EA201600409A1 20171130 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2017\PDF/201600409 Полный текст описания [**] EA201600409 20160622 Регистрационный номер и дата заявки EAA1 Код вида документа [PDF] eaa21711 Номер бюллетеня [**] КРАСНЫЙ ПИГМЕНТ ГРУППЫ АНТРАХИНОНОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАСНОГО ПИГМЕНТА ШТАММА ГРИБА PENICILLIUM OXALICUM VAR. ARMENIACA, ПРОДУКТ СПОСОБА, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ Название документа [8] C07C 50/18, [8] C07C 50/20, [8] C07C 65/28, [8] C12P 15/00, [8] A61K 31/122, [8] A61K 31/216, [8] A61P 35/00, [8] C12R 1/80 Индексы МПК [CZ] Сардарян Эдуард Оганестович Сведения об авторах [AM] САРДАРЯН ГАГИК ЭДУАРДОВИЧ, [CZ] САРДАРЯН ГУРГЕН ЭДУАРДОВИЧ Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201600409a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Предложен способ получения экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, который обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток и не проявляет негативных побочных эффектов на организм человека. Препарат не обладает цитотоксическим и мутагенным эффектом и не накапливается в организме. Полученный продукт с высокой противоопухолевой активностью может применяться в качестве лечебно- профилактического средства для лечения опухолевых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак печени, легочной карциномы, хронического лейкоза и обширной гепатоцеллюлярной карциномы.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Предложен способ получения экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, который обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток и не проявляет негативных побочных эффектов на организм человека. Препарат не обладает цитотоксическим и мутагенным эффектом и не накапливается в организме. Полученный продукт с высокой противоопухолевой активностью может применяться в качестве лечебно- профилактического средства для лечения опухолевых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак печени, легочной карциномы, хронического лейкоза и обширной гепатоцеллюлярной карциномы.


Евразийское (21) 201600409 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2017.11.30
(22) Дата подачи заявки 2016.06.22
(51) Int. Cl.
C07C 50/18 (2006.01) C07C 50/20 (2006.01) C07C 65/28 (2006.01) C12P15/00 (2006.01) A61K31/122 (2006.01) A61K31/216 (2006.01) A61P35/00 (2006.01) C12R 1/80 (2006.01)
(54) КРАСНЫЙ ПИГМЕНТ ГРУППЫ АНТРАХИНОНОВ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАСНОГО ПИГМЕНТА ШТАММА ГРИБА PENICILLIUM OXALICUM VAR ARMENIACA, ПРОДУКТ СПОСОБА, ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ И СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ И/ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
(96) EA/AM2016/000002 (AM) 2016.06.22
(71) Заявитель:
САРДАРЯН ГАГИК ЭДУАРДОВИЧ (AM); САРДАРЯН ГУРГЕН ЭДУАРДОВИЧ (CZ)
(72) Изобретатель:
Сардарян Эдуард Оганестович (CZ)
(74) Представитель:
Баландина Л.А. (RU)
(57) Предложен способ получения экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, который обладает высокой ингибирующей активностью по отношению к росту опухолевых клеток и не проявляет негативных побочных эффектов на организм человека. Препарат не обладает цитотоксическим и мутагенным эффектом и не накапливается в организме. Полученный продукт с высокой противоопухолевой активностью может применяться в качестве лечебно- профилактического средства для лечения опухолевых заболеваний, таких как рак молочной железы, рак толстой кишки, рак печени, легочной карциномы, хронического лейкоза и обширной гепатоцеллюлярной карциномы.
Соединение, способ получения экзогенного красного пигмента штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, продукт способа, его применение, фармацевтическая композиция и способ профилактики и/или лечения
онкологических заболеваний Область техники Настоящее изобретение относится к области биотехнологической и фармацевтической промышленности, в частности, к способу получения экзогенного красного пигмента штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, продукту, полученному в соответствии с заявленным способом, фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного агента экзогенный красный пигмент, и способу лечения онкологических заболеваний.
Уровень техники.
Известен штамм ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, выде ленный из солончаковых почв Араратской долины, обладающий свойством продуцировать экзогенный красный пигмент, который обладает способностью ингибировать рост некоторых линии опухолевых клеток, зарегистрированный в Международном Депозитарии Чешской коллекции производственных микроорганизмов Университета имени Масарика, г. Брно, под инвентарным номером ССМ 8374 (патент CZ №. 302 696).
Однако противоопухолевая активость экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС ССМ 8374 в соответствии с патентом CZ №. 302 696, не является достаточно эффективной для использования в терапевтичских целях для лечения онкологических заболеваний. Следовательно, актуальной является задача получения экзогенного красного пигмента с эффективной противоопухолевой активностью, пригодной для использования в терапевтичских целях.
Краткое описание изобретения
Автор изобретения впервые разработал способ получения экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС, который позволил поличить пигмент с эффективной противоопухолевой активностью. Относительно известного способа (патент CZ №. 302 696) в заявленном способе оптимизированы параметры ферментационного процесса, такие как количество растворимого кислорода (аэрация), регулирование величины рН питательной среды, которые оказывают влияние как на количество, так и на качество крсного пигмента, а также очистки экзогенного красного пигмента с малым содержанием сопутствующих примесей, которые неожиданно приводят к получению пигмента, обладающего высокой противоопухолевой активностью.
Другим аспектом изобретения является продукт, полученный в цоотзетствии с заявленным способом, имеющий ароматический скелет хиноидного типа и входящий в группу антрахинонов.
Ещё одним аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вещества экзогенный красный пигмент, полученный заявленным способом. В предпочтительном воплощении композиция представляет капсулу или таблетку, содержащую от 30 до 100 мг активного вещества (пигмента).
Изобретение также относится к применению экзогенного красного пигмента, полученного заявленным способом, в качестве противоопухолевого лечебно-профилактического средства и способу лечения онкологических заболеваний.
Подробное описание изобретения Автор изобретения впервые разработал способ получения экзогенного красного пигмента, продуцируемого штаммом ЕС, который позволил получить пигмент с эффективной противоопухолевой активностью.
Одним из аспектов изобретения является соединение 8-этил-3,6-дипядрокси-5 [(1Е)-3-метилбута-1,3-диен -1ил)] -9,10 диоксо дигидроантрацен -2
карбоновой кислоты метиловый эфир., представляющий красный пигмент группы антрахинонов и являющийся метаболитом штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, формулы 1:
Формула I
Другим аспектом изобретения является способ получения экзогенного красного пигмента штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, предусматривающий ферментацию штамма глубинным методом культивирования в аэробных условиях при концентрации растворимого воздуха 80-95 %, при автономно регулируемого грибом рН от 5,8 до 6,4 в период культивирования гриба в жидкой органической питательной среде, разделение пигмента из культуральной жидкости с последующей очисткой, отличающийся тем, что очистку осуществляют в два этапа, причём второй этап очиски осуществляют путем нейтрализации рН культуральной жидкости до величины рН= 6,8-7,2 и центрифугируют при 15 000-20 000 об/мин для освобождения от нерастворимых высокомолекулярных примесей при данной величине рН (Пример 1).
Стадия роста гриба- продуцента составляет от 20 до 25 часов, стадия биосинтеза пигмента составляет 64-68 часов, где количество пигмента достигает в среднем 7 -9 г/л.
После второго этапа очистки проводят ультрафильтрацию на мембранах 300 - 500 Дальтон для освобождения от низкомолекулярных солей и избыточной
воды, с получением концентрата, содержащий 120- 200 г / л пигмента. Продукт, полученный в соответствии с предложенным способом имеет степень очистки 80-90 %. и соотношение пиков Ка = 1,45-1,55 (Пример 1).
В одном из вариантов способа полученный концентрат, содержащий 120150 г / л пигмента добавляют инертные носители мальтодекстрин или крахмал и сушат в распылительной сушилке при 180 до 220 ° С с получением конечного продукта в виде сухого порошка от розового до темно красного цвета, содержащего от 20 % до 50 % красного пигмента с носителем от 80 % до 50 % соответственно.
Ещё одим аспектом изобретения является продукт, полученный согласно предложенному способу со степенью очистки 80-90 %. и соотношением пиков Кв= 1,45-1,55.
Ещё одним аспектом изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вешества соединение 8-этил-3,6-дигидрокси-5 [(1Е)-3-метилбута-1,3-диен -1ил)] -9,10 диоксо дигидроантрацен -2-карбоновой кислоты метиловый эфир или продукт предложенного способа в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Для получения фармацевтических композиций согласно изобретению используют любые фармацевтически приемлемые эксципиенты или растворители. Для перорального введения фармацевтическая композиция может принимать форму растворов, суспензий, таблеток, пилюль, капсул, порошков. Таблетки, содержащие различные наполнители, например, цитрат натрия, карбонат кальция и фосфат кальция или любые другие фармацевтически приемлемые наполнители, могут также включать различные дезинтеграторы, например, крахмал, предпочтительно картофельный крахмал или тапиоку, сложные силикаты или любые другие фармацевтически приемлемые дезинтеграторы, вместе со связывающими веществами, например,
поливинилпирролидоном, сахарозой, желатином, аравийской камедью и любыми другими фармацевтически приемлемыми связывающими веществами. Кроме того, часто применяются скользящие вещества, например, стеарат магния, лаурилсульфат натрия, тальк для таблетирования или любые другие фармацевтически приемлемые скользящие вещества. Композиции согласно изобретению также могут представлять собой мягкие или твердые заполненные желатиновые капсулы; предпочтительные в этом случае капсулы включают, например, лактозу или молочный сахар, а также полиэтиленгликоли с высоким молекулярным весом. Если для перорального введения желательны водные суспензии и/или эликсиры, заявленные композиции могут сочетаться с различными подслащивающими средствами, улучшающими вкус и запах, подкрашивающими веществами, эмульгирующими веществами и/или суспендирующими средствами, а также растворителями, такими как вода, этанол, пропиленгликоль, глицерин и различными их комбинациями. Для парентерального введения могут использоваться растворы в кунжутном или арахисовом масле или в водном пропиленгликоле, так же как и стерильные водные растворы соответствующих водорастворимых солей. Такие водные растворы могут быть соответственно буферными, если необходимо, и водный растворитель сначала изотонируют с помощью достаточного количества раствора соли или глюкозы. Эти водные растворы особенно подходят для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрибрюшинного введения.
Изобретение относится также к применению вышеуказанных композиций и продукта предложенного способа для лечения и/или предупреждения онкологических заболеваний. Суточная доза зависит от тяжести заболевания, веса пациента и желаемого эффекта. Дозу устанавливают индивидуально, в зависимости от переносимости и клинической эффективности. В наиболее предпочтительном варианте суточная доза составляет 30-100 мг.
Противоопухолевые свойста продукта изобретения ( 8-этил-3,6-дигадрокси-5 [(1Е)-3-метилбута-1,3-Диен -1ил)] -9,10 диоксо дигидроантрацен -2-карбоновой кислоты метиловый эфира) были исследовано в экспериментах на животных с трансплантированными опухолями:
Меланомы В16 - мыши линии C57BL6, СТ26 рака толстой кишки - мыши линии BALB /с, рака 4Т1-молочной железы - мыши линии BALB /с, карциномы легких Льюиса - мыши линии С57 BL /6, L1210 лейкемии - мыши линии DBA2, и рака толстой кишки (НСТ-116) на голых мышах (Пример 5).
Из полученных результатов видно, что тестированный препарат изобретения ингибирует рост опухолей более эффективно, чем известный продукт. В отличие от известного пигмента, резко тормозит рост опухолевых клеток меланомы В16, карциномы Льюиса и лейкемии L1210.
Таким образом, результаты экспериментов свидетельствуют, что продукт, полученный согласно изобретению, обладает высокой противоопухолевой активностью, значительно подавляя рост раковых клеток , тем самым сильно снижая риск формирования различных линии опухолей.
Продукт, полученный в соответствии с предложенным способом может быть использован:
- Для лечения преканцерозов различных органов, является дополнением при лечении злокачественных опухолей;
- Для ингибирование роста опухолевых клеток, блокирования образования и предотвращения рост раковых клеток;
- При высоком риске развития опухолей рака молочной железы;
- С целью препятствия злокачественной трансформации;
- В качестве адъювантной терапии в лечении злокачественных новообразований;
- Для улучшения общей переносимости организма при химио и радио терапии
Характеристики штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca
Штамм EC является непатогенным, не вызывает микозы и не продуцирует микотоксины: афлатоксины (Bl, В2, Gl, G2), Т-2 токсин, Охратоксин, Стергмататоксицин и D-секалоновую кислоту. Эти соединения не были обнаружены в мицелии в культуральной жидкости и в конечном продукте (пигменте).
Производственный активированный штамм ES был получен из маточной культуры гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca методом культивирования на органических питательных средах с предшественниками, способных регулировать направленный биосинтез путем активации ферментных систем, участвующих в метаболизме экзогенного красного пигмента. Во время исследования небыли использованы мутагенные химические вещества или методы вызывающие генетические изменения.
Из полученных результатов эксперимента обнаруживалось, что среди 39 аминокислот в формах L -, D -, и DL наиболее подходящим предшественником оказались L-тирозин и L-диоксифенилаланин, обладающих способностью стимулипровать биосинтез экзогенного красного пигмента.
Культивирование проводилась в течение 7-8 поколений. Колонии переносили в среду оптимальную для биосинтеза пигмента, т.е. в отвар капусты или кукурузный экстракт (20 г / л) или в дрожжевой экстракт (7 г / л) с добавлением сахара (20 г / л).
Штамм ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, полученный из маточной культуры держали в активном состоянии методом последующих пересевов.
Штамм ЕС продуцирует пигмент в количестве 5-10 г / л Морфологические признаки:
Диаметр колонии штамма ЕС в монокультуре на 3-ие сутки инкубации достигает 1,5-2,0 см, а на 5-6-ые сутки роста 4,0- 5,0 см. Колония гладкая с
ровной поверхностью, бархатистая, пушистая, невыпуклая, сегментации отсутствуют, не наблюдается появление экссудата и запаха при росте гриба.
В растущей культуре гриба наблюдается обильное спорообразование, биомасса на 5-6 сутки инкубации становится порошкообразной, рассыпчатой, сыпучей и легко распадается в виде порошка при встряхивании чашки Петри. Мицелии короткие, не срастаются в агар, на ранней фазе роста окрашены в серовато- белый цвет, в последующие стадии роста становятся зелеными, а далее при старении культуры - темно-зелеными. У растущего края колонии наблюдается присутствие белой полосы маргинальной зоны шириной 0,5-1,0 см. Хорошо растет при температуре 27-29 ° С.
Штамм ЕС относится к числу стабильных аэробных микроорганизмов, не растет на питательных средах с агаром при глубинном росте без доступа кислорода, а при культивировании в жидких питательных средах в отсутствии воздуха (аэрации) при глубинном росте образуется хлопкообразная масса, пигментообразование почти прекращается. Культуральные характеристики:
При посеве нового штамма ЕС на чашки Петри на агаризованных синтетических питательных средах наблюдается сильное торможение роста в виде тонкого покрова (пленки). На органических средах в ранних стадиях развития культуры питательная среда окрашивается в розовый цвет, который в более поздних стадиях динамично усиливается и полностью диффундируется в питательную" среду, интенсивно окрашивая последний в тёмно-красный цвет. Примеры.
Пример 1. Получение красного пигмента 1. Ферментация
При глубинной ферментации нового производственного штамма- продуцента в процессе культивирования большое влияние на биосинтетическую активность и на качество пигмента оказывают количество растворимого воздуха и значение
рН ферментационной среды, которые способствуют балансированию окислительно- восстановительных процессов, приводящих к улучшению направленного биоснтеза, а также увеличению скорости утилизации углеводов и органического азота.
Ферментацию проводили глубинным методом в ферментерах при остаточном давлении 0,02-0,03 мПа при температуре в пределах от 27 до 29° С, при непрерывном перемешивании со скоростью 280-320 мин"1 с помощью двухъярусной мешалки с подачей стерильного воздуха в количестве, обеспечивающем растворимость от 80 до 90 % в ферментационной среде. Проведенные производственные ферментации в указанных условиях показали, что оптимальная растворимость воздуха в питательной среде в период культивирования находится в пределах от 85 % до 90 %, которые следует считать оптимальными, так как увеличивается количество пигмента и показатель качества (соотношение пиков) полученного конечного продукта составляет от 1,45 до 1,55.
Количество ниже минимальной границы растворимого кислорода приводит к дефициту, в результате чего повышаются окислительные процессы, которые способствуют снижению рН= 4,5, приводят к угнетению биосинтетической активности и сильной деградации качества пигмента с низким показателем от 0,9 до 1,1.
Изучение влияния как начальных величин рН от 4,0 до 8,0 ферментационной среды, так и при его регулировании в процессе ферментации в разных фазах роста и развития гриба показало, что существует тенденция саморегулирования грибом значения рН питательной среды, то есть, в кислой среде (рН=4,0) в стадии активного роста гриба происходит нормализация рН (рН= 5,5-6,4), а в среде со значениями рН= 7,5-85 происходит снижение рН до стандартного критерия (рН= 5,6-6,4). Однако во время нормализации при низких значениях наблюдается сильное блокирование активности ферментных
систем, ответственных за метаболизм пигмента. Аналогичное наблюдается также при высоких значениях рН.
Экспериментально было установлено, что штамм ЕС при ферментации обладает способностью нормализовать рН путем саморегулирования, а эффективной стабильной начальной величиной является рН = 5,6 - 6,4, при которой поддерживается на максимальном уровне активность биосинтеза пигмента с высоким качественным показателем при нормальном росте и развитии гриба- продуцента.
Технологические показатели ферментации представлены в таблице 1. Таблица 1
1. Продолжительность ферментационного процесса
68-72 часов
2 . Средняя ферментативная активность гриба
12,0-13,5 г/л
3. Кристаллический сахар
14- 18 г/л
4. Дрожжевой экстракт +Кукурузный экстракт
2,5-3,5+ 2,5-3,5 г/л
5. Количество образования биомассы в конце
3,0-4,5 % от объёма
6. Количество посевного материала
2,0-3,5 % от объёма
7. Оптимальная температура культивирования
26- 30° С
8. Количество растворимого воздуха в среде
85 - 90 %
9. Интенсивность перемешивания
280-320 мин1
10. Рабочее давление в ферментёре
0,02-0,03 мПа
11. Количество пеногосителя (полпроилен гликоль)
0,02-0,03 % от объёма
12. Начальный рН питательной среды
5,6-6,4
2. Отделение биомассы от культуральной жидкости;
С целью максимального растворения пигмента после завершения ферментации остаточное давление в ферментере снижают до нуля добавлением раствора аммиака рН ферментационной среды доводят до 9.0-9.5 и перемешивают 50-55 мин при 35-40° С до стабилизации рН. В случае снижения рН доводят до начальной величины и продолжают перемешивание 20-25 мин. Далее отделяют биомассу гриба от культуральной жидкости, содержащей пигмент центрифугированием при 3 000-5 000 об/мин.
3. Очистка
Очистку осуществляют путем нейтрализации рН культуральной жидкости до величины 5,5-6,0 и центрифугируют при 15 000-20 000 об/мин для освобождения от нерастворимых высокомолекулярных примесей при данной величине рН.
Далее осуществляют нанофильтрацию с применением мембранного фильтра с пропускаемостью 300 Дальтон с целью удаления избыточной воды и освобождения от микромолекулярных примесей до получения концентрата в объеме 200-250 л с концентрацией пигмента в растворе до уровня 150-200 г/л.
Технологические параметры нанофильтрации представлены в таблице 2.
Таблица 2
Наименование
Показатели
1 .Размеры пористости мембран
250 и 300 Дальтон
2. рН культуральной жидкости
5,5-6,0
3.Температура фильтрующей жидкости
50-60° С
4. Рабочее давление
0,55-0,60 мПа
Количество пигмента в концентрате определяют спектрометрически согласно формуле:
W= А х R х V где: W- количество пигмента в концентрате в гр/л.
А- величина поглощения в видимой области Амах = 494 нм R- разведение
V- объём концентрата на литр Нарушение факторов начальной рН питательной среды и количество растворенного кислорода оказывают большое влияние на производительность и при отклонении от нормального, приводят к резкому угнетению ферментативной активности, в результате чего снижается не только количество пигмента, но и происходит качественное изменение, которое выражается в снижении соотношения пиков максимумов Амах А2 : Хмяк А1 до величины 0,9-1,1, тогда как
этот показатель в конечном продукте в соответствии с предложенным способом доходит до 1,45-1,55.
Качество пигмента определяют спектрометрически по соотношению величины пиков в видимой области спектра Хмах А2 = 494 / Амах А1= 420, где величина, достигаемая согласно заявленному способу, составляет 1,45-1,55.
Ка ^мах А2 . Амах А1
Контроль стандарта качества пигмента в процессе ферментации осуществляют спектральным отличием в соотношениях пиков поглащения в видимой области А,мах А2 / Амах А1, которые изменяются в зависимости от срока ферментации: через 32 часа инкубации составляют 0,9; через 48 часов соотношение пиков увеличивается на 1,20, а в конце ферментации достигает от 1, 45 до 1,55. При остаточном количестве углеводов 0,15-0,2 г/л в ферментационной среде при таких показателях конечный продукт считается качественным. 4. Сушка:
После получения концентрата в раствор пигмента добавляют инертные носители (мальтодекстрин, крахмал или поваренная соль). Содержание пигмента в концентрированном растворе составляет от 30 % до 50 % с носителем от 70 % до 50 %, который сушат с помощью распылительной сушки при температуре 280-320° С. Высыхая, продукт под действием силы тяжести опускается на дно сушильной камеры, где он собирается и непрерывно выводится из зоны сушки. В результате сочетания с невысокой температурой диспергируемых частиц пигмента позволяет получить высококачественный сухой порошкообразный продукт без вкуса и запаха темно-красного цвета и кроваво-красный в водном растворе с влажностью от 5 до 6 %. Во время этого процесса происходит интенсивный массо- и теплообмен, где диспергированные частицы пигмента теряют влагу за довольно небольшой промежуток времени.
Сушка проходит практически мгновенно, при этом температура у частиц продукта в сушильной камере практически равна температуре испарения чистой влаги. Такой метод сушки не вызывает денатурацию свойств или качественные изменения пигмента.
Оценка конечного продукта:
Производство красного пигмента является экологически чистым и безопасным, так как в качестве компонентов ферментационной питательной среды используются кристаллический сахар и дрожжевой экстракт, а при изоляции применяются методы центрифугирования и нанофильтрации без применения агрессивных химических соединений.
Конечный продукт содержит низкое количество вредных элементов (кадмия, ртути, свинца, мышьяка).
В пигменте содержится определенное количество аминного азота, которое при перерасчете на общий белок (N х 6,25) составляет 4,35 % и находится в пределах толерантности, а не является белками или пептидами животного происхождения.
Содержание неутилизированного грибом сахара в конце ферментации в культуральной жидкости составляет 0,2-0,25 г/л, что одновременно является показателем качества конечного продукта.
В конечнем продукте содержится лимитированное количество вредных элементов (кадмия, ртути, свинца, мышьяка), которое соответствуют допустимым стандартам.
В продукте не обнаружено присутствие щавелевой кислоты, микотоксины и прочие биологически активные соединения, которые могут сформироваться грибом в процессе ферментации.
Продукт не содержит наиболее распространенные микотоксины: афлатоксины Bl, В2, G1 и G2, Охратоксин, токсин Т-2, Стеригмататоксицин и
Д- Секалоновая кислоту. Эти соединения не были обнаружены как в биомассе гриба в культуральной жидкости, так и в конечном продукте.
Процесс ферментации протекает в асептических условиях и полученный концентрат, который является основным продуктом перед добавлением инертного носителя, практически является стерильным, а процесс сушки может только способствовать уменьшению количества микроорганизмов, которые могут присутствовать в виде случайного загрязнения от инертного носителя.
Красный пигмент, полученный в соответствии с заявленным способом не обладает цитотоксической активностью Определение содержания красного пигмента в образце:
Взвешивают 10 мг сухого порошка пигмента и растворяют при перемешивании в 100 мл дистиллированной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу и дистиллированной водой доводят объем до 1000 мл и перемешивают. После полного растворения пигмента измеряют максимум поглощения в видимой области при длине волны Амакс.= 494 нм против дистиллированной воды.
Процентное содержание вещества (X %) рассчитывают согласно формуле:
100 х Ах 100
X (%)
1,05 х W
где: А - величина поглощения при длине волны 1,05 - константа
W - вес образца (10 мг в 1000 мл дистилированной воды) Физико-химические свойства продукта, полученного согласно предложенному способу.
В видимой области спектра поглощения вещество имеет два характерных пика максимумов поглощения при X мах А1 = 420 нм и X мах А2 - 494 нм,
последний из которых является доминирующим. Соотношение А2 и А1 пиков определяет качество пигмента.
Растворимость: в воде, в ледяной уксусной кислоте, в этаноле и в изопропиловом спирте.
Стабильность: Вещество устойчиво в нейтральном (рН= 7,0-7,2), в щелочном ( рН= 8,0-9,0), водных растворах и в ледяной уксусной кислоте. При кипячении в течение 30-35 мин, не наблюдается как количественное, так и качественное изменение спектра поглащения в видимой области.
Влажность
Содержание пигмента Зола
Азот (аминный) Тяжелые металлы:
Мышьяк Свинец Ртуть Кадмий
Микробиологическая чистота:
Всего бактерий
Общее количество грибов и дрожжей
Сальмонелла
E.coli
84,42 % 12%
2,94 (N х 6,25)
не более 0,015 мг / кг не более 0,009 мг / кг не более 0,0048 мг / кг не более 0,036 мг / кг
Метод определения
Аналитический Спектрометрия Гравиметрия Титрование
AAS-гибриды AAS-кювета AAS-AMA ААС-кювета
Пример 2. Определение структуры красного пигмента продуцируемый производственным штамом гриба Penicillium oxalicum var.Armeniaca.
Определение структуры осуществлялось с помощью хроматографического разделения и спектральных анализов (ИК, УФ, ЯМР, ВЭЖХ системы с нормальной фазой и использованием диода детектора - DAD и ИК-спектра). Характеристика молекулярной массы пигмента была получена методами LDI (Laser Desorption Ionization) и MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization).
Согласно данным, полученным методом MALDI масс-спектров, молекулярная масса хромофора равна 392 и этот хромофор по крайней мере имеет три в значительной степени кислые группы для того, чтобы связывать катионы натрия (щелочных металлов); одна группа сильнее, а две другие, в соответствии с высокой насыщенностью, слабее; это может касаться, например, карбоксильной или карбонильной групп, фенольных гидроксилей, которые в газовой фазе переходят в енольное состояние.
Из полученных данных 13С-ЯМР - спектров, можно сделать вывод, что только 3 синглета (изолированных, не связанных протонами) и, по крайней мере, один дублет неароматических СН = СН группы принадлежат к основным хромофорам:, и именно этот хромофор содержит скелетные карбонилы и не менее двух фенольных гидроксильных групп, прикрепленных к нему, а именно к его четвертичным атомам углерода.
В ИК- спектрах обнаружены следующие характерные группы:
- Эфиры и лактоны (1710-1750 см-1) алифатические выше, т.е, на сопряженные скелеты ниже; пяти членов циклы около 30 см-1, которые сопровождаются полосами валентных колебаний в районе 1000 -1300 см-1.
- Карбоновые кислоты (1680-1730 см-1 диммеры, около 1760 см""1 мономеров, алифатические выше, на сопряженные скелеты ниже в сопровождении полос валентных колебаний С-О при 1300 см-1 и широкая полоса моста гидроксильных групп в области 2500 - 3500 см"1.
- Полоса водородных связей кислот и связи С-Н альдегидов по сравнению с 4-6 на бензойной и коричной кислотах, из которых ясно, что, в соответствии с положениями дублета в 2530 см-1 и 2620 см-1 альдегид, очевидно, относится к фиолетовой части. С другой стороны, вполне вероятно, что он относится к карбонильной карбоксильной группе -СООН.
- В спектрах альдегиды, ароматические гидроксильные кислоты, такие как альдегид 2,2-оксибензойной кислоты, структурный мотив может
-
рассматриваться в случае пигмента группы, имеющей С-Н альдегид, который почти невидно, вероятно, из-за водородных связей между карбонильными группами альдегидов и фенольного водорода. Эта связь является причиной низкого поглощения карбонильных групп как 1634 см-1, которые почти в 100 см-1 меньше, чем это наблюдается среди других пигментов антрахиноновой природы.
На основе полученных спектральных анализов было установлено, что изолированный пигмент, продуцируемый штаммом ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca по химической структуре имеет ароматический скелет хиноидного типа и как новое своеобразное, индивидуальное производное входит в группу антрахинонов:
Класс: АНТРАХИНОН
Химическая суммарная формула: Сгз Нго Об
Молярная масса: 392 г моль"1
Химическая структура:
Химическое название (согласно IUPAC): 8 - этил - 3,6 -дигидрокси -5 [(1Е)-3 -метилбута - 1,3 - диен - 1ил)] - 9,10 диоксо дигидроантрацен - 2 -карбоновой кислоты метиловый эфир. Пример 3. Токсикологические исследования
Токсилогические исследования были проведены в соответствии с руководящими принципами ОЭСР (OECD) для тестирования химических
веществ, которые обеспечивают полный спектр токсикологических исследований, сосредоточенных на выявлении побочных эффектов пигмента на живые организмы.
1. Острая оральная токсичность на мышах
2. Острое раздражение глаз /Острое кожное раздражение
3. 90-дневное хроническое токсикологическое исследование на крысах
4. Потенциальный токсический эффект
5. 14-дневное экспериментальное исследование на крысах и на собаках
6. Псевдоаллергические реакции (острые и хронические воспаления)
7. Бактериальный тест обратной мутации
8. Микроядерный тест на эритроцитах
Полученные результаты токсикологических исследований показали, что пигмент не оказывает токсического действия и не имеет побочного негативного влияния:
- на изменение состава и улучшение реологических параметров крови, понижение уровня молочной кислоты в мышцах, повышение уровеня гемоглобина.
- улучшение коронарного и мозгового кровообращения, нормализацию артериального давления
- нарушение функции печени, почек, желудка, кишечника и надпочечников
- в высоких концентрациях (1000мг/кг/день) не оказывает негативного влияния на количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина, гематокрита, WBC, дифференциальных параметров, утолщения крови и на биохимические показатели глюкозы, натрия, калия, мочевины, креатикина, ALP, АЛТ, ACT, билирубина, холестерина, общего белка, альбумина и глобулинов.
- не обнаружено побочных реакций как, например, кожной сыпи, аллергии, раздражения или других негативных симптомов.
-
Цитотоксичность:
Полученные результаты цитотоксической активности красителя проявляются при невероятно высоких концентрациях (0,83-1,12 мг/мл), которые на несколько порядков выше цитотоксической активности (IC50) известных антибиотиков, у которых она проявляется при концентрациях 0,001-0,01 мг / мл. То есть, разница в критической концентрации цитотоксической активности красного пигмента ниже примерно на шесть порядков. Потенциальная цитогенетическая активность:
Было установлено, что пигмент не обладает цитогенетической активностью в тесте на индукцию хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей во всех диапазонах изученных доз. Иммунотоксичность:
Введение пигмента во всех исследованных дозах не оказывало влияния на жизнеспособность клеточных элементов исследованных органов иммунной системы, пигмент не оказал влияния на массу и на клеточные структуры органов иммунной системы, ни в селезенке, ни в лимфоузлах, а также костном мозге экспериментальных мышей. Пигмент не обладает иммунотоксическими свойствами.
Антибиотическая активность:
Были исследованы тест микроорганизмы: Staphylococcus aureus АТСС 6538, Escherichia coli АТСС 11229, Bacillus cereus АТСС 2, Bacillus circulans Вас 6/79, Staphylococcus pyogenenes ATCC 12344 и Serratia marcescens 14041.
В опытах не наблюдается зоны подавления ни в одном из тест-бактериальных штаммов, которые указывают на отсутствие антибиотической активности испытуемого красителя. Полученные результаты эксперимента показывают, что пигмент не оказывает угнетающего влияния на вышеупомянутые микроорганизмы. Пример 5. Противоопухолевая активность
Влияние продукта изобретения на рост следующих опухолей проводился согласно методике, описанной в патенте CZ 302696:
1. Меланома В16 - мыши линии C57BL6.
2. СТ26 рак толстой кишки - мыши линии BALB /с.
3. Рак 4Т1-молочной железы, - мыши линии BALB /с.
4. Карцинома легких Льюиса - мыши линии С57 BL /6.
5. L1210 лейкемии - мыши линии DBА2 мышей.
6. Рак толстой кишки (линия НСТ-116) на голых мышах Опухолевые клетки вводились мышам подкожно в правый бок в количестве
1x107 клеток/мышь, за исключением меланомы В16, где вводили 2х 10б опухолевых клеток. В исследованиях использовали самок инбредных мышей с весом 18-20 г. линий DBA 2, BALB/C и С57В16. За день до инокуляции осуществляли анализ крови, полученной из глазного сплетения. Спустя 24 часа после забора крови вводили перорально ежедневно пигмент согласно изобретению в дозе 200 мг/кг. Контрольным мышам вводили физ. раствор в том же объёме. Другой группе мышей вводили известный продукт (патент CZ 302696).
Расчет проводили в соответствии с процентом TGI (ингибирование роста опухоли): % TGI = V (экспериментальная группа) / Vi (контрольная группа -мыши без применения препарата, трансплантированные соответствующими опухолевыми клетками) х 100
Достигнутый % торможения роста опухоли (%TGI)
Опухоль
10-й день
21-й день
31-Й
день
Меланома В16
20,68*
27,8
36,06 *
39,15
16,36*
26,30
СТ-26 рак толстой кишки
52,33*
56,27
48,76 *
58,76
56,29*
79,12
4Т1 рак молочной железы
33,21*
41,27
34,41*
37,01
30,19*
35,39
Карцинома легких Льюиса
14,89*
24,80
1,89*
11,58
L1210 лейкемия
57,18*
67,18
15,08*
35,28
7,0*
27,05
Рак толстой кишки (НСТ-116)
84,03
79,48
68,36
*Данные согласно патенту CZ 302696
Из полученных результатов очевидно, что тестированный препарат изобретения ингибирует рост опухолей более эффективно, чем известный продукт. В отличие от известного пигмента, резко тормозит рост опухолевых клеток меланомы В16, карциномы Льюис и лейкемии L1210.
Таким образом, данные, представленные в таблице, свидетельствуют, что продукт, полученный согласно изобретению, обладает высокой противоопухолевой активностью, значительно подавляя рост раковых клеток , тем самым сильно снижая риск формирования различных линии опухолей
Продукт, полученный в соответствии с предложенным способом может быть использован:
- Для лечения преканцерозов различных органов, является дополнением при лечении злокачественных опухолей;
- Для ингибирование роста опухолевых клеток, блокирования образования и предотвращения рост раковых клеток;
- При высоком риске развития опухолей рака молочной железы;
- С целью препятствия злокачественной трансформации;
- В качестве адъювантной терапии в лечении злокачественных новообр;азований;
- Для улучшения общей переносимости организма при химио и радио терапии
Пример 6. Ферментационные питательные среды 1.
Сахар 10 - 15 г / л
Кукурузный экстракт 5 - 10 г / л
Сахар
Дрожжевой экстракт
11 - 17г/л 6 - 7 г / л
Сахар
Дрожжевой автолизат
12 - 20г/л
8 - Юг/л
Комбинированная питательная среда Дрожжевой автолизат + К}тсурузный экстракт
Сахар
Дрожжевой автолизат Кукурузный экстракт
Юг/л
2-5 г/л
2-5 г/л
Пример 7. Варианты ферментации
1. Ферментацию гриба осуществляют, как описано в примере 1, в ферментере в аэробных условиях при значениях рН= 6,0 до рН=6,2 при 27 до 29 ° С с получением пигмента при Ка = 1,55
2. Ферментацию гриба осуществляют, как описано в примере 1. В процессе ферментации растворимость кислорода составляет 80-90 %.
Ка =1,45-1,5
Остаточное количество углеводов 0,6-0,8 г/л Ферментация завершается через 68 - 72 часов.
3. Ферментацию гриба осуществляют в условиях примера 1. Для отделения от биомассы гриба и от макро-частиц осуществляют первичное центрифугирование при высоких значениях рН= 8,0-95
Ка =1,5-1,55
4. Ферментацию гриба осуществляют в условиях примера 1. Вторичное центрифугирование осуществляют при нейтральных значениях рН= 6,0-7,0 с целью освобождения от нерастворимых примесей при данном рН
Ка =1,5-1,55
Пример 8. Фармацевтические композиции
1. Продукт, полученный в соответствии с предложенным способом, гомогенизируют с фармацевтическим инертным наполнителем мальтодекстрином, получают в виде капсул или прессуют в таблетки, содержащие активное вещество в количестве 30 и 40 мг как противоопухолевый лечебный препарат
2. Продукт, полученный в соответствии с предложенным способом, гомогенизируют с фармацевтическим инертным наполнителем мальтодекстрином получают в виде капсул или прессуют в таблетки, содержащие активное вещество в количестве 100 мг как противоопухолевый лечебный препарат.
Формула изобретения
1. Соединение 8-этил-3,6-дигидрокси-5 [(1Е)-3-метилбута-1,3-диен-1 ил)] -9,10 диоксо дигидроантрацен -2-карбоновой кислоты метиловый эфир, представляющий красный пигмент группы антрахинонов и являющийся метаболитом штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var. Armeniaca, формулы 1:
Формула I
2. Способ получения экзогенного красного пигмента штамма ЕС гриба Penicillium oxalicum var . Armeniaca, предусматривающий ферментацию штамма глубинным методом культивирования в аэробных условиях при концентрации растворимого воздуха 80-95 %, при автономно регулируемого грибом рН от 5,8 до 6,4 в период культивирования гриба в жидкой органической питательной среде, разделение пигмента из культуральной жидкости с последующей очисткой, отличающийся тем, что очистку осуществляют в два этапа, причём второй этап очиски осуществляют путем нейтрализации рН культуральной жидкости до величины рН= 6,8-7,2 и центрифугируют при 15 000-20 000 об/мин для освобождения от нерастворимых высокомолекулярных примесей при данной величине рН. 4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что стадия роста гриба- продуцента составляет от 20 до 25 часов, стадия биосинтеза пигмента составляет 64-68 часов, где количество пигмента достигает в среднем 7 -9 г/л.
5. Способ по п. 2, отличающийся тем, что после завершения ферментации рН
среды доводят до 8,5 - 9,0 для увеличения растворимости пигмента, отделяют
биомассу и нерастворимые макро-частицы от культуральной жидкости
центрифугированием при 3 000-5 ООО тыс об/мин.
6. Способ по п. 2, отличающийся тем, что проводят после второго этапа очистки проводят ультрафильтрацию на мембранах 300 - 500 Дальтон для освобождения от низкомолекулярных солей и избыточной воды, с получением концентрата, содержащий 120- 200 г / л пигмента
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что в полученный концентрат, содержащий 120- 150 г / л пигмента добавляют инертные носители мальтодекстрин или крахмал и сушат в распылительной сушилке при 180 до 220 ° С с получением конечного продукта в виде сухого порошка от розового до темно красного цвета, содержащего от 20 % до 50 % красного пигмента с носителем от 80 % до 50 % соответственно
7. Продукт, полученный в соответствии со способом по любому из п.п.1-6 со степенью очистки 80-90 %. и соотношением пиков Ка = 1,45-1,55.
8. Применение соединения по п. 1 или продукта по п. 7 в качестве лечебно-профилактического противоопухолевого средства для профилактики и/или лечения онкологических заболеваний
9. Применение по п. 8, где онкологические заболевания выбирают из группы, включающей рак молочной железы, толстой кишки, рак печени, легочной карциномы, хронического лейкоза и обширной гепатоцеллюлярной карциномы
10. Способ лечения онкологических заболеваний, отличающийся тем, что пациенту вводят соединение по п. 1 или продукт по п.7 в терапевтически эффективном количестве.
11. Способ по п. 10, где онкологические заболевания выбирают из группы, включающей рак молочной железы, толстой кишки, рак печени, легочной карциномы, хронического лейкоза и обширной гепатоцеллюлярной карциномы
10.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного вешества соединение по п. 1 или продукт по п. 7 в терапевтически эффективном количестве и фармацевтически приемлемый наполнитель
13. Фармацевтическая композиция по п. 12, представляющая собой раствор для инъекций или твёрдую лекарственную форму, или капсулу.
14. Фармацевтическая композиция по п. 13, где капсула или таблетка содержат продукт по п. 7 в количестве 30-100 мг.
10.
ЕАПВ/ОП-2
ЕВРАЗИЙСКОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО
Номер евразийской заявки: 201600409
ОТЧЁТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
Номер евразийской заявки: 201600409
КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
С07С50/18 (2006.01) С07С50/20 (2006.01) С07С65/28 (2006.01) С12Р15/00 (2006.01) А61К31/122 (2006.01) А61К31/216 (2006.01) А61Р35/00 (2006.01) C12R1/80 (2006.01)
Дополнительный лист
(19)
(19)
(19)