EA201690299A1 20161130

	Патентная документация ЕАПВ
Запрос:	ea201690299a*\id
Результат:	ID\|Номер и дата охранного документа

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

В настоящем изобретении предложены полипептиды, содержащие Fc-область антитела, которая имеет делецию по меньшей мере одного остатка цистеина в шарнирной области и замену по меньшей мере одной аминокислоты на поверхности домена СН3 на остаток аминокислоты, содержащий сульфгидрильную группу. Также предложены гибридные Fc-белки и антитела, содержащие такие полипептиды, нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие указанные полипептиды, а также клетки-хозяева и способы получения указанных полипептидов.

Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Евразийское (21) 201690299 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C07K16/00 (2006.01)
2016.11.30
(22) Дата подачи заявки 2014.07.30
(54) СТАБИЛИЗАЦИЯ Fc-СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИПЕПТИДОВ
(31) (32)
61/860,800
2013.07.31
(33) US
(86) PCT/US2014/048908
(87) WO 2015/017548 2015.02.05
(88) 2015.11.05
(71) Заявитель: ЭМДЖЕН ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Каннан Гунасекаран, Лавалле Дженнифер, Джекобсен Фредерик У.
(US)
(74)
Представитель: Медведев В.Н. (RU)
(57) В настоящем изобретении предложены полипептиды, содержащие Fc-область антитела, которая имеет делецию по меньшей мере одного остатка цистеина в шарнирной области и замену по меньшей мере одной аминокислоты на поверхности домена СН3 на остаток аминокислоты, содержащий сульфгидрильную группу. Также предложены гибридные Fc-белки и антитела, содержащие такие полипептиды, нуклеиновые кислоты и векторы, кодирующие указанные полипептиды, а также клетки-хозяева и способы получения указанных полипептидов.
2420-531708ЕА/045 СТАБИЛИЗАЦИЯ Fc-СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИПЕПТИДОВ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/860800, поданной 31 июля 2013 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Настоящая заявка включает перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия в формате ASCII, созданная 28 июля 2014 г., имеет название А-1852-WO-PCT_SL.txt и размер 122 988 байтов.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Антитела стали объектом, который часто используют в биофармацевтической промышленности, поскольку они обладают рядом характеристик, привлекательных для разработчиков терапевтических молекул. Помимо того, что антитела способны связываться со специфическими структурами или клетками, они делают свои мишени восприимчивыми к фагоцитозу и элиминации, опосредованных клетками, содержащими Fc-рецепторы (Raghavan and Bjorkman 1996). Кроме того, способность антитела к рН-зависимому взаимодействию с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) увеличивает период полувыведения антитела из сыворотки крови (Ghetie and Ward 2000). Указанное уникальное свойство антител позволяет увеличивать период полувыведения терапевтического белка или пептида из сыворотки посредством конструирования гибридных Fc-молекул.
Антитела принадлежат к белкам класса иммуноглобулинов, который включает IgG, IgA, IgE, IgM и IgD. Наиболее часто встречающийся подкласс иммуноглобулинов в сыворотке человека -IgG, схематическая структура которого представлена на фиг. 1 (Deisenhofer 1981; Huber 1984; Roux 1999). Структура IgG включает четыре цепи, две легких и две тяжелых; каждая легкая цепь содержит два домена, а каждая тяжелая цепь содержит четыре домена. Антигенсвязывающий сайт расположен в области Fab
(Fragment antigen binding, антигенсвязывающем фрагменте), которая содержит вариабельный домен легкой (VL) и вариабельный домен тяжелой (VH) цепи, а также константный домен легкой (LC) и константный домен тяжелой (СН1) цепи. Часть тяжелой цепи, включающую шарнирную область, домен СН2 и домен СНЗ называют "Fc" (кристаллизуемый фрагмент). Молекулу IgG можно рассматривать как гетеротетрамер, содержащий две тяжелые цепи, которые удерживают вместе дисульфидные связи (-S-S-) в шарнирной области, и две легкие цепи. Число дисульфидных связей в шарнирной области варьирует в разных подклассах иммуноглобулинов
(Papadea and Check 1989) . Сайт связывания FcRn расположен в Fc-области антитела (Martin, West et al. 2001), и, соответственно, характеристика антитела, заключающаяся в увеличенном периоде полувыведения из сыворотки, определяется Fc-фрагментом. Сама по себе Fc-область может рассматриваться как гомодимер тяжелых цепей, содержащий область шарнира, домены СН2 и СНЗ.
Fc-область встречающихся в природе антител IgG представляет собой гомодимер; и её можно экспрессировать и очистить в виде димера. Как обсуждается выше, Fc-область антитела обеспечивает период полувыведения из сыворотки за счет механизма рециклирования FcRn. Поэтому Fc используют в качестве партнера для слияния, увеличивающего период полувыведения из сыворотки терапевтических белков, пептидов (пептител) и доменов белка. Однако для некоторых вариантов терапевтического применения может требоваться удаление шарнирной области, устраняющее ковалентную связь между двумя полипептидными цепями, которые образуют Fc. Например, при рекомбинантном объединении Fc-области с белком, который содержит внутренние дисульфидные связи или свободные остатки цистеина, дисульфидные связи в области шарнира могут влиять на укладку и приводить к агрегации. При этом удаление шарнирной области устраняет ковалентную связь между двумя полипептидными цепями. Это может приводить к диссоциации нековалентных взаимодействий между двумя цепями Fc на этапе получения или in vivo, и приводить к связыванию цепей Fc с другими белками/молекулами.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Согласно настоящему описанию в настоящем документе введение дисульфидной связи в область контактной поверхности СНЗ-домена может повышать термостабильность Fc-содержащих молекул, не содержащих дисульфидных связей в составе шарнирной области. Кроме того, ковалентная связь обеспечивает интактность двух полипептидных цепей, которые образуют димер в структуре Fc, предотвращая их диссоциацию in vitro или in vivo. Как показано на Фиг. 3, согласно определенным вариантам реализации, единственной ковалентной связью между двумя цепями Fc в гомодимере Fc дикого типа с удаленным шарниром и мутантном гетеродимере Fc с удаленным шарниром является указанная введенная дисульфидная связь.
Согласно определенным вариантам реализации один или более остатков, составляющих поверхность контакта СНЗ-СНЗ на обоих доменах СНЗ, заменены на остаток аминокислоты, содержащий сульфгидрильную группу таким образом, что взаимодействие стабилизируется за счет формирования дисульфидной связи (-S-S-) между доменами СНЗ. Согласно предпочтительным вариантам реализации аминокислота указанной поверхности, такая как лейцин, треонин, серии или тирозин, заменена на цистеин или метионин, предпочтительно, на цистеин. Согласно определенным вариантам реализации указанная аминокислота заменена на неприродную аминокислоту с требуемыми характеристиками заряда, такую как гомоцистеин или глутатион.
Согласно первому аспекту настоящего изобретения полипептид
содержит Fc-область антитела, имеющую делецию или замену одного
или более остатков цистеина шарнирной области, и замену одной
или более аминокислот контактной поверхности СНЗ на остаток
аминокислоты, содержащий сульфгидрильную группу,
предпочтительно, цистеин. В шарнирной области могут отсутствовать остатки цистеина в результате замены или делеции. Согласно определенным вариантам реализации шарнирная область в Fc-фрагменте отсутствует полностью. Согласно другим вариантам реализации удалена только часть шарнирной области, предпочтительно часть, содержащая остатки цистеина.
Согласно определенным вариантам реализации указанного
первого аспекта аминокислота Y349, L351, S354, Т394 на контактной поверхности СНЗ или Y407 заменена на остаток содержащий сульфгидрильную группу, предпочтительно цистеин. Согласно предпочтительным вариантам реализации Fc-фрагмент содержит замену L351C. При взаимодействии в подходящих условиях двух Fc-содержащих полипептидов, имеющих замену L351C, формируется дисульфидная связь между остатками L351C в двух цепях. Аналогичным образом, при взаимодействии в подходящих условиях двух Fc-содержащих полипептидов, имеющих замену Т394С, формируется дисульфидная связь между остатками Т394С в двух цепях. Кроме того, при взаимодействии в подходящих условиях двух Fc-содержащих полипептидов, имеющих замену Y407C, формируется дисульфидная связь между остатками Y4 07C в двух цепях. При взаимодействии в подходящих условиях Fc-содержащего полипептида, имеющего замену Y34 9C, с Fc-содержащим полипептидом, имеющим замену S354C, формируется дисульфидная связь между остатком Y349C одной цепи и остатком S354C другой цепи.
Fc-область полипептида согласно первому аспекту может включать одну или большее количество дополнительных замен аминокислот в области СН2 и/или СНЗ. Согласно предпочтительным вариантам реализации Fc в области СН2 включает одну или более замен аминокислот, изменяющих эффекторную функцию Fc-содержащего белка по сравнению с аналогичным белком, содержащим СН2 дикого типа. Согласно другим вариантам реализации Fc в области СНЗ включает одну или более замен аминокислот, изменяющих способность Fc-содержащего полипептида к гомодимеризации и/или увеличивающих способность к гетеродимеризации с Fc-содержащим полипептидом, содержащим реципрокные замены аминокислот в области СНЗ.
Согласно определенным вариантам реализации указанного первого аспекта, удалены или заменены одна или большее количество аминокислот на С-конце Fc-области. Согласно предпочтительным вариантам реализации С-концевой лизин удален или заменен на другую аминокислоту. Согласно другим вариантам реализации две или три концевые аминокислоты удалены или заменены на другую аминокислоту.
Согласно определенным вариантам реализации указанного первого аспекта указанный полипептид представляет собой тяжелую цепь антитела. Согласно другим вариантам реализации указанный полипептид представляет собой гибридный Fc-белок. Указанный гибридный Fc-белок может содержать линкер на N-конце и/или С-конце молекулы Fc.
Во втором аспекте настоящего изобретения нуклеиновая кислота кодирует полипептид согласно указанному первому аспекту.
В третьем аспекте экспрессионный вектор содержит нуклеиновую кислоту согласно указанному второму аспекту, функционально связанную с регуляторной последовательностью, такой как гетерологичный промотор и/или энхансер.
В четвертом аспекте клетка-хозяин содержит экспрессионный вектор согласно указанному третьему аспекту. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанная клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, дрожжевую клетку или клетку линии клеток млекопитающих. Предпочтительной линией клеток млекопитающих является линия клеток яичника китайского хомячка (СНО).
Пятый аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения полипептида согласно указанному первому аспекту. Предложенные способы включают культивирование клетки-хозяина согласно указанному четвертому аспекту в условиях, при которых активна регуляторная область в указанной клетке-хозяине, и выделение указанного полипептида из культуры.
Согласно шестому аспекту фармацевтическая композиция содержит полипептид согласно указанному первому аспекту.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Схематическое изображение антитела IgGl с указанием доменов. Антитело IgGl представляет собой Y-образный тетрамер, содержащий две тяжелых цепи (большей длины) и две легких цепи (меньшей длины). Указанные две тяжелых цепи соединены между собой дисульфидными связями (-S-S-) в шарнирной области. Fab -антигенсвязывающий фрагмент, Fc - кристаллизуемый фрагмент, VL -вариабельный домен легкой цепи, VH - вариабельный домен тяжелой цепи, CL - константный (без вариаций последовательности) домен
легкой цепи, CHI - константный домен тяжелой цепи 1, СН2 -константный домен тяжелой цепи 2, СНЗ - константный домен тяжелой цепи 3.
Фиг. 2. Схемы димеров Fc, в которых отсутствует шарнирная область ("удаленный шарнир"), с введенной дисульфидной связью в область контактной поверхности СНЗ-домена, (а) в случае гомодимера Fc дикого типа и (Ь) в случае мутантного гетеродимера Fc, где также были введены мутации (например, мутации типа "выступы-во-впадины" или мутации пар заряженных остатков) в область контактной поверхности СНЗ-домена.
Фиг. 3. ДСН-ПТААГ-электрофорез, дающий основную одиночную полосу, подтверждающую наличие ковалентной связи между положительно заряженными ("+") и отрицательно заряженными ("-") цепями Fc для гибридной конструкции гетеродимера Fc с мутацией пар заряженных остатков и удаленным шарниром с введенной дисульфидной связью L351C в область контактной поверхности СНЗ-домена .
Фиг. 4. Обзор фармакокинетики гетеродимерных (с мутациями пар заряженных остатков) гибридных Fc-белков, в которых отсутствует шарнирная область. А. Fc-гибрид без шарнира и без линкера между терапевтическим пептидом и Fc. В. То же, что и А, за исключением вариации в терапевтическом пептиде. С. То же, что и В, за исключением того, что Fc соединен с терапевтическим пептидом посредством негликозилированного линкера. D. То же, что и С, за исключением другого линкера. Е. То же, что и А, за исключением того, что одна цепь Fc включает замену Y349C, а другая включает замену S354C. F. То же, что и В, за исключением того, что одна цепь Fc включает замену Y349C, а другая включает замену S354C.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем документе описаны способы повышения стабильности Fc-каркасов антител, в частности, Fc-каркасов, не содержащих шарнирной области, не содержащих части шарнирной области, образующей дисульфидные связи, или отличающихся тем, что их шарнирная область включает замену одного или большего количества остатков цистеина. Такие способы включают введение
одной или большего числа сконструированных дисульфидных связей в область контактной поверхности СНЗ-домена.
Как видно на Фиг.1, антитело IgGl представляет собой Y-образный тетрамер с двумя тяжелыми цепями (большей длины) и двумя легкими цепями (меньшей длины). Указанные две тяжелых цепи соединены между собой дисульфидными связями (-S-S-) в шарнирной области. Молекулу IgG можно считать гетеротетрамером, состоящим из двух тяжелых цепей, удерживаемых вместе дисульфидными связями (-S-S-) в шарнирной области, и двух легких цепей. Число дисульфидных связей в шарнире в подклассах иммуноглобулинов варьирует.
Ковалентную связь между двумя тяжелыми цепями во встречающихся в природе антителах обеспечивают дисульфидные связи в шарнирной области (контактирующей с растворителем). Соответственно, в димере Fc или антителе, не содержащем шарнирной области, ковалентная связь между двумя тяжелыми цепями отсутствует. Дисульфиды шарнирной области, наряду с дисульфидной связью между легкими и тяжелыми цепями (CL-CH1), удерживают все четыре цепи в ковалентно связанном состоянии. Молекулярная масса интактного антитела составляет приблизительно 150 кДа, и оно образует одну полосу при анализе способом невосстанавливающего ДСН-ПТААГ-электрофореза. Дисульфидная связь в области контактной поверхности СНЗ-домена в IgGl / Fc дикого типа (WT) отсутствует.
Примером последовательности аминокислот IgGl Fc человека является
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID N0: 9)
В приведенной выше последовательности DKTHTCPPCPAPELLGG (SEQ ID N0: 10) соответствует шарнирной области.
Аминокислоты, составляющие поверхность контакта СНЗ-СНЗ, описаны в следующих предварительных заявках того же заявителя: 61/019569, поданной 1/7/2008, и 61/120305, поданной 12/5/09, а также PCT/US2009/000071, поданной 1/6/2009 (все указанные источники полностью включены в настоящий документ посредством
ссылки).
Всего было идентифицировано 4 8 кристаллических структур антител с координатами, соответствующими Fc-области из Базы данных белковых структур (PDB) (Bernstein, Koetzle et al. 1977), с применением алгоритма поиска на основе структуры (Ye and Godzik 2004). Исследование идентифицированных кристаллических структур Fc показало, что структура, определенная при максимальном разрешении, соответствует Fc-фрагменту ритуксимаба, связанному с минимизированным вариантом В-домена белка А, называемым Z34C (код PDB: 1L6X) . Биологическую структуру гомодимера Fc для 1L6X устанавливали с использованием координат и кристаллической симметрии осажденного мономера Fc. Для идентификации остатков, участвующих во взаимодействии СНЗ-СНЗ-доменов, использовали два способа: (i) контактный способ, основанный на критерии предельного расстояния и (ii) анализ площади доступной для растворителя поверхности.
В соответствии с контактным способом остатки на поверхности по определению представляют собой остатки, тяжелые атомы боковых цепей которых расположены ближе установленного предела к тяжелым атомам любых остатков второй цепи. Хотя предельное расстояние 4,5А является предпочтительным, для идентификации остатков контактной поверхности можно использовать и большее предельное расстояние (например, 5,5А) (Bahar and Jernigan 1997) .
Второй способ включает вычисление площади доступной для растворителя поверхности (ASA) остатков СНЗ-домена в присутствии и в отсутствие второй цепи (Lee and Richards 1971) . Остатки, демонстрирующие разную ASA (> 1 А2) в двух расчетах, идентифицируют как остатки контактной поверхности. С помощью обоих способов был идентифицирован аналогичный набор остатков поверхности контакта. Кроме того, полученные данные согласовались с опубликованным исследованием (Miller 1990).
В Таблице 1 приведены 24 остатка поверхности контакта, идентифицированные с применением критерия контактного способа при пределе расстояния 4,5А. Дополнительно исследовали консервативность структуры указанных остатков. С указанной целью 4 8 идентифицированных в PDB кристаллических структур Fc
совмещали и анализировали путем вычисления среднеквадратичного отклонения для тяжелых атомов боковых цепей. Обозначения остатков основаны на системе нумерации EU по Rabat, соответствующей также нумерации в Базе данных белковых структур (PDB) .
LYS A 439
ASP В 356'
Определяли кристаллическую структуру Fc дикого типа и анализировали её на наличие потенциальных положения для введения остатков цистеина для сконструированной дисульфидной связи. В частности, были выбраны остатки Т394 и L351. Остатки Т394 цепей Fc дикого типа расположены рядом в области контактной поверхности СНЗ-домена. Мутация с заменой Т394 на цистеин в обеих цепях Fc обеспечивает образование дисульфидной связи. Аналогичным образом, остатки L351 цепей Fc дикого типа расположены рядом в области контактной поверхности СНЗ-домена. Мутация с заменой L351 на цистеин в обеих цепях Fc также обеспечивает образование дисульфидной связи. Мутация с заменой на цистеин как Т394, так и L351 в обеих цепях Fc обеспечивает образование двух дисульфидных связей.
Поскольку в дисульфидной связи задействованы одни и те же остатки на обеих цепях, как положение Т394, так и L351 подходит для применения в случае гомодимеров Fc дикого типа, а также сконструированных гетеродимеров Fc, таких как цепи Fc с мутациями типа "выступы-во-впадины" или мутациями пар заряженных остатков.
Положения Y34 9 и S354 расположены рядом на контактной поверхности СНЗ Fc дикого типа. В гетеродимере Fc одна область СНЗ может включать замену Y34 9C, а другая СНЗ область может включать замену S354C. Было обнаружено, что стабильность гетеродимеров с парами заряженных остатков, содержащих мутации типа "цистеиновый зажим" (Y349C/S354C), выше, чем у гетеродимеров, не содержавших цистеиновый зажим. В частности, мономеры гетеродимеров с парами заряженных остатков без цистеинового зажима были представлены в виде отдельных полос на ДСН-ПААГ, тогда как гетеродимеры с парами заряженных остатков с мутацией типа "цистеиновый зажим" были представлены в виде одной полосы. То же самое было справедливо и для гетеродимеров с парами заряженных остатков, содержащих (L351C/L351C) мутацию типа "цистеиновый зажим".
Гетеродимеры, содержащие первую СНЗ-содержащую молекулу, включающую замену Y34 9C, и вторую СНЗ-содержащую молекулу,
включающую замену S354C, демонстрировали более высокую стабильность и более высокий процент гетеродимеров по сравнению с содержащими в указанных положениях остатки аминокислот дикого типа. Кроме того, гетеродимеры, содержащие первую и вторую СНЗ-содержащую молекулу, каждая из которых включала замену L351C, демонстрировали более высокую стабильность и более высокую продуктивность, чем содержащие L351 молекулы.
Остатки контактной поверхности в составе домена СНЗ
демонстрируют тенденцию к высокой консервативности в различных
подклассах и классах антител, и даже у разных видов.
Соответственно, хотя предложенные варианты реализации относятся
к IgGl человека, конструирование с использованием цистеинов
подходит и для других Fc-содержащих молекул. Примеры
последовательностей Fc представлены ниже. Остатки,
соответствующие Y349, L351, S354, Т394 или Y407 IgGl человека в составе приведенных ниже последовательностей могут быть заменены на содержащий сульфгидрил остаток, предпочтительно цистеин. Соответствующие остатки IgG человека других подклассов выделены жирным шрифтом.
> IGHG1 человека (SEQ ID N0: 11) PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK > IGHG2 человека (SEQ ID NO: 12)
RKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTWHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> IGHG3 человека (SEQ ID NO: 13) LKTPLGDTTHTCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVQ FKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTT PPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
> IGHG4 человека (SEQ ID NO: 14) SKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEVQFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
> IGHG1 мыши (SEQ ID NO: 15) VPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISKDDPEVQFSWFVD DVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTK GRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNT NGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
> IGHG2A мыши (SEQ ID NO: 16) DKKIEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCWVDVSEDD PDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPA PIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELN YKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSWHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
> IGHG2B мыши (SEQ ID NO: 17) EPSGPISTINPCPPCKECHKCPAPNLEGGPSVFIFPPNIKDVLMISLTPKVTCWVDVSE DDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTIRVVSTLPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDL PSPIERTISKIKGLVRAPQVYTLPPPAEQLSRKDVSLTCLWGFNPGDISVEWTSNGHTE ENYKDTAPVLDSDGSYFIYSKLNMKTSKWEKTDSFSCNVRHEGLKNYYLKKTISRSPGK
> IGHG2C мыши (SEQ ID NO: 18) EPRVPITQNPCPPLKECPPCAAPDLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPMVTCWVDVSED DPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNRALP S PIEKTISKPRGPVRAPQVYVLPPPAEEMTKKE FSLTCMITGFLPAEIAVDWTSNGRTEQ NYKNTATVLDSDGSYFMYSKLRVQKSTWERGSLFACSWHEVLHNHLTTKTISRSLGK
> IGHG3 мыши(SEQ ID NO: 19) EPRIPKPSTPPGSSCPPGNILGGPSVFIFPPKPKDALMISLTPKVTCWVDVSEDDPDVH VSWFVDNKEVHTAWTQPREAQYNSTFRVVSALPIQHQDWMRGKEFKCKVNNKALPAPIER TISKPKGRAQTPQVYTIPPPREQMSKKKVSLTCLVTNFFSEAISVEWERNGELEQDYKNT PPILDSDGTYFLYSKLTVDTDSWLQGEIFTCSVVHEALHNHHTQKNLSRSPGK
> IGHG1 овцы (SEQ ID NO: 20) EPGCPDPCKHCRCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCWVDVGQDDPEVQFS WFVDNVEVRTARTKPREEQFNSTFRVVSALPIQHQDWTGGKEFKCKVHNEALPAPIVRTI SRTKGQAREPQVYVLAPPQEELSKSTLSVTCLVTGFYPDYIAVEWQKNGQPESEDKYGTT TSQLDADGSYFLYSRLRVDKNSWQEGDTYACVVMHEALHNHYTQKSISKPPGK
> IGHG2 овцы (SEQ ID NO: 21) GISSDYSKCSKPPCVSRPSVFIFPPKPKDSLMITGTPEVTCWVDVQGDPEVQFSWFVDN VEVRTARTKPREEQFNSTFRWSALPIQHDHWTGGKEFKCKVHSKGLPAPIVRTISRAKG
QAREPQVYVLAPPQEELSKSTLSVTCLVTGFYPDYIAVEWQRARQPESEDKYGTTTSQLD ADGSYFLYSRLRVDKSSWQRGDTYACVVMHEALHNHYTQKSISKPPGK
> IGHG1 коровы (SEQ ID NO: 22) DPTCKPSPCDCCPPPELPGGPSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCWVDVGHDDPEVKFSW FVDDVEVNTATTKPREEQFNSTYRWSALRIQHQDWTGGKEFKCKVHNEGLPAPIVRTIS RTKGPAREPQVYVLAPPQEELSKSTVSLTCMVTSFYPDYIAVEWQRNGQPESEDKYGTTP PQLDADSSYFLYSKLRVDRNSWQEGDTYTCWMHEALHNHYTQKSTSKSAGK
> IGHG2 коровы (SEQ ID NO: 23) GVSSDCSKPNNQHCCVREPSVFIFPPKPKDTLMITGTPEVTCWVNVGHDNPEVQFSWFV DDVEVHTARTKPREEQFNSTYRWSALPIQHQDWTGGKEFKCKVNIKGLSASIVRIISRS KGPAREPQVYVLDPPKEELSKSTVSVTCMVIGFYPEDVDVEWQRDRQTESEDKYRTTPPQ LDADRSYFLYSKLRVDRNSWQRGDTYTCWMHEALHNHYMQKSTSKSAGK
> IGHG3 коровы (3) (SEQ ID NO: 24) KSEVEKTPCQCSKCPEPLGGLSVFIFPPKPKDTLTISGTPEVTCWVDVGQDDPEVQFSW FVDDVEVHTARTKPREEQFNS TYRWSALRIQHQDWLQGKE FKCKVNNKGLPAPIVRTIS RTKGQAREPQVYVLAPPREELSKSTLSLTCLITGFYPEEIDVEWQRNGQPESEDKYHTTA PQLDADGSYFLYSKLRVNKSSWQEGDHYTCAVMHEALRNHYKEKSISRSPGK
> IGHG1 крысы(SEQ ID NO: 25) VPRNCGGDCKPCICTGSEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCWVDISQDDPEVHFSWF VDDVEVHTAQTRPPEEQFNSTFRSVSELPILHQDWLNGRTFRCKVTSAAFPSPIEKTISK PEGRTQVPHVYTMSPTKEEMTQNEVSITCMVKGFYPPDIYVEWQMNGQPQENYKNTPPTM DTDGSYFLYSKLNVKKEKWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
> IGHG2A крысы (SEQ ID NO: 2 6) VPRECNPCGCTGSEVSSVFIFPPKTKDVLTITLTPKVTCWVDISQNDPEVRFSWFIDDV EVHTAQTHAPEKQSNSTLRSVSELPIVHRDWLNGKTFKCKVNSGAFPAPIEKSISKPEGT PRGPQVYTMAPPKEEMTQSQVSITCMVKGFYPPDIYTEWKMNGQPQENYKNTPPTMDTDG SYFLYSKLNVKKETWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
> IGHG2B крысы (SEQ ID NO: 27) ERRNGGIGHKCPTCPTCHKCPVPELLGGPSVFIFPPKPKDILLISQNAKVTCVWDVSEE EPDVQFSWFVNNVEVHTAQTQPREEQYNSTFRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKALP SPIEKTISKPKGLVRKPQVYVMGPPTEQLTEQTVSLTCLTSGFLPNDIGVEWTSNGHIEK NYKNTEPVMDSDGSFFMYSKLNVERSRWDSRAPFVCSVVHEGLHNHHVEKSISRPPGK
> IGHG кролика (SEQ ID NO: 28) APSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEDDPEVQFTWYI NNEQVRTARPPLREQQFNSTIRWSTLPIAHEDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKA RGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLD
SDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
> IGHG1 лошади (SEQ ID NO: 29) EPIPDNHQKVCDMSKCPKCPAPELLGGPSVFIFPPNPKDTLMITRTPEVTCWVDVSQEN PDVKFNWYMDGVEVRTATTRPKEEQFNSTYRVVSVLRIQHQDWLSGKEFKCKVNNQALPQ PIERTITKTKGRSQEPQVYVLAPHPDEDSKSKVSVTCLVKDFYPPEINIEWQSNGQPELE TKYSTTQAQQDSDGSYFLYSKLSVDRNRWQQGTTFTCGVMHEALHNHYTQKNVSKNPGK
> IGHG2 лошади (SEQ ID NO: 30) ARVTPVCSLCRGRYPHPIGGPSVFIFPPNPKDALMISRTPWTCWVNLSDQYPDVQFSW YVDNTEVHSAITKQREAQFNSTYRWSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNVGVPQPISRAIS RGKGPSRVPQVYVLPPHPDELAKSKVSVTCLVKDFYPPDISVEWQSNRWPELEGKYSTTP AQLDGDGSYFLYSKLSLETSRWQQVESFTCAVMHEALHNHFTKTDISESLGK
> IGHG3 лошади (SEQ ID NO: 31) EPVLPKPTTPAPTVPLTTTVPVETTTPPCPCECPKCPAPELLGGPSVFIFPPKPKDVLMI TRTPEVTCLWDVSHDSSDVLFTWYVDGTEVKTAKTMPNEEQNNSTYRWSVLRIQHQDW LNGKKFKCKVNNQALPAPVERTIS KAT GQTRVPQVYVLAPHPDE L S KNKVSVT СLVKD FL PTDITVEWQSNEHPEPEGKYRTTEAQKDSDGSYFLYSKLTVETDRWQQGTTFTCWMHEA LHNHVMQKNVSHSPGK
> IGHG4 лошади (SEQ ID NO: 32) VIKECGGCPTCPECLSVGPSVFIFPPKPKDVLMISRTPTVTCWVDVGHDFPDVQFNWYV DGVETHTATTEPKQEQNNSTYRWSILAIQHKDWLSGKEFKCKVNNQALPAPVQKTISKP TGQPREPQVYVLAPHRAELSKNKVSVTCLVKDFYPTDIDIEWKSNGQPEPETKYSTTPAQ LDSDGSYFLYSKLTVETNRWQQGTTFTCAVMHEALHNHYTEKSVSKSPGK
> IGHG5 лошади (SEQ ID NO: 33) WKGSPCPKCPAPELPGGPSVFIFPPKPKDVLKISRKPEVTCWVDLGHDDPDVQFTWFV DGVETHTATTEPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLSGKEFKCSVTNKALPAPVERTTSKA KGQLRVPQVYVLAPHPDELAKNTVSVTCLVKDFYPPEIDVEWQSNEHPEPEGKYSTTPAQ LNSDGSYFLYSKLSVETSRWKQGESFTCGVMHEAVENHYTQKNVSHSPGK
> IGHG6 лошади (SEQ ID NO: 34) VIKEPCCCPKCPDSKFLGRPSVFIFPPNPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQENPDVKFNWY VDGVEAHTAT TKAKEKQDNS TYRWSVLPIQHQDWRRGKE FKCKVNNRALPAPVERTITK AKGELQDPKVYILAPHREEVTKNTVSVTCLVKDFYPPDINVEWQSNEEPEPEVKYSTTPA QLDGDGSYFLYSKLTVETDRWEQGESFTCVVMHEAIRHTYRQKSITNFPGK
> IGHG1 макака-крабоеда (SEQ ID NO: 35) EIKTCGGGSKPPTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPD VKFNWYVNGAEVHHAQTKPRETQYNSTYRWSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKALPAPI QKTISKDKGQPREPQVYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIWEWESSGQPENTYK
TTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWRQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> IGHG1 макака-резуса (SEQ ID NO: 36) EIKTCGGGSKPPTCPPCTSPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSQEDPD VKFNWYVNGAEVHHAQTKPRETQYNSTYRWSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKALPAPI QKTISKDKGQPREPQVYTLPPSREELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIWEWESSGQPENTYK TTPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> IGHG2 макака-резуса (SEQ ID NO: 37) GLPCRSTCPPCPAELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEEPDVKFNWYV DGVEVHNAQTKPREEQFNSTYRWSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKALPAPKQKTVSKT KGQPREPQVYTLPPPRKELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIWEWASNGQPENTYKTTPPVLD SDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
> IGHG3 макака-резуса (SEQ ID NO: 38) EFTPPCGDTTPPCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSQEDPEV QFNWYVDGAEVHHAQTKPREEQFNSTYRWSVLTVTHQDWLNGKEYTCKVSNKGLPAPIE KTISKAKGQPREPQVYILPPPQEELTKNQVSLTCLVTGFYPSDIAVEWESNGQPENTYKT TPPVLDSDGSYFLYSKLTVDKSRWQQGNTFSCSVMHEALHNHYTQKSLSVSP
> IGHG1 свиньи (SEQ ID NO: 39) GIHQPQTCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCWVDVSKEHAEVQFSWYV DGVEVHTAE TRPKEEQFNS TYRWSVLPIQHQDWLKGKE FKCKVNNVDLPAPITRTISKA IGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTLTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPENTYRTTPPQ QDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGDKFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK
> IGHG2A свиньи (SEQ ID NO: 40) GTKTKPPCPICPACESPGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPQVTCWVDVSQENPEVQFSWYV DGVEVHTAQTRPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLNGKEFKCKVNNKDLPAPITRIISKA KGQTREPQVYTLPPHAEELSRSKVSITCLVIGFYPPDIDVEWQRNGQPEPEGNYRTTPPQ QDVDGTYFLYSKFSVDKASWQGGGIFQCAVMHEALHNHYTQKSISKTPGK
> IGHG2B свиньи (SEQ ID NO: 41) GTKTKPPCPICPACESPGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPQVTCWVDVSQENPEVQFSWYV DGVEVHTAQTRPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLNGKEFKCKVNNKDLPAPITRIISKA KGQTREPQVYTLPPHAEELSRSKVSITCLVIGFYPPDIDVEWQRNGQPEPEGNYRTTPPQ QDVDGTYFLYSKFSVDKASWQGGGIFQCAVMHEALHNHYTQKSISKTPGK
> IGHG3 свиньи (SEQ ID NO: 42) GTKTKPPCPICPGCEVAGPSVFIFPPKPKDTLMISQTPEVTCVWDVSKEHAEVQFSWYV DGVEVHTAE TRPKEEQFNS TYRWSVLPIQHQDWLKGKE FKCKVNNVDLPAPITRTISKA IGQSREPQVYTLPPPAEELSRSKVTVTCLVIGFYPPDIHVEWKSNGQPEPEGNYRTTPPQ QDVDGTFFLYSKLAVDKARWDHGETFECAVMHEALHNHYTQKSISKTQGK
> IGHG4 свиньи (SEQ ID NO: 43) GTKTKPPCPICPACEGPGPSAFIFPPKPKDTLMISRTPKVTCWVDVSQENPEVQFSWYV DGVEVHTAQTRPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLNGKEFKCKVNNKDLPAPITRIISKA KGQTREPQVYTLPPPTEELSRSKVTLTCLVTGFYPPDIDVEWQRNGQPEPEGNYRTTPPQ QDVDGTYFLYSKLAVDKASWQRGDTFQCAVMHEALHNHYTQKSIFKTPGK
> IGHG5 свиньи (SEQ ID NO: 44) GRPCPICPACEGPGPSAFIFPPKPKDTFMISRTPKVTCVWDVSQENPEVQFSWYVDGVE VHTAQTRPKEEQFNSTYRWSVLPIQHQDWLNGKEFKCKVNNKDLPAPITRIISKAKGQT REPQVYTLPPPTEELSRSKLSVTCLITGFYPPDIDVEWQRNGQPEPEGNYRTTPPQQDVD GTYFLYSKLAVDKASWQRGDPFQCAVMHEALHNHYTQKSIFKTPGN
Согласно определенным вариантам реализации полипептид, содержащий область СНЗ, представляет собой молекулу IgG и дополнительно содержит домены СН1 и СН2. Примеры последовательностей IgG человека включают константные области IgGl (например, SEQ ID N0:1), IgG2 (например, SEQ ID N0:2), IgG3 (например, SEQ ID N0:3) и IgG4(например, SEQ ID N0:4).
Fc-область также может входить в состав или происходить из константной области тяжелой цепи IgA (например, SEQ ID N0:5), IgD (например, SEQ ID N0:6), IgE (например, SEQ ID N0:7) и IgM (например, SEQ ID NO: 8).
Предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения включают, не ограничиваясь перечисленными, антитело, биспецифическое антитело, моноспецифическое моновалентное антитело, биспецифическое макситело (макситело относится к scFv-Fc) , монотело, пептитело, биспецифическое пептитело, моновалентное пептитело (пептид, соединенный с одним плечом гетеродимерной молекулы Fc) и гибридный белок рецептор-Fc.
Согласно некоторым вариантам реализации указанная стратегия может использоваться наряду с другими стратегиями для изменения взаимодействий доменов антитела, например, изменения СНЗ-домена для уменьшения или стимуляции способности указанного домена к взаимодействию с самим собой.
Если замены скоординированы надлежащим образом, изменения способствуют образованию дисульфидной связи между остатками контактной поверхности, которая стабилизует формирование гетеродимера.
Согласно определенным аспектам настоящего изобретения предложен способ получения гетеродимерного белка. Указанный гетеродимер может содержать первый СНЗ-содержащий полипептид и второй СНЗ-содержащий полипептид, которые при объединениие образуют контактную поверхность, сконструированную для стимуляции и стабилизации формирования гетеродимера. Указанные первый СНЗ-содержащий полипептид и второй СНЗ-содержащий полипептид сконструированы таким образом, что в состав контактной поверхности входят одна или большее количество аминокислот, содержащих сульфгидрильную группу, расположение которых обеспечивает образование дисульфидной связи между сульфгидрильной группой аминокислоты на первом СНЗ-содержащем гетеродимере и сульфгидрильной группой аминокислоты на втором СНЗ-содержащем гетеродимере.
Согласно определенным вариантам реализации СНЗ-содержащий полипептид содержит Fc-область IgG, предпочтительно происходящую из Fc-область IgG человека дикого типа. Под Fc IgG человека "дикого типа" понимается последовательность аминокислот, которая встречается в природе в популяции человека. Разумеется, как может незначительно варьировать последовательность Fc у разных индивидуумов, так же одно или несколько изменений может быть внесено в последовательность дикого типа; при этом она по-прежнему будет входить в объем настоящего изобретения. Например, Fc-область может включать дополнительные изменения, не связанные с настоящим изобретением, такие как мутация в сайте гликозилирования, включение не встречающейся в природе аминокислоты, мутации типа ""выступы-во-впадины" или мутации пар заряженных остатков.
Дополнительные мутации, которые могут быть внесены в Fc IgGl, включают облегчающие образование гетеродимера между Fc-содержащими полипептидами. Согласно некоторым вариантам реализации Fc-область сконструирована так, чтобы формировались "выступы" и "впадины", облегчающие образование гетеродимера двух разных Fc-содержащих полипептидных цепей при совместной экспрессии в клетке. Патент США 7 695963. Согласно другим вариантам реализации Fc-область изменяют с использованием
эффекта электростатического взаимодействия для стимуляции формирования гетеродимера наряду с предотвращением образования гомодимера двух разных Fc-содержащих полипептидов при совместной экспрессии в клетке. W0 09/089004, включенная в настоящий документ посредством ссылки полностью. Предпочтительные гетеродимерные Fc включают Fc, одна цепь которых включает замены D399K и Е356К, а другая цепь включает замены K409D и K392D. Согласно другим вариантам реализации одна цепь Fc включает замены D399K, Е356К и Е357К, а другая цепь Fc включает замены K409D, K392D и K370D.
Тяжелые цепи могут также содержать одну или большее
количество мутаций, влияющих на связывание антитела, содержащего
указанные тяжелые цепи, с одним или большим количеством Fc-
рецепторов. Одна из функций Fc- части антитела заключается в
коммуникации с иммунной системой при связывании антителом
мишени. Указанную коммуникацию называют "эффекторной функцией".
Коммуникация обуславливает антителозависимую клеточную
цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ) и/или комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ). АЗКЦ и АЗКФ опосредованы связыванием Fc с Fc-рецепторами на поверхности клеток иммунной системы. КЗЦ опосредована связыванием Fc с белками системы комплемента, например, Clq.
Подклассы IgG варьируют в отношении способности опосредовать эффекторные функции. Например, IgGl значительно превосходит IgG2 и IgG4 в отношении опосредования АЗКЦ и КЗЦ. Эффекторная функция антитела может быть увеличена или уменьшена путем введения в Fc одной или нескольких мутаций. Варианты реализации настоящего изобретения включают Fc-содержащие белки, например, антитела или гибридные Fc-белки, содержащие Fc, сконструированный для увеличения эффекторной функции (U.S. 7317091 и Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009; оба источника включены в настоящий документ посредством ссылки полностью). Примеры молекул Fc IgGl с повышенной эффекторной функцией включают (согласно системе нумерации Ей) содержащие следующие замены:
S239D/I332E
S239D/A330S/I332E
S239D/A330L/I332E
S2 98A/D333A/K334A
P247I/A339D
P247I/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F2 4 3L/R2 92P/Y3 0 0L/P3 9 6L
F2 4 3L/R2 92P/Y3 0 0L/V3 05I/P3 9 6L
G236A/S239D/I332E
К326А/ЕЗЗЗА
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K2 90E/S2 98G/T2 99A/K32 6E
K2 90N/S2 98G/T2 99A/K32 6E
K334V
L235S+S239D+K334V
Q311M+K334V
S239D+K334V
F243V+K334V
E294L+K334V
S298T+K334V
E2 33L+Q311M+K334V
L234I+Q311M+K334V
S298T+K334V
A330M+K334V
A330F+K334V
Q311М+АЗ 3 ОМ+КЗ 3 4 V
Q311М+АЗ 3 О F+K3 3 4V
S 2 9 8 Т+АЗ 3 ОМ+КЗ 3 4V
S298T+A330F+K334V
S 2 3 9D+A3 3 ОМ+КЗ 3 4V
S239D+S298T+K334V
L234Y+K290Y+Y296W L234Y+F243V+ Y296W L234Y+E294L+ Y296W L234Y + Y296W K290Y + Y296W
Дополнительные варианты реализации настоящего изобретения включают Fc-содержащие белки, например, антитела или гибридные Fc-белки, с Fc, сконструированным таким образом, чтобы понижать эффекторную функцию. Примеры молекул Fc с пониженной эффекторной функцией включают (при использовании системы нумерации Ей) содержащие следующие замены:
N297A или N297Q (IgGl)
L234A/L235A (IgGl)
V234A/G237A (IgG2)
L235A/G237A/E318A (IgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S (IgGl)
C22 6S/C22 9S/E2 33P/L2 34V/L2 35A (IgGl)
L234F/L235E/P331S (IgGl)
S267E/L328F (IgGl)
Другой способ повышения эффекторной функции содержащих Fc IgG белков заключается в уменьшении фукозилирования Fc. Удаление коровой фукозы из олигосахаридов типа биантенарных комплексов, присоединенных к Fc, значительно повышало эффекторную функцию АЗКЦ без изменения связывания антигена или эффекторной функции КЗЦ. Известен ряд способов уменьшения или предотвращения фукозилирования содержащих Fc молекул, например, антител. Они включают рекомбинантную экспрессию в определенных линиях клеток млекопитающих, в том числе линии клеток, с нокаутом FUT8, варианте линии клеток СНО Lecl3, линии клеток гибридомы крысы YB2/0, линии клеток, содержащей малые интерферирующие РНК, направленные конкретно против гена FUT8, и линии клеток, коэкспрессирующих |3-1,4-Л/"-ацетилглюкозаминилтрансферазу III и ос-маннозидазу II комплекса Гольджи. Как вариант, содержащая Fc молекула может экспрессироваться в не принадлежащей
млекопитающему клетке, такой как растительная, дрожжевая или прокариотическая клетка, например, Е. coli. Соответственно, согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит Fc, отличающийся пониженным фукозилированием или полностью нефукозилированный.
Известно, что IgGl человека содержит участок гликозилирования в положении N2 97 (система нумерации EU) , и гликозилирование вносит вклад в эффекторную функцию антител IgGl. Группы вводили мутации по остатку N297 с целью получения агликозилированных антител. Указанные мутации в основном относились к заменам N2 97 на аминокислоты, напоминающие аспарагин в физико-химическом отношении, например, на глутамин (N2 97Q) или на аланин (N2 97A), который имитирует аспарагины без полярных групп.
В настоящем документе "агликозилированное антитело", или "агликозилированный Fc" относится к статусу гликозилирования остатка в положении 2 97 в составе Fc. Антитело или другая молекула может быть гликозилировано(а) по одному или нескольким другим положениям, но, тем не менее, будет считаться агликозилированным антителом или агликозилированным гибридным Fc-белком.
В предварительной заявке на патент США сер. №. 61/784669, принадлежащей заявителям настоящей заявки, поданной 14 марта 2 013, полностью включенной в настоящий документ посредством ссылки, описан лишенный эффекторной функции Fc IgGl. Мутация аминокислоты N2 97 IgGl человека с заменой на глицин, т.е. N2 97G, обеспечивает значительно более эффективное очищение и лучшие биофизические свойства по сравнению с заменами указанного остатка на другие аминокислоты. Соответственно, согласно предпочтительным вариантам реализации антитело или гибридный Fc-белок содержит Fc IgGl человека с заменой N2 97G.
Агликозилированные содержащие Fc IgGl молекулы, как было показано, менее стабильны, чем гликозилированные содержащие Fc IgGl молекулы. Fc-область может также быть сконструирована таким образом, чтобы повышать стабильность агликозилированной молекулы. Согласно некоторым вариантам реализации одна или
большее количество аминокислот заменены на цистеин таким образом, чтобы формировались дисульфидные связи в димерном состоянии. Остатки V259, А287, R292, V302, L306, V323 или 1332 области СН2 могут быть заменены на цистеин. Согласно предпочтительным вариантам реализации специфические пары остатков заменены таким образом, что они преимущественно образуют дисульфидную связь друг с другом, таким образом ограничивая или предотвращая образование перекрестных дисульфидных связей. Предпочтительные пары включают, не ограничиваясь перечисленными, А287С и L306C, V259C и L306C, R292C и V302C, V323C и I332C.
В настоящем изобретении предложены Fc-содержащие молекулы, отличающиеся тем, что один или большее количество остатков V259, А287, R292, V302, L306, V323 или 1332 заменены на цистеин. Предпочтительные Fc-содержащие молекулы включают содержащие замены А287С и L306C, V259C и L306C, R292C и V302C, или V323C и I332C.
Представляющий интерес полипептид может быть присоединен к N-концу или С-концу Fc-области IgG для получения гибридного Fc-белка. Согласно определенным вариантам реализации указанный гибридный Fc-белок содержит линкер между Fc и представляющим интерес полипептидом. В данной области техники известно множество различных линкерных полипептидов, которые могут использоваться в контексте гибридного Fc-белка. Согласно предпочтительным вариантам реализации гибридный Fc-белок содержит одну или большее количество копий пептида, включающего GGGGS (SEQ ID N0: 45), GGNGT (SEQ ID NO: 46) или YGNGT (SEQ ID NO: 47) между Fc и представляющим интерес пептидом или полипептидом. Согласно некоторым вариантам реализации указанная область полипептида между Fc-областью и область представляющего интерес пептида или полипептида содержит одну копию GGGGS (SEQ ID N0: 45), GGNGT (SEQ ID NO: 46) или YGNGT (SEQ ID NO: 47). Линкеры GGNGT (SEQ ID NO: 4 6) или YGNGT (SEQ ID NO: 47) подвергаются гликозилированию при экспрессии в подходящих клетках; такое гликозилирование может помогать стабилизации белка в растворе и/или при введении in vivo. Соответственно,
согласно определенным вариантам реализации гибридный Fc-белок содержит гликозилированный линкер между Fc-областью и областью представляющего интерес белка.
В предварительной заявке на патент США 61/591161, поданной 1/26/12, принадлежащей заявителям настоящей заявки, и РСТ-заявке №PCT/US2013/023456, поданной 1/28/13 (обе заявки полностью включены в настоящий документ посредством ссылки), описаны гибридные белки GDF15-FC. Согласно определенным вариантам реализации настоящего изобретения полипептид содержит Fc-область антитела, из которой удалены или в которой заменены один или большее количество цистеинов шарнирной области, и одна или большее количество аминокислот контактной поверхности СНЗ заменены на содержащий остаток с сульфгидрильной группой, предпочтительно цистеин, при этом указанный полипептид не является гибридом Fc и GDF15. В частности, полипептид содержит Fc-область антитела, из которой удалены или в которой заменены один или большее количество цистеинов шарнирной области, и одна или большее количество аминокислот контактной поверхности СНЗ заменены на содержащий остаток с сульфгидрильной группой , предпочтительно цистеин, при этом указанный полипептид не является гибридным белком Fc с GDF15 согласно описанию в РСТ-заявке №PCT/US2013/023456, например, как гибридные GDFlS-белки, содержащие:
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPP SRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID N0: 48);
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 49) ;
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTCPP SRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRW OQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTG
VSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 50) ;
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTCPPSRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL KSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPG RCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 51);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTCPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVL DSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 52) ;
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 53) ;
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVLDSDGSFFLYSDLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 54);
APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPGRCCRLHTVRASLEDLGWAD WVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAPCCVPASYNPMVLIQKTDTG VSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 55);
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVYTLPPCRKEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL KSDGSFFLYSKLTVDKSRWOOGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGARNGDHCPLGPG RCCRLHTVRASLEDLGWADWVLSPREVQVTMCIGACPSQFRAANMHAQIKTSLHRLKPDTVPAP CCVPASYNPMVLIQKTDTGVSLQTYDDLLAKDCHCI (SEQ ID NO: 56); или
MEWSWVFLFFLSVTTGVHSAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEK TISKAKGQPREPQVCTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYDTTPPVL DSDGSFFLYSDLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:
Полинуклеотиды, кодирующие антитела и гибридные Fc-белки
Настоящим изобретением охвачены нуклеиновые кислоты, кодирующие тяжелые цепи антитела и гибридные Fc-белки. Аспекты настоящего изобретения включают варианты полинуклеотидов {например, обусловленные вырожденностью), которые кодируют описанные в настоящем документе последовательности аминокислот.
Последовательности нуклеотидов, соответствующие описанным в
настоящем документе последовательностям аминокислот, для
применения в качестве зондов или праймеров для выделения
нуклеиновых кислот, или в качестве запрашиваемых
последовательностей для поиска в базах данных, могут быть получены путем "обратной трансляции" последовательностей аминокислот. Хорошо известная процедура полимеразной цепной реакции (ПЦР) может быть применена для выделения и амплификации последовательности ДНК, кодирующей тяжелые цепи антитела и гибридные Fc-белки. Олигонуклеотиды, определяющие требуемые концы комбинации фрагментов ДНК, используют в качестве 5'- и 3'-праймеров. Указанные олигонуклеотиды могут дополнительно содержать сайты распознавания рестрикционными эндонуклеазами для облегчения встраивания амплифицированной комбинации фрагментов ДНК в экспрессионный вектор. Техники ПЦР описаны в источниках: Saiki et al. , Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; и PGR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990).
Молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему
изобретению включают ДНК и РНК как в одноцепочечной, так и в
двуцепочечной форме, а также соответствующие комплементарные
последовательности. "Выделенная нуклеиновая кислота"
представляет собой нуклеиновую кислоту, отделенную от соседних генетических последовательностей, присутствующих в геноме организма, из которого была выделена указанная нуклеиновая кислота, в случае нуклеиновых кислот, выделенных из встречающихся в природе источников. Понятно, что в тех случаях, когда нуклеиновые кислоты синтезированы ферментативным способом
на матрице или химическим путем, например, продукты ПЦР, молекулы кДНК или олигонуклеотиды, они представляют собой выделенные нуклеиновые кислоты. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты в виде отдельного фрагмента или в виде компонента конструкции нуклеиновой кислоты большего размера. Согласно одному предпочтительному варианту реализации нуклеиновые кислоты по существу не содержат загрязняющего эндогенного материала. Молекула нуклеиновой кислоты предпочтительно происходит из ДНК или РНК, выделенной по меньшей мере однократно в по существу чистом виде и в количестве или в концентрации, позволяющей проведение идентификации, манипуляций и восстановления последовательности составляющих ее нуклеотидов при помощи стандартных биохимических методов (таких как изложенные в руководстве Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) . Такие последовательности предпочтительно представлены и/или сконструированы в форме открытой рамки считывания, не прерываемой внутренними нетранслируемыми последовательностями, или интронами, которые, как правило, присутствуют в эукариотических генах. Последовательности нетранслируемой ДНК могут присутствовать в направлении 5' или 3' от открытой рамки считывания, где они не мешают манипуляциям с кодирующей областью или ее экспрессии.
Варианты, предложенные в настоящем изобретении, обычно получают путем сайт-специфического мутагенеза нуклеотидов в ДНК, кодирующей тяжелую цепь или гибридный Fc-белок, с применением кассетного или ПЦР-мутагенеза, или других техник, хорошо известных в данной области техники, для получения ДНК, кодирующей указанный вариант, и последующей экспрессии рекомбинантной ДНК в культуре клеток согласно описанию в настоящем документе. Однако содержащие тяжелые цепи и гибридные Fc-белки могут быть получены и путем синтеза in vitro с применением общепринятых техник. Указанные варианты, как правило, проявляют такую же в качественном отношении биологическую активность, что и встречающийся в природе аналог,
хотя могут также выбраны варианты, обладающие модифицированными характеристиками, как будет более подробно изложено далее.
Как будет ясно специалистам в данной области техники, ввиду вырожденности генетического кода может быть получено очень большое число нуклеиновых кислот, все из которых кодируют тяжелые цепи и гибридные Fc-белки согласно настоящему изобретению. Соответственно, идентифицировав конкретную последовательность аминокислот, специалисты в данной области техники смогут получить любое число различных нуклеиновых кислот, путем простой модификации последовательности одного или большего количества кодонов способом, который не изменяет последовательность аминокислот кодируемого белка.
В настоящем изобретении также предложены экспрессионные системы и конструкций в форме плазмид, экспрессионных векторов, транскрипционных или экспрессионных кассет, которые содержат по меньшей мере один полинуклеотид согласно описанию выше. Кроме того, в настоящем изобретении предложены клетки-хозяева, содержащие такие экспрессионные системы или конструкции.
Как правило, экспрессионные векторы, используемые в любых
клетках-хозяевах, содержат последовательности для поддержания
плазмиды, и для клонирования и экспрессии экзогенных
последовательностей нуклеотидов. Такие последовательности, в
совокупности называемые "фланкирующими последовательностями",
согласно определенным вариантам реализации, как правило,
включают один или большее количество следующих
последовательностей нуклеотидов: промотор, одна или большее количество энхансерных последовательностей, точка начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полную интронную последовательность, содержащую донорный и акцепторный участки сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, участок связывания рибосомы, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для встраивания нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который необходимо экспрессировать, и селектируемый маркерный элемент. Каждая из указанных последовательностей описана ниже.
Вектор необязательно может включать кодирующую "метку" последовательность, т.е. молекулу олигонуклеотида, расположенную 5'- или 3'-конце кодирующей тяжелую цепь или гибридный Fc-белок последовательности; указанная последовательность олигонуклеотида кодирует поли-His (например, гекса-His (SEQ ID N0: 58)), или другую "метку", например, FLAG, НА (гемагглютинин вируса гриппа) или туе, для которых существуют коммерчески доступные антитела. Указанную метку, как правило, присоединяют к полипептиду в ходе экспрессии указанного полипептида, и она может служить для аффинной очистки или детекции белка из клетки-хозяина. Аффинную очистку можно осуществлять, например, посредством колоночной хроматографии с применением антител против метки в качестве аффинной матрицы. Необязательно, указанную метку можно впоследствии удалять из очищенной(ого) тяжелой цепи или гибридных Fc-белков различными способами, например, расщеплением с помощью определенных пептидаз.
Фланкирующие последовательности могут быть гомологичными
(т.е. принадлежать тому же виду и/или штамму/линии, что и
клетка-хозяин), гетерологичными (т.е. принадлежать виду,
отличному от вида или штамма/линии клетки-хозяина), гибридными
(т.е. представлять собой комбинацию фланкирующих
последовательностей более чем из одного источника),
синтетическими или нативными. Таким образом, источником
фланкирующей последовательности может быть любой
прокариотический или эукариотический организм, любой позвоночный или беспозвоночный организм, или любое растение, при условии, что фланкирующая последовательность функциональна в клетке-хозяине и может быть активирована за счет имеющихся у клетки-хозяина механизмов.
Фланкирующие последовательности, подходящие для применения в векторах согласно настоящему изобретению, могут быть получены любыми из ряда способов, хорошо известных в данной области техники. Как правило, фланкирующие последовательности, подходящие для применения согласно настоящему изобретению, ранее были идентифицированы путем картирования и/или расщепления рестрикционными эндонуклеазами и, соответственно, могут быть
выделены из подходящего тканевого источника с применением подходящих рестрикционных эндонуклеаз. В некоторых случаях может быть известна полная последовательность нуклеотидов фланкирующей последовательности. Для целей настоящего изобретения фланкирующая последовательность может быть синтезирована с применением описанных в настоящем документе способов синтеза или клонирования нуклеиновых кислот.
Независимо от того, известна ли вся фланкирующая последовательность или только ее часть, она может быть получена с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и/или путем скрининга геномной библиотеки с применением подходящего зонда, например, фрагмента олигонуклеотида и/или фланкирующей последовательности из того же или другого вида. Если фланкирующая последовательность неизвестна, фрагмент ДНК, содержащий фланкирующую последовательность, может быть выделен из большего фрагмента ДНК, который может содержать, например, кодирующую последовательность или даже другой ген или гены. Выделение можно осуществлять путем расщепления рестрикционной эндонуклеазой с получением требуемого фрагмента ДНК и последующим выделением посредством очищения хроматографией в агарозном геле на колонке Qiagen(r) (Чатсворт, Калифорния) , или с применением других способов, известных специалисту в данной области техники. Выбор подходящих ферментов для достижения указанной цели будет очевиден для специалиста в данной области техники.
Участок начала репликации, как правило, входит в состав прокариотических экспрессионных векторов из коммерческих источников; указанный участок начала репликации способствует амплификации вектора в клетке-хозяине. Если выбранный вектор не содержит сайта начала репликации, последний может быть химически синтезирован на основе известной последовательности и лигирован в вектор. Например, начало репликации из плазмиды pBR322 (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) подходит для большинства грамотрицательных бактерий, а различные вирусные сайты начала репликации {например, SV4 0, полиомавируса, аденовируса, вируса везикулярного стоматита (ВВС), или папилломавирусов, таких как
ВПЧ или ВПБ) подходят для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно компонент начала репликации для экспрессионных векторов млекопитающих не требуется (например, участок начала репликации SV4 0 часто используется исключительно постольку, поскольку также содержит ранний вирусный промотор).
Последовательность терминации транскрипции, как правило,
расположена в направлении 3' от конца кодирующей области
полипептида и служит для терминации транскрипции. Обычно
последовательность терминации транскрипции в прокариотических
клетках представляет собой богатый G-C фрагмент, за которым
следует последовательность поли-Т. Хотя указанная
последовательность может легко быть клонирована из библиотеки или даже приобретена из коммерческого источника в виде части вектора, ее также можно легко синтезировать с применением способов синтеза нуклеиновых кислот, таких как описанные в настоящем документе.
Селектируемый маркерный ген кодирует белок, необходимый для выживания и роста клетки-хозяина, культивируемой на селективной культуральной среде. Типичные селективные маркерные гены кодируют белки, которые (а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, тетрациклину или канамицину для прокариотических клеток-хозяев; (Ь) восполняют ауксотрофную недостаточность клетки; или (с) обеспечивают важнейшие питательные вещества, отсутствующие в комплексной среде или среде определенного состава. Специфические селектируемые маркеры представлены геном устойчивости к канамицину, геном устойчивости к ампициллину и геном устойчивости к тетрациклину. Ген устойчивости к неомицину также может быть успешно использован для отбора как прокариотических, так и эукариотических клеток-хозяев.
Другие селектируемые гены могут быть использованы для
амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация
представляет собой процесс, при котором гены, которые требуются
для получения белка, критически важного для роста или выживания
клетки, тандемно повторяются в составе хромосом последовательных
поколений рекомбинантных клеток. Примеры подходящих
селектируемых маркеров для клеток млекопитающих включают ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР) и беспромоторный ген тимидинкиназы. Клетки-трансформанты млекопитающих подвергают селективному давлению, при котором только трансформанты уникальным образом адаптированы для выживания за счет селектируемого гена, присутствующего в векторе. Давление отбора реализуют путем культивирования трансформированных клеток в условиях, когда концентрация селективного агента в среде последовательно повышается, что приводит к амплификации и селектируемого гена, и ДНК, которая кодирует другой ген, например, тяжелую цепь антитела или гибридный Fc-белок. В результате увеличения количества полипептида, например, тяжелой цепи или гибридного Fc-белка, синтезируют из амплифицированной ДНК.
Участок связывания рибосомы обычно необходим для инициации
трансляции мРНК и характеризуется последовательностью Шайна-
Дальгарно (прокариоты) или последовательностью Козак
(эукариоты). Указанный элемент, как правило, расположен в
направлении 3' от промотора и в направлении 5' от
последовательности полипептида, который требуется
экспрессировать. Согласно определенным вариантам реализации одна или большее количество кодирующих областей могут быть функционально связаны с внутренним сайтом связывания рибосомы
(IRES), обеспечивая трансляцию двух открытых рамок считывания с одного РНК-транскрипта.
В некоторых случаях, например, если в экспрессионной системе для эукариотической клетки-хозяина требуется гликозилирование, могут быть проведены манипуляции с различными предпоследовательностями или пропоследовательностями для повышения гликозилирования или выхода. Например, можно изменить участок расщепления пептидазой конкретного сигнального пептида, или добавить пропоследовательности, которые также могут влиять на гликозилирование. Конечный белковый продукт может содержать в положении -1 (относительно первой аминокислоты зрелого белка) одну или большее количество дополнительных аминокислот, связанных с экспрессией, которые не обязательно полностью удалены. Например, конечный белковый продукт может содержать
один или два остатка аминокислот, обнаруживаемых в сайте расщепления пептидазой, присоединенных к аминоконцу. Как вариант, применение некоторых сайтов расщепления ферментами может приводить к получению незначительно усеченной формы требуемого полипептида, если расщепление ферментом происходит в такой области зрелого полипептида.
Экспрессионные и клонирующие векторы согласно настоящему изобретению, как правило, содержат промотор, распознаваемый организмом-хозяином и функционально связанный с молекулой, кодирующей тяжелую цепь или гибридный Fc-белок. Промоторы представляют собой нетранскрибируемые последовательности, расположенные выше (т.е. в направлении 5') относительно стартового кодона структурного гена (обычно в пределах приблизительно 100-1000 п.о.), контролирующие транскрипцию структурного гена. Промоторы обычно относят к одному из двух классов: индуцируемые промоторы и конститутивные промоторы. Индуцируемые промоторы инициируют повышение уровней транскрипции ДНК, находящейся под их контролем, в ответ на некоторые изменения условий культивирования, например, присутствие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Конститутивные промоторы, с другой стороны, постоянно транскрибируют ген, с которым они функционально связаны, то есть в незначительной степени контролируют или не контролируют экспрессию гена. Хорошо известно значительное число промоторов, распознаваемых различными потенциальными клетками-хозяевами.
Подходящие промоторы для применения у хозяев-дрожжей также хорошо известны в данной области техники. Целесообразно использование дрожжевых энхансеров с дрожжевыми промоторами. Подходящие промоторы для применения у клеток-хозяев млекопитающих хорошо известны и включают, не ограничиваясь перечисленными, полученные из геномов вирусов, таких как полиомавирус, вирус оспы кур, аденовирус (например, аденовирус 2), вирус папилломы крупного рогатого скота, вирус саркомы птиц, цитомегаловирус, ретровирусы, вирус гепатита В и, предпочтительно, вирус обезьян 40 (SV40). Другие подходящие промоторы млекопитающих включают гетерологичные промоторы
млекопитающих, например, промоторы генов теплового шока и промотор гена актина.
Дополнительные промоторы, которые могут представлять
интерес, включают, не ограничиваясь перечисленными: ранний
промотор SV40 (Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310);
промотор ЦМВ (Thornsen et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A.
81:659-663); промотор, содержащийся в длинном 3'-концевом
повторе вируса саркомы Рауса (Yamamoto et al., 1980, Cell
22:787-797); промотор тимидинкиназы вируса герпеса (Wagner et
al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445);
промоторные и регуляторные последовательности гена
металлотионеина Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); и
прокариотические промоторы, такие как бета-лактамазный промотор
(Villa-Kamaroff et al. , 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
75:3727-3731); или промотор tac (DeBoer et al. , 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25). Также представляют интерес
следующие области контроля транскрипции животных,
демонстрирующие тканеспецифичность и использовавшиеся у трансгенных животных: контрольная область гена эластазы I, активная в ацинарных клетках поджелудочной железы (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al. , 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); контрольная область гена инсулина, активная в бета-клетках поджелудочной железы (Hanahan, 1985, Nature 315:115122); контрольная область гена иммуноглобулина, активная в лимфоидных клетках (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:143 6-1444); контрольная область вируса опухоли молочной железы мышей, активная в клетках яичек, молочной железы, лимфоидных и тучных клетках (Leder et al. , 1986, Cell 45:485-495); контрольная область гена альбумина, активная в печени (Pinkert et al. , 1987, Genes and Devel. 1 :268-27б); контрольная область гена альфа-фетопротеина, активная в печени (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al. , 1987, Science 253:53-58); контрольная область гена альфа-1-антитрипсина, активная в печени (Kelsey et al. ,
1987, Genes and Devel. 1:161-171); контрольная область гена бета-глобина, активная в миелоидных клетках (Mogram et al. , 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al. , 1986, Cell 46:89-94); контрольная область гена основного белка миелина, активная в олигодендроцитах головного мозга (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712); контрольная область гена легкой цепи-2 миозина, активная в скелетных мышцах (Sani, 1985, Nature 314:283-286); и контрольная область гена гонадотропного рилизинг-гормона, активная в гипоталамусе (Mason et al. , 1986, Science 234:13721378).
В вектор может быть встроена энхансерная последовательность
для усиления транскрипции у высших эукариот. Энхансеры
представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно имеющие
длину приблизительно 10-3 0 0 п.о., воздействующие на промотор с
усилением транскрипции. Энхансеры являются относительно
независимыми от ориентации и расположения, поскольку
обнаруживались как в направлении 5', так и в направлении 3'
относительно транскрипционной единицы. Известен ряд доступных
энхансерных последовательностей из генов млекопитающих
{например, глобина, эластазы, альбумина, альфа-фетопротеина и
инсулина). Однако, как правило, используют вирусный энхансер.
Энхансер SV4 0, энхансер раннего промотора цитомегаловируса,
энхансер полиомы и энхансеры аденовирусов, известные в данной
области техники, представляют собой примеры энхансерных
элементов для активации эукариотических промоторов. Хотя
энхансер может располагаться в векторе либо в направлении 5',
либо в направлении 3' относительно кодирующей
последовательности, он, как правило расположен на участке в
направлении 5' от промотора. Последовательность, кодирующая
подходящую нативную или гетерологичную сигнальную
последовательность (лидерную последовательность или сигнальный пептид) может быть встроена в экспрессионный вектор для содействия внеклеточной секреции антитела или гибридного Fc-белка. Выбор сигнального пептида или лидера зависит от типа клеток-хозяев, где будет продуцироваться белок, и гетерологичная сигнальная последовательность может замещать нативную сигнальную
последовательность. Примеры сигнальных пептидов, функциональных в клетках-хозяевах млекопитающих, включают следующие: сигнальная последовательность для интерлейкина-7 (IL-7), описанная в патенте США №4965195; сигнальная последовательность для рецептора интерлейкина-2, описанная в Cosman et al.,1984, Nature 312:768; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-4, описанный в европейском патенте №0367566; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа I, описанный в патенте США №4 9 68 607; сигнальный пептид рецептора интерлейкина-1 типа II, описанный в европейском патенте №0460846.
Указанный вектор может содержать один или большее количество элементов, облегчающих экспрессию при встраивании вектора в геном клетки-хозяина. Примеры включают элемент EASE (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) и область прикрепления к матриксу (MAR). Области MAR опосредуют структурную организацию хроматина и могут изолировать встроенный вектор, предохраняя его от эффекта "положения". Соответственно, MAR подходят для применения, в частности, когда вектор используется для получения стабильных трансфектантов. В данной области техники известен ряд природных и синтетических содержащих MAR нуклеиновых кислот, см., например, патенты США №№ 6239328; 7326567; 6177612; 6388066; 6245974; 7259010; 6037525; 7422874; 7129062.
Экспрессионные векторы согласно настоящему изобретению
могут быть сконструированы из исходного вектора, например,
коммерчески доступного вектора. Такие векторы могут содержать
или не содержать все требуемые фланкирующие последовательности.
Если одна или большее количество фланкирующих
последовательностей, согласно описанию в настоящем документе, изначально не присутствуют в векторе, они могут быть получены индивидуально и лигированы в вектор. Способы, применяемые для получения каждой из фланкирующих последовательностей, хорошо известны специалисту в данной области техники.
После того, как вектор сконструирован и молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая тяжелую цепь или гибридный Fc-белок, встроена в надлежащий участок вектора, готовый вектор
может быть встроен в подходящую клетку-хозяина для амплификации и/или экспрессии полипептида. Трансформация экспрессионным вектором выбранной клетки-хозяина может быть осуществлена хорошо известными способами, включая трансфекцию, инфекцию, соосаждение с фосфатом кальция, электропорацию, микроинъекцию, липофекцию, опосредованную ДЭАЭ-декстраном трансфекцию или другие известные техники. Выбранный способ отчасти зависит от типа клетки-хозяина, которую предполагается использовать. Указанные способы и другие подходящие способы хорошо известны специалистам в данной области техники, и представлены, например, у Sambrook et al. , 2 001, выше.
Клетка-хозяин при культивировании в подходящих условиях синтезирует тяжелую цепь или гибридный Fc-белок, который(ая) затем может быть собран(а) из культуральной среды (если клетка-хозяин секретирует его в среду) или получен непосредственно из продуцирующей его клетки-хозяина (если он не секретируется) . Выбор подходящей клетки-хозяина зависит от различных факторов, таких как требуемые уровни экспрессии, модификации полипептида, желательные или необходимые для активности (например, гликозилирование или фосфорилирование) и простоты укладки в биологически активную молекулу. Клетка-хозяин может быть эукариотической или прокариотической.
Доступные линии клеток млекопитающих для применения в качестве хозяев для экспрессии хорошо известны в данной области техники и включают, не ограничиваясь перечисленными, иммортализованные линии клеток, доступные в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, АТСС); любые линии клеток, используемые в экспрессионных системах, известных в данной области техники, можно применять для получения рекомбинантных полипептидов согласно настоящему изобретению. В общих чертах, клетки-хозяева трансформируют рекомбинантным экспрессионным вектором, который содержит ДНК, кодирующую нужную тяжелую цепь или Fc-гибрид. Подходящие клетки-хозяева включают прокариотические клетки, дрожжи или клетки высших эукариот. Прокариоты включают грамотрицательные или грамположительные организмы, например, Е. coll или бациллы.
Клетки высших эукариот включают клетки насекомых и устойчивые клеточные линии, происходящие из млекопитающих. Примеры подходящих линий клеток-хозяев млекопитающих включают линию клеток C0S-7 почки обезьяны (АТСС CRL 1651) (Gluzman et al. , 1981, Cell 23:175), клетки L, клетки 293, клетки С127, клетки ЗТЗ (АТСС CCL 163), клетки яичника китайского хомячка (СНО) или их производные, такие как Veggie СНО и родственные линии клеток, растущие на бессывороточной среде (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), клетки HeLa, линии клеток ВНК (АТСС CRL 10) и линия клеток CVI/EBNA, происходящая из линии клеток CVI почки африканской зеленой мартышки (АТСС CCL 70), описанная в McMahan et al. , 1991, EMBO J. 10: 2 821, эмбриональные клетки почки человека, такие как 2 93, 2 93 EBNA или MSR 2 93, эпидермальные клетки А431 человека, клетки Со1о205 человека, другие линии трансформированных клеток приматов, нормальные диплоидные клетки, линии клеток, происходящие из in vitro культуры первичной ткани, первичные эксплантаты, клетки HL-60, U937, НаК или Jurkat. Необязательно, для экспрессии полипептида можно использовать такие клеточные линии млекопитающих, как, например, HepG2/3B, KB, NIH ЗТЗ или S49, если предполагается применение полипептида в анализе передачи сигналов или репортерных генов.
Как вариант, возможно получение полипептида у низших эукариот, таких как дрожжи, или у прокариот, таких как бактерии. Подходящие дрожжи включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, штаммы Kluyveromyces, Candida или любой дрожжевой штамм, способный экспрессировать гетерологичные полипептиды. Подходящие бактериальные штаммы включают Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium или любой бактериальный штамм, способный экспрессировать гетерологичные полипептиды. В том случае, когда полипептид получают в дрожжах или в бактериях, может быть целесообразным модифицировать продуцируемый полипептид, например, путем фосфорилирования или гликозилирования подходящих сайтов, для получения функционального полипептида. Такие ковалентные присоединения можно проводить с применением известных химических
или ферментативных способов.
Полипептид может также быть получен путем функционального связывания выделенной нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению с подходящими контрольными последовательностями в одном или нескольких экспрессионных векторах насекомых, и применения экспрессионной системы для насекомых. Материалы и методы для применения экспрессионных систем на основе бакуловирусов/клеток насекомых коммерчески доступны в виде наборов, например, от Invitrogen, Сан-Диего, Калифорния, США (набор МахВас(r)) ; такие способы хорошо известны в данной области техники, согласно описанию у Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), и Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) . Также для получения полипептидов с применением РНК, происходящих из описанных в настоящем документе конструкций нуклеиновых кислот, можно использовать бесклеточные системы трансляции. Подходящие клонирующие и экспрессионные векторы для применения в бактериальных, грибных, дрожжевых клетках-хозяевах, а также клетках-хозяевах млекопитающих, описаны Pouwels et al. {Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) . Клетка-хозяин, которая содержит выделенную нуклеиновую кислоту согласно настоящему изобретению, предпочтительно функционально связанную с по меньшей мере одной последовательностью контроля экспрессии, представляет собой "рекомбинантную клетку-хозяина". ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
Улучшенная стабильность и пониженная агрегация, свойственные полипептидам согласно настоящему изобретению, в частности, делает их подходящими для применения в фармацевтических композициях. Такие композиции содержат один или большее число дополнительных компонентов таких как физиологически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель. Необязательно, указанная композиция дополнительно содержит один или большее количество физиологически активных агентов, например, согласно описанию ниже. Согласно различным конкретным вариантам реализации указанная композиция содержит
один, два, три, четыре, пять или шесть физиологически активных агентов помимо одного или большего количества антител и/или гибридных Fc-белков, предложенных в настоящем изобретении.
Согласно одному варианту реализации указанная
фармацевтическая композиция содержит антитело и/или гибридный Fc-белок согласно настоящему изобретению наряду с одним или большим количеством веществ, выбранных из группы, состоящей из буфера, антиоксиданта, например, аскорбиновой кислоты, низкомолекулярного полипептида (например, содержащего менее 10 аминокислот) , белка, аминокислоты, углевода, такого как глюкоза, сахароза или декстрины, хелатирующего агента, такого как EDTA, глутатиона, стабилизатора и вспомогательного вещества. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор в смеси с конспецифичным сывороточным альбумином представляют собой примеры подходящих разбавителей. В соответствии с надлежащими промышленными стандартами можно также добавлять консерванты, такие как бензиловый спирт. Композиция может быть получена в виде лиофилизата с применением подходящих растворов вспомогательных веществ (например, сахарозы) в качестве разбавителей. Подходящие компоненты нетоксичны для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях. Дополнительные примеры компонентов, подходящих для применения в фармацевтических составах, приведены в руководстве: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed. (1980), 20th Ed. (2000), Mack Publishing Company, Easton, PA.
Предложены наборы для применения практикующими медицинскими специалистами, включающие одно или большее количество антител и/или гибридных Fc-белков согласно настоящему изобретению, и этикетку или другие инструкции для применения при лечении любых из обсуждаемых в настоящем документе состояний. Согласно одному варианту реализации набор включает стерильный состав с одним или большим количеством антител и/или гибридных Fc-белков, который может быть представлен в виде композиции согласно описанию выше и может размещаться в одном или нескольких сосудах.
Дозировки и частота введения могут варьировать в зависимости от таких факторов, как способ введения,
конкретное(ый) применяемое(ый) антитело и/или гибридный Fc-белок, природа и тяжесть подлежащего лечению заболевания, того, является ли состояние острым или хроническим, размеров и общего состояния субъекта. Подходящие дозировки могут быть определены при помощи процедур, известных в соответствующей области техники, например, в ходе клинических испытаний, которые могут включать исследования с эскалацией дозы.
Антитело и/или гибридный Fc-белок согласно настоящему изобретению можно вводить, например, однократно или более чем однократно, например, через регулярные интервалы на протяжении периода времени. Согласно конкретным вариантам реализации антитело и/или гибридный Fc-белок вводят по меньшей мере однократно на протяжении периода продолжительностью один месяц или более, например, на протяжении одного, двух или трех месяцев, или даже в течение неопределенно долгого периода. При лечении хронических состояний обычно наиболее эффективно долгосрочное лечение. Однако при лечении острых состояний введение на протяжении менее продолжительных периодов, например, от одной до шести недель, может быть достаточным. В общих чертах, антитело и/или гибридный Fc-белок вводят до проявления у пациента медицински значимой степени улучшения относительно исходного выбранного показателя или показателей.
Как известно в соответствующей области техники, фармацевтические композиции, содержащие антитело и/или гибридный Fc-белок согласно настоящему изобретению, вводят субъекту способом, подходящим при имеющихся показаниях. Фармацевтические композиции могжно вводить с применением любой подходящей техники, в том числе, но не ограничиваясь перечисленным, парентерально, местно или путем ингаляции. При инъецировании фармацевтическую композицию можно вводить, например, внутрисуставно, внутривенно, внутримышечно, внутрь очага поражения, внутрибрюшинно или подкожно, в виде болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Предусмотрено локальное введение, например, в участок, пораженный заболеванием или повреждением, а также трансдермальная доставка и замедленное высвобождение из имплантатов. Доставка посредством ингаляции включает, например,
назальную или пероральную ингаляцию, применение небулайзера, ингаляционные антитела и/или гибридный Fc-белок в форме аэрозоля и т.п. Другие альтернативы включают составы для перорального приема, в том числе таблетки, сиропы или пастилки. ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Если в настоящем документе не указано иное, научные и
технические термины, используемые в отношении настоящего
изобретения, имеют значения, обычно подразумеваемые
специалистами в данной области техники. Кроме того, если иное не продиктовано контекстом, термины в единственном числе включают и множественное число, а термины во множественном числе включают и единственное число. Обычно системы номенклатуры, используемые применительно к культивированию клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетике и химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, описанных в настоящем документе, и применительно к соответствующим техникам, хорошо известны и являются общеупотребительными в соответствующей области техники. Способы и техники, предложенные в настоящем изобретении, обычно реализуют в соответствии со стандартными способами, хорошо известными в данной области техники и описанными в различных общих и более специализированных источниках, цитируемых и обсуждаемых в различных разделах настоящего описания, если не указано иное. См., например, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), и Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990), которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Ферментативные реакции и техники очищения реализуют в соответствии с инструкциями производителя, как принято в данной области техники или согласно описанию в настоящем документе. Терминология, используемая применительно к аналитической химии, синтетической органической химии, и медицинской и фармацевтической химии, и соответствующие лабораторные процедуры и техники, описанные в настоящем
документе, хорошо известны и являются общеупотребительными в данной области техники. Для химического синтеза, химического анализа, разработки, получения и доставки фармацевтических составов и лечения пациентов можно применять стандартные техники.
Приведенные ниже термины, если не указано иное, подразумевают следующие значения. Термин "выделенная молекула" (где молекула представляет собой, например, полипептид, полинуклеотид или антитело) представляет собой молекулу, которая в силу своего происхождения или источника происхождения (1) не связана с естественным образом ассоциированными с ней компонентами, сопровождающими ее в естественном состоянии, (2) по существу не содержит других молекул, происходящих из того же вида (3) экспрессируется клеткой другого вида или (4) не встречается в природе. Соответственно, молекула, которая была химически синтезирована или экспрессирована в клеточной системе, отличной от клетки, из которой она естественным образом происходит, является "выделенной" в отношении естественным образом ассоциированных с ней компонентов. Молекула также может быть по существу освобождена от естественным образом ассоциированных с ней компонентов путем выделения с применением техник очищения, хорошо известных в данной области техники. Чистота или гомогенность молекулы может быть проанализирована с применением ряда способов, хорошо известных в данной области техники. Например, чистота образца полипептида может быть проанализирована с применением электрофореза в полиакриламидном геле и окрашивания геля для визуализации полипептида с применением техник, хорошо известных в данной области техники. Для определенных целей можно обеспечивать большее разрешение с применением ВЭЖХ или других способов очищения, хорошо известных в данной области техники.
Полинуклеотидные и полипептидные последовательности обозначают с применением стандартных однобуквенных или трехбуквенных аббревиатур. Если не указано иное, аминоконец полипептидных последовательностей находится слева, а карбоксильный конец - справа, и 5'-конец одноцепочечных
последовательностей нуклеиновой кислоты и верхней цепи двуцепочечных последовательностей нуклеиновой кислоты находится слева, а 3'-конец - справа. Конкретная полипептидная или полинуклеотидная последовательность также может быть описана путем описания ее отличий от референсной последовательности.
Термины "пептид", "полипептид" и "белок" относятся к молекуле, содержащей две или большее количество остатков аминокислот, соединенных между собой пептидными связями. Указанные термины охватывают, например, нативные и искусственные белки, фрагменты белков и аналоги полипептидов (такие как мутеины, варианты белков и гибридные белки) белковой последовательности, а также посттрансляционно или иным образом ковалентно или нековалентно модифицированные белки. Пептид, полипептид или белок может быть мономерным или полимерным.
Термин "фрагмент полипептида" в настоящем документе относится к полипептиду с делецией на аминоконце и/или карбоксильном конце по сравнению с соответствующим полноразмерным белком. Длина фрагментов может составлять, например, по меньшей мере 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 50, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350 или 400 аминокислот. Длина фрагментов может составлять также, например, максимум 1000, 750, 500, 250, 200, 175, 150, 125, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 14, 13, 12, 11 или 10 аминокислот. Фрагмент может также содержать на одном или на обоих концах одну или большее количество дополнительных аминокислот, например, последовательность аминокислот из другого встречающегося в природе белка или искусственной последовательности аминокислот.
Полипептиды согласно настоящему изобретению включают полипептиды, которые были модифицированы любым способом и с любой целью, например, для: (1) снижения восприимчивости к протеолизу, (2) уменьшения восприимчивости к окислению, (3) изменения сродства к связыванию для образования белковых комплексов, (4) изменения сродства к связыванию и (4) придания или модификации других физико-химических или функциональных свойств. Аналоги включают мутеины полипептида. Например, одна или несколько замен аминокислот (например, консервативных замен
аминокислот) могут быть введены во встречающуюся в природе последовательность (например, в часть полипептида, расположенную вне домена(ов), образующего(их) межмолекулярные контакты). "Консервативная замены аминокислоты" представляет собой замену, по существу не изменяющую структурные характеристики исходной последовательности (например, заменяющая аминокислота не проявляет тенденции к разрушению спирали, возникающей в исходной последовательности, или разрушению других типов вторичной структуры, характерные для исходной последовательности или необходимые для ее функционирования). Примеры известных в данной области техники вторичных и третичных структур полипептидов описаны в источниках: Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); и Thornton et al. Nature 354:105 (1991), все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
"Вариант" полипептида включает последовательность
аминокислот, в которую были встроены, из которой были удалены и/или в которой были заменены один или большее количество остатков аминокислот относительно другой последовательности полипептидов. Варианты согласно настоящему изобретению включают содержащие варианты доменов СН2 или СНЗ. Согласно определенным вариантам реализации вариант включает одну или большее количество мутаций, присутствие которых в молекуле Fc повышает сродство полипептида к одному или большему количеству FcyRs. Такие варианты проявляют повышенную антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность. Примеры обеспечивающих такой эффект вариантов описаны в патенте США № 7317091.
Другие варианты включают уменьшающие способность содержащих СНЗ-домен полипептидов к гомодимеризации, наряду с повышением способность к гетеродимеризации. Примеры таких вариантов Fc описаны в патентах США №5731168 и №7183076. Дополнительные примеры описаны в предварительной заявке на патент США 61/019569 того же заявителя, поданной 1/7/08, и 61/120,305, поданной 12/5/08 (обе заявки включены в настоящий документ полностью
посредством ссылки).
"Производное" полипептида представляет собой полипептид (например, антитело), который был химически модифицирован, например, путем сопряжения с другим химическим фрагментом, таким как, например, полиэтиленгликоль, цитотоксический агент, альбумин (например, альбумин сыворотки человека), путем фосфорилирования и гликозилирования. Если не указано иное, термин "антитело" включает, помимо антител, содержащих две полноразмерных тяжелых цепи и две полноразмерных легких цепи, их производные, варианты, фрагменты и мутеины, примеры которых описаны в настоящем документе.
Содержащий СНЗ-домен полипептид может иметь, например, структуру встречающегося в природе иммуноглобулина. "Иммуноглобулин" представляет собой тетрамерную молекулу. Во встречающихся в природе иммуноглобулинах каждый тетрамер состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара содержит одну "легкую" (приблизительно 2 5 кДа) и одну "тяжелую" цепь (приблизительно 50-70 кДа) . Аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область размером приблизительно 100-110 или более аминокислот, в первую очередь, отвечающую за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи определяет константную область, в первую очередь, отвечающую за эффекторную функцию. Легкие цепи человека классифицируют как легкие цепи каппа и лямбда. Тяжелые цепи классифицируют как мю, дельта, гамма, альфа или эпсилон, и они определяют изотип антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. Вариабельные и константные области в составе легких и тяжелых цепей соединены областью "J", имеющей длину приблизительно 12 или более аминокислот, при этом тяжелая цепь также включает область "D" длиной приблизительно 10 или более аминокислот. См. в целом: Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)) (включен в настоящий документ посредством ссылки полностью для любых целей). Вариабельные области каждой пары легкой/тяжелой цепи образуют участок связывания антитела, так что интактный иммуноглобулин содержит два сайта связывания.
Встречающиеся в природе цепи иммуноглобулинов демонстрируют
одинаковую
общую
структуру,
включающую
относительно
консервативные
каркасные
области
(FR) ,
соединенные
тремя
гипервариабельными областями, также называемыми определяющими комплементарность областями, или CDR. В направлении от N-конца к С-концу и легкие, и тяжелые цепи содержат домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Обозначения аминокислот каждого домена соответствуют определениям Rabat et al. из руководства: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., US Dept. of Health and Human Services, PHS, NIH, NIH Publication no. 91-3242, 1991. Интактные антитела включают поликлональные, моноклональные, гибридные, гуманизированные или полностью принадлежащие человеку, содержащие полноразмерные тяжелые и легкие цепи.
Антитело может содержать один или большее количество сайтов связывания. При наличии более чем одного сайта связывания указанные сайты связывания могут быть идентичны друг другу, или могут различаться. Например, встречающийся в природе иммуноглобулин человека, как правило, содержит два идентичных сайта связывания, тогда как "биспецифическое", или "бифункциональное" антитело содержит два разных сайта связывания.
Термин "антитело человека" включает все антитела, содержащие одну или большее количество вариабельных и константных областей, происходящих из последовательностей иммуноглобулина человека. Согласно одному варианту реализации все вариабельные и константные домены происходят из последовательностей иммуноглобулина человека (полностью принадлежащего человеку антитела). Указанные антитела могут быть получены различными способами, примеры которых описаны ниже, в том числе путем иммунизации представляющим интерес антигеном мыши, генетически модифицированной для экспрессирования антител, происходящих из кодирующих тяжелые и/или легкие цепи человека. Один или большее количество генов, кодирующих тяжелые цепи человека, могут быть изменены таким образом, чтобы включать мутацию Ser362. Когда таких мышей иммунизируют антигеном, у мышей синтезируются антитела человека с мутацией Ser364.
Гуманизированное антитело имеет последовательность, отличающуюся от последовательности антитела, происходящего из не являющегося человеком вида, одной или большим количеством замен, делеций и/или добавлений аминокислот, таким образом, что указанное гуманизированное антитело с меньшей вероятностью индуцирует иммунный ответ, и/или индуцирует менее тяжелый иммунный ответ по сравнению с антителом, происходящим из не являющегося человеком вида при введении субъекту-человеку. Согласно одному варианту реализации определенные аминокислоты в каркасных и константных доменах тяжелой и/или легкой цепей антитела, происходящего из не являющегося человеком вида, мутированы для получения гуманизированного антитела. Согласно другому варианту реализации константный(ые) домен(ы) антитела человека присоединены к вариабельному(ым) домену(ам), происходящему(им) из не являющегося человеком вида. Примеры способов получения гуманизированных антител можно найти в патентах США №№ 6054297, 5886152 и 5877293.
Термин "гибридное антитело" относится к антителу, которое содержит одну или большее количество областей из одного антитела и одну или большее количество областей из одного или нескольких других антител. Согласно одному примеру гибридного антитела часть тяжелой и/или легкой цепи идентична гомологичным или происходящим из антитела конкретного вида или антитела, принадлежащего конкретному классу или подклассу, а оставшаяся часть цепи(ей) идентична, гомологична или происходит из антител(а) другого вида, или принадлежит антителу другого класса или подкласса. Также включены фрагменты таких антител, проявляющие требуемую биологическую активность.
Фрагменты или аналоги антител могут быть легко получены специалистами в данной области техники с применением принципов, изложенных в настоящем описании, и хорошо известных в данной области техник. Предпочтительные амино- и карбоксильные концы фрагментов или аналогов расположены возле границ функциональных доменов. Структурные и функциональные домены могут быть идентифицированы путем сравнения данных о последовательностях аминокислот и/или нуклеотидов с общедоступными или частными
базами данных последовательностей.
Компьютеризированные способы сравнения можно применять для идентификации мотивов последовательностей или белковых доменов с предсказанной конформацией, присутствующих в других белках с известной структурой и/или функцией.
Известны способы идентификации последовательностей белков, подвергающихся укладке в известную трехмерную структуру. См., например, Bowie et al., 1991, Science 253:164.
"Антитело с привитыми CDR" представляет собой антитело, содержащее одну или большее количество областей CDR, происходящих из антитела конкретного вида или изотипа, и каркасную область другого антитела того же или другого вида или изотипа.
"Мультиспецифическое антитело" представляет собой антитело, распознающее более одного эпитопа на одном или нескольких антигенах. Подклассом антител указанного типа являются "биспецифические антитела".
"Процент идентичности" двух полинуклеотидных или двух полипептидных последовательностей определяют путем сравнения указанных последовательностей с применением компьютерной программы GAP (часть пакета GCG Wisconsin Package, версия 10.3 (Accelrys, Сан-Диего, Калифорния)) с применением параметров по умолчанию.
Термины "полинуклеотид", "олигонуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются в различных разделах настоящего описания взаимозаменяемо и включают молекулы ДНК (например, кДНК или геномную ДНК), молекулы РНК (например, мРНК), аналоги ДНК или РНК, полученные с применением аналогов нуклеотидов (например, пептидные нуклеиновые кислоты и не встречающиеся в природе аналоги нуклеотидов) и их гибриды. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двуцепочечной. Согласно одному варианту реализации молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению содержат непрерывную открытую рамку считывания, кодирующую антитело или Fc-гибрид, и его производное, мутеин или вариант.
Два одноцепочечных полинуклеотида "полностью
комплементарны" друг другу, если их последовательности могут
быть выровнены в антипараллельной ориентации таким образом, что
каждый нуклеотид в одном полинуклеотиде располагается напротив
комплементарного нуклеотида в другом полинуклеотиде без введения
пропусков и без неспаренных нуклеотидов на 5'-конце или 3'-конце
какой-либо из последовательностей. Полинуклеотид
"комплементарен" другому полинуклеотиду, если указанные два полинуклеотида способны гибридизоваться друг с другом в умеренно жестких условиях. Соответственно, полинуклеотид может быть комплементарен другому полинуклеотиду, не являясь полностью комплементарным ему.
"Вектор" представляет собой нуклеиновую кислоту, которую можно применять для введения другой нуклеиновой кислоты, связанной с ней, в клетку. Один тип векторов представлен "плазмидой", которая представляет собой линейную или кольцевую молекулу двуцепочечной ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты нуклеиновой кислоты. Другой тип вектора представлен вирусным вектором (например, дефектные по репликации ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы) , отличающимся тем, что дополнительные сегменты ДНК можно вводить в вирусный геном. Определенные векторы способны к автономной репликации в клетке-хозяине, в которую их вводят (например, бактериальные векторы, содержащие бактериальную точку начала репликации и эписомальные векторы млекопитающих). Другие векторы (например, неэписомальные векторы млекопитающих) встраиваются в геном клетки-хозяина при введении в указанную клетку-хозяина, и таким образом реплицируются вместе с геномом хозяина. "Экспрессионный вектор" представляет собой тип вектора, способный направлять экспрессию выбранного полинуклеотида.
Последовательность нуклеотидов "функционально связана" с
регуляторной последовательностью, если указанная регуляторная
последовательность влияет на экспрессию (например, уровень,
временные характеристики или локализацию экспрессии) указанной
последовательности нуклеотидов. "Регуляторная
последовательность" представляет собой нуклеиновую кислоту, которая влияет на экспрессию (например, уровень, временные
характеристики или локализацию экспрессии) нуклеиновой кислоты, с которой она функционально связана. Регуляторная последовательность может, например, оказывать эффекты непосредственно на регулируемую нуклеиновую кислоту, или действовать через одну или большее количество других молекул (например, полипептидов, которые связываются с регуляторной последовательностью и/или нуклеиновой кислотой). Примеры регуляторных последовательностей включают промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Дополнительные примеры регуляторных последовательностей описаны, например, Goeddel, 1990, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA; и Baron et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23:3605-06.
"Клетка-хозяин" представляет собой клетку, которая может быть использована для экспрессии нуклеиновой кислоты, например, нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Клетка-хозяин может представлять собой прокариота, например, Е. coli, или может представлять собой эукариота, например, одноклеточного эукариота (например, дрожжи или другой гриб), растительную клетку (например, растительную клетку тобака или томата), клетку животного (например, клетку человека, клетку обезьяны, клетку хомяка, клетку крысы, клетку мыши или клетку насекомого) или гибридому. Примеры клеток-хозяев включают линии клеток яичника китайского хомячка (СНО) или их производные, в том числе линию СНО DXB-11, дефицитную по ДГФР (см. Urlaub et al, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20), линии клеток СНО, растущие на бессывороточной среде (см. Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31), клетки CS-9, клетки, производные от СНО DXB-11 и клетки AM-1/D (описанные в патенте США № 6210924). Другие линии клеток СНО включают СНО-К1 (АТСС# CCL-61), ЕМ 9
(АТСС# CRL-1861) и UV20 (АТСС# CRL-1862). Примеры других клеток-хозяев включают линию COS-7 клеток почки обезьяны (АТСС CRL 1651) (см. Gluzman et al. , 1981, Cell 23:175), клетки L, клетки С 127, клетки ЗТЗ (АТСС CCL 163), клетки HeLa, линии клеток ВНК
(АТСС CRL 10), линию клеток CV1/EBNA, происходящую из линии
клеток почки африканской зеленой мартышки CV1 (АТСС CCL 70) (см. McMahan et al. , 1991, EMBO J. 10:2821), эмбриональные клетки почки человека, такие как 2 93, 2 93 EBNA или MSR 2 93, эпидермальные клетки человека А431, клетки человека Со1о205, другие линии трансформированных клеток приматов, нормальные диплоидные клетки, линии клеток, происходящие из in vitro культуры первичной ткани, первичные эксплантаты, клетки HL-60, U937, НаК или Jurkat. Как правило, клетка-хозяин представляет собой культивируемую клетку, которая может быть трансформирована или трансфицирована кодирующей полипептид нуклеиновой кислотой, которая затем может экспрессироваться в клетке-хозяине.
Выражение "рекомбинантная клетка-хозяин" может быть применено для обозначения клетки-хозяина, которая была трансформирована или трансфицирована нуклеиновой кислотой, которую необходимо экспрессировать. Клетка-хозяин также может представлять собой клетку, которая содержит нуклеиновую кислоту, но не экспрессирует ее на требуемом уровне, если в указанную клетку-хозяина не введена регуляторная последовательность таким образом, чтобы обеспечить ее функциональную связь с нуклеиновой кислотой. Следует понимать, что термин клетка-хозяин относится не только к конкретной клетке-субъекту, но и к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут происходить определенные модификации в результате, например, мутации или воздействия окружающей среды, такое потомство фактически может не быть идентичным исходной клетке, но, тем не менее, входить в объем термина согласно настоящему документу.
ПРИМЕРЫ
Следующие примеры, в том числе проведенные эксперименты и
полученные результаты, представлены исключительно в
иллюстративных целях и не должны быть истолкованы как ограничивающие настоящее изобретение.
ПРИМЕР 1
Получение конструкций с цистеиновым зажимом
Гибридные пептиды, содержащие последовательности Fc с парами заряженных остатков с цистеиновым зажимом (шарнирная
область удалена), стабильно экспрессировали в адаптированной к росту в суспензии в бессывороточной среде линии клеток СН0-К1. Fc-гибридные молекулы клонировали в стабильный экспрессионный вектор, содержащий ген устойчивости к пуромицину, а цепи Fc клонировали в гигромицин-содержащий экспрессионный вектор
(Selexis, Inc.). Плазмиды трансфицировали в пропорции 1:1 с применением липофектамина LTX; клетки отбирали через 2 дня после трансфекции на ростовой среде, содержащей 10 мкг/мл пуромицина и 600 мкг/мл гигромицина. В ходе отбора среду заменяли 2 раза в неделю. Когда жизнеспособность клеток достигала приблизительно 90%, клетки размножали для масштабного производства в подпитываемой культуре. Клетки высевали с плотностью 1еб/мл в продукционную среду и подпитывали на 3, б и 8 день. Кондиционированную среду (СМ), продуцированную клетками, собирали на 10 день и осветляли. Конечные показатели жизнеспособности, как правило, составляли более 90%.
Fc-гибриды осветляли, кондиционированную среду (СМ) очищали с применением двухэтапной хроматографической процедуры. Приблизительно 5 л СМ вводили прямо в колонку GE MabSelect SuRe, заранее уравновешенную забуференным фосфатом солевым раствором
(ФСБ) Дульбекко. Связанный белок проводили через три этапа отмывки: сначала в 3-х объемах колонки (CV) ФСБ; затем в 1 CV 2 0 мМ Tris, 100 мМ хлорида натрия, рН 7,4; и наконец, в 3 CV 500 мМ L-аргинина, рН 7,5. Указанные этапы отмывки устраняли несвязанные или слабосвязанные компоненты среды и загрязняющие примеси из клеток-хозяев. Затем колонку повторно уравновешивали 5 CV 20 мМ Tris, 100 мМ хлорида натрия при рН 7,4 что возвращает УФ-поглощение к базовому уровню. Нужный белок элюировали 100 мМ уксусной кислотой при рН 3,6 и собирали в массе. Объединенный белок быстро титровали до значений рН в диапазоне от 5,0 до 5,5, используя 1М Tris-HCl, рН 9,2.
Затем объединенный белок со скорректированным рН загружали на колонку с сульфопропил-сефарозой GE SP Sepharose HP, предварительно уравновешенную 2 0 мМ MES при рН 6,0. Затем связанный белок промывали 5 CV уравновешивающего буфера, и наконец элюировали 2 0 CV, в 0-50% линейном градиенте
концентраций от 0 до 4 00 мМ хлорида натрия в 2 0 мМ MES при рН 6,0. При элюировании собирали фракции и анализировали посредством аналитической эксклюзионной хроматографии (Superdex 2 00) для определения подходящих фракций для объединения с получением гомогенного продукта. Высокоэффективная хроматография с сульфопропил-сефарозой (SP) устраняет связанные с продуктом загрязняющие примеси, такие как свободный Fc, усеченные молекулы и мультимеры Fc и GDF15.
Затем в полученных высокоэффективной SP-хроматографией объединенных фракциях буфер заменяли на рецептурный буфер путем диализа, концентрировали приблизительно до 15 мг/мл с применением центрифуги с отсечением по молекулярной массе 10 кДа Sartorius Vivaspin 20 и, в заключение, стерилизовали фильтрацией. Полученный раствор, содержащий очищенные Fc-гибридные молекулы, помещали на хранение при 5° С. Идентичность и чистоту полученных продуктов оценивали с применением масс-спектрального анализа, электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
ПРИМЕР 2
Анализ конструкций с цистеиновым зажимом Образование дисульфидной связи
Гибридные Fc-белки без шарнирной области, содержащие мутацию L351C, экспрессировали и очищали согласно описанию выше.
Образцы анализировали с применением ДСН-электрофореза в полиакриламидном геле. Конструкции с разной молекулярной массой обладают разной подвижностью в ДСН-ПААГ. Это облегчает идентификацию связанных цепей. На фиг. 3 последняя дорожка соответствует восстанавливающим условиям, при которых дисульфидные связи распадаются, а другие дорожки соответствуют невосстанавливающим условиям для различных фракций в процессе очищения. Дисульфиды остаются интактными в невосстанавливающих условиях. Выше расположенная полоса, наблюдаемая в невосстанавливающих условиях, демонстрирует, что введенная ковалентная связь за счет дисульфидных связей между двумя цепями Fc на СНЗ-домене действительно формируется. Последняя дорожка на
фиг. 3 демонстрирует, что в восстанавливающих условиях сконструированные дисульфиды распадаются, как и ожидалось, обуславливая возникновение двойных полос. Анализ фармакокинетики
Проводили сравнение шести гибридных конструкций Fc-белков, не содержащих шарнирной области (A-F).
A. Fc-гибрид без шарнира и без линкера между терапевтическим пептидом и Fc.
B. То же, что и А, за исключением вариации в терапевтическом пептиде.
C. То же, что и В, за исключением того, что Fc соединен с терапевтическим пептидом негликозилированным линкером.
D. То же, что и С за исключением другого линкера.
E. То же, что и А, за исключением того, что одна цепь Fc включает замену Y34 9C, а другая включает замену S354C.
F. То же, что и В, за исключением того, что одна цепь Fc включает замену Y34 9C, а другая включает замену S354C.
Экспериментальные вещества вводили внутривенно через хвостовую вену самцам мышей с индуцированным диетой ожирением CD-I (п=3 на каждое экспериментальное вещество) в дозе 1 мг/кг. Собирали серийные образцы крови (50 мкл на каждый момент времени) каждого животного в следующие моменты времени: 1, 4, 8, 24, 72, 168, 240 и 336 часов после дозирования. Концентрации экспериментального вещества в образцах сыворотки количественно определяли с применением сэндвич-анализа ELISA, где используются антитела против экспериментальных веществ для захвата и детекции. Нижний предел количественного определения для анализа составлял 313 мкг/л. Строили графики для профилей концентрация-время и выполняли анализ без компартментализации для вычисления показателей ФК с применением ПО Watson.
Как видно на фиг. 4, из б протестированных вариантов варианты с цистеиновым зажимом, Е и F, имели минимальный общий системный клиренс и, соответственно, максимальную экспозицию (выражаемую как площадь под кривой концентрация-время, AUC) . Е продемонстрировал более чем 3-кратное увеличение AUC по сравнению с вариантом без цистеинового зажима A, a F
продемонстрировал в 1,6-кратное улучшение AUC по сравнению с В. Соответственно, фармакокинетика гибридных Fc-белков, в которых отсутствует шарнирная область, значительно улучшается при введении дисульфидной связи в контактную поверхность СНЗ.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ЭМДЖИН ИНК.
<12 0> СТАБИЛИЗАЦИЯ FC-СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИПЕПТИДОВ
<130> A-1852-WO-PCT
<140> <141>
<150> 61/860800 <151> 2013-07-31
<160> 58
<170> PatentIn, версия 3.5
<210> 1 <211> 330 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Туг Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 2
<211> 326
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
115 120 125
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
130 135 140
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
145 150 155 160
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
165 170 175
Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp
180 185 190
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro
195 200 205
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu
210 215 220
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
225 230 235 240
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
245 250 255
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
275 280 285
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
290 295 300
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
305 310 315 320
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325
<210> 3 <211> 377 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro
100 105 110
Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg
115 120 125
Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys
130 135 140
Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
145 150 155 160
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
165 170 175
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
180 185 190
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
195 200 205
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
210 215 220
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
225 230 235 240
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
245 250 255
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
260 265 270
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
275 280 285
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
290 295 300
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
305 310 315 320
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
325 330 335
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
340 345 350
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
355 360 365
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
370 375
<210> 4
<211> 327
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 4
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 5 <211> 353 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 5
Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr
1 5 10 15
Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe
20 25 30
Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val
35 40 45
Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr
50 55 60
Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly
65 70 75 80
Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp
85 90 95
Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro
100 105 110
Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser
115 120 125
Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe
145 150 155 160
Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu
165 170 175
Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys
180 185 190
Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr
195 200 205
Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn
210 215 220
Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser
245 250 255
Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro
260 265 270
Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly
275 280 285
Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp
290 295 300
Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro
325 330 335
Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys
340 345 350
Tyr
<210> 6
<211> 384
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 6
Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg
1 5 10 15
His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly
20 25 30
Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser
35 40 45
Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr
50 55 60
Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly
65 70 75 80
Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu
85 90 95
Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro
100 105 110
Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala
115 120 125
Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys
130 135 140
Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu
145 150 155 160
Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala
165 170 175
Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val
180 185 190
Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly
195 200 205
Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser
210 215 220
Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu
225 230 235 240
Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro
260 265 270
Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala
275 280 285
Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile
290 295 300
Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe
305 310 315 320
Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala
325 330 335
Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr
340 345 350
Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala
355 360 365
Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys
370 375 380
<210> 7
<211> 428
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 7
Ala Ser Thr Gln Ser Pro Ser Val Phe Pro Leu Thr Arg Cys Cys Lys
1 5 10 15
Asn Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Ala Thr
20 25 30
Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Met Val Thr Trp Asp Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Asn Gly Thr Thr Met Thr Leu Pro Ala Thr Thr Leu Thr Leu Ser Gly
50 55 60
His Tyr Ala Thr Ile Ser Leu Leu Thr Val Ser Gly Ala Trp Ala Lys
65 70 75 80
Gln Met Phe Thr Cys Arg Val Ala His Thr Pro Ser Ser Thr Asp Trp
85 90 95
Val Asp Asn Lys Thr Phe Ser Val Cys Ser Arg Asp Phe Thr Pro Pro
100 105 110
Thr Val Lys Ile Leu Gln Ser Ser Cys Asp Gly Gly Gly His Phe Pro
115 120 125
Pro Thr Ile Gln Leu Leu Cys Leu Val Ser Gly Tyr Thr Pro Gly Thr
130 135 140
Ile Asn Ile Thr Trp Leu Glu Asp Gly Gln Val Met Asp Val Asp Leu
145 150 155 160
Ser Thr Ala Ser Thr Thr Gln Glu Gly Glu Leu Ala Ser Thr Gln Ser
165 170 175
Glu Leu Thr Leu Ser Gln Lys His Trp Leu Ser Asp Arg Thr Tyr Thr
180 185 190
Cys Gln Val Thr Tyr Gln Gly His Thr Phe Glu Asp Ser Thr Lys Lys
195 200 205
Cys Ala Asp Ser Asn Pro Arg Gly Val Ser Ala Tyr Leu Ser Arg Pro
210 215 220
Ser Pro Phe Asp Leu Phe Ile Arg Lys Ser Pro Thr Ile Thr Cys Leu
225 230 235 240
Val Val Asp Leu Ala Pro Ser Lys Gly Thr Val Asn Leu Thr Trp Ser
245 250 255
Arg Ala Ser Gly Lys Pro Val Asn His Ser Thr Arg Lys Glu Glu Lys
260 265 270
Gln Arg Asn Gly Thr Leu Thr Val Thr Ser Thr Leu Pro Val Gly Thr
275 280 285
Arg Asp Trp Ile Glu Gly Glu Thr Tyr Gln Cys Arg Val Thr His Pro
290 295 300
His Leu Pro Arg Ala Leu Met Arg Ser Thr Thr Lys Thr Ser Gly Pro
305 310 315 320
Arg Ala Ala Pro Glu Val Tyr Ala Phe Ala Thr Pro Glu Trp Pro Gly
325 330 335
Ser Arg Asp Lys Arg Thr Leu Ala Cys Leu Ile Gln Asn Phe Met Pro
340 345 350
Glu Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu His Asn Glu Val Gln Leu Pro Asp
355 360 365
Ala Arg His Ser Thr Thr Gln Pro Arg Lys Thr Lys Gly Ser Gly Phe
370 375 380
Phe Val Phe Ser Arg Leu Glu Val Thr Arg Ala Glu Trp Glu Gln Lys
385 390 395 400
Asp Glu Phe Ile Cys Arg Ala Val His Glu Ala Ala Ser Pro Ser Gln
405 410 415
Thr Val Gln Arg Ala Val Ser Val Asn Pro Gly Lys 420 425
<210> 8 <211> 452
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 8
Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn
1 С 1 П 1С
10 15
Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser
35 40 45
Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln
65 70 75 80
Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn
85 90 95
Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys
100 105 110
Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg
115 120 125
Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile
130 135 140
Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr
145 150 155 160
Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln
180 185 190
Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln
195 200 205
Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val
210 215 220
Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr
225 230 235 240
Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr
245 250 255
Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn
260 265 270
Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala
275 280 285
Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr
290 295 300
Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg
305 310 315 320
Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro
325 330 335
Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu
340 345 350
Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg
355 360 365
Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro
370 375 380
Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val
385 390 395 400
Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His
405 410 415
Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr
420 425 430
Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala
435 440 445
Gly Thr Cys Tyr 450
<210> 9 <211> 227 <212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 9
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 10
<211> 17
<212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 10
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly
<210> 11 <211> 231 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 11
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230
<210> 12 <211> 227 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 12
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 13 <211> 233 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr
50 55 60
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
85 90 95
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln
115 120 125
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
130 135 140
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
145 150 155 160
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn
165 170 175
Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230
<210> 14 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Leu Gly Lys
225
<210> 15 <211> 227 <212> БЕЛОК <213> Mus sp.
<400> 15
Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu
1 С 1 Л 1С
10 15
Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr
20 25 30
Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys
35 40 45
Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val
50 55 60
His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe
65 70 75 80
Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu
145 150 155 160
Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro
165 170 175
Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val
180 185 190
Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu
195 200 205
His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser
210 215 220
Pro Gly Lys
225
<210> 16 <211> 237 <212> БЕЛОК
<213> Mus sp.
<400> 16
Asp Lys Lys Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro
1 С 1 Л 1С
10 15
Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
20 25 30
Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile
35 40 45
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln
50 55 60
Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln
65 70 75 80
Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu
85 90 95
Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
100 105 110
Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys
115 120 125
Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro
130 135 140
Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr
145 150 155 160
Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys
165 170 175
Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
180 185 190
Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val
195 200 205
Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn
210 215 220
His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 17
<211> 239
<212> БЕЛОК
<213> Mus sp.
<400> 17
Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys Lys
1 5 10 15
Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser Val
20 25 30
Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Thr
35 40 45
Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp
50 55 60
Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln
65 70 75 80
Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val Ser
85 90 95
Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys
100 105 110
Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr Ile
115 120 125
Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
130 135 140
Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys Leu
145 150 155 160
Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser Asn
165 170 175
Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser Lys
195 200 205
Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly Leu
210 215 220
Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 18
<211> 238
<212> БЕЛОК
<213> Mus sp.
<400> 18
Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro Pro Leu Lys Glu
1 5 10 15
Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro
35 40 45
Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val
50 55 60
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
65 70 75 80
Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala
85 90 95
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys
100 105 110
Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
130 135 140
Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met Ile
145 150 155 160
Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn Gly
165 170 175
Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr Trp
195 200 205
Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Val Leu His
210 215 220
Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys
225 230 235
<210> 19
<211> 233
<212> БЕЛОК
<213> Mus sp. <400> 19
Glu Pro Arg Ile Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Cys Pro
1 5 10 15
Pro Gly Asn Ile Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
20 25 30
Pro Lys Asp Ala Leu Met Ile Ser Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
35 40 45
Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val His Val Ser Trp Phe
50 55 60
Val Asp Asn Lys Glu Val His Thr Ala Trp Thr Gln Pro Arg Glu Ala
65 70 75 80
Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His
85 90 95
Gln Asp Trp Met Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Arg
115 120 125
Ala Gln Thr Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Arg Glu Gln Met
130 135 140
Ser Lys Lys Lys Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Asn Phe Phe Ser
145 150 155 160
Glu Ala Ile Ser Val Glu Trp Glu Arg Asn Gly Glu Leu Glu Gln Asp
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Ile Leu Asp Ser Asp Gly Thr Tyr Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Thr Asp Ser Trp Leu Gln Gly Glu Ile
195 200 205
Phe Thr Cys Ser Val Val His Glu Ala Leu His Asn His His Thr Gln
210 215 220
Lys Asn Leu Ser Arg Ser Pro Gly Lys 225 230
<210> 20
<211> 233
<212> БЕЛОК <213> Ovis aries
<400> 20
Glu Pro Gly Cys Pro Asp Pro Cys Lys His Cys Arg Cys Pro Pro Pro
1 5 10 15
Glu Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp
50 55 60
Asn Val Glu Val Arg Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
65 70 75 80
Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp
85 90 95
Trp Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys
130 135 140
Ser Thr Leu Ser Val Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Gln Lys Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys
165 170 175
Tyr Gly Thr Thr Thr Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu
180 185 190
Tyr Ser Arg Leu Arg Val Asp Lys Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr
195 200 205
Tyr Ala Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
210 215 220
Lys Ser Ile Ser Lys Pro Pro Gly Lys
225 230
<210> 21
<211> 228
<212> БЕЛОК <213> Ovis aries
<400> 21
Gly Ile Ser Ser Asp Tyr Ser Lys Cys Ser Lys Pro Pro Cys Val Ser
1 5 10 15
Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ser Leu Met
20 25 30
Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gln Gly
35 40 45
Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asn Val Glu Val Arg
50 55 60
Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg
65 70 75 80
Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Asp His Trp Thr Gly Gly Lys
85 90 95
Glu Phe Lys Cys Lys Val His Ser Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Val
100 105 110
Arg Thr Ile Ser Arg Ala Lys Gly Gln Ala Arg Glu Pro Gln Val Tyr
115 120 125
Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Leu Ser Val
130 135 140
Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile Ala Val Glu Trp
145 150 155 160
Gln Arg Ala Arg Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Gly Thr Thr Thr
165 170 175
Ser Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Arg
180 185 190
Val Asp Lys Ser Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Ala Cys Val Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys
210 215 220
Pro Pro Gly Lys
225
<210> 22
<211> 232
<212> БЕЛОК <213> Bos taurus
<400> 22
Asp Pro Thr Cys Lys Pro Ser Pro Cys Asp Cys Cys Pro Pro Pro Glu
1 5 10 15
Leu Pro Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Gly His Asp Asp Pro Glu Val Lys Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
50 55 60
Val Glu Val Asn Thr Ala Thr Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp
85 90 95
Thr Gly Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Glu Gly Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Pro Ala Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Gln Glu Glu Leu Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Val Ser Leu Thr Cys Met Val Thr Ser Phe Tyr Pro Asp Tyr Ile
145 150 155 160
Ala Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr
165 170 175
Gly Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Ser Ser Tyr Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Glu Gly Asp Thr Tyr
195 200 205
Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Thr Ser Lys Ser Ala Gly Lys 225 230
<210> 23
<211> 230
<212> БЕЛОК <213> Bos taurus
<400> 23
Gly Val Ser Ser Asp Cys Ser Lys Pro Asn Asn Gln His Cys Cys Val
1 5 10 15
Arg Glu Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Thr Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asn Val Gly
35 40 45
His Asp Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Thr Gly
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Ile Lys Gly Leu Ser Ala Ser
100 105 110
Ile Val Arg Ile Ile Ser Arg Ser Lys Gly Pro Ala Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Val Leu Asp Pro Pro Lys Glu Glu Leu Ser Lys Ser Thr Val
130 135 140
Ser Val Thr Cys Met Val Ile Gly Phe Tyr Pro Glu Asp Val Asp Val
145 150 155 160
Glu Trp Gln Arg Asp Arg Gln Thr Glu Ser Glu Asp Lys Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Leu Asp Ala Asp Arg Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Arg Val Asp Arg Asn Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Val Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Met Gln Lys Ser Thr
210 215 220
Ser Lys Ser Ala Gly Lys
225 230
<210> 24
<211> 232
<212> БЕЛОК <213> Bos taurus
<400> 24
Lys Ser Glu Val Glu Lys Thr Pro Cys Gln Cys Ser Lys Cys Pro Glu
1 5 10 15
Pro Leu Gly Gly Leu Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
20 25 30
Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
35 40 45
Val Gly Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp
50 55 60
Val Glu Val His Thr Ala Arg Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Ala Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Gln Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Gly Leu Pro
100 105 110
Ala Pro Ile Val Arg Thr Ile Ser Arg Thr Lys Gly Gln Ala Arg Glu
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Lys Ser
130 135 140
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Leu Ile Thr Gly Phe Tyr Pro Glu Glu Ile
145 150 155 160
Asp Val Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Ser Glu Asp Lys Tyr
165 170 175
His Thr Thr Ala Pro Gln Leu Asp Ala Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Arg Val Asn Lys Ser Ser Trp Gln Glu Gly Asp His Tyr
195 200 205
Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu Arg Asn His Tyr Lys Glu Lys
210 215 220
Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 25
<211> 229
<212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 25
Val Pro Arg Asn Cys Gly Gly Asp Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Gly
1 5 10 15
Ser Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val
20 25 30
Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile
35 40 45
Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val His Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val
50 55 60
Glu Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Pro Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Arg Thr Phe Arg Cys Lys Val Thr Ser Ala Ala Phe Pro Ser
100 105 110
Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Pro Glu Gly Arg Thr Gln Val Pro
115 120 125
His Val Tyr Thr Met Ser Pro Thr Lys Glu Glu Met Thr Gln Asn Glu
130 135 140
Val Ser Ile Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr
145 150 155 160
Val Glu Trp Gln Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr
165 170 175
Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu
180 185 190
Asn Val Lys Lys Glu Lys Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser
195 200 205
Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser
210 215 220
His Ser Pro Gly Lys
225
<210> 26
<211> 225
<212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 26
Val Pro Arg Glu Cys Asn Pro Cys Gly Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser
1 5 10 15
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Thr Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr
20 25 30
Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asn Asp
35 40 45
Pro Glu Val Arg Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His Thr
50 55 60
Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg Ser
65 70 75 80
Val Ser Glu Leu Pro Ile Val His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Thr
85 90 95
Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Gly Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys
100 105 110
Ser Ile Ser Lys Pro Glu Gly Thr Pro Arg Gly Pro Gln Val Tyr Thr
115 120 125
Met Ala Pro Pro Lys Glu Glu Met Thr Gln Ser Gln Val Ser Ile Thr
130 135 140
Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Thr Glu Trp Lys
145 150 155 160
Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met
165 170 175
Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys
180 185 190
Glu Thr Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu
195 200 205
Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly
210 215 220
Lys
225
<210> 27
<211> 238
<212> БЕЛОК <213> Rattus sp.
<400> 27
Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro Thr Cys Pro Thr
1 5 10 15
Cys His Lys Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile Ser Gln Asn Ala
35 40 45
Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu Glu Pro Asp Val
50 55 60
Gln Phe Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
65 70 75 80
Gln Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Ala
85 90 95
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys
100 105 110
Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Pro Lys Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr Val Met Gly Pro
130 135 140
Pro Thr Glu Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu Thr Cys Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp Thr Ser Asn Gly
165 170 175
His Ile Glu Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Met Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu Arg Ser Arg Trp
195 200 205
Asp Ser Arg Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His
210 215 220
Asn His His Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 28
<211> 228
<212> БЕЛОК
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 28
Ala Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Glu Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln
50 55 60
Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Ile Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Glu Asp Trp Leu Arg
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys
115 120 125
Val Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val
145 150 155 160
Glu Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Ala Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser
180 185 190
Val Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 29
<211> 239
<212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 29
Glu Pro Ile Pro Asp Asn His Gln Lys Val Cys Asp Met Ser Lys Cys
1 5 10 15
Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile
20 25 30
Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Thr Arg Thr Pro Glu
35 40 45
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys
50 55 60
Phe Asn Trp Tyr Met Asp Gly Val Glu Val Arg Thr Ala Thr Thr Arg
65 70 75 80
Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
85 90 95
Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys
100 105 110
Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Gln Pro Ile Glu Arg Thr Ile Thr Lys
115 120 125
Thr Lys Gly Arg Ser Gln Glu Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro His
130 135 140
Pro Asp Glu Asp Ser Lys Ser Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asn Ile Glu Trp Gln Ser Asn Gly Gln
165 170 175
Pro Glu Leu Glu Thr Lys Tyr Ser Thr Thr Gln Ala Gln Gln Asp Ser
180 185 190
Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Asp Arg Asn Arg
195 200 205
Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys Gly Val Met His Glu Ala Leu
210 215 220
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Asn Val Ser Lys Asn Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 30
<211> 232
<212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 30
Ala Arg Val Thr Pro Val Cys Ser Leu Cys Arg Gly Arg Tyr Pro His
1 5 10 15
Pro Ile Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp
20 25 30
Ala Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Val Val Thr Cys Val Val Val Asn
35 40 45
Leu Ser Asp Gln Tyr Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Asn
50 55 60
Thr Glu Val His Ser Ala Ile Thr Lys Gln Arg Glu Ala Gln Phe Asn
65 70 75 80
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp
85 90 95
Leu Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Val Gly Val Pro
100 105 110
Gln Pro Ile Ser Arg Ala Ile Ser Arg Gly Lys Gly Pro Ser Arg Val
115 120 125
Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Ser
130 135 140
Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile
145 150 155 160
Ser Val Glu Trp Gln Ser Asn Arg Trp Pro Glu Leu Glu Gly Lys Tyr
165 170 175
Ser Thr Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr
180 185 190
Ser Lys Leu Ser Leu Glu Thr Ser Arg Trp Gln Gln Val Glu Ser Phe
195 200 205
Thr Cys Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Phe Thr Lys Thr
210 215 220
Asp Ile Ser Glu Ser Leu Gly Lys
225 230
<210> 31
<211> 256
<212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 31
Glu Pro Val Leu Pro Lys Pro Thr Thr Pro Ala Pro Thr Val Pro Leu
1 5 10 15
Thr Thr Thr Val Pro Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Cys Pro Cys Glu
20 25 30
Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
35 40 45
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Thr Arg Thr Pro
50 55 60
Glu Val Thr Cys Leu Val Val Asp Val Ser His Asp Ser Ser Asp Val
65 70 75 80
Leu Phe Thr Trp Tyr Val Asp Gly Thr Glu Val Lys Thr Ala Lys Thr
85 90 95
Met Pro Asn Glu Glu Gln Asn Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
100 105 110
Leu Arg Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Lys Phe Lys Cys
115 120 125
Lys Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro Val Glu Arg Thr Ile Ser
130 135 140
Lys Ala Thr Gly Gln Thr Arg Val Pro Gln Val Tyr Val Leu Ala Pro
145 150 155 160
His Pro Asp Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val Ser Val Thr Cys Leu Val
165 170 175
Lys Asp Phe Leu Pro Thr Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Ser Asn Glu
180 185 190
His Pro Glu Pro Glu Gly Lys Tyr Arg Thr Thr Glu Ala Gln Lys Asp
195 200 205
Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Glu Thr Asp
210 215 220
Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala
225 230 235 240
Leu His Asn His Val Met Gln Lys Asn Val Ser His Ser Pro Gly Lys
245 250 255
<210> 32 <211> 230 <212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 32
Val Ile Lys Glu Cys Gly Gly Cys Pro Thr Cys Pro Glu Cys Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Thr Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly
35 40 45
His Asp Phe Pro Asp Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Gln Glu Gln Asn Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Ile Leu Ala Ile Gln His Lys Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Gln Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Val Gln Lys Thr Ile Ser Lys Pro Thr Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Val Leu Ala Pro His Arg Ala Glu Leu Ser Lys Asn Lys Val
130 135 140
Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Thr Asp Ile Asp Ile
145 150 155 160
Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Thr Lys Tyr Ser Thr
165 170 175
Thr Pro Ala Gln Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Thr Val Glu Thr Asn Arg Trp Gln Gln Gly Thr Thr Phe Thr Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Glu Lys Ser Val
210 215 220
Ser Lys Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 33
<211> 230
<212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 33
Val Val Lys Gly Ser Pro Cys Pro Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Pro
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
20 25 30
Lys Ile Ser Arg Lys Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Leu Gly
35 40 45
His Asp Asp Pro Asp Val Gln Phe Thr Trp Phe Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Thr His Thr Ala Thr Thr Glu Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Ser
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Ser Val Thr Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Val Glu Arg Thr Thr Ser Lys Ala Lys Gly Gln Leu Arg Val Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Val Leu Ala Pro His Pro Asp Glu Leu Ala Lys Asn Thr Val
130 135 140
Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Glu Ile Asp Val
145 150 155 160
Glu Trp Gln Ser Asn Glu His Pro Glu Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Thr
165 170 175
Thr Pro Ala Gln Leu Asn Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ser Val Glu Thr Ser Arg Trp Lys Gln Gly Glu Ser Phe Thr Cys
195 200 205
Gly Val Met His Glu Ala Val Glu Asn His Tyr Thr Gln Lys Asn Val
210 215 220
Ser His Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 34 <211> 231 <212> БЕЛОК
<213> Equus caballus
<400> 34
Val Ile Lys Glu Pro Cys Cys Cys Pro Lys Cys Pro Asp Ser Lys Phe
1 5 10 15
Leu Gly Arg Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asn Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Ala His Thr Ala Thr Thr Lys Ala Lys Glu Lys Gln Asp Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Arg
85 90 95
Arg Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ala
100 105 110
Pro Val Glu Arg Thr Ile Thr Lys Ala Lys Gly Glu Leu Gln Asp Pro
115 120 125
Lys Val Tyr Ile Leu Ala Pro His Arg Glu Glu Val Thr Lys Asn Thr
130 135 140
Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asn
145 150 155 160
Val Glu Trp Gln Ser Asn Glu Glu Pro Glu Pro Glu Val Lys Tyr Ser
165 170 175
Thr Thr Pro Ala Gln Leu Asp Gly Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Glu Thr Asp Arg Trp Glu Gln Gly Glu Ser Phe Thr
195 200 205
Cys Val Val Met His Glu Ala Ile Arg His Thr Tyr Arg Gln Lys Ser
210 215 220
<210> 35 <211> 235 <212> БЕЛОК
/01 Q\
Ile Thr Asn Phe Pro Gly Lys 225 230
<213> Macaca fascicularis
<400> 35
Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro
1 5 10 15
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys Asp Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Arg Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 36 <211> 235
<212> БЕЛОК
<213> Macaca mulatta
<400> 36
Glu Ile Lys Thr Cys Gly Gly Gly Ser Lys Pro Pro Thr Cys Pro Pro
1 С 1 П 1С
10 15
Cys Thr Ser Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
20 25 30
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
35 40 45
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Asp Val Lys Phe Asn
50 55 60
Trp Tyr Val Asn Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro Arg
65 70 75 80
Glu Thr Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
85 90 95
Thr His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser
100 105 110
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Gln Lys Thr Ile Ser Lys Asp Lys
115 120 125
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
130 135 140
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
145 150 155 160
Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu
165 170 175
Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr
180 185 190
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
195 200 205
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
210 215 220
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 37 <211> 228 <212> БЕЛОК
<213> Macaca mulatta
<400> 37
Gly Leu Pro Cys Arg Ser Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Glu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Glu Pro Asp Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Asn Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Thr His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Lys Gln Lys Thr Val Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Arg Lys Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val
130 135 140
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Val Val
145 150 155 160
Glu Trp Ala Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Thr Tyr Lys Thr Thr Pro
165 170 175
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
180 185 190
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Ser Cys Ser Val
195 200 205
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
210 215 220
Ser Pro Gly Lys
225
<210> 38
<211> 232
<212> БЕЛОК
<213> Macaca mulatta
<400> 38
Glu Phe Thr Pro Pro Cys Gly Asp Thr Thr Pro Pro Cys Pro Pro Cys
1 5 10 15
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
20 25 30
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
35 40 45
Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
50 55 60
Tyr Val Asp Gly Ala Glu Val His His Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu
65 70 75 80
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Thr
85 90 95
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Ser Asn
100 105 110
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
115 120 125
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ile Leu Pro Pro Pro Gln Glu Glu
130 135 140
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
165 170 175
Thr Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe
180 185 190
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
195 200 205
Thr Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
210 215 220
Gln Lys Ser Leu Ser Val Ser Pro 225 230
<210> 39 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 39
Gly Ile His Gln Pro Gln Thr Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Thr Leu Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val
145 150 155 160
Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Asn Thr Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Asp Lys Phe Glu Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ser Lys Thr Gln Gly Lys 225 230
<210> 40 <211> 230 <212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 40
Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser
1 5 10 15
Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val
145 150 155 160
Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Ser Lys Thr Pro Gly Lys 225 230
<210> 41
<211> 230
<212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 41
Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Ser
1 С 1 П 1С
10 15
Pro Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Gln Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro His Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Ser Ile Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val
145 150 155 160
Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Ser Lys Thr Pro Gly Lys 225 230
<210> 42
<211> 230
<212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 42
Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val
1 5 10 15
Ala Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Gln Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Lys Glu His Ala Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Glu Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Val Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Thr Ile Ser Lys Ala Ile Gly Gln Ser Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Thr Val Thr Cys Leu Val Ile Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile His Val
145 150 155 160
Glu Trp Lys Ser Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ala Val Asp Lys Ala Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ser Lys Thr Gln Gly Lys 225 230
<210> 43
<211> 230
<212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 43
Gly Thr Lys Thr Lys Pro Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly
1 5 10 15
Pro Gly Pro Ser Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
20 25 30
Met Ile Ser Arg Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
35 40 45
Gln Glu Asn Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
50 55 60
Val His Thr Ala Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
65 70 75 80
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn
85 90 95
Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro
100 105 110
Ile Thr Arg Ile Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln
115 120 125
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Pro Thr Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val
130 135 140
Thr Leu Thr Cys Leu Val Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val
145 150 155 160
Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr
165 170 175
Thr Pro Pro Gln Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys
180 185 190
Leu Ala Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Thr Phe Gln Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Phe Lys Thr Pro Gly Lys 225 230
<210> 44 <211> 226 <212> БЕЛОК <213> Sus scrofa
<400> 44
Gly Arg Pro Cys Pro Ile Cys Pro Ala Cys Glu Gly Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
Ala Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Phe Met Ile Ser Arg
20 25 30
Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asn Pro
35 40 45
Glu Val Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala
50 55 60
Gln Thr Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
65 70 75 80
Ser Val Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe
85 90 95
Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Thr Arg Ile
100 105 110
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
115 120 125
Pro Pro Pro Thr Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Leu Ser Val Thr Cys
130 135 140
Leu Ile Thr Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Asp Val Glu Trp Gln Arg
145 150 155 160
Asn Gly Gln Pro Glu Pro Glu Gly Asn Tyr Arg Thr Thr Pro Pro Gln
165 170 175
Gln Asp Val Asp Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp
180 185 190
Lys Ala Ser Trp Gln Arg Gly Asp Pro Phe Gln Cys Ala Val Met His
195 200 205
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Phe Lys Thr Pro
210 215 220
Gly Asn 225
<210> 45 <211> 5 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 45
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 46 <211> 5 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 46
Gly Gly Asn Gly Thr
1 5
<210> 47 <211> 5 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 47
Tyr Gly Asn Gly Thr 1 5
<210> 48 <211> 216 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 48
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 С 1 П 1С
10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
210 215
<210> 49 <211> 217 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<400> 49
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 50 <211> 332
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 50
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg Lys Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Asn Gly
210 215 220
Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
225 230 235 240
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
245 250 255
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
260 265 270
Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
275 280 285
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
290 295 300
Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
325 330
<210> 51
<211> 351
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 51
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala
225 230 235 240
Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
245 250 255
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
260 265 270
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
275 280 285
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
290 295 300
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
305 310 315 320
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
325 330 335
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
340 345 350
<210> 52 <211> 236
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 52
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Cys Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 53 <211> 216 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 53
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Lys Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 210 215
<210> 54 <211> 217 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 54
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215
<210> 55 <211> 332 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 55
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
1 5 10 15
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
20 25 30
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
35 40 45
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
50 55 60
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
65 70 75 80
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
85 90 95
Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
100 105 110
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Lys Glu Met
115 120 125
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
130 135 140
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
165 170 175
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
180 185 190
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala Arg Asn Gly
210 215 220
Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val
225 230 235 240
Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro
245 250 255
Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe
260 265 270
Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu
275 280 285
Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn
290 295 300
Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
325 330
<210> 56
<211> 351
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 56
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
130 135 140
Lys Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ala
225 230 235 240
Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu
245 250 255
His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val
260 265 270
Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro
275 280 285
Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu
290 295 300
His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala
305 310 315 320
Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser
325 330 335
Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile
340 345 350
<210> 57 <211> 236 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<400> 57
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
65 70 75 80
Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
85 90 95
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
100 105 110
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg
130 135 140
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Tyr Asp Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
180 185 190
Phe Phe Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln
195 200 205
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
210 215 220
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 58 <211> 6 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая метка 6xHis
<400> 58
His His His His His His
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Полипептид, содержащий Fc-область антитела, указанная Fc-область включает делецию или замену одного или более остатков цистеина в шарнирной области и замену одной или более аминокислот контактной поверхности СНЗ на содержащий сульфгидрильную группу остаток.
2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что в указанная Fc-области отсутствует содержащая цистеин часть шарнирной области.
3. Полипептид по п. 2, отличающийся тем, что в указанной Fc-области отсутствует шарнирная область.
4. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что все цистеины в шарнирной области заменены на другую аминокислоту.
5. Полипептид по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что аминокислота контактной поверхности СНЗ, замененная на содержащий сульфгидрильную группу остаток, представляет собой Y349, L351, S354, Т394 или Y407.
6. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что Y349 заменена на цистеин (Y349C).
7. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что L351 заменена на цистеин (L351C).
8. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что S354 заменена на цистеин (S354C).
9. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что Т3 94 заменена на цистеин (Т394С).
10. Полипептид по п. 5, отличающийся тем, что Y407 заменена на цистеин (Y407C).
11. Полипептид по любому из пп. 1-10, отличающийся тем, что указанная Fc-область содержит область СН2, включающую одну или более замен аминокислот.
12. Полипептид по любому из пп. 1-11, отличающийся тем, что указанная область СНЗ дополнительно включает одну или более дополнительных замен аминокислот.
13. Полипептид по любому из пп. 1-12, отличающийся тем, что одна или более аминокислот на С-конце указанной Fc-области удалены.
10.
14. Полипептид по п. 13, отличающийся тем, что удалено три, две или одна аминокислота на С-конце указанной Fc-области.
15. Полипептид по п. 14, отличающийся тем, что удалена концевая аминокислота на С-конце указанной Fc-области.
16. Полипептид по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит тяжелую цепь антитела.
17. Полипептид по любому из пп. 1-15, отличающийся тем, что указанный полипептид содержит гибридный Fc-белок.
18. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по любому из пп. 1-17.
19. Экспрессионный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 18, функционально связанную с промотором.
20. Клетка-хозяин, содержащая экспрессионный вектор по п.
19.
21. Способ получения полипептида, включающий
a) культивирование клетки-хозяина по п. 20 в условиях, при которых указанный промотор активен в указанной клетке-хозяине; и
b) выделение указанного полипептида из культуры.
22. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид по любому из пп. 1-17.
По доверенности
У Fab
СЛ GO
О 00
(b)
СН2
СИ2
СНЗ
СНЗ
Введенная дисульфидная связь на контактной поверхности снз
Фиг. 2
Фиг. 3
57) .
Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys
195 200 205
Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys
195 200 205
Phe Ser Val Asp Lys Ala Ser Trp Gln Gly Gly Gly Ile Phe Gln Cys
195 200 205
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
Ala Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile
210 215 220
<220>
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический полипептид
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
195 200 205