[RU]

Настоящее изобретение относится к белковым наночастицам, обладающим способностью самосборки, сконструированным из подходящих доменов олигомеризации и дополнительно включающих TLR5-связывающий белок флагеллин в качестве молекулы адъюванта. Более того, настоящее изобретение относится к применению таких наночастиц для вакцинации.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к белковым наночастицам, обладающим способностью самосборки, сконструированным из подходящих доменов олигомеризации и дополнительно включающих TLR5-связывающий белок флагеллин в качестве молекулы адъюванта. Более того, настоящее изобретение относится к применению таких наночастиц для вакцинации.

---

Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201691202 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.01.30
(22) Дата подачи заявки 2015.01.09
(51) Int. Cl. C07K14/00 (2006.01)
(54)
ФЛАГЕЛЛИН-СОДЕРЖАЩИЕ БЕЛКОВЫЕ НАНОЧАСТИЦЫ В КАЧЕСТВЕ ПЛАТФОРМЫ ДЛЯ ВАКЦИНЫ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
14150600.6; 14189264.6 2014.01.09; 2014.10.16 EP
PCT/EP2015/050289
WO 2015/104352 2015.07.16
Заявитель:
АЛЬФА-О ПЕПТИДС АГ (CH)
Изобретатель:
Буркхард Питер (US), Раман Сентил Кумар, Паулильо Сара Мария, Пьяцца Маттео, Кулангара Кэролайн, Миттельхольцер Кристиан (CH)
Представитель: Нилова М.И. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к белковым наночастицам, обладающим способностью самосборки, сконструированным из подходящих доменов олигомеризации и дополнительно включающих 1Ъ115-связывающий белок флагеллин в качестве молекулы адъюванта. Более того, настоящее изобретение относится к применению таких нано-частиц для вакцинации.
Флагеллин-содержащие белковые наночастицы в качестве платформы для
вакцины
Область техники
Настоящее изобретение относится к белковым наночастицам, обладающим способностью самосборки, которые включают белковую последовательность TLR5-связывающего белка флагеллина в качестве встроенного адъюванта. Более того, настоящее изобретение относится к применению таких наночастиц для вакцинации.
Уровень техники
Первой линией защиты против инвазивных агентов является врожденный иммунитет хозяина, и толл-подобные рецепторы (TLR), которые представляют собой рецепторы,
15 связанные с мембраной, играют в нем ключевую роль (Yoon S.I. и др., Science 2012, 335:85964). TLR распознают антигены с высоко консервативной структурой молекул посредством применения своих эктодоменов с богатыми лейцином повторами (LRR). Данный LRR имеет форму подковы. Каждый TLR обладает определенным лиганд-связывающим доменом, который распознает свой конкретный молекулярный антиген, который может
20 представлять собой специальные формы нуклеиновых кислот вирусов или бактерий, поверхностные молекулы бактерий, такие как липополисахариды (LPS), или другие молекулы, ассоциированные с патогенами, обладающие определенной структурой. Даже при том, что они распознают различные неродственные молекулярные антигены, все известные структуры TLR, активированных агонистами, т.е. TLRs, которые распознали и
25 связали свой молекулярный антиген, образуют однотипную димерную структуру после связывания с антигеном, которая приводит их С-концевые области в непосредственную близость друг от друга, что, в свою очередь, активирует их внутриклеточные домены рецептора толл/интерлейкина-1 (TIR) и, таким образом, инициирует каскады клеточных сигналов.
Что касается объема настоящего изобретения, интересно отметить, что из множества различных рецепторов TLR, TLR5 является единственным белок-связывающим TLR, который консервативен у позвоночных от рыб до млекопитающих. TLR5 связывается с разобранной формой флагеллина филамента плетевидного жгутика из бета- и гамма
протеобактерий, которая отвечает за перемещение флагеллина. В результате недавних кристаллографических исследований обнаружили димерный комплекс между флагеллином и TLR5. После связывания флагеллина с TLR5, индуцируется Му088-зависимый сигнальный путь, который, в свою очередь, активирует провоспалительный фактор 5 транскрипции NF-kB в дендритных клетках, моноцитах и эпителиальных клетках, приводя, в конечном итоге, к врожденному иммунному ответу против жгутиковых бактерий.
Флагеллин имеет молекулярную архитектуру, которая состоит из четырех доменов DO, D1, D2 и D3. Белковая цепь начинается с N-концевой области домена DO и образует большую
10 петлю, проходящую через другие домены Dl, D2 и D3, дойдя до кончика молекулы, указанная цепь поворачивает и уходит назад через D3, D2 и D1, при этом приводя ее С-концевую область в домене DO в непосредственную близость к N-концевой области. Флагеллин способен активировать врожденную иммунную систему двумя путями. Первый путь заключается в связывании с рецептором TLR5, главным образом, через высоко
15 консервативный участок его домена Dl (Yoon и др., см. ссылку выше.). Другой путь активации заключается во взаимодействии с инфламмасомой, главным образом, через высоко консервативный С-концевой участок его домена DO (Lightfield K.L. и др, Nat Immunol, 2008, 9:1171-8).
20 Флагеллин применяли в качестве традиционного адъюванта, т.е. в качестве отдельного компонента, который вводят совместно с антигеном, или который также был разработан таким образом, чтобы содержать сам антиген в своей собственной молекулярной архитектуре. Второй подход обладает тем преимуществом, что эффект адъюванта колокализован с эффектом антигена, в результате чего дозировку адъюванта можно
25 значительно уменьшить и, как следствие, побочные эффекты также можно значительно снизить.
Одно из возможных ограничений флагеллина состоит в его способности индуцировать воспалительные иммунные реакции. Возможно уменьшение воспалительной части 30 иммунной стимуляции посредством конструирования производных флагеллина, у которых отсутствует С-концевой участок D0, который взаимодействует с инфламмасомой.
Многие адъюванты обладают существенными ограничениями в своем применении в связи с их сильными побочными эффектами. К примеру, полный адъювант Фрейнда, который
представляет собой очень сильный иммуностимулирующий состав, больше не может применяться даже в экспериментах на животных. В настоящее время существует лишь несколько одобренных адъювантов для применения в медицине, наиболее важными из которых являются квасцы. Одним из возможных способов уменьшения побочных эффектов 5 системно применяемых адъювантов является их приготовление в виде дисперсной системы, т.е. включение адъювантов в аэрозоль или в масляную эмульсию, которые могут устранить побочные эффекты и сконцентрировать адъювант в непосредственной близости от представляющего интерес антигена. Таким образом, антиген и адъювант могут одновременно достигнуть одного и того же лимфоузла, увеличивая в результате эффект 10 адъюванта при одновременном снижении системных побочных эффектов адъюванта.
Флагеллин в частности представляет собой адъювант, привлекательный для применения в белковых наночастицах, таких как те, которые описаны в публикации WO 2004/071493, поскольку флагеллин сам по себе является белком, в отличие от многих других адъювантов, 15 которые представляют собой небольшие молекулы, такие как имиквимод, или объекты, имеющие в основе нуклеиновую кислоту, такие как CpG. Поскольку флагеллин представляет собой белок, на его основе можно сконструировать наночастицу при помощи средств молекулярной биологии без необходимости использования химических сшивок.
20 Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение относится к белковой наночастице, обладающей способностью самосборки, которая состоит из агрегатов множества строительных блоков согласно Формуле (1а) или (lb)
X - ND1 - LI - ND2 - FLA (la) или FLA-ND1 - LI - ND2 - X(Ib),
состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND1, линкер L1, домен олигомеризации белка ND2, производное флагеллина FLA и дополнительный 30 заместитель X, при этом
ND1 представляет собой белок, который образует олигомеры (NDl)m из m субъединиц ND1,
ND2 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND2)n из п субъединиц ND2,
каждое тип представляет собой число от 2 до 10 при условии, что m не равно п и не кратно n, а п не кратно т,
5 L1 представляет собой связь или короткий гибкий линкер,
FLA представляет собой флагеллин или производное флагеллина, у которого отсутствуют части аминокислотной последовательности флагеллина, но по меньшей мере присутствует TLR5-связывающий домен D1, и при этом необязательно отсутствующий(-ие) домен(-ы) 10 заменен(-ы) гибким линкерным сегментом от 1 до 20 аминокислот, соединяющим два конца оставшейся последовательности флагеллина, или заменен(-ы) полностью уложенным (фолдированным) белковым антигеном;
X отсутствует или представляет собой последовательность пептида или белка, содержащую 15 от 1 до 1000 аминокислот,
необязательно совместно собранную со множеством строительных блоков согласно формуле (II),
20 Y-ND3-L2-ND4-Z (II),
состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND3, линкер L2, домен олигомеризации белка ND4 и дополнительные заместители Y и Z, при этом
25 ND3 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND3)y из у субъединиц ND3,
ND4 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND4)Z из z субъединиц ND4,
каждое у и z представляет собой число от 2 до 10 при условии, что у не равно z и не кратно 30 z, и z не кратно у, и при этом
либо ND3 идентичен ND1, либо ND4 идентичен ND2, или оба ND3 и ND4 идентичны ND1 и ND2, соответственно,
L2 представляет собой связь или короткий гибкий линкер, который может отличаться от L1 или быть идентичен L1, и
Z и Y независимо друг от друга отсутствуют или представляют собой последовательность 5 белка или пептида, содержащую от 1 до 1 ООО аминокислот.
Краткое описание фигур
Фигура 1: Схематическое представление различных белковых наночастщ, состоящих из 10 совместно собранных эпитоп-содержащих цепей и флагеллин-содержащих цепей или цепей, содержащих производное флагеллина, в вертикальном положении.
В верхнем левом углу представлен мономер флагеллин-содержащей белковой цепи, слитый с доменами олигомеризации ND2 и ND1; справа представлена совместно собранная 15 наночастица с ND3-L2-ND4-Z в соотношении 1:59, предполагающая Т=1 икосаэдрическую симметрию.
Для наглядности, наиболее вероятно разупорядоченные, гистидиновые метки (X и Y) не представлены.
"ND1" и "ND3": пентамерные домены олигомеризации; "ND2" и "ND4": тримерные домены 20 олигомеризации; "FLA": флагеллин или производное флагеллина; "Z": эпитоп
A) Модель флагеллина D0-D1-D2-D3 и соответствующая эпитоп-презентирующая наночастица.
B) Модель флагеллина D0-D1-D2 и соответствующая эпитоп-презентирующая наночастица.
25 С) Модель флагеллина D0-D1 и соответствующая эпитоп-презентирующая наночастица.
D) Модель флагеллина D1-D2-D3 и соответствующая эпитоп-презентирующая
наночастица.
E) Модель В-клеточного эпитопа NANP (Z), слитого с доменом олигомеризации ND4 кора
ND3-L2-ND4.
Фигура 2: Схематическое изображение взаимодействия флагеллина с TLR5.
В идеале флагеллин должен быть димерным и располагаться в перевернутой ориентации на наночастицах. Представляемая часть белковых цепей начинается с (например,
пентамерного) домена олигомеризации ND1, который присоединен к (например, димерному) домену олигомеризации ND2 при помощи линкера L, дополнительно соединенного с производным флагеллина FLA, состоящего из D2, и далее домена D1 флагеллина до кончика (Т) включительно. На кончик присоединяют последовательность 5 D1, которая укладывается сама на себя и в домен D2. Для наглядности наиболее вероятно, разупорядоченные, гистидиновые метки не представлены.
А) Слева: Модель мономера. Справа: Модель димера, в котором флагеллин удерживают в правильной димерной конформации для взаимодействия с TLR5. 10 В) Верхняя вставка: Модель димера флагеллина, взаимодействующего с димером TLR5. Нижняя вставка, слева: Модель полностью собранной "только флагеллиновой" частицы в обрезанном представлении. Справа: Модель полностью собранной "только флагеллиновой" частицы в полном представлении.
15 Фигура 3: Карта векторарРЕР-Т.
"prom": промотор; "term": терминатор; "ori": точка начала репликации; "bp": пары нуклеотидных оснований; "amp": ген устойчивости к ампициллину.
20 Фигура 4: Микроизображения белковых наночастщ в просвечивающем электронном микроскопе
После рефолдинга и совместной сборки рекомбинантно экспрессированных белков, образцы адсорбировали на решетках с покрытием из углерода и негативно окрашивали 2% 25 уранилацетатом.
A) Т81C-WRW-8RRVRA-D0-D1 : T81c-WRW-8RRVRA-T1BT* соотношение совместной
сборки 12:48, описано в разделе "Разработка FLA-SAPN" и Примере 6. Отрезок
отображает 500 нм.
B) T81c-8-D0-Dl : T81c-8-Pf соотношение совместной сборки 3:57, описано в Примере 8.
30 Отрезок отображает 200 нм.
C) PD52-2i88-PANDORA-D2-Dl-ori: PD52-2i88-PANDORA-Noro соотношение совместной
сборки 5:55, описано в Примере 7. Отрезок отображает 200 нм.
D) DFM-D0-D1 : DFM-D2-Dl-tip3_NIC-pept соотношение совместной сборки 5:55, описано
в Примере 9. Отрезок отображает 200 нм.
Фигура 5: ДСН-ПААГ-электрофорез конструкции L0NG-D2-D1-ori Примеров 1 и 5.
Данная конструкция обладает теоретической молекулярной массой 41,1 кДа 5 CL - Очищенный лизат FT - Проба после колонки
1 - рН 8,0 промывка с 10 мМ имидазола
2 - рН 8,0 промывка с 500 мМ NaH2P04
3 - рН 6,3 промывка 10 4 - рН 5,9 промывка
5 - рН 4,5 промывка
Elu - элюирование 250 мМ имидазола, 5 и 10 мкл образца нанесенно на гель.
Фигура 6: Микроизображения в просвечивающем электронном микроскопе белковых 15 наночастиц конструкции LONG-D2-D 1-ori при различных разрешениях
После рефолдинга и совместной сборки рекомбинантно экспрессированного белка, наночастицу адсорбировали на решетках с покрытием из углерода и негативно окрашивали 2% уранилацетатом.
20 Отрезок отображает 1000 нм, 500 нм, 200 нм и 100 нм для верхнего правого, левого верхнего, нижнего правого и левого нижнего изображений соответственно.
Фигура 7: Активация клеточного пути TLR5.
25 A) Long-D2-D 1-ori (Пример 5)
B) Т81C-WRW-8RRVRA-D0-D1 : T81c-WRW-8RRVRA-T1BT* (12:48) (Пример 6)
C) PD52-2i88-PANDORA-D2-D 1-ori : PD52-2i88-PANDORA-Noro (5:55) (Пример 7) Верхние вставки: оценка чувствительной к дозе активности
Нижние вставки: оценка ЕС50
IMG-2205: флагеллин Salmonella Typhimurium (0,29 нг/мл), положительный контроль
Ось X: Концентрация (нг/мл) наночастицы
Ось Y: экспрессия SEAP (нг/мл) или % А =% активности
Рисунок 8: ИФА анализ связывания титров антитела после иммунизации мышей C57BI/6 (описано в Примерах 8 [вставка А] и 9 [вставка Б]).
5 ¦ Отдельно T81c-8-Pf в дозе 1 мкг
• Отдельно T81c-8-Pf в дозе 10 мкг
X Совместная сборка T81c-8-D0-Dl и T81c-8-Pf в соотношении 3:57 и дозе 1 мкг ^ Совместная сборка T81c-8-D0-Dl и T81c-8-Pf в соотношении 3:57 и дозе 10 мкг
• Совместная сборка T81c-8-D0-Dl и T81c-8-Pf в соотношении 9:51 и дозе 1 мкг 10 Ж Совместная сборка T81c-8-D0-Dl и T81c-8-Pf в соотношении 9:51 и дозе 10 мкг
Ось X: коэффициент разбавления сыворотки Ось Y: OD = оптическая плотность
Планшет ИФА покрывают полным иммуногеном, применяемым для иммунизации 15 В)
• Совместная сборка DIM-D0-D1 и DIM-D2-Dl-tip3_NIC-pept в соотношении 5:55 и дозе 10 мкг
¦ Никотин, соединенный с носителем гемоцианином фиссуреллы в дозе 10 мкг Ось X: коэффициент разведения сыворотки 20 Ось Y: OD = оптическая плотность
Планшет ИФА покрывают только никотином, прикрепленным к несвязанному носителю
Фигура 9: Микроизображения в просвечивающем электронном микроскопе белковых наночастиц конструкции Nic-DEDDL
После рефолдинга и совместной сборки рекомбинантно экспрессированного белка, наночастицу адсорбировали на решетках с покрытием из углерода и негативно окрашивали 2% уранилацетатом. Отрезок отображает 1000 нм.
30 Фигура 10: Образование антител
Иммунизацию групп из трех мышей C57BI/6 осуществляли подкожно либо 10 мкг Nic-DEDDL (Пример 10), либо 10 мкг Nic-KLH (никотин, соединенный с носителем гемоцианином фиссуреллы) в качестве положительного контроля тремя инъекциями
каждой с интервалом в неделю. Титр антител в нулевой день (т.е. до первой инъекции) и далее неделю спустя после каждой инъекции определяли при помощи ИФА. D = количество дней после первой иммунизации; А = титр антитела (логарифмическая шкала log2).
Подробное описание изобретения
В настоящем изобретении описаны различные формы флагеллина, которые включают в себя различные домены флагеллина в любой ориентации, встроенного в наночастицы. Некоторые из конструкций имеют в составе флагеллин, прикрепленный к наночастицам через свои N- и С-концевые области в непосредственной близости к поверхности наночастицы (Фигура 1), в то время как в других конструкциях дальние участки флагеллина расположены в непосредственной близости к поверхности наночастицы, тем самым представляя флагеллин в перевернутой ориентации на наночастицах (Фигура 2).
Так как воспалительные иммунные реакции являются одной из главных проблем адъювантов и в частности TLR-связывающих адъювантов, выгодно уменьшать их способность индуцировать воспалительные реакции. Известно, что С-концевой участок флагеллина, который является частью домена DO, содержит пептидную последовательность, которая взаимодействует с инфламмасомой и, следовательно, ответственна за воспалительные реакции флагеллина. Таким образом, были разработаны конструкции на основе флагеллина, у которых отсутствует С-концевой участок домена DO, который активирует инфламмасому (Фигура 2).
Изобретение относится к белковой наночастице, обладающей способностью самосборки, которая состоит из агрегатов множества строительных блоков Формулы (1а) или (lb)
X - ND1 - LI - ND2 - FLA (la) или FLA-ND1 - LI - ND2 - X(Ib), 30
состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND1, линкер L1, домен олигомеризации белка ND2, производное флагеллина FLA и дополнительный заместитель X, при этом
ND1 представляет собой белок, который образует олигомеры (NDl)m из m субъединиц ND1,
ND2 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND2)n из п субъединиц ND2,
5 каждое тип представляет собой число от 2 до 10 при условии, что m не равно п и не кратно п, а п не кратно ш,
L1 представляет собой связь или короткий гибкий линкер,
FLA представляет собой флагеллин или производное флагеллина, у которого отсутствуют части аминокислотной последовательности флагеллина, но у которого по меньшей мере присутствует ТЬЯб-связывающий домен D1, и при этом необязательно отсутствующий(-ие) домен(-ы) заменен(-ы) гибким линкерным сегментом от 1 до 20 аминокислот, соединяющим два конца оставшейся последовательности флагеллина, или заменен(-ы) полностью уложенным белковым антигеном;
X отсутствует или представляет собой пептидную или белковую последовательность, содержащую от 1 до 1000 аминокислот,
20 необязательно совместно собранную со множеством строительных блоков согласно Формуле (II),
Y-ND3-L2-ND4-Z (II),
25 состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND3, линкер L2, домен олигомеризации белка ND4 и дополнительные заместители Y и Z, при этом
ND3 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND3)y из у субъединиц ND3,
30 ND4 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND4)Z из z субъединиц ND4,
каждое у и z представляет собой число от 2 до 10 при условии, что у не равно z и не кратно z, и z не кратно у, и при этом
либо ND3 идентичен ND1, либо ND4 идентичен ND2, или оба ND3 и ND4 идентичны ND1 и ND2 соответственно,
L2 представляет собой связь или короткий гибкий линкер, который может отличаться от L1 5 или быть идентичен L1, и
Z и Y независимо друг от друга отсутствуют или представляют собой пептидную последовательность от 1 до 100 аминокислот, содержащую от 1 до 1 ООО аминокислот.
10 Белковые частицы согласно настоящему изобретению обеспечивают очень эффективный способ колокализации молекулы адъюванта с представляющим интерес иммуногеном, следовательно, адъювантное свойство флагеллина можно колокализовать с вакцинным антигеном против которого желательна иммунная реакция. Посредством совместной сборки двух белковых цепей, формирующих наночастицу, одной с флагеллином или с
15 производным флагеллина (FLA) в молекуле согласно Формуле (1а) или (lb), другой согласно Формуле (II), содержащей антиген, представляющий интерес (Y или Z), в одну единую белковую наночастицу, адъювант и антиген полностью колокализованы. В связи с этим в данных конструкциях адъювантный эффект сочетается с преимуществом от того, что на наночастицах антиген представлен многократно. Кроме того, силу адъювантного действия
20 можно увеличить или уменьшить при помощи применения различных соотношений при совместной сборке флагеллин-содержащих белковых цепей согласно Формуле (1а) или (lb) с антиген-содержащими белковыми цепями согласно Формуле (II). Адъювантный эффект подбирают для того, чтобы найти оптимальный вариант между наилучшей антигенностью и наименьшим побочным эффектом.
Как было указано выше, FLA представляет собой флагеллин или производное флагеллина, у которого отсутствуют части аминокислотной последовательности флагеллина, но который по меньшей мере содержит TLR5-связывающий домен D1. Отсутствующий(-ие) домен(-ы) можно заменить гибким линкерным сегментом от 1 до 20 аминокислот, 30 соединяющим два конца оставшейся последовательности флагеллина, или их можно заменить полностью уложенным белковым антигеном. Область гибкого линкера может содержать подходящие сайты присоединения для ковалентного связывания антигенов.
Сами по себе флагеллин-содержащие наночастицы (т.е. без совместной сборки с антиген-содержащей белковой цепью, формирующей наночастицу) можно применять в качестве обычного адъюванта, который просто добавляют к любой форме доставки антигена в рассматриваемой вакцине.
В качестве дополнительного альтернативного варианта, антигены можно конструировать в качестве заместителя X на только флагеллин-содержащих белковых цепях, формирующих наночастицу, согласно Формуле (1а) или (lb), т.е. опять таки без совместной сборки с антиген-содержащей белковой цепью, формирующей наночастицу, согласно Формуле (II) 10 для того, чтобы добиться максимальных преимуществ от адъювантного эффекта и эффекта от того, что антиген представлен многократно, применяя антиген X в качестве В-клеточного эпитопа и производного флагеллина FLA в качестве адъюванта.
В связи с тем, что в архитектуре флагеллина белковая цепь проходит в виде петли через все
15 домены DO, D1, D2 и D3 и снова возвращается обратно, можно удалить один или несколько доменов из последовательности посредством воссоединения двух концов в непрерывную пептидную цепь, что приводит в результате к производному флагеллина FLA. Таким образом, конструкцию производного флагеллина, в которой отсутствуют домены флагеллина D2 и D3, можно сконструировать просто посредством соединения белковой
20 цепи на стыке доменов Din D2. Аналогичным образом, концевые домены (либо D3, либо D2 и D3 совместно) можно заменить белковым антигеном, при условии, что данный белковый антиген с его N- и С-концами можно соединить с N- и С-концами на стыке между D1 и D2. Концевые домены D2 и D3 можно также заменить пептидной последовательностью с подходящими остатками для ковалентного связывания молекул
25 антигена. Примером такой пептидной петли является последовательность KYKDGDKGDDK (SEQ Ш №: 1), которая содержит четыре остатка лизина для ковалентного связывания с его первичной аминогруппой. Такая гидрофильная петля, включающая остатки лизина, обеспечивает сайты связывания для ковалентного присоединения молекул лиганда к первичной аминогруппе боковой цепи лизина. Замена
30 остатков лизина в последовательности флагеллина посредством аргинина приводит к удалению нежелательных сайтов связывания в остальной части молекулы. Две данные модификации образуют производное флагеллина со следующей последовательностью:
MAQVWmSLSLLTQNmNRSQSALGTAffiRLSSGLRINSARDDAAGQAIANRFTANIRG LTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLDSIQAEITQRL NEroRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETroroLRQINSQTLGLDQLNVQQKY KDGDKGDDKTENPLQRroAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSR 5 IEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLSLLR (SEQ Ш №: 28)
Дополнительно, в объем настоящего изобретения включено конструирование флагеллина в виде димера на наночастице. Таким образом, оптимизировано взаимодействие с TLR5, который также является димером. Этого легко достигнуть посредством применения
10 димерного домена олигомеризации белка, такого как ND1 (ш равен 2) или ND2 (п равен 2), и его применения в качестве сайта присоединения для производного флагеллина FLA, т.е. как это показано в Формуле (lb) или (1а) соответственно. Это принудительно переводит производное флагеллина в димерную форму, которая более легко взаимодействует с TLR5 (Фигура 2). Предпочтительно, чтобы в такой конструкции димерный домен
15 олигомеризации в строительном блоке согласно Формуле (1а) или (lb), к которому присоединен флагеллин (либо ND2 в Формуле (1а), либо ND1 в Формуле (lb)), отличался от соответствующего домена олигомеризации в строительном блоке согласно Формуле (II) (либо ND4 при совместной сборке с цепями согласно Формуле (1а), либо ND3 при совместной сборке с цепями согласно Формуле (lb)). Предпочтительно димерный домен
20 олигомеризации в строительном блоке согласно Формуле (1а) или (lb) обладает более сильным взаимодействием, т.е. способностью к формированию димера, чем соответствующий домен олигомеризации (ND3 или ND4) в строительном блоке согласно Формуле (II). Это обеспечивает гарантию того, что в совместно собранной наночастице со строительными блоками согласно Формуле (1а) или (lb) и Формуле (II) флагеллин или
25 производное флагеллина FLA всегда образует димер на смежных строительных блоках согласно Формуле (1а) или (lb), и не распределен в качестве одиночного мономера по всей совместно собранной наночастице.
Кроме того, посредством конструирования флагеллина в перевернутой ориентации 30 преимущественно в виде димера на наночастице, можно оптимизировать взаимодействие с димером TLR5 (Фигура 2). Такая наночастица является предпочтительной. Например, конструкцию флагеллина D1-D2 можно сконструировать посредством соединения белковых цепей с пептидной последовательностью подобной KAKKKDGKDDKDS (SEQ Ш №: 29, "Т" в Фигуре 2) на стыке между доменом DO и Dl, таким образом минуя домен
DO, и полного удаления домена D3 без воссоединения белковых цепей. Следовательно, у образующейся в результате молекулы флагеллина N- и С-концы будут располагаться в области D2 с образованием последовательности, подобной
5 SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFroRTASGVSTLINEDA AAARRSTANPLASID S ALSRVD AVRS SLGAIQNRFD SAKAKKKDGKDDKDSKNANDGI SIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEroRVSNQTQFN GVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITroLQKIDVKSLGLDGFNVNGPREATVGDLRSSFRN VTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV 10 (SEQID№:30)
Можно было применять аналогичные последовательности гибкого линкера ("Т" в Фигуре 2), имеющие от 1 до 20 аминокислот, такие как, к примеру, GS или GKDGKDGS (SEQ Ш №: 31) или GKDGKDGKDGKDGS (SEQ Ш №: 32). Предпочтительно последовательности 15 линкера содержат, главным образом, заряженные или полярные аминокислоты с располагающимися между ними остатками глицина для того, чтобы сделать линкер гибким. Во избежание нежелательных сайтов связывания на данной конструкции D2-D1, остатки лизина заменяют остатками аргинина.
20 Далее производное флагеллина FLA должно быть соединено с димерным доменом олигомеризации ND1 или ND2 в части D2 флагеллина. Приготовление наночастицы из такого строительного блока либо отдельной, либо совместно собранной с соответствующим строительным блоком согласно Формуле (II), будет образовывать предпочтительную наночастицу с производным флагеллина в перевернутой ориентации.
Мономерные строительные блоки
Пептид (или полипептид, или белок) представляет собой цепь или последовательность аминокислот, ковалентно связанных амидными связями. Пептид может быть природным, 30 природным модифицированным, частично синтетическим или полностью синтетическим. Природные модифицированные, частично синтетические или полностью синтетические понимают в том значении, что они не встречаются в природе. Термин аминокислота одновременно охватывает встречающиеся в природе аминокислоты, выбранные из 20 незаменимых a-L-аминокислот, синтетических аминокислот, таких как a-D-аминокислоты,
6-аминогексановая кислота, норлейцин, гомоцистеин или подобные им, также, как и встречающиеся в природе аминокислоты, которые некоторым образом модифицировали для изменения некоторых свойств, таких как заряд, такие как фосфосерин или фосфотирозин или другие модификации, такие как н-октаноил-серин, или подобные им. У 5 производных аминокислот аминогруппа, формирующая амидную связь, является алкилированной, или боковая цепь амино-, гидрокси или тиогруппы является алкилированной или ацилированной, или боковая цепь карбоксигруппы является амидированной или этерифицированной. Предпочтительно, белок согласно настоящему изобретению содержит аминокислоты, выбранные из 20 незаменимых природных a-L-10 аминокислот.
В грубом приближении, пептиды можно отличить от белков на основе их размера, т.е. приблизительно цепь из 50 аминокислот или менее можно рассматривать в качестве пептида, в то время как более длинные цепи можно считать белками. Дипептиды представляют собой самые короткие пептиды и состоят из 2-х аминокислот, соединенных одной пептидной связью. Точно также трипептиды состоят из трех аминокислот, тетрапептиды состоят из четырех аминокислот и т.д. Полипептид представляет собой длинную, непрерывную и неразветвленную пептидную цепь. В литературе границы размера, отличающего пептиды из белков, являются несколько расплывчатыми. Иногда длинные "пептиды", такие как бета-амилоид, рассматривали в качестве белка, и наоборот, меньшие белки, такие как инсулин, упоминали как пептиды.
Короткую подвижную линкерную цепь L1 или L2 выбирают из необязательно замещенных атомов углерода, необязательно замещенных атомов азота, атомов кислорода, атомов серы 25 и их комбинаций, с предпочтительно 1 до 60 атомами, в частности, содержащих от 1 до 20 атомов в цепи. Такая короткая подвижная линкерная цепь представляет собой, к примеру, цепь полиэтиленокси, гибкую сахарную цепь или, предпочтительно, гибкую пептидную цепь, к примеру, пептидную цепь, состоящую из 1 до 20 аминокислот, в частности, от 1 до 6 аминокислот, содержащую одну или нескольких аминокислот глицина. Наиболее 30 предпочтительные линкеры состоят из 1 до 6 аминокислот с высоким содержанием глицина.
Домены олигомеризации согласно настоящего изобретения предпочтительно представляют собой суперспирали. Суперспираль представляет собой белковую последовательность с
непрерывной структурой в основном гидфрофобных остатков с интервалом в 3 и 4 остатка, которая организуется с формированием мультимерной группы спиралей, как будет более подробно объяснено в данной заявке ниже.
5 Домены олигомеризации, которые не являются суперспиралями, представляют собой, к примеру, домен тримеризации (фолдон) белка фибритина бактериофага Т4 (Tao, Y. и др., Structure 1997, 5:789-798).
Домены олигомеризации ND1, ND2, ND3 и/или ND4 и линкеры L1 и/или L2 можно
10 необязательно также заместить нацеливающими частицами или заместителями,
усиливающими адъювантные свойства наночастицы, такими как иммуностимулирующая
нуклеиновая кислота, предпочтительно олигодезоксинуклеотид, содержащий
дезоксиинозин, олигодезоксинуклеотид, содержащий дезоксиуридин,
олигодезоксинуклеотид, содержащий мотив CG, CpGs, имиквимод, резиквимод,
15 гардиквимод, инозин и цитидин, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, или подобные им. Другие заместители, усиливающие адъювантные свойства наночастицы, представляют собой антимикробные пептиды, такие как катионные пептиды, которые являются классом иммуностимулирующих, положительно заряженных молекул, которые могут способствовать и/или улучшать адаптивные иммунные реакции. Примером такого
20 пептида с иммуностимулирующими свойствами является положительно заряженный искусственный антимикробный пептид KLKLLLLLKLK (SEQ Ш №: 2), который индуцирует сильный адаптивный иммунитет, запускаемый специфическим белком типа 2, после иммунизации в режиме прайм-буст. Конкретная нацеливающая частица, рассматриваемая в качестве заместителя, представляет собой ER-нацеливающий сигнал,
25 т.е. сигнальный пептид, который индуцирует перенос белка или пептида к эндоплазматическому ретикулуму (ER).
Необязательные заместители, к примеру, те необязательные заместители, которые описаны в данной заявке выше, предпочтительно соединяют с подходящими аминокислотами ближе 30 к концу и напротив конца, связанного с L1 или L2 домена олигомеризации ND1, ND2, ND3 и/или ND4. При самосборке белковой наночастицы такие заместители далее будут присутствовать на поверхности наночастицы. Такие заместители можно присоединять к концу непрерывной белковой цепи, или можно присоединять к боковой цепи
функциональной группы аминокислоты, расположенной рядом с концом ND1, ND2, ND3 и/или ND4 напротив конца, связанного с L1 или L2.
В наиболее предпочтительном варианте реализации заместитель представляет собой пептидный или белковый заместитель и обозначается X, Y и/или Z, представляя собой 5 простое удлинение белковой цепи, к примеру, как X - ND1 - LI - ND2 - FLA на N-концевой области ND1, или на обоих концах, как Y - ND3 - L2 - ND4 - Z для получения комбинированной одиночной непрерывной белковой последовательности, которая может экспрессироваться в рекомбинантной системе экспрессии белка в качестве одиночной молекулы.
В других вариантах реализации пептидные или непептидные заместители можно соединять с функциональной группой боковой цепи аминокислоты, расположенной рядом с концом ND1, ND2, ND3 и/или ND4 напротив конца, связанного с L1 или L2, или, предпочтительно, с функциональной группой боковой цепи аминокислоты в диапазоне удлинений X, Y и/или 15 Z, если X, Y и/или Z представляют собой пептиды или белки.
Кроме того, также возможно присоединение заместителя к линкеру L1 или L2. В таком случае, при рефолдинге белковой наночастицы, обладающей способностью самосборки, заместитель будет расположен во внутренней полости такой самоорганизующейся 20 белковой наночастицы.
Тенденция к образованию олигомеров означает, что такие белки могут образовывать олигомеры в зависимости от условий, к примеру, при условиях денатурации они представляют собой мономеры, в то время как при физиологических условиях они могут
25 образовывать, к примеру, димеры, тримеры, тетрамеры или пентамеры. В соответствии с заранее определенными условиями они принимают одно единственное состояние олигомеризации, которое является необходимым для образования наночастиц. Тем не менее, их состояние олигомеризации можно изменять при изменяющихся условиях, к примеру, от димеров до тримеров при увеличении концентрации соли (Burkhard Р. и др.,
30 Protein Science 2000, 9:2294-2301) или от пентамеров к мономерам при понижении значения рН.
Архитектура строительного блока согласно Формуле (la), (lb) или (II) явно отличается от вирусных капсидных белков. Вирусные капсиды состоят либо из одного единственного
белка, который образует 60 олигомеров или числа ему кратного, как, к примеру, частицы вируса гепатита В (ЕР 1 262 555, ЕР 0 201 416), или более, чем их одного белка, который подвергается процессу совместной сборки с образованием структуры вирусного капсида, который может принимать и другие геометрические формы, отличные от икосаэдра в 5 зависимости от типа вируса (Fender Р. и др., Nature Biotechnology 1997, 15:52-56). Белковые наночастицы, обладающие способностью самосборки (SAPN), согласно настоящему изобретению также явно отличаются от вирусоподобных частиц, так как они (а) сконструированы из других белков, отличных от вирусных капсидных белков, и (б) полость в середине наночастицы слишком мала для того, чтобы разместить ДНК/РНК полного 10 вирусного генома.
Домены олигомеризации белка хорошо известны (Burkhard Р. И др., Trends Cell Biol 2001, 11:82-88). База данных структуры белка RCSB-PDB (http://www.rcsb.org/) содержит атомные структуры белков. Данный веб-сайт предлагает инструменты для идентификации
15 белковых олигомеров среди таких атомных структур. Применение режима расширенного поиска (http://www.rsb.org/pdb/search/advSearch.do) с классификатором "А5" в "Protein Stoichiometry" выгружает пентамерные домены олигомеризации белка. Применение режима расширенного поиска с классификатором "Coiled coil proteins" в "SCOP classification Browser" выгружает суперспиральные домены олигомеризации белка.
20 Объединение двух режимов поиска выгружает все пентамерные суперспиральные белковые структуры в базе данных. Точно так же, димерные, тримерные или тетрамерные суперспиральные структуры можно получить, применяя соответственно "А2", "A3" или "А4" в качестве классификаторов. В настоящем изобретении домены олигомеризации ND1, ND2, ND3 и ND4 предпочтительно представляют собой суперспиральные домены.
25 Суперспираль представляет собой белковую последовательность с непрерывной структурой в основном гидрофобных остатков с интервалом в 3 и 4 остатка, обычно в последовательности из семи аминокислот (гептадный повтор) или одиннадцати аминокислот (ундекадный повтор), которая организуется (сворачивается) для образования мультимерной группы спиралей. Также предполагаются суперспирали с
30 последовательностями, включающими некоторые неравномерное распределение расположенных 3 и 4 остатков. Гидрофобные остатки представляют собой в частности гидрофобные аминокислоты Val, De, Leu, Met, Туг, Phe и Тф. В основном гидрофобный означает, что по меньшей мере 50% остатков должны быть выбраны из указанных гидрофобных аминокислот.
К примеру, в предпочтительном мономерном строительном блоке согласно Формуле (1а), (lb) или (II), ND1, ND2, ND3 и ND4 представляют собой белки любой из Формул
5 [aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)]x (Ша),
[aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)]x (ШЬ),
[aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)]x (Шс),
[aa(d)-aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)]x (Hid),
[aa(e)-aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)]x (Ше),
10 [aa(f)-aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)]x (ПН),
[aa(g)-aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-aa(f)]x (IHg),
при этом aa означает аминокислоту или ее производное, аа(а), aa(b), аа(с), aa(d), аа(е), aa(f) и aa(g) являются одинаковыми или различными аминокислотами или их производными, 15 предпочтительно аа(а) и aa(d) являются одинаковыми или различными гидрофобными аминокислотами или их производными; и х представляет собой число между 2 и 20, предпочтительно между 3 и 10.
Гептад представляет собой гептапептид согласно Формуле aa(a)-aa(b)-aa(c)-aa(d)-aa(e)-20 aa(f)-aa(g) (Ша) или любую из его перестановок согласно Формулам (П1Ь) до (Illg).
Предпочтительными являются мономерные строительные блоки согласно Формуле (1а), (lb) или (II), при этом все домены олигомеризации белка ND1, ND2, ND3 и ND4 представляют собой
(1) белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом х равен 3, а аа(а) и aa(d) выбраны из 20 природных a-L-аминокислот таким образом, чтобы сумма баллов из Таблицы 1 для данных 6 аминокислот составляла по меньшей мере 14, и такие белки, содержащие вплоть до 17 дополнительных гептадов; или
(2) белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом х равен 3, а аа(а) и aa(d) выбраны из 20 природных a-L-аминокислот таким образом, чтобы сумма баллов из Таблицы 1 для данных 6 аминокислот составляла по меньшей мере 12 при условии, что одна аминокислота аа(а) представляет собой заряженную аминокислоту, способную
(2)
образовывать внутриспиральный солевой мостик к аминокислоте aa(d) или aa(g) соседнего гептада, или что одна аминокислота aa(d) представляет собой заряженную аминокислоту, способную образовывать внутриспиральный солевой мостик к аминокислоте аа(а) или аа(е) соседнего гептада, и такие белки, содержащие вплоть до двух дополнительных гептадов. 5 Заряженная аминокислота, способная образовывать внутриспиральный солевой мостик к аминокислоте соседнего гептада, представляет собой, к примеру, Asp или Glu, если другая аминокислота представляет собой Lys, Arg или His, или наоборот.
Кроме того, предпочтительными являются мономерные строительные блоки согласно Формуле (la), (lb) или (II), при этом один или более доменов олигомеризации белка ND1, ND2, ND3 или ND4 выбраны из следующих предпочтительных белков:
(11) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) выбран из Val, Не, Leu и Met и их производных, и aa(d) выбран из Leu, Met, Val и He и их производных.
5 (12) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом один аа(а) представляет собой Asn и другие аа(а) выбраны из Asn, Не и Leu, и aa(d) представляет собой Leu. Такой белок обычно представляет собой домен димеризации.
(13) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) и aa(d) оба представляют
10 собой Leu или оба Не. Такой белок обычно представляет собой домен тримеризации.
(14) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) и aa(d) оба представляют
собой Тгр. Такой белок обычно представляет собой домен пентамеризации.
15 (15) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) и aa(d) оба представляют собой Phe. Такой белок обычно представляет собой домен тетрамеризации.
(16) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) и aa(d) оба представляют собой либо Тгр, либо Phe. Такой белок обычно представляет собой домен пентамеризации.
(17) Белок согласно любой из Формул (Ша) до (Illg), при этом аа(а) представляет собой либо Leu, либо Не, и один aa(d) представляет собой Gin, и другие aa(d) выбраны из Gin, Leu и Met. Такой белок обладает способностью представлять собой домен пентамеризации.
25 Другие предпочтительные белки представляют собой белки (1), (2), (11), (12), (13), (14),
(15) , (16) и (17) как определено в настоящей заявке выше, и при этом также
(21) по меньшей мере один aa(g) выбран из Asp и Glu и аа(е) в следующем гептаде
представляет собой Lys, Arg или His; и/или
(22) по меньшей мере один aa(g) выбран из Lys, Arg и His, и аа(е) в следующем гептаде
представляет собой Asp или Glu, и/или
(23) по меньшей мере один aa(g) выбран из Lys, Arg и His, и аа(а до g) с интервалом 3 или 4 аминокислоты в последовательности представляет собой Asp или Glu. Такие пары аминокислот аа(а до g) представляют собой, к примеру, аа(Ь) и аа(е) или aa(f).
5 Программы прогнозирования суперспиралей, такие как PCOILS (http://toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils; Gruber М.В. и др., J. Struct. Biol. 2006, 155(2): 140-5) или MULTICOIL (http://groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi-bin/multicoil.cgi) могут прогнозировать, какие белковые последовательности образуют суперспираль. Таким образом, в мономерном строительном блоке согласно Формуле (la), (lb), или (II) ND1, ND2, 10 ND3 и ND4 представляют собой белки, которые содержат по крайней мере последовательность длиной в два гептад-повтора, которую прогнозируют при помощи программы прогнозирования суперспиралей PCOILS для образования суперспирали с вероятностью более, чем 0,9 для всех ее аминокислот с по меньшей мере с размерами одного из окон в 14, 21, или 28.
В более предпочтительном мономерном строительном блоке согласно Формуле (la), (lb) или (II), ND1, ND2, ND3 и ND4 представляют собой белки, которые содержат по меньшей мере одну последовательность длиной в три гептад-повтора, которую прогнозируют при помощи программы прогнозирования суперспиралей PCOILS для образования 20 суперспирали с вероятностью более, чем 0,9 для всех ее аминокислот с по меньшей мере с размерами одного из окон в 14, 21, или 28.
Известные суперспиральные последовательности можно получить из банков данных, таких как банк данных белков RCSB (http://www.rcsb.org).
Наиболее предпочтительными являются суперспиральные последовательности и мономерные строительные блоки, описанные в примерах.
В еще одном предпочтительном варианте реализации один домен олигомеризации ND1, 30 ND2, ND3 или ND4 представляет собой домен тримеризации (фолдон) белка фибритина бактериофага Т4 (Tao, Y. и др., Structure 1997, 5:789-798.) или его производное. Данный домен тримеризации имеет последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ Ш №: 3). Небольшие модификации данного домена также предусмотрены.
Белковые наночастицы, обладающиеспособностъю самосборки: НОК единицы
Белковые наночастицы, обладающие способностью самосборки (SAPN), образуются из мономерных строительных блоков согласно Формуле (la), (lb) или смеси мономерных 5 строительных блоков согласно Формуле (1а) или (lb) с мономерными строительными блоками согласно Формуле (II). Если собираются такие строительные блоки, они образуют так называемые НОК (LCM) единицы. Число мономерных строительных блоков, которые будут собираться в такую НОК единицу, будет определяться наименьшим общим кратным (НОК). Следовательно, если, к примеру, домены олигомеризации мономерного 10 строительного блока образуют пентамер (NDl)s (m = 5) и димер (ND2)2 (п = 2), то 10 мономеров будут образовывать НОК единицу. Если линкерный сегмент L обладает приемлемой длиной, данная НОК единица может собраться в виде сферической белковой наночастицы.
15 Белковые наночастицы, обладающей способностью самосборки (SAPN), могут самоорганизовываться посредством сборки только одной или более одной НОК единиц (Таблица 2). Такие SAPN представляют собой топологически замкнутые структуры.
Правильные многогранники
Существует пять правильных многогранников, тетраэдр, куб, октаэдр, додекаэдр и икосаэдр. Они обладают различными элементами внутренней вращательной симметрии. Тетраэдр обладает одной осью второго порядка и двумя осями третьего порядка, куб и октаэдр обладают осями вращательной симметрии второго, третьего и четвертого порядка,
25 додекаэдр и икосаэдр обладают осями вращательной симметрии второго, третьего и пятого порядка. В кубе пространственная ориентация этих осей является точно такой же, как и в октаэдре, и также в додекаэдре и икосаэдре пространственная ориентация данных осей относительно друг друга является в точности одинаковой. Следовательно, для целей SAPN согласно настоящему изобретению додекаэдр и икосаэдр можно рассматривать как будучи
30 идентичными. Додекаэдр/икосаэдр построен из 60 идентичных трехмерных строительных блоков (Таблица 2). Данные строительные блоки являются асимметричными единицами (AUs) многогранника. Они представляют собой пирамиды и грани пирамиды соотносятся с одной из осей вращательной симметрии, следовательно, данные AUs будут нести на своих гранях элементы симметрии второго, третьего и пятого порядка. Если данные элементы
симметрии образуются из доменов олигомеризации белка, то такие AUs конструируются из мономерных строительных блоков, как описано выше. Достаточно выравнить два домена олигомеризации ND1 и ND2, или ND3 и ND4 вдоль двух осей симметрии AU. Если два данных домена олигомеризации образуют стабильные олигомеры, то будет автоматически 5 образовываться граница раздела симметрии вдоль третьей оси симметрии, и ее можно стабилизировать посредством оптимизации взаимодействий вдоль данной границы раздела, к примеру, гидрофобных, гидрофильных или ионных взаимодействий, или ковалентных связей, таких как дисульфидные мостики.
10 Таблица 2: Возможные комбинации состояний олигомеризации в формировании
правильных многогранников
многогранника
Для получения самоорганизующихся белковых наночастиц (SAPN) с правильной геометрией (додекаэдр, икосаэдр, октаэдр, куб), требуется более одной НОК единицы. К примеру, чтобы образовать икосаэдр из мономера, содержащего тримерные и пентамерные домены олигомеризации, требуется 4 НОК единицы, каждая из которых состоит из 15 20 мономерных строительных блоков, т.е. белковая наночастица с правильной геометрией будет состоять из 60 мономерных строительных блоков. В Таблице 2 перечислены необходимые комбинации состояний олигомеризации двух доменов олигомеризации и количества НОК единиц для формирования двух возможных многогранников.
Будут ли НОК единицы также подвергаться сборке с образованием правильного многогранника, состоящего из более одной НОК единицы, зависит от геометрического расположения двух доменов олигомеризации ND1 и ND2 или ND3 и ND4 по отношению друг к другу, особенно от угла между осями вращательной симметрией двух доменов 5 олигомеризации. В основном данный процесс управляется посредством i) взаимодействия между соседними доменами в наночастице, ii) длины линкерного сегмента L, ш) формы индивидуальных доменов олигомеризации. Данный угол больше в НОК единицах по сравнению с размещением в правильном многограннике. Кроме того, данный угол не идентичен в мономерных строительных блоках в отличие от правильного многогранника.
10 Если этот угол ограничен меньшими значениями правильного многогранника (с помощью привлекательных гидрофобных, гидрофильных или ионных взаимодействий, или ковалентного дисульфидного мостика между двумя доменами олигомеризации) и линкерный сегмента L является достаточно коротким, то данное число НОК единиц, каждая из которых содержит определенное количество мономерных строительных блоков, будет
15 далее дополнительно отжигаться для того, чтобы образовать правильный многогранник (Таблица 2), или включать больше мономерных строительных блоков для образования наночастиц, у которых отсутствует строгая внутренняя симметрия многогранника.
Если угол между двумя доменами олигомеризации достаточно мал (даже меньше, чем в 20 правильном многограннике с икосаэдрической симметрией), тогда большое количество (несколько сотен) белковых цепей могут организовываться в белковую наночастицу. При такой конструкции SAPN может обладать молекулярной массой, соответствующей нескольким 60 белковым цепям архитектуры аналогичной той, что описывает теория квазиэквивалентности или мозаичная теория вирусных капсидов для "всех пентамерных" 25 вирусных архитектур.
Предпочтительно, чтобы антигены, которые состоят из флагеллин-содержащих наночастиц, могли представлять собой или В-клеточные эпитопы и/или Т-клеточные эпитопы, и быть выбранными из группы, состоящей из (а) белков или пептидов, 30 подходящих для индуцирования иммунной реакции против раковых клеток; (б) белков, пептидов или углеводов, подходящих для индуцирования иммунной реакции против инфекционных заболеваний; (в) белков или пептидов, подходящих для индуцирования иммунной реакции против аллергенов; (г) белковых или пептидных гормонов, подходящих для индуцирования иммунной реакции для лечения заболевания человека; и (д) молекул
гаптенов, подходящих для индуцирования иммунной реакции для лечения зависимостей или других расстройств. Белковые наночастицы, содержащие такие белки, их пептидные фрагменты, пептиды, углеводы или гаптены могут являться подходящими для индуцирования иммунной реакции у людей, или также у сельскохозяйственных и 5 домашних животных.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к мономерным строительным блокам согласно Формуле (1а) или (lb), как определено выше.
10 В ином аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей белковую наночастицу как описано в настоящем описании. Такая композиция является особенно подходящей в качестве вакцины. Предпочтительные вакцинные композиции содержат белковую наночастицу в водном буферном растворе и могут дополнительно содержать, к примеру, вспомогательные вещества, полученные из Сахаров (такие как глицерол,
15 трегалоза, сахароза или подобные им) или вспомогательные вещества, полученные из аминокислот (такие как аргинин, пролин, глутамат или подобные им), или анионные, катионные, неионные или твиттер-ионные детергенты (такие как холат, дезоксихолат, твин или подобные им), или любой вид соли (такой как NaCl, MgCh или подобные им) для регуляции ионной силы раствора.
В другом своем аспекте настоящее изобретение относится к способу вакцинации человека или животного, не являющегося человеком, который включает введение эффективного количества белковой наночастицы, как представлено в настоящем описании выше, субъекту, нуждающемуся в такой вакцинации.
Разработка FLA-SAPN (флагеллина, содержащего самоорганизующуюся белковую наночастицу)
Конкретный пример FLA-SAPN согласно настоящего изобретения представляет собой 30 следующие конструкции "FLA-SAPN-la" и "FLA-SAPN-2".
Т81C-WRW-8RRVRA-D0-D1 (FLJB_SALTY)(FLA-SAPN-1 а) в соответствии с Формулой (1а)
MGHHHHHHASWRWDGGLWRGSWQTWNARWDQWSNDWNAWRSDWQAWR
DDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERR
LEELERRIEEIARGMAQViNTNSLSLLTQNNLNKSQ S ALGTAIERLS SGLRINS AKD
DAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQ
5 S ANSTNSQ SDLD SIQ AEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQ VGANDG
ETroroLKQINSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDL GAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLA QANQVPQNVLSLLR (SEQ Ш №:4)
10 T81C-WRW-8RRVRA-T1BT* (FLA-SAPN-2) в соответствии с Формулой (II)
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWR SDWQAWRDDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTL RVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ ID №: 5)
Для облегчения процесса очистки FLA-SPAN-la начинается с последовательности X как определено в Формуле (1а) или (lb):
MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGS (SEQ Ш №:6)
которая содержит гистидиновую метку для никелевой аффиной очистки и сайты рестрикции на уровне ДНК для дальнейшего субклонирования (Ncol, Ndel, BamHI).
Для ND1 был выбран домен пентамеризации (т=5). Конкретная пентаметрическая суперспираль представляет собой новейшую модицикацию типтофан-зипперного домена петнамеризации (Liu J. и др., Proc Natl Acad Sci U S А 2004; 101(46): 16156-61, pdb-entry 1T8Z).
Исходный триптофан-зипперный домен пентамеризации имеет последовательность
S SNAKWDQWS SDWQTWN AKWDQWSND WNAWRSDWQ AWKDDWARWNQR
WDNWAT
(SEQ ID №: 12).
Модифицированная суперспиральная последовательность домена пентамеризации, применяемая для FLA-SAPN-1а, начинается в положении 13, заканчивается в положении 49 и содержит незначительные вариации в С-концевой области (RALWM вместо NQRWD), но сохраняя структуру гептадного повтора остатков триптофана как в исходной последовательности (SEQ Ш N0: 12).
13 -WQTWNARWDQW SND WNAWRSDWQ AWRDDW ARWRALWM-49 (SEQ ID
№:7).
Далее данную последовательность удлиняют посредством короткого линкера LI (GG) из двух остатков глицина, далее соединяют с доменом тримеризации ND2 следующей последовательности, которая представляет собой чрезвычайно устойчивый суперспиральный тример:
RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG
(SEQID№:8)
Было показано, что тример образуется даже при условиях полной денатурации ДСН-ПААГ-электрофореза (Фигура 5). Он также содержит pan-DR-связывающий HTL-эпитоп строки RFVAAWTLRVRA, который является производным от последовательности PADRE с оптимизированной тримерной суперспиральной предрасположенностью.
В FLA-SAPN-la участок "FLA" согласно Формуле la состоит из доменов DO и Dl флагеллина Salmonella typhimurium (как в патенте США № 8420102) со следующей последовательностью
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRiNSAKDDAAGQAIANRFT 5 ANKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLD SIQAEITQRLNEroRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETIDIDLKQiNSQ TLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAIT NLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLS LLR (SEQ Ш №:9)
Такая конструкция далее приводит к следующей последовательности, которую применяли для экспрессии белков, очистки и проведения биофизических анализов
MGHHHHHHASWRWDGGLWRGSWQTWNARWDQWSND WNAWRSDWQ AWR DDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERR
15 LEELERRIEEIARGMAQ VINTNSLSLLTQNNLNKSQ S ALGTAIERLS SGLRINS AKD
DAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQ S ANSTNSQ SDLD SIQAEITQRLNEroRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDG ETIDIDLKQiNSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDL GAVQNRFNSAITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLA
20 QANQVPQNVLSLLR (SEQ Ш №:4)
Модель мономера FLA-SAPN-la представлена на Фигуре 1С. Соответствующая конструкция "FLA-SAPN-2" представляет собой следующее:
Для облегчения процесса очистки FLA-SAPN-2 начинается с последовательности Y как определено в Формуле (II)
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGS (SEQ ID №:10) которая содержит гистидиновую метку для никелевой аффиной очистки, 30 последовательность Т-клеточного эпитопа Т1ВТ* (Calvo-Calle J.M., Infection and immunity 2006:6929-6939) из циркумспорозитного белка CS из Plasmodium falciparum
EYLNKIQNSLSTEWSPSSVT (SEQ ГО №:13)
с одним цистеином, замененным на серии, и сайты рестрикции на уровне ДНК для дальнейшего субклонирования (Ncol, Ndel, BamHI) и, следовательно, несколько отличается от "X" в FL-SPAN-la.
5 ND3 в FLA-SPAN-2 полностью идентичен ND1 в FLA-SAPN-1а для обеспечения надлежащей совместной сборки. 13-WQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWKDDWARWRALWM-49 (SEQ ID №:7).
Далее данную последовательность удлиняют посредством короткого линкера L2 (GG) из 10 двух остатков глицина, который также идентичен FLA-SAPN-1а.
Далее в FLA-SAPN-2 линкер соединяют с доменом тримеризации ND4 в следующей последовательности
RLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERRLEELERRIEEIARG 15 (SEQID№:8)
которая является в точности одинаковой, как и в FLA-SAPN-1а, следовательно, кора ND1-L1-ND2 и ND3-L2-ND4 и наночастиц FlA-SAPN-la и FLA-SAPN-2 являются полностью идентичными и обеспечивают надлежащую совместную сборку двух белковых цепей после рефолдинга.
В FLA-SAPN-2 участок "Z" согласно Формуле (II) состоит из повторяющейся области циркумспорозоитного белка (CSP) Plasmodium falciparum, которая содержит три повтора фосфатазы N-ацетилнеураминовой кислоты (NANP) и некоторые их модификации (DPNANPNVDPNANPNV, SEQ Ш №: 14), которые обнаруживают в нативной 25 последовательности циркумспорозитного белка, и представляет собой В-клеточный эпитоп, к которому должна быть выработана иммунная реакция. Он связан с частицей посредством последовательности SG:
SGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ Ш №: 11)
30 Такая конструкция далее приводит к следующей последовательности, которую применяли для экспрессии белков, очистки и проведения биофизических анализов:
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWR SDWQ AWRDDW ARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTL
RVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ ID №: 5)
Модель мономера FLA-SAPN-2 представлена на фигуре 1С.
Модель наночастицы, совместно собранной из FLA-SAPN-la и FLA-SAPN-2 в соотношении 1:59 представлена на Фигуре 1С, предполагая Т=1 икосаэдрическую симметрию.
10 ЕМ-изображение совместно собранных белков FLA-SAPN-la и FLA-SAPN-2 в соотношении 48:12 представлено на Фигуре 4.
Примеры
15 Пример 1 - Клонирование
ДНК, кодирующие конструкции наночастиц, были получены с применением стандартных
методик молекулярной биологии. Плазмиды, содержащие ДНК, кодирующую белковую
последовательность LONG-D2-D1 -ori
20 MGHHHHHHASWRWDGGLWRGSWQTWNARWDQWSND WNAWRSDWQ AWR
DDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERR LEELERRIEEIARGSGSSARLSDLEANNAVKGESKITVNGAEYTANATGDKITLAG KTMFroKTASGVSTLINEDAAAAKKSTANPLASroSALSKVDAVRSSLGAIQNRF DSAIGSRNANDGISIAQTTEGALNErNNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLKSIQDE 25 IQQRLEEroRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGANDGETITroLQKroVKSLGL DGFNVNGPKEATVGDLKSSFKNVTGYDTYAAGADKYRVDINSGAV (SEQ Ш №:15)
были сконструированы посредством клонирования в сайты рестрикции NcoI/EcoRI 30 основной конструкции экспрессии SAPN согласно Фигуре 3.
Для данной конструкции не существует этапа смешивания/совместной сборки различных конструкций. Иммуноген вакцины будет получен посредством ковалентного присоединения эпитопов вакцины, таких как никотин, на носитель с уже включенным в 35 него производным флагеллина, предпочтительно на остатки лизина.
Данная конструкция состоит из пентамерного суперспирального триптофанового зиппера (ND1), присоединенного посредством двух остатков глицина (GG) к самостоятельно сконструированной тримерной суперспирали (ND2), которая содержит panDR-5 связывающий эпитоп CD4 строки ERFVAAWTLRVRAL (SEQ ГО №:16). На N-конце она содержит гистидиновую метку и сайт расщепления тромбина (X). Архитектура кора данного X - ND1 - LI - ND2 подробно описана выше. На С-конец прикрепляют флагеллиновую конструкцию (FLA), состоящую из доменов Din D2 флагеллина Salmonella из структуры с PDB-кодом 3V47 (банк данных белка RCSB). Остатки от 348 до 447,
10 перекрывающие участки доменов D1 и D2, связывают с остатками 24 до 214, снова охватывающими участки Din D2 в противоположном направлении с помощью одиночного остатка глицина. Данная конструкция скрепляет молекулы флагеллина D1 и D2 с наночастицами таким образом, что домен D1 располагается на внешней поверхности наночастицы, и TLRS-связывающий сайт подвергается воздействию на поверхности
15 наночастицы (Фигура 2а). В отличие от Фигуры 2, самостоятельно сконструированная суперспираль ND2 представляет собой тримерную суперспираль.
Пример 2 - Экспрессия
20 Плазмиды трансформировали в клетки кишечной палочки BL21 (DE3), которые выращивали в бульоне Луриа с ампициллином при 37 °С. Экспрессию индуцировали изопропил-рГО-тиогалакто-пиранозидом. Через четыре часа после индукции, клетки убирали с 37 °С и проводили их сбор при помощи центрифугирования при 4000 х g в течение 15 мин. Клеточный осадок хранили при -20 °С. Осадок оттаивали на льду и
25 суспендировали в буфере для лизиса, состоящего из 9 М мочевины, 100 мМ №ШР04, 10 мМ Трис рН 8, 20 мМ имидазола и 0,2 мМ трис-2-карбоксиэтилфосфина (ТСЕР).
В качестве альтернативы другие клеточные линии также можно применять для экспрессии, такие как клетки KRX. В клетках KRX экспрессию можно осуществлять с протоколом 30 ранней аутоиндукции клеток KRX с применением предварительной ночной культуры при 37 градусах с ампициллином (100 мкг/мл) и глюкозой (0,4%). Проводили разбавление предварительных ночных культур в соотношении 1:100 в культуре для экспрессии, содержащей ампициллин (100 мкг/мл), глюкозу (0,05%) и рамнозу (0,1%) при 25 °С в течение 24 часов. Уровень экспрессии белка оценивали при помощи электрофореза с
додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ-электрофореза), как представлено на Фигуре 5. Конструкция образует мономеры, тримеры и тетрамеры даже в условиях денатурации при ДСН-ПААГ-электрофорезе.
5 Пример 3 - Очистка
Лизис клеток проводили посредством разрушения их ультразвуком и лизат очищали при помощи центрифугирования при 30500 х g в течение 45 мин. Очищенный лизат инкубировали с Ni-NTA агарозными гранулами (Qiagen, Valencia, СА, USA) в течение по
10 меньшей мере 1 часа. Колонку промывали лизирующим буфером, а затем буфером, содержащим 9 М мочевины, 500 мМ NaH2P04, 10 мМ Трис рН 8, 20 мМ имидазола и 0,2 мМ ТСЕР. Белок элюировали с градиентом рН: 9 М мочевины, 100 мМ NaH2P04, 20 мМ цитрата, 20 мМ имидазола и 0,2 мМ ТСЕР. Последующие промывки проводили при рН 6,3, 5,9 и 4,5. Последующий градиента рН, градиент лизирующего буфера, увеличивающего
15 эффективность действия имидазола, применяли для дальнейшего элюирования белка. Чистоту оценивали при помощи электрофореза с додецилсульфатом натрия в полиакриламидном геле (ДСН-ПААГ-электрофореза) как представлено на Фигуре 5.
Пример 4 - Рефолдинг
Для рефолдинга белок ребуферизовали при следующих условиях: 9 М мочевины, 20 мМ Трис рН 8,5, 50 мМ NaCl, 5% глицерина, 2 мМ ЭДТА. Для быстрого рефолдинга первого скриннинга 4 мкл раствора с концентрацией 1,8 мг/мл добавляли к буферному раствору как представлено в Таблице 3 до конечной концентрации 0,05 мг/мл. Далее проводили анализ 25 раствора при помощи негативной контрастирующей просвечивающей электронной микроскопии при различных разрешениях.
8,5
8,5
150
MES = 2-морфолиноэтансульфоновая кислота
HEPES = 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-ил]этансульфоновая кислота TRIS = 2-амино-2-гидроксиметил-пропан-1,3-диол
При необходимости можно осуществить дополнительные скриннинги для оптимизации условий проведения рефолдинга с меньшими объемами выборки для рН и ионной силы. Кроме того, можно добавлять вспомогательные вещества, такие как трегалоза, сахароза, аргинин, пролин или другие, или при необходимости можно добавлять детергенты, такие 10 как холат, дезоксихолат, Твин-80 или другие. Для LONG-D2-D 1-ori никакой дополнительной оптимизации рефолдинга не требуется, и условия для рефолдинга представляли собой рН 8,5, 50 мМ NaCl, 20 мМ Трис, 5% глицерина. ЕМ-изображения LONG-D2-D 1-ori после рефолдинга при разных разрешениях демонстрируют хорошее образование наночастиц (Фигура 6).
Пример 5-1 исследование пути активации TLR5
Агонистическую активность LONG-D2-D 1-ori на Toll-подобном рецепторе 5 (TLR5) исследовали, применяя клетки TLR5/SEAPorter НЕК 293 (IMGENEX, Cat. No. ML-105) и
20 оценивали ECso активного LONG-D2-D 1-ori. Клеточную линию ML-105 высевали в 96-луночные планшеты в количестве 5 х 104 клеток на лунку в течение 16 часов. Клетки обрабатывали различными концентрациями (от 0,01 до 1000 нг/мл) каждого испытуемого образца, положительным контролем (флагеллин MGENEX, Cat. No. MG-2205) или контрольным растворителем (каждым соответствующим буфером) в двух параллелях в
25 течение 24 часов. Далее среду для культивирования клеток из каждой лунки разводили в соотношении 1:2 и переносили в 96-луночные микротитрационные планшеты в двух параллелях, в которые также в двух параллелях добавляли серийно разведенные стандарты секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP). Чашки инкубировали при 65 °С в течение 30 мин для инактивации любой эндогенной щелочной фосфатазы. Далее субстрат фосфатазы
30 добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Планшеты анализировали посредством считывания при 405 нм и оценки чувствительной к дозе активности и оценки подготовленной ЕС50 (Фигура 7А).
Агонистическая активность TLR5 была умеренно высокой с расчетным значением ЕС50 12,59 нг/мл в сравнении с 0,29 нг/мл положительного контроля флагеллина из Salmonella typhimurium.
Пример 6 - II исследование пути активации TLR5
Соединение согласно Формуле (1а), обозначаемое T81c-WRW-8RRVRA-D0-Dl (FLJBSALTY):
10 MGHHHHHHASWRWDGGLVPRGSWQTWNARWDQWSND WNAWRSDWQ AWR
DDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTLRVRALERR LEELERRIEEIARGMAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQ S ALGTAIERLS SGLRINS AKD DAAGQAIANRFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQ SANSTNSQSDLD SIQ AEITQRLNEroRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQ VGANDG
15 ETIDIDLKQiNSQTLGLD SLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDL
GAVQNRFNSAITOLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLA QANQVPQNVLSLLR (SEQ Ш №:4)
Соединение согласно Формуле (II), обозначаемое T81c-WRW-8RRVRA-T1BT* (FLA-20 SAPN-2):
MGHHHHHHASEYLNKIQNSLSTEWSPSSVTGSWQTWNARWDQWSNDWNAWR SDWQ AWRDDW ARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELERRLEELERFVAAWTL RVRALERRLEELERRIEEIARGSGDPNANPNVDPNANPNVNANPNANPNANP (SEQ ID №: 5)
Две данные совместно собранные цепи подробно описаны выше. Архитектура кора ND1 -LI - ND2, которая является одинаковой в обеих Формулах (1а) и (II), т.е. такой же, как у ND3 - L2 - ND4, является такой же, как и в Примере 1. В цепи 1 (Формула 1а) участок FLA состоит из доменов флагеллина DO и Dl, однако от другого штамма, нежели чем в Примере 30 1. Заместители Y и Z в цепи 2 представляют собой Т-клеточный эпитоп Т1ВТ* и последовательность длиной в 28 остатков из области повтора NANP циркумспорозитного белка из Plasmodium falciparum в качестве В-клеточного эпитопа.
Клонирование, экспрессия, очистка и рефолдинг двух цепей по существу соответствует протоколам, описанным в Примерах 1, 2, 3 и 4. Условиями для рефолдинга данных совместно собранных наночастиц являются рН 7,5, 50 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 5 % глицерина. ЕМ-изображение совместно собранных наночастиц представлено на Фигуре 4А.
Оценку чувствительной к дозе активности как агониста TLR5 и оценку ЕС50 проводили в соответствии с протоколом, описанным в Пример 5. Активность агониста TLR5 была очень высокой с рассчитанным значением ЕС50 всего лишь в 0,0901 нг/мл в сравнении с 0,29 нг/мл положительного контроля флагеллина из Salmonella Typhimurium (Фигура 7В).
10 Следовательно, данные наночастицы индуцируют очень сильную активацию TLR5, которая примерно в три раза сильнее, чем у природного флагеллина, даже несмотря на то, что флагеллин-содержащие цепи присутствуют только при мольном соотношении в 12:48. Кривая дозовой активности оказывается колоколообразной кривой, следовательно, при более высокой концентрации флагеллина иммунная реакция снижается. Оптимальная
15 концентрация находится около уровня в 50 нг/мл.
Пример 7 - III исследование пути активации TLR5
Соединение согласно Формуле (1а), обозначаемое PD52-2i88-PANDORA-D2-D 1-ori:
MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLT WKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGS SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFroRTASGVSTLI NEDAAAARRSTANPLASroSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAIGSKNANDGISIAQ TTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQDEIQQRLEEIDRVSNQTQF NGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITroLQKroVKSLGLDGFNVNGPREATVGDL RSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV (SEQ Ш №:17)
Соединение согласно Формуле (II), обозначаемое PD52-2i88-PANDORA-Noro:
MGHHHHHHASGSWEKWNAKWDEWKNDWNDWRRDWQAWVDDWAYWTLT 30 WKYGELYSKLAELERRNEELERRLEELARFVAALSMRLAELERRNEELARGSGS TVEQKTRPFTLPNLPLSSLSNSRAPLPISSMGISPDNVQSVQFQNGRCTLDGRLVG TTPVSLSHVAKIRGTSNGTVINLTELDGTPFHPFEGPAPIGFPDLGGCDWHINMTQ FGHSSQTQYDVDTTPDTFVPHLGSIQANGIGSGNYVGVLSWISPPSHPSGSQVDL WKIPNYGSSITEATHLAPSVYPPGFGEVLVFFMSKMPGPGAYNLPCLLPQEYISHL
ASEQAPTVGEAALLHYVDPDTGRNLGEFKAYPDGFLTCVPNGASSGPQQLPING VFVFVSWVSRFYQLKPVGTAS (SEQ ID №: 18)
Две данные совместно собранные цепи PD52-2i88-PANDORA-D2-D 1-ori и PD52-2i88-5 PANDORA-Noro обладают одинаковой архитектурой кора в обеих Формулах (1а) и (II), т.е. ND1 - LI - ND2 является таким же, как и ND3 - L2 - NEW. В PD52-2i88-PANDORA-D2-Dl-Ori (Формула la) участок FLA состоит из доменов флагеллина D2 и D1. Домен олигомеризации ND2 (или ND4 соответственно) конструируют для образования димерной суперспирали. Это важно в связи с тем, что В-клеточный эпитоп (Z), также как и форма 10 флагеллина (FLA), оба представляют собой димерные белки. Соотношение совместной сборки составляет 5:55.
Заместители Y и Z в PD52-2i88-PANDORA-Noro (Формула II) представляют собой гистидиновую метку и последовательность длиной в 298 остатков из Р-белка норовируса,
15 связанную с ND4 посредством линкера GSGS соответственно. Данная последовательность соответствует Р2-субдомену норовируса Hu/1968/US (Jiang X. и др., Virology 1993; 195(1):51-61) с соответствующим кодом pdb-ввода 1ШМ для рентгеновской кристаллической структуры. Она содержит остатки 223 до 520, которые представляют собой домен Р (у которого отсутствует 10 С-концевых остатков 521-530, так как 10 данных
20 остатков разупорядочены в рентгеновской кристаллической структуре и являются в значительной степени положительно заряженными) плюс 3 аминокислоты С-концевой области домена S согласно номенклатуре, представленной Prasad B.V. V. и др., Science 1999; 286:287-290. Остаток треонина 223 тщательно выбирали при помощи программ компьютерной визуализации для того, чтобы он служил точкой присоединения к пого-
25 SAPN, потому как она представляет собой наиболее близкую точку соприкосновения между участками поперек оси второго порядка в кристаллической структуре вирусного капсида.
Клонирование, экспрессия, очистка и рефолдинг двух цепей по существу соответствуют протоколам, описанным в Примерах 1, 2, 3 и 4. Условиями для рефолдинга данных 30 совместно собранных наночастиц являются рН 6,8 80 мМ NaCl, 20 мМ MES, 5 % глицерина. ЕМ-изображение совместно собранных наночастиц (в соотношении 5:55) представлено на Фигуре 4С.
Оценку чувствительной к дозе активности как агониста TLR5 и оценку ЕС50 проводили согласно протоколу, описанному в Примере 5. Активность агониста TLR5 была умеренно высокой с рассчитанным значением ЕС50 всего лишь 17,66 нг/мл в сравнении с 0,29 нг/мл положительного контроля флагеллина из Salmonella Typhimurium (Фигура 1С).
Пример 8 - Иммуногенность I
Соединение согласно Формуле (1а), обозначаемое T81c-8-D0-Dl (Eurogentec 0):
MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWK DDWARWRALWMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRR RLEELARGNTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRiNSAKDDAAGQAIAN RFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQS DLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETroiDLKQI NSQTLGLDGGENPLQKroAALAQVDTLRSDLGAVQNRFNSAITOLGNTVNNLTS VRSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQN (SEQ Ш №:19)
Соединение согласно Формуле (II), обозначаемое T81c-8-Pf:
MGHHHHHHASWKWDGGLVPRGSWQTWNAKWDQWSNDWNAWRSDWQAWK
DDWARLRALLMGGRLLLRLEELERRLEELAKFVAAWTLKAAAVDLELAALRRR
20 LEELARGGSGANANPNANPNANPNANP (SEQ ID №:20)
Две данные совместно собранные цепи являются подобными тем, которые описаны в Примере 6. Там отсутствует Т-клеточный эпитоп Т1ВТ* в Y, и В-клеточный эпитоп из области повторения CS белка из Plasmodium falciparum в Z имеет длину всего лишь в 16
25 остатков. Тримерная суперспираль (ND2 и ND4) содержит panDR-связывающий эпитоп PADRE. В цепи 1 (Формула 1а) участок FLA состоит из доменов флагеллина DO (остатки от 6 до 171) и D1 (остатки от 229 до 312), однако из фазы I варианта С150 среднего домена флагеллина Salmonella enterica подвида enterica serovar Typhimurium, который опять-таки представляет собой иной штамм, нежели чем в примерах 1 и 6. DO и Dl соединяют при
30 помощи двух остатков глицина.
Клонирование, экспрессия, очистка и рефолдинг двух цепей по существу соответствуют протоколам, описанным в Примерах 1, 2, 3 и 4. Условиями для рефолдинга данного типа совместно собранных наночастиц являются рН 8,5, 50 мМ NaCl, 20 мМ Трис, 5 %
глицерина. ЕМ-изображение совместно собранных наночастиц в соотношении 3:57 представлено на Фигуре 4В.
Иммунизацию групп из семи мышей С 57В1/6 осуществляли внутрибрюшинно либо 10 мкг, 5 либо 1 мкг тремя инъекциями каждые две недели. Иммуногены представляли собой либо только T81c-8-Pf (Формула II), либо совместную сборку T81c-8-D0-Dl (Формула 1а) и Т81с-8-Pf (Формула II) в двух различных соотношениях совместной сборки 3:57 и 9:51. Другими словами - предполагая Т1-икосаэдрическую симметрию наночастиц - присутствовали три различных иммуногена, которые содержали либо ноль, либо три, либо девять молекул D0-
10 D1 на наночастицу. Титр антител после третьей инъекции определяли при помощи ИФА, что представлено на Фигуре 8А. Предполагали предельное значение параметра иммунной реакции с 1 мкг при соотношении совместной сборки в 3:57 (что соответствует в общей сложности примерно 20 нг флагеллина), повышающее титр антител примерно в девять раз по сравнению с наночастицами без доменов D0-D1. Доза выше 10 мкг при соотношении
15 совместной сборки в 9:51 (что соответствует в общей сложности приблизительно 2 мкг флагеллина) фактически несколько снижает иммунную реакцию по сравнению с наночастицами без доменов D0-D1.
Пример 9 - Иммуногенность II
Соединение согласно Формуле (1а), обозначаемое DIM-D0-D1 (Eurogentec 1):
MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATW MGGRLL SRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERL AQF VRAL SMQN AELERRLEEL ARGMAQVWmSLSLLTQNNLNKSQSALGTAffiRLSSGLRWSAKDDAAGQAIAN
25 RFTANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELAVQSANSTNSQS DLDSIQAEITQRLNEIDRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETroroLKQI NSQTLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKIDAALAQVDALRSDLGAVQNRFNS AITNLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQN VLSLLR
30 (SEQIT> №:21)
Соединение согласно Формуле (II), обозначаемое DFM-D2-Dl-tip3_NIC-pept:
MGHHHHHHASGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWARWRATW MGGRLL SRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERL AQF VRAL SMQN AELERRLEEL
ARGSGSSARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFroRTAS
GVSTLINEDAAAARRSTANPLASroSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDG
KDDKDSKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGTNSDSDLRSIQD
EIQQRLEEroRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITroLQKroVKSLG
5 LDGFNVNGPREAT VGDLRS SFRNVTGYDT Y AAGADRYRVDrNS GAV (SEQ Ш
№:22)
Согласно Примеру 5 и Примеру 6 производное флагеллина скорее всего будет более
иммуногенным в форме D0-D1, чем в форме D2-D1. Поэтому форму D0-D1 можно 10 применять в качестве агониста TLR5 для повышения иммуногенности иммуногена,
который несет форму D2-D1 флагеллина. Следовательно, в данном примере
последовательность D0-D1
MAQVINTNSLSLLTQNNLNKSQSALGTAIERLSSGLRiNSAKDDAAGQAIANRFT ANIKGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEiNNNLQRVRELAVQSANSTNSQSDLD 15 SIQAEITQRLNEroRVSGQTQFNGVKVLAQDNTLTIQVGANDGETroroLKQINSQ TLGLDSLNVHGAPVDPASPWTENPLQKroAALAQVDALRSDLGAVQNRFNSAIT NLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLAQANQVPQNVLS LLR (SEQ Ш №:23)
20 соответствует "FLA" в Формуле (la), в то время как последовательность D2-Dl-tip3
SARLSDLEANNAVRGESKITVNGAEYTANATGDRITLAGRTMFroRTASGVSTLI NEDAAAARRSTANPLASroSALSRVDAVRSSLGAIQNRFDSAKAKKKDGKDDKD SKNANDGISIAQTTEGALNEINNNLQRVRELSVQATNGmSDSDLRSIQDEIQQRL EEroRVSNQTQFNGVKVLSQDNQMKIQVGAKDGETITroLQKroVKSLGLDGFNV
25 NGPREATVGDLRSSFRNVTGYDTYAAGADRYRVDINSGAV (SEQ Ш №:24)
соответствует "Z" в Формуле (II). Данная последовательность "Z" в D2-Dl-tip3 представляет собой модификацию флагеллина, в котором домен D2 скомбинирован с доменом D1 флагеллина как это описано выше. Кроме того, белковую подложку D2-D1-30 Tip3 применяют в качестве носителя для отображения антигена никотина. Для того, чтобы допустить ковалентное связывание активированного никотина с белковой подложкой, боковые цепи лизина, которые не экспонированы на поверхность, подвергают мутированию до аргининов, в то время как аргинины, которые экспонированы на поверхность, подвергают мутированию до лизинов. После ковалентного присоединения
активированного никотина к первичным аминам белковой последовательности, далее никотин располагается на поверхности наночастицы. Более того, для того, чтобы расположить молекулы никотина на внешней поверхности наночастиц, белок D2-D1 осуществляет перенос так называемой последовательности "tip3" KAKKKDGKDDKD (SEQ 5 Ш №: 25) на наиболее экспонированный участок молекулы (рис 2А), которая содержит высокую плотность лизинов, следовательно, ковалентное связывание никотина с боковыми цепями лизина будет обеспечивать то, что молекулы никотина с высокой плотностью располагаются на поверхности наночастицы.
Кор DIM-D0-D1 и DIM-D2-Dl-tip3_NIC-pept (т.е. ND1-L1-ND2 и ND3-L2-ND4) является идентичным, и, в частности, домены олигомеризации ND2 и ND4 соответственно сконструированы для образования димерных суперспиралей. Это позволяет располагать молекулу флагеллина (в любой форме) в качестве димера, готового взаимодействовать с димерным TL5-рецептором (Фигура 2В).
Клонирование, экспрессия, очистка и рефолдинг двух цепей по существу соответсвует протоколам, описанным в Примерах 1, 2, 3 и 4. Условиями для рефолдинга для данного типа совместно собранных наночастиц являются рН 7,0, 50 мМ NaCl, 20 мМ HEPES, 5 % глицерина. ЕМ-изображение совместно собранных наночастиц в соотношении 5:55 представлено на Фигуре 4D.
Иммунизацию групп из семи мышей C57BI/6 осуществляли внутрибрюшинно 10 мкг в трех инъекциях каждые две недели. Иммуногены представляли собой либо совместную сборку DFM-D0-D1 (Формула 1а) и DFM-D2-Dl-tip3_NIC-pept (Формула II) в соотношении 25 совместной сборки 5:55, либо стандартный носитель гемоцианин фиссуреллы (KLH), к которому прикрепляли аналогичную активированную молекулу никотина. KLH представляет собой большой, мультисубъединичный, переносящий кислород металлопротеин, обнаруживаемый в гемолимфе Megathura crenulatau часто применяемый в качестве носителя для антигенов в экспериментах по иммунизации. Титр антител после 30 третьей инъекции определяли при помощи ИФА, что представлено на Фигуре 8В. Титр антител наночастиц иммуногена данного типа с TLR5-aroHHCTOM значительно увеличен по сравнению с титром стандартного носителя KLH, располагающего тот же самый антиген (никотин) на своей поверхности.
Пример 10 - Иммуногенность III
Соединение согласно Формуле (1а), обозначаемое DEDDL:
MGDKHHHHHHKDGSDKGSWEEWNARWDEWENDWNDWREDWQAWRDDWA
5 RWRATWMGGRLLSRLERLERRNEELRRLLQLLRNRLERLAQFVRALSMQNAEL
ERREEELARGMAQVWmSLSLLTQNNLNRSQSALGTAffiRLSSGLRWSARDDA
AGQAIANRFTANIRGLTQASRNANDGISIAQTTEGALNEiNNNLQRVRELAVQSA
NSmSQSDLDSIQAEITQRLNEroRVSGQTQFNGVRVLAQDNTLTIQVGANDGETI
DroLRQINSQTLGLDQLNVQQKYKDGDKGDDKTENPLQRroAALAQVDALRSDL
10 GAVQNRFNS AimLGNTVNNLSEARSRIEDSDYATEVSNMSRAQILQQAGTSVLA
QANQVPQNVLSLLR (SEQ Ш №:26)
Данная белковая цепь наночастицы содержит такой же "FLA" модифицированный домен из фазы I варианта С150 среднего домена флагеллина Salmonella enterica подвида enterica 15 serovar Typhimurium, как и в Примере 8. Все остатки лизина в данной последовательности заменяют на аргинин. Домены DO и D1 соединяют посредством аминокислотной последовательностью KYKDGDKGDDK (SEQ Ш №: 1), которая содержит четыре лизина в качестве связующих сайтов для ковалентного присоединения молекул.
20 Тримерная суперспираль (ND2) содержит panDR-связывающую последовательность ELRRLLQLLRNRLERL AQF VRAL SMQN A (SEQ Ш №:27). Заместитель "X" содержит гистидиновую метку шести аминокислот и трех остатков лизина, примерно равномерно распределенных по всей последовательности для ковалентного присоединения молекул. N-конец также является подходящим для ковалентного присоединения, например, при
25 помощи химии сложного эфира N-гидроксисукцинимида (НГС).
Клонирование, экспрессия и очистка белковой цепи по существу соответствует протоколам, описанным в Примерах 1, 2 и 3.
30 Предварительно до замены буфера для реакции связывания, объединенные фракции элюции из аффинной очистки инкубировали с 5 мМ ЭДТА по меньшей мере в течение часа для связывания в хелатный комплекс любых возможных выщелоченных ионов никеля. Далее буфер заменяли, применяя обессоливающую колонку HiPrep 26/10. Колонку уравновешивали следующим связывающим буфером: 6 М гуанидингидрохлорида, 150 мМ
NaCl, 20 мМ HEPES рН 7,2 в объеме пяти колонок с последующим связыванием образца в колонке. Стадию элюирования проводили связующим буфером в объеме двух колонок.
Связывание НГС-никотина (N-гидроксисукцинимидный эфир никотиновой кислоты) 5 проводили в мольном соотношении 1:50 (DEDDL : НГС-никотин) с 11,1 мг белка (2,5 мл объема), что соответствует 0,24 мкмоль белка. НГС-никотин (5 мг) растворяли в 150 мкл 100% ДМСО, что соответсвует 12,8 мкмоль. Для 50-кратного молярного избытка НГС-никотина, добавляли к белку 141 мкл данного раствора НГС-никотина, что соответствует 12 мкмоль. Реакцию связывания инкубировали в течение 3-х часов в темноте (покрывали 10 алюминиевой фольгой) и перемешивали при помощи магнитной мешалки.
На следующем этапе замены буфера для того, чтобы удалить несвязанный НГС-никотин и заменить буфер на буфер предварительного рефолдинга, заполненную колонку PD minitrap G-25 применяли для ребуферизации в следующих условиях: 8 М мочевины, 20 мМ Трис рН 15 8,5, 150 мМ NaCl и 10% трегалозы.
Рефолдинг белковой цепи по существу соответствует протоколу, описанному в Примере 4. В частности, 8 мг связанного белка Nic-DEDDL (белок DEDDL, соединенный с никотином, 2,4 мл белкового раствора 3,35 мг/мл) по каплям добавляли к 158,4 мл буфера рефолдинга 20 (20 мМ HEPES рН 7,0, 150 мМ NaCl, 10% трегалозы) при перемешивании. Добивались конечной концентрации белка в 0,05 мг/мл. Реакцию рефолдинга проводили в течение 10 минут общего времени. Наночастицы Nic-DEDDL после рефолдинга представлены на Фигуре 9.
25 Иммунизацию групп из трех 6 мышей C57BI/6 осуществляли подкожно либо 10 мкг Nic-DEDDL, либо 10 мкг Nic-KLH (никотин, соединенный с гемоцианином фиссуреллы) в качестве положительного контроля в трех инъекций каждая с недельным перерывом. Титр антител в нулевой день (т.е. до первой инъекции) и далее неделю спустя после каждой инъекции (день 7, 14 и 21) определяли при помощи ИФА, что представлено на Фигуре 10.
30 Данные эксперименты показывают высокую иммуногенность Nic-DEDDL с более чем 30-кратно лучшей индукцией антител по сравнению с Nic-KLH. Пиковые значения только после 3 вакцинаций находятся в титрах, близких к 163840.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Альфа-O Пептиде АГ
<12 0> Флагеллин-содержащие белковые наночастицы в качестве платформы для вакцины
<130> P3091PC00 <160> 32
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция <400> 1
Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Lys Gly Asp Asp Lys
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Lys Leu Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Lys
1 5 10
<210> 3 <211> 27 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 3
Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln Ala Tyr Val Arg Lys
1 5 10 15
Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 20 25
<210> 4
<211> 392
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Met Gly His His His His His His Ala Ser Trp Arg Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Trp Gln Thr Trp Asn Ala Arg Trp Asp Gln
20 25 30
Trp Ser Asn Asp Trp Asn Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Arg
35 40 45
Asp Asp Trp Ala Arg Trp Arg Ala Leu Trp Met Gly Gly Arg Leu Leu
50 55 60
Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg
65 70 75 80
Leu Glu Glu Leu Glu Arg Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Arg Val Arg
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Ile Glu Glu Ile
100 105 110
Ala Arg Gly Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu
115 120 125
Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile
130 135 140
Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala
145 150 155 160
Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu
165 170 175
Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr
180 185 190
Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg
195 200 205
Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu
210 215 220
Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg
225 230 235 240
Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp
245 250 255
Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp
260 265 270
Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Ser Leu
275 280 285
Asn Val His Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala Ser Pro Trp Thr Glu Asn
290 295 300
Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg
305 310 315 320
Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn
325 330 335
Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu
340 345 350
Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile
355 360 365
Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro
370 375 380
Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg
385 390
<210> 5
<211> 155
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 5
Met Gly His His His His His His Ala Ser Glu Tyr Leu Asn Lys Ile
1 5 10 15
Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ser Ser Val Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Gln Thr Trp Asn Ala Arg Trp Asp Gln Trp Ser Asn Asp Trp Asn
35 40 45
Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Arg Asp Asp Trp Ala Arg Trp
50 55 60
Arg Ala Leu Trp Met Gly Gly Arg Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu
65 70 75 80
Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg
85 90 95
Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Arg Val Arg Ala Leu Glu Arg Arg Leu
100 105 110
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Ile Glu Glu Ile Ala Arg Gly Ser Gly Asp
115 120 125
Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asn
130 135 140
Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
145 150 155
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 6
Met Gly His His His His His His Ala Ser Trp Arg Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser 20
<210> 7 <211> 37 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 7
Trp Gln Thr Trp Asn Ala Arg Trp Asp Gln Trp Ser Asn Asp Trp Asn
1 5 10 15
Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Arg Asp Asp Trp Ala Arg Trp
20 25 30
Arg Ala Leu Trp Met
<210> 8
<211> 54
<212> PRT
/01 Оч Т/Г
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 8
Arg Leu Leu Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu
1 5 10 15
Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu
20 25 30
Arg Val Arg Ala Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Ile
35 40 45
Glu Glu Ile Ala Arg Gly
<213> Искусственная последовательность
<223> Синтетическая конструкция <400> 9
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100
105
110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Ser Leu Asn Val His
165 170 175
Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala Ser Pro Trp Thr Glu Asn Pro Leu Gln
180 185 190
Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu
195 200 205
Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn
210 215 220
Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln
245 250 255
Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val
260 265 270
Leu Ser Leu Leu Arg
275
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 10
Met Gly His His His His His His Ala Ser Glu Tyr Leu Asn Lys Ile
1 5 10 15
Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Ser Ser Val Thr Gly Ser
20 25 30
<210> 11
<211> 30
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 11
Ser Gly Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro
1 5 10 15
Asn Val Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
20 25 30
<210> 12
<211> 53
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 12
Ser Ser Asn Ala Lys Trp Asp Gln Trp Ser Ser Asp Trp Gln Thr Trp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Trp Asp Gln Trp Ser Asn Asp Trp Asn Ala Trp Arg Ser
20 25 30
Asp Trp Gln Ala Trp Lys Asp Asp Trp Ala Arg Trp Asn Gln Arg Trp
35 40 45
Asp Asn Trp Ala Thr 50
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 13
Glu Tyr Leu Asn Lys Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro
1 5 10 15
Ser Ser Val Thr 20
<210> 14
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 14
Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Val
1 5 10 15
<210> 15
<211> 368
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 15
Met Gly His His His His His His Ala Ser Trp Arg Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Trp Gln Thr Trp Asn Ala Arg Trp Asp Gln
20 25 30
Trp Ser Asn Asp Trp Asn Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Arg
35 40 45
Asp Asp Trp Ala Arg Trp Arg Ala Leu Trp Met Gly Gly Arg Leu Leu
50 55 60
Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg
65 70 75 80
Leu Glu Glu Leu Glu Arg Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Arg Val Arg
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Ile Glu Glu Ile
100 105 110
Ala Arg Gly Ser Gly Ser Ser Ala Arg Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asn
115 120 125
Asn Ala Val Lys Gly Glu Ser Lys Ile Thr Val Asn Gly Ala Glu Tyr
130 135 140
Thr Ala Asn Ala Thr Gly Asp Lys Ile Thr Leu Ala Gly Lys Thr Met
145 150 155 160
Phe Ile Asp Lys Thr Ala Ser Gly Val Ser Thr Leu Ile Asn Glu Asp
165 170 175
Ala Ala Ala Ala Lys Lys Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp
180 185 190
Ser Ala Leu Ser Lys Val Asp Ala Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile
195 200 205
Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Gly Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn
225 230 235 240
Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr
245 250 255
Asn Ser Asp Ser Asp Leu Lys Ser Ile Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg
260 265 270
Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val
275 280 285
Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Asn
290 295 300
Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser
305 310 315 320
Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Gly Pro Lys Glu Ala Thr Val
325 330 335
Gly Asp Leu Lys Ser Ser Phe Lys Asn Val Thr Gly Tyr Asp Thr Tyr
340 345 350
Ala Ala Gly Ala Asp Lys Tyr Arg Val Asp Ile Asn Ser Gly Ala Val
355 360 365
<210> 16
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 16
Glu Arg Phe Val Ala Ala Trp Thr Leu Arg Val Arg Ala Leu
1 5 10
<210> 17
<211> 351
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
Met Gly His His His His His His Ala Ser Gly Ser Trp Glu Lys Trp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Trp Asp Glu Trp Lys Asn Asp Trp Asn Asp Trp Arg Arg
20 25 30
Asp Trp Gln Ala Trp Val Asp Asp Trp Ala Tyr Trp Thr Leu Thr Trp
35 40 45
Lys Tyr Gly Glu Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Phe Val Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ser Met Arg Leu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Asn Glu Glu Leu Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Gly Ser Ser Ala Arg Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asn Asn
100 105 110
Ala Val Arg Gly Glu Ser Lys Ile Thr Val Asn Gly Ala Glu Tyr Thr
115 120 125
Ala Asn Ala Thr Gly Asp Arg Ile Thr Leu Ala Gly Arg Thr Met Phe
130 135 140
Ile Asp Arg Thr Ala Ser Gly Val Ser Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala
145 150 155 160
Ala Ala Ala Arg Arg Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser
165 170 175
Ala Leu Ser Arg Val Asp Ala Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln
180 185 190
Asn Arg Phe Asp Ser Ala Ile Gly Ser Lys Asn Ala Asn Asp Gly Ile
195 200 205
Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn
210 215 220
Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr Asn
225 230 235 240
Ser Asp Ser Asp Leu Arg Ser Ile Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg Leu
245 250 255
Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys
260 265 270
Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Lys Asp
275 280 285
Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser Leu
290 295 300
Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Gly Pro Arg Glu Ala Thr Val Gly
305 310 315 320
Asp Leu Arg Ser Ser Phe Arg Asn Val Thr Gly Tyr Asp Thr Tyr Ala
325 330 335
Ala Gly Ala Asp Arg Tyr Arg Val Asp Ile Asn Ser Gly Ala Val
340 345 350
<210> 18
<211> 399
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 18
Met Gly His His His His His His Ala Ser Gly Ser Trp Glu Lys Trp
1 5 10 15
Asn Ala Lys Trp Asp Glu Trp Lys Asn Asp Trp Asn Asp Trp Arg Arg
20 25 30
Asp Trp Gln Ala Trp Val Asp Asp Trp Ala Tyr Trp Thr Leu Thr Trp
35 40 45
Lys Tyr Gly Glu Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Phe Val Ala Ala
65 70 75 80
Leu Ser Met Arg Leu Ala Glu Leu Glu Arg Arg Asn Glu Glu Leu Ala
85 90 95
Arg Gly Ser Gly Ser Thr Val Glu Gln Lys Thr Arg Pro Phe Thr Leu
100 105 110
Pro Asn Leu Pro Leu Ser Ser Leu Ser Asn Ser Arg Ala Pro Leu Pro
115 120 125
Ile Ser Ser Met Gly Ile Ser Pro Asp Asn Val Gln Ser Val Gln Phe
130 135 140
Gln Asn Gly Arg Cys Thr Leu Asp Gly Arg Leu Val Gly Thr Thr Pro
145 150 155 160
Val Ser Leu Ser His Val Ala Lys Ile Arg Gly Thr Ser Asn Gly Thr
165 170 175
Val Ile Asn Leu Thr Glu Leu Asp Gly Thr Pro Phe His Pro Phe Glu
180 185 190
Gly Pro Ala Pro Ile Gly Phe Pro Asp Leu Gly Gly Cys Asp Trp His
195 200 205
Ile Asn Met Thr Gln Phe Gly His Ser Ser Gln Thr Gln Tyr Asp Val
210 215 220
Asp Thr Thr Pro Asp Thr Phe Val Pro His Leu Gly Ser Ile Gln Ala
225 230 235 240
Asn Gly Ile Gly Ser Gly Asn Tyr Val Gly Val Leu Ser Trp Ile Ser
245 250 255
Pro Pro Ser His Pro Ser Gly Ser Gln Val Asp Leu Trp Lys Ile Pro
260 265 270
Asn Tyr Gly Ser Ser Ile Thr Glu Ala Thr His Leu Ala Pro Ser Val
275 280 285
Tyr Pro Pro Gly Phe Gly Glu Val Leu Val Phe Phe Met Ser Lys Met
290 295 300
Pro Gly Pro Gly Ala Tyr Asn Leu Pro Cys Leu Leu Pro Gln Glu Tyr
305 310 315 320
Ile Ser His Leu Ala Ser Glu Gln Ala Pro Thr Val Gly Glu Ala Ala
325 330 335
Leu Leu His Tyr Val Asp Pro Asp Thr Gly Arg Asn Leu Gly Glu Phe
340 345 350
Lys Ala Tyr Pro Asp Gly Phe Leu Thr Cys Val Pro Asn Gly Ala Ser
355 360 365
Ser Gly Pro Gln Gln Leu Pro Ile Asn Gly Val Phe Val Phe Val Ser
370 375 380
Trp Val Ser Arg Phe Tyr Gln Leu Lys Pro Val Gly Thr Ala Ser
385 390 395
<210> 19
<211> 360
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 19
Met Gly His His His His His His Ala Ser Trp Lys Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Trp Gln Thr Trp Asn Ala Lys Trp Asp Gln
20 25 30
Trp Ser Asn Asp Trp Asn Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Lys
35 40 45
Asp Asp Trp Ala Arg Trp Arg Ala Leu Trp Met Gly Gly Arg Leu Leu
50 55 60
Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys Phe
65 70 75 80
Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu Ala
85 90 95
Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Asn Thr Asn Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu
115 120 125
Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala
130 135 140
Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn
145
150
155
160
Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser
165 170 175
Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu
180 185 190
Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser
195 200 205
Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn
210 215 220
Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val
225 230 235 240
Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly
245 250 255
Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly
260 265 270
Leu Asp Gly Gly Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala
275 280 285
Gln Val Asp Thr Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe
290 295 300
Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Thr Ser
305 310 315 320
Val Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn
325 330 335
Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala
340 345 350
Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn 355 360
<210> 20
<211> 128
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400>
Met Gly His His His His His His Ala Ser Trp Lys Trp Asp Gly Gly
1 5 10 15
Leu Val Pro Arg Gly Ser Trp Gln Thr Trp Asn Ala Lys Trp Asp Gln
20 25 30
Trp Ser Asn Asp Trp Asn Ala Trp Arg Ser Asp Trp Gln Ala Trp Lys
35 40 45
Asp Asp Trp Ala Arg Leu Arg Ala Leu Leu Met Gly Gly Arg Leu Leu
50 55 60
Leu Arg Leu Glu Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Lys Phe
65 70 75 80
Val Ala Ala Trp Thr Leu Lys Ala Ala Ala Val Asp Leu Glu Leu Ala
85 90 95
Ala Leu Arg Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Gly Ser Gly Ala
100 105 110
Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro
115 120 125
<210> 21 <211> 382
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 21
Met Gly His His His His His His Ala Ser Gly Ser Trp Glu Glu Trp
1 5 10 15
Asn Ala Arg Trp Asp Glu Trp Glu Asn Asp Trp Asn Asp Trp Arg Glu
20 25 30
Asp Trp Gln Ala Trp Arg Asp Asp Trp Ala Arg Trp Arg Ala Thr Trp
35 40 45
Met Gly Gly Arg Leu Leu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Leu Arg Arg Leu Leu Gln Leu Leu Arg Asn Arg Leu Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ala Gln Phe Val Arg Ala Leu Ser Met Gln Asn Ala Glu Leu Glu
85 90 95
Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Met Ala Gln Val Ile Asn Thr
100 105 110
Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser
115 120 125
Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn
130 135 140
Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr
145 150 155 160
Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly
165 170 175
Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn
180 185 190
Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr
195 200 205
Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg
210 215 220
Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val
225 230 235 240
Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn
245 250 255
Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr
260 265 270
Leu Gly Leu Asp Ser Leu Asn Val His Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala
275 280 285
Ser Pro Trp Thr Glu Asn Pro Leu Gln Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala
290 295 300
Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe
305 310 315 320
Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu
325 330 335
Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn
340
345
350
Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala
355 360 365
Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg
370 375 380
<210> 22
<211> 368
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 22
Met Gly His His His His His His Ala Ser Gly Ser Trp Glu Glu Trp
1 5 10 15
Asn Ala Arg Trp Asp Glu Trp Glu Asn Asp Trp Asn Asp Trp Arg Glu
20 25 30
Asp Trp Gln Ala Trp Arg Asp Asp Trp Ala Arg Trp Arg Ala Thr Trp
35 40 45
Met Gly Gly Arg Leu Leu Ser Arg Leu Glu Arg Leu Glu Arg Arg Asn
50 55 60
Glu Glu Leu Arg Arg Leu Leu Gln Leu Leu Arg Asn Arg Leu Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ala Gln Phe Val Arg Ala Leu Ser Met Gln Asn Ala Glu Leu Glu
85 90 95
Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Ser Gly Ser Ser Ala Arg Leu
100 105 110
Ser Asp Leu Glu Ala Asn Asn Ala Val Arg Gly Glu Ser Lys Ile Thr
115 120 125
Val Asn Gly Ala Glu Tyr Thr Ala Asn Ala Thr Gly Asp Arg Ile Thr
130 135 140
Leu Ala Gly Arg Thr Met Phe Ile Asp Arg Thr Ala Ser Gly Val Ser
145 150 155 160
Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Arg Ser Thr Ala Asn
165 170 175
Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Arg Val Asp Ala Val Arg
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser Ala Lys Ala Lys
195 200 205
Lys Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp Ser Lys Asn Ala Asn Asp Gly
210 215 220
Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn
225 230 235 240
Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala Thr Asn Gly Thr
245 250 255
Asn Ser Asp Ser Asp Leu Arg Ser Ile Gln Asp Glu Ile Gln Gln Arg
260 265 270
Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val
275 280 285
Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln Val Gly Ala Lys
290 295 300
Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile Asp Val Lys Ser
305 310 315 320
Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Gly Pro Arg Glu Ala Thr Val
325 330 335
Gly Asp Leu Arg Ser Ser Phe Arg Asn Val Thr Gly Tyr Asp Thr Tyr
340 345 350
Ala Ala Gly Ala Asp Arg Tyr Arg Val Asp Ile Asn Ser Gly Ala Val
355 360 365
<210> 23
<211> 277
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 23
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Lys Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Lys Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Lys Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Lys Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Ser Leu Asn Val His
165 170 175
Gly Ala Pro Val Asp Pro Ala Ser Pro Trp Thr Glu Asn Pro Leu Gln
180 185 190
Lys Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp Leu
195 200 205
Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly Asn
210 215 220
Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser Asp
225 230 235 240
Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln Gln
245 250 255
Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn Val
260 265 270
Leu Ser Leu Leu Arg
<210> 24
<211> 260
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 24
Ser Ala Arg Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asn Asn Ala Val Arg Gly Glu
1 5 10 15
Ser Lys Ile Thr Val Asn Gly Ala Glu Tyr Thr Ala Asn Ala Thr Gly
20 25 30
Asp Arg Ile Thr Leu Ala Gly Arg Thr Met Phe Ile Asp Arg Thr Ala
35 40 45
Ser Gly Val Ser Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Arg
50 55 60
Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Arg Val
65 70 75 80
Asp Ala Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser
85 90 95
Ala Lys Ala Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp Ser Lys Asn
100 105 110
Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn
115 120 125
Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala
130 135 140
Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Arg Ser Ile Gln Asp Glu
145 150 155 160
Ile Gln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln
165 170 175
Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln
180 185 190
Val Gly Ala Lys Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile
195 200 205
Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Gly Pro Arg
210 215 220
Glu Ala Thr Val Gly Asp Leu Arg Ser Ser Phe Arg Asn Val Thr Gly
225 230 235 240
Tyr Asp Thr Tyr Ala Ala Gly Ala Asp Arg Tyr Arg Val Asp Ile Asn
245 250 255
Ser Gly Ala Val
260
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 25
Lys Ala Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp
1 5 10
<210> 26
<211> 390
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 26
Met Gly Asp Lys His His His His His His Lys Asp Gly Ser Asp Lys
1 5 10 15
Gly Ser Trp Glu Glu Trp Asn Ala Arg Trp Asp Glu Trp Glu Asn Asp
20 25 30
Trp Asn Asp Trp Arg Glu Asp Trp Gln Ala Trp Arg Asp Asp Trp Ala
35 40 45
Arg Trp Arg Ala Thr Trp Met Gly Gly Arg Leu Leu Ser Arg Leu Glu
50 55 60
Arg Leu Glu Arg Arg Asn Glu Glu Leu Arg Arg Leu Leu Gln Leu Leu
65 70 75 80
Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu Ala Gln Phe Val Arg Ala Leu Ser Met
85 90 95
Gln Asn Ala Glu Leu Glu Arg Arg Leu Glu Glu Leu Ala Arg Gly Met
100 105 110
Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn Asn
115 120 125
Leu Asn Arg Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu Ser
130 135 140
Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Arg Asp Asp Ala Ala Gly Gln Ala
145 150 155 160
Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Arg Gly Leu Thr Gln Ala Ser
165 170 175
Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala
180 185 190
Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala Val
195 200 205
Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile Gln
210 215 220
Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly Gln
225 230 235 240
Thr Gln Phe Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu Thr
245 250 255
Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu Arg
260 265 270
Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Gln Leu Asn Val Gln Gln
275 280 285
Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Lys Gly Asp Asp Lys Thr Glu Asn Pro Leu
290 295 300
Gln Arg Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser Asp
305 310 315 320
Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu Gly
325 330 335
Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp Ser
340 345 350
Asp Туг Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu Gln
355 360 365
Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln Asn
370 375 380
Val Leu Ser Leu Leu Arg 385 390
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 27
Glu Leu Arg Arg Leu Leu Gln Leu Leu Arg Asn Arg Leu Glu Arg Leu
1 5 10 15
Ala Gln Phe Val Arg Ala Leu Ser Met Gln Asn Ala 20 25
<210> 28
<211> 279
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 28
Met Ala Gln Val Ile Asn Thr Asn Ser Leu Ser Leu Leu Thr Gln Asn
1 5 10 15
Asn Leu Asn Arg Ser Gln Ser Ala Leu Gly Thr Ala Ile Glu Arg Leu
20 25 30
Ser Ser Gly Leu Arg Ile Asn Ser Ala Arg Asp Asp Ala Ala Gly Gln
35 40 45
Ala Ile Ala Asn Arg Phe Thr Ala Asn Ile Arg Gly Leu Thr Gln Ala
50 55 60
Ser Arg Asn Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly
65 70 75 80
Ala Leu Asn Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ala
85 90 95
Val Gln Ser Ala Asn Ser Thr Asn Ser Gln Ser Asp Leu Asp Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Glu Ile Thr Gln Arg Leu Asn Glu Ile Asp Arg Val Ser Gly
115 120 125
Gln Thr Gln Phe Asn Gly Val Arg Val Leu Ala Gln Asp Asn Thr Leu
130 135 140
Thr Ile Gln Val Gly Ala Asn Asp Gly Glu Thr Ile Asp Ile Asp Leu
145 150 155 160
Arg Gln Ile Asn Ser Gln Thr Leu Gly Leu Asp Gln Leu Asn Val Gln
165 170 175
Gln Lys Tyr Lys Asp Gly Asp Lys Gly Asp Asp Lys Thr Glu Asn Pro
180 185 190
Leu Gln Arg Ile Asp Ala Ala Leu Ala Gln Val Asp Ala Leu Arg Ser
195 200 205
Asp Leu Gly Ala Val Gln Asn Arg Phe Asn Ser Ala Ile Thr Asn Leu
210 215 220
Gly Asn Thr Val Asn Asn Leu Ser Glu Ala Arg Ser Arg Ile Glu Asp
225 230 235 240
Ser Asp Tyr Ala Thr Glu Val Ser Asn Met Ser Arg Ala Gln Ile Leu
245 250 255
Gln Gln Ala Gly Thr Ser Val Leu Ala Gln Ala Asn Gln Val Pro Gln
260 265 270
Asn Val Leu Ser Leu Leu Arg
Искусственная последовательность
275
<223>
Синтетическая конструкция
<400>
Lys Ala Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 260
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 30
Ser Ala Arg Leu Ser Asp Leu Glu Ala Asn Asn Ala Val Arg Gly Glu
1 5 10 15
Ser Lys Ile Thr Val Asn Gly Ala Glu Tyr Thr Ala Asn Ala Thr Gly
20 25 30
Asp Arg Ile Thr Leu Ala Gly Arg Thr Met Phe Ile Asp Arg Thr Ala
35 40 45
Ser Gly Val Ser Thr Leu Ile Asn Glu Asp Ala Ala Ala Ala Arg Arg
50 55 60
Ser Thr Ala Asn Pro Leu Ala Ser Ile Asp Ser Ala Leu Ser Arg Val
65 70 75 80
Asp Ala Val Arg Ser Ser Leu Gly Ala Ile Gln Asn Arg Phe Asp Ser
85 90 95
Ala Lys Ala Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Asp Lys Asp Ser Lys Asn
100 105 110
Ala Asn Asp Gly Ile Ser Ile Ala Gln Thr Thr Glu Gly Ala Leu Asn
115 120 125
Glu Ile Asn Asn Asn Leu Gln Arg Val Arg Glu Leu Ser Val Gln Ala
130 135 140
Thr Asn Gly Thr Asn Ser Asp Ser Asp Leu Arg Ser Ile Gln Asp Glu
145 150 155 160
Ile Gln Gln Arg Leu Glu Glu Ile Asp Arg Val Ser Asn Gln Thr Gln
165 170 175
Phe Asn Gly Val Lys Val Leu Ser Gln Asp Asn Gln Met Lys Ile Gln
180 185 190
Val Gly Ala Lys Asp Gly Glu Thr Ile Thr Ile Asp Leu Gln Lys Ile
195 200 205
Asp Val Lys Ser Leu Gly Leu Asp Gly Phe Asn Val Asn Gly Pro Arg
210 215 220
Glu Ala Thr Val Gly Asp Leu Arg Ser Ser Phe Arg Asn Val Thr Gly
225 230 235 240
Tyr Asp Thr Tyr Ala Ala Gly Ala Asp Arg Tyr Arg Val Asp Ile Asn
245 250 255
Ser Gly Ala Val 260
<210> <211> <212>
PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 31
Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Ser 1 5
<210> 32
<211> 14
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 32
Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Lys Asp Gly Ser
1 5 10
Формула изобретения
1. Белковая наночастица, обладающая способностью самосборки, которая состоит из агрегатов множества строительных блоков Формулы (1а) или (lb)
X - ND1 - LI - ND2 - FLA (la) или FLA-ND1 - LI - ND2 - X(Ib),
состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND1, линкер L1, домен олигомеризации белка ND2, производное флагеллина FLA и дополнительный заместитель X, при этом:
ND1 представляет собой белок, который образует олигомеры (NDl)m из m субъединиц ND1, ND2 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND2)n из п субъединиц ND2, каждое тип представляет собой число от 2 до 10 при условии, что m не равно п и не кратно п, и п не кратно т,
L1 представляет собой связь или короткий гибкий линкер,
FLA представляет собой флагеллин или производное флагеллина, у которого отсутствуют части последовательности аминокислот флагеллина и/или у которого от 1 до 20 аминокислот, заменены другими аминокислотами, и/или дополнительно содержащее антиген, связанный непосредственно или связанный через линкер, содержащий от 1 до 20 аминокислот;
X отсутствует или представляет собой последовательность пептида или белка, содержащую от 1 до 1000 аминокислот;
необязательно собранную совместно с множеством строительных блоков Формулы (II),
Y-ND3-L2-ND4-Z (II),
состоящих из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND3, линкер L2, домен олигомеризации белка ND4 и дополнительные заместители Y и Z, при этом: ND3 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND3)y из у субъединиц ND3, ND4 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND4)Z из z субъединиц ND4, каждое у и z представляет собой число от 2 до 10 при условии, что у не равно z и не крано z, и z не кратно у, и при этом,
либо ND3 идентичен ND1, либо ND4 идентичен ND2, или оба ND3 и ND4 идентичны ND1 и ND2, соответственно,
L2 представляет собой связь или короткий гибкий линкер, который может отличаться от L1 или быть идентичен L1, и Y и Z независимо друг от друга отсутствуют или представляют собой последовательность пептида или белка, содержащую от 1 до 1 ООО аминокислот.
2. Белковая наночастица по п.1, состоящая из агрегатов множества строительных блоков Формулы (1а) или (lb)
X-ND1-LI-ND2-FLA (la) или FLA - ND1 - LI - ND2 - X (lb),
собранных совместно с множеством строительных блоков Формулы (II)
Y-ND3-L2-ND4-Z (II).
3. Белковая наночастица по п.1, в которой по меньшей мере один из ND1 и ND2 и по меньшей мере один из ND3 и ND4 представляют собой суперспираль.
4. Белковая наночастица по любому из пп. 1-3, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из X, Y и Z является представляющим интерес антигеном.
5. Белковая наночастица по любому из пп. 1-4, отличающаяся тем, что FLA представляет собой производное флагеллина, у которого отсутствуют домены флагеллина D2 и D3.
6. Белковая наночастица по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что FLA представляет собой производное флагеллина, которое содержит представляющий интерес антиген .
7. Белковая наночастица по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что п в строительном блоке Формулы (1а) или m в строительном блоке Формулы (lb) равно 2.
8. Белковая наночастица по п. 7, отличающаяся тем, что FLA через часть D2 флагеллина связан с доменом олигомеризации ND2 Формулы (1а), при этом п равно 2, или с доменом олигомеризации ND1 в Формуле (lb), при этом m равно 2.
9. Белковая наночастица по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из ND1, ND2, ND3 и ND4 представляет собой суперспираль.
10. Белковая наночастица по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что по меньшей мере один из ND1, ND2, ND3 и ND4 представляет собой домен тримеризации белка фибритина бактериофага Т4.
11. Композиция, содержащая белковую наночастицу по любому из пп. 1-10.
12. Мономерный строительный блок Формулы (1а) или (lb)
X-ND1 - LI - ND2 - FLA (la) или FLA - ND1 - LI - ND2 - X (lb),
состоящий из непрерывной цепи, содержащей домен олигомеризации белка ND1, линкер L1, домен олигомеризации белка ND2, производное флагеллина FLA и дополнительный заместитель X, при этом
ND1 представляет собой белок, который образует олигомеры (NDl)m из m субъединиц ND1, ND2 представляет собой белок, который образует олигомеры (ND2)n из п субъединиц ND2, каждое тип представляет собой число от 2 до 10 при условии, что m не равно п и не кратно п, и п не кратно т,
L1 представляет собой связь или короткий гибкий линкер,
FLA представляет собой флагеллин или производное флагеллина, у которого отсутствуют части последовательности аминокислот флагеллина и/или у которого от 1 до 20 аминокислот заменены другими аминокислотами, и/или дополнительно содержащее антиген, связанный непосредственно или связанный через линкер, содержащий от 1 до 20 аминокислот;
X отсутствует или представляет собой последовательность пептида или белка, содержащую от 1 до 1000 аминокислот.
13. Способ вакцинации человека или отличного от человека животного, включающий введение эффективного количества белковой наночастицы по любому из пп.1-10 субъекту, нуждающемуся в такой вакцинации.
13.
Флагеллин или
производное флагеллина : ч-
Домен олигомеризации ND2 :
Домен олигомеризации ND1
Домен олигомеризации ND2 •
Домен
олигомеризации ND1
явив
Масса кДа
25 20
пР°ба Элюиро- Элюиро-
Очищенный после 1 2 3 4 5 вание ванне
лизат колонки
¦-5- 1-0
мкл мкл
ШШШШШЯШШШЯШШт
ШШШШШШШ
швшшшшшшшшшшшшшм
iViVHiHiiHHBiiiBi
'* ;> :J;:
яЯ1
500 450
400
- 350 с;
"I 300 х
200 СО
150 100 50
LONG-D2Dl-ori MP
IMG 2205
20-
•20-
|-г-ГТТГТ *~ ' 1 **ИЦ Г-ГТТГТ" ТТТТГ?| Г-ГТР-If-^ТТТЧ!1|-г-пгттл
-3-2-101234 log[LONG-D2-D1-ori NP] нг/мл
100 -
T1BTVD0-O1 148:12)
ВС я:. = 0.0951 нг/мл !
т "
Urn
О О х со
60 - - - ;
20-3-2-101234
log[T1BT/D0-D1 (48:12)] нг/мл
500
450
400 "
ISO
300 -
250
200 -
150
100 -
PD52-2 i8S- PAN DORA-Noro/02 - Dl-orl {48:12) IMG-2205
о о
120 100 80 60 40 20 0 -20
PD52-2i88-PANDORA-Noro'D2-D*-on ;4R¦'2 LC-yj ~ I7 f> 6 нг/мл
f-ТНТШIr-r~-7ftf-tПЛТ"-^TTTTTiy-nr-^-r-T'I'f'""'чтт~Т" rv
-3-2-10 1 2 3
!og[PD52-2i88-PANDORA-Noro/ D2-D1-ori (48:12)]
нг/мл
3.0
з.о
Количество дней после первой иммунизации
275
275
Фиг. 1
Фиг. 1
Фиг. 1
Фиг. 1
Фиг. 1
Фиг. 1
2/14
2/14
3/14
Фиг. 2
3/14
Фиг. 2
4/14
Фиг. 3
4/14
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 4
6/14
6/14
7/14
Фиг. 5
7/14
Фиг. 5
7/14
Фиг. 5
7/14
Фиг. 5
7/14
Фиг. 5
7/14
Фиг. 5
8/14
Фиг. 6
8/14
Фиг. 6
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
9/14
Фиг. 7
10/14
10/14
10/14
10/14
11/14
11/14
11/14
11/14
11/14
11/14
11/14
11/14
12/14
Фиг. 8
12/14
Фиг. 8
13/14
Фиг. 9
13/14
Фиг. 9
14/14
Фиг. 10
14/14
Фиг. 10