[RU]

Заявленное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1. Упомянутые полипептиды предпочтительно расщепляют пептидогликан грамотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter. Дополнительно, заявленное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим упомянутые полипептиды, векторам, включающим упомянутые нуклеиновые кислоты и соответствующим клеткам-хозяинам. И, наконец, заявленное изобретение относится к композициям, содержащим упомянутые полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки-хозяины, согласно заявленному изобретению.

(57) Реферат / Формула:

Заявленное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1. Упомянутые полипептиды предпочтительно расщепляют пептидогликан грамотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter. Дополнительно, заявленное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим упомянутые полипептиды, векторам, включающим упомянутые нуклеиновые кислоты и соответствующим клеткам-хозяинам. И, наконец, заявленное изобретение относится к композициям, содержащим упомянутые полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки-хозяины, согласно заявленному изобретению.

---

Евразийское (21) 201691004 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C12N 9/36 (2006.01)
2017.01.30 C12N 9/50 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2014.11.14
(54) ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННОГО ЭНДОЛИЗИНА KZ144
(31) PCT/EP2013/073869
(32) 2013.11.14
(33) EP
(86) PCT/EP2014/074671
(87) WO 2015/071436 2015.05.21
(71) Заявитель: ЛИСАНДО АГ (LI)
(72) Изобретатель:
Миллер Стефан, Стернер Рейнхард, Стуер Хейке (DE)
(74) Представитель:
Гончаров В.В. (BY) (57) Заявленное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1. Упомянутые полипептиды предпочтительно расщепляют пептидогликан гра-мотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter. Дополнительно, заявленное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим упомянутые полипептиды, векторам, включающим упомянутые нуклеиновые кислоты и соответствующим клеткам-хозяи-нам. И, наконец, заявленное изобретение относится к композициям, содержащим упомянутые полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки-хозяины, согласно заявленному изобретению.
Последовательность модифицированного эндолизина KZ144
Заявленное изобретение относится к полипептидам, содержащим аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1. Упомянутые полипептиды предпочтительно расщепляют пептидогликан грамотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter. Дополнительно, заявленное изобретение относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим упомянутые полипептиды, векторам, включающим упомянутые нуклеиновые кислоты и соответствующим клеткам-хозяинам. И, наконец, заявленное изобретение относится к композициям, содержащим упомянутые полипептиды, нуклеиновые кислоты, векторы и/или клетки-хозяины, согласно заявленному изобретению.
Огромный, литический бактериофаг семейства Myoviridae фК2(280 334 bp) инфицирует Pseudomonas aeruginosa, важный условно-патогенный нозокомиальный патоген, устойчивый ко многим широко используемым антибиотикам, и, следовательно, являющийся причиной многих проблем внутрибольничной среды. В 2007 г., Briers et al. (Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344) секвенировали геном упомянутого бактериофага и идентифицировали эндолизин KZ144, высоколитическую гидролазу пептидогликана. В WO 2010/149792, был предложен слитый белок, содержащий последовательность упомянутого эндолизина в качестве ферментативного элемента для расщепления клеточной стенки грамотрицательных бактерий.
Помимо общего действия упомянутых эндолизина и слитых белков, оказалось, что по некоторым техническим причинам, эндолизиновый полипептид показывает субоптимальные свойства, в частности, что касается стабильности и процессинга. Таким образом, присутствовала необходимость разработки дополнительного эндолизинового энзима (фермента) с предпочительным улучшением свойств по данным параметрам. Соответственно, задачей заявленного изобретения является обеспечение наличия такого полипептида,
который достигается практическим воплощением сущности изобретения, выраженной в прилагаемой формуле.
Далее следует краткое описание прилагаемых фиг., которые предназначены для более подробного иллюстрирования заявленного изобретения. Тем не менее, данные фиг. не носят ограничительного характера относительно сущности заявленного изобретения.
Фиг.1: представляет: SEQIDNO: 1,
SEQ ID NO: 2 KZ144 эндолизин без N-терминального метионина,
SEQ ID NO: 3 KZ144 эндо лизин без N-терминального метионина и с
остатками селенометионина вместо остатков метионина,
SEQIDNO: 4 KZ144 эндолизин с мутацией Е115А без N-
терминального метионина, и
SEQ ID NO: 5 KZ144 эндолизин.
Фиг.2: представляет:
SEQ ID NO: 136 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с C14S и C50S (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 28) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQID N0: 135).
SEQ ID N0: 137 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID N0: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с T82I, A206V и S232T (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID N0: 29) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID N0: 135).
SEQ ID NO: 138 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID N0: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с T82I, A206V, S232T, I122M; и А160Т (подчеркнуто
сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 30) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135). SEQ ID NO: 139 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с C14S, C50S,I122M; и А160Т (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 31) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135).
SEQ ID NO: 140 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с C14S, C23S и C50S (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 32) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135).
SEQ ID NO: 141 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с T82I, A206V, S232T, I122M; А160Т, C14S и C50S (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 33) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135).
SEQ ID NO: 142 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), модифицированный KZ144 без N-терминального метионина и с T82I, A206N, S232T, I122M; А160Т C14S и C50S (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 49) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135).
SEQIDNO: 151 Слитый белок SMAP-29 (подчеркнуто сплошной линией; SEQ ID NO: 76), KZ144 без N-терминального метионина (подчеркнуто сплошно-пунктирной линией; SEQ ID NO: 2) и гистидиновой меткой His-tag (подчеркнуто пунктирной линией; SEQ ID NO: 135).
В первом аспекте, заявленное изобретение относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность, демонстрирующую как
минимум примерно 90% идентичность с последовательностью SEQ ID NO: 1, в которой SEQ ID NO: 1 характеризуется тем, что
XI может отсутствовать или любая аминокислота, в частности
Х14 любая аминокислота, предпочтительно S, R или N, более предпочтительно S или R
Х23 любая аминокислота, предпочтительно S, R или N, более предпочтительно S
Х50 любая аминокислота, предпочтительно S, R или N, более предпочтительно S или N
Х82 любая аминокислота, предпочтительно Т или I
XI22 любая аминокислота, предпочтительно I или М
XI49 любая аминокислота, предпочтительно М или Р
XI54 любая аминокислота, предпочтительно L или Т
XI60 любая аминокислота, предпочтительно А или Т
XI67 любая аминокислота, предпочтительно I или L
XI79 любая аминокислота, предпочтительно N или Е
XI86 любая аминокислота, предпочтительно V или Y
Х206 любая аминокислота, предпочтительно А, N или V
Х212 любая аминокислота, предпочтительно Т или N
Х224 любая аминокислота, предпочтительно Р или Q
Х230 любая аминокислота, предпочтительно N или Y
Х232 любая аминокислота, предпочтительно S или Т;
и в которой полипептид не содержит аминокислотную
последовательность SEQ ID N0:2, или SEQ ID N0:3, или SEQ ID
NO: 4.
Аминокислотные белковые остатки могут быть модифицированы, например, ковалентными прикреплениями различных групп, как, например, углеводы и фосфаты. Прочие вещества могут быть более свободно ассоциированы с полипептидными цепочками, как, например, гемы или липиды, приводя к образованию конъюгированных полипептидов, которые также обозначают
термином "полипептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения. Термин в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, также включает белки. Таким образом, термин "полипептид" также относится к комплексам из двух или более аминокислотных полимерных цепей. Термин "полипептид" не включает воплощения полипептидов с вариативными модификациями, часто встречающимися в технике, как, например, биотинилирование, ацетилирование, пегилирование, химические изменения амино-, SH- или карбоксигрупп (например, защитных групп) и т.д. Термин "полипептид", согласно данному описанию, не ограничен специфичной длиной аминокислотной полимерной цепи, но обычно имеет длину примерно более 50 аминокислот, примерно более 100 аминокислот или даже примерно более 150 аминокислот. Обычно, но не обязательно, типичный полипептид согласно заявленному изобретению не превышает примерно 750 аминокислот в длину. Как будет представлено в описании далее по тексту, полипептид согласно заявленному изобретению может также представлять собой слитый белок, а именно, слияние как минимум двух последовательностей аминокислот, не встречающееся в такой комбинации в естественном состоянии в природе.
В данном описании, термин "% идентичность последовательности", необходимо понимать следующим образом: две сравниваемые последовательности располагают на одной линии для максимальной корреляции между последовательностями. Данное действие может включать вставку "гэпов" в одной или обеих последовательностях, для повышения соосности. Затем можно определить % идентичности по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (т.н. (глобальное) совмещение по всей длине), что в особенности подходит для последовательностей одинаковой или схожей длины, или вдоль более коротких, определенных участков (т.н.. локальное совмещение), что более подходит для последовательностей различной длины. В контексте данного описания, аминокислотная последовательность, демонстрирующая "идентичность последовательности" как минимум, например, 95% в сравнении с запрашиваемой (искомой) аминокислотной последовательностью, означает то,
что исследуемая аминокислотная последовательность идентична запрашиваемой последовательности, за исключением того, что исследуемая аминокислотная последовательность может включать до пяти аминокислотных сдвигов на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Иными словами, для получения аминокислотной последовательности с как минимум 95% идентичностью с запрашиваемой аминокислотной последовательностью, в исследуемой последовательности может возникнуть необходимость инсерции, делеции или замены до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков другими аминокислотами. Методы сравнения идентичности и гомологичности двух или более последовательностей хорошо известны специалистам в данной области техники. Процент идентичности двух последовательностей можно, например, определить при помощи математического алгоритма. Предпочтительным, но не ограничивающим, примером используемого математического алгоритма может являться алгоритм Карлина - Karlinet а/. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Такой алгоритм интегрирован в семейство программных продуктов BLAST, например, программа BLAST или NBLAST (см.также Altschul et al, 1990, J. Mol. Biol. 215, 403-410 или Altschul et al. (1 997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402), доступные с сайта NCBI по адресу ncbi.nlm.nih.gov) и FASTA (Pearson (1 990), Methods Enzymol. 83, 63-98; Pearson and Lipman (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 85, 2444-2448.). Последовательности, которые идентичны другим, могут быть до определенной степени идентифицированы данными программами. Помимо этого, доступны программы в Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 9.1 (Devereux et al, 1984, Nucleic Acids Res., 387-395), например, программы BESTFIT и GAP, могут применять для определения % идентичности между двумя полипептидными последовательностями. BESTFIT использует алгоритм "локальной гомологичности" (Smith and Waterman (1981 ), J. Mol. Biol. 147, 195197.) и находит самый точный единственный участок схожести между двумя последовательностями. Если в данном описании есть ссылка на аминокислотную последовательность, демонстрирующую определенную степень идентичности последовательности в сравнении со стандартной (эталонной) последовательностью, то упомянутое различие в последовательности имеет
место предпочтительно вследствие консервативных аминокислотных замен. Предпочтительно, такая последовательность сохраняет активность стандартной последовательности, например, хотя, возможно, на более замедленном уровне. Кроме того, если в данном описании присутствует ссылка на последовательность, демонстрирующую, "как минимум", в определенном проценте, идентичность последовательности, то 100%-я идентичность последовательности предпочтительно не охвачена.
"Консервативные аминокислотные замены", как они трактуются в данном описании, могут произойти в пределах группы аминокислот, которые имеют достаточно схожие физико-химические свойства, с тем, чтобы замена между членами группы сохранила биологическую активность молекулы (см., например, Grantham, R. (1974), Science 185, 862-864). В частности, консервативные аминокислотные замены являются предпочтительно заменами, в которых аминокислоты происходят из того же самого класса аминокислот (например, основные аминокислоты, кислые аминокислоты, полярные аминокислоты, аминокислоты с алифатическими боковыми цепями, аминокислоты с положительно или отрицательно заряженными боковыми цепями, аминокислоты с ароматическими радикалами в боковых цепях, аминокислоты, боковые цепи которых могут вступить в водородные связи, например, боковые цепи, у которых есть гидроксильная функция, и т.д.). Консервативные замены являются в данном случае, например, заменой основного аминокислотного остатка (Lys, Arg, His) другим основным аминокислотным остатком (Lys, Arg, His), заменой алифатического аминокислотного остатка (Gly, Ala, Val, Leu, lie) другим алифатическим аминокислотным остатком, заменой ароматического аминокислотного остатка (Phe, Туг, Тгр) другим ароматическим аминокислотным остатком, заменой треонина серином или лейцина изолейцином. Дополнительные консервативные аминокислотные замены известны специалистам в данной области техники.
Термин "делеция", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, преимущественно относится к отсутствию 1, 2, 3, 4, 5
(или даже более 5) непрерывных аминокислотных остатков в производной последовательности в сравнении с соответствующей стартовой последовательностью, либо интра-секвенциально, либо на N- или С-конце.
Термин "инсерция", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, преимущественно относится к дополнительному интра-секвенционному присутствию 1, 2, 3, 4, 5 (или даже более 5) непрерывных аминокислотных остатков в производной последовательности в сравнении с соответствующей стартовой последовательностью.
Термин "аддиция", в том смысле, в котором он используются в описании заявленного изобретения, преимущественно к дополнительному присутствию 1, 2, 3, 4, 5 (или даже более 5) непрерывных аминокислотных остатков на N- и/или С-конце производной последовательности в сравнении с соответствующей стартовой последовательностью.
Термин "замена", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к присутствию аминокислотного остатка, расположенного на определенной позиции производной последовательности, отличного от аминокислотного остатка, присутствующего или отсутствующего на соответствующей позиции в стартовой последовательности. Как упомянуто выше, данные замены предпочтительно являются консервативными.
Термин "клеточная стенка", используемый в описании заявленного изобретения, относится ко всем компонентам, образующим внешнюю оболочку клетки грамотрицательной бактерии, обеспечивая, таким образом, ее целостность. В частности, термин "клеточная стенка" в том значении, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидогликану, внешней мембране грамотрицательной бактерии с липополисахаридом, клеточной мембране бактерии, а также к дополнительным слоям на пептидогликане, как, например, капсулы, внешние белковые слои или слаймы.
Термин "удлинение аминокислотной последовательности", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к определенному удлинению аминокислотной последовательности в аминокислотной последовательности полипептида согласно заявленному изобретению. Упомянутая последовательность относится к последовательности катионного пептида, поликатионного пептида, амфипатичного пептида, гидрофобного пептида, суши-пептида и/или антимикробного пептида. Термин не включает обычные метки, такие как His-метки, а именно His5-MeTKH, гЛвб-метки, His7-MeTKH, His8-MeTKH, His9-MeTKH, HislO-метки, Hisll-метки, His 12-метки, Hisl6-MeTKH и His20-MeTKH, Strep-метки, Avi-метки, Мус-метки, Gst-метки, JS-метки, цистеин-метки, FLAG-метки и прочие метки, известные в данной области техники, белки, связывающие тиоредоксин или мальтозу (МСБ). Предпочтительно, удлинение аминокислотной последовательности в данном описании имеет длину от примерно 6 до примерно 39 аминокислотных остатков.
В описании заявленного изобретения, термин "катионный пептид" преимущественно относится к пептиду с положительно заряженными аминокислотными остатками. Предпочтительно, катионный пептид имеет значение рКа (отрицательный десятичный логарифм константы диссоциации) равное 9,0 или выше. Как правило, по крайней мере, четыре аминокислотных остатка катионного пептида могут быть положительно заряженными, например, лизин или аргинин. Термин "положительно заряженные" относится к боковым цепочкам аминокислотных остатков, которые имеют чистый положительный заряд при примерно физических условиях. Термин "катионный пептид", используемый в заявленном изобретении, также относится к поликатионным пептидам, а также включает катионные пептиды, которые содержат, например, менее 20%, предпочтительно менее 10% положительно заряженных аминокислотных остатков.
Термин "поликатионный пептид", используемый в описании заявленного изобретения, предпочтительно относится к пептиду, состоящему из преимущественно положительно заряженных аминокислотных остатков, в
частности, остатков лизина и/или аргинина. Пептид состоит из преимущественно положительно заряженных аминокислотных остатков, причем как минимум примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или около 100% аминокислотных остатков представляют собой положительно заряженные аминокислотные остатки, в частности остатки лизина и/или аргинина. Те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки и/или отрицательно заряженные аминокислотные остатки и/или гидрофобные аминокислотные остатки. Предпочтительно, те из аминокислотных остатков, которые не являются положительно заряженными, могут представлять собой нейтрально заряженные аминокислотные остатки, в частности серии и/или глицин.
Предпочтительными являются антимикробные пептиды. Антимикробный пептид может быть членом суперсемейства РНК-азы А, дефензином, кателицидином, гранулизином, гистатином, псориазином, дермицидином или гепсидином. Антимикробный пептид может встречаться в естественном виде у насекомых, рыб, растений, паукообразных насекомых, позвоночных животных или млекопитающих. Предпочтительно, антимикробный пептид может встречаться в естественном виде у насекомых, рыб, растений, паукообразных насекомых, позвоночных животных или млекопитающих. Предпочтительно, антимикробный пептид может встречаться в естественном виде в хрене, тутовом шелкопряде, тарантуле (паук-волк), лягушке, предпочтительно в Xenopuslaevis, лягушках Rana, более предпочтительно в Ranacatesbeiana, жабе, предпочтительно азиатской жабе Bufobufogargarizans, у мух, предпочтительно у дрозофилы, более предпочтительно у малой дрозофилы, melanogaster, в Aedesaegypti, у медоносной пчелы, полевого шмеля, предпочтительно в Bombuspascuorum, у мясной мухи, предпочтительно в серой мясной мухе Sarcophaga, у обыкновенного сокола, в скорпионе, мечехвосте, зубатке, предпочтительно в Parasilurusasotus, корове, овцах, свиньях, у жвачных животных, обезьян и человека. Как используется в данном описании, "антимикробный пептид" (АМП) может в частности быть пептидом, который не
является катионным пептидом, поликатионным пептидом, амфипатичным пептидом, суши-пептидом, дефензинами и гидрофобным пептидом, но, тем не менее, показывает антимикробную активность.
Термин "суши-пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к белкам комплементарного контроля с короткими повторениями транскрипции. Суши модуль суши-пептидов функционирует как домен взаимодействия "белок-белок" в различных белках. Доказано, что пептиды, содержащие Sushi домен, показывают антимикробную активность. Предпочтительно, суши-пептиды представляют собой натуральные пептиды.
Термин "амфипатичный пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к пептидам, имеющим как гидрофильные, так и гидрофобные функциональные группы. Предпочтительно, в контексте описания заявленного изобретения, термин "амфипатичный пептид" относится к пептиду, имеющему определенное расположение гидрофильных и гидрофобных групп, например, амфипатичные пептиды могут являться альфа-спиральными, с превалирующими неполярными боковыми цепями вдоль одной стороны спирали и полярными остатками вдоль остальной части поверхности.
Термин "гидрофобная группа", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к химическим группам, как, например, аминокислотные боковые цепи, которые преимущественно водонерастворимы, но растворимы в масляной фазе, причем растворимость в масляной фазе выше, чем растворимость в воде или водной фазе. В воде, аминокислоты с гидрофобной боковой цепью, взаимодействуют друг с другом для получения неводной среды. Примерами аминокислотных остатков с гидрофобными боковыми цепями являются остатки валина, изолейцина, лейцина, метионина, фенилаланина, триптофана, цистеина, аланина, тирозина и пролина.
Термин "гидрофобный пептид", в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к гидрофобному пептиду, предпочтительно состоящему из преимущественно аминокислотных остатков с гидрофобными группами. Такой пептид предпочтительно состоит из преимущественно гидрофобных аминокислотных остатков, т.е., как минимум примерно 20, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или как минимум примерно 100 % аминокислотных остатков, являющихся гидрофобными аминокислотными остатками. Те аминокислотные остатки, которые не являются гидрофобными, -предпочтительно нейтральные и предпочтительно не гидрофильные.
Термин "метка" ("маркер"), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, относится к аминокислотной последовательности, которая в традиционной области техники слита с или включена в другую аминокислотную последовательность с целью: а) улучшения экспрессии всей аминокислотной последовательности или полипептида, б) содействия очистке всей аминокислотной последовательности или полипептида, в) содействия иммобилизации всей аминокислотной последовательности или полипептида, и/или г) содействия детекции (обнаружения) всей аминокислотной последовательности или полипептида. Примерами меток являются His метки, например, His5-MeTKH, Швб-метки, His7-MeTKH, HisS-метки, His9-MeTKH, HislO-метки, His 11-метки, His 12-метки, Hisl6-MeTKH и His20- метки, Strep-метки, Avi-метки, Мус-метки, GST-метки, JS-метки, цистеин-метки, FLAG-метки, НА- метки, тиоредоксин- или мальтоза-связывающие белки (МСБ), CAT, GFP, YFP, и т.д. Специалистам в данной области техники известно большое количество меток, приемлемых для различных практических применений. Метка, например, может придавать меченому полипептиду свойство связывания с антителом в различных форматах твердофазного иммуноферментного анализа или прочих промышленных применениях.
Термин "содержащий" ("включающий"), в том смысле, в котором он используется в описании заявленного изобретения, не ограничивается понятием "состоящий из" (т.е. исключающий присутствие прочих дополнительных
субстанций). Напротив, термин "содержащий" подразумевает возможное наличие дополнительного вещества. Термин "содержащий" охватывает преимущественно осуществимые варианты практического воплощения в объеме притязаний заявленного изобретения с формулировкой "состоящий из" (т.е. исключающий присутствие прочих дополнительных субстанций) и "содержащий, но не [исключительно] состоящий из" (т.е. требующий присутствия прочих дополнительных субстанций), с предпочтением первому варианту.
Полипептид согласно заявленному изобретению может демонстрировать в аминокислотной последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1 как минимум один (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или даже все 17) из следующего перечня: Х14 не является С; Х23 не является С; Х50 не является С; Х82 является I; Х122 является М; Х149 является Р; XI54 является Т, XI60 является Т; XI67 является L; XI79 является F; XI80 является Е; XI86 является Y; Х206 является N или V, Х212 является N; Х224 является Q; Х230 является Y и/или Х232 является Т. Следует понимать, что номер, указывающий на позицию соответствующего аминокислотного остатка, представляет относительную позицию в последовательности согласно SEQ ID N0:1, а не всю полную аминокислотную последовательность полипептида согласно заявленному изобретению, которая может быть и более длинной.
Новаторский полипептид демонстрирует, как упомянуто выше, как минимум 90% идентичность последовательности. Такой полипептид может, вследствие этого, иметь более высокий уровень идентичности последовательности, например, может иметь как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 98,5%, как минимум примерно 99% (т.е., отклонение менее, чем на 3 аминокислоты), как минимум примерно 99,3% (т.е., отклонение менее, чем на 2 аминокислоты), как минимум примерно 99,5%, как минимум примерно 99,6%
или даже 100% идентичности последовательности с последовательностью SEQ IDNO: 1.
Новаторский полипептид, содержащий последовательность, разделяющую заданный уровень идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (или ее прочие специфические последовательности, см.далее по тексту) может, например, отклоняться от эталонной последовательности при помощи аддиции, замены, вставки (инсерции) или делеции одного или более аминокислотных остатков и всех возможных их комбинаций. Только лишь для ясности понимания, указано, что данные комбинации относятся к определенным позициям в последовательности. "Деления", сопровождаемая "аддицией", или "аддиция", сопровождаемая "делецией" одной или более аминокислот, в той же самой относительной позиции, не является комбинацией "аддиции" и "делеции" (или наоборот), но попадает в рамки термина "замена". Предпочтительно, отклонения в последовательности от последовательности SEQ ID NO: 1 (или ее прочих специфических последовательностей, см.далее по тексту) являются консервативными, т.е. консервативными заменами. Даже боле предпочтительно, отклонение в последовательности ограничивается теми позициями в SEQ ID NO: 1 (или ее прочих специфических последовательностях, см.далее по тексту), которые были определены как не критичные для ферментной активности, т.е. XI, Х14, Х23, Х50, Х82, Х122, Х149; Х160, Х167, Х179, Х180, Х186; Х206; Х212; Х224; Х230 и/или Х232.
Предпочтительно, полипептид согласно заявленному изобретению демонстрирует в аминокислотной последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичности последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1 остаток глутаминовой килоты в позиции 115. Как показано в публикации Briers et al. (Molecular Microbiology (2007) 65(5), 1334-1344), мутация E115A привела к потере активности примерно 70% энзима. Таким образом, поскольку новаторский полипептид, содержащий данную мутацию, не будет приводить к потере активности и может выполнять различные технические функции, несомненно предпочтительно, чтобы данная
мутация отсутствовала в удлинении последовательности согласно SEQ ID NO: 1 в пределах новаторского полипептида.
В особенно предпочтительном варианте практического воплощения заявленного изобретения, полипептид согласно заявленному изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 1.
Авторы заявленного изобретения обнаружили, что три остатка цистеина в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5(KZ144 последовательность эндолизина) не играют существенной роли в ферментной активности. Так, в последовательности согласно SEQ ID NO: 1 (консенсусная последовательность согласно заявленному изобретению) новаторского полипептида (или как минимум 90% идентичности последовательности с ней), в некоторых воплощениях Х14 не является С, Х23 не является С, или Х50 не является С. Комбинации возможны, например, Х14 и Х23 не являются С, Х14 и Х50 не являются С, или Х23 и Х50 не являются С. Аналогично, также возможно, что ни Х14, ни Х23, ни Х50 не являются С. В принципе, данные аминокислотные остатки можно удалить или заменить любыми другими аминокислотами. Примерами таких других аминокислот являются S, R и N. Таким образом, Х14 может, например, являться S, N, или R; более предпочтительно S или R; наиболее предпочтительно R; Х23 может, например, являться S, N, или R, более предпочтительно S; и Х50 может, например, являться S, N, или R, более предпочтительно S или N; наиболее предпочтительно N. XI4, Х23 и Х50 могут, естественно, иметь различные аминокислотные замены, например Х14 может являться R, а Х23 и Х50 могут являться S; или Х14 и Х23 являются S, а Х50 - N; Х14 может являться R, а Х23 - S, Х50 - N и т.п. Любая другая возможная комбинация также применима в данном изобретении. Предпочтительны консервативные аминокислотные замены. Особенно предпочтительна замена остатком серина остатка цистеина. Таким образом, особенно предпочтительные примеры согласно заявленному изобретению следующие: Х14 является S, Х23 является S или Х50 является S. Конечно, возможны и такие варианты: Х14 и Х23 являются S, или Х14 и Х50 являются S, или Х23 и Х50 являются S. XI4, Х23 и
Х50 также могут быть все S. Отсутствие одного или более, или даже всех этих трех остатков цистеина обладает преимуществом в том, что снижается риск агрегации (например, путем нежелательного образования дисульфидных мостиков) полипептида согласно заявленному изобретению, что делает данный вариант предпочтительным воплощением заявленного изобретения.
Помимо необязательности наличия вышеупомянутых остатков цистеина, авторы заявленного изобретения также обнаружили, что прочие различные остатки в последовательности SEQ ID NO: 5 также не являются незаменимыми и, более того, могут быть заменены другими остатками, увеличивая таким образом, например, теплоустойчивость новаторского полипептида. Примерами таких замен являются X82I, Х122М, Х149Р; Х154Т, Х160Т, X167L, X179F, Х180Е, X186Y, X206V, X206N, X212N, X230Y и Х232Т. Данные замены могут быть единичными или в любой комбинации. Типичной комбинацией является сочетание Х122М и Х160Т. Прочими неограничительными примерами комбинаций служат X82I, X206V плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х160Т, X206V, плюс X232T;X82I, Х122М, Х160Т, X206N, плюс X232T;X82I, Х122М, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, Х160Т, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х160Т, Х180Е, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х160Т, X186Y, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х160Т, X206V, X230Y, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, Х160Т, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X167L, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X179F, X206V, плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X206V, X212N плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, X206V, X224Q плюс Х232Т; X82I, Х122М, Х149Р, Х154Т, X206V, плюс Х232Т и т.п. Естественно, данный второй тип аминокислотных модификаций можно комбинировать с вышеупомянутыми заменами цистеина в любой возможной комбинации. Неограничивающими примерами данных комбинаций являются: X14S, X50S, Х122М and Х160Т; X14S, X50S, X82I, Х122М, Х160Т, X206V, и Х232Т; X14S, X50S, X82I, Х122М, Х160Т, X206N, и X232T;X14S, X50S, X82I, Х122М, X206V, и Х232Т; X14S, X50S, X82I, Х122М, Х149Р, Х160Т, X206V, и Х232Т; X14S, X50S, X82I, Х122М, Х160Т, Х180Е, X206V, и Х232Т; X14S, X50S, X82I, Х122М,
Х160Т, X186Y, X206V, и Х232Т; X14S, X50S, X82I, Х122М, Х160Т, X206V, X230Y, и Х232Т; X14R, X50S,X82I, Х122М, Х160Т, X206V, и Х232Т; X14S, X50N,X82I, Х122М, Х160Т, X206V, и Х232Т; X14R, X50S, X82I, Х122М, Х149Р, X206V, и Х232Т; X14R, X50S, X82I, Х122М, Х149Р, Х160Т, X206V, и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, X206V, и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, X167L, X206V, и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, X179F, X206V, и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, X206V, X212N, и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, X206V, X224Q и Х232Т; X14R, X50N, X82I, Х122М, Х149Р, Х154Т, X206V, и Х232Т; и т.п.
В SEQ ID NO: 1 (консенсусная последовательность согласно заявленному изобретению) первый аминокислотный остаток обозначен как либо отсутствующий, либо как любая аминокислота, в частности, М. Результаты проведенных исследований, авторами заявленного изобретения, и из предшествующего уровня техники (см. W0 2010/149792) показывают, что N-терминальный метионин KZ144 является необязательным. Таким образом, в некоторых воплощениях заявленного изобретения, позиция XI в последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1 в новаторском полипептиде не является М. Если полипептид согласно заявленному изобретению демонстрирует, например, на N-терминальном конце последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 1, дополнительные элементы последовательности, таковые могут иметь полезные свойства, например, для повышения эффективности экспрессии в клетке-хозяине, в случае, если метионин в позиции 1 по SEQ ID NO: 1 удален или заменен на другую аминокислоту с целью избежать инициирующего кодона в соответствующей нуклеотидной последовательности, что может потенциально привести к одновременной экспрессии полипептида с отсутствующими дополнительными элементами последовательности, расположенными преимущественно на N-терминальном конце. С другой стороны, если отсутствуют дополнительные элементы последовательности на N-терминальном конце новаторского полипептида, XI, конечно, является предпочтительно метионином (например, для экспрессии). Однако, для ферментной активности, XI никогда не требуется.
Последовательности, попадающие в определение SEQ ID NO: 1, которая в особенности была протестирована авторами изобретения, представляют собой, например, SEQ ID NOs: 6-27 (и соответствующие последовательности без N-терминального метионина, SEQ ID NOs: 28-49).
Следует понимать, что все вышеописанное касательно исходной последовательности SEQ ID N0:1 относится в аналогичной степени и к более специфическим последовательностям. Так, исключительно для ясности понимания упомянуто, что полипептид согласно заявленному изобретению, содержащий последовательность, демонстрирующую как минимум 90% идентичность последовательности с исходной последовательностью SEQ ID NO: 1 как описано выше, может в предпочтительных вариантах практического воплощения несомненно демонстрировать аналогичным способом как минимум 90% идентичность последовательности с более специфическими последовательностями SEQ ID N0:1, изложенными или даже раскрытыми в данном описании. Таким образом, в предпочтительных воплощениях заявленного изобретения, полипептид согласно заявленному изобретению может, например, содержать последовательность, демонстрирующую как минимум 90% идентичность последовательности с последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 6-49, причем полипептид не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4.
Полипептид согласно заявленному изобретению может содержать, помимо энзимной аминокислотной последовательности, например, последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (или другими последовательностями, попадающими в данное определение), дополнительные удлинения аминокислотной последовательности, например, аналогичные раскрытым в WO 2010/149792. Полипептид согласно заявленному изобретению может, например, дополнительно содержать как минимум одно удлинение аминокислотной последовательности, выбираемое из группы, состоящей из
амфипатичного пептида, катионного пептида, поликатионного пептида, гидрофобного пептида или натурального антимикробного пептида, как, например, суши-пептид и дефензин. Такие дополнительные удлинения аминокислотной последовательности могут улучшать антимикробные войства новаторского полипептида. В некоторых воплощениях, новаторский полипептид может содержать как минимум два различных удлинения аминокислотной последовательности, выбираемое из группы: амфипатичный пептид, катионный пептид, поликатионный пептид, гидрофобный пептид или натуральный антимикробный пептид, как, например, суши-пептид и дефензин.
Данные одно или более дополнительные удлинения аминокислотной последовательности могут присутствовать на N- или С-концах последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1. Они могут, например, присутствовать на N- или С-концах новаторского полипептида. Предпочтительными примерами таких дополнительных удлинений аминокислотной последовательности (без ограничительного признака) являются последовательности KRK и SEQ ID NOs: 50-120, как описано подробно далее по тексту. Полипептид согласно заявленному изобретению может содержать как минимум одно дополнительное удлинение аминокислотной последовательности, выбираемое из данной группы. Для дополнительной информации, в особенности, что касается общих и специфических характеристик возможных дополнительных удлинений аминокислотной последовательности, см.также, например, WO 2010/023207, WO 2010/149792, WO 2010/149795 и WO 2012/085259.
Примеры удлинений катионной и поликатионной аминокислотных последовательностей приведены в нижеследующей таблице.
Таблица 1:
удлинение аминокислотной последовательности
длина SEQ ID NO:
KRKKRK
SEQ Ш N0:50
KRXKR
SEQ Ш N0:51
KRSKR
SEQ Ш N0:52
KRGSG
SEQ Ш N0:53
KRKKRKKRK
SEQ Ш N0:54
RRRRRRRRR
SEQ Ш N0:55
KKKKKKKK
SEQ Ш N0:56
KRKKRKKRKK
SEQ Ш N0:57
KRKKRKKRKKRK
SEQ Ш N0:58
KRKKRKKRKKRKKR
SEQ Ш N0:59
KKKKKKKKKKKKKKKK
SEQ Ш N0:60
KRKKRKKRKKRKKRKKRK
SEQ Ш N0:61
KRKKRKKRKKRKKRKKRKK
SEQ Ш N0:62
RRRRRRRRRRRRRRRRRRR
SEQ Ш N0:63
KKKKKKKKKKKKKKKKKKK
SEQ Ш N0:64
KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
SEQ Ш N0:65
KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKK
SEQ Ш N0:66
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK
SEQ Ш N0:67
KRKKRKKRKRGS GKRKKRKKRK
SEQ Ш N0:68
KRKKRKKRKRGS GS GKRKKRKKRK
SEQ Ш N0:69
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKK
SEQ Ш N0:70
KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRK
SEQ Ш N0:71
KRKKRKKRKRGS GS GKRKKRKKRKGS GS GKRKKRKK RK
SEQ Ш N0:72
KRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRKKRK KRK
SEQ Ш N0:73
KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRKKRKKRKRS KRK KRKKRK
SEQ Ш N0:74
Примеры антимикробных аминокислотных последовательностей, которые могут применять в практических воплощениях заявленного изобретения, приведены в нижеследующей таблице 2.
Эскулетин 1
GIFSKLGRKKIKNLLISGLKNVGKEVGMDVVRTG IKIAGCKIKGEC
SEQ ID NO: 100
Тахилепсин
RWCFRVCYRGICYRKCR
SEQ ID NO: 101
Андроктонин
RSVCRQIKICRRRGGCYYKCTNRPY
SEQ ID NO: 102
Альфа-дефензин
DCYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFCC
SEQ ID NO: 103
Бета-дефензин
NPVSCVRNKGICVPIRCPGSMKQIGTCVGRAVKC CRKK
SEQ ID NO: 104
Тета-дефензин
GFCRCLCRRGVCRCICTR
SEQ ID NO: 105
Дефензин (сапецин А)
ATCDLLSGTGINHSACAAHCLLRGNRGGYCNGK AVCVCRN
SEQ ID NO: 106
Тионин (crambin)
TTCCPSIVARSNFNVCRIPGTPEAICATYTGCIIIPG ATCPGDYAN
SEQ ID NO: 107
Дефензин из хрена
QKLCQRPS GTWS GVCGNNNACKNQCIRLEKARH GSCNYVFPAHCICYFPC
SEQ ID NO: 108
Дрозомицин
DCLS GRYKGPC A VWDNETCRRVCKEEGRS S GHC SPSLKCWCEGC
SEQ ID NO: 109
Гепсидин
DTHFPICIFCCGCCHRSKCGMCCKT
SEQ ID NO: 110
Вас 5
RFRPPIRRPPIRPPFYPPFRPPIRPPIFPPIRPPFRPPL GRPFP
SEQ ID NO: 111
PR-39
RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGFPPRFPPR FP
SEQ ID NO: 112
Пиррокорицин
VDKGSYLPRPTPPRPIYNRN
SEQ ID NO: 113
Гистатин 5
DSHAKRHHGYKRKFHEKHHSHRGY
SEQ ID NO: 114
Как минимум одним дополнительным удлинением аминокислотной последовательности может являться суши-пептид, описанный Ding JL, Li Р, Но BCell Mol Life Sci. 2008 Apr;65(7-8):1202-19.The Sushi peptides: structural
characterization and mode of action against Gram-negative bacteria. Особенно предпочтителен суши 1 пептид согласно SEQ ID NO: 115. Остальными предпочтительными суши-пептидами являются суши-пептиды S1 и S3 и их мультиплеты; FASEB J. 2000 Sep;14(12): 1801-13.
Предпочтительными гидрофобными пептидами являются Walmaghl с аминокислотной последовательностью согласно SEQ ID NO: 116 и гидрофобный пептид с аминокислотной последовательностью согласно Phe-Phe-Val-Ala-Pro (SEQ ID NO: 117).
Предпочтительными амфипатичными пептидами являются а4-спираль Т4 лизоцима согласно SEQ ID NO: 118 и WLBU2-BapnaHTy, имеющие аминокислотную последовательность согласно SEQ ID NO: 119 и Walmagh 2 согласно SEQ ID NO: 120.
Как упомянуто выше, полипептид согласно заявленному изобретению может содержать как минимум одно дополнительное удлинение аминокислотной последовательности, выбираемое из группы, состоящей из: KRK и SEQ ID NOs: 50-120. Соответствующими примерами являются, например, полипептиды, содержащие последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 121-127 (и соответствующих последовательностей без N-терминального метионина, SEQID NOs: 128-134.
Полипептид согласно заявленному изобретению содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID N0:1, причем полипептид не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4. Таким образом, полипептид согласно заявленному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум 91,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 121 - 134, причем полипептид не содержит ни
аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4.
Такой новаторский полипептид может, например, содержать последовательность, демонстрирующую более высокий уровень идентичности последовательности по сравнению с 91,5% аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 121 - 134, например, может демонстрировать как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 98,5%, как минимум примерно 98,75%, как минимум примерно 99% (например, отклонение менее 3 аминокислот), как минимум примерно 99,5% (например, отклонение менее 2 аминокислот), как минимум примерно 99,6% или даже 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 121 - 134.
В добавление, и вне зависимости от присутствия в новаторском полипептиде одного или более дополнительных удлинения аминокислотных последовательностей, упомянутых выше, полипептид может дополнительно содержать одну или более маркерных последовательностей. Такие маркерные последовательности могут присутствовать на N-терминальном или С-терминальном конце последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1. Они могут, например, быть расположены на N-терминальном или С-терминальном конце новаторского полипептида. В предпочтительном воплощении, одна или более маркерных последовательностей расположены на С-терминальном конце аминокислотной последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1.
Одна или более маркерных последовательностей могут, например, быть сцеплены с аминокислотной последовательностью, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с
последовательностью SEQ ID NO: 1 напрямую или через короткий линкер из 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно из 1 до 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно из 1 до 2 аминокислот. Линкерные последовательности предпочтительно являются лабильными (шарнирными) последовательностями, содержащими один или более остатков глицина. В технике известны многочисленные примеры меток, некоторые из которых были уже упомянуты выше. В контексте заявленного изобретения, особенно предпочтительной маркерной последовательностью является His-метка, предпочтительно His-метка согласно SEQ ID N0:135.
Длина полипептида согласно заявленному изобретению, в принципе, не ограничена, но предпочтительно не является избыточно большой. Предпочтительно, полипептид согласно заявленному изобретению имеет общую длину, не превышающую примерно 320 аминокислот, предпочтительно не превышающую примерно 310 аминокислот.
Специфические примеры полипептидов согласно заявленному изобретению можно выбрать из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 136-142 (и соответствующих последовательностей без N-терминального метионина, SEQ ID NOs: 143-149).
Полипептид согласно заявленному изобретению содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с SEQ ID N0:1, причем полипептид не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4. Таким образом, полипептид согласно заявленному изобретению может содержать аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 91,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 136 - 149, причем полипептид не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4.
Такой новаторский полипептид может, например, содержать последовательность, демонстрирующую более высокий уровень идентичности последовательности с 91,5% идентичности аминокислотной последовательности, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 136 - 149, например, может демонстрировать как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 98,5%, как минимум примерно 99%, как минимум примерно 99,25% (например, отклонение менее 3 аминокислот), как минимум примерно 99,5% (например, отклонение менее 2 аминокислот), как минимум примерно 99,6% или даже 100% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 136 - 149. Отклонения от SEQ ID NOs: 136 -149 могут в частности происходить в двух последовательностях, связывающих компоненты SMAP29 пептида, модифицированного KZ144 эндолизина и His-метки.
Полипептид согласно заявленному изобретению предпочтительно обладает способностью расщеплять пептидогликан грамотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter. В частности, полипептид согласно заявленному изобретению предпочтительно обладает способностью расщеплять пептидогликан Pseudomonasaeroginosa, в частности Pseudomonasaeroginosa ПА01, Campylobacter]ejuni и/или Campylobacter coli.
Пептидогликан-расщепляющую активность на грамотрицательных бактериях можно измерить при помощи хорошо известных в данной области техники анализов, например, при помощи муралитических тестов, в которых происходит проникновение через или удаление внешней мембраны грамотрицательных бактерий (например, с хлороформом) для обеспечения доступа предполагаемого энзима (фермента) к пептидогликанному слою. Если энзим активен, расщепление пептидогликанного слоя приведет к снижению опалесцентности (мутности), которое можно измерить фотометрией (см., например, Briers et al, J. Biochem. Biophys Methods 70: 531-533, (2007).
Дополнительно, заявленное изобретение относится к нуклеиновой кислоте, кодирующей полипептид согласно заявленному изобретению. Специалист в данной области техники, опираясь на принцип вырожденности генетического кода, будет иметь представление, каким способом можно генерировать данную нуклеиновую кислоту.
Дополнительно, заявленное изобретение относится к вектору, например, экспрессионному или клонирующему векторам, включающему нуклеиновую кислоту согласно заявленному изобретению.
Дополнительно, заявленное изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей полипептид согласно заявленному изобретению, нуклеиновую кислоту согласно заявленному изобретению, и/или вектор согласно заявленному изобретению.
В дальнейшем аспекте, заявленное изобретение относится к композиции, содержащей полипептид согласно заявленному изобретению, нуклеиновую кислоту согласно заявленному изобретению, вектор согласно заявленному изобретению, и/или клетку-хозяин согласно заявленному изобретению. Предпочтительно, упомянутая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемые разбавитель, эксципиент или носитель.
Как описано выше, полипептид согласно заявленному изобретению содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, отличающийся тем, что не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID NO: 3, ни SEQ ID NO: 4. Тем не менее, в дополнительном аспекте, и с некоторым отличием от вышеупомянутых полипептидов согласно заявленному изобретению, данное изобретение также дополнительно относится к полипептиду, содержащему аминокислотную
последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1, отличающемуся тем, что не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID NO: 152, ни SEQ ID NO: 4. Дополнительно, упомянутый полипептид в данном аспекте также не содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3. Все воплощения и комбинации полипептида согласно заявленному изобретению, раскрытые в данных описании, примерах или в формуле, и соответствующие нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяины и композиции, также специально рассчитаны в рамках данного дополнительного аспекта.
Примеры
Далее по тексту, представлены специфические примеры, иллюстрирующие различные воплощения и аспекты заявленного изобретения. Тем не менее, не следует рассматривать данные воплощения как ограничивающие объем заявленного изобретения. Наоборот, различные модификации заявленного изобретения, в дополнение к приведенным в данном описании, сопроводительных чертежах и примерах, будут, как станет очевидно специалистам в данной области техники, находиться в границах объема прилагаемой формулы изобретения.
Пример 1: Идентификация мутаций, стабилизирующих KZ144 эндолизин
Дл определения предпочтительных сайтов модификации в эндо лизине KZ144 (SEQ ID NO: 5), авторы изобретения на первом этапе применили целевую дестабилизацию белка-мишени. С данной целью, генерировали укороченный на N-терминальном конце KZ144 (SEQ ID NO: 150), и в его последовательность ввели мутации путем случайного мутагенеза (ПЦР сниженной точности), с последующим слитием и селекцией с использованием хлорамфеникольного теста (САТ-проба).
Температуру плавления белка предпочтительных образцов определили путем кругового дихроизма (КД). Изменения эллиптичности белков зарегистрировали при 220 нм как функцию температуры с использованием спектрометра Jasco J-815 CD и обработали в простой сигмовидной "складчатой" модели при помощи аналитического программного обеспечения JASCO. Температуры плавления белка (Tmelt) определили как среднюю точку конформационного перехода с уничтожением складок. Спектры зарегистрировали при концентрации белков 5.0-5.8 мкм при скорости нагрева 1°С/мин и времени инкубации 3 сек в объеме 410 мкл в 1 мм свеопоглощающей кварцевой кюветы Hellma. Измерения провели в 50 мМ буфера NaPh buffer, 300 мМ NaCl при рН 7.4, 7.0, 6.2 и 5.7.
Некоторые из определенных самых предпочтительных образцов приведены в нижеследующей таблице:
Таблица 3
Таким образом, идентифицированные стабилизирующие мутации могут вводить в прочие последовательности, например, в качестве полнодлинных последовательностей, также повышающих стабильность.
В последующем этапе, в некоторые конструкты ввели серии для замены остатков цистеина С14, С23 и/или С50 (позиция, обозначенная относительно SEQ ID NO: 5; консервативные замены). Остальные опробованные заместители в указанных позициях - N и R.
На следующем этапе экспериментов, протестировали различные комбинации мутаций в контексте полнодлинного эндолизина KZ144 (SEQ ID NO: 5):
Таблица 4
АА-Замена
# мутаций
0 Тм
Тм*
C14S C50S T82I I122M А160Т A206V S232T
57,6
+4,4
C14S C50S T82I I122M А160Т A206V N230Y S232T
57,8
+4,6
C14S C50S T82I I122M А160Т М180Е A206V S232T
57,7
+4,5
C14S C50S T82I I122M М149Р А160Т A206V S232T
58,9
+5,7
C14S C50S T82I I122M А160Т V186Y A206V S232T
56,7
+3,5
C14R C50S T82I I122M А160Т A206V S232T
59,9
+6,7
C14S C50S T82I I122M Т160А A206V S232T
58,3
+5,1
C14S C50N T82I I122M А160Т A206V S232T
58,5
+5,3
C14R C50S T82I I122M М149Р А160Т A206V S232T
+7,9
C14R C50S T82I I122M A206V S232T М149Р
61,7
+8,5
Пример 2: Температура плавления некоторых полипептидов согласно заявленному изобретению и минимальная ингибирующая концентрация выбранных бактериальных штаммов
Для построения полипептидов согласно SEQ ID NO 151 (без мутаций) и SEQ ID NOs: 136 -142 использовали литический фермент (gpl44) фага KZ Pseudomonas aeruginosa. В качестве сливающейся с пептидом клетки, выбрали SMAP-29. SMAP-29 был обнаружен в лейкоцитах овец и состоит из 29 аминокислот (RGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAG; молекулярная масса: 3.3 КДа, SEQ ID NO: 76). Построен из максимум двух ЛПС-связывающих сайтов, которые соединены центральным шарниром.
Клонирование
Построили молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие соответствующие пептид и эндолизин при помощи сайта рестрикции aNdel (5-CAT ATG-3 ) на 5 -конце молекулы нуклеиновой кислоты и сайта рестрикции Xhol (5-СТС GAGS') на 3-конце молекулы нуклеиновой кислоты. Пептид и эндолизин соединены посредством BamHI (5 -GGA ТСС-3 ).
Построили слитые белки путем сшивки как минимум двух последовательностей нуклеиновой кислоты с использованием стандартных технологий клонирования, описанных, например, Sambrook et al. 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Для этого, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептидное удлинение, частично расщепили, используя соответствующие рестриктазы Ndel и BamHI. После этого, расщепленные нуклеиновые кислоты, кодирующие пептидное удлинение, лигандировали в экспрессионном векторе рЕТ21 b (Novagen, Darmstadt, Germany), который перед этим также частично расщепили, используя соответствующие рестриктазы Ndel и BamHI. Затем, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую эндолизин, частично расщепили, используя соответствующие рестриктазы BamHI и Xhol, с тем, чтобы лигандировать эндолизин в экспрессионном векторе pET21b (Novagen, Darmstadt, Germany), который перед этим также частично расщепили, используя соответствующие рестриктазы BamHI и Xhol.
Последовательность слития пептид-эндолизин контролировали при помощи секвенирования ДНК и корректные клоны трансформировали в E.coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany) для экспрессии белка.
Очистка
Рекомбинантную экспрессию слитых белков осуществили в клетках Е. coli BL21(DE3) pLysS (Novagen, Darmstadt, Germany). Клетки выращивали до достижения оптической плотности OD60OHM = 0.5-0.8. Затем индуцировали экспрессию слитого белка с 0.5 мМ ИПТГ (изопропилтиогалактозида) и провели экспрессию при 37°С в течение 4 ч.
Клетки собрали центрифугированием в течение 20 мин при бОООг и разрушили ультразвуком на льду. Растворимую и нерастворимую фракции сырого экстракта E.coli сепарировали центрифугированием (Sorvall, SS34, 30 мин, 15 000 оборотов в мин). Все белки подвергли очистке при помощи Ni2+ аффинной хроматографии (Akta FPLC, GE Healthcare), с использованием С-концевой His6-метки, кодированной вектором рЕТ21Ь. Образцы микрофильтрировали (0.2 мкм) перед каждым этапом хроматографии.
Ni + аффинную хроматографию провели в 4 последующих этапа, все при комнатной температуре:
1. Эквшибрация Histrap FF 5 мл колонки (GE Healthcare) с максимум 10 объемами колонки отмывочного буфера (20 мМ имидазола, 1 мМ NaCl и 20 мМ ГЭПЭС при рН 7,4) при скорости потока 3-5 мл/мин.
2. Загрузка всего лизата (с требуемым белком-мишенью) в Histrap FF 5 мл колонку при скорости потока 3-5 мл/мин.
3. Отмывка колонки с максимум 10 объемами колонки отмывочного буфера для удаления несвязанного белка.
4. Элюирование связанного белка-мишени из колонки с увеличивающимся градиентным режимом с 15 объемами колонки элюирующего буфера (500 мМ имидазола, 500 мМ NaCl и 20 мМ ГЭПЭС при рН 7,4) до 100% при скорости потока 3-5 мл/мин.
Хроматографию гидрофобного взаимодействия (ХГВ) осуществили в 5 последовательных этапов, все при комнатной температуре:
1. Эквшибрация HiScreen Phenyl HP 5 мл колонки (GE Healthcare) с максимум 5 объемами колонки отмывочного буфера (20 мМ сульфата аммония, 1 мМ NaCl и 20 мМ ГЭПЭС при рН 7,4) при скорости потока 1-2 мл/мин.
2. Приготовление образца (5 мг на 1 мл колонки белкового пула из этапа аффинной очистки Ni2+) начинают с первого приготовления концентрации белка 0.5 мг/мл путем добавления заранее определенного объема отмывочного буфера из этапа аффинной очистки Ni2+. Затем регулируют концентраию сульфата аммония путем поступенчатого добавления заранее определенного объема стокового раствора сульфата аммония (3.8 М) до окончательной концентрации примерно 850 мМ.
3. Загрузка подготовленного образца в колонку HiScreen Phenyl HP 5 мл при скорости потока 1-2 мл/мин.
4. Отмывка колонки с 5 объемами колонки отмывочного буфера для удаления несвязанного белка.
5. Элюирование белка-мишени из колонки с 40% элюирующего буфера (500 мМ NaCl и 20 мМ ГЭПЭС при рН 7,4) при скорости потока 1-2 мл/мин. Белок-мишень вымывается в размытом максимуме на данном этапе.
Замена буфера путем диализа мембраны:
Элюирующий пул этапа гидрофобной интерактивной хроматографии диализировали (мембрана: регенерированная целлюлоза с MWCO: 6000-8000D) в буер хранения (500 мМ NaCl и 20 мМ ГЭПЭС; рН7.4) при 4°С. Фактор диализа 160-250.
Характеризация
Температуры плавления, характеризующие стабильность полипептидов согласно SEQ ID NOs: 136 -142 при повышенных температурах, определили при помощи спектроскопии кругового дихроизма (CD), как упомянуто выше.
Активность полипептидов согласно SEQ ID NOs: 136 -142 определили на Р. aeroginasa, С. jejuni и С. coli и характеризовали, как определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) на соответствующих штаммах.
Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК)
По аналогии с определением "минимальной ингибирующей концентрации (МИК)" для антибиотиков, МИК определили микроразбавлением. Тест на бактериях Campylobacter проводили полностью в микроаэрофильных условиях и при 42°С.
Схема проведения эксперимента:
Соответствующую, полученную за ночь, культуру разбавили 1:10. Ps. aeruginosa инкубировали при 37°С до OD600=0.6 (примерно 109 клеток/мл). Campylobacter
sp. инкубировали микроаэрофильно до OD600=0.08 (примерно 2,5x10 клеток/мл). Бактериальную культуру разбавили до концентрации от 2x105 до
8x10 КОЕ на мл в среде Мюллера-Хинтона (со стандартизированным содержанием катионов) и разделили на требуемое количество трубок.
Целевой полипептид добавили в различных концентрациях (определена как конечная концентрация мкг/мл в среде Мюллера-Хинтона). В случае Ps. aeruginosa, добавили ЭДТК к конечной концентрации 2 мМ. В случае Campylobacter sp, ЭДТК не использовали.
Смесь инкубировали на ночь при 37°С для Ps. Aeruginosa и при 42°С для Campylobacter. Бактериальный рост был визуально определен по наличию опалесцентности (в сравнении с отрицательным контролем). МИК определили как концентрацию в трубке без бактериального роста. Положительный (без целевого пептида и/или ЭДТК) и отрицательный контроль (среда Мюллера-Хинтона без бактерий) включили в эксперимент.
Результаты приведены в нижеследующей таблице: Таблица 5
ИМЦна ПОЛ1р
S82 [мкг/мл]
ИМЦна Camp, jejuni S371 [мкг/мл]
ИМЦна Camp, coli S344 [мкг/мл]
SEQID N0:
Мутации*
Концентрация [УФ]
Т [°С]
500 мкм ЭДТК
без ЭДТК
без ЭДТК
151
5,5 мкм
44,14
136
C14S C50S
5,2 мкм
49,07
137
T82I A206V S232T
5,4 мкм
45,4
138
T82I
5,5 мкм
47,57
Необходимо отметить еще раз, что указанная позиция относится к позиции в последовательности KZ144, SEQ ID NO: 5, а не к позиции SEQ ID NO: обозначенной в таблице.
Проведенные мутации не только повысили температуру плавления полипептидов SEQ ID NOs: 136 -142 в сравнении с полипептидом SEQ ID NO: 151, но также не повлияли на активность полипептида, даже в случае семикратной мутации SEQ ID NO: 141.
Пример 3: Теплоустойчивость полипептида согласно SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141
Для демонстрации того, что повышенная температура плавления на самом деле не влияет на теплоустойчивость соответствующих мутированных полипептидов, изобретатели в качестве примера подвергли мутированные полипептиды SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 141 действию температур, заведомо превышающих температуру плавления нативного немутированного референтного полипептида (SEQID N0: 151).
С данной целью, оба полипептида подвергли длительному непосредственному нагреву при температурах 51°С и 52°С. После этого, определили активность на штамме Pseudomonas aeruginosa в качестве модельной системы в адаптированных условиях.
Результаты приведены в нижеследующей таблице: Таблица 6
SEQ ID N0:
Мутации
Концентрация [УФ]
Нагревание
ИМЦ на П0Л1р S82 [мкг/мл] 500 мкм ЭДТК
139
C14S
3-4
C50S I122M А160Т
5,3 мкм
1мин5ГС
12,5
2мин5ГС
2мин 52°С
17,6
141
T82I A206V S232T I122M А160Т C14S C50S
3-6
5,45 мкм
1мин5ГС
2мин5ГС
2мин 52°С
12,5
Белковый бус
эер: 50 мМ
NaPh, рН 7.45 300 мМ NaCl
Как и ранее упомянуто, указанная позиция относится к позиции в пределах участка последовательности, соответствующего последовательности KZ144, SEQ ID NO: 5, а не к позиции в пределах полно-длинной последовательности SEQ ID NO: обозначенной в таблице.
Евразийский патентный поверенный
Владимир В. Гончаров
Регистрационный номер 184
SEQUENCE LISTING
<110> Lysando AG
<120> Modified KZ144 endolysin sequence
<130> LYS-021 PCT 1
<150> PCT/EP2013/073869
<151> 2013-11-14
<160> 152
<170> PatentIn version 3.5
<213> Artificial
<220>
<223> Consensus Sequence
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid or absent; in particular it can be methionine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular serine, arginine or aspargine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (23)..(23)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular serine, arginine or aspargine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (50)..(50)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular serine, arginine or aspargine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (82)..(82)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular threonine or isoleucine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (122)..(122)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular isoleucine or methionine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (149)..(149)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular
methionine or proline
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (154)..(154)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular leucine or threonine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (160)..(160)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular alanine or threonine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (167)..(167)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular isoleucine or leucine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (179)..(179)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular asparagine or phenylalanine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (180)..(180)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular methionine or glutamic acid
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (186)..(186)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular valine or tyrosine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (206)..(206)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular alanine, asparagine or valine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (212)..(212)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular threonine or asparagine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (224)..(224)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular proline or glutamine
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (230)..(230)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular asparagine or tyrosine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (232)..(232)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid, in particular serine or threonine
<400> 1
Xaa Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Xaa Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Xaa Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Xaa Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Xaa Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Xaa Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Xaa Lys Tyr Gly Val Xaa Thr Asp Pro Thr Gly Xaa
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Xaa Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Xaa Xaa Asn Ile Leu Arg Pro Xaa Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Xaa Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Xaa Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Xaa
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Xaa Pro Xaa Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gin Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 2
<211> 259
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> KZ144 endolysin without N-terminal methionine
<400> 2
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 3
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> KZ144 without N-terminal methionine, with selenomethionine
instead of methionine residues
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)7.(79)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (142)..(142)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (148)..(148)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (170)..(170)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (179)..(179)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (250)..(250)
<223> Xaa is selenomethionine
<400> 3
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Xaa Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Xaa Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Xaa Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Xaa Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Xaa Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Xaa Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225
230
235
240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Xaa Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
259
<210> <211>
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> Mutated KZ144 with E115A and without n-terminal methionine
<220>
<221> misc
<222> (114)..(114)
<223> mutation corresponding to position E115A in KZ144 endolysin
<400> 4
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Ala Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145
150
155
160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 5
<211> 260
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> phiKZgp144
<400> 5
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 6
<211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S
<400> 6
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232
<400> 7
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<213> artificial sequence
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160T
<400> 8
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180
185
190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 9
<211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160T
<400> 9
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 10
<211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S
<400> 10
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
Pro Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 11
<211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50S
<400> 11
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 12
<211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S
<400> 12
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 13 <211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with N230Y, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S
and C50S <400> 13
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Tyr Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 14 <211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with M180E, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S
<400> 14
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Glu Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 15 <211> 260
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with M149P, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S
and C50S <400> 15
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 16 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with V186Y, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S
and C50S
<400> 16
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Tyr Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 17
<211> 260 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14R and
C50S <400> 17
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 18
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, C14S and C50S
<400> 18
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 19 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50N
<400> 19
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 20
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14R, C50S, T82I, I122M, M149P, A206V and
<400> 20
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 21
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14R, C50S, T82I, I122M, M149P, A160T, A206V
and S232T
<400> 21
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 22 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, S232T, C14R and
C50N <400> 22
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 23 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, I167L, A206V, S232T, C14R
and C50N
<400> 23
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Leu Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 24
<211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, N179F, A206V, S232T, C14R
and C50N
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Leu Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Phe Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 25 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, T212N, S232T, C14R and C50N
<400> 25
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
Arg Phe Leu Asn Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys 260
<210> 26
<211> 260 <212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, P224Q, S232T, C14R
and C50N <400> 26
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Gln
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 27 <211> 260
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, L154T, A206V, S232T, C14R
and C50N
<400> 27
Met Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu
1 5 10 15
Gln Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly
20 25 30
Ile Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp
35 40 45
Asn Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu
50 55 60
Leu Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met
65 70 75 80
Pro Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala
85 90 95
Val Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala
100 105 110
Ser Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser
115 120 125
Ala Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile
130 135 140
Glu Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Thr Thr Asp Pro Thr Gly Ala
145 150 155 160
Leu Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile
165 170 175
Lys Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr
180 185 190
Asp Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg
195 200 205
Arg Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro
210 215 220
Lys Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser
225 230 235 240
Pro Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala
245 250 255
Ala His Arg Lys
260
<210> 28
<211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 28
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<211> 259 <212> PRT
<213> artificial sequence <220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232, without N-terminal methionine
<400> 29
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 30 <211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160T, without N-terminal methionine
<400> 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 31 <211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160T, without
N-terminal methionine
<400> 31
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 32
<211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 32
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 33
<211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 33
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 34 <211> 259
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 34
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 35 <211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with N230Y, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 35
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Tyr Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 36
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with M180E, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S
and C50S, without N-terminal methionine
<400> 36
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Glu Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 37
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> mutated KZ144 with M149P, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S
and C50S, without N-terminal methionine
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 38
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with V186Y, T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S, without N-terminal methionine
<400> 38
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Tyr Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 39 <211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14R and C50S, without N-terminal methionine
<400> 39
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 40
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, C14S and C50S,
without N-terminal methionine
<400> 40
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 41
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50N, without N-terminal methionine
<400> 41
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 42
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14R, C50S, T82I, I122M, M149P, A206V and S232T; without N-terminal methionine
<400> 42
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 43
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14R, C50S, T82I, I122M, M149P, A160T, A206V and S232T; without N-terminal methionine
<400> 43
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 44
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, S232T, C14R and
C50N, without N-terminal methionine
<400> 44
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 45 <211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, I167L, A206V, S232T, C14R and C50N, without N-terminal methionine
<400> 45
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Leu Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, N179F, A206V, S232T, C14R and C50N, without N-terminal methionine
<400> 46
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Leu Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Phe Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 47 <211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, T212N, S232T, C14R and C50N, without N-terminal methionine
<400> 47
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Asn Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 48
<211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, A206V, P224Q, S232T, C14R
and C50N, without N-terminal methionine
<400> 48
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Gln Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 49 <211> 259
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, I122M, M149P, L154T, A206V, S232T, C14R
and C50N, without N-terminal methionine
<400> 49
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Asn Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
65 70 75 80
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Pro Lys Tyr Gly Val Thr Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
245 250 255
His Arg Lys
<210> 50
<211> 6
<212> PRT
<213> artificial
<223> synthetic sequence
<400> 50
Lys Arg Lys Lys Arg Lys 1 5
<210> 51
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synethtic sequence
<220>
<221> misc_feature
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 51
Lys Arg Xaa Lys Arg 1 5
<210> <211> <212>
52 5
PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 52
Lys Arg Ser Lys Arg 1 5
<210> 53 <211> 5 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 53
Lys Arg Gly Ser Gly 1 5
<210> 54 <211> 9 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys 1 5
<210> 55 <211> 9 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 55
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg 1 5
<210> 56 <211> 8
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 56
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys 1 5
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 57
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10
<210> 58
<211> 12
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 58
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
1 5 10
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence <400> 59
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10
<210> 60
<211> 16
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 60
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
<210> 61
<211> 18
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 61
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys
<210> 62
<211> 19
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 62
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 63
Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg Arg
<210> 64 <211> 19 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 64
Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys
1 5 10 15
Lys Lys Lys
<210> 65
<211> 20
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 65
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys
<210> 66 <211> 21 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 66
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Lys
<210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence <400> 67
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys
<210> 68
<211> 22
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 68
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Lys Arg Lys
1 5 10 15
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
<210> 69
<211> 24 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 69
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
<210> 70
<211> 25
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 70
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
20 25
<210> 71
<211> 31
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 71
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
20 25 30
<210> 72 <211> 38 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 72
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Gly Ser Gly Ser Gly Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Gly Ser Gly Ser Gly Lys Arg Lys
20 25 30
Lys Arg Lys Lys Arg Lys
<210> 73
<211> 39
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys
1 5 10 15
Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg
20 25 30
Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
<210> 74 <211> 42 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 74
Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Lys Arg Lys Arg Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys Arg
20 25 30
Ser Lys Arg Lys Lys Arg Lys Lys Arg Lys
35 40
<210> 75
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 75
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser 35
<210> 76
<211> 29
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> SMAP-29 sheep
<400> 76
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly 20 25
<210> 77
<211> 13
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Indolicidine bovine
<400> 77
Ile Leu Pro Trp Lys Trp Pro Trp Trp Pro Trp Arg Arg
1 5 10
<210> 78
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Protegrin Porcine
<400> 78
Arg Gly Gly Arg Leu Cys Tyr Cys Arg Arg Arg Phe Cys Val Cys Val
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 79
<211> 31
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Cecropin P1 Mammal (pig)
<400> 79
Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys
1 5 10 15
Arg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro Arg
20 25 30
<210> 80
<211> 23
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Magainin frog
<400> 80
Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Lys Lys Phe Gly Lys Ala Phe
1 5 10 15
Val Gly Glu Ile Met Asn Ser
<210> 81
<211> 25
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pleurocidin fish
<400> 81
Gly Trp Gly Ser Phe Phe Lys Lys Ala Ala His Val Gly Lys His Val
1 5 10 15
Gly Lys Ala Ala Leu Thr His Tyr Leu 20 25
<210> 82
<211> 36
<212> PRT
<213> Aedes aegypti
<400> 82
Gly Gly Leu Lys Lys Leu Gly Lys Lys Leu Glu Gly Ala Gly Lys Arg
1 5 10 15
Val Phe Asn Ala Ala Glu Lys Ala Leu Pro Val Val Ala Gly Ala Lys
20 25 30
Ala Leu Arg Lys
<210> 83
<211> 40
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 83
Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His
1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Leu Gly Ile Pro Gln Gln Ala Ala
20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly
<210> 84
<211> 21
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Buforin II vertebrate
<400> 84
Thr Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His
1 5 10 15
Arg Leu Leu Arg Lys
<210> 85
<211> 39
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Sarcotoxin IA Fly
<400> 85
Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His
1 5 10 15
Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Gly Leu Gly Ile Ala Gln Gln Ala Ala
20 25 30
Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg 35
<210> 86
<211> 17
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 86
Ala Asn Arg Pro Val Tyr Ile Pro Pro Pro Arg Pro Pro His Pro Arg
1 5 10 15
Leu
87 24
<210> <211> <212> PRT
<213> unknown
<223> Ascaphine 5 Frog
<400> 87
Gly Ile Lys Asp Trp Ile Lys Gly Ala Ala Lys Lys Leu Ile Lys Thr
1 5 10 15
Val Ala Ser His Ile Ala Asn Gln 20
<210> 88
<211> 22
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Nigrocine 2 Frog
<400> 88
Gly Leu Leu Ser Lys Val Leu Gly Val Gly Lys Lys Val Leu Cys Gly
1 5 10 15
Val Ser Gly Leu Val Cys 20
<210> 89
<211> 24
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pseudin 1 Rana Frog
<400> 89
Gly Leu Asn Thr Leu Lys Lys Val Phe Gln Gly Leu His Glu Ala Ile
1 5 10 15
Lys Leu Ile Asn Asn His Val Gln
<210> 90
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ranalexin Frog
<400> 90
Phe Leu Gly Gly Leu Ile Val Pro Ala Met Ile Cys Ala Val Thr Lys
1 5 10 15
Lys Cys
<210> 91
<211> 26
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Melittin bee
<400> 91
Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu
1 5 10 15
Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gln Gln 20 25
<210> 92
<211> 25
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Lycotoxin 1 Spider
<400> 92
Ile Trp Leu Thr Ala Leu Lys Phe Leu Gly Lys His Ala Ala Lys Lys
1 5 10 15
Leu Ala Lys Gln Gln Leu Ser Lys Leu
20 25
<210> 93
<211> 19
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Parasin 1 Fish
<400> 93
Lys Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
1 5 10 15
Arg Ser Ser
<210> 94
<211> 39
<212> PRT
<213> unknown
<223> Buforin I Toad
Ala Gly Arg Gly Lys Gln Gly Gly 1 5
Lys Val Arg Ala Lys Ala Lys Thr
10 15
Arg Ser Ser Arg Ala Gly Leu Gln Phe Pro Val Gly Arg Val His Arg
20 25 30
Leu Leu Arg Lys Gly Asn Tyr
<210> 95
<211> 34
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Dermaseptin 1 Frog
<400> 95
Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Lys Leu Gly Thr Met Ala Leu His
1 5 10 15
Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gln Gly
20 25 30
Thr Gln
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Bactenecin 1 Cow
<400> 96
Arg Leu Cys Arg Ile Val Val Ile Arg Val Cys Arg
1 5 10
<210> 97
<211> 21
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Thanatin Insect
<400> 97
Gly Ser Lys Lys Pro Val Pro Ile Ile Tyr Cys Asn Arg Arg Thr Gly
1 5 10 15
Lys Cys Gln Arg Met 20
<210> 98
<211> 19
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Brevinin 1T Rana frogs
<400> 98
Val Asn Pro Ile Ile Leu Gly Val Leu Pro Lys Val Cys Leu Ile Thr
1 5 10 15
Lys Lys Cys
<210> 99
<211> 26
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Ranateurin 1 Rana frog
<400> 99
Ser Met Leu Ser Val Leu Lys Asn Leu Gly Lys Val Gly Leu Gly Phe
1 5 10 15
Val Ala Cys Lys Ile Asn Ile Lys Gln Cys
20 25
<210> 100
<211> 46
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Esculentin 1 Rana frogs
<400> 100
Gly Ile Phe Ser Lys Leu Gly Arg Lys Lys Ile Lys Asn Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Gly Leu Lys Asn Val Gly Lys Glu Val Gly Met Asp Val Val Arg
20 25 30
Thr Gly Ile Lys Ile Ala Gly Cys Lys Ile Lys Gly Glu Cys
35 40 45
<212> PRT
<213> Limulus polyphemus
<400> 101
Arg Trp Cys Phe Arg Val Cys Tyr Arg Gly Ile Cys Tyr Arg Lys Cys
1 5 10 15
Arg
<210> 102
<211> 25
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Androctonin Scorpion
<400> 102
Arg Ser Val Cys Arg Gln Ile Lys Ile Cys Arg Arg Arg Gly Gly Cys
1 5 10 15
Tyr Tyr Lys Cys Thr Asn Arg Pro Tyr
20 25
<210> 103
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 103
Asp Cys Tyr Cys Arg Ile Pro Ala Cys Ile Ala Gly Glu Arg Arg Tyr
1 5 10 15
Gly Thr Cys Ile Tyr Gln Gly Arg Leu Trp Ala Phe Cys Cys
20 25 30
<210> 104
<211> 38
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> beta-defensin cow
<400> 104
Asn Pro Val Ser Cys Val Arg Asn Lys Gly Ile Cys Val Pro Ile Arg
1 5 10 15
Cys Pro Gly Ser Met Lys Gln Ile Gly Thr Cys Val Gly Arg Ala Val
20 25 30
Lys Cys Cys Arg Lys Lys 35
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> theta-defensin monkey
<400> 105
Gly Phe Cys Arg Cys Leu Cys Arg Arg Gly Val Cys Arg Cys Ile Cys
1 5 10 15
Thr Arg
<210> 106
<211> 40
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> defensin (sapecin A) insect
<400> 106
Ala Thr Cys Asp Leu Leu Ser Gly Thr Gly Ile Asn His Ser Ala Cys
1 5 10 15
Ala Ala His Cys Leu Leu Arg Gly Asn Arg Gly Gly Tyr Cys Asn Gly
20 25 30
Lys Ala Val Cys Val Cys Arg Asn 35 40
<210> 107
<211> 46
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Thionin (crambin) plant
<400> 107
Thr Thr Cys Cys Pro Ser Ile Val Ala Arg Ser Asn Phe Asn Val Cys
1 5 10 15
Arg Ile Pro Gly Thr Pro Glu Ala Ile Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Cys
20 25 30
Ile Ile Ile Pro Gly Ala Thr Cys Pro Gly Asp Tyr Ala Asn
35 40 45
<210> 108
<211> 50
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> defensin from radish
<400> 108
Gln Lys Leu Cys Gln Arg Pro Ser Gly Thr Trp Ser Gly Val Cys Gly
1 5 10 15
Asn Asn Asn Ala Cys Lys Asn Gln Cys Ile Arg Leu Glu Lys Ala Arg
20 25 30
His Gly Ser Cys Asn Tyr Val Phe Pro Ala His Cys Ile Cys Tyr Phe
35 40 45
Pro Cys
<210> 109
<211> 44
<212> PRT
<213> Drosophila melanogaster
<400> 109
Asp Cys Leu Ser Gly Arg Tyr Lys Gly Pro Cys Ala Val Trp Asp Asn
1 5 10 15
Glu Thr Cys Arg Arg Val Cys Lys Glu Glu Gly Arg Ser Ser Gly His
20 25 30
Cys Ser Pro Ser Leu Lys Cys Trp Cys Glu Gly Cys
35 40
<210> 110
<211> 25
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 110
Asp Thr His Phe Pro Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg
1 5 10 15
Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr 20 25
<213> unknown
<220>
<223> Bac 5 Cow
<400> 111
Arg Phe Arg Pro Pro Ile Arg Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Phe Tyr
1 5 10 15
Pro Pro Phe Arg Pro Pro Ile Arg Pro Pro Ile Phe Pro Pro Ile Arg
20 25 30
Pro Pro Phe Arg Pro Pro Leu Gly Arg Pro Phe Pro
35 40
<210> 112
<211> 39
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> PR-39 Pig
<400> 112
Arg Arg Arg Pro Arg Pro Pro Tyr Leu Pro Arg Pro Arg Pro Pro Pro
1 5 10 15
Phe Phe Pro Pro Arg Leu Pro Pro Arg Ile Pro Pro Gly Phe Pro Pro
20 25 30
Arg Phe Pro Pro Arg Phe Pro
<210> 113
<211> 20
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> Pyrrhocoricin Insect
<400> 113
Val Asp Lys Gly Ser Tyr Leu Pro Arg Pro Thr Pro Pro Arg Pro Ile
1 5 10 15
Tyr Asn Arg Asn
<210> 114
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 114
Asp Ser His Ala Lys Arg His His Gly Tyr Lys Arg Lys Phe His Glu
1 5 10 15
Lys His His Ser His Arg Gly Tyr 20
<210> 115
<211> 34
<212> PRT
<213> Limulus polyphemus
<400> 115
Gly Phe Lys Leu Lys Gly Met Ala Arg Ile Ser Cys Leu Pro Asn Gly
1 5 10 15
Gln Trp Ser Asn Phe Pro Pro Lys Cys Ile Arg Glu Cys Ala Met Val
20 25 30
Ser Ser
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 116
Gly Phe Phe Ile Pro Ala Val Ile Leu Pro Ser Ile Ala Phe Leu Ile
1 5 10 15
Val Pro
<210> 117
<211> 5
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 117
Phe Phe Val Ala Pro 1 5
<212> PRT
<213> unknown
<220>
<223> alpha4-helix of T4 lysozyme
<400> 118
Pro Asn Arg Ala Lys Arg Val Ile Thr Thr Phe Arg Thr
1 5 10
<210> 119
<211> 27
<212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 119
Lys Arg Trp Val Lys Arg Val Lys Arg Val Lys Arg Trp Val Lys Arg
1 5 10 15
Val Val Arg Val Val Lys Arg Trp Val Lys Arg 20 25
<210> 120 <211> 25 <212> PRT
<213> artificial
<220>
<223> synthetic sequence
<400> 120
Gly Lys Pro Gly Trp Leu Ile Lys Lys Ala Leu Val Phe Lys Lys Leu
1 5 10 15
Ile Arg Arg Pro Leu Lys Arg Leu Ala
20 25
<210> 121
<211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S plus SMAP-29
<400> 121
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys 290
<210> 122
<211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232 plus SMAP-29
<400> 122
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys
290
<210> 123 <211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160T plus SMAP-29
<400> 123
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys
290
<210> 124
<211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160T plus SMAP-29
<400> 124
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys
290
<210> 125
<211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S plus SMAP-29
<400> 125
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys
290
<210> 126 <211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50S plus SMAP-29 <400> 126
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys
290
<210> 127
<211> 291
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50S plus SMAP-29
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys 290
<210> 128
<211> 290
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S plus SMAP-29 without Met
<400> 128
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> 129
<211> 290
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232 plus SMAP-29 without Met
<400> 129
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> 130
<211> 290
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160T plus
<400> 130
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> 131
<211> 290
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160T plus SMAP-29
without Met
<400> 131
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> 132
<211> 290
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50S plus SMAP-29 w/o Met
<400> 132
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> 133 <211> 290 <212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S plus SMAP-29 without Met
<400> 133
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys 290
<210> 134
<211> 290 <212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50S plus SMAP-29 without Met <400> 134
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys
290
<210> <211> <212>
135 6
PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> His-Tag (6x)
<400> 135
His His His His His His 1 5
<210> 136
<211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S plus SMAP-29 and HisTag
<400> 136
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 137
<211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232 plus SMAP-29 and HisTag
<400> 137
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 138 <211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160Tplus SMAP-29 and HisTag
<400> 138
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 139
<211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160Tplus SMAP-29 and HisTag
<400> 139
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 140
<211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50Splus SMAP-29 and HisTag
<400> 140
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 141 <211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and C50Splus SMAP-29 and HisTag
<400> 141
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 142
<211> 299
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and C50Splus SMAP-29 and HisTag
<400> 142
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
20 25 30
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Ser Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Ile Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
275 280 285
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 143
<211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S and C50S plus SMAP-29 and HisTag, w/o Met
<400> 143
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 144 <211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V and S232 plus SMAP-29 and HisTag,
w/o Met
<400> 144
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 145 <211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M and A160Tplus
SMAP-29 and HisTag, w/o Met <400> 145
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Cys
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 146 <211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C50S, I122M and A160Tplus SMAP-29 and HisTag, w/o Met
<400> 146
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 147
<211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with C14S, C23S and C50Splus SMAP-29 and HisTag,
w/o Met
<400> 147
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Ser Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 148
<211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206V, S232T, I122M, A160T, C14S and
C50Splus SMAP-29 and HisTag, w/o Met
<400> 148
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
85 90 95
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Val Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 149
<211> 298
<212> PRT
<213> artificial sequence
<220>
<223> mutated KZ144 with T82I, A206N, S232T, I122M, A160T, C14S and C50S plus SMAP-29 and HisTag, w/o Met
<400> 149
Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys Lys
1 5 10 15
Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser Lys
20 25 30
Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Ser Gln Leu Gln Thr
35 40 45
Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile Phe
50 55 60
Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn Ser
65 70 75 80
Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu Phe
Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro Ile
100 105 110
Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu
115 120 125
Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile
130 135 140
Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Met Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr
145 150 155 160
Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn
165 170 175
Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Thr Leu Arg
180 185 190
Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu
195 200 205
Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr
210 215 220
Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Asn Ala Arg Arg Phe
225 230 235 240
Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu
245 250 255
Ala Gln Ala Asn Pro Thr Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys
260 265 270
Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His
275 280 285
Arg Lys Leu Glu His His His His His His
290 295
<210> 150
<211> 190
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KZ144 fragment 71-260 with Y75A
Pro Pro Ile Pro Ala Lys Thr Ile Pro Met Pro Thr Ala Asn Lys Ser
1 5 10 15
Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val Glu Asn Ala Thr Gly
20 25 30
Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser Ile Glu Ser Ala Phe
35 40 45
Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala Thr Gly Trp Phe Gln
50 55 60
Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu Asn Tyr Gly Met Lys
65 70 75 80
Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu Arg Lys Asp Pro Arg
85 90 95
Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys Glu Asn Met Asn Ile
100 105 110
Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp Thr Asp Leu Tyr Leu
115 120 125
Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg Phe Leu Thr Thr Gly
130 135 140
Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys Glu Ala Gln Ala Asn
145 150 155 160
Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro Lys Thr Ile Gln Glu
165 170 175
Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala His Arg Lys
180 185 190
<210> 151
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> KZ144 plus SMAP-29 and HisTag
<400> 151
Met Arg Gly Leu Arg Arg Leu Gly Arg Lys Ile Ala His Gly Val Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Gly Pro Thr Val Leu Arg Ile Ile Arg Ile Ala Gly Gly Ser
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
35 40 45
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
50 55 60
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
65 70 75 80
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
85 90 95
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Met Pro
100 105 110
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Met Asn Ala Val
115 120 125
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
130 135 140
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
145 150 155 160
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Met Ile Glu
165 170 175
Asn Tyr Gly Met Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
180 185 190
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Met Gly Ala Glu Leu Ile Lys
195 200 205
Glu Asn Met Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
210 215 220
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
225 230 235 240
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
245 250 255
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
260 265 270
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Met Asp Gly Lys Val Ala Ala
His Arg Lys Leu Glu His His His His His His 290 295
<210> 152
<211> 256
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> KZ144 without N-terminal methionine, with selenomethionine
instead of methionine residues
<220>
<221> misc_feature
<222> (79)7.(79)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (93)..(93)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (142)..(142)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (148)..(148)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (170)..(170)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (179)..(179)
<223> Xaa is selenomethionine
<220>
<221> misc feature
<222> (250)..(250)
<223> Xaa is selenomethionine
<400> 152
Lys Val Leu Arg Lys Gly Asp Arg Gly Asp Glu Val Cys Gln Leu Gln
1 5 10 15
Thr Leu Leu Asn Leu Cys Gly Tyr Asp Val Gly Lys Pro Asp Gly Ile
20 25 30
Phe Gly Asn Asn Thr Phe Asn Gln Val Val Lys Phe Gln Lys Asp Asn
35 40 45
Cys Leu Asp Ser Asp Gly Ile Val Gly Lys Asn Thr Trp Ala Glu Leu
50 55 60
Phe Ser Lys Tyr Ser Pro Pro Ile Pro Tyr Lys Thr Ile Pro Xaa Pro
65 70 75 80
Thr Ala Asn Lys Ser Arg Ala Ala Ala Thr Pro Val Xaa Asn Ala Val
85 90 95
Glu Asn Ala Thr Gly Val Arg Ser Gln Leu Leu Leu Thr Phe Ala Ser
100 105 110
Ile Glu Ser Ala Phe Asp Tyr Glu Ile Lys Ala Lys Thr Ser Ser Ala
115 120 125
Thr Gly Trp Phe Gln Phe Leu Thr Gly Thr Trp Lys Thr Xaa Ile Glu
130 135 140
Asn Tyr Gly Xaa Lys Tyr Gly Val Leu Thr Asp Pro Thr Gly Ala Leu
145 150 155 160
Arg Lys Asp Pro Arg Ile Ser Ala Leu Xaa Gly Ala Glu Leu Ile Lys
165 170 175
Glu Asn Xaa Asn Ile Leu Arg Pro Val Leu Lys Arg Glu Pro Thr Asp
180 185 190
Thr Asp Leu Tyr Leu Ala His Phe Phe Gly Pro Gly Ala Ala Arg Arg
195 200 205
Phe Leu Thr Thr Gly Gln Asn Glu Leu Ala Ala Thr His Phe Pro Lys
210 215 220
Glu Ala Gln Ala Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Asn Lys Asp Gly Ser Pro
225 230 235 240
Lys Thr Ile Gln Glu Val Tyr Asn Leu Xaa Asn Ile Leu Arg Pro Val
245 250 255
Формула изобретения (первоначально поданная)
1. Полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID N0:1, в которой SEQ ID NO: 1 отличается тем, что:
XI может отсутствовать или являться любой аминокислотой, в частности М, Х14 может являться любой аминокислотой, предпочтительно S, R или N, более
предпочтительно S или R Х23 может являться любой аминокислотой, предпочтительно S, R или N, более
предпочтительно S
Х50 может являться любой аминокислотой, предпочтительно S, R or N, более предпочтительно S или N
Х82 может являться любой аминокислотой, предпочтительно Т или I
Х122
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
I или М
Х149
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
М или Р
Х154
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
L или Т
Х160
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
А или Т
Х167
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
I или L
Х179
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
N или F
Х180
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
М или Е
Х186
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
V или Y
Х206
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
А, N или V
Х212
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
Т или N
Х224
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
Р или Q
Х230
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
N или Y
Х232
может
являться
любой
аминокислотой,
предпочтительно
S или Т;
и при этом полипептид не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID N0:3, ни SEQ ID NO: 4.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что демонстрирует в аминокислотной последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID N0:1 как минимум один из следующего перечня:
Х14
не является С;
Х23
не является С;
Х50
не является С;
Х82
является I
Х122
является М
Х149
является Р
Х154
является Т
Х160
является Т
Х167
является L
Х179
является F
Х180
является Е
Х186
является Y
Х206
является N или V
Х212
является N
Х224
является Q
Х230
является Y и/или
Х232
является Т.
3. Полипептид по пп. 1 или 2, в котором:
Х14 является S, R или N, более предпочтительно S или R
Х23 является S, R или N, более предпочтительно S
Х50 является S, R или N, более предпочтительно S или N
Х82 является Т или I
XI22 является I или М
XI49 является М или Р
XI54 является L или Т
Х160
является А или Т
Х167
является I или L
Х179
является N или F
Х180
является М или Е
Х186
является V или Y
Х206
является А, N или V
Х212
является Т или N
Х224
является Р или Q
Х230
является N или Y
Х232
является S или Т.
4. Полипептид по пп.2-3, в котором последовательность, демонстрирующая как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID N0:1, отклоняется от последовательности SEQ ID N0:1 как определено в пл.2- 3 только в одном или более остатках, выбираемых из XI, Х14, Х23, Х50, Х82, XI22, XI49, XI54, XI60, XI67, XI79, XI80, XI86, Х206, Х212, Х224, Х230 и/или Х232.
5. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что демонстрирует в аминокислотной последовательности последовательность с как минимум примерно 90% идентичностью последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1 остаток глутаминовой кислоты в позиции 115.
6. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что демонстрирует как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 99%, как минимум примерно 99,5% или даже 100% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1.
7. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит последовательность SEQ ID NO: 1.
8. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х14 не является С.
9. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х23 не является С.
10. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х50 не является С.
11. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х14 и Х23 не являются С.
12. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х14 и Х50 не являются С.
13. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х23 и Х50 не являются С.
14. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором ни Х14, ни Х23, ни Х50 не являются С.
15. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х14 является S.
16. Полипептид по любому из пп. 1-14, в котором Х14 является R.
17. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х23 является S.
18. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х50 является S.
19. Полипептид по любому из пп. 1-17, в котором Х50 является N.
20. Полипептид по любому из пп. 1-15 и 17-19, в котором Х14 и Х23 являются S.
21. Полипептид по любому из пп. 1-15, 17 и 18, в котором Х14 и Х50 являются S.
22. Полипептид по любому из пп. 1-18, в котором Х23 и Х50 являются S.
23. Полипептид по любому из пп.1-15, 17 и 18, в котором Х14, Х23 и Х50 являются S.
24. Полипептид по п. 16, в котором Х14 является R и Х50 является S.
25. Полипептид по п. 15, в котором Х14 является S и Х50 является N.
26. Полипептид по п. 16, в котором Х14 является R и Х50 является N.
27. Полипептид по п. 16, в котором Х149 является Р.
28. Полипептид по п.27, в котором Х160 является Т.
29. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х82 является I.
30. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х122 является М.
31. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х149 является Р.
32. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI54 является Т.
33. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI60 является Т.
34. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI67 является L.
35. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI79 является F.
36. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI80 является Е.
37. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI86 является Y.
38. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х206 является V.
39. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х206 является N.
40. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х212 является N.
41. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х224 является Q.
42. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х230 является Y.
43. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х232 является Т.
44. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором Х122 является М and XI60 является Т.
45. Полипептид по любому из предшествующих пл., в котором Х82 является I, Х206 является V и Х232 является Т.
46. Полипептид по п.27, в котором Х160 является А.
47. Полипептид по п.45, в котором Х122 является М и Х160 является Т.
48. Полипептид по п.45, в котором Х122 является М.
49. Полипептид по п.21, в котором Х122 является М и Х160 является Т.
50. Полипептид по п.47, в котором X14 является S и Х50 является S.
51. Полипептид по п.49, в котором Х82 является I, Х206 является N и Х232 является Т.
52. Полипептид по п.51, в котором Х149 является Р.
53. Полипептид по п.51, в котором Ml80 является Е.
54. Полипептид по п.51, в котором XI86 является Y.
55. Полипептид по п.51, в котором Х230 является Y.
56. Полипептид по п.24, в котором Х82 является I, Х122 является М, Х206 является V, и Х232 является Т.
57. Полипептид по п.56, в котором Х160 является Т.
58. Полипептид по пп.56 или 57, в котором Х149 является Р.
59. Полипептид по п.24, в котором Х82 является I, Х122 является М, Х160 является Т, Х206 является V, а Х232 является Т.
60. Полипептид по п.25, в котором Х82 является I, Х122 является М, Х160 является Т, Х206 является V, а Х232 является Т.
61. Полипептид по п.26, в котором Х82 является I, Х122 является М, Х149 является Р, Х206 является V, а Х232 является Т.
62. Полипептид по п.61, в котором XI67 является L.
63. Полипептид по п. 61, в котором XI79 является F.
64. Полипептид по п.61, в котором Х212 является N.
65. Полипептид по п.61, в котором Х224 является Q.
66. Полипептид по п.61, в котором Х154 является Т.
67. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором XI не является М.
68. Полипептид по любому из предшествующих пп., в котором SEQ ID NO: 1 представляет собой последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 6-49.
69. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 649.
70. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит дополнительно как минимум одно удлинение аминокислотной последовательности, выбираемое из группы, состоящей из амфипатичного пептида, катионного пептида, поликатионного пептида, гидрофобного пептида, натурального антимикробного пептида, суши-пептида и дефензина.
71. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит как минимум два различных удлинения аминокислотной последовательности, выбираемых из группы: амфипатичный пептид, катионный пептид, поликатионный пептид, гидрофобный пептид, натуральный антимикробный пептид, суши-пептид и дефензин.
72. Полипептид по любому из пп.70-71, в котором как минимум одно удлинение аминокислотной последовательности присутствует на N- или С-концах полипептида.
73. Полипептид по любому из пп.70-72, отличающийся тем, что содержит как минимум одно удлинение аминокислотной последовательности, выбираемое из группы, состоящей из: KRK и SEQ ID NOs: 50 - 120.
74. Полипептид по любому из пп.70-73, отличающийся тем, что содержит как минимум одно удлинение аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью SMAP-29, SEQ ID NO: 76.
75. Полипептид по п.74, в котором последовательность SMAP-29, SEQ ID NO: 76, расположена в полипептиде на N-терминальном конце последовательности, демонстрирующей как минимум примерно 90% идентичность последовательности с последовательностью SEQ ID NO: 1.
76. Полипептид по любому из пп.70-75, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 91,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 121-134, и при этом не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID NO: 3,nor SEQ ID NO: 4.
77. Полипептид по п.76, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 98,5%, как минимум примерно 98,75%, как минимум примерно 99%, или как минимум примерно 99,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 121-134.
78. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 121-134.
79. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит дополнительно маркерную последовательность.
80. Полипептид по п.79, в котором маркер расположен на С-терминальном конце аминокислотной последовательности, демонстрирующей как минимум 90% идентичность последовательности с SEQ ID N0:1.
81. Полипептид по любому из пп.79-80, в котором маркер сцеплен с аминокислотной последовательностью, демонстрирующей как минимум 90% идентичность последовательности с SEQ ID N0:1 напрямую или через короткий линкер из 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно из 1 до 5 аминокислотных остатков, более предпочтительно из 1 до 2 аминокислот.
82. Полипептид по любому из пп.79-81, отличающийся тем, что содержит гистидиновый маркер His-метку, предпочтительно His-метку в соответствии с SEQ ID N0:135.
83. Полипептид по любому из пп.79-82, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 91,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 136-149, и при этом не содержит ни аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, ни SEQ ID NO: 3.
84. Полипептид по п. 83, отличающийся тем, что содержит аминокислотную последовательность, демонстрирующую как минимум примерно 95%, как минимум примерно 96%, как минимум примерно 97%, как минимум примерно 98%, как минимум примерно 98,5%, как минимум примерно 98,75%, как минимум примерно 99%, или как минимум примерно 99,5% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, выбираемой из любых SEQ ID NOs: 136-149.
85. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что имеет общую длину, не превышающую примерно 320 аминокислот, предпочтительно не превышающую примерно 310 аминокислот.
86. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что содержит последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NOs: 136-149.
87. Полипептид по любому из предшествующих пп., отличающийся тем, что расщепляет пептидогликан грамотрицательных бактерий, в частности, бактерий Pseudomonas и/или Campylobacter bacteria.
88. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-87.
89. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п.88.
90. Клетка-хоозяин, содержащая полипептид по любому из пп.1-87, нуклеиновую кислоту по п.88, и/или вектор по п.89.
91. Композиция, содержащая полипептид по любому из пп.1-87, нуклеиновую кислоту по п.88, вектор по п.89 и/или клетку-хозяин по п.90.
92. Композиция по п.91, отличающаяся тем, что представляет собой фармацевтическую композицию, содержащую фармацевтически приемлемые разбавитель, эксципиент или носитель.
SEQ IDNQ:1
XKVLRKGDRGDEVXQLQTLLNLXGYDVGKPDGIFGNNTFNQWKFQKDNXLDSDGIVGK NTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPXAN KSRAAATPVMN AVENATGVRSQLLLTFASIESAFDY EXKAKTSSATGW FQFLTGTWKTMIENYGXKYGVXTDPTGXLRKDPRXSALMGAELIKEX XNILRPXLKREPTDTDLYLAHFFGPGXARRFLXTGQNELAATHFXKEAQAXPXIFYNKDGS PKTIQEVYNLMDGKVAAHRK
SEQ ID NQ:2
KVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGKPDGIFGNNTFNQWKFQKDNCLDSDGIVGKN TWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAAATPVMNAVENATGVRSQLLLTFASIESAFDYEI KAKTSSATGWFQ FLTGTWKTMIEN YGM KYGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNI LRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFLTTGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPK TIQEVYNLMDGKVAAHRK
SEO го коз (М=селенометтюнин^
KVLRKGDRGDEVCQLOTLLNLCGYDVGKPDGIFGNNTFNOWKFQKDNCLDSDGIVGKN TW AE L FS К YS PPIP YKTIPM PT AN К S RAAATP V M N AVE N ATG VRSQ LLLT FAS IE S A FD Y EI KAKTSSATGWFQFLTGTWKTMIENYGMKYGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNI LRPVLKREPTDTOLYLAHFFGPGAARRFLTTGQMELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPK TIQEVYNLMDGKVAAHRK
SEQ ID NQ:4
KVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGKPDGIFGNNTFNQWKFQKDNCLDSDGIVGKN TWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAAATPVMNAVENATGVRSQLLLTFASIASAFDYEI KAKTSSATGWFQ FLTGTWKTM IEN YGM KYGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNI LRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFLTTGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPK TIQEVYNLMDGKVAAHRK
SEQ ID NO: 5
MKVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGKPDGIFGNNTFNQVVKFQKDNCLDSDGIVGK NTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTAN KSRAAATPVMN AVENATGVRSQLLLTFASIESAFDY EI KAKTSSATGWFQ FLTGTWKTMIEN YGMKYGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENM N1LRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFLTTGQN ELAATHFPKEAQANPSIFYN KDGSP KTIQEVYNLMDGKVAAHRK
Фиг. 16
SEQ ID NO: 13 б
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVsQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNsLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAAA TPVMN AVENATGVRSQLLLTFASIESAFDYEIKAKTSSATGWFQF LTGTW KTMIENYGMK YGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEQ IDNQ:137
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNCLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPiANKSRAAA TPVMN AVENATGVRSQLLLTFAS I ESAFDYE I KAKTSSATGWFQF LTGTW KTMIENYGMK YGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGvARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPtlFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEP ID NO: 138
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNCLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPiANKSRAAA T P V M N AVE N AT G VRS Q L LLTF AS IE S A F D Y E m KAKTS S ATG W FQ F LTGTW KTMIE N Y G M KYGVLTDPTGtLRKDPRISALMGAELIKEMMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGvARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPtlFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEP ID NO: 139
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVsQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNsLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAAA TPVMN AVENATGVRSQLLLTFAS I ESAFDYEmKAKTSSATGWFQFLTGTWKTM IEN YGM KYGVLTDPTGtLRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEQ ID NO: 140
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVsQLQTLLNLsGYDVGKP DGIFGNNTFNQVVKFQKDNsLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAAAT PVMNAVEN ATGVRSQLLLTFASI ESAFDYE IKAKTSSATGW FQ FLTGTWKTMIEN YGMKY GVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRFLT TGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEQ ID NO: 141
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVsQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNsLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPiANKSRAAA TPVMN AVENATGVRSQLLLTFAS IE S A F D Y E m KAKTS S ATG W FQ F LTGT W KTM IEN YGM KYGVLTDPTGtLRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGvARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPtlFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEQ ID NO: 142
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVsQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNsLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPiANKSRAAA T P V M N AVE NAT G VRS Q L LLTF AS IE S A F D Y E m KAKTS S ATGW FQ F LTGTW KTMIE N Y G M KYGVLTDPTGtLRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGnARRFL TTGQNELAATHFPKEAQANPtlFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
SEQ ID NO: 151
MRGLRRLGRKIAHGVKKYGPTVLRIIRIAGGSKVLRKGDRGDEVCQLQTLLNLCGYDVGK PDGIFGNNTFNQWKFQKDNCLDSDGIVGKNTWAELFSKYSPPIPYKTIPMPTANKSRAA ATPVMNAVENATGVRSQLLLTFASIESAFDYEIKAKTSSATGWFQ FLTGTW KTMIENYGM KYGVLTDPTGALRKDPRISALMGAELIKENMNILRPVLKREPTDTDLYLAHFFGPGAARRF LTTGQNELAATHFPKEAQANPSIFYNKDGSPKTIQEVYNLMDGKVAAHRKLEHHHHHH
(19)
S232T
180
190
185
180
190
185
<400>
<400>
195 200 205
<210> 29
<210> 29
<220>
<220>
50 55 60
50 55 60
<400> 37
<400> 37
<210> 46 <211> 259
<210> 46 <211> 259
100
110
105
100
110
105
<220>
<220>
<400> 54
<400> 54
<210> 59 <211> 14
<210> 59 <211> 14
<210> 63 <211> 19
<210> 63 <211> 19
<212> PRT
/О 1 О ^ ^.A-
<212> PRT
/О 1 О ^ ^.A-
<400> 73
<400> 73
<220>
<220>
<220>
<220>
<400> 94
<400> 94
<210> 101 <211> 17
<210> 101 <211> 17
<211> 44
<210> 118 <211> 13
<210> 118 <211> 13
<210> 118 <211> 13
<210> 118 <211> 13
<210> 118 <211> 13
<210> 118 <211> 13
100
110
105
180
190
185
180
190
185
<400> 127
<400> 127
165
175
170
165
175
170
SMAP-2 9 without Met
SMAP-2 9 without Met
145
155
160
150
130
140
135
130
140
135
130
140
135
245
255
250
245
255
250
225
235
240
230
210 215 220
195
205
200
85 90 95
<400> 150
275
285
280
275
285
280
Фиг. 1a
Фиг. 1a
Фиг. 2a
Фиг. 2a
Фиг.26
Фиг.26