EA201690992A1 20161031 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2016\PDF/201690992 Полный текст описания [**] EA201690992 20141112 Регистрационный номер и дата заявки GB1320066.2 20131113 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок EP2014/074409 Номер международной заявки (PCT) WO2015/071330 20150521 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21610 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FCRN Название документа [8] C07K 16/28, [8] G01N 33/53 Индексы МПК [GB] Этерфолд Пол Алан, [GB] Ческа Томас Аллен, [GB] Финни Хелен Маргарет, [GB] Кеворкян Лара, [GB] Саркар Каушик, [GB] Смит Брайан Джон, [GB] Тайсон Керри Луиза Сведения об авторах [BE] ЮСБ БИОФАРМА СПРЛ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201690992a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Изобретение относится к антителам, специфичным к FcRn, к содержащим их композициям, к применению их в терапии, к способам экспрессии и необязательно к способам объединения в составе указанного антитела, ДНК, кодирующей антитела, и хозяев, содержащих указанную ДНК.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к антителам, специфичным к FcRn, к содержащим их композициям, к применению их в терапии, к способам экспрессии и необязательно к способам объединения в составе указанного антитела, ДНК, кодирующей антитела, и хозяев, содержащих указанную ДНК.


Евразийское (21) 201690992 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/28 (2006.01)
2016.10.31 G01N33/53 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2014.11.12
(54) АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FCRN
(31) (32)
1320066.2 2013.11.13
(33) GB
(86) PCT/EP2014/074409
(87) WO 2015/071330 2015.05.21
(71) Заявитель:
ЮСБ БИОФАРМА СПРЛ (BE)
(72) Изобретатель:
Этерфолд Пол Алан, Ческа Томас Аллен, Финни Хелен Маргарет, Кеворкян Лара, Саркар Каушик, Смит Брайан Джон, Тайсон Керри Луиза (GB)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) Изобретение относится к антителам, специфичным к FcRn, к содержащим их композициям, к применению их в терапии, к способам экспрессии и необязательно к способам объединения в составе указанного антитела, ДНК, кодирующей антитела, и хозяев, содержащих указанную ДНК.
2420-534235ЕА/072
АНТИТЕЛА, СПЕЦИФИЧНЫЕ К FCRN
Изобретение относится к антителам, специфичным к FcRn, к содержащим их композициям, к их применению в терапии, к способам экспрессии и необязательно к включению в состав указанного антитела, к ДНК, кодирующей антитела, и к хозяевам, содержащим указанную ДНК.
FcRn представляет собой нековалентный комплекс а-цепи
мембранного белка FcRn и |32-микроглобулина ((32М) . У взрослых млекопитающих FcRn играет ключевую роль в поддержании уровня антител в сыворотке путем функционирования в качестве рецептора, который связывает и утилизирует антитела IgG-изотипа. IgG-молекулы подвергаются эндоцитозу эндотелиальными клетками и, если они связываются с FcRn, то они повторно подвергаются обратному трансцитозу, например, в кровотоке. Напротив, IgG-молекулы, которые не связываются с FcRn, проникают в клетки и направляются по лизосомному пути деградации. Вариант IgGl, в котором His4 35 подвергнут мутации с получением аланина, приводит к селективной потере связывания FcRn и к существенно уменьшенному периоду полужизни в сыворотке (Firan et al. 2 001, International Immunology 13:993).
Предполагается, что FcRn представляет собой потенциальную мишень для некоторых аутоиммунных расстройств, вызванных по меньшей мере частично аутоантителами. Используемое в настоящее время лечение для некоторых таких расстройств включает плазмаферез. Иногда плазмаферез применяют наряду с иммуноподавляющей терапией при долгосрочной тактике лечения заболевания. Замещение плазмы предлагает самый быстрый краткосрочный ответ для удаления вредных аутоантител. Однако может быть целесообразным подавить продуцирование аутоантител иммунной системой, например, путем использования лекарственных средств, таких как преднизон, циклофосфамид, циклоспорин, микофенолат мофетил, ритуксимаб или их смеси.
Примеры заболеваний, которые могут подвергаться лечению с помощью плазмафереза, включают: Синдром Гийена-Барре;
Хроническую воспалительную демиелинизирующую полиневропатию;
синдром Гудпасчера; синдромы гипервязкости; криоглобулинемию;
Парапротеинемию; макроглобулинемию Вальденстрема; миастению;
тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру (ТТП)/гемолитико-
уремический синдром; гранулематоз Вегенера; синдром Ламберта-
Итона; антифосфолипидный синдром (APS или APLS);
микроскопический полиангиит; рецидивирующий очаговый и
сегментарный гломерулосклероз в трансплантированной почке;
синдром HELLP; синдром PANDAS; болезнь Рефсума; синдром Бехчета;
связанную с ВИЧ невропатию; базедову болезнь у младенцев и
новорожденных; пузырчатку обыкновенную; рассеянный склероз,
рабдомиолиз и аллоиммунные заболевания.
Плазмаферез иногда используется в качестве резервной терапии для удаления Fc-содержащих лекарственных средств, например в случаях крайней необходимости для уменьшения серьезных побочных эффектов.
Хотя плазмаферез пригоден при некоторых медицинских состояниях, имеются потенциальный риск и затруднения, связанные с данной терапией. Вставка довольно крупного внутривенного катетера может приводить к кровотечению, повреждению легкого (в зависимости от места вставки катетера), и, если катетер остается слишком надолго, то это может приводить к инфекции и/или к поражению вен с ограниченной возможностью повторения процедуры.
Процедура имеет дополнительные затруднения, ассоциированные с этим, например, когда кровь пациента вытекает из тела, попадая в прибор для плазмафереза, кровь при этом имеет тенденцию сворачиваться. Для снижения данной тенденции в одном общепринятом протоколе проводят инфузию цитрата, пока кровь протекает через цепь. Цитрат связывается с кальцием в крови, который является существенным для свертывания крови. Цитрат очень эффективен для предотвращения свертывания крови; однако его использование может приводить к угрожающему для жизни низкому уровню кальция. Это детектируют с помощью симптома Хвостека или симптома Труссо. Для предотвращения данного затруднения кальций инфузируют внутривенно, пока пациент подвергается плазмаферезу; кроме того, также осуществляют
добавку кальция через рот.
Другие сложности процедуры включают: гипотензию; потенциальное экспонирование с продуктами крови с риском трансфузионных реакций или заболеваний, передаваемых трансфузией, подавления иммунной системы пациента и кровотечения или гематомы в месте вставки иглы.
Дополнительные средства, которые обеспечивают плазмаферез, ограничены, и процедура является очень дорогой.
Альтернативой плазмаферезу является внутривенное введение
иммуноглобулина (IVIG), который представляет собой продукт
крови, содержащий объединенные поликлональные IgG,
экстрагированные из плазмы более тысячи доноров. Терапию осуществляют внутривенно, и ее продолжительность составляет в районе от 2 недель до 3 месяцев.
Осложнения IVIG-лечения включают головную боль, дерматит, вирусную инфекцию, вызванную контаминацией лекарственного продукта, например, ВИЧ или гепатит, отек легкого, аллергические реакции, острую почечную недостаточность, венозный тромбоз и асептический менингит.
Таким образом, имеется значительная неудовлетворенная потребность в терапии аутоиммунных расстройств, которая менее инвазивна и которая воздействует на пациентов с меньшими медицинскими осложнениями.
Таким образом, имеется значительная неудовлетворенная потребность в терапии иммунологических расстройств и/или аутоиммунных расстройств, которая менее инвазивна и которая воздействует на пациентов с меньшими медицинскими осложнениями.
Соответственно, агенты, которые блокируют или снижают связывание IgG с FcRn, могут пригодиться при лечении или предотвращении таких аутоиммунных и воспалительных заболеваний. Антитела к FcRn были описаны ранее в W02009/131702, WO2007/087289 и WO2006/118772.
Однако все равно остается потребность в получении улучшенных антител к FcRn.
Сущность Изобретения
Таким образом, в одном аспекте предлагается антитело к FcRn
или его связывающий фрагмент, содержащий тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область, где указанная вариабельная область содержит одну, две или три CDR, независимо выбранных из SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2 и SEQ ID N0:3, например, где CDR HI представляет собой SEQ ID N0:1, CDR Н2 представляет собой SEQ ID N0:2 и/или CDR НЗ представляет собой SEQ ID N0:3.
Таким образом, одно воплощение CDR HI представляет собой SEQ ID N0:1, и CDR Н2 представляет собой SEQ ID N0:2, или CDR HI представляет собой SEQ ID N0:1, и CDR НЗ представляет собой SEQ ID N0:3, или CDR Н2 представляет собой SEQ ID N0:2, и CDR НЗ представляет собой SEQ ID N0:3.
В другом аспекте предлагается антитело или фрагмент,
содержащие последовательность или комбинации
последовательностей, как определено в данном документе, например, вариабельную область родственной пары.
Антитела по изобретению блокируют связывание IgG с FcRn, и, как полагают, они подходят для снижения одной или нескольких биологических функций FcRn, включающих снижение периода полужизни антител в кровотоке. Это может быть полезно, так как дает возможность пациенту быстрее выводить антитела, такие как аутоантитела. Соответственно, антитела по изобретению уменьшают связывание IgG с FcRn.
Важно, что антитела по настоящему изобретению способны связываться с человеческим FcRn, например, при обоих рН б и 7,4 со сравнимой и высокой аффинностью связывания. Таким образом, предпочтительно, что антитела способны продолжать связываться с FcRn даже внутри эндосомы, максимизируя посредством этого блокировку связывания FcRn с IgG.
В одном воплощении, антитела или связывающие фрагменты по настоящему изобретению содержат легкую цепь или фрагмент легкой цепи, содержащий вариабельную область, например, содержащий одну, две или три CDR, независимо выбранных из SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7 и SEQ ID N0:6, конкретно где CDR LI представляет собой SEQ ID N0:4, CDR L2 представляет собой SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7, и CDR L3 представляет собой SEQ ID N0:6.
Таким образом, одно воплощение CDR L1 представляет собой SEQ ID N0:4, и CDR L2 представляет собой SEQ ID N0:5, или CDR L3 представляет собой SEQ ID N0:6, или CDR L2 представляет собой SEQ ID N0:5 SEQ ID N0:7, и CDR L3 представляет собой SEQ ID N0:6.
В одном воплощении, антитела или связывающие фрагменты по настоящему изобретению содержат последовательности CDR, выбранные из SEQ ID N0:1-7, например, где CDR HI представляет собой SEQ ID N0:1, CDR Н2 представляет собой SEQ ID N0:2, CDR НЗ представляет собой SEQ ID N0:3, CDR L1 представляет собой SEQ ID N0:4, CDR L2 представляет собой SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7 и CDR L3 представляет собой SEQ ID N0:6.
Также предлагается антитело или связывающий фрагмент, который связывается с тем же эпитопом, что и антитело или связывающий фрагмент, которые в явной форме раскрыты в данном документе. Соответственно, предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132 и Е133 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48), и где антитело к FcRn или его связывающий фрагмент дополнительно связывается с одним или с несколькими (как например со всеми) остатками, выбранными из группы, состоящей из А81, G83, G84, К85, G86, Р87, N113, L135, А136 и Q139 и необязательно дополнительно связывается с одним или несколькими остатками, выбранными из группы, состоящей из L82, Y8 8, L112 и D130 .
В одном воплощении, предлагается антитело или связывающий фрагмент, которые перекрестно блокируют связывание антитела или связывающего фрагмента, которые в явной форме раскрыты в данном документе, с человеческим FcRn, или которые перекрестно блокируются от связывания с человеческим FcRn указанным антителом.
В одном воплощении, антитела и связывающие фрагменты по настоящему изобретению блокируют связывание человеческого IgG с человеческим FcRn.
В одном воплощении, антитела и связывающие фрагменты по настоящему изобретению не связываются с |32-микроглобулином.
В одном воплощении, антитела и связывающие фрагменты по настоящему изобретению не связываются с человеческим |32-микроглобулином.
В одном примере, антитела и связывающие фрагменты по настоящему изобретению не уменьшают уровень альбумина в кровотоке более чем на 50%, предпочтительно не более чем на 25%.
В одном примере антитела и связывающие фрагменты по настоящему изобретению не уменьшают уровень альбумина в кровотоке.
Изобретение также охватывает полинуклеотид, такой как ДНК, кодирующую антитело или фрагмент, описанные в данном документе, например, где ДНК включена в вектор.
Также предлагается клетка-хозяин, содержащая указанный полинуклеотид.
В данном документе предлагаются методы экспрессии антитела или фрагмента, а также методы конъюгации антитела или фрагмента с полимером, таким как ПЭГ.
Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициями, содержащим указанные антитела и фрагменты.
В одном воплощении предлагается способ лечения, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела, фрагмента или композиции, как описано в данном документе.
Настоящее изобретение также охватывает антитело, фрагмент или композицию согласно настоящему изобретения для применения при лечении, конкретно, при лечении иммунологического и/или аутоиммунного расстройства.
Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются антитела, их фрагменты и способы удаления патогенных IgG, чего достигают путем ускорения естественного для организма механизма катаболизма IgG.
По существу, антитела и фрагменты согласно изобретению блокируют систему, которая осуществляет рециклинг IgG в организме.
Настоящая терапия, вероятно, обеспечивает замену или дополнение для лечения некоторых заболеваний, где в качестве терапии используют плазмаферез или IVIg, что является предпочтительным для пациентов.
Краткое Описание Фигур
Фигура 1 демонстрирует % hlgG в трансгенных мышах, определенный с помощью ЖХ-МС/МС
Фигура 1а демонстрирует эффект формата 1638 IgG4P в отношении концентрации человеческого IVIg в сыворотке трансгенной мыши, содержащей человеческий FcRn.
Фигура lb демонстрирует эффект форматов 163 8 FabFv и Fab'ПЭГ в отношении концентрации человеческого IVIg в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn
Фигура 1с демонстрирует фармакокинетику формата 1638 IgG4P в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура Id демонстрирует фармакокинетику форматов 1638 FabFv и Fab'ПЭГ в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn
Фигура 1е Эффект форматов 163 8 FabFv и Fab'ПЭГ в отношении концентрации сывороточного альбумина в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn
Фигура If Эффект формата 1638 IgG4P в отношении концентрации сывороточного альбумина в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn
Фигура 2 демонстрирует репрезентативные кривые связывания СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п=3) составили 0,2 нМ в нейтральном буфере, и 0,22 нМ в кислом буфере, соответственно
Фигура 3 демонстрирует, что СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует рециклинг IgG в клоне 15 клеток MDCKII
Фигура 4 демонстрирует, что СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует трансцитоз IgG в клоне 15 клеток MDCK II
Фигура 5 демонстрирует, что СА17 0_163 8.g4 9 FabFv ингибирует трансцитоз IgG в клоне 15 клеток MDCK II.
Фигура 6 демонстрирует репрезентативные кривые связывания для СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п = 3) составили 0,3 в нейтральном буфере и 0,43 в кислом буфере, соответственно (см. Таблицу 2).
Фигура 7 демонстрирует последовательности СА17 0 163 8 CDR Фигура 8 Последовательности антител согласно настоящему описанию изобретения
Фигура 9а Гуманизация антитела 1б3 8.д4 9 Фигура 9Ь Гуманизация антитела 1б3 8.д4 9 Подробное описание изобретения
FcRn, применяемый в настоящем документе, относится к
нековалентному комплексу между альфа-цепью рецептора
человеческого IgG, также известного как неонатальный Fc-
рецептор, аминокислотная последовательность которого
представлена в UniProt под номером Р55899, внеклеточный домен
которого представлен на Фигуре 8 (SEQ ID N0:48), вместе с
человеческим J32-микроглобулином (|32М) , аминокислотная
последовательность которого представлена в UniProt под номером Р617 69 (представленный в данном документе с сигнальным пептидом (SEQ ID N0:50), без сигнального пептида (SEQ ID N0:72)).
Молекула антитела, применяемая в данном документе, относится к антителу или к его связывающему фрагменту.
Термин "антитело", используемый в данном документе, как правило, относится к интактным (цельным) антителам, т.е. содержащим элементы двух тяжелых цепей и двух легких цепей. Антитело может содержать дополнительные домены связывания, например, как для молекулы DVD-Ig, раскрытой в W0 2007/024715, или как так называемый (FabFv)2Fc, описанный в WO2011/030107. Таким образом, антитело, применяемое в данном документе, включает би-, три- или тетравалентные антитела.
Связывающие фрагменты антител включают одноцепочечные антитела (т.е. полноразмерную тяжелую цепь и легкую цепь); Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный Fab', F(ab')2, Fv, Fab-Fv, Fab-dsFv, однодоменные антитела (например, VH или VL, или VHH), scFv, dsscFv, би-, три- или тетравалентные антитела, Бис-scFv, диатела, тритела, тетратела и эпитоп-связывающие фрагменты любого из вышеперечисленных (см., например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217).
Методы создания и получения таких фрагментов антител хорошо известны в данной области (см., например, Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181) . Формат Fab-Fv был впервые раскрыт в WO2009/040562, а его варианты, стабилизированные дисульфидами, Fab-dsFv, были впервые раскрыты в WO2010/035012. Другие фрагменты антител для применения в настоящем изобретении включают фрагменты Fab и Fab', описанные в Международных патентных заявках WO2005/003169, WO2005/003170 и WO2005/003171. Поливалентные антитела могут содержать множество специфичностей, например, могут быть биспецифичными или моноспецифичными (см., например, W092/22583 и WO05/113605). Один такой пример последних представляет собой Tri-Fab (или TFM), как описано в W092/22583.
В одном воплощении предлагается Fab-фрагмент.
В одном воплощении предлагается Fab'-фрагмент.
Типичная молекула Fab' содержит пару тяжелой и легкой цепи, где тяжелая цепь содержит вариабельную область Vh, константный домен Chi и натуральную или модифицированную шарнирную область, и легкая цепь содержит вариабельную область VI и константный домен С1.
В одном воплощении согласно настоящему изобретению предлагается димер Fab' с получением F(ab')2, где димеризация может осуществляться, например, через шарнир.
В одном воплощении, антитело или его связывающий фрагмент содержит домен связывания. Домен связывания будет, как правило, содержать б CDR, три из тяжелой цепи и три из легкой цепи. В одном воплощении, CDR находятся в каркасе и вместе образуют вариабельную область. Таким образом, в одном воплощении, антитело или связывающий фрагмент содержит домен связывания, специфичный для антигена, содержащий вариабельную область легкой цепи и вариабельную область тяжелой цепи.
Будет понятно, что может быть осуществлена одна или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) аминокислотных замен, вставок и/или делеций в CDR или в других последовательностях (например, в вариабельных доменах), представленных настоящим изобретением, без значительного изменения способности антитела
связываться с FcRn. Эффект любой из аминокислотных замен, вставок и/или делеций может быть легко протестирован специалистом в данной области, например, путем использования методов, описанных в данном документе, конкретно в Примерах, для определения связывания/блокировки FcRn.
Могут быть осуществлены одна или несколько (например, 1, 2, 3 или 4) аминокислотных замен, вставок и/или делеций в каркасной области, применяемой в антителе или в его фрагменте, представленном настоящим изобретением, где аффинность связывания с FcRn сохраняется или увеличивается.
Остатки в вариабельных доменах антитела пронумерованы стандартным образом согласно системе, разработанной Rabat et al. Данная система представлена в Rabat et al, 1987, в Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA (далее "Rabat et al. (выше)"). Данная система нумерации используется в настоящем описании за исключением случаев, где указано иное.
Обозначения остатков по Rabat не всегда соответствуют линейной нумерации аминокислотных остатков. Фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество или дополнительные аминокислоты, в отличие от строгой нумерации по Rabat, соответствуя укорачиванию или вставке структурного компонента, будь то каркасная область или область, определяющая комплементарность (CDR) основной структуры вариабельного домена. Корректная нумерация остатков по Rabat может определяться для данного антитела путем выравнивания остатков гомологии в последовательности антитела с последовательностью со "стандартной" нумерацией по Rabat.
CDR вариабельного домена тяжелой цепи локализованы в остатках 31-35 (CDR-H1), остатках 50-65 (CDR-H2) и остатках 95102 (CDR-H3) согласно системе нумерации Rabat. Однако согласно Chothia (Chothia, С. and Lesk, A.M. J. Mol. Biol, 196, 901-917 (1987)), петля, эквивалентная CDR-H1, протягивается от остатка 2 6 к остатку 32. Таким образом, до тех пор, пока не указано иное, обозначение "CDR-H1", применяемое в данном документе, относится к остаткам 2 6-35, как описано с помощью комбинации
системы нумерации по Rabat и определения топологической петли по Chothia.
CDR вариабельного домена легкой цепи локализованы в остатках 24-34 (CDR-L1), остатках 50-56 (CDR-L2) и в остатках 8 9-97 (CDR-L3) согласно системе нумерации Rabat.
Антитела и фрагменты настоящего описания изобретения блокируют FcRn и посредством этого могут предотвращать его функционирование в рециклинге IgG. Блокировка, применяемая в данном документе, относится к физической блокировке, такой как поглощение рецептора, но также включает случай, где антитело или фрагменты связываются с эпитопом, что обуславливает, например, конформационное изменение, которое означает, что природный лиганд больше не связывается с рецептором. Молекулы антител по настоящему изобретению связываются с FcRn и посредством этого уменьшают или предотвращают (например, ингибируют) связывание FcRn с константной областью IgG. В одном воплощении, антитело или его фрагмент связывается с FcRn конкурентно по отношению к IgG.
В одном примере, антитело или его связывающий фрагмент функционирует в качестве конкурентного ингибитора связывания человеческого FcRn с человеческим IgG. В одном примере, антитело или его связывающий фрагмент связывается с сайтом связывания IgG на FcRn. В одном примере антитело блокирует сайт связывания IgG. В одном примере антитело или его связывающий фрагмент не связывается с (32М.
Антитела для применения в настоящем изобретении могут быть получены с использованием любого подходящего метода, известного в данной области. Полипептид/белок FcRn, в том числе химерные белки, клетки, (рекомбинантно или естественно) экспрессирующие полипептид (как например активированные Т-клетки), могут использоваться для продуцирования антител, которые специфично распознают FcRn, индивидуально или в комбинации с (32М. Полипептид может представлять собой "зрелый" полипептид или его биологически активный фрагмент или производное. Человеческий белок зарегистрирован в базе данных Swiss-Prot под номером
Р558 99. Внеклеточный домен альфа-цепи человеческого FcRn представлен в SEQ ID N0:48. Последовательность зрелого
человеческого (32М представлена в SEQ ID N0:72.
В одном воплощении антиген представляет собой мутантную форму FcRn, которая сконструирована для презентирования FcRn на поверхности клетки, так чтобы при интернализации FcRn в клетке динамического процессирования было мало или оно отсутствовало, чего можно достичь, например, путем создания мутации в цитоплазматическом хвосте альфа-цепи FcRn, где ди-лейцин подвергают мутации до ди-аланина, как описано в Ober et al 2001 Int. Immunol. 13, 1551-1559.
Полипептиды для применения при иммунизации хозяина могут быть получены с помощью способа, хорошо известного в данной области, из генетически сконструированных клеток-хозяев, содержащих системы экспрессии, или они могут быть извлечены из естественных биологических источников. В настоящей заявке термин "полипептиды" включает пептиды, полипептиды и белки. Они используются взаимозаменяемо до тех пор, пока не указано иное. В некоторых случаях полипептид FcRn является частью более крупного белка, такого как химерный белок, например, сшитый с аффинной меткой или с чем-то подобным.
Могут быть получены антитела, созданные против полипептида FcRn, где иммунизация животного необходима, путем введения полипептидов животному, предпочтительно не человеку, с использованием хорошо известных и стандартных протоколов, см., например, Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Многие теплокровные животные, такие как кролики, мыши, крысы, овцы, коровы, верблюды или свиньи могут быть иммунизированы. Однако наиболее подходящими являются мыши, кролики, свиньи и крысы.
Моноклональные антитела могут быть получены с помощью метода, известного в данной области, такого как гибридомный метод (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), триомный метод, метод гибридомы человеческих В-клеток (Kozbor et al r
1983, Immunology Today, 4:72) и метод EBV-гибридомы (Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985) .
Антитела для применения в изобретении также могут быть созданы с использованием методов антитела единственного лимфоцита путем клонирования и экспрессии кДНК вариабельной области иммуноглобулина, полученного из единственного лимфоцита, выбранного для продуцирования специфических антител, например, с использованием способов, описанных в Babcook, J. et al r 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (15) :7843-78481; WO92/02551; WO2004/051268 и в международной патентной заявке WO2004/106377.
Скрининг антител может осуществляться с использованием анализов для измерения связывания с человеческим FcRn и/или анализов для измерения способности блокировать связывание IgG с рецептором. Примером анализа связывания является ИФА, конкретно, с использованием химерного белка человеческого FcRn и человеческого Fc, который иммобилизуют на планшетах, и с применением вторичного антитела для детектирования антитела к FcRn, связанного с химерным белком. Примеры подходящих антагонистических и блокирующих анализов описаны в данном документе ниже.
Подразумевается, что термин "специфичное", применяемый в данном документе, относится к антителу, которое только распознает антиген, к которому оно специфично, или к антителу, которое обладает значительно более высокой аффинностью связывания с антигеном, к которому оно специфично, по сравнению со связыванием с антигенами, к которым оно не специфично, например, к антителу с аффинностью связывания по меньшей мере в 5, б, 7, 8,9, 10 раз выше. Аффинность связывания может быть измерена с помощью методов, таких как BIAcore, как описано в данном документе ниже. В одном примере антитело по настоящему изобретению не связывается с |32-микроглобулином (|32М) . В одном примере антитело по настоящему изобретению связывается с FcRn макаки. В одном примере антитело по настоящему изобретению не связывается с крысиным или мышиным FcRn.
Предлагаются аминокислотные последовательности и
полинуклеотидные последовательности некоторых антител согласно настоящему изобретению, и они образуют аспект изобретения.
В одном воплощении, антитела или связывающие фрагменты
согласно настоящему изобретению являются полностью
человеческими, например, получены из фаговой библиотеки иди аналогичным образом.
В одном примере антитела относятся к антителам грызунов, как например, к выделенным из крысы и содержат последовательность вариабельного домена легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:8, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:12.
В одном воплощении антитело или фрагменты согласно изобретению являются гуманизированными.
Гуманизированные антитела (которые включают CDR-привитые антитела) представляют собой Молекулы антител, содержащие одну или несколько областей, определяющих комплементарность (CDR) , из видов животных, но не человека, и каркасную область из молекулы человеческого иммуноглобулина (см., например, US 5585089; W091/09967). Понятно, что может быть необходимо только перенести остатки, определяющие специфичность CDR, а не всю CDR (см., например, Kashmiri et al. , 2005, Methods, 36, 25-34) . Гуманизированные антитела необязательно дополнительно могут содержать один или несколько каркасных остатков, выделенных из видов животных, но не из человека, из которых были выделены CDR. Последние часто обозначаются как донорные остатки.
Таким образом, в одном воплощении, используемый в данном документе термин "гуманизированная молекула антитела" относится к молекуле антитела, где тяжелая и/или легкая цепь содержит одну или несколько CDR (включая, если целесообразно, одну или несколько модифицированных CDR) из донорного антитела (например, антитела животного, но не человека, как например, мышиное моноклональное антитело), привитых в каркас вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи акцепторного антитела (например, человеческого антитела), необязательно дополнительно содержащего один или несколько каркасных остатков, выделенных из видов
животных, но не из человека, из которых были выделены CDR (донорные остатки). Для обзора см., Vaughan et al, Nature Biotechnology, 16r 535-539, 1998. В одном воплощении только один или несколько из остатков, определяющих специфичность, из любой из CDR, описанных в данном документе выше, переносят в каркас человеческого антитела, а не всю CDR (см., например, Kashmiri et al. , 2005, Methods, 36, 25-34) . В одном воплощении только остатки, определяющие специфичность, из одной или из нескольких CDR, описанных в данном документе выше, переносят на каркас человеческого антитела. В другом воплощении только остатки, определяющие специфичность, из каждой из CDR, описанные в данном документе выше, переносят на каркас человеческого антитела.
Когда прививают CDR или остатки, определяющие специфичность, то может использоваться любая подходящая каркасная последовательность акцепторной вариабельной области, имеющая отношение к классу/типу донорного антитела, из которого выделены CDR, включая каркасные области мыши, примата и человека.
Соответственно, гуманизированное антитело согласно
настоящему изобретению содержит вариабельный домен, содержащий человеческие акцепторные каркасные области, а также одну или несколько CDR, конкретно представленных в данном документе. Таким образом, в одном воплощении предлагается блокирующее гуманизированное антитело, которое связывается с человеческим FcRn, где вариабельный домен содержит человеческие акцепторные каркасные области и донорные CDR из животных, но не из человека.
Примеры человеческих каркасов, которые могут использоваться в настоящем изобретении, представляют собой KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY и POM (Rabat et al, supra). Например, KOL и NEWM могут использоваться для тяжелой цепи, REI может использоваться для легкой цепи, и EU, LAY и РОМ могут использоваться как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи. Альтернативно, могут использоваться человеческие зародышевые последовательности; они доступны по адресу http://www.imgt.org/
В гуманизированном антителе по настоящему изобретению акцепторные тяжелая и легкая цепи необязательно нуждаются в
доставке из того же антитела и могут, если целесообразно, содержать составные цепи, содержащие каркасные области, выделенные из различных цепей.
Одну такую подходящую каркасную область для тяжелой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению выделяют из человеческой последовательности IGHV3-7 подгруппы VH3 вместе с JH3 (SEQ ID N0:46 и 47).
Соответственно, в одном примере предлагается
гуманизированное антитело, содержащее последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:2, для CDR-H2 и последовательность, представленную в SEQ ID N0:3, для CDRH3, где каркасная область тяжелой цепи выделена из человеческой последовательности IGHV3-7 подгруппы VH3 вместе с JH3.
Последовательность человеческого JH3 представлена ниже: (DAFDV)WGQGTMVTVS (SEQ ID N0:69). Мотив DAFDV (SEQ ID N0:70) является частью CDR-H3 и не является частью каркаса 4 (Ravetch, JV. et al, 1981, Cell, 27, 583-591).
В одном примере вариабельный домен тяжелой цепи антитела содержит последовательность, представленную в SEQ ID N0:25 или 59, как например 25.
Подходящую каркасную область для легкой цепи гуманизированного антитела по настоящему изобретению выделяют из человеческой последовательности IGKV1-27 подгруппы VK1 вместе с JK4 (SEQ ID N0:44 и 45).
Соответственно, в одном примере предлагается
гуманизированное антитело, содержащее последовательность, представленную в SEQ ID N0:4, для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7, для CDR-L2 и последовательность, представленную в SEQ ID N0:6, для CDRL3, где каркасная область легкой цепи выделена из человеческой последовательности IGKV1-27 подгруппы VK1 вместе с JK4.
Последовательность JK4 представлена ниже: (LT)FGGGTKVEIK (Seq ID N0:71). Мотив LT является частью CDR-L3 и не является частью каркаса 4 (Hieter, PA., et al., 1982, J. Biol. Chem., 257, 1516-1522) .
В одном примере вариабельный домен легкой цепи антитела содержит последовательность, представленную в SEQ ID N0:16 или 51, как например 16.
В гуманизированном антителе по настоящему изобретению каркасные области не нуждаются в точно такой же последовательности, как у акцепторного антитела. Например, нетипичные остатки могут быть заменены на более часто встречающиеся остатки для класса или типа акцепторной цепи. Альтернативно, выбранные остатки в акцепторных каркасных областях могут быть заменены так, что они будут соответствовать остатку, присутствующему в таком же положении в донорном антителе (см. Reichmann et al. , 1998, Nature, 332, 323-324). Такие замены следует поддерживать на минимальном необходимом уровне для получения аффинности донорного антитела. Протокол для выбора остатков в акцепторных каркасных областях, которые могут нуждаться в замене, представлен в W091/09967.
Таким образом, в одном воплощении, 1, 2, 3, 4 или 5 остатков в каркасе заменяют на альтернативные аминокислотные остатки.
Соответственно, в одном примере предлагается
гуманизированное антитело, где по меньшей мере остатки в каждом из положений 4 8 и 7 8 вариабельного домена тяжелой цепи (нумерация Rabat) являются донорными остатками, см., например, последовательность, представленную в SEQ ID N0:25.
В одном воплощении остаток 4 8 вариабельного домена тяжелой цепи заменяют на альтернативную аминокислоту, например, на валин.
В одном воплощении остаток 7 8 вариабельного домена тяжелой цепи заменяют на альтернативную аминокислоту, например, лейцин.
В одном воплощении, остаток 4 8 представляет собой валин, а остаток 78 представляет собой лейцин в вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи согласно настоящему изобретению.
Соответственно, в одном примере предлагается
гуманизированное антитело, где по меньшей мере остатки в каждом из положений 7 0 и 71 вариабельного домена легкой цепи (нумерация Rabat) являются донорными остатками, см., например,
последовательность, представленную в SEQ ID N0:16.
В одном воплощении остаток 7 0 вариабельного домена легкой цепи заменяют на альтернативную аминокислоту, например, на аспарагиновую кислоту.
В одном воплощении остаток 71 вариабельного домена легкой цепи заменяют на альтернативную аминокислоту, например, на фенилаланин.
В одном воплощении, остаток 7 0 представляет собой аспарагиновую кислоту, а остаток 71 представляет собой фенилаланин в вариабельной области гуманизированной легкой цепи согласно настоящему изобретению.
В одном воплощении, в изобретении предлагается последовательность антитела, которая является на 80% сходной или идентичной последовательности, раскрытой в данном документе, например, на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98%) или на 99% относительно части или цельной соответствующей последовательности, например, последовательности вариабельного домена, последовательности CDR или последовательности вариабельного домена за исключением CDR. В одном воплощении соответствующая последовательность представляет собой SEQ ID N0:16 или 51. В одном воплощении соответствующая последовательность представляет собой SEQ ID N0:25 или 59.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается молекула антитела, которая связывается с человеческим FcRn, содержащая тяжелую цепь, где вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или сходства с последовательностью данного документа, например с последовательностью, представленной в SEQ ID N0:25 или 59, как например 25.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается молекула антитела, которая связывается с человеческим FcRn, содержащая легкую цепь, где вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% идентичности или сходства с последовательностью данного документа, например с
последовательностью, представленной в SEQ ID N0:16 или 51, как например 1 б.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается молекула антитела, которая связывается с человеческим FcRn, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% сходен или идентичен последовательности, представленной в данном документе, например, последовательности, представленной в SEQ ID N0:25, но где молекула антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:2, для CDR-H2, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:3, для CDR-H3.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается молекула антитела, которая связывается с человеческим FcRn, где антитело содержит вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% сходен или идентичен последовательности, представленной в данном документе, например, последовательности, представленной в SEQ ID N0:16, но где молекула антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:4, для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:5 или в SEQ ID N0:7, для CDR-L2, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:6, для CDR-L3.
В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается молекула антитела, которая связывается с человеческим FcRn, где антитело содержит вариабельный домен тяжелой цепи, который по меньшей мере на 90% , 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% сходен или идентичен последовательности, представленной в данном документе, например, последовательности, представленной в SEQ ID N0:25, и вариабельный домен легкой цепи, который по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 96%, 97%, 98% или 99% сходен или идентичен последовательности, представленной в данном документе, например, последовательности, представленной в SEQ ID N0:16, но где молекула антитела имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, для CDR-H1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:2, для CDR-H2, последовательность, представленную в SEQ ID N0:3, для CDR-H3, последовательность,
представленную в SEQ ID N0:4, для CDR-L1, последовательность, представленную в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7, для CDR-L2, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:6, для CDR-L3.
Используемый в данном документе термин "идентичность"
выявляет, что в любом конкретном положении в сравниваемых
последовательностях аминокислотные остатки между
последовательностями будут идентичны. Используемый в данном документе термин "сходство" выявляет, что в любом конкретном положении в сравниваемых последовательностях аминокислотные остатки между последовательностями будут относиться к сходному типу. Например, лейцин может быть заменен на изолейцин или валин. Другие аминокислоты, которые часто могут быть заменены на другие, включают, но не ограничиваются этим:
фенилаланин, тирозин и триптофан (аминокислоты, имеющие ароматические боковые цепи);
лизин, аргинин и гистидин (аминокислоты, имеющие основные боковые цепи);
аспартат и глутамат (аминокислоты, имеющие кислотные боковые цепи);
аспарагин и глутамин (аминокислоты, имеющие амидные боковые цепи); и
цистеин и метионин (аминокислоты, имеющие сера-содержащие боковые цепи). Степень идентичности и сходства можно легко рассчитать (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing. Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987, Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991, программа BLAST(tm), доступная из NCBI (Altschul, S.F. et al, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Gish, W. & States, D.J. 1993, Nature Genet. 3:266-272. Madden, T.L. et alr 1996, Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al r 1991, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. 1997, Genome Res.
7:649-656,) .
Молекулы антител по настоящему изобретению могут содержать
цельную молекулу антитела, содержащую полноразмерную тяжелую и
легкую цепь или их фрагменты, и может представлять собой в
частности Fab, модифицированный Fab, Fab', модифицированный
Fab', F(ab')2, Fv, однодоменные антитела (например, VH или VL,
или VHH), scFv, dsscFv, би-, три- или тетравалентные антитела,
Бис-scFv, диатела, тритела, тетратела и эпитоп-связывающие
фрагменты любого из вышеперечисленных (см., например, Holliger
and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9): 1126-1136; Adair and
Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217).
Методы создания и получения таких фрагментов антитела хорошо
известны в данной области (см., например, Verma et al., 1998,
Journal of Immunological Methods, 216, 165-181). Другие
фрагменты антител для применения в настоящем изобретении
включают фрагменты Fab и Fab', описанные в Международных
патентных заявках WO2005/003169, WO2005/003170 и WO2005/003171.
Поливалентные антитела могут содержать множество специфичностей,
например, могут быть биспецифичными или моноспецифичными (см.,
например, W092/22583, WO05/113605, WO2009/040562 и
WO2010/035012).
В одном воплощении молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент антитела, содержащий вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:16 и 25, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:29.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab-фрагмент антитела, содержащий вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:51 и 59, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab- или Fab'-фрагмент антитела, содержащий вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:16 и
25, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:29 (Fab) или SEQ ID N0:33 (Fab').
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой Fab'-фрагмент антитела, содержащий вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:51 и 59, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:55, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:63.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgGl, содержащее вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:16 и 25, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:73.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgGl, содержащее вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:51 и 59.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG4, содержащее вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:16 и 25, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:25.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерный формат антитела IgG4, содержащего вариабельные области, представленные в SEQ ID
N0:51 и 59, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:55, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:59.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерное антитело IgG4P, содержащее вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:16 и 25, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:37 или SEQ ID N0:39.
В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой полноразмерный формат антитела IgG4P, содержащего вариабельные области, представленные в SEQ ID N0:51 и 59, например, для легкой и тяжелой цепи, соответственно. В одном воплощении, молекула антитела имеет легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:55, и тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:59.
Применяемый в данном документе IgG4P представляет собой подвергнутый мутации 1д64-изотип дикого типа, где аминокислота 241 заменена пролином, см., например, случай, где серии в положении 241 заменяли на пролин, как описано в Angal et al. , Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108.
В одном воплощении антитело согласно настоящему изобретению предлагается в виде FcRn-связывающего антитела, представляющего химерный белок, который содержит иммуноглобулиновый компонент, например, Fab- или Fab'-фрагмент и одно или два однодоменных антитела (dAb) , связанных с ним прямо или косвенно, например, как описано в WO2009/040562, WO2010035012, WO2011/030107, W02011/061492 и W02011/086091, которые все включены в данный документ ссылкой.
В одном воплощении, химерный белок содержит двудоменные антитела, например, в виде пары вариабельного домена тяжелой
цепи (VH) и вариабельного домена легкой цепи (VL), необязательно связанных дисульфидной связью.
В одном воплощении, Fab- или Fab'-элемент химерного белка обладает такой же или сходной специфичностью как у однодоменного антитела или антител. В одном воплощении, Fab или Fab' обладает отличной специфичностью по отношению к однодоменному антителу или к антителам, то есть химерный белок является поливалентным. В одном воплощении, поливалентный химерный белок согласно настоящему изобретению содержит сайт связывания альбумина, например, там пара VH/VL обеспечивает сайт связывания с альбумином. В одном таком воплощении, тяжелая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:42, и легкая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:40.
В одном воплощении, Fab или Fab' согласно настоящему изобретению конюгирован с молекулой ПЭГ или с человеческим сывороточным альбумином.
СА170_01б38д49 и 1638.д49 применяются в данном документе взаимозаменяемо и используются для обозначения специфической пары вариабельных областей антитела, которые могут использоваться в ряде различных форматов. Эти вариабельные области представляют собой последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:25, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:16.
CA170_01638g28 и 1638.g28 применяются в данном документе взаимозаменяемо и используются для обозначения специфической пары вариабельных областей антитела, которые могут использоваться в ряде различных форматов. Эти вариабельные области представляют собой последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:59, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:51.
Домены константных областей молекулы антитела по настоящему изобретению, если они присутствуют, могут быть выбраны, принимая во внимание предполагаемую функцию молекулы антитела и, конкретно, эффекторную функцию, которая может потребоваться. Например, домены константных областей могут представлять собой домены человеческих IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. Конкретно, могут
использоваться домены константной области человеческого IgG, особенно изотипов IgGl и IgG3, когда молекула антитела предназначается для терапевтических применений, и требуются эффекторные функции антитела. Альтернативно, изотипы IgG2 и IgG4 могут использоваться, когда молекула антитела предназначается для терапевтических целей, и эффекторные функции антитела не являются необходимыми. Понятно, что также могут использоваться варианты последовательности этих доменов константных областей. Например, могут использоваться молекулы IgG4, в которых серии в положении заменен на пролин, как описано в Angal et al. r Molecular Immunology, 1993, 30 (1), 105-108. Специалисту в данной области понятно, что антитела могут подвергаться множеству пост-трансляционных модификаций. Тип и степень этих модификаций часто зависит от линии клетки-хозяина, используемой для экспрессии антитела, а также от условий культивирования. Такие модификации могут включать вариации в гликозилировании, окисление метионина, образование дикетопиперазина, изомеризацию аспартата и дезаминирование аспарагина. Частой модификацией является потеря С-концевого основного остатка (такого как лизин или аргинин) благодаря действию карбоксипептидаз (как описано в Harris, RJ. Journal of ChromatograpH у 705:129-134, 1995). Соответственно, С-концевой лизин тяжелой цепи может отсутствовать.
В одном воплощении, тяжелая цепь антитела содержит CHI-домен, и легкая цепь антитела содержит CL-домен, либо каппа, либо лямбда.
В одном таком воплощении, легкая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:29.
В одном таком воплощении, легкая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:33.
В одном таком воплощении, легкая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:37.
В одном таком воплощении, легкая цепь имеет
последовательность, представленную в SEQ ID N0:20, и тяжелая цепь имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:74.
В одном воплощении, С-концевая аминокислота из молекулы антитела отщепляется во время пост-трансляционных модификаций.
В одном воплощении, N-концевая аминокислота из молекулы антитела отщепляется во время пост-трансляционных модификаций.
Также в настоящем изобретении предлагается специфическая область или эпитоп человеческого FcRn, который связывается антителом, предложенным в настоящем изобретении, конкретно, антителом, содержащим последовательность дНЗЗ (SEQ ID N0:25) тяжелой цепи и/или последовательность gL7 (SEQ ID N0:16) легкой цепи, или антителом, содержащим последовательность gH2 (SEQ ID N0:59) тяжелой цепи и последовательность gL2 (SEQ ID N0:51) легкой цепи.
Данная специфическая область или эпитоп полипептида
человеческого FcRn может идентифицироваться с помощью любого
подходящего метода картирования эпитопов, известного в данной
области, в комбинации с любым из антител, предлагаемых в
настоящем изобретении. Примеры таких методов включают скрининг
пептидов различной длины, выделенных из FcRn, на предмет
связывания с антителом по настоящему изобретению с
использованием наименьшего фрагмента, который может специфично
связываться с анителом, содержащим последовательность эпитопа,
распознаваемую антителом. Пептиды FcRn могут быть получены
синтетически или с помощью протеолитического гидролиза
полипептида FcRn. Пептиды, которые связываются с антителом,
могут быть идентифицированы, например, с помощью анализа масс-
спектрометрии. В другом примере, ЯМР-спектроскопия или
рентгеноструктурная кристаллография могут использоваться для
идентификации эпитопа, связанного антителом по настоящему
изобретению. В одном примере, где используется
рентгеноструктурная кристаллография, эпитопы определяют в виде таких остатков на полипептиде FcRn, которые располагаются внутри области 4 А антитела. В одном примере, эпитоп определяют в таких остатках на полипептиде FcRn, которые располагаются внутри
области 5 А антитела. После идентификации эпитопный фрагмент, который связывается с антителом по настоящему изобретению, может использоваться, если потребуется, в качестве иммуногена для получения дополнительных антител, которые связываются с таким же эпитопом.
В одном воплощении, антитело по настоящему изобретению связывается с внеклеточной последовательностью альфа-цепи человеческого FcRn, как представлено ниже:
AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSW YWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFA-LNGEEFMNFDLK QGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPH
RLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGD
FGPNS DGS FHAS S S LTVKS GDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELE S PAKS S (SEQ ID
N0:48).
Подчеркнутые остатки это те, которые? как известно, являются критическими при взаимодействии человеческого FcRn с Fc-областью человеческого IgG. Выделенные жирным шрифтом это остатки человеческого FcRn-полипептида, вовлеченные в связывание антитела, содержащего последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:25, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:16, т.е. они располагаются внутри области 4 А антитела, как определено с помощью рентгеноструктурной кристаллографии. Остатки, выделенные курсивом, это те, которые вовлечены в связывание такого же антитела в области 5 А.
В одном аспекте изобретения, предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132 и Е133 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48), и где антитело к FcRn или его связывающий фрагмент дополнительно связывается с одним или с несколькими остатками, как например, с двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью или с десятью остатками, выбранными из группы, состоящей из А81, G83, G84, К85, G86, Р87, N113, L135, А136 и
Q139 и необязательно дополнительно связывается с одним или несколькими остатками, выбранными из группы, состоящей из L82, Y88, LI 12 и D130.
Соответственно, в одном примере предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132, и Е133, и по меньшей мере один остаток, например, по меньшей мере, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 остатков, выбранных из группы, состоящей из А81, G8 3, G8 4, К8 5, G8 6, Р8 7, N113, L135, А136 и Q139, и где указанное антитело к FcRn или его связывающий фрагмент необязательно дополнительно связывается с одним или с несколькими остатками, например, по меньшей мере с 2, 3 или 4 остатками, выбранными из группы, состоящей из L82, Y88, LI 12 и D130 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере антитело согласно данному аспекту изобретения не связывается с V105, Р106, Т107, А108 и К109 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере антитело согласно данному аспекту изобретения не связывается с Е116, F117, М118, N119, F120, D121, L122, К123, Q124, G128 и G129 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере, антитело согласно данному аспекту изобретения не связывается с V105, Р106, Т107, А108, К109, Е116, F117, M118,N119, F120, D121, L122, К123, Q124, G128, и G129 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокисоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132, и Е133, и по меньшей мере один остаток, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5, б, 7 или 8 остатков, выбранных из группы, состоящей из А81, L82, G83, G84, К85, G86, Р87 и Y88 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере предлагается антитело к FcRn или его
связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132, и Е133, и по меньшей мере один остаток, например, по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или б остатков, выбранных из группы, состоящей из L112, N113, D130, L135, А136, и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132, и Е133, и по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, состоящей из А81, L82, G83, G84, К85, G86, Р87, Y88, L112, N113, D130, L135, А136, и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит остатки Е115, W131, Р132, и Е133, и по меньшей мере один остаток, выбранный из группы, состоящей из А81, L82, G83, G84, К85, G86, Р87, Y88, L112, N113, D130, L135, А136, и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере в настоящем изобретении предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит или состоит из остатков А81, G83, G84, К85, G86, Р87, N113, Е115, W131, Р132, Е133, L135, А136, и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном примере в настоящем изобретении предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, который связывается с эпитопом человеческого FcRn, который содержит или состоит из остатков А81, L82, G83, G84, К85, G86, Р87, Y88, L112, N113, Е115, D130, W131, Р132, Е133, L135, А136, и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
В одном воплощении настоящего изобретения предлагаются полностью человеческие антитела, которые связываются с эпитопом,
описанным в данном документе выше. В одном воплощении они являются гуманизированными. В одном примере, они обладают аффинностью к человеческому FcRn, составляющей 150 пМ или менее, обычно 130 пМ или менее.
Антитела, которые перекрестно блокируют связывание молекулы антитела согласно настоящему изобретению, конкретно, молекулы антитела, содержащей последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:25, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:16, могут одинаково использоваться при блокировке активности FcRn. Соответственно, в настоящем изобретении также предлагается молекула антитела к FcRn, которая перекрестно блокирует связывание любой из молекул антитела, описанных выше в данном документе, с человеческим FcRn и/или перекрестно блокируется от связывания человеческого FcRn любым из этих антител. В одном воплощении, такое антитело связывается с таким же эпитопом, описанным в данном документе выше. В другом воплощении, перекрестно-блокирующее нейтрализующее антитело связывается с эпитопом, который граничит и/или перекрывается с эпитопом, связанным антителом, описанным выше в данном документе.
Перекрестно-блокирующие антитела могут быть
идентифицированы с использованием любого подходящего метода, известного в данной области, например, с использованием конкурентного ИФА или анализа BIAcore, где связывание перекрестно-блокирующего антитела с человеческим FcRn предотвращает связывание антитела по настоящему изобретению или наоборот. Такие анализы перекрестной блокировки могут использовать естественный или рекомбинантный FcRn или подходящий химерный белок/полипептид. В одном примере, связывание и перекрестную блокировку измеряют с использованием внеклеточного домена рекомбинантного человеческого FcRn (SEQ ID N0:48). В одном примере, внеклеточный домен альфа-цепи рекомбинантного человеческого FcRn используется в комплексе с (32-микроглобулином (32М) (SEQ ID N0: 72) .
В одном воплощении, предлагается молекула антитела к FcRn,
которая блокирует связывание FcRn с IgG и которая перекрестно блокирует связывание антитела, чья тяжелая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID N0:25, и чья легкая цепь содержит последовательность, представленную в SEQ ID N0:16, с человеческим FcRn. В одном воплощении, перекрестно-блокирующие антитела, предлагаемые настоящим изобретением, ингибируют связывание антитела, содержащего последовательность тяжелой цепи, представленную в SEQ ID N0:25, и последовательность легкой цепи, представленную в SEQ ID N0:16, более чем на 80%, например, более чем на 85%, как например, более чем на 90%, конкретно, более чем на 95% ингибирования.
В одном воплощении перекрестно-блокирующие антитела, предлагаемые настоящим изобретением, являются полностью человеческими. В одном воплощении перекрестно-блокирующие антитела, предлагаемые настоящим изобретением, являются гуманизированными. В одном воплощении, перекрестно-блокирующие антитела, предлагаемые настоящим изобретением, имеют аффинность к человеческому FcRn, составляющую 150 пМ или менее, 130 пМ или менее или 100 пМ или менее. В одном воплощении, перекрестно-блокирующие антитела, предлагаемые настоящим изобретением, имеют аффинность к человеческому FcRn, составляющую 50 пМ или менее. Аффинность может измеряться с использованием методов, описанных в данном документе ниже.
Биологические молекулы, такие как антитела или фрагменты содержат кислотные и/или основные функциональные группы, придавая таким образом молекуле суммарный положительный или отрицательный заряд. Количество общего "наблюдаемого" заряда будет зависеть от абсолютной аминокислотной последовательности структуры, локального окружения заряженных групп в ЗО-структуре и от условий окружающей среды молекулы. Изоэлектрическая точка (pi) представляет собой рН , при котором конкретная молекула или ее поверхность, доступная растворителю, не несет никакого суммарного электрического заряда. В одном примере, антитело к FcRn и фрагменты по изобретению могут быть сконструированы так, чтобы они имели подходящую изоэлектрическую точку. Это может приводить к получению антител и/или их фрагментов с более
сильными свойствами, конкретно, с подходящими профилями растворимости и/или стабильности и/или с улучшенными характеристиками очистки.
Таким образом, в одном аспекте изобретения предлагается гуманизированное антитело к FcRn, сконструированное так, что оно имеет изоэлектрическую точку, отличную от изоэлектрической точки исходного идентифицированного антитела. Антитело может, например, быть сконструировано путем замены аминокислотного остатка, такой как замена аминокислотного остатка на один или несколько основных аминокислотных остатков. Альтернативно, основные аминокислотные остатки могут вводиться или кислотные аминокислотные остатки могут удаляться. Альтернативно, если молекула имеет неприемлемо высокое значение pi, то при необходимости могут вводиться кислотные остатки для снижения pi. Важно, что при манипуляции с pi следует принимать во внимание сохранение целевой активности антитела или его фрагмента. Таким образом, в одном воплощении сконструированное антитело или его фрагмент обладает такой же или по существу такой же активностью, как у "немодифицированного" антитела или фрагмента.
Такие программы, как ** ExPASY
http://www.expasy.ch/tools/pi_tool.html, и http://www.iut-
arles.up.univ-mrs.fr/w3bb/d_abim/compo-p.html, могут использоваться для предсказания значения изоэлектрической точки антитела или его фрагмента. Альтернативно или дополнительно, pi может измеряться с использованием любого подходящего стандартного лабораторного метода.
Молекула антитела по настоящему изобретению,
соответственно, обладает высокой аффинностью связывания,
конкретно, в наномолярном диапазоне. Аффинность может измеряться
с использованием любого подходящего метода, известного в данной
области, включая BIAcore, как описано в разделе Примеры данного
документа, с использованием выделенного естественного или
рекомбинантного FcRn или подходящего химерного
белка/полипептида. В одном примере, аффинность измеряют с
использованием внеклеточного домена рекомбинантного
человеческого FcRn, как описано в разделе Примеры данного
документа (SEQ ID N0:48). В одном примере аффинность измеряют с использованием внеклеточного домена альфа-цепи рекомбинантного человеческого FcRn (SEQ ID N0:48) вместе с человеческим J3 2 - микроглобулином (|32М) (SEQ ID N0:72) . Соответственно, молекулы антител по настоящему изобретению обладают аффинностью связывания к выделенному человеческому FcRn, составляющей примерно 1 нМ или менее. В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания, составляющей примерно 50 0 пМ или менее (т.е. более высокой аффинностью). В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания, составляющей примерно 250 пМ или менее. В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания, составляющей примерно 2 00 пМ или менее. В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению обладает аффинностью связывания, составляющей примерно 150 пМ или менее. В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается антитело к FcRn с аффинностью связывания, составляющей примерно 100 пМ или менее. В одном воплощении, в настоящем изобретении предлагается гуманизированное антитело к FcRn с аффинностью связывания, составляющей примерно 100 пМ или менее. В одном воплощении в настоящем изобретении предлагается антитело к FcRn с аффинностью связывания, составляющей примерно 50 пМ или менее.
В одном воплощении, антитела по настоящему изобретению способны связываться с человеческим FcRn как при рН б или ниже (конкретно при рН б), так и при рН 7,4 или выше (конкретно при рН 7,4) со сравнимой аффинностью. Таким образом, предпочтительно, антитела способны продолжать связываться с FcRn даже внутри эндосомы, максимизируя посредством этого блокировку связывания FcRn с IgG.
В одном воплощении, антитела по настоящему изобретению способны связываться с человеческим FcRn с аффинностью связывания, составляющей 150 пМ или менее, при измерении при рН б и рН 7,4. В одном воплощении, антитела по настоящему изобретению способны связываться с человеческим FcRn с
аффинностью связывания, составляющей 130 пМ или менее, при изммерении при рН б и рН 7,4. В одном воплощении, антитела по настоящему изобретению способны связываться с человеческим FcRn с аффинностью связывания, составляющей 130 пМ или менее, при измерении при рН б, и с аффинностью связывания, составляющей 50 пМ или менее, при измерении при рН 7,4.
Аффинность антитела или связывающего фрагмента по настоящему изобретению, а также степень, до которой связывающий агент (такой как антитело) ингибирует связывание, может определяться специалистом в данной области с использованием стандартных методов, например, таких, которые описаны Scatchard et al. (Ann. KY. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) или с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием таких систем, как BIAcore. Для поверхностного плазмонного резонанса молекулы-мишени иммобилизуют на твердой подложке и экспонируют с лигандами в подвижной фазе, проходящей через проточную ячейку. Если происходит связывание лиганда с иммобилизованной мишенью, то изменяется локальный коэффициент преломления, приводя к изменению угла SPR, которое можно отследить в реальном времени путем детектирования изменений интенсивности отраженного света. Скорость изменения сигнала SPR можно проанализировать с получением констант кажущейся скорости фазы ассоциации и диссоциации реакции связывания. Отношение этих значений соответствует константе кажущегося равновесия
(аффинность) (см., например, Wolff et al, Cancer Res. 53:2560-65
(1993)).
В настоящем изобретении аффинность тестируемой молекулы антитела, как правило, определяют с использованием SPR, как указано ниже. Тестируемая молекула антитела захватывается на твердую подложку и внеклеточный домен альфа-цепи человеческого FcRn в нековалентном комплексе с человеческим |32М проходит в потоке над захваченным антителом в подвижной фазе, и определяют аффинность тестируемой молекулы антитела к человеческому FcRn. Тестируемая молекула антитела может захватываться на твердую подложку поверхности чипа с использованием соответствующего
метода, например, с использованием агента захвата, специфичного к анти-Fc или к анти-Fab'. В одном примере аффинность определяют при рН 6. В одном примере аффинность определяют при рН 7,4.
Понятно, что аффинность антител, предлагаемых настоящим изобретением, может изменяться с использованием подходящего метода, известного в данной области. Таким образом, настоящее изобретение также относится к вариантам молекул антитела по настоящему изобретению, которые обладают улучшенной аффинностью к FcRn. Такие варианты могут быть получены с помощью ряда протоколов созревания аффинности, включающих введение мутаций в CDR (Yang et al, J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), перетасовку цепей (Marks et al, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), использование штаммов E. coll с геном-мутатором (Low et al r J. Mol. Biol, 250, 359-368, 1996), ДНК-шаффлинг (Patten et al, Curr. Opin. Biotechnol, 8, 724-733, 1997), фаговый дисплей (Thompson et al, J. Mol. Biol, 256, 77-88, 1996) и ПЦР с ДНК-шаффлингом (sexual PCR) (Crameri et al, Nature, 391, 288-291, 1998) . Vaughan et al (вьше) обсуждают эти методы созревания аффинности.
В одном воплощении, Молекулы антител по настоящему изобретению блокируют активность человеческого FcRn. Анализы, подходящие для определения способности антитела блокировать FcRn, описаны в разделе Примеры данного документа. Подходящий анализ для определения способности молекулы антитела блокировать рециклинг IgG in vitro описан в данном документе ниже.
Если целесообразно, то антитело для применения в настоящем изобретении может быть конъюгировано с одной или с несколькими эффекторными молекулами. Понятно, что эффекторная молекула может включать единственную эффекторную молекулу или две или более таких молекул, связанных с образованием единственного компонента, который может быть присоединен к антителам по настоящему изобретению. В случае если целесообразно получение фрагмента антитела, связанного с эффекторной молекулой, то этого можно достичь с помощью стандартных химических процедур или методов рекомбинантной ДНК, так что фрагмент антитела будет связан с эффекторной молекулой либо прямо, либо посредством
агента конденсации. Методы конъюгации таких эффекторных молекул с антителами хорошо известны в данной области (см., Hellstrom et al. , Controlled Drug Delivery, 2nd Ed., Robinson et al. , eds., 1987, pp. 623-53; Thorpe et al., 1982 , Immunol. Rev., 62:119-58 и Dubowchik et al., 1999, PH armacology and Therapeutics, 83, 67-123). Конкретные химические процедуры включают, например, те, что описаны в W0 93/06231, WO 92/22583, WO 89/00195, WO 89/01476 и WO 03/031581. Альтернативно, в случае, где эффекторная молекула является белком или полипептидом, связь может достигаться с использованием процедур рекомбинантной ДНК, например, как описано в WO 86/01533 и ЕР0392745.
Используемый в данном документе термин "эффекторная молекула" включает, например, противоопухолевые агенты, лекарственные средства, токсины, биологически активные белки, например, ферменты, другое антитело или фрагменты антитела, синтетические или природные полимеры, нуклеиновые кислоты и их фрагменты, например, ДНК, РНК и их фрагменты, радионуклиды, особенно радиойод, радиоизотопы, хелатированные металлы, наночастицы и репортерные группы, такие как флуоресцентные соединения или соединения, которые могут детектироваться с помощью ЯМР или ЭПР спектроскопии.
Примеры эффекторных молекул могут включать цитотоксины или
цитотоксические агенты, включающие любой агент, который является
вредным (например, убивает их) для клеток. Примеры включают
комбрестатины, доластатины, эпотилоны, стауроспорин,
майтансиноиды, спонгистатины, ризоксин, халихондрины, роридины, гемиастерлины, таксол, цитохалазин В, грамицидин D, этидий бромид, эметин, митомицин, этопосид, тенопосид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидрокси антрациндион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокортикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропранолол и пуромицин и их аналоги или гомологи.
Эффекторные молеклы также включают, но не ограничиваются ими, антиметаболиты (например, метотрексат, б-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлоретамин, тиотепа хлорамбуцил, мелфалан,
кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклотосфамид, бусульфан, дибромоманнит, стрептозотоцин, митомицин С, и цис-дихлордиамин платина (II) (DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее дауномицин) и доксорубицин), антибиотики
(например , дактиномицин (ранее актиномицин) , блеомицин, митрамицин, антрамицин (АМС), калихимицины или дуокармицины), и антимитотические агенты (например , винкристин и винбластин).
Другие эффекторные молекулы могут включать хелатированные радионуклиды, такие как и11п и 90Y, Lu177, Висмут213, Калифорний252, Иридий192 и Вольфрам188/Рений188; или лекарственные средства, такие как, в частности, алкилфосфохолины, ингибиторы топоизомеразы I, таксоиды и сурамин. Другие эффекторные молекулы включают белки, пептиды и ферменты. Ферменты, представляющие интерес, включают, в частности, протеолитические ферменты, гидролазы, лиазы, изомеразы, трансферазы. Белки, полипептиды и пептиды, представляющие интерес, включают, в частности, иммуноглобулины, токсины, такие как абрин, рицин А, синегнойный эндотоксин, или дифтерийный токсин, белок, такой как инсулин, фактор некроза опухоли, а-интерферон, р-интерферон, фактор роста нервов, фактор роста тромбоцитов или тканевой активатор плазминогена, тромботический агент или анти-ангиогенный агент, например, ангиостатин или эндостатин, или модификатор биологического ответа, такой как лимфокин, интерлейкин-1 (IL-1), интерлейкин-2
(IL-2), гранулоцит макрофаг колониестимулирующий фактор (GM-CSF), гранулоцит колониестимулирующий фактор (G-CSF), фактор роста нервов (NGF) или другой фактор роста и иммуноглобулины.
Другие эффекторные молекулы могут включать детектируемые
вещества, используемые, например, в диагностике. Примеры
детектируемых веществ включают различные ферменты,
простетические группы, флуоресцентные материалы, люминесцентные материалы, биолюминесцентные материалы, радиоактивные нуклиды, позитронно-активные металлы (для использования в позитрон-эмиссионной томографии), и ионы нерадиоактивных парамагнитных металлов. См., в основном, патент США No. 4741900 для ионов металлов, которые могут быть конъюгированы с антителами для
применения в качестве диагностиков. Подходящие ферменты включают пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, бета-галактозидазу или ацетилхолинэстеразу; подходящие простетические группы включают стрептавидин, авидин и биотин; подходящие флуоресцентные материалы включают умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат, родамин, дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансил хлорид и фикоэритрин; подходящие люминесцентные материалы включают люминол; подходящие биолюминесцентные материалы включают люциферазу, люциферин и акворин; и подходящие радиоактивные нуклиды включают 125I, 131I, luIn и 99Тс.
В другом примере эффекторная молекула может повышать период полужизни антитела in vivo, и/или уменьшать иммуногенность антитела и/или усиливать доставку антитела через эпителиальный барьер в иммунную систему. Примеры подходящих эффекторных молекул данного типа включают полимеры, альбумин, альбумин-связывающие белки или альбумин-связывающие соединения, такие как те, что описаны в WO05/117984.
В одном воплощении, период полужизни, который обеспечивается эффекторной молекулой, независимой от FcRn, является предпочтительным.
В случае, где эффекторная молекула является полимером, она,
в общем случае, может быть синтетическим или природным
полимером, например, необязательно замещенной неразветвленной
или разветвленной полиалкиленовой цепью, полиалкениленовым или
полиоксиалкиленовым полимером или разветвленным или
неразветвленным полисахаридом, например, гомо- или
гетерополисахаридом.
Специфические необязательные заместители, которые могут присутствовать в вышеописанных синтетических полимерах, включают одну или несколько гидроксильных, метильных или метоксигрупп.
Специфические примеры синтетических полимеров включают необязательно замещенные неразветвленные или разветвленные цепи поли(этиленгликоля), поли(пропиленгликоля), поли(винилового спирта) или их производные, особенно необязательно замещенные поли(этиленгликоли) , такие как метоксиполи(этиленгликоль) или их производные.
Специфические природные полимеры включают лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производные.
В одном воплощении, полимером является альбумин или его фрагмент, такой как человеческий сывороточный альбумин или его фрагмент.
Подразумевается, что используемый в данном документе термин "производные" включает реактивные производные, например, тиол-селективные реакционноспособные группы, такие как малеимиды и тому подобные. Реакционноспособная группа может быть связана непосредственно с полимером или посредством линкерного сегмента. Понятно, что остаток такой группы будет в некоторых случаях образовывать часть продукта в виде связывающей группы между фрагментом антитела и полимером.
Размер полимера может варьироваться по необходимости, но, как правило, его средняя молекулярная масса находится в диапазоне от 500 Да до 50000 Да, например, от 5000 до 40000 Да, как например, от 20000 до 40000 Да. Размер полимера, конкретно, может быть выбран на основе назначенного применения продукта, например, по способности к локализации в определенных тканях, таких как опухоли, или благодаря повышенному периоду полужизни в кровотоке (для обзора см. Chapman, 2002, Advanced Drug Delivery Reviews, 54, 531-545). Таким образом, в случае, где продукт предназначен для ухода из кровотока и проникновения в ткань, например, для применения при лечении опухоли, может быть предпочтительным применение полимера небольшой молекулярной массы, например, около 5000 Да. Для таких применений, где продукт остается в кровотоке, может быть предпочтительным использование полимера с более высокой молекулярной массой, например, в диапазоне от 20000 Да до 40000 Да.
Подходящие полимеры включают полиалкиленовый полимер, такой
как поли(этиленгликоль) или, особенно,
метоксиполи(этиленгликоль) или их производные, и особенно с молекулярной массой в диапазоне примерно от 15000 Да примерно до 40000 Да.
В одном примере, антитела для применения в настоящем изобретении присоединены к компонентам поли(этиленгликоля)
(ПЭГ). В одном конкретном примере антитело представляет собой фрагмент антитела, и ПЭГ-молекулы могут быть присоединены посредством любой доступной функциональной группы аминокислотной боковой цепи или концевой аминокислотной функциональной группы, локализованной в фрагменте антитела, например, любой свободной амино-, имино-, тиольной, гидроксильной или карбоксильной группы. Такие аминокислоты могут иметь природное происхождение в фрагменте антитела или могут быть сконструированы и вставлены во фрагмент с использованием методов рекомбинантной ДНК (см., например, US 5219996; US 5667425; W098/25971, WO2008/038024). В одном воплощении, молекула антитела по настоящему изобретению представляет собой модифицированный Fab-фрагмент, где модификация представляет собой вставку в С-концевую область его тяжелой цепи одной или нескольких аминокислот для возможности соединения с эффекторной молекулой. Соответственно, дополнительные аминокислоты образуют модифицированную шарнирную область, содержащую один или несколько остатков цистеина, к которым может быть присоединена эффекторная молекула. Множество сайтов может использоваться для присоединения двух или более молекул ПЭГ.
Соответственно, молекулы ПЭГ ковалентно связаны посредством тиольной группы по меньшей мере одного остатка цистеина, локализованного в фрагменте антитела. Каждая полимерная молекула, присоединенная к модифицированному фрагменту антитела, может быть ковалентно связана с атомом серы остатка цистеина, локализованного во фрагменте. Ковалентная связь, как правило, представляет собой дисульфидную связь, конкретно, связь сера-углерод. В случае использования тиольной группы в качестве точки присоединения соответственно активированных эффекторных молекул, могут использоваться, например, тиольные селективные производные, такие как малеимиды и производные цистеина. Активированный полимер может использоваться в качестве исходного материала при получении полимер-модифицированных фрагментов антитела, как описано выше. Активированный полимер может представлять собой любой полимер, содержащий тиольную реакционноспособную группу, такую как галогенкарбоновая кислота
или эфир, например, иодоацетамид, имид, например, малеимид, винилсульфон или дисульфид. Такие исходные материалы могут быть получены коммерчески (например, из Nektar, ранее Shearwater Polymers Inc., Хантсвилл, Алабама, США) или могут быть получены из коммерчески доступных исходных материалов с использованием стандартных химических процедур. Конкретные ПЭГ-молекулы включают 2 0К метокси-ПЭГ-амин (получаемый из Nektar, ранее Shearwater; Rapp Polymere; и SunBio) и M-PEG-SPA (получаемый из Nektar, ранее Shearwater).
В одном воплощении, антитело представляет собой
модифицированный Fab-фрагмент, Fab'-фрагмент или diFab, который
пэгилирован, т.е. содержит ковалентно присоединенный ПЭГ
(поли(этиленгликоль)), например, согласно методу, раскрытому в
ЕР 0948544 или ЕР1090037 [см., также "Poly(ethyleneglycol)
Chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications", 1992, J.
Milton Harris (ed) , Plenum Press, New York,
"Poly(ethyleneglycol) Chemistry and Biological Applications",
1997, J. Milton Harris and S. Zalipsky (eds), American Chemical
Society, Washington DC and "Bioconjugation Protein Coupling
Techniques for the Biomedical Sciences", 1998, M. Aslam and A.
Dent, Grove Publishers, New York; Chapman, A. 2002, Advanced
Drug Delivery Reviews 2002, 54:531-545]. В одном примере, ПЭГ
присоединяют к цистеину в шарнирной области. В одном примере,
Fab-фрагмент, модифицированный с помощью ПЭГ, содержит
малеимидную группу, ковалентно связанную с единственной тиольной
группой в модифицированной шарнирной области. Остаток лизина
может быть ковалентно связан с малеимидной группой, и к каждой
из аминогрупп на остатке лизина может быть присоединен полимер
метоксиполи(этиленгликоль), имеющий молекулярную массу
приблизительно 2 0000 Да. Суммарная молекулярная масса ПЭГ, присоединенного к Fab-фрагменту, может, таким образом, составлять приблизительно 40000 Да.
Конкретные молекулы ПЭГ включают лизин, модифицированный с
помощью 2-[3-(N-малеимид)пропионамид]этиламид N,N'-
бис(метоксиполи(этиленгликоля) MW 2 0000), также известный как PEG2MAL40K (получаемый из Nektar, ранее Shearwater).
Альтернативные источники ПЭГ-линкеров включают NOF, которые поставляют GL2-400MA3 (где m в структуре ниже составляет 5) и GL2-400MA (где m составляет 2), и п составляет приблизительно 450 :
m составляет 2 или 5
То есть молекулярная масса каждого ПЭГ составляет приблизительно 2 0000 Да.
Таким образом, в одном воплощении ПЭГ представляет собой 2,З-Бис(метитполиоксиэтилен-окси)-1-{[3-(б-малеимидо-1-оксогексил)амино]пропилокси}гексан (разветвленный на две цепи
ПЭГ, -СН2)3NHCO(СН2) 5-MAL, Mw 40000, известный как SUNBRIGHT GL2-4 0 0МАЗ.
Дополнительные эффекторные молекулы ПЭГ следующего типа:
доступны из Dr Reddy, NOF и Jenkem.
В одном воплощении, предлагается антитело, которое является пэгилированным (например, с помощью ПЭГ, описанного в данном документе), где ПЭГ присоединен посредством цистеинового аминокислотного остатка в аминокислотном положении цепи, соответствующем 232, или около него, например, в аминокислоте 232 тяжелой цепи (с последовательной нумерацией), например, в аминокислоте 232 последовательности SEQ ID N0:33.
В одном воплощении настоящего изобретения предлагается молекула Fab'-ПЭГ, содержащая один или несколько полимеров ПЭГ, например, 1 или 2 полимера, такие как полимер 4 0 кДа или
полимеры.
Молекулы Fab'-ПЭГ согласно настоящему изобретению могут быть особенно предпочтительными из-за того, что их период полужизни не зависит от Fc-фрагмента. В одном примере в настоящем изобретении предлагается способ лечения заболевания, ослабленного с помощью блокировки человеческого FcRn, где способ включает введение терапевтически эффективного количества антитела к FcRn или его связывающего фрагмента, где антитело или его связывающий фрагмент имеет период полужизни, который не зависит от связывания Fc с FcRn.
В одном воплощении, предлагается Fab', конъюгированный с полимером, таким как молекула ПЭГ, молекула крахмала или молекула альбумина.
В одном воплощении, предлагается scFv, конъюгированный с полимером, таким как молекула ПЭГ, молекула крахмала или молекула альбумина.
В одном воплощении, антитело или его фрагмент конъюгированы с молекулой крахмала, например, для повышения периода полужизни. Методы конъюгации крахмала с белком описаны в US 8017739, который включен в данный документ ссылкой.
В одном воплощении предлагается молекула, связывающая FcRn (т.е. антитело или его связывающий фрагмент), которая:
вызывает 50-85% уменьшение, как например, более 70% уменьшения концентрации IgG в плазме,
вызывает не более чем 25% или 2 0% уменьшение концентрации альбумина в плазме, и/или
имеет возможность повторного дозирования для достижения продолжительного сохранения низкой концентрации IgG в плазме.
В настоящем изобретении также предлагается выделенная последовательность ДНК, кодирующая тяжелую и/или легкую цепь молекулы антитела по настоящему изобретению. Соответственно, последовательность ДНК кодирует тяжелую или легкую цепь молекулы антитела по настоящему изобретению. Последовательность ДНК по настоящему изобретению может включать синтетическую ДНК, например, полученную химическим процессингом, кДНК, геномную ДНУ или любую их комбинацию.
ДНК-последовательности, которые кодируют молекулу антитела по настоящему изобретению, могут быть получены с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области. Например, ДНК-последовательности, кодирующие часть или цельную тяжелую и легкую цепь, могут быть синтезированы, если целесообразно, из определенных ДНК-последовательностей или на основе соответствующих аминокислотных последовательностей.
ДНК, кодирующая акцепторные каркасные последовательности, широкодоступна специалистам в данной области и может легко синтезироваться на основе их известных аминокислотных последовательностей.
Стандартные методы молекулярной биологии могут использоваться для получения ДНК-последовательностей, кодирующих молекулу антитела по настоящему изобретению. Целевые ДНК-последовательности могут быть синтезированы полностью или частично с использованием методов олигонуклеотидного синтеза. При необходимости могут использоваться методы сайт-направленного мутагенеза и полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В данном документе представлены примеры подходящих ДНК-последовательностей .
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельную область легкой цепи 1638.д49, представлены в последовательности SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:19 и SEQ ID N0:21.
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельную область легкой цепи 1638.д28, представлены в последовательности SEQ ID N0:52 и SEQ ID N0:54.
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи 1638.д49, представлены в последовательности SEQ ID N0:26 и SEQ ID N0:28.
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих вариабельную область тяжелой цепи 1638.д28, представлены в последовательности SEQ ID N0:60 и 62.
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих легкую цепь (вариабельный и константный домены) 1б38.д49, представлены в последовательности SEQ ID N0:21, SEQ ID N0:22 и SEQ ID N0:24 и для легкой цепи 1638.д28 последовательность
представлена в SEQ ID N0:54, SEQ ID N0:56, SEQ ID N0:58, и для тяжелой цепи 1638.g28 последовательность представлена в SEQ ID N0:64 или SEQ ID N0:66.
Примеры подходящих ДНК-последовательностей, кодирующих тяжелую цепь 1638.д49 (вариабельный и константный домены в зависимости от формата), представлены в SEQ ID N0:30 (Fab), SEQ ID N0:34 или 36 (Fab'), SEQ ID N0:38 (IgG4P), SEQ ID N0:43 (FabFv) и SEQ ID N0:74 (IgGl).
Соответственно, в одном примере настоящего изобретения предлагается вставленная ДНК-последовательность, кодирующая тяжелую цепь Fab- или Fab'-фрагмента антитела по настоящему изобретению, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID N0:30, 32, 34, 36, 64 или 66. Также предлагается выделенная ДНК-последовательность, кодирующая легкую цепь Fab-или Fab'-фрагмента антитела по настоящему изобретению, которая включает последовательность, представленную в SEQ ID N0:21, 22 или 5 б.
В одном примере настоящего изобретения предлагается
выделенная ДНК-последовательность, кодирующая тяжелую цепь и
легкую цепь антитела IgG4(Р) по настоящему изобретению, в
котором ДНК, кодирующая тяжелую цепь, включает
последовательность, представленную в SEQ ID N0:38, и ДНК, кодирующая легкую цепь, включает последовательность, представленную в SEQ ID N0:22.
В одном примере в настоящем изобретении предлагается выделенная ДНК-последовательность, кодирующая тяжелую цепь и легкую цепь антитела IgGl по настоящему изобретению, в котором ДНК, кодирующая тяжелую цепь, включает последовательность, представленную в SEQ ID N0:74, и ДНК, кодирующая легкую цепь, включает последовательность, представленную в SEQ ID N0:22.
В одном примере настоящего изобретения предлагается
выделенная ДНК-последовательность, кодирующая тяжелую цепь и
легкую цепь антитела Fab-dsFv по настоящему изобретению, в
котором ДНК, кодирующая тяжелую цепь, включает
последовательность, представленную в SEQ ID N0:43, и ДНК, кодирующая легкую цепь, включает последовательность,
представленную в SEQ ID N0:41.
Настоящее изобретение также относится к клонирующему или экспрессирующему вектору, содержащему одну или несколько ДНК-последовательностей по настоящему изобретению. Соответственно, предлагается клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий одну или несколько ДНК-последовательностей, кодирующих антитело по настоящему изобретению. Соответственно, клонирующий или экспрессирующий вектор содержит две ДНК-последовательности, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь молекулы антитела по настоящему изобретению, соответственно, и подходящие сигнальные последовательности. В одном примере вектор содержит межгенную последовательность между тяжелой и легкой цепями (см. WO03/048208).
Общие методы, с помощью которых конструировали векторы, методы трансфекции и культивирования также известны специалистам в данной области. В этом отношении сделана ссылка на "Current Protocols in Molecular Biology", 1999, F. M. Ausubel (ed), Wiley Interscience, New York, и Maniatis Manual, Cold Spring Harbor Publishing.
Также предлагается клетка-хозяин, содержащая один или несколько клонирующих или экспрессирующих векторов, включающих одну или несколько ДНК-последовательностей, кодирующих антитело по настоящему изобретению.
Соответственно, в настоящем изобретении также предлагается клетка-хозяин для экспрессии антитела согласно изобретению, содержащая:
i) ДНК-последовательность, кодирующую тяжелую цепь указанного антитела, и
ii) ДНК-последовательность, кодирующую легкую цепь указанного антитела,
где ДНК-последовательности представлены в одном или в нескольких клонирущих или экспрессирующих векотрах.
Любая подходящая система клетка-хозяин/вектор может
использоваться для экспрессии ДНК-последовательностей,
кодирующих молекулу антитела по настоящему изобретению. Может использоваться бактериальная система, например Е. coliг а также
другие микробные системы (особенно для экспрессии фрагментов антитела), или также могут использоваться эукариотические системы экспрессии, например, клетки-хозяева млекопитающих (особенно для экспрессии полноразмерных антител). Подходящие клетки-хозяева млекопитающих включают клетки СНО, миеломные или гибридомные клетки.
Подходящие типы клеток из яичников китайского хомяка (СНО-клетки) для применения в настоящем изобретении могут включать клетки СНО и СН0-К1, включающие клетки dhfr- СНО, такие как СНО-DG44 и CH0-DXB11, которые могут использоваться вместе с маркером селекции DHFR, или клетки CH0K1-SV, которые могут использоваться вместе с маркером селекции глутамин синтетазой. Другие типы клеток для использования в экспрессии антител включают лимфоцитарные клеточные линии, например, миеломные клетки NSO и клетки SP2, клетки COS.
В настоящем изобретении также предлагается способ получения молекулы антитела по настоящему изобретению, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей вектор или векторы по настоящему изобретению, при условиях, подходящих для экспрессии белка из ДНК, кодирующей молекулу антитела по настоящему изобретению, и выделение молекулы антитела.
Молекула антитела может содержать только полипептид тяжелой
цепи или только легкой цепи, в этом случае только
последовательность, кодирующая полипептид тяжелой цепи или
только легкой цепи необходима для трансфекции клеток-хозяев. Для
получения продуктов, содержащих обе цепи - тяжелую и легкую,
клеточная линия может быть трансфецирована двумя векторами,
причем первый вектор кодирует полипептид легкой цепи, а второй
вектор кодирует полипептид тяжелой цепи. Альтернативно, может
использоваться единственный вектор, включающий
последовательности, кодирующие легкую цепь и тяжелую цепь.
Антитела и фрагменты согласно настоящему изобретению экспрессируются из клеток-хозяев на хорошем уровне. Таким образом, свойства антител и/или фрагментов способствуют коммерческому процессированию.
Таким образом, предлагается способ культивирования клетки
хозяина и экспрессии антитела или его фрагмента, выделения последних и необязательно очистки с получением выделенного антитела или его фрагмента. В одном воплощении, способ дополнительно включает стадию конъюгации эффекторной молекулы с выделенным антителом или с его фрагментом, например, конъюгации с полимером ПЭГ, конкретно, как описано в данном документе.
В одном воплощении, предлагается способ очистки антитела (конкретно, антитела или его фрагмента согласно изобретению), включающий стадии: осуществления анионо-обменной хроматографии несвязывающего типа, так что примеси остаются на колонке, а антитело элюируется.
В одном воплощении, для очистки применяется аффинный захват на FcRn-колонке.
В одном воплощении для очистки применяется цибакрон голубой или аналогичный краситель для очистки химерных молекул с альбумином или конъюгатов.
Подходящие ионообменные смолы для применения в способе включают смолу Q.FF (поставляется GE-Healthcare). Стадия может, например, осуществляться при рН примерно 8.
Способ может дополнительно включать исходную стадию
захвата, применяющую катионо-обменную хроматографию,
осуществляемую при рН примерно 4-5, как например, 4,5. Катионо-обменная хроматография может, например, применять смолу, такую как CaptoS или SP сефарозу FF (поставляется GE-Healthcare). Антитело или его фрагмент могут затем элюироваться со смолы с применением солевого раствора, такого как хлорид натрия, например, при концентрации 2 00 мМ.
Таким образом, при необходимости стадия или стадии хроматографии могут включать одну или несколько стадий промывки.
Способ очистки также может включать стадии фильтрации, как например, стадию диафильтрации.
Таким образом, в одном воплощении, предлагается очищенное антитело к FcRn или его фрагмент, например, гуманизированное антитело или фрагмент, конкретно антитело или фрагмент согласно изобретению по существу в очищенной форме, конкретно, свободное или по существу свободное от эндотоксина и/или белка клетки
хозяина или ДНК.
Подразумевается, что используемый выше термин "очищенная форма" относится по меньшей мере к 90% чистоты, как например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% масс./масс, или более чистоты.
Подразумевается, что "по существу свободный от эндотоксина", как правило, относится к содержанию эндотоксина 1 EU на 1 мг продукта антитела или менее, как например, 0,5 или 0,1 EU на 1 мг продукта.
Подразумевается, что "по существу свободный от белка клетки-хозяина или от ДНК", как правило, относится к содержанию белка клетки-хозяина и/или ДНК, которое составляет 400пг на 1 мг продукта антитела или менее, как например, ЮОпг на 1мг или менее, конкретно, 20пг на 1мг, соответственно.
Молекулы антител по настоящему изобретению также могут использоваться для диагностики, например, при in vivo диагностике и визуализации болезненных состояний, включающих FcRn.
Антитела по настоящему изобретению применяются для лечения и/или профилактики патологического состояния, в настоящем изобретении также предлагаются фармацевтические или диагностические композиции, включающие молекулу антитела по настоящему изобретению в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, разбавителями или носителями. Соответственно, предлагается применение молекулы антитела по изобретению для получения лекарственного средства. Композиция обычно поставляется в виде части стерильной фармацевтической композиции, которая стандартно включает фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем изобретении также предлагается способ получения фармацевтической или диагностической композиции, включающий введение и смешивание молекулы антитела по настоящему изобретению вместе с одним или с несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, разбавителями или
носителями.
Молекула антитела может представлять собой единственный активный ингредиент в фармацевтической или в диагностической композиции или ей могут сопутствовать другие активные ингредиенты, включающие другие ингредиенты, такие как стероиды или другие лекарственные молекулы, конкретно, лекарственные молекулы, чей период полужизни независим от связывания FcRn.
Фармацевтические композиции соответственно включают терапевтически эффективное количество антитела по изобретению. Используемый в данном документе термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству терапевтического агента, которое необходимо для лечения, ослабления или предотвращения целевого заболевания или патологического состояния, или для демонстрации детектируемого или превентивного эффекта. Для любого антитела терапевтически эффективное количество можно исходно оценить либо с помощью культурального анализа, или с помощью животных моделей, обычно грызунов, кроликов, собак, свиней или приматов. Животная модель также может использоваться для определения соответствующего диапазона концентрации и пути введения. Такую информацию можно затем использовать для определения подходящих доз и путей введения людям.
Точное терапевтически эффективное количество для объекта-человека будет зависеть от тяжести болезненного состояния, общего состояния здоровья объекта, возраста, массы тела и пола объекта, диеты, времени и частоты введения, лекарственной комбинации(й) , чувствительности реакции и восприимчивости/ответа на терапию. Это количество может определяться с помощью стандартного эксперимента, что находится в компетенции врача. Как правило, терапевтически эффективное количество будет составлять от 0,01 мг/кг до 500 мг/кг, например, 0,1 мг/кг - 200 мг/кг, как например, 100 мг/кг.
Фармацевтические композиции могут быть представлены стандартным образом в единых лекарственных формах, содержащих определенное количество активного агента по изобретению на одну дозу.
Терапевтические дозы антител согласно настоящему изобретению демонстрируют отсутствие видимых токсикологических эффектов in vivo.
В одном воплощении антитела или фрагмента согласно изобретению однократная доза может обеспечивать до 70% уменьшения уровня IgG в кровотоке. В одном примере антитела или фрагмента согласно изобретению однократная доза может обеспечивать до 8 0% уменьшения уровня IgG в кровотоке. В одном примере антитела или фрагмента согласно изобретению однократная доза может обеспечивать более чем 8 0% уменьшения уровня IgG в кровотоке.
Максимальное терапевтическое уменьшение IgG в кровотоке может наблюдаться примерно через 1 неделю после введения соответствующей терапевтической дозы. Уровень IgG может восстанавливаться в течение около недель после дозирования, если при этом не вводились дополнительные терапевтические дозы. Применяемый в данном документе термин "восстановление" относится к возвращению уровня до значений, наблюдавшихся перед началом исходного дозирования.
Предпочтительно, уровень IgG in vivo может сохраняться на соответствующем низком уровне с помощью введения последовательных доз антитела или фрагмента согласно изобретению.
Композиции могут вводиться пациенту индивидуально или могут вводиться в комбинации (напримерг одновременно, последовательно или раздельно) с другими агентами, лекарственными средствами или с гормонами.
Применяемый в данном документе термин "агенты" относится к компоненту, который при введении оказывает физиологическое воздействие.
Применяемый в данном документе термин "лекарственное средство" относится к химическому компоненту, который в терапевтической дозе оказывает соответствующее физиологическое воздействие.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно настоящему изобретению применяют вместе с иммуноподавляющей
терапией, такой как стероиды, конкретно, преднизон.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно настоящему изобретению применяются вместе с Ритуксимаб или с другими В-клеточными терапиями.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно настоящему изобретению применяются вместе с любым агентом, модулирующим В-клетки или Т-клетки, или с иммуномодулятором. Примеры включают метотрексат, микрофениолат и азатиоприн.
Доза, в которой вводят молекулу антитела по настоящему изобретению, зависит от характера патологического состояния, которое подвергается лечению, степени присутствующего воспаления и от того используется ли молекула антитела для профилактики или для лечения существующего патологического состояния.
Частота дозирования будет зависеть от периода полужизни антитела, его расположения, опосредованного мишенью, продолжительностью эффекта и присутствием антител к лекарственным средствам. Если антитело имеет короткий период полужизни (несколько часов) или ограниченную активность и/или если целесообразна доставка небольших объемов лекарственного средства (например, для подкожной инъекции), то может потребоваться частое дозирование, настолько частое, как один или более раз в день. Альтернативно, если антитело имеет длительный период полужизни, обладает продолжительной активностью или может дозироваться в больших объемах (как например, с помощью инфузии), то дозирование может быть нечастым, раз в день или каждые несколько дней, недель или месяцев. В одном воплощении, между дозами дается достаточно времени, чтобы была возможность уменьшения уровня антитела к лекарственному средству.
Подразумевается, что используемый в данном документе термин "период полужизни" относится к периоду существования молекулы в кровотоке, например, в сыворотке/плазме.
Применяемый в данном документе термин "фармакодинамика" относится к профилю и, конкретно, к продолжительности биологического действия молекулы согласно настоящему изобретению.
Фармацевтически приемлемый носитель не должен сам вызывать
продуцирование антител, вредных для индивидуума, получающего
композицию, и не должен быть токсичным. Подходящие носители
могут представлять собой крупные медленно метаболизирующиеся
макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы,
полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолиевые кислоты,
полимерные аминокислоты, сополимеры аминокислот и
инактивированные вирусные частицы.
Могут использоваться фармацевтически приемлемые соли, например, соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты и сульфаты или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты и бензоаты.
Фармацевтически приемлемые носители в терапевтических композициях могут дополнительно содержать жидкости, такие как вода, физиологический раствор, глицерин и этанол. Дополнительно, в такой композиции могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как увлажнители или эмульгаторы или регулирующие рН буферные вещества. Такие носители дают возможность фармацевтическим композициям быть включенным в состав в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, густых суспензий и суспензий для потребления пациентом.
Подходящие формы для введения включают формы, подходящие для парентерального введения, например, с помощью инъекции или инфузии, например, с помощью болюсной инъекции или продолжительной инфузии. В случае, когда продукт предназначен для инъекции или инфузии, он может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или в водном носителе, и он может содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие агенты, консерванты, стабилизаторы и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, молекула антитела может быть представлена в сухой форме для восстановления перед использованием с помощью подходящей стерильной жидкости.
После смешивания композиции по изобретению можно вводить непосредственно объекту. Объектами, которых подвергают лечению, могут быть животные. Однако в одном или в нескольких воплощениях композиции адаптированы для введения объекту-человеку.
Соответственно, в составах согласно настоящему изобретению
рН конечного состава не совпадает со значением изоэлектрической точки антитела или фрагмента, например, если pi белка находится в диапазоне 8-9 или выше, то рН состава, равное 7, может быть подходящим. Не будучи связанными теорией, полагают, что это, в конечном счете, может обеспечить получение конечного состава с улучшенной стабильностью, например, когда антитело или фрагмент сохраняется в растворе.
В одном примере фармацевтический состав при рН в диапазоне 4-7 включает: 1-200мг/мл молекулы антитела согласно настоящему изобретению, 1-100 мМ буфера, 0,001-1% поверхностно активного вещества, а) 10-500 мМ стабилизатора, Ь) 10-500 мМ стабилизатора и 5-500 мМ агента тоничности, или с) 5-500 мМ агента тоничности.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут
быть введены любыми путями, включая, без ограничения
перечисленным, пероральные, внутривенные, внутримышечные,
внутриартериальные, костномозговые, интратекальные,
внутрижелудочковые, трансдермальные, чрескожные (например, см. WO98/20734), подкожные, внутрибрюшинные, интраназальные, энтеральные, местные, подъязычные, интравагинальные или ректальные пути введения. Безыгольные инжекторы также могут использовать для введения фармацевтических композиций по изобретению. Как правило, терапевтические композиции могут быть получены в виде инъецируемых растворов, либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий. Также могут быть приготовлены твердые формы, подходящие для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией.
Прямая доставка композиций будет, как правило, осуществляться посредством инъекции, подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно или внутримышечно, или доставка осуществляется в межтканевое пространство. Композиции также могут быть введены в пораженный участок. Лечение с использованием дозировок может представлять собой схему однократного дозирования или схему многократного дозирования.
Понятно, что активный ингредиент в композиции представляет собой молекулу антитела. Как таковой он будет восприимчив к деградации в желудочно-кишечном тракте. Таким образом, если
композицию следует вводить с помощью пути с использованием желудочно-кишечного тракта, то композиция должна будет содержать агенты, которые защищают антитела от деградации, но которые высвобождают антитела из желудочно-кишечного тракта после всасывания.
Детальное обсуждение фармацевтически приемлемых носителей доступно в Remington's РН armaceutical Sciences (Mack Publishing Company, N.J. 1991).
В одном воплощении, состав предлагается в виде состава для местного введения, включающего ингаляцию.
Подходящие препараты для ингаляции включают порошки для ингаляции, дозированные аэрозоли, содержащие газы-пропелленты, или растворы для ингаляции, свободные от газов-пропеллентов. Порошки для ингаляции согласно изобретению, содержащие активное вещество, могут состоять только из вышеупомянутых активных веществ или из смеси вышеупомянутых активных веществ вместе с физиологически приемлемым вспомогательным веществом.
Эти порошки для ингаляции могут включать моносахариды (например, глюкозу или арабинозу), дисахариды (например, лактозу, сахарозу, мальтозу), олиго- и полисахариды (например, декстраны), полиспирты (например, сорбит, маннит, ксилит), соли (например, хлорид натрия, карбонат кальция) или их смеси друг с другом. Соответственно, используют моно- или дисахариды, такие как лактоза или глюкоза, особенно, но не исключительно в форме их гидратов.
Для частиц, которые депонируются в легких, требуется размер менее чем 10 микрон, как например, 1-9 микрон, например, от 1 до 5 мкм. Размер частиц активного ингредиента (такого как антитело или его фрагмент) имеет первостепенное значение.
Газы-пропелленты, которые могут использоваться для
приготовления аэрозолей для ингаляции, известны в данной
области. Подходящие газы-пропелленты выбирают из числа
углеводородов, таких как п-пропан, n-бутан или изобутан, и
галогенуглеводородов, таких как хлорированные и/или
фторированные производные метана, этана, пропана, бутана, циклопропана или циколбутана. Вышеупомянутые газы-пропелленты
могут использоваться сами по себе или в виде их смесей.
Особенно подходящие газы-пропелленты представляют собой галогенированные производные алканов, выбранные из числа TG 11, TG 12, TG 134а и TG227. Из вышеупомянутых галогенированных углеводородов особенно подходящими являются TG134a (1,1,1,2-тетрафторэтан) и TG227 (1, 1, 1, 2, 3, 3, 3-гептафторпропан), а также их смеси.
Аэрозоли для ингаляции, содержащие газы-пропелленты, также
могут содержать другие ингредиенты, такие как ко-растворители,
стабилизаторы, поверхностно-активные агенты (ПАВ),
антиоксиданты, смазывающие агенты и средства для приведения рН . Все эти ингредиенты известны в данной области.
Аэрозоли для ингаляции, содержащие газы-пропелленты, согласно изобретению могут содержать до 5 масс.% активного вещества. Аэрозоли согласно изобретению содержат, например, 0,002-5 масс.%, 0,01-3 масс.%, 0,015-2 масс.%, 0,1-2 масс.%, 0,5-2 масс.% или 0,5-1 масс.% активного ингредиента.
Альтернативно, местные введения в легкое также могут представлять собой введение состава в виде жидкого раствора или суспензии, например, с применением устройства, такого как небулайзер, например, небулайзер, соединенный с компрессором (например, небулайзер Pari LC-Jet Plus(R), соединенный с компрессором Pari Master(R), произведенный Pari Respiratory Equipment, Inc., Ричмонд, Вирджиния.).
Антитело по изобретению может быть доставлено будучи диспергированным в растворителе, например, в форме раствора или суспензии. Оно может быть суспендировано в подходящем физиологическом растворе, например, в солевом растворе или в другом фармакологически приемлемом растворителе или в буферном растворе. Примеры буферных растворов, известные в данной области, могут содержать 0,05мг - 0,15мг динатрий эдетата, 8мг -9мг NaCl, 0,15мг - 0,25мг полисорбата, 0,25мг - 0,3мг безводной лимонной кислоты и 0,45мг - 0,55мг цитрата натрия на 1 мл воды с достижением рН примерно 4-5. Для суспензии может применяться, например, лиофилизированное антитело.
Составы в виде терапевтических суспензий или растворов
также могут содержать одно или несколько вспомогательных веществ. Вспомогательные вещества хорошо известны в данной области и включают буферы (например, цитратный буфер, фосфатный буфер, ацетатный буфер и бикарбонатный буфер), аминокислоты, мочевину, спирты, аскорбиновую кислоту, фосфолипиды, белки (например, сывороточный альбумин), EDTA, хлорид натрия, липосомы, маннит, сорбит и глицерин. Растворы или суспензии могут быть инкапсулированы в липосомах или биодеградируемых микросферах Состав, как правило, будет обеспечиваться, по существу, в стерильной форме с применением стерильного способа получения.
Это может включать получение и стерилизацию путем фильтрации буферного растворителя/раствора, используемого для состава, асептическое суспендирование антитела в стерильном растворе буферного растворителя и разлив состава в стерильную тару с помощью методов, знакомых специалистам в данной области.
Составы для распыления согласно настоящему изобретению могут обеспечиваться, например, в виде форм с однократной дозой (например, запечатанные пластиковые контейнеры или флаконы), упакованных фольгой. Каждый флакон содержит однократную дозу в объеме, например, 2 мл растворителя/буферного раствора.
Антитела, раскрытые в данном документе, могут быть пригодны для доставки посредством распыления.
Также предусмотрено, что антитело по настоящему изобретению может вводиться с использованием генной терапии. Чтобы этого достичь, ДНК-последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепь молекулы антитела под контролем подходящих ДНК-компонентов, вводят пациенту так, чтобы цепи антитела экспрессировались с ДНК-последовательностей и происходила их сборка in situ.
В настоящем изобретении также предлагается молекула антитела (или композиции, ее содержащие) для применения для контроля таких заболеваний как аутоиммунное заболевание, например, острый рассеянный энцефаломиелит (ADEM), острый некротический геморрагический лейкоэнцефалит, болезнь Аддисона, агаммаглобулинемия, гнездная алопеция, амилоидоз, ANCA-ассоциированный васкулит, анкилозирующий спондилит, анти-
GBM/Анти-ТВМ нефрит, антифосфолипидный синдром (APS), аутоиммунная ангиодистрофия, аутоиммунная апластическая анемия, аутоиммунная дизавтономия, аутоиммунный гепатит, аутоиммунная гиперлипидемия, аутоиммунный иммунодефицит, аутоиммунные заболевания внутреннего уха (AIED), аутоиммунный миокардит, аутоиммунный панкреатит, аутоиммунная ретинопатия, аутоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (АТП), аутоиммунные заболевания щитовидной железы, аутоиммунная крапивница, аксональная & NAL невропатии, болезнь Бало, болезнь Бехчета, буллезный пемфигоид, кардиомиопатия, болезнь Каслман, целиакия, болезнь Шагаса, хронические воспалительные демиелинизирующие полиневропатии
(CIDP) , хронический рецидивирующий мультифокальной остеомиелит
(CRMO), синдром Чарга-Стросса, рубцовый
пемфигоид/доброкачественный пемфигоид слизистой, болезнь Крона, синдром Когане, холодная болезнь агглютининов, врожденная блокада сердца, Коксаки миокардит, болезнь CREST, наследственная смешанная криоглобулинемия, демиелинизирующие невропатии, Дерматит герпетиформный, дерматомиозит, болезнь Девич
(оптиконевромиелит), дилатационная кардиомиопатия, дискоидная
волчанка, синдром Дресслера, эндометриоз, эозинофильный
ангиоцентрический фиброз, эозинофильный фасциит, эритема,
экспериментальный аллергический энцефаломиелит, синдром Эванса,
фиброзирующий альвеолит, гигантоклеточный артериит (височный
артериит), гломерулонефрит, синдром Гудпасчера, гранулематоз с
полиангиитом (GPA) см. Вегенера, болезнь Грейвса, синдром
Гийена-Барре, энцефалит Хашимото, тиреоидит Хашимото,
гемолитическая анемия, пурпура Шенлейна-Геноха, Герпес в период
беременности, гипогаммаглобулинемия, идиопатический
гипокомплементемический тубулоинтерстициальный нефрит,
идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ИТП), IgA-
нефропатии, 1дС4-связанные заболевания, 1дС4-связанные
склерозирующие заболевания, иммунорегуляторные липопротеины,
воспалительная аортальная аневризма, воспалительная
псевдоопухоль, тела включения миозит, инсулинозависимый диабет
(тип 1), интерстициальный цистит, артрит ювенильный, ювенильный диабет, синдром Кавасаки, опухоль Куттнера, синдром Ламберта-
Итона, лейкоцитокластический васкулит, красный плоский лишай,
лишай склероатрофический, деревянистый конъюнктивит, линейный
IgA-зависимый дерматоз (ЛАД), волчанка (SLE), болезнь Лайма,
хронический медиастенальный фиброз, болезнь Меньера,
микроскопический полиангиит, синдром Микулича, смешанное
заболевание соединительной ткани (MCTD), разъедающая язва
роговицы, болезнь Муха-Хаберманн, мультифокальный фибросклероз,
рассеянный склероз, миастения, миозит, нарколепсия,
оптиконевромиелит (Девич), нейтропения, глазной рубцовой пемфигоид, неврит зрительного нерва, болезнь Ормонда
(забрюшинный фиброз), палиндромный ревматизм, PANDAS (детские
аутоиммунные нервно-психические расстройства, связанные со
стрептококком), паранеопластическая дегенерация мозжечка,
парапротеин-полинейропатии, пароксизмальная ночная
гемоглобинурия (НПГ), синдром Парри Ромберга, синдром Парсоннаж-
Тернера, Pars planitis (периферийный увеит), пузырчатка
обыкновенная, периаотит, периартериит, периферическая
нейропатия, перивенозной энцефаломиелит, злокачественная анемия,
синдром POEMS, узелковый полиартрит, тип I, II, и III
аутоиммунные полигландулярные синдромы, полимиалгия
ревматическая, полимиозит, синдром постинфарктный,
посткардиотомный синдром, прогестероновый дерматит, первичный билиарный цирроз печени, первичный склерозирующий холангит, псориаз, псориатический артрит, идиопатический легочный фиброз, пиодермия гангренозная, ИЭЦА, феномен Рейно, рефлекторная симпатическая дистрофия, синдром Рейтера, возвратный полихондрит, синдром беспокойных ног, забрюшинный фиброз
(болезнь Ормонда), ревматизм, ревматоидный артрит, тиреоидит Риделя, саркоидоз, синдром Шмидта, склерит, склеродермия, синдром Шегрена, аутоиммунитет к антигенам спермы и тестикул, синдром мышечной скованности, подострый бактериальный эндокардит
(SBE), синдром Сусака, симпатическая офтальмия, артериит
Такаясу, височный артериит/гигантоклеточный артериит,
тромбическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТП), синдром Толоса-Хант, поперечный миелит, язвенный колит, недифференцированные заболевания соединительной ткани (UCTD), увеит, васкулит,
везикулобуллезный дерматоз, Витилиго, макроглобулинемии Вальденстрема, идиопатическая гемолитическая анемия с тепловыми антителами и гранулематоз Вегенера (теперь называется гранулематоз с полиангиитом (GPA)).
Дополнительные показания к применению также могут включать синдром повышенной вязкости крови; криоглобулинемию; рецидивирующий фокальный и сегментный гломерулосклероз в трансплантированной почке; синдром HELLP; болезнь Рефсума; ВИЧ-ассоциированную невропатию; рабдомиолиз и аллоиммунные заболевания.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно изобретению применяют при лечении или профилактике эпилепсии или пароксизма.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно изобретению применяют при лечении или профилактике рассеянного склероза.
В одном воплощении, антитела или фрагменты согласно изобретению применяют при аллоиммунных заболеваниях/показаниях, которые включают:
Трансплантацию от несовместимого донора из-за антител к HLA Фетальную и неонатальную тромбоцитопению, FNAIT (или неонатальная аллоиммунная тромбоцитопения, NAITP или NAIT или NAT, или аллоиммунная тромбоцитопения плод-мать, FMAITP или FMAIT).
Дополнительные показания к применению включают: быстрое выведение Fc-содержащих биофармацевтических лекарственных средств у пациентов-людей и комбинация терапии антител к FcRn с другими терапиями - IVIg, Ритуксан, плазмаферез. Например, терапия с антителом к FcRn может применяться после терапии с использованием Ритуксана. Кроме того, терапия с использованием антитела к FcRn может использоваться для быстрого выведения визуализирующих агентов, таких как радиоактивно меченные антитела, используемые при визуализации опухолей.
В одном воплощении, антитела и фрагменты по изобретению применяют при неврологических заболеваниях, таких как:
хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия
(CIDP)
синдром Гийена - Барре Парапротеинемические плиневропатии
Оптикомиелит (NMO, NMO спектральные расстройства или NMO спектральные заболевания), и Миастения гравис.
В одном воплощении, антитела и фрагменты по изобретению применяют при дерматологических расстройствах, таких как: Буллёзный пемфигоид Обыкновенная пузырчатка ANCA-ассоциированный васкулит Дилатационная кардиомиопатия
В одном воплощении, антитела и фрагменты по изобретению применяют при иммунологических, гематологических расстройствах, таких как:
Идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура (ITP) Тромботическая тромбоцитопеническая пурпура (ТТР) Идиопатическая гемолитическая анемия с тепловыми антителами Синдром Гудпасчера
Трансплантация от несовместимого донора из-за антител к HLA
В одном воплощении, расстройство выбирают из следующих:
Миастения гравис, оптиконейромиелит, CIDP, синдром Гийом-Барре,
Парапротеин-Полиневропатия, рефракторная эпилепсия, ITP/TTP,
гемолитическая анемия, синдром Гудпасчера, АВО несоответствие,
волчаночный нефрит, почечный васкулит, склеродерма,
фиброзирующий альвеолит, дилатационная кардиомиопатия, болезнь Грейвса, диабет типа 1, Аутоиммунный диабет, пузырчатка, склеродерма, волчанка, ANCA васкулит, дерматомиозит, болезнь Шегрена и ревматоидный артрит.
В одном воплощении, расстройство выбирают из следующих: аутоиммунный полиэндокринный синдром типа 1 (APECED или синдром Уитакера) и 2 (синдром Шмидта); алопеция; миастенический криз; щитовидный криз; заболевания щитовидной железы, ассоциированные с щитовидной железой глазные заболевания; связанная с щитовидной железой офтальмопатия; аутоиммунный диабет; энцефалит и/или энцефалопатия, связанные с аутоантителами; пузырчатка
листовидная; буллезный эпидермолиз; герпетиформный дерматит;
хорея Сиденхам; острая моторная аксональная нейропатия (AMAN);
синдром Миллера-Фишера; мультифокальная моторная невропатия
(ММН) ; опсоклонус; воспалительная миопатия; синдром
Исаака(аутоиммунная невромиотония) , Паранеопластические синдромы и лимбический энцефалит.
Антитела и фрагменты по настоящему изобретению могут применяться при лечении или профилактике.
В настоящем изобретении также предлагается способ уменьшения концентрации нежелательных антител у индивидуума, включающий стадии введения индивидууму терапевтически эффективной дозы антитела к FcRn или его связывающего фрагмента, описанного в данном документе.
В настоящем изобретении дополнительно предлагается применение молекулы антитела согласно настоящему изобретению для получения лекарственного средства для лечения и/или профилактики патологического расстройства, описанного в данном документе, такого как аутоиммунное заболевание.
В одном воплощении настоящее изобретение включает применение антител или их фрагментов в качестве реагентов для диагностики, например, антител или их фрагментов, конъюгированных с репортерной молекулой. Таким образом, предлагается антитело или фрагмент согласно изобретению, которое является меченным. В одном аспекте предлагается колонка, содержащая антитела или фрагмент согласно изобретению.
Таким образом, предлагается антитело к FcRn или его связывающий фрагмент для применения в качестве реагента для таких применений как:
1) очистка белка FcRn (или его фрагментов) конъюгированного с матрицей и используемого в качестве аффинной колонки или (в качестве модифицированной формы антитела к FcRn), в качестве осаждающего агента (например, в качестве формы, модифицированной с использованием домена, распознаваемого другой молекулой, которая может быть модифицирована путем добавления Fc (или полученной в виде полноразмерного IgG), который необязательно осаждается с помощью реагента антитела к Fc);
2) детектирование и/или количественная оценка FcRn на клетках или в клетках, живых или фиксированных (клетки in vitro или in vivo в тканевых или в клеточных срезах). Такое применение может включать количественную оценку FcRn в качестве биомаркера для отслеживания эффекта обработки антителом к FcRn. Для этих целей кандидат может использоваться в модифицированной форме (например, путем добавления Fc-домена как в полноразмерном IgG, или некоторых других компонентов в качестве генетически сшитого белка или химического конъюгата, как например добавление флуоресцентной метки, используемой для целей детектирования).
3) очистка или сортировка FcRn-несущих клеток, меченных путем связывания с кандидатом, модифицированным способами, приведенными в (1) и (2) .
Также в настоящем изобретении предлагается анализ, подходящий для оценки способности тестируемой молекулы, такой как молекула антитела, блокировать активность FcRn и, конкретно, способности клеток к рециклингу IgG. Такой анализ может использоваться для идентификации ингибиторов активности FcRn, таких как молекулы антител или небольшие молекулы, и, как таковой, он может использоваться в качестве серийного анализа при получении такого ингибитора.
В одном аспекте предлагается анализ, подходящий для оценки способности тестируемой молекулы, такой как молекула антитела, блокировать активность человеческого FcRn и, конкретно, способность человеческого FcRn осуществлять рециклинг IgG, где способ включает стадии:
a) нанесения на поверхность покрытия в виде клеток
млекопитающих, но не человека, рекомбинантно экспрессирующих
альфа-цепь человеческого FcRn и человеческий J3 2-микро глобулин
(Р2М),
b) контакт клеток при слабо кислых условиях, как например,
при рН примерно 5,9 с тестируемой молекулой и с IgG для
рециклинга клеткой, в течение периода времени, достаточного для
возможности связывания как тестируемой молекулы, так и IgG с
FcRn, необязательно добавление тестируемой молекулы перед IgG
для рециклинга, и инкубирование в течение периода времени, достаточного для возможности связывания тестируемой молекулы с FcRn.
c) промывка с использованием слабо кислого буфера, и
d) детектирование количества IgG, интернализованного и/или подвергнутого рециклингу клетками.
В одном аспекте предлагается анализ, подходящий для оценки способности тестируемой молекулы, такой как молекула антитела, блокировать активность человеческого FcRn и, конкретно, способность человеческого FcRn к рециклингу IgG, где способ включает стадии:
a) нанесения на поверхность покрытия в виде клеток
млекопитающих, но не человека, рекомбинантно экспрессирующих
альфа-цепь человеческого FcRn и человеческий J3 2-микро глобулин
(р2М),
b) контакт клеток при слабо кислых условиях, как например, при рН примерно 5,9 с тестируемой молекулой антитела и с IgG для рециклинга клеткой, в течение периода времени, достаточного для возможности связывания как тестируемой молекулы, так и IgG с FcRn, необязательно добавление тестируемой молекулы перед IgG для рециклинга, и инкубирование в течение периода времени, достаточного для возможности связывания тестируемой молекулы с FcRn.
c) промывка с использованием слабо кислого буфера для удаления несвязанного IgG и тестируемой молекулы антитела, и
d) детектирование количества IgG, подвергнутого клетками рециклингу.
В одном аспекте предлагается анализ, подходящий для оценки способности тестируемой молекулы, такой как молекула антитела, блокировать активность человеческого FcRn и, конкретно, способность человеческого FcRn к рециклингу IgG, где способ включает стадии:
а) нанесения на поверхность покрытия в виде клеток млекопитающих, но не человека, рекомбинантно экспрессирующих альфа-цепь человеческого FcRn и Р2-человеческий микроглобулин
(р2М),
b) контакт клеток при слабо кислых условиях, как например, при рН примерно 5,9 с тестируемой молекулой антитела и с IgG для рециклинга клеткой, в течение периода времени, достаточного для возможности связывания как тестируемой молекулы, так и IgG с FcRn, необязательно добавление тестируемой молекулы перед IgG для рециклинга, и инкубирование в течение периода времени, достаточного для возможности связывания тестируемой молекулы с FcRn.
c) промывка с использованием слабо кислого буфера для удаления несвязанного IgG и тестируемой молекулы антитела,
d) инкубирование клеток в нейтральном буфере, как например, при рН примерно 7, 2
e) детектирование количества IgG, подвергнутого клетками рециклингу, путем определения количества IgG, высвобождаемого в надосадочную жидкость.
Подходящие клетки включают клетки Мадин-Дарби почек собак (MDCK) II. Трансфекция клеток MDCKII альфа-цепью человеческого FcRn и человеческим Р2-микроглобулином Р2М) ранее описана в Claypool et al r 2002, Journal of Biological Chemistry, 277, 31, 28038-28050. В данной статье также описан рециклинг IgG этими трансфецированными клетками.
Среда для поддержания клеток во время теста включает полную среду, содержащую MEM (Gibco #21090-022), 1 х неосновные аминокислоты (Gibco 11140-035), 1 х пируват натрия (Gibco #11360-039), и L-глутамин (Gibco # 25030-024).
Раствор для кислой промывки можно приготовить, используя HBSS+ (РАА #Н15-008) и добавляя туда 1М MES, доводя рН до 5,9 +/- 0,5. BSA примерно 1% также может быть добавлен (Sigma # А9 64 7). Раствор для нейтральной промывки можно приготовить, используя HBSS+ (РАА #Н15-008) и добавляя туда 10 М Hepes, доводя рН до 7,2 +/- 0,5. BSA примерно 1% также может быть добавлен (Sigma # А9647).
Промывка клеток с помощью кислого буфера удаляет несвязанное тестируемое антитело и несвязанный IgG и позволяет
осуществлять дальнейший анализ. Кислые условия, используемые в стадии (Ь) , способствуют связыванию IgG с FcRn и его интернализации и рециклингу.
Количество тестируемого антитела или фрагмента и IgG только на поверхности клеток может определяться с помощью промывки клеток нейтральным раствором для промывки и с помощью анализа надосадочной жидкости/смыва для детектирования количества тестируемого антитела или IgG. Важно, что лизирующий буфер не применяется. Для определения количества IgG, интернализованного клетками, антитело может быть сначала удалено с поверхности клетки с использованием нейтральной промывки, и клетки лизируют лизирующим буфером и затем анализируют внутреннее содержание. Для определения количества IgG, подвергнутого клетками рециклингу, клетки инкубируют при нейтральных условиях в течение соответствующего периода времени и буферную среду анализируют на предмет содержания IgG. Если необходимо поверхностное и внутреннее содержание антител клетки, то клетка может быть промыта с использованием кислой промывки для сохранения присутствия антитела на клеточной поверхности с последующим клеточным лизисом и анализом объединенного материала.
В случае, где целью является измерение как интернализованного, так и подвергнутого рециклингу IgG, образцы прогоняют в двух экземплярах и проводят тестирование интернализации и рециклинга по отдельности.
Подходящий лизирующий буфер включает 150 мМ NaCl, 2 0 мМ Tris, рН 7,5, 1 мМ EDTA, 1 мМ EGTA, 1% Triton-X 100, на каждые 10 мл добавляли протеазные ингибиторы/фосфатные ингибиторы, как описано в инструкции производителя.
Как правило, IgG, который подвергается рециклингу, является меченным, в одном примере используется биотинилированный человеческий IgG. Затем IgG может детектироваться с применением, например, детектирующего антитела, меченного стрептавидином с sulfo-tag (такого как MSD # r32ad-5) 25 мл в количестве 0,2 мкг/мл MSD блокирующего буфера. Блокирующий буфер может содержать 500 мМ Tris, рН 7,5, 1,5 М NaCl и 0,2% Tween-20 и 1,5% BSA.
Альтернативно, IgG может быть предварительно помечен с помощью флуорофора или похожей метки.
В одном воплощении, подходящая поверхность представляет собой пластиковый планшет или лунку, такую как 9б-луночный планшет или что-то подобное, предметное стекло или мембрану. В одном примере клетки наносят в виде покрытия на поверхность с такой плотностью, которая приводит к образованию монослоя.
В одном воплощении, анализ, описанный в данном документе, не является измерением трансцитоза антитела сверху вниз через мембрану в градиенте рН ,например, когда кислые условия с одной стороны мембраны и нейтральные условия с обратной стороны мембраны.
В одном примере, тестируемое антитело или его фрагмент и IgG могут инкубировать с клетками в стадии (Ь) в течение примерно 1 часа например при нормальной температуре при кислых условиях для возможности связывания.
В одном примере, тестируемое антитело или его фрагмент могут инкубировать с клетками в стадии (Ь) в течение примерно 1 часа, например, при нормальной температуре при кислых условиях для возможности связывания перед добавлением IgG для рециклинга. Затем IgG для рециклинга клеткой может инкубироваться с клетками в стадии (Ь) в течение примерно 1 часа, например, при нормальной температуре при кислых условиях для возможности связывания.
Нейтральные условия облегчают высвобождение IgG в надосадочную жидкость.
Подразумевается, что "содержащий" в контексте настоящего описания означает "включающий".
В случае, где это технически уместно, воплощения изобретения могут быть объединены.
Воплощения описаны в данном документе, как включающие некоторые признаки/элементы. Изобретение также охватывает отдельные воплощения, состоящие или по существу состоящие из указанных признаков/элементов.
Технические ссылки, такие как патенты и заявки, включены в данный документ ссылкой.
Настоящее изобретение дополнительно описано исключительно
путем иллюстрации в следующих примерах, которые ссылаются на сопроводительные чертежи, в которых:
Фигура 1 демонстрирует % hlgG в трансгенных мышах, определенный с помощью ЖХ-МС/МС
Фигура 1а демонстрирует эффект формата 1638 IgG4P в отношении концентрации человеческого IVIg в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура lb демонстрирует эффект форматов 163 8 FabFv и Fab'ПЭГ в отношении концентрации человеческого IVIg в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура 1с демонстрирует фармакокинетику формата 1638 IgG4P в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура Id демонстрирует фармакокинетику форматов 1638 FabFv и Fab'PEG в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура 1е Эффект форматов 163 8 FabFv и Fab'PEG в отношении концентрации сывороточного альбумина в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
Фигура If Эффект формата 1638 IgG4P в отношении концетрации сывороточного альбумина в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn.
Фигура 2 демонстрирует репрезентативные кривые связывания СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п=3) составили 0,2нМ в нейтральном буфере, и 0,22 нМ в кислом буфере, соответственно
Фигура 3 демонстрирует, что СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует рециклинг IgG в клоне 15 клеток MDCK II
Фигура 4 демонстрирует, что СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует трансцитоз IgG в клоне 15 клеток MDCK II.
Фигура 5 демонстрирует, что СА17 0_163 8.g4 9 FabFv ингибирует трансцитоз IgG в клоне 15 клеток MDCK II.
Фигура 6 демонстрирует репрезентативные кривые связывания для СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п=3) составили 0,3 в нейтральном буфере, и 0,43 в кислом буфере, соответственно (см. Таблицу 2).
Фигура 7 демонстрирует последовательности СА17 0 163 8 CDR
Фигура 8 Последовательности антител согласно настоящему
изобретению
Фигура 9а Гуманизация антитела 1б3 8.д4 9 Фигура 9Ь Гуманизация антитела 1б3 8.д4 9 ПРИМЕРЫ
Сокращения
°С температура, градусы по Цельсию
ATR FTIR Затухающее общее отражение ИК-спектроскопия с
Фурье-преобразованием
СН2 константная область тяжелой цепи 2
cIEF капиллярное изоэлектрическое фокусирование
DSC дифференциальная сканирующая калориметрия
GOF фукозилированный безгалактозный биантенарный
гликан Н-цепь Тяжелая цепь
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
IgG иммуноглобулин G
L-цепь Легкая цепь
нЖХМС наножидкостная хроматография масс-спектрометрия
PBS фосфатно-солевой буферный раствор
Pi изоэлектрическая точка
SD стандартное отклонение
SEC эксклюзионная хроматография
ToF время пролета
Тпл температура плавления
ТСЕР tris(2-карбоксиэтил)фосфин
ТНР ris(гидроксипропил)фосфин
Tris tris(гидроксиметил)аминометан
Следующую иммунизацию осуществляли с целью наработки материала для В-клеточной культуры и скрининга антител:
Крыс Sprague Dawley иммунизировали с использованием трех доз мышиных фибробластов NIH3T3, ко-экспрессирующих мутантный человеческий FcRn (L320A; L321A) (Ober et al., 2001 Int. Immunol. _3_, 1551-1559) и мышиный |32M, и с использованием четвертой конечной бустерной дозы внеклеточного домена человеческого FcRn. Сыворотку отслеживали как на предмет
связывания с мутантным FcRn на клетках НЕК-2 93, так и на предмет его способности предотвращать связывание Alexafluor 488-меченного человеческого IgG. Оба метода осуществляли с помощью проточной цитометрии. Для обнаружения связывания IgG в сыворотке использовали меченые фикоэритрином (РЕ) вторичные антитела, специфичные к мышиному или крысиному Fc.
В-клеточные культуры получали с использованием метода, сходного с описанным у Zubler et al. (1985). Вкратце, В-клетки с плотностью приблизительно 5000 клеток на лунку культивировали в 9б-луночных культуральных планшетах с штрих-кодом, содержащих 200 мкл на лунку среды RPMI 1640 (Gibco BRL), дополненной 10% FCS (РАА laboratories ltd), 2% HEPES (Sigma Aldrich), 1% L-Глутамином (Gibco BRL), 1% раствором пенициллин/стрептомицин
(Gibco BRL), 0,1% |3-меркаптоэтанола (Gibco BRL), 2-5% надосадочной жидкости культуры активированных кроличьих спленоцитов и гамма-облученных клеток EL-4-B5 мышиной тимомы
(5х104/на лунку) в течение семи дней при 37°С в атмосфере 5% С02.
Присутствие FcRn-специфичных антител в надосадочной жидкости В-клеточной культуры определяли с использованием анализа связывания на основе гомогенной флуоресценции с использованием клеток НЕК-2 93, транзиторно трансфецированных мутантным FcRn (поверхностно-стабилизированный) в качестве источника антигена-мишени. 10 мкл надосадочной жидкости трансфецировали из 9б-луночных культуральных планшетов со штрих-кодом в 384-луночные аналитические планшеты с черными стенками со штрих-кодом, содержащие 5000 трансфецированных клеток НЕК-293 на лунку, с использованием жидкостного манипулятора Matrix Platemate. Связывание обнаруживали с использованием Су-5 конъюгатов козьих антител к крысиному или к мышиному Fcy-специфичному IgG (Jackson). Планшеты считывали на системе клеточного детектирования Applied Biosystems 8200. Из 3800x96-луночных культуральных планшетов, представляющих 3 8 различных иммунизированных животных, идентифицировали 9800 антител, связывающих человеческий FcRn. Оценили, что это соответствовало скринингу приблизительно 2,5 биллионов В-клеток.
После первичного скрининга положительные надосадочные жидкости консолидировали на 9б-луночных мастер-планшетах со штрих-кодом с использованием автоматизированного устройства Aviso Onyx hit-picking robot, и В-клетки в культуральных планшетах, замороженных при -80°С. Мастер-планшеты затем скринировали в Biacore-анализе с целью идентификации лунок, содержащих антитела с высокой аффинностью и антитела, которые ингибировали связывание человеческого с FcRn (см. ниже).
Анализ биомолекулярного взаимодействия с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) осуществляли на системе BIAcore Т200 (GE Healthcare). Козьи IgG к крысиному Fc-гамма (Chemicon International Inc.) в 10 мМ NaAc, рН 5 буфер, иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 посредством конденсации аминов до уровня захвата приблизительно 19500 единиц ответа (RU) с использованием HBS-EP+ в качестве подвижного буфера. 50 мМ Фосфата, рН 6+150 мМ NaCl использовали в качестве реакционного буфера для анализов аффинности и блокировки. Надосадочные жидкости В-клеточной культуры разводили в отношении 1 к 5 в 200 мМ Фосфата, рН 6 +150 мМ NaCl. бООс-инъекцию разведенной надосадочной жидкости В-клеток со скоростью потока 5 мкл/мин использовали для захвата с помощью иммобилизованного антитела IgG к крысиному Fc. Человеческий FcRn в концентрации 100 нМ инъецировали над захваченной надосадочной жидкостью В-клеточной культуры в течение 180 с со скоростью 30 мкл/мин с последующей 3 60 с-диссоциацией. Человеческий IgG (Jackson ImmunoResearch) инъецировали еще в течение 60 с с диссоциацией в течение 180с со скоростью 30 мкл/мин.
Данные анализировали с использованием программы оценки Т2 0 0 (версия 1.0) для определения констант аффинности (KD) антител и определения таких констант, при которых происходила блокировка связывания IgG. В качестве альтернативного анализа также проводили скрининг надосадочных жидкостей мастер-планшетов в клеточном анализе блокировки человеческого IgG. 25 мкл надосадочной жидкости В-клеточной культуры из мастер-планшетов добавляли в 9б-луночный круглодонный полипропиленовый планшет.
Клетки НЕК-293, трансфецированные мутантным hFcRn (50000 клеток на лунку в 25 мкл PBS рН 6/1% FCS), затем добавляли к каждой лунке и инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки промывали с помощью 150мкл среды PBS. Клетки затем ресуспендировали в 50 мкл/на лунку среды PBS/FCS, содержащей человеческий IgG, меченный с помощью Alexafluor 488 или 649, в количестве 7,5 мкг/мл и инкубировали 1 час при 4°С. Клетки затем промывали дважды с помощью 150 мкл среды и затем ресуспендировали в 35 мкл/на лунку среды PBS/FCS, содержащей 1% формальдегид в качестве фиксатора. Планшеты затем считывали на проточном цитометре FACS Canto 2.
Для того чтобы можно было извлечь гены вариабельных областей антитела из выбранных интересующих лунок, осуществляли стадию обратной свертки для возможности идентифицировать антиген-специфичные В-клетки в данной лунке, которая содержит гетерогенную популяцию В-клеток. Этого можно добиться, используя метод Флуоресцентного фокусирования. Вкратце, иммуноглобулин-секретирующие В-клетки из положительной лунки смешивали со стрептавидиновыми микросферами (New England Biolabs), покрытыми биотинилированным человеческим FcRn и добавляли FITC-конъюгат козьих антител, специфичных к крысиному или к мышиному фрагменту Fey, в конечном разведении 1:1200 (Jackson). После статической
инкубации при 37°С в течение 1 часа, антиген-специфичные В-клетки можно было идентифицировать благодаря наличию флуоресценции вокруг такой В-клетки. Эти индивидуальные В-клетки, идентифицированные с использованием микроскопа Olympus, затем отбирали с использованием микроманипулятора Eppendorf и помещали в ПЦР-пробирку. Флуоресцентные фокусы генерировали из 2 68 отобранных лунок. Гены вариабельных областей антитела извлекали из индивидуальных клеток с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ)-ПЦР с использованием праймеров, специфичных к вариабельной области тяжелой и легкой цепи. Осуществляли два раунда ПЦР на аппарате Aviso Onyx liquid handling robot, с помощью вложенной ПЦР с включением сайтов рестрикции на 3'- и 5'-концах, что допускало клонирование
вариабельных областей в мышиный yl IgG (VH) или в мышиную каппа-цепь (VL) в экспрессирующих векторах млекопитающих. Парные конструкты тяжелой и легкой цепи ко-трансфецировали в клетки НЕК-293 с использованием Фектина 293 (Invitrogen) и культивировали в 48-луночных планшетах в объеме 1 мл. После 5-7 дней экспрессии надосадочные жидкости собирали, и антитело подвергали дополнительному скринингу.
С помощью ПЦР успешно извлекали родственные пары тяжелой и легкой цепи из индивидуальных В-клеток из 156 из отобранных лунок. С помощью анализа ДНК-последовательности клонированных генов вариабельных областей идентифицировали ряд уникальных семейств рекомбинантного антитела. После транзиторной экспрессии надосадочные жидкости детально исследовали с помощью обоих анализов блокировки человеческого IgG с помощью FACS (описан выше) и рециклинга IgG. В некоторых случаях получали и тестировали очищенный мышиный yl IgG (данные помечены соответственно).
В анализе рециклинга применяли клетки MDCK II (клон, как описано в Примерах 5, б и 7 ниже), сверхэкспрессирующие человеческий FcRn и бета 2 микроглобулин, которые высевали в количестве 25000 клеток на лунку 9б-луночного планшета. Инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% С02. Клетки промывали с помощью HBSS+ Са/Mg рН 7,2+1% BSA и затем инкубировали в присутствии 50 мкл варьирующихся концентраций надосадочных жидкостей после транзиторной экспрессии НЕК-2 93 или в присутствии очищенного антитела в течение 1 часа при 37°С, 5% СОг • Надосадочную жидкость удаляли и добавляли к клеткам 500нг/мл биотинилированного человеческого IgG (Jackson) в 50 мкл HBSS+ Са/Mg рН 5,9 + 1% BSA и инкубировали в течение 1 часа при 37°С, 5% СОг • Затем клетки промывали три раза с помощью HBSS+ Са/Mg рН 5,9 добавляли к клеткам 100 мкл HBSS+ Са/Mg рН 7,2 и
инкубировали при 37°С, 5% СОг в течение 2 часов. Надосадочную жидкость удаляли из клеток и анализировали на суммарный IgG с использованием анализа MSD с захватывающим антителом против человеческого IgG (Jackson) и с детектирующим антителом,
содержащим стрептавидин, меченный sulfo-tag (MSD). Кривую ингибирования анализировали с помощью нелинейной регрессии с определением значений IC50.
На основе показателей данного анализа отбирали семейство антител, содержащих шесть CDR, представленных в SEQ ID N0 1-6. Антитело СА17 0 01638 обладало лучшей активностью и было отобрано для гуманизации.
Пример 1 Метод гуманизации
Антитело СА17 0 01638 гуманизировали путем прививки CDR из V-областей крысиного антитела на каркас V-области человеческого зародышевого антитела. С целью восстановления активности антитела ряд каркасных остатков из крысиных V-областей также сохраняли в гуманизированной последовательности. Эти остатки отбирали с использованием протокола, изложенного в Adair et al.
(1991) (Humanised antibodies WO91/09967). Сравнение
последовательностей V-области крысиного антитела (донорного) с последовательностями V- области человеческого зародышевого антитела (акцепторного) представлено на Фигурах 9А и В, вместе с сконструированными гуманизированными последовательностями. CDR, привитые из донорной на акцепторную последовательность, такие, как определено у Kabat (Kabat et al., 1987), за исключением CDR-Н1, где использовали объединенное определение Chothia/Kabat (см. Adair et al., 1991 Humanised antibodies. WO91/09967). Человеческую V-область IGKV1-27 вместе с J-областью JK4
(http://www.imgt.org/) выбирали в качестве акцептора для CDR легкой цепи. Человеческую V-область IGHV3-7 вместе с J-областью JK3 (http://www.imgt.org/) выбирали в качестве акцептора для CDR тяжелой цепи.
Гены, кодирующие ряд вариантов последовательностей V-областей тяжелой и легкой цепи разрабатывали и конструировали с помощью способа автоматического синтеза Entelechon GmbH. Дополнительные варианты V-областей как тяжелой, так и легкой цепи создавали путем модификации генов VH и VK с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. Эти гены клонировали в ряд векторов для экспрессии гуманизированного антитела 1638 Fab или IgG4 в Е. coli и в клетках млекопитающих, соответственно.
Варианты цепей и их комбинации оценивали на предмет их эффективности по отношению к родительскому антителу, их биофизических свойств и пригодности для дальнейших процессов, что привело к отбору привитой легкой цепи gL7 и привитой тяжелой цепи дНЗЗ. Конечные привитые последовательности gL7 и дНЗЗ представлены на Фигурах 9А и В, соответственно. Данное объединение V-областей получило название 1638.д49.
Каркасные остатки легкой цепи в привитом компоненте gL7 все взяты из человеческого зародышевого гена, за исключением остатков 7 0 и 71 (нумерация Kabat), где донорные остатки гистидина (Н70) и тирозина (Т71), соответственно, сохранены. Сохранение этих двух остатков важно для полноценной эффективности гуманизированного антитела или Fab. Остаток 56 в CDRL2 привитого компонента gL7 подвергали мутации, превращая из аспарагиновой кислоты (D56) в остаток глутаминовой кислоты (Е56), удаляя таким образом потенциальный сайт изомеризации аспарагиновой кислоты из последовательности gL7. Каркасные остатки тяжелой цепи в привитом компоненте дНЗЗ все взяты из человеческого зародышевого гена, за исключением остатков 48 и 78 (нумерация Kabat), где донорные остатки лизина (L48) и аланина (А78), соответственно, сохранены. Сохранение этих двух остатков существенно для полноценной эффективности гуманизированного антитела или Fab.
Для экспрессии 1638.g49 Fab в Е. coli гены V-областей гуманизированной тяжелой и легкой цепи клонировали в UCB-экспрессирующий вектор pTTOD, который содержит ДНК, кодирующую человеческую константную область С-каппа (К1тЗ аллотип) и CHI-область человеческого антитела гамма-1 (вместе или без шарнирной области) (Glml7 аллотип).
Для экспрессии 1638.g49 IgG4 в клетках млекопитающих, ген V-области гуманизированной легкой цепи соединяли с ДНК-последовательностью, кодирующей константную область человеческой C-kappa (К1тЗ аллотип), для создания непрерывного гена легкой цепи. Ген V-области гуманизированной тяжелой цепи соединяли с ДНК-последовательностью, кодирующей константную область тяжелой цепи человеческого антитела гамма-4 вместе с шарниром,
стабилизирующим мутацию S241P (Angal et al. , Mol Immunol. 1993, 30(1): 105-8), для создания непрерывного гена тяжелой цепи. Гены тяжелой и легкой цепи клонировали в экспрессирующий вектор млекопитающих.
Другой более ранний привитой компонент 1638.д28 использовали в Примере 8А, описанном в данном документе ниже, и он содержит больше донорных остатков в тяжелой цепи (дН2), чем привитой компонент 1638.д49 (F24, L48, К71, Т73, А78 и V93). Также легкая цепь данного антитела (gL2) содержит немодифицированную CDRL2, представленную в SEQ ID N0:5, в отличие от модифицированной CDRL2 из SEQ ID N0:7, которую использовали в 1638.д49. Последовательность обоих вариантов антител представлена на Фигуре 8. Антитело 1638.д28 экспрессировали как Fab'-фрагмент, как описано выше для 1638.д49.
Пример 2 Получение конгьюгата 1638.д4 9 Fab'-ПЭГ
Fab', экспрессированный в периплазматическое пространство E.coli, экстрагировали из клеток путем тепловой экстракции. Fab' очищали с помощью Протеин G-аффинной очистки с использованием кислой элюции. Fab' восстанавливали и пэгилировали с использованием 40 кДа ПЭГ (SUNBRIGHT GL2-400MA3). ПЭГ ковалентно связан посредством малеимидной группы с одной или несколькими тиольными группами фрагмента антитела. Эффективность пэгилирования подтверждали с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Fab'-ПЭГ отделяли от непэгилированного Fab' и diFab' с помощью катионообменной хроматографии. Фракции анализировали с помощью эксклюзионной ВЭЖХ и SDS-PAGE. Объединение проводили для минимизации уровня примесей. Конечный образец концентрировали и подвергали диафильтрации в целевом буфере.
Пример 3 Аффинность для связывания hFcRn
Анализ биомолекулярного взаимодействия с использованием технологии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) осуществляли на системе BIAcore Т200 (GE Healthcare) и определяли связывание с внеклеточным доменом человеческого FcRn. Внеклеточный домен человеческого FcRn получали в виде нековалентного комплекса между внеклеточным доменом альфа-цепи
человеческого (SEQ ID N0:48) и (32-микроглобулином ((32М) (SEQ ID N0:72). Affinipure, F(ab')2 фрагмент козьего IgG, специфичный к человеческому Fc-фрагменту (для захвата IgG4) (Jackson ImmunoResearch Lab, Inc.) в количестве 50 мкг/мл в 10 мМ NaAc, буфер рН 5, иммобилизовали на сенсорном чипе СМ5 посредством конденсации аминов до уровня захвата 5000-6000 единиц ответа (RU) с использованием HBS-EP+ (GE Healthcare) в качестве подвижного буфера.
50 мМ Фосфат, рН б + 150 мМ NaCl + 0,05% Р20 или HBS-P+, рН 7,4 (GE Healthcare) использовали в качестве подвижного буфера для анализа аффинности. Антитело 1638.g49 IgG4P разводили до 1 мкг/мл в подвижном буфере. бОс-инъекцию IgG4 со скоростью потока 10 мкл/мин использовали для захвата иммобилизованным антителом к Fc-фрагменту человеческого IgG. Внеклеточный домен человеческого FcRn титровали от 2 0 нМ до 1,2 5 нМ над захваченным антителом к FcRn (IgG4) в течение 300с со скоростью 30 мкл/мин с последующей 12 0с диссоциацией. Поверхность регенерировали с помощью обработки 2x60 с 50 мМ НС1 со скоростью потока 10 мкл/мин для подвижного буфера при рН б или с помощью обработок 60 с 4 0 мМ НС1 и 30с 10 мМ NaOH для подвижного буфера при рН 7,4. Данные
анализировали с
использованием
расчетной программы
программного
обеспечения Т200 (версия 1.0) с
использованием модели связывания
1:1 с локальным
Rmax.
Таблица 1
Данные аффинности для антитела
1638.g49 IgG4P к hFcRn при рН6 и
7.4
рН 6
Человеческий FcRn
1638.g49 IgG4P
ka (M'V1)
kd (s2)
KD (M)
1,10Е+06
1,43Е-04
1,29E-10
1,10Е+06
1,39Е-04
1,26E-10
1,11Е+06
1,40Е-04
1,27E-10
Среднее
1,10Е+06
1,41Е-04
1,27E-10
рН 7, 4
Человеческий FcRn
1638.g49 IgG4P
ka (M'V3)
kd (s4)
KD (M)
9,75Е+05
2,51Е-05
2,57Е-11
9,62Е+05
3,19Е-05
3,32Е-11
9,62Е+05
2,82Е-05
2,93Е-11
Среднее
9,67Е+05
2,84Е-05
2,94Е-11
Таким образом, определили, что аффинность 1638.49g IgG4 составляет 127 пМ при рН б и 29 пМ при рН 7,4. Пример 4
Анализировали полноразмерную молекулу IgG4P и молекулу Fab-dsFv, где вариабельная область 1638.д49 была включена в Fab-домен каждого формата, на предмет биохимической целостности и биофизической стабильности.
1. Подтверждение последовательности.
Методы и Результаты
а) Анализ интактной массы
Масс-спектрометрический анализ интактных молекул
осуществляли на двух партиях молекул IgG4 и Fab-dsFv после восстановления с помощью 2 0 мМ ТСЕР в течение одного часа. Массы измеряли на масс-спектрометре Agilent 6510, оборудованном модулем для ВЭЖХ-чипов (chip cube) и чипом С8 (43 мм Zorbax 3 0OA С8 колонка + 43 нл ловушка) . Все образцы разводили до 0,1 мг/мл в смеси 98% вода/2% метанол/0,3% муравьиная кислота (растворитель А) перед инъекцией и загружали в систему 0,3 мкл. Белки элюировали из чипа в масс-спектрометр с использованием градиента до 40% ацетонитрила/0,1% муравьиной кислоты со скоростью потока 350 нл/мин. Данные ToF-MS собирали в режиме определения положительных ионов от 500 до 5000 m/z и процессировали с использованием программного обеспечения Agilent MassHunter.
Наблюдаемые массы для обеих цепей, легкой и тяжелой, для обоих форматов представлены ниже (Таблица 2).
Ожидаемая масса, рассчитанная на основе аминокислотной последовательности с добавлением IgG4: 2 L- и 4 Н- дисульфида взаимодействия, GOF-гликозилирование и клиппирование С-концевого Lys из Н-цепи FabFv: 3 L- и 3 Н- дисульфида взаимодействия.
Анализ интактной массы IgG4, восстановленного с помощью ТСЕР, согласовывался с ожидаемыми последовательностями с преимущественным GOF-гликозилированием и клиппированным С-концевым лизином (приблизительно 90%) на Н-цепи, что типично для рекомбинантного IgG.
Аналогично, масс-спектр интактных цепей Fab-dsFv согласовывался с массой последовательности и ожидаемым количеством дисульфидов. Присутствовала гетерогенность в наблюдаемой массе обеих цепей благодаря частичному восстановлению внутрицепных дисульфидов с помощью ТСЕР.
Ь) Картирование дисульфидов осуществляли только на IgG4.
IgG4 (50 мкг) обрабатывали с помощью 0,15% Rapigest в Tris-НС1 рН 7,5 при 50°С в течение 15 минут, и любые свободные цистеины алкилировали с помощью иодоацетамида. Добавляли трипсин (1:25 масс./масс.) и гидролизовали белок в течение ночи при комнатной температуре и затем реакцию гасили путем добавления муравьиной кислоты (5% об./об.), и удаляли любой осадок центрифугированием. Образцы хранили при -20°С и разводили 1:1 водой перед загрузкой в систему ЖХ-МС. Аликвоты (~3-5 мкг) загружали на колонку С18 2,1x150 мм (Waters BEH1.7u), уравновешенную водой, содержащей 0,2% муравьиную кислоту, и элюировали с использованием градиента ацетенитрила/1-пропанола в масс-спектрометр Waters Xevo, функционирующий в режиме определения положительных ионов MSE. Данные анализировали с использованием программного обеспечения MassLynx и BioPH armaLynx.
Результаты выявили, что наблюдались все ожидаемые
дисульфид-связанные пептиды за исключением образцов с пептида
T19-SS-T19 с междуцепной связью Н-Н, которую наблюдали только
для единственной дисульфидной связи и с низкой интенсивностью.
Не было никаких указаний на присутствие образцов с
беспорядочными дисульфидными связями или с
карбамидометилированными остатками цистеина.
2. Биохимический анализ
Эксклюзионная хроматография ВЭЖХ (SEC HPLC)
Эксклюзионная хроматография позволяла анализировать мономерный и олигомерный материал. Ее осуществляли с использованием TSK G3000SW (7,7 мм I.D х 30 см L) колонки, связанной с системой Agilent 1100. Образцы (инъекция 25 мкл/25 мкг) элюировали изократически в 0,2 М фосфате натрия, рН 7 со
скоростью потока 1 мл/мин в течение 30 минут, 30°С. Элюирование отслеживали с помощью поглощения при 280 нм.
Профили элюирования продемонстрировали, что IgG4 и Fab-dsFv являются гомогенными и элюируются с ожидаемым временем удержания исходя из стандартов SEC (BioRad 151-1901).
3. Молекулярный заряд.
Капиллярное изоэлектрическое фокусирование (cIEF) проводили для оценки pi и содержания кислых частиц.
Образцы IgG4 и Fab-dsFv разводили до 1мг/мл в воде класса ВЭЖХ для анализа (не восстановительные условия). Образцы также подвергали восстановлению (2 мМ ТНР/3 0 минут) и алкилированию (20 мМ иодоацетамид/80 минут) для анализа на предмет аддуктов цистеина.
Образцы готовили с помощью смешивания следующих ингредиентов: 30 мкл образца белка, 0,35% метилцеллюлозы, 4% амфолиты рН 3-10 (РН armalyte), 1 мкл каждого синтетического pi-маркера (4,65 и 9,77) и воды класса ВЭЖХ с получением конечного объема 100 мкл. Затем смесь анализировали с использованием анализатора iCE280 IEF (Convergent Biosciences), осуществляли пре-фокусирование при 1500В в течение 1 минуты с последующим фокусированием при 3000В в течение б минут. Калиброванные электроферограммы затем интегрировали с использованием программного обеспечения Empower (от Waters).
pi принимали такое значение, как у большинства частиц (наибольший пик).
Для формата IgG4 большинство частиц имело pi 7,3. Предположили, что это является клиппированной родительской молекулой (удаление С-концевого лизина, подтвержденное масс-спектрометрическим анализом), что не является нетипичным для молекул IgG. Клиппированная молекула была бы более кислой, чем родительская молекула (основной пик при 7,4). Отсутствовали изменения профиля до и после восстановления и алкилирования, указывая на отсутствие аддуктов цистеина.
Для формата Fab-dsFv, за pi принимали такое значение, как у большинства частиц (наибольший пик), которое составило 9. Также
были заметны более кислые частицы (pi 8,8), которые были менее заметны после восстановления/алкилирования, указывая на присутствие способного восстанавливаться аддукта.
Для обоих форматов присутствовали минорные пики, будучи либо кислыми (слева от основного пика) или основными (справа от основного пика). Полагали, что эти частицы являются производными основных частиц, но их дополнительно не охарактеризовывали.
4. Термостабильность (Тпл)
При нагревании белок будет иметь тенденцию к
разворачиванию, и наиболее стабильно свернутая белковая
структура это такая, для которой требуется более сильное
нагревание, чтобы ее развернуть. Таким образом,
термостабильность (измеренная в виде температуры плавления, Тпл) представляет собой меру стабильности сворачивания белка или устойчивость молекулы к разворачиванию (денатурации), что может быть предпосылкой к образованию агрегатов. В температурном градиенте в определенных условиях температура, при которой 50% молекул разворачиваются, представляет собой Тпл. Оценки Тпл проводили двумя независимыми методами
i) Анализ Thermofluor, измерение 50% разворачивания с
помощью связывания флуоресцентного красителя (Sypro Orange) с
экспонированными гидрофобными поверхностями, которые становятся
экспонированными при разворачивании структуры, вызванном
нагреванием и
ii) Дифференциальная сканирующая калориметрия (DSC).
Результаты этих двух методов, как правило, коррелируют,
слабо различаясь в абсолютных значениях, что связано с различиями применяемых методов, i) Анализ Thermofluor
Образцы готовили следующим образом: 5 мкл ЗОх sypro orange помещали в 96 луночный V-донный планшет. Затем добавляли 45 мкл образца белка в количестве 0,1 мг/мл. Смесь наносили пипеткой по 10 мкл в четырех экземплярах в 384-луночный планшет. Формат 3 8 4-луночного планшета: образец 1: лунки А1, В1, А2, В2; образец 2: лунки CI, Dl, С2, D2. Внутренний контроль представляет собой чужеродный IgG4. Данный контроль добавляли в количестве 0,1
мг/мл (в PBS рН 7,4) к 5 мкл ЗОх концентрированного красителя, 10 мкл данного мастер-микса помещали в 3 8 4-луночный планшет в четырех экземплярах. Планшеты помещали в систему быстрого ПЦР в реальном времени 7900 НТ и нагревали от 20°С до 99°С с использованием скорости изменения 1,1°С/мин; устройство CCD одновременно отслеживает изменения флуоресценции в лунках. Модифицированную матрицу ХЕ (IDBS) использовали для обработки данных интенсивности и принимали во внимание множество конформационных переходов.
Два конформационных перехода с уничтожением складок были обнаружены для обеих молекул, IgG4 и Fab-dsFv. Значение Тпл2 для обеих молекул характеризовало разворачивание Fab-домена и, как показано, было чуть ниже для формата IgG4. Значение Тпл1 характеризовало домен СН2 (константный домен тяжелой цепи) и домен dsFv IgG4 и молекулы Fab-dsFv, соответственно. Было показано, что формат Fab-dsFv является более термостабильным, чем формат IgG в PBS, рН 7,4.
Анализ DSC осуществляли только на молекуле Fab-dsFv для подтверждения данных анализа Thermofluor и для определения эффекта двух различных типов буфера (PBS рН 7,4 и 50 мМ ацетат натрия/125 мМ хлорид натрия, рН 5) в отношении термостабильности. Образцы в количестве 1 мг/мл в PBS рН 7,4 и 50мМ ацетат натрия/125 мМ хлорид натрия, рН 5 с соответствующими эталонными буферами загружали на прибор MicroCal VP Capillary DSC в трех экземплярах. Настройки системы включали температурное сканирование от 20°С до 110°С, и скорость сканирования 60°С/ч. Конечные термограммы обрабатывали с использованием программного обеспечения Origin согласно инструкциям производителя. Тпл определяли с использованием автоматизированного программного алгоритма детектирования Тпл (для основного конформационного
перехода) и вручную выбирали пик для любых других конформационных переходов, которые не детектировались автоматически программой.
Можно было наблюдать два отдельных конформационных перехода в двух тестируемых буферах.
Более низкий конформационный переход (Тпл1) характеризовал домен dsFv молекулы Fab-dsFv, а более высокая температура перехода (Тпл2) характеризовала Fab-домен.
Данные DSC хорошо согласовывались с данными, полученными из анализа Thermofluor. Данный метод был способен различать два развернутых домена легче, чем анализ Thermofluor.
Молекула Fab-dsFv продемонстрировала небольшое увеличение термостабильности в буфере 50 мМ ацетат натрия/125 мМ хлорид натрия, рН 5.
Буфер
Значение Тпл1 (°С)
Значение Тпл2 (°С)
Fab-dsFv (50 мМ NaOAc/125 мМ NaCl, рН 5)
86,1
73, 6
0, 15
Fab-dsFv (PBS, рН 7,4)
84, 1
0,1
71,2
0, Об
5. Молекулярная структура: Ослабленная Полная Спектроскопия Инфракрасного Преобразования Фурье Отражения (ATR FTIR)
Этот способ использовали для сравнения степени взаимодействия между р-листами в пределах молекулы (интра-р-лист) и между отдельными молекулами (интер-р-лист).
Анализ осуществляли с помощью спектрометра Bruker Tensor 2 7 FTIR и устройства для сбора образцов из ячейки BIOATRII при разрешении 4 см-1; 120 сканов; установка диафрагмы б мм и 20 мкл объем образца при 2 0°С, где осуществляли следующие процедуры для анализа только Fab-dsFv.
1. Измеряли пять фоновых спектров воздуха методом BI0ATR 10 Об 10. хрт .
2. 2 0 мкл сигма PBS рН 7,4 добавляли в ячейку, а затем удаляли.
1.
3. 2 0 мкл сигма PBS рН 7,4 добавляли в ячейку и снимали спектр, буфер удаляли и свежий буфер добавляли и снимали спектр (дважды).
4. 20 мкл образца добавляли в ячейку и снимали спектр, образец затем удаляли из ячейки.
5. 2 0 мкл сигма PBS рН 7,4 добавляли в ячейку, а затем удаляли.
6. 2 0 мкл образца добавляли в ячейку и снимали спектр, образец затем удаляли из ячейки, (дважды)
7. Затем ячейку очищали процедурой, представленной ниже:
a. 2 0 мкл 1% SDS добавляли в ячейку + очищали с помощью Q-
tip
b. 2 0 мкл 1% SDS добавляли в ячейку и удаляли
c. 5 раз добавляли 2 0 мкл Н20 в ячейку и удаляли
d. 2 0 мкл буфера добавляли в ячейку и удаляли
8. Данные анализировали для получения конечного формата данных следующим образом.
a. 1 спектр буфера удаляли из 1 спектра Fab-dsFv и затем повторяли со 2 спектром буфера и 2 спектром Fab-ds Fv.
b. Данные вырезали с 22 0 0 см-1 по 1000 см-1
c. Дублированные спектры усредняли.
d. Вторую производную брали со сглаживанием по 25 точкам. Это был показан окончательный формат данных.
Результаты анализа показали, что Fab-dsFv имел характеристики интра-бета-листа, что типично для молекул антитела.
Пример 5 Клеточный анализ эффективности
Клеточные анализы эффективности проводили на клетках Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) II, которые были стабильно трансфецированы вектором с двумя генами, человеческим FcRn и человеческим |32М, с последующей селекцией на маркере генетицине. Стабильный клеточный клон выбирали так, чтобы он был способен к рециклингу и подвергать трансцитозу человеческие IgG, и его использовали для всех дальнейших исследований. Его назвали MDCK II клон 15.
Клеточная аффинность СА170_1638.g4 9 IgG4 для человеческого
FcRn
Количественные эксперименты проточной цитометрии проводили с помощью клеток MDCK II клон 15 и AlexaFluor 488-меченных СА170_1638.g49 IgG4. Специфическое связывание антитела с FcRn по всему диапазону концентраций антител использовали для определения Kd. Анализы осуществляли как в нейтральном, так и кислом буферах для определения возможного влияния, которое оказывает рН окружающей среды в плазме крови (рН 7,4) или эндосомах (рН 6) на связывание с антителом. На Фигуре 2 показаны репрезентативные кривые связывания для СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п=3) были равны 0,2 в нейтральном буфере, и 0,22 в кислом буфере, соответственно (см. Таблицу 4).
Фигура 2 демонстрирует СА170_1638.g49 IgG4 связывание клеток MDCK II клон 15 при кислом и нейтральном рН .
Клетки MDCK II клон 15 инкубировали в буфере для FACS (PBS с 0,2% масс./об. BSA, 0,09% масс./об. NaN3) в течение 30 минут перед добавления Alexa-fiuor 488-меченного СА170_1638.g49 IgG4 в течение 1 часа в буфере для FACS либо при рН 7,4, либо рН 6. Концентрации конечного антитела в диапазоне от 400 нМ до 0,003 нМ. Клетки отмывали в ледяном буфере для FACS, затем анализировали проточной цитометрией с помощью проточного цитометра Guava (Millipore, Великобритания). Наборы данных титрования также были получены для изотипических контрольных антител для каждого формата антитела для определения неспецифического связывания. Количество молей связанного антитела было рассчитано с помощью интерполированных значений из стандартной кривой, полученной из гранул, содержащих различные количества флуоресцентного красителя. Значения геометрического
среднего флуоресценции определяли в при проточном цитометрическом анализе клеток и гранул. Неспецифическое связывание вычитали из значений антитела к FcRn, а специфическое связывание определяли из кривой, полученной анализом нелинейной регрессии с помощью уравнения связывания в одном участке (GrapH pad Prism(r)) для определения KD. Данные являются репрезентативами 3 экспериментов. СА170_1638.g49 IgG4 могут связывать человеческий FcRn, экспрессированный на клетках как при кислом, так и нейтральном рН
Пример 6 Функциональные клеточные тесты
Экспрессия FcRn является первичной внутриклеточной (Borvak J et al. 1998, Int. Immunol., 10 (9) 1289-98 и Cauza К et al. 2005, J. Invest. Dermatol., 124 (1), 132-139), и ассоциирована с эндосомными и лизосомными мембранами. Fc-часть IgG связывается с FcRn при кислом рН ( <б,5), но не при нейтральном физиологическом рН (7,4) (Rhagavan М et al. 1995), и эта рН -зависимость облегчает рециклинг IgG.
Сразу после поглощения пиноцитозом и попадания в кислую эндосому, IgG, связанный с FcRn, будет подвергнуто рециклингу вместе с FcRn на клеточную поверхность, тогда как при физиологически нейтральном рН IgG будет высвобождено. (Ober RJ et al. 2004, The Journal of Immunology, 172, 2021-2029) . Любое IgG, не связанное с FcRn, будет переходить к деградации в лизосоме.
Для проверки способности СА170_1638.g49 IgG4 ингибировать способность FcRn к рециклингу IgG, был разработан in vitro анализ. Вкратце, клетки MDCK II клон 15 инкубировали с биотинилированными человеческими IgG в присутствии или в отсутствии 1638 IgG4 в кислом буфере (рН 5,9) для того, чтобы позволить связаться с FcRn. Все избыточные антитела удаляли, и клетки инкубировали в буфере с нейтральным рН (рН 7,2), который позволяет высвободить экспонированный на поверхность, связанный и интернализованный IgG в надосадочной жидкости. Ингибирование FcRn исследовали с помощью анализа MSD для детекции количества подвергнутого рециклингу IgG, и, таким образом, высвобожденного в надосадочную жидкость.
Фигура 3 демонстрирует, что СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует рециклинг IgG в клоне 15 клеток MDCK II. Клетки MDCK II клон 15 рассевали по 15000 клеток на лунку в 9б-луночном планшете и инкубировали в течение ночи при 37°С, 5% СОг. Клетки инкубировали с 1 мкг/мл биотинилированных человеческих IgG (Jackson) в присутствии или отсутствии СА170_1638.д49 IgG4 в HBSS+ (Са/Mg) рН
5,9+1% BSA в течение 1 часа при 37°С, 5% СОг. Клетки промывали HBSS+ рН 5, 9 затем инкубировали при 37°С, 5% СОг в течение 2 часов в HBSS рН 7,2. Надосадочную жидкость удаляли из клеток и анализировали на общие IgG с помощью анализа MSD (с использованием захватывающего антитела против человеческого IgG
(Jackson) и проявляющего антитело с помощью стрептавидина, меченного sulfo-tag (MSD)). Кривую ингибирования анализировали нелинейной регрессией (GrapH pad Prism(r)) для определения ЕС50. График представляет объединенные данные из 3 экспериментов. Как показано на Фигуре 3 СА170_1638.g49 IgG4 ингибирует рециклинг IgG зависимым от концентрации образом со средним значением ЕС50
(п=3), равным 0,31 нМ.
СА170 1638.g49 IgG4 и FabFv ингибируют трансцитоз человеческого IgG
FcRn может перемещать IgG через слои поляризованных эпителиальных клеток как в апикально-базолатеральном направлении, так и базолатерально-апикальном направлении, и таким образом, играет важную роль в обеспечении перемещения IgG между кровотоком и люменом через слизистые барьеры (Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4): 1746-59).
FcRn может перемещать IgG через слои поляризованных эпителиальных клеток как в апикально-базолатеральном направлении, так и базолатерально-апикальном направлении, и таким образом, играет важную роль в обеспечении перемещения IgG между кровотоком и люменом через слизистые барьеры (Claypool et al. 2004 Mol Biol Cell 15(4): 1746-59).
Анализ in vitro был разработан для определения способности СА170_1638.g49 IgG4 и FabFv ингибировать FcRn-зависимый трансцитоз IgG. Вкратце, клетки MDCK II клон 15 рассевали в 24
луночной планшете Transwell и позволяли им образовать монослои в течение 3 дней. Клетки инкубировали с биотинилированным человеческим IgG в кислом буфере, который облегчают связывание с FcRn, на апикальной стороне в присутствии и отсутствии СА170_1638.g49 IgG4 или FabFv. Человеческие IgG подвергались транцитозу через клетки с апикальной к базолатеральной стороне и высвобождались в нижнюю камеру. Уровни IgG на базолатеральной стороне затем измеряли с помощью анализа MSD.
Фигуры 4 и 5 демонстрируют, что СА17 0_163 8.g4 9 IgG4 и FabFv ингибируют апикально-базолатеральный трансцитоз IgG в клетках MDCK II клон 15. Клетки MDCK II клон 15 рассевали по 500000 клеток на лунку в 24 луночном планшете Transwell и инкубировали в течение 3 дней при 37°С, 5% СОг до образования монослоя. рН апикального компартмента корректировали до 5,9, а базолатеральной стороны до 7,2 в буфере HBSS+ (Ca/Mg) +1% BSA. Клетки на апикальном компартменте инкубировали с 1 мкг/мл биотинилированного человеческого IgG (Jackson) в присутствии и отсутствии СА170_1638.g49 IgG4 или FabFv в указанных
концентрациях в течение 4 часов при 37°С, 5% СОг. Базолатеральную среду затем собирали и общее количество IgG измеряли анализом MSD (с использованием захватывающего антитела против человеческих IgG (Jackson) и проявляющего антитело с стрептавидином, меченным sulfo-tag (MSD)). Кривую ингибирования анализировали нелинейной регрессией (GrapH pad Prism(r)) для определения ЕС50. График представляет объединенные данные из 3 экспериментов.
Таким образом, Фигуры 4 и 5 демонстрируют, что СА170_1638.g49 IgG4 и FabFv могут ингибировать апикально-базолатеральный трансцитоз человеческих IgG зависимым от концентрации способом со значением ЕС50 равным 2,4 и 0,42 нМ, соответственно (п=3).
Сводка in vitro эффектов СА170 1638.g49 IgG4 и FabFv СА170_1638.g49 IgG4 и FabFv ингибируют как рециклинг, так и трансцитоз IgG. ЕС50, равное 0,31 нМ, полученное в анализе рециклинга IgG, сравнимо с данными аффинного связывания клеток,
в котором были получены значения KD, равное 0,2 нМ в нейтральном буфере и 0,22 нМ в кислом буфере. В анализе трансцитоза IgG ЕС50, равное 2,4 нМ и 0,42 нМ получали для СА170_1638.g49 IgG4 и FabFv соответственно, демонстрируя слабое снижение эффективности между IgG4 и FabFv. Однако данные в этом разделе ясно показали, что СА170_1638.g49 IgG4 и FabFv могут ингибировать функцию человеческого FcRn.
Пример 7 Перекрестная реактивность СА170_1638.д49 IgG4 FcRn низших приматов.
Для проверки применения СА170_1638.д49 IgG4 в исследовании PK/PD низших приматов и преклинической токсикологии, изучали его относительную аффинность с FcRn яванского макака. Клетки MDCK II стабильно трансфецировали FcRn и |32М яванского макака (MDCKII (клон 40) использовали в клеточном анализе, вместе с ранее описанными клетками MDCK II, стабильно трансфецированными человеческим FcRn и |32М (MDCK II клон 15) .
Фигура б демонстрирует СА170_1638.g49 IgG4 IgG4 связывание клеток MDCK II клона 15 при кислом и нейтральном рН Специфическое связывание антитела с FcRn в диапазоне концентраций антител использовали для определения KD. Анализы осуществляли как в нейтральном, так и кислом буферах для определения возможного влияния, которое оказывает рН окружающей среды в плазме крови (рН 7,4) или эндосомах (рН б) на связывание с антителом.
Фигура б демонстрирует репрезентативные кривые связывания для СА170_1638.g49 IgG4. Средние значения KD (п=3) составляли 0,3 в нейтральном буфере и 0,43 в кислом буфере, соответственно.
Пример 8А Обработка антителом FcRn облегчает очистку hlgG in vivo в трансгенных мышах hFcRn
Эффект молекул антител к FcRn (СА170_01519.д57 Fab'-ПЭГ
(описанных в WO2014/019727) и С7А170_01638. д28 Fab'-ПЭГ) на выведение человеческого IVIG определяли на трансгенных мышах с человеческим FcRn (В6. Cg-FcgrttmlDcr Tg (FCGRT) 32Dcr/DcrJ, JAX Mice) . Мышей инфузировали внутривенно 500 мг/кг человеческого IgG (Человеческий Igl 10% Gamunex-c, Talecris Biotherapeutics). Через 24 часа животным вводили дозу контроля-носителя (PBS) или антитела к FcRn в виде одиночной дозы внутривенно (100 мг/кг). Образцы были серийными образцами крови из кончика хвоста, которые забирали в моменты времени -24, 8, 24, 48, 72, 96, 144 и 192 часов относительно обработки антителом к FcRn. Сывороточные уровни человеческого IgG в мышах hFcRn определяли с помощью ЖХ-МС/МС. Данные, представленные на Фигуре 1, являются средними ± SEM с 5-6 мышами на группу обработки. Блокировка hFcRn каждой из протестированных молекул антител к FcRn приводит к усиленному выведению hIVIG, а также наблюдали пониженные концентрации общего IgG по сравнению с контрольными мышами.
Пример 8В. Обработка антителом к FcRn облегчает очистку hlgG in vivo в трансгенных мышах hFcRn
Обнаруженное антитело к человеческому FcRn связывается с FcRn и ингибирует связывание человеческого IgG с человеческим FcRn, но не связывает или ингибирует мышиный FcRn. Следовательно, эффект молекул антитела к FcRn в формате IgG4P
(1638.g49), формате Fab'-ПЭГ (1638.g28), и формате FabFv в
отношении выведения человеческого IVIg определяли на трансгенных
мышах с человеческим FcRn (мыши Вб.Cg-FcgrttmlDcr
Tg(FCGRT)32Dcr/DcrJ, JAX) . Мышей инфузировали внутривенно 500
мг/кг человеческого IgG (Человеческий Igl 10% Gamunex-c,
Talecris Biotherapeutics). Через 24 часа животным внутривенно
вводили дозу контроля носителя (PBS) или антитела к FcRn в виде
одиночной дозы. Дозы, периоды отбора образцов и количества
повторов были такими же, как указанные на Фигурах 1а-1е. Образцы
были серийными образцами крови из кончика хвоста. Уровни в
сыворотке человеческого IgG , эндогенного мышиного альбумина и
самой молекулы антитела к FcRn определяли с помощью ЖХ-МС/МС, с
детекцией и количественным определением пептидных
последовательностей, уникальных к каждому из этих аналитов. Данные, представленные на Фигурах 1а-1е, являются геометрическим средним и 95% доверительным интервалом.
Блокада hFcRn каждой из трех протестированных молекул антитела к FcRn приводили к выведению hIVIg, который был усилен по сравнению с выведением в контрольных мышах, которые были обработаны только носителем, или с контрольным Fab'-ПЭГ (АЗЗ, не антитело к FcRn, конъюгированное с 4 0 кДа ПЭГ, каким являлся 1638 Fab'-ПЭГ) - см. Фигуру 1а и lb. Эффект был дозозависимым -большие дозы давали более продолжительные периоды, в ходе которых в сыворотке детектировали антитела к FcRn (Фигуры 1с и Id) , это приводит к более пролонгированному и более полному выведению человеческих IVIg из мышей. 1638 Fab'-ПЭГ демонстрировали краткосрочную фармакокинетику (более быстрое исчезновение из свободного раствора в сыворотке) , чем контрольные АЗЗ Fab'-ПЭГ, подтверждающую, что 1638 Fab'-ПЭГ подвергаются опосредованному мишенью расположению - исчезают из свободного раствора при связывании с FcRn-мишенью. Хотя мышиные IgG не связываются с человеческим FcRn, присутствующим в этих трансгенных мышах, эндогенный мышиный альбумин связывался и подвергался рециклингу человеческим FcRn. Хотя связывание антитела к человеческому FcRn с человеческим FcRn не блокирует связывание альбумина с FcRn в in vitro анализе, если такое ингибирование происходит in vitro, то это может привести к ускоренному выведению эндогенного мышиного альбумина. Данные показаны на Фигуре 1е. Поскольку концентрация альбумина в сыворотке была отчасти вариабельной (от 16,6 до 59,9 мг/мл в группе из 30 мышей, перед инъекцией лекарственного средства в виде антитела к FcRn) для того, чтобы осуществить более легкое сравнение результатов группы, данные альбумина нормализовали и представляли в виде процента концентрации сывороточного альбумина в момент ноль на Фигуре 1е. Возобновляемый эффект в отношении концентрации альбумина в плазме может быть результатом введения дозы в форматах Fab'-ПЭГ или FabFv. Дисперсионный анализ (ANOVA) проводили при повторных измерениях, проверяя различия в обработке и различия по времени одновременно. При
каждом измерении Fab'-ПЭГ или FabFv-обработанных животных по сравнению с контролем в одном и том же эксперименте в одной и той же временной точке, контроли были иррелевантными (не связывающими FcRn) Fab'-ПЭГ или представляли собой только носитель, соответственно. Эти два формата продемонстрировали снижение концентраций альбумина (при 5% уровне в дисперсионном анализе данных) около 48-72 часов после инъекции лекарственного средства, с уровнями восстановления после этого к уровням до введения лекарственного средства. Максимальное снижение концентрации альбумина в плазме составило около 10% после 100 мг/кг формата Fab'-ПЭГ (48 часов), или около 25% после 250 мг/кг FabFv через 14 4 часа. Сходный дисперсионный анализ проводили на данных, демонстрирующих эффект 1638 IgG4P в отношении уровня альбумина в плазме (показанный на Фигуре If) . НЕ было отмечено значимого отличия между обработанными и контрольными животными, что подтверждает, что обработка форматом IgG4P или 1638 не влияет на концентрацию альбумина в плазме.
Пример 9 Кристаллическая структура и анализ комплекса 1638.g4 9 Fab:FcRn
1б3 8.д4 9 Fab были совместно кристаллизованы с hFcRn альфа-цепью области ECD (SEQ ID N0:48) и человеческим бета 2 микроглобулином (SEQ ID N0:72) . Белки были в 50 мМ ацетате натрия, 125 мМ NaCl рНб, а условия кристаллизации были 0,1 М Tris рН 8,5, 40% ПЭГ400 и 0,2М LiS04.H20 при концентрации белка 10 мг/мл и объемном соотношении капли 0,4 мкл белка на 0,4 мкл резервуар в сидячей каплей, в эксперименте диффузии пара. Кристаллам позволяли расти в течение 8-21 дня, после этого их собирали из капли, переносили в луночный буфер (поскольку он уже содержит 40% ПЭГ400) и мгновенно замораживали в жидком азоте (18 0°С) в течение 10 секунд. Рентгеновские данные собирали с SOLEIL с помощью осцилляционного способа. Размер ячейки кристаллов составлял а=101,49 А, Ь=210,4 А, с=101,49 А; альфа = 90 градусов, бета = 90 градусов и гамма = 90 градусов. Пространственная группа была определена как P2i2i2. Молекулярная упаковка была определена с помощью РН aser, и уточнение было
проведено с помощью Refmac с использованием даных между 30 и 2,7 А, для получения конечного R-фактора 21,8% и Rfree 27,2%. Результаты показаны ниже: Остатки, взаимодействующие с 1638.49 Fab', находились в FcRn-цепи (не (32М) и указаны ниже жирным шрифтом в последовательности внеклеточного домена FcRn.
AESHLSLLYHLTAVSSPAPGTPAFWVSGWLGPQQYLSYNSLRGEAEPCGAWVWENQVSW YWEKETTDLRIKEKLFLEAFKALGGKGPYTLQGLLGCELGPDNTSVPTAKFA-LNGEEFMNFDLK QGTWGGDWPEALAISQRWQQQDKAANKELTFLLFSCPH
RLREHLERGRGNLEWKEPPSMRLKARPSSPGFSVLTCSAFSFYPPELQLRFLRNGLAAGTGQGD
FGPNS DGS FHAS S S LTVKS GDEHHYCCIVQHAGLAQPLRVELE S PAKS S (SEQ ID
N0:48).
Подчеркнутые остатки это те, которые, как известно, являются критическими для взаимодействия человеческого FcRn с Fc-областью человеческого IgG. Жирным выделены остатки, которые вовлечены в связывание антитела 1638.49 Fab' при 4 А. Остатки, выделенные курсивом, это те, которые вовлечены в связывание этого же антитела при 5-А.
Эпитоп, определенный остатками антитела ближе, чем 4-А, состоял из: А81, G83, G84, К85, G86, Р87, N113, Е115, W131, Р132, Е133, L135, А136, Q139.
Эпитоп, определенный остатками антитела ближе 5А, состоял из: А81, G83, G84, К85, G86, Р87, N113, Е115, W131, Р132, Е133, L135, А136, Q139, L82, Y88, L112, D130.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> UCB Biopharma SPRL <120> Антитело к FcRn <130> G0191
<150> GB1320066.2
<151> 2013-11-13
<160> 74
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH1
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly
1 5 10
Белок
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH2 <400> 2
Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn
1 5 10 15
Белок
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRH3 <400> 3
Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> CDRL1
<400> 4
Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala
1 5 10
<210> <211> <212> 5
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRL2
<400> 5
Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp 1 5
<210> <211> <212> 6 9
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRL3
<400> 6
Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp Thr 1 5
<210> <211> <212>
/О 1 о
7 7
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> CDRL2 ВАРИАНТ
<400> 7
Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu
1 5
<210> 8
<211> 107
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VL-область крысиного антитела 1638
<400> 8
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Gly Met Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> <211> <212>
321 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> VL-область крысиного антитела 1638
<210> 10
<211> 127
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
^ о о -> ^
<223> VL-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом
<400> 10
Met Asn Val Pro Thr Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Ile Thr
1 5 10 15
Asp Gly Ile Cys Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Leu Gly Glu Thr Ile Ser Ile Glu Cys Arg Thr Ser Glu Asp
35 40 45
Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Lys Ser Pro
50 55 60
Gln Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Ser Leu Lys Ile Ser
85 90 95
Gly Met Gln Pro Glu Asp Glu Gly Asp Tyr Phe Cys Leu Gln Gly Phe
100 105 110
Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
115 120 125
<210> 11
<211> 381
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VL-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями,
подчеркнутыми и выделенными курсивом
atgaatgtgc
ccactcaatt
ccttgggttg
ttgctgctgt
ggataacaga
tggcatatgc
gacatcctga
tgacacagtc
tccagcttcc
ctgtctgcat
ctctgggaga
aactatctcc
120
atcgaatgtc
gaacaagtga
agacatttac
actaatttag
cgtggtacca
gcagaagtca
180
gggaaatctc
ctcaactcct
gatctatgtt
gcaaagacgt
tgcaagatgg
ggtcccatca
240
cggttcagtg
gcagtggatc
tggcacgcat
tattctctca
agatcagcgg
catgcaacct
300
gaagatgaag
gggattattt
ctgtctgcag
ggtttcaagt
ttccgtggac
gttcggtgga
360
ggcaccaagc
tggaactgaa
381
<210> 12
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH-область крысиного антитела 1638
<400> 12
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Phe
85 90 95
Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser 115 120
<210> 13
<211> 366
<212>
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<223> VH-область крысиного антитела 1638
<210> 14
<211> 141
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
s о о о ^
<223> VH-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом
<400> 14
Met Asp Arg Leu Thr Ser Ser Phe Leu Leu Leu Ile Val Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln
20 25 30
Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Asn
85 90 95
Asn Gln Ala Phe Leu Lys Ile Thr Asn Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala
100 105 110
Thr Tyr Phe Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro
115 120 125
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser
130 135 140
<210> 15
<211> 423
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH-область крысиного антитела 1638 с подчеркнутыми и выделенными курсивом
<400> 15
atggacaggc taacttcctc attcctactg ctgattgtcc gttactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct tgcactttct ctgggttttc actgagtact tatggtgtgg ccttcaggga agggtctgga gtggctggca aacatttggt aatccatctc tggaaaaccg actcactatc tccaaggaca ctcaagatca ccaatgtgga cactgcagat agcgccacat gcttactatg gcagccatcc cccttttgac tactggggcc tcg
ctgcatatgt cccagaccct gtgtgggctg gggatgatga cctccaacaa acttctgtgt aaggagtcat cctgtctcag cagtctgact gattcgtcag taagcgctac ccaagcattc tcggaccccg ggtcacagtc
60 120 180 240 300 360 420 423
<210> 16 <211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 V-область
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 17
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 V-область
gatatccaga
tgacccagag
tccaagcagt
ctctccgcca
gcgtaggcga
tcgtgtgact
attacctgtc
gcactagcga
ggacatctac
accaacctgg
cgtggtatca
gcagaaacca
120
ggcaaagtgc
cgaaactgct
gatctacgtc
gcgaaaaccc
tccaggaagg
tgtaccgtct
180
cgcttttccg
gctctggtag
cggtactcac
tacaccctga
ccatctcttc
cctccagccg
240
gaagatgttg
ctacctacta
ttgcctccag
ggcttcaaat
tcccgtggac
tttcggtggc
300
ggcacgaaag
tggaaatcaa
321
<210> 18
<211> 128
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 V-область (экспрессия в E. coli)
<400> 18
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu
35 40 45
Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
100 105 110
Phe Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 19
<211> 384
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 V-область (экспрессия в E. coli)
atgaaaaaga
cagctatcgc
aattgcagtg
gccttggctg
gtttcgctac
cgtagcgcaa
gctgatatcc
agatgaccca
gagtccaagc
agtctctccg
ccagcgtagg
cgatcgtgtg
120
actattacct
gtcgcactag
cgaggacatc
tacaccaacc
tggcgtggta
tcagcagaaa
180
ccaggcaaag
tgccgaaact
gctgatctac
gtcgcgaaaa
ccctccagga
aggtgtaccg
240
tctcgctttt
ccggctctgg
tagcggtact
cactacaccc
tgaccatctc
ttccctccag
300
ccggaagatg
ttgctaccta
ctattgcctc
cagggcttca
aattcccgtg
gactttcggt
360
ggcggcacga
aagtggaaat
caaa
384
<210> 20
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> 1638 gL7 легкая цепь (V + константная область)
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 21 <211> 642 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 легкая цепь (V + константная область, экспрессия в E. coli)
<400> 21
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca 120
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct 180
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg 240
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc 300
ggcacgaaag tggaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcac cagtaacaaa aagttttaat agaggggagt gt 642
<210> 22 <211> 642 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 легкая цепь (V + константная область, экспрессия в клетках млекопитающего)
<400> 22
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact 60
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca 120
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct 180
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg 240
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc 300
ggcacgaaag tggaaatcaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc 360
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 420
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 480
gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 540
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600
ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc 642
<210> 23 <211> 235
<212> белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 легкая цепь (экспрессия в E. coli) <400> 23
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu
35 40 45
Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
100 105 110
Phe Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 24
<211> 705
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 легкая цепь ( экспрессия в E. coli)
atgaaaaaga
cagctatcgc
aattgcagtg
gccttggctg
gtttcgctac
cgtagcgcaa
gctgatatcc
agatgaccca
gagtccaagc
agtctctccg
ccagcgtagg
cgatcgtgtg
120
actattacct
gtcgcactag
cgaggacatc
tacaccaacc
tggcgtggta
tcagcagaaa
180
ccaggcaaag
tgccgaaact
gctgatctac
gtcgcgaaaa
ccctccagga
aggtgtaccg
240
tctcgctttt
ccggctctgg
tagcggtact
cactacaccc
tgaccatctc
ttccctccag
300
ccggaagatg
ttgctaccta
ctattgcctc
cagggcttca
aattcccgtg
gactttcggt
360
ggcggcacga
aagtggaaat
caaacgtacg
gtagcggccc
catctgtctt
catcttcccg
420
ccatctgatg
agcagttgaa
atctggaact
gcctctgttg
tgtgcctgct
gaataacttc
480
tatcccagag
aggccaaagt
acagtggaag
gtggataacg
ccctccaatc
gggtaactcc
540
caggagagtg
tcacagagca
ggacagcaag
gacagcacct
acagcctcag
cagcaccctg
600
acgctgagca
aagcagacta
cgagaaacac
aaagtctacg
cctgcgaagt
cacccatcag
660
ggcctgagct
caccagtaac
aaaaagtttt
aatagagggg
agtgt
705
<210> 25
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 V-область
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120
<210> 26
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
60 120 180 240 300 360 366
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 V-область (экспрессия в E. coli)
<400> 27
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His
115 120 125
Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
<210> 28
<211> 429
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 V-область (экспрессия в E.coli)
<210> 29
<211> 226
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab тяжелая цепь (V + CH1 человеческой цепи гамма)
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys
225
<210> 30
<211> 678
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab тяжеая цепь (V + CH1 человеческой цепи гамма)
<400> 30
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60
tcttgtgcag
cgtccggctt
ctctctgtct
acctacggcg
ttggtgttgg
ttgggtacgt
120
caggctccag
gtaaaggtct
ggaatggctc
gcaaacatct
ggtgggacga
cgataaacgc
180
tacaacccgt
ccctggagaa
ccgcttcacc
attagccgtg
ataacgcgaa
aaactccgcg
240
tatctccaga
tgaactccct
gcgtgccgaa
gacacggctg
tgtactattg
cgcgcgcact
300
ccggcgtact
atggctctca
cccaccgttt
gattactggg
gtcagggtac
catggttacc
360
gtctcgagcg
cttctacaaa
gggcccatcg
gtcttccccc
tggcaccctc
ctccaagagc
420
acctctgggg
gcacagcggc
cctgggctgc
ctggtcaagg
actacttccc
cgaaccggtg
480
acggtgtcgt
ggaactcagg
cgccctgacc
agcggcgtgc
acaccttccc
ggctgtccta
540
cagtcctcag
gactctactc
cctcagcagc
gtggtgaccg
tgccctccag
cagcttgggc
600
acccagacct
acatctgcaa
cgtgaatcac
aagcccagca
acaccaaggt
cgacaagaaa
660
gttgagccca
aatcttgt
678
<210> 31
<211> 247
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab тяжелая цепь (экспрессия в E. coli)
<400> 31
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His
115 120 125
Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
245
<210> 32
<211> 741
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab тяжелая цепь ( экспрессия в E. coli)
atgaagaaga
ctgctatagc
aattgcagtg
gcgctagctg
gtttcgccac
cgtggcgcaa
gctgaggttc
agctggtcga
gtctggaggc
gggcttgtcc
agcctggagg
gagcctgcgt
120
ctctcttgtg
cagcgtccgg
cttctctctg
tctacctacg
gcgttggtgt
tggttgggta
180
cgtcaggctc
caggtaaagg
tctggaatgg
ctcgcaaaca
tctggtggga
cgacgataaa
240
cgctacaacc
cgtccctgga
gaaccgcttc
accattagcc
gtgataacgc
gaaaaactcc
300
gcgtatctcc
agatgaactc
cctgcgtgcc
gaagacacgg
ctgtgtacta
ttgcgcgcgc
360
actccggcgt
actatggctc
tcacccaccg
tttgattact
ggggtcaggg
taccatggtt
420
accgtctcga
gcgcttctac
aaagggccca
tcggtcttcc
ccctggcacc
ctcctccaag
480
agcacctctg
ggggcacagc
ggccctgggc
tgcctggtca
aggactactt
ccccgaaccg
540
gtgacggtgt
cgtggaactc
aggcgccctg
accagcggcg
tgcacacctt
cccggctgtc
600
ctacagtcct
caggactcta
ctccctcagc
agcgtggtga
ccgtgccctc
cagcagcttg
660
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtcgacaag 720
aaagttgagc ccaaatcttg t 741
<210> 33
<211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab' тяжелая цепь (V + CH1 человеческой цепи гамма + шарнир)
<400> 33
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 225 230
<210> 34 <211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638
gH33 Fab'
тяжелая цепь (V + CH1
человеческой цепи гамма
+ шарн
<400> 34
gaggttcagc
tggtcgagtc
tggaggcggg
cttgtccagc
ctggagggag
cctgcgtctc
tcttgtgcag
cgtccggctt
ctctctgtct
acctacggcg
ttggtgttgg
ttgggtacgt
120
caggctccag
gtaaaggtct
ggaatggctc
gcaaacatct
ggtgggacga
cgataaacgc
180
tacaacccgt
ccctggagaa
ccgcttcacc
attagccgtg
ataacgcgaa
aaactccgcg
240
tatctccaga
tgaactccct
gcgtgccgaa
gacacggctg
tgtactattg
cgcgcgcact
300
ccggcgtact
atggctctca
cccaccgttt
gattactggg
gtcagggtac
catggttacc
360
gtctcgagcg
cttctacaaa
gggcccatcg
gtcttccccc
tggcaccctc
ctccaagagc
420
acctctgggg
gcacagcggc
cctgggctgc
ctggtcaagg
actacttccc
cgaaccggtg
480
acggtgtcgt
ggaactcagg
cgccctgacc
agcggcgtgc
acaccttccc
ggctgtccta
540
cagtcctcag
gactctactc
cctcagcagc
gtggtgaccg
tgccctccag
cagcttgggc
600
acccagacct
acatctgcaa
cgtgaatcac
aagcccagca
acaccaaggt
cgacaagaaa
660
gttgagccca
aatcttgtga
caaaactcac
acatgcgccg
702
<210> 35
<211> 255
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> 1638 gH33 Fab' тяжелая цепь (экспрессия в E. coli)
<400> 35
<220>
^ о о о ^
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His
115 120 125
Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
245 250 255
<210> 36
<211> 765
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 Fab' тяжелая цепь ( экспрессия в E. coli)
<400> 36 atgaagaaga
ctgctatagc
aattgcagtg
gcgctagctg
gtttcgccac
cgtggcgcaa
gctgaggttc
agctggtcga
gtctggaggc
gggcttgtcc
agcctggagg
gagcctgcgt
120
ctctcttgtg
cagcgtccgg
cttctctctg
tctacctacg
gcgttggtgt
tggttgggta
180
cgtcaggctc
caggtaaagg
tctggaatgg
ctcgcaaaca
tctggtggga
cgacgataaa
240
cgctacaacc
cgtccctgga
gaaccgcttc
accattagcc
gtgataacgc
gaaaaactcc
300
gcgtatctcc
agatgaactc
cctgcgtgcc
gaagacacgg
ctgtgtacta
ttgcgcgcgc
360
actccggcgt
actatggctc
tcacccaccg
tttgattact
ggggtcaggg
taccatggtt
420
accgtctcga
gcgcttctac
aaagggccca
tcggtcttcc
ccctggcacc
ctcctccaag
480
agcacctctg
ggggcacagc
ggccctgggc
tgcctggtca
aggactactt
ccccgaaccg
540
gtgacggtgt
cgtggaactc
aggcgccctg
accagcggcg
tgcacacctt
cccggctgtc
600
ctacagtcct
caggactcta
ctccctcagc
agcgtggtga
ccgtgccctc
cagcagcttg
660
ggcacccaga
cctacatctg
caacgtgaat
cacaagccca
gcaacaccaa
ggtcgacaag
720
aaagttgagc
ccaaatcttg
tgacaaaact
cacacatgcg
ccgcg
765
<210> 37
<211> 450
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<223> 1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4P человеческой цепи гамма)
<220>
s о о о ^
<400> 37
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100
105
110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355
360
365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 38
<211> 1350
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4P человеческой цепи гамма)
<210> 39 <211> 449
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4P цепи гамма млекопитающих, нет c-концевого lys)
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val
195 200 205
Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys
210 215 220
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385
390
395
400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Gly
<210> 40
<211> 341
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 FabFv легкая цепь
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
225 230 235 240
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser Pro
245 250 255
Ser Val Trp Ser Asn Phe Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
260 265 270
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Ala Ser Lys Leu Thr Ser Gly Val
275 280 285
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
290 295 300
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gly
305 310 315 320
Gly Tyr Ser Ser Ile Ser Asp Thr Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val
325 330 335
Glu Ile Lys Arg Thr 340
<210> 41 <211> 1023
<212>
ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL7 FabFv легкая цепь
<400> 41
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc
gcactagcga
ggacatctac
accaacctgg
cgtggtatca
gcagaaacca
120
ggcaaagtgc
cgaaactgct
gatctacgtc
gcgaaaaccc
tccaggaagg
tgtaccgtct
180
cgcttttccg
gctctggtag
cggtactcac
tacaccctga
ccatctcttc
cctccagccg
240
gaagatgttg
ctacctacta
ttgcctccag
ggcttcaaat
tcccgtggac
tttcggtggc
300
ggcacgaaag
tggaaatcaa
acgtacggta
gcggccccat
ctgtcttcat
cttcccgcca
360
tctgatgagc
agttgaaatc
tggaactgcc
tctgttgtgt
gcctgctgaa
taacttctat
420
cccagagagg
ccaaagtaca
gtggaaggtg
gataacgccc
tccaatcggg
taactcccag
480
gagagtgtca
cagagcagga
cagcaaggac
agcacctaca
gcctcagcag
caccctgacg
540
ctgagcaaag
cagactacga
gaaacacaaa
gtctacgcct
gcgaagtcac
ccatcagggc
600
ctgagctcgc
ccgtcacaaa
gagcttcaac
aggggagagt
gtggtggagg
tggctctggc
660
ggtggtggct
ccggaggcgg
aggaagcgac
atccagatga
cccagagccc
ttcctctgta
720
agcgccagtg
tcggagacag
agtgactatt
acctgccaaa
gctccccttc
agtctggtcc
780
aattttctat
cctggtatca
gcaaaagccc
ggaaaggctc
ctaaattgct
gatctacgaa
840
gcaagcaaac
tcaccagcgg
cgtgcccagc
aggttcagcg
gcagtgggtc
tggaactgac
900
tttaccctga
caatctcctc
actccagccc
gaggacttcg
ccacctatta
ctgcggtgga
960
ggttacagta
gcataagtga
tacgacattt
ggatgcggca
ctaaagtgga
aatcaagcgt
1020
acc
1023
<210> 42
<211> 363
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 FabFv тяжелая цепь
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Thr Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
245 250 255
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Ile Asp Leu Ser
260 265 270
Asn Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu
275 280 285
Trp Ile Gly Ile Ile Trp Ala Ser Gly Thr Thr Phe Tyr Ala Thr Trp
290 295 300
Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val
305 310 315 320
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
325 330 335
Cys Ala Arg Thr Val Pro Gly Tyr Ser Thr Ala Pro Tyr Phe Asp Leu
340 345 350
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360
<210> 43
<211> 1089
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH33 FabFv тяжелая цепь
<400> 43
gaggttcagc
tggtcgagtc
tggaggcggg
cttgtccagc
ctggagggag
cctgcgtctc
tcttgtgcag
cgtccggctt
ctctctgtct
acctacggcg
ttggtgttgg
ttgggtacgt
120
caggctccag
gtaaaggtct
ggaatggctc
gcaaacatct
ggtgggacga
cgataaacgc
180
tacaacccgt
ccctggagaa
ccgcttcacc
attagccgtg
ataacgcgaa
aaactccgcg
240
tatctccaga
tgaactccct
gcgtgccgaa
gacacggctg
tgtactattg
cgcgcgcact
300
ccggcgtact
atggctctca
cccaccgttt
gattactggg
gtcagggtac
aatggttacc
360
gtctcgtccg
cttctacaaa
gggcccatcg
gtcttccccc
tggcaccctc
ctccaagagc
420
acctctgggg
gcacagcggc
cctgggctgc
ctggtcaagg
actacttccc
cgaaccggtg
480
acggtgtcgt
ggaactcagg
cgccctgacc
agcggcgtgc
acaccttccc
ggctgtccta
540
cagtcctctg
gactctactc
cctcagcagc
gtggtgaccg
tgccctccag
cagcttgggc
600
acccagacct
acatctgcaa
cgtgaatcac
aagcccagca
acaccaaggt
ggacaagaaa
660
gttgagccca
aatcttgttc
cggaggtggc
ggttccggag
gtggcggtac
aggtggcggt
720
gggtccgaag
tccagctgct
tgaatccgga
ggcggactcg
tgcagcccgg
aggcagtctt
780
cgcttgtcct
gcgctgtatc
tggaatcgac
ctgagcaatt
acgccatcaa
ctgggtgaga
840
caggcacctg
ggaaatgcct
cgaatggatc
ggcattatat
gggctagtgg
gacgaccttt
900
tatgctacat
gggcgaaggg
tagattcaca
atctcacggg
ataatagtaa
gaacacagtg
960
tacctgcaga
tgaactccct
gcgagcagag
gataccgccg
tttactattg
tgctcgcact
1020
gtcccaggtt
atagcactgc
accctacttt
gatctgtggg
ggcagggcac
tctggtcacc
1080
gtctcgtcc
1089
<210> 44
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Акцепторная каркасная область JK4 человеческого IGKV1-27
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 45
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 46
<211> 114
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Акцепторная каркасная область JH3 человеческого IGHV3-7
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> <211> <212> <213>
47 342
DNA
Искусственная последовательность
<220> <223>
Акцепторная каркасная область JH3 человеческого
IGHV3-7
<400> 47
gaggtgcagc
tggtggagtc
tgggggaggc
ttggtccagc
ctggggggtc
cctgagactc
tcctgtgcag
cctctggatt
cacctttagt
agctattgga
tgagctgggt
ccgccaggct
120
ccagggaagg
ggctggagtg
ggtggccaac
ataaagcaag
atggaagtga
gaaatactat
180
gtggactctg
tgaagggccg
attcaccatc
tccagagaca
acgccaagaa
ctcactgtat
240
ctgcaaatga
acagcctgag
agccgaggac
acggctgtgt
attactgtgc
gagagatgct
300
tttgatgtct
ggggccaagg
gacaatggtc
accgtctctt
342
<210> 48
<211> 274
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Внеклеточная последовательность альфа-цепи FcRn человека
<400> 48
Ala Glu Ser His Leu Ser Leu Leu Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Ser
1 5 10 15
Pro Ala Pro Gly Thr Pro Ala Phe Trp Val Ser Gly Trp Leu Gly Pro
20 25 30
Gln Gln Tyr Leu Ser Tyr Asn Ser Leu Arg Gly Glu Ala Glu Pro Cys
35 40 45
Gly Ala Trp Val Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu
50 55 60
Thr Thr Asp Leu Arg Ile Lys Glu Lys Leu Phe Leu Glu Ala Phe Lys
65 70 75 80
Ala Leu Gly Gly Lys Gly Pro Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys
85 90 95
Glu Leu Gly Pro Asp Asn Thr Ser Val Pro Thr Ala Lys Phe Ala Leu
100 105 110
Asn Gly Glu Glu Phe Met Asn Phe Asp Leu Lys Gln Gly Thr Trp Gly
115 120 125
Gly Asp Trp Pro Glu Ala Leu Ala Ile Ser Gln Arg Trp Gln Gln Gln
130 135 140
Asp Lys Ala Ala Asn Lys Glu Leu Thr Phe Leu Leu Phe Ser Cys Pro
145 150 155 160
His Arg Leu Arg Glu His Leu Glu Arg Gly Arg Gly Asn Leu Glu Trp
165 170 175
Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Ser Ser Pro Gly
180 185 190
Phe Ser Val Leu Thr Cys Ser Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu
195 200 205
Gln Leu Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ala Gly Thr Gly Gln Gly
210 215 220
Asp Phe Gly Pro Asn Ser Asp Gly Ser Phe His Ala Ser Ser Ser Leu
225 230 235 240
Thr Val Lys Ser Gly Asp Glu His His Tyr Cys Cys Ile Val Gln His
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gln Pro Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser Pro Ala Lys
260 265 270
Ser Ser
<210> 49
<211> 99
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Крысиный бета 2-M
<400> 49
Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Pro Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gln Phe His Pro
20 25 30
Pro Gln Ile Glu Ile Glu Leu Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Asn
35 40 45
Ile Glu Met Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile
50 55 60
Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Val Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Lys His Val Thr Leu Lys Glu Pro Lys Thr Val Thr Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 50
<211> 119
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий бета 2-M, включающий сигнальную последовательность
<400> 50
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met 115
<210> 51
<211> 107
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638gL2 V-область
<400> 51
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 52
<211> 321
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<210> 53 <211> 128
<212> Бел
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL2 V-область (экспрессия E. coli)
<400> 53
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu
35 40 45
Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
100 105 110
Phe Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
<210> 54
<211> 384
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL2 V-область (экспрессия в E. coli)
60 120 180 240 300 360 384
<210> 55
<211> 214
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL2 легкая цепь (V + константная область)
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Thr Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Phe Lys Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210
<210> 56
<211> 642
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL2 легкая цепь (V + константная область с для экспрессии в E. coli)
оптимизацией по кодонам
<210> 57
<211> 235
<212> Белок
<220>
^ о о -> ^
<213> Искусственная последовательность
<223> 1638 gL2 легкая цепь (экспрессия E. coli)
<400> 57
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Glu
35 40 45
Asp Ile Tyr Thr Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Val Ala Lys Thr Leu Gln Asp Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly
100 105 110
Phe Lys Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
115 120 125
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
130 135 140
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
165 170 175
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 58 <211> 705 <212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gL2 легкая цепь (экспрессия в E. coli)
<210> 59
<211> 122
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638gH2 V-область
<400> 59
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser 115 120
<210> 60
<211> 366
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638gH2 V-область
gaggttcagc
tggtcgagtc
tggaggcggg
cttgtccagc
ctggagggag
cctgcgtctc
tcttgtgcat
tctccggctt
ctctctgtct
acctacggcg
ttggtgttgg
ttgggtacgt
120
caggctccag
gtaaaggtct
ggaatggctc
gcaaacatct
ggtgggacga
cgataaacgc
180
tacaacccgt
ccctggagaa
ccgcttcacc
attagcaaag
ataccgcgaa
aaactccgcg
240
tatctccaga
tgaactccct
gcgtgccgaa
gacacggctg
tgtactattg
cgttcgcact
300
ccggcgtact
atggctctca
cccaccgttt
gattactggg
gtcagggtac
catggttacc
360
gtctcg
366
<210> 61 <211> 143
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 V-область с сигнальной последовательностью, подчеркнутой и выделенной курсивом
(экспрессия в E. coli)
<400> 61
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His
115 120 125
Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
130 135 140
<210> 62
<211> 429
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 V-область с сигнальной последовательностью, подчеркнутой и выделенной курсиовм
(экспрессия в E. coli)
<400> 62
atgaagaaga
ctgctatagc
aattgcagtg
gcgctagctg
gtttcgccac
cgtggcgcaa
gctgaggttc
agctggtcga
gtctggaggc
gggcttgtcc
agcctggagg
gagcctgcgt
120
ctctcttgtg
cattctccgg
cttctctctg
tctacctacg
gcgttggtgt
tggttgggta
180
cgtcaggctc
caggtaaagg
tctggaatgg
ctcgcaaaca
tctggtggga
cgacgataaa
240
cgctacaacc
cgtccctgga
gaaccgcttc
accattagca
aagataccgc
gaaaaactcc
300
gcgtatctcc
agatgaactc
cctgcgtgcc
gaagacacgg
ctgtgtacta
ttgcgttcgc
360
actccggcgt
actatggctc
tcacccaccg
tttgattact
ggggtcaggg
taccatggtt
420
accgtctcg
429
<210> 63
<211> 234
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (V + CH1 человеческой цепи гамма + шарнир)
<400> 63
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala 225 230
<210> 64
<211> 702
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (V + CH1 человеческой цепи гамма + шарнир)
<400> 64
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc 60
tcttgtgcat tctccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt 120
caggctccag
gtaaaggtct
ggaatggctc
gcaaacatct
ggtgggacga
cgataaacgc
tacaacccgt
ccctggagaa
ccgcttcacc
attagcaaag
ataccgcgaa
aaactccgcg
tatctccaga
tgaactccct
gcgtgccgaa
gacacggctg
tgtactattg
cgttcgcact
ccggcgtact
atggctctca
cccaccgttt
gattactggg
gtcagggtac
catggttacc
gtctcgagcg
cttctacaaa
gggcccatcg
gtcttccccc
tggcaccctc
ctccaagagc
acctctgggg
gcacagcggc
cctgggctgc
ctggtcaagg
actacttccc
cgaaccggtg
acggtgtcgt
ggaactcagg
cgccctgacc
agcggcgtgc
acaccttccc
ggctgtccta
cagtcctcag
gactctactc
cctcagcagc
gtggtgaccg
tgccctccag
cagcttgggc
acccagacct
acatctgcaa
cgtgaatcac
aagcccagca
acaccaaggt
cgacaagaaa
gttgagccca
aatcttgtga
caaaactcac
acatgcgccg
180 240 300 360 420 480 540 600 660 702
<210> 65
<211> 255
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 Fab' тяжелая цепь ( экспрессия в E. coli)
<400> 65
Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala
1 5 10 15
Thr Val Ala Gln Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Phe Ser Gly Phe
35 40 45
Ser Leu Ser Thr Tyr Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro
50 55 60
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys
65 70 75 80
Arg Tyr Asn Pro Ser Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Thr
85 90 95
Ala Lys Asn Ser Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
100 105 110
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His
115 120 125
Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
145 150 155 160
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
165 170 175
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
180 185 190
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
195 200 205
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
210 215 220
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
225 230 235 240
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Ala Ala
245 250 255
<210> 66
<211> 765
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (экспрессия в E. coli)
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcg ccgcg
765
<210> 67
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-концевая последовательность тияжелой цепи
<400> 67
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> N-концевая последовательность легкой цепи
<400> 68
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческая последовательность JH3
<400> 69
Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
1 5 10 15
<210> <211> <212>
/01 0\
70 5
Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> часть CDR-H3
<400> 70
Asp Ala Phe Asp Val 1 5
<210> 71
<211> 12
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность JK4
<400> 71
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
Белок
<210> <211> <212>
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Человеческий бета 2-микроглобулин
<400> 72
Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Ala Glu
1 5 10 15
Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser Gly Phe His Pro
20 25 30
Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu Arg Ile Glu Lys
35 40 45
Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Leu
50 55 60
Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp Glu Tyr Ala Cys
65 70 75 80
Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile Val Lys Trp Asp
85 90 95
Arg Asp Met
<210> 73 <211> 453
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1638gH33 IgG1 тяжелая цепь (V + константная область 1 человеческой цепи гамма )
<400> 73
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Glu Asn Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Ala
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Thr Pro Ala Tyr Tyr Gly Ser His Pro Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys
210 215 220
Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu
225 230 235 240
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
245 250 255
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
260 265 270
Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
275 280 285
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser
290 295 300
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
305 310 315 320
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala
325 330 335
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
340 345 350
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln
355 360 365
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
370 375 380
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
385 390 395 400
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
405 410 415
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
420 425 430
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
435 440 445
450
Leu Ser Pro Gly Lys
л с; п
<213> Искусственная последовательность
<223> 1638gH33 IgG1 тяжелая цепь (V + константная область-1 человеческой цепи гамма, экзоны подчеркнуты)
<400> 74
gaggttcagc
tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc
tcttgtgcag
cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt
120
caggctccag
gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc
180
tacaacccgt
ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg
240
tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact 300
ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac aatggttacc 360
gtctcgagcg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540
cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa 660
gttggtgaga ggccagcaca gggagggagg gtgtctgctg gaagccaggc tcagcgctcc 720
tgcctggacg catcccggct atgcagcccc agtccagggc agcaaggcag gccccgtctg 780
cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc actcatgctc agggagaggg tcttctggct 840
ttttccccag gctctgggca ggcacaggct aggtgcccct aacccaggcc ctgcacacaa 900
aggggcaggt gctgggctca gacctgccaa gagccatatc cgggaggacc ctgcccctga 960
cctaagccca ccccaaaggc caaactctcc actccctcag ctcggacacc ttctctcctc 1020
ccagatctga gtaactccca atcttctctc tgcagagccc aaatcttgtg acaaaactca 1080
cacatgccca ccgtgcccag gtaagccagc ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga 1140
caggtgccct agagtagcct gcatccaggg acaggcccca gccgggtgct gacacgtcca 1200
cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc 1260
caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg 1320
acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc 1380
ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg 1440
tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 1500
acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt gggacccgtg 1560
gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac cctctgccct gagagtgacc 1620
gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1680
ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1740
tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 1800
accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1860
gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1920
cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa 1965
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, содержащие тяжелую цепь или фрагмент тяжелой цепи, содержащий вариабельную область, где указанная вариабельная область содержит три CDR, где CDR HI имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:1, CDR Н2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:2, и CDR НЗ имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:3.
2. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что антитело или его связывающий фрагмент дополнительно содержит легкую цепь или ее фрагмент, содержащий вариабельную область, содержащую три CDR, где CDR L1 имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:4, CDR L2 имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:5 или SEQ ID N0:7 и CDR L3 имеет последовательность, представленную в SEQ ID N0:6.
3. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, содержащие тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:12, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:8.
4. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, отличающиеся тем, что антитело является гуманизированным.
5. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, содержащие тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:2 5, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:16.
6. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 1 или 2, содержащие тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:59, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:51.
7. Антитело или его связывающий фрагмент, которые
связываются с человеческим FcRn, содержащим тяжелую цепь, где
вариабельный домен тяжелой цепи содержит последовательность,
имеющую по меньшей мере 8 0% идентичности или сходства с
последовательностью, представленной в SEQ ID N0:25, и где
вариабельный домен легкой цепи содержит последовательность,
имеющую по меньшей мере 8 0% идентичности или сходства с
последовательностью, представленной в SEQ ID N0:16.
8. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 7,
отличающиеся тем
, что молекула
антитела
имеет
последовательность,
представленную
SEQ
NO:
ДЛЯ
CDR-
¦HI,
последовательность,
представленную
SEQ
NO:
ДЛЯ
CDR-
¦Н2,
последовательность,
представленную
SEQ
NO:
ДЛЯ
CDR-
¦НЗ,
последовательность,
представленную
SEQ
NO:
ДЛЯ
CDR-
¦L1,
последовательность,
представленную
SEQ
: 5
или
SEQ
N0:7, для CDR-L2 и последовательность, представленную в SEQ ID N0:6, для CDR-L3.
9. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому
из пп. 1-8, отличающиеся тем, что антитело или его связывающий
фрагмент представляют собой scFv-, Fv-, Fab- или Fab'-фрагмент.
10. Fab'-фрагмент антитела к FcRn по п. 9, содержащий тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:33, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20.
11. Fab'-фрагмент антитела к FcRn по п. 6, содержащий тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:63, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:55.
12. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, отличающиеся тем, что антитело или его связывающий фрагмент конъюгированы с полимером, например, выбранным из крахмала, альбумина и полиэтиленгликоля.
13. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 12, отличающиеся тем, что полимер представляет собой ПЭГ, например, с молекулярной массой в диапазоне 5-50 кДа.
14. Антитело к FcRn по любому из пп. 1-8, отличающееся тем, что оно представляет собой полноразмерное антитело.
15. Антитело по п. 14, отличающееся тем, что его выбирают из группы, состоящей из IgGl, IgG4 и IgG4P.
16. Антитела к FcRn по п. 5, 14 или 15, содержащее тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:37, SEQ ID N0:39 или SEQ ID N0:73, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:20.
10.
17. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, отличающиеся тем, что антитело или его связывающий фрагмент представляет собой Fab-dsFv, содержащий тяжелую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:42, и легкую цепь, содержащую последовательность, представленную в SEQ ID N0:40.
18. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, которые связываются с тем же эпитопом человеческого FcRn, что и антитело по п. 5, 10 или 1 б.
19. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, которые связываются с эпитопом человеческого FcRn, который содержит одну, две, три или четыре аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из остатков Е115, W131, Р132, и Е133, и один или несколько остатков, выбранных из группы, состоящей из А81, G8 3, G84, К85, G86, Р87, N113, L135, А136 и Q139 внеклеточного домена человеческого FcRn (SEQ ID N0:48).
20. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по п. 19, которые дополнительно связываются с одним или с несколькими остатками, выбранными из группы, состоящей из L82, Y8 8, L112 и D130 .
21. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 17-20, которые перекрестно блокируют связывание антитела по п. 5с человеческим FcRn, или которые перекрестно блокируются антителом по п. 5 от связывания с человеческим FcRn.
22. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 17-21, которые являются гуманизированными или полностью человеческими.
23. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 17-22, которые обладают аффинностью связывания с человеческим FcRn, составляющей 150пМ или менее при обоих рН б и 7,4.
24. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому из пп. 1-23, которые блокируют связывание человеческого IgG с человеческим FcRn.
25. Антитело к FcRn или его связывающий фрагмент по любому
из пп. 1-24, которые не связываются с человеческим |32-микроглобулином (SEQ ID N0:72).
26. Выделенная последовательность ДНК, кодирующая тяжелую и/или легкую цепь антитела по любому из пп. 1-25.
27. Клонирующий или экспрессирующий вектор, содержащий одну или несколько последовательностей ДНК по п. 26.
28. Вектор по п. 27, отличающийся тем, что он содержит (i) последовательность, представленную в SEQ ID N0:30, 32, 34 или 36, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:21 или 24, или (ii) последовательность, представленную в SEQ ID N0:38, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:22, или (iii) последовательность, представленную в SEQ ID N0:74, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:22, или (iv) последовательность, представленную в SEQ ID N0:41, и последовательность, представленную в SEQ ID N0:43.
29. Клетка-хозяин, содержащая один или несколько
клонирующих или экспрессирующих векторов по п. 27 или 28.
30. Способ получения антитела, обладающего специфичностью связывания к человеческому FcRn, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 29 и выделение антитела.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая антитело к FcRn или его связывающий фрагмент, как определено по любому из пп. 125, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, разбавителями или носителями.
32. Фармацевтическая композиция по п. 31, содержащая другие активные ингредиенты.
33. Антитело или его связывающий фрагмент, как определено по любому из пп. 1-25, или композиция, как определено по п. 31 или 32, для применения в терапии.
34. Антитело или его связывающий фрагмент, как определено
по любому из пп. 1-25, или композиция, как определено по п. 31
или 32, для применения при лечении аутоимунного заболевания,
такого как миастения, пузырчатка обыкновенная,
оптиконевромиелит, синдром Гийена-Барре, волчанка,
30.
идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и тромботическая тромбоцитопеническая пурпура.
35. Способ лечения пациента, включающий введение терапевтически эффективного количества антитела или его связывающего фрагмента, как определено по любому из пп. 1-25, или композиции, как определено по п.31 или 32.
36. Способ по п. 35, отличающийся тем, что лечение предназначено для аутоиммунного заболевания, такого как миастения, пузырчатка обыкновенная, оптиконевромиелит, синдром Гийена-Барре, волчанка, идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и тромботическая тромбоцитопеническая пурпура.
По доверенности
ФИГ. 1А Эффект формата 1638 lgG4P в отношении концентрации человеческого IVIg в
сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
о.1 -I 1 1 1 1 1
8 24 48 72 144 192
ФИГ 1В Эффект форматов 1638 FabFv и Fab'-ПЭГ в отношении концентрации человеческого IVIg в сыворотке трансгенных мышей, содержащих человеческий FcRn.
-¦ • Контроль (PBS) n=4
1638 FabFv 40 мг/кг
1638 FabFv 120 мг/кг -•- 1638 FabFv 250 мг/кг
1638g28 Fab'-ПЭГ 100 мг/кг -х- АЗЗ Fab'-ПЭГ 100 мг/кг
Среднее геометрическое и 95% со доверительный интервал. п=6 до г\5 тех пор, пока не указано иное 00
10J-I 1 1 1 1 1 1
8 24 48 72 96 144 192
ФИГ 1D Фармакокинетика форматов 1638 FabFv и Fab'-ПЭГ в трансгенных мышах,
содержащих человеческий FcRn
юооо-а
1638 FabFv 40 мг/кг
1638 FabFv 120 мг/кг -•- 1638 FabFv 250 мг/кг
1638д28 Fab'-ПЭГ 100 мг/кг -х-АЗЗ Fab'-ПЭГ 100 мг/кг
Среднее геометрическое и 95% доверительный интервал. п=6, нанесены измеряемые значения (последующие значения образца были ниже границы обнаружения)
ел со
ФИГ 1Е Эффект форматов 1638 FabFv and Fab'-ПЭГ в отношении концентрации сывороточного альбумина в трансгенных мышах, содержащих человеческий FcRn
-¦- Контроль (PBS) п=2 1638 FabFv 40 мг/кг 1638 FabFv 120 мг/кг
-•- 1638 FabFv 250 мг/кг
1638д28 Fab'-ПЭГ 100 мг/кг
-х- АЗЗ Fab'-ПЭГ 100 мг/кг
Среднее арифметическое и 95% доверительный интервал. п=6 до тех пор, пока не указано иное Замечание: Плечи 95% доверительного интервала носителя в момент времени 8ч обрезали, чтобы расширить другие данные
5 со
п 1 1 1 1 1-
8 24 48 72 144 196
ФИГ. 2 представлены репрезентативные кривые для СА170 1638.
g49 lgG4. Средние значения KD (п = 3) составили 0,2 в нейтральном буфере, и 0,22 в кислом буфере, соответственно
2.5x10**-i
ю-"' г::'1 i:;v ю- & 10* 1№7 ю-"
Свободные
Ф И Г. 3 представлено, что СА170_1638.g49 lgG4 ингибирует
рециклинг IgG в клетках MDCK II клон 15
I • 1 1 1 1
-4 -3 -2 -1 0
Log 10 концентрации белка (мкг/мл)
ФИ Г. 4 представлено, что CA170_1638.g49 lgG4 ингибирует
трансцитоз IgG в клетках MDCK II клон 15
i 1 1 1 1 1
-3 -2-1012
Log10 концентрации антитела (мкг/мл)
Ф И Г. 5 представлено, что СА170_1638.g49 FabFv ингибирует
трансцитоз IgG в клетках MDCK II клон 15
I I § 1- i 1
-3-2-10 1 2
Log концентрации антитела (мкг/мл)
ФИ Г. 6 представлено связывание CA170_1638.g49 lgG4 на клетках
MDCK II клон 40 при кислом и нейтральном рН
6.0x10"9-,
Свободные
ФИГ. 7 Последовательности антитела CA170J638
CDRH1
GFSLSTYGVGVG SEQ ID NO: 1
CDRH2
NIWWDDDKRYNPSLEN SEQ ID NO: 2
CDRH3
TPAYYGSHPPFDY SEQ ID NO: 3
CDRL1
RTSEDIYTNLA SEQ ID NO: 4
CDRL2
VAKTLQD SEQ ID NO: 5
CDRL3
LQGFKFPWT SEQ ID NO: 6
CDRL2 ВАРИАНТ
VAKTLQE SEQ ID NO: 7
ФИГ. 8А
VL-область крысиного антитела 1638 SEQ ID NO: 8
DILMTQSPAS LSASLGETIS IECRTSEDIY TNLAWYQQKS GKSPQLLIYV AKTLQDGVPS RFSGSGSGTH YSLKISGMQP EDEGDYFCLQ GFKFPWTFGG GTKLELK
VL-область крысиного антитела 1638 SEQ ID NO: 9
gacatcctga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactatctcc atcgaatgtc gaacaagtga agacatttac actaatttag cgtggtacca gcagaagtca gggaaatctc ctcaactcct gatctatgtt gcaaagacgt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc tggcacgcat tattctctca agatcagcgg catgcaacct gaagatgaag gggattattt ctgtctgcag ggtttcaagt ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaactgaa a
VL-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом SEQ ID N0: 10
MNVPTQFLGL LLLWITDGIC DILMTQSPAS LSASLGETIS IECRTSEDIY TNLAWYQQKS GKSPQLLIYV AKTLQDGVPS RFSGSGSGTH YSLKISGMQP EDEGDYFCLQ GFKFPWTFGG GTKLELK
VL-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом SEQ ID N0: 11
atgaatgtgc ccactcaatt ccttgggttg ttgctgctgt ggataacaga tggcatatgc gacatcctga tgacacagtc tccagcttcc ctgtctgcat ctctgggaga aactatctcc atcgaatgtc gaacaagtga agacatttac actaatttag cgtggtacca gcagaagtca gggaaatctc ctcaactcct gatctatgtt gcaaagacgt tgcaagatgg ggtcccatca cggttcagtg gcagtggatc tggcacgcat tattctctca agatcagcgg catgcaacct gaagatgaag gggattattt ctgtctgcag ggtttcaagt ttccgtggac gttcggtgga ggcaccaagc tggaactgaa a
VH-область крысиного антитела 1638 SEQ ID NO: 12
QVTLKESGPG ILQPSQTLSL TCTFSGFSLS TYGVGVGWIR QPSGKGLEWL ANIWWDDDKR YNPSLENRLT ISKDTSNNQA FLKITNVDTA DSATYFCVRT PAYYGSHPPF DYWGQGVMVT VS
VH-область крысиного антитела 1638 SEQ ID NO: 13
caggttactc tgaaagagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg acttgcactt tctctgggtt ttcactgagt acttatggtg tgggtgtggg ctggattcgt cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcaaacattt ggtgggatga tgataagcgc tacaatccat ctctggaaaa ccgactcact atctccaagg acacctccaa caaccaagca ttcctcaaga tcaccaatgt ggacactgca gatagcgcca catacttctg tgttcggacc ccggcttact atggcagcca tccccctttt gactactggg gccaaggagt catggtcaca gtctcg
VH-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом SEQ ID N0: 14
MDRLTSSFLL LIVPAYVLSQ VTLKESGPGI LQPSQTLSLT CTFSGFSLST YGVGVGWIRQ PSGKGLEWLA NIWWDDDKRY NPSLENRLTI SKDTSNNQAF LKITNVDTAD SATYFCVRTР AYYGSHPPFD YWGQGVMVTV S
VH-область крысиного антитела 1638 с сигнальными последовательностями, подчеркнутыми и выделенными курсивом SEQ ID N0: 15
atggacaggc taacttcctc attcctactg ctgattgtcc ctgcatatgt cctgtctcag gttactctga aagagtctgg ccctgggata ttgcagccct cccagaccct cagtctgact tgcactttct ctgggttttc actgagtact tatggtgtgg gtgtgggctg gattcgtcag ccttcaggga agggtctgga gtggctggca aacatttggt gggatgatga taagcgctac aatccatctc tggaaaaccg actcactatc tccaaggaca cctccaacaa ccaagcattc ctcaagatca ccaatgtgga cactgcagat agcgccacat acttctgtgt tcggaccccg gcttactatg gcagccatcc cccttttgac tactggggcc aaggagtcat ggtcacagtc teg
ФИГ. 8В
(сигнальные последовательности, подчеркнутые и выделенные курсивом) 1638 gL7 V-область SEQ ID NO: 16
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRTSEDIY TNLAWYQQKP GKVPKLLIYV AKTLQEGVPS RFSGSGSGTH YTLTISSLQP EDVATYYCLQ GFKFPWTFGG GTKVEIK
1638 gL7 V-область SEQ ID NO: 17
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc ggcacgaaag tggaaatcaa a
1638 gL7 V-область (экспрессия в E. Coli) SEQ ID NO: 18
MKKTAIAIAV ALAGFATV AQ ADIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRTSEDI YTNLAWYQQK PGKVPKLLIY VAKTLQEGVP SRFSGSGSGT HYTLTISSLQ PEDVATYYCL QGFKFPWTFG GGTKVEIK
1638 gL7 V-область (экспрессия в E. Coli) SEQ ID NO: 19
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg actattacct gtcgcactag cgaggacatc tacaccaacc tggcgtggta tcagcagaaa ccaggcaaag tgccgaaact gctgatctac gtcgcgaaaa ccctccagga aggtgtaccg tctcgctttt ccggctctgg tagcggtact cactacaccc tgaccatctc ttccctccag ccggaagatg ttgctaccta ctattgcctc cagggcttca aattcccgtg gactttcggt ggcggcacga aagtggaaat caaa
1638 gL7 легкая цепь (V + константная область) SEQ ID NO: 2 0
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRTSEDIY TNLAWYQQKP GKVPKLLIYV AKTLQEGVPS
RFSGSGSGTH YTLTISSLQP EDVATYYCLQ GFKFPWTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
1638 gL7 легкая цепь (V + константная область, экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 21
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc
ggcacgaaag tggaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcac cagtaacaaa aagttttaat agaggggagt gt
ФИГ. 8С
(сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом)
1638 gL7 легкая цепь (V + константая область, экспрессия в клетках млекопитающих)
SEQ ID NO: 22
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc
ggcacgaaag tggaaatcaa acggaccgtg gccgctccct ccgtgttcat cttcccaccc
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac
ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag
gaatccgtca ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc
ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc
ctgtccagcc ccgtgaccaa gtccttcaac cggggcgagt gc
1638 gL7 легкая цепь (экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 2 3
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ ADIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRTSEDI YTNLAWYQQK
PGKVPKLLIY VAKTLQEGVP SRFSGSGSGT HYTLTISSLQ PEDVATYYCL QGFKFPWTFG
GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASWCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS
QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
1638 gL7 легкая цепь (экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 2 4
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa
gcfcgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg
actattacct gtcgcactag cgaggacatc tacaccaacc tggcgtggta tcagcagaaa
ccaggcaaag tgccgaaact gctgatctac gtcgcgaaaa ccctccagga aggtgtaccg
tctcgctttt ccggctctgg tagcggtact cactacaccc tgaccatctc ttccctccag
ccggaagatg ttgctaccta ctattgcctc cagggcttca aattcccgtg gactttcggt
ggcggcacga aagtggaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag
ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgt
1638 gH33 V-область SEQ
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL YNPSLENRFT ISRDNAKNSA
ID NO: 25
SCAASGFSLS TYGVGVGWVR YLQMNSLRAE DTAVYYCART
QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT VS
1638 gH33 V-
gaggttcagc tcttgtgcag caggctccag tacaacccgt tatctccaga ccggcgtact ¦область SEQ
tggtcgagtc cgtccggctt gtaaaggtct ccctggagaa tgaactccct atggctctca
ID NO: 26
tggaggcggg cttgtccagc
ctctctgtct acctacggcg
ggaatggctc gcaaacatct
ccgcttcacc attagccgtg
gcgtgccgaa gacacggctg
cccaccgttt gattactggg
ctggagggag cctgcgtctc ttggtgttgg ttgggtacgt ggtgggacga cgataaacgc ataacgcgaa aaactccgcg tgtactattg cgcgcgcact gtcagggtac aatggttacc gtctcg
1638 gH33 V-область (экспрессия в E. Coli) SEQ ID NO: 2 7
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFSL STYGVGVGWV RQAPGKGLEW LANIWWDDDK RYNPSLENRF TISRDNAKNS AYLQMNSLRA EDTAVYYCAR TPAYYGSHPP FDYWGQGTMV TVS
ФИГ. 8D (сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом) 1638 gH33 V-область (экспрессия в E.coli) SEQ ID N0: 2 8
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt ctctcttgtg cagcgtccgg cttctctctg tctacctacg gcgttggtgt tggttgggta cgtcaggctc caggtaaagg tctggaatgg ctcgcaaaca tctggtggga cgacgataaa cgctacaacc cgtccctgga gaaccgcttc accattagcc gtgataacgc gaaaaactcc gcgtatctcc agatgaactc cctgcgtgcc gaagacacgg ctgtgtacta ttgcgcgcgc actccggcgt actatggctc tcacccaccg tttgattact ggggtcaggg taccatggtt accgtctcg
1638 gH33 Fab тяжелая цепь (V + CHI человеческой цепи гамма) SEQ ID NO: 2 9
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR
YNPSLENRFT ISRDNAKNSA YLQMNSLRAE DTAVYYCART PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSC
1638 gH33 Fab тяжелая цепь (V + CHI человеческой
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtctcgagcg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca gttgagccca aatcttgt
цепи гамма) SEQ ID NO:
ctggagggag cctgcgtctc
ttggtgttgg ttgggtacgt
ggtgggacga cgataaacgc
ataacgcgaa aaactccgcg
tgtactattg cgcgcgcact
gtcagggtac catggttacc
tggcaccctc ctccaagagc
actacttccc cgaaccggtg
acaccttccc ggctgtccta
tgccctccag cagcttgggc
acaccaaggt cgacaagaaa
1638 gH33 Fab тяжелая цепь (V + CHI человеческой цепи гамма) SEQ ID NO: 31
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFSL STYGVGVGWV
RQAPGKGLEW LANIWWDDDK RYNPSLENRF TISRDNAKNS AYLQMNSLRA EDTAVYYCAR
TPAYYGSHPP FDYWGQGTMV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP
VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSC
1638 gH33 Fab тяжелая цепь (экспрессия в Е. Coli) SEQ ID NO: 32
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc ctctcttgtg cgtcaggctc cgctacaacc gcgtatctcc actccggcgt accgtctcga agcacctctg gtgacggtgt ctacagtcct ggcacccaga aaagttgagc agctggtcga cagcgtccgg caggtaaagg cgtccctgga agatgaactc actatggctc gcgcttctac ggggcacagc cgtggaactc caggactcta cctacatctg ccaaatcttg gtctggaggc cttctctctg tctggaatgg gaaccgcttc cctgcgtgcc tcacccaccg aaagggccca ggccctgggc aggcgccctg ctccctcagc caacgtgaat t gggcttgtcc tctacctacg ctcgcaaaca accattagcc gaagacacgg tttgattact tcggtcttcc tgcctggtca accagcggcg agcgtggtga cacaagccca agcctggagg gcgttggtgt tctggtggga gtgataacgc ctgtgtacta ggggtcaggg ccctggcacc aggactactt tgcacacctt ccgtgccctc gcaacaccaa gagcctgcgt tggttgggta cgacgataaa gaaaaactcc ttgcgcgcgc taccatggtt ctcctccaag ccccgaaccg cccggctgtc cagcagcttg ggtcgacaag
ФИГ. 8Е (сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом) 1638 gH33 Fab' тяжелая цепь (V + СН1 человеческой цепи гамма + шарнир) SEQ ID N0: 33
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS YNPSLENRFT ISRDNAKNSA YLQMNSLRAE VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH
TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR DTAVYYCART PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH ТСАА
1638 gH33 Fab
gaggttcagc tcttgtgcag caggctccag tacaacccgt tatctccaga ccggcgtact gtctcgagcg acctctgggg acggtgtcgt cagtcctcag acccagacct gttgagccca tggtcgagtc cgtccggctt gtaaaggtct ccctggagaa tgaactccct atggctctca cttctacaaa gcacagcggc ggaactcagg gactctactc acatctgcaa aatcttgtga tggaggcggg ctctctgtct ggaatggctc ccgcttcacc gcgtgccgaa cccaccgttt gggcccatcg cctgggctgc cgccctgacc cctcagcagc cgtgaatcac caaaactcac cttgtccagc acctacggcg gcaaacatct attagccgtg gacacggctg gattactggg gtcttccccc ctggtcaagg agcggcgtgc gtggtgaccg aagcccagca acatgcgccg ctggagggag ttggtgttgg ggtgggacga ataacgcgaa tgtactattg gtcagggtac tggcaccctc actacttccc acaccttccc tgccctccag acaccaaggt eg cctgcgtctc ttgggtacgt egataaaege aaactccgcg cgcgcgcact catggttacc ctccaagagc egaaceggtg ggctgtccta cagcttgggc cgacaagaaa
1638 gH33 Fab' тяжелая цепь (экспрессия в Е.) SEQ ID NO: 35
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAASGFSL STYGVGVGW RQAPGKGLEW LANIWWDDDK RYNPSLENRF TISRDNAKNS AYLQMNSLRA EDTAVYYCAR TPAYYGSHPP FDYWGQGTMV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SWTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCAA
1638 gH33 Fab
atgaagaaga
тяжелая цепь
ctgetatagc
(экспрессия в
aattgcagtg
E.) SEQ ID NO: 36
gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc ctctcttgtg cgtcaggctc cgctacaacc gcgtatctcc actccggcgt accgtctcga agcacctctg gtgacggtgt ctacagtcct ggcacccaga aaagttgagc agctggtcga cagcgtccgg caggtaaagg cgtccctgga agatgaactc actatggctc gegettctac ggggcacagc cgtggaactc caggactcta cctacatctg ccaaatcttg gtctggaggc cttctctctg tctggaatgg gaaccgcttc cctgcgtgcc tcacccaccg aaagggecca ggccctgggc aggcgccctg ctccctcagc caacgtgaat tgacaaaact gggcttgtcc tctacctacg ctcgcaaaca accattagcc gaagacacgg tttgattact tcggtcttcc tgcctggtca accagcggcg agcgtggtga cacaagccca cacacatgcg agcctggagg gcgttggtgt tctggtggga gtgataacgc ctgtgtacta ggggtcaggg ccctggcacc aggactactt tgcacacctt ccgtgccctc gcaacaccaa ccgcg gagcctgcgt tggttgggta cgacgataaa gaaaaactcc ttgcgcgcgc taccatggtt ctcctccaag ccccgaaccg cccggctgtc cagcagcttg ggtcgacaag
1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4Р человеческой гамма цепи)
SEQ ID NO: 37
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL YNPSLENRFT ISRDNAKNSA
VSSASTKGPS QSSGLYSLSS PSVFLFPPKP STYRWSVLT MTKNQVSLTC
VFPLAPCSRS WTVPSSSLG KDTLMISRTP VLHQDWLNGK LVKGFYPSDI
SCAASGFSLS YLQMNSLRAE TSESTAALGC TKTYTCNVDH EVTCVWDVS EYKCKVSNKG AVEWESNGQP QEGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSLGK
TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL DTAVYYCART PAYYGSHPPF LVKDYFPEPV TVSWNSGALT KPSNTKVDKR VESKYGPPCP QEDPEVQFNW YVDGVEVHNA LPSSIEKTIS KAKGQPREPQ ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY
ANIWWDDDKR DYWGQGTMVT SGVHTFPAVL PCPAPEFLGG KTKPREEQFN VYTLPPSQEE SRLTVDKSRW
ФИГ. 8F (сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом)
1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4Р человеческой гамма цепи) SEQ
ID NO: 38
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gtctcgtctg cctccaccaa gggcccctcc acctccgagt ctaccgccgc tctgggctgc acagtgtcct ggaactctgg cgccctgacc cagtcctccg gcctgtactc cctgtcctcc accaagacct acacctgtaa cgtggaccac gtggaatcta agtacggccc tccctgcccc cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact gattactggg gtcagggtac aatggttacc gtgttccctc tggccccttg ctcccggtcc ctggtcaagg actacttccc cgagcccgtg tccggcgtgc acaccttccc tgccgtgctg gtcgtgaccg tgccctcctc cagcctgggc aagccctcca acaccaaggt ggacaagcgg ccctgccctg cccctgaatt tctgggcgga
ccttccgtgt tcctgttccc cccaaagccc aaggacaccc tgatgatctc ccggaccccc
gaagtgacct tacgtggacg tccacctacc gagtacaagt
aaggccaagg atgaccaaga gccgtggaat ctggacagcg caggaaggca cagaagtccc
cggccagccc cttcctgtac ctgctccgtg cctgggcaag
gcgtggtggt ggacgtgtcc gcgtggaagt gcacaatgcc gggtggtgtc cgtgctgacc gcaaggtgtc caacaagggc gccagccccg cgagccccag accaggtgtc cctgacctgt
gggagtccaa acggctcctt acgtcttctc tgtccctgag
caggaagatc ccgaggtcca gttcaattgg aagaccaagc ccagagagga acagttcaac gtgctgcacc aggactggct gaacggcaaa ctgccctcca gcatcgaaaa gaccatctcc
gtgtacaccc tgccccctag ccaggaagag ctggtcaagg gcttctaccc ctccgacatt gagaacaact acaagaccac cccccctgtg tctcggctga ccgtggacaa gtcccggtgg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc
1638 gH33 IgG4 тяжелая цепь (V + константная область 4Р гамма цепи млекопитающих, нетс-концевого lys) SEQ ID NO: 3 9
EVQLVESGGGLV QPGGSLRLSC AASGFSLSTY GVGVGWVRQA PGKGLEWLAN IWWDDDKRYN PSLENRFTIS RDNAKNSAYL QMNSLRAEDT AVYYCARTPA YYGSHPPFDY WGQGTMVTVS SASTKGPSVF PLAPCSRSTS ESTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSW TVPSSSLGTK TYTCNVDHKP SNTKVDKRVE SKYGPPCPPC PAPEFLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCWVDVSQE DPEVQFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQFNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKGLP SSIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSQEEMT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSR LTVDKSRWQE GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSLG
1638 gL7 FabFv легкая цепь SEQ ID NO: 40
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRTSEDIY TNLAWYQQKP GKVPKLLIYV AKTLQEGVPS
RFSGSGSGTH YTLTISSLQP EDVATYYCLQ GFKFPWTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGECGGGGSG GGGSGGGGSD IQMTQSPSSV
SASVGDRVTI TCQSSPSVWS NFLSWYQQKP GKAPKLLIYE ASKLTSGVPS RFSGSGSGTD
FTLTISSLQP EDFATYYCGG GYSSISDTTF GCGTKVEIKR T
($) ]/\ Г(tm). 8^В(сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом) 1638 gL7 FabFv легкая цепь SEQ ID NO: 41
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggaagg tgtaccgtct
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc
ggcacgaaag tggaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gtggtggagg tggctctggc
ggtggtggct ccggaggcgg aggaagcgac atccagatga cccagagccc ttcctctgta
agcgccagtg tcggagacag agtgactatt acctgccaaa gctccccttc agtctggtcc
aattttctat cctggtatca gcaaaagccc ggaaaggctc ctaaattgct gatctacgaa
gcaagcaaac tcaccagcgg cgtgcccagc aggttcagcg gcagtgggtc tggaactgac
tttaccctga caatctcctc actccagccc gaggacttcg ccacctatta ctgcggtgga
ggttacagta gcataagtga tacgacattt ggatgcggca ctaaagtgga aatcaagcgt acc
1638 gH33 FabFv тяжелая цепь SEQ ID NO: 42
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR
YNPSLENRFT ISRDNAKNSA YLQMNSLRAE DTAVYYCART PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCSGGG GSGGGGTGGG
GSEVQLLESG GGLVQPGGSL RLSCAVSGID LSNYAINWVR QAPGKCLEWI GIIWASGTTF
YATWAKGRFT ISRDNSKNTV YLQMNSLRAE DTAVYYCART VPGYSTAPYF DLWGQGTLVT VSS
1638 gH33 FabFv тяжелая цепь SEQ ID NO: 43
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc
tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt
caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc
tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg
tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact
ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac aatggttacc
gtctcgtccg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc
acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg
acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta
cagtcctctg gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc
acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa
gttgagccca aatcttgttc cggaggtggc ggttccggag gtggcggtac aggtggcggt
gggtccgaag tccagctgct tgaatccgga ggcggactcg tgcagcccgg aggcagtctt
cgcttgtcct gcgctgtatc tggaatcgac ctgagcaatt acgccatcaa ctgggtgaga
caggcacctg ggaaatgcct cgaatggatc ggcattatat gggctagtgg gacgaccttt
tatgctacat gggcgaaggg tagattcaca atctcacggg ataatagtaa gaacacagtg
tacctgcaga tgaactccct gcgagcagag gataccgccg tttactattg tgctcgcact
gtcccaggtt atagcactgc accctacttt gatctgtggg ggcagggcac tctggtcacc
gtctcgtcc
Акцепторная каркасная последовательность Ж4 человеческого IGKV1 -27 SEQ ID NO: 4 4
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS NYLAWYQQKP GKVPKLLIYA ASTLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDVATYYCQK YNSAPLTFGG GTKVEIK
ФИГ. 8Н (сигнальные последовательности подчеркнутые и выделенные курсивом)
Акцепторная каркасная последовательность JK4 человеческого IGKV1-27 SEQ ID N0: 4 5
gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc
atcacttgcc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtatca gcagaaacca
gggaaagttc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct
cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct
gaagatgttg caacttatta ctgtcaaaag tataacagtg cccctctcac tttcggcgga
gggaccaagg tggagatcaa a
Акцепторная каркасная последовательность JH3 человеческого IGHV3-7 SEQ ID NO: 4 6
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYWMSWVRQA PGKGLEWVAN IKQDGSEKYY VDSVKGRFTI SRDNAKNSLY LQMNSLRAED TAVYYCARDA FDVWGQGTMV TVSS
Акцепторная каркасная последовательность JH3 человеческого IGHV3-7 SEQ ID NO: 4 7
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc
tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct
ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat
gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat
ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatgct
tttgatgtct ggggccaagg gacaatggtc accgtctctt ca
Внеклеточная последовательность альфа-цепи человеческого FcRn SEQ ID NO: 4 8
AESHLSLLYH LTAVSSPAPG TPAFWVSGWL GPQQYLSYNS LRGEAEPCGA WVWENQVSWY WEKETTDLRI KEKLFLEAFK ALGGKGPYTL QGLLGCELGP DNTSVPTAKF ALNGEEFMNF DLKQGTWGGD WPEALAISQR WQQQDKAANK ELTFLLFSCP HRLREHLERG RGNLEWKEPP SMRLKARPSS PGFSVLTCSA FSFYPPELQL RFLRNGLAAG TGQGDFGPNS DGSFHASSSL TVKSGDEHHY CCIVQHAGLA QPLRVELESP AKSS
Крысиный P2M SEQ ID NO:
IQKTPQIQVY SRHPPENGKP SFYILAHTEF TPTETDVYAC 49
NFLNCYVSQF HPPQIEIELL RVKHVTLKEP KTVTWDRDM
KNGKKIPNIE MSDLSFSKDW
Человеческий P2M, включающий сигнальную
MSRSVALAVL ALLSLSGLEA IQRTPKIQVY KNGERIEKVE HSDLSFSKDW SFYLLYYTEF последовательность SEQ ID NO: 50
SRHPAENGKS NFLNCYVSGF HPSDIEVDLL TPTEKDEYAC RVNHVTLSQP KIVKWDRDM
1638gL2V-область SEQ ID NO: 51
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRTSEDIY TNLAWYQQKP GKVPKLLIYV AKTLQDGVPS
RFSGSGSGTH YTLTISSLQP EDVATYYCLQ GFKFPWTFGG GTKVEIK
1638gL2V-область SEQ ID NO: 52
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggacgg tgtaccgtct
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc
ggcacgaaag tggaaatcaa a
ФИГ. 81
(1638.g28 = gL2 gH2) сигнальные последовательности подчеркнуты и выделены курсивом 1638 gL2 V-область (экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 53
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ ADIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRTSEDI YTNLAWYQQK PGKVPKLLIY VAKTLQDGVP SRFSGSGSGT HYTLTISSLQ PEDVATYYCL QGFKFPWTFG GGTKVEIK
1638 gL2 V-область (экспрессия в E. coli) SEQ ID NO: 54
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa
gcigatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg
actattacct gtcgcactag cgaggacatc tacaccaacc tggcgtggta tcagcagaaa
ccaggcaaag tgccgaaact gctgatctac gtcgcgaaaa ccctccagga cggtgtaccg
tctcgctttt ccggctctgg tagcggtact cactacaccc tgaccatctc ttccctccag
ccggaagatg ttgctaccta ctattgcctc cagggcttca aattcccgtg gactttcggt
ggcggcacga aagtggaaat caaa
1638 gL2 V-область (экспрессия в E. coli) SEQ ID NO: 55
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRTSEDIY TNLAWYQQKP GKVPKLLIYV AKTLQDGVPS
RFSGSGSGTH YTLTISSLQP EDVATYYCLQ GFKFPWTFGG GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SWCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC
1638 gL2 легкая цепь (V + константная область, с оптимизацией кодонов для экспрессии вЕ. coli) SEQ ID NO: 5 6
gatatccaga tgacccagag tccaagcagt ctctccgcca gcgtaggcga tcgtgtgact
attacctgtc gcactagcga ggacatctac accaacctgg cgtggtatca gcagaaacca
ggcaaagtgc cgaaactgct gatctacgtc gcgaaaaccc tccaggacgg tgtaccgtct
cgcttttccg gctctggtag cggtactcac tacaccctga ccatctcttc cctccagccg
gaagatgttg ctacctacta ttgcctccag ggcttcaaat tcccgtggac tttcggtggc
ggcacgaaag tggaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc
ctgagctcac cagtaacaaa aagttttaat agaggggagt gt
1638 gL2 легкая цепь (экспрессия в Е. Coli) SEQ ID NO: 57
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ ADIQMTQSPS SLSASVGDRV TITCRTSEDI YTNLAWYQQK PGKVPKLLIY VAKTLQDGVP SRFSGSGSGT HYTLTISSLQ PEDVATYYCL QGFKFPWTFG GGTKVEIKRT VAAPSVFIFP PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC
ФИГ. 8J
1638 gL2 легкая цепь (экспрессия в Е. Coli) SEQ ID NO: 58
atgaaaaaga cagctatcgc aattgcagtg gccttggctg gtttcgctac cgtagcgcaa
gctgatatcc agatgaccca gagtccaagc agtctctccg ccagcgtagg cgatcgtgtg
actattacct gtcgcactag cgaggacatc tacaccaacc tggcgtggta tcagcagaaa
ccaggcaaag tgccgaaact gctgatctac gtcgcgaaaa ccctccagga cggtgtaccg
tctcgctttt ccggctctgg tagcggtact cactacaccc tgaccatctc ttccctccag
ccggaagatg ttgctaccta ctattgcctc cagggcttca aattcccgtg gactttcggt
ggcggcacga aagtggaaat caaacgtacg gtagcggccc catctgtctt catcttcccg
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag
ggcctgagct caccagtaac aaaaagtttt aatagagggg agtgt
1638gH2V-область SEQ ID NO: 59
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAFSGFSLS TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR YNPSLENRFT ISKDTAKNSA YLQMNSLRAE DTAVYYCVRT PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT VS
1638gH2V-область SEQ ID NO: 60
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc
tcttgtgcat tctccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt
caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc
tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagcaaag ataccgcgaa aaactccgcg
tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgttcgcact
ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac catggttacc gtctcg
1638 gH2 V-область с сигнальной последовательностью, подчеркнутой и выделенной курсивом (экспрессиявЕ. Coli) SEQ ID NO: 61
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAFSGFSL STYGVGVGWV RQAPGKGLEW LANIWWDDDK RYNPSLENRF TISKDTAKNS AYLQMNSLRA EDTAVYYCVR TPAYYGSHPP FDYWGQGTMV TVS
1638 gH2 V-область с сигнальной последовательностью, подчеркнутой и выделенной курсивом (экспрессиявЕ. Coli) SEQ ID NO: 62
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt
ctctcttgtg cattctccgg cttctctctg tctacctacg gcgttggtgt tggttgggta
cgtcaggctc caggtaaagg tctggaatgg ctcgcaaaca tctggtggga cgacgataaa
cgctacaacc cgtccctgga gaaccgcttc accattagca aagataccgc gaaaaactcc
gcgtatctcc agatgaactc cctgcgtgcc gaagacacgg ctgtgtacta ttgcgttcgc
actccggcgt actatggctc tcacccaccg tttgattact ggggtcaggg taccatggtt
accgtctcg
1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (V + CHI человеческой гамма цепи + шарнир) SEQ ID NO: 63
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAFSGFSLS TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR YNPSLENRFT ISKDTAKNSA YLQMNSLRAE DTAVYYCVRT PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCAA
ФИГ. 8К Сигнальные последовательности подчеркнуты и выделены курсиовм
1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (V + СН1 человеческой гамма цепи + шарнир) SEQ ID N0: 64
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc tcttgtgcat tctccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagcaaag ataccgcgaa aaactccgcg tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgttcgcact ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac catggttacc gtctcgagcg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac acatgcgccg eg
1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 65
MKKTAIAIAV ALAGFATVAQ AEVQLVESGG GLVQPGGSLR LSCAFSGFSL STYGVGVGWV
RQAPGKGLEW LANIWWDDDK RYNPSLENRF TISKDTAKNS AYLQMNSLRA EDTAVYYCVR
TPAYYGSHPP FDYWGQGTMV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEP
VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVN HKPSNTKVDK
KVEPKSCDKT HTCAA
1638 gH2 Fab' тяжелая цепь (экспрессия в Е. coli) SEQ ID NO: 66
atgaagaaga ctgctatagc aattgcagtg gcgctagctg gtttcgccac cgtggcgcaa
gctgaggttc agctggtcga gtctggaggc gggcttgtcc agcctggagg gagcctgcgt
ctctcttgtg cattctccgg cttctctctg tctacctacg gcgttggtgt tggttgggta
cgtcaggctc caggtaaagg tctggaatgg ctcgcaaaca tctggtggga cgacgataaa
cgctacaacc cgtccctgga gaaccgcttc accattagca aagatacege gaaaaactcc
gcgtatctcc agatgaactc cctgcgtgcc gaagacacgg ctgtgtacta ttgcgttcgc
actccggcgt actatggctc tcacccaccg tttgattact ggggtcaggg taccatggtt
accgtctcga gcgcttctac aaagggecca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag
agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg
gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc
ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg
ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtcgacaag
aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcg ccgcg
Человеческий Р2-микроглобулин SEQ ID NO: 72
IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPT EKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
ФИГ. 8L
1638gH33 IgGl тяжелая цепь (V + константная область-1 человеческой гамма цепи) SEQ
ID N0: 73
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFSLS TYGVGVGWVR QAPGKGLEWL ANIWWDDDKR YNPSLENRFT ISRDNAKNSA YLQMNSLRAE DTAVYYCART PAYYGSHPPF DYWGQGTMVT VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL QSSGLYSLSS WTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS RDELTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
1638gH33 IgGl тяжелая цепь (V + константная область-1 человеческой гамма цепи,
экзоны подчеркнуты) SEQ ID N0: 74
gaggttcagc tggtcgagtc tggaggcggg cttgtccagc ctggagggag cctgcgtctc tcttgtgcag cgtccggctt ctctctgtct acctacggcg ttggtgttgg ttgggtacgt caggctccag gtaaaggtct ggaatggctc gcaaacatct ggtgggacga cgataaacgc tacaacccgt ccctggagaa ccgcttcacc attagccgtg ataacgcgaa aaactccgcg tatctccaga tgaactccct gcgtgccgaa gacacggctg tgtactattg cgcgcgcact ccggcgtact atggctctca cccaccgttt gattactggg gtcagggtac aatggttacc gtctcgagcg cttctacaaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt cgacaagaaa
gttggtgaga ggccagcaca gggagggagg tgcctggacg catcccggct atgcagcccc cctcttcacc cggaggcctc tgcccgcccc ttttccccag gctctgggca ggcacaggct aggggcaggt gctgggctca gacctgccaa cctaagccca ccccaaaggc caaactctcc ccagatctga gtaactccca atcttctctc cacatgccca ccgtgcccag gtaagccagc caggtgccct agagtagcct gcatccaggg cctccatctc ttcctcagca cctgaactcc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc gtgtctgctg gaagccaggc tcagcgctcc agtccagggc agcaaggcag gccccgtctg actcatgctc agggagaggg tcttctggct aggtgcccct aacccaggcc ctgcacacaa gagccatatc cgggaggacc ctgcccctga actccctcag ctcggacacc ttctctcctc tgcagagccc aaatcttgtg acaaaactca ccaggcctcg ccctccagct caaggcggga acaggcccca gccgggtgct gacacgtcca tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg
acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggt gggacccgtg gggtgcgagg gccacatgga cagaggccgg ctcggcccac cctctgccct gagagtgacc gctgtaccaa cctctgtccc tacagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaa
ФИГ. 9А
ПРИВИТАЯ ЛЕГКАЯ ЦЕПЬ 163 8
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105
Легкая цепь 1638 DI^TQSPASLSASLGETISIECRTSEDIYTNIATOQQKSGKSPQLLIYVAKTLQDGVPSRFSGSGSGTHYSLKISGMQPEDEGDYFCLQGFKFPWTFGGGTKLELK
IGKV1-27 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKVPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQIgNSAPLTFGGGTKVEIK
1638gL7 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYTNIAmQQKPGKVPKLLIYVAKTLQE'GVPSRFSGSGSGTmTLTISSLQPEDVATYYCLQGFKFPWTFGGGTKVEIK
Подписи
1638 = крысиная последовательность вариабельной области легкой цепи
1638gL7 = Гуманизированная прививка 1638 вариабельной области легкой цепи с использованиемчеловеческой зародышевой последовательности IGKV1-27 в качестве акцепторного каркаса CDR показаны жирным шрифтом/подчеркнуты
Донорные остатки показаны жирным шрифтом/курсивом и выделены: Н70 и Y71
Мутация в CDRL2 для удаления сайта потенциальной изомеризации аспарагиновой кислоты показана жирным шрифтом/подчеркнута и выделена: Е56
ФИГ 9В
ПРИВИТАЯ ТЯЖЕЛАЯ ЦЕПЬ 1638
1 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 а 55 60 65 70 75 80 аЬс 85 90 95 100 105 110
Тяжелая цепь 1638 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCTFSGFSLSTYGVGVGWIROPSGKGLEHL
III III 111 I I 11 11 1111111 I II I 111111 I 11 111 I I 111 111 11111111 I I I I 1111111111 I
IGHV3-7 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSS-YWMSWRQAPGKGLEWANIKQDGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVY YCAR DAFDVWGQGTMVTVS
1638gH33 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSLSTYGVGVGWRQAPGKGLEWIIANIW-Подписи
Донорные остатки показаны жирным шрифтом/курсивом и выделены: L48 и А78 CDR показаны жирным шрифтом/подчер кнуты
1638gL7 = Гуманизированная прививка 1638 вариабельной области тяжелой цепи с использованиемчеловеческой зародышевой
последовательности IGHV3-7 в качестве акцепторного каркаса
1638 = крысиная последовательность вариабельной области тяжелой цепи
1Секвенирование белка (химический метод Эдмана) N-концевую аминокислотную последовательность обоих
образцов, IgG4 и Fab-dsFv, получали с использованием прибора Applied Biosystems Procise 494. Он функционирует как рекомендовано инструкциями производителя. Приблизительно 100 пмол каждого образца наносили на диски поливинилидендифторида (Prosorb, использовали согласно рекомендациям производителя) и подвергали 18 циклам, которые включали два пустых прогона и стандартный, что приводило к анализу первых 15 аминокислотных остатков тяжелой и легкой цепей. Анализ осуществляли с использованием программного обеспечения SequencePro Data Analysis Application 42.0.
Для каждого образца наблюдаемая последовательность представляла собой смесь из двух приблизительно равно представленных последовательностей, EVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID N0:67) и DIQMTQSPSSLSASV (SEQ ID N0:68), согласующихся с N-концевыми последовательностями, ожидаемыми от
последовательностей генов тяжелой и легкой цепи, соответственно. Приблизительно равная представленность предполагала равные молярные количества 2 цепей с небольшой или с незначительной N-концевой блокадой.
ii) Масс-спектрометрический анализ
2Секвенирование белка (химический метод Эдмана) N-концевую аминокислотную последовательность обоих
образцов, IgG4 и Fab-dsFv, получали с использованием прибора Applied Biosystems Procise 494. Он функционирует как рекомендовано инструкциями производителя. Приблизительно 100 пмол каждого образца наносили на диски поливинилидендифторида (Prosorb, использовали согласно рекомендациям производителя) и подвергали 18 циклам, которые включали два пустых прогона и стандартный, что приводило к анализу первых 15 аминокислотных остатков тяжелой и легкой цепей. Анализ осуществляли с использованием программного обеспечения SequencePro Data Analysis Application 42.0.
Для каждого образца наблюдаемая последовательность представляла собой смесь из двух приблизительно равно представленных последовательностей, EVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID N0:67) и DIQMTQSPSSLSASV (SEQ ID N0:68), согласующихся с N-концевыми последовательностями, ожидаемыми от
последовательностей генов тяжелой и легкой цепи, соответственно. Приблизительно равная представленность предполагала равные молярные количества 2 цепей с небольшой или с незначительной N-концевой блокадой.
ii) Масс-спектрометрический анализ
3Секвенирование белка (химический метод Эдмана) N-концевую аминокислотную последовательность обоих
образцов, IgG4 и Fab-dsFv, получали с использованием прибора Applied Biosystems Procise 494. Он функционирует как рекомендовано инструкциями производителя. Приблизительно 100 пмол каждого образца наносили на диски поливинилидендифторида (Prosorb, использовали согласно рекомендациям производителя) и подвергали 18 циклам, которые включали два пустых прогона и стандартный, что приводило к анализу первых 15 аминокислотных остатков тяжелой и легкой цепей. Анализ осуществляли с использованием программного обеспечения SequencePro Data Analysis Application 42.0.
Для каждого образца наблюдаемая последовательность представляла собой смесь из двух приблизительно равно представленных последовательностей, EVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID N0:67) и DIQMTQSPSSLSASV (SEQ ID N0:68), согласующихся с N-концевыми последовательностями, ожидаемыми от
последовательностей генов тяжелой и легкой цепи, соответственно. Приблизительно равная представленность предполагала равные молярные количества 2 цепей с небольшой или с незначительной N-концевой блокадой.
ii) Масс-спектрометрический анализ
4Секвенирование белка (химический метод Эдмана) N-концевую аминокислотную последовательность обоих
образцов, IgG4 и Fab-dsFv, получали с использованием прибора Applied Biosystems Procise 494. Он функционирует как рекомендовано инструкциями производителя. Приблизительно 100 пмол каждого образца наносили на диски поливинилидендифторида (Prosorb, использовали согласно рекомендациям производителя) и подвергали 18 циклам, которые включали два пустых прогона и стандартный, что приводило к анализу первых 15 аминокислотных остатков тяжелой и легкой цепей. Анализ осуществляли с использованием программного обеспечения SequencePro Data Analysis Application 42.0.
Для каждого образца наблюдаемая последовательность представляла собой смесь из двух приблизительно равно представленных последовательностей, EVQLVESGGGLVQPG (SEQ ID N0:67) и DIQMTQSPSSLSASV (SEQ ID N0:68), согласующихся с N-концевыми последовательностями, ожидаемыми от
последовательностей генов тяжелой и легкой цепи, соответственно. Приблизительно равная представленность предполагала равные молярные количества 2 цепей с небольшой или с незначительной N-концевой блокадой.
ii) Масс-спектрометрический анализ
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
Время (часы)
8/23
8/23
14/23
14/23
15/23
15/23
16/23
16/23
16/23
16/23
16/23
16/23
16/23
16/23