(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к новым энтомотоксичным полипептидам семейства альбуминов 1b бобовых. Эти полипептиды можно использовать, в частности, в качестве инсектицидов.
Евразийское (21) 201691049 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N15/82 (2006.01)
2016.09.30
(22) Дата подачи заявки 2014.12.09
(54) ЭНТОМОТОКСИЧНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ
(31) (32) (33)
(86) (87) (71)
(72)
(74)
1362361 2013.12.10
PCT/IB2014/066727
WO 2015/087238 2015.06.18
Заявитель:
ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ ЛЯ РЕШЕРШ АГРОНОМИК; ЭНСТИТЮ НАСЬОНАЛЬ ДЕ СЬЯНС АППЛИКЕ ДЕ ЛИОН (FR)
Изобретатель:
Руайе Коринн, Да Сильва Педро, Грессан Фредерик, Караки Ламис, Рабе Иван (FR)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) Изобретение относится к новым энтомоток-сичным полипептидам семейства альбуминов 1b бобовых. Эти полипептиды можно использовать, в частности, в качестве инсектицидов.
2420-534953RU/085
ЭНТОМОТОКСИЧНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ
Настоящее изобретение относится к энтомотоксичным полипептидам семейства альбуминов lb бобовых и к их применениям.
Альбумины lb (Alb) представляют собой энтомотоксичные пептиды семейства ноттинов. Впервые эти пептиды были идентифицированы в семенах гороха (Higginset al., J. Biol. Chem., 261, 11124-30, 1986) под названием PAlb (для субъединицы b альбумина1 гороха), затем в сое, где их также называют легинсулином (Watanabeet al. , Eur. J. Biochem., 224, 167-72, 1994), и в дальнейшем в зернах других Бобовых, принадлежащих в частности к родам Vicia, Phaseolus и Glycine (Louiset al., Plant. Sci., 167, 705-14, 2004; Louiset al., Phytochemistry, 68, 521-35, 2007).
Последовательности пептидов Alb являются высоко консервативными; в частности, они содержат 11 инвариантных оснований: 5 оснований пролина и б оснований цистеина, образующих 3 дисульфидных мостика. Третичная структура PAlb (Jouvensalet al., Biochemistry 42, 11915-23, 2003) включает узел, образуемый тремя дисульфидными мостиками, три антипараллельных [3-листа, петлю L1, содержащую консервативную последовательность CSPFE и петлю L2, гидрофобность аминокислоты которых сохраняется.
Отмечалось, что многие изоформы Alb могут совместно существовать в одном и том же растении (заявка РСТ WO 99/58695; Tayloret al., J. Agric. Food. Chem., 52, 7499-506, 2004; Tayloret al., J. Agric. Food. Chem., 52, 7491-8, 2004), что указывает на то, что се эти пептиды принадлежат к многородовому семейству, представители которого незначительно различаются.
Alb возникает в результате созревания полипротеина, называемого А1 (дляг "альбумина 1"). А1 состоит из, от N-конца к С-концу, сигнального пептида, субъединицы b (Alb) и ее пропептида, субъединицы a (Ala) и ее пропептида. После внутрипептидного расщепления сигнального пептида пропротеин направляется в белковые тела запаса семени. В этих структурах,
производных вакуолей, пропептиды элиминируются эндопептидазами, высвобождая, таким образом, два зрелых белка: Alb и Ala.
В заявке РСТ W099/58 695 описано выявление
энтомотоксического действия PAlb и его использование в качестве инсектицида, в частности для защиты семян зерновых от зерновых долгоносиков. В дальнейшем было опубликовано, что другие насекомые являются чувствительными к PAlb: в частности, жесткокрылые (Sitophilus sp, Harmonia axyridis) , определенные двукрылые, и в частности комары (Culex pipiens и Aedes aegyptii), и определенные виды тли, такие как Acyrthosiphon pisum; у чешуекрылых Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda и Ostrinia nubilalis являются не чувствительными к PAlb, тогда как Ephestia khuniella и клетки Sf9 (происходящие от Spodoptera frugiperda) являются чувствительными к нему (GRESSENT et al., J. Insect. Sci, 7, 1-10, 2007; GRESSENT et al. , Toxins (Basel), 3, 1502-17, 2011). Недавно было показано, что в инсектицидное действие PAlb вовлечено ингибирование мембранной протонной помпы, V-АТФазы, активность которой на уровне кишечника является необходимой у насекомых, т.к. она обеспечивает энергию, необходимую для всасывания питательных веществ (CHOUABE et al. , J. Biol. Chem., 286, 36291-6, 2011).
Для определения остатков, необходимых для
энтомотоксического действия PAlb DA SILVA et al. (DA SILVA et al. , J. Biol. Chem., 285, 32689-94, 2010) вводили различные точечные мутации в последовательность белка, в частности на уровне петель L1 и L2. Таким образом, они продемонстрировали, что наличие остатков фенилаланина в положении 10, аргинина в положении 21, изолейцина в положении 2 3 и лейцина в положении 27 являлись важными в поддержании токсического действия.
Альбумины Alb входят в число редких энтомотоксических пептидов активных перорально, известных в настоящее время. Априори по отношению к химическим пестицидам они предоставляют много преимуществ, в частности сохранение качества почв и вод после обработки, а также защита фермера (вовремя обработки) и потребителя.
Кроме того, некоторые из насекомых, чувствительных к Alb,
имеют очень важное экономическое или санитарное влияние. Например, зерновые долгоносики являются причиной приблизительно 2 0% потери зерновых во всем мире, комары являются основными переносчиками заболеваний человека и млекопитающих во всем мире, и тли являются переносчиками вируса растений.
В настоящее время альбумины Alb главным образом получают экстракций семян бобовых (заявка РСТ WO 99/58695) или пептидным синтезом с последующим сворачиванием in vitro (DA SILVA et al. , Biopolymers, 92, 436-44, 2009). Их также получают в рекомбинантной в форме, например, в E.coli, как описано в частности (HANADA and HIRANO, Biochemistry, 43, 12105-12, 2004) в случае легинсулина, гомолога PAlb в сое или в дрожжах Pichia pastoris (заявки CN101082046 и CN101033465).
PAlb также экспрессировали в трансгенных растениях, в частности в зерновых, для защиты от долгоносиков: а также были получены растения трансгенного риса, экспрессирующие белок PAlb гороха (Petit, докторская диссертация, Universite Montpellier II, 2006; заявка РСТ WO 2009/056689), и наблюдали, что накопление PAlb в семенах таких растений обеспечивало им энтомотоксические свойства в отношении личинок и взрослых насекомых S. oryzae. Однако получаемый уровень токсичности не являлся достаточным для обеспечения полной защиты.
Авторы изобретения провели исследование о наличии в других бобовых пептидов Alb, обладающих энтомотоксичными свойствами, превосходящими свойства белка PAlb эталона гороха.
Это исследование позволило авторам изобретения идентифицировать в люцерне (Medicago truncatula) альбумин Alb, который является приблизительно в 10 раз более активным, чем альбумин PAlb гороха.
Этот альбумин Alb представляет собой полипептид длиной 41 аминокислота, соответствующий следующей ниже последовательности:
ASCPNVGAVCSPFETKPCGNVKDCRCLPWGLFFGTCINPTG (SEQ ID NO: 1), которая представляет собой взрослую форму альбумина Alb.
Она возникает в результате созревания полипротеина А1, последовательность которого последовательность является такой, как указано ниже:
MTYVKLAILAVLHLTIFLIFQTKNVEAASCPNVGAVCSPFETKPCGNVKDCRCLPWGLF FGTCINPTGSKYNMKMIEEHPNLCQTHGECIKKGSGNFCARYANADIEYGWCFVSVSEAERYFK IGSNTAVKSFFKIASKEKDYLKMALEIATEE (SEQ ID NO: 2)
Ниже приведено выравнивание последовательностей полипептида PAlb Pi sum sativum (SEQ ID NO: 3) с полипептидом Alb последовательности SEQ ID NO: 1 по настоящему изобретению.
PAlb:
ASC-N-G-VCSPFEMPPCG-TSACRCIPVGLVIGYCRNPSG
SEQ ID NO: 1:
ASCPNVGAVCSPFETKPCGNVKDCRCLPWGLFFGTCINPTG
Вариации аминокислоты подчеркнуты; остатки,
идентифицируемые как важные для энтомотоксического действия у PAlb (DA SILVA et al. , 2010, указано выше), указаны жирным шрифтом.
Объектом настоящего изобретения является полипептид Alb последовательности SEQ ID NO: 1.
Оно также включает полипептиды производные Alb SEQ ID NO: 1 пептида в результате замен аминокислот, сохраняющих профиль гидрофобности, третичную структуру и энтомотоксические свойства полипептида SEQ ID NO: 1.
Неограничивающие примеры замен указаны в таблице I ниже. Энтомотоксические свойства замещенных пептидов можно легко устанавливать, например, путем определения их аффинности к участку связывания с PAlb и/или их токсичности на культуры клеток Sf9 Spodoptera frugiperda, как описано ниже в примерах.
способами, используемыми ранее для других полипептидов Alb.
В частности, его можно получать синтезом пептидов или также генетической инженерией, экспрессией полинуклеотида, кодирующего это полипептид в клетках-хозяевах или подходящем организме-хозяине .
Настоящее изобретение также включает рекомбинантные экспрессионные кассеты, содержащие полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую полипептид по изобретению под транскрипционным контролем соответствующего промотора.
В экспрессионных кассетах по изобретению
последовательность, кодирующую полипептид по изобретению, такой как полипептид SEQ ID N0: 1, можно использовать в выделенной форме, т.е. она не является связанной с последовательностью, кодирующей пропептид, не соответствующий ни последовательностям, кодирующим субъединицу Ala, и ни его пропептиду. Альтернативно, когда такая кодирующая последовательность предназначена для экспрессии в клетках-хозяевах с возможностью обеспечения созревания полипептида Alb, ее можно связывать при необходимости с последовательностью, кодирующей ее пропептид и с другой стороны при необходимости с последовательностью, кодирующей субъединицу Ala, и/или последовательностью, кодирующая пропептид указанных субъединиц Ala.
При любых обстоятельствах последовательность, кодирующую полипептид по изобретению, также можно связывать с сигнальным пептидом, который может представлять собой эндогенный сигнальный пептид полипротеина А1 или при необходимости гетерологичный сигнальный пептид.
Для конструирования экспрессионных кассет по изобретению
специалист в данной области проводит выбор подходящего промотора
общепринятым образом в зависимости от конкретной клетки-хозяина
или организма-хозяина, выбираемых для экспрессии. Таким образом,
он может представлять собой прокариотический промотор или
эукариотический промотор. Этот промотор может являться
конститутивным или хорошо индуцируемым, если желательной
является экспрессия предпочтительно представляющего интерес
полипептида в определенных условиях среды; а также в случае
экспрессии в организме-хозяине модно использовать
тканеспецифический промотор, обеспечивающий предпочтительную экспрессию в определенных тканях-мишенях или органах мишенях.
Экспрессионные кассеты по изобретению могут дополнительно содержать элементы, обычно используемые в этом типе конструкций, для улучшения экспрессии представляющего интерес гена, такого как терминатор транскрипции, "энхансерные" последовательности, интроны и т.д.
Объектом настоящего изобретения так же является рекомбинантный вектор, являющийся результатом введения экспрессирующей кассеты по изобретению в вектор-хозяин.
Среди очень большого разнообразия доступных векторов-хозяев специалист в данной области обычно проводит выбор наиболее подходящего вектора в частности в зависимости от критериев, таких как выбранная клетка-хозяин или организм-хозяин, протокол предполагаемой трансформации и т.д.
Настоящее изобретение также относится к клеткам-хозяевам и организмам-хозяевам, трансформированным экспрессирующей кассетой по изобретению.
В настоящем описании под клеткой или организмом, трансформированным экспрессирующей кассетой, понимают любую клетку-хозяина или организм-хозяин, генетическое содержимое которого было модифицировано путем переноса указанной экспрессирующей кассеты в указанную клетку или указанный организм, независимо от способа переноса, который был использован, и от соответствующей генетической информации, вносимой указанной кассетой, которая является интегрированной в хромосомную ДНК или остается внехромосомной.
Трансформированные по изобретению клетки могут представлять собой прокариотические, или эукариотические клетки. В случае прокариотических клеток можно привести, например, Е. coli, агробактерии, такие как Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes, или энтомопатогенные бактерии или симбиотические бактерии насекомых, в частности бактерии, способные колонизировать пищеварительный тракт насекомых. В случае эукариотических клеток можно упомянуть, в частности растительные клетки, которые можно получать из двудольных или
однодольных растении, клетки дрожжей или клетки насекомых. Трансформированные по изобретению организмы, в частности, могут представлять собой трансгенные растения.
Настоящее изобретение также относится к применению полипептида по изобретению, такого как инсектицид. Затрагиваемые насекомые представляют собой, в частности, насекомых, чувствительных к PAlb (см., gressent et al. , 2007, 2011, указано выше). Кроме того, специалист в данной области может легко оценивать чувствительность других насекомых к полипептиду Alb по изобретению, добавляя этот полипептид в различных дозах в корм к тестируемым насекомым.
В рамках такого применения в качестве инсектицида полипептид по изобретению также можно использовать так, как описано в заявке РСТ W099/58695.
Предпочтительно, его можно экспрессировать в трансгенном растении для защиты указанного растения от насекомых-паразитов.
Настоящее изобретение также относится к способу получения трансгенного растения, экспрессирующего полипептид по изобретению, отличающегося тем, что он включает следующие стадии:
трансформацию растительных клеток экспрессирующей кассетой по изобретению;
- воспроизведение растений из трансформированных клеток;
- отбор растений, в геном которых интегрирована указанная экспрессирующая кассета.
Для осуществления настоящего изобретения доступно очень много способов трансформации зародышевых или соматических растительных клеток (выделенных в форме тканевых культур или культур органа, или на целой растении) и воспроизведения растений. Выбор наиболее подходящего способа, как правило, зависит от конкретного растения.
В качестве неограничивающих примеров можно привести трансформацию протопластов в присутствии полиэтиленгликоля, электропорацию, использование пушки частиц, микроинъекцию цитоплазмы или ядра, или трансформацию посредником Agrobacterium. В случае однодольных растений предпочтительно
использовать трансформацию Agrobacterium tumefaciens.
Настоящее изобретение также относится к трансгенному растению, содержащему в своем геноме по меньшей мере одну копию экспрессирующей кассеты по изобретению.
В настоящем описании под трансгенным растением понимают трансформированное растение, в котором генетическая информация экзона, вносимая трансформирующим полинуклеотидом, является стабильно интегрированной в хромосомную ДНК в форме трансгена, и, таким образом, может передаваться потомкам указанного растения. Таким образом, это определение также включает потомков растений, происходящих в результате исходного трансгена, если они содержат в своем геноме копию трансгена.
Трансгенные растения по изобретению экспрессируют полипептид Alb по изобретению во всем растении или по меньшей мере в их определенных тканях или органах, например, в семенах. Эта экспрессия придает представляющим интерес тканям и органам токсичность по отношению к насекомым-вредителям и увеличивает, таким образом, их устойчивость к атакам насекомых.
Для увеличения их спектра устойчивости к насекомым трансгенные растения по изобретению при необходимости также могут содержать один или несколько других генов, кодирующих один или ряд других энтомотоксинов. В качестве примеров можно привести токсины СгуЗ Bacillus thuringiensis, в частности СгуЗА, ингибиторы протеаз, токсины Vip, авидин, лектины и т.д.
Настоящее изобретение можно применять к любым растениям, которые не экспрессируют естественным образом полипептид Alb по изобретению, или также к тем, которые не экспрессируют его естественным образом в органе, который желательно защищать. Оно представляет контренный интерес для зерновых, таких как пшеница, кукуруза или рис, а также его можно использовать для всех растений, которые могут атаковать насекомые вредители, чувствительные к этому белку. В частности, они могут включать бобовые, отличные от Medicago truncatula, у которых он может увеличивать естественную устойчивость: в качестве примера можно привести горох, фасоль, сою и т.д.
Растительный материал (протопласты, каллюс, черенки,
посевной материалы и т.д.), получаемый из трансформированных клеток или трансгенных растений по изобретению, также является частью объекта настоящего изобретения. Изобретение также включает продукты, получаемые из трансгенных растений по изобретению и в которых содержится полипептид Alb по изобретению; в частности в семенах и их производных продуктах, например в муке или манной крупе.
При использовании в качестве инсектицида полипептид Alb по изобретению также можно экспрессировать в энтомопатогенном или неэнтомопатогенном микроорганизме, способном инфицировать насекомое, которое является желательной мишенью. Можно привести, например, бактерии (DURVASULA et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 94, 3274-8, 1997; RIEHLE et al. , Int. J. Parasitol, 37, 595603, 2007; DURVASULA et al. , Exp. Parasitol., 119, 94-8, 2008) или вирус, такой как бакуловирусы (BONNING and NUSAWARDANI, Methods Mol. Biol., 388, 359-66, 2007; INCEOGLU et al., Adv. Virus Res., 68, 323-60, 2006) или денсовирусы (REN et al., PLoS Pathog., 4, el000135, 2008).
Этот способ применения представляет особый интерес в случае использования против насекомых, не относящихся к фитопатогенным, таким как комары.
Рекомбинантные бактерии и вирусы, содержащие
экспрессирующую кассету по изобретению, и использование таких бактерий и вирусов в качестве, также является частью настоящего изобретения.
Получение рекомбинантных бакуловирусов или денсовирусов по изобретению можно проводить стандартным известными способами (см., например, в случае бакуловирусов: O'REILLY et al. , BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL, Freeman and Cie, New York, 1994, и в случае денсовирусов: РСТ WO 93/01295, РСТ WO 96/14423, BOSSIN et al. , Journal of Virology, 77, 1106071, 2003; CARLSON et al. , Advances in Virus Research, Volume 68, 361-92, 2006).
В случае вирусов, продуцируемых в клетках насекомых, чувствительных к полипептиду Alb по изобретению (например, бакуловирусов, продуцируемых в клетках насекомых Sf9), промотор,
используемый в экспрессирующей кассете для регуляции экспрессии полипептида Alb, предпочтительно представляет собой поздний промотор (например, промотор полиэдрина или промотор р10), для обеспечения возможности ограничивать токсические эффекты этого полипептида на клетки насекомого, используемые для получения таких бакуловирусов.
Настоящее изобретение будет лучше понятно благодаря дополнительному описанию, которое следует ниже, которое ссылается на неограничивающий пример, иллюстрирующий свойства полипептида Alb по изобретению.
Пример 1: Идентификация и характеризация энтомотоксичных альбуминов Alb у Medlcago truncatula
Анализ с использованием компьютерного моделирования геномных данных и EST de Medicago truncatula позволил идентифицировать 53 гена семейства альбуминов А1. 43 из этих генов содержали полную последовательность субъединицы Alb.
Выбирали б из этих генов и соответствующие полипептиды Alb химически синтезировали и подвергали сворачиванию in vitro, как ранее описано DA SILVA et al. (Biopolymers, 92, 436-44, 2009), чтобы тестировать их активность. Полипептид PAlb Pisum sativum также синтезировали таким же образом для использования в качестве положительного контрольного образца.
Выровненные последовательности синтезированных полипептидов указаны в таблице II ниже. Для полипептидов е Medicago truncatula условное обозначение, используемое в настоящем описании, относится к первой и последней аминокислоте последовательности, за которыми следует ряд аминокислот в ней.
AG41
ASCPNVGAVCSPFETKP-CGNVKDCRCLPWGLFFGT
CINPTG
DS37
DEC-W-G-PCSVLQTPP-CPLSK-CYCIPLFLWGY
CSHASS
QT41
QSC-I-G-FCSVFDSKPLCGSSR-CRCNKPLNNPFVGI-
CERRPST
GL44
GQCARVGMRCSRALPNP-CGDIVTCRCVHLHLVGST
CIDYTGDGL
EG41
EFCSSVGSFCSPFNTNP-CGYLGNCRCVPYYLYGGT
CENPFG
AS40
AKC GEACDTQFNF-
CNAGDGCRCFITDAYLTLPGFCAQLST
Затем эти пептиды тестировали на их аффинность к участку связывания с PAlb и на их энтомотоксические свойства.
Аффинность к участку связывания с PAlb определяли анализом связывания лиганда с использованием меченого йодом 1251 токсина, такого как ранее описанный (GRESSENT et al. , Eur. J. Biochem., 270, 2429-35, 2003).
Энтомотоксические свойства определяли по оценке CL50 (летальной концентрации для 50%) на культурах клеток Sf9 Spodoptera frugiperda, как описано Rahiouiet al. (Biochimie, 89, 1539-43, 2007) Клетки культивировали при 27°С в среде Lonza, дополненной 5% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 0,1% гентамицина, затем высевали в 9б-луночные планшеты за 24 часа до экспериментов (15000 клеток/лунка) и подвергали возрастающим концентрациям синтетического пептида. Через 24 часа определяли жизнеспособность клеток с использованием теста оценки жизнеспособности CellTiter-Blue (Promega) по инструкциям производителя. После добавления красителя клетки инкубировали при 27°С в течение 4 часов. Затем измеряли оптическую плотность при 570 и 600 нм с использованием микроплашечного ридера (MR 7000, Dynatech Laboratories Inc., USA).
Результаты указаны в таблице III ниже: "-" представляет собой отрицательный результат (отсутствие токсичности или отсутствие связывания в диапазоне тестируемых концентраций)
Эти результаты демонстрируют, что определенные тестируемые пептиды (AS37, EG41, AS4 0) обладают токсичностью сравнимой с токсичностью эталонного пептида PAlb, тогда как другие (DS37, QT41, и GL44) не обладают энтомотоксичными свойствами. В частности наличие тирозина (Y) вместо аргинина (R) в консервативном мотиве СХС (DS37 в сравнении с AS37), по-видимому, коррелирует с утратой свойств связывания и токсичности.
Пептид AG41 обладает осень повышенной токсичностью приблизительно в десять раз больше токсичности PAlb.
Для большей части пептидов (за исключением EG41) токсичность, по-видимому, коррелирует с аффинностью к участку связывания с PAlb.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE
INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON ROYER, Corinne DA SILVA, Pedro GRESSENT, Frfidfiric KARAKI, Lamis
RAHBE, Yvan
<12 0> ЭНТОМОТОКСИЧНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ <130> EMT/ll-F539-167-PCT <150> FR 13 62361
<151> 2013-12-10 <160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 41 <212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 1
Ala Ser Cys Pro Asn Val Gly Ala Val Cys Ser Pro Phe Glu Thr Lys
1 5 10 15
Pro Cys Gly Asn Val Lys Asp Cys Arg Cys Leu Pro Trp Gly Leu Phe
20 25 30
Phe Gly Thr Cys Ile Asn Pro Thr Gly 35 40
<210> 2
<211> 154
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<220>
<221> Сигнал
<222> (1)..(27)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(68)
<223> Зрелый A1b
<220>
<221> PROPEP
<222> (69)..(76)
<223> пропептид A1b
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (77)..(142)
<223> Зрелый A1a
<220>
<221> PROPEP
<222> (143)..(154)
<223> пропептид A1a
<400> 2
Met Thr Tyr Val Lys Leu Ala Ile Leu Ala Val Leu His Leu Thr Ile
1 5 10 15
Phe Leu Ile Phe Gln Thr Lys Asn Val Glu Ala Ala Ser Cys Pro Asn
20 25 30
Val Gly Ala Val Cys Ser Pro Phe Glu Thr Lys Pro Cys Gly Asn Val
35 40 45
Lys Asp Cys Arg Cys Leu Pro Trp Gly Leu Phe Phe Gly Thr Cys Ile
50 55 60
Asn Pro Thr Gly Ser Lys Tyr Asn Met Lys Met Ile Glu Glu His Pro
65 70 75 80
Asn Leu Cys Gln Thr His Gly Glu Cys Ile Lys Lys Gly Ser Gly Asn
85 90 95
Phe Cys Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Asp Ile Glu Tyr Gly Trp Cys Phe
100 105 110
Val Ser Val Ser Glu Ala Glu Arg Tyr Phe Lys Ile Gly Ser Asn Thr
115 120 125
Ala Val Lys Ser Phe Phe Lys Ile Ala Ser Lys Glu Lys Asp Tyr Leu
130 135 140
Lys Met Ala Leu Glu Ile Ala Thr Glu Glu 145 150
<210> 3
<211> 37
<212> Белок
<213> Pisum sativum
<400> 3
Ala Ser Cys Asn Gly Val Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Gly
1 5 10 15
Thr Ser Ala Cys Arg Cys Ile Pro Val Gly Leu Val Ile Gly Tyr Cys
20 25 30
Arg Asn Pro Ser Gly
<210> 4
<211> 37
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 4
Ala Asp Cys Ser Gly Ile Cys Ser Pro Phe Glu Met Pro Pro Cys Arg
1 5 10 15
Ser Ser Asp Cys Arg Cys Ile Pro Ile Ala Leu Ile Gly Gly Phe Cys
20 25 30
Ile Asn Pro Ile Ser
<210> 5
<211> 37
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 5
Asp Glu Cys Trp Gly Pro Cys Ser Val Leu Gln Thr Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Leu Ser Lys Cys Tyr Cys Ile Pro Leu Phe Leu Val Val Gly Tyr Cys
20 25 30
Ser His Ala Ser Ser 35
<210> 6
<211> 41
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 6
Gln Ser Cys Ile Gly Phe Cys Ser Val Phe Asp Ser Lys Pro Leu Cys
1 5 10 15
Gly Ser Ser Arg Cys Arg Cys Asn Lys Pro Leu Asn Asn Pro Phe Val
20 25 30
Gly Ile Cys Glu Arg Arg Pro Ser Thr 35 40
<210> 7
<211> 44
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 7
Gly Gln Cys Ala Arg Val Gly Met Arg Cys Ser Arg Ala Leu Pro Asn
1 5 10 15
Pro Cys Gly Asp Ile Val Thr Cys Arg Cys Val His Leu His Leu Val
20 25 30
Gly Ser Thr Cys Ile Asp Tyr Thr Gly Asp Gly Leu 35 40
<210> 8
<211> 41
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 8
Glu Phe Cys Ser Ser Val Gly Ser Phe Cys Ser Pro Phe Asn Thr Asn
1 5 10 15
Pro Cys Gly Tyr Leu Gly Asn Cys Arg Cys Val Pro Tyr Tyr Leu Tyr
20 25 30
Gly Gly Thr Cys Glu Asn Pro Phe Gly 35 40
<210> 9
<211> 40
<212> Белок
<213> Medicago truncatula
<400> 9
Ala Lys Cys Gly Glu Ala Cys Asp Thr Gln Phe Asn Phe Cys Asn Ala
1 5 10 15
Gly Asp Gly Cys Arg Cys Phe Ile Thr Asp Ala Tyr Leu Thr Leu Pro
20 25 30
Gly Phe Cys Ala Gln Leu Ser Thr 35 40
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный энтомотоксичный полипептид, отличающийся тем,
что он определяется следующей последовательностью:
ASCPNVGAVCSPFETKPCGNVKDCRCLPWGLFFGTCINPTG (SEQ ID N0: 1).
2. Рекомбинантная экспрессирующая кассета, содержащая полинуклеотид, содержащий последовательность, кодирующую полипептид по п.1, где указанный полинуклеотид расположен под транскрипционным контролем соответствующего промотора.
3. Рекомбинантный вектор, содержащий экспрессирующую кассету по п.2.
4. Клетка-хозяин, трансформированная экспрессирующей кассетой по п.2.
5. Трансгенное растение, содержащее трансген, содержащий экспрессирующую кассету по п.2.
6. Рекомбинантный вирус, содержащий экспрессирующую кассету по п.2 .
7. Применение полипептида по п.1 или рекомбинантного вируса по п.б в качестве инсектицида.
По доверенности
