(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к стабильным F-полипептидам респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, иммуногенным композициям, содержащим указанные полипептиды, и их применениям для предупреждения и/или лечения инфекции, вызванной RSV.
2420-529510ЕА/032 СТАБИЛИЗИРОВАННЫЕ РАСТВОРИМЫЕ F-ПОЛИПЕПТИДЫ RSV ДО СЛИЯНИЯ
Настоящее изобретение относится к области медицины. Настоящее изобретение, в частности, относится к рекомбинантному F-полипептиду RSV до слияния и к его применениям, например, в иммуногенных композициях.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Респираторный синцитиальный вирус (RSV) представляет собой оболочечный вирус с несегментированной одноцепочечной РНК с негативной полярностью из семейства Paramyxoviridae, рода Pneumovirus. По оценкам в мире ежегодно наблюдается 64 миллионов инфекций RSV, которые приводят к 160000 смертей (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей младше 2 лет RSV является наиболее распространенным возбудителем заболеваний респираторного тракта, который является причиной примерно 50% госпитализаций вследствие респираторных инфекций, с пиком госпитализации, наблюдающимся в 2-4-месячном возрасте. Сообщалось, что практически все дети к двухлетнему возрасту были инфицированы RSV. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным врожденным иммунитетом. У пожилых людей уровень тяжести заболевания, вызванного RSV, смертности и заболеваемости занимают второе место, уступая лишь инфекциям, вызываемым непандемическим гриппом А.
Для инфицирования клетки-хозяина RSV, подобно другим оболочечным вирусам, таким как вирус гриппа и HIV, требуют слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Что касается RSV, консервативный белок слияния (F-белок RSV) подвергает слиянию вирусные мембраны и клеточные мембраны клетки-хозяина. В современных моделях на основе исследований парамиксовирусов F-белок RSV исходно уложен в конформацию "до слияния". Во время проникновения в клетку предшествующая слиянию конформация подвергается рефолдингу и конформационным изменениям до своей конформации "после слияния". Таким образом,
F-белок RSV представляет собой метастабильный белок, который
управляет слиянием мембран путем сочетания необратимого
рефолдинга белка с соприкосновением мембран при помощи
исходного фолдинга в метастабильную форму (конформация до
слияния), которая в дальнейшем подвергается
дискретным/стадийным конформационным изменениям до конформации с более низкой энергией (конформации после слияния).
Очевидно, исходя из электронной микроскопии RSV-F, что существуют значительные структурные различия между тримером F до слияния и после слияния, которые недавно были подтверждены с помощью кристаллографии (McLellan J.S. et al. Science 340 (6136) : 1113-7 (2013) и McLellan J.S. et al. Science 342(6158): 592-8 (2013)). Эти наблюдения указывают на то, что F-белок RSV до слияния и после слияния отличаеится в антигенном отношении (Calder, L. J. et al. Virology 271, 122-131 (2000)).
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не доступна, хотя и очень желательна. Кандидаты вакцин на основе F-белка RSV оказались неэффективными вследствие проблем, например, связанных со стабильностью, чистотой, воспроизводимостью и эффективностью. Как указывали выше, кристаллические структуры выявили значительное конформационное изменение между состояниями до слияния и после слияния. Величина перестройки предполагала, что только часть антител, направленных на конформацию RSV-F после слияния будет способна к перекрестной реакции с нативной конформацией шиловидного отростка до слияния на поверхности вируса. Соответственно, усилия для получения вакцины против RSV сосредотачивались на разработке вакцин, которые содержат формы F-белка RSV до слияния (см., например, WO20101149745, WO2010/1149743, WO2009/1079796, W02012/158613). Однако, данные усилия не дали стабильных F-полипептидов RSV до слияния, которые можно было бы использовать в качестве кандидатов для испытания у людей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение представляет стабильные,
рекомбинантные полипептиды слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, т.е. F-полипептиды RSV,
которые являются стабильными в конформации до слияния. F-полипептиды RSV по настоящему изобретению содержат по меньше мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми. В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются мембранно-связанными. Настоящее изобретение также представляет молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния согласно настоящему изобретению и векторы, содержащие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Настоящее изобретение также относится к композициям, предпочтительно, иммуногенным композициям, содержащим F-полипептид RSV, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, и к их применению в индуцировании иммунного ответа против F-белка RSV, в частности, их применению в качестве вакцины. Настоящее изобретение также относится к способам индуцирования у субъекта иммунного ответа против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающий введение субъекту эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты. Предпочтительно, индуцированный иммунный ответ характеризуется выработкой нейтрализующих антител к RSV и/или защитным иммунитетом против RSV. В конкретных аспектах настоящее изобретение относится к способу индуцирования у субъекта выработки антител к F-белку респираторного синцитиального вируса (RSV), включающий введение субъекту эффективного количества иммуногенной композиции, содержащей F-полипептид RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей упомянутый F-полипептид RSV и/или вектор, содержащий молекулу упомянутой нуклеиновой кислоты.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
ФИГ. 1: А) гель-фильтрационная хроматограмма, полученная с использованием колонки Superdex200, элюата A2_F24 N67I+S215P из ионообменной колонки. Стрелки указывают точки элюации стандартного белка (1 - тироглобулин 669 кДа, 2 - ферритин 440 кДа и 3 - IgG 150 кДа) . В) анализ SDS-PAGE F-белка до слияния,
содержащего пик от хроматограммы SEC, в восстанавливающих условиях.
ФИГ. 2: вестерн-блоттинг NativePAGE с загрузкой образцов, содержащих 1) супернатант из клеток, экспрессирующих конструкцию до слияния с изолейциновой застежкой (S) F4 3; 2) супернатант из клеток, экспрессирующих главным образом тримерный (верхняя полоса) F-белок после слияния RSV; и 3) очищенный тримерный A2_F24 N671 до слияния.
ФИГ. 3: уровни экспрессии конструкций с точечными мутациями по отношению к немутировавшему A2_F24.
На фиг. 4 представлены результаты способа, описанного в примере б(А), определяющего температуру, при которой происходит 50% потеря связывания CR9501; (В) представлено сравнение стабильности F до слияния (A2_F24 N67I+S215P) и немодифицированного эктодомена при определении по 50% потере связывания специфического антитела CR9501 до слияния.
ФИГ. 5: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния; А) A2_F24 (SEQ ID NO: 19), В) A2_F24 K465Q, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 N671 и E) A2_F24 E92D на 1, 5 и 33 дни.
ФИГ. 6: результаты анализа Octet, представляющие зависимую от времени хранения потерю связывания специфического моноклонального антитела CR9501 до слияния по отношению к конструкциям до слияния; A) A2_F2 4 K4 65Q, В) A2_F2 4 K4 65Q+N67I, С) A2_F24 S46G, D) A2_F24 S46G+E92D, Е) A2_F24 S46G+N67I, F) A2_F24 E92D, G) A2_F24 S46G+E92D, H) A2_F24 N67I+E92D и I) A2_F24 E92D+S215P на 1, 5 и 33 дни.
ФИГ. 7: титры VNA у мышей на б неделе после прайм-бустерного введения на 0 и 4 неделе иммуногенов в дозах согласно таблице 14.
ФИГ. 8: титры VNA хлопковых крыс на 7 неделе после прайм-буста на 0 и 4 неделе иммуногенами и дозами согласно таблице 15.
ФИГ. 9: вирусная нагрузка в легких и носу на 5 день после i.n. контрольного заражения с использованием RSV.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Белок слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) участвует в слиянии вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина, которое требуется для инфицирования. МРНК F RSV транслируется в белок-предшественник из 574 аминокислот, обозначенный F0, который содержит последовательность сигнального пептида на N-конце (например, аминокислотные остатки 1-2 6 с SEQ ID N0: 1), которая удаляется сигнальной пептидазой в эндоплазматическом ретикулуме. F0 отщепляется в двух сайтах (между аминокислотными остатками 109/110 и 136/137) с помощью клеточных протеаз (в частности, фурином) в транс-Гольджи, при этом удаляется короткая гликозилированная вставочная последовательность (также обозначенная как участок р27, содержащий аминокислотные остатки от 110 до 136, и образуется два домена или субъединицы, обозначенные F1 и F2. Домен F1 (аминокислотные остатки 137-574) содержит гидрофобный пептид слияния на своем N-конце, и С-конец содержит трансмембранный (ТМ) (аминокислотные остатки 530-550) и цитоплазматический участок (аминокислотные остатки 551-574) . Домен F2 (аминокислотные остатки 27-109) ковалентно связан с F1 двумя дисульфидными мостиками. Гетеродимеры F1-F2 подвергаются сборке в вирионе в виде гомотримеров.
Вакцина против инфекции RSV в настоящее время не существует, хотя и является очень желательной. Одним потенциальным подходом к получению вакцины является субъединичная вакцина на основе очищенного F-белка RSV. Однако, для этого подхода желательно, чтобы очищенный F-белок RSV находился в конформации, которая подобна конформации F-белка RSV в состоянии до слияния, который стабилен в течение продолжительного периода, и может быть получен в достаточных количествах. Кроме того, для вакцины на основе субъединицы необходимо осуществить усечение F-белка RSV путем делеции трансмембранного (ТМ) и цитоплазматического участка с получением растворимого секретируемого F-белка (sF) . Поскольку участок ТМ отвечает за заякоривание в мембране и тримеризацию, незаякоренный растворимый F-белок является в значительной
степени более лабильным, чем белок полной длины, и будет с легкостью подвергаться рефолдингу в конечное состояние после слияния. Для получения растворимого F-белка в стабильной конформации до слияния, который демонстрирует высокие уровни экспрессии и высокую стабильность, необходимо, таким образом, стабилизировать конформацию до слияния.
Стабилизация F-белка другого парамиксовируса в конформации до слияния была успешно выполнена для вируса парагриппа типа 5
(PIV5). Yin et al. (Nature 439: 38-44 (2006)) таким образом стабилизировали структуру F-белка до слияния PIV-5 с помощью мутации в сайта расщепления фурином в Fo, что блокировало процессинг в F1 и F2. Кроме того, трансмембранный (ТМ) и цитоплазматический домен были замещены широко известным петлевым доменом тримеризации: GCN4pII. Этот домен образует тримерную спиральную суперспиральную структуру и является модификацией встречающегося в природе димерного спирального суперспирального пептида GCN4 (О'Shea et al., Science 243: 538542 (1989)). Пептид GCN4-pII, в котором аминокислотная последовательность лейциновой застежки GCN4 была замещена изолейциновыми остатками в каждом положении а и d гептада, как показано, образует трехцепочечную параллельную альфа-петлевую суперспираль (Harbury et al., Science 262: 1401-1407 (1993)).
Для стабилизации F RSV в конформации до слияния использовали ту же стратегию, такую как, например, мутация в сайте расщепления фурином, и слияние эктодомена RSV-F с доменом тримеризации GCN4pII (как раскрыто, например, в WO2010/149743, WO2010/149745, WO2009/079796, W02012/158613) или с доменом тримеризации фибритина (MCLellan et al. , Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010)). Этот домен фибритина или ^Foldon' получен из фибритина Т4 и описан ранее в качестве искусственного встречающегося в природе домена тримеризации
(Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). Однако, эти усилия не привели к получению стабильного белка RSV-F до слияния. Более того, эти усилия даже не привели к получению кандидатов, пригодных для испытания у людей.
Настоящее изобретение далее представляет стабильные рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния, т.е. F-полипептиды RSV, которые являются стабилизированными в конформации до слияния. В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, были введены и/или объединены несколько стадий модификации для получения упомянутых стабильных растворимых F-полипептидов RSV до слияния. Стабильные F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению находятся в конформации до слияния, т.е. они содержат (демонстрируют) по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния. Эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния, представляет собой эпитоп, который не представлен в конформации после слияния. Не ограничиваясь конкретной теорией, полагают, что конформация F-белка RSV до слияния может содержать эпитопы, которые являются такими же, как эпитопы на F-белке RSV, экспрессируемые на встречающихся в природе вирионах RSV, и таким образом, может предоставлять преимущества для активизации защитных нейтрализующих антител.
В определенных вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDRl-участок тяжелой цепи с SEQ ID N0: 54, CDR2-y4acTOK тяжелой цепи с SEQ ID N0: 55, CDRS-участок тяжелой цепи с SEQ ID N0: 56 и CDRl-участок легкой цепи с SEQ ID N0: 62, CDR2-y4acTOK легкой цепи с SEQ ID N0: 63 и CDRS-участок легкой цепи с SEQ ID N0: 64 (далее в этом документе упоминаемый как CR9501), и/или специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDRl-участок тяжелой цепи с SEQ ID N0: 58, CDR2-y4acTOK тяжелой цепи с SEQ ID N0: 59, CDRS-участок тяжелой цепи с SEQ ID N0: 60 и CDRl-участок легкой цепи с SEQ ID N0: 66, CDR2-y4acTOK легкой цепи с SEQ ID N0: 67 и CDRS-участок легкой цепи с SEQ ID N0: 68 (упоминаемый как CR9502) . CR9501 и CR9502 содержат вариабельные участки тяжелой и легкой цепи, и таким образом, связывающие специфичности антител 58С5 и 30D8, соответственно, которые, как было показано ранее, специфично связываются с F-белком RSV в его конформации до слияния, но не
в конформации после слияния (смотри WO2012/006596).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере один эпитоп, который распознается по меньшей мере одним специфичным моноклональным антителом до слияния, как описано выше, и полипептиды являются тримерными.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.
В некоторых вариантах осуществления аминокислоту в положении 67 подвергают мутированию до гидрофобной аминокислоты.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
В некоторых вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат домен F1 и домен F2 и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, которая связывает указанный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
В определенных вариантах осуществления стабильные F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением содержат усеченный домен F1 и домен F2, и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, связывающую указанный усеченный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептиды дополнительно содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215.
Таким образом, полипептиды по настоящему изобретению
содержат по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в домене F1 и/или домене F2 по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV в F-белке RSV дикого типа.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат мутацию аминокислотного остатка N или Т в положении 67 (N/T67I) в I и/или мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в Р (S215P).
Известно, что RSV существуют в виде одного серотипа, имеющего две антигенные подгруппы: А и В. Аминокислотные последовательности зрелых процессированных F-белков двух групп являются идентичными на приблизительно 93%. Как используется во всей настоящей заявке, положения аминокислот приведены в отношении к последовательности F-белка RSV из штамма А2 (SEQ ID N0: 1). Как используется в настоящем изобретении, выражение "аминокислота в положении "х" F-белка RSV, таким образом, означает аминокислоту, соответствующую аминокислоте в положении "х" в F-белке RSV штамма А2 RSV с SEQ ID N0: 1. Необходимо отметить, что в системе нумерации, используемой в настоящей заявке, 1 относится к N-концевой аминокислоте незрелого F0-белка (SEQ ID N0: 1) . При использовании штамма RSV, отличного от штамма А2, положения аминокислот F-белка следует нумеровать по отношению к нумерации F-белка штамма А2 SEQ ID N0: 1 с помощью выравнивания последовательностей другого штамма RSV с F-белком с SEQ ID N0: 1 со вставкой гэпов, при необходимости. Выравнивание последовательностей можно выполнять с помощью способов, хорошо известных в данной области, например, с помощью CLUSTALW, Bioedit или CLC Workbench.
Аминокислота в соответствии с настоящим изобретением может быть любой из двадцати встречающихся в природе (или лстандартных' аминокислот) или их вариантов, таких как, например, D-аминокислоты (D-энантиомеры аминокислот с хиральным центром), или любым вариантом, которые не встречаются в природе в белках, таких как норлейцин. Стандартные аминокислоты можно разделить на несколько групп, исходя из их свойств. Важными факторами являются заряд, гидрофильность или гидрофобность, размер и функциональные группы. Эти свойства являются важными
для структуры белков и белок-белковых взаимодействий. Некоторые аминокислоты обладают специфическими свойствами, такие как цистеин, который может образовывать ковалентные дисульфидные связи (или дисульфидные мостики) с другими цистеиновыми остатками, пролин, который индуцирует повороты полипептидного остова, и глицин, который является более гибким, чем другие аминокислоты. В таблице 11 представлены аббревиатуры и свойства стандартных аминокислот.
Опытному специалисту следует принять во внимание, что мутации можно осуществлять с белком при помощи стандартных методик молекулярной биологии. Результатом мутаций в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно является повышенные уровни экспрессии и/или повышенные стабилизации F-полипептидов RSV до слияния по сравнению с F-полипептидами RSV, которые не содержат данную (данные) мутацию (мутации).
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются растворимыми.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния дополнительно содержат гетерологичный домен тримеризации, связанный с упомянутым усеченным доменом F1. В соответствии с настоящим изобретением было показано, что путем связывания гетерологического домена тримеризации с С-концевым аминокислотным остатком усеченного домена F1, необязательно объединенного со связывающей последовательностью, связывающей домен F1 и F2, и стабилизирующей (стабилизирующими) мутацией (мутациями), представлены F-полипептиды RSV, которые демонстрируют высокую экспрессию и которые связываются со специфичными антителами до слияния, указывая, что полипептиды находятся в конформации до слияния. Кроме того, F-полипептиды RSV стабилизированы в конформации до слияния, т.е. даже после процессинга полипептидов они по-прежнему связаны со специфичными антителами CR9501 и/или CR9502 до слияния, указывая, что специфический эпитоп до слияния сохраняется.
В дополнительных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат одну или несколько дополнительных мутаций (по сравнению с F-белком RSV дикого типа), выбранных из группы,
состоящей из:
несколько дополнительных мутаций выбраны из группы, состоящей из:
мутации аминокислотного остатка К в положении 7 7 в Е мутации аминокислотного остатка К в положении 8 0 в Е
(а) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G (S46G);
(Ь) (К77Е) ;
(с;
(К8 0Е) ;
мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в Р мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N
(d) мутации аминокислотного остатка Е в положении 92 в D (E92D) ; (е)
(N175P); (f)
(G184N);
(g)
(V185N);
(h) мутации аминокислотного остатка К в положении 201 в Q
;K201Q); (i)
мутации аминокислотного остатка К в положении 209 в Q
(K209Q);
(j) мутации аминокислотного остатка К в положении 421 в N (K421N);
(к) мутации аминокислотного остатка N в положении 426 в S (N426S);
(1) мутации аминокислотного остатка К в положении 4 65 в Е или Q (K4 65Q);
(т) мутации аминокислотного остатка D в положении 48 6 в N (D4 8 6N);
(п) мутации аминокислотного остатка Е в положении 4 87 в Q, N или I (E487Q/N/I) и
(о) мутации аминокислотного остатка К в положении 50 8 в Е (К508Е).
Снова необходимо отметить, что для положений аминокислотных остатков отсчет выполняется по отношению к SEQ ID NO: 1. Специалист сможет определить соответствующие аминокислотные остатки в F-белках других штаммов RSV.
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере две мутации (по сравнению с F-белком RV дикого типа). В предпочтительных вариантах осуществления по меньшей мере двумя мутациями являются мутация аминокислоты N или Т в положении 67 в I (N/T67I) и мутация аминокислоты S в положении 215 в Р (S215P).
В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния содержат по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из:
мутации
аминокислотного
остатка
положении
4 6 в G;
мутации
аминокислотного
остатка
положении
7 7 в Е;
мутации
аминокислотного
остатка
положении
8 0 в Е;
мутации
аминокислотного
остатка
положении
92 в D;
мутации
аминокислотного
остатка
положении
175 в Р
мутации
аминокислотного
остатка
положении
184 в N
мутации
аминокислотного
остатка
положении
185 в N
мутации
аминокислотного
остатка
положении
201 в Q
мутации
аминокислотного
остатка
положении
209 в Q
мутации
аминокислотного
остатка
положении
421 в N
(к) мутации аминокислотного остатка N в положении 42 6 в S; (1) мутации аминокислотного остатка К в положении 4 65 в Е или Q ;
(т) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N; (п) мутации аминокислотного остатка Е в положении 4 87 в Q, N или I и
(о) мутации аминокислотного остатка К или R в положении 508 в Е.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат по меньшей мере три мутации.
В определенных вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID N0: 3) . В некоторых вариантах осуществления гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID N0: 4).
Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления полипептиды по настоящему изобретению содержат усеченный домен F1. Как используется в данном документе, "усеченный" домен F1 относится к домену F1, который не является доменом F1 полной длины, т.е. где на N-конце или С-конце один или несколько аминокислотных остатков были удалены. В соответствии с настоящим изобретением по меньшей мере трансмембранный домен и цитоплазматический хвост были удалены для обеспечения экспрессии продукта в виде растворимого эктодомена.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 495 в F-белке RSV (обозначенного SEQ ID N0: 1), т.е. С-концевая часть домена F1, начиная с аминокислотного остатка 496 (обозначенного SEQ ID N0: 1) была удалена. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 513 в F-белке RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 усекают после аминокислотного остатка 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 525 или 52 5.
В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 4 95 домена Fl RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID N0:
4 и связан с аминокислотным остатком 495 домена Fl RSV.
В некоторых других вариантах осуществления домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 домена F1 RSV. В некоторых вариантах осуществления домен тримеризации содержит SEQ ID N0: 3 и связан с аминокислотным остатком 513 домена Fl RSV.
В некоторых вариантах осуществления домен F1, который является необязательно усеченным, и домен F2 связаны при помощи связывающей последовательности, которая связывает С-концевую аминокислоту домена F2 с N-концевой аминокислотой (необязательно усеченного) домена F1. В некоторых вариантах связывающая последовательность (или линкер) содержит от 1 до 10 аминокислотных остатков, предпочтительно от 2 до 9 аминокислотных остатков, предпочтительно от 3 до 8 аминокислотных остатков, предпочтительно от 4 до 7 аминокислотных остатков, более предпочтительно линкер содержит
5 или б аминокислотных остатков. В данной области техники известны несколько конформационно нейтральных линкеров, которые можно использовать в соответствии с настоящим изобретением без нарушения конформации F-полипептидов RVS до слияния. В предпочтительных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID N0: 5).
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма А2 RSV с SEQ ID N0: 1.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма A RSV происходят из штамма A RSV с SEQ ID N0: 69.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма В RSV. В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из штамма В RSV SEQ ID N0: 2.
В некоторых вариантах осуществления домен F1 и/или F2 происходят из одного штамма RSV. В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния являются химерными полипептидами, т.е. содержат домены F1 и F2, которые происходят из разных штаммов RSV.
В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии F-полипептидов RSV до слияния настоящего изобретения повышен по сравнению с эктодоменом F-полипептида RSV дикого типа (т.е. без трансмембранного или цитоплазматического участка) без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен по меньшей мере в 5 раз, предпочтительно до 10 раз. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии повышен более чем в 10 раз.
F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением являются стабильными, т.е. не изменяются с легкостью в конформацию после слияния при процессинге полипептидов, таком как, например, очистка, циклы замораживания-оттаивания и/или хранение и т.д.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV до слияния в соответствии с настоящим изобретением имеют повышенную стабильность при хранении при 4°С по сравнению с F-полипептидом RSV без мутации (мутаций). В некоторых вариантах осуществления полипептиды являются стабильными при хранении при 4°С в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере б месяцев, даже более предпочтительно по меньшей мере 1 года. Под "стабильными при хранении " подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным для специфичного антитела до слияния (например, CR9501) при хранении полипептида в растворе (например, среде для культивирования) при 4°С в течение по меньшей мере 3 0 дней, например, как определено с помощью способа, описанного в примере 7 или 9. В некоторых вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния в течение по меньшей мере б
месяцев, предпочтительно в течение по меньшей мере 1 года при хранении F-полипептидов RSV до слияния при 4°С.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением обладают повышенной стабильностью при воздействии теплом по сравнению с F-полипептидами RSV без указанной (указанных) мутации (мутаций). В определенных вариантах осуществления F-полипептиды REV до слияния являются термостабильными в течение по меньшей мере 3 0 минут при температуре 55°С, предпочтительно при 58°С, более
предпочтительно при 60°С. Под "термостабильными"
подразумевается, что полипептиды по-прежнему демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия повышенной температурой в течение по меньшей мере 30 минут (т.е. температуры 55°С или выше), например, как определено с помощью способа, описанного в примере 6.
В определенных вариантах осуществления полипептиды демонстрируют по меньшей мере один специфичный эпитоп до слияния после воздействия от 1 до б циклов замораживания-размораживания в подходящей буферной смеси.
В некоторых вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-52 и 71-89. В определенных вариантах осуществления F-полипептид RSV до слияния по настоящему изобретению состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 21-52 и 71-89.
Как используется во всей настоящей заявке, нуклеотидные последовательности представлены в направлении от 5' до 3' , и аминокислотные последовательности от N-конца к С-концу, как принято в данной области.
В некоторых вариантах осуществления кодируемые полипептиды в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержат лидерную последовательность, также называемую как сигнальная последовательность или сигнальный пептид, соответствующую аминокислотам 1-2 6 в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO:
69. Она представляет собой короткий (длиной как правило, 5-30 аминокислот) пептид, присутствующий на N-конце большинства вновь синтезируемых белков, которые предназначены для поступления в секреторный путь. В некоторых вариантах осуществления полипептиды в соответствии с настоящим изобретением не содержат лидерную последовательность.
В определенных вариантах осуществления полипептиды содержат HIS-метку. His-метка или полигистидиновая метка представляет собой аминокислотный мотив в белках, который состоит из по меньшей мере пяти остатков (Н) гистидина, часто на N- или С-конце белка, который обычно используют для целей очистки.
В определенных вариантах осуществления полипептиды не содержат HIS-метку. В соответствии с настоящим изобретением неожиданно было показано, что при удалении HIS-метки уровень экспрессии и стабильность повышаются по сравнению с полипептидами с HIS-меткой.
Настоящее изобретение дополнительно представляет молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептиды RSV в соответствии с настоящим изобретением.
В предпочтительных вариантах осуществления молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, являются оптимизированными по кодонам для экспрессии в клетках млекопитающих, предпочтительно клетках человека. Способы оптимизации по кодонам известны или были описаны ранее (например, WO 96/09378). Последовательность считается оптимизированной по кодонам, если по меньшей мере один кодон, не являющийся предпочтительным, по сравнению с последовательностью дикого типа замещен кодоном, который является более предпочтительным. В данном документе кодон, не являющийся предпочтительным, представляет собой кодон, который используется менее часто в организме, чем другой кодон, кодирующий такую же аминокислоту, и кодон, являющийся более предпочтительным, представляет собой кодон, который используется более часто в организме, чем кодон, не являющийся предпочтительным. Частоту использования кодонов для конкретного
организма можно найти в таблицах частоты использования кодонов, таких как в http://www.kazusa.or.jp/codon. Предпочтительно более одного кодона, не являющегося предпочтительным, предпочтительно большинство или все кодоны, не являющиеся предпочтительными, замещают кодонами, которые являются более предпочтительными. Предпочтительно наиболее часто используемые кодоны в организме используются в оптимизированной по кодонам последовательности. Замещение предпочтительными кодонами, как правило, приводит к более высокой экспрессии.
Специалисту в данной области будет понятно, что несколько
различных молекул полинуклеотидов и нуклеиновых кислот могут
кодировать один и тот же полипептид в результате вырожденности
генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной
области могут при помощи традиционных методик проводить
нуклеотидные замены, которые не влияют на последовательность
полипептида, кодируемую молекулами нуклеиновых кислот, для
отражения частоты использования кодонов любым конкретным
организмом-хозяином, в котором полипептиды будут
экспрессироваться. Следовательно, если конкретно не указано
иное, "нуклеотидная последовательность, кодирующая
аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК могут включать в себя или могут не включать в себя интроны.
Последовательности нуклеиновых кислот можно клонировать с помощью стандартных методик молекулярной биологии или получать de novo с помощью синтеза ДНК, который можно проводить с использованием стандартных процедур при помощи компаний, предоставляющих услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Настоящее изобретение также представляет векторы, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты, как описано выше. Таким образом, в определенных вариантах осуществления молекула
нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением является частью вектора. Такими векторами можно легко манипулировать с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области, и например, их можно сконструировать так, чтобы они были способны к репликации в прокариотических и/или эукариотических клетках. Кроме того, многие векторы можно использовать для трансформации эукариотических клеток, и они будут интегрироваться целиком или частично в геном таких клеток, что приведет в результате к стабильным клеткам-хозяевам, содержащим в их геноме необходимую нуклеиновую кислоту. Используемый вектор может представлять собой любой вектор, который подходит для клонирования ДНК и который можно использовать для транскрипции нуклеиновой кислоты, представляющей интерес. Подходящими векторами в соответствии с настоящим изобретением являются, например, аденовекторы, такие как Ао!2б или Ad35, альфавирус, парамиксовирус, вирус осповакцины, вирус герпеса, ретровирусные векторы и т.д. Специалист в данной области может выбрать подходящие векторы экспрессии и вставить последовательности нуклеиновых кислот настоящего изобретения функциональным образом.
Клетки-хозяева, содержащие молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие F-полипептиды RSV до слияния, также образуют часть настоящего изобретения. F-полипептиды RSV до слияния можно получить с помощью технологии рекомбинантной ДНК, включающей экспрессию молекул в клетках-хозяевах, например, клетках яичников китайского хомячка (СНО), линиях опухолевых клеток, клетках ВНК, клеточных линиях человека, таких как клетки НЕК293, клетки PER.C6 или клетках дрожжей, грибов, насекомых и т.п. или трансгенных животных, или растений. В некоторых вариантах осуществления клетки происходят из многоклеточного организма, в некоторых вариантах осуществления они происходят из позвоночных или беспозвоночных. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетками являются клетки человека. В целом получение рекомбинантных белков, таких как F-полипептиды RSV до слияния по настоящему изобретению, в клетке
хозяине предусматривает введение гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид в экспрессируемом формате, в клетку-хозяина, культивирование клеток в условиях, способствующих экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты и обеспечение экспрессии полипептида в указанной клетке. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок в экспрессируемом формате, может находиться в форме кассеты экспрессии и обычно требует последовательностей, способствующих экспрессии нуклеиновой кислоты, таких как энхансер(ы), промотор, сигнал полиаденилирования и т.п. Специалист в данной области осведомлен о том, что разные промоторы можно использовать для обеспечения экспрессии гена в клетках-хозяевах. Промоторы могут быть конститутивными или регулируемыми, и их можно получать из разных источников, в том числе, вирусов, прокариотических или эукариотических источников, или получать искусственным путем.
Среды для культивирования клеток доступны от различных поставщиков, и подходящую среду можно стандартно выбрать для клетки-хозяина для экспрессии белка, представляющего интерес, в данном случае F-полипептидов RSV до слияния. Подходящую среда может содержать или может не содержать сыворотку.
"Гетерологической молекулой нуклеиновой кислоты" (также называемой в данном документе как лтрансген') является молекула нуклеиновой кислоты, которая в природе не присутствует в клетке-хозяине. Ее вводят, например, в вектор с помощью стандартных методик молекулярной биологии. Трансген обычно функционально связан с последовательностями, контролирующими экспрессию. Это можно выполнить, например, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Многие промоторы можно использовать для экспрессии трансгена (трансгенов), и они известны специалисту, например, такие промоторы могут включать промоторы вирусов, млекопитающих, синтетические промоторы и т.п. Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например, предранний промотор CMV, например,
содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например, сигнал polyA гена бычьего гормона роста (патент США № 5122458) может располагаться позади трансгена(ов). В качестве альтернативы, несколько широко используемых векторов экспрессии доступны в данной области и их получают из коммерческих источников, например, серии векторов pcDNA и pEF Invitrogen, pMSCV и pTK-Hyg от BD Sciences, pCMV-Script от Stratagene и т.д., которые можно использовать для рекомбинантной экспрессии белка, представляющего интерес, или для получения подходящих промоторов и/или последовательностей терминаторов транскрипции, последовательностей polyA и т.п.
Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезивную культуру клеток, например, клетки, прикрепленные к поверхности культурального флакона или к микроносителям, а также суспензионную культуру. Манипуляции с суспензионными культурами наиболее крупного масштаба проводят в периодическом процессе или процессе с подпиткой, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время непрерывные процессы на основе принципов перфузии становятся более распространенными и они также являются подходящими. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области и могут, как правило, быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу согласно стандартным протоколам. Культивирование можно проводить, например, в чашках, роллер-флаконах или в биореакторах, используя периодические, подпитываемые, непрерывные системы и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (смотри, например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9)).
Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее
изобретение также представляет композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, который демонстрирует эпитоп, присутствующий в конформации F-белка RSV до слияния, но отсутствует в конформации после слияния. Настоящее изобретение также представляет композиции, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, кодирующие такой F-полипептид RSV до слияния. Настоящее изобретение также представляет иммуногенные композиции, содержащие F-полипептиды RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор, как описано выше. Настоящее изобретение также представляет применение стабилизированного F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV. Дополнительно представлены способы индуцирования у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV, предусматривающие введение субъекту F-полипептида RSV до слияния, и/или молекулу нуклеиновой кислоты, и/или вектор в соответствии с настоящим изобретением. Также представлены F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты, и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением для индуцирования иммунного ответа у субъекта к F-белку RSV. Также представлено применение F-полипептидов RSV до слияния, и/или молекул нуклеиновой кислоты, и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением для получения лекарственного средства для применения в индуцировании у субъекта иммунного ответа к F-белку RSV.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты
или векторы по настоящему изобретению можно использовать для
предупреждения (профилактики) и/или для лечения инфекций RSV. В
определенных вариантах осуществления предупреждение и/или
лечение может быть направлено на группы пациентов, которые
восприимчивы к инфекции RSV. Такие группы пациентов включают
без ограничений, например, пожилых (например, ^50 лет, > б0 лет
и предпочтительно ^65 лет), молодых (например, ^5 лет <1 лет),
госпитализированных пациент и пациентов, которые получали
лечение противовирусными соединениями, но проявили
недостаточный ответ на лечение противовирусными соединениями.
F-полипептиды RSV до слияния, молекулы нуклеиновых кислот и/или векторы в соответствии с настоящим изобретением можно использовать, например, в самостоятельном лечении и/или профилактике заболевания или состояния, вызванного RSV, или в комбинации с другими профилактическими и/или терапевтическими средствами лечения, такими как (существующими или будущими) вакцины, противовирусные средства и/или моноклональные антитела.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способы предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV с использованием F-полипептидов RSV до слияния, молекул нуклеиновых кислот и/или векторов в соответствии с настоящим изобретением. В конкретном варианте осуществления способ предупреждения и/или лечения у субъекта инфекции RSV предусматривает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества F-полипептида RSV до слияния, молекулы нуклеиновой кислоты и/или вектора, описанных выше. Терапевтически эффективное количество относится к количеству полипептида, молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, которое является эффективным для предупреждения, уменьшение интенсивности и/или лечения заболевания или состояния, возникшего в результате инфекции, вызванной RSV. Предупреждение охватывает подавление или уменьшение распространения RSV, или подавление или уменьшение проявления, развития или прогрессирования одного или нескольких симптомов, связанных с инфекцией, вызванной RSV. Уменьшение интенсивности, как используется в данном документе, может относиться к уменьшению видимых или ощутимых симптомов заболевания, виремии или других поддающихся измерению проявлений инфекции гриппа.
Для введения субъектам, таким как люди, в настоящем изобретении могут использоваться фармацевтические композиции, содержащие F-полипептид RSV до слияния, молекулу нуклеиновой кислоты и/или вектор, как описано в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте выражение "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или наполнитель в используемых
дозировках и концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или вредных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны из уровня техники (смотри Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]) . F-полипептиды RSV или молекулы нуклеиновой кислоты предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно использование лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают путем стерильной фильтрации или с помощью других способов, широко известных из уровня техники. Затем растворы лиофилизируют или расфасовывают по контейнерам, предназначенным для лекарственных форм. рН раствора обычно находится в диапазоне от рН 3,0 до рН 9,5, например, от рН 5,0 до рН 7,5. F-полипептиды RSV обычно находятся в растворе, имеющем подходящий фармацевтически приемлемый буфер, и композиция может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления F-полипептиды RSV можно составлять в виде инъекционного препарата.
В некоторых вариантах осуществления композиция в
соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит
один или несколько адъювантов. Адъюванты, известные из уровня
техники, дополнительно повышают иммунный ответ к применяемой
антигенной детерминанте. Выражения "адьювант" и
"иммуностимулятор" используют в данном документе
взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа к F-полипептидам RSV по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как
гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляных эмульсий (или композиции типа масло в воде), в том числе сквален-водных эмульсий, таких как MF59 (смотри, например, W0 90/14837); составы с сапонинами, такие как, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS)
(смотри, например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфорил липид A (MPL), З-О-деацилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилирующие токсины бактерий или их мутантные формы, такие как термолабильный энтеротоксин LT из Е. coli, холерный токсин СТ и т.п.; белки эукариотов (например, антитела или их фрагменты (например, направленные против самого антигена или CDla, CD3, CD7, CD8 0) и лиганды к рецепторам
(например, CD40L, GMCSF, GCSF и др.), которые стимулируют иммунный ответ при взаимодействии с клетками реципиентов. В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например, в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации в концентрациях 0,05-5 мг, например, 0,075-1,0 мг алюминия из расчета на дозу.
F-полипептиды RSV до слияния можно также вводить в комбинации с наночастицами или конъюгированными с наночастицами, такими как, например, полимерами, липосомами, виросомами, вирус-подобными частицами. F-полипептиды до слияния можно комбинировать с наночастицами, инкапсулировать в наночастицах или конъюгировать с наночастицами с адъювантом или без него. Инкапсулирование в липосомы описано, например, в документе US 4235877. Конъюгирование с макромолекулами раскрыто, например, в документах US 4372945 или US 4474757.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.
В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение представляет способы получения вакцины против респираторного синцитиального вируса (RSV), включающие обеспечение композиции в соответствии с настоящим изобретением
и помещение ее в фармацевтически приемлемую композицию. Выражение "вакцина" относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, который является эффективным для индуцирования у субъекта определенной степени иммунитета к определенному патогенному микроорганизму или заболеванию, которые приведут по меньшей мере к снижению (до полного отсутствия включительно) тяжести, продолжительности или другого проявления симптомов, связанных с инфекцией патогенным микроорганизмом или заболеванием. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество F-полипептида RSV до слияния и/или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей F-полипептид RSV до слияния, и/или вектор, содержащий указанную молекулу нуклеиновой кислоты, который приводит к образованию иммунного ответа к F-белку RSV. Это обеспечивает способ предупреждения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит у субъекта вследствие инфекции и репликации RSV. Выражение "вакцина" согласно настоящему изобретению подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию, и, таким образом, как правило, включает фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. Она может содержать или не содержать дополнительные активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или против других возбудителей инфекции. Введение дополнительных активных компонентов можно, например, осуществлять путем отдельного введения или путем введения комбинации продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов.
Композиции можно вводить субъекту, например, субъекту-человеку. Суммарная доза F-полипептидов RSV в композиции для однократного введения может, например, составлять от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг, например, 1 мкг - 1 мг, например, 10 мкг - 100 мкг. Определение
рекомендуемой дозы будет осуществляться в процессе эксперимента и является стандартным для специалистов в данной области.
Введение композиций в соответствии с настоящим изобретением можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как внутрикожное, внутримышечное, подкожное, чрескожное введение или введение через слизистые, например, интраназальное, пероральное и т.п. В одном варианте осуществления композицию вводят путем внутримышечной инъекции. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например вакцины, для индуцирования иммунного ответа к антигену (антигенам), присутствующему в вакцине.
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например, грызуна, например, мышь, хлопкового хомяка или примата, кроме человека, или человека. Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека.
Полипептиды, молекулы нуклеиновых кислот, векторы и/или комбинации можно также вводить в виде прайма или в виде буста в гомологичном или гетерологичном режиме прайм-буст. При проведении бустерной вакцинации обычно такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев после введения композиции субъекту в первый раз (которое в данном случае называется "первичной вакцинацией"). В некоторых вариантах осуществления введение включает прайм и по меньшей мере одно бустерное введение.
Кроме того, полипептиды по настоящему изобретению можно использовать в качестве диагностического средства, например, для проверки иммунного статуса индивидуума путем определения способности антител в сыворотке такого индивида к связыванию с полипептидами по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также относится к in vitro диагностическому способу для выявления у пациента присутствия инфекции RSV, при этом указанный способ включает стадии а) приведения в контакт
биологического образца, полученного от указанного пациента, с полипептидом в соответствии с настоящим изобретением; и Ь) выявления присутствия комплексов антитело-полипептид.
Настоящее изобретение дополнительно представляет способ стабилизации конформации F-полипептида RSV до слияния, включающий введение одной или нескольких мутаций в домен F1 и/или F2 RSV, по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV дикого типа, где одна или несколько мутаций выбраны группы, состоящей из
(a) стабилизирующей мутации, которая блокирует вращение домена HRA в участке, прилегающем к консервативному дисульфидному мостику 69-212, при это указанный мостик содержит аминокислотные остатки 66-68 и 214-216,
(b) мутации в спирали (в С-конце домена F2) , содержащей аминокислотные остатки 7 6-98 в С-конце домена F2;
(c) мутации, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB (N-концевой конец HRB), содержащего аминокислоты 486, 487 и 489; и
(d) стабилизирующей мутации в участке HRA.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 67.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 215.
В определенных вариантах осуществления мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 6 6 или 68 и/или в положении 214 или 216.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 77.
В определенных вариантах осуществления мутация в спирали находится в положении 80.
В определенных вариантах осуществления аминокислотный остаток в положении 77 и/или 80 изменяется в отрицательно заряженную аминокислоту.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 92.
В определенных вариантах осуществления мутация, которая
снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB, содержит аминокислоты 486, 487, 489.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 4 89.
В определенных вариантах осуществления мутация находится в положении 486.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует бета-повороты между аминокислотными остатками 175-193.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 175.
В определенных вариантах осуществления мутация стабилизирует поворот в положении 184-185.
Стабилизированные F-полипептиды RSV до слияния, получаемые и/или полученные с помощью такого способа, также образуют часть настоящего изобретения, а также варианты их применения, как описано выше.
Далее настоящее изобретение поясняют следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния линкеры и домены тримеризации
В исследовании, которое привело к настоящему изобретению, стабилизированные варианты растворимых F-белков (sF) до слияния конструировали путем стабилизации двух основных участков, которые инициируют рефолдинг. Первой стратегией было блокирование пептида слияния в его положении и предотвращение его высвобождения из головного участка путем фиксации и соединения доменов F1-F2 с помощью короткой петли. Высвобождение пептида слияния можно предотвратить с помощью перенесения ковалентного соединения N-конца F1 к С-концу F2. Как показано в этом примере, подвергли испытаниям ряд разных линкеров. Вставка 5-аминокислотной петли между F1 и F2, в
частности, содержащей аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5), была наиболее успешной. Этот линкер конструировали исходя из расстояния, определенного в 3D модели гомологии, которая была получена для RSV-F типа А2 на основе выравнивания последовательности с F-последовательностью вируса парагриппа 5 типа, для которого опубликована 3D структура (Yin et. al., 2006).
AAA47 881PIV5 MGTIIQFLVVSCLLAGAGSLDPAALMQIGVIPTNVRQLMYYTEASSA
FUS_HRSVlB MELLIHRSSAIFLTLAVNALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYT
ACO83 301HRSVA2ref MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYT
. * к *
AAA47 881PIV5 FIWKLMPTIDS PISGCNI - TSISSYNATVTKLLQPIGENLETIRNQLIP-TRRRRR-
FUS_HRSV1B SVITIELSNIKET - KCNGT DTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAP
ACO83 301HRSVA2ref SVITIELSNIKKN-KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELP
AAA47 881PIV5 FAGWIGLAALGVATAAQVTAAVALVKANENAAAILNLKNAIQ
FUS_HRSV1B QYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALL
ACO83 301HRSVA2ref RFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALL
AAA47 881PIV5 KTNAAVADWQATQSLGTAVQAVQDHINSVVSPAITAANCKAQDAIIGSILNLYLTELTT
FUS_HRSV1B STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNRLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQMNSRLLE
ACO83 301HRSVA2ref STNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLE
+ ^ 4r - "le ш *k - - - • -k • . ~k . -k • • • -к
AAA47 881PIV5 IFHNQIТЫР-ALSPITIQALRILLGSTLPTWEKSFNTQISAAELLSSGLLTGQIVGLDL
FUS_HRSV1B ITREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSII ACO83 301HRSVA2ref ITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSII
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83 301HRSVA2ref
TYMQMVIKIELPTLTVQPATQIIDLATISAFI-NNQEVMAQL-PTRVMVTG-SLIQA KEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVS FF KEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFF
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83 301HRSVA2ref
YPAS QCTITPNTVYCRYNDAQVLS DDTMAC LQGN LTRCTFS PVVGSFLTRFVLFDGI
PQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLG-PQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLG-
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83 301HRSVA2ref
VYANCRS-MLCKCMQPAAVILQPSSSPVTVIDMYKCVSLQLDNLRFTITQLAHVTYNSTI AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKG AIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKG
AAA47881PIV5
FUS_HRSV1B
ACO83 301HRSVA2ref
KLESS-QILSIDPLDISQNLAAVNKSLSDALQHLAQSDTYLSAITSATTTS-VLSIIA EPIINYYDPLVFPS DEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITT11 EPIINFYDPLVFPS DEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITT11
AAA47881PIV5
FUS_HR5V1B
ACO83 301HRSVA2ref
ICLGSLGLILIILLSVWWKLLTIWANRNRMENFVYHK
IVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK-IVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN-
* . . * ~k ~k . .. * -k . . .
Выравнивание между F-последователвноствю HRSV типа А и В с PIV5 (верхняя последователвноств) г которую исполвзовали для конструирования модели гомологии RSV-F до слияния
Другим нестабильным участком является второй гептадный
повтор (HRB), который образует тримерный спиральный участок
стебля в F-белке до слияния. Делеция трансмембранного домена
(ТМ) в растворимом F-белке дополнительно дестабилизирует этот
участок, что было восполнено добавлением различных
гетерологических доменов тримеризации. Полностью
процессированный зрелый эктодомен RSV-F сливали на С-конце с
различными доменами тримеризации и в различных положениях (т.е. домен F1 усекали по различным аминокислотным остаткам).
Несколько конструкций получали на основе штаммов А2 или В1
RSV. Различные домены тримеризации связывали с доменом Fl RSV,
который усекали по различным положениям. Домены тримеризации,
которые исследовали, включали мотив фибритина (содержащий
аминокислотную последовательность: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
(SEQ ID N0: 4), и мотив "фибритин длинный", более длинный,
растянутый на N-конце домен фибритина, который включает его
встречающиеся в природе спиральные участки (содержащие
аминокислотную последовательность:
S S LQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS Т FL (SEQ ID N0: б), которые добавляли к F1-домену RSV в рамке (в регистре) с предполагаемым гептадным повтором участка HRB.
Полученные дополнительные конструкции содержали гептадные
идеальные спиральные тримерные суперспирали, или домен
изолейциновой застежки (IZ) (Suzuki et al. , Protein Engineering
11: 1051-1055 (1998)), содержащие аминокислотную
последовательность: IEAIEKK (SEQ ID NO: 7) . В соответствии с настоящим изобретением использовали различные домены IZ, обозначенные как изолейциновая застежка (L) , содержащая аминокислотную последовательность (I)EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID N0: 8), и изолейциновая застежка (S), содержащая аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID N0: 3).
Эти домены IZ сопоставимы по структуре с GCN4, однако, домены IZ не являются встречающимися в природе последовательностями, а сконструированы для того, чтобы быть оптимальными доменами тримеризации, и поэтому более стабильными.
Дополнительные конструкции получали с другими известными доменами тримеризации: GCN4II
EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID N0: 9) Оптимизированный GCN4II
EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID N0: 10)
Матриллин -1 (длинная версия)
EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID N0:
Матриллин - 1 которая версия, которая содержит только домен застежки:
EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID N0: 12) Получали следующие конструкции:
конструкция F18 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID N0: 4), связанный с аминокислотным остатком 513 домена F1.
Конструкция F19 содержала домен тримеризации фибритина (SEQ ID N0: 4), связанный с аминокислотным остатком 499 домена F1.
Конструкция F2 0 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID N0: 8), связанный с аминокислотным остатком 516 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB для оптимизации гидрофобной природы гептадных положений и облегчения слияния с доменом IZ с сохранением рамки считывания.
Конструкция F21 также содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID N0: 8), но связанный с аминокислотным остатком 501 домена F1 и без дополнительных модификаций в участке HRB.
Конструкция F22 содержала домен изолейциновой застежки (L) (SEQ ID N0: 8), связанный с аминокислотным остатком 495 домена F1 и содержащий дополнительные модификации в HRB.
Конструкция F2 3 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID N0: 3), связанный с аминокислотным остатком 495.
Конструкция F4 6 содержала домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID N0: 3), но связанный с более длинным эктодоменом RSV-F, т.е. домен F1 усекали после аминокислотного остатка 513.
Все конструкции содержали HIS-метку.
Конструкции исследовали в отношении уровней экспрессии, стабильности при хранении и связывания с антителом CR9501. Аминокислотные последовательности вариабельных участков тяжелой и легкой цепи и CDR тяжелой и легкой цепи этого антитела приведены ниже. CR9501 содержит связывающие участки антител,
обозначенных как 58С5 в WO2012/006596.
Конструкции синтезировали и оптимизировали по кодонам в Gene Art (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния). Конструкции клонировали в pCDNA2 0 04 или создавали при помощи стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР, и секвенировали. Используемой системой экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в течение 5 дней при 37°С и 10% СОг • Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 минут при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°С до использования.
Супернатанты с 5 дня оценивали в отношении экспрессии F-белка с помощью вестерн-блоттинга, используя моноклональное антитело CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи антитела к F RSV мотавизумаб (обозначенного как CR9503). Приблизительные уровни экспрессии конструкций F-белка RSV до слияния определяли с использованием CR9503, вторичного антитела, конъюгированного с IR-красителем, к иммуноглобулину человека (Li-Cor, Линкольн, Небраска) или HRP-конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания). Затем определяли количества белка с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV, или визуально на глаз, или с использованием системы Odyssey CLx для инфракрасной визуализации. Альтернативно использовали количественный октет (интерферометрия BioLayer) для определения концентрации белка в супернатантах. Для определения стабильности конструкций и выявления положительных или отрицательных влияющих стабилизирующих эффектов введенных мотивов тримеризации, конструкции, способные к связыванию с CR9501, обрабатывали в диапазоне температур от 45 до 65°С в течение 30 минут для исследования стабильности эпитопа CR9501.
Эта процедура подробно описана в примере 8. Результаты обобщены в таблице 1.
Как можно увидеть в таблице 1, единственными конструкциями, которые экспрессировались, были вариант фибритина (F18) и F23. Несмотря на то, что F18 был тримерным и демонстрировал экспрессию, он был нестабильным при хранении при 4°С. В противоположность этому, F23 был стабильным при 4°С, связывался со специфичными антителами до слияния, но, по-видимому, был мономерным. Таким образом, оба варианта F18 и F2 3 использовали для оптимизации стабильности и тримеризации.
Затем получали несколько конструкций, в которых пептид слияния на N-конце F1 был прикреплен путем слияния с С-концом домена F2. Все конструкции содержали His-метку.
Получали несколько конструкций, в том числе конструкции, в которых сайты расщепления фурином подвергали мутации, что приводило к образованию растворимого F-белка, который по-прежнему содержал пептид р2 7 (т.е. F12, F15.1 и F17) . В других конструкциях участок из 27 остатков (петля Р27), который отщеплялся от предшественника F0, замещали альтернативной закрытой петлей или связывающей последовательностью: с помощью замещения участка RSV-F лгомологичным' участком PIV-5 F, F-белком до слияния, который получали и успешно кристаллизовали (F25), или путем замещения участка минимальной (GS)n петлей, которая бы связывала с помощью мостика концы F2 и Fl (F24), или путем замещения участка центральным консервативным участком RSV-G (F26). Моделирование гомологии RSV-F на основе PIV-5 и измерений in silico привело в результате к выбору минимальной петли из 5 аминокислотных остатков между остатками 108 и 136. В качестве линкера выбирали остатки Gly (G) и Ser (S), которые являются гибкими и полярными и имеют высокую вероятность быть внесенными (F24). Кроме того, F137 подвергали мутации в S, поскольку локальные модификации, вызванные петлей, могли смещать гидрофобный F и вызывать нестабильности. Это представлено ниже. Также R10 6 подвергали мутированию в Q и замещали 27 остатков (109-135), используя GSGSG.
РAANNRARREAPQYMNY TINT TKNLNVSISKKRKRR i36FLGFLLGVG
PAANNQAR GSGSGRi36SLGFLLGVG
Как представлено в таблице 2, все варианты не демонстрировали экспрессию или демонстрировали очень низкую экспрессию, за исключением варианта с короткой петлей GSGSG (F24), которая демонстрировала намного более высокую экспрессию (44 мкг/мл) по сравнению с конструкцией на основе F дикого типа RSV, т.е. подобной конструкцией, но без указанного линкера (Fll). F2 4, который являлся тримерным, был, однако, нестабильным при хранении подобно всем другими вариантам с С-конценвым мотивом тримеризации фибритина. Все варианты содержали HIS-метку.
примере 1
Затем, наиболее подходящие модификации комбинировали для поиска оптимальных F-полипептидов до слияния. Комбинации получали из вариантов с петлей GSGSG, С-концевым усечением F1 и добавлением мотива фибритина (SEQ ID NO: 4) или изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) (смотри таблицу 3).
Экспрессия и стабильность конструкций на основе F RSV с комбинациями оптимизаций согласно таблицам
Добавление петли GSGSG всегда повышало экспрессию функциональных конструкций, а также термостабильность белка. Комбинация петли GSGSG с усеченным F и мотивом изолейциновой застежки (S) (F43, F47) продемонстрировала высокую экспрессию, термостабильность и значительную стабильность в хранении при 4°С. Однако, эти варианты были по-прежнему мономерными. Мотив тримеризации с изолейциновой застежкой (S) демонстрировал более высокую экспрессию с вариантом F, который представлял собой F, усеченный на С-конце в положении 4 95 (сравните F4 3 с F5 6 и F2 3 с F4 6) . В противоположность этому, для вариантов с доменом тримеризации фибритина усечение в положении 513 продемонстрировало высокую экспрессию по сравнению с усечением в положении 4 95, которое не демонстрировало экспрессии (сравните F24 с F44).
Поскольку HIS-метку могла нарушать нативный фолдинг тримеров, то конструировали варианты без HIS-метки для фибритина и варианта изолейциновой застежки (S) (таблица 4).
описано в примере 8; ND: не определено.
Удивительным являлось то, что делеция HIS-метки повышала экспрессию в F47. Более того, для F47 она немного повышала содержание тримеров и для F2 4 она умеренно повышала только уровень экспрессии.
Затем, изучали несколько альтернативных доменов тримеризации и усечений в комбинации со стабилизированным петлей GSGSG вариантом F (F47) (смотри таблицу 5). Все варианты имеют петлю GSGSG и содержат HIS-метку.
Экспрессия и стабильность вариантов на основе F RSV с альтернативными доменами тримеризации
Белок RSV
Вариант
Описание
% тримеризации
Связывание антитела
Мотив тримеризации
Модификации
Точка терминации
Экспрессия (мкг/мл)
CR9501
CR9503
F47
Изолейциновая застежка (S)
Нет
495
Изолейциновая застежка (S)
S502T
502
3,5
Matl
Матриллин длинный
Отсутствует
520
Три- и гексадимеры
Mat2
Матриллин короткий
Отсутствует
516
Mat3
Матриллин короткий
Отсутствует
495
1,5
Оптимизированный GCN
Оптимизированный GCN4II
Отсутствует
516
Оптимизированный GCN+L512K
Оптимизированный GCN4II
L512K
516
Связывание антитела определяли как связывание в день сбора клеток (как описано в примере 7);
+ указывает связывание; - указывает отсутствие связывания.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. ND: не определено.
Только домен матриллина 1 (Dames-SA et. al. , Nat. Struc.
Biol., 5(8), 1998), который содержит и N-концевой домен
застежки, и С-концевую часть с остатками цистеина, которые
могут потенциально образовывать дисульфидные мостики между
тримерами, как было обнаружено, способен к более высоким
уровням экспрессии, чем F47 (таблица 5, матриллин длинный).
Более того, вариант с мотивом тримериации матриллина длинного
демонстрирует тримерные F-белки. Однако, продукт не связывался
со специфическим Mab CR9501 до слияния и также демонстрировал
гексамерные молекулы, которые делают домен тримеризации
матриллина 1 не подходящим для получения тримерного нативного
F-белка. Никакой из мотивов застежки на основе матриллина или
на основе GCN4II не демонстрировал повышенной экспрессии или
стабильности по отношению к F4 7 (таблица 5, матриллин короткий,
GCN4II-оптимизированный). Снова усечение на 4 95 приводит к
более высоким уровням экспрессии. Добавление мотива GCN4,
который содержал оптимизированную триггерную
последовательность, не продемонстрировало экспрессии.
GCN4 II представляет собой домен тримеризации, который
успешно используют для стабилизации тримера вируса парагриппа
типа 5 до слияния (Yin et al. , Nature 439:38-44, 2006) и его
испытывали другие для стабилизации F RSV до слияния (как
раскрыто, например, в WO2010/149743, WO2010/14975,
WO2009/079796, W02010/158613) . Домен тримеризации GCN4II оценивали и сравнивали с другими конструкциями, которые содержат домен изолейциновой застежки (S) (SEQ ID NO: 3) или домен фибритина (SEQ ID NO: 4) (результаты представлены в таблице 6) . Эти варианты также сравнивали с другими модификациями, т.е. коротким линкером на основе одной мутации лизина и L512K. Все варианты содержали HIS-метку.
Экспрессия и стабильность вариантов F RSV с замещением GCN4II, L512K и р27
описано в примере 1; термостабильность определяли, как описано в примере 8; ND: не определено.
Короткая связь между F1 и F2, по-видимому, сопоставима с петлей GSGSG. Добавление мотива GCN4II не приводит в результате к какой-либо экспрессии F-белка в какой-либо из исследованных конструкций (т.е. ни в последовательности F RSV А2, описанной в WO2010/149743 или WO2010/149745, ни в последовательности F RSV А2, используемой в соответствии с настоящим изобретением, ни последовательности F RSV В1).
Было показано, в соответствии с настоящим изобретением, что введение этих двух типов модификаций, т.е. введение связывающей последовательности и гетерологического домена тримеризации, было недостаточно для обеспечения экспрессии стабильного тримерного F-белка до слияния. Помимо этих двух основных участков нестабильности, которые были стабилизированы, т.е. HRB и пептида слияния, как описано выше, другие участки в F-белке до слияния также способствуют значительному рефолдингу и/или вносят значительный рефолдинг в F после слияния, и можно оптимизировать больше положений в последовательности для остановки рефолдинга F-белка до слияния. Таким образом, разные аминокислотные остатки в домене HRA и HRB и во всех доменах, которые контактируют с этими участками в F до слияния, подвергали мутированию для повышения структурной стабильности до слияния, как описано в следующих примерах.
ПРИМЕР 2
Получение стабильных F-полипептидов RSV до слияния стабилизирующие мутации
Поскольку содержание тримеров (для конструкции F47) и стабильность при хранении (для конструкции F2 4) не были оптимальными, создавали дополнительные варианты, которые содержали точечные мутации для повышения уровней экспрессии, стабильности и нативной тримерной структуры. Результаты представлены в таблице 7 и 8.
Номенклатура мутаций на основе последовательности дикого типа (SEQ ID NO: 1).
Все конструкции являются вариантами F47-: тип А2, мотив изолейциновой застежки (S) (SEQ ID N0: 3), линкер GSGSG; точка терминации 495, без HIS-метки (SEQ ID N0: 16). Как представлено в таблице 7, многие мутации повышали экспрессию F47-, но только вариант F47_S4 6G одновременно демонстрировал более высокий уровень тримеров, помимо высокой экспрессии.
В таблице 8 представлены результаты экспрессии и стабильности вариантов для F24. Все варианты представляли собой RSV типа А2, с мотивом фибритина, линкером GSGSG; точкой терминации 513, без HIS-метки.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1. Конечная стабильность представлена в данном документе в виде
процента связывания антитела до слияния (CR9501) через 5 дней хранения при 4°С по отношению к 1 дню; стабильность фазовой ассоциации определяют, как описано в примере 9.
Многие мутации повышали экспрессию A2_F24-. Для большинства мутаций наблюдали видимую взаимосвязь между повышенной экспрессией на фоне F4 7- (таблица 7) и на фоне A2_F24- (таблица 8). N671 оказывала более положительное влияние на экспрессию F на фоне A2_F24-. Наиболее значимого повышения экспрессии достигали с использованием единичных точечных мутаций: S46G, S215P, N671, К80Е, E92D, D486N, G184N, V185N, E487N, N175P, K209Q, E487I, E487Q, К77Е, K201Q, N426S и K465Q. При первичном скрининге с помощью анализа конечной стабильности (пример 7) варианты с наиболее высокой экспрессией также демонстрировали лучшую стабильность при хранении (E92D, K4 65Q, К465Е, N426S, S46G, S215P и N671). Для того чтобы оценить, действительно ли эти мутации стабилизировали конформацию до слияния, супернатанты культур разводили до 5 и 10 мкг/мл, исходя из результатов количественного вестерн-блоттинга, и их хранили до 33 дней при 4°С. В качестве точечных мутантов только N671 и S215P были полностью стабильны со временем (смотри пример 9).
Экспрессия и стабильность вариантов A2_F24 с двумя дополнительными мутациями
Затем несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и надлежащую стабильность конформации до слияния, комбинировали для того чтобы оценить, были ли стабилизации аддитивными или имели ли возможный синергетический эффект (таблица 9).
А2 F24 S46G+N67I
115, 5
Стабильный
А2 F24 S46G+E92D
14,3
Нестабильный
А2 F24 N67I+E92D
134,2
Стабильный
А2 F24 N67I+S215P
152, 1
Стабильный
А2 F24 E92D+S215P
49, 1
Стабильный
А2 F24 K465Q+S215P
53, 3
Стабильный
А2 F24 S46G+S215P
43, 8
Стабильный
Стабильность при хранении относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.
Уровень экспрессии определяли, как описано в примере 1.
Все варианты являлись вариантами F24-: А2 типа, мотив фибритина, линкер GSGSG; точка терминации 513, связывание со всеми МаЬ, без HIS-метки (SEQ ID N0: 19).
При комбинировании ранее выявленных точечных мутаций можно было наблюдать очень интересные синергетические эффекты в отношении уровней экспрессии с комбинациями, включающими N671 в качестве наиболее эффективной. Все полученные двойные мутанты, независимо от того была ли включена N671 или S215P, были стабильными спустя более 3 0 дней при хранении при 4°С (пример 9) . Неожиданным образом, было установлено, мутация N671 оказывала наиболее сильный эффект на уровни экспрессии F до слияния при включении в двойные мутанты. Также комбинации с мутациями S215P приводили к умеренной экспрессии. Выбирали комбинацию N671 с S215P, поскольку она приводила к очень высокому уровню экспрессии, и поскольку обе точечные мутации были стабильными при хранении. Кроме того, было отмечено, что N671 и S215P обладали способностью стабилизировать некоторые мутанты, которые в качестве единичных мутаций были нестабильными, указывая на то, что участок, где эти две мутации встречались, является центральным для конформационных изменений, которым подвергается белок во время перехода к конформации после слияния.
Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением было показано, что по меньшей мере некоторые мутации приводили в результате к повышенным уровням экспрессии и повышенной
стабилизации белка RSV до слияния. Предполагается, что эти
явления связаны. Мутации, описанные в этом примере, все в
результате приводили к повышенному продуцированию F-
полипептидов до слияния. Только выбор этих полипептидов
оставался стабильным при длительном хранении (смотри пример 9).
Используемый анализ стабильности основывается на потере
специфического эпитопа CR9501 до слияния в верхней части F до
слияния в анализе связывания и он может быть недостаточно
чувствительным для определения всех вкладов в стабильность
всего белка. Мутации, для которых наблюдали только повышенную
экспрессию, являются, таким образом (вероятно
стабилизирующими), потенциальными мутациями, которые можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями для получения F-конструкции до слияния с высокой стабильностью и высокими уровнями экспрессии.
Затем проверяли, была ли способна двойная мутация N671 -S215P, подобно единичным мутациям, стабилизировать точечные мутации, которые, как единичные мутации считались нестабильными на основании использованных критериев. Выбирали дополнительные мутации на основе подходящих уровней экспрессии и стабильности в соответствии с таблицей 8. Разрабатывали и исследовали в отношении уровней экспрессии и стабильности варианты тройных мутантных RSV-F (таблица 10).
Стабильность относится к анализу фазовой ассоциации, представленной в примере 9.
+ означает <10% потери связывания CR9501 через 5 дней; ++ означает <5% потери связывания CR9501 через 5 дней; +++ означает 0% потери связывания CR9501 через 5 дней.
Снова наблюдали аддитивный эффект в отношении уровнией экспрессии. Как ожидалось, тройные мутанты D4 7 9N и E4 8 7R экспрессируют при несколько меньших уровнях, поскольку единичные мутанты также находились среди наиболее низких из выбранных мутаций (таблица 8). В связи со стабилизирующим эффектом мутации N67I+S215P, дополнительные мутации, которые являются нестабильными в качестве единичных мутаций, приводили к образованию стабильных вариантов F до слияния при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P. Некоторыми наиболее иллюстративными примерами являются тройные мутанты с дополнительной V18 5N, G18 4N или E4 8 7N, которые демонстрировали высокую экспрессию, но низкую стабильность в качестве единичных мутантов (таблица 8), но демонстрировали даже более высокую экспрессию и были высокостабильными при добавлении к фону A2_F24 N67I+S215P.
Стабилизирующие мутации также стабилизируют белок RSV-F из других штаммов и также в процессированном варианте F
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния,
использовали в отношении F-белков RSV из других штаммов (SEQ ID N0 69 и 70) и использовали в отношении варианта F RSV А2 без мутаций в сайте расщепления фурином (F18: SEQ ID N0 71) для оценки являются ли модификации универсальным решением для стабилизации F RSV до слияния (таблица 11).
Таблица 11
Экспрессия и стабильность вариантов A2_F18 с дополнительными мутациями и F из штамма Bl (SEQ ID N0: 2) и CL57-v224 типа А
* Относительную экспрессию нормализуют по отношению к экспрессии A2_F24_N67I, S215P, E487Q (seq ID #33)
** Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°С в течение 5 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501. NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.
При введении ранее выявленных точечных мутаций в A2_F18 (SEQ ID No. 71), стабильность и уровни экспрессии были сопоставимыми с вариантом одноцепочечного F24 (SEQ ID No. 21), который содержал короткую петлю между F1 и F2. Снова наблюдали синергизм, демонстрируя более высокую экспрессию и стабильность при добавлении мутаций к вариантам, которые содержали N671 или двойную мутацию N671, S215P. Двойная точечная мутация N671, S215P не только стабилизировала F до слияния штамма А2, но также F до слияния штамма В1 и CL57-v224 (таблица 11).
Стабилизирующие мутации также стабилизируют полноразмерный белок RSV-F
Несколько мутаций, которые демонстрировали высокую экспрессию и значительную стабильность конформации до слияния в
растворимой версии RSV-F, соответствующей эктодомену, использовали по отношению к полноразмерному белку RSV-F. Мутации вводили в полноразмерный RSV-F с наличием или без мутаций в сайте отщепления фурином. Ни один домен тримеризации не сливался с этими вариантами (таблица 12) .
Экспрессия и стабильность вариантов полноразмерных версий A2_F18 и A2_F2 4 с дополнительными
мутациями
Вариант F-белка RSV*
Свойства
Аминокислотные замены
SEQ ID No
Линкер Fl, F2
Экспрессия,
кратность увеличения* *
Термостабильность* * *
Нет (F А2 дикого типа, полноразмерный)
Отсутствует
N671
Отсутствует
1,4
N.D.
S215P
Отсутствует
1,4
N.D.
E92D
Отсутствует
1,4
N.D.
N671, K465Q
Отсутствует
1,4
N.D.
N671, S46G
Отсутствует
0,2
N.D.
N671, E92D
Отсутствует
1,4
N.D.
N671, К80Е
Отсутствует
2,3
N.D.
N671, G184N
Отсутствует
1,5
N.D.
N671, V185N
Отсутствует
1,4
N.D.
N671, E487Q
Отсутствует
2,5
N.D.
N671, S215P,V185N
Отсутствует
2,7
N.D.
N671, S215P,K508E
Отсутствует
3, 0
N.D.
N671, S215P,K80E
Отсутствует
3,1
N.D.
N671, S215P,K465Q
Отсутствует
2,9
N.D.
N671, S215P
Отсутствует
2,4
+ +
N671, S215P, G184N
Отсутствует
7, 6
+ +
N671, S215P, E92D
Отсутствует
6, 8
N.D.
N671, S215P, S46G
Отсутствует
6, 8
N671, S215P, D486N
Отсутствует
5,9
+ + +
N671, S215P, E487Q
Отсутствует
6, 2
N.D.
N671, S215P, S46G, K66E
Отсутствует
12, 1
+ + +
N671, S215P, D486N, K66E
Отсутствует
9,2
+ + +
N671, S215P, S46G, E92D, K66E
Отсутствует
11, 8
+ + +
N671, S215P, S46G, E487Q, K66E
Отсутствует
11, 0
+ + +
N671, S215P, S46G, D486N, K66E
Отсутствует
10,5
+ + +
N671, S215P, D486N, K66E, I76V
Отсутствует
7,2
+ + +
N671, S215P, S46G, K66E, I76V
Отсутствует
9,7
+ + +
N671, S215P, S46G, K80E
Отсутствует
4,5
N.D.
N67I+S215P+G18 4N+K8 0E+E92D+E4 8 7Q+S4 6G
Отсутствует
9,1
N.D.
Отсутствует
Q GSGSG_S
3, 8
N671, S215P
Q GSGSG_S
6, 2
N.D.
N671, S215P, G184N
Q GSGSG_S
7,2
+ +
N671, S215P, E92D
Q GSGSG S
5, 9
N.D.
Стабильность определяли с помощью тепловой обработки клеток НЕК293Т в течение 5-10 минут при 46, 55, 3, 60°С.
*** обозначение для данных стабильности
- снижение связывания до слияния - связывание специфического Mab CR9501 после нагревания до 4б°С (например, дикий тип)
+ небольшое снижение связывания CR9501 после нагревания до 4б°С, но не в той же степени, как дикого типа
++ без изменения в связывании CR9501 до 60°С включительно, при 60°С некоторое снижение связывания CR9501
+++ без изменения в связывании CR9501 при 60°С
Ранее выявленные стабилизирующие точечные мутации также были стабилизирующими в полноразмерном F-белке. Повышение уровня экспрессии было менее выраженным, но демонстрировало ту же тенденцию. Это может быть вызвано различным фоном, при котором вводили мутации, но причина может также быть в различной методике количественной оценки (FACS по сравнению с вестерн-блоттингом) и биологическим максимумом экспрессии вследствие рециклинга поверхностных белков. Введение связывающей последовательности (или короткой петли) повышало экспрессию и стабильность, и точечные мутации оказывали то же действие. Точечные мутации не были или вряд ли были синергетическими с короткой петлей (подобно тому, как было обнаружено для растворимого белка (таблица 9-11))
Поскольку точечная мутация в положении 67 оказывала такой положительный эффект в отношении уровня экспрессии и стабильности, все аминокислотные замены исследовали в отношении этого положения для изучения того, были ли выбраны наиболее оптимальные положения или можно было бы улучшить эти положения (таблица 13).
Таблица 13
Анализ полной замены экспрессии и стабильности для положения
N67M
2, 579
87,3
78,7
N67P
2,414
14,3
0, 0
N67Q
0, 955
N67R
0, 523
N67S
1,277
0, 0
0, 0
N67T
1, 577
0, 0
0, 0
N67V
2, 457
84,2
77, 0
N67W
1, 794
99, 9
104,3
N67Y
1, 830
61,3
45, 8
* Относительная экспрессия - концентрацию белка определяли с помощью метода количественного октета с использованием антитела CR9503 и экспрессию по отношению к концентрации A2_F24 (SEQ ID #19)
** Стабильность - выражают в виде % концентрации белка, определенного после хранения при 4°С в течение 5 и 10 дней, относительно дня сбора клеток. Концентрации определяли с помощью количественной методики Octet с использованием антитела CR9501. NA - данные отсутствуют: связывания CR9501 не выявили.
Как представлено в таблице 13, преимущественно гидрофобные остатки и, в частности, Не, Leu и Met в положении 67 могли повышать экспрессию и стабильности. Не представляет собой остаток, который в наибольшей степени повышал экспрессию и стабильность. Остатки Glu и Gin, самый маленький остаток Gly и положительно заряженные остатки Arg и Lys обладали наибольшим дестабилизирующим эффектом в положении 67 в отношении конформации до слияния.
В соответствии с настоящим изобретением мутации аминокислот, которые стабилизируют конформацию F-белка RSV до слияния, можно группировать в различные категории, которые стабилизируют конформацию различным образом. Стратегии для стабилизации F до слияния основаны на модели гомологии RSV-F, которая была основана на кристаллической структуре PIV5 (Yin et. al. , 2 006) и выравнивании на странице 27.
Аминокислотные остатки 67 и 215
Аминокислотные остатки в положениях 67 и 215 являются очень близкими по 3D структуре модели до слияния и кристаллической структуры после слияния. Остатки являются близкими по консервативному дисульфидному мостику в верхней части участка DIII, который образует шарнир, по которому участок HRA подвергается рефолдингу в удлиненный суперспиральный растянутый спиральный тример. Мутации в этом участке будут влиять на функцию шарнира и, таким образом, мутации, которые были введены, стабилизируют конформацию до слияния с помощью блокады шарнирной функции.
Аминокислотные остатки 77, 8 0
Аминокислотные остатки в положениях 7 7 и 8 0 расположены в длинной спирали (остатки 7 6-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на N-конце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния. Поскольку эти два участка подлежат разделению во время рефолдинга с конформации до слияния в конформацию после слияния, аминокислоты в этом участке, которые предотвращают это разделение, стабилизировали бы конформацию до слияния. Поскольку эти два участка должны разделяться во время рефолдинга, некоторые из остатков можно оптимизировать для усиления взаимодействия. Примером отталкивания, которое наблюдалось, являлось отталкивание между положительно заряженным Lys8 0. Мутация Lys8 0 до отрицательно заряженного остатка Glu повышала экспрессию F до слияния. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния, эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N671 и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в таблице 10.
Аминокислотный остаток 92
Аминокислотный остаток в положении 92 также расположен в длинной спирали (остатки 7 6-98) на С-конце F2, который находится в непосредственном контакте с группой вторичных структур в DIII на N-конце F1, который подвергается рефолдингу в длинную суперспиральную структуру конформации после слияния.
При отделении спирали от участка HRA, он передвигается к участку DIII, который содержит эпитоп Synagis (эпитоп II) (Arbiza et al. , J. Gen. Virol. 73:2225-2234, 1992), и отрицательно заряженный Glu92 перемещается очень близко к положительно заряженному Arg2 82 в положении после конформации. Мутации, которые уменьшают это перемещение, будут стабилизировать конформацию до слияния. Мутация Glu92 в консервативный остаток Asp будет уменьшать перемещение, поскольку он не сможет достигнуть Arg282. Аминокислотные остатки 4 8 6, 4 87
Аминокислотные остатки 486, 487 и 489 в верхней части HRB в конформации до слияния создают мутацию отрицательно заряженного фрагмента Glu4 8 7 в Asn или Не, повышающую экспрессию F до слияния. Мутации Asp4 8 6 в Asn или Gin и/или Glu489 в Asn, Не или Gin будут иметь такой же самый эффект. Вследствие последовательного перехода к конформации после слияния, эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N671 и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в таблице 10, например, D4 8 6N.
Аминокислотные остатки 175, 184, 185
Для рефолдинга от конформации до слияния в конформацию после слияния участок между остатком 175 и 193 необходимо преобразовать от петли - бета-шпильки в спираль.
Этот участок демонстрирует наиболее существенный структурный переход. Часть этого участка фактически имеет наиболее высокую степень прогнозирования образования альфа-спирали. Фактические спиральные структуры в модели до слияния представлены ниже выделением серого цвета. Весь данный участок преобразуется в одну большую спираль, когда он подвергается рефолдингу в конформацию после слияния. В нижней последовательности остатки выделены серым цветом с наиболее высокой степенью прогнозирования образования спирали на основе Agadir (http://agadir.crg.es/). Из этого сравнения ясно, что С-концевая часть, которая сохраняется в бета-шпильке в конформации до слияния (остатки 187-202), имеет высокую
склонность к образованию альфа-шпильки.
150 160 170 180 190 200 210 SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC
hhhhhh hhhhhhh hhhhh sssssss ssssssss hhhhhhhh
SGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSC
Последовательность остатков 150-212 RSV-F представлена выше. На второй строке вторичные структуры верхней строки указаны с помощью h (для спирали) и s (для нитей) на основании 3D модели гомологии PIV-5. Спирали выделены серым затенением. Нижняя строка является той же самой последовательностью, в которой спирали затенены серым цветом, на основе свойств спирали последовательности.
Таким образом, пролин вводили в положение 175 для стабилизации этого поворота и для предотвращения рефолдинга в спираль, которая в качестве единичной мутации повысила уровень экспрессии, указывая, что она стабилизирует конформацию до слияния и обеспечивает лучший процессинг белка. Для поворота в шпильке (остатки 184, 185) в базе данных Brookhaven проводили поиск в отношении структурно гомологичной шпильки от стабильного белка, который не подвергается рефолдингу. Была обнаружена высокая структурная гомология с петлей шпильки в протеинкиназе А (код pdb 3FHI). В соответствии с выравниванием, представленным ниже, остатки 184 Gly или 18 5Val замещали Asn для того, чтобы стабилизировать этот поворот и предотвратить его рефолдинг.
WSLSNGVSVLTSKV НРАЫЬ2 178-192
EMDVYVNNEWAT SVG 3fhi:B 179-193
Эти мутации можно комбинировать с другими стабилизирующими мутациями, например, N671 и S215P, для получения полного эффекта этой стабилизации, как показано в таблице 10.
Аминокислотные остатки в положениях 421 и 42 6 расположены в петле в участке DII. Остаток S46 расположен на нити, которая переходит от DI к DIII. Аминокислотный остаток в положении 426 подвергали мутации в серии и аминокислотный остаток в положении 4 6 подвергали мутации в глицин. Эти мутации повышали
Аминокислотные остатки 421, 42 6 и 4 6
стабильность и уровни экспрессии до слияния. Аминокислотный остаток 4 65
Аминокислотный остаток Lys4 65 расположен в другом участке, который проходит через большое конформационное изменение. Lys4 65 расположен на перекрещенной петле, которая связывает верхнюю часть участка DII с HRB. Поскольку участок HRB движется от нижней части к верхней часть и образует комплексы с HRA для образования пучка из шести спиралей, перекрещенная петля также перемещается с верхней части в нижнюю часть. Эта петля должна, таким образом, быть метастабильной для обеспечения отделения DII и смены положения в другом окружении. Lys4 65 на перекрещенной петле расположен непосредственно рядом с Lys445 на участке DII. Мутация Lys465 в Gin или Glu нейтрализует отталкивание и повышало стабильность и уровни экспрессии F до слияния.
ПРИМЕР 3
Экспрессия F-белка до слияния
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный F-белок RSV до слияния, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Используемой системой для экспрессии были клетки 293Freestyle (Life Technologies, Ренфрушир, Великобритания). Клетки временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали во встряхивателе-инкубаторе в течение 5 дней при 37°С и 10% СОг• Супернатант культуры собирали и центрифугировали в течение 5 минут при 300 g для удаления клеток и клеточного дебриса. Отцентрифугированный супернатант затем фильтровали в стерильных условиях с помощью 0,22 мкм вакуумного фильтра и хранили при 4°С до использования.
ПРИМЕР 4
Очистка F-белка RSV до слияния
Рекомбинантные полипептиды очищали с помощью 2-стадийного протокола очистки с применением катион-обменной колонки для первичной очистки, а затем колонки superdex2 0 0 для завершающей
стадии с удалением остаточных примесей. Для исходного ионобменной стадии супернатант культуры разбавляли 2 объемами по 50 мМ NaOAc, рН 5,0, и пропускали через 5 мл колонку HiTrap Capto S при скорости 5 мл в минуту. Затем колонки отмывали 10 объемами, соответствующими объему колонки (CV), по 20 мМ NaOAc, 50 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, рН 5 и элюировали 2 CV по 20 мМ NaOAc, 1М NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, рН 5. Элюат концентрировали с помощью концентратора-центрифуги, а затем белок очищали с помощью колонки superdex200 с использованием 40 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 0,01% (об./об.) tween20, рН 7,4, в качестве подвижного буфера. На фигуре 1А представлена хроматограмма с гель-фильтрационной колонки и главный пик содержит F-белок RSV до слияния. Фракции, содержащие этот пик, снова объединяли и концентрацию белка определяли при OD2 8 0 и сохраняли при 4°С до использования. На фигуре 1В представлен сокращенный результат анализа SDS-PAGE конечного препарата белка, и можно видеть, что чистота составляла > 95%. Идентичность полосы подтверждали с помощью вестерн-блоттинга и специфических к F-белку антител (не показано).
ПРИМЕР 5
NativePAGE
Для исходного определения мультимерного состояния F-полипептидов до слияния в соответствии с настоящим изобретением супернатанты культур от временно трансфицированных клеток анализировали в гель-системе NativePAGE Bis-Tris (Life Technologies). Затем гели подвергали блоттингу с использованием iBlot technolog в соответствии с инструкциями производителя (Life Technologies). Антитело CR9503, специфичное к F-белку RSV (последовательность приведена ниже в таблице 17), использовали в качестве первичного зонда для выявления F-белка RSV до слияния, а затем использовали HRP-конъюгированное мышиное антитело к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или ШБуе800С1л/-конъюгированное аффинно очищенное антитело к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Блоты проявляли с использованием
стандартной пленки (Codak) или с использованием инфракрасной системы для визуализации Odyssey CLx. На фигуре 2 представлен анализ NativePAGE супернатантов от мономерного F47- (линия 1), F-белка RSV после слияния и первично тримерного F-белка RSV (линия 2) и очищенного F-белка RSV до слияния (линия 3), показывающий, что после очистки только тримерные молекулы присутствуют в препарате F-белка RSV до слияния, поскольку он мигрирует подобным образом к тримерной полосе после слияния. Это также подтверждается объемом элюирования из гель-фильтрационной колонки (фигура 1А). ПРИМЕР 6
Количественный вестерн-блоттинг
Для количественного определения конструкций F-белка RSV до слияния использовали количественный вестерн-блоттинг. Разбавления супернатантов культур прогоняли в 4-12% (вес/объем) градиентных гелях Bis-Tris NuPAGE (Life Technology) и проводили блоттинг с помощью технологии iBlot (Life Technology). Блоты инкубировали с CR9503 (как описано выше) и проявляли с использованием конъюгированного мышиного антитела к IgG человека (Jackson ImmunoResearch, Вест Гров, Пенсильвания) или ШБуе800С1л/-конъюгированного аффинно очищенного антитела к IgG человека (кроличье) (Rockland Immunochemicals, Гилбертсвилл, Пенсильвания). Количества белка затем определяли с помощью серии разбавлений очищенного стандартного белка RSV или с использованием системы инфракрасной визуализации Odyssey CLx или на глаз. На фигуре 3 можно увидеть эффекты по отношению к конструкции A2_F24 (SEQ ID NO: 19) по показателю общих уровней экспрессии. Было показано, что единичные мутации повышали уровень экспрессии до 5 раз. Если создавали двойные мутанты по некоторым из этих мутаций, то могли наблюдаться синергетические эффекты и в некоторых случаях дополнительное повышение экспрессии до 11 раз по сравнению с A2_F2 4.
ПРИМЕР 7
Анализ конечной стабильности
Подтверждение конформации до слияния экспрессируемых полипептидов в соответствии с настоящим изобретением выполняли
с помощью технологии интерферометрии BioLayer (Octet) с использованием специфичных антител CR9501 или CR9502 до слияния, или неконформационного специфического антитела CR9503, которое содержит вариабельные участки тяжелой и легкой цепи мотавизумаба. Антитела биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизировали на стрептавидиновых биосенсорах
(ForteBio, Портсмут, Великобритания). Процедура заключалась в следующем. После уравновешивания сенсоров в кинетическом буфере
(ForteBio) в течение 60 секунд наконечники переносили в PBS с 5 мкг/мл предпочтительного антитела. Загрузку проводили в течение 2 50 секунд. Затем включали другую стадию уравновешивания в течение 200 секунд в кинетическом буфере. В конечном итоге наконечники переносили в супернатант культуры для экспрессии, содержащий F-полипептиды RSV до слияния и записывали ответ связывания (нм) через 1200 секунд. Эта фаза также обозначается как фазовая ассоциация. Это выполняли непосредственно после сбора клеток (1 день), а также спустя 5 дней (5 день), и разницу в связывании CR9501 использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных стабилизировать конформацию до слияния. Конструкцию считали стабильной, если наблюдали менее 2 0% потери связывания на 5 день, а если наблюдали менее 2 0% потери связывания, ее считали нестабильной. Стабильные конструкции затем подвергали более строгому исследованию при необходимости. Анализ данных выполняли с помощью программного обеспечения ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio). ПРИМЕР 8
Анализ термостабильности
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в F-полипептиды RSV определяли по тепловому стрессу. Для этой цели супернатант культур от временно трансфицированных клеток или очищенный белок нагревали с использованием диапазона температур. Образцы затем охлаждали на льду для предотвращения дополнительных индуцированных теплом конформационных изменений и инкубировали с антителом CR9501 в системе по технологии Octet, как описано в примере 7. Ответы, полученные в конце
фазовой ассоциации при различных температурах, изображали на графике в виде функции температуры и приближали с помощью нелинейной регрессии с использованием программного обеспечения Prism. Это приводило к определению температуры, где уровень связывания антител составляет 50% от максимума и эту величину можно было использовать для сравнению различных конструкций в отношении термостабильности до слияния. На фигуре 4 сравнивают немодифицированный эктодомен (SEQ ID NO: 13) и конструкцию A2_F24 N67I + S215P (SEQ ID NO: 21) . Можно заметить, что индуцированный температурой стресс оказывал меньший эффект на конструкцию A2_F24 N67I+S215P (SEQ ID NO: 21) по сравнению с немодифицированным эктодоменом. Таким образом, можно сделать заключение, что стабилизирующие мотивы, введенные в полипептиды в соответствии с настоящим изобретением, т.е. сайт тримеризации, линкер F1-F2 и 2 точечные мутации, приводили к более стабильному F-белку до слияния. ПРИМЕР 9
Анализ стабильности фазовой ассоциации
Для определения стабильности различных точечных мутаций использовали анализ связывания Octet, разновидность ранее описанного анализа конечной стабильности (пример 7) . Анализ фазовой ассоциации выполняли вследствие очень высоких уровней экспрессии некоторых точечных мутантов, поскольку он более строгий и полностью предотвращает смещение уровня экспрессии. Также использовали антитело CR9501, однако, вместо выбора связывающего ответа в конце фазовой ассоциации использовали всю кривую ассоциации для снижения потенциального смещения концентраций конечного анализа. Это выполняли с использованием значений из всей фазовой ассоциации эксперимента с помощью указанных точечных мутаций A2_F24. Данные восполняли за счет количества связанного антитела на чипе. Измерения выполняли в 1, 5 и 33 дни, и сравнивали формы кривых по этим трем дням. Если получали идентичные кривые, то конструкцию считали стабильной, а если нет, то нестабильной. На фигуре 5 можно увидеть анализ четырех различных вариантов. Нестабильные белковые конструкции до слияния можно выявить с помощью
зависимой от времени потери связывания CR9501 (A2_F24, K4 65Q, S46G), в то время как стабильные конструкции до слияния (N671) не демонстрировали такого снижения. Мутация E92D, по-видимому, попадала в группу между двумя мутациями, имеющими промежуточную стабильность, поскольку наблюдали лишь незначительные изменения в форме кривой. На фигуре б выбранные точечные мутации комбинировали для получения двойных мутантов и их анализировали. Как можно увидеть, различные мутации проявляли различные фенотипы в отношении стабильности и индуцирования стабильности. Если полипептиды содержат мутации K4 65Q или S4 6G по отдельности или в комбинации, все трое, т.е. два единичный и двойной мутанты, являются нестабильными и связывание специфического антитела до слияния со временем теряется. Если мутацию S4 6G комбинируют с E92D, которая ранее, как было показано, имеет промежуточную стабильность в виде единичной мутации, изменения стабильности могло не наблюдаться, указывая, что мутация E92D не может корректировать нестабильные белковые конструкции. Если мутацию N671 комбинировали с мутацией S4 6G или E92D, то результатом была полностью стабильная конструкция. Это могло также наблюдаться, если мутацию S215P комбинировали с мутацией E92D, показывая уникальный потенциал этих двух мутаций для стабилизации нестабильных конструкций до слияния. ПРИМЕР 10
Количественный анализ с использованием Octet
Для определения концентрации F-белка RSV в супернатантах клеточных культур использовали количественный метод на основе Octet. Антитела CR9501 и CR9503 биотинилировали с помощью стандартных протоколов и иммобилизовали на стрептавидиновых биосенсорах (ForteBio, Портсмут, Великобритания). После этого покрытые биосенсоры блокировали в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Количественный эксперимент выполняли следующим образом: температура ЗОС, скорость встряхивания 1000 об./мин, время анализа 300 секунд. Концентрацию белка в супернатанте клеточной культуры рассчитывали с помощью стандартной кривой. Стандартную кривую получали для каждого покрытого антитела с использованием белка
A2_F24_N67I+S215P (SEQ ID# 21), разбавленного в супернатанте ложно-трансфицированных клеточных культур. Измерения проводили в день сбора супернатанта (1 день) и после хранения супернатанта при 4°С в течение 5 дней или дольше. Разницу в концентрации, определенную с помощью CR9501, использовали в качестве скринингового средства для выявления мутаций, способных к стабилизации конформации до слияния. Конструкция считалась стабильной, если наблюдалось менее, чем 20% снижение определяемой концентрации на 5 день. Анализ данных выполняли с помощью компьютерной программы ForteBio Data Analysis 6.4 (ForteBio).
ПРИМЕР 11
Анализ FACS и термостабильность
Плазмиды экспрессии, кодирующие рекомбинантный
полноразмерный F-белок RSV, создавали с помощью стандартных способов, широко известных в данной области, включая сайт-направленный мутагенез и ПЦР. Клетки НЕК2 93-Т временно трансфицировали с помощью 293Fectin (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя и культивировали в
течение 4 8 часов при 37°С и 10% СОг. Клетки отделяли от чашек для культивирования с помощью буфера FACS (5 мМ EDTA, 1% FBS в PBS), отмывали и ресуспендировали в том же буфере. Клетки окрашивали в отношении поверхностного F-белка RSV с использованием биотинилированных антител CR9501 или CR9503, с последующим окрашиванием АРС-меченым стрептавидином. Для дифференцировки живых и мертвых клеток пропидия йодид добавляли в суспензию клеток в конце процедуры окрашивания. Клетки анализировали на FACS Canto (BD Biosciences) в соответствии со стандартными способами, хорошо известными любому специалисту в данной области. Анализ данных выполняли с использование программного обеспечения FlowJo 9.0 (Tree Star Inc.). Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) рассчитывали для популяции живых АРС-положительных клеток.
Стабилизирующий потенциал введенных характеристик в полноразмерный мембранно-связанный F RSV определяли по
тепловому стрессу. Через 4 8 часов после трансфекции клетки отделяли от чашек культивирования, как описано выше, и суспензию клеток нагревали в течение 5-10 минут с использованием диапазона температур (37, 46, 55, 3, 60°С) . Клетки затем окрашивали и анализировали с помощью FASC, как описано выше. MFI рассчитывали для популяции живых АРС-положительных клеток. Процент АРС-положительных клеток рассчитывали для популяции живых клеток. Окрашивание с помощью CR9503 приводило к подобным MFI и % АРС-положительных клеток в образцах, подвергнутых тепловому шоку возрастающими температурами. Окрашивание с помощью CR9501 уменьшало образцы клеток, трансфицированных нестабильными белками. Потеря связывания CR9501 указывала на потерю F-белка RSV до слияния на поверхности клетки. ПРИМЕР 12
Доклиническая оценка иммуногенности F до слияния
Схема иммунизации
Для определения иммуногенности стабилизированного F RSV до слияния (A2F24,N67I, S215P) (SEQ ID NO: 21) мышей иммунизировали в соответствии с таблицей 14 0,5 или 5 мкг в прайм-бустерном режиме на 0 неделе и на 4 неделе. Как представлено на фигуре 7, мыши, иммунизированные F до слияния, демонстрировали более высокие титры VNA, чем мыши, иммунизированные F после слияния RSV.
Затем хлопковых крыс иммунизировали двумя различными дозами RSV-F в конформации после слияния и до слияния (таблица 15) . Животных иммунизировали i.m. на 0 неделе и 4 неделе. На фигуре 8 представлены высокие титры нейтрализующих антител в день контрольного заражения (7 неделя).
Таблица 15
Группы, иммуноген и доза для определения иммуногенности и
Вирусную нагрузку в легких и носу определяли через пять дней после контрольного заражения (смотри фигуру 9).
Стандартные аминокислоты, аббревиатуры и свойства
Показано, что F-полипептиды до слияния в соответствии с настоящим изобретением способны индуцировать мощный иммунный ответ, который снижал вирусную нагрузку в легких и даже в носу.
Цистеин
Cys
Неполярная
Нейтральный
Глутаминовая кислота
Glu
Полярная
Отрицательный
Глутамин
Gin
Полярная
Нейтральный
Глицин
Gly
Неполярная
Нейтральный
Гистидин
His
Полярная
Положительный (10%) Нейтральный
(90%)
Изолейцин
Неполярная
Нейтральный
Лейцин
Leu
Неполярная
Нейтральный
Лизин
Lys
Полярная
Положительный
Метионин
Met
Неполярная
Нейтральный
Фенилаланин
Phe
Неполярная
Нейтральный
Пролин
Pro
Неполярная
Нейтральный
Серии
Ser
Полярная
Нейтральный
Треонин
Thr
Полярная
Нейтральный
Триптофан
Trp
Неполярная
Нейтральный
Тирозин
Tyr
Полярная
Нейтральный
Валин
Val
Неполярная
Нейтральный
Аминокислотная последовательность нескольких конструкций F RSV до слияния приведена ниже. Следует отметить, что нумерация аминокислот в различных конструкциях, описанных в данном документе, основана на последовательности дикого типа (SEQ ID N0: 1), которая означает, что все аминокислоты с 1 положения до 108 положения включительно конструкций до слияния соответствуют положениям аминокислот 1-108 последовательности дикого типа, где нумерация аминокислот с 138 положения до конца смещена на 22 аминокислоты, т.е. L138 в последовательности дикого типа (SEQ ID N0: 1) соответствует L116 во всех конструкциях до слияния. Это связано с тем фактом, что была выполнена делеция в конструкциях до слияния, т.е. вставка линкера GSGSG, при этом фактическая нумерация F1 не является одинаковой между конструкциями. Таким образом, нумерация, используемая по отношению к специфическим мутациям в соответствии с настоящим изобретением, например, S215P, относится к положению аминокислоты в последовательности дикого типа.
Последовательности
Полноразмерная последовательность F-белка RSV А2 (SEQ ID NO: 1)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Полноразмерная последовательность F-белка RSV Bl (SEQ ID NO: 2)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML
TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIWLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGI NNIAFSK
SEQ ID NO: 3
EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA
SEQ ID NO: 4
GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLS T FL SEQ ID NO: 5
GSGSG
F8: RSV A2, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 13)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHHHHHHHH
Fll: RSV Bl, эктодомен дикого типа (SEQ ID NO: 14) MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLHHHHHHHH
F47: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO:
15)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI
ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH HHH
F47-: RSV A2, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO: 16)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGG
F43: RSV Bl, стабилизированный линкером, IZ (S) (SEQ ID NO:
17)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVEKKIEAIEKKIEAIEKKIEAGGIEGRHHHHH H
F24: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 18)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT
DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGRHHHHHH
A2_F24: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 19)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 20)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 21)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-N67I+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 22)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEI_KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+E92D: RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 23)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+E92D RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 24)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEI_KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+K465Q RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 25)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN
IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+K465Q RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 26)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEI_KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GQNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S46G RSV A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 27)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24- N67I+S46G RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 28)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFGALRTGWYTSVITIELSN IKEI_KCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM
SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 E92D+S215P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 29)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
F24-E92D+S215P: RSV Bl, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 30)
MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K508E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 31)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE
GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRESDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487I: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 32)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 33)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVIT IELSNIKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLG VGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPI VNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITND QKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNI CLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKI MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYY VNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIP EAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E487N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 34)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDNFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2 F24 N67I+S215P+D486N: A2, стабилизированный линкером,
фибритин (SEQ ID NO: 35)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 36)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GESLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K465Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 37)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N426S: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 38)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI
ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASSKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K421N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 39)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTNCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K209Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 40)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNQQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K201Q: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 41)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDQQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT
DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+V185N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 42)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGNSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+G184N: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 43)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNNVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+N175P: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 44)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTPKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD
GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+E92D: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 45)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K80E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 4 6)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIEQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+K77E: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 47)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIELIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24 N67I+S215P+S46G: A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 48)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV S4 6G A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 49)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV K4 65Q A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 50)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GQSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV N671 A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 51)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKI_KCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS
CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
A2_F24: RSV E92D A2, стабилизированный линкером, фибритин (SEQ ID NO: 52)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLSTFLGGIEGR
Полноразмерная последовательность белка F RSV CL57-v224
(SEQ ID NO: 69)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Эктодомен, RSV CL57-v224 (SEQ ID NO: 70)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE
VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELL
PreF, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 71)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 72) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P, RSV Bl, фибритин (SEQ ID NO: 73) MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLN VSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRRSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
RSV N671 S215P, RSV CL57-v224, фибритин (SEQ ID NO: 74) MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGT DAKVKLIKQE LDKYKNAVTELQLLMQS T PAANNRARRE L PRFMNYT LNNTKNNN
VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreFL N671 S215P, RSV Bl, фибритин, петля (SEQ ID NO: 22) MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQS CRIPNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKT DISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLE GKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FL
PreFL N671 S215P, RSV CL57-v224, фибритин, петля (SEQ ID NO: 75)
MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRD GQAYVRKDGEWVLLS T FL
PreF N671 S215P E487Q, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 76) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY
VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P K201N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 77)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDNQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P E92D, RSV A2, фибритин (SEQ ID N0:78) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
PreF N671 S215P D486N, RSV A2, фибритин (SEQ ID NO: 79) MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL
Fwt N671 S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO:
80)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN
VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N671 S215P, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO:
81)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 82)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N671 S215P E92D, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 83)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTDLQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS
CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 84)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N671 S215P E487Q, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 85)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDQFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 86)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK
LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N671 S215P D486N, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 87)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
Fwt N671 S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 88)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTN VTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLT SKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYML TNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWK LHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSE VNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDY VSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLA FIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGI NNIAFSN
Fsl N671 S215P S46G, мембранно-связанный F RSV, A2 (SEQ ID NO: 89)
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLGALRTGWYTSVITIELSN IKKIKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNQARGSGSGRSLGFLLGVGSAI ASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAWSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQS CSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLM SNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRT DRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKT
DVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQE GKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIM ITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
CR9501, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 53): QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTP SLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS LSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
CR9501, легкая цепь (SEQ ID NO: 61): EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFT GSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLK SGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLS S PVTKS FNRGEC
CR9502, тяжелая цепь (SEQ ID NO: 57): EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQK IQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKG PSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC
CR9502, легкая цепь (SEQ ID NO: 65): QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLWYDDRDRPSGIPDRFSG SNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSE ELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWK SHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный полипептид слияния (F) респираторного синцитиального вируса (RSV) до слияния, содержащий по меньшей мере один эпитоп, который является специфичным к конформации F-белка до слияния, где по меньшей мере один эпитоп распознается специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDRl-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 54, CDR2-y4acTOK тяжелой цепи SEQ ID NO: 55, CDR3-y4acTOK тяжелой цепи SEQ ID NO: 56 и CDRl-участок легкой цепи SEQ ID NO: 62, CDR2-y4acTOK легкой цепи SEQ ID NO: 63 и CDR3-y4acTOK легкой цепи SEQ ID NO: 64, и/или специфическим моноклональным антителом до слияния, содержащим CDRl-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 58, CDR2-участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 59, CDR3-y4acTOK тяжелой цепи SEQ ID NO: 60 и CDRl-участок легкой цепи SEQ ID NO: 66, CDR2-участок легкой цепи SEQ ID NO: 67 и CDR3-y4acTOK легкой цепи SEQ ID NO: 68.
2. F-полипептид RSV до слияния по п. 1, где полипептид является тримерным.
3. F-полипептид RSV до слияния по п. 1 или п. 2, где полипептид содержит мутацию аминокислотного остатка в положении 67 и/или мутацию аминокислотного остатка в положении 215.
4. F-полипептид RSV до слияния по п. 1, п. 2 или п. 3, где полипептид содержит домен F1 и домен F2 и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, которая связывает указанный домен F1 с указанным доменом F2.
5. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов 1-4, содержащий усеченный домен F1 и домен F2, и связывающую последовательность, содержащую от 1 до 10 аминокислотных остатков, которая связывает указанный домен F1 с указанным доменом F2, где полипептид содержит по меньшей мере одну стабилизирующую мутацию в домене F1 и/или F2 по сравнению с доменом F1 и/или доменом F2 RSV в F-белке RSV дикого типа, где по меньшей мере одна стабилизирующая мутация выбрана из группы, состоящей из
(а) мутации аминокислотного остатка N/T в положении 67,
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 215.
6. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов 1-5, где по меньшей мере одна стабилизирующая мутация выбрана из группы, состоящей из
(a) мутации аминокислотного остатка N/T в положении 67 в
I; и
(b) мутации аминокислотного остатка S в положении 215 в Р.
7. F-полипептид RSV до слияния по п. 5 или п. б, где полипептид содержит гетерологичный домен тримеризации, связанный с указанным усеченным доменом F1.
8. F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-7, где полипептид содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, где указанная мутация выбрана из группы, состоящей из
(а)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
4 6;
(Ь)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
77;
(с)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
80;
(cl)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
92;
(е)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
175;
(f)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
184;
(g)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
185;
(h)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
2 01;
(i)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
2 09;
(j )
мутации
аминокислотного
остатка
положении
421;
(k)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
42 6;
(1)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
4 65;
(m)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
48 6;
(n)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
487 и
(o)
мутации
аминокислотного
остатка
положении
508 .
F-полипептид RSV до слияния по
. 8, где
по ме
мере одна дополнительная мутация выбрана из группы, состоящей
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G;
(b) мутации аминокислотного остатка К в положении 7 7 в Е;
(c) мутации аминокислотного остатка К в положении 8 0 в Е;
(с!) мутации аминокислотного остатка Е в положении 92 в D;
(е) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в Р;
(a)
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N;
(д) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N;
(h) мутации аминокислотного остатка К в положении 201 в Q;
(i) мутации аминокислотного остатка К в положении 209 в Q;
(j) мутации аминокислотного остатка К в положении 421 в N;
(к) мутации аминокислотного остатка N в положении 42 6 в S;
(1) мутации аминокислотного остатка К в положении 4 65 в Е
или Q ;
(т) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N; (п) мутации аминокислотного остатка Е в положении 4 87 в Q, N или I и
(0) мутации аминокислотного остатка К в положении 508 в Е.
10. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов 1-9, где полипептид содержит по меньшей мере две мутации.
11. F-полипептид RSV до слияния по п. 10, где по меньшей мере две мутации предусматривают мутацию аминокислотного остатка N/T в положении 67 в I и мутацию аминокислотного остатка S в положении 215 в Р.
12. F-полипептид RSV до слияния по п. 11, где полипептид содержит по меньшей мере одну дополнительную мутацию, выбранную из группы, состоящей из
(a) мутации аминокислотного остатка S в положении 46 в G;
(b) мутации аминокислотного остатка К в положении 7 7 в Е;
(c) мутации аминокислотного остатка К в положении 8 0 в Е; (с!) мутации аминокислотного остатка Е в положении 92 в D;
(е) мутации аминокислотного остатка N в положении 175 в Р;
(f) мутации аминокислотного остатка G в положении 184 в N;
(д) мутации аминокислотного остатка V в положении 185 в N;
(h) мутации аминокислотного остатка К в положении 201 в Q;
(1) мутации аминокислотного остатка К в положении 209 в Q;
(j) мутации аминокислотного остатка К в положении 421 в N;
(к) мутации аминокислотного остатка N в положении 42 6 в S;
(1) мутации аминокислотного остатка К в положении 4 65 в Е
или Q ;
(т) мутации аминокислотного остатка D в положении 486 в N;
(п) мутации аминокислотного остатка Е в положении 4 87 в Q, N или I и
(о) мутации аминокислотного остатка К в положении 508 в Е.
13. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов 1-12, где гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3).
14. F-полипептид RSV до слияния по п. 13, где домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 4 95 F-белка RSV.
15. F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-14, где гетерологичный домен тримеризации содержит аминокислотную последовательность GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID N0: 4).
16. F-полипептид RSV до слияния по п. 15, где домен тримеризации связан с аминокислотным остатком 513 F-белка RSV.
17. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где линкер между доменом F1 и F2 содержит 5 аминокислотных остатков.
18. F-полипептид RSV до слияния по п. 17, где линкер содержит аминокислотную последовательность GSGSG (SEQ ID NO: 5) .
19. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма А RSV.
20. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где домен F1 и/или домен F2 происходят из штамма В RSV.
21. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где полипептид является стабильным в течение по меньшей мере 30 минут при 55°С, предпочтительно при 58°С, более предпочтительно при 60°С.
22. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где полипептид является стабильным после хранения при 4°С в течение по меньшей мере 30 дней, предпочтительно по меньшей мере 60 дней, предпочтительно по меньшей мере б месяцев, еще более предпочтительно по меньшей мере 1 года.
13.
23. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих
пунктов, где полипептид содержит аминокислотную
последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID
NO: 21 - SEQ ID NO: 52 и 71-89.
24. F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов, где полипептид не содержит HIS-метку.
25. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая F-полипептид RSV до слияния по любому из предыдущих пунктов 1-24.
26. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 25, где молекула нуклеиновой кислоты была оптимизирована по кодону для экспрессии в клетках млекопитающих.
27. Вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п. 2 5 или п. 2 6.
28. Композиция, содержащая F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-2 4, молекулу нуклеиновой кислоты по п. 2 5 или п. 2 6 и/или вектор по п. 27.
29. F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-24, молекула нуклеиновой кислоты по п. 2 5 или п. 2 6 и/или вектор по п. 2 7 для применения в индуцировании иммунного ответа к F-белку RSV.
30. F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-24, молекула нуклеиновой кислоты по п. 2 5 или п. 2 6 и/или вектор по п. 2 7 для применения в качестве вакцины.
31. F-полипептид RSV до слияния по любому из пп. 1-24, молекула нуклеиновой кислоты по п. 2 5 или п. 2 6 и/или вектор по п. 2 7 для применения в профилактике и/или лечении инфекции RSV.
32. Способ стабилизации конформации F-полипептида RSV до слияния, включающий введение одной или нескольких мутаций в домен F1 и/или F2 RSV по сравнению с доменом F1 и/или F2 RSV дикого типа, где одна или несколько мутаций выбраны из группы, состоящей из
(e) стабилизирующей мутации в участке, которая блокирует
вращение домена HRA, прилегающего к консервативному
дисульфидному мостику 69-212, при этом указанный участок
содержит аминокислотные остатки 66-68 и 214-216,
(f) мутации в спирали, содержащей аминокислотные остатки
7 6-98 в С-конце домена F2;
(д) мутации, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB, содержащего аминокислоты 4 8 6, 4 8 7; и
(h) стабилизирующей мутации в участке HRA.
33. Способ по п. 32, где мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 67.
34. Способ по п. 32 или п. 33, где мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 215.
35. Способ по п. 32, п. 33 или п. 34, где мутация в шарнирном участке HRA находится в положении 6 6 или 68 и/или в положении 214 или 216.
36. Способ по п. 32, где мутация в спирали находится в положении 77.
37. Способ по п. 32, где мутация в спирали находится в положении 80.
38. Способ по п. 36 или п. 37, где аминокислотный остаток в положении 7 7 и/или 8 0 изменяется в отрицательно заряженную аминокислоту.
39. Способ по любому из пп. 32-38, где мутация находится в положении 92.
40. Способ по п. 32, где мутация, которая снижает отталкивание отрицательных зарядов между верхними частями участка стебля HRB, содержит аминокислоты 486, 487, 489.
41. Способ по п. 40, где мутация находится в положении
489.
42. Способ по п. 40, где мутация находится в положении
486.
43. Способ по п. 32, где мутация стабилизирует бета-повороты между аминокислотными остатками 175-193.
44. Способ по п. 43, где мутация стабилизирует поворот в положении 175.
45. Способ по п. 43, где мутация стабилизирует поворот в положении 184-185.
46. Стабилизированный F-полипептид RSV до слияния, получаемый с помощью способа по любому из пп. 32-45.
По доверенности
ФИГ. I
529510
NativePAGE
1 2
Тример
Мономер
ФИГ. 2
% экспрессии по сравнению с диким типом
8 S а
о о а
I , ., i , I
KS08E -|Г К498Е - I E487Q E487R -КЛв?* • Е487Н ¦ Е487Р'
Едати
D479N D479K -E472Q-Е472К К465Е H4S5Q E4S3K -E463Q G430S -к М42вК -Р M426S H421N Е328К -ki T3118-i 1309V
V207P I206P L204P-H
L203P Q202P D194P -L193P V192P-GV184ЈG-f Vt7*P Л1Т7Р -I К176ЙЛ
к "tree
S189P K1MP H166P V157P H85E H77E VKMtlV I57V
K465Q * E32D S46C +E92D
D486M S215P K209Q K201Q V185* G104H И175Р E"2B S4S(c) H80E N67!
H4S5Q +S46G M4S5Q ни NC7I S4SG + MK7I $4вО + 8215Р NC7I+ S215P K/ie*"+S215P S*G+S215P NS7I +E92D A E3ZD +S215P A2 КЛ
ФИГ.З
0J"
5"L Ш П ЭС)Ч
iu|irniifii|nui(i(V|iiiMiifi{Mfiriipi]iiiiHiii[iiiAii4|iiiiiiiii|
10 20 Э0 40 ML 60 70 80
Температура (°С)
Температура, при которой происходит 50% потеря
связывания
О, s
о х и
о о. с
" о
g я s з
D. " С
W
сч со о о; п. <ц Н О С
85П
60*
55-
50-
45-
А2 F24
S X
к ч а н О
2000
-0.2-*
Время (с)
K465Q
K46SQ
н О
-0.2-J
WO 1500 Время (с)
2000
K465Q, N67!
-0.2J
1000 1500 Время (с)
2000
- День 1 -- День 5
- День 33
¦л О
-0.2-
ШО 1500
Время (с)
2"Ю
S46G, N671
О-6-i 0.40.20.0-
-0.2J
50*0 1000
Время (с)
1500
2000
День 1 День 5 День 33
E92D
N671, E92D
и П.
0.8т
0,6-
0.40.2-
0.0-
-0.2J
1000 1500 Время (с)
2000
1.0-1 0.8 0,6 0.4 0.2 0.0 ¦0.2-
E92D,S215P
bbv*-"
1000 1500 Время (е)
2000
День 1 День 5 День 33
О 5^
#т... Л ..
<4
LLoQ
0-1
Доза:
Вакцина: Адъювант:
* ' ' I-"I"' " ¦'¦ц""1 I' " " ¦ ч г ¦ г lul т
0,5 мкг 5,0 мкг 0,5 мкг 5,0 мкг 0,5 мкг 0,5мкг FI-RSV Р§3
F после слияния F до слияния После До
I 1
Поли 1:С
ФИГ. 7
20-
о to
. ...л
1,01
Доза Прайм Адъювант
ФИГ. 8
е-,
Легкое
ы О и
А А .Ajib.
,*p 1Д|Г "W"
Доза
Прайм
Адъювант
'¦ л " ¦ "¦ I 0,5 мкг 5,0 мкг i
1 I 1 " '-"Г 10'вир.
част
' 1 1 1 1 1 1 1 t I¦ ""-Г ',|[" "Г- """ '¦ I"
0,5 мкг 5,0 мкг { 0,5 мкг 5,0 мкг Q.5 МКГ 5,0 мкг
F после слияния F до слияния р до слияния F до слияния АШ.Г PSS
Поли (1:С) Фосфатный о адъювант
Нос
ы О и
А *
= 4-
Ю'внр. част
2 *| ##+ • ШШ*- ¦
'Т'""- -"¦-[-" ............. f ...... .......,,"...",..¦ .¦¦.I,.,.,,.,,,,,, ,.,,"t, ч,".,..,, ,,." ".
0,5 мкг 5,0 мкг j 0,5 мкг 5.0 мкг j 0,5 мкг 5,0 мкг 0,5 мкг 5,0 мкг
Доза
Прайм F после слияния F до^ слияния р д0 слияния F до слияния PBS
Поли (1:С) Фосфатный адъювант
ФИГ. 9
11)
Таблица 1
Таблица 2
Таблица 2
Таблица 2
Таблица 3
Таблица 3
Таблица 4
Таблица 4
Таблица 4
Таблица 5
Таблица 5
Таблица б
Таблица б
Таблица б
Таблица 7
Таблица 7
Таблица 8
Таблица 8
Таблица 12
Таблица 17
1/12
1/12
2/12
2/12
3/12
3/12
4/12
4/12
ФИГ. 4
ФИГ. 4
4/12
4/12
ФИГ. 4
ФИГ. 4
4/12
4/12
ФИГ. 4
ФИГ. 4
4/12
4/12
ФИГ. 4
ФИГ. 4
4/12
4/12
ФИГ. 4
ФИГ. 4
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
5/12
5/12
ФИГ. 5
ФИГ. 5
6/12
6/12
ФИГ. 5 (продолжение)
ФИГ. 5 (продолжение)
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
7/12
7/12
ФИГ. 6
ФИГ. 6
8/12
8/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
8/12
8/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
8/12
8/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
8/12
8/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
9/12
9/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
9/12
9/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
9/12
9/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
9/12
9/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
9/12
9/12
ФИГ. 6 (продолжение)
ФИГ. 6 (продолжение)
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
10/12
11/12
12/12
11/12
12/12
11/12
12/12
11/12
12/12
11/12
12/12
11/12
12/12
11/12
12/12
