезно для обнаружения KLB в биологическом образце. В другом своем аспекте, настоящее описание относится к способам диагностики и/или детекции заболевания с применением анти-KLB антитела или биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела, раскрытых в настоящем описании. Термин "детекция" в настоящем описании включает количественную и/или качественную детекцию.
В некоторых неограничивающих вариантах осуществления, биологический образец включает клинический образец, одну или несколько клеток, клетки в культуре, клеточные супернатанты, клеточные лизаты и образцы ткани, но не ограничивается ими. Источником образца может быть твердая ткань (например, из свежего, замороженного
и/или консервированного органа, образца ткани, биоптата или аспирата) или клетки индивидуума. В некоторых вариантах осуществления, биологический образец может включать одну или несколько клеток и/или ткань печени, например, из печени субъекта.
В некоторых вариантах осуществления, предусмотрено анти-KLB антитело для применения в способе диагностики или детекции. В еще одном аспекте предусмотрен способ детекции присутствия KLB в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления, способ диагностики или детекции включает контактирование биологического образца с антителом, которое связывает эпитоп, присутствующий на KLB, как раскрыто в настоящем описании, в условиях, допускающих связывание антитела с KLB, и детекцию образующегося комплекса антитела и KLB. Такой способ может представлять собой способ in vitro или in vivo, например, иммунофлуоресцентный анализ или вестерн-блоттинг. В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитело используют для отбора субъектов, которым может быть показана терапия анти-KLB антителом, например, где KLB является биомаркером для отбора пациентов.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, используемое в описанных способах, не оказывает существенного влияния на печень, например, на функции печени. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не модулирует активность рецепторного комплекса FGFR/KLB в печени по сравнению с модуляцией рецепторного комплекса FGFR7KLB в печени белком FGF21. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не приводит к ингибированию комплекса FGFR4/KLB и/или не приводит к повышению уровней печеночных ферментов, включая ALT, AST, ALP и GLDH, но не ограничиваясь ими. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не функционирует как агонист комплекса FGFR2c/KLB и/или комплекса FGFR3c/KLB в печени, что может привести к активации сигналинга МАРК и/или измененной экспрессии Spry4 и Dusp6 в печени. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не приводит к активации сигналинга МАРК в печени по сравнению с активацией сигналинга МАРК белком FGF21. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению не функционирует в качестве агониста комплекса FGFR4/KLB в печени.
В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело для применения в раскрытых способах включает антитела, которые не блокируют связывание и/или взаимодействие лигандов FGF, например, FGF19 и FGF21, с комплексом KLB/FGFRlc. В
некоторых вариантах осуществления, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, раскрытое в настоящем описании, относится к антителу, которое модулирует активность комплекса KLB/FGFRlc и не блокирует взаимодействие и/или связывание нативных лигандов FGF, например, FGF19 и FGF21, с комплексом KLB/FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, раскрытое в настоящем описании, относится к антителу, которое не блокирует активность и/или связывание нативных лигандов FGF с рецептором FGF в отсутствие KLB. Для примера, а не в качестве ограничения, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело по настоящему изобретению не блокирует взаимодействие нативных лигандов FGF с комплексом FGFR1/KLA или только с FGFR1. В некоторых вариантах осуществления, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, раскрытое в настоящем описании, относится к антителу, которое не блокирует активность и/или связывание нативных лигандов FGF с белком KLB в отсутствие FGFR1. Для примера, а не в качестве ограничения, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело по настоящему изобретению не блокирует взаимодействие нативных лигандов FGF с комплексом FGFR4/KLB, комплексом FGFR2c/KLB и/или комплексом FGFR3c/KLB.
В некоторых вариантах осуществления, анти-KLB антитела, анти-FGFRl с антитела и/или биспецифические анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела, например, анти-KLB/aHTH-FGFRl с, используемые в описанных способах, могут быть помечены. Метки включают, без ограничения, метки или фрагменты, которые детектируются непосредственно, например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки, а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, которые детектируются косвенно, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Не ограничивающие примеры меток
32 14 125 3 131
включают радиоизотопы JZP, "С, 1ZJI, JH, и 1JT, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светлячка и бактериальную люциферазу (см. патент США 4,737,456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу, глюкоамилазу, лизоцим, оксидазы Сахаров, например, глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, оксидазы гетероциклов, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, такой как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы, а также подобные им метки.
В. Способы лечения
В некоторых вариантах осуществления, одно или несколько антител, раскрытых в настоящем описании, могут быть использованы для лечения заболевания и/или расстройства у субъекта. В качестве примера, а не ограничения, болезнь может являться нарушением обмена веществ. Неограничивающие примеры метаболических расстройств включают синдромом поликистозных яичников (PCOS), метаболический синдром (MetS), ожирение, неалкогольный стеатогепатит (NASH), неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), гиперлипидемию, артериальную гипертензию, диабет 2 типа, диабет не 2 типа, диабет 1 типа, латентный аутоиммунный диабет (LAD) и диабет взрослого типа у молодых (MODY). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, метаболическим нарушением является диабет 2 типа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, метаболическим нарушением является ожирение.
В некоторых вариантах осуществления, одно или несколько антител, раскрытых в настоящем описании, могут быть использованы для лечения синдрома Барде-Бидля, синдрома Прадера-Вилли, синдрома Альстрёма, синдрома Коэна, наследственной остеодистрофии Олбрайта (псевдогипопаратиреоидизм), синдрома Карпентера, синдрома МОМО, синдрома Рубинштейна-Тейби, синдрома ломкой Х-хромосомы и синдрома Бёрьесона-Форсмана-Лемана. В некоторых вариантах осуществления, одно или несколько антител, раскрытых в настоящем описании, могут быть использованы для лечения старения и связанных с ним заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS.
В некоторых вариантах осуществления, одно или несколько антител, раскрытых в настоящем описании, могут быть использованы для лечения болезни сердца, инсульта, сердечных приступов, гиперинсулинемии, высокого кровяного давления, заболевания коронарных сосудов сердца, мигрени или головных болей, непосредственно связанных с ожирением или черепной гипертензией, застойной сердечной недостаточности, новообразований, дислипидемии, анемии, болезни желчного пузыря, остеоартрита, дегенеративного артрита, остеохондроза, дегенеративного заболевания суставов, при замене суставов, для лечения ускоренного дегенеративного заболевания суставов, астмы, рецидивирующей пневмонии, рецидивирующего плеврита, рецидивирующего бронхита, рестриктивного легочного заболевания, гастроэзофагеального рефлюкса (ГЭРБ), избытка волос на лице и теле (гирсутизма), высыпаний, хронических кожных инфекций, избыточной потливости, частых грибковых инфекций, стрессового недержания мочи, нерегулярных менструаций, гормональных нарушений, поликистоза яичников,
бесплодия, рака (например, рака молочной железы, толстой кишки и матки), апноэ во
сне, идиопатической внутричерепной гипертензии, депрессии,
психологической/сексуальной дисфункции, социальной дискриминации и преждевременной смерти.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело для применения в способе лечения. Для примера, а не в качестве ограничения, настоящее изобретение обеспечивает антитело, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, для применения в способе лечения субъекта, имеющего нарушение обмена веществ, например, PCOS, MetS, ожирение, NASH, NAFLD, гиперлипидемию, артериальную гипертензию, диабет 2 типа, диабета не 2 типа, диабет 1 типа, латентный LAD, MODY, а также находящегося в состоянии старения и страдающего связанными с ним заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS, которое включает введение индивидууму эффективного количества антитела, раскрытого в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение обеспечивает антитело, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, для применения в способе лечения субъекта, страдающего заболеванием или расстройством, описанным выше, которое включает введение индивидууму эффективного количества указанного антитела.
В некоторых вариантах осуществления, способ может дополнительно включать введение субъекту эффективного количества, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического агента. Не ограничивающие примеры дополнительных терапевтических агентов, например, второго терапевтического агента, описаны ниже.
В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение дополнительно относится к способу индукции потери веса, включающему введение индивидууму эффективного количества одного или более антител, предлагаемых в настоящем изобретении, например, биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела.
Термины "индивидуум", "пациент" или "субъект", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к млекопитающему. Млекопитающие включают, но не ограничиваются ими, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак, лошадей), приматов (например, людей и приматов, отличных от человека, таких как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В некоторых вариантах осуществления, индивидуум или субъект является человеком.
Настоящее описание дополнительно предусматривает антитело, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, для применения в активации корецепторного комплекса KLB/FGFRlc, например, у субъекта. Для примера, а не в
качестве ограничения, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело может быть биспецифическим анти-KLB/aHTH-FGFRl с антителом. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение предусматривает антитело, например, биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, для применения в способе активации корецепторного комплекса KLB/FGFRlc у субъекта. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, способ включает введение субъекту эффективного количества антитела для активации рецепторного комплекса KLB/FGFRlc.
Антитела согласно настоящему изобретению могут быть применены в терапии либо отдельно, либо в комбинации с другими агентами. Для примера, а не в качестве ограничения, антитело по настоящему изобретению может быть введено совместно, по меньшей мере, с одним дополнительным терапевтическим агентом. В некоторых вариантах осуществления, второй/дополнительный терапевтический агент может включать анти-диабетический агент, предотвращающий ожирение агент или лекарственное средство для метаболических заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, антигипертензивные лекарства и статины. Не ограничивающие примеры второго/дополнительного терапевтического агента включают метформин, пиоглитазон, DPP4i, аналоги GLP1, сульфонилмочевины, инсулин, аналоги лептина и лорказерин (например, BELVIQ(r)).
Настоящее изобретение также относится к применению антитела, например, биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела, для производства или получения лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, лекарственный препарат предназначен для лечения нарушений обмена веществ, как описано выше. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к применению антитела для производства лекарственного средства для лечения ожирения. В некоторых вариантах осуществления, настоящее изобретение относится к применению антитела для производства лекарственного средства для лечения диабета 2 типа. В некоторых вариантах осуществления, способ дополнительно включает введение индивидууму эффективного количества, по меньшей мере, одного дополнительного терапевтического агента, например, как раскрыто в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, лекарственный препарат предназначен для активации корецепторного комплекса KLB/FGFRlc. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, лекарственный препарат может быть использован в способе активации корецепторного комплекса KLB/FGFRlc у индивидуума, включающем введение индивидууму
количества лекарственного средства, эффективного для активации рецепторного комплекса KLB/FGFRlc.
В некоторых вариантах осуществления, антитело для применения в описанных способах лечения может присутствовать в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтическая композиция может включать фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления изобретения, фармацевтическая композиция может включать одно или несколько антител по настоящему изобретению.
Дополнительно или альтернативно, фармацевтическая композиция может включать второй терапевтический агент. Когда одно или несколько из описанных антител вводят с другим терапевтическим агентом, одно или несколько антител и другой терапевтический агент можно вводить в любом порядке или одновременно. Такие комбинированные терапии, упомянутые выше, охватывают комбинированное введение (где два или несколько терапевтических агентов включены в одну и ту же или в отдельные лекарственные формы), а также раздельное введение, и в этом случае введение антитела по настоящему изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента или агентов. В одном варианте осуществления время между введением антитела по настоящему изобретению и введением дополнительного терапевтического агента составляет примерно один месяц, или примерно одну, две или три недели, или примерно один, два, три, четыре, пять или шесть дней.
Антитело по настоящему изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любыми подходящим способами, включая парентеральный, внутрилегочный и назальный, и, если антитело желательно применять для местного лечения, можно использовать внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может быть осуществлено любым подходящим способом, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, что частично зависит от того, является ли введение кратковременным или хроническим. В настоящем описании предусмотрены различные схемы дозирования, включая, без ограничения, одно или несколько введений в различных временных точках, болюсное введение и импульсную инфузию.
Антитела согласно настоящему изобретению будут введены в фармацевтическую композицию, дозированы и введены в соответствии с хорошей медицинской практикой. Факторы, подлежащие рассмотрению в этом контексте, включают конкретное
расстройство, которое подлежит лечению, конкретное млекопитающее, которое подвергается лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам. Антитело необязательно может быть введено в фармацевтическую композицию с одним или несколькими агентами, используемыми в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого расстройства. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в лекарственной форме, типа расстройства или лечения и других факторов, описанных выше. Другие агенты, как правило, используют в тех же дозах и вводят теми же путями, как раскрыто в настоящем описании, или в дозах, составляющих приблизительно от 1 до 99% от доз, раскрытых в настоящем описании, или в любой дозировке и любым способом, которые были эмпирически/клинически определены как подходящие.
Для профилактики или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела по настоящему изобретению (при применении отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими агентами) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антител, тяжести и течения заболевания, от того, вводят антитело в профилактических или терапевтических целях, от предшествующей терапии, истории болезни пациента и реакции на антитело, а также мнения лечащего врача. В некоторых вариантах осуществления, антитело по настоящему изобретению можно вводить по мере необходимости. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может быть введено пациенту один раз или несколько раз. В качестве примера, но не в качестве ограничения антитело и/или фармацевтическая лекарственная форма, которая содержит антитело, раскрытое в настоящем описании, можно вводить субъекту два раза в день, один раз в день, один раз в два дня, один раз в три дня, один раз в четыре дня, один раз в пять дней, один раз в шесть дней, один раз в неделю, раз в две недели, один раз в три недели, один раз в месяц, раз в два месяца, один раз в три месяца, раз в полгода или раз в год.
В некоторых вариантах осуществления, в зависимости от типа и тяжести заболевания начальная предполагаемая доза для введения пациенту, например, с помощью одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии может составлять примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг антитела (например, 0,1 мг/кг-10 мг/кг). Одна типичная суточная доза может варьировать от приблизительно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. В некоторых вариантах осуществления изобретения, суточная доза может быть больше, чем примерно 100 мг/кг.
В некоторых вариантах осуществления, доза может быть отрегулирована для достижения концентрации антитела в плазме 1-1000 мкг/мл и, в некоторых способах, для достижения концентрации 25-300 мкг/мл.
В случае повторного введения в течение нескольких дней или более в зависимости от состояния лечение обычно может быть продолжено до желаемого подавления симптомов заболевания. Пример одной дозы антитела будет находиться в диапазоне от приблизительно 0,05 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг. В некоторых вариантах осуществления, пациенту могут быть введены одна или несколько доз, составляющих приблизительно 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любой их комбинации). В качестве альтернативы, антитело можно вводить в виде лекарственной формы с замедленным высвобождением, которую требуется вводить реже. Дозировка и частота может изменяться в зависимости от времени полувыведения антитела в организме пациента. В некоторых вариантах осуществления, такие дозы можно вводить периодически, например, каждую неделю или один раз в три недели (например, таким образом, что пациент получает от двух до двадцати, или, например, приблизительно шесть доз антитела). Может быть введена начальная более высокая нагрузочная доза, за которой следует одна или несколько более низких доз.
В некоторых вариантах осуществления, способ может дополнительно включать мониторинг субъекта и определение эффективности лечения. Например, ход терапии можно легко контролировать с помощью традиционных способов и анализов.
IV. Фармацевтические лекарственные формы
В настоящем описании дополнительно предусмотрены фармацевтические лекарственные формы, содержащие одно или несколько антител, как раскрыто в настоящем описании, с фармацевтически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции могут включать комбинацию нескольких (например, двух или более) антител и/или их антигенсвязывающих частей, раскрытых в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может включать одно или несколько биспецифических антител анти-KLB/aHTH-FGFRl.
В некоторых вариантах осуществления, раскрытые фармацевтические лекарственные формы могут быть получены путем объединения антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных лекарственных форм или водных растворов. В качестве примера, но не в качестве ограничения,
лиофилизированные лекарственные формы антител описаны в патенте США № 6,267,958. В некоторых вариантах осуществления, водные лекарственные формы антител могут включать лекарственные формы, которые описаны в патенте США № 6,171,586 и WO2006/044908, где последние лекарственные формы включают гистидин-ацетатный буфер. В некоторых вариантах осуществления изобретения, антитело может иметь чистоту более чем примерно 80%, более чем примерно 90%, более чем примерно 91%, более чем примерно 92%, более чем примерно 93%, более чем примерно 94%, более чем примерно 95%, более чем примерно 96%, более чем примерно 97%, более чем примерно 98%, более чем примерно 99% более чем примерно 99,1%, более чем примерно 99,2%, более чем примерно 99,3%, более чем примерно 99,4% более чем примерно 99,5%, более чем примерно 99,6%, более чем примерно 99,7%, более чем примерно 99,8% или более чем примерно 99,9%.
Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях и включают, без ограничения, буферы, такие как фосфатный, цитратный буфер и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); низкомолекулярные (приблизительно менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, Zn-белковые комплексы); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Примеры фармацевтически приемлемых носителей в настоящем описании дополнительно включают агенты для диспергирования лекарственных средств в интерстициальной ткани, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20 человека, такие как rHuPH20 (HYLENEX(r), Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и способы их применения, включая rHuPH20, описаны в опубликованных патентных заявках США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968. В одном из аспектов, sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными
гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Носитель может быть пригоден для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального, спинального или эпидермального введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от способа введения активное соединение, т.е. биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, может быть покрыто материалом для защиты соединения от действия кислот и других естественных условий, которые могут инактивировать соединение.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также можно вводить в комбинированной терапии, т.е. в сочетании с другими агентами. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции, раскрытые в настоящем описании, могут также содержать более чем один активный ингредиент, если это необходимо для конкретного назначения, подлежащего лечению, например, ингредиенты с комплементарной активностью, которые не оказывают отрицательного влияния друг на друга. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, фармацевтическая лекарственная форма может включать второй активный ингредиент для лечения того же заболевания, для которого используется первый терапевтический агент. Такие активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предназначенной цели. Для примера, а не в качестве ограничения, лекарственная форма по настоящему изобретению может также содержать более чем один активный ингредиент, если это необходимо для конкретного назначения, подлежащего лечению, предпочтительно активные ингредиенты с комплементарной активностью, которые не оказывает отрицательного влияния друг на друга. Например, может быть желательно дополнительно обеспечить второй терапевтический агент, полезный для лечения того же заболевания. Такие активные ингредиенты предпочтительно присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предназначенной цели.
Композиция по настоящему изобретению может быть введена различными способами, известными в данной области техники. Путь и/или способ введения изменяются в зависимости от желаемых результатов. Активные соединения могут быть объединены с носителями, которые защищают соединение от быстрого высвобождения, например, в виде лекарственных форм с контролируемым высвобождением, включая имплантаты, трансдермальные пластыри и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Множество способов получения таких лекарственных форм
описано, например, в Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. В некоторых вариантах осуществления, фармацевтические композиции изготовлены в соответствии со стандартом Надлежащей производственной практики (GMP) Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов.
Могут быть получены препараты с замедленным высвобождением, содержащие антитело, раскрытое в настоящем описании. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, где матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. В некоторых вариантах осуществления, активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, полученные, например, способами коацервации или путем межфазной полимеризации, например, в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилат)ные микрокапсулы, соответственно, в коллоидные системы доставки лекарственных средств (например, липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие способы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
Для введения антитела по настоящему изобретению с помощью определенных способов введения может быть необходимо покрыть соединение материалом для предотвращения его инактивации или вводить соединение совместно с материалом для предотвращения его инактивации. Например, соединение может быть введено субъекту в соответствующем носителе, например, в липосомах или в разбавителе. Фармацевтически приемлемые разбавители включают физиологический раствор и водные буферные растворы. Липосомы включают эмульсии вода-в-масле-в-воде CGF, а также обычные липосомы (Strejan et al.. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
Фармацевтически приемлемые носители включают стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки для экстемпорального получения стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Использование таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в данной области. За исключением тех случаев, когда обычная среда или агент несовместимы с активным соединением, предусмотрено их применение в фармацевтических композициях по настоящему изобретению. В композиции также могут быть включены дополнительные активные соединения.
Терапевтические композиции, как правило, должны быть стерильными, по существу изотоническими и стабильными в условиях производства и хранения.
Композиция может быть получена в виде раствора, микроэмульсии, липосомы или другой упорядоченной структуры, подходящей для высокой концентрации лекарственного средства. Носитель может быть растворителем или дисперсионной средой, содержащей, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси. Надлежащую текучесть можно поддерживать, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ. Во многих случаях в композицию предпочтительно включать изотонические агенты, например, сахара, многоатомные спирты, такие как маннит, сорбит, или хлорид натрия. Пролонгированная абсорбция инъекционных композиций может быть достигнута путем включения в композицию агента, который задерживает абсорбцию, например, солей моностеарата и желатина.
Стерильные инъекционные растворы могут быть получены путем включения одного или нескольких предусмотренных антител в необходимом количестве в соответствующий растворитель с добавлением, в случае необходимости, одного или комбинации ингредиентов, перечисленных выше, с последующей стерилизацией путём микрофильтрации, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Как правило, дисперсии получают путем введения активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и требуемые другие ингредиенты из тех, которые перечислены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и сублимационная сушка (лиофилизация), которые обеспечивают получение порошка активного ингредиента с любым дополнительным желательным ингредиентом из предварительно стерилизованного фильтрованием раствора.
Терапевтические композиции могут быть также введены с использованием медицинских устройств, известных в данной области. Например, терапевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить с помощью безыгольного инъекционного устройства для подкожных инъекций, такого как устройство, описанное, например, в патентах США №№ 5399163, 5383851, 5312335, 5064413, 4941880, 4790824 или 4,596,556. Примеры имплантатов и модулей, используемых в настоящем изобретении, включают устройства, описанные в патенте США № 4,487,603, который раскрывает имплантируемый микроинфузионный насос для дозирования препарата с контролируемой скоростью; патенте США № 4486194, в котором описано
терапевтическое устройство для введения препаратов через кожу; патенте США № 4447233, в котором представлен инфузионный насос для доставки препарата с точной скоростью инфузии; патенте США № 4447224, в котором описано имплантируемое инфузионное устройство с переменным потоком для непрерывной доставки лекарственного средства; патенте США № 4439196, в котором описана многокамерная осмотическая система доставки лекарственного средства; и в патенте США № 4475196, в котором описана осмотическая система доставки лекарственного средства. Известны многие другие подобные имплантаты, системы доставки и модули.
Для терапевтических композиций лекарственные формы по настоящему изобретению включают такие лекарственные формы, которые пригодны для перорального, назального, местного (в том числе трансбуккального и подъязычного), ректального, вагинального и/или парентерального введения. Лекарственные формы могут быть удобно представлены в виде стандартной лекарственной формы и могут быть получены любыми способами, известными в области фармации. Количество антитела, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения лекарственной формы для однократного введения, варьирует в зависимости от субъекта, подлежащего лечению, и конкретного способа введения. Количество антитела, которое может быть объединено с материалом-носителем для получения лекарственной формы для однократного введения, как правило, представляет собой количество композиции, которое дает терапевтический эффект. Как правило, из ста процентов, это количество составляет от примерно 0,01 процента до примерно девяносто девяти процентов активного ингредиента, от примерно 0,1 процента до примерно 70 процентов или от примерно 1 процента до примерно 30 процентов активного ингредиента.
Лекарственные формы для местного или трансдермального введения композиций по настоящему изобретению включают порошки, спреи, мази, пасты, кремы, лосьоны, гели, растворы, пластыри и ингаляторы. Активное соединение может быть смешано в стерильных условиях с фармацевтически приемлемым носителем, и, необязательно, с любыми требуемыми консервантами, буферами или пропеллентами.
Фразы "парентеральное введение" и "введенный парентерально" означают способы введения, отличные от энтерального и местного введения, обычно путем инъекции, и включают внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, интратекальные, внутрикапсульные, интраорбитальные, внутрисердечные, внутрикожные, внутрибрюшинные, транстрахеальные, подкожные, подэпидермисные, внутрисуставные, субкапсулярные, субарахноидальные, интраспинальные, эпидуральные и надчревные инъекции и инфузии, не ограничиваются ими.
Эти фармацевтические композиции могут также содержать адъюванты, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгаторы и диспергирующие агенты. Предотвращение присутствия микроорганизмов может быть обеспечено как за счет процедур стерилизации, описанных выше, так и включением различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, сорбиновой кислоты и подобных им агентов. Кроме того, может быть желательно включать в композиции изотонические агенты, такие как сахара, хлорид натрия и подобные вещества. Кроме того, пролонгированная абсорбция инъекционной фармацевтической формы может быть достигнута включением агентов, которые задерживают абсорбцию, таких как моностеарат алюминия и желатин.
В некоторых вариантах осуществления, когда антитела по настоящему изобретению вводят в виде фармацевтических препаратов человеку и животным, они могут быть введены отдельно или в виде фармацевтической композиции, содержащей, например, от примерно 0,01% до примерно 99,5% (или от примерно 0,1 до примерно 90%) антитела, раскрытого в настоящем описании, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
V. Изделия
Настоящее описание дополнительно относится к изделиям, содержащим материалы, пригодные для лечения, профилактики и/или диагностики расстройств, описанных выше.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, изделие включает контейнер и этикетку или вкладыш, закрепленные на контейнере или связанные с контейнером. Неограничивающие примеры подходящих контейнеров включают бутылки, флаконы, шприцы, мешки для вводимых внутривенно растворов и т.п. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может содержать композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон, имеющий поддающуюся прокалыванию иглой для подкожных инъекций пробку).
В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, один активный агент в композиции представляет собой антитело, раскрытое в настоящем описании. На этикетке или вкладыше в упаковку может быть указано, что композицию используют для лечения определённого состояния.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, изделие может
содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нём композицией, где композиция содержит антитело по настоящему изобретению; и (Ь) второй контейнер с содержащейся в нём композицией, где композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, изделие может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, указывающий, что эти композиции могут быть использованы для лечения конкретного состояния.
В качестве альтернативы или дополнительно, изделие может дополнительно включать дополнительный контейнер, например, второй или третий контейнер, включающий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы, но не ограничиваясь ими. Изделие может включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Приведенные ниже примеры лишь иллюстрируют настоящее описание и не должны рассматриваться в качестве какого-либо ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Характеристика агонистических анти-FGFRl антител.
Три полученных методом фагового дисплея анти-FGFRl антитела, YW 182.2 (также называемое в настоящем описании "RlMAbl"), YW 182.3 (также называемое в настоящем описании "RlMAb2") и YW182.5 (также называемое в настоящем описании "RlMAb3") были описаны ранее (WO 2012/158704, включена в настоящее описание посредством ссылки). Каждое из трех антител действует как мощный FGFR1-селективный агонист и проявляет инсулин-сенсибилизирующие свойства у мышей.
Для более глубокого понимания этой агонистической активности была проверена способность фрагментов Fab этих антител действовать в качестве агониста FGFRlc. Клетки НЕК293 культивировали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM) + 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS) и временно трансфицировали экспрессионными векторами, кодирующими люциферазу Renilla (pRL-SV40, Promega), FGFRlc, транскрипционный активатор (pFA2-Elkl или pFA2-CREB, Stratagene) и репортерную люциферазу светлячка под контролем сайтов связывания GAL4 (pFR-Luc, Stratagene), используя трансфекционный реагент FUGENE(r) НЕ) (Roche). На следующий день трансфицированные клетки культивировали в течение еще 6-8 ч в бессывороточной среде и на них тестировали IgG и каждое из YW182.2, YW182.3 и YW182.5 при возрастающих концентрациях. Активность люциферазы в клетках определяли с
использованием системы люциферазного анализа DUAL-GLO(r) (Promega) и сканера ENVISION(r) MultiLabel (PerkinElmer). Активность люциферазы светлячка нормализовали по активности коэкспрессируемой люциферазы Renilla. Неожиданно оказалось, что YW182.2 Fab, но не YW182.3 Fab или YW182.5 Fab, проявил агонистическую активность (Фиг. 1 А).
Фиг. 1В представляет эксперименты по конкурентному связыванию, которые были выполнены для изучения причин различий в активации FGFR1 под действием YW182.2 Fab и YW182.3 Fab. YW182.2 дополнительно характеризовали по сравнению с YW182.3, который имеет высокую аффинность, а также по сравнению с более низкоаффинным анти-FGFRl антителом, YW182.5. Оба антитела YW182.2 и YW182.3 конкурировали с YW182.5 за связывание с внеклеточным доменом FGFR1 (ECD), и это говорит о том, что все 3 антитела распознают перекрывающиеся области FGFR1. Тем не менее, как показано на Фиг. 1В, относительная аффинность YW182.5 была значительно ниже (1С50> 30 раз), чем у YW182.2 и YW182.3.
Фиг. 2А показывает аффинности связывания анти-FGFRl антител, YW 182.2 и YW182.3, с FGFRlb и FGFRlc. Аффинность анти-FGFRl антител оценивали для определения того, объясняют ли различия в аффинности анти-FGFRl антител различия, наблюдаемые для их агонистической активности. Анализ аффинности связывания Fab с FGFRlb или FGFRlc проводили с использованием прибора BIACORE(r) Т100, как описано в Liang и др. J. Mol. Biol. 366(3): 815-29 (2007), со следующими изменениями. Мышиное антитело к человеческому антителу Fc было нанесено первым на карбоксиметилированный декстрановый чип СМ5 BIAcore с использованием процедуры непосредственного связывания со свободными аминогруппами, описанной производителем. YW182.2 или YW182.3 были захвачены на чипе СМ5 биосенсора до достижения приблизительно 200 единиц отклика (RU). Измерения связывания проводили с использованием рабочего буфера, состоящего из 10 мМ HEPES рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 (HBS-P-буфера). Серии 2-кратных разведений белка FGFRlc ECD-His вводили в диапазоне концентраций 1,5-50 нМ в HBS-P-буфере при скорости потока 30 мкл/мин при 25° С. Скорости ассоциации (Коп, моль/с) и скорости диссоциации (K0ff, с) были рассчитаны с использованием простой модели связывания Ленгмюра один к одному (BIACORE(r) Evaluation Software version 3.2). Равновесную константу диссоциации (Kd, моль) рассчитывали как отношение K0ff/Kon. Как показано на Фиг. 2А, наблюдаемые аффинности YW 182.2 и YW182.3 были очень похожими, что свидетельствует о том, что аффинность не может объяснить разницу в агонистической активности двух антител.
Фиг. 2В показывает способность YW182.5 (ЮМАЬЗ) специфически взаимодействовать с FGFR1. Как и YW182.2 и YW182.3, YW182.5 показало специфическое связывание с FGFR1 в анализе ELISA (Фиг. 2В).
Фиг. 2С показывает агонистическую активность YW182.5 для различных FGFR в клетках L6 в люциферазном анализе с использованием GAL-ELK1 (ETS-подобный фактор транскрипции 1). Для проведения люциферазного анализа клетки FIEK293T или крысы L6 трансфицировали экспрессионными векторами, кодирующими соответствующие рецепторы под контролем CMV-промотора, люциферазу Renilla (PRL-SV40, Promega), слитый белок транскрипционного активатора GAL-ELK1 (pFA2-ELKl, компании Agilent) и репортерную люциферазу светлячка под контролем сайтов связывания GAL4 (PFR-Luc, Agilent), с использованием трансфекционного реагента FuGene ЕЮ (Promega). На следующий день трансфицированные клетки культивировали в течение еще 6-8 часов в бессывороточной среде DMEM, содержащей соответствующие белковые лиганды в различных концентрациях. Активность люциферазы в клетках определяли с использованием системы люциферазного анализа Dual-Glo (Promega) и сканера Envision MultiLabel (PerkinElmer). Активность люциферазы светлячка нормализована к активности совместно экспрессируемой люциферазы Renilla, и показана как среднее значение ± SEM. Подобно YW182.2 и YW182.3, YW182.5 выступал в качестве специфического агониста для FGFR1 в клетках L6 (Фиг. 2С).
Агонистическая активность YW182.5 дополнительно протестирована в клетках НЕК293 с помощью люциферазного анализа GAL-ELK1, описанного выше. Как показано на Фиг. 2D, YW182.5 также выступал в качестве специфического агониста для FGFRlc в люциферазном анализе GAL-ELK1 в клетках НЕК293.
Фиг. 2Е показано влияние YW182.5 на уровень глюкозы в крови в модели дибета на мышах. Для определения уровня глюкозы в крови мыши были приобретены у Jackson Laboratory и содержались в стерильном виварии при температуре 21° С по стандарту 12 ч свет/12 ч темноты с доступом к пище (LABDIET(r) 5010) и воде в неограниченном количестве. Мыши db/db линии C57BLKS/J были самками, а другие мыши были самцами. Для кормления согласно диете с высоким содержанием жиров была использована диета с высоким содержанием жиров и высоким содержанием углеводов (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% калорий из жира). Уровни неорганического фосфора и кальция в сыворотке определяли с помощью биохимического анализатора COBAS INTEGRA(r) 400 (Roche). Уровни FGF23 в сыворотке определяли с помощью ELISA (Immutopics). Уровни глюкозы в крови определяли с помощью глюкометра CONTOUR(r) (Bayer). Для анализа липидов в печени использовали набор для количественного
определения триглицеридов (MBL International). Общие холестерин, триглицериды, Р-гидроксибутират (Termo DMA) и свободные жирные кислоты (Roche) в сыворотке определяли с помощью колориметрического анализа. Для определения уровней сывороточного инсулина (Crystal Chem), сывороточного FGF23 (Immutopics), сывороточного высокосолекулярного мышиного адипонектина (Alpco) и сывороточного высокомолекулярного адипонектина обезьян (R &D Systems) использовали ELISA. Кортикостерон измеряли с помощью радиоиммуноанализа (Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core). Все мыши, используемые для инъекций, имели возраст около 24 месяцев, за исключением KLB-дефицитных мышей, которые были использованы в некоторых опытах в возрасте 7-8 месяцев. Подобно введению YW182.2 и YW182.3, введение YW182.5 нормализует уровень глюкозы в крови у диабетических мышей db/db (Фиг. 2D).
Пример 2. Картирование эпитопов анти-FGFRl антител.
ECD FGFR1 состоит из трех Ig-подобных доменов, называемых D1-D3. Как показано на Фиг. 1С, два непересекающихся пептида Р26: KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ Ш NO: 143) и Р28: FKPDHRIGGYKVRY (SEQ Ш NO: 144), присутствующих в домене D2 FGFR1, были предварительно идентифицированы как связывающиеся с двумя антителами YW182.2 и YW182.3 (WO 2012/158704, включена в настоящее описание посредством ссылки).
Чтобы определить, какие остатки в этих пептидах являются наиболее важными для связывания антитела, в клетках НЕК293 экспрессировали полноразмерные белки FGFR1 с различными заменами на аланин в пределах определенных областей эпитопов и тестировали их на связывания антител с помощью Вестерн-блоттинга. Как показано на Фиг. 1D, замены на аланин в К175, К177, Y205, R208 предотвращали связывание YW182.2 и YW182.5, не влияя на экспрессию, что показано с помощью зондирования с использованием анти-FGFRl к домену D1 (анти-Dl). Связывание YW182.3 было предотвращено при замене R208A, но не при заменах К175, К177 или Y205.
Способность антител активировать мутантные FGFR1 с заменами на аланин in vivo тестировали с помощью анализа GAL-ELK1, описанного выше. Было установлено, что для каждого из анти-FGFRl антител активация хорошо коррелируют со свойствами связывания этих мутантов (Фиг. 1Е). Эти результаты свидетельствуют о том, что для связывания YW182.2 и YW182.5 несмотря на различную аффинность связывания необходим сходный набор аминокислот в домене D2, в то время как для связывания YW182.3 имеет большое значение другой набор аминокислот в той же области.
Кристаллические структуры 2:2 комплекса FGFR ECD/FGF были описаны ранее
(Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)). В гомодимерных структурах 2:2 FGFRlc ECD/FGF2 один домен D2 взаимодействует с другим доменом D2, и каждый FGF2 связывается с двумя доменами D2 с двух сторон, чтобы стабилизировать димер D2 (Фиг. 1F). В этих структурах важные для связывания YW182.2 и YW182.5 замены на аланин (К175, К177, Y205 и R208) расположены внутри димера D2. Так как YW182.2 Fab действует в качестве агониста, то предполагается, что YW 182.2 Fab может связываться с двумя доменами D2 одновременно для стабилизации димера D2, и по существу, действует как молекулярный миметик лигандов FGF. На основе анализа замен на аланин можно заключить, что YW182.5 Fab может связываться аналогичным образом за исключением того, что его аффинность значительно ниже, чем у YW182.2 Fab.
Пример 3. Выделение и характеристика анти-KLB антител.
Мыши BALB/C были иммунизированы НЕК293, стабильно экспрессирующими белки hFGFRlc и hKLB. Селезенки собирали через 12 недель и получали гибридомы. Гибридомы, продуцирующие антитела анти-hKLB, были идентифицированы с помощью анализа FACS с использованием клеток НЕК293, используемых для иммунизации. В общем, клетки 293, экспрессирующие один hKLB, один hFGFRl или оба белка, окрашивали разведенным супернатантом гибридомы и РЕ-конъюгированными козьими антителами против мышиного антитела IgG (Jackson Labs) в буфере FACS (0,5% BSA в PBS). Тот же самый буфер FACS использовали для промывки окрашенных клеток. Окрашенные клетки анализировали с помощью F AC Scan (Becton Dickinson) и программного обеспечения для анализа FlowJo FACS (Tree Star). кДНК, кодирующую тяжелую цепь и легкую цепь IgG, клонировали в экспрессионные векторы. Все рекомбинантные молекулы моноклонального антитела получали из временно трансфицированных клеток яичника китайского хомячка (СНО) и очищали с использованием обычной колоночной хроматографии.
Было выявлено около 20 различных гибридом, продуцирующих анти-KLB антитела. Последовательности CDR легкой цепи и тяжелой цепи для 16 из этих анти-KLB антител приведены в таблицах 2 и 3. Последовательности легкой цепи этих 16 анти-KLB антител, а также 8С5 показаны на Фиг. ЗА (11F1, 6D12, 11D4, 8Е1, 46СЗ, 8Н7, 21НЗ, 25F7, 14Е6, 14С6, 24А1, 5F8, 6С1, 12А1, 12В8, 14С10 и 8С5; SEQ Ш N0: 111-127, соответственно).
Последовательности тяжелой цепи этих 16 анти-KLB антител, а также 8С5 показаны на Фиг. ЗВ (11F1, 6D12, 11D4, 8Е1, 46СЗ, 8Н7, 21НЗ, 25F7, 14Е6, 14С6, 24А1, 5F8, 6С1, 12А1, 12В8, 14С10 и 8С5; SEQ IDNO: 94-110, соответственно). Таблица 2. Последовательности CDR Н мышиных моноклональных анти-KLB антител
Антитело
CDR HI
CDR H2
CDR H3
11F1
SYGIS (SEQ ID NO: 1)
T VS S GGRYT Y YPD S VKG (SEQ ID NO: 16)
GGDGYALDY (SEQ ID NO: 32)
6D12
DYYMN (SEQ ID NO: 2)
WIDPENDDTIYDPKFQG (SEQ ID NO: 17)
FTTVFAY (SEQ ID NO: 33)
11D4
NYGVS (SEQ ID NO: 3)
VIWGDGSINYHSALIS (SEQ ID NO: 18)
THDWFDY (SEQ ID NO: 34)
8Е1
DTYMN (SEQ ID NO: 4)
RIDPS NGN AKYDPKFQG (SEQ ID NO: 19)
RALGNGYALGY (SEQ ID NO: 35)
46СЗ
DTYIH (SEQ ID NO: 5)
RIDPANGNTKYDPKFQD (SEQ ID NO: 20)
GTSYSWFAY (SEQ ID NO: 36)
8Н7
SYWIH (SEQ ID NO: 6)
EIDPSVSNS N YNQKFKG (SEQ ID NO: 21)
LGVMVYGSSPFWFAY (SEQ ID NO: 37)
21НЗ
SYWIH (SEQ ID NO: 6)
EIDPSVSNS N YNQKFKG (SEQ ID NO: 21)
LGVMVYGSSPFWFAY (SEQ ID NO: 37)
25F7
DTFTH (SEQ ID N0:7)
RIDPS NGNTK YDPKFQG (SEQ ID NO: 22)
RALGNGYAMDY (SEQ ID NO: 38)
14Е6
EYTMN (SEQ ID NO: 8)
GINPNNGETSYNQKFKG (SEQ ID NO: 23)
KTTNY (SEQ ID NO: 39)
14С6
SYWIE (SEQ ID NO: 9)
EIFPGGGSTIYNENFRD (SEQ ID NO: 24)
RGYYDAAWFDY (SEQ ID NO: 40)
24 А1
DYEMH (SEQ ID NO: 10)
AIWPENADSVYNQKFKG (SEQ ID NO: 25)
EGGNY (SEQ ID NO: 41)
5F8
DTYIH (SEQ ID NO: 11)
RIDPANGNTKYDPKFQG (SEQ ID NO: 26)
SGNYGAMDY (SEQ ID NO: 42)
6С1
SYWIE (SEQ ID NO: 9)
EILPGSDSTKYVEKFKV (SEQ ID NO: 27)
GGYHYPGWLVY (SEQ ID NO: 43)
12А11
RYWMS (SEQ ID NO: 12)
EIS PDS S TIN YTPS LKD (SEQ ID NO: 28)
PSPALDY (SEQ ID NO: 44)
12В8
NYGMN (SEQ ID NO: 13)
WIDTDTGEATYTDDFKG (SEQ ID NO: 29)
EEYGLFGFPY (SEQ ID NO: 45)
14С10
TSAMGIG (SEQ ID NO: 14)
HIWWDDDKRYNPALKS (SEQ ID NO: 30)
IDGIYDGSFYAMDY (SEQ ID NO: 46)
8С5
TYGVH (SEQ
VIWS GGSTD YNA AFIS
DYGSTYVDAIDY (SEQ ID
антител
Антитело
CDR LI
CDRL2
CDRL3
11F1
SASQVISNYLN (SEQ ID NO: 48)
FTSSLRS (SEQ ID NO: 63)
QQYSKLPWT (SEQ ID NO: 79)
6D12
SASSSGRYTF (SEQ Ш NO: 49)
DTSKLAS (SEQ ID NO: 64)
FQGTGYPLT (SEQ ID NO: 80)
11D4
RASQDISNYFN (SEQ ID NO: 50)
YTSRLQS (SEQ ID NO: 65)
HQVRTLPWT (SEQ ID NO: 81)
8Е1
KASDHINNWLA (SEQ ID NO: 51)
GTTNLET (SEQ ID NO: 66)
QQYWNTPFT (SEQ ID NO: 82)
46СЗ
RSSQNIVHSDGNTYLE (SEQ ID NO: 52)
KVSNRFS (SEQ ID NO: 67)
FQGSHVLT (SEQ ID NO: 83)
8Н7
KASQFVSDAVA (SEQ ID NO: 53)
SASYRYT (SEQ ID NO: 68)
QQHYIVPYT (SEQ ID NO: 84)
21НЗ
KASQFVSDAVA (SEQ ID NO: 53)
SASYRYT (SEQ ID NO: 68)
QQHYIVPYT (SEQ ID NO: 84)
25F7
KAS DHINNWLA (SEQ ID NO: 51)
GASNLET (SEQ ID NO: 69)
QQYWNTPFT (SEQ ID NO: 82)
14Е6
RASQEISGYLS (SEQ ID NO: 54)
AASTLDS (SEQ ID NO: 70)
LQYGSYPWT (SEQ Ш NO: 85)
14С6
SASSSLSSSYLY (SEQ ID NO: 55)
GASNLAS (SEQ ID NO: 71)
HQWSSYPLT (SEQ ID NO: 86)
24 А1
KSSQSLLNSGNQKNSLA (SEQ ID NO: 56)
LASTRES (SEQ ID NO: 72)
QQHHSTPYT (SEQ ID NO: 87)
5F8
RASSSVNHMY (SEQ ID NO: 57)
YTSTLAP (SEQ ID NO: 73)
QQFTISPSMYT (SEQ ID NO: 88)
6С1
KASQNVDSYVA (SEQ ID NO: 58)
SASYRFS (SEQ ID NO: 74)
QQYNISPYT (SEQ ID NO: 89)
12А11
RASQSISDYVY (SEQ ID NO: 59)
YASQSIS (SEQ ID NO: 75)
QNGHNFPYT (SEQ ID NO: 90)
12В8
KASEDIYNRLA (SEQ ID
AATSLET (SEQ ID
QQYWSNPLT (SEQ ID
NO: 60)
NO: 76)
NO: 91)
14С10
RASESVDSYGNSFMH (SEQ ID NO: 61)
RASNLES (SEQ ID NO: 77)
QQSNEDYT (SEQ ID NO: 92)
8С5
RASESVESYGNRYMT (SEQ ID NO: 62)
RAANLQS (SEQ ID NO: 78)
QQSNEDPWT (SEQ Ш NO: 93)
Большинство полученных из гибридом анти-KLB антител вместе с одним антителом, полученным с помощью фагового дисплея (обозначено Ph # 5, которое было получено с помощью фагового дисплея с использованием рекомбинантного белка hKLB-ECD-HIS (R &D Systems)), были ранжированы на основе медианы сдвига, который наблюдали на диаграмме FACS при измерении связывания 0,8 мкг/мл антител с клетками 293, экспрессирующими hKLB (Фиг. 4).
Кроме того, некоторые антитела были ранжированы по ELISA. Для этих экспериментов анти-KLB антитела, являющиеся химерными рекомбинантными IgG с мышиными вариабельными областями и константными областями hlgGl, были использованы для измерения связывания белка hKLB-ECD-His. Относительное связывание всех тестируемых антител за исключением 14Е6 были схожим, 14Е6 проявило более сильное связывание в условиях ELISA, чем при анализе FACS (Фиг. 5).
Пример 4. Связывание KLB с анти-KLB антителами.
Для тестирования конкуренции связывания между различными анти-KLB антителами использовали ELISA. В некоторых экспериментах антитела IgG, очищенные из супернатантов гибридомы, соответствующих 6D12, 8С5 и 11F1, биотинилировали с использованием набора для биотинилирования NHS-PEO Solid Phase (Pierce). Связывание с белком KLB-ECD-His тестировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена стрептавидина в присутствии различных концентраций анти-KLB, полученных из гибридом. В некоторых экспериментах связывание рекомбинантного человеческого IgG с белком KLB-ECD-His тестировали с использованием конъюгированного с пероксидазой хрена антитела против человеческого IgG (Jackson ImmunoResearch Inc.) в присутствии различных концентраций анти-KLB, полученных из гибридом. Было отмечено, что ни одно из антител 11F1, 11D4, 8Е1 и 46СЗ не конкурируют с 6D12 за связывание (другие белки не были испытаны против 6D12). Анти-KLB антитела 14Е6 и 12А11 конкурируют за связывание с 8С5, но не с 11D4 и 14С10 (другие не испытывали против 8С5), и 11D4 конкурирует за связывание с 11F1, но не с 6D12, 8Е1 и 46СЗ (другие не были испытаны против 11F1).
Пример 5. Межвидовая кросс-реактивность анти-KLB антител.
Видовую кросс-реактивность раскрытых анти-KLB антител анализировали с помощью анализа FACS с использованием кДНК KLB из мыши, крысы, кролика, яванского макака и макак-резусов, клонированной в экспрессионные векторы млекопитающих pRK, которые временно трансфицировали в клетки НЕК293Т. Экспрессируемые последовательности внеклеточного домена полипептида KLB были следующими.
Мышь:
FSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAFQVEGSWKTDG RGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGT VAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFND YATYCFQTFGDRVKYWrriHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKA HS К VWHN YDKNFRPHQKGWLSITLGS HWIEPNRTDNMED VINC QHS MS S VLGWFAN PIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNV SLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDE IRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFP LKESTPDMKGRFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEG VRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYY RCVVSEGLKLGVFPMVTLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRE LGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHG AVSLSLHCDWAEPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASK NQRGLS S S VLPRFT AKES RLVKGT VDF Y ALNHFTTRF VIHKQLNTNRS V ADRD VQFLQ DITRLSSPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKY VQEALKA YLIDKVKIKGYYAFKLTEEKS KPRFGFFTSDFRAKS S VQFYS KLIS S S GLPAE NRSPACGQPAEDTDCTICSFLV (SEQ ID NO: 158).
Крыса (+ FLAG на N-конце):
DYKDDDDKLEFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPGQLFLYDTFPKNFSWGVGTGAF QVEGSWKADGRGPSIWDRYVDSHLRGVNSTDRSTDSYVFLEKDLLALDFLGVSFYQF S IS WPRLFPNGT V A A VN AKGLQ Y YRALLD S LVLRNIEPIVTLYFTWDLPLTLQEE YGGW KNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMHAPGEKGNLTA VYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRTENMEDVINCQHS MSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTSSVIPEFSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSN TVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDNPRILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLN QVLQAIKFDEIQVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHY YKQIIQDNGFPLQESTPDMKGQFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVT GNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLS
KINRQ VLRY YRC V VS EGLKLGIS PM VTLYHPTHS HLGLPMPLLS S GG WLNTNT AKAFQ DYAGLCFKELGDLVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYD RQYRPVQHGAVSLSLHSDWAEPANPYVESHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPL AMKEYIASKKQRGLSSSVLPRFTLKESRLVKGTIDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNCSVA DRDVQFLQDITRLSSPSRLAVTPWGMRKLLGWIRRNYRDMDIYVTANGIDDLALEDD QIRKYYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSVQFYS KLISSSGFSSENRSРАСGQPPEDTECAICSFLT (SEQ ID NO: 147). Кролик (+ FLAG на N-конце):
DYKDDDDKLDFPGDGRAVWSQNPNLSPVNESQLFLYDTFPKNFFWGVGTGAF QVEGSWKKDGKGLSVWDHFIATHLNVSSRDGSSDSYIFLEKDLSALDFLGVSFYQFSIS WPRLFPDGTVAVANAKGLQYYNRLLDSLLLRNIEPVVTLYHWDLPWALQEKYGGWK NETLIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGLHAPGEKGNVAAVY TVGHNLLKAHS К VWHNYNRNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRAESIVDILKCQQSM V SVLGWFANPIHGDGDYPEVMTKKLLSVLPAFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPL NTMAKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYGNPRILIAENGWFTDSYVQTEDTTAIYMMKNF LNQVLQAIRLDGVRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYNTRRGLFYVDFNSEQRERRPKSSA HYYKQVIGENGFTLREATPDLQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWN ATGNRMLHRVEGVRLKTRPAQCTDFITIKKQLEMLARMKVTHFRFALDWASVLPTGN LS E VNRQ ALRY YRC V VTEGLKLNIS PM VTLY YPTH AHLGLP APLLHS GGWLDPS T AKA FRDYAGLCFRELGDLVKLWITINEPNRLSDVYNRTSNDTYQAAHNLLIAHAIVWHLYD RQYRPSQRGALSLSLHSDWAEPANPYVASHWQAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPV AMREYIASKTRRGLSSSVLPRFSDAERRLVKGAADFYALNHFTTRFVMHEQQNGSRY DSDRDVQFLQDITRLASPSRLAVMPWGEGKLLRWMRNNYGDLDVYITANGIDDQALQ NDQLRQYYLEKYVQEALKAYLIDKIKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQF YNKLITSNGFPSENGGPRCNQTQGNPECTVCLLLL (SEQ ID NO: 148).
Яванский макак (+ FLAG на N-конце):
DYKDDDDKLEFSGDGRAVWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGVGTGAL QVEGSWKKDGKGPSIWDHFVHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSI SWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYNTLLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWK NDTIIDIFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVY TVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDILKCQQSMV SVLGWFASPIHGDGDYPEGMKKKLLSILPLFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLN TMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFL S Q VLQ AIRLDEIR VFG YT A WS LLD GFE WQD A YTIRRGLF Y VDFNS KQKERKPKS S AH Y YKQIIRENGFSLKEATPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWNAT
GNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLS AVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHAGGWLNPSTVEAF QAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYD RQFRPS QRG A VS LS LH AD W AEP ANP Y ADS HWRA AERFLQFEIA WF AEPLFKTGD YP A AMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYD SDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDR LRKYYLEKYLQE VLKA YLIDKVRIKGYY AFKLAEEKS KPRFGFFTSDFKAKS SIQFYNK MISSSGFPSENSSSRCSQTQKNTECTVCLFLA (SEQ ID NO: 149). Макак-резус (+ FLAG на N-конце):
DYKDDDDKLEFSGDGRAVWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGVGTGAL QVEGSWKKDGKGPSIWDHFVHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSI SWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYNALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWK NDTIIDIFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVY TVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDILKCQQSMV SVLGWFANPIHGDGDYPEGMKKKLLSILPLFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLN TMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPQILIAENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFL S Q VLQ AIRLDEIR VFG YT A WS LLD GFE WQD A YTIRRGLF Y VDFNS KQKERKPKS S AH Y YKQIIRENGFSLKEATPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWNAT GNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLS AVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHAGGWLNPSTVEAF QAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYD RQFRPS QRG A VS LS LH AD W AEP ANP Y ADS HWRA AERFLQFEIA WF AEPLFKTGD YP A AMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYD SDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDR LRKYYLEKYLQEVLKA YLIDKVRIKGYY AFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNK MISSSGFPSENSSSRCSQTQKNTECTVCLFLV (SEQ ID NO: 150).
Как показано в Таблице 4, было обнаружено, что большинство антител, например, 6D12, 11D4 и 8Е1, связываются с KLB кролика, яванского макака и макак-резусов и около половины анти-KLB антител, например, 8С5, 14Е6 и 14С6, связываются с KLB мыши и крысы.
6D12
нет
нет
11D4
нет
нет
8Е1
нет
нет
46СЗ
нет
нет
нет
нет
8Н7
Слабое
нет
21НЗ
Слабое
нет
25F7
нет
нет
Слабое
8С5
нет
14Е6
14С6
24 А1
5F8
нет
нет
6С1
нет
нет
12А11
Слабое
нет
12В8
нет
нет
14С10
нет
нет
Пример 6. Картирование эпитопов анти-KLB антител.
Чтобы определить, связывают ли анти-KLB антитела внеклеточный домен (ECD) человеческого альфа-Клото (hKLA), была использована конструкция, имеющая следующую последовательность.
Предсказанная экспрессируемая полипептидная последовательность (с С-концевым (внутриклеточным) FLAG):
EPGDGAQTWARFSRPPAPEAAGLFQGTFPDGFLWAVGSAAYQTEGGWQQHGKGASI
WDTFTHHPLAPPGDSRNASLPLGAPSPLQPATGDVASDSYNNVFRDTEALRELGVTHY
RFSISWARVLPNGSAGVPNREGLRYYRRLLERLRELGVQPVVTLYHWDLPQRLQDAY
GGWANRALADHFRDYAELCFRHFGGQVKYWrriDNPYVVAWHGYATGRLAPGIRGS
PRLG YLV AHNLLLAH AKVWHLYNTSFRPT QGGQ VS IALS S HWINPRRMTDHSIKEC QK
SLDFVLGWFAKPVFIDGDYPESMKNNLSSILPDFTESEKKFIKGTADFFALCFGPTLSFQ
LLDPHMKFRQLESPNLRQLLSWIDLEFNHPQIFIVENGWFVSGTTKRDDAKYMYYLKK
FIMETLKAIKLDGVD VIGYT AWS LMDGFEWHRGYSIRRGLFYVDFLS QDKMLLPKS S A
LFYQKLIEKNGFPPLPENQPLEGTFPCDFAWGVVDNYIQVDTTLSQFTDLNVYLWDVH
HSKRLIKVDGVVTKKRKSYCVDFAAIQPQIALLQEMHVTHFRFSLDWALILPLGNQSQ
VNHTILQYYRCMASELVRVNITPVVALWQPMAPNQGLPRLLARQGAWENPYTALAFA
EYARLCFQELGHHVKLWITMNEPYTRNMTYSAGHNLLKAHALAWHVYNEKFRHAQ
NGKISIALQADWIEPACPFSQKDKEVAERVLEFDIGWLAEPIFGSGDYPWVMRDWLNQ
RNNFLLPYFTEDEKKLIQGTFDFLALSHYTTILVDSEKEDPIKYNDYLEVQEMTDITWL
NSPSQVAVVPWGLRKVLNWLKFKYGDLPMYIISNGIDDGLHAEDDQLRVYYMQNYIN
EALKAHILDGINLCGYFAYSFNDRTAPRFGLYRYAADQFEPKASMKHYRKIIDSNGFPG
PETLERFCPEEFT VCTECS FFHTRKS LLAFIAFLFFAS IIS LS LIF Y YS KKGRRS YKLED YK
DDDDK (SEQ ID NO: 151).
Оба белка KLA и KLB имеют два гликозидаза-подобных домена, один N-концевой и один С-концевой. Чтобы определить область KLB, распознаваемую антителами, анти-KLB, hKLB, hKLA и химерную конструкцию, содержащую N-концевой гликозидаза-подобный домен hKLA и С-концевой гликозидаза-подобный домен hKLB, клонировали в экспрессионный вектор млекопитающих pCMV-Tag4A (Agilent). N- и С-концевые домены hKLA и hKLB соответствуют последовательностям SEQ Ш N0: 151 и SEQ Ш N0: 145, соответственно, как показано в Таблице 5. N-концевые домены hKLA и hKLB были разделены на 5 сегментов, и С-концевые домены были разделены на 5 сегментов на основе гомологии последовательностей между двумя белками.
Сегмент 8 ECD KLA
614-729 из SEQIDNO: 151
Сегмент 9 ECD KLA
730-831 из SEQIDNO: 151
Сегмент 10 ECD KLA
832-944 из SEQIDNO: 151
Сегмент 1 ECD KLB
1-77 из SEQ ID NO: 145
Сегмент 2 ECD KLB
78-184 из SEQIDNO: 145
Сегмент 3 ECD KLB
185-313 из SEQIDNO: 145
Сегмент 4 ECD KLB
314-425 из SEQIDNO: 145
Сегмент 5 ECD KLB
426-455 из SEQ ID NO: 145
Сегмент 6 ECD KLB
456-514 из SEQIDNO: 145
Сегмент 7 ECD KLB
515-598 из SEQIDNO: 145
Сегмент 8 ECD KLB
599-722 из SEQ ID NO: 145
Сегмент 9 ECD KLB
723-829 из SEQ ID NO: 145
Сегмент 10 ECD KLB
830-992 из SEQ ID NO: 145
Антитела согласно настоящему изобретению анализировали с помощью FACS, и примерно половина антител по данным этого анализа распознавала N-концевой гликозидаза-подобный домен hKLB, в то время как остальные антитела распознавали С-концевой гликозидаза-подобный домен (Таблица 6). Как показано в Таблице 6, два антитела, которые распознают N-концевой домен hKLB, связывают часть домена, содержащую сегмент 1, в то время как остальным для связывания необходимы только сегменты 2-5.
На основании способности RIMAb активировать FGFR1 в виде Fab была получена молекула, в которой более низкоаффинное RIMAb было присоединено к более высокоаффинному анти-KLB антителу, что привело к созданию биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела (Фиг. 6А; WO2012/158704).
Не желая ограничиваться конкретной теорией, авторы предполагают, что FGF21-опосредованная активация происходит путём привлечения FGF21 к комплексу FGFRlc/KLB через С-концевой KLB-связывающий хвост, в то время как детерминанты для FGFR-специфичности располагаются в N-концевой области, которая, вероятно, связывается с FGFR с низкой аффинностью (см. Фиг. 6В) (Yie et al. FEBS Lett. 583(1): 1924 (2009)). Таким образом, присоединение низкоаффинного RlMAbl к высокоаффинному анти-KLB антителу в виде биспецифического антитела может привести к KLB-зависимому агонисту FGFR1. Не желая ограничиваться конкретной теорией, авторы предполагают, что биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело, которое включает плечо FGFR1, имеющее низкую аффинность, может снизить риск прочного связывания биспецифического анти-KLB/aHTH-FGFRl антитела с FGFR1 в отсутствие KLB и риск предотвращения связывания и/или активации FGFR1 другими лигандами FGF (например, FGF1, FGF2, FGF8 и FGF23). Кроме того, плечо FGFR1 с низкой аффинностью делает возможным присутствие более высоких уровней примесей анти-FGFRl, включая, без ограничения, половину антитела анти-FGFRl, несущую выступ, нековалентные димеры анти-FGFRl антител, ковалентные димеры анти-FGFRl и формы с высокой молекулярной массой, которые не приводят к клинически значимым побочным эффектам.
В настоящем описании bFKBl, в общем, относится к любому из нескольких биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRl антител, раскрытых в настоящем описании. Подробные данные о конкретных биспецифических анти-KLB/aHTH-FGFRl антителах, раскрытых на фигурах, представлены ниже. Клетки FIEK293 котрансфицировали смесью
четырех экспрессионных векторов, кодирующих тяжелые и легкие цепи анти-FGFRl (YW182.2 (RlMAbl) и YW182.3 (RlMAb2)) и анти-KLB антител, описанных выше. Тяжелые цепи анти-FGFRl и анти-KLB были соответственно помечены Flag-пептидом и Oct-гистидином, так что гетеродимер IgG может быть очищен с помощью последовательной аффинной очистки из кондиционированной среды. Частично очищенный гетеродимер IgG затем анализировали в люциферазном анализе GAL-ELK1 для идентификации KLB-зависимых агонистов. Чтобы свести к минимуму неправильное спаривание тяжелых и легких цепей, анти-FGFRl был экспрессирован с человеческой константной областью Fab, а анти-KLB был экспрессирован с мышиной константной областью Fab. Меченые биспецифические IgG первоначально были испытаны в неочищенном виде с использованием 28 комбинаций 3 анти-RlMAbs и 18 анти-KLB АЬ (Таблица 7).
Фиг. 7А показывает данные по индукции для некоторых биспецифических комбинаций YW182.2 (RlMAbl), YW182.3 (RlMAb2) и YW182.5 (RlMAb3) с 18С5, 12А11 и 14Е6 в люциферазном анализе GAL-ELK1. В большинстве случаев, было отмечено, что активированный биспецифическими антителами сигналинг значительно лучше происходит в клетках, которые коэкспрессируют FGFRlc и KLB, по сравнению с клетками, которые экспрессируют только FGFRlc, но не KLB.
На основании данных об активности этих антител в начальных экспериментах 8 репрезентативных анти-KLB Ab (Ph#5, 8С5, 12А11, 14С10, 6D12, 11D4, 6С1 и, в качестве отрицательного контроля, 14Е6) были использованы для получения немеченых биспецифических антител с YW182.5 (получали с помощью описанной выше технологии "выступ-во-впадину" и использовали для дальнейшего исследования (см. выше, и, например, в Atwell, et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). Как показано на Фиг. 8А, биспецифические антитела были получены с константной областью IgGl человека (дикого типа, с эффекторной функцией (1)) и с константной областью IgGl человека с мутацией N297G для устранения эффекторной функции (3) или константной областью мыши с двойной мутацией [D265G/N297G] (DANG) для устранения эффекторной функции (2).
В таблице 7 ниже перечислены различные биспецифические антитела, которые были получены с использованием технологии "выступ-во-впадину".
агглютинина амброзии (мышиный IgG2a) или человеческие анти-Нег2 антитела трастузумаб (IgGl человека). Fab-фрагменты экспрессировали в E.coli и очищали с использованием обычной колоночной хроматографии. За исключением FGF21, который был использован в анализе связывания радиоактивно меченого лиганда с клетками, который проводили с йод-меченым FGF21 от Phoenix Pharmaceuticals и произведенным самостоятельно немеченым FGF21, рекомбинантный FGF21 для всех остальных анализов был получен от R &D Systems (2539-FG/CF). Каждая из биспецифических комбинаций (за исключением отрицательного контроля) показала зависимость сигналинга от FGFRlc и KLB. Данные для некоторых комбинаций показаны на Фиг. 7В. Кроме того, сочетание плеч анти-KLB и YW182.5 (RlMAb3) показало более низкий фоновый сигналинг в клетках, которые экспрессируют FGFRlc, но не KLB.
Как показано на Фиг. 6С, активность анти-KLB/aHTH-FGFRl с антитела (BsAbl7) была протестирована на клетках НЕК293, дефицитных по FGFR1, экспрессируюших различные рецепторы. Клетки НЕК293Т, дефицитные по FGFR1, были получены с использованием способа CRISPR-cas9 с помощью гидовых РНК. Анти-КЬВ/анти-
FGFRlc антитела показали индукцию активности люциферазы в рекомбинантных клетках, коэкспрессирующих hFGFRlc и hKLB (Фиг. 6С).
Аналогичные результаты наблюдались для других анти-KLB/aHTH-FGFRl с антител. Как показано на Фиг. 7С, при тестировании в люциферазном анализе GAL-ELK1 в клетках НЕК293, экспрессирующих FGFRlc совместно с KLB или без него, множество комбинаций биспецифических антител из плеч анти-FGFRl и анти-KLB, например, BsAb5, 6, 7, 8, 9, 10, дозозависимо индуцировали активность люциферазы в клетках, экспрессирующих рекомбинантные hFGFRlc и hKLB, но не в клетках без экспрессии KLB. Эти результаты указывают на то, что эти биспецифические антитела действуют как KLB-зависимые агонисты FGFR, так же, как FGF21.
Также была протестирована синергия антитела анти-KLB/aHTH-FGFRl с (BsAbl7) с FGF21. Как показано на Фиг. 9В, между BsAbl7 и FGF21 не наблюдалось синергии, когда последовательно увеличивали концентрацию FGF21, а концентрацию BsAbl7 оставляли неизменной.
Кроме того, когда концентрацию анти-KLB/aHTH-FGFRl с антитела (BsAbl7) последовательно увеличивали, а концентрацию FGF21 оставляли неизменной, между BsAbl7 и FGF21 не наблюдалось синергии (Фиг. 9С).
Аффинность связывания (Kd) двух биспецифических антител, BsAblO и BsAb9, (наряду с hFGF21) в растворе с клетками НЕК293, экспрессирующими KLB человека, яванского мамака и мыши, FGFRlc человека или оба белка hFGFRlc и hKLB, измеряли с помощью анализа связывания радиоактивно меченного лиганда. Для анализа связывания клетками радиоактивного лиганда клетки НЕК293, которые стабильно коэкспрессировали KLB и/или FGFRlc, помещали в 96-луночный планшет при плотности от 100000 до 200000 клеток на 0,2 мл связывающего буфера (DMEM с 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 50 мМ HEPES, рН 7,2, 0,1% азида натрия и 350 мМ человеческого IgG). К клеткам добавляли смеси для реакции конкуренции объемом 50 мкл, содержащие фиксированную концентрацию йод-меченого FGF21 (Phoenix Pharmaceuticals) или йод-меченого BsAb и серийные разведения немеченного FGF21 (Genentech) или немеченного BsAb. Реакционную смесь для конкуренции инкубировали с клетками в течение 2 ч при комнатной температуре. После 2 ч инкубации реакционные смеси для конкуренции переносили в фильтровальный планшет Millipore Multiscreen и промывали четыре раза буфером для связывания, чтобы отделить свободные йод-меченый FGF21 или антитело от связанных. Активность фильтров считывали на гамма-счётчике Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer Life и Analytical Sciences). Данные о связывании были оценены с использованием программного обеспечения New
Ligand (Genentech), которое использует алгоритм аппроксимации Мансона и Родбарда (Munson and Rodbard Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980)) для определения аффинности связывания.
Как показано в Таблице 8, оба антитела проявили хорошую реакционную способность по отношению к клеткам, экспрессирующим только KLB (межвидовой паттерн соответствует наблюдаемому ранее), но оба антитела гораздо слабее связываются с клетками, экспрессирующими только hFGFRlc, и более сильно связываются с клетками, экспрессирующими hKLB и hFGFRlc. Таблица 8. Связывание биспецифических анти-KLB антител с KLB/FGFR1 из разных
видов
FGFRlc
(нет)
(нет)
(нет)
Человек
Человек
KLB
Человек
Яванский макак
мышь
Человек
(нет)
BsAblO
6,6 нМ
15,4 нМ
15,5 нМ
2,3 нМ
300 нМ
BsAb9
9,8 нМ
35 нМ
нет данных
2,2 нМ
300 нМ
hFGF21
нет данных
нет данных
нет данных
5,3 нМ
нет данных
Фиг. 9D показывает аффинность BsAblO и BsAb9 к клеткам FTEK293, стабильно экспрессирующим hKLB, hFGFRlc или оба белка, по сравнению с антителом с двумя соответствующими связывающими анти-FGFRl плечами (YW182.5) по данным анализа FACS. Были получены результаты, аналогичные указанным выше (Фиг. 9D).
Дальнейшие эксперименты проводили с одним биспецифическим антителом, BsAblO, которое имеет YW182.5 в качестве анти-FGFRl плеча и 8С5 в качестве анти-KLB плеча, и производными BsAblO (BsAbll-20). Как показано на Фиг. 6С, мышиные рецепторы были экспрессированы в клетках FTEK293, и было показано, что BsAb 17 также индуцирует активность люциферазы в этих клетках, что подтверждает видовую кросс-реактивность этого АЬ.
BsAblO затем было протестировано в миобластах крысы L6, в которых отсутствуют эндогенные KLB и FGFR, но которые были трансфицированы для экспрессии hKLB и каждой из 5 изоформ hFGFR (Фиг. 9А). Было обнаружено, что BsAblO индуцирует активность люциферазы только в клетках, экспрессирующих как FGFRlc, так и KLB, что указывает на активность BsAblO в качестве специфического агониста для комплекса FGFRlc/KLB, но не KLB в комплексе с другими FGFR (Фиг. 9А). FGF21 и FGF19 были использованы в качестве контроля, чтобы продемонстрировать, что FGF21 индуцирует активность люциферазы, когда клетки
экспрессируют комбинацию KLB и любого из FGFRlc, 2с или Зс, и что FGF19 индуцирует активность люциферазы, когда клетки экспрессируют комбинацию KLB и FGFR4. За исключением FGF21, который был использован в анализе связывания радиоактивно меченого лиганда с клетками, который проводили с йод-меченым FGF21 от Phoenix Pharmaceuticals и произведенным самостоятельно немеченым FGF21, рекомбинантный FGF21 для всех остальных анализов был получен от R &D Systems (2539-FG/CF). кДГЖ, кодирующие внеклеточный домен (ECD) человеческих FGFRlb, lc, 2Ь, 2с, ЗЬ, Зс и 4, были клонированы в экспрессионный вектор, содержащий промотор цитомегаловируса (CMV), чтобы получить химерные белки человеческий FGFR-человеческий Fc или His-меченые белки FGFR.
Тем не менее, как описано выше, исходное анти-FGFRl с антитело для BsAblO, RlMAb3 (YW182.5), неожиданно может связываться с FGFRlb, изоформой FGFR1, которая не вступает во взаимодействие с KLB. Кроме того, RlMAb3 (YW182.5) может активировать FGFRlb в анализе GAL-ELK1 в клетках L6, что отличается от активности BsAblO (см. Фиг. 2С и 2В).
Кроме того, сочетание FGFRlb и KLB не приводит к активации под действием BsAblO (Фиг. 9А). Не желая быть ограниченными какой-либо конкретной теорией, авторы предполагают, что эти данные свидетельствуют о том, что наличие предварительно сформированного комплекса FGFR1/KLB является необходимым условием для KLB-зависимой активации FGFR1 под действием BsAblO.
Пример 8. BsAblO и его производные действуют как молекулярные миметики FGF21.
Дальнейшее исследование BsAblO и его производных (BsAbll-20) и FGF21 выявило некоторые сходства и различия. Для определения уровня фосфорилирования промежуточных участников сигнализации МАРК клетки выращивали в базальной среде-2 для преадипоцитов, содержащей FBS, L-глутамин и GA-1000. При достижении клетками сплошного покрытия подкожные преадипоциты (приобретенные у Lonza) дифференцировали в культуральной среде, содержащей дексаметазон, индометацин и 3-изобутил-1-метилксантин (IB MX). Для анализа экспрессии генов клетки дифференцировали в течение 14 дней, а затем дополнительно культивировали в течение дополнительных 48 часов с указанными агонистами. Для анализа сигналинга МАРК клетки дифференцировали в течение 10 дней, культивировали в среде без сыворотки в течение 3 ч, а затем культивировали в течение дополнительного часа с указанными агонистами.
Как показано на Фиг. 6D, по данным вестерн-блоттинга BsAblO, BsAb 17, BsAb20
и FGF21 проявили сравнимую активность в отношении индукции фосфорилирования промежуточных участников сигналинга МАРК, таких как МЕК и ERK, в первичных человеческих адипоцитах, которые представляют собой релевантный тип клеток для анти-диабетической активности FGF21. Антитела, используемые для Вестерн-блот-анализа, были получены от Cell Signaling Technology: pFRS2a (T196) (#3864), pMEKl/2 (S217/221) (#9154), pERKl/2 (T202/204) (#4370), ERK1/2 (#4695), HSP90 (#4874), р-актин (# 5125), от Abeam: UCP1 (abl0983) или от R &D Systems: KLB (AF2619).
Как показано на Фиг. 8В, усиление фосфорилирования ERK, представленное в виде кратного изменения уровня pERK, наблюдалось в первичных человеческих адипоцитах, обработанных BsAblO, BsAbl7, BsAb20 или FGF21.
Кроме того, профиль аффинности BsAblO напоминает FGF21. При тестировании с помощью FACS BsAblO показало сильное связывание с клетками, экспрессирующими hKLB, вне зависимости от коэкспрессии FGFRlc (Фиг. 10А). Неожиданным стало очень низкое связывание BsAblO с клетками, экспрессирующими FGFRlc, но не KLB, что указывает на чрезвычайно низкую моновалентную аффинность плеча YW182.5 (Фиг. 10А).
Как представлено на Фиг. 10В, анализ связывания радиоактивно-меченого лиганда показал, что константа диссоциации (Kd) BsAblO для клеток, экспрессирующих как FGFRlc, так и KLB, составляет 2,3 нМ и близка к 5,3 нМ для hFGF21 в аналогичном формате анализа. Эти значения близки к наблюдаемой ЕС50 этих молекул в анализе GAL-ELK1 в клетках НЕК293 (3,2 нМ и 4,7 нМ, соответственно, для BsAblO и FGF21). При экспрессии в клетках только человеческого KLB или только мышиного KLB Kd составили 6,6 нМ и 15,5 нМ, соответственно.
Поскольку аффинность к FGFR1 была настолько низкой, анализ связывания радиоактивно-меченого лиганда не позволяет достоверно определить Kd BsAblO для клеток, экспрессирующих только FGFRlc, но, по оценкам, она составляет > 300 нМ, как показано на Фиг. ЗВ. По той же причине кинетика связывания BsAblO с FGFR1 не может быть достоверно определена и с помощью SPR.
Кроме того, взаимодействие между белками FGFRlc-ECD и KLB-ECD стабилизировалось BsAblO, как ранее наблюдалось для FGF21, что согласуется с предположением, что BsAblO действует как FGFRlc-селективный миметик FGF-21 (Фиг. 11) (Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398-410 (2012)). Взаимодействие FGFRl/KLB/BsAblO было изучено с помощью измерений с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе PROTEON(tm) XPR36 (Bio-Rad Laboratories) при температуре 25° С. Белок FGFRl-His (20 мкг/мл) при рН 4,5
иммобилизовали при поверхностной плотности (1000 RU) на активированный сенсорный чип PROTEON(tm) GLC с использованием стандартных процедур аминного связывания, как описано производителем. BsAblO и/или смеси 1:1 BsAblO и KLB-ECD вводили при концентрации 6,25 нМ, 12,5 нМ, 25 нМ, 50 нМ, 100 нМ или 200 нМ в PBS, содержащем 0,005% объем/объем TWEEN(r)-20, 0,3M NaCl (рН 7,4), при скорости потока 80 мкл/мин и записывали сенсограммы фаз ассоциации и диссоциацию. Образцы вводили в течение 300 с, после чего диссоциацию оценивали в течение 600 с. Данные сравнивали с внутренними контролями, обрабатывали и измеряли константы диссоциации с помощью программного обеспечения PROTEON(tm) Manager (версия 3.0, Bio-Rad). Предполагается, что активация комплекса FGFRlc/KLB под действием BsAblO происходит путём образования трехкомпонентного комплекса из FGFRlc-ECD, KLB-ECD и BsAblO.
Как показано на Фиг. 11, было также отмечено, что BsAblO формирует тройной комплекс с рекомбинантными KLB-ECD и FGF21 или FGF19. Взаимодействие BsAblO/KLB/FGF было изучено с помощью интерферометрии биослоя (BLI), измеренной на приборе Octet RED (ForteBio) при температуре 25° С. BsAblO (20 мкг/мл) при рН 4,5 иммобилизовали на активированном реагирующем с аминогруппами биосенсорном чипе, как описано производителем. KLB-ECD (20 мкг/мл) в PBS, содержащем 0,005% объем/объем TWEEN(r)-20, 0,3 М NaCl (рН 7,4), захватывали на тех же самых биосенсорных чипах, после чего проводили измерения с FGF21 (R &D Systems) при концентрации 0, 0,2, 0,8, или 2 мкМ в том же буфере. Качественные данные были обработаны с помощью программного обеспечения для сбора данных (ForteBio).
На Фиг. 12А показана схема проведенного эксперимента с резонансным флуоресцентным переносом энергии с временным разрешением (TR-FRET) на поверхности клеток. Для TR-FRET С087-клетки котрансфицировали для экспрессии SNAP-меченого FGFR1 и немеченого KLB и высевали в 96-луночный планшет с прозрачным дном (Costar) в количестве 100000 клеток на лунку. Трансфицированные клетки метили через 24 ч после трансфекции 100 нМ конъюгированного с донором бензилгуанин SNAP-Lumi4-Tb (Cisbio) и 1 мкМ конъюгированного с акцептором бензил-гуанин SNAPAlexa647 (NEB) в течение 1 ч при 37° С, 5% СОг- После трех промывок излучение Lumi4-Tb и сигнал TR-FRET регистрировали при 620 нм и 665 нм, соответственно, в течение 400 мкс после задержки на 60 мкс после возбуждения лазером с длиной волны 343 нм с использованием планшетного спектрофлуориметра Safire2 (Тесап) при t = 0 и t = 15 мин после добавления лиганда. Сигнал эмиссии А1еха647 был обнаружен при 682 нм после возбуждения при 640 нм на том же планшетном
спектрофлуориметре. Интенсивность FRET затем вычисляли следующим образом: (сигнал при 665 нм клеток, меченных SNAP-донором и SNAP-акцептором) - (сигнал при 665 нм тех же трансфицированных клеток, меченных SNAP-донором и не меченых SNAP-акцептором).
Как показано на Фиг. 12В, эксперимент TR-FRET позволяет предположить, что BsAb 17 и FGF21 оба усиливают димеризацию FGFRlc-ECD, когда KLB также присутствует в клетке. Результаты представлены как отношение FRET: интенсивность FRET, разделенная на излучение донора при длине волны 620 нм.
Кроме того, BsAblO связывается с С-концевой половиной KLB-ECD, в то время как FGF21 и FGF19, предположительно, связываются с сайтом в N-концевой половине KLB (Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ral53 (2012)), что свидетельствует о том, что эпитоп BsAblO на KLB должен отличаться от сайта связывания FGF21 и FGF19. Для картирования эпитопа KLB для BsAblO проводили связывание 8С5 (KLB-связывающее плечо BsAblO) с серией химерных антигенов, экспрессированных в клетках НЕК293. Каждый химерный белок был сконструирован путем слияния KLB человека и альфа-Клото (KLA) человека (50% идентичности с белком KLB человека) или KLB кролика (86% идентичности с KLB человека). Как показано на Фиг. 13В, 8С5 связывается с С-концевым доменом KLB, в частности, с областью, содержащей 34 аминокислоты в С-концевом домене KLB (SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS; SEQ ID NO: 142).
Как показано на Фиг. 13В, аминокислотная последовательность SEQ Ш NO: 142 может соответствовать аминокислотам 857-890 белка KLB, который включает сигнальную последовательность, например, такую как последовательность из 52 аминокислот, представленную в SEQ Ш NO: 157, или может относиться к аминокислотам 805-838 белка KLB, который не включает сигнальную последовательность.
Несмотря на сходство между FGF21 и BsAblO и его производными в активности, имеющей место после связывания с рецептором, эпитоп BsAblO на KLB отличается от сайта связывания FGF21 и FGF19 (Фиг. 14А).
На Фиг. 14В показаны результаты люциферазного анализа GAL-ELK1, выполненного на миобластах крысы L6, котрансфицированных FGFR4 и KLB и обработанных FGF19 отдельно или в комбинации с анти-KLB/aHTH-FGFRl с антителом (BsAbl7). Как показано на Фиг. 14В, предварительная обработка BsAbl7 также не блокировала активность FGF19 в клетках L6, экспрессирующих комплекс FGFR4/KLB.
Кроме того, как показано на Фиг. 14С, предварительная обработка BsAb 17 не
блокировала активность FGF 19 в клетках гепатомы Н41ГЕ, экспрессирующих FGFR4 и KLB. В присутствии BsAb 17 FGF 19 был еще способен активировать комплекс FGFR4/KLB для индукции фосфорилирования ERK (Фиг. 14С). Эти данные указывают на то, что представленное биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl, например, биспецифическое антитело анти-KLB/aHTH-FGFRl с, не мешает взаимодействию FGF19 или FGF21 с комплексом KLB/FGFRlc.
Пример 9. BsAblO и его производные действуют в качестве длительно действующего миметика FGF21 in vivo.
Кросс-реактивность BsAblO и его производных с мышиным рецепторным комплексом, как описано выше (см., например, Фиг. 6С и 10В), позволила протестировать его активность in vivo с помощью моделей на мышах. Чтобы избежать потенциальной токсичности от эффекторной функции IgG, в Fc-область BsAb20 была введена двойная мутация [D265A/N297G], которая предотвращает связывание с FcgR и привлечение иммунных эффекторных клеток. Кроме того, чтобы избежать потенциальной токсичности от эффекторной функции IgG, в Fc-область BsAb 17 была введена замена N297G, которая предотвращает связывание с FcgR и привлечение иммунных эффекторных клеток.
Как показано на Фиг. 15А, когда диабетическим мышам db/db вводили внутрибрюшинно 5 мг/кг BsAb 17, уровень глюкозы в крови снижался в отсутствие изменений в потреблении пищи и весе тела. Мыши C57BL/6 на диете с низким уровнем жира, получившие BsAb 17, продемонстрировали снижение уровня глюкозы в крови, но не достигли токсической гипогликемии (Фиг. 15А).
Кроме того, когда мышам C57BL/6 на диете с высоким содержанием жиров (индуцированное диетой ожирение, DIO) вводили BsAb 17 в дозе 3 мг/кг в дни 0 и 6, наблюдалось значительное снижение веса и уровня глюкозы в крови (Фиг. 15В). Для кормления согласно диете с высоким содержанием жиров была использована диета с высоким содержанием жиров и высоким содержанием углеводов (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% калорий из жира).
Как показано на Фиг. 15С, увеличение толерантности к глюкозе наблюдалось у мышей C57BL/6 на диете с высоким содержанием жиров (индуцированное диетой ожирение, DIO), которым был введен BsAb 17 в дозе 3 мг/кг.
У мышей C57BL/6 на диете с высоким содержанием жиров (индуцированное диетой ожирение, DIO), которым был введен BsAb 17 в дозе 3 мг/кг, наблюдалось снижение уровней триглицеридов в печени, сывороточного инсулина, свободных жирных кислот, триглицеридов и общего холестерина (Фиг. 15D). Аналогичные
результаты ранее наблюдались при инъекциях FGF21.
Чтобы определить, требуется ли для наблюдаемого при лечении биспецифическим анти-KLB/aHTH-FGFRl с антителом улучшения толерантности к глюкозе наличие функционального KLB, проводили отдельный эксперимент на klb-гетерозиготных мышах и гомозиготных klb-дефицитных мышах. Для создания klb-дефицитных (КО) мышей Klb-специфичную пару нуклеаз с "цинковыми пальцами" (ZFN) получали от Sigma-Aldrich и использовали для пронуклеарной микроинъекции в соответствии с известными способами. Пара ZFN нацелена на следующую последовательность Klb в геноме мыши (разрезаемый сайт обозначен маленькими буквами), и у мышей КО не хватает одной удалённой пары оснований (g выделен жирным шрифтом), что вызывает сдвиг рамки считывания: GTT АСС GGCTTCtccggaGAC GGGA A AGC A AT ATGG (SEQ Ш NO: 156). Фиг. 16А показывает N-концевую аминокислотную последовательность мышиного белка KLB и соответствующую аминокислотная последовательность, кодируемую аллелем klb у klb-дефицитных мышей.
На Фигуре 16В приведены результаты вестерн-блоттинга, который был выполнен, чтобы подтвердить отсутствие экспрессии белка KLB у klb-дефицитных мышей.
Как показано на Фиг. 16С, BsAb20 улучшает толерантность к глюкозе у klb-гетерозиготных мышей, что измерено с помощью теста на толерантность к глюкозе (GTT), но не у гомозиготных klb-дефицитных мышей, что указывает на необходимость присутствия функционального KLB для улучшения толерантности к глюкозе. Для теста на толерантность к глюкозе (GTT) мыши голодали в течение ночи, и им вводили внутрибрюшинно 2 г/кг раствор глюкозы.
Кроме того, в отличие от анти-FGFRl RlMAbl, которое изменяет уровни FGF23 и фосфора в сыворотке (Wu et al., Sci Transl Med 3, 113ral26 (2011) и Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)), биспецифическое анти-KLB/aHTH-FGFRl антитело не влияет на эти параметры в сыворотке крови, что указывает на отсутствие KLB-независимой агонистической активности FGFR 1 (Фиг. 16D).
Как показано на Фиг. 17, BsAb 17 не меняет уровней FGF23 или фосфора в сыворотке, которые являются чувствительными маркерами KLB-независимого FGFR1. Действие инсулина у обработанных BsAb 17 мышей измеряли с помощью гиперинсулинемических-эугликемических фиксаций. В целом, мышей анестезировали изофлураном и катетеризировали левую общую сонную артерию и правую шейную вену для отбора проб и инфузии, соответственно. Свободные концы катетеров были тоннельно выведены под кожей на заднюю часть шеи, где свободные концы катетеров
были прикреплены к трубке из MICRO-RENATHANE(r) (0,033 в OD). Животных после операции содержали индивидуально и ежедневно регистрировали вес тела. Все метаболические эксперименты были проведены после 5-дневного периода послеоперационного восстановления и были предварительно описаны. Мышей в сознании в условиях свободного поведения помещали в 1 л пластиковый контейнер с подстилкой и не давали корм с 7:00 утра (t = -300 мин). Мыши были немедленно подключены к двухканальному поворотному соединению из нержавеющей стали (Instech Laboratories), чтобы обеспечить одновременно инфузию в яремную вену и отбор проб артериальной крови. Мышей не трогали, и они могли свободно передвигаться, чтобы исключить стресс. За 2 ч до начала фиксации в яремную вену вводили болюс 5 мКи [3-HJ-D-глюкозы (t = -120 мин), после чего следовала постоянная инфузия со скоростью 0,05 мкКи/мин. После 2 ч периода уравновешивания при t = 0 мин (т.е. 5 ч голодания) отбирали исходный образец артериальной крови для измерения уровня глюкозы в крови, [3- HJ-D-глюкозы, гематокрита и инсулина в плазме. Затем начинали процедуру гиперинсулинемической-эугликемической фиксации в течение 145 мин (4 мЕд/кг/мин). [3- HJ-D-глюкозу добавляли к переменной инфузии глюкозы, которая была использована для поддержания эугликемии, а постоянную инфузию [3- HJ-D-глюкозы прекращали, чтобы зафиксировать удельную активность глюкозы в артериальной крови на постоянном уровне. Красные клетки крови от мыши донора линии C57BL/6J промывали и восстанавливали в равном объеме 0,9% гепаринизированного физиологического раствора (гематокрит ~ 50%) и проводили их инфузию со скоростью 4 мкл/мин в течение данного исследования, чтобы заменить кровь, удалённую во время исследования. Образцы артериальной крови брали через каждые десять минут, чтобы определить уровень глюкозы в крови. При t = 80, 90, 100 и 120 мин были взяты образцы крови для определения [3- HJ-D-глюкозы. При t = 120 мин в катетер яремной вены вводили болюс 13 мкКи 2-дезокси[14С]глюкозы ([2-14C]DG). При t = 122, 125, 130, 135 и 145 мин артериальную кровь отбирали для определения уровня глюкозы в крови, [3- H]-D-глюкозы и [2-14C]DG в плазме. Концентрацию инсулина в артериальной крови измеряли в точках 100 и 120 мин. При t = 145 мин мышей анестезировали. Камбаловидную, икроножную мышцу, белую наружную часть латеральной широкой мышцы бедра (Quad), печень, сердце, эпидидимальную и подкожную белую жировую ткань, бурую жировую ткань и мозг вырезали, немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70° С до предстоящего анализа ткани. Иммунореактивный инсулин анализировали с использованием набора Linco Rat Radioimmunoassay (LincoResearch).
Для измерения уровня [3- HJ-D-глюкозы образцы плазмы депротеинизировали с
помощью гидроксида бария (Ва(ОН)2) и сульфата цинка (Z11SO4), сушили, и определяли радиоактивность с помощью жидкостной сцинтилляции. Вырезанные ткани депротеинизировали хлорной кислотой и затем нейтрализовали до рН ~ 7,5. В части образца измеряли радиоактивность ([2-14C]DG и [2-14С]ОС-фосфат ([2-14C]DGP)), а часть обрабатывали Ва(ОН)2 и Z11SO4, и для нее измеряли радиоактивность в супернатанте ([2-14C]DG). Уровни радиоактивности [2-14C]DG и [2-14С]ОС-фосфата ([2-14C]DGP) определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного подсчета. Скорости потоков глюкозы были оценены с использованием уравнения нестационарного состояния, учитывающего объем распределения (130 мл/кг). Тканеспецифичный клиренс (Kg) [2-14C]DG и показатель поглощения глюкозы (Rg) рассчитывали, как описано ранее (Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)): Kg=[2-14C]DGPTMHb/AUC [2-14C]DGn]ia3Ma> Rg=Kg x [глюкоза]плазма, где [2-14C]DGPTKaHb является радиоактивностью [2-14C]DGP в ткани (распадов в минуту /г), AUC [2-14C]DGnna3Ma является площадью под кривой исчезновения [2-14C]DG в плазме (распадов в минуту/мл/мин), [глюкоза]ПЛазма является средним уровнем глюкозы в крови (мкг/мкл) в течение времени эксперимента (t = 102-125 мин). Данные представлены в виде среднего значения ± SEM.
Как показано на Фиг. 15Е, которая представляет потребление глюкозы всем организмом, измеренное после однократной инъекции BsAb 17 в дозе 10 мг/кг, BsAb 17 увеличивает скорость стимулируемого инсулином потребления глюкозы всем организмом.
Кроме того, как показано на Фиг. 15F, BsAb 17 усиливает подавление инсулином скорости эндогенной продукции глюкозы после однократной инъекции BsAb 17 в дозе 10 мг/кг. Эти результаты указывают на то, что однократное введение 10 мг/кг BsAb 17 мышам DIO за 5 дней до фиксации заметно понижало концентрации глюкозы и инсулина после голодания.
Поглощение глюкозы тканями (Rg) в конце стимулируемого инсулином периода усиливалось в сердце, скелетных мышцах, белой жировой ткани (WAT) и межлопаточной ВАТ ткани (iBAT), что указывает на сенсибилизацию BsAb 17 всего организма к инсулину (Фиг. 15G).
В ходе эксперимента по фиксации было определено количество отклонений уровня глюкозы в артериальной крови. Как показано на Фиг. 18А, в ходе эксперимента по гиперинсулинемической-эугликемической фиксации количество отклонений уровня глюкозы в артериальной крови у мышей, которым вводили BsAb 17, отличалась от количества отклонений у мышей, которым вводили контрольный IgG.
Также была определена разница в весе между мышами, которым вводили BsAb 17,
и мышами, которым вводили контрольной IgG. Как показано на Фиг. 18В, изменения в концентрациях глюкозы и инсулина наблюдались без видимой потери в весе.
После инъекции BsAb 17 также анализировали стационарную скорость инфузии глюкозы. Как показано на Фиг. 18С, стационарная скорость инфузии глюкозы увеличилась на 64% после инъекции BsAb 17. Эти результаты показывают, что BsAb 17 улучшил чувствительность всего организма к инсулину у мышей DIO еще до того, как стала очевидной потеря веса.
Предыдущие исследования с фармакологическими дозами FGF19 или FGF21 показали увеличение расхода энергии (ЕЕ) (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013)), таким образом, было высказано предположение, что будет наблюдаться аналогичный эффект. Для расчета ЕЕ и дыхательного коэффициента (RQ) были использованы следующие уравнения. EE=V02x(3,815+l,232xRQ), где (RQ=VC02/V02). Действительно, одна инъекция BsAb 17 DIO или мышам на диете с низким уровнем жира при нормальной комнатной температуре (21° С) привела к значительному увеличению потребления 02 (V02), выработки С02 (VC02) и ЕЕ у животного после инъекции без существенного изменения активности (Фиг. 19А). Неожиданно было обнаружено, что наблюдаемое увеличение ЕЕ на 15-46% не сопровождалось значительными изменениями в дыхательных коэффициентах (RQ=VC02/V02) (Фиг. 19А).
Аналогичное увеличение ЕЕ без изменения RQ было вызвано непрерывной инфузией FGF21 мышам DIO (Фиг. 21С).
Фиг. 20А показывает количество V02, VC02 и общее измерение активности мышей DIO, получавших одну инъекцию BsAb 17 при нормальной комнатной температуре.
Как показано на Фиг. 19В, увеличение ЕЕ сохранялось, когда температура клетки была повышена до термонейтральной (29-30° С), что позволяет предположить, что вызываемая BsAb 17 индукция активации коричневого жира не зависит от адаптивного термогенного входа из симпатической нервной системы.
Фиг. 20В показывает количество V02, VC02 и общее измерение активности мышей DIO, получавших одну инъекцию BsAb 17 при нормальной комнатной температуре с последующим сдвигом температуры до термонейтральной.
Повышение ЕЕ было также очевидно, когда мышей DIO, акклиматизированных к термонейтральной комнатной температуре (29-30° С), тестировали в течение двух недель (Фиг. 21В).
Как показано на Фиг. 21 А, которая показывает средние величины ЕЕ, изменения в ЕЕ наблюдались у мышей на диете с низким уровнем жира и мышей DIO при нормальной комнатной температуре и у мышей на диете с низким уровнем жира и мышей DIO, акклиматизированных в термонейтральной комнатной температуре.
В противоположность этому, непрерывная инфузия агониста РЗ-специфических адренорецепторов CL-316,243, как и ожидалось, индуцировала острое повышение ЕЕ и снижение RQ (Фиг. 19Н). Непрерывную инфузию FGF21 или CL-316,243 осуществляли с помощью осмотического мини-насоса (Alzet 2001), который имплантировали подкожно. Таким образом, индукция ЕЕ под действием BsAb 17 и FGF21 является устойчивой, но, как предполагается, более избирательной, чем другие описанные ранее механизмы активации ВАТ, такие как введение симпатомиметиков (норадреналина или агониста РЗ -специфических адренорецепторов CL-316243), сердечных натрийуретических пептидов, или интерлейкина 4, которые сопровождаются усилением окисления липидов и снижением RQ (Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011); Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374-383 (2010); Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011); Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008); Bordicchia et al., J. Clin. Invest. 122, 1022-1036 (2012); и de Souzaet al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)).
He желая ограничиваться конкретной теорией, авторы считают, что несколько линий доказательств позволяют предположить доминирующую роль активации ВАТ в метаболическом действии BsAb 17. Во-первых, как показано на Фиг. 19С, инъекции BsAb 17 повышают поглощение 18Р-фтордезоксиглюкозы (FDG) именно в iBAT.
Во-вторых, однократные инъекции BsAb 17 индуцировали экспрессию белка UCP1 в паховой WAT (ingWAT), что свидетельствует о превращении жировой ткани в бурую (Фиг. 19D).
Как показано на Фиг. 19Е, также наблюдалась индукция экспрессии UCP1 в культивируемых первичных адипоцитах, обработанных FGF21 или BsAb 17, что указывает на прямое действие на зрелые адипоциты. Для определения экспрессии UCP1 тотальную РНК использовали для синтеза кДНК с использованием набора для синтеза кДНК SUPERSCRIPT(r) VILO (ABI). Для qPCR образцы в трех повторностях помещали в прибор ViiA 7 Real-Time PCR (Applied Biosystems). Использовали предварительно созданные компанией Applied Biosystems зонды для анализа экспрессии UCP1 TaqMan(r) Gene (Hs01027785_ml). Для каждого образца мРНК количество нормализовали на количество транскриптов ТВР (Hs00427620_ml) и SDHA (Hs00188166_ml).
Далее с помощью телеметрической системы наблюдали увеличение температуры тела покоя после однократной инъекции BsAb 17, которое длилось в течение > 26 дней до
постепенного возвращения к исходному уровню (Фиг. 19F).
Фиг. 22 показывает различия в центральной температуре тела, которые наблюдались у мышей после однократной инъекции BsAb 17 по сравнению с мышами, обработанными контрольным IgG. Центральную температуру тела контролировали с использованием датчика TA-F10 (Sciences Data International, DSI), который имплантировали в брюшную полость. После восстановления после хирургического вмешательства мышей случайным образом делили на группы на основании массы тела и температуры тела. Температуру тела и активность контролировали с помощью имплантируемых систем телеметрии DSI.
Профили экспрессии генов были проанализированы для iBAT из мышей DIO, получавших однократную инъекцию BsAb 17, FGF21 или контрольного IgG. Как показано на Фиг. 19G, индуцированные однократной инъекцией BsAb 17 изменения экспрессии генов в iBAT напоминают результаты двукратных ежедневных инъекций FGF21.
И, наконец, при введении мышам C57BL/6 как FGF21, так и BsAb20 происходит индукция фосфорилирования ERK и МЕК в различных жировых тканях, в том числе в iBAT и ingWAT (Фиг. 23).
В предыдущих исследованиях предполагалось, что адипонектин вносит свой вклад в полное действие FGF21 (Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790-797 (2013)). На самом деле, одна инъекция BsAbl7 мышам DIO привела к увеличению уровней сывороточного высокомолекулярного (HMW) адипонектина при ассоциированной потере веса (Фиг. 24А).
Аналогичным образом, однократное введение BsAb 17 макакам на диете с низким уровнем жира (Фиг. 24В) привело к увеличению уровней сывороточного высокомолекулярного (HMW) адипонектина при ассоциированной потере веса.
Как показано на Фиг. 24С, после однократной инъекции BsAb 17 мыши с нокаутом адипонектина (Adipoq) на HFD демонстрировали устойчивую реакцию, выражающуюся в увеличении ЕЕ (25,3% увеличения против 20,9% увеличения у мышей дикого типа (wt)).
Кроме того, после однократной инъекции BsAb 17 у мышей с нокаутом адипонектина (Adipoq) на HFD уменьшался вес тела и уровень триглицеридов печени (Фиг. 24D). Тем не менее, изменения толерантности к глюкозе, толерантности к инсулину, изменения уровня инсулина в сыворотке крови и различных липидов были менее выражены у мышей с нокаутом (Фиг. 24D), что согласуется с идеей, что BsAb 17 действует как миметик FGF21, регулируя метаболизм питательных веществ всего
организма, в частности, через функции адипонектина. Для определения толерантности к инсулину, мыши голодали в течение 4 ч, и им внутрибрюшинно вводили 1 ед/кг раствора инсулина человека (Humulin R, Eli Lilly and Company).
Повышенная селективность BsAblO к рецептору (см. Фиг. 9А) и описанный ранее низкий уровень проникновения молекул IgG в мозг (Yu et al., Sci Transl Med 3, 84ra44 (2011)) предсказывают измененный профиль безопасности BsAblO и его производных по сравнению с FGF21/19. В соответствии с низким уровнем экспрессии FGFR1 в печени, FGF21, но не BsAb 17, индуцирует экспрессию мРНК классических генов-мишеней FGFR Spry4 и Dusp6 в печени (Фиг. 25).
BsAb 17 или BsAb20 также привели к увеличению сигнала фосфо-ERK в различных жировых тканях и ациноцитах поджелудочной железы, но не в печени (Фиг. 23).
Фиг. 26 показывает, что BsAb 17 по данным иммуногистохимии также не приводит к увеличению фосфорилирования ERK в различных участках головного мозга, включая циркумвентрикулярные органы.
Кроме того, хроническое применение BsAb20 в лечении мышей DIO в течение 8 недель уменьшило количество BrdU+ клеток в печени до уровня, характерного для мышей C57BL/6 на диете с низким уровнем жира, противоположно тому, как это ожидалось для FGF19-noflo6Hoft активности (Фиг. 27). Для включения BrdU в печень мышам внутрибрюшинно вводили 100 мг/кг BrdU (BD Biosciences) за 2 ч до эвтаназии. Анти-BrdU окрашивание проводили, как описано (Nicholes, К., et al. Am. J. Pathol. 160, 2295-2307 (2002)), и BrdU-положительные гепатоциты подсчитывали с использованием автоматизированной системы анализа изображений Ariol.
Проводили анализ костей мышей, которые были обработаны анти-KLB/aHTH-FGFRl с антителом. Фиг. 28А показывает схему анализа. Для выполнения анализа костной ткани образцы бедренной кости визуализировали с помощью системы микровизуализации цСТ40 от SCANCO Medical (Бассерсдорф, Швейцария), работающей с рентгеновской трубкой с энергией 70 кэВ и током 114 мкА. Непрерывные аксиальные изображения срезов были получены с изотропным размером воксела 12 мкм. Морфометрический анализ трабекулярной кости в бедренной кости был выполнен с помощью программного обеспечения дСТ40 от SCANCO Medical (Бассерсдорф, Швейцария). Для определения интересующего объема (VOI), включающего вторичную трабекулярную кость, находящуюся дорсальнее проксимальной пластинки роста бедренной кости и выступающую на 1,5 мм дистальнее первичной трабекулярной кости, был использован полуавтоматический профиль. Кортикальная кость была исключена
путем размещения границ VOI в пределах внутренней границы кортикальной кости. До сегментации изображения для подавления электромагнитных помех к данным изображений был применен ограниченный трехмерный (3D) гауссовский низкочастотный фильтр (сигма фильтра = 0,5, поддержка фильтра = 1). Для выделения "бинаризованной" трабекулярной структуры из VOI применяли глобальный порог (0,36 г НА/см ). Порог трабекулярной сегментации был выбран путем визуального осмотра результатов сегментации из репрезентативного подмножества выборок. Трабекулярные структурные характеристики были определены количественно путем прямого морфометрическогоЗО-анализа. Предыдущие исследования показали, что морфометрический анализ трабекулярной кости с помощью микро-компьютерной томографии хорошо коррелирует с аналогичными оценками, сделанными с помощью гистоморфометрии.
Как показано на Фиг. 28В, хроническое лечение мышей DIO с применением BsAb20 в течение 6 недель привело к ожидаемым изменениям в метаболических параметрах без какого-либо отрицательного сигнала в различных параметрах костной ткани в большеберцовой трабекулярной и бедренной кортикальной костях по данным микро-компьютерной томографии.
Как показано на Фиг. 29, инъекция BsAb 17 мышам DIO не увеличивала уровни сывороточного кортикостерона выше контроля. Хронический положительный энергетический баланс, распространенный в современном обществе, приводит к пандемии ожирения и связанным с ним нарушениям метаболизма, характеризующимся резистентностью к инсулину, гиперинсулинемией, нарушением толерантности к глюкозе, гиперлипидемией и гепатостеатозом, которые часто приводят к серьезным заболеваниям, таким как диабет 2 типа, цирроз печени, инсульт и болезни сердца. В 2009 году было сообщено о наличии UCP1-позитивного ВАТ у взрослых людей и ее функциональной значимости в активации ЕЕ с помощью рассеивания тепла, что привело к огромному интересу по терапевтической индукции и активации ВАТ для лечения ожирения и связанных с ним метаболических заболеваний (Yoneshiro and Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)).
Тем не менее, наиболее известные механизмы активации ВАТ также вызывают липолиз белой жировой ткани, что может оказать негативное воздействие на сердечнососудистую систему (Dong et al., Cell Metab. 18, 118-129 (2013)). Следует отметить, что трансплантация ВАТ увеличивает ЕЕ и вызывает потерю веса без изменения RQ (Stanford et al., J. Clin. Invest. 123, 215-223 (2013)). В связи с этим FGF21 и антитело-агонист анти-FGFRl/KLB, предусмотренные в настоящем описании, представляют собой
уникальный подход к селективной индукции термогенного ответа в ВАТ без изменения RQ, тем самым имитируя трансплантацию ВАТ, а не неспецифическую симпатоактивацию. Кроме того, на основании наблюдаемых эффектов у мышей, предполагается, что опосредуемая антителом активация комплекса FGFRlc/KLB может обеспечить более безопасное и более эффективное средство для борьбы с ожирением и для анти-диабетической терапии по равнению с более широкой активацией комплекса FGFR/KLB аналогами FGF21 hjihFGF19.
Пример 10. Гуманизация анти-KLB антитела 8С5.
Мышиные CDR легкой цепи из 8С5 были перенесены в каркасные области каппа 2 и каппа 4 легкой цепи человека. В дополнение к первичному перемещению были также произведены точечные мутации, так что в позицию 4 в каждой легкой цепи была введена замена на лейцин (обозначенной "M4L"). Был проведен анализ для выявления тех вариантов, которые лучше экспрессируются и не проявляют значительной агрегации. Аналогичным образом CDR тяжелой цепи были перенесены в каркасные области HI, Н2, НЗ и Н4 IgGl тяжелой цепи человека. Различные остатки в каркасе тяжелой цепи мутировали следующим образом: в HI были внесены следующие изменения: K71R, N73Т и V78A (исходный вариант обозначен "KNV", а изменённый вариант - "RTA"); в Н2 были внесены следующие изменения: N73T (исходный вариант обозначен "KNV", а изменённый вариант - "KTV"); в НЗ были внесены следующие изменения: K71R и V78L (исходный вариант обозначен "KNV", а изменённый вариант - "RNL"), и в Н4 были внесены следующие изменения: K71V, N73T и V78F (исходный вариант обозначен "KNV", а изменённый вариант - "VTF").
Были получены антитела, сконструированные на основе всех парных комбинаций из 4-х легких цепей и 8 тяжелых цепей (в общей сложности 32 антитела), и были протестированы уровни их экспрессии и аффинности. Основываясь на этих экспериментах, полученные из 8С5 легкая цепь K4.M4L и тяжелая цепь H3.KNV, проявляли наилучшее сочетание уровня экспрессии и желаемой аффинности.
Ниже приведены последовательности вариабельных областей 8C5.K4.M4L.H3.KNV и полноразмерного антитела.
Вариабельная область тяжелой цепи 8C5.K4.M4L.H3.KNV
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIW SGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARDYGSTYVDAIDY WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 128)
Полноразмерная тяжелая цепь 8C5.K4.M4L.H3.KNV
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHWVRQAPGKGLEWLGVIW
S GGSTD YNAAFISRLTIS KDNS KNT VYLQMNS LRAEDT A VYYC ARD YGSTYVD AID Y WGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT S G VHTFPA VLQS S GL YS LS S V VT VPS S S LGTQT YICN VNHKPS NTKVDKKVEPKS CDKT HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQ V YTLPPS REEMTKNQ VS LS С A VKGFYPS DIA VEWES NGQPENN YKTTPP VLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 129)
Вариабельная область легкой цепи 8C5.K4.M4L.H3.KNV
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPPKLLIYR AANLQS GVPDRFS GS GS GTDFTLTIS S LQAED VA VYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 130)
Полноразмерная легкая цепь 8C5.K4.M4L.H3.KNV
DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYMTWYQQKPGQPPKLLIYR AANLQS GVPDRFS GS GS GTDFTLTIS S LQAED VAVYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEIKR TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 131)
Пример 11. Создание гибридного антитела анти-FGFRl между YW182.3 и YW182.5.
YW182.5, которое является плечом анти-FGFRl, не активирующим комплекс KLB/FGFRlc в отсутствие плеча анти-FGFRl, дает хорошие результаты в сочетании с 8С5, и имеет триптофан в положении 33 тяжелой цепи, который подвержен окислению. YW 182.2, который, как предполагается, связывает тот же эпитоп, что и YW 182.5, также имеет триптофан в положении 33 тяжелой цепи. Некоторые мутации были введены в этом положении, чтобы обойти эту проблему: для YW182.5 были введены мутации W33Y, W33H, W33F и W33L, и для YW182.2 были введены мутации W33Y и W33F. Неожиданно оказалось, что введенные мутации имели различные эффекты в двух антителах. В случае YW182.2 было отмечено, что мутации не оказали заметного влияния на аффинность или агонистическую активность в отношении FGFR1, в то время как для YW182.5 мутации значительно уменьшили аффинность и агонистическую активность по отношению к FGFR1 (см, например, Фиг. 31). Поэтому с целью выявления антител с мутацией W33Y, но с аффинностью, близкой к таковой для антитела YW182.5, были проведены эксперименты с использованием двух подходов.
В одном из подходов для последовательности YW 182.2 W33Y тяжелой цепи было
выполнено аланиновое сканирование CDR3 с мутациями на аланин в положениях 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100а и 100b. Аффинности полученных антител были проанализированы, и были идентифицированы антитела, сохранившие очень высокую исходную аффинность YW182.2 W33Y (Таблица 9).
Во втором подходе CDR антитела YW 182.2 W33Y (с очень высокой аффинностью) и антитела YW 182.5 W33Y (почти без связывания) были перемешаны и составлены в различных комбинациях. Антитела YW182.2 W33Y и YW182.5 W33Y имеют идентичные последовательности CDR в легкой цепи (CDR-L1, RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 139); CDR-L2, SASFLYS (SEQ ID NO: 140), и CDR-L3 QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 141)), имеют различие в одном аминокислотном остатке в CDR-H1 (YW182.2 W33Y CDR-H1, STYIS (SEQ ID NO: 152) и YW182.5 W33Y CDR-H1, SNYIS (SEQ ID NO: 136)); различия в трёх аминокислотных остатках в CDR-H2 или рядом с CDR-H2 (YW182.2 W33Y CDR-H2, EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 137) и YW182.5 W33Y, EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 153)), а также очень сильно отличающиеся последовательности CDR-H3 (YW182.2 W33Y, EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 154) и YW182.5 W33Y GTDVMDY (SEQ ID NO: 138)). Были сконструированы и протестированы антитела с тяжелыми цепями на основе всех возможных комбинаций CDR тяжелых цепей YW182.5 W33Y и YW182.2 W33Y (восемь, включая два исходных антитела). Большинство антител имели аффинность, аналогичную аффинности одного или другого антитела, но, неожиданно, одна комбинация продемонстрировала аффинность, которая была почти идентичной исходной аффинности антитела YW182.5. Это антитело имеет CDR-H1 и CDR-H3 из YW182.5
W33Y, но CDR-H2 из YW182.2 W33Y. Это антитело обозначили "YW182.5 YGDY", чтобы представить следующие изменения в последовательности YW182.5: W33Y, A49G, A56D и D58Y.
Ниже приведены последовательности антитела YW 182.5 YGDY. Вариабельная область тяжелой цепи YW182.5 YGDY
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNYISWVRQAPGKGLEWVGEIDP YDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO: 132).
Полноразмерная тяжелая цепь YW 182.5 YGDY
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNYISWVRQAPGKGLEWVGEIDP YDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCATGTDVMDYWGQ GTLVT VS S AS TKGPS VFPLAPS S KS TS GGT A ALGCLVKD YFPEP VT VS WNS G ALTS G VH TFPA VLQS S GLYS LS S VVTVPS S SLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCP PCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQ V YTLPPS REEMTKNQ VS LWCLVKGF YPS DIA VE WES NGQPENN YKTTPP VLD S DGS FFLYS KLT VDKS RWQQGN VFS С S VMHE ALHNH YTQKS LS LS PGK (SEQ ID NO: 133).
Вариабельная область легкой цепи YW 182.5 YGDY
DIQMTQS PS S LS AS VGDRVTITCR AS QD VST A V A W YQQKPGKAPKLLIYS AS FL YS G VPS RFS GS GS GTDFTLTIS S LQPEDF AT Y YCQQS YTTPPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 134).
Полноразмерная легкая цепь YW182.5 YGDY
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFL YS G VPS RFS GS GS GTDFTLTIS S LQPEDF AT Y YCQQS YTTPPTFGQGTKVEIKRT V A APS VFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YS LS S TLTLS KAD YEKHKV Y ACE VTHQGLS S P VTKS FNRGEC (SEQ ID NO: 135)
Пример 12. Тестирование биспецифических антител с гуманизированными вариантами 8С5 и анти-FGFRl.
Различные комбинации биспецифических антител 8C5.K4H3.M4L.KNV и различных плечей анти-FGFRl тестировали в люциферазном анализе GAL-ELK1 в клетках НЕК293, экспрессирующих FGFRlc с KLB или без него. Как было отмечено ранее, каждая комбинация биспецифического антитела дозозависимо индуцировала активность люциферазы в клетках, экспрессирующих рекомбинантный hFGFRlc и hKLB, но не в клетках без экспрессии KLB (Фиг. 30). Эти данные подтверждают, что эти
модифицированные варианты сохраняют преимущества исходных антител, например, BsAbl3. Аффинности связывания антитела анти-KLB/aHTH-FGFRl, которое имеет гуманизированное плечо 8С5 (8C5.K4.M4L.H3.KNV) и плечо YW182.5_YGDY, с комплексом KLB/FGFRlc человека, макака и мыши на поверхности FfEK293, приведены в Таблице 10.
В дополнение к различным описанным и заявленным вариантам приведенное раскрытие изобретения также относится к другим вариантам осуществления, имеющим другие комбинации признаков, раскрытых и заявленных в настоящем документе. Таким образом, конкретные признаки, представленные в настоящем описании, могут быть объединены друг с другом иным образом в пределах объема приведенного раскрытия изобретения, таким образом, что раскрытие изобретения включает любую пригодную комбинацию признаков, раскрытых в данном документе. Предшествующее описание конкретных вариантов осуществления изобретения было представлено в целях иллюстрации и описания. Оно не предназначено быть исчерпывающим или ограничивать изобретение этими раскрытыми вариантами осуществления.
Специалистам в данной области будет очевидно, что в композиции и способы согласно раскрытому изобретению могут быть внесены различные модификации и вариации, не выходя за пределы сущности или объема раскрытого изобретения. Таким образом, предполагается, что изобретение включает модификации и изменения, которые находятся в пределах объема прилагаемой формулы изобретения и ее эквивалентов.
В настоящем описании цитируются различные публикации, патенты и патентные
заявки, и их содержание включено в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ДЖЕНЕНТЕК, ИНК.
<12 0> АНТИТЕЛА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 00B206.0170
<140> <141>
<150> 62/081,435 <151> 2014-11-18
<150> 61/920,396
<151> 2013-12-23 <160> 166
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 1
Ser Tyr Gly Ile Ser
1 5
<210> 2 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 2
Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5
<210> 3 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 3
Asn Tyr Gly Val Ser 1 5
<210> 4 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 4
Asp Thr Tyr Met Asn 1 5
<210> 5 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 5
Asp Thr Tyr Ile His 1 5
<210> 6 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 6
Ser Tyr Trp Ile His 1 5
<210> 7 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 7
Asp Thr Phe Thr His 1 5
<210> 8 <211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 8
Glu Tyr Thr Met Asn 1 5
<210> 9 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 9
Ser Tyr Trp Ile Glu 1 5
<210> 10 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 10
Asp Tyr Glu Met His 1 5
<210> 11 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 11
Asp Thr Tyr Ile His 1 5
<210> 12 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 12
Arg Tyr Trp Met Ser 1 5
<210> 13 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 13
Asn Tyr Gly Met Asn 1 5
<210> 14 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 14
Thr Ser Ala Met Gly Ile Gly
1 5
<210> 15 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 15
Thr Tyr Gly Val His
1 5
<210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial
Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 16
Thr Val Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 17 <211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 17
Trp Ile Asp Pro Glu Asn Asp Asp Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 18
<211> 16 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 18
Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 19
<211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 19
Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 20 <211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 20
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Asp
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 21
Glu Ile Asp Pro Ser Val Ser Asn Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 22 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 22
Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 23 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 23
Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 24 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 24
Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe Arg
1 5 10 15
Asp
<210> 25 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 25
Ala Ile Trp Pro Glu Asn Ala Asp Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 26
<211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 26
Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 27 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 27
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Val Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Val
<210> 28
<211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 28
Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 29
<211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 29
Trp Ile Asp Thr Asp Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Thr Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 30
His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 31 <211> 16 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 31
Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile Ser
1 5 10 15
<210> 32 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 32
Gly Gly Asp Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5
<210> 33 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 33
Phe Thr Thr Val Phe Ala Tyr 1 5
<210> 34 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"
<400> 34
Thr His Asp Trp Phe Asp Tyr 1 5
<210> 35 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 35
Arg Ala Leu Gly Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 36 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 36
Gly Thr Ser Tyr Ser Trp Phe Ala Tyr 1 5
<210> 37 <211> 15 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 37
Leu Gly Val Met Val Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Trp Phe Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 38 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 38
Arg Ala Leu Gly Asn Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
<210> 39 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 39
Lys Thr Thr Asn Tyr 1 5
<210> 40 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 40
Arg Gly Tyr Tyr Asp Ala Ala Trp Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 41
Glu Gly Gly Asn Tyr
1 5
<210> 42 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 42
Ser Gly Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 1 5
<210> 43
<211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 43
Gly Gly Tyr His Tyr Pro Gly Trp Leu Val Tyr
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 44
Pro Ser Pro Ala Leu Asp Tyr 1 5
<210> 45 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial
Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 45
Glu Glu Tyr Gly Leu Phe Gly Phe Pro Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 46
Ile Asp Gly Ile Tyr Asp Gly Ser Phe Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 47 <211> 12 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 47
Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 48
Ser Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 49
<211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 49
Ser Ala Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 50 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 50
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Phe Asn
1 5 10
<210> 51 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 51
Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 52 <211> 16
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 52
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu
1 5 10 15
<210> 53 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 53
Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Asp Ala Val Ala
1 5 10
<210> 54 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 54
Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Ser
1 5 10
<210> 55 <211> 12 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 55
Ser Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser Tyr Leu Tyr
1 5 10
<210> 56 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 56
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 57 <211> 10 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 57
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 58
Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ser Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 59
<211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 59
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Val Tyr
1 5 10
<210> 60 <211> 11 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 60
Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg Leu Ala
1 5 10
<210> 61 <211> 15 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 61
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr Gly Asn Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 62 <211> 15 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 62
Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr Gly Asn Arg Tyr Met Thr
1 5 10 15
<210> 63 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 63
Phe Thr Ser Ser Leu Arg Ser 1 5
<210> 64 <211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 64
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5
<210> 65 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 65
Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser 1 5
<210> 66 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 66
Gly Thr Thr Asn Leu Glu Thr 1 5
<210> 67 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 67
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5
<210> 68 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 68
Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr 1 5
<210> 69 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 69
Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5
<210> 70 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 70
Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser 1 5
<210> 71 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 71
Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 72 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 72
Leu Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5
<210> 73 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 73
Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Pro 1 5
<210> 74 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 74
Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser 1 5
<210> 75 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 75
Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 76 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 76
Ala Ala Thr Ser Leu Glu Thr
1 5
<210> 77 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 77
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5
<210> 78 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 78
Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser 1 5
<210> 79 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 79
Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp Thr 1 5
<210> 80 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 80
Phe Gln Gly Thr Gly Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 81 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 81
His Gln Val Arg Thr Leu Pro Trp Thr 1 5
<210> 82 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 82
Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Pro Phe Thr 1 5
<210> 83 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 83
Phe Gln Gly Ser His Val Leu Thr
1 5
<210> 84 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 84
Gln Gln His Tyr Ile Val Pro Tyr Thr 1 5
<210> 85 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 85
Leu Gln Tyr Gly Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5
<210> 86 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 86
His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 87 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 87
Gln Gln His His Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5
<210> 88 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial
Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 88
Gln Gln Phe Thr Ile Ser Pro Ser Met Tyr Thr
1 5 10
<210> 89 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 89
Gln Gln Tyr Asn Ile Ser Pro Tyr Thr 1 5
<210> 90 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 90
Gln Asn Gly His Asn Phe Pro Tyr Thr 1 5
<210> 91 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 91
Gln Gln Tyr Trp Ser Asn Pro Leu Thr 1 5
<210> 92 <211> 8 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 92
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Tyr Thr 1 5
<210> 93 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 93
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Trp Thr 1 5
<210> 94 <211> 118 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Pro Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Val Ser Ser Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Glu Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Gly Asp Gly Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 95 <211> 116 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 95
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Leu Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Thr
35 40 45
Gly Trp lie Asp Pro Glu Asn Asp Asp Thr lie Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Lys Ala Thr lie Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Phe Thr Thr Val Phe Ala Tyr Trp Gly His Gln Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala 115
<210> 96
<211> 115 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 96
Gln Val Gln Val Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Ile Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Glu Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Thr His Asp Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ala 115
<210> 97 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 97
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ala Asp Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Ala Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Ser Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ala Leu Gly Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 98 <211> 118 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 98
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Phe Asn Ile Ile Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ser Asp Thr Asp Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Leu Phe Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Thr Ser Tyr Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Ser Val Ser Ala
115
<210> 99
<211> 124 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 99
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Val Ser Asn Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Val Met Val Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Trp Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 100 <211> 124 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 100
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Ser Val Ser Asn Ser Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Val Arg Leu Gly Val Met Val Tyr Gly Ser Ser Pro Phe Trp Phe Ala
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 101 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 101
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Leu Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Gln Asp Thr
20 25 30
Phe Thr His Trp Val Arg Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ser Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Lys Ile Leu Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ile Gly Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Ala Leu Gly Asn Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 102 <211> 114 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 102
Glu Val Pro Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Pro Ser Gly Asp Thr Phe Thr Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Glu Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Phe
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ile Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Thr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Ile Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 103 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 103
Gln Ile Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Asn Glu Asn Phe
50 55 60
Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Tyr Tyr Asp Ala Ala Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 104 <211> 114 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 104
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Glu Met His Trp Met Lys Gin Thr Pro Val Tyr Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Trp Pro Glu Asn Ala Asp Ser Val Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Asp Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Glu Gly Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 105
<211> 118 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 105
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ser Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Asp Trp Leu
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Ala Met Thr Ser Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Gly Asn Tyr Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 106 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 106
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Asp Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Thr Gly Asn Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Asp Ser Thr Lys Tyr Val Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr His Tyr Pro Gly Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120
<210> 107 <211> 116 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 107
Glu Val Lys Phe Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Asp Lys Phe Val Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Lys Val Arg Ser Ala Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Ser Pro Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala 115
<210> 108
<211> 119 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 108
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Thr Asp Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Thr Asp Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Glu Tyr Gly Leu Phe Gly Phe Pro Tyr Trp Gly His Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115
<210> 109 <211> 124 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 109
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Ala Met Gly Ile Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Arg Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Gly Ile Tyr Asp Gly Ser Phe Tyr Ala Met Asp
100 105 110
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 110 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 110
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Ala Cys Thr Val Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Thr Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 111 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 111
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ile Cys Ser Ala Ser Gln Val Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Thr Ser Ser Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 112 <211> 106 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 112
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Thr
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asn Thr Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Thr Gly Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 113 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 113
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Phe Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asn Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Lys Ala Thr Tyr Phe Cys His Gln Val Arg Thr Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 114 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 114
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Ser Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Thr Thr Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ile Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 115 <211> 111 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 115
Ala Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 С 1 Л 1С
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Arg Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 116 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 116
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Asp Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Cys Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Arg Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Val Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Glu 100 105
<210> 117 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 117
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Phe Val Ser Asp Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Cys Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Arg Thr
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Val Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Thr Leu Glu Ile Glu 100 105
<210> 118 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Tyr Leu Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Asp His Ile Asn Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile
Ser Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Asn Thr Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 119
<211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 119
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Ser Gly Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Leu Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Arg Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Gly Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 120 <211> 108 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 120
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Leu Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 121 <211> 113 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 121
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Met Ser Val Gly
1 5 10 15
Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln
85 90 95
His His Ser Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 122
<211> 108 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 122
Glu Ser Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn His Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Asp Ala Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr
35 40 45
Tyr Thr Ser Thr Leu Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Thr Ile Ser Pro Ser Met
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 123 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 123
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 124 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 124
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ile Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Asn Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 125 <211> 107 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 125
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Ala Ala Thr Ser Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ser Asn Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 126 <211> 110 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 126
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 127
<211> 111 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 127
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Arg Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 128 <211> 120 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 128
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 129 <211> 450 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 129
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Ala Ala Phe Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Tyr Gly Ser Thr Tyr Val Asp Ala Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 130 <211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 130
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Arg Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 131
<211> 218 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 131
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Glu Ser Tyr
20 25 30
Gly Asn Arg Tyr Met Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ala Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 132 <211> 116 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 132
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Thr Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 133 <211> 446 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 133
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Asn
20 25 30
Tyr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Thr Asp Val Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 134 <211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 134
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 135 <211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 135
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 136 <211> 5 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 136
Ser Asn Tyr Ile Ser 1 5
<210> 137 <211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 137
Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 С 1 Л 1С
10 15
Gly
<210> 138 <211> 7 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 138
Gly Thr Asp Val Met Asp Tyr 1 5
<210> 139
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 139
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 140
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 140
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser 1 5
<210> 141 <211> 9 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 141
Gln Gln Ser Tyr Thr Thr Pro Pro Thr 1 5
<210> 142 <211> 34 <212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: beta-Klotho
peptide"
<400> 142
Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu
1 5 10 15
Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr
20 25 30
Ala Ser
<210> 143
<211> 16
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Fibroblast Growth Factor Receptor 1 peptide"
<400> 143
Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys Pro
1 5 10 15
<210> 144 <211> 14 <212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Fibroblast Growth Factor Receptor 1 peptide"
<400> 144
Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr
1 5 10
<210> 145
<211> 992
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 145
Phe Ser Gly Asp Gly Arg Ala Ile Trp Ser Lys Asn Pro Asn Phe Thr
1 5 10 15
Pro Val Asn Glu Ser Gln Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn
20 25 30
Phe Phe Trp Gly Ile Gly Thr Gly Ala Leu Gln Val Glu Gly Ser Trp
35 40 45
Lys Lys Asp Gly Lys Gly Pro Ser Ile Trp Asp His Phe Ile His Thr
50 55 60
His Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Asn Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile
65 70 75 80
Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser Ala Leu Asp Phe Ile Gly Val Ser Phe
85 90 95
Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val
100 105 110
Thr Val Ala Asn Ala Lys Gly Leu Gln Tyr Tyr Ser Thr Leu Leu Asp
115 120 125
Ala Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Trp
130 135 140
Asp Leu Pro Leu Ala Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Asp
145 150 155 160
Thr Ile Ile Asp Ile Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Met
165 170 175
Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu
180 185 190
Val Ala Trp His Gly Tyr Gly Thr Gly Met His Ala Pro Gly Glu Lys
195 200 205
Gly Asn Leu Ala Ala Val Tyr Thr Val Gly His Asn Leu Ile Lys Ala
210 215 220
His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asn Thr His Phe Arg Pro His Gln
225 230 235 240
Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn
245 250 255
Arg Ser Glu Asn Thr Met Asp Ile Phe Lys Cys Gln Gln Ser Met Val
260 265 270
Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr
275 280 285
Pro Glu Gly Met Arg Lys Lys Leu Phe Ser Val Leu Pro Ile Phe Ser
290 295 300
Glu Ala Glu Lys His Glu Met Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe
305
310
315
320
Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Lys Pro Leu Asn Thr Met Ala Lys Met
325 330 335
Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg Glu Ala Leu Asn Trp Ile Lys
340 345 350
Leu Glu Tyr Asn Asn Pro Arg Ile Leu Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe
355 360 365
Thr Asp Ser Arg Val Lys Thr Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met
370 375 380
Lys Asn Phe Leu Ser Gln Val Leu Gln Ala Ile Arg Leu Asp Glu Ile
385 390 395 400
Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp
405 410 415
Gln Asp Ala Tyr Thr Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn
420 425 430
Ser Lys Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys
435 440 445
Gln Ile Ile Arg Glu Asn Gly Phe Ser Leu Lys Glu Ser Thr Pro Asp
450 455 460
Val Gln Gly Gln Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser
465 470 475 480
Val Leu Lys Pro Glu Ser Val Ala Ser Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro
485 490 495
His Leu Tyr Val Trp Asn Ala Thr Gly Asn Arg Leu Leu His Arg Val
500 505 510
Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val
515 520 525
Asn Ile Lys Lys Gln Leu Glu Met Leu Ala Arg Met Lys Val Thr His
530 535 540
Tyr Arg Phe Ala Leu Asp Trp Ala Ser Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu
545 550 555 560
Ser Ala Val Asn Arg Gln Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser
565 570 575
Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser Ala Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro
580 585 590
Thr His Ala His Leu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Leu His Ala Asp Gly
595 600 605
Trp Leu Asn Pro Ser Thr Ala Glu Ala Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu
610 615 620
Cys Phe Gln Glu Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn
625 630 635 640
Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Ile Tyr Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr
645 650 655
Tyr Gly Ala Ala His Asn Leu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Trp Arg
660 665 670
Leu Tyr Asp Arg Gln Phe Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu
675 680 685
Ser Leu His Ala Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser
690 695 700
His Trp Arg Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe
705 710 715 720
Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu
725 730 735
Tyr Ile Ala Ser Lys His Arg Arg Gly Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro
740 745 750
Arg Leu Thr Glu Ala Glu Arg Arg Leu Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe
755 760 765
Cys Ala Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Met His Glu Gln Leu
770 775 780
Ala Gly Ser Arg Tyr Asp Ser Asp Arg Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp
785 790 795 800
Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly
805 810 815
Val Arg Lys Leu Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp
820
825
830
Ile Tyr Ile Thr Ala Ser Gly Ile Asp Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp
835 840 845
Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr Leu Gly Lys Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys
850 855 860
Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Arg Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys
865 870 875 880
Leu Ala Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp
885 890 895
Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile Gln Phe Tyr Asn Lys Val Ile Ser Ser
900 905 910
Arg Gly Phe Pro Phe Glu Asn Ser Ser Ser Arg Cys Ser Gln Thr Gln
915 920 925
Glu Asn Thr Glu Cys Thr Val Cys Leu Phe Leu Val Gln Lys Lys Pro
930 935 940
Leu Ile Phe Leu Gly Cys Cys Phe Phe Ser Thr Leu Val Leu Leu Leu
945 950 955 960
Ser Ile Ala Ile Phe Gln Arg Gln Lys Arg Arg Lys Phe Trp Lys Ala
965 970 975
Lys Asn Leu Gln His Ile Pro Leu Lys Lys Gly Lys Arg Val Val Ser
980 985 990
<210> 146 <211> 820
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 146
Met Trp Ser Trp Lys Cys Leu Leu Phe Trp Ala Val Leu Val Thr Ala
1 5 10 15
Thr Leu Cys Thr Ala Arg Pro Ser Pro Thr Leu Pro Glu Gln Ala Gln
20 25 30
Pro Trp Gly Ala Pro Val Glu Val Glu Ser Phe Leu Val His Pro Gly
35 40 45
Asp Leu Leu Gln Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val Gln Ser Ile
50 55 60
Asn Trp Leu Arg Asp Gly Val Gln Leu Ala Glu Ser Asn Arg Thr Arg
65 70 75 80
Ile Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Gln Asp Ser Val Pro Ala Asp Ser
85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Cys Val Thr Ser Ser Pro Ser Gly Ser Asp Thr Thr
100 105 110
Tyr Phe Ser Val Asn Val Ser Asp Ala Leu Pro Ser Ser Glu Asp Asp
115 120 125
Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr
130 135 140
Lys Pro Asn Pro Val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys Met Glu
145 150 155 160
Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe Lys Cys
165 170 175
Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val Arg Tyr
195 200 205
Ala Thr Trp Ser Ile Ile Met Asp Ser Val Val Pro Ser Asp Lys Gly
210 215 220
Asn Tyr Thr Cys Ile Val Glu Asn Glu Tyr Gly Ser Ile Asn His Thr
225 230 235 240
Tyr Gln Leu Asp Val Val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro Ile Leu Gln
245 250 255
Ala Gly Leu Pro Ala Asn Lys Thr Val Ala Leu Gly Ser Asn Val Glu
260 265 270
Phe Met Cys Lys Val Tyr Ser Asp Pro Gln Pro His Ile Gln Trp Leu
275 280 285
Lys His Ile Glu Val Asn Gly Ser Lys Ile Gly Pro Asp Asn Leu Pro
290 295 300
Tyr Val Gln Ile Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Thr Thr Asp Lys Glu
305 310 315 320
Met Glu Val Leu His Leu Arg Asn Val Ser Phe Glu Asp Ala Gly Glu
325 330 335
Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser Ile Gly Leu Ser His His Ser Ala
340 345 350
Trp Leu Thr Val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg Pro Ala Val Met Thr
355 360 365
Ser Pro Leu Tyr Leu Glu Ile Ile Ile Tyr Cys Thr Gly Ala Phe Leu
370 375 380
Ile Ser Cys Met Val Gly Ser Val Ile Val Tyr Lys Met Lys Ser Gly
385 390 395 400
Thr Lys Lys Ser Asp Phe His Ser Gln Met Ala Val His Lys Leu Ala
405 410 415
Lys Ser Ile Pro Leu Arg Arg Gln Val Thr Val Ser Ala Asp Ser Ser
420 425 430
Ala Ser Met Asn Ser Gly Val Leu Leu Val Arg Pro Ser Arg Leu Ser
435 440 445
Ser Ser Gly Thr Pro Met Leu Ala Gly Val Ser Glu Tyr Glu Leu Pro
450 455 460
Glu Asp Pro Arg Trp Glu Leu Pro Arg Asp Arg Leu Val Leu Gly Lys
465 470 475 480
Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gln Val Val Leu Ala Glu Ala Ile
485 490 495
Gly Leu Asp Lys Asp Lys Pro Asn Arg Val Thr Lys Val Ala Val Lys
500 505 510
Met Leu Lys Ser Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu Ser Asp Leu Ile Ser
515 520 525
Glu Met Glu Met Met Lys Met Ile Gly Lys His Lys Asn Ile Ile Asn
530 535 540
Leu Leu Gly Ala Cys Thr Gln Asp Gly Pro Leu Tyr Val Ile Val Glu
545 550 555 560
Tyr Ala Ser Lys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu Gln Ala Arg Arg Pro
565 570 575
Pro Gly Leu Glu Tyr Cys Tyr Asn Pro Ser His Asn Pro Glu Glu Gln
580 585 590
Leu Ser Ser Lys Asp Leu Val Ser Cys Ala Tyr Gln Val Ala Arg Gly
595 600 605
Met Glu Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Cys Ile His Arg Asp Leu Ala Ala
610 615 620
Arg Asn Val Leu Val Thr Glu Asp Asn Val Met Lys Ile Ala Asp Phe
625 630 635 640
Gly Leu Ala Arg Asp Ile His His Ile Asp Tyr Tyr Lys Lys Thr Thr
645 650 655
Asn Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe Asp
660 665 670
Arg Ile Tyr Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu
675 680 685
Trp Glu Ile Phe Thr Leu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Val Pro Val
690 695 700
Glu Glu Leu Phe Lys Leu Leu Lys Glu Gly His Arg Met Asp Lys Pro
705 710 715 720
Ser Asn Cys Thr Asn Glu Leu Tyr Met Met Met Arg Asp Cys Trp His
725 730 735
Ala Val Pro Ser Gln Arg Pro Thr Phe Lys Gln Leu Val Glu Asp Leu
740 745 750
Asp Arg Ile Val Ala Leu Thr Ser Asn Gln Glu Tyr Leu Asp Leu Ser
755 760 765
Met Pro Leu Asp Gln Tyr Ser Pro Ser Phe Pro Asp Thr Arg Ser Ser
770 775 780
Thr Cys Ser Ser Gly Glu Asp Ser Val Phe Ser His Glu Pro Leu Pro
785 790 795 800
Glu Glu Pro Cys Leu Pro Arg His Pro Ala Gln Leu Ala Asn Gly Gly
805 810 815
Leu Lys Arg Arg
820
<210> 147 <211> 948 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 147
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Phe Ser Gly Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ala Ile Trp Asp Lys Lys Gln Tyr Val Ser Pro Val Asn Pro Gly Gln
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn Phe Ser Trp Gly Val Gly
35 40 45
Thr Gly Ala Phe Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Ala Asp Gly Arg Gly
50 55 60
Pro Ser Ile Trp Asp Arg Tyr Val Asp Ser His Leu Arg Gly Val Asn
65 70 75 80
Ser Thr Asp Arg Ser Thr Asp Ser Tyr Val Phe Leu Glu Lys Asp Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Asp Phe Leu Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser
100 105 110
Trp Pro Arg Leu Phe Pro Asn Gly Thr Val Ala Ala Val Asn Ala Lys
115 120 125
Gly Leu Gln Tyr Tyr Arg Ala Leu Leu Asp Ser Leu Val Leu Arg Asn
130 135 140
Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Thr Leu
145 150 155 160
Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Ala Thr Met Ile Asp Leu Phe
165 170 175
Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Gly Asp Arg Val Lys
180 185 190
Tyr Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Phe
195 200 205
Gly Thr Gly Met His Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Thr Val Gly His Asn Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His
225 230 235 240
Asn Tyr Asp Lys Asn Phe Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile
245 250 255
Thr Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn Arg Thr Glu Asn Met Glu
260 265 270
Asp Val Ile Asn Cys Gln His Ser Met Ser Ser Val Leu Gly Trp Phe
275 280 285
Ala Asn Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Phe Met Lys Thr
290 295 300
Ser Ser Val Ile Pro Glu Phe Ser Glu Ala Glu Lys Glu Glu Val Arg
305 310 315 320
Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe Arg
325 330 335
Pro Ser Asn Thr Val Val Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn Leu
340 345 350
Arg Gln Val Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asp Asn Pro Arg Ile
355 360 365
Leu Ile Ser Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Tyr Ile Lys Thr Glu
370 375 380
Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Asn Gln Val Leu
385 390 395 400
Gln Ala Ile Lys Phe Asp Glu Ile Gln Val Phe Gly Tyr Thr Ala Trp
405 410 415
Thr Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Thr Arg Arg
420 425 430
Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Glu Gln Lys Glu Arg Lys Pro
435 440 445
Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Gln Asp Asn Gly Phe
450 455 460
Pro Leu Gln Glu Ser Thr Pro Asp Met Lys Gly Gln Phe Pro Cys Asp
465 470 475 480
Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Phe Thr Val
485 490 495
Ser Ser Pro Gln Phe Thr Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Val Thr
500 505 510
Gly Asn Arg Leu Leu Tyr Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr Arg
515 520 525
Pro Ser Gln Cys Thr Asp Tyr Val Ser Ile Lys Lys Arg Val Glu Met
530 535 540
Leu Ala Lys Met Lys Val Thr His Tyr Gln Phe Ala Leu Asp Trp Thr
545 550 555 560
Ser Ile Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Lys Ile Asn Arg Gln Val Leu
565 570 575
Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly Ile Ser
580 585 590
Pro Met Val Thr Leu Tyr His Pro Thr His Ser His Leu Gly Leu Pro
595 600 605
Met Pro Leu Leu Ser Ser Gly Gly Trp Leu Asn Thr Asn Thr Ala Lys
610 615 620
Ala Phe Gln Asp Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Lys Glu Leu Gly Asp Leu
625 630 635 640
Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp Met
645 650 655
Tyr Asn Arg Thr Ser Asn Asp Thr Tyr Arg Ala Ala His Asn Leu Met
660 665 670
Ile Ala His Ala Gln Val Trp His Leu Tyr Asp Arg Gln Tyr Arg Pro
675 680 685
Val Gln His Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ser Asp Trp Ala Glu
690 695 700
Pro Ala Asn Pro Tyr Val Glu Ser His Trp Lys Ala Ala Glu Arg Phe
705 710 715 720
Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Asp Pro Leu Phe Lys Thr Gly
725 730 735
Asp Tyr Pro Leu Ala Met Lys Glu Tyr Ile Ala Ser Lys Lys Gln Arg
740 745 750
Gly Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Arg Phe Thr Leu Lys Glu Ser Arg
755 760 765
Leu Val Lys Gly Thr Ile Asp Phe Tyr Ala Leu Asn His Phe Thr Thr
770 775 780
Arg Phe Val Ile His Lys Gln Leu Asn Thr Asn Cys Ser Val Ala Asp
785 790 795 800
Arg Asp Val Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser Pro Ser
805 810 815
Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Met Arg Lys Leu Leu Gly Trp Ile
820 825 830
Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Met Asp Ile Tyr Val Thr Ala Asn Gly Ile
835 840 845
Asp Asp Leu Ala Leu Glu Asp Asp Gln Ile Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu
850 855 860
Lys Tyr Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Val Lys
865 870 875 880
Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Thr Glu Glu Lys Ser Lys Pro
885 890 895
Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Val Gln
900 905 910
Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Ser Ser Ser Gly Phe Ser Ser Glu Asn Arg
915 920 925
Ser Pro Ala Cys Gly Gln Pro Pro Glu Asp Thr Glu Cys Ala Ile Cys
930 935 940
Ser Phe Leu Thr 945
<210> 148 <211> 949
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 148
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Asp Phe Pro Gly Asp Gly Arg
1 5 10 15
Ala Val Trp Ser Gln Asn Pro Asn Leu Ser Pro Val Asn Glu Ser Gln
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Val Gly
35 40 45
Thr Gly Ala Phe Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Ser Val Trp Asp His Phe Ile Ala Thr His Leu Asn Val Ser Ser
65 70 75 80
Arg Asp Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu Ser
85 90 95
Ala Leu Asp Phe Leu Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp
100 105 110
Pro Arg Leu Phe Pro Asp Gly Thr Val Ala Val Ala Asn Ala Lys Gly
115 120 125
Leu Gln Tyr Tyr Asn Arg Leu Leu Asp Ser Leu Leu Leu Arg Asn Ile
130 135 140
Glu Pro Val Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Trp Ala Leu Gln
145 150 155 160
Glu Lys Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Glu Thr Leu Ile Asp Leu Phe Asn
165 170 175
Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr
180 185 190
Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr Gly
195 200 205
Thr Gly Leu His Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asn Val Ala Ala Val Tyr
210 215 220
Thr Val Gly His Asn Leu Leu Lys Ala His Ser Lys Val Trp His Asn
225
230
235
240
Tyr Asn Arg Asn Phe Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr
245 250 255
Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn Arg Ala Glu Ser Ile Val Asp
260 265 270
Ile Leu Lys Cys Gln Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala
275 280 285
Asn Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Val Met Thr Lys Lys
290 295 300
Leu Leu Ser Val Leu Pro Ala Phe Ser Glu Ala Glu Lys Asn Glu Val
305 310 315 320
Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn Phe
325 330 335
Lys Pro Leu Asn Thr Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu Asn
340 345 350
Leu Arg Gln Val Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Gly Asn Pro Arg
355 360 365
Ile Leu Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser Tyr Val Gln Thr
370 375 380
Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Asn Gln Val
385 390 395 400
Leu Gln Ala Ile Arg Leu Asp Gly Val Arg Val Phe Gly Tyr Thr Ala
405 410 415
Trp Ser Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Asn Thr Arg
420 425 430
Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Glu Gln Arg Glu Arg Arg
435 440 445
Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Val Ile Gly Glu Asn Gly
450 455 460
Phe Thr Leu Arg Glu Ala Thr Pro Asp Leu Gln Gly Gln Phe Pro Cys
465 470 475 480
Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser Val
485 490 495
Ala Ser Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val Trp Asn Ala
500 505 510
Thr Gly Asn Arg Met Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys Thr
515 520 525
Arg Pro Ala Gln Cys Thr Asp Phe Ile Thr Ile Lys Lys Gln Leu Glu
530 535 540
Met Leu Ala Arg Met Lys Val Thr His Phe Arg Phe Ala Leu Asp Trp
545 550 555 560
Ala Ser Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Glu Val Asn Arg Gln Ala
565 570 575
Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Thr Glu Gly Leu Lys Leu Asn Ile
580 585 590
Ser Pro Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly Leu
595 600 605
Pro Ala Pro Leu Leu His Ser Gly Gly Trp Leu Asp Pro Ser Thr Ala
610 615 620
Lys Ala Phe Arg Asp Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Arg Glu Leu Gly Asp
625 630 635 640
Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser Asp
645 650 655
Val Tyr Asn Arg Thr Ser Asn Asp Thr Tyr Gln Ala Ala His Asn Leu
660 665 670
Leu Ile Ala His Ala Ile Val Trp His Leu Tyr Asp Arg Gln Tyr Arg
675 680 685
Pro Ser Gln Arg Gly Ala Leu Ser Leu Ser Leu His Ser Asp Trp Ala
690 695 700
Glu Pro Ala Asn Pro Tyr Val Ala Ser His Trp Gln Ala Ala Glu Arg
705 710 715 720
Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys Thr
725 730 735
Gly Asp Tyr Pro Val Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys Thr Arg
740
745
750
Arg Gly Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Arg Phe Ser Asp Ala Glu Arg
755 760 765
Arg Leu Val Lys Gly Ala Ala Asp Phe Tyr Ala Leu Asn His Phe Thr
770 775 780
Thr Arg Phe Val Met His Glu Gln Gln Asn Gly Ser Arg Tyr Asp Ser
785 790 795 800
Asp Arg Asp Val Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ala Ser Pro
805 810 815
Ser Arg Leu Ala Val Met Pro Trp Gly Glu Gly Lys Leu Leu Arg Trp
820 825 830
Met Arg Asn Asn Tyr Gly Asp Leu Asp Val Tyr Ile Thr Ala Asn Gly
835 840 845
Ile Asp Asp Gln Ala Leu Gln Asn Asp Gln Leu Arg Gln Tyr Tyr Leu
850 855 860
Glu Lys Tyr Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys Ile
865 870 875 880
Lys Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Thr Glu Glu Lys Ser Lys
885 890 895
Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser Ile
900 905 910
Gln Phe Tyr Asn Lys Leu Ile Thr Ser Asn Gly Phe Pro Ser Glu Asn
915 920 925
Gly Gly Pro Arg Cys Asn Gln Thr Gln Gly Asn Pro Glu Cys Thr Val
930 935 940
Cys Leu Leu Leu Leu
945
<210> 149 <211> 950
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 149
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Phe Ser Gly Asp Gly Arg
1 5 10 15
Ala Val Trp Ser Lys Asn Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Val Gly
35 40 45
Thr Gly Ala Leu Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Ser Ile Trp Asp His Phe Val His Thr His Leu Lys Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Thr Asn Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu
85 90 95
Ser Ala Leu Asp Phe Ile Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser
100 105 110
Trp Pro Arg Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys
115 120 125
Gly Leu Gln Tyr Tyr Asn Thr Leu Leu Asp Ser Leu Val Leu Arg Asn
130 135 140
Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu
145 150 155 160
Gln Glu Lys Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe
165 170 175
Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Gly Asp Arg Val Lys
180 185 190
Tyr Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr
195 200 205
Gly Thr Gly Met His Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Ala Ala Val
210 215 220
Tyr Thr Val Gly His Asn Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His
225 230 235 240
Asn Tyr Asn Thr His Phe Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile
245 250 255
Thr Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn Arg Ser Glu Asn Thr Met
260 265 270
Asp Ile Leu Lys Cys Gln Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe
275 280 285
Ala Ser Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Lys Lys
290 295 300
Lys Leu Leu Ser Ile Leu Pro Leu Phe Ser Glu Ala Glu Lys Asn Glu
305 310 315 320
Val Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn
325 330 335
Phe Lys Pro Leu Asn Thr Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu
340 345 350
Asn Leu Arg Glu Ala Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asn Asn Pro
355 360 365
Arg Ile Leu Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser His Val Lys
370 375 380
Thr Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln
385 390 395 400
Val Leu Gln Ala Ile Arg Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr
405 410 415
Ala Trp Ser Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile
420 425 430
Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg
435 440 445
Lys Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn
450 455 460
Gly Phe Ser Leu Lys Glu Ala Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro
465 470 475 480
Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser
485 490 495
Val Ala Ser Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro Tyr Leu Tyr Val Trp Asn
500 505 510
Ala Thr Gly Asn Arg Leu Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys
515 520 525
Thr Arg Pro Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu
530 535 540
Glu Met Leu Ala Arg Met Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp
545 550 555 560
Trp Ala Ser Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln
565 570 575
Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly
580 585 590
Ile Ser Ala Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly
595 600 605
Leu Pro Glu Pro Leu Leu His Ala Gly Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr
610 615 620
Val Glu Ala Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly
625 630 635 640
Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser
645 650 655
Asp Ile Tyr Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn
660 665 670
Leu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Arg Gln Phe
675 680 685
Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp
690 695 700
Ala Glu Pro Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu
705 710 715 720
Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys
725 730 735
Thr Gly Asp Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His
740 745 750
Arg Arg Gly Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu
755 760 765
Arg Arg Leu Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe
770 775 780
Thr Thr Arg Phe Val Met His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp
785 790 795 800
Ser Asp Arg Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser
805 810 815
Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg
820 825 830
Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser
835 840 845
Gly Ile Asp Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr
850 855 860
Leu Glu Lys Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys
865 870 875 880
Val Arg Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser
885 890 895
Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser
900 905 910
Ile Gln Phe Tyr Asn Lys Met Ile Ser Ser Ser Gly Phe Pro Ser Glu
915 920 925
Asn Ser Ser Ser Arg Cys Ser Gln Thr Gln Lys Asn Thr Glu Cys Thr
930 935 940
Val Cys Leu Phe Leu Ala
945 950
<210> 150 <211> 950
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 150
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Leu Glu Phe Ser Gly Asp Gly Arg
1 5 10 15
Ala Val Trp Ser Lys Asn Pro Asn Phe Thr Pro Val Asn Glu Ser Gln
20 25 30
Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn Phe Phe Trp Gly Val Gly
35 40 45
Thr Gly Ala Leu Gln Val Glu Gly Ser Trp Lys Lys Asp Gly Lys Gly
50 55 60
Pro Ser Ile Trp Asp His Phe Val His Thr His Leu Lys Asn Val Ser
65 70 75 80
Ser Thr Asn Gly Ser Ser Asp Ser Tyr Ile Phe Leu Glu Lys Asp Leu
85 90 95
Ser Ala Leu Asp Phe Ile Gly Val Ser Phe Tyr Gln Phe Ser Ile Ser
100 105 110
Trp Pro Arg Leu Phe Pro Asp Gly Ile Val Thr Val Ala Asn Ala Lys
115 120 125
Gly Leu Gln Tyr Tyr Asn Ala Leu Leu Asp Ser Leu Val Leu Arg Asn
130 135 140
Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Trp Asp Leu Pro Leu Ala Leu
145 150 155 160
Gln Glu Lys Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Asp Thr Ile Ile Asp Ile Phe
165 170 175
Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Thr Phe Gly Asp Arg Val Lys
180 185 190
Tyr Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu Val Ala Trp His Gly Tyr
195 200 205
Gly Thr Gly Met His Ala Pro Gly Glu Lys Gly Asn Leu Ala Ala Val
210 215 220
Tyr Thr Val Gly His Asn Leu Ile Lys Ala His Ser Lys Val Trp His
225 230 235 240
Asn Tyr Asn Thr His Phe Arg Pro His Gln Lys Gly Trp Leu Ser Ile
245 250 255
Thr Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn Arg Ser Glu Asn Thr Met
260 265 270
Asp Ile Leu Lys Cys Gln Gln Ser Met Val Ser Val Leu Gly Trp Phe
275 280 285
Ala Asn Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr Pro Glu Gly Met Lys Lys
290 295 300
Lys Leu Leu Ser Ile Leu Pro Leu Phe Ser Glu Ala Glu Lys Asn Glu
305 310 315 320
Val Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe Gly Pro Asn Asn
325 330 335
Phe Lys Pro Leu Asn Thr Met Ala Lys Met Gly Gln Asn Val Ser Leu
340 345 350
Asn Leu Arg Glu Ala Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu Tyr Asn Asn Pro
355 360 365
Gln Ile Leu Ile Ala Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp Ser His Val Lys
370 375 380
Thr Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn Phe Leu Ser Gln
385 390 395 400
Val Leu Gln Ala Ile Arg Leu Asp Glu Ile Arg Val Phe Gly Tyr Thr
405 410 415
Ala Trp Ser Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp Ala Tyr Thr Ile
420 425 430
Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Lys Gln Lys Glu Arg
435 440 445
Lys Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile Ile Arg Glu Asn
450 455 460
Gly Phe Ser Leu Lys Glu Ala Thr Pro Asp Val Gln Gly Gln Phe Pro
465 470 475 480
Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro Glu Ser
485 490 495
Val Ala Ser Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro Tyr Leu Tyr Val Trp Asn
500 505 510
Ala Thr Gly Asn Arg Leu Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg Leu Lys
515 520 525
Thr Arg Pro Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys Gln Leu
530 535 540
Glu Met Leu Ala Arg Met Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala Leu Asp
545 550 555 560
Trp Ala Ser Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn Arg Gln
565 570 575
Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys Leu Gly
580 585 590
Ile Ser Ala Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His Leu Gly
595 600 605
Leu Pro Glu Pro Leu Leu His Ala Gly Gly Trp Leu Asn Pro Ser Thr
610 615 620
Val Glu Ala Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu Leu Gly
625 630 635 640
Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg Leu Ser
645 650 655
Asp Ile Tyr Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala His Asn
660 665 670
Leu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Arg Gln Phe
675 680 685
Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala Asp Trp
690 695 700
Ala Glu Pro Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala Ala Glu
705 710 715 720
Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu Phe Lys
725 730 735
Thr Gly Asp Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser Lys His
740 745 750
Arg Arg Gly Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu Ala Glu
755 760 765
Arg Arg Leu Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn His Phe
770 775 780
Thr Thr Arg Phe Val Met His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg Tyr Asp
785 790 795 800
Ser Asp Arg Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu Ser Ser
805 810 815
Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu Leu Arg
820 825 830
Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr Ala Ser
835 840 845
Gly Ile Asp Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys Tyr Tyr
850 855 860
Leu Glu Lys Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile Asp Lys
865 870 875 880
Val Arg Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu Lys Ser
885 890 895
Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys Ser Ser
900 905 910
Ile Gln Phe Tyr Asn Lys Met Ile Ser Ser Ser Gly Phe Pro Ser Glu
915 920 925
Asn Ser Ser Ser Arg Cys Ser Gln Thr Gln Lys Asn Thr Glu Cys Thr
930 935 940
Val Cys Leu Phe Leu Val
945 950
<210> 151 <211> 989
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide"
<400> 151
Glu Pro Gly Asp Gly Ala Gln Thr Trp Ala Arg Phe Ser Arg Pro Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Leu Phe Gln Gly Thr Phe Pro Asp Gly Phe
20 25 30
Leu Trp Ala Val Gly Ser Ala Ala Tyr Gln Thr Glu Gly Gly Trp Gln
35 40 45
Gln His Gly Lys Gly Ala Ser Ile Trp Asp Thr Phe Thr His His Pro
50 55 60
Leu Ala Pro Pro Gly Asp Ser Arg Asn Ala Ser Leu Pro Leu Gly Ala
65 70 75 80
Pro Ser Pro Leu Gln Pro Ala Thr Gly Asp Val Ala Ser Asp Ser Tyr
85 90 95
Asn Asn Val Phe Arg Asp Thr Glu Ala Leu Arg Glu Leu Gly Val Thr
100 105 110
His Tyr Arg Phe Ser Ile Ser Trp Ala Arg Val Leu Pro Asn Gly Ser
115 120 125
Ala Gly Val Pro Asn Arg Glu Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Arg Leu Leu
130 135 140
Glu Arg Leu Arg Glu Leu Gly Val Gln Pro Val Val Thr Leu Tyr His
145 150 155 160
Trp Asp Leu Pro Gln Arg Leu Gln Asp Ala Tyr Gly Gly Trp Ala Asn
165 170 175
Arg Ala Leu Ala Asp His Phe Arg Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe Arg
180 185 190
His Phe Gly Gly Gln Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile Asp Asn Pro Tyr
195 200 205
Val Val Ala Trp His Gly Tyr Ala Thr Gly Arg Leu Ala Pro Gly Ile
210 215 220
Arg Gly Ser Pro Arg Leu Gly Tyr Leu Val Ala His Asn Leu Leu Leu
225 230 235 240
Ala His Ala Lys Val Trp His Leu Tyr Asn Thr Ser Phe Arg Pro Thr
245 250 255
Gln Gly Gly Gln Val Ser Ile Ala Leu Ser Ser His Trp Ile Asn Pro
260 265 270
Arg Arg Met Thr Asp His Ser Ile Lys Glu Cys Gln Lys Ser Leu Asp
275 280 285
Phe Val Leu Gly Trp Phe Ala Lys Pro Val Phe Ile Asp Gly Asp Tyr
290 295 300
Pro Glu Ser Met Lys Asn Asn Leu Ser Ser Ile Leu Pro Asp Phe Thr
305 310 315 320
Glu Ser Glu Lys Lys Phe Ile Lys Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Leu
325 330 335
Cys Phe Gly Pro Thr Leu Ser Phe Gln Leu Leu Asp Pro His Met Lys
340 345 350
Phe Arg Gln Leu Glu Ser Pro Asn Leu Arg Gln Leu Leu Ser Trp Ile
355 360 365
Asp Leu Glu Phe Asn His Pro Gln Ile Phe Ile Val Glu Asn Gly Trp
370 375 380
Phe Val Ser Gly Thr Thr Lys Arg Asp Asp Ala Lys Tyr Met Tyr Tyr
385 390 395 400
Leu Lys Lys Phe Ile Met Glu Thr Leu Lys Ala Ile Lys Leu Asp Gly
405 410 415
Val Asp Val Ile Gly Tyr Thr Ala Trp Ser Leu Met Asp Gly Phe Glu
420 425 430
Trp His Arg Gly Tyr Ser Ile Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe
435 440 445
Leu Ser Gln Asp Lys Met Leu Leu Pro Lys Ser Ser Ala Leu Phe Tyr
450 455 460
Gln Lys Leu Ile Glu Lys Asn Gly Phe Pro Pro Leu Pro Glu Asn Gln
465 470 475 480
Pro Leu Glu Gly Thr Phe Pro Cys Asp Phe Ala Trp Gly Val Val Asp
485 490 495
Asn Tyr Ile Gln Val Asp Thr Thr Leu Ser Gln Phe Thr Asp Leu Asn
500 505 510
Val Tyr Leu Trp Asp Val His His Ser Lys Arg Leu Ile Lys Val Asp
515 520 525
Gly Val Val Thr Lys Lys Arg Lys Ser Tyr Cys Val Asp Phe Ala Ala
530 535 540
Ile Gln Pro Gln Ile Ala Leu Leu Gln Glu Met His Val Thr His Phe
545 550 555 560
Arg Phe Ser Leu Asp Trp Ala Leu Ile Leu Pro Leu Gly Asn Gln Ser
565 570 575
Gln Val Asn His Thr Ile Leu Gln Tyr Tyr Arg Cys Met Ala Ser Glu
580 585 590
Leu Val Arg Val Asn Ile Thr Pro Val Val Ala Leu Trp Gln Pro Met
595 600 605
Ala Pro Asn Gln Gly Leu Pro Arg Leu Leu Ala Arg Gln Gly Ala Trp
610 615 620
Glu Asn Pro Tyr Thr Ala Leu Ala Phe Ala Glu Tyr Ala Arg Leu Cys
625 630 635 640
Phe Gln Glu Leu Gly His His Val Lys Leu Trp Ile Thr Met Asn Glu
645 650 655
Pro Tyr Thr Arg Asn Met Thr Tyr Ser Ala Gly His Asn Leu Leu Lys
660 665 670
Ala His Ala Leu Ala Trp His Val Tyr Asn Glu Lys Phe Arg His Ala
675 680 685
Gln Asn Gly Lys Ile Ser Ile Ala Leu Gln Ala Asp Trp Ile Glu Pro
690 695 700
Ala Cys Pro Phe Ser Gln Lys Asp Lys Glu Val Ala Glu Arg Val Leu
705 710 715 720
Glu Phe Asp Ile Gly Trp Leu Ala Glu Pro Ile Phe Gly Ser Gly Asp
725 730 735
Tyr Pro Trp Val Met Arg Asp Trp Leu Asn Gln Arg Asn Asn Phe Leu
740 745 750
Leu Pro Tyr Phe Thr Glu Asp Glu Lys Lys Leu Ile Gln Gly Thr Phe
755 760 765
Asp Phe Leu Ala Leu Ser His Tyr Thr Thr Ile Leu Val Asp Ser Glu
770 775 780
Lys Glu Asp Pro Ile Lys Tyr Asn Asp Tyr Leu Glu Val Gln Glu Met
785 790 795 800
Thr Asp Ile Thr Trp Leu Asn Ser Pro Ser Gln Val Ala Val Val Pro
805 810 815
Trp Gly Leu Arg Lys Val Leu Asn Trp Leu Lys Phe Lys Tyr Gly Asp
820 825 830
Leu Pro Met Tyr Ile Ile Ser Asn Gly Ile Asp Asp Gly Leu His Ala
835 840 845
Glu Asp Asp Gln Leu Arg Val Tyr Tyr Met Gln Asn Tyr Ile Asn Glu
850 855 860
Ala Leu Lys Ala His Ile Leu Asp Gly Ile Asn Leu Cys Gly Tyr Phe
865 870 875 880
Ala Tyr Ser Phe Asn Asp Arg Thr Ala Pro Arg Phe Gly Leu Tyr Arg
885 890 895
Tyr Ala Ala Asp Gln Phe Glu Pro Lys Ala Ser Met Lys His Tyr Arg
900 905 910
Lys Ile Ile Asp Ser Asn Gly Phe Pro Gly Pro Glu Thr Leu Glu Arg
915 920 925
Phe Cys Pro Glu Glu Phe Thr Val Cys Thr Glu Cys Ser Phe Phe His
930 935 940
Thr Arg Lys Ser Leu Leu Ala Phe Ile Ala Phe Leu Phe Phe Ala Ser
945 950 955 960
Ile Ile Ser Leu Ser Leu Ile Phe Tyr Tyr Ser Lys Lys Gly Arg Arg
965 970 975
Ser Tyr Lys Leu Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
980 985
<210> 152
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 152
Ser Thr Tyr Ile Ser 1 5
<210> 153
<211> 17 <212> PRT
<213> Artificial Sequence <220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 153
Glu Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 154 <211> 14 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 154
Glu His Phe Asp Ala Trp Val His Tyr Tyr Val Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 155 <211> 455 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 155
Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu Lys Pro
1 5 10 15
Glu Ser Val Ala Ser Ser Pro Gln Phe Ser Asp Pro His Leu Tyr Val
20 25 30
Trp Asn Ala Thr Gly Asn Arg Leu Leu His Arg Val Glu Gly Val Arg
35 40 45
Leu Lys Thr Arg Pro Ala Gln Cys Thr Asp Phe Val Asn Ile Lys Lys
50 55 60
Gln Leu Glu Met Leu Ala Arg Met Lys Val Thr His Tyr Arg Phe Ala
65 70 75 80
Leu Asp Trp Ala Ser Val Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Ala Val Asn
85 90 95
Arg Gln Ala Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly Leu Lys
100
105
110
Leu Gly Ile Ser Ala Met Val Thr Leu Tyr Tyr Pro Thr His Ala His
115 120 125
Leu Gly Leu Pro Glu Pro Leu Leu His Ala Asp Gly Trp Leu Asn Pro
130 135 140
Ser Thr Ala Glu Ala Phe Gln Ala Tyr Ala Gly Leu Cys Phe Gln Glu
145 150 155 160
Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro Asn Arg
165 170 175
Leu Ser Asp Ile Tyr Asn Arg Ser Gly Asn Asp Thr Tyr Gly Ala Ala
180 185 190
His Asn Leu Leu Val Ala His Ala Leu Ala Trp Arg Leu Tyr Asp Arg
195 200 205
Gln Phe Arg Pro Ser Gln Arg Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu His Ala
210 215 220
Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro Tyr Ala Asp Ser His Trp Arg Ala
225 230 235 240
Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Glu Pro Leu
245 250 255
Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ala Ala Met Arg Glu Tyr Ile Ala Ser
260 265 270
Lys His Arg Arg Gly Leu Ser Ser Ser Ala Leu Pro Arg Leu Thr Glu
275 280 285
Ala Glu Arg Arg Leu Leu Lys Gly Thr Val Asp Phe Cys Ala Leu Asn
290 295 300
His Phe Thr Thr Arg Phe Val Met His Glu Gln Leu Ala Gly Ser Arg
305 310 315 320
Tyr Asp Ser Asp Arg Asp Ile Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr Arg Leu
325 330 335
Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu
340 345 350
Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr
355 360 365
Ala Ser Gly Ile Asp Asp Gln Ala Leu Glu Asp Asp Arg Leu Arg Lys
370 375 380
Tyr Tyr Leu Gly Lys Tyr Leu Gln Glu Val Leu Lys Ala Tyr Leu Ile
385 390 395 400
Asp Lys Val Arg Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Ala Glu Glu
405 410 415
Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Lys Ala Lys
420 425 430
Ser Ser Ile Gln Phe Tyr Asn Lys Val Ile Ser Ser Arg Gly Phe Pro
435 440 445
Phe Glu Asn Ser Ser Ser Arg 450 455
<210> 156
<211> 36
<212> DNA <213> Mus sp.
<400> 156
gttaccggct tctccggaga cgggaaagca atatgg 36
<210> 157 <211> 52 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 157
Met Lys Pro Gly Cys Ala Ala Gly Ser Pro Gly Asn Glu Trp Ile Phe
1 5 10 15
Phe Ser Thr Asp Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Arg Asn Thr Met Ser Asn
20 25 30
Gly Gly Leu Gln Arg Ser Val Ile Leu Ser Ala Leu Ile Leu Leu Arg
35 40 45
Ala Val Thr Gly 50
<210> 158 <211> 938 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 158
Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ala Ile Trp Asp Lys Lys Gln Tyr Val Ser
1 5 10 15
Pro Val Asn Pro Ser Gln Leu Phe Leu Tyr Asp Thr Phe Pro Lys Asn
20 25 30
Phe Ser Trp Gly Val Gly Thr Gly Ala Phe Gln Val Glu Gly Ser Trp
35 40 45
Lys Thr Asp Gly Arg Gly Pro Ser Ile Trp Asp Arg Tyr Val Tyr Ser
50 55 60
His Leu Arg Gly Val Asn Gly Thr Asp Arg Ser Thr Asp Ser Tyr Ile
65 70 75 80
Phe Leu Glu Lys Asp Leu Leu Ala Leu Asp Phe Leu Gly Val Ser Phe
85 90 95
Tyr Gln Phe Ser Ile Ser Trp Pro Arg Leu Phe Pro Asn Gly Thr Val
100 105 110
Ala Ala Val Asn Ala Gln Gly Leu Arg Tyr Tyr Arg Ala Leu Leu Asp
115 120 125
Ser Leu Val Leu Arg Asn Ile Glu Pro Ile Val Thr Leu Tyr His Trp
130 135 140
Asp Leu Pro Leu Thr Leu Gln Glu Glu Tyr Gly Gly Trp Lys Asn Ala
145 150 155 160
Thr Met Ile Asp Leu Phe Asn Asp Tyr Ala Thr Tyr Cys Phe Gln Thr
165 170 175
Phe Gly Asp Arg Val Lys Tyr Trp Ile Thr Ile His Asn Pro Tyr Leu
180 185 190
Val Ala Trp His Gly Phe Gly Thr Gly Met His Ala Pro Gly Glu Lys
195 200 205
Gly Asn Leu Thr Ala Val Tyr Thr Val Gly His Asn Leu Ile Lys Ala
210 215 220
His Ser Lys Val Trp His Asn Tyr Asp Lys Asn Phe Arg Pro His Gln
225 230 235 240
Lys Gly Trp Leu Ser Ile Thr Leu Gly Ser His Trp Ile Glu Pro Asn
245 250 255
Arg Thr Asp Asn Met Glu Asp Val Ile Asn Cys Gln His Ser Met Ser
260 265 270
Ser Val Leu Gly Trp Phe Ala Asn Pro Ile His Gly Asp Gly Asp Tyr
275 280 285
Pro Glu Phe Met Lys Thr Gly Ala Met Ile Pro Glu Phe Ser Glu Ala
290 295 300
Glu Lys Glu Glu Val Arg Gly Thr Ala Asp Phe Phe Ala Phe Ser Phe
305 310 315 320
Gly Pro Asn Asn Phe Arg Pro Ser Asn Thr Val Val Lys Met Gly Gln
325 330 335
Asn Val Ser Leu Asn Leu Arg Gln Val Leu Asn Trp Ile Lys Leu Glu
340 345 350
Tyr Asp Asp Pro Gln Ile Leu Ile Ser Glu Asn Gly Trp Phe Thr Asp
355 360 365
Ser Tyr Ile Lys Thr Glu Asp Thr Thr Ala Ile Tyr Met Met Lys Asn
370 375 380
Phe Leu Asn Gln Val Leu Gln Ala Ile Lys Phe Asp Glu Ile Arg Val
385 390 395 400
Phe Gly Tyr Thr Ala Trp Thr Leu Leu Asp Gly Phe Glu Trp Gln Asp
405 410 415
Ala Tyr Thr Thr Arg Arg Gly Leu Phe Tyr Val Asp Phe Asn Ser Glu
420 425 430
Gln Lys Glu Arg Lys Pro Lys Ser Ser Ala His Tyr Tyr Lys Gln Ile
435 440 445
Ile Gln Asp Asn Gly Phe Pro Leu Lys Glu Ser Thr Pro Asp Met Lys
450 455 460
Gly Arg Phe Pro Cys Asp Phe Ser Trp Gly Val Thr Glu Ser Val Leu
465 470 475 480
Lys Pro Glu Phe Thr Val Ser Ser Pro Gln Phe Thr Asp Pro His Leu
485 490 495
Tyr Val Trp Asn Val Thr Gly Asn Arg Leu Leu Tyr Arg Val Glu Gly
500 505 510
Val Arg Leu Lys Thr Arg Pro Ser Gln Cys Thr Asp Tyr Val Ser Ile
515 520 525
Lys Lys Arg Val Glu Met Leu Ala Lys Met Lys Val Thr His Tyr Gln
530 535 540
Phe Ala Leu Asp Trp Thr Ser Ile Leu Pro Thr Gly Asn Leu Ser Lys
545 550 555 560
Val Asn Arg Gln Val Leu Arg Tyr Tyr Arg Cys Val Val Ser Glu Gly
565 570 575
Leu Lys Leu Gly Val Phe Pro Met Val Thr Leu Tyr His Pro Thr His
580 585 590
Ser His Leu Gly Leu Pro Leu Pro Leu Leu Ser Ser Gly Gly Trp Leu
595 600 605
Asn Met Asn Thr Ala Lys Ala Phe Gln Asp Tyr Ala Glu Leu Cys Phe
610 615 620
Arg Glu Leu Gly Asp Leu Val Lys Leu Trp Ile Thr Ile Asn Glu Pro
625 630 635 640
Asn Arg Leu Ser Asp Met Tyr Asn Arg Thr Ser Asn Asp Thr Tyr Arg
645 650 655
Ala Ala His Asn Leu Met Ile Ala His Ala Gln Val Trp His Leu Tyr
660 665 670
Asp Arg Gln Tyr Arg Pro Val Gln His Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu
675 680 685
His Cys Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro Phe Val Asp Ser His Trp
690 695 700
Lys Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Asp
705 710 715 720
Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ser Val Met Lys Glu Tyr Ile
725 730 735
Ala Ser Lys Asn Gln Arg Gly Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Arg Phe
740 745 750
Thr Ala Lys Glu Ser Arg Leu Val Lys Gly Thr Val Asp Phe Tyr Ala
755 760 765
Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Ile His Lys Gln Leu Asn Thr
770 775 780
Asn Arg Ser Val Ala Asp Arg Asp Val Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr
785 790 795 800
Arg Leu Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Val Arg
805 810 815
Lys Leu Leu Ala Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Arg Asp Ile Tyr
820 825 830
Ile Thr Ala Asn Gly Ile Asp Asp Leu Ala Leu Glu Asp Asp Gln Ile
835 840 845
Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu Lys Tyr Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr
850 855 860
Leu Ile Asp Lys Val Lys Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Thr
865 870 875 880
Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Arg
885 890 895
Ala Lys Ser Ser Val Gln Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Ser Ser Ser Gly
900 905 910
Leu Pro Ala Glu Asn Arg Ser Pro Ala Cys Gly Gln Pro Ala Glu Asp
915 920 925
Thr Asp Cys Thr Ile Cys Ser Phe Leu Val 930 935
<210> 159
<211> 53
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 159
Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe
1 5 10 15
Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys
20 25 30
Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val
35 40 45
Arg Tyr Ala Thr Trp 50
<210> 160 <211> 34 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 160
Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu
1 5 10 15
Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr
20 25 30
Ala Ser
<210> 161 <211> 34 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<400> 161
Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu
1 5 10 15
Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr
20 25 30
Ala Ser
<210> 162 <211> 34 <212> PRT
<213> Rattus sp.
<400> 162
Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Met Arg Lys Leu
1 5 10 15
Leu Gly Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Met Asp Ile Tyr Val Thr
20 25 30
Ala Asn
<210> 163 <211> 34 <212> PRT <213> Mus sp.
<400> 163
Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu
1 5 10 15
Leu Ala Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Arg Asp Ile Tyr Ile Thr
20 25 30
Ala Asn
<210> 164 <211> 34
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Unknown: Rabbit polypeptide"
<400> 164
Ala Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Met Pro Trp Gly Glu Gly Lys Leu
1 5 10 15
Leu Arg Trp Met Arg Asn Asn Tyr Gly Asp Leu Asp Val Tyr Ile Thr
20 25 30
Ala Asn
<210> 165
<211> 17
<212> PRT <213> Mus sp.
<400> 165
Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ala Ile Trp Asp Lys Lys Gln Tyr Val Ser
1 5 10 15
Pro
<210> 166 <211> 14 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide"
<400> 166
Phe Ser Glu Thr Gly Lys Gln Tyr Gly Ile Lys Asn Ser Thr
1 5 10
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное биспецифическое антитело или его антигенсвязывающая часть, которые связываются с бета-Клото (KLB) и рецептором фактора роста фибробластов 1 (FGFR1).
2. Антитело по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с С-концевым доменом KLB.
3. Антитело по п.1, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с фрагментом KLB, включающим аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 142.
4. Антитело по любому из пп. 1-3, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с эпитопом FGFR1 в пределах фрагмента FGFRlc, содержащего последовательность аминокислот, приведенную в SEQ ГО N0: 143 или SEQ ГО N0: 144.
5. Антитело по любому из пп. 1-4, где антитело или его антигенсвязывающая часть снижает уровень глюкозы в крови in vivo.
6. Антитело по любому из пп. 1-5, где антитело или его антигенсвязывающая часть не оказывает существенного влияния на плотность костной ткани.
7. Антитело по любому из пп. 1-6, где антитело или его антигенсвязывающая часть не оказывает существенного влияния на печень.
8. Антитело по любому из пп. 1-7, где антитело или его антигенсвязывающая часть индуцирует фосфорилирование ERK и МЕК в печени на значительно более низком уровне по сравнению с FGF21.
9. Антитело по любому из пп. 1-8, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с KLB с Kd от 10~8 М до 10~13 М.
10. Антитело по любому из пп. 1-9, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с FGFRlc с Kd от 10 нМ до 10 мкМ.
11. Антитело по любому из пп. 1-10, где антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой моноклональное антитело.
12. Антитело по любому из пп. 1-11, где антитело или его антигенсвязывающая часть представляет собой человеческое, гуманизированное или химерное антитело.
13. Антитело по любому из пп. 1-12, где антитело или его антигенсвязывающая часть содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ ГО N0: 128, и вариабельная область легкой цепи включает
10.
последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 130.
14. Антитело по любому из пп. 1-12, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает:
(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащую аминокислотную
последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 1-15 и SEQ Ш
N0: 1-15 с консервативными заменами;
(b) домен CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 16-31 и SEQ Ш N0: 16-31 с консервативными заменами;
(c) домен CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 32-47 и SEQ Ш N0: 32-47 с консервативными заменами;
(d) домен CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 48-62 и SEQ Ш N0: 48-62 с консервативными заменами;
(e) домен CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 63-78 и SEQ Ш N0: 63-78 с консервативными заменами; и
(f) домен CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 79-93 и SEQ Ш N0: 79-93 с консервативными заменами.
15. Антитело по любому из пп.1-12, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает:
(a) домен CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 15, или указанную последовательность с консервативными заменами;
(b) домен CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 31, или указанную последовательность с консервативными заменами;
(c) домен CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 47, или указанную последовательность с консервативными заменами;
(d) домен CDR1 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 62, или указанную
(a)
последовательность с консервативными заменами;
(e) домен CDR2 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 78, или указанную последовательность с консервативными заменами; и
(f) домен CDR3 вариабельной области легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ Ш N0: 93, или указанную последовательность с консервативными заменами.
16. Анти-бета-Клото антитело или его антигенсвязывающая часть, включающие (а) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0: 1-15, (b) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ Ш N0 : 79-93, и (с) HVR-Н2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 16-31.
17. Антитело по п. 16, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 1-15, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 16-31, и (с) HVR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 32-47.
18. Антитело по п. 17, дополнительно включающее (a) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 48-62, (b) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 63-78, и (с) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ГО N0: 79-93.
19. Антитело по п. 18, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 12, (Ь) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 28, (с) HVR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 44, (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 59, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 75, и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 90.
20. Антитело по п. 18, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает (a) HVR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 15, (Ь) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 31, (с) HVR-НЗ, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ГО N0: 47, (d) HVR-L1,
16.
содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 62, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 78, и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 93.
21. Антитело по п.20, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает
(а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную
последовательность SEQ Ш N0: 128, и (Ь) вариабельную область легкой цепи,
содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 130.
22. Антитело по п.20, где антитело или его антигенсвязывающая часть включает
(a) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 129, и
(b) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 131.
23. Анти-KLB антитело или его антигенсвязывающая часть, которые конкурентно ингибируют связывание любого антитела по пп. 16-22.
24. Антитело по п.23, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с тем же эпитопом, который связывают антитела 12А11 или 8С5.
25. Антитело по п.23, где антитело или его антигенсвязывающая часть связывается с эпитопом в С-концевом домене KLB.
26. Антитело по п.25, где антитело связывается с эпитопом KLB в пределах фрагмента KLB, состоящего из аминокислотной последовательности SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).
27. Анти-KLB антитело или его антигенсвязывающая часть, включающие (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ Ш N0: 128; (Ь) вариабельную область легкой цепи, имеющую, по меньшей мере, 95% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью SEQ Ш N0: 130; и (с) вариабельную область тяжелой цепи, как в (а), и вариабельную область легкой цепи, как в(Ь).
28. Антитело по любому из пп. 16-27, где антитело представляет собой биспецифическое антитело.
29. Антитело по п.28, где антитело включает вариабельный домен, который связывается с FGFR1.
30. Антитело по п.28, где FGFR1 представляет собой FGFRlc.
31. Антитело по п.30, где антитело связывается с фрагментом FGFRlc, состоящим из аминокислотной последовательности KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ Ш NO: 143) или FKPDHRIGGYKVRY (SEQ Ш NO: 144).
32. Антитело по п.30, где антитело включает (a) HVR-H1, содержащую
аминокислотную последовательность SEQ Ш NO: 136, (b) HVR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 137, (с) HVR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 138, (d) HVR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 139, (е) HVR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 140, и (f) HVR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 141.
33. Антитело по п.30, где антитело включает (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 132, и (Ь) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 134.
34. Антитело по п.30, где антитело включает (а) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 133, и (Ь) легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ Ш N0: 135.
35. Выделенное анти-KLB/aHTH-FGFRl биспецифическое антитело, включающее:
(a) первое антитело или его антигенсвязывающую часть, включающие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 128, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 130; и
(b) второе антитело или его антигенсвязывающую часть, включающие вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 132, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 134.
36. Выделенное анти-KLB/aHTH-FGFRl биспецифическое антитело, включающее:
(а) первое антитело или его антигенсвязывающую часть, включающие область
тяжелой цепи и область легкой цепи, где область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 129, и область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 131; и
(b) второе антитело или его антигенсвязывающую часть, включающие область тяжелой цепи и область легкой цепи, где область тяжелой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 133, и область легкой цепи содержит последовательность аминокислот, которая, по меньшей мере, на 95% идентична последовательности, приведенной в SEQ Ш N0: 135.
37. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по любому из пп. 136.
38. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п.37.
39. Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по п.38 таким образом, что продуцируется антитело.
40. Способ по п.39, дополнительно включающий выделение антитела из клетки-хозяина.
41. Фармацевтическая лекарственная форма, содержащая одно или несколько антител по любому из пп. 1-36 и фармацевтически приемлемый носитель.
42. Фармацевтическая лекарственная форма по п.41, дополнительно содержащая дополнительный терапевтический агент.
43. Антитело по любому из пп. 1-36 для применения в качестве лекарственного средства.
44. Антитело по любому из пп. 1-36 для применения в лечении расстройства, выбранного из группы, состоящей из синдрома поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (MetS), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии, артериальной гипертензии, диабета 2 типа, диабета не 2 типа, диабета 1 типа, латентного аутоиммунного диабета (LAD), диабета взрослого типа у молодых (MODY), а также старения и связанных с ним заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS.
45. Антитело по любому из пп. 1-36 для применения для активации рецепторного комплекса KLB/FGFR1.
46. Применение антитела по любому из пп. 1-36 для получения лекарственного средства для лечения нарушений обмена веществ.
47. Применение антитела по любому из пп. 1-36 для получения лекарственного средства для активации рецепторного комплекса KLB/FGFR1.
48. Применение по п.46, где нарушение обмена веществ представляет собой диабет.
37.
49. Способ лечения индивидуума, имеющего заболевание, выбранное из группы, состоящей из синдрома поликистозных яичников (PCOS), метаболического синдрома (MetS), ожирения, неалкогольного стеатогепатита (NASH), неалкогольной жировой болезни печени (NAFLD), гиперлипидемии, артериальной гипертензии, диабета 2 типа, диабета не-2 типа, диабета 1 типа, латентного аутоиммунного диабета (LAD), диабета взрослого типа у молодых (MODY), а также старения и связанных с ним заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и ALS, синдрома Барде-Бидля, синдрома Прадера-Вилли, синдрома Альстрёма, синдрома Коэна, наследственной остеодистрофии Олбрайта (псевдогипопаратиреоидизм), синдрома Карпентера, синдрома МОМО, синдрома Рубинштейна-Тейби, синдрома ломкой Х-хромосомы и синдрома Бёрьесона-Форсмана-Лемана, где способ включает введение индивидууму эффективного количества одного или нескольких антител по любому из пп. 1-36.
50. Способ по п.49, где заболевание представляет собой диабет.
51. Способ по п.49, дополнительно включающий введение индивидууму дополнительного терапевтического агента.
52. Способ активации рецепторного комплекса KLB-FGFR1 у индивидуума, включающий введение индивидууму эффективного количества антитела по любому из пп. 1-36.
53. Антитело по любому из пп. 1-36, где антитело или его антигенсвязывающая часть активирует комплекс KLB-FGFRlc.
37.
НЕК293 + FGFRlc HEK293 20i 20i
15-
10 5
-*-R1MAb3 I9G -o-RlMAbl Fab -oR1MAb2 Fob -^-R1MAb3 Fab
-12 -9 -6 10 10 10
0 дамнннуо-о-,
[Ab] (M)
-12 -9 -6 10 10 10
[Ab] (M)
RLU - интенсивность сигнала люминесценции, относительные световые единицы
Фиг. 1А
150 п
СО _Q CD
CD 00
100-
50-
контроль IgG
R1MAb1
R1MAb2 R1MAb3
-1-1-1-1-1-1-1-1-1 - 2 -9 -6 -3 10 10 10 10
[конкурирующее Ab]
161 170 180 190 200( | 212
... (ЂKKLHAVPAAKTVKFT ... IЂKKLHAVPAAKTVKFKCPSS6TFWTLR1(I(LKN6KEFKPDHR I GGYKVRYATW...
KLHAVPAAKTVKFKCP (P26) FKPOHRIGGYKVRY(P28)
Фиг. 1С
R1MAb1 R1MAb2 R1MAb3
Анти-DI
¦ < ^ (D if) r^rOLOOOOOO
со cr> r** o> о о о o>
WT- дикий тип
Фиг. ID
Фиг. IF
120 100 80 i I 60 40 20H 0
? WT
ш K164A
va H166A
в K175A
ея K177A
и G193A
a Y205A
и R208A
ш Н200А
¦ Р198А
нет антитела
RlMAbl
R1MAb2
R1MAb3
Анти-DI
WT-дикий тип
Фиг. IE
R1MAM
R1MAb2
FGFRlb FGFRlc FGFRlb
FGFRk
kon
i-1 _-1
1.9 x 106 4.6 x 106 4.5 x 105
7.3 x 105
2.2 x 10"3 11.3
3.6 x 10"3 7.8
3.7 x 10"4 8.2
5.1 x 10"4 7.1
(M)
x 10-10 x 10-Ю x 10"10
x 10"10
Фиг. 2A
kon koff (M"1c-1) (с"')
Ко (M)
R1MAb1
R1MAb2
FGFRlb FGFRlc FGFRlb FGFRlc 1.9 x 106 4.6 x 106 4.5 x 105
7.3 x 105 2.2 x 10"3
3.6 x 10"3
3.7 x 10"4
5.1 x 10"4
11.3 x lO40 7.8 x 10-1° 8.2 x 10-1°
7.1 x 10-1°
OD630 - оптическая плотность при 630 нм
Фиг. 2В
3 6 [R1МАЬЗ] log(nM)
FGFRlb FGFR1c FGFR2b FGFR2c FGFR3b FGFR3c FGFR4
без FGFR
Фиг. 2C
FGFRlc R1МАЫ + R1MAb2 +
R1МАЬЗ +
R1 МАЬЗ -
-3 0 3 6 [Ab] log(nM)
Фиг. 2D
Нумерация по Kabat
11F1 6012 ИМ
8Е1 46СЗ
8Н7 21НЗ 25F7 14Е6 14С6 24А1
5F8
6С1 12А11 12В8 14С10
8С5
Q M Q M
D I Q M E N V L
V M
V M Q M Q M
D I A V L M
I I I I
I V L I V M
E S V L
I V M
1 V M
I 0 M
I V L
I V L
T Q T
T Q S
T Q T
T Q S
T Q T
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T Q S
T s s
P A I
P S S
S S Y
P L S
0 К F
0 К F
S S Y
P s s
P A I
P s s
P A L
Q К F
P A T
s s s
P A S
P T s
L S A
U S A
L S A
L S V
L P V
U S T
U S T
L S V
L S
U S A
L P N
U S A
U S T
L S V
F S V
L A V
L A V
о -Q о "о a> ч-
¦*1Л (DNooo)OT-cMio*ina> Nr^ r--1-r^-r-^ I--
•.- - - • <- - • <- CS SL6DRVTI ICSASO
N С R A S 0
T С К A S D
S С R S S 0
T С К A S 0
T С К A S 0
T С К A S D
SPGEKVTMTCSAS
S L 6 D R V T
N I V H S
S L 6 G S V T
S L G D 0 A S
S V G D R V S
S V G D R V S
S L G G R V
SLGERVSLTCRASO
S P G E R V T L T С S A S S S
SVGQKVTMSCKSSOSLLNSG
SLGEKVTMTCRAS
SVGDRVSVTCKASO
TPGDRVSLSCRASO, . . . S L G D R V T I T С К A S E . . . . SLGQRATISCRASESVDS SLGQRATISCRASESVES
00 0)0
Y I s
S S G
D I S
H I N
D G N
F V S
F V S
H I N
E I S
L S S
N Q К
S S V
N V D
S I S
D I Y
Y G N
Y G N
ч- CM to ю ю о
N Y L
R Y T
N Y F
N W L
T Y L
D A V
D A V
N W L
G Y L
S Y L
N S L
N H M
S Y V
D Y V
N R L
S F M
R Y M
Ю Ю Ю
N 1 Y
F I Y
N I Y
A I Y
E I Y
A I Y
A I Y
A I Y
S I L
Y I Y
A If Y
Y If Y
A If Y
Y If Y
A If Y
H If Y
T If Y
CDR L2 - Contact
jCDR \1 - Chothiaj
CDR L2 - Kabat
J 1 I- CX3CTS <=> ^-одгО-^|-1ЛСОГ~~СОСТ> СЭ'- OJrO-^-LOCOr- СООТО'-СМГО^- lOCOl- CO 0)O <- CNIrO-^-LOtOI- CO
no Kabat ююю^-^-^"+'*^--+^^-^-Ю1ЛЮЮЮ1Л1ЛЮ1ЛЮ(0"ою(Осо юшсою CONI- r-~~ r-~- i- r- r- i-- i-
11F1 QQKPDGTVKLLIYFTSSLRSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNL
6D12 QQKSNTAPKLIIYDTSKLASGVPGRFSGSGSGNSYSLTISSU
11D4 QQKPNGTIKLLIYYTSRLQSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNL
8E1 QQKPGNAPRLLIYGTTNLETGVPSRFSGSGSGRDYILSITSL
46C3 L Q К P G Q S P К L L I Y К V S N R F S G V P D R F S G S G S G R D F T L К I S R V
8H7 QQKPGQSPKLLICSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSV
21H3 QQKPGQSPKLLICSASYRYTGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSV
25F7 QQKPGNAPRLLISGASNLETGIPSRFSGSGSGKDYTLTITSL
14E6 QQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPRRFSGSRSGSDYSLTISSL
14C6 QQKPGSSPKLKIYGASNLASGVPGRFSGSGSGTSYSLTISSM
24A1 QQKPGQSPKLLVYLASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSV
5F8 QQKSDASPKLIIIYYTSTLAPGVPARFSGSGSGNSYSLTISSM
6C1 QQKAGQSPKPLIYSASYRFSGVPDRFTGSGSGTEFTLTISNV
12A11 Q О К S H E S P R L L I I Y A S Q S I S G I P S R F S G S G S G S D F T L S I N S V
12B8 QQKPGSAPRLLISAATSLETGVPSRFSGSGSGKDYTLSITSL
14C10 QQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPV
8C5 Q О К P G Q P P К L L I Y R A A N L Q S G I P A R F S G S G S R T D F T L T I D P V
CDR L3 - Contact
CDR L3 - Kabat
CNJ ГО LO СО Г--
ооо Осэсэ
11F1
Р .
. 1 т
6D12
L Т
11D4
Р .
. 1 Т
8Е1
Р .
. F Т
46СЗ
L Т
8Н7
Р .
. Y Т
21НЗ
Р .
. Y Т
25F7
Р .
. F Т
14Е6
Р .
. W Т
14С6
L Т
24А1
Р .
. Y Т
5F8
Р S
У Y Т
6С1
Р .
. Y Т
12А11
Р .
. Y Т
12В8
L Т
14С10
, ,
. Y Т
8С5
Р .
. 1 Т
Нумерация о _Q о •"-
no Kabat г-- оо оосюсюсхэсхэоосхэсосхэо^ст> о^о^от
F G G G Т К L
F G A G Т К L
F G G G Т К L
F G S G Т К L
F G A G Т R L
F G G G Т Т L
F G G G Т Т L
F G S G Т К L
F G G G Т К L
F G S G Т К L
F G G G Т К L
F G G G Т К L
F G G G Т К L
F G G G Т К L
F G A G Т К L
F G G G Т К L
F G G G Т К V
Вариабельная область тяжелой цепи
I CDR Ш - СопЬосГ
Нумерация
no Kabat
i- оо en
11F1
6D12
11D4
8E1
46C3
8H7
21H3
25F7
14E6
14C6
24A1
5F8
6C1
12A11
12B8
14C10
8C5
CO О) о
- 4- см
L К L
V N L
L S I
V К L
V К L
V R L
V R L
V R L
V К I
V R M
V T L
V К L
V К I
L R L
А К I
L S L
L S V
-- CM
см см
s с
s с
т с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
s с
т с
А С
l-O LO
см см см
A P S
К A S
T V s
T A A
T A S
К A S
К A S
T A S
К P S
К A S
К A S
T S S
К V T
A V S
К A S
S F S
T V S
GFTFSSYGI GFNIKDYYM GFSLTNYGV DFNIKDTYM D F N I I D T Y I GYSFTSY1IM GYSFTSYWI G F N I Q D T F T GDTFTEYTM GYTFSSY1IM GYTFTDYEM D F N I К D T Y I GNTFSSYIIM GIDFSRYWM GYAFSNYGM GFSLSTSAM D F S L T T Y G V
LO LO ГО ГО
Ю Ю
oo cn
ГО ГО
s .
R Q
N .
К Q
S .
R 0
H .
К Q
H .
К Q
H .
К Q
H .
К Q
H .
R Q
N .
R Q
E .
К 0
H .
К Q
H .
К Q
E .
К Q
S .
R Q
N .
К Q
G I
R Q
H .
R Q
CDR Н2 - Contact ICDR H2 - Chothial
CDR H2 - Kabat
о" о
to со
Y Р
Y D
Y H
Y D
Y D
Y N
Y N
Y D
Y N
Y N
Y N
Y D
Y V
Y T
Y T
Y N
Y N
^- oj ro (O со со со
P К S A P К P К Q К Q К P К Q К E N Q К P К E К P S D D P A A A
D S V К Q
LO CO I CO CO CO
G R F
G К A
S R L
G R F S R L S R L ooaio со со г"
T I s
T I T
T I T
S I T
A L T
T L T
T L T
К I L
T L T
T F T
T L T
A M T
T F T
V I S
V F S
T I S
T I S
*- CNI Ю
1-х 1-х Г-.
R D N
A D T
К D N
A D S
S D T
A D К
A D К
A D T
V D К
A D T
A D К
S D T
A D T
R D N
L E T
К D T
К D N
LOtO I-
1-х 1-х Г-. 1-х
A E S S
S К S Q
S S N T
D S N T
S S S T
S S S T
S S N T
S S S T
S S N T
S S S T
S S
S S А К
S A S T S R N Q S К S Q
CO OS СЭ *-
1-х г-" 00 CO
L Y L Q
V Y L Q
V F L К
A Y L H
A Y L L
A Y M Q
A Y M Q
A Y L Q
A F M D
A Y M Q
A Y M D
A Y L R
A Y M Q
L Y L Q
A Y L Q
V F L К
V F F К
CDR НЗ - Contact
CDR H3 - Kabat
Нумерация no Kabat
о _o о ~o as ч- cn
00000000 <-СМП*ЮЮМХ)0) О ¦"- OOOOOOOOOOOOOOOOCS^-
A L DYWGQGTSVTV
AYWGHQTMVTV
DYWGQGTLVTV
G Y A L . . . . GYWGQGTSVTV
" F AYWGQGTLVSV
Y G S S P F G Y A U
YGSSPFWFAYWGQGTLVTV FAYWGQGTLVTV DYWGQGTSVTV NYWGQGTTLIV D Y
AM.. P G W L
D Y W G Q P Y W G H W
FGF. D G S F Y A Y V D A I .
G Q G T L V T V NYWGQGTTLTV DYWGQGTSVTV V Y W G Q G T L V T V G T L V T V
D Y W G Q
G T L V T V G T S V T V DYWGQGTSVTV
CM ro
S S
S A
S A
S S
S A
S A
S A
S S
S S
S A
S S
S S
S A
S A
S A
S S
S S
OD450 - оптическая плотность при 450 нм
Фиг. 6B
FGFRlc
отрицательный
контроль FGF21 bFKBl IqG
pFRS2a рМЕК
МЕК pERK
ERK
f - актин
::(tm):№:::-v::c-:-:-:-::::-:-:^-:::-:-:
Фиг. 6D
140л 120-
FGFRlc
FGFRk + KLB
g. 100
I 80H
i вон
н 40H
123456789 10
1. Имитация трансфекции
2. RlMAbl/трастузумаб
3. R1MAb1/KLBmAbl
4. R1MAb1/KLBmAb3
5. R1MAb1/KLBmAb7
6. Р1МАЬ2/трастузумаб
7. R1MAb2/KLBmAb1
8. R1MAb2/KLBmAb3
9. R1MAb2/KLBmAb7
10. Очищенное RlMAbl (133 нМ)
Фиг. 7A
50-1
40302010-
FGFRIc
FGFRlc + KLB
1 2 3 4 6 8
1. Имитация трансфекции
2. R1MAb3/KLBmAb1 (bFKBl)
3. R1MAb3/KLBmAb2
4. R1MAb3/KLBmAb3
5. Очищенное RlMAb3 (133 нМ)
6. Очищенное RlMAb2 (133 нМ)
Фиг. 7B
FGFRlc -л-FGFRlc + KLB
12-i 108642-
R1MAb3/ KLBmAb4
-9 -6
12-i 1086420
R1MAb3/ KLBmAbS
12-. 108642
R1MAb3/ KLBmAb6
-9 -6
юд[м]
FGFR1
(2)
(3)
Мышиная константная область, без эффекторных функций
^ Голубой: человеческая последовательность
Гуманизированный IgG, без эффекторных функций
Красный: мышиная последовательность
Фиг. 8А
FGF21 bFKBl (1) bFKBl (3) IgG
FGF21 -¦- bFKBl (2) bFKBl (3) IgG
Фиг. 8B
0.81
0.6-
^0А 0.2
1 пМ bFKBl без IgG
0.0 i i i i-i-i-i-i-i-i -15 -12 -9 -6
FGF21, log [M]
Фиг. 9B
0.8 п 0.60.40.2
16 нМ FGF21 2 нМ FGF21 -m- 250 nM FGF21 без FGF21
0.0-|-\-i-\-i-i-\-i-i-i -15 -12 -9 -6
bFKBl, log [M]
Фиг. 9C
НЕК293: hKLB
0 3
loglO (nM)
HEK293: hKLB/FGFRk HEK293: FGFRlc
0 3
loglO (пМ)
2000 n
0 3
loglO (иМ) Фиг. 9D
YW182.5 IgG • BsAb#9 BsAb#10
4000л
3000-
2000-
Г .
1000-
hFGFRlc + hKLB
loglO (nM) hKLB
0 3 6
loglO (nM) hFGFRlc
0 3 6
loglO (nM)
Фиг. 10A
FQPR1 Человеческий Человеческий (нет)
Человеческий (нет) Человеческий
(нет) Мышиный
BsAM 2.3 нм > 300нм 6.6 нм
FGF21 5.3 "1ТА данных данных
15.5 нм
Нет данных
Фиг. 10В
FGFR1
Чип: FGFRlc Аналит: KLB
1200 8004004
0-т--5 0
1200-1
н о
800-
400-
Чип: FGFRlc Аналит: bFKBl
Koff{1/c)=4.80E-2
Чип: FGFRlc
Аналит: KL6 +
bFKBl
Время (мин)
чип: FGFRlb
Аналит: bFKBl
12001
и РЗ
н о
800-
s в
400
-5 0 5 10 15
Время (мин)
1200 800 400
чип: FGFRlb
Аналит: KLB + bFKBl
Ко"(1/с)=4.02Е-2
0 5 10 15
Время (мин)
Фиг. 12В
.HI
Глпкозидаза-подобный(]Ч) |Глпкозидаза-подобный (С)
домен Iдомен
П I
Связывание в анализе FACS
KLBmAbl KLBmAb2
KLB человека
KLA человека
+ + + + + +
Человек Яванский макак
Крыса Мышь Кролик
S S S S А]
V R
V R M1R
V R
Е G
R W R W
R R R R
R W N N RfN
Y I Т
Y I Т
YfflT
Y I Т
Y I Т
890
S S N N N
Фиг. 13В
Qi Л
3 я а х
Время (мин)
0 2 4 6 8
Время (мин)
Фиг. 14А
0.5п 0.40.30.20.10.0-
FGFR4/KLB
---FGF19
-*-bFKBl + ihmfgfi9
-i-i-i-i-i-i-i-i-i -15 -12 -9 -6
log [M]
0,4 нм FGF19 0,142 нм bFKBl
pERK ERK
++++++-
(c):.л;;;:.й;;:.:
^VAVAWA*,1?
"•> :":•№
!^!!:У!!:У!!:;у"У!!!У!:!:!!'!^
? 110 ? 100 H
S 90i
E +/+ ns
db/db ns
5 0
? 15
ID "
4. H О E X Я ь
+/+ db/db ns
ns - Незначимое отличие
50J 403020100-
IgG bFKBl
5 10 15
Время (дни)
5 10 15 20
Время (дни)
I ^ 3004
ft CQ 100
500п
0 30
90 120
Время (мин)
Фиг. 15C
И В
3 S
s g
я с и S
4 в ю м
Ё о
и в
40п 3020-
10- ***
0 5 10 15
Инсулин (нг/мл)
нш-IgG ¦ bFKBl
Фиг. 15G
дикий тип: FS6D6KAI WDKKQYVSP
нокаут: FSETGKQYG I KNST *
Фиг. 16В
К1Ь+/-
Klb
600-1
---IgG
bFKBl
О 30 60 90 120
Время (мин)
30 60 90 120
Время (мин)
ns - Незначимое отличие
Фиг. 16С
Щ Носитель ^ bFKBl ¦ R1МАЫ
О ffl Л
ч я я
IX)
PQ S
о 2
ffl
200 -1
150-
100-
"Базальный уровень'1
Контроль IgG
bFKBl
т-г
-30 0 30 60
Время (мин)
I 1 ' I
90 120
Ч v
HS - Незначимое отличие
он-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I-I
О 30 60 90 120
Время (мин)
Фиг. 18С
0.91
0.8-
I о л
я ы
Щ 0.6 н
0.50.4
21 °С
Контроль IgG
bFKB
в I
Дни после инъекции
ЕЕ - потребление энергии
0.90-1 0.850.800.75-
21 °С
0.70-1 0.65
Контроль IgG
bFKBl
ns - Незначимое отличие
RQ - дыхательный коэффициент
Дни после инъекции
ЕЕ - потребление энергии
ns - Незначимое отличие
RQ - дыхательный коэффициент
Фиг. 19В
Дни после инъекции
о о
О 7 14 21 28 35
Дни после инъекции
Внутрибрюшинная инъекция
IgG
bFKBl
IgG
Насос
Носитель
Носитель
1.1
1.0 §0.9 Н 0.8 Н 0.7
До введения дозы
ЕЕ - потребление энергии
ns - Незначимое отличие
RQ - дыхательный коэффициент
Фиг. 19Н
Дни после инъекции
КонтрольIgG
bFKBl
-5! X
5.0-1 4.54.03.53.0-сч1 95> 2.01.51.0
21 °C
IN II N M
И И N П I
Дни после инъекции
Дни после инъекции
и IgG в bFKBl
мыши на диете
с низким уровнем жира
21 °С
0.8п
22.2%
15.3%
0.60.40.20.0 мыши на диете
с низким уровнем жира
после повышения температуры
до 30 °с
45.9%
0.60.4- Ё 0.20.0
39.6%
Фиг. 21В
Дни после инъекции
DIO 21 °C
20 30 40
Время (дни)
Фиг. 22
Печень
Поджелудочная Эпидидимальная Межлопаточная Паховая
железа WAT ВАТ WAT
ЫКВ1 "
FGF21
+ +
- - + + - + + -
+ +
- + + -
- - + +
+ + - -
+ 4 -
- + + -
+ +
МЕК pERK ERK
н я
SJ PQ
10-1 -5Н
-15-
1 -ЮН
= -20
День 7
ш в
а-к
v в
ч h о и
о н
u Я
25-1 201510-
0^-
День 7
0 0.3 3 30
Доза (мг/кг)
О 0.3 3 30 Доза (мг/кг)
Фиг. 24А
и Ч ш Н w
Носитель
bFKBl (3) bFKBl (30)
-20 2 4 6 8 101214
Дни после инъекции
п-I-I-I-I-I
0 2 4 6 8 101214
Дни после инъекции
IgG
bFKBl
День 11
День 11
День 5
День 11
День 11
S -10 E-15
-20
+/+ -/
к ч
Q3 м
+/+ -/
ss >
J s
ш a
v о
SO ffl
о -я
15n
+/+ -/-
День 6
День 7
День 11
День 11
День 11
Фиг. 24D
я _ га 1? я д
STS 1-54
в и
I 11.0-
V В
| * 0.50.0
***
3-1
Spry4
***
PBS (два раза в день) + Контроль IgG (внутрибрюшинно, однократно)
щ PBS (два раза в день) + bFKBl (внутрибрюшинно, однократно)
Щ FGF21 (два раза в день) + Контроль IgG (внутрибрюшинно, однократно)
Фиг. 25
bFKBl
i. \
¦'lb
' -
.t'i
: ' :> *
> % i
Мыши на диете
с низким содержанием жира
Фиг. 27
Анализ
сыворотки ПТ иСТ анализ костей
~| 1 1 1 1 1
2 3 4 5 6 (Недели после первой инъекции)
Фиг. 28А
Контроль, получающий диету с низким
Контроль IgG bFKBl (i мг/кг) bFKBl (з мг/кг) содержанием жира
Изменение веса тела (%)
112.8 ± 1.1
116,6 ± 1.1
102.3 ± 4.7 *
ITT AUC (ч*мг/кг)
226 i 18
153 ± 15 *
156 ± 23 *
Анализ сыворотки
Инсулин (нг/мл)
3.87 ± 0.42
2.00 ± 0.54 *
1.37 ± 0.65 *
0.59 ± 0.60 ***
FGF21 (пг/мл)
824 ± 67
754 ±65
696 ± 62 jf
690 ±60*
Лептин (пг/мл)
46.5 ± 2.3
45.6 ± 2.1
32.9 ± 1.9 *
3.20 ± 1.8 **"
Высокомолекулярный адипонектин (пг/мл) Общий холестерин (мг/дл)
2802 ± 202
4174 ± 199
5667 ± 299 *
2745 ± 321 *
240.6 ± 9.3
200.7 ± 9.4 **
177.4 ± 9.7 ***
74.6 ± 9.6 ***
Триглицериды (мг/дл)
41.3 ± 2.7
44.8 ± 2.8
31.9 ± 2.9 $
57.69 ± 2.8 **
FFA (мМ)
1.01 ± 0.04
1.04 ± 0.04
0.81 ± 0.04 **
0.77 ± 0.03 **
цСТ-анализ трабекулярного вещества кости
BV/IV
0.107 ± 0.006
0.114 ± 0.006
0.117 ± 0.010
0.136 ± 0.004 *
Плотность кости (мг НА/см3)
1028 i 3
1026 ±6
1033 ±3
975 ± 6 ***
Объем кости (мм3)
0.286 ± 0.026
0.327 ± 0.025
0.330 ± 0.033
0.390 ± 0.017 *
Общий объем (мм3)
2.65 i 0.09
2.86 ± 0.07
2.80 ± 0.10
2.87 ± 0.09
Число трабекул (мм *)
4.11 ±0.04
4.08 ± 0.09
4.22 ± 0.13
4.73 ± 0.07 ***
Толщина трабекул (мм)
0.0517 ± 0.0009
0.0526 ± 0.0008
0.0528 ± 0.0014
0.0477 ± 0.0002 *
Расстояние между трабекулами (мм)
0.234 ± 0.003
0.235 ± 0.006
0.228 ± 0.008
0.202 ± 0.003 ***
Площадь поверхности костей (мм2)
13.6 ± 1.0
15.5 ± 1.0
15.3 ± 1.2
19.5 ± 0.9 **
BS/BV (мм1)
52.6 ± 1.7
51.3 ± 1.1
51.2 ± 2.1
53.5 ± 0.4
цСТ-анализ кортикального вещества кости
BV/TV
0.404 ± 0.005
0.391 ± 0.005
0.391 ± 0.006
0.393 ± 0.007
Плотность кости (мг НА/см3)
1236 ± 2
1239 ±3
1240 ± 22
1243 ± 2 *
Объем кости (мм3)
2.55 ± 0.06
2.57 ± 0.06
2.46 ± 0.07
2.56 ± 0.09
Общий объем (мм3)
6.33 ± 0.17
6.6 ± 0.23
6.33 ± 0.26
6.52 ± 0.26
Толщина кости (мм)
0.119 ± 0.001
0.116 ± 0.001
0.115 ± 0,001 $
0.115 ± 0.002
Объем костного мозга (мм3)
3.79 ± 0.12
4.05 ± 0.17
3.88 ± 0.22
3.98 ± 0.18
Фиг. 28В
500-1 * 400-
в 300 -1
CTRL LPS 5 5 25
IgG bFKBl
FGFR1
- BsAb#13
- BsAb#15 BsAb#16
EC50 BsAb#13 1.0 нм BsAbjflS 2.6 нм BsAb#16 07 " vi
loglO(nM)
FGFR1 - BsAb|13
loglO(nM)
loglO(nM)
KLB/FGFR1
EC50 BsAb|l3 1.0 вм BsAb#19 12.5 вм
"- 182.5
1000
109
112
112
124
124
1/47
1/47
Фиг. IB
Фиг. IB
2/47
2/47
2/47
2/47
2/47
2/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
3/47
4/47
4/47
4/47
4/47
4/47
4/47
5/47
5/47
12/47
12/47
Фиг. 5
Фиг. 5
13/47
13/47
15/47
15/47
15/47
15/47
15/47
16/47
16/47
16/47
18/47
18/47
18/47
18/47
18/47
20/47
21/47
22/47
Фиг. 12А
21/47
22/47
Фиг. 12А
21/47
22/47
Фиг. 12А
21/47
22/47
Фиг. 12А
21/47
22/47
Фиг. 12А
21/47
22/47
Фиг. 12А
23/47
22/47
Фиг. 12А
23/47
22/47
Фиг. 12А
857
24/47
857
24/47
Фиг. 14B
Фиг. 14B
857
24/47
857
24/47
Фиг. 14B
Фиг. 14B
857
24/47
857
24/47
Фиг. 14B
Фиг. 14B
857
24/47
857
24/47
Фиг. 14B
Фиг. 14B
25/47
25/47
Фиг. 15В
Фиг. 15В
25/47
25/47
Фиг. 15В
Фиг. 15В
25/47
25/47
Фиг. 15В
Фиг. 15В
26/47
26/47
Фиг. 15Е
Фиг. 15Е
26/47
26/47
Фиг. 15Е
Фиг. 15Е
26/47
26/47
Фиг. 15Е
Фиг. 15Е
27/47
27/47
27/47
27/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
28/47
29/47
30/47
Фиг. 18В
29/47
30/47
Фиг. 18В
29/47
30/47
Фиг. 18В
29/47
30/47
Фиг. 18В
29/47
30/47
Фиг. 18В
31/47
30/47
Фиг. 18В
32/47
32/47
32/47
34/47
35/47
35/47
Фиг. 19G
Фиг. 19G
36/47
36/47
36/47
36/47
36/47
36/47
37/47
38/47
Фиг. 20В
39/47
38/47
Фиг. 20В
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
40/47
Фиг. 24С
41/47
42/47
Фиг. 24С
41/47
42/47
Фиг. 24С
41/47
42/47
Фиг. 24С
41/47
42/47
Фиг. 24С
41/47
42/47
Фиг. 24С
43/47
43/47
Фиг. 26
Фиг. 26
44/47
44/47
45/47
45/47
46/47
46/47
46/47
46/47
46/47
46/47
|
