(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к композициям на основе двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), нацеленной на ген ALAS1, и способам применения таких композиций на основе dsRNA для изменения (например, ингибирования) экспрессии ALAS1.
2420-533174ЕА/042
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА
ALAS1 Родственные заявки
Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США № 61/887288, поданной 4 октября 2013 г., и предварительной заявки на патент США № 61/983720, поданной 24 апреля 2014 г. Полное содержание каждой из упомянутых выше заявок, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате с кодировкой ASCII и, таким образом, включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Указанная копия файла с кодировкой ASCII, созданная 2 октября 2014 г., имеет название A2038-7202WO_SL.txt, и ее размер составляет 1107486 байт.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к специфическому ингибированию экспрессии гена ALAS1.
Уровень техники
Врожденные порфирии представляют собой семейство нарушений, возникающих в результате недостаточной активности определенных ферментов в рамках пути биосинтеза гема, также называемым в данном документе порфириновым путем. Недостаточность ферментов порфиринового пути приводит к неполному образованию гема и к накоплению предшественников порфиринов и порфиринов, которые в высоких концентрациях токсичны для ткани.
Из ряда врожденных порфирий, острая перемежающаяся порфирия (AIP, например, аутосомно-доминантная AIP), вариегатная порфирия (VP, например, аутосомно-доминантная VP), наследственная копропорфирия (копропорфирия или НСР, например, аутосомно-доминантная НСР), и порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы
5'-аминолевулиновой кислоты (также известной как 8-аминолевулиновая кислота или ALA) (ADP, например, аутосомно-рецессивная ADP) классифицируются как острые печеночные порфирии и проявляются острыми неврологическими приступами, которые могут быть опасными для жизни. Острые приступы характеризуются симптомами, связанными с вегетативной, периферической и центральной нервной системы, в том числе болью в животе, гипертензией, тахикардией, запором, двигательной слабостью, параличом и судорогами. При ненадлежащем лечении может наступать квадриплегия, нарушение функции дыхания и смерть. Различные факторы, включая лекарственные средства, индуцирующие цитохромы Р450, режим питания и гормональные изменения, могут провоцировать острые приступы вследствие повышения активности синтазы 5' -аминолевулиновой кислоты печени 1 (ALAS1), первого и скорость-лимитирующего фермента пути биосинтеза гема. При острых порфириях, например, AIP, VP, НСР и ADP, недостаточность соответствующего фермента приводит к образованию и накоплению в печени одного или нескольких веществ (например, порфиринов и/или предшественников порфиринов, например, ALA и/или PBG), которые могут быть нейротоксичными и могут приводить к возникновению острых приступов. См., например, Balwani, М and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
Современная терапия острых неврологических приступов заключается во внутривенном введении гемина (пангематина(r), Lundbeck, или нормосанга(r), Orphan Europe), который предусматривает экзогенный гем для ингибирования ALAS 1 посредством отрицательной обратной связи, и, тем самым, снижает образование ALA и PBG. Гемин используют для лечения во время острого приступа и для предупреждения приступов, особенно у женщин с острыми порфириями, которые испытывают частые приступы при гормональных изменениях во время менструальных циклов. Хотя в целом у пациентов наблюдается хороший ответ на лечение, его эффект является медленным, при этом, как правило, требуется от двух до четырех дней или дольше для приведения концентраций ALA и PBG в моче к нормальным значениям. Поскольку при внутривенном введении гемин быстро метаболизируется, как правило, требуется от трех до четырех инфузий для эффективного лечения или предупреждения острого приступа. Кроме того, повторяющиеся инфузий могут вызывать перенасыщение железом и флебит, который может нарушать доступ к периферическим венам. Несмотря на то, что ортотопическая
трансплантация печени имеет лечебный эффект, эта процедура характеризуется серьезными осложнениями и смертностью, а наличие доноров печени ограничено. Таким образом, требуется альтернативный терапевтический подход, который является более эффективным, быстродействующим и безопасным. Было бы особенно предпочтительным, если бы такое лечение могло осуществляться с помощью подкожного введения, поскольку это исключило бы необходимость в инфузиях и длительной госпитализации.
AIP, также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBGD), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS), является наиболее распространенной среди острых печеночных порфирий. Распространенность AIP по оценкам составляет 5-10 на 100000, при этом приблизительно у 5-10% пациентов наблюдаются симптомы. AIP представляет собой аутосомно-доминантное нарушение, вызванное мутациями в гене HMBS, что приводит к пониженной, например, составляющей половину от нормы, активности фермента. Ранее мышиную модель АГР, характеризующуюся -30% активности HMBS дикого типа, получали с помощью гомологичной рекомбинации. Как и у пациентов-людей, у этих мышей повышается активность печеночной ALAS1 и накапливаются большие количества ALA и PBG в плазме и моче при введении порфириногенных лекарственных средств, таких как фенобарбитал. В связи с этим, они являются отличной моделью для оценки эффективности новых терапевтических средств для лечения острых печеночных порфирий.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение описывает способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления уровень экспрессии гена ALAS 1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1. Такое ингибирование может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS 1, таких как порфирий.
Соответственно, в данном документе описаны композиции и способы, которые влияют на расщепление РНК-транскриптов гена ALAS 1, опосредованное индуцируемым РНК комплексом сайленсинга (RISC), например, в клетке или у субъекта (например, у
млекопитающего, такого как человек). Также описаны композиции и способы лечения нарушения, связанного с экспрессией гена ALAS1, такого как порфирия, например, X-сцепленная сидеробластная анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса или ADP), острая перемежающаяся порфирия (AIP), врожденная эритропоэтическая порфирия (СЕР), поздняя кожная порфирия (РСТ), наследственная копропорфирия (копропорфирия, или НСР), вариегатная порфирия (VP), эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) или транзиторная эритропорфирия детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), АГР, НСР или VP. Согласно определенным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP) или АГР.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP), порфирий, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP) и гематоэритропоэтической порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, АГР, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Используемое в данном документе выражение "iRNA", "RNAi", "средство на основе iRNA", "средство для RNAi", или "молекула iRNA" относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНК-транскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1 в клетке или у млекопитающего.
Включенные в композиции iRNA, описанные в данном документе, охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, например, участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину,
который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS 1 (например, гена ALAS 1 мыши или человека) (также называемого в данном документе "iRNA, специфическая по отношению к ALAS1"). Альтернативно, или в комбинации, iRNA охватывают dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (например, варианта 1 или 2 гена ALAS1 человека) (также называемого в данном документе "iRNA, специфическая по отношению к ALAS1").
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, содержит антисмысловую нить с участком, который практически комплементарен участку ALAS1 человека. Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_000688.4 (SEQ Ш N0:1) или NM_000688.5 (SEQ Ш N0:382). Согласно вариантам осуществления ALAS1 человека имеет последовательность NM_199166.1.
Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность iRNA (например, dsRNA) нацелена на участок 871-895 (плюс или минус 5, 4, 3, 2 или 1 нуклеотид в каком-либо одном или обоих направлениях относительно 5' и/или 3' конца) транскрипта ALAS 1 NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность нацелена на нуклеотиды 871-893, 871-892 или 873-895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4. Согласно вариантам осуществления антисмысловая последовательность содержит последовательность или состоит из последовательности, которая полностью комплементарна или практически комплементарна нуклеотидам 871893, 871-892 или 873-895 транскрипта ALAS1 NM_000688.4.
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS 1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем по 3, 2 или 1 нуклеотиду от последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID N0: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ГО N0: 4154). Согласно вариантам
осуществления антисмысловая нить содержит последовательность UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID N0: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ГО N0: 4154). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ГО N0: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 в том числе одной или нескольких (например, всех) из модификаций антисмысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно одному аспекту представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS 1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности, приведенной в любой из таблиц 2140, или немодифицированного варианта антисмысловой последовательности (например, варианте с аналогичной нуклеотидной последовательностью, за исключением того, что некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы), приведенной в любой из таблиц 21-40. Согласно одному варианту осуществления антисмысловая последовательность содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от (i) антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 или (ii) немодифицированного варианта любой из этих последовательностей. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15
(например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID N0: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ГО N0: 4154). Согласно варианту осуществления антисмысловая последовательность нацелена на положения 871-893 NM_000688.4 (SEQ ГО N0:1). Согласно вариантам осуществления смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ ID NO: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA не включает смысловую и/или антисмысловую последовательность, приведенную в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS 1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами, не более чем 2 нуклеотидами или не более чем одним нуклеотидом от антисмысловой последовательности AD-60519. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем О, 1 или 2) нуклеотидами от антисмысловой последовательности AD-60489 или производного AD-60489, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-60489
модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519 или AD-60901. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления производное AD-60489 представляет собой AD-61193.
Согласно одному варианту осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 15 (например, по меньшей мере 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 или 23) смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 (например, не более чем 0, 1 или 2) нуклеотидами от производного AD-58632, описанного в данном документе. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов модифицированы, как описано в данном документе, например, один или несколько (или все) нуклеотидов AD-58632 модифицированы, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, и AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления производное AD-58632 представляет собой AD-60819.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,05 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,02 нМ. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 0,01 нМ. Согласно вариантам осуществления IC50 определяют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 10 мг/кг. Согласно некоторым вариантам
осуществления dsRNA характеризуется разовой дозой ED50 менее чем приблизительно 5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления ЕС50 определяют, как описано в данном документе в примерах.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632 и AD-60489.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419 (например, включающую нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD
60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892, или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ Ш N0: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ Ш N0: 4154), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ Ш N0: 4155). Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60519).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая
содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую последовательность, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (где смысловая и/или антисмысловая последовательность включает одну или несколько (например, все) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60819).
Согласно вариантам осуществления представлена dsRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей антисмысловой и/или смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819 показаны ниже в таблице 44.
Таблица 44: Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819
Целевые
сайты
антисмыс
ловой
последов
ательност
NM_0006 88.4
Назван ие
дуплек са
Смысловая
последовательность (5'-3''
Антисмысловая последовательность (5'-3''
Соответствующая немодифицированна я смысловая последовательность
Соответствующая немодифицированна я антисмысловая последовательность
871-893
AD-60489
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuC faUfcUfuAfL96 (SEQ ID NO: 4156)
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4157)
CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4158)
UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQ ID N0:4159)
871-893
AD-60519
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96(SEQIDNO:4160) usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUf
uUfcUfgsgsu(SEQIDNO:
4161)
CAGAAAGAGUGUCUC AUCUUAfSEQID NO: 4162)
UAAGAUGAGACACUC UUUCUGGU (SEQ ID N0:4163)
871-893
AD-61193
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfauc uuaL96(SEQIDNO:4164) usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTu UfcUfgsgsu (SEQ ID NO: 4165)
CAGAAAGAGUGUCUC
AUCUUAfSEQID NO:
4166)
UAAGAUGAGACACUC
TUUCUGGU (SEQ ID
N0:4167)
873-895
AD-60819
GfsasAfaGfaGfuGfuCfuCfauc
uuCfuuL96(SEQIDNO:
4168)
asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucu uucsusg(SEQIDNO:4169)
GAAAGAGUGUCUCAU
CUUCUU (SEQ ID NO:
4170)
AAGAAGAUGAGACAC
UCUUUCUG (SEQ ID
N0:4171)
где с, a, g, u = 2'-0Me рибонуклеозиды; Af, Cf, G, Uf = 2'F рибонуклеозиды; S = фосфотиоат; L96 имеет структуру, обозначенную в таблице 1.
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (в том числе нуклеотидной последовательности и одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой
AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819. Согласно вариантам осуществления представлена двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA представляет собой AD-60489, AD-60519 или AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489, AD-60519 или AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60489, содержит AD-60489 или состоит из AD-60489 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60489).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519, содержит AD-60519 или состоит из AD-60519 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60519).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-61193, содержит AD-61193 или состоит из AD-61193 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-61193).
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60819, содержит AD-60819 или состоит из AD-60819 (например, в том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций AD-60819).
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из таблиц 2140) является эффективной для подавления уровня mRNA ALAS1 в печени, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снижены до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня mRNA ALAS1 в печени, например, уровня у индивида, не получавшего лечение, или группы индивидов, например, индивида или группы индивидов, получавших лечение только PBS). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня mRNA ALAS1 в
печени оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления dsRNA (например, AD-60489, AD-60519, AD-61193, AD-60819 или другая dsRNA, раскрытая в данном документе в любой из таблиц 2140) является эффективной для подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, для достижения сайленсинга по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% или 80% (например, так, чтобы уровни mRNA ALAS1 снизились до 90% или менее, 80% или менее, 70% или менее, 60% или менее, 50% или менее, 40% или менее, 30% или менее или 20% или менее относительно контрольного уровня циркулирующей mRNA ALAS1, например, уровня, который наблюдался до лечения dsRNA или уровня у не получавшего лечения индивида или группы индивидов). Согласно вариантам осуществления эффективность dsRNA в отношении подавления уровня циркулирующей mRNA ALAS 1 оценивают с применением модели на низших приматах, например, описанной в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением анализа по выявлению циркулирующей внеклеточной РНК (cERD), например, как описано в данном документе или в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Способ cERD можно применять относительно любого соответствующего биологического образца. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца крови, например, образца сыворотки. Согласно вариантам осуществления уровень циркулирующей mRNA ALAS1 оценивают с применением образца мочи.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-60489, раскрытой в данном документе, например, в любой из таблиц в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA представляет собой AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA представляет собой производное AD-58632, раскрытой в данном документе, например, в любой из таблиц в данном документе. Согласно вариантам осуществления dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкое значение IC50, например, как определено на основании анализов in vitro, например, описанных в данном документе, например, в примерах.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает более низкая эффективная доза. Эффективную дозу можно определить на основе введения разовой дозы или нескольких повторяющихся доз. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе разовой дозы ED50. Согласно вариантам осуществления эффективную дозу или разовую дозу ED50 определяют на основе in vivo анализа. Согласно вариантам осуществления in vivo анализ проводят для низшего животного, например, для крысы, для низшего примата или для мыши.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, необходимой для получения снижения уровня mRNA ALAS 1 (например, уровня mRNA ALAS1 в печени и/или уровня циркулирующей mRNA ALAS1), например, как описано в данном документе в примерах. Согласно вариантам осуществления циркулирующую mRNA оценивают с применением анализа cERD.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения снижения уровня (например, уровня в моче и/или плазме) ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления эффективную дозу определяют на основе дозы, требуемой для получения конкретного лечебного эффекта, описанного в данном документе, например, предупреждения или облегчения симптомов, связанных с порфирией.
Согласно вариантам осуществления на повышенную активность указывает достижение более высокого уровня dsRNA в печени. Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в печени получают после разовой дозы dsRNA (например, дозы по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг). Согласно вариантам осуществления более высокий уровень в
печени получают после введения нескольких доз dsRNA (например, 2-10 ежедневных или еженедельных доз по 1, 2,5, 3, 5 или 10 мг/кг).
Согласно одному варианту осуществления iRNA охватывает dsRNA с нитью РНК (антисмысловой нитью), имеющей участок, который практически комплементарен части mRNA ALAS1, например, mRNA ALAS1 человека (например, mRNA ALAS1 человека, представленной под SEQ ГО N0:1 или SEQ ГО N0:382).
Согласно одному варианту осуществления iRNA для ингибирования экспрессии гена ALAS1 включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. iRNA включает смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью. Антисмысловая нить включает нуклеотидную последовательность, которая практически комплементарна по меньшей мере части mRNA, кодирующей транскрипт ALAS 1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, и по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину. Как правило, iRNA составляет 19-24 нуклеотида в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 19-21 нуклеотид в длину и находится в липидном составе, например, составе на основе липидных наночастиц (LNP) (например, составе LNP11).
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет 21-23 нуклеотида в длину и находится в форме конъюгата, например, конъюгата с одним или несколькими производными GalNAc, описанными в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 15 до приблизительно 25 нуклеотидов в длину, и согласно другим вариантам осуществления iRNA составляет от приблизительно 25 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину. iRNA, нацеленная на ALAS1, при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35% или по меньшей мере на 40% или более, например, при анализе с помощью способа, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления
iRNA, нацеленная на ALAS 1, составлена как компонент стабильной частицы нуклеиновая кислота-липид (SNALP).
Согласно одному варианту осуществления iRNA (например, dsRNA), описанная в данном документе, включает первую последовательность dsRNA, которую выбирают из группы, состоящей из смысловых последовательностей из таблиц 21 -40, и вторую последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей из таблиц 21-40.
Молекулы iRNA, описанные в данном документе, могут включать встречающиеся в природе нуклеотиды или могут включать по меньшей мере один модифицированный нуклеотид. Согласно вариантам осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает одну или несколько из модификаций нуклеотида, выбранных из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтила, 2'-0-алкила, 2'-0-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси, 2'-гидроксила или любой их комбинации. Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один модифицированный нуклеотид включает без ограничения 2'-0-метил-модифицированный нуклеотид, 2'-фтор-модифицированный нуклеотид, нуклеотид с 5'-фосфотиоатной группой, и концевой нуклеотид, связанный с лигандом, например, N-ацетилгалактозамином (GalNAc) или производным холестерила. Альтернативно, модифицированный нуклеотид можно выбрать из группы: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'-амино-модифицированного нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания. Такая модифицированная последовательность может быть основана, например, на первой последовательности упомянутой iRNA, выбранной из группы, состоящей из смысловых последовательностей, раскрытых в таблицах 21 -40, и второй последовательности, выбранной из группы, состоящей из соответствующих антисмысловых последовательностей, раскрытых в таблицах 21-40.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, нацелена на вариант РНК-транскрипта ALAS 1 дикого типа, и согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на мутантный транскрипт (например, РНК ALAS 1, несущей аллельный вариант). Например, iRNA, описанная в настоящем изобретении, может быть нацелена на полиморфный вариант, такой как однонуклеотидный полиморфизм (SNP) ALAS 1. Согласно другому варианту осуществления iRNA нацелена на транскрипт ALAS 1 как дикого, так и мутантного типа. Согласно еще одному варианту осуществления iRNA нацелена на конкретный вариант транскрипта ALAS1 (например, вариант 1 ALAS1 человека). Согласно еще одному варианту осуществления средство на основе iRNA нацелено на несколько вариантов транскриптов (например, как вариант 1, так и вариант 2 ALAS1 человека).
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном изобретении, нацелена на некодирующий участок РНК-транскрипта ALAS1, такой как 5' или 3' нетранслируемый участок транскрипта.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, описанная в данном документе, находится в форме конъюгата, например, углеводного конъюгата, который может выполнять роль целевого фрагмента и/или лиганда, описанного в данном документе. Согласно одному варианту осуществления конъюгат присоединен к 3'-концу смысловой нити dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат присоединен с помощью линкера, например, с помощью двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Такой конъюгат также называется в данном документе конъюгат GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат нацеливает средство для RNAi на конкретную клетку, например, клетку печени, например, гепатоцит. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно конкретным вариантам осуществления конъюгат представляет собой
I JQH
\J3
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, например, линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой О. Согласно некоторым вариантам осуществления X представляет собой S.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в таблице 1 и показано ниже.
GalNAc с тремя разветвлениями
С он он
ноЛ^-т-Л^-0
" AcHN
он он
О. и
АсНоМнон ° I 9J I
трдос-Фтндроксяпролннол
А
но.
Сайт tottt.tor.-mim
AcHN
Линкер: С12-дикарбоновая кислота
Согласно одному варианту осуществления dsRNA характеризуется одним, двумя, тремя, четырьмя, пятью, шестью, семью, восемью, девятью, десятью, одиннадцатью, двенадцатью, тринадцатью, четырнадцатью, пятнадцатью, шестнадцатью или всем из следующего:
(i) синтезирована химическим путем, например, синтезирована с помощью твердофазного синтеза олигонуклеотидов;
(ii) все нуклеотиды в dsRNA модифицированы, например, все нуклеотиды являются 2'-ОМе или 2'-Б-модифицированными, или представляют собой комбинацию из 2'-ОМе и 2'-Б-модифицированных;
(ш) все нуклеотиды связаны 3'-5' фосфодиэфирными связями;
(iv) смысловая нить содержит 21 нуклеотид или состоит из 21 нуклеотида;
(v) антисмысловая нить содержит 23 нуклеотида или состоит из 23 нуклеотидов;
(vi) имеет тупой конец на 3'-конце смысловой нити;
(vii) имеет 3'-выступающий конец, например, имеет выступающий конец из двух нуклеотидов, на 3' -конце антисмысловой нити;
(viii) присоединена ковалентными связями к лиганду, содержащему три фрагмента N-ацетилгалактозамина (GalNAc);
(ix) 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (например, называемым в данном документе L96, как определено в таблице 1). Согласно одному варианту осуществления З'-конец присоединен к фрагменту GalNAc с тремя разветвлениями при помощи фосфодиэфирной связи;
(x) имеет антисмысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, четыре) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и на 5' конце антисмысловой нити. Согласно одному варианту осуществления две фосфотиоатные связи расположены на 3' конце и две фосфотиоатные связи расположены на 5' конце антисмысловой нити;
(xi) имеет смысловую нить, которая содержит одну или несколько (например, две) фосфотиоатных связей. Согласно одному варианту осуществления одна или несколько (например, две) фосфотиоатных связей расположены на 5' конце смысловой нити;
(ix)
(xii) 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити;
(xiii) образует 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на 3'-конце антисмысловой нити;
(xiv) содержит смысловую или антисмысловую нить или состоит из смысловой или антисмысловой нити с последовательностью AD-60519;
(xv) имеет смысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций смысловой нити AD-60519;
(xvi) имеет антисмысловую нить с 10, 12, 14, 16, 18, 19, 20 или всеми из модификаций антисмысловой нити AD-60519; или
(xvii) имеет последовательность дуплекса и все модификации AD-60519.
Согласно вариантам осуществления dsRNA находится в форме конъюгата
следующей структуры (также называемой в данном документе AD-60519 или ALN-60519) (SEQ ID NOS 5238-5239 соответственно, по порядку):
Смысловая нить
Af, Cf, Gf, Uf = 2'-F рибонуклеозиды
Am, Cm, Gm, Um = 2'-OMe рибонуклеозиды
S = фосфотиоат
OH OH
196
AcHN о 1
OH OH r ,
l \ 0 H N О, 0
AcHN 6 6
OH OH
AcHN О И H
HO.
Согласно одномуаспекту в данном документе представлена композиция, например, фармацевтическая композиция, которая включает одну или несколько из iRNA, описанных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или средство доставки. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для ингибирования экспрессии гена ALAS 1 в организме, как правило, у человека. Согласно одному варианту осуществления композиция применяется для лечения порфирий, например, АГР.
Согласно одному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 1530 пар оснований в длину, и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ Ш NO: 1 или 382.
Согласно дополнительному аспекту iRNA, представленная в данном документе, представляет собой двунитевую RNAi (dsRNA), содержащую смысловую нить, комплементарную антисмысловой нити, где упомянутая антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS1, где каждая нить имеет от приблизительно 14 до приблизительно 30 нуклеотидов, где упомянутое средство для двунитевой RNAi представлено формулой (III):
смысловая: 5' np -Na -(X X X)i-Nb -Y Y Y -Nb -(Z Z Z)j -Na - nq 3'
антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')1-Na'- nq' 5' (III)
где
каждый из i, j, k и 1 независимо равняется 0 или 1;
каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждый Na и Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два неодинаково модифицированных нуклеотида;
каждый Nb и Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 нуклеотидов, которые являются либо модифицированными, либо немодифицированными, либо их комбинациями;
каждый rip, rip', nq и nq' независимо представляет собой выступающий
нуклеотид;
каждый из XXX, YYY, ZZZ, Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех идентичных модификаций трех последовательных нуклеотидов;
модификации Nb отличаются от модификации Y, а модификации Nb' отличаются от модификации Y'.
Согласно вариантам осуществления смысловая нить конъюгирована по меньшей мере с одним лигандом.
Согласно вариантам осуществления i равняется 1; j равняется 1, или как i, так и j равняются 1.
Согласно вариантам осуществления к равняется 1; 1 равняется 1, или как к, так и 1 равняются 1.
Согласно вариантам осуществления XXX комплементарен Х'Х'Х', YYY комплементарен Y'Y'Y', a ZZZ комплементарен Z'Z'Z'.
Согласно вариантам осуществления мотив Y'Y'Y' находится в 11, 12 и 13 положениях антисмысловой нити от 5'-конца.
Согласно вариантам осуществления Y' представляет собой 2'-0-метил.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 15-30 пар нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 17-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 19-21 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок дуплекса составляет 21-23 пары нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления модификация нуклеотида выбрана из группы, состоящей из запертой нуклеиновой кислоты (LNA), ациклического нуклеотида, гекситной или гексозной нуклеиновой кислоты (HNA), циклогексеновой нуклеиновой кислоты (CeNA), 2'-метоксиэтил, 2'-0-алкил, 2'-0-аллил, 2'-С-аллил, 2'-фтор, 2'-дезокси, 2'-гидроксил и любой их комбинации.
Согласно вариантам осуществления модификации нуклеотидов выбраны из группы, состоящей из LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтила, 2'-0-алкила, 2'-0-аллила, 2'-С-аллила, 2'-фтора, 2'-дезокси, 2'-гидроксила и их комбинаций.
Согласно вариантам осуществления модификациями нуклеотидов являются 2'-0-метил-, 2'-фтор или обе.
Согласно вариантам осуществления лиганд содержит углевод.
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен с помощью линкера.
Согласно вариантам осуществления линкер является двухвалентным или трехвалентным разветвленным линкером.
Согласно вариантам осуществления лиганд представляет собой
э .он
но-
AcHN
Согласно вариантам осуществления лиганд присоединен к 3'-концу смысловой
нити.
Согласно вариантам осуществления dsRNA состоит из нуклеотидной последовательности или содержит нуклеотидную последовательность, выбранную из группы последовательностей, представленных в таблицах 21-40.
Согласно дополнительному аспекту представленная в данном документе iRNA представляет собой двунитевую рибонуклеиновую кислоту (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1, эта антисмысловая нить содержит по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов, отличающихся не более чем 3 нуклеотидами от антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из таблиц 21-40. Согласно вариантам осуществления нуклеотиды антисмысловой нити имеют меньше модификаций, больше модификаций или другие
модификации относительно антисмысловых последовательностей, приведенных в любой из таблиц 21-40.
Согласно вариантам осуществления смысловые и антисмысловые последовательности являются последовательностями дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, при оценке с применением анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS 1 в печени, например, при оценке с применением образца для биопсии печени. Согласно вариантам осуществления экспрессию mRNA ALAS1 оценивают исходя из уровня mRNA ALAS1 в биологической жидкости, например, крови, сыворотке, плазме, спинномозговой жидкости или моче. Согласно вариантам осуществления уровень экспрессии mRNA ALAS 1 оценивают с применением анализа по выявлению внеклеточной РНК в кровотоке (cERD), например, анализа cERD, описанного в данном документе или в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs (Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) или Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном в Интернете 19 декабря 2013 г.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере один из модифицированных нуклеотидов выбран из группы, состоящей из: 2'-0-метил-модифицированного нуклеотида, нуклеотида, содержащего 5'-фосфотиоатную группу, и концевого нуклеотида, присоединенного к группе производного холестерила или бисдециламида додекановой кислоты.
Согласно некоторым вариантам осуществления модифицированный нуклеотид выбран из группы, состоящей из: 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированного нуклеотида, 2'-дезокси-модифицированного нуклеотида, запертого нуклеотида, ациклического нуклеотида, нуклеотида с удаленными основаниями, 2'-амино-модифицированного
нуклеотида, 2'-алкил-модифицированного нуклеотида, морфолинового нуклеотида, фосфорамидата и нуклеотида, содержащего не встречающиеся в природе основания.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 17 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления каждая нить составляет не более 30 нуклеотидов в длину.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 1 нуклеотида. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из
1 нуклеотида.
Согласно некоторым вариантам осуществления по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из
2 нуклеотидов. Согласно вариантам осуществления антисмысловая нить содержит 3'-выступающий конец из 2 нуклеотидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA, описанная в данном документе, дополнительно содержит лиганд.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой лиганд GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд конъюгирован с 3'-концом смысловой нити dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из антисмысловых последовательностей, приведенных в таблицах 21 -40, или соответствующей
антисмысловой последовательности, в которой некоторые или все из нуклеотидов немодифицированы. Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID NO: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ Ш NO: 4154). Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60489. Согласно некоторым вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности дуплекса AD-60519.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности состоит из антисмысловой последовательности, выбранной из дуплекса, раскрытого в данном документе, который подавляет экспрессию mRNA ALAS1 по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 90%, например, как определено с помощью анализа, раскрытого в примерах, представленных в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из последовательности смысловой нити, выбранной из таблиц 21 -40, и антисмысловой нити, состоящей из антисмысловой последовательности, выбранной из таблиц 21-40. Согласно вариантам осуществления dsRNA содержит пару соответствующих смысловой и антисмысловой последовательностей, выбранных из таковых дуплексов, раскрытых в таблицах 21-40.
Согласно одному аспекту настоящее изобретение представляет клетку, содержащую по меньшей мере одну из iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе. Клетка, как правило, представляет собой клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно другим вариантам осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлена фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS 1, при этом композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят в составе безбуферного раствора.
Согласно вариантам осуществления безбуферным раствором является солевой раствор или вода, например, вода для инъекций.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит AD-60519 и воду для инъекций. Согласно вариантам осуществления композиция содержит приблизительно 100-300 мг/мл, например, 200 мг/мл AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиции характеризуются рН 6,0-7,5, например, приблизительно 7,0. Согласно вариантам осуществления композиция предназначена для подкожной инъекции. Согласно вариантам осуществления фармацевтическую композицию фасуют в упаковку (например, стеклянный флакон, например, 2 мл стеклянный флакон) объемом приблизительно 0,3-1 мл, например, 0,55 мл. Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция представляет собой ALN-AS1, описанную в данном документе в примерах.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) вводят с буферным раствором. Согласно вариантам осуществления буферный раствор содержит ацетат, цитрат, проламин, карбонат или фосфат или любую их комбинацию. Согласно вариантам осуществления буферный раствор представляет собой забуференный фосфатом солевой раствор (PBS).
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, iRNA (например, dsRNA) нацелена на гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят внутривенно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтических композиций, описанных в данном документе, композицию вводят подкожно.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий собой GalNAc), который нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно вариантам осуществления фармацевтическая композиция содержит iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе, которая содержат лиганд (например, лиганд, представляющий собой GalNAc), и при этом фармацевтическую
композицию вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления лиганд нацеливает iRNA (например, dsRNA) в гепатоциты.
Согласно определенным вариантам осуществления фармацевтическая композиция, например, композиция, описанная в данном документе, включает липидный состав. Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi представляет собой состав LNP, например, состав МСЗ. Согласно некоторым вариантам осуществления состав LNP нацеливает средство для RNAi в конкретную клетку, например, клетку печени, например, гепатоцит. Согласно вариантам осуществления липидный состав представляет собой состав LNP11. Согласно вариантам осуществления композицию вводят внутривенно.
Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция составлена для введения согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, не более одного раза каждые четыре недели, не более одного раза каждые три недели, не более одного раза каждые две недели или не более одного раза каждую неделю. Согласно другому варианту осуществления введение фармацевтической композиции может продолжаться в течение месяца или дольше, например, одного, двух, трех или шести месяцев, или одного года или дольше.
Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например, dsRNA, нацеленную на ALAS 1, вводят с терапевтическим средством без iRNA, как например, средством, известным для лечения порфирий (например, АГР) или симптома порфирий (например, болевых ощущений). Согласно другому варианту осуществления композицию, содержащую iRNA, описанную в настоящем изобретении, например, dsRNA, нацеленную на АГР, вводят в сочетании со схемой лечения для средства без iRNA, такого как гемин или глюкоза (например, инфузия глюкозы (например, TV глюкозы)). Например, iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно вводить до, после или одновременно с глюкозой, декстрозой или подобным лечением, которое помогает восстановить энергетический баланс (например, полное парентеральное питание). iRNA, описанную в настоящем изобретении, можно также вводить до, после или одновременно с введением препарата на основе гема (например, гемина, аргината гема или гемальбумина), а также необязательно в комбинации с глюкозой (например, ГУ глюкозой) или т. п.
Как правило, глюкозу, вводимую для лечения порфирий, вводят внутривенно (IV). Внутривенное введение глюкозы называют в данном документе "IV глюкозой." Однако, также охвачены альтернативные варианты осуществления, согласно которым глюкозу вводят другими способами.
Согласно одному варианту осуществления iRNA ALAS1 вводят пациенту, а затем пациенту назначают схему введения средства или лечебного средства, не содержащего iRNA (например, глюкозы и/или препарата на основе гема) (или наоборот). Согласно другому варианту осуществления iRNA ALAS1 и терапевтическое средство без iRNA или схему лечения назначают в одно и то же время.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ включает: (а) введение в клетку iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, и (Ь) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS 1, вследствие чего происходит ингибирование экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения или ингибирования экспрессии гена ALAS 1 в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). Способ включает:
(а) введение в клетку двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где dsRNA включает по меньшей мере две последовательности, которые комплементарны друг другу. dsRNA содержит смысловую нить с первой последовательностью и антисмысловую нить со второй последовательностью; антисмысловая нить содержит участок комплементарности, который практически комплементарен по меньшей мере части mRNA, кодирующей ALAS1, и при этом участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее, например, 15-30 нуклеотидов в длину, и, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40% или более; и
(b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени,
достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS 1, вследствие чего происходит снижение или ингибирование экспрессии гена ALAS 1 в клетке.
Согласно вариантам осуществления изложенных выше способов ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит.
Согласно вариантам осуществления клетка принадлежит субъекту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1.
Согласно вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирий (AIP), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP), порфирий, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, АГР, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления экспрессию ALAS1 ингибируют по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно определенным вариантам осуществления клетка (например, гепатоцит) представляет собой клетку млекопитающего (например, клетку человека, низшего примата или грызуна).
Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся
в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)).
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения порфирий, или диагностированной порфирией, например, Х-сцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP или порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (АГР), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно некоторым вариантам осуществления нарушение представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), АГР, НСР или VP. Согласно конкретным вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или АГР.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP), порфирий, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, АГР, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления введенная dsRNA снижает или ингибирует экспрессию гена ALAS1 или уровень одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидроксиметилбилана (НМВ), уропорфириногена Г или Ш, копропорфириногена Г или Ш, протопорфириногена ГХ и протопорфирина ГХ) или продуктов или метаболитов порфирина по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%,
30%, 35%, 40%, 45%, 50% или более относительно эталонного образца (например, необработанной клетки или клетки, обработанной нецелевой контрольной dsRNA). Без привязки к конкретной теории, ALAS 1 является первым ферментом в рамках порфиринового пути. Таким образом, снижение экспрессии гена ALAS1, по-видимому, снижает уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов.
Согласно другим аспектам в настоящем изобретении представлены способы лечения, предупреждения или контроля патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1 (например, патологических процессов, в которые вовлечены порфирины, предшественники порфиринов, или нарушения в рамках порфиринового пути, как например, порфирий). Согласно одному варианту осуществления способ включает введение субъекту, например, пациенту, нуждающемуся в таком лечении, предупреждении или контроле, эффективного (например, терапевтически или профилактически эффективного) количества одного или нескольких из iRNA, описанных в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе, или композиции, содержащей iRNA (например, dsRNA), описанной в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения и/или предупреждения порфирий, включающий введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину, и при этом антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQIDNO:l или SEQ Ш N0:382.
Согласно одному варианту осуществления субъект (например, пациент) страдает порфирией. Согласно другому варианту осуществления субъект (например, пациент) подвержен риску развития порфирий. Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA, нацеленной на ALAS1, ослабляет или облегчает у пациента тяжесть по меньшей мере одного симптома нарушения, связанного с ALAS 1.
Согласно одному варианту осуществления субъект представляет собой млекопитающее (например, человека) с риском возникновения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или диагностированным нарушением, связанным с экспрессией ALAS1, например, порфирией, например, Х-сцепленной сидеробластической анемией (XLSA), порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирией Досса), острой перемежающейся порфирией (АГР), врожденной эритропоэтической порфирией (СЕР), поздней кожной порфирией (РСТ), наследственной копропорфирией (копропорфирией, или НСР), вариегатной порфирией (VP), эритропоэтической протопорфирией (ЕРР) или транзиторной эритропорфирией детского возраста. Согласно дополнительному варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), АГР, НСР или VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления нарушение представляет собой порфирию, обусловленную недостаточностью дегидратазы ALA (ADP) или АГР.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP), порфирий, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, АГР, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно вариантам осуществления порфирию, симптом порфирий, продром или приступ порфирий индуцирован воздействием провоцирующего фактора, описанного в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является химическое воздействие. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является лекарственное средство, например, лекарственное средство рецептурного отпуска или отпускаемое без рецепта лекарственное средство. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором
является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят после острого приступа порфирий.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время острого приступа порфирий.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически с целью предупреждения острого приступа порфирий.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) находится в форме конъюгата GalNAc.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,05-50
мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в концентрации 0,01 мг/кг-5 мг/кг веса тела субъекта.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в виде состава LNP и его вводят в дозе 0,05-5 мг/кг.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее), например, один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA в конъюгате GalNAc вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления введение iRNA в конъюгате GalNAc представляет собой подкожное введение.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) составлена в форме конъюгата GalNAc и его вводят, например, подкожно, в дозе 0-5 мг/кг, например, 0-2,5 мг/кг или 1-2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят еженедельно. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в виде композиции, содержащей iRNA и
воду для инъекции. Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60519. Согласно вариантам осуществления композиция содержит iRNA, например, AD-60519, в концентрации приблизительно 200 мг/мл.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают уровень порфирина или предшественника порфирина у субъекта.
Согласно вариантам осуществления уровень снижают по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90%. Согласно варианту осуществления уровень снижают по меньшей мере на 30%.
Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является 8-аминолевулиновая кислота (ALA) или порфобилиноген (PBG).
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) характеризуется значением IC50 в диапазоне 0,01-1 нМ.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа, описанного в данном документе,
(i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS 1 (например, порфирией),
(ii) ингибируют экспрессию ALAS1 у субъекта (например, при оценке с помощью анализа cERD),
(iii) снижают уровень предшественника порфирина (например, ALA или PBG) или порфирина у субъекта,
(iv) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, или
(v) снижает у субъекта частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, при воздействии в отношении субъекта провоцирующего фактора (например, предменструальной фазы или лютеиновой фазы).
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают болевые ощущения и/или прогрессирующую нейропатию.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят согласно схеме дозирования.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят до или во время острого приступа порфирий.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят до острого приступа порфирий.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время продрома. Согласно вариантам осуществления продром характеризуется болью в животе, тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят во время конкретной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают периодические приступы порфирий, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов. Согласно вариантам осуществления периодические приступы ассоциированы с провоцирующим фактором. Согласно вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл, например, конкретная фаза менструального цикла, например, лютеиновая фаза.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG повышен в плазме или моче субъекта. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, печеночной порфирий. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию гена), ассоциированное с порфирией, как описано в данном документе. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий и испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления субъект не испытывает острых приступов, но испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (Ь) испытывает болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме и/или в моче. Согласно вариантам осуществления повышенный уровень ALA и/или PBG сопровождается другими симптомами, например, болевыми ощущениями (например, хронической болью, например, хронической нейропатической болью) или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, например, мутацию, описанную в данном документе.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG,, например, уровень выше нормального значения, или выше или равен нормальному значению. Согласно вариантам осуществления упомянутый уровень выше нормального значения. Согласно вариантам осуществления нормальное значение соответствует двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в образце здоровых индивидов. Согласно вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA и/или PBG в плазме или уровень ALA и/или PBG в моче, который выше, или выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному уровню верхнего предела нормального диапазона значений. Используемый в данном документе "верхний предел нормального диапазона значений" относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонного образца, например, образца индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые не страдают порфирией. Согласно вариантам осуществления у
субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 2-4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления у субъекта уровень ALA и/или PBG в моче составляет выше 4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек и имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают один или несколько признаков или симптомов порфирий. Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам
осуществления с помощью способа уменьшают болевые ощущения (например, хроническую боль, например, хроническую нейропатическую боль) и/или нейропатию (например, прогрессирующую нейропатию). Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой боль в животе. Согласно вариантам осуществления болевое ощущение представляет собой нейропатическую боль (например, боль, ассоциированную с прогрессирующей нейропатией при острых порфириях). Уменьшение болевых ощущений может включать, например, предупреждение болевых ощущений, задержку начала проявления болевых ощущений, снижение частоты болевых ощущений и/или снижение тяжести болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления уменьшение болевых ощущений оценивают на основе применения субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа облегчают или предупреждают острые приступы порфирий, например, путем снижения тяжести, продолжительности или частоты приступов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают или предупреждают повреждение нервов.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа предупреждают ухудшение клинических показателей (например, предупреждают развитие патологических изменений) или результатом является улучшение клинических показателей, например, клинических показателей функции мышц и/или нервов, например, EMG и/или показателей скорости проводимости нерва.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом гема.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа уменьшают применение субъектом антиболевой терапии.
Согласно вариантам осуществления с помощью способа снижают риск госпитализации.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG (например, уровня ALA и/или PBG в плазме или в моче). Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня ALA и/или PBG.
Согласно вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение до значения, меньшего или равного нормальному значению. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует значению, равному двум стандартным отклонениям выше среднего уровня в эталонном образце.
Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта до уровня, который в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня ALA в два раза ниже верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня PBG в два раза ниже верхнего референтного предела.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят в виде разовой дозы или нескольких доз, например, согласно схеме дозирования.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят субъекту, подверженному риску развития порфирий, профилактически. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) или композицию, содержащую iRNA, вводят профилактически, начиная с периода полового созревания. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или имеет повышенный уровень ALA и/или PBG (например, повышенный уровень ALA и/или PBG в плазме или моче). Согласно вариантам осуществления мутация способствует восприимчивости субъекта к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления мутация ассоциирована с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией).
Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в промоторе гена ALAS 1, или в участках, расположенных выше или ниже относительно гена ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления мутация представляет собой мутацию в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA или ее конъюгат) или композицию, содержащую iRNA, вводят подкожно. Согласно вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, dsRNA) вводят в дозе 0,5-50 мг/кг. Согласно определенным вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 10 мг/кг (например, 5 мг/кг или менее) один раз в неделю; например, в дозе 1 мг/кг или менее, 2,5 мг/кг или менее, или 5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю. Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в дозе приблизительно 2,5 мг/кг или менее, например, один раз в неделю.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например, АГР. Согласно вариантам осуществления пациент испытывает рецидивирующие приступы порфирий.
Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе менее 5 мг/кг, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA (например, AD-60519) вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно одному варианту осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и iRNA (например, AD-60519) вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг; или в повторяющихся еженедельных дозах, например, по 1 и 2,5 мг/кг в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель).
Согласно одному варианту осуществления субъект имеет АГР, например, является пациентом с АГР, при этом iRNA (например, AD-60519) вводят в дозе 1-2,5 мг/кг еженедельно.
Согласно вариантам осуществления используют схему лечения, при которой iRNA изначально вводят более часто, с последующим менее частым введением. Согласно вариантам осуществления iRNA изначально вводят один раз в день в течение нескольких дней (например, в течение 2-14 дней, например, в течение 2, 3, 4, 5, 6 или 7 дней). Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз в неделю. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят один раз каждые две недели. Согласно вариантам осуществления iRNA затем вводят с частотой, эффективной для уменьшения одного или нескольких признаков или симптомов порфирий.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA), где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить из 15-30 пар оснований в длину и антисмысловая нить комплементарна по меньшей мере 15 смежным нуклеотидам под SEQ ГО N0:1 или SEQ ГО N0:382.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества dsRNA или композиции, содержащей dsRNA, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в данном документе, эффективны для снижения уровня ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG снижают так, чтобы он был меньше, или меньше или равен нормальному значению, например, верхнему пределу нормального диапазона значений.
Согласно вариантам осуществления у субъекта, который подлежит лечению, не наблюдаются симптомы, и он имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией, например, АГР.
Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в дозе менее 5 мг/кг, например, по 0,1, 0,35, 1,0 или 2,5 мг/кг. Согласно вариантам осуществления iRNA вводят в повторяющихся дозах, например, еженедельных дозах.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке (например, эритроидной клетке или клетке печени, такой как, например, гепатоцит). Согласно одному варианту осуществления клетку обрабатывают ex vivo, in vitro или in vivo (например, клетка принадлежит субъекту (например, пациенту, нуждающемуся в лечении, предупреждении и/или контроле нарушения, связанного с экспрессией ALAS1)). Способ включает приведение клетки в контакт с эффективным количеством одной или нескольких из iRNA, нацеленных на ALAS 1, например, одной или нескольких из iRNA, раскрытых в данном документе, вследствие чего происходит снижение уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке; или снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в других клетках, тканях или жидкостях субъекта, в организме которого находится клетка, относительно уровня, предшествующего приведению в контакт. Такие способы можно применять для лечения (например, облегчения тяжести) нарушений, связанных с экспрессией ALAS 1, таких как порфирий, например, АГР или порфирия, обусловленная недостаточностью дегидратазы ALA.
Согласно одному варианту осуществления стадия приведения в контакт является эффективной ex vivo, in vitro или in vivo. Например, клетка может принадлежать субъекту, например, млекопитающему (например, человеку), с риском возникновения порфирий или субъекту с диагностированной порфирией. Согласно варианту осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию, например, порфирию, выбранную из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP), порфирий, обусловленной недостаточностью дегидратазы ALA (ADP), и гематоэритропоэтической порфирий. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой печеночную порфирию у гомозигот по доминантному аллелю (например, АГР, НСР или VP у гомозигот по доминантному аллелю) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, включающий приведение клетки в контакт с iRNA (например, dsRNA), описанной в
данном документе, в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
Согласно вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина представляет собой 8-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген I или III, копропорфириноген I или III, протопорфириноген IX или протопорфирин IX. Согласно вариантам осуществления предшественником порфирина является ALA или PBG.
Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку. Согласно дополнительному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит).
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить iRNA (например, dsRNA), описанную в данном документе.
Согласно одному аспекту в данном документе представлен вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить dsRNA, где упомянутая dsRNA содержит участок комплементарности по меньшей мере к части mRNA, кодирующей ALAS1, где упомянутая dsRNA составляет 30 пар оснований или менее в длину, и где упомянутая dsRNA нацелена на упомянутую mRNA для расщепления.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину.
Согласно вариантам осуществления участок комплементарности составляет 19-21 нуклеотид в длину.Согласно одному аспекту в настоящем изобретении представлен вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор включает по меньшей мере одну регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну нить iRNA, описанную в данном документе. Согласно одному варианту осуществления вектор содержит по меньшей мере одну нить iRNA ALAS 1.
Согласно одному аспекту в данном документе представлена клетка, содержащая вектор, описанный в данном документе. Согласно одному аспекту представлена клетка, содержащая
вектор для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке. Вектор включает регуляторную последовательность, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует по меньшей мере одну нить из iRNA, описанных в данном документе. Согласно одному варианту осуществления клетка представляет собой клетку печени (например, гепатоцит). Согласно другому варианту осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS 1 в образце биологической жидкости (например, образце крови (например, образце сыворотки или плазмы), образце спинномозговой жидкости или мочи субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS 1, таким образом анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта.
Согласно другому аспекту представлен способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта, при этом упомянутый способ включает (i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1; (ii) получение cDNA ALAS1 из mRNA ALAS 1; (iii) приведение в контакт cDNA ALAS 1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS1 или ее частью, с получением реакционной смеси; и (iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS 1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1, таким образом, анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, и при этом уровень mRNA ALAS 1 определяют путем выявления количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно включает получение образца биологической жидкости от субъекта. Согласно вариантам осуществления образец биологической жидкости является отделенным от ткани и содержит экзосомы. Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирий оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта относительно нормального значения.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта, в ответ на лечение порфирий, относительно нормального значения, указывает на то, что лечение порфирий является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирий.
Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, упомянутые в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте.
Подробная информация о различных вариантах осуществления настоящего изобретения изложена ниже в описании. Другие характеристики, цели и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из описания и графических материалов, а также из формулы изобретения.
Описание графических материалов
На ФИГ. 1 обозначен путь биосинтеза гема.
На ФИГ. 2А и ФИГ. 2В показана таблица, в которой приведены определенные порфирий, ассоциированные с генетическими ошибками в рамках метаболизма гема.
На ФИГ. ЗА и ФИГ. ЗВ обозначен транскрипт mRNA ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.4 (GL40316942, дата регистрации 19 ноября 2011 г.), SEQ ID NO: 1).
На ФИГ. 4А и ФИГ. 4В обозначен транскрипт mRNA ALAS1 человека (эталонная последовательность NM_000688.5 (GI: 362999011, дата регистрации 1 апреля 2012 г.), SEQ ID NO: 382).
На ФИГ. 5 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 мыши (mALASl) относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
На ФИГ. 6 показан дозозависимый эффект siRNA AD-53558 при подавлении mRNA ALAS1 у крыс относительно PBS в качестве контроля. Также показаны результаты для контроля AD-1955 с люциферазой (LUC).
На ФИГ. 7 показана продолжительность подавления mRNA ALAS1 мыши (mALASl) с помощью siRNA AD-53558 относительно PBS в качестве контроля.
На ФИГ. 8 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней ALA в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом в экспериментальной (siRNA ALAS1) и контрольной (siRNA LUC) группах.
На ФИГ. 9 показаны уровни ALA в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На ФИГ. 10 показаны средние значения ± стандартные отклонения уровней PBG в плазме (в мкМ) на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На ФИГ. 11 показаны уровни PBG в плазме (в мкМ) отдельных животных на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у животных, которые были подвержены обработке siRNA ALAS1 и контролем (siRNA LUC).
На ФИГ. 12 показан относительный уровень mRNA mALASl в печени на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у отобранных типичных экспериментальных (siRNA ALAS1) и контрольных (PBS) животных.
На ФИГ. 13 показаны эффекты трех siRNA mALASl, конъюгированных с GalNAc, в отношении экспрессии mALASl (относительно PBS в качестве контроля) в ткани печени мыши.
На ФИГ. 14 показаны уровни ALA и PBG в плазме в динамике после введения фенобарбитала и обработки siRNA ALAS1 или контрольной siRNA LUC.
На ФИГ. 15 показаны эффекты siRNA ALAS1, конъюгированных с GalNAc, в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции АГР фенобарбиталом.
На ФИГ. 16 показаны дозозависимые эффекты siRNA ALAS1 в отношении уровней ALA и PBG в плазме в мышиной модели индукции АГР фенобарбиталом. Для животных, которые получали siRNA ALAS1, доза вводимой siRNA (0,05 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,5 мг/кг или 1,0 мг/кг) показана на горизонтальной оси.
На ФИГ. 17 на верхней части рисунка показана схема эксперимента, применяемая для исследования подавления ALA и PBG с помощью siRNA ALAS1. На нижней части рисунка показаны уровни ALA и PBG в плазме на исходном уровне, в контрольном (Luc) состоянии и после обработки siRNA ALAS1 на 0 неделе, 2 неделе и 4 неделе.
На ФИГ. 18 показана схема эксперимента, применяемая для сравнения эффектов лечения siRNA ALAS 1 или гемином в отношении животной модели АГР (вверху), и результаты по уровням ALA (мкмоль/л) в плазме (в середине) и уровням PBG (мкмоль/л) в плазме (внизу).
На ФИГ. 19 показаны относительные уровни mRNA (ALAS1/GAPDH) у животных, обработанных 30 мг/кг, 10 мг/кг или 3 мг/кг AD-58632, относительно животных, обработанных PBS в качестве контроля.
На ФИГ. 20 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффекта доза-ответ конъюгата GalNAc с AD-58632 ALAS1 в крысиной модели АГР.
На ФИГ. 21 показаны относительные уровни mRNA PBGD в печени (верхний график) и относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (нижний график) в крысиной модели АГР. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS1.
На ФИГ. 22 показаны уровни PBG (верхняя часть рисунка) и ALA (нижняя часть рисунка) в моче относительно уровней креатинина в крысиной модели АГР. Группы животных подлежали одной из четырех обработок: (1) обработка только фенобарбиталом (РВ), (2) обработка фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD), (3) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 30 мг/кг siRNA ALAS1, (4) фенобарбиталом, siRNA PBGD и 10 мг/кг siRNA ALAS 1.
На ФИГ. 23 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали пять
суточных доз siRNA по 6 мг/кг, 2 мг/кг или 1 мг/кг по отношению к однократным болюсным дозам siRNA по 30 мг/кг, 10 мг/кг или 5 мг/кг.
На ФИГ. 24 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632, относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали четыре еженедельные дозы siRNA по 10 мг/кг, 5 мг/кг или 2,5 мг/кг.
На ФИГ. 25 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 с помощью AD-58632 и с помощью пяти дуплексов из 19/19 мономеров .
На ФИГ. 26 показаны результаты оценки исследования эффекта длины нити и выступающих концов в отношении наиболее оптимальных двух дуплексов из 19 мономеров.
На ФИГ. 27 представлен график, на котором показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы) для каждой группы, подлежащей обработке при исследовании NHP, описанном в примере 34.
На ФИГ. 28 показаны результаты подавления mRNA ALAS-1 относительно PBS в качестве контроля, в группах крыс, которые получали 3 мг/кг или 10 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На ФИГ. 29 показана схема эксперимента, применяемая для изучения эффективности siRNA ALAS1 AD-58632 и AD-60489 в отношении подавления mRNA в печени у низших приматов.
На ФИГ. 30 показаны результаты дозозависимого подавления mRNA в печени у низших приматов после обработки 1,25 мг/кг, 2,5 мг/кг или 5 мг/кг AD-58632 или AD-60489.
На ФИГ. 31 показано сравнение результатов подавления mRNA, полученных исходя из биоптатов печени и исходя из анализа cERD при исследовании на низших приматах.
На ФИГ. 32 показана динамика подавления mRNA, оцененного с применением анализа cERD при исследовании на низших приматах. На горизонтальной оси указано время согласно дню исследования.
На ФИГ. 33 показаны результаты подавления mRNA ALAS1 у крыс, которые получали PBS или разовую дозу, составляющую 5 мг/кг одного из указанных дуплексов siRNA.
На ФИГ. 34 приведены концентрации siRNA в печени крыс, которые получали разовую дозу, составляющую 5 мг/кг указанной siRNA.
На ФИГ. 35 (вверху) показан схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности AD-60925 и AD-60926. На ФИГ. 35 (внизу) показаны относительные уровни mRNA ALAS1/GAPDH крысы у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926.
На ФИГ. 36 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926.
На ФИГ. 37 показаны относительные уровни PBG в моче (вверху) и ALA в моче (внизу) в динамике у крыс, обработанных (1) AF11-PBGD, (2) AF11-PBGD и РВ, (3) AF-11PBGD, РВ и 3 мг/кг AD-60925, или (4) AF11-PBGD, РВ и AD-60926. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ.
На ФИГ. 38 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крысы у крыс, которые получали 4 дозы PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На ФИГ. 39 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На ФИГ. 40 (вверху) показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крысы у крыс, которые получали разовую дозу PBS или 3 мг/кг одной из указанных siRNA. На ФИГ. 40 (внизу) показана концентрация siRNA в печени.
На ФИГ. 41 (вверху) показаны результаты подавления mRNA ALAS1 (rALASl) крысы с помощью AD-60489, AD-60519 и AD-60901. На ФИГ. 41 (внизу) приведена концентрация siRNA в печени.
На ФИГ. 42 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крысы у крыс, которых обрабатывали разовой дозой PBS или 2,5 мг/кг одной из указанных siRNA.
На ФИГ. 43 показаны относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крысы у крыс, которых обрабатывали PBS или одной из указанных siRNA в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель.
На ФИГ. 44 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких доз AD-60519 два раза в неделю. На ФИГ. 44
(внизу) показаны графики, обозначающие подавление PBG и ALA в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD-60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD-60519.
На ФИГ. 45 показаны графики, обозначающие подавление PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в сыворотке в мышиной модели АГР, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и шестью дозами PBS (исходный уровень), (ii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами PBS (солевой раствор), (iii) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 2,5 мг/кг AD-60519, или (iv) siRNA PBGD, РВ и шестью дозами 5 мг/кг AD-60519.
На ФИГ. 46 (вверху) показана схема эксперимента, применяемая для изучения терапевтической эффективности нескольких еженедельных доз AD-60519. На ФИГ. 46 (внизу) показан график, обозначающий относительные уровни mRNA ALAS1 (rALASl/GAPDH) крысы у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519, или (v) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На ФИГ. 47 показаны графики, обозначающие уровни PBG (верхний график) и ALA (нижний график) в моче у крыс, которых обрабатывали (i) siRNA PBGD и четырьмя дозами PBS, (ii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами PBS, (iii) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 3 мг/кг AD-60519, (iv) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 1 мг/кг AD-60519, или (v) siRNA PBGD, РВ и четырьмя дозами 0,3 мг/кг AD-60519.
На ФИГ. 48 представлена диаграмма, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На ФИГ. 49 представлен график, на котором показаны результаты подавления mRNA в печени у низших приматов (NHP) после обработки конъюгатами GalNAc с siRNA ALAS 1.
На ФИГ. 50 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS 1 в сыворотке у низших приматов (NHP) в различные периоды времени в ходе проведения исследования, в котором изучали эффекты обработки конъюгатами
GalNAc с siRNA ALAS1. Дни на горизонтальной оси соответствуют дням на диаграмме из ФИГ. 48.
На ФИГ. 51 показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства), при оценке в исследовании для разовой дозы у крыс, в котором применяли cERD в моче для отслеживания подавления ALAS 1.
На ФИГ. 52 представлена схема, на которой показана схема исследования на низших приматах, в котором изучали эффекты нескольких доз и разовой дозы AD-60519 в отношении подавления mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS1 в крови.
На ФИГ. 53 представлена столбиковая диаграмма, на которой показаны средние относительные уровни mRNA ALAS1 в печени (% PBS в качестве контроля) на 24 день исследования (группы с несколькими дозами) или на 4 день исследования (группы с разовой дозой).
На ФИГ. 54 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами (верхний график, показывающий результаты вплоть до 24 дня) и групп с разовой дозой (нижний график, показывающий результаты вплоть до 22 дня).
На ФИГ. 55 представлен график, на котором показаны уровни mRNA в печени, mRNA в сыворотке и mRNA в моче на 4 день исследования (в группах с разовой дозой) или на 24 день исследования (в группах с несколькими дозами). Показаны данные для отдельных животных и средние величины для каждой группы.
На ФИГ. 56 представлен график, на котором показаны нормализованные уровни mRNA ALAS1 в сыворотке (показано в виде доли уровня дозы до приема лекарственного средства) через 8 недель при оценке с применением cERD для групп с несколькими дозами. Каждая точка на графике представляет остаточную mRNA ALAS1 для средней величины группы образцов 3 животных ± стандартное отклонение группы.
На ФИГ. 57 представлена схема структуры ALN-60519 (также называемая в данном документе AD-60519). На ФИГ. 57 раскрыты SEQ Ш N0 5238-5239 соответственно, по порядку.
На ФИГ. 58 показаны уровни mRNA ALAS1 при оценке соответствующих образцов сыворотки и мочи или от пациентов с АГР, или от здоровых добровольцев (NHV). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке или моче измеряли с применением способа cERD. Для пациентов А и В с АГР проводили забор второго набора образцов сыворотки и мочи для оценки изменений mRNA ALAS1 в динамике.
Подробное описание изобретения
iRNA управляет специфическим в отношении последовательности разрушением mRNA посредством процесса, известного как РНК-интерференция (RNAi). В данном документе описаны iRNA и способы их применения для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего, где iRNA нацелена на ген ALAS1. Также представлены композиции и способы лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS 1, таких как порфирий (например, порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP или порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия, врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР), Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
Порфирий представляют собой врожденные или приобретенные нарушения, причиной которых может быть пониженная или повышенная активность определенных ферментов в пути биосинтеза гема, также называемого в данном документе порфириновым путем (см. ФИГ. 1). Порфирины являются основными предшественниками гема. Порфирины или предшественники порфирина включают 8-аминолевулиновую кислоту (ALA), порфобилиноген (PBG), гидроксиметилбилан (НМВ), уропорфириноген Г или Ш, копропорфириноген Г или Ш, протопорфириноген ГХ и протопорфирин ГХ. Гем является неотъемлемой частью гемоглобина, миоглобина, каталаз, пероксидаз и цитохромов, при этом последние включают цитохромы легких и цитохромы Р450 печени. Гем синтезируется в большинстве или во всех клетках организма человека. Приблизительно 85% гема образуется в эритроидных клетках, преимущественно для гемоглобина. Большая часть оставшегося гема образуется в печени, 80% которого используется для синтеза цитохромов. Недостаточность определенных ферментов в
порфириновом пути приводит к недостаточному образованию гема, а также к накоплению предшественников порфиринов и/или порфиринов, которые в высоких концентрациях могут быть токсичны для работы клеток или органов.
Порфирий могут проявляться на ряду с неврологическими осложнениями ("острые"), проблемами с кожей ("кожные") или обоими. Порфирий можно классифицировать по основному сайту локализации сверхсинтеза и накопления порфиринов или их предшественников. При печеночных порфириях порфирины и предшественники порфиринов сверхсинтезируются преимущественно в печени, в то время как при эритропоэтических порфириях порфирины сверхсинтезируются в эритроидных клетках в кости. Острые и печеночные порфирий приводят к нарушению работы нервной системы и неврологическим проявлениям, которые влияют как на центральную, так и на периферическую нервную систему, что приводит к появлению симптомов, таких как, например, болевые ощущения (например, боль в животе и/или хроническая нейропатическая боль), рвота, нейропатия (например, острая нейропатия, прогрессирующая нейропатия), мышечная слабость, судороги, расстройства психики (например, галлюцинации, депрессия, тревожность, паранойя), сердечные аритмии, тахикардия, запор и диарея. Кожные или эритропоэтические порфирий преимущественно поражают кожу, вызывая симптомы, такие как фотосенсибилизация, которая может быть болезненной, пузыри, некроз, зуд, отечность и усиленный рост волос в определенных областях, таких как лоб. Последующая инфекция повреждений кожи может приводить к потери костей и тканей, а также образованию шрамов, обезображиванию и потере пальцев (например, пальцев рук, пальцев ног). Большинство порфирий вызваны мутациями генов, которые кодируют ферменты в рамках пути биосинтеза гема. Краткое описание порфирий, связанных с генетическими ошибками в метаболизме гема, представлено на ФИГ. 2.
Не все порфирий являются генетически обусловленными. Например, у пациентов с заболеванием печени может развиться порфирия в результате нарушения работы печени, а транзиторная форма эритропорфирии (транзиторная эритропорфирия детского возраста) была описана для детского возраста (см. Crawford, R.I. et al, J Am Acad Dermatol. 1995 авг; 33(2 Pt 2):333-6.). У пациентов с PCT может быть приобретенная недостаточная активность уропорфиногендекарбоксилазы (URO-D) вследствие образования фермента
ORO-D с более низкой, чем нормальная, активностью фермента (см. Phillips et al. Blood, 98:3179-3185,2001.)
Острая перемежающаяся порфирия (АГР) (также называемая недостаточностью порфобилиногендезаминазы (PBG), или недостаточностью гидроксиметилбилансинтазы (HMBS)), является наиболее распространенным типом острой печеночной порфирий. Другие типы острых печеночных порфирий включат наследственную копропорфирию (НСР), вариегатную порфирию (VP) и порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP). Острые печеночные порфирий описаны, например, в Balwani, М and Desnick, R.J., Blood, 120:4496-4504, 2012.
АГР является, как правило, аутосомно-доминантным заболеванием, которое характеризуется недостаточностью фермента порфобилиногендезаминазы (PBG-дезаминаза); этот фермент также известен как гидроксиметилбилансинтаза (НМВ синтаза или HMBS). PBG-дезаминаза является третьим ферментом в пути биосинтеза гема (см. ФИГ. 1) и катализирует реакцию конденсации по типу "голова к хвосту" четырех молекул порфобилиногена в линейный тетрапиррол, гидроксиметилбилан (НМВ). Были описаны образованные в результате альтернативного сплайсинга варианты транскриптов, кодирующие различные изоформы PBG-дезаминазы. Мутации в гене PBG-дезаминазы ассоциированы с АГР. Такие мутации могут приводить к пониженному количеству PBG-дезаминазы и/или пониженной активности PBG-дезаминазы (индивиды, пораженные заболеванием, как правило, имеют -50% снижение активности PBG-дезаминазы).
Существует по меньшей мере две различные модели патофизиологии АГР и других острых печеночных порфирий (см., например, Lin CS-Y et al., Clinical Neurophysiology, 2011; 122:2336-44). Согласно одной модели, сниженный уровень образования гема вследствие недостаточности PBG-дезаминазы вызывает энергетический дефицит и дегенерацию аксонов. Согласно другой, на сегодняшний день более предпочтительной модели, накопление предшественников порфиринов (например, ALA и PBG) приводит к нейротоксичности.
Было обнаружено, что АГР распространена в определенных популяциях с частотой до 1 на 10000 (например, в Северной Швеции; см. Floderus Y, et al. Clin Genet. 2002;62:288-97). По оценкам, распространенность в общей популяции в Соединенных Штатах и Европе, за исключением Великобритании, составляет приблизительно от 1 на
10000 до 1 на 20000. Собственно клиническое заболевание проявляется лишь у приблизительно 10-15% индивидов, которые несут мутации, которые, как известно, ассоциированы с АГР. Однако, у индивидов с определенными мутациями пенетрантность составляет до 40% (например, мутация W198X). АГР, как правило, находится в латентной форме до периода полового созревания. Симптомы более распространены у женщин, чем у мужчин. Распространенность заболевания вероятно занижена вследствие его неполной пенетрантности и длительных латентных периодов. В Соединенных Штатах по оценкам насчитывается приблизительно 2000 пациентов, которые испытали по меньшей мене один приступ. По оценкам насчитывается приблизительно 150 активных рецидивирующих случаев во Франции, Швеции, Великобритании и Польше; этими пациентами являются преимущественно молодые женщины со средним возрастом 30 лет. См., например, Elder et al, J Inherit Metab Dis., опубликованную в Интернете 1 ноября 2012 г.
АГР поражает, например, висцеральную, периферическую, вегетативную и центральную нервную системы. Симптомы АГР разнообразны и включают симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта (например, сильную и нечетко локализированную боль в животе, тошноту/рвоту, запор, диарею, непроходимость кишечника), симптомы со стороны мочевыводящих путей (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча, например, темно-красная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражение черепных нервов и/или приведение к слабости в руках и ногах), судороги, нейропатическая боль (например, боль, ассоциированная с прогессирующей нейропатией, например, хроническая нейропатическая боль), психоневрологические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинации, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), поражение вегетативной нервной системы (приводящее, например, к симптомам со стороны сердечно-сосудистой системы, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденное состояние и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов. Наиболее распространенными симптомами являются боль в животе и тахикардия. Неврологические проявления включают моторную и вегетативную нейропатию и судороги. У пациентов часто наблюдается хроническая нейропатическая боль и развивается прогрессирующая
нейропатия. Пациенты с рецидивирующими приступами часто имеют продром. После тяжелого приступа может возникать необратимый паралич. Нормализация после тяжелых приступов, которые своевременно не лечили, может занять недели или месяцы. Острый приступ может быть летальным, например, вследствие паралича дыхательных мышц или сердечно-сосудистой недостаточности вследствие нарушения баланса электролитов. (См., например, Thunell S. Hydroxymethylbilane Synthase Deficiency. 2005 сентября 27 [обновлено 1 сентября 2011 г.]. В: Pagon RA, Bird TD, Dolan CR, et al., editors. GeneReviews(tm) [интернет]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993- (далее в данном документе Thunell (1993)), который включен, таким образом, при помощи ссылки во всей своей полноте.) До того, как лечение гемином стало доступным, до 20% пациентов с АГР умирали от заболевания.
Индивиды, которые несут гены АГР, подвержены повышенному риску возникновения гепатоцеллюлярного рака. У индивидов с рецидивирующими приступами риск гепатоцеллюлярного рака является особенно серьезным: после 50 лет риск почти в 100 раз выше, чем в общей популяции.
Приступы острой порфирий могут провоцироваться эндогенными или экзогенными факторами. Механизмы, с помощью которых такие факторы индуцируют приступы, могут включать, например, повышенную потребность в ферментах Р450 печени и/или индукцию активности ALAS1 в печени. Повышенная потребность в ферментах Р450 печени приводит к сниженному содержанию свободного гема в печени, тем самым индуцируя синтез ALAS1 печени.
Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода),
синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993).
Свыше 1000 лекарственных средств противопоказаны при острых печеночных порфириях (например, АГР, НСР, ADP и VP), в том числе, например, спирт, барбитураты, карбамазепин, каризопродол, клоназепам (высокие дозы), даназол, диклофенак и другие допустимые NSArDS, препараты спорыньи, эстрогены, этхлорвинол, глютетимид, гризеофульвин, мефенитоин, мепробамат (также мебутамат и тибутамат), метиприлон, методопрамид, фенитоин, примидон, прогестерон и синтетические прогестины, пиразинамид, пиразолоны (аминопирин и антипирин), рифампин, сукцинимиды (этосукцимид и метсукцимид), сульфонамидные антибиотики и вальпроевая кислота.
Объективные признаки АГР включают изменение цвета мочи во время острого приступа (моча может выглядеть красной или красно-коричневой) и повышенные концентрации PBG и ALA в моче во время острого приступа. Молекулярно-генетическое тестирование позволяет идентифицировать мутации в гене PBG-дезаминазы (также известной как HMBS) у более 98% пораженных заболеванием индивидов. Thunell (1993).
Диагностика порфирий может включать оценку семейного анамнеза, оценку уровней предшественников порфиринов в моче, крови или кале, и/или оценку активности ферментов и анализ мутаций ДНК. Дифференциальная диагностика порфирий может включать определение типа порфирий на основе измерений отдельных уровней порфиринов или предшественников порфиринов (например, ALA, PBG) в моче, кале и/или плазме (например, при помощи хроматографии или флуорометрии) во время приступа. Диагноз АГР может быть подтвержден установлением того, что активность PBG-дезаминазы в эритроцитах составляет 50% или менее относительно нормального уровня. ДНК-тестирование в отношении мутаций можно проводить для пациентов и членов семей с повышенным риском. Диагноз АГР, как правило, подтверждается по ДНК-тестированию для идентификации конкретной вызывающей болезнь мутации гена (например, мутации HMBS).
Общепринятый контроль острых приступов АГР включает госпитализацию, отслеживание симптомов и устранение небезопасных лекарственных средств. Лечение острых приступов, как правило, требует госпитализации для контроля и лечения острых симптомов, в том числе, например, боли в животе, судорог, безвоживания/гипонатриемии,
тошноты/рвоты, тахикардии/гипертензии, задержки мочеиспускания/непроходимости кишечника. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить профилактическими противосудорожными средствами и допустимыми лекарственными препаратами (хотя многие противосудорожные препараты противопоказаны), тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами. Лечение может включать отказ от небезопасных лекарственных препаратов, отслеживание дыхательной функции, а также мышечной силы и неврологического статуса. Умеренные приступы (например, приступы без пареза или гипонатриемии) можно лечить по меньшей мере 300 г внутривенной 10% глюкозы в день, хотя незамедлительно обеспечивают повышенное введение гемина. Тяжелые приступы, как правило, лечат как можно раньше гемином с внутривенным введением (3-4 мг/кг в сутки в течение 4-14 дней) и IV глюкозой при ожидании начала действия IV гемина. Как правило, приступы лечат IV гемином в течение 4 дней и IV глюкозой при ожидании введения IV гемина. В течение 3 -4 дней после начала введения гемина часто наблюдается клиническое улучшение, сопровождающееся понижением уровней ALA и PBG.
Гемин (пангематин(r) или гемин для инъекции, ранее известный как гематин) является единственным препаратом, одобренным для применения в Соединенных Штатах, и был первым лекарственным средством, одобренным Законом об орфанных лекарственных препаратах. Пангематин(r) представляет собой гемин, полученный из обработанных эритроцитов (PRBC), и представляет собой протопорфирин ГХ, содержащий ион трехвалентного железа (гем В) с хлоридным лигандом. Гем служит для ограничения синтеза порфирина в печени и/или костного мозге. Точный механизм, с помощью которого гемин приводит к симптоматическому улучшению у пациентов с острыми случаями печеночных порфирий, пока не был выяснен; однако, его действие, по-видимому, связано с (механизм обратной связи) ингибированием синтазы 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), фермента, который ограничивает скорость пути биосинтеза порфирина/гема. См. Panhematin(r) product label, Lundbeck, Inc., октябрь 2010 г. Ингибирование ALA-синтазы должно приводить к пониженному образованию ALA и PBG, а также порфиринов и промежуточных соединений порфиринов.
Недостатки препаратов на основе гема (например, гемина) включают отсроченное влияние в отношении клинических симптомов и неспособность предотвратить рецидив приступов. Побочные реакции, ассоциированные с введением гема (например, гемина) могут включать флебит (например, тромбофлебит), затрудненность венозного доступа, антикоагуляцию (или коагулопатии), тромбоцитопению, отказ почек или перенасыщение железом, что особенно вероятно в случае пациентов, требующих нескольких курсов лечения гемином при рецидивирующих приступах. У пациентов с рецидивирующими приступами для предупреждения флебита необходим постоянный венозный катетер для возможности доступа. При высоких дозах может происходить повреждение почек. Редкие зарегистрированные побочные эффекты включают лихорадку, боль, чувство общего недомогания, гемолиз, анафилаксию и острую сосудистую недостаточность. См. Anderson, К.Е., Approaches to Treatment and Prevention of Human Porphyrias, в The Porphyrin Handbook: Medical Aspects of Porphyrins, Edited by Karl M. Kadish, Kevin M. Smith, Roger Guilard (2003) (далее в данном документе Anderson).
Гем сложно получать в стабильной форме для внутривенного введения. Он нерастворим при нейтральном рН, но его можно получать в виде гидроксида гема при рН 8 или выше. Anderson. Пангематин представляет собой лиофилизированный препарат гемина. При растворении лиофилизированного гемина для внутривенного введения быстро образуются продукты распада; эти продукты распада обуславливают временный антикоагулянтный эффект и флебит в участке инфузий. Anderson. Гемальбумин и аргинат гема (нормосанг, европейский вариант гемина) являются более стабильными и потенциально могут приводить к менее интенсивному тромбофлебиту. Однако, в Соединенных Штатах аргинат гема не одобрен для применения. Пангемин можно стабилизировать путем растворения его для инфузий в 30% альбумине человека вместо стерильной воды; однако, альбумин увеличивает внутрисосудистый объем и расширяющие эффекты и повышает стоимость лечения, а также риск, связанный с патогенами, поскольку его выделяют из крови человека. См., например, Anderson, выше.
Успешное лечение острого приступа не предупреждает или отсрочивает рецидив. Стоит вопрос о том, может ли сам гемин вызывать рецидивирующие приступы вследствие индукции гемоксигеназы. Несмотря на это, в некоторых областях (особенно Франции),
молодых женщин с несколькими рецидивирующими приступами с целью осуществления профилактики подвергают лечению гемином еженедельно.
Небольшой опыт трансплантации печени указывает на то, что при успешном исходе это можно считать эффективным лечением АГР. В Европе насчитывалось примерно 12 трансплантаций у пациентов, с лечебным или отличающимся эффектами. Трансплантация печени может восстанавливать нормальную экскрецию ALA и PBG и предупреждать острые приступы. См., например, Dar, F.S. et al. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 9(l):93-96 (2010). Кроме того, если печень пациента с АГР пересаживают другому пациенту ("домино-трансплантат"), у пациента, получающего трансплантат, может развиться АГР. Среди отдаленных клинических эффектов острых порфирий имеет место хроническая нейропатическая боль, которая может быть следствием прогрессирующей нейропатии, обусловленной нейротоксическими эффектами, например, повышенным содержанием предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG). Нейротоксические эффекты могут быть ассоциированы с образованием токсических промежуточных соединений гема, например, измененной передачей сигналов GABA и/или опосредованного железом окисления и образованием активных форм кислорода (ROS). Пациенты могут испытывать нейропатическую боль до или во время острого приступа. Пациенты старшего возраста могут испытывать усиленную нейропатическую боль с возрастом, для лечения которой, как правило, назначают различные наркотические лекарственные средства. У пациентов с острыми печеночными порфириями были зафиксированы нарушения электромиограммы и уменьшение времени проведения возбуждения. Следует отметить, что у мышей с АГР (недостаточность PBG-дезаминазы), которых не подвергали обработке и стимуляции, развивается прогрессирующая моторная нейропатия, которая, как было показано, вызывает прогрессирующую дегенерацию и гибель аксонов нерва, контролирующего четырехглавую мышцу, предположительно, вследствие постоянно повышенных уровней предшественников порфиринов (ALA и PBG), порфиринов и/или недостатка гема (Lindberg et al., J. Clin. Invest., 103(8): 1127-1134, 1999). Среди пациентов с острой порфирией (например, ADP, АГР, НСР или VP) между приступами уровни предшественников порфиринов (ALA и PBG) часто повышены у пациентов, у которых не наблюдаются симптомы и у пациентов, у которых наблюдаются симптомы. Таким образом, ожидается, что снижение количества предшественников порфиринов и
возобновление нормального биосинтеза гема посредством снижения уровня экспрессии и/или активности ALAS1, будет предупреждать и/или минимизировать развитие хронической и прогрессирующей нейропатии. Лечение, например, длительное лечение (например, периодическое лечение с помощью iRNA, описанной в данном документе, например, лечение согласно схеме дозирования, описанной в данном документе, например, еженедельное лечение или лечение два раза в неделю) может непрерывно снижать экспрессию ALAS1 у пациентов с острой порфирией, которые имеют повышенные уровни предшественников порфиринов, порфиринов, продуктов порфиринов или их метаболитов. Такое лечение может быть предусмотрено при необходимости предупреждения или снижения частоты или тяжести отдельных симптомов у пациента (например, боли и/или нейропатии) и/или снижения уровня предшественника порфирина, порфирина, продукта порфирина или метаболита.
Существует необходимость идентификации новых терапевтических средств, которые можно применять для лечения порфирий. Как было описано ранее, существующие варианты лечения, такие как продукты на основе гема (например, гемин), имеют многочисленные недостатки. Например, влияние гемина на клинические симптомы является отсроченным, он является дорогостоящим и может оказывать побочные эффекты (например, тромбофлебит, антикоагуляцию, тромбоцитопению, перенасыщение железом, отказ почек). Новые терапевтические средства, такие как описанные в данном документе, могут быть направлены на эти недостатки и неудовлетворенные потребности пациентов, с более быстрым действием, без индуцирования флебита, с обеспечением возможности подкожного введения, успешным предупреждением рецидивирующих приступов, предупреждением или облегчением болевых ощущений (например, хронической нейропатической боли) и/или прогрессирующей нейропатии, и/или они не вызывают определенных побочных эффектов, ассоциированных с гемином (например, перенасыщение железом, повышенный риск гепатоцеллюлярного рака).
Пациенты с AIA включают пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, и пациентов, которые испытывают острые, единичные приступы. Среди пациентов, которые испытывают рецидивирующие приступы, приблизительно 5-10% страдают от рецидивирующих перемежающихся приступов (2-3 приступа в год) или рецидивирующих приступов (> 4 приступов в год). Для этих пациентов вероятнее всего
рассматривается вопрос о трансплантации печени или получении профилактических инфузий гема (например, гемина). Пациенты с рецидивирующими приступами вероятнее всего имеют низкое качество жизни вследствие длительных пребываний в больнице, опиатной зависимости и/или токсичности для венозной сети. Длительное введение гема может индуцировать гемоксигеназу (НО-1). Таким образом, постепенное снижение дозы гема пациентам может составлять сложность, и некоторым требуется более частое введение. Некоторые врачи в связи с этим ограничивают применение гема до случаев с наиболее серьезными приступами. Соответственно, существует неудовлетворенная потребность в подходящей, эффективной профилактике и вариантах лечения с лучшей переносимостью.
Для пациентов, которые испытывают острые приступы, клинические рекомендации предполагают введение гема как можно раньше. Однако, учитывая трудности диагностики и отсутствие незамедлительной доступности лекарственных препаратов, введение может быть отсроченным. Медленное начало проявления эффектов гема (например, гемина) и его плохая переносимость замедляют наступление улучшения. В связи с наличием продолжительной сильной боли в животе, даже после введения гема, может потребоваться, чтобы пациенты получали опиаты в течение нескольких дней.
Отсроченное введение гема или продолжающееся воздействие провоцирующих факторов может приводить к более серьезным осложнениям, в том числе моторной нейропатии и сопутствующих симптомов (например, слабости, пареза). В тяжелых случаях может возникать дыхательная недостаточность и паралич. Восстановление от неврологических симптомов может потребовать намного дольше времени для выздоровления. Соответственно, в контексте острых приступов, необходимы варианты лечения, характеризующиеся ускоренным началом действия и лучшей переносимостью. Фармакологическая валидность ALAS 1 в качестве цели для сайленсинга mRNA основана по меньшей мере на следующих результатах: mRNA ALAS1 в значительной степени активирована во время приступа; пангематин подавляет ALAS-1, а добавление гема к клеткам печени в культуре приводит к пониженному количеству mRNA ALAS-1. Некоторые результаты также указывают на то, что подавление mRNA ALAS 1 может быть достигнуто путем нацеливания на печень. Например, было показано, что трансплантация печени характеризуется лечебным эффектом, а метаболиты из печени стимулируют
приступы (см., например, Dar et al. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 9:93-6 (2010); Dowman et al. Ann Intern Med 154:571-2 (2011); и Wu et al. Genes Dev 23:2201-2209 (2009). Поэтому снижение уровня экспрессии ALAS1, например, в печени, с применением композиций на основе iRNA, можно применять для лечения порфирий. Согласно определенным вариантам осуществления композиции на основе iRNA можно применять для профилактики и неотложного лечения порфирий. Например, композиции на основе iRNA можно применять профилактически при наступлении рецидивирующих приступов для индуцирования длительного или хронического подавления экспрессии ALAS1 (что приводит к длительному или хроническому подавлению ALA/PBG), и, таким образом, ослаблению рецидивирующей активации ALAS1, которая стимулирует приступы. Такое профилактическое лечение может снижать число и тяжесть приступов. Во время наступления острого приступа введение композиции на основе iRNA может оказывать лечебный эффект в отношении острого приступа, например, посредством снижения уровней ALA/PBG.
В настоящем раскрытии представлены способы и композиции на основе iRNA для модулирования экспрессии гена ALAS1. Согласно определенным вариантам осуществления экспрессию ALAS1 снижают или ингибируют с применением iRNA, специфической по отношению к ALAS1, что, таким образом, приводит к пониженной экспрессии гена ALAS1. Сниженная экспрессия гена ALAS1 может снижать уровень одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов или продуктов или метаболитов порфиринов. Пониженная экспрессия гена ALAS1, а также связанное с этим снижение уровня одного или нескольких предшественников порфиринов и/или порфиринов, может быть пригодным при лечении нарушений, связанных с экспрессией ALAS1, например, порфириями.
iRNA композиций, описанных в данном документе, включают нить РНК (антисмысловую нить) с участком, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, этот участок практически комплементарен по меньшей мере части mRNA-транскрипта гена ALAS1 (также называемого в данном документе "iRNA, специфическая по отношению к ALAS1"). Применение такой iRNA обеспечивает целевое разрушение mRNA генов, которые вовлечены в патологии, ассоциированные с экспрессией ALAS1 у
млекопитающих, например, порфирий, такие как порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (также известная как порфирия Досса или плюмбопорфирия) или острая перемежающаяся порфирия. Очень низкие дозы iRNA, специфических по отношению к ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1. iRNA, нацеленные на ALAS1, могут специфично и эффективно опосредовать RNAi, что приводит к значительному ингибированию экспрессии гена ALAS1, например, в анализах на клетках. Таким образом, способы и композиции, включающие эти iRNA, пригодны для лечения патологических процессов, связанных с экспрессией гена ALAS1, таких как порфирий (например, Х-сцепленная сидеробластическая анемия (XLSA), порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (порфирия Досса), острая перемежающаяся порфирия (АГР), врожденная эритропоэтическая порфирия, поздняя кожная порфирия, наследственная копропорфирия (копропорфирия), вариегатная порфирия, эритропоэтическая протопорфирия (ЕРР) и транзиторная эритропорфирия детского возраста).
В следующем описание раскрывается, как получать и применять композиции, содержащие iRNA, для ингибирования экспрессии гена ALAS 1, а также композиции и способы лечения заболеваний и нарушений, вызванных или модулируемых экспрессией этого гена. Варианты осуществления фармацевтических композиций, описанных в настоящем изобретении, включают iRNA с антисмысловой нитью, содержащей участок, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, при этом этот участок практически комплементарен по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1, вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Варианты осуществления композиций, описанных в настоящем изобретении, также включают iRNA с антисмысловой нитью с участком комплементарности, который составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и практически комплементарен по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS1.
Соответственно, согласно некоторым аспектам в настоящем изобретении описаны фармацевтические композиции, содержащие iRNA ALAS 1 и фармацевтически приемлемый носитель, способы применения композиций для ингибирования экспрессии
гена ALAS1, и способы применения фармацевтических композиций для лечения нарушений, связанных с экспрессией ALAS 1.
I. Определения
В целях удобства значение определенных выражений и фраз, используемых в настоящем описании, примерах и прилагаемой формуле изобретения, представлены ниже. При наличии очевидного несоответствия между использованием выражения в других частях настоящего описания и его определением, представленным в этом разделе, определение, данное в этом разделе, будет иметь преимущественную силу.
Каждый из "G," "С," "А," "Т" и "U", как правило, означает нуклеотид, который в качестве основания содержит гуанин, цитозин, аденин, тимидин и урацил соответственно. Однако, понятно, что выражение "рибонуклеотид", или "нуклеотид" также может означать модифицированный нуклеотид, который подробнее описан ниже, или заменяющий фрагмент в качестве заместителя. Специалисту в данной области хорошо известно, что гуанин, цитозин, аденин и урацил могут быть замещены другими фрагментами без значительного изменения свойств в отношении спаривания оснований олигонуклеотида, содержащего нуклеотид, несущий такой заменяющий фрагмент. Например, без ограничения, нуклеотид, содержащий инозин в качестве основания, может образовывать пару оснований с нуклеотидами, содержащими аденин, цитозин или урацил. Следовательно, нуклеотиды, содержащие урацил, гуанин или аденин, могут быть замещены в нуклеотидных последовательностях dsRNA, описанных в настоящем изобретении, нуклеотидами, содержащими, например, инозин. Согласно другому примеру аденин и цитозин в любом месте в олигонуклеотиде могут быть замещены гуанином и урацилом соответственно, с образованием неоднозначного спаривания оснований G-U с целевой mRNA. Последовательности, содержащие такие заменяющие фрагменты, пригодны для композиций и способов, описанных в настоящем изобретении. Используемое в данном документе выражение "ALAS1" (также известное как ALAS-1; 8-аминолевулинатсинтаза 1; 8-ALA синтаза 1; синтаза 5' -аминолевулиновой кислоты 1; ALAS-H; ALASH; ALAS-N; ALAS3; ЕС2.3.1.37; 5-аминолевулинатсинтаза, неспецифическая, митохондриальная; ALAS; MIG4; OTTHUMP00000212619; OTTHUMP00000212620; OTTHUMP00000212621; OTTHUMP00000212622;
индуцирующий миграцию белок 4; ЕС 2.3.1 ) относится к кодируемому ядром митохондриальному ферменту, который является первым и, как правило, скорость-лимитирующим ферментом в пути биосинтеза гема млекопитающих. ALAS1 катализирует конденсацию глицина с сукцинил-КоА с образованием 8-аминолевулиновой кислоты (ALA). Ген ALAS1 человека экспрессируется повсеместно, находится в хромосоме Зр21.1 и, как правило, кодирует последовательность из 640 аминокислот. В отличие от этого, ген ALAS-2, который кодирует изозим, экспрессируется только в эритроцитах, находится в хромосоме Хр 11.21 и, как правило, кодирует последовательность из 550 аминокислот. Используемое в данном документе выражение "белок ALAS1" означает любой вариант белка ALAS 1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата), а также его любые мутанты и фрагменты, которые сохраняют активность ALAS1. Аналогично, "транскрипт ALAS1" относится к любому варианту транскрипта ALAS1 из любого вида (например, человека, мыши, низшего примата). Последовательность mRNA-транскрипта ALAS1 человека можно найти как NM 000688.4 (ФИГ. ЗА и ФИГ. ЗВ; SEQ ID N0:1). Другой mRNA-транскрипт ALAS1 человека можно найти как NM_000688.5 (ФИГ. 4А и ФИГ. 4В; SEQ Ш N0:382). Уровень зрелого кодируемого белка ALAS1 регулируется гемом: высокие уровни гема подавляют зрелый фермент в митохондрии, в то время как низкие уровни гема активируют его. Было выявлено несколько образованных в результате альтернативного сплайсинга вариантов, кодирующих этот же белок.
Используемое в данном документе выражение "iRNA", "RNAi", "средство на основе iRNA" или "средство для RNAi" относится к средству, которое содержит РНК в том значении, в каком это выражение определено в данном документе, и которое опосредует целевое расщепление РНК-транскрипта, например, через путь с участием индуцируемого РНК комплекса сайленсинга (RISC). Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, влияет на ингибирование экспрессии ALAS1. Ингибирование экспрессии ALAS1 можно оценивать по снижению уровня mRNA ALAS1 или снижению уровня белка ALAS1. Использованное в данном документе выражение "целевая последовательность" относится к непрерывной части нуклеотидной последовательности молекулы mRNA, образованной в процессе транскрипции гена ALAS 1, в том числе к mRNA, которая является продуктом процессинга РНК первичного продукта транскрипции. Целевая часть последовательности будет по
меньшей мере достаточно длинной для того, чтобы выполнять роль субстрата для iRNA-направленного расщепления в этой части или рядом с этой частью. Например, целевая последовательность будет, как правило, составлять 9-36 нуклеотидов в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину, в том числе все поддиапазоны между ними. В качестве неограничивающих примеров целевая последовательность может состоять из 15-30 нуклеотидов, 15-26 нуклеотидов, 15-23 нуклеотидов, 15-22 нуклеотидов, 15-21 нуклеотида, 15-20 нуклеотидов, 15-19 нуклеотидов, 15-18 нуклеотидов, 15-17 нуклеотидов, 18-30 нуклеотидов, 18-26 нуклеотидов, 18-23 нуклеотидов, 18-22 нуклеотидов, 18-21 нуклеотида, 18-20 нуклеотидов, 19-30 нуклеотидов, 19-26 нуклеотидов, 19-23 нуклеотидов, 19-22 нуклеотидов, 19-21 нуклеотида, 19-20 нуклеотидов, 20-30 нуклеотидов, 20-26 нуклеотидов, 20-25 нуклеотидов, 20-24 нуклеотидов, 20-23 нуклеотидов, 20-22 нуклеотидов, 20-21 нуклеотида, 21-30 нуклеотидов, 21-26 нуклеотидов, 21-25 нуклеотидов, 21-24 нуклеотидов, 21-23 нуклеотидов или 21-22 нуклеотидов.
Используемое в данном документе выражение "нить, содержащая последовательность" относится к олигонуклеотиду, содержащему цепь из нуклеотидов, которая характеризуется последовательностью, обозначаемой с применением стандартной номенклатуры нуклеотидов.
Используемое в данном документе, и если не указано иное, выражение "комплементарный" при использовании для описания первой нуклеотидной последовательности по отношению ко второй нуклеотидной последовательности означает способность олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую нуклеотидную последовательность, гибридизироваться и образовывать дуплексную структуру при определенных условиях с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность, как будет понятно специалисту в данной области. Такие условия, например, могут представлять собой жесткие условия, где жесткие условия могут включать: 400 мМ NaCl, 40 мМ PIPES рН 6,4, 1 мМ EDTA, 50°С или 70°С в течение 12-16 часов с последующим отмыванием. Можно применять другие условия, такие как физиологически соответствующие условия, характерные для организма. Специалист в данной области сможет определить набор условий, наиболее подходящих
для тестирования комплементарности двух последовательностей в соответствии с конечным применением гибридизированных нуклеотидов.
Комплементарные последовательности в iRNA, например, в dsRNA, описанных в данном документе, включают образование пар оснований олигонуклеотида или полинуклеотида, содержащего первую полинуклеотидную последовательность, с олигонуклеотидом или полинуклеотидом, содержащим вторую нуклеотидную последовательность по всей длине одной или обеих нуклеотидных последовательностей. Такие последовательности могут быть указаны в данном документе как "полностью комплементарные" по отношению друг к другу. Однако, при указании первой последовательности как "практически комплементарной" по отношению ко второй последовательности, две последовательности могут быть полностью комплементарными, или они могут образовывать одну или несколько, но, как правило, не более 5, 4, 3 или 2 ошибочно спаренных пар оснований при гибридизации с образованием дуплекса вплоть до 30 пар оснований, с сохранением при этом способности гибридизоваться при условиях, наиболее соответствующих их конечному применению, например, ингибировании экспрессии гена посредством пути RISC. Однако, когда два олигонуклеотида предназначены образовывать при гибридизации один или несколько однонитевых выступов, то такие выступы не будут считаться ошибочными спариваниями применительно к определению комплементарности. Например, dsRNA, содержащая один олигонуклеотид из 21 нуклеотида в длину и другой олигонуклеотид из 23 нуклеотидов в длину, где более длинный олигонуклеотид содержит последовательность из 21 нуклеотида, которая полностью комплементарна более короткому олигонуклеотиду, может быть указана как "полностью комплементарная" для целей, описанных в данном документе.
"Комплементарные" последовательности, используемые в данном документе, могут также включать или могут быть образованы полностью из пар оснований, образованных не по модели Уотсона-Крика, и/или пар оснований, образованных из не встречающихся в природе и модифицированных нуклеотидов, в такой степени, при которой выполняются вышеуказанные требования по отношению к их способности гибридизоваться. Такие пары оснований, образованные не по модели Уотсона-Крика, включают без ограничения неоднозначное или хугстиновское спаривание оснований G:U.
Выражения "комплементарный", "полностью комплементарный" и "практически комплементарный" в настоящем документе могут быть использованы по отношению к совпадению оснований между смысловой нитью и антисмысловой нитью dsRNA или между антисмысловой нитью средства на основе iRNA и целевой последовательностью, как будет понятно из контекста их использования.
Используемый в данном документе полинуклеотид, который "практически комплементарен по меньшей мере части" матричной РНК (mRNA) относится к полинуклеотиду, который практически комплементарен непрерывной части mRNA, представляющей интерес, (например, mRNA, кодирующей белок ALAS1). Например, полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS 1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS 1. В качестве другого примера полинуклеотид комплементарен по меньшей мере части mRNA ALAS 1, если последовательность практически комплементарна непрерывной части mRNA, кодирующей ALAS1.
Выражение "двунитевая РНК" или "dsRNA," используемое в данном документе, относится к iRNA, которая включает молекулу РНК или комплекс молекул с гибридизированным участком дуплекса, который содержит две антипараллельные и практически комплементарные нити нуклеиновых кислот, которые будут указаны как характеризующиеся "смысловой" и "антисмысловой" ориентацией по отношению к целевой РНК. Участок дуплекса может быть любой длины, обеспечивающей специфическое разрушение требуемой целевой РНК, например, посредством пути RISC, но диапазон длины которой, как правило, будет составлять 9-36 пар оснований, например, 15-30 пар оснований в длину. С учетом дуплекса из 9-36 пар оснований, дуплекс может быть любой длины в этом диапазоне, например, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35 или 36 или в любом поддиапазоне между ними, в том числе без ограничения 15-30 пар оснований, 15-26 пар оснований, 1523 пары оснований, 15-22 пары оснований, 15-21 пару оснований, 15-20 пар оснований, 15-19 пар оснований, 15-18 пар оснований, 15-17 пар оснований, 18-30 пар оснований, 1826 пар оснований, 18-23 пары оснований, 18-22 пары оснований, 18-21 пару оснований,
18- 20 пар оснований, 19-30 пар оснований, 19-26 пар оснований, 19-23 пары оснований,
19- 22 пары оснований, 19-21 пару оснований, 19-20 пар оснований, 20-30 пар оснований,
18-
20-26 пар оснований, 20-25 пар оснований, 20-24 пары оснований, 20-23 пары оснований,
20- 22 пары оснований, 20-21 пару оснований, 21-30 пар оснований, 21-26 пар оснований,
21- 25 пар оснований, 21-24 пары оснований, 21-23 пары оснований или 21-22 пары оснований. dsRNA, образованные в клетке при обработке дайсером и подобными ферментами, как правило, находятся в диапазоне 19-22 пар оснований в длину. Одна нить участка дуплекса dsDNA содержит последовательность, которая практически комплементарна участку целевой РНК. Две нити, образующие дуплексную структуру, могут быть получены из одной молекулы РНК по меньшей мере с одним самокомплементарным участком, или могут быть получены из двух или более отдельных молекул РНК. Если участок дуплекса образован из двух нитей одной молекулы, то молекула может иметь участок дуплекса, отделенный однонитевой цепью нуклеотидов (называемой в данном документе "петля шпилька") между 3'-концом одной нити и 5'-концом соответствующей другой нити, образующей дуплексную структуру. Петля "шпилька" может содержать по меньшей мере один неспаренный нуклеотид; согласно некоторым вариантам осуществления петля "шпилька" может содержать по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 20, по меньшей мере 23 или более неспаренных нуклеотидов. Если две практически комплементарные нити dsRNA составлены из отдельных молекул РНК, то эти молекулы не должны, но могут быть соединены ковалентной связью. Если эти две нити ковалетно соединены посредством способов, отличных от петли "шпильки", то соединяющая структура называется "линкер." Выражение "siRNA" также используют в данном документе для обозначения dsRNA, описанной выше.
Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA может быть "однонитевой siRNA", которую вводят в клетку или организм для ингибирования целевой mRNA. Однонитевые средства для RNAi связываются с Argonaute 2 комплекса RISC, обладающим эндонуклеазной активностью, который затем расщепляет целевую mRNA. Однонитевые siRNA, как правило, составляют 15-30 нуклеотидов и химически модифицированы. Конструирование и тестирование однонитевых siRNA описаны в патенте США № 8101348 и в Lima et al, (2012) Cell 150: 883-894, полное содержание каждого из которых, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки.
Любые из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе (например, последовательностей, представленные в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в таблицах 21-40), можно применять в качестве однонитевой siRNA, описанной в данном документе или химически модифицированной способами, описанными в Lima etal, (2012) Cell 150:883-894.
Согласно другому аспекту средство на основе РНК представляет собой "молекулу однонитевой антисмысловой РНК". Молекула однонитевой антисмысловой РНК комплементарна последовательности в целевой mRNA. Молекулы однонитевой антисмысловой РНК могут ингибировать трансляцию стехиометрическим образом путем спаривания оснований с mRNA и физического нарушения механизма трансляции, см., Dias, N. et al., (2002) Mol Cancer Ther 1:347-355. Альтернативно, однонитевые антисмысловые молекулы ингибируют целевую mRNA путем гибридизации с целью и расщепления цели посредством расщепления с помощью RNaseH. Молекула однонитевой антисмысловой РНК может составлять от приблизительно 10 до приблизительно 30 нуклеотидов в длину и иметь последовательность, которая комплементарна целевой последовательности. Например, молекула однонитевой антисмысловой РНК может содержать последовательность, которая включает по меньшей мере приблизительно 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из любой из антисмысловых нуклеотидных последовательностей, описанных в данном документе, например, последовательностей, представленных в любой из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20 или в таблицах 21-40.
Специалист в данной области поймет, что выражение "молекула РНК" или "молекула рибонуклеиновой кислоты" охватывает не только молекулы РНК, экспрессируемые или встречающиеся в природе, но также аналоги и производные РНК, содержащие один или несколько рибонуклеотидных/рибонуклеозидных аналогов или производных, описанных в данном документе или известных из уровня техники. Строго говоря, "рибонуклеозид" включает нуклеозидное основание и рибозу, а "рибунуклеотид" представляет собой рибонуклеозид с одной, двумя или тремя фосфатными фрагментами. Однако, выражения "рибунуклеозид" и "рибонуклеотид", используемые в данном документе, можно считать эквивалентными. РНК можно модифицировать в отношении
структуры нуклеотидных оснований, структуры рибозы или структуры рибозо-фосфатного остова, например, как описано ниже в данном документе. Однако, молекулы, содержащие рибонуклеозидные аналоги или производные, должны сохранять способность образовывать дуплекс. В качестве неограничивающих примеров молекула РНК также может включать по меньшей мере один модифицированный рибонуклеозид, в том числе без ограничения 2'-0-метил-модифицированный нуклеозид, нуклеозид, содержащий 5' фосфотиоатную группу, концевой нуклеозид, соединенный с группой производного холестерила или группой бисдециламида додекановой кислоты, запертый нуклеозид, ациклический нуклеозид, нуклеозид с удаленными основаниями, 2'-дезокси-2'-фтор-модифицированный нуклеозид, 2'-амино-модифицированный нуклеозид, 2'-алкил-модифицированный нуклеозид, морфолиновый нуклеозид, фосфорамидат или нуклеозид, содержащий не встречающиеся в природе основания, или их комбинацию. Альтернативно, молекула РНК может содержать по меньшей мере два модифицированных рибонуклеозида, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7, по меньшей мере 8, по меньшей мере 9, по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20 или более, вплоть до полной длины молекулы dsRNA. Модификации не обязательно должны быть одинаковыми для каждого из такого множества модифицированных рибонуклеозидов в молекуле РНК. Согласно одному варианту осуществления модифицированные РНК, предполагаемые для применения в способах и композициях, описанных в данном документе, представляют собой пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA), которые характеризуются способностью образовывать необходимую дуплексную структуру, и которые обеспечивают или опосредуют специфическое разрушение целевой РНК, например, посредством пути RISC.
Согласно одному аспекту модифицированный рибонуклеозид включает дезоксирибонуклеозид. В таком случае средство на основе iRNA может содержать один или несколько дезоксирибонуклеозидов, в том числе, например, дезоксирибонуклеозидный(дезоксирибонуклеозидные) выступающий(выступающие) конец(концы) или один или несколько дезоксинуклеозидов в двунитевой части dsRNA. Согласно определенным вариантам осуществления процентное содержание в молекуле РНК дезоксирибонуклеозидов составляет по меньшей мере 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% или выше (но не 100%) дезоксирибонуклеозидов,
например, в одной или обеих нитях. Согласно другим вариантам осуществления выражение "iRNA" не охватывает двунитевую молекулу ДНК (например, встречающуюся в природе двунитевую молекулу ДНК или молекулу ДНК, содержащую 100% дезоксинуклеозидов). Согласно одному аспекту средство для РНК-интерференции включает однонитевую РНК, которая взаимодействует с целевой последовательностью РНК для расщепления целевой РНК. Без углубления в теорию, длинная двунитевая РНК, введенная в клетки, разрезается на siRNA эндонуклеазой III типа, известной как дайсер (Sharp et al., Genes Dev. 2001, 15:485). Дайсер, фермент, подобный рибонуклеазе III типа, обеспечивает процессинг dsRNA на короткие интерферирующие РНК длиной 19-23 пары оснований с характерными 3'-выступающими концами из двух оснований (Bernstein, et al., (2001) Nature 409:363). siRNA затем включаются в индуцируемый РНК комплекс сайленсинга (RISC), в котором одна или несколько хеликаз раскручивают дуплекс siRNA, что позволяет комплементарной антисмысловой нити направлять целевое распознавание (Nykanen, et al., (2001) Cell 107:309). После связывания с соответствующей целевой mRNA одна или несколько эндонуклеаз в RISC расщепляет цель для индукции сайленсинга (Elbashir, et al., (2001) Genes Dev. 15:188). Таким образом, согласно одному аспекту настоящее изобретение относится к однонитевой РНК, которая способствует образованию RISC-комплекса с осуществлением сайленсинга целевого гена.
Используемое в данном документе выражение "нуклеотидный выступающий конец" относится по меньшей мере к одному неспаренному нуклеотиду, который выступает из дуплексной структуры iRNA, например, dsRNA. Например, если 3'-конец одной нити dsRNA выходит за пределы 5'-конца другой нити или наоборот, то образуется нуклеотидный выступающий конец. dsRNA может содержать выступающий конец по меньшей мере из одного нуклеотида; альтернативно, выступающий конец может содержать по меньшей мере два нуклеотида, по меньшей мере три нуклеотида, по меньшей мере четыре нуклеотида, по меньшей мере пять нуклеотидов или более. Нуклеотидный выступающий конец может содержать нуклеотидный/нуклеозидный аналог или состоять из нуклеотидного/нуклеозидного аналога, в том числе дезоксинуклеотида/нуклеозида. Выступающий(выступающие) конец(концы) может(могут) находиться в пределах смысловой нити, антисмысловой нити или их комбинации. Кроме того, нуклеотид(нуклеотиды) выступающего конца может(могут)
присутствовать на 5'-конце, З'-конце или обоих концах или антисмысловой, или смысловой нити dsRNA.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на З'-конце и/или 5'-конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить dsRNA имеет выступающий конец из 1-10 нуклеотидов на З'-конце и/или 5'-конце. Согласно другому варианту осуществления один или несколько нуклеотидов выступающего конца замещают нуклеозидтрифосфатом.
Выражение "тупой конец" или "с тупыми концами", используемые в данном документе в отношении dsRNA, означают, что на данном терминальном конце dsRNA отсутствуют неспаренные нуклеотиды или нуклеотидные аналоги, т. е., отсутствует нуклеотидный выступающий конец. Один или оба конца dsRNA могут быть тупыми. Если оба конца dsRNA являются тупыми, то dsRNA называется dsRNA с тупыми концами. Для внесения ясности, dsRNA "с тупыми концами" представляет собой dsRNA, которая является тупой по обоим концам, т. е., ни на одном из концов молекулы нет нуклеотидного выступающего конца. Чаще всего такая молекула будет двунитевой по всей длине.
Выражение "антисмысловая нить" или "направляющая нить" относится к нити iRNA, например, dsRNA, которая включает участок, который практически комплементарен целевой последовательности. Используемое в данном документе выражение "участок комплементарности" относится к участку антисмысловой нити, который практически комплементарен последовательности, например, целевой последовательности, определенной выше. Если участок комплементарности не полностью комплементарен целевой последовательности, то ошибочные спаривания могут находиться во внутренних или концевых участках молекулы. Как правило, допустимые в наибольшей степени ошибочные спаривания находятся в концевых участках, например, по 5, 4, 3 или 2 нуклеотиду 5'- и/или 3'-конца.
Выражение "смысловая нить", или "сопровождающая нить", используемое в данном документе, относится к нити iRNA, которая включает участок, практически комплементарный участку антисмысловой нити, как это выражение определено выше.
Используемое в данном документе выражение "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид. SNALP представляет собой везикулу из липидов,
покрывающих внутреннее пространство со сниженным водным содержимым, содержащий нуклеиновую кислоту, такую как iRNA, или плазмиду, из которой транскрибируется iRNA. SNALP описаны, например, в опубликованных патентных заявках США №№ 20060240093, 20070135372 и международной заявке № WO 2009082817. Эти заявки включены в данный документ при помощи ссылки по всей своей полноте.
Специалистам в данной области понятно, что "введение в клетку" в отношении iRNA означает облегчение или осуществление захвата или абсорбции клеткой. Абсорбция или захват iRNA может происходить путем спонтанных диффузионных или активных клеточных процессов, или при помощи вспомогательных средств или приспособлений. Значение этого выражения не ограничено клетками in vitro; iRNA также может быть "введена в клетку," при этом клетка является частью живого организма. В таком случае введение в клетку будет включать доставку в организм. Например, в случае in vivo доставки iRNA может быть инъецирована в определенный участок ткани или введена системно. In vivo доставку также можно осуществлять с помощью системы доставки на основе Р-глюкана, такой как описанные в патентах США №№ 5032401 и 5607677, и публикации патента США № 2005/0281781, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей свой полноте. In vitro введение в клетку включает известные из уровня техники способы, такие как электропорация и липофекция. Дополнительные подходы описаны ниже в данном документе или известны из уровня техники.
Используемое в данном документе выражение "модулировать экспрессию" относится по меньшей мере к частичному "ингибированию" или частичной "активации" экспрессии гена ALAS 1 в клетке, обработанной композицией на основе iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии ALAS1 в контрольной клетке. Контрольная клетка включает необработанную клетку, или клетку, обработанную нецелевой контрольной iRNA.
Выражения "активировать", "усиливать", "активировать экспрессию", "повышать экспрессию" и т. п., в части данного документа, где они относятся к гену AL AS 1, относятся по меньшей мере к частичной активации экспрессии гена ALAS1, которая проявляется в повышении количества mRNA ALAS 1, которую можно выделить из первой клетки или группы клеток или выявить в первой клетке или группе клеток, в которой ген ALAS 1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были
обработаны с повышением экспрессии гена ALAS 1 относительно второй клетки или группы клеток, практически идентичных первой клетке или группе клеток, но которая не была обработана или которые не были обработаны подобным образом (контрольные клетки).
Согласно одному варианту осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS 1 активирован по меньшей мере приблизительно на 60%, 70% или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 активирована по меньшей мере приблизительно на 85%, 90% или 95% или более путем введения iRNA, описанной в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия гена ALAS1 повышена по меньшей мере в 1 раз, по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 50 раз, по меньшей мере в 100 раз, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз или более в клетках, обработанных iRNA, описанной в данном документе, относительно экспрессии в необработанных клетках. Активация экспрессии малыми dsRNA описана, например, в Li et al., 2006 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103:17337-42, и в US20070111963 и US2005226848, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Выражения "осуществлять сайленсинг", "ингибировать экспрессию", "осуществлять негативную регуляцию", "подавлять экспрессию" и т. п. в части данного документа, где они относятся к гену ALAS 1, относятся по меньшей мере к частичному подавлению экспрессии гена ALAS1, что оценивают, например, по экспрессии mRNA ALAS1, экспрессии белка ALAS1 или другому показателю, функционально связанному с экспрессией гена ALAS1 (например, концентрациям ALA или PBG в плазме или моче). Например, ингибирование экспрессии ALAS 1 может проявляться в снижении количества mRNA ALAS 1, которая может быть выделена из первой клетки или группы клеток или выявлена в первой клетке или группе клеток, в которых ген ALAS 1 транскрибируется, и которая была обработана или которые были обработаны так, что экспрессия гена ALAS 1 ингибируется относительно контроля. Контролем может быть вторая клетка или группа клеток, практически идентичная первой клетке или группе клеток, за исключением того,
что вторая клетка или группа клеток не была обработана подобным образом (контрольные клетки). Степень ингибирования, как правило, выражена в виде процента контрольного уровня, например,
( mRNA в контрольных клетках) - (mRNA в обработанных клетках) (mRNA в контрольных клетках)
Альтернативно, степень ингибирования может быть выражена с точки зрения снижения показателя, который функционально связан с экспрессией гена ALAS1, например, количества белка, кодируемого геном ALAS 1, или уровня одного или нескольких порфиринов. Снижение показателя, функционально связанного с экспрессией гена ALAS 1,подобным образом может быть выражено в виде процента от контрольного уровня. В целом, сайленсинг гена ALAS1 можно определять в любой клетке, экспрессирующей ALAS1 либо конститутивно, либо при помощи генной инженерии, и при помощи любого подходящего анализа. Однако, если требуется информация для определения, ингибирует ли данная iRNA экспрессию гена ALAS 1 в определенной степени и, таким образом, охватывается настоящим изобретением, роль такой информации будут выполнять анализы, представленные ниже в примерах.
Например, в некоторых случаях экспрессия гена ALAS1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% или 50% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS1 подавляется по меньшей мере на приблизительно 60%, 65%, 70%, 75% или 80% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам осуществления ген ALAS 1 подавляется по меньшей мере приблизительно на 85%, 90%, 95%, 98% или 99% путем введения iRNA, описанной в настоящем изобретении.
Используемые в контексте экспрессии ALAS1 выражения "лечить", "осуществлениея лечения", "лечение" т. п. относятся к ослаблению или облегчению патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS 1 (например, патологических процессов, включающих порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например, порфирий). В контексте настоящего изобретения в части, касающейся
любых из других состояний, упомянутых ниже в данном документе (кроме патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS1), выражения "лечить", "лечение" и т. п. означают предупреждение, облегчение или ослабление по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с таким состоянием, или замедление или устранение прогрессирования или прогнозирование прогрессирования такого состояния. Например, способы, описанные в данном документе, при использовании для лечения порфирий, могут служить для облегчения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией (например, болевых ощущений), снижения тяжести или частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, укорочения приступа, связанного с порфирией, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, гепатоцеллюлярного рака или нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии)). Таким образом, если контекст явно не указывает на иное, предполагается, что выражения "лечить," "лечение" и т. п. охватывают профилактику, например, предупреждение нарушения и/или симптомов нарушений, связанных с экспрессией ALAS 1.
Под выражением "снижать" в контексте маркера или симптома нарушения понимают статистически или клинически значимое снижение такого уровня. Снижение, например, может составлять по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или более и, как правило, вплоть до уровня, соответствующего уровню в пределах нормы для индивида без такого нарушения.
Используемые в данном документе фразы "терапевтически эффективное количество" и "профилактически эффективное количество" относятся к количеству, которое дает терапевтическое преимущество при лечении, предупреждении или контроле патологических процессов, связанных с экспрессией ALAS 1. Конкретное количество, которое является терапетически эффективным, может быть легко определено рядовым врачом, и может варьировать в зависимости от факторов, известных в уровне техники, таких как, например, тип патологического процесса, история болезни и возраст пациента, стадия патологического процесса и введение других средств.
Используемое в данном документе выражение "фармацевтическая композиция" содержит фармакологически эффективное количество iRNA и фармацевтически приемлемый носитель. Используемое в данном документе выражение "фармакологически эффективное количество", "терапевтически эффективное количество" или просто "эффективное количество" относится к такому количеству iRNA, эффективному для получения предполагаемого фармакологического, терапевтического или превентивного результата. Например, в способе лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, в способе лечения порфирий), эффективное количество включает количество, эффективное для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, количество, эффективное для снижения частоты приступов, количество, эффективное для снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, или количество, эффективное для снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Например, если определенное клиническое лечение считается эффективным, когда имеет место по меньшей мере 10% снижение измеряемого показателя, ассоциированного с заболеванием или нарушением, то терапевтически эффективное количество лекарственного средства для лечения этого заболевания или нарушения представляет собой количество, необходимое для получения по меньшей мере 10% снижения этого значения. Например, терапевтически эффективное количество iRNA, нацеленной на ALAS1, может снижать уровни белка ALAS1 на любое измеряемое количество, например, по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%.
Выражение "фармацевтически приемлемый носитель" относится к носителю для введения терапевтического средства. Такие носители включают без ограничения солевой раствор, забуференный солевой раствор, декстрозу, воду, глицерол, этанол и их комбинацию. Выражение, в частности, исключает среду для культивирования клеток. Для лекарственных средств, вводимых перорально, фармацевтически приемлемые носители включают без ограничения фармацевтически приемлемые вспомогательные средства, такие как инертные разбавители, средства для улучшения распадаемости, связывающие средства, смазывающие средства, подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция,
фосфат натрия и кальция и лактозу, в то время как кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются подходящими средствами для улучшения распадаемости. Связывающие средства могут включать крахмал и желатин, в то время как смазывающие средства, если присутствуют, будут представлять собой, как правило, стеарат магния, стеариновую кислоту и тальк. При необходимости, таблетки могут быть покрыты веществом, таким как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат, для задержки всасывания в желудочнокишечном тракте. Средства, включенные в составы лекарственных средств, дополнительно описаны ниже в данном документе.
Выражение "приблизительно" в отношении числа или числового диапазона означает, что указанное число или числовой диапазон является приближением в пределах колебания экспериментальных данных (или в пределах статистической ошибки эксперимента), и, таким образом, число или числовой диапазон могут варьировать, например, от 1 до 15% указанного числа или числового диапазона.
П. Средства на основе iRNA
В данном документе описаны средства на основе iRNA, которые ингибируют экспрессию гена ALAS1. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA включает молекулы двунитевой рибонуклеиновой кислоты (dsRNA) для ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке или у субъекта (например, у млекопитающего, например, у человека с порфирией), где dsRNA включает антисмысловую нить с участком комплементарности, который комплементарен по меньшей мере части mRNA, образованной в результате экспрессии гена ALAS1, и где участок комплементарности составляет 30 нуклеотидов или менее в длину, как правило, 19-24 нуклеотида в длину, и где dsRNA при контакте с клеткой, экспрессирующей ген ALAS1, ингибирует экспрессию гена ALAS1 по меньшей мере на 10%, при анализе, например, с помощью PCR или способа на основе разветвленной ДНК (bDNA), или с помощью способа на основе определения белков, такого как вестерн-блоттинг. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA активирует экспрессию гена ALAS1 в клетке или у млекопитающего. Экспрессию гена ALAS1 в культуре клеток, таких как клетки COS, клетки HeLa, первичные гепатоциты, клетки HepG2, первичные культивируемые клетки, или в биологическом образце от субъекта, можно анализировать
путем измерения уровней mRNA ALAS 1, например, с помощью анализа bDNA или TaqMan, или путем измерения уровней белка, например, с помощью имунофлуоресцентного анализа, с применением, например, методик вестерн-блоттинга или проточной цитометрии.
dsRNA включает две нити РНК, которые достаточно комплементарны для гибридизации, с образованием дуплексной структуры при условиях, в которых dsRNA будет применяться. Одна нить dsRNA (антисмысловая нить) включает участок комплементарности, который практически комплементарен, и, как правило, полностью комплементарен целевой последовательности, полученной из последовательности mRNA, образованной в ходе экспрессии гена ALAS1. Другая нить (смысловая нить) включает участок, который комплементарен антисмысловой нити, таким образом, что две нити гибридизируются и образуют дуплексную структуру при объединении при подходящих условиях. Как правило, дуплексная структура составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 пару оснований в длину включительно. Аналогично, участоккомплементарности целевой последовательности составляет 15-30 включительно, чаще 18-25 включительно, еще чаще 19-24 включительно, и чаще всего 19-21 нуклеотид в длину включительно. Согласно некоторым вариантам осуществления dsRNA составляет 15-20 нуклеотидов в длину включительно, и согласно другим вариантам осуществления dsRNA составляет 25-30 нуклеотидов в длину включительно. Специалисту в данной области будет понятно, что целевой участок РНК, предназначенный для расщепления, зачастую будет представлять собой часть более крупной молекулы РНК, обычно молекулы mRNA. При необходимости, "часть" целевой mRNA представляет собой непрерывную последовательность целевой mRNA достаточной длины, чтобы быть субстратом для RNAi-направленного расщепления (т. е., расщепления посредством пути RISC). dsRNA с дуплексами по меньшей мере из 9 пар оснований могут при некоторых обстоятельствах опосредовать RNAi-направленное расщепление РНК. Наиболее часто цель будет составлять по меньшей мере 15 нуклеотидов в длину, например, 15-30 нуклеотидов в длину.
Специалисту в данной области такжебудет понятно, что участок дуплекса представляет собой основную функциональную часть dsRNA, например, участок дуплекса из 9-36, например, 15-30 пар оснований. Таким образом, согласно одному варианту
осуществления в том случае, когда он процессирован до функционального дуплекса, например, из 15-30 пар оснований, который нацелен на необходимую РНК для расщепления, молекула РНК или комплекс из молекул РНК с участком дуплекса из более 30 пар оснований представляет собой dsRNA. Таким образом, специалисту в данной области будет понятно, что согласно одному варианту осуществления miRNA представляет собой dsRNA. Согласно другому варианту осуществления dsRNA представляет собой не встречающуюся в природе miRNA. Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA, пригодное для нацеливания экспрессии ALAS 1, не образуется в целевой клетке путем расщепления более крупной dsRNA.
dsRNA, описанная в данном документе, может дополнительно включать один или несколько однонитевых нуклеотидных выступающих концов. dsRNA может быть синтезирована при помощи стандартных способов, известных из уровня техники, дополнительно описанных ниже, например, с применением автоматического синтезатора ДНК, такого как коммерчески доступные, например, от Biosearch, Applied Biosystems, Inc. Согласно одному варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS1 человека. Согласно другому варианту осуществления ген ALAS1 представляет собой ген ALAS 1 мыши или крысы.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в таблицах 21 -40, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность, раскрытую в данном документе, например, в таблицах 21-40.
Согласно конкретным вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из таблицы 2 или таблицы 3, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из таблицы 2 или таблицы 3. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает
антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 или 15. Согласно вариантам осуществления первая последовательность представляет собой смысловую нить dsRNA, которая включает смысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20, и вторая последовательность представляет собой антисмысловую нить dsRNA, которая включает антисмысловую последовательность из таблицы 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 или 20.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из смысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в таблицах 21 -40, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из антисмысловых последовательностей, представленных в данном документе, например, в таблицах 21-40.
Согласно одному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в таблицах 2 и 3, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из таблиц 2 и 3. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14 и 15. Согласно дополнительному аспекту dsRNA может включать по меньшей мере смысловую и антисмысловую нуклеотидные последовательности, при этом смысловую нить выбирают из группы последовательностей, представленных в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20, и соответствующую антисмысловую нить смысловой нити выбирают из таблиц 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18 и 20.
Согласно вариантам осуществления iRNA представляет собой AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419 (например, в
том числе нуклеотидную последовательность и/или одну или несколько (например, все) из модификаций упомянутых выше dsRNA). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности (в том числе одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из антисмысловой последовательности AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419. Согласно вариантам осуществления iRNA содержит смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности (и/или одной или нескольких (например, всех модификаций)), выбранной из AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900, AD-60935, AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193, AD-60519, AD-60519, AD-60901, AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925, AD-60926, AD-60820, AD-60843, AD-60819, AD-61140, AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145, AD-61146, AD-60892 или AD-60419.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU или UAAGAUGAGACACUCTTJUCUGGU, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит последовательность или состоит из последовательности CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA. Согласно вариантам осуществления один или несколько нуклеотидов антисмысловой нити и/или смысловой нити модифицированы, как описано в данном документе.
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60519 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-61193 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60819 (и/или одной или нескольких (например, всех) из модификаций смысловой нити и/или антисмысловой нити AD-60489).
Согласно вариантам осуществления представлена iRNA для ингибирования экспрессии ALAS1, где dsRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая содержит антисмысловую последовательность или состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности), и/или (ii) смысловую нить, которая содержит смысловую последовательность или состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819 (или соответствующей немодифицированной антисмысловой последовательности). Согласно вариантам осуществления iRNA содержит (i) антисмысловую нить, которая состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, и/или (ii) смысловую нить, которая состоит из смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819, за исключением того, что антисмысловая нить и/или смысловая нить dsRNA отличается 1, 2 или 3 нуклеотидами от соответствующей
антисмысловой и/или смысловой последовательности AD-60489, AD-60519, AD-61193 или AD-60819.
Последовательности и модификации AD-60489, AD-60519, AD-61193 и AD-60819, раскрытые в данном документе, показаны в таблице 44.
Согласно одному варианту осуществления iRNA представляет собой ALN-60519. ALN-60519 представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид, ковалентно связанный с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc) (обозначенных на ФИГ. 57). Согласно одному варианту осуществления все нуклеотиды ALN-60519 являются 2'-ОМе или 2'-Г-модифицированными и соединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных связей с образованием сахарофосфатного остова олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити ALN-60519 конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфотиоатных связи - две на З'-конце и две на 5'-конце.
Смысловая нить ALN-60519 содержит две фосфотиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити ALN-60519 гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотид ом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на З'-конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловая нить и антисмысловая нить ALN-60519 могут быть синтезированы при помощи стандартного твердофазного синтеза олигонуклеотидов, с использованием стандартной химической структуры фосфородиамита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждая нить может быть собрана от 3'-5'-конца последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
Согласно этим аспектам одна из двух последовательностей комплементарна другой из двух последовательностей, при этом одна из последовательностей практически комплементарна последовательности mRNA, полученной в результате экспрессии гена ALAS1. Соответственно, dsRNA будет включать два олигонуклеотида, где один олигонуклеотид описан в данном документе как смысловая нить, и второй олигонуклеотид описан как соответствующая антисмысловая нить. Описанные в другой
части в данном документе и известные из уровня техники комплементарные последовательности dsRNA также могут содержаться в виде самокомплементарных участков одной молекулы нуклеиновой кислоты, в отличие от пребывания с составе отдельных олигонуклеотидов.
Специалисту в данной области хорошо известно, что dsRNA с дуплексной структурой из 20-23, в частности, из 21 пары оснований были признаны особенно эффективными в индуцировании РНК-интерференции (Elbashir et al., EMBO 2001, 20:6877-6888). Однако, другими исследователями было обнаружено, что более короткие или более длинные дуплексные структуры РНК также могут быть эффективными. Согласно вариантам осуществления, описанным выше, в соответствии с природой олигонуклеотидных последовательностей, представленных в таблицах в данном документе, dsRNA, описанные в данном документе, могут включать по меньшей мере одну нить длиной минимум 21 нуклеотид. С достаточной вероятностью можно предполагать, что более короткие дуплексы с одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, за исключением лишь нескольких нуклеотидов на одном или обоих концах, могут быть так же эффективны относительно dsRNA, описанных выше. Поэтому, согласно настоящему изобретению рассматриваются dsRNA с частичной последовательностью по меньшей мере из 15, 16, 17, 18, 19, 20 или более смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, раскрытых в данном документе, и различающихся их способностью ингибировать экспрессию гена ALAS1 не более чем на 5, 10, 15, 20, 25 или 30% ингибирования от dsRNA, содержащей полную последовательность.
Кроме того, РНК, представленные в таблицах в данном документе, идентифицируют сайт в ALAS 1-транскрипте, который восприимчив к RISC-опосредованному расщеплению. Соответственно, настоящее изобретение также описывает iRNA, которые нацелены на одну из таких последовательностей. В контексте данного документа подразумевают, что iRNA нацелена на конкретный сайт РНК-транскрипта, если iRNA способствует расщеплению транскрипта в любом месте в этом конкретном сайте. Такая iRNA будет, как правило, включать по меньшей мере 15 смежных нуклеотидов из одной из последовательностей, представленных в данном документе, например, в таблицах 2, 3, 6, 7, 8, 9, 14, 15, 18, 20 и в таблицах 21-40,
объединенных с дополнительными нуклеотидными последовательностями, полученными из участка, прилегающего к выбранной последовательности в гене ALAS1.
Хотя целевая последовательность, как правило, составляет 15-30 нуклеотидов в длину, имеет место широкий спектр пригодности конкретных последовательностей в этом диапазоне для направления расщепления любой определенной целевой РНК. Ряд пакетов программного обеспечения и рекомендации, изложенные в данном документе, служат в качестве руководства для идентификации оптимальных целевых последовательностей для любого данного целевого гена, но также можно воспользоваться эмпирическим подходом, в котором "окно" или "рамку" данного размера (в качестве неограничивающего примера 21 нуклеотид) буквально или условно (в том числе, например, in silico) накладывают на целевую последовательность РНК для идентификации последовательностей в размерном диапазоне, которые могут выполнять роль целевых последовательностей. Передвигая "окно" последовательности постепенно на один нуклеотид выше или ниже относительно исходного расположения целевой последовательности, можно идентифицировать следующую потенциальную целевую последовательность, до тех пор, пока не будет идентифицирован полный набор возможных последовательностей для каждого данного выбранного целевого размера. С помощью этого способа, вместе с системным синтезом и тестированием идентифицированных последовательностей (с помощью анализов, описанных в данном документе, или известных из уровня техники) для идентификации таких последовательностей с оптимальными качествами, можно идентифицировать те последовательности РНК, которые при нацеливании средством на основе iRNA опосредуют наилучшее ингибирование экспрессии целевых генов. Таким образом, в то время как идентифицированные последовательности, например, в таблицах в данном документе, представляют эффективные целевые последовательности, предполагается, что дополнительная оптимизация эффективности ингибирования может быть достигнута путем постепенного "перемещения окна" на один нуклеотид выше или ниже относительно определенных последовательностей для идентификации последовательностей с такими же или лучшими характеристиками ингибирования.
Также предполагается, что для любой идентифицированной последовательности, например, в таблицах в данном документе, дополнительная оптимизация может быть достигнута целенаправленно либо добавлением, либо удалением нуклеотидов для
получения более длинных или более коротких последовательностей, и тестированием таких последовательностей и последовательностей, полученных путем перемещения окна более длинного или более короткого размера выше или ниже относительно целевой РНК от данной точки. Также объединение этого подхода для получения новых кандидатных целей вместе с тестированием эффективности iRNA на основе этих целевых последовательностей в анализе ингибирования, известного из уровня техники или описанного в данном документе, может иметь результатом дополнительные улучшения в эффективности ингибирования. Более того, такие оптимизированные последовательности можно корректировать, например, введением модифицированных нуклеотидов, описанных в данном документе или известных из уровня техники, добавлением или изменениями выступающего конца, или другими модификациями, известными из уровня техники и/или описанными в данном документе для дополнительной оптимизации молекулы (например, повышения стабильности в сыворотке или периода полужизни в крови, повышения термостабильности, улучшения трансмембранной доставки, нацеливания на конкретную локацию или тип клеток, повышения степени взаимодействия с ферментами в рамках пути сайленсинга, повышения уровня высвобождения из эндосом и т. д.) в качестве ингибитора экспрессии.
iRNA, описанная в данном документе, может содержать одно или несколько ошибочно спаренных оснований относительно целевой последовательности. Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанная в данном документе, содержит не более 3 ошибочно спаренных оснований. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы эта область ошибочно спаренных оснований не располагалась в центре участка комплементарности. Если антисмысловая нить iRNA содержит ошибочно спаренные основания относительно целевой последовательности, предпочтительно, чтобы ошибочно спаренное основание было ограничено расположением по меньшей мере в последних 5 нуклеотидах либо от 5'- либо 3'-конца участка комплементарности. Например, для средства на основе iRNA из 23 нуклеотидов, нить РНК которой комплементарна участку гена ALAS1, нить РНК, как правило, не содержит ошибочно спаренного основания в центральных 13 нуклеотидах. Способы, описанные в данном документе, или способы, известные из уровня техники, можно применять для определения того, является ли iRNA,
содержащая ошибочно спаренное основание относительно целевой последовательности, эффективной в ингибировании экспрессии гена ALAS1. Рассмотрение эффективности iRNA с ошибочно спаренными основаниями в ингибировании экспрессии гена ALAS 1 является важным, особенно, если известно, что конкретный участок комплементарности в гене ALAS1 характеризуется вариацией полиморфных последовательностей в популяции.
Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере один конец dsRNA имеет однонитевой нуклеотидный выступающий конец из 1 -4, как правило, 1 или 2 нуклеотидов. dsRNA по меньшей мере с одним нуклеотидным выступающим концом неожиданным образом характеризуются более высокими ингибиторными свойствами относительно своих аналогов с тупыми концами. Согласно еще одному варианту осуществления РНК из iRNA, например, dsRNA, химически модифицирована для усиления стабильности или других предпочтительных характеристик. Нуклеиновые кислоты, описанные в настоящем изобретении, могут быть синтезированы и/или модифицированы способами, хорошо известными из уровня техники, такими как описанные в "Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA, который включен, таким образом, в данный документ при помощи ссылки. Модификации включают, например, (а) концевые модификации, например, 5'-концевые модификации (фосфорилирование, конъюгацию, инвертированные связи и т. д.), 3'-концевые модификации (конъюгацию, нуклеотиды ДНК, инвертированные связи и т. д.), (Ь) модификации оснований, например, замещение стабилизирующими основаниями, дестабилизирующими основаниями или основаниями, которые образуют пару оснований с широким спектром партнеров, удаление оснований (нуклеотиды с удаленными основаниями) или конъюгированные основания, (с) модификации Сахаров (например, в 2'-положении или 4'-положении, или наличие ациклического сахара) или замещение сахара, а также (d) модификации остовов, в том числе модификацию или замещение фосфодиэфирных связей. Конкретные примеры соединений РНК, пригодных в настоящем изобретении, включают без ограничения РНК, содержащие модифицированные остовы или отличные от природных межнуклеозидные связи. РНК с модифицированными скелетами включают, среди прочих, такие, которые не содержат атом фосфора в остове. Применительно к настоящему описанию, а также некоторым упоминаниям из уровня техники, модифицированные РНК без атома фосфора
в пределах их межнуклеозидного остова также могут считаться олигонуклеозидами. Согласно конкретным вариантам осуществления модифицированные РНК будут содержать атом фосфора в их межнуклеозидном остове.
Остовы модифицированной РНК включают, например, фосфотиоаты, хиральные фосфотиоаты, фосфородитиоаты, сложные фосфотриэфиры, сложные аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другой алкил-фосфонаты, в том числе 3'-алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, в том числе 3'-аминофосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, сложные тионоалкилфосфотриэфиры и борофосфаты с типичными 3'-5'-связями, их 2'-5'-связанные аналоги и таковые, имеющие обратную ориентацию, где соседние пары нуклеозидных единиц связываются 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Также включены различные соли, смешанные соли и формы свободных кислот.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше фосфор-содержащих связей, включают без ограничения патенты США №№ 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177195; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939;5453496;5455233; 5466677; 5476925;5519126; 5536821; 5541316; 5550111; 5563253; 5571799;5587361; 5625050; 6028188;6124445; 6160109; 6169170; 6172209; 6239265; 6277603; 6326199; 6346614; 6444423; 6531590; 6534639;6608035; 6683167; 6858715; 6867294; 6878805; 7015315; 7041816; 7273933; 7321029 и патент США RE39464, каждый из которых включен в даннй документ при помощи ссылки.
Остовы модифицированных РНК, которые не имеют атом фосфора, включают остовы, образованные короткоцепочечными алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомами и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или несколькими короткоцепочечными гетероатомными или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (частично образованные из части нуклеозида, содержащей сахар); силоксановые скелеты; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; содержащие алкен остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные
и сульфонамидные остовы; амидные остовы и другие, содержащие части смешанных компонентов N, О, S и СНг.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение приведенных выше олигонуклеозидов, включают без ограничения патенты США №№ 5034506; 5166315;5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 564562; 5264564; 5405938; 5434257; 5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437 и 5677439, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
В других миметиках РНК, подходящих или предполагаемых для применения в iRNA, как сахар, так и межнуклеозидная связь, т. е. остов нуклеотидных единиц, замещены новыми группами. Единицы оснований сохраняются для гибридизации с соответствующим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик РНК, который, как было показано, обладает очень шорошими свойствами для гибридизации, называется пептидо-нуклеиновой кислотой (PNA). В соединениях PNA остов РНК, содержащий сахар, замещен содержащим амид остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеотидные основания сохраняются и соединяются непосредственно или опосредованно с атомами аза-азота в амидной части остова. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение соединений PNA, включают без ограничения патенты США №№ 5539082; 5714331 и 5719262, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки. Дополнительное описание соединений PNA можно найти, например, в Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500.
Некоторые варианты осуществления, описанные в настоящем изобретении, включают РНК с фосфотиоатными остовами и олигонуклеозиды с остовами с гетероатомами и, в частности, -СН2-NH-СНг-, -СНг-ЩСНз)-О-СНг-[известный как метилен (метилимино) или MMI скелет], -СН2-0-гЧ(СНз)-СН2-, -СН2-гЧ(СНз)-г\Г(СНз)-СН2- и - г\Г(СНз)-СН2-СН2-[где нативный скелет сложного фосфодиэфира представлен как -О-Р-О-СН2-] упомянутого выше патента США № 5489677 и амидные остовы упомянутого выше патента США № 5602240. Согласно некоторым вариантам осуществления РНК, описанные в настоящем документе, характеризуются структурами морфолинового скелета согласно упомянутому выше патенту США № 5034506.
Модифицированные РНК также могут содержать один или несколько фрагментов с замещенным сахаром. iRNA, например, dsRNA, описанные в настоящем документе, могут включать в 2'-положении одно из следующих: ОН; F; О-, S- или N-алкил; О-, S- или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил или О-алкил-О-алкил, где алкил, алкенил и алкинил могут быть замещенными или незамещенными Ci-Сюалкилом или С2-Сюалкенилом и алкинилом. Иллюстративные пригодные модификации включают 0[(СН2)пО]шСНз, 0(СН2)."ОСН3, 0(CH2)nNH2, 0(СН2)"СН3, 0(CH2)nONH2 и 0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2, где п и m составляют от 1 до приблизительно 10. Согласно другим вариантам осуществления dsRNA включают в 2'-положении одно из следующих: низший Ci-Сюалкил, замещенный низший алкил, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, CI, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, Б02СНз, ON02, N02, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенный силил, расщепляющую РНК группу, репортерную группу, интеркалятор, группу для улучшения фармакокинетических свойств iRNA или группу для улучшения фармакодинамических свойств iRNA и другие заместители с подобными свойствами. Согласно некоторым вариантам осуществления модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-0-СН2СН2ОСНз, также известный как 2'-0-(2-метоксиэтил) или 2'-МОЕ) (Martin et al, Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504), т. e. алкокси-алкоксигруппу. Другой иллюстративной модификацией является 2'-диметиламинооксиэтокси, т. е. группа 0(СН2)201Ч(СНз)2, также известная как 2'-DMAOE, как описано ниже в примерах в данном документе, и 2'-диметиламиноэтоксиэтокси (также известный из уровня техники как 2'-0-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-DMAEOE), т. е. 2'-О-СН2-О-СН2-N(CH2)2, также описанный ниже в примерах в данном документе.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA содержит один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) ациклических нуклеотидов (или нуклеозидов). Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить или антисмысловая нить, или как смысловая нить, так и антисмысловая нить, включают менее пяти ациклических нуклеотидов на нить (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид на нить). Один или несколько ациклических нуклеотидов могут быть расположены, например, в двунитевом участке смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей; на 5'-конце, З'-конце, как 5'-, так и 3'-концах смысловой или антисмысловой нити, или обеих нитей средства на основе iRNA.
Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в положениях 1-8 смысловой или антисмысловой нити, или обеих. Согласно одному варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся в антисмысловой нити в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити. Согласно другому варианту осуществления один или несколько ациклических нуклеотидов находятся на одном или обеих 3'-концевых выступающих концах средства на основе iRNA.
Выражение "ациклический нуклеотид" или "ациклический нуклеозид", используемое в данном документе, относится к любому нуклеотиду или нуклеозиду с ациклическим сахаром, например, ациклической рибозой. Иллюстративный ациклический нуклеотид или нуклеозид может включать нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе). Согласно определенным вариантам осуществления связь между любыми из углеродов рибозы (CI, С2, СЗ, С4 или С 5), независимо или в комбинации, отсутствует со стороны нуклеотида. Согласно одному варианту осуществления связь между углеродами С2-СЗ рибозного кольца отсутствует, например, мономер ациклического 2'-3'-секо-нуклеотида. Согласно другим вариантам осуществления связь между С1-С2, СЗ-С4 или С4-С5 отсутствует (например, мономер Г-2', 3'-4' или 4'-5'-секо-нуклеотида). Иллюстративные ациклические нуклеотиды раскрыты в US 8314227, включенном в данный документе при помощи ссылки во всей своей полноте. Например, ациклический нуклеотид может включать любой из мономеров D-J на фигурах 1-2 согласно US 8314227. Согласно одному варианту осуществления ациклический нуклеотид включает следующий мономер:
Р=0
где основание представляет собой нуклеотидное основание, например, встречающееся в природе или модифицированное нуклеотидное основание (например, нуклеотидное основание, описанное в данном документе).
Согласно определенным вариантам осуществления ациклический нуклеотид может быть модифицированным или дериватизированным, например, при объединении ациклического нуклеотида с другим фрагментом, например, лигандом (например, GalNAc, холестерином в качестве лигандов), алкилом, полиамином, сахаром, полипептидом, среди прочих.
Согласно другим вариантам осуществления средство на основе iRNA включает один или несколько ациклических нуклеотидов и одну или несколько LNA (например, LNA, описанную в данном документе). Например, один или несколько ациклических нуклеотидов и/или одна или несколько LNA могут находиться в смысловой нити, антисмысловой нити или обеих. Число ациклических нуклеотидов в одной нити может быть одинаковым или может отличаться от числа LNA в противоположной нити. Согласно определенным вариантам осуществления смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти LNA (например, четыре, три, два или одну LNA), расположенных в двунитевом участке или 3'-выступающем конце. Согласно другим вариантам осуществления одна или две LNA расположены в двунитевом участке 3' -выступающего конца смысловой нити. Альтернативно, или в комбинации, смысловая нить и/или антисмысловая нить содержит менее пяти ациклических нуклеотидов (например, четыре, три, два или один ациклический нуклеотид) в двунитевом участке или 3' -выступающем конце. Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства на основе iRNA содержит одну или две LNA в 3'-выступающем конце смысловой нити, и один или два ациклических нуклеотида в двунитевом участке антисмысловой нити (например, в положениях 4-10 (например, положениях 6-8) от 5'-конца антисмысловой нити) средства на основе iRNA.
Согласно другим вариантам осуществления включение одного или нескольких ациклических нуклеотидов (отдельно или в дополнение к одной или нескольким LNA) в средство на основе iRNA приводит к одному или нескольким (или всем) из следующего: (i) снижению нецелевого эффекта; (ii) снижению участия сопровождающей нити в RNAi; (iii) повышению специфичности ведущей нити к ее целевой mRNA; (iv) снижению
нецелевого эффекта microRNA; (v) повышению стабильности; или (vi) повышения устойчивости к разрушению молекулы iRNA.
Другие модификации включают 2'-метокси (2'-ОСНз), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Подобные модификации также могут быть осуществлены в других положениях РНК из iRNA, в частности, в 3'-положении сахара в З'-концевом нуклеотиде или в 2'-5'-связанных dsRNA и в 5'-положении 5'-концевого нуклеотида. iRNA также могут содержать миметики Сахаров, такие как циклобутиловые фрагменты, вместо пентофуранозильного сахара. Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение таких структур с модифицированными сахарами, включают без ограничения патенты США №№ 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633 и 5700920, некоторые из которых принадлежат авторам настоящей заявки, и каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
iRNA также может включать в себя модификации и замещения нуклеотидного основания (часто называемого в уровне техники просто "основанием"). Используемые в данном документе выражения "немодифицированные" или "природные" нуклеотидные основания включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотидные основания включают другие синтетические и природные нуклеотидные основания, такие как 5-метилцитозин (5-те-С), 5-гидроксиметилцитозин, ксантин, гипоксантин, 2-аминоаденин, 6-метил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-пропил- и другие алкил-производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинилурацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 8-галоген-, 8-амино-, 8-тиол-, 8-тиоалкил-, 8-гидроксил- и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген-, в частности, 5-бром-, 5-трифторметил- и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин, а также 3-деазагуанин и 3-деазааденин. Дополнительные нуклеотидные основания включают раскрытые в патенте США № 3687808, раскрытые в Modified Nucleosides in Biochemistry, Biotechnology and Medicine, Herdewijn, P. ed. Wiley-VCH, 2008; раскрытые в The Concise
Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. L, ed. John Wiley & Sons, 1990, раскрытые в Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613, а также раскрытые в Sanghvi, Y S., Chapter 15, dsRNA Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, В., Ed., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидных оснований особенно пригодны для повышения аффинности связывания олигомерных соединений, описанных в настоящем изобретении. Они включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что 5-метилцитозиновые замещения повышают стабильность дуплекса нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. Т. and Lebleu, В., Eds., dsRNA Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и представляют собой иллюстративные замещения оснований, еще более конкретно при комбинировании с 2'-0-метоксиэтильными модификациями Сахаров.
Иллюстративные патенты США, которые описывают получение определенных указанных выше модифицированных нуклеотидных оснований, а также других модифицированных нуклеотидных оснований, включают без ограничения указанный выше патент США №3687808, а также патенты США №№ 4845205; 513030; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5594121; 5596091; 5614617; 5681941; 6015886; 6147200; 6166197; 6222025; 6235887; 6380368; 6528640; 6639062; 6617438; 7045610; 7427672 и 7495088, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки, и патент США № 5750692, также включенный в данный документ при помощи ссылки.
РНК из iRNA также может быть модифицирована с включением одной или нескольких (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) запертых нуклеиновых кислот (LNA) (также называемых в данном документе "запертыми нуклеотидами"). Согласно одному варианту осуществления запертая нуклеиновая кислота представляет собой нуклеотид с модифицированным рибозным фрагментом, в котором рибозный фрагмент содержит дополнительные мостиковые соединяющие, например, 2'- и 4'-углероды. Такая структура эффективно "запирает" рибозу в З'-эндо структурной конформации. Было показано, что добавление запертых нуклеиновых кислот в siRNA повышает стабильность siRNA в сыворотке, повышает термостабильность и снижает
нецелевые эффекты (Elmen, J. et al, (2005) Nucleic Acids Research 33(l):439-447; Mook, OR. et al, (2007) Mol Cane Ther 6(3):833-843; Grunweller, A. et al, (2003) Nucleic Acids Research 31(12):3185-3193).
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение нуклеотидов с запертыми нуклеиновыми кислотами, включают в себя без ограничения следующие: патенты США№№ 6268490; 6670461; 6794499; 6998484; 7053207; 7084125; 7399845 и 8314227, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте. Иллюстративные LNA включают без ограничения 2', 4'-С-метиленбициклонуклеотид (см., например, Wengel et al, международную публикацию согласно РСТ № WO 00/66604 и WO 99/14226).
Согласно другим вариантам осуществления средства на основе iRNA включают один или несколько (например, приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более) нуклеотидов с G-зажимом. Нуклеотид с G-зажимом представляет собой модифицированный аналог цитозина, где модификации придают способность связываться водородными связями как по Уотсону и Крику, так и по Хугстину, с комплементарным гуанином в дуплексе, см., например, Lin and Matteucci, 1998, /. Am. Chem. Soc, 120, 85318532. Замещение одного аналога с G-зажимом в олигонуклеотиде может приводить к значительно повышенной термостабильности спирали и распознаванию ошибочно спаренных оснований при гибридизации с комплементарными олигонуклеотидами. Включение таких нуклеотидов в молекулы iRNA может приводить к повышенной аффинности и специфичности к мишеням нуклеиновых кислот, комплементарным последовательностям или матричным нитям.
Потенциально стабилизирующие модификации на концах молекул РНК могут включать в себя №(ацетиламинокапроил)-4-гидроксипролинол (Hyp-C6-NHAc), N-(капроил-4-гидроксипролинол (Нур-С6), гЧ-(ацетил-4-гидроксипролинол (Hyp-NHAc), тимидин-2'-0-дезокситимидин (эфир), №(аминокапроил)-4-гидроксипролинол (Нур-Сб-амино), 2-докозаноил-уридин-З"-фосфат, инвертированное основание dT(idT) и другие. Раскрытие такой модификации можно найти в публикации РСТ №WO 2011/005861.
Мотивы iRNA
Согласно одному варианту осуществления последовательность смысловой нити может быть представлена формулой (I):
5' np-Na-(X X X )i-Nb-Y Y Y -Nb-(Z Z Z )rNa-nq 3' (I) где
каждая из i и j независимо равняется 0 или 1; каждая из р и q независимо равняется 0-6;
каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждая пр и nq независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb и Y имеют неодинаковую модификацию; и
каждый из XXX, YYY и ZZZ независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов. Предпочтительно, в YYY все нуклеотиды 2'-Б-модифицированы.
Согласно одному варианту осуществления Na и/или Nb имеет модификации чередующегося паттерна.
Согласно одному варианту осуществления мотив YYY находится в сайте расщепления смысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив YYY может находиться в сайте расщепления или рядом с ним (например, может находиться в положениях 6, 7, 8; 7, 8, 9; 8, 9, 10; 9, 10, 11; 10, 11, 12 или 11, 12, 13) в смысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 1, a j равняется 0, или i равняется 0, aj равняется 1, или как i, так и j равняются 1. Смысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' np-Na-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (lb);
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Na-nq 3' (Ic); или
5' np-Na-XXX-Nb-YYY-Nb-ZZZ-Na-nq 3' (Id).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (lb), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Ic), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (Id), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6. Каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X, Y и Z может быть одинаковой или отличной от остальных.
Согласно другим вариантам осуществления i равняется 0, a j равняется 0, и смысловая нить может быть представлена формулой:
5' np-Na-YYY- Na-nq 3' (la).
В тех случаях, когда смысловая нить представлена формулой (1а), каждая Na независимо может представлять собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления последовательность антисмысловой нити RNAi может быть представлена формулой (II):
5' nq'-Na'-(Z'Z'Z')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(X'X'X')i-N'a-np' 3' (II) где
каждая из к и 1 независимо равняется 0 или 1; каждая из р' и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
каждая пр' и nq' независимо представляет собой выступающий нуклеотид;
где Nb' и Y' имеют неодинаковую модификацию;
каждый из Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления Na' и/или Nb' содержит модификации чередующегося паттерна.
Мотив Y'Y'Y' находится в сайте расщепления антисмысловой нити или рядом с ним. Например, если средство для RNAi содержит участок дуплекса, составляющий 17-23 нуклеотида в длину, то мотив Y'Y'Y' может находиться в положениях 9, 10, 11; 10, 11, 12; 11, 12, 13; 12, 13, 14 или 13, 14, 15 антисмысловой нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца. Предпочтительно, мотив Y'Y'Y' находится в положениях 11, 12, 13.
Согласно одному варианту осуществления в мотиве Y'Y'Y' все нуклеотиды 2'-ОМе-модифицированы.
Согласно одному варианту осуществления к равняется 1, а 1 равняется 0, или к равняется 0, а 1 равняется 1, или как к, так и 1 равняются 1.
Антисмысловая нить, таким образом, может быть представлена следующими формулами:
5' nq> -Na'-Z'Z'Z'-Nb'-YTT'-Na'-iy 3' (lib);
5' nq> -Na'-Y'Y'Y'-Nb'-X'X'X'-iy 3' (Пс); или
5' iy-Na'- Z'Z'Z'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'- X'X'X'-Na'-iy 3' (Ш).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (lib), Nb представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (Пс), Nb' представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена формулой (Ш), каждый Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 010, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Предпочтительно, Nb равняется 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.
Согласно другим вариантам осуществления к равняется 0, а 1 равняется 0, и антисмысловая нить может быть представлена формулой:
5'np'-Na'-Y'Y'Y'-Na'-nq'3'(Ia).
В тех случаях, когда антисмысловая нить представлена как формула (Па), каждая Na' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
Каждая из X', Y' и Z' может быть одинаковой или отличной от остальных.
Каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо может быть модифицирован LNA, HNA, CeNA, 2'-метоксиэтилом, 2'-0-метилом, 2'-0-аллилом, 2'-С-аллилом, 2'-гидроксилом или 2'-фтором. Например, каждый нуклеотид смысловой нити и антисмысловой нити независимо модифицирован 2'-0-метилом или 2'-фтором. Каждая X, Y, Z, X', Y' и Z', в частности, может представлять собой 2'-0-метил-модификацию или 2'-фтор-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления смысловая нить средства для RNAi может содержать мотив YYY, находящийся в 9, 10 и 11 положениях нити, в тех случаях, когда участок дуплекса составляет 21 нуклеотид, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y представляет собой 2'-Б-модификацию. Смысловая нить может дополнительно содержать мотив XXX или мотивы ZZZ в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из XXX и ZZZ независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
Согласно одному варианту осуществления антисмысловая нить может содержать мотив Y'Y'Y', находящийся в положениях 11, 12, 13 нити, при этом отсчет начинается с 1-го нуклеотида от 5'-конца или, необязательно, отсчет начинается с 1-го спаренного нуклеотида в дуплексном участке от 5'-конца; и Y' представляет собой 2'-0-метил-модификацию. Антисмысловая нить может дополнительно содержать мотив Х'Х'Х' или мотивы Z'Z'Z' в качестве фланкирующих модификаций на противоположном конце дуплексного участка; и каждый из Х'Х'Х' и Z'Z'Z' независимо представляет собой 2'-ОМе-модификацию или 2'-F-модификацию.
Смысловая нить, представленная любой из вышеприведенных формул (la), (lb), (Ic) и (Id), образует дуплекс с антисмысловой нитью, представленной любой из формул (Па), (ПЬ), (Пс) и (lid), соответственно.
Соответственно, средства для RNAi для применения в способах согласно настоящему изобретению могут содержать смысловую нить и антисмысловую нить, при этом каждая нить содержит 14-30 нуклеотидов, дуплекс для RNAi, представленный формулой (III):
смысловая: 5' np -Na-(X X X)i -Nb- Y Y Y -Nb -(Z Z Z)rNa-nq 3'
антисмысловая: 3' np'-Na'-(X'X'X')k-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-(Z'Z'Z')i-Na'-nq' 5'
(III)
где
каждый из i, j, k и 1 независимо равняется 0 или 1; каждый из р, р', q и q' независимо равняется 0-6;
каждая Na и Na независимо представляют собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-25 модифицированных нуклеотидов, при этом каждая последовательность содержит по меньшей мере два модифицированных различными способами нуклеотида;
каждая Nb и Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10 модифицированных нуклеотидов;
где
каждая np', np, nq' и nq, каждая из которых может присутствовать или отсутствовать, независимо представляет собой выступающий нуклеотид; и
каждый из XXX, YYY, ZZZ, Х'Х'Х', Y'Y'Y' и Z'Z'Z' независимо представляет собой один мотив из трех одинаковых модификаций трех последовательных нуклеотидов.
Согласно одному варианту осуществления i равняется 0, a j равняется 0; или i равняется 1, aj равняется 0; или i равняется 0, aj равняется 1; или как i, так и j равняются 0; или как i, так и j равняются 1. Согласно другому варианту осуществления к равняется 0, а 1 равняется 0; или к равняется 1, а 1 равняется 0; к равняется 0, а 1 равняется 1; или как к, так и 1 равняются 0; или как к, так и 1 равняются 1.
Иллюстративные комбинации смысловой нити и антисмысловой нити, образующих дуплекс для RNAi, включают формулы, приведенные ниже:
5'np-Na-YYY-Na-nq3'
3' np-Na -Y'Y'Y' -Na'nq' 5' (Ша)
5' np -Na -YYY -Nb -ZZZ -Na-nq 3' 3' np'-Na'-Y'Y'Y'-Nb-Z'Z'Z'-Na nq 5'
(Illb)
5' np-Na- X X X -Nb -Y Y Y - Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Na -nq 5' (IIIc)
5' np -Na -XXX -Nb-Y Y Y -Nb- ZZZ -Na-nq 3' 3' np'-Na'-X'X'X'-Nb'-Y'Y'Y'-Nb'-Z'Z'Z'-Na-nq' 5' (Hid)
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Ша), каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 220, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (ПГЬ), каждая Nb независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 1 -10, 1-7, 1-5 или 1-4 модифицированных нуклеотида. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Шс), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Hid), каждая Nb, Nb' независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 0-10, 0-7, 0-5, 0-4, 0-2 или 0 модифицированных нуклеотидов. Каждая Na, Na независимо представляет собой олигонуклеотидную последовательность, содержащую 2-20, 2-15 или 2-10 модифицированных нуклеотидов. Каждая из Na, Na', Nb и Nb независимо содержит модификации чередующегося паттерна.
Каждая из X, Y и Z в формулах (III), (Ша), (ШЬ), (Шс) и (Hid) может быть одинаковой или отличной от остальных.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (III), (Ша), (ШЬ), (Шс) и (Hid), по меньшей мере один из нуклеотидов Y может образовывать пару
оснований с одним из нуклеотидов Y'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'; или все три из нуклеотидов Y образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Y'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (ПГЬ) или (Hid), по меньшей мере один из нуклеотидов Z может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов Z'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'; или все три из нуклеотидов Z образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами Z'.
В тех случаях, когда средство для RNAi представлено в качестве формулы (Шс) или (Hid), по меньшей мере один из нуклеотидов X может образовывать пару оснований с одним из нуклеотидов X'. Альтернативно, по меньшей мере два из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'; или все три из нуклеотидов X образуют пары оснований с соответствующими нуклеотидами X'.
Согласно одному варианту осуществления модификация нуклеотида Y отличается от модификации нуклеотида Y', модификация нуклеотида Z отличается от модификации нуклеотида Z', и/или модификация нуклеотида X отличается от модификации нуклеотида X'.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Hid), модификациями Na являются 2'-0-метил- или 2'-фтор-модификации. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Hid), модификациями Na являются 2'-0-метил- или 2'-фтор-модификации, и пр' > 0, и по меньшей мере один пр' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи. Согласно еще одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Hid), модификациями Na являются 2'-0-метил- или 2'-фтор-модификации, пр' > 0, и по меньшей мере один пр' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, а смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно другому варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Hid), модификациями Na являются 2'-0-метил- или 2'
фтор-модификации, np' > 0, и по меньшей мере один пр' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления в тех случаях, когда средство для RNAi представлено формулой (Ша), модификациями Na являются 2'-0-метил- или 2'-фтор-модификации, пр' > 0, и по меньшей мере один пр' соединен с соседним нуклеотидом посредством фосфотиоатной связи, смысловая нить содержит по меньшей мере одну фосфотиоатную связь, и смысловая нить конъюгирована с одним или несколькими производными GalNAc, присоединенными посредством двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим по меньшей мере два дуплекса, представленных формулой (III), (Ша), (ШЬ), (Шс) и (Hid), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления средство для RNAi является мультимером, содержащим три, четыре, пять, шесть или более дуплексов, представленных формулой (III), (Ша), (ШЬ), (Шс) и (Hid), где дуплексы соединены линкером. Линкер может быть расщепляемым или нерасщепляемым. Необязательно, мультимер дополнительно содержит лиганд. Каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген или на два различных гена или каждый из дуплексов может быть нацелен на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Согласно одному варианту осуществления два средства для RNAi, представленные формулой (III), (Ша), (ШЬ), (Шс) и (Hid), соединены друг с другом на 5'-конце, и один или оба 3'-конца необязательно конъюгированы с лиганд ом. Каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген или на два различных гена или каждое из средств может быть нацелено на один и тот же ген в двух различных целевых сайтах.
Конъюгаты iRNA
Средства на основе iRNA, раскрытые в данном документе, могут находиться в форме конъюгатов. Конъюгат может быть прикреплен в любом подходящем положении в молекуле iRNA, например, на З'-конце или 5'-конце смысловой или антисмысловой нити. Конъюгат необязательно прикреплен с помощью линкера.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA, описанное в данном документе, связано химически с одним или несколькими лигандами, фрагментами или конъюгатами, которые могут придавать функциональность, например, с влиянием на (например, с усилением) активность, распределение в клетке или захват клеткой iRNA. Такие фрагменты включают без ограничения липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент (Letsinger et al, Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 1989, 86: 65536556), холевая кислота (Manoharan et al., Biorg. Med. Chem. Let., 1994, 4:1053-1060), тиоэфир, например, берил-8-тритилтиол (Manoharan etal., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306-309; Manoharan et al, Biorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765-2770), тиохолестерин (Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533-538), алифатическая цепь, например додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10:1111-1118; Kabanov etal, FEBS Lett, 1990, 259:327-330; Svinarchuk et al, Biochimie, 1993, 75:49-54), фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654; Shea etal, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777-3783), полиамин или полиэтиленгликолевая цепь (Manoharan et al, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969-973) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al, Tetrahedron Lett., 1995, 36:3651-3654), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229-237), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277:923-937).
Согласно одному варианту осуществления лиганд изменяет распределение, нацеливание или время существования средства на основе iRNA, в которое он введен. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд обеспечивает повышенную аффинность в отношении выбранной цели, например, молекулы, клетки или типа клеток, компартмента, например, клеточного компартмента или части органа, ткани, органа или
участка тела, например, по сравнению с видами, у которых отсутствует такой лиганд. Типичные лиганды не будут принимать участия в спаривании дуплекса в дуплексной нуклеиновой кислоте.
Лиганды могут включать встречающееся в природе вещество, такое как белок (например, сывороточный альбумин человека (HSA), липопротеин низкой плотности (LDL) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновую кислоту) или липид. Лиганд также может быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например, синтетическая полиаминокислота. Примеры полиаминокислот включают полиаминокислоту, представляющую собой полилизин (PLL), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Ь-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и ангидрида малеиновой кислоты, сополимер L-лактида и гликолида, сополимер дивинилового эфира и малеинового ангидрида, М-(2-гидроксипропил)меакриламидный сополимер (НМРА), полиэтиленгликоль (PEG), поливиниловый спирт (PVA), полиуретан, поли(2-этилакриловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают: полиэтиленимин, полилизин (PLL), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, полиамин-пептидомиметик, полиамин-дендример, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, соль четвертичного полиамина или а-спиральный пептид.
Лиганды также включают нацеливающие группы, например, нацеливающее на определенную клетку или ткань средство, например, лектин, гликопротеин, липид или белок, например, антитело, которое связывается с конкретным типом клетки, таким как клетка почки. Нацеливающая группа может представлять собой тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углевод-муцин, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу, поливалентную фукозу, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентнную галактозу, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчную кислоту, фолат, витамин В12, биотин или RGD-пептид или миметик RGD-пептида.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд представляет собой GalNAc, который содержит одну или несколько производных N-ацетилгалактозамина
(GalNAc). Дополнительное описание лигандов GalNAc представлено в разделе под названием Углеводные конъюгаты.
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие средства (например, акридины), кросс-линкеры (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, EDTA), липофильные молекулы, например, холестерин, холевую кислоту, адамантануксусную кислоту, 1-пиренмасляную кислоту, дигидротестостерон, 1,3-бис-0(гексадецил)глицерин, геранилоксигексильную группу, гексадецил-глицерин, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, гептадецильную группу, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, 03-(олеоил)литохолевую кислоту, 03-(олеоил)холеновую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид antennapedia, Tat-пептид), алкилирующие средства, фосфат, амино, меркапто, PEG (например, PEG-40K), MPEG, [MPEG] 2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченные радиоизотопом маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), помощники транспорта/всасывания (например, аспирин, витамин Е, фолиевую кислоту), синтетические рибонуклеотиды (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазольные кластеры, конъюгаты акридин-имидазол, комплекс ЕиЗ+ тетраазамакроциклы), динитрофенил, HRP или АР.
Лигандами могут быть белки, например, гликопротеины, или пептиды, например, молекулы со специфической аффинностью в отношении ко-лиганда, или антитела, например, антитело, которое связывается с определенным типом клетки, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды могут также включать гормоны и рецепторы гормонов. Они также могут включать отличные от пептидов виды, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентную лактозу, поливалентную галактозу, N-ацетилгалактозамин, N-ацетилглюкозамин, поливалентную маннозу или мультивалентную фукозу. Лигандом может быть, например, липополисахарид, активатор МАР-киназы р38 или активатор NF-кВ.
Лигандом может быть вещество, например, лекарственное средство, которое может улучшать захват средства на основе iRNA клеткой, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например, путем разрушения микротрубочек, микрофиламентов
и/или промежуточных филаментов клетки. Лекарственным средством может быть, например, таксон, винкристин, винбластин, цитохалазин, нокодазол, яплакинолид, латрункулин А, фаллоидин, свинголид А, инданоцин или миосервин.
Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд, присоединенный к iRNA, описанной в данном документе, выполняет роль фармакокинетического модулятора (РК-модулятора). РК-модуляторы включают липофильные соединения, желчные кислоты, стероиды, фосфолипидные аналоги, пептиды, средства, связывающие белки, PEG, витамины и т. д. Иллюстративные РК-модуляторы включают без ограничения холестерин, жирные кислоты, холевую кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и т. д. Также известно, что олигонуклеотиды, которые содержат несколько фосфотиоатных связей, связываются с белком сыворотки, таким образом, короткие олигонуклеотиды, например, олигонуклеотиды из приблизительно 5 оснований, 10 оснований, 15 оснований или 20 оснований, содержащие несколько из фосфотиоатных связей в остове, также пригодны согласно настоящему изобретению в качестве лигандов (например, РК-модулирующих лигандов). Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, белки сыворотки) также пригодны для применения в качестве РК-модулирующих лигандов согласно вариантам осуществления, описанным в данном документе.
Конъюгированные с лигандами олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с применением олигонуклеотида, который обладает реакционно-способной функциональностью, обусловленной боковой цепью, как например, полученной в результате присоединения связывающей молекулы к олигонуклеотиду (описанному ниже). Этот реакционно-способный олигонуклеотид может вступать в реакцию непосредственно с коммерчески доступными лигандами, лигандами, которые синтезируют с любой из ряда защитных групп или лигандами со связывающим фрагментом, прикрепленным к ним.
Олигонуклеотиды, применяемые в конъюгатах согласно настоящему изобретению, можно получать удобным и обычным способом с помощью хорошо известной методики твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими
поставщиками, в том числе, например, Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Дополнительно или альтернативно можно использовать любые другие средства для такого синтеза, известные в уровне техники. Также известно применение подобных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфотиоаты и алкилированные производные.
В конъюгированных с лигандами олигонуклеотидах и нуклеозидах, связанных с определенными последовательностями, несущими молекулы лигандов, по настоящему изобретению, олигонуклеотиды и олигонуклеозиды могуть быть собраны на подходящем синтезаторе ДНК, с использованием предшественников стандартных нуклеотидов и нуклеозидов, или предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов, которые уже несут связывающий фрагмент, предшественников конъюгатов нуклеотидов или нуклеозидов с лигандами, которые уже несут молекулу лиганда, или ненуклеозидные несущие лиганд структурные элементы.
При применении предшественников конъюгатов нуклеотидов, которые уже несут связывающий фрагмент, синтез нуклеозидов, связанных с определенными последовательностями, как правило, является завершенным, а молекула лиганда затем вступает в реакцию со связывающим фрагментом с образованием конъюгированного с лигандом олигонуклеотида. Согласно некоторым вариантам осуществления олигонуклеотиды или связанные олигонуклеозиды согласно настоящему изобретению синтезированы автоматическим синтезатором с применением фосфорамидатов, полученных из конъюгатов нуклеозидов с лигандами, в дополнение к стандартным фосфорамидатам и не стандартным фосфорамидатам, которые коммерчески доступны и, как правило, применяют в синтезе олигонуклеотидов.
Конъюгаты липидов Согласно одному варианту осуществления лиганд представляет собой липид или липидную молекулу. Такой липид или липидная молекулу могут, как правило, связываться с сывороточным белком, таким как сывороточный альбумин человека (HSA). Связывающийся с HSA лиганд делает возможным распределение конъюгата в целевой ткани, например, отличной от ткани почек целевой ткани организма. Например, целевой
тканью может быть печень, в том числе паренхиматозные клетки печени. Также в качестве лигандов можно применять другие молекулы, которые могут связываться с HSA. Например, можно применять непроксин или аспирин. Липид или липидный лиганд может (а) повышать устойчивость к разрушению конъюгата, (Ь) улучшать нацеливание или транспорт в целевую клетку или клеточную мембрану и/или (с) может быть применен для корректировки связывания с сывороточным белком, например, HSA.
Липидный лиганд можно применять для модулирования, например, регулирования (например, ингибирования) связывания конъюгата с целевой тканью. Например, менее вероятно, что липид или липидный лиганд, который связывается с HSА более сильно, будет нацелен на почки и, таким образом, менее вероятно, что он будет выведен из организма. Липид или липидный лиганд, который связывается с HSA менее сильно, можно применять для нацеливания конъюгата на почки.
Согласно одному варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA. Например, лиганд может связываться с HSA с достаточной аффинностью, таким образом, распределение конъюгата в отличной от ткани почек ткани усиливается. Однако, как правило, аффинность не является настолько сильной, что связывание HSA-лиганда не может быть необратимым.
Согласно другому варианту осуществления липидный лиганд связывается с HSA слабо или вообще не связывается, так что распределение конъюгата в почке будет усиливаться. Другие фрагменты, которые нацелены на клетки почек, также можно применять вместо или в дополнение к липидным лигандам.
Согласно другому аспекту лигандом является фрагмент, например, витамин, который поглощается целевой клеткой, например, пролиферирующей клеткой. Такие варианты являются особенно пригодными для лечения нарушений, характеризующихся нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или доброкачественного типа, например, раковых клеток. Иллюстративные витамины включают витамин А, Е и К. Другие иллюстративные витамины включают витамин В, например фолиевую кислоту, В12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или биогенные вещества, поглощаемые раковыми клетками. Также включены HSA и липопротеин низкой плотности (LDL).
Средства, обеспечивающие проникновение в клетку
Согласно другому аспекту лигандом является средство, обеспечивающее проникновение в клетку, такое как спиральное средство для проникновения в клетку. Согласно одному варианту осуществления средство является амфипатическим. Иллюстративным средством является пептид, такой как tat или antennopedia. Если средство представляет собой пептид, то он может быть модифицированным, при этом средство может включать пептидилмиметик, инвертомеры, отличные от пептидных или псевдопептидные связи и применение D-аминокислот. Спиральное средство, как правило, представляет собой а-спиральное средство и может характеризоваться липофильной и липофобной фазой.
Лигандом может быть пептид или пептидомиметик. Пептидомиметик (также называемый в данном документе олигопептидомиметиком) является молекулой, способной сворачиваться в определенную трехмерную структуру, подобную природному пептиду. Присоединение пептида или пептидомиметика к средствам на основе iRNA может влиять на фармакокинетическое распределение iRNA, например, посредством усиления распознавания клеток и абсорбции клетками. Фрагмент, представляющий собой пептид или пептидомиметик, может составлять примерно 5-50 аминокислот в длину, например, примерно 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину.
Пептидом или пептидомиметиком, может быть, например, пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, катионный пептид, амфипатический пептид или гидрофобный пептид (например, состоящий главным образом из Туг, Тгр или Phe). Фрагментом, представляющим собой пептид, может быть пептид-дендример, пептид с ограниченной конформационной свободой или перекрестно сшитый пептид. Согласно другому альтернативному варианту фрагмент, представляющий собой пептид, может включать гидрофобную последовательность, контролирующую перенос через мембрану (MTS). Иллюстративный содержащий гидрофобную MTS пептид представляет собой RFGF с аминокислотной последовательностью AAVALLPAVLLALLAP (SEQ Ш N0:3367). RFGF-аналог (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP (SEQ Ш N0:3368)), содержащий гидрофобную MTS, также может быть нацеливающим фрагментом. Фрагмент, представляющий собой пептид, может быть пептидом "для доставки", который может переносить большие полярные молекулы, в том числе пептиды,
олигонуклеотиды и белки, через клеточные мембраны. Например, последовательности белка Tat HIV (GRKKRRQRRRPPQ SEQ Ш N0:3369)) и белка Antennapedia Drosophila (RQnCIWFQNRRMKWKK (SEQ Ш NO: 3370)) способны функционировать в качестве пептидов для доставки. Пептид или пептидомиметик могут кодироваться случайными последовательностями ДНК, как, например, пептид, идентифицированный из библиотеки фагового дисплея или комбинаторной библиотеки "одна гранула-одно соединение" (ОВОС) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Как правило, пептид или пептидомиметик, связанный со средством на основе dsRNA посредством введенной мономерной единицы, представляет собой нацеливающий на клетку пептид, такой как содержащий аргинин-глицин-аспарагиновую кислоту (RGD) пептид или RGD-миметик. Фрагмент, представляющий собой пептид, может характеризоваться длиной в диапазоне от приблизительно 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Фрагменты, представляющие собой пептиды, могут характеризоваться структурной модификацией, как например, для повышения стабильности или управления конформационными свойствами. Можно использовать любые из структурных модификаций, описанных ниже.
RGD-пептид для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретную(определенные) ткань(ткани). RGD-содержащие пептиды и пептидомиметики могут включать D-аминокислоты, а также синтетические RGD-миметики. В дополнение к RGD можно применять другие фрагменты, которые нацелены на лиганд интегрин. Предпочтительные конъюгаты этого лиганда нацелены на РЕСАМ-1 или VEGF.
Фрагмент, представляющий собой RGD-пептид, можно применять для нацеливания на конкретный тип клетки, например, опухолевую клетку, такую как эндотелиальная опухолевая клетка или опухолевая клетка рака молочной железы (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). RGD-пептид может облегчать нацеливание средства на основе dsRNA на опухоли ряда других тканей, в том числе легкого, почки, селезенки или печени (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Как правило, RGD-пептид будет облегчать нацеливание средства на основе iRNA на почку. RGD-пептид может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным,
например, гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на конкретные ткани. Например, гликозилированный RGD-пептид может доставлять средство на основе iRNA к опухолевой клетке, экспрессирующей ауВз (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
"Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку" способен проникать в клетку, например, микробную клетку, такую как клетка бактерии или гриба, или клетку млекопитающего, такую как клетка человека. Пептидом, обеспечивающим проникновение в микробную клетку, например, может быть а-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin PI), содержащий дисульфидную связь пептид (например, а-дефензин, Р-дефензин или бактенецин) или пептид, содержащий только одну или две преобладающие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Пептид, обеспечивающий проникновение в клетку, также может включать клеточный сигнал внутриядерной локализации (NLS). Например, пептидом, обеспечивающим проникновение в клетку, может быть двухкомпонентный амфипатический пептид, такой как MPG, который получен из домена слитого пептида gp41 HIV-1 и NLS из большого Т-антигена SV40 (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
Углеводные конъюгаты
Согласно некоторым вариантам осуществления композиций и способов по настоящему изобретению олигонуклеотид iRNA дополнительно содержит углевод. Конъюгированная с углеводом iRNA является предпочтительной для in vivo доставки нуклеиновых кислот, а также композиций, пригодных для in vivo терапевтического применения, описанного в данном документе. Используемое в данном документе выражение "углевод" относится к соединению, которое представляет собой углевод per se, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, имеющих по меньшей мере 6 атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с каждым атомом углерода; или соединению, имеющему в качестве его части углеводный фрагмент, образованный из одного или нескольких единиц моносахаридов, каждая из которых имеет по меньшей мере шесть атомов углерода (которые могут быть линейными, разветвленными или циклическими) с атомом кислорода, азота или серы, связанным с
каждым атомом углерода. Типичные углеводы включают сахара (моно-, ди-, три- и олигосахариды, содержащие от приблизительно 4, 5, 6, 7, 8 или 9 единиц моносахаридов) и полисахариды, такие как крахмалы, гликоген, целлюлоза и полисахаридные смолы. Определенные моносахариды включают С5 и более (например, С5, С6, С7 или С8) сахара; ди- и трисахариды включают сахара с двумя или тремя единицами моносахаридов (например, С5, С6, С7 или С8).
Согласно одному варианту осуществления углеводный конъюгат содержит моносахарид. Согласно одному варианту осуществления моносахаридом является N-ацетилгалактозамин (GalNAc). Конъюгаты GalNAc описаны, например, в патенте США № 8106022, все содержимое которого, таким образом, включено в данный документ при помощи ссылки. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc выполняет роль лиганда, который нацеливает iRNA к конкретным клеткам. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc нацеливает iRNA к клеткам печени, например, выполняя роль лиганда для рецептора асиалогликопротеина в клетках печени (например, гепатоцитах).
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат содержит одно или несколько производных GalNAc. Производные GalNAc могут быть присоединены с помощью линкера, например, двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера. Согласно некоторым вариантам осуществления лиганд GalNAc конъюгирован с 3'-концом смысловой нити. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc конъюгирован со средством на основе iRNA (например, с 3'-концом смысловой нити) с помощью линкера, например, линкера, описанного в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc представляет
собой
Формула П.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi присоединено к углеводному конъюгату с помощью линкера, как показано в следующей схеме, где X представляет собой О или S
Согласно некоторым вариантам осуществления средство для RNAi конъюгировано с L96, как определено в таблице 1 и показано ниже
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат для применения в композициях и способах согласно настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из:
но,
но.
-О NHAc
Формула IV,
НО^
о _
NHAc
он /
но^
NHAc
но^
NHAc
Формула V,
Формула VI,
Формула VII,
°н. Формула VIII,
РО3
но"дад
PO3
O^. OH
_ о
P03
но-л~-~М'0ч ноД^---^---Д
Формула XII,
Формула XIII,
Формула XIV,
О Формула XV,
НО ОН НО-!
н^РАСНМ о
AcHN
Формула XVI,
° Формула XVII,
.он HOHOV^T-\^O но^о
Формула XVIII,
.он H°Ho^pw0
но-""^-0 но
° Формула XIX,
° Формула XX,
0 Формула XXI,
0 Формула XXII.
Другой типичный углеводный конъюгат для применения в вариантах осуществления, описанных в данном документе, включает без ограничения
HO_!^r~V0
н К
(Формула XXIII), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Согласно некоторым вариантам осуществления углеводный конъюгат дополнительно содержит один или несколько дополнительных лигандов, описанных
выше, таких как без ограничения РК-модулятор и/или пептид, обеспечивающий проникновение в клетку.
Согласно одному варианту осуществления iRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с углеводом с помощью линкера. Неограничивающие примеры углеводных конъюгатов с iRNA с линкерами композиций и способов согласно настоящему изобретению включают без ограничения
(Формула XXV),
но .он но .он
'NY°\ о
х-о
N-!^^N^Mo^N-(iA>
О н х О У
х= 1-30 у = 1-15
(Формула XXVI),
(Формула XXVIII),
х= 1-30 у = 1-15 z= 1-20
х-О
(Формула XXIX) и
(Формула XXX), где один из X или Y представляет собой олигонуклеотид, другой представляет собой водород.
Линкеры
Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат или лиганд, описанные в данном документе, могут быть присоединены к олигонуклеотиду iRNA с помощью различных линкеров, которые могут быть расщепляемыми или нерасщепляемыми.
Выражение "линкер" или "линкерная группа" означает органический фрагмент, который соединяет две части соединения, например, связывает ковалентными связями две части соединения. Линкеры, как правило, содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, единицу, такую как NR8, С(О), C(0)NH, SO, SO2, SO2NH или цепь из атомов, такую как без ограничения замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклиалкенил, гетероциклиалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкерингетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкерилгетероалкинил, алкилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил,
алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, в которых один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться О, S, S(O), SO2, N(R8), С(О), замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным гетероарилом, замещенным или незамещенным гетероциклилом; где R8 представляет собой водород, ацил, алифатический или замещенный алифатический компонент. Согласно одному варианту осуществления линкер составляет приблизительно 1-24 атома, 2-24, 3-24, 4-24, 5-24, 6-24, 6-18, 7-18, 8-18 атомов, 7-17, 8-17, 6-16, 7-16 или 8-16 атомов.
Согласно одному варианту осуществления dsRNA согласно настоящему изобретению конъюгирована с двухвалентным и трехвалентным разветвленным линкером, выбранным из группы структур, показанных в любой из формул (XXXI) -(XXXIV):
Формула XXXI
Формула XXXII
Q -R
Э2А г"2А т> 2А
,2А
_Х2А_|_2А
)3A_Q3A_p^3A
"ЗА
_уЗА_|_ЗА
vAA. N
.p2B_Q2B_j{2B
,2В
_у2В_|_2В
p3B_Q3B_p^3B
"зв
_уЗВ_|_ЗВ
/ p4A_Q4A_ j^4A
Ч p4B_Q4B_R4B
"4А
,4В
.у4А_|_4А
_у4В_|_4В
Formula (VI)
или
Formula (VII)
Фор
где
q2A, q2B, q3 A, q3B, q4A, q4B, q5A, q5B и q5C независимо представляют собой для каждого случая 0-20, и где повторяющаяся единица может быть рдинаковой или различной;
каждая из Р2А, Р2В, РЗА, Рзв, Р4А, Р4В, Р5А, Р5В, Р5С, Т2А, Т2В, ТЗА, Тзв, Т4А, Т4В, Т4А, Т5В, Т5С независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой СО, NH, О, S, ОС(О), NHC(O), СН2, CH2NH или СН20;
r^lA ^2B r^iA r^m ^4A ^yffi r^5A r^5B ^5С
Q > Q > Q > Q > Q > Q > Q > Q > Q независимо для каждого случая отсутствует, представляет собой алкилен, замещенный алкилен, где один или несколько метиленов могут прерываться или оканчиваться одним или несколькими из О, S, S(O), S02, N(RN), C(R')=C(R"), С=С или С(0);
т> 2А п2В пЗА пЗВ п4А п4В п5А п5В п5С
каждый из R , R , R , R , R , R , R , R , R независимо для каждого случая
отсутствует, представляет собой NH, О, S, СН2, С(0)0, C(0)NH, NHCH(Ra)C(0), -С(О)-
CH(Ra)-NH-, СО, CH=N-0, ^N S-S
-S-s.
или гетероциклил;
T 2A т 2B т ЗА т ЗВ т 4А т 4В т 5А т 5В т 5С г- ~
L , L , L , L , L , L , L , L иЬ представляют собой лиганд; т. е. независимо для каждого случая моносахарид (такой как GalNAc), дисахарид, трисахарид, тетрасахарид, олигосахарид или полисахарид; и Ra представляет собой Н или аминокислотную боковую цепь. Трехвалентные конъюгирующие производные GalNAc особенно пригодны для применения со средствами на основе RNAi для ингибирования экспрессии целевого гена, такие как из формулы (XXXV):
Формула XXXV
где L , L и L представляют собой моносахарид, такой как производное GalNAc.
Примеры подходящих двухвалентных и трехвалентных разветвленных линкерных групп, конъюгирующих производные GalNAc, включают без ограничения структуры, приведенные выше в виде формул II, VII, XI, X и XIII.
Расщепляемая линкерная группа представляет собой группу, которая достаточно стабильна вне клетки, но которая при вхождении в целевую клетку расщепляется с высвобождением двух частей, которые линкер удерживает вместе. Согласно предпочтительному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа расщепляется приблизительно в 10 раз, 20 раз, 30 раз, 40 раз, 50 раз, 60 раз, 70 раз, 80 раз, 90 раз или более, или по меньшей мере приблизительно в 100 раз быстрее в целевой клетке или при первом упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделировании внутриклеточных условий), чем в крови субъекта или при втором упомянутом условии (которое можно, например, выбрать для имитации или моделирования условий, которые имеют место в крови или сыворотке).
Расщепляемые линкерные группы восприимчивы к средствам расщепления, например, рН, редокс-потенциалу или присутствию разрушающих молекул. Как правило, средства расщепления более распространены или встречаются при более высоких уровнях или при большей активности внутри клетки, чем в сыворотке или крови. Примеры таких разрушающих средств включают: окислительно-восстановительные средства, которые выбирают для конкретных субстратов или которые не обладают специфичностью к субстратам, в том числе, например, окислительные или восстановительные ферменты или восстановительные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут разрушать редокс-расщепляемую линкерную группу путем восстановления; эстеразы; эндосомы или средства, которые могут создавать кислую среду, например, таковые, которые приводят к рН, равному пять или ниже; ферменты, которые могут гидролизовать или разрушать расщепляемую кислотой линкерную группу, действуя в качестве универсальной кислоты, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными) и фосфатазы.
Расщепляемая линкерная группа, такая как дисульфидная связь, может быть восприимчивой к рН. рН сыворотки человека составляет 7,4, в то время как средняя внутриклеточная рН немного ниже, и находится в диапазоне приблизительно 7,1-7,3. Эндосомы характеризуются более кислым рН в диапазоне 5,5-6,0, а лизосомы характеризуются еще более кислым рН, приблизительно 5,0. Некоторые линкеры будут содержать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется при предпочтительном рН, тем самым высвобождается катионный липид из лиганда внутрь клетки или в предпочтительный компартмент клетки.
Линкер может включать расщепляемую линкерную группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой линкерной группы, включенной в линкер, может зависеть от клетки, подлежащей нацеливанию. Например, лиганд, нацеливаемый на печень, может быть связан с катионным липидом с помощью линкера, который включает эфирную группу. Клетки печени содержат много эстераз, и, таким образом, линкер может быть расщеплен более эффективно в клетках печени, чем в клетках, которые не содержат много эстераз. Другие типы клеток с высоким содержанием эстераз включают клетки легкого, коры почек и семенника.
Линкеры, которые содержат пептидные связи, можно применять при нацеливании на другие типы клеток с высоким содержанием пептидаз, такие как клетки печени и синовиоциты.
Как правило, пригодность кандидатной расщепляемой линкерной группы может быть оценена с помощью тестирования способности разрушающего средства (или условия) расщеплять линкерную группу. Кроме того, желательным также является тестирование кандидатной расщепляемой линкерной группы в отношении способности выдерживать расщепление в крови или при контакте с другой нецелевой тканью. Таким образом, можно определить относительную восприимчивость расщеплению между первым и вторым условием, где первое выбирают в качестве показателя расщепления в целевой клетке и второе выбирают в качестве показателя расщепления в других тканях или биологическим жидкостях, например, крови или сыворотке. Оценки можно проводить в бесклеточных системах, в клетках, в культуре клеток, в культуре органов или тканей или для целых животных. Может быть полезным выполнять первоначальные измерения в
условиях бесклеточной системы или в условиях культуры, а подтверждать с помощью дополнительных измерений на целых животных. Согласно предпочтительным вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения расщепляются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью или сывороткой (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий).
Расщепляемые с помощью редокс-потенциала линкерные группы Согласно одному варианту осуществления расщепляемая линкерная группа представляет собой расщепляемую с помощью редокс-потенциала линкерную группу, которая расщепляется при восстановлении или окислении. Примером расщепляемой при восстановлении линкерной группы является дисульфидная линкерная группа (-S-S-). Для определения того, является ли кандидатная расщепляемая линкерная группа подходящей "расщепляемой при восстановлении линкерной группой" или, например, подходящей для применения с определенным фрагментом iRNA и определенным нацеливающим средством, можно обратиться к способам, описанным в данном документе. Например, кандидат может быть оценен при помощи инкубирования с дитиотреитолом (DTT) или другим восстанавливающим средством с применением реактивов, известных в уровне техники, которые имитируют скорость расщепления, которая наблюдалась бы в клетке, например, целевой клетке. Кандидаты также могут быть оценены в условиях, которые выбирают для имитации условий в крови или сыворотке. Согласно одному варианту кандидатные соединения расщепляются в наибольшей степени приблизительно на 10% в крови. Согласно другим вариантам осуществления пригодные кандидатные соединения разрушаются по меньшей мере приблизительно в 2, 4, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или приблизительно в 100 раз быстрее в клетке (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внутриклеточных условий) по сравнению с кровью (или в in vitro условиях, выбранных для имитации внеклеточных условий). Скорость расщепления кандидатных соединений может быть определена при помощи стандартных анализов ферментативной кинетики в условиях, выбранных для имитации внутриклеточных сред, и по сравнению с условиями, выбранными для имитации внеклеточных сред.
Фосфатные расщепляемые линкерные группы Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит фосфатную расщепляемую линкерную группу. Фосфатная расщепляемая линкерная группа расщепляется средствами, которые разрушают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как клеточные фосфатазы. Примерами фосфатных линкерных групп являются -0-P(0)(ORk)-0-, -0-P(S)(ORk)-0-, -0-P(S)(SRk)-0-, -S-P(0)(ORk)-0-, -O-P(0)(ORk)-S-, -S-P(0)(ORk)-S-, -0-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-0-, -0-P(0)(Rk)-0-, -O-P(S)(Rk)-0-, -S-P(0)(Rk)-0-, -S-P(S)(Rk)-0-, -S-P(0)(Rk)-S-, -0-P(S)( Rk)-S-. Предпочтительными вариантами осуществления являются -0-Р(0)(ОН)-0-, -0-P(S)(OH)-0-, -0-P(S)(SH)-0-, -S-P(0)(OH)-0-, -0-P(0)(OH)-S-, -S-P(0)(OH)-S-, -0-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-0-, -0-P(0)(H)-0-, -0-P(S)(H)-0-, -S-P(0)(H)-0, -S-P(S)(H)-0-, -S-P(0)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом осуществления является -0-Р(0)(ОН)-0-. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые кислотами линкерные группы Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит расщепляемую кислотой линкерную группу. Расщепляемая кислотой линкерная группа представляет собой линкерную группу, которая расщепляется при кислых условиях. Согласно предпочтительным вариантам осуществления расщепляемые кислотой линкерные группы расщепляются в кислой среде с рН приблизительно 6,5 или ниже (например, приблизительно 6,0, 5,75, 5,5, 5,25, 5,0 или ниже), или с помощью средств, таких как ферменты, которые могут выступать в роли универсальной кислоты. В клетке определенные органеллы с низким рН, такие как эндосомы и лизосомы, обеспечивают среду расщепления для расщепляемых кислотами линкерных групп. Примеры расщепляемых кислотами линкерных групп включают без ограничения гидразоны, сложные эфиры и сложные эфиры аминокислот. Расщепляемые кислотами группы могут характеризоваться общей формулой -C=NN-, С(0)0 или -ОС(О). Предпочтительным вариантом осуществления является случай, когда углерод, присоединяемый к кислороду сложного эфира (алкоксигруппе), представляет собой арильную группу, замещенную алкильную группу или четвертичную алкильную группу, такую как диметилпентил или
трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы Согласно другому варианту осуществления расщепляемый линкер содержит сложноэфирную расщепляемую линкерную группу. Сложноэфирная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные эстеразы и амидазы. Примеры сложноэфирных расщепляемых линкерных групп включают без ограничения сложные эфиры с алкиленовыми, алкениленовыми и алкиниленовыми группами. Сложноэфирные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой -С(0)0- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Пептидные расщепляемые линкерные группы Согласно еще одному варианту осуществления расщепляемый линкер содержит пептидную расщепляемую линкерную группу. Пептидная расщепляемая линкерная группа расщепляется ферментами, такими как клеточные пептидазы и протеазы. Пептидные расщепляемые линкерные группы представляют собой пептидные связи, образованные между аминокислотами с получением олигопептидов (например, дипептидов, трипептидов и т. д.) и полипептидов. Пептидные расщепляемые группы не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может образовываться между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь представляет собой особый тип амидной связи, образованной между аминокислотами с получением пептидов и белков. Пептидная расщепляемая группа, как правило, ограничена пептидной связью (т. е. амидной связью), образованной между аминокислотами, с образованием пептидов и белков, и не включает всю амидную функциональную группу. Пептидные расщепляемые линкерные группы характеризуются общей формулой - NHCHRAC(0)NHCHRBC(0)-, где RA и RB представляют собой R-группы двух соседних аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены при помощи способов, аналогичных описанным выше.
Иллюстративные патенты США, в которых описывается получение конъюгатов РНК, включают без ограничения патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730;5552538; 5578717, 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045;
5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585,481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599928 и 5688941; 6294664; 6320017; 6576752; 6783931; 6900297; 7037646; 8106022, полное содержание каждого из которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Нет необходимости, чтобы все положения в данном соединении были единообразно модифицированными, и, фактически, более чем одна из вышеупомянутых модификаций может быть включена в одно соединение или даже в один нуклеозид в iRNA. Настоящее изобретение также предусматривает соединения iRNA, которые являются химерными соединениями.
"Химерные" соединения iRNA, или "химеры", в контексте настоящего изобретения представляют собой соединения iRNA, например, dsRNA, которые содержат две или более химически разных участка, при этом каждый состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т. е. нуклеотида, в случае соединения dsRNA. Такие iRNA, как правило, содержат по меньшей мере один участок, где РНК модифицируют так, чтобы придать iRNA повышенную устойчивость к разрушению нуклеазой, улучшенный захват клеткой и/или повышенную аффинность связывания с целевой нуклеиновой кислотой. Дополнительный участок iRNA может служить в качестве субстрата для ферментов, способных расщеплять гибриды РНК:ДНК или РНК:РНК. В качестве примера, РНКаза Н является клеточной эндонуклеазой, которая расщепляет нить РНК дуплекса РНК:ДНК. Активация РНКазы Н, следовательно, приводит к расщеплению целевой РНК со значительным повышением, таким образом, эффективности ингибирования экспрессии гена посредством iRNA. Следовательно, при применении химерных dsRNA сравниваемые результаты часто могут быть получены для более коротких iRNA по сравнению с фосфотиоатдезокси dsRNA, гибридизирующимися с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК, как правило, можно выявить путем гель-электрофореза и при необходимости с помощью ассоциированных с гибридизацией нуклеиновых кислот методик, известных в уровне техники.
В некоторых случаях РНК из iRNA может быть модифицирована группой, не являющейся лигандом. Ряд молекул, не являющихся лигандами, конъюгировали с iRNA для усиления активности, распределения в клетке или клеточного захвата iRNA, и процедуры для выполнения таких типов конъюгирования доступны в научной литературе. В такие фрагменты, не являющиеся лигандами, включены липидные фрагменты, такие как холестерин (Kubo, Т. et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 2007, 365(1):54-61; Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86:6553), холевая кислота (Manoharan et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 1994, 4:1053), тиоэфир, например, гексил-8-тритилтиол (Manoharan et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 1992, 660:306; Manoharan et al, Bioorg. Med. Chem. Let., 1993, 3:2765), тиохолестерин (Oberhauser et al, Nucl. Acids Res., 1992, 20:533), алифатическая цепь, например, додекандиоловые или ундециловые остатки (Saison-Behmoaras et al, EMBO J., 1991, 10:111; Kabanov etal, FEBS Lett, 1990, 259:327; Svinarchuk etal, Biochimie, 1993, 75:49), фосфолипид, наприме, ди-гексадецил-рац-глицерин или 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-З-Н-фосфонат триэтиламмония (Manoharan et al, Tetrahedron Lett, 1995, 36:3651; Shea et al, Nucl. Acids Res., 1990, 18:3777), полиамин или полиэтиленгликольная цепь (Manoharan et al, Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14:969) или адамантануксусная кислота (Manoharan et al, Tetrahedron Lett, 1995, 36:3651), пальмитиловый фрагмент (Mishra et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264:229), или октадециламин, или гексиламино-карбонил-оксихолестериновый фрагмент (Crooke et al, J. Pharmacol. Exp. Then, 1996, 277:923). Иллюстративные патенты Соединенных Штатов, которые описывают получение таких конъюгатов РНК, были приведены выше. Типичные протоколы конъюгирования предусматривают синтез РНК, несущих аминолинкер в одном или нескольких положениях последовательности. Затем проводят реакцию аминогруппы с молекулой, подлежащей конъюгированию, при помощи соответствующих реагентов конденсации или активации. Реакция конъюгирования может быть выполнена либо с РНК, все еще связанной с твердой подложкой, либо после расщепления РНК в фазе раствора. Очистка конъюгата РНК с помощью HPLC, как правило, дает чистый конъюгат.
Доставка iRNA
Доставка iRNA нуждающемуся в этом субъекту может быть осуществлена несколькими различными путями. Доставку in vivo можно осуществлять непосредственно
путем введения субъекту композиции, содержащей iRNA, например dsRNA. Альтернативно, доставку можно осуществлять опосредованно путем введения одного или нескольких векторов, которые кодируют и направляют экспрессию iRNA. Такие альтернативные случаи описаны далее ниже.
Прямая доставка
Как правило, любой способ доставки молекулы нуклеиновой кислоты может быть адаптирован для применения с iRNA (см., например, Akhtar S. and Julian RL. (1992) Trends Cell. Biol. 2(5): 139-144 и WO94/02595, которые включены в данный документ при помощи ссылки в своей полноте). Однако, существуют три фактора, которые необходимо учитывать для успешной доставки молекулы iRNA in vivo: (а) биологическая стабильность доставляемой молекулы, (2) предупреждение неспецифических эффектов, и (3) накопление доставляемой молекулы в целевой ткани. Неспецифические эффекты iRNA могут быть сведены к минимуму путем локального введения, например, путем прямой инъекции, или вживления в ткань (в качестве неограничивающего примера опухоли), или местного введения препарата. Локальное введение в место обработки максимально увеличивает локальную концентрацию средства, ограничивает воздействие средства на системные ткани, которые в ином случае могут быть повреждены средством или которые могут разрушить средство, и позволяет вводить более низкую общую дозу молекулы iRNA. В нескольких исследованиях был показан эффективный нокдаун генных продуктов при введении iRNA локально. Например, было показано, что внутриглазная доставка dsRNA к VEGF как путем инъекции в стекловидное тело макаков-крабоедов (Tolentino, MJ., et al (2004) Retina 24:132-138), так и субретинальных инъекций мышам (Reich, SJ., et al (2003) Mol. Vis. 9:210-216) предупреждают неоваскуляризацию в экспериментальной модели возрастной дегенерации макулы. Кроме того, прямая внутриопухолевая инъекция dsRNA мышам снижает объем опухолей (Pille, J., et al (2005) Mol. Ther. 11:267-274) и может увеличивать выживаемость мышей с опухолями (Kim, WJ., et al (2006) Mol. Ther. 14:343-350; Li, S., etal (2007) Mol. Ther. 15:515-523). РНК-интерференция также была успешной при локальной доставке к CNS путем прямой инъекции (Dorn, G., et al. (2004) Nucleic Acids 32:e49; Tan, PH., et al (2005) Gene Ther. 12:59-66; Makimura, H., et al (2002) BMC Neurosci. 3:18; Shishkina, GT., etal (2004) Neuroscience 129:521-528; Thakker, ER., et
al (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101:17270-17275; Akaneya,Y., et al (2005) J. Neurophysiol. 93:594-602) и к легким путем интраназального введения (Howard, КА., et al (2006) Mol. Ther. 14:476-484; Zhang, X., etal (2004) J. Biol. Chem. 279:10677-10684; Bitko, V., et al (2005) Nat. Med. 11:50-55). Что касается системного введения iRNA для лечения заболевания, РНК может быть модифицирована или, альтернативно, доставлена при помощи системы доставки лекарственного средства; оба способа служат для предупреждения быстрого разрушения dsRNA эндо- и экзонуклеазами in vivo.
Модификация РНК или фармацевтический носитель также могут обеспечивать нацеливание композиции на основе iRNA на целевую ткань, и с их помощью можно избежать нежелательных нецелевых эффектов. Молекулы iRNA можно модифицировать при помощи химической конъюгации с другими группами, например, липидной или углеводной группой, описанными в данном документе. Такие конъюгаты можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты. Например, конъюгаты GalNAc или составы на основе липидов (например, LNP) можно применять для нацеливания iRNA на определенные клетки, например, клетки печени, например, гепатоциты.
Липофильные группы, такие как холестерин, улучшают захват клеткой и предупреждают разрушение. Например, направленную против АроВ iRNA, конъюгированную с фрагментом, представляющим собой липофильный холестерин, инъецировали системно мышам, что приводило к нокдауну mRNA ароВ как в печени, так и в тонкой кишке (Soutschek, J., et al (2004) Nature 432:173-178). Как было показано, конъюгация iRNA с аптамером способствует ингибированию роста опухоли и опосредует регресс опухоли на мышиных моделях рака предстательной железы (McNamara, JO., et al (2006) Nat. Biotechnol. 24:1005-1015). Согласно альтернативному варианту осуществления iRNA можно доставлять с помощью систем доставки лекарственных средств, таких как наночастица, дендример, полимер, липосомы или катионная система доставки. Положительно заряженные катионные системы доставки способствуют связыванию молекулы iRNA (отрицательно заряженной) и также увеличивают взаимодействия на отрицательно заряженной клеточной мембране с обеспечением эффективного захвата iRNA клеткой. Катионные липиды, дендримеры или полимеры могут либо быть связанными с iRNA, либо их индуцирцют с целью образования везикулы или мицеллы
(см., например, Kim SH., et al (2008) Journal of Controlled Release 129(2): 107-116), которые заключают в себя iRNA. Образование везикул или мицелл также предупреждает разрушение iRNA при введении системно. Способы получения и введения катионных комплексов с iRNA находятся в пределах квалификации специалиста в данной области (см., например, Sorensen, DR., et al (2003) J. Mol. Biol 327:761-766; Verma, UN., et al (2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300; Arnold, AS et al (2007) J. Hypertens. 25:197-205, которые включены в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте). Некоторые неограничивающие примеры систем доставки лекарственных средств, пригодных для системной доставки iRNA, включают DOTAP (Sorensen, DR., et al (2003), выше; Verma, UN., et al (2003), выше), олигофектамин, "твердые частицы с нуклеиновой кислотой-липидом" (Zimmermann, TS., et al (2006) Nature 441:111-114), кардиолипин (Chien, PY., et al (2005) Cancer Gene Ther. 12:321-328; Pal, A., et al (2005) Int J. Oncol. 26:1087-1091), полиэтиленимин (Bonnet ME., et al (2008) Pharm. Res. электронная публикация перед печатью 16 августа; Aigner, А. (2006) J. Biomed. Biotechnol. 71659), содержащие Arg-Gly-Asp (RGD) пептиды (Liu, S. (2006) Mol. Pharm. 3:472-487) и полиамидоамины (Tomalia, DA., etal (2007) Biochem. Soc. Trans. 35:61-67; Yoo, H., et al (1999) Pharm. Res. 16:17991804). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA образуют комплекс с циклодекстрином для системного введения. Способы введения и фармацевтические композиции на основе iRNA и циклодекстринов можно найти в патенте США № 7427605, который включен в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Кодируемые векторами iRNA
Согласно другому аспекту iRNA, нацеленная на ген ALAS1, может экспрессироваться из транскрипционных единиц, вставленных в ДНК- или РНК-векторы (см., например, Couture, A, et al., TIG. (1996), 12:5-10; Skillern, A., et al., международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22113, Conrad, международную публикацию согласно РСТ № WO 00/22114 и Conrad, патент США № 6054299). Экспрессия может быть временной (порядка от часов до недель) или длительной (от недель до месяцев или дольше) в зависимости от конкретной применяемой конструкции и целевой ткани или типа клеток. Такие трансгены можно вводить в виде линейной конструкции, кольцевой плазмиды или вирусного вектора, который может быть интегрирующим или
неинтегрирующим вектором. Трансген также может быть сконструирован с возможностью наследования его в виде экстрахромосомной плазмиды (Gassmann, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995) 92:1292).
Отдельные нить или нити iRNA могут транскрибироваться с промотора вектора экспрессии. В тех случаях, когда необходимо экспрессировать две отдельные нити с получением, например, dsRNA, тогда в целевую клетку можно совместно вводить два отдельных вектора экспрессии (например, путем трансфекции или инфекции). Альтернативно, каждая отдельная нить dsRNA может транскрибироваться с участием промоторов, оба из которых расположены в одной и той же плазмиде экспрессии. Согласно одному варианту осуществления dsRNA экспрессируется в инвертированном повторе, соединенном линкерной полинуклеотидной последовательностью, таким образом, что dsRNA имеет структуру типа "стебель-петля".
Вектор экспрессии с iRNA, как правило, является ДНК-плазмидой или вирусным вектором. Вектор экспрессии, совместимый с эукариотическими клетками, например, с клетками позвоночных, можно применять для получения рекомбинантных конструкций для экспрессии iRNA, как описано в данном документе. Векторы экспрессии для эукариотических клеток хорошо известны в уровне техники и доступны от ряда коммерческих источников. Как правило, такие векторы содержат удобные сайты рестрикции для вставки необходимого сегмента нуклеиновой кислоты. Доставка векторов, экспрессирующих iRNA, может быть системной, как, например, путем внутривенного или внутримышечного введения, путем введения в целевые клетки, эксплантированные от пациента, с последующим обратным введением пациенту или путем любого другого способа, который обеспечивает возможность введения в необходимую целевую клетку.
Плазмиду экспрессии iRNA можно трансфицировать в целевую клетку в виде комплекса с носителем на основе катионного липида (например, олигофектамином) или носителем на основе некатионных липидов (например, Transit-TKO(tm)). В настоящем изобретением также рассматриваются множественные трансфекции при помощи липидов для iRNA-опосредованного нокдауна, нацеленного на различные участки целевой РНК, на протяжении недели или более. Успешное введение векторов в клетки хозяина можно контролировать при помощи разнообразных известных способов. Например, о временной трансфекции может сообщать репортер, такой как флуоресцентный маркер, такой как
зеленый флуоресцентный белок (GFP). Стабильная трансфекция клеток ex vivo может быть подтверждена с применением маркеров, которые обеспечивают устойчивость трансфицированной клетки к определенным факторам окружающей среды (например, антибиотикам и лекарственным средствам), ка кнапример, устойчивость к гигромицину В.
Системы вирусных векторов, которые можно использовать для способов и композиций, описанных в данном документе, включают, без ограничения, (а) аденовирусные векторы; (Ь) ретровирусные векторы, в том числе без ограничения лентивирусные векторы, вирус мышиного лейкоза Молони и т. д.; (с) векторы на основе аденоассоциированного вируса; (d) векторы на основе вируса простого герпеса; (е) векторы на основе SV40; (f) векторы на основе вируса полиомы; (g) векторы на основе вируса папилломы; (h) векторы на основе пикорнавируса; (i) векторы на основе поксвируса, такого как ортопоксвирус, например, векторы на основе вируса осповакцины или авипокс, например, канарипокс или вируса оспы кур; и (j) хелпер-зависимый или "слабый" аденовирус. Также преимущественными могут быть вирусы с нарушенной репликацией. Различные векторы будут или не будут встраиваться в геном клеток. При необходимости, конструкции могут включать вирусные последовательности для трансфекции. Альтернативно, конструкция может быть включена в векторы, способные к эписомальной репликации, например, векторы на основе EPV и EBV. В конструкциях для рекомбинантной экспрессии iRNA, как правило, будут необходимы регуляторные элементы, например, промоторы, энхансеры и т. д. для обеспечения экспрессии iRNA в целевых клетках. Другие аспекты, учитываемые в отношении векторов и конструкций, описаны далее ниже.
Векторы, пригодные для доставки iRNA, будут включать регуляторные элементы (промотор, энхансер и т. д.), достаточные для экспрессии iRNA в необходимой целевой клетке или ткани. Регуляторные элементы можно выбирать для получения либо конститутивной, либо регулируемой/индуцибельной экспрессии.
Экспрессия iRNA может быть точно регулируемой, например, путем применения индуцибельной регуляторной последовательности, которая чувствительна к определенным физиологическим регуляторам, например, уровням циркулирующей глюкозы или гормонам (Docherty et al., 1994, FASEB J. 8:20-24). Такие индуцибельные экспрессирующие системы, подходящие для управления экспрессией dsRNA в клетках
или у млекопитающих, включают, например, регулирование при помощи экдизона, при помощи эстрогена, прогестерона, тетрациклина, химических индукторов димеризации и изопропил-Р-01-тиогалактопиранозида (IPTG). Специалист в данной области сможет выбрать соответствующую регуляторную/промоторную последовательность, опираясь на предполагаемое использование трансгена iRNA.
Согласно конкретному варианту осуществления можно применять вирусные векторы, которые содержат последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA. Например, можно применять ретровирусный вектор (см. Miller et al, Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Такие ретровирусные векторы содержат компоненты, необходимые для правильной упаковки вирусного генома и интеграции в ДНК клетки-хозяина. Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие iRNA, клонируют в один или несколько векторов, которые облегчают доставку нуклеиновой кислоты в организм пациента. Более подробное описание ретровирусных векторов можно найти, например, в Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994), в котором описано применение ретровирусного вектора для доставки гена mdrl к гемопоэтическим стволовым клеткам для придания стволовым клеткам лучшей устойчивости к химиотерапии. Другими источниками, иллюстрирующими применение ретровирусных векторов в генной терапии, являются: Clowes etal, J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994); Kiem etal, Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); и Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993). Лентивирусные векторы, предусматриваемые для применения, включают, например, векторы на основе HIV, описанные в патентах США №№ 6143520; 5665557 и 5981276, которые включены в данный документ при помощи ссылки.
Аденовирусы также предусматриваются для применения при доставке iRNA. Аденовирусы представляют собой особенно перспективные "проводники", например, для доставки генов к респираторному эпителию. Аденовирусы естественным образом инфицируют респираторный эпителий, где они вызывают заболевание с легким течением. Другими целями для основанных на аденовирусах системах доставки являются печень, центральная нервная система, эндотелиальные клетки и мышцы. Аденовирусы обладают преимуществом в том смысле, что они способны инфицировать неделящиеся клетки. В Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)
представлена обзорная статья о генной терапии на основе аденовирусов. В Bout et al, Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) показано применение аденовирусных векторов для переноса генов в респираторный эпителий макак-резус. Другие примеры применения аденовирусов в генной терапии можно найти в Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld etal, Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli etal, J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); публикации согласно РСТ W094/12649 и Wang, et al, Gene Therapy 2:775-783 (1995). Подходящий AV вектор для экспрессии iRNA, описанной в настоящем изобретении, способ конструирования рекомбинантного AV вектора и способ доставки вектора в целевые клетки описаны в Xia Н et al. (2002), Nat. Biotech. 20: 1006-1010.
Также предусмотрено применение векторов на основе адено-ассоциированного вируса (AAV) (Walsh et al, Proc. Soc. Exp. Sci., USA 204:289-300 (1993); патент США № 5436146). Согласно одному варианту осуществления iRNA может экспрессироваться в виде двух отдельных комплементарных однонитевых молекул РНК при помощи рекомбинантного AAV-вектора, например, либо с РНК-промоторами, U6 или HI, либо с промотором цитомегаловируса (CMV). Подходящие AAV-векторы для экспрессии dsRNA, описанной в настоящем изобретении, способы конструирования рекомбинантного AV вектора и способы доставки векторов в целевые клетки описаны в Samulski R et al. (1987), J. Virol. 61: 3096-3101; Fisher К J et al. (1996), J. Virol, 70: 520-532; Samulski R et al. (1989), J. Virol. 63: 3822-3826; патенте США № 5252479; патенте США № 5139941; международной заявке на патент № WO 94/13788 и международной заявке на патент № WO 93/24641, полное раскрытие которых включено в данный документ при помощи ссылки.
Другой типичный вирусный вектор представляет собой поксвирус, такой как вирус осповакцины, например, аттенуированный вирус осповакцины, как, например, модифицированный вирус Анкара (MVA) или NYVAC, авипокс, как, например, вирус оспы кур или канарипокс.
Тропизм вирусных векторов может быть модифицирован путем псевдотипирования векторов белками оболочки или другими поверхностными антигенами из других вирусов или путем замещения различных вирусных капсидных белков, в случае необходимости. Например, лентивирусные векторы можно подвергать псевдотипированию поверхностными белками из вируса везикулярного стоматита (VSV),
вируса бешенства, вируса Эбола, вируса Мокола и т. п. AAV-векторы можно получать для нацеливания на различные клетки путем конструирования векторов так, чтобы они экспрессировали различные серотипы капсидных белков; см., например, Rabinowitz J Е et al. (2002), J Virol 76:791-801, полное раскрытие которого включено в данный документ при помощи ссылки.
Фармацевтический препарат вектора может включать вектор в приемлемом разбавителе или может включать матрицу замедленного высвобождения, в которую включено средство доставки генов. Альтернативно, в случае, когда вектор доставки целого гена может вырабатываться нативно рекомбинантными клетками, например, ретровирусные векторы, тогда фармацевтический препарат может включать одну или несколько клеток, которые предусматривают систему доставки генов.
III. Фармацевтические композиции, содержащие iRNA
Согласно одному варианту осуществления настоящее изобретение представляет фармацевтические композиции, содержащие iRNA, которые описаны в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтическая композиция, содержащая iRNA, является применимой для лечения заболевания или нарушения, связанного с экспрессией или активностью гена ALAS 1 (например, нарушения, включающего порфириновый путь). Такие фармацевтические композиции составляют, исходя из способа доставки. Например, композиции могут быть составлены для системного введения посредством доставки парентеральным путем, например, путем внутривенной (IV) доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, состав LNP), составляют для внутривенной доставки. Согласно некоторым вариантам осуществления композицию, представленную в данном документе (например, композицию, содержащую конъюгат GalNAc), составляют для подкожной доставки.
Фармацевтические композици, описанные в данном документе, вводят в дозе, достаточной для ингибирования экспрессии гена ALAS 1. Как правило, подходящая доза iRNA будет находиться в диапазоне от 0,01 до 200,0 миллиграмм на килограмм массы тела реципиента в сутки, как правило, в диапазоне от 1 до 50 мг на килограмм массы тела в сутки. Например, dsRNA можно вводить по 0,05 мг/кг, 0,5 мг/кг, 1 мг/кг, 1,5 мг/кг, 2
мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг, 20 мг/кг, 30 мг/кг, 40 мг/кг или 50 мг/кг на разовую дозу. Фармацевтическую композицию можно вводить один раз в сутки или iRNA можно вводить в виде двух, трех или более частей дозы через определенные интервалы на протяжении дня, или даже с применением непрерывной инфузий, или доставки с помощью состава с контролируемым высвобождением. В таком случае, количество iRNA, содержащееся в каждой части дозы, должно быть соответственно меньше, чтобы обеспечить общую суточную дозу. Единица дозирования также может быть составлена для доставки в течение нескольких дней, например, с применением традиционного состава с замедленным высвобождением, который предусматривает замедленное высвобождение iRNA в течение периода в несколько дней. Составы с замедленным высвобождением хорошо известны из уровня техники и особенно пригодны для доставки средств в определенный участок, например, их можно применять со средствами по настоящему изобретению. Согласно такому варианту осуществления единица дозирования содержит соответствующее количество суточной дозы.
Эффект разовой дозы в отношении уровней ALAS1 может быть длительным, так что последующие дозы вводят с интервалами не более 3, 4 или 5 дней или с интервалами не более 1, 2, 3 или 4 недель.
Специалисту в данной области будет понятно, что определенные факторы могут влиять на дозу и временные рамки, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе без ограничения тяжесть заболевания или нарушения, варианты предшествующего лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции может включать один период лечения или серию периодов лечения. Расчеты эффективных доз и времени полужизни in vivo для отдельных iRNA, охваченных настоящим изобретением, можно проводить с применением традиционных методологий, или на основании тестирования in vivo с применением соответствующей животной модели, как описано в другой части в данном документе.
Достижения в области генетики мыши привели к созданию ряда мышиных моделей для исследования различных заболеваний человека, таких как патологические процессы, связанные с экспрессией ALAS1 (например, патологические процессы, включающие порфирины или нарушения в рамках порфиринового пути, такие как, например,
порфирий). Такие модели можно применять для in vivo тестирования iRNA, а также для определения терапевтически эффективной дозы и/или эффективной схемы дозирования.
Подходящей мышиной моделью, например, является мышь, содержащая трансген, экспрессирующий ALAS1 человека. Мыши с мутациями нокин (например, мутациями, которые ассоциированы с острыми печеночными порфириями у людей) можно применять для определения терапевтически эффективной дозы и/или длительности введения siRNA ALAS 1. Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, которые включают соединения iRNA, описанные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно вводить различными путями в зависимости от того, необходимо ли локальное или же системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (например, при помощи трансдермального пластыря), легочным, например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи ингалятора; интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным, пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную или внутримышечную инъекцию или инфузию; субдермальное, например посредством вживленного устройства; или интракраниальное, например, интрапаренхиматозное, интратекальное или интравентрикулярное введение.
iRNA можно доставлять таким образом, чтобы происходило нацеливание на конкретную ткань, такую как, ткань, которая вырабатывает эритроциты. Например, iRNA может быть доставлена в костный мозг, печень (например, гепатоциты печени), лимфатические узлы, селезенку, легкие (например,, плевру легких) или позвоночник. Согласно одному варианту осуществления iRNA доставляется в костный мозг.
Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Необходимыми или желательными могут быть общепринятые фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т. д. Также можно использовать презервативы с покрытием, перчатки и т. п. Подходящие составы для местного применения включают составы, в которых iRNA, описанные в настоящем изобретении, находятся в смеси со средством для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот,
стероиды, хелатирующие средства и поверхностно-активные вещества. Подходящие липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOPE), димиристоил фосфатидилхолин (DMPC), дистеароил фосфатидилхолин), отрицательно заряженные (например, димиристоил фосфатидилглицерин (DMPG)) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил (DOTAP) и диолеоил фосфатидилэтаноламин (DOTMA)). iRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомах или могут образовывать комплексы с ними, в частности, с катионными липосомами. Альтернативно, iRNA могут образовывать комплексы с липидами, в частности, с катионными липидами. Подходящие жирные кислоты и сложные эфиры включают без ограничения арахидоновую кислоту, олеиновую кислоту, эйкозановую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или Ci_ юалкиловые сложные эфиры (например, изопропилмиристат (ГРМ)), моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль. Составы для местного применения подробно описаны в патенте США № 6747014, который включен в данный документ при помощи ссылки.
Липосомные составы
Существует много упорядоченных поверхностно-активных структур, помимо микроэмульсий, которые были исследованы и которые применяют для состава лекарственных средств. Они включают монослои, мицеллы, бислои и везикулы. Везикулы, такие как липосомы, привлекли к себе большой интерес в связи со своей специфичностью и длительностью действия, которую они обеспечивают с точки зрения доставки лекарственных средств. Используемое в настоящем изобретении выражение "липосома" означает везикулу, состоящую из амфифильных липидов, упорядоченных в сферический бислой или бислои.
Липосомы представляют собой однослойные или многослойные везикулы, которые имеют мембрану, образованную из липофильного материала, и водное внутреннее пространство. Водная часть содержит композицию, подлежащую доставке. Катионные
липосомы обладают преимуществом в том смысле, что они способны сливаться с клеточной стенкой. Некатионные липосомы, хотя и не могут сливаться настолько эффективно с клеточной стенкой, поглощаются макрофагами in vivo.
Для того, чтобы пройти через интактную кожу млекопитающего, липидные везикулы должны пройти через ряд мелких пор, каждая с диаметром менее 50 нм, под воздействием подходящего трансдермального градиента. Таким образом, желательно применять липосому с высокой способностью к деформации и способностью проходить через такие мелкие поры.
Дополнительные преимущества липосом включают: липосомы, полученные из природных фосфолипидов, биосовместимы и биоразрушаемы; липосомы могут включать широкий диапазон воды и жирорастворимых лекарственных средств; липосомы могут защищать инкапсулированные лекарственные средства во внутренних отделениях от метаболизма и разрушения (Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Важными аспектами в получении липосомных составов являются заряд поверхности липида, размер пузырька и водный объем липосом.
Липосомы являются пригодными для переноса и доставки активных ингредиентов к участку действия. Поскольку мембрана липосом структурно подобна биологическим мембранам, при нанесении липосом на ткань, липосомы начинают сливаться с клеточными мембранами и по мере продолжения слияния липосомы и клетки, содержимое липосом выбрасывается в клетку, где может действовать активное средство.
Липосомные составы были предметом обширного исследования в качестве способа доставки многих лекарственных средств. Существует все больше данных о том, что в случае местного применения липосомы проявляют некоторые преимущества по сравнению с другими составами. Такие преимущества включают сниженное побочное действие, связанное с высокой степенью системной абсорбции введенного лекарственного средства, повышенное накопление введенного лекарственного средства в необходимой цели и возможность вводить в кожу широкий спектр лекарственных средств, как гидрофильных, так и гидрофобных.
В нескольких отчетах подробна описана способность липосом доставлять в кожу средства, в том числе ДНК с высоким молекулярным весом. В кожу вводили соединения,
в том числе анальгетики, антитела, гормоны и ДНК с высоким молекулярным весом. Результатом большей части было нацеливание в верхний слой эпидермиса.
Липосомы делятся на два широких класса. Катионные липосомы являются положительно заряженными липосомами, которые взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Положительно заряженный комплекс ДНК/липосомы связывается с отрицательно заряженной клеточной поверхностью и интернализируется в эндосому. Вследствие того, что внутри эндосомы кислый рН, липосомы разрываются, высвобождая свое содержимое в цитоплазму клетки (Wang etal, Biochem. Biophys. Res. Commun, 1987, 147, 980-985).
Липосомы, которые являются рН-чувствительными или отрицательно-заряженными, захватывают ДНК вместо образования комплекса с ними. Поскольку как ДНК, так и липид имеют одинаковый заряд, то происходит отталкивание вместо образования комплекса. Тем не менее, некоторая часть ДНК захватывается водным внутренним пространством этих липосом. рН-чувствительные липосомы применяли для доставки ДНК, кодирующей ген тимидинкиназы, к монослоям клеток в культуре. Экспрессию экзогенного гена выявляли в целевых клетках (Zhou et al, Journal of Controlled Release, 1992, 19, 269-274).
Один основной тип липосомных композиций включает фосфолипиды, отличные от фосфатидилхолина природного происхождения. Композиции нейтральных липосом, например, могут быть образованы из димиристоилфосфатидилхолина (DMPC) или дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC). Композиции анионных липосом, как правило, образованы из димиристоилфосфатидилглицерина, тогда как анионные фузогенные липосомы образованы главным образом из диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE). Другой тип липосомных композиций образован из фосфатидилхолина (PC), такого как, например, PC соевых бобов и PC яиц. Другой тип образован из смесей фосфолипида, и/или фосфатидилхолина, и/или холестерина.
В некоторые исследованиях оценивали местную доставку липосомных лекарственных составов в кожу. Нанесение липосом, содержащих интерферон, на кожу морских свинок, приводило к уменьшению герпетических поражений кожи, в то время как доставка интерферона другими способами (например, в виде раствора или эмульсии) была неэффективной (Weiner et al, Journal of Drug Targeting, 1992, 2, 405-410). Также в
дополнительном исследовании тестировали эффективность интерферона, вводимого в виде части липосомного состава, по сравнению с введением интерферона с применением водной системы, и сделали заключение, что липосомный состав был более эффективным по сравнению с водным введением (du Plessis et al, Antiviral Research, 1992, 18, 259-265).
Неионные липосомные системы также исследовали для определения их пригодности для доставки лекарственных средств в кожу, в частности, системы, содержащие неионное поверхностно-активное вещество и холестерин. Неионные липосомные составы, содержащие Novasome(tm) I
(глицерилдилаурат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир) и Novasome(tm) II (глицерилдистеарат/холестерин/полиоксиэтилен-10-стеариловый эфир), применяли для доставки циклоспорина-А в слой дермы кожи мышей. Результаты показали, что такие неионные липосомные системы были эффективны в облегчении депонирования циклоспорина-А в различных слоях кожи (Ни et al. S.T.P.Pharma. Sci., 1994, 4, 6, 466).
ЛИПОСОМЫ также включают "пространственно стабилизированные" липосомы, выражение, используемое в данном документе, относится к липосомам, содержащим один или несколько специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению времени жизни в крови по сравнению с липосомами, у которых отсутствуют такие специализированные липиды. Примерами пространственно стабилизированных липосом являются липосомы, в которых часть липидной составляющей, образующей везикулу липосомы (А), содержит один или несколько гликолипидов, таких как моносиалоганглиозид GMI, ИЛИ (В), полученная из одного или нескольких гидрофильных полимеров, таких как полиэтиленгликолевый (PEG) фрагмент. Без углубления в теорию, в уровне техники полагают, что по меньшей мере для пространственно стабилизированных липосом, содержащих ганглиозиды, сфингомиелин или PEG-производные липиды, увеличенное время полужизни в кровотоке этих пространственно стабилизированных липосом является следствием сниженной степени захвата клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES) (Allen et al., FEBS Letters, 1987, 223, 42; Wu et al, Cancer Research, 1993, 53, 3765).
Разнообразные липосомы, содержащие один или несколько гликолипидов, известны из уровня техники. Papahadjopoulos et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci., 1987, 507, 64) описали способность моносиалоганглиозида GMI, сульфата галактоцереброзида и
фосфатидилинозитола увеличивать время полужизни липосом в крови. Эти результаты были интерпретированы Gabizon et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85, 6949). В патентах США № 4837028 и WO 88/04924, оба из которых принадлежат Allen et al., раскрыты липосомы, содержащие (1) сфингомиелин и (2) ганглиозид GMI ИЛИ сложные эфиры сульфата галактоцереброзида. В патенте США № 5543152 (Webb et al) раскрыты липосомы, содержащие сфингомиелин. Липосомы, содержащие 1,2-sn-димиристоилфосфатидилхолин, раскрыты в WO 97/13499 (Lim et al).
В уровне техники известно много липосом, содержащих липиды, полученные с помощью одного или нескольких гидрофильных полимеров, и способы их получения. Sunamoto et al. (Bull. Chem. Soc. Jpn., 1980, 53, 2778) описали липосомы, содержащие неионный детергент, 2Сш5с который содержит PEG-фрагмент. Ilium et al. (FEBS Lett., 1984, 167, 79) обнаружили, что гидрофильное покрытие полистиреновых частиц полимерными гликолями приводит к значительно увеличенному времени полужизни в крови. Синтетические фосфолипиды, модифицированные присоединением карбоновых групп полиалкиленгликолей (например, PEG), описаны Sears (патенты США №№ 4426330 и 4534899). Klibanov etal. (FEBS Lett., 1990, 268, 235) описали эксперименты, демонстрирующие, что липосомы, содержащие фосфатидилэтаноламин (РЕ), полученный с помощью PEG или PEG стеарата, характеризуются значительным увеличением времени полужизни в крови. Blume et al. (Biochimica et Biophysica Acta, 1990, 1029, 91) расширили такие наблюдения в отношении других дериватизированных PEG фосфолипидов, например, DSPE-PEG, образованный в результате комбинации
дистеароилфосфатидилэтаноламина (DSPE) и PEG. Липосомы, содержащие ковалентно связанные PEG-фрагменты на своей внешней поверхности, описаны в европейском патенте № ЕР 0445131 В1 и WO 90/04384 Fisher. Липосомные композиции, содержащие 120 мольных процентов РЕ, дериватизированных PEG, и способы их получения описаны Woodle et al. (патенты США №№ 5013556 и 5356633) и Martin et al. (патент США № 5213804 и европейский патент № ЕР 0496813 В1). Липосомы, содержащие ряд других конъюгатов липид-полимер раскрыты в WO 91/05545 и патенте США № 5225212 (оба из которых принадлежат Martin et al) и в WO 94/20073 (Zalipsky et al). Липосомы, содержащие PEG-модифицированный церамид, раскрыты в WO 96/10391 (Choi et al). В патенте США № 5540935 (Miyazaki et al) и патенте США № 5556948 (Tagawa et al.)
описаны PEG-содержащие липосомы, которые могут быть дополнительно дериватизированы функциональными фрагментами на их поверхностях.
В уровне техники известен ряд липосом, содержащих нуклеиновые кислоты. В WO 96/40062 Thierry et al. раскрываты способы инкапсулирования в липосомы нуклеиновых кислот с высоким молекулярным весом. В патенте США № 5264221 Tagawa et al. раскрыты связанные с белком липосомы и заявлено, что содержимое таких липосом может включать dsRNA. В патенте США № 5665710 Rahman et al. описаны определенные способы инкапсулирования в липосомы олигодезоксинуклеотидов. В WO 97/04787 Love et al. раскрыты липосомы, содержащие dsRNA, наыеленные на ген raf.
Трансферсомы представляют собой еще один тип липосом и представляют собой липидные агрегаты с высокой способностью деформироваться, они являются перспективными кандидатами как средства доставки лекарственных средств. Трансферсомы могут быть описаны как липидные капельки, которые обладают настолько высокой способностью деформироваться, что они легко могут проникать через поры, меньшие, чем капелька. Трансферсомы являются приспосабливающимися к окружающей среде, в которой их используют, например, они являются самооптимизирующимися (приспосабливающимися к форме пор кожи), самовосстанавливающимися, зачастую достигают мишеней без разделения на фрагменты и часто могут быть самозагружающимися. Для получения трансферсом можно добавлять поверхностные пограничные активаторы, обычно поверхностно-активные вещества, к стандартной липосомной композиции. Трансферсомы применяли для доставки сывороточного альбумина в кожу. Как было показано, опосредованная трансферсомами доставка сывороточного альбумина была такой же эффективной, как подкожная инъекция раствора, содержащего сывороточный альбумин.
Поверхностно-активные вещества находят широкое применение в составах, таких как эмульсии (в том числе микроэмульсии) и липосомы. Наиболее распространенным способом классифицирования и ранжирования свойств многих различных типов поверхностно-активных веществ, как природных, так и синтетических, является применение гидролипидного баланса (HLB). Природа гидрофильной группы (также известной как "головка") предоставляет наиболее эффективное средство для распределения по категориям различных поверхностно-активных веществ, применяемых в
составах (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Если молекула поверхностно-активного вещества не ионизирована, то ее классифицируют как неионное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества находят широкое применение в фармацевтических и косметических продуктах, и их можно применять при широком диапазоне значений рН. Обычно их значения HLB находятся в диапазоне от 2 до приблизительно 18, в зависимости от их структуры. Неионные поверхностно-активные вещества включают неионные сложные эфиры, такие как сложные эфиры этиленгликоля, сложные эфиры пропиленгликоля, сложные эфиры глицерила, сложные эфиры полиглицерила, сложные эфиры сорбитана, сложные эфиры сахарозы и этоксилированные сложные эфиры. Неионные алканоамиды и эфиры, как, например, этоксилаты жирного спирта, пропоксилированные спирты и этоксилированные/пропоксилированные блоксополимеры, также включены в данный класс. Полиоксиэтиленовые поверхностно-активные вещества являются наиболее распространенными представителями класса неионных поверхностно-активных веществ.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет отрицательный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как анионное. Анионные поверхностно-активные вещества включают карбоксилаты, как, например, омыляющие вещества, ациллактилаты, ациламиды аминокислот, сложные эфиры серной кислоты, такие как алкилсульфаты и этоксилированные алкилсульфаты, сульфонаты, такие как алкилбензолсульфонаты, ацилизетионаты, ацилтаураты и сульфосукцинаты, и фосфаты. Наиболее важными представителями класса анионных поверхностно-активных веществ являются алкилсульфаты и омыляющие вещества.
Если молекула поверхностно-активного вещества несет положительный заряд при растворении или диспергировании в воде, то поверхностно-активное вещество классифицируют как катионное. Катионные поверхностно-активные вещества включают четвертичные соли аммония и этоксилированные амины. Четвертичные соли аммония являются наиболее применяемыми представителями данного класса.
Если молекула поверхностно-активного вещества обладает способностью нести либо положительный, либо отрицательный заряд, то поверхностно-активное вещество классифицируют как амфотерное. Амфотерные поверхностно-активные вещества включают производные акриловой кислоты, замещенные алкиламиды, N-алкилбетаины и фосфатиды.
Было рассмотрено применение поверхностно-активных веществ в готовых лекарственных формах, составах и в эмульсиях (Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, p. 285).
Частицы нуклеиновая кислота-липид
Согласно одному варианту осуществления dsRNA ALAS1, описанная в настоящем изобретении, полностью инкапсулирована в липидный состав, например, с образованием SPLP, pSPLP, SNALP или другой частицы нуклеиновая кислота-липид. Используемое в данном документе выражение "SNALP" относится к стабильной частице нуклеиновая кислота-липид, в том числе SPLP. Используемое в данном документе выражение "SPLP" относится к частице нуклеиновая кислота-липид, содержащей плазмидную ДНК, инкапсулированную в липидной везикуле. SNALP и SPLP, как правило, содержат катионный липид, некатионный липид и липид, который предупреждает агрегацию частиц (например, конъюгат PEG-липид). SNALP и SPLP особенно пригодны для системных применений, поскольку они характеризуются длительным временем жизни в крови после внутривенной (i.v.) инъекции и накапливаются в дистальных участках (например, участках, физически отделенных от места введения). SPLP включают "pSPLP", которая включает инкапсулированный комплекс конденсирующее средство-нуклеиновая кислота, который приведен в публикации согласно РСТ № WO 00/03683. Частицы согласно настоящему изобретению обычно имеют средний диаметр от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, чаще от приблизительно 60 нм до приблизительно 130 нм, чаще от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм, наиболее часто от приблизительно 70 нм до приблизительно 90 нм и практически нетоксичны. Кроме того, нуклеиновые кислоты, когда присутствуют в частицах нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению, устойчивы в водном растворе к разрушению нуклеазой. Частицы нуклеиновая кислота-липид и способ их получения раскрыты, например, в
патентах США №№ 5976567; 5981501; 6534484; 6586410; 6815432; публикации согласно РСТ № WO 96/40964.
Согласно одному варианту осуществления соотношение липида и лекарственного средства (соотношение масса/масса) (например, соотношение липида и dsRNA) будет находится в диапазоне от приблизительно 1:1 до приблизительно 50:1, от приблизительно 1:1 до приблизительно 25:1, от приблизительно 3:1 до приблизительно 15:1, от приблизительно 4:1 до приблизительно 10:1, от приблизительно 5:1 до приблизительно 9:1 или от приблизительно 6:1 до приблизительно 9:1.
Катионный липид может представлять собой, например, хлорид ТЧ^-диолеил-Г^гЧ-диметиламмония (DODAC), бромид М,М-дистеарил-гЧ,гЧ-диметиламмония (DDAB), хлорид М-(1-(2,3-диолеоилокси)пропил)-К,К,гЧ-триметиламмония (DOTAP), хлорид N-(1-(2,3 -диолеилокси)пропил)-К,г> Г,гЧ-триметиламмония (DOTMA), N,N-диметил-2,3 -диолеилокси)пропиламин (DODMA), 1,2-дилинолеилокси-гЧ,гЧ-диметиламинопропан (DLinDMA), 1,2-дилиноленилокси-г> Г,гЧ-диметиламинопропан (DLenDMA), 1,2-дилинолеилкарбамоилокси-3-диметиламинопропан (DLin-C-DAP), 1,2-дилинолеилокси-З-(диметиламино)ацетоксипропан (DLin-DAC), 1,2-дилинолеилокси-З-морфолинопропан (DLin-MA), 1,2-дилинолеоил-З-диметиламинопропан (DLinDAP), 1,2-дилинолеилтио-З-диметиламинопропан (DLin-S-DMA), 1-линолеоил-2-линолеилокси-3-диметиламинопропан (DLin-2-DMAP), хлористую соль 1,2-дилинолеилокси-З-триметиламинопропана (DLin-TMA.Cl), хлористую соль 1,2-дилинолеоил-З-триметиламинопропана (DLin-TAP.Cl), 1,2-дилинолеилокси-3-(гЧ-метилпиперазино)пропан (DLin-MPZ) или 3-(гЧ,гЧ-дилинолеиламино)-1,2-пропандиол (DLinAP), 3-(гЧ,гЧ-диолеиламино)-1,2-пропандиол (DOAP), 1,2-дилинолеилоксо-3-(2-гЧ,гЧ-диметиламино)этоксипропан (DLin-EG-DMA), 1,2-дилиноленилокси-М,К-диметиламинопропан (DLinDMA), 2,2-дилинолеил-4-диметиламинометил-[1,3]-диоксолан (DLin-K-DMA) или его аналоги, (3aR,5s,6aS)-N,N-flHMeTrni-2,2-flH((9Z,12Z)-OKrafleKa-9,12-диенил)тетрагидро-ЗаН-циклопента[ё][1,3]диоксол-5-амин (ALN100), (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (МСЗ), 1,Г-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пиперазин-1-ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (Tech G1) или их смесь. Катионный липид может
содержать от приблизительно 20 мол. % до приблизительно 50 мол. % или приблизительно 40 мол. % от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно другому варианту осуществления можно применять соединение 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан для получения наночастиц липид -siRNA. Синтез 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолана описан в предварительной заявке на патент США № 61/107998, поданной 23 октября 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки.
Согласно одному варианту осуществления частицы липид-siRNA включают 40% 2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан; 10%DSPC; 40% холестерин; 10% PEG-C-DOMG (мольный процент) с размером частиц 63,0 ± 20 нм и соотношением siRNA/липид 0,027.
Некатионный липид может представлять собой анионный липид или нейтральный липид, в том числе без ограничения дистеароилфосфатидилхолин (DSPC), диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), дипальмитоилфосфатидилглицерин (DPPG), диолеоил-фосфатидилэтаноламин (DOPE), пальмитоилолеоилфосфатидилхолин (РОРС), пальмитоилолеоилфосфатидилэтаноламин (POPE), диолеоил-фосфатидилэтаноламин-4-(К-малеимидометил)-циклогексан-1-карбоксилат (DOPE-mal),
дипальмитоилфосфатидилэтаноламин (DPPE), димиристоилфосфоэтаноламин (DMPE), дистеароил-фосфатидил-этаноламин (DSPE), 16-О-монометил-РЕ, 16-О-диметил-РЕ, 18-1-транс-РЕ, 1-стеароил-2-олеоил-фосфатидилэтаноламин (SOPE), холестерин или их смесь. Некатионный липид может составлять от приблизительно 5 мол. % до приблизительно 90 мол. %, приблизительно 10 мол. % или приблизительно 58 мол. %, если холестерин включен, от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Конъюгированный липид, который ингибирует агрегацию частиц, может представлять собой, например, конъюгат полиэтиленгликоль (РЕО)-липид, в том числе, без ограничения, PEG-диацилглицерин (DAG), PEG-диалкилоксипропил (DAA), PEG-фосфолипид, PEG-церамид (Сег) или их смесь. Конъюгат PEG-DAA может представлять собой, например, PEG-дилаурилоксипропил (С12), PEG-димиристоилоксипропил (С14), PEG-дипальмитилоксипропил (Cie) или PEG-дистеарилоксипропил (Cig). Конъюгированный липид, который предупреждает агрегацию частиц, может составлять от
О мол. % до приблизительно 20 мол. % или приблизительно 2 мол. % от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид дополнительно включают холестерин в количестве, например, от приблизительно 10 мол. % до приблизительно 60 мол. % или приблизительно 48 мол. % от общего содержания липидов, присутствующих в частице.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидной наночастицы (LNP).
LNP01
Согласно одному варианту осуществления липидоид ND98-4HC1 (MW 1487) (см. заявку на патент США № 12/056230, поданную 26 марта 2008 г., которая включена в данный документ при помощи ссылки), холестерин (Sigma-Aldrich) и PEG-церамид С16 (Avanti Polar Lipids) можно применять для получения наночастицы липид-dsRNA (т. е. частиц LNP01). Маточные растворы каждого в этаноле могут быть получены следующим образом: ND98, 133 мг/мл; холестерин, 25 мг/мл, PEG-церамид С16, 100 мг/мл. Маточные растворы ND98, холестерина и PEG-церамида С16 можно затем объединять, например, в молярном соотношении 42:48:10. Объединенный липидный раствор можно смешивать с водным раствором dsRNA (например, в ацетате натрия, рН 5) так, чтобы конечная концентрация этанола составляла приблизительно 35-45%, а конечная концентрация ацетата натрия составляла приблизительно 100-300 мМ. Наночастицы липид-dsRNA обычно образуются самопроизвольно при смешивании. В зависимости от необходимого распределения частиц по размеру, полученную смесь наночастиц можно продавливать через поликарбонатную мембрану (например, с отсечением по размеру в 100 нм) с применением, например, экструдера с термоцилиндром, как, например, Lipex Extruder (Northern Lipids, Inc). В некоторых случаях стадию экструзии можно пропустить. Удаление этанола и одновременная замена буфера могут быть осуществлены, например, при помощи диализа или тангенциальной поточной фильтрации. Буфер можно заменить, например, забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS) с рН приблизительно 7, например, рН приблизительно 6,9, рН приблизительно 7,0, рН приблизительно 7,1, рН приблизительно 7,2, рН приблизительно 7,3 или рН приблизительно 7,4.
н н
Изомер IND98
Формула 1
Составы LNP01 описаны, например, в публикации международной заявки № WO 2008/042973, которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
Дополнительные иллюстративные составы с липидом-dsRNA представлены в следующей таблице.
LNP07
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС)
XTC/DSPC/xoflecTepHH/PEG-DMG
60/7,5/31/1,5,
липид: siRNA ~ 6:1
LNP08
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС)
XTC/DSPC/xoflecTepnH/PEG-DMG
60/7,5/31/1,5,
липид: siRNA - 11:1
LNP09
2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил- [ 1,3] -диоксолан (ХТС)
XTC/DSPC/xoflecTepnH/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид^РЛЧА 10:1
LNP 10
(3aR,5s,6aS)-N,N-flHMenui-2,2-m((9Z, 122)-октадека-9,12-диенил)тетрагидро -3 аН-циклопента[с1] [1,3]диоксол-5-амин (ALN100)
ALN100/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
flnni^siRNA 10:1
LNP 11
(6Z,9Z,28Z,312)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноат (МСЗ)
MC-3/D SPC/xoflecTepnH/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид^РЛЧА 10:1
LNP 12
1,1'-(2-(4-(2-((2-(бис(2-гидроксидодецил)амино)этил)(2-гидроксидодецил)амино)этил)пипера зин-1 -ил)этилазанедиил)дидодекан-2-ол (С12-200)
С12-200/D SPC/xo лестерин/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
flnni^siRNA 10:1
LNP 13
ХТС
XTC/DSPC/xofl/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид:siRNA: 33:1.
LNP 14
МСЗ
MC3/DSPC/xofl/PEG-DMG
40/15/40/5
липид: siRNA: 11:1.
LNP 15
МСЗ
MC3/DSPC/xofl/PEG-DSG/GalNAc-
PEG-DSG
50/10/35/4,5/0,5
липид: siRNA: 11:1.
LNP 16
MC3
МСЗ/DSPC/XOJI/PEG-DMG
50/10/38,5/1,5
липид:siRNA: 7:1.
LNP 17
MC3
МСЗ/DSPC/XOJI/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 jnnnresiRNA: 10:1.
LNP 18
MC3
MC3/DSPC/XOJI/PEG-DMG 50/10/38,5/1,5 jnnnresiRNA: 12:1.
LNP 19
MC3
MC3/DSPC/XOJI/PEG-DMG
50/10/35/5
липид:siRNA: 8:1.
LNP20
MC3
MC3/DSPC/XOJI/PEG-DPG 50/10/38,5/1,5 jnnnresiRNA: 10:1.
LNP21
С12-200
C12-200/DSPC/XOJI/PEG-DSG
50/10/38,5/1,5
липид:siRNA: 7:1.
LNP22
ХТС
XTC/DSPC/XOJI/PEG-DSG 50/10/38,5/1,5 jnnnresiRNA: 10:1.
DSPC: дистеароилфосфатидилхолин;
DPPC: дипальмитоилфосфатидилхолин;
PEG-DMG: PEG-дидимиристоилглицерин (C14-PEG или PEG-C14) (PEG со ср. мол.
весом 2000);
PEG-DSG: PEG-дистирилглицерин (C18-PEG или PEG-C18) (PEG со ср. мол. весом
2000);
PEG-cDMA: РЕО-карбамоил-1,2-димиристоилоксипропиламин (PEG со ср. мол. весом 2000).
Составы, содержащие SNALP (1,2-дилиноленилокси-г\Г,гЧ-диметиламинопропан (DLinDMA)), описаны в международной публикации № WO2009/127060, поданной 15 апреля 2009 г., которая включена, таким образом, при помощи ссылки.
ХТС-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/148366, поданной 29 января 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/156851, поданной 2 марта 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № , поданной 10 июня 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/228373, поданной 24 июля 2009 г.; предварительной заявке США с серийным № 61/239686, поданной 3 сентября 2009 г., и международной заявке № PCT/US2010/022614, поданной 29 января 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
МСЗ-содержащие составы описаны, например, в предварительной заявке США с серийным № 61/244834, поданной 22 сентября 2009 г., предварительной заявке США с серийным № 61/185800, поданной 10 июня 2009 г., и международной заявке № PCT/US10/28224, поданной 10 июня 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
ALNY-100-содержащие составы описаны, например, в международной заявке на патент с номером PCT/US09/63933, поданной 10 ноября 2009 г., которая, таким образом, включена при помощи ссылки.
С12-200-содержащие составы описаны в предварительной заявке США с серийным № 61/175770, поданной 5 мая 2009 г., и международной заявке № PCT/US10/33777, поданной 5 мая 2010 г., которые, таким образом, включены при помощи ссылки.
Синтез катионных липидов
Любое из соединений, например, катионные липиды и т. п., применяемые в частицах нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, можно получить при помощи известных методик органического синтеза, включая способы, описанные более подробно в примерах. Все заместители являются такими, как определено ниже, если не указано иное.
"Алкил" означает углеводород с прямой цепью или разветвленный, нециклический или циклический, насыщенный алифатический углеводород, содержащий от 1 до 24
атомов углерода. Типичные насыщенные алкилы с прямой цепью включают метил, этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и т. п.; тогда как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и т. п. Типичные насыщенные циклические алкилы включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и т. п.; тогда как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и т. п.
"Алкенил" означает алкил, который определен выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Типичные алкенилы с прямой цепью и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2-бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил и т. п.
"Алкинил" означает любой алкил или алкенил, которые определены выше, которые дополнительно содержат по меньшей мере одну тройную связь между соседними атомами углерода. Типичные алкинилы с прямой цепью и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и т. п.
"Ацил" означает любой алкил, алкенил или алкинил, в которых атом углерода в точке присоединения замещен оксогруппой, которая определена ниже. Например, -С(=0)алкил, -С(=0)алкенил и -С(=0)алкинил представляют собой ацильные группы.
"Гетероцикл" означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое, гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, ненасыщенным, либо ароматическим, и которое содержит 1 или 2 гетероатома, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы необязательно могут быть окислены, и гетероатом азота необязательно может быть кватернизирован, в том числе бициклические кольца, в которых любой из вышеперечисленных гетероциклов слит с бензольным кольцом. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, которые определены ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил,
тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и т. п.
Выражения "необязательно замещенный алкил", "необязательно замещенный алкенил", "необязательно замещенный алкинил", "необязательно замещенный ацил" и "необязательно замещенный гетероцикл" означают, что при замещении по меньшей мере один атом водорода заменяется заместителем. В случае оксо-заместителя (=0) замещаются два атома водорода. В этом отношении заместители включают оксо, галоген, гетероцикл, -CN, -0RX, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry -NRxS02Ry, -C(=0)Rx, -C(=0)ORx, -C(=0)NRxRy, -SOnRx и -SOnNRxRy, где n равняется 0, 1 или 2, Rx и Ry являются одинаковыми или отличаются и независимо являются водородом, алкилом или гетероциклом, и каждый из упомянутых алкильных или гетероциклических заместителей может быть дополнительно замещен одним или несколькими из оксо, галогена, -ОН, -CN, алкила, -ORx, гетероцикла, -NRxRy, -NRxC(=0)Ry -NRxS02Ry, -C(=0)Rx, -C(=0)ORx, -C(=0)NRxRy, -SO"Rx и -SO"NRxRy.
"Галоген" означает фтор, хлор, бром и йод.
Согласно некоторым вариантам осуществления способы, описанные в настоящем изобретении, могут потребовать применение защитных групп. Методика с применением защитных групп хорошо известна специалистам в данной области (см., например, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et al., Wiley-Interscience, New York City, 1999). Вкратце, защитные группы в контексте настоящего изобретения представляют собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность функциональной группы. Защитную группу можно добавлять к функциональной группе для блокирования ее химической активности во время определенных реакций и затем удалять с открытием исходной функциональной группы. Согласно некоторым вариантам осуществления применяют "защитную группу для спиртовой группы". "Защитная группа для спиртовой группы" представляет собой любую группу, которая снижает или устраняет нежелательную химическую активность спиртовой функциональной группы. Защитные группы можно добавлять и удалять при помощи методик, хорошо известных в уровне техники.
Синтез формулы А
Согласно одному варианту осуществления частицы нуклеиновая кислота-липид, описанные в настоящем изобретении, составляют с применением катионного липида формулы А:
где R1 и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил, или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо. Согласно некоторым вариантам осуществления катионный липид представляет собой ХТС, (2,2-дилинолеил-4-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксолан). Как правило, липид формулы А, приведенной выше, может быть получен при помощи следующих схем реакций 1 или 2, где все заместители являются такими, как определено выше, если не указано иное.
Липид А, где Ri и R2 независимо представляют собой алкил, алкенил или алкинил, при этом каждый необязательно может быть замещен, a R3 и R4 независимо представляют собой низший алкил или R3 и R4 могут, взятые вместе, образовывать необязательно замещенное гетероциклическое кольцо, может быть получен согласно схеме 1. Кетон 1 и бромид 2 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 1 и 2 дает кеталь 3. Обработка кеталя 3 амином 4 дает липиды формулы А. Липиды формулы А можно превращать в соответствующую аммонийную соль при помощи органической соли формулы 5, где X представляет собой анион, противоион, выбранный из галогена, гидроксида, фосфата, сульфата или т. п.
Схема 2
BrMg-Ft,
R2-CN
N-R4
R2 Ri
Альтернативно, исходный материал в виде кетона 1 может быть получен согласно схеме 2. Реактив Гриньяра 6 и цианид 7 могут быть приобретены или получены согласно способам, известным специалисту в данной области. Реакция между 6 и 7 дает кетон 1. Превращение кетона 1 в соответствующие липиды формулы А является таким, как описано на схеме 1.
Синтез МСЗ
Получение DLin-M-C3-DMA (т. е. (6Z,9Z,28Z,31Z)-renTaTpnaKOHTa-6,9,28,31-тетраен-19-ил-4-(диметиламино)бутаноата) было следующим. Раствор (6Z,9Z,28Z,31Z)-гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-ола (0,53 г), гидрохлорида 4-N,N-диметиламиномасляной кислоты (0,51 г), 4-гЧ,гЧ-диметиламинопиридина (0,61 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (0,53 г) в дихлорметане (5 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор промывали разбавленной хлористоводородной кислотой, за которой следовал разбавленный водный бикарбонат натрия. Органические фракции высушивали над безводным сульфатом магния, фильтровали и растворитель удаляли при помощи роторного вакуумного испарителя. Остаток пропускали через колонку с силикагелем (20 г) с применением градиента элюирования 1-5% метанол/дихлорметан. Фракции, содержащие очищенный продукт, объединяли и растворитель удаляли с получением бесцветного масла (0,54 г).
Синтез ALNY-100
Синтез кеталя 519 [ALNY-100] осуществляли с применением следующей схемы 3:
NHBoc NHMi
Cbz-OSu, NEt3
NCbz
OH S17A
Me2N'
u;
Синтез 515:
К перемешиваемой суспензии LiAlH4 (3,74 г, 0,09852 моля) в 200 мл безводного THF в двугорлой RBF (1л) медленно добавляли раствор 514 (10 г, 0,04926 моля) в 70 мл THF при 0°С в атмосфере азота. После завершения добавления реакционную смесь нагревали до комнатной температуры и затем нагревали до появления конденсации в течение 4 ч. Течение реакции отслеживали при помощи TLC. После завершения реакции (определяли при помощи TLC) смесь охлаждали до 0°С и гасили аккуратным добавлением насыщенного раствора Na2S04. Реакционную смесь перемешивали в течение 4 ч. при комнатной температуре и отфильтровывали. Остаток хорошо промывали THF. Фильтрат и осадок, полученный при промывке, смешивали, и разбавляли 400 мл диоксана и 26 мл конц. НС1, и перемешивали в течение 20 минут при комнатной температуре. Летучие вещества отгоняли в вакууме с получением хлористоводородной соли 515 в виде белого твердого вещества. Выход: 7,12 г 1Н-ЯМР (DMSO, 400 МГц): 5= 9,34 (широкий, 2Н), 5,68 (s, 2Н), 3,74 (m, Ш), 2,66-2,60 (т, 2Н), 2,50-2,45 (т, 5Н).
Синтез 516:
К перемешиваемому раствору соединения 515 в 100 мл сухого DCM в 250 мл двухгорлой RBF добавляли NEt3 (37,2 мл, 0,2669 моля) и охлаждали до 0°С в атмосфере азота. После медленного добавления №(бензилокси-карбонилокси)-сукцинимида (20 г, 0,08007 моля) в 50 мл сухого DCM реакционной смеси давали нагреться до комнатной температуры. После завершения реакции (2-3 ч., определяли при помощи TLC) смесь
промывали последовательно раствором 1 н. НС1 (1 х 100 мл) и насыщенным раствором NaHC03 (1 х 50 мл). Органический слой затем высушивали над безводн. Na2S04 и растворитель выпаривали с получением неочищенного материала, который очищали при помощи колоночной хроматографии с силикагелем с получением 516 в виде липкой массы. Выход: 11 г (89%). Ш-ЯМР (CDC13, 400 МГц): 5 = 7,36-7,27(m, 5Н), 5,69 (s, 2Н), 5,12 (s, 2Н), 4,96 (br., 1Н) 2,74 (s, ЗН), 2,60(т, 2Н), 2,30-2,25(т, 2Н). LC-MS [М+Н] -232,3 (96,94%).
Синтез 517А и 517В:
Циклопентен 516 (5 г, 0,02164 моля) растворяли в растворе 220 мл ацетона и воды (10:1) в одногорлой 500 мл RBF и к нему добавляли ТчГ-метил-морфолин-гЧ-оксид (7,6 г, 0,06492 моля), за которым следовали 4,2 мл 7,6% раствора Os04 (0,275 г, 0,00108 моля) в трет-бутаноле при комнатной температуре. После завершения реакции (~ 3 ч.) смесь гасили при помощи добавления твердого Na2S03 и полученную смесь перемешивали в течение 1,5 ч. при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавляли DCM (300 мл) и промывали водой (2 х 100 мл), после чего следовал насыщенный раствор NaHC03 (1 х 50 мл), вода (1 х 30 мл) и в конце соляной раствор (1х 50 мл). Органическую фазу высушивали над безводн. Na2S04 и растворитель удаляли в вакууме. В результате очистки неочищенного материала при помощи колоночной хроматографии с силикагелем получали смесь диастереоизомеров, которые разделяли при помощи преп. HPLC. Выход: -6 г неочищенного продукта.
517А - пик-1 (белое твердое вещество), 5,13 г (96%). Ш-ЯМР (DMSO, 400 МГц): 5= 7,39-7,3l(m, 5Н), 5,04(s, 2Н), 4,78-4,73 (т, Ш), 4,48-4,47(d, 2Н), 3,94-3,93(т, 2Н), 2,71(s, ЗН), 1,72- 1,67(т, 4Н). LC-MS - [М+Н]-266,3, [M+NH4 +]-283,5 присутствует, HPLC-97,86%. Стереохимию подтверждали при помощи рентгенограммы.
Синтез 518:
При помощи процедуры, аналогичной описанной для синтеза соединения 505, соединение 518 (1,2 г, 41%) получали в виде бесцветного масла. Ш-ЯМР (CDC13, 400 МГц): 5= 7,35-7,33(m, 4Н), 7,30-7,27(т, Ш), 5,37-5,27(т, 8Н), 5,12(s, 2Н), 4,75(т,1Н), 4,58
4,57(m,2H), 2,78-2,74(m,7H), 2,06-2,00(m,8H), l,96-l,91(m, 2H), l,62(m, 4H), l,48(m, 2H), l,37-l,25(br m, 36H), 0,87(m, 6H). HPLC-98,65%.
Общая процедура для синтеза соединения 519:
Раствор соединения 518 (1 экв.) в гексане (15 мл) добавляли по каплям к охлажденному на льду раствору LAH в THF (1 М, 2 экв.). После завершения добавления смесь нагревали при 40°С в течение 0,5 ч., затем охлаждали снова на ледяной бане. Смесь аккуратно гидролизовали насыщенным водным Na2S04, затем фильтровали через целит и переводили в масло. С помощью колоночной хроматографии получали чистое 519 (1,3 г, 68%), которое получали в виде бесцветного масла. 13С ЯМР = 130,2, 130,1 (х2), 127,9 (хЗ), 112,3, 79,3, 64,4, 44,7, 38,3, 35,4, 31,5, 29,9 (х2), 29,7, 29,6 (х2), 29,5 (хЗ), 29,3 (х2), 27,2 (хЗ), 25,6, 24,5, 23,3, 226, 14,1; MS с электрораспылением (+ve): Молекулярный вес для C44H80NO2 (М + Н)+ вычисл. 654,6, обнаруженный 654,6.
Составы, полученные либо при помощи стандартного способа, либо при помощи способа без экструзии, можно характеризовать одинаковым образом. Например, составы, как правило, характеризуют при помощи визуального осмотра. Это должны быть белесые прозрачные растворы, в которых нет агрегатов или осадка. Размер частиц и распределение частиц по размеру липидных наночастиц можно измерять при помощи рассеяния света, с применением, например, Malvern Zetasizer Nano ZS (Malvern, США). Размеры частиц должны составлять приблизительно 20-300 нм, например, 40-100 нм. Распределение частиц по размеру должно быть одновершинным. Общую концентрацию dsRNA в составе, а также захваченную фракцию определяют при помощи анализа на исключение красителя. Образец составленной dsRNA можно инкубировать со связывающимся с РНК красителем, например Ribogreen (Molecular Probes), в присутствии или в отсутствие разрушающего состав поверхностно-активного вещества, например, 0,5% Triton-ХЮО. Общую dsRNA в составе можно определять по сигналу от образца, содержащего поверхностно-активное вещество, по отношению к калибовочной кривой. Захваченную фракцию определяют путем вычитания содержания "свободной" dsRNA (которое измерено по сигналу при отсутствии поверхностно-активного вещества) из общего содержания dsRNA. Процент захваченной dsRNA, как правило, составляет > 85%. Для состава SNALP размер частиц составляет по меньшей мере 30 нм, по меньшей мере 40 нм, по меньшей мере 50 нм, по
меньшей мере 60 нм, по меньшей мере 70 нм, по меньшей мере 80 нм, по меньшей мере 90 нм, по меньшей мере 100 нм, по меньшей мере 110 нм и по меньшей мере 120 нм. Подходящий диапазон, как правило, составляет от приблизительно по меньшей мере 50 нм до приблизительно по меньшей мере 110 нм, от приблизительно по меньшей мере 60 нм до приблизительно по меньшей мере 100 нм или от приблизительно по меньшей мере 80 нм до приблизительно по меньшей мере 90 нм.
Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, микрочастица, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, желатиновые капсулы, пакетики с порошком для приготовления раствора, таблетки или минитаблетки. Могут быть необходимы загустители, ароматизирующие вещества, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие средства или связующие вещества. Согласно некоторым вариантам осуществления пероральные составы являются такими, в которых dsRNA, описанные в настоящем изобретении, вводят в сочетании с одним или несколькими веществами, способствующими проникновению, поверхностно-активными вещества и хелаторами. Подходящие поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или их сложные эфиры или соли, желчные кислоты и/или их соли. Подходящие желчные кислоты/соли желчных кислот включают хенодезоксихолевую кислоту (CDCA) и урсодезоксихенодезоксихолевую кислоту (UDCA), холевую кислоту, дегидрохолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, глюхолевую кислоту, глихолевую кислоту, гликодезоксихолевую кислоту, таурохолевую кислоту, тауродезоксихолевую кислоту, тауро-24,25-дигидро-фузидат натрия и гликодигидрофузидат натрия. Подходящие жирные кислоты включают арахидоновую кислоту, ундекановую кислоту, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприловую кислоту, каприновую кислоту, миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин, дилаурин, глицерил 1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитин, ацилхолин или моноглицерид, диглицерид или их фармацевтически приемлемую соль (например, натриевую). Согласно некоторым вариантам осуществления применяют комбинации веществ, способствующих проникновению, например, жирные кислоты/соли жирных кислот в комбинации с желчными кислотами/солями желчных кислот. Одной иллюстративной комбинацией является натриевая соль лауриновой кислоты, каприновой кислоты и UDCA.
Дополнительные вещества, способствующие проникновению, включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. dsRNA, описанные в настоящем изобретении, могут быть доставлены перорально, в форме гранул, в том числе распыляемых высушенных частиц, или формируют комплексы с образованием микро- или наночастиц. Комплексообразующие средства для dsRNA включают полиаминокислоты; полиимины; полиакрилаты; полиалкилакрилаты, полиоксэтаны, полиалкилцианоакрилаты; катионизированные желатины, альбумины, крахмалы, акрилаты, полиэтиленгликоли (PEG) и крахмалы; полиалкилцианоакрилаты; DEAE-производные полиимины, пуллуланы, целлюлозы и крахмалы. Подходящие комплексообразующие средства включают хитозан, N-триметилхитозан, поли-Ь-лизин, полигистидин, полиорнитин, полиспермины, протамин, поливинилпиридин, политиодиэтиламинометилэтилен (PTDAE), полиаминостирол (например, р-амино), поли(метилцианоакрилат), поли(этилцианоакрилат), поли(бутилцианакрилат), поли(изобутилцианакрилат), поли(изогексилцианоакрилат), DEAE-метакрилат, DEAE-гексилакрилат, DEAE-акриламид, DEAE-альбумин и DEAE-декстран, полиметилакрилат, полигексилакрилат, поли(В,Ь-молочную кислоту), сополимер DL-молочной и гликолевой кислоты (PLGA), альгинат и полиэтиленгликоль (PEG). Пероральные составы для dsRNA и их получение описаны подробно в патенте США № 6887906, публикации США № 20030027780 и патенте США № 6747014, каждый из которых включен в данный документ при помощи ссылки.
Композиции и составы для парентерального, интрапаренхиматозного (в головной мозг), интратекального, интравентрикулярного или внутрипеченочного введения могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие соответствующие добавки, такие как, без ограничения, вещества, способствующие проникновению, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или наполнители.
Фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению включают, без ограничения, растворы, эмульсии и содержащие липосомы составы. Такие композиции могут быть получены из ряда компонентов, которые включают, без ограничения, предварительно полученные жидкости, самоэмульгирующиеся твердые вещества и самоэмульгирующиеся полутвердые вещества.
Фармацевтические составы, описанные в настоящем изобретении, которые в целях удобства могут находиться в виде единичной лекарственной формы, можно получать согласно традиционным методикам, хорошо известным в фармацевтической промышленности. Такие методики включают стадию приведения активных ингредиентов во взаимодействие с фармацевтическим(фармацевтическими) носителем(носителями) или наполнителем(наполнителями). Как правило, составы получают путем равномерного и тщательного приведения активных ингредиентов во взаимодействие с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми, и другими, а затем, при необходимости, придания продукту формы.
Композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть составлены в виде любых из многих возможных лекарственных форм, как, например, без ограничения, таблеток, капсул, желатиновых капсул, жидких сиропов, пластичных гелей, суппозиториев и клизмы. Композиции также могут быть составлены в виде суспензий в водной, неводной или смешанной среде. Водные суспензии дополнительно могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Дополнительные составы
Эмульсии
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть получены и составлены в виде эмульсий. Эмульсии, как правило, являются гетерогенными системами одной жидкости, диспергированной в другой, в форме капелек, диаметр которых обычно превышает 0,1 мкм (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 2, p. 335; Higuchi et al. в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 301).
Эмульсии часто представляют собой двухфазные системы, содержащие две несмешиваемые жидкие фазы, тщательно перемешанные и диспрегированные одна в другой. Как правило, эмульсии могут представлять собой либо эмульсии по типу "вода в масле" (w/o), либо "масло в воде" (o/w). В тех случаях, когда водная фаза является мелкораспыленной в общем объеме масляной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу "вода в масле" (w/o). Альтернативно, в тех случаях, когда масляная фаза является мелкораспыленной в общем объеме водной фазы и диспергированной в виде мельчайших капелек в нем, тогда полученную композицию называют эмульсией по типу "масло в воде" (o/w). Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты вдобавок к диспергированным фазам и активное лекарственное средство, которое может присутствовать в виде раствора либо в водной фазе, либо в масляной фазе, либо само по себе в качестве отдельной фазы. При необходимости в эмульсиях могут присутствовать фармацевтические наполнители, такие как эмульгаторы, стабилизаторы, красители и антиоксиданты. Фармацевтические эмульсии также могут представлять собой множественные эмульсии, которые состоят из более чем двух фаз, как например, в случае эмульсий по типу "масло-в-воде-в-масле" (o/w/o) и "вода-в-масле-в-воде" (w/o/w). Такие сложные составы часто обеспечивают определенные преимущества, которые не обеспечивают простые двухкомпонентные эмульсии. Множественные эмульсии, в которых отдельные масляные капельки эмульсии o/w включают маленькие водные капельки, составляющие эмульсию w/o/w. Аналогично этому система масляных капелек, заключенная в каплях воды, стабилизированных в масляной диспергирующей фазе, обеспечивает эмульсию o/w/o.
Эмульсии характеризуются малой термодинамической устойчивостью, или она отсутствует. Часто диспергированная или дисперсная фаза эмульсии хорошо диспергирована в дисперсионной или диспергирующей фазе и поддерживается в такой форме при помощи эмульгаторов или вязкости состава. Любая фаза эмульсии может быть полутвердой или твердой, как и в случае мазевых основ, подобных эмульсии, и кремов. Другие способы стабилизации эмульсий охватывают применение эмульгаторов, которые могут быть включены в любую фазу эмульсии. Эмульгаторы в целом могут быть разделены на четыре категории: синтетические поверхностно-активные вещества,
встречающиеся в природе эмульгаторы, абсорбционные базы и высокодисперные твердые вещества (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Синтетические поверхностно-активные вещества, также известные как сурфактанты, нашли широкое применение в составе эмульсий, и они рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., 1988, volume 1, p. 199). Поверхностно-активные вещества обычно являются амфифильными и содержат гидрофильную и гидрофобную часть. Соотношение гидрофильной и гидрофобной природы поверхностно-активного вещества называют гидрофильно-липофильным балансом (HLB), и оно является ценным инструментом при распределении на категории и выборе поверхностно-активных веществ при получении составов. Поверхностно-активные вещества можно разделять на различные классы, исходя из природы гидрофильной группы: неионные, анионные, катионные и амфотерные (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY Rieger, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 285).
Встречающиеся в природе эмульгаторы, применяемые в составах эмульсий, включают ланолин, пчелиный воск, фосфатиды, лецитин и гуммиарабик. Абсорбционные базы, такие как безводный ланолин и гидрофильный вазелин, обладают гидрофильными свойствами, так что они могут впитывать воду с образованием эмульсий w/o, с сохранением их полутвердой консистенции. Мелкоизмельченные твердые вещества также применяли в качестве подходящих эмульгаторов, в частности, в комбинации с поверхностно-активными веществами и в вязких препаратах. Они включают полярные неорганические твердые вещества, такие как гидроксиды тяжелых металлов,
неразбухающие глины, такие как бентонит, аттапульгит, гекторит, каолин, монтмориллонит, коллоидный силикат алюминия и коллоидный алюмосиликат магния, пигменты и неполярные твердые вещества, такие как углерод или глицерила тристеарат.
Большое разнообразие неэмульгирующих материалов также включают в составы эмульсий и они вносят вклад в свойства эмульсий. Они включают жиры, масла, воски, жирные кислоты, жирные спирты, сложные эфиры жирных кислот, увлажнители, гидрофильные коллоиды, консерванты и антиоксиданты (Block, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335; Idson, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199).
Гидрофильные коллоиды или гидроколлоиды включают встречающиеся в природе смолы и синтетические полимеры, такие как полисахариды (например, гуммиарабик, агар, альгиновую кислоту, каррагенан, гуаровую камедь, камедь карайи и трагакант), производные целлюлозы (например, карбоксиметилцеллюлозу и
карбоксипропилцеллюлозу) и синтетические полимеры (например, карбомеры, простые эфиры целлюлозы и карбоксивиниловые полимеры). Они диспергируются или набухают в воде с образованием коллоидных растворов, которые стабилизируют эмульсии путем образования крепких межфазных пленок вокруг капелек диспергированной фазы, а также путем повышения вязкости дисперсионной фазы.
Поскольку эмульсии зачастую содержат некоторое количество ингредиентов, таких как углеводы, белки, стеролы и фосфатиды, которые легко способствуют росту микроорганизмов, то такие составы зачастую включают консерванты. Широко применяемые консерванты, включенные в составы эмульсий, включают метилпарабен, пропилпарабен, четвертичные соли аммония, бензалкония хлорид, сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты и борную кислоту. Антиоксиданты также обычно добавляют к составам эмульсий для предупреждения старения состава. Применяемые антиоксиданты могут представлять собой ловушки свободных радикалов, как, например, токоферолы, алкил галлаты, бутилированный гидроксианизол, бутилированный гидрокситолуол, или восстановители, как, например, аскорбиновая кислота и метабисульфит натрия, и синергистами антиоксидантов, как, например, лимонная кислота, винная кислота и лецитин.
Применение составов эмульсий с помощью дерматологического, перорального и парентерального путей и способы их получения рассмотрены в литературе (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Составы эмульсий для пероральной доставки являются очень распространенными для применения в связи с удобством составления, а также с точки зрения эффективности при всасывании и биодоступности (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Idson в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 199). Слабительные средства на основе минеральных масел, жирорастворимые витамины и питательные препараты с высоким содержанием жира являются одними из материалов, которые обычно вводят перорально в виде эмульсий o/w.
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения композиции iRNA и нуклеиновые кислоты составлены в виде микроэмульсий. Микроэмульсия может быть определена как система воды, масла и амфифильного вещества, которая является отдельным оптически изотропным и термодинамически устойчивым жидким раствором (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff, в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245). Обычно микроэмульсии представляют собой системы, которые получают путем сперва диспергирования масла в водном растворе поверхностно-активного вещества, а затем добавления достаточного количества четвертого компонента, как правило, спирта со средней длиной цепи с получением прозрачной системы. Таким образом, микроэмульсии также были описаны как термодинамически устойчивые, изотропически чистые дисперсии двух несмешиваемых жидкостей, которые стабилизируются межфазными пленками поверхностно-активных молекул (Leung и Shah, в Controlled Release of Drugs: Polymers and Aggregate Systems,
Rosoff, M., Ed., 1989, VCH Publishers, New York, pages 185-215). Микроэмульсии обычно получают путем объединения от трех до пяти компонентов, которые включают масло, воду, поверхностно-активное вещество, вторичное поверхностно-активное вещество и электролит. То, является ли микроэмульсия эмульсией по типу "вода в масле" (w/o) или по типу "масло в воде" (o/w), зависит от свойств применяемого масла и поверхностно-активного вещества, а также от структуры и геометрической упаковки полярных головок и углеводородных хвостов молекул поверхностно-активного вещества (Schott, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985, p. 271).
Активно изучался феноменологический подход с использованием фазовых диаграмм, и с его помощью специалистами в данной области были получены обширные данные о том, как составлять микроэмульсии (см., например, Ansel's Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Allen, LV., Popovich NG., and Ansel HC, 2004, Lippincott Williams & Wilkins (8th ed.), New York, NY; Rosoff в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 245; Block в Pharmaceutical Dosage Forms, Lieberman, Rieger and Banker (Eds.), 1988, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., volume 1, p. 335). По сравнению с традиционными эмульсиями микроэмульсии предлагают преимущество стабилизации водонерастворимых лекарственных средств в составе термодинамически устойчивых капелек, которые образуются самопроизвольно.
Поверхностно-активные вещества, применяемые для получения микроэмульсий, включают без ограничения ионные поверхностно-активные вещества, неионные поверхностно-активные вещества, Brij 96, полиоксиэтиленолеиловые эфиры, сложные эфиры жирных кислот и полиглицерина, тетраглицерина монолаурат (ML310), тетраглицерина моноолеат (МОЗ10), гексаглицерина моноолеат (РОЗ 10), гексаглицерина пентаолеат (РО500), декаглицерина монокапрат (МСА750), декаглицерина моноолеат (МО750), декаглицерина секвиолеат (SO750), декаглицерина декаолеат (DAO750) отдельно или в комбинации со вторичными поверхностно-активными веществами. Вторичное поверхностно-активное вещество, обычно являющееся спиртом с короткой цепью, таким как этанол, 1-пропанол и 1-бутанол, служит для увеличения межфазной текучести путем проникновения в пленку из поверхностно-активного вещества и соответственно создания неупорядоченной пленки из-за пустого пространства,
образующегося среди молекул поверхностно-активного вещества. Однако микроэмульсии могут быть получены без применения вторичных поверхностно-активных веществ, и в уровне техники известны самоэмульгирующиеся системы микроэмульсий без спирта. Водной фазой, как правило, может быть вода, водный раствор лекарственного средства, глицерин, PEG300, PEG400, полиглицерины, пропиленгликоли и производные этиленгликоля. Масляная фаза может включать без ограничения материалы, такие как Captex 300, Captex 355, Capmul МСМ, сложные эфиры жирных кислот, среднецепочечные (С8-С12) моно-, ди- и триглицериды, полиоксиэтилированные сложные эфиры жирных кислот и глицерина, жирные спирты, полигликолизированные глицериды, насыщенные полигликолизированные С8-С10 глицериды, растительные масла и силиконовое масло.
Микроэмульсии представляют особый интерес с точки зрения растворимости лекарственного средства и повышенной абсорбции лекарственных средств. Липидные микроэмульсии (как o/w, так и w/o) были предложены для увеличения пероральной биодоступности лекарственных средств, включая пептиды (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385-1390; Ritschel, Meth. Find. Exp. Clin. Pharmacol., 1993, 13, 205). Микроэмульсии обеспечивают преимущества в виде улучшенной растворимости лекарственного средства, защиты лекарственного средства от ферментативного гидролиза, возможного повышенной абсорбции лекарственного средства за счет индуцированных поверхностно-активным веществом изменений текучести мембран и проницаемости, удобства получения, удобства перорального введения по сравнению с твердой лекарственной формой, улучшенной клинической действенности и пониженной токсичности (см., например, патент США №№ 6191105; 7063860; 7070802; 7157099; Constantinides et al, Pharmaceutical Research, 1994, 11, 1385; Ho et al, J. Pharm. Sci., 1996, 85, 138-143). Часто микроэмульсии могут образовываться самопроизвольно, когда их компоненты объединяют при температуре окружающей среды. Это может быть в особенности преимущественным, когда составляют термолабильные лекарственные средства, пептиды или iRNA. Микроэмульсии также были эффективными при трансдермальной доставке активных компонентов как при косметических, так и при фармацевтических применениях. Предполагается, что композиции и составы микроэмульсий согласно настоящему изобретению будут способствовать повышенной
системной абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот из желудочно-кишечного тракта, а также улучшать локальный клеточный захват iRNA и нуклеиновых кислот.
Микроэмульсии согласно настоящему изобретению также могут содержать дополнительные компоненты и добавки, такие как сорбитанмоностеарат (Grill 3), Labrasol и вещества, способствующие проникновению, для улучшения свойств состава и для повышения абсорбции iRNA и нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению. Вещества, способствующие проникновению, применяемые в микроэмульсиях согласно настоящему изобретению, могут быть классифицированы, как принадлежащие к одной из пяти основных категорий: поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p. 92). Каждый из этих классов рассматривался выше.
Вещества, способствующие проникновению
Согласно одному варианту осуществления в настоящем изобретении используют разнообразные вещества, способствующие проникновению, для воздействия на эффективную доставку нуклеиновых кислот, в частности iRNA, в кожу животных. Большинство лекарственных средств присутствуют в растворе как в ионизированной, так и в неионизированной формах. Однако, как правило, только жирорастворимые или липофильные лекарственные средства легко проходят через клеточные мембраны. Было установлено, что даже нелипофильные лекарственные средства могут проходить через клеточные мембраны, если мембрана, через которую необходимо пройти, обработана веществом, способствующим проникновению. Вдобавок к обеспечению диффузии нелипофильных лекарственных средств через клеточные мембраны вещества, способствующие проникновению, также повышают проницаемость для липофильных лекарственных средств.
Вещества, способствующие проникновению, можно классифицировать как принадлежащие к одной из пяти основных категорий, т. е. поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие средства и нехелатриующие поверхностно-неактивные вещества (см., например, Malmsten, М. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et
al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92). Каждый из вышеуказанных классов веществ, способствующих проникновению, описан ниже более подробно.
Поверхностно-активные вещества: В связи с настоящим изобретением поверхностно-активные вещества (или "сурфактанты") являются химическими структурными единицами, которые при растворении в водном растворе снижают поверхностное натяжение раствора или межфазное натяжение между водным раствором и другой жидкостью, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. Помимо солей желчных кислот и жирных кислот, эти вещества, способствующие проникновению, включают, например, лаурилсульфат натрия, полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир и полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир (см., например, Malmsten, М. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92) и перфторированные эмульсии, такие как FC-43. Takahashi et al., J. Pharm. Pharmacol., 1988, 40, 252).
Жирные кислоты: Разнообразные жирные кислоты и их производные, которые действуют как вещества, способствующие проникновению, включают, например, олеиновую кислоту, лауриновую кислоту, каприновую кислоту (н-декановую кислоту), миристиновую кислоту, пальмитиновую кислоту, стеариновую кислоту, линолевую кислоту, линоленовую кислоту, дикапрат, трикапрат, моноолеин (1-моноолеоил-рац-глицерин), дилаурин, каприловую кислоту, арахидоновую кислоту, глицерин-1-монокапрат, 1-додецилазациклогептан-2-он, ацилкарнитины, ацилхолины, их Ci_ юалкиловые сложные эфиры (например, метиловый, изопропиловый и трет-бутиловый) и их моно- и диглицериды (т.е. олеат, лаурат, капрат, миристат, пальмитат, стеарат, линолеат и т. д.) (см., например, Touitou, Е., et al. Enhancement in Drug Delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, p.92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; El Hariri et al, J. Pharm. Pharmacol., 1992, 44, 651-654).
Соли желчных кислот: Физиологическая роль желчи включает содействие в распределении и всасывании липидов и жирорастворимых витаминов (см., например, Malmsten, М. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Brunton, Chapter 38 в Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics,
9th Ed., Hardman et al. Eds., McGraw-Hill, New York, 1996, pp. 934-935). Разные природные соли желчных кислот и их синтетические производные действуют как вещества, способствующие проникновению. Таким образом, выражение "соли желчных кислот" включают любые встречающиеся в природе компоненты желчи, а также любое из их синтетических производных. Подходящие соли желчных кислот включают, например, холевую кислоту (или ее фармацевтически приемлемую натриевую соль, холат натрия), дегидрохолевую кислоту (дегидрохолат натрия), дезоксихолевую кислоту (дезоксихолат натрия), глюхолевую кислоту (глюхолат натрия), глихолевую кислоту (глихолат натрия), гликодезоксихолевую кислоту (гликодезоксихолат натрия), таурохолевую кислоту (таурохолат натрия), тауродезоксихолевую кислоту (тауродезоксихолат натрия), хенодезоксихолевую кислоту (хенодезоксихолат натрия), урсодезоксихолевую кислоту (UDCA), тауро-24,25-дигидро-фузидат (STDHF) натрия, гликодигидрофузидат натрия и полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир (РОЕ) (см., например, Malmsten, М. Surfactants and polymers in drug delivery, Informa Health Care, New York, NY, 2002; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Swinyard, Chapter 39 в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990, pages 782-783; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Yamamoto et al., J. Pharm. Exp. Ther., 1992, 263, 25; Yamashita et al., J. Pharm. Sci., 1990, 79, 579-583).
Хелатирующие средства: Хелатирующие средства, используемые применительно к настоящему изобретению, можно определить как соединения, которые удаляют ионы металла из раствора путем образования комплексов с ними, в результате чего абсорбция iRNA через слизистую повышается. В отношении их применения в качестве веществ, способствующих проникновению, в настоящем изобретении хелатирующие средства обладают дополнительным преимуществом, также выступая в качестве ингибиторов ДНКазы, поскольку большинство охарактеризованных ДНК-нуклеаз требуют двухвалентный ион металла для катализа и, таким образом, ингибируются хелатирующими средствами (Jarrett, J. Chromatogr., 1993, 618, 315-339). Подходящие хелатирующие средства включают, без ограничения, двунатриевый
этилендиаминтетраацетат (EDTA), лимонную кислоту, салицилаты (например, салицилат натрия, 5-метоксисалицилат и гомовалинат), N-ацилпроизводные коллагена, лаурет-9 и N
аминоацилпроизводные Р-дикетонов (енамины)(см., например, Katdare, A. et al., Excipient development for pharmaceutical, biotechnology, and drug delivery, CRC Press, Danvers, MA, 2006; Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92; Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33; Buur et al., J. Control Rel., 1990, 14, 43-51).
Нехелатирующие поверхностно-неактивные вещества: Используемые в данном документе нехелатирующие поверхностно-неактивные соединения, способствующие проникновению, могут быть определены как соединения, которые проявляют небольшую активность как хелатирующие средства или как поверхностно-активные вещества, но которые тем не менее повышают абсорбцию iRNA через слизистую пищеварительного тракта (см., например, Muranishi, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1990, 7, 1-33). Этот класс веществ, способствующих проникновению, включает, например, ненасыщенные цикломочевины, производные 1-алкил- и 1-алкенилазацикло-алканона (Lee et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1991, page 92) и нестероидные противовоспалительные средства, такие как диклофенак натрия, индометацин и фенилбутазон (Yamashita et al., J. Pharm. Pharmacol., 1987, 39, 621-626).
Средства, которые усиливают захват iRNA на клеточном уровне, также можно добавлять к фармацевтическим и другим композициям согласно настоящему изобретению. Например, катионные липиды, такие как липофектин (Junichi et al, патент США № 5705188), катионные производные глицерина и поликатионные молекулы, такие как полилизин (Lollo et al., заявка согласно РСТ WO 97/30731), также, как известно, усиливают клеточный захват dsRNA. Примеры коммерчески доступных реагентов для трансфекции включают среди прочего, например, Lipofectamine(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine 2000(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), 293fectin(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Cellfectin(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), DMRIE-C(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), FreeStyle(tm) MAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine(tm) 2000 CD (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Lipofectamine(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), RNAiMAX (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Oligofectamine(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), Optifect(tm) (Invitrogen; Карлсбад, Калифорния), реагент для трансфекции X-tremeGENE Q2 (Roche; Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOTAP
(Грензахерштрассе, Швейцария), реагент для липосомной трансфекции DOSPER (Грензахерштрассе, Швейцария) или Fugene (Грензахерштрассе, Швейцария), реагент Transfectam(r) (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент для трансфекции TransFast(tm) (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx(tm)-20 (Promega; Мэдисон, Висконсин), реагент Tfx(tm)-50 (Promega; Мэдисон, Висконсин), DreamFect(tm) (OZ Biosciences; Марсель, Франция), EcoTransfect (OZ Biosciences; Марсель, Франция), реагент для трансфекции TransPassa Dl (New England Biolabs; Ипсвич, Массачусетс, США), LyoVec(tm)/LipoGen(tm) (Invitrogen; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции PerFectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции NeuroPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции GenePORTER 2 (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции Cytofectin (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции BaculoPORTER (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), реагент для трансфекции TroganPORTER(tm) (Genlantis; Сан-Диего, Калифорния, США), RiboFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), PlasFect (Bioline; Тонтон, Массачусетс, США), UniFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США), SureFECTOR (B-Bridge International; Маунтин-Вью, Калифорния, США) или HiFect(tm) (B-Bridge International, Маунтин-Вью, Калифорния, США).
Для усиления проникновения введенных нуклеиновых кислот можно использовать другие средства, в том числе гликоли, такие как этиленгликоль и пропиленгликоль, пирролы, такие как 2-пиррол, азоны и терпены, такие как лимонен и ментон.
Носители
Определенные композиции согласно настоящему изобретению также содержат в составе соединения-носители. Используемые в данном документе выражения "соединение-носитель" или "носитель" могут означать нуклеиновую кислоту или ее аналог, которые являются инертными (т. е. не обладают биологической активностью per se), но распознаются в качестве нуклеиновой кислоты in vivo процессами, которые снижают биодоступность нуклеиновой кислоты с биологической активностью, например, путем разрушения биологически активной нуклеиновой кислоты или путем содействия ее удалению из кровотока. Совместное введение нуклеиновой кислоты и соединения
носителя, обычно с избытком последнего вещества, может привести к существенному сокращению количества нуклеиновой кислоты, перерабатываемой печенью, почками или другими внесосудистыми депо, предположительно вследствие конкуренции между соединением-носителем и нуклеиновой кислотой за общий рецептор. Например, переработка частично фосфотиоатной dsRNA печеночной тканью может быть снижена при ее совместном введении с полиинозиновой кислотой, сульфатом декстрана, полицитидиновой кислотой или 4-ацетамидо-4'изотиоциано-стильбен-2,2'-дисульфокислотой (Miyao et al., DsRNA Res. Dev., 1995, 5, 115-121; Takakura et al., DsRNA & Nucl. Acid Drug Dev., 1996, 6, 177-183.
Наполнители
В отличие от соединения-носителя "фармацевтический носитель" или "наполнитель" представляет собой фармацевтически приемлемый растворитель, суспендирующее средство или любую другую фармакологически инертную среду для доставки одной или нескольких нуклеиновых кислот в организм животного. Наполнитель может быть жидким или твердым веществом и его выбирают с учетом предполагаемого способа введения с тем, чтобы обеспечить необходимый объем, консистенцию и т. д., при объединении с нуклеиновой кислотой и другими компонентами данной фармацевтической композиции. Типичные фармацевтические носители включают без ограничения связывающие средства (например, прежелатинизированный маисовый крахмал, поливинилпирролидон или гидроксипропилметилцеллюлозу и т. д.); наполнители (например, лактозу и другие сахара, микрокристаллическую целлюлозу, пектин, желатин, сульфат кальция, этилцеллюлозу, полиакрилаты или вторичный кислый фосфат кальция и т. д.); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк, кремнезем, коллоидный диоксид кремния, стеариновую кислоту, стеараты металла, гидрогенизированные растительные масла, кукурузный крахмал, полиэтиленгликоли, бензоат натрия, ацетат натрия и т. д.); разрыхлители (например, крахмал, натрия крахмалгликолат и т. д.); и смачивающие средства (например, лаур ил сульфат натрия и т. д).
Фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не реагируют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами, также можно применять для
составления композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирты, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Составы для местного применения нуклеиновых кислот могут включать стерильные и нестерильные водные растворы, неводные растворы в обычных растворителях, таких как спирты, или растворы нуклеиновых кислот в жидких или твердых масляных основах. Растворы также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки. Можно применять фармацевтически приемлемые органические или неорганические наполнители, подходящие для введения, отличного от парентерального, которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновыми кислотами.
Подходящие фармацевтически приемлемые наполнители включают, без ограничения, воду, солевые растворы, спирт, полиэтиленгликоли, желатин, лактозу, амилозу, стеарат магния, тальк, кремниевую кислоту, вязкий парафин, гидроксиметилцеллюлозу, поливинилпирролидон и т. п.
Другие компоненты
Композиции согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать другие вспомогательные компоненты, традиционно встречающиеся в фармацевтических композициях, при применении в уровнях, установленных в уровне техники. Таким образом, например, композиции могут содержать дополнительные совместимые фармацевтически активные материалы, такие как, например, противозудные средства, вяжущие средства, местные анестетики или противовоспалительные средства, или могут содержать дополнительные материалы, пригодные для физического составления композиций согласно настоящему изобретению в различных лекарственных формах, такие как красители, ароматизирующие средства, консерванты, антиоксиданты, замутнители, загустители и стабилизаторы. Однако, такие материалы при добавлении не должны чрезмерно вступать в конфликт с биологическими активностями компонентов композиций согласно настоящему изобретению. Составы могут быть стерильными и, при
необходимости, их можно смешивать со вспомогательными средствами, например, смазывающими веществами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими средствами, эмульгаторами, солями для оказания влияния на осмотическое давление, буферами, красящими веществами, ароматизаторами и/или отдушками и т. п., которые не взаимодействуют неблагоприятным образом с нуклеиновой(нуклеиновыми) кислотой(кислотами) состава.
Водные суспензии могут содержать вещества, которые повышают вязкость суспензии, в том числе, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, сорбит и/или декстран. Суспензия также может содержать стабилизаторы.
Согласно некоторым вариантам осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящем изобретении, включают (а) одно или несколько соединений, представляющих собой iRNA, и (Ь) одно или несколько биологических средств, которые действуют по механизму, отличному от RNAi. Примеры таких биологических средств включают средства, препятствующие взаимодействию ALAS1 и по меньшей мере одного связывающего партнера ALAS1.
Токсичность и терапевтическая эффективность таких соединений могут быть определены стандартными фармацевтическими процедурами на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, для определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между токсичным и терапевтическим действием представляет собой терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение LD50/ED50. Типичными являются соединения, которые характеризуются высоким терапевтическим индексом.
Данные, полученные при анализах клеточных культур и исследованиях на животных, можно применять при составлении ряда доз для применения у людей. Доза композиций, описанных в настоящем изобретении, как правило, находится в диапазоне концентраций в крови, который включают ED50 с малой токсичностью или юез токсичности. Доза может варьировать в этом диапазоне в зависимости от применяемой лекарственной формы и используемого пути введения. Для любого соединения, применяемого в способах, описанных в настоящем изобретении, терапевтически эффективную дозу можно первоначально установить по результатам анализов на клеточной культуре. Доза может быть составлена для животных моделей для получения
диапазона концентрации в плазме соединения или, при необходимости, полипептидного продукта целевой последовательности (например, достижения уменьшенной концентрации полипептида), что включает IC50 (т. е. концентрацию исследуемого соединения, при помощи которой достигают полумаксимальное ингибирование симптомов), при определении на клеточной культуре. Такую информацию можно применять для более точного определения пригодной дозы у людей. Уровни в плазме можно определять, например, при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии.
В дополнение к их введению, рассматриваемому выше, iRNA, описанные в настоящем изобретении, можно вводить в комбинации с другими известными средствами, эффективными в лечении заболеваний или нарушений, связанных с экспрессией ALAS1. В любом случае, курирующий врач может корректировать количество и временные рамки введения iRNA, исходя из результатов, наблюдаемых при применении стандартных средств измерения эффективности, известных в данной области или описанных в данном документе.
Способы лечения заболеваний, связанных с экспрессией гена ALAS1
Настоящее изобретение относится, в частности, к применению iRNA, нацеленная на ALAS1, для ингибирования экспрессии ALAS1 и/или лечения заболевания, нарушения или патологического процесса, который связан с экспрессией ALAS1.
Используемое в данном документе выражение "нарушение, связанное с экспрессией ALAS1", "заболевание, связанное с экспрессией ALAS1", "патологический процесс, связанный с экспрессией ALAS1" или т. п. включает состояние, нарушение или заболевание, в котором экспрессия ALAS 1 изменена (например, повышена), уровень одного или нескольких порфиринов изменен (например, повышен), уровень или активность одного или нескольких ферментов в пути биосинтеза гема (порфириновом пути) изменен, или другие механизмы, которые ведут к патологическим изменениям в пути биосинтезе гема. Например, iRNA, нацеленную на ген ALAS 1 или ее комбинацию, можно применять для лечения состояний, в которых уровни порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) повышены (например, определенные порфирий), или состояний, в которых имеются нарушения ферментов пути
биосинтеза гема (например, определенные порфирий). Нарушения, связанные с экспрессией ALAS1, включают, например, Х-сцепленную сидеробластическую анемию (XLSA), порфирию, обусловленную недостаточностью ALA (порфирию Досса), острую перемежающуюся порфирию (AIP), врожденную эритропоэтическую порфирию, позднюю кожную порфирию, наследственную копропорфирию (копропорфирию), вариегатную порфирию, эритропоэтическую протопорфирию (ЕРР) и транзиторную эритропорфирию детского возраста.
Используемое в данном документе выражение "субъект", подлежащий лечению согласно способам, описанным в данном документе, включает человека или отличное от человека животное, например, млекопитающее. Млекопитающим может быть, например, грызун (например, крыса или мышь) или примат (например, обезьяна). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает нарушением, связанным с экспрессией ALAS1 (например, с диагностированной порфирией или испытывал один или несколько симптомов порфирий и является носителем мутации, связанной с порфирией) или подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1 (например, субъект с семейной историей порфирий или субъект, который является носителем генетической мутации, связанной с порфирией).
Классификации порфирий, в том числе острых печеночных порфирий, описаны, например, в Balwani, М. & Desnick, R.J., Blood, 120(23), опубликованном online в виде Blood First Edition paper, юль 12, 102; DOI 10.1182/blood-2012-05-423186. Как описано в Balwain & Desnick, острая перемежающаяся порфирия (AIP), наследственная копропорфирия (НСР), вариегатная порфирия (VP) являются аутосомно-доминантными порфириями, а порфирия, обусловленная недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP), является аутосомно-рецессивной. В редких случаях AIP, НСР и VP возникают как гомозиготные доминантные формы. Кроме того, существует редкая гомозиготная рецессивная форма поздней кожной порфирий (РСТ), которая является единственной печеночно-кожной порфирией и также известной как гепатоэритропоэтическая порфирия. Клинические и лабораторные характеристики этих порфирий описаны ниже в таблице 11.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, АГР, НСР, VP, ADP или гематоэритропоэтической порфирий.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой острую печеночную порфирию, например, острую печеночную порфирию выбирают из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP) и порфирий, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой двойную порфирию, например, по меньшей мере две формы порфирий. Согласно некоторым вариантам осуществления двойная порфирия представляет две или более форм порфирий, выбранных из острой перемежающейся порфирий (АГР), наследственной
копропорфирии (НСР), вариегатной порфирий (VP) и порфирий, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы (ADP).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой гомозиготную доминатную печеночную порфирию (например, гомозиготную доминантную АГР, НСР или VP) или гепатоэритропоэтическую порфирию. Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой АГР, НСР, VP или гепатоэритропоэтическую порфирию или их комбинацию (например, двойную порфирию). Согласно некоторым вариантам осуществления АГР, НСР или VP является либо гетерозиготной доминантной либо гомозиготной доминантной.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирий, например, ADP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA и/или копропорфирина Ш. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, ADP, и характеризуется повышенным уровнем Zn-протопорфирина в эритроцитах.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, АГР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или уропорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет порфирию или имеет риск развития порфирий, например, НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина Ш. Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина Ш.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, VP, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) ALA, PBG и/или копропорфирина Ш.
Согласно вариантам осуществления ссубъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, НСР, и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) копропорфирина Ш и/или протопорфирина.
Согласно вариантам осуществления субъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирий), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в моче) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата. Согласно вариантам осуществления ссубъект страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, РСТ (например, гепатоэритропоэтической порфирий), и характеризуется повышенным уровнем (например, повышенным уровнем в кале) уропорфирина и/или порфирин-7-карбоксилата.
Мутация, связанная с порфирией, включает любую мутацию в гене, кодирующем фермент в пути биосинтеза порфирина (порфириновый путь), или гена, который изменяет экспрессию гена в пути биосинтеза гема. Согласно многим вариантам осуществления субъект несет одну или несколько мутаций в ферменте порфиринового пути (например, мутацию в ALA-дегидратазе или PBG-дезаминазе). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект страдает острой порфирией (например, АГР, порфирией, обусловленной недостаточностью ALA-дегидратазы).
В некоторых случаях пациенты с острой печеночной порфирией (например, АГР) или пациенты, которые несут мутации, ассоциированные с острой печеночной порфирией (например, АГР), но у которых не наблюдаются симптомы, имеют повышенные уровни ALA и/или PBG по сравнению со здоровыми индивидами. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335349, 2007. В таких случаях уровень ALA и/или PBG может быть повышен даже в том случае, если пациента не страдает от приступа или никогда не страдал. В некоторых таких случаях у пациента, в остальном, полностью не наблюдаются симптомы. В некоторых таких случаях пациент испытывает болевые ощущения, например, нейропатическую боль, которая может представлять собой хроническую боль (например, хроническую нейропатическую боль). В некоторых случаях пациент страдает от нейропатии. В некоторых случаях пациент страдает от прогрессирующей нейропатии.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Уровни порфирина или предшественника порфирина могут быть оценены при помощи способов,
известных из уровня техники, или способов, описанных в данном документе. Например, способы оценки уровней ALA и PBG в моче и плазме, а также уровней порфиринов в моче и плазме, раскрыты в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; и Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007; полное содержание которых тем самым включено в данный документ при помощи ссылки во всей своей полноте.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект представляет собой животную модель порфирий, например, мышиную модель порфирий (например, мутантную мышь, описанную в Lindberg et al. Nature Genetics, 12: 195-199, 1996). Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, например, человек, который страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления субъекта не страдает от острого приступа порфирий. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект никогда не страдал от приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент испытывает хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления пациент страдает от повреждения нервов. Согласно вариантам осуществления у субъекта наблюдаются изменения EMG и/или изменения в скорости проводимости нерва. Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирий (например, имеет мутацию гена, ассоциированную с порфирией), но у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее страдал от острого приступа, но у него не наблюдаются симптомы во время лечения.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирий и получает профилактическое лечение для предупреждения развития порфирий. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое лечение начинается в период полового созревания. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение снижает уровень (например, уровень в плазме или уровень в моче) порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления лечение предупреждает развитие повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно некоторым вариантам
осуществления лечение предупреждает развитие симптома, ассоциированного с порфирией, например, болевого ощущения или повреждения нервов, или снижает частоту или тяжесть симптомов.
Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, повышен, например, в образце плазмы или мочи от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе абсолютного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, у субъекта оценивают на основе относительного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления относительный уровень представлен относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина, в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы. Согласно некоторым вариантам осуществления образцом является образец кала.
Повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, может быть установлен, например, путем демонстрации того, что субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG (например, уровень ALA и/или PBG в плазме или моче), который выше нормального значения или выше или равен нормальному значению. Врач с опытом лечения порфирий сможет определить, является ли уровень порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) повышенным, например, с целью диагностирования порфирий или для определения того, подвержен ли субъект риску развития порфирий, например, субъект может иметь предрасположенность к острому приступу или к патологии, ассоциированной с порфирией, такой как, например, хроническая боль (например, нейропатическая боль) и нейропатия (например, прогрессирующая нейропатия).
Используемое в данном документе выражение "нормальное значение" относится к значению, полученному от субъекта, когда субъект не находится в состоянии заболевания, или значению, полученному от субъекта с нормальными показателями или здорового субъекта, или значению, полученному от эталонной выборки или популяции, например, группы субъектов с нормальными показателями или здоровых субъектов (например, группы субъектов, которые не несут мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или группы субъектов, которые не испытывают симптомов, ассоциированных с порфирией).
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень до болезни у одного и того же индивида. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет среднее или медианное значение в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, равное двум стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, которое равно 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5 или 5 стандартным отклонениям выше среднего в эталонной выборке или популяции.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, субъект имеет уровень ALA и/или PBG, который по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% или 90% выше нормального значения. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG, который по меньшей мере в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 раз выше нормального значения.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение соответствует верхнему пределу нормального диапазона значений. Используемый в данном документе "верхний предел нормального диапазона значений" относится к уровню, который представляет собой верхний предел 95% доверительного интервала для эталонной выборки или популяции, например, группы индивидов с нормальными показателями (например, дикого типа) или здоровых индивидов, например, индивидов, которые не несут генетическую мутацию, ассоциированную с порфирией, и/или индивидов, которые
не страдают порфирией. Соответственно, нижний предел нормального диапазона значений относится к уровню, который представляет собой нижний предел того же 95% доверительного интервала.
Согласно некоторым вариантам осуществления, где субъект имеет повышенный уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, этот уровень выше или равен 2-кратному, 3-кратному, 4-кратному или 5-кратному уровню относительно нормального значения, например, верхнего предела нормального диапазона значений. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG, в моче, который составляет выше 4-кратного уровня относительно верхнего предела нормального диапазона значений.
Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006 или Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335-349, 2007. Согласно некоторым вариантам осуществления нормальное значение представляет собой значение, представленное в таблице 1 Sardh et al.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина. Согласно определенным вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 3, 4, 5, 6, 7 или 8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человека, и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для PBG в моче составляет 1,2 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 1,0 ммоль/моль креатинина, 1,2 ммоль/моль креатинина, 2,4 ммоль/моль
креатинина, 3,6 ммоль/моль креатинина, 4,8 ммоль/моль креатинина или 6,0 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень PBG в моче, который выше, или выше или равен 4,8 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в плазме составляет 0,12 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0.10 мкмоль/л, 0,12 мкмоль/л, 0,24 мкмоль/л, 0,36 мкмоль/л, 0,48 мкмоль/л или 0,60 мкмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в плазме, который выше, или выше или равен 0,48 мкмоль/л.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для ALA в моче составляет 3,1 ммоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень ALA в моче, который выше, или выше или равен 2,5 ммоль/моль креатинина, 3,1 ммоль/моль креатинина, 6,2 ммоль/моль креатинина, 9,3 ммоль/моль креатинина, 12,4 ммоль/моль креатинина или 15,5 ммоль/моль креатинина.
Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в плазме составляет 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 10 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 нмоль/л. Субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в плазме, который выше, или выше или равен 40 нмоль/л. Согласно вариантам осуществления нормальное значение для порфирина в моче составляет 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше, или выше или равен 25 мкмоль/моль креатинина. Согласно вариантам осуществления субъектом является человек, и субъект имеет уровень порфирина в моче, который выше или равен 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80 мкмоль/моль креатинина.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, порфирина или предшественника порфирина,
например, ALA или PBG, который выше, чем уровень 99% индивидов в выборке здоровых индивидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень, например, уровень в плазме или уровень в моче, ALA или PBG, который выше на два стандартных отклонения среднего уровня в выборке здоровых индивидов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в моче, который составляет 1,6 или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями (например, субъекта, который не несет мутацию, ассоциированную с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень ALA в плазме, который составляет 2- или 3-кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в моче, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет уровень PBG в плазме, который составляет четыре или более кратный уровень относительно среднего уровня у субъекта с нормальными показателями.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для получения заранее определенного снижения повышенного уровня порфирина или предшественника порфирина, например, ALA или PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое эффективно для предупреждения или облегчения симптомов, например, болевых ощущений или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое составляет по меньшей мере 1,2,3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно описанным способам, испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно некоторым вариантам осуществления страдает порфирией или подвержен риску развития порфирий, например, острой печеночной порфирий, например, АГР. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения или предупреждения повреждения нервов.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект, который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, (а) имеет повышенный уровень ALA и/или PBG, и (Ь) испытывает болевые ощущения, например, хроническую боль. Согласно вариантам осуществления способ является эффективным для снижения повышенного уровня ALA и/или PBG, и/или для лечения болевых ощущений, например, путем уменьшения тяжести болевых ощущений или излечения болевых ощущений.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели нарушения, связанного с экспрессией ALAS1.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является животное, которое служит в качестве модели порфирий (например, генетически модифицированное животное с одним или несколькими мутациями). Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой АГР, и субъектом является животная модель АГР. Согласно одному такому варианту осуществления субъектом является генетически модифицированная мышь, которая характеризуется недостаточностью порфобилиногендезаминазы, например, такая как мышь, описанная в Lindberg et al., Nature Genetics, 12:195-199, 1996, или гомозиготная мышь R167Q, описанная в Yasuda, М., Yu, С. Zhang, J., Clavero, S., Edelmann, W., Gan, L., Phillips, J.D., & Desnick, R.J. Acute
intermittent porphyria: A severely affected knock-in mouse that mimics the human homozygous dominant phenotype. (резюме презентации, представленной 14 октября 2011 года в Американском обществе генетики человека; № 1308F в программе; доступно он-лайн с 4 апреля 2012 года на ichg201 l.org/cgi-bin/showdetail.pl?absno=21167); оба из этих источников тем самым включены в данный документ во всей своей полноте. Были получены несколько моделей с нокином для обеспечения мутаций, вызывающих гомозиготную доминантную АГР у человека. Используемые мутации включают, например, R167Q, R173Q и R173W в PBG-дезаминазе. Жизнеспособные гомозиготы включали R167Q/R176Q и R167Q/R173Q, обе которые проявляют постоянно повышенные уровни ALA и PBG, аналогичные фенотипу при гомозиготной доминантной АГР человека; согласно некоторым вариантам осуществления субъект является такой жизнеспособной мышиной моделью гомозиготной АГР.
Согласно одному варианту осуществления субъект, который подлежит лечению согласно методам, описанным в данном документе (например, субъект-человек или пациент-человек), подвержен риску развития нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано нарушение, связанное с экспрессией ALAS1, например, порфирия. Согласно некоторым вариантам осуществления субъектом является субъект, который испытывал один или несколько острых приступов с одним или несколькими симптомами порфирий. Согласно другим вариантам осуществления субъектом является субъект, который хронически испытывал один или несколько симптомов порфирий (например, болевые ощущения, например, нейропатическую боль, и/или нейропатию, например, прогрессирующую нейропатию). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение (например, мутацию), описанное в данном документе, но, в остальном, у него не наблюдаются симптомы. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект ранее подвергался лечению препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином), описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, субъект с порфирией, такой как, например, АГР), который подлежит лечению согласно способам, описанным в данном документе, недавно испытывал или в настоящее время испытывает продром. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъекту вводят
комбинированное лечение, например, iRNA, описанную в данном документе, и один или несколько дополнительных лекарственных препаратов, которые, как известно, являются эффективными против порфирий (например, глюкоза и/или препарат на основе гема, такой как гемин, описанный в данном документе) или ассоциированных с ней симптомов.
Согласно одному варианту осуществления iRNA, описанную в данном документе, вводят в комбинации с глюкозой или декстрозой. Например, может предусматриваться внутривенное введение 10-20% декстрозы в физиологическом растворе. Как правило, если вводится глюкоза, по меньшей мере 300 г 10% глюкозы вводят внутривенно ежедневно. iRNA (например, iRNA в составе LNP) можно также вводить внутривенно, как часть той же инфузий, которую используют для введения глюкозы или декстрозы, или в виде отдельной инфузий, которую вводят до, одновременно или после введения глюкозы или декстрозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят при помощи другого пути введения (например, подкожно). Согласно еще одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с полным парентеральным питанием. iRNA можно вводить до, одновременно или после введения полного парентерального питания.
Согласно одному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином). Согласно дополнительному варианту осуществления iRNA вводят в комбинации с препаратом на основе гема и глюкозой, препаратом на основе гема и декстрозой или препаратом на основе гема и полным парентеральным питанием.
Используемое в данном документе выражение "продром" предусматривает любой симптом, который отдельный субъект испытывал заранее, непосредственно перед развитием острого приступа. Типичные симптомы продрома включают, например, боль в животе, тошноту, головные боли, психологические симптомы (например, тревожность), возбужденное состояние и/или бессонницу. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает болевые ощущения (например, боль в животе и/или головную боль). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает тошноту. Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект испытывает психологические симптомы (например, тревожность). Согласно некоторым вариантам осуществления во время продрома субъект становится возбужденным и /или страдает от бессонницы.
Острый "приступ" порфирий включает проявление одного или нескольких симптомов порфирий, как правило, у пациента, который имеет мутацию, ассоциированную с порфирией (например, мутацию в гене, который кодирует фермент в порфириновом пути).
Согласно определенным вариантам осуществления введение iRNA ALAS1 приводит к снижению уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов, описанных в данном документе (например, ALA и/или PBG). Снижение может измерять относительно соответствующего контрольного или нормального значения. Например, снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов можно установить у отдельного субъекта, например, как снижение по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50% или более по сравнению с уровнем, который наблюдался до лечения (например, непосредственно перед лечением). Снижение уровня предшественника порфирина, порфирина или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при помощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG у субъекта. Уровень ALA или PBG у субъекта можно оценивать, например, на основе абсолютного уровня ALA или PBG, или на основе относительного уровня ALA или PBG (например, относительно уровня другого белка или соединения, например, уровня креатинина) в образце от субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления образец представляет собой образец плазмы.
Согласно определенным вариантам осуществления iRNA, которая нацелена на ALAS 1, вводят в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами, например, другим препаратом, который, как известно, является эффективным в лечении порфирий или симптомов порфирий. Например, другим лекарственным препаратом может быть глюкоза (например, IV глюкоза) или препарат на основе гема (например, гемин, аргинат гема или гемальбумин). Дополнительный
лекарственный препарат(ы) можно вводить до, после или одновременно с введением iRNA.
iRNA и дополнительное терапевтическое средство можно вводить в комбинации в одной и той же композиции, например, внутривенно, или дополнительное терапевтическое средство можно вводить как часть отдельной композиции или другим способом, описанным в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение iRNA или введение iRNA в комбинации с одним или несколькими дополнительными лекарственными препаратами (например, глюкозой, декстрозой и т.п.), снижает частоту острых приступов (например, путем предупреждения острых приступов так, что они больше не возникают, или путем снижения числа приступов, которые возникают в определенный период времени, например, меньшее число приступов возникает за год). Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA вводят согласно схеме дозирования с регулярными интервалами, например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят после острого приступа порфирий. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав, например состав LNP.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время острого приступа порфирий. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в композиции, например, композиции, содержащей липидный состав (например, состав LNP), или композиции, содержащей конъюгат GalNAc.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят профилактически для предупреждения острого приступа порфирий. Согласно некоторым таким вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, например, в композиции, содержащей конъюгат
GalNAc. Согласно некоторым вариантам осуществления профилактическое введение выполняют до, во время или после воздействия или возникновения провоцирующего фактора. Согласно некоторым вариантам осуществления субъект подвержен риску развития порфирий.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время продрома. Согласно некоторым вариантам осуществления продром характеризуется болевыми ощущениями (например, головной болью и/или болью в животе), тошнотой, психологическими симптомами (например, тревожностью), возбужденным состоянием и/или бессонницей.
Согласно некоторым вариантам осуществления siRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла, например, во время лютеиновой фазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения приступов (например, рецидивирующих приступов, которые ассоциированы с продромом и/или с провоцирующим фактором, например, с определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения частоты приступов. Согласно вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для снижения тяжести приступа (например, путем облегчения одного или нескольких признаков или симптомов, ассоциированных с приступом). Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для сокращения продолжительности приступа. Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для прекращения приступа.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести болевых ощущений, например, нейропатической боли.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение siRNA ALAS1 является эффективным для предупреждения или снижения частоты или тяжести нейропатии.
Эффекты введения siRNA ALAS1 могут быть установлены, например, путем сравнения с соответствующим контролем. Например, снижение частоты острых
приступов, а также снижение уровня одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов у группы пациентов с АГР может быть установлено, например, как пониженная частота по сравнению с соответствующей контрольной группой. Контрольная группа (например, группа из подобных индивидов или та же группа индивидов в перекрестном исследовании) может включать, например, популяцию, не получавшую лечения, популяцию, которую лечили при помощи традиционного лекарственного препарата от порфирий (например, традиционный лекарственный препарат от АГР может включать глюкозу, гемин или оба); популяцию, которую лечили при помощи плацебо или нецелевой iRNA, необязательно в комбинации с одним или несколькими традиционными лекарственными препаратами от порфирий (например, глюкозой, например, TV глюкозой) и т.п.
Используемое в данном документе выражение "подверженный риску" развития порфирий включает субъекта со случаями заболевания порфирией в семье и/или одним или несколькими рецидивирующими или хроническими симптомами порфирий в анамнезе, и/или субъекта, который имеет генетическое изменение (например, мутацию) в гене, кодирующем фермент в рамках пути биосинтеза гема, и субъекта, который имеет генетическое изменение, например, мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией.
Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, способствует восприимчивости индивида к острому приступу (например, при воздействии провоцирующего фактора, например, лекарственного средства, пребывания на диете или другого провоцирующего фактора, например, провоцирующего фактора, раскрытого в данном документе). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с повышенными уровнями порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с хронической болью (например, хронической нейропатической болью) и/или нейропатией (например, прогрессирующей нейропатией). Согласно вариантам осуществления изменение, например мутация, ассоциировано с изменениями EMG и/или скорости проводимости нервов.
Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в гене ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в
промоторе гена ALAS 1 или в участках, расположенных выше или ниже гена ALAS 1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой мутацию в факторах транскрипции или других генах, которые взаимодействуют с ALAS1. Согласно вариантам осуществления изменение представляет собой изменение, например мутацию, в гене, который кодирует фермент в рамках пути биосинтеза гема.
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе (например, генетическую мутацию, которая, как известно, ассоциирована с порфирией). Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в моче или плазме) ALA и/или PBG. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект не имеет повышенный уровень ALA и/или PBG. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, описанное в данном документе, и имеет другие симптомы, например, хроническую боль, изменения EMG, изменения скорости проводимости нервов и/или другие симптомы, ассоциированные с порфирией. Согласно вариантам осуществления субъект имеет генетическое изменение, но не испытывает острых приступов.
Согласно вариантам осуществления субъект имеет мутацию, ассоциированную с АГР, НСР, VP или ADP.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой АГР. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например, по меньшей мере одну мутацию, в гене PBG-дезаминазы. Многие мутации PBG-дезаминазы известны из уровня техники, например, описанные в Hrdinka, М. et al. Physiological Research, 55 (Suppl 2):SI 19-136 (2006). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект является гетерозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Согласно другим вариантам осуществления субъект является гомозиготным по мутации PBG-дезаминазы. Гомозиготный субъект может иметь две идентичные мутации или две различные мутации в гене PBG-дезаминазы.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой НСР. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение,
например, по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует фермент копропорфириноген III оксидазу.
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой VP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например, по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует протопорфириногеноксидазу.
Согласно вариантам осуществления порфирия представляет собой ADP, например, аутосомно-рецессивную ADP. Согласно некоторым таким вариантам осуществления субъект имеет изменение, например, по меньшей мере одну мутацию, в гене, который кодирует ALA-дегидратазу.
Способы лечения, представленные в данном документе, могут служить для облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, возникнет при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Кроме того, способы, представленные в данном документе, могут служить для снижения уровня одного или нескольких предшественников порфиринов, порфиринов и/или связанных продуктов или метаболитов порфирина. Уровень предшественника порфирина или порфирина можно измерять в любом биологическом образце, таком как, например, моча, кровь, кал, спинномозговая жидкость или образец ткани. Образец может находиться в субъекте или может быть получен или выделен из субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления порфирия представляет собой AIP, а уровень PBG и/или ALA снижен. Согласно некоторым вариантам осуществления продукт или метаболит порфирина представляет собой порфобилин, порфобилиноген или уропорфирин. Снижение уровня продукта или метаболита порфирина можно измерять при помощи любого способа, известного из уровня техники. Например, уровень PBG и/или ALA в моче или плазме можно оценивать при помощи теста Уотсона-Шварца, ионообменной хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии. См., например, Thunell (1993).
Способы, описанные в данном документе, могут также служить для снижения хронически повышенных уровней предшественников порфиринов (например, ALA и/или PBG) у субъектов, страдающих порфирией (например, острой печеночной порфирией, например, АГР) или подверженных риску развития порфирий. Способы оценки уровней (например, хронически повышенных уровней) предшественников порфиринов в плазме и моче включают, например, HPLC-масс-спектрометрию и ионообменную хроматографию. Уровни предшественников порфиринов можно выражать в виде уровня относительно другого белка или соединения, например, креатинина. См., например, Floderus, Y. et al, Clinical Chemistry, 52(4): 701-707, 2006; Sardh et al., Clinical Pharmacokinetics, 46(4): 335349, 2007.
Используемое в данном документе выражение "провоцирующий фактор" относится к эндогенному или экзогенному фактору, который может индуцировать острый приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией. Провоцирующие факторы включают голодание (или другие формы пониженной или недостаточной калорийности потребляемой пищи вследствие жестких диет, занятий спортом, связанных с длинными дистанциями и т. д.), формы стресса, связанные с метаболизмом (например, инфекции, оперативное вмешательство, международные авиаперелеты и психологический стресс), эндогенные гормоны (например, прогестерон), курение сигарет, жирорастворимые чужеродные химические соединения (в том числе, например, химические соединения, присутствующие в табачном дыме, определенные лекарственные средства рецептурного отпуска, органические растворители, биоциды, соединения в алкогольных напитках), эндокринные факторы (например, половые гормоны (женщины могут испытывать обострения болезни во время менструального периода), синтетические эстрогены, прогестероны, стимуляторы овуляции и гормональная заместительная терапия). См., например, Thunell (1993). Распространенные провоцирующие факторы включают лекарственные средства, индуцирующие цитохром Р450, и фенобарбитал.
Симптомы, ассоциированные с порфирией, могут включать боль или спазмы в животе, головные боли, эффекты, вызванные патологиями нервной системы, и светочувствительность, вызывающую появление сыпи, образование волдырей и рубцов на коже (фотодерматит). Согласно определенным вариантам осуществления порфирия
представляет собой АГР. Симптомы АГР включают симптомы, связанные с желудочно-кишечным трактом (например, сильная и плохо локализуемая боль в животе, тошнота/рвота, запор, диарея, непроходимость кишечника), симптомы, связанные с мочевой системой (дизурия, задержка мочеиспускания/недержание мочи или темная моча), неврологические симптомы (например, сенсорная нейропатия, моторная нейропатия (например, поражающая черепные нервы и/или приводящая к слабости мышц в руках или ногах), судороги, нейропатическую боль, прогрессирующую нейропатию, головные боли, нейропсихиатрические симптомы (например, спутанность сознания, тревожность, возбуждение, галлюцинация, истерия, делирий, апатия, депрессия, фобии, психоз, бессонница, сонливость, кома), вовлечение автономной нервной системы (приводящее, например, к симптомам, связанным с сердечно-сосудистой системой, таким как тахикардия, гипертензия и/или аритмии, а также другим симптомам, таким как, например, повышенные уровни катехоламинов в крови, потение, возбужденность и/или тремор), обезвоживание и нарушения баланса электролитов.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA, нацеленную на ALAS1, вводят вместе (например, до, после или одновременно) с другим лекарственным препаратом, который может служить для ослабления одного или нескольких из упомянутых выше симптомов. Например, боль в животе можно лечить, например, наркотическими анальгетиками, судороги можно лечить, например, противосудорожными препаратами, тошноту/рвоту можно лечить, например, фенотиазинами, и тахикардию/гипертензию можно лечить, например, бета-блокаторами.
Выражение "снижать" (или "повышать"), как предполагается, относится к измеряемому изменению, например, статистически значимому изменению. Изменение может составлять, например, изменение (например, снижение (или повышение) относительно нормального значения, например, эталонной величины, где iRNA не вводят) по меньшей мере на 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% или более.
Настоящее изобретение дополнительно относится к применению iRNA или фармацевтической композиции на ее основе, например, для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, в комбинации с другими фармацевтическими препаратами и/или другими терапевтическими способами, например, с известными фармацевтическими препаратами и/или известными терапевтическими способами, такими
как, например, применяемые в настоящее время для лечения нарушения. Согласно одному варианту осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе можно вводить совместно с препаратом на основе гема (например, гемином, аргинатом гема или гемальбумином, описанными в данном документе) и/или совместно с внутривенными инфузиями глюкозы. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA или фармацевтическую композицию на ее основе применяют профилактически, например, для предупреждения или облегчения симптомов прогнозируемого приступа острой порфирий. Профилактическое применение может планироваться по времени в соответствии с воздействием или прогнозируемым воздействием провоцирующего фактора на субъекта. Описанный в данном документе провоцирующий фактор может представлять собой любой эндогенный или экзогенный фактор, который, как известно, провоцирует острый приступ. Например, предменструальная фаза представляет собой эндогенный провоцирующий фактор, а лекарственное средство, провоцирующее цитохром Р450, представляет собой экзогенный провоцирующий фактор.
Количество, эффективное для лечения нарушения, связанного с экспрессией ALAS 1 (например, порфирий, такой как АГР), зависит от типа нарушения, подлежащего лечению, тяжести симптомов, субъекта, который подлежит лечению, пола, возраста и общего состоянии субъекта, способа введения и т.д. Для каждого отдельно взятого случая соответствующее "эффективное количество" может определить специалист в данной области с помощью стандартного проведения экспериментов. Контролирование эффективности лечения или предупреждения путем измерения любого из таких показателей или любой комбинации показателей относится к компетенции специалиста в данной области. Применительно к введению iRNA, нацеленной на ALAS1, или фармацевтической композиции на ее основе выражение "эффективный против" нарушения, связанного с экспрессией ALAS1, указывает, что введение способом, принятым в клинической практике, приводит к благоприятному эффекту, например, для отдельного пациента или по меньшей мере для части пациентов, например, статистически значимой части пациентов. Благоприятные эффекты включают, например, предупреждение или снижение симптомов, или другие эффекты. Например, благоприятные эффекты включают, например, улучшение (например, снижение тяжести или частоты) симптомов, снижение тяжести или частоты приступов, сниженный риск
развития сопутствующего заболевания (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака), повышенную способность переносить провоцирующий фактор, улучшение качества жизни, снижение экспрессии ALAS1, снижение уровня (например, уровня в плазме или моче) порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG) или другой эффект, как правило, расцениваемый как положительный лечащими врачами, хорошо осведомленными в лечении определенного типа нарушения.
Эффект лечения или предупреждения является очевидным, когда наблюдается улучшение, например, статистически значимое улучшение, одного или нескольких показателей болезненного состояния, или когда отсутствует усугубление или развитие симптомов в тех случаях, когда, при иных обстоятельствах, они прогнозировались. В качестве примера, положительное изменение измеряемого показателя заболевания по меньшей мере на 10%, например, по меньшей мере на 20%, 30%, 40%, 50% или более, может служить признаком эффективного лечения. Об эффективности данного лекарственного средства на основе iRNA или состава с таким лекарственным средством можно также судить при помощи экспериментальной животной модели данного заболевания, которая известна из уровня техники. При использовании экспериментальной животной модели эффективность лечения подтверждается, когда наблюдают статистически значимое снижение маркера (например, ALA или PBG в плазме или моче) или ослабление симптома.
Пациентам можно вводить терапевтическое количество iRNA. Терапевтическое количество может составлять, например, 0,05-50 мг/кг. Например, терапевтическое количество может составлять 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0 или 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA составлена в виде липидного состава, например, состава LNP, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,05-5 мг/кг, например, 0,05, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 или 5,0 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления липидный состав, например, состав LNP, вводят внутривенно.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят путем внутривенной инфузий в течение определенного периода времени, как, например, в течение периода 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут или 25 минут.
Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA находится в форме конъюгата GalNAc, описанного в данном документе. Согласно некоторым таким вариантам осуществления терапевтическое количество может составлять 0,5-50 мг, например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 мг/кг dsRNA. Согласно некоторым вариантам осуществления конъюгат GalNAc вводят подкожно.
Согласно некоторым вариантам осуществления введение повторяют, например, регулярно, как, например, ежедневно, раз в две недели (т. е. каждые две недели) в течение одного месяца, двух месяцев, трех месяцев, четырех месяцев или дольше. После осуществления схемы первичного лечения лекарственные препараты можно вводить менее часто. Например, после введения раз в две недели в течение трех месяцев введение можно повторять один раз в месяц в течение шести месяцев, или года, или дольше.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят двумя или более дозами. Согласно некоторым вариантам осуществления число или величина последующих доз зависят от достижения необходимого эффекта, например, подавления гена ALAS, снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA и/или PBG), или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассциированных с порфирией (например, болевых ощущений, например, нейропатической боли), и/или предупреждения приступов или снижения частоты и/или тяжести приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят в соответствии со схемой. Например, средство на основе iRNA можно вводить раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю или пять раз в неделю. Согласно некоторым вариантам осуществления схема предусматривает введения с равными интервалами, например, ежечасно, каждые четыре часа, каждые шесть часов, каждые восемь часов, каждые двенадцать часов, ежедневно, каждые 2 дня, каждые 3 дня,
каждые 4 дня, каждые 5 дней, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц. Согласно вариантам осуществления средство на основе iRNA вводят еженедельно или раз в две недели для достижения необходимого эффекта, например, снижения уровня ALA и/или PBG, уменьшения болевых ощущений и/или предупреждения острых приступов.
Согласно вариантам осуществления схема предусматривает введения с небольшими интервалами с последующим более длительным периодом времени, в течение которого средство не вводят. Например, схема может предусматривать первоначальный набор доз, которые вводят за относительно короткий период времени (например, приблизительно каждые 6 часов, приблизительно каждые 12 часов, приблизительно каждые 24 часа, приблизительно каждые 48 часов или приблизительно каждые 72 часа) с последующим более длительным периодом времени (например, приблизительно 1 неделя, приблизительно 2 недели, приблизительно 3 недели, приблизительно 4 недели, приблизительно 5 недель, приблизительно 6 недель, приблизительно 7 недель или приблизительно 8 недель), в течение которого средство на основе iRNA не вводят. Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежечасно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, ежедневно, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно другому варианту осуществления средство на основе iRNA первоначально вводят ежедневно, а впоследствии вводят с более длительными интервалами (например, еженедельно, раз в две недели или раз в месяц). Согласно определенным вариантам осуществления более длительный интервал увеличивается со временем, или его определяют на основе достижения необходимого эффекта. Согласно конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят один раз в день в течение острого приступа с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения. Согласно другому конкретному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят через день в течение первой недели с последующим еженедельным введением доз, начиная с восьмого дня введения.
Согласно одному варианту осуществления средство на основе iRNA вводят для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов,
например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором. Согласно некоторым вариантам осуществления провоцирующим фактором является менструальный цикл. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят периодически, например, через равные промежутки для предупреждения или снижения тяжести или частоты рецидивирующих приступов, например, циклических приступов, ассоциированных с провоцирующим фактором, например, менструальным циклом, например, определенной фазой менструального цикла, например, лютеиновой фазой. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время определенной фазы менструального цикла или на основе уровней гормонов у пациента, получающего лечение (например, на основе уровней гормонов, которые ассоциированы с определенной фазой менструального цикла). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят в один или несколько определенных дней менструального цикла, например, в 1-й, 2-й, 3-й, 4-й, 5-й, 6-й, 7-й, 8-й, 9-й, 10-й, 11-й, 12-й, 13-й, 14-й, 15-й, 16-й, 17-й, 18-й, 19-й, 20-й, 21-й, 22-й, 23-й, 24-й, 25-й, 26-й, 27-й день или в 28-й день (или более поздний день для субъектов, которые имеют более длинный менструальный цикл). Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят во время лютеиновой фазы, например, в один или несколько дней между 14-м - 28-м днями менструального цикла (или позже у субъектов, которые имеют менструальный цикл, который составляет более 28 дней). Согласно некоторым вариантам осуществления у субъекта оценивают время наступления овуляции (например, с помощью анализа крови или мочи, который определяет гормон, ассоциированный с овуляцией, например, LH) и iRNA вводят через заранее определенный интервал после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят непосредственно после овуляции. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA вводят через 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 или 18 дней после овуляции. Любую из этих схем необязательно можно повторять в течение одного или нескольких циклов. Число циклов может зависеть от достижения необходимого эффекта, например подавления гена ALAS1 и/или достижения терапевтического или профилактического эффекта, например, снижения или предупреждения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией.
Согласно некоторым вариантам осуществления вводят первоначальную дозу средства на основе iRNA и проверяют уровень ALA или PBG, например, через 1 -48 часов, например, 2, 4, 8, 12 или 24 часа, после введения первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если уровень ALA и/или PBG снизился (например, с достижением заранее определенного снижения, например, нормализации), и/или если симптомы, ассоциированные с порфирией (например, болевые ощущения), улучшились (например, так что у пациента не наблюдаются симптомы), дальнейшую дозу не вводят, в то же время, если уровень ALA и/или PBG не снизился (например, не достиг заранее определенного снижения, например, не нормализовался), то дальнейшую дозу ALA или PBG вводят. Согласно некоторым вариантам осуществления дальнейшую дозу вводят через 12, 24, 36, 48, 60 или 72 часа после первоначальной дозы. Согласно некоторым вариантам осуществления, если первоначальная доза не является эффективной в снижении уровня ALA и/или PBG, то дальнейшую дозу модифицируют, например повышают, для достижения необходимого понижения (например, заранее определенного снижения, например, нормализации) уровней ALA или PBG.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой понижение по меньшей мере на 10%, 20%, 30%, 40% или 50%. Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое является эффективным в предупреждении или облегчении симптомов, например, болевых ощущений, продромальных симптомов, или рецидивирующих приступов.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение по меньшей мере на 1, 2, 3 или более стандартных отклонений, где стандартное отклонение определяют на основе значений из эталонной выборки, например, эталонной выборки, описанной в данном документе.
Согласно некоторым вариантам осуществления заранее определенное снижение представляет собой снижение, которое доводит уровень порфирина или предшественника порфирина до уровня, который меньше нормального значения, или до уровня, который меньше или равен нормальному значению (например, нормальному значению, описанному в данном документе).
Используемое в данном документе выражение "нормализация" уровней ALA или PBG (или "нормальный" или "нормализованный" уровень) относится к уровню (например, уровню в моче и/или плазме) либо ALA, либо PBG, либо обоих, который находится в пределах ожидаемого диапазона для здорового индивида, индивида, у который не наблюдаются симптомы (например, индивида, который не испытывает болевых ощущений и/или не страдает нейропатией), или индивида, который не имеет мутации, ассоциированной с порфирией. Например, согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах двух стандартных отклонений от нормального среднего. Согласно некоторым вариантам осуществления нормализованный уровень находится в пределах нормального диапазона значений, например, в пределах 95% доверительного интервала для соответствующей контрольной выборки, например, выборки здоровых индивидов или индивидов, которые не имеют генной мутации, ассоциированной с порфирией. Согласно некоторым вариантам осуществления уровень ALA и/или PBG у субъекта (например, уровень ALA и/или PBG в плазме и/или крови) отслеживают через определенные промежутки времени, при этом дальнейшую дозу средства на основе iRNA вводят, если уровень повышается выше нормального значения.
Введение iRNA может снижать уровни mRNA или белка ALAS1, например, в клетке, ткани, крови, моче или другой части организма пациента по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80 % или по меньшей мере на 90% или более. Введение iRNA может снижать уровни продуктов, ассоциированных с экспрессией гена ALAS1, например, уровни одного или нескольких порфиринов или предшественников порфиринов (например, уровень ALA и/или PBG). Введение средства на основе iRNA также может ингибировать или предупреждать повышение уровней mRNA или белка ALAS1 во время острого приступа АГР.
Перед введением полной дозы iRNA пациентам можно вводить меньшую дозу, такую как 5% инфузионную дозу, и отслеживать у них побочные эффекты, такие как аллергическая реакция, или повышенные уровни липидов или кровяного давления.
Согласно другому варианту осуществления у пациента можно отслеживать нежелательные эффекты.
Способы модулирования экспрессии гена ALAS1
Согласно еще одному аспекту в настоящем изобретении представлен способ модулирования (например, ингибирования или активации) экспрессии гена ALAS1, например, в клетке или у субъекта. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек). Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску заболевания, связанного с экспрессией ALAS1, или у него диагностировано такое заболевание, как описано выше.
Согласно одному варианту осуществления способ включает приведение клетки в контакт с iRNA, описанной в данном документе, в количестве, эффективном для снижения экспрессии гена ALAS 1 в клетке. Используемое в данном документе выражение "приведение в контакт" включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть приведена в контакт, когда композицию, содержащую iRNA, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту.
Экспрессию гена ALAS1 можно оценивать на основе уровня экспрессии mRNA ALAS 1, белка ALAS 1 или уровня показателя, функционально связанного с уровнем экспрессии гена ALAS 1 (например, уровня порфирина или частоты или тяжести симптома, связанного с порфирией). Согласно некоторым вариантам осуществления экспрессия ALAS1 ингибируется по меньшей мере на 5%, по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 15%, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 35%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 45%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 55%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 65%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на
95%. Согласно некоторым вариантам осуществления iRNA характеризуется IC50 в диапазоне 0,001-0,01 нМ, 0,001-0,10 нМ, 0,001-1,0 нМ, 0,001-10 нМ, 0,01-0,05 нМ, 0,010,50 нМ, 0,02-0,60 нМ, 0,01-1,0 нМ, 0,01-1,5 нМ, 0,01-10 нМ. Значение 1С50 может быть нормализовано относительно соответствующего контрольного значения, например, IC50 нецелевой iRNA.
Согласно некоторым вариантам осуществления способ предусматривает введение в клетку iRNA, описанной в данном документе, и поддержание клетки в течение времени, достаточного для достижения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS1, вследствие чего ингибирования экспрессии гена ALAS1 в клетке.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, например, композиции, содержащей iRNA, которая нацеливается на ALAS1, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS 1 понижается, например, на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель или четырех недель или дольше. Согласно некоторым вариантам осуществления понижение экспрессии ALAS 1 можно выявлять в течение 1 часа, 2 часов, 4 часов, 8 часов, 12 часов или 24 часов после первого введения.
Согласно другому варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, описанной в данном документе, млекопитающему так, что экспрессия целевого гена ALAS 1 повышается, например, по меньшей мере на 10% по сравнению с необработанным животным. Согласно некоторым вариантам осуществления активация ALAS 1 наблюдается на протяжении длительного периода времени, например, по меньшей мере двух, трех, четырех дней или более, например, одной недели, двух недель, трех недель, четырех недель или более. Не желая быть связанными теорией, iRNA может активировать экспрессию ALAS1 путем стабилизации mRNA-транскрипта ALAS1, взаимодействия с промотором в геноме и/или подавления ингибитора экспрессии ALAS1.
iRNA, применимые для способов и композиций, описанных в настоящем изобретении, специфично нацелены на РНК (первичные или процессированные) гена ALAS1. Композиции для ингибирования экспрессии гена ALAS1 с использованием iRNA можно получать, а способы такого ингибирования можно осуществлять, как описано в другой части данного документа.
Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает введение композиции, содержащей iRNA, где iRNA содержит нуклеотидную последовательность, которая комплементарна по меньшей мере части РНК-транскрипта гена ALAS 1 млекопитающего, который подлежит лечению. Если организм, который подлежит лечению, представляет собой млекопитающего, такого как человек, то композицию можно вводить любым способом, известным из уровня техники, в том числе без ограничения с помощью перорального, внутрибрюшинного или парентерального пути введения, в том числе с помощью интракраниального (например, интравентрикулярного, интрапаренхиматозного и интратекального), внутривенного, внутримышечного, подкожного, трансдермального, воздушного (аэрозольного), назального, ректального и местного (в том числе буккального и сублингвального) введения.
Согласно определенным вариантам осуществления композиции вводят путем внутривенной инфузий или инъекции. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат siRNA, находящуюся в липидном составе (например, в составе LNP, таком как состав LNP11) для внутривенной инфузий. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирий и/или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Согласно другим вариантам осуществления композиции вводят подкожно. Согласно некоторым таким вариантам осуществления композиции содержат iRNA, конъюгированную с лигандом GalNAc. Согласно определенным вариантам осуществления такие композиции можно применять для лечения острых приступов порфирий или для профилактики (например, для снижения тяжести или частоты приступов).
Способы снижения уровня порфирина или предшественника порфирина
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлен способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина, например, в клетке или у субъекта.
Согласно некоторым вариантам осуществления клетка находится ex vivo, in vitro или in vivo. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой эритроидную клетку или гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления клетка представляет собой гепатоцит. Согласно некоторым вариантам осуществления
клетка находится внутри субъекта (например, млекопитающего, такого как, например, человек).
Согласно некоторым вариантам осуществления субъект (например, человек) подвержен риску развития порфирий или у него диагностирована порфирия, как описано в данном документе. Согласно некоторым вариантам осуществления способ является эффективным для лечения порфирий, как описано в данном документе (например, путем облегчения одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, снижения частоты приступов, ассоциированных с порфирией, снижения вероятности того, что приступ, состоящий из одного или нескольких симптомов, ассоциированных с порфирией, будет возникать при воздействии провоцирующего фактора, и/или снижения риска развития состояний, ассоциированных с порфирией (например, нейропатии (например, прогрессирующей нейропатии), гепатоцеллюлярного рака). Согласно одному варианту осуществления способ предусматривает приведение клетки в контакт с RNAi, как описано в данном документе, в количестве, достаточном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке, или в другой соответствующей клетке или группе клеток, или у субъекта. Используемое в данном документе выражение "приведение в контакт" включает непосредственное приведение клетки в контакт, а также опосредованное приведение клетки в контакт. Например, клетка внутри субъекта (например, эритроидная клетка или клетка печени, такая как гепатоцит) может быть приведена в контакт, когда композицию, содержащую RNAi, вводят (например, внутривенно или подкожно) субъекту. Используемое в данном документе выражение "другая соответствующая клетка или группа клеток" включает любую клетку или группу клеток, в которых уровень порфирина или предшественника порфирина снижается в результате приведения в контакт. Например, клетка может быть частью ткани, находящейся внутри субъекта (например, клеткой печени, находящейся внутри субъекта), и приведение в контакт клетки внутри субъекта (например, приведение в контакт одной или нескольких клеток печени, находящихся внутри субъекта) с RNAi может приводить к снижению уровня порфирина или предшественника порфирина в другой соответствующей клетке или группе клеток (например, нервных клетках субъекта), или в ткани или жидкости субъекта (например, в моче, крови, плазме или спинномозговой жидкости субъекта).
Согласно некоторым вариантам осуществления порфирин или предшественник порфирина выбирается из группы, состоящей из 8-аминолевулиновой кислоты (ALA), порфобилиногена (PBG), гидкросиметилбилана (НМВ), уропорфиногена III, копропорфиногена III, протопорфиногена ГХ и протопорфирина ГХ. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой ALA. Согласно некоторым вариантам осуществления предшественник порфирина представляет собой PBG. Согласно некоторым вариантам осуществления способ снижает уровень ALA и PBG. Уровень порфирина или предшественника порфирина можно измерять, как описано в данном документе и как известно из уровня техники.
Анализы и способы отслеживания активности RNAi
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении представлены анализы и способы отслеживания уровней mRNA ALAS 1. Активность RNAi в печени можно отслеживать с помощью определения уровней mRNA или продукта 5'RACE в ткани, или с помощью определения уровня секретируемого белка в крови.
Альтернативно или в комбинации, можно определять уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1, например, при помощи анализов cERD (Circulating Extracellular RNA Detection). Согласно некоторым вариантам осуществления уровень mRNA ALAS 1 можно определять в образце биологической жидкости, например, образце сыворотки или мочи. Согласно некоторым вариантам осуществления в биологические жидкости из различных типов клеток выделяются экзосомы, которые содержат mRNA и miRNA, происходящие из исходной ткани. Такие экзосомы можно использовать для отслеживания уровня циркулирующей RNAi. Согласно одному варианту осуществления образец, например, образец сыворотки или мочи от субъекта, получающего лечение посредством iRNA, описанной в данном документе, может быть очищен при помощи низкоскоростного центрифугирования, затем при помощи центрифугирования со скоростью приблизительно 160000g в течение приблизительно 2 часов с образованием осадка. RNA можно экстрагировать и анализировать для измерения уровней mRNA ALAS1. Иллюстративные способы и анализы раскрыты в PCT/US2012/043584, опубликованном как WO 2012/177906, содержание которых включено при помощи ссылки.
Соответственно, представлен анализ или способ определения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта. Анализ или способ предусматривают получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца мочи, крови или плазмы) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS 1; и определение в образце уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают стадию получения cDNA ALAS1 из mRNA ALAS1; и приведения в контакт cDNA ALAS1 с нуклеиновой кислотой (например, зондом и/или праймером), комплементарной cDNA ALAS 1 или ее части, что тем самым приводит к образованию реакционной смеси; и определения (например, измерения) уровня cDNA ALAS1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 является показателем уровня mRNA ALAS1, тем самым анализируют уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
Согласно одному варианту осуществления анализ или способ предусматривают получение образца биологической жидкости от субъекта, где биологический образец отделяют от ткани и где биологический образец содержит экзосомы. Анализ или способ могут дополнительно предусматривать определение уровней РНК в биологическом образце, где РНК экспрессируется за счет гена в ткани субъекта, где экзосомы не очищают от биологического образца перед определением уровней РНК в биологическом образце.
Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец крови. Согласно вариантам осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец сыворотки. Согласно другому варианту осуществления упомянутый образец биологической жидкости представляет собой образец мочи.
Согласно вариантам осуществления способ включает PCR, qPCR или 5'-RACE.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер.
Согласно вариантам осуществления упомянутая нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент и уровень mRNA ALAS 1 определяют по выявлению количества выявляемого фрагмента.
Согласно вариантам осуществления упомянутый способ дополнительно предусматривает получение образца биологической жидкости от субъекта.
Согласно вариантам осуществления этих способов эффективность лечения порфирий оценивают на основе сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта по отношению к нормальному значению.
Согласно вариантам осуществления снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS 1 у субъекта в ответ на лечение порфирий относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирий является эффективным. Согласно вариантам осуществления нормальное значение представляет собой уровень циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта до лечения порфирий.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют такое значение, которое обычно понятно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя способы и материалы, аналогичные или эквивалентные таковым, описанным в данном документе, можно применять в практическом осуществлении или исследовании iRNA и способов, описанных в настоящем изобретении, подходящие способы и материалы описаны ниже. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие литературные источники, которые упоминаются в данном документе, включены при помощи ссылки во всей своей полноте. В случае противоречия настоящее описание, в том числе определения, будет иметь преимущественную силу. Кроме того, материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не подразумеваются как ограничивающие.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Синтез siRNA
Источник реагентов
Если источник реагента конкретным образом не указан в данном документе, такой реагент может быть получен от любого поставщика реагентов для целей использования в молекулярной биологии в количестве/с чистотой, стандартными для применения в молекулярной биологии.
Синтез олигонуклеотидов.
Все олигонуклеотиды синтезировали на синтезаторе AKTAoligopilot. Для синтеза олигонуклеотидов применяли коммерчески доступную твердую подложку из стекла с контролируемым размером пор (dT-CPG, 500 A, Prime Synthesis) и РНК-фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-0-диметокситритил-К6-бензоил-2'-трет-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-0-К,М'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-0-диметокситритил-К4-ацетил-2'-трет-бутилдиметилсилил-цитидин-3'-0-К,М'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-0-диметилокситритил-К2-изобутрил-2'-трет-бутилдиметилсилил-гуанозин-3'-0-М,М'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-0-диметокситритил-2'-трет-бутилдиметилсилил-уридин-3'-0-М,М'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Б-фосфорамидиты, 5'-0-диметокситритил-К4-ацетил-2'-фтор-цитидин-3'-0-М,М'-диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит и 5'-Одиметокситритил-2'-фторуридин-3'-0-N,N'-диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит приобретали у Promega. Все фосфорамидиты применяли в концентрации 0,2 М в ацетонитриле (CH3CN), за исключением гуанозина, который применяли в концентрации 0,2 М в 10% THF7ANC (объем/объем). Время связывания/рециркуляции составляло 16 минут. Активатор представляет собой 5-этилтиотетразол (0,75 М, American International Chemicals); для РО-окисления применяли йод/воду/пиридин, а для PS-окисления применяли PADS (2%) в смеси 2,6-лутидин/АСГЧ (1:1 объем/объем).
З'-Лиганд-конъюгированные нити синтезировали с помощью твердой подложки, содержащей соответствующий лиганд. Например, введение единицы холестерина в последовательность выполняли от фосфорамидита гидроксипролинол-холестерина. Холестерин привязывали к транс-4-гидроксипролинолу с помощью 6-аминогексаноатной связи с получением фрагмента, представляющего собой гидроксипролинол-холестерин. iRNA, меченые на 5'-конце Су-3 и Су-5.5 (флуорофором), синтезировали из соответствующего фосфорамидита Quasar-570 (Су-3), приобретенного у Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов с 5'-концом и/или внутренним положением достигали с помощью соответствующим образом защищенного лиганд-фосфорамидитного строительного блока. В течение 15 минут дополнительно выполняли связывание 0,1 М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии активатора
5-(этилтио)-1//-тетразола со связанным с твердой подложкой олигонуклеотидом. Окисление межнуклеотидного фосфита до фосфата выполняли с использованием стандартной смеси йод-вода, которая описана (1), или путем обработки смесью трет-бутилгидропероксида/ацетонитрила/воды (10: 87: 3) с конъюгированным олигонуклеотидом при времени задержки окисления 10 минут. Фосфоротиоат вводили с помощью окисления фосфита до фосфоротиоата с использованием реагента для переноса серы, такого как DDTT (приобретенного у AM Chemicals), PADS и/или реагента Бокажа. Холестерин-фосфорамидит синтезировали своими силами и использовали в концентрации 0,1 М в дихлорметане. Время связывания для холестерин-фосфорамидита составляло 16 минут.
Снятие защиты I (снятие защиты с нуклеотидного основания)
После завершения синтеза подложку переносили в 100 мл стеклянный флакон (VWR). Олигонуклеотид отделяли от подложки с одновременным снятием защиты с основных и фосфатных групп с использованием 80 мл смеси этанольного аммиака [аммиак:этанол (3:1)] в течение 6,5 часа при 55°С. Флакон быстро охлаждали на льду и затем смесь этанольного аммиака фильтровали в новый 250-мл флакон. CPG промывали с помощью 2 х 40 мл частей смеси этанола/воды (1:1 объем/объем). Объем смеси затем сокращали до ~ 30 мл при помощи роторного испарителя. Затем смесь замораживали на сухом льду и сушили в условиях вакуума на скоростной вакуумной установке.
Снятие защиты II (удаление группы 2'-TBDMS)
Высушенный остаток ресуспендировали в 26 мл триэтиламина, триэтиламинтригидрофторида (TEA"3HF) или смеси пиридина-HF и DMSO (3:4:6) и нагревали при 60°С в течение 90 минут для удаления групп трет-бутилдиметилсилила (TBDMS) в 2'-положении. Затем реакционную смесь гасили 50 мл 20 мМ ацетата натрия и рН корректировали до 6,5. Олигонуклеотид хранили в холодильнике до очистки.
Анализ
Перед очисткой олигонуклеотиды анализировали при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), а выбор буфера и колонки зависел от природы последовательности и/или конъюгированного лиганда.
Очистка при помощи HPLC
Конъюгированные с лигандом олигонуклеотиды очищали при помощи препаративной HPLC с обращенной фазой. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищали при помощи анионообменной HPLC на колонке TSKgel, полученной своими силами. Буферами являются 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ фосфат натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN, 1 М NaBr (буфер В). Фракции, содержащие олигонуклеотиды полной длины, объединяли, обессоливали и лиофилизировали. Приблизительно 0,15 OD обессоленных олигонуклеотидов разбавляли в воде до 150 мкл и затем отмеряли пипеткой в специальные виалы для CGE- и LC/MS-анализа. Затем соединения анализировали при помощи LC-ESMS и CGE.
Получение siRNA
Для общего получения siRNA эквимолярные количества смысловой и антисмысловой нитей нагревали в lxPBS при 95°С в течение 5 минут и медленно охлаждали до комнатной температуры. Целостность дуплекса подтверждали с помощью HPLC-анализа.
Последовательности нуклеиновых кислот представлены ниже с использованием стандартной номенклатуры и, в частности, сокращений таблицы 1.
Abs
бета-Ь-аденозин-Зч-фосфоротиоат
2'-дезокси-2'-фтораденозин-3'-фосфат, 2'-дезокси-2'-фтораденозин-5'-фосфат или 2'-дезокси-2'-фтораденозин
Afs
2'-дезокси-2'-фтораденозин-3'-фосфоротиоат
аденозин-З'-фосфоротиоат
цитидин-3'-фосфат, цитидин-5'-фосфат или цитидин
бета-Ь-цитидин-З'-фосфат или бета-Ь-цитидин
Cbs
бета-Ь-цитидин-З'-фосфоротиоат
2'-дезокси-2' -фторцитидин-3' -фосфат, 2' -дезокси-2'-фторцитидин-5'-фосфат или 2'-дезокси-2'-фторцитидин
Cfs
2' - дезокси-2' -фторцитидин-3' -фосфоротиоат
(Chd)
2'-0-гексадецил-цитидин-3'-фосфат или 2'-0-гексадецил-цитидин
(Chds)
2'-0-гексадецил-цитидин-3'-фосфоротиоат
цитидин-3 '-фосфоротиоат
гуанозин-3'-фосфат, гуанозин-5'-фосфат или гуанозин
бета-Ь-гуанозин-Зч-фосфат, бета-Ь-гуанозин-5ч-фосфат или бета-L-гуанозин
Gbs
бета-Ь-гуанозин-Зч-фосфоротиоат
2'-дезокси-2'-фторгуанозин-3'-фосфат, 2'-дезокси-2'-фторгуанозин-5'-фосфат или 2'-дезокси-2'-фторгуанозин
Gfs
2'-дезокси-2'-фторгуанозин-3'-фосфоротиоат
гуанозин-3' -фосфоротиоат
5'-метилуридин-3'-фосфат, 5'-метилуридин-5'-фосфат или 5'-метилуридин
бета-Ь-тимидин-З'-фосфат, бета-Ь-тимидин-5'-фосфат или бета-L-тимидин
Tbs
бета-Ь-тимидин-З'-фосфоротиоат
2'-дезокси-2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфат, 2'-дезокси-2'-фтор-5-метилуридин-З'-фосфат или 2'-дезокси-2'-фтор-5-метилуридин
Tfs
2'-дезокси-2'-фтор-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
5-метилуридин-З' -фосфоротиоат
уридин-3'-фосфат, уридин-5'-фосфат или уридин
бета-Ь-уридин-Зч-фосфат, бета-Ь-уридин-5ч-фосфат или бета-L-уридин
Ubs
бета-Ь-уридин-Зч-фосфоротиоат
2'-дезокси-2'-фторуридин-3'-фосфат, 2'-дезокси-2'-фторуридин или 2'-дезокси-2'-фторуридин-3'-фосфат
Ufs
2'-дезокси-2'-фторуридин-3 '-фосфоротиоат
(Uhd)
2'-0-гексадецил-уридин-3'-фосфат, 2'-0-гексадецил-уридин-6'-фосфат или 2'-0-гексадецил-уридин
(Uhds)
2'-0-гексадецил-уридин-3'-фосфоротиоат
уридин-3' -фосфоротиоат
любой нуклеотид (G, А, С, Т или U)
2'-0-метиладенозин-3'-фосфат, 2'-0-метиладенозин-5'-фосфат или 2'-0-метиладенозин
2'-0-метиладенозин-3' -фосфоротиоат
2'-0-метилцитидин-3'-фосфат, 2'-О-метилцитидин-5'-фосфат или 2'-0-метилцитидин
2'-0-метилцитидин-3'-фосфоротиоат
2'-0-метилгуанозин-3'-фосфат, 2'-0-метилгуанозин-5'-фосфат или 2'-0-метилгуанозин
2'-0-метилгуанозин-3' -фосфоротиоат
2'-0-метил-5-метилуридин-3'-фосфат, 2'-0-метил-5-метилуридин-5'-фосфат или 2'-0-метил-5-метилуридин
2'-0-метил-5-метилуридин-3'-фосфоротиоат
2'-0-метилуридин-3'-фосфат, 2'-0-метилуридин-5'-фосфат или 2'-0-метилуридин
2'-0-метилуридин-3' -фосфоротиоат
2ч-дезоксиаденозин-Зч-фосфат, X -дезоксиаденозин-5ч-фосфат или X-дезоксиаденозин
dAs
2ч-дезоксиаденозин-Зч-фосфоротиоат
2ч-дезоксицитидин-Зч-фосфат, 2,-дезоксицитидин-5ч-фосфат или 2"-дезоксицитидин
dCs
2ч-дезоксицитидин-Зч-фосфоротиоат
2ч-дезоксигуанозин-Зч-фосфат, X -дезоксигуанозин-5ч-фосфат или X-дезоксигуанозин
dGs
2ч-дезоксигуанозин-Зч-фосфоротиоат или X-дезоксигуанозин
2'-дезокситимидин-3'-фосфат, 2'-дезокситимидин-5'-фосфат или 2'-дезокситимидин
dTs
2ч-дезокситимидин-Зч-фосфоротиоат
2ч-дезоксиуридин-Зч-фосфат, 2,-дезоксиуридин-5ч-фосфат или X - дезоксиуридин
фосфоротиоатная связь
L961
К-[трис(ОаШАс-алкил)-амидодеканоил)]-4-гидроксипролинол-Нур-(ОаШАс-алкил)3
Пример 2. Конструирование и синтез siRNA ALAS1
Экспериментальные способы Биоинформатика
Транскрипты
Конструирование siRNA выполняли для выявления siRNA, нацеливающихся на транскрипты ALAS1 человека, макака-резуса (Масаса mulatto), мыши и крысы, аннотированные в базе данных генов NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/). При конструировании использовали следующие транскрипты из коллекции эталонных последовательностей в NCBI: человек - NM_000688.4 (см. ФИГ. 3), NM_199166.1; макак-резус - ХМ_001090440.2, ХМ_001090675.2; мышь - NM_020559.2; крыса - NM_024484.2. Вследствие высокого расхождения последовательностей примат/грызун дуплексы siRNA конструировали в нескольких отдельных партиях, в том числе без ограничения партиях, содержащих дуплексы, соответствующие только транскриптам человека и макака-резуса; только транскриптам человека, макака-резуса, мыши и крысы и только транскриптам мыши и крысы. Большинство дуплексов siRNA конструировали так, чтобы они были на 100% идентичны приведенному транскрипту человека и транскриптам других видов, рассмотренным в каждой партии конструирования (выше). В некоторых случаях (см. таблицу 8) ошибочные спаривания между дуплексом и целевой mRNA допускались в первом антисмысловом (последнем смысловом) положении, в тех случаях если комплементарной парой оснований антисмысловой нити щелевой mRNA была пара GC или CG. В этих случаях дуплексы конструировали с парами UA или AU в качестве первой
антисмысловой:последней смысловой пары. Таким образом, дуплексы сохраняли комплементарность, но являлись несовпадающими по отношению к мишени (U:C, U:G, А:С или A:G). Восемнадцать из этих дуплексов с "UA-заменами" конструировали как часть набора человек/макак-резус/мышь/крыса (см. дуплексы в таблице 8 с пометками "C19U", "G19U", "С 19А" или "G19A" в столбце положения).
Прогнозирование конструирования, специфичности и эффективности siRNA Прогнозируемую специфичность всех возможных олигомеров из 19 нуклеотидов прогнозировали исходя из каждой последовательности. Затем выбирали кандидатные олигомеры из 19 нуклеотидов, у которых отсутствовали повторы длиннее 7 нуклеотидов. Эти siRNA, 1510 кандидатных человека/макака-резуса, 114 человека/макака-резуса/мыши/крысы и 717 мыши/крысы, использовали при обширных поисках в отношении соответствующих транскриптом (определенные как набор из записей NM_ и ХМ_ в пределах наборов эталонных последовательностей человека, макака-резуса, собаки, мыши или крысы в NCBI) с применением исчерпывающего алгоритма "грубой силы", включенного в скрипт питон 'BruteForce.py'. Скрипт затем разбирал выравнивания транскрипт-олигомер с получением балла, основанного на положении и количестве ошибочных спариваний между siRNA и любым потенциальным 'нецелевым' транскриптом. "Нецелевой" балл взвешивали для усиления различий в 'затравочном' участке siRNA в положениях 2-9 с 5'-конца молекулы. Каждой паре олигомер-транскрипт из поиска "грубой силы" присваивали балл для ошибочного спаривания путем суммирования отдельных баллов для ошибочного спаривания; ошибочные спаривания в положениях 2-9 определяли как 2,8, ошибочные спаривания в положениях сайта расщепления 10-11 определяли как 1,2 и ошибочные спаривания в участке 12-19 определяли как 1,0. Дополнительное нецелевое прогнозирование выполняли путем сравнения встречаемости гептамеров и октамеров, полученных из 3 отличных полученных из затравки гексамеров каждого олигомера. Гексамеры из положений 2-7 по отношению к 5'-началу использовали для создания 2 гептамеров и одного октамера. ТептамерГ создавали путем добавления А на 3'-конец гексамера; гептамер2 создавали путем добавления А на 5'-конец гексамера; октамер создавали путем добавления А как на 5'-конец, так и на 3' -конец гексамера. Заранее вычисляли встречаемость октамеров и гептамеров в 3'UTRome человека, макака-резуса, мыши или крысы (определенные как
подпоследовательности транскриптом из базы данных эталонных последовательностей в NCBI, где конец кодирующего участка, 'CDS', является четко определенным). Встречаемость октамеров нормализовали по отношению к встречаемости гептамеров с использованием медианного значения из диапазона встречаемостей октамеров. Затем вычисляли 'mirSeedScore' путем вычисления суммы ( (3 X нормализованное подсчитанное число для октамеров ) + ( 2 X подсчитанное число для гептамера2) + (1 X подсчитанное число для гептамера1)).
Обоим нитям siRNA присваивали категорию специфичности согласно рассчитанным баллам: балл выше 3 оценивали как высоко специфичная, равный 3 как специфичная и от 2,2 до 2,8 оценивали как умеренно специфичная. Упорядочивание проводили по специфичности антисмысловой нити. Затем отбирали дуплексы, у антисмысловых олигонуклеотидов которых отсутствовала GC в первом положении, отсутствовал G в обоих положениях 13 и 14 и присутствовали 3 или более Us или As в затравочном участке (характеристики дуплексов с высокой прогнозированной эффективностью).
Кандидатные коньюгированные с GalNAc дуплексы, 21 и 23 нуклеотида в длину для смысловой и антисмысловой нитей соответственно, конструировали путем удлинения антисмысловых олигомеров из 19 нуклеотидов 4 дополнительными нуклеотидами в 3'-направлении (сохраняя полную комплиментарность с целевым транскриптом). Смысловую нить описывали как обратную комплементарную последовательность первых 21 нуклеотида антисмыслового олигомера из 23 нуклеотидов. Выбирали такие дуплексы, которые сохраняли полные соответствия ко всем выбранным транскриптам видов на протяжении всех 23 нуклеотидов.
Отбор последовательностей siRNA
Синтезировали олигонуклеотиды siRNA из 19 нуклеотидов, являющиеся дуплексами человека/макака-резуса, полученными в общей сложности из 90 смысловых и 90 антисмысловых, человека/макака-резуса/мыши/крысы полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и мыши/крысы, полученными в общей сложности из 40 смысловых и 40 антисмысловых, и составляли в дуплексы. Синтезировали олигонуклеотиды из 21/23 нуклеотидов, являющиеся дуплексами
человека/макака-резус, полученными в общей сложности из 45 смысловых и 45 антисмысловых, с получением 45 конъюгированных с GalNAc дуплексов.
Последовательности смысловой и антисмысловой нитей модифицированных дуплексов показаны в таблице 2, а последовательности смысловой и антисмысловой нитей немодифицированных дуплексов показаны в таблице 3.
Синтез последовательностей ALAS1
Последовательности ALAS1 синтезировали на синтезаторе MerMade 192 с масштабом либо 1, либо 0,2 мкмоль. Одиночные нити получали с модификациями 2'0-метила для in vitro скрининга с использованием реагентов для трансфекции. 3'-Конъюгаты GalNAc получали с последовательностями, содержащими модификации 2'F и 2'-0-метила смысловой нити в конструкциях из 21-23 нуклеотидов для свободного захвата в клетках. Для всех последовательностей в перечне из 21 нуклеотида использовали химию 'endolight', подробно описанную ниже.
• Все пиримидины (цитозин и уридин) в смысловой нити содержали 2'-0-метиловые основания (2'-0-метил-С и 2'-0-метил-и).
• В антисмысловой нити пиримидины, расположенные рядом с (по направлению к 5'-положению) рибунуклеозидом А, замещали их соответствующими 2-0-метил-нуклеозидами.
• Вводили удлинение из двух оснований dTsdT на З'-конце как смысловой, так и антисмысловой последовательностей.
• Файл последовательности конвертировали в текстовый файл, чтобы сделать его совместимым для загрузки в компьютерную программу синтеза MerMade 192.
Для конъюгированных с GalNAc смысловых нитей и комплементарных антисмысловых последовательностей 2'F и другие модифицированные нуклеозиды вводили в комбинации с 2'0-метилрибонуклеозидами. Синтез осуществляли на модифицированной GalNAc CPG-подложке для смысловой нити, а для антисмысловой последовательности на CPG, модифицированной универсальной подложке.
Синтез, расщепление и снятие защиты
В синтезе последовательностей ALAS1 применяли синтез нуклеотидов на твердой подложке с использованием химии фосфорамидитов. Для последовательностей, отвечающих химии "endolight", из 21 нуклеотида в качестве твердой подложки использовали дезокситимидин-CPG, в то время как для конъюгатов GalNAc для смысловой нити использовали твердую подложку GalNAc, а для антисмысловой нити -универсальную CPG.
Синтез упомянутых выше последовательностей выполняли с масштабом либо 1, либо 0,2 мкм в 96-луночных планшетах. Растворы амидитов получали при концентрации 0,1 М, а этилтиотетразол (0,6 М в ацетонитриле) использовали в качестве активатора.
Синтезированные последовательности расщепляли и снимали защиту в 96-луночных планшетах, используя метиламин на первой стадии и фторидный реагент на второй стадии. Для последовательностей, содержащих GalNAc и 2Т-нуклеозид, условия снятия защиты модифицировали. После расщепления и снятия защиты последовательности осаждали с использованием смеси ацетон:этанол (80:20) и осадок ресуспендировали в 0,2 М натрий-ацетатном буфере. Образцы из каждой последовательности анализировали при помощи LC-MS для подтверждения идентичности, УФ - для количественного определения, а выбранный набор образцов анализировали при помощи ГЕХ-хроматографии для определения чистоты.
Очистка и обессоливание
Последовательности ALAS 1 осаждали и очищали на системе очистки АКТА с использованием колонки с Sephadex. ALAS1 исследовали при температуре окружающей среды. Введение и сбор образца выполняли в 96-луночных (лунка с глубиной 1,8 мл) планшетах. В элюенте собирали один пик, соответствующий последовательности полной длины. Обессоленные последовательности ALAS 1 анализировали в отношении концентрации (УФ-измерением при А260) и чистоты (ионообменной хроматографией HPLC). Комплементарные одиночные нити затем объединяли в стехиометрическом соотношении 1:1с образованием дуплексов siRNA.
1185-1203
AD-55108.2
uuucuGGAAcuAGuAAAuudTsd T
AAU U uACuAG U UCcAGAAAdTsd T
1188-1206
AD-55113.2
cuGGAAcuAG uAAAu uccAdTsd T
UGGAAUUuACuAGUUCcAGdTs dT
1325-1343
AD-55075.2
uGuGAGAuuuAcucuGAuudTsd T
AAUcAGAGuAAAUCUcAcAdTsd T
1364-1382
AD-55081.2
AuccAAGGGAuucGAAAcAdTsd T
UGUUUCGAAUCCCUUGGAUdTs dT
1382-1400
AD-55087.2
AGccGAGuGccAAAGuAcAdTsd T
UGuACUUUGGcACUCGGCUdTs dT
1478-1496
AD-55093.2
uuuGAAAcuGuccAuucAAdTsd T
UUGAAUGGAcAGUUUcAAAdTs dT
1531-1549
AD-55099.2
uGAuGuGGcccAuGAGuuudTsd T
AAACUcAUGGGCcAcAUcAdTsd T
1631-1649
AD-53573.3
G u cAu G ccAAAAAuG G AcAdTsd T
UGUCcAUUUUUGGcAUGACdTs dT
1637-1655
AD-55109.2
ccAAAAAuGGAcAucAuuudTsd T
AAAUGAUGUCcAUUUUUGGdTs dT
1706-1724
AD-55114.2
AcGAGuucucuGAuuGAcAdTsd T
UGUcAAUcAGAGAACUCGUdTs dT
1962-1980
AD-55076.2
AAGucuGuGAuGAAcuAAudTsd T
AUuAGUUcAUcAcAGACUUdTsd T
1967-1985
AD-55082.2
uGuGAuGAAcuAAuGAGcAdTs dT
UGCUcAUuAGUUcAUcAcAdTsd T
1977-1995
AD-55088.2
uAAuGAGcAGAcAuAAcAudTsd T
AUGUuAUGUCUGCUcAUuAdTs dT
2189-2207
AD-55094.2
uuuGAAGuGAuGAGuGAAAdTs dT
UUUcACUcAUcACUUcAAAdTsd T
2227-2245
AD-55100.2
AGGcuuGAGcAAGuuGGuAdTs dT
uACcAACUUGCUcAAGCCUdTsd T
2313-2331
AD-55105.2
ucuucAGAGuuGucuuuAudTsd T
AuAAAGAcAACUCUGAAGAdTsd T
2317-2335
AD-55110.2
cAGAGuuGucuuuAuAuGudTsd T
AcAuAuAAAGAcAACUCUGdTsd T
2319-2337
AD-55115.2
GAGuuGucuuuAuAuGuGAdTs dT
UcAcAuAuAAAGAcAACUCdTsdT
2320-2338
AD-55077.2
AGuuGucuuuAuAuGuGAAdTsd T
UUcAcAuAuAAAGAcAACUdTsd T
2344-2362
AD-55083.2
uuAuAuuAAAuuuuAAucudTsd T
AGAU uAAAAU U uAAuAuAAdTsd T
2352-2370
AD-55089.2
AAuuuuAAucuAuAGuAAAdTsd T
UUuACuAuAGAUuAAAAUUdTs dT
2353-2371
AD-55095.2
AuuuuAAucuAuAGuAAAAdTsd T
U U U uACuAuAGAU uAAAAUdTs dT
2376-2394
AD-55101.2
AGuccuGGAAAuAAAuucudTsd T
AGAAUUuAUUUCcAGGACUdTs dT
358-376
AD-53511.1
cuGcccAuucuuAucccGAdTsdT
UCGGGAuAAGAAUGGGcAGdTs dT
789-807
AD-53512.1
ccAGuGuGGuuAGuGuGAAdTs dT
UUcAcACuAACcAcACUGGdTsdT
1076-1094
AD-53513.1
GucuGGuGcAGuAAuGAcudTsd T
AGUcAUuACUGcACcAGACdTsd T
1253-1271
AD-53514.1
GcAcucuuGuuuuccucGudTsdT
ACGAGGAAAAcAAGAGUGCdTs dT
1544-1562
AD-53515.1
GAGuuuGGAGcAAucAccudTsd T
AGGUGAUUGCUCcAAACUCdTs dT
2228-2246
AD-53516.1
GGcuuGAGcAAGuuGGuAudTs dT
AuACcAACUUGCUcAAGCCdTsd T
100
101
404-422
AD-53517.1
GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T
AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T
102
103
404-422
AD-53517.1
GGcAAAucucuGuuGuucudTsd T
AGAAcAAcAGAGAUUUGCCdTsd T
104
105
866-884
AD-53518.1
cAAAGAccAGAAAGAGuGudTs dT
AcACUCUUUCUGGUCUUUGdTs dT
106
107
1080-1098
AD-53519.1
GGuGcAGuAAuGAcuAccudTsd T
AGGuAGUcAUuACUGcACCdTsd T
108
109
1258-1276
AD-53520.1
cuuGuuuuccucGuGcuuudTsdT
AAAGcACGAGGAAAAcAAGdTsd T
110
111
1616-1634
AD-53521.1
GGGGAucGGGAuGGAGucAdTs dT
UGACUCcAUCCCGAUCCCCdTsd T
112
113
2230-2248
AD-53522.1
cuuGAGcAAGuuGGuAucudTsd T
AGAuACcAACUUGCUcAAGdTsd T
114
115
436-454
AD-53523.1
ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T
AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT
116
117
436-454
AD-53523.1
ccccAAGAuGAuGGAAGuudTsd T
AACUUCcAUcAUCUUGGGGdTs dT
118
119
885-903
AD-53524.1
cucAucuucuucAAGAuAAdTsdT
UuAUCUUGAAGAAGAUGAGdTs dT
120
121
1127-1145
AD-53525.1
GGGGcAGuuAuGGAcAcuudTs dT
AAGUGUCcAuAACUGCCCCdTsd T
122
123
1315-1333
AD-53526.1
GAuGccAGGcuGuGAGAuudTs dT
AAUCUcAcAGCCUGGcAUCdTsd T
124
125
1870-1888
AD-53527.1
GAGAcAGAuGcuAAuGGAudTs dT
AUCcAUuAGcAUCUGUCUCdTsd T
126
127
2286-2304
AD-53528.1
ccccAGGccAuuAucAuAudTsdT
AuAUGAuAAUGGCCUGGGGdTs dT
128
129
489-507
AD-53529.1
cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT
UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT
130
131
489-507
AD-53529.1
cAGcAGuAcAcuAccAAcAdTsdT
UGUUGGuAGUGuACUGCUGdTs dT
132
133
915-933
AD-53530.1
cuGuuuccAcuuuucAGuAdTsdT
uACUGAAAAGUGGAAAcAGdTs dT
134
135
1138-1156
AD-53531.1
GGAcAcuuuGAAAcAAcAudTsd T
AUGUUGUUUcAAAGUGUCCdTs dT
136
137
1324-1342
AD-53532.1
cuGuGAGAuuuAcucuGAudTsd T
AUcAGAGuAAAUCUcAcAGdTsd T
138
139
1927-1945
AD-53533.1
cccuGuGcGGGuuGcAGAudTsd T
AUCUGcAACCCGcAcAGGGdTsd T
140
141
2312-2330
AD-53534.1
GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T
uAAAGAcAACUCUGAAGACdTsd T
142
143
646-664
AD-53535.1
cAcuGcAAGcAAAuGcccudTsdT
AGGGcAUUUGCUUGcAGUGdTs dT
144
145
922-940
AD-53536.1
cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T
ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT
146
147
1163-1181
AD-53537.1
GGGGcAGGuGGuAcuAGAAdTs dT
UUCuAGuACcACCUGCCCCdTsd T
148
149
1347-1365
AD-53538.1
GGAAccAuGccuccAuGAudTsdT
AUcAUGGAGGcAUGGUUCCdTs dT
150
151
1964-1982
AD-53539.1
GucuGuGAuGAAcuAAuGAdTs dT
UcAUuAGUUcAUcAcAGACdTsd T
152
153
2321-2339
AD-53540.1
GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T
AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsdT
SEQID N0:
(смыто -вая)
SEQIDNO: (антисмысловая )
Положение на транскрипте NM_ 000688.4
Название дуплекса
Смысловая
последовательность (5'-3')
Антисмысловая последовательность (5'-3')
192
193
522-540
AD-55078.2
CUCCGGCCAGUGAGAAAGA
UCUUUCUCACUGGCCGGAG
194
195
669-687
AD-55084.2
UGGCAGCACAGAUGAAUCA
UGAUUCAUCUGUGCUGCCA
196
197
790-808
AD-55090.2
CAGUGUGGUUAGUGUGAAA
UUUCACACUAACCACACUG
198
199
853-871
AD-55096.2
CAUCAUGCAAAAGCAAAGA
UCUUUGCUUUUGCAUGAU G
200
201
876-894
AD-55102.2
AAAGAGUGUCUCAUCUUCU
AGAAGAU GAGACACUCU U U
202
203
877-895
AD-55106.2
AAGAGUGUCUCAUCUUCUU
AAGAAGAUGAGACACUCUU
204
205
914-932
AD-55111.2
UCUGUUUCCACUUUUCAGU
ACUGAAAAGUGGAAACAGA
206
207
923-941
AD-55073.2
ACUUUUCAGUAUGAUCGUU
AACGAUCAUACUGAAAAGU
208
209
926-944
AD-55079.2
UUUCAGUAUGAUCGUUUCU
AGAAACGAUCAUACUGAAA
210
211
927-945
AD-55085.2
UUCAGUAUGAUCGUUUCUU
AAGAAACGAUCAUACUGAA
212
213
928-946
AD-55091.2
UCAGUAUGAUCGUUUCUUU
AAAGAAACGAUCAUACUGA
214
215
932-950
AD-55097.2
UAUGAUCGUUUCUUUGAGA
UCUCAAAGAAACGAUCAUA
216
217
973-991
AD-55103.2
UGACCACACCUAUCGAGUU
AACUCGAUAGGUGUGGUCA
218
219
975-993
AD-55107.2
ACCACACCUAUCGAGUUUU
AAAACUCGAUAGGUGUGGU
220
221
1029-1047
AD-55112.2
UGGCAGAUGACUAUUCAGA
UCUGAAUAGUCAUCUGCCA
222
223
1077-1095
AD-55074.2
UCUGGUGCAGUAAUGACUA
UAGUCAUUACUGCACCAGA
224
225
1124-1142
AD-55080.2
UGUGGGGCAGUUAUGGACA
UGUCCAUAACUGCCCCACA
226
227
1137-1155
AD-55086.2
UGGACACUUUGAAACAACA
UGUUGUUUCAAAGUGUCCA
228
229
1182-1200
AD-55098.2
AUAUUUCUGGAACUAGUAA
UUACUAGUUCCAGAAAUAU
230
231
1184-1202
AD-55104.2
AUUUCUGGAACUAGUAAAU
AUUUACUAGUUCCAGAAAU
232
233
1185-1203
AD-55108.2
UUUCUGGAACUAGUAAAUU
AAUUUACUAGUUCCAGAAA
234
235
1188-1206
AD-55113.2
CUGGAACUAGUAAAUUCCA
UGGAAUUUACUAGUUCCAG
236
237
1325-1343
AD-55075.2
UGUGAGAUUUACUCUGAUU
AAUCAGAGUAAAUCUCACA
238
239
1364-1382
AD-55081.2
AUCCAAGGGAUUCGAAACA
UGUUUCGAAUCCCUUGGAU
240
241
1382-1400
AD-55087.2
AGCCGAGUGCCAAAGUACA
UGUACUUUGGCACUCGGCU
242
243
1478-1496
AD-55093.2
UUUGAAACUGUCCAUUCAA
UUGAAUGGACAGUUUCAAA
244
245
1531-1549
AD-55099.2
UGAUGUGGCCCAUGAGUUU
AAACUCAUGGGCCACAUCA
246
247
1631-1649
AD-53573.3
GUCAUGCCAAAAAUGGACA
UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
248
249
1637-1655
AD-55109.2
CCAAAAAUGGACAUCAUUU
AAAUGAUGUCCAUUUUUGG
250
251
1706-1724
AD-55114.2
ACGAGUUCUCUGAUUGACA
UGUCAAUCAGAGAACUCGU
252
253
1962-1980
AD-55076.2
AAGUCUGUGAUGAACUAAU
AUUAGUUCAUCACAGACUU
254
255
1967-1985
AD-55082.2
UGUGAUGAACUAAUGAGCA
UGCUCAUUAGUUCAUCACA
256
257
1977-1995
AD-55088.2
UAAUGAGCAGACAUAACAU
AUGUUAUGUCUGCUCAUUA
258
259
2189-2207
AD-55094.2
UUUGAAGUGAUGAGUGAAA
UUUCACUCAUCACUUCAAA
260
261
2227-2245
AD-55100.2
AGGCUUGAGCAAGUUGGUA
UACCAACUUGCUCAAGCCU
262
263
2313-2331
AD-55105.2
UCUUCAGAGUUGUCUUUAU
AUAAAGACAACUCUGAAGA
264
265
2317-2335
AD-55110.2
CAGAGUUGUCUUUAUAUGU
ACAUAUAAAGACAACUCUG
266
267
2319-2337
AD-55115.2
GAGUUGUCUUUAUAUGUG A
UCACAUAUAAAGACAACUC
268
269
2320-2338
AD-55077.2
AGUUGUCUUUAUAUGUGA A
UUCACAUAUAAAGACAACU
270
271
2344-2362
AD-55083.2
UUAUAUUAAAUUUUAAUCU
AGAUUAAAAUUUAAUAUAA
272
273
2352-2370
AD-55089.2
AAUUUUAAUCUAUAGUAAA
UUUACUAUAGAUUAAAAUU
274
275
2353-2371
AD-55095.2
AUUUUAAUCUAUAGUAAAA
UUUUACUAUAGAUUAAAAU
276
277
2376-2394
AD-55101.2
AGUCCUGGAAAUAAAUUCU
AGAAUUUAUUUCCAGGACU
278
279
358-376
AD-53511.1
CUGCCCAUUCUUAUCCCGA
UCGGGAUAAGAAUGGGCAG
280
281
789-807
AD-53512.1
CCAGUGUGGUUAGUGUGAA
UUCACACUAACCACACUGG
282
283
1076-1094
AD-53513.1
GUCUGGUGCAGUAAUGACU
AGUCAUUACUGCACCAGAC
284
285
1253-1271
AD-53514.1
GCACUCUUGUUUUCCUCGU
ACGAGGAAAACAAGAGUGC
286
287
1544-1562
AD-53515.1
GAGUUUGGAGCAAUCACCU
AGGUGAUUGCUCCAAACUC
288
289
2228-2246
AD-53516.1
GGCUUGAGCAAGUUGGUAU
AUACCAACUUGCUCAAGCC
290
291
404-422
AD-53517.1
GGCAAAUCUCUGUUGUUCU
AGAACAACAGAGAUUUGCC
292
293
404-422
AD-53517.1
GGCAAAUCUCUGUUGUUCU
AGAACAACAGAGAUUUGCC
294
295
866-884
AD-53518.1
CAAAGACCAGAAAGAGUGU
ACACUCUUUCUGGUCUUUG
296
297
1080-1098
AD-53519.1
GGUGCAGUAAUGACUACCU
AGGUAGUCAUUACUGCACC
298
299
1258-1276
AD-53520.1
CUUGUUUUCCUCGUGCUUU
AAAGCACGAGGAAAACAAG
300
301
1616-1634
AD-53521.1
GGGGAUCGGGAUGGAGUCA
UGACUCCAUCCCGAUCCCC
302
303
2230-2248
AD-53522.1
CUUGAGCAAGUUGGUAUCU
AGAUACCAACUUGCUCAAG
304
305
436-454
AD-53523.1
CCCCAAGAUGAUGGAAGUU
AACUUCCAUCAUCUUGGGG
306
307
436-454
AD-53523.1
CCCCAAGAUGAUGGAAGUU
AACUUCCAUCAUCUUGGGG
308
309
885-903
AD-53524.1
CUCAUCUUCUUCAAGAUAA
UUAUCUUGAAGAAGAUGAG
310
311
1127-1145
AD-53525.1
GGGGCAGUUAUGGACACUU
AAGUGUCCAUAACUGCCCC
312
313
1315-1333
AD-53526.1
GAUGCCAGGCUGUGAGAUU
AAUCUCACAGCCUGGCAUC
314
315
1870-1888
AD-53527.1
GAGACAGAUGCUAAUGGAU
AUCCAUUAGCAUCUGUCUC
316
317
2286-2304
AD-53528.1
CCCCAGGCCAUUAUCAUAU
AUAUGAUAAUGGCCUGGGG
318
319
489-507
AD-53529.1
CAGCAGUACACUACCAACA
UGUUGGUAGUGUACUGCU G
320
321
489-507
AD-53529.1
CAGCAGUACACUACCAACA
UGUUGGUAGUGUACUGCU G
322
323
915-933
AD-53530.1
CUGUUUCCACUUUUCAGUA
UACUGAAAAGUGGAAACAG
324
325
1138-1156
AD-53531.1
GG ACACU U UG AAACAACAU
AUGUUGUUUCAAAGUGUCC
326
327
1324-1342
AD-53532.1
CUGUGAGAUUUACUCUGAU
AUCAGAGUAAAUCUCACAG
328
329
1927-1945
AD-53533.1
CCCUGUGCGGGUUGCAGAU
AU CU G CAACCCG CACAG G G
330
331
2312-2330
AD-53534.1
GUCUUCAGAGUUGUCUUUA
UAAAGACAACUCUGAAGAC
332
333
646-664
AD-53535.1
CACUGCAAGCAAAUGCCCU
AGGGCAUUUGCUUGCAGUG
334
335
922-940
AD-53536.1
CACUUUUCAGUAUGAUCGU
ACGAUCAUACUGAAAAGUG
336
337
1163-1181
AD-53537.1
GGGGCAGGUGGUACUAGAA
UUCUAGUACCACCUGCCCC
338
339
1347-1365
AD-53538.1
GGAACCAUGCCUCCAUGAU
AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
340
341
1964-1982
AD-53539.1
GUCUGUGAUGAACUAAUGA
UCAUUAGUUCAUCACAGAC
342
343
2321-2339
AD-53540.1
GUUGUCUUUAUAUGUGAA U
AUUCACAUAUAAAGACAAC
344
345
671-689
AD-53541.1
GCAGCACAGAUGAAUCAGA
UCUGAUUCAUCUGUGCUGC
346
347
924-942
AD-53542.1
CUUUUCAGUAUGAUCGUUU
AAACGAUCAUACUGAAAAG
348
349
1164-1182
AD-53543.1
GGGCAGGUGGUACUAGAAA
UUUCUAGUACCACCUGCCC
350
351
1460-1478
AD-53544.1
GUCCCCAAGAUUGUGGCAU
AUGCCACAAUCUUGGGGAC
352
353
1976-1994
AD-53545.1
CUAAUGAGCAGACAUAACA
UGUUAUGUCUGCUCAUUAG
354
355
786-804
AD-53546.1
GCCCCAGUGUGGUUAGUGU
ACACUAACCACACUGGGGC
356
357
935-953
AD-53547.1
GAUCGUUUCUUUGAGAAAA
UUUUCUCAAAGAAACGAUC
358
359
1165-1183
AD-53548.1
GGCAGGUGGUACUAGAAAU
AUUUCUAGUACCACCUGCC
360
361
1530-1548
AD-53549.1
GUGAUGUGGCCCAUGAGUU
AACUCAUGGGCCACAUCAC
362
363
2003-2021
AD-53550.1
CAAGCAAUCAAUUACCCUA
UAGGGUAAUUGAUUGCUU G
364
365
788-806
AD-53551.1
CCCAGUGUGGUUAGUGUGA
UCACACUAACCACACUGGG
366
367
974-992
AD-53552.1
GACCACACCU AUCG AG U U U
AAACUCGAUAGGUGUGGUC
368
369
1191-1209
AD-53553.1
GAACUAGUAAAUUCCAUGU
ACAUGGAAUUUACUAGUUC
370
371
1541-1559
AD-53554.1
CAUGAGUUUGGAGCAAUCA
UGAUUGCUCCAAACUCAUG
372
373
2075-2093
AD-53555.1
CCCCAGAUGAUGAACUACU
AGUAGUUCAUCAUCUGGGG
374
375
360-378
AD-53561.1
GCCCAUUCUUAUCCCGAGU
ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
376
377
1356-1374
AD-53567.1
CCUCCAUGAUCCAAGGGAU
AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
378
379
1631-1649
AD-53573.1
GUCAUGCCAAAAAUGGACA
UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
380
381
1634-1652
AD-53579.1
AUGCCAAAAAUGGACAUCA
UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
Пример 3. In vitro скрининг дуплексов siRNA ALAS1 в отношении нокдауна активности ALAS1.
Дуплексы siRNA ALAS 1 подвергали скринингу в отношении способности снижать экспрессию ALAS1 in vitro.
In vitro скрининг
Клеточная культура и трансфекции
Клетки НерЗВ (АТСС, Манассас, Вирджиния) выращивали практически до слияния при 37°С в атмосфере 5% СО2 в MEM (АТСС), дополненной 10% FBS, до отделения от чашки Петри путем обработки трипсином. Трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл дуплексов siRNA на лунку в 96-луночном планшете и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. 80 мкл полных питательных сред, содержащих ~2 х104 клеток НерЗВ, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение либо 24 часов либо 120 часов перед очисткой РНК. Эксперименты с использованием разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 10 нМ и 0,1 нМ, а эксперименты в отношении зависимости эффекта от дозы
выполняли при конечной концентрации дуплекса 10, 1,67, 0,27, 0,046, 0,0077, 0,0013, 0,00021, 0,00004 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора "DYNABEADS mRNA Isolation Kit" (Invitrogen, № по кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем смешивали в течение 5 минут при 850 об./мин. с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость смешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и смешивали в течение 1 минуты. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и смешивали в течение 5 минут. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и смешивали в течение 1 минуты. Гранулы опять фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулам давали возможность высохнуть в течение 2 минут. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 минут при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 минут. Удаляли 40 мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора "ABI High capacity cDNA reverse transcription kit" (Applied Biosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № по кат. 4368813)
Мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл НгО на реакцию добавляли в 10 мкл общей РНК. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин., 37°С 120 мин., 85°С 5 с, хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени
2 мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 0,5 мкл зонда TaqMan для GAPDH (Applied Biosystems, № по кат. 4326317Е), 0,5 мкл зонда TaqMan для ALAS1 (Applied Biosystems, № по кат. Hs00167441_ml) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночные планшеты (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе "Roche LC480 Real Time PCR system" (Roche) с применением ДДО;^0)-анализа. Каждый дуплекс исследовали при двух независимых трансфекциях с двумя биологическими повторами каждый и каждую трансфекцию оценивали в двух параллельных испытаниях, если не указано иное в итоговых таблицах.
Для вычисления относительного кратного изменения данные в реальном времени анализировали с применением AACt-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 вычисляли с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, или наивных клеток в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
In vitro нокдаун эндогенной экспрессии ALAS1 дуплексами siRNA ALAS1
В таблице 4 показан нокдаун ALAS1 в клетках НерЗВ с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. таблицу 2). Сайленсинг выражали в виде доли оставшегося транскрипта РНК относительно отрицательного контроля (с люциферазой) siRNA AD-1955. Данные получали, как описано выше, после трансфекции 10 нМ или 0,1 нМ каждой siRNA. qPCR проводили с использованием зонда TaqMan ALAS1 Hs00167441_ml.
средн.
средн.
AD-55078.2
0,7
0,87
0,001
0,089
AD-55084.2
0,08
0,3
0,04
AD-55090.2
0,06
0,08
0,002
0,003
AD-55096.2
0,61
0,92
0,171
0,34
AD-55102.2
0,63
0,62
0,005
0,069
AD-55106.2
0,07
0,08
0,004
0,027
AD-55111.2
0,06
0,23
0,013
0,062
AD-55073.2
0,21
0,4
0,018
0,061
AD-55079.2
0,17
0,43
0,033
0,089
AD-55085.2
0,13
0,21
0,011
0,019
AD-55091.2
0,27
0,55
0,033
0,009
AD-55097.2
0,31
0,38
0,051
0,059
AD-55103.2
0,05
0,11
0,017
0,006
AD-55107.2
0,12
0,24
0,007
0,008
AD-55112.2
0,15
0,2
0,036
0,025
AD-55074.2
0,16
0,45
0,008
0,002
AD-55080.2
0,79
0,99
0,095
0,304
AD-55086.2
0,09
0,22
0,005
0,035
AD-55098.2
0,25
0,51
0,03
0,07
AD-55104.2
0,06
0,017
0,001
AD-55108.2
0,47
0,65
0,03
0,015
AD-55113.2
0,38
0,62
0,068
0,039
AD-55075.2
0,12
0,28
0,007
0,051
AD-55081.2
0,21
0,51
0,036
0,066
AD-55087.2
0,19
0,017
0,02
AD-55093.2
0,24
0,56
0,029
0,053
AD-55099.2
0,05
0,18
0,001
0,038
AD-53573.3
0,67
1,07
0,16
0,153
AD-55109.2
0,07
0,23
0,006
0,052
AD-55114.2
0,08
0,16
0,004
0,017
AD-55076.2
0,05
0,14
0,007
0,035
AD-55082.2
0,08
0,3
0,019
0,016
AD-55088.2
0,06
0,12
0,008
0,02
AD-55094.2
0,06
0,18
0,005
0,023
AD-55100.2
0,45
0,83
0,02
0,05
AD-55105.2
0,02
0,05
0,005
0,004
AD-55110.2
0,15
0,19
0,031
0,016
AD-55115.2
0,35
0,58
0,045
0,052
AD-55077.2
0,14
0,14
0,006
0,019
AD-55083.2
0,56
0,98
0,24
0,188
AD-55089.2
0,62
0,79
0,036
0,094
AD-55095.2
0,59
0,92
0,12
0,079
AD-55101.2
0,71
0,97
0,074
0,097
AD-1955
1,00
1,01
0,03
0,04
AD-53511.1
0,84
1,08
0,028
0,0515
AD-53512.1
0,15
0,65
0,062
0,023
AD-53513.1
0,34
0,86
0,055
0,011
AD-53514.1
0,12
0,61
0,003
0,008
AD-53515.1
0,25
0,66
0,005
0,004
AD-53516.1
1,05
1,02
0,032
0,011
AD-53517.1
0,145
0,725
0,025
0,0155
AD-53518.1
0,72
0,85
0,045
0,028
AD-53519.1
0,18
0,66
0,061
0,004
AD-53520.1
0,18
0,9
0,041
0,001
AD-53521.1
0,97
1,07
0,01
0,003
AD-53522.1
0,87
1,1
0,065
0,112
AD-53523.1
0,48
0,96
0,0305
0,0255
AD-53524.1
0,11
0,66
0,02
0,006
AD-53525.1
0,71
1,03
0,016
0,01
AD-53526.1
0,23
0,85
0,075
0,01
AD-53527.1
0,25
0,83
0,015
0,017
AD-53528.1
0,44
0,93
0,037
0,006
AD-53529.1
0,185
0,73
0,015
0,014
AD-53530.1
0,1
0,62
0,02
0,003
AD-53531.1
0,48
0,93
0,019
0,045
AD-53532.1
0,06
0,17
0,003
AD-53533.1
0,36
0,93
0,025
0,034
AD-53534.1
0,1
0,36
0,014
0,012
AD-53535.1
0,58
1,05
0,036
0,071
AD-53536.1
0,12
0,45
0,009
0,026
AD-53537.1
0,73
0,96
0,101
0,015
AD-53538.1
0,74
1,07
0,046
AD-53539.1
0,52
0,97
0,057
0,032
AD-53540.1
0,1
0,47
0,017
0,012
AD-53541.1
0,11
0,29
0,026
0,015
AD-53542.1
0,08
0,23
0,008
0,006
AD-53543.1
0,62
1,01
0,027
0,014
AD-53544.1
0,8
1,04
0,002
0,001
AD-53545.1
0,17
0,73
0,007
0,007
AD-53546.1
0,27
0,93
0,058
0,019
AD-53547.1
0,12
0,28
0,008
0,01
AD-53548.1
0,1
0,34
0,022
0,002
AD-53549.1
0,8
1,04
0,011
0,026
AD-53550.1
0,05
0,54
0,02
0,003
AD-53551.1
0,96
1,16
0,029
0,044
AD-53552.1
0,13
0,5
0,002
0,009
AD-53553.1
0,92
1,1
0,027
0,02
AD-53554.1
0,76
0,67
0,005
0,004
AD-53555.1
0,11
0,53
0,009
0,007
AD-53561.1
0,72
0,94
0,014
0,001
AD-53567.1
0,16
0,66
0,019
0,003
AD-53573.1
1,06
1,10
0,019
0,037
AD-53579.1
0,19
0,76
0,036
0,019
IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS1 в in vitro скрининге
В таблице 5 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS 1, определенные в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии НерЗВ с помощью модифицированных ALAS1 дуплексов siRNA (см. таблицу 2). Данные были получены, как описано выше, через 24 или 120 часов после трансфекции каждого дуплекса siRNA. В этом примере сайленсинг ALAS 1 выражают в виде доли оставшегося транскрипта mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в качестве отрицательного контроля. Данные из повторных экспериментов по трансфекции использовали для приведения в соответствие одиночной линии для определения IC50. Несколько из дуплексов (например, AD-53541.1, AD-53542.1 и AD-53547.1) характеризовались IC50 ДО приблизительно 0,03 нМ через 24 часа. Многие дуплексы характеризовались IC50 ДР 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53536.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53548.1, AD-53550.1, AD-53552.1) через 24 часа, и некоторые из них также характеризовались IC50 ДО 0,1 нМ (например, AD-53534.1, AD-53540.1, AD-53541.1, AD-53542.1, AD-53547.1, AD-53552.1) через 120 часов.
Таблица 5. ICgn выбранных дуплексов siRNA ALAS1, нормализованных относительно AD-1955
IC50(HM)
ID дуплекса
24 часа
120 часов
AD-53534.1
0,045
0,076
AD-53536.1
0,049
0,105
AD-53540.1
0,054
0,077
AD-53541.1
0,032
0,062
AD-53542.1
0,028
0,093
AD-53547.1
0,03
0,062
AD-53548.1
0,044
0,101
AD-53550.1
0,085
0,152
AD-53552.1
0,077
0,063
AD-53567.1
0,219
0,357
AD-53579.1
0,217
0,566
Пример 4. In vivo сайленсинг с применением siRNA ALAS1 мыши/крысы, находящейся в составе в виде LNP
Последовательности модифицированных дуплексов AD-53558 показаны ниже в таблице 6.
Данный дуплекс помещали в состав в виде состава LNP11 (см. таблицу 10 выше). siRNA AD-53558, находящуюся в составе LNP, исследовали in vivo у мышей (N=25 животных; 5 животных на группу) и крыс (N=20 животных; 4 животных на группу) и было
доказано, что она in vivo подвергает сайленсингу mRNA ALAS 1. Результаты показаны на ФИГ. 5 и ФИГ. 6.
На ФИГ. 5 показано, что у мышей siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS1 (mALASl) мыши снижалась приблизительно на 78%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 60%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг, и mRNA ALAS1 мыши снижалась приблизительно на 49%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг. Эти снижения выражали относительно контроля PBS. Также использовали контроль AD-1955 LUC, как показано на ФИГ. 5.
Аналогично, на ФИГ. 6 показано, что у крыс siRNA характеризовалась эффектом доза-ответ. Экспрессия mRNA ALAS 1 крысы снижалась приблизительно на 70%, когда siRNA вводили в количестве 1 мг/кг; mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 62%, когда siRNA вводили в количестве 0,3 мг/кг, и mRNA ALAS1 снижалась приблизительно на 34%, когда siRNA вводили в количестве 0,1 мг/кг.
Также исследовали длительность сайленсинга у мышей (N=15; 3 животных на временную точку). Результаты показаны на ФИГ. 7, на которой показано, что AD-53558 подавлял mRNA mALASl приблизительно на 80% в течение по меньшей мере 9 дней. Подавление по меньшей мере на 50% сохранялось по меньшей мере в течение 14 дней.
Пример 5. Эффективность siRNA ALAS1 на мышиной модели AIP
Эффекты состава LNP11 с AD-53558 (siRNA ALAS1 мыши/крысы, описанная в предыдущем примере) исследовали на мышиной модели АГР. PBGD нокаут является нежизнеспособным (-/-, 0% активности). Гетерозиготные PBGD нокаутированные мыши (+/-, -50% активности) способны иметь, но не имеют полный биохимический фенотип и, таким образом, не повторяют фенотип заболевания человека. В связи с этим была разработана мышиная модель АГР, которая представляет собой сложную гетерозиготу с аллелями Т1/Т2, включая нарушение промотора Т1 (+/-) и изменение сайта сплайсинга Т2 (-/-). Было показано, что эти мыши характеризуются остаточной активностью PBGD в печени, которая составляет приблизительно -30% от уровня дикого типа и нормальными или незначительно повышенными исходными уровнями ALA и PBG в плазме. Было обнаружено, что мыши имеют нормальный вид в ранний период жизни, а с возрастом
становятся несколько более вялыми и атаксичными. При медико-патологическом исследовании было отмечено, что к возрасту шести месяцев у мышей развивались нарушенная координация движений и мышечная работа, а также дегенерация аксонов. Исследование патологии мышиной модели показало дегенерацию аксонов, нарушенную координацию движений и мышечную работу у более старых мышей. Было обнаружено, что уровни ALA и PBG в моче и плазме заметно повышаются при последовательном интраперитонеальном введении фенобарбитала (см. Lindberg et al., (1996), Nature Genetics, 12:195-219 и Lindberg et al., (1999), Journal of Clinical Investigation, 103:1127-34). Мышей восстанавливали при помощи AAV-опосредованной экспрессии PBGD в печени (Yasuda et al. (2010), Molecular Medicine, 1:17-22 и Unzu et al. (2011), Molecular Medicine, 2:243-50).
Ha 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 (n=5) или контрольного LUC AD-1955 (n=3) путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS 1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Уровни метаболитов измеряли в плазме при помощи LC-MS и также измеряли в моче. Исходные уровни метаболитов измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на ФИГ. 8-12 и в таблицах 12 и 13.
На ФИГ. 8 и ФИГ. 9 показаны уровни ALA в плазме в мкМ. Исходные уровни ALA были низкими (п=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней ALA в плазме у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию ALA в плазме (п=5), как показано на ФИГ. 8. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции ALA в плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. ФИГ. 9). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня ALA в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели АГР.
На ФИГ. 10 и ФИГ. 11 показаны уровни PBG в плазме в мкМ. Исходные уровни PBG были низкими (п=4), а обработка фенобарбиталом индуцировала значимые повышения уровней PBG у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=3). Обработка siRNA ALAS1 ингибировала индукцию PBG в плазме (п=5), как показано на ФИГ. 10. siRNA ALAS1 была неизменно эффективной при блокировании индукции PBG в
плазме у каждого из отдельных изученных животных (см. ФИГ. 11). Данные результаты указывают на то, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровня PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели АГР.
РВ означает фенобарбитал. А "+" указывает, что вводили фенобарбитал.
В таблицах 12 и 13 показаны уровни ALA и PBG в моче на исходном уровне и после обработки фенобарбиталом у контрольных животных, обработанных siRNA LUC (n=2) (CTR, которая относится к животному, обработанному PBS буфером, п=1), и животных, обработанных siRNA ALAS1 (п=5).
Обработка фенобарбиталом индуцировала сильные повышения (~25-30-кратные повышения) ALA (~9-кратное по сравнению с исходными уровнями) и PBG (~ 19-кратное по сравнению с исходными уровнями) в моче у мышей, обработанных siRNA LUC, т.е. контроле, в то время как такие повышения не наблюдались у животных, обработанных siRNA ALAS1. Таким образом, siRNA ALAS1 блокировала индуцированные фенобарбиталом повышения уровней ALA и PBG в моче. Данные результаты согласуются с измерениями в плазме и показывают, что обработка siRNA ALAS1 была эффективной в предупреждении повышений уровней метаболитов в моче (ALA и PBG), связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели АГР.
В дополнительных экспериментах (ФИГ. 12) было обнаружено, что обработка фенобарбиталом индуцировала большие повышения (~25-кратные) экспрессии mRNA ALAS1 в печени в мышиной модели. Введение siRNA ALAS1 полностью блокировало эту индукцию mRNA ALAS 1. Данные результаты представляют дополнительное доказательство того, что siRNA ALAS1 является эффективной в животной модели АГР.
В обобщенном смысле из результатов, представленных в этом примере, видно, что siRNA ALAS1 является эффективной в лечении острых приступов в животной модели острой печеночной порфирий, АГР. Измерения нескольких результатов подтверждают это заключение, в том числе уровни ALA в плазме, уровни PBG в плазме, уровни ALA в моче, уровни PBG в моче и уровни экспрессии mRNA ALAS1 в печени.
Пример 6. In vivo сайленсинг при помощи конъюгированных с GalNAc siRNA ALAS1 мыши
В экспериментах, описанных в этом примере, исследовали in vivo эффективность трех конъюгированных с GalNAc siRNA (см. таблицу 7). Эти siRNA конструировали и получали при помощи способов, таких как описанные в примере 2.
ности на транскрипте
NM_ 020559.2
NM_ 020559.2
385
386
775-795
AD-56211
AfaGfuCfuGfuUfUfCfc AfcUfuUfuCfaAfL96
uUfgAfaAfaGfuGfgaa AfcAfgAfcUfusUfsg
773-795
387
388
2168-2188
AD-56173
AfcAfuAfgUfaGfCfCfa GfaAfuUfgUfcUfL96
aGfaCfaAfuUfcUfggc UfaCfuAfuGfusGfsg
2166-2188
389
390
775-795
AD-57929
AfsasGfuCfuGfuUfUfC fcAfcUfuUfuCfaAfL96
usUfsgAfaAfaGfuGfga aAfcAfgAfcUfususg
773-795
Мышей (n=40; n=4 на экспериментальное условие) разделяли на группы, которые получали PBS или дозы по 3 мг/кг, 10 мг/кг или 30 мг/кг siRNA, вводимые подкожно. Уровень mRNA mALASl/mGAPDH относительно контроля PBS определяли в клетках печени через 72 часа после введения. Результаты показаны на ФИГ. 13. Наблюдался нечеткий эффект доза-ответ для siRNA AD-56211 и AD-56173. В отличие от этого, siRNA ALAS1 AD-57929 проявил эффект доза-ответ при ингибировании экспрессии mALASl. По данным результатам видно, что конъюгат GalNAc с ALAS1 был эффективным при ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 in vivo и проявлял эффект доза-ответ.
Пример 7. siRNA человека
Дополнительные siRNA человека конструировали и получали, как описано в примере 2. Лучшие 45 siRNA отбирали на основании их прогнозируемой эффективности. Последовательности из этих 45 siRNA представлены в таблице 8 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ Ш NO: 391-551, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ Ш NO: 392-552 соответственно). Таблица 8 раскрыта в международной публикации № WO2013/155204A2. Содержимое WO 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе таблица 8, явным образом включены при помощи ссылки.
Пример 8. siRNA человека
Получали дополнительные siRNA человека из 19 нуклеотидов. Последовательности из этих siRNA представлены в таблице 9 и при этом прилагается перечень последовательностей (например, смысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с нечетным номером, идентифицированных под SEQ Ш N0: 553-3365, и антисмысловая последовательность, соответствующая одной из последовательностей с четным номером, идентифицированных под SEQ Ш N0: 554-3366 соответственно). Таблица 9 раскрыта в международной публикации № WO2013/155204A2. Содержимое W0 2013/155204 и перечень последовательностей, в том числе таблица 9, явным образом включены при помощи ссылки. Эти siRNA можно исследовать в отношении эффективности с помощью способов, описанных в данном документе, и/или способов, известных из уровня техники.
Пример 9. Подавление предшественников порфиринов при помощи siRNA ALAS1 при парадигме неотложного лечения
Мышиную модель АГР (см. пример 5) использовали для исследования того, будет ли siRNA ALAS 1 функционировать в качестве парадигмы неотложного лечения для снижения уже повышенных уровней ALA и PBG, которые бы присутствовали, например, когда пациент-человек с порфирией испытывает острый приступ. Введение siRNA состава LNP11 с AD-53558 в количестве 1 мг/кг через 12 часов после последней дозы фенобарбитала быстро снижало уровни как ALA, так и PBG в плазме мышей, в то время как у контрольных животных, обработанных Luc, уровни продолжали расти (ФИГ. 14). Эти результаты указывали на то, что siRNA ALAS является эффективной для лечения острого приступа. siRNA ALAS1 была эффективной для снижения и предупреждения дальнейших повышений уровней ALA и PBG.
Как можно видеть на ФИГ. 14, siRNA ALAS характеризовалась быстрым началом действия в снижении уровней ALA и PBG. Начало действия происходило в течение нескольких часов после введения siRNA. Эффект на уровень ALA в плазме мог наблюдаться в течение 4 часов после введения siRNA (см. ФИГ. 14; siRNA вводили через 12 часов после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 16 часов после последней дозы
фенобарбитала). Эффект на уровень PBG в плазме мог наблюдаться в течение 8 часов после введения siRNA (см. ФИГ. 14; siRNA вводили через 12 часов после последней дозы фенобарбитала, а снижение уровня ALA в плазме относительно контроля можно было наблюдать через 20 часов после последней дозы фенобарбитала).
Пример 10. siRNA, которые нацелены на ALAS1
Конструировали дополнительные немодифицированные и модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS 1, и получали их, как описано в примере 2. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже. Способы
Опосредованная липидами трансфекция
Для НерЗВ, РМН и первичных гепатоцитов Cynomolgus трансфекцию выполняли путем добавления 14,8 мкл Opti-MEM с 0,2 мкл Lipofectamine RNAiMax на лунку (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, № по кат. 13778-150) к 5 мкл каждого дуплекса siRNA в отдельной лунке в 96-луночном планшете. Смесь затем инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Восемьдесят мкл полных питательных сред без антибиотика, содержащих соответствующее число клеток, затем добавляли к смеси siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК.
Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса, модифицированного GalNAc, 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ, 10 нМ и 0,2 нМ.
Трансфекция посредством свободного поглощения
Криоконсервированные первичные гепатоциты Cynomolgus (Celsis In Vitro Technologies, M003055-P) размораживали на водяной бане при 37°С непосредственно перед использованием и ресуспендировали в количестве 0,26х106 клеток/мл в среде InVitroGRO CP (с покрытием) (Celsis In Vitro Technologies, № по кат. Z99029). Во время трансфекций клетки помещали в 96-луночный планшет с коллагеном BD BioCoat (BD, 356407) по 25000 клеток на лунку и инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СОг-Эксперименты по свободному поглощению выполняли путем добавления 10 мкл дуплексов siRNA в PBS на лунку в 96-луночном (96w) планшете. Девяносто мкл полных питательных сред, содержащих соответствующее число клеток для типа клеток, затем
добавляли к siRNA. Клетки инкубировали в течение 24 часов перед очисткой РНК. Эксперименты в отношении разовой дозы выполняли при конечной концентрации дуплекса 1 мкМ, 500 нМ, 20 нМ и 10 нМ.
Выделение общей РНК с использованием набора "DYNABEADS mRNA Isolation Kit" (Invitrogen, № no кат. 610-12)
Клетки собирали и лизировали в 150 мкл лизирующего/связывающего буфера, затем перемешивали в течение 5 минут при 850 об./мин. с помощью Eppendorf Thermomixer (скорость перемешивания была одинаковой на протяжении процесса). Десять микролитров магнитных гранул и 80 мкл смеси лизирующего/связывающего буфера добавляли в круглодонный планшет и перемешивали в течение 1 минуты. Магнитные гранулы фиксировали при помощи магнитного стенда и супернатант удаляли без смещения гранул. После удаления супернатанта лизированные клетки добавляли к оставшимся гранулам и перемешивали в течение 5 минут. После удаления супернатанта магнитные гранулы промывали 2 раза 150 мкл промывочного буфера А и перемешивали в течение 1 минуты. Гранулы снова фиксировали, а супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл промывочного буфера В, фиксировали и супернатант удаляли. Гранулы затем промывали 150 мкл элюирующего буфера, фиксировали и супернатант удаляли. В конце гранулы оставляли высыхать в течение 2 минут. После высыхания добавляли 50 мкл элюирующего буфера и смешивали в течение 5 минут при 70°С. Гранулы фиксировали на магните на 5 минут. Удаляли сорок пять мкл супернатанта и добавляли в другой 96-луночный планшет.
Синтез cDNA с использованием набора "ABIHigh capacity cDNA reverse transcription kit" (AppliedBiosystems, Форстер-Сити, Калифорния, № no кат. 4368813)
Получали мастер-микс из 2 мкл 10Х буфера, 0,8 мкл 25Х dNTP, 2 мкл случайных праймеров, 1 мкл обратной транскриптазы, 1 мкл ингибитора РНКазы и 3,2 мкл НгО на реакцию. Равные объемы мастер-микса и РНК смешивали для конечного объема в 12 мкл для in vitro отслеживаемых образцов или 20 мкл для in vivo отслеживаемых образцов. cDNA получали с использованием термоциклера Bio-Rad С-1000 или S-1000 (Hercules, Калифорния) посредством следующих стадий: 25°С 10 мин., 37°С 120 мин., 85°С 5 с и хранение при 4°С.
PCR в режиме реального времени
Два мкл cDNA добавляли к мастер-миксу, содержащему 2 мкл НгО, 0,5 мкл зонда TaqMan GAPDH (Life Technologies, № по кат. 4326317Е для клеток НерЗВ, № по кат. 352339Е для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов), 0,5 мкл зонда TaqMan С5 (Life Technologies, № по кат. Hs00167441_ml для клеток НерЗВ или Mm00457879_ml для первичных гепатоцитов мыши или сделанный по индивидуальному заказу зонд для первичных гепатоцитов макак-крабоедов) и 5 мкл мастер-микса с зондом Lightcycler 480 (Roche, № по кат. 04887301001) на лунку в 384-луночных (384 w) планшетах (Roche, № по кат. 04887301001). PCR в режиме реального времени выполняли в системе "Roche LC480 Real Time PCR system" (Roche) с применением ДДО;^С))-анализа. Для in vitro скрининга каждый дуплекс исследовали с двумя биологическими повторами, если не указано иное, и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами. Для in vivo скрининга каждый дуплекс исследовали в одном или нескольких экспериментах (3 мыши на группу) и каждую PCR в реальном времени выполняли с двойными техническими повторами.
Для вычисления относительного кратного изменения уровней mRNA ALAS 1 данные в реальном времени анализировали с применением ДДО;-способа и нормализовали в соответствии с таковыми анализов, выполненных с клетками, трансфицированными 10 нМ AD-1955, или имитационными трансфицированными клетками. IC50 рассчитывали с применением модели согласования по 4 параметрам с использованием XLFit и нормализовали в соответствии с данными для клеток, трансфицированных AD-1955, в таком же диапазоне доз или в отношении его наиболее низкой дозы.
Смысловая и антисмысловая последовательности AD-1955 являются такими, которые приведены ниже.
СМЫСЛОВАЯ: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ Ш N0:3682);
АНТИСМЫСЛОВАЯ: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ Ш N0:3683).
Последовательности одиночных нитей и дуплексов модифицированных и немодифицированных siRNA представлены в таблице 14 и таблице 15 соответственно.
3409
3410
AD-58869
GfsgsUfaCfuAfgAfAfAfuAfuUfuCf uGfgAfL96
usCfscAfgAfaAfuAfuuuCfuAfgUfaCfc sAfsc
1174-1196
3411
3412
AD-58870
GfsasCfaUfcAfuGfCfAfaAfaGfcAfa AfgAfL96
usCfsuUfuGfcUfuUfugcAfuGfaUfgUf csCfsu
853-875
3413
3414
AD-58871
AfsasAfuUfuUfaAfUfCfuAfuAfgUf aAfaAfL96
usUfsuUfaCfuAfuAfgauUfaAfaAfuUf usAfsa
2353-2375
3415
3416
AD-58873
CfsasUfgAfuCfcAfAfGfgGfaUfuCfg AfaAfL96
usUfsuCfgAfaUfcCfcuuGfgAfuCfaUf gsGfsa
1362-1384
3417
3418
AD-58874
AfsgsAfcCfaGfaAfAfGfaGfuGfuCf uCfaUfL96
asUfsgAfgAfcAfcUfcuuUfcUfgGfuCf usUfsu
871-893
3419
3420
AD-58875
AfsusCfcUfgAfaGfAfGfcGfcUfgAfg GfgAfL96
usCfscCfuCfaGfcGfcucUfuCfaGfgAfu sCfsc
1810-1832
3421
3422
AD-58876
GfsusCfuGfuGfaUfGfAfaCfuAfaUf gAfgCfL96
gsCfsuCfaUfuAfgUfucaUfcAfcAfgAfc sUfsu
1966-1988
3423
3424
AD-58877
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuCfL96
gsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sGfsu
875-897
3425
3426
AD-58878
AfscsUfuUfuCfaGfUfAfuGfaUfcGf uUfuCfL96
gsAfsaAfcGfaUfcAfuacUfgAfaAfaGfu sGfsg
925-947
3427
3428
AD-58879
UfscsAfuGfcCfaAfAfAfaUfgGfaCfa UfcAfL96
usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcAfuGf asCfsu
1634-1656
3429
3430
AD-58880
AfsasUfaUfuUfcUfGfGfaAfcUfaGf uAfaAfL96
usUfsuAfcUfaGfuUfccaGfaAfaUfaUf usUfsc
1183-1205
3431
3432
AD-58881
CfsusUfcUfuCfaAfGfAfuAfaCfuUf gCfcAfL96
usGfsgCfaAfgUfuAfucuUfgAfaGfaAf gsAfsu
892-914
3433
3434
AD-58882
UfsusUfcAfgUfaUfGfAfuCfgUfuUf cUfuUfL96
asAfsaGfaAfaCfgAfucaUfaCfuGfaAfa sAfsg
928-950
3435
3436
AD-58883
CfscsCfaGfuGfuGfGfUfuAfgUfgUf gAfaAfL96
usUfsuCfaCfaCfuAfaccAfcAfcUfgGfg sGfsc
790-812
3437
3438
AD-58884
GfscsUfgUfgAfgAfUfUfuAfcUfcUf gAfuUfL96
asAfsuCfaGfaGfuAfaauCfuCfaCfaGfc sCfsu
1325-1347
3439
3440
AD-58885
AfsgsGfcUfuGfaGfCfAfaGfuUfgGf uAfuCfL96
gsAfsuAfcCfaAfcUfugcUfcAfaGfcCfu sGfsa
2229-2251
3441
3442
AD-58886
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc sUfsg
877-899
3443
3444
AD-58887
AfsusUfuCfuGfgAfAfCfuAfgUfaAf aUfuCfL96
gsAfsaUfuUfaCfuAfguuCfcAfgAfaAf usAfsu
1186-1208
3445
3446
AD-58888
UfsgsUfgAfuGfuGfGfCfcCfaUfgAf gUfuUfL96
asAfsa Cf u Cf a Uf gGf gccAf с Af u Cf a Cf a sCfsa
1531-1553
3447
3448
AD-58889
AfsasGfaGfaGfaAfGfUfcCfuAfuUf uCfuCfL96
gsAfsgAfaAfuAfgGfacuUfcUfcUfcUf usUfsc
2208-2230
3449
3450
AD-58890
UfsgsGfcAfgCfaCfAfGfaUfgAfaUfc AfgAfL96
usCfsuGfaUfuCfaUfcugUfgCfuGfcCf asGfsg
671-693
3451
3452
AD-58891
AfsusGfaUfcGfuUfUfCfuUfuGfaGf aAfaAfL96
usUfsuUfcUfcAfaAfgaaAfcGfaUfcAf usAfsc
935-957
3453
3454
AD-58892
UfscsUfgGfaAfcUfAfGfuAfaAfuUf cCfaUfL96
asUfsgGfaAfuUfuAfcuaGfuUfcCfaGf asAfsa
1189-1211
3455
3456
AD-59095
GfscsCfcAfuUfcUfUfAfuCfcCfgAfg UfL96
asCfsuCfgGfgAfuAfagaAfuGfgsgsc
360-382
3457
3458
AD-59096
Gf sgs Af a Cf cAf u Gf Cf Cf u Cf cAf u Gf a UfL96
asUfscAfuGfgAfgGfcauGfgUfuscsc
1347-1369
3459
3460
AD-59097
UfsgsGfaGfuCfuGfUfGfcGfgAfuCf cUfL96
asGfsgAfuCfcGfcAfcagAfcUfcscsa
1794-1816
3461
3462
AD-59098
CfsasCfcCfaCfgGfGfUfgUfgUfgGfg AfL96
usCfscCfaCfaCfaCfccgUfgGfgsusg
1112-1134
3463
3464
AD-59099
GfsgsAfgUfcUfgUfGfCfgGfaUfcCf uAfL96
usAfsgGfaUfcCfgCfacaGfaCfuscsc
1795-1817
3465
3466
AD-59100
CfsasAfaAfcUfgCfCfCfcAfaGfaUfg AfL96
usCfsaUfcUfuGfgGfgcaGfuUfususg
428-450
3467
3468
AD-59101
GfscsCfuCfcAfuGfAfUfcCfaAfgGfg AfL96
usCfscCfuUfgGfaUfcauGfgAfgsgsc
1355-1377
3469
3470
AD-59102
CfsasUfcAfuCfcCfUfGfuGfcGfgGfu UfL96
asAfscCfcGfcAfcAfgggAfuGfasusg
1921-1943
3471
3472
AD-59103
AfscsCfcAfcGfgGfUfGfuGfuGfgGf gAfL96
usCfscCfcAfcAfcAfcccGfuGfgsgsu
1113-1135
3473
3474
AD-59104
CfsasCfaUfcAfuCfCfCfuGfuGfcGfg AfL96
usCfscGfcAfcAfgGfgauGfaUfgsusg
1919-1941
3475
3476
AD-59105
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfL96
asGfsaUfgAfgAfcAfcucUfuUfcsusg
873-895
3477
3478
AD-59106
CfscsUfcCfaUfgAfUfCfcAfaGfgGfa UfL96
asUfscCfcUfuGfgAfucaUfgGfasgsg
1356-1378
3479
3480
AD-59107
UfsgsCfcCfaUfuCfUfUfaUfcCfcGfa AfL96
usUfscGfgGfaUfaAfgaaUfgGfgscsa
359-381
3481
3482
AD-59108
CfsusUfcAfcCfcUfGfGfcUfaAfgAfu AfL96
usAfsuCfuUfaGfcCfaggGfuGfasasg
1297-1319
3483
3484
AD-59109
AfsusCfaUfcCfcUfGfUfgCfgGfgUfu AfL96
usAfsaCfcCfgCfaCfaggGfaUfgsasu
1922-1944
3485
3486
AD-59110
AfsgsAfaAfgAfgUfGfUfcUfcAfuCfu UfL96
asAfsgAfuGfaGfaCfacuCfuUfuscsu
874-896
3487
3488
AD-59111
CfsusCfcAfuGfaUfCfCfaAfgGfgAfu UfL96
asAfsuCfcCfuUfgGfaucAfuGfgsasg
1357-1379
3489
3490
AD-59112
CfscsAfuUfcUfuAfUfCfcCfgAfgUfc Afl_96
usGfsaCfuCfgGfgAfuaaGfaAfusgsg
362-384
3491
3492
AD-59113
CfsasCfcCfuGfgCfUfAfaGfaUfgAfu AfL96
usAfsuCfaUfcUfuAfgccAfgGfgsusg
1300-1322
3493
3494
AD-59114
UfscsAfuCfcCfuGfUfGfcGfgGfuUf gAfL96
usCfsaAfcCfcGfcAfcagGfgAfusgsa
1923-1945
3495
3496
AD-59115
AfsasGfaGfuGfuCfUfCfaUfcUfuCf uUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcsusu
877-899
3497
3498
AD-59116
GfsusCfaUfgCfcAfAfAfaAfuGfgAfc AfL96
usGfsuCfcAfuUfuUfuggCfaUfgsasc
1631-1653
3499
3500
AD-59117
CfsasUfuCfuUfaUfCfCfcGfaGfuCfc Afl_96
usGfsgAfcUfcGfgGfauaAfgAfasusg
363-385
3501
3502
AD-59118
AfscsCfcUfgGfcUfAfAfgAfuGfaUfg AfL96
usCfsaUfcAfuCfuUfagcCfaGfgsgsu
1301-1323
3503
3504
AD-59119
CfsusCfuUfcAfcCfCfUfgGfcUfaAfg AfL96
usCfsuUfaGfcCfaGfgguGfaAfgsasg
1295-1317
3505
3506
AD-59120
AfsusGfcCfaAfaAfAfUfgGfaCfaUfc AfL96
usGfsaUfgUfcCfaUfuuuUfgGfcsasu
1634-1656
3507
3508
AD-59121
UfsgsCfcCfcAfaGfAfUfgAfuGfgAfa UfL96
asUfsuCfcAfuCfaUfcuuGfgGfgscsa
434-456
3509
3510
AD-59122
GfsasAf cCfa UfgCf Cf Uf cCf a UfgAf u Afl_96
usAfsuCfaUfgGfaGfgcaUfgGfususc
1348-1370
3511
3512
AD-59123
UfscsUfuCfaCfcCfUfGfgCfuAfaGfa UfL96
asUfscUfuAfgCfcAfgggUfgAfasgsa
1296-1318
3513
3514
AD-59124
UfsgsCfcAfaAfaAfUfGfgAfcAfuCfa UfL96
asUfsgAfuGfuCfcAfuuuUfuGfgscsa
1635-1657
3515
3516
AD-59125
CfscsAfgAfaAfgAfGfUfgUfcUfcAfu AfL96
usAfsuGfaGfaCfaCfucuUfuCfusgsg
872-894
3517
3518
AD-59126
GfsasAfaCfuGfuCfCfAfuUfcAfaUfg AfL96
usCfsaUfuGfaAfuGfgacAfgUfususc
1481-1503
3519
3520
AD-59127
UfscsAfcCfcUfgGfCfUfaAfgAfuGfa UfL96
asUfscAfuCfuUfaGfccaGfgGfusgsa
1299-1321
3521
3522
AD-59128
CfscsCfuGfgAfgUfCfUfgUfgCfgGfa UfL96
asUfscCfgCfaCfaGfacuCfcAfgsgsg
1791-1813
3523
3524
AD-59129
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf uAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfususc
875-897
3525
3526
AD-59130
UfsgsGfaGfcCfcUfGfGfaGfuCfuGf uAfL96
usAfscAfgAfcUfcCfaggGfcUfcscsa
1786-1808
3580
3581
AD-58878
ACUUUUCAGUAUGAUCGUUUC
GAAACGAUCAUACUGAAAAGUGG
925-947
3582
3583
AD-58879
UCAUGCCAAAAAUGGACAUCA
UGAUGUCCAUUUUUGGCAUGACU
1634-1656
3584
3585
AD-58880
AAUAUUUCUGGAACUAGUAAA
UUUACUAGUUCCAGAAAUAUUUC
1183-1205
3586
3587
AD-58881
CUUCUUCAAGAUAACUUGCCA
UGGCAAGUUAUCUUGAAGAAGAU
892-914
3588
3589
AD-58882
UUUCAGUAUGAUCGUUUCUUU
AAAGAAACGAUCAUACUGAAAAG
928-950
3590
3591
AD-58883
CCCAGUGUGGUUAGUGUGAAA
UUUCACACUAACCACACUGGGGC
790-812
3592
3593
AD-58884
GCUGUGAGAUUUACUCUGAUU
AAUCAGAGUAAAUCUCACAGCCU
1325-1347
3594
3595
AD-58885
AGGCUUGAGCAAGUUGGUAUC
GAUACCAACUUGCUCAAGCCUGA
2229-2251
3596
3597
AD-58886
GAAAGAGUGUCUCAUCUUCUU
AAGAAGAUGAGACACUCUUUCUG
877-899
3598
3599
AD-58887
AUUUCUGGAACUAGUAAAUUC
GAAUUUACUAGUUCCAGAAAUAU
1186-1208
3600
3601
AD-58888
UGUGAUGUGGCCCAUGAGUUU
AAACUCAUGGGCCACAUCACACA
1531-1553
3602
3603
AD-58889
AAGAGAGAAGUCCUAUUUCUC
GAGAAAUAGGACUUCUCUCUUUC
2208-2230
3604
3605
AD-58890
UGGCAGCACAGAUGAAUCAGA
UCUGAUUCAUCUGUGCUGCCAGG
671-693
3606
3607
AD-58891
AUGAUCGUUUCUUUGAGAAAA
UUUUCUCAAAGAAACGAUCAUAC
935-957
3608
3609
AD-58892
UCUGGAACUAGUAAAUUCCAU
AUGGAAUUUACUAGUUCCAGAAA
1189-1211
3610
3611
AD-59095
GCCCAUUCUUAUCCCGAGU
ACUCGGGAUAAGAAUGGGC
360-382
3612
3613
AD-59096
GGAACCAUGCCUCCAUGAU
AUCAUGGAGGCAUGGUUCC
1347-1369
3614
3615
AD-59097
UGGAGUCUGUGCGGAUCCU
AGGAUCCGCACAGACUCCA
1794-1816
3616
3617
AD-59098
CACCCACGGGUGUGUGGGA
UCCCACACACCCGUGGGUG
1112-1134
3618
3619
AD-59099
GGAGUCUGUGCGGAUCCUA
UAGGAUCCGCACAGACUCC
1795-1817
3620
3621
AD-59100
CAAAACUGCCCCAAGAUGA
UCAUCUUGGGGCAGUUUUG
428-450
3622
3623
AD-59101
GCCUCCAUGAUCCAAGGGA
UCCCUUGGAUCAUGGAGGC
1355-1377
3624
3625
AD-59102
CAUCAUCCCUGUGCGGGUU
AACCCGCACAGGGAUGAUG
1921-1943
3626
3627
AD-59103
ACCCACGGGUGUGUGGGGA
UCCCCACACACCCGUGGGU
1113-1135
3628
3629
AD-59104
CACAUCAUCCCUGUGCGGA
UCCGCACAGGGAUGAUGUG
1919-1941
3630
3631
AD-59105
CAGAAAGAGUGUCUCAUCU
AGAUGAGACACUCUUUCUG
873-895
3632
3633
AD-59106
CCUCCAUGAUCCAAGGGAU
AUCCCUUGGAUCAUGGAGG
1356-1378
3634
3635
AD-59107
UGCCCAUUCUUAUCCCGAA
UUCGGGAUAAGAAUGGGCA
359-381
3636
3637
AD-59108
CUUCACCCUGGCUAAGAUA
UAUCUUAGCCAGGGUGAAG
1297-1319
3638
3639
AD-59109
AUCAUCCCUGUGCGGGUUA
UAACCCGCACAGGGAUGAU
1922-1944
3640
3641
AD-59110
AGAAAGAGUGUCUCAUCUU
AAGAUGAGACACUCUUUCU
874-896
3642
3643
AD-59111
CUCCAUGAUCCAAGGGAUU
AAUCCCUUGGAUCAUGGAG
1357-1379
3644
3645
AD-59112
CCAUUCUUAUCCCGAGUCA
UGACUCGGGAUAAGAAUGG
362-384
3646
3647
AD-59113
CACCCUGGCUAAGAUGAUA
UAUCAUCUUAGCCAGGGUG
1300-1322
3648
3649
AD-59114
UCAUCCCUGUGCGGGUUGA
UCAACCCGCACAGGGAUGA
1923-1945
3650
3651
AD-59115
AAGAGUGUCUCAUCUUCUU
AAGAAGAUGAGACACUCUU
877-899
3652
3653
AD-59116
GUCAUGCCAAAAAUGGACA
UGUCCAUUUUUGGCAUGAC
1631-1653
3654
3655
AD-59117
CAUUCUUAUCCCGAGUCCA
UGGACUCGGGAUAAGAAUG
363-385
3656
3657
AD-59118
ACCCUGGCUAAGAUGAUGA
UCAUCAUCUUAGCCAGGGU
1301-1323
3658
3659
AD-59119
CUCUUCACCCUGGCUAAGA
UCUUAGCCAGGGUGAAGAG
1295-1317
3660
3661
AD-59120
AUGCCAAAAAUGGACAUCA
UGAUGUCCAUUUUUGGCAU
1634-1656
3662
3663
AD-59121
UGCCCCAAGAUGAUGGAAU
AUUCCAUCAUCUUGGGGCA
434-456
3664
3665
AD-59122
GAACCAUGCCUCCAUGAUA
UAUCAUGGAGGCAUGGUUC
1348-1370
3666
3667
AD-59123
UCUUCACCCUGGCUAAGAU
AUCUUAGCCAGGGUGAAGA
1296-1318
3668
3669
AD-59124
UGCCAAAAAUGGACAUCAU
AUGAUGUCCAUUUUUGGCA
1635-1657
3670
3671
AD-59125
CCAGAAAGAGUGUCUCAUA
UAUGAGACACUCUUUCUGG
872-894
3672
3673
AD-59126
GAAACUGUCCAUUCAAUGA
UCAUUGAAUGGACAGUUUC
1481-1503
3674
3675
AD-59127
UCACCCUGGCUAAGAUGAU
AUCAUCUUAGCCAGGGUGA
1299-1321
3676
3677
AD-59128
CCCUGGAGUCUGUGCGGAU
AUCCGCACAGACUCCAGGG
1791-1813
3678
3679
AD-59129
GAAAGAGUGUCUCAUCUUA
UAAGAUGAGACACUCUUUC
875-897
3680
3681
AD-59130
UGGAGCCCUGGAGUCUGUA
UACAGACUCCAGGGCUCCA
1786-1808
Результаты этих анализов in vitro представлены в таблице 16. В таблице 16 также указаны целевые виды каждой из siRNA.
AD-58891
H/Rh
21/23
62,8
75,7
75,4
109,2
23,6
34,3
15,6
55,8
AD-58892
H/Rh
21/23
60,2
92,9
89,8
92,9
22,8
43,3
20,2
75,6
AD-59095
M/R/Rh/ H
19me r
88,9
Н.Д.
132,8
Н.Д.
48,3
97,4
54,3
99,0
AD-59096
M/R/Rh/ H
19me r
95,5
Н.Д.
90,5
Н.Д.
105,7
138,6
131,4
120,7
AD-59097
M/R/Rh/ H
19me r
92,5
Н.Д.
84,2
Н.Д.
75,0
Н.Д.
94,7
108,5
AD-59098
M/R/Rh/ H
19me r
84,0
Н.Д.
87,7
Н.Д.
109,3
Н.Д.
130,0
87,3
AD-59099
M/R/Rh/ H
19me r
89,7
Н.Д.
90,0
Н.Д.
77,8
85,4
46,8
74,9
AD-59100
M/R/Rh/ H
19me r
84,8
Н.Д.
144,3
Н.Д.
70,6
108,1
91,5
117,6
AD-59101
M/R/Rh/ H
19me r
79,0
Н.Д.
103,8
Н.Д.
89,8
102,9
124,2
107,0
AD-59102
M/R/Rh/ H
19me r
85,9
Н.Д.
100,6
Н.Д.
72,2
68,5
87,9
95,1
AD-59103
M/R/Rh/ H
19me r
86,0
Н.Д.
91,1
Н.Д.
93,0
81,3
130,0
96,0
AD-59104
M/R/Rh/ H
19me r
92,6
Н.Д.
96,9
Н.Д.
94,9
91,4
124,4
83,1
AD-59105
M/R/Rh/ H
19me r
48,9
Н.Д.
101,7
Н.Д.
18,4
48,9
17,0
34,7
AD-59106
M/R/Rh/ H
19me r
63,2
Н.Д.
76,7
Н.Д.
28,5
40,7
28,6
46,4
AD-59107
M/R/Rh/ H
19me r
71,4
Н.Д.
68,7
Н.Д.
37,1
45,3
26,8
63,6
AD-59108
M/R/Rh/ H
19me r
70,7
Н.Д.
85,1
Н.Д.
89,9
84,8
139,2
101,7
AD-59109
M/R/Rh/ H
19me r
86,1
Н.Д.
83,4
Н.Д.
84,9
96,2
131,7
86,7
AD-59110
M/R/Rh/ H
19me r
70,8
Н.Д.
119,7
Н.Д.
38,5
60,4
67,4
80,3
AD-59111
M/R/Rh/ H
19me r
66,1
Н.Д.
76,5
Н.Д.
52,2
61,0
69,7
87,6
AD-59112
M/R/Rh/ H
19me r
71,2
Н.Д.
80,2
Н.Д.
91,2
83,4
127,4
89,0
AD-59113
M/R/Rh/ H
19me r
67,0
Н.Д.
77,8
Н.Д.
49,1
59,0
66,8
91,4
AD-59114
M/R/Rh/ H
19me r
81,7
Н.Д.
79,3
Н.Д.
96,3
88,0
129,6
72,4
AD-59115
M/R/Rh/ H
19me r
40,4
Н.Д.
69,6
Н.Д.
19,6
35,7
9,3
16,9
AD-59116
M/R/Rh/ H
19me r
72,2
Н.Д.
78,3
Н.Д.
53,5
77,8
70,1
107,8
AD-59117
M/R/Rh/ H
19me r
70,7
Н.Д.
75,6
Н.Д.
75,8
74,9
129,0
103,5
AD-59118
M/R/Rh/ H
19me r
68,8
Н.Д.
75,9
Н.Д.
81,4
82,1
114,1
89,7
AD-59119
M/R/Rh/ H
19me r
64,9
Н.Д.
86,5
Н.Д.
85,1
125,1
122,8
124,8
AD-59120
M/R/Rh/ H
19me r
63,5
Н.Д.
75,1
Н.Д.
29,9
52,0
16,1
54,1
AD-59121
M/R/Rh/ H
19me r
67,6
Н.Д.
72,0
Н.Д.
88,8
77,4
108,0
103,1
AD-59122
M/R/Rh/ H
19me r
60,2
Н.Д.
62,3
Н.Д.
25,1
45,3
16,2
54,8
AD-59123
M/R/Rh/ H
19me r
68,6
Н.Д.
108,2
Н.Д.
59,2
84,6
80,0
97,7
AD-59124
M/R/Rh/ H
19me r
47,5
Н.Д.
56,5
Н.Д.
23,9
40,0
9,8
18,9
AD-59125
M/R/Rh/ H
19me r
45,4
Н.Д.
47,2
Н.Д.
15,2
40,7
14,7
15,1
AD-59126
M/R/Rh/ H
19me r
64,3
Н.Д.
74,6
Н.Д.
51,6
57,1
35,5
54,4
AD-59127
M/R/Rh/ H
19me r
103,4
Н.Д.
105,8
Н.Д.
94,0
156,4
135,9
113,7
AD-59128
M/R/Rh/ H
19me r
102,4
Н.Д.
81,4
Н.Д.
66,3
89,3
60,2
74,9
AD-59129
M/R/Rh/ H
19me r
41,3
Н.Д.
38,8
Н.Д.
17,9
41,4
8,6
12,6
AD-59130
M/R/Rh/ H
19me r
58,3
Н.Д.
80,8
Н.Д.
94,9
78,3
106,7
88,0
В таблице 17 показаны IC50 отдельных дуплексов siRNA ALAS 1. IC50 определяли в результате нокдауна эндогенно экспрессируемой ALAS1 в клеточной линии НерЗВ через 24 часа после трансфекции каждого модифицированного ALAS1 дуплекса siRNA (см. таблицу 14). По меньшей мере семь дуплексов, в том числе AD-58882, AD-58878, AD-58886, AD-58877, AD-59115, AD-58856 и AD-59129, неизменно проявляли IC5o менее 0,1 нм, указывая на то, что эти дуплексы были особенно эффективными в подавлении экспрессии ALAS 1.
AD-58874
0,140
0,102
AD-59125
0,118
0,115
AD-59105
0,511
0,144
AD-59120
180,592
0,498
AD-59122
36,646
0,646
AD-59106
7,906
0,847
AD-59126
Н.Д.
1,014
AD-59107
Н.Д.
1,971
Пример 11. Активность ALASl-GalNAc в мышиной модели при индукции AIP фенобарбиталом
Мышиную модель АГР использовали для исследования эффекта siRNA, которая представляла собой конъюгат ALAS 1-GalNAc. siRNA характеризовалась последовательностью дуплекса AD-58632 (см. таблицу 20).
Мышей с АГР не обрабатывали (исходный уровень) или им вводили подкожно на 1 день солевой раствор или конъюгат ALAS 1-GalNAc в количестве 20 мг/кг. На 2, 3 и 4 дни их оставляли необработанными (исходный уровень) или им вводили интраперитонеально инъекции фенобарбитала. На 5 день забирали плазму и измеряли уровни ALA и PBG с использованием анализа LC-MS. Как показано на ФИГ. 15, конъюгат ALASl-GalNAc снижал образование ALA и PBG в плазме приблизительно на 84 и 80% соответственно. По данным результатам видно, что обработка конъюгатом ALASl-GalNAc была эффективной
в предупреждении повышений уровней как ALA, так и PBG в плазме, связанных с индуцированными фенобарбиталом острыми приступами в этой животной модели АГР.
Пример 12. Дополнительные siRNA, которые нацелены на ALAS1 и ингибируют экспрессию ALAS1
Конструировали модифицированные последовательности siRNA, которые нацеливают siRNA ALAS1, и получали их, как описано в примере 2. Последовательности представлены в таблице 18. Активность in vitro модифицированных дуплексов исследовали, как описано ниже.
3711
3712
AD-59448
GAGUCAUGCCAAAAAUGGAdT dT
UCCAUUUUUGGCAUGACUCdT dT
1629-1647
3713
3714
AD-59392
CUGUGCGGAUCCUGAAGAGdT dT
CUCUUCAGGAUCCGCACAGdT dT
1800-1818
3715
3716
AD-59469
CACUUUGAAACAACAUGGUdT dT
ACCAUGUUGUUUCAAAGUGdT dT
1141-1159
3717
3718
AD-59431
AAGUGAUGAGUGAAAGAGAd TdT
UCUCUUUCACUCAUCACUUdT dT
2193-2211
3719
3720
AD-59423
AUCUGCUAGUCACAUGGAAdT dT
UUCCAUGUGACUAGCAGAUdT dT
2103-2121
3721
3722
AD-59517
UGGGGCAGGUGGUACUAGAd TdT
UCUAGUACCACCUGCCCCAdTd T
1162-1180
3723
3724
AD-59578
GCAGAUGACUAUUCAGACUdT dT
AGUCUGAAUAGUCAUCUGCdT dT
1031-1049
3725
3726
AD-59495
GCCUCAUUCCUCAGCUGAGdT dT
CUCAGCUGAGGAAUGAGGCdT dT
2143-2161
3727
3728
AD-59432
GUAUGAUCGUUUCUUUGAGd TdT
CUCAAAGAAACGAUCAUACdT dT
931-949
3729
3730
AD-59382
UAUCCAGAUGGUCUUCAGAdT dT
UCUGAAGACCAUCUGGAUAdT dT
2302-2320
3731
3732
AD-59472
UAGUGUGAAAACCGAUGGAdT dT
UCCAUCGGUUUUCACACUAdT dT
799-817
3733
3734
AD-59459
UCCCCAUGGCAGAUGACUAdT dT
UAGUCAUCUGCCAUGGGGAdT dT
1023-1041
3735
3736
AD-59413
CCACUGCAGCAGUACACUAdT dT
UAGUGUACUGCUGCAGUGGd TdT
483-501
3737
3738
AD-59478
CUGUGAACCGGCGAGCACAdT dT
UGUGCUCGCCGGUUCACAGdT dT
999-1017
3739
3740
AD-59376
GGUCCUAUGCUGCUGGCUUd TdT
AAGCCAGCAGCAUAGGACCdTd T
1731-1749
3741
3742
AD-59556
AGCCUUUGGUUGUGUUGGAd TdT
U CCAACACAACCAAAG GCU dTd T
1672-1690
3743
3744
AD-59399
AAUUCCAUGUGGACUUAGAdT dT
UCUAAGUCCACAUGGAAUUdT dT
1200-1218
3745
3746
AD-59474
CCAGGGCACUGCAAGCAAAdT dT
UUUGCUUGCAGUGCCCUGGdT dT
640-658
3747
3748
AD-53542
cuuuucAGuAuGAucGuuudTsd T
AAACGAUcAuACUGAAAAGdTs dT
924-942
3749
3750
AD-59480
GAAUCAGAGAGGCAGCAGUdT dT
ACUGCUGCCUCUCUGAUUCdT dT
682-700
3751
3752
AD-59549
GCAAAGAUCUGACCCCUCAdT dT
UGAGGGGUCAGAUCUUUGCd TdT
1441-1459
3753
3754
AD-59515
GGAGAAGAGCUCCUACGGAdT dT
UCCGUAGGAGCUCUUCUCCdT dT
2033-2051
3755
3756
AD-59427
CCAUGAGUUUGGAGCAAUCdT dT
GAUUGCUCCAAACUCAUGGdT dT
1540-1558
3757
3758
AD-59390
CUUUGAGAAAAAAAUUGAUdT dT
AUCAAUUUUUUUCUCAAAGdT dT
943-961
3759
3760
AD-59511
UGAGCAGACAUAACAUCUAdT dT
UAGAUGUUAUGUCUGCUCAdT dT
1980-1998
3761
3762
AD-59532
CGUGCAAGCAAUCAAUUACdT dT
GUAAUUGAUUGCUUGCACGdT dT
1999-2017
3763
3764
AD-59562
AAAGCAAAGACCAGAAAGAdT dT
UCUUUCUGGUCUUUGCUUUd TdT
862-880
3765
3766
AD-59513
GGAUGUGCAGGAAAUGAAUd TdT
AUUCAUUUCCUGCACAUCCdT dT
733-751
3767
3768
AD-59362
CAGCAUACUUCCUGAACAUdT dT
AUGUUCAGGAAGUAUGCUGd TdT
321-339
3769
3770
AD-53541
GcAGcAcAGAuGAAucAGAdTsd T
UCUGAUUcAUCUGUGCUGCdT sdT
671-689
3771
3772
AD-59490
UCUGUUGUUCUAUGCCCAAdT dT
UUGGGCAUAGAACAACAGAdT dT
412-430
3773
3774
AD-59422
UGAGACAGAUGCUAAUGGAdT dT
UCCAUUAGCAUCUGUCUCAdT dT
1869-1887
3775
3776
AD-59467
GCCAAUGACUCAACCCUCUdT dT
AGAGGGUUGAGUCAUUGGCd TdT
1280-1298
3777
3778
AD-59579
GAGUGCAACUUCUGCAGGAdT dT
UCCUGCAGAAGUUGCACUCdT dT
2159-2177
3779
3780
AD-59426
GUGAAAGAGAGAAGUCCUAdT dT
UAGGACUUCUCUCUUUCACdT dT
2202-2220
3781
3782
AD-59363
UAACUUGCCAAAAUCUGUUdT dT
AACAGAUUUUGGCAAGUUAdT dT
901-919
3783
3784
AD-59436
AAGCCAGUCUUGAGCUUCAdT dT
UGAAGCUCAAGACUGGCUUdT dT
711-729
3785
3786
AD-53536
cAcuuuucAGuAuGAucGudTsd T
ACGAUcAuACUGAAAAGUGdTs dT
922-940
3787
3788
AD-59491
GCAGCAGUGUCUUCUGCAAdT dT
UUGCAGAAGACACUGCUGCdT dT
693-711
3789
3790
AD-59500
UCCUGAACAUGGAGAGUGUdT dT
ACACUCUCCAUGUUCAGGAdT dT
330-348
3791
3792
AD-59394
AUUUCUGGAACACUUGGCAdT dT
UGCCAAGU G U U CCAGAAAUdT dT
1652-1670
3793
3794
AD-59441
CAG UACACUACCAACAGAU dT dT
AUCUGUUGGUAGUGUACUGd TdT
492-510
3795
3796
AD-59365
GCAUGACCUCAAUUAUUUCdT dT
GAAAUAAUUGAGGUCAUGCdT dT
2261-2279
3797
3798
AD-59411
AGAACUGCUGCAAAGAUCUdT dT
AGAUCUUUGCAGCAGUUCUdT dT
1432-1450
3799
3800
AD-59544
CACCCCAGAUGAUGAACUAdT dT
UAGUUCAUCAUCUGGGGUGd TdT
2073-2091
3801
3802
AD-59428
GAUCCAAGGGAUUCGAAACdT dT
GUUUCGAAUCCCUUGGAUCdT dT
1363-1381
3803
3804
AD-59471
CU CAU CACCAAAAAG CAAG dTd T
CUUGCUUUUUGGUGAUGAGd TdT
1052-1070
3805
3806
AD-59518
ACAACAUGGUGCUGGGGCAdT dT
UGCCCCAGCACCAUGUUGUdT dT
1150-1168
3807
3808
AD-53547
GAucGuuucuuuGAGAAAAdTsd T
UUUUCUcAAAGAAACGAUCdTs dT
935-953
3809
3810
AD-59573
CAGCACGAGUUCUCUGAUUdT dT
AAUCAGAGAACUCGUGCUGdT dT
1702-1720
3811
3812
AD-59473
AAUGAUGUCAGCCACCUCAdT dT
UGAGGUGGCUGACAUCAUUdT dT
1412-1430
3813
3814
AD-59412
AG U U AU GG ACACU U U GAAAdT dT
UUUCAAAGUGUCCAUAACUdT dT
1132-1150
3815
3816
AD-59522
GAUGAUGAACUACUUCCUUdT dT
AAGGAAGUAGUUCAUCAUCdT dT
2080-2098
3817
3818
AD-59502
GCAGGAAAUGAAUGCCGUGdT dT
CACGGCAUUCAUUUCCUGCdT dT
739-757
3819
3820
AD-59499
UCUUCAAGAUAACUUGCCAdT dT
UGGCAAGUUAUCUUGAAGAdT dT
892-910
3821
3822
AD-59520
CGAUGGAGGGGAUCCCAGUdT dT
ACUGGGAUCCCCUCCAUCGdT dT
811-829
3823
3824
AD-59581
CCAAAAAGCAAG U G U CAG U dT dT
ACUGACACUUGCUUUUUGGdT dT
1059-1077
3825
3826
AD-59461
GAUUGGGGAUCGGGAUGGAd TdT
UCCAUCCCGAUCCCCAAUCdTd T
1612-1630
3827
3828
AD-59370
CCCUGGAGUCUGUGCGGAUdT dT
AUCCGCACAGACUCCAGGGdT dT
1791-1809
3829
3830
AD-53540
GuuGucuuuAuAuGuGAAudTsd T
AUUcAcAuAuAAAGAcAACdTsd T
2321-2339
3831
3832
AD-59574
CGGGCAUUGUCCACUGCAGdT dT
CUGCAGUGGACAAUGCCCGdT dT
473-491
3833
3834
AD-59375
UAUUCAGACUCCCUCAUCAdT dT
UGAUGAGGGAGUCUGAAUAd TdT
1040-1058
3835
3836
AD-59387
CACUGCAUUUUGAAGUGAUd TdT
AUCACUUCAAAAUGCAGUGdT dT
2181-2199
3837
3838
AD-59397
CCAGAAAGAGUGUCUCAUCdT dT
GAUGAGACACUCUUUCUGGdT dT
872-890
3839
3840
AD-59396
AGGCGGAGGGAUUGGGGAUd TdT
AUCCCCAAUCCCUCCGCCUdTd T
1603-1621
3841
3842
AD-59393
AGACCUCCAUGGGAAAGAUdT dT
AUCUUUCCCAUGGAGGUCUdT dT
1231-1249
3843
3844
AD-59483
GCAGGAGGCCACUGCAUUUdT dT
AAAUGCAGUGGCCUCCUGCdT dT
2172-2190
3845
3846
AD-59430
AUCUGUUUCCACUUUUCAGdT dT
CUGAAAAGUGGAAACAGAUdT dT
913-931
3847
3848
AD-59463
AGAGAAGUCCUAUUUCUCAdT dT
UGAGAAAUAGGACUUCUCUdT dT
2209-2227
3849
3850
AD-53534
GucuucAGAGuuGucuuuAdTsd T
uAAAGAcAACUCUGAAGACdTs dT
2312-2330
3851
3852
AD-59514
GGCUGGAACUGAAGCCUCAdT dT
UGAGGCUUCAGUUCCAGCCdT dT
2130-2148
3853
3854
AD-59575
GCCAUUAUCAUAUCCAGAUdT dT
AUCUGGAUAUGAUAAUGGCdT dT
2292-2310
3855
3856
AD-59364
AGCAGGCCCCAGUGUGGUUdT dT
AACCACACUGGGGCCUGCUdT dT
781-799
3857
3858
AD-59402
UCAGCUGAGUGCAACUUCUdT dT
AGAAGUUGCACUCAGCUGAdT dT
2153-2171
3859
3860
AD-59479
GAGCACACAUCU UCCCCAUdT dT
AUGGGGAAGAUGUGUGCUCd TdT
1011-1029
3861
3862
AD-59481
ACU U CCAG G ACAU CAU G CAdT dT
UGCAUGAUGUCCUGGAAGUdT dT
843-861
3863
3864
AD-59530
CCUAUCGAGUUUUUAAAACdT dT
GUUUUAAAAACUCGAUAGGdT dT
981-999
3865
3866
AD-59582
CUUCCUUGAGAAUCUGCUAdT dT
UAGCAGAUUCUCAAGGAAGdT dT
2092-2110
3867
3868
AD-59506
ACCAAC AG AU С AAAG AAACdTd T
GUUUCUUUGAUCUGUUGGUd TdT
501-519
3869
3870
AD-59567
UAACCCCAGGCCAU UAUCAdT dT
UGAUAAUGGCCUGGGGUUAd TdT
2283-2301
3871
3872
AD-59485
CCAUGCCUCCAUGAUCCAAdT dT
UUGGAUCAUGGAGGCAUGGd TdT
1351-1369
3873
3874
AD-59525
UGAUGAACUAAUGAGCAGAdT dT
UCUGCUCAUUAGUUCAUCAdT dT
1969-1987
3875
3876
AD-59566
CCUGAAGAGCGCUGAGGGAdT dT
UCCCUCAGCGCUCUUCAGGdT dT
1810-1828
3877
3878
AD-59580
AACACUUGGCAAAGCCUUUdT dT
AAAGGCUUUGCCAAGUGUUdT dT
1660-1678
3879
3880
AD-59512
UCUGCAGAAAGCAGGCAAAdT dT
UUUGCCUGCUUUCUGCAGAdT dT
391-409
3881
3882
AD-59475
CCGGCCUCCCUGUUGUCCAdT dT
UGGACAACAGGGAGGCCGGdT dT
1890-1908
3883
3884
AD-59438
CAUCAUCCCUGUGCGGGUUdT dT
AACCCGCACAGGGAUGAUGdT dT
1921-1939
3885
3886
AD-59442
UGUGCGGGUUGCAGAUGCUd TdT
AGCAUCUGCAACCCGCACAdTd T
1930-1948
3887
3888
AD-59516
GGAAAGAGGUUGCUGAAACdT dT
GUUUCAGCAACCUCUUUCCdT dT
759-777
3889
3890
AD-59429
AGGUCCACGCAGUGGGGCUdT dT
AGCCCCACUGCGUGGACCUdT dT
1572-1590
3891
3892
AD-59510
UGCCGUGAGGAAAGAGGUUd TdT
AACCUCUUUCCUCACGGCAdTd T
751-769
3893
3894
AD-59457
GCUAAUGGAUGCCGGCCUCdT dT
GAGGCCGGCAUCCAUUAGCdT dT
1879-1897
3895
3896
AD-59434
GAAGCAAGUGGGGCUGGAAd TdT
UUCCAGCCCCACUUGCUUCdT dT
2119-2137
3897
3898
AD-59454
CAUCUUCCGCCACAAUGAUdT dT
AUCAUUGUGGCGGAAGAUGd TdT
1399-1417
3899
3900
AD-59468
AUUUCUCAGGCUUGAGCAAdT dT
UUGCUCAAGCCUGAGAAAUdT dT
2220-2238
3901
3902
AD-59565
CCCGAGUCCCCCAGGCCUUdTd T
AAGGCCUGGGGGACUCGGGdT dT
372-390
3903
3904
AD-59416
CAAGCAAAU GCCCU U UCCU dT dT
AGGAAAGGGCAUUUGCUUGd TdT
651-669
3905
3906
AD-59420
CCCCUCAGUCCCCAAGAUUdTd T
AAUCUUGGGGACUGAGGGGd TdT
1453-1471
3907
3908
AD-59552
CUACGGUGCCCCGGGGAGAdT dT
UCUCCCCGGGGCACCGUAGdT dT
2019-2037
3909
3910
AD-59558
AAAACUGCCCCAAGAUGAUdT dT
AUCAUCUUGGGGCAGUUUUd TdT
429-447
3911
3912
AD-59404
ACAAAACUGCUAAGGCCAAdT dT
UUGGCCUUAGCAGUUUUGUd TdT
540-558
3913
3914
AD-59455
GAUUCUGGGAACCAUGCCUdT dT
AGGCAUGGUUCCCAGAAUCdT dT
1340-1358
3915
3916
AD-59496
CCAGAUGGCACACAGCUUCdT dT
GAAGCUGUGUGCCAUCUGGdT dT
593-611
3917
3918
AD-59446
AGGGAUUCGAAACAGCCGAdT dT
UCGGCUGUUUCGAAUCCCUdT dT
1369-1387
3919
3920
AD-59435
CUCUGCAGUCCUCAGCGCAdT dT
UGCGCUGAGGACUGCAGAGdT dT
109-127
3921
3922
AD-59419
CCGCCGCCUCUGCAGUCCUdT dT
AGGACUGCAGAGGCGGCGGdT dT
102-120
3923
3924
AD-59533
CUGGCUGGAGCCCUGGAGUdT dT
ACUCCAGGGCUCCAGCCAGdTd T
1781-1799
3925
3926
AD-59366
GACAUCAUG CAAAAGCAAAdT dT
UUUGCUUUUGCAUGAUGUCd TdT
851-869
3927
3928
AD-59521
GCUUGAGCAAGUUGGUAUCd TdT
GAUACCAACUUGCUCAAGCdT dT
2229-2247
3929
3930
AD-59563
CAGGCUGUGAGAUUUACUCdT dT
GAG U AAAU С U CACAG CC U G dT dT
1320-1338
3931
3932
AD-59534
AGAGCUGUGUGAUGUGGCCd TdT
GGCCACAUCACACAGCUCUdTd T
1522-1540
3933
3934
AD-59407
GGAGCUGGCAGACCUCCAUdT dT
AUGGAGGUCUGCCAGCUCCdT dT
1222-1240
3935
3936
AD-59445
AUCCCAGUGGACUGCUGAAdT dT
UUCAGCAGUCCACUGGGAUdT dT
822-840
3937
3938
AD-59546
GUCAAACUCAUGAGACAGAdT dT
UCUGUCUCAUGAGUUUGACdT dT
1859-1877
3939
3940
AD-59456
CUUUCCUGGCAGCACAGAUdT dT
AUCUGUGCUGCCAGGAAAGdT dT
663-681
3941
3942
AD-59503
CCCUCCGGCCAGUGAGAAAdT dT
UUUCUCACUGGCCGGAGGGdT dT
520-538
3943
3944
AD-59536
CUACCUAGGAAUGAGUCGCdT dT
GCGACUCAUUCCUAGGUAGdT dT
1093-1111
3945
3946
AD-59385
CCCAAGAUUGUGGCAUUUGdT dT
CAAAUGCCACAAUCUUGGGdT dT
1463-1481
3947
3948
AD-59367
GAGCAAUCACCUUCGUGGAdT dT
UCCACGAAGGUGAUUGCUCdT dT
1551-1569
3949
3950
AD-59458
UGCCCAUUCUUAUCCCGAGdT dT
CUCGGGAUAAGAAUGGGCAdT dT
359-377
3951
3952
AD-59381
AAGGCCAAGGUCCAACAGAdT dT
UCUGUUGGACCUUGGCCUUdT dT
551-569
3953
3954
AD-59538
CACACAGCUUCCGUCUGGAdT dT
UCCAGACGGAAGCUGUGUGdT dT
601-619
3955
3956
AD-59421
UUAUGGGGCUCGAGGCGGAd TdT
UCCGCCUCGAGCCCCAUAAdTd T
1591-1609
3957
3958
AD-59388
UGUCUUCUGCAAAGCCAGUdT dT
ACUGGCUUUGCAGAAGACAdT dT
700-718
3959
3960
AD-59444
AGGCCUGAGCAUGACCUCAdT dT
UGAGGUCAUGCUCAGGCCUdT dT
2253-2271
3961
3962
AD-59528
AUGUGAAUUAAGUUAUAUUd TdT
AAUAUAACUUAAUUCACAUdT dT
2332-2350
3963
3964
AD-59498
ACUGCUGAAGAACUUCCAGdT dT
CUGGAAGUUCUUCAGCAGUdT dT
832-850
3965
3966
AD-59497
UGAGAAAGACAAAACUGCUdT dT
AGCAGUUUUGUCUUUCUCAdT dT
532-550
3967
3968
AD-59384
UCAGCCACCUCAGAGAACUdT dT
AGUUCUCUGAGGUGGCUGAd TdT
1419-1437
3969
3970
AD-59452
GGCAACGAGCGUUUCGUUUd TdT
AAACGAAACGCUCGUUGCCdT dT
51-69
3971
3972
AD-59379
CCUGAUGGAUCCCAGCAGAdT dT
UCUGCUGGGAUCCAUCAGGdT dT
572-590
3973
3974
AD-59529
UGUGCCCACUGGAAGAGCUdT dT
AGCUCUUCCAGUGGGCACAdT dT
1509-1527
3975
3976
AD-59389
CCACAGGAGCCAGCAUACUdT dT
AGUAUGCUGGCUCCUGUGGdT dT
311-329
3977
3978
AD-59585
GUGGUACUAGAAAUAUUUCd TdT
GAAAUAUUUCUAGUACCACdT dT
1170-1188
3979
3980
AD-59570
UUCGCCGCUGCCCAUUCUUdT dT
AAGAAUGGGCAGCGGCGAAdT dT
351-369
3981
3982
AD-59415
CCGCCAGCACCAGCGCAACdTd T
GUUGCGCUGGUGCUGGCGGd TdT
1840-1858
3983
3984
AD-59505
CGCUGAGGGACGGGUGCUUd TdT
AAGCACCCGUCCCUCAGCGdTd T
1819-1837
3985
3986
AD-59557
UGGACUUCUCGACUUGAGUd TdT
ACUCAAGUCGAGAAGUCCAdT dT
69-87
3987
3988
AD-59548
AAAGAAACCCCUCCGGCCAdTd T
UGGCCGGAGGGGUUUCUUUd TdT
512-530
3989
3990
AD-59487
UUGACACCGUACGGUCCUAdT dT
UAGGACCGUACGGUGUCAAdT dT
1719-1737
3991
3992
AD-59550
CCCUCUUCACCCUGGCUAAdT dT
UUAGCCAGGGUGAAGAGGGdT dT
1293-1311
3993
3994
AD-59572
CCCCCAGGCCUUUCUGCAGdT dT
CUGCAGAAAGGCCUGGGGGdT dT
379-397
3995
3996
AD-59554
AUG CCCAAAAC U GCCCCAAdTd T
UUGGGGCAGUUUUGGGCAUd TdT
423-441
3997
3998
AD-59437
CUUGAGUGCCCGCCUCCUUdT dT
AAGGAGGCGGGCACUCAAGdT dT
81-99
3999
4000
AD-59584
GGGUACAUCGCCAGCACGAdT dT
UCGUGCUGGCGAUGUACCCdT dT
1691-1709
4001
4002
AD-59373
GUGUGGGGCAGUUAUGGACd TdT
GUCCAUAACUGCCCCACACdTd T
1123-1141
4003
4004
AD-59545
ACAUAGUCCUGGAAAUAAAdT dT
UUUAUUUCCAGGACUAUGUdT dT
2372-2390
4005
4006
AD-59547
AUCCCAGCAGAGUCCAGAUdT dT
AUCUGGACUCUGCUGGGAUdT dT
580-598
4007
4008
AD-59470
CUAGAUUCUUUCCACAGGAdT dT
UCCUGUGGAAAGAAUCUAGdT dT
300-318
4009
4010
AD-59417
UUGUUUUCCUCGUGCUUUGd TdT
CAAAGCACGAGGAAAACAAdTd T
1259-1277
4011
4012
AD-59535
CCUCCUUCGCCGCCGCCUCdTd T
GAGGCGGCGGCGAAGGAGGdT dT
93-111
4013
4014
AD-59507
UGAGGCUGCUCCCGGACAAdT dT
UUGUCCGGGAGCAGCCUCAdT dT
31-49
4015
4016
AD-59519
CCAACAGACUCCUGAUGGAdT dT
UCCAUCAGGAGUCUGUUGGdT dT
562-580
4017
4018
AD-59391
UCACAUGGAAGCAAGUGGGdT dT
CCCACUUGCUUCCAUGUGAdT dT
2112-2130
4019
4020
AD-59537
CAUUCAAUGGAUGGGGCGGd TdT
CCGCCCCAUCCAUUGAAUGdTd T
1490-1508
4021
4022
AD-59450
AGGAAUGAGUCGCCACCCAdT dT
UGGGUGGCGACUCAUUCCUdT dT
1099-1117
4023
4024
AD-59449
UGGACUUAGAGCGGGAGCUd TdT
AGCUCCCGCUCUAAGUCCAdTd T
1209-1227
4025
4026
AD-59418
CUAAAAACACAGAAGUCUGdT dT
CAGACUUCUGUGUUUUUAGd TdT
1950-1968
4027
4028
AD-59561
CCCUCACCACACACCCCAGdTd T
CUGGGGUGUGUGGUGAGGGd TdT
2062-2080
4029
4030
AD-59460
AAUCCUUGCUUCAGGGACUdT dT
AGUCCCUGAAGCAAGGAUUdT dT
171-189
4031
4032
AD-59409
UUGUGGCAUUUGAAACUGUd TdT
ACAGUUUCAAAUGCCACAAdT dT
1470-1488
4033
4034
AD-59476
UCAAUUACCCUACGGUGCCdT dT
GGCACCGUAGGGUAAUUGAdT dT
2010-2028
4035
4036
AD-59406
CAAGCCAGCCCCUCGGGCAdTd T
UGCCCGAGGGGCUGGCUUGdT dT
460-478
4037
4038
AD-59569
GAGUCUUCCCUGCCUGGAUdT dT
AUCCAGGCAGGGAAGACUCdT dT
259-277
4039
4040
AD-59451
UGGAGAGUGUUGUUCGCCGd TdT
CGGCGAACAACACUCUCCAdTd T
339-357
4041
4042
AD-59553
ACCCCUUGCCUGCCACAAGdTd T
CUUGUGGCAGGCAAGGGGUdT dT
621-639
4043
4044
AD-59372
CUGGAUGGAUGAGUGGCUUd TdT
AAGCCACUCAUCCAUCCAGdTd T
272-290
4045
4046
AD-59377
CAAGAUGAUGGAAGUUGGGd TdT
CCCAACUUCCAUCAUCUUGdT dT
439-457
4047
4048
AD-59531
UUUCGUUUGGACUUCUCGAd TdT
UCGAGAAGUCCAAACGAAAdT dT
62-80
4049
4050
AD-59560
UCAUCUUCACCACCUCUCUdT dT
AGAGAGGUGGUGAAGAUGAd TdT
1749-1767
4051
4052
AD-59489
UGCCCAGUUCUUCCCGCUGdT dT
CAGCGGGAAGAACUGGGCAdT dT
132-150
4053
4054
AD-59540
AAAAAUGGACAUCAUUUCUdT dT
AGAAAUGAUGUCCAUUUUUdT dT
1639-1657
4055
4056
AD-59378
CUUGAGCUUCAGGAGGAUGd TdT
CAUCCUCCUGAAGCUCAAGdT dT
719-737
4057
4058
AD-59403
CCUCUCUGCCACCCAUGCUdTd T
AGCAUGGGUGGCAGAGAGGdT dT
1761-1779
4059
4060
AD-59493
AAAGUCAGGAUCCCUAAGAdT dT
UCUUAGGGAUCCUGACUUUdT dT
242-260
4061
4062
AD-59374
CGACCACGGAGGAAUCCUUdT dT
AAGGAUUCCUCCGUGGUCGdT dT
159-177
4063
4064
AD-59380
UUCCGUCUGGACACCCCUUdT dT
AAGGGGUGUCCAGACGGAAdT dT
609-627
4065
4066
AD-59576
CCACCCAUGCUGCUGGCUGdT dT
CAG CCAG CAGC AU G G G U G G dT dT
1769-1787
4067
4068
AD-59425
UGAGAAAAAGAAUGACCACdT dT
GUGGUCAUUCUUUUUCUCAd TdT
961-979
4069
4070
AD-59509
UAAGAUGAUGCCAGGCUGUdT dT
ACAGCCUGGCAUCAUCUUAdT dT
1309-1327
4071
4072
AD-59488
AGUUAUAUUAAAUUUUAAUd TdT
AUUAAAAUUUAAUAUAACUdT dT
2342-2360
4073
4074
AD-59486
UCUUCCCGCUGUGGGGACAdT dT
UGUCCCCACAGCGGGAAGAdT dT
140-158
4075
4076
AD-59465
UGCCACAAGCCAGGGCACUdT dT
AGUGCCCUGGCUUGUGGCAdT dT
631-649
4077
4078
AD-59484
AGCGCAGUUAUGCCCAGUUdT dT
AACUGGGCAUAACUGCGCUdT dT
122-140
4079
4080
AD-59368
GGACCAGGAGAAAGUCAGGdT dT
CCUGACUUUCUCCUGGUCCdT dT
232-250
4081
4082
AD-59464
UGUCCACUGCCCCAGCCACdTd T
GUGGCUGGGGCAGUGGACAdT dT
1903-1921
4083
4084
AD-59386
AUCGCGGCCUGAGGCUGCUdT dT
AGCAGCCUCAGGCCGCGAUdT dT
22-40
4085
4086
AD-59439
GGGGAUGUGGGGACCAGGAd TdT
UCCUGGUCCCCACAUCCCCdTd T
222-240
4087
4088
AD-59440
CUGGAAAUAAAUUCUUGCUdT dT
AGCAAGAAUUUAUUUCCAGdT dT
2380-2398
4089
4090
AD-59542
U U GAAACUGU CCAU U CAAU dT dT
AU U G AAU GGACAG U U U CAAdT dT
1479-1497
4091
4092
AD-59559
GUGGGGACACGACCACGGAdT dT
UCCGUGGUCGUGUCCCCACdT dT
150-168
4093
4094
AD-59586
CGCAGUGGGGCUUUAUGGGd TdT
CCCAUAAAGCCCCACUGCGdTd T
1579-1597
4095
4096
AD-59408
UUGUCUUUAUAUGUGAAUUd TdT
AAUUCACAUAUAAAGACAAdT dT
2322-2340
4097
4098
AD-59568
UCACCCUGGCUAAGAUGAUdT dT
AUCAUCUUAGCCAGGGUGAdT dT
1299-1317
4099
4100
AD-59398
GUAUCUGCUCAGGCCUGAGdT dT
CUCAGGCCUGAGCAGAUACdT dT
2243-2261
4101
4102
AD-59508
AUGAGUGGCUUCUUCUCCAdT dT
UGGAGAAGAAGCCACUCAUdT dT
280-298
4103
4104
AD-59523
GAAG U U G GGGCCAAG CCAGdT dT
CUGGCUUGGCCCCAACUUCdT dT
449-467
4105
4106
AD-59410
UCAGGGACUCGGGACCCUGdT dT
CAGGGUCCCGAGUCCCUGAdT dT
181-199
4107
4108
AD-59541
UCCUACGGAUUGCCCCCACdT dT
GUGGGGGCAAUCCGUAGGAdT dT
2043-2061
4109
4110
AD-59524
UUACUCUGAUUCUGGGAACdT dT
GUUCCCAGAAUCAGAGUAAdT dT
1333-1351
4111
4112
AD-59501
AUCCCUAAGAGUCUUCCCUdT dT
AGGGAAGACUCUUAGGGAUdT dT
251-269
4113
4114
AD-59383
UGCCAAAGUACAUCUUCCGdT dT
CGGAAGAUGUACUUUGGCAdT dT
1389-1407
4115
4116
AD-59577
UCCUCGGGUUUAGGGGAUGd TdT
CAUCCCCUAAACCCGAGGAdTd T
210-228
4117
4118
AD-59447
UGCUGAAACCUCAGCAGGCdT dT
GCCUGCUGAGGUUUCAGCAdT dT
769-787
4119
4120
AD-59555
CCACCCACGGGUGUGUGGGdT dT
CCCACACACCCG UGGGUGGdT dT
1111-1129
4121
4122
AD-59405
UGGUGCAGUAAUGACUACCdT dT
GGUAGUCAUUACUGCACCAdT dT
1079-1097
4123
4124
AD-59371
UUCUCCACCUAGAUUCUUUdT dT
AAAGAAUCUAGGUGGAGAAdT dT
292-310
4125
4126
AD-59443
UAAGGCGCCGGCGAUCGCGdT dT
CGCGAUCGCCGGCGCCUUAdT dT
9-27
4127
4128
AD-59401
UGGAACUAGUAAAUUCCAUdT dT
AUGGAAUUUACUAGUUCCAdT dT
1189-1207
4129
4130
AD-59494
GGACCCUGCUGGACCCCUUdT dT
AAGGGGUCCAGCAGGGUCCdT dT
192-210
4131
4132
AD-59504
UCAAUUAUUUCACUUAACCdT dT
GGUUAAGUGAAAUAAUUGAd TdT
2269-2287
4133
4134
AD-59369
CCCGGACAAGGGCAACGAGdT dT
CUCGUUGCCCUUGUCCGGGdT dT
41-59
4135
4136
AD-59571
UUUUAAAACUGUGAACCGGdT dT
CCGG U UCACAG U U UUAAAAdT dT
991-1009
4137
4138
AD-59527
GUGCUUCGCCGCCAGCACCdT dT
GGUGCUGGCGGCGAAGCACdT dT
1832-1850
4139
4140
AD-59466
UGGACCCCUUCCUCGGGUUdT dT
AACCCGAGGAAGGGGUCCAdT dT
201-219
4141
4142
AD-59526
CUGUAUAUUAAGGCGCCGGdT dT
CCGGCGCCUUAAUAUACAGdT dT
1-19
4143
4144
AD-59543
UUGCCCCCACCCCUCACCAdTd T
UGGUGAGGGGUGGGGGCAAd TdT
2052-2070
4145
4146
AD-59564
AUGGGGCGGUGUGCCCACUdT dT
AGUGGGCACACCGCCCCAUdTd T
1500-1518
4147
4148
AD-59583
CUAUAGUAAAAACAUAGUCdT dT
GACUAUGUUUUUACUAUAGd TdT
2361-2379
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS 1 исследовали в скрининге разовой дозы в клетках НерЗВ, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты по разовой дозе выполняли при концентрации дуплекса 10 нМ и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA). Результаты показаны в таблице 19 и выражены в виде процента оставшейся mRNA.
Таблица 19. Подавление mRNA ALAS1, определенное при помощи анализа с bDNA
Дуплекс
% оставшейся mRNA
AD-59453
11,2
1,5
AD-59395
12,7
1,1
AD-59477
14,5
2,0
AD-59492
14,8
2,1
AD-59361
15,1
4,9
AD-59462
15,4
2,6
AD-59433
15,8
2,7
AD-59424
16,0
1,7
AD-59414
16,1
1,3
AD-59539
16,2
2,6
AD-59400
16,2
1,8
AD-59551
16,3
2,3
AD-59482
16,6
2,1
AD-59448
16,6
3,7
AD-59392
16,9
3,5
AD-59469
16,9
2,2
AD-59431
17,0
2,0
AD-59423
17,1
3,8
AD-59517
17,2
1,5
AD-59578
17,3
AD-59495
17,7
3,7
AD-59432
17,7
2,8
AD-59382
17,9
3,2
AD-59472
18,6
3,5
AD-59459
18,7
3,8
AD-59413
18,8
2,4
AD-59478
18,9
3,0
AD-59376
18,9
3,2
AD-59556
18,9
2,4
AD-59399
19,0
4,1
AD-59474
19,4
1,6
AD-53542
19,4
1,7
AD-59480
19,6
1,6
AD-59549
19,7
2,1
AD-59515
19,8
4,4
AD-59427
19,9
3,2
AD-59390
19,9
3,4
AD-59511
19,9
2,2
AD-59532
20,0
2,4
AD-59562
20,2
2,6
AD-59513
20,3
3,9
AD-59362
20,6
2,5
AD-53541
20,6
2,2
AD-59490
20,7
2,3
AD-59422
20,8
4,5
AD-59467
21,2
2,3
AD-59579
21,2
3,3
AD-59426
21,7
2,3
AD-59363
21,7
2,7
AD-59436
21,7
2,7
AD-53536
21,9
1,5
AD-59491
21,9
2,6
AD-59500
22,2
2,8
AD-59394
22,3
10,1
AD-59441
22,3
2,6
AD-59365
22,4
4,2
AD-59411
22,5
2,9
AD-59544
22,5
2,1
AD-59428
22,7
4,7
AD-59471
22,9
5,0
AD-59518
22,9
2,3
AD-53547
22,9
1,5
AD-59573
23,0
4,2
AD-59473
23,2
1,8
AD-59412
23,4
2,5
AD-59522
23,4
3,3
AD-59502
23,6
2,7
AD-59499
23,6
1,6
AD-59520
23,8
3,8
AD-59581
23,9
6,0
AD-59461
24,3
4,2
AD-59370
24,3
5,6
AD-53540
24,4
2,1
AD-59574
24,5
2,0
AD-59375
24,6
2,3
AD-59387
24,8
7,2
AD-59397
24,9
9,6
AD-59396
25,0
10,2
AD-59393
25,3
11,6
AD-59483
25,4
3,8
AD-59430
25,5
1,8
AD-59463
25,6
4,8
AD-53534
25,9
3,1
AD-59514
26,2
5,7
AD-59575
26,2
3,2
AD-59364
26,2
4,5
AD-59402
26,3
3,1
AD-59479
26,3
2,5
AD-59481
26,4
2,2
AD-59530
26,4
4,4
AD-59582
26,6
3,9
AD-59506
27,0
4,1
AD-59567
27,3
AD-59485
27,7
4,7
AD-59525
28,3
3,1
AD-59566
28,5
0,6
AD-59580
28,7
7,1
AD-59512
29,5
2,5
AD-59475
29,6
4,2
AD-59438
29,6
3,3
AD-59442
29,9
2,8
AD-59516
30,4
3,8
AD-59429
30,8
4,3
AD-59510
31,3
1,9
AD-59457
31,4
1,2
AD-59434
31,6
3,5
AD-59454
32,0
1,9
AD-59468
32,2
3,2
AD-59565
32,4
1,5
AD-59416
32,7
1,7
AD-59420
33,2
3,1
AD-59552
33,2
2,2
AD-59558
33,8
3,8
AD-59404
34,0
5,4
AD-59455
34,8
1,3
AD-59496
34,9
5,2
AD-59446
35,5
1,7
AD-59435
35,9
1,2
AD-59419
36,0
1,4
AD-59533
36,7
3,7
AD-59366
36,7
6,0
AD-59521
36,9
4,3
AD-59563
36,9
4,1
AD-59534
36,9
3,3
AD-59407
37,1
4,7
AD-59445
37,2
3,2
AD-59546
37,9
4,9
AD-59456
38,3
4,0
AD-59503
38,8
5,0
AD-59536
39,8
4,2
AD-59385
39,9
13,7
AD-59367
40,0
3,6
AD-59458
40,0
3,4
AD-59381
40,3
9,9
AD-59538
40,8
4,9
AD-59421
40,9
6,4
AD-59388
41,0
9,1
AD-59444
41,1
2,7
AD-59528
41,9
3,3
AD-59498
42,2
3,3
AD-59497
42,4
4,9
AD-59384
42,7
17,6
AD-59452
42,7
3,1
AD-59379
43,6
2,6
AD-59529
43,8
4,8
AD-59389
44,1
6,4
AD-59585
44,3
3,2
AD-59570
45,1
4,0
AD-59415
46,6
2,3
AD-59505
47,5
6,2
AD-59557
48,1
4,4
AD-59548
49,9
4,0
AD-59487
50,7
3,2
AD-59550
50,8
5,8
AD-59572
51,1
4,0
AD-59554
51,3
6,0
AD-59437
52,2
4,8
AD-59584
54,9
2,7
AD-59373
55,3
20,1
AD-59545
55,4
3,4
AD-59547
55,9
4,7
AD-59470
56,0
2,7
AD-59417
56,4
7,7
AD-59535
57,6
5,1
AD-59507
58,8
4,7
AD-59519
59,1
5,6
AD-59391
60,1
12,5
AD-59537
60,6
9,1
AD-59450
60,7
7,2
AD-59449
61,6
6,8
AD-59418
61,8
8,4
AD-59561
62,2
7,2
AD-59460
62,8
4,7
AD-59409
64,4
9,0
AD-59476
65,2
5,6
AD-59406
65,6
3,5
AD-59569
66,7
7,6
AD-59451
66,9
2,9
AD-59553
67,2
8,8
AD-59372
67,3
25,6
AD-59377
68,7
5,1
AD-59531
68,7
9,0
AD-59560
68,7
12,7
AD-59489
69,6
8,9
AD-59540
70,1
10,1
AD-59378
70,6
14,1
AD-59403
71,4
3,3
AD-59493
72,3
3,5
AD-59374
75,9
5,1
AD-59380
76,4
11,1
AD-59576
77,5
16,2
AD-59425
77,9
10,6
AD-59509
78,0
3,2
AD-59488
78,6
7,1
AD-59486
79,4
5,0
AD-59465
79,5
5,1
AD-59484
79,8
3,2
AD-59368
80,0
11,9
AD-59464
80,2
9,3
AD-59386
80,6
33,2
AD-59439
80,9
4,0
AD-59440
82,2
1,9
AD-59542
83,3
10,6
AD-59559
83,7
9,1
AD-59586
83,8
11,5
AD-59408
86,3
2,8
AD-59568
86,8
4,2
AD-59398
87,4
24,9
AD-59508
87,5
2,5
AD-59523
87,6
11,8
AD-59410
88,8
8,3
AD-59541
88,9
10,8
AD-59524
89,5
12,1
AD-59501
89,9
5,1
AD-59383
90,8
27,4
AD-59577
91,1
2,3
AD-59447
91,3
12,9
AD-59555
91,7
3,4
AD-59405
92,5
5,7
AD-59371
93,5
31,7
AD-59443
93,8
9,0
AD-59401
94,5
7,1
AD-59494
95,1
9,1
AD-59504
96,8
11,7
AD-59369
96,8
4,8
AD-59571
97,4
7,0
AD-59527
98,6
7,8
AD-59466
99,7
14,0
AD-59526
102,9
4,6
AD-59543
103,7
3,0
AD-59564
103,7
12,1
AD-59583
112,4
13,2
Двести тридцать два дуплекса, которые были исследованы, подавляли mRNA ALAS1 в различной степени в этом анализе разовой дозы. Согласно этому анализу, по меньшей мере четыре из дуплексов (AD-59453, AD-59395, AD-59477 и AD-59492) подавляли mRNA ALAS1 на 85% или более, 39 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 80% или более, 101 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 70% или более, и 152 из дуплексов подавляли mRNA ALAS1 на 50% или более. В противоположность, некоторые дуплексы не характеризовались заметным подавлением в данном анализе.
Пример 13. Дозочувствительное ингибирование предшественников
порфиринов ALA и PBG при помощи siRNA ALAS1
Дозочувствительные эффекты siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели АГР (см. пример 5). В этой модели показана -30% остаточная активность PBGD, ~2-кратное повышение исходных уровней ALA и PBG, ~30-100-кратное повышение уровней ALA и PBG после индукции инъекциями фенобарбитала раз в день в течение 3-4 дней. У более старых животных наблюдалась дегенерация аксонов и нарушенная двигательная функция.
siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. На 1 день мышам вводили 1 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг или 0,05 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Вводили три инъекции фенобарбитала (1 инъекция в сутки на 2, 3 и 4 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфирина, ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5 день, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день. Результаты показаны на ФИГ. 16. siRNA ALAS1 ингибировала уровни ALA и PBG дозозависимым образом. Ингибиторный эффект на уровни ALA в плазме наблюдали в дозах siRNA ALAS1 до 0,05 мг/кг, а ингибиторный эффект на уровни PBG в плазме отмечали в дозах siRNA до 0,1 мг/кг.
Пример 14. Стойкое ингибирование предшественников порфиринов ALA и PBG при помощи siRNA ALAS1
Стойкость эффектов siRNA ALAS1 исследовали в мышиной модели АГР (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на ФИГ. 17. На 1 день мышам вводили 1 мг/кг siRNA ALAS1 или контроль LUC AD-1955 путем внутривенной инъекции. Три инъекции фенобарбитала вводили на 0 неделе (1 инъекция в день на 2, 3 и 4 дни), 2 неделе (1 инъекция в день на 15, 16и17 дни) и 4 неделе (1 инъекция в день на 29, 30 и 31 дни) для индукции ALAS1 в печени и предшественников порфиринов ALA и PBG. Образцы плазмы и ночной мочи собирали на 5, 18 и 32 дни, а уровни метаболитов измеряли при помощи LC-MS. Исходные уровни ALA и PBG измеряли перед первой обработкой на 1 день.
Как показано на ФИГ. 17, siRNA ALAS1 оказывала стойкий эффект в снижении уровней ALA и PBG в плазме. Введение siRNA ALAS1 подавляло уровни ALA и PBG в плазме по меньшей мере в течение 2 недель. Из этих результатов видно, что siRNA ALAS1 является эффективным лекарственным препаратом для снижения повышенных уровней ALA и PBG и, таким образом, может использоваться в профилактике, например, для снижения хронически повышенных уровней ALA и PBG и для предупреждения рецидивирующих приступов порфирий.
Пример 15. siRNA ALAS1 обеспечивает более быстрое наступление действия по сравнению с лечением гемином
Эффекты обработки siRNA ALAS1 сравнивали с эффектами обработки гемином в мышиной модели АГР (см. пример 5). siRNA ALAS1, используемая в этом примере, представляла собой дуплекс AD-53558 в составе AF11. Схема эксперимента и результаты этого эксперимента показаны на ФИГ. 18. Фенобарбитал (РВ) и диэтилдитиокарбамат (DDC) вводили на 1, 2 и 3 дни. DDC представляет собой другой индуктор р450, который, как и фенобарбитал, повышает потребность в геме и способствует продлению индукции метаболитов ALA/PBG.
Гемин в дозе 4 мг/кг, siRNA ALAS1 в дозе 2 мг/кг или контрольный лекарственный препарат вводили внутривенно через 8 часов после последней дозы РВ и DDC.
Как показано на ФИГ. 18, наступление действия лекарственного препарата было более быстрым при лечении siRNA ALAS1 по сравнению с лечением гемином. Быстрое снижение уровней ALA и PBG при лечении siRNA указывает на то, что siRNA является эффективным лекарственным препаратом для лечения острых приступов, поскольку ожидается, что быстрое улучшение клинических симптомов будет сопровождаться снижением уровней ALA и PBG.
Пример 16. Эффекты AD-58632 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1
AD-58632 представляет собой дуплекс из 21/23 нуклеотидов, раскрытых в примере 11. AD-58632 нацелен на транскрипт человека NM_ 000688.4, а также является кросс-реактивным по отношению к mRNA-транскриптам мышей, крыс и макак-крабоедов. AD-58632 был единственным кросс-реактивным дуплексом из 21/23 нуклеотидов, идентифицированным в результате скрининга приблизительно 45 соединений. Дополнительные эксперименты с этим дуплексом описаны в данном примере.
Дозозависимые эффекты AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1 У крыс исследовали дозозависимый эффект AD-58632 в подавлении mRNA ALAS1 относительно mRNA GAPDH. Исследовали дозы 30 мг/кг, 10 мг/кг и 3 мг/кг. Уровни mRNA ALAS1 измеряли в печени через 72 часа после последней дозы. AD-58632, по сравнению с контролем PBS, подавлял mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. ФИГ. 19). AD-58632 характеризовался разовой дозой ED50 приблизительно 10 мг/кг.
Эффекты AD-58632 в крысиной модели АГР
Дозозависимый эффект конъюгата AD-58632 на основе GalNAc с siRNA ALAS1 дополнительно исследовали в крысиной модели АГР. В этой модели siRNA в LNP использовали для нокдауна уровня PBGD исключительно в печени до индукции потребности в геме фенобарбиталом. Крысиная модель АГР характеризуется временным нокдауном siRNA PBGD в печени, характеризуется -15% остаточной активностью mRNA PBGD и характеризуется приблизительно 10-50-кратным повышением уровней ALA и PBG при индукции суточной инъекцией фенобарбитала в течение трех дней.
Схема эксперимента показана на ФИГ. 20. Исследовали четыре группы крыс. Одну группу обрабатывали только фенобарбиталом (РВ) в указанные временные точки. Вторую группу обрабатывали фенобарбиталом и siRNA порфобилиногендезаминазы (PBGD). Третья группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 30 мг/кг siRNA ALAS1. Четвертая группа получала фенобарбитал, siRNA PBGD и дозу в 10 мг/кг siRNA ALAS1. Как показано на ФИГ. 20, siRNA PBGD вводили внутривенно на 1 день. siRNA ALAS1 с GalNAc вводили на 4 день. Инъекции фенобарбитала вводили на 4, 5, 6 и 7 дни. Мочу
собирали в течение 24-часового периода, начиная на 7 день и заканчивая на 8 день. Уровни mRNA PBGD, mRNA GAPDH и mRNA ALAS-1 оценивали на 8 день при помощи анализа с bDNA. Уровни PBG и ALA в моче определяли при помощи LC-MS.
Результаты по mRNA показаны на ФИГ. 21. siRNA PBGD снижала уровень mRNA PBGD, но не снижала уровень mRNA ALAS1. siRNA ALAS1 снижала уровни mRNA ALAS1 дозозависимым образом (см. ФИГ. 21). Результаты по уровням ALA и PBG показаны на ФИГ. 22. siRNA ALAS1 снижала уровни ALA и PBG дозозависимым образом (см. ФИГ. 22).
Пример 17. Введение дробных доз AD-58632
Эффективность конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 AD-58632 исследовали в двух отдельных парадигмах с введением дробных доз. Для каждого из этих исследований использовали самок крыс линии Sprague Dawley. Крыс содержали в SCLR (комната со световым циклом, в которой в течение 12 часов свет включен и в течение 12 часов свет выключен) и выводили из эксперимента через 72 часа после последней инъекции. Уровни mRNA ALAS 1 и GAPDH в печени измеряли при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA).
Парадигма пяти суточных доз против разовой болюсной дозы В первой парадигме группам крыс вводили либо пять доз siRNA (по одной дозе каждый день), либо разовую болюсную дозу, которая содержала такую же общую концентрацию, как и сумма из пяти отдельных доз. В частности, крыс закрепляли за одним из следующих условий обработки: (1) подкожная инъекция по 6 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (2) подкожная инъекция по 2 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (3) подкожная инъекция по 1 мг/кг siRNA раз в день в течение пяти дней, (4) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 30 мг/кг siRNA, (5) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 10 мг/кг siRNA, (6) подкожная инъекция разовой болюсной дозы из 5 мг/кг siRNA или (7) контрольный лекарственный препарат, представляющий собой PBS.
Результаты показаны на ФИГ. 23. В этой парадигме разовая болюсная доза siRNA оказывала большее подавление mRNA ALAS1, чем повторное введение доз той же концентрации siRNA в течение пяти дней. Это было справедливо для всех изученных доз.
Введение дозы раз в неделю в течение четырех недель
При второй парадигме крысам вводили подкожные инъекции siRNA в одной из трех доз (10 мг/кг, 5 мг/кг или 2,5 мг/кг) раз в неделю в течение четырех недель. Контрольная группа получала инъекции PBS.
Результаты показаны на ФИГ. 24. По сравнению с введением разовой дозы, введение четырех доз раз в неделю по 10 мг/кг повышало достигаемый максимальный нокдаун (ED50 составляет 10 мг/кг в разовой дозе). В отличие от этого введение нескольких доз по 5 и 2,5 мг/кг в неделю при этой парадигме не повышало сайленсинг. Пример 18. Идентификация и исследование siRNA ALAS1 с более КОРОТКИМИ смысловой и антисмысловой нитями
Дополнительные эксперименты проводили для исследования эффектов укорочения дуплексов siRNA до 19-19 нуклеотидов. Были выявлены пять дополнительных новых кросс-реактивных дуплексов из 19-19 нуклеотидов, которые связываются с mRNA-транскриптами ALAS1 человека (h) (NM_000688.4), макака-резус (rh) (XM_001090440.2), мыши (m) (NM_020559.2) и крысы (г) (NM_024484.2). Ни один из этих дуплексов не характеризовался такими же хорошими результатами, как AD-58632 из 21/23 нуклеотидов (см. ФИГ. 25).
Исследовали эффекты модификации длины и выступающих концов в отношении двух лучших дуплексов из 19-19 нуклеотидов (AD-59115 и AD-59125) (ФИГ. 26 и 27). Модифицированные последовательности показаны в таблице 21.
*Некомплементарный выступающий конец
Выступающие концы повышали эффективность. Они также представляли дополнительную производную последовательность (AD-60489, который был основан на AD-60095) для дополнительных исследований связи структура-активность (SAR) (1 ошибочно спаренное основание в положении 23 грызуна).
Пример 19. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1
ALAS1
Исследовали эффекты дополнительного дуплекса AD-60489 на основе конъюгата GalNAc с siRNA ALAS1 и сравнивали их с эффектами AD-58632. Последовательности таких дуплексов показаны в таблице 22А. AD-60489 содержит одно ошибочно спаренное основание по отношению к mRNA ALAS1 грызуна на З'-конце антисмысловой нити. Таким образом, в случае если AD-58632 полностью комплементарен последовательностям человека, макака-крабоеда, мыши и крысы, то AD-60489 полностью комплементарен только последовательностям человека и макака-крабоеда.
Подавление mRNA ALAS1 показано на ФИГ. 28. По сравнению с AD-58632, AD-60489 обеспечивал более эффективное подавление при 3 мг/кг и 10 мг/кг и характеризовался приблизительно двукратным улучшением ED50. Разовая доза ED50 AD-60489 составляла приблизительно 5 мг/кг.
Пример 20. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах
Эффективность AD-58632 и AD-60489 в подавлении mRNA в печени исследовали у отличных от человека приматов. Схема эксперимента показана на ФИГ. 29. Дозы siRNA (5 мг/кг, 2,5 мг/кг или 1,25 мг/кг) или контроля PBS в объеме 2 мл/кг вводили подкожно каждый день в течение 5 дней, затем каждые 2 дня в течение 3 недель. Сайленсинг mRNA
ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 15 день. Биопсию брали после забора сыворотки и до введения дозы 10 (см. ФИГ. 29). Образцы сыворотки для способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и 43 дни. Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на -3, 6, 30 и 43 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP).
AD-58632 и AD-60489 подавляли уровни mRNA ALAS1 в печени дозозависимым образом (см. ФИГ. 30). AD-60489 характеризовался более высокой эффективностью, чем AD-58632. Например, в наименьшей изученной дозе (1,25 мг/кг) AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS 1 на приблизительно 42% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 характеризовался незначительным подавлением в этой дозе. При 2,5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 26% от контрольного уровня, в то время как AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 64% от контрольного уровня. При 5 мг/кг AD-60489 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 21% от контрольного уровня, a AD-58632 подавлял относительный транскрипт ALAS1 на приблизительно 55% от контрольного уровня.
Результаты клинической биохимии указывали, что длительный нокдаун ALAS 1 при помощи siRNA ALAS1 был безопасным и хорошо переносился. Повышений уровней ALT, AST или ALP отмечено не было.
Пример 21. Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в исследованиях на отличных от человека приматах, которые оценивали при помощи анализа cERD
Эффекты AD-60489 и AD-58632 на основе конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 оценивали у отличных от человека приматов при помощи способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD). Этот способ описан, например, в Sehgal, A. et al. Quantitation of tissue-specific target gene modulation using circulating RNA (постер, представленный 9 февраля 2012 г. на симпозиуме Keystone Gene Silencing by small RNAs
(Ванкувер, 7-12 февраля, 2012 г.) и Sehgal, A. et al. Tissue-specific gene silencing monitored in circulating RNA, RNA, 20: 1-7, опубликованном во всемирной сети Интернет 19 декабря 2013 г. Как показано на ФИГ. 29, образцы сыворотки для способа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) собирали на -10, -3, 7, 15, 23, 31 и 43 дни.
Для анализа cERD образцы сыворотки размораживали на льду. 375-400 мкл 8 М LiCl добавляли к 3-3,5 мл сыворотки в ультрацентрифужные (UC) пробирки и инкубировали при температуре 4°С в течение по меньшей мере 1 часа. PBS добавляли сверху каждой UC пробирки, оставляя приблизительно 1 см сухого пространства сверху, чтобы предупредить сжатие стенок пробирок во время вращения. Пробирки сушили с удалением любого конденсата вследствие инкубации на льду. Образцы загружали в МС 55 Rotor под крышку и образцы центрифугировали при 150000-200000 g в течение 100-120 минут. Супернатант удаляли из осадка. 1 мл тризола добавляли к осадку в UC пробирке, пробирку перемешивали на вортексе и содержимое переносили в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку. В каждую пробирку добавляли 200 мкл хлороформа и пробирку несколько раз опрокидывали верх дном для перемешивания. За один раз получали один образец. Образцы центрифугировали при 13000 об./мин. в течение 10-20 минут при 4°С. Верхнюю водную фазу переносили в свежую 1,5 мл пробирку (объем -500 мкл). Равные объемы 100% изопропанола, 1 мкл линейного акриламида (4°) и 1/10ую объема 3MNaoAc с рН 5,5 или менее добавляли к каждому образцу (как правило, 500 мкл изопропанола и 50 мкл NaoAc). Образец центрифугировали при 13000 об./мин. в течение 10 минут при 4°С. Супернатанты откладывали. Осадок промывали два раза охлажденным 70% ЕЮН (500 мкл при каждой промывке) и центрифугировали при 13000 об./мин. в течение ~5 минут при 4°С после каждой промывки. Осадку позволяли высохнуть на воздухе в течение ~5 минут и затем ресуспендировали в 20 мкл NF НгО 10 мкл использовали в реакции с cDNA. Ресуспендированную РНК хранили при -80°С. Результаты
Нокдаун mRNA в сыворотке, как было оценено при помощи анализа cERD, коррелировал с результатами, полученными в результате биопсии печени. См. ФИГ. 31. Это является неожиданным результатом, поскольку ALAS1 не является сывороточным белком. Анализ cERD, представленный в данном документе, способствует отслеживанию циркулирующей mRNA ALAS1. Это имеет преимущество, например, в том, что уровни
mRNA ALAS 1 можно измерять со временем без периодических биопсий печени, что было бы технически сложным и дорогостоящим.
Кинетику нокдауна mRNA определяли с помощью результатов анализа cERD. См. ФИГ. 32. AD-60489 обеспечивал более чем 50% нокдаун, даже в дозе лишь 1,25 мг/кг.
Пример 22. Исследования безопасности siRNA ALAS1
Дополнительные исследования безопасности указывают на то, что длительный нокдаун ALAS1 является безопасным и хорошо переносится. Исследования на отличных от человека приматах
Как описано выше (см. пример 20), в исследованиях на отличных от человека приматах повышений уровней ALT, AST или ALP после введения AD-60489 и AD-58632 не наблюдали.
Исследования на крысах
На крысах в течение четырех недель проводили исследование с применением AD-58632. siRNA вводили каждый день в течение 5 дней по 10 мг/кг в первую неделю, затем через день по 10 мг/кг в течение 2-4 недель исследования. Общее воздействие составило 140 мг. Побочных клинических признаков или изменений веса тела не наблюдали. Изменений, связанных с исследуемым препаратом, в параметрах крови или свертываемости крови не наблюдали. Кроме того, не наблюдали побочной гистопатологической картины. Наблюдали минимальную вакуолизацию в селезенке и минимальный субкапсулярный фиброз в почке.
Исследования на мышах
У мышей mRNA Р450 оценивали после нокдауна ALAS1. Наблюдали незначительные дозозависимые повышения Сур2Ь10 через 48 часов после введения состава LNP с ALAS1. Через 168 часов происходил возврат к норме.
Пример 23. Идентификация дополнительных эффективных siRNA ALAS1 с помощью исследований связи структура-активность
Исследования связи структура-активность (SAR), в том числе исследования, описанные в других примерах в данном документе, проводили для идентификации дополнительных эффективных siRNA ALAS1, полученных из таковых, которые уже были идентифицированы, например, AD-58632 и AD-60489. Исследовали эффекты химических модификаций. Химические модификации включают 1) 2'-0-метил- против 2'-фтор-модификаций, 2) снижение 2'Uf (2'-фтор-модификации), 3) добавление PS (фосфоротиоата), 4) использование внутренних dT, и/или 5) гликоль-нуклеиновые кислоты (GNA). Не желая быть связанными теорией, модификации могут усиливать эффективность, например, посредством 1) лучшего раскручивания или повышенной нагрузки RISC или 2) лучшим каталитическим захватом цели. Модификации также могут усиливать стабильность таким образом, что соединения могут накапливаться и функционировать эффективнее при введении нескольких доз.
Повышенную активность относительно других дуплексов (например, AD-58632 и/или AD-60489) наблюдали в некоторых случаях (см. таблицу 22В), в то время как в других случаях наблюдали подобную активность (см. таблицу 23) или сниженную активность (таблица 24). Эти случаи представлены лишь в качестве примеров на основании скрининга более чем 150 siRNA. В данном документе представлены дополнительные примеры исследований SAR.
Таблица 23. Подобная активность относительно исходных соединений и повышенная
стабильность
Дуплекс
IC50
Смысловая (от 5' к 3')
Антисмысловая (от 5' к 3')
AD-58632.10
(исходное)
0,017
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96 (SEQ ID NO: 4204)
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg (SEQ ID NO: 4205)
AD-60886.1
0,801
GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96 (SEQ ID NO: 4206)
asAfsgAf(Ag n)Gf aUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg (SEQ ID NO: 4207)
Пример 24. In vitro исследования связи структура-активность AD-58632
Получали AD-58632 и производные siRNA AD-58632 и некоторые siRNA отслеживали in vitro в отношении активности. Сокращения химических модификаций представлены в таблице 1. In vitro активность при 10 нМ и 0Л нМ siRNA
In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS 1 исследовали в клетках НерЗВ, которые трансфицировали с использованием Lipofectamine2000 в качестве средства трансфекции. Эксперименты проводили при указанных концентрациях siRNA (например, 0,1 нМ, 10 нМ) и анализировали при помощи анализа с разветвленной ДНК (bDNA) через 24 часа после трансфекции. Результаты выражали в виде процента оставшейся mRNA относительно siRNA AD-1955, нецелевой siRNA, которую использовали в качестве отрицательного контроля.
Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены в таблице 25, таблице 26 и таблице 27.
4272
4273
873 - 895
AD-60403.1
gsasaaGfaGfuGfudCudCaucdTucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
25,28
1,68
105,23
23,99
4274
4275
873 - 895
AD-60409.1
gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
30,48
1,88
72,34
3,34
4276
4277
873 - 895
AD-60415.1
gsasaaGfaGfuGfudCudCadTcdTudCuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
25,28
7,10
69,53
10,72
4278
4279
873 - 895
AD-60421.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucuuucsusg
59,28
5,83
66,88
0,63
4280
4281
873 - 895
AD-60427.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcdTcuuucsusg
34,80
8,13
79,65
11,25
4282
4283
873 - 895
AD-60432.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfcucdTuucsusg
46,78
6,42
79,19
16,72
4284
4285
873 - 895
AD-60438.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcdTcuuucsusg
32,07
9,46
57,87
10,18
4286
4287
873 - 895
AD-60444.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfadTgAfgAfcAfcucdTuucsusg
55,55
10,17
89,52
3,91
4288
4289
873 - 895
AD-60404.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfa(Tgn)gAfgAfcAfcucuuucsusg
50,06
9,17
93,46
2,56
4290
4291
873 - 895
AD-60410.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
asAfsGfAfaGfaugAfgAfcAfc(Tgn)cuuucsusg
44,40
13,93
88,96
6,06
4292
4293
873 - 895
AD-60416.1
gsasaaGfaGfuGfucucaucuucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu c(Tg n) u u cs usg
28,56
7,82
76,36
19,47
4294
4295
873 - 895
AD-60422.1
GfsasAfaGfAfGfuGf(Tgn)cucaucuucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
40,37
10,86
84,06
12,08
4296
4297
873 - 895
AD-60428.1
GfsasAfaGfAfGfuGfuc(Tgn)caucuucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
56,81
22,64
92,15
0,26
4298
4299
873 - 895
AD-60433.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc(Agn)ucuucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
36,78
5,31
67,92
12,55
4300
4301
873 - 895
AD-60439.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuca(Tgn)cuucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
32,81
6,72
77,93
13,33
4302
4303
873 - 895
AD-60445.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
13,25
3,28
78,08
4,05
4304
4305
873 - 895
AD-60451.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucu(Tgn)cuuL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
34,74
11,06
88,93
5,19
4306
4307
873 - 895
AD-60457.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucuuc(Tgn)uL96
as Afs Gf Af a Gf a ug Afg Af cAf cu cuuucsusg
41,26
6,16
92,15
0,64
4308
4309
873 - 895
AD-60463.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuAfL96
usAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
19,58
7,98
69,67
4,64
4310
4311
873 - 895
AD-60469.1
CfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfgsasc
19,35
9,30
72,30
0,50
4312
4313
873 - 895
AD-60474.1
CfsusAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuAfgsasc
21,60
4,27
76,35
11,71
4314
4315
873 - 895
AD-60479.1
CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsasc
28,01
4,45
76,55
27,32
4316
4317
873 - 895
AD-60484.1
CfsusUfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfaAfgsusg
20,31
3,08
71,99
9,53
4318
4319
873 - 895
AD-60446.1
GfsusUfuGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcAfaAfcsusg
18,65
5,11
73,52
17,87
4320
4321
873 - 895
AD-60452.1
GfsasUfuCfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfgAfaUfcsusg
28,72
1,21
83,09
15,75
4322
4323
873 - 895
AD-60458.1
GfsasAfuCfuGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcAfgAfuUfcsusg
50,15
13,02
114,93
11,58
4324
4325
873 - 895
AD-60464.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
(Ag n)AfsgAf aGf aUfgAfg acAfcUfcUfu Ufcsusg
35,71
5,07
103,88
3,01
4326
4327
873 - 895
AD-60470.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
17,59
0,78
73,15
11,75
4328
4329
873 - 895
AD-60475.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfullfcsusg
22,07
4,57
68,64
25,12
4330
4331
873 - 895
AD-60480.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
15,54
1,22
66,39
14,34
4332
4333
873 - 895
Н.Д.
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4334
4335
873 - 895
AD-60447.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
31,33
4,75
104,36
7,71
4336
4337
873 - 895
AD-60453.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAf aGfa(Tg n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg
15,42
0,90
76,29
0,41
4338
4339
873 - 895
AD-60459.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAf aGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
27,70
10,91
89,20
3,46
4340
4341
873 - 895
AD-60465.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg
28,44
6,84
87,28
5,73
4342
4343
873 - 895
AD-60471.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus
24,03
8,87
85,86
14,62
4344
4345
873 - 895
AD-60476.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus
21,48
5,53
88,73
25,48
4346
4347
873 - 895
AD-60481.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfu(Tgn) L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
15,18
4,19
68,10
6,86
4348
4349
873 - 895
AD-60486.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCf(Tgn)U fL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
15,31
0,31
74,06
8,48
4350
4351
873 - 895
AD-60448.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
14,89
1,35
59,22
6,64
4352
4353
873 - 895
AD-60454.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
19,24
5,72
75,90
1,27
4354
4355
873 - 895
AD-60460.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
14,91
5,84
60,11
6,01
4356
4357
873 - 895
AD-60466.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
13,99
7,53
56,83
11,59
4358
4359
873 - 895
AD-60472.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
12,35
0,60
64,36
11,74
4360
4361
873 - 895
AD-60477.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
15,62
1,76
65,96
7,77
4362
4363
873 - 895
AD-60482.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
18,58
6,43
66,67
2,31
4364
4365
873 - 895
AD-60487.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
34,89
15,62
86,39
6,10
4366
4367
873 - 895
AD-60449.1
GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
22,65
80,09
0,75
4368
4369
873 - 895
AD-60455.1
GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
31,05
2,82
104,24
23,01
4370
4371
873 - 895
AD-60461.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfu(Cgn)uUf L96
asAfs(Ggn)AfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
16,30
2,08
85,78
22,00
4372
4373
873 - 895
AD-60467.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUf(Tgn)CfuU fL96
asAfsg(Agn)aGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
17,77
8,38
82,16
18,92
4374
4375
873 - 895
AD-60473.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
14,64
4,25
61,05
7,88
4376
4377
873 - 895
Н.Д.
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfuU fL96
asAfsgAfa(Ggn)aUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4378
4379
873 - 895
AD-60483.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfa(Tgn)cUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGf(Agn)UfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
26,18
2,83
91,12
16,03
4380
4381
873 - 895
AD-60488.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCf(Agn)UfcUfuCfuU fL96
asAfsgAf aGfa(Tg n)g Afg acAfcUfcUfu Ufcsusg
24,74
0,56
87,66
7,90
4382
4383
873 - 895
AD-60450.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu(Cgn)aUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAf aGfaUf(Gg n)Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
37,09
2,89
111,90
1,97
4384
4385
873 - 895
AD-60456.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCf(Tgn)CfaUfcUfuCfuU fL96
asAfsgAfaGfaUfg(Agn)gacAfcUfcUfuUfcsusg
41,82
0,60
102,56
11,25
4386
4387
873 - 895
AD-60462.1
GfsasAfaGfaGfuGfUf(Cgn)uCfaUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAf(Ggn)acAfcUfcUfuUfcsus
38,91
3,89
122,47
35,17
4388
4389
873 - 895
AD-60468.1
GfsasAfaGfaGfuGf(Tgn)CfuCfaUfcUfuCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfg(Agn)cAfcUfcUfuUfcsus
28,44
3,05
97,09
2,66
4390
4391
873 - 895
AD-60550.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
20,35
0,63
69,13
22,65
4392
4393
873 - 895
AD-60555.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
19,17
8,76
68,86
17,72
4394
4395
873 - 895
AD-60560.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfsL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg
25,71
5,66
67,63
27,72
4396
4397
873 - 895
AD-60565.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfscUfsuCfuUfs L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfscUfsuUfscsusg
22,78
7,32
74,11
1,85
Как показано в таблице выше, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавление, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-58632, AD-60472, AD-60423, AD-60445, AD-60423, AD-60417, AD-60466, AD-60473, AD-60434, AD-60448, AD-60460, AD-60411, AD-60481, AD-60486, и AD-60453, AD-60480, AD-60405, AD-60477, AD-60461, AD-60470, AD-60467, AD-60482, AD-60446, AD-60555, AD-60454, AD-60469 и AD-60463. Кроме того, в данном in vitro скрининге siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS 1 (более чем 30% подавление, так что оставалось менее 70% mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60423, AD-58632, AD-60434, AD-60423, AD-60466, AD-60419, AD-60438, AD-60448, AD-60460, AD-60473, AD-60411, AD-60405, AD-60472, AD-60477, AD-60417, AD-60480, AD-60482, AD-60421, AD-60560, AD-60433, AD-60481, AD-60475, AD-60555, AD-60437, AD-60550, AD-60415, AD-60463, и AD-60443.
Как показано в таблице ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60445, AD-60480, AD-60460 и AD-60466, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-58632, AD-60405, AD-60423, AD-60434, AD-60419, AD-60480, AD-60460 и AD-60466.
4444
4445
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAfaGfaugAfgAfcAfcucuuucsusg
4446
4447
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAfaGfaugAfgacAfcu cuuucsusg
4448
4449
873 - 895
AD-60480.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAf(Ag n)Gf aUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
15,5
1,2
66,4
14,3
4450
4451
873 - 895
gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96
asAfsgAf(Ag n)Gf aUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
4452
4453
873 - 895
gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96
asAfsgAf(Ag n)Gf aUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
4454
4455
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsus
4456
4457
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAf(Ag n)Gf aUfg Afg acAfcUfcUfu Ufcsus
4458
4459
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6
asAfsgAfs(Agns)GfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcs usg
4460
4461
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcu cuuucsusg
4462
4463
873 - 895
gsasaagaGfuGfuCfuCfaucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcu cuuucsusg
4464
4465
873 - 895
gsasaagaGfuGfuCfucaucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4466
4467
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfdTcucaucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcu cuuucsusg
4468
4469
873 - 895
GfsasAfaGfAfGfuGfucucauc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAfgacAfcu cuuucsusg
4470
4471
873 - 895
Gfs as Af aGfAf Gfu Gfucucaucs(Tgns)ucuuL9 6
asAfsgAfs(Agns)GfaugAfgacAfcucuuucsusg
4472
4473
873 - 895
AD-58632.8
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
11,8
2,7
46,7
4,2
4474
4475
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4476
4477
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4478
4479
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4480
4481
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsuCfsuUf sL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4482
4483
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfcUfsucsuUfs L96
asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4484
4485
873 - 895
AD-60460.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
14,9
5,8
60,1
6,0
4486
4487
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4488
4489
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4490
4491
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)uCfuUf L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4492
4493
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)suCfsu UfsL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4494
4495
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUfc(Tgn)sucsu UfsL96
asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4496
4497
873 - 895
AD-60466.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
14,0
7,5
56,8
11,6
4498
4499
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
4500
4501
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4502
4503
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfuCfu UfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4504
4505
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)UfsuCfs uUfsL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
4506
4507
873 - 895
GfsasAfaGfaGfuGfdTCfuCfaUf(Cgn)Ufsucs uUfsL96
asAfsGfAfaGfaUfgAfgacAfcdTcUfuUfcsusg
1С 5 0 на основе активности in vitro
Аналогично экспериментам, описанным выше, проводили дополнительные эксперименты доза-ответ при конечной концентрации дуплексов 10 нМ, 1,66667 нМ, 0,277778 нМ, 0,046296 нМ, 0,007716 нМ, 0,001286 нМ, 0,000214 нМ и 3,57Е-05 нМ и рассчитывали величины IC50.
4574
4575
873 - 895
AD-60445.2
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg
0,077
4576
4577
873 - 895
AD-60890.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
1,201
4578
4579
873 - 895
AD-60445.3
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsGfAfaGfaugAfgAf cAfcucuuucsusg
0,302
4580
4581
873 - 895
AD-60820.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAfaGfaugAfgAfc Afcu cuuucsusg
0,006
4582
4583
873 - 895
AD-60824.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAfaGfaugAfgac Afcu cuuucsusg
0,032
4584
4585
873 - 895
AD-60480.2
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,066
4586
4587
873 - 895
AD-60893.1
gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,034
4588
4589
873 - 895
AD-60884.1
gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,157
4590
4591
873 - 895
AD-60886.1
GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,801
4592
4593
873 - 895
AD-60888.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaUfgA fgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,201
4594
4595
873 - 895
AD-60828.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuul_96
asAfsgAfs(Agns)GfaUf gAfgacAfcUfcUfuUfcsu sg
0,145
4596
4597
873 - 895
AD-60832.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg
0,036
4598
4599
873 - 895
AD-60836.1
gsasaagaGfuGfuCfuCfa ucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg
0,076
4600
4601
873 - 895
AD-60840.1
gsasaagaGfuGfuCfucau cuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg
0,033
4602
4603
873 - 895
AD-60844.1
GfsasAfaGfAfGfuGfdTcu caucuucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg
0,017
4604
4605
873 - 895
AD-60848.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc auc(Tgn)ucuuL96
asAfsgAf(Agn)GfaugAf gacAfcucuuucsusg
0,007
4606
4607
873 - 895
AD-60821.1
GfsasAfaGfAfGfuGfucuc aucs(Tgns)ucuul_96
asAfsgAfs(Agns)Gfaug AfgacAfcucuuucsusg
0,076
4608
4609
873 - 895
AD-58632.11
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,063
4610
4611
873 - 895
AD-60825.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,031
4612
4613
873 - 895
AD-60829.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,033
4614
4615
873 - 895
AD-60833.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,100
4616
4617
873 - 895
AD-60837.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsuCfsuUfsL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,031
4618
4619
873 - 895
AD-60841.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfcUfsucsuUfsL96
asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg
0,010
4620
4621
873 - 895
AD-60460.2
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,009
4622
4623
873 - 895
AD-60845.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,002
4624
4625
873 - 895
AD-60849.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUfc(Tgn)uCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,005
4626
4627
873 - 895
AD-60822.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)uCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,007
4628
4629
873 - 895
AD-60826.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)suCfsuUfs L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,009
4630
4631
873 - 895
AD-60830.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUfc(Tgn)sucsuUfsL 96
asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg
0,019
4632
4633
873 - 895
AD-60466.2
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,066
4634
4635
873 - 895
AD-60834.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcUfcUfuUfcsusg
0,024
4636
4637
873 - 895
AD-60838.1
GfsasAfaGfaGfuGfUfCfu CfaUf(Cgn)UfuCfuUfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,013
4638
4639
873 - 895
AD-60842.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfuCfuUfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,010
4640
4641
873 - 895
AD-60846.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsuCfsuUf sL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgac AfcdTcUfuUfcsusg
0,011
4642
4643
873 - 895
AD-60850.1
GfsasAfaGfaGfuGfdTCf uCfaUf(Cgn)UfsucsuUfs L96
asAfsGfAfaGfaUfgAfga cAfcdTcUfuUfcsusg
0,018
Как показано в таблице 28, следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD-60845, AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819 и AD-60460.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60845 , AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, и AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, и AD-60830.
Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ: AD-60845 , AD-60843, AD-60849, AD-60820, AD-60848, AD-60822, AD-60826, AD-60819, и AD-60460, AD-60841, AD-60842, AD-60846, AD-60847, AD-60838, AD-60419, AD-60839, AD-60835, AD-586320, AD-60844, AD-60850, AD-60830, AD-60423, AD-60834, AD-60419, AD-60434, AD-60825, AD-60837, AD-60823, AD-60824, AD-60840, AD-60829, AD-60893, AD-60832, и AD-60827.
Пример 25. In vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах. Последовательности siRNA, которые отслеживали, представлены в таблице ниже.
Вводили разовую дозу 5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA, проводили измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), при помощи анализа с bDNA, и уровни лекарственного средства в ткани определяли при помощи qPCR. Результаты представлены на ФИГ. 33 и ФИГ. 34. Как показано на ФИГ. 33, по меньшей мере десять дуплексов (AD-60405, AD-60887, AD-60923, AD-60434, AD-60892, AD-60419, AD-60924, AD-60445, AD-60925 и AD-60926),
которые отслеживали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632. Кроме того, как показано на ФИГ. 34, эти дуплексы (за исключением AD-60926) обеспечивали более высокие концентрации в печени, чем AD-58632.
Пример 26. Эффективность AD-60925 и AD-60926 в крысиной модели AIP
Терапевтическую эффективность AD-60925 и AD-60926 (описанных в предыдущем примере) исследовали на крысиной модели АГР. Схема эксперимента показана вверху ФИГ. 35. Крыс обрабатывали PBS или 3 мг/кг siRNA ALASl-GalNAc t.i.w., фенобарбиталом (РВ) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 (AF11-PBGD) в периоды времени, указанные на ФИГ. 35. Контрольные крысы получали только siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом.
Результаты показаны на ФИГ. 35, ФИГ. 36 и ФИГ. 37. Введение фенобарбитала индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению с контролем. Обработка суммарно восемью дозами в 3 мг/кг AD-60925 или AD-60926 три раза в неделю подавляла mRNA ALAS1 (ФИГ. 35), PBG в моче (ФИГ. 36 и ФИГ. 37, вверху) и ALA в моче (ФИГ. 36 и ФИГ. 37, внизу). Фенобарбитал индуцировал повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче. Динамика эффектов лечения показана на ФИГ. 37. Стрелки указывают на временные точки при введении РВ. Обработка siRNA предупреждала индуцированные фенобарбиталом повышения mRNA ALAS1, PBG и ALA в моче.
Как AD-60925, так и AD-60926 характеризовались терапевтической эффективностью лечения АГР. AD-60925 был более эффективным, чем AD-60926 в подавлении mRNA ALAS1, ALA в моче и PBG в моче.
Пример 27. Дополнительные in vivo исследования связи структура-активность AD-58632
Получали производные исходной siRNA AD-58632 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг, часть 1
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в таблице ниже.
Крысам вводили четыре дозы по 2,5 мг/кг siRNA дважды в неделю (два раза в неделю) в течение двух недель. Через 72 часа после введения последней дозы siRNA животных выводили из эксперимента и выполняли измерения уровней mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) при помощи анализа с bDNA.
Как показано на ФИГ. 38, по меньшей мере четыре из siRNA (AD-60820, AD-60843, AD-60819 и AD-61140), которые исследовали, характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632. In vivo скрининг, часть II
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в таблице ниже.
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 72 часа после введения siRNA измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на ФИГ. 39, siRNA AD-61141, AD-61142, AD-60835, AD-60839, AD-61143, AD-61144, AD-61145 и AD-61146 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-58632. siRNA, которая обеспечивала наибольшее подавление в этом эксперименте, была AD-60835.
Пример 28. In vitro исследования связи структура-активность AD-60489
Получали AD-60489 и производные siRNA AD-60489 и некоторые siRNA подвергали скринингу in vitro в отношении активности. In vitro активность siRNA в подавлении mRNA ALAS1 исследовали, как описано в примере 24. Последовательности siRNA и результаты in vitro исследования представлены ниже в таблицах.
4746
4747
871-893
AD-60515.1
csasgaaaGfAfGfugucudCaucuua L96
u s Afs Af Gf au gAfgAf cAfcdTcu u u cug s gsu
64,16
13,95
98,80
0,92
4748
4749
871-893
AD-60521.1
csasgaaaGfAfGfugucucadTcuua L96
usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcuuucugs gsu
73,99
36,39
99,96
7,29
4750
4751
871-893
AD-60527.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucdTua L96
u s Afs Af Gf a u gAf gAf cAf cdTcu u u cug s gsu
82,69
26,56
114,13
4,81
4752
4753
871-893
AD-60533.1
csasgaaaGfAfGfudGudCucaucu uaL96
u s Afs Af Gf a u gAf gAf cAf cdTcu u u cug s gsu
89,41
4,69
107,40
9,67
4754
4755
871-893
AD-60492.1
csasgaaaGfAfGfudGucudCaucu uaL96
u s Afs Af Gf a u gAf gAf cAf cdTcu u u cug s gsu
83,52
1,56
100,70
0,79
4756
4757
871-893
AD-60498.1
csasgaaaGfAfGfudGucucadTcuu aL96
u s Afs Af Gf a u gAf gAf cAf cdTcu u u cug s gsu
64,64
16,21
98,41
19,6 0
4758
4759
871-893
AD-60504.1
csasgaaaGfAfGfudGudCucadTc uuaL96
u s Afs Af Gf au gAfgAf cAfcdTcu u u cug s gsu
57,55
5,13
93,14
0,41
4760
4761
871-893
AD-60510.1
csasgaaaGfAfGfudGudCudCadT cuuaL96
u s Afs Af Gf au gAfgAf cAfcdTcu u u cug s gsu
58,88
25,48
91,39
2,06
4762
4763
871-893
AD-60516.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96
u s Afs Af Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu
53,24
6,56
84,40
2,73
4764
4765
871-893
AD-60522.1
csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96
u s Afs Af Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu
67,17
6,48
91,62
5,43
4766
4767
871-893
AD-60528.1
CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96
u s Afs Af Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu u u cu g sgsu
81,44
37,04
89,71
8,60
4768
4769
871-893
AD-60534.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96
usAfsAfGfaugAfgAfcAfcdTcdTuucug sgsu
62,63
20,55
99,62
7,37
4770
4771
871-893
AD-60493.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96
u s Afs Af Gf a u gAf gAf cAf cdTcu u dTcu g sgsu
107,18
0,11
87,98
2,41
4772
4773
871-893
AD-60499.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96
usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcu gsgsu
35,92
13,78
77,52
6,68
4774
4775
871-893
AD-60505.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL 96
u s Afs Af Gf a u g Afg Af cAfc(Tg n) cu u u cu gsgsu
66,77
16,45
109,82
2,48
4776
4777
871-893
AD-60511.1
csasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96
u s Afs Af Gf a u g Afg Af cAfc(Tg n) cu u u cu gsgsu
82,10
10,11
95,50
14,7 3
4778
4779
871-893
AD-60517.1
CfsasgaAfaGfAfGfugucucaucuua L96
u s Afs Af Gf a u g Afg Af cAfc(Tg n) cu u u cu gsgsu
80,83
29,69
93,57
18,4 1
4780
4781
871-893
AD-60523.1
GfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfc scsa
29,60
1,64
67,16
8,40
4782
4783
871-893
AD-60529.1
GfsusGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcAfc scsa
21,15
1,21
79,02
28,9 9
4784
4785
871-893
AD-60535.1
GfsusCfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc scsa
31,78
13,54
79,36
26,5 6
4786
4787
871-893
AD-60494.1
GfsusCfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfgAfc sgsu
30,14
3,42
81,46
12,8 8
4788
4789
871-893
AD-60500.1
CfsusCfuAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuAfgAfg sgsu
29,85
11,78
72,14
4,56
4790
4791
871 - 893
AD-60506.1
CfsusCfuUfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfaAfgUfg sgsu
19,06
1,98
88,93
11,1 3
4792
4793
871-893
AD-60512.1
CfsusGfuUfuGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcAfaAfcUfg sgsu
29,71
1,79
86,32
17,6 9
4794
4795
871-893
AD-60518.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
(Tgns)AfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
27,47
2,59
81,03
10,9 3
4796
4797
871-893
AD-60524.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
17,02
1,39
71,65
17,4 2
4798
4799
871-893
Н.Д.
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
4800
4801
871-893
AD-60536.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu
61,77
10,19
91,55
2,20
4802
4803
871-893
AD-60541.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
25,47
2,83
54,36
15,0 2
4804
4805
871-893
AD-60546.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
49,32
1,50
90,79
11,3 6
4806
4807
871-893
AD-60551.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
24,37
1,11
76,80
24,9 9
4808
4809
871-893
AD-60556.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
21,43
4,71
61,90
5,64
4810
4811
871-893
AD-60561.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu
28,25
6,41
71,84
27,0 1
4812
4813
871-893
AD-60566.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu
27,57
4,87
67,91
18,2 8
4814
4815
871-893
AD-60570.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu
24,11
0,04
58,75
21,0 2
4816
4817
871-893
AD-60583.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfu(Agn)L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
15,32
4,78
42,01
9,51
4818
4819
871-893
AD-60585.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUf(Tgn)AfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
21,15
4,14
49,54
13,3 4
4820
4821
871-893
AD-60587.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
14,66
1,73
41,47
13,2 0
4822
4823
871-893
AD-60589.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
20,77
5,12
43,97
15,6 3
4824
4825
871-893
AD-60591.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
13,66
0,05
36,42
16,9 4
4826
4827
871-893
AD-60592.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
13,35
4,11
35,43
11,3 6
4828
4829
871-893
AD-60593.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
15,13
0,28
39,99
19,3 9
4830
4831
871-893
AD-60582.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
19,56
8,17
51,59
1,11
4832
4833
871-893
AD-60584.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
23,36
6,63
58,79
10,3 5
4834
4835
871-893
AD-60586.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
27,78
2,20
76,86
6,81
4836
4837
871-893
AD-60588.1
CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
105,27
14,25
99,26
19,6 2
4838
4839
871-893
AD-60590.1
CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfc susg
28,74
1,66
81,88
22,0 4
4840
4841
871-893
AD-60558.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Ufc(Tgn)uAfL96
usAfs(Agn)GfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
22,74
14,85
60,42
19,3 8
4842
4843
871-893
н.д.
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa Uf(Cgn)UfuAfL96
usAfsa(Ggn)aUfgAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
4844
4845
871-893
AD-60568.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa( Tgn)cUfuAfL96
usAfsaGf(Agn)aUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu
86,66
21,93
110,05
16,4 4
4846
4847
871-893
AD-60572.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(A gn)UfcUfuAfL96
usAfsaGfa(Tgn)gAfgAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
22,37
4,86
71,24
22,1 9
4848
4849
871-893
AD-60539.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn )aUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUf(Ggn)AfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
43,35
14,53
104,44
2,51
4850
4851
871-893
AD-60544.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCf(Tgn) CfaUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfg(Agn)gAfcacUfcUfuUfc Ufgsgsu
25,85
1,18
69,98
5,86
4852
4853
871-893
AD-60549.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfu(Cgn)uC faUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAf(Ggn)AfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
29,40
4,62
72,98
20,1 6
4854
4855
871-893
AD-60554.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGf(Tgn)Cfu CfaUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfg(Agn)cacUfcUfuUfc Ufgsgsu
33,74
0,45
75,36
19,3 9
4856
4857
871-893
Н.Д.
CfsasGfaAfaGfaGfUf(Ggn)uCfuC faUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAf(Cgn)acUfcUfuUf cUfgsgsu
4858
4859
871-893
AD-60564.1
CfsasGfaAfaGfaGf(Tgn)GfuCfuC faUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfc(Agn)cUfcUfuUf cUfgsgsu
27,77
10,34
77,01
11,5 1
4860
4861
871-893
AD-60569.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu
20,34
5,29
59,40
19,7 4
4862
4863
871-893
AD-60573.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfg sgsu
20,07
3,83
60,80
14,9 3
4864
4865
871-893
AD-60540.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfcUfuAfsL96
usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu
24,36
0,56
75,75
14,9 7
4866
4867
871-893
Н.Д.
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa UfscUfsuAfsL96
usAfsaGfaUfsgAfgAfcacUfcUfsuUfsc Ufgsgsu
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 80% подавления, так что оставалось менее 20% mRNA) при концентрации 10 нМ, включали AD-60501, AD-60592, AD-60591, AD-60513, AD-60507, AD-60587, AD-60519, AD-60593, AD-60583, AD-60524, AD-60489, AD-60495, AD-60506, и AD-60582.
В in vitro скрининге, для которого результаты показаны в таблицах выше, siRNA, которые обеспечивали наибольшее подавление mRNA ALAS1 (более чем 30% подавления, так что оставалось менее 70% mRNA) при концентрации 0,1 нМ, включали AD-60592, AD-60591, AD-60593, AD-60587, AD-60583, AD-60589, AD-60501, AD-60507, AD-60585, AD-60489, AD-60513, AD-60582, AD-60519, AD-60541, AD-60570, AD-60584, AD-60569, AD-60558, AD-60573, AD-60556, AD-60495, AD-60523, AD-60566, и AD-60544
Как показано в таблице ниже, исследование дополнительных siRNA показало, что следующие дуплексы обеспечивали более чем 80% подавление при концентрации 10 нМ: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593, а следующие дуплексы обеспечивали более чем 30% подавление при концентрации 0,1 нм: AD-60489, AD-60495, AD-60501, AD-60507, AD-60513, AD-60519, AD-60583, AD-60591, AD-60592 и AD-60593.
SEQ ID NO: (смысловая)
SEQ ID NO: (антисмысловая)
Целевые сайты антисмысловой последовательност и NM 000688.4
Название дуплекса
Смысловая последовательность (5'-3')
Антисмысловая (AS) последовательность (5'-3')
Средн. 10 нМ
SD 10 нМ
Среди ¦ 0,1 нМ
SD 0,1 нМ
4868
4869
871-893
AD-60489.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaU fcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu
17,0
0,2
50,7
5,1
4870
4871
871-893
AD-60495.1
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuU fcUfgsgsu
17,1
5,9
63,6
18,6
4872
4873
871-893
AD-60501.1
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
11,9
0,7
45,2
8,9
4874
4875
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4876
4877
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4878
4879
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
u s Afs a Gf ad Tg Afg Af cAf cd Tcu ud Tcugsgsu
4880
4881
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfuGfuCfuCfauc uuAfL96
usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4882
4883
871-893
AD-60507.1
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
14,6
7,8
48,5
19,6
4884
4885
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4886
4887
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4888
4889
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4890
4891
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
u s Afs a Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu ud Tcugsgsu
4892
4893
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu AfL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4894
4895
871-893
AD-60513.1
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
14,4
2,4
51,0
7,0
4896
4897
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4898
4899
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4900
4901
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4902
4903
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
u s Afs a Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu ud Tcugsgsu
4904
4905
871-893
CfsasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuu aL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4906
4907
871-893
AD-60519.1
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
14,7
4,9
51,7
7,7
4908
4909
871-893
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4910
4911
871-893
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4912
4913
871-893
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4914
4915
871-893
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
u s Afs a Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu ud Tcugsgsu
4916
4917
871-893
csasgaaaGfaGfuGfuCfuCfaucuua L96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4918
4919
871-893
AD-60499.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
35,9
13,8
77,5
6,7
4920
4921
871-893
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4922
4923
871-893
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
4924
4925
871-893
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4926
4927
871-893
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
u s Afs a Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu ud Tcugsgsu
4928
4929
871-893
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL9 6
u s Afs Af Gf ad Tg Afg Afcacd Tcu u d Tcugsgsu
4930
4931
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4932
4933
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfu UfcUfgsgsu
4934
4935
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
u s Afs Af Gf au g Afg Af cAf cu cu u u cu gsgsu
4936
4937
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuud Tcugsgsu
4938
4939
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
u s Afs a Gf ad Tg Afg AfcAfcd Tcu ud Tcugsgsu
4940
4941
871-893
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuu aL96
UsAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuud Tcugsgsu
4942
4943
871-893
AD-60583.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cllfu(Agn)L96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg
15,3
4,8
42,0
9,5
4944
4945
871-893
AD-60591.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(T gn)cllfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg
13,7
0,0
36,4
16,9
4946
4947
871-893
AD-60592.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Ag n)UfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg
13,4
4,1
35,4
11,4
4948
4949
871-893
AD-60593.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn) aUfcUfuAfL96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUf uUfcsusg
15,1
0,3
40,0
19,4
4950
4951
871-893
AD-60489.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
17,0
0,2
50,7
5,1
4952
4953
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUf cUfuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUf cUfgsgsu
4954
4955
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUf cUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUf cUfgsgsu
5060
5061
871-893
AD-60526.2
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96
usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu
н.д.
5062
5063
871-893
AD-60852.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu
4,970
5064
5065
871-893
AD-60856.1
csasgaaaGfAfGfugucucaucuuaL96
usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu
н.д.
5066
5067
871-893
AD-60861.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,019
5068
5069
871-893
AD-60865.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfcUfuUfcUfgsgsu
0,061
5070
5071
871-893
AD-60869.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
usAfsAfGfaugAfgAfcAfcucuuucugsgsu
н.д.
5072
5073
871-893
AD-60873.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
usAfsAfGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu
0,009
5074
5075
871-893
AD-60877.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcdTcuudTcugsgsu
0,008
5076
5077
871-893
AD-60881.1
csasgaaaGfAfGfugucuca(Tgn)cuuaL96
usAfsAfGfadTgAfgAfcacdTcuudTcugsgsu
0,025
5078
5079
871-893
AD-60583.2
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfu(Agn)L9 6
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,022
5080
5081
871-893
AD-60591.3
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,031
5082
5083
871-893
AD-60592.3
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfuUfcUfgsgsu
0,010
5084
5085
871-893
AD-60593.2
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu(Cgn)aUfcUfuAfL 96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,006
5086
5087
871-893
AD-60489.4
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,011
5088
5089
871-893
AD-60857.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
0,019
5090
5091
871-893
AD-60862.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfaUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,012
5092
5093
871-893
AD-60866.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfcUfuAfL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,015
5094
5095
871-893
AD-60870.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscUfsuAfsL9 6
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,012
5096
5097
871-893
AD-60874.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfaUfscusuAfsL9 6
usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,003
5098
5099
871-893
AD-60591.2
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,014
5100
5101
871-893
AD-60878.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,008
5102
5103
871-893
AD-60882.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,003
5104
5105
871-893
AD-60853.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)cUfuAfL9 6
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,007
5106
5107
871-893
AD-60858.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scUfsuAf sL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,013
5108
5109
871-893
AD-60863.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfa(Tgn)scusuAfs L96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,002
5110
5111
871-893
AD-60592.2
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,013
5112
5113
871-893
AD-60867.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96
asAfsgAfaGfaUfgAfgacAfcUfcUfuUfcsusg
0,084
5114
5115
871-893
AD-60871.1
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,008
5116
5117
871-893
AD-60875.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfcUfuAfL 96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,004
5118
5119
871-893
AD-60879.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscUfsuA fsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,001
5120
5121
871-893
AD-60883.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCf(Agn)UfscusuAf sL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,004
5122
5123
871-893
AD-60854.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)UfscUfs uAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,002
5124
5125
871-893
AD-60859.1
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfuCfs(Agns)Ufscusu AfsL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcacUfcdTuUfcUfgsgsu
0,002
Как показано в таблице выше, несколько дуплексов характеризовались эффективностью в подавлении mRNA ALAS1. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,01 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874, AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, и AD-60873. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,02 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874 , AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894, AD-60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD-60857, AD-60513, и AD-60861. Следующие дуплексы характеризовались IC50 менее чем 0,05 нМ: AD-60879, AD-60859, AD-60863, AD-60854, AD-60882, AD-60874 , AD-60883, AD-60875, AD-60501, AD-60593, AD-60853, AD-60877, AD-60878, AD-60871, AD-60873, AD-60489, AD-60592, AD-60894, AD-60489, AD-60870, AD-60862, AD-60858, AD-60592, AD-60591, AD-60872, AD-60866, AD-60905, AD-60857, AD-60513, AD-60861, AD-60583.2, AD-60902.1, AD-60881.1, AD-60519.2, AD-60507.2, AD-60591.3, AD-60851.1, AD-60896.1, и AD-60537.2.
Пример 29. In vivo исследования связи структура-активность AD-60489
Получали производные исходной siRNA AD-60489 и подвергали скринингу in vivo на крысах.
In vivo скрининг 1 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в
таблице ниже.
Как показано на ФИГ. 40 (вверху), siRNA AD-60501, AD-60519, AD-60901, AD-60495, AD-60900 и AD-60935 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-60489. siRNA AD-60519, AD-60901, AD-60495 и AD-60935 обеспечивали более высокие уровни в печени, чем AD-60489 (см. ФИГ. 40, внизу). Таким образом, большинство из дуплексов, которые обеспечивали повышенное подавление mRNA ALAS1, также достигали более высоких уровней в печени.
По меньшей мере для дуплексов AD-60489, AD-60519 и AD-60901 эффективность коррелировала с уровнями siRNA в печени (см. ФИГ. 41), так что более высокий уровень siRNA в печени был связан с более высоким подавлением mRNA ALAS 1.
In vivo скрининг 2 производных AD-60489
Последовательности siRNA, которые подвергали скринингу, представлены в таблице ниже.
Таблица 37. Последовательности дуплексов siRNA ALAS1
SEQID NO: (смысл овая)
SEQID NO: (антисмыслова я)
Целевые сайты антисмысловой последовательное ти NM_000688.4
Название дуплекса
Смысловая
последовательность
(5'-3')
Антисмысловая
последовательность
(5'-3')
5142
5143
871-893
AD-60489
CfsasGfaAfaGfaGfUfGfuCfu CfaUfcUfuAfL96
UsAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcUfu UfcUfgsgsu
5144
5145
871-893
AD-60879
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfuCfu Cf(Agn)UfscUfsuAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfcdTu UfcUfgsgsu
5146
5147
871-893
AD-61190
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu
5148
5149
871-893
AD-61191
CfsasGfaAfaGfaGfdTGfu CfuCf(Agn)UfscUfsuAfsL96
UsAfsAfGfaUfgAfgAfcAfcUfc UfuUfcUfgsgsu
5150
5151
871-893
AD-60877
csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuual_96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5152
5153
871-893
AD-61192
csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuual_96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5154
5155
871-893
AD-60865
csasgaaaGfaGfuGfuCfu Cfaucuual_96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5156
5157
871-893
AD-60861
csasgaaaGfAfGfugucuca (Tgn)cuual_96
usAfsaGfaUfgAfgAfcacUfc UfuUfcUfgsgsu
5158
5159
871-893
AD-60876
csasgaaaGfaGfuGfuCfu CfaucuuaL96
usAfsaGfadTgAfgAfcAfcd TcuudTcugsgsu
5160
5161
871-893
AD-61193
csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuuaL96
u s Afs a G f a U f gAfg Af ca с UfcdTuUfcUfgsgsu
5162
5163
871-893
AD-60519
csasgaaaGfaGfuGfu CfuCfaucuual_96
usAfsAfGfa UfgAfgAfcAfc UfcUfuUfcUfgsgsu
Крысам вводили разовую дозу 2,5 мг/кг siRNA. Через 5 дней после введения siRNA измерения уровней mRNA, mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH), выполняли при помощи анализа с bDNA.
Как показано на ФИГ. 42, siRNA AD-60879, AD-61190, AD-61191, AD-60865, AD-60861, AD-60876, AD-61193 и AD-60519 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с AD-60489.
Пример 30. Введение нескольких доз повышает эффективность
Для исследования эффектов введения нескольких доз siRNA крысам (п=3 на группу) вводили PBS или siRNA (AD-58632, AD-60925, AD-60419, AD-60445, AD-60892, AD-60489, AD-60519 или AD-60901) в дозе 2,5 мг/кг два раза в неделю в течение 2 недель. Уровни mRNA ALAS1 крыс (rALASl) и mRNA GAPDH крыс (rGAPDH) оценивали при помощи анализа с bDNA.
Как показано на ФИГ. 43, производные siRNA AD-58632, AD-60892, AD-60419, AD-60445 и AD-60925 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 no сравнению с исходным AD-58632. Кроме того, производные siRNA AD-60489, AD-60519 и AD-60901 характеризовались повышенным подавлением mRNA ALAS1 по сравнению с исходным AD-60489.
Пример 31. Исследования введения нескольких доз AD-60519 и AD-60489
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали на крысиной модели АГР. Схема эксперимента показана на ФИГ. 44 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALASl-GalNAc либо в количестве 2,5 мг/кг, либо в количестве 5 мг/кг два раза в неделю в течение трех недель. Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на ФИГ. 44. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD, без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 18-19 дни исследования.
Результаты показаны на ФИГ. 44 (внизу). Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче (см. ФИГ. 44) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно 2,5 или 5 мг/кг из шести доз AD-60519 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в моче и ALA в моче (ФИГ. 44). Эти результаты показывают, что AD-60519 является эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 был эффективным в снижении повышений уровней PBG и ALA в моче, связанных с острыми приступами в крысиной модели АГР.
В дополнительных исследованиях с использованием такой же схемы эксперимента, но в мышиной модели (см. схему вверху ФИГ. 44) исследовали терапевтическую эффективность AD-60519 и AD-60489 в подавлении индуцированных фенобарбиталом повышений уровней PBG и ALA в сыворотке. В контрольной группе PBS ("физиологического раствора") введение фенобарбитала повышало уровни PBG и ALA в сыворотке (см. ФИГ. 45) по сравнению только с PBS. Обработка суммарно шестью дозами в 2,5 или 5 мг/кг AD-60519 или AD-60489 два раза в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней PBG в сыворотке и ALA в сыворотке (ФИГ. 44). Эти результаты показывают, что как AD-60519, так и AD-60489, являются эффективным в подавлении уровней ALA и PBG при введении повторных доз до 2,5 мг/кг. В частности, AD-60519 и AD-60489 были эффективными в снижении повышений уровней PBG и ALA в сыворотке, связанных с острыми приступами.
Поскольку лекарственные препараты в этом примере вводили до индукции фенобарбиталом, эти результаты указывают, что AD-60519 и AD-60489 оказывают профилактические эффекты.
Пример 32. Дополнительные последовательности siRNA
Получали следующие последовательности производных siRNA AD-58632 (таблица 39) и AD-60489 (таблица 40).
5218
5219
871-893
AD-60879
CfsasGfaAfaGfaGfdT
GfuCfuCf(Agn)UfscUfs
uAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5220
5221
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfdT
GfuCfuCf(Agn)UfscUfs
uAfsL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5222
5223
871-893
CfsasGfaAfaGfaGfdT
GfuCfuCf(Agn)UfscUfs
uAfsL96
usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu
5224
5225
871-893
AD-60877
csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96
usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu
5226
5227
871-893
csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96
usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5228
5229
871-893
AD-60865
csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
5230
5231
871-893
AD-60861
csasgaaaGfAfGfugucu ca(Tgn)cuuaL96
usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcUfuUfcUfgsgsu
5232
5233
871-893
AD-60876
csasgaaaGfaGfuGfu Cf uCfaucuuaL96
usAfsaGfadTgAfgAfcA fcdTcuudTcugsgsu
5234
5235
871-893
csasgaaaGfaGfuGfu Cf uCfaucuuaL96
usAfsaGfaUfgAfgAfca cUfcdTuUfcUfgsgsu
5236
5237
871-893
AD-60519
csasgaaaGfaGfuGfu Cf uCfaucuuaL96
usAfsAfGfaUfgAfgAfc AfcUfcUfuUfcUfgsgsu
Пример 33. Дополнительные исследования введения нескольких доз AD-60519
Терапевтическую эффективность AD-60519 исследовали в крысиной модели АГР, подобной той, которую использовали в примере 31. Схема эксперимента показана на ФИГ. 46 (вверху). Крыс обрабатывали PBS или siRNA ALASl-GalNAc в количестве 3 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг раз в неделю в течение четырех недель (обработка на 0 день, 7 день, 14 день и 21 день). Фенобарбитал (фенобарб) и siRNA PBGD в составе LNP с AF11 вводили в периоды времени, указанные на ФИГ. 46. Контрольная группа получала только PBS и siRNA PBGD без индукции фенобарбиталом. Мочу собирали на 25 день исследования.
Результаты показаны на ФИГ. 46 (внизу) и на ФИГ. 47. Введение фенобарбитала и PBS индуцировало экспрессию mRNA ALAS1 и повышало уровни PBG и ALA в моче по сравнению только с PBS. Обработка суммарно четырьмя дозами в 3 мг/кг, 1 мг/кг или 0,3 мг/кг AD-60519 раз в неделю подавляла индуцированные фенобарбиталом повышения уровней mRNA ALAS1 крыс в печени дозозависимым образом (см. ФИГ. 46). (Уровни mRNA ALAS1 (rALASl) крыс в печени выражали относительно уровней mRNA GAPDH крыс). Уровни PBG в моче и ALA в моче также характеризовались дозозависимыми эффектами.
Повторные дозы AD-60519 раз в неделю были эффективными в подавлении экспрессии mRNA ALAS1 и в снижении повышенных уровней ALA и PBG, связанных с
индуцированными острыми приступами в крысиной модели АГР. Эти эффекты лечения были дозозависимыми. Данные результаты показывают, что AD-60519 может действовать профилактически при введении доз до приступа.
Пример 34. Эффекты введения нескольких доз конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 у отличных от человека приматов
Эффекты конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS1 в печени и mRNA ALAS 1 в крови исследовали в исследовании на отличных от человека приматах (NTTP). Использовали конъюгаты GalNAc AD-58632, AD-60519, AD-61193 и AD-60819. Схема исследования показана в таблице 41 и на ФИГ. 48.
недели
Каждая группа получала несколько подкожных доз конъюгата GalNAc с ALAS 1 siRNA в объеме дозы 2 мг/мл. Группа 1 (п=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-58632 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 2 (п=3) получала 1,25 мг/кг с 0,625 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 3 (п=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 4 (п=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 5 (п=3) получала 5 мг/кг с 2,5 мг/мл AD-60519 на 1, 2, 3, 4, 5, 11, 18 и 25 дни. Группа 6 (п=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-61193 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни. Группа 7 (п=3) получала 2,5 мг/кг с 1,25 мг/мл AD-60819 на 1, 2, 3, 4, 5, 8, 11, 15, 18, 22 и 25 дни.
Образцы сыворотки для анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) (см. пример 21) собирали на -3, 7, 13, 21, 27, 39, 46 и 60 дни (на ФИГ. 48, "PD заборы" указывает дни, в которые собирали сыворотку). Сыворотки собирали для биохимического анализа крови на -3 и 6 дни. Биохимический анализ включал оценку уровней аланинтрансферазы (ALT), аспартатаминотрансферазы (AST) и щелочной фосфатазы (ALP). Сайленсинг mRNA ALAS1 оценивали в ткани печени, полученной в результате биопсии печени на 21 день (см. ФИГ. 48). Биопсию выполняли после забора сыворотки.
Подавление уровней mRNA ALAS 1 в печени
Уровни mRNA ALAS1 в печени на 21 день исследования показаны на ФИГ. 49. Результаты показаны в виде процента от среднего уровня, наблюдаемого в контрольной группе, обработанной PBS. Результаты показаны в виде средних величин для каждой группы обработки.
Эти результаты, представленные на ФИГ. 49 показывают, что по сравнению с контрольными животными, которые получали обработку PBS, все из условий обработки были эффективными в подавлении уровней mRNA ALAS1 в печени. Обработки обеспечивали сайленсинг mRNA, находящийся в диапазоне приблизительно от 20% до 80% (соответствующий уровням mRNA ALAS1, находящимся в диапазоне приблизительно от 80% до 20% от контрольных уровней). Отдельные животные, которые
получали AD-58632, характеризовались сайленсингом приблизительно 20-50%, при этом средний уровень сайленсинга составлял приблизительно 40% (уровни mRNA ALAS 1 составляли в среднем приблизительно 60% от контрольных уровней). При всех используемых схемах введения доз AD-60519 был высокоэффективным в подавлении уровней mRNA ALAS1. Отдельные животные, которые получали AD-60519, характеризовались сайленсингом приблизительно 60-80% (уровни mRNA ALAS1 составляли приблизительно 20-40% от контрольных уровней). В среднем, режимы обработки AD-60519 обеспечивали сайленсинг приблизительно 65-75%. Как раскрыто в данном документе, AD-60519 является производным AD-60489. Подобные результаты для AD-60489 раскрыты в примере 20 и показаны на ФИГ. 30. Кроме того, AD-61193 (производное AD-60489) и AD-60819 (производное AD-58632) также обеспечивали сайленсинг на более чем 50%. Заслуживает внимания, что уровни сайленсинга, описанные в этом примере и в примере 20 (например, приблизительно 20-80%), достигались даже в "неиндуцированном" состоянии; ожидается, что в индуцированном состоянии, например, когда уровни ALAS 1 остро или хронически повышены (например, у пациента, имеющего порфирию или с риском развития порфирий, например, острой печеночной порфирий, например, АГР), более низкие уровни сайленсинга, например, снижение уровней mRNA ALAS 1 до нормальных уровней или уровней до приступа, могут быть достаточными для достижения терапевтической эффективности.
Подавление уровней циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1
На ФИГ. 50 показаны уровни циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 (средние величины и стандартные отклонения) в каждой временной точке в течение исследования, когда получали образцы сыворотки. Результаты по циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 показывают эффективность сайленсинга mRNA после обработки несколькими дозами каждой из изученных siRNA (AD60519, AD-61193, AD-60819 и AD-58632). Во всех группах наибольший эффект подавления на циркулирующую mRNA ALAS1 наблюдали на 27 день, после конечной дозы siRNA на 25 день. Во всех группах обработки в течение нескольких недель после прекращения обработки уровни mRNA ALAS 1 постепенно повышались и возвращались к исходному уровню при конечном измерении на 60 день.
Наиболее выраженное подавление циркулирующей mRNA ALAS 1 (максимальный сайленсинг около 80%) наблюдали в группе 3 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группе 5 (5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели). Группа 2 (1,25 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели), группа 4 (2,5 мг/кг AD-60519, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели), группа 7 (2,5 мг/кг AD-60819, раз в день, 5 дней, два раза в неделю, 3 недели) и группа 6 (2,5 мг/кг AD-61193, раз в день, 5 дней, раз в неделю, 3 недели) также характеризовались отличным подавлением, при максимальном сайленсинге (27 день) более чем 50%. В группе 1 также был достигнут заметный сайленсинг (более чем 30% на 27 день).
Эти результаты согласуются с результатами по mRNA ALAS 1 в печени и подтверждают высокую активность AD-60519. При уровнях доз до 1,25 мг/кг AD-60519 обеспечивал 65-75% сайленсинг.
Корреляция между уровнями циркулирующей mRNA ALAS1 и печени На ФИГ. 27 показаны уровни mRNA ALAS1 в печени (левые столбцы) и в сыворотке (правые столбцы). Имеется высокая корреляция между относительными уровнями mRNA ALAS1, измеренными в печени и в сыворотке, указывая на то, что эти измерения представляют надежные результаты.
Пример 35. Исследование введения разовой дозы AD-60519 и AD-60589 крысам при помощи анализа cERD мочи для отслеживания длительности подавления mRNA ALAS1
Исследование введения разовой дозы проводили у крыс с использованием конъюгатов GalNAc с siRNA ALAS1 AD-60489 и AD-60519. Эффективность этих конъюгатов GalNAc в ингибировании экспрессии mRNA ALAS1 отслеживали на основании оценок мочи при помощи анализа определения циркулирующей внеклеточной РНК. Анализ был подобным анализу, используемому в примерах 21 и 34, за исключением того, что использовали образцы мочи. Образцы мочи лиофилизировали для ее концентрирования. Лиофилизированную мочу ресуспендировали в 4 мл ёНгО и перемешивали на вортексе. Затем образец центрифугировали при 4000xg в течение 10-20 минут для осаждения любых клеточных остатков. Оставшиеся стадии были подобны таковым, описанным в примере 21.
Группам крыс вводили разовую дозу 10 мг/кг AD-60489 или AD-60519. Нормализованные уровни mRNA ALAS 1 в различные временные точки в течение исследования показаны на ФИГ. 51. Временная точка, указанная как "0 часов" представлена для исходного, до введения дозы, образца мочи, отобранного непосредственно перед введением mRNA ALAS1. Результаты для следующих временных точке выражены в виде доли от уровня до введения дозы.
Как можно увидеть исходя из результатов, показанных на ФИГ. 51, AD-60519 представлял повышенную эффективность по сравнению с AD-60489. При этой максимальной величине разовая доза AD-60519 обеспечивала подавление до приблизительно 80%, при этом подавление, предоставленное AD-60489, составляло приблизительно 60%. Эффект разовой дозы 10 мг/кг этих siRNA ALAS1 в подавлении mRNA ALAS 1 длился приблизительно 21 день. Эти результаты показывают валидность анализа cERD мочи для отслеживания уровней mRNA ALAS 1.
Пример 36. Фармакологические эффекты AD-60519 у отличных от человека приматов
Дополнительное исследование эффектов конъюгата GalNAc AD-60519 с siRNA ALAS1 проводили у отличных от человека приматов. В исследовании изучали эффект введения доз раз в неделю по сравнению с ведением доз два раза в неделю, использования нагрузочной дозы по сравнению с использованием не нагрузочной дозы, а также кинетику сайленсинга mRNA ALAS1 после разовой дозы. Схема исследования показана в таблице 42 и на ФИГ. 52.
поддерж. - 5
7 недель
36, 43,
мг/кг
Нагрузка -Раз в день, 3 дня, 5 мг/кг,
поддерж. -2,5 мг/кг
Нагрузка, 1-3
дни, раз в неделю,
270
0,25/0,125
7 недель
1,4, 8,
11, 15,
18,22
25, 29,
Раз в две
32, 36,
недели, 8 недель
924
0,25
39, 43, 46, 50, 53
Разовая доза
0,05
Разовая доза
116
0,5
Каждая группа получала одну или несколько подкожных доз AD-60519, как представлено в таблице 42. Группа 1 (п=3) получала 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 2 (п=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл раз в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 3 (п=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 4 (п=3) получала нагрузочную дозу 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мл/кг раз в день в течение трех дней с последующим поддержанием дозы 2,5 мг/кг в объеме дозы 0,125 мл/кг раз в неделю в течение 7 недель (дозы вводили на 1, 2, 3, 8, 15, 22, 29, 36, 43 и 50 дни). Группа 5 (п=3) получала 5 мг/кг в объеме дозы 0,25 мг/мл два раза в неделю в течение 8 недель (дозы вводили на 1, 4, 8, 11, 15, 18, 22, 25, 29, 32, 36, 39, 43, 46, 50 и 53 дни). Группа 6 (п=3) получала разовую дозу 1 мг/кг в объеме дозы 0,05 мл/кг на 1 день. Группа 7 (п=3) получала разовую дозу 10 мг/кг в объеме дозы 0,5 мл/кг на 1 день.
Образцы сыворотки (приведенные в виде "PD заборов" на ФИГ. 52), образцы плазмы (приведенные в виде "РК заборов" на ФИГ. 52) и образцы мочи собирали, как указано на ФИГ. 52 и в таблице 43. Образцы мочи и сыворотки подлежали анализу cERD. Все образцы крови и мочи, собранные в день биопсии печени, собирали до биопсии печени.
Результаты по mRNA ALAS1 в печени показаны на ФИГ. 53. Значимого подавления mRNA ALAS1 достигали во всех условиях введения. До 75-80% сайленсинга ALAS1 достигали при схемах введения нескольких доз с использованием AD-60519. Через три дня после разовой дозы достигали сайленсинг приблизительно 15% при использовании разовой дозы 1 мг/кг и достигали сайленсинг приблизительно 70% при использовании разовой дозы 10 мг/кг (см. ФИГ. 53). Сравнение данных из групп 1 и 7 показывает небольшую разницу в кинетике после разовой дозы (в группе 7) по сравнению с введением нескольких доз (группа 1) при одинаковом суммарном количестве (введено 30 мг), как оценено через 3 дня после введения дозы в группе 7 и через два дня после четвертой дозы в группе 1. В частности, более сильный сайленсинг наблюдали после разовой дозы (сайленсинг приблизительно 70% в среднем в группе 7 по сравнению с
сайленсингом приблизительно 45% в среднем в группе 1). См. ФИГ. 54. Такой же результат также наблюдали в исследованиях на крысах.
Результаты по mRNA ALAS1 в сыворотке до 22 дня показаны на ФИГ. 54 (вверху). Корреляция между mRNA ALAS1 в печени, mRNA ALAS1 в сыворотке и mRNA ALAS1 в плазме показаны на ФИГ. 55. Данные результаты показывают высокую корреляцию между уровнями mRNA ALAS1 в печени, сыворотке и моче. Результаты также представляют дополнительное доказательство, показывающее высокую активность AD-60519. Сайленсинг на 55-75% наблюдали при всех уровнях дозы во всех схемах введения нескольких доз. Введение нагрузочных доз (раз в день в течение 3 дней, как в группах 3 и 4) приводило к несколько более быстрому снижению mRNA ALAS 1. Группы, которые получали дозы раз в неделю (группы 1 и 2) или два раза в неделю (группа 5) в итоге характеризовались сопоставимыми уровнями подавления mRNA ALAS 1, указывая на то, что накопление в течение времени обеспечивает длительный нокдаун.
Результаты, показывающие кинетику сайленсинга mRNA ALAS1 после разовой дозы, представлены на ФИГ. 54 (внизу). В группе введения 1 мг/кг подавление mRNA ALAS1 приблизительно на 20% наблюдали на 6 день. В группе введения 10 мг/кг отмечали быстрое, приблизительно 70% подавление mRNA ALAS 1 на 4 день, при этом восстановление до 20% от исходного уровня наблюдали на 22 день (через 21 день после введения дозы). Уровни mRNA ALAS1 в сыворотке возвращались к исходному уровню приблизительно через 2 недели или 4 недели после введения разовой дозы 1 мг/кг или 10 мг/кг соответственно.
Полная динамика mRNA ALAS в сыворотке до 8 недели после введения AD-60519 показана на ФИГ. 56. Все группы достигали максимальной величины 80% подавления mRNA ALAS1 через 5-8 недель после введения дозы ALN-AS1. Группы введения трех суточных доз на 1 неделе (раз в день, 3 дня) характеризовалась более быстрым наступлением подавления mRNA ALAS1, чем таковые с введением одной дозы на первой неделе (раз в неделю, 8 недель). Все животные возвращались к исходным уровням ALAS1 приблизительно через 30-40 дней после последней дозы.
Пример 37. Получение лекарственного препарата на основе siRNA
ALN-60519 (ФИГ. 57) представляет собой химически синтезированный двунитевой олигонуклеотид, связанный ковалентными связями с лигандом, содержащим три остатка N-ацетилгалактозамина (GalNAc). Все нуклеотиды являются 2'-ОМе- или 2'-F-модифицированными и соединены посредством 3'-5'-фосфодиэфирных связей, образуя, таким образом, сахаро-фосфатный скелет олигонуклеотида. Смысловая нить и антисмысловая нить содержат 21 и 23 нуклеотида соответственно. 3'-конец смысловой нити конъюгирован с фрагментом GalNAc с тремя разветвлениями (называемым в данном документе L96) посредством фосфодиэфирной связи. Антисмысловая нить содержит четыре фосфоротиоатных связи - две на З'-конце и две на 5'-конце. Смысловая нить содержит две фосфоротиоатных связи на 5'-конце. 21 нуклеотид смысловой нити гибридизируется с комплементарным 21 нуклеотидом антисмысловой нити, образуя, таким образом, 21 пару нуклеотидных оснований и выступающий конец из двух оснований на З'-конце антисмысловой нити. Две одиночные нити, смысловую нить и антисмысловую нить, синтезировали при помощи стандартного твердо-фазного синтеза олигонуклеотидов, используя стандартную химическую структуру фосфорамидита с 5'-гидроксильной группой, защищенной в виде диметокситрифенилметилового (DMT) эфира. Каждую нить собирали от 3'- к 5'-концу последовательным добавлением защищенных нуклеозидных фосфорамидитов.
AD-60519, также обозначаемый в данном документе ALN-60519, помещали в состав в виде раствора для инъекции для подкожного применения, обозначаемый в данном документе ALN-AS1. ALN-60519 растворяли в воде для инъекции (WFI) и корректировали рН (целевой 7,0). Определяли концентрацию ALN-60519 и корректировали ее добавлением WFI. Раствор с конечной концентрацией приблизительно 200 мг/мл затем стерилизовали посредством фильтрации и наполняли в 2 мл стеклянные ампулы типа I. Выбирали объем наполнения примерно 0,55 мл для обеспечения полного изъятия 0,5 мл лекарственного препарата.
Пример 38. Измерение уровней mRNA ALAS1 в сыворотке или моче пациентов с AIP или здоровых добровольцев при помощи способа cERD
Исследования фармакологии на отличных от человека приматах с использованием ALN-AS 1 указывало на то, что способ определения циркулирующей внеклеточной РНК (cERD) для измерения mRNA ALAS 1 в сыворотке или моче был надежным и воспроизводимым. Анализ cERD также использовали для измерения уровней mRNA ALAS1 в сыворотке и моче от пациентов с АГР и здоровых добровольцев. Уровни mRNA ALAS1, как правило, были повышенными у пациентов с АГР относительно здоровых добровольцев, что согласуется с ролью индукции ALAS 1, которую она играет в патофизиологии заболевания (ФИГ. 58). Важно, что уровни ALAS1 в сыворотке и моче у одного и того же пациента коррелировали друг с другом. У двух пациентов, которые имели повторные заборы мочи и сыворотки, уровень mRNA ALAS1 был стабильным в течение времени. Образно говоря, эти данные указывают на то, что mRNA ALAS1 можно измерять в образцах сыворотки и мочи от субъектов, в том числе пациентов с АГР, а способ cERD является применимым для отслеживания фармакодинамической активности ALN-AS1.
Пример 39. Иллюстративные клинические исследования
Можно провести исследование на человеке для определения безопасности и переносимости ALN-AS1 при введении в виде разовой дозы и нескольких доз пациентам с АГР, которые являются бессимптомными выраженными экскреторам (ASHE) (пациентам, которые имеют повышенные уровни ALA и/или PBG, как описано в данном документе) или пациентам с АГР, которые имеют рецидивирующие приступы.
Вторичные цели включают характеристику РК в плазме и моче для ALN-AS1, а также оценку влияния ALN-AS1 после введения дозы на уровни ALA и PBG как в плазме, так и в моче. Анализ cERD, при помощи которого измеряют mRNA в экзосомах, использовали для измерения 5-аминолевулинатсинтазы (mRNA ALAS-1) в сыворотке (или плазме) и моче.
Бессимптомным выраженным экскреторам ALN-AS1 вводят в разовых дозах, например, по 0,1, 0,35 1,0 или 2,5 мг/кг, или повторных дозах раз в неделю, например, по 1 и 2,5 мг/кг, в течение нескольких недель (например, в течение 4 недель). В качестве сравнения вводят контрольный лекарственный препарат (например, плацебо). Оценивают безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и
PBG. Дозу ALN-AS1, которая снижает ALA и PBG до нормального референтного диапазона (например, дозу, которая нормализует уровни ALA и/или PBG до уровней ниже 2 верхних референтных величин) можно выбрать для последующих исследований, например, у пациентов с АГР.
У пациентов с АГР частоту приступов и исходные симптомы оценивают во время вводного периода без введения доз (например, в 12 недель). Пациентам вводили ALN-AS1, например, в дозе 1-2,5 мг/кг раз в неделю. Оценивали безопасность, фармакокинетику и эффекты лекарственного средства на уровни ALA и PBG. Кроме того, отслеживали изменения числа приступов, применения гема, применения обезболивающего средства и госпитализации.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
Специалисты в данной области распознают или будут способны определить, используя лишь стандартный экспериментальный подход, многие эквиваленты к конкретным вариантам осуществления настоящего изобретения, описанным в данном документе. Предполагается, что такие эквиваленты охвачены следующей формулой изобретения.
Формула изобретения
1. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1 (например, SEQ ID N0:1), антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из антисмысловой последовательности UAAGAUGAGACACUCUUUCUGGU (SEQ ID N0: 4153) или UAAGAUGAGACACUCTUUCUGGU (SEQ ID NO: 4154).
2. Двунитевая рибонуклеиновая кислота (dsRNA) для ингибирования экспрессии ALAS1, где упомянутая dsRNA содержит смысловую нить и антисмысловую нить, при этом антисмысловая нить содержит участок комплементарности РНК-транскрипту ALAS 1 (например, SEQ ID N0:1), антисмысловая нить которого содержит по меньшей мере 20 смежных нуклеотидов из (i) антисмысловой последовательности, приведенной в любой из таблиц 21-40, или (ii) немодифицированного варианта антисмысловой последовательности, приведенной в любой из таблиц 21-40 (SEQ ID NO: 4172-5237).
3. DsRNA по п. 2, где упомянутая dsRNA содержит по меньшей мере один модифицированный нуклеотид.
4. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где дуплексный участок составляет 17-23 пары нуклеотидов в длину.
5. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где по меньшей мере одна нить содержит 3'-выступающий конец по меньшей мере из 2 нуклеотидов.
6. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где каждая нить составляет не более 26 нуклеотидов в длину.
7. DsRNA по п. 3, где по меньшей мере один модифицированный нуклеотид выбран из 2'-О-метила, 2'-фтор-модифицированного нуклеотида и необязательно одной или нескольких 5'-фосфотиоатных групп или любой их комбинации.
8. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащая лиганд, при этом лиганд необязательно конъюгирован с 3'-концом смысловой нити dsRNA.
9. DsRNA по п. 8, где лиганд содержит углевод, при этом лиганд необязательно представляет собой лиганд GalNAc.
11. DsRNA по любому из пп. 8-10, где лиганд присоединен с помощью двухвалентного или трехвалентного разветвленного линкера.
12. DsRNA по п. 11, где лиганд и линкер показаны в формуле XXIV:
14. DsRNA по любому из пп. 8-13, где лиганд нацеливает dsRNA в гепатоциты.
15. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA содержит смысловую нить, состоящую из смысловой последовательности, выбранной из смысловых последовательностей, приведенных в таблицах 21 -40, и антисмысловой нити, состоящей из антисмысловой последовательности, выбранной из антисмысловых последовательностей, приведенных в таблицах 21-40.
16. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется значением IC50, составляющим менее 1 нМ, менее 0,05 нМ, менее 0,02 нМ или менее 0,01 нМ.
17. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется разовой дозой ED50, составляющей менее приблизительно 10 мг/кг или менее приблизительно 5 мг/кг.
18. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где dsRNA характеризуется повышенной активностью относительно AD-58632 или AD-60489, при этом необязательно dsRNA выбрана из dsRNA, приведенных в таблицах 21-40.
14.
19. DsRNA по любому из предыдущих пунктов, где смысловая нить содержит последовательность CAGAAAGAGUGUCUCAUCUUA (SEQ Ш N0: 4155) или состоит из нее.
20. DsRNA по п. 1 или п. 2, где:
(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
(ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где антисмысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
(iii) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
(iv) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, где смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60519;
(v) смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60519, а антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519, или
(vi) смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60519, а антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60519, где смысловая и антисмысловая последовательности содержат все модифицированные нуклеотиды из AD-60519.
21. DsRNA по п. 1 или п. 2, где:
(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60489, и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489, или
(ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60489, и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60489, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60489.
22. DsRNA по п. 1 или п. 2, где:
(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-61193, и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193, или
(ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-61193, и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-61193, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-61193.
23. DsRNA по п. 2, где:
(i) антисмысловая нить содержит антисмысловую последовательность AD-60819, и/или смысловая нить содержит смысловую последовательность AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819, или
(ii) антисмысловая нить состоит из антисмысловой последовательности AD-60819, и/или смысловая нить состоит из смысловой последовательности AD-60819, где антисмысловая и/или смысловая последовательность содержит все модифицированные нуклеотиды из AD-60819.
24. Вектор, кодирующий по меньшей мере одну нить dsRNA по любому из пп. 1-23.
25. Клетка, содержащая dsRNA по любому из пп. 1-23 или вектор по п. 24.
26. Фармацевтическая композиция для ингибирования экспрессии гена ALAS1, при этом композиция содержит dsRNA по любому из пп. 1-23.
24.
27. Фармацевтическая композиция по п. 26, где dsRNA вводится в безбуферном солевом или водном растворе.
28. Фармацевтическая композиция по п. 26 или п. 27, где упомянутая композиция является пригодной для подкожного введения.
29. Способ ингибирования экспрессии ALAS1 в клетке, при этом способ предусматривает:
(a) введение в клетку dsRNA по любому из пп. 1-23 и
(b) поддержание клетки, полученной на стадии (а), в течение времени, достаточного для обеспечения разрушения mRNA-транскрипта гена ALAS 1, с ингибированием тем самым экспрессии гена ALAS 1 в клетке,
при этом экспрессия ALAS 1 необязательно ингибируется по меньшей мере на 20% или по меньшей мере на 30%.
30. Способ снижения уровня порфирина или предшественника порфирина (например, ALA или PBG) в клетке (например, гепатоците), предусматривающий приведение клетки в контакт с dsRNA по любому из пп. 1-23 в количестве, эффективном для снижения уровня порфирина или предшественника порфирина в клетке.
31. Способ лечения порфирий, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества
(i) dsRNA по любому из пп. 1-23 или
(ii) композиции по любому из пп. 26-28,
с осуществлением тем самым лечения порфирий.
32. Способ по п. 31, где субъектом является субъект с риском развития порфирий или с диагностированной порфирией.
33. Способ по п. 31 или п. 32, где порфирия представляет собой острую перемежающуюся порфирию или порфирию, обусловленную недостаточностью ALA-дегидратазы.
32.
34. Способ по любому из пп. 31-33, где (i) dsRNA или композицию, содержащую dsRNA,
вводят после острого приступа порфирий, (ii) dsRNA или композицию, содержащую
dsRNA, вводят во время острого приступа порфирий, или (iii) dsRNA или композицию,
содержащую dsRNA, вводят профилактически для предупреждения острого приступа
порфирий.
35. Способ по любому из пп. 31-34, где dsRNA вводят в дозе 0,05-50 мг/кг веса тела субъекта, например, в дозе 0,01 мг/кг - 5 мг/кг веса тела субъекта.
36. Способ по любому из пп. 31-35, где с помощью способа
(i) снижают уровень порфирина или предшественника порфирина (например, 5-аминолевулиновой кислоты (ALA) или порфобилиногена (PBG)) у субъекта, при этом необязательно уровень снижают по меньшей мере на 30%, и/или
(ii) ингибируют экспрессию ALAS 1 у субъекта.
37. Способ по любому из пп. 31-36, где с помощью упомянутого способа (i) облегчают симптом, ассоциированный с нарушением, связанным с ALAS 1 (например, порфирией), (ii) снижают частоту острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта, и/или (iii) снижают вероятность возникновения острых приступов симптомов, ассоциированных с порфирией, у субъекта в случае, когда субъект подвержен воздействию провоцирующего фактора, например, предменструальной фазы.
38. Способ по любому из пп. 31-37, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят согласно схеме дозирования, например, еженедельно, один раз в две недели или ежемесячно.
39. Способ по любому из пп. 31-38, где dsRNA вводят до острого приступа порфирий, например, во время продрома.
37.
40. Способ по любому из пп. 31-39, где субъект имеет повышенный уровень (например, уровень в плазме или моче) ALA и/или PBG, и при этом необязательно субъект испытывает хроническую боль.
41. Способ по любому из пп. 31-40, где с помощью способа снижают повышенный уровень ALA и/или PBG.
42. Способ по любому из пп. 31-41, где с помощью способа снижают или предупреждают боль, нейропатию и/или повреждение нервов.
43. Способ по любому из пп. 31-42, где с помощью способа предупреждают острые приступы порфирий.
44. Способ по любому из пп. 31-43, где dsRNA или композицию, содержащую dsRNA, вводят систематически.
45. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, терапевтически эффективного количества
(i) dsRNA по любому из пп. 1-23 или
(ii) композиции по любому из пп. 26-28,
при этом необязательно способ является эффективным для снижения уровня ALA и/или PBG.
46. Способ лечения субъекта с повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ предусматривает введение dsRNA по любому из пп. 1-23 по 1 мг/кг, 2,5 мг/кг или 5 мг/кг один раз в неделю в течение по меньшей мере десяти недель со снижением тем самым уровня ALA и/или PBG у упомянутого субъекта.
47. Способ лечения пациента-человека с АГР, который испытывал несколько рецидивирующих приступов, при этом способ предусматривает введение dsRNA по
46.
любому из пп. 1-23 в дозе 2,5 мг/кг в течение по меньшей мере 6 месяцев с осуществлением тем самым лечения упомянутого пациента, при этом необязательно с помощью упомянутого способа
(i) снижают частоту приступов,
(ii) сокращают применение гематина,
(iii) снижают риск госпитализации и/или
(iv) повышают качество жизни.
48. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ предусматривает:
выявление (например, измерение) уровня mRNA ALAS 1 в образце биологической жидкости (например, образце крови, образце плазмы, образце сыворотки или образце мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS1,
с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта.
49. Способ анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта, при этом упомянутый способ предусматривает
(i) получение РНК (например, внеклеточной РНК) из образца биологической жидкости (например, образца крови, образца плазмы, образца сыворотки или образца мочи) от субъекта, при этом упомянутый образец биологической жидкости содержит mRNA ALAS 1;
(ii) получение cDNA ALAS1 с mRNA ALAS 1;
(iii) приведение в контакт cDNA ALAS 1 с нуклеиновой кислотой, комплементарной (например, зондом и/или праймером) cDNA ALAS1 или ее части, с получением тем самым реакционной смеси; и
(iv) выявление (например, измерение) уровня cDNA ALAS 1 в реакционной смеси, где уровень cDNA ALAS1 указывает на уровень mRNA ALAS1,
с осуществлением тем самым анализа уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта,
при этом необязательно
(a) способ предусматривает PCR, qPCR или 5'-RACE,
(b) нуклеиновая кислота представляет собой зонд или праймер, и/или
(c) нуклеиновая кислота содержит выявляемый фрагмент, а уровень mRNA ALAS 1 определяют посредством выявления количества выявляемого фрагмента.
50. Способ по п. 49, где эффективность лечения порфирий оценивают на основании сравнения уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта с нормальным значением.
51. Способ по п. 49, где снижение уровня циркулирующей внеклеточной mRNA ALAS1 у субъекта в ответ на лечение порфирий относительно нормального значения указывает на то, что лечение порфирий является эффективным.
52. Способ по любому из пп. 49-51, дополнительно предусматривающий получение образца биологической жидкости от субъекта, где необязательно образец биологической жидкости является отделенным от ткани, и при этом образец биологической жидкости содержит экзосомы.
53. Композиция, содержащая dsRNA по п. 20 и воду для инъекции.
54. Композиция по п. 53, содержащая приблизительно 200 мг/мл dsRNA по п. 20.
55. Композиция по п. 53 или п. 54, где композиция характеризуется значением рН 6,0-7,5, например, приблизительно 7,0.
56. Композиция по любому из пп. 53-55, где композиция составлена для подкожной инъекции.
50.
57. Способ лечения субъекта с порфирией (например, АГР) или повышенным уровнем ALA и/или PBG, при этом способ предусматривает подкожное введение субъекту композиции по любому из пп. 53-56.
58. Способ по п. 57, где композицию вводят в дозе 0-5 мг/кг, например, в дозе 2,5 мг/кг или менее или в дозе 1-2,5 мг/кг.
59. Способ по п. 58, где композицию вводят еженедельно.
По доверенности
МИТОХОНДРИИ
СОО I
соо сн
' ALA-СИНТАЗ А
со,
Ч ^CoASH H-c-NH2
соо
с=о
H-C-NH
АМИНОЛЕВУЛИНОВАЯ КИСЛОТА
РЕПРЕССИЯ ПО ТИПУ ОБРАТНОЙ СВЯЗИ
ЦИТОПЛАЗМА
соо-
СОО СН-,
NH.
Ь N
I I сн2 сн2
.-СНГ-м^Н
2Н+ Fe++
ФЕРРОХЕЛАТАЗА СН,
УРОДЕКАРБОКС11ЛАЗА
¦АН -А СО,
ФИГ. 1
ФИГ. 2A
Фермент, положение на хромосоме
Катализируемая реакция
Связанная порфирия
Тип порфнрии
Типичный тип наследования
Типичные симптомы
аминолевулинат (ALA) синтаза 1
Зр21
Глнцин+сукцинилКоа 1
5-аминолевулиновая кислота (ALA)
аминолевулинат (ALA) синтаза 2
(ALAS2)
(эритроид-специфнческая)
Хр11.21
Глнцин+сукцинилКоа 1
З-аминолевулиновая кислота (ALA)
Х-сцепленная
сидеробпастическая
анемия: (XLSA)
Х-сцеппенная
протопорфирня
(XLP)
Эритропоэтическая
Х-сцепленная
аминолевулинатдег
идратаза
(ALAD)
9q34
5-амннолевулиновая кислота (ALA)
порфобилшшген (PBG)
Порфирия. обусловленная недостаточностью ALA (ADP или порфирия Досса)
Печеночная
Аутосомно-рецессивная
Боль в животе, нейропатия
PBG-дезаыиназа
(PBGD)
или
гидроксиметилбила
нсинтаза
(HMBS)
llq23
Порфобилиноген (PBG)
Гндроксиметилбнлан (НМВ)
Острая
перемежающаяся порфирия (AIP)
Печеночная
Аутосомно-доминантная
Периодическая
боль в животе,
периферическая
нейропатия.
психоневрологиче
скне нарушения.
тахикардия
ФИГ. 2B
Уропорфириноген III синтаза
(UROS)
10q26
Гидроксимегнпбилан 1
Уропорфириноген III (URO)
Врожденная эритропоэтическая порфирия (СЕР)
Эритропоэтическая
Аутосомно-рецессивная
Тяжелая
фоточувствительность с эритемой, отечность и образование волдырей, гемолитическая анемия, спленомегалня
Уропорфириноген
декарбоксилаза
(UROD)
lq34
Уропорфириноген III (URO)
Копропорфиноген III
Поздняя кожная порфирия (РСТ)
Печеночная
Аутосомно-доминантная или
спорадическа я
Фоточувствительная с пузырьками и буллами
Копропорфнриног ен Ш оксидаза (СРОХ) 3ql2
Копропорфириноген Ш (COPRO)
Протопорфириногек IX
Наследственная копропорфирия (НСР)
Печеночная
Аутосомно-доминантная
Фоточувствительностъ. неврологические симптомы, колики
Протопорфнриног еноксндаза (РРОХ)
lql4
Протопорфириноген IX (PROTO)
Протопорфирин ГХ
Вариегатная порфирия (VP)
Смешанная
Аутосомно-доминантная
Фоточувствительностъ. неврологические симптомы, задержка развития
Феррохелатаза 18q21.3
Протопорфирин ГХ 1
Гем
Эритропоэтическая
протопорфнрия
(ЕРР)
Эритропоэтическая
Аутосомно-рецессивная
Фоточувствительностъ с повреждениями кожи, камни в желчном пузыре, умеренное нарушение функции печения
ctgtat.ar.ta aggcgccggc gatcgcggcc tgaggc.-gct ccc.ggacaag ggcaacgagc
61 gtttcgt-tg cacttctcga cttgagtgcc cgcctccttc gccgccgcct ctgcagtcct
12: cagcgcagtt atgcccagtt cttcccgctg tggggacacg accacggagg aatccttgct
L81 tcagggactr: qgg.ir-.c.c.tgc. T.qq.ir.ccct.r. cctcgggt.t.t aggggatgtg gggnccaggii
241 gaaagtcagg atccctaaga gtcttccctg cctggatgga tgagtggctt cttctccacc
301 tagattc-tt ccacoggagc cagcatactT cctgnacatg gagagtgttg ttcgccgctg
361 cccattc'ta tcccgagtcc cccaggcct" tctgcagaaa gcaggcaaat ctctgttgtt
421 ctatgcccaa aactgcccca agatgatgga agttggggcc aagccagccc ctcgggcatt
481 gtccactgca gcagtaoact. accaacagar. caaagaaacc cct.cccgcca gr.gagaaaga
54. caaaactgct aaggccaagg r.ccaacagac tcctgar.gga tcccagcaga gtccagatgg
SO- cacacagctt ccgtctggac accccttgcc tgccacaagc cagggcactg caagcaaatg
661 ccctttcctg gcagcacaga ^gaatcagag aggcagcagt gtcttctgca aagccagrct
"721 tgagcttcag gaggatgtgc aggaaatgaa tgccgtgagg aaagaggttg ctgaaacctc
781 aycayycccc aytytyytta ytgtyaaaae c-yatyyayyy yatcccayty gactgctyaa
841 yaacttc_cag gacatcatgt; aaaagcaaag ciccdgaaaga gtytctcatc ttcttcaaga
901 taacttqcca aaatctgttt ccacttttca gtatga.cgt tctjtttqaqa aaaaaatcga
961 tqaqaaaaaq aaLqaccaca cctatcgaqt. LLtLaaaaci q-_qaaccqgc qaqcacacaL
1021 cttccccatg ccagatgact attcagactc cctcatcacc aaaaaccaag tgtcagtctg
1081 gtgcagLaat. caclacctag gaaLgagLcg ccacccacgg g'.gl.gigggg cagLLaLgga
1L41 cactttgaaa caacatggtg ctggggcagg tggtactaga aatatttctg gaactag-aa
130". attccatgtg gacttagagc gggagctggc agacctcc.at gggaaagatg ccgcactctt
1261 gttttccicg tgctttgtgg ccaatgactc aaccctcttc accctcgcta agatgatgcc
1321 aggctgtgag atttactctg attctgggaa ccatgcctcc atgatccaag ggattcgaaa
1381 r.agccgagtg ccaaagtaca т.слл.с.г.даса caatgar.gtc agccacctca gagaactgct
1441 gcaaagatct. gac_t_cctr:ag г.спо^яадаг. tgtggr.at.tt gaaactgt.r.c. at_t.caat.gga
1501 tggggcggtg tgcccactgg aagagctgt.g tgatgtggcc catgagtttg gagcaatoac
1561 cttcgtggat gaggtccacg cagtggggct ttatggggct cgaggcggag ggattgggga
1621 tcgggatgga gtcatgccaa aaatggacat catttctgga acacttggca aagccttrgg
1681 ttgtgttyga ggytacatcg ccagcacgag ttctctyatt gacaccgtac ggtccta^yc
1~-11 tgctgyc-tc atcttcacca cctctctgcc acccatgctg c-ggctggag ccctggagtc
1801 tgtg^ggatu utgaagaycg ctgagggayg ggtgt-ticgc cgccagcacc agcgcaacgt
1861 caaacLcatq agacaqatqc -"aaLqgaLqc cqqccLccci q'.LqLccacL qccccaqcca
1321 catcatccct ctgcgggttg cagatgctgc taaaaacaca gaagtctgtg atgaactaat
lrJ81 qaqcaqacat. aacaLcLacq Lqcaaqcaa;. caaLLacccL acqqtqcccc qqqcaqaaqa
2041 gctcctacgg attgccccca cccctcacca cacaccccag a~gatgaact acttcct-ga
21 o: gaatctgcta gtcacatgga agcaagtggg gctggaactg aagcctcat.t cctcagcrga
2161 gtgcaacttc tgcaggaggc cactgcattt tgaagtgatg agtgaaagag agnagtccta
222: tttctcaggc ttgagcaagt tggtatctgc tcaggcctga gcatgaccte aattatttca
2231 cttaacccca ggccattatc atatccagar ggtcttcaga gt-gtcttta tatgtgaatt 2311 aagttatatt aaatr.ttaat ctatagtaaa aacatagtcc tggaaataaa rtcttgctta 2401 aatggtg
{SEQ ID N0:1)
cagaagaagg
ccggcgatcg
121
ciicgacttg.i
181
cagttcttcc
2 31
cctgctggac
301
taayagtctt
361
ggagccagca
<;2i
agtcccccag
481
CL-ccaagaty
541
acacLaccaa
601
caaggtc.caa
661
tggacacccc
721
acagatgnnt.
781
tgtgcaggaa
8-31
ggttagtgtg
901
catgcaaaay
961
tgtttccact
1021
ccacacctat
1081
tgacLaLLca
1141
cctaggaatg
1201
tggtgctggg
1261
agagcgggag
1321
tgtggccaat
1381
ctctgattct
1441
gtacatcttc
1501
ctcaqlcccc
1561
aclggaagag
16Л
ccacgcagtg
1S81
gccaaaaatg
1741
catcgccagc
1801
caccacctct
1861
gagcgctgag
1921
gatgctaatg
1981
ggttgcagat
2041
ctacgLqcaa
2\Q1
ccccacccct
21 61
atggaagcaa
2221
gnggocact.g
cagcgcccaa cggcctgagg gt.gcccgact. cgctgtgggg ccct~cctcg ccctgcctgg tactrcctga gcct^tctgc atyyaayttg caqa'.caaaq cagactcctg ttgcctgcca садлдлддс.л atgaatgccg aaaaccgatg eaaagaceag tttcaqtatq cgag-tttta gacLcccLca agtcgccacc gcaggtggta frt.ggcagacc: gactcaaccc gggaaccatg cgccacaatg aaqailqLqq cLgtgtgaLg gggc-ttatg gacazcattt acgagttctc ctgccaccca ggacgggtgc gatgccggcc gtjtgct aaaa qcaa'.caaL L caccacacac gtggggctgg crntt.r.t.gaag ggcgcatgcg ctgctcccgg cctr.cgc.cgc acacgaccac ggtrtagggg atggatgagt acatggagag agaaagcagg gggccaagc:c: aaacccctcc atggatccca caagccaggg goagr.gt.r.t.r. tgaggaaaga gaggggatcc aaagagtgtc atcgtttct^ aaactgtgaa Lcaccaaaaa cacgggtgtg ctagaaatar trinat.gggaa tcttceccct cctccatgat atyteiaytrca calilqaaac Lggcccatga gggctcgagg ctggaacacc tgattgacac tgcr.gct.ggc ttcgccgcca tccctgttg^ acacagaagr accclacqq-. cccagatgat aactgaagcc t-.gnt.gagt.ga cagcggtcac acaagggcaa r.gcctctgca ggaggaatcc atgtggggac ggcttcttct tgttgttcgc caaatctctg agcccctcgg qgccaquqaq geagagtcca cactgcaagc ^tgcaaagcc ggttgctgaa cagtggactg tcatcttctt tqagaaaaaa ccggcgagca gcaagtgtca tggggcagtt ttctggaact agat.gcr:gf;a ggctaagatg ccaagggatt cctcagagaa IglccaLtca gtttggagca cggagggatt tggcaaagcc cgtacggtcc t.ggagcc:ct;g gcaccagcgc ccactgcccc t:tgtgatgaa gccccqgqqa gaactacttc tcattcct ca angagagang tcccgctgta cgagcgtttc gtcct.c.igcg ttgcttcagg caggagaaag ccaciztagat cgctgcccat ttgttctatg gcattgtcca aaaqacaaaa gatggeacac aaatgccctt agr.ct.tgagc acctcagcag ctgaagaact cadyataact at^qatgaqa cacatcttcc gLctggLgca atggacactt agraaattcc ctctt.gt.ttt atgccaggct cgaaacagcc ctgctgcaaa atqqat-gggg atcaccLtcg ggggatcggg ttcggttgtg ta^gctgctg cagt.^t.gtgc aacgtcaaac agccacatca ctaatgagca gaaqaqcLcc cttgagaatc gctgagtgca t.cctat.t.tcr.
tattaaggcg gtttggactt cagt.tat.gc.r. gactcgggac ~c aggatccc tctttecaca tcttatcccg cccaaaactg ctgcagtragt CtqcLaaqqc agcttccgtc tcctggcagc r.t.K.iggagga gccccagtgt ¦^ccaggacat "qccaaaatc aaaagaatga ccatggcaga gtaalgacLa igaaacaaca atgtggactt Cctcgtgct.t gtgagactta gagtgccaaa yatctgacsjc cqqtqLqccc -^ggaLgaggL atggagtcat ntggagggta gcttcacctt ggatcctgaa icatgagaca -ccctgtgcg yacataacat -..acggatlqc tgctagtcac acttctgcag caggct.t.gag
2281 caagttggta tctgctcagg cctgagcatg acctcaatta tttcacttaa ccccaggcca 2341 ttatcatatc cagat.ggt.ct tcagagttgt ctttatatgt gaattaagtt atattaaatt 2h01 ttaatetata gtaaaaacat agtcctggaa ataaattctt gcttaaatgg tgaaaaaa (SEQ ГО КО:..182)
WO 2015/051318 PCT/US2014/059160
8/61
ФИГ. 5
< < 14 12 10
4 2 0
Г4*
<
r со to
<
о и
A r-j
О t-i i
О ¦
LUC* ALASbi
Обработанные фенобарбиталом
Исходный уровень Без фенобарбитала
ALAS1 siRNA LUC siRNA
Обработанные фенобарбиталом
Обработанные фенобарбиталом
Исходный уровень Без фенобарбитала
<
? 4
s 3 "
& 7 и
° 1
Ж х
л о
Е~ О
Исходный i Исходный уровень уровень
ALA51 biRNA
Фенобарбитал
0 I
4 8 12 16 20 24
Часы после последней дозы фенобарбитала
4 8 12 16 20 24
Часы после последней дозы фенобарбитала
ALAS-GalNac 20mpk
Ш ALA 2Ш PBG
W/ Фенобарбитал
ФИГ. 17
ALAS1 siRNA
1 мг/кг
S IPK3 I f I 1 I 1
ALA'PBCi в плазме
IPx3
1 1 1
pg ALA'PBG в плазме 1Рх 3
1 1 I
I I I I I
1д. 2д. Зд. 4ц. 5л.
О неделя
1 I I I
15д. 1бд. 17д. 18д.
2 неделя
1 I I I
29д. ЗОд. 31 д. 32д.
4 неделя
ФИГ. 18
PB+ DOC IPx 3
Гем или siRNA
l д.
2 д.
3 д.
"t t т 1
ALA'PBG в плазме 4 д.
60.00
50.00
40.00
и Е
| 30.00
-J 20.00 <
10.00
0.00
6 ч 12 ч 18 ч 24 ч
Часы после последней дозы PB/DDC
ФИГ. 19
ФИГ. 20
PBGD siRNA i v.
ALAS1-GalNAc
14 инъекции РВ раз в день
I I I I I
" Измерение:
1. ALA/PBG в моче
2. mRNA ALAS-1 и PBGD
l д.
4 д. 5 д.
6 д.
/ д.
8 д.
моча за 24 часа
¦5 1
PBGD siRNA
Фенобарбитал
30 мг/кг
10 мг/кг +
ФИГ. 23
ФИГ. 24
WO 2015/051318 PCT/US2014/059160
30/61
E-O
O* 03
Ex s
(5,
a x n
< ?
X X
EX X
a X я
OOOOOOOOOOo
ISV VNIF11 ЭНН'ЕЖЙЭРОЭ ЭОНЧГЭ1ИЭОН10
ФИГ. 29
Доза Доза, Доза Доза Доза Доза Доза Доза
Дозы 1-5 Доза б Доза 7 Доза 8 Дозд 9 10 П 12 13 14 15 16 17
День исследования : 1 2 3 4 5 7 9 11 13 1_5 17 19 21 23 25 27 29
PD заборы: -10 7
^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^
15 __
I Бнопсв
Сыворотка для детекции mRNA: -10, -3, 7*. 15*. 23*. 31 и 43 день (*Все образцы крови собирали до повторного введения дозы)
Биопсия печени для mRNA: 15** день (**Сыворогку собирали до биопсии) Сыворотка для биохимического анализа (ALT, AST, ALP): -3, 6, 30, 43 день Некропсия: нет
Наблюдение в участке инъекции: да
<
00 " О
г О*
* со
S ° Ч-) I
<
* СО
<гм
со Ь in
й ГО
гч m
ш о.
<
о о
СО о
0.0
мг/кг
siRNA
AD-60445 AO-60825 AD-60S26
ФИГ. 34
45000.0-,-40000.0 35000.0 30000.0 25000.0 _ 20000.0 ¦[ 15000.0 I 10000.0 j 5000.0 I 0.0 '
11111
if*
ФИГ. 35
ALAS-GalNAc з мг/кг (TIW) ^ Фенобарбитал
Од. 7 д. 14 д. 19 д. (Вывед. из экспер.)
^ ' 4^
PBGD LNP
о E
200
150
(C 100 -j-
WO 2015/051318 PCT/US2014/059160
41/61
ФИГ. 38
ФИГ. 39
ФИГ. 40
-ж-
AD-60489 AD-6CJ501 AD-60519 AD-60901 AD-60495 AD-60900 AD-60935 AD-60905
¦ill
25000 20000
S 15000
ЕГ U С
10000
5000
.1.
..ШШ...
AD-ЫЛВЭ AD-60501.2 AD-S051B.2 АС-вОЭ01.1 AO-S0495.2 AD-S090Q.1 AD-60P35.1 AD-60905.1
ФИГ. 41
ФИГ. 43
ФИГ. 44
X ALAS-GaINAc (BIW)
Ў 2.5 или 5 мг/кг
^ Фенобарбитал (РВ)
Од.
14 д.
18-19 дд. (моча)
а со
.30 п
? 20
PBGD LNP
два раза в неделю два раза б неделю
о ю ft.
AD-60519 BIW j AD-50489 BIW
Обработка РВ
2.5 мг/кг I 5 мг/кг : 2"5 NIT/КГ i
AD-60519 BIW AD-60489 BIW
Обработка РВ
ФИГ. 46
ALAS-GalNAc fBIW) 2.5 или 5 мг/кг
" Фенобарбитал
Од.
7 д.
14 д.
21 д.
PDGOLNP
25 д. (моча)
X О
CL < 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
< <
PBS
AD-60519 (3mpk)
AD-60519 (lmpk)
AD-60519 (0.3mpk)
siRNA РВ
PBGD LNP
+ +
siRNA РВ
PBGDLNP
(С.Зггрк) +
(С-
% 2
а О г- 3 ОО
<7>
-> -г
В! а
Q о
а о
Q а.
ФИГ. 49
День
-Ф- 2,5 мг/кг AD-58632 QDx5, BIWx3 ..x... 1,25 мг/кг AD-60519, QDx5, BIWx3 2.5 мг/кг AD-60519, QDx5, BIWx3 2,5 мг/кг AD-60519, QDx5, QWx3
5 мг/кг AD-6Q519,QDx5,QWx3 2,5 мг/кг AD-611 93, QDx5, BIWx3 2,5 мг/кг AD-60819, QDx5, BIWx3
ФИГ. 50
(ШОГ Ц0ННЭ1ГЭГЭ(11Ю Э5НВ(5В? 10 МГОЕ)
ISVTV KBHHBaotHiiBNdoH
5 §
3 ?
ОО СО
Ч. К
к и
н щ
щ .. " а-Q °
со м
ш о
со о.
[''О
ГС 4)
м со ¦д X и о ш
к!1 Sis
; а-
PCT/US2014/059160
<
С-1 1Л
1.4n
-2.5 мг/кг AD-60519QWX8
-~¦- 5 мг/кг AD-60519 QWxS
-о- 5 мг/кг AD-60519 QDx3, 5mpk QWx7
__ - о - 5 мг/кг AD-60519 BIWxS
-•-1 мг/кг AD-60519 - о - 10 мг/кг AD-60519
О О
6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 о 6 6 6 6 6
ж ж
о s
I X
-о.=0 ? ? О
\ <=-^
- <\=o ? - °=T4~ -=-¦ <-^
Y^-J 3-^
U 19 ^
-c=0 ? ? о=с-
YA => < ^
-Q-=0 ? ^ 0=D-
< -Э
-c=0 Г 0=o--
^ J ^
Э < \^
^A-s -5 XA
\ 4 О U Y^
E o=0\
=> < \ A
-o_=0 ^_ с 0=Q--
Y^ О - - U Y^
Y О - U ^
-o-=0 ? ^_ 0=A-
vA- <=> -^
Y^ < 3 ^
-о.-о С 0=0,-
4 5 "** \
^-1 ^--1
-\=0 E ? 0=Q--
-Q-=0 С " O=o_-
-o-=0 E E 0=Q-
Y^ U О Y^
О С 0=Q-
x о ^
? 0=0,-
=> "\A О X
га a О Ч
(J J!
3 "
и * S
о о
О 6 О О О
" Z гч
О ^ О
о о о 6 о
II Е
5! О
PL s
г" О
а ю
о s
Е Т
< cb < и
Пациенты с AIP
Здоровые добровольцы с нормальными показателями
109
112
112
124
124
124
124
124
124
124
124
125
125
126
126
126
126
126
126
127
127
127
127
127
127
127
127
128
128
128
128
128
128
129
129
129
129
129
129
130
130
130
130
130
130
131
131
132
132
132
132
132
132
132
132
132
132
132
132
133
133
133
133
163
163
164
164
170
170
170
170
171
171
171
171
171
171
171
171
247
247
249
249
279
279
283
283
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
1/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
2/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
2/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
4/61
ФИГ. ЗА
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
4/61
ФИГ. ЗА
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
5/61
ФИГ. зв
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
5/61
ФИГ. зв
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
6/61
ФИГ. 4A
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
6/61
ФИГ. 4A
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
7/61
ФИГ. 4B
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
7/61
ФИГ. 4B
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
9/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
9/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
12/61
ФИГ. 9
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
12/61
ФИГ. 9
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
12/61
ФИГ. 9
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
12/61
ФИГ. 9
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
13/61
ФИГ. 10
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
13/61
ФИГ. 10
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
14/61
ФИГ. 11
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
14/61
ФИГ. 11
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
15/61
ФИГ. 12
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
15/61
ФИГ. 12
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
16/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
16/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
17/61
ФИГ. 14
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
17/61
ФИГ. 14
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
18/61
ФИГ. 15
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
18/61
ФИГ. 15
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
18/61
ФИГ. 15
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
18/61
ФИГ. 15
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
19/61
ФИГ. 16
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
19/61
ФИГ. 16
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
20/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
21/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
22/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
22/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
23/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
24/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
25/61
ФИГ. 22
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
24/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
25/61
ФИГ. 22
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
24/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
25/61
ФИГ. 22
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
26/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
25/61
ФИГ. 22
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
27/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
27/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
29/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
29/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
29/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
32/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
32/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
32/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
32/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
34/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
35/61
ФИГ. 32
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
34/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
35/61
ФИГ. 32
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
34/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
35/61
ФИГ. 32
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
34/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
35/61
ФИГ. 32
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
37/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
38/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
38/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
40/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
42/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
42/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
43/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
44/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
44/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
45/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
45/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
47/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
47/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
47/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
47/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
48/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
48/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
48/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
48/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
49/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
50/61
ФИГ. 47
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
50/61
ФИГ. 47
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
50/61
ФИГ. 47
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
50/61
ФИГ. 47
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
51/61
ФИГ. 48
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
52/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
52/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
53/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
55/61
ФИГ. 52
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
55/61
ФИГ. 52
PCT/US2014/059160
56/61
ФИГ. 53
56/61
ФИГ. 53
56/61
ФИГ. 53
56/61
ФИГ. 53
56/61
ФИГ. 53
56/61
ФИГ. 53
WO 2015/051318
58/61
ФИГ. 55
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
57/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
58/61
ФИГ. 55
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
57/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
58/61
ФИГ. 55
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
59/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
60/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
60/61
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
61/61
ФИГ. 58
PCT/US2014/059160
WO 2015/051318
61/61
ФИГ. 58
PCT/US2014/059160
