[RU]

Настоящее изобретение относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат две полипептидные цепи и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33 (т.е. "gpA33 × CD3 биспецифическое моновалентное диатело"). Настоящее изобретение также относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат домен Fc иммуноглобулина ("биспецифические моновалентные Fc диатела") и состоят из трех полипептидных цепей и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 × CD3 биспецифическое моновалентное Fc-диатело"). Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc-диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc-диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат две полипептидные цепи и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33 (т.е. "gpA33 × CD3 биспецифическое моновалентное диатело"). Настоящее изобретение также относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат домен Fc иммуноглобулина ("биспецифические моновалентные Fc диатела") и состоят из трех полипептидных цепей и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 × CD3 биспецифическое моновалентное Fc-диатело"). Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc-диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc-диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.

---

Евразийское (21) 201690447 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2016.08.31
(22) Дата подачи заявки 2014.08.20
(51) Int. Cl.
A61K 39/00 (2006.01) C12P 21/08 (2006.0l) C07K16/00 (2006.01)
(54) БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОНОВАЛЕНТНЫЕ ДИАТЕЛА, КОТОРЫЕ СПОСОБНЫ СВЯЗЫВАТЬСЯ С gpA33 И CD3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
(31) (32) (33)
(86) (87) (88) (71)
(72)
61/869,528; 61/907,691; 13198859 2013.08.23; 2013.11.22; 2013.12.20 US; US; EP PCT/US2014/051793 WO 2015/026894 2015.02.26
2015.04.16
Заявитель:
МАКРОДЖЕНИКС, ИНК. (US)
Изобретатель:
Мур Пол А., Ли Джонатан, Чэнь Франсин Чжифэнь, Джонсон Лесли С., Шах Калпана, Бонвини Эцио (US)
(74)
Представитель: Карпенко О.Ю., Лыу Т.Н., Угрюмов В.М., Дементьев В.Н., Глухарёва А.О., Клюкин В.А., Строкова О.В., Христофоров А.А. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к биспеци-фическим моновалентным диателам, которые содержат две полипептидные цепи и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпи-топа CD3, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33 (т.е. "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело"). Настоящее изобретение также относится к биспе-цифическим моновалентным диателам, которые содержат домен Fc иммуноглобулина ("биспеци-фические моновалентные Fc диатела") и состоят из трех полипептидных цепей и которые характеризуются наличием по меньшей мере одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное Fc-диатело"). Би-специфические моновалентные диатела и биспе-цифические моновалентные Fc-диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc-диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОНОВАЛЕНТНЫЕ ДИАТЕЛА, КОТОРЫЕ СПОСОБНЫ СВЯЗЫВАТЬСЯ С GPA33 И CD3. И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
Ссылки на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет в соответствии с заявками на выдачу патентов США №№ 61/869528 (поданной 23 августа 2013 г.; в стадии рассмотрения) и 61/907691 (поданной 22 ноября 2013 г.; в стадии рассмотрения), и заявкой на выдачу Европейского патента № 13198859 (поданной 20 декабря 2013 г.), каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Ссылка на перечень последовательностей
Настоящая заявка включает в себя один или несколько перечней последовательностей в соответствии с 37 C.F.R. 1.821 et seq., которые раскрыты как на бумажном, так и на машиночитаемом носителе, и чьи бумажные и машиночитаемые раскрытия полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат две полипептидных цепи и которые характеризуются наличием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического для эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело"). Настоящее изобретение также относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат домен Fc иммуноглобулина ("биспецифические моновалентные Fc - диатела") и состоит из трех полипептидных цепей и которые характеризуются наличием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное Fc - диатело"). Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc - диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применение таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения I. gpA33
Колоректальный рак принадлежит к числу самых распространенных злокачественных опухолей в западном мире и является ведущей причиной смертельных исходов, вызванных злокачественными опухолями (Silverberg, Е. et al. (1989) "Cancer Statistics, 1989" CA Cancer J Clin. 39(l):3-20). Одной потенциально применимой мишенью для рака толстой кишки является трансмембранный гликопротеин АЗЗ с молекулярной массой 43 кДа (gpA33) ((Heath, J.К. et al. (1997) "The Human A33 Antigen Is A Transmembrane Glycoprotein And A Novel Member Of The Immunoglobulin Superfamily," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 94(2):469-474; Ritter, G. et al. (1997) "Characterization Of Posttranslational Modifications Of Human A33 Antigen, A Novel Palmitoylated Surface Glycoprotein Of Human Gastrointestinal Epithelium," Biochem. Biophys. Res. Commun. 236(3):682-686). gpA33 был впервые открыт путем получения моноклональных мышиных антител против происходящей из карциномы поджелудочной железы человека клеточной линии ASPC1. Обнаружили, что одно антитело (МАЬ АЗЗ) реагировало с белком клеточной поверхности с молекулярной массой 43 кДа, который в связи с этим обозначили как "gpA33" (Wong, N.A. et al. (2006) "EpCAM and gpA33 Are Markers Of Barrett's Metaplasia" J. Clin. Pathol. 59(3):260-263).
gpA33 представляет собой трансмембранный белок семейства адгезивных молекул, обеспечивающих межклеточный контакт; Abud, Н.Е. et al. (2000) "The Murine АЗЗ Antigen Is Expressed At Two Distinct Sites During Development, The ICM Of The Blastocyst and The Intestinal Epithelium" Mech. Dev. 98(1-2): 111-114; Barendswaard, E.C. et al. (1998) "Rapid and Specific Targeting Of Monoclonal Antibody A33 To A Colon Cancer Xenograft In Nude Mice" Int. J. Oncol. 12(l):45-53; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution and Efficacy Of [131I]A33scFv::CDy, A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer" Int. J. Oncol. 32(4):925-930). Несмотря на то, что функциональная значимость антигена АЗЗ еще не выяснена, было показано, что он опосредует восстановление слизистой толстой кишки в животной модели колита и равномерно экспрессируется в > 95% всех колоректальных карцином. Экспрессия АЗЗ является равномерной в течение всех стадий заболевания, а также при любой степени гистологической дифференциации, и антиген не секретируется или не выделяется в кровоток обнаруживаемым образом (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics
And Pharmacodynamics Of The Anti-АЗЗ Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330, In Patients With Advanced Colorectal Cancer" Eur. J. Cancer. 49(6): 1169-1175; Panjideh, H. et al. (2008) "Biodistribution And Efficacy Of [131I]A33scFv::CDy, A Recombinant Antibody-Enzyme Protein For Colon Cancer "Int. J. Oncol. 32(4):925-930). Напротив, было идентифицировано только несколько случаев экспрессии не относящегося к желудочно-кишечному тракту антигена АЗЗ (Johnstone, C.N. et al. (2000) "Characterization Of Mouse A33 Antigen, A Definitive Marker For Basolateral Surfaces Of Intestinal Epithelial Cells" Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 279(3):G500-G510).
В связи с тем, что экспрессия антигена АЗЗ в высокой степени ограничена, исследователи изучали возможность лечения опосредованных АЗЗ злокачественных опухолей с помощью антител (Infante, J.R. et al. (2013) "Safety, Pharmacokinetics And Pharmacodynamics Of The Anti-АЗЗ Fully-Human Monoclonal Antibody, KRN330, In Patients With Advanced Colorectal Cancer" Eur. J. Cancer. 49(6): 1169-1175; Ackerman, M.E. et al. (2008) "A33 Antigen Displays Persistent Surface Expression" Cancer Immunol. Immunother. 57(7):1017-1027; Barendswaard, E.C. et al. (2001) "Relative Therapeutic Efficacy Of (125)1- And (131 )I-Labeled Monoclonal Antibody A33 In A Human Colon Cancer Xenograft," J. Nucl. Med. 42(8):1251-1256; Carrasquillo, J.A. et al. (2011) "(124)I-huA33 Antibody PET Of Colorectal Cancer" J. Nucl. Med. 52(8): 1173-1180; Chong, G. et al. (2005) "Phase I Trial Of 131I-HuA33 In Patients With Advanced Colorectal Carcinoma" Clin. Cancer Res. ll(13):4818-4826; Deckert, P.M. et al. (2000) "Pharmacokinetics And Microdistribution Of Polyethylene Glycol-Modified Humanized A33 Antibody Targeting Colon Cancer Xenografts" Int. J. Cancer. 87(3):382-390; Johnston, A.P. et al. (2012) "Targeting Cancer Cells: Controlling The Binding And Internalization Of Antibody-Functionalized Capsules" ACS Nano. 6(8):6667-6674; Koppe, M.J. et al. (2005) "Radioimmunotherapy And Colorectal Cancer" Br. J. Surg. Mar;92(3):264-276; Sakamoto, J. et al. (2006) "A Phase I Radioimmunolocalization Trial Of Humanized Monoclonal Antibody НиАЗЗ In Patients With Gastric Carcinoma" Cancer Sci. 97(11): 1248-1254; Scott, A.M. et al. (2005) "A Phase I Trial Of Humanized Monoclonal Antibody A33 In Patients With Colorectal Carcinoma: Biodistribution, Pharmacokinetics, And Quantitative Tumor Uptake" Clin. Cancer Res. 11(13):4810-4817; Tschmelitsch, J. et al. (1997) "Enhanced Antitumor Activity Of Combination Radioimmunotherapy (131I-Labeled Monoclonal Antibody A33) With Chemotherapy (Fluorouracil),"Cancer Res. 57(11):2181-2186). Аналогично фрагменты таких антител также были исследованы в отношении их потенциальной терапевтической роли (Coelho, V. et al. (2007) "Design, Construction, And In Vitro
Analysis Of A33scFv: :CDy, A Recombinant Fusion Protein For Antibody-Directed Enzyme Prodrug Therapy In Colon Cancer" Int. J. Oncol. 31(4):951-957).
II. CD3
CD3 представляет собой T - клеточный корецептор, состоящий из четырех различных цепей (Wucherpfennig, K.W. et al. (2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling" Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14; Chetty, R. et al. (1994) "CD3: Structure, Function And The Role Of Immunostaining In Clinical Practice" J. Pathol. 173:303-307).
У млекопитающих комплекс CD3 содержит цепь CD3y, цепь CD38 и две цепи CD3s. Указанные цепи связываются с молекулой, известной как Т - клеточный рецептор (TCR), для создания сигнала активации в Т - лимфоцитах. При отсутствии CD3 не происходит правильная сборка TCR, и они распадаются (Thomas, S. et al. (2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer" Immunology 129(2): 170-177). CD3 обнаружен связанным с мембранами всех зрелых Т -клеток и практически ни с каким другим типом клеток (см. Janeway, С.A. et al. (2005) В: IMMUNOBIOLOGY: THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun, Z. J. et al. (2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3e:y Heterodimer" Cell 105(7):913-923; Kuhns, M.S. et al. (2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCRJCD3 Complex" Immunity. 2006 Feb;24(2): 133-139).
III. Биспецифические диатела
Способность интактного, немодифицированного антитела (например, IgG) связывать эпитоп антигена зависит от присутствия вариабельных доменов на легких и тяжелых цепях иммуноглобулина (т.е. доменов VL и VH, соответственно). Конструкция диатела основана на одноцепочечном конструкте Fv (scFv) (см., например, Holliger et al. (1993) "''Diabodies': Small Bivalent And Bispecifw Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; патентную публикацию США № 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like
Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20): 1966519672; WO 02/02781 (Mertens et al.); Olafsen, T. et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications" Protein Eng. Des Sel. 17(l):21-27; Wu, A. et al. (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange" Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy" Cancer Res. 69(12):4941-4944).
Взаимодействие легкой цепи антитела и тяжелой цепи антитела и, в частности, взаимодействие его доменов VL и VH формирует один из сайтов связывания с эпитопом антитела. Напротив, конструкт scFv содержит домен VL и VH антитела, содержащиеся в одной полипептидной цепи, причем в домены отделены гибким линкером, длина которого достаточна для обеспечения возможности самосборки двух доменов в функциональный сайт связывания с эпитопом. Если самосборка доменов VL и VH становится невозможной вследствие недостаточной длины линкера (меньше чем приблизительно 12 аминокислотных остатков), два конструкта scFv взаимодействуют друг с другом с образованием бивалентной молекулы, в которой VL одной цепи ассоциируются с VH другой (рассмотрено в Marvin et al. (2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies, " Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658).
Природные антитела способны связываться только с одним видом эпитопов (т.е. являются моноспецифическими), хотя они могут связываться с множественными копиями этого вида (т.е. проявляя бивалентность или мультивлентность). В известном уровне техники сообщалось о способности производить диатела, которые отличаются от таких природных антител в том, что они способны связывать два или больше различных видов эпитопов (т.е. проявляя биспецифичность или мультиспецифичность в дополнение к бивалентности или мультивалентности) (см., например, Holliger et al. (1993) "''Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400 (Hollinger et al.); US 2004/0220388 (Mertens et al.); Alt et al. (1999) FEBS Lett. 454(l-2):90-94; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity" J. Biol.
Chem. 280(20): 19665-19672; WO 02/02781 (Mertens et al); Mertens, N. et al, "New Recombinant Bi- and Trispecific Antibody Derivatives" In: NOVEL FRONTIERS IN THE PRODUCTION OF COMPOUNDS FOR BIOMEDICAL USE, A. VanBroekhoven et al (Eds.), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands (2001), pages 195-208; Wu, A. et al (2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Variable Domain Exchange" Protein Engineering 14(2): 1025-1033; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System" Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle, P.A. et al. (2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944).
Обеспечение не моноспецифическими диателами предоставляет существенное преимущество: способность колигирования и колокализации клеток, которые экспрессируют различные эпитопы. Таким образом, бивалентные диатела характеризуются широким диапазоном применений, включая в себя терапию и иммунодиагностику. Бивалентность обеспечивает возможность большой гибкости в конструировании и разработке диатела в различных применениях, обеспечивая повышенную авидность в отношении мультимерных антигенов, перекрестную сшивку различных антигенов и направленное нацеленное воздействие на конкретные типы клеток на основании присутствия обоих целевых антигенов. В связи с их повышенной валентностью низкие скорости диссоциации и быстрое выведение из циркуляции (для диател небольшого размера, составляющего ~50 кДа или ниже), известные в настоящей области техники молекулы диател также продемонстрировали конкретное применение в области визуализации опухолей (Fitzgerald et al. (1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expressed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221). Особое значение представляет колигирование различных клеток, например, перекрестная сшивка цитотоксических Т - клеток с опухолевыми клетками (Staerz et al. (1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells, " Nature 314:628-631, and Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody, " Protein Eng. 9:299-305).
Домены связывания с эпитопом диатела также могут быть направлены на поверхностную детерминанту любой иммунной эффекторной клетки, такой как CD3, CD 16, CD32 или CD64, которые экспрессируются на Т - лимфоцитах, клетках -естественных киллерах (NK) или других мононуклеарных клетках. Во многих
исследованиях также обнаружили, что связывание диатела с детерминантами эффекторных клеток, например, рецепторами Fey (FcyR), активирует эффекторную клетку (Holliger et al. (1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bispecific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Holliger et al. (1999)
"Carcinoembryonic Antigen (CEA)-Specific T-cell Activation In Colon Carcinoma Induced By Anti-CD3 x Anti-CEA Bispecific Diabodies And B7 x Anti-CEA Bispecific Fusion Proteins," Cancer Res. 59:2909-2916; международные патентные публикации №№ WO 2006/113665; WO 2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO 2012/162068). Как правило, активация эффекторных клеток запускается связыванием антигена, связанного антителом, с эффекторной клеткой посредством взаимодействия Fc-FcyR; таким образом, в связи с этим, молекулы диател согласно настоящему изобретению могут проявлять Ig-подобную функциональность, независимо от того, содержат ли они домен Fc (например, согласно результатам любого анализа эффекторной функции, известного в настоящей области техники или представленного в качестве примера в настоящем документе (например, анализа ADCC)). Путем перекрестной сшивки опухолевых и эффекторных клеток диатело не только приводит эффекторную клетку в пространственную близость относительно опухолевых клеток, но приводит к эффективному лизису опухолевых клеток (см., например, Cao et al. (2003) "Bispecific Antibody Conjugates In Therapeutics, " Adv. Drug. Deliv. Rev. 55:171-197).
Тем не менее, вышеперечисленные преимущества сталкиваются с существенной стоимостью. Образование таких не моноспецифических диател требует успешной сборки двух или больше отдельных и различных полипептидов (т.е. такое образование требует, чтобы диатела образовывались посредством гетеродимеризации различных видов полипептидных цепей). Этот факт контрастирует с моноспецифическими диателами, которые образуются посредством гомодимеризации идентичных полипептидных цепей. Поскольку необходимо предоставить по меньшей мере два несходных полипептида (т.е. два вида полипептидов) для образования не моноспецифического диатела, и поскольку гомодимеризация таких полипептидов приводит к неактивным молекулам (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng.
13(8):583-588), получение таких полипептидов должно осуществляться таким путем, который предотвратит образование ковалентных связей между полипептидами одного и того же вида (Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588). В связи с
этим в настоящей области техники раскрыто нековалентное связывание таких полипептидов (см., например, Olafsen et al. (2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al. (2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Region" Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura, S. et al. (2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity " J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
Тем не менее, в настоящей области техники установлено, что биспецифические моновалентные диатела, состоящие из нековалентно связанных полипептидов, являются нестабильными и легко диссоциируются до нефункциональных мономеров (см. например, Lu, D. et al. (2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity " J. Biol. Chem. 280(20): 19665-19672).
Ввиду такой проблемы, в настоящей области техники добились успеха в разработке стабильных, ковалентно связанных гетеродимерных не моноспецифических диател (см., например, международные патентные публикации №№ WO 2006/113665; WO/2008/157379; WO 2010/080538; WO 2012/018687; WO/2012/162068; Johnson, S. et al. (2010) "Effector Cell Recruitment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And In Vivo B-Cell Depletion" J. Molec. Biol. 399(3):436-449; Veri, M.C. et al. (2010) "Therapeutic Control Of В Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor lib (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold" Arthritis Rheum. 62(7): 1933-1943; Moore, P.A. et al. (2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma" Blood 117(17):4542-4551; патентные публикации США №№ 2012/0294796 и 2013/0149236). Такие подходы предусматривают конструирование одного или нескольких цистеиновых остатков в каждом из используемых видов полипептидов. Например, было показано, что добавление цистеинового остатка к С-концу таких конструктов обеспечивает образование дисульфидной связи между полипептидными цепями, стабилизируя полученный гетеродимер, не создавая помехи для характеристик связывания бивалентной молекулы.
Были описаны диатела и другие иммуноглобулины, предположительно характеризующиеся специфичностью в отношении любого или обоих из gpA33 и CD3 (см., например, патентные публикации США №№ 2012/0014957; 2012/0034160; 2012/0087858; 2012/0189541; 2012/0195900; 2012/0201746; 2012/0237442; 2012/0263722; 2012/0258108 и 2012/0276608).
Несмотря на такой успех, получение стабильных, функциональных гетеродимерных, не моноспецифических диател может быть дополнительно усовершенствовано путем тщательного рассмотрения и размещения используемых доменов в полипептидных цепях. Таким образом, настоящее изобретение относится к предоставлению специфических полипептидов, которые детально разработаны для получения, посредством связывания ковалентной связью, гетеродимерных диател и гетеродимерных Fc - диател, которые способны одновременно связывать gpA33 и CD3.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к "gpA33 х CD3 биспецифическим моновалентным диателам". Согласно конкретным вариантам осуществления диатела согласно настоящему изобретению дополнительно содержат домен Fc - области иммуноглобулина (т.е. "домен Fc ") ("gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела") или альбуминсвязывающий домен ("ABD") ("gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела с ABD") для увеличения периода полужизни in vivo. gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению и gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению содержат две различных полипептидных цепи, которые ассоциируются друг с другом гетеродимерным образом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3. Таким образом, gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела и gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению являются моновалентными в том смысле, что они способны связываться только с одной копией эпитопа gpA33 и только с одной копией эпитопа CD3, но являются биспецифическими в том смысле, что одно диатело способно связываться одновременно с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3.
gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению состоят из двух полипептидных цепей ("первой" и "второй"
полипептидной цепи), которые ковалентно связаны друг с другом, например, с помощью связывания дисульфидным мостиком цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению состоят из трех полипептидных цепей ("первой", "второй" и "третьей" полипептидной цепи), причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом. Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к таким gpA33 х CD3 биспецифическим моновалентным диателам и gpA33 х CD3 биспецифическим моновалентным Fc -диатела и к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc - диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.
В частности, согласно настоящему изобретению предусмотрено биспецифическое моновалентное диатело, причем биспецифическое моновалентное диатело способно специфически связываться с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3, причем биспецифическое моновалентное диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
А. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27); причем субдомены (1A) и (IB) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2);
В. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УНсвз) (SEQ ID NO:25), причем субдомены (1А) и (IB) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем домен 2 первой полипептидной цепи и домен 2 второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена;
и при этом:
(a) домен VL первой полипептидной цепи и домен VH второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(b) домен VH первой полипептидной цепи и домен VL второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрен вариант осуществления описанного выше биспецифического моновалентного диатела, в котором первая полипептидная цепь или вторая полипептидная цепь содержит альбуминсвязывающий домен (SEQ ID NO:34), соединенный на С-конце с доменом 2 или на N-конце с доменом 1А посредством линкера 3 (SEQ ID NO:32).
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрено биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3, и обладает доменом Fc IgG, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело содержит первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь и треть полипептидную цепь, причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третьей полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
A. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УНсвз) (SEQ ID NO:25), причем субдомены (1А) и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и
iii. домен 3, содержащий субдомен (ЗА), который содержит а цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39) и субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG; причем домены 3 и 2 отделены друг от друга спейсерным пептидом (линкером 5) (SEQ ID NO:33);
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5), и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27); причем субдомены (1A) и (IB) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем домен 2 первой полипептидной цепи и домен 2 второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена; и
C. третья полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу, домен 3, содержащий:
субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39); и
(2)
субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
и при этом:
(a) полипептидные части доменов Fc IgG первой и третьей полипептидной цепи образуют домен Fc IgG;
(b) домен VL первой полипептидной цепи и домен VH второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(c) домен VH первой полипептидной цепи и домен VL второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрено биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3 и обладает доменом Fc IgG, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело содержит первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь и третью полипептидную цепь, причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и первая и третьей полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
А. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
домен 3, содержащий субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39) и субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с
CD3 (VHCDS) (SEQ ID NO:25), причем субдомены (1A) и (IB) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l); причем домены 1 и 3 отделены друг от друга спейсерным пептидом (линкером 4) (SEQ ID NO:38); iii. домен 2, причем домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHgpA33) (SEQ ID NO:27); причем субдомены (1A) и (IB) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем домен 2 отделен от домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем домен 2 первой полипептидной цепи и домен 2 второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена; и
C. третья полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу, домен 3, содержащий:
(1) субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39); и
(2) субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
и при этом:
(а) полипептидные части доменов Fc IgG первой и третьей полипептидной цепи образуют домен Fc IgG;
(b) домен VL первой полипептидной цепи и домен VH второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(c) домен VH первой полипептидной цепи и домен VL второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления любого из описанных выше биспецифических моновалентных Fc -диател, в которых субдомен (ЗВ) первой полипептидной цепи содержит последовательность, отличную от последовательности субдомена (ЗВ) третьей полипептидной цепи.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател, в которых субдомен (ЗВ) первой полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:40, и субдомен (ЗВ) третьей полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател, в которых субдомен (ЗВ) первой полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41, и субдомен (ЗВ) третьей полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:40.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател, в которых домен 3 первой полипептидной цепи и/или домен 3 третьей полипептидной цепи содержит вариантную последовательность СН2-СНЗ, которая проявляет измененное связывание с рецептором Fey.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления любого из описанных выше биспецифических моновалентных диател или любого из описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател, в которых домен 2 первой полипептидной цепи содержит Е-спираль (SEQ ID NO:3), и домен 2 второй полипептидной цепи содержит К-спираль (SEQ ID NO:4).
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрены варианты осуществления любого из описанных выше биспецифические моновалентные диатела или любого из описанных выше биспецифические моновалентные Fc - диатела, в
которых домен 2 первой полипептидной цепи содержит К-спираль (SEQ ID NO:4), и домен 2 второй полипептидной цепи содержит Е-спираль (SEQ ID NO:3).
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрено биспецифическое моновалентное диатело, причем биспецифическое моновалентное диатело способно специфически связываться с эпитопом CD3 и с эпитопом gpA33, причем биспецифическое моновалентное диатело содержит следующее:
(1) первая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28, и вторая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:30; или
(2) первая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:35, и вторая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:30;
причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрено биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с эпитопом CD3 и с эпитопом gpA33 и обладает доменом Fc IgG, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело содержит следующее:
(1) первая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, вторая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44, и третья полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; или
(2) первая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48, вторая полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28, и третья полипептидная цепь, характеризующаяся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46;
причем первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом первой дисульфидной связью, и первая и третьей полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом второй дисульфидной связью.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрена фармацевтическая композиция, содержащая любое из описанных выше биспецифических моновалентных диател или любое из описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател; и физиологически приемлемый носитель.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрено применение описанной выше фармацевтической композиции в лечении злокачественной опухоли, характеризующейся экспрессией gpA33, и, главным образом, такое применение, при котором злокачественная опухоль представляет собой колоректальный рак, рак толстой кишки, рак желудка или рак поджелудочной железы.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрена клетка, которая экспрессирует полипептидную цепь любого из описанных выше биспецифических моновалентных диател или любого из описанных выше биспецифических моновалентных Fc - диател, а также полинуклеотид, который кодирует такой экспрессированный полипептид.
Согласно настоящему изобретению дополнительно предусмотрена клетка, которая экспрессирует антитело или его полипептидную часть или фрагмент, причем антитело связывается с gpA33, и при этом антитело или его полипептидная часть или фрагмент содержит:
(1) CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:15) и CDR3 (SEQ ID NO:16)
легкой цепи антитела к gpA33 человека;
(2) CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:19) и CDR3 (SEQ ID N0:20)
тяжелой цепи антитела к gpA33 человека; или
(3) как (1), так и (2).
Краткое описание графических материалов
На фигуре 1 проиллюстрированы структуры первой и второй полипептидных цепей двухцепочечного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела согласно настоящему изобретению.
На фигурах 2А и 2В проиллюстрированы структуры двух версий первой, второй и третьей полипептидных цепей трехцепочечного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела согласно настоящему изобретению (версия 1, фигура 2А; версия 2, фигура 2В).
На фигуре 3 продемонстрировано, что диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с CD3 и с gpA33.
На фигуре 4 проиллюстрирована способность диател согласно настоящему изобретению лечить злокачественную опухоль. Клетки колоректального рака или клетки рака поджелудочной железы инкубировали в присутствии gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела ("DART-1) и или РВМС человека (Е:Т = 25:1), или активированных Т-клеток человека (Е:Т = 10:1), и измеряли цитотоксичность (фигура 4А (клетки колоректального рака Colon CSCL), фигура 4В (клетки колоректального рака Со1о205), и фигура 4С (клетки рака поджелудочной железы ASPC-1).
На фигурах 5A-5F показано, что активация Т-клеток CD8 происходила в присутствии биспецифического моновалентного диатела к CD3 ("DART-1) только в присутствии злокачественные клетки (фигуры 5А-5С: CD8 Т-клетки + клетки colo205 (фигура 5А), Т-клетки CD8 + клетки ASPC-1 (фигура 5В), Т-клетки CD8 отдельно (фигура 5С); фигуры 5D-5F: Т-клетки CD4 + клетки colo205 (фигура 5D), Т-клетки CD4+ клетки ASPC-1 (фигура 5Е), Т-клетки CD8 отдельно (фигура 5F).
На фигурах 6A-6D показано, что gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела (DART-1 и DART-2) опосредовали эквивалентную цитотоксичность в отношении клеток колоректальной аденокарциномы SW948 (фигура 6А) и клеток colo205 (фигура 6В) и клеток Colo205-Luc (фигура 6С), и что ни одно диатело не опосредовало цитотоксичность gpA33-отрицательной клеточной линии злокачественной опухоли, НСТ116 (фигура 6D).
На фигурах 7A-7D показана способность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-2), gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен (DART-2 с ABD "w/ABD") и gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc иммуноглобулина IgG (DART-2 с Fc "w/Fc") стимулировать цитотоксичность злокачественных клеток в присутствии РВМС человека или яванского макака.
На фигуре 8 продемонстрирована in vivo способность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-1) уменьшать объем опухоли в мышиной модели рака толстой кишки Со1о205.
На фигурах 9A-9D показаны данные сцинтиграфии опухолей у мышей NOD (страдающих диабетом без ожирения) scid (с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью) гамма (NSG), которым имплантировали клетки Со1о205 через два
дня после получения инертного носителя (фигура 9А) или gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело (DART-1) (фигура 9В), и через 12 дней после получения инертного носителя (фигура 9С) или DART-1 (фигура 9D).
На фигуре 10 продемонстрирована in vivo способность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-1) уменьшать объем опухоли в мышиной модели рака поджелудочной железы ASPC-1.
На фигуре 11 показана способность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc иммуноглобулина IgG (версия 1DART-2 w/Fc) опосредовать резкое снижение объема опухоли в in vivo модели рака толстой кишки.
На фигуре 12 показана способность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc иммуноглобулина IgG (версия 1DART-2 w/Fc) опосредовать снижение объема опухоли в in vivo модели рака толстой кишки даже в крайне низких дозах.
На фигуре 13 показана фармакокинетика gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-2) и gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc иммуноглобулина IgG (версия 1DART-2 w/Fc) у яванских макак.
На фигурах 14А-14В показан анализ SPR связывания версии 1 DART-2 w/Fc с иммобилизированным CD3 человека и яванского макака. Черные пунктирные линии представляют глобальную аппроксимацию 1:1 модели Ленгмюра кривых связывания, полученных при концентрациях DART-2 w/Fc, составляющих 0, 6,25, 12,5, 25, 50 или 100 нМ. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
На фигурах 15А-15В показан анализ SPR связывания версии 1 DART-2 w/Fc с захваченным gpA33 человека и яванского макака. Черные пунктирные линии представляют глобальную аппроксимацию 1:1 модели Ленгмюра кривых связывания, полученных при концентрации версии 1 DART-2 w/Fc, составляющей 0, 6,25, 12,5, 25, 50 или 100 нМ. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат две полипептидных цепи и которые характеризуются наличием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и
одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело"). Настоящее изобретение также относится к биспецифическим моновалентным диателам, которые содержат домен Fc иммуноглобулина ("биспецифические моновалентные Fc - диатела") и состоят из трех полипептидных цепей и которые характеризуются наличием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3 (т.е. a "gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное Fc - диатело"). Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению способны одновременно связываться с gpA33 и CD3. Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые содержат такие биспецифические моновалентные диатела или такие биспецифические моновалентные Fc - диатела. Настоящее изобретение дополнительно относится к способам применения таких диател в лечении злокачественной опухоли и других заболеваний и состояний.
gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению состоят из двух полипептидных цепей, которые ассоциируются друг с другом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3. Отдельные полипептидные цепи диатела ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Каждая полипептидная цепь содержит антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи, антигенсвязывающий домен вариабельного домена тяжелой цепи и домен гетеродимеризации. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи от антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи. Антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи первой полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи второй полипептидной цепи с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении первого антигена (т.е. или gpA33, или CD3). Аналогично, антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи второй полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении второго
антигена (т.е. или gpA33, или CD3, в зависимости от идентичности первого антигена). Таким образом, выбор антигенсвязывающего домена вариабельного домена легкой цепи и антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, чтобы две полипептидных цепи совместно содержали антигенсвязывающие домены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, способные связываться с gpA33 и CD3.
gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению состоят из первой полипептидной цепи, второй полипептидной цепи и третьей полипептидной цепи. Первая и вторая полипептидные цепи ассоциируются друг с другом с образованием одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа gpA33, и одного сайта связывания, специфического в отношении эпитопа CD3. Первая полипептидная цепь и третья полипептидная цепь ассоциируются друг с другом с образованием домена Fc иммуноглобулина. Первая и вторая полипептидные цепи биспецифического моновалентного Fc - диатела ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Первая и третьей полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах каждой полипептидной цепи. Каждая из первой и второй полипептидных цепей содержит антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи, антигенсвязывающий домен вариабельного домена тяжелой цепи и домен гетеродимеризации. Промежуточный линкерный пептид (линкер 1) отделяет антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи от антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи. Антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи первой полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи второй полипептидной цепи с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении первого антигена (т.е. или gpA33, или CD3). Аналогично, антигенсвязывающий домен вариабельного домена легкой цепи второй полипептидной цепи взаимодействует с антигенсвязывающим доменом вариабельного домена тяжелой цепи первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении второго антигена (т.е. или gpA33, или CD3, в зависимости от идентичности первого антигена). Таким образом, выбор
антигенсвязывающего домена вариабельного домена легкой цепи и антигенсвязывающего домена вариабельного домена тяжелой цепи первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, чтобы две полипептидных цепи совместно содержали антигенсвязывающие домены вариабельных доменов легкой и тяжелой цепи, способные связываться с gpA33 и CD3. Каждая из первой и третьей полипептидных цепей содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) SEQ ID NO:39: и частично или полностью домен СН2 и/или частично или полностью домен СНЗ полного домена Fc иммуноглобулина и цистеинсодержащий пептид. Некоторая часть или весь домен СН2 и/или некоторая часть или весь домен СНЗ ассоциируются с образованием домена Fc иммуноглобулина биспецифических моновалентных Fc -диател согласно настоящему изобретению. Первая и третья полипептидные цепи биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению ковалентно связаны друг с другом, например, путем связывания дисульфидной связью цистеиновых остатков, расположенных в пределах цистеинсодержащего пептида полипептидных цепей.
Образование гетеродимеров первой и второй полипептидных цепей биспецифического моновалентного диатела или биспецифического моновалентного Fc - диатела может управляться доменами гетеродимеризации. Такие домены включают в себя GVEPKSC (SEQ ID NO:54) (или VEPKSC; SEQ ID NO:55) на одной полипептидной цепи и GFNRGEC (SEQ ID NO:56) (или FNRGEC; SEQ ID NO:57) на другой полипептидной цепи (US2007/0004909). Альтернативно, такие домены могут быть сконструированы так, чтобы они содержали спирали противоположных зарядов. Домен гетеродимеризации одной из полипептидных цепей содержит последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми положительно заряженных аминокислот, и домен гетеродимеризации другой полипептидной цепи содержит последовательность по меньшей мере из шести, по меньшей мере из семи или по меньшей мере из восьми отрицательно заряженных аминокислот. Например, первый или второй домен гетеродимеризации может содержать последовательность, содержащую восемь положительно заряженных аминокислот, и другие из доменов гетеродимеризации могут содержать последовательность, содержащую восемь отрицательно заряженных аминокислот. Положительно заряженная аминокислота может представлять собой лизин, аргинин, гистидин и т.д. и/или отрицательно заряженная аминокислота может представлять собой глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту и т.д.
Положительно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой лизин и/или отрицательно заряженная аминокислота предпочтительно представляет собой глутаминовую кислоту.
Биспецифические моновалентные диатела и биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению сконструированы так, чтобы такие первые и вторые полипептидные цепи были ковалентно связаны друг с другом посредством цистеиновых остатков вдоль их длины. Такие цистеиновые остатки могут быть введены в промежуточный линкер, который отделяет домены VL и VH полипептидов. Альтернативно и более предпочтительно, второй пептид (линкер 2) введен в каждую из полипептидных цепей, например, на амино-конце полипептидных цепей или в положении, которое помещает линкер 2 между доменом гетеродимеризации и антигенсвязывающим доменом вариабельного домена легкой цепи или вариабельного домена тяжелой цепи.
Как указано выше, gpA33 экспрессируется клетками колоректального рака. Антитела, способные иммуноспецифически связываться с gpA33, способны связываться с такими клетками. CD3 экпрессируется на Т-клетках. Таким образом, антитела, способные иммуноспецифически связываться как с gpA33, так и с CD3, способны направлять Т-клетки на клетки колоректального рака и другие злокачественные клетки, которые экспрессируют gpA33 (например, клетки карциномы толстой кишки, клетки рака поджелудочной железы и т.д.) и, таким образом, обеспечивать улучшенную терапию для таких злокачественных опухолей.
I. Предпочтительные gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела согласно настоящему изобретению
A. gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела
Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения предусмотрены gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела, которые состоят из первой полипептидной цепи и второй полипептидной цепи, чьи последовательности позволяют полипептидным цепям ковалентно связаться друг с другом с образованием ковалентно-ассоциированного комплекса, который способен одновременно связываться как с gpA33, так и CD3.
Первая полипептидная цепь предпочтительных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател содержат, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться или с CD3, или с gpA33 (т.е.
или VLCD3, или VLgpA33), первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33 (если такая первая полипептидная цепь содержит УЬсвз), или с CD3 (если такая первая полипептидная цепь содержит VLgPA33), цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), стимулирующий образование гетеродимера домен и С-конец (фигура 1).
Вторая полипептидная цепь предпочтительных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател содержит, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33, или с CD3 (т.е. или VLgPA33, или VLCD3, в зависимости от домена VL, выбранного для первой полипептидной цепи диатела), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться ли с CD3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит УЬ^дззХ или с CD3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит УЬсвз), цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2), стимулирующий образование гетеродимера домен и С-конец (фигура 1).
Домен VL первой полипептидной цепи предпочтительных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател взаимодействует с доменом VH второй полипептидной цепи предпочтительных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател с образованием первого функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении первого антигена (т.е. или CD3, или gpA33). Аналогично, домен VL второй полипептидной цепи взаимодействует с доменом VH первой полипептидной цепи с образованием второго функционального антигенсвязывающего сайта, который является специфическим в отношении второго антигена (т.е. или gpA33, или CD3, в зависимости от идентичности первого антигена). Таким образом, выбор доменов VL и VH первой и второй полипептидных цепей скоординирован так, чтобы две полипептидных цепи предпочтительных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател совместно содержали домены VL и VH, способные связываться с gpA33 и CD3 (т.е. они содержат
VLCD3/VHcD3 и УЬ^АЗЗ/УН^АЗЗ).
Длина промежуточного линкерного пептида (линкера 1, который отделяет такие домены VL и VH) наиболее предпочтительно выбрана так, чтобы существенно или полностью предотвращать связывание доменов VL и VH полипептидной цепи друг с другом. Таким образом, домены VL и VH первой полипептидной цепи существенно или полностью не способны связываться друг с другом. Аналогично, домены VL и VH
второй полипептидной цепи существенно или полностью не способны связываться друг с другом. Предпочтительный промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:l): GGGSGGGG.
Цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) будет содержать 1, 2, 3 или больше цистеинов. Предпочтительный цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2: GGCGGG.
Стимулирующие образование гетеродимера домены первого и второго полипептидов отличаются друг от друга и сконструированы, чтобы ассоциироваться друг с другом так, чтобы стимулировать ассоциацию первой и второй полипептидных цепей. Таким образом, согласно предпочтительному варианту осуществления одна из этих полипептидных цепей будет сконструирована, чтобы содержать стимулирующий образование гетеродимера "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3):
EVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
чьи остатки будут формировать отрицательный заряд при рН 7, тогда как другая из двух полипептидных цепей буде сконструирована так, чтобы содержать стимулирующий образование гетеродимера "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4):
IWAALKEI^AALKEKVAALKEKVAALKE
чьи остатки будут формировать положительный заряд при рН 7. Присутствие таких заряженных доменов стимулирует ассоциацию между первым и вторым полипептидами и, таким образом, способствует гетеродимеризации. Несущественно, какая спираль обеспечивается какой цепью, при условии, что спирали, используемые на первой и второй полипептидных цепях различаются так, чтобы способствовать гетеродимеризации между такими цепями.
1. gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, "DART-1"
Первая и вторая полипептидные цепи предпочтительного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, обозначенного в настоящем документе как "DART-1", содержат полипептидные домены, характеризующиеся следующими последовательностями:
Домен VL антитела, которое связывает CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
Антигенсвязывающий домен VLCD3 содержит CDR1 с последовательностью: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:7): GTNKRAP; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV.
Домен VH антитела, которое связывает CD3 (УНСБЗ) (SEQ ID NO:9):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYAT YYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS
Антигенсвязывающий домен VHCD3 содержит: CDR1 с последовательностью (SEQ ID N0:10): TYAMN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO: 11)
RIRSKYNNYATYYADSVKD; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:12):
HGNFGNSYVSWFAY.
Домен VL мышиного антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:13):
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELK
Антигенсвязывающий домен VLGPA33 содержит CDR1 с последовательностью (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:15): DTSNLAS; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
Домен VH мышиного антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:17):
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGETNY NGK FKDKAT L TADKSS T TAYMEL S S L T SVDSAVYFCARIYGNNVY FDVWGAGTTVTVSS
Антигенсвязывающий домен VHGPA33 содержит CDR1 с последовательностью
(SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:19):
RIYPGDGETNYNGKFKD; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID N0:20):
I YGNNVY FDV.
Первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:l): GGGSGGGG. Цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2: GGCGGG.
Стимулирующий образование гетеродимера домен первой полипептидной цепи представляет собой "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3). Стимулирующий образование гетеродимера домен второй полипептидной цепи представляет собой "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Таким образом, первая полипептидная цепь DART-1 характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:21):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQV QLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFSGSWMNWVKQRPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNG KFKDKATLTADKSSTTAYMELSSLTSVDSAVYFCARIYGNNVYFDVWGAGTTVTVSSGGC GGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Следует принимать во внимание, что остатки 1-110 SEQ ID NO:21 представляют собой домен VL антитела, которое связывает CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); остатки 111-118 SEQ ID NO:21 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 119-237 SEQ ID NO:21 представляют собой домен VH мышиного антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:17), остатки 238-243 SEQ ID NO:21 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2) и остатки 244-271 SEQ ID NO:21 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует первую полипептидную цепь DART-1, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:22):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctg acatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcag aagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacc cctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggca caggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttc gggggtggcacaaaactgactgtgctgggaggtggtggatccggcggaggtggacaggtc cagctgcagcagtctggacctgagctggtgaagcctggggcctcagtgaagatttcctgc aaagcttcaggctacacattcagtggctcttggatgaactgggtgaagcagaggcctgga cagggtcttgagtggattggacggatctaccctggagatggagaaactaactacaatggg aagtttaaggacaaggccacactgactgcagacaaatcatccaccacagcctacatggag ctcagcagcctgacctctgtggactctgcggtctatttctgtgcaagaatctatggtaat aacgtttacttcgatgtctggggcgcagggaccacggtcaccgtgtcttccggaggatgt ggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgct gcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa
Вторая полипептидная цепь DART-1 характеризуется следующей
последовательностью (SEQ ID NO:23):
QIVLTQSPAIMSASPGERVTMTCSARSSISFMYWYQQKPGSSPRLLIYDTSNLASGVPVR FSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGSGTKLELKRGGGSGGGGEVQLV ESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFNTYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRSKYNNYATYYADS VKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSS G G С G G GKVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE
Следует принимать во внимание, что остатки 1-107 SEQ ID NO:23 представляют собой домен VL мышиного антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:13); остатки 108-115 SEQ ID NO:23 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 116-240 SEQ ID NO:23 представляют собой домен VH антитела, которое связывает CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:9), остатки 241-246 SEQ ID NO:23 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2) и остатки 247-274 SEQ ID NO:23 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует вторую полипептидную цепь DART-1, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:24):
Caaattgttctcacccagtctccagcaatcatgtctgcatctccaggggagagggtcacc atgacctgcagtgccaggtcaagtataagtttcatgtactggtaccagcagaagccagga tcctcccccagactcctgatttatgacacatccaacctggcttctggagtccctgttcgc ttcagtggcagtgggtctgggacctcttattctctcacaatcagccgaatggaggctgaa gatgctgccacttattactgccagcagtggagtagttacccactcacgttcggttctggg accaagctggagctgaaacggggtggaggatccggcggaggcggagaggtgcagctggtg gagtctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctct ggattcaccttcaacacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctg gagtgggttgcaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactct gtgaaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatg aacagcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggc aattcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttcc ggaggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagag aaggtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
2. gpA33 x CD3 биспецифическое моновалентное диатело, "DART-2"
Первая и вторая полипептидные цепи второго предпочтительного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, обозначенного в настоящем документе как "DART-2," содержат полипептидные домены, характеризующиеся следующими последовательностями:
Домен VL антитела, которое связывает CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLG
Антигенсвязывающий домен VLCD3 содержит CDR1 с последовательностью: (SEQ ID NO:6) RSSTGAVTTSNYAN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:7): GTNKRAP; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:8): ALWYSNLWV
Домен VH антитела, которое связывает CD3 (УНСБЗ) (SEQ ID NO:25):
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYAT YYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTL VTVSS
Антигенсвязывающий домен VHCD3 содержит CDR1 с последовательностью (SEQ ID N0:10): TYAMN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:ll):
RIRSKYNNYATYYADSVKD; и CDR3 с последовательностью: (SEQ ID NO:12)
HGNFGNSYVSWFAY.
Обсуждаемое выше мышиное антитело, которое связывается с gpA33 человека, гуманизировали для получения доменов VL и VH предпочтительного диатела DART-2. Указанные гуманизированные домены представлены ниже:
Домен VL гуманизированного антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:26):
DIQLTQS PS FLSASVGDRVTITCSARS SIS FMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIK
Антигенсвязывающий домен VLGPA33 содержит CDR1 с последовательностью (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:15): DTSNLAS; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
Домен VH гуманизированного антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:27):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNY NGKFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSS
Антигенсвязывающий домен VHGPA33 содержит CDR1 с последовательностью
(SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:19):
RIYPGDGETNYNGKFKD; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID N0:20):
I YGNNVY FDV.
Первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:l): GGGSGGGG. Цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2: GGCGGG.
Стимулирующий образование гетеродимера домен первой полипептидной цепи представляет собой "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3). Стимулирующий образование гетеродимера домен второй полипептидной цепи представляет собой "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Таким образом, первая полипептидная цепь DART-2 характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:28):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQV QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNG KFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGC GGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEK
Следует принимать во внимание, что остатки 1-110 SEQ ID NO:28
представляют собой домен VL антитела, которое связывает CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID
NO:5); остатки 111-118 SEQ ID NO:28 представляют собой первый промежуточный
спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 119-237 SEQ ID NO:28
представляют собой домен VH антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID
NO:27), остатки 238-243 SEQ ID NO:28 представляют собой цистеинсодержащий
спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2) и остатки 244-271 SEQ ID NO:28
представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "Е-спиральный" домен
(SEQ ID NO:3).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует первую полипептидную цепь DART-2, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:29):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctg acatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcag aagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacc cctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggca caggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttc gggggtggcacaaaactgactgtgctgggaggtggtggatccggcggaggtggacaggtc cagctggtccagagcggggccgaagtcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgc aaagcatcaggctatacatttacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccagga cagggactggagtggatcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatgga aagttcaaagaccgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggag ctgagctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggaggatgt ggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgct gcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaa
Вторая полипептидная цепь DART-2 характеризуется следующей
последовательностью (SEQ ID N0:30):
DIQLTQS PS FLSASVGDRVTITCSARS SIS FMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSG G С G G GKVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE
Следует принимать во внимание, что остатки 1-106 SEQ ID N0:30 представляют собой домен VL антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:26); остатки 107-114 SEQ ID N0:30 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 115-239 SEQ ID N0:30 представляют собой домен VH антитела, которое связывает CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:25), остатки 240-245 SEQ ID N0:30 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2) и остатки 246-273 SEQ ID N0:30 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует вторую полипептидную цепь DART-2, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:31):
Gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgagtgact attacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagcagaagcccggc aaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctccggggtgccatctcgg ttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaattagctccctggaggctgaa gatgccgctacctactattgccagcagtggagcagctatcctctgaccttcggacagggg actaaactggaaatcaagggtggaggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggag tctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctgga ttcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggag tgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtg aaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaac agcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccgga ggatgtggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaag gtcgccgcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
3. gpA33 x CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен (ABD) ("DART-2 w/ABD")
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело будет содержать альбуминсвязывающий домен ("ABD") (gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело с ABD").
Как раскрыто в международной патентной публикации WO 2012/018687, для улучшения in vivo фармакокинетических свойств молекул диател молекулы могут быть модифицированы так, чтобы они содержали полипептидную часть белка, связывающегося с сывороточными белками, на одном или нескольких концах молекулы диатела. Наиболее предпочтительно, такая полипептидная часть белка, связывающегося с сывороточными белками, будет встроена на С-конце молекулы диатела. Особенно предпочтительная полипептидная часть белка, связывающегося с
сывороточными белками, для этой цели представляет собой альбуминсвязывающий домен (ABD) из белка G стрептококка. Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 является особенно предпочтительным.
Альбуминсвязывающий домен 3 (ABD3) белка G штамма Streptococcus G148 состоит из 46 аминокислотных остатков, образующих стабильный трехспиральную структуру и характеризуется широкой альбуминсвязывающей специфичностью (Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules" J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120). Альбумин представляет собой наиболее распространенный белок в плазме и характеризуется периодом полувыведения, составляющим 19 дней у людей. Альбумин содержит несколько низкомолекулярных сайтов связывания, которые позволяют ему нековалентно связываться с другими белками и, тем самым, продлевать их периоды полужизни в сыворотке.
Таким образом, первая полипептидная цепь или вторая полипептидная цепь gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен, содержит третий линкер (линкер 3), который отделяет Е-спираль (или К-спираль) такой полипептидной цепи от альбуминсвязывающего домена. Предпочтительная последовательность такого линкера 3 представляет собой GGGS (SEQ ID NO:32) или GGGNS (SEQ ID NO:33). Предпочтительный альбуминсвязывающий домен (ABD) характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34):
LAQAKEAAIRE LDKYGVS DYYKNLIDNAKSAEGVKALIDEILAAL P
Чтобы проиллюстрировать этот аспект настоящего изобретения, первая полипептидную цепь описанного выше DART-2 модифицировали так, чтобы она содержала альбуминсвязывающий домен, приводя в результате к образованию gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего ABD, обозначенного в настоящем документе как "DART-2 w/ABD."
Первая полипептидная цепь такого DART-2 w/ABD характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQV QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNG KFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGC GGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGSLAQAKEAAIRELDKYGVSDYYKNLI DNAKSAE GVKALIDEILAAL P
Следует принимать во внимание, что остатки 1-271 SEQ ID NO:35 являются идентичными остаткам 1-271 DART-2 и, таким образом, представляют, в направлении от N-конца к С-концу, домен VL антитела, которое связывает CD3 (VLCD3) (SEQ ID NO:5); первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); домен VH антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:27), цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2), стимулирующий образование гетеродимера "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3) и С-конец. Остатки 272-275 представляют собой линкер 3 (SEQ ID NO:32), и остатки 276-321 представляют собой альбуминсвязывающий домен (SEQ ID NO:34).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует первую полипептидную цепь DART-2 w/ABD, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:36):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctg acatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcag aagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacc cctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggca caggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttc gggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggaggtggacaggtc cagctggtccagagcggggccgaagtcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgc aaagcatcaggctatacatttacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccagga cagggactggagtggatcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatgga aagttcaaagaccgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggag ctgagctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggaggatgt ggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggaggtcgct gcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcgggtctctggcccaggcaaaa gaggcagccatccgcgaactggataaatatggcgtgagcgattattataagaacctgatt gacaacgcaaaatccgcggaaggcgtgaaagcactgattgatgaaattctggccgccctg cct
Вторая полипептидная цепь DART-2 w/ABD является такой же, как обсуждаемая выше вторая полипептидная цепь DART-2 (SEQ ID N0:30).
В. gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела, содержащие домен Fc IgG ("DART-2 w/Fc")
Согласно дополнительному варианту осуществления настоящее изобретение предусматривает gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела, содержащие домен Fc IgG. Соответственно, такие диатела в настоящем документе называется "gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела". Домен Fc Fc - диател согласно настоящему изобретению может представлять собой либо полную область Fc
(например, полную область Fc IgG) или только фрагмент полной области Fc. Хотя домен Fc биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению может обладать способность связываться с одним или несколькими рецепторами Fc (например, FcyR), более предпочтительно такой домен Fc будет вызывать сниженное связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16a) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа) или будет существенно устранять способность такого домена Fc связываться с таким(и) рецептором(ами). Домен Fc биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению может включать в себя частично или полностью домен СН2 и/или частично или полностью домен СНЗ полной области Fc или может содержать вариантную последовательность СН2 и/или вариантную последовательность СНЗ (которая может включать в себя, например, одну или несколько вставок и/или одну или несколько делеций относительно доменов СН2 или СНЗ полной области Fc). Домен Fc биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению может содержать не относящиеся к Fc полипептидные части, или может содержать части не встречающихся в природе полных областей Fc, или может содержать не встречающиеся в природе ориентации доменов СН2 и/или СНЗ (такие как, например, два домена СН2 или два домена СНЗ, или, в направлении от N-конца к С-концу, домен СНЗ, соединенный с доменом СН2, и т.д.).
Согласно первому варианту осуществления, обозначенному как "версия 1" и показанному на фигуре 2А, первая полипептидная цепь иллюстративного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33, или с CD3 (т.е. или VLGPA33, или УЬСБЗХ промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33 (если такая первая полипептидная цепь содержит УЬсоз), или с CD3 (если такая первая полипептидная цепь содержит VLGPA33), цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), стимулирующий образование гетеродимера домен, спейсерный пептид (линкер 5), цистеинсодержащий пептид (пептид 1), домен Fc IgG (предпочтительно, все или часть доменов СН2 и СНЗ области Fc антитела) и С-конец.
Согласно второму варианту осуществления, обозначенному как "версия 2" и показанному на фигуре 2В, первая полипептидная цепь иллюстративного gpA33 х CD3
биспецифического моновалентного Fc - диатела будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, цистеинсодержащий пептид (пептид 1), домен Fc IgG (предпочтительно, все или часть доменов СН2 и СНЗ области Fc антитела), промежуточный спейсерный пептид (линкер 4); домен VL моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33, или с CD3 (т.е. или VLgpA33, или УЬсвзХ промежуточный спейсерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33 (если такая первая полипептидная цепь содержит УЬСБЗ), или с CD3 (если такая первая полипептидная цепь содержит VLgpA33), цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2), стимулирующий образование гетеродимера домен и С-конец.
Предпочтительно, согласно любому варианту осуществления домен Fc первой полипептидной цепи будет вызывать сниженное связывание с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), FcyRIIB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16a) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа) или будет существенно устранять способность такого домена Fc связываться с таким(и) рецептором(ами). Варианты и мутантные формы Fc, способные опосредовать такое измененное связывание, хорошо известны в настоящей области техники и включают в себя аминокислотные замены в положениях 234 и 235, замену в положении 265 или замену в положении 297 (см., например, патент США № 5624821, включенный в настоящий документ посредством ссылки). Согласно предпочтительному варианту осуществления домен СН2 и СНЗ включает в себя замену в положении 234 на аланин и в положении 235 на аланин.
Вторая полипептидная цепь таких иллюстративных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател (версии 1 и версии 2) будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец, домен VL моноклонального антитела, способного связываться или с gpA33, или с CD3 (т.е. или VLgpA33, или VLCD3> В зависимости от домена VL, выбранного для первой полипептидной цепи диатела), промежуточный линкерный пептид (линкер 1), домен VH моноклонального антитела, способного связываться или с CD3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит VLgpA33), или с CD3 (если такая вторая полипептидная цепь содержит УЬсш), цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2), стимулирующий образование гетеродимера домен (предпочтительно К-спиральный домен) и С-конец.
Иллюстративные gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела (версия 1 и версия 2) будут дополнительно содержать третью полипептидную цепь, которая будет содержать, в направлении от N-конца к С-концу, N-конец,
цистеинсодержащий пептид (пептид 1), домен Fc IgG (предпочтительно, все или часть доменов СН2 и СНЗ области Fc антитела), характеризующийся таким же изотипом, что и домен Fc первой полипептидной цепи, и С-конец. Домен Fc третьей полипептидной цепи предпочтительно будет вызывать снижение связывания с FcyRIA (CD64), FcyRIIA (CD32A), Fey RUB (CD32B), FcyRIIIA (CD 16a) или FcyRIIIB (CD 16b) (относительно связывания, проявляемого областью Fc дикого типа) или будет существенно устранять способность такого домена Fc связываться с таким(и) рецептором(ами), как обсуждалось выше, по отношению к первой полипептидной цепи иллюстративных gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател.
Необязательно присутствующий промежуточный спейсерный пептид (линкер 4) будет предпочтительно содержать аминокислотную последовательность (SEQ ID NO:37): APSSS и более предпочтительно характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:38): APSSSPME.
Цистеинсодержащий пептид (пептид 1) первой и третьей полипептидных цепей и могут состоять из одной и той же аминокислотной последовательности или из различных аминокислотных последовательностей и будут содержать 1, 2, 3 или больше цистеиновых остатков. Особенно предпочтительный пептид 1 характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:39): DKTHTCPPCP.
Промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) предпочтительно характеризуется последовательностью SEQ ID NO:l, описанной выше. Цистеинсодержащий второй промежуточный спейсерный пептид (линкер 2) предпочтительно характеризуется последовательностью SEQ ID NO:2, описанной выше.
Стимулирующий образование гетеродимера домен первой и второй полипептидных цепей gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател будет предпочтительно представлять собой описанный выше Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) и К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), и будет выбран так, чтобы одна из таких полипептидных цепей содержала Е-спиральный домен, тогда как другая содержала К-спиральный домен, как обсуждалось выше.
Предпочтительный спейсерный пептид (линкер 5) характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:33) GGG.
Домены СН2 и/или СНЗ первого и третьего полипептидов необязательно должны быть идентичными и предпочтительно модифицированы так, чтобы
содействовать образованию комплекса между двумя полипептидами. Например, аминокислотная замена (предпочтительно замена на аминокислоту, содержащую объемную боковую группу, образующую 'выступ', например, триптофан) может быть введена в домен СН2 или СНЗ так, чтобы стерическое влияние предотвращало взаимодействие с аналогично мутированным доменом и вынуждало мутированный домен образовывать пару с доменом, в котором была сконструирована комплементарная, или обеспечивающая размещение мутация, т.е. 'впадина' (например, замена на глицин). Такие наборы мутаций можно сконструировать в любой паре полипептидов, содержащих молекулу биспецифического моновалентного Fc - диатела, и, кроме того, сконструировать в любой части полипептидных цепей указанной пары. Способы белковой инженерии, чтобы способствовать гетеродимеризации вместо гомодимеризации, хорошо известны в настоящей области техники, в частности, в отношении инженерии иммуноглобулиноподобных молекул, и предусмотрены в настоящем документе (см., например, Ridgway et al. (1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization, " Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al. (1997) "Stable Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library, " J. Mol. Biol. 270: 26-35, и Xie et al. (2005) "A New Format Of Bispecific Antibody: Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101; каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки). Предпочтительно, что 'выступ' конструируют в доменах СН2-СНЗ первой полипептидной цепи, а 'впадину' конструируют в доменах СН2-СНЗ третьей полипептидной цепи. Таким образом, 'выступ' будет содействовать в предотвращении гомодимеризации первой полипептидной цепи посредством своих доменов СН2 и/или СНЗ. Поскольку третья полипептидная цепь предпочтительно содержит замену, обеспечивающую образование 'впадины', она будет гетеродимеризоваться с первой полипептидной цепью, а также гомодимеризоваться самим с собой. Предпочтительный выступ создается путем модификации домена Fc нативной области Fc IgG так, чтобы она содержала модификацию T366W. Предпочтительная впадина создается путем модификации домена Fc нативной области Fc IgG, чтобы она содержала модификацию T366S, L368A и Y407V. Для содействия в очищении гомодимера третьей полипептидной цепи от конечного биспецифического моновалентного Fc - диатела, содержащего первую, вторую и третью полипептидные цепи, сайт связывания с белком А доменов СН2 и СНЗ третьей полипептидной цепи предпочтительно подвергают мутации с помощью
аминокислотной замены в положении 435 (H435R). Для содействия в очищении третья полипептидная цепь гомодимера третьей полипептидной цепи от конечного биспецифического моновалентного Fc - диатела, содержащего первую, вторую и третью полипептидные цепи, сайт связывания с белком А доменов СН2 и СНЗ третьей полипептидной цепи предпочтительно подвергают мутации с помощью аминокислотной замены. Таким образом, гомодимер третьей полипептидной цепи не будет связываться с белком А, тогда как биспецифическое моновалентное Fc - диатело будет сохранять свою способность связывать белок А через сайт связывания с белком А на первой полипептидной цепи.
Предпочтительная последовательность для доменов СН2 и СНЗ домена Fc антитела, присутствующего в первой полипептидной цепи, представляет собой (SEQ ID N0:40):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Предпочтительная последовательность для доменов СН2 и СНЗ домена Fc
антитела, присутствующего в третьей полипептидной цепи, представляет собой (SEQ
ID NO:41):
APEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
1. Версия 1 DART-2 w/Fc
Первая, вторая и третья полипептидные цепи предпочтительного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела, обозначенного в настоящем документе как "версия 1 DART-2 w/Fc", содержат полипептидные домены, характеризующиеся следующими последовательностями:
Первая полипептидная цепь такой версии 1 DART-2 w/Fc характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:42):
DIQLTQS PS FLSASVGDRVTITCSARS SIS FMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVE SGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSV KDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSG GCGGGEVAALEKEVAALEKEVAALEKEVAALEKGGGDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWS VLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
Следует принимать во внимание, что остатки 1-106 SEQ ID NO:42 представляют собой домен VL антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:26); остатки 107-114 SEQ ID NO:42 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 115-239 SEQ ID NO:42 представляют собой домен VH антитела, которое связывает CD3 (УНСБЗ) (SEQ ID NO:25); остатки 240-245 SEQ ID NO:42 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2); остатки 246-273 SEQ ID NO:42 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "Е-спиральный" домен (SEQ ID NO:3); остатки 274-276 представляют собой спейсерный пептид (линкер 5) (SEQ ID NO:33); остатки 277-286 представляют собой пептид 1 (SEQ ID NO:39), остатки 277-503 представляют собой последовательность для доменов СН2 и СНЗ домена Fc антитела (SEQ ID N0:40).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует первую полипептидную цепь версии 1 DART-2 w/Fc, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:43):
gacattcagctgactcagtccccctcttttctgtccgcatccgtcggagatcgagtgact attacttgctctgctaggtcctcaatcagcttcatgtactggtatcagcagaagcccggc aaagcacctaagctgctgatctacgacacaagcaacctggcctccggggtgccatctcgg ttctctggcagtgggtcaggaactgagtttaccctgacaattagctccctggaggctgaa gatgccgctacctactattgccagcagtggagcagctatcctctgaccttcggacagggg actaaactggaaatcaagggtggaggatccggcggcggaggcgaggtgcagctggtggag tctgggggaggcttggtccagcctggagggtccctgagactctcctgtgcagcctctgga ttcaccttcagcacatacgctatgaattgggtccgccaggctccagggaaggggctggag tgggttggaaggatcaggtccaagtacaacaattatgcaacctactatgccgactctgtg aaggatagattcaccatctcaagagatgattcaaagaactcactgtatctgcaaatgaac agcctgaaaaccgaggacacggccgtgtattactgtgtgagacacggtaacttcggcaat tcttacgtgtcttggtttgcttattggggacaggggacactggtgactgtgtcttccgga ggatgtggcggtggagaagtggccgcactggagaaagaggttgctgctttggagaaggag gtcgctgcacttgaaaaggaggtcgcagccctggagaaaggcggcggggacaaaactcac acatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtcttcctcttcccc ccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtg gacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtg cataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagc gtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctcc aacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccga gaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagc ctgtggtgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaat gggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttc ttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctca
tgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtct ccgggtaaa
Вторая полипептидная цепь такой версии 1 DART-2 w/Fc характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:44):
QAWTQEPSLTVSPGGTVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQQKPGQAPRGLIGGTNKRAPWT PARFSGSLLGGKAALTITGAQAEDEADYYCALWYSNLWVFGGGTKLTVLGGGGSGGGGQV QLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGSWMNWVRQAPGQGLEWIGRIYPGDGETNYNG KFKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARIYGNNVYFDVWGQGTTVTVSSGGC G G GKVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE
Следует принимать во внимание, что остатки 1-110 SEQ ID NO:44 представляют собой домен VL антитела, которое связывает CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); остатки 111-118 SEQ ID NO:44 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 119-237 SEQ ID NO:44 представляют собой домен VH антитела, которое связывает gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:27), остатки 238-243 SEQ ID NO:44 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2) и остатки 244-271 SEQ ID NO:44 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует вторую полипептидную цепь версии 1 DART-2 w/Fc, характеризуется последовательностью (SEQ ID NO:45):
caggctgtggtgactcaggagccttcactgaccgtgtccccaggcggaactgtgaccctg acatgcagatccagcacaggcgcagtgaccacatctaactacgccaattgggtgcagcag aagccaggacaggcaccaaggggcctgatcgggggtacaaacaaaagggctccctggacc cctgcacggttttctggaagtctgctgggcggaaaggccgctctgactattaccggggca caggccgaggacgaagccgattactattgtgctctgtggtatagcaatctgtgggtgttc gggggtggcacaaaactgactgtgctgggagggggtggatccggcggaggtggacaggtc cagctggtccagagcggggccgaagtcaaaaaacccggagcaagcgtgaaggtctcctgc aaagcatcaggctatacatttacaggcagctggatgaactgggtgaggcaggctccagga cagggactggagtggatcgggcgcatctaccctggagacggcgaaactaactataatgga aagttcaaagaccgagtgaccatcacagccgataagtctactagtaccgcctacatggag ctgagctccctgcggtctgaagataccgccgtctactattgcgctagaatttacggaaac aatgtctattttgacgtgtgggggcagggaacaactgtgactgtctcctccggaggatgt ggcggtggaaaagtggccgcactgaaggagaaagttgctgctttgaaagagaaggtcgcc gcacttaaggaaaaggtcgcagccctgaaagag
Третья полипептидная цепь такой версии 1 DART-2 w/Fc характеризуется
следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:46):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNRYTQKSLSLSPGK
Следует принимать во внимание, что остатки 1-10 SEQ ID NO:46 представляют собой пептид 1 (SEQ ID NO:39) и остатки 11-227 представляют собой домены СН2 и СНЗ домена Fc антитела (SEQ ID NO:41).
Предпочтительный полинуклеотид, который кодирует третью полипептидную цепь версии 1 DART-2 w/Fc, характеризуется следующей последовательностью (SEQ ID NO:47):
Gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaagccgcggggggaccgtcagtc ttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcaca tgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggac ggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtac cgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaag tgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaag aaccaggtcagcctgagttgcgcagtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggag tgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactcc gacggctccttcttcctcgtcagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcagggg aacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccgctacacgcagaagagc ctctccctgtctccgggtaaa
2. Версия 2 DART-2 w/Fc
Первая, вторая и третья полипептидные цепи второго предпочтительного gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела, обозначенного в настоящем документе как "версия 2 DART-2 w/Fc", содержат полипептидные домены, характеризующиеся следующими последовательностями. Среди прочих отличий, версия 1 DART-2 w/Fc отличается от версии 2 DART-2 w/Fc в расположении последовательностей СН2 и СНЗ первой полипептидной цепи; указанные последовательности расположены на С-конце относительно последовательностей VL и VH версии 1 DART-2 w/Fc, тогда как они расположены на N-конце относительно последовательностей VL и VH версии 2 DART-2 w/Fc.
Первая полипептидная цепь такой версии 2 DART-2 w/Fc характеризуется следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:48):
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKAPSSSPMEDIQLT QSPSFLSASVGDRVTITCSARSSISFMYWYQQKPGKAPKLLIYDTSNLASGVPSRFSGSG SGTEFTLTISSLEAEDAATYYCQQWSSYPLTFGQGTKLEIKGGGSGGGGEVQLVESGGGL VQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGLEWVGRIRSKYNNYATYYADSVKDRFT ISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCVRHGNFGNSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGGCGGG KVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE KVAAL KE
Следует принимать во внимание, что остатки 1-10 SEQ ID NO:48 представляют собой пептид 1 (SEQ ID NO:39); остатки 11-227 SEQ ID NO:48 представляют собой последовательность для доменов СН2 и СНЗ домена Fc антитела (SEQ ID N0:40); остатки 228-235 SEQ ID NO:48 представляют собой промежуточный спейсерный пептид (линкер 4) (SEQ ID NO:38); остатки 236-341 SEQ ID NO:48 представляют собой домен VL антитела, которое связывает gpA33 (VLGPA33) (SEQ ID NO:26); остатки 342-349 SEQ ID NO:48 представляют собой первый промежуточный спейсерный пептид (линкер 1) (SEQ ID NO:l); остатки 350-474 SEQ ID NO:48 представляют собой домен VH антитела, которое связывает CD3 (УНСБЗ) (SEQ ID NO:25); остатки 475-480 SEQ ID NO:48 представляют собой цистеинсодержащий спейсерный пептид (линкер 2) (SEQ ID NO:2); и остатки 481-508 SEQ ID NO:48 представляют собой стимулирующий образование гетеродимера "К-спиральный" домен (SEQ ID NO:4).
Вторая полипептидная цепь такой версии 2 DART-2 w/Fc характеризуется аминокислотной последовательностью первой полипептидной цепи DART-2 (т.е. SEQ ID NO:28) (описанной выше).
Третья полипептидная цепь такой версии 2 DART-2 w/Fc характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46 (описанной выше).
Фармацевтические композиции
Композиции согласно настоящему изобретению включают в себя композиции нерасфасованного лекарственного средства, пригодные в производстве фармацевтических композиций (например, неочищенных или нестерильных композиции) и фармацевтических композиций (т.е. композиций, которые являются подходящими для введения субъекту или пациенту), которые можно использовать в получении стандартных лекарственных форм. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател, раскрытых в настоящем документе, и дополнительное терапевтическое средство и фармацевтически приемлемый носитель. Композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одной или нескольких молекул согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены фармацевтические композиции, содержащие такие gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела
или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела и второе терапевтическое антитело (например, специфическое к антигену злокачественной опухоли моноклональное антитело), которое является специфическим в отношении конкретного антигена, связанного со злокачественной опухолью, и фармацевтически приемлемый носитель.
Согласно конкретному варианту осуществления термин "фармацевтически приемлемый" означает одобренный регуляторным органом федерального правительства или правительства штата или перечисленный в Фармакопее США или другой общепризнанной фармакопее для применения у животных и более конкретно у людей. Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному и неполному), вспомогательное вещество или инертный носитель, с которым водят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая в себя масла минерального, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и подобное. Вода представляет собой предпочтительный носитель, если фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и растворы глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъекционных растворов. Подходящие фармацевтические вспомогательные вещества включают в себя крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и подобное. Композиция при необходимости также может содержать незначительные количества смачивающих средств или эмульгаторов, или рН буферных средств. Указанные композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, драже, капсул, порошков, составов замедленного высвобождения и подобное.
Как правило, ингредиенты композиций согласно настоящему изобретению поставляются либо отдельно, либо смешанными вместе в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметически запаянном контейнере, таком как ампула или саше с указанием количества активного средства. Если композиция предназначена для введения с помощью инфузии, она может продаваться с инфузионным флаконом, содержащим стерильную воду или солевой раствор фармацевтической степени
чистоты. Если композиция предназначена для введения с помощью инъекции, ампула со стерильной водой для инъекций или солевым раствором может быть предоставлена с тем, чтобы ингредиенты можно было смешать перед введением.
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены в состав в виде нейтральных или солевых форм. Фармацевтически приемлемые соли включают в себя без ограничения соли, образованные такими анионами, как анионы, происходящие из соляной, ортофосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т.д., и соли, образованные катионами, такими как катионы, происходящие из натрия, калия, аммония, кальция, гидроксидов железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и т.д.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрен фармацевтический пакет или набор, содержащий одна или несколько контейнеров, заполненных такими раскрытыми gpA33 х CD3 биспецифическими моновалентными диателами или gpA33 х CD3 биспецифическими моновалентными Fc - диателами (отдельно или с дополнительным(и) терапевтическим(и) средством(ами)) и таким фармацевтически приемлемым носителем. Кроме того, одно или несколько других профилактических или терапевтических средств, пригодных для лечения заболевания, также могут быть включены в фармацевтический пакет или набор. Согласно настоящему изобретению также предусмотрен фармацевтический пакет или набор, содержащий один или несколько контейнеров, заполненных одним или несколькими ингредиентами фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Необязательно такой(ие) контейнер(ы) может сопровождать уведомление в форме, предусмотренной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических средств или биологических продуктов, причем указанное уведомление отражает разрешение соответствующим органом производства, применения или продажи для введению людям.
Согласно настоящему изобретению предусмотрены наборы, которые можно использовать в описанных выше способах. Согласно одному варианту осуществления набор содержит одну или несколько молекул согласно настоящему изобретению. Согласно другому варианту осуществления набор дополнительно содержит одно или несколько других профилактических или терапевтических средств, пригодных для лечения злокачественной опухоли, в одном или нескольких контейнерах. Согласно другому варианту осуществления набор дополнительно содержит одно или несколько антител, которые связывают один или несколько антигенов, ассоциированных со
злокачественной опухолью. Согласно определенным вариантам осуществления другое профилактическое или терапевтическое средство представляет собой химиотерапевтическое средство. Согласно другим вариантам осуществления профилактическое или терапевтическое средство представляет собой биологическое или гормональное терапевтическое средство.
Применения композиций согласно настоящему изобретению
gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению характеризуются способностью осуществлять лечение любого заболевания или состояния, связанного с экспрессией gpA33 или характеризующегося его экспрессией. Таким образом, без ограничения фармацевтические композиции, содержащие такие молекулы, можно использовать в диагностике или лечении злокачественных опухолей толстой кишки, колоректальных злокачественных опухолей и злокачественных опухолей поджелудочной железы.
Способы введения
Композиции согласно настоящему изобретению могут быть предусмотрены для лечения, профилактики и уменьшения интенсивности одного или нескольких симптомов, связанных с заболеванием, нарушением или инфекцией, путем введения субъекту эффективного количества фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Согласно предпочтительному аспекту такие композиции являются по существу очищенными (т.е. по существу не содержат веществ, которые ограничивают ее действие или производят нежелательные побочные эффекты). Согласно конкретному варианту осуществления субъект представляет собой животное, предпочтительно млекопитающее, такое как не относящееся к приматам млекопитающее (например, корова, лошадь, кошка, собака, грызун и т.д.) или примат (например, обезьяна, такая как, яванский макак, человек и т.д.). Согласно предпочтительному варианту осуществления субъект представляет собой человека.
Известны различные системы доставки и их можно использовать для введения композиций согласно настоящему изобретению, например, инкапсулирование в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать антитело или слитый белок, опосредованный рецептором эндоцитоз (см., например, Wu et al. (1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A
Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432), конструкция из нуклеиновой кислоты в виде части ретровирусного или другого вектора и т.д.
Способы введения gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению включают в себя без ограничения парентеральное введение (например, интрадермальное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и мукозальное введение (например, интраназальный и пероральный пути). Согласно конкретному варианту осуществления молекулы согласно настоящему изобретению вводят внутримышечно, внутривенно или подкожно. Композиции можно вводить любым удобным путем, например, с помощью инфузии или болюсной инъекции, путем поглощения через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую ротовой полости, слизистую прямой кишки и кишечника и т.д.) и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, пульмонарное введение также можно использовать, например, с помощью применения ингалятора или небулайзера и состава с аэрозольным средством. См., например, патенты США №№ 6019968; 5985320; 5985309; 5934272; 5874064; 5855913; 5290540 и 4880078 и международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрено, что gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению упакованы в такой гереметически запаянный контейнер, как ампула или саше, с указанием количества таких молекул. Согласно одному варианту осуществления gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению поставляют в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в гереметически запаянном контейнере и его можно развести, например, водой или солевым раствором до соответствующей концентрации для введения субъекту. gpA33 х CD3 диатела или gpA33 х CD3 Fc - диатела согласно настоящему изобретению предпочтительно поставляют в виде сухого стерильного лиофилизированного порошка в гереметически запаянном контейнере в стандартной дозировке, составляющей по меньшей мере 5 мкг, более предпочтительно по меньшей мере 10 мкг, по меньшей мере
15 мкг, по меньшей мере 25 мкг, по меньшей мере 50 мкг, по меньшей мере 100 мкг или по меньшей мере 200 мкг.
Лиофилизированные gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела согласно настоящему изобретению необходимо хранить при температуре от 2 до 8°С в их оригинальном контейнере и молекулы необходимо вводить не позднее чем через 12 часов, предпочтительно не позднее чем через 6 часов, не позднее чем через 5 часов, не позднее чем через 3 часа или не позднее чем через 1 час после их разведения. Согласно альтернативному варианту осуществления gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела или gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc -диатела согласно настоящему изобретению поставляют в жидкой форме в гереметически запаянном контейнере с указанием количества и концентрации молекулы, слитого белка или конъюгированной молекулы. Жидкую форму таких биспецифических моновалентных диател или биспецифических моновалентных Fc -диател предпочтительно поставляют в гереметически запаянном контейнере, в котором молекулы находятся в концентрации, составляющей по меньшей мере 1 мкг/мл, более предпочтительно по меньшей мере 2,5 мкг/мл, по меньшей мере 5 мкг/мл, по меньшей мере 10 мкг/мл, по меньшей мере 50 мкг/мл или по меньшей мере 100 мкг/мл.
Количество gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению, которое будет эффективным в лечении, профилактике или уменьшении интенсивности одного или нескольких связанных с нарушением симптомов, можно определить с помощью стандартных клинических техник. Точная доза, применяемая в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности состояния, и должна определяться в соответствии с решением лечащего врача и всех соответствующих обстоятельств пациента. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости от дозы из in vitro тестовых систем или тестовых систем - животных моделей.
Для gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател, предусмотренных настоящим изобретением, вводимая пациенту дозировка составляет, как правило, по меньшей мере приблизительно 0,01 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,05 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,2 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 1 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 2 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 3 мкг/кг,
по меньшей мере приблизительно 5 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 10 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 20 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 30 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 50 мкг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,1 мг/кг, по меньшей мере приблизительно 0,15 мг/кг массы тела субъекта или больше.
Дозировку и частоту введения биспецифических моновалентных диател или биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению можно снизить или изменить путем усиления поглощения и проникновения биспецифических моновалентных Fc - диател в ткани с помощью таких модификаций, как, например, липидизация.
Согласно одному варианту осуществления вводимую пациенту дозировку gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 Fc биспецифических моновалентных диател согласно настоящему изобретению можно рассчитать для применения в качестве монотерапии. Согласно другому варианту осуществления биспецифические моновалентные диатела или биспецифические моновалентные Fc -диатела согласно настоящему изобретению используют в комбинации с другими терапевтическими композициями, и вводимая пациенту дозировка является ниже, чем при использовании такие биспецифических моновалентных диател или биспецифических моновалентных Fc - диател в качестве монотерапии.
Согласно конкретному варианту осуществления может быть необходимым введение фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению местно в нуждающуюся в лечении область; этого можно достичь, например, без ограничения с помощью местной инфузии, инъекции или посредством имплантата, причем указанный имплантат изготовлен из пористого, непористого или желатинообразного материала, включая в себя такие мембраны, как мембраны Sialastic, или волокна. При введении молекулы согласно настоящему изобретению предпочтительно необходимо уделить внимание применению материалов, которые не абсорбируют молекулу.
Согласно другому варианту осуществления композиции могут быть доставлены в везикуле, в частности липосоме (см. Langer (1990) "New Methods Of Drug Delivery, " Science 249:1527-1533); Treat et al., в Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353- 365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 3 17-327; см., главным образом, там же).
Согласно другому варианту осуществления композиции могут быть доставлены в системе контролируемого или замедленного высвобождения. Любую технику, известная специалисту в настоящей области техники, можно использовать для
получения составов замедленного высвобождения, содержащих одну или несколько молекул согласно настоящему изобретению. См., например, патент США № 4526938; международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 91/05548; WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, " Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Согласно одному варианту осуществления насос можно использовать в системе контролируемого высвобождения (См. Langer, ранее; Sefton, (1987) "Implantable Pumps, " CRC Crit. Rev. Biomed. Eng. 14:201-240; Buchwald et al. (1980) "Long-Term, Continuous Intravenous Heparin Administration By An Implantable Infusion Pump In Ambulatory Patients With Recurrent Venous Thrombosis, " Surgery 88:507-516; и Saudek et al. (1989) "A Preliminary Trial Of The Programmable Implantable Medication System For Insulin Delivery, " N. Engl. J. Med. 321:574-579). Согласно другому варианту осуществления полимерные материалы можно использовать для достижения контролируемого высвобождения антител (см., например, MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); CONTROLLED DRUG BIOAVAILABILITY, DRUG PRODUCT DESIGN AND PERFORMANCE, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Levy et al. (1985) "Inhibition Of Calcification Of Bioprosthetic Heart Valves By Local Controiled-Release Diphosphonate," Science 228:190-192; During et al. (1989) "Controlled Release Of Dopamine From A Polymeric Brain Implant: In Vivo Characterization," Ann. Neurol. 25:351-356; Howard et al. (1989) "Intracerebral Drug Delivery In Rats With Lesion-Induced Memory Deficits," J. Neurosurg. 7(1): 105-112); патенты США №№ 5679377; 5916597; 5912015; 5989463; 5128326; международные патентные публикации согласно РСТ №№ WO 99/15154 и WO 99/20253). Примеры полимеров, используемых в составах замедленного высвобождения, включают в себя без ограничения полимер 2-гидроксиэтилметакрилата, полимер метилметакрилата, полимер акриловой кислоты, сополимер этилена и винилацетата, полимер метакр иловой кислоты, полигликолиды (PLG), полиангидриды, полимер N
винилпирролидона, полимер винилового спирта, полиакриламид, полиэтиленгликоль, полилактиды (PLA), сополимер лактидов и гликолидов (PLGA) и полиортоэфиры. Согласно другому варианту осуществления систему контролируемого высвобождения можно разместить вблизи к терапевтической мишени (например, легким), таким образом, будет необходима только доля системной дозы (см., например, Goodson, in MEDICAL APPLICATIONS OF CONTROLLED RELEASE, ранее, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Согласно другому варианту осуществления полимерные композиции, пригодные в качестве имплантатов контролируемого высвобождения, используются согласно Dunn с соавт. (см. патент США № 5945155). Указанный конкретный способ основан на терапевтическом эффекте in situ контролируемого высвобождения биоактивного материала из полимерной системы. Имплантация, как правило, происходит в любом месте в организме пациента, нуждающегося в терапевтическом лечении. Согласно другому варианту осуществления используют неполимерную систему замедленной доставки, при помощи которой неполимерный имплантат в организме субъекта используется в качестве системы доставки лекарственного средства. При имплантации в организм органический растворитель имплантата будет рассеиваться, диспергироваться или выщелачиваться из композиции в окружающую тканевую жидкость, и неполимерный материал будет постепенно коагулировать или осаждаться с образованием твердой, микропористой матрицы (см. патент США № 5888533).
Системы контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (1990, "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533). Любую технику, известную специалисту в настоящей области техники, можно использовать для получения составов замедленного высвобождения, содержащих одно или несколько терапевтических средств согласно настоящему изобретению. См., например, патент США №4526938; международные патентные публикации №№ WO 91/05548 и WO 96/20698; Ning et al. (1996) "Intratumoral Radioimmunotheraphy Of A Human Colon Cancer Xenograft Using A Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al. (1995) "Antibody Mediated Lung Targeting Of Long-Circulating Emulsions, " PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397; Cleek et al. (1997) "Biodegradable Polymeric Carriers For A bFGF Antibody For Cardiovascular Application, " Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854; и Lam et al. (1997) "Microencapsulation Of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody For Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.
Согласно конкретному варианту осуществления в случае, если композиция согласно настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую биспецифическое моновалентное диатело или биспецифическое моновалентное Fc - диатело согласно настоящему изобретению, нуклеиновая кислота может быть введена in vivo для стимуляции экспрессии кодируемого ею биспецифического моновалентного диатела или биспецифического моновалентного Fc диатела, путем конструирования ее в виде части соответствующего нуклеиновокислотного экспрессионного вектора и введения ее так, чтобы она стала внутриклеточной, например, путем применения ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или путем использования бомбардировки микрочастицами (например, генной пушки; Biolistic, Dupont), или покрытия липидами, или рецепторами клеточной поверхности, или средствами трансфекции, или путем введения ее, соединенной с гомеобокс-подобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al. (1991) "Antennapedia Homeobox Peptide Regulates Neural Morphogenesis, " Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:1864-1868) и т.д. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и встроена в ДРГК клетки - хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.
Лечение субъекта с помощью терапевтически или профилактически эффективного количества gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател или gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател согласно настоящему изобретению может включать в себя однократное лечение или предпочтительно может включать в себя серию лечений. Согласно предпочтительному примеру субъект получает лечение с помощью молекул согласно настоящему изобретению один раз в неделю приблизительно 1 - 10 недель, предпочтительно 2-8 недель, более предпочтительно приблизительно 3-7 недель и даже более предпочтительно в течение приблизительно 4, 5 или 6 недель. Согласно другим вариантам осуществления фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению вводят один раз в день, два раза в день или три раза в день. Согласно другим вариантам осуществления фармацевтические композиции вводят один раз в неделю, два раза в неделю, один раз в две недели, один раз в месяц, каждые шесть недель, один раз в два месяца, дважды в год или один раз в год. Также следует понимать, что эффективная дозировка молекул, используемых для лечения, может увеличиваться или уменьшаться в течение курса конкретного лечения.
Представив описание настоящего изобретения в общих чертах, оно станет более понятным со ссылкой на следующие примеры, которые представлены для иллюстрации и не предусмотрено, что они ограничивают настоящее изобретение, если не указано иное.
Пример 1
Характеристики моноклонального антитела к gpA33 человека
Мышиное моноклональное антитело, способное специфически связываться с gpA33 человека, подвергали химеризации и гуманизации. Цепи VL и VH исходного мышиного антитела характеризуются последовательностями SEQ ID NO: 13 и 17, соответственно. Цепи VL и VH гуманизированного антитела характеризуются последовательностями SEQ ID NO:26 и 27, соответственно.
Антигенсвязывающий домен VLGPA33 содержит CDR1 с последовательностью (SEQ ID NO:14): SARSSISFMY; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:15): DTSNLAS; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID NO:16): QQWSSYPLT.
Антигенсвязывающий домен VHGPA33 содержит CDR1 с последовательностью (SEQ ID NO:18): GSWMN; CDR2 с последовательностью (SEQ ID NO:19): RIYPGDGETNYNGKFKD; и CDR3 с последовательностью (SEQ ID N0:20): I YGNNVY FDV.
Данные показывают, что модификации, приводящие к гуманизации доменов VL и VH антитела, не оказывают существенное влияние на кинетику связывания с gpA33.
Пример 2
Конструкция gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател и Fc -диател и контрольных диател
В таблице 2 содержится перечень последовательностей полипептидных цепей предпочтительных gpA33 х CD3 диател и gpA33 х CD3 Fc - диател, которые
экспресировали и очищали. Обнаружили, что диатела способны одновременно связываться с gpA33 и CD3, судя по обнаружению такого одновременного связывания иллюстративными gpA33 х CD3 биспецифическими моновалентными диателами, DART-1 и DART-2, и иллюстративным gpA33 х CD3 биспецифическим моновалентным Fc - диателом (DART-2 w/Fc). Кроме того, получили контрольное биспецифическое моновалентное диатело ("контрольное DART"), которое являлось биспецифическим моновалентным в отношении CD3 и FITC, и было обнаружено, что оно способно одновременно связываться с CD3 и FITC.
Таблица 2
Диатело
Полипептиды - заместители (в направлении от N-конца к С-концу)
gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело (DART-1)
SEQ ID NO:21 SEQ ID NO:23
gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело (DART-2)
SEQ ID NO:28 SEQ ID N0:30
gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен (DART-2 w/ABD), содержит альбуминсвязывающий домен (ABD) для увеличения периода полужизни in vivo
SEQ ID NO:35 SEQ ID N0:30
gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее версию 1 домена Fc IgG (версия 1 DART-2 w/Fc), содержит домен Fc для увеличения периода полужизни ш vivo
SEQ ID NO:42 SEQ ID NO:44 SEQ ID NO:46
gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее версию 2 домена Fc IgG (версия 2 DART-2 w/Fc), содержит домен Fc для увеличения периода полужизни ш vivo
SEQ ID NO:48 SEQ ID NO:28 SEQ ID NO:46
gpA33 x CD3 биспецифические моновалентные диатела представляют собой гетеродимеры, состоящие из двух полипептидных цепей (одна цепь каждой перечисленной последовательности), и gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела представляют собой гетеродимеры, состоящие из трех полипептидных цепей (одна цепь каждой перечисленной аминокислотной последовательности). Способы образования биспецифических моновалентных диател представлены в
международных патентных публикациях №№ WO 2006/113665, WO 2008/157379, WO 2010/080538, WO 2012/018687, WO 2012/162068 и WO 2012/162067.
Было обнаружено, что контрольное CD3 х FITC биспецифическое моновалентное диатело способно одновременно связываться с CD3 и с FITC. Было обнаружено, что описанные выше gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела и gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные Fc - диатела способны одновременно связываться с gpA33 и с CD3. Чтобы продемонстрировать такое одновременное связывание, gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1 инкубировали в присутствии растворимого фрагмента CD3, который был иммобилизирован на твердой подложке. Обнаружение связывания оценивали с помощью способности иммобилизированных антител дополнительно связывать gpA33. Результаты подтверждают способность описанных выше gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател и gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных Fc - диател опосредовать одновременное связывание с gpA33 и CD3 (фигура 3).
Пример 3
gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела являются цитотоксическими в отношении злокачественных клеток
Способность gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател согласно настоящему изобретению лечить злокачественную опухоль проиллюстрировали путем инкубации клеток колоректального рака или клеток рака поджелудочной железы в присутствии gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного DART-1 и либо РВМС человека (Е:Т = 25:1), либо активированных Т-клеток человека (Е:Т = 10:1). gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1 проявило сильную способность к перенаправленному цитолизу с концентрациями, требующими достижения 50% максимальной активности (ЕС50) в диапазоне от суб-нг/мл до приблизительно 1 нг/мл. Напротив, цитотоксичность не наблюдалась при использовании gpAЗЗ-oтpицaтeльныx клеточных линий злокачественной опухоли (например, НСТ116). Результаты исследования показаны на фигуре 4А (клетки колоректального рака, сходные со стволовыми (клетки Colon CSCL), на фигуре 4В (клетки колоректального рака Со1о205) и на фигуре 4С (клетки рака поджелудочной железы ASPC-1). Результаты обобщенно представлены в таблице 3.
Таблица 3
Целевая клеточная линия
ЕС50 gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (иг/мл)
Эффектор:мишень (Е:Т)
Максимальный наблюдаемый цитолиз в %
Colon CSLC
0,9015
25:1
Colo205
0,5853
10:1
ASPC-1
1,142
10:1
Пример 4
Т-клеточная активация в присутствии gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател
Для того чтобы дополнительно показать способность диател согласно настоящему изобретению лечить злокачественную опухоль, дремлющие Т-клетки человека инкубировали с gpA33 х CD3 биспецифическими моновалентными DART-1 в присутствии или при отсутствии злокачественных клеток (colo205 или ASPC-1). Для получения характеристик Т-клеточной активации во время опосредованного gpA33 х CD3 биспецифическим моновалентным диателом (DART-1) процесса перенаправленного цитолиза, Т-клетки из анализов перенаправленного цитолиза окрашивали в отношении маркера Т-клеточной активации CD25 и анализировали с помощью FACS. CD25 подвергался положительной регуляции в CD 8 (фигуры 5А-5В) и CD4 (фигуры 5D-5E) Т-клетках зависимым от дозы образом, указывая на то, что gpA33 х CD3 биспецифические моновалентные диатела индуцировали Т-клеточную активацию в процессе перенаправленного цитолиза. Напротив, при отсутствии клеток -мишеней не наблюдалась активация CD8 (фигура 5С) или CD4 (фигура 5F) Т-клеток, что указывает на то, что gp-A33 х CD3 диатела не активируют Т-клетки при отсутствии клеток - мишеней. Аналогично, CD8 или CD4 Т-клетки не были активированы при инкубации с клетками - мишенями и контрольным биспецифическим моновалентным диателом (контрольным DART) (фигуры 5А-5В и фигуры 5D-5F, соответственно), что указывает на необходимость перекрестной сшивки Т-клетки и клетки - мишени с gpA33 х CD3 биспецифическими моновалентными диателами.
Пример 5
Эквивалентность gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-1), характеризующегося последовательностями мышиного вариабельного домена антитела к gpA33 человека, и gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-2), характеризующегося последовательностями гуманизированного вариабельного домена антитела к gpA33 человека
Как обсуждалось выше, gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1 содержит домены VLgpA33 и VHgpA33 мышиного моноклонального антитела, тогда как gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-2 содержит гуманизированный домен VLgpA33 и гуманизированный домен VHgpA33 того же мышиного антитела. Чтобы продемонстрировать способность гуманизированных доменов VLgPA33 и УН^АЗЗ стимулировать нацеливание Т-клеток на экспрессирующие gpA33 злокачественные клетки, злокачественные клетки, которые экспрессируют gpA33, инкубировали в присутствии дремлющих Т-клеток (анализ LDH; Е:Т = 10:1) в присутствии либо DART-1, DART-1, либо контрольного биспецифического моновалентного диатела (контрольного DART). Результаты настоящего анализа (показанного на фигурах 6A-6D) показали, что DART-1 и DART-2 опосредовали эквивалентную цитотоксичность в отношении клеток колоректальной аденокарциномы SW948 (фигура 6А) и клеток colo205 (фигура 6В). Как DART-1, так и DART-2 опосредовали цитотоксичность экспрессирующей люциферазу клеточной линии Со1о205, которая была стабильно трансфектирована с геном люциферазы светлячка (шс2) (Colo205-Luc), что измеряли по сниженной люминесценции (фигура 6С). Ни DART-1, ни DART-2 не опосредовали цитотоксичность gpAЗЗ-oтpицaтeльнoй клеточной линии злокачественной опухоли, НСТ116 (фигура 6D). Как показано в таблице 4, DART-1 и DART-2 проявили сходную эквивалентную биоактивность против множественных опухолевых клеточных линий.
Таблица 4
Эффектор/мишень
Анализ LDH
Люциферазный анализ
Донорная Т-клетка
Опухолевая клеточная линия
gpA33xCD3 DART-2
gpA33xCD3 DART 1
gpA33xCD3 DART-2
gpA33xCD3 DART 1
D54677
SW948
0,79
1,34
D54677
Colo205
1Д7
2,52
D51031
Colo205-Luc
2,29
3,53
2,53
4,55
D41440
Colo205
2,29
3,37
D41440
Colo205-Luc
2,80
4,26
2,57
3,26
Пример 6
Перекрестная реактивность gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател, gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател, содержащих альбуминсвязывающий домен, и gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател, содержащих домен Fc IgG, с РВМС яванского макака
Как показано выше, гуманизированный домен VLgpA33 и гуманизированный домен VHgpA33 gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела DART-2 опосредуют цитотоксичность gpA33-3KcnpeccnpyioiiiHx злокачественных клеток в присутствии Т-клеток человека. Неожиданно обнаружили, что домены VLCD3 И VHCD3 gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател согласно настоящему изобретению также способны связываться с CD3 Т-клеток яванского макака и перенаправлять указанные клетки на уничтожение экспрессирующих gpA33 клеток.
Как показано на фигурах 7A-7D, было обнаружено, что все из gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела DART-2, gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего альбуминсвязывающий домен (DART-2 w/ABD), и gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела DART-2, содержащего домен Fc IgG (DART-2 w/Fc) были способны стимулировать цитотоксичность злокачественных клеток в присутствии РВМС человека или яванского макака. На фигурах 7А-7В показана способность трех диател опосредовать цитотоксичность клеток Colo205-Luc, которые инкубировали с РВМС человека, которую измеряли с помощью анализа LDH (фигура 7А) или люциферазного анализа (фигура 7В). На фигурах 7C-7D показана соответствующая способность трех диател опосредовать цитотоксичность клеток Colo205-Luc, которые инкубировали с РВМС яванского макака, которую измеряли с помощью анализа LDH (фигура 7А) или люциферазного анализа (фигура 7В).
Как показано в таблице 5, gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-2 и gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее альбуминсвязывающий домен (DART-2 w/ABD), проявляли сопоставимую CTL
активность. Биспецифические моновалентные диатела проявили сходную активность в отношении эффекторных клеток РВМС как человека, так и яванского макака (супо).
in vivo реактивность gpA33 х CD3 диатела в мышиной модели опухоли толстой кишки
Чтобы продемонстрировать in vivo способность gpA33 х CD3 диател согласно настоящему изобретению обеспечивать лечение злокачественной опухоли, клетки colo205 имплантировали совместно с активированными Т-клетками в страдающих диабетом без ожирения с тяжелой комбинированной иммунной недостаточностью гамма мышей (Agliano, A. et al. (2008) "Human Acute Leukemia Cells Injected In NOD/Ltsz-Scid/IL-2Rgamma Null Mice Generate A Faster And More Efficient Disease Compared To Other NOD/Scid-Related Strains" Int. J. Cancer 123(9):2222-2227; Sanchez, P.V. et al. (2009) "A Robust Xenotransplantation Model For Acute Myeloid Leukemia" Leukemia 23(11):2109-2117; Racki, W.J. et al. (2010) "NOD-Scid IL2rgamma(Null) Mouse Model Of Human Skin Transplantation And Allograft Rejection " Transplantation 89(5):527-536; Choi, B. et al. (2011) "Human В Cell Development And Antibody Production In Humanized NOD/SCID/IL-2Ry(Null) (NSG) Mice Conditioned By Busulfan" J. Clin. Immunol. 31(2):253-264; Sartelet, H. et al. (2012) "Description Of A New Xenograft Model Of Metastatic Neuroblastoma Using NOD/SCID/Il2rg Null (NSG) Mice" In Vivo 26(1): 1929; Spranger, S. et al. (2012) "NOD/scid IL-2Rg(null) Mice: A Preclinical Model System To
Evaluate Human Dendritic Cell-Based Vaccine Strategies in vivo" J. Transl. Med. 10:30; von Bonin, M. et al. (2013) "ш vivo Expansion Of Co-Transplanted T Cells Impacts On Tumor Re-Initiating Activity Of Human Acute Myeloid Leukemia In NSG Mice" PLoS One. 8(4):e60680).
gpA33 x CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1 вводили внутривенно мышам один раз в день в течение 4 дней (QDx4), начиная со дня имплантации. Обнаружили, что объем опухоли Со1о205 увеличился у мышей, получающих контроль - инертный носитель (фигура 8). Тем не менее, обнаружили, что животные, получающие DART-1, проявляли пониженный объем опухоли Со1о205 или ее отсутствие (фигура 8).
Изображение мышей NSG, которым имплантировали клетки Со1о205, показало, что на 2 день лечение мыши, получающие инертный носитель (фигура 9А) или gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1 (фигура 9В), характеризовались наличием значительных опухолей. Тем не менее, на 12 день лечения мыши, получающие gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1, характеризовались резко уменьшенными объемами опухолей (фигура 9D). На 12 день лечения мыши, получающие инертный носитель, продемонстрировали увеличенный объем опухоли (фигура 9С).
В качестве дополнительного доказательства in vivo способности gpA33 х CD3 диател согласно настоящему изобретению обеспечивать лечение злокачественной опухоли, описанную выше модель опухоли проводили с использованием клеток опухоли поджелудочной железы ASPC-1 и активированных Т-клеток человека (Е:Т = 1:1). gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело DART-1, контрольное биспецифическое моновалентное диатело (контрольное DART) или инертный носитель вводили внутривенно один раз в день в течение 9 дней (QDx9), начиная со дня имплантации. Обнаружили, что объем опухоли ASPC-1 увеличивался у мышей, получающих контроль - инертный носитель (фигура 10). Тем не менее, обнаружили, что животные, получающие DART-1, проявляли уменьшенный объем опухоли, зависимым от дозы образом (фигура 10).
Пример 8
Определение эффективности версии 1 gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc IgG (версии 1 DART-2 w/Fc)
Для определения эффективности версии 1 gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc IgG (версии 1 DART-2 w/Fc), мышам проводили инфузию (с использованием осмотических насосов) в течение 7 дней с описанной выше версией 1 DART-2 w/Fc при различных уровнях дозировки. Через 48 ч после имплантации насоса (т.е. в присутствии устойчивого уровня циркулирующей в крови версии 1DART-2 w/Fc), смесь опухолевых клеток Со1о205 и Т-клеток имплантировали подкожно в организм мышей и осуществляли мониторинг степени роста опухоли. В таблице 6 обобщенно представлена схема исследования; каждая группа содержала по 8 самок мышей.
Таблица 6
Группа
Лечение
Доза (мг/кг)
Путь / Схема
Клеточный(е) имплантат(ы)
Инертный носитель
IV/QDx5
COLO205 (5E6)
gpA33xCD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее домен Fc IgG (версия 1 DART-2 w/Fc)
IP/CIF
COLO205 (5E6)
hT-клетки (5E6)
Версия 1 DART-2 w/Fc
1,5
IP/CIF
COLO205 (5E6)
hT-клетки (5E6)
Версия 1 DART-2 w/Fc
0,75
IP/CIF
COLO205 (5E6)
hT-клетки (5E6)
Версия 1 DART-2 w/Fc
0,375
IP/CIF
COLO205 (5E6)
hT-клетки (5E6)
Версия 1 DART-2 w/Fc
0,5
IV/QDx5
COLO205 (5E6)
что введение описанных выше gpA33 х CD3 биспецифических моновалентных диател, содержащих домен Fc IgG (версии 1 DART-2 w/Fc), опосредовало резкое снижение объема опухоли во всех исследованных дозировках.
В свете резкого снижения объема опухоли, полученного в представленном выше исследовании, провели дополнительное исследование для оценки эффективности в намного меньших дозах. В таблице 7 обобщенно представлена схема этого
Результаты этого дополнительного исследования показаны на фигуре 12. На фигуре 12 каждый символ обозначает животное, которое получило указанную дозировку описанного выше gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc IgG (версии 1 DART-2 w/Fc), или инертного носителя. Данные показывают эффективность во всех исследованных дозировках.
Пример 9
Фармакокинетический профиль gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела (DART-2) и gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного диатела, содержащего домен Fc IgG (DART-2 w/Fc), у яванского макака
Способность доменов VLCD3 И VHCD3 диател согласно настоящему изобретению связываться с CD3 яванского макака обеспечивает возможность применения этих животных для измерения in vivo фармакокинетики диател согласно настоящему изобретению.
Для измерения таких фармакокинетических параметров описанное выше gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело (DART-2) или gpA33 х CD3 биспецифическое моновалентное диатело, содержащее домен Fc IgG (версия 1 DART-2 w/Fc) вводили с помощью инъекции яванским макакам (10 мкг/кг/день) и подвергали мониторингу концентрацию таких молекул, оставшихся в кровотоке. На фигуре 13 показан результат этого исследования и указано, что DART-2 и версия 1 DART-2 w/Fc проявляют кинетику выведения первого порядка.
Пример 10
Анализ SPR связывания gpA33 х CD3 биспецифического моновалентного Fc - диатела (версии 1 DART-1 w/Fc) с CD3 и gpA33 человека и яванского макака
Связывание gpA33 х CD3 биспецифического Fc - диатела (версии 1 DART-2 w/Fc) с растворимыми версиями рецептора CD3 человека и яванского макака анализировали с помощью SPR на биосенсоре BIAcore 3000 (GE, Healthcare). Рецепторы иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5 согласно процедуре, рекомендуемой производителем. Кратко, карбоксильные группы на поверхности сенсорного чипа активировали инъекцией раствора, содержащего 0,2 М г\Г-этил-г\Г-(3-диэтиламино-пропил)карбодиимида и 0,05 М N-гидрокси-сукцинимида. Рецептор растворимого CD3 (1 мкг/мл) затем впрыскивали на активированную поверхность СМ5
в 10 мМ ацетата натрия, рН 5,0, с объемной скоростью потока, составляющей 5 мкл/мин, с последующим добавлением 1 М этаноламина для деактивации.
Растворимые версии CD3 яванского макака и человека, используемые в таком анализе, экспрессировали в клетках млекопитающих в виде CD3s / CD38 гетеродимера, стабилизированного противоположно заряженными стимулирующими образование гетеродимера Е-спиральными и К-спиральными последовательностями на их С-концах. Растворимый CD3s яванского макака содержал первые 118 аминокислотных остатков CD3s яванского макака с аллелем V35 (FN 18+), за которым следовал описанный выше Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) на карбокси-конце. Аминокислотная последовательность аллеля V35 (FN 18+) CD3s яванского макака представляет собой следующее (SEQ ID NO:49):
MQSGTRWRVL GLCLLSIGVW GQDGNEEMGS ITQTPYQVSI SGTTVILTCS
QHLGSEAQWQ HNGKNKEDSG DRLFLPEFSE MEQSGYYVCY PRGSNPEDAS
HHLYLKARVC ENCMEMDVMA VATIVIVDIC ITLGLLLLVY YWSKNRKAKA
KPVTRGAGAG GRQRGQNKER PPPVPNPDYE PIRKGQQDLY SGLNQRRI
Растворимый CD38 яванского макака содержал первые 101 аминокислотный
остаток CD38 яванского макака, за которым следовал описанный выше К-спиральный
домен (SEQ ID NO:4) на карбокси-конце. Аминокислотная последовательность CD38
яванского макака представляет собой следующее (SEQ ID N0:50):
MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPVEELE DRVFVKCNTS VTWVEGTVGT
LLTNNTRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESAVQVHY RMCQNCVELD
PATLAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ
PLRDRDDAQY SRLGGNWARN К
Два белка коэкспрессировали в клетках CHO-S млекопитающего и очищали с использованием mAb к Е/К-спирали, прикрепленном к SEPHAROSE(r).
Растворимый CD3s человек содержал остатки 1-127 CD3s человека с C119S и C122S, за которыми следовал описанный выше Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) на карбокси-конце. Аминокислотная последовательность CD3s человека представляет собой следующее (SEQ ID NO:51):
MQSGTHWRVL GLCLLSVGVW GQDGNEEMGG ITQTPYKVSI SGTTVILTCP QYPGSEILWQ HNDKNIGGDE DDKNIGSDED HLSLKEFSEL EQSGYYVCYP RGSKPEDANF YLYLRARVCE NCMEMDVMSV ATIVIVDICI TGGLLLLVYY WSKNRKAKAK PVTRGAGAGG RQRGQNKERP PPVPNPDYEP IRKGQRDLYS GLNQRRI
Растворимый CD38 человека содержал остатки 1-101 CD38 человека, за которыми следовал описанный выше К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) на
карбокси-конце. Два белка коэкспрессировали в клетках CHO-S млекопитающего и очищали с использованием с использованием аффинной колонки к Е/К-спирали. Аминокислотная последовательность CD38 человека представляет собой следующее (SEQ ID NO:52):
FKIPIEELE DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT LLSDITRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESTVQVHY RMCQSCVELD PATVAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SHLGGNWARN К
Растворимый gpA33 человека содержал остатки 1-235 gpA33 человека с (SEQ ID NO:53) повторами HHHHHH ("6His") на карбокси-конце. Растворимый gpA33 яванского макака содержал остатки 1-314 gpA33 яванского макака от Met 1 до Gin 314 с 6 His повторами на карбокси-конце. Белки экспрессировали в клетках CHO-S млекопитающего и очищали с использованием Ni SEPHAROSE(r).
Эксперименты по связыванию проводили в буфере HBS-EP, который содержит 10 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA и 0,005% поверхностно-активное вещество Р20. Связывание версии 1 DART-2 w/Fc анализировали (в двух параллелях) в концентрациях, составляющих 0, 6,25, 12,5, 25, 50 и 100 нМ, впрыскиваемых в течение 120 секунд с объемной скоростью потока, составляющей 30 мкл/мин.
Восстановление поверхности иммобилизированного рецептора проводили путем импульсной инъекции 10 мМ глицина, рН 1,5. Стандартные кривые получали путем впрыскивания каждого разведения DART-2 w/Fc на обработанную поверхность без иммобилизированного белка. Кривые связывания в нулевой концентрации вычитали как фон. Данные KD определяли путем глобальной аппроксимации кривых связывания с моделью связывания 1:1 Ленгмюра (программное обеспечение BIAevaluation(tm) v4.1).
Анализ SPR связывания gpA33 х CD3 биспецифического Fc - диатела (версии 1 DART-2 w/Fc) с CD3 и gpA33 человека и яванского макака продемонстрировал существенное сходство молекул из двух различных видов (фигуры 14А-14В; фигуры 15А-15В). В таблице 8 представлены равновесные константы диссоциации (KD), рассчитанные путем глобальной аппроксимации к константам аффинности и кинетическим константам 1:1 модели Ленгмюра для взаимодействий DART-2 w/Fc. Значения KD версии 1 DART-2 w/Fc для CD3 человека и яванского макака являются почти идентичными при 23 и 26 нМ, соответственно, несмотря на некоторое различие в реакциях максимального связывания между двумя антигенами. Случайная ориентация антигенов с различными аминокислотными последовательностями, непосредственно иммобилизированными на поверхности, может привести к различным плотностям
доступных сайтов связывания на поверхности. Значения KD для взаимодействия версии 1 DART-2 w/Fc с gpA33 человека и обезьяны представляют собой 2,2 нМ и 12 нМ, соответственно (таблица 8). Различие в аффинности является результатом небольшого снижения константы скорости ассоциации и увеличения константы скорости диссоциации для взаимодействия версии 1 DART-2 w/Fc с gpA33 яванского макака (таблица 8). Данные представляют собой средние значения от трех независимых экспериментов в двух параллелях (SD = стандартное отклонение; h, человек; супо, яванский макак).
Таблица 8
Равновесные константы диссоциации (KD) для связывания версии 1 DART-2 W/Fc с антигенами из различных видов
Антигены
ka (±SD)
(ivrY1)
kd (±SD) (c1)
KD(±SD) (нМ)
hCD3s/5
l,5(±0,l)x 10b
3,5(±0,06)xlO~J
23 ±2,0
cynoCD3s/5
1,3(±0,02)х10э
3,4(±0,02) xlO"3
26 ±0,6
hgpA33-His
4,2(±0,3) xlOb
9,0(±0,5)xl0~4
2,2±0,2
cynogpA33-His
2,3(±0,2)х10э
2,8(±0,1) xlO"3
12±1,0
Все упомянутые в настоящем описании изобретения публикации и патенты включены в настоящий документ в той же степени, как если бы было предусмотрено, что каждая отдельная публикация или патентная заявка специально и индивидуально включена посредством ссылки во всей своей полноте. Наряду с тем, что настоящее изобретение было описано с использованием конкретных его вариантом осуществления, следует понимать, что возможны дополнительные модификации, и предусмотрено, что настоящая заявка охватывает любые изменения, применения или адаптации настоящего изобретения, следуя в целом принципам настоящего изобретения и включая в себя такие отклонения от настоящего раскрытия, которые согласуются с известной или общепринятой практикой в настоящей области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение, и которые могут быть применены к основным признакам, изложенным выше в настоящем документе.
Перечень последовательностей
<110> МАКРОДЖЕНИКС, ИНК. Moore, Paul Li, Jonathan Chen, Francine Johnson, Leslie Shah, Kalpana Bonvini, Ezio
<12 0> БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ МОНОВАЛЕНТНЫЕ ДИАТЕЛА, КОТОРЫЕ СПОСОБНЫ СВЯЗЫВАТЬСЯ С GPA33
И CD3, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 1301.0112PCT
<150> US 61/869,528 <151> 2013-08-23
<150> US 61/907,691
<151> 2013-11-22
<150> EP 13198859 <151> 2013-12-20
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 1 Polypeptide <400> 1
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 2 Polypeptide
<400> 2
Gly Gly Cys Gly Gly Gly
1 5
<210> 3
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E-Coil Domain
<400> 3
Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys 20 25
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> K-Coil Domain
<400> 4
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
1 5 10 15
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
20 25
110
<210> <211>
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(110)
<223> Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 5
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly
100 105 110
<210> 6
<211> 14
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> CDR1 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 6
Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(7)
<223> CDR2 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 7
Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro 1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR3 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 8
Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val 1 5
<210> 9
<211> 125
<212> PRT
^ О 1 О ^ Л/Г, , ~
<213> Mus musculus
<221> MISC_FEATURE
<223> Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 9
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> <211> <212>
10 5
PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(5)
<223> CDR1 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 10
Thr Tyr Ala Met Asn 1 5
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(19)
<223> CDR2 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 11
Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser
1 5 10 15
Val Lys Asp
12 14
<210> <211> <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(14)
<223> CDR3 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-CD3 Antibody
<400> 12
His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 13
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> Light Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 13
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(10)
<223> CDR1 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 14
Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met Tyr
1 5 10
<210> 15
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7)
<223> CDR2 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 15
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(9)
<223> CDR3 of Light Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 16
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5
<210> 17 <211> 119 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE <222> (1)..(119)
<223> Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Gly Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
18 5
PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR1 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 18
Gly Ser Trp Met Asn 1 5
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc_feature
<223> CDR2 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400>
Arg lie Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> misc feature
<223> CDR3 of Heavy Chain Variable Domain of Murine Anti-gpA33 Antibody
<400> 20
Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 21
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of DART-1
<400> 21
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu
115 120 125
Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Ser Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr
165 170 175
Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Val Asp
195 200 205
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe
210 215 220
Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
<210> 22
<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-1
aagtttaagg
acaaggccac
actgactgca
gacaaatcat
ccaccacagc
ctacatggag
600
ctcagcagcc
tgacctctgt
ggactctgcg
gtctatttct
gtgcaagaat
ctatggtaat
660
aacgtttact
tcgatgtctg
gggcgcaggg
accacggtca
ccgtgtcttc
cggaggatgt
720
ggcggtggag
aagtggccgc
actggagaaa
gaggttgctg
ctttggagaa
ggaggtcgct
780
gcacttgaaa
aggaggtcgc
agccctggag
aaa
813
<210> 23
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Polypeptide Chain of DART-1
<400> 23
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Gly Gly Gly Ser Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
115 120 125
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
130 135 140
Asn Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
145 150 155 160
Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr
165 170 175
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser
180 185 190
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr
195 200 205
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val
210 215 220
Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala
245 250 255
Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu
260 265 270
Lys Glu
<210> 24
<211> 822
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding Second Polypeptide Chain of DART-1
<400> 24
caaattgttc
tcacccagtc
tccagcaatc
atgtctgcat
ctccagggga
gagggtcacc
atgacctgca
gtgccaggtc
aagtataagt
ttcatgtact
ggtaccagca
gaagccagga
120
tcctccccca
gactcctgat
ttatgacaca
tccaacctgg
cttctggagt
ccctgttcgc
180
ttcagtggca
gtgggtctgg
gacctcttat
tctctcacaa
tcagccgaat
ggaggctgaa
240
gatgctgcca
cttattactg
ccagcagtgg
agtagttacc
cactcacgtt
cggttctggg
300
accaagctgg
agctgaaacg
gggtggagga
tccggcggag
gcggagaggt
gcagctggtg
360
gagtctgggg
gaggcttggt
ccagcctgga
gggtccctga
gactctcctg
tgcagcctct
420
ggattcacct
tcaacacata
cgctatgaat
tgggtccgcc
aggctccagg
gaaggggctg
480
gagtgggttg
caaggatcag
gtccaagtac
aacaattatg
caacctacta
tgccgactct
540
gtgaaggata
gattcaccat
ctcaagagat
gattcaaaga
actcactgta
tctgcaaatg
600
aacagcctga
aaaccgagga
cacggccgtg
tattactgtg
tgagacacgg
taacttcggc
660
aattcttacg
tgtcttggtt
tgcttattgg
ggacagggga
cactggtgac
tgtgtcttcc
720
ggaggatgtg
gcggtggaaa
agtggccgca
ctgaaggaga
aagttgctgc
tttgaaagag
780
aaggtcgccg cacttaagga aaaggtcgca gccctgaaag ag
822
<210> 25
<211> 125
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(125)
<223> Heavy Chain Variable Domain of Anti-CD3 Antibody
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp
50 55 60
Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe
100 105 110
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 26
<211> 106
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light Chain Variable Domain of Humanized Anti-gpA33 Antibody
<400> 26
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 119
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy Chain Variable Domain of Humanized Anti-gpA33 Antibody
<400> 27
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Ser
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 28
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of DART-2
<400> 28
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr
165 170 175
Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe
210 215 220
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys
260 265 270
<210> 29
<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-2
caggctgtgg
tgactcagga
gccttcactg
accgtgtccc
caggcggaac
tgtgaccctg
acatgcagat
ccagcacagg
cgcagtgacc
acatctaact
acgccaattg
ggtgcagcag
120
aagccaggac
aggcaccaag
gggcctgatc
gggggtacaa
acaaaagggc
tccctggacc
180
cctgcacggt
tttctggaag
tctgctgggc
ggaaaggccg
ctctgactat
taccggggca
240
caggccgagg
acgaagccga
ttactattgt
gctctgtggt
atagcaatct
gtgggtgttc
300
gggggtggca
caaaactgac
tgtgctggga
ggtggtggat
ccggcggagg
tggacaggtc
360
cagctggtcc
agagcggggc
cgaagtcaaa
aaacccggag
caagcgtgaa
ggtctcctgc
420
aaagcatcag
gctatacatt
tacaggcagc
tggatgaact
gggtgaggca
ggctccagga
480
cagggactgg
agtggatcgg
gcgcatctac
cctggagacg
gcgaaactaa
ctataatgga
540
aagttcaaag
accgagtgac
catcacagcc
gataagtcta
ctagtaccgc
ctacatggag
600
ctgagctccc
tgcggtctga
agataccgcc
gtctactatt
gcgctagaat
ttacggaaac
660
aatgtctatt
ttgacgtgtg
ggggcaggga
acaactgtga
ctgtctcctc
cggaggatgt
720
ggcggtggag
aagtggccgc
actggagaaa
gaggttgctg
ctttggagaa
ggaggtcgct
780
gcacttgaaa
aggaggtcgc
agccctggag
aaa
813
<210> 30
<211> 273
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Polypeptide Chain of DART-2
<400> 30
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
165 170 175
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
180 185 190
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser
210 215 220
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala
245 250 255
Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
260
265
270
Glu
<210> 31
<211> 819
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding Second Polypeptide Chain of DART-2
60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 819
<210> 32
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 3 Polypeptide
<400> 32
Gly Gly Gly Ser 1
<210> 33
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 3 Polypeptide <400> 33
Gly Gly Gly Asn Ser 1 5
<210> 34
<211> 46
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Albumin Binding Domain
<400> 34
Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly
1 5 10 15
Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys Ser Ala Glu
20 25 30
Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro
35 40 45
<210> 35
<211> 321
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of DART-2 w/ABD
<400> 35
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr
165 170 175
Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe
210 215 220
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
245 250 255
Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Leu Ala Gln Ala Lys Glu Ala Ala Ile Arg Glu Leu Asp
275 280 285
Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr Lys Asn Leu Ile Asp Asn Ala Lys
290 295 300
Ser Ala Glu Gly Val Lys Ala Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu
305 310 315 320
Pro
<210> 36 <211> 963 <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-2 w/ABD
<400> 36
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60
acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180
cctgcacggt tttctggaag tctgctgggc ggaaaggccg ctctgactat taccggggca 240
caggccgagg acgaagccga ttactattgt gctctgtggt atagcaatct gtgggtgttc 300
gggggtggca caaaactgac tgtgctggga gggggtggat ccggcggagg tggacaggtc 360
cagctggtcc agagcggggc cgaagtcaaa aaacccggag caagcgtgaa ggtctcctgc 420
aaagcatcag gctatacatt tacaggcagc tggatgaact gggtgaggca ggctccagga 480
cagggactgg agtggatcgg gcgcatctac cctggagacg gcgaaactaa ctataatgga 540
aagttcaaag accgagtgac catcacagcc gataagtcta ctagtaccgc ctacatggag 600
ctgagctccc tgcggtctga agataccgcc gtctactatt gcgctagaat ttacggaaac 660
aatgtctatt ttgacgtgtg ggggcaggga acaactgtga ctgtctcctc cggaggatgt 720
ggcggtggag aagtggccgc actggagaaa gaggttgctg ctttggagaa ggaggtcgct 780
gcacttgaaa aggaggtcgc agccctggag aaaggcggcg ggtctctggc ccaggcaaaa 840
gaggcagcca tccgcgaact ggataaatat ggcgtgagcg attattataa gaacctgatt 900
gacaacgcaa aatccgcgga aggcgtgaaa gcactgattg atgaaattct ggccgccctg 960
cct 963
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker 4 Polypeptide
<400> 37
Ala Pro Ser Ser Ser 1 5
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<223> Linker 4 Polypeptide
<400> 38
Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu 1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Peptide 1
<400> 39
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 40
<211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH2 and CH3 Domains of Modified Fc Domain of First DART Polypeptide Chain
<400> 40
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 41 <211> 217
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH2 and CH3 Domains of Modified Fc Domain of Third DART Polypeptide Chain
<400> 41
Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 42
<211> 503
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 1 Construct
<400> 42
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
115 120 125
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
130 135 140
Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
145 150 155 160
Trp Val Gly Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr
165 170 175
Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys
180 185 190
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala
195 200 205
Val Tyr Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser
210 215 220
Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly
225 230 235 240
Gly Cys Gly Gly Gly Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala
245 250 255
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Leu Glu
260 265 270
Lys Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
275 280 285
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
290 295 300
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
305 310 315 320
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
325 330 335
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
340 345 350
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
355 360 365
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
370 375 380
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
385 390 395 400
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
405 410 415
Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
420 425 430
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
435 440 445
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
450 455 460
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
465 470 475 480
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
485 490 495
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
500
<210> 43
<211> 1509
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding First Polypeptide Chain of DART-2
w/Fc Version 1 Construct
aaggatagat tcaccatctc aagagatgat tcaaagaact cactgtatct gcaaatgaac 600
agcctgaaaa ccgaggacac ggccgtgtat tactgtgtga gacacggtaa cttcggcaat 660
tcttacgtgt cttggtttgc ttattgggga caggggacac tggtgactgt gtcttccgga 720
ggatgtggcg gtggagaagt ggccgcactg gagaaagagg ttgctgcttt ggagaaggag 780
gtcgctgcac ttgaaaagga ggtcgcagcc ctggagaaag gcggcgggga caaaactcac 840
acatgcccac cgtgcccagc acctgaagcc gcggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 900
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 960
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1020
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1080
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1140
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1200
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1260
ctgtggtgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1320
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1380
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1440
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1500
ccgggtaaa 1509
<210> 44
<211> 271
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Second Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 1 Construct
<400> 44
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Trp Thr Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu
115 120 125
Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
130 135 140
Tyr Thr Phe Thr Gly Ser Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr
165 170 175
Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys
180 185 190
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp
195 200 205
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Tyr Gly Asn Asn Val Tyr Phe
210 215 220
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys
225 230 235 240
Gly Gly Gly Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys
245 250 255
Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
260 265 270
<210> 45
<211> 813
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic Acid Molecule Encoding Second Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 1 Construct
<400> 45
caggctgtgg tgactcagga gccttcactg accgtgtccc caggcggaac tgtgaccctg 60 acatgcagat ccagcacagg cgcagtgacc acatctaact acgccaattg ggtgcagcag 120
aagccaggac aggcaccaag gggcctgatc gggggtacaa acaaaagggc tccctggacc 180
cctgcacggt
tttctggaag
tctgctgggc
ggaaaggccg
ctctgactat
taccggggca
240
caggccgagg
acgaagccga
ttactattgt
gctctgtggt
atagcaatct
gtgggtgttc
300
gggggtggca
caaaactgac
tgtgctggga
gggggtggat
ccggcggagg
tggacaggtc
360
cagctggtcc
agagcggggc
cgaagtcaaa
aaacccggag
caagcgtgaa
ggtctcctgc
420
aaagcatcag
gctatacatt
tacaggcagc
tggatgaact
gggtgaggca
ggctccagga
480
cagggactgg
agtggatcgg
gcgcatctac
cctggagacg
gcgaaactaa
ctataatgga
540
aagttcaaag
accgagtgac
catcacagcc
gataagtcta
ctagtaccgc
ctacatggag
600
ctgagctccc
tgcggtctga
agataccgcc
gtctactatt
gcgctagaat
ttacggaaac
660
aatgtctatt
ttgacgtgtg
ggggcaggga
acaactgtga
ctgtctcctc
cggaggatgt
720
ggcggtggaa
aagtggccgc
actgaaggag
aaagttgctg
ctttgaaaga
gaaggtcgcc
780
gcacttaagg
aaaaggtcgc
agccctgaaa
gag
813
<210> 46
<211> 227
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Third Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 1 Construct
<400> 46
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn Arg Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 47
<211> 681
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleic acid Molecule Encoding Third Polypeptide Chain of DART-2
w/Fc Version 1 Construct
<400> 47
gacaaaactc
acacatgccc
accgtgccca
gcacctgaag
ccgcgggggg
accgtcagtc
ttcctcttcc
ccccaaaacc
caaggacacc
ctcatgatct
cccggacccc
tgaggtcaca
120
tgcgtggtgg
tggacgtgag
ccacgaagac
cctgaggtca
agttcaactg
gtacgtggac
180
ggcgtggagg
tgcataatgc
caagacaaag
ccgcgggagg
agcagtacaa
cagcacgtac
240
cgtgtggtca
gcgtcctcac
cgtcctgcac
caggactggc
tgaatggcaa
ggagtacaag
300
tgcaaggtct
ccaacaaagc
cctcccagcc
cccatcgaga
aaaccatctc
caaagccaaa
360
gggcagcccc
gagaaccaca
ggtgtacacc
ctgcccccat
cccgggagga
gatgaccaag
420
aaccaggtca
gcctgagttg
cgcagtcaaa
ggcttctatc
ccagcgacat
cgccgtggag
480
tgggagagca
atgggcagcc
ggagaacaac
tacaagacca
cgcctcccgt
gctggactcc
540
gacggctcct
tcttcctcgt
cagcaagctc
accgtggaca
agagcaggtg
gcagcagggg
600
aacgtcttct
catgctccgt
gatgcatgag
gctctgcaca
accgctacac
gcagaagagc
660
ctctccctgt
ctccgggtaa
681
<210> 48
<211> 508
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> First Polypeptide Chain of DART-2 w/Fc Version 2 Construct
<400> 48
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Ala Pro Ser Ser Ser Pro Met Glu Asp Ile Gln Leu Thr
225 230 235 240
Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile
245 250 255
Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Ile Ser Phe Met Tyr Trp Tyr Gln Gln
260 265 270
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu
275 280 285
Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu
290 295 300
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr
325 330 335
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val Gln
340 345 350
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Met Asn
370 375 380
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile
385 390 395 400
Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
405 410 415
Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
420 425 430
Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
435 440 445
Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr Trp
450 455 460
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Cys Gly Gly Gly
465
470
475
480
Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val
485 490 495
Ala Ala Leu Lys Glu Lys Val Ala Ala Leu Lys Glu
500 505
<210> 49 <211> 198 <212> PRT
<213> Macaca fascicularis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(198)
<223> V35 allele (FN18+) of CD3 epsilon
<400> 49
Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys
50 55 60
Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu
65 70 75 80
Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro
85 90 95
Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn
100 105 110
Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp
115 120 125
Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys
130 135 140
Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn
165 170 175
Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly
180 185 190
Leu Asn Gln Arg Arg Ile
<210> 50
<211> 171 <212> PRT
195
<213> Macaca fascicularis
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(171)
<223> CD3 delta
<400> 50
Met Glu His Ser Thr Phe Leu Ser Gly Leu Val Leu Ala Thr Leu Leu
1 5 10 15
Ser Gln Val Ser Pro Phe Lys Ile Pro Val Glu Glu Leu Glu Asp Arg
20 25 30
Val Phe Val Lys Cys Asn Thr Ser Val Thr Trp Val Glu Gly Thr Val
35 40 45
Gly Thr Leu Leu Thr Asn Asn Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile
50 55 60
Leu Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Ala Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Asn Cys
85 90 95
Val Glu Leu Asp Pro Ala Thr Leu Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val
100 105 110
Ile Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His
115 120 125
Glu Thr Gly Arg Leu Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg
130 135 140
Asn Asp Gln Val Tyr Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr
145 150 155 160
Ser Arg Leu Gly Gly Asn Trp Ala Arg Asn Lys 165 170
<210> 51
<211> 207
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(207)
<223> CD3 epsilon
<400> 51
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 52
<211> 150
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(150)
<223> CD3 delta
<400> 52
Phe Lys Ile Pro Ile Glu Glu Leu Glu Asp Arg Val Phe Val Asn Cys
1 5 10 15
Asn Thr Ser Ile Thr Trp Val Glu Gly Thr Val Gly Thr Leu Leu Ser
20 25 30
Asp Ile Thr Arg Leu Asp Leu Gly Lys Arg Ile Leu Asp Pro Arg Gly
35 40 45
Ile Tyr Arg Cys Asn Gly Thr Asp Ile Tyr Lys Asp Lys Glu Ser Thr
50 55 60
Val Gln Val His Tyr Arg Met Cys Gln Ser Cys Val Glu Leu Asp Pro
65 70 75 80
Ala Thr Val Ala Gly Ile Ile Val Thr Asp Val Ile Ala Thr Leu Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Gly Val Phe Cys Phe Ala Gly His Glu Thr Gly Arg Leu
100 105 110
Ser Gly Ala Ala Asp Thr Gln Ala Leu Leu Arg Asn Asp Gln Val Tyr
115 120 125
Gln Pro Leu Arg Asp Arg Asp Asp Ala Gln Tyr Ser His Leu Gly Gly
130 135 140
Asn Trp Ala Arg Asn Lys
145 150
<210> 53
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 6His Peptide <400> 53
His His His His His His 1 5
<210> 54
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heterodimerization Domain
<400> 54
Gly Val Glu Pro Lys Ser Cys
1 5
55 6
PRT
<210> <211> <212>
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heterodimerization Domain
<400> 55
Val Glu Pro Lys Ser Cys 1 5
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heterodimerization Domain
<400> 56
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
1 5
<210> <211> <212>
57 6
PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heterodimerization Domain
<400> 57
Phe Asn Arg Gly Glu Cys 1 5
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Биспецифическое моновалентное диатело, причем указанное биспецифическое моновалентное диатело способно специфически связываться с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3, причем биспецифическое моновалентное диатело содержит первую полипептидную цепь и вторую полипептидную цепь, причем указанная первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
A. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHgPA33) (SEQ ID NO:27); причем указанные субдомены (1А) и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2);
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:25), причем указанные субдомены (1А) и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем
указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена;
и при этом:
(a) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(b) указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
2. Биспецифическое моновалентное диатело по п. 1, в котором указанная первая
полипептидная цепь содержит альбуминсвязывающий домен (SEQ ID NO:34), причем
указанный домен расположен на С-конце по отношению к указанному домену 2 и
отделен от указанного домена 2 линкером 3 (SEQ ID NO:32).
3. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем указанное
биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с
эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3 и содержит домен Fc IgG, причем биспецифическое
моновалентное Fc - диатело содержит первую полипептидную цепь, вторую
полипептидную цепь и третью полипептидную цепь, причем указанная первая и вторая
полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и указанная первая и третья
полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
А. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:25), причем указанные субдомены (1А)
и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и
iii. домен 3, содержащий субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39) и субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG; причем указанные домены 3 и 2 отделены друг от друга спейсерным пептидом (линкер 5) (SEQ ID NO:33);
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5), и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:27); причем указанные субдомены (1А) и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена; и
C. третья полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу, домен 3, содержащий:
(1) субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39); и
субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
и при этом:
(a) указанные полипептидные части доменов Fc IgG указанной первой и третьей полипептидной цепи образуют указанный домен Fc IgG;
(b) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(c) указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
4. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем указанное биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с эпитопом gpA33 и с эпитопом CD3 и содержит домен Fc IgG, причем биспецифическое моновалентное Fc - диатело содержит первую полипептидную цепь, вторую полипептидную цепь и третью полипептидную цепь, причем указанная первая и вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и указанная первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом, и при этом:
А. первая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-
концу:
домен 3, содержащий субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39), и субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VLgpA33) (SEQ ID NO:26), и субдомен (IB), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (VHCD3) (SEQ ID NO:25), причем указанные субдомены (1А)
и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
причем указанные домены 1 и 3 отделены друг от друга спейсерным пептидом (линкер 4) (SEQ ID NO:38); iii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3) или К-спиральный домен (SEQ ID NO:4), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и
B. вторая полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу:
i. домен 1, содержащий субдомен (1А), который содержит домен VL моноклонального антитела, способного связываться с CD3 (УЬСБЗ) (SEQ ID NO:5); и субдомен (1В), который содержит домен VH моноклонального антитела, способного связываться с gpA33 (VHGPA33) (SEQ ID NO:27); причем указанные субдомены (1А) и (1В) отделены друг от друга пептидным линкером (SEQ ID NO:l);
ii. домен 2, причем указанный домен 2 представляет собой К-спиральный домен (SEQ ID NO:4) или Е-спиральный домен (SEQ ID NO:3), причем указанный домен 2 отделен от указанного домена 1 пептидным линкером (SEQ ID NO:2); и причем указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи не представляют собой оба Е-спиральных домена или оба К-спиральных домена; и
C. третья полипептидная цепь содержит, в направлении от N-конца к С-концу, домен 3, содержащий:
(1) субдомен (ЗА), который содержит цистеинсодержащий пептид (пептид 1) (SEQ ID NO:39); и
(2) субдомен (ЗВ), который содержит полипептидную часть домена Fc IgG, содержащую домены СН2 и СНЗ домена Fc иммуноглобулина IgG;
и при этом:
(а) указанные полипептидные части доменов Fc IgG указанной первой и третьей полипептидной цепи образуют указанный домен Fc IgG;
(b) указанный домен VL указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VH указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом CD3; и
(c) указанный домен VH указанной первой полипептидной цепи и указанный домен VL указанной второй полипептидной цепи образуют антигенсвязывающий домен, способный специфически связываться с эпитопом gpA33.
5. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело по любому из пп. 3-4, в котором указанный субдомен (ЗВ) указанной первой полипептидной цепи содержит последовательность, отличную от последовательности указанного субдомена (ЗВ) указанной третьей полипептидной цепи.
6. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело по п. 5, в котором указанный субдомен (ЗВ) указанной первой полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:40, и указанный субдомен (ЗВ) указанной третьей полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41.
7. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело по п. 5, в котором указанный субдомен (ЗВ) указанной первой полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:41, и указанный субдомен (ЗВ) указанной третьей полипептидной цепи характеризуется аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:40.
8. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело по любому из пп. 3-4, в котором указанный домен 3 указанной первой полипептидной цепи и/или указанный домен 3 указанной третьей полипептидной цепи содержит вариантную последовательность СН2-СНЗ, которая проявляет измененное связывание с рецептором Fey.
9. Биспецифическое моновалентное диатело по любому из пп. 1-2 или биспецифическое моновалентное Fc - диатело по любому из пп. 3-8, в котором
5.
указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи содержит Е-спираль (SEQ ID NO:3), и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи содержит К-спираль (SEQ ID NO:4).
10. Биспецифическое моновалентное диатело по любому из пп. 1-2 или
биспецифическое моновалентное Fc - диатело по любому из пп. 3-8, в котором
указанный домен 2 указанной первой полипептидной цепи содержит К-спираль (SEQ
ID NO:4), и указанный домен 2 указанной второй полипептидной цепи содержит Е-
спираль (SEQ ID NO:3).
11. Биспецифическое моновалентное диатело, причем указанное
биспецифическое моновалентное диатело способно специфически связываться с
эпитопом CD3 и с эпитопом gpA33, причем указанное биспецифическое моновалентное
диатело содержит:
(1) первую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28, и вторую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:30; или
(2) первую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:35, и вторую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID N0:30;
причем указанная первая и указанная вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом дисульфидной связью.
12. Биспецифическое моновалентное Fc - диатело, причем указанное
биспецифическое моновалентное Fc - диатело способно специфически связываться с
эпитопом CD3 и с эпитопом gpA33 и содержит домен Fc IgG, причем указанное
биспецифическое моновалентное Fc - диатело содержит:
(1) первую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:42, вторую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:44, и третью полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; или
(2) первую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:48, вторую полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:28, и третью полипептидную цепь, характеризующуюся аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:46; причем указанная первая и указанная вторая полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом первой дисульфидной связью, и указанная первая и третья полипептидные цепи ковалентно связаны друг с другом второй дисульфидной связью.
13. Фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое
моновалентное диатело по любому из пп. 1-2 или 9-12 или биспецифическое
моновалентное Fc - диатело по любому из пп. 3-10; и физиологически приемлемый
носитель.
14. Применение фармацевтической композиции по п. 13 в лечении злокачественной опухоли, характеризующейся экспрессией gpA33.
15. Применение по п. 14, при котором указанная злокачественная опухоль представляет собой колоректальный рак, рак толстой кишки, рак желудка или рак поджелудочной железы.
16. Клетка, которая экспрессирует полипептидную цепь любого из биспецифических моновалентных диател по пп. 1-2 или 9-12 или полипептидную цепь любого из биспецифических моновалентных Fc - диател по пп. 3-10.
17. Полинуклеотид, который кодирует полипептид по п. 16.
18. Клетка, которая экспрессирует антитело или его полипептидную часть или фрагмент, причем антитело связывается с gpA33, и при этом антитело или его полипептидная часть или фрагмент содержит:
(1) CDR1 (SEQ ID NO:14), CDR2 (SEQ ID NO:15) и CDR3 (SEQ ID NO:16) легкой цепи антитела к gpA33 человека;
(2) CDR1 (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 19) и CDR3 (SEQ ID N0:20)
тяжелой цепи антитела к gpA33 человека; или
(3) как (1), так и (2).
(3)
Полипептидная цепь 1 соон VWWV~ ~с
Линкер 2
К-спираль (или Е-спираль)
Линкер 1
Полипептидная цепь 1
СООн
СН2
Пептид 1
Линкер 5
Полипептидная цепь 2
Линкер 2 соон^\/ЩЛг = с
Е-спираль (или К-спираль)
Линкер 1
СНЗ
Полипептидная цепь 3
соон
Собранное Fc - диатело (версия 1)
соон
Пептид 1
Клетки CS LC толстой кишки РВМС человека - Е:Е=25:1
w 40 О
О 30
120
и о
Н 1 0
т и
1 0 0
101
1 0 2
1 0 3
Концентрация (нг/мл)
ФИГУРА 4A
Клетки колоректального рака Colo205 Активированные Т-клетки - Е:Е=10:1
104
Концентрация (нг/мл)
ФИГУРА 4B
Клетки рака поджелудочной железы ASPC Активированные Т-клетки - Е:Е=10:1
А 40
н о
О 30
3 20
Н 1 0
ё 0
1 0 -2 1 0 0 1 0 2 1 0 4
Концентрация (нг/мл)
C о lo 2 0 5 + CD8 Т- клетки
150
ю 1 00 ем О О
1 0 -2 10 0 10 2
Концентрация (нг/мл)
1 0 '
ФИГУРА 5A
150
ю 1 00 ем О О
1 0 -2 1 0 0 1 0 2 1 0 4
Концентрация (нг/мл)
ФИГУРА 5B
150
ю 1 00 ем О О
gpA33 x CD3 DART-1
К о нтр. DART
1 0
1 0 1
1 0 '
1 0 '
Концентрация ((нг/мл)
C о lo 2 0 5 + CD4 Т- клетки
300
_ 250 u_
2 200 ю
100 50 0
gpA33 x CD3 DART-1
Контр. DART
10 -2 10 0 10 :
Концентрация (нг/мл)
104
ФИГУРА 5D
ASPC-1 +
CD4 Т- клетки
350
300
_ 250 u_
2 200
ю ем
150 100 50 0
1 0 -2 1 0 0 1 0 2 1 0 4
Концентрация (нг/мл)
ФИГУРА 5E
350
300
_ 250 u_
2 200
ю ем
Q О
150 100 50 0
CD4 Т-клетки отдельно
gpA33 x CD3 DART-1
Контр. DART
1 0 -2 1 0 0 1 0 2 1 0 4
Концентрация (нг/мл)
s w 9 4 8 + дремлющи е Т-клетки
(LDH) E:T = 1 0:1
1 0 -3 1 0 -2 1 0 -1 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3
Концент'рация (нг/мл)
Colo205-Luc + дремлю щие Т-клетки (LU M) E:T = 10:1
-100 0 Ч 1 1 1 1 1 1
1 0 -3 1 0 -2 1 0 -1 1 0 0 1 0 1 1 0 2 1 0 3
Концентрация (нг/мл)
ФИГУРА 6C
HCT116 (A33-ve) + дремлющие Т-клетки (LDH) E :T = 1 0:1
gpA33 x CD3 DART-2 gpA33 x CD3 DART-1
Контр. DART
1 0
D D D D
10-3 10-2 1 0 -1 100 101 102 103 104
Концентрация (нг/мл)
Colo205-Luc + РВМС челомека (LDH) E:T = 30:1 24 ч
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
мкМ
ФИГУРА 7A
Coio205-Luc + РВМС человека
(LU M ) E :T = 3 0 :1 24 ч
30000 25000 20000
g 15000
5 10000 H
Контр, DART
gpA33 x CD3 DART-2 w/Fc gpA33 x CD3 DART-2 w/ABD
gpA33 x CD3 DART-2
5000 0
-5000
1 0
1 0
10°
мкМ
Coio205-Luc +РВМС явансжого макака
(LDH) E:T = 30:1 24 Ч
м1с]М
ФИГУРА 7C
Coio205-Luc + РВМС яванского макака
(LUM) E:T = 30:1 24 4
10-5 10-4 10-3 10-2 10-1 100 101 102
мкМ
3000 Н
день, исследования
инертный носитель
ф gpA33xCD3 DART-1 (0,02 м^кг) ¦Д- gpA33xCD3 DART-1 (0,1 мг/кг) Q gpA33xCD3 DART-1 (0,5 мг/кг)
ФИГУРА 8
ФИГУРА 9A День 2 Визуальные данные (инертный носитель):
ФИГУРА 9B День 2 Визуальные данные (gpA33 x CD3 DART-1 (0,5 мг/кг)):
ФИГУРА 9D День 12 Визуальные данные (gpA33 x CD3 DART-1
(0,5 мг/кг)):
день исследования -•- 'инертный носитель
-¦- Co(trol DART (0.5 мг/кг)
¦Q gpA33xCD3 DART-1 (0,5 мг/кг)
¦Д- gpA33xCD3 DART-1 (0,1 мг/кг)
¦V- gpA33xCD3 DART-1(0,02 мг/кг)
ФИГУРА 10
en 4
м м(
и л о
x с
vo О
10 20 30 40
день исследования
инертный носитель
gpA33xCD3 DART 2 w/Fc версия 1 (3,1 мг/кг/день) gpA33xCD3 DART 2 w/Fc версия 1 (1,5 мг/кг/день)
gpA33xCD3 DART 2 w/Fc версия 1 (0,75 мг/кг/день) gpA33xCD3 DART 2 w/Fc версия 1 (0,375 мг/кг/день)
версия 1 (0,5 мг/кг/день)
ФИГУРА 11
80 п
70' 60-
g 40-
о 30: -L
¦ о
т г
I °" § I
версия 1
ФИГУРА 12
0.1-
0.01
1
120
Время (ч)
144
? дрАЗЗ х CD3 DART-2 (обезыша 1) О дрАЗЗ х CD3 DART-2 (обезьяна 2) ¦ дрАЗЗ х CD3 DART-2 w/Fc версия 1 (обезьяна 3)
ФИГУРА 13
-50 0 50 150
Время
250 350
сек
Связывание версии 1 DART-2 w/Fc с CD3 человека
Связывание версии 1 DART-2 w/Fc с CD3 яванского макака
ФИГУРА 14A
140 j
100 : 60 ] 20 -
-20 1 ¦ f ч м ч 1 м I ¦ I ¦ I ¦ I
-50 0 50 150 250 350
Время сек
Связывание версии 1 DART-2 w/Fc с gpA33 человека
ФИГУРА 15A
-20 1 ¦ i ¦ i ¦ i ¦ i ¦ T ¦ i ¦ i ¦ i ¦ i
-50 0 50 150 250 350
Время сек Связывание версии 1 DART-2 w/Fc с gpA33 яванского макака
ФИГУРА 15B
(1)
(19)
(19)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(1)
(2)
(2)
(2)
(2)
1/20
1/20
ФИГУРА 1
ФИГУРА 1
1/20
1/20
ФИГУРА 1
ФИГУРА 1
2/20
2/20
ФИГУРА 2A
ФИГУРА 2A
2/20
2/20
ФИГУРА 2A
ФИГУРА 2A
2/20
2/20
ФИГУРА 2A
ФИГУРА 2A
2/20
2/20
ФИГУРА 2A
ФИГУРА 2A
3/20
3/20
ФИГУРА 2B
ФИГУРА 2B
4/20
4/20
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
5/20
5/20
ФИГУРА 4C
ФИГУРА 4C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
200
6/20
200
6/20
ФИГУРА 5C
ФИГУРА 5C
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
350
7/20
350
7/20
ФИГУРА 5F
ФИГУРА 5F
8/20
8/20
ФИГУРА 6B
ФИГУРА 6B
8/20
8/20
ФИГУРА 6B
ФИГУРА 6B
8/20
8/20
ФИГУРА 6B
ФИГУРА 6B
9/20
9/20
ФИГУРА 6D
ФИГУРА 6D
9/20
9/20
ФИГУРА 6D
ФИГУРА 6D
9/20
9/20
ФИГУРА 6D
ФИГУРА 6D
9/20
9/20
ФИГУРА 6D
ФИГУРА 6D
9/20
9/20
ФИГУРА 6D
ФИГУРА 6D
10/20
10/20
ФИГУРА 7В
ФИГУРА 7В
10/20
10/20
ФИГУРА 7В
ФИГУРА 7В
10/20
10/20
ФИГУРА 7В
ФИГУРА 7В
10/20
10/20
ФИГУРА 7В
ФИГУРА 7В
10/20
10/20
ФИГУРА 7В
ФИГУРА 7В
11/20
11/20
ФИГУРА 7D
ФИГУРА 7D
12/20
12/20
13/20
13/20
15/20
15/20
16/20
16/20
16/20
16/20
17/20
101
18/20
17/20
101
18/20
19/20
101
18/20
20/20
20/20