[RU]

Изобретение относится к производному N-бензилтриптантрина, а также способу его получения и применения. Производное N-бензилтриптантрина по настоящему изобретению отличается тем, что данное производное характеризуется общей структурной структурой, как представлено формулой 1, где каждая группа является такой, как определено в описании. Способ получения соединения является простым, характеризуется мягкими условиями и высоким выходом и подходит для промышленного производства. Производное N-бензилтриптантрина характеризуется хорошей активностью ингибирования индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и может применяться для лечения заболеваний, характеризующихся патологическим проявлением IDO-опосредованного метаболизма триптофана.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к производному N-бензилтриптантрина, а также способу его получения и применения. Производное N-бензилтриптантрина по настоящему изобретению отличается тем, что данное производное характеризуется общей структурной структурой, как представлено формулой 1, где каждая группа является такой, как определено в описании. Способ получения соединения является простым, характеризуется мягкими условиями и высоким выходом и подходит для промышленного производства. Производное N-бензилтриптантрина характеризуется хорошей активностью ингибирования индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и может применяться для лечения заболеваний, характеризующихся патологическим проявлением IDO-опосредованного метаболизма триптофана.

---

Евразийское (21) 201690915 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.02.28
(22) Дата подачи заявки 2014.11.12
(51) Int. Cl.
C07D 487/04 (2006.01) A61K31/519 (2006.01) A61K31/5377 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) A61P3/00 (2006.01)
(54) ПРОИЗВОДНОЕ N-БЕНЗИЛТРИПТАНТРИНА, А ТАКЖЕ СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
(31) 201310560572.0
(32) 2013.11.12
(33) CN
(86) PCT/CN2014/090947
(87) WO 2015/070766 2015.05.21
(71) Заявитель:
ФУДАНЬ ЮНИВЕРСИТИ (CN)
(72) Изобретатель:
Ян Цин, Куан Чуньсян (CN)
(74) Представитель:
Поликарпов А.В. (RU)
(57) Изобретение относится к производному N-бензилтриптантрина, а также способу его получения и применения. Производное N-бензилтрип-тантрина по настоящему изобретению отличается тем, что данное производное характеризуется общей структурной структурой, как представлено формулой 1, где каждая группа является такой, как определено в описании. Способ получения соединения является простым, характеризуется мягкими условиями и высоким выходом и подходит для промышленного производства. Производное N-бензи-лтриптантрина характеризуется хорошей активностью ингибирования индоламин-2,3-диоксигеназы (IDO) и может применяться для лечения заболеваний, характеризующихся патологическим проявлением IDO-опосредованного метаболизма триптофана.
Производное N-бензилтриптантрина, а также способ его получения и
применение
Область техники
Настоящее изобретение относится к области фармацевтической химии и в частности относится к производному N-бензилтриптантрина, а также способу его получения и применения. Предшествующий уровень техники
Индол-2,3-Диоксигеназа (сокращенно IDO; MW 48,000; ЕС 1.13.11.42) представляет собой гемсодержащий фермент, который составляет первый фермент, а также скорость-лимитирующий фермент в пути метаболизма триптофана у млекопитающих. IDO катализирует реакцию окисления, в которой незаменимая аминокислота триптофан подвергается двойному окислению с получением N-формилкинуренина, а также, отвечает за физиологическую очистку триптофана in vivo. При разложении триптофана IDO обеспечивает микросреду с недостаточным содержанием триптофана in vivo, приводя таким образом к возникновению различных заболеваний, которые тесно связаны с недостачей триптофана, таких как онкологическое заболевание, катаракты и неврологические нарушения. Следовательно поиск высокоэффективного ингибитора, который воздействует на IDO, в последние годы стал целью исследования и разработки лекарственных средств. IFN-y представляет собой один из целого ряда потенциальных индукторов экспрессии IDO. В течение непрерывной активации при высоком уровне стимуляции IFN-y, IDO снижает доступность триптофана в свободной сыворотке, снижая таким образом образование 5-гидрокситриптамина. Данные изменения, в сочетании с накоплением неврологически активных метаболитов кинуренина, таких как хинолиновая кислота (также индуцированная с помощью IDO), способствуют наступлению неврологических/психических нарушений и выступают в качестве причины ряда психологических нарушений, в то же время вызывая также симптомы, связанные с хроническими заболеваниями, характеризующимися активностью IDO и распадом триптофана.
Активность IDO также относится к наступлению ядерных катаракт, связанных с возрастом. IDO представляет собой первый фермент, участвующий в биосинтезе УФ-фильтра в хрусталике, а также представляет собой скорость-лимитирующий фермент. Модификации относительно соединений УФ-фильтра, полученных при распаде триптофана (3-гидроксикинуренин и кинуренин-глюкозид), присутствуют в белках
хрусталика человека. Количество данных соединений УФ-фильтра с возрастом увеличивается, постепенно вызывая помутнение хрусталика, которое в дальнейшем приводит к так называемым связанным с возрастом ядерным катарактам. 5 Экспрессия IDO также относится к ослаблению иммунного ответа, вызванному блокированием местной пролиферации Т-лимфоцитов. Т-лимфоциты очень чувствительны к недостаче триптофана и в отсутствие триптофана Т-лимфоциты будут задерживаться в фазе G1 клеточного цикла. Данное опосредованное Т-клетками ослабление иммунного ответа является
10 причиной многих заболеваний, в том числе аутоиммунных заболеваний, отторжения аллотрансплантата, нейродегенеративных нарушений, депрессии, бактериальных или вирусных инфекций (например, вируса иммунодефицита человека (HIV)) и онкологического заболевания (Swanson et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2003, 30, 311).
15 Было обнаружено, что большинство опухолей человека конститутивно экспрессируют IDO. Мышиные опухолевые клетки, полученные от предварительно иммунизированных мышей, показали, что экспрессия IDO может обеспечивать защиту от отторжения, а введение 1-МТ снижает вышеупомянутый эффект. Более того, одновременное введение IDO-
20 ингибитора повышало эффективность лечения онкологического заболевания. IDO-ингибиторы могут применяться в контроле психических нарушений, а также в лечении других заболеваний, которые включают в себя IDO-опосредованный метаболизм триптофана в качестве патологического проявления; при этом указанные заболевания включают в себя вирусные
25 инфекции, такие как СПИД, бактериальную инфекцию, такую как болезнь Лайма и стрептококковая инфекция, нейродегенеративные нарушения (например болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона), депрессию, онкологическое заболевание (в том числе Т-клеточный лейкоз и рак толстой кишки), заболевания глаз (такие как
30 катаракты и связанное с возрастом пожелтение) и аутоиммунные заболевания. Ряд различных анализов in vitro (Takikawa, et al. J. Biol. Chem. 1998, 263, 2041) может использоваться для фильтрования (например, посредством высокопроизводительного скрининга) и измерения ингибирования активности IDO исходной реакции или экстрактов,
35 полученных из природных источников, или определения связанных с ингибированием IDO констант скорости реакции.
IDO тесно связана с патогенезом многих различных заболеваний и как уже было показано является мишенью для онкологического заболевания, болезни
Альцгеймера, депрессии, катаракт и других серьезных заболеваний. IDO-ингибиторы имеют широкие перспективы применения в качестве лекарственных средств, однако до настоящего времени на рынке не было представлено подходящего IDO-ингибитора в качестве лекарственного 5 средства; следовательно поиск нового, эффективного IDO-ингибитора имеет важную теоретическую ценность и значение для потенциального применения.
Существующие исследования показали, что IDO-ингибитор 1-МТ (1-метил-триптофан) может повышать чувствительность клеток опухоли к Т-
10 клеточной иммунной стимуляции in vitro; и то же средство способно замедлять рост клеток опухоли и повышать эффективность химиотерапевтического средства против опухоли in vivo в животных моделях, с эффектами, наблюдаемыми для практически всех спонтанно возникающих опухолей. К сожалению, эффективность ингибирования
15 большинства существующих ингибиторов IDO является низкой, и константа ингибирования (Ki) большинства широко применяемых ингибиторов IDO в испытаниях in vivo и in vitro, 1-МТ, составляет лишь 34 мкМ. Таким образом, в данной области существует острая необходимость в разработке нового эффективного IDO-ингибитора.
20 Описание настоящего изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение производного N-бензилтриптантрина, а также способа его получения и применения. В первом аспекте настоящего изобретения представлено производное N-бензилтриптантрина, где указанное производное характеризуется общей
25 структурой, как показано в формуле 1 ниже.
R2 О
где
R1 представляет собой водород или фтор;
30 R представляет собой -NR3R4;
каждый из является независимо выбранным из следующей группы: Н,
замещенные или незамещенные С1-С4алкильные группы, замещенные или незамещенные С2-С4алкенильные группы, замещенные или незамещенные С2-С4алкинильные группы и замещенные или незамещенные СЗ-
35 Сбциклоалкильные группы;
или R и R образуют замещенное или незамещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо со смежным атомом азота, причем указанное 5-6-членное насыщенное кольцо включает в себя 1-2 атома азота, а также 0-2 гетероатома, выбранные из следующей группы: О и S; 5 в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе (предпочтительно атомы водорода, присутствующие на атоме азота), являются замещенными заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы, С1-С4галогеналкильные группы, амино-защитные
10 группы (предпочтительно т-бутоксикарбонил) и галогены.
В другом предпочтительном варианте осуществления, если R3 и R4 вместе со смежным атомом азота образуют замещенное или незамещенное 5-6-членное насыщенное кольцо, присутствующий на кольце атом азота может необязательно нести амино-защитную группу.
15 В другом предпочтительном варианте осуществления указанная амино-защитная группа выбрана из следующей группы:
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное 5-7-членное гетероциклическое кольцо не является гетероарильным кольцом. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное 5-7-членное 20 гетероциклическое кольцо представляет собой насыщенное гетероциклическое кольцо, предпочтительно 5-6-членное насыщенное гетероциклическое кольцо.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное 5-7-членное гетероциклическое кольцо содержит только один или два гетероатома.
25 В другом предпочтительном варианте осуществления все гетероатомы указанного 5-7-членного гетероциклического кольца образованы атомами N. В другом предпочтительном варианте осуществления каждый из R3 и R4 вместе независимо выбраны из следующей группы: С1-С4алкильные группы; или R3 и R4 вместе со смежным атомом азота образуют замещенное или
30 незамещенное 5-6-членное насыщенное кольцо, причем указанное 5-6-членное насыщенное кольцо включает в себя 1-2 атома азота, а также один необязательный гетероатом, выбранный из следующей группы: О.
3 4
В другом предпочтительном варианте осуществления R и R не являются одновременно образованными атомами Н. 35 В другом предпочтительном варианте осуществления R представляет собой циклический имин.
В другом предпочтительном варианте осуществления R представляет собой замещенную или незамещенную группу, выбранную из следующей группы:
N N -|
V.._/ \
/**"*\ , /" " \ / \ t -Г'
BocN N I HH H-4 О N Л ы
\-HTTP://www.eapatis.com/getimage.asp?src=//eapatis2012/Data/EATXT/ \ 4. ./' \ \ / \ .,•N ¦ ;
где "-" обозначает место присоединения;
в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе, замещены заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы и галогены.
В другом предпочтительном варианте осуществления R1 представляет собой F.
Во втором аспекте настоящего изобретения представлено производное N-бензилтриптантрина, где общая структура указанного производного такая, как показанная ниже:
Y-R1
( О
R = Н или F
R2- - N \i \ BocN U-\ HN N-| q V- < ^
где заместитель R представляет собой циклический имин или диалкил-замещенный амин, a R1 представляет собой водород или фтор. В другом предпочтительном варианте осуществления указанное производное представляет собой соединение, выбранное из следующей группы:
о Г^!Ч О /=в%
^ N i\ - N %
о о
1a 1b
Г N V ^ \ / г'"' Ы N ^. /
О О
1c Id ,
В третьем аспекте настоящего изобретения представлен способ получения производного N-бензилтриптантрина, как представлено в первом или втором аспектах настоящего изобретения, причем указанный способ включает в себя следующие стадии:
(d) соединение, приведенное в формуле 5 (2-бромметилтриптантрин), вводят в реакцию с R2H в инертном растворителе в присутствии триэтиламина с получением соединения, приведенного в формуле 1; где R и R являются такими, как представлено выше.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (d) указанный инертный растворитель образован DMF, предпочтительно безводным DMF.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (d) указанную реакцию осуществляют при температуре около 10-40°С. В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (d) длительность указанной реакции составляет 0,5-12 часов, при этом предпочтительным является диапазон 1-5 часов.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (d) молярное соотношение приведенного в формуле 5 соединения R Н и триэтиламина составляет 1 :(1-2): (2-5).
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает в себя стадию (с) перед стадией (d):
Ц Л. ,-> -~ /~~ - ^ л г~
-N- ^, - N "i
О О 4 5
(с) соединение, приведенное в формуле 4, вводят в реакцию с бромирующим средством в инертном растворителе с получением соединения, приведенного в формуле 5; причем применяемое бромирующее средство предпочтительно представляет собой NBS.
В другом предпочтительном варианте осуществления реакцию на стадии (с) осуществляют в присутствии активатора, а также предпочтительно осуществляют в присутствии AIBN.
В другом предпочтительном варианте осуществления стадия (с) включает в себя: смешивание NBS и A1BN с последующей реакцией с соединением, приведенным в формуле 4.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанным на стадии 5 (с) инертным растворителем является дихлорметан, при этом предпочтительным является безводный дихлорметан.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (с) указанную реакцию осуществляют при температуре около 75-85°С. В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (с) 10 длительность указанной реакции составляет 15-17 часов.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (с) молярное соотношение приведенного в формуле 4 соединения, NBS и AIBN составляет 1:1: (0,005-0,02).
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ 15 дополнительно включает в себя стадию (Ь) перед стадией (с):
'"V"""0 Ь bNfY^N-'\i
н ь
3 4
(b) соединение, приведенное в формуле 3, вводят в реакцию с "^--'^н в инертном растворителе в присутствии триэтиламина с получением 20 соединения, приведенного в формуле 4.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (Ь) указанный инертный растворитель образован толуолом, предпочтительно безводным толуолом.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (Ь)
25 указанную реакцию осуществляют при температуре около 100-120°С.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (Ь)
длительность указанной реакции составляет 3,5-4,5 часа.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (Ь) молярное
R- ... J(
Г 1 >
соотношение приведенного в формуле 3 соединения, "N и
30 триэтиламина составляет (0,2-0,5): (0,2-0,5): 1.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает в себя стадию (а) перед стадией (Ь):
WO 2015/070766 О
I ; > о -
'NO H
2 3
(а) соединение, приведенное в формуле 2, вводят в реакцию с окисляющим средством в инертном растворителе с получением приведенного в формуле 3 соединения; причем применяемым окислительным средством предпочтительно является мета-хлорпероксибензойная кислота. В другом предпочтительном варианте осуществления указанным на стадии (а) инертным растворителем является дихлорметан, при этом предпочтительным является безводный дихлорметан.
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (а) указанную реакцию осуществляют при комнатной температуре (при этом предпочтительным является диапазон 10-40°С).
В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (а) длительность указанной реакции составляет 1,5-2,5 часа. В другом предпочтительном варианте осуществления на стадии (а) молярное соотношение приведенного в формуле 2 соединения и окислительного средства составляет (0,5-1): 1.
В четвертом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения производного N-бензилтриптантрина, как приведено во втором аспекте настоящего изобретения, причем путь синтеза описан ниже:
У о
N "О Н
VR1
N Yv О
VR1
i ;; R <
'Л. /
R = Н или F;
H2 =
BocN
конкретные стадии являются следующими: (1) синтез метилизатоевого ангидрида (3)
Суспендируют 5-метилизатин в сухом дихлорметане и добавляют мета-хлорпероксибензойную кислоту порциями при 0°С, затем перемешивают в течение 1,5-2,5 часов при комнатной температуре; сразу после
подтверждения завершения реакции посредством TLC отфильтровывают полученное в ходе реакции белое твердое вещество и промывают трижды этилацетатом с получением 5-метилизатоевого ангидрида; молярное соотношение 5-метилизатина и мета-хлорпероксибензойной кислоты 5 составляет (0,5-1): 1;
(2) синтез 2-метилтриптантрина (4)
Суспендируют смесь метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и триэтиламина в сухом толуоле, затем нагревают в течение 3,5-4,5 часов при температуре 100-120°С и отгоняют растворитель при пониженном давлении; 10 растворяют полученное твердое желтое вещество в дихлорметане и добавляют этилацетат, затем фильтруют полученное желтое твердое вещество и промывают этилацетатом три раза с получением 2-метилтриптантрина; следует отметить, что молярное соотношение метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и триэтиламина составляет (0,215 0,5): (0,2-0,5): 1;
(3) синтез 2-бромметилтриптантрина (5)
Растворяют 2-метилтриптантрин, полученный на стадии (2), в сухом дихлорметане при 75-85°С в условиях защиты газообразным азотом, затем порциями добавляют в смесь NBS и AIBN. Нагревают реакционный раствор
20 до 75°С в течение 15-17 часов и подтверждают завершение реакции посредством TLC. Сразу после охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры осуществляют промывание солевым раствором и высушивание над безводным сульфатом натрия с получением концентрированного желтого продукта; следует отметить, что молярное
25 соотношение 2-метилтриптантрина, NBS и AIBN составляет 1:1: (0,0050,02);
(4) синтез N-бензилтриптантрина (1)
Перемешивают вместе 2-бромметилтриптантрин, алифатический амин и триэтиламин при комнатной температуре в сухом DMF в течение 1,5-2,5
30 часов, а затем сразу после проверки завершения реакции посредством TLC добавляют 50 мл воды и осуществляют три последовательные экстракции с использованием 10 мл дихлорметана; далее подвергают весь полученный объем дихлорметана трем промывкам водой и затем сушат над безводным сульфатом натрия. Осуществляют разделение полученного
35 концентрированного желтого твердого вещества с использованием силикагеля с получением производного N-бензилтриптантрина желтого цвета; при этом молярное соотношение 2-бромметилтриптантрина, алифатического амина и триэтиламина составляет 1 : (1-2): (2-5).
В пятом аспекте настоящего изобретения представлено применение производного N-бензилтриптантрина, приведенного в первом и втором аспектах настоящего изобретения, в получении лекарственного средства, предназначенного для предотвращения и/или лечения заболеваний, которые 5 включают в себя нарушение IDO-опосредованного метаболизма триптофана в качестве патологического проявления.
В шестом аспекте настоящего изобретения представлено применение для представленного в формуле 1 соединения, как описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или фармацевтически приемлемой соли 10 для использования для:
(i) получения IDO-ингибитора;
(ii) получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с метаболизмом триптофана; а также
(ш) нетерапевтического ингибирования IDO in vitro.
15 В другом предпочтительном варианте осуществления указанное заболевание, связанное с метаболизмом триптофана, является выбранным из следующей группы: опухоли, депрессия, тревога, СПИД, аутоиммунные заболевания, психические нарушения, инфекции болезни Лайма, стрептококковые инфекции, нейродегенеративные нарушения (такие как болезнь Альцгеймера,
20 болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона), депрессия, онкологическое заболевание (в том числе Т-клеточный лейкоз и рак толстой кишки), заболевания глаз (такие как катаракты и связанное с возрастом пожелтение) и аутоиммунные заболевания.
В седьмом аспекте настоящего изобретения представлена фармацевтическая 25 композиция, причем указанная фармацевтическая композиция включает в себя: (i) соединение, приведенное в формуле 1, как описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль; а также (ii) фармацевтически приемлемый носитель. В другом предпочтительном варианте осуществления указанную 30 фармацевтическую композицию применяют для лечения заболеваний, связанных с нарушением метаболизма триптофана.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное заболевание, связанное с метаболизмом триптофана, является выбранным из следующей группы: опухоли, депрессия, тревога, СПИД, аутоиммунные заболевания, 35 психические нарушения, инфекции болезни Лайма, стрептококковые инфекции, нейродегенеративные нарушения (такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона), депрессия, онкологическое заболевание (в том числе Т-клеточный лейкоз и рак толстой кишки).
заболевания глаз (такие как катаракты и связанное с возрастом пожелтение) и аутоиммунные заболевания.
В восьмом аспекте настоящего изобретения представлен ШО-ингибитор, причем указанный IDO-ингибитор включает в себя соединение, приведенное 5 в формуле 1, как описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль. В девятом аспекте настоящего изобретения представлен способ нетерапевтического ингибирования активности IDO in vitro, причем указанный способ включает в себя следующий процесс: приведенное в 10 формуле 1 соединение, как описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль приводят в контакт с мишенью для ингибирования в количестве, которое обеспечивает эффективное ингибирование.
В десятом аспекте настоящего изобретения представлен способ получения 15 фармацевтической композиции, применяемой в лечении заболевания, связанного с нарушением метаболизма триптофана, причем в указанном способе приведенное в формуле 1 соединение, как описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль смешивают с фармацевтически приемлемым носителем в 20 терапевтически эффективном количестве с образованием фармацевтической композиции.
В одиннадцатом аспекте настоящего изобретения представлен способ лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма триптофана, причем в указанном способе приведенное в формуле 1 соединение, как 25 описано в первом и втором аспектах настоящего изобретения, или его фармацевтически приемлемую соль применяют в терапевтически эффективном количестве для лечения субъекта.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанное заболевание, связанное с метаболизмом триптофана, является выбранным из следующей
30 группы: опухоли, депрессия, тревога, СПИД, аутоиммунные заболевания, психические нарушения, инфекции болезни Лайма, стрептококковые инфекции, нейродегенеративные нарушения (такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона), депрессия, онкологическое заболевание (в том числе Т-клеточный лейкоз и рак толстой кишки),
35 заболевания глаз (такие как катаракты и связанное с возрастом пожелтение) и аутоиммунные заболевания.
Следует отметить, что в объеме настоящего изобретения вышеупомянутые технические характеристики настоящего изобретения и технические
характеристики, описанные более конкретно в следующем тексте (например, в примерах) могут быть объединены друг с другом, образуя таким образом новые или предпочтительные технические решения. В данном документе, в связи с ограничениями объема, они не приведены в исчерпывающем 5 количестве.
Подробное описание
Вследствие проведенного авторами настоящего изобретения длительного и всестороннего исследования, авторы данного изобретения неожиданно обнаружили тип производного N-бензилтриптантрина, имеющего структуру,
10 как показано в формуле 1, который демонстрирует высокоспецифичную активность ингибирования IDO, причем активность ингибирования 1DO (IC50) неожиданно оказывается значительно улучшенной (значение IC50 может снижаться на 1-3 порядка) в указанном соединении, по сравнению с некоторыми другими производными N-бензилтриптантрина, обладающими
15 весьма схожей структурой, а следовательно указанное соединение имеет хороший потенциал применения. Настоящее изобретение было завершено авторами данного изобретения на основании вышеупомянутого открытия. Термины
Если не указано иное, все относящиеся к настоящему изобретению 20 соединения будут включать в себя все их оптические изомеры или таутомерные формы.
Термин "С1-С4алкильная группа" относится к алкильной группе с прямой или разветвленной цепью, имеющей 1-4 атома углерода, такой как метальная, этильная, пропильная, изопропильная, бутильная, изобутильная,
25 втор-бутильная, трет-бутильная или подобные группы.
Термин "С2-С4алкенильная группа" относится к алкенильной группе с прямой или разветвленной цепью, имеющей 2-4 атома углерода, такой как этенильная, пропенильная, бутенильная или подобные группы. Термин "С2-С4алкинильная группа" относится к алкинильной группе с
30 прямой или разветвленной цепью, имеющей 2-4 атома углерода, такой как этинильная, пропинильная, бутинильная или подобные группы. Термин "5-7-членное гетероциклическое кольцо" относится к одному кольцу, содержащему 5-7 элементов, причем указанное кольцо не имеет полностью спаренной тг-электронной системы. В частности, в контексте настоящего
35 изобретения указанное кольцо может необязательно содержать 1-3 гетероатома, причем указанные гетероатомы включают в себя О и N. Иллюстративные примеры насыщенных колец включают в себя пиперазинильную группу, морфолино-группу и т. д.
Если не указано иное, термин "замещение" относится к тем случаям, в которых один или несколько присутствующих на указанной группе атомов водорода являются замещенными заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы, С1-С4галогеналкильные группы, амино-5 защитные группы (предпочтительно т-бутоксикарбонил) и галогены. Термин "галоген" относится к F, О, Вг и I. Производные N-бензилтриптантрина
Триптантрин представляет собой тип индолхиназолинового алкалоида, имеющего химическое название индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-дион.
10 Триптантрин представляет собой желтый игольчатый кристалл в его чистой форме и может быть обнаружен прежде всего в растениях, относящихся к семейству индиго, таких как Strobilanthes cusia, Polygonum tinctorium и Isatis tinctoria. В качестве альтернативы он может быть экстрагирован из ферментативного бульона, содержащего некоторые микроорганизмы.
15 Несмотря на то, что триптантрин может быть экстрагирован из растений индиго, а также метаболитов микроорганизмов, процесс разделения является длительным, а выход является низким, что делает сложным удовлетворение требований, связанных с исследованием, и требований для клинических лекарственных средств. Только при исследовании быстрых,
20 высокопродуктивных, простых и легко доступных путей синтеза может быть обеспечено больше ресурсов для применений триптантрина, делая возможными дальнейшие исследования, разработку и применение. Чтобы преодолеть недостатки существующих методик в настоящем изобретении выполнены структурные модификации триптантрина с целью
25 улучшения растворимости и фармакологической активности триптантрина, с целью получения активного соединения со значимостью для практического использования. Исследование и фармакологическое испытание, относящиеся к настоящему изобретению, показывают, что производные N-бензилтриптантрина, которые получены путем введения растворимой в воде
30 группы в молекулу триптантрина, обладают способностью быть более эффективными в качестве IDO-ингибитора, демонстрируя различные фармакологические активности, такие как антибактериальная, противовоспалительная и противоопухолевая активности, и характеризуясь широким потенциалом применения. Более того, по сравнению с обычными
35 способами синтезирования производных триптантрина, в представленном настоящим изобретением способе синтеза предложены преимущества простоты обработки при использовании мягких условий и получения
высокого выхода, что делает его более подходящим для промышленного получения.
В частности, представленное настоящим изобретением производное N-бензилтриптантрина характеризуется общей структурой, как показано ниже в формуле 1:
где
R1 представляет собой водород или фтор; R2 представляет собой -NR3R4;
в данном случае каждый из R3 и R4 являются независимо выбранными из следующей группы: С1-С4алкильные группы; или R3 и R4 вместе со смежным атомом азота образуют замещенное или незамещенное 5-6-членное насыщенное кольцо, причем указанное 5-6-членное насыщенное кольцо включает в себя по меньшей мере один атом азота, а также 1-2 необязательных гетероатома, выбранные из следующей группы: О и N; в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе (предпочтительно атомы водорода, присутствующие на атоме азота), являются замещенными заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы, т-бутоксикарбонильные группы и галогены. Предпочтительно R должен нести атом азота, а также гетероатом, выбранный из следующей группы: О и N.
Предпочтительно R должен представлять собой замещенную или незамещенную группу, выбранную из следующей группы:
N N J
г\ , / Л / л t BocN N 5 HN N-i О H i м
v - ¦> -\ • .J 4 1 ' Ч -г t
где " обозначает место присоединения;
в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе, замещены заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы и галогены.
Соединение, описанное в настоящем изобретении, его таутомерные формы, структурные аналоги или фармацевтически приемлемые соли, а также
композиции, содержащие по меньшей мере один случай указанного соединения, его структурный аналог или фармацевтически приемлемую соль, могут применяться для ингибирования IDO, а также в применениях для лечения и/или предотвращения заболеваний, которые включают в себя IDO-5 опосредованный метаболизм триптофана в качестве патологического проявления. Такие заболевания включают в себя без ограничения опухоли, онкологическое заболевание, заболевания глаз, аутоиммунные заболевания, психические нарушения, депрессию и тревогу. Указанные применения включают в себя применения in vitro и in vivo, а также применения в 10 получении лекарственных средств, IDO-ингибиторов и фармацевтических композиций. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что в особенно предпочтительном варианте осуществления, если R1 представляет собой F, соединение демонстрирует оптимальную активность ингибирования IDO.
15 Получение производных N-бензилтриптантрина
В последние годы специалисты в области фармацевтической химии приложили значительные усилия для исследования синтеза триптантрина и его производных, и основным способом, применяемым для синтеза триптантрина, была реакция изатина с изатоевым ангидридом; указанный
20 способ является простым, обеспечивает высокий выход и в нем применяются мягкие условия реакции. Более того, в исходные материалы изатин и изатоевый ангидрид можно добавлять дополнительные функциональные группы для синтеза ряда различных функциональных триптантринов. В настоящее время основной способ, применяемый для синтеза изатина,
25 включает в себя проведение реакции хлоралгидрата, гидроксиламина и анилина в водном растворе хлористоводородной кислоты с получением оксимов, после чего вызывается замыкание кольца в концентрированной серной кислоте с получением изатина; указанный способ очень хорошо подходит для синтеза галоген- и алкил-содержащих триптантринов и
30 обеспечивает высокий выход. Однако данный способ сложно применять для получения триптантрина, содержащего активные группы, в связи с тем фактом, что указанные активные группы легко дают реакции с побочными продуктами в течение процесса синтеза изатина.
Вследствие длительных научно-исследовательских работ авторы настоящего 35 изобретения успешно разработали способ синтеза, который можно применять для получения триптантрина, имеющего активные группы. В частности, указанный способ включает в себя следующую стадию:
о , о
5 1
(d) соединение, приведенное в формуле 5 (2-бромметилтриптантрин), вводят в реакцию с R Н в инертном растворителе в присутствии триэтиламина с получением соединения, показанного в формуле 1.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает в себя следующую стадию:
о 6
4 5
(с) соединение, приведенное в формуле 4 (2-метилтриптантрин), вводят в реакцию с бромирующим средством в инертном растворителе с получением соединения, приведенного в формуле 5; причем применяемым бромирующим средством предпочтительно является NBS.
В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения реакцию бромирования осуществляют в присутствии активатора, такого как AIBN. Предпочтительный вариант осуществления включает в себя смешивание NBS и AIBN с последующей реакцией с соединением, приведенным в формуле 4.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает в себя следующую стадию:
н о з 4
(b) соединение, приведенное в формуле 3, вводят в реакцию с "' ^ в инертном растворителе в присутствии триэтиламина с получением соединения, приведенного в формуле 4.
В другом предпочтительном варианте осуществления указанный способ дополнительно включает в себя следующую стадию:
WO 2015/070766 О
ы н
- 17-
PCT/CN2014/090947
(а) соединение, приведенное в формуле 2, вводят в реакцию с окисляющим средством в инертном растворителе с получением приведенного в формуле 3 соединения; причем применяемым окислительным средством предпочтительно является мета-хлорпероксибензойная кислота. Время реакции, температуры реакции и т. д., приведенные в вышеупомянутых стадиях, можно регулировать на основании действительных условий; например, для подтверждения окончания реакции можно применять способы, обычные для данной отрасли (например, анализ TLC). Растворители, применяемые в каждой стадии, конкретно никоим образом не ограничены и можно применять инертные растворители, которые не вступают в реакцию с реагентами, являющимися обычными для данной отрасли. Следует понимать, что поскольку в настоящей заявке раскрыта вышеупомянутая схема реакции, конкретные условия в каждой стадии могут быть установлены специалистом в данной области, принимая во внимание его существующие знания в данной отрасли.
Среди способов получения производных N-бензилтриптантрина, представленных в настоящем изобретении, оптимальный путь синтеза приведен ниже.
гх6
(1) синтез метилизатоевого ангидрида (3)
Суспендировать 5-метилизатин в сухом дихлорметане и добавить мета-хлорпероксибензойную кислоту порциями при 0°С, затем перемешивать в течение 1,5-2,5 часов при комнатной температуре; сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC отфильтровать полученное в ходе реакции белое твердое вещество и трижды промывать этилацетатом с получением 5-метилизатоевого ангидрида; следует отметить,
что молярное соотношение 5-метилизатина и мета-хлорпероксибензойной кислоты составляет (0,5-1) : 1;
(2) Синтез 2-метилтриптантрина (4)
Суспендировать смесь метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и 5 триэтиламина в сухом толуоле, затем нагревать в течение 3,5-4,5 часов при температуре 100-120°С и отгонять растворитель при пониженном давлении; растворить полученное желтое твердое вещество в дихлорметане и добавить этилацетат, затем фильтровать полученное желтое твердое вещество и промывать три раза этилацетатом с получением 2-метилтриптантрина; 10 следует отметить, что молярное соотношение метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и триэтиламина составляет (0,2-0,5): (0,2-0,5): 1;
(3) Синтез 2-бромметилтриптантрина (5)
Растворить 2-метилтриптантрин, полученный на стадии (2), в сухом дихлорметане при 75-85°С в условиях защиты газообразным азотом, затем
15 порциями добавить смесь NBS и AIBN. Нагреть реакционный раствор до 75°С в течение 15-17 часов и подтвердить завершение реакции посредством TLC. Сразу после охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры осуществляется промывание солевым раствором и высушивание над безводным сульфатом натрия с получением
20 концентрированного желтого продукта; следует отметить, что молярное соотношение 2-метилтриптантрина, NBS и AIBN составляет 1:1: (0,0050,02);
(4) Синтез N-бензилтриптантрина (1)
Перемешивать вместе 2-бромметилтриптантрин, алифатический амин и 25 триэтиламин при комнатной температуре в сухом DMF в течение 1,5-2,5 часов, а затем сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC добавить 50 мл воды и осуществить три последовательные экстракции с использованием 10 мл дихлорметана; затем весь полученный объем дихлорметана подвергнуть трем промывкам водой и затем высушить над 30 безводным сульфатом натрия. Осуществить разделение полученного концентрированного твердого вещества с помощью силикагеля с получением производного N-бензилтриптантрина желтого цвета. В данном случае молярное соотношение 2-бромметилтриптантрина, алифатического амина и триэтиламина составляет 1 : (1-2): (2-5). 35 В приведенных выше формулах определения каждой группы являются такими, как представлено выше. IDO-ингибиторы и их применения
В связи с тем фактом, что представленное настоящим изобретением производное N-бензилтриптантрина демонстрирует высокоспецифичную активность ингибирования IDO, его можно использовать в получении лекарственных средств, применяемых для лечения и/или предотвращения 5 заболеваний, которые включают в себя нарушение IDO-опосредованного метаболизма триптофана качестве патологического проявления (такого как опухоли).
Указанное заболевание, включающее в себя нарушение метаболизма триптофана, включает в себя любые заболевания, которые подразумевают
10 нарушение IDO-опосредованного метаболизма триптофана в качестве патологического проявления, которые являются известными или неизвестными в данной отрасли, и предпочтительно указанное заболевание, связанное с нарушением метаболизма триптофана, является выбранным из следующей группы: опухоли, депрессия, тревога, СПИД, аутоиммунные
15 заболевания, психические нарушения, инфекции болезни Лайма, стрептококковые инфекции, нейродегенеративные нарушения (такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона), депрессия, онкологическое заболевание (в том числе Т-клеточный лейкоз и рак толстой кишки), заболевания глаз (такие как катаракты и связанное с
20 возрастом пожелтение) и аутоиммунные заболевания.
По сравнению с существующими методиками в настоящем изобретении предложены следующие основные преимущества:
(1) В настоящем изобретении представлен класс IDO-ингибиторов с новой
структурой, которые по сравнению с соединениями, имеющими подобные
25 структуры, демонстрируют удивительное улучшение активности. Указанные соединения не только обеспечивают активность ингибирования IDO, но в то же время они могут выступать также в качестве дополнительно модифицированных фармацевтических промежуточных соединений, а также имеют потенциальную значимость для практического использования в
30 разработке новых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний.
(2) В настоящем изобретении также представлен способ синтеза
производных N-бензилтриптантрина, и в указанном пути синтеза
предлагаются преимущества простоты обработки, использования мягких
35 условий реакции, снижения применения растворителя, снижения загрязнения и т. д., а также он подходит для массового производства. В следующем разделе настоящее изобретение будет дополнительно описано посредством конкретных примеров вариантов осуществления. Следует
понимать, что данные примеры всего лишь иллюстрируют настоящее изобретение и не предназначены для ограничения объема правоприменения настоящего изобретения. Для экспериментальных способов, включенных в следующие примеры вариантов осуществления, которые не определяют конкретные условия, применяют обычные условия или условия, рекомендованные производителем. Если не указано иное, процентные содержания и частичные количества рассчитаны по весу. Если не указано иное, приведенные в следующих примерах вариантов осуществления реагенты и исходные материалы представляют собой коммерчески доступные продукты. Конкретный путь синтеза приведен ниже.
о о о ^
¦К,X У*1
',. .... J 0 Ii ^ .,, < ,Л X. у"
н Н О
2 3 4
f~~\
о о
г-\
. b
Условия реакции для каждой стадии:
Стадия а. т-СРВА(2 экв.), СН2С12, RT;
Стадия b. Et3N, толуол, обратный холодильник, 759^
Стадия с. NBS, AIBN, CH2CI2, обратный холодильник;
Стадия d. К2С03, KI, DMF, амин.
Пример варианта осуществления 1 - синтез 2-((диметиламино)метил)-8-фтор-индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1а)
Конкретные стадии являются следующими.
Стадия (1). Синтез 6-метил-1Н-бензо[а][1,3]оксазин-1,4-диона (За)
}-¦¦ о I
2а За
Соединение 2а (500 мг, 3 ммоля) суспендировали в 10 мл сухого
дихлорметана, после чего порциями добавляли мета-хлорпероксибензойную кислоту (1,3 г, 6 ммолей, 75%) при 0°С. Посредством TLC определяли завершение реакции после перемешивания смеси в течение 2 часов при комнатной температуре, после чего полученное в ходе реакции белое твердое вещество отфильтровывали и осуществляли три промывки 10 мл этилацетата с получением соединения За (350 мг, 65%).
Стадия (2). Синтез 8-фтор-2-метил-индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (4а)
N. А "ч Л А. ./ VF
- ~v о ........ Y 'N-y.i'
За 4а
Смесь соединения За (1 г, 5,6 ммоля), 5-фторизатина (0,93 г, 5,6 ммоля) и триэтиламина (1,5 мл, 11,2 ммоля) суспендировали в сухом толуоле (10 мл) и нагревали при 110°С в течение 4 часов. Растворитель отгоняли при пониженном давлении и полученное таким образом желтое твердое вещество растворяли в 2 мл дихлорметана, после чего добавляли 2 мл этилацетата и желтое твердое вещество фильтровали и промывали три раза 2 мл этилацетата с получением соединения в виде желтого твердого вещества, т. е. соединение 4а (1,1 г, 75%). Характеристики:
!Н ЯМР (400 МГц, DMSO) 5 8,50 (dd, J= 8,8, 4,2 Гц, 1Н), 8,14 (s, 1Н), 7,86 (d, J= 8,2 Гц, 1Н), 7,82 - 7,76 (m, 1Н), 7,76 - 7,67 (m, Ш), 7,44 - 7,37 (m, 1Н), 2,53 (s, ЗН).
Стадия (3). Синтез 2-(бромметил)8-фтор-индол[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (5а)
, / У F ... A. I Vf
О о
4а 5а
Смесь NBS (381 мг, 2,14 ммоля) и AIBN (29 мг, 0,18 ммоля) добавляли тремя порциями в раствор дихлорметана (3,6 мл), содержащий соединение 4а (500 мг, 1,78 ммоля) при температуре 80°С в условиях защиты газообразным азотом. Реакционный раствор нагревали до 80°С в течение 16 часов. Сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC реакционный раствор охлаждали до комнатной температуры, промывали солевым раствором и высушивали над безводным сульфатом натрия с получением концентрированного желтого продукта (5а). Характеристики:
'Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 5 8,66 (dd, J = 8,8, 4,0 Гц, 1Н), 8,45 (d, J= 1,9 Гц, 1H), 8,04 (d, J= 8,3 Гц, 1H), 7,90 (dd, J= 8,3, 2,1 Гц, 1H), 7,61 (dd, J= 6,5, 2,6 Гц, 1H), 7,52 (td, J= 8,6, 2,7 Гц, 1H), 4,65 (s, 2H).
Стадия (4). Синтез 2-((диметиламино)метил)-8-фториндоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1а)
О о
^ X /" > F . " Л
, ¦"- ; I Г'*
О о 5* 1а
Соединение 5а (500 мг, 1,39 ммоля), гидрохлорид диметиламина (227 мг, 2,78 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC добавляли 50 мл воды и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия. Полученное концентрированное желтое твердое вещество подвергали разделению с использованием колонки с силикагелем с получением желтого соединения (1а).
Характеристики:
'НЯМР (400 МГц, CDC13) 5 8,63 (dd, J= 8,8, 4,1 Гц, 1Н), 8,33 (d, J= 1,5 Гц,
1H), 7,98 (d,J= 8,3 Гц, 1H), 7,87 (dd,J= 8,3, 1,8 Гц, 1H), 7,58 (dd,J=6,5, 2,6
Гц, 1H), 7,48 (td, J= 8,7, 2,7 Гц, 1H), 3,61 (s, 2H), 2,30 (s, 6H).
Пример варианта осуществления 2 - синтез трет-бутилового сложного
эфира 4-((8-фтор-6,12-диоксо-6,12-дигидрокси-индоло[2,1-Ь]хинолин-2-
ил)метил)пиперазин-1-карбоновой кислоты (lb)
Стадии (1) - (3) такие, как указаны в примере варианта осуществления 1.
Стадия (4). Синтез трет-бутилового сложного эфира 4-((8-фтор-6,12-
диоксо-6,12-дигидрокси-индоло[2,1-Ь]хинолин-2-ил)метил)пиперазин-1-
карбоновой кислоты (lb)
о г-, о
-V"- ^ l- ;"**N''*
О О 5a 1b
Соединение 5a (500 мг, 1,39 ммоля), N-Boc-пиперазин (546 мг, 2,78 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC добавляли 50 мл воды и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и
осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия. Полученное концентрированное желтое твердое вещество подвергали разделению с использованием колонки с силикагелем с получением желтого соединения (lb).
5 Характеристики:
'Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 5 8,66 (dd, У = 8,8, 4,0 Гц, 1Н), 8,39 (d, J = 1,5 Гц, 1Н), 8,01 (d, J= 8,3 Гц, 1Н), 7,90 (dd, J= 8,3, 1,8 Гц, 1Н), 7,60 (dd, J= 6,5, 2,6 Гц, 1Н), 7,51 (td, J= 8,6, 2,7 Гц, 1Н), 3,71 (s, 2Н), 3,47 (m, 4Н), 2,46 (т, 4Н), 1,48 (s, 9Н).
10 Пример варианта осуществления 3 - синтез 8-фтор-2-(пиперазин-1-илметил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1с)
> ' .4 - F / v- - F
'-Д-м- -/'" HN- - ' м- \' о о
!а 1с
Стадии (1) - (3) такие, как указаны в примере варианта осуществления 1. 15 Стадия (4). Синтез 8-фтор-2-(пиперазин-1-илметил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1с)
Соединение 5а (500 мг, 1,39 ммоля), N-Boc-пиперазин (546 мг, 2,78 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после
20 подтверждения завершения реакции посредством TLC добавляли 50 мл воды и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия с получением концентрированного желтого твердого вещества. Желтое твердое вещество
25 растворяли в 3 мл дихлорметана и дополнительно добавляли 1 мл трифторуксусной кислоты при комнатной температуре. Реакционный раствор перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре, и сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC (СГЬСЬ/МеОН^ЮЛ, Rf 0,2) растворитель удаляли при пониженном
30 давлении, добавляли 10 мл защитного раствора №НСОз и этилацетат (10 мл х 3) применяли для осуществления экстракции, после чего органическую фазу промывали солевым раствором и осуществляли высушивание с получением концентрированного твердого вещества, которое подвергали разделению с использованием колонки с силикагелем с получением
35 соединения в виде желтого твердого вещества (1с). Характеристики:
'H ЯМР (400 МГц, CDC13) 8 8,65 (dd, J= 8,8, 4,0 Гц, 1H), 8,37 (s, 1H), 8,00 (d, J= 8,3 Гц, 1H), 7,89 (dd, J= 8,3, 1,6 Гц, 1H), 7,59 (dd, J= 6,5, 2,6 Гц, 1H), 7,50 (td, J= 8,7, 2,7 Гц, 1H), 3,70 (s, 2H), 3,51 - 3,44 (m, 4H), 2,46 (s, 4H). Пример варианта осуществления 4 - синтез 8-фтор-2-((4-метил-5 пиперазин-1-ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (Id)
0 F 0 Г\ F
6 О 5а -Id
Стадии (1) - (3) такие, как указаны в примере варианта осуществления 1.
Стадия (4). Синтез 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-ил)
10 метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (Id)
Соединение 5а (220 мг, 0,61 ммоля), N-метилпиперазин (122 мг, 1,22 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC добавляли 50 мл воды
15 и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия. Полученное концентрированное желтое твердое вещество подвергали разделению с использованием колонки с силикагелем с получением желтого соединения
20 (Id).
Характеристики:
'Н ЯМР (400 МГц, CDC13) б 8,65 (dd, J= 8,8, 4,0 Гц, 1Н), 8,38 (d,J= 1,5 Гц, 1Н), 7,99 (d, J= 8,3 Гц, 1Н), 7,87 (dd, J= 8,3, 1,8 Гц, 1Н), 7,59 (dd, J= 6,5, 2,6 Гц, 1Н), 7,50 (td, J= 8,7, 2,7 Гц, 1Н), 3,50 (s, 2Н), 2,59 (s, 8Н), 2,38 (s, ЗН). 25 Пример варианта осуществления 5 - синтез 8-фтор-2-((морфолино-1-ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1е) Стадии (1) - (3) такие, как указаны в примере варианта осуществления 1. Стадия (4). Синтез 8-фтор-2-((морфолино-1-ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (1е)
5а 1в
Соединение 5а (500 мг, 1,39 ммоля), морфолин (242 мг, 2,78 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при
комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC (ЕЮAc, Rf 0,5) добавляли 50 мл воды и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и 5 осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия с получением концентрированного желтого твердого вещества, которое подвергали разделению с использованием колонки с силикагелем (EtOAc) с получением желтого соединения (1е). Характеристики:
10 'Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 8 8,66 (dd, J= 8,8, 4,1 Гц, 1Н), 8,39 (s, 1Н), 8,01 (d, J=8,3 Гц, 1Н), 7,90 (dd,J=8,3, 1,7 Гц, 1Н), 7,60 (dd, J= 6,5, 2,7 Гц, 1Н), 7,51 (td, J= 8,6, 2,7 Гц, 1Н), 3,79 - 3,73 (m, 4Н), 3,70 (s, 2Н), 2,52 (s, 4Н). Пример варианта осуществления 6 - синтез 2-((4-метил-пиперазин-1-ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (If)
15 Стадия (1) указана в примере варианта осуществления 1.
Стадия (2). Синтез 2-метил-индол[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (4Ь)
о о
- w-^o " -и S J
V .Л,
н О
г* 4ь
Смесь соединения За (1,7 г, 9,6 ммоля), изатина (1,4 г, 9,6 ммоля) и 20 триэтиламина (2,7 мл, 19,2 ммоля) суспендировали в сухом толуоле (18 мл) и нагревали при 110°С в течение 4 часов. Сразу после охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры полученное в результате желтое твердое вещество фильтровали и промывали три раза 2 мл этилацетата с получением соединения в виде желтого твердого вещества (4Ь) 25 (0,5 г, 20%).
Характеристики:
1Н ЯМР (400 МГц, CDCI3) 8 8,65 (d,J= 8,1 Гц, 1Н), 8,25 (s, 1Н), 7,94 (dd, J = 7,8, 5,0 Гц, 2Н), 7,85 - 7,75 (m, 1Н), 7,71 - 7,64 (т, 1Н), 7,44 (t, J= 7,5 Гц, 1Н), 2,58 (s, ЗН).
30 Стадия (3). Синтез 2-метил-индол[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (5Ь)
~У'^"'~К"~У - 8г' -т ''n Ч
о о
4Ь 5Ь
Смесь NBS (381 мг, 2,14 ммоля) и AIBN (29 мг, 0,18 ммоля) добавляли тремя порциями в раствор дихлорметана (5 мл), содержащий соединение 4Ь (262 мг, 1,0 ммоля) при температуре 80°С в условиях защиты газообразным азотом. Сразу после охлаждения реакции до комнатной температуры осуществляли промывку солевым раствором и осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия с получением концентрированного желтого продукта (5Ь) (245 мг, 91%).
Стадия (4). Синтез 2-((4-метил-пиперазин-1-ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (If)
о ^ о ^
5Ь ° 1f 0
Соединение 5Ь (220 мг, 0,61 ммоля), N-метилпиперазин (116 мг, 1,616 ммоля), йодид калия (10 мг) и триэтиламин (0,5 мл) перемешивали в 5 мл раствора DMF при комнатной температуре в течение 2 часов. Сразу после
15 подтверждения завершения реакции посредством TLC добавляли 50 мл воды и осуществляли три последовательные экстракции с использованием 10 мл этилацетата, после чего органическую фазу промывали три раза водой и осуществляли высушивание над безводным сульфатом натрия. Полученное концентрированное желтое твердое вещество подвергали разделению с
20 использованием колонки с силикагелем с получением желтого соединения (If) (120 мг, 55%). Характеристики:
'Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 5 8,66 (d, J = 8,1 Гц, Ш), 8,39 (s, Ш), 8,01 (d, J = 8,3 Гц, 1Н), 7,94 (d, J= 7,5 Гц, 1Н), 7,89 (dd, J= 8,2, 1,7 Гц, 1Н), 7,82 (t, J= 7,8 25 Гц, 1Н), 7,45 (t, J= 7,5 Гц, Ш), 3,71 (s, 2Н), 2,71 - 2,41 (m, 8Н), 2,33 (s, ЗН).
Пример варианта осуществления 7 - установление активности ингибирования IDO
В ходе конструирования плазмиды, содержащей человеческий ген IDO, экспрессированный в Escherichia coli, осуществляли экстракцию и очистку в
30 соответствии со способом, представленным в Littlejohn, et al. (Takikawa О, Kuroiwa T, Yamazaki F, et al. J. Biol. Chem. 1988, 263, 2041 - 2048). Активность ингибирования IDO относительно каждого соединения устанавливали с использованием способов, описанных в литературе. 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), 40 мМ витамина С, 400 мкг/мл каталазы,
35 20 мкМ метиленового синего и фермента IDO смешивали вместе в 96-луночном планшете. Затем в вышеупомянутую смесь добавляли субстрат L
триптофан и образец для тестирования. Реакцию проводили в течение 60 минут при 37°С, после чего реакцию останавливали с помощью добавления 30% (вес/об.) трихлоруксусной кислоты. 96-луночный планшет нагревали до 65°С в течение 15 минут для завершения преобразования из 5 формилкинуренина в кинуренин, а затем осуществляли центрифугирование при 6000 g в течение 5 минут. Из каждой лунки удаляли 100 мкл надосадочной жидкости и переносили в новый 96-луночный планшет, после чего добавляли 2% (вес/об.) раствор п-(диметиламино)бензальдегида в уксусной кислоте и желтый цвет, полученный как результат конечной 10 реакции с кинуренином, наблюдался при 490 нм в считывающем устройстве для микропланшетов; результаты эксперимента показаны в таблице 1. Пример варианта осуществления 8 - установление того, является ли ингибитор обратимым
Тестировали серию различных концентраций фермента с учетом постоянной 15 концентрации ингибитора и измеряли скорости конечной реакции. Строили график зависимости скорости реакции от концентрации фермента (v - [Е]) и на основании характеристик полученной в результате кривой было возможно определить, является ли ингибитор обратимым.
Условия реакции: 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), 40 мМ витамина 20 С, 400 мкг/мл каталазы, 20 мкМ метиленового синего и 300 мМ субстрата L-триптофана или одновременно 100 мМ ингибитора добавляли к 500 мкл реакционной системы, после чего смесь выдерживали при 37°С в течение 5 минут, после чего в вышеупомянутую смесь добавляли разные объемы фермента IDO и обеспечивали протекание конечной реакции в течение 30 25 минут при 37°С, а также добавляли 200 мкл 30% (вес/об.) трихлоруксусной кислоты для завершения реакции; реакционную систему нагревали до 65°С в течение 15 минут для завершения преобразования формилкинуренина в кинуренин, после чего осуществляли центрифугирование в течение 10 минут при 12000 об/мин, надосадочную жидкость удаляли и смешивали с равным 30 объемом 2% (вес/об.) раствора п-диметиламинобензальдегида в уксусной кислоте, а затем осуществляли измерения с использованием считывающего устройства для планшетов при длине волны 490 нм. Строили график v - [Е] и результаты реакции показаны в таблице 1.
Пример варианта осуществления 9 - установление типа ингибитора и 35 измерение значения Ki
50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), 40 мМ витамина С, 400 мкг/мл каталазы, 20 мкМ метиленового синего и 100, 250 или 300 мМ субстрата L-триптофана добавляли к 500 мкл реакционной системы и добавляли
различные концентрации соединения в каждую реакционную систему для приведенной единичной концентрации субстрата, после чего смесь выдерживали при 37°С в течение 5 минут, после чего в вышеупомянутую смесь добавляли 10 мкл IDO (около 20 нМ) и обеспечивали протекание 5 конечной реакции в течение 30 минут при 37°С, а затем добавляли 200 мкл 30% (вес/об.) трихлоруксусной кислоты для завершения реакции; реакционную системы нагревали до 65°С на водяной бане в течение 15 минут для завершения преобразования формилкинуренина в кинуренин, после чего осуществляли центрифугирование в течение 10 минут при 12000 об/мин,
10 надосадочную жидкость удаляли и смешивали с равным объемом 2% раствора (вес/об.) п-диметиламинобензальдегида в уксусной кислоте, а затем осуществляли измерения с использованием считывающего устройства для планшетов при длине волны 490 нм. График Диксона (1/v - [I]) применяли для установления типа ингибитора, образованного соединением, а график S/v
15 - [I] строили для получения значения Ki ингибитора; результаты эксперимента показаны в таблице 1.
Пример варианта осуществления 10 - измерение концентрации полумаксимального ингибирования IC50
Смешивали между собой 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 6,5), 40 мМ
20 витамина С, 400 мкг/мл каталазы, 20 мкМ метиленового синего, 150 мМ субстрата L-триптофана и ингибитор. Смеси, содержащие 100, 200, 400, 600, 800, 1000 или 1200 мкМ ингибитора нагревали до 37°С в течение 5 минут и затем в вышеуказанные смеси добавляли фермент IDO. Обеспечивали протекание реакции при 37°С в течение 30 минут, после чего добавляли 200
25 мкл 30%) (вес/об.) трихлоруксусной кислоты для завершения реакции; реакционную систему нагревали до 65°С в течение 15 минут для завершения преобразования формилкинуренина в кинуренин, после чего осуществляли центрифугирование в течение 10 минут при 12000 об/мин, 200 мкл надосадочной жидкости удаляли и смешивали с равным объемом 2%
30 (вес/об.) раствора п-диметиламинобензальдегида в уксусной кислоте, и желтый цвет, полученный в результате конечной реакции с кинуренином, наблюдался при 490 нм в устройстве для считывания микропланшетов; полученные таким образом результаты вводили в программное обеспечение для расчета IC50, чтобы получить значения IC50 ингибитора; и результаты
35 экспериментов показаны в таблице 1.
CO,
индолампн-2,3-диоксигеназа IDO
о coa"
A. ,-v.
'' NHCHO
; 30%TCA, 60°C, 15 мин.
-чу --" NH3*
о co2-
NHCHO
Хмакс = 490 нм
Пример варианта осуществления 11 - измерение концентрации полумаксимального ингибирования IC50 (клетки)
Липосому Lipofectamin 2000 применяли для трансфекции НЕК 293 клеток 5 плазмидой pcDNA3.1-hIDO. При измерении активности ингибирования на клеточном уровне среда клеточной культуры НЕК293 соответствовала DMEM с высоким содержанием глюкозы, при этом среда содержала 50 ед/мл пенициллина, 50 ед/мл стрептомицина и 10% FBS, и культивирование осуществляли при 37°С в атмосфере 5% СО2. Через двадцать четыре часа
10 после трансфекции клеток плазмидой добавляли тестовое лекарственное средство и осуществляли инкубацию, после чего надосадочную жидкость переносили в другой 96-луночный планшет и добавляли 10 мкл 30% (вес/об,) трихлоруксусной кислоты, а затем смесь нагревали до 65°С в течение 15 минут для завершения преобразования формилкинуренина в кинуренин,
15 после чего осуществляли центрифугирование в течение 10 минут при 12000 об/мин, смешивали с равным объемом 2%о (вес/об.) раствора п-диметиламинобензальдегида в уксусной кислоте, а затем измеряли поглощение при 490 нм с использованием считывающего устройства для планшетов; результаты эксперимента показаны в таблице 1.
20 Измерения активности ингибирования IDO соединений, полученных в примерах вариантов осуществления 1-6, осуществляли с использованием способов, приведенных выше в примерах вариантов осуществления 7-11, и IDO-ингибитор 1-метил-триптофан (1-МТ, коммерчески доступный), который в настоящее время обычно применяют как в экспериментах in vivo,
25 так и в экспериментах in vitro, применяли в качестве контроля; результаты показаны в таблице 1,
Таблица 1. Активность ингибирования IDO производных N-бензилтриптантрина (I), синтезированных в приведенных выше примерах
Соединение
Тип ингибирования
Ki (мкМ)
1С50
1С50 (мкМ)
(in vitro)
(мкМ) (клетка)
Конкурентный
380
18,4
Пример варианта осуществления 1
Антиконкурентный
0,31
0,11
1,01 Ю-3
Пример варианта осуществления 2
Антиконкурентный
7,21
1,88
0,64
Пример варианта осуществления 3
Неконкурентный
4,12
0,68
7,3810"2
Пример варианта осуществления 4
Антиконкурентный
2,64
0,50
2,2410"2
Пример варианта осуществления 5
Антиконкурентный
0,47
0,40
1,2110"3
Пример варианта осуществления 6
Антиконкурентный
5,97
2,52
0,97
Пример 12 - анализ пролиферации Т-клеток
12.1. Выделение лимфоцитов селезенки (осуществленное в соответствии с инструкциями к среде для разделения лимфоцитов):
5 1. Двух мышей умерщвляли путем смещения шейных позвонков и селезенки удаляли на стерильном столе, а затем для дальнейшего применения помещали в 6 см планшет, содержащий культуральную среду RP1640. 2. 100 мкМ меш помещали в 50 мл пробирку центрифуги и каждую селезенку нарезали на куски меньшего размера с использованием ножниц, измельчали 10 на поверхности сита и добавляли небольшое количество RP1640 в целях консервирования.
3. Затем добавляли среду для разделения лимфоцитов, эквивалентную двойному объему полученной в результате суспензии.
4. Центрифугирование осуществляли при 800 g в течение 20 минут, после чего становились видимыми три отдельных слоя, при этом средний слой
5 демонстрировал легкий желтый оттенок.
5. Клетки в среднем слое удаляли и добавляли культуральную среду RP1640 для осуществления обратной промывки. Затем клетки центрифугировали при 250 g в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем клетки собирали.
10 6. Культуральную среду отсасывали и клетки ресуспендировали в среду RP1640, после чего осуществляли подсчет клеток.
12.2. Обработка клеток LLC (карциномы легкого Льюиса):
1. Среду (DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% FBS) отсасывали и осуществляли промывку 1-2 раза с использованием PBS; 15 2. Добавляли 0,25% трипсина для активации расщепления;
3. Трипсин отсасывали и добавляли культуральную среду, после чего клетки
отбирали пипеткой и переносили в 1,5 мл пробирку центрифуги;
4. Осуществляли центрифугирование с последующим отсасыванием
надосадочной жидкости, а затем клетки ресуспендировали в 1 мл
20 культуральной среды DMEM;
5. Добавляли митомицин С (конечная концентрация: 25 мкг/мл), смесь
перемешивали в пипетке до достижения гомогенного состояния, а затем
смесь помещали в ванну при 37°С на 30 минут;
6. Осуществляли промывку 3 раза с помощью RP1640, клетки подсчитывали
25 и образец откладывали.
12.3. Методика эксперимента
1. Обработанные клетки LLC (2 х 104 клеток/лунка; клетки-стимуляторы) и лимфоциты селезенки (105 клеток/лунка; реактивные клетки) добавляли в 96-луночный планшет, после чего RPT640 (10% FBS добавляли для доведения
30 объема до 200 мкл;
2. Осуществляли группирование и добавляли 50 мкМ IDO-ингибитора для группы введения, после чего образцы помещали в инкубатор при 37°С, 95% RH, 5% СОг и культивировали в течение 72 часов;
3. Набор реактивов WST-1 применяли для измерения пролиферации Т-35 клеток, и значения поглощения при длине волны 450 нм измеряли с
использованием устройства для считывания планшетов;
4. Расчет скорости пролиферации Т-лимфоцитов:
Скорость пролиферации Т-лимфоцитов (%) = [лунка с группой введения (Т-лимфоциты + клетки LLC + ШО-ингибитор) значение OD - контрольная лунка (Т-лимфоциты + клетки LLC) значение OD] / контрольная лунка (Т-лимфоциты + клетки LLC) значение OD х 100% 12.4. Результаты эксперимента
Пример варианта осуществления 13 - противоопухолевый эффект 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-ил)метил)индоло[2Д-Ь]хиназолин-6,12-диона (пример варианта осуществления 4)
1. Установление модели опухоли Льюиса LLC: здоровых самок мышей C57BL/6 с весом 20 ± 1 г и полученных от Shanghai Slyke Experimental Animal Center выращивали в лаборатории класса SPF. Стерильный солевой раствор применяли для суспендирования клеток карциномы легкого Льюиса при концентрации 1 х 10 /мл. Клетки подкожно инокулировали в подмышечные области мышей в стерильных рабочих условиях, при этом каждому животному инокулировали по 0,2 мл.
2. Экспериментальное группирование и профилактическое введение: мышей произвольно разделяли на пять групп по 10 животных. Контрольной группе давали эквивалентный объем 0,5% карбоксиметилцеллюлозы натрия посредством искусственного питания; 1-метил-триптофан (1-МТ) вводили при концентрациях 150 мг/кг в группе с высокой дозировкой и 75 мг/кг в группе с низкой дозировкой посредством искусственного питания; 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-дион вводили при концентрациях 150 мг/кг в группе с высокой дозировкой и 75 мг/кг в группе с низкой дозировкой посредством искусственного питания. Инокуляцию опухоли осуществляли спустя 7 дней непрерывного введения, после чего введение продолжали в течение 21 дня и наблюдали рост опухоли. Длину опухоли вдоль большой оси (а) и малой оси (Ь) измеряли, начиная от дня инокуляции опухоли и каждый последующий день после нее при объеме опухоли = ab2/2. На следующий день введение прекращали, мышей
умерщвляли посредством смещения шейных позвонков и опухоли удаляли, взвешивали и консервировали в жидком азоте.
3. Результаты обработки для профилактического введения: вследствие
профилактического введения, длящегося одну неделю, с последующим
5 непрерывным введением после инокуляции, у мышей, которым вводили 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-дион, наблюдался значительно ингибированный рост опухоли карциномы легкого Льюиса in vivo; в группе с высокой дозировкой через 20 дней после начала введения значительного образования опухоли не наблюдалось, тогда как в
10 контрольной группе образование опухоли было отмечено спустя всего 11 дней после начала введения; у мышей в группе 1-МТ наблюдалось образование опухоли через 13 дней после начала введения. На основании объема опухоли скорости ингибирования опухоли, наблюдаемые для групп с высокой дозировкой 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-ил)метил)индоло[2,1-
15 Ь]хиназолин-6,12-диона и 1-МТ, составляли 62,15% и 32,35% соответственно, тогда как скорости ингибирования опухоли в группах с низкой дозировкой составляли 46,62% и 27,00%. На основании веса опухоли скорости ингибирования опухоли, наблюдаемые для групп с высокой дозировкой 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-диона
20 и 1-МТ, составляли 57,8% и 28,2% соответственно. Животные, которым вводили 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-дион, демонстрировали нормальный вес, блестящую шерсть и более гибкое реагирование.
4. Экспериментальное группирование и введение после инокуляции: мышей
25 произвольно разделяли на четыре группы по 10 животных через 48 часов
после проведения инокуляции опухоли. Исходную дозу вводили, как только диаметр опухоли достигал 5 мм. Животным в контрольной группе вводили равный объем 0,5% CMC (карбоксиметилцеллюлозы натрия) посредством искусственного питания; животным в группе 1-МТ вводили дозу 200 мг/кг
30 посредством искусственного питания; животным в группе 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-диона вводили дозу 200 мг/кг посредством искусственного питания; животным в группе паклитаксела вводили дозу 100 мг/кг посредством внутривенного введения один раз в неделю; животным в группе 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-
35 ил)метил)индоло[2,1-Ь]хинолиноксазолин-6,12-диона + паклитаксел вводили 200 мг/кг 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-диона и 100 мг/кг паклитаксела (внутривенное введение в хвостовую вену) непрерывно в течение двух недель. Длину опухоли вдоль большой оси
(а) и малой оси (b) измеряли начиная от дня введения и каждый последующий день после него при объеме опухоли = ab2/2. На следующий день введение прекращали, мышей умерщвляли посредством смещения шейных позвонков, опухоли удаляли, взвешивали и консервировали в жидком азоте.
5. Результаты обработки для введения после инокуляции: после того, как
животных в течение двух недель подвергали непрерывному введению 200
мг/кг 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-
6,12-диона или 1-МТ посредством искусственного питания, рост опухоли
карциномы легкого Льюиса in vivo продемонстрировал значительное
ингибирование по сравнению с контрольной группой, и ингибирование роста
опухоли было более выраженным в группе 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-
ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона по сравнению с группой 1-МТ.
На основании объема опухоли скорости ингибирования опухоли,
наблюдаемые для групп 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1-
ил)метил)индоло[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона, 1-МТ, паклитаксела и 8-фтор-2-((4-метил-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-диона + паклитаксел, составляли 23,38%, 15,68%, 51,45% и 72,48%) соответственно. В качестве широко применяемого в клинической практике химиотерапевтического средства паклитаксел обычно обеспечивал ингибирование роста опухоли, однако лекарственное средство тоже давало более сильные токсические побочные эффекты; на протяжении проведения эксперимента у мышей наблюдалось как снижение веса, потеря шерсти, так и в общем признаки снижения подвижности. С другой стороны, хотя введение только 8-фтор-2-((4-мети л-пиперазин-1 -ил)метил)индоло[2,1 -Ь]хиназолин-6,12-диона не привело к полному исчезновению опухоли, наблюдалось более значительное ингибирование опухоли и обработанные таким образом мыши демонстрировали нормальный вес, блестящую шерсть и более гибкое реагирование.
Сравнительный пример - получение 2-метил-индол[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона и тестирование активности
Стадия (1) указана в примере варианта осуществления 1.
Стадия (2). Синтез 2-метил-индол[2,1-Ь]хиназолин-6,12-диона (4Ь)
о о
н о
За 4Ъ
Смесь соединения За (1,7 г, 9,6 ммоля), изатина (1,4 г, 9,6 ммоля) и триэтиламина (2,7 мл, 19,2 ммоля) суспендировали в сухом толуоле (18 мл) и нагревали при 110°С в течение 4 часов. Сразу после охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры полученное в результате 5 желтое твердое вещество фильтровали и промывали три раза 2 мл этилацетата с получением соединения в форме желтого твердого вещества (4Ь) (0,5 г, 20%). Характеристики :
!Н ЯМР (400 МГц, CDC13) 5 8,65 (d, J= 8,1 Гц, 1Н), 8,25 (s, 1H), 7,94 (dd, J = 1 0 7,8, 5,0 Гц, 2H), 7,85 - 7,75 (m, 1H), 7,71 - 7,64 (m, 1H), 7,44 (t,J= 7,5 Гц, 1H), 2,58 (s, 3H).
С использованием способа измерения, описанного в примерах вариантов осуществления 9-11, для измерения активности соединения, полученного в сравнительном примере, получали активность ингибирования IDO in vitro
15 IC50 997,25 мкМ, тогда как Ki и in vivo IC50 не измеряли.
Как показывают экспериментальные данные в таблице 1, относящееся к настоящей заявке соединение демонстрирует исключительно хорошую активность ингибирования IDO относительно доступных в настоящее время обычных IDO-ингибиторов, а также соединений с подобными структурами.
20 Более конкретно, по сравнению с существующим обычным IDO-ингибитором 1-МТ значения in vitro и внутриклеточной IC50, полученные для представленного настоящей заявкой соединения, являются более низкими на 1-3 порядка, что указывает на то, что представленное настоящей заявкой соединение обеспечивает отличную активность ингибирования IDO.
25 Следует отметить, что существует весьма значительное улучшение в представленном настоящей заявкой соединении, в сравнении с другими соединениями с очень схожими структурами (такое как соединение, приведенное в сравнительном примере) с точки зрения активности ингибирования. Активность ингибирования все еще остается значительно
30 повышенной даже по сравнению с определенными IDO-ингибиторами, которые так же характеризуются активными группами в своей структуре. Принимая во внимание связь между структурой соединения и активностью, обычно наблюдаемой в данной отрасли, отличие, наблюдаемое между представленным настоящей заявкой соединением и подобными структурами,
35 является весьма исключительным феноменом. Это указывает на то, что представленное настоящей заявкой соединение представляет собой чрезвычайно уникальный тип структуры, и его биологическая активность является удивительной.
Все упомянутые в настоящем изобретении публикации включены в ссылки, как если бы каждая отдельная публикация была приведена в качестве ссылки. Также следует понимать, что после прочтения представленных в настоящем изобретении инструкций специалист в данной области сможет выполнять различные изменения или модификации относительно настоящего изобретения, и данные эквивалентные формы также входят в объем формулы изобретения, которая включена в данную заявку.
Формула изобретения
1. Производное N-бензилтриптантрина, которое отличается тем, что указанное производное характеризуется общей структурой, которая показана в формуле 1 ниже:
N ^ О
где
R1 представляет собой водород или фтор; R2 представляет собой -NR3R4;
10 каждый из R3 и R4 является независимо выбранным из следующей группы: Н, замещенные или незамещенные С1-С4алкильные группы, замещенные или незамещенные С2-С4алкенильные группы, замещенные или незамещенные С2-С4алкинильные группы и замещенные или незамещенные СЗ-Сбциклоалкильные группы;
15 или R3 и R4 вместе со смежным атомом азота образуют замещенное или незамещенное 5-7-членное гетероциклическое кольцо, причем указанное 5-6-членное насыщенное кольцо включает в себя 1-2 атома азота, а также 0-2 гетероатома, выбранные из следующей группы: О и S;
в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или 20 несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе (предпочтительно атомы водорода, присутствующие на атоме азота), являются замещенными заместителем, выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы, С1-С4галогеналкильные группы, амино-защитные группы (предпочтительно т-бутоксикарбонил) и галогены. 25 2. Производное N-бензилтриптантрина по п. 1, отличающееся тем, что каждый из R3 и R4 является независимо выбранным из следующей группы: С1-С4алкильные группы; или R3 и R4 вместе со смежным атомом азота образуют замещенное или незамещенное 5-6-членное насыщенное кольцо, причем указанное 5-6-членное насыщенное кольцо включает в себя 1 или 2 30 атома азота, а также необязательный 1 гетероатом, выбранный из следующей группы: О.
3. Производное N-бензилтриптантрина по п. 1, отличающееся тем, что R представляет собой замещенную или незамещенную группу, выбранную из
следующей группы:
N N j BocN N i HN N-* О N -; ^
где обозначает место присоединения;
в данном случае замещение относится к случаям, в которых один или несколько атомов водорода, присутствующих на указанной группе, замещены заместителем, выбранным из следующей группы: С1 -С4алкильные группы и галогены.
4. Производное N-бензилтриптантрина, отличающееся тем, что общая структура указанного производного является такой, как приведено ниже:
....... .Д, J > R!
о 1 R1 = Н или F
,- -А /\ / \ / -v <*t**
R? • -Ы Н \ BoeN N | UN N- J о V 3 м
Ч".У N / \"._У ' \ / } ^-"-^
10 где заместитель R2 представляет собой циклический имин или диалкил-замещенный амин, a R1 представляет собой водород или фтор. 5. Производное N-бензилтриптантрина по п. 1 или п. 4, отличающееся тем, что указанное производное представляет собой соединение, выбранное из
Ь О
1Ь ч 1с
о г^
If ° .
6. Способ получения производного N-бензилтриптантрина по п. 1 или п. 4, отличающийся тем, что он включает в себя следующие стадии:
N t ^ ^
о . о
5 1
(d) соединение, приведенное в формуле 5 (2-бромметилтриптантрин), вводят 20 в реакцию с R Н в инертном растворителе в присутствии триэтиламина с получением соединения, показанного в формуле 1, где R1 и R2 являются такими, как определено выше.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что указанный способ дополнительно включает в себя стадию (с) перед стадией (d):
У "V (tm) \_J ---- Br'' "Nf4*^ "N ""^ , ° °
25 * e
(с) соединение, приведенное в формуле 4, вводят в реакцию с бромирующим средством в инертном растворителе с получением соединения, приведенного
в формуле 5; причем применяемое бромирующее средство предпочтительно представляет собой NBS.
8. Способ получения производного N-бензилтриптантрина по п. 4,
отличающийся тем, что путь синтеза является следующим:
о о о
г s 4
о Л о
S 1
R1 = H или F;
RZ " SM_J BOQN' ^ 4n" г \ / 4.... / ' \._/ " "\ / 1 .--"x.
конкретные стадии являются следующими:
(1) синтез метилизатоевого ангидрида (3)
10 суспендируют 5-метилизатин в сухом дихлорметане и добавляют мета-хлорпероксибензойную кислоту порциями при 0°С, затем перемешивают в течение 1,5-2,5 часов при комнатной температуре; сразу после подтверждения завершения реакции посредством TLC отфильтровывают полученное в ходе реакции белое твердое вещество и промывают трижды
15 этилацетатом с получением 5-метилизатоевого ангидрида; молярное соотношение 5-метилизатина и мета-хлорпероксибензойной кислоты составляет (0,5-1) : 1;
(2) синтез 2-метилтриптантрина (4)
суспендируют смесь метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и 20 триэтиламина в сухом толуоле, затем нагревают в течение 3,5-4,5 часов при температуре 100-120°С и отгоняют растворитель при пониженном давлении; растворяют полученное твердое желтое вещество в дихлорметане и добавляют этилацетат, затем фильтруют полученное желтое твердое вещество и промывают этилацетатом три раза с получением 225 метилтриптантрина; причем молярное соотношение метилизатоевого ангидрида, 5-фторизатина и триэтиламина составляет (0,2-0,5): (0,2-0,5): 1;
(3) синтез 2-бромметилтриптантрина (5)
растворяют 2-метилтриптантрин, полученный на стадии (2), в сухом дихлорметане при 75-85°С в условиях защиты газообразным азотом, затем 30 добавляют смесь NBS и AIBN порциями; нагревают реакционный раствор при 75 °С в течение 15-17 часов и подтверждают окончание реакции посредством TLC; сразу после охлаждения реакционного раствора до комнатной температуры осуществляют промывание солевьм раствором и
высушивание над безводным сульфатом натрия; органическую фазу концентрируют с получением желтого продукта, при этом молярное соотношение 2-метилтриптантрина, NBS и AIBN составляет 1:1: (0,0050,02); а также 5 (4) синтез N-бензилтриптантрина (1)
перемешивают вместе 2-бромметилтриптантрин, алифатический амин и триэтиламин при комнатной температуре в сухом DMF в течение 1,5-2,5 часов, а затем сразу после проверки завершения реакции посредством TLC добавляют 50 мл воды и осуществляют три последовательные экстракции с
10 использованием 10 мл дихлорметана; далее подвергают весь полученный объем дихлорметана трем промывкам водой и затем сушат над безводным сульфатом натрия; осуществляют разделение полученного концентрированного желтого твердого вещества с использованием силикагеля с получением производного N-бензилтриптантрина желтого
15 цвета; при этом молярное соотношение 2-бромметилтриптантрина, алифатического амина и триэтиламина составляет 1 : (1-2): (2-5).
9. Применение производного N-бензилтриптантрина по п. 1 или п. 4 в получении лекарственного средства, предназначенного для предотвращения и/или лечения заболеваний, которые включают в себя нарушение IDO-
20 опосредованного метаболизма триптофана в качестве патологического проявления.
10. Применение приведенного в формуле 1 соединения по п. 1 или п. 4 или его фармацевтически приемлемой соли, отличающееся тем, что оно применяется для:
25 (i) получения IDO-ингибитора;
(ii) получения лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с метаболизмом триптофана; а также
(iii) нетерапевтического ингибирования IDO in vitro.
11. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что она включает в
30 себя: (i) приведенное в формуле 1 соединение по п. 1 или п. 4 или его
фармацевтически приемлемую соль; а также (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
12. IDO-ингибитор, отличающийся тем, что он включает в себя приведенное в формуле 1 соединение по п. 1 или п. 4 или его фармацевтически
35 приемлемую соль.
13. Способ нетерапевтического ингибирования активности IDO in vitro, отличающийся тем, что указанный способ включает в себя следующую стадию: приведенное в формуле 1 соединение по п. 1 или п. 4 или его
13.
фармацевтически приемлемую соль приводят в контакт с мишенью ингибирования в количестве, которое обеспечивает эффективное ингибирование.
14. Способ получения фармацевтической композиции, применяемой для лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма триптофана, отличающийся тем, что в указанном способе приведенное в формуле 1 соединение по п. 1 или п. 4 или его фармацевтически приемлемую соль смешивают с фармацевтически приемлемым носителем в терапевтически эффективном количестве с получением фармацевтической композиции.
15. Способ лечения заболевания, связанного с нарушением метаболизма триптофана, отличающийся тем, что в указанном способе приведенное в формуле 1 соединение по п. 1 или п. 4 или его фармацевтически приемлемую соль применяют в терапевтически эффективном количестве для лечения субъекта.
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
(19)
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
(19)
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
(19)
WO 2015/070766
-2-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-2-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-4-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-4-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-4-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-6-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-6-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-7-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-7-
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-9-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-9-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 10-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 10-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 11 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 11 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 12-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 12-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 13 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 13 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 14-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 14-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 15 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 15 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 16-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 16-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 18-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 18-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 19-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
- 19-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-20-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 -21 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 -21 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-22-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-22-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-23 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-23 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-24-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-24-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-25 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-25 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-26-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-26-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-27-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-27-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 28 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 28 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-29-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 30 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 30 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 31 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 31 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-32 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-32 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-33 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-33 -
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-34-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-34-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 35 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766 - 35 - PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-36-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
-36-
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
-2 -
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
-2 -
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
-3-
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
-3-
WO 2015/070766 PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947
WO 2015/070766
PCT/CN2014/090947