|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Изобретение относится к биологии, биофизике и медицине, в частности к исследованию связывания флуоресцирующих лекарственных соединений (например, фотосенсибилизаторов) со стенками кровеносного сосуда ex vivo, и может найти применение при прогнозировании фармакокинетического поведения веществ в кровеносной системе, при отборе соединений, перспективных для использования в качестве сенсибилизаторов при нацеленном фотодинамическом воздействии на васкулярную систему органов, тканей или злокачественных новообразований. Предлагаемое изобретение направлено на решение задачи упрощения и удешевления способа определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo за счет обеспечения возможности непрерывной регистрации в режиме реального времени величины сигнала флуоресценции соединения в стенке образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo. Для решения данной задачи используется способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo, заключающийся в том, что образец кровеносного сосуда, закрепленный в держателе, помещают в заполненную буферным раствором кювету спектрофлуориметра в центр падающего пучка возбуждающего света, прокачивают через образец с заданной скоростью порции неокрашенной или окрашенной флуоресцирующим соединением перфузионной жидкости, непрерывно регистрируют в режиме реального времени величину сигнала флуоресценции соединения в стенке кровеносного сосуда и определяют параметры связывания/вымывания флуоресцирующего соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo, а также устройство, содержащее спектрофлуориметр с термостатируемым кюветодержателем, в котором размещена кювета с буферным раствором, держатель для фиксации образца кровеносного сосуда, включающий крышку с закрепленными в ней подводящим и отводящим патрубками, причем нижняя концевая часть подводящего патрубка изогнута с радиусом закругления 2,5-3 мм, а нижние концы патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм с герметично закрепленным на них образцом кровеносного сосуда; подводящий патрубок с помощью подводящей магистрали, снабженной трехходовым краном, подсоединен к емкости с перфузионной жидкостью; отводящий патрубок посредством отводящей магистрали подключен к перистальтическому насосу, обеспечивающему прохождение перфузионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной объемной скоростью.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к биологии, биофизике и медицине, в частности к исследованию связывания флуоресцирующих лекарственных соединений (например, фотосенсибилизаторов) со стенками кровеносного сосуда ex vivo, и может найти применение при прогнозировании фармакокинетического поведения веществ в кровеносной системе, при отборе соединений, перспективных для использования в качестве сенсибилизаторов при нацеленном фотодинамическом воздействии на васкулярную систему органов, тканей или злокачественных новообразований. Предлагаемое изобретение направлено на решение задачи упрощения и удешевления способа определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo за счет обеспечения возможности непрерывной регистрации в режиме реального времени величины сигнала флуоресценции соединения в стенке образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo. Для решения данной задачи используется способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo, заключающийся в том, что образец кровеносного сосуда, закрепленный в держателе, помещают в заполненную буферным раствором кювету спектрофлуориметра в центр падающего пучка возбуждающего света, прокачивают через образец с заданной скоростью порции неокрашенной или окрашенной флуоресцирующим соединением перфузионной жидкости, непрерывно регистрируют в режиме реального времени величину сигнала флуоресценции соединения в стенке кровеносного сосуда и определяют параметры связывания/вымывания флуоресцирующего соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo, а также устройство, содержащее спектрофлуориметр с термостатируемым кюветодержателем, в котором размещена кювета с буферным раствором, держатель для фиксации образца кровеносного сосуда, включающий крышку с закрепленными в ней подводящим и отводящим патрубками, причем нижняя концевая часть подводящего патрубка изогнута с радиусом закругления 2,5-3 мм, а нижние концы патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм с герметично закрепленным на них образцом кровеносного сосуда; подводящий патрубок с помощью подводящей магистрали, снабженной трехходовым краном, подсоединен к емкости с перфузионной жидкостью; отводящий патрубок посредством отводящей магистрали подключен к перистальтическому насосу, обеспечивающему прохождение перфузионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной объемной скоростью.
Евразийское (21) 201600104 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. G01N21/64 (2006.01)
2017.07.31 G01N 33/483 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2015.12.30
(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ СВЯЗЫВАНИЯ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ СТЕНКАМИ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ EX VIVO И УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО РЕАЛИЗАЦИИ
(96) 2015/EA/0166 (BY) 2015.12.30
(71) Заявитель:
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (БГУ) (BY)
(72) Изобретатель:
Зорин Владимир Петрович, Хлудеев Иван Иванович, Зорина Татьяна Евгеньевна (BY)
(57) Изобретение относится к биологии, биофизике и медицине, в частности к исследованию связывания флуоресцирующих лекарственных соединений (например, фотосенсибилизаторов) со стенками кровеносного сосуда ex vivo, и может найти применение при прогнозировании фармакокинети-ческого поведения веществ в кровеносной системе, при отборе соединений, перспективных для использования в качестве сенсибилизаторов при нацеленном фотодинамическом воздействии на вас-кулярную систему органов, тканей или злокачественных новообразований. Предлагаемое изобретение направлено на решение задачи упрощения и удешевления способа определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo за счет обеспечения возможности непрерывной регистрации в режиме реального времени величины сигнала флуоресценции соединения в стенке образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo. Для решения данной задачи используется способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo, заключающийся в том, что образец кровеносного сосуда, закрепленный в держателе, помещают в заполненную буферным раствором кювету спектрофлуоримет-ра в центр падающего пучка возбуждающего света, прокачивают через образец с заданной скоростью порции неокрашенной или окрашенной флуоресцирующим соединением перфузионной жидкости, непрерывно регистрируют в режиме реального времени величину сигнала флуоресценции соединения в стенке кровеносного сосуда и определяют параметры связывания/вымывания флуоресцирующего соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo, а также устройство, содержащее спектрофлуориметр с термоста-тируемым кюветодержателем, в котором размещена кювета с буферным раствором, держатель для I фиксации образца кровеносного сосуда, включаю- I щий крышку с закрепленными в ней подводящим и отводящим патрубками, причем нижняя концевая часть подводящего патрубка изогнута с радиусом закругления 2,5-3 мм, а нижние концы патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм с герметично закрепленным на них образцом кровеносного сосуда; подводящий патрубок с помощью подводящей магистрали, снабженной трехходовым краном, подсоединен к емкости с перфузионной жидкостью; отводящий патрубок посредством отводящей магистрали подключен к перистальтическому насосу, обеспечивающему прохождение пер-фузионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной объемной скоростью.
G01N 21/01, G01N 33/483
Способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo и устройство для его реализации
Изобретение относится к биологии, биофизике и медицине, в частности к исследованию связывания флуоресцирующих лекарственных соединений (например, фотосенсибилизаторов) со стенками кровеносного сосуда ex vivo и может найти применение при прогнозировании фармакокинетического поведения веществ в кровеносной системе, при отборе соединений, перспективных для использования в качестве сенсибилизаторов при нацеленном фото динамическом воздействии на васкулярную систему органов, тканей или злокачественных новообразований.
Терапевтический эффект многих лекарственных соединений определяется в значительной степени их воздействием на клетки, входящие в состав кровеносных сосудов органов и тканей организма. В таких случаях уровень содержания лекарственных соединений в крови и скорость их перераспределения на клетки стенок кровеносных сосудов являются важными предикторами конечного лечебного эффекта. Таким образом, для отбора наиболее эффективных препаратов среди соединений, потенциально пригодных для получения необходимого терапевтического эффекта, необходимо разрабатывать способы оценки параметров связывания лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов. Большинство ныне известных способов решения данной задачи используют методы анализа в условиях in vivo или in vitro. В первом случае анализ результатов существенно осложняется изменением концентрации исследуемых соединений в крови, причем скорость выведения сильно зависит от процессоь элиминации лекарственных соединений в органах системы выделения организма. В экспериментах in vitro обычно используют культуры отдельных типов клеток, выращеннэгх в питательной среде. В этом случае лекарственные соединения контактируют с клетками, находящимися в виде суспензии или монослоя на поверхности подложки, поэтому условия взаимодействия могут существенно отличаются от тех, которые имеют место в реальных кровеносных сосудах, представляющих собой сложные многослойные структуры из клеток различных типов. Для таких объектов более приемлемым (компромиссным) является метод ex vivo, позволяющий проводить эксперименты на образцах (кусочках) живых кровеносных сосудов в условиях, моделирующих процессы взаимодействия исследугмых соединений с клетками сосудов в организме.
Известен способ оценки связывания лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов in vivo, в котором в исследуемый участок кровеносного сосуда вводится специальный катетер и с его помощью извлекаются образцы стенки артерии до и после введения лекарственного соединения в кровь. При этом полученные образцы артерии затем анализируются с помощью спектральных или химических методов для определения содержания в них исследуемого лекарственного соединения [1]
Недостатком данного способа являете* необходимость использования уникальных катетеров для забора образцов, сложность манипуляций, требующая высокой специальной подготовки медицинского персонала, невозможность наблюдения динамики процесса в режиме реального времени.
Известен способ оценки связывания флуоресцирующих соединений стенками аорты свиньи в условиях ex vivo, в котором через образец аорты пропускали раствор красите
ля, а затем образец замораживали и делали тонкие поперечные срезы с помощью микротома. В полученных срезах артерии с помощью микроскопа определяли границы распространения и относительные уровни накопления красителя в составе стенок кровеносного сосуда [2].
Однако известный способ является модификацией стандартного гистологического исследования срезов тканей и не позволяет отслеживать динамику изменения содержания соединения (красителя) в стенке кровеносного сосуда.
Наиболее близким к заявляемому изобретению способом, выбранным в качестве прототипа, является способ исследования ex vi\o накопления красителей в атеросклероти-ческих бляшках мышиной аорты, включающий извлечение аорты вместе с кусочком основания сердца после умерщвления животного, промывку её буфером, введение микрокатетеров через проксимальное и дистальное отверстия в аорту, закрепление их с помощью микрохирургической нити, перенос аорты на предметное стекло микроскопа, заливку жидким поли-диметил-силоксаном (ПДМС), его полимеризацию в прозрачный блок, окрашивание атеросклеротических бляшек раствором, содержащим специальный маркер (специфичный к липидным каплям краситель или моноклональные антитела CD45), и оценка изменения интенсивности флуоресценции маркеров в составе бляшек методом покадровой микроскопической съемки аорты.
К недостаткам данного способа относятся:
1) объект наблюдения должен быть практически прозрачным;
2) требуется достаточно трудоемкая подготовка образца (выделение аорты из животного, процедура размещения в растворе моь омера с последующей полимеризацией последнего для получения встроенного в полимерный блок образца аорты);
3) необходимо использование дорогих расходных материалов (антитела, ткане-специфичные красители);
4) требуется длительное время (2 часа) перфузии раствора, содержащего маркер, через аорту для окрашивания атеросклеротических бляшек маркером;
5) метод нацелен на обнаружение связывания маркеров с клетками определенных типов, характерных для атеросклеротических бляшек (макрофаги, лейкоциты), в то время как связывание маркеров с эндотелием сосудов и. соответственно, регистрируемый сигнал крайне малы.
Наиболее близким техническим решени ем к заявляемому изобретению является устройство, выбранное в качестве прототипа, содержащее конфокальный флуоресцентный микроскоп, термостатируемую площадку с помещенным на нее полимерным блоком с находящейся внутри аортой мыши, перфузионной системы для имитации физиологического кровоснабжения, состоящей из перистальтического насоса, системы предварительного подогрева среды, шприц-насоса для подачи свежей среды и среднего стока. Данное устройство имеет два существенных недостатка. Во-первых, для получения сигнала флуоресценции в конфокальном микроскопе требуется использование мощного потока света на длине волны возбуждения флуорофора, что может приводить, в случае исследования фотосенсибилизаторов, к их быстрому фотообесцвечиванию и падению интенсивности флуоресценции. Во-вторых, использование покадровой съемки под действием мощного возбуждающего света может приводить к искажению измеряемых в эксперименте уровней накопления фотосенсибилизаторов из-за их выгорания, а в случае уменьшения интенсив
ности возбуждающего света требуется применение специализированных высокочувствительных видеокамер, что сильно удорожает таксе устройство [3].
Предлагаемое изобретение направлено на решение задачи упрощения и удешевления способа определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo за счет обеспечения возможности непрерывной регистрации в режиме реального времени величины сигнала флуоресценции соединения в стенке образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo.
Для решения данной задачи используется способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ех vivo, заключающийся в том, что образец кровей осного сосуда, закрепленный в держателе, помещают в заполненную буферным раствором кювету спектрофлуориметра в центр падающего пучка возбуждающего света, прокачивают через образец с заданной скоростью порции неокрашенной или окрашенной флуоресцирующим соединением перфузионной жидкости, непрерывно регистрируют в режиме реального времени величину сигнала флуоресценции соединения в стенке кровеносного сосуда и определяют параметры связывания/вымывания флуоресцирующего соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo, а также устройство, содержащее сиектрофлуориметр с термостатируе-мым кюветодержателем, в котором размещена кювета с буферным раствором, держатель для фиксации образца кровеносного сосуда, включающий крышку с закрепленными в ней подводящим и отводящим патрубками, причем нижняя концевая часть подводящего патрубка изогнута с радиусом закругления 2,5-3 мм, а нижние концы патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм с герметично закрепленным на них образцом кровеносного сосуда; подводящий патрубок с помощью подводящей магистрали, снабженной трехходовым краном, подсоединен к емкости с перфузионной жидкостью; отводящий патрубок посредством отводящей магистрали подключен к перистальтическому насосу, обеспечивающим прохождение перфузионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной объемной скоростью.
Сущность изобретения заключается в том, образец кровеносного сосуда (артерии), закрепленный в держателе, помещают в кювет)' спектрофлуориметра и прокачивают через образец артерии перфузионную жидкость ИЛЕ порцию раствора флуоресцирующего соединения, непрерывно регистрируя величину сигнала флуоресценции соединения, содержащегося в стенке кровеносного сосуда.
Технический результат заключается в том, что изобретение дает возможность определять параметры связывания (и вымывания) флуоресцирующего соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo в режиме реального времени без использования специальных маркеров.
Для реализации заявляемого способа определения необходимо использование устройства, которое обеспечивает размещение исследуемого образца кровеносного сосуда (артерии) в кюветном отделении спектрофлуориметра и позволяет пропускать через образец определенное количество перфузата или растворю флуоресцирующего соединения с заданной объемной скоростью.
В заявляемом устройстве для регистрации флуоресценции используется высокочувствительный прибор - спектрофлуориметр, в котором возбуждающий свет имеет низкую интенсивность, что практически полность ю устраняет эффект фотообесцвечивания исследуемого соединения при измерении сигнала. Высокая чувствительность устройства
позволяет использовать непрозрачные образцы кровеносных сосудов, например, сонной артерии кролика. Не требуется фиксации образца в прозрачном блоке из полимера, поскольку используемые образцы артерии хорошо сохраняют свою форму.
Разработанное устройство, содержит компьютеризированный спектрофлуориметр (SOLAR SFL-1211A или СМ 2203 (СОЛАР, Минск)), систему прокачки и держатель образца, обеспечивающий размещение образца кровеносного сосуда в луче света возбуждения и прохождение через образец потока неокрашенной перфузионной жидкости (буферного раствора) или порций раствора исследуемого флуоресцирующего соединения с заданной объемной скоростью. Состав буферного раствора обеспечивает поддержание всех клеток образца артерии в жизнеспособном состоянии и при необходимости может содержать компоненты сыворотки крови.
Сущность изобретения поясняется с помощью фиг.1 - 3.
Фиг. 1 - схема устройства, реализующего предлагаемый способ.
Фиг. 2 - графики изменения интенсивности флуоресценции различных фотосенсибилизаторов в стенке кровеносного сосуда при прохождении малых объемов окрашенной и неокрашенной сыворотки через образец кровеносного сосуда.
Фиг. 3 - графики изменения интенсивно сти флуоресценции различных фотосенсибилизаторов в стенке кровеносного сосуда при прохождении больших объемов окрашенной и неокрашенной сыворотки через образец кровеносного сосуда.
Схема устройства, реализующего предлагаемый способ, изображена на фиг. 1, где
А - образец кровеносного сосуда, С -слектрофлуориметр, К - термостатируемый
кюветодержатель, 1 - стандартная кювета, 2 - буферный раствор, 3 - крышка, 4 -
отводящий патрубок, 5 - подводящий патрубок,
6 - подводящая магистраль, 7 - трехходовой кран,
8 - емкость с перфузионной жидкостью,
9 - отводящая магистраль, 10 - перистальтический насос.
Устройство для определения параметров связывания стенками кровеносных сосудов флуоресцирующих лекарственных соединений содержит спектрофлуориметр с термо-статируемым кюветодержателем (С), в котором находится кювета (1), заполненная буферным раствором (2), и помещенный в кювету держатель образца. Конструктивно держатель состоит из крышки (3), в которой жестко закреплены изготовленные из медицинской нержавеющей стали патрубки: прямой отводящий патрубок (4) и подводящий патрубок (5), концевая часть которого изогнута с радиусом закругления 2,5-3 мм. Выбранный радиус закругления во-первых, обеспечивает ламинарность потока перфузионной жидкости, и во-вторых, позволяет разместить держатель в кювете таким образом, чтобы образец кровеносного сосуда находился в центре падающего пучка возбуждающего света спектрофлуориметра. Концы отводящего и подводящего патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм, на них закрепляется образец кровеносного сосуда (А). Зазор 7-8 мм обеспечивает возможность герметичного закрепления образца кровеносного сосуда таким образом, чтобы при помещении в кюветодержатель спектрофлуориметра поток возбуждающего света попадал на. тот участок кровеносного сосуда, в котором клетки стенки сосуда непосредственно контактируют с перфузионной жидкостью и происходит связывание флуоресцирующего соединения этими клетками. Подводящий патрубок (5) с помощью подводящей магистрали (6), снабженной трехходовым краном (7) для введения в поток жидкости порций флуоресцирующего соединения, подсоединен к емкости с перфузионной жид
костью (8). Отводящий патрубок (4) с помощью отводящей магистрали (9) подключен к перистальтическому насосу (10), который обеспечивает прокачивание перфузиионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной объемной скоростью.
Изобретение реализуется следующим образом.
Образец исследуемого кровеносного сосуда животного надевают на концы патрубков держателя, герметично закрепляют. Нижнюю часть держателя вставляют в кювету, заполненную буферным раствором, размещая образец кровеносного сосуда в центре падающего пучка возбуждающего света флуориметра. Длины волны возбуждения и регистрации устанавливают в соответствии с длинами волн максимума спектра поглощения и максимума спектра испускания флуоресценция исследуемого флуоресцирующего соединения соответственно. В равномерный поток перфузионной жидкости с помощью трехходового крана вводят порцию раствора флуоресцирующего соединения и регистрируют в режиме реального времени изменение интенсивности флуоресценции данного соединения по мере прохождения через образец кровеносн ого сосуда. На основании анализа формы кривой изменения интенсивности флуоресценции определяют параметры связывания/вымывания исследуемого флуоресцирующего соединения в стенке кровеносного сосуда. Отсутствие проникновения флуоресцирующего вещества через стенку кровеносного сосуда (артерии) наружу контролируют по отсутствию флуоресценции находящегося в кювете буферного раствора после извлечения из кюветы держателя с образцом кровеносного сосуда.
Примеры, подтверждающие возможность осуществления изобретения.
Пример 1. В качестве примера на фиг. 2 изображены кинетики изменения содержания в стенке сосуда трех хлориновых соединений - хлорина еб (Хл еб), диметилового эфира хлорина еб (ДМЭ) и триметилового эфира хлорина еб (ТМЭ) при прохождении через него порции небольшого объема окрашенной сенсибилизаторами, а затем неокрашенной перфузионной жидкости, содержащей 5 % эмбриональную телячью сыворотку. Концентрация сенсибилизаторов в пробах была одинакова и составляла 5 мкмоль/л, объем порции равен 1,0 мл, скорость потока составляла 330 мкл/мин, в качестве перфузионной жидкости использовЕлась буферная смесь Кребса-Хенселейта, содержащая 5% эмбриональную телячью сыворотку.
Сравнение экспериментальных кинетик связывания/вымывания из стенки сонной артерии кролика фотосенсибилизаторов, близких по химической структуре, но различающихся по своим физико-химическим свойствам свидетельствует о значительном влиянии физико-химических свойств используемых фотосенсибилизаторов на параметры кинетики их связывания и вымывания из стенки сосуда. В качестве количественного показателя скорости вымывания принимали величину, обратно пропорциональную времени, за которое интенсивность флуоресценции ФС в образце снижается на 50%. Анализ кинетических кривых показывает, что по сравнению с Хл еб, вымывание ДМЭ происходит в среднем в 4 раза медленнее, что свидетельствует о более эффективном накоплении и удержании ДМЭ стенкой артерии. Для ТМЭ, наоборот, такое изменение сигнала флуоресценции происходит в 2,9 раза быстрее в сравнении с Хл еб, свидетельствуя, что ТМЭ почти не удерживается стенкой сосуда.
Из всех представленных фотосенсибилизаторов неполярный ТМЭ (3) демонстрирует минимальное связывание стенкой сосуда и максимальную скорость вымывания из нее, тогда как ДМЭ (1) демонстрирует наиболее высокий уровень накопления в стенке сосуда и минимальную скорость снижения его концентрации (вымывания). С помощью заявляемого устройства можно исследовать динамику процессов связывания и вымывания различных флуоресцирующих соединений из образцов кровеносных сосудов ex vivo и проводить их сравнение по параметрам связывании/вымывания.
Пример 2. В качестве примера на фиг.З изображены кинетики изменения содержания в стенке сосуда двух хлориновых фотосенс:*билизаторов - Хл еб и ДМЭ, при прохождении через него порции большого объема окрашенной сенсибилизаторами, а затем неокрашенной эмбриональной телячьей сыворотки. Концентрация сенсибилизаторов в пробах была одинакова и составляла 5 мкмоль/л, объем порции равен 5,0 мл, скорость потока составляла 330 мкл/мин, в качестве перфузионной жидкости использовалась буферная смесь, содержащая 5% эмбриональной телячьей сыворотки.
Представленные результаты демонстрируют существенные различия между кинетическими параметрам связывания и вымывания Хл еб (1) и ДМЭ (2). Для Хл еб интенсивность флуоресценции в период прохождения окрашенной пробы через образец меняется незначительно, что свидетельствует о низкой скорости проникновения данного фотосенсибилизатора в клетки стенки артерии. В то же время для ДМЭ характерен непрерывный рост интенсивности измеряемого сигнала флуоресценции, который за время прохождения окрашенной пробы через образец возрастает в 1,3 раза в сравнении с Хл еб. При вымывании время полувыведения Хл еб в 4 раза менылг, чем у ДМЭ, а скорость на начальном этапе выведения, соответственно, для Хл еб выше в 4 раза в сравнении с ДМЭ. С помощью заявляемого устройства можно исследовать влияние структурных особенностей строения фотосенсибилизаторов на динамику процессов их связывания и вымывания из образцов кровеносных сосудов ex vivo.
Таким образом, заявляемый способ и устройство для его реализации позволяют определять параметры связывания/вымывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo на основании непрерывной регистрации ки-нентики изменения собственной флуоресценции данных соединений в режиме реального времени с помощью стандартного спектрофлуориметра, что в результате упрощает и удешевляет процесс исследования, поскольку не требуется сложная и длительная процедура фиксации и окрашивания образца в полимерном блоке, а также использование дорогостоящих маркеров и конфокального флуоресцентного микроскопа, снабженного специализированной высокочувствительной видеокамерой.
Источники информации
1. Патент США US20120179178 Al, А61В17/22, 12.07.2012
2. Heckenkamp J., Adili F., Kishimoto J., Koch M., LaMuraglia G.M. Local photodynamic action of methylene blue favorably modulates the postinterventional vascular wound healing re-sponse//J. Vase. Surg. - 2000. - V. 31.-P. 1168-1177.
3. Wang X., Wolf M.P., Banziger K.R., Lehner R , Hunziker P.R. Polydimethylsiloxane embedded mouse aorta ex vivo perfusion model: proof-of-concept study focusing on atherosclerosis//.!. Biomed. Opt. - 2012. - V. 17(7), 076006 (July 06, 2012); doi: 10.Ill7/1JBO. 17.7.076006.
Формула изобретения
1. Способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных
соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo, заключающийся в том, что образец
кровеносного сосуда, закрепленный в держателе, помещают в заполненную буферным
раствором кювету спектрофлуориметра в цент]) падающего пучка возбуждающего света,
прокачивают через образец с заданной скоростью порции неокрашенной или окрашенной
флуоресцирующим соединением перфузионной жидкости, непрерывно регистрируют в
режиме реального времени величину сигнала флуоресценции соединения в стенке
кровеносного сосуда и определяют параметры связывания/вымывания флуоресцирующего
соединения стенками образца кровеносного сосуда в условиях ex vivo.
2. Устройство для определения параметров связывания флуоресцирующих
лекарственных соединений стенками крове носных сосудов ex vivo, содержащее
спектрофлуориметр с термостатируемым кювет одержателем, в котором размещена кювета
с буферным раствором, держатель для фиксации образца кровеносного сосуда,
включающий крышку с закрепленными в ней подводящим и отводящим патрубками,
причем нижняя концевая часть подводящего патрубка изогнута с радиусом закругления
2,5-3 мм, а нижние концы патрубков расположены на одной оси с зазором 7-8 мм с
герметично закрепленным на них образцом кровеносного сосуда; подводящий патрубок с
помощью подводящей магистрали, снабженной трехходовым краном, подсоединен к
емкости с перфузионной жидкостью; отводящий патрубок посредством отводящей
магистрали подключен к перистальтическому насосу, обеспечивающим прохождение
перфузионной жидкости через образец кровеносного сосуда с выбранной постоянной
объемной скоростью.
Способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных соединений стенками кровеносных сосудов ex vivo и устройство для его реализации
1-Хле6,2-ДМЭ,3-ТМЭ
Способ определения параметров связывания флуоресцирующих лекарственных единений стенками кровеносных сосудов e x vivo и устройство для его реализации
1 - Хл е6, 2 - ДМЭ
Фиг.З.
Л. КЛАССИФИКАЦИЯ ПРЕДМЕТА ИЗОБРЕТЕНИЯ:
G01N21/64 (2006.01) G01N33/483 (2006.01)
Согласно Международной патентной классификации (МПК) или национальной классификации и МПК
Ь. ОБЛАСТЬ ПОИСКА:
Минимум просмотренной документации (система классификации и индексы МПК)
G01N 21/64, 21/05, 33/483, 21/01, 21/00, 33/48
Дат а действительного завершения патентного поиска: 25 мая 2016 (25.05.2016)
Наименование и адрес Международного поискового органа: Федеральный институт промышленной собственности
РФ. I 25993.Москва, Г-59, ГСП-3, Бережковская наб., д. 30-1 .Факс: (499) 243-3337, телетайп: 114818 ПОДАЧА
Уполномоченное лицо:
О.С. Стельмах
Телефон №(495) 531-6481
ЕАПВ/ОП-2
ОТЧЕТ О ПАТЕНТНОМ ПОИСКЕ
Номер евразийской заявки:
201600104
ДОКУМЕНТЫ, СЧИТАЮЩИЕСЯ РЕЛЕВАНТНЫМИ ( продолжение графы В )
Категория*
Ссылки на документы с указанием, где это возможно, релевантных частей
Относится к пункту №
ЗОРИН В.П. Физико-химические характеристики лимфоидных клеток при пролифиративных процессах. Минск, 1984, с. 40-49
1-2
(19)
|
