(57) Реферат / Формула:
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к неожиданному открытию того, что для лечения фиброзного нарушения можно применять полипептид, содержащий укороченную лиганд-связывающую часть внеклеточного домена эндоглинового (ENG) полипептида.
Евразийское (2D 201690855 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K38/17(2006.01)
2016.10.31
(22) Дата подачи заявки 2014.10.24
(54) ЭНДОГЛИНОВЫЕ ПЕПТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(31) (32)
61/896,002 2013.10.25
(33) US
(86) PCT/US2014/062147
(87) WO 2015/061666 2015.04.30
(71) Заявитель:
АКСЕЛЕРОН ФАРМА, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Гринберг Ася, Кастонгэй Роузлин, Вернер Эрик, Кумар Равиндра (US)
(74) Представитель:
Медведев В.Н. (RU) (57) В определенных аспектах настоящее изобретение относится к неожиданному открытию того, что для лечения фиброзного нарушения можно применять полипептид, содержащий укороченную лиганд-связывающую часть внеклеточного домена эндоглинового (ENG) полипептида.
2420-534572ЕА/071 ЭНДОГЛИНОВЫЕ ПЕПТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи согласно 35 U.S.С. §119 по предварительной патентной заявке США № 61/896002, поданной 25 октября 2013 года и названной Endoglin Peptides То Treat Fibrotic Diseases, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Фиброз представляет собой образование избытка волокнистой соединительной ткани в органе или ткани. Фиброз может возникать в ответ на физическое или химическое повреждение как часть репаративного или реактивного процесса, также обозначаемого как рубцевание. Фиброз также может возникать в результате патологических аномалий в клетке или ткани без внешнего повреждения. Фиброз приводит к депонированию соединительной ткани, которая может поддерживать гомеостаз ткани и заживление после травмы. Однако избыточный фиброз может приводить к облитерации структуры и затруднять функционирование соответствующего органа или ткани, приводя к фиброзным нарушениям, таким как, например, фиброз печени, легочный фиброз и кистозный фиброз. Как правило, фиброзная ткань не может осуществлять специализированные функции соответствующего органа и не может репарироваться. Таким образом, варианты лечения фиброзных нарушений ограничены подходами замены ткани, такими как трансплантация органа, и паллиативное лечение.
Желательна разработка эффективных композиций и способов ингибирования и лечения фиброза. Они включают способы и композиции, которые могут ингибировать и/или реверсировать избыточный фиброз, ассоциированный с фиброзными нарушениями.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к эндоглиновым (ENG) полипептидам и применению таких эндоглиновых полипептидов для лечения или профилактики фиброзных нарушений. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения относятся к способам лечения или профилактики фиброзного нарушения у
нуждающегося в этом пациента. В некоторых вариантах осуществления
способ включает введение пациенту эффективного количества
эндоглинового полипептида, представленного в настоящем описании. В
некоторых вариантах осуществления используемый эндоглиновый
полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей
мере на 95% идентичную аминокислотам 42-333 SEQ ID N0: 1. В
некоторых вариантах осуществления фиброзное нарушение является
фиброзом печени, сосудистым фиброзом, легочным фиброзом, фиброзом
поджелудочной железы, фиброзом почек, скелетно-мышечным фиброзом,
фиброзом сердца, фиброзом кожи, фиброзом глаза, диффузной
склеродермией (PSS), хронической реакцией "трансплантат против
хозяина", болезнью Пейрони, постцистокопическим стенозом уретры,
ретроперитонеальным фиброзом, медиастинальным фиброзом,
прогрессирующим массивным фиброзом, пролиферативным фиброзом,
нефрогенным системным фиброзом, опухолевым фиброзом, болезнью
Дюпюитрена, стриктурами, фиброзом, индуцируемым радиацией,
кистозным фиброзом, плевральным фиброзом, саркоидозом,
склеродермией, повреждением/фиброзом спинного мозга,
миелофиброзом, рестенозом сосудов, атеросклерозом, инъекционным фиброзом (который может возникать как осложнение внутримышечных инъекций, особенно у детей) или осложнениями пневмокониоза у работников угольной промышленности. В некоторых вариантах осуществления фиброзное нарушение не является миелофиброзом. В некоторых вариантах осуществления фиброз печени является циррозом печени, алкогольным фиброзом печени, повреждением желчных протоков, первичным биллиарным циррозом, инфекционным фиброзом печени, врожденным фиброзом печени или аутоиммунным гепатитом. В некоторых вариантах осуществления инфекционный фиброз печени является бактериально-индуцированным или вирусно-индуцированным. В некоторых вариантах осуществления легочный фиброз является идиопатическим, фармакологически-индуцированным, индуцированным радиацией, хронической обструктивной болезнью легких (C0PD) или хронической астмой. В некоторых вариантах осуществления фиброз сердца является эндомиокардиальным фиброзом или идиопатической кардиомиопатией. В некоторых вариантах осуществления фиброз кожи
является склеродермией, посттравматическим, оперативным
рубцеванием кожи, келоидами или образованием кожных келоидов. В
некоторых вариантах осуществления фиброз глаза является глаукомой,
склерозом глаз, рубцеванием конъюнктивы, рубцеванием роговицы или
птеригиумом. В некоторых вариантах осуществления
ретроперитонеальный фиброз является идиопатическим,
фармакологически-индуцированным или индуцированным радиацией. В некоторых вариантах осуществления кистозный фиброз является кистозным фиброзом поджелудочной железы или кистозным фиброзом легких. В некоторых вариантах осуществления инъекционный фиброз возникает как осложнение внутримышечной инъекции.
В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид, применяемый для лечения фиброзного нарушения по настоящему изобретению, не включает последовательность, состоящую из аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, начинающейся с аминокислоты, соответствующей любому из положений 2 6-42 SEQ ID NO: 1 и заканчивающейся аминокислотой, соответствующей любому из положений 333-37 8 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам 2 6-34 6 SEQ ID NO: 1, аминокислотам 2 6-359 SEQ ID NO: 1 или аминокислотам 2 6-37 8 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид состоит из первой части, состоящей из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 95% идентичной аминокислотам 2 6-34 6 SEQ ID NO: 1, аминокислотам 26-359 SEQ ID NO: 1 или аминокислотам 26-378 SEQ ID NO: 1, и второй части, гетерологичной по отношению к SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления вторая часть эндоглинового полипептида содержит Fc-часть IgG. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид не включает более 50 последовательных аминокислот из последовательности, состоящей из аминокислот 379-586 SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид является димером или
мультимером более высокого порядка, содержащим два или более эндоглиновых полипептида, и, необязательно, может являться гомодимером, гетеродимером, гомомультимером или гетеромультимером.
В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид, применяемый для лечения фиброзного нарушения по настоящему изобретению, связывается с ВМР-9 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее lxlCT9 М или константой скорости диссоциации
(kd) менее 1x1 СГ3 с-1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-9 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1x1 СГ9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 5x1 СГ4 с-1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид связывается с BMP-10 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1х10~9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 5x10-3 с-1. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-10 человека с равновесной константой диссоциации
(KD) менее 1x10-9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 2,5х10~3 с-1. Необязательно эндоглиновый полипептид, отличающийся любым из указанных выше свойств связывания ВМР-9 или ВМР-10, является димером или мультимером более высокого порядка. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид не
связывается с TGF-131 человека, TGF-|33 человека, VEGF человека или основным фактором роста фибробластов человека (FGF-2). В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид является слитым белком, включающим, помимо части, содержащей аминокислотную последовательность эндоглина, одну или несколько полипептидных частей, повышающих оно или несколько из: стабильности in vivo, времени полужизни in vivo, захвата/введения, локализации или распределения в тканях, образования белковых комплексов, таких как димеры или мультимеры, и/или очистки. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид включает часть константного домена иммуноглобулина и/или часть сывороточного альбумина. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид содержит домен Fc иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления
домен Fc иммуноглобулина соединяют с полипептидной частью ENG с помощью линкера. В некоторых вариантах осуществления линкер состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID N0: 31 (TGGG) или GGG. В некоторых вариантах осуществления домены Fc образуют димер. В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатка, выбранных из: гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с остатком липида, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим средством.
В некоторых вариантах осуществления эндоглиновый полипептид вводят внутривенно, внутримышечно, внутриартериально, подкожно или перорально.
Настоящее изобретение частично относится к эндоглиновым полипептидам и применению таких эндоглиновых полипептидов в качестве селективных антагонистов ВМР9 и/или ВМР10. Как представлено в настоящем описании, полипептиды, содержащие часть или весь внеклеточный домен эндоглина (ECD), связываются с ВМР9 и ВМР10, не демонстрируя существенного связывания с другими членами суперсемейства TGF-бета. В настоящем описании показано, что полипептиды, содержащие часть или весь ECD эндоглина, являются эффективными антагонистами передачи сигнала ВМР9 и ВМР10 и действуют, ингибируя ангиогенез и рост опухоли in vivo. Таким образом, в определенных аспектах настоящее изобретение относится к эндоглиновым полипептидам как антагонистам ВМР9 и/или ВМР10 для применения в ингибировании ангиогенеза, а также других нарушений, ассоциированных с ВМР9 или ВМР10, представленных в настоящем описании.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим укороченный внеклеточный домен эндоглина, для применения в ингибировании ангиогенеза и лечении других ВМР9-или ВМР1О-ассоциированных нарушений. Не будучи связанными каким-либо конкретным механизмом действия, ожидают, что такие
полипептиды будут действовать, связывая ВМР9 и/или ВМР10 и
ингибируя способность этих лигандов образовывать сигнальные
комплексы с такими рецепторами, как ALK1, ALK2, ActRIIA, ActRIIB и
BMPRII. В определенных вариантах осуществления эндоглиновый
полипептид содержит, состоит или, по существу, состоит из
аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 7 0%, 8 0%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной
последовательности аминокислот 42-333, 26-346, 26-359 или 26-378
последовательности эндоглина человека SEQ ID NO: 1. Эндоглиновый
полипептид может содержать, состоять или, по существу, состоять из
аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 7 0%, 8 0%,
90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной
последовательности аминокислот, начинающейся с любого из положений
2 6-42 SEQ ID NO: 1 и заканчивающейся любым из положений 333-37 8
последовательности эндоглина человека SEQ ID NO: 1. Эндоглиновый
полипептид может содержать, состоять или, по существу, состоять из
полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, гибридизующейся в
менее строгих, строгих или очень строгих условиях с
последовательностью, комплементарной нуклеотидной
последовательности, выбранной из группы, состоящей из: нуклеотидов 537-1412 SEQ ID NO: 2, нуклеотидов 121-1035 SEQ ID NO: 30, нуклеотидов 121-1074 SEQ ID NO: 26, нуклеотидов 121-1131 SEQ ID NO: 24, нуклеотидов 73-1035 SEQ ID NO: 30, нуклеотидов 73-1074 SEQ ID NO: 26 и нуклеотидов 73-1131 SEQ ID NO: 24. В каждом из перечисленных выше случаев эндоглиновый полипептид можно выбирать так, чтобы он не включал полноразмерный ECD эндоглина (например, эндоглиновый полипептид можно выбирать так, чтобы он не включал последовательность аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1, или их часть, или любую дополнительную часть уникальной последовательности SEQ ID NO: 1) . Эндоглиновый полипептид можно использовать в качестве мономерного белка или в димеризованной форме. Эндоглиновый полипептид также можно подвергать слиянию со второй полипептидной частью для получения улучшенных свойств, таких как повышенное время полужизни или более высокая легкость получения или очистки. Слияние может являться прямым, или между эндоглиновым полипептидом
и любой другой частью можно встраивать линкер. Линкер может являться структурированным или неструктурированным и может состоять из 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 50 или более аминокислот, необязательно, с относительно свободной вторичной структурой. Линкер может быть богат остатками глицина и пролина и, например, может содержать последовательность из треонина/серина и глицинов (например, TGGG (SEQ ID NO: 31)) или просто один или несколько остатков глицина (например, GGG (SEQ ID NO: 32) . Для повышения времени полужизни эндоглинового полипептида в сыворотке при системном введении (например, внутривенном, интраартериальном и интраперитонеальном введении) особенно пригодным могут являться слияния с Fc-частью иммуноглобулина или соединение с остатком полиоксиэтилена (например, полиэтиленгликоля). В определенных вариантах осуществления слитый белок эндоглин-Fc содержит полипептид, содержащий, состоящий или, по существу, состоящий из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 7 0%, 8 0%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности аминокислот, начинающейся с любого из положений 2 6-42 SEQ ID NO: 1 и заканчивающейся любым из положений 333-37 8 последовательности эндоглина человека SEQ ID NO: 1, и, необязательно, может не включать полноразмерный ECD эндоглина (например, эндоглиновый полипептид можно выбирать так, чтобы он не включал последовательность аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1 или ее часть, или так, чтобы он не включал какие-либо 5, 10, 20, 30, 40, 50, 52, 60, 70, 100, 150 или 2 00 или более других аминокислот из любой части эндоглина или любой части аминокислот 379-581 SEQ ID NO: 1), где полипептид является слитым с Fc-частью иммуноглобулина с промежуточным линкером или без него. Эндоглиновый полипептид, включающий слитый белок эндоглин-Fc, может связываться с ВМР9 и/или ВМР10 с KD менее 10~8 М, 10~9 М, 10~10 М, 10"11 М или менее или константой диссоциации (kd) менее 10~3 с-1, Зх10~3 с-1, 5х10~3 с-1 или 1x10-4 с-1. Можно выбирать эндоглиновый полипептид, имеющий KD к ВМР9 меньше KD к ВМР10, необязательно, меньше в 5, 10, 20, 30, 40 раз или более. Эндоглиновый полипептид может иметь небольшую аффинность или не иметь значительной аффинности к любому или всем
из TGF-pi, - Р2 или - Р3 и может иметь KD к любому или всем из TGF-Pl, -Р2 или -|33 более 1(Г9 М, 10~8 М, 1 СГ7 М или 1 СГ6 М. Эндоглиновый полипептид может являться димером или мультимером более высокого порядка.
Fc-часть можно выбирать таким образом, чтобы она соответствовала организму. Необязательно, Fc-часть является Fc-частью IgGl человека. Необязательно, слитый белок эндоглин-Fc содержит аминокислотную последовательность любой из SEQ ID N0: 33, 34, 35 или 36. Необязательно, слитый белок эндоглин-Fc является белком, получаемым посредством экспрессии нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID N0: 17, 20, 22, 24, 26, 28 или 30 в линии клеток млекопитающего, в частности, линии клеток китайского хомяка (СНО). Эндоглиновый полипептид можно составлять в виде фармацевтического препарата, по существу, апирогенного. Можно получать фармацевтический препарат для системной доставки (например, внутривенной, внутримышечной, интраартериальной или подкожной доставки) или местной доставки (например, в глаз).
Эндоглиновые полипептиды, представленные в настоящем
описании, можно использовать совместно или последовательно с одним
или несколькими дополнительными терапевтическими средствами,
включая, например, антиангиогенные средства, антагонисты VEGF,
антитела против VEGF, противоопухолевые композиции,
цитотоксические средства, химиотерапевтические средства,
противогормональные средства и ингибирующие рост средства. Дополнительные примеры каждой из указанных выше категорий молекул представлены в настоящем описании.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза у млекопитающего посредством введения какого-либо из эндоглиновых полипептидов, представленных в настоящем описании в целом или конкретно. Эндоглиновый полипептид можно доставлять местно (например, в глаз) или системно (например, внутривенно, внутримышечно, внутриартериально или подкожно). В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования ангиогенеза в глазу млекопитающего посредством введения эндоглинового полипептида
млекопитающему в место, дистальное относительно глаза, например, посредством системного введения.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к
способам лечения опухоли у млекопитающего. Такой способ может
включать введение млекопитающему, имеющему опухоль, эффективного
количества эндоглинового полипептида. Способ дополнительно может
включать введение одного или нескольких дополнительных средств,
включая, например, антиангиогенные средства, антагонисты VEGF,
антитела против VEGF, противоопухолевые композиции,
цитотоксические средства, химиотерапевтические средства,
противогормональные средства и ингибирующие рост средства. Опухоль также может являться опухолью, использующей множество проангиогенных факторов, такой как опухоль, резистентная к терапии против VEGF.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения пациентов, имеющих нарушение, связанное с ВМР9 или ВМР10. Примеры таких нарушений представлены в настоящем описании, и, как правило, они могут включать нарушения сосудистого русла, гипертензию и фиброзные нарушения.
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к офтальмологическим составам. Такие составы могут содержать эндоглиновый полипептид, представленный в настоящем описании. В определенных аспектах настоящее изобретение относится к способам лечения фиброзного заболевания глаза или заболевания глаза, связанного с ангиогенезом. Такие способы могут включать системное введение или введение в указанный глаз фармацевтического состава, содержащего эффективное количество эндоглинового полипептида, представленного в настоящем описании.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигуре 1 показана нативная аминокислотная
последовательность ENG человека, изоформа 1 (L-ENG). Подчеркнуты лидерная последовательность (остатки 1-25) и предсказанный трансмембранный домен (остатки 58 7-611).
На фигуре 2 показана нативная нуклеотидная
последовательность, кодирующая ENG человека, изоформу 1 (L-ENG).
Подчеркнуты последовательности, кодирующие лидерную
последовательность (нуклеотиды 414-488) и предсказанный
трансмембранный домен (нуклеотиды 2172-2246).
На фигуре 3 показана нативная аминокислотная последовательность ENG человека, изоформа 2 (S-ENG). Подчеркнуты лидерная последовательность (остатки 1-25) и предсказанный трансмембранный домен (остатки 587-611). По сравнению с изоформой 1, изоформа 2 имеет более короткий и отличающийся С-конец, но последовательность внеклеточного домена (см. фигуру 9) является идентичной.
На фигуре 4 показана нативная нуклеотидная
последовательность, кодирующая ENG человека, изоформу 2 (S-ENG).
Подчеркнуты последовательности, кодирующие лидерную
последовательность (нуклеотиды 414-488) и предсказанный
трансмембранный домен (нуклеотиды 2172-2246).
На фигуре 5 показана нативная аминокислотная последовательность ENG мыши, изоформа 1 (L-ENG). Подчеркнуты лидерная последовательность (остатки 1-26) и предсказанный трансмембранный домен (остатки 582-606), а внеклеточный домен зрелого пептида выделен квадратными скобками (см. фигуру 10). Изоформа 3 ENG мыши (инвентарный номер GenBank NM_001146348) отличается от представленной последовательности только лидерной последовательностью, в которой треонин в положении 23 (выделен) подвергнут делеции и есть замена глицина серином в положении 2 4 (также выделена).
На фигуре 6 показана нативная нуклеотидная
последовательность, кодирующая ENG мыши, изоформу 1 (L-ENG).
Подчеркнуты последовательности, кодирующие лидерную
последовательность (нуклеотиды 364-441) и предсказанный трансмембранный домен (нуклеотиды 2107-2181) . Нуклеотидная последовательность, кодирующая изоформу 3 ENG мыши (инвентарный номер GenBank NM_001146348), отличается от представленной последовательности только лидерной последовательностью, особенно в положениях 430-433 (выделены).
На фигуре 7 показана нативная аминокислотная
последовательность ENG мыши, изоформа 2 (S-ENG). Подчеркнуты лидерная последовательность (остатки 1-26) и предсказанный трансмембранный домен (остатки 582-606). По сравнению с изоформой 1, изоформа 2 имеет более короткий и отличающийся С-конец, но последовательность внеклеточного домена (см. фигуру 10) является идентичной.
На фигуре 8 показана нативная нуклеотидная
последовательность, кодирующая ENG мыши, изоформу 2 (S-ENG).
Подчеркнуты последовательности, кодирующие лидерную
последовательность (нуклеотиды 364-441) и предсказанный трансмембранный домен (нуклеотиды 2107-2181).
На фигуре 9 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена ENG человека. Внеклеточные домены двух изоформ человека идентичны по аминокислотной и нуклеотидной последовательности.
На фигуре 10 показана аминокислотная последовательность внеклеточного домена ENG мыши, на 69% идентичного его аналогу у человека. Внеклеточные домены двух изоформ мыши идентичны по аминокислотной и нуклеотидной последовательности.
На фигуре 11 показана аминокислотная последовательность домена Fc IgGl человека. Подчеркнутые остатки являются необязательными участками мутаций, как описано в тексте.
На фигуре 12 показана укороченная с N-конца аминокислотная последовательность домена Fc IgGl человека. Подчеркнутые остатки являются необязательными участками мутаций, как описано в тексте.
На фигуре 13 показана аминокислотная последовательность
hENG(26-58 б)-hFc. Подчеркнут домен ENG, лидерная
последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 14 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-58 б)-hFc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, нуклеотиды, кодирующие лидерную последовательность ТРА, подчеркнуты двойной линией, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 15 показана аминокислотная последовательность
hENG(26-58 б)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнут домен ENG, лидерная последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 16 показана аминокислотная последовательность
mENG(27-581)-mFc. Подчеркнут домен ENG, лидерная
последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 17 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая mENG(27-581)-mFc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, нуклеотиды, кодирующие лидерную последовательность ТРА, подчеркнуты двойной линией, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 18 показано определение характеристик связывания ВМР-9 с hENG(26-58 б)-hFc, как определяли с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Связывание ВМР-9 с иммобилизованным hENG(26-58б)-hFc оценивали при концентрациях лиганда 0 и 0,01-0,625 нМ (с двукратными повышениями, за исключением 0,3125 нМ) и использовали нелинейную регрессию для определения KD как 2 9 пМ.
На фигуре 19 показано определение характеристик связывание ВМР-10 с hENG(26-58 б)-hFc, как определяли с помощью анализа на основе SPR. Связывание ВМР-10 с иммобилизованным hENG(26-58б)-hFc оценивали при концентрациях лиганда 0 и 0,01-1,25 нМ (с двукратными повышениями) и использовали нелинейную регрессию для определения KD как 4 00 пМ.
На фигуре 20 показан эффект растворимого внеклеточного домена ENG человека, hENG(26-58б) , в отношении связывания ВМР-9 с ALK1. Концентрации hENG(26-586) 0-50 нМ предварительно смешивали с фиксированной концентрацией ВМР-9 (10 нМ) и определяли связывание ВМР-9 с иммобилизованным ALK1 с помощью анализа на основе SPR. Преобладающий след соответствует отсутствию hENG(26-58 б), в то время как наименьший след соответствует соотношению ENG:BMP-9 5:1. Связывание ВМР-9 с ALK1 ингибировалось растворимым hENG(26-586) в зависимости от концентрации с IC50 9,7 нМ.
На фигуре 21 показан эффект растворимого внеклеточного домена ENG человека, hENG(26-58б) , в отношении связывания ВМР-10 с ALK1. Концентрации hENG(26-586) 0-50 нМ предварительно смешивали с фиксированной концентрацией ВМР-10 (10 нМ) и измеряли связывание ВМР-10 с иммобилизованным ALK1 с помощью анализа на основе SPR. Преобладающий след соответствует отсутствию hENG(26-58 б), и наименьший след соответствует соотношению ENG:BMP-10 5:1. Связывание ВМР-10 с ALK1 ингибировалось растворимым hENG(26-586) в зависимости от концентрации с IC50 6,3 нМ.
На фигуре 22 показан эффект mENG(27-581)-hFC в отношении образования тяжа эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) в культуре. Данные представляют собой средние значения для двух параллельных культур +SD. Индуктор, стимулятор роста эндотелиальных клеток (ECGS), удваивал среднюю длину тяжа по сравнению с отсутствием обработки, и mENG(27-581)-hFc сокращает это повышение на приблизительно 60%. В отсутствие стимуляции (без обработки) mENG(27-581)-hFc имеет низкий эффект.
На фигуре 23 показан эффект mENG(27-581)-hFc в отношении ангиогенеза, стимулируемого VEGF, в анализе хориоаллантоиновой мембраны куриного яйца (САМ). Данные представляют собой средние значения +SEM; *р <0,05. Количество дополнительных кровеносных сосудов, индуцируемых обработкой VEGF, снижалось на 65% при конкурентной обработке mENG(27-581)-hFc.
На фигуре 24 показан эффект обработки mENG(27-581)-mFc в течение 11 дней в отношении ангиогенеза, стимулируемого комбинацией факторов роста (GF) фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и основного фактора роста фибробластов (FGF-2) в анализе ангиореактора мыши. Ангиогенез в единицах относительной флуоресценции ±SEM; *р <0,05. mENG(27-581)-mFc полностью блокировал ангиогенез, стимулируемый GF, в этом анализе in vivo.
На фигуре 25 показана доменная структура слитых конструкций hENG-Fc. Полноразмерный внеклеточный домен ENG (остатки 2 6-58 6 в верхней структуре) состоит из орфанного домена и N-концевых и С-концевых доменов zona pellucida (ZP). Под ней представлена
структура выбранных укороченных вариантов и то, проявляют ли они высокоаффинное связывание (+/-) с ВМР-9 и ВМР-10 в анализе на основе SPR.
На фигуре 26 показана аминокислотная последовательность
hENG(26-437)-hFc. Подчеркнут домен ENG, лидерная
последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 27 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-437)-hFc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, нуклеотиды, кодирующие лидерную последовательность ТРА, подчеркнуты двойной линией, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 28 показана аминокислотная последовательность hENG(26-378)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнут домен ENG, лидерная последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 29 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-378)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 30 показана аминокислотная последовательность
hENG(26-359)-hFc . Подчеркнут домен ENG, лидерная
последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 31 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-359)-hFc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, нуклеотиды, кодирующие лидерную последовательность ТРА, подчеркнуты двойной линией, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 32 показана аминокислотная последовательность hENG(26-359)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнут домен ENG, лидерная последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и
выделены.
На фигуре 33 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-359)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, нуклеотиды, кодирующие лидерную последовательность ТРА, подчеркнуты двойной линией, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 34 показана аминокислотная последовательность hENG(26-34 б)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнут домен ENG, лидерная последовательность ТРА подчеркнута двойной линией, и последовательности линкера приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 35 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-34 б)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc. Подчеркнуты нуклеотиды, кодирующие домен ENG, и нуклеотиды, кодирующие последовательности линкера, приведены жирным шрифтом и выделены.
На фигуре 36 показаны эксклюзионные хроматограммы hENG(26586)-hFc (A), hENG(26-359)-hFc (В) и hENG(26-346)-hFc (С) после очистки соответствующих белков, полученных из клеток СНО, с помощью аффинной хроматографии с протеином А. Процент выделения мономерного hENG(26-34б)-hFc равен таковому в случае hENG(26-58б)-hFc. Напротив, выделение мономерного hENG(26-359)-hFc снижалось в присутствие дополнительных высокомолекулярных агрегатов, таким образом, требуя дополнительных способов для достижения чистоты, эквивалентной чистоте для других конструкций.
На фигуре 37 показано определение кинетических характеристик связывания ВМР-9 с hENG(26-586)-hFc (A), hENG(26-359)-hFc (В) и hENG(26-34 б)-hFc (С), как определяли в анализе на основе SPR. Связывание ВМР-9 с иммобилизованными белками, полученными из клеток СНО, оценивали при концентрациях лиганда 0,0195-0,625 нМ с двукратными повышениями. RU, единицы ответа. Необходимо отметить более низкие скорости обратной реакции для укороченных вариантов по сравнению с hENG(26-58б)-hFc.
На фигуре 38 показан эффект hENG(26-359)-hFc в отношении
ангиогенеза, стимулируемого VEGF, в анализе САМ. Данные представляют собой средние значения +SEM; *р <0,05. Количество дополнительных кровеносных сосудов, индуцируемых обработкой VEGF, снижалось на 75% при конкурентной обработке hENG(26-359)-hFc, хотя hENG(26-359)-hFc не связывается с VEGF.
На фигуре 39 показан эффект обработки hENG(26-34 б)-hFc в течение 11 дней в отношении ангиогенеза, стимулируемого комбинацией факторов роста (GF) VEGF и FGF-2 в анализе ангиореактора мыши. А. Ангиогенез в единицах относительной флуоресценции ±SEM; *р <0,05. В. Фотографии отдельных ангиореакторов (четыре на мышь), распределенных по исследуемым группам, с образованием кровеносного сосуда, видимым в виде затененных включений. Хотя сам по себе он неспособен связываться с VEGF или FGF-2, в этом анализе in vivo hENG(26-34 б)-hFc полностью блокировал ангиогенез, стимулируемый GF.
На фигуре 40 показан эффект mENG(27-581)-mFc в отношении роста ксенотрансплантатов опухоли молочной железы 4Т1 у мышей. Данные представляют собой средние значения +SEM. Ко дню 2 4 после имплантации объем опухоли составлял на 45% меньше (р <0,05) у мышей, которым вводили mENG(27-581)-mFc, по сравнению с наполнителем.
На фигуре 41 показан эффект mENG(27-581)-mFc в отношении роста ксенотрансплантатов опухоли Со1оп-2б у мышей. Обработка mENG(27-581)-mFc ингибировала рост опухоли дозозависимым образом, при этом объем опухоли в группе высокой дозы составлял на приблизительно 70% меньше, чем в случае наполнителя, ко дню 58 после имплантации.
На фигуре 42 показана печень как % массы тела в модели фиброза печени мыши СС14 с введением эндоглина (mENG(27-581)-mFc) или без него.
На фигуре 43 показано окрашивание ткани печени гематоксилин-эозином у ложно-инъецированных мышей (PBS).
На фигуре 44 показано окрашивание ткани печени гематоксилин-эозином у мышей, которым инъецировали mENG(27-581)-mFc.
На фигуре 45 показано окрашивание ткани печени трихромом по Массону у мышей с индуцированной СС14.
На фигуре 4 6 показано окрашивание ткани печени масляным красным О у СС14-индуцированных мышей, которым инъецировали PBS или mENG(27-581)-mFc. Животные, которым вводили mENG(2 7-581)-mFc, имели наименьшую процентную долю печеней с обширным положительным окрашиванием масляным красным О.
На фигуре 47 показаны уровни щелочной фосфатазы в сыворотке у СС14-индуцированных и ложно-индуцированных (оливковым маслом) мышей, которым вводили mENG(27-581)-mFc или PBS. АР в сыворотке была более низкой в когортах, которым вводили эндоглин.
На фигуре 48 показан эффект введения ENG-Fc в отношении печеночного депонирования липидов у мышей MCDD, модели фиброза печени, вызываемого пищевой недостаточностью метионина и холина. По сравнению с наполнителем (А, С), введение mENG(27-581)-mFc в течение 3 недель значительно снижало печеночное депонирование липидов (В, D) у мышей MCDD. Отложения липидов идентифицировали по интенсивному окрашиванию масляным красным О, растворимым в липидах диазокрасителем. Увеличение в 100 раз (А, В) и 200 раз (С, D).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Обзор
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к полипептидам ENG. ENG (также известный как CD105) обозначают как корецептор лигандов суперсемейства трансформирующего фактора роста-р (TGF-P) , и он участвует в нормальном и патологическом фиброзе и ангиогенезе. Экспрессия ENG является низкой в покоящемся сосудистом эндотелии, но повышающе регулируется в эндотелиальных клетках заживающих ран, развивающихся эмбрионов, воспаленных тканях и солидных опухолях (Dallas et al, 2008, Clin Cancer Res 14:1931-1937). Мыши, гомозиготные по нулевым аллелям ENG, умирают рано в период беременности по причине дефектного развития сосудов (Li et al, 1999, Science 284:1534-1537), в то время как мыши, гетерозиготные по нулевому аллелю ENG, демонстрируют аномалии ангиогенеза во взрослом возрасте (Jerkic et al, 2006, Cardiovasc Res 69:845-854). У людей идентифицированы мутации гена ENG,
являющиеся причиной наследственной геморрагической телеангиэктазии
(болезни Рандю-Вебера-Ослера) типа-1 (ННТ-1), аутосомно-
доминантной формы сосудистой дисплазии, отличающейся
артериовенозными мальформациями, приводящими к прямому току (соединению) артерии с веной (артериовенозному шунту) без участия капиллярного русла (McAllister et al, 1994, Nat Genet 8:345-351; Fernandez-L et al, 2006, Clin Med Res 4:66-78) . Типичные симптомы у пациентов с ННТ включают рецидивирующий повторяющийся время от времени эпистаксис, желудочно-кишечное кровотечение, кожные и кожно-слизистые телеангиэктазы и артериовенозные мальформации в легочном, мозговом или печеночном сосудистом русле.
Хотя конкретную роль ENG в фиброзе и ангиогенезе еще предстоит определить, вероятно, она связана со значительной ролью системы передачи сигнала TGF-|3 в этом процессе (Cheifetz et al, 1992, J Biol Chem 267:19027-19030; Pardali et al, 2010, Trends Cell Biol 20:556-567) . Примечательно, что экспрессия ENG повышающе регулируется в пролиферирующих клетка эндотелия сосудов в опухолевых тканях (Burrows et al, 1995, Clin Cancer Res 1:16231634; Miller et al, 1999, Int J Cancer 81:568-572), и количество экспрессирующих ENG кровеносных сосудов в опухоли отрицательно коррелирует с выживаемостью для широкого диапазона опухолей человека (Fonsatti et al, 2010, Cardiovasc Res 86:12-19). Таким образом, ENG является многообещающей мишенью для антиангиогенной терапии в целом и для злокачественных новообразований в частности (Dallas et al, 2008, Clin Cancer Res 14:1931-1937; Bernabeu et al, 2009, Biochim Biophys Acta 1792:954-973).
Структурно ENG является гомодимерным гликопротеином поверхности клетки. Он принадлежит к семейству белков zona pellucida (ZP) и состоит из короткого С-концевого цитоплазматического домена, одного гидрофобного трансмембранного домена и длинного внеклеточного домена (ECD) (Gougos et al, 1990, J Biol Chem 2 65:83 61-83 64) . Как определяли с помощью электронной микроскопии, мономерный ECD ENG состоит из двух областей ZP и орфанного домена, локализованного на N-конце (Llorca et al, 2007, J Mol Biol 3 65:694-7 05). У людей альтернативный сплайсинг
первичного транскрипта приводит к образованию двух изоформ ENG, одна из которых состоит из 658 остатков (длинная, L, SEQ ID N0: 1), и а другая - из 625 остатков (короткая, S, SEQ ID N0: 3), отличающихся только их цитоплазматическим доменом (Bellon et al,
1993, 23:2340-2345; ten Dijke et al, 2008, Angiogenesis 11:79-89).
ENG мыши существует в виде трех изоформ: L-ENG (SEQ ID N0: 5), S-
ENG (SEQ ID NO: 7) и третьего варианта (изоформы 3) с неизвестным
функциональным значением, идентичной L-ENG, за исключением
изменений в двух положениях в лидерной последовательности (Perez-
Gomez et al, 2005, Oncogene 24:4450-44 61). ECD ENG мыши
демонстрирует идентичность аминокислот 69% по отношению к таковому
в ENG человека, и в нем отсутствует интегриновый мотив
взаимодействия Arg-Gly-Asp (RGD), обнаруживаемый в белке человека.
Недавно полученные данные позволяют предполагать, что изоформы L-
ENG и S-ENG могут играть разные функциональные роли in vivo
(Blanco et al, 2008, Circ Res 103:1383-1392; ten Dijke et al,
2008, Angiogenesis 11:79-89).
Считают, что в качестве корецептора ENG модулирует ответы других рецепторов на лиганды семейства TGF-р без прямого опосредования передачи сигнала самого лиганда. Лиганды семейства TGF-p, как правило, передают сигнал посредством связывания с гомодимерным рецептором типа II, запускающим рекрутирование и трансфосфорилирование гомодимерного рецептора типа I, таким образом, приводя к фосфорилированию белков Smad, отвечающих за активацию транскрипции конкретных генов (Massague, 2000, Nat Rev Mol Cell Biol 1:169-178). С учетом анализа эктопической клеточной экспрессии, сообщалось, что ENG не может связываться с лигандами самостоятельно, и что для его связывания с TGF-pi, TGF-рз, активином А, морфогенетическим белком кости-2 (ВМР-2) и ВМР-7 необходимо наличие соответствующего рецептора типа I и/или типа II (Barbara et al, 1999, J Biol Chem 274:584-594). Как бы то ни было, есть доказательство того, что ENG, экспрессируемый клеточной линией фибробластов, может связываться с TGF-pi (St.-Jacques et al,
1994, Endocrinology 134:2 645-2 657), и результаты, полученные
недавно с помощью клеток COS, свидетельствуют о том, что трансфицированный полноразмерный ENG может связываться с ВМР-9 в отсутствие трансфицированных рецепторов типа I или типа II (Scharpfenecker et al, 2007, J Cell Sci 120:964-972).
В дополнение к изложенному выше, ENG может находиться в растворимой форме in vivo в конкретных условиях после протеолитического расщепления полноразмерного мембраносвязанного белка (Hawinkels et al, 2010, Cancer Res 70:4141-4150). Наблюдали повышенные уровни растворимого ENG в кровотоке пациентов со злокачественными новообразованиями и преэклампсией (Li et al, 2000, Int J Cancer 89:122-126; Calabro et al, 2003, J Cell Physiol 194:171-175; Venkatesha et al, 2006, Nat Med 12:642-649; Levine et al, 2006, N Engl J Med 355:992-1005). Хотя роль эндогенного растворимого ENG плохо понятна, предполагают, что белок, соответствующий остаткам 26-437 предшественника ENG (аминокислотам 26-437 SEQ ID NO: 1), действует как скавенджер или ловушка для лигандов семейства TGF-|3 (Venkatesha et al, 2006, Nat Med 12:642649; WO-2007/143023) , из которых лишь TGF-|3l и TGF-|33 специфически вовлечены в этот процесс.
Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим укороченную часть внеклеточного домена ENG, селективно связывающимся с ВМР9 и/или ВМР10 и которые могут действовать как антагонисты ВМР9 и/или ВМР10, имеющим полезные свойства относительно полноразмерного внеклеточного домена и которые можно использовать для ингибирования фиброза. Настоящее изобретение частично относится к особенности физиологических, высокоаффинных лигандов для растворимых полипептидов ENG. Неожиданно, в настоящем описании показано, что растворимые полипептиды ENG обладают высокоспецифичным, высокоаффинным связыванием с ВМР-9 и ВМР-10, в то же время не проявляя какого-либо значимого связывания с TGF-|3l, TGF-|32 или TGF-рз, и, кроме того, в настоящем описании показано, что растворимые полипептиды ENG ингибируют взаимодействие ВМР9 и ВМР10 с рецепторами типа II, таким образом, ингибируя передачу клеточного сигнала. В описании также показано, что полипептиды ENG
ингибируют фиброз. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что полипептид ENG может иметь антиангиогенный эффект несмотря на обнаружение того, что полипептид ENG не проявляет значимое связывание с TGF-|3l, TGF-|33, VEGF или FGF-2.
Таким образом, в определенных аспектах настоящее изобретение относится к эндоглиновым полипептидам как антагонистам ВМР-9 или ВМР-10 для применения в ингибировании какого-либо нарушения, связанного с ВМР-9 или ВМР-10, в целом и в ингибировании фиброза и/или ангиогенеза в частности, включая VEGF-зависимый ангиогенез и VEGF-независимый ангиогенез. Однако, следует отметить, что ожидают, что антитела против самого ENG будут иметь другие эффекты полипептида ENG. Ожидают, что пан-нейтрализующее антитело против ENG (ингибирующее связывание всех сильных и слабых лигандов) будет ингибировать передачу сигнала таких лигандов через ENG, но не будет ингибировать способность таких лигандов передавать сигнал через другие рецепторы (например, ALK-1, ALK-2, BMPRII, ActRIIA или ActRIIB в случае ВМР-9 или ВМР-10). Также следует отметить, что, учитывая существование циркулирующих нативных растворимых полипептидов ENG, которые, учитывая представленные в настоящем описании данные, предположительно, действуют как природные антагонисты BMP-9/10, не ясно, будет ли нейтрализующее антитело против ENG, главным образом, ингибировать мембраносвязанную форму ENG (таким образом, действуя как антагонист ENG/BMP-9/10) или растворимую форму ENG (таким образом, действуя как агонист ENG/BMP-9/10). С другой стороны, с учетом настоящего описания, ожидают, что полипептид ENG будет ингибировать все лиганды, с которыми он сильно связывается (включая ВМР-9 или ВМР-10 в случае конструкций, таких как описанные в примерах), но не будет влиять на лиганды, с которыми он слабо связывается. Таким образом, хотя пан-нейтрализующее антитело против ENG будет блокировать передачу сигнала ВМР-9 и ВМР-10 через ENG, оно не будет блокировать передачу сигнала ВМР-9 или ВМР-10 через другой рецептор. Кроме того, хотя полипептид ENG может ингибировать передачу сигнала ВМР-9 через все рецепторы (включая рецепторы помимо ENG), ожидают, что он будет ингибировать передачу сигнала слабо связывающегося
лиганда через любой рецептор, даже ENG.
Если не указано иначе, белки, представленные в настоящем
описании, являются человеческими формами. Ссылки Genbank для
белков являются следующими: изоформа 1 ENG человека (L-ENG),
NM_001114753; изоформа 2 ENG человека (S-ENG), NM_000118; изоформа
1 ENG мыши (L-ENG), NM_007932; изоформа 2 ENG мыши (S-ENG),
NM_001146350; изоформа 3 ENG мыши, NM_001146348.
Последовательности нативных белков ENG человека и мыши приведены на фигурах 1-8.
Термины, используемые в настоящем описании, как правило, имеют значения, общепринятые в этой области, в контексте настоящего описания и в конкретном контексте, в котором используют каждый термин. Конкретные термины представлены в описании для обеспечения дополнительного руководства для практикующего специалиста в описании композиций и способов, представленных в настоящем описании, и их получении и применении. Объем или значение любого использования термина будут очевидны из конкретного контекста, в котором используют термин.
2. Терапевтические способы и применение полипептидов ENG
Фиброз и фиброзные нарушения
Некоторые аспекты настоящего изобретения основаны на неожиданном наблюдении того, что полипептиды ENG можно применять для ингибирования и/или лечения фиброзных нарушений. Настоящее изобретение относится к способам ингибирования фиброза у млекопитающего посредством введения эффективного количества полипептида ENG, например, полипептида ENG, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам 42-333 SEQ ID N0: 1, включая слитый белок ENG-Fc или антагонисты нуклеиновой кислоты (например, антисмысловую или миРНК) указанного выше. Эти полипептиды ENG, слитые белки ENG-Fc и антагонисты нуклеиновой кислоты в настоящем описании в совокупности обозначают как "терапевтические средства".
В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к полипептидам ENG и способам применения таких полипептидов, применимых в лечении, ингибировании или профилактике
фиброза. Как применяют в настоящем описании, термин "фиброз" относится к аномальному образованию или развитию избыточной волокнистой соединительной ткани клетками в органе или ткани. Хотя процессы, относящиеся к фиброзу, могут возникать как часть образования нормальной ткани или заживления, дисрегуляция этих процессов может приводить к изменению клеточного состава и избыточному депонированию соединительной ткани, постепенно нарушающему функционирование ткани или органа. Образование волокнистой ткани может являться результатом репаративного или реактивного процесса.
Фиброзные нарушения или состояния, которые можно лечить
полипептидами ENG и терапевтическими способами с применением таких
полипептидов по настоящему изобретению, включают, в качестве
неограничивающих примеров, фибрознопролиферативные нарушения,
связанные с сердечно-сосудистыми заболеваниями, такими как
заболевание сердца, заболевание мозга и заболевание периферических
сосудов, а также систем тканей и органов, включая сердце, кожу,
почки, легкие, брюшную полость, кишечник и печень (как описано,
например, в Wynn, 2004, Nat Rev 4:583-594, включенном в настоящее
описание посредством ссылки). Примеры нарушений, которые можно
лечить, включают, в качестве неограничивающих примеров, фиброз
почек, включая нефропатии, ассоциированные с травмой/фиброзом,
например, хронические нефропатии, ассоциированные с диабетом
(например, диабетическую нефропатию), волчанку, склеродермию,
гломерулонефрит, фокально-сегментарный гломерулосклероз и IgA-
нефропатию; легочный фиброз, например, идиопатический легочный
фиброз, фиброз, индуцируемый радиацией, хроническую обструктивную
болезнь легких (COPD), склеродермию и хроническую астма; фиброз
кишечника, например, склеродермию и фиброз кишечника,
индуцированный радиацией; фиброз печени, например, цирроз,
алкогольный фиброз печени, повреждение желчных протоков, первичный
биллиарный цирроз, фиброз печени, индуцируемый инфекцией или
вирусом, врожденный фиброз печени и аутоиммунный гепатит; и другие
фиброзные состояния, такие как кистозный фиброз,
эндомиокардиальный фиброз, медиастинальный фиброз, плевральный
фиброз, саркоидоз, склеродермия, повреждение/фиброз спинного мозга, миелофиброз, рестеноз сосудов, атеросклероз, кистозный фиброз поджелудочной железы и легких, инъекционный фиброз (который может возникать как осложнение внутримышечных инъекций, особенно у детей), эндомиокардиальный фиброз, идиопатический легочный фиброз, медиастинальный фиброз, миелофиброз, ретроперитонеальный фиброз, прогрессирующий массивный фиброз, осложнение пневмокониоза у работников угольной промышленности и нефрогенный системный фиброз.
Как применяют в настоящем описании, термины "фиброзное
нарушение", "фиброзное состояние" и "фиброзное заболевание"
взаимозаменяемо используют в отношении нарушения, состояния или
заболевания, отличающегося фиброзом. Примеры фиброзных нарушений
включают, в качестве неограничивающих примеров, сосудистый фиброз,
легочный фиброз (например, идиопатический легочный фиброз), фиброз
поджелудочной железы, фиброз печени (например, цирроз), фиброз
почек, скелетно-мышечный фиброз, фиброз сердца (например,
эндомиокардиальный фиброз, идиопатическую кардиомиопатию), фиброз
кожи (например, склеродермию, посттравматическое, оперативное
рубцевание кожи, келоиды и образование келоидов кожи), фиброз
глаза (например, глаукому, склероз глаз, рубцевание конъюнктивы и
роговицы и птеригиум), диффузную склеродермию (PSS), хроническую
реакцию "трансплантат против хозяина", болезнь Пейрони,
постцистокопический стеноз уретры, идиопатический и
фармакологически-индуцированный ретроперитонеальный фиброз,
медиастинальный фиброз, прогрессирующий массивный фиброз, пролиферативный фиброз и опухолевый фиброз.
Как применяют в настоящем описании, термин "клетка" относится к любой клетке, подверженной фиброзному ответу, включая, в качестве неограничивающих примеров, отдельные клетки, ткани и клетки в тканях и органах. Как применяют в настоящем описании, термин "клетка" включает саму клетку, а также внеклеточный матрикс (ЕСМ), окружающий клетку. Например, ингибирование фиброзного ответа клетки включает, в качестве неограничивающих примеров ингибирование фиброзного ответа одной или нескольких клеток в легком (или ткани легкого); одной или нескольких клеток в печени
(или ткани печени); одной или нескольких клеток в почке (или ткани почки); одной или нескольких клеток в мышечной ткани; одной или нескольких клеток в сердце (или ткани сердца); одной или нескольких клеток в поджелудочной железе; одной или нескольких клеток в коже; одной или нескольких клеток в кости, одной или нескольких клеток в сосудистом русле, одной или нескольких стволовых клеток или одной или нескольких клеток в глазу.
Способы и композиции по настоящему изобретению можно применять для лечения и/или профилактики фиброзных нарушений. Примеры типов фиброзных нарушений включают, в качестве неограничивающих примеров, сосудистый фиброз, легочный фиброз
(например, идиопатический легочный фиброз), фиброз поджелудочной
железы, фиброз печени (например, цирроз), фиброз почек, скелетно-
мышечный фиброз, фиброз сердца (например, эндомиокардиальный
фиброз, идиопатическую кардиомиопатию), фиброз кожи (например,
склеродермию, посттравматическое, оперативное рубцевание кожи,
келоиды и образование келоидов кожи), фиброз глаза (например,
глаукому, склероз глаз, рубцевание конъюнктивы и роговицы и
птеригиум), диффузную склеродермию (PSS), хроническую реакцию
"трансплантат-против-хозяина", болезнь Пейрони,
постцистокопический стеноз уретры, идиопатический и
фармакологически-индуцированный ретроперитонеальный фиброз,
медиастинальный фиброз, прогрессирующий массивный фиброз, пролиферативный фиброз, опухолевый фиброз, болезнь Дюпюитрена, стриктуры и фиброз, индуцируемый радиацией. В конкретном варианте осуществления фиброзное нарушение не является миелофиброзом.
Способы и композиции по настоящему изобретению можно применять для лечения и/или профилактики нарушения печени, проявляющихся фиброзом печени или приводящих к нему, включая неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), неалкогольный стеатогепатит (NASH) и острые фиброзные нарушения, которые могут являться результатом длительного избыточного потребления алкоголя, холестаза, аутоиммунные болезни печени, избыток железа или меди и хронический вирусный гепатит. NAFLD является результатом метаболических состояний ожирения и диабета типа 2. Пациенты с
NAFLD могут проявлять диапазон гистопатологических признаков, включая от отдельного стеатоза (жировой инфильтрации печени) до некровоспаления, часто обозначаемого как NASH. NAFLD и NASH у пациентов могут прогрессировать до состояний фиброза на более поздней стадии, включая фиброз на поздней стадии и цирроз. У пациентов с NASH развивается прогрессирующий фиброз в 25%-50% в течение периода от 4 до б лет, и NASH у 15%-25% индивидуумов может прогрессировать до цирроза. Цирроз при NASH является основной причиной трансплантации печени в США и связан с повышенным риском печеночноклеточной карциномы и смертностью среди пациентов, ожидающих трансплантацию печени. Алкоголизм и вирусная инфекция также могут вызывать повреждение печени, прогрессирующее до фиброза печени и цирроза. Можно использовать множество инструментов для оценки состояния печени и прогрессирования фиброзного заболевания. Биопсия печени позволяет оценивать гистологические свойства ткани печени, включая окрашивание на коллаген и количественный анализ уровней коллагена в ткани, а также уровней липидов в случае стеатоза. Шкала активности NAFLD
(NAS) представляет собой балльную оценку и является суммой отдельных баллов для стеатоза (0-3), баллонной дистрофии гепатоцитов (0-2) и лобулярного воспаления (0-3), при этом большинство пациентов с NASH имеют баллы NAS > 5. См. Kleiner et al. Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology 41(6), 1313-1321
(2005). Сывороточные маркеры включают маркеры функции печени, АЛТ и ACT, и маркеры образования внеклеточного матрикса, маркеры фибролитического процесса, маркеры деградации внеклеточного матрикса и конкретные цитокины.
Настоящее изобретение относится к применению полипептидов ENG в комбинации с одними или несколькими другими способами лечения. Таким образом, в дополнение к применению полипептидов ENG, по отношению к индивидууму также можно использовать один или несколько "стандартных" способов терапии для лечения фиброзных нарушений. Например, полипептиды ENG можно вводить в комбинации с
(т.е. совместно с) цитотоксинами, иммуносупрессорными средствами,
радиотоксичными средствами и/или терапевтическими антителами.
Конкретные котерапевтические средства, предусматриваемые в
настоящем изобретении, включают, в качестве неограничивающих
примеров, стероиды (например, кортикостероиды, такие как
преднизон), иммуносупрессорные и/или противовоспалительные
средства (например, гамма-интерферон, циклофосфамид, азатиоприн,
метотрексат, пеницилламин, циклоспорин, колхицины,
антитимоцитарный глобулин, микофенолат мофетил и
гидроксихлорохин), цитотоксические лекарственные средства, блокаторы кальциевых каналов (например, нифедипин), ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), парааминобензойную кислоту (РАВА), диметилсульфоксид, ингибиторы трансформирующего
фактора роста-бета (TGF-|3) , ингибиторы интерлейкина-5 (ИЛ-5) и пан-ингибиторы каспаз.
Дополнительные противофиброзные средства, которые можно
использовать в комбинации с полипептидами ENG, включают, в
качестве неограничивающих примеров, лектины (как описано,
например, в патенте США №: 7026283, содержание которого включено в
настоящее описание посредством ссылки в полном объеме), а также
противофиброзные средства, описываемые Wynn et al (2007, J Clin
Invest 117:524-529, содержание которого включено в настоящее
описание посредством ссылки в полном объеме). Например,
дополнительные противофиброзные средства и способы терапии
включают, в качестве неограничивающих примеров, различные
противовоспалительные/иммуносупрессорные/цитотоксические
лекарственные средства (включая колхицин, азатиоприн,
циклофосфамид, преднизон, талидомид, пентоксифиллин и теофиллин), модификаторы передачи сигнала TGF-р (включая релаксин, SMAD7, HGF, и BMP7, а также ингибиторы TGF-|3l, TGF|3RI, TGF|3RII, EGR-I И CTGF) , цитокин и антагонисты рецепторов цитокинов (ингибиторы ИЛ-ip, ИЛ-5, ИЛ-б, ИЛ-13, ИЛ-21, Hn-4R, Hn-13Ral, ГМ-КСФ, ФНО, онкостатина М,
W1SP-I и PDGF), цитокины и хемокины (ИФНу, ИФНа/Р, ИЛ-12, ИЛ-10, HGF, CXCL10 и CXCL11), антагонисты хемокинов (ингибиторы CXCL1, CXCL2, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL6, CCL17 и CCL18), антагонисты
рецепторов хемокинов (ингибиторы CCR2, CCR3, CCR5, CCR7, CXCR2 и
CXCR4), антагонисты TLR (ингибиторы TLR3, TLR4 и TLR9),
антагонисты ангиогенеза (VEGF-специфические антитела и
заместительная терапия аденозиндезаминазой), гипотензивные лекарственные средства (бета-блокаторы и ингибиторы ANG 11, АСЕ и альдостерона), вазоактивные вещества (антагонисты рецептора ЕТ-1 и бозентан), ингибиторы ферментов, синтезирующих и процессирующих коллаген (ингибиторы пролилгидроксилазы) , антагонисты В-клеток (ритуксимаб), антагонисты интегринов/молекул адгезии (молекулы, блокирующие интегрины ocl |31 и av|36, а также ингибиторы интегрин-зависимых киназ и антитела против ICAM-I и VCAM-I), проапоптотические лекарственные средства, направленные против миофибробластов, ингибиторы ММР (ингибиторы ММР2, ММР9 и ММР12), и ингибиторы TIMP (антитела против TIMP-1).
Полипептид ENG и котерапевтическое средство или котерапию можно использовать в одном составе или раздельно. В случае раздельного введения полипептид ENG можно вводить до, после или одновременно с котерапевтическим средством или котерапией. Одно средство может предшествовать или следовать после введения другого средства через интервалы в диапазоне от минут до недель. В вариантах, осуществления в которых индивидууму раздельно вводят два или более различных типа терапевтических средств, как правило, будут обеспечивать, чтобы между временем каждой доставки не прошел значительный период времени, таким образом, чтобы эти разные типы средств все равно были способны иметь преимущественно комбинированный эффект в отношении тканей или клеток-мишеней.
Ангиогенез
Ангиогенез, процесс образования новых кровеносных сосудов, критичен при многих нормальных и аномальных физиологических состояниях. В нормальных физиологических условиях у людей и животных ангиогенез происходит в конкретных и ограниченных ситуациях. Например, в норме ангиогенез наблюдают при заживлении ран, эмбриональном развитии и образовании corpus luteum, эндометрия и плаценты.
Нежелательный или неправильно регулируемый ангиогенез
возникает при многих нарушениях, при которых аномальный рост эндотелия может вызывать патологический процесс или участвовать в нем. Например, ангиогенез участвует в росте многих опухолей. Нерегулируемый ангиогенез вовлечен в такие патологические процессы, как ревматоидный артрит, ретинопатии, гемангиомы и псориаз. Различные патологические состояния, при которых имеет место нерегулируемый ангиогенез, классифицируют как заболевания, ассоциированные с ангиогенезом.
Считают, что контролируемый и неконтролируемый ангиогенез происходит схожим образом. Капилляры, главным образом, состоят из эндотелиальных клеток и перицитов, окруженных базальной мембраной. Ангиогенез начинается с эрозии базальной мембраны ферментами, высвобождаемыми эндотелиальными клетками и лейкоцитами. Затем эндотелиальные клетки, выстилающие просвет кровеносных сосудов, выступают через базальную мембрану. Ангиогенные факторы заставляют эндотелиальные клетки мигрировать через эродированную базальную мембрану. Мигрирующие клетки образуют "отросток", выступающий из родительского кровеносного сосуда, где эндотелиальные клетки подвергаются митозу и пролиферируют. Эндотелиальные отростки соединяются друг с другом с образованием капиллярных петель, создавая новый кровеносный сосуд.
Доказано, что средства, ингибирующие ангиогенез, являются
эффективными в лечении множества нарушений. Avastin (бевацизумаб), моноклональное антитело, связывающееся с фактором роста эндотелия сосудов (VEGF), используют в лечении множества злокачественных
новообразований. Доказано, что Macugen , аптамер, связывающийся с VEGF, является эффективным в лечении неоваскулярной (влажной) возрастной дегенерации желтого пятна. Антагонисты пути передачи сигнала SDF/CXCR4 ингибируют неоваскуляризацию опухоли и эффективны против злокачественного новообразования в моделях на мышах (Guleng et al. Cancer Res. 2005 Jul 1; 65 (13) : 58 64-71) . В лечении различных типов опухолей в качестве антиангиогенных средств используют множество, так называемых, многоцелевых ингибиторов тирозинкиназ, включая вандетаниб, сунитиниб, акситиниб, сорафениб, ваталаниб и пазопаниб. Талидомид и
родственные соединения (включая помалидомид и леналидомид) демонстрируют благоприятные эффекты в лечении злокачественных новообразований, и хотя молекулярный механизм действия неясен, ингибирование ангиогенеза, по-видимому, является важным компонентом противоопухолевого эффекта (см., например, Dredge et al. Microvasc Res. 2005 Jan;69(l-2) :5б-бЗ) . Хотя многие антиангиогенные средства обладают эффектом в отношении ангиогенеза независимо от затронутой ткани, другие ангиогенные средства, как правило, могут иметь ткане-специфичный эффект.
Настоящее изобретение относится к способам и композициям для лечения или профилактики состояний нерегулируемого ангиогенеза, включая неопластические и ненеопластические нарушения. Кроме того, изобретение относится к способам и композициям для лечения или профилактики конкретных сердечно-сосудистых нарушений. Кроме того, настоящее изобретение относится к способам лечения нарушений, ассоциированных с активностью ВМР9 и/или ВМР10.
Настоящее изобретение относится к способам ингибирования ангиогенеза у млекопитающего посредством введения индивидууму эффективного количества полипептида ENG, включая слитый белок ENG-Fc или антагонисты нуклеиновых кислот (например, антисмысловой или миРНК) указанного выше, в совокупности обозначаемых в настоящем описании как "терапевтические средства". Представленные данные конкретно указывают на то, что антиангиогенные терапевтические средства, представленные в настоящем описании, можно применять для ингибирования ангиогенеза, ассоциированного с опухолями. Ожидают, что эти терапевтические средства также будут применимы в ингибировании ангиогенеза в глазу.
Заболевания, ассоциированные с ангиогенезом, включают, в
качестве неограничивающих примеров, ангиогенез-зависимое
злокачественное новообразование, включая, например, солидные опухоли, гемобластозы, такие как лейкозы, и опухолевые метастазы; доброкачественные опухоли, например гемангиомы, невриномы слухового нерва, нейрофибромы, трахомы и пиогенные гранулемы; ревматоидный артрит; псориаз; рубеоз; болезнь Рандю-Вебера-Ослера; ангиогенез миокарда; неоваскуляризацию бляшек; телеангиэктазию;
гемофилический артрит и ангиофиброму.
В частности, полипептидные терапевтические средства по настоящему изобретению применимы для лечения или профилактики злокачественного новообразования (опухоли) и, в частности, таких злокачественных новообразований, о которых известно, что они основаны на ангиогенных процессах для поддержания роста. В отличие от большинства антиангиогенных средств, полипептиды ENG влияют на ангиогенез, индуцируемый множеством факторов. Это весьма актуально в случае злокачественных новообразований, где злокачественное новообразование часто имеет множество факторов, поддерживающих ангиогенез в опухоли. Таким образом, терапевтические средства, представленные в настоящем описании, будут особенно эффективными в лечении опухолей, резистентных к лечению лекарственным средством, направленным против отдельного ангиогенного фактора (например, бевацизумабом, направленным против VEGF), а также могут являться особенно эффективными в комбинации с другими антиангиогенными соединениями, действующим за счет другого механизма.
Дисрегуляция ангиогенеза может приводить ко многим
нарушениям, которые можно лечить композициями и способами по
изобретению. Эти нарушения включают неопластические и
ненеопластические состояния. Термины "злокачественное
новообразование" и "злокачественный" относятся к физиологическому состоянию у млекопитающих, как правило, отличающемуся повышающе регулируемым ростом/пролиферацией клеток. Примеры злокачественного новообразования или неопластических нарушений включают, в качестве неограничивающих примеров, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретные примеры таких злокачественных новообразований включают плоскоклеточный рак, мелкоклеточный рак легких, немелкоклеточный рак легких, аденокарциному легкого, плоскоклеточную карциному легкого, рак брюшины, печеночно-клеточный рак, злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта, рак поджелудочной железы, глиобластому, рак шейки матки, рак яичников, рак печени, рак мочевого пузыря, гепатому, рак молочной железы, рак толстого кишечника, колоректальный рак, карциному эндометрия или тела матки, карциному слюнной железы, рак
почки, рак предстательной железы, рак женских наружных половых
органов, рак щитовидной железы, печеночную карциному, рак желудка,
меланому и различные типы рака головы и шеи, включая
плоскоклеточный рак головы и шеи. Другие примеры неопластических
нарушений и родственных состояний включают карциномы пищевода,
текомы, арренобластомы, гиперплазию эндометрия, эндометриоз,
фибросаркомы, хориокарциному, назофарингеальную карциному,
ларингеальные карциномы, гепатобластому, саркому Капоши, карциномы
кожи, гемангиому, кавернозную гемангиому, гемангиобластому,
ретинобластому, астроцитому, глиобластому, шванному,
олигодендроглиому, медуллобластому, нейробластому,
рабдомиосаркому, остеогенную саркому, лейомиосаркомы, карциномы мочевыводящих путей, опухоль Вильмса, почечноклеточную карциному, карциному предстательной железы, аномальную пролиферацию сосудов, ассоциированную с факоматозом, и синдром Мейгса. Злокачественное новообразование, в частности, поддающееся лечению терапевтическими средствами, представленными в настоящем описании, может отличаться одним или несколькими из следующего: злокачественное новообразование имеет ангиогенную активность, повышенные уровни ENG, определяемые в опухоли или сыворотке, повышенные уровни экспрессии или биологической активности ВМР-9 или ВМР-10, метастазирует или имеет риск метастазирования, или любую их комбинацию.
Ненеопластические нарушения с нерегулируемым ангиогенезом,
поддающиеся лечению полипептидами ENG, применимыми в изобретении,
включают, в качестве неограничивающих примеров, нежелательную или
аномальную гипертрофию, артрит, ревматоидный артрит, псориаз,
псориатические бляшки, саркоидоз, атеросклероз,
атеросклеротические бляшки, диабетические и другие пролиферативные ретинопатии, включая синдром Терри, ретролентальную фиброплазию, неоваскулярную глаукому, возрастную дегенерацию желтого пятна, диабетический отек желтого пятна, неоваскуляризацию роговицы, неоваскуляризация трансплантата роговицы, отторжение трансплантата роговицы, неоваскуляризацию сетчатки/сосудистой оболочки, неоваскуляризацию радужки (рубеоз), болезнь неоваскуляризации
глаза, рестеноз сосудов, артериовенозные мальформации (AVM), менингиому, гемангиому, ангиофиброму, гиперплазию щитовидной железы (включая болезнь Грейвса), трансплантацию роговицы и другой ткани, хроническое воспаление, воспаление легких, острое повреждение легких/ARDS, сепсис, первичную легочную гипертензию, злокачественные легочные выпоты, отек мозга (например, ассоциированный с острым инсультом/закрытой черепно-мозговой травмой/травмой) , синовиальное воспаление, образование паннуса при RA, оссифицирующий миозит, гипертрофический остеогенез, остеоартрит, рефрактерный асцит, поликистоз яичников, эндометриоз, заболевания с образованием полостей, заполненных жидкостью
(панкреатит, компартмент-синдром, ожоги, заболевание кишечника), фиброз матки, преждевременные роды, хроническое воспаление, такое как IBD (болезнь Крона и язвенный колит), отторжение аллотрансплантата почки, воспалительное заболевание кишечника, нефротический синдром, нежелательное или аномальное разрастание тканевых масс (не злокачественных), гемофилический артрит, гипертрофические рубцы, ингибирование роста волос, болезнь Рандю-Вебера-Ослера, пиогенную гранулему, ретролентальную фиброплазию, склеродермию, трахому, сращения сосудов, синовит, дерматит, преэклампсию, асциты, перикардиальный выпот (такой как ассоциированный с перикардитом) и плевральный выпот. Дополнительные примеры таких нарушений включают эпителиальные или сердечные нарушения.
В определенных вариантах осуществления таких способов одно или несколько полипептидных терапевтических средств можно вводить совместно (одновременно) или в разные моменты времени
(последовательно). Кроме того, полипептидные терапевтические средства можно вводить с другим типом соединений для лечения злокачественного новообразования или для ингибирования ангиогенеза.
В определенных вариантах осуществления рассматриваемые способы по настоящему изобретению можно применять в отдельности. Альтернативно, рассматриваемые способы можно применять в комбинации с другими общепринятыми подходами противоопухолевой
терапии, направленными на лечение или профилактику пролиферативных нарушений (например, опухоли). Например, такие способы можно применять в профилактике злокачественного новообразования, профилактике рецидива злокачественного новообразования и метастазирования после хирургического вмешательства, и в качестве адъюванта в другой общепринятой терапии злокачественного новообразования. В настоящем описании признают, что можно повышать эффективность общепринятых способов терапии злокачественных новообразований (например, химиотерапии, лучевой терапии, фототерапии, иммунотерапии и хирургии), применяя рассматриваемое полипептидное терапевтическое средство.
Показано, что широкий спектр общепринятых соединений имеет противоопухолевую активность. Эти соединения используют в качестве фармацевтических средств в химиотерапии для уменьшения размеров солидных опухолей, профилактике метастазирования и дальнейшего роста или снижения количества злокачественных клеток при лейкозах или злокачественных новообразованиях костного мозга. Хотя химиотерапия эффективна в лечении различных типов злокачественных новообразований, многие противоопухолевые соединения индуцируют нежелательные побочные эффекты. Показано, что при комбинировании двух или более разных способов лечения, они могут действовать синергично и делать возможным снижение дозы каждого из лекарственных средств, таким образом, снижая вредные побочные эффекты, вызываемые каждым соединением при более высоких дозах. В других случаях, злокачественные новообразования, рефрактерные к лечению, могут отвечать на комбинированное лечение двумя или более разными способами лечения.
При одновременном или последовательном введении
терапевтического средства, представленного в настоящем описании, в комбинации с другим общепринятым противоопухолевым средством, такое терапевтическое средство может повышать терапевтический эффект противоопухолевого средства или преодолевать резистентность клеток к такому противоопухолевому средству. Это делает возможным снижение дозы противоопухолевого средства, таким образом, снижая нежелательные побочные эффекты, или восстанавливает эффективность
противоопухолевого средства в резистентных клетках.
По настоящему изобретению антиангиогенные средства, представленные в настоящем описании, можно применять в комбинации с другими композициями и способами лечения заболеваний. Например, опухоль можно общепринято лечить посредством хирургического вмешательства, лучевой или химиотерапии в комбинации с полипептидом ENG, а затем можно вводить полипептид ENG пациенту для увеличения периода покоя микрометастазов и для стабилизации любой остаточной первичной опухоли.
В этой области идентифицированы и известны многие антиангиогенные средства, включая приведенные в настоящем описании и, например, в Carmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara et al., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004) и Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) . Также см. патентную заявку США № US20030055006. В одном из вариантов осуществления полипептид ENG применяют в комбинации с нейтрализующим антителом против VEGF (или фрагментом), и/или другим антагонистом VEGF, или антагонистом рецептора VEGF, включая, в качестве неограничивающих примеров, например, растворимый рецептор VEGF (например, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, фрагменты нейропилинов (например, NRP1, NRP2)), аптамеры, способные блокировать VEGF или VEGFR, нейтрализующие антитела против VEGFR, низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR (RTK), антисмысловые стратегии для VEGF, рибозимы против VEGF или рецепторов VEGF, варианты антагонистов VEGF и любые их комбинации. Альтернативно или дополнительно, в дополнение к антагонисту VEGF и другому средству пациенту можно совместно вводить, необязательно, два или более ингибиторов ангиогенеза. В определенном варианте осуществления в комбинации с полипептидом ENG, антагонистом VEGF и антиангиогенным средством можно вводить одно или несколько дополнительных терапевтических средств, например, противоопухолевых средств.
Термины "VEGF" и "VEGF-A" взаимозаменяемо используют в отношении фактора роста эндотелия сосудов из 165 аминокислот и родственных факторов роста эндотелия сосудов из 121, 145, 183, 189 и 206 аминокислот, как описано в Leung et al. Science, 246:1306
(1989), Houck et al. Mol Endocrinol, 5:1806 (1991) и Robinson & Stringer, J Cell Sci, 144 (5) :853-865 (2001), вместе с его природными аллельными и процессированными формами.
Термин "антагонист VEGF" относится к молекуле, способной нейтрализовать, блокировать, ингибировать, отменять, снижать или противодействовать активностям VEGF, включая его связывание с одним или несколькими рецепторами VEGF. Антагонисты VEGF включают антитела против VEGF и их антигенсвязывающие фрагменты, молекулы рецепторов и производные, специфически связывающиеся с VEGF, таким образом, блокируя его связывание с одним или несколькими рецепторами, антителами против рецепторов VEGF и антагонистами рецепторов VEGF, такими как низкомолекулярные ингибиторы тирозинкиназ VEGFR, и слитые белки, например, VEGF-Trap
(Regeneron), VEGF121-гелонин (Peregrine). Антагонисты VEGF также включают варианты антагонистов VEGF, антисмысловые молекулы против VEGF, аптамеры РНК и рибозимы против VEGF или рецепторов VEGF.
"Антитело против VEGF" является антителом, связывающимся с
VEGF с достаточной аффинностью и специфичностью. Антитело против
VEGF можно использовать в качестве терапевтического средства для
таргетной терапии и противодействия заболеваниям или состояниям, в
которые вовлечена активность VEGF. См., например, патенты США №№
6582959 6703020; W098/45332; WO96/30046; WO94/10202,
WO2005/044853; ЕР 0666868В1; патентные заявки США №№ 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 и 20050112126; Popkov et al, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004); и WO2005012359. Антитело против VEGF, как правило, не будет связываться ни с другими гомологами VEGF, такими как VEGF-B или VEGF-C, ни с другими факторами роста, такими как P1GF, PDGF или bFGF. Антитело против VEGF "бевацизумаб (BV)", также известное как "rhuMAb VEGF" или "Avastin(r)", является рекомбинантным гуманизированным моноклональным антителом против VEGF, полученным согласно Presta et al. Cancer Res. 57:4593-4599 (1997). Оно содержит мутантные каркасные области IgGl человека и антигенсвязывающие определяющие комплементарность области из моноклонального антитела мыши против hVEGF А.4.6.1, блокирующего
связывание VEGF человека с его рецепторами. Приблизительно 93% аминокислотной последовательности бевацизумаба, включая большую часть каркасных областей, получают из IgGl человека, и приблизительно 7% последовательности получают из антитела мыши А4.б.1. Бевацизумаб имеет молекулярную массу приблизительно 14 9000 Да и является гликозилированным. Бевацизумаб и другие гуманизированные антитела против VEGF, включая фрагмент антитела против VEGF "ранибизумаб", также известный как "Lucentis(r)", дополнительно описывают в патенте США № 68 84 87 9, выданном 2 6 февраля 2005 года.
Термин "противоопухолевая композиция" относится к композиции, применимой в лечении злокачественного новообразования, содержащей по меньшей мере одно активное терапевтическое средство, например, "противоопухолевое средство". Примеры терапевтических средств (противоопухолевых средств, также обозначаемых в настоящем описании как "противоопухолевое средство") включают, в качестве неограничивающих примеров, например, химиотерапевтические средства, ингибирующие рост средства, цитотоксические средства, средства, используемые в лучевой терапии, антиангиогенные средства, апоптотические средства, антитубулиновые средства, токсины, и другие средства для лечения злокачественных новообразований, например, нейтрализующее антитело против VEGF, антагонист VEGF, средства против HER-2, против CD2 0, антагонист рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) (например, ингибитор тирозинкиназ), ингибитор HER1/EGFR, эрлотиниб, ингибитор СОХ-2 (например, целекоксиб), интерфероны, цитокины, антагонисты (например, нейтрализующие антитела), связывающиеся с одним или несколькими из ЕгЬВ2, ЕгЬВЗ, ЕгЬВ4 или рецепторов VEGF, ингибиторы тирозинкиназ рецепторов тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и/или фактора стволовых клеток (SCF) (например, иматиниба мезилат
(Gleevec(r) Novartis)), TRAIL/Apo2L и другие биоактивные и органические химические средства, и т.д.
"Ангиогенный фактор или средство" является фактором роста, стимулирующим развитие кровеносных сосудов, например, стимулирующим ангиогенез, рост эндотелиальных клеток, стабильность
кровеносных сосудов и/или васкулогенез и т.д. Например, ангиогенные факторы включают, в качестве неограничивающих примеров, VEGF и членов семейства VEGF, P1GF, семейство PDGF, семейство фактора роста фибробластов (FGF), лиганды TIE
(ангиопоэтины), эфрины, ANGPTL3, ALK-1, и т.д. Они также будут включать факторы, усиливающие заживление ран, такие как гормон роста, инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), VIGF, эпидермальный фактор роста (EGF), CTGF и членов его семейства и TGF-a и TGF-p. См., например, Klagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:31723179 (2003); Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364
(1999); Tonini et al. , Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 1, в которой приведены ангиогенные факторы); и Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003).
Термин "антиангиогенное средство" или "ингибитор ангиогенеза" относится к низкомолекулярному веществу, полинуклеотиду (включая, например, ингибиторную РНК (РНКи или миРНК)), полипептид, выделенный белок, рекомбинантный белок, антитело или его конъюгаты или слитые белки, прямо или косвенно ингибирующие ангиогенез, васкулогенез или нежелательную проницаемость сосудов. Например, антиангиогенное средство является антителом или другим антагонистом ангиогенного средства, как определено выше, например, антителами против VEGF, антителами против рецепторов VEGF, низкомолекулярными соединениями, блокирующим передачу сигнала рецепторами VEGF (например, PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT(r)/SU 112 4 8 (сунитиниб малат), AMG7 0 6 или описываемые, например, в международной патентной заявке № WO2004/113304). Антиангиогенные средства также включают нативные ингибиторы ангиогенеза, например, ангиостатин, эндостатин и т.д. См., например, Klagsbrun and
D'Amore, Annu. Rev. Physiol, 53:217-39 (1991); Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (например, таблицу 3, в которой представлена антиангиогенная терапия при злокачественной меланоме); Ferrara & Alitalo, Nat Med 5(12): 1359-1364 (1999); Tonini et al, Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (например, таблицу 2,
в которой приведены ангиогенные факторы); и Sato Int. J. Clin. Oncol, 8:200-206 (2003) (например, в таблице 1 приведены антиангиогенные средства, используемые в клинических испытаниях).
В определенных аспектах изобретения другие терапевтические
средства, применимые для комбинированной противоопухолевой терапии
с помощью полипептида ENG, включают другие способы терапии
злокачественных новообразований: например, хирургическое
вмешательство, цитотоксические средства, способы лучевой терапии, включающие облучение или введение радиоактивных веществ, химиотерапевтические средства, противогормональные средства, ингибирующие рост средства, противоопухолевые композиции и лечение противоопухолевыми средствами, приведенными в настоящем описании и известными в этой области, или их комбинации.
Как применяют в настоящем описании, термин "цитотоксическое средство" относится к веществу, ингибирующему или предотвращающему функционирование клеток и/или вызывающему деструкцию клеток. Термин предназначен для включения радиоактивных изотопов
т\ 4-211 т131 -г 125 v90 г> ~186 г> ~188 о(tm)Д53 о-! 212 -п32
(например, At , I , I , Y , Re , Re , Sm , Bi , P и
радиоактивных изотопов Lu) , химиотерапевтических средств, например, метотрексата, адриамицина, алкалоидов барвинка (винкристина, винбластина, этопозида), доксорубицина, мелфалана, митомицина С, хлорамбуцила, даунорубицина или других интеркаляторов, ферментов и их фрагментов, таких как нуклеолитические ферменты, антибиотики и токсины, такие как низкомолекулярные токсины или ферментативно-активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения, включая их фрагменты и/или варианты, и различные противоопухолевые или противораковые средства, описываемые ниже. Другие цитотоксические средства описаны ниже. Туморицидное средство вызывает деструкцию опухолевых клеток.
"Химиотерапевтическое средство" является химическим
соединением, применимым в лечении злокачественного
новообразования. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие средства, такие как тиотепа и CYTOXAN(r) циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан;
азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа;
этиленимины и метиламеламины, включая алтретамин,
триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфаорамид и
триметилоломеламин; ацетогенины (особенно буллатацин и
буллатацинон); дельта-9-тетрагидроканнабиол (дронабинол,
MARINOL(r)) ; бета-лапахон; лапахол; колхицины; бетулиновую кислоту; камптотецин (включая синтетический аналог топотекан (HYCAMTIN(r)) , СРТ-11 (иринотекан, CAMPTOSAR(r)) , ацетилкамптотецин, скополетин и 9-аминокамптотецин) ; бриостатин; каллистатин; СС-1065 (включая его синтетические аналоги адозелезин, карзелезин и бизелезин); подофиллотоксин; подофиллиновую кислоту; тенипозид; криптофицины
(в частности, криптофицин 1 и криптофицин 8); доластатин; дуокармицин (включая синтетические аналоги, KW-2189 и СВ1-ТМ1); элеутеробин; панкратистатин; саркодиктин; спонгистатин; азотистые иприты, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлоретамин, гидрохлорид оксида мехлоретамина, мелфалан, новэмбихин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацилиприт; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорзотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин и ранимнустин; антибиотики, такие как ендииновые антибиотики (например, калихимицин, в частности, калихеамицин гамма II и калихеамицин омега II (см., например, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186
(1994)); динемицин, включая динемицин А; эсперамицин; а также
неокарциностатин хромофор и родственные хромопротеиновые хромофоры
ендииновых антибиотиков), аклациномизины, актиномицин, антрамицин,
азасерин, блеомицины, кактиномицин, карабицин, карминомицин,
карцинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин,
деторубицин, б-диазо-5-оксо-1-норлейцин, доксорубицин ADRIAMYCIN(r)
(включая морфолино-доксорубицин, цианоморфолино-доксорубицин, 2-пирролино-доксорубицин и дезоксидоксорубицин), эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марселломицин, митомицины, такие как митомицин С, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, порфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин,
зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил
(5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин,
метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как
флударабин, б-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги
пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, б-азауридин,
кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин,
флоксуридин; андрогены, такие как калустерон, пропионат
дромостанолона, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон;
антиадреналовые средства, такие как аминоглутетимид, митотан, трилостан; производное фолиевой кислоты, такое как фолиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамид гликозид; аминолевулиновая кислота; энилурацил; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин; диазиквон; элфорнитин; ацетат эллиптиния; эпотилон; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; майтанзиноиды, такие как майтанзин и ансамитоцины; митогуазон; митоксантрон; мопиданмол; нитраерин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; лозоксантрон; 2-этилгидразид; прокарбазин; полисахаридный комплекс PSK(r) (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; ризоксин; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновую кислоту; триазиквон; 2,2',2"-трихлортриэтиламин; трихотецены (в частности, токсин Т-2, верракурин А, роридин А и ангуидин); уретан; виндезин (ELDISINE(r), FILDESIN(r)) ; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; дацитозин; арабинозид ("Ага-С"); тиотепа; таксоиды, например, TAXOL(r) паклитаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE(tm) без кремофора, состав сконструированных альбуминовых наночастиц паклитаксела (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), и TAXOTERE(r) доксетаксел (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин (GEMZAR(r)) ; б-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платины, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин (VELBAN(r)) ; платину; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоксантрон; винкристин (ONCOVIN(r)) ; оксалиплатин; лейковорин; винорелбин (NAVELBINE(r)) ; новантрон; эдатрексат; дауномицин; аминоптерин; ибандронат; ингибитор топоизомераз RFS 2000;
дифторметилорнитин (DMFO); ретиноиды, такие как ретиноевая кислота; капецитабин (XELODA(r)) ; фармацевтически приемлем соли, кислоты или производные любого из указанных выше; а также комбинации двух или более из указанных выше, такие как CHOP, an аббревиатура для комбинированной терапии циклофосфамидом, доксорубицином, винкристином и преднизолоном, и FOLFOX, аббревиатура для схемы лечения оксалиплатином (ELOXATIN(tm)) в комбинации с 5-FU и лейковорином.
В определение также включены противогормональные средства,
регулирующие, снижающие, блокирующие или ингибирующие эффекты
гормонов, которые могут стимулировать рост злокачественного
новообразования, и зачастую находятся в форме системного или
общего лечения. Они могут сами являться гормонами. Примеры
включают антиэстрогены и селективные модуляторы рецепторов
эстрогена (SERM), включая, например, тамоксифен (включая NOLVADEX(r)
тамоксифен) , EVISTA(r) ралоксифен, дролоксифен, 4-
гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY117018, онапристон и
FARESTON(r) торемифен; антипрогестероны; ингибиторы рецепторов
эстрогена (ERD); средства, супрессирующие или прекращающие работу
яичников, например, агонисты гонадолиберина (LHRH), такие как
LUPRON(r) и ELIGARD(r) лейпролида ацетат, гозерелина ацетат,
бусерелина ацетат и трипторелин; другие антиандрогены, такие как
флутамид, нилутамид, бикалутамид; и ингибиторы ароматазы,
ингибирующие фермент ароматазу, регулирующую продукцию эстрогена в
надпочечниках, такие как, например, 4(5)-имидазолы,
аминоглютетимид, MEGASE(r) мегестрола ацетат, AROMASIN(r) экземестан,
форместанин, фадрозол, RIVISOR(r) ворозол, FEMARA(r) летрозол, и
ARIMIDEX(r) анастрозол. Кроме того, такое определение
химиотерапевтических средств включает бисфосфонаты, такие как клодронат (например, BONEFOS(r) или OSTAC(r)) , DIDROCAL(r) этидронат, NE-58095, Z ОМЕ ТА(r) золедроновую кислоту/золедронат, FOSAMAX(r) аледронат, AREDIA(r) памидронат, SKELID(r) тилудронат, или ACTONEL(r) ризедронат; а также троксацитабин (аналог нуклеозида цитозина 1,3
диоксолан); антисмысловые олигонуклеотиды, в частности, ингибирующие экспрессию генов пути передачи сигнала, участвующего в аномальной клеточной пролиферации, такие как, например, РКС-альфа, Raf, H-Ras и рецептор эпидермального фактора роста (EGF-R); вакцины, такие как вакцина THERATOPE(r), и генотерапевтические вакцины, например, вакцина ALLOVECTIN(r), вакцина LEUVECTIN(r) и вакцина VAXID(r); ингибитор топоизомеразы 1 LURTOTECAN(r); ABARELIX(r) rmRH; лапатиниб дитозилат (двойной низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназ ЕгЬВ-2 и EGFR, также известный как GW572016); и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любого из указанных выше.
Как применяют в настоящем описании, термин "ингибирующее рост
средство" относится к соединению или композиции, ингибирующей рост
клетки in vitro или in vivo. Таким образом, ингибирующее рост
средство может являться средством, значительно снижающим
процентную долю клеток в S-фазе. Примеры ингибирующих рост средств
включают средства, блокирующие прохождение клеточного цикла (в
ином месте, чем S-фаза), такие как средства индуцирующие арест
клеточного цикла в Gl-фазе и в М-фазе. Классические блокаторы М-
фазы включают алкалоиды барвинка (винкристин и винбластин),
таксаны и ингибиторы топоизомеразы II, такие как доксорубицин,
эпирубицин, даунорубицин, этопозид и блеомицин. Средства,
вызывающие арест клеточного цикла в Gl-фазе также приводят к
аресту клеточного цикла в S-фазе, например, ДНК-алкилирующие
средства, такие как тамоксифен, преднизон, дакарбазин,
мехлоретамин, цисплатин, метотрексат, 5-фторурацил и ага-С.
Дополнительную информацию можно найти в The Molecular Basis of
Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, названной "Cell
cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" Murakami et
al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), в частности p. 13. Таксаны
(паклитаксел и доцетаксел) являются противоопухолевыми
лекарственными средствами, получаемыми из тисового дерева. Доцетаксел (TAXOTERE(r), Rhone-Poulenc Rorer), получаемый из тиса европейского, является полусинтетическим аналогом паклитаксела
(TAXOL(r), Bristol-Myers Squibb). Паклитаксел и доцетаксел стимулируют сборку микротрубочек из димеров тубулина и стабилизируют микротрубочки, предотвращая деполимеризацию, что приводит к ингибированию митоза в клетках.
Кроме того, индивидуумам, о которых известно, что они имеют высокий риск развития новых и рецидивирующих злокачественных новообразований, профилактически можно вводить средства, ингибирующие ангиогенез. Таким образом, аспект настоящего изобретения включает способы профилактики злокачественного новообразования у индивидуума, включающие введение индивидууму эффективного количества полипептида ENG и/или его производного или другого средства по настоящему изобретению, ингибирующего ангиогенез.
Конкретные нормальные физиологические процессы также ассоциированы с ангиогенезом, например, овуляция, менструация и плацентация. Белки по настоящему изобретению, ингибирующие ангиогенез, применимы в лечении заболевания с избыточной или аномальной стимуляцией эндотелиальных клеток. Эти заболевания включают, в качестве неограничивающих примеров, спайки в желудочно-кишечном тракте, атеросклероз, склеродермию и гипертрофические рубцы, т.е. келоиды. Они также применимы в лечении заболеваний, включающих ангиогенез как патологическое следствие, таких как болезнь кошачьих царапин (Rochele minalia quintosa) и язвы {Helicobacter pylori) .
Общие белки, ингибирующие ангиогенез, можно использовать в качестве противозачаточных средств, снижая или предотвращая васкуляризацию матки, необходимую для имплантации эмбриона. Таким образом, настоящее изобретение относится к эффективному способу контроля рождаемости, когда женщине вводят количество ингибиторного белка, достаточное для предотвращения имплантации эмбриона. В одном из аспектов способа контроля рождаемости количество ингибирующего белка, достаточное для блокирования имплантации эмбриона, вводят до или после полового акта и оплодотворения, таким образом, предоставляя эффективный способ контроля рождаемости, возможно способ, "используемый на следующее
утро". Хотя и не желая быть связанными этим утверждением, полагают, что ингибирование васкуляризации эндометрия матки препятствует имплантации бластоцисты. Аналогичное ингибирование васкуляризации слизистой оболочки маточной трубы препятствует имплантации бластоцисты, предотвращая возникновение внематочной беременности. Способы введения могут включать, в качестве неограничивающих примеров, пилюли, инъекции (внутривенные, подкожные, внутримышечные), суппозитории, вагинальные губки, вагинальные тампоны и внутриматочные контрацептивы. Также считают, что введение средств по настоящему изобретению, ингибирующих ангиогенез, будет препятствовать нормальной повышенной васкуляризации плаценты, а также развитию сосудов в успешно имплантировавшейся бластоцисте и развитию эмбриона и плода.
В глазу ангиогенез ассоциирован, например, с диабетической
ретинопатией, синдромом Терри, дегенерацией желтого пятна,
отторжением трансплантата роговицы, неоваскулярной глаукомой и
ретролентальной фиброплазией. Терапевтические средства,
представленные в настоящем описании, можно вводить интраокулярно
или посредством другого местного введения в глаз. Другие
заболевания, ассоциированные с ангиогенезом в глазу, включают в
качестве неограничивающих примеров, эпидемический
кератоконъюнктивит, дефицит витамина А, излишнее ношение контактных линз, атопический кератит, верхний лимбальный кератит, птеригиум, сухой кератоконъюнктивит, синдром Шегрена, розацеа, фликтенулез, сифилис, микобактериальную инфекцию, липидную дегенерацию, химические ожоги, бактериальные язвы, грибковые язвы, инфекции, вызванные вирусом простого герпеса, опоясывающий лишай, инфекции, вызванные простейшими, саркому Капоши, язву Мурена, краевую дегенерацию роговицы Терьена, краевой кератолиз, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, полиартериит, травму, гранулематоз Вегенера, склерит, синдром Стивенса-Джонсона, пемфигоид, радиальную кератотомию, отторжение трансплантата роговицы, серповидноклеточную анемию, саркоид, эластическую псевдоксантому, болезнь Педжета, окклюзию вен, окклюзию артерий, обструктиное заболевание сонных артерий (carotid obstructive
disease), хронический увеит/витреит, микобактериальные инфекции, болезнь Лайма, системную красную волчанку, синдром Терри, болезнь Илза, болезнь Бехчета, инфекции, вызывающие ретинит или хориоидит, предполагаемый глазной гистоплазмоз, болезнь Беста, миопию, ямки диска зрительного нерва, болезнь Штаргардта, промежуточный увеит, хроническое отслоение сетчатки, синдром повышенной вязкости крови, токсоплазмоз, осложнения после травмы и лазерной обработки. Другие заболевания включают, в качестве неограничивающих примеров, заболевания, ассоциированные с рубеозом (неоваскуляризацией угла передней камеры), и заболевания, вызываемые аномальной пролиферацией сосудисто-волокнистой или волокнистой ткани, включая все формы пролиферативной витреоретинопатии.
Состояния глаза можно подвергать лечению или профилактике,
например, посредством системной, местной, внутриглазной инъекции
терапевтического средства или посредством введения устройства с
замедленным высвобождением, высвобождающего терапевтическое
средство. Терапевтическое средство можно доставлять в
фармацевтически приемлемом офтальмологическом наполнителе, таким
образом, что соединение поддерживают в контакте с поверхностью
глаза в течение достаточного периода времени, чтобы позволять
соединению проникать через роговицу и внутренние области глаза,
например, переднюю камеру, заднюю камеру, стекловидное тело,
водянистую влагу, жидкую часть стекловидного тела, роговицу,
радужку/ресничное тело, хрусталик, сосудистую оболочку
глаза/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемый
офтальмологический наполнитель, например, может являться мазью, растительным маслом или инкапсулирующим материалом. Альтернативно, терапевтические средства по настоящему изобретению можно инъецировать напрямую в стекловидное тело и водянистую влагу. Кроме того, альтернативно, соединения можно вводить системно, например, посредством внутривенной инфузии или инъекции, для лечения глаза.
Можно вводить одно или несколько терапевтических средств. Способы по настоящему изобретению также включают совместное введение с другими лекарственными средствами, используемыми для
лечения состояний глаза. При введении нескольких средств или комбинации средств и лекарственных средств, введение можно осуществлять одновременно или последовательно. Терапевтические средства и/или лекарственные средства можно вводить различными путями введения или одним и тем же путем введения. В одном из вариантов осуществления терапевтическое средство и лекарственное средство вводят вместе с офтальмологическим фармацевтическим составом.
В одном из вариантов осуществления терапевтическое средство применяют для лечения заболевания, ассоциированного с ангиогенезом в глазу, посредством конкурентного введения с другими лекарственными средствами, блокирующими ангиогенез с помощью фармакологических механизмов. Лекарственные средства, которые можно вводить одновременно с терапевтическим средством по настоящему изобретению, включают, в качестве неограничивающих
тм тм
примеров, пегаптаниб (Macugen ), ранибизумаб (Lucentis ),
скваламина лактат (Evizon ) , гепараназу и глюкокортикоиды
(например, триамцинолон). Один из вариантов осуществления
относится к способу лечения заболевания, ассоциированного с
ангиогенезом, посредством введения офтальмологического
фармацевтического состава, содержащего по меньшей мере одно терапевтическое средство, представленное в настоящем описании, и по меньшей мере одно из следующих лекарственных средств:
тм тм
пагаптаниб (Macugen ), ранибизумаб (Lucentis ), скваламина лактат
(Evizon ), гепараназу и глюкокортикоиды (например, триацинолон). Другие заболевания или нарушения
В некоторых вариантах осуществления полипептиды ENG можно применять для лечения пациента, страдающего сердечно-сосудистым нарушением или состоянием, ассоциированным с ВМР-9 или ВМР-10, но не обязательно с сопутствующим ангиогенезом. Неограничивающие примеры нарушений этого типа включают заболевание сердца (включая заболевание миокарда, инфаркт миокарда, стенокардию и заболевание клапанов сердца); заболевание почек (включая хроническое воспаление клубочков, диабетическую почечную недостаточность и
ассоциированное с волчанкой воспаление почек); нарушения кровяного
давления (включая системный и легочный типы); нарушения,
ассоциированные с атеросклерозом или другими типами
артериосклероза (включая инсульт, геморрагический инсульт,
субарахноидальное кровотечение, стенокардию и почечный
артериосклероз) ; тромботические нарушения (включая тромбоз сосудов
головного мозга, легочный тромбоз, тромботический некроз
кишечника); осложнения диабета (включая диабетическую ретинопатию,
диабетическую нефропатию, диабетическую полинейропатию,
диабетическую гангрену и связанные с диабетом хронические
инфекции); воспалительные нарушения сосудов (системную красную
волчанку, ревматизм суставов, воспаление артерий суставов,
крупноклеточное воспаление артерий, болезнь Кавасаки, болезнь
Такаясу, синдром Чарга-Стросса и болезнь Шенлейн-Геноха) ; и
нарушения сердца, такие как врожденное заболевание сердца,
кардиомиопатия (например, дилатационная, гипертрофическая,
рестриктивная кардиомиопатия) и застойная сердечная
недостаточность. Полипептид ENG можно вводить индивидууму в отдельности или в комбинации с одним или несколькими средствами или способами терапии, например, терапевтическими средствами, применимыми для лечения ВМР-9/10-ассоциированных сердечнососудистых нарушений и/или состояний. В одном из вариантов осуществления второе средство или способ терапии выбран из одного или нескольких из: ангиопластики, бета-блокаторов, гипотензивных средств, кардиотонических средств, антитромботических средств, вазодилататоров, антагонистов гормонов, антагонистов эндотелина, блокаторов кальциевых каналов, ингибиторов фосфодиэстеразы, антагонистов ангиотензина типа 2 и/или блокаторов/ингибиторов цитокинов.
В других вариантах осуществления полипептиды ENG могут быть применимы в лечении воспалительных нарушений или состояний, вероятно, связанных с ВМР9, но еще не указанных выше. Примеры нарушений включают заболевание печени (включая острый гепатит, хронический гепатит и цирроз); торакальный или абдоминальный отек; хроническое заболевание поджелудочной железы; аллергии (включая
аллергический ринит, астму, бронхит и атопический дерматит); болезнь Альцгеймера; синдром Рейно и диффузный склероз. 3. Составы и эффективные дозы
Терапевтические средства, представленные в настоящем описании, можно составлять в фармацевтических композициях. Фармацевтические композиции для применения по настоящему изобретению можно составлять общепринятым образом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или эксципиентов. Такие составы, как правило, будут, по существу, апирогенными, в соответствии с большинством нормативных требований.
В определенных вариантах осуществления терапевтический способ по настоящему изобретению включает системное или местное введение композиции в виде имплантата или устройства. При введении терапевтическая композиция для применения по настоящему изобретению находится в апирогенной, физиологически приемлемой форме. Терапевтически применимые средства, иные, чем антагонисты передачи сигнала ENG, которые, необязательно, также можно включать в композицию, как описано выше, можно вводить одновременно или последовательно с рассматриваемыми соединениями (например, полипептидами ENG) в способах, представленных в настоящем описании.
Как правило, белковые терапевтические средства,
представленные в настоящем описании, будут вводить парентерально и, в частности, внутривенно или подкожно. Фармацевтические композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать один или несколько полипептидов ENG в комбинации с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми стерильными изотоническими водными или неводными растворами, дисперсиями, суспензиями или эмульсиями или стерильными порошками, которые можно восстанавливать в стерильные инъецируемые растворы или растворы непосредственно перед использованием, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства, растворы, делающие состав изотоническим по отношению к крови предполагаемого реципиента, или суспендирующие средства или
загустители. Примеры подходящих водных и неводных носителей, которые можно использовать в фармацевтических композициях по настоящему изобретению, включают воду, этанол, полиолы (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.) и их подходящие смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Можно поддерживать подходящую текучесть, например, используя материалы для покрытия, такие как лецитин, поддерживая необходимый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества.
В одном из вариантов осуществления полипептиды ENG, представленные в настоящем описании, вводят в офтальмологическом фармацевтическом составе. В некоторых вариантах осуществления офтальмологический фармацевтический состав является стерильным водным раствором, предпочтительно, с подходящей концентрацией для инъекции, или мазью. Такие мази, как правило, содержат один или несколько полипептидов ENG, представленных в настоящем описании, растворенных или суспендированных в стерильной фармацевтически приемлемой мазевой основе, такой как основа минеральное масло-белый вазелин. В композициях мазей в состав также можно включать безводный ланолин. В такие композиции мазей также предпочтительно добавляют тиомерсал или хлорбутанол в качестве противомикробных средств. В одном из вариантов осуществления стерильный водный раствор является таким, как описано в патенте США № 6071958.
Настоящее изобретение относится к составам, которые можно варьировать по включению кислот и оснований для корректировки рН и буферных средств для поддержания рН в узком диапазоне. В состав можно добавлять дополнительные лекарственные средства. Они включают, в качестве неограничивающих примеров, пагаптаниб, гепараназу, ранибизумаб или глюкокортикоиды. Офтальмологический фармацевтический состав по настоящему изобретению получают посредством асептических манипуляций, или осуществляют стерилизацию на подходящей стадии получения.
Композиции и составы, при желании, могут находиться в упаковке или дозирующем устройстве, которое может содержать одну
или несколько стандартных лекарственных форм, содержащих активный ингредиент. Например, упаковка может содержать металлическую фольгу или полимерную пленку, такая как блистерная упаковка. Упаковку или дозирующее устройство можно дополнять инструкциями по введению.
4. Растворимые полипептиды ENG
За исключением конкретных условий, природные белки ENG являются трансмембранными белками, при этом часть белка расположена вне клетки (внеклеточная часть), и часть белка расположена внутри клетки (внутриклеточная часть). Аспекты настоящего изобретения включают полипептиды, содержащие часть внеклеточного домена (ECD) ENG.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение
относится к полипептидам ENG. Полипептиды ENG могут включать
полипептид, состоящий из или содержащий аминокислотную
последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную и,
необязательно, по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%
идентичную укороченному домену ECD природного полипептида ENG, С-
конец которого приходится на любую из аминокислот 333-37 8 SEQ ID
NO: 1, и где полипептид не включает последовательность, состоящую
из аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1. Необязательно, полипептид ENG
не включает более 5 последовательных аминокислот или более 10, 20,
30, 40, 50, 52, 60, 70, 80, 90, 100, 150 или 200 или более
последовательных аминокислот из последовательности, состоящей из
аминокислот 379-586 SEQ ID NO: 1, или последовательности,
состоящей из аминокислот 379-581 SEQ ID NO: 1. Непроцессированный
полипептид ENG может включать или исключать любую сигнальную
последовательность, а также любую последовательность, N-концевую
по отношению к сигнальной последовательности. Как подробно
представлено в настоящем описании, N-конец зрелого
(процессированного) полипептида ENG может приходиться на любую из аминокислот 26-42 SEQ ID NO: 1. Примеры зрелых полипептидов ENG включают аминокислоты 25-377 SEQ ID NO: 23, аминокислоты 25-358 SEQ ID NO: 25 и аминокислоты 25-345 SEQ ID NO: 29. Аналогично, полипептид ENG может содержать полипептид, кодируемый нуклеотидами
73-1131 SEQ ID NO: 24, нуклеотидами 73-1074 SEQ ID NO: 26 или
нуклеотидами 73-1035 SEQ ID NO: 30, или их молчащими вариантами
или нуклеиновыми кислотами, гибридизующимися с
последовательностью, комплементарной им, в строгих условиях гибридизации (как правило, такие условия известны в этой области, но могут включать, например, гибридизацию в 50% об./об. формамиде, 5-кратном SSC, 2% масс./об. блокирующем средстве, 0,1% N-
лауроилсаркозине и 0,3% SDS при 65°С в течение ночи и промывку, например, 5-кратным SSC при приблизительно 65°С) . Таким образом, термин "полипептид ENG" включает выделенные внеклеточные части полипептидов ENG, их варианты (включая варианты, содержащие, например, не более 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30 или 35 замен аминокислот в последовательности, соответствующей аминокислотам 26-378 SEQ ID NO: 1), их фрагменты и слитые белки, содержащие что-либо из указанного выше, но в каждом случае, предпочтительно, любой из указанных выше полипептидов ENG будет сохранять значительную аффинность к ВМР-9 и/или ВМР-10. Как правило, полипептид ENG будут конструировать растворимыми в водных растворах при биологически значимых температурах, уровнях рН и осмолярности.
Данные, представленные в настоящем описании, свидетельствуют о том, что Fc-слитые белки, содержащие более короткие, укороченные с С-конца варианты полипептидов ENG, не проявляют значительного
связывания с TGF-pi и TGF-рз, но, вместо этого, проявляют более высокоаффинное связывание с ВМР-9, со значимо меньшей скоростью диссоциации по сравнению с ENG(26-437)-Fc или Fc-слитым белком, содержащим полноразмерный ENG ECD. Конкретно, обнаруживали, что все укороченные с С-конца варианты, заканчивающиеся аминокислотами 378, 359 и 346 SEQ ID NO: 1, связываются с ВМР-9 со значимо более высокой аффинностью (и связываются с ВМР-10 с не меньшей аффинностью) по сравнению с ENG(26-437) или ENG(26-586). Однако, связывание с ВМР-9 и ВМР-10 полностью нарушалось более обширными укорочениями С-конца до аминокислот 332, 329 или 257. Таким образом, ожидают, что все полипептиды ENG, заканчивающиеся между
аминокислотой 333 и аминокислотой 37 8, будут активными, но конструкции, заканчивающиеся аминокислотами 34 6 и 359 или между ними, могут являться наиболее активными. Предсказывали, что формы, заканчивающиеся аминокислотами 3 60 и 37 8 или между ними, имеют тенденцию к промежуточной аффинности связывания лиганда, показанной ENG(26-378). Ожидают улучшений в других ключевых параметрах в случае конкретных конструкций, заканчивающихся аминокислотами 333 и 37 8 или между ними, с учетом улучшений экспрессии белка и времени полувыведения, наблюдаемых в случае ENG(26-34 б)-Fc по сравнению со слитыми белками, содержащими полноразмерный ECD ENG (см. примеры). Желательным может являться использование любого из этих укороченных вариантов в зависимости от клинических или экспериментальных условий.
Ожидают, что на N-конце полипептид ENG, начинающийся с аминокислоты 26 (начального глутамата) SEQ ID NO: 1 или перед ней, будет сохранять активность связывания лиганда. Как представлено в настоящем описании, N-концевое укорочение до аминокислоты 61 SEQ ID NO: 1 устраняет связывание лиганда, как и более обширные укорочения N-конца. Однако, как дополнительно представлено в настоящем описании, консенсусное моделирование первичных последовательностей ENG свидетельствует о том, что упорядоченная вторичная структура в области, определяемой аминокислотами 2 6-60 SEQ ID NO: 1, ограничена бета-тяжем из четырех остатков, с высокой достоверностью предсказанным в положениях 42-45 SEQ ID N0: 1, и бета-тяжем из двух остатков, с очень низкой достоверностью предсказанным в положениях 28-29 SEQ ID N0: 1. Таким образом, активный полипептид ENG, предпочтительно, будет начинаться с (или до) аминокислоты 26 или с любой из аминокислот 27-42 SEQ ID N0: 1.
В совокупности, активная часть полипептида ENG может содержать аминокислотные последовательности 26-333, 26-334, 26335, 26-336, 26-337, 26-338, 26-339, 26-340, 26-341, 26-342, 26343, 26-344, 26-345 или 26-346 SEQ ID N0: 1, а также варианты этих последовательностей, начинающиеся с любой из аминокислот 27-42 SEQ ID N0: 1. Примеры полипептидов ENG содержат аминокислотные последовательности 26-346, 26-359 и 26-378 SEQ ID N0: 1. Также
включены варианты в этих диапазонах, в частности, варианты, имеющие по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности по отношению к соответствующей части SEQ ID NO: 1. Полипептид ENG может не включать последовательность, состоящую из аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1.
Как описано выше, настоящее изобретение относится к полипептидам ENG, имеющим конкретную степень идентичности или схожести последовательности по отношению к природному полипептиду ENG. Для определения процента идентичности двух аминокислотных последовательностей, их выравнивают в целях оптимального сравнения (например, можно включать пропуски в одной или обеих первой и второй аминокислотной последовательности или последовательности нуклеиновой кислоты для оптимального выравнивания, и в целях сравнения можно не принимать во внимание негомологичные последовательности). Затем сравнивают аминокислотные остатки в соответствующих положениях аминокислот. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы являются идентичными в этом положении (как применяют в настоящем описании, "идентичность" аминокислоты эквивалентна "гомологии" аминокислоты). Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для последовательностей, принимая во внимание количество пропусков и длину каждого пропуска, который необходимо включать для оптимального выравнивания двух последовательностей.
Сравнение последовательностей и определение процента идентичности и схожести двух последовательностей можно осуществлять с использованием математического алгоритма. (Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; и Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J.,
eds., M Stockton Press, New York, 1991).
В одном из вариантов осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Needleman и Wunsch (J Mol. Biol. (48):444-453 (1970)), включенного в программу GAP в пакете программ GCG (доступном на http://www.gcg.com). В конкретном варианте осуществления в программе GAP используют следующие параметры: матрицу Blosum 62 или матрицу РАМ250, штраф за открытие пропуска 16, 14, 12, 10, 8, б или 4 и штраф за удлинение пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или б. В еще одном варианте осуществления процент идентичности двух нуклеотидных последовательностей определяют с использованием программы GAP в пакете программ GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Res. 12(1):387 (1984)) (доступном на http://www.gcg.com). Примеры параметров включают использование матрицы NWSgapdna.CMP, штрафа за открытие пропуска 40, 50, 60, 7 0 или 8 0 и штрафа за удлинение пропуска 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Если не указано иначе, процент идентичности двух аминокислотных последовательностей следует определять с помощью программы GAP с использованием матрицы Blosum 62, штрафа за открытие пропуска 10 и штрафа за удлинение пропуска 3, и если с помощью такого алгоритма нельзя вычислить желаемый процент идентичности, необходимо выбирать подходящую альтернативу, представленную в настоящем описании.
В другом варианте осуществления процент идентичности двух аминокислотных последовательностей определяют с использованием алгоритма Е. Myers и W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)), включенного в программу ALIGN (версии 2.0), с использованием таблицы веса остатков РАМ12 0, штрафа за удлинение пропуска 12 и штрафа за открытие пропуска 4.
Другой вариант осуществления для определения лучшего общего
выравнивания между двумя аминокислотными последовательностями
можно определять с использованием компьютерной программы FASTDB на
основе алгоритма Brutlag et al. {Сотр. Арр. Biosci., 6:237-245
(1990)). При выравнивании последовательностей запрашиваемая и
рассматриваемая последовательности являются аминокислотными
последовательностями. Результат указанного глобального
выравнивания последовательностей представлен в терминах процента идентичности. В одном из вариантов осуществления идентичность аминокислотных последовательностей определяют с использованием компьютерной программы FASTDB на основе алгоритма Brutlag et al. {Сотр. Арр. Biosci., 6:237-245 (1990)). В конкретном варианте осуществления параметры, используемые для вычисления процента идентичность и схожести выравниваемых аминокислот, включают: матрица=РАМ 150, размер участка максимального совпадения=2, штраф за несовпадение=1, штраф за соединение=2 0, длина группы рандомизации=0, граничный балл=1, штраф за открытие пропуска=5 и штраф за удлинение пропуска=0,05.
В определенных вариантах осуществления полипептид ENG связывается с ВМР-9 и ВМР-10, и полипептид ENG не демонстрирует значительного связывания с TGF-|3l или TGF-|33 . Связывание можно оценивать с использованием очищенных белков в растворе или в системе поверхностного плазмонного резонанса, такой как система
Biacore . Можно выбирать полипептиды ENG, проявляющие антиангиогенную активность. Биологические анализы на активность ингибирования ангиогенеза включают анализ хориоаллантоиновой мембраны куриного яйца (САМ), анализ ангиореактора мыши и анализы для измерения эффекта введения выделенных или синтезированных белков в отношении имплантированных опухолей. Анализ САМ, анализ ангиореактора мыши и другие анализы описаны в примерах.
Полипептиды ENG дополнительно могут включать какую-либо из различных лидерных последовательностей на N-конце. Такая последовательность будет позволять пептидам экспрессироваться и воздействовать на путь секреции в эукариотической системе. См., например, Ernst et al. , патент США № 5082783 (1992). Альтернативно, нативную сигнальную последовательность ENG можно использовать для воздействия на экструзию из клетки. Возможные лидерные последовательности включают меллитин пчелы медоносной, ТРА и нативные лидерные последовательности (SEQ ID NO: 13-15, соответственно). Примеры слитых белков ENG-Fc, включающих лидерную последовательность ТРА, включают SEQ ID NO: 23, 25, 27 и 29. Процессинг сигнальных пептидов может варьироваться, помимо других
переменных факторов, в зависимости от выбранной лидерной последовательности, используемого типа клеток и условий культивирования, и, таким образом, конкретные N-концевые участки инициации транскрипции в случае зрелых полипептидов ENG могут сдвигаться на 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот в направлении N-конца или С-конца. Примеры зрелых слитых белков ENG-Fc включают SEQ ID N0: 33-36, как представлено ниже с подчеркнутой частью полипептида ENG.
LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS PELLMSLITG GGTHTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQYNSTY RWSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 35) ENG(26-34б)-hFc человека (укороченный Fc)
изобретении предусмотрены конкретные мутации полипептидной ENG таким образом, что изменяют гликозилирование полипептида. Можно выбирать такие мутации таким образом, чтобы встраивать или удалять один или несколько участков гликозилирования, таких как 0-связанные или N-связанные участки гликозилирования. Как правило, аспарагин-связанные участки распознавания гликозилирования содержат трипептидную последовательность, аспарагин-Х-треонин (или аспарагин-Х-серин) (где "X" является любой аминокислотой), специфически распознаваемую соответствующими клеточными ферментами гликозилирования. Изменение также можно осуществлять посредством добавления или замены одного или нескольких остатков серина или треонина в последовательность полипептида ENG дикого типа (в случае О-связанных участков гликозилирования). Множество замен или делеций аминокислот в одном или обоих первом или третьем положениях аминокислот участка распознавания гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) приводит к отсутствию гликозилирования в модифицированной трипептидной
последовательности. Другими способами повышения количества молекул
углеводов на полипептиде ENG является химическое или
ферментативное присоединение гликозидов к полипептиду ENG. В
зависимости от используемого способа присоединения, сахара можно
присоединять к (а) аргинину и гистидину; (Ь) свободным
карбоксильным группам; (с) свободным сульфгидрильным группам,
таким как группы цистеина; (d) свободным гидроксильным группам,
таким как группы серина, треонина или гидроксипролина; (е)
ароматическим остаткам, таким как фенилаланин, тирозин или
триптофан; или (f) амидной группе глутамина. Эти способы описаны в
W0 87/05330, опубликованном 11 сентября 1987 года, и Aplin and
Wriston (1981) CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306, включенных в
настоящее описание посредством ссылок. Удаление одной или
нескольких молекул углеводов, присутствующих на полипептиде ENG,
можно осуществлять химически и/или ферментативно. Химическое
дегликозилирование может включать, например, подвергание
полипептида ENG воздействию соединения трифторметансульфоновой
кислоты или эквивалентного соединения. Эта обработка приводит к
расщеплению большинства или всех Сахаров, за исключением
соединяющего сахара (N-ацетилглюкозамина или N-
ацетилгалактозамина), одновременно оставляя аминокислотную последовательность интактной. Химическое дегликозилирование дополнительно описано Hakimuddin et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259:52 и Edge et al. (1981) Anal. Biochem. 118:131. Ферментативное расщепление молекул углеводов на полипептидах ENG можно осуществлять с использованием различных эндо- и экзо-гликозидаз, как описано Thotakura et al. (1987) Meth. Enzymol. 138:350. Последовательность полипептида ENG при необходимости можно корректировать в зависимости от типа используемой системы экспрессии, т.к. все из клеток млекопитающих, дрожжей, насекомых и растений могут встраивать различные профили гликозилирования, на которые может влиять аминокислотная последовательность пептида. В основном, полипептиды ENG для применения у людей будут экспрессироваться в линии клеток млекопитающих, обеспечивающей правильное гликозилирование, такой как линии клеток НЕК2 93 или
СНО, хотя ожидают, что другие экспрессирующие линии клеток млекопитающих, линии дрожжевых клеток со сконструированными ферментами гликозилирования и клетки насекомых также будут применимыми.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрен способ получения мутантов, в частности, наборов комбинаторных мутантов полипептида ENG, а также укороченные мутанты; совокупности комбинаторных мутантов особенно применимы для идентификации функционального варианта последовательности. Целью скрининга таких комбинаторных библиотек может являться получение, например, вариантов полипептида ENG, которые могут действовать как агонисты или антагонисты, или альтернативно, которые вместе обладают новыми активностями. Ниже представлены различные анализы для скрининга, и такие анализы можно использовать для оценки вариантов. Например, вариант полипептида ENG можно подвергать скринингу на способность связываться с лигандом ENG для предотвращения связывания лиганда ENG с полипептидом ENG или для противодействия передачи сигнала, вызываемой лигандом ENG. Активность полипептида ENG или его вариантов также можно тестировать в клеточном анализе или анализе in vivo, в частности, любом из анализов, описываемых в примерах.
Можно получать варианты, полученные комбинаторно, имеющие селективную или, как правило, повышенную активность относительно полипептида ENG, содержащего внеклеточный домен природного полипептида ENG. Аналогично, с помощью мутагенеза можно получать варианты, имеющие время полужизни в сыворотке, значительно отличающееся от соответствующего полипептида ENG дикого типа. Например, измененный белок можно делать более стабильным или менее стабильным к протеолитической деградации или другим процессам, приводящим к деструкции или иной элиминации или инактивации нативного полипептида ENG. Такие варианты и кодирующие их гены можно использовать для изменения уровней полипептидов ENG посредством модуляции времени полужизни полипептидов ENG. Например, короткое время полужизни может приводить к более временным биологическим эффектам и делать возможным более жесткий контроль уровней рекомбинантного полипептида ENG у пациента. В
слитый белок Fc можно встраивать мутации в линкере (при его наличии) и/или Fc-части для изменения времени полужизни белка.
Можно получать комбинаторную библиотеку с помощью вырожденной
библиотеки генов, кодирующих библиотеку полипептидов, каждый из
которых включает, по меньшей мере, часть потенциальных
последовательностей полипептида ENG. Например, смесь синтетических
олигонуклеотидов можно ферментативно лигировать в
последовательности генов таким образом, что вырожденный набор потенциальных нуклеотидных последовательностей полипептида ENG экспрессируется в виде отдельных полипептидов, или альтернативно, в виде набора более крупных слитых белков (например, в случае фагового дисплея).
Существует множество способов, с помощью которых можно получать библиотеку потенциальных вариантов полипептидов ENG из вырожденной олигонуклеотидной последовательности. Химический синтез вырожденной последовательности гена можно осуществлять с помощью автоматизированного ДНК-синтезатора, а затем синтетические гены можно лигировать в подходящий вектор для экспрессии. Синтез вырожденных олигонуклеотидов хорошо известен в этой области (см. например, Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. ,
(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp273-289; Itakura et al. , (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al.,
(1984) Science 198:1056; Ike et al. , (1983) Nucleic Acid Res. 11:477). Такие способы используют для прямой оценки других белков
(см., например, Scott et al. , (1990) Science 249:386-390; Roberts et al., (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al., (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. , (1990) PNAS USA 87: 63786382; а также патенты США №№: 5223409, 5198346 и 5096815) .
Альтернативно, можно использовать другие формы мутагенза для получения комбинаторной библиотеки. Например, варианты полипептида ENG можно получать и выделять из библиотеки посредством скрининга с использованием, например, аланин-сканирующего мутагенеза и т.п.
(Ruf et al., (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. , (1993) Gene 137:109
118; Grodberg et al., (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al., (1993) J. Biol. Chem. 2 68:2888-2892; Lowman et al., (1991) Biochemistry 30:10832-10838; и Cunningham et al. , (1989) Science 244:1081-1085), линкер-сканирующего мутагенеза (Gustin et al., (1993) Virology 193:653-660; Brown et al. , (1992) Mol. Cell Biol. 12:2644-2652; McKnight et al., (1982) Science 232:316); насыщающего мутагенеза (Meyers et al., (1986) Science 232:613); ПЦР-мутагенеза (Leung et al. , (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19) или случайного мутагенеза, включая химический мутагенез, и т.д. (Miller et al., (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; и Greener et al. , (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34) . Линкер-сканирующий мутагенез, в частности, в комбинаторных условиях, является привлекательным способом идентификации укороченных (биоактивных) форм полипептидов ENG.
В этой области известен широкий диапазон способов скрининга продуктов генов комбинаторных библиотек, полученных с помощью точечных мутаций и укорочений, и, в связи с этим, скрининга библиотек кДНК на продукты генов, имеющие конкретное свойство. Такие способы, как правило, можно будет адаптировать для быстрого скрининга библиотек генов, полученных посредством комбинаторного мутагенеза полипептидов ENG. Наиболее широко используемые способы скрининга больших библиотек генов, как правило, включают клонирование библиотеки генов в реплицируемые экспрессирующие векторы, трансформации соответствующих клеток с получением библиотеки векторов и экспрессию комбинаторных генов в условиях, в которых определение желаемой активности способствует относительно легкому выделению вектора, кодирующего ген, продукт которого определяли. Предпочтительные анализы включают анализы связывания лиганда ENG и анализы лиганд-опосредованной передачи сигнала в клетке.
В определенных вариантах осуществления полипептиды ENG по
настоящему изобретению дополнительно могут содержать
посттрансляционные модификации в дополнение к любым, от природы присутствующим в полипептидах ENG. Такие модификации включают, в
качестве неограничивающих примеров, ацетилирование,
карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование,
липидизацию, пегилирование (полиэтиленгликолем) и ацилирование. В результате модифицированные полипептиды ENG могут содержать неаминокислотные элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахарид и фосфаты. Эффекты таких неаминокислотных элементов в отношении функциональности полипептида ENG можно тестировать, как представлено в настоящем описании, для других вариантов полипептида ENG. Когда полипептид ENG продуцируется в клетках посредством расщепления образующейся формы полипептида ENG, посттрансляционный процессинг также может быть важен для правильного фолдинга и/или функционирования белка. Различные клетки (такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 или НЕК293) имеют конкретный клеточный аппарат и характерные механизмы для таких посттрансляционных активностей, и их можно выбирать для обеспечения правильной модификации и процессинга полипептидов ENG.
В определенных аспектах функциональные варианты или модифицированные формы полипептидов ENG включают слитые белки, имеющие, по меньшей мере, часть полипептидов ENG и один или несколько слитых доменов. Хорошо известные примеры таких слитых доменов включают, в качестве неограничивающих примеров, полигистидин, Glu-Glu, глутатион-Б-трансферазу (GST), тиоредоксин, протеин А, протеин G, константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Fc), мальтозо-связывающий белок (МВР) или сывороточный альбумин человека. Слитый домен можно выбирать таким образом, чтобы он придавал желательную активность. Например, некоторые слитые домены особенно пригодны для выделения слитых белков посредством аффинной хроматографии. В целях аффинной очистки используют соответствующие матрицы для аффинной хроматографии, такие как глутатион-, амилаза- и никель- или кобальт-конъюгированные смолы. Многие из таких матриц доступны в форме "набора", такие как система очистки Pharmacia GST и система
QIAexpress (Qiagen), применимые с партнерами по слиянию с (Н1Эб) . В качестве другого примера, слитый домен можно выбирать таким образом, чтобы он облегчал определение полипептидов ENG. Примеры
таких доменов для определения включают различные флуоресцентные белки (например, GFP), а также "эпитопные метки", как правило, являющиеся короткими пептидными последовательностями, для которых доступно специфическое антитело. Хорошо известные эпитопные метки, для которых легкодоступны специфические моноклональные антитела, включают метки FLAG, гемагглютинина вируса гриппа (НА) и с-тус. В некоторых случаях слитые домены имеют участок расщепления протеазой, такой как в случае фактора Ха или тромбина, позволяющей соответствующей протеазе частично расщеплять слитые белки и, таким образом, высвобождать из них рекомбинантные белки. Затем высвобожденные белки можно отделять от слитого домена с помощью последующего хроматографического расщепления. В конкретных предпочтительных вариантах осуществления полипептид ENG подвергают слиянию с доменом, стабилизирующим полипептид ENG in vivo (домен-"стабилизатор"). Термин "стабилизирующий" означает что-либо, повышающее время полужизни в сыворотке, независимо от того, является ли это результатом снижения деструкции, снижения выведения почками или другого фармакокинетического эффекта. Известно, что слияние с Fc-частью иммуноглобулина придает желаемые фармакокинетические свойства широкому диапазону белков. Аналогично, слияние с сывороточным альбумином человека может придавать желаемые свойства. Другие типы слитых доменов, которые можно выбирать, включают домены мультимеризации (например, димеризации, тетрамеризации) и функциональные домены.
В качестве конкретных примеров, настоящее изобретение относится к слитым белкам, содержащим варианты полипептидов ENG, слитые с одной из двух последовательностей домена Fc (например, SEQ ID N0: 11, 12). Необязательно, домен Fc имеет одну или несколько мутаций в таких остатках, как Asp-265, Lys-322 и Asn-434 (пронумерованных согласно соответствующему полноразмерному IgG). В конкретных случаях мутантный домен Fc, имеющий одну или несколько из этих мутаций (например, мутацию Asp-265), имеет сниженную способность к связыванию с рецептором Fey относительно домена Fc дикого типа. В других случаях мутантный домен Fc, имеющий одну или несколько из этих мутаций (например, мутацию Asn-434), имеет
повышенную способность к связыванию с Fc-рецептором, связанным с МНС класса I, (FcRN) относительно домена Fc дикого типа.
Следует понимать, что различные элементы слитых белков можно
располагать любым образом, соответствующим желаемой
функциональности. Например, полипептид ENG можно помещать на С-
конец гетерологичного домена, или, альтернативно, гетерологичный
домен можно помещать на С-конец полипептида ENG. Домен полипептида
ENG и гетерологичный домен могут не являться смежными в слитом
белке, и на С- или N-конец домена или между доменами можно
включать дополнительные домены или аминокислотные
последовательности.
Как применяют в настоящем описании, термин "домен Fc иммуноглобулина" или просто "Fc" следует понимать как означающий карбокси-концевую часть константной области цепи иммуноглобулина, предпочтительно - константной области тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части. Например, Fc-область иммуноглобулин может содержать 1) домен СН1, домен СН2 и домен СНЗ, 2) домен СН1 и домен СН2, 3) домен СН1 и домен СНЗ, 4) домен СН2 и домен СНЗ или 5) комбинацию двух или более доменов и шарнирной области иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления Fc-область иммуноглобулина содержит, по меньшей мере, шарнирную область иммуноглобулина, домен СН2 и домен СНЗ, и, предпочтительно, в ней отсутствует домен СН1.
В одном из вариантов осуществления классом иммуноглобулина, из которого получают константную область тяжелой цепи, является IgG (Igy) (подклассы у 1, 2, 3 или 4) . Можно использовать другие классы иммуноглобулина, IgA (Iga), IgD (Ig8), IgE (Igs) и IgM (Igu). Выбор подходящей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина подробно описан в патентах США №№ 5541087 и 5726044. Считают, что выбор конкретных последовательностей константной области тяжелой цепи иммуноглобулина из конкретных классов и подклассов иммуноглобулинов для достижения конкретного результата находится в пределах знаний в этой области. Часть конструкции ДНК, кодирующей область Fc иммуноглобулина, предпочтительно, содержит, по меньшей мере, часть шарнирного
домена, и предпочтительно - по меньшей мере, часть домена СН3 Fc гамма или гомологичных доменов в любом из IgA, IgD, IgE или IgM.
Кроме того, предполагают, что замена или делеция аминокислот в константных областях тяжелой цепи иммуноглобулина может быть применима в практическом осуществлении способов и композиций, представленных в настоящем описании. Одним из примеров будет встраивание замен аминокислот в верхнюю область СН2 для получения варианта Fc со сниженной аффинностью к Fc-рецепторам (Cole et al. (1997) J. Immunol. 159:3613).
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным и/или очищенным формам полипептидов ENG, выделенным или иным образом, по существу, не содержащим (например, по меньшей мере на 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% не содержащим) другие белки и/или другие виды полипептидов ENG. Как правило, полипептиды ENG будут получать посредством экспрессии из рекомбинантных нуклеиновых кислот.
В определенных вариантах осуществления изобретение включает нуклеиновые кислоты, кодирующие растворимые полипептиды ENG, содержащие кодирующую последовательность для внеклеточной части белка ENG. В дополнительных вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей такие нуклеиновые кислоты. Клетка-хозяин может являться любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, полипептид по настоящему изобретению можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как Е. coll, клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), дрожжах или клетках млекопитающих. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалистам в этой области. Таким образом, некоторые варианты осуществления настоящего изобретения дополнительно относятся к способам получения полипептидов ENG. Установлено, что слитые белки ENG-Fc, приведенные в SEQ ID NO: 25 и 29 и экспрессируемые в клетках СНО, имеют мощную антиангиогенную активность.
5. Нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ENG
В определенных аспектах настоящее изобретение относится к выделенным и/или рекомбинантным нуклеиновым кислотам, кодирующим
любые из полипептидов ENG, включая фрагменты, функциональные варианты и слитые белки, представленные в настоящем описании. Например, SEQ ID N0: 2 и 4 кодируют длинную и короткую изоформы, соответственно, нативного полипептида-предшественника ENG человека, в то время как SEQ ID N0: 30 кодирует один вариант внеклеточного домена ENG, слитого с доменом Fc IgGl. Рассматриваемые нуклеиновые кислоты могут являться одноцепочечными или двухцепочечными. Такие нуклеиновые кислоты могут являться молекулами ДНК или РНК. Эти нуклеиновые кислоты можно использовать, например, в способах получения полипептидов ENG или непосредственно в качестве терапевтических средств (например, в подходах антисмысловой, РНКи- или генотерапии).
Следует понимать, что в определенных аспектах рассматриваемые нуклеиновые кислоты, кодирующие полипептиды ENG, дополнительно включают нуклеиновые кислоты, являющиеся вариантами SEQ ID N0: 24, 2 6, 2 8 или 30. Варианты нуклеотидных последовательностей включают последовательности, отличающиеся одной или несколькими заменами, вставками или делециями нуклеотидов, такие как аллельные варианты.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к выделенным или рекомбинантным последовательностям нуклеиновой кислоты, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичным SEQ ID N0: 24, 26, 28 или 30. Специалисту в этой области будет понятно, что последовательности нуклеиновой кислоты, комплементарные SEQ ID N0: 24, 2 6, 2 8 или 30, и варианты SEQ ID N0: 24, 2 6, 2 8 или 3 0 также входят в объем настоящего изобретения. В дополнительных вариантах осуществления последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут являться выделенными, рекомбинантными и/или слитыми с гетерологичной нуклеотидной последовательностью или находиться в библиотеке ДНК.
В других вариантах осуществления нуклеиновые кислоты по
настоящему изобретению также включают нуклеотидные
последовательности, в очень строгих условиях гибридизующиеся с нуклеотидными последовательностями, приведенными в SEQ ID N0: 24, 2 6, 2 8 или 30, последовательностями, комплементарными SEQ ID N0:
24, 2 6, 2 8 или 30, или их фрагментами. Как указано выше, специалисту в этой области будет понятно, что можно варьировать соответствующую строгость условий, способствующих гибридизации ДНК. Например, можно осуществлять гибридизацию в б,0-кратном хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) при приблизительно 45°С с последующей промывкой 2,0-кратным SSC при 50°С. Например, концентрацию соли на этапе промывки можно выбирать из условий от низкой строгости при приблизительно 2,0-кратном SSC при 50°С до высокой строгости при приблизительно 0,2-кратном SSC при 50°С. Кроме того, температуру на этапе промывки можно повышать с условий с низкой строгостью при комнатной температуре приблизительно 22°С до условий с высокой строгостью при приблизительно 65°С. Можно варьировать температуру и концентрацию соли или можно поддерживать постоянную температуру или концентрацию соли, одновременно меняя другую переменную. В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к нуклеиновым кислотам, гибридизующимся в условиях с низкой строгостью при б-кратном SSC при комнатной температуре с последующей промывкой в 2-кратном SSC при комнатной температуре.
Выделенные нуклеиновые кислоты, отличающиеся от нуклеиновых кислот, приведенных SEQ ID NO: 24, 2 6, 2 8 или 30, по причине вырожденности генетического кода, также входят в объем настоящего изобретения. Например, ряд аминокислот обозначен несколькими триплетами. Кодоны, обозначающие одну и ту же аминокислоту, или синонимичные кодоны (например, CAU и САС являются синонимичными кодонами для гистидина) могут приводить к "молчащим" мутациям, не влияющим на аминокислотную последовательность белка. Однако, ожидают, что в клетках млекопитающих будут существовать полиморфизмы последовательности ДНК, приводящие к изменениям в аминокислотных последовательностях рассматриваемых белков. Специалисту в этой области будет понятно, что эти изменения одного или нескольких нуклеотидов (до приблизительно 3-5% нуклеотидов) нуклеиновых кислот, кодирующих конкретный белок, могут существовать у индивидуумов указанных видов как результат
природных аллельных вариантов. Любое и все такие изменения нуклеотидов и образующиеся полиморфизмы аминокислот входят в объем настоящего изобретения.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные
нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут быть
функционально связаны с одной или несколькими регуляторными
нуклеотидными последовательностями в экспрессирующей конструкции.
Регуляторные нуклеотидные последовательности, как правило, будут
соответствовать клетке-хозяину, используемой для экспрессии. В
этой области известно множество типов соответствующих
экспрессирующих векторов и подходящих регуляторных
последовательностей для различных клеток-хозяев. Как правило,
указанные одна или несколько регуляторных нуклеотидных
последовательностей могут включать, в качестве неограничивающих
примеров, промоторные последовательности, лидерные или сигнальные
последовательности, участки связывания рибосомы,
последовательности инициации и терминации транскрипции, последовательности инициации и терминации трансляции и последовательности энхансеров или активаторов. Конститутивные или индуцибельные промоторы, известные в этой области, включены в настоящее изобретение. Промоторы могут являться природными промоторами или гибридными промоторами, в которых комбинируют элементы нескольких промоторов. Экспрессирующая конструкция может присутствовать в клетке на эписоме, такая как плазмида, или экспрессирующую конструкцию можно встраивать в хромосому. В предпочтительном варианте осуществления экспрессирующий вектор содержит ген селективного маркера, делающий возможной селекцию трансформированных клеток-хозяев. Гены селективных маркеров хорошо известны в этой области и будут варьироваться в зависимости от используемой клетки-хозяина.
В определенных аспектах настоящего изобретения
рассматриваемую нуклеиновую кислоту предоставляют в
экспрессирующем векторе, содержащем нуклеотидную
последовательность, кодирующую полипептид ENG, и функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной
последовательностью. Регуляторные последовательности известны в
этой области, и их выбирают для воздействия на экспрессию
полипептида ENG. Таким образом, термин "регуляторная
последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие
элементы контроля экспрессии. Примеры регуляторных
последовательностей описаны в Goeddel; Селе Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Например, в этих векторах для экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих полипептид ENG, можно использовать любую из широкого спектра последовательностей контроля экспрессии, контролирующих экспрессию последовательности ДНК при функциональной связи с ней. Такие применимые последовательности контроля экспрессии, включают, например, ранние и поздние промоторы SV4 0, промотор tet, предранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, промоторы RSV, систему lac, систему trp, систему ТАС или TRC, промотор Т7, экспрессия которого регулируется РНК-полимеразой Т7, основные области оператора и промотора фага лямбда, контрольные области белка оболочки fd, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Pho5, промоторы факторов а-скрещивания дрожжей, полигедроновый промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, о которых известно, что они контролируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации. Следует понимать, что дизайн экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, и/или типа белка, экспрессия которого является желательной. Кроме того, также необходимо принимать во внимание копийность вектора, способность контролировать эту копийность и экспрессию любого другого белка, кодируемого вектором.
Рекомбинантную нуклеиновую кислоту, включенную в настоящее изобретение, можно получать посредством лигирования клонированного гена или его части, в вектор, подходящий для экспрессии в прокариотических клетках, эукариотических клетках (дрожжей, птиц, насекомых или млекопитающих) или и тех, и других. Средства
экспрессии для получения рекомбинантного полипептида ENG включают плазмиды и другие векторы. Например, подходящие векторы включают плазмиды следующих типов: плазмиды, полученные из pBR322, плазмиды, полученные из pEMBL, плазмиды, полученные из рЕХ, плазмиды, полученные из рВТас, и плазмиды, полученные из pUC, для экспрессии в прокариотических клетках, таких как Е. coli.
Некоторые векторы для экспрессии в клетках млекопитающих содержат прокариотические последовательности для облегчения размножения вектора в бактериях и одну или несколько эукариотических единиц транскрипции, экспрессирующихся в эукариотических клетках. Векторы, полученные из pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2 gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, nMSG, pSVT7, pko-neo и pHyg, являются примерами векторов для экспрессии в клетках млекопитающих, подходящих для трансфекции эукариотических клеток. Некоторые из этих векторов модифицируют с использованием последовательностей из бактериальных плазмид, таких как pBR322, для облегчения репликации и селекции по резистентности к лекарственному средству в прокариотических и эукариотических клетках. Альтернативно, для транзиторной экспрессии белков в эукариотических клетках можно использовать производные вирусов, таких как вирус папилломы крупного рогатого скота (BPV-1) или вирус Эпштейна-Барр (рНЕВо, производное pREP и р205). Примеры других вирусных (включая ретровирусных) систем экспрессии можно найти ниже в описании систем доставки для генотерапии. В этой области хорошо известны различные способы, используемые в получении плазмид и трансформации организмов-хозяев. Другие подходящие системы экспрессии для прокариотических и эукариотических клеток, а также общие рекомбинантные способы см. в Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). В некоторых случаях, желательной может являться экспрессия рекомбинантных полипептидов с использованием бакуловирусной системы экспрессии. Примеры таких бакуловирусных систем экспрессии включают векторы, полученные из pVL (такие как pVL13 92, pVL13 93 и pVL941), векторы, полученные из pAcUW (такие как pAcUWl), и
векторы, полученные из pBlueBac (такие как p-gal-содержащие pBlueBac III).
В предпочтительном варианте осуществления для получения рассматриваемых полипептидов ENG в клетках СНО будут конструировать вектор, такой как вектор Pcmv-Script (Stratagene, La Jolla, Calif.), векторы pcDNA4 (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) и векторы pCI-neo (Promega, Madison, Wise.). Как будет очевидно, рассматриваемые генные конструкции можно использовать, чтобы вызывать экспрессию рассматриваемых полипептидов ENG в клетках, выращиваемых в культуре, например, для получения белков, включающих слитые белки или варианты белков, для очистки.
Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансфицированной с использованием рекомбинантного гена, включающего кодирующую последовательность (например, SEQ ID N0: 24, 2 6, 2 8 или 30) для одного или нескольких рассматриваемых полипептидов ENG. Клетка-хозяин может являться любой прокариотической или эукариотической клеткой. Например, полипептид ENG, представленный в настоящем описании, можно экспрессировать в бактериальных клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых (например, с использованием бакуловирусной системы экспрессии), дрожжах или клетках млекопитающих. Специалистам в этой области известны другие подходящие клетки-хозяева.
Таким образом, настоящее изобретение дополнительно относится
к способам получения рассматриваемых полипептидов ENG. Например,
клетку-хозяина, трансфицированную с использованием
экспрессирующего вектора, кодирующего полипептид ENG, можно культивировать в подходящих условиях, чтобы сделать возможной экспрессию полипептида ENG. Полипептид ENG может секретироваться, и его можно выделять из смеси клеток и среды, содержащей полипептид ENG. Альтернативно, полипептид ENG может оставаться в цитоплазме или мембранной фракции, и клетки собирают, лизируют и выделяют белок. Культура клеток включает клетки-хозяева, среды и другие побочные продукты. Подходящие среды для культивирования клеток хорошо известны в этой области. Рассматриваемые полипептиды ENG можно выделять из среды для культивирования клеток, клеток
хозяев или и того, и другого известными в этой области способами очистки белков, включая ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, ультрафильтрацию, электрофорез, иммуноаффинную очистку с использованием антител, специфичных для конкретных эпитопов полипептидов ENG, и аффинную очистку с использованием средства, связывающегося с доменом, слитым с полипептидом ENG (например, для очистки слитого белка ENG-Fc можно использовать колонку с протеином А) . В предпочтительном варианте осуществления полипептид ENG является слитым белком, содержащим домен, облегчающий его очистку. Например, очистку можно осуществлять посредством серии этапов хроматографии на колонках, включая, например, три или более из следующего, в любом порядке: хроматографию с протеином А, хроматографию с Q-сефарозой, хроматографию с фенилсефарозой, эксклюзионную хроматографию и катионообменную хроматографию. Очистку можно завершать вирусной фильтрацией и заменой буфера.
В другом варианте осуществления слитый ген, кодирующий лидерную последовательность для очистки, такую как поли-(His)/ последовательность участка расщепления энтерокиназой на N-конце желаемой части рекомбинантного полипептида ENG, может делать возможной очистку экспрессируемого слитого белка посредством аффинной хроматографии с использованием Ni^-смолы. Затем лидерную последовательность для очистки можно удалять посредством обработки энтерокиназой для получения очищенного полипептида ENG (например, см. Hochuli et al. , (1987) J. Chromatography 411:177; и Janknecht et al., PNAS USA 88:8972).
Способы получения слитых генов хорошо известны. По существу, соединение различных фрагментов ДНК, кодирующих различные последовательности полипептида, осуществляют общепринятыми способами с использованием тупых концов или ступенчатых разрывов для лигирования, расщепления рестрикционными ферментами для получения соответствующих концов, заполнения липких концов при необходимости, обработки щелочной фосфатазой во избежание нежелательного соединения и ферментативного лигирования. В другом варианте осуществления слитый ген можно синтезировать
общепринятыми способами, включая использование автоматизированных ДНК-синтезаторов. Альтернативно, можно осуществлять ПНР-амплификацию фрагментов гена с использованием якорных праймеров, при этом между двумя последовательными фрагментами генов образуются комплементарные липкие концы, которые затем можно отжигать для получения последовательности химерного гена (см., например, Current Protocols in Molecular biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992).
Примеры категорий соединений нуклеиновых кислот, являющихся
антагонистами ENG, ВМР-9 или ВМР-10, включают антисмысловые
нуклеиновые кислоты, конструкции РНКи и каталитические конструкции
нуклеиновых кислот. Соединение нуклеиновой кислоты может являться
одно- или двухцепочечным. Двухцепочечное соединение также может
включать области липких концов или некомплементарности, где одна
или другая цепь является одноцепочечной. Одноцепочечное соединение
может включать области самокомплементарности, что означает, что
соединение образует, так называемую, "шпильку" или структуру
"стебель-петля", с областью с двухцепочечной структурой.
Соединение нуклеиновой кислоты может содержать нуклеотидную
последовательность, комплементарную области, состоящей из не более
1000, не более 500, не более 250, не более 100 или не более 50,
35, 30, 25, 22, 20 или 18 нуклеотидов полноразмерной
последовательности нуклеиновой кислоты ENG или последовательность
нуклеиновой кислоты лиганда. Предпочтительно, область
комплементарности будет составлять по меньшей мере 8 нуклеотидов, и необязательно, по меньшей мере 10 или по меньшей мере,15 нуклеотидов, и необязательно от 15 до 25 нуклеотидов. Область комплементарности может приходиться на интрон, кодирующую последовательность или некодирующую последовательность целевого транскрипта, такого как часть кодирующей последовательности. Как правило, соединение нуклеиновой кислоты будет иметь длину от приблизительно 8 до приблизительно 500 нуклеотидов или пар оснований в длину, и, необязательно, длина будет составлять от приблизительно 14 до приблизительно 50 нуклеотидов. Нуклеиновая кислота может являться ДНК (в частности для применения в качестве
антисмысловой), РНК или гибридом РНК:ДНК. Любая цепь может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые нелегко классифицировать как ДНК или РНК. Аналогично, двухцепочечное соединение может являться ДНК:ДНК, ДНК:РНК или РНК:РНК, и любая цепь также может включать смесь ДНК и РНК, а также модифицированные формы, которые нелегко классифицировать как ДНК или РНК. Соединение нуклеиновой кислоты может включать любую из множества модификаций, включая одну или несколько модификаций остова (сахар-фосфатной части природной нуклеиновой кислоты, включающей межнуклеотидные связи) или части оснований (пуриновой или пиримидиновой части природной нуклеиновой кислоты). Соединение антисмысловой нуклеиновой кислоты, предпочтительно, будет иметь длину от приблизительно 15 до приблизительно 3 0 нуклеотидов и, зачастую, будет содержать одну или несколько модификаций для улучшения характеристик, таких как стабильность в сыворотке, в клетке или в месте, в которое соединение, вероятно, будут доставлять, таком как желудок в случае перорально доставляемых соединений и легкое для ингаляционных соединений. В случае конструкции РНКи, цепь, комплементарная целевому транскрипту, как правило, будет являться РНК или ее модификацией. Другая цепь может являться РНК, ДНК или любым другим вариантом. Дуплексная часть двухцепочечной или одноцепочечной "шпильки" конструкции РНКи, предпочтительно, будет иметь длину от 18 до 4 0 нуклеотидов и, необязательно, от приблизительно 21 до 23 нуклеотидов, при условии, что она служит субстратом для Dicer. Каталитические или ферментативные нуклеиновые кислоты могут являться рибозимами или ДНК-ферментами, а также могут содержать модифицированные формы. Соединения нуклеиновых кислот могут ингибировать экспрессию мишени приблизительно на 50%, 75%, 90% или более при контакте с клетками в физиологических условиях и в концентрации, когда нонсенс- или смысловой контроль имеет небольшой эффект или не имеет эффекта. Предпочтительными концентрациями для тестирования эффекта соединений нуклеиновых кислот являются 1, 5 и 10 микромоль. Соединения нуклеиновых кислот также можно тестировать на эффекты, например, в отношении ангиогенеза.
6. Изменения Fc-слитых белков
Изобретение дополнительно относится к слитым белкам ENG-Fc со сконструированными Fc-областями или вариантами Fc-областей. Такие антитела и Fc-слитые белки могут быть применимы, например, в модуляции эффекторных функций, таких как антиген-зависимая цитотоксичность (ADCC) и комплементзависимая цитотоксичность (CDC). Кроме того, модификации могут улучшать стабильность антител и слитых белков Fc. Варианты аминокислотной последовательности антител и слитых белков Fc получают посредством включения соответствующих изменений нуклеотидов в ДНК или посредством пептидного синтеза. Такие варианты включают, например, делеции, и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антител и Fc-слитых белков, представленных в настоящем описании. Любую комбинацию делеции, инсерции и замены осуществляют на конечной конструкции, при условии, что конечная конструкция обладает желаемыми характеристиками. Изменения аминокислот также могут изменять посттрансляционный процессинг антител и Fc-слитых белков, такие как изменения количества или положения участков гликозилирования.
Можно получать антитела и Fc-слитые белки со сниженной эффекторной функцией, включая изменения в аминокислотную последовательность, включая, в качестве неограничивающих примеров, мутацию Ala-Ala, описываемую Bluestone et al. (см. WO 94/28027 и WO 98/47531; также см. Xu et al. 2000 Cell Immunol 200; 16-26) . Таким образом, в определенных вариантах осуществления для снижения или устранения эффекторной функции можно использовать антитела и Fc-слитые белки по настоящему изобретению с мутациями в константной области, включая мутацию Ala-Ala. По этим вариантам осуществления антитела и Fc-слитые белки могут содержать мутацию в аланин в положении 2 34, или мутацию в аланин в положении 235, или их комбинацию. В одном из вариантов осуществления антитело или Fc-слитый белок содержит каркас IgG4, где мутация Ala-Ala будет означать мутации из фенилаланина в аланин в положении 2 34 и/или мутацию из лейцина в аланин в положении 235. В другом варианте осуществления антитело или Fc-слитый белок содержит каркас IgGl,
где мутация Ala-Ala будет означать мутации из лейцина в аланин в положении 234 и/или мутацию из лейцина в аланин в положении 235. Антитело или Fc-слитый белок альтернативно или дополнительно могут нести другие мутации, включая точечную мутацию К322А в домене СН2
(Hezareh et al. 2001 J Virol. 75: 12161-8).
В конкретных вариантах осуществления антитело или Fc-слитый белок можно модифицировать для повышения или ингибирования обусловленной комплементом цитотоксичности (CDC). Модулированной активности CDC можно достигать посредством включения одной или нескольких замен, инсерций или делеций аминокислот в Fc-область
(см., например, патент США № 6194551). Альтернативно или дополнительно, в Fc-область можно встраивать остатки цистеина, таким образом, делая возможным образование межцепочечной дисульфидной связи в этой области. Полученное таким образом гомодимерное антитело может иметь улучшенную или сниженную способность к интернализации и/или повышенное или сниженное обусловленное комплементом уничтожение клеток. См. Caron et al. , J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) и Shopes, В. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992), W099/51642, Duncan & Winter Nature 322: 73840 (1988); патент США № 5648260; патент США № 5624821 и W094/29351 .
ПРИМЕРЫ
В целом, описанное изобретение будет более понятным со ссылкой на следующие примеры, включенные исключительно в целях иллюстрирования конкретных вариантов осуществления и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначенные для ограничения изобретения.
Пример 1: Экспрессия слитого белка, содержащего полноразмерный внеклеточный домен ENG человека
Авторы настоящего изобретения конструировали растворимый слитый белок эндоглина (ENG) (hENG(26-586)-hFc), в котором полноразмерный внеклеточный домен (ECD) ENG человека (фигура 9, SEQ ID NO: 9) присоединяли к домену Fc IgGl человека (фигура 11, SEQ ID NO: 11) с минимальным линкером между этими доменами. hENG(26-58 б)-hFc экспрессировали посредством транзиторной
трансфекции в клетках НЕК 293. В кратком изложении, клетки НЕК 293 подготавливали в спиннере емкостью 500-мл при бхЮ5 клеток/мл в средах Freestyle (Invitrogen) объемом 250 мл и выращивали в течение ночи. На следующий день эти клетки обрабатывали комплексом ДНК:РЕ1 (1:1) при 0,5 мкг/мл конечной концентрации ДНК. Через 4 часа добавляли 250 мл среды и выращивали клетки в течение 7 дней. Кондиционированные среды собирали посредством центрифугирования клеток и концентрировали. Для экспрессии в клетках СНО конструкции полипептида ENG трансфицировали в линию клеток СНО DUKX ВН. Клоны подвергали селекции метотрексатом (МТХ), как правило, при начальной концентрации 5 нМ или 10 нМ, и, необязательно, с последующей амплификацией в 50 нМ МТХ для повышения экспрессии. Высокоэкспрессирующийся клон можно идентифицировать посредством клонирования способом разведений и адаптировать для выращивания в бессывороточной суспензии для получения кондиционированных сред для очистки. Необязательно, в вектор можно включать универсальный хроматинраскрывающий элемент (UCOE) для облегчения экспрессии. См., например, Cytotechnology. 2002 Jan;38(1-3):43-б.
Можно использовать три разные лидерные последовательности:
(i) Меллитина пчелы медоносной (HBML): MKFLVNVALVFMWYISYIYA
(SEQ ID NO: 13)
(ii) Тканевого активатора плазминогена (ТРА):
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID N0: 14)
(iii) Нативного ENG человека: MDRGTLPLAVALLLASCSLSPTSLA (SEQ
ID NO: 15)
В выбранной форме hENG(26-58 б)-hFc используют лидерную
последовательность ТРА, она имеет непроцессированную
аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 13 (SEQ ID NO: 16), и кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной на фигуре 14 (SEQ ID NO: 17) . Авторы настоящего изобретения также предусмотрели альтернативную последовательность hENG(26-58 б)-hFc с лидерной последовательностью ТРА (фигура 15, SEQ ID NO: 18), содержащей укороченный с N-конца домен hFc (фигура 12, SEQ ID NO: 12), присоединенный к hENG(26-586) через линкер TGGG. Очистку осуществляли различными способами, включая,
например, фильтрацию кондиционированных сред с последующей хроматографией с протеином А, элюированием с глициновым буфером с низким рН (3,0), нейтрализацией образца и диализом против PBS. Чистоту образцов оценивали посредством аналитической эксклюзионной хроматографии, электрофореза в ПААГ в присутствие SDS, окрашивания серебром и вестерн-блоттинга. С помощью анализа зрелого белка подтверждали ожидаемую N-концевую последовательность.
Пример 2: Экспрессия слитого белка, содержащего полноразмерный внеклеточный домен ENG мыши
Авторы настоящего изобретения конструировали растворимый
слитый белок ENG мыши (mENG(27-581)-mFc), в котором полноразмерный
внеклеточный домен ENG мыши (фигура 10, SEQ ID N0: 10) подвергали
слиянию с доменом Fc IgG2a мыши с минимальными линкерами между эти
доменами. mENG(27-581)-mFc экспрессировали посредством
транзиторной трансфекции в клетки НЕК 2 93.
В выбранной форме mENG(27-581)-mFc использовали лидерную
последовательность ТРА, она имеет непроцессированную
аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 16
(SEQ ID N0: 19) и кодируется нуклеотидной последовательностью,
представленной на фигуре 17 (SEQ ID N0: 20). Очистку осуществляли
посредством фильтрации кондиционированных сред из
трансфицированных клеток НЕК 2 93 с последующей хроматографией с протеином А. Чистоту образцов оценивали посредством аналитической эксклюзионной хроматографии, электрофореза в ПААГ в присутствие SDS, окрашивания серебром и анализа вестерн-блоттинга.
Пример 3: Селективное связывание ВМР-9/ВМР-10 с белками, содержащими полноразмерный внеклеточный домен ENG
Считают, что рассматриваемый в качестве корецептора ENG функционирует, облегчая связывание TGF-|3l и -3 с мультибелковыми комплексами рецепторов типа I и типа II. Для исследования возможности прямого связывания лиганда выделенным ENG авторы настоящего изобретения использовали методологию поверхностного плазмонного резонанса (SPR) (инструмент Biacore(tm)) для скрининга на связывание иммобилизованных белков, содержащих полноразмерный внеклеточный домен ENG, с различными растворимыми лигандами
при 100 нМ
** [hBMP-9], [hBMP-10]=2,5 нМ; все другие лиганды тестировали при 2 5 нМ
*** [hBMP-9], [hBMP-10]=0,5 нМ; [hTGF-pi], [hTGF~P2], [hTGF-Р3]=10 нМ; все другие лиганды тестировали при 2 5 нМ
Как показано в этой таблице, аффинность связывания с hENG(26586)-hFc являлась высокой ( + + + +, KD <1 нМ) для hBMP-9 и hBMP-Ю, как оценивали при низких концентрациях лиганда. Даже при концентрации в 4 0 раз выше связывание TGF-pi, TGF-P2, TGF-рз, активина А, ВМР-2 и ВМР-7 с hENG(26-586)-hFc являлось неопределимым (-) . В случае этой последней группы лигандов примечательно отсутствие прямого связывания с выделенным слитым белком ENG, т.к. показано, что мультибелковые комплексы рецепторов типа I и типа II лучше связываются с большинством из них в присутствие ENG, чем в его отсутствие. Как дополнительно показано в таблице выше, аналогичные результаты получали при скрининге лигандов на их способность связываться с иммобилизованным hENG(2 6-58 6) (R &D Systems, кат. №1097-EN), вариантом человека без домена Fc, или их способность связываться с иммобилизованным mENG(27-581)-hFc (R &D Systems, кат.
№1320-EN), состоящим из внеклеточного домена ENG мыши (остатки 27581), присоединенного к домену Fc IgGi человека через последовательность линкера из шести остатков (IEGRMD). Определение характеристик с помощью SPR (фигуры 18, 19) показало, что иммобилизованный hENG(26-58б)-hFc связывается с растворимым ВМР-9 с KD 2 9 пМ, а растворимый ВМР-10 - с KD 4 00 пМ. Таким образом, селективное высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10 является ранее неизвестным свойством внеклеточного домена ENG, являющимся общим для различных видов.
Пример 4: Растворимый внеклеточный домен hENG ингибирует связывание ВМР-9/ВМР-10 с ALK1 и другими родственными рецепторами
ВМР-9 и ВМР-10 являются высокоаффинными лигандами для рецептора ALK1 типа I (киназы, подобной рецептору активина 1). Для определения эффекта растворимого hENG(26-586) (R &D Systems, кат. №1097-EN) в отношении связывания ВМР-9 и ВМР-10 с ALK1 использовали анализ на основе SPR. ALKl-hFc иммобилизовали, а затем подвергали воздействию растворов, содержащих растворимый hENG(26-58 б), предварительно смешанный с ВМР-9 в различных соотношениях. Как показано на фигуре 20, растворимый hENG(26-586) ингибировал связывание ВМР-9 с ALKl-Fc в зависимости от концентрации с IC50 менее 10 нМ. Аналогичные результаты получали с использованием ВМР-10 (фигура 21). Различные эксперименты показали, что растворимый hENG(2 6-58 6) не связывает ALK1 и, таким образом, не ингибирует связывание лиганда с ALK1 с помощью этого механизма. Фактически, дополнительные эксперименты на основе SPR показали, что растворимый hENG(2 6-58 6) не связывается ни с рецепторами ALK2-ALK7 типа I, ни с рецепторами типа II, такими как рецептор активина НА, рецептор активина IIB, рецептор морфогенетического белка кости II и рецептор TGF-|3 II. Эти результаты представляют собой дополнительное доказательство того, что ENG ингибирует связывание ВМР-9 и ВМР-10 с ALK1, главным образом, посредством прямого взаимодействия с этими лигандами.
В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что растворимые химерные белки ENG-Fc, а также нехимерный растворимый ENG можно использовать в качестве антагонистов передачи сигнала
ВМР-9 и ВМР-10 через множество путей передачи сигнала, включая ALK1.
Пример 5: Эффект mENG(27-581)-hFc в отношении эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) в культуре
Авторы настоящего изобретения исследовали ангиогенный эффект mENG(27-581)-hFc в системе культивирования на основе HUVEC. HUVEC культивировали на полимеризованном субстрате Matrigel, и эффект тестируемых образцов в отношении образования трубок из эндотелиальных клеток (тяжей) оценивали посредством фазово-контрастной микроскопии через 12 часов воздействия. Тяжи, имеющие ширину в одну клетку и по меньшей мере три ветви, идентифицировали визуально и использовали компьютеризированный анализ изображений для определения общей длины таких тяжей. Средние значения основаны на двух параллельных лунках планшета для культивирования на условие эксперимента, при этом каждую лунку охарактеризовывали как среднее для трех полей наблюдения. По сравнению с базовыми условиями (без обработки) сильный индуктор, стимулятор роста эндотелиальных клеток (ECGS, 0,2 мкг/мл), приводил к удвоению средней длины тяжа (фигура 22) . mENG(27-581)-hFc (R &D Systems, кат. №1320-EN; 10 мкг/мл) снижал это повышение приблизительно на 60%, эффект, специфичный для условий стимуляции, т.к. одна и та же концентрация mENG(27-581)-hFc имела небольшой эффект в отсутствие ECGS (фигура 22). Эти результаты свидетельствуют о том, что слитый белок ENG-Fc может ингибировать агрегацию эндотелиальных клеток в условиях иной стимуляции в модели ангиогенеза в культуре клеток.
Пример 6: ENG-Fc ингибирует индуцируемый VEGF ангиогенез в анализе хориоаллантоиновой мембраны куриного яйца (САМ)
Систему анализа хориоаллантоиновой мембраны куриного яйца (САМ) использовали для исследования эффектов слитого белка ENG-Fc в отношении ангиогенеза. В кратком изложении, оплодотворенные эмбрионы курицы возрастом девять дней держали в инкубаторе для яиц при контролируемой температуре (37°С) и влажности (60%) . Скорлупу яйца размягчали спиртом, делали небольшое отверстие для создания "пузыря" между мембраной скорлупы и САМ и удаляли для создания окна, располагающегося над видимыми кровеносными сосудами.
Небольшие фильтровальные диски обрабатывали VEGF (50 нг ежедневно) в присутствие или отсутствие белка mENG(27-581)-hFc (R &D Systems, кат. №1320-EN; 14 мкг ежедневно), растворенного в буфере (рН 7,4) содержащем 0,01 М HEPES, 0,5 М NaCl, 3 мМ ЭДТА, 0,005% об./об. поверхностно-активного вещества Р20 и 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Затем фильтровальные диски, содержащие тестируемый образец, вставляли в отверстие и соединяли с САМ. Яйца (п=8 на группу) обрабатывали свежим тестируемым образцом ежедневно в течение трех дней и на четвертый день визуально определяли количество кровеносных сосудов, связанных с фильтровальным диском, с использованием лампы для яиц.
Как и ожидали, обработка VEGF в анализе САМ значительно повышала количество кровеносных сосудов по сравнению с наполнителем. Количество дополнительных кровеносных сосудов, индуцируемых с помощью обработки VEGF, снижалось на 65% при конкурентной обработке mENG(27-581)-hFc (фигура 23) . Исследования с использованием SPR показали, что VEGF не связывается с mENG(27581)-mFc, и, таким образом, эффекты mENG(27-581)-hFc в отношении ангиогенеза в настоящем эксперименте с САМ не являлись результатом прямого взаимодействия между слитым белком и VEGF. Изложенные выше результаты свидетельствуют о том, что ENG-Fc может значительно ингибировать хорошо известный ангиогенный эффект VEGF в модели in vivo без контакта с самим VEGF.
Пример 7: Эффект mENG(27-581)-mFc в отношении ангиогенеза в анализе ангиореактора мыши
Эффекты слитого белка ENG-Fc в отношении ангиогенеза дополнительно исследовали в анализе ангиореактора мыши, также известного как прямой анализ ангиогенеза in vivo (DIVAA(tm); Guedez et al. , 2003, Am J Pathol 162:1431-1439), который осуществляли по инструкциям производителя (Trevigen(r)) . В кратком изложении, полые цилиндры, полученные из силикона, подходящего для имплантации, и закрытые с одного конца, наполняли 2 0 мкл экстракта базальной мембраны (ВМЕ), предварительного смешанного с комбинацией основного фактора роста фибробластов (FGF-2, 1,8 г) и VEGF (600 нг) или без нее. После желирования ВМЕ ангиореакторы подкожно
имплантировали бестимусным мышам (четыре на мышь). Мышам ежедневно
вводили mENG(27-581)-mFc (10 мг/кг, s.c.) или наполнитель (Tris-
забуференный физиологический раствор) в течение 11 дней, после
чего мышам инъецировали декстран, меченый
флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), (20 мг/кг, i.v.) и умерщвляли их через 2 0 мин. Удаляли ангиореакторы и количественно анализировали количество FITC-декстрана, содержащегося в каждом из них, с помощью флуоресцентного спектрофотометра для чтения планшетов (Infinite(r) М200, Тесап) при возбуждении 485 нм/эмиссии 520 нм в качестве индекса образования кровеносных сосудов. Как показано на фигуре 24, добавление FGF-2 и VEGF к ВМЕ приводило к значительному повышению васкуляризации в ангиореакторах по завершении исследования, в то время как конкурентное введение mENG(27-581)-mFc полностью предотвращало это повышение. Эти результаты, полученные в системе млекопитающего, дополняют результаты, полученные с использованием описываемого выше анализа САМ, и демонстрируют антиангиогенную активность слитых белков ENG-Fc, включающих полноразмерный внеклеточный домен ENG, in vivo.
Пример 8: Экспрессия вариантов с укороченным внеклеточным доменом hENG
Авторы настоящего изобретения получали растворимые слитые белки ENG, в которых укороченные варианты ECD ENG человека подвергали слиянию с доменом Fc IgGl человека с минимальным линкером. Эти варианты приведены ниже, и структуры выбранных вариантов схематически представлены на фигуре 25.
Конструкция человека
Транзиторная экспрессия
Очищенный
Стабильная Экспрессия (клетки СНО)
Полноразмерный
hENG(26-586)-hFc
НЕК 293
Карбокси-концевые укорочения
hENG(26-581)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(26-437)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(26-378)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(26-359)-hFc
НЕК 293
hENG(26-346)-hFc
НЕК 293
hENG(26-332)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(26-329)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(26-257)-hFc
НЕК 293
Нет
Амино-концевые укорочения
hENG(360-586)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(438-586)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(458-586)-hFc
COS
Нет
Нет
Двойные укорочения
hENG(61-346)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(129-346)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(133-346)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(166-346)-hFc
НЕК 293
Нет
hENG(258-346) -hFc
НЕК 293
Нет
hENG(360-581) -hFc
НЕК 293
Нет
hENG(360-457) -hFc
COS
Нет
Нет
hENG(360-437)-hFc
COS
Нет
Нет
hENG(458-581)-hFc
COS
Нет
Нет
Эти варианты экспрессировали посредством транзиторной трансфекции в клетках НЕК 2 93 или клетках COS, как указано.
В выбранной форме hENG(26-437)-hFc использовали лидерную
последовательность ТРА, она имеет непроцессированную
аминокислотную последовательность, представленную на фигуре 26
(SEQ ID N0: 21), и кодируется нуклеотидной последовательностью,
представленной на фигуре 27 (SEQ ID N0: 22) . В выбранной форме
hENG(26-378)-hFc также использовали лидерную последовательность
ТРА, она имеет непроцессированную аминокислотную
последовательность, представленную на фигуре 28 (SEQ ID N0: 23),
кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной на
фигуре 29 (SEQ ID N0: 24). В выбранной форме hENG(26-359)-hFc
также использовали лидерную последовательность ТРА, она имеет
непроцессированную аминокислотную последовательность,
представленную на фигуре 30 (SEQ ID N0: 25), кодируется
нуклеотидной последовательностью, представленной на фигуре 31 (SEQ
ID N0: 2 6) . Авторы настоящего изобретения также предусмотрели
альтернативную последовательность hENG(26-359)-hFc с лидерной
последовательностью ТРА (фигура 32, SEQ ID N0: 27), содержащую
укороченный с N-конца домен hFc (фигура 12, SEQ ID N0: 12),
присоединенный к hENG(26-359) с помощью линкера TGGG. Нуклеотидная
последовательность, кодирующая этот альтернативный белок hENG(26-
359)-hFc, представлена на фигуре 33 (SEQ ID N0: 28) . В выбранной
форме hENG(26-34 б)-hFc использовали лидерную последовательность
ТРА, она имеет непроцессированную аминокислотную
последовательность, представленную на фигуре 34 (SEQ ID N0: 29) содержащую укороченный с N-конца домен hFc, кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной на фигуре 35 (SEQ ID N0: 30).
Выбранные варианты hENG-hFc, каждый с укороченным с N-конца доменом Fc (SEQ ID NO: 12), стабильно экспрессировали в клетках СНО (описанными выше способами) и очищали от кондиционированных сред посредством фильтрации и хроматографии с протеином А. С помощью анализа зрелого белка, экспрессируемого в клетках СНО, подтверждали ожидаемую N-концевую последовательность hENG(26-359)
hFc и hENG(26-34 б)-hFc. Учитывая выход белка (нескорректированный
по различиям в теоретической молекулярной массе), hENG(26-34б)-hFc
(90 мг/л) превосходил hENG(26-359)-hFc (9 мг/л) и полноразмерный
hENG(26-58б)-hFc (31 мг/л) . Как показано на фигуре 36, при анализе
этих очищенных образцов посредством эксклюзионной хроматографии
определяли качество белка hENG(26-34 б)-hFc (на 96% мономерного)
как превосходящее качество белка hENG(26-359)-hFc (на 84%
мономерного) и эквивалентное качеству белка hENG(26-58 б)-hFc (на
9 6% мономерного). Таким образом, в случае более высоких уровней
высокомолекулярных агрегатов необходимо использование
дополнительных этапов очистки для hENG(26-359)-hFc по сравнению с hENG(26-346)-hFc.
Пример 9: Высокоаффинное связывание ВМР-9/ВМР-10 с укороченными вариантами hENG-hFc
Авторы настоящего изобретения использовали способ SPR для скрининга следующих вариантов белка hENG-hFc на высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10 человека. В этих экспериментах, иммобилизованные белки hENG-hFc подвергали воздействию растворимого ВМР-9 или ВМР-10 по 100 нМ каждого.
Конструкция человека
Связывание с hBMP-9 и hBMP-10
Полноразмерный
hENG(26-586)-hFc
+ + + +
Карбокси-концевые укорочения
hENG(26-581)-hFc
+ + + +
hENG(26-437)-hFc
+ + + +
hENG(26-378)-hFc
+ + + +
hENG(26-359)-hFc
+ + + +
hENG(26-346)-hFc
+ + + +
hENG(26-332)-hFc
hENG(26-329)-hFc
hENG(26-257)-hFc
Амино-концевые укорочения
hENG(360-586)-hFc
hENG(438-586)-hFc
hENG(458-586) -hFc
- Связывание неопределимо
Как указано выше в таблице, высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10 наблюдали только для полноразмерной конструкции и для таких укороченных с С-конца вариантов, как hENG(26-34б)-hFc. Высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10 было утрачено для всех протестированных N-концевых укорочений более чем на 61 аминокислот.
Панель лигандов подвергали скринингу на потенциальное связывание с укороченными с С-конца вариантами hENG(26-34 б)-hFc, hENG(26-359)-hFc и hENG(26-437)-hFc. Высокоаффинное связывание этих трех белков являлось селективным для ВМР-9 и ВМР-10. Ни hENG(26-346)-hFc, ни hENG(26-359)-hFc, ни hENG(26-437)-hFc не проявляли детектируемое связывание с ВМР-2, ВМР-7, TGF-|3l, TGF-|32, TGF-рз или активином А даже при высоких концентрациях лиганда.
Лиганд
Связывание конструкции
hENG(26-346) -hFc*
hENG(26-359)-hFc**
hENG(26-437)-hFc**
hBMP-2
hBMP-2/7
hBMP-7
hBMP-9
++++
++++
++++
hBMP-10
++++
++++
++++
hTGF-pi
hTGF-|32
hTGF-|33
ЬАктивин A
* [hBMP-9], [hBMP-10]=5 нМ; [hTGF-рз]=50 нМ; все другие лиганды тестировали при 100 нМ
** [hBMP-9], [hBMP-10]=5 нМ; [hTGF-p3]=50 нМ; все другие лиганды тестировали при 100 нМ ++++ KD <1 нМ
- Связывание неопределимо
Авторы настоящего изобретения использовали способ SPR для сравнения кинетики связывания ВМР-9 с пятью конструкциями: hENG(26-586)-hFc, hENG(26-437)-hFc, hENG(26-378)-hFc, hENG(26359)-hFc и hENG(26-346)-hFc. На фигуре 37 показаны кривые связывания для нескольких конструкций, и в таблице ниже приведены вычисленные значения равновесной константы диссоциации и констант скорости диссоциации (kd) . Аффинность ВМР-9 человека к hENG(26359)-hFc или hENG(26-34 б)-hFc (с KD в нижнем пикомолярном диапазоне) была на порядок выше, чем в случае полноразмерной конструкции. Для ловушек лигандов, таких как ENG-Fc, крайне желательно проявлять относительно низкую скорость диссоциации лиганда, поэтому десятикратное улучшение (снижение) скорости диссоциации ВМР-9 в случае hENG(26-34 б)-hFc по сравнению с полноразмерной конструкцией является особенно примечательным.
Лиганд
Конструкция
KD (xl0~12 M)
kd (xl0~4 c_1)
hENG(26-586)-hFc*
hENG(26-437)-hFc**
hBMP-9
hENG(26-378)-hFc**
6,7
3,4
hENG(26-359)-hFc*
4,2
3,5
hENG(26-346)-hFc*
4,3
2,4
* белок, полученный из клеток СНО
** белок, полученный из клеток НЕК2 93
Как показано ниже, каждый из укороченных вариантов также
связывался с ВМР-10 с более высокой аффинностью и с лучшей
кинетикой по сравнению с полноразмерной конструкцией. Тем не менее, укороченные варианты отличались по их степени предпочтительности для ВМР-9 по сравнению с ВМР-10 (с учетом соотношения KD) , при этом hENG(26-34б)-hFc демонстрировал наибольший дифференциал, a hENG(26-437)-hFC - наименьший. Это различие в степени предпочтительности лиганда среди укороченных вариантов потенциально может отражаться в значимых различиях их активности in vivo.
** белок, полученный из клеток НЕК2 93
Представленные выше результаты свидетельствуют о том, что слитые белки, содержащие конкретные укороченные с С-конца варианты ECD hENG, демонстрируют высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10, но не с различными другими лигандами семейства TGF-p, включая TGF-pi и TGF-рз. В частности, укороченные варианты hENG(26-359)-hFc, hENG(26-346)-hFc и hENG(26-378)-hFc демонстрируют более высокую аффинность связывания при равновесии и улучшенные кинетические свойства в случае ВМР-9 по сравнению с полноразмерной конструкцией hENG(26-58 б)-hFc и укороченным вариантом hENG(26437)-hFc.
Пример 10: Прогнозирование вторичной структуры N-концевой области ENG
Как описано выше, обнаруживали, что N-концевые укорочения, такие короткие, как 36 аминокислоты (hENG(61-346)-hFc), устраняют связывание лиганда с полипептидами ENG. Для прогнозирования эффекта даже более коротких N-концевых укорочений в отношении связывания лиганда вторичную структуру орфанного домена эндоглина человека предсказывали путем вычислений с использованием
модифицированного Psipred версии 3 (Jones, 1999, J Mol Biol
2 92:195-2 02). Анализ показал, что упорядоченная вторичная
структура в области полипептида ENG, определяемая аминокислотами
26-60 SEQ ID NO: 1, ограничена бета-тяжем из четырех остатков,
предсказанным с высокой достоверностью в положениях 42-45 SEQ ID
NO: 1, и бета-тяжем из двух остатков, предсказанным с очень низкой
достоверностью в положениях 28-29 SEQ ID NO: 1. Таким образом,
варианты полипептида ENG, начинающиеся с аминокислот 2 7 или 2 8 и,
необязательно, начинающиеся с любой из аминокислот 29-42 SEQ ID
NO: 1, вероятно, сохраняют важные элементы и связывание лиганда.
Пример 11: Активность вариантов ENG-Fc в клеточном анализе
Для определения активности, с которой слитые белки hENG-hFc
ингибируют передачу сигнала ВМР-9 и ВМР-10, использовали анализ
репортерного гена в клетках А204. Этот анализ основан на линии
клеток рабдомиосаркомы человека, трансфицированных с
использованием pGL3 BRE-люцифераза-репортерной плазмиды
(Korchynskyi et al, 2002, J Biol Chem 277: 4883-4891), а также репортерной плазмиды Renilla (pRLCMV-люцифераза) для контроля эффективности трансфекции. В BMP-чувствительных генах (содержащих промотор Idl) присутствуют мотивы BRE, поэтому этот вектор общепринято используют в случае факторов передачи сигнала через Smadl и/или Smad5. В отсутствие слитых белков ENG-Fc ВМР-9 и ВМР-10 дозозависимым образом стимулируют передачу сигнала в клетках А204 .
В первый день анализа клетки А2 04 (инвентарный номер АТСС(r): НТВ-82(tm); депонент: DJ Giard) распределяли в 48-луночные планшеты при 105 клеток на лунку. На следующий день раствор, содержащий 12 мкг pGL3 BRE-люциферазы, 0,1 мкг pRLCMV-люциферазы, 30 мкл Fugene б (Roche Diagnostics) и 970 мкл OptiMEM (Invitrogen) , преинкубировали в течение 3 0 мин при комнатной температуре перед добавлением к 24 мл буфера для анализа (среды МакКоя, дополненной 0,1% BSA) . Эту смесь наносили на высеянные клетки (500 мкл/лунку) для инкубации в течение ночи при 37°С. На третий день удаляли среду и заменяли ее тестируемыми веществами (250 мкл/лунку), разведенными в буфере для анализа. После инкубации в течение ночи
при 37°С клетки промывали, лизировали пассивным буфером для лизиса (Promega El941) и замораживали при -7 0°С. Перед анализом планшеты нагревали до комнатной температуры с осторожным встряхиванием. Лизаты клеток переносили в двух параллелях на планшет для считывания хемилюминесценции (9б-луночный) и анализировали в люминометре с реагентами из системы Dual-Luciferase Reporter Assay system (Promega El 98 0) для определения нормированной активности люциферазы.
Результаты свидетельствуют о том, что белки hENG-hFc являются мощными ингибиторами клеточной передачи сигнала, опосредуемой ВМР-9 и ВМР-10. Как показано в таблице ниже, полноразмерная конструкция hENG(26-58 б)-hFc ингибирует передачу сигнала ВМР-9 и ВМР-10 со значениями IC50 в субнаномолярном и нижнем наномолярном диапазонах, соответственно. Кроме того, укороченные варианты hENG(26-359)-hFc и hENG(26-34 б)-hFc являлись более мощными, чем hENG(26-586)-hFc.
Конструкция
IC50 (нМ)
hBMP-9
hBMP-10
hENG(26-586) -hFc
0,26
7,9
hENG(26-359) -hFc
0,16
3,5
hENG(26-346)-hFc
0, 19
4, 6
Пример 12: Укороченный вариант hENG(26-359)-hFc ингибирует индуцируемый VEGF ангиогенез в анализе САМ
Авторы настоящего изобретения исследовали эффекты укороченного варианта hENG(26-359)-hFc в отношении ангиогенеза в той же системе анализа САМ, которая описана в примере б, в которой VEGF используют для индукции ангиогенеза. Количество дополнительных кровеносных сосудов, индуцируемых обработкой VEGF
(50 нг ежедневно), снижали на 75% посредством конкурентной обработки hENG(26-359)-hFc (SEQ ID NO: 25; 20 мкг ежедневно)
(фигура 38) . С помощью исследований на основе SPR подтверждали, что VEGF не связывается с hENG(26-359)-hFc, и, таким образом, эффекты этого варианта в отношении ангиогенеза в настоящем эксперименте САМ не являлись результатом прямого взаимодействия
между слитым белком и VEGF. Необходимо отметить, что в случае hENG (26-359) -hFc доза 10 мкг соответствует дозе 14 мкг, используемой в случае более длинных конструкций ENG-Fc, тестируемых в примере б, с учетом теоретической молекулярной массы каждой конструкции. Таким образом, укороченный вариант hENG(2 6359)-hFc демонстрировал эквивалентную, если не более высокую, эффективность ингибирования индуцируемого VEGF ангиогенеза по сравнению с конструкциями ENG с полноразмерным ECD (фигура 23) в той же системе анализа.
Пример 13: Укороченный вариант hENG(26-346)-hFc ингибирует ангиогенез в анализе ангиореактора мыши
Укороченный вариант hENG(26-34 б)-hFc тестировали в том же анализе ангиореактора мыши, который описан в примере 7. Ангиореакторы подкожно имплантировали бестимусным мышам (четыре на мышь) и мышам ежедневно вводили hENG(26-34б)-hFc (10 мг/кг, s.c.) или наполнитель (Tris-забуференный физиологический раствор) в течение 11 дней, после чего мышам инъецировали декстран, меченый флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), (20 мг/кг, i.v.) и умерщвляли их через 20 мин. Затем измеряли количество FITC-декстрана, содержащегося в каждом ангиореакторе, в качестве индекса образования кровеносных сосудов. Как показано на фигуре 39, добавление факторов роста (GF) FGF-2 и VEGF в ангиореакторы приводило к значительному повышению васкуляризации, в то время как конкурентное введение hENG(26-34б)-hFc полностью предотвращало это повышение. В исследованиях на основе SPR подтверждали, что hENG(26-34 б)-hFc не связывается ни с FGF-2, ни с VEGF, таким образом, исключая возможность того, что эффекты hENG(26-346)-hFc в отношении индуцируемого ангиогенеза в настоящем эксперименте являлись результатом прямого взаимодействия между слитым белком и FGF-2 или VEGF. Эти результаты, полученные с помощью системы анализа млекопитающего, дополняют результаты, полученные для укороченного варианта hENG(26-359)-hFc в анализе САМ (пример 12) . В совокупности, они демонстрируют антиангиогенную активность слитых белков ENG-Fc, включающих предпочтительные укорочения внеклеточного домена ENG, in vivo.
Пример 14: Большее время полужизни укороченного варианта hENG(26-346)-hFc in vivo
Авторы настоящего изобретения осуществляли модифицированное исследование фармакокинетики для определения общего времени полувыведения hENG(26-34 б)-hFc и сравнивали его с таковым для полноразмерного белка mENG(27-581)-mFc. Белок hENG(26-34 б)-hFc флуоресцентно метили красителем Alexa Fluor(r) 750 с использованием набора для быстрого мечения антитела SAIVI(tm) (визуализации небольших животных in vivo) по инструкциям производителя (Invitrogen(tm)). Меченый белок отделяли от свободной метки посредством эксклюзионной хроматографии. Бестимусным мышам (п=3, 17-20 г) инъецировали меченый hENG(26-34б)-hFc (2 мг/кг, s.c.) и осуществляли визуализацию всего тела посредством системы визуализации IVIS (Xenogen(r)/Caliper Life Sciences) для определения уровней слитого белка через 2, 4, б, 8, 24, 32, 48 и 72 часа после инъекции. Среднее время полувыведения hENG(26-34 б)-hFc составляло 26,5 часа, что составляет на 20% больше, чем время полужизни mENG(27-581)-mFc 22 часа, определенное в аналогичном исследовании.
Пример 15: Эффект белков ENG-Fc в отношении роста опухоли в моделях ксенотрансплантата мыши
Белки ENG-Fc тестировали на двух разных моделях ксенотрансплантатов мыши для определения того, могут ли эти белки ингибировать рост опухоли. В первом эксперименте бестимусным мышам в возрасте б недель подкожно инъецировали 106 клеток карциномы молочной железы 4Т1 (инвентарный номер АТСС(r): CRL-2539(tm); депонент: ВА Pulaski). Мышам (п=10 на группу) ежедневно вводили (s.c.) дозу mENG(27-581)-mFc (10 мг/кг) или наполнителя (Tris-забуференного физиологического раствора). Опухоли измеряли вручную с помощью штангенциркуля с цифровой индикацией и вычисляли объем опухоли по формуле: объем=0,5(длина) (ширина2) . Как показано на фигуре 40, введение mENG(27-581)-mFc снижало объем опухоли на 45% по сравнению с наполнителем ко дню 2 4 после имплантации.
Слитые белки ENG-Fc также тестировали на модели ксенотрансплантата карциномы Со1оп-2б. Мышам BALB/c в возрасте 7
недель подкожно инъецировали 1,5х106 клеток карциномы Со1оп-2б
(инвентарный номер АТСС(r): CRL-2638(tm); депонент: N Restifo). Мышам (п=10 на группу) ежедневно вводили (s.c.) дозу mENG(27-581)-mFc (1, 10 или 30 мг/кг) или наполнителя (Tris-забуференного физиологического раствора). Объем опухоли определяли, как описано выше. Как показано на фигуре 41, введение mENG(27-581)-mFc вызывало дозозависимое снижение объема опухоли со снижениями на 55% и приблизительно 7 0% по сравнению с наполнителем в дозах 10 мг/кг и 30 мг/кг, соответственно, ко дню 58 после имплантации. Таким образом, mENG(27-581)-mFc значительно замедлял рост двух разных типов опухолей в моделях ксенотрансплантатов мыши, что соответствует указанной выше антиангиогенной активности слитых белков, включающих полноразмерный внеклеточный домен ENG мыши (примеры 5-7) . В предварительном эксперименте укороченный вариант hENG(26-346) также замедлял рост опухоли по сравнению с наполнителем в модели ксенотрансплантата Со1оп-2б, что соответствует антиангиогенной активности этого варианта в анализе ангиореактора мыши (пример 13).
В совокупности, указанные выше результаты свидетельствуют о том, что слитые белки, содержащие полноразмерный ECD ENG, и их конкретные укороченные варианты демонстрируют высокоаффинное связывание с ВМР-9 и ВМР-10, но не с множеством других лигандов
семейства TGF|3, включая TGF|3-1 и TGF|3-3. Эти полипептиды ENG могут ингибировать ангиогенез и рост опухоли в модельных системах и, таким образом, иметь потенциал для лечения пациентов с нежелательным ангиогенезом, включая пациентов со злокачественными новообразованиями. По сравнению с конструкциями, содержащими полноразмерный ECD ENG, укороченные полипептиды ENG hENG(26-34б)-hFc и/или hENG(26-359)-hFc демонстрировали более высокую активность и улучшенные свойства в отношении нескольких других ключевых параметров (см. общую таблицу ниже).
Параметр
Полипептид ECD в слитом белке (полученный из клеток СНО)
Полноразмерный ECD - 2 6-5 8 6 человека или 27-581 мыши
26-359 человека
26-346 человека
Экспрессия
Количество
31 мг/л
9 мг/л
90 мг/л
Качество
на 96% мономерный
на 84% мономерный
на 96% мономерный
Аффинность связывания (KD)
ВМР-9
33 пМ
4,2 пМ
4,3 пМ
ВМР-10
4 90 пМ
8 6 пМ
140 пМ
Скорость диссоциации (kd)
ВМР-9
25х10~4 с-1
3,5х10~4 с-1
2,4х10~4 с-1
ВМР-10
110х10~4 с-1
23х10~4 с-1
28х10~4 с-1
Активность (1С50 в клеточном анализе)
ВМР-9
0,26 нМ
0,16 нМ
0,19 нМ
ВМР-10
7, 9 нМ
3,5 нМ
4, 6 нМ
Время полувыведения
22 часа
2 6,5 часа
Антиангиогенная активность
HUVEC
САМ
ингибирование 65%
ингибирование 75%
Ангиореактор
ингибирование 100%
ингибирование 100%
Противоопухолевая активность
Опухоль 4Т1
Опухоль Colon-26
Дозозависимая
Не исследовали
Вариант hENG(26-34 б)-hFc, в частности, обладал лучшей
комбинацией свойств с более высокой активностью, более высокой
аффинностью связывания, более медленной скоростью диссоциации,
большим временем полувыведения и лучшей продукцией белка, чем
конструкции с ECD полноразмерным ENG. В качестве ловушек для
лигандов, укороченные полипептиды ENG, предпочтительно, должны
проявлять низкую скорость диссоциации лиганда, т.к. крайне
желательным является десятикратное снижение скорости
диссоциации ВМР-9 в случае hENG(26-34 б)-hFc по сравнению с
полноразмерной конструкцией. Вариант hENG(26-378)-hFc
демонстрировал свойства связывания ВМР-9 (аффинность и скорость диссоциации) в промежутке между hENG(26-34 б)-hFc и hENG(2 6359)-hFc, с одной стороны, и hENG(26-437)-hFc, с другой стороны, при этом hENG(2 6-37 8) больше похож на более короткие конструкции.
Пример 16: Лечение с использованием белков ENG-Fc в модели фиброза печени мыши
Эффективность белков ENG-Fc в лечении фиброза оценивали в модели фиброза печени мыши, вызванного CCL4 (тетрахлоридом углерода). В этом исследовании использовали пятьдесят мышей. Самцов и самок мышей А/J возрастом приблизительно 14 недель на начало эксперимента (день 0) подвергали акклиматизации в лаборатории в течение по меньшей мере 4 8 часов. Животных проверяли ежедневно в течение эксперимента и умерщвляли при наблюдении любых признаков заболеваемости, летальности и токсичности тестируемого образца.
Животным вводили дозу 1 мл/кг 50% СС14 в оливковом масле через желудочный зонд дважды в неделю для индукции фиброза печени. Животным вводили дозы mENG(27-581)-mFc в течение 13 недель, как описано в таблица ниже.
Группа
Фиброз печени
Лечение
Доза
Частота
Введение
СС14+Оливковое масло
PBS
Равный объем
В . I. W.
I .Р.
СС14+Оливковое масло
мю-
эндоглин
10 мг/кг
Т.I.W.
I .Р.
Оливковое масло
PBS
Равный объем
В . I . W .
I .Р.
Оливковое масло
мю-
эндоглин
10 мг/кг
Т.I.W.
I .Р.
Животных анализировали на предмет изменений массы тела (BW) , массы печени, внешнего вида печени и гистологию. В день 0, день 28, день 56 и день 90 животных подвергали ЯМР-сканированию. Животных умерщвляли в день 4 5 или 90 с использованием СОг. Для анализа сыворотки животных не кормили за 12 часов до умерщвления и забора сыворотки. Цельную кровь собирали для анализа функции печени, и печень каждого животного собирали и взвешивали. Половину печени помещали в картридж с 10% формалином и быстро замораживали долю печени в жидком азоте.
Лечение mENG(27-581)-mFc не влияло на массу печени (измеряемую как процентную долю массы тела) в течение 13 недель (фигура 42). Через 13-недельный период введения животных умерщвляли и срезы печени окрашивали гематоксилином-эозином и трихромом по Массону (фигуры 43-45). Подвергнутые лечению животные демонстрировали значительно меньший фиброз относительно неподвергнутых лечению животных (фигура 45). Кроме того, при окрашивании масляным красным О выявляли, что лечение mENG(2 7-581)-mFc приводило к снижению накопления жировых отложений в ткани печени, что, зачастую, является предшественником повреждения печени и фиброзного депонирования (фигура 4 6) . Кроме того, по-видимому, лечение mENG(2 7-581)-mFc снижало баллонную дегенерацию гепатоцитов, ассоциированную с апоптозом и наблюдаемую в связи с воспалением печени. Уровни щелочной фосфатазы в сыворотке были меньше в когортах, подвергнутых лечению эндоглином, по сравнению с неподвергнутыми лечению (фигура 47). В совокупности, эти данные свидетельствуют о том, что лечение mENG(27-581)-mFc может снижать повреждение печени в этой модели фиброза печени мыши, и, таким образом, по-видимому, белки ENG-Fc применимы в лечении фиброзных нарушений печени, включая цирроз и возможные печеночноклеточные
карциномы.
Пример 17: Эффект белка ENG-Fc в пищевой модели фиброза печени мыши
Эффективность белков ENG-Fc также оценивали на модели неалкогольного стеатогепатита (NASH) мыши, вызываемого метионином и пищевой недостаточностью холина (MCDD). Мышей C57BL/6 дикого типа держали на стандартной диете или диете, включающей большое количество сахарозы (40%) и жира (10%), но с недостатком метионина и холина, важных для р-окисления в печени и продукции липопротеина очень низкой плотности (Takahashi et al. , 2012, World J Gastroenterol 18:2300-2308) . В результате мыши с MCDD демонстрировали жировые отложения, считающиеся предшественниками повреждения печени и фиброзного депонирования (Corbin et al., 2012, Curr Opin Gastroenterol 28:159-165). В возрасте 12 недель мышей сажали на соответствующие диеты и начинали интраперитонеальное введение mENG(27-581)-mFc (10 мг/кг) или наполнителя (п=10 на группу) дважды в неделю в течение 3 недель. По завершении введения доз мышей умерщвляли и срезы печени окрашивали масляным красным О, растворимым в липидах диазокрасителем, для оценки степени депонирования липидов.
Как и ожидали, у мышей, которых кормили стандартным кормом, наблюдали лишь небольшие липидные отложения в ткани печени (данные не представлены) , в то время как мыши с MCDD демонстрировали множество больших липидных отложений, в совокупности занимающих значительную часть общей площади ткани (фигура 4 8А, С). У мышей с MCDD лечение mENG(2 7-581)-mFc значительно снижало липидные отложения в печени по сравнению с наполнителем (фигура 48) . Хотя эндогенный TGFP в значительной степени участвует в прогрессировании заболевания печени (Dooley et al. , 2012, Cell Tissue Res 347:245-256), Fc-слитый белок, содержащий рецептор TGFP типа II и связывающийся с TGFP с высокой аффинностью, имеет небольшой эффект в отношении накопления липидных отложений в печени (данные не представлены). Как описано в примере 3, mENG(27-581)-mFc и
другие белки ENG-Fc не связываются ни с TGF|3l, TGF|32, ни с TGF|33, поэтому биологическая активность mENG (27-581) -mFc у мышей с MCDD не является результатом ингибирования передачи сигнала этими лигандами. В совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что mENG(27-581)-mFc может значительно снижать депонирование липидов в модели на мышах, в которой недостаточность питательных веществ, в конечном итоге, приводит к фиброзу и неалкогольному стеатогепатозу, таким образом, представляя дополнительное доказательство того, что белки ENG-Fc, по-видимому, применимы в лечении фиброза печени. ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ
Все публикации и патенты, упомянутые в настоящем описании, таким образом, включены посредством ссылки в полном объеме, как если бы каждая отдельная публикация или патент были конкретно и отдельно указаны как включенные посредством ссылок. В случае конфликта, настоящая заявка, включая любые определения в настоящем описании, будет обладать приоритетом.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения подробно представлены в настоящем описании, изложенное выше описание является иллюстративным, а не ограничивающим. Многие варианты изобретения будут очевидны специалистам в этой области при рассмотрении настоящего описания и представленной ниже формулы изобретения. Полный объем изобретения необходимо определять со ссылкой на формулу изобретения вместе с полным объемом эквивалентов и описание вместе с такими вариантами.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Acceleron Pharma, Inc.
<12 0> ЭНДОГЛИНОВЫЕ ПЕПТИДЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ФИБРОЗНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
<130> A0904.70009WO00
<140> PCT/US2014/062147
<141> 2014-10-24
<150> US 61/896,002
<151> 2013-10-25
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
658
<210> <211>
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu
20 25 30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln
35 40 45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val
50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu
65 70 75 80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu
85 90 95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu
100 105 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln
115 120 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr
130 135 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala
145 150 155 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gin Ser lie Leu Leu Arg Leu Gly Gin Ala Gin
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
180 185 190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
195 200 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
210 215 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu
225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
275 280 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
290 295 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
325 330 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
355 360 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly
385 390 395 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser
465 470 475 480
Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala
500 505 510
Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln
545 550 555 560
Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser
565 570 575
Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val
580 585 590
Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala
595 600 605
Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Ser Pro Ser Lys Arg Glu
610 615 620
Pro Val Val Ala Val Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr
625 630 635 640
Asn His Ser Ile Gly Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser
645 650 655
Met Ala
<210> 2
<211> 2030
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 2
cctgccactg gacacaggat aaggcccagc gcacaggccc ccacgtggac agcatggacc 60
gcggcacgct ccctctggct gttgccctgc tgctggccag ctgcagcctc agccccacaa 120
gtcttgcaga aacagtccat tgtgaccttc agcctgtggg ccccgagagg ggcgaggtga 180
catataccac tagccaggtc tcgaagggct gcgtggctca ggcccccaat gccatccttg 240
aagtccatgt cctcttcctg gagttcccaa cgggcccgtc acagctggag ctgactctcc 300
aggcatccaa gcaaaatggc acctggcccc gagaggtgct tctggtcctc agtgtaaaca 360
gcagtgtctt cctgcatctc caggccctgg gaatcccact gcacttggcc tacaattcca 420
gcctggtcac cttccaagag cccccggggg tcaacaccac agagctgcca tccttcccca 480
agacccagat ccttgagtgg gcagctgaga ggggccccat cacctctgct gctgagctga 540
atgaccccca gagcatcctc ctccgactgg gccaagccca ggggtcactg tccttctgca 600
tgctggaagc cagccaggac atgggccgca cgctcgagtg gcggccgcgt actccagcct 660
tggtccgggg ctgccacttg gaaggcgtgg ccggccacaa ggaggcgcac atcctgaggg 720
tcctgccggg ccactcggcc gggccccgga cggtgacggt gaaggtggaa ctgagctgcg 780
cacccgggga tctcgatgcc gtcctcatcc tgcagggtcc cccctacgtg tcctggctca 840
tcgacgccaa ccacaacatg cagatctgga ccactggaga atactccttc aagatctttc 900
cagagaaaaa cattcgtggc ttcaagctcc cagacacacc tcaaggcctc ctgggggagg 960
cccggatgct caatgccagc attgtggcat ccttcgtgga gctaccgctg gccagcattg 1020
tctcacttca tgcctccagc tgcggtggta ggctgcagac ctcacccgca ccgatccaga 1080
ccactcctcc caaggacact tgtagcccgg agctgctcat gtccttgatc cagacaaagt 1140
gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1200
ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1260
ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1320
atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1380
tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1440
cctccaacac catcgagccg gggcagcaga gctttgtgca ggtcagagtg tccccatccg 1500
tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1560
ccgtggaact catccagggc cgggcggcca agggcaactg tgtgagcctg ctgtccccaa 1620
gccccgaggg tgacccgcgc ttcagcttcc tcctccactt ctacacagta cccataccca 1680
aaaccggcac cctcagctgc acggtagccc tgcgtcccaa gaccgggtct caagaccagg 1740
aagtccatag gactgtcttc atgcgcttga acatcatcag ccctgacctg tctggttgca 1800
caagcaaagg cctcgtcctg cccgccgtgc tgggcatcac ctttggtgcc ttcctcatcg
1860
gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgttcc cccagcaagc
1920
gggagcccgt ggtggcggtg gctgccccgg cctcctcgga gagcagcagc accaaccaca
1980
gcatcgggag cacccagagc accccctgct ccaccagcag catggcatag
2030
<213> Homo sapiens <400> 3
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu
20 25 30
Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln
35 40 45
Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val
50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu
65 70 75 80
Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu
85 90 95
Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu
100 105 110
Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln
115 120 125
Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr
130 135 140
Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala
145 150 155 160
Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln
165 170 175
Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg
180
185
190
Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His
195 200 205
Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu
210 215 220
Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu
225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg
275 280 285
Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg
290 295 300
Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala
305 310 315 320
Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr
325 330 335
Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met
355 360 365
Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly
385 390 395 400
Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val
405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser
420 425 430
Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser
465 470 475 480
Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala
500 505 510
Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln
545 550 555 560
Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser
565 570 575
Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Leu Val Leu Pro Ala Val
580 585 590
Leu Gly Ile Thr Phe Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala
595 600 605
Ala Leu Trp Tyr Ile Tyr Ser His Thr Arg Glu Tyr Pro Arg Pro Pro
610 615 620
Gln
625
<210> 4
<211> 1931
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 4
cctgccactg gacacaggat aaggcccagc gcacaggccc ccacgtggac agcatggacc 60
gcggcacgct ccctctggct gttgccctgc tgctggccag ctgcagcctc agccccacaa 120
gtcttgcaga aacagtccat tgtgaccttc agcctgtggg ccccgagagg ggcgaggtga 180
catataccac tagccaggtc tcgaagggct gcgtggctca ggcccccaat gccatccttg 240
aagtccatgt cctcttcctg gagttcccaa cgggcccgtc acagctggag ctgactctcc 300
aggcatccaa gcaaaatggc acctggcccc gagaggtgct tctggtcctc agtgtaaaca 360
gcagtgtctt cctgcatctc caggccctgg gaatcccact gcacttggcc tacaattcca 420
gcctggtcac cttccaagag cccccggggg tcaacaccac agagctgcca tccttcccca 480
agacccagat ccttgagtgg gcagctgaga ggggccccat cacctctgct gctgagctga 540
atgaccccca gagcatcctc ctccgactgg gccaagccca ggggtcactg tccttctgca 600
tgctggaagc cagccaggac atgggccgca cgctcgagtg gcggccgcgt actccagcct 660
tggtccgggg ctgccacttg gaaggcgtgg ccggccacaa ggaggcgcac atcctgaggg 720
tcctgccggg ccactcggcc gggccccgga cggtgacggt gaaggtggaa ctgagctgcg 780
cacccgggga tctcgatgcc gtcctcatcc tgcagggtcc cccctacgtg tcctggctca 840
tcgacgccaa ccacaacatg cagatctgga ccactggaga atactccttc aagatctttc 900
cagagaaaaa cattcgtggc ttcaagctcc cagacacacc tcaaggcctc ctgggggagg 960
cccggatgct caatgccagc attgtggcat ccttcgtgga gctaccgctg gccagcattg 1020
tctcacttca tgcctccagc tgcggtggta ggctgcagac ctcacccgca ccgatccaga 1080
ccactcctcc caaggacact tgtagcccgg agctgctcat gtccttgatc cagacaaagt 1140
gtgccgacga cgccatgacc ctggtactaa agaaagagct tgttgcgcat ttgaagtgca 1200
ccatcacggg cctgaccttc tgggacccca gctgtgaggc agaggacagg ggtgacaagt 1260
ttgtcttgcg cagtgcttac tccagctgtg gcatgcaggt gtcagcaagt atgatcagca 1320
atgaggcggt ggtcaatatc ctgtcgagct catcaccaca gcggaaaaag gtgcactgcc 1380
tcaacatgga cagcctctct ttccagctgg gcctctacct cagcccacac ttcctccagg 1440
cctccaacac catcgagccg gggcagcaga gctttgtgca ggtcagagtg tccccatccg 1500
tctccgagtt cctgctccag ttagacagct gccacctgga cttggggcct gagggaggca 1560
ccgtggaact catccagggc cgggcggcca agggcaactg tgtgagcctg ctgtccccaa 1620
gccccgaggg tgacccgcgc ttcagcttcc tcctccactt ctacacagta cccataccca 1680
aaaccggcac cctcagctgc acggtagccc tgcgtcccaa gaccgggtct caagaccagg 1740
aagtccatag gactgtcttc atgcgcttga acatcatcag ccctgacctg tctggttgca 1800
caagcaaagg cctcgtcctg cccgccgtgc tgggcatcac ctttggtgcc ttcctcatcg 1860
gggccctgct cactgctgca ctctggtaca tctactcgca cacgcgtgag taccccaggc 1920
ccccacagtg a 1931
<213> Mus musculus
<400> 5
Met Asp Arg Gly Val Leu Pro Leu Pro Ile Thr Leu Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Tyr Ser Phe Val Pro Thr Thr Gly Leu Ala Glu Arg Val Gly Cys Asp
20 25 30
Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser
35 40 45
Gln Val Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala Ala Asn Ala Val Arg Glu
50 55 60
Val His Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly Met Leu Ser His Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Glu Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Leu Val Leu Val Ser Asn Lys Asn Val Phe Val Lys Phe Gln Ala
100 105 110
Pro Glu Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asp Ser Ser Leu Val Ile Phe
115 120 125
Gln Gly Gln Pro Arg Val Asn Ile Thr Val Leu Pro Ser Leu Thr Ser
130 135 140
Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr Lys Gly Ala Ile Thr Ser
145 150 155 160
Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile Val Leu Gln Leu Gly Gln
165 170 175
Asp Pro Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro Glu Ala His Lys Asp Met
180 185 190
Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala Gln Thr Pro Val Gln Ser
195 200 205
Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys Glu Ala Tyr Ile Leu Arg
210 215 220
Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Met Met
225 230 235 240
Glu Leu Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile Leu Ile Leu His Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn His Ser Met Gln Ile Leu
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Pro Gly Ser Lys Val Lys
275 280 285
Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ala Arg
290 295 300
Lys Leu Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Val
305 310 315 320
Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys Gly Gly Val Phe Gln Thr
325 330 335
Thr Pro Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Val Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys Cys Gly Asn Gln Val Met
355 360 365
Thr Leu Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln Thr Leu Gln Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys Gln Ala Glu Asp Thr Asp
385 390 395 400
Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Lys Val
405 410 415
Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile Ile Ser Phe Pro Ser Gly
420 425 430
Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys Ile Asp Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe Val Gln Val Ser Val Ser
465 470 475 480
Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu Ile Gln Ser Arg Thr Ala
500 505 510
Lys Gly Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met Val Pro Thr Pro Thr Ala
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg Pro Ser Thr Leu Ser Gln
545 550 555 560
Glu Val Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu Asn Ile Val Ser Pro Asp
565 570 575
Leu Ser Gly Lys Gly Leu Val Leu Pro Ser Val Leu Gly Ile Thr Phe
580 585 590
Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile
595 600 605
Tyr Ser His Thr Arg Gly Pro Ser Lys Arg Glu Pro Val Val Ala Val
610 615 620
Ala Ala Pro Ala Ser Ser Glu Ser Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Gly
625 630 635 640
Ser Thr Gln Ser Thr Pro Cys Ser Thr Ser Ser Met Ala 645 650
<211> 1965
<212> ДНК <213> Mus musculus
<400> 6
agcatggacc gtggcgtgct ccctctgccc attaccctgc tgtttgtcat ctatagcttt 60
gtacccacaa caggtctcgc agaaagagtc ggctgtgatc tacagcctgt ggaccccaca 120
aggggtgagg tgacgtttac caccagccag gtctccgagg gctgtgtagc tcaggctgcc 180
aatgctgtgc gtgaagtcca cgttctcttc ctggattttc ccggaatgct gtcacatctg 240
gagctgactc ttcaggcatc caagcaaaat ggcacggaga cccaggaggt gttcctggtc 300
ctcgtttcga acaaaaatgt cttcgtgaag ttccaggccc cggaaatccc attgcacttg 360
gcctacgact ccagcctggt catcttccaa ggacagccaa gagtcaacat cacagtgcta 420
ccatccctta cctccaggaa acagatcctc gactgggcag ccaccaaggg cgccatcacc 480
tcgatagcag cactggatga cccccaaagc atcgtcctcc agttgggcca agacccaaag 540
gcaccattct tgtgcttgcc agaagctcac aaggacatgg gcgccacact tgaatggcaa 600
ccacgagccc
agaccccagt
ccaaagctgt
cgcttggaag
gtgtgtctgg
ccacaaggag
660
gcctacatcc
tgaggatcct
gccaggttct
gaggccgggc
cccggacggt
gaccgtaatg
720
atggaactga
gttgcacatc
tggggacgcc
attctcatcc
tgcatggtcc
tccatatgtc
780
tcctggttca
tcgacatcaa
ccacagcatg
cagatcttga
ccacaggtga
atactccgtc
840
aagatctttc
caggaagcaa
ggtcaaaggc
gtggagctcc
cagacacacc
ccaaggcctg
900
atagcggagg
cccgcaagct
caatgccagc
attgtcacct
cctttgtaga
gctccctctg
960
gtcagcaatg
tctccctgag
ggcctccagc
tgcggtggtg
tgttccagac
cacccctgca
1020
cccgttgtga
ccacacctcc
caaggacaca
tgcagccccg
tgctactcat
gtccctgatc
1080
cagccaaagt
gtggcaatca
ggtcatgact
ctggcactca
ataaaaaaca
cgtgcagact
1140
ctccagtgca
ccatcacagg
cctgactttc
tgggactcca
gctgccaggc
tgaagacact
1200
gacgaccatc
ttgtcctgag
tagcgcctac
tccagctgcg
gcatgaaagt
gacagcccat
1260
gtggtcagca
atgaggtgat
catcagtttc
ccgtcaggct
caccaccact
tcggaaaaag
1320
gtacagtgca
tcgacatgga
cagcctctcc
ttccagctgg
gcctctacct
cagcccgcac
1380
ttcctccagg
catccaacac
catcgaacta
ggccagcagg
ccttcgtaca
ggtgagcgtg
1440
tctccattga
cctctgaggt
cacagtccag
ctagatagct
gccatctgga
cttggggccc
1500
gaaggggaca
tggtggaact
catccagagc
cgaacagcca
agggcagctg
tgtgaccttg
1560
ctgtctccaa
gccctgaagg
tgacccacgc
ttcagcttcc
tcctccgggt
ctacatggtg
1620
cccacaccca
ccgctggcac
cctcagttgc
aacttagctc
tgcgccctag
caccttgtcc
1680
caggaagtct
acaagacagt
ctccatgcgc
ctgaacatcg
tcagccctga
cctgtctggt
1740
aaaggccttg
tcctgccctc
tgtactgggt
atcacctttg
gtgccttcct
gattggggcc
1800
ctgctcacag
ctgcactctg
gtacatctat
tctcacacac
gtggccccag
caagcgggag
1860
cccgtggtgg
cagtggctgc
cccggcctcc
tctgagagca
gcagtaccaa
ccacagcatc
1920
gggagcaccc
agagcacccc
ctgctccacc
agcagcatgg
cgtag
1965
<210> 7 <211> 641
<212> PRT <213> Mus musculus
<400> 7
Met Asp Arg Gly Val Leu Pro Leu Pro Ile Thr Leu Leu Phe Val Ile
1 5 10 15
Tyr Ser Phe Val Pro Thr Thr Gly Leu Ala Glu Arg Val Gly Cys Asp
20 25 30
Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser
Gln Val Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala Ala Asn Ala Val Arg Glu
50 55 60
Val His Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly Met Leu Ser His Leu Glu
65 70 75 80
Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Glu Thr Gln Glu Val
85 90 95
Phe Leu Val Leu Val Ser Asn Lys Asn Val Phe Val Lys Phe Gln Ala
100 105 110
Pro Glu Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asp Ser Ser Leu Val Ile Phe
115 120 125
Gln Gly Gln Pro Arg Val Asn Ile Thr Val Leu Pro Ser Leu Thr Ser
130 135 140
Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr Lys Gly Ala Ile Thr Ser
145 150 155 160
Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile Val Leu Gln Leu Gly Gln
165 170 175
Asp Pro Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro Glu Ala His Lys Asp Met
180 185 190
Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala Gln Thr Pro Val Gln Ser
195 200 205
Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys Glu Ala Tyr Ile Leu Arg
210 215 220
Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Met Met
225 230 235 240
Glu Leu Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile Leu Ile Leu His Gly Pro
245 250 255
Pro Tyr Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn His Ser Met Gln Ile Leu
260 265 270
Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Pro Gly Ser Lys Val Lys
275 280 285
Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ala Arg
290 295 300
Lys Leu Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Val
305 310 315 320
Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys Gly Gly Val Phe Gln Thr
325 330 335
Thr Pro Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro
340 345 350
Val Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys Cys Gly Asn Gln Val Met
355 360 365
Thr Leu Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln Thr Leu Gln Cys Thr Ile
370 375 380
Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys Gln Ala Glu Asp Thr Asp
385 390 395 400
Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Lys Val
405 410 415
Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile Ile Ser Phe Pro Ser Gly
420 425 430
Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys Ile Asp Met Asp Ser Leu
435 440 445
Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser
450 455 460
Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe Val Gln Val Ser Val Ser
465 470 475 480
Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp
485 490 495
Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu Ile Gln Ser Arg Thr Ala
500 505 510
Lys Gly Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro
515 520 525
Arg Phe Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met Val Pro Thr Pro Thr Ala
530 535 540
Gly Thr Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg Pro Ser Thr Leu Ser Gln
545
550
555
560
Glu Val Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu Asn Ile Val Ser Pro Asp
565 570 575
Leu Ser Gly Lys Gly Leu Val Leu Pro Ser Val Leu Gly Ile Thr Phe
580 585 590
Gly Ala Phe Leu Ile Gly Ala Leu Leu Thr Ala Ala Leu Trp Tyr Ile
595 600 605
Tyr Ser His Thr Arg Glu Tyr Pro Lys Pro Pro Pro His Ser His Ser
610 615 620
Lys Arg Ser Gly Pro Val His Thr Thr Pro Gly His Thr Gln Trp Ser
625 630 635 640
Leu
<210> 8
<211> 1929
<212> ДНК <213> Mus musculus
<400> 8
agcatggacc
gtggcgtgct
ccctctgccc
attaccctgc
tgtttgtcat
ctatagcttt
gtacccacaa
caggtctcgc
agaaagagtc
ggctgtgatc
tacagcctgt
ggaccccaca
120
aggggtgagg
tgacgtttac
caccagccag
gtctccgagg
gctgtgtagc
tcaggctgcc
180
aatgctgtgc
gtgaagtcca
cgttctcttc
ctggattttc
ccggaatgct
gtcacatctg
240
gagctgactc
ttcaggcatc
caagcaaaat
ggcacggaga
cccaggaggt
gttcctggtc
300
ctcgtttcga
acaaaaatgt
cttcgtgaag
ttccaggccc
cggaaatccc
attgcacttg
360
gcctacgact
ccagcctggt
catcttccaa
ggacagccaa
gagtcaacat
cacagtgcta
420
ccatccctta
cctccaggaa
acagatcctc
gactgggcag
ccaccaaggg
cgccatcacc
480
tcgatagcag
cactggatga
cccccaaagc
atcgtcctcc
agttgggcca
agacccaaag
540
gcaccattct
tgtgcttgcc
agaagctcac
aaggacatgg
gcgccacact
tgaatggcaa
600
ccacgagccc
agaccccagt
ccaaagctgt
cgcttggaag
gtgtgtctgg
ccacaaggag
660
gcctacatcc
tgaggatcct
gccaggttct
gaggccgggc
cccggacggt
gaccgtaatg
720
atggaactga
gttgcacatc
tggggacgcc
attctcatcc
tgcatggtcc
tccatatgtc
780
tcctggttca
tcgacatcaa
ccacagcatg
cagatcttga
ccacaggtga
atactccgtc
840
aagatctttc
caggaagcaa
ggtcaaaggc
gtggagctcc
cagacacacc
ccaaggcctg
900
atagcggagg
cccgcaagct
caatgccagc
attgtcacct
cctttgtaga
gctccctctg
960
gtcagcaatg tctccctgag ggcctccagc tgcggtggtg tgttccagac cacccctgca 1020
cccgttgtga ccacacctcc caaggacaca tgcagccccg tgctactcat gtccctgatc 1080
cagccaaagt gtggcaatca ggtcatgact ctggcactca ataaaaaaca cgtgcagact 1140
ctccagtgca ccatcacagg cctgactttc tgggactcca gctgccaggc tgaagacact 1200
gacgaccatc ttgtcctgag tagcgcctac tccagctgcg gcatgaaagt gacagcccat 1260
gtggtcagca atgaggtgat catcagtttc ccgtcaggct caccaccact tcggaaaaag 1320
gtacagtgca tcgacatgga cagcctctcc ttccagctgg gcctctacct cagcccgcac 1380
ttcctccagg catccaacac catcgaacta ggccagcagg ccttcgtaca ggtgagcgtg 1440
tctccattga cctctgaggt cacagtccag ctagatagct gccatctgga cttggggccc 1500
gaaggggaca tggtggaact catccagagc cgaacagcca agggcagctg tgtgaccttg 1560
ctgtctccaa gccctgaagg tgacccacgc ttcagcttcc tcctccgggt ctacatggtg 1620
cccacaccca ccgctggcac cctcagttgc aacttagctc tgcgccctag caccttgtcc 1680
caggaagtct acaagacagt ctccatgcgc ctgaacatcg tcagccctga cctgtctggt 1740
aaaggccttg tcctgccctc tgtactgggt atcacctttg gtgccttcct gattggggcc 1800
ctgctcacag ctgcactctg gtacatctat tctcacacac gtgagtatcc caagcctcca 1860
ccccattccc acagcaagcg ctcagggccc gtccacacca ccccggggca cacccagtgg 1920
agcctctga 1929
<210> 9
<211> 561
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr
325 330 335
Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val
340
345
350
Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser
355 360 365
Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr
370 375 380
Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala
385 390 395 400
Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His
405 410 415
Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser
420 425 430
Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser
435 440 445
Phe Val Gln Val Arg Val Ser Pro Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln
450 455 460
Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu
465 470 475 480
Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser
485 490 495
Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr
500 505 510
Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr Gly Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu
515 520 525
Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe
530 535 540
Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser Pro Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys
545 550 555 560
Gly
<210> 10
<211> 555
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Glu Arg Val Gly Cys Asp Leu Gln Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu
1 5 10 15
Val Thr Phe Thr Thr Ser Gln Val Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Ala Asn Ala Val Arg Glu Val His Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly
35 40 45
Met Leu Ser His Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Glu Thr Arg Glu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Asn Lys Asn Val
65 70 75 80
Phe Val Lys Phe Gln Ala Pro Glu Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asp
85 90 95
Ser Ser Leu Val Ile Phe Gln Gly Gln Pro Arg Val Asn Ile Thr Val
100 105 110
Leu Pro Ser Leu Thr Ser Arg Lys Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr
115 120 125
Lys Gly Ala Ile Thr Ser Ile Ala Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile
130 135 140
Val Leu Gln Leu Gly Gln Asp Pro Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro
145 150 155 160
Glu Ala His Lys Asp Met Gly Ala Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala
165 170 175
Gln Thr Pro Val Gln Ser Cys Arg Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys
180 185 190
Glu Ala Tyr Ile Leu Arg Ile Leu Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg
195 200 205
Thr Val Thr Val Met Met Glu Leu Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile
210 215 220
Leu Ile Leu His Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn
225 230 235 240
His Ser Met Gln Ile Leu Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe
245 250 255
Pro Gly Ser Lys Val Lys Gly Val Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly
260 265 270
Leu Ile Ala Glu Ala Arg Lys Leu Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe
275 280 285
Val Glu Leu Pro Leu Val Ser Asn Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys
290 295 300
Gly Gly Val Phe Gln Thr Thr Pro Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro
305 310 315 320
Lys Asp Thr Cys Ser Pro Val Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys
325 330 335
Cys Gly Asn Gln Val Met Thr Leu Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln
340 345 350
Thr Leu Gln Cys Thr Ile Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys
355 360 365
Gln Ala Glu Asp Thr Asp Asp His Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser
370 375 380
Ser Cys Gly Met Lys Val Thr Ala His Val Val Ser Asn Glu Val Ile
385 390 395 400
Ile Ser Phe Pro Ser Gly Ser Pro Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys
405 410 415
Ile Asp Met Asp Ser Leu Ser Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro
420 425 430
His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe
435 440 445
Val Gln Val Ser Val Ser Pro Leu Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu
450 455 460
Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu
465 470 475 480
Ile Gln Ser Arg Thr Ala Lys Gly Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro
485 490 495
Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met
500 505 510
Val Pro Thr Pro Thr Ala Gly Thr Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg
515 520 525
Pro Ser Thr Leu Ser Gln Glu Val Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu
530 535 540
Asn Val Val Ser Pro Asp Leu Ser Gly Lys Gly
545 550 555
<210> 11
<211> 233
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230
<210> 12
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
1 5 10 15
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
20 25 30
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
35 40 45
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
50 55 60
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
65 70 75 80
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
85 90 95
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
145 150 155 160
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
165 170 175
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
180 185 190
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
195 200 205
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> Apis mellifera
<400> 13
Met Lys Phe Leu Val Asn Val Ala Leu Val Phe Met Val Val Tyr Ile
1 5 10 15
Ser Tyr Ile Tyr Ala 20
<210> 14
<211> 22
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 14
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro 20
<210> <211>
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala 20 25
<210> 16
<211> 820
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr
355 360 365
Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr
370 375 380
Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp
385 390 395 400
Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser
405 410 415
Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser
420 425 430
Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu Ser
435 440 445
Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn
450 455 460
Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser Pro
465 470 475 480
Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu
485 490 495
Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys
500 505 510
Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg
515 520 525
Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr Gly
530 535 540
Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp
545 550 555 560
Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser Pro
565 570 575
Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Thr Gly Gly Gly Pro Lys Ser
580 585 590
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
595 600 605
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
610 615 620
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
625 630 635 640
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
645 650 655
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
660 665 670
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
675 680 685
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
690 695 700
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
705 710 715 720
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 725 730
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 740 745
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 755 760
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 770 775
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
785 790 795
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 805 810
Ser Pro Gly Lys
820
Thr Lys Asn Gln Val 735
Ser Asp Ile Ala Val 750
Tyr Lys Thr Thr Pro 765
Tyr Ser Lys Leu Thr 780
Phe Ser Cys Ser Val
800
Lys Ser Leu Ser Leu 815
<210> 17 <211> 2463
<212> ДНК <213> Homo sapiens
<400> 17
atggatgcaa
tgaagagagg
gctctgctgt
gtgctgctgc
tcgcccggcg
ccgaaacagt
ccattgtgac
cttcagcctg
gtgacatata
ccactagcca
ggtctcgaag
ggctgcgtgg
cttgaagtcc
atgtcctctt
cctggagttc
ccaacgggcc
ctccaggcat
ccaagcaaaa
tggcacctgg
ccccgagagg
aacagcagtg
tcttcctgca
tctccaggcc
ctgggaatcc
tccagcctgg
tcaccttcca
agagcccccg
ggggtcaaca
cccaagaccc
agatccttga
gtgggcagct
gagaggggcc
ctgaatgacc
cccagagcat
cctcctccga
ctgggccaag
tgcatgctgg
aagccagcca
ggacatgggc
cgcacgctcg
gccttggtcc
ggggctgcca
cttggaaggc
gtggccggcc
agggtcctgc
cgggccactc
ggccgggccc
cggacggtga
tgcgcacccg
gggatctcga
tgccgtcctc
atcctgcagg
ctcatcgacg
ccaaccacaa
catgcagatc
tggaccactg
tttccagaga
aaaacattcg
tggcttcaag
ctcccagaca
tgtgtggagc
agtcttcgtt
tgggccccga
gagggacgag
120
ctcaggcccc
caatgccatc
180
cgtcacagct
ggagctgact
240
tgcttctggt
cctcagtgta
300
cactgcactt
ggcctacaat
360
ccacagagct
gccatccttc
420
ccatcacctc
tgctgctgag
480
cccaggggtc
actgtccttc
540
agtggcggcc
gcgtactcca
600
acaaggaggc
gcacatcctg
660
cggtgaaggt
ggaactgagc
720
gtccccccta
cgtgtcctgg
780
gagaatactc
cttcaagatc
840
cacctcaagg
cctcctgggg
900
gaggcccgga
tgctcaatgc
cagcattgtg
gcatccttcg
tggagctacc
gctggccagc
960
attgtctcac
ttcatgcctc
cagctgcggt
ggtaggctgc
agacctcacc
cgcaccgatc
1020
cagaccactc
ctcccaagga
cacttgtagc
ccggagctgc
tcatgtcctt
gatccagaca
1080
aagtgtgccg
acgacgccat
gaccctggta
ctaaagaaag
agcttgttgc
gcatttgaag
1140
tgcaccatca
cgggcctgac
cttctgggac
cccagctgtg
aggcagagga
caggggtgac
1200
aagtttgtct
tgcgcagtgc
ttactccagc
tgtggcatgc
aggtgtcagc
aagtatgatc
1260
agcaatgagg
cggtggtcaa
tatcctgtcg
agctcatcac
cacagcggaa
aaaggtgcac
1320
tgcctcaaca
tggacagcct
ctctttccag
ctgggcctct
acctcagccc
acacttcctc
1380
caggcctcca
acaccatcga
gccggggcag
cagagctttg
tgcaggtcag
agtgtcccca
1440
tccgtctccg
agttcctgct
ccagttagac
agctgccacc
tggacttggg
gcctgaggga
1500
ggcaccgtgg
aactcatcca
gggccgggcg
gccaagggca
actgtgtgag
cctgctgtcc
1560
ccaagccccg
agggtgaccc
gcgcttcagc
ttcctcctcc
acttctacac
agtacccata
1620
cccaaaaccg
gcaccctcag
ctgcacggta
gccctgcgtc
ccaagaccgg
gtctcaagac
1680
caggaagtcc
ataggactgt
cttcatgcgc
ttgaacatca
tcagccctga
cctgtctggt
1740
tgcacaagca
aaggcaccgg
tggtggaccc
aaatcttgtg
acaaaactca
cacatgccca
1800
ccgtgcccag
cacctgaact
cctgggggga
ccgtcagtct
tcctcttccc
cccaaaaccc
1860
aaggacaccc
tcatgatctc
ccggacccct
gaggtcacat
gcgtggtggt
ggacgtgagc
1920
cacgaagacc
ctgaggtcaa
gttcaactgg
tacgtggacg
gcgtggaggt
gcataatgcc
1980
aagacaaagc
cgcgggagga
gcagtacaac
agcacgtacc
gtgtggtcag
cgtcctcacc
2040
gtcctgcacc
aggactggct
gaatggcaag
gagtacaagt
gcaaggtctc
caacaaagcc
2100
ctcccagccc
ccatcgagaa
aaccatctcc
aaagccaaag
ggcagccccg
agaaccacag
2160
gtgtacaccc
tgcccccatc
ccgggaggag
atgaccaaga
accaggtcag
cctgacctgc
2220
ctggtcaaag
gcttctatcc
cagcgacatc
gccgtggagt
gggagagcaa
tgggcagccg
2280
gagaacaact
acaagaccac
gcctcccgtg
ctggactccg
acggctcctt
cttcctctat
2340
agcaagctca
ccgtggacaa
gagcaggtgg
cagcagggga
acgtcttctc
atgctccgtg
2400
atgcatgagg
ctctgcacaa
ccactacacg
cagaagagcc
tctccctgtc
cccgggtaaa
2460
tga
2463
<210> 18
<211> 814
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr
355 360 365
Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr
370 375 380
Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp
385 390 395 400
Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser
405 410 415
Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser
420 425 430
Ser Pro Gln Arg Lys Lys Val His Cys Leu Asn Met Asp Ser Leu Ser
435 440 445
Phe Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn
450 455 460
Thr Ile Glu Pro Gly Gln Gln Ser Phe Val Gln Val Arg Val Ser Pro
465 470 475 480
Ser Val Ser Glu Phe Leu Leu Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu
485 490 495
Gly Pro Glu Gly Gly Thr Val Glu Leu Ile Gln Gly Arg Ala Ala Lys
500 505 510
Gly Asn Cys Val Ser Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg
515 520 525
Phe Ser Phe Leu Leu His Phe Tyr Thr Val Pro Ile Pro Lys Thr Gly
530 535 540
Thr Leu Ser Cys Thr Val Ala Leu Arg Pro Lys Thr Gly Ser Gln Asp
545 550 555 560
Gln Glu Val His Arg Thr Val Phe Met Arg Leu Asn Ile Ile Ser Pro
565 570 575
Asp Leu Ser Gly Cys Thr Ser Lys Gly Thr Gly Gly Gly Thr His Thr
580 585 590
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
595 600 605
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
610 615 620
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
625 630 635 640
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
645 650 655
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
660 665 670
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
675 680 685
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
690 695 700
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
705 710 715 720
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
725 730 735
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
740 745 750
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
755 760 765
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
770 775 780
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
785 790 795 800
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 805 810
<210> 19
<211> 821
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 19
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Gly Glu Arg Val Gly Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Asp Pro Thr Arg Gly Glu Val Thr Phe Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Glu Gly Cys Val Ala Gln Ala Ala Asn Ala Val Arg Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Asp Phe Pro Gly Met Leu Ser His Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Glu Thr Gln Glu Val Phe Leu
85 90 95
Val Leu Val Ser Asn Lys Asn Val Phe Val Lys Phe Gln Ala Pro Glu
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asp Ser Ser Leu Val Ile Phe Gln Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Val Asn Ile Thr Val Leu Pro Ser Leu Thr Ser Arg Lys
130 135 140
Gln Ile Leu Asp Trp Ala Ala Thr Lys Gly Ala Ile Thr Ser Ile Ala
145 150 155 160
Ala Leu Asp Asp Pro Gln Ser Ile Val Leu Gln Leu Gly Gln Asp Pro
165 170 175
Lys Ala Pro Phe Leu Cys Leu Pro Glu Ala His Lys Asp Met Gly Ala
180 185 190
Thr Leu Glu Trp Gln Pro Arg Ala Gln Thr Pro Val Gln Ser Cys Arg
195 200 205
Leu Glu Gly Val Ser Gly His Lys Glu Ala Tyr Ile Leu Arg Ile Leu
210 215 220
Pro Gly Ser Glu Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Met Met Glu Leu
225 230 235 240
Ser Cys Thr Ser Gly Asp Ala Ile Leu Ile Leu His Gly Pro Pro Tyr
245 250 255
Val Ser Trp Phe Ile Asp Ile Asn His Ser Met Gln Ile Leu Thr Thr
260 265 270
Gly Glu Tyr Ser Val Lys Ile Phe Pro Gly Ser Lys Val Lys Gly Val
275 280 285
Glu Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Ile Ala Glu Ala Arg Lys Leu
290 295 300
Asn Ala Ser Ile Val Thr Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Val Ser Asn
305 310 315 320
Val Ser Leu Arg Ala Ser Ser Cys Gly Gly Val Phe Gln Thr Thr Pro
325 330 335
Ala Pro Val Val Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Val Leu
340 345 350
Leu Met Ser Leu Ile Gln Pro Lys Cys Gly Asn Gln Val Met Thr Leu
355 360 365
Ala Leu Asn Lys Lys His Val Gln Thr Leu Gln Cys Thr Ile Thr Gly
370 375 380
Leu Thr Phe Trp Asp Ser Ser Cys Gln Ala Glu Asp Thr Asp Asp His
385 390 395 400
Leu Val Leu Ser Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Lys Val Thr Ala
405 410 415
His Val Val Ser Asn Glu Val Ile Ile Ser Phe Pro Ser Gly Ser Pro
420 425 430
Pro Leu Arg Lys Lys Val Gln Cys Ile Asp Met Asp Ser Leu Ser Phe
435 440 445
Gln Leu Gly Leu Tyr Leu Ser Pro His Phe Leu Gln Ala Ser Asn Thr
450 455 460
Ile Glu Leu Gly Gln Gln Ala Phe Val Gln Val Ser Val Ser Pro Leu
465 470 475 480
Thr Ser Glu Val Thr Val Gln Leu Asp Ser Cys His Leu Asp Leu Gly
485 490 495
Pro Glu Gly Asp Met Val Glu Leu Ile Gln Ser Arg Thr Ala Lys Gly
500 505 510
Ser Cys Val Thr Leu Leu Ser Pro Ser Pro Glu Gly Asp Pro Arg Phe
515 520 525
Ser Phe Leu Leu Arg Val Tyr Met Val Pro Thr Pro Thr Ala Gly Thr
530 535 540
Leu Ser Cys Asn Leu Ala Leu Arg Pro Ser Thr Leu Ser Gln Glu Val
545 550 555 560
Tyr Lys Thr Val Ser Met Arg Leu Asn Ile Val Ser Pro Asp Leu Ser
565 570 575
Gly Lys Gly Thr Gly Gly Gly Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn
580 585 590
Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu
595 600 605
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val
610 615 620
Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
625 630 635 640
Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val
645 650 655
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser
660 665 670
Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met
675 680 685
Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser
690 695 700
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro
705 710 715 720
Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu
725 730 735
Phe Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala
740 745 750
Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr
755 760 765
Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu
770 775 780
Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser
785 790 795 800
Val Val His Glu Gly Leu His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser
805 810 815
Arg Ser Leu Gly Lys
820
<210> 20 <211> 2466
<212> ДНК <213> Mus musculus
<400> 20
atggatgcaa
tgaagagagg
gctctgctgt
gtgctgctgc
tgtgtggagc
agtcttcgtt
tcgcccggcg
gggaaagagt
cggctgtgat
ctacagcctg
tggaccccac
aaggggtgag
120
gtgacgttta
ccaccagcca
ggtctccgag
ggctgtgtag
ctcaggctgc
caatgctgtg
180
cgtgaagtcc
acgttctctt
cctggatttt
cccggaatgc
tgtcacatct
ggagctgact
240
cttcaggcat
ccaagcaaaa
tggcacggag
acccaggagg
tgttcctggt
cctcgtttcg
300
aacaaaaatg
tcttcgtgaa
gttccaggcc
ccggaaatcc
cattgcactt
ggcctacgac
360
tccagcctgg
tcatcttcca
aggacagcca
agagtcaaca
tcacagtgct
accatccctt
420
acctccagga
aacagatcct
cgactgggca
gccaccaagg
gcgccatcac
ctcgatagca
480
gcactggatg
acccccaaag
catcgtcctc
cagttgggcc
aagacccaaa
ggcaccattc
540
ttgtgcttgc
cagaagctca
caaggacatg
ggcgccacac
ttgaatggca
accacgagcc
600
cagaccccag
tccaaagctg
tcgcttggaa
ggtgtgtctg
gccacaagga
ggcctacatc
660
ctgaggatcc
tgccaggttc
tgaggccggg
ccccggacgg
tgaccgtaat
gatggaactg
720
agttgcacat
ctggggacgc
cattctcatc
ctgcatggtc
ctccatatgt
ctcctggttc
780
atcgacatca accacagcat gcagatcttg accacaggtg aatactccgt caagatcttt 840
ccaggaagca aggtcaaagg cgtggagctc ccagacacac cccaaggcct gatagcggag 900
gcccgcaagc tcaatgccag cattgtcacc tcctttgtag agctccctct ggtcagcaat 960
gtctccctga gggcctccag ctgcggtggt gtgttccaga ccacccctgc acccgttgtg 1020
accacacctc ccaaggacac atgcagcccc gtgctactca tgtccctgat ccagccaaag 1080
tgtggcaatc aggtcatgac tctggcactc aataaaaaac acgtgcagac tctccagtgc 1140
accatcacag gcctgacttt ctgggactcc agctgccagg ctgaagacac tgacgaccat 1200
cttgtcctga gtagcgccta ctccagctgc ggcatgaaag tgacagccca tgtggtcagc 1260
aatgaggtga tcatcagttt cccgtcaggc tcaccaccac ttcggaaaaa ggtacagtgc 1320
atcgacatgg acagcctctc cttccagctg ggcctctacc tcagcccgca cttcctccag 1380
gcatccaaca ccatcgaact aggccagcag gccttcgtac aggtgagcgt gtctccattg 1440
acctctgagg tcacagtcca gctagatagc tgccatctgg acttggggcc cgaaggggac 1500
atggtggaac tcatccagag ccgaacagcc aagggcagct gtgtgacctt gctgtctcca 1560
agccctgaag gtgacccacg cttcagcttc ctcctccggg tctacatggt gcccacaccc 1620
accgctggca ccctcagttg caacttagct ctgcgcccta gcaccttgtc ccaggaagtc 1680
tacaagacag tctccatgcg cctgaacatc gtcagccctg acctgtctgg taaaggcacc 1740
ggtgggggtg agcccagagt gcccataaca cagaacccct gtcctccact caaagagtgt 1800
cccccatgcg cagctccaga cctcttgggt ggaccatccg tcttcatctt ccctccaaag 1860
atcaaggatg tactcatgat ctccctgagc cccatggtca catgtgtggt ggtggatgtg 1920
agcgaggatg acccagacgt ccagatcagc tggtttgtga acaacgtgga agtacacaca 1980
gctcagacac aaacccatag agaggattac aacagtactc tccgggtggt cagtgccctc 2040
cccatccagc accaggactg gatgagtggc aaggagttca aatgcaaggt caacaacaga 2100
gccctcccat cccccatcga gaaaaccatc tcaaaaccca gagggccagt aagagctcca 2160
caggtatatg tcttgcctcc accagcagaa gagatgacta agaaagagtt cagtctgacc 2220
tgcatgatca caggcttctt acctgccgaa attgctgtgg actggaccag caatgggcgt 2280
acagagcaaa actacaagaa caccgcaaca gtcctggact ctgatggttc ttacttcatg 2340
tacagcaagc tcagagtaca aaagagcact tgggaaagag gaagtctttt cgcctgctca 2400
gtggtccacg agggtctgca caatcacctt acgactaaga ccatctcccg gtctctgggt 2460
aaatga 2466
<210> 21
<211> 671
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr
355 360 365
Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile Thr
370 375 380
Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly Asp
385 390 395 400
Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val Ser
405 410 415
Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser Ser
420 425 430
Ser Pro Gln Arg Thr Gly Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
435 440 445
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
450 455 460
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
465 470 475 480
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
485 490 495
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
500
505
510
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
515 520 525
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
530 535 540
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
545 550 555 560
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
565 570 575
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
580 585 590
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
595 600 605
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
610 615 620
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
625 630 635 640
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
645 650 655
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
660 665 670
ctgaatgacc
cccagagcat
cctcctccga
ctgggccaag
cccaggggtc
actgtccttc
540
tgcatgctgg
aagccagcca
ggacatgggc
cgcacgctcg
agtggcggcc
gcgtactcca
600
gccttggtcc
ggggctgcca
cttggaaggc
gtggccggcc
acaaggaggc
gcacatcctg
660
agggtcctgc
cgggccactc
ggccgggccc
cggacggtga
cggtgaaggt
ggaactgagc
720
tgcgcacccg
gggatctcga
tgccgtcctc
atcctgcagg
gtccccccta
cgtgtcctgg
780
ctcatcgacg
ccaaccacaa
catgcagatc
tggaccactg
gagaatactc
cttcaagatc
840
tttccagaga
aaaacattcg
tggcttcaag
ctcccagaca
cacctcaagg
cctcctgggg
900
gaggcccgga
tgctcaatgc
cagcattgtg
gcatccttcg
tggagctacc
gctggccagc
960
attgtctcac
ttcatgcctc
cagctgcggt
ggtaggctgc
agacctcacc
cgcaccgatc
1020
cagaccactc
ctcccaagga
cacttgtagc
ccggagctgc
tcatgtcctt
gatccagaca
1080
aagtgtgccg
acgacgccat
gaccctggta
ctaaagaaag
agcttgttgc
gcatttgaag
1140
tgcaccatca
cgggcctgac
cttctgggac
cccagctgtg
aggcagagga
caggggtgac
1200
aagtttgtct
tgcgcagtgc
ttactccagc
tgtggcatgc
aggtgtcagc
aagtatgatc
1260
agcaatgagg
cggtggtcaa
tatcctgtcg
agctcatcac
cacagcggac
cggtggtgga
1320
cccaaatctt
gtgacaaaac
tcacacatgc
ccaccgtgcc
cagcacctga
actcctgggg
1380
ggaccgtcag
tcttcctctt
ccccccaaaa
cccaaggaca
ccctcatgat
ctcccggacc
1440
cctgaggtca
catgcgtggt
ggtggacgtg
agccacgaag
accctgaggt
caagttcaac
1500
tggtacgtgg
acggcgtgga
ggtgcataat
gccaagacaa
agccgcggga
ggagcagtac
1560
aacagcacgt
accgtgtggt
cagcgtcctc
accgtcctgc
accaggactg
gctgaatggc
1620
aaggagtaca
agtgcaaggt
ctccaacaaa
gccctcccag
cccccatcga
gaaaaccatc
1680
tccaaagcca
aagggcagcc
ccgagaacca
caggtgtaca
ccctgccccc
atcccgggag
1740
gagatgacca
agaaccaggt
cagcctgacc
tgcctggtca
aaggcttcta
tcccagcgac
1800
atcgccgtgg
agtgggagag
caatgggcag
ccggagaaca
actacaagac
cacgcctccc
1860
gtgctggact
ccgacggctc
cttcttcctc
tatagcaagc
tcaccgtgga
caagagcagg
1920
tggcagcagg
ggaacgtctt
ctcatgctcc
gtgatgcatg
aggctctgca
caaccactac
1980
acgcagaaga
gcctctccct
gtccccgggt
aaatga
2016
<210> 23
<211> 606
<212> PRT
<213> Heme sapiens
<400> 23
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr
355 360 365
Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala Thr Gly Gly Gly Thr His Thr
370 375 380
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
385 390 395 400
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
405 410 415
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
420 425 430
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
435 440 445
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
450 455 460
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
465 470 475 480
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
485 490 495
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
500 505 510
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
515 520 525
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
530 535 540
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
545 550 555 560
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
565 570 575
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
580 585 590
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
595 600 605
<210> 24
<211> 1821
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
ggaactcaca
catgcccacc
gtgcccagca
cctgaactcc
tggggggacc
gtcagtcttc
1200
ctcttccccc
caaaacccaa
ggacaccctc
atgatctccc
ggacccctga
ggtcacatgc
1260
gtggtggtgg
acgtgagcca
cgaagaccct
gaggtcaagt
tcaactggta
cgtggacggc
1320
gtggaggtgc
ataatgccaa
gacaaagccg
cgggaggagc
agtacaacag
cacgtaccgt
1380
gtggtcagcg
tcctcaccgt
cctgcaccag
gactggctga
atggcaagga
gtacaagtgc
1440
aaggtctcca
acaaagccct
cccagccccc
atcgagaaaa
ccatctccaa
agccaaaggg
1500
cagccccgag
aaccacaggt
gtacaccctg
cccccatccc
gggaggagat
gaccaagaac
1560
caggtcagcc
tgacctgcct
ggtcaaaggc
ttctatccca
gcgacatcgc
cgtggagtgg
1620
gagagcaatg
ggcagccgga
gaacaactac
aagaccacgc
ctcccgtgct
ggactccgac
1680
ggctccttct
tcctctatag
caagctcacc
gtggacaaga
gcaggtggca
gcaggggaac
1740
gtcttctcat
gctccgtgat
gcatgaggct
ctgcacaacc
actacacgca
gaagagcctc
1800
tccctgtccc
cgggtaaatg
1821
<210> 25 <211> 593 <212> PRT <213> Homo
sapiens
<400> 25
Met Asp Ala 1
Met Lys Arg Gly Leu 5
Cys Cys Val
Leu Leu Leu
Cys Gly 15
Ala Val Phe
Val Ser Pro Gly Ala 20
Glu Thr Val 25
His Cys Asp
Leu Gln
Pro Val Gly 35
Pro Glu Arg Asp Glu 40
Val Thr Tyr
Thr Thr Ser 45
Gln Val
Ser Lys Gly
Cys Val Ala Gln Ala 55
Pro Asn Ala
Ile Leu Glu
Val His
Val Leu Phe 65
Leu Glu Phe Pro Thr 70
Gly Pro Ser 75
Gln Leu Glu
Leu Thr
Leu Gln Ala
Ser Lys Gln Asn Gly 85
Thr Trp Pro
Arg Glu Val
Leu Leu
Val Leu Ser
Val Asn Ser Ser Val 100
Phe Leu His
105
Leu Gln Ala 110
Leu Gly
Ile Pro Leu
115
His Leu Ala Tyr Asn 120
Ser Ser Leu
Val Thr Phe 125
Gln Glu
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Thr Gly Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys
355 360 365
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
370 375 380
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
385 390 395 400
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
405 410 415
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
420 425 430
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
435 440 445
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
450 455 460
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
465 470 475 480
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
485 490 495
Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
500 505 510
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
515 520 525
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
530 535 540
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
545 550 555 560
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
565 570 575
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
580 585 590
Lys
<213> Homo sapiens
<400> 26
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt
tcgcccggcg ccgaaacagt ccattgtgac cttcagcctg tgggccccga gagggacgag 120
gtgacatata ccactagcca ggtctcgaag ggctgcgtgg ctcaggcccc caatgccatc 180
cttgaagtcc atgtcctctt cctggagttc ccaacgggcc cgtcacagct ggagctgact 240
ctccaggcat ccaagcaaaa tggcacctgg ccccgagagg tgcttctggt cctcagtgta 300
aacagcagtg tcttcctgca tctccaggcc ctgggaatcc cactgcactt ggcctacaat 360
tccagcctgg tcaccttcca agagcccccg ggggtcaaca ccacagagct gccatccttc 420
cccaagaccc agatccttga gtgggcagct gagaggggcc ccatcacctc tgctgctgag 480
ctgaatgacc cccagagcat cctcctccga ctgggccaag cccaggggtc actgtccttc 540
tgcatgctgg aagccagcca ggacatgggc cgcacgctcg agtggcggcc gcgtactcca 600
gccttggtcc ggggctgcca cttggaaggc gtggccggcc acaaggaggc gcacatcctg 660
agggtcctgc cgggccactc ggccgggccc cggacggtga cggtgaaggt ggaactgagc 720
tgcgcacccg gggatctcga tgccgtcctc atcctgcagg gtccccccta cgtgtcctgg 780
ctcatcgacg ccaaccacaa catgcagatc tggaccactg gagaatactc cttcaagatc 840
tttccagaga aaaacattcg tggcttcaag ctcccagaca cacctcaagg cctcctgggg 900
gaggcccgga tgctcaatgc cagcattgtg gcatccttcg tggagctacc gctggccagc 960
attgtctcac ttcatgcctc cagctgcggt ggtaggctgc agacctcacc cgcaccgatc 1020
cagaccactc ctcccaagga cacttgtagc ccggagctgc tcatgtcctt gatcaccggt 1080
ggtggaccca aatcttgtga caaaactcac acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc 1140
ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc 1200
cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag 1260
ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag 1320
cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg 1380
aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa 1440
accatctcca aagccaaagg gcagccccga gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc 1500
cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc 1560
agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat gggcagccgg agaacaacta caagaccacg 1620
cctcccgtgc tggactccga cggctccttc ttcctctata gcaagctcac cgtggacaag 1680
agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac 1740
cactacacgc agaagagcct ctccctgtcc ccgggtaaat ga 1782
<210> 27
<211> 587
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly
1 5 10 15
Ala Val Phe Val Ser Pro Gly Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln
20 25 30
Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val
35 40 45
Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His
50 55 60
Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr
65 70 75 80
Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu
85 90 95
Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly
100 105 110
Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu
115 120 125
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu
340 345 350
Leu Leu Met Ser Leu Ile Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro
355 360 365
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
370 375 380
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
385 390 395 400
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
405 410 415
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
420 425 430
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
435 440 445
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
450 455 460
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
465 470 475 480
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
485 490 495
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
500 505 510
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
515 520 525
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
530 535 540
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
545 550 555 560
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
565 570 575
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580 585
<210> 28 <211> 1764
<212> ДНК <213> Homo sapiens
<400> 28
atggatgcaa
tgaagagagg
gctctgctgt
gtgctgctgc
tgtgtggagc
agtcttcgtt
tcgcccggcg
ccgaaacagt
ccattgtgac
cttcagcctg
tgggccccga
gagggacgag
120
gtgacatata
ccactagcca
ggtctcgaag
ggctgcgtgg
ctcaggcccc
caatgccatc
180
cttgaagtcc
atgtcctctt
cctggagttc
ccaacgggcc
cgtcacagct
ggagctgact
240
ctccaggcat
ccaagcaaaa
tggcacctgg
ccccgagagg
tgcttctggt
cctcagtgta
300
aacagcagtg
tcttcctgca
tctccaggcc
ctgggaatcc
cactgcactt
ggcctacaat
360
tccagcctgg
tcaccttcca
agagcccccg
ggggtcaaca
ccacagagct
gccatccttc
420
cccaagaccc
agatccttga
gtgggcagct
gagaggggcc
ccatcacctc
tgctgctgag
480
ctgaatgacc
cccagagcat
cctcctccga
ctgggccaag
cccaggggtc
actgtccttc
540
tgcatgctgg
aagccagcca
ggacatgggc
cgcacgctcg
agtggcggcc
gcgtactcca
600
gccttggtcc
ggggctgcca
cttggaaggc
gtggccggcc
acaaggaggc
gcacatcctg
660
agggtcctgc
cgggccactc
ggccgggccc
cggacggtga
cggtgaaggt
ggaactgagc
720
tgcgcacccg
gggatctcga
tgccgtcctc
atcctgcagg
gtccccccta
cgtgtcctgg
780
ctcatcgacg
ccaaccacaa
catgcagatc
tggaccactg
gagaatactc
cttcaagatc
840
tttccagaga
aaaacattcg
tggcttcaag
ctcccagaca
cacctcaagg
cctcctgggg
900
gaggcccgga
tgctcaatgc
cagcattgtg
gcatccttcg
tggagctacc
gctggccagc
960
attgtctcac
ttcatgcctc
cagctgcggt
ggtaggctgc
agacctcacc
cgcaccgatc
1020
cagaccactc
ctcccaagga
cacttgtagc
ccggagctgc
tcatgtcctt
gatcaccggt
1080
ggtggaactc
acacatgccc
accgtgccca
gcacctgaac
tcctgggggg
accgtcagtc
1140
ttcctcttcc
ccccaaaacc
caaggacacc
ctcatgatct
cccggacccc
tgaggtcaca
1200
tgcgtggtgg
tggacgtgag
ccacgaagac
cctgaggtca
agttcaactg
gtacgtggac
1260
ggcgtggagg
tgcataatgc
caagacaaag
ccgcgggagg
agcagtacaa
cagcacgtac
1320
cgtgtggtca
gcgtcctcac
cgtcctgcac
caggactggc
tgaatggcaa
ggagtacaag
1380
tgcaaggtct
ccaacaaagc
cctcccagcc
cccatcgaga
aaaccatctc
caaagccaaa
1440
gggcagcccc
gagaaccaca
ggtgtacacc
ctgcccccat
cccgggagga
gatgaccaag
1500
aaccaggtca
gcctgacctg
cctggtcaaa
ggcttctatc
ccagcgacat
cgccgtggag
1560
tgggagagca
atgggcagcc
ggagaacaac
tacaagacca
cgcctcccgt
gctggactcc
1620
gacggctcct
tcttcctcta
tagcaagctc
accgtggaca
agagcaggtg
gcagcagggg
1680
aacgtcttct
catgctccgt
gatgcatgag
gctctgcaca
accactacac
gcagaagagc
1740
ctctccctgt
ccccgggtaa
atga
1764
<210> 29 <211> 574 <212> PRT
<213> Homo
sapiens
<400> 29
Met Asp Ala 1
Met Lys Arg Gly Leu 5
Cys Cys Val 10
Leu Leu Leu
Cys Gly 15
Ala Val Phe
Val Ser Pro Gly Ala 20
Glu Thr Val 25
His Cys Asp
Leu Gln
Pro Val Gly 35
Pro Glu Arg Asp Glu 40
Val Thr Tyr
Thr Thr Ser 45
Gln Val
Ser Lys Gly
Cys Val Ala Gln Ala 55
Pro Asn Ala
Ile Leu Glu
Val His
Val Leu Phe 65
Leu Glu Phe Pro Thr 70
Gly Pro Ser 75
Gln Leu Glu
Leu Thr
Leu Gln Ala
Ser Lys Gln Asn Gly 85
Thr Trp Pro 90
Arg Glu Val
Leu Leu
Val Leu Ser
Val Asn Ser Ser Val 100
Phe Leu His
105
Leu Gln Ala 110
Leu Gly
Ile Pro Leu
115
His Leu Ala Tyr Asn 120
Ser Ser Leu
Val Thr Phe 125
Gln Glu
Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln
130 135 140
Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu
145 150 155 160
Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly
165 170 175
Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr
180 185 190
Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu
195 200 205
Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro
210 215 220
Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser
225 230 235 240
Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro
245 250 255
Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr
260 265 270
Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly
275 280 285
Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met
290 295 300
Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser
305 310 315 320
Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser
325 330 335
Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr
340 345 350
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
355 360 365
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
370 375 380
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
385 390 395 400
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
405 410 415
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
420 425 430
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
435 440 445
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
450 455 460
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
465 470 475 480
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
485 490 495
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
500 505 510
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
515 520 525
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
530 535 540
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
545 550 555 560
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 565 570
<210> 30
<211> 1725
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 30
atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60
tcgcccggcg ccgaaacagt ccattgtgac cttcagcctg tgggccccga gagggacgag 120
gtgacatata ccactagcca ggtctcgaag ggctgcgtgg ctcaggcccc caatgccatc 180
cttgaagtcc atgtcctctt cctggagttc ccaacgggcc cgtcacagct ggagctgact 240
ctccaggcat ccaagcaaaa tggcacctgg ccccgagagg tgcttctggt cctcagtgta 300
aacagcagtg tcttcctgca tctccaggcc ctgggaatcc cactgcactt ggcctacaat 360
tccagcctgg tcaccttcca agagcccccg ggggtcaaca ccacagagct gccatccttc 420
cccaagaccc agatccttga gtgggcagct gagaggggcc ccatcacctc tgctgctgag 480
ctgaatgacc cccagagcat cctcctccga ctgggccaag cccaggggtc actgtccttc 540
tgcatgctgg aagccagcca ggacatgggc cgcacgctcg agtggcggcc gcgtactcca 600
gccttggtcc ggggctgcca cttggaaggc gtggccggcc acaaggaggc gcacatcctg 660
agggtcctgc cgggccactc ggccgggccc cggacggtga cggtgaaggt ggaactgagc 720
tgcgcacccg gggatctcga tgccgtcctc atcctgcagg gtccccccta cgtgtcctgg 780
ctcatcgacg ccaaccacaa catgcagatc tggaccactg gagaatactc cttcaagatc 840
tttccagaga aaaacattcg tggcttcaag ctcccagaca cacctcaagg cctcctgggg 900
gaggcccgga tgctcaatgc cagcattgtg gcatccttcg tggagctacc gctggccagc 960
attgtctcac ttcatgcctc cagctgcggt ggtaggctgc agacctcacc cgcaccgatc 1020
cagaccactc ctcccaccgg tggtggaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1080
ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1140
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1260
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1320
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1380
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1440
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1560
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1620
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1680
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aatga 1725
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 31
Thr Gly Gly Gly 1
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
32 3
PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический полипептид
<400> 32 Gly Gly Gly
<210> 33
<211> 582
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 33
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr
325 330 335
Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val
340 345 350
Ala Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
355 360 365
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
370 375 380
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
385 390 395 400
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
405 410 415
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
420
425
430
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
435 440 445
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
450 455 460
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
465 470 475 480
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
485 490 495
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
500 505 510
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
515 520 525
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
530 535 540
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
545 550 555 560
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
565 570 575
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
580
<210> 34
<211> 569
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Thr Gly
325 330 335
Gly Gly Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
340 345 350
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
355 360 365
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
370 375 380
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
385 390 395 400
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
405 410 415
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
420 425 430
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
435 440 445
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
450 455 460
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
465 470 475 480
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
485 490 495
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
500 505 510
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
515 520 525
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
530 535 540
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
545 550 555 560
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
565
<210> 35
<211> 563
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Thr Gly
325 330 335
Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
340 345 350
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
355 360 365
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
370 375 380
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
385 390 395 400
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
405 410 415
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
420 425 430
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
435 440 445
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
450 455 460
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
465 470 475 480
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
485 490 495
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
500 505 510
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
515 520 525
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
530 535 540
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
545 550 555 560
Pro Gly Lys
<210> 36
<211> 550
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36
Glu Thr Val His Cys Asp Leu Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Asp Glu
1 5 10 15
Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala
20 25 30
Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr
35 40 45
Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly
50 55 60
Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val
65 70 75 80
Phe Leu His Leu Gln Ala Leu Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn
85 90 95
Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu
100 105 110
Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg
115 120 125
Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu
130 135 140
Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu
145 150 155 160
Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro
165 170 175
Ala Leu Val Arg Gly Cys His Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu
180 185 190
Ala His Ile Leu Arg Val Leu Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr
195 200 205
Val Thr Val Lys Val Glu Leu Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala
210 215 220
Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala
225 230 235 240
Asn His Asn Met Gln Ile Trp Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile
245 250 255
Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln
260 265 270
Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser
275 280 285
Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser
290 295 300
Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro
305 310 315 320
Pro Thr Gly Gly Gly Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
325 330 335
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
340 345 350
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
355 360 365
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
370 375 380
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
385 390 395 400
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
405 410 415
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
420 425 430
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
435 440 445
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
450 455 460
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
465 470 475 480
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
485 490 495
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
500 505 510
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
515 520 525
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
530 535 540
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или профилактики фиброзного нарушения у нуждающегося в этом пациента, включающий введение пациенту эффективного количества эндоглинового полипептида, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную аминокислотам 42-333 SEQ ID NO: 1.
2. Способ по п. 1, где фиброзное нарушение является фиброзом печени.
3. Способ по п. 2, где фиброз печени является циррозом печени, алкогольным фиброзом печени, повреждением желчных протоков, первичным биллиарным циррозом, инфекционным фиброзом печени, врожденным фиброзом печени или аутоиммунным гепатитом.
4. Способ по п. 4, где инфекционный фиброз печени является бактериально-индуцированным или вирусно-индуцированным.
5. Способ по любому из пп. 1-4, где эндоглиновый полипептид не включает последовательность, состоящую из аминокислот 379-430 SEQ ID NO: 1.
6. Способ по любому из пп. 1-5, где эндоглиновый полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, начинающейся с аминокислоты, соответствующей любому из положений 2 6-42 SEQ ID NO: 1, и заканчивающейся аминокислотой, соответствующей любому из положений 333-37 8 SEQ ID NO: 1.
7. Способ по любому из пп. 1-6, где эндоглиновый полипептид содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
a. аминокислот 2 6-34 6 SEQ ID NO: 1,
b. аминокислот 2 6-359 SEQ ID NO: 1, и
c. аминокислот 26-378 SEQ ID NO: 1.
8. Способ по любому из пп. 1-7, где эндоглиновый полипептид состоит из первой части, состоящей из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 95% идентичной последовательности, выбранной из группы, состоящей из:
a. аминокислот 2 6-34 6 SEQ ID N0: 1,
b. аминокислот 2 6-359 SEQ ID NO: 1, и
с. аминокислот 26-378 SEQ ID NO: 1
и второй части, являющейся гетерологичной SEQ ID NO: 1.
9. Способ по п. 8, где вторая часть эндоглинового полипептида содержит Fc-часть IgG.
10. Способ по любому из пп. 1-9, где эндоглиновый полипептид является димером.
11. Способ по любому из пп. 1-10, где эндоглиновый полипептид является гомодимером.
12. Способ по любому из пп. 1-11, где эндоглиновый полипептид не включает более 50 последовательных аминокислот из последовательности, состоящей из аминокислот 379-586 SEQ ID NO: 1.
13. Способ по любому из пп. 1-12, где эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-9 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1x10-9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 1x10-3 с-1.
14. Способ по любому из пп. 1-13, где эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-9 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1x10-9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 5x10-4 с-1.
15. Способ по любому из пп. 1-14, где эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-10 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1x10-9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 5x10-3 с-1.
16. Способ по любому из пп. 1-15, где эндоглиновый полипептид связывается с ВМР-10 человека с равновесной константой диссоциации (KD) менее 1x10-9 М или константой скорости диссоциации (kd) менее 2,5х10~3 с-1.
17. Способ по любому из пп. 1-16, где эндоглиновый полипептид не связывается с TGF-|3l человека, TGF-|33 человека, VEGF человека или основным фактором роста фибробластов человека
(FGF-2) .
18. Способ по любому из пп. 1-17, где эндоглиновый полипептид является слитым белком, включающим, помимо части,
18.
содержащей аминокислотную последовательность эндоглина, одну или несколько полипептидных частей, повышающих одно или несколько: стабильность in vivo, время полужизни in vivo, захват/введение, локализацию или распределение в тканях, образование белковых комплексов и/или очистку.
19. Способ по любому из пп. 1-18, где эндоглиновый полипептид включает часть, выбранную из группы, состоящей из: константного домена иммуноглобулина и сывороточного альбумина.
20. Способ по любому из пп. 1-19, где эндоглиновый полипептид содержит домен Fc иммуноглобулина.
21. Способ по п. 20, где домен Fc иммуноглобулина соединяют с частью полипептида ENG посредством линкера.
22. Способ по п. 21, где линкер состоит из аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO: 31 (TGGG) или GGG.
23. Способ по любому из пп. 1-22, где эндоглиновый полипептид включает один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, выбранных из: гликозилированной аминокислоты, пегилированной аминокислоты, фарнезилированной аминокислоты, ацетилированной аминокислоты, биотинилированной аминокислоты, аминокислоты, конъюгированной с остатком липида, и аминокислоты, конъюгированной с органическим дериватизирующим средством.
24. Способ по любому из пп. 1-23, где эндоглиновый
полипептид вводят внутривенно, внутримышечно,
внутриартериально, подкожно или перорально.
По доверенности
534572
Аминокислотная последовательность ENG человека, изоформа 1 (L-ENG) (GenBank NMJ01114753)
1 MDRGTLPLAV ALLLASCSLS PTSLAETVHC DLQPVGPERG EVTYTTSQVS KGCVAQAPNA
61 ILEVHVLFLE FPTGPSQLSL TLQASKQNGT WPREVLLVLS VNSSVFLELQ ALGIPLHLAY
121 NSSLVTFQEP PGVNTTELPS FPRTQILEWA AERGPITSAA ELNDPQSILL RLGQAQGSLS
181 FCMLEASQDM GRTLEWRPRT PALVRGCHLS GVAGHKEAHI LRVLPGHSAG PRTVTVKVEL
241 SCAPGDLBAV L1LQGPPYVS WLIDAHHHMQ IWTTGEYSFK IFPEKNIRGF KLPDTPQGLL
301 GEARMLNASI VASFVELPLA SIVSLHASSC GGRLQTSPAP IQTTPPKDTC SPELLMSLIQ
361 TKCADDAMTL VLKKELVAHL KCTITGLTFW DPSCEAEDRG DKFVLRSAYS SCGMQVSASM
421 ISNEAWNIL SSSSPQRKKV HCLNMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNTIEPG QQSFVQVRVS
481 PSVSEFLLQL DSCHLDLGPE GGTVELIQGR AAKGNCVSLL SPSPEGDPRF SFLLHFYTVP
541 IPKTGTLSCT VALRPKTGSQ DQEVHRTVFM RLNUSPDLS GCTSKGLVLP AVLGITFGAF
601 LIGALLTAAL WYIYSHTRSP SKREPVVAVA APASSESSST NHSIGSTQST PCSTSSMA {SEQ ID NO: 1)
ФИГ.1
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ENG человека, изоформу 1 (L-ENG) (GenBank NMJ01114753)
361
CCTGCCACTG
GACACAGGAT
AAGGCCCAGC
GCACAGGCCC
CCACGTGGAC
AGCATGGACC
421
GCGGCACGCT
CCCTCTGGCT
GTTGCCCTGC
TGCTGGCCAG
CTGCAGCCTC
AGCCCCACAA
481
GTCTTGCAGA
AACAGTCCAT
TGTGACCTTC
AGCCTGTGGG
CCCCGAGAGG
GGCGAGGTGA
541
CATATACCAC
TAGCCAGGTC
TCGAAGGGCT
GCGTGGCTCA
GGCCCCCAAT
GCCATCCTTG
601
AAGTCCATGT
CCTCTTCCTG
GAGTTCCCAA
CGGGCCCGTC
ACAGCTGGAG
CTGACTCTCC
651
AGGCATCCAA
GCAAAATGGC
ACCTGGCCCC
GAGAGGTGCT
TCTGGTCCTC
AGTGTAAACA
721
GCAGTGTCTT
CCTGCATCTC
CAGGCCCTGG
GAATCCCACT
GCACTTGGCC
TACAATTCCA
781
GCCTGGTCAC
CTTCCAAGAG
CCCCCGGGGG
TCAACACCAC
AGAGCTGCCA
TCCTTCCCCA
841
AGACCCAGAT
CCITGAGTGG
GCAGCTGAGA
GGGGCCCCAT
CACCTCTGCT
GCTGAGCTGA
901
ATGACCCCCA
GAGCATCCTC
CTCCGACTGG
GCCAAGCCCA
GGGGTCACTG
TCCTTCTGCA
961
TGCTGGAAGC
CAGCCAGGAC
ATGGGCCGCA
CGCTCGAGTG
GCGGCCGCGT
ACTCCAGCCT
1021
TGC-TCCGGGG
CTGCCACTTG
GAAGGCGTGG
CCGGCCACAA
GGAGGCGCAC
ATCCTGAGGG
1081
TCCTGCCGGG
CCACTCGGCC
GGGCCCCGGA
CGGTGACGGT
GAAGGTGGAA
CTGAGCTGCG
1141
CACCCGGGGA
TCTCGATGCC
GTCCTCATCC
TGCAGGGTCC
CCCCTACGTG
TCCTGGCTCA
1201
TCGACGCCAA
CCACAACATG
CAC-ATCTGGA
CCACTGGAGA
ATACTCCTTC
AAGATCTTTC
1261
CAGAGAAAAA
CATTCGTGGC
TTCAAGCTCC
CAGACACACC
TCAAGGCCTC
CTGGGGGAGG
1321
CCCGGATGCT
CAATGCCAGC
ATTGTGGCAT
CCTTCGTGGA
GCTACCGCTG
GCCAGCATTG
1381
TCTCACTTCA
TGCCTCCAGC
TGCGC-TGGTA
GGCTGCAGAC
CTCACCCGCA
CCGATCCAGA
1441
CCACTCCTCC
CAAGGACACT
TGTAGCCCGG
AGCTGCTCAT
GTCCTTGATC
CAGACAAAGT
1501
GTGCCGACGA
CGCCATGACC
CTGGTACTAA
AGAAAGAGCT
TGTTGCGCAT
TTGAAGTGCA
1561
CCATCACGGG
CCTGACCTTC
TGGGACCCCA
GCTGTGAGGC
AGAGGACAGG
GGTGACAAGT
1621
TTGTCTTGCG
CAGTGCTTAC
TCCAGCTGTG
GCATGCAGGT
GTCAGCAAGT
ATGATCAGCA
1681
ATGAGGCGGT
GGTCAATATC
CTGTCGAGCT
CATCACCACA
GCGGAAAAAG
GTGCACTGCC
1741
TCAACATGGA
CAGCCTCTCT
TTCCAGCTGG
GCCTCTACCT
CAGCCCACAC
TTCCTCCAGG
1801
CCTCCAACAC
CATCGAGCCG
GGGCAGCAGA
GCTTTGTGCA
GGTCAGAGTG
TCCCCATCCG
1861
TCTCCGAGTT
CCTGCTCCAG
TTAGACAGCT
GCCACCTGGA
CTTGGGGCCT
GAGGGAGGCA
1921
CCGTGGAACT
CATCCAGGGC
CGGGCGGCCA
AGGGCAACTG
TGTGAGCCTG
CTGTCCCCAA
1981
GCCCCGAGGG
TGACCCGCGC
TTCAGCTTCC
TCCTCCACTT
CTACACAGTA
CCCATACCCA
2041
AAACCGGCAC
CCTCAGCTGC
ACGGTAGCCC
TGCGTCCCAA
GACCGGGTCT
CAAGACCAGG
2101
AAGTCCATAG
GACTGTCTTC
ATGCGCTTGA
ACATCATCAG
CCCTGACCTG
TCTGGTTGCA
2151
CAAGCAAAGG
CCTCGTCCTG
CCCGCCGTGC
TGGGCATCAC
CTTTGGTGCC
TTCCTCATCG
222.1
GGGCCCTGCT
CACTGCTGCA
CTCTGGTACA
TCTACTCGCA
CACGCGTTCC
CCCAGCAAGC
2281
GGGAGCCCGT
GGTGGCGGTG
GCTGCCCCGG
CCTCCTCGGA
GAGCAGCAGC
ACCAACCACA
2341
GCATCGGGAG
CACCCAGAGC
ACCCCCTGCT
CCACCAGCAG
CATGGCATAG
(SEQ ID NO: 2}
ФИГ.2
Аминокислотная последовательность ENG человека, изоформа 2 (S-ENG) (GenBank NM 000118)
1 MDRGTLPLAY ALLLASCSLS PTSLAETVBC DLQPVGPERG EVTYTTSQVS KGCVAQAPNA
61 ILEVHVLFLE FPTGPSQLEL TLQASKQNGT WPREVLLVLS VNSSVFLHLQ ALGIPLHLAY
121 NSSLVTFQEP PGVNTTSLPS FPKTQILEWA AERGPITSAA ELNDPQSILL RLGQAQGSLS
181 FCMLEASQDM GRTLEWRPRT PALVRGCHLE GVAGHKEAHI LRVLPGHSAG PRTVTVKVEL
241 SCAPGDLDAV LILQGPPYVS WLIDAHHNMQ IWTTGEYSFK IFPEKNIRGF KLPDTPQGLL
301 GEARMLNASI VASFVELPLA SIVSLHASSC GGRLQTSPAP IQTTPPKDTC SPELLMSLIQ
361 TKCADDAMTL VLKKELVAHL KCTITGLTFW DPSCEAEDRG DKFVLRSAYS SCGMQVSASM
421 ISNEAWNIL SSSSPQRKKV HCLHMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNTIEPG QQSFVQVRVS
481 PSVSEFLLQL DSCHLDLGPE GGTVELIQGR AAKGNCVSLL SPSPEGDPRF SFLLHFYTVP
541 IPKTGTLSCT VALRPKTGSQ DQEVHRTVFM RLNUSPDLS GCTSKGLVLP AVLGITFGAF
601 LIGALLTAAL WYIYSHTREY PRPPQ (SEQ ID NO: 3)
ФИГ.З
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ENG человека, изоформу 2 (S-ENG) (GenBank NM 000118)
361 CCTGCCACTG GACACAGGAT AAGGCCCAGC GCACAGGCCC CCACGTGGAC AGCATGGACC
421 GCGGCACGCT CCCTCTGGCT GTTGCCCTGC TGCTGGCCAG CTGCAGCCTC AGCCCCACAA
481 GTCTTGCAGA AACAGTCCAT 7GTCACCTTC AGCCTGTGCG CCCCGAGAGG GGCGAGGTGA
541 CATATACCAC TAGCCAGGTC TCGAAGGGCT GCGTGGCTCA GGCCCCCAAT GCCATCCTTG
601 AAGTCCATGT CCTCTTCCTG GAGTTCCCAA CGGGCCCGTC ACAGCTGGAG CTGACTCTCC
661 AGGCATCCAA GCAAAATGGC ACCTGGCCCC GAGAGGTGCT TCTGGTCCTC AGTGTAAACA
721 GCAGTGTCTT CCTGCATCTC CAGGCCCTGG GAATCCCACT GCACTTGGCC TACAATTCCA
781 GCCTGGTCAC CTTCCAAGAG CCCCCGGGGG TCAACACCAC AGAGCTGCCA TCCTTCCCCA
841 AGACCCAGAT CCTTGAGTGG GCAGCTGAGA GGGGCCCCAT CACCTCTGCT GCTGAGCTGA
901 ATGACCCCCA GAGCATCCTC CTCCGACTGG GCCAAGCCCA GGGGTCACTG TCCTTCTGCA
961 TGCTGGAAGC CAGCCAGGAC ATGGGCCGCA CGCTCGAGTG GCGGCCGCGT ACTCCAGCCT
1021 TGGTCCGGGG CTGCCACTTG GAAGGCGTGG CCGGCCACAA GGAGGCGCAC ATCCTGAGGG
1081 TCCTGCCGGG CCACTCGGCC GGGCCCCGGA CGGTGACGGT GAAGGTGGAA CTGAGCTGCG
1141 CACCCGGGGA TCTCGATGCC GTCCTCATCC TGCAGGGTCC CCCCTACGTG TCCTGGCTCA
1201 TCGACGCCAA CCACAACATG CAGATCTGGA CCACTGGAGA ATACTCCTTC AAGATCTTTC
1261 CAGAGAAAAA CATTCGTGGC TTCAAGCTCC CAGACACACC TCAAGGCCTC CTGGGGGAGG
1321 CCCGGATGCT CAATGCCAGC ATTGTGGCAT CCTTCGTGGA GCTACCGCTG GCCAGCATTG
1381 TCTCACTTCA TGCCTCCAGC TGCGGTGGTA GGCTGCAGAC CTCACCCGCA CCGATCCAGA
1441 CCACTCCTCC CAAGGACACT TGTAGCCCGG AGCTGCTCAT GTCCTTGATC CAGACAAAGT
1501 GTGCCGACGA CGCCATGACC CTGGTACTAA AGAAAGAGCT TGTTGCGCAT TTGAAGTGCA
1561 CCATCACGGG CCTGACCTTC TGGGACCCCA GCTGTGAGGC AGAGGACAGG GGTGACAAGT
1621 TTGTCTTGCG CAGTGCTTAC TCCAGCTGTG GCATGCAGGT GTCAGCAAGT ATGATCAGCA
1681 ATGAGGCGGT GGTCAATATC CTGTCGAGCT CATCACCACA GCGGAAAAAG GTGCACTGCC
1741 TCAACATGGA CAGCCTCTCT TTCCAGCTGG GCCTCTACCT CAGCCCACAC TTCCTCCAGG
1801 CCTCCAACAC CATCGAGCCG GGGCAGCAGA GCTTTGTGCA GGTCAGAGTG TCCCCATCCG
1861 TCTCCGAGTT CCTGCTCCAG TTAGACAGCT GCCACCTGGA CTTGGGGCCT GAGGGAGGCA
1921 CCGTGGAACT CATCCAGGGC CGGGCGGCCA AGGGCAACTG TGTGAGCCTG CTGTCCCCAA
1981 GCCCCGAGGG TGACCCGCGC TTCAGCTTCC ТССТССАСТТ СTAGACAGТА CCCATACCCA
2041 AAACCGGCAC CCTCAGCTGC ACGGTAGCCC TGCGTCCCAA GACCGGGTCT CAAGACCAGG
2.101 AAGTCCATAG GACTGTCTTC ATGCGCTTGA ACATCATCAG CCCTGACCTG TCTGGTTGCA
2161 CAAGCAAAGG CCTCGTCCTG CCCGCCGTGC TGGGCATCAC CTTTGGTGCC TTCCTCATCG
222.1 GGGCCCTGCT CACTGCTGCA CTCTGGTACA TCTACTCGCA CACGCGTGAG TACCCCAGGC
2281 CCCCACAGTG A
(SEQ ID NO: 4}
ФИГ.4
Аминокислотная последовательность ENG мыши, изоформа 1 (L-ENG) (GenBank NM 007932)
1 MDRGVLPLPI TLLFVIYSFV PTTGLAERVG CDLQPVDPTR GEVTFTTSQV SEGCVAQMN
61 AVREVHVLFL DFPGMLSHLE LTLQASKQHG TETQEVFLVL VSNKNVFVKF QAPEIPLHLA
121 YDSSLVIFQG QPRVNITVLP SLTSRKQILD WAATKGAITS IAALDDPQSI VLOLGQDPKA
131 PFLCLPEAHK DMGATLEWQP RAQTPVQSCR LEGVSGHKEA YILRILPGSE AGPRTVTVMM
241 ELSCTSGDAI LILHGPPYVS WFIDINHSMQ ILTTGEYSVK IFPGSKVKGV ELPDTPQGLI
301 AEARKLNASI VTSFVELPLV SNVSLRASSC GGVFQTTPAP VVTTPPKDTC SPVLLMSLIQ
361 PKCGNQVMTL ALNKKHVQTL QCTITGLTFW DSSCQAEDTD DHLVLSSAYS SCGMKVTAHV
421 VSNEVIISFP SGSPPLRKKV QCIDMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNTIELG QQAFVQVSVS
481 PLTSEVTVQL DSCHLDLGPE GDMVELIQSR TAKGSCVTLL SPSPEGDPRF SFLLRV'YMVP
541 TPTAGTLSCN LALRPSTLSQ EVYKTVSMRL NIVSPDLSGK GLVLPSVLGI TFGAFLIGAL
601 LTAALWYIYS HTRGPSKRSP VVAVAAPASS ESSSTHHSIG STQSTPCSTS SMA
(SEQ ID NO: 5)
ФИГ.5
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ENG мыши, изоформу 1 (L-ENG) (GenBank NM 007932)
361 AGCATGGACC GTGC-CGTGCT CCCTCTGCCC ATTACCCTGC TGTTTGTCAT CTATAGCTTT
421 GTACCCACAA CAGSTCTCGC AGAAAGAGTC GGCTGTGATC TACAGCCTGT GGACCCCACA
431 AGGGGTGAGG TGACGTTTAC CACCAGCCAG GTCTCCGAGG GCTGTGTAGC TCAGGCTGCC
541 AATGCTGTC-C GTGAAGTCCA CGTTCTCTTC CTGGATTTTC CCGGAATGCT GTCACATCTG
601 GAGCTGACTC TTCAGGCATC CAAGCAAAAT GGCACGGAGA CCCAGGAGGT GTTCCTGGTC
661 CTCGTTTCGA ACAAAAATGT CTTCGTGAAG TTCCAGGCCC CGGAAATCCC ATTGCACTTG
721 GCCTACGACT CCAGCCTGGT CATCTTCCAA GGACAGCCAA GAGTCAACAT CACAGTGCTA
781 CCATCCCTTA CCTCCAGGAA ACAGATCCTC GACTGGGCAG CCACCAAGGG CGCCATCACC
841 TCGATAGCAG CACTGGATGA CCCCCAAAGC ATCGTCCTCC AGTTGGGCCA AGACCCAAAG
901 GCACCATTCT TGTGCTTGCC AGAAGCTCAC AAGGACATGG GCGCCACACT TGAATGGCAA
961 CCACGAGCCC AGACCCCAGT CCAAAGCTGT CGCTTGGAAG GTGTGTCTGG CCACAAGGAG
1021 GCCTACATCC TGAGGATCCT GCCAGGTTCT GAGGCCGGGC CCCGGACGGT GACCGTAATG
1081 ATGGAACTGA GTTGCACATC TGGGGACGCC ATTCTCATCC TGCATGGTCC TCCATATGTC
1141 TCCTGGTTCA TCGACATCAA CCACAGCATG CAGATCTTGA CCACAGGTGA ATACTCCGTC
1201 AAGATCTTTC CAGGAAGCAA GGTCAAAGGC GTGGAGCTCC CAGACACACC CCAAGGCCTG
1261 ATAGCGGAGG CCCGCAAGCT CAATGCCAGC ATTGTCACCT CCTTTGTAGA GCTCCCTCTG
1321 GTCAGCAATG TCTCCCTGAG GGCCTCCAGC TGCGGTGGTG TGTTCCAGAC CACCCCTGCA
1381 CCCGTTGTGA CCACACCTCC CAAGGACACA TGCAGCCCCG TGCTACTCAT GTCCCTGATC
1441 CAGCCAAAGT GTGGCAATCA GGTCATGACT CTGGCACTCA ATAAAAAACA CGTGCAGACT
1501 CTCCAGTGCA CCATCACAGG CCTGACTTTC TGGGACTCCA GCTGCCAGGC TGAAGACACT
1561 GACGACCATC TTGTCCTGAG TAGCGCCTAC TCCAGCTGCG GCATGAAAGT GACAGCCCAT
1621 GTGGTCAGCA ATGAGGTGAT CATCAGTTTC CCGTCAGGCT CACCACCACT TCGGAAAAAG
1681 GTACAGTGCA TCGACATGGA CAGCCTCTCC TTCCAGCTGG GCCTCTACCT CAGCCCGCAC
1741 TTCCTCCAGG CATCCAACAC CATCGAACTA GGCCAGCAGG CCTTCGTACA GGTGAGCGTG
1801 TCTCCATTGA CCTCTGAGGT CACAGTCCAG CTAGATAGCT GCCATCTGGA CTTGGGGCCC
1861 GAAGGGGACA TC-GTGGAACT CATCCAGAGC CGAACAGCCA AGGGCAGCTG TGTGACCTTG
1921 CTGTCTCCAA GCCCTGAAGG TGACCCACGC TTCAGCTTCC TCCTCCGGGT CTACATGGTG
1981 CCCACACCCA CCGCTGGCAC CCTCAGTTGC AACTTAGCTC TGCGCCCTAG CACCTTGTCC
2041 CAC-GAAGTCT ACAAGACAGT CTCCATGCGC CTGAACATCG TCAGCCCTGA CCTC-TCTC-GT
2101 AAAGGCCTTG TCCTGCCCTC TGTACTGGGT ATCACCTTTG GTGCCTTCCT GATTGGGGCC
2161 CTGCTCACAG CTGCACTCTG G'ГАСАТСTAT TCTCACACAC GTGGCCCCAG CAAGCGGGAG
222.1 CCCGTGGTGG CAGTGGCTGC CCCGGCCTCC TCTGAGAGCA GCAGTACCAA CCACAGCATG
2281 GGGAGCACCC AGAGCACCCC CTGCTCCACC AGCAGCATGG CGTAG
(SEQ ID NO: 6}
ФИГ.6
Аминокислотная последовательность ENG мыши, изоформа 2 (S-ENG)
(GenBank NM 001146350)
1 MDRGVL.PL?! TLLFVIYSFV PTTGLAERVG CDLQPVDPTR GEVTFTTSQV SEGCVAQAAN
61 AVREVHVLFL DFPGMLSHLE LTLQASKQNG TETQEVFLVL VSNKNVFVKF QAPEIPLHLA
121 YDSSLVIFQG QPRVNITVLP SLTSRKQILD WAATKGAITS IAALDDPQSI VLOLGQDPKA
181 PFLCLPEAHK DMGATLEWQP RAQTPVQSCR LEGVSGHKEA YILRILPGSE AGPRTVTVMM
241 ELSCTSGDA! LILHGPPYVS WFIDINHSMQ ILTTGEYSVK IFPGSKVKGV ELPDTPQGLI
301 AEARKLNASI VTSFVELFLV SOTSLRASSC GGVFQTTPAP WTTPPXDTC SPVLLMSLIQ
361 PKCGNQVMTL ALNKKHVQTL QCTITGLTFW DSSCQAEDTD DHLVLSSAYS SCGMKVTAHV
421 VSNEVIISFP SGSPPLRKKV QCIDMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNTIELG QQAFVQVSVS
481 PLTSEVTVQL DSCHLDLGPE GDMVELIQSR TAKGSCVTLL SPSPEGDPRF SFLLRVYMVP
541 TPTAGTLSCN LALRPSTLSQ EVYKTVSMRL NIVSPDLSG.K GLVLPSVLGI TFGAFLIGAL
601 LTAALWYIYS HTREYPKPPP HSHSXRSGPV HTTPGHTOWS L
(SEQ ID NO: 7)
ФИГ.7
Нуклеотидная последовательность, кодирующая ENG мыши, изоформу 2 (S-ENG) (GenBank NM 001146350)
361 AGCATGGACC GTGGCGTC-CT CCCTCTGCCC ATTACCCTGC TGTTTGTCAT CTATAGCTTT
421 GTACCCACAA CAGGTCTCGC AGAAAGAGTC GGCTGTGATC TACAGCCTGT GGACCCCACA
481 ACGGGTGAGC TGACGTTTAC CACCAGCCAG GTCTCCGAGG GCTGTGTAGC TCAGGCTGCC
541 AATGCTGTC-C GTGAAGTCCA CGTTCTCTTC CTGGATTTTC CCGGAATGCT GTCACATCTG
601 GAGCTGACTC TTCAGGCATC CAAGCAAAAT GGCACGGAGA CCCAGGAGGT GTTCCTGGTC
661 CTCGTTTCGA ACAAAAATGT CTTCGTGAAG TTCCAGGCCC CGGAAATCCC ATTGCACTTG
721 GCCTACGACT CCAGCCTGGT CATCTTCCAA GGACAGCCAA GAGTCAACAT CACAGTGCTA
781 CCATCCCTTA CCTCCAGGAA ACAGАТССTC GACTGGGCAG CCACCAAGGG CGCCATCACC
841 TCGATAGCAG CACTGGATGA CCCCCAAAGC ATCGTCCTCC AGTTGGGCCA AGACCCAAAG
901 GCACCATTCT TGTGCTTGCC AGAAGCTCAC AAGGACATGG GCGCCACACT TGAATGGCAA
961 CCACGAGCCC AGACCCCAGT CCAAAGCTGT CGCTTGGAAG GTGTGTCTGG CCACAAGGAG
1021 GCCTACATCC TGAGGATCCT GCCAGGTTCT GAGGCCGGGC CCCGGACGGT GACCGTAATG
.1081 ATGGAACTGA GTTGCACATC TGGGGACGCC ATTCTCATCC TGCATGGTCC TCCATATGTC
1141 TCCTGGTTCA TCGACATCAA CCACAGCATG CAGATCTTGA CCACAGGTGA ATACTCCGTC
1201 AAGATCTTTC CAGGAAGCAA GGTCAAAGGC GTGC-AGCTCC CAGACACACC CCAAGGCCTG
1261 ATAGCGGAGG CCCGCAAGCT CAATGCCAGC ATTGTCACCT CCTTTGTAGA GCTCCCTCTG
1321 GTCAGCAATG TCTCCCTGAG GGCCTCCAGC TGCGGTGGTG TGTTCCAGAC CACCCCTGCA
1381 CCCGTTGTGA CCACACCTCC CAAGC-ACACA TGCAGCCCCG TGCTACTCAT GTCCCTGATC
1441 CAGCCAAAGT GTGGCAATCA GGTCATGACT CTGGCACTCA ATAAAAAACA CGTGCAGACT
1501 CTCCAGTGCA ССАТСACAGG CCTGACTTTC TGGGACTCCA GCTGCCAGGC TGAAGACACT
1561 GACGACCATC TTGTCCTGAG TAGCGCCTAC TCCAGCTGCG GCATGAAAGT GACAGCCCAT
1621 GTGGTCAGCA ATGAGGTGAT CATCAGTTTC CCGTCAGGCT CACCACCACT TCGGAAAAAG
1681 GTACAGTGCA TCGACATGGA CAGCCTCTCC TTCCAGCTGG GCCTCTACCT CAGCCCGCAC
1741 TTCCTCCAGG CATCCAACAC CATCGAACTA GGCCAGCAGG CCTTCGTACA GGTGAGCGTG
1801 TCTCCATTGA CCTCTGAGGT CACAGTCCAG CTAGATAGCT GCCATCTGGA CTTGGGGCCC
1861 GAAGGGGACA TC-GTGGAACT CATCCAGAGC CGAACAGCCA AGGGCAGCTG TGTGACCTTG
1921 CTGTCTCCAA GCCCTGAAGG TGACCCACGC TTCAGCTTCC TCCTCCGGGT CTACATGGTG
1981 CCCACACCCA CCGCTGGCAC CCTCAGTTGC AACTTAGCTC TGCGCCCTAG CACCTTGTCC
2041 CAGGAAC-TCT ACAAGACAGT CTCCATGCC-C CTGAACATCC- TCAGCCCTGA CCTGTCTC-GT
2.101 AAAGGCCTTG TCCTGCCCTC TGTACTGGGT ATCACCTTTG GTGCCTTCCT GATTGGGGCC
2151 CTGCTCACAG CTGCACTCTG GTACATCTAT TCTCACACAC GTGAGTATCC CAAGCCTCCA
2221 CCCCATTCCC ACAGCAAGCG CTCAGGGCCC GTCCACACCA CCCCGGGGCA CACCCAGTGG
2281 AGCCTCTGA
(SEQ ID NO: 8}
ФИГ.8
Аминокислотная последовательность внеклеточного домена ENG человека
ЕТУНС DLQPVGPERG EVTYTTSQVS KGCVAQAPNA ILEVHVLFLE FPTGPSQLEL TLQASKQNGT WPREVLLVLS VNSSVFLHLQ ALGIPLHLAY NSSLVTFQEP PGVNTTELPS FPKTQILEWA AERGPITSAA ELNDPQSILL RLGQAQGSLS FCMLEASQDM GRTLEWRPRT PALVRGCHLE GVAGHKEAHI LRVLPGHSAG PRTVTVKVEL SCAPGDLDAV LILQGPPYVS WLIDANHNMQ IWTTGEYSFK 1FPEKNIRGF KLPDTPQGLL G2ARMLMSI VASFVELPLA SIVSLHASSC GGRLQTSPAP IQTTPPKDTC SPELLMSLIQ TKCADDAHTL VLKKELVAHL KCTITGLTFW DPSCEAEDRG DKFVLRSAYS SCGMQVSASM ISNEAWKIL SSSSPQRKKV HCLNMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNT1EPG QQSFVQVRVS PSVSEFLLQL DSCHLDLGPE GGTV'ELIOGR AAKGNCVSLL SPSPEGDPRF SFLLHFYTVP IPKTGTLSCT VALRPKTGSQ DQEVHRTVFM RLNIISPDLS GCTSKG (SEQ ID NO:9)
ФИГ.9
Аминокислотная последовательность внеклеточного домена ENG мыши
ERVG CDLOPVDPTR GEVTFTTSQV SEGCVAQAAN
AVREVHVLFL DFPGMLSHLE LTLQASKQNG TETREVFLVL VSNKNVFVKF QAPEIPLHLA
YDSSLVIFQG QPRVNITVLP SLTSRKQILD WAATKGAITS IAALDDPQSI VLQLGQDPKA
PFLCLPEAHK DMGATLEWQP RAQTPVQSCR LEGVSGBKEA YILRILPGSE AGPRTVTVMM
ELSCTSGDAI LILHGPPYVS WFIDINHSMQ ILTTGEYSVK IFPGSKVKGV ELPDTPQGLI
AEARKLNASI VTSFVELPLV SNVSLRASSC GGVFQTTPAP WTTPPKDTC SPVLLMSLIQ
PKCGNQVMTL ALMKKHVQTL QCTITGLTFW DSSCQAEDTD DHLVLSSAYS SCGMKVTAHV
VSNEVIISFP SGSPPLRKKV QCIDMDSLSF QLGLYLSPHF LQASNTIELG QQAFVQVSVS
PLTSEVTVGL DSCHLDLGPE GDMVELIQSR TAKGSCVTLL SPSPEGDPRF SFLLRVYMVP
TPTAGTLSCN LALRPSTLSQ EVYKTVSMRL NWSPDLSGK G {SEQ ID NO: 10}
ФИГ.10
Аминокислотная последовательность домена Fc lgG1 человека
1 GGPKSCDKTH TCPPCPAPEL LG6PSVFLFP PKPKDTLMIS RTPEVTCWV DVSHEDPEVK 61 FNWYVDGVEV HNAKTKPREE QYNSTYRWS VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK 121 TISKAKGQPR EPQVYTLPPS REEMTKNQVS LTCLVKGFYP SDIAVEMESN GQPENNYKTT
181 PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ !0 NO; 11)
ФИГ.11
Аминокислотная последовательность домена Fc lgG1 человека,
укороченного с N-конца
1 ТНТСРРСРАР ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE VKFNWYVDGV
61 EVBNAKTKPR EEQYNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKALPAPI EKTISKAKGQ
121 PREPQVYTLP PSREEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG
181 SFFLYSKLTV DKSRWQQGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSPGK (SEQ 10 NO: 12)
ФИГ.12
Аминокислотная последовательность hENG(26-586)-hFc
1 MDMKRGLCC VLLLCGAVFV ЗРЩЩТУНСР LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
51 GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101 NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151 ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201 ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251 ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301 EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351 PELLMSLIQT KCADDAMTLV LKKELVAHLK CTITC-LTFWD PSCEAEDRGD
...................... ............. ....................................... ........ .......................... ..........
^01 KFVLRSAYSS CGMQVSASMI SNEAWNILS SSSPQRKKVB CLNMDSLSFQ
451 LGLYLSFHFL QASNTIEPGQ OSFVQYRVS? SVSEFLLQLD SCHLDLGPEG
501 GTVELIQGRA AKGNCVSLLS PSPEGDPRFS FLLHFYTVPI PKTGTLSCTV
551 ALRPKTGSQD QEVHRTVFMR LNIISPDLSG CTSKC-№C-P KSCDKTHTCP
601 PCPAPELLGG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVWDVS HEDPEVKFNW
651 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRWSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA
701 LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI
751 AVEWESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV
801 MHEALHNHYT QKSLSLSPGK
(SEQ ID NO: 16)
ФИГ.13
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-586)-hFc
i ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CClGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG
101 TGGGCCCCGA GAGGGACGAG GTGACATATA CCACTAGCCA GGTCTCGAAG
GGCTGCGTGG__^TCAG_GCCjCC^
201 CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CGTCACAGCT GGAGCTGACT CTCCAGGCAT
CCAAGCAAAA TGGCACCTGG CCCCGAGAGG TGCTTCTGGT CCTCAGTGTA
3 0 i AA_CjySjC_AGT^
GGCCTACA^T TCCAGCOT'GG TCACCTTCC & AGAGCCCCCG GGGGTCAACA
401 CCACAGAGCT GCCATCCTTC CCCAAGACCC AGATCCTTGA GTGGGCAGCT
501 CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC TGCATGCTGG AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
60 i G.CCTTGGT_C_C^^
Г'"> й.Л'ЬгТ1Л,Л"Г'"' ЪГ'ТФР'^Т-СР ллрг'ллллтп лллл^ллрлл рлльрллфЛй
701 CGGTGAAGGT GGAACTGAGC TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC
л ФрлгрррАР Г1 crnppnpppmji .irmpmn/imn/i (tm)/i > фрг> ,\ rip РРЛ АРРЛ''1 Л Л
801 CATGCAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC TTTCCAGAGA AAAACATTCG TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTGGGG 90 i GAGGCCCGGA TGC'ICAATGC CAGCATTGTG GCATCCTTCG TGGAGCTACC
1001 AGACCTCACC CGCACCGATC CAGACCACTC CTCCCAAGGA CACTTGTAGC
CCGGAGCTGC TCATGTCCTT GATCCAGACA AAGTGTGCCG ACGACGCCAT 1101 GACCCTGGTA CTAAAGAAAG AGCTTGTTGC GCATTTGAAG TGCACCATCA
CGGGCCTGAC CTTCTGGGAC CCCAGCTGTG AGGCAGAGGA CAGGGGTGAC 1201 AAGTTTGTCT TGCGCAGTGC TTACTCCAGC TGTGGCATGC AGGTGTCAGC
AAGTATGATC AGCAATGAGG CGGTGGTCAA TATCCTGTCG AGCTCATCAC 1301 CACAGCGGAA AAAGGTGCAC TGCCTCAACA TGGACAGCCT CTCTTTCCAG
CTGGGCCTCT ACCTCAGCCC ACACTTCCTC CAGGCCTCCA ACACCATCGA 14 0 i GCCGGGGCA
AGTTCCTGCT CCAGTTAGAC AGCTGCCACC TGGACTTGGG GCCTGAGGGA 1501 G^CAC^GTG^...AACTCMCCA..G
1601 ACTTCTACAC AGTACCCATA CCCAAAACCG GCACCCTCAG CTGCACGGTA GCCCTGCGTC CCAAGACCGG GTCTCAAGAC CAGGAAGTCC ATAGGACTGT l/0i CTTCATGCGC TTGAACATCA TCAGCCCTGA CCTGTCTGGT TGCACAAGCA
AAGGC|ACCGG~alGGTGGACCC AAATCTTGTG ACAAAACTCA CACATGCCCA 1801 CCGTGCCCAG CACCTGAACT CCTGGGGGGA CCGTCAGT'CT TCCTCTTCCC CCCAAAACCC AAGGACACCC TCATGATCTC CCGGACCCCT GAGGTCACAT
ФИГ.14
1901 GCGTGGTGGT GGACGTGAGC
TACGTGGACG GCGTGGAGGT 2001 GCAGTACAAC AGCACGTACC
AGGACTGGCT GAATGGCAAG 2.101 CTCCCAGCCC CCATCGAGAA
AGAACCACAG GTGTACACCC 2201 ACCAGGTCAG CCTGACCTGC
GCCGTGGAGT GGGAGAGCAA 2301 GCCTCCCGTG CTGGACTCCG
CCGTGGACAA GAGCAGGTGG 2401 ATGCATGAGG CTCTGCACAA
CCCGGGTAAA TGA
(SEQ ID NO: 17)
CACGAAGACC CTGAGGTCAA GTTCAACTGG GCATAATGCC AAGACAAAGC CGCGGGAGGA GTGTGGTCAG CGTCCTCACC GTCCTGCACC GAGTACAAGT GCAAGGTCTC CAACAAAGCC AACCATCTCC AAAGCCAAAG GGCAGCCCCG TGCCCCCATC CCGGGAGGAG ATGACCAAGA CTGGTCAAAG GCTTCTATCC CAGCGACATC TGGGCAGCCG GAGAACAACT ACAAGACСAC ACGGCTCCTT CTTCCTCTAT AGCAAGCTCA CAGCAGGGGA ACGTCTTCTC ATGCTCCGTG CCACTACACG CAGAAGAGCC TCTCCCTGTC
ФИГ.14 продолжение
Аминокислотная последовательность hENG(26-586)-hFc с укороченным
с N-конца доменом Fc
MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV
SPp]ETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF
PTGPSQLELT
LQASKQNGTW PREVLLVLSV
10.1
NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151
ERGPITSAAE LNDPOSILLR
iiGQAQGSijbF
CMLEASODM
G RTLEWRPRTP
201
ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL
RVLPGHSAGP
RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251
ILQGPPYVSW LIDANHNMQI
WTTGEYSFKI
FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301
EARMLNASIV ASFVELPLAS
IVSLHASSCG
GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351
PELLMSLIOT KCADDAMTLV
LKKELVAHLK
С TITGL 'iJ'W
D PSCEAEDRGD
401
KFVLRSAYSS CGMQVSASMI
SNEAWNILS
SSSPQRKKVfi CLNMDSLSFQ
451
LGLYLSPHFL QASNTIEPGQ QSFVQVRVSP
SVbEFLLiQL
D SCHLDLGPEG
501 GTVELIQGRA AKGNCVSLLS
PSPEGDPRFS
FLLHFYTVPI PKTGTLSCTV
551
ALRPKTGSQD QEVHRTVFMR
lNIISPDlSG
CTSKGIGGG
T HTCPPCPAPE
601 LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE
651 VHNAKTKPRE EQYNSTYRW SVLTVLHODW LNGKEYKCKV SNKALPAPIE
701 KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVSWES
751 NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF SCSVMHEALH
801 NHYTQKSLSL SPGK (SEQ ID NO: 18)
ФИГ.15
Аминокислотная последовательность mENG(27-581)-mFc
MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV
SPpjjBRVGCD
LQPVDPTRGE VTFTTSQVSE
GCVAQAANAV REVHVLFLDF
PGMLSHLELT
LQASKQNGTE TQEVFLVLVS
101
NKNVFVKFQA PEIPLHLAYD
SSLVIFQGQP
RVNITVLPSL TSRKQILDWA
151
ATKGAITSIA ALDDPQSIVL
OLGODPKAPF
LCLPEAHKDM GATLEWQPRA
201
QTPVQSCRLE GVSGHKEAYI
LRILPGSEAG
PRTVTVMMEL SCTSGDAILI
251
LHGPPYVSWF IDINHSMQIL
TTGEYSVKIF
PGSKVKGVEL PDTPQGLIAE
301
ARKLNASIVT SFVELPLVSN
VSLRASSCGG
VFQTTPAPW TTPPKDTCSP
351
VLLMSLIQPK CGNQVMTLAL
NKKHVQTLQC
TITGLTFWDS SCQAEDTDDH
401
LVLSSAYSSC GMKVTAHWS
NEVIISFPSG
SPPLRKKVQC IDMDSLSFQL
451
GLYLSPHFLQ ASNTISLGQQ
AFVQVSVSPL
TSEVTVQLDS CHLDLGPEGD
501
MVELIQSRTA KGSCVTLLSP
SPEGDPRFSF
LLRVYMVPTP TAGTLSCNLA
551
LRPSTLSQEV YKTVSMRLNI
VSPDLSGKGET
6GG|EPRVPIT QNPCPPLKEC
601
PPCAAPDLLG GPSVFIFPPK
IKDVLMISLS
PMVTCVWDV SEDDPDVQIS
651
WFVNHVEVHT AQTQTHREDY
NSTLRWSAL
PIQHQDWMSG KEFKCKVNNR
701
ALPSPIEKTI SKPRGPVRAP QVYVLPPPAE
EMTKKEPSLT CMITGFLPAE
751
IAVDWT8NGR TEQNYKNTAT
VLDSDGSYFM
YSKLRVQKST WERGSLFACS
801
WHEGLHNHL TTKTISRSLG (SEQ ID NO: 19}
ФИГ.16
Нуклеотидная последовательность, кодирующая mENG(27-581)-mFc
i ATGGATGCAA TGMGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC A^TC^'^^TT__TCGCCCj3G^G (^y_AAAGAGT____CG^ 101 TGGACCCCAC AAGGGGTGAG GTGACGTTTA CCACCAGCCA GGTCTCCGAG GGCTGTGTAG CTCAGGCTGC CAATGCTGTG CGTGAAGTCC ACGTTCTCTT
ТЛ1 ppmppxmmmm npppn ? Пф.лр tpprop jiri Л mpm РР'ЛРРФ'"> Л РФ ргрфл ,\ ррл Л гг:
CCAAGCAAAA TGGCACGGAG ACCCAGGAGG TGTTCCTGGT CCTCGTTTCG 301 AACAAAAATG TCTTCGTGAA GTTCCAGGCC CCGGAAATCC CATTGCACTT
401 TCACAGTGCT ACCATCCCTT ACCTCCAGGA AACAGATCCT CGACTGGGCA
GCCACCAAGG GCGCCATCAC CTCGATAGCA GCACTGGATG ACCCCCAAAG
50i CATCGTCCTC CAG'TTGGGCC AAGACCCAAA GGCACCATTC TTGTGCTTGC
CAGAAGCTCA CAAGGACATG GGCGCCACAC TTGAATGGCA ACCACGAGCC
601 CAGACCCCAG TCCAAAGCTG TCGCTTGGAA GGTGTGTCTG GCCACAAGGA
701 TGACCGTAAT GATGGAACTG AGTTGCACAT CTGGGGACGC CATTCTCATC
CTGCATGGTC CTCCATATGT CTCCTGGTTC ATCGACATCA ACCACAGCAT
801 GCAGATCTTG ACCACAGGTG MTACTCCGT CAAGATCTTT _CCAGGMGCA
AGGTCAAAGG CGTGGAGCTC CCAGACACAC CCCAAGGCCT GATAGCGGAG
901 GCCCGCAAGC TCAATGCCAG CATTGTCACC TCCTTTGTAG AGCTCCCTCT
рлл> рдлркдф р(рпл'> ррг> фР71 рпппптрп л р cimppppmpprp рфргрфг> р к р л
1001 CCACCCCTGC ACCCGTTGTG ACCACACCTC CCAAGGACAC ATGCAGCCCC GTGCTACTCA TGTCCCTGAT CCAGCCAAAG TGTGGCAATC AGGTCATGAC
1101 TCTGGCACTC AATAAAAAAC ACGTGCAGAC TCTCCAGTGC ACCATCACAG
рррфрлртф.-р пгг-сг!"'ьг"т-> ',с й'",лт1Г'',г <5Г''> гт^аВГЙГВР ФГ,й'"1г <вг,'"'аГР
1201 CTTGTCCTGA GTAGCGCCTA CTCCAGCTGC GGCATGAAAG TGACAGCCCA
TGTGGTCAGC AATGAGGTGA TCATCAGTTT CCCGTCAGGC ТСАССАССАС 1301 TTCGGAAAAA GGTACAGTGC ATCGACATGG ACAGCCTCTC CTTCCAGCTG
GGCCTCTACC TCAGCCCGCA CTTCCTCCAG GCATCCAACA CCATCGAACT 1401 AGGCCAGCAG GCCTTCGTAC AGGTGAGCGT GTCTCCATTG ACCTCTGAGG
TCAjCAGTCCA_GCTA5ATAj3C^ 1501 ATGGTGGAAC TCATCCAGAG CCGAACAGCC AAGGGCAGCT GTGTGACCTT
GCTGTCTCCA AGCCCTGAAG GTG &CCCACG CTTCAGCTTC CTCCTCCGGG 1601 ^',Q^Aj2^
CTGCGCCCTA GCACCTTGTC CCAGGAAGTC TACAAGACAG TCTCCATGCG 1701 CCTGAACATC GTCAGCCCTG ACCTGTCTGG -'AAAGGCACC GGTGGGGGTjG
AGCCCAGAGT GCCCATAACA CAGAACCCCT GTCCTCCACT CAAAGAGTGT 1801 CCCCCATGCG CAGCTCCAGA CCTCTTGGGT GGACCATCCG TCTTCATCTT
CCCTCCAAAG ATCAAGGATG TACTCATGAT CTCCCTGAGC CCCATGGTCA
ФИГ.17
1901 CATC-TGTGGT GGTGGATGTG AC-CGAC-GATG ACCCAGACGT CCAGATCAGC
TGGTTTGTGA ACAACGTGGA AGTACACACA GCTCAGACAC AAACCCATAG 2001 AGAGGATTAC AACAGTACTC TCCGGGTGGT CAGTGCCCTC CCCATCCAGC
ACCAGGACTG GATGAGTGGC AAGGAGTTCA AATGCAAGGT CAACAACAGA 2101 GCCCTCCCAT CCCCCATCGA GAAAACCATC TCAAAACCCA GAGGGCCAGT
AAGAGCTCCA CAGGTATATG TCTTGCCTCC ACCAGCAGAA GAGATGACTA 2201 AGAAAGAGTT CAGTCTGACC TGCATGATCA CAGGCTTCTT ACCTGCCGAA
ATTGCTGTGG ACTGGACCAG CAATGGGCGT ACAGAGCAAA ACTACAAC-AA 2301 CACCGCAACA GTCCTGGACT CTGATGGTTC TTACTTCATG TACAGCAAGC
TCAGAGTACA AAAGAGCACT TGGGAAAGAG GAAGTCTTTT CGCCTGCTCA 2401 GTGGTCCACC- AGGGTCTGCA CAATCACCTT ACGACTAAGA CCATCTCCCC-
GTCTCTGGGT AAATGA
(SEQ ID NO: 20)
ФИГ.17 продолжение
Высокоаффинное связывание hENG(26-586)-hFc с ВМР-9
S.1 10: - s 8^
? се
н- 4..j
2" Q--2" -4-
¦100
300
Время (с)
ФИГ.18
! s i s i ! i s
100 200 300 400
500
700
со со
Высокоаффинное связывание hENG(26-586)-hFc с ВМР-10
?20: ,?15:
10:
о о о
-100
100
200 300
Время (с)
ФИГ.19
400
500
600
700
Эффект растворимого внеклеточного домена ENG человека, hENG(26-586), в отношении связывания ВМР-9 с ALK1
35301 251 20Н 15
Без hENG(26-586)
ICffi=9.7
о> 101 со f' / J ,/
I / f У
> ; 5:1 hENG(26-586):BMP-9
200
400
600
Время (с)
ФИГ.20
Эффект растворимого внеклеточного домена ENG человека, hENG(26-586), в отношении связывания ВМР-10 с ALK1
5у 30
1б 25-
Без hENG(26-586)
iW4w
1СЯ=6.3
20 151 10 5
/-^-•..4..,,...^,V,A^
5:1 hENG(26-586):BMP-10
200 400
Время (с)
600
800
ФИГ.21
Эффект mENG(27-581)-hFC в отношении образования тяжа эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) в культуре
1.2'
1.С
.1,0.8-
? 0.6-
^0.4-
0.2
Без mENG ECGS ECGS+ обработки (27-581)-hFc mENG(27-581)-hFc
ФИГ.22
mENG(27-581)-hFC ингибирует ангиогенеза, стимулируемого VEGF, в анализе САМ
90'
°- 80
8 70 > <
? 60 1 50
m о
§ зо
5 20
Наполнитель VEGF
ФИГ.23
VEGF+ mENG(27-581)-hFc
Эффект mENG(27-581)-hFC в отношении ангиогенеза, стимулируемого факторами
роста, в анализе ангиореактора мыши
Без GF + GF+ GF +
Наполнитель Наполнитель mENG(27-581)-mFc
ФИГ.24
Схематическое сравнение выбранных укороченных конструкций hENG
BMP9/BMP10
Домен ZP Связывание с
Орфанный домен м.конец с.конец hFc
359 378
34g
360
457
Аминокислотная последовательность hENG(26-437)-hFc
MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPpAIETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101
NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151
ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201
ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251
ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301
EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351
PELLMSLIQT KCADDAMTLV LKKELVAHLK CTITGLTFWD PSCEAEDRGD
401 KFVLRSAYSS CGMOVSASMI SNEAWNILS SSSPQR№3 PKSCDKTHTC
451 PPCPAPELLG GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCWVDV SHSDPEVKFN
501 WYVDGVEVHN AKTKPREEQY NSTYRVVSVL TVLHQDWLHG KEYKCKVSNK
551 ALPAPIEKTI SKAKGQPRE? QVYTLPPSRE EMTKNQVSLT CLVKGFYPSD
601 IAVEWSSNGO PENNYKTTP? VLDSDGSFFL YSKLTVDKSR WQQGNVFSCS
651 VMHSALHNHY TQKSLSLSPG К (SEQ ID NO: 21)
ФИГ.26
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-437)-hFc
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG
101 TGGGCCCCGA GAGGGACGAG GTGACATATA CCACTAC-CCA GGTCTCGAAG GGCTGCGTGG CTCAGGCCCC CAATGCCATC CTTGAAGTCC ATGTCCTCTT 201 CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CGTCACAGCT GGAGCTGACT CTCCAGGCAT
:CAAGCAAAA 'IGGCACCTGG CCCCGAGAGG TGCTTCTGGT CCTCAGTGTA 01 AACAGCAGTG TCTTCCTGCA TCTCCAGGCC CTGGGAATCC CACTGCACTT
GGCCTACAAT TCCAGCCTGG TCACCTTCCA AGAGCCCCCG GGGGTCAACA
01 CCACAGAGCT GCCATCCTTC CCCAAGACCC AGATCCTTGA GTGGGCAGCT
501 CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC TGCATGCTGG AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
601 GCCTTGGTCC GGGGCTGCCA CTTC-GAAGGC GTGGCCGGCC ACAAGC-AGGC
GCACATCCTG AGGGTCCTGC CGGGCCACTC GGCCGGGCCC CGGACGGTGA 701 CGGTGAAGGT GGAACTGAGC TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC
ATCCTGCAGG GTCCCCCCTA CGTGTCCTGG CTCATCGACG CCAACCACAA 301 CATGCAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC TTTCCAGAGA
AAAACATTCG TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTGGGG 901 GAGGCCCGGA TGCTCAATGC CAGCATTGTG GCATCCTTCG TGGAGCTACC
GCTGGCCAGC ATTGTCTCAC TTCATGCCTC CAC-CTGCGGT GGTAGGCTGC 001 AGACCTCACC CGCACCGATC CAGACCACTC CTCCCAAGGA CACTTGTAGC
CCGGAGCTGC TCATGTCCTT GATCCAGACA AAGTGTGCCG ACGACGCCAT 101 GACCCTGGTA CTAAAGAAAG AGCTTGTTGC GCATTTGAAG TGCACCATCA
CGGGCCTGAC CTTCTGGGAC CCCAGCTGTG AGGCAGAGGA CAGGGGTGAC 201 AAGTTTGTCT TGCGCAGTGC TTACTCCAGC TGTGGCATGC AGGTGTCAGC
AAGTATGATC AGCAATGAGG CGGTGGTCAA TATCCTGTCG AGCTCATCAC
301 CACAGCGGj &C CGGTfcGTGGA CCCAAATCTT GTGACAAAAC TCACACATGC CCACCGTGCC CAGCACCTGA ACTCCTGGGG GGACCGTCAG TCTTCCTCTT
401 CCCCCCAAAA CCCAAGGACA CCCTCATGAT CTCCCGGACC CCTGAGGTCA
CATGCGTGGT GGTGGACGTG AGCCACGAAG ACCCTGAGGT CAAGTTCAAC 501 TGGTACGTGG ACGGCGTGGA GGTGCATAA? GCCAAGACAA AGCCGCGGGA
GGAGCAGTAC AACAGCACGT ACCGTGTGGT CAGCGTCCTC ACCGTCCTGC 601 ACCAGGACTG GCTGAATGGC AAGC-AGTACA AGTGCAAGGT CTCCAACAAA
GCCCTCCCAG CCCCCATCGA GAAAACCATC TCCAAAGCCA AAGGGCAGCC 701 CCGAGAACCA CAGGTGTACA CCCTGCCCCC ATCCCGGGAG GAGATGACCA
AGAACCAGGT CAGCCTGACC TGCCTGGTCA AAGGCTTCTA TCCCAGCGAC 801 ATCGCCGTGG AGTGGGAGAG CAATGGGCAG CCGGAGAACA ACTACAAGAC
CACGCCTCCC GTGCTGGACT CCGACGGCTC CTTCTTCCTC TATAGCAAGC 901 TCACCGTGGA CAAGAGCAGG TGGCAGCAGG GGAACGTCTT CTCATGCTCC
GTGATGCATG AGGCTCTGCA CAACCACTAC ACGCAGAAGA GCCTCTCCCT 001 GTCCCCGGGT AAATGA
(SEQ ID NO: 22)
ФИГ.27
Аминокислотная последовательность hENG(26-378)-hFc
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SP№TVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
51 GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101 NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151 ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201 ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251 ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301 EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351 PELLMSLIQT KCADDAMTLV LKKELVATG6 GTBTCPPCPA PELLGGPSVF
401 LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP
451 REEQYNSTYR WSVLTVLHQ DWLNGKEYKC KVSNKALPAP IEKTISKAKG
501 OPRSPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDIAVEW ESNGQPENNT
551 KTTPPVLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHSA LHNHYTQKSL
601 SLSPGK
{SEQ ID NO: 23}
ФИГ.28
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-378)-hFc
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC AGTCTTCGTT
61 TCGCCCGGCG CCGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG TGGGCCCCGA GAGGGACGAG
121 GTGACATATA CCACTAGCCA GGTCTCGAAG GGCTGCGTGG CTCAGGCCCC CAATGCCATC
131 CTTGAAGTCC ATGTCCTCTT CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CGTCACAGCT GGAGCTGACT
241 CTCCAGGCAT CCAAGCAAAA TGC-CACCTGG CCCCGAGAGG TGCTTCTGGT CCTCAGTGTA
301 AACAGCAGTG TCTTCCTGCA TCTCCAGGCC CTGGGAATCC CACTGCACTT GGCCTACAAT
361 TCCAGCCTGG TCACCTTCCA AGAGCCCCCG GGGGTCAACA CCACAGAGCT GCCATCCTTC
421 CCCAAGACCC AC-ATCCTTGA GTC-GGCAGCT GAGAGGGGCC CCАТСACCTC TGCTGCTGAG
481 CTGAATGACC CCCAGAGCAT CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC
541 TGCATGCTGG AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
601 C-CCTTGGTCC GC-GGCTGCCA CTTGGAAGGC GTGC-CCGC-CC ACAAGGAGGC GCACATCCTG
661 AGGGTCCTGC CGGGCCACTC GGCCGGGCCC CGGACGGTGA CGGTGAAGGT GGAACTGAGC
721 TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC ATCCTGCAGG GTCCCCCCTA CGTGTCCTGG
781 CTCATCGACG CCAACCACAA CATGCAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC
841 TTTCCAGAGA AAAACATTCG TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTGGGG
9 01 GAGjGCCCGGA..^
961 ATTGTCTCAC TTCATC-CCTC CAC-CTGCGGT GGTAGGCTGC AGACCTCACC CGCACCGAT'C
1021 CAGACCACTC CTCCCAAGGA CACTTGTAGC CCGGAGCTGC TCATGT'CCTT GATCCAGACA
1081 AAGTGTGCCG ACGACGCCAT GACCCTGGTA CTAAAGAAAG AGCTTGTTGC QACCGGTGGT
1141 .GGAACTCACA CATGCCCACC GTGCCCAGCA CCTGAACTCC TGGGGGGACC GTCAGTCTTC 1201 CTCTTCCCCC CAAAACCCAA GGACACCCTC ATGATCTCCC GGACCCCTGA GGTCACATGC 1261 GTGGTGGTGG ACGTGAGCCA CGAAGACCCT GAGGTCAAGT TCAACTGGTA CGTGGACGGC 1321 C-TGGAGGTC-C ATAATC-CCAA GACAAAC-CCG CGGC-AGGAGC AGTACAACAG CACGTACCGT 1381 GTGGTCAGCG TCCTCACCGT CCTGCACCAG GACTGGCTGA ATGGCAAGGA GTACAAGTGC 1441 AAGGTCTCCA ACAAAGCCCT CCCAGCCCCC ATCGAGAAAA CCATCTCCAA AGCCAAAGGG 1501 CAGCCCCGAG AACCACAGGT GTACACCCTG CCCCCATCCC GGGAGGAGAT GACCAAGAAC 1561 CAGGTCAGCC TGACCTGCCT GGTCAAAGGC TTCTATCCCA GCGACATCGC CGTGGAGTGG 1621 GAGAGCAATG GGCAGCCGGA GAACAACTAC AAGACCACGC CTCCCGTGCT GGACTCCGAC 16 В1 GGCTCCTTCT TCCTCTATAG CAAGCTCACC GTGGACAAGA GCAGGTGGCA GCAGGGGAAC 1741 GTCTTCTCAT GCTCCGTGAT GCATGAGGCT CTGCACAACC ACTACACGCA GAAGAGCCTC 1801 TCCCTGTCCC CGGGTAMTG A (SEQ ID NO: 24)
ФИГ.26
Аминокислотная последовательность hENG(26-359)-hFc
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPp &ETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
51 GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101 NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151 ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201 ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251 ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301 EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351 PELLMSLITG GGPKSCDKTE TCPPCPAPEL LGGPSVFLFP PKPKDTLMIS
401 RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HMAKTKPREE QYNSTYRWS
451 VLTVLHQDWL NGKEYKCKVS NKALPAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPS
501 REEMTKNOVS LTCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF
551 FLYSKLTVDK SRWOQGNVFS CSVMHEALHN HYTQKSLSLS PGK
(SEQ ID NO: 25)
ФИГ.30
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-359)-hFc
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAC-G GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC
AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG
101 TGGGCCCCGA GAGCGACCAG GTGACATATA CCACTAGCCA GGTCTCGAAG
GGCTGCGTGG CTCAGGCCCC CAATGCCATC CTTGAAGTCC ATGTCCT'CTT
201 CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CGTCACAGCT GGAGCTGACT CTCCAGGCAT
CCAAGCAAAA TGGCACCTGG CCCCGAGAGG TGCTTCTGGT CCTCAGTGTA
301 AACAGCAGTG TCTTCCTGCA TCTCCAGGCC CTGGGAATCC CACTGCACTT
GGCCTACAAT TCCAGCCTGG TCACCTTCCA AGAGCCCCCG GGGGTCAACA
401 CCACAGAGCT GCCATCCTTC CCCAAGACCC AGATCCTTGA GTGGGCAGCT
GAGAGGGGCC CCATCACCTC TGCTGCTGAG CTGAATGACC CCCAGAGCAT
501 CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC TGCATGCTGG
AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
601 GCCTTGGTCC GGGGCTGCCA CTTGGAAGGC GTGGCCGGCC ACAAGGAGGC
GCACATCCTG AGGGTCCTGC CGGGCCACTC GGCCGGGCCC CGGACGGTGA
701 CGGTGAAGGT GGAACTC-AGC TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC
ATCCTGCAGG GTCCCCCCTA CGTGTCCTGG CTCATCGACG CCAACCACAA
801 CATGCAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC TTTCCAGAGA
AAAACATTCC- TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTGGGG
901 GAGGCCCGGA TGCTCAATGC CAGCATTGTG GCATCCTTCG TGGAGCTACC
GCTGGCCAGC ATTGTCTCAC TTCATGCCTC CAGCTGCGGT GGTAGGCTGC
1001 AGACCTCACC CGCACCC-ATC CAGACCACTC CTCCCAAGGA CACTTGTAGC
CCGGAGCTGC TCATGTCCTT GATC &CCGGTj GGTGGACCCA AATCTTGTGA
1101 CAAAACTCAC ACATGCCCAC CGTGCCCAGC ACCTGAACTC CTGGGGGGAC
CGTCAC-TCTT CCTCTTCCCC CCAAAACCCA AGGACACCCT CATGATCTCC
1201 CGGACCCCTG AGGTCACATG CGTGGTGGTG GACGTGAGCC ACGAAGACCC
TGAGGTCAAG TTCAACTGGT ACGTGGACGG CGTGGAGGTG CATAATGCCA
1301 AGACAAAGCC GCGGGAGGAG CAGTACAACA GCACGTACCG TGTGGTCAGC
GTCCTCACCG TCCTGCACCA GGACTGGCTG AATGGCAAGG AGTACAAGTG
1401 CAAGGTCTCC AACAAAGCCC TCCCAGCCCC CATCGAGAAA ACCATCTCCA
AAGCCAAAGG GCAGCCCCGA GAACCACAGG TGTACACCCT GCCCCCATCC
1501 CGGGAGGAGA TGACCAAGAA CCAGGTCAGC CTGACCTGCC TGGTCAAAGG
CTTCTATCCC AGCGACATCG CCGTGGAGTG GGAGAGCMT GGGCAGCCGG
1601 AGAACAACTA CAAGACCACG CCTCCCGTGC TGGACTCCGA CGGCTCCTTC
TTCCTCTATA GCAAGCTCAC CGTGGACAAG AGCAGGTGGC AGCAGGGGAA
1701 CGTCTICTCA TGCTCCGTGA TGCATGAGGC TCTGCACAAC CACTACACGC
AGAAGAGCCT CTCCCTGTCC CCGGGTAAAT GA
(SEQ ID NO; 26)
ФИГ.31
Аминокислотная последовательность hENG(26-359)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc
MDAMKRGLCC
VLLLCGAVFV
SPSMlETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
GCVAQAPNAI
LEVHVLFLEF
PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101
NSSVFLHLQA
LGIPLHLAYN
SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151
ERGPITSAAE
LNDPQSILLR
LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201
ALVRGCHLEG
VAGHKEAHIL
RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251
ILQGPPYVSW
LIDANHNMQI
WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301
EARMLNASIV
ASFVELPLAS
IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPKDTCS
351 PELLMSLI.TS GGTJBTCPPCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT
401 CVWDVSHED PEVKFNWYVD GVEVHNAKTK PREEOYNSTY RVVSVLTVLH
451 QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSREEMTK
501 NOVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL
551 TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 27)
ФИГ.32
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-359)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GT'GCTGCTGC TGTGTGGAGC
AGTCTTCGTT TCGCCCGGCG CCGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG
101 TGGGCCCCGA GAGGGACGAG GTGACATATA CCACTAGCCA GGTCTCGAAG
GGCTGCGTGG CTCAGGCCCC CAATGCCATC CTTGAAGTCC ATGTCCTCTT
201 CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CGTCACAGCT GGAGCTGACT CTCCAGGCAT
CCAAGCAAAA TGGCACCTGG CCCCGAGAGG TGCT'TCTGGT CCTCAGTGTA
301 AACAGCAGTG TCTTCCTGCA TCTCCAGGCC CTGGGAATCC CACTGCACTT
GGCCTACAAT TCCAGCCTGG TCACCTTCCA AGAGCCCCCG GGGGTCAACA
401 CCACAGAGCT GCCATCCTTC CCCAAGACCC AGATCCTTGA GTGGGCAGCT
GAGAGGGGCC CCATCACCTC TGCTGCTGAG CTGAATGACC CCCAGAGCAT
501 CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC TGCATGCTGG
AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
601 GCCTTGGTCC GGGGCTGCCA CTTGGAAGGC GTGGCCGGCC ACAAGGAGGC
GCACATCCTG AGGGTCCTGC CGGGCCACTC GGCCGGGCCC CGGACGGTGA
701 CGGTGAAGGT GGAACTGAGC TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC
ATCCTGCAGG GTCCCCCCTA CGTGTCCTGG CTCATCGACG CCAACCACAA
S01 CATC-CAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC TTTCCAGAGA
AAAACATTCG TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTGGGG
901 GAGGCCCGGA TGCTCAATGC CAGCATTGTG GCATCCTTCG TGGAGCTACC
1001 AGACCTCACC CGCACCGATC CAGACCACTC CTCCCAAGGA CACTTGTAGC
CCGGAGCTGC TCATGTCCTT GATCACCGGT GG'TGGAIACTC ACACATGCC
1101 ACCGTGCCCA GCACCTGAAC TCCTGGGGGC- ACCGTCAGTC TTCCTCTTCC
CCCCAAAACC CAAGGACACC CTCATGATCT CCCGGACCCC T'GAGGTCACA
1201 TGCGTGGTGG TGGACGTGAG CCACGAAGAC CCTGAGGTCA AGTTCAACTG
GTACGTGGAC GGCGTGGAGG TGCATAATGC CAAGACAAAG CCGCGGGAGG
1301 AGCAGTACAA CAGCACGTAC CGTGTGGTCA GCGTCCTCAC CGTCCTGCAC
CAGGACTGGC TGAATGGCAA GGAGTACAAG TGCAAGGTCT CCAACAAAGC
1401 CCTCCCAGCC CCCATCGAGA AAACCATCTC CAAAGCCAAA GGGCAGCCCC
GAGAACCACA GGTGTACACC CTGCCCCCAT CCCGGGAGGA GATGACCAAG
1501 AACCAGGTCA GCCTGACCTG CCTGGTCAAA GGCTTCTATC CCAGCGACAT
CGCCGTGC-AG TGGGAGAGCA ATGGGCAGCC GGAGAACAAC TACAAGACCA
1601 CGCCTCCCGT GCTGGACTCC GACGGCTCCT TCTTCCTCTA TAGCAAGCTC
ACCGTGGACA AGACCAGCIG GCAGCAGGGG AACGTCTTCT CATGCTCCGT
1701 GATGCATGAG GCTCTGCACA ACCACTACAC GCAGAAGAGC CTCTCCCTGT
CCCCGGGTAA ATGA
(SEQ ID NO; 28)
ФИГ.ЗЗ
Аминокислотная последовательность hENG(26-346)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc
1 MDAMKRGLCC VLLLCGAVFV SPGAETVHCD LQPVGPERDE VTYTTSQVSK
51 GCVAQAPNAI LEVHVLFLEF PTGPSQLELT LQASKQNGTW PREVLLVLSV
101 NSSVFLHLQA LGIPLHLAYN SSLVTFQEPP GVNTTELPSF PKTQILEWAA
151 ERGPITSAAE LNDPQSILLR LGQAQGSLSF CMLEASQDMG RTLEWRPRTP
201 ALVRGCHLEG VAGHKEAHIL RVLPGHSAGP RTVTVKVELS CAPGDLDAVL
251 ILQGPPYVSW LIDANHNMQI WTTGEYSFKI FPEKNIRGFK LPDTPQGLLG
301 EARMLNASIV ASFVELPLAS IVSLHASSCG GRLQTSPAPI QTTPPTGGGjT
351 HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV
401 KFN1YVDGVE VHKAKTKPRE EQYNSTYRVV SVLTVLHODW LNGKEYKCKV
451 SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SREEMTKNQV SLTCLVKGFY
501 PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD KSRWQQGNVF
551 SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK
(SEQ ID NO: 29}
ФИГ.34
Нуклеотидная последовательность, кодирующая hENG(26-346)-hFc с укороченным с N-конца доменом Fc
1 ATGGATGCAA TGAAGAGAGG GCTCTGCTGT GTGCTGCTGC TGTGTGGAGC AGTCTTCGTT
61 TCGCCCGGCG CCJGAAACAGT CCATTGTGAC CTTCAGCCTG TGGGCCCCGA GAGGGACGAG
121 GTGACATATA CCACTAGCCA GGTCTCGAAG GGCTGCGTGG CTCAGGCCCC CAATGCCATC
181 CTTGAAGTCC ATC-TCCTCTT CCTGGAGTTC CCAACGGGCC CC-TCACAGCT GGAGCTGACT
241 CTCCAGGCAT CCAAGCAAAA TGGCACCTGG CCCCGAGAGG TGCTTCTGGT CCTCAGTGTA
301 AACAGCAGTG TCTTCCTGCA TCTCCACGCC CTGGGAATCC CACTGCACTT GGCCTACAAT
361 TCCAGCCTGG TCACCTTCCA AGAGCCCCCG GGGGTCAACA CCACAGAGCT GCCATCCTTC
421 CCCAAGACCC AGATCCTTGA GTGGGCAGCT GAGAGGGGCC CCATCACCTC TGCTGCTGAG
481 CTGAATGACC CCCAGAGCAT CCTCCTCCGA CTGGGCCAAG CCCAGGGGTC ACTGTCCTTC
541 TGCATGCTGG AAGCCAGCCA GGACATGGGC CGCACGCTCG AGTGGCGGCC GCGTACTCCA
601 GCCTTGGTCC GGGGCTGCCA CTTGCAAGGC GTGGCCGGCC ACAAGGAGGC GCACATCCTG
661 AGGGTCCTGC CGGGCCACTC GC-CCGGGCCC CGC-ACGC-TGA CGGTGAAGGT GGAACTGAGC
721 TGCGCACCCG GGGATCTCGA TGCCGTCCTC ATCCTGCAGG GTCCCCCCTA CGTGTCCTGG
781 CTCATCGACG CCAACCACAA CATGCAGATC TGGACCACTG GAGAATACTC CTTCAAGATC
841 TTTCCAGAGA AAAACATTCG TGGCTTCAAG CTCCCAGACA CACCTCAAGG CCTCCTC-GGG
901 GAGGCCCGGA TGCTCAATGC CAGCATTGTG GCATCCTTCG TGGAGCTACC GCTGGCCAGC
961 ATTGTCTCAC TTCATCCCTC CAGCTGCGGT GGTAGGCTGC AGACCTCACC CGCACCGATC
1021 CAGACCACTC CTCCCACCGG TGCTGCflACT CACACATGCC CACCGTGCCC AGCACCTGAA
1081 CTCCTGGGGG GACCGTCAGT CTTCCTCTTC CCCCCAAAAC CCAAGGACAC CCTCATGATC
1141 TCCCGGACCC CTGAGGTCAC ATGCGTGGTG GTGGACCTGA GCCACGAAGA CCCTGAGGTC
1201 AAGTTCAACT GGTACGTGGA CGGCGTGGAG GTGCATAATG CCAAGACAAA GCCGCGGGAG
1261 GAGCAGTACA ACAGCACGTA CCGTGTGGTC AGCGTCCTCA CCGTCCTGCA CCAGGACTGG
1321 CTGAATGC-CA AGGAC-TACAA GTGCAAGGTC TCCAACAAAG CCCTCCCAGC CCCCATCGAG
1381 AAAACCATCT CCAAAGCCAA AGGGCAGCCC CGAGAACCAC AGGTGTACAC CCTGCCCCCA
1441 TCCCGGGAGG AGATGACCAA GAACCAGGTC AGCCTGACCT GCCTGGTCAA AGGCTTCTAT
1501 CCCAGCGACA TCGCCGTGGA GTGGGAGAGC AATGGGCAGC CGGAGAACAA CTACAAGACC
1561 ACGCCTCCCG TGCTGGACTC CGACGGCTCC TTCTTCCTCT ATAGCAAGCT CACCGTGGAC
1521 AAGAGCAGGT GGCAGCAGGG GAACGTCTTC TCATGCTCCG TGATGCATGA GGCTCTGCAC
1681 AACCACTACA CGCAGAAGAG CCTCTCCCTG TCCCCGC-GTA AATGA
(SEQ ID NO: 30)
ФИГ.35
Эксклюзионная хроматограмма белков hENG-hFc после начальной очистки
hENG(26-586)-hFc
_ 1601 CD ?-140} 11120]
Ш S=iooi
Эксклюзионная хроматограмма белков hENG-hFc после начальной очистки
hENG(26-359)-hFc
^ CD
Ё 1 30
° | 20i
Л '
I \
i \ ¦ \
ь мономера
Т 9 ! 1 j ( \ ! [ 1 \ \ \ ! ! 1 \ i i J J 1 i i \ S ! 1 j S 1 i J ! 1 S [ 1 J T~
МИН
ФИГ.36В
Эксклюзионная хроматограмма белков hENG-hFc после начальной очистки
hENG(26-346)-hFc
CD =Г
О S
CD СТ
21 CD
200' 150' 100 50 0
96% мономера
/.5
~т 1 ; 1 1 s 1 j [ ! j i [ s с 1 i j 1 г~
2.5 5
I2.5
17.5
МИН
ФИГ.36С
Определение характеристик высокоаффинного связывания ВМР-9 с
вариантами hENG-hFc
¦> 0 hEng-hFc 26-586
10-
200400600
ФИГ.37А
Время (с)
Определение характеристик высокоаффинного связывания ВМР-9 с
вариантами hENG-hFc
2Ch hEng-hFc 26-359
15-
10-
200 400
Время (с)
ФИГ.37В
Определение характеристик высокоаффинного связывания ВМР-9 с
вариантами hENG-hFc
го-, hEng-hFc 26-346
200 400
Время (с)
ФИГ.37С
hENG(26-359)-hFC ингибирует ангиогенеза, стимулируемого VEGF, в анализе САМ
¦=t
> <
nz о о nz
m о
о m i- о
CD 9080 70605040302010-
V/Y, ''///
Наполнитель VEGF
VEGF+ hENG(26-359)-hFc
ФИГ.38
Эффект hENG(26-346)-hFC в отношении ангиогенеза, стимулируемого факторами
роста, в анализе ангиореактора мыши
Наполнитель Наполнитель hENG(26-346)-hFc
ЗбОп
Эффект mENG(27-581)-mFc в отношении роста опухолей молочной железы 4Т1 у мышей
CD Ю
200017501500125010007505002500-
~т~~ 17
Наполнитель
mENG(27-581)-mFc
11~
Дни после имплантации
ФИГ.40
Эффект mENG(27-581)-mFc в отношении роста опухолей Colon-26 у мышей
1800160014001200
-о-Наполнитель ,
-*-mENG(27-581)-mFd мг/кг !
-*-mENG(27-581)-mFc 10 мг/кг I
mENG(27-581)-mFc 30 мг/кг Jj
о Ю001
S 800-
§ 600
400-
200
4.00%
1 1
-О 3
о го
^ 2.00%
(70'
0.00%
Оливковое 1 масло Наполнитель
CCI4
Оливковое масло Эндоглин
ФИГ.42
PBS Эндоглин + Fc
Животные, которым вводили эндоглин-Fc, имели наименьшую процентную долю печеней с обширным положительным окрашиванием масляным красным О
ФИГ.46
Уровни щелочной фосфатазы
CCI4 I Оливковое масло Наполнитель
CCI4
Эндоглин
Оливковое масло
*р <0,05 по сравнению с наполнителем+СС1_4
ФИГ.47
Наполнитель ENG-Fc
101
101
1/43
1/43
3/43
3/43
12/43
12/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
20/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
21/43
22/43
22/43
23/43
23/43
23/43
23/43
23/43
23/43
24/43
24/43
27/43
27/43
28/43
28/43
33/43
33/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
34/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
35/43
36/43
36/43
36/43
36/43
36/43
36/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
39/43
41/43
41/43
42/43
42/43
42/43
42/43
43/43
43/43
