[RU]

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, в частности в слюне человека. Сущность изобретения - получают исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости, проводят инкубацию полученной смеси с перемешиванием и определяют концентрацию белка после инкубации путем измерения оптической плотности смеси относительно холостой пробы и последующего расчета, причем при получении исходной смеси в качестве биологической жидкости используют слюну человека, а реагент готовят путем смешивания буферного раствора диэтаноламина 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/мл, после чего к 1 мл при получении смеси к реагенту прибавляют 100 мкл образца биологической жидкости, после перемешивания полученной смеси инкубацию проводят в течение 5 мин при температуре 37°С, добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптическую плотность против холостой пробы при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в течение времени до 30 минут, а активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярного поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости, при этом холостую пробу готовят в виде смеси реагента с дистиллированной водой в тех же количествах, что и исходной смеси, с проведением над ней тех же операций, что и для исходной смеси.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, в частности в слюне человека. Сущность изобретения - получают исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости, проводят инкубацию полученной смеси с перемешиванием и определяют концентрацию белка после инкубации путем измерения оптической плотности смеси относительно холостой пробы и последующего расчета, причем при получении исходной смеси в качестве биологической жидкости используют слюну человека, а реагент готовят путем смешивания буферного раствора диэтаноламина 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/мл, после чего к 1 мл при получении смеси к реагенту прибавляют 100 мкл образца биологической жидкости, после перемешивания полученной смеси инкубацию проводят в течение 5 мин при температуре 37°С, добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптическую плотность против холостой пробы при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в течение времени до 30 минут, а активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярного поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости, при этом холостую пробу готовят в виде смеси реагента с дистиллированной водой в тех же количествах, что и исходной смеси, с проведением над ней тех же операций, что и для исходной смеси.

---

(19)
Евразийское
патентное
ведомство
(21) 201600526 (13) A1
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2018.01.31
(22) Дата подачи заявки 2016.06.29
(51) Int. Cl. G01N21/59 (2006.01)
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ
(96) (71)
(72)
(74)
2016000055 (RU) 2016.06.29
Заявитель:
ТИТОВ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ; БЕЛЬСКАЯ ЛЮДМИЛА
ВЛАДИМИРОВНА; КОВАЛЕНКО ДМИТРИЙ АНАТОЛЬЕВИЧ;
ХАРИТОНАШВИЛИ ИРАКЛИЙ ТЕЙМУРАЗОВИЧ; ЗАЙЧЕНКО
НИКОЛАЙ МИХАЙЛОВИЧ (RU)
Изобретатель:
Бельская Людмила Владимировна, Титов Андрей Владимирович, Сарф Елена Александровна (RU)
Представитель:
Зайченко Н.М. (RU) (57) Изобретение относится к области медицины, а именно к клинической лабораторной диагностике, и может быть использовано для определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, в частности в слюне человека. Сущность изобретения - получают исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости, проводят инкубацию полученной смеси с перемешиванием и определяют концентрацию белка после инкубации путем измерения оптической плотности смеси относительно холостой пробы и последующего расчета, причем при получении исходной смеси в качестве биологической жидкости используют слюну человека, а реагент готовят путем смешивания буферного раствора диэтанолами-на 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/ мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/ мл, после чего к 1 мл при получении смеси к реагенту прибавляют 100 мкл образца биологической жидкости, после перемешивания полученной смеси инкубацию проводят в течение 5 мин при температуре 37°С, добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптическую плотность против холостой пробы при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в течение времени до 30 минут, а активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярно-го поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости, при этом холостую пробу готовят в виде смеси реагента с дистиллированной водой в тех же количествах, что и исходной смеси, с проведением над ней тех же операций, что и для исходной смеси.
МПК GO IN 33/53
Способ определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях
Изобретение относится к области медицины, а именно клинической лабораторной диагностике; и может быть использовано для определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, в частности, в слюне человека.
Фосфатазы, ферменты класса гидролаз, катализирующие гидролиз сложных эфиров фосфорной кислоты в организме животных, растений и в микроорганизмах. Функция фосфатазы - поддержание уровня фосфата, необходимого для различных биохимических процессов, и, возможно, транспорт фосфата в клетку. В зависимости от того, при каком рН фосфатаза активна, различают щелочную фосфатазу (ЩФ) с оптимумом действия при рН 9,2-9,6 и кислую фосфатазу с оптимумом действия при рН 3,4-6,2.
Активность ЩФ отражает, прежде всего, повреждение костной ткани и печени, хотя более высокая активность ЩФ обнаруживается в других тканях. Повышение активности ЩФ наблюдается в следующих случаях: заболевания печени (обтурационная желтуха, объемные процессы в печени (опухоли, метастазы), цирроз печени, внутрипеченочный и внепеченочный холестаз, вирусный гепатит, инфекционный мононуклеоз, цитомегаловирусная инфекция, хронический алкоголизм), заболевания костной ткани (болезнь Педжета, метастатические опухоли, остеогенная саркома, остеомаляция, рахит, заживление после переломов кости), смешанная группа заболеваний (гиперпаратиреоз, гипертиреоз, инфаркт миокарда, болезнь Ходжкина,
язвенный колит, саркоидоз, амилоидоз, хроническая почечная недостаточность, недостаточность кровообращения, ревматоидный артрит), злокачественные опухоли предстательной железы, яичка, почки, шейки матки, яичника, поджелудочной железы, мочевого пузыря, легкого.
Известны способы определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях.
Представителем классического подхода к определению активности ЩФ является способ [Shinowara G. Estimation of serum inorganic phosphate and "acid" and "alkaline" phosphatase activity / G. Shinowara, L. M. Jones, H. L. Reinhart // J. Biol. Chem. - 1942. - Vol. 142. - P. 921-933], в котором субстратом служит (З-глицерофосфат, реакция протекает в вероналовом буферном растворе {рН9,Ъ), а высвобождающиеся в ходе реакции фосфат-ионы определяют с использованием фосфорномолибденового реактива, при этом, величину поглощения регистрируют при длине волны 600 нм.
Недостатком способа является относительно низкая чувствительность.
Примером другого подхода к определению активности ЩФ может служить способ [King Е. J. A convenient method for determining serum and bile phosphatase activity / E. J. King, A. R. Armstrong // Can. Med. Assoc. J. - 1934. - Vol. 31. - P. 376-381], в котором в качестве субстрата применяют фенилфосфат, при этом, высвобождающийся в реакции фенол определяют реактивом Folin-Ciocalteu.
Этот способ является более чувствительным, по отношению к предыдущему, но обладает относительно узкой областью применения.
Известен также спектрофотометрический кинетический способ [Moss D. W. A note on the spectrophotometry estimation of alkaline phosphatase activity / D. W. Moss // Enzymologia. - 1966. - Vol. 31. - P. 193-202], при использовании которого среда содержала 0,1 моль/л бикарбонатный буферный раствор (рН 10,0 при 37 °С), 5 ммоль/л MgCb. а в качестве субстрата - а-нафтилфосфат, причем, об активности фермента судят по
скорости высвобождения а-нафтола, при этом, скорость реакции регистрируют при 340 нм в течение 5-10 минут.
Однако этот способ характеризуется относительно узкой областью применения.
Помимо указанных выше, известен высокочувствительный флуориметрическими способ определения активности ЩФ [Cornish С. J. Automated flourometric alkaline phosphatase micro assay with 4_methylumbelliferyl_phosphate as a substrate / C. J. Cornish, F. C. Neale, S. Posen // Am. J. Clin. Pathol. - 1970. - Vol. 53. - P. 68-76.] с 4-метиллюмбелиферилфосфатом в качестве субстрата, в котором интенсивность флуоресценции образующегося 4-метиллюмбелиферона определяют при 465 нм.
К недостаткам этого способа следует отнести относительно высокую сложность и наличие эффекта "гашения" сигнала, свойственный всем флуориметрическим методам.
Известен также способ [Bessey О. Л. A method for the rapid determination of alkaline phosphatase with five cubic milimeters of serum / O. A. Bessey, О. H. Lowry, M. J. Brock // J. Biol. Chem. - 1946. - Vol. 164. - P. 321], в котором используется хромогенный самоопределяющийся субстрат - 4-нитрофенилфосфат, или п~нитрофенилфосфат (4-НФФ, или п-НФФ) и в связи с тем, что продукт его гидролиза обладает желтой окраской при рН реакционной среды, скорость ферментативной реакции контролируют по образованию иона 4-феноксида.
Однако этот способ также характеризуется относительно узкой областью применения.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения активности ЩФ в сыворотке крови методом конечной точки по Бессею, Лоури, Броку [Камышников B.C. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М.: МЕДпресс-информ, 2009.
896 с], основан на учете количества образовавшегося в результате ферментативного расщепления р-нитрофенилфосфата р-нитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание, а интенсивность окраски фотометрируемого раствора пропорциональна активности фермента. Для этого в пробирки вносят по 0,5 мл субстратно-буферного раствора, их содержимое прогревают при температуре 37°С в течение 5 мин, затем в опытные пробы добавляют по 50 мкл сыворотки, содержимое пробирок перемешивают и инкубируют 30 мин при температуре 37°С, после инкубации в каждую из пробирок вносят 5 мл раствора гидроксида натрия, а в контрольные пробы по 50 мкл сыворотки крови, содержимое пробирок перемешивают и фотометрируют в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 415 нм (фиолетовый светофильтр), полученные данные сравнивают с соответствующими данными контрольных проб, выполняемых для каждой исследуемой сыворотки крови, прежде всего, чтобы учесть мешающее определению влияние билирубина, и по разности абсорбции опытной и контрольной проб по калибровочной кривой оценивают активность фермента в размерности ммоль/(ч л).
Недостатком описанного способа является относительно низкая оперативность, обусловленная необходимостью использования контрольных проб для каждого исследуемого образца, а также достаточно узкая область применения для анализа активности ЩФ, обусловленная тем, что оно применимо к сыворотке крови.
В последнее время возросло внимание исследователей к изучению свойств слюны человека, как материала с уникальными свойствами и диагностическими возможностями. Исследование слюны относится к неинвазивным методам и проводится для оценки возрастного и физиологического статуса, выявления соматических заболеваний, патологии слюнных желёз и тканей полости рта, генетических маркёров, мониторинга лекарственных средств и др. Высоки потенциальные возможности
использования слюны с целью выявления системных заболеваний и локальных патологий. К числу наиболее диагностически важных параметров можно отнести активность ферментов слюны.
Задача, которая решается в изобретении, заключается в создании способа определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, который отличается более высокой оперативностью и более широкой областью применения, в частности, допускает использование в качестве биологической жидкости слюну человека.
Технический результат, который реализуется при использовании предложенного способа, заключается в повышении оперативности и расширении области применения способа для более широкого вида биологических жидкостей, в частности, слюны человека.
Предложенное изобретение основано на том, что, в слюне человека содержание билирубина ничтожно мало, в связи с чем отпадает необходимость использования контрольной пробы для каждого исследуемого образца, что существенно упрощает процедуру проведения анализа и значительно сокращает время и расход реагентов.
В соответствии с эти, поставленная задача решается, а требуемый технический результат достигается тем, что, в способе определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, получают исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости, проводят инкубацию полученной смеси с перемешиванием и определяют концентрацию белка после инкубации путем измерения оптической плотности смеси относительно холостой пробы и последующего расчета, согласно изобретению, что, при получении исходной смеси в качестве биологической жидкости используют слюну человека, а реагент готовят путем смешивания буферного раствора диэтаноламина 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/мл, после чего к 1 мл, при получении смеси к реагенту прибавляют 100 мкл
образца биологической жидкости, и после перемешивания полученной смеси инкубацию проводят в течение 5 мин при температуре 37°С и добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптическую плотность против холостой пробы при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в течение времени до 30 минут, а активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярного поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости, при этом, холостую пробу готовят в виде смеси реагента с дистиллированной водой в тех же количествах, что и исходной смеси и с проведением над ней тех же операций, что и для исходной смеси.
Предложенный способ определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях реализуется следующим образом.
В начале готовят реагент путем смешивания буферного раствора диэтаноламина 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/мл.
Далее готовят исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости при котором прибавляют к реагенту 100 мкл образца биологической жидкости, в качестве которой используют слюну человека.
Полученную смесь перемешивают и проводят ее инкубацию путем выдержки в течение 5 мин при температуре 37°С.
После инкубации добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптической плотности против холостой пробы, которую готовят и над которой проводят те же операции, что и смеси реагента с образцом биологической жидкости, но в которой вместо биологической жидкости используют дистиллированную воду в тех же количествах, при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, используя период времени до 30 минут, а
активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как: отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярного поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости.
Описанный способ повышает достигнуть требуемого технического результата, поскольку при его реализации повышается оперативность и расширяется область применения, поскольку он может быть использован, в частности, применительно к слюне человека.
Для подтверждения возможности использования слюны в качестве субстрата для определения активности ЩФ для клинической лабораторной диагностики проведен эксперимент, в котором принимали участие 15 добровольцев (возраст 20.2±1.3 года). Ранее было показано, что половая принадлежность не оказывает значительного влияния на состав слюны человека, поэтому при дальнейшем исследовании в группы были включены добровольцы обоих полов. Было проведено исследование воспроизводимости состава слюны человека при заборе образцов у одного и того же человека в течение недели с интервалом в 24 часа. Результаты приведены в таблице 1.
Среднее
20.7±0.9
Как видно из приведенных данных, наблюдаются колебания активности ферментов, однако статистически достоверных отличий между полученными значениями установить не удалось. После обработки данных по всем добровольцам определены "нормальные" значении активности ЩФ активности для возраста 20-22 года. Оно составило 19.8±0.7 Е/л.
Таким образом, в ходе проведенных исследований показано, что вариабельность суточных колебаний ферментативной активности не превышает статистически значимой погрешности эксперимента, что позволяет использовать полученные значения в качестве критериев нормы в клинической лабораторной диагностике при применении слюны в качестве биосубстрата.
Формула изобретения
Способ определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях, согласно которому получают исходную смесь реагента с образцом биологической жидкости, проводят инкубацию полученной исходной смеси с перемешиванием и определяют концентрацию белка после инкубации путем измерения оптической плотности исходной смеси относительно холостой пробы и последующего расчета, отличающийся тем, что, при получении исходной смеси в качестве биологической жидкости используют слюну человека, а реагент готовят путем смешивания буферного раствора диэтаноламина 1 ммоль/мл с магнием хлористым 0,5 мкмоль/мл и раствором р-нитрофенилфосфата 5 мкмоль/мл, после чего к 1 мл, при получении смеси к реагенту прибавляют 100 мкл образца биологической жидкости, и после перемешивания полученной смеси инкубацию проводят в течение 5 мин при температуре 37°С и добавляют в нее 1 мл раствора натрия гидроокиси 0,5 моль/л (20 г/л) и перемешивают с последующим измерением оптическую плотность против холостой пробы при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм в течение времени до 30 минут, а активность щелочной фосфатазы в Е/л рассчитывают, используя значение фактора, рассчитанное как отношение общего объема раствора в кювете к коэффициенту миллимолярного поглощения п-нитрофенола 18,75 и объему образца биологической жидкости, при этом, холостую пробу готовят в виде смеси реагента с дистиллированной водой в тех же количествах, что и исходной смеси и с проведением над ней тех же операций, что и для исходной смеси.
ЕАПВ/ОП-2
ЕВРАЗИЙСКОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО
ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
(статья 15(3) ЕАПК и правило 42 Патентной инструкции к ЕАПК)
Номер евразийской заявки: 201600526
Дата подачи: 29 июня 2016 (29.06.2016) Дата испрашиваемого приоритета:
Название изобретения: Способ определения активности щелочной фосфатазы в биологических жидкостях
Заявитель:
ТИТОВ Андрей Владимирович и др.
П Некоторые пункты формулы не подлежат поиску (см. раздел I дополнительного л иста) | I Единство изобретения не соблюдено (см. раздел II дополнительного листа)
А. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ: Согласно международной патентной классификации (МПК)
G01N 21/59 (2006.01)
Б. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК) G01N 21/59, 21/17, 21/62, 21/00, 21/64, 33/48
Другая проверенная документация в той мере, в какой она включена в область поиска:
В. ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ
Категория*
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
RU 2329509 С2 (ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ "ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СТОМАТОЛОГИИ И ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ХИРУРГИИ" ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ВЫСОКОТЕХНОЛОГИЧНОЙ МЕДИЦИНСКОЙ ПОМОЩИ) 20.07.2008, с. 4, строки 43-45, с. 5, строки 39-52, формула
Инструкция по применению набора реагентов для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке и плазме крови человека кинетическим методом "ЩФ-UTS". Утверждена приказом Росздравнадзора от 04.08.2009 №6235-Пр/09
Инструкция по применению набора реагентов для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке и плазме крови человека кинетическим методом (Щелочная Фосфа-таза ФС) Утверждена приказом Росздравнадзора от 30.10.2009 №8697-Пр/09
Справочник. Лабораторные методы исследования в клинике. Под редакцией прфессора В.В. Меньшикова, Москва, "Медицина" 1987, с. 206-27
| | последующие документы указаны в продолжении графы В Д данные о патентах-аналогах указаны в приложении
* Особые категории ссылочных документов:
"А" документ, определяющий общий уровень техники
"Е" более ранний документ, но опубликованный на дату подачи евразийской заявки или после нее
"О" документ, относящийся к устному раскрытию, экспонированию и т.д.
"Р" документ, опубликованный до даты подачи евразийской
заявки, но после даты испрашиваемого приоритета "D" документ, приведенный в евразийской заявке
"Т" более поздний документ, опубликованный после даты приоритета и приведенный для понимания изобретения
"X" документ, имеющий наиболее близкое отношение к предмету поиска, порочащий новизну или изобретательский уровень, взятый в отдельности "Y" документ, имеющий наиболее близкое отно
поиска, порочащий изобретательский уровень в сочетании с другими документами той же категории " &" документ, являющийся патентом-аналогом "L" документ, приведенный в других целях
Дата действительного завершения патентного поиска:
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ, 125993,Москва, Г-59, ГСП-3, Бережковская наб., 30-1.
Факс: 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Телефон № (495) 531-6481
02 декабря 2016 (02.12.2016)
Т.Ф. Владимирова