(57) Реферат / Формула:
В настоящем документе раскрыты способы лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или увеличения размера мышц нижних конечностей у характеризующегося наличием рака предстательной железы пациента, предусматривающие введение терапевтически эффективного количества антагониста миостатина.
АНТАГОНИЗМ МИОСТАТИНА У СУБЪЕКТОВ - ЛЮДЕЙ
ОПИСАНИЕ Ссылки на родственные заявки
Согласно настоящей заявке испрашивается приоритет согласно предварительной заявке на выдачу патента США № 61/799928, поданной 15 марта 2013 г., полное содержание которой включено в настоящий документ посредством ссылки.
Положение о финансируемом из федерального бюджета исследовании или разработке
Не предусмотрено.
Перечень последовательностей
Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан посредством EFS-Web и полностью включен в настоящий документ посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 13 марта 2014 г., названа 26324РСТ_ sequencelisting.txt, и ее размер составляет 200000 байт.
Область техники, которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к способам применения антагонистов миостатина, например, миостатинсвязывающих пептител, для лечения кахексии у пациентов с раком предстательной железы.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Относящееся к факторам роста суперсемейство трансформирующих факторов роста (TGF) Р состоит из большого числа факторов роста и дифференциации, которые регулируют развитие и гомеостаз мышечной ткани. Миостатин, представитель суперсемейства TGF-|3, экспрессируется практически исключительно в скелетных мышцах и действует как отрицательный регулятор роста мышц (Roth and Walsh, 2004; Thomas et al, 2000). Миостатин ингибирует пролиферацию миобластов, вызывая положительную регуляцию ингибиторов циклинзависимых киназ (CDK) (например, р21), что в свою очередь приводит к отрицательной регуляции CDK2 и к аресту клеточного цикла в GQ/GI. Кроме того, миостатин отрицательно регулирует
дифференциацию миобластов посредством сниженной экспрессии MyoD (Langley et al, 2002).
Наблюдения, полученные на мышах и крупном рогатом скоте с приводящими к утрате функции мутациями в гене миостатина (Roth and Walsh, 2004; Grobet et al, 1998; Szabo et al, 1998; Grobet et al, 1997; Kambadur et al, 1997; McPherron and Lee, 1997; McPherron et al, 1997), а также недавний клинический случай, описывающий ребенка с приводящими к утрате функции мутациями, воздействующими на оба аллеля миостатина (Schuelke et al, 2004), убедительно свидетельствуют о том, что миостатин играет важную роль в регуляции перинатального развития скелетных мышц. В мышце взрослой мыши миостатин, как полагают, ингибирует активацию регенеративных миосателлитоцитов (McCroskery et al, 2003). Отдельно стоит отметить, что с помощью подхода специфической в отношении мышц инактивации гена миостатина в заданных условиях выявлено, что постнатально у мышей можно индуцировать общую мышечную гипертрофию в степени, сходной со степенью у конститутивно дефицитных по миостатину нокаутных мышей (Grobet et al, 2003).
Атрофия скелетных мышц широко распространена и оказывает клиническое влияние при различных состояниях и заболеваниях, таких как раковая кахексия, андрогенная депривация, почечная кахексия вследствие терминальной стадии почечной недостаточности, хроническое обструктивное заболевание легких, сердечная кахексия, ВИЧ/СПИД, индуцированная стероидами миопатия, дисфункциональная атрофия, саркопения преклонного возраста и послеоперационная иммобилизация (Muscaritoli et al, 2006; Alibhai et al, 2006; Morley et al, 2006; MacDonald et al, 2003; Roubenoff et al, 1997). Атрофия скелетных мышц приводит к сниженной мышечной силе, физической и психологической недееспособности и сниженному качеству жизни (Muscaritoli et al, 2006; Roubenoff et al, 1997). Современные возможности лечения, используемые для мышечной атрофии при заболеваниях или в условиях отсутствия подвижности, включая в себя стимуляторы аппетита, нутритивную поддержку, кортикостероиды, анаболические стероиды и гормон роста, ограничены в своей применимости и могут быть связаны со значительными системными побочными эффектами (Muscaritoli et al, 2006; MacDonald et al, 2003).
Рак предстательной железы представляет собой самый распространенный вид злокачественных опухолей у мужчин и вторую наиболее распространенную причину связанной со злокачественной опухолью смерти у мужчин в США (Американское онкологическое общество, 2005). Андроген-депривационная терапия (АДТ) путем
введения агонистов гонадолиберина (ГнРГ) представляет собой главное направление лечения метастазирующего рака предстательной железы. (Sharafi et al JAMA 2005) Неоадъювантная/адъювантная АДТ улучшает выживаемость у мужчин, получающих лучевую терапию в отношении рака предстательной железы на ранней стадии с промежуточной и высокой степенью риска. С адъювантной АДТ также связывают улучшенную выживаемость после простатэктомии для мужчин с пораженными лимфатическими узлами. В современной клинической практике длительное лечение с помощью агониста ГнРГ, обычно в отношении биохимического рецидива, представляет собой наиболее распространенную форму андроген-депривационной терапии. (Sharafi et al JAMA 2005).
АДТ характеризуется разнообразными неблагоприятными эффектами, включая в себя увеличение массы тела, увеличенную жировую массу, сниженную безжировую массу тела и утомляемость. (Hematol Oncol Clin North Am, 2006 Aug;20(4):909-23. В проспективных клинических исследованиях АДТ связана со сниженной безжировой массой тела и размером мышц и увеличенной жировой массой. (Smith et al, 2002; Smith et al, 2001). Изменения композиционного состава тела становятся очевидными в первые шесть месяцев лечения и продолжают проявляться в течение длительной терапии. (Smith et al JCO 2012). Сниженная мышечная масса и сила могут вносить вклад в общую утомляемость и сниженное качество жизни у мужчин с раком предстательной железы. Связанные с лечением изменения в композиционном составе тела также могут вносить вклад в сниженную под действием АДТ чувствительность к инсулину и повышенный риск развития сахарного диабета, связанного с АДТ. (Smith et al 2006 JCEM; Keating et al 2006 JCO; Braga-Basaria et al 2006).
AMG 745 представляет собой новое пептитело к миостатину. Структурно оно представляет собой белок слияния с Fc человека на N-конце и нейтрализующим миостатин биоактивным пептидом на С-конце. AMG 745 и/или AMG 745/Mu-S, мышиный суррогат AMG 745, был испытан на разнообразных мышиных моделях, включая в себя нормальных мышей, мышей с иммунодефицитом, мышей MDX (модель миодистрофии Дюшенна), характеризующихся наличием опухоли толстой кишки 26 мышей (модель раковой кахексии), мышей с подвешенной нижней конечностью (модель дисфункциональной атрофии) и подвергнутых орхиэктомии мышей (модель андрогенной недостаточности). Эффекты AMG 745 и/или AMG 745/Mu-S в указанных моделях включали в себя повышенный набор массы тела, повышенное или улучшенное сохранение массы скелетных мышц и повышенную силу по сравнению с контрольными
мышами. Доклиническое исследование на подвергнутых орхиэктомии мышах, модели заболевания гипогонадизма, которое характеризуется атрофией мышечной ткани и накоплением жировой ткани, связанными с андрогенной недостаточностью, продемонстрировало, что введение AMG 745/Mu-S значительно ослабляло потерю безжировой массы тела и накопление жира, что оценивали с помощью ядерно-магнитно-резонансной (ЯМР) томографии, и более того, продемонстрировало, что in vivo ингибирование миостатина может усилить рост скелетных мышц посредством андроген-независимого механизма.
Антагонисты миостатина и их применения описаны в международной патентной заявке № PCT/US2003/040781, опубликованной как WO/2004/058988 и поданной 19 декабря 2003 г., и PCT/US2006/046546, опубликованной как WO2007/067616 и поданной 6 декабря 2006 г. и родственных патентных заявках на национальной фазе.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
В настоящем документе описаны способы лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или снижения жировой массы и/или увеличения размера мышц нижней конечности у нуждающегося в этом субъекта -человека, предусматривающие введение терапевтически эффективного количества антагониста миостатина в смеси с фармацевтически приемлемым носителем субъекту, причем субъект - человек характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию; антагонист миостатина состоит из пептитела, содержащего полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ ID N0:635 (MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE); антагонист миостатина вводят в состав, содержащий 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс./объем) сахарозы, 0,004% (масс./объем) полисорбата 20, рН 4,75; и антагонист миостатина вводят подкожно в дозах, составляющих 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг один раз в неделю в течение 4 недель.
Также описаны способы лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или снижения жировой массы и/или увеличения размера
мышц нижних конечностей у нуждающегося в этом субъекта - человека, предусматривающие введение терапевтически эффективного количества антагониста миостатина в смеси с фармацевтически приемлемым носителем субъекту, причем субъект - человек характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию, и антагонист миостатина содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0:311 (LADHGQCIRWPWMCPPEGWE). Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина состоит из пептитела, содержащего полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:635 (MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE). Согласно другим вариантам осуществления антагонист миостатина состоит из пептитела, состоящего из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ Ш N0:635.
Используемый в способе антагонист миостатина может представлять собой пептитело, экспрессированное в нерастворимых тельцах включения в Е. coli и выделенное посредством сбора клеток, лизирования клеток, солюбилизирования телец включения, рефолдинга, концентрирования и хроматографического очищения.
Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина конъюгирован с дополнительным соединением.
Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина введен в состав фармацевтической композиции. Примеры включают в себя без ограничения фармацевтическую композицию, содержащую буфер, антиоксидант, низкомолекулярную молекулу, лекарственное средство, белок, аминокислоту, углевод, липид, хелатирующее средство, стабилизатор или вспомогательное вещество. Например, состав может содержать 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс./объем) сахарозы, 0,004% (масс/объем) полисорбата 20, рН 4,75.
В способе может применяться введение, которое представляет собой, например, парентеральное или пероральное или подкожное.
Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина вводят в дозе, составляющей 0,01 - 10,0 мг/кг, включительно, или в дозе, составляющей 0,3 - 3,0 мг/кг, включительно, или в дозе, составляющей 0,3, 1,0 или 3,0 мг/кг. Антагонист миостатина можно вводить, например, два раза в день, один раз в день, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц или один раз в месяц. Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина вводят один раз в неделю в течение 4 недель.
Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина вводят совместно с дополнительным средством, например, средством против рака предстательной железы.
Краткое описание фигур
На фигуре 1 показана активность миостатина, измеренная по зависимости активности экспрессированной люциферазы (ось у) от концентрации (ось х) для пептида TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 32) и пептитела TN8-19 (pb) для определения IC50 для каждого из них с использованием анализа люциферазы с применением С2С12 pMARE, описанного в примерах ниже. Пептитело характеризуется более низким значением IC50 по сравнению с пептидом.
На фигуре 2 представлен график, на котором показано увеличение общей массы тела для мышей CD1 nu/nu, получивших лечение с помощью увеличивающихся доз 1х mTN8-19-21 пептитела в течение периода, составляющего 14 дней, по сравнению с мышами, получившими лечение с помощью контроля - huFc, как описано в примере 8.
На фигуре ЗА показано увеличение массы икроножной мышцы при вскрытии мышей, получивших лечение в соответствии с фигурой 2 (пример 8). На фигуре ЗВ показано увеличение безжировой массы, определенное с помощью ЯМР в 0 день по сравнению с 13 днем эксперимента, описанного в примере 8.
На фигуре 4 показано увеличение безжировой массы тела у мышей CD1 nu/nu, получивших лечение с помощью инъекций два раза в неделю с увеличивающимися дозировками lx mTN8-19-32 пептитела, определенное с помощью ЯМР в 0 день и 13 день эксперимента, описанного в примере 8.
На фигуре 5А показано увеличение массы тела для мышей CD1 nu/nu, получивших лечение с помощью инъекций lx mTN8-19-7 два раза в неделю по сравнению с 2х mTN8-19-7 и контрольным животным в течение 35 дней, как описано в примере 8. На фигуре 5В показано увеличение убойной безжировой массы при
вскрытии для lx и 2х вариантов в дозе 1 мг/кг и 3 мг/кг по сравнению с животными, получающими инертный носитель (huFc) (контроли).
На фигуре 6А показано увеличение безжировой мышечной массы по сравнению с массой тела для пожилых мышей mdx, получивших лечение с помощью либо 1х mTN8-19-33 пептитела с созревшей аффинностью, либо инертного носителя huFc в дозе, составляющей 10 мг/кг подкожно через день в течение трех месяцев. На фигуре 6В показано изменение жировой массы по сравнению с массой тела, что определяли с помощью ЯМР для одних и тех же мышей через 3 месяца лечения.
На фигуре 7 показано изменение массы тела с течением времени в граммах для животных с индуцированным коллагеном артритом (CIA), получивших лечение с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc или инертного носителя muFc, а также нормальных не страдающих CIA животных.
На фигуре 8 показано относительное изменение массы тела с течением времени у мышей с индуцированным стрептозотоцином (STZ) сахарным диабетом, получивших лечение с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc или контроля - инертного носителя muFc.
На фигуре 9 показан клиренс креатинина у мышей с индуцированным стрептозотоцином (STZ) сахарным диабетом и совпадающих по возрасту нормальных мышей после лечения с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc или инертного носителя muFc.
На фигуре 10А показано выделение альбумина с мочой у мышей с индуцированным стрептозотоцином (STZ) сахарным диабетом и совпадающих по возрасту нормальных мышей после лечения с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc или инертного носителя muFc. На фигуре 10В показан объем мочи за 24 часа у мышей с индуцированным стрептозотоцином (STZ) сахарным диабетом и совпадающих по возрасту нормальных мышей после лечения с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc или инертного носителя muFc.
На фигуре 11 показано изменение массы тела с течение времени для 4 групп мышей С57В1/6; 2 групп, предварительно получивших лечение в течение 1 недели с помощью пептитела 2х mTN8-19-21/muFc, затем получивших лечение с помощью 5-фторурацила (5-Fu) или инертного носителя (PBS); и 2 группы, предварительно получивших лечение в течение 2 недель с помощью 2х mTN8-19-21/muFc и затем получивших лечение с помощью 5-фторурацила или инертного носителя (PBS). Треугольниками внизу фигуры показаны временные точки введения 2-недельного
предварительного лечения с помощью 2х mTN8-19-21/muFc, временные точки введения 1-недельного предварительного лечения с помощью 2х mTN8-19-21/muFc и временные точки введения 5-Fu.
На фигуре 12 показаны процентные отношения коэффициента выживаемости животных, описанных на фигуре 11 выше, показывая нормальных мышей, не получивших лечение, животных, получивших лечение только с помощью 5-Fu, животных, получивших предварительное лечение с помощью 2х mTN8-19-21/muFc в течение 1 недели и затем получивших лечение с помощью 5-Fu, и животных, получивших предварительное лечение с помощью 2х mTN8-19-21/muFc в течение 2 недель и затем получивших лечение с помощью 5-Fu.
На фигуре 13 показано процентное изменение от исходного значения общей безжировой массы тела у субъектов - людей, получивших лечение с помощью AMG 745 или плацебо. Группы плацебо расположены слева в каждом из EOS и FUP; группы AMG 745 расположены справа в каждом из EOS и FUP.
Подробное раскрытие настоящего изобретения
Согласно настоящему изобретению предусмотрены способы лечения кахексии у пациентов с раком предстательной железы, получающих андроген-депривационную терапию, путем введения антагониста миостатина, содержащего миостатинсвязывающий пептид SEQ ID N0:311, например, пептитело, состоящее из SEQID N0:635.
Миостатин
Миостатин, фактор роста, также известный как GDF-8, представляет собой представителя семейства TGF-B. Известно, что миостатин представляет собой отрицательный регулятор скелетной мышечной ткани. Миостатин синтезируется как неактивный препробелок, который активируется путем протеолитического расщепления (Zimmers et al., ранее (2002)). Белок - предшественник расщепляется с образованием №32-концевого неактивного продомена и состоящего приблизительно из 109 аминокислот СООН-концевого белка в форме гомодимера размером приблизительно 25 кДа, который представляет собой зрелую, активную форму (Zimmers et al, ранее (2002)). Считается, что зрелый димер циркулирует в крови в виде неактивного латентного комплекса, связанного с пропептидом (Zimmers et al, ранее (2002)).
Используемый в настоящем документе термин "полноразмерный миостатин" относится к полноразмерной последовательности препробелка человека, описанной в McPherron et al. PNAS USA 94, 12457 (1997), а также к родственным полноразмерным полипептидам, включая в себя аллельные варианты и межвидовые гомологи (McPherron et al. ранее (1997)). Используемый в настоящем документе термин "продомен" или "пропептид" относится к неактивному №32-концевому белку, который отщепляется с высвобождением активного СООН-концевого белка. Используемый в настоящем документе термин "миостатин" или "зрелый миостатин" относится к зрелому, биологически активному СООН-концевому полипептиду, в мономерной, димерной, мультимерной форме или другой форме. "Миостатин" или "зрелый миостатин" также относится к фрагментам биологически активного зрелого миостатина, а также родственным полипептидам, включая в себя аллельные варианты, сплайс-варианты и пептиды и полипептиды слияния. Сообщалось, что зрелый миостатин - СООН-концевой белок характеризуется 100% идентичностью последовательности в пределах многих видов, включая в себя человека, мышь, курицу, свинью, индейку и крысу (Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001)). Миостатин может включать или не включать в себя дополнительные концевые остатки, такие как нацеливающие последовательности или остатки метионина и лизина и/или последовательности - метки или последовательности белка слияния, в зависимости от того, как он получен.
Антагонисты миостатина
Согласно описанным в настоящем документе способам лечения используются антагонисты миостатина, содержащие миостатинсвязывающий пептид SEQ Ш N0:311, например, пептитело, содержащее по меньшей мере один полипептид, состоящий из SEQ ГО N0:635, например, пептитело AMG-745.
Используемый в настоящем документе термин "антагонист миостатин" используется взаимозаменяемо с термином "ингибитор миостатина". Антагонист миостатина согласно настоящему изобретению ингибирует или блокирует по меньшей мере одну активность миостатина или альтернативно блокирует экспрессию миостатина или его рецептора. Ингибирование или блокирование активности миостатина может быть достигнуто, например, путем использования одного или нескольких ингибирующих средств, которые препятствуют связыванию миостатина с его рецептором и/или блокируют передачу сигнала, которая является результатом связывания миостатина со своим рецептором. Антагонисты включают в себя средства,
которые связываются с самим миостатином, или средства, которые связываются с рецептором миостатина.
Другие примеры антагонистов миостатина включают в себя без ограничения фоллистатин, продомен миостатина, продомен фактора роста и дифференциации 11 (GDF-11), белки слияния продоменов, антагонистические антитела, которые связываются с миостатином, антагонистические антитела или фрагменты антител, которые связываются с рецептором активина типа ПВ, растворимый рецептор активина типа ПВ, белки слияния растворимого рецептора активина типа ПВ, растворимые аналоги миостатина (растворимые лиганды), олигонуклеотиды, низкомолекулярные молекулы, пептидомиметики и миостатинсвязывающие средства. Они описаны более подробно ниже.
Фоллистатин ингибирует миостатин, как описано, например, в Amthor et al., Dev Biol 270, 19-30 (2004), и патент США № 6004937, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Другие ингибиторы включают в себя, например, связывающие TGF-B белки, включая в себя ассоциированный с фактором роста и дифференциации сывороточный белок-1 (GASP), описанный в Hill et al., Mol. Endo. 17 (6): 1144-1154 (2003). Антагонисты миостатина включают в себя пропептидную область миостатина и родственные GDF белки, включая в себя GDF-11, описанный в РСТ публикации WO 02/09641, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Антагонисты миостатина дополнительно включают в себя модифицированные и стабилизированные пропептиды, включая в себя Fc-слияния продомена, описанные, например, в Bogdanovisch et al, FASEB J 19, 543-549 (2005). Дополнительные антагонисты миостатина включают в себя антитела или фрагменты антител, которые связывают и ингибируют или нейтрализуют миостатин, включая в себя пробелок и/или зрелый белок миостатина, который находится в мономерной или димерной форме. Такие антитела описаны, например, в заявке на патент США № 2004/0142383 и заявке на патент США № 2003/1038422, и РСТ публикации WO 2005/094446, РСТ публикации WO 2006/116269, все из которых включены посредством ссылки в настоящий документ. Антагонистические антитела к миостатину дополнительно включают в себя антитела, которые связываются с пробелком миостатина и предотвращают расщепление в зрелую активную форму.
Используемый в настоящем документе термин "антитело" относится к интактным антителам, включая в себя поликлональные антитела (смотрите, например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press,
(1988)), и моноклональным антителам (смотрите, например, патенты США №№ RE 32011, 4902614, 4543439 и 4411993 и Monoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)). Используемый в настоящем документе термин "антитело" также относится к фрагменту антитела, такому как F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, Fc и одноцепочечные антитела или комбинациям указанного, которые получают с помощью техник рекомбинантной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных антител. Термин "антитело" также относится к биспецифическим или бифункциональным антителам, которые представляют собой искусственное гибридное антитело с двумя различными парами тяжелых/легких цепей и двумя различными сайтами связывания. Биспецифические антитела можно получить с помощью разнообразных способов, включая в себя слияние гибридом или связывание фрагментов Fab'. (Смотрите Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., /. 7mmtmo/,148:1547-1553 (1992)). Используемый в настоящем документе термин "антитело" также относится к химерным антителам, то есть антителам, содержащим человек константный иммуноглобулиновый домен антитела человека, связанный с одним или несколькими не относящимися к человеку вариабельными иммуноглобулиновыми доменами антитела, или их фрагментам (смотрите, например, патент США № 5595898 и патент США № 5693493). Термин "антитела" также относится к "гуманизированным" антителам (смотрите, например, патент США № 4816567 и международную патентную публикацию № WO 94/10332), миниантитела (WO 94/09817), одноцепочечные слияния Fv-Fc (Powers et al., / Immunol. Methods 251:123-135 (2001)), и антитела, полученные с помощью трансгенных животных, причем трансгенное животное, содержащее пропорциональную часть производящих антитела человека генов, но испытывающее недостаточность в продукции эндогенных антител, способно производить человеческие антитела (смотрите, например, Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997) и патент США № 6300129). Термин "антитела" также включает в себя мультимерные антитела или комплексы белков более высокого порядка, такие как гетеродимерные антитела. "Антитела" также включает в себя антиидотипические антитела.
Антагонисты миостатина дополнительно включают в себя растворимые рецепторы, которые связываются с миостатином и ингибируют по меньшей мере одну активность. Используемый в настоящем документе термин "растворимый рецептор" включает в себя процессированные варианты или фрагменты рецептора миостатина,
модифицированные или измененные иным образом, способные к специфическому связыванию с миостатином и блокированию или ингибированию передачи сигнала через миостатин. Указанные процессированные варианты рецептора миостатина, например, включают в себя встречающиеся в природе растворимые домены, а также варианты, полученные вследствие протеолиза N- или С-концов. Растворимый домен включает в себя весь или часть внеклеточного домена рецептора, отдельно или прикрепленного к дополнительным пептидам или модификациям. Миостатин связывается с рецепторами активина, включая в себя рецептор активина типа ПВ (ActRIIB) и рецептор активина типа ПА (ActRIIA), описанные в Lee et al, PNAS 98 (16), 9306-9311 (2001). Белки слияния растворимых рецепторов также могут действовать в качестве антагонистов, например, Fc растворимого рецептора, описанный в публикации заявки на патент США № 2004/0223966 и РСТ публикации WO 2006/012627, обе из которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
Антагонисты миостатина дополнительно включают в себя растворимые лиганды, которые конкурируют с миостатином за связывание с рецепторами миостатина. Используемый в настоящем документе термин "антагонист - растворимый лиганд" относится к растворимым пептидам, полипептидам или пептидомиметикам, способным к связыванию с миостатиновым рецептором активина типа ПВ (или ActRIIA) и блокированию передачи сигнала через комплекс миостатин-рецептор путем конкуренции с миостатином. Антагонисты - растворимые лиганды включают в себя варианты миостатина, также называемые "аналоги миостатина", которые сохраняют значительную гомологию, но не активность лиганда, включая в себя такие усечения, как N- или С-концевые усечения, замены, делеции и другие изменения в аминокислотной последовательности, такие как замещение неаминокислотного пептидомиметика аминокислотным остатком. Антагонисты - растворимые лиганды, например, могут быть способны к связыванию с рецептором, но не обеспечивают передачу сигнала. Для целей согласно настоящему изобретению белок является "по существу сходным" с другим белком, если они являются по меньшей мере на 80%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 90%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно на 95% идентичными друг другу в отношении аминокислотной последовательности.
Антагонисты миостатина дополнительно включают в себя полинуклеотидные
антагонисты. Указанные антагонисты включают в себя антисмысловые или смысловые
олигонуклеотиды, содержащие одноцепочечную полинуклеотидную
последовательность (или РНК, или ДНК), способную к связыванию с целевыми иРНК (смысловые) или ДНК (антисмымсловые) последовательностями. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению содержат фрагменты нацеленной полинуклеотидной последовательности, кодирующей миостатин или его рецептор, факторы транскрипции или другие полинуклеотиды, вовлеченные в экспрессию миостатина или его рецептора. Такой фрагмент, как правило, содержит по меньшей мере приблизительно 14 нуклеотидов, как правило, приблизительно 14 -приблизительно 30 нуклеотидов. Способность управлять антисмысловым или смысловым олигонуклеотидом на основании последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей данный белок, описана, например, в Stein and Cohen, Cancer Res. 48:2659, 1988, и van der Krol et al. BioTechniques 6:958, 1988. Связывание антисмысловых или смысловых олигонуклеотидов с целевыми последовательностями нуклеиновых кислот с образованием дуплексов, которые блокируют или ингибируют экспрессию белка с помощью одного из нескольких средств, включая в себя усиленное разложение иРНК с помощью РНКазы Н, ингибирование сплайсинга, преждевременная терминация транскрипции или трансляции или с помощью других средств. Антисмысловые олигонуклеотиды, таким образом, могут использоваться для блокирования экспрессии белков. Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды дополнительно содержат олигонуклеотиды с модифицированными сахарно-фосфодиэфирными каркасами (или другими сахарными связями, такими как те, которые описаны в международной патентной публикации WO 91/06629) и причем такие сахарные связи являются устойчивыми к эндогенным нуклеазам. Такие олигонуклеотиды с устойчивыми сахарными связями являются стабильными in vivo (т.е. способны противостоять ферментативному расщеплению), но сохраняют специфичность последовательности, будучи способными связываться с целевыми нуклеотидными последовательностями. Другие примеры смысловых или антисмысловых олигонуклеотидов включают в себя те олигонуклеотиды, которые ковалентно связываются с органическими фрагментами, такими как описанные в международной патентной публикации WO 90/10448, и другими фрагментами, которые увеличивают аффинность олигонуклеотида в отношении целевой последовательности нуклеиновой кислоты, например, с поли- (Ь)-лизином. Кроме того, к смысловым или антисмысловым олигонуклеотидам могут быть прикреплены интеркалирующие средства, такие как эллиптицин, и алкилирующие средства или комплексы металлов
для модификации специфичностей связывания антисмыслового или смыслового олигонуклеотида с целевой нуклеотидной последовательностью.
Антисмысловые или смысловые олигонуклеотиды можно ввести в содержащую целевую нуклеиновую кислоту клетку, с помощью любого способа переноса генов, включая в себя, например, липофекцию, опосредованную СаРСч трансфекцию ДНК, электропорацию или с использованием таких векторов для переноса генов, как вирус Эпштейна-Барра или аденовирус. Смысловые или антисмысловые олигонуклеотиды также можно в содержащую целевую нуклеиновую кислоту клетку посредством образования конъюгата с лигандсвязывающей молекулой, как описано в международной патентной публикации WO 91/04753. Подходящие лигандсвязывающие молекулы включают в себя без ограничения рецепторы клеточной поверхности, факторы роста, прочие цитокины или другие лиганды, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности. Предпочтительно, чтобы конъюгация лигандсвязывающей молекулы существенно не нарушала способность лигандсвязывающей молекулы связываться с соответствующей ей молекулой или рецептором, а также не блокировала вход в клетку для смыслового или антисмыслового олигонуклеотида либо его конъюгированного варианта. Альтернативно, смысловой или антисмысловой олигонуклеотид можно ввести в клетку, содержащую целевую нуклеиновую кислоту, посредством образования олигонуклеотидно-липидного комплекса, описанного в международной патентной публикации WO 90/10448. Предпочтительно, чтобы смысловой или антисмысловой олигонуклеотидно-липидный комплекс был диссоциирован в клетке эндогенной липазой.
Дополнительные способы предотвращения экспрессии миостатина или рецепторов миостатина представляют собой РНК-интерференцию (PHKi), полученную путем введения специфической малой интерферирующей РНК (миРНК), как описано, например, в Bosher et al., Nature Cell Biol 2, E31-E36 (2000).
Антагонисты миостатина дополнительно включают в себя низкомолекулярные антагонисты, которые связываются или с миостатином, или с его рецептором. Низкомолекулярные молекулы выбирают путем скрининга в отношении связывания с миостатином или его рецептором с последующими специфическими и неспецифическими элюированиями, аналогично выбору связывающих средств, описанных в настоящем документе.
Используемый в настоящем документе термин "способный связываться с миостатином" или "характеризующийся аффинностью связывания в отношении
миостатина" относится к антагонисту миостатина, такому как связывающее средство, описанное в настоящем документе, которое связывается с миостатином, что продемонстрировано с помощью фагового анализа ELISA, анализов BIAcore(r) или KinExA(tm), описанных в примерах ниже.
Используемый в настоящем документе, термин "способный модифицировать активность миостатина" относится к действию средства в качестве либо агониста, либо антагониста по отношению по меньшей мере к одной биологической активности миостатина. Используемый в настоящем документе активность "агониста" или "миметика" относится к средству с биологической активностью, сопоставимой с белком, который взаимодействует с представляющим интерес белком, как описано, например, в международной патентной заявке WO 01/83525, выданной 2 мая 2001 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки.
Используемый в настоящем документе термин "ингибирование активности миостатина" или "противодействие активности миостатина" относится к способности антагониста миостатина снижать или блокировать активность миостатина или передачу сигнала, как продемонстрировано или в in vitro анализах, таких как, например, анализ активность миостатин с использованием клеток pMARE С2С12, или с помощью in vivo испытаний на животных, как описано ниже.
Миостатинсвязывающие средства
Используемые в способах согласно настоящему изобретению антагонисты миостатина включают в себя миостатинсвязывающие средства, например, содержат по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид, например, SEQ ID N0:311, например, пептитело AMG-745.
Согласно одному варианту осуществления связывающие средства согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один миостатинсвязывающий пептид, ковалентно прикрепленный по меньшей мере к одному инертному носителю, такому как полимер или домен Fc. Прикрепление миостатинсвязывающих пептидов по меньшей мере к одному инертному носителю предусмотрено для увеличения эффективности связывающего средства в качестве терапевтического средства путем увеличения биологической активности средства и/или снижения расщепления in vivo, увеличения периода полужизни in vivo, снижения токсичности или иммуногенности in vivo. Связывающие средства могут дополнительно содержать линкерную последовательность, соединяющую пептид и инертный носитель. Пептид или пептиды прикрепляются напрямую или опосредованно посредством линкерной
последовательности к инертному носителю на N-конце, С-конце или аминокислотной боковой цепи пептида. Согласно настоящему варианту осуществления связывающие средства согласно настоящему изобретению характеризуются следующей структурой:
112
(X )a-F -(X )ь или его мультимеры;
1 12
где F представляет собой инертный носитель; и X и X каждый независимо выбраны из
-(LV Р1;
-(h\-Pl-(L\ -Р2;
-(L^-P^LVP'-CLVP3;
и -(Ь'^-Р'АЭДе -P3-(L4)F-P4; где Р1, Р2, Р3 и Р4 представляют собой пептиды, способные связываться с миостатином; и
12 3 4
каждый из L , L , L и L представляет собой линкеры; и а, Ь, с, d, е и f каждый независимо представляет собой 0 или 1, при условии, что по меньшей мере один из а и b равен 1.
Любой пептид, содержащий остаток цистеинил может быть перекрестно сшит с другим Cys-содержащим пептидом, любой или оба из которых могут быть связаны с инертным носителем. Любой пептид, содержащий больше одного остатка Cys, может также образовывать внутрипептидную дисульфидную связь.
Согласно одному варианту осуществления инертный носитель представляет собой домен Fc, определенный ниже. Указанный вариант осуществления называется "пептитело". Используемый в настоящем документе термин "пептитело" относится к молекуле, содержащей домен Fc антитела, прикрепленный по меньшей мере к одному пептиду. Получение пептител в общем описано в РСТ публикации WO 00/24782, опубликованной 4 мая 2000 г., которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Иллюстративные пептитела предусмотрены в виде 1х и 2х конфигураций с одной копией и двумя копиями пептида (прикрепленными в тандеме), соответственно, как описано в примерах ниже.
Пептиды
Согласно одному варианту осуществления в способах согласно настоящему изобретению используется антагонист миостатина, содержащий пептид, состоящий из SEQ ID N0:311.
Используемый в настоящем документе термин "пептид" относится к молекулам, составляющим приблизительно 5 - приблизительно 90 аминокислот, связанным с помощью пептидных связей. Пептиды согласно настоящему изобретению
предпочтительно составляют приблизительно 5 - приблизительно 50 аминокислот в длину, более предпочтительно приблизительно 10 - 30 аминокислот в длину и наиболее предпочтительно приблизительно 10-25 аминокислот в длину и способны связываться с белком миостатином.
Пептиды согласно настоящему изобретению могут содержать часть последовательности встречающихся в природе белков, могут представлять собой рандомизированные последовательности, происходящие из встречающихся в природе белков, или могут представлять собой полностью рандомизированные последовательности, пептиды согласно настоящему изобретению могут быть созданы с помощью любых способов, известных в настоящей области техники, включая в себя химический синтез, ферментативную обработку белков или рекомбинантную технологию. Фаговый дисплей и РНК-пептидный скрининг и другие техники скрининга на основании аффинности являются особенно применимыми для создания пептидов, способных связываться с миостатином.
Технология фагового дисплея описана, например, в Scott et al. Science 249: 386 (1990); Devlin et al, Science 249: 404 (1990); патенте США № 5223409, выданном 29 июня 1993 г.; патенте США № 5733731, выданном 31 марта 1998 г.; патенте США № 5498530, выданном 12 марта 1996 г.; патенте США № 5432018, выданном 11 июля 1995 г.; патенте США № 5338665, выданном 16 августа 1994 г.; патенте США № 5922545, выданном 13 июля 1999 г.; международной патентной публикации WO 96/40987, опубликованной 19 декабря 1996 г.; и международной патентной публикации WO 98/15833, опубликованной 16 апреля 1998 г., причем каждый из вышеприведенных документов включен в настоящий документ посредством ссылки. С использованием фаговых библиотек случайные пептидные последовательности представлены путем слияния с белками оболочки нитевидного фага. Как правило, представленные пептиды аффинно элюируют либо специфически, либо неспецифически против целевой молекулы. Удерживаемые фаги можно обогатить с помощью последовательных циклов аффинной очистки и повторной репродукции. Пептиды, связывающиеся наилучшим образом, отбирают для дополнительного анализа, например, с использованием фагового ELISA, описанного ниже, и затем секвенируют. Необязательно библиотеки мутагенеза могут быть созданы и подвергнуты скринингу для дополнительной оптимизации последовательности наилучшим образом связывающихся средств (Lowman, Ann Rev Biophys Biomol Struct 26:401-24 (1997)).
Другие способы создания миостатинсвязывающих пептидов включают в себя дополнительные техники отбора на основе аффинности, известные в настоящей области техники. Пептидная библиотека может быть слита на карбоксильном конце 1ас-репрессора и экспрессирована в E.coli. Другой основанный на использовании Е. coli способ позволяет осуществить дисплей на наружной мембране клетки путем слияния с ассоциированным с пептидогликаном липопротеином (PAL). Далее в настоящем документе указанные и сходные с ними способы обобщенно называются "дисплей Е. со1Г. Согласно другому способу трансляцию случайной РНК обрывают до высвобождения рибосомы, в результате чего получают библиотеку полипептидов с еще прикрепленными к ним молекулами ассоциированных с ними РНК. В настоящем документе далее указанные и сходные с ними способы обобщенно называются "рибосомный дисплей". Согласно другим способам используется химическая связь пептидов с РНК. Смотрите, например, Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94: 12297-303 (1997). Далее в настоящем документе указанные и сходные с ними способы обобщенно называются "РНК-пептидный скрининг". Способы дрожжевого двухгибридного скрининга также могут быть использованы для идентификации пептидов согласно настоящему изобретению, которые связываются с миостатином. Кроме того, были разработаны полученные химическими способами пептидные библиотеки, в которых пептиды иммобилизированы на стабильных небиологических материалах, таких как полиэтиленовые стержни или проницаемые для растворителей смолы. В другой полученной химическим путем пептидной библиотеке используется фотолитография для сканирования пептидов, иммобилизированных на предметных стеклах. Далее в настоящем документе указанные и сходные с ними способы обобщенно называются "химическо-пептидный скрининг". Преимущество химическо-пептидного скрининга может состоять в том, что он позволяет использовать D-аминокислоты и другие аналоги, а также непептидные элементы. Как биологические, так и химические способы обобщенно изложены в Wells and Lowman, Curr Opin Biotechnol 3: 355-62 (1992).
Кроме того, выбранные пептиды, способные связываться с миостатином, могут быть дополнительно улучшены посредством использования "рационального дизайна". Согласно указанному подходу поэтапные изменения производят в пептидной последовательности и эффект замещения на аффинность связывания или специфичность пептида или некоторое другое свойство пептида наблюдают в соответствующем анализа. Один пример указанной техники представляет собой
замещение за один раз одного остатка аланином, что называется "аланиновая прогулка" или "аланиновый скрининг". Если замещают два остатка, это называется "двойная аланиновая прогулка". Полученный пептид, содержащий аминокислотные замены, исследуют в отношении усиленной активности или некоторого дополнительного преимущественного свойства.
Кроме того, анализ структуры белок-белкового взаимодействия также можно использовать для определения предполагаемых пептидов, которые имитируют взаимодействие большего по размеру белка. В таком анализе кристаллическая структура белка может указывать на идентичность и относительную ориентацию критически важных остатков белка, из которого может быть сконструирован пептид. Смотрите, например, Takasaki et al., Nature Biotech 15:1266 (1977). Указанные способы также можно использовать для исследования взаимодействия между целевым белком и пептидами, выбранными с помощью фагового дисплея или других способов аффинной селекции, на основе которых можно предположить дополнительные модификации пептидов для увеличения аффинности связывания и способности пептида ингибировать активность белка.
Согласно одному варианту осуществления пептиды создают в виде семейств родственных пептидов. Иллюстративные пептиды представлены в SEQ ID NO: 1 - 132. Указанные иллюстративные пептиды получены посредством способа отбора, в котором наилучшим образом связывающие средства, созданные с помощью технологии фагового дисплея, и дополнительно проанализированы с помощью фагового ELISA для получения кандидатных пептидов с помощью техники аффинной селекции, такой как технология фагового дисплея, описанная в настоящем документе. Тем не менее, пептиды согласно настоящему изобретению можно получить с помощью любого количества известных способов, включая в себя химический синтез, описанный ниже.
Пептиды могут быть дополнительно улучшены с помощью способа "созревания аффинности". Указанная процедура направлена на увеличение аффинности или активности пептидов и пептител согласно настоящему изобретению с использованием фагового дисплея или других технологий селекции. НА основании консенсусной последовательности могут быть созданы, например, направленные вторичные библиотеки фагового дисплея, в которых "коровые" аминокислоты (определенные из консенсусной последовательности) сохраняют неизменными или изменяют их частоту встречаемости. Альтернативно, отдельную пептидная последовательность можно использовать для создания смещенной, направленной библиотеки фагового дисплея.
Пэннинг таких библиотек при более жестких условиях может дать в результате пептиды с усиленным связыванием с миостатином, селективным связыванием с миостатином или с некоторым дополнительным требуемым свойством. Тем не менее, пептиды, содержащие последовательности с созревшей аффинностью, затем могут быть получены с помощью любого числа известных способов, включая в себя химический синтез, или рекомбинантно. Указанные пептиды используются для создания связывающих средств, таких как пептитела различных конфигураций, которые проявляют большую ингибирующую активность в клеточных анализах и in vivo анализах.
В пример 6 ниже описано созревание аффинности пептидов "первого раунда", описанных выше для получения пептидов с созревшей аффинностью. Иллюстративные пептитела с созревшей аффинностью представлены в таблицах IV и V. Затем дополнительно определяют характеристики полученных 1х и 2х пептител, произведенных из указанных пептидов, в отношении аффинности связывания, способности к нейтрализации активности миостатина, специфичности к миостатину по сравнению с определенными другими представителями семейства TGF-P, такими как активин, и в отношении дополнительной in vitro и in vivo активности, как описано ниже. Пептиды и пептитела с созревшей аффинностью обозначены приставкой "т" перед названием их семейства, чтобы отличить их от пептидов первого раунда того же семейства.
Иллюстративные пептиды первого раунда, выбранные для дополнительного созревания аффинности согласно настоящему изобретению, включали в себя следующие пептиды:
TN8-19 QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33) Линейный-2 MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ ID NO: 104) Линейный-15 HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV (SEQ ID NO: 117) Линейный-17, RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID NO: 119) Линейный-20 YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEQ ID NO: 122) Линейный-21 HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ (SEQ Ш NO: 123) Линейный-24 EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). Семейства с созревшей аффинностью каждого из них представлены ниже в таблицах IV и V.
Пептиды согласно настоящему изобретению также включают в себя варианты и производные выбранных пептидов, которые способны связываться с миостатином.
Используемый в настоящем документе термин "вариант" относится к пептидам, в которых одна или несколько аминокислот вставлена, подвергнута делеции или замещена относительно исходной аминокислотной последовательности, и которые все еще способны связываться с миостатином. Содержащие вставки и замещения варианты могут содержать встречающиеся в природе аминокислоты, а также не встречающиеся в природе аминокислоты. Используемый в настоящем документе термин "вариант" включает в себя фрагменты пептидов, которые все еще сохраняют способность связываться с миостатином. Используемый в настоящем документе термин "производное" относится к пептидам, которые были химически модифицированы некоторым образом, отличным от вариантов с вставкой, делецией и заменой. Варианты и производные пептидов и пептител согласно настоящему изобретению описаны более подробно ниже.
Инертные носители
Используемый в настоящем документе термин "инертный носитель" относится к молекуле, которая может быть прикреплена к одному или нескольким пептидам согласно настоящему изобретению. Предпочтительно, чтобы инертные носители придавали связывающим средствам согласно настоящему изобретению по меньшей мере одно требуемое свойство. Вероятно, пептиды отдельно подвергаются удалению ш vivo либо с помощью почечной фильтрации, механизмов клеточного клиренса в ретикулоэндотелиальной системе, либо с помощью протеолитического расщепления. Прикрепление к инертному носителю улучшает терапевтическую ценность связывающего средства путем снижения расщепления связывающего средства и/или увеличения периода полужизни, снижения токсичности, снижения иммуногенности и/или увеличения биологической активности связывающего средства.
Иллюстративные инертные носители включают в себя домены Fc; неразветвленные полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), полилизин, декстран; разветвленный полимер (смотрите, например, патент США № 4289872, выданный Denkenwalter с соавт. 15 сентября 1981 г.; патент США № 5229490, выданный Tarn 20 июля 1993 г.; международную патентную публикацию WO 93/21259, Frechet с соавт, публикованную 28 октября 1993 г.); липид; холестериновую группу (такую как стероид); углевод или олигосахарид; или любой природный или синтетический белок, полипептид или пептид, который связывается с рецептором реутилизации.
Согласно одному варианту осуществления миостатинсвязывающие средства согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере один пептид,
1 2
прикрепленный по меньшей мере к одному инертному носителю (F , F ) через N-конец, С-конец или боковую цепь одного из аминокислотных остатков пептида(ов). Также можно использовать многочисленные инертные носители; такие как домен Fc на каждом конце или домен Fc на одном конце и группа ПЭГ на другом конце или боковой цепи.
Домены Fc
Домен Fc представляет собой один предпочтительный инертный носитель. Используемый в настоящем документе термин "домен Fc" включает в себя молекулы и последовательности нативного Fc и вариантов Fc, определенных ниже. Используемый в настоящем документе термин "нативный Fc" относится к не являющемуся антигенсвязывающим фрагменту антитела или аминокислотной последовательности указанного фрагмента, который получен с помощью техник рекомбинантной ДНК или с помощью ферментативного или химического расщепления интактных антител, предпочтительный Fc представляет собой полностью человеческий Fc и он может происходить из любой из иммуноглобулинов, таких как IgGl и IgG2. Тем не менее, молекулы Fc, которые являются частично человеческими или происходят из не относящихся к человеку видов, также включены в настоящий документ. Нативные молекулы Fc состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть соединены в димерные или мультимерные формы ковалентной (т.е. дисульфидными связями) и нековалентной связью. Количество межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Fc находится в диапазоне от 1 до 4 в зависимости от класса (например, IgG, IgA, IgE) или подкласса (например, IgGl, IgG2, IgG3, IgAl, IgGA2). Один пример нативного Fc представляет собой связанный дисульфидными связями димер, являющийся результатом обработки IgG папаином (смотрите Ellison et al. (1982), Nucl Acids Res 10: 4071-9). Используемый в настоящем документе термин "нативный Fc" используется для обозначения мономерных, димерных и мультимерных форм.
Используемый в настоящем документе термин "вариант Fc" относится к модифицированной форме нативной последовательности Fc при условии, что сохраняется связывание с рецептором реутилизации, как описано, например, в международных патентных публикациях WO 97/34631 и WO 96/32478, обе из которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Варианты Fc можно сконструировать, например, путем замещения или делеции остатков, вставки остатков или процессирования частей, содержащий сайт. Вставленные или замещенные остатки
также могут представлять собой измененные аминокислоты, такие как пептидомиметики или D-аминокислоты. Варианты Fc могут быть необходимы по ряду причин, некоторые из которых описаны ниже. Иллюстративные варианты Fc включают в себя молекулы и последовательности, в которых:
1. Удаляют сайты, вовлеченные в формирование дисульфидных связей. Такое удаление может позволить избежать реакции с другими содержащими цистеин белками, присутствующими в клетке-хозяине, используемой для получения молекул согласно настоящему изобретению. С этой целью содержащий цистеин сегмент на N-конце можно отсечь или остатки цистеина можно подвергнуть делеции или замещению другими аминокислотами (например, аланилом, сер илом). Даже если остатки цистеина удаляют, одноцепочечные домены Fc все еще могут формировать димерный домен Fc, который удерживается вместе нековалентно.
2. Модифицируют нативный Fc, чтобы сделать его более совместимым с выбранной клеткой-хозяином. Например, можно удалить последовательность РА вблизи N-конца типичного нативного Fc, которая может быть распознана пищеварительным ферментом в Е. coli, таким как пролиниминопептидазой. Также можно добавить N-концевой остаток метитонила, особенно если молекула экспрессируется рекомбинантно в такой бактериальной клетке, как Е. coli.
3. Удаляют часть N-конца нативного Fc для предотвращения N-концевой гетерогенности при экспрессии в выбранной клетке-хозяине. С этой целью можно подвергнуть делеции любой из первых 20 аминокислотных остатков на N-конце, в частности, остатки в положениях 1, 2, 3, 4 и 5.
4. Удаляют один или несколько сайтов гликозилирования. Остатки, которые типично гликозилируются (например, аспарагин) могут обеспечивать цитолитический ответ. Такие остатки могут быть подвергнуты делеции или замещению негликозилированными остатками (например, аланином).
5. Удаляют сайты, вовлеченные во взаимодействие с комплементом, такие как сайт связывания с Clq. Например, можно подвергнуть делеции или замещению последовательность ЕКК IgGl человека. Рекрутинг комплемента может не быть предпочтительным для молекул согласно настоящему изобретению и, таким образом, его избегают с помощью такого варианта Fc.
6. Удаляют сайты, которые воздействуют на связывание с рецепторами Fc, отличными от рецептора реутилизации. Нативный Fc может содержать сайты для взаимодействия с определенными лейкоцитами, которые не являются необходимыми
1.
для молекул слияния согласно настоящему изобретению и, таким образом, могут быть удалены.
7. Удаляют сайт ADCC. Сайты ADCC известны в настоящей области техники. Смотрите, например, Molec Immunol 29 (5):633-9 (1992) в отношении сайтов ADCC в IgGl. Указанные сайты также не являются необходимыми для молекул слияния согласно настоящему изобретению и, следовательно, могут быть удалены.
8. Если нативный Fc получен из не относящегося к человеку антитела, нативный Fc может быть гуманизирован. Как правило, для гуманизации нативного Fc, будут замещать выбранные остатки в не относящемся к человеку нативном Fc остатками, которые в норме обнаруживают в нативном Fc человека. Техники гуманизации антител хорошо известны в настоящей области техники.
Термин "домен Fc" включает в себя молекулы в мономерной или мультимерной форме, независимо от того, были ли они отщеплены от целого антитела или получены иным способом. Используемый в настоящем документе термин "мультимер", применимый к доменам Fc или молекулам, содержащим домены Fc, относится к молекулам с двумя или больше полипептидными цепями, связанными ковалентно, нековалентно или с помощью как ковалентных, так и нековалентных взаимодействий. Молекулы IgG, как правило, образуют димеры; IgM - пентамеры; IgD - димеры; и IgA -мономеры, димеры, тримеры или тетрамеры. Мультимеры могут быть образованы с использованием последовательности и полученной активности нативного источника Ig Fc или путем дериватизации такого нативного Fc. Термин "димер", применяемый к доменам Fc или молекулам, содержащим домены Fc, относится к молекулам с двумя полипептидными цепями, связанными ковалентно или нековалентно.
Не относящиеся к Fc инертные носители
Кроме того, альтернативный инертный носитель согласно настоящему изобретению представляет собой не относящийся к домену Fc белок, полипептид, пептид, антитело, фрагмент антитела или низкомолекулярную молекулу (например, соединение - пептидомиметик), способные связываться с рецептором реутилизации. Например, в качестве инертного носителя можно использовать полипептид, описанный в патенте США № 5739277, выданном 14 апреля 1998 г. Presta с соавт. Пептиды также можно выбрать с помощью фагового дисплея в отношении связывания с рецептором реутилизации FcRn. Такие связывающиеся с рецептором реутилизации соединения также включены в значение термина "инертный носитель" и находятся в пределах объема настоящего изобретения. Такие инертные носители должны быть выбраны на
основании увеличенного периода полужизни (например, избегая последовательностей, распознаваемых протеазами) и уменьшенной иммуногенности (например, предпочитая неиммуногенные последовательности, получаемые при гуманизации антител).
Кроме того, также можно использовать полимерные инертные носители для конструирования связывающих средств согласно настоящему изобретению. Различные способы прикрепления химических фрагментов, применимых в качестве инертных носителей, доступны в настоящее время, смотрите, например, международную патентную публикацию согласно РСТ № WO 96/11953, имеющую название "Композиции химически модифицированных на N-конце белков и способы" ("N-Terminally Chemically Modified Protein Compositions and Methods"), полностью включенную в настоящий документ посредством ссылки. В указанной публикации согласно РСТ раскрыто среди прочего селективное прикрепление водорастворимых полимеров к N-концу белков.
Предпочтительный полимерный инертный носитель представляет собой полиэтиленгликоль (ПЭГ). Группа ПЭГ может характеризоваться любой подходящей молекулярной массой и может быть неразветвленной или разветвленной. Средняя молекулярная масса ПЭГ предпочтительно будет находиться в диапазоне от приблизительно 2 кДа до приблизительно 100 кДа, более предпочтительно от приблизительно 5 кДа до приблизительно 50 кДа, наиболее предпочтительно от приблизительно 5 кДа до приблизительно 10 кДа. Группы ПЭГ будут, как правило, прикрепляться к соединениям согласно настоящему изобретению посредством ацилирования или восстановительного алкилирования посредством реакционноспособной группы на фрагменте ПЭГ (например, альдегидной, амино, тиольной или сложноэфирной группы) к реакционноспособной группе на соединении согласно настоящему изобретению (например, альдегидной, амино или сложноэфирной группе). Применимая стратегия для пэгилирования синтетических пептидов состоит из комбинирования, посредством образования связи конъюгатов в растворе, пептида и фрагмента ПЭГ, каждый из которых содержит конкретную функциональную группу, которая является взаимно реакционноспособной в отношении другой группы. Пептиды можно легко получить с помощью общепринятого твердофазного синтеза, известного в настоящей области техники. Пептиды "предварительно активируют" с помощью соответствующей функциональной группы на специфическом сайте. Предшественников очищают и полностью определяют их характеристики до реакции с фрагментом ПЭГ. Лигирование пептида с ПЭГ, как правило, происходит в водной фазе
и его легко можно подвергнуть мониторингу с помощью аналитической ВЭЖХ с обращенной фазой. Пэгилированные пептиды можно легко очистить с помощью препаративной ВЭЖХ и охарактеризовать с помощью аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и масс-спектрометрией с лазерной десорбцией.
Полисахаридные полимеры представляют собой другой тип водорастворимого полимера, который можно использовать для модификации белков. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно связанных связями al-б. Декстран сам по себе доступен во многих диапазонах молекулярных масс и легко доступен в молекулярных массах от приблизительно 1 кДа до приблизительно 70 кДа. Декстран представляет собой подходящий водорастворимый полимер для применения в настоящем изобретении в качестве инертного носителя отдельно или в комбинации с другим инертным носителем (например, Fc). Смотрите, например, международные патентные публикации №№ WO 96/11953 и WO 96/05309. Применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами было опубликовано; смотрите, например, публикацию европейского патента № 0 315 456, которая тем самым включена в настоящий документ посредством ссылки. Декстран с молекулярной массой, составляющий приблизительно 1 кДа - приблизительно 20 кДа, является предпочтительным в случае, когда декстран используется в качестве инертного носителя согласно настоящему изобретению.
Линкеры
Используемые в настоящем изобретении агонисты миостатина необязательно могут дополнительно содержать "линкерную" группу. Согласно одному варианту осуществления линкер состоит из последовательности GGGGGAQ (SEQ ID N0:636).
В первую очередь линкеры служат в качестве спейсера между пептидом и инертным носителем или между двумя пептидами связывающих средств согласно настоящему изобретению. Согласно одному варианту осуществления линкер состоит из аминокислот, соединенных вместе с помощью пептидных связей, предпочтительно 1 -20 аминокислот, соединенных пептидными связями, причем аминокислоты выбраны из 20 встречающихся в природе аминокислот. Специалистам в настоящей области техники понятно, что одна или несколько из указанных аминокислот могут быть гликозилированы. Согласно одному варианту осуществления 1-20 аминокислот выбраны из глицина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. Предпочтительно, чтобы линкер состоял из большинства аминокислот, которые не
являются стерически затрудненными, такие как глицин и аланин. Таким образом, иллюстративные линкеры представляют собой полиглицины (в частности, (Gly)s, (Gly)g), поли(01у-А1а) и полиаланины. Используемое в настоящем документе обозначение "g" относится к глициновым гомопептидным линкерам. Как показано в таблице II, "gn" относится к 5х gly линкеру на N-конце, тогда как "gc" относится к 5х gly линкеру на С-конце. Комбинации Gly и Ala также являются предпочтительными. Одна иллюстративная линкерная последовательность, применимая для конструирования связывающих средств согласно настоящему изобретению, представляет собой следующую: gsgsatggsgstassgsgsatg (SEQ ID NO: 305). Указанная линкерная последовательность обозначена как "к" или последовательность 1к. Обозначения "кс", которые можно найти в таблице II, относится к линкеру к на С-конце, тогда как обозначение "kn" относится к линкеру к на N-конце.
Линкеры согласно настоящему изобретению также могут представлять собой непептидные линкеры. Например, можно использовать такие алкильные линкеры, как -NH-(CH2)s-C(0)-, где s = 2-20. Указанные алкильные линкеры могут быть дополнительно замещены любой не вызывающей стерические затруднения группой, такой как низший алкил (например, Ci-Сб), низший ацил, галоген (например, О, Вг), CN, NH2, фенил и т.д. Иллюстративный непептидный линкер представляет собой линкер ПЭГ и он характеризуется молекулярной массой, составляющей 100 - 5000 кДа, предпочтительно 100 - 500 кДа. Пептидные линкеры могут быть изменены с образованием производных таким же способом, как изложено выше.
Иллюстративные антагонисты миостатина, например, связывающие средства
Агонисты миостатина, например, связывающие средства, используемые в описанных в настоящем документе способах, содержат по меньшей мере один пептид, способный связываться с миостатином, например, пептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:311.
Согласно одному варианту осуществления миостатинсвязывающий пептид составляет приблизительно 5 - приблизительно 50 аминокислот в длину, согласно другому варианту осуществления приблизительно 10 - 30 аминокислот в длину и согласно другому варианту осуществления приблизительно 10-25 аминокислот в длину. Согласно одному варианту осуществления миостатинсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность WMCPP (SEQ ID NO: 633). Согласно другому варианту осуществления миостатинсвязывающий пептид содержит
аминокислотную последовательность Cai a^Wa^WMCPP (SEQ Ш NO: 352), где ai, аг и аз выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты. Согласно другому варианту осуществления миостатинсвязывающий пептид содержит аминокислотную последовательность Cbib^Wb^WMCPP (SEQ Ш NO: 353), где bi выбран из любой из аминокислот Т, I или R; Ьг выбран из любой из R, S, Q; Ьз выбран из любой из Р, R и Q, и где пептид составляет 10-50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
Другие миостатинсвязывающие пептиды содержат формулу:
ciC2C3C4C5C6Cc7C8Wc9WMCPPcioCiiCi2ci3 (SEQ ID NO: 354), где:
ci отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
C2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
сз отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
C4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
C5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
Сб отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
cj представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
eg представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
C9 представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту; и
сю - ев представляет собой любую аминокислоту; и где пептид составляет 20 -50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
Другие миостатинсвязывающие пептиды содержат формулу:
dicbcbcbcbckCcbdsWdQWMCPP d^nd^d^ (SEQ ID NO: 355), где
di отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
d2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
d3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
сЦ отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
ds отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
ёб отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
dj выбран из любой из аминокислот Т, I или R;
dg выбран из любой из R, S, Q;
dg выбран из любой из Р, R и Q, и
dio - di3 выбран из любой аминокислоты,
и где пептид составляет 20 - 50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
Другие миостатинсвязывающие пептиды содержат по меньшей мере один из следующих пептидов:
(1) пептид, способный связываться с миостатином, причем пептид содержит последовательность WYeie^Ye^G, (SEQ ID NO: 356),
где ei представляет собой Р, S или Y, &2 представляет собой С или Q, и
ез представляет собой G или Н, причем пептид составляет 7-50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
(2) пептид, способный связываться с миостатином, причем пептид содержит последовательность f 1 EMLf9S Li 3I4LL, (SEQ ID NO: 455),
где fi представляет собой M или I,
12 представляет собой любую аминокислоту,
f3 представляет собой L или F,
14 представляет собой Е, Q или D;
и где пептид составляет 7-50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
(3) пептид, способный связываться с миостатином, причем пептид содержит последовательность Lgig?LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456), где
gi представляет собой Q, D или E,
g2 представляет собой S, Q, D или E,
g3 представляет собой любую аминокислоту,
g4 представляет собой L, W, F, или Y, и где пептид составляет 8-50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
(4) пептид, способный связываться с миостатином, причем пептид содержит последовательность П1П2ПзП4П5П6п7п8Г19 (SEQ ID N0: 457), где hi представляет собой R или D,
представляет собой любую аминокислоту, Ьз представляет собой А, Т S или Q, h-4 представляет собой L или М, h-5 представляет собой L или S, h-б представляет собой любую аминокислоту, h-7 представляет собой F или Е, hg представляет собой W, F или С,
h-9 представляет собой L, F, М или К, и где пептид составляет 9-50 аминокислот в длину, и его физиологически приемлемые соли.
Другие миостатинсвязывающие пептиды характеризуются следующей обобщенной структурой:
112
(X )a-F -(X )ь или ее мультимеры;
1 12
причем F представляет собой инертный носитель; и каждый из X и X независимо выбран из
-ОЛ- Р1;
-(h\-Pl-(L\ -Р2;
-(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e-P3;
и -(L1)c-P1-(L2)d-P2-(L3)e -Р3-(Ь4)ГР4;
12 3 4
где Р , Р , Р и Р представляют собой пептиды, способные связываться с миостатином; и
12 3 4
каждый из L , L , L и L представляет собой линкер; и каждый из а, Ь, с, d, е и f независимо представляет собой 0 или 1 при условии, что по меньшей мере один из а и b представляет собой 1.
Другие миостатинсвязывающие пептиды характеризуются указанной
12 3 4
обобщенной структурой, предусмотренные пептиды Р , Р , Р и Р могут быть выбраны из одного или нескольких пептидов, содержащих любую из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 633, SEQ ID NO: 352, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 354, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 356, SEQ ID NO: 455, SEQ ID NO: 456 или SEQ ID
12 3 4
NO: 457. Согласно другому варианту осуществления Р , Р , Р и Р независимо выбраны из одного или нескольких пептидов, содержащих любую из следующих последовательностей SEQ ID NO: 305 - 351 и SEQ ГО NO: 357 - 454.
Согласно дополнительному варианту осуществления инертные носители связывающих средств с приведенной выше общей формулой представляют собой домены Fc. Следовательно, пептиды слиты с доменом Fc, либо напрямую, либо опосредованно, тем самым обеспечивая пептитела. Пептитела согласно настоящему изобретению проявляют высокую аффинность связывания в отношении миостатина и могут ингибировать активность миостатин, как продемонстрировано в представленных в настоящем документе in vitro анализах и in vivo испытании на животных.
Варианты и производные пептидов и пептител
Агонисты миостатина, например, описанные в настоящем документе связывающие средства также включают в себя варианты и производные описанных в настоящем документе пептидов и пептител. Поскольку как пептиды, так и пептитела согласно настоящему изобретению могут быть описаны в контексте их аминокислотной последовательности, термины "варианты" и "производные" можно применять к пептиду отдельно или пептиду как компоненту пептитела. Используемый в настоящем документе термин "варианты пептида" относится к пептидам или пептителам, характеризующимся одним или несколькими аминокислотными остатками, вставленными, подвергнутыми делеции или замещенными по сравнению с исходной аминокислотной последовательностью и которые сохраняют способность связываться с миостатином и модифицировать его активность. Используемые в настоящем документе фрагменты пептидов или пептител включены в определение термина "варианты".
Например, используемый в способах антагонист миостатина может содержать пептитело, содержащее по меньшей мере один полипептид, характеризующийся аминокислотной последовательностью, которая является по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:635.
Следует понимать, что любой указанный пептид или пептитело может содержать один или два или все три типа вариантов. Содержащие вставки и замещения варианты могут содержать природные аминокислоты, а также не встречающиеся в природе аминокислоты или и те и другие.
Варианты пептидов и пептител также включают в себя зрелые пептиды и пептитела, причем лидерные или сигнальные последовательности удаляют, и в полученных белках с дополнительными аминоконцевыми остатками аминокислоты могут быть встречающимися в природе и не встречающимися в природе.
Предусмотрены пептитела с дополнительным метитонильным остатком в аминокислотном положении -1 (Ме1_1-пептитело), а также пептитела с дополнительными остатками метионина и лизина в положениях -2 и -1 (Met" -Lys" -). Варианты с дополнительными остатками Met, Met-Lys, Lys (или одним или несколькими основными остатками, в общем) являются особенно применимыми для усиленной рекомбинантной продукции белков в бактериальных клетках-хозяевах.
Варианты пептидов или пептител согласно настоящему изобретению также включают в себя пептиды с дополнительными аминокислотными остатками, которые являются результатом применения специфических экспрессионных систем. Например, применение коммерчески доступных векторов, которые экспрессируют требуемый полипептид как часть продукта слияния с глутатион-Б-трансферазой (GST), обеспечивает требуемый полипептид с дополнительным остатком глицина в аминокислотном положении -1 после отщепления компонента GST от требуемого полипептида. Также предусмотрены варианты, которые являются результатом экспрессии в других векторных системах, включая в себя варианты, в которых гистидиновые метки встроены в аминокислотную последовательность, как правило, как карбоки- и/или амино-конце последовательности.
Согласно одному примеру предусмотрены содержащие вставки варианты, в которых один или несколько аминокислотных остатков, либо встречающихся в природе, либо не встречающихся в природе аминокислот, добавлены в аминокислотную последовательность пептида. Вставки могут быть расположены на любом или обоих концах белка или могут располагаться в пределах внутренних областей аминокислотной последовательности пептитела. Содержащие вставки варианты с дополнительными остатками на любом или обоих концах могут включать в себя, например, белки слияния и белки, включающие в себя аминокислотные маркеры или метки. Содержащие вставки варианты включают в себя пептиды, в которых один или несколько аминокислотных остатков добавляют к аминокислотной последовательности пептида или ее фрагменту.
Содержащие вставки варианты также включают в себя белки слияния, в которых амино и/или карбокси-концы пептида или пептитела слиты с другим полипептидом, его фрагментом или аминокислотами, которые, как правило, не являются частью какой-либо конкретной белковой последовательности. Примеры таких белков слияния представляют собой иммуногенные полипептиды, белки с продолжительными периодами полувыведения из крови, такие как константные области
иммуноглобулинов, маркерные белки, белки или полипептиды, которые облегчают очистку требуемого пептида или пептитела, и полипептидные последовательности, которые стимулируют образование мультимерных белков (такие как мотивы "лейциновая молния", которые являются применимыми в образовании/стабильности димеров).
Указанный тип содержащего вставки варианта, как правило, содержит всю или существенную часть нативной молекулы, связанной на N- или С-конце со всей молекулой или частью второго полипептида. Например, белки слияния, как правило, используют лидерные последовательности из других видов для обеспечения рекомбинантной экспрессии белка в гетерологическом хозяине. Другой применимый белок слияния включает в себя добавление иммунологически активного домена, такого как эпитоп антитела, для облегчения очистки белка слияния. Встраивание сайта расщепления в соединительный участок слияния или вблизи него будет облегчать удаление лишнего полипептида после очистки. Другие применимые слияния включают в себя соединение функциональных доменов, таких как активные сайты из ферментов, домены гликозилирования, клеточные сигналы направленного воздействия или трансмембранные участки.
Существуют многочисленные коммерчески доступные системы экспрессии белков слияния, которые можно использовать в настоящем изобретении. Особенно применимые системы включают в себя без ограничения система глутатион-S-трансферазы (GST) (Pharmacia), система связывающего мальтозу белка (NEB, Beverley, MA), система FLAG (IBI, New Haven, CT) и система 6xHis (Qiagen, Chatsworth, CA). Указанные системы способны производить рекомбинантные пептиды и/или пептитела, содержащие только небольшое количество дополнительных аминокислот, которые, вероятно, не окажут существенное влияние на активность пептида или пептитела. Например, как система FLAG, так и система 6xHis добавляют лишь короткие последовательности, обе из которых, как известно, являются слабо антигенными и которые не оказывают неблагоприятного воздействия на укладку полипептида в его нативную конформацию. Другое N-концевое слияние, которое предусмотрено как применимое, представляет собой слияние дипептида Met-Lys в N-концевой области белка или пептидов. Такое слияние может приводить к благоприятному повышению экспрессии или активности белка.
Другие системы слияния производят полипептидные гибриды, при этом желательно произвести удаление партнера по слиянию из требуемого пептида или
пептитела. Согласно одному варианту осуществления партнер по слиянию связан с рекомбинантным пептителом с помощью пептидной последовательности, содержащей специфическую последовательность распознавания протеазой. Примеры подходящих последовательностей представляют собой последовательности, распознаваемые протеазой вируса гравировки табака (Life Technologies, Gaithersburg, MD) или фактором Ха (New England Biolabs, Beverley, MA).
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены полипептиды слияния, которые содержат весь или часть пептида или пептитела согласно настоящему изобретению в комбинации с процессированным тканевым фактором (tTF). tTF представляет собой нацеленно воздействующее на сосуды средство, состоящее из процессированной формы индуцирующего коагуляцию белка человека, которое действует как коагулирующее средство кровеносных сосудов опухолей, описанное в патентах США №№: 5877289; 6004555; 6132729; 6132730; 6156321 и европейском патенте № ЕР 0988056. Слияние tTF с пептителом или пептидом к миостатину или их фрагментами облегчает доставку антагонистов миостатина к целевым клеткам, например, клеткам скелетных мышцы, клеткам миокарда, фибробластам, преадипоцитам и, возможно, адипоцитам.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предусмотрены содержащие делецию варианты, в которых удален один или несколько аминокислотных остатков в пептиде или пептителе. Делеции могут быть осуществлены на одном или обоих концах пептитела или путем удаления одного или нескольких остатков в пределах аминокислотной последовательности пептитела. Содержащий делецию варианты обязательно включают в себя все фрагменты пептида или пептитела.
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предусмотрены содержащие замещение варианты пептидов и пептител согласно настоящему изобретению. Содержащие замещение варианты включают в себя те пептиды и пептитела, в которых один или несколько аминокислотных остатков удалены и замещены одним или несколькими альтернативными аминокислотами, причем аминокислоты могут быть встречающимися в природе или не встречающимися в природе. Содержащие замещение варианты создают пептиды или пептитела, которые являются "сходными" с исходным пептидом или пептителом в том смысле, что две молекулы характеризуются определенным процентным отношением аминокислот, которые являются идентичными. Содержащие замещение варианты включают в себя замещения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 и 20 аминокислот в пределах пептида или
пептитела, причем количество замещений может составлять вплоть до 10% от количества аминокислот пептида или пептитела. Согласно одному аспекту замещения являются консервативными по природе, тем не менее, в настоящем изобретении предусмотрены замещения, которые являются также не консервативными, а также включает в себя нестандартные аминокислоты.
Идентичность и сходство родственных пептидов и пептител можно легко рассчитать с помощью известных способов. Такие способы включают в себя без ограничения способы, описанные в Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Праймер, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991); и Carillo etal., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988).
Предпочтительные способы определения родства или процентной идентичности двух пептидов или полипептидов или полипептида и пептида разрабатывают так, чтобы получить наибольшее совпадение между исследуемыми последовательностями. Способы определения идентичности описаны в общедоступных компьютерных программах. Предпочтительные способы с использованием компьютерных программ для определения идентичности между двумя последовательностями включают в себя без ограничения пакт программ GCG, включая в себя GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). Программа BLASTX является общедоступной от Национальной центра биотехнологической информации (NCBI) и других источников (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., ранее (1990)). Хорошо известный алгоритм Smith Waterman также можно использовать для определения идентичности.
Определенные схемы выравнивания для выравнивания двух аминокислотных последовательностей могут давать в результате совпадение только короткого участка двух последовательностей, и эта небольшой выровненный участок может характеризоваться очень высокой идентичностью последовательности, даже если отсутствует существенная взаимосвязь между двумя полноразмерными последовательностями. Следовательно, согласно определенным вариантам
осуществления выбранный способ выравнивания будет давать в результате выравнивание, которое охватывает по меньшей мере 10% полной длины целевого полипептида, подвергаемого сравнению, т.е. по меньшей мере 40 смежных аминокислот, если сравнению подлежат последовательности, составляющие по меньшей мере 400 аминокислот, 30 смежных аминокислот, если сравнению подлежат последовательности, составляющие по меньшей мере 300 - приблизительно 400 аминокислот, по меньшей мере 20 смежных аминокислот, если сравнению подлежат последовательности, составляющие 200 - приблизительно 300 аминокислот, и по меньшей мере 10 смежных аминокислот, если сравнению подлежат последовательности, составляющие приблизительно 100 - 200 аминокислот. Например, с использованием компьютерного алгоритма GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) два полипептида, для которых следует определить процент идентичности последовательности, выравнивают для оптимального совпадения их соответственных аминокислот ("совпадающий интервал", определяемый алгоритмом). Согласно определенным вариантам осуществления штраф за введение делеции (который, как правило, рассчитывают как ЗХ средней диагонали; "средняя диагональ" представляет собой среднее диагонали используемой матрицы сравнения; "диагональ" представляет собой балл или число, присвоенное конкретной матрицей сравнения каждому абсолютному совпадению аминокислот) и штраф за удлинение делеции (который, как правило, составляет 1/10 от штрафа за введение делеции), а также такая матрица сравнения, как РАМ 250 или BLOSUM 62, используются совместно с алгоритмом. Согласно определенным вариантам осуществления алгоритмом также используется стандартная матрица сравнения (смотрите, Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)(1978) для матрицы сравнения РАМ 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) для матрицы сравнения BLOSUM 62).
Согласно определенным вариантам осуществления, например, параметры для сравнения полипептидных последовательностей могут соответствовать следующему: алгоритм: Needleman et al., /. Mol. Biol., 48:443-453 (1970); матрица сравнения: BLOSUM 62 из Henikoff et al., ранее (1992); штраф за введение делеции: 12; штраф за удлинение делеции: 4; пороговое значение сходства: 0, при условии отсутствия штрафов за концевые делеции.
Согласно определенным вариантам осуществления параметры для сравнений последовательностей полинуклеотидных молекул (по сравнению с аминокислотной последовательностью) могут соответствовать следующему: алгоритм: Needleman et al.,
ранее (1970); матрица сравнения: совпадение = +10, несовпадение = 0; штраф за введение делеции: 50: штраф за удлинение делеции: 3
Можно использовать другие иллюстративные алгоритмы, штрафы за введение делеции, штрафы за удлинение делеции, матрицы сравнения, пороговые значение сходства и т.д., включая в себя те, которые представлены в Program Manual, Wisconsin Package, Version 9, September, 1997. Специалистам в настоящей области техники будет очевидно, какие конкретные выборы необходимо сделать, и они будут зависеть от конкретного сравнения, которое необходимо провести, такого как ДНК с ДНК, белок с белком, белок с ДНК; и кроме того, от того, проводится ли сравнение между данными парами последовательностей (в этом случае, как правило, предпочтительными являются GAP или BestFit) или между одной последовательностью и большой базой данных последовательностей (в этом случае предпочтительными являются FASTA или BLASTA).
Стереоизомеры (например, D-аминокислоты) двадцати стандартных (встречающихся в природе) аминокислот, не встречающиеся в природе аминокислот, такие как а-, а-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нестандартные аминокислоты также могут быть подходящими компонентами для пептидов согласно настоящему изобретению. Примеры не встречающихся в природе аминокислот включают в себя, например, следующие: аминоадипиновая кислота, бета-аланин, бета-аминопропионовая кислота, аминомасляная кислота, пиперидиновая кислота, аминокапроновая кислота, аминогептановая кислота, аминоизомасляная кислота, аминопимелиновая кислота, диаминомасляная кислота, десмозин, диаминопимелиновая кислота, диаминопропионовая кислота, N-этилглицин, N-этиласпарагин, гидроксилизин, алло-гидроксилизин, гидроксипролин, изодесмозин, алло-изолейцин, N-метилглицин, саркозин, N-метилизолейцин, N-метилвалин, норвалин, норлейцин, орнитин, 4-гидроксипролин, у-карбоксиглутамат, ?-К,гЧ,гЧ-триметиллизин, s-N-ацетиллизин, О-фосфосерин, N-ацетилсерин, N-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, a-N-метиларгинин, и другие сходные аминокислоты и аминокислоты (например, 4-гидроксипролин).
Встречающиеся в природе остатки можно разделить на (перекрывающиеся) классы на основании общих свойств боковых цепей:
1) нейтральные гидрофобные: Met, Ala, Val, Leu, He, Pro, Trp, Met, Phe;
2) нейтральные полярные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin, Tyr, Gly;
3) кислые: Asp, Glu;
4) основные: His, Lys, Arg;
5) остатки, которые влияют на ориентацию цепей: Gly, Pro; и
6) ароматические: Trp, Туг, Phe.
Замены аминокислот могут быть консервативными, которые дают в результате пептиды с функциональными и химическими характеристиками, сходными с таковыми у исходного пептида. Консервативные аминокислотные замены включают в себя обмен представителя одного из вышеприведенных классов на другого представителя того же класса. Консервативные изменения могут предусматривать нетрадиционные аминокислотные остатки, которые, как правило, встраиваются путем химического пептидного синтеза, а не путем синтеза в биологических системах. Они включают в себя пептидомиметики и другие обращенные или инвертированные формы аминокислотных фрагментов.
Неконсервативные замены могут включать в себя обмен представителя одного из указанных классов на представителя другого класса. Указанные изменения могут приводить к существенной модификации в функциональных и/или химических характеристиках пептидов. При осуществлении таких изменений согласно определенным вариантам осуществления может учитываться индекс гидропатичности аминокислот. Каждой аминокислоте был присвоен индекс гидропатичности на основании ее гидрофобности и характеристик заряда. Они представляют собой: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серии (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9) и аргинин (-4,5).
Важность гидропатического индекса аминокислоты в придании белку интерактивной биологической функции понятна в настоящей области техники. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Известно, что определенные аминокислоты могут быть замещены другими аминокислотами со сходным гидропатическим индексом или показателем, сохраняя при этом сходную биологическую активность. При осуществлении изменений на основании гидропатического индекса согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи гидропатические индексы находятся в пределах ±2. Согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи гидропатические индексы
находятся в пределах ±1, и согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи гидропатические индексы находятся в пределах ±0,5.
В настоящей области техники также понятно, что замену сходных аминокислот можно эффективно осуществить с учетом гидрофильности, в частности, когда биологически функциональное пептитело или пептид, созданный таким образом, предусмотрен для применения в иммунологических вариантах осуществления, как в настоящем случае. Согласно определенным вариантам осуществления наибольшая локальная средняя гидрофильность белка, обеспеченная гидрофильностью его смежных аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическим свойством белка.
Следующие значения гидрофильности были присвоены указанным аминокислотным остаткам: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0 ±1); глутамат (+3,0 ± 1); серии (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5 ± 1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (3,4). При осуществлении изменений на основании сходных значений гидрофильности согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах ±2, согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах ±1, и согласно определенным вариантам осуществления предусмотрена замена аминокислот, чьи значения гидрофильности находятся в пределах ±0,5. Кроме того, можно идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей на основании гидрофильности. Указанные области также называются "эпитопные коровые области".
Иллюстративные аминокислотные замены представлены в таблице А ниже.
Таблица А: Аминокислотные замены
Исходные Иллюстративные замены Предпочтительные
His
Asn, Gin, Lys, Arg
Arg
Leu, Val, Met, Ala, Phe, норлейцин
Leu
Leu
Норлейцин, He, Val, Met, Ala, Phe
Lys
Arg, 1,4 диамино-масляная кислота,
Arg
Gin, Asn
Met
Leu, Phe, He
Leu
Phe
Leu, Val, He, Ala, Tyr
Leu
Pro
Ala
Gly
Ser
Thr, Ala, Cys
Thr
Thr
Ser
Ser
Trp
Tyr, Phe
Tyr
Tyr
Trp, Phe, Thr, Ser
Phe
Val
He, Met, Leu, Phe, Ala, норлейцин
Leu
Специалист в настоящей области техники сможет получить варианты пептидов и пептител согласно настоящему изобретению с помощью случайной замены, например, и исследования полученного пептида или пептитела в отношении связывающей активности с использованием описанных в настоящем документе анализов.
Кроме того, специалист в настоящей области техники сможет изучить структурно-функциональные исследования или трехмерный структурный анализ для идентификации остатков в сходных полипептидах, которые являются важными для активности или структуры. Принимая во внимание такое сравнение, можно сделать предположение о важности аминокислотных остатков в белке, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые важны для активности или структуры в сходных белках. Специалист в настоящей области техники сможет сделать выбор в пользу химически сходных аминокислотных замен для таких предположительно важных аминокислотных остатков. Затем варианты могут быть подвергнуты скринингу с использованием описанных в настоящем документе анализов активности.
Ряд научных публикаций были посвящены прогнозированию вторичной структуры. Смотрите Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou et al, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou et al, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou et al, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45-148 (1978); Chou et al, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 и Chou et al, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Более того, в настоящее время доступны компьютерные программы, которые помогают осуществить прогноз вторичной структуры. Один способ прогнозирования вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, которые характеризуются идентичностью последовательности больше чем 30% или сходством,
составляющим больше чем 40%, часто характеризуются сходными структурными топологиями. Недавний рост баз данных белковых структур (PDB) обеспечил повышенную прогнозируемость вторичной структуры, включая в себя потенциальное количество укладок в пределах белковой структуры. Смотрите Holm et al, Nucl. Acid. Res., 27(l):244-247 (1999). Существует предположение (Brenner et al, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)), что в конкретном белке существует ограниченное количество укладок и что как только критическое число структур будет выявлено, структурное прогнозирование станет намного более точным.
Дополнительные способы прогнозирования вторичной структуры включают в себя способ "протягивания" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3):377-87 (1997); Sippl et al, Structure, 4(1): 15-19 (1996)), способ "профильного анализа" (Bowie et al, Science, 253:164-170 (1991); Gribskov et al, Meth. Enzym., 183:146-159 (1990); Gribskov et al, Proc. Nat. Acad. Set, 84(13):4355-4358 (1987)) и способ "эволюционной связи" (смотрите Holm, ранее (1999), и Brenner, ранее (1997)).
Согласно определенным вариантам осуществления варианты пептида или пептитела включают в себя гликозилированные варианты, в которых один или несколько сайтов гликозилирования, такие как N-связанный сайт гликозилирования, были добавлены к пептителу. N-связанный сайт гликозилирования характеризуется последовательностью: Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный как X, может представлять собой любой аминокислотный остаток за исключением пролина. Замена или добавление аминокислотных остатков для создания указанной последовательности обеспечивает потенциально новый сайт для добавления N-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые удаляют указанную последовательность, будут удалять существующую N-связанную углеводную цепь. Также предусмотрена реаранжировка N-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования (как правило, сайты, которые встречаются в природе) устраняются и один или несколько новых N-связанных сайтов создаются.
Производные
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены "производные" пептидов или пептител согласно настоящему изобретению. Используемый в настоящем документе термин "производное" относится к модификациям, отличным от вставок, делеций или замен аминокислотных остатков или в дополнение к ним, которые
сохраняют способность связываться с миостатином. Согласно одному варианту осуществления антагонист миостатина конъюгирован с дополнительным соединением.
Предпочтительно, чтобы модификации, произведенные в пептидах согласно настоящему изобретению для получения производных, были ковалентными по природе и включали в себя, например, химическую связь с полимерами, липидами, другими органическими и неорганическими фрагментами. Производные согласно настоящему изобретению могут быть получены для увеличения периода полувыведения пептитела из крови или могут быть разработаны для улучшения способности нацеленного воздействия пептитела на требуемые клетки, ткани или органы.
Настоящее изобретение дополнительно предусматривает связывающие средства - производные, ковалентно модифицированные так, чтобы включать в себя прикрепления одного или нескольких водорастворимых полимеров, таких как полиэтиленгликоль, полиоксиэтиленгликоль или полипропиленгликоль, описанные в патентах США №№ 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 и 4179337. Другие применимые полимеры, известные в настоящей области техники, включают в себя монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу или другие углеводные полимеры, сополимер N-винилпирролидона и полиэтиленгликоля, гомополимеры пропиленгликоль, сополимер полипропиленоксида и этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин) и поливиниловый спирт, а также смеси указанных полимеров. Особенно предпочтительными являются пептитела, ковалентно модифицированные с помощью субъединиц полиэтиленгликоля (ПЭГ). Водорастворимые полимеры могут быть связаны в конкретных положениях, например, на амино-конце пептител, или могут быть случайно прикрепленными к одной или нескольким боковым цепям полипептида. Применение ПЭГ для улучшения терапевтической способности связывающих средств, например, пептител, и особенно для гуманизированных антител, описано в патенте США № 6133426, выданном Gonzales с соавт. 17 октября 2000 г.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрена дериватизация пептидной части и/или части инертного носителя миостатинсвязывающих средств. Такие производные могут улучшать растворимость, абсорбцию, период биологического полувыведения и подобные свойства соединений. Фрагменты могут альтернативно устранять или ослаблять любой нежелательный побочный эффект соединений и подобное. Иллюстративные производные включают в себя соединения, в которых:
1. Производное или некоторая его часть является циклической. Например, пептидная часть может быть модифицирована так, чтобы содержать два или больше остатков Cys (например, в линкере), которые будут циклизироваться путем образования дисульфидной связи.
2. Производное является перекрестно сшитым или предоставлено способным к перекрестным сшивкам между молекулами. Например, пептидная часть может быть модифицирована так, чтобы содержать один остаток Cys и благодаря этому она способна образовывать межмолекулярную дисульфидную связь с подобной молекулой. Производное также может быть перекресно сшито посредством своего С-конца.
3. Одно или несколько пептидил [-C(0)NR-] соединений (связей) замещены непептидильной связью. Иллюстративные непептидильные связи представляют собой -СН2-карбамат [-CH2-OC(0)NR-], фосфонат, -СН2-сульфонамид [-CH2-S(0)2NR-], мочевина [-NHC(0)NH-], -СН2-вторичный амин и алкилированный [-C(0)NR6-, где R6 представляет собой низший алкил].
4. N-конец является дериватизированным. Как правило, N-конец может быть ацилирован или модифицирован до замещенного амина. Иллюстративные N-концевые группы производных включают в себя -NRRi (отличный от -NH2), -NRC(0)Ri, -NRC(0)ORb -NRS(0)2Rb -NHC(0)NHRb сукцинимид или бензилоксикарбонил-NH-(CBZ-NH-), где каждый из R и Ri независимо представляет собой водород или низший алкил и где фенильное кольцо может быть замещено 1-3 заместителями, выбранными из группы, состоящей из С1-С4 алкила, С1-С4 алкокси, хлора и брома.
5. Свободный С-конец является дериватизированным. Как правило, С-конец является эстерифицированным или амидированным. Например, можно использовать способы, описанные в настоящей области техники, для добавления (NH-CH2-CH2-NH2)2 к соединениям согласно настоящему изобретению на С-конце. Аналогично, можно использовать способы, описанные в настоящей области техники, для добавления -NH2, (или "кэппирования" с помощью группы -NH2) к соединениям согласно настоящему изобретению на С-конце. Иллюстративные С-концевые группы производных включают в себя, например, -C(0)R2, где R2 представляет собой низший алкокси или -NR3R4, где R3 и R4 независимо представляют собой водород или Ci-Cg алкил (предпочтительно Ci-С4 алкил).
6. Дисульфидная связь замещена другим, предпочтительно более стабильным, перекрестно-сшивающим фрагментом (например, алкиленом). Смотрите, например,
1.
Bhatnagar et al, J Med Chem 39: 3814-9 (1996), Alberts et al, Thirteenth Am Pep Symp, 357-9 (1993).
7. Один или несколько отдельных аминокислотных остатков являются модифицированными. Различные дериватизирующие средства известны для осуществления реакции специфически с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками, как описано подробно ниже.
Остатки лизинила и амино-концевые остатки могут реагировать с ангидридами янтарной или другой карбоновой кислоты, которые изменяют на противоположный заряд остатков лизинила. Другие подходящие реагенты для дериватизации альфа-амино-содержащих остатков включают в себя такие сложные имидоэфиры, как метилпиколинимидат; пиридоксалфосфат; пиридоксал; хлорборогидрид; тринитробензолсульфоновую кислоту; О-метилизомочевину; 2,4-пентандион; и катализируемую трансаминазой реакцию с глиоксилатом.
Остатки аргинила могут быть модифицированы путем реакции с любым одним или комбинацией нескольких общепринятых реагентов, включая в себя фенилглиоксал, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион и нингидрин. Дериватизация аргинильных остатков требует, чтобы реакция была проведена в щелочных условиях из-за высокого значения рКа гуанидиновой функциональной группы. Более того, указанные реагенты могут реагировать с группами лизина, а также эпсилон-аминогруппой аргинина.
Специфическая модификация тирозильных остатков была широко изучена, уделяя особый интерес введению спектральных меток в тирозильные остатки с помощью реакции с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Чаще всего N-ацетилимидазол и тетранитрометан используются для образования соединений О-ацетилтирозила и 3-нитропроизводных, соответственно.
Группы карбоксильных боковых цепей (аспартил или глутамил) могут быть селективно модифицированы с помощью реакции с карбодиимидами (R'-N=C=N-R'), такими как 1-циклогексил-3-(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1-этил-3-(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Более того, остатки аспартила и глутамила могут превращаться в остатки аспарагинила и глутаминила путем реакции с ионами аммония.
Остатки глутаминила и аспарагинила могут быть деамидированы до соответствующих остатков глутамила и аспартила. Альтернативно, указанные остатки деамидируют при слабокислотных условиях. Любая форма указанных остатков попадает в пределы объема настоящего изобретения.
Остатки цистеинила могут быть замещены аминокислотными остатками или другими фрагментами либо для устранения дисульфидных связей, либо наоборот для стабилизации перекрестной сшивки. Смотрите, например, Bhatnagar et al., {ранее).
Дериватизация с помощью бифункциональных средств применима для перекрестного сшивания пептидов или их функциональных производных с нерастворимой в воде матрице-подложке или с другими макромолекулярными инертными носителями. Часто используемые перекрестно-сшивающие средства включают в себя, например, 1,1-бис(диазоацетил)-2-фенилэтан, глутаральдегид, сложные эфиры N-гидроксисукцинимида, например, сложные эфиры с 4-азидосалициловой кислотой, гомобифункциональные сложные имидоэфиры, включая в себя такие сложные эфиры дисукцинимидила, как 3,3'-дитиобис(сукцинимидилпропионат), и такие бифункциональные малеимиды, как бис-гЧ-малеимидо-1,8-октан. Такие дериватизирующие средства, как метил-3-[(р-азидофенил)дитио]пропиоимидат, дают в результате фотоактивируемые промежуточные соединения, которые способны формировать перекрестные сшивки под действием света. Альтернативно, такие реакционноспособные нерастворимые в воде матрицы, как цианогенные активированные бромидом углеводы и реакцинноспособные субстраты, описанные в патентах США №№ 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537 и 4330440, используются для иммобилизации белков.
Углеводные (олигосахаридные) группы могут быть традиционно прикреплены к сайтам, которые, как известно, представляют собой сайты гликозилирования в белках. Как правило, О-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам серина (Ser) или треонина (Thr), тогда как N-связанные олигосахариды прикрепляются к остаткам аспарагина (Asn), когда они являются частью последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может представлять собой любую аминокислоту за исключением пролина. X представляет собой предпочтительно одну из 19 встречающихся в природе аминокислот, отличных от пролина. Структуры N-связанных и О-связанных олигосахаридов и остатков Сахаров, обнаруженных в каждом типе, являются различными. Один тип сахара, который часто встречается на обоих, представляет собой N-ацетилнейраминовую кислоту (имеющую название сиаловая кислота). Сиаловая кислота представляет собой, как правило, концевой остаток как N-связанных, так и О-связанных олигосахаридов и благодаря своему отрицательному заряду может придавать гликозилироанному соединению кислотные свойства. Такой(ие) сайт(ы) могут быть введены в линкер соединений согласно настоящему изобретению, и они
предпочтительно гликозилируются клеткой во время рекомбинантной продукции полипептидных соединений (например, в клетках млекопитающих, таких как СНО, ВНК, COS). Тем не менее, такие сайты могут дополнительно быть гликозилированы с помощью синтетических или полусинтетических процедур, известных в настоящей области техники.
Другие возможные модификации включают в себя гидроксилирование пролина и лизина, фосфорилирование гидроксильных групп остатков серила или треонила, окисление атома серы в Cys, метилирование альфа-аминогрупп боковых цепей лизина, аргинина и гистидина [смотрите, например, Creighton, Proteins: Structure and Molecule Properties (W. H. Freeman & Co., San Francisco), pp. 79-86 (1983)].
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть также изменены на уровне ДНК. Последовательность ДНК любой части соединения может быть изменена до кодонов, более совместимых с выбранной клеткой-хозяином. Для Е. coli, которая представляет собой предпочтительную клетку-хозяина, в настоящей области техники известны оптимизированные кодоны. Кодоны могут быть замещены для устранения сайтов рестрикции или для введения молчащих сайтов рестрикции, которые могут содействовать в процессинге ДНК в выбранной клетке-хозяине. Последовательности ДНК инертного носителя, линкера и пептида могут быть модифицированы для введения любого из вышеупомянутых изменений последовательности.
Также предусмотрены дополнительные производные включают в себя непептидные аналоги, которые обеспечивают стабилизированную структуру или уменьшенное биоразложение. Аналоги пептидных миметиков можно получить на основании выбранного ингибирующего пептида путем замещения одного или нескольких остатков непептидными фрагментами. Предпочтительно, чтобы непептидные фрагменты обеспечивали сохранение пептидом своей естественной конформации или стабилизировали предпочтительную, например, биоактивную, конформацию, которая сохраняет способность распознавать и связывать миостатин. Согласно одному аспекту полученный аналог/миметик проявляет повышенную аффинность связывания в отношении миостатина. Один пример способов получения непептидных аналогов - миметиков из пептидов описан в Nachman et al., Regul Pept 57:359-370 (1995). При необходимости пептиды согласно настоящему изобретению могут быть модифицированы, например, с помощью гликозилирования, амидирования, карбоксилирования или фосфорилирования или путем создания солей присоединения кислоты, амидов, сложных эфиров, в частности С-концевых сложных эфиров, и N
ацильных производных пептидов согласно настоящему изобретению. Пептитела также могут быть модифицированы для создания пептидных производных путем образования ковалентных или нековалентных комплексов с другими фрагментами. Ковалентно связанные комплексы можно получить путем соединения химических фрагментов с функциональными группами на боковых цепях аминокислот, содержащих пептитела, или на N- или С-конце.
В частности, предполагают, что пептиды могут быть конъюгированы с репортерной группой, включая в себя без ограничения радиоактивную метку, флуоресцентную метку, фермент (например, который катализирует колориметрическую или флуорометрическую реакцию), субстрат, твердую матрицу или носитель (например, биотин или авидин). В настоящем изобретении соответственно предусмотрена молекула, содержащая молекулу пептитела, причем молекула предпочтительно дополнительно содержит репортерную группу, выбранную из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуоресцентной метки, фермента, субстрата, твердой матрицы и носителя. Такие метки хорошо известны специалистам в настоящей области техники, например, в частности, предусмотрены биотиновые метки. Применение таких меток хорошо известно специалистам в настоящей области техники и описано, например, в патентах США№№ 3817837; 3850752; 3996345 и 4277437. Другие применимые метки включают в себя без ограничения радиоактивные метки, флуоресцентные метки и хемилюминесцентные метки. Патенты США, относящиеся к применению таких меток, включают в себя, например, патенты США №№ 3817837; 3850752; 3939350 и 3996345. Любое из пептител согласно настоящему изобретению может содержать одну, две или больше любых из указанных меток.
Способы получения пептидов и пептител
Описанные в настоящем документе агонисты миостатина и пептиды можно получить с использованием широкого разнообразия техник, известных в настоящей области техники. Согласно одному варианту осуществления агонист миостатина получают с использованием способа, описанного в примере 17 ниже.
Пептиды можно синтезировать в растворе или на твердой подложке в соответствии с общепринятыми техниками. Различные автоматизированные установки для синтеза являются коммерчески доступными и могут быть использованы в соответствии с известными протоколами. Смотрите, например, Stewart and Young (supra); Tam et al, J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press,
New York, 1-284; Barany et al, Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987); и патент США № 5424398, каждый из которых включен в настоящий документ посредством ссылки.
В способах твердофазного пептидного синтеза используются сополимер стирола и дивинилбензола, содержащий 0,1-1,0 мМ аминов/г полимера. В указанных способах пептидного синтеза используется прикрепление защитных групп бутилоксикарбонил (t-ВОС) или 9-фторенилметилокси-карбонил (FMOC) к альфа-аминогруппам. Оба способа включают в себя поэтапные синтезы, посредством которых отдельную аминокислоту добавляют на каждой стадии, начиная с С-конца пептида (смотрите, Coligan et al, Curr Prot Immunol, Wiley Interscience, 1991, Unit 9). По завершению химического синтеза синтетический пептид может быть подвергнут снятию защитных групп для удаления аминокислотных блокирующих групп t-BOC или FMOC и может быть отщеплен от полимера путем обработки кислотой при пониженной температуре (например, жидкий HF-10% анизол в течение приблизительно 0,25 - приблизительно 1 ч при 0°С). После испарения реагентов пептиды экстрагируют из полимера с помощью 1% раствора уксусной кислоты и затем лиофилизируют с получением сырого материала. Его обычно можно очистить с помощью таких техник, как гель-фильтрация на колонке Sephadex G-15 с использованием 5% уксусной кислоты в качестве растворителя. Лиофилизация соответствующих фракций колонки даст на выходе гомогенные пептиды или пептидные производные, характеристики которых затем можно определить с помощью таких стандартных техник, как анализ аминокислот, тонкослойная хроматография, высокоэффективная жидкостная хроматография, абсорбционная спектроскопия в ультрафиолетовом диапазоне, молярное вращение, растворимость, и количественно определить с помощью твердофазного расщепления по Эдману.
Техники фагового дисплея могут быть особенно эффективными в идентификации пептидов согласно настоящему изобретению, описанных выше. Кратко, получают фаговую библиотеку (с использованием, например, ml 13, fd или лямбда-фага), представляющую вставки 4 - приблизительно 80 аминокислотных остатков. Вставки могут представлять собой, например, полностью вырожденный или смещенный набор. Выбирали содержащие фаг вставки, которые связываются с требуемым антигеном, и этот процесс повторяли в течение нескольких раундов повторной селекции фага, который связывается с требуемым антигеном. Секвенирование ДНК проводят для идентификации последовательностей экспрессированных пептидов. Минимальный линейный участок последовательности,
которая связывается с требуемым антигеном, можно определить таким способом. Процедуру можно повторить с использованием смещенной библиотеки, содержащей вставки, содержащие часть или весь минимальный линейный участок вместе с одним или несколькими дополнительными вырожденными остатками выше или ниже него относительно хода транскрипции. Указанные техники могут идентифицировать пептиды согласно настоящему изобретению с большей аффинностью связывания в отношении миостатина, чем средства, уже идентифицированные в настоящем документе.
Независимо от способа получения пептидов, молекула нуклеиновой кислота, кодирующая каждый такой пептид, может быть получена с использованием стандартных процедур рекомбинантной ДНК. С нуклеотидной последовательностью таких молекул можно обращаться соответствующим образом без изменения аминокислотной последовательности, которую она кодирует, для учета вырожденности кода нуклеиновой кислоты, а также для учета предпочтительного использования кодона в конкретных клетках-хозяевах.
Согласно настоящему изобретению также предусмотрены нуклеиновой кислоты, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие пептиды и пептитела согласно настоящему изобретению. Указанные молекулы нуклеиновой кислоты включают в себя векторы и конструкты, содержащие полинуклеотиды, кодирующие пептиды и пептитела согласно настоящему изобретению, а также варианты и производные пептидов и пептител. Иллюстративные молекулы нуклеиновой кислоты предусмотрены в примерах ниже.
Техники рекомбинантной ДНК также обеспечивают удобный способ получения полноразмерных пептител и других больших полипептидных связывающих средств согласно настоящему изобретению или их фрагментов. Полинуклеотид, кодирующий пептитело или фрагмент, может быть вставлен в экспрессионный вектор, который в свою очередь может быть введен в клетку-хозяина для продукции связывающих средств согласно настоящему изобретению. Получение иллюстративных пептител согласно настоящему изобретению описано в примере 2 ниже.
Разнообразные системы экспрессионных векторов/хозяев можно использовать для экспрессии пептидов и пептител согласно настоящему изобретению. Указанные системы включают в себя без ограничения следующее: микроорганизмы, такие как бактерии, трансформированные рекомбинантного бактериофага, экспрессионные векторы - плазмидные или космидные ДНК; дрожжи, трансформированные
дрожжевыми экспрессионными векторами; системы клеток насекомых, инфицированных вирусными экспрессионными векторами (например, бакуловирусом); системы растительных клеток, трансфектированных вирусными экспрессионными векторами (например, вирус мозаики цветной капусты, CaMV; вирус табачной мозаики, TMV) или трансформированные с помощью бактериальных экспрессионных векторов (например, плазмида Ti или pBR322); или системы клеток животных. Одна предпочтительная клеточная линия - хозяин представляет собой штамм E.coli 2596 (№ АТСС 202174), используемый для экспрессии пептител, описанных ниже в примере 2. Клетки млекопитающего, которые применимы в получении рекомбинантных белков, включают в себя без ограничения клетки VERO, клетки HeLa, клеточные линии яичника китайского хомячка (СНО), клетки COS (такие как COS-7), клетки W138, ВНК, HepG2, ЗТЗ, RIN, MDCK, А549, PC 12, К562 и 293.
Термин "экспрессионный вектор" относится к плазмиде, фагу, вирусу или вектору для экспрессии полипептида из полинуклеотидной последовательности. Экспрессионный вектор может содержать единицу транскрипции, содержащую совокупность (1) генетического элемента или элементов с регуляторной ролью в генной экспрессии, например, промоторы или энхансеры, (2) структурной последовательности, которая кодирует связывающее средство, которое транскрибируется в иРНК и транслируется в белок, и (3) соответствующих последовательностей инициации и терминации транскрипции. Структурные единицы, предусмотренные для применения в дрожжевых или эукариотических экспрессионных системах, предпочтительно включают в себя лидерную последовательность, обеспечивающую возможность внеклеточной секреции траслированного белка клеткой - хозяином. Альтернативно, если рекомбинантный белок экспрессируется без лидерной или транспортной последовательности, он может включать в себя амино-концевой остаток метионила. Указанный остаток может быть впоследствии отщеплен или не отщеплен от экспрессированного рекомбинантного белка с получением конечного пептидного продукта.
Например, пептиды и пептитела могут быть рекомбинантно экспрессированы в дрожжах с использованием коммерчески доступной экспрессионной системы, например, Pichia Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), согласно инструкциям производителя. Указанная система также основана на пре-про-альфа-последовательности для управления секрецией, но транскрипция вставки управляется промотором алкогольоксидазы (АОХ1) при индукции метанолом. Секретированный
пептид очищают от дрожжевой ростовой среды с использованием способов, используемых для очистки пептида от супернатантов клеток бактерий и млекопитающих.
Альтернативно, кДНК, кодирующую пептиды и пептитела, можно клонировать в бакуловирусный экспрессионный вектор pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Этот вектор можно использовать согласно указаниям производителя (PharMingen) для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda в не содержащей белок sF9 среде и для получения рекомбинантного белка. Рекомбинантный белок можно очистить и концентрировать из среды с использованием гепарин-сефарозной колонки (Pharmacia).
Альтернативно, пептид или пептитело может быть экспрессировано в системе клеток насекомых. Системы клеток насекомых для экспрессии белка хорошо известны специалистам в настоящей области техники. В одной такой системе вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) можно использовать в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов в клетках Spodoptera frugiperda или в личинках Trichoplusia. Кодирующая пептид последовательность может быть клонирована во вспомогательную область вируса, такую как ген полиэдрина, и помещена под контроль промотора полиэдрина. Успешная вставка пептида будет делать ген полиэдрина неактивным и производить рекомбинантный вирус, у которого отсутствует белок оболочки. Рекомбинантные вирусы можно использовать для инфицирования клеток S. frugiperda или личинок Trichoplusia, в которых экспрессируется пептид (Smith et al, J Virol 46: 584 (1983); Engelhard et al, Proc Nat Acad Sci (USA) 91: 3224-7 (1994)).
Согласно другому примеру последовательность ДНК, кодирующая пептид, может быть амплифицирована с помощью ПНР и клонирована в соответствующий вектор, например, pGEX-3X (Pharmacia). Вектор pGEX разработан для получения белка слияния, содержащего глутатион-8-трансферазу (GST), кодируемую вектором, и белок, кодируемый фрагментом ДНК, вставленным в клонирующий сайт вектора. Праймеры для ПЦР могут быть созданы, чтобы включать в себя, например, соответствующий сайт расщепления. Если фрагмент слияния используется исключительно для облегчения экспрессии или является иным образом нежелательным в качестве прикрепления к представляющему интерес пептиду, рекомбинантный белок слияния может быть впоследствии отщеплен от части GST белка слияния. Конструкт pGEX-ЗХ/конкретное связывающее средство - пептид трансформируют в клетки XL-1 Blue Е. coli (Stratagene, La Jolla CA), и отдельные трансформанты выделяют и выращивают. Плазмидная ДНК из отдельных трансформантов может быть очищена и частично секвенирована с
использованием автоматизированного секвенатора для подтверждения присутствия требуемой вставки кодирующей конкретное связывающее средство нуклеиновой кислоты в правильной ориентации.
Белок слияния, который можно получить в виде нерастворимого тельца включения в бактериях, можно очистить следующим образом. Клетки-хозяева собирают путем центрифугирования; отмывают в 0,15 М NaCl, 10 мМ трисе, рН 8, 1 мМ EDTA; и обрабатывают с помощью 0,1 мг/мл лизозима (Sigma, St. Louis, МО) в течение 15 минут при комнатной температуре. Лизат можно сделать прозрачным с помощью обработки ультразвуком, и клеточный детрит можно осадить с помощью центрифугирования в течение 10 минут при 12000 X g. Содержащий белок слияния осадок можно ресуспендировать в 50 мМ трисе, рН 8 и 10 мМ EDTA, нанести слоем на 50% глицерин и центрифугировать в течение 30 мин при 6000 X g. Осадок можно ресуспендировать в раствор стандартного фосфатно-солевого буфера (PBS), не содержащего Mg++ и Са++. Белок слияния можно дополнительно очистить с помощью фракционирования ресуспендированного осадка в денатурирующем SDS-PAGE (Sambrook et al, ранее). Гель можно смочить в 0,4 М КС1 для визуализации белка, который можно вырезать и электроэлюировать в гелевом подвижном буфере, не содержащем SDS. Если GST/белок слияния получают в бактериях в виде растворимого белка, его можно очистить с использованием модуля для очистки GST Purification Module (Pharmacia).
Белок слияния можно подвергнуть обработке для отщепления GST от пептида согласно настоящему изобретению. Реакцию обработки (20-40 мг белка слияния, 20-30 единиц тромбина человека (4000 Ед/мг, Sigma) в 0,5 мл PBS можно инкубировать 16-48 часов при комнатной температуре и загрузить на денатурирующий гель SDS-PAGE для фракционирования продуктов реакции. Гель можно смочить в 0,4 М КС1 для визуализации полос белка. Идентичность полосы белка, соответствующей прогнозируемой молекулярной массе пептида, можно подтвердить с помощью анализа аминокислотной последовательности с использованием автоматизированного секвенатора (Applied Biosystems Model 473А, Foster City, CA). Альтернативно, идентичность можно подтвердить путем проведения ВЭЖХ и/или масс-спектрометрии пептидов.
Альтернативно, последовательность ДНК, кодирующую пептид, можно клонировать в плазмиду, содержащую требуемый промотор и необязательно лидерную последовательность (Better et al., Science 240:1041-43 (1988)). Последовательность
указанного конструкта можно подтвердить с помощью автоматизированного секвенирования. Плазмиду затем можно трансформировать в штамм МС1061?. coli с использованием стандартных процедур, в которых используются инкубация в СаСЬ и обработка бактерий тепловым шоком (Sambrook et al, ранее). Трансформированные бактерии можно выращивать в среде LB, дополненной карбенициллином, и продукцию экспрессированного белка можно индуцировать выращиванием в подходящей среде. Если лидерная последовательность присутствует, она может осуществлять секрецию пептида и может отщепляться в ходе секреции.
Относящиеся к млекопитающим системы - хозяева для экспрессии рекомбинантных пептидов и пептител хорошо известны специалистам в настоящей области техники. Штаммы клеток -хозяева можно выбрать для конкретной способности процессировать экспрессированный белок или производить определенные посттрансляционные модификации, которые будут пригодными в обеспечении активности белка. Такие модификации белка включают в себя без ограничения ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование, фосфорилирование, липидизацию и ацилирование. Различные клетки - хозяева, такие как СНО, HeLa, MDCK, 293, WI38 и подобное, содержат специфический клеточный аппарат и характеризуются определенными механизмами для таких посттрансляционных активностей и могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга введенного чужеродного белка.
Предпочтительно, чтобы трансформированные клетки можно было использовать для длительной высокоэффективной продукции белка. После того, как такие клетки трансформируют векторами, которые содержат селектируемые маркеры, а также требуемую экспрессионную кассету, клетки оставляют расти в течение 1-2 дней в обогащенных средах перед тем, как их переключают на селективные среды. Селектируемый маркер разрабатывают для обеспечения роста и выделения клеток, которые успешно экспрессируют введенную последовательности. Устойчивые скопления стабильно трансформированных клеток могут пролиферировать с использованием техник тканевой культуры, соответствующих используемой клеточной линии.
Ряд систем селекции можно использовать для выделения клеток, которые были трансформированы для продукции рекомбинантного белка. Такие системы селекции включают в себя без ограничения гены тимидинкиназы HSV, гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы и аденинфосфорибозилтрансферазы, в клетках tk,
hgprt или aprt, соответственно. Также, устойчивость к метаболитам можно использовать в качестве основы для селекции в отношении dhfr, который обеспечивает устойчивость к метотрексату; gpt, который обеспечивает устойчивость к микофенольной кислоте; пео, который обеспечивает устойчивость к аминогликозиду G418 и обеспечивает устойчивость к хлорсульфурону; и hygro, который обеспечивает устойчивость к гигромицину. Дополнительные селектируемые гены, которые можно применять, включают в себя trpB, который позволяет клеткам использовать индол вместо триптофана, или hisD, который позволяет клеткам использовать гистинол вместо гистидина. Маркеры, которые дают визуальную индикацию для идентификации трансформантов, включают в себя антоцианины, В-глюкуронидазы и его субстрат, GUS, и люциферазу и ее субстрат, люциферин.
Очищение и рефолдинг связывающих средств
В некоторых случаях агонисты миостатина, например, связывающие средства, такие как пептиды и/или пептитела согласно настоящему изобретению могут нуждаться в "рефолдинге" и окислении в правильную третичную структуру и образовании дисульфидных связей, чтобы стать биологически активнами. Согласно одному варианту осуществления агонист миостатина очищают и подвергают рефолдингу с использованием способа, описанного в примере 17 ниже.
Рефолдинг можно осуществить с использованием ряда процедур, хорошо известных в настоящей области техники. Такие способы включают в себя, например, воздействие солюбилизированного полипептидного средства до рН, как правило, выше 7 в присутствии хаотропного средства. Выбор хаотропа аналогичен выборам, используемым для солюбилизации телец включения; тем не менее, хаотроп, как правило, используют в более низкой концентрации. Иллюстративные хаотропные средства представляют собой гуанидин и мочевину. В большинстве случаев раствор для рефолдинга/окисления также будет содержать восстановитель вместе со своей окисленной формой в конкретном соотношении для получения конкретного окислительно-восстановительного потенциала, который обеспечивает возможность для того, чтобы произошла дисульфидная перетасовка для образования цистеиновых мостиков. Некоторые часто используемые окислительно-восстановительные пары включают в себя цистеин/цистамин, глутатион/дитиобис-GSH, хлорид меди, дитиотреитол-ОТТ/дитиан-ОТТ и 2-меркаптоэтанол-(ЬМЕ)/дитио-ЬМЕ. Во многих случаях сорастворитель можно использовать для повышения эффективности
рефолдинга. Часто используемые сорастворители включают в себя глицерин, полиэтиленгликоль различных молекулярных масс и аргинин.
Может быть желательным очистить пептиды и пептитела согласно настоящему изобретению. Техники очищения белков хорошо известны специалистам в настоящей области техники. Указанные техники включают в себя, на одном уровне, грубое фракционирование белковых и небелковых фракций. Отделив пептид и/или пептитело от других белков, представляющий интерес пептид или полипептид можно дополнительно очистить с использованием хроматографических и электрофоретических техник для достижения частичного или полного очищения (или очищения до гомогенности). Аналитические способы, особенно подходящие для получения пептител и пептидов согласно настоящему изобретению, представляют собой ионнообменную хроматографию, гель-фильтрацию; электрофорез в полиакриламидном геле; изоэлектрическое фокусирование. Особенно эффективный способ очищения пептидов представляет собой быструю белковую жидкостную хроматографию или даже ВЭЖХ.
Определенные аспекты настоящего изобретения относятся к очищению и согласно конкретным вариантам осуществления к существенному очищению пептитела или пептида согласно настоящему изобретению. Используемый в настоящем документе термин "очищенное пептитело или пептид" относится к композиции, выделяемой из других компонентов, в которой пептитело или пептид очищено до любой степени относительно своего встречающегося в природе состояния. Очищенный пептид или пептитело, следовательно, также относится к пептителу или пептиду, который не содержит элементов окружения, в котором его можно обнаружить в природе.
Как правило, "очищенный" будет относиться к композиции пептида или пептитела, которая была подвергнута фракционированию для удаления различных других компонентов, и указанная композиция по существу сохраняет свою выраженную биологическую активность. Если используется термин "по существу очищенный", это обозначение будет относиться к композиции пептида или пептитела, в которой пептитело или пептид образует основной компонент композиции, например, составляющий приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 95% или больше от белков в композиции.
Различные способы количественного определения степени очищения пептида или пептитела будут известными специалистам в настоящей области техники в свете
настоящего раскрытия. Они включают в себя, например, определение активности специфического связывания активной фракции или оценку количества пептида или пептитела во фракции с помощью анализа SDS/PAGE. Предпочтительный способ оценки чистоты фракции пептида или пептитела состоит в расчете связывающей активности фракции, сравнения ее со связывающей активностью исходного экстракта и, таким образом, расчета степени очищения, в настоящем документе оцениваемой по "-кратности значения очищения". Фактические единицы, используемые для представления количества связывающей активности, безусловно, будут зависеть от конкретной техники анализа, выбранной для оценки очищения и от того, проявляет ли или нет пептитело или пептид обнаруживаемую связывающую активность.
Различные техники, подходящие для применения в очищении, будут хорошо известны специалистам в настоящей области техники. Они включают в себя, например, осаждение в сульфате аммония, ПЭГ, антителах (иммунопреципитация) и подобное или с помощью тепловой денатурации с последующим центрифугированием; такие стадии хроматографии, как аффинная хроматография (например, с использованием комплекса белок-А-сефароза), ионообменная хроматографии, гель-фильтрация, хроматографии с обращенной фазой, гидроксилапатитная и аффинная хроматография; изоэлектрическое фокусирование; гель-эфлектрофорез; и комбинации таких и других техник. Как в общем известно в настоящей области техники, полагают, что порядок проведения различных стадий очищения может быть изменен или что определенные стадии можно опустить и все же получить в результате подходящий способ получения по существу очищенного связывающего средства.
Отсутствует общее требование, чтобы связывающие средства согласно настоящему изобретению всегда были предоставлены в своем наиболее очищенном состоянии. Фактически, предусмотрено, что менее существенно очищенные продукты связывающих средств будут находить применимость согласно определенным вариантам осуществления. Частичное очищение можно осуществить с использованием меньших стадий очищения в комбинации или с использованием различных форм одной и той же общей схемы очищения. Например, принято, что катионообменная колоночная хроматография, проведенная с использованием устройства ВЭЖХ, будет, как правило, давать в результате очищение большей "кратности", чем та же техник с использованием хроматографической системы пониженного давления. Способы, проявляющие пониженную степень относительного очищения, могут иметь
преимущества в общем выделении пептида или пептитела или в сохранении активности связывания пептида или пептитела.
Известно, что миграция пептида или полипептида может варьировать, иногда значительно, при различных условиях SDS/PAGE (Capaldi et al., Biochem Biophys Res Comm, 76: 425 (1977)). Следовательно, следует понимать, что при отличающихся условиях электрофореза, кажущиеся молекулярные массы очищенных или частично очищенных продуктов экспрессии связывающих средств могут варьировать.
Активность миостатинсвязывающих средств и других антагонистов Антагонисты, включая в себя связывающие средства, описанные в настоящем документе, можно исследовать в отношении их способности связываться с миостатином и ингибировать или блокировать активность миостатина. Любое число анализов или испытаний на животных можно использовать для определения способности средства ингибировать или блокировать активность миостатина. Некоторые анализы, используемые для определения характеристик пептидов и пептител согласно настоящему изобретению, описаны в примерах ниже. Один анализ представляет собой анализ С2С12 pMARE-luc, в котором используется чувствительная к миостатин клеточная линия (миобласты С2С12), трансфектированная с помощью репортерного вектора люциферазы, содержащего чувствительные к миостатину/активину элементы (MARE). Иллюстративные пептитела анализируют путем предварительной инкубации серии разведений пептител с миостатином и затем подвергая клетки воздействию инкубационной смеси. Определяют результирующую люциферазную активность и титрационную кривую строят из серии разведений пептител. Затем определяют значение IC50 (концентрация пептитела, необходимая для достижения 50% ингибирования активности миостатина, которую измеряют по люциферазной активности). Второй анализ, описанный ниже, представляет собой анализ BIAcore(r) для определения кинетических параметров ка (константа скорости ассоциации), kd (константа скорости диссоциации), и KD (равновесная константа диссоциации) для миостатинсвязывающих средств и других антагонистов, таких как антитела, способные связываться с миостатином и его рецептором. Пониженные равновесные константы диссоциации (KD, выраженные в нМ) указывают на большую аффинность пептитела к миостатину. Дополнительные анализы включают в себя блокирующие анализы, для определения того, нейтрализует ли такое связывающее средство, как пептитело (предотвращает связывание миостатина с его рецептором) или не нейтрализует (не предотвращает связывание миостатина с его рецептором); анализы
селективности, которые определяют связываются ли связывающие средства согласно настоящему изобретению селективно с миостатином, а не с определенными другими представителями семейства TGF-B; и анализы KinEx А(tm) или равновесные анализы с использованием растворов, которые также определяют KD И считаются более чувствительными в некоторых случаях. Указанные анализы описаны в примере 3.
На фигуре 1 показаны значения IC50 пептида по сравнению с IC50 пептитела из пептида. На фигуре продемонстрировано, что пептитело является значительно более эффективным при ингибировании активности миостатина, чем пептид отдельно. Кроме того, пептитела с созревшей аффинностью, как правило, проявляют улучшенные значения IC50 И KD ПО сравнению с исходными пептидами и пептителами. Значения IC50 для ряда иллюстративных пептител с созревшей аффинностью показаны в таблице VII в примере 7 ниже. Кроме того, в некоторых случаях создание 2х варианта пептитела, в котором два пептида прикреплены в тандеме, увеличивает активность пептитела как in vitro, так и in vivo.
In vivo активности продемонстрированы в примерах ниже. Активности связывающих средств включают в себя без ограничения увеличенная безжировая мышечная масса, увеличенная мышечная сила и уменьшенная жировая масса относительно общей массы тела в получивших лечение животных моделях. Активности in vivo, описанные в настоящем документе, дополнительно включают в себя ослабление истощения безжировой мышечной массы и силы в животных моделях, включая в себя модели гипогонадизма, ревматоидной кахексии, раковой кахексии и гиподинамии.
Способы лечения
Согласно настоящему изобретению предусмотрены способы и виды лечения кахексии у страдающих раком предстательной железы пациентов, подвергающихся андроген-депривационной терапии, путем введения терапевтического количества антагониста миостатина, например, связывающего средства, содержащего миостатинсвязывающий пептид согласно SEQ ID N0:311, например, пептитело, содержащее по меньшей мере один полипептид, состоящий из SEQ ID N0:635.
Используемый в настоящем документе термин "кахексия" относится к состоянию усиленной мышечной атрофии и потери безжировой массы тела в результате ряда заболеваний, таких как рак предстательной железы. Как показано в примерах ниже, такие антагонисты миостатина, как иллюстративные пептитела, описанные в настоящем документе, существенно увеличивают безжировую мышечную
массу, уменьшают жировую массу, изменяют соотношение мышечной массы к жировой и увеличивают мышечную силу.
Антагонисты миостатина также можно вводить профилактически для предотвращения мышечной атрофии и связанных с ней нарушений в будущем у нуждающегося в таком лечении субъекта.
Антагонисты миостатина согласно настоящему изобретению можно использовать отдельно или в комбинации с другими средствами для усиления их терапевтических эффектов или снижения потенциальных побочных эффектов.
Фармацевтические композиции
Согласно некоторым вариантам осуществления в способах согласно настоящему изобретению используется антагонист миостатина, который введен в состав фармацевтической композиции. Фармацевтическая композиция может включать в себя, например, буфер, антиоксидант, низкомолекулярную молекулу, лекарственное средство, белок, аминокислоту, углевод, липид, хелатирующее средство, стабилизатор или вспомогательное вещество. Согласно одному варианту осуществления антагонист миостатина введен в состав, содержащий 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс./объем) сахарозы, 0,004% (масс/объем) полисорбата 20, рН 4,75.
Такие композиции содержат терапевтически или профилактически эффективное количество одного или нескольких антагонистов миостатина в смеси с фармацевтически приемлемым средством. Фармацевтические композиции содержат антагонисты, которые ингибируют миостатин частично или полностью в смеси с фармацевтически приемлемым средством. Как правило, антагонисты будут достаточно очищены для введения субъекту.
Фармацевтическая композиция может содержать материалы состава для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проникновения композиции. Подходящие материалы состава включают в себя без ограничения аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); противомикробные средства; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты, другие органические кислоты); объемообразующие средства (такие как маннит или глицин), хелатирующие средства (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA)); комплексообразующие средства (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета
циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин); наполнители; моносахариды; дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как альбумин сыворотки, желатин или иммуноглобулины); красители; ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как хлорид бензалкония, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или пероксид водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиле нгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие средства; поверхностно-активные вещества или смачивающие средства (такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); усиливающий стабильность средства (сахароза или сорбит); усиливающий тоничность средства (такие как галогениды щелочных металлов (предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит); инертные носители для доставки; разбавители; вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990).
Оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в настоящей области техники в зависимости, например, от предусмотренного пути введения, формата доставки и требуемой дозировки. Смотрите например, Remington's Pharmaceutical Sciences, ранее. Такие композиции могут оказывать влияние на физическое состояние, стабильность, скорость in vivo высвобождения и скорость in vivo выведения связывающего средства.
Главный инертный носитель или носитель в фармацевтической композиции может быть либо водным, либо неводным по природе. Например, подходящий инертный носитель или носитель может представлять собой воду для инъекции, физиологический солевой раствор или искусственную спинномозговую жидкость, возможно дополненную другими материалами, часто используемыми в композициях для парентерального введения. Нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, представляют собой дополнительные иллюстративные инертные носители. Другие иллюстративные фармацевтические композиции содержат трис-буфер со значением рН приблизительно
7,0-8,5 или ацетатный буфер, со значением рН приблизительно 4,0-5,5, которые могут дополнительно включать в себя сорбит или его подходящий заменитель. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения содержащие связывающее средство композиции можно получить для хранения путем смешивания выбранной композиции с требуемой степенью чистоты с необязательными средствами для получения состава (Remington's Pharmaceutical Sciences, ранее) в форме лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, содержащий связывающее средство продукт можно ввести в состав в виде лиофилизата с использованием соответствующих вспомогательных веществ, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции можно выбрать для парентеральной доставки, например, подкожной. Альтернативно, композиции могут быть выбраны для ингаляции или для энтеральной доставки, например, доставки перорально, доставки через ухо, офтальмологически, ректально или вагинально. Получение таких фармацевтически приемлемых композиций находится в компетенции специалиста в настоящей области техники.
Компоненты состава присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для места введения. Например, буферы используются для поддержания физиологического рН или слегка пониженного рН, как правило, находятся в диапазоне рН, составляющем приблизительно 5 - приблизительно 8.
Если предусмотрено парентеральное введение, терапевтические композиции для применения согласно настоящему изобретению могут находиться в форме апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, содержащего требуемое связывающее средство в фармацевтически приемлемом инертном носителе. Особенно подходящий инертный носитель для парентеральной инъекции представляет собой стерильную дистиллированную воду, в которой связывающее средство введено в состав в виде стерильного, изотонического раствора, надлежащим образом сохраненного. Еще один препарат может включать в себя состав требуемой молекулы с таким средством, как инъекционные микросферы, биоразлагаемые частицы, полимерные соединения (полимолочная кислота, полигликолевая кислота), гранулы или липосомы, что обеспечивает контролируемое или замедленное высвобождение продукта, который затем может быть доставлен посредством инъекции замедленного всасывания. Также можно использовать гиалуроновую кислоту и это может давать эффект стимуляции пролонгированной длительности циркуляции. Другие подходящие
средства введения требуемой молекулы включают в себя имплантируемые устройства доставки лекарственного средства.
Согласно другому аспекту фармацевтические составы, подходящие для парентерального введения, могут быть составлены в водных растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнка, раствор Рингера или физиологически забуференный солевой раствор. Водные инъекционные суспензии могут содержать вещества, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит или декстран. Кроме того, суспензии активных соединений можно получить в виде соответствующих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или инертные носители включают в себя нелетучие масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Нелипидные поликатионные аминополимеры также можно использовать для доставки. Необязательно суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства для увеличения растворимости соединений и обеспечения получения высококонцентрированных растворов. Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция может быть введена в состав для ингаляции. Например, связывающее средство может быть введено в состав в виде сухого порошка для ингаляции. Ингаляционные растворы полипептида или молекулы нуклеиновой кислоты также могут быть введены в состав с пропеллентом для аэрозольной доставки. Согласно другому варианту осуществления растворы могут быть небулизированы. Пульмонарное введение дополнительно описано в заявке согласно РСТ № PCT/US94/001875, в которой описана пульмонарная доставка химически модифицированных белков.
Также предусмотрено, что определенные составы можно вводить перорально. Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения молекулы связывающего средства, которые вводят таким образом, могут быть введены в состав с указанными носителями, обычно используемыми в составлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы, или без них. Например, капсула может быть разработана для высвобождения активной части состава в месте в желудочно-кишечном тракте, когда биодоступность максимизирована, а пресистемное расщепление минимизировано. Дополнительные средства могут быть предусмотрены для облегчения абсорбции молекулы связывающего средства. Также можно использовать разбавители, ароматизаторы, воски с низкой температурой плавления,
растительные масла, способствующие скольжению средства, суспендирующие средства, способствующие распадаемости таблеток средства и связующие.
Фармацевтические композиции для перорального введения также могут быть введены в состав с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в настоящей области техники, в дозировках, подходящих для перорального введения. Такие носители обеспечивают введение фармацевтических композиций в состав в виде таблеток, микрогранул, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, вязких растворов, суспензий и подобного для приема пациентом внутрь.
Фармацевтические препараты для перорального применения можно получить посредством комбинации активных соединений с твердым вспомогательным веществом и обработки полученной смеси гранул (необязательно после помола) с получением таблеток или сердцевин драже. При необходимости можно добавить подходящие вспомогательные средства. Подходящие вспомогательные вещества включают в себя углеводные или белковые наполнители, такие как сахара, включая в себя лактозу, сахарозу, маннит и сорбит; крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза или карбоксиметилцеллюлоза натрия; камеди, включая в себя аравийскую и трагакантовую камедь; и белки, такие как желатин и коллаген. При необходимости можно добавить способствующие распадаемости или солюбилизирующие средства, такие как перекрестно-связанный поливинилпирролидон, агар и альгиновая кислота или ее соль, такая как альгинат натрия.
Сердцевины драже можно использовать совместно с подходящими оболочками, такими как концентрированные растворы Сахаров, которые также могут содержать гуммиарабик, тальк, поливинилпирроллидон, гель карбопол, полиэтиленгликоль и/или диоксид титана, растворы лака и подходящие органические растворители или смеси растворителей. Красители или пигменты можно добавлять к таблеткам или оболочкам драже для идентификации продукта или для определения характеристик количества активного соединения, т.е. дозировки.
Фармацевтические препараты, которые можно использовать перорально, также включают в себя твердые капсулы, изготовленные из желатина, а также мягкие, герметичные капсулы, изготовленные из желатина и оболочки, такой как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты, смешанные с наполнителями или связующими, такими как лактоза или крахмалы, способствующими скольжению средствами, такими как тальк или стеарат магния, и необязательно
стабилизаторами. В мягких капсулах активные соединения могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как нелетучие масла, жидкость или жидкий полиэтиленгликоль со стабилизаторами или без них.
Другая фармацевтическая композиция может содержать эффективное количество связывающего средства в смеси с нетоксическими вспомогательными веществами, которые являются подходящими для производства таблеток. Путем растворения таблеток в стерильной воде или другом подходящем инертном носителе, растворы можно получить в единичной лекарственной форме. Подходящие вспомогательные вещества включают в себя без ограничения инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактоза или фосфат кальция; или связывающие средства, такие как крахмал, желатин или аравийская камедь; или способствующие скольжению средства, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Дополнительные фармацевтические композиции станут очевидными специалистам в настоящей области техники, включая в себя составы, содержащие молекулы связывающего средства в составах замедленной или контролируемой доставки. Техники получения составов других разнообразных средств замедленной или контролируемой доставки, таких как носители - липосомы, биоразлагаемые микрочастицы или пористые гранулы и инъекции замедленного всасывания, также известны специалистам в настоящей области техники. Смотрите например, международную патентную заявку PCT/US93/00829, в которой раскрыто контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций. Дополнительные примеры препаратов замедленного высвобождения включают в себя полупроницаемые полимерные матрицы в форме профилированных изделий, например, пленок или микрокапсул. Матрицы замедленного высвобождения могут включать в себя сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919, европейский патент № ЕР 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (Sidman et al., Biopolymers, 22:547556 (1983), поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) (Langer et al., /. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech., 12:98-105(1982)), этиленвинилацетат (Langer et al., ранее) или поли-0(-)-3-гидроксимасляную кислоту (европейский патент № ЕР 133988). Композиции замедленного высвобождения также включают в себя липосомы, которые можно получить с помощью любого из нескольких способов,
известных в настоящей области техники. Смотрите, например, Eppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985); европейские патенты №№ ЕР 36676; ЕР 88046; ЕР 143949.
Фармацевтическая композиция, подлежащая применению для in vivo введения, как правило, должна быть стерильной. Это можно осуществить путем фильтрации через стерильные мембранные фильтры. Если композиция лиофилизирована, стерилизацию с использованием указанного способа можно проводить или до, или после лиофилизации и разведения. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизированной форме или в растворе. Кроме того, парентеральные композиции, как правило, помещают в контейнер со стерильным отверстием для доступа, например, пакет или флакон для внутривенного раствора с пробкой, поддающейся прокалыванию с помощью иглы для подкожных инъекций.
Как только фармацевтическая композиция введена в состав, ее могут хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие составы могут хранить или в готовой к применению форме или в форме (например, лиофилизированной), требующей разведения перед использованием.
Согласно конкретному варианту осуществления настоящее изобретение относится к наборам для получения единицы дозы для однократного введения. Каждый из наборов может содержать как первый контейнер, содержащий высушенный белок, и второй контейнер, содержащий водный состав. Также в объем настоящего изобретения включены наборы, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы для жидкостей и шприцы с лиофилизатом).
Дозировка
Эффективное количество фармацевтической композиции, подлежащей использованию в терапевтических целях, будет зависеть, например, от терапевтического контекста и целей. Специалисту в настоящей области техники будет понятно, что соответствующие уровни дозировки для лечения, таким образом, будут варьировать частично в зависимости от доставляемой молекулы, показания, для которого используется молекула связывающего средства, пути введения и размера (массы тела, площади поверхности тела или размера органа) и состояния (возраст и общее состояние здоровья) пациента. Соответственно, лечащий врач может титровать дозировку и модифицировать путь введения для получения оптимального терапевтического эффекта. Типичная дозировка может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1мг/кг вплоть до приблизительно 100 мг/кг или более в зависимости
от упомянутых выше факторов. Согласно другим вариантам осуществления дозировка может находиться в диапазоне от 0,1 мг/кг вплоть до приблизительно 100 мг/кг; или от 1 мг/кг вплоть до приблизительно 100 мг/кг; или от 5 мг/кг вплоть до приблизительно 100 мг/кг.
Согласно одному варианту осуществления способов лечения, описанных в настоящем документе, антагонист миостатина вводят в дозе, составляющей 0,01 - 10,0 мг/кг включительно, или в дозе, составляющей 0,3 - 3,0 мг/кг включительно, или в дозе, составляющей 0,3, 1,0 или 3,0 мг/кг.
Для любого соединения терапевтически эффективную дозу можно оценить изначально либо в анализах с использованием клеточных культур, либо в животных моделях, таких как мыши, крысы, кролики, собаки, свиньи или обезьяны. Животную модель также можно использовать для определения соответствующего диапазона концентраций и пути введения. Такую информацию можно затем использовать для определения применимых доз и путей введения людям.
Точную дозировку будут определять в свете факторов, относящихся в требующему лечения субъекту. Дозировку и введение регулируют для обеспечения достаточного содержания активного соединения или для поддержания требуемого эффекта. Факторы, которые можно учитывать, включают в себя тяжесть болезненного состояния, общее состояние здоровья субъекта, возраст, массу тела и пол субъекта, время и частоту введения, комбинацию(и) лекарственных средств, реакции чувствительности и ответ на терапию. Фармацевтические композиции длительного действия можно вводить каждые 3-4 дня, каждую неделю или два раза в неделю в зависимости от периода полураспада и скорости выведения из организма конкретного состава.
Согласно некоторым вариантам осуществления антагонист миостатина вводят два раза в день, один раз в день, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц или один раз в месяц. Например, антагонист миостатина вводят один раз в неделю в течение 4 недель.
Частота введения дозировки будет зависеть от фармакокинетических параметров молекулы связывающего средства в используемом составе. Как правило, композицию вводят, пока не получат дозировку, при которой достигается требуемый эффект. Композицию, следовательно, могут вводить в виде однократной дозы или в виде множественных доз (в одинаковой или различных концентрациях/дозировках) в течение определенного времени или в виде непрерывной инфузии. Рутинно
осуществляют дополнительное уточнение соответствующей дозировки. Соответствующие дозировки могут уточнять посредством применения соответствующих данных в отношении зависимости ответа от дозы.
Путь введения фармацевтической композиции находится в соответствии с известными способами, например, перорально, подкожно, посредством инъекции с помощью внутривенного, интраперитонеального, интрацеребрального (интрапаренхимального), интрацеребровентрикулярного, внутримышечного, интраокулярного, интраартериального, интрапортального, внутриочагового путей, интрадермально, с помощью интратекального, интравентрикулярного, трансдермального, подкожного, интраперитонеального, интраназального, энтерального, местного, подъязычного, уретрального, вагинального или ректального способов, с помощью систем замедленного высвобождения или с помощью имплантированных устройств. При необходимости композиции можно вводить путем болюсной инъекции или непрерывно с помощью инфузии или с помощью имплантируемого устройства.
Альтернативно или дополнительно, композицию можно вводить местно посредством имплантации мембраны, губки или другого соответствующего материала, на котором требуемая молекула была абсорбирована или инкапсулирована в него. При использовании имплантируемого устройства устройство можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, и доставку требуемой молекулы можно осуществить посредством диффузии, обеспечивающего высвобождение в определенное время болюса или непрерывного введения.
В некоторых случаях может быть желательным использовать фармацевтические композиции способом ex vivo. В таких случаях клетки, ткани или органы, которые были удалены из организма пациента, подвергают воздействию фармацевтических композиций, после чего клетки, ткани и/или органы последовательно имплантируют обратно в организм пациента.
В других случаях антагонист миостатина, такой как пептитело, можно доставить путем имплантации определенных клеток, которые были генетически сконструированы с использованием таких способом, как описанные в настоящем документе способы, для экспрессии и секреции полипептида. Такие клетки могут представлять собой клетки животного или человека и могут быть аутологическими, гетерологическими или ксеногенными. Необязательно клетки могут быть иммортализированными. Для снижения вероятности иммунологического ответа клетки можно инкапсулировать во избежание инфильтрации в окружающие ткани. Материалы для инкапсулирования, как
правило, представляют собой биосовместимые, полупроницаемые полимерные оболочки или мембраны, которые обеспечивают высвобождение белкового(ых) продукта(ов), но предотвращают разрушению клеток иммунной системой пациента или другими вредными факторами из окружающих тканей.
Описывая настоящее изобретение, следующие примеры предусмотрены для иллюстрации, а не для ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Идентификация миостатинсвязывающих пептидов
Три библиотеки нитевидных фагов, TN8-IX (5 X 109 независимых трансформантов), TN12-I (1,4 X 109 независимых трансформантов) и линейная (2,3 X 109 независимых трансформантов) (Dyax Corp.) использовали для проведения селекции в отношении миостатинсвязывающего фага. Каждую библиотеку инкубировали на покрытых миостатином поверхностях и подвергали различным условиям пэннинга: неспецифическое элюирование, и специфическое элюирование с использованием рекомбинантной химеры рецептора активина IIB/Fc человека (R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota), или элюирование пропептида миостатина, описанное ниже. Для всех трех библиотек фаги элюировали неспецифическим образом для первого раунда селекции, тогда как рецептор и промиостатин использовали во втором и третьем раундах селекции. Процедуры селекции проводили, как описано ниже.
Получение миостатина
Белок миостатин получали рекомбинантным способом в штамме К-12 2596 E.coli (АТСС № 202174) следующим образом. Полинуклеотиды, кодирующие молекулу промиостатина человека клонировали в экспрессионный вектор pAMG21 (АТСС № 98113), который находился под управлением экспрессионного вектора pCFM1656 (АТСС № 69576) и системы экспрессионного вектора, описанной в патенте США № 4710473 согласно процедуре, описанной в опубликованной международной патентной заявке № WO 00/24782. Полинуклеотиды, кодирующие промиостатин, получали из экспрессионного вектора млекопитающего. Кодирующую область амплифицировали с использованием стандартного способа ПЦР и следующих праймеров ПЦР для введения сайта рестрикции для Ndel и BamHI.
5' праймер: 5' -GAGAGAGAGCATATGAATGAGAACAGTGAGC AAAAAG-3' (SEQ ID NO: 292)
З'праймер: 5' -AGAGAGGGATCCATTATGAGCACCCACAGCGGTC-3' (SEQ ID NO: 293)
Продукт ПЦР и вектор обрабатывали обоими ферментами, смешивали и лигировали. Продукт лигирования трансформировали в штамм № 2596 Е. coli. Отдельные колонии проверяли под микроскопом в отношении экспрессии рекомбинантного белка в форме телец включения. Плазмиду выделяли и секвенировали через кодирующую область рекомбинантного гена для верификации генетической достоверности.
Бактериальную пасту получали из 10 л ферментации с использованием периодического способа при 37°С. Культуру индуцировали с помощью HSL при плотности клеток, составляющей 9,6 ООбоо и собирали через шесть часов при плотности, составляющей 104 ООбоо- Пасту хранили при -80°С. Пасту E.coli, экспрессирующую промиостатин, лизировали в микрофлюидизаторе при 16000 фут/кв. дюйм, центрифугировали для выделения нерастворимой фракции телец включения. Тельца включения ресуспендировали в гидрохлориде гуанидина, содержащем дитиотреитол, и солюбилизировали при комнатной температуре. Полученное затем разбавляли в 30 раз в водном буфере. Подвергнутый рефолдингу промиостатин затем концентрировали и буфер заменяли на 20 мМ трис, рН 8,0, и наносили на анионобменную колонку. Аниообменную колонку элюировали с увеличивающимся градиентом хлорида натрия. Фракции, содержащие промиостатин, объединяли. Промиостатин, полученный в E.coli, не содержит первые 23 аминокислоты и начинается с метионина перед остатком аспарагина 24. Для получения зрелого миостатина объединенный промиостатин ферментативно расщепляли на пропептид и С-концевой зрелый миостатин. Полученную смесь затем наносили на колонку С4-rpHPLC с использованием увеличивающегося градиента ацетонитрила, содержащего 0,1% трифторуксусную кислоту. Фракции, содержащие зрелый миостатин объединяли и высушивали в вакуумном концентраторе SpeedVac(tm).
Рекомбинантный зрелый миостатин, полученный из Е. coli, испытывали в анализе с использованием миобластов С2С12, описанном ниже, и обнаружили, что он является полностью активным по сравнению с рекомбинантным мышиным миостатином, коммерчески полученным в клеточной системе млекопитающего (R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota). Полученный в E.coli зрелый миостатин использовали в анализах фагового дисплея и скрининге, описанных ниже.
Получение покрытых миостатином пробирок
Миостатин иммобилизировали на 5 мл пробирках Immuno (tm) (NUNC) в концентрации, составляющей 8 мкг белка миостатина в 1 мл 0,1М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6). Покрытую миостатином пробирку Immuno(tm) инкубировали с орбитальным встряхиванием в течение 1 ч при комнатной температуре. Покрытую миостатином пробирку Immuno (tm) затем блокировали путем добавления 5 мл 2% содержащего молоко PBS и инкубации при комнатной температуре в течение 1 часа с вращением. Полученную покрытую миостатином пробирку Immuno (tm) затем отмывали трижды с помощью PBS перед тем, как подвергнуть процедурам селекции. Дополнительные пробирки Immuno (tm) также получали для проведения отрицательной селекции (без миостатина). Для каждого условия пэннинга пять - десять пробирок Immuno(tm) подвергали описанной выше процедуре за исключением того, что пробирки Immuno(tm) покрывали 1 мл 2% BSA-PBS вместо белка миостатина.
Отрицательная селекция
Для каждого условия пэннинга приблизительно 100 случайных эквивалентов библиотек для библиотек TN8-IX и TN12-I (5 X 1011 БОЕ для TN8-IX и 1,4 X 1011 БОЕ для TN12-I) и приблизительно 10 случайных эквивалентов библиотек для линейной библиотеки (2,3 X 1010 БОЕ) отбирали аликвотами из маточного раствора библиотеки и разбавляли до 1 мл с помощью PBST (PBS с 0,05% Tween-20). 1 мл разбавленного маточного раствора библиотеки добавляли в пробирку Immuno(tm), приготовленную для отрицательной селекции, и инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре с орбитальным встряхиванием. Содержащий фаги супернатант отбирали и добавляли во вторую пробирку Immuno(tm) для другой стадии отрицательной селекции. Таким образом, проводили пять - десять стадий отрицательной селекции.
Селекция в отношении связывания с миостатином
После последней стадии описанной выше отрицательной селекции содержащий фаги супернатант добавляли к полученным покрытым миостатином пробиркам Immuno(tm). Пробирку Immuno (tm) инкубировали с орбитальным встряхиванием в течение одного часа при комнатной температуре, позволяя конкретному фагу связаться с миостатином. После удаления супернатанта пробирку Immuno(tm) отмывали приблизительно 15 раз с помощью 2% содержащего молоко PBS, 10 раз с помощью PBST и дважды с помощью PBS для трех раундов селекции со всеми тремя библиотеками (TN8-IX, TN12-I и линейными библиотеками) за исключением того, что для второго раунда селекций с библиотеками TN8-IX и TN12-I пробирку Immuno (tm)
отмывали приблизительно 14 раз с помощью 2% содержащего молоко PBS, дважды с помощью 2% BSA-PBS, 10 раз с помощью PBST и один раз с помощью PBS. Неспецифическое элюирование
После последней стадии отмывки, связанные фаги элюировали из пробирки Immuno (tm) путем добавления 1 мл раствора 100 мМ триэтиламина (Sigma, St. Louis, Missouri) с 10-минутной инкубацией с орбитальным встряхиванием. рН содержащего фаг раствора затем нейтрализовали с помощью 0,5 мл 1 М трис-HCl (рН 7,5).
Элюирование связанного фага с помощью рецептора (рецептора активина человека)
Для 2 и 3 раунда после последней стадии отмывки связанные фаги элюировали из пробирки Immuno(tm) путем добавления 1 мл 1 мкМ белка рецептора (рекомбинантная химера рецептора активина человека IIB/Fc, R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minnesota) с 1-часовой инкубацией для каждого условия.
Элюирование связанного фага с помощью пропептида
Для 2 и 3 раунда после последней стадии отмывки связанные фаги элюировали из пробирки Immuno (tm) путем добавления 1 мл 1 мкМ пропептидного белка (полученного, как описано выше) с 1-часовой инкубацией для каждого условия.
Амплификация фагов
Свежую культуру E.coli. (XL-1 Blue MRF) выращивали до СЮбоо = 0,5 в среде LB, содержащей 12,5 мкг/мл тетрациклина. Для каждого условия пэннинга 20 мл этой культуры охлаждали на льду и центрифугировали. Бактериальный осадок ресуспендировали в 1 мл солевом растворе min А.
Каждую смесь из различных способов элюирования добавляли к концентрированному образцу бактерий и инкубировали при 37°С в течение 15 минут. 2 мл среды NZCYM (2х NZCYM, 50 мкг/мл ампициллина) добавляли к каждой смеси и инкубировали при 37°С в течение 15 минут. Полученные 4 мл раствора помещали на большую чашку со средой, содержащей агар с NZCYM, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали в течение ночи при 37°С.
Каждую смесь бактерий с фагами, которую выращивали в течение ночи на большой, содержащей агар с NZCYM чашке, соскабливали в 35 мл среды LB и содержащую агар чашку дополнительно промывали с помощью дополнительных 35 мл среды LB. Полученную бактериально-фаговую смесь в среде LB центрифугировали с удалением полученного осадка бактерий. 50 мкл содержащего фага супернатанта
переносили в свежую пробирку и 12,5 мл раствора ПЭГ (20% ПЭГ 8000, 3,5 М ацетата аммония) добавляли и инкубировали на льду в течение 2 часов для осаждения фагов. Осажденные фаги центрифугировали и ресуспендировали в 6 мл буфера для ресуспендирования фагов (250 мМ NaCl, 100 мМ трис рН8, 1 мМ EDTA). Этот фаговый раствор дополнительно очищали путем центрифугирования с удалением оставшихся бактерий и осаждения фага во второй раз путем добавления 1,5 мл раствора ПЭГ. После стадии центрифугирования осадок фагов ресуспендировали в 400 мкл PBS. Этот раствор подвергали конечному центрифугированию для удаления остаточного бактериального детрита. Полученный препарат фагов титровали с помощью стандартного анализа бляшкообразования (Molecular Cloning, Maniatis et al., 3rd Edition). Дополнительные раунды селекции и амплификации
Во втором раунде амплифицированный фаг (1011 БОЕ) из первого раунда использовали в качестве исходного фага для проведения стадий селекции и амплификации. Амплифицированный фаг (1011 БОЕ) из второго раунда в свою очередь использовали в качестве исходного фага для проведения третьего раунда селекции и амплификации. После стадий элюирования третьего раунда небольшую фракцию элюированного фага помещали на планшет для анализа бляшкообразования, приведенного выше. Отдельные бляшки собирали и помещали в 96-луночные микротитровальные планшеты, содержащие 100 мкл буфера ТЕ в каждой лунке. Эти контрольные планшеты инкубировали при 4°С в течение ночи для обеспечения элюирования фагов в буфер ТЕ.
Клональный анализ
Фаговый ELISA
Клоны фагов подвергали фаговому ELISA и затем секвенировали. Последовательности ранжировали, как обсуждается ниже.
Фаговый ELISA проводили следующим образом. Культуру Е. Coli XL-1 Blue MRF' выращивали до достижения значения ООбоо, составляющего 0,5. 30 мкл этой культуры переносили аликвотой в каждую лунку 96-луночного микротитровального планшета. 10 мкл элюированного фага добавляли в каждую лунку и оставляли на 15 минут при комнатной температуре, чтобы произошло инфицирование бактерий. Приблизительно 120 мкл среды LB, содержащей 12,5 мкг/мл тетрациклина и 50 мкг/мл ампициллина добавляли в каждую лунку. Микротитровальный планшет затем инкубировали с встряхиванием в течение ночи при 37 °С. Белок миостатин (2 мкг/мл в 0,1 М натрийкарбонатном буфере, рН 9,6) наносили на 96-луночные планшеты
Maxisorp (NUNC) в течение ночи при 4°С. В качестве контроля отдельный планшет Maxisorp(tm) покрывали 2% BSA, приготовленном в PBS.
На следующий день жидкость в покрытых белком планшетах Maxisorp(tm) извлекали, отмывали три раза с помощью PBS и каждую лунку блокировали с помощью 300 мкл 2% раствора молока при комнатной температуре в течение 1 часа. Раствор молока удаляли и лунки отмывали три раза с помощью раствора PBS. После последней стадии отмывки приблизительно 50 мкл PBST с 4% раствором молока добавляли к каждой лунке покрытых белком планшетов Maxisorp(tm). Приблизительно 50 мкл культивируемых в течение ночи культур из каждой лунки в 96-луночном микротитровальном планшете переносили в соответствующие лунки покрытых миостатином планшетов, а также контрольных покрытых 2% BSA планшетов. 100 мкл смеси в двух видах планшетов инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Жидкость отбирали из планшетов Maxisorp(tm) и лунки промывали приблизительно три раза с помощью PBST с последующей промывкой два раза с помощью PBS. Конъюгированное с HRP антитело к М13 (Amersham Pharmacia Biotech) разбавляли приблизительно до 1:7500 и 100 мкл разбавленного раствора добавляли к каждой лунке планшетов Maxisorp(tm) для 1-часовой инкубации при комнатной температуре. Жидкость снова отбирали и лунки промывали приблизительно три раза с помощью PBST с последующей промывкой два раза с помощью PBS. 100 мкл хемилюминесцентного субстрата LumiGlo(tm) (KPL) добавляли к каждой лунке планшетов Maxisorp(tm) и инкубировали в течение приблизительно 5 минут для того, чтобы произошла реакция. Хемилюминесцентные единицы планшетов Maxisorp (tm) считывали на планшет-ридере (Lab System).
Секвенирование фаговых клоны
Для каждого фагового клона матрицу секвенирования получали с помощью
способа ПЦР. Следующую пару олигонуклеотидов использовали для амплификации
500 нуклеотидного фрагмента: праймер № 1: 5'-
CGGCGCAACTATCGGTATCAAGCTG-3' (SEQ ID NO: 294) и праймер № 2: 5'-CATGTACCGTAACACTGAGTTTCGTC-3'(SEQ ID NO: 295). Следующую смесь получали для каждого клона.
Реагенты
Объем (мкл)/пробирка
дистиллированная НгО
26,25
50% глицерин
10Х буфер ПЦР
(масс/объем MgCb)
25 мМ MgCl2
10 мМ смесь dNTP
100 мкМ праймера 1
0,25
100 мкМ праймера 2
0,25
полимераза Taq
0,25
Фаг в ТЕ (раздел 4)
Конечный объем реакции
Амплификатор (GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem) использовали для прохождения следующей программы: [94°С в течение 5 мин; 94°С в течение 30 с, 55°С в течение 30 с, 72°С в течение 45 с] х 30 циклов; 72°С в течение 7 мин; охлаждение до 4°С. Продукт ПЦР из каждой реакции очищали с использованием набора для многолуночного очищения продуктов ПЦР QIAquick Multiwell (Qiagen) согласно протоколу производителя. Очищенный продукт ПЦР проверяли, пропуская 10 мкл каждой реакции ПЦР, смешанных с 1 мкл красителя (10Х BBXS красителя для загрузки на агарозный гель) на 1% агарозный гель. Оставшийся продукт затем секвенировали с использованием секвенатора ABI 377 (Perkin Elmer) согласно рекомендуемому производителем протоколу.
Ранжирование и анализ последовательностей
Пептидные последовательности, которые были транслированы из нуклеотидных последовательностей, подвергали корреляции с данными ELISA. Идентифицировали клоны, которые показали высокие хемилюминесцентные единицы в покрытых миостатином лунках и низкие хемилюминесцентные единицы в покрытых 2% BSA лунках. Идентифицировали последовательности, которые появлялись много раз. Кандидатные последовательности, выбранные на основании этих критериев, подвергали дополнительному анализу в качестве пептител. Проанализировали приблизительно 1200 отдельных клонов. Из этих приблизительно 132 пептидов выбрали для создания пептител согласно настоящему изобретению. Они показаны в
таблице I ниже. Пептиды с SEQ Ш NO: 1 - 129 использовали для создания пептител с тем же названием. Пептиды с SEQ ID N0: 130 - 141, показанные в таблице I, содержа два или больше пептидов из SEQ ID NO: 1 - 132, прикрепленных с помощью линкерной последовательности. SEQ ID NO: 130 - 141 также использовали для создания пептител с тем же названием.
Консенсусные последовательности определяли для полученной из TN-8 группы пептидов. Они являлись следующими:
KDXCXXWHWMCКРХ (SEQ ID NO: 142)
WXXCXXXGFWCXNX (SEQ ID NO: 143)
IXGCXWWDXXCYXX (SEQ ID NO: 144)
XXWCVSPXWFCXXX (SEQ ID NO: 145)
XXXCPWFAXXCVDW (SEQ ID NO: 146)
Для всех вышеприведенных консенсусных последовательностей подчеркнутые "коровые последовательности" из каждой консенсусной последовательности представляют собой аминокислоту, которая всегда находится в указанном положении. "X" относится к любой встречающийся в природе или модифицированной аминокислоте. Два цистеина, содержащиеся в коровых последовательностях, представляли собой фиксированные аминокислоты в библиотеке TN8-IX.
Миостатин-TNS-11 21
ANWCVSPNWFCMVM
Миостатин-TNS-12 22
WTECYQQEFWCWNL
Миостатин-TNS-13 23
ENTCERWKWMCPPK
Миостатин-TNS-14 24
WLPCHQEGFWCMNF
Миостатин-TNS-15 25
STMCSQWHWMCNPF
Миостатин-TNS-16 26
IFGCHWWDVDCYQF
Миостатин-TNS-17 27
IYGCKWWDIQCYDI
Миостатин-TNS-18 28
PDWCIDPDWWCKFW
Миостатин-TNS-19 29
QGHCTRWPWMCPPY
Миостатин-ТЛЧ8-20 30
WQECYREGFWCLQT
Миостатин-ТШ-21 31
WFDCYGPGFKCWSP
Миостатин-ТЛЧ8-22 32
GVRCPKGHLWCLYP
Миостатин-ТЛЧ8-23 33
HWACGYWPWSCKWV
Миостатин-ТЛЧ8-24 34
GPACHSPWWWCVFG
Миостатин-ТЛЧ8-25 35
TTWCISPMWFCSQQ
Миостатин-ТЛЧ8-26 36
HKFCPPWAIFCWDF
Миостатин-ТЛЧ8-27 37
PDWCVSPRWYCNMW
Миостатин-ТШ-28 38
VWKCHWFGMDCEPT
Миостатин-ТЛЧ8-29 39
KKHCQPWTWMCAPK
MHOCTaTHH-TN8-30 40
WFQCGSTLFWCYNL
Миостатин-ТШ-31 41
WSPCYDHYFYCYTI
Миостатин-ТШ-32 42
SWMCGFFKEVCMWV
Миостатин-ТШ-ЗЗ 43
EMLCMIHPVFCNPH
Миостатин-ТШ-34 44
LKTCNLWPWMCPPL
MHOCTaTHH-TN8-35 45
VVGCKWYEAWCYNK
Миостатин-ТШ-36 46
PIHCTQWAWMCPPT
Миостатин-ТШ-37 47
DSNCPWYFLSCVIF
Миостатин-ТШ-38 48
HIWCNLAMMKCVEM
Миостатин-ТШ-39 49
NLQCIYFLGKCIYF
Миостатин-ТЛЧ8-40 50
AWRCMWFSDVCTPG
Миостатин-ТШ-41 51
WFRCFLDADWCTSV
MnocTaTHH-TN8-42 52
EKICQMWSWMCAPP
Миостатин-ТШ-43 53
WFYCHLNKSECTEP
MnocTaTHH-TN8-44 54
FWRCAIGIDKCKRV
MnocTaTHH-TN8-45 55
NLGCKWYEVWCFTY
Миостатин-ТШ-46 56
IDLCNMWDGMCYPP
MnocTaTHH-TN8-47 57
EMPCNPWGWMCPPV
Миостатин-TN 12-1 58
WFRCVLTGIVDWSECFGL
Миостатин-TN 12-2 59
GFSCTFGLDEFYVDCSPF
Миостатин-TN 12-3 60
LPWCHDQVNADWGFCMLW
Миостатин-TN 12-4 61
YPTCSEKFWIYGQTCVLW
Миостатин-TN 12-5 62
LGPCPIHHGPWPQYCVYW
Миостатин-TN 12-6 63
PFPCETHQISWLGHCLSF
Миостатин-TN 12-7 64
HWGCEDLMWSWHPLCRRP
Миостатин-TN 12-8 65
LPLCDADMMPTIGFCVAY
Миостатин-TN 12-9 66
SHWCETTFWMNYAKCVHA
Миостатин-TN 12-10 67
LPKCTHVPFDQGGFCLWY
Миостатин-TN 12-11 68
FSSCWSPVSRQDMFCVFY
Миостатин-TN 12-13 69
SHKCEYSGWLQPLCYRP
Миостатин-TN 12-14 70
PWWCQDNYVQHMLHCDSP
Миостатин-TN 12-15 71
WFRCMLMNSFDAFQCVSY
Миостатин-TN 12-16 72
PDACRDQPWYMFMGCMLG
Миостатин-TN 12-17 73
FLACFVEFELCFDS
Миостатин-TN 12-18 74
SAYCIITESDPYVLCVPL
Миостатин-TN 12-19 75
PSICESYSTMWLPMCQHN
Миостатин-TN12-20 76
WLDCHDDSWAWTKMCRSH
Миостатин-TN 12-21 77
YLNCVMMNTSPFVECVFN
Миостатин-TN12-22 78
YPWCDGFMIQQGITCMFY
Миостатин-TN 12-23 79
FDYCTWLNGFKDWKCWSR
Миостатин-TN 12-24 80
LPLCNLKEISHVQACVLF
Миостатин-TN 12-25 81
SPECAFARWLGIEQCQRD
Миостатин-TN 12-26 82
YPQCFNLHLLEWTECDWF
Миостатин-TN 12-27 83
RWRCEIYDSEFLPKCWFF
Миостатин-TN 12-28 84
LVGCDNVWHRCKLF
Миостатин-TN 12-29 85
AGWCHVWGEMFGMGCSAL
Миостатин-TN 12-30 86
HHECEWMARWMSLDCVGL
Миостатин-TN 12-31 87
FPMCGIAGMKDFDFCVWY
Миостатин-TN 12-32 88
RDDCTFWPEWLWKLCERP
Миостатин-TN 12-33 89
YNFCSYLFGVSKEACQLP
Миостатин-TN 12-34 90
AHWCEQGPWRYGNICMAY
Миостатин-TN 12-35 91
NLVCGKISAWGDEACARA
Миостатин-TN 12-36 92
HNVCTIMGPSMKWFCWND
Миостатин-TN 12-37 93
NDLCAMWGWRNTIWCQNS
Миостатин-TN 12-3 8 94
PPFCQNDNDMLQSLCKLL
Миостатин-TN 12-39 95
WYDCNVPNELLSGLCRLF
Миостатин-TN12-40 96
YGDCDQNHWMWPFTCLSL
Миостатин-TN 12-41 97
GWMCHFDLHDWGATCQPD
Миостатин-TN12-42 98
YFHCMFGGHEFEVHCESF
Миостатин-TN 12-43 99
AYWCWHGQCVRF
Миостатин-линейный-1 100
SEHWTFTDWDGNEWWVRPF
Миостатин-линейный-2 101
MEMLDSLFELLKDMVPISKA
Миостатин-линейный-3 102
SPPEEALMEWLGWQYGKFT
Миостатин-линейный-4 103
SPENLLNDLYILMTKQEWYG
Миостатин-линейный-5 104
FHWEEGIPFHVVTPYSYDRM
Миостатин-линейный-6 105
KRLLEQFMNDLAELVSGHS
Миостатин-линейный-7 106
DTRDALFQEFYEFVRSRLVI
Миостатин- линейный-8 107
RMSAAPRPLTYRDIMDQYWH
Миостатин-линейный-9 108
NDKAHFFEMFMFDVHNFVES
Миостатин-линейный-10 109
QTQAQKIDGLWELLQSIRNQ
Миостатин-линейный-11 110
MLSEFEEFLGNLVHRQEA
Миостатин-линейный-12 111
YTPKMGSEWTSFWHNRIHYL
Миостатин-линейный-13 112
LNDTLLRELKMVLNSLSDMK
Миостатин-линейный-14 113
FDVERDLMRWLEGFMQSAAT
Миостатин-линейный-15 114
HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
Миостатин-линейный-16 115
VESLHQLQMWLDQKLASGPH
Миостатин-линейный-17 116
RATLLKDFWQLVEGYGDN
Миостатин-линейный-18 117
EELLREFYRFVSAFDY
Миостатин-линейный-19 118
GLLDEFSHFIAEQFYQMPGG
Миостатин-линейный-20 119
YREMSMLEGLLDVLERLQHY
Миостатин-линейный-21 120
HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ
Миостатин-линейный-22 121
WREHFLNSDYIRDKLIAIDG
Миостатин-линейный-23 122
QFPFYVFDDLPAQLEYWIA
Миостатин-линейный-24 123
EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN
Миостатин-линейный-25 124
EALFQNFFRDVLTLSEREY
Миостатин-линейный-26 125
QYWEQQWMTYFRENGLHVQY
Миостатин-линейный-27 126
NQRMMLEDLWRIMTPMFGRS
Миостатин-линейный-29 127
FLDELKAELSRHYALDDLDE
Миостатин- линейный-30 128
GKLIEGLLNELMQLETFMPD
Миостатин-линейный-31 129
ILLLDEYKKDWKSWF
Миостатин-2хТШ-19 кс 130
QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGSTASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY
Миостатин-2хТШ-соп6 131
WYPCYEGHFWCYDLGSGSTASSGSGSATGWYPCYEG HFWCYDL
Миостатин-2хТЛЧ8-5 кс 132
HTPCPWFAPLCVEWGSGSATGGSGSTASSGSGSATGH TPCPWFAPLCVEW
Миостатин-2хТШ-18кс 133
PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGSTASSGSGSATG PDWCIDPDWWCKFW
Миостатин-2хТШ-11 кс 134
ANWCVSPNWFCMVMGSGSATGGSGSTASSGSGSATG ANWCVSPNWFCMVM
Миостатин-2хТЛЧ8-25 кс 135
PDWCIDPDWWCKFWGSGSATGGSGSTASSGSGSATG PDWCIDPDWWCKFW
Миостатин-2хТЛЧ8-23 кс 136
HWACGYWPWSCKWVGSGSATGGSGSTASSGSGSAT GHWACGYWPWSCKWV
Миостатин-ТМ8-29-19 кс 137
KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGSTASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY
Миостатин-ТШ-19-29 кс 138
QGHCTRWPWMCPPYGSGSATGGSGSTASSGSGSATG KKHCQIWTWMCAPK
Миостатин-ТШ-29-19 кп 139
KKHCQIWTWMCAPKGSGSATGGSGSTASSGSGSATG QGHCTRWPWMCPPY
MHocTaTHH-TN8-29-19-8g 140
KKHCQIWTWMCAPKGGGGGGGGQGHCTRWPWMCP PY
MnocTaTHH-TN8-19-29-6gc 141
QGHCTRWPWMCPPYGGGGGGKKHCQIWTWMCAPK
Пример 2: Создание пептител
Конструирование ДНК, кодирующий белки слияния пептида с Fc
Пептиды, способные связываться с миостатином, использовали отдельно или в
комбинации друг с другом для конструирования белков слияния, в которых пептид
слит с доменом Fc IgGl человека. Аминокислотная последовательность части Fc
каждого пептитела является следующей (от амино-конца к карбоксильному концу):
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW
YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI
EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK (SEQ ID NO: 296)
Проводили слияние пептида в N-конфигурации (пептид прикрепляли к N-концу области Fc), С-конфигурации (пептид прикрепляли к С-концу области Fc) или N,C-конфигурации (пептид прикрепляли как к N, так и С-концу области Fc). Отдельные векторы использовали для экспрессии N-концевых слияний и С-концевых слияний. Каждое пептитело конструировали путем отжига пар олигонуклеотидов ("олиго") с выбранной нуклеиновой кислотой фага для создания двухцепочечной нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид. Эти полинуклеотидные молекулы конструировали в виде фрагментов Apah - Xhol. Фрагменты лигировали или в pAMG21-Fc N-концевой вектор для N-концевой ориентации, или в pAMG21-Fc-C-концевой вектор для С-концевой ориентации, которые были предварительно обработаны ApaU и Xhol . Полученные смеси для лигирования трансформировали с помощью электропорации в клетки штаммов 2596 или 4167 Е. coli (hsdR- вариант клеток штамма 2596) с использованием стандартных процедур. Клоны подвергали скринингу в отношении способности производить рекомбинантный белковый продукт и обладать генным слиянием, характеризующимся правильной нуклеотидной последовательностью. Для каждого из модифицированных пептидов выбирали один такой клон.
Многие конструкты создавали с использованием альтернативного вектора, обозначенного как pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc. Этот вектор сходен с описанным выше вектором за исключением того, что обработку вектора проводили с помощью BsmBI. Некоторые конструкты сливали пептидные последовательности на обоих концах Fc. В таких случаях вектор состоял из pAMG21-2xBs-N(ZeoR) Fc и pAMG21-2xBs-C-Fc.
Конструирование pAMG21
Экспрессионную плазмиду pAMG21 (АТСС № 98113) получали из экспрессионного вектора pCFM1656 (АТСС № 69576) и системы экспрессионных векторов, описанной в патенте США № 4710473 согласно процедуре, описанной в опубликованной международной патентной публикации WO 00/24782, причем все документы включены в настоящий документ посредством ссылки.
Fc N-концевой вектор
Fc N-концевой вектор конструировали с использованием вектора pAMG21 Fc_Gly5_ Тро в качестве матрицы. 5' ПЦР праймер (ниже) разрабатывали для удаления пептидной последовательности Тро в pAMG Тро Gly5 и замещения ее полилинкером, содержащим сайты ApalA и Xhol. С использованием указанного вектора в качестве
матрицы ПЦР проводили с полимеразой Expand Long Polymerase, с использованием следующих 5' праймера и универсального 3' праймера:
5'праймер
ACAAACAAACATATGGGTGCACAGAAAGCGGCCGCAAAAAAA CTCGAGGGTGGAGGCGGTGGGGACA 3'(SEQ ГО N0:297)
3'праймер
5' GGTCATTACTGGACCGGATC 3'(SEQ ГО N0: 298)
Полученный продукт ПЦР очищали гель-фильтрацией и обрабатывали с помощью рестриктаз Ndel и BsrGI. Как плазмиду, так и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес пептид, вместе с его линкером подвергали очищению с помощью спин-колонок для гель-фильтрации Qiagen (Chatsworth, CA). Плазмиду и вставку затем лигировали с использованием стандартных процедур лигирования и полученную после лигирования смесь трансформировали в клетки Е. coli (штамм 2596). Выбирали отдельные клоны и проводили секвенирование ДНК. Идентифицировали правильный клон и его использовали в качестве источника вектора для модифицированных пептидов, описанных в настоящем документе.
Конструирование Fc С-концевого вектора
Fc С-концевой вектор конструировали с использованием вектора pAMG21 Fc_Gly5_ Тро в качестве матрицы. 3' ПЦР праймер разрабатывали для удаления пептидной последовательности Тро и замещения ее полилинкером, содержащим сайты ApaLl и Xhol. ПЦР проводили с полимеразой Expand Long Polymerase, с использованием универсального 5' праймера и 3' праймера.
5' праймер: 5'-CGTACAGGTTTACGCAAGAAAATGG-3' (SEQ ID N0: 299) 3' праймер: 5'-TTTGTTGGATCCATTACTCGAGTTTTTTTGCGGCCGCT TTCTGTGCACCACCACCTCCACCTTTAC-3' (SEQ ID N0: 300) Полученный продукт ПЦР очищали гель-фильтрацией и обрабатывали с помощью рестриктаз BsrGI и ВатШ. Как плазмиду, так и полинуклеотид, кодирующий каждый представляющий интерес пептид, вместе с его линкером подвергали очищению с помощью спин-колонок для гель-фильтрации Qiagen. Плазмиду и вставку затем лигировали с использованием стандартных процедур лигирования и полученную после лигирования смесь трансформировали в клетки Е. coli (штамм 2596). Штамм 2596 (АТСС № 2021"/Ч) представляет собой штамм Е. coli К-12, модифицированный так, чтобы содержать lux - промотор и два чувствительных к температуре лямбда-репрессора, репрессор cI857s7 и lac IQ. Выбирали отдельные клоны и проводили секвенирование ДНК. Идентифицировали правильный клон и его использовали в
качестве источника вектора для модифицированных пептидов, описанных в настоящем документе.
Экспрессия в Е. coli.
Культуры каждого из конструктов слияния pAMG21-Fc в штамме Е. coli 2596 выращивали при 37°С в среде Terrific Broth (смотрите Tartof and Hobbs, "Improved media for growing plasmid and cosmid clones", Bethesda Research Labs Focus, Volume 9, page 12, 1987, процитированную в вышеупомянутой ссылке Sambrook et al.). Индукция экспрессии генного продукта из промотора luxPR достигалась после добавления синтетического аутоиндуктора, ^(З-оксогексаноил)-ОЬ-гомосеринлактона, к культуральной среде до конечной концентрации, составляющей 20 нг/мл. Культуры инкубировали при 37°С в течение дополнительных шести часов. Бактериальные культуры затем исследовали под микроскопом на присутствие телец включения и собирали путем центрифугирования. Преломляющие тельца включения наблюдали в индуцированных культурах, что указывало на то, что Fc-слияния наиболее вероятно производились в нерастворимой фракции в Е. coli. Клеточные осадки лизировали напрямую путем ресуспендирования в буфере для образцов Laemmli, содержащем 10% [3-меркаптоэтанола и затем анализировали с помощью SDS-PAGE. В большинстве случаев на геле SDS-PAGE наблюдали интенсивно окрашенную кумасси голубым полосу соответствующей молекулярной массы.
Укладка и очищение пептител
Клетки разрушали в воде (1/10 объема по объему) с помощью гомогенизации под высоким давлением (3 прохода при 15000 фунт/дюйм ) и тельца включения собирали путем центрифугирования (4000 об/мин в J-6B в течение 30 минут). Тельца включения солюбилизировали в растворе, содержащем 6 М гуанидин, 50 мМ трис, 8 мМ DTT, рН 8,0 в течение 1 часа в соотношении 1/10 при окружающей температуре. Солюбилизированную смесь разбавляли в 25 раз в растворе, содержащем 4 М мочевину, 20% глицерин, 50 мМ трис, 160 мМ аргинин, 3 мМ цистеин, 1 мМ цистамин, рН 8,5. Смесь инкубировали в течение ночи на холоде. Смесь затем диализировали против 10 мМ триса, рН 8,5, 50 мМ NaCl, 1,5 М мочевины. После диализа в течение ночи рН диализата доводили до рН 5 с помощью уксусной кислоты. Осадок удаляли путем центрифугирования и супернатант загружали на SP-сефарозную колонку с быстрой скоростью потока, уравновешенную в 10 мМ NaAc, 50 мМ NaCl, рН 5, 4°С). После загрузки колонку отмывали до базовой линии с помощью 10 мМ NaAc, 50 мМ NaCl, рН 5,2. Колонку проявляли с помощью градиента 20-кратного объема колонки от
50 мМ до 500 мМ NaCl в ацетатном буфере. Альтернативно, после отмывки до базовой линии, колонку отмывали 5-кртаными объемами колонки 10 мМ фосфата натрия, рН 7,0 и колонку проявляли с помощью градиента 15-кратного объема колонки от 0 до 400 мМ NaCl в фосфатном буфере. Фракции колонки анализировали с помощью SDS-PAGE. Фракции, содержащие димерное пептитело, объединяли. Фракции также анализировали с помощью гель-фильтрации для определения присутствия каких-либо агрегатов.
Ряд пептител получали из пептидов в таблице I. Пептиды прикрепляли к молекуле Fc IgGl человека с образованием пептител в таблице П. В отношении пептител в таблице II С-конфигурация указывает на то, что указанный пептид прикреплен на С-концах Fc. N-конфигурация указывает на то, что указанный пептид прикреплен на N-концах Fc. ^С-конфигурация указывает на то, что один пептид прикреплен на N-концах, а другой на С-концах каждой молекулы Fc. Обозначение 2х указывает на то, что два указанных пептида прикреплены в тандеме друг к другу, а также прикреплены на N- или С-концах, или на обоих N,C Fc, разделенные с помощью указанного линкера. Два пептида, прикрепленные в тандеме, разделенные линкером, обозначены, например, как MHOcraTHH-TN8-29-19-8g, что указывает на то, что пептид TN8-29 прикреплен посредством линкера (gly)g к пептиду TN8-19. Пептид(ы) прикреплены к Fc посредством линкерной последовательности (gly)s, если не указано иное. В некоторых случаях пептид(ы) прикреплены посредством линкера к. Линкер, обозначенный к или 1к, относится к линкерной последовательности gsgsatggsgstassgsgsatg (SEQ ID NO: 301), причем kc относится к линкеру, прикрепленному к С-концу Fc, и kn относится к линкеру, прикрепленному к N-концу Fc. В таблице II ниже четвертая колонка относится к линкерной последовательности, соединяющей Fc с первым пептидом, и пятая колонка 5 относится к конфигурации N или С или им обеим.
Поскольку молекула Fc димеризуется в растворе, пептитело, сконструированное так, чтобы содержать один пептид, будет в действительности представлять собой димер с двумя копиями пептида и двумя молекулами Fc, и вариант 2Х с двумя пептидами в тандеме в действительности будет представлять собой димер с четырьмя копиями пептида и двумя молекулами Fc.
Поскольку пептитела, представленные в таблице II, экспрессируются в Е. coli, первый аминокислотный остаток представляет собой Met (М). Следовательно, пептитела в N-конфигурации представляют собой, например, Met-пептид-линкер-Рс
или Мег-пептид-линкер-пептид-линкер-Fc. Пептитела в С-конфигурации расположены,
например, в виде следующего Met-Fc-линкер-пептид или Met-Fc-линкер-пептид-
линкер-пептид. Пептитела в С,гЧ-конфигурации представляют собой комбинацию обеих
конфигураций, например, Мег-пептид-линкер-Бс-линкер-пептид.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие иллюстративные пептитела,
представлены ниже в таблице П. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие
иллюстративное пептитело согласно настоящему изобретению, включают в себя
нуклеотидную последовательность, кодирующую последовательность Fc-полипептида,
такую как следующая:
5'GACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGA
CCGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCG
GACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG
GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAA
AGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC
CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC
AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGC
AGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGAC
CAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAC
ATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACC
ACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCAC
CGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG
CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAA-3' (SEQ Ш NO: 301)
Кроме того, также предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие состоящий из пяти остатков глицина ggggg линкер, такие как следующий: 5'-GGTGGAGGTGGTGGT-3' (SEQ ID NO: 302)
Полинуклеотид, кодирующий пептитело, также включает в себя кодон кодирующий ATG метионина и стоп-кодон, такой как ТАА.
Следовательно, структура первого пептитела в таблице II представляет собой TN8-Conl с С-конфигурацией и (gly)s линкер является следующим: M-Fc-GGGGG-KDKCKMWHWMCKPP (SEQ Ш NO: 303). Иллюстративные полинуклеотиды, кодирующие указанное пептитело, будут следующими:
5'-
ATGGACAAAACTCACACATGTCCACCTTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAC CGTCAGTTTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACC CCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAG
TTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGG
GAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACC
AGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCC
CAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCAC
AGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCT
GACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGC
AATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGAC
GGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGG
GGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCA
GAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGTGGAGGTGGTGGTAAGACAAATGC
AAAATGTGGCACTGGATGTGCAAACCGCCG-3' (SEQ ID NO: 304)
Таблица II: Название пептитела, пептидная последовательность,
ID NO: 156)
Миостатин-ТШ-
IFGCKWWDVDCYQF
ATCTTCGGTTGCAAATGGTGGGA
con8
CGTTGACTGCTACCAGTTC (SEQ ID NO: 157)
Миостатин-ТШ-
ADWCVSPNWFCMVM
GCTGACTGGTGCGTTTCCCCGAA
соп9
CTGGTTCTGCATGGTTATG (SEQ ID NO: 158)
Миостатин-ТШ-
HKFCPWWALFCWDF
CACAAATTCTGCCCGTGGTGGGC
giy
сопЮ
TCTGTTCTGCTGGGACTTC (SEQ ID NO: 159)
Миостатин-ТШ-
KDLCKMWHWMCKPP
AAAGACCTGTGCAAAATGTGGC
gly
ACTGGATGTGCAAACCGCCG (SEQ ID NO: 160
Миостатин-ТШ-
IDKCAIWGWMCPPL
ATCGACAAATGCGCTATCTGGGG
gly
TTGGATGTGCCCGCCGCTG (SEQ ID NO: 161)
Миостатин-ТШ-
WYPCGEFGMWCLNV
TGGTACCCGTGCGGTGAATTCGG
gly
TATGTGGTGCCTGAACGTT (SEQ ID NO: 162)
Миостатин-ТШ-
WFTCLWNCDNE
TGGTTCACCTGCCTGTGGAACTG
gly
CGACAACGAA (SEQ ID NO: 163)
Миостатин-ТШ-
HTPCPWFAPLCVEW
CACACCCCGTGCCCGTGGTTCGC
gly
TCCGCTGTGCGTTGAATGG (SEQ ID NO: 164)
Миостатин-ТШ-6
KEWCWRWKWMCKPE
AAAGAATGGTGCTGGCGTTGGA AATGGATGTGCAAACCGGAA (SEQ ID NO: 165)
gly
Миостатин-ТШ-
FETCPSWAYFCLDI
TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGC
gly
TTACTTCTGCCTGGACATC (SEQ ID NO: 166)
Миостатин-ТШ-
FETCPSWAYFCLDI
TTCGAAACCTGCCCGTCCTGGGC
gly
TTACTTCTGCCTGGACATC (SEQ ID NO: 167)
Миостатин-ТШ-8
AYKCEANDWGCWWL
GCTTACAAATGCGAAGCTAACG ACTGGGGTTGCTGGTGGCTG (SEQ ID NO: 168)
gly
Миостатин-ТШ-
NSWCEDQWHRCWWL
AACTCCTGGTGCGAAGACCAGT
gly
GGCACCGTTGCTGGTGGCTG (SEQ ID NO: 169)
Миостатин-ТШ-
WSACYAGHFWCYDL
TGGTCCGCTTGCTACGCTGGTCA
gly
CTTCTGGTGCTACGACCTG (SEQ ID NO: 170)
Миостатин-ТШ-
ANWCVSPNWFCMVM
GCTAACTGGTGCGTTTCCCCGAA
gly
CTGGTTCTGCATGGTTATG (SEQ ID NO: 171)
Миостатин-ТШ-
WTECYQQEFWCWNL
TGGACCGAATGCTACCAGCAGG
gly
AATTCTGGTGCTGGAACCTG (SEQ ID NO: 172)
Миостатин-ТШ-
ENTCERWKWMCPPK
GAAAACACCTGCGAACGTTGGA
gly
AATGGATGTGCCCGCCGAAA (SEQ ID NO: 173)
Миостатин-ТШ-
WLPCHQEGFWCMNF
TGGCTGCCGTGCCACCAGGAAG
gly
GTTTCTGGTGCATGAACTTC (SEQ ID NO: 174)
Миостатин-ТШ-
STMCSQWHWMCNPF
TCCACCATGTGCTCCCAGTGGCA
CTGGATGTGCAACCCGTTC (SEQ ID NO: 175)
Миостатин-ТШ-
IFGCHWWDVDCYQF
ATCTTCGGTTGCCACTGGTGGGA
giy
CGTTGACTGCTACCAGTTC (SEQ ID NO: 176)
Миостатин-ТШ-
IYGCKWWDIQCYDI
ATCTACGGTTGCAAATGGTGGGA
gly
CATCCAGTGCTACGACATC (SEQ ID NO: 177)
Миостатин-ТШ-
PDWCIDPDWWCKFW
CCGGACTGGTGCATCGATCCGGA
gly
CTGGTGGTGCAAATTCTGG (SEQ ID NO: 178)
Миостатин-ТШ-
QGHCTRWPWMCPPY
CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCC
gly
GTGGATGTGCCCGCCGTAC (SEQ ID NO: 179)
Миостатин-ТШ-
WQECYREGFWCLQT
TGGCAGGAATGCTACCGTGAAG
gly
GTTTCTGGTGCCTGCAGACC (SEQ ID NO: 180)
Миостатин-ТШ-
WFDCYGPGFKCWSP
TGGTTCGACTGCTACGGTCCGGG
gly
TTTCAAATGCTGGTCCCCG (SEQ ID NO: 181)
Миостатин-ТШ-
GVRCPKGHLWCLYP
GGTGTTCGTTGCCCGAAAGGTCA
gly
CCTGTGGTGCCTGTACCCG (SEQ ID NO: 182)
Миостатин-ТШ-
HWACGYWPWSCKWV
CACTGGGCTTGCGGTTACTGGCC
gly
GTGGTCCTGCAAATGGGTT (SEQ ID NO: 183)
Миостатин-ТШ-
GPACHSPWWWCVFG
GGTCCGGCTTGCCACTCCCCGTG
gly
GTGGTGGTGCGTTTTCGGT (SEQ ID NO: 184)
Миостатин-ТШ-
TTWCISPMWFCSQQ
ACCACCTGGTGCATCTCCCCGAT
gly
GTGGTTCTGCTCCCAGCAG (SEQ ID NO: 185)
Миостатин-ТШ-
HKFCPPWAIFCWDF
CACAAATTCTGCCCGCCGTGGGC
gly
TATCTTCTGCTGGGACTTC (SEQ ID NO: 186)
Миостатин-ТШ-
PDWCVSPRWYCNMW
CCGGACTGGTGCGTTTCCCCGCG
gly
TTGGTACTGCAACATGTGG (SEQ ID NO: 187)
Миостатин-ТШ-
VWKCHWFGMDCEPT
GTTTGGAAATGCCACTGGTTCGG
gly
TATGGACTGCGAACCGACC (SEQ ID NO: 188)
Миостатин-ТШ-
KKHCQPWTWMCAPK
AAAAAACACTGCCAGATCTGGA
gly
CCTGGATGTGCGCTCCGAAA (SEQ ID NO: 189)
Миостатин-ТШ-
WFQCGSTLFWCYNL
TGGTTCCAGTGCGGTTCCACCCT
gly
GTTCTGGTGCTACAACCTG (SEQ ID NO: 190)
Миостатин-ТШ-
WSPCYDHYFYCYTI
TGGTCCCCGTGCTACGACCACTA
gly
CTTCTACTGCTACACCATC (SEQ ID NO: 191)
Миостатин-ТШ-
SWMCGFFKEVCMWV
TCCTGGATGTGCGGTTTCTTCAA
gly
AGAAGTTTGCATGTGGGTT (SEQ ID NO: 192)
Миостатин-ТШ-
EMLCMIHPVFCNPH
GAAATGCTGTGCATGATCCACCC
GGTTTTCTGCAACCCGCAC (SEQ ID NO: 193)
Миостатин-ТШ-
LKTCNLWPWMCPPL
CTGAAAACCTGCAACCTGTGGCC
giy
GTGGATGTGCCCGCCGCTG (SEQ ID NO: 194)
Миостатин-ТШ-
VVGCKWYEAWCYNK
GTTGTTGGTTGCAAATGGTACGA
gly
AGCTTGGTGCTACAACAAA (SEQ ID NO: 195)
Миостатин-ТШ-
PIHCTQWAWMCPPT
CCGATCCACTGCACCCAGTGGGC
gly
TTGGATGTGCCCGCCGACC (SEQ ID NO: 196)
Миостатин-ТШ-
DSNCPWYFLSCVIF
GACTCCAACTGCCCGTGGTACTT
gly
CCTGTCCTGCGTTATCTTC (SEQ ID NO: 197)
Миостатин-ТШ-
HIWCNLAMMKCVEM
CACATCTGGTGCAACCTGGCTAT
gly
GATGAAATGCGTTGAAATG (SEQ ID NO: 198)
Миостатин-ТШ-
NLQCIYFLGKCIYF
AACCTGCAGTGCATCTACTTCCT
gly
GGGTAAATGCATCTACTTC (SEQ ID NO: 199)
Миостатин-ТШ-
AWRCMWFSDVCTPG
GCTTGGCGTTGCATGTGGTTCTC
gly
CGACGTTTGCACCCCGGGT (SEQ ID NO: 200)
Миостатин-ТШ-
WFRCFLDADWCTSV
TGGTTTCGTTGTTTTCTTGATGCT
gly
GATTGGTGTACTTCTGTT (SEQ ID NO: 201)
Миостатин-ТШ-
EKICQMWSWMCAPP
GAAAAAATTTGTCAAATGTGGTC
gly
TTGGATGTGTGCTCCACCA (SEQ ID NO: 202)
Миостатин-ТШ-
WFYCHLNKSECTEP
TGGTTTTATTGTCATCTTAATAA
gly
ATCTGAATGTACTGAACCA (SEQ ID NO: 203)
Миостатин-ТШ-
FWRCAIGIDKCKRV
TTTTGGCGTTGTGCTATTGGTATT
gly
GATAAATGTAAACGTGTT (SEQ ID NO: 204)
Миостатин-ТШ-
NLGCKWYEVWCFTY
AATCTTGGTTGTAAATGGTATGA
gly
AGTTTGGTGTTTTACTTAT (SEQ ID NO: 205)
Миостатин-ТШ-
IDLCNMWDGMCYPP
ATTGATCTTTGTAATATGTGGGA
gly
TGGTATGTGTTATCCACCA (SEQ ID NO: 206)
Миостатин-ТШ-
EMPCNIWGWMCPPV
GAAATGCCATGTAATATTTGGGG
gly
TTGGATGTGTCCACCAGTT (SEQ ID NO: 207)
Миостатин-
WFRCVLTGIVDWSECF
TGGTTCCGTTGCGTTCTGACCGG
gly
TN12-1
TATCGTTGACTGGTCCGAATGCT TCGGTCTG (SEQ ID NO: 208)
Миостатин-
GFSCTFGLDEFYVDCS
GGTTTCTCCTGCACCTTCGGTCT
gly
TN 12-2
GGACGAATTCTACGTTGACTGCT CCCCGTTC (SEQ ID NO: 209)
Миостатин-
LPWCHDQVNADWGF
CTGCCGTGGTGCCACGACCAGGT
gly
TN 12-3
CMLW
TAACGCTGACTGGGGTTTCTGCA TGCTGTGG (SEQ ID NO: 210)
Миостатин-
YPTCSEKFWIYGQTCV
TACCCGACCTGCTCCGAAAAATT
TN 12-4
CTGGATCTACGGTCAGACCTGCG TTCTGTGG (SEQ ID NO: 211)
Миостатин-
LGPCPIHHGPWPQYCV
CTGGGTCCGTGCCCGATCCACCA
giy
TN 12-5
CGGTCCGTGGCCGCAGTACTGCG TTTACTGG (SEQ ID NO: 212)
Миостатин-
PFPCETHQISWLGHCL
CCGTTCCCGTGCGAAACCCACCA
gly
TN 12-6
GATCTCCTGGCTGGGTCACTGCC TGTCCTTC (SEQ ID NO: 213)
Миостатин-
HWGCEDLMWSWHPL
CACTGGGGTTGCGAAGACCTGAT
gly
TN 12-7
CRRP
GTGGTCCTGGCACCCGCTGTGCC GTCGTCCG (SEQ ID NO: 214)
Миостатин-
LPLCDADMMPTIGFCV
CTGCCGCTGTGCGACGCTGACAT
gly
TN12-8
GATGCCGACCATCGGTTTCTGCG TTGCTTAC (SEQ ID NO: 215)
Миостатин-
SHWCETTFWMNYAK
TCCCACTGGTGCGAAACCACCTT
gly
TN 12-9
CVHA
CTGGATGAACTACGCTAAATGCG TTCACGCT (SEQ ID NO: 216)
Миостатин-
LPKCTHVPFDQGGFCL
CTGCCGAAATGCACCCACGTTCC
gly
TN12-10
GTTCGACCAGGGTGGTTTCTGCC TGTGGTAC (SEQ ID NO: 217)
Миостатин-
FSSCWSPVSRQDMFCV
TTCTCCTCCTGCTGGTCCCCGGTT
gly
TN12-11
TCCCGTCAGGACATGTTCTGCGT TTTCTAC (SEQ ID NO: 218)
Миостатин-
SHKCEYSGWLQPLCY
TCCCACAAATGCGAATACTCCGG
gly
TN12-13
TTGGCTGCAGCCGCTGTGCTACC GTCCG (SEQ ID NO: 219)
Миостатин-
PWWCQDNYVQHMLH
CCGTGGTGGTGCCAGGACAACT
gly
TN12-14
CDSP
ACGTTCAGCACATGCTGCACTGC GACTCCCCG (SEQ ID NO: 220)
Миостатин-
WFRCMLMNSFDAFQC
TGGTTCCGTTGCATGCTGATGAA
gly
TN12-15
VSY
CTCCTTCGACGCTTTCCAGTGCG TTTCCTAC (SEQ ID NO: 221)
Миостатин-
PDACRDQPWYMFMG
CCGGACGCTTGCCGTGACCAGCC
gly
TN12-16
CMLG
GTGGTACATGTTCATGGGTTGCA TGCTGGGT (SEQ ID NO: 222)
Миостатин-
FLACFVEFELCFDS
TTCCTGGCTTGCTTCGTTGAATTC
gly
TN12-17
GAACTGTGCTTCGACTCC (SEQ ID NO: 223)
Миостатин-
SAYCIITESDPYVLCVP
TCCGCTTACTGCATCATCACCGA
gly
TN12-18
ATCCGACCCGTACGTTCTGTGCG TTCCGCTG (SEQ ID NO: 224)
Миостатин-
PSICESYSTMWLPMCQ
CCGTCCATCTGCGAATCCTACTC
gly
TN12-19
CACCATGTGGCTGCCGATGTGCC AGCACAAC (SEQ ID NO: 225)
Миостатин-
WLDCHDDSWAWTKM
TGGCTGGACTGCCACGACGACTC
gly
TN 12-20
CRSH
CTGGGCTTGGACCAAAATGTGCC GTTCCCAC (SEQ ID NO: 226)
Миостатин-
YLNCVMMNTSPFVEC
TACCTGAACTGCGTTATGATGAA
gly
TN 12-21
VFN
CACCTCCCCGTTCGTTGAATGCG TTTTCAAC (SEQ ID NO: 227)
Миостатин-
YPWCDGFMIQQGITC
TACCCGTGGTGCGACGGTTTCAT
gly
TN 12-22
MFY
GATCCAGCAGGGTATCACCTGCA TGTTCTAC (SEQ ID NO: 228)
Миостатин-
FDYCTWLNGFKDWKC
TTCGACTACTGCACCTGGCTGAA
TN 12-23
WSR
CGGTTTCAAAGACTGGAAATGCT GGTCCCGT (SEQ ID NO: 229)
Миостатин-
LPLCNLKEISHVQACV
CTGCCGCTGTGCAACCTGAAAGA
giy
TN 12-24
AATCTCCCACGTTCAGGCTTGCG TTCTGTTC (SEQ ID NO: 230)
Миостатин-
SPECAFARWLGIEQCQ
TCCCCGGAATGCGCTTTCGCTCG
gly
TN 12-25
TTGGCTGGGTATCGAACAGTGCC AGCGTGAC (SEQ ID NO: 231)
Миостатин-
YPQCFNLHLLEWTEC
TACCCGCAGTGCTTCAACCTGCA
gly
TN 12-26
DWF
CCTGCTGGAATGGACCGAATGC GACTGGTTC (SEQ ID NO: 232)
Миостатин-
RWRCEIYDSEFLPKCW
CGTTGGCGTTGCGAAATCTACGA
gly
TN 12-27
CTCCGAATTCCTGCCGAAATGCT GGTTCTTC (SEQ ID NO: 233)
Миостатин-
LVGCDNVWHRCKLF
CTGGTTGGTTGCGACAACGTTTG
gly
TN 12-28
GCACCGTTGCAAACTGTTC (SEQ ID NO: 234)
Миостатин-
AGWCHVWGEMFGMG
GCTGGTTGGTGCCACGTTTGGGG
gly
TN 12-29
CSAL
TGAAATGTTCGGTATGGGTTGCT CCGCTCTG (SEQ ID NO: 235)
Миостатин-
HHECEWMARWMSLD
CACCACGAATGCGAATGGATGG
gly
TN12-30
CVGL
CTCGTTGGATGTCCCTGGACTGC GTTGGTCTG (SEQ ID NO: 236)
Миостатин-
FPMCGIAGMKDFDFC
TTCCCGATGTGCGGTATCGCTGG
gly
TN 12-31
VWY
TATGAAAGACTTCGACTTCTGCG TTTGGTAC (SEQ ID NO: 237)
Миостатин-
RDDCTFWPEWLWKLC
CGTGATGATTGTACTTTTTGGCC
gly
TN12-32
ERP
AGAATGGCTTTGGAAACTTTGTG AACGTCCA (SEQ ID NO: 238)
Миостатин-
YNFCSYLFGVSKEACQ
TATAATTTTTGTTCTTATCTTTTT
gly
TN12-33
GGTGTTTCTAAAGAAGCTTGTCA ACTTCCA (SEQ ID NO: 239)
Миостатин-
AHWCEQGPWRYGNIC
GCTCATTGGTGTGAACAAGGTCC
gly
TN12-34
MAY
ATGGCGTTATGGTAATATTTGTA TGGCTTAT (SEQ ID NO: 240)
Миостатин-
NLVCGKISAWGDEAC
AATCTTGTTTGTGGTAAAATTTC
gly
TN12-35
ARA
TGCTTGGGGTGATGAAGCTTGTG CTCGTGCT (SEQ ID NO: 241)
Миостатин-
HNVCTIMGPSMKWFC
CATAATGTTTGTACTATTATGGG
gly
TN12-36
WND
TCCATCTATGAAATGGTTTTGTT
GGAATGAT
(SEQ ID NO: 242)
Миостатин-
NDLCAMWGWRNTIW
AATGATCTTTGTGCTATGTGGGG
gly
TN12-37
CQNS
TTGGCGTAATACTATTTGGTGTC AAAATTCT (SEQ ID NO: 243)
Миостатин-
PPFCQNDNDMLQSLC
CCACCATTTTGTCAAAATGATAA
gly
TN 12-3 8
KLL
TGATATGCTTCAATCTCTTTGTA AACTTCTT (SEQ ID NO: 244)
Миостатин-
WYDCNVPNELLSGLC
TGGTATGATTGTAATGTTCCAAA
gly
TN12-39
RLF
TGAACTTCTTTCTGGTCTTTGTCG TCTTTTT (SEQ ID NO: 245)
Миостатин-
YGDCDQNHWMWPFT
TATGGTGATTGTGATCAAAATCA
gly
TN 12-40
CLSL
TTGGATGTGGCCATTTACTTGTC
ТТТСТСТТ (SEQ Ш N0: 246)
Миостатин-
GWMCHFDLHDWGAT
GGTTGGATGTGTCATTTTGATCT
giy
TN 12-41
CQPD
TCATGATTGGGGTGCTACTTGTC AACCAGAT (SEQ ID NO: 247)
Миостатин-
YFHCMFGGHEFEVHC
TATTTTCATTGTATGTTTGGTGGT
giy
TN 12-42
ESF
CATGAATTTGAAGTTCATTGTGA ATCTTTT (SEQ ID NO: 248)
Миостатин-
AYWCWHGQCVRF
GCTTATTGGTGTTGGCATGGTCA
giy
TN 12-43
ATGTGTTCGTTTT (SEQ ID NO: 249)
Миостатин-
SEHWTFTDWDGNEW
TCCGAACACTGGACCTTCACCGA
giy
линейный-1
WVRPF
CTGGGACGGTAACGAATGGTGG GTTCGTCCGTTC (SEQ ID NO: 250)
Миостатин-
MEMLDSLFELLKDMV
ATGGAAATGCTGGACTCCCTGTT
giy
линейный-2
PISKA
CGAACTGCTGAAAGACATGGTTC CGATCTCCAAAGCT (SEQ ID NO: 251)
Миостатин-
SPPEEALMEWLGWQY
TCCCCGCCGGAAGAAGCTCTGAT
giy
линейный-3
GKFT
GGAATGGCTGGGTTGGCAGTAC GGTAAATTCACC (SEQ ID NO: 252)
Миостатин-
SPENLLNDLYILMTKQ
TCCCCGGAAAACCTGCTGAACG
giy
линейный-4
EWYG
ACCTGTACATCCTGATGACCAAA CAGGAATGGTACGGT (SEQ ID NO: 253)
Миостатин-
FHWEEGIPFHVVTPYS
TTCCACTGGGAAGAAGGTATCCC
giy
линейный-5
YDRM
GTTCCACGTTGTTACCCCGTACT CCTACGACCGTATG (SEQ ID NO: 254)
Миостатин-
KRLLEQFMNDLAELV
AAACGTCTGCTGGAACAGTTCAT
giy
линейный-6
SGHS
GAACGACCTGGCTGAACTGGTTT CCGGTCACTCC (SEQ ID NO: 255)
Миостатин-
DTRDALFQEFYEFVRS
GACACCCGTGACGCTCTGTTCCA
giy
линейный-7
RLVI
GGAATTCTACGAATTCGTTCGTT CCCGTCTGGTTATC (SEQ ID NO: 256)
Миостатин-
RMSAAPRPLTYRDIMD
CGTATGTCCGCTGCTCCGCGTCC
giy
линейный-8
QYWH
GCTGACCTACCGTGACATCATGG ACCAGTACTGGCAC (SEQ ID NO: 257)
Миостатин-
NDKAHFFEMFMFDVH
AACGACAAAGCTCACTTCTTCGA
giy
линейный-9
NFVES
AATGTTCATGTTCGACGTTCACA ACTTCGTTGAATCC (SEQ ID NO: 258)
Миостатин-
QTQAQKIDGLWELLQ
CAGACCCAGGCTCAGAAAATCG
giy
линейный-10
SIRNQ
ACGGTCTGTGGGAACTGCTGCAG TCCATCCGTAACCAG (SEQ ID NO: 259)
Миостатин-
MLSEFEEFLGNLVHRQ
ATGCTGTCCGAATTCGAAGAATT
giy
линейный-11
CCTGGGTAACCTGGTTCACCGTC AGGAAGCT (SEQ ID NO: 260)
Миостатин-
YTPKMGSEWTSFWHN
TACACCCCGAAAATGGGTTCCGA
giy
линейный-12
RIHYL
ATGGACCTCCTTCTGGCACAACC GTATCCACTACCTG (SEQ ID NO:
261)
Миостатин-линейный-13
LNDTLLRELKMVLNSL SDMK
CTGAACGACACCCTGCTGCGTGA ACTGAAAATGGTTCTGAACTCCC TGTCCGACATGAAA (SEQ Ш N0: 262)
5 gly
Миостатин-линейный-14
FDVERDLMRWLEGFM QSAAT
TTCGACGTTGAACGTGACCTGAT GCGTTGGCTGGAAGGTTTCATGC AGTCCGCTGCTACC (SEQ ID N0: 263)
5 gly
Миостатин-линейный-15
HHGWNYLRKGSAPQ WFEAWV
CACCACGGTTGGAACTACCTGCG TAAAGGTTCCGCTCCGCAGTGGT TCGAAGCTTGGGTT (SEQ ID NO: 264)
5 gly
Миостатин-линейный-16
VESLHQLQMWLDQKL ASGPH
GTTGAATCCCTGCACCAGCTGCA GATGTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAC (SEQ ID NO: 265)
5 gly
Миостатин-линейный-17
RATLLKDFWQLVEGY GDN
CGTGCTACCCTGCTGAAAGACTT CTGGCAGCTGGTTGAAGGTTACG GTGACAAC (SEQ ID NO: 266)
5 gly
Миостатин-линейный-18
EELLREFYRFVSAFDY
GAAGAACTGCTGCGTGAATTCTA CCGTTTCGTTTCCGCTTTCGACTA С (SEQ ID NO: 267)
5 gly
Миостатин-линейный-19
GLLDEFSHFIAEQFYQ MPGG
GGTCTGCTGGACGAATTCTCCCA CTTCATCGCTGAACAGTTCTACC AGATGCCGGGTGGT (SEQ ID NO: 268)
5 gly
Миостатин-линейный-20
YREMSMLEGLLDVLE RLQHY
TACCGTGAAATGTCCATGCTGGA AGGTCTGCTGGACGTTCTGGAAC GTCTGCAGCACTAC (SEQ ID NO: 269)
5 gly
Миостатин-линейный-21
HNSSQMLLSELIMLVG SMMQ
CACAACTCCTCCCAGATGCTGCT GTCCGAACTGATCATGCTGGTTG GTTCCATGATGCAG (SEQ ID NO: 270)
5 gly
Миостатин-линейный-22
WREHFLNSDYIRDKLI AIDG
TGGCGTGAACACTTCCTGAACTC CGACTACATCCGTGACAAACTGA TCGCTATCGACGGT (SEQ ID NO: 271)
5 gly
Миостатин-линейный-23
QFPFYVFDDLPAQLEY WIA
CAGTTCCCGTTCTACGTTTTCGA CGACCTGCCGGCTCAGCTGGAAT ACTGGATCGCT (SEQ ID NO: 272)
5 gly
Миостатин-линейный-24
EFFHWLHNHRSEVNH WLDMN
GAATTCTTCCACTGGCTGCACAA CCACCGTTCCGAAGTTAACCACT GGCTGGACATGAAC (SEQ ID NO: 273)
5 gly
Миостатин-линейный-25
EALFQNFFRDVLTLSE REY
CGTGATGTTCTTACTCTTTCTGA ACGTGAATAT (SEQ ID NO: 274)
5 gly
N С
Миостатин-линейный -26
QYWEQQWMTYFREN GLHVQY
CAATATTGGGAACAACAATGGA TGACTTATTTTCGTGAAAATGGT CTTCATGTTCAATAT (SEQ ID NO: 275)
5 gly
Миостатин-
NQRMMLEDLWRIMTP
AATCAACGTATGATGCTTGAAGA
5 gly
линейный-27
MFGRS
TCTTTGGCGTATTATGACTCCAA TGTTTGGTCGTTCT (SEQ ID NO: 276)
Миостатин-линейный-29
FLDELKAELSRHYALD DLDE
TTTCTTGATGAACTTAAAGCTGA ACTTTCTCGTCATTATGCTCTTGA TGATCTTGATGAA (SEQ ID NO: 277)
5 gly
Миостатин-линейный-30
GKLIEGLLNELMQLET FMPD
GGTAAACTTATTGAAGGTCTTCT TAATGAACTTATGCAACTTGAAA CTTTTATGCCAGAT (SEQ ID NO: 278)
5 gly
N С
Миостатин-линейный-31
ILLLDEYKKDWKSWF
ATTCTTCTTCTTGATGAATATAA AAAAGATTGGAAATCTTGGTTT (SEQ ID NO: 279)
5 gly
Миостатин-2XTN8-19kc
QGHCTRWPWMCPPY GSGSATGGSGSTASSG SGSATGQGHCTRWPW MCPPY
CAGGGCCACTGTACTCGCTGGCC
GTGGATGTGCCCGCCGTACGGTT
CTGGTTCCGCTACCGGTGGTTCT
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCTACTGGTCAGGGTCA
CTGCACTCGTTGGCCATGGATGT
GTCCACCGTAT (SEQ ID NO: 280)
Миостатин-2XTN8-CON6
WYPCYEGHFWCYDLG SGSTASSGSGSATGWY PCYEGHFWCYDL
TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCA
CTTCTGGTGCTACGATCTGGGTT
CTGGTTCCACTGCTTCTTCTGGTT
CCGGTTCCGCTACTGGTTGGTAC
CCGTGCTACGAAGGTCACTTTTG
GTGTTATGATCTG (SEQ ID NO:
281)
5 gly
Миостатин-2XTN8-5 кс
HTPCPWFAPLCVEWG SGSATGGSGSTASSGS GSATGHTPCPWFAPLC VEW
CACACTCCGTGTCCGTGGTTTGC
TCCGCTGTGCGTTGAATGGGGTT
CTGGTTCCGCTACTGGTGGTTCC
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCAACTGGTCACACCCC
GTGCCCGTGGTTTGCACCGCTGT
GTGTAGAGTGG (SEQ ID NO: 282)
Миостатин-2XTN8-18kc
PDWCIDPDWWCKFW GSGSATGGSGSTASSG SGSATGPDWCIDPDW WCKFW
CCGGATTGGTGTATCGACCCGGA
CTGGTGGTGCAAATTCTGGGGTT
CTGGTTCCGCTACCGGTGGTTCC
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCAACTGGTCCGGACTG
GTGCATCGACCCGGATTGGTGGT
GTAAATTTTGG (SEQ ID NO: 283)
Миостатин-2XTN8-11 кс
ANWCVSPNWFCMVM GSGSATGGSGSTASSG SGSATGANWCVSPNW FCMVM
CCGGATTGGTGTATCGACCCGGA
CTGGTGGTGCAAATTCTGGGGTT
CTGGTTCCGCTACCGGTGGTTCC
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCAACTGGTCCGGACTG
GTGCATCGACCCGGATTGGTGGT
GTAAATTTTGG (SEQ ID NO; 284)
Миостатин-2XTN8-25 кс
PDWCIDPDWWCKFW GSGSATGGSGSTASSG SGSATGPDWCIDPDW WCKFW
ACCACTTGGTGCATCTCTCCGAT
GTGGTTCTGCTCTCAGCAGGGTT
CTGGTTCCACTGCTTCTTCTGGTT
CCGGTTCTGCAACTGGTACTACT
TGGTGTATCTCTCCAATGTGGTT
TTGTTCTCAGCAA (SEQ ID NO: 285)
Миостатин-2XTN8-23 кс
HWACGYWPWSCKWV GSGSATGGSGSTASSG SGSATGHWACGYWP WSCKWV
CACTGGGCATGTGGCTATTGGCC
GTGGTCCTGCAAATGGGTTGGTT
CTGGTTCCGCTACCGGTGGTTCC
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCAACTGGTCACTGGGC
TTGCGGTTACTGGCCGTGGTCTT
GTAAATGGGTT (SEQ ID NO: 286)
Миостатин-ТШ-29-19 кс
KKHCQIWTWMCAPK GSGSATGGSGSTASSG SGSATGQGHCTRWPW MCPPY
AAAAAACACTGTCAGATCTGGA
CTTGGATGTGCGCTCCGAAAGGT
TCTGGTTCCGCTACCGGTGGTTC
TGGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTC
CGGTTCCGCTACTGGTCAGGGTC
ACTGCACTCGTTGGCCATGGATG
TGTCCGCCGTAT (SEQ ID NO:
287)
Миостатин-ТШ-19-29 кс
QGHCTRWPWMCPPY GSGSATGGSGSTASSG SGSATGKKHCQIWTW MCAPK
CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCC
GTGGATGTGCCCGCCGTACGGTT
CTGGTTCCGCTACCGGTGGTTCT
GGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCC
GGTTCTGCTACTGGTAAAAAACA
CTGCCAGATCTGGACTTGGATGT
GCGCTCCGAAA (SEQ ID NO: 288)
Миостатин-ТШ-29-19 кп
KKHCQIWTWMCAPK GSGSATGGSGSTASSG SGSATGQGHCTRWPW MCPPY
AAAAAACACTGTCAGATCTGGA
CTTGGATGTGCGCTCCGAAAGGT
TCTGGTTCCGCTACCGGTGGTTC
TGGTTCCACTGCTTCTTCTGGTTC
CGGTTCCGCTACTGGTCAGGGTC
ACTGCACTCGTTGGCCATGGATG
TGTCCGCCGTAT (SEQ ID NO:
289)
Миостатин-ТШ-29-19-8g
KKHCQIWTWMCAPK GGGGGGGGQGHCTR WPWMCPPY
AAAAAACACTGCCAGATCTGGA CTTGGATGTGCGCTCCGAAAGGT GGTGGTGGTGGTGGCGGTGGCC AGGGTCACTGCACCCGTTGGCCG TGGATGTGTCCGCCGTAT (SEQ ID NO: 290)
8 gly
Миостатин-ТШ-19-29-6gc
QGHCTRWPWMCPPY GGGGGGKKHCQIWT WMCAPK
CAGGGTCACTGCACCCGTTGGCC GTGGATGTGCCCGCCGTACGGTG GTGGTGGTGGTGGCAAAAAACA CTGCCAGATCTGGACTTGGATGT GCGCTCCGAAA (SEQ ID NO: 291)
6 gly
Пример 3: Анализы in vitro
Анализ активности миостатина с использованием клеток С2С12
Указанный анализ демонстрирует нейтрализирующую миостатин способность исследуемого ингибитора с помощью измерения степени, с которой происходит ингибирование связывания миостатина с его рецептором.
Чувствительную к миостатину репортерную клеточную линию создавали путем трансфекции клеток - миобластов С2С12 (АТСС № CRL-1772) с помощью конструкта pMARE-luc. Конструкт pMARE-luc получали путем клонирования 12 повторов последовательности CAGA, представляющих чувствительные к миостатину/активину элементы (Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998)) в репортерный вектор pLuc-MCS (№ по кат. Stratagene 219087) выше против хода транскрипции бокса TATA. Клетки-миобласты С2С12 естественным образом экспрессируют на своей клеточной поверхности рецепторы миостатина/активина. Если миостатин связывается клеточными рецепторами, актвируется путь Smad и фосфорилированный Smad связывается с чувствительным элементом (Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996)), приводя к экспрессии гена люциферазы. Активность люцифераза затем измеряют с использованием коммерческого набора для репортерного люциферазного анализа (№ по кат. Е4550, Promega, Madison, WI) согласно протоколу производителя. Стабильную линию клеток С2С12, которые были трансфектированы с помощью pMARE-luc (клон C2C12/pMARE № 44) использовали для измерения активности миостатина согласно следующей процедуре.
Равные количества репортерных клеток (клон C2C12/pMARE № 44) помещали в 96-луночные культуры. Первый раунд скрининга с использованием двух разведений пептител проводили с концентрацией миостатина, зафиксированной на 4 нМ. Рекомбинантный зрелый миостатин предварительно инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре с пептителами в концентрации 40 нМ и 400 нМ, соответственно. Репортерную клеточную культуру обрабатывали миостатином с пептителами или без них в течение шести часов. Активность миостатина измеряли путем определения люциферазной активности в обработанных культурах. Настоящий анализ использовали для изначальной идентификации наиболее активных пептител, которые ингибировали активность передачи сигнала миостатина в репортерном анализе. Впоследствии создавали состоящую из девяти точек титрационную кривую с концентрацией миостатина, зафиксированной на 4 нМ. Миостатин предварительно инкубировали с каждой из следующих девяти концентраций пептител: 0,04 мМ, 0,4 нМ, 4 нМ, 20 нМ, 40 нМ, 200 нМ, 400 нМ, 2 мкМ и 4 мкМ в течение двух часов перед добавлением смеси к репортерной клеточной культуре. Значения IC50 для ряда иллюстративных пептител представлены в таблицах III и для пептител с созревшей аффинностью в таблице VIII.
Анализ BIAcore
Анализ аффинности каждого кандидатного пептитела к миостатину проводили на приборе BJAcore(r)3000 (Biacore, Inc., Piscataway, N1) с использованием сенсорного чипа СМ5 и 0,005% поверхностно-активного вещества Р20 (Biacore, Inc.) в качестве подвижного буфера. Рекомбинантный зрелый белок миостатин иммобилизировали на сенсорном чипе СМ5 высокой чистоты (Biacore, Inc.) посредством групп первичных аминов с использованием набора для сочетания аминов Amine Coupling Kit (Biacore, Inc.) согласно предложенному производителем протоколу.
Анализы прямого связывания использовали для скрининга и ранжирования пептител в порядке их способности связываться с иммобилизированным миостатином. Анализы связывания проводили путем введения двух концентраций (40 и 400 нМ) каждого кандидатного миостатинсвязывающего пептитела на поверхность с иммобилизированным миостатином с объемной скоростью потока, составляющей 50 мкл/мин в течение 3 минут. По истечению времени диссоциации, составляющего 3 минут, поверхность восстанавливали. Кривые связывания сравнивали качественно в отношении интенсивности сигнала связывания, а также в отношении скорости диссоциации. Кинетические параметры связывания пептител, включая в себя ка (константу скорости ассоциации), kd (константу скорости диссоциации) и KD (равновесную константу диссоциации) определяли с использованием компьютерной программы оценки BIA 3.1 (Biacore, Inc.). Чем ниже равновесные константы диссоциации (выраженные в нМ), тем выше аффинность пептитела к миостатину. Примеры значений KD пептител показаны в таблице III и таблице VI для пептител с созревшей аффинностью ниже.
Анализ блокирования на поверхности ActRIIB/Fc
Анализы блокирования проводили с использованием иммобилизированного ActRIIB/Fc (R &D Systems, Minneapolis, MN) и миостатина в присутствии и при отсутствии пептител с помощью системы для анализа BIAcore(r). Анализы использовали для классификации пептител на не нейтрализующие (те, которые не предотвращали связывание миостатина с ActRIIB/Fc) или нейтрализующие (те, которые предотвращали связывание миостатина с ActRIIB/Fc). Исходное связывание миостатин-ActRIIB/Fc вначале определяли при отсутствии какого-либо пептитела.
Для исследований раннего скрининга пептитела разбавляли до 4 нМ, 40 нМ и 400 нМ в буфере для образца и инкубировали с 4 нМ миостатина (также разбавленного в буфере для образца). Смеси пептитело:лиганд оставляли до достижения равновесного
состояния при комнатной температуре (по меньшей мере в течение 5 часов) и затем вводили на поверхность иммобилизированного ActRJJB/Fc в течение 20 - 30 минут с объемной скоростью потока, составляющей 10 мкл/мин. Ответ в виде увеличенного связывания (по сравнению с контрольным связыванием при отсутствии пептитела) указывает на то, что связывание пептитела с миостатином было не нейтрализующим. Ответ в виде пониженного связывания (по сравнению с контролем) указывает на то, что связывание пептитела с миостатином блокировало связывание миостатина с ActRIIB/Fc. Дополнительно определяли характеристики выбранных пептител с использованием анализа блокирования полной серии концентраций для получения значений IC50 (для нейтрализующих пептител) или ЕС50 (для не нейтрализующих пептител). Образцы пептител серийно разбавляли от 200 нМ до 0,05 мМ в буфере для образца и инкубировали с 4 мМ миостатина при комнатной температуре до достижения равновесия (минимум пять часов) пред введением на поверхность иммобилизированного ActRIIB/Fc в течение 20 - 30 минут с объемной скоростью потока, составляющей 10 мкл/мин. После введения образца связанному лиганду оставляли для диссоциации от рецептора в течение 3 минут. Значения IC50 для каждого пептитела в присутствии 4 нМ миостатина рассчитывали путем построения графика зависимости сигнала связывания от концентрации пептитела. Обнаружили, например, что пептитела TN8-19, L2 и L17 ингибируют активность миостатина в клеточном анализе, но связывание TN-8-19 не блокирует взаимодействия миостатин/ActRIIB/Fc, указывая на то, что TN-8-19 связывается с другим эпитопом, чем тот, который наблюдается для других двух пептител.
Сортировка эпитопа для пептител
Очищенное пептитело иммобилизировали на чипе BIAcore для захвата миостатина до введения второго пептитела и определяли количество вторичного пептитела, связанного с захваченным миостатином. Только пептитела с отличающимися эпитопами будут связываться с захваченным миостатином, таким образом, обеспечивая сортировку пептител со сходными или различными свойствами связывания с эпитопом. Например, было показано, что пептитела TN8-19 и L23 связываются с различными эпитопами на миостатине.
Анализы селективности
Указанные анализы проводили с использованием технология BIAcore(r) для определения селективности связывания пептител с другими представителями семейства TGFB. ActRIIB/Fc, TGFBRII/Fc и BMPR-1A/Fc (все приобретены в R & D
Systems, Minneapolis, MN) ковалентно соединяли с сенсорными чипами высокой степени чистоты согласно предложенному производителем протоколу. Поскольку анализы BIAcore обнаруживают изменения показателя преломления, различие между ответом, обнаруженным при введении на поверхности иммобилизированного рецептора по сравнению с ответом, обнаруженным при введении контрольную поверхность при отсутствии какого-либо пептитела, представляет фактическое связывание активина A, TGFpi, TGFP3 и ВМР4 с рецепторами, соответственно. При предварительной инкубации пептител и молекул TGFP изменение (увеличение или уменьшение) в ответах связывания указывает на связывание пептитела с семейством молекул TGFp. Все пептитела согласно настоящему изобретению связываются с миостатином, но не с активином A, TGFpi, TGFP3 или ВМР4. Равновесные анализы KinEx А(tm)
Анализы равновесного связывания с использованием растворов с применением технологии KinExA(tm) (Sapidyne Instruments, Inc.) использовали для определения равновесной константы диссоциации (KD) связывания миостатина с молекулами пептител. Этот анализ с использованием растворов в некоторых случаях считается более чувствительным, чем анализ BIAcore. На Reacti-Gel(tm) 6Х предварительно наносили приблизительно 50 мкг/мл миостатина в течение ночи и затем блокировали с помощью BSA. 30 пМ и 100 пМ образцов пептител инкубировали с различными концентрациями (0,5 пМ - 5 нМ) миостатина в буфере для образца при комнатной температуре в течение 8 часов перед пропусканием через покрытые миостатином гранулы. Количество связанного с гранулами пептитела подсчитывали с помощью флуоресцентно (Су5) меченого антитела козы к Fc человека в концентрации 1 мг/мл в суперблоке. Сигнал связывания пропорционален концентрации свободного пептитела в равновесии с данной концентрацией миостатина. KD получали из нелинейной регрессии конкурентных кривых с использованием модели двойной кривой гомогенного связывания с одним сайтом, представленной в программном обеспечении KinEx А(tm) (Sapidyne Instruments, Inc.).
Пример 4: Сравнение ингибиторов миостатина
Способность трех иллюстративных пептител первого раунда связываться с (KD) и ингибировать (IC50) сравнивали со значениями KD И IC50, полученными для белка слияния растворимого рецептора actRIIB/Fc (R &D Systems, Inc., Minneapolis, Minn.). Значения IC50 определяли с использованием клеточного анализа pMARE luc,
Пептитела характеризуются значением IC50, которое является улучшенным по сравнению с ингибитором слияния рецептор/Fc и аффинностями связывания, которые сопоставимы у двух пептител со слиянием рецептор/Fc.
Пример 5: Сравнение способности пептида и пептитела ингибировать миостатин
Следующую пептидную последовательность: QGHCTRWPWMCPPY (TN8-19) (SEQ ID NO: 33) использовали для конструирования соответствующего пептитела TN8-19(pb) согласно процедуре, описанной в примере 2 выше. Как пептид отдельно, так и пептитело подвергали скринингу в отношении активности ингибирования миостатина с использованием анализа с применением С2С12, описанного в примере 3 выше. На фигуре 1 можно увидеть, что IC50 (эффективная концентрация для 50% ингибирования миостатина) для пептитела существенно меньше, чем таковая у пептида, и, таким образом, способность пептида ингибировать активность миостатина была существенно улучшена путем помещения его в конфигурацию пептитела.
Пример 6: Создание пептидов и пептител с созревшей аффинностью Некоторые из пептидов первого раунда, используемые для создания пептител, выбирали для созревания аффинности. Выбранные пептиды включали в себя следующие: TN8-19 с ограниченной остатками цистеина конфомационной свободой,
QGHCTRWPWMCPPY (SEQ ID NO: 33), и
линейные
пептиды:
линейный-2
MEMLDSLFELLKDMVPISKA (SEQ Ш
NO:
104);
линейный-15
HHGWN YLRKGS APQWFE A W V (SEQ. Ш
NO:
117);
линейный-17
RATLLKDFWQLVEGYGDN (SEQ ID
NO:
119);
линейный-20
YREMSMLEGLLDVLERLQHY (SEQ ID
NO:
122),
линейный-21
HNS S QMLLS ELIMLVGS MMQ (SEQ Ш
NO:
123),
линейный-24
EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN (SEQ ID NO: 126). На основании консенсусной последовательности создавали направленные вторичные библиотеки фагового дисплея, в которых "коровые" аминокислоты (определенные из консенсусной последовательности) либо сохранялись неизменными, либо смещенными в отношении частоты из встречаемости. Альтернативно, отдельную пептидную последовательность могли использовать для создания смещенной, направленной библиотеки фагового дисплея. Пэннинг таких библиотек при более жестких условиях может давать в результате пептиды с усиленным связыванием с миостатином, селективным связыванием с миостатином или с некоторым дополнительным требуемым свойством. Получение допированных олигонуклеотидов для библиотек В синтезаторе ДНК синтезировали олигонуклеотиды, которые являлись на 91% "допированной" на коровых последовательностях, то есть каждый раствор представлял собой 91% представленного основания (A, G, С или Т), и 3% каждого из других 3 нуклеотидов. Для семейства TN8-19, например, 91% допированный олигонуклеотид, используемый для конструирования вторичной фаговой библиотеки, являлся следующим:
5'-С AC AGT GCA С AG GGT NNK NNK NNK саК ggK саК tgK асК cgK tgK ссК tgK atK tgK ссК ссК taK NNK NNK NNK CAT TCT CTC GAG АТС A-3' (SEQ Ш NO: 634)
где "N" указывает на то, что каждый из четырех нуклеотидов А, Т, С и G был представлен в равной степени, К указывает на то, что G и Т представлены в равной степени и строчная буква обозначает смесь 91% указанного основания и 3% каждого из других оснований. Семейство олигонуклеотидов, полученных таким образом, амплифицировали с помощью ПЦР, как описано выше, лигировали в фагемидные векторы, например, модифицированную плазмиду pCES 1 (Dyax) или любой доступный фагемдный вектор согласно описанному выше протоколу. Все созданные вторичные фаговые библиотеки являлись на 91% допированными и содержали 1 - 6,5х 109 независимых трансформантов. Библиотеки подвергали пэннингу, как описано выше, но при следующих условиях:
1 раунд пэннинга:
12 13
Исходное количество фагов: 101" - 10" КОЕ фагемиды
Способ селекции: селекция с использованием пробирки Nunc Immuno Tube
Отрицательная селекция: 2 X с использованием пробирок Nunc Immuno,
покрытых 2% BSA в течение 10 мин каждая
Покрытие для пэннинга: покрывают с помощью 1 мкг белка миостатина в 1 мл 0,1 М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 3 часа
Условия отмывки: 6 X PBST с содержанием 2% молока; 6 X PBST; 2 X PBS Условие элюирования: элюирование в 100 мМ TEA
2 раунд пэннинга:
Исходное количество фагов: 1011 КОЕ фагемиды
Способ селекции: селекция с использованием пробирки Nunc Immuno Tube
Отрицательная селекция: 2 X с использованием пробирок Nunc Immuno, покрытых 2% BSA в течение 30 мин каждая
Покрытие для пэннинга: покрывают с помощью 1 мкг белка миостатина в 1 мл 0,1 М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 1 час
Условия отмывки: 15 X PBST с содержанием 2% молока, 1 X PBST с содержанием 2% молока в течение 1 ч, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST в течение 1 ч, 10 X PBST и 3 X PBS
Условие элюирования: элюирование в 100 мМ TEA
3 раунд пэннинга:
Исходное количество фагов: 1010 КОЕ фагемиды
Способ селекции: селекция с использованием пробирки Nunc Immuno Tube
Отрицательная селекция: 6 X с использованием пробирок Nunc Immuno, покрытых 2% BSA в течение 10 мин каждая.
Покрытие для пэннинга: покрывают с помощью 0,1 мкг белка миостатина в 1 мл 0,1 М натрийкарбонатного буфера (рН 9,6)
Время связывания: 1 час
Условия отмывки: 15 X PBST с содержанием 2% молока, 1 X PBST с содержанием 2% молока в течение 1 ч, 10 X 2%-BSA-PBST, 1 X 2%-BSA-PBST в течение 1 ч, 10 X PBST и 3 X PBS
Условие элюирования: элюирование в 100 мМ TEA
Пэннинг вторичных библиотек давал в результате пептиды с усиленным связыванием с миостатином. Отдельные выбранные клоны подвергали описанному выше фаговому ELISA и секвенировали.
Следующие пептиды семейства TN8-19 с созревшей аффинностью показаны в таблице IV ниже.
Таблица IV: Пептидные последовательности пептител TN*-19 с созревшей аффинностью
Пептитело с
созревшей
SEQ ID
Пептидная последовательность
аффинностью
NO:
mTN8-19-l
305
VALHGQCTRWPWMCPPQREG
mTN8-19-2
306
YPEQGLCTRWPWMCPPQTLA
mTN8-19-3
307
GLNQGHCTRWPWMCPPQDSN
mTN8-19-4
308
MITQGQCTRWPWMCPPQPSG
mTN8-19-5
309
AGAQEHCTRWPWMCAPNDWI
310
GVNQGQCTRWRWMCPPNGW
mTN8-19-6
311
LADHGQCIRWPWMCPPEGW
mTN8-19-7
mTN8-19-8
312
ILEQAQCTRWPWMCPPQRGG
mTN8-19-9
313
TQTHAQCTRWPWMCPPQWEG
mTN8-19-10
314
VVTQGHCTLWPWMCPPQRWR
mTN8-19-ll
315
IYPHDQCTRWPWMCPPQPYP
316
SYWQGQCTRWPWMCPPQWR
mTN8-19-12
317
MWQQGHCTRWPWMCPPQGW
mTN8-19-13
mTN8-19-14
318
EFTQWHCTRWPWMCPPQRSQ
mTN8-19-15
319
LDDQWQCTRWPWMCPPQGFS
mTN8-19-16
320
YQTQGLCTRWPWMCPPQSQR
mTN8-19-17
321
ESNQGQCTRWPWMCPPQGGW
mTN8-19-18
322
WTDRGPCTRWPWMCPPQANG
mTN8-19-19
323
VGTQGQCTRWPWMCPPYETG
mTN8-19-20
324
PYEQGKCTRWPWMCPPYEVE
mTN8-19-21
325
SEYQGLCTRWPWMCPPQGWK
mTN8-19-22
326
TFS QGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-23
327
PGAHDHCTRWPWMCPPQSRY
328
VAEEWHCRRWPWMCPPQDW
mTN8-19-24
mTN8-19-25
329
VGTQGHCTRWPWMCPPQPAG
mTN8-19-26
330
EEDQAHCRSWPWMCPPQGWV
mTN8-19-27
331
ADTQGHCTRWPWMCPPQHWF
mTN8-19-28
332
S GPQGHCTRWPWMC APQGWF
mTN8-19-29
333
TLVQGHCTRWPWMCPPQRWV
mTN8-19-30
334
GMAHGKCTRWAWMCPPQSW
mTN8-19-31
335
ELYHGQCTRWPWMCPPQSWA
336
VADHGHCTRWPWMCPPQGW
mTN8-19-32
mTN8-19-33
337
PESQGHCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19-34
338
IPAHGHCTRWPWMCPPQRWR
mTN8-19-35
339
FTVHGHCTRWPWMCPPYGWV
mTN8-19-36
340
PDFPGHCTRWRWMCPPQGWE
mTN8-19-37
341
QLWQGPCTQWPWMCPPKGRY
342
HANDGHCTRWQWMCPPQWG
mTN8-19-38
mTN8-19-39
343
ETDHGLCTRWPWMCPPYGAR
344
GTWQGLCTRWPWMCPPQGW
mTN8-19-40
mTN8-19 conl
345
VATQGQCTRWPWMCPPQGWG
mTN8-19 con2
346
VATQGQCTRWPWMCPPQRWG
mTN8 сопб-1
347
QREWYPCYGGHLWCYDLHKA
mTN8 con6-2
348
ISAWYSCYAGHFWCWDLKQK
349
WTGWYQCYGGHLWCYDLRR
mTN8 сопб-3
mTN8 con6-4
350
KTFW YPC YDGHFWC YNLKS S
mTN8 con6-5
351
ESRWYPCYEGHLWCFDLTET
Консенсусная последовательность, полученная из TN-8-19- 1 - Соп2 с созревшей аффинностью (исключая последовательности mTN8 сопб), показанная выше, представляет собой: CaiaAVa^WMCPP (SEQ ID NO: 352). Все эти пептиды содержат последовательность WMCPP (SEQ Ш N0: 633). Подчеркнутые аминокислоты представляют коровые аминокислоты, присутствующие во всех вариантах осуществления, и аь аг и аз выбраны из нейтральной гидрофобной, нейтральной полярной или основной аминокислоты. Согласно одному варианту осуществления указанной консенсусной последовательности, Cbib?Wb^WMCPP (SEQ Ш NO: 353), bi выбран из любой из аминокислот Т, I или R; Ьг выбран из любой из R, S, Q; и Ьз выбран из любой из Р, R и Q. Все пептиды содержат последовательность WMCPP (SEQ ID NO: 633). Более подробный анализ последовательностей TN8 с созревшей аффинностью, содержащих SEQ ID NO: 352, предусматривает следующую формулу:
ciC2C3C4C5C6Cc7C8Wc9WMCPPcioCiiCi2Ci3 (SEQ ID NO: 354), где:
ci отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
С2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
сз отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
С4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
С5 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
Сб отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
cj представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
eg представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
С9 представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту; и где
сю - ев представляет собой любую аминокислоту.
Согласно одному варианту осуществления описанного выше состава Ъу выбран из любой из аминокислот Т, I или R; bg выбран из любой из R, S, Q; и Ъд выбран из любой из Р, R и Q. Указанное представлено следующей последовательностью:
d1d2d3d4d5d6Cd7d8Wd9WMCPP d^nd^d^ (SEQ ID NO: 355).
di отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
d2 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
d3 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
d4 отсутствует или представляет собой любую аминокислоту;
ds отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или кислую аминокислоту;
d6 отсутствует или представляет собой нейтральную гидрофобную, нейтральную полярную или основную аминокислоту;
dj выбран из любой из аминокислот Т, I или R;
dg выбран из любой из R, S, Q;
dg выбран из любой из Р, R и Q
и dio - di3 выбраны из любой аминокислоты.
Консенсусная последовательность серии mTN8 сопб представляет собой WYeie2Ye3G, (SEQ ID NO: 356), где ei представляет собой Р, S или Y; е2 представляет собой С или Q, и ез представляет собой G или Н.
В дополнение к семейству TN-19 с созревшей аффинностью дополнительные пептиды с созревшей аффинностью получали из линейных пептидов L-2, L-15, L-17, L-20, L-21 и L-24 первого раунда. Указанные семейства представлены в таблице V ниже.
Таблица V: Дополнительные пептиды с созревшей аффинностью
Пептитело с
SEQ ID
созревшей
NO:
Пептидная
аффинностью
последовательность
104
MEMLDSLFELLKDMVPISKA
mL2-Conl
357
RMEMLESLLELLKEIVPMS KAG
mL2-Con2
358
RMEMLESLLELLKEIVPMSKAR
mL2-l
359
RMEMLESLLELLKDIVPMSKPS
mL2-2
360
GMEMLESLFELLQEIVPMSKAP
mL2-3
361
RMEMLESLLELLKDIVPISNPP
mL2-4
362
RIEMLESLLELLQEIVPISKAE
mL2-5
363
RMEMLQSLLELLKDIVPMSNAR
mL2-6
364
RMEMLESLLELLKEIVPTSNGT
mL2-7
365
RMEMLESLFELLKEIVPMSKAG
mL2-8
366
RMEMLGSLLELLKEIVPMSKAR
mL2-9
367
QMELLDSLFELLKEIVPKSQPA
mL2-10
368
RMEMLDSLLELLKEIVPMSNAR
mL2-ll
369
RMEMLESLLELLHEIVPMSQAG
mL2-12
370
QMEMLESLLQLLKEIVPMSKAS
mL2-13
371
RMEMLDSLLELLKDMVPMTTGA
mL2-14
372
RIEMLESLLELLKDMVPMANAS
mL2-15
373
RMEMLESLLQLLNEIVPMSRAR
mL2-16
374
RMEMLESLFDLLKELVPMSKGV
mL2-17
375
RIEMLESLLELLKDIVPIQKAR
mL2-18
376
RMELLESLFELLKDMVPMSDSS
mL2-19
377
RMEMLESLLEVLQEIVPRAKGA
mL2-20
378
RMEMLD S LLQLLNEI VPMS H AR
mL2-21
379
RMEMLESLLELLKDIVPMSNAG
mL2-22
380
RMEMLQSLFELLKGMVPISKAG
mL2-23
381
RMEMLESLLELLKEIVPNSTAA
mL2-24
382
RMEMLQSLLELLKEIVPISKAG
mL2-25
383
RIEMLD S LLELLNEL VPMS К AR
L-15
117
HHGWNYLRKGSAPQWFEAWV
mL15-conl
384
QVESLQQLLMWLDQKLASGPQG
mL15-l
385
RMELLESLFELLKEMVPRSKAV
mL15-2
386
QAVSLQHLLMWLDQKLASGPQH
mL15-3
387
DEDSLQQLLMWLDQKLASGPQL
mL15-4
388
PVASLQQLLIWLDQKLAQGPHA
mL15-5
389
EVDELQQLLN WLDHKLAS GPLQ
mL15-6
390
DVESLEQLLMWLDHQLASGPHG
mL15-7
391
QVDSLQQVLLWLEHKLALGPQV
mL15-8
392
GDESLQHLLMWLEQKLALGPHG
mL15-9
393
QIEMLESLLDLLRDMVPMSNAF
mL15-10
394
EVDSLQQLLMWLDQKLASGPQA
mL15-ll
395
EDESLQQLLIYLDKMLSSGPQV
mL15-12
396
AMDQLHQLLIWLDHKLASGPQA
mL15-13
397
RIEMLESLLELLDEIALIPKAW
mL15-14
398
EVVSLQHLLMWLEHKLASGPDG
mL15-15
399
GGESLQQLLMWLDQQLASGPQR
mL15-16
400
GVESLQQLLIFLDHMLVSGPHD
mL15-17
401
N VES LEHLMM WLERLL AS GP Y A
mL15-18
402
QVDSLQQLLIWLDHQLASGPKR
mL15-19
403
EVESLQQLLMWLEHKLAQGPQG
mL15-20
404
EVDSLQQLLMWLDQKLASGPHA
mL15-21
405
EVDSLQQLLMWLDQQLASGPQK
mL15-22
406
G VEQLPQLLM WLEQKL AS GPQR
mL15-23
407
GEDSLQQLLMWLDQQLAAGPQV
mL15-24
408
ADDSLQQLLMWLDRKLASGPHV
mL15-25
409
PVDSLQQLLIWLDQKLASGPQG
L-17
119
RATLLKDFWQLVEGYGDN
mL17-conl
410
DWRATLLKEFWQLVEGLGDNLV
mL17-con2
411
QSRATLLKEFWQLVEGLGDKQA
mL17-l
412
DGRATLLTEFWQLVQGLGQKEA
mL17-2
413
LARATLLKEFWQLVEGLGEKVV
mL17-3
414
GSRDTLLKEFWQLVVGLGDMQT
mL17-4
415
DARATLLKEFWQLVDAYGDRMV
mL17-5
416
NDRAQLLRDFWQLVDGLGVKSW
mL17-6
417
GVRETLLYELWYLLKGLGANQG
mL17-7
418
QARATLLKEFCQLVGCQGDKLS
mL17-8
419
QER ATLLKEF WQL V AGLGQNMR
mL17-9
420
SGRATLLKEFWQLVQGLGEYRW
mL17-10
421
TMRATLLKEFWLFVDGQREMQW
mL17-ll
422
GERATLLNDFWQLVDGQGDNTG
mL17-12
423
DERETLLKEFWQLVHGWGDNVA
mL17-13
424
GGRATLLKELWQLLEGQGANLV
mL17-14
425
TARATLLNELVQLVKGYGDKLV
mL17-15
426
GMRATLLQEFWQLVGGQGDNWM
mL17-16
427
STRATLLNDLWQLMKGWAEDRG
mL17-17
428
SERATLLKELWQLVGGWGDNFG
mL17-18
429
VGRATLLKEFWQLVEGLVGQSR
mL17-19
430
EIRATLLKEFWQLVDEWREQPN
mL17-20
431
QLRATLLKEFLQLVHGLGETDS
mL17-21
432
TQRATLLKEFWQLIEGLGGKHV
mL17-22
433
HYRATLLKEFWQLVDGLREQGV
mL17-23
434
QSRVTLLREFWQLVESYRPIVN
mL17-24
435
LSRATLLNEFWQFVDGQRDKRM
mL17-25
436
WDRATLLNDFWHLMEELSQKPG
mL17-26
437
QERATLLKEFWRMVEGLGKNRG
mL17-27
438
NERATLLREFWQLVGGYGVNQR
L-20
122
YREMSMLEGLLDVLERLQHY
mL20-l
439
HQRDMSMLWELLDVLDGLRQYS
mL20-2
440
TQRDMSMLDGLLEVLDQLRQQR
mL20-3
441
TSRDMSLLWELLEELDRLGHQR
mL20-4
442
MQHDMSMLYGLVELLESLGHQI
mL20-5
443
WNRDMRMLESLFEVLDGLRQQV
mL20-6
444
GYRDMSMLEGLLAVLDRLGPQL
mL20 conl
445
TQRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR
mL20 con2
446
WYRDMSMLEGLLEVLDRLGQQR
L-21
123
HNSSQMLLSELIMLVGSMMQ
mL21-l
447
TQNSRQMLLSDFMMLVGSMIQG
mL21-2
448
MQTSRHILLSEFMMLVGSIMHG
mL21-3
449
HDNSRQMLLSDLLHLVGTMIQG
mL21-4
450
MENSRQNLLRELIMLVGNMSHQ
mL21-5
451
QDTSRHMLLREFMMLVGEMIQG
mL21 conl
452
DQNSRQMLLSDLMILVGSMIQG
L-24
126
EFFHWLHNHRSEVNHWLDMN
mL24-l
453
NVFFQWVQKHGRVVYQWLDINV
mL24-2
454
FDFLQWLQNHRSEVEHWLVMDV
Представленные в таблицах IV и V пептиды с созревшей аффинностью затем объединяли в пептитела, как описано выше, и анализировали с использованием in vivo анализов.
Пептиды с созревшей аффинностью L2 содержат консенсусную последовательность f 1EML17SL1414LL, (SEQ ID NO: 455), где fi представляет собой M или I; i2 представляет собой любую аминокислоту; Гз представляет собой L или F; и 14 представляет собой Е, Q или D.
Семейство пептидов с созревшей аффинностью L15 содержит последовательность Lgig?LLg3g4L, (SEQ ID NO: 456), где gi представляет собой Q, D или E, g2 представляет собой S, Q, D или E, g3 представляет собой любую аминокислоту, и g4 представляет собой L, W, F или Y. Семейство с созревшей аффинностью L17 содержит последовательность: h^hshihshelv/hghg (SEQ ID NO: 457), где hi представляет собой R или D; I12 представляет собой любую аминокислоту; Ьз представляет собой А, Т S или Q; 1ц представляет собой L или М; hs представляет собой L или S; he представляет собой любую аминокислоту; I17 представляет собой F или Е; h§ представляет собой W, F или С; и I19 представляет собой L, F, М или К. Консенсусные последовательности также можно определить для показанных выше семейств пептидов mL20, mL21 и mL24.
Пептитела конструировали из указанных пептидов с созревшей аффинностью, описанных выше, с использованием линкера, прикрепленного к Fc-домену IgGl
человека, с SEQ ID NO: 296, на N-конце (N-конфигурация), на С-конце ОС-конфигурация) Fc или как N-, так и на С-концах (^С-конфигурации), как описано в примере 2 выше. Названные пептиды прикрепляли к С- или N-концам посредством линкерной последовательности из 5 остатков глицина (5G), 8 остатков глицина или к линкерной последовательности. В варианте пептитела 2Х пептиды соединяли с такими линкерами, как 5 gly, 8 gly или к. Пептиды и пептитела с созревшей аффинностью обозначают строчной буквой "ш", например, mTN8-19-22. Пептитела согласно настоящему изобретению дополнительно содержат два сплайс-сайта, где пептиды сплайсировались в фагемидные векторы. Положение указанных сплайс-сайтов представляет собой AQ-пептид-LE. Пептитела, как правило, включают в себя указанные дополнительные аминокислоты (хотя они могут не быть включены в пептидные последовательности, приведенные в таблицах). В некоторых пептителах аминокислоты LE удаляли из пептидных последовательностей. Такие пептитела обозначают как -LE.
Иллюстративные пептитела и иллюстративные полинуклеотидные последовательности, кодирующие их, представлены в таблице VI ниже. В эту таблицу включены примеры последовательностей пептител (а не только пептида), такие как 2х mTN8-19-7 (SEQ ID NO: 615) и пептитела с подвергнутыми делеции последовательностями LE (SEQ ID NO: 617). С целью объяснения линкерные последовательности в версиях 2х относятся к линкеру между тандемными пептидами. Указанные последовательности пептител содержат Fc, линкеры, последовательности AQ и LE. Прилагаемая нуклеотидная последовательность кодирует пептидную последовательность в дополнение к линкерным последовательностям AQ/LE, если они присутствуют, но не кодирует обозначенный линкер.
Таблица VI: Название пептитела, пептидная, нуклеотидная последовательность, линкер и конец
Название пептитела
Пептид
Нуклеотидная последовательность (SEQ ID No)
Линкер
Конец
mL2-Conl
RMEMLESLLELL KEIVPMSKAG
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 458)
5 gly
mL2-Con2
RMEMLESLLELL KEIVPMSKAR
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 459)
5 gly
mL2-l
RMEMLESLLELL KDIVPMSKPS
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAAACCATCT (SEQ ID NO:
5 gly
460)
mL2-2
GMEMLES LFELL QEIVPMSKAP
GGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTT TTGAACTTCTTCAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCCA (SEQ ID NO: 461)
5 gly
mL2-3
RMEMLESLLELL KDIVPISNPP
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATTTCTAATCCACCA (SEQ ID NO: 462)
5 gly
mL2-A
RIEMLESLLELLQ EIVPISKAE
CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTCAAGAAATTGTTCC AATTTCTAAAGCTGAA (SEQ ID NO: 463)
5 gly
mL2-5
RMEMLQSLLELL KDIVPMSNAR
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEQ ID NO: 464)
5 gly
mL2-6
RMEMLESLLELL KEIVPTSNGT
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AACTTCTAATGGTACT (SEQ ID NO: 465)
5 gly
mL2-7
RMEMLES LFELL KEIVPMSKAG
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 466)
5 gly
mL2-8
RMEMLGSLLELL KEIVPMSKAR
CGTATGGAAATGCTTGGTTCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT(SEQ ID NO: 467)
5 gly
mL2-9
QMELLD SLFELL KEIVPKSQPA
CAAATGGAACTTCTTGATTCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AAAATCTCAACCAGCT (SEQ ID NO: 468)
5 gly
mL2-10
RMEMLDSLLELL KEIVPMSNAR
CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAATGCTCGT (SEQ ID NO: 469)
5 gly
mL2-ll
RMEMLESLLELL HEIVPMSQAG
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTCATGAAATTGTTCC AATGTCTCAAGCTGGT (SEQ ID NO: 470)
5 gly
mL2-12
QMEMLESLLQLL KEIVPMSKAS
CAAATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATGTCTAAAGCTTCT (SEQ ID NO: 471)
5 gly
mL2-13
RMEMLDSLLELL KDMVPMTTGA
CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGACTACTGGTGCT (SEQ ID NO: 472)
5 gly
mL2-14
RIEMLESLLELLK DMVPMANAS
CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGGCTAATGCTTCT (SEQ ID NO: 473)
5 gly
mL2-15
RMEMLES LLQLL NEIVPMSRAR
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTCAACTTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCGTGCTCGT (SEQ ID NO: 474)
5 gly
mL2-16
RMEMLESLFDLL KELVPMSKGV
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTT TTGATCTTCTTAAAGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGGTGTT (SEQ ID NO: 475)
5 gly
mL2-17
RIEMLESLLELLK DIVPIQKAR
CGTATTGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATTCAAAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 476)
5 gly
mL2-18
RMELLESLFELLK DMVPMSDSS
CGTATGGAACTTCTTGAATCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGATATGGTTCC AATGTCTGATTCTTCT (SEQ ID NO: 477)
5 gly
mL2-19
RMEMLES LLE VL QEIVPRAKGA
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAAGTTCTTCAAGAAATTGTTCC ACGTGCTAAAGGTGCT (SEQ ID NO: 478)
5 gly
mL2-20
RMEMLDSLLQLL NEIVPMSHAR
CGTATGGAAATGCTTGATTCTCTTC TTCAACTTCTTAATGAAATTGTTCC AATGTCTCATGCTCGT (SEQ ID NO: 479)
5 gly
mL2-21
RMEMLESLLELL KDIVPMSNAG
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGATATTGTTCC AATGTCTAATGCTGGT (SEQ ID NO: 480)
5 gly
mL2-22
RMEMLQSLFELL KGMVPISKAG
CGTATGGAAATGCTTCAATCTCTTT TTGAACTTCTTAAAGGTATGGTTCC AATTTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 481)
5 gly
mL2-23
RMEMLESLLELL KEIVPNSTAA
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AAATTCTACTGCTGCT (SEQ ID NO: 482)
5 gly
mL2-24
RMEMLQSLLELL KEIVPISKAG
CGTATGGAAATGCTTGAATCTCTTC TTGAACTTCTTAAAGAAATTGTTCC AATTTCTAAAGCTGGT (SEQ ID NO: 483)
5 gly
mL2-25
RIEMLD SLLELLN ELVPMSKAR
CGTATTGAAATGCTTGATTCTCTTC TTGAACTTCTTAATGAACTTGTTCC AATGTCTAAAGCTCGT (SEQ ID NO: 484)
5 gly
mL17-Conl
DWRATLLKEFW QLVEGLGDNLV
GATTGGCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGAAGGTCT TGGTGATAATCTTGTT (SEQ ID NO: 485)
5 gly
mL17-l
DGRATLLTEFWQ LVQGLGQKEA
GATGGTCGTGCTACTCTTCTTACTG AATTTTGGCAACTTGTTCAAGGTCT TGGTCAAAAAGAAGCT (SEQ ID NO: 486)
5 gly
mL17-2
LARATLLKEFWQ LVEGLGEKVV
CTTGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGAAGGTCT TGGTGAAAAAGTTGTT (SEQ ID NO: 487)
5 gly
mL17-3
GSRDTLLKEFWQ LVVGLGDMQT
GGTTCTCGTGATACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGTTGGTCT TGGTGATATGCAAACT (SEQ ID NO: 488)
5 gly
mL17^
DARATLLKEFWQ LVDAYGDRMV
GATGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGATGCTTA TGGTGATCGTATGGTT (SEQ ID NO:
5 gly
489)
mL17-5
NDRAQLLRDFWQ LVDGLGVKSW
AATGATCGTGCTCAACTTCTTCGTG ATTTTTGGCAACTTGTTGATGGTCT TGGTGTTAAATCTTGG (SEQ ID NO: 490)
5 gly
mL17-6
GVRETLLYELWY LLKGLGANQG
GGTGTTCGTGAAACTCTTCTTTATG AACTTTGGTATCTTCTTAAAGGTCT TGGTGCTAATCAAGGT (SEQ ID NO: 491)
5 gly
mL17-7
QARATLLKEFCQ LVGCQGDKLS
CAAGCTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGTCAACTTGTTGGTTGTCA AGGTGATAAACTTTCT (SEQ ID NO: 492)
5 gly
mL17-8
QERATLLKEFWQ LVAGLGQNMR
CAAGAACGTGCTACTCTTCTTAAA GAATTTTGGCAACTTGTTGCTGGTC TTGGTCAAAATATGCGT (SEQ ID NO: 493)
5 gly
mL17-9
SGRATLLKEFWQ LVQGLGEYRW
TCTGGTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGAAGGTCT TGGTGAATATCGTTGG (SEQ ID NO: 494)
5 gly
mL17-10
TMRATLLKEFWL FVDGQREMQW
ACTATGCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCTTTTTGTTGATGGTCA ACGTGAAATGCAATGG (SEQ ID NO: 495)
5 gly
mL17-ll
GERATLLNDFWQ LVDGQGDNTG
GGTGAACGTGCTACTCTTCTTAATG ATTTTTGGCAACTTGTTGATGGTCA AGGTGATAATACTGGT (SEQ ID NO: 496)
5 gly
mL17-12
DERETLLKEFWQ LVHGWGDNVA
GATGAACGTGAAACTCTTCTTAAA GAATTTTGGCAACTTGTTCATGGTT GGGGTGATAATGTTGCT (SEQ ID NO: 497)
5 gly
mL17-13
GGRATLLKELWQ LLEGQGANLV
GGTGGTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AACTTTGGCAACTTCTTGAAGGTCA AGGTGCTAATCTTGTT (SEQ ID NO: 498)
5 gly
mL17-14
TARATLLNELVQ LVKGYGDKLV
ACTGCTCGTGCTACTCTTCTTAATG AACTTGTTCAACTTGTTAAAGGTTA TGGTGATAAACTTGTT (SEQ ID NO: 499)
5 gly
mL17-15
GMRATLLQEFWQ LVGGQGDNWM
GGTATGCGTGCTACTCTTCTTCAAG AATTTTGGCAACTTGTTGGTGGTCA AGGTGATAATTGGATG (SEQ ID NO: 500)
5 gly
mL17-16
STRATLLNDLWQ LMKGWAEDRG
TCTACTCGTGCTACTCTTCTTAATG ATCTTTGGCAACTTATGAAAGGTTG GGCTGAAGATCGTGGT (SEQ ID NO: 501)
5 gly
mL17-17
SERATLLKELWQ LVGGWGDNFG
TCTGAACGTGCTACTCTTCTTAAAG AACTTTGGCAACTTGTTGGTGGTTG GGGTGATAATTTTGGT (SEQ ID NO: 502)
5 gly
mL17-18
VGRATLLKEFWQ LVEGLVGQSR
GTTGGTCGTGCTACTCTTCTTAAAG AATTTTGGCAACTTGTTGAAGGTCT TGTTGGTCAATCTCGT (SEQ ID NO: 503)
5 gly
2x mTN8-Con6-(N)-1K
M-GAQ-
WYPCYEGHFWC
YDL-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-WYPCYEGHFWC YDL-LE-5 G-FC (SEQ ID NO: 504)
TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACT
TCTGGTGCTACGATCTGGGTTCTGG
TTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGGT
TCCGCTACTGGTTGGTACCCGTGCT
ACGAAGGTCACTTTTGGTGTTATGA
TCTG (SEQ ID NO: 505)
2x mTN8-Con6-(C)-IK
FC-5G-AQ-
WYPCYEGHFWC
YDL-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-WYPCYEGHFWC YDL-LE (SEQ ID NO: 506)
TGGTATCCGTGTTATGAGGGTCACT
TCTGGTGCTACGATCTGGGTTCTGG
TTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGGT
TCCGCTACTGGTTGGTACCCGTGCT
ACGAAGGTCACTTTTGGTGTTATGA
TCTG (SEQ ID NO: 507)
2x mTN8-Con7-(N)-1K
M-GAQ-
IFGCKWWDVQC
YQF-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-IFGCKWWDVQC YQF-LE-5G-FC (SEQ ID NO: 508)
ATCTTTGGCTGTAAATGGTGGGAC
GTTCAGTGCTACCAGTTCGGTTCTG
GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG
TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC
AAGTGGTGGGATGTACAGTGTTAT
CAGTTT (SEQ ID NO: 509)
2x mTN8-Con7-(C)-IK
FC-5G-AQ-
IFGCKWWDVQC
YQF-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-IFGCKWWDVQC YQF-LE (SEQ ID NO: 510)
ATCTTTGGCTGTAAATGGTGGGAC
GTTCAGTGCTACCAGTTCGGTTCTG
GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG
TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC
AAGTGGTGGGATGTACAGTGTTAT
CAGTTT (SEQ ID NO: 511)
2x mTN8-Con8-(N)-1K
M-GAQ-
IFGCKWWDVDC
YQF-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-IFGCKWWDVDC YQF-LE-5G-FC (SEQ ID NO: 512)
ATCTTTGGCTGTAAGTGGTGGGAC
GTTGACTGCTACCAGTTCGGTTCTG
GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG
TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC
AAATGGTGGGACGTTGATTGTTAT
CAGTTT (SEQ ID NO: 513)
2x mTN8-Con8-(C)-IK
FC-5G-AQ-
IFGCKWWDVDC
YQF-
GSGSATGGSGST ASSGSGSATG-IFGCKWWDVDC YQF-LE (SEQ ID NO: 514)
ATCTTTGGCTGTAAGTGGTGGGAC
GTTGACTGCTACCAGTTCGGTTCTG
GTTCCACTGCTTCTTCTGGTTCCGG
TTCCGCTACTGGTATCTTCGGTTGC
AAATGGTGGGACGTTGATTGTTAT
CAGTTT (SEQ ID NO: 515)
ML15-Conl
QVESLQQLLMWL DQKLASGPQG
CAGGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGGGT (SEQ ID NO: 516)
5 gly
ML15-1
RMELLESLFELLK EMVPRSKAV
CGTATGGAACTGCTGGAATCCCTG TTCGAACTGCTGAAAGAAATGGTT CCGCGTTCCAAAGCTGTT (SEQ ID NO: 517)
5 gly
mL15-2
QAVSLQHLLMW LDQKLAS GPQH
CAGGCTGTTTCCCTGCAGCACCTGC TGATGTGGCTGGACCAGAAACTGG CTTCCGGTCCGCAGCAC (SEQ ID
5 gly
NO: 518)
mL15-3
DEDSLQQLLMWL DQKLASGPQL
GACGAAGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGCTG (SEQ ID NO: 519)
5 gly
mL15^
PVASLQQLLIWL DQKLAQGPHA
CCGGTTGCTTCCCTGCAGCAGCTGC TGATCTGGCTGGACCAGAAACTGG CTCAGGGTCCGCACGCT (SEQ ID NO: 520)
5 gly
mL15-5
EVDELQQLLNWL DHKLASGPLQ
GAAGTTGACGAACTGCAGCAGCTG CTGAACTGGCTGGACCACAAACTG GCTTCCGGTCCGCTGCAG (SEQ ID NO: 521)
5 gly
mL15-6
DVESLEQLLMWL DHQLASGPHG
GACGTTGAATCCCTGGAACAGCTG CTGATGTGGCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGCACGGT (SEQ ID NO: 522)
5 gly
mL15-7
QVDSLQQVLLWL EHKLALGPQV
CAGGTTGACTCCCTGCAGCAGGTT CTGCTGTGGCTGGAACACAAACTG GCTCTGGGTCCGCAGGTT (SEQ ID NO: 523)
5 gly
mL15-8
GDESLQHLLMWL EQKLALGPHG
GGTGACGAATCCCTGCAGCACCTG CTGATGTGGCTGGAACAGAAACTG GCTCTGGGTCCGCACGGT (SEQ ID NO: 524)
5 gly
mL15-9
QIEMLESLLDLLR DMVPMSNAF
CAGATCGAAATGCTGGAATCCCTG CTGGACCTGCTGCGTGACATGGTTC CGATGTCCAACGCTTTC (SEQ ID NO: 525)
5 gly
mL15-10
EVDSLQQLLMWL DQKLASGPQA
GAAGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGGCT (SEQ ID NO: 526)
5 gly
mL15-ll
EDESLQQLLIYLD KMLSSGPQV
GAAGACGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTACCTGGACAAAATGCTG TCCTCCGGTCCGCAGGTT (SEQ ID NO: 527)
5 gly
mL15-12
AMDQLHQLLIWL DHKLASGPQA
GCTATGGACCAGCTGCACCAGCTG CTGATCTGGCTGGACCACAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGGCT (SEQ ID NO: 528)
5 gly
mL15-13
RIEMLESLLELLD EIALIPKAW
CGTATCGAAATGCTGGAATCCCTG CTGGAACTGCTGGACGAAATCGCT CTGATCCCGAAAGCTTGG (SEQ ID NO: 529)
5 gly
mL15-14
EVVSLQHLLMWL EHKLASGPDG
GAAGTTGTTTCCCTGCAGCACCTGC TGATGTGGCTGGAACACAAACTGG CTTCCGGTCCGGACGGT (SEQ ID NO: 530)
5 gly
mL15-15
GGESLQQLLMWL DQQLASGPQR
GGTGGTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGCAGCTG GCTTCCGGTCCGCAGCGT (SEQ ID NO: 531)
5 gly
mL15-16
GVESLQQLLIFLD HMLVSGPHD
GGTGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTTCCTGGACCACATGCTGG TTTCCGGTCCGCACGAC (SEQ ID NO: 532)
5 gly
mL15-17
NVESLEHLMMW LERLLASGPYA
AACGTTGAATCCCTGGAACACCTG ATGATGTGGCTGGAACGTCTGCTG GCTTCCGGTCCGTACGCT (SEQ ID NO: 533)
5 gly
mL15-18
QVDSLQQLLIWL DHQLASGPKR
CAGGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTGGCTGGACCACCAGCTG GCTTCCGGTCCGAAACGT (SEQ ID NO: 534)
5 gly
mL15-19
EVESLQQLLMWL EHKLAQGPQG
GAAGTTGAATCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGAACACAAACTG GCTCAGGGTCCGCAGGGT (SEQ ID NO: 535)
5 gly
mL15-20
EVDSLQQLLMWL DQKLASGPHA
GAAGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCACGCT (SEQ ID NO: 536)
5 gly
mL15-21
EVDSLQQLLMWL DQQLASGPQK
GAAGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGCAGCTG GCTTCCGGTCCGCAGAAA (SEQ ID NO: 537)
5 gly
mL15-22
GVEQLPQLLMWL EQKLASGPQR
GGTGTTGAACAGCTGCCGCAGCTG CTGATGTGGCTGGAACAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGCGT (SEQ ID NO: 538)
5 gly
mL15-23
GEDSLQQLLMWL DQQLAAGPQV
GGTGAAGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCAGCAGCTG GCTGCTGGTCCGCAGGTT (SEQ ID NO: 539)
5 gly
mL15-24
ADDSLQQLLMW LDRKLASGPHV
GCTGACGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATGTGGCTGGACCGTAAACTG GCTTCCGGTCCGCACGTT (SEQ ID NO: 540)
5 gly
mL15-25
PVDSLQQLLIWL DQKLASGPQG
CCGGTTGACTCCCTGCAGCAGCTG CTGATCTGGCTGGACCAGAAACTG GCTTCCGGTCCGCAGGGT (SEQ ID NO: 541)
5 gly
mL17-Con2
QSRATLLKEFWQ LVEGLGDKQA
CAGTCCCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGAAGGT CTGGGTGACAAACAGGCT (SEQ ID NO: 542)
5 gly
mL17-19
EIRATLLKEFWQL VDEWREQPN
GAAATCCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGACGAA TGGCGTGAACAGCCGAAC (SEQ ID NO: 543)
5 gly
mL17-20
QLRATLLKEFLQL VHGLGETDS
CAGCTGCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCCTGCAGCTGGTTCACGGTC TGGGTGAAACCGACTCC (SEQ ID NO: 544)
5 gly
mL17-21
TQRATLLKEFWQ LIEGLGGKHV
ACCCAGCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGATCGAAGGT CTGGGTGGTAAACACGTT (SEQ ID NO: 545)
5 gly
mL17-22
HYRATLLKEFWQ LVDGLREQGV
CACTACCGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCAGCTGGTTGACGGT CTGCGTGAACAGGGTGTT (SEQ ID NO: 546)
5 gly
mL17-23
QSRVTLLREFWQ LVESYRPIVN
CAGTCCCGTGTTACCCTGCTGCGTG AATTCTGGCAGCTGGTTGAATCCTA CCGTCCGATCGTTAAC (SEQ ID NO:
5 gly
547)
mL17-24
LSRATLLNEFWQ FVDGQRDKRM
CTGTCCCGTGCTACCCTGCTGAACG AATTCTGGCAGTTCGTTGACGGTCA GCGTGACAAACGTATG (SEQ ID NO: 548)
5 gly
mL17-25
WDRATLLNDFW HLMEELSQKPG
TGGGACCGTGCTACCCTGCTGAAC GACTTCTGGCACCTGATGGAAGAA CTGTCCCAGAAACCGGGT (SEQ ID NO: 549)
5 gly
mL17-26
QERATLLKEFWR MVEGLGKNRG
CAGGAACGTGCTACCCTGCTGAAA GAATTCTGGCGTATGGTTGAAGGT CTGGGTAAAAACCGTGGT (SEQ ID NO: 550)
5 gly
mL17-27
NERATLLREFWQ LVGGYGVNQR
AACGAACGTGCTACCCTGCTGCGT GAATTCTGGCAGCTGGTTGGTGGTT ACGGTGTTAACCAGCGT (SEQ ID NO: 551)
5 gly
mTN8Con6-l
QREWYPCYGGHL WCYDLHKA
CAGCGTGAATGGTACCCGTGCTAC GGTGGTCACCTGTGGTGCTACGAC CTGCACAAAGCT (SEQ ID NO: 552)
5 gly
mTN8Con6-2
ISAWYSCYAGHF WCWDLKQK
ATCTCCGCTTGGTACTCCTGCTACG CTGGTCACTTCTGGTGCTGGGACCT GAAACAGAAA (SEQ ID NO: 553)
5 gly
mTN8Con6-3
WTGWYQCYGGH LWCYDLRRK
TGGACCGGTTGGTACCAGTGCTAC GGTGGTCACCTGTGGTGCTACGAC CTGCGTCGTAAA (SEQ ID NO: 554)
5 gly
mTN8Con6^
KTFWYPCYDGHF WCYNLKSS
AAAACCTTCTGGTACCCGTGCTAC GACGGTCACTTCTGGTGCTACAAC CTGAAATCCTCC (SEQ ID NO: 545)
5 gly
mTN8Con6-5
ESRWYPCYEGHL WCFDLTET
GAATCCCGTTGGTACCCGTGCTAC GAAGGTCACCTGTGGTGCTTCGAC CTGACCGAAACC (SEQ ID NO: 546)
5 gly
mL24-l
NVFFQWVQKHG RVVYQWLDINV
AATGTTTTTTTTCAATGGGTTCAAA AACATGGTCGTGTTGTTTATCAATG GCTTGATATTAATGTT (SEQ ID NO: 557)
5 gly
mL24-2
FDFLQWLQNHRS EVEHWLVMDV
TTTGATTTTCTTCAATGGCTTCAAA ATCATCGTTCTGAAGTTGAACATTG GCTTGTTATGGATGTT (SEQ ID NO: 558)
5 gly
mL20-l
HQRDMSMLWEL LDVLDGLRQYS
CATCAACGTGATATGTCTATGCTTT GGGAACTTCTTGATGTTCTTGATGG TCTTCGTCAATATTCT (SEQ ID NO: 559)
5 gly
mL20-2
TQRDMSMLDGLL EVLDQLRQQR
ACTCAACGTGATATGTCTATGCTTG ATGGTCTTCTTGAAGTTCTTGATCA ACTTCGTCAACAACGT (SEQ ID NO: 560)
5 gly
mL20-3
TSRDMSLLWELL EELDRLGHQR
ACCTCCCGTGACATGTCCCTGCTGT GGGAACTGCTGGAAGAACTGGACC GTCTGGGTCACCAGCGT (SEQ ID NO: 561)
5 gly
mL20^
MQHDMSMLYGL VELLESLGHQI
ATGCAACATGATATGTCTATGCTTT ATGGTCTTGTTGAACTTCTTGAATC TCTTGGTCATCAAATT (SEQ ID NO:
5 gly
562)
mL20-5
WNRDMRMLESL FEVLDGLRQQV
TGGAATCGTGATATGCGTATGCTTG AATCTCTTTTTGAAGTTCTTGATGG TCTTCGTCAACAAGTT (SEQ ID NO: 563)
5 gly
mL20-6
GYRDMSMLEGLL AVLDRLGPQL
GGTTATCGTGATATGTCTATGCTTG AAGGTCTTCTTGCTGTTCTTGATCG TCTTGGTCCACAACTT (SEQ ID NO: 564)
5 gly
mL20 Conl
TQRDMSMLEGLL EVLDRLGQQR
ACTCAACGTGATATGTCTATGCTTG AAGGTCTTCTTGAAGTTCTTGATCG TCTTGGTCAACAACGT (SEQ ID NO: 565)
5 gly
mL20 Con2
WYRDMSMLEGL LEVLDRLGQQR
TGGTACCGTGACATGTCCATGCTG GAAGGTCTGCTGGAAGTTCTGGAC CGTCTGGGTCAGCAGCGT (SEQ ID NO: 566)
5 gly
mL21-l
TQNSRQMLLSDF MMLVGSMIQG
ACTCAAAATTCTCGTCAAATGCTTC TTTCTGATTTTATGATGCTTGTTGG TTCTATGATTCAAGGT (SEQ ID NO: 567)
5 gly
mL21-2
MQTSRHILLSEFM MLVGSIMHG
ATGCAAACTTCTCGTCATATTCTTC TTTCTGAATTTATGATGCTTGTTGG TTCTATTATGCATGGT (SEQ ID NO: 568)
5 gly
mL21-3
HDNS RQMLLS DL LHLVGTMIQG
CACGACAACTCCCGTCAGATGCTG CTGTCCGACCTGCTGCACCTGGTTG GTACCATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 569)
5 gly
mL21^
MENSRQNLLRELI MLVGNMSHQ
ATGGAAAACTCCCGTCAGAACCTG CTGCGTGAACTGATCATGCTGGTTG GTAACATGTCCCACCAG (SEQ ID NO: 570)
5 gly
mL21-5
QDTSRHMLLREF MMLVGEMIQG
CAGGACACCTCCCGTCACATGCTG CTGCGTGAATTCATGATGCTGGTTG GTGAAATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 571)
5 gly
mL21 Conl
DQNS RQMLLS DL MILVGSMIQG
GACCAGAACTCCCGTCAGATGCTG CTGTCCGACCTGATGATCCTGGTTG GTTCCATGATCCAGGGT (SEQ ID NO: 572)
5 gly
mTN8-19-l
VALHGQCTRWP WMCPPQREG
GTTGCTCTTCATGGTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACGTGAAGGT (SEQ ID NO: 573)
5 gly
mTN8-19-2
YPEQGLCTRWPW MCPPQTLA
TATCCAGAACAAGGTCTTTGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AAACTCTTGCT (SEQ ID N: 574)
5 gly
mTN8-19-3
GLNQGHCTRWP WMCPPQDSN
GGTCTGAACCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGACTCCAAC (SEQ ID NO: 575)
5 gly
mTN8-19^
MITQGQCTRWPW MCPPQPSG
ATGATTACTCAAGGTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACCATCTGGT (SEQ ID NO: 576)
5 gly
mTN8-19-5
AGAQEHCTRWP WMCAPNDWI
GCTGGTGCTCAGGAACACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCGCTCCG AACGACTGGATC (SEQ ID NO: 577)
5 gly
mTN8-19-6
GVNQGQCTRWR WMCPPNGWE
GGTGTTAACCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCGTTGGATGTGCCCGCCG AACGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 578)
5 gly
mTN8-19-7
LADHGQCIRWPW MCPPEGWE
CTGGCTGACCACGGTCAGTGCATC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG GAAGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 579)
5 gly
mTN8-19-8
ILEQAQCTRWPW MCPPQRGG
ATCCTGGAACAGGCTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTGGTGGT (SEQ ID NO: 580)
5 gly
mTN8-19-9
TQTHAQCTRWP WMCPPQWEG
ACTCAAACTCATGCTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATGGGAAGGT (SEQ ID NO: 581)
5 gly
mTN8-19-10
VVTQGHCTLWP WMCPPQRWR
GTTGTTACTCAAGGTCATTGTACTC TTTGGCCATGGATGTGTCCACCACA ACGTTGGCGT (SEQ ID NO: 582)
5 gly
mTN8-19-ll
IYPHDQCTRWPW MCPPQPYP
ATTTATCCACATGATCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AACCATATCCA (SEQ ID NO: 583)
5 gly
mTN8-19-12
SYWQGQCTRWP WMCPPQWRG
TCTTATTGGCAAGGTCAATGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATGGCGTGGT (SEQ ID NO: 584)
5 gly
mTN8-19-13
MWQQGHCTRWP WMCPPQGWG
ATGTGGCAACAAGGTCATTGTACT CGTTGGCCATGGATGTGTCCACCA CAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 585)
5 gly
mTN8-19-14
EFTQWHCTRWP WMCPPQRSQ
GAATTCACCCAGTGGCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTCCCAG (SEQ ID NO: 586)
5 gly
mTN8-19-15
LDDQWQCTRWP WMCPPQGFS
CTGGACGACCAGTGGCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTTCTCC (SEQ ID NO: 587)
5 gly
mTN8-19-16
YQTQGLCTRWP WMCPPQSQR
TATCAAACTCAAGGTCTTTGTACTC GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC AATCTCAACGT (SEQ ID NO: 588)
5 gly
mTN8-19-17
ESNQGQCTRWP WMCPPQGGW
GAATCTAATCAAGGTCAATGTACT CGTTGGCCATGGATGTGTCCACCA CAAGGTGGTTGG (SEQ ID NO: 589)
5 gly
mTN8-19-18
WTDRGPCTRWP WMCPPQANG
TGGACCGACCGTGGTCCGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGCTAACGGT (SEQ ID NO: 590)
5 gly
mTN8-19-19
VGTQGQCTRWP WMCPPYETG
GTTGGTACCCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGAAACCGGT (SEQ ID NO: 591)
5 gly
mTN8-19-20
PYEQGKCTRWP WMCPPYEVE
CCGTACGAACAGGGTAAATGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGAAGTTGAA (SEQ ID NO: 592)
5 gly
mTN8-19-21
SEYQGLCTRWPW MCPPQGWK
TCCGAATACCAGGGTCTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGAAA (SEQ ID NO: 593)
5 gly
mTN8-19-22
TFSQGHCTRWPW MCPPQGWG
ACCTTCTCCCAGGGTCACTGCACCC GTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCGC AGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 594)
5 gly
mTN8-19-23
PGAHDHCTRWP WMCPPQSRY
CCGGGTGCTCACGACCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCCGTTAC (SEQ ID NO: 595)
5 gly
mTN8-19-24
VAEEWHCRRWP WMCPPQDWR
GTTGCTGAAGAATGGCACTGCCGT CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGACTGGCGT (SEQ ID NO: 596)
5 gly
mTN8-19-25
VGTQGHCTRWP WMCPPQPAG
GTTGGTACCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCCGGCTGGT (SEQ ID NO: 597)
5 gly
mTN8-19-26
EEDQAHCRSWP WMCPPQGWV
GAAGAAGACCAGGCTCACTGCCGT TCCTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGTT (SEQ ID NO: 598)
5 gly
mTN8-19-27
ADTQGHCTRWP WMCPPQHWF
GCTGACACCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCACTGGTTC (SEQ ID NO: 599)
5 gly
mTN8-19-28
SGPQGHCTRWPW MCAPQGWF
TCCGGTCCGCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCGCTCCG CAGGGTTGGTTC (SEQ ID NO: 600)
5 gly
mTN8-19-29
TLVQGHCTRWP WMCPPQRWV
ACCCTGGTTCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTGGGTT (SEQ ID NO: 601)
5 gly
mTN8-19-30
GMAHGKCTRWA WMCPPQSWK
GGTATGGCTCACGGTAAATGCACC CGTTGGGCTTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCTGGAAA (SEQ ID NO: 602)
5 gly
mTN8-19-31
ELYHGQCTRWP WMCPPQSWA
GAACTGTACCACGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGTCCTGGGCT (SEQ ID NO: 603)
5 gly
mTN8-19-32
VADHGHCTRWP WMCPPQGWG
GTTGCTGACCACGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 604
5 gly
mTN8-19-33
PESQGHCTRWPW MCPPQGWG
CCGGAATCCCAGGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 605)
5 gly
mTN8-19-34
IPAHGHCTRWPW MCPPQRWR
ATCCCGGCTCACGGTCACTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTGGCGT (SEQ ID NO: 606)
5 gly
mTN8-19-35
FTVHGHCTRWP WMCPPYGWV
TTCACCGTTCACGGTCACTGCACCC GTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCGT ACGGTTGGGTT (SEQ ID NO: 607)
5 gly
mTN8-19-36
PDFPGHCTRWRW MCPPQGWE
CCAGATTTTCCAGGTCATTGTACTC GTTGGCGTTGGATGTGTCCACCAC AAGGTTGGGAA (SEQ ID NO: 608)
5 gly
mTN8-19-37
QLWQGPCTQWP WMCPPKGRY
CAGCTGTGGCAGGGTCCGTGCACC CAGTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG AAAGGTCGTTAC (SEQ ID NO: 609)
5 gly
mTN8-19-38
HANDGHCTRWQ WMCPPQWGG
CACGCTAACGACGGTCACTGCACC CGTTGGCAGTGGATGTGCCCGCCG CAGTGGGGTGGT (SEQ ID NO: 610)
5 gly
mTN8-19-39
ETDHGLCTRWPW MCPPYGAR
GAAACCGACCACGGTCTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG TACGGTGCTCGT (SEQ ID NO: 611)
5 gly
mTN8-19^0
GTWQGLCTRWP WMCPPQGWQ
GGTACCTGGCAGGGTCTGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGCAG (SEQ ID NO: 612)
5 gly
mTN8-19 Conl
VATQGQCTRWP WMCPPQGWG
GTTGCTACCCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGGGTTGGGGT (SEQ ID NO: 613)
5 gly
mTN8-19 Con2
VATQGQCTRWP WMCPPQRWG
GTTGCTACCCAGGGTCAGTGCACC CGTTGGCCGTGGATGTGCCCGCCG CAGCGTTGGGGT (SEQ ID NO: 614)
5 gly
2X mTN8-19-7
FC-5G-AQ-LADHGQCIRWPW MCPPEGWELEGS GSATGGSGSTASS GSGSATGLADHG QCIRWPWMCPPE GWE-LE (SEQ ID NO: 615)
CTTGCTGATCATGGTCAATGTATTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAG
AAGGTTGGGAACTCGAGGGTTCCG
GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC
CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT
GCTACTGGTCTGGCTGACCACGGT
CAGTGCATCCGTTGGCCGTGGATG
TGCCCGCCGGAAGGTTGGGAACTG
GAA (SEQ ID NO: 616)
2X mTN8-19-7 ST-GG del2x LE
FC-5G-AQ-LADHGQCIRWPW MCPPEGWEGSGS ATGGSGGG AS SG SGSATGLADHGQ CIRWPWMCPPEG WE (SEQ ID NO: 617)
CTTGCTGATCATGGTCAATGTATTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAG
AAGGTTGGGAAGGTTCCGGTTCCG
CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGCG
CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC
TGGTCTGGCTGACCACGGTCAGTG
CATCCGTTGGCCGTGGATGTGTCCA
CCAGAAGGTTGGGAA (SEQ ID NO:
618)
2X mTN8-19-21
FC-5G-AQ-SEYQGLCTRWPW MCPPQGWKLEGS GSATGGSGSTASS GSGSATGSEYQG LCTRWPWMCPPQ GWK -LE (SEQ ID NO: 619)
TCTGAATATCAAGGTCTTTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGAAACTCGAGGGTTCCG
GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC
CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT
GCTACTGGTTCTGAGTATCAAGGC
CTCTGTACTCGCTGGCCATGGATGT
GTCCACCACAAGGCTGGAAGCTGG
AA (SEQ ID NO: 620)
2X mTN8-19-21 ST-GG del2x LE
FC-5G-AQ-SEYQGLCTRWPW MCPPQGWKGSGS ATGGSGGG AS SG SGSATGSEYQGL CTRWPWMCPPQ GWK (SEQ ID NO: 621)
TCTGAATATCAAGGTCTTTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGAAAGGTTCCGGTTCCG
CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGCG
CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC
TGGTTCTGAGTATCAAGGCCTCTGT
ACTCGCTGGCCATGGATGTGTCCA
CCACAAGGTTGGAAA (SEQ ID NO:
622)
2Х mTN8-19-22
FC-5G-AQ-TFSQGHCTRWPW MCPPQGWGLEGS GSATGGSGSTASS GSGSATGTFSQG HCTRWPWMCPP QGWG -L E (SEQ ID NO: 623)
ACTTTTTCTCAAGGTCATTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG
GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC
CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT
GCTACTGGTACTTTTTCTCAAGGCC
ATTGTACTCGCTGGCCATGGATGTG
TCCACCACAAGGCTGGGGCCTGGA
A (SEQ ID NO: 624)
2Х mTN8-19-32
FC-5G-AQ-
VADHGHCTRWP
WMCPPQGWGLE
GSGSATGGSGST
ASSGSGSATGVA
DHGHCTRWPWM
CPPQGWG-LE
(SEQ ID NO: 625)
GTTGCTGATCATGGTCATTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG
GTTCCGCAACCGGCGGCTCTGGCT
CCACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTC
TGCTACTGGTGTTGCTGACCACGGT
CACTGCACCCGTTGGCCGTGGATG
TGCCCGCCGCAGGGTTGGGGTCTG
GAA (SEQ ID NO: 626)
2Х mTN8-19-32 ST-GG del2x LE
FC-5G-AQ-VADHGHCTRWP WMCPPQGWGGS GSATGGSGGGAS SGSGSATGVADH GHCTRWPWVCPP QGWG (SEQ ID NO: 627)
GTTGCTGATCATGGTCATTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGGGTGGTTCCGGTTCCG
CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGTG
CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC
TGGTGTTGCTGACCACGGTCACTGC
ACCCGTTGGCCGTGGGTGTGTCCA
CCACAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO:
628)
2X mTN8-19-33
FC-5G-AQ-PESQGHCTRWPW MCPPQGWGLEGS GSATGGSGSTASS GSGSATGPESQG HCTRWPWMCPP QGWGLE (SEQ ID NO: 629)
CCAGAATCTCAAGGTCATTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGGGTCTCGAGGGTTCCG
GTTCCGCTACCGGCGGCTCTGGCTC
CACTGCTTCTTCCGGTTCCGGTTCT
GCTACTGGTCCGGAATCCCAGGGT
CACTGCACCCGTTGGCCGTGGATG
TGCCCGCCGCAGGGTTGGGGTCTG
GAA (SEQ ID NO: 630)
2X mTN8-19-33 ST-GG del2x LE
FC-5G-AQ-PESQGHCTRWPW MCPPQGWGGSGS ATGGSGGG AS SG SGSATGPESQGH CTRWPWMCP PQGWG (SEQ ID NO: 631)
CCAGAATCTCAAGGTCATTGTACTC
GTTGGCCATGGATGTGTCCACCAC
AAGGTTGGGGTGGTTCCGGTTCCG
CTACCGGCGGCTCTGGCGGTGGTG
CTTCTTCCGGTTCCGGTTCTGCTAC
TGGTCCGGAATCCCAGGGTCACTG
CACCCGTTGGCCGTGGATGTGTCC
ACCACAAGGTTGGGGT (SEQ ID NO:
632)
Пример 7: In vitro скрининг пептител с созревшей аффинностью
Следующие иллюстративные пептитела подвергали скринингу согласно представленным выше протоколам для получения следующих значений KD И IC50. На таблице VII показан диапазон значений KD ДЛЯ выбранных пептител с созревшей аффинностью по сравнению с исходными пептителами, что определяли с помощью анализов с применением растворов KinExA(tm) или анализов BIAcore(r). Указанные
значения демонстрируют повышенную аффинность связывания пептител с созревшей аффинностью в отношении миостатина по сравнению с исходными пептителами. На таблице VIII показаны значения IC50 для ряда пептител с созревшей аффинностью. Диапазон значений представлен в указанной таблице. Таблица VII: KD пептител
Пептитела
TN8-19 (исходное)
> 1 нМ
2xmTN8-19 (исходное)
> 1 нМ
lxmTN8-19-7
10 nM
2xmTN8-19-7
12 пМ
lxmTN8-19-21
6пМ
2xmTN8-19-21
6пМ
lxmTN8-19-32
9пМ
lxmTN8-19-33
21 пМ
2xmTN8-19-33
3 пМ
lxmTN8-19-22
4пМ
lxmTN8-19-conl
20 пМ
Таблица VIII: IC50 пептител
Пептитело с созревшей аффинностью
ICSO(HM)
mTN8-19 Conl
1,0-4,4
mTN8-19-2
7,508-34,39
mTN8-19-4
16,74
mTN8-19-5
7,743 - 3,495
mTN8-19-6
17,26
mTN8-19-7
1,778
mTN8-19-9
22,96 - 18,77
mTN8-19-10
5,252 - 7,4
mTN8-19-ll
28,66
mTN8-19-12
980,4
mTN8-19-13
20,04
mTN8-19-14
4,065 - 6,556
mTN8-19-16
4,654
mTN8-19-21
2,767-3,602
mTN8-19-22
1,927-3,258
mTN8-19-23
6,584
mTN8-19-24
1,673-2,927
mTN8-19-27
4,837-4,925
mTN8-19-28
4,387
mTN8-19-29
6,358
mTN8-19-32
1,842-3,348
mTN8-19-33
2,146-2,745
mTN8-19-34
5,028 - 5,069
mTN8Con6-3
86,81
mTN8Con6-5
2385
mTN8-19-7(-LE)
1,75-2,677
mTN8-19-21(-LE)
2,49
mTN8-19-33(-LE)
1,808
2xmTN8-19-7
0,8572 -2,649
2xmTN8-19-9
1,316-1,228
2xmTN8-19-14
1,18-1,322
2xmTN8-19-16
0,9903 -1,451
2xmTN8-19-21
0,828 -1,434
2xmTN8-19-22
0,9937-1,22
2xmTN8-19-27
1,601-3,931
2xmTN8-19-7(-LE)
1,077-1,219
2xmTN8-19-21(-LE)
0,8827-1,254
2xmTN8-19-33(-LE)
1,12-1,033
mL2-7
90,24
mL2-9
105,5
mL15-7
32,75
mL15-9
354,2
mL20-2
122,6
mL20-3
157,9
mL20-4
160
Пример 8: In vivo анаболическая активность иллюстративных пептител
Мышиную модель CD1 nu/nu (Charles River Laboratories, Massachusetts) использовали для определения in vivo эффективности пептител согласно настоящему изобретению, которые включали в себя область Fc человека (huFc). Эта модель чувствительна к ингибиторам согласно настоящему изобретению с быстрым анаболическим ответом, который связан с повышенной сухой мышечной массой и с повышением содержания миофибриллярных белков, но не связан с накоплением в организме воды.
В одном примере эффективность 1х пептитела mTN8-19-21 in vivo продемонстрировали с помощью следующего эксперимента. Группе из 10 8-недельных мышей линии CD1 nu/nu два раза в неделю или один раз в неделю вводили дозировки по 1 мг/кг, 3 мг/кг и 10 мг/кг (подкожная инъекция). Контрольная группа из 10 8-недельных мышей линии CD1 nu/nu получала два раза в неделю (подкожную) инъекцию huFc (инертный носитель) в дозе, составляющей 10 мг/кг. Животных взвешивали через день и безжировую массу тела определяли с помощью ЯМР в 0 день и 13 день. Животных затем умерщвляли на 14 день и определяли размер икроножной мышцы. Результаты показаны на фигурах 2 и 3. На фигуре 2 показано увеличение
общей массы тела мышей за 14 дней для различных дозировок пептитела по сравнению с контролем. Как можно увидеть на фигуре 2, все дозировки показали увеличение массы тела по сравнению с контролем, при этом все дозировки показали статистически значимое увеличение по сравнению с контролем на 14 день. На фигуре 3 показано изменение в безжировой массе тела на 0 день и 13 день, которое определяли с помощью ядерно-магнитно-резонансной (ЯМР) томографии (EchoMRI 2003, Echo Medical Systems, Houston, Tx), а также изменение массы икроножной мышцы, извлеченной из организма животных на 14 день.
В другом примере 1х пептитело mTN8-19-32 вводили мышам CD1 nu/nu в виде инъекции два раза в неделю в дозе 1 мг/кг, 3 мг/кг, 10 мг/кг и 30 мг/кг по сравнению с контролем huFc (инертный носитель). Получившие лечение с помощью пептитела животные показали увеличение общей массы тела (не показано), а также безжировой массы тела на 13 день по сравнению с 0 днем, что определяли с помощью измерения ЯМР. Увеличение безжировой массы тела показано на фигуре 4.
В другом примере 1х пептитело с созревшей аффинностью сравнивали с 2х пептителом с созревшей аффинностью в отношении in vivo анаболической эффективности. Самцам мышей CD1 nu/nu (по 10 животных на группу) вводили два раза в неделю инъекции по 1 мг/кг и 3 мг/кг lx mTN8-19-7 и 2х mTN8-19-7 в течение 35 дней, тогда как контрольной группе (10 животных) два раза в неделю вводили инъекции huFc (3 мг/кг). Как показано на фигуре 5, лечение с помощью 2х пептитела приводило к большему набору массы тела и безжировой массы туши при вскрытии по сравнению с 1х пептителом или контролем.
Пример 9: Увеличение мышечной силы
Нормальным совпадающих по возрасту самцам мышей С57В1/6 в возрасте 4 месяца в течение 30 дней вводили по 2 инъекции в неделю подкожные инъекции по 5 мг/кг в неделю 2х mTN8-19-33, 2х mTN8-19-7 и контроля - инертного носителя huFc согласно группам лечения (по 10 животных в группе). Животным обеспечивали восстановительный период без каких-либо дополнительных инъекций. Силу захватывания измеряли на 18 день восстановительного периода. Силу захватывания измеряли с использованием измерительного прибора Columbia Instruments модели 1027 dsm (Columbus, Ohio). Лечение с помощью пептитела приводило к значительному увеличению силы захватывания, при этом получившие предварительное лечение с помощью 2х mTN8-19-33 животные продемонстрировали увеличение в силы захватывания на 14% по сравнению с получившими контроль мышами, тогда как 2х
mTN8-19-7 дал в результате увеличение силы захватывания на 15% по сравнению с получившими контроль мышами.
Пример 10: Фармакокинетика
In vivo фармакокинетические эксперименты проводили с использованием репрезентативных пептител без последовательностей LE. Дозировки, составляющие 10 мг/кг и 5мг/кг, вводили мышам CD1 nu/nu и определяли следующие параметры: Стах (мкг/мл), площадь под кривой (AUC) (мкг-ч/мл) и период полужизни (ч). Обнаружили, что 2х версии пептител с созревшей аффинностью характеризуются значительно более продолжительным периодом полужизни, чем 1х версии. Например, lx mTN8-19-22 с созревшей аффинностью характеризуется периодом полужизни в организме животных, составляющим приблизительно 50,2 часов, тогда как 2х mTN8-19-22 характеризуется периодом полужизни, составляющим приблизительно 85,2 часов, lx mTN8-7 с созревшей аффинностью характеризуется периодом полужизни, составляющим приблизительно 65 часов, тогда как 2х mTN8-19-7 характеризуется периодом полужизни, составляющим приблизительно 106 часов.
Пример 11: Лечение мышей mdx
Было показано, что пептитела согласно настоящему изобретению увеличивают безжировую мышечную массу у животного и являются применимыми для лечения разнообразных нарушений, при которых происходит мышечная атрофия. Мышечная дистрофия представляет собой одно из таких нарушений. Мышиную модель мышечной дистрофии Душенна представляет собой мышь mdx Душенна (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine). Пожилым mdx мышам (в возрасте 10 месяцев) вводили инъекции или пептитела lx mTN8-19-33 (п=8/группа), или инертного носителя - белка huFc (N=6/rpynna) в течение периода времени, составляющего три месяца. Схема введения представляла собой введение через день, по 10 мг/кг, с помощью подкожной инъекции. Лечение с помощью пептитела оказало положительный эффект на увеличение и поддержание массы тела у пожилых mdx мышей. Значительные увеличения массы тела наблюдали в получившей лечение с помощью пептитела группе по сравнению с получившей лечение с помощью hu-Fc контрольной группой, как показано на фигуре 6А. Кроме того, анализ ЯМР выявил, что соотношение безжировой массы тела к жировой массе также значительно увеличилось у пожилых mdx мышей в результате лечения с помощью пептитела по сравнению с контрольной группой, и что процентное отношение жировой массы в массе тела снижалось у получивших лечение с помощью пептитела мышей по сравнению с контрольной группой, как показано на фигуре 6В.
Пример 12: Лечение артрита CIA в мышиной модели
Мышиная модель индуцированного коллагеном артрита представляет собой широко используемую модель ревматоидного артрита. Мышей DBA/1J в возрасте 8 недель (Jackson Labs, Bar Harbor, Maine) иммунизировали на 1 день и 21 день эксперимента с помощью 100 мкг бычьего коллагена II (Chrondex, Redmond, WA) в основание хвоста для индуцирования артрита. Относящиеся к артриту состояния у мышей оценивали в баллах по покраснению и/или отеку сустава и лапы, и животных отбирали на этом основании. Выбрали три группы животных: нормальные животные, которые не получали коллаген (нормальная группа, 12 животных), животные, получившие коллаген вместе с инертным носителем - мышиным Fc (CIA/инертный носитель, 6 животных) и животные, получившие коллаген вместе с пептителом 2х mTN8-19-21, прикрепленным к мышиному Fc (2х mTN8-19-21/muFc, также называемым 2х-21) (С1А/пептитело, 8 животных). Мышиный Fc, используемый у настоящих экспериментах и в примерах ниже, представляет собой Fc из мышиного IgG. Животным группы CIA/инертный носитель и группы CIA/пептитело в дополнение к введению коллагена на 1 и 21 день, вводили подкожно инъекцию (п/к) 5 мг/кг пептитела к миостатину, 2х mTN8-19-21/muFc, или инертного носителя - мышиного Fc отдельно дважды в неделю, начиная с 8 дня и продолжая до 50 дня. Животных взвешивали каждые четыре дня. Результаты показаны на фигуре 7. На фигуре 7 показано увеличение массы тела животных группы CIA/пептитело (2x21) по сравнению с животными группы CIA/инертный носитель, которые теряли массу, что указывает на то, что антагонисты миостатина, включая в себя описанные в настоящем документе пептитела, могут противодействовать ревматоидной кахексии, проявляющейся у контрольных животных.
Пример 13: Лечение подвергнутых орхиэктомии мышей В следующем примере описано лечение подвергнутых орхиэктомии мышей С57В1/6 с помощью иллюстративного пептитела. Двум группам совпадающих по возрасту и массе шестимесячных подвергнутых хирургической орхиэктомии мышей С57В1/6 (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) вводили или мышиный Fc, или пептитело 2х mTN8-19-21/muFc (11 животных на группу). Двум группам мышей вводили инъекции IP по 3 мг/кг пептитела или мышиного Fc IP 2 раза в неделю. Лечение начинали через 3 недели после операции и продолжали в течение 10 недель. Ядерно-магнитно-резонансную томографию (ЯМР) проводили на каждом живом животном для оценки безжировой массы в начале исследования, на 7 неделе и на 10
неделе. Как можно увидеть в таблице ниже, подвергнутые орхиэктомии мыши, получившие лечение с помощью мышиного Fc, начинают терять безжировую массу к 10 неделе. Сравнение подвергнутых орхиэктомии группы, получившей пептитело, с группой Fc - инертного носителя указывает на то, что пептитело улучшало набор безжировой массы тела у подвергнутых орхиэктомии животных по сравнению с животными, получившими лечение с помощью мышиного Fc. Этот результат показан в таблице ниже.
Таблица VIII: Безжировая масса после лечения подвергнутых орхиэктомии
Кроме того, лечение подвергнутых орхиэктомии мышей с помощью пептитела к миостатину не привело к увеличению содержания тестостерона. Эти результаты показывают, что антагонисты миостатина, такие как описанные в настоящем документе пептитела, можно использовать для лечения андроген-депривированных состояний.
Пример 14: Снижение содержаний TNF-a
Самкам мышей BALB/c в возрасте 8-10 недель (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) предварительно вводили контроль - PBS или 10 мг/кг пептитела 2х TN8-19-21/muFc за один день до сенсибилизации LPS. В каждой группе было по 5 животных. В 1 день LPS (липополисахарид из E.coli 055, В5 (Sigma) вводили внутривенно в дозе, составляющей 0,5 мг/кг (10 мкг/мышь). Образцы сыворотки собирали через 30 минут после введения LPS. Измеряли содержания mTNF-a (фактор некроза опухоли а). Результаты показали, что животные, которые получили предварительное лечение с помощью пептитела, характеризовались пониженным содержанием mTNF-a в своей крови. Получившие лечение с помощью PBS животные в
среднем содержали приблизительно 380 пг/мл mTNF-a в своей крови. Получившие лечение с помощью пептитела животные в среднем содержали приблизительно 120 пг/мл mTNF-a в своей крови. Этот результат показывает, что антагонисты миостатина могут снижать по меньшей мере содержание одного цитокина, ответственного за воспаление, внося вклад в эффективность антагониста в лечение ревматоидного артрита и других иммунных нарушений.
Пример 15: Модель индуцированного STZ сахарного диабета Целью следующих экспериментов являлось определение эффектов антагонистов миостатина в животной модели индуцированного стрептозотоцином (STZ) сахарного диабета. Кроме того, эксперименты разработали для определения того, будет ли антагонист миостатина замедлять или предотвращать прогрессирование или развитие диабетической нефропатии. Используемое пептитело представляло собой 2х mTN8-19-21, прикрепленное к мышиному Fc (2х mTN8-19-21/muFc или 2х-21). Контрольный инертный носитель представлял собой мышиный Fc отдельно.
Индуцированный стрептозотоцином сахарный диабет:
Животную модель сахарного диабета создавали путем многочисленных инъекций низких доз стрептозотоцина. Восьминедельных мышей С57В1/6 приобретали в Charles River Laboratory. Всех животных помещали в отдельные клетки на одну неделю. Измеряли массы тела животных и затем случайным образом делили на 2 группы (п=20/группа). 20 мышам вводили инъекцию низкой дозы стрептозотоцина (STZ, Sigma Co.), составляющей 40 мг/кг (растворенного в 0,1 мл раствора цитратного буфера) в течение 5 последовательных дней. Другой группе из 20 мышей вводили инъекцию инертного носителя (0,1 мл раствора цитратного буфера) в течение 5 последовательных дней. Содержание глюкозы в крови измеряли с использованием глюкооксидазного способа (Glucometer Elite, Bayer Corp., Elkhart, IN). Индукцию сахарного диабета определяли по измерению содержания глюкозы в крови. Содержание глюкозы в крови выше 11 ммоль/л или 200 мг/дл рассматривали как гипергликемию. После этого диабетических и совпадающих по возрасту нормальных мышей содержали в течение еще 4 месяцев. Массу тела, потребление пищи и содержание глюкозы в крови измеряли каждый месяц. Через 4 месяца после инъекции STZ 16 из 20 мышей развили сахарный диабет, и их использовали в последующих исследованиях. Диабетических мышей делили на две группы лечения на основании их массы тела. Совпадающих по возрасту нормальных мышей также делили на две группы лечения.
Схема эксперимента:
Начина с 0 дня, обеим диабетическим группам вводили подкожную инъекцию инертного носителя (mu-Fc) или 2х mTN8-19-21 в дозе, составляющей 5 мг/кг, 3 раза в неделю в течение 6 недель. Массу тела и потребление пищи измеряли 3 раза в неделю. Не страдающим сахарным диабетом мышей, которым была введена инъекция STZ, лечили с помощью инертного носителя (muFc) в той же дозе и по той же схеме в течение 6 недель. Содержание глюкозы в крови измеряли с использованием глюкооксидазного способа на 0 день, 15 день, 30 день и в конце исследования. Схема исследования представлена в таблице ниже.
Для оценки изменений в безжировой и жировой массах у диабетических и совпадающих по возрасту нормальных мышей, получивших лечение с помощью 2х mTN8-19-21/muFc, композиционный состав тела измеряли с использованием прибора для измерения ЯМР Bruker Minispec NMR (Echo Medical Systems, Houston, TX) в начале (0 день), через 2 недели (15 день), через 4 недели (30 день) и в конце исследования (45 день).
В конце исследования (45 день) мышей содержали в отдельных метаболических клетках в течение 24 часов для сбора мочи. 24-часовой объем мочи измеряли гравиметрически и концентрацию альбумина в моче определяли с помощью ферментного иммуносорбентного анализа с использованием набора для анализа мышиного микроальбумина в моче (Альфа Diagnostic, San Antonio, TX).
Почечную функцию оценивали по расчету скорости клиренса креатитина. Содержания креатинина в плазме и моче измеряли ферментативным способом (CRE,
Mizuho medy, Saga, Japan) с использованием автоматического анализатора Hitachi 717 Clinical Chemistry Auto Analyzer (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Содержания в крови азота мочевины измеряли с использованием автоматического анализатора.
Всех животных умерщвляли по завершению исследования (46 день). Мышей подвергали эвтаназии в камере СО2 и собирали образцы крови из сердца и анатомическое препарирование тканей всего тела. Получали образцы сыворотки и хранили их при - 80 °С для биохимического анализа. Измеряли содержания глюкозы в сыворотке крови, азота мочевины крови (BUN), содержания креатинина. Сразу же после эвтаназии икроножную мышцу и безжировую массу туши удаляли и взвешивали. Половину средней части правой почки фиксировали в растворе изопентана N2 и погружали в парафин. Срезы окрашивали с помощью Н &Е и PSA (реактив Шиффа) для анализа гломерулярных структур.
Результаты выражали как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Непарный критерий Стьюдента использовали для определения статистических различий между группами. Различие считалось статистически значимым, если значение р составляло меньше чем 0,05.
Результаты: изменения массы тела и содержания глюкозы в крови у мышей с индуцированным STZ сахарным диабетом
Множественная инъекция низких доз STZ мышам С57В1/6 привела к тому, что мыши, получившие STZ характеризовались значительно повышенным содержанием глюкозы в крови, чем группа совпадающих по возрасту нормальных мышей, при этом в среднем 20 животных, начиная с нормальных содержаний, составляющих приблизительно 120 мг/дл среднего содержания сахара в крови для 20 животных, увеличивали среднее значение приблизительно до 250-280 мг/дл через 2 недели после инъекции STZ и вплоть до 350 мг/дл через 8 - 18 недель после инъекции. Статистически значимые различия обнаружили для изменений массы тела между получившими инъекцию STZ мышами и контрольной группой в течение всего 4 -месячного периода перед началом лечения с помощью пептитела к миостатину. Контрольная группа стабильно увеличивала массу тела, при этом средний набор массы составлял вплоть до 40% за 20 недель (среднее увеличение от 25 г вплоть до 34 или 35 г через 20 недель), тогда как группа STZ незначительно увеличила массу тела за 20-недельных период, при этом увеличение составило лишь приблизительно 12 - 14% за 20 недель (25 г - приблизительно 28 или 29 г через 20 недель).
Шестинедельное лечение с помощью 2х mTN8-19-21/muFc и инертного носителя у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом и лечением в течение 6 недель совпадающих по возрасту нормальных мышей дало в результате значительно увеличенный набор массы тела у получивших лечение с помощью 2х-21 страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей по сравнению с этим показателем у получившей лечение инертным носителем диабетической группы. Общая масса тела увеличилась вплоть до приблизительно на 1,5 г у получивших STZ мышей, которым вводили 2х-21, по сравнению с мышами, получающими инертный носитель. Дельта-функции массы тела представлены как чистые изменения массы тела через 6 недель лечения с помощью 2х mTN8-19-21/muFc или инертного носителя по сравнению с их соответствующими исходными значениями на 0 день. Это показано на фигуре 8. 6-недельное лечение с помощью 2х-21 значительно ослабило потерю массы тела у страдающих сахарным диабетом животных.
Изменения композиционного состава тела у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом и совпадающих по возрасту нормальных мышей, получившие лечение с помощью 2х -21
Безжировую массу тела представляют как чистые изменения безжировой массы тела через 6 недели лечения с помощью 2х-21 или инертного носителя по сравнению с их исходными значениями в 0 день. Эти значения представлены в таблице ниже. Лечение с помощью 2х-21 значительно увеличивает (р <0,05) чистый набор безжировой массы тела как у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей, так и у совпадающих по возрасту нормальных мышей (6,16 ±0,81 г и 8,56 ±0,75 г) по сравнению с получившими лечение с помощью инертного носителя контрольными мышами (0,94 ±1,94 г и 1,60 ± 1,28 г). % изменения жировой массы представляет чистое изменение через 6 недели лечения с помощью 2х-21 или инертного носителя по сравнению с их исходными значениями в 0 день в каждой группе (смотрите вторую таблицу ниже). % набора жировой массы у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей не отличался значительно от группы, получившей 2х-21 (15,60 ± 7,01) и получившей инертный носитель группы (-21,59 ± 6,84). Лечение с помощью 2х-21 снижало чистый набор жировой массы у совпадающих по возрасту нормальных мышей (- 1,53 ± 3,42 по сравнению с 7,13 ± 3,38), но не достигало статистически значимых уровней.
Таблица X:. Эффект 2Х-21 на безжировую массу тела у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей и совпадающих по возрасту нормальных мышей (измерение ЯМР)
Таблица XI. Эффект 2Х-21 на жировую массу тела у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей и совпадающих по возрасту нормальных мышей (измерение ЯМР)
Жировая масса тела
Лечение
Исходное значение
изменения
Животное
Инъекция
п/к 5 мг/кг, 3 раза в неделю
(г) D0
D15
D30
D45
Страдающие индуцированным STZ сахарным диабетом мыши
Mu-Fc
3,13 ±0,36
(-12,73 ± 7,66)
(-16,61 ± 6,16)
(-21,59 ± 6,84)
2х-21
2,95 ± 0,22
(-15. 43 ±4,14)
(-14,66 ± 6,83)
(-15,60 ± 7,01)
Нормальные мыши C57BL/6
Mu-Fc
8,43 ± 0,54
(-4,76 ± 1,10)
(1,91 ±2,74)
(7,13 ±3,38)
2х-21
8,90 ± 0,56
(-7,08 ± 0,52)
(-6,14 ± 2,75)
(-1,53 ± 3,42)
Изменения содержания глюкозы в крови у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей и совпадающих по возрасту нормальных мышей, получивших лечение с помощью 2х -21
В таблице ниже показан 2х mTN8-19-21/muFc на изменения содержания глюкозы в крови у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей и совпадающих по возрасту нормальных мышей. Содержание глюкозы в крови не отличалось значительно между получившими лечение с помощью 2х-21 и получившими лечение с помощью инертного носителя группами как у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей, так и совпадающих по возрасту нормальных мышей.
Таблица XII. Эффект 2Х-21 на содержание глюкозы в крови у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей и совпадающих по возрасту
Соотношение массы почек к массе тела:
Гипергликемия у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей, вероятно, ассоциирована с гипертрофией почек. Соотношение массы почек к массе тела у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей было выше, чем этот показатель у совпадающих по возрасту нормальных мышей (0,98 ± 0,04 по сравнению с 0,67 ± 0,02). Лечение с помощью 2х-21 в течение 6 недель значительно снижало соотношение массы почек к массе тела от 0,98 ± 0,04 до значения,
составляющего 0,84 ± 0,04 (р <0,05) у получивших лечение с помощью инертного носителя страдающих сахарным диабетом мышей. Скорость клиренса креатитина
У страдающих сахарным диабетом мышей наблюдалась тенденция к увеличению скорости клиренса креатитина по сравнению с не страдающими сахарным диабетом нормальными контрольными мышами (фигура 9). Средняя скорость клиренса креатитина у страдающих сахарным диабетом мышей была больше чем в два раза выше, чем у совпадающих по возрасту нормальных мышей. Лечение с помощью 2х-21 снижало скорость клиренса креатитина у страдающих сахарным диабетом мыши по сравнению с получившими лечение с помощью инертного носителя страдающими сахарным диабетом мышами, как показано на фигуре 9, на которой показана функция почек.
24-часовой объем мочи и экскреция альбумина с мочой:
Экскреция альбумина с мочой и 24-часовой объем мочи являются очень важными биомаркерами в определении повреждения почек на ранней стадии диабетической нефропатии. Результаты показали, что как экскреция альбумина с мочой (фигура ЮА), так и 24-часовой объем мочи были увеличены у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей по сравнению с совпадающими по возрасту нормальными мышами. Лечение с помощью 2х-21 снижало содержания альбумина в моче у страдающих сахарным диабетом мышей, а также снижало 24-часовой объем мочи (фигура 10В). Этим продемонстрирована нормализация функции почек.
Введение пептитела у миостатину 2х mTNF8-19-21/muFc значительно ослабляло потерю массы тела и сохраняло массу скелетных мышц и безжировую массу тела у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей. В дополнение к увеличению массы скелетных мышц и безжировой массы, 2х mTN8-19-21/muFc ослабляло гипертрофию почек, увеличивало скорость клиренса креатитина и снижало 24-часовой объем мочи и экскрецию альбумина с мочой у страдающих индуцированным STZ сахарным диабетом мышей. Это демонстрирует улучшенную почечную функцию на ранней стадии развития диабетической нефропатии.
Пример 16: Эффекты антагониста миостатина в мышиной модели кахексии, индуцированной химиотерапией с помощью 5-фторурацила
Соединение 5-фторурацил (5-Fu) широко применяется в качестве терапевтического средства для пациентов с колоректальным раком, раком молочной
железы, желудка или поджелудочной железы. Побочный эффект терапии с помощью 5-Fu заключается в потере массы тела и мышечной атрофии. Исследовали потенциальный терапевтический эффект терапии с помощью антагониста миостатина в лечении индуцированной 5-Fu кахексии. Используемое пептитело представляло собой 2х mTN8-19-21/muFc (также называемое 2х-21) или 2х mTN8-19-21, прикрепленное к мышиному Fc. Контроль - инертный носитель представлял собой мышиный Fc отдельно.
В настоящем исследовании нормальных самцов мышей С57В1/6 делили на 4 группы (п = 24) и подвергали интраперитонеальному (IP) введению 5-Fu (45 - 50 мг/кг) или инертного носителя - фосфатно-солевого буфера (PBS) в течение 5 последовательных дней (0 день - 4 день). Двум группам предварительно вводили 2x21 в дозе, составляющей 10 мг/кг два раза в неделю, начиная со 2 недели (-13 день) или с 1 недели (-6 день) до начала лечения с помощью 5-Fu (в 0 день), и продолжали после лечения с помощью 5-Fu до конца исследования на 24 день. Массу тела, безжировую массу тела и потребление пищи подвергали мониторингу дважды в неделю или чаще до и после терапии с помощью 5-Fu. Сыворотку собирали через 0, 2, 24, 96, 168, 336 часов после последней дозы для окончательного исследования.
В 0 день и перед терапией с помощью 5-FU средние увеличения массы тела групп, получивших предварительное лечение с помощью 2x21 в течение 1 или 2 недель, составляли 12,6% и 13,9%, соответственно, по сравнению с 6,4% для контрольной группы, получившей только 5-Fu (оба значения р < 0,0001). Это было аналогичным 14,7% и 16,2% увеличению безжировой массы тела в группах, получивших предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью пептитела, по сравнению с 7,4% увеличением в группе, получившей только 5-Fu (р = 0,001 и р < 0,0001). На 6 день после введения дозы 5-Fu изменения массы тела в группах, получивших предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью 2x21 составляло -1,9% и -1,4% по сравнению с -8,6% для группы, получившей только 5-Fu (оба значения р составляли < 0,0001); безжировая масса тела изменялась на -1,3% и -0,9% по сравнению с -8,8% для группы, получившей только 5-Fu (оба значения р составляли <0,0001). На 8 день в ходе восстановления изменения массы тела в группах, получивших предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью 2x21 значительно увеличивались до 6,8% и 8,5 %, соответственно, по сравнению с 0,6% увеличением в группе, получившей только 5-Fu (р = 0,0006 и р < 0,0001). Аналогично, безжировая масса тела изменялась на 4,9% и 6,0% в группах, получивших предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью 2x21, по сравнению с
3,3% для получившей только 5-Fu группы (р = 0,001 и р <0,0001, соответственно). Результаты обобщены на фигуре 11.
С 8 дня до 24 дня почти у всех мышей развилась тяжелая нейтропения и некоторые мыши умерли вследствие тяжелых побочных эффектов. Коэффициенты выживаемости для групп, получивших предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью 2x21 до введения 5-Fu, составляли 46% по сравнению с 13% коэффициентом выживаемости для получившей только 5-Fu группы (р = 0,001 и р =0,009, соответственно). Результаты выживаемости обобщены на фигуре 12.
Статистический анализ с использованием способов дисперсионного анализа для повторных измерений показал, что группы, получившие предварительное лечение в течение 1 или 2 недель с помощью пептитела 2x21 перед лечением с помощью 5-Fu, характеризовались значительно большей массой тела и безжировой массой тела на протяжении всего исследования с -13 дня до 8 дня по сравнению с группой, получившей лечение только с помощью 5-Fu (р значения для обоих составляли меньше чем 0,0001).
Результаты настоящего исследования продемонстрировали, что предварительное лечение с помощью пептитела к миостатину, 2x21, в дозе, составляющей 10 мг/кг два раза в неделю в течение 1 или 2 недель, эффективно уменьшало индуцированную 5-Fu потерю массы тела и мышечную атрофию у мышей С57В1/6. Кроме того, предварительное лечение с помощью пептитело увеличивало коэффициент и длительность выживаемости в ответ на химиотерапию с помощью 5-Fu. Следовательно, антагонисты миостатина, такие как миостатинсвязывающие средства согласно настоящему изобретению, можно использовать перед и во время лечения с помощью химиотерапевтических или других химических средств для предотвращения или уменьшения химической кахексии.
Пример 17: Увеличение безжировой массы тела и размера мышц нижних конечностей после фармакологического ингибирования миостатина у пациентов-людей, характеризующихся наличием рака предстательной железы, получающих андроген-депривационную терапию
Для исследования потенциального эффекта на ингибирование миостатина у людей исследование проводили с помощью AMG 745 у пациентов с раком предстательной железы, подвергающихся АДТ. Цели исследования включали в себя оценку безопасности, переносимость, фармакокинетики (РК) и фармакодинамики (PD) AMG 745.
Материалы и способы Общая схема исследования
Исследование представляло собой многоцентровое, рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое испытание с использованием постепенно нарастающих доз у мужчин с раком предстательной железы, получающих АДТ. Испытание разрабатывали для оценки безопасности, переносимости, РК и фармакодинамики AMG 745.
AMG 745
AMG 745 представляет собой новое пептитело к миостатину. Пептитело представляет собой пептидный компонент ("пепти-") и часть Fc иммуноглобулина в общей структуре, которая напоминает антитело ("-тело"). В таком формате пептидная "головка" взаимодействует с миостатином и ингибирует передачу сигнала через его рецептор. Второй домен, Fc-компонент, стабилизирует комплекс в организме, обеспечивает трансцитоз эндотелиальными клетками и рециркуляцию через FcRnl и продлевает время удержания в терапевтически применимом диапазоне. Данные настоящего исследования указывают на то, что ингибирование миостатина может индуцировать релевантные физиологические эффекты в целевой ткани.
AMG 745 состоит из 2 идентичных полипептидных цепей, которые ковалентно соединяются посредством дисульфидных связей. N-концевая часть каждой цепи состоит из последовательности Fc IgGl человека, которая слита на С-конце посредством линкера из остатков глицина (пять остатков глицина вместе с AQ) с пептидом к миостатину. Каждая полипептидная цепь состоит из 255 аминокислот, начинаясь с аминокислоты метионина и заканчиваясь глутаминовой кислотой. На каждой полипептидной цепи по 3 дисульфидных связи внутри цепи между остатками
42 102 148 206 242 249
Cys -Cys , Cys -Cys и Cys -Cys , а также 2 дисульфидных связи между цепями
7 7 10 10
цепьГ^ цепь2 И CYS цепьГ^ цепь2- 510 ЯМИНОКИСЛОТ, КОТОрые СОСТАВЛЯЮТ МОЛекулу
AMG 745 дают теоретическую молекулярную массу, составляющую 57099 дальтон. Как экспрессированный микроорганизмом белок, AMG 745 не гликозилирован.
Состоящая из 255 остатков аминокислотная последовательность каждой полипептидной цепи (SEQ ID N0:635) AMG 745 показана ниже. Указанная простым шрифтом часть последовательности показывает последовательность Fc IgGl (SEQ ID N0:296). Часть жирны шрифтом показывает состоящую из пяти глицинов вместе с AQ
линкерную последовательность (SEQ ID N0:636). Часть последовательности жирным шрифтом и курсивом показывает пептид к миостатину (SEQ ID N0:311).
Последовательность (аминокислотные) AMG 745
MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE
DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY
KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV
KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ
GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP
PEGWE (SEQ ID N0:635)
Экспрессия и получение
AMG 745 экспрессировали в виде нерастворимых телец включения путем ферментации Е coli, как описано в настоящем документе. Типичная ферментация продолжается в течение 12 -16 часов после индукции с последующим сбором клеток с помощью тарельчатого сепаратора. Путем лизирования клеток с помощью гомогенизации под высоким давлением выделяли тельца включения. После отмывки и центрифугирования полученную дважды отмытую суспензию телец включения (DWIB) хранили при -30° ± 10°С до очищения.
После солюбилизации DWIB AMG 745 подвергали рефолдингу в растворе, содержащем мочевину, глицерин, аргинин и окислительно-восстановительную пару цистеин/цистамин. После рефолдинга продукт концентрировали и реагенты для рефолдинга удаляли посредством способа ультрафильтрации и диафильтрации (UF/DF). Диафильтрированный продукт окисляли с последующим осветлением. Продукт впоследствии очищали посредством 3 различных стадий хроматографии: 2 анионообменных колонки (Q Sepharose Fast Flow), одна, работающая в формате непрерывного потока, а вторая в формате связывания и элюирования, и колонка HIC (Butyl Sepharose Fast Flow). Продукт затем дополнительно концентрировали и подвергали диафильтрации в буфера для получения состава с помощью способа UF/DF. Введенный в состав продукт затем фильтровали через 0,2 мкм фильтр в контейнеры для насыпных продуктов и замораживали при -30° ± 10°С.
Дополнительную стадию хроматографии добавляли к процессу очищения для способа получения клинических лекарственных веществ для удаления относящихся к клетке-хозяину примесей.
Состав
Конечная состав дозированной лекарственной формы для AMG 745 в концентрации 30 мг/мл представлял собой 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс/объем) сахарозы, 0,004% (масс/объем) полисорбата 20, рН 4,75.
Дозировки и субъекты
Каждую из подкожных доз, составляющих 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг и 3,0 мг/кг, вводили один раз в неделю в течение 4 недель и оценивали в следующих когортах. Восемь субъектов, рандомизированных в соотношении распределения 3:1 на AMG 745 или плацебо распределяли в когорту, получающую дозу 0,3 мг/кг и в когорту, получающую дозу 1,0 мг/кг. Для оценки безопасности, переносимости, РК и эффекта введения доз в течение 4 недель на безжировую массу тела, в общем 38 субъектов относили к получающей дозу 3,0 мг/кг когорте, рандомизированной в соотношении распределения 1:1 на AMG 745 или плацебо.
Решения о повышении доз были приняты после того, как последний субъект, включенный в предшествующую когорту, был подвергнут клиническому контролю в течение по меньшей мере 14 дней после получения третьей дозы исследуемого продукта и они были основаны на слепом обзоре всех существующих неблагоприятных явлений, основных показателей жизнедеятельности и лабораторных данных.
Настоящее исследование было одобрено местным Экспертным советом организации и проведено согласно руководствам FDA и ICH в отношении надлежащей клинической практики. Все субъекты предоставили письменное информированное согласие перед началом исследования.
Исследуемые субъекты
Подходящими для участия в исследовании субъектами являлись мужчины с документально подтвержденным раком предстательной железы в анамнеза; не подтвержденными документально отдаленными метастазами на момент включения в исследование; получаемая АДТ (андроген-депривационная терапия) в течение по меньшей мере 6 месяцев в качестве первичного, адъювантного или консервативного лечения рака предстательной железы перед включением в исследование; если АДТ вводится периодически, то содержание общего тестостерона в сыворотке составляло < 50 нг/дл при скрининге; со стабильным специфическим к предстательной железе антигеном (PSA), что определял исследователь; с отсутствием первичного заболевания мышц, миопатии или нейропатии в анамнезе; с массой < 137 кг (300 фунтов) и ростом < 78 дюймов; с общесоматическим статусом ECOG (Восточная объединенная
онкологическая группа), составляющим 0 при скрининге; с отсутствием клинически значимого повышенного содержания креатинфосфокиназы (СРК); со скоростью клубочковой фильтрации (GFR) > 40 мл/мин; с содержанием аспартатаминотрансферазы (AST) или аланинаминотрансферазы (ALT) < 2,5 х верхней границы нормы.
Процедуры исследования
Следующие процедуры проводили перед исследованием и периодически во время исследования для всех когорт: оценка физического состояния, основных показателей жизнедеятельности, электрокардиограмма, анализ крови, биохимический анализ, анализ мочи, скрининг в отношении антител к AMG 745 и забор образца крови для исследования РК. Для когорты 3 мг/кг сканирования DXA (двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия) и КТ нижних конечностей проводили перед введением дозы и на 29 день исследования (окончание исследования) и во время визита последующего наблюдения через один месяц. Все сканирования DXA проводили на сканирующем устройстве Hologic или GE Lunar. Это же сканирующее устройства необходимо использовать для всех визитов для отдельного субъекта. Все сканирования DXA посылали в центральное учреждение по проведению считывания данных для обзора и анализа.
Силу нижних конечностей оценивали на основании максимальной массы, поднимаемой за один повтор (1-RM) с использованием устройства для изучения разгибания ноги в коленном суставе. Эту оценку проводили в течение 2 недель до и/или на 2 день, на 29 день и при визите последующего клинического наблюдения через 1 месяц.
Краткий набор тестов по оценке физической производительности (SPPB) проводили в течение 2 недель перед и/или на 1 день, на 29 день и при визите последующего клинического наблюдения через 1 месяц. SPPB включал в себя оценку вертикального равновесия, тест с ходьбой за определенное время и пять повторов подъема со стула.
Неблагоприятные события и сопутствующие лекарственные средства регистрировали при всех визитах во время исследования. Статистический анализ
8 субъектов, рандомизированных в соотношении распределения 3:1 на AMG 745 или плацебо, необходимо включить в получающую дозу 0,3 мг/кг когорту и в получающую дозу 1 мг/кг когорту для оценки безопасности и РК после введения
многочисленных доз. Для определения характеристик безопасности/ РК и, кроме того, для исследования эффекта AMG 745 на композиционный состав всего тела, 38 субъектов, рандомизированных в соотношении распределения 1:1 на AMG 745 или плацебо, запланировали включить в получающую дозу 3 мг/кг когорту. Это запланированное включение в исследование допускало различие между группами, составляющее 1,5% для вторичного конечного результата, процентное изменение безжировой массы тела от исходного значения к 5 неделе (стандартное отклонение, составляющее 2,1; Smith et al. 2001), и обеспечило 80% мощность для одностороннего критерия при 10% уровне значимости. Анализ дисперсии (ANOVA) использовали для сравнения процентного изменения от исходного значения между группами лечения (3 мг/кг AMG 745 по сравнению с плацебо).
Фармакокинетические анализы включали в себя всех получивших лечение субъектов, у которых могут быть оценены фармакокинетические параметры. Фармакокинетические параметры оценивали с использованием некомпартментных способов. Суммарные статистические показатели от получившей определенную дозу когорты создавали для каждого фармакокинетического параметра. Получали графики профиля зависимости концентрации AMG 745 в сыворотке от времени для отдельных субъектов и среднее для каждой дозы.
Для анализов безопасности включали всех субъектов, которые получали AMG 745 или плацебо, а также получивших плацебо субъектов из всех когорт объединяли для формировования составной группы плацебо.
Результаты
В общем 54 субъектов получали исследуемый продукт (31- AMG 745, 23 -плацебо), и все эти субъекты завершили исследование. 53 из 54 субъектов, которые получали исследуемый продукт, получили все 4 запланированных дозы. Один субъект (AMG 745 3-мг/кг) был выведен из исследования исследователем после второй дозы из-за неблагоприятных явлений в виде эритемы живота; этого субъекту вернули в исследование и он завершил исследование на стадии оценок при последующем клиническом наблюдении. Демографический состав и исходные характеристики популяции в исследовании обобщенно представлены в таблице 1.
Большинство субъектов (87%) относились к белой европеоидной расе. Среднее значение (SD) возраста составляло 73,1 (6,8) лет для субъектов, которые получали AMG 745, и 73,5 (6,7) лет для субъектов, которые получали плацебо. Исходные значения роста, массы, индексов массы тела (ИМТ) и исходные характеристики,
относящиеся к опухолевой нагрузке и лечению, обобщенно представлены в таблице 2. Все указанные исходные характеристики, как правило, были пропорциональными между субъектам, получающими AMG 745, и субъектами, получающими плацебо. Фармакокинетические результаты
AMG 745 проявлял зависимую от дозы линейную фармакокинетику после 4-недельного введения SC (подкожно) доз в диапазоне от 0,3 до 3 мг/кг. Среднее tmax находилось в диапазоне приблизительно 24 - 72 часов после первой дозы и приблизительно 24 - 48 часов после четвертой дозы; средний кажущийся сывороточный клиренс (CL/F), оцененный после четвертой доза, находился в диапазоне 1,89 - 2,29 мл/ч/кг (таблица 2).
Результаты в отношении антитела к AMG 745
Для 54 субъектов, которые завершили исследование, образцы сыворотки проанализировали с помощью биосенсорных иммуноанализаторов на основании поверхностно-плазмонного резонанса в отношении связывающих антител к AMG 745 (целой молекуле). Образцы от 2 субъектов дали положительные результаты в 1 или нескольких иммуноанализах:
Частота встречаемости связывающих антител к AMG 745 (целой молекуле) среди субъектов, которые получали AMG 745, составляла 1/31 (3%). Положительный результат в отношении антитела к AMG 745, вероятно, не оказывал влияния на воздействие AMG 745 у этих субъектов.
Нейтрализирующие антитела невозможно было оценить по техническим причинам, относящимся к биоанализу.
Фармакодинамические результаты
Анализы фармакодинамических эффектов были ограничены получающей дозу 3 мг/кг когортой и исследование разрабатывали так, чтобы оно характеризовалось 80% мощностью для обнаружения статистически значимого различия в процентном изменении безжировой массы тела между группами лечения.
Безжировая масса тела
Процентное изменение (предел среднего [SE]) безжировой массы тела от исходного значения до EOS (29 день) составляло 1,5% (0,5%) для получающих AMG 745 субъектов и -0,7% (0,5%) для получающих плацебо субъектов, с различием между группами, составляющим 2,2% (0,8%), что было статистически значимым (р = 0,008). Этот эффект сохранялся во время визита последующего наблюдения через 1 месяц после 29 дня: процентное изменение безжировой массы тела составляло 1,9% (0,5%)
для получавших AMG 745 субъектов и 0,2% (0,5%) для получавших плацебо субъектов, и различие между группами, составляющее 1,7% (0,7%), было статистически значимым (р = 0,023) (таблица 3; фигура 13).
Процентное изменение (предел среднего [SE]) безжировой массы правой ноги вместе с левой ногой от исходного значения до EOS (29 день) было положительным для получивших AMG 745 субъектов (1,3% [0,9%]) и отрицательным для получивших плацебо субъектов (-1,0% [0,9%]), и различие (предел среднего [SE]) составляло 2,3% [1,3%]) (р = 0,084). Во время визита последующего наблюдения (через 1 месяц после 29 дня) процентное изменение (предел среднего [SE]) безжировой массы правой ноги вместе с левой ногой от исходного значения до визита последующего наблюдения было положительным для получивших AMG 745 субъектов (1,6% [0,8%]) и отрицательным для получивших плацебо субъектов (-0,6% [0,8%]), и различие (предел среднего [SE]) составляло 2,1% [1,1%]) (р = 0,065) (таблица 3).
Процентное изменение жировой массы тела
Процентное изменение жировой массы тела от исходного значения до EOS (29 день) составляло -0,7% (0,2%) для получивших AMG 745 субъектов и 0,3% (0,2%) для получивших плацебо субъектов, и различие между группами, составляющее -1,0% (0,3%), являлось статистически значимым (р = 0,005). Процентное изменение жировой масса тела от исходного значения до визита последующего наблюдения (через 1 месяц после 29 дня) составляло -0,8% (0,3%) для получивших AMG 745 субъектов и 0,0% (0,3%) для получивших плацебо субъектов, и различие между группами составляло -0,7% [0,4%]) (р = 0,068) (таблица 3).
Размер мышц нижних конечностей
Процентное изменение размера мышц нижних конечностей от исходного значения до EOS (29 день) составляло 1,2% (0,7%) для получивших AMG 745 субъектов и -0,7% (0,7%) для получивших плацебо субъектов, и различие между группами составляло 1,8% (1,0%) (р = 0,065). Процентное изменение размера мышц нижних конечностей от исходного значения до визита последующего наблюдения (через 1 месяц после 29 дня) составляло 2,7% (0,7%) для получивших AMG 745 субъектов и -0,1% (0,7%) для получивших плацебо субъектов, и различие между группами, составляющее 2,8% (1,0%), являлось статистически значимым (р = 0,007) (таблица 3).
Масса тела и индекс массы тела
Согласуясь с наблюдаемыми увеличениями безжировой массы тела и сопутствующими снижениями жировой массы, отсутствовали общие эффекты либо на массу тела, либо на ИМТ
Физическое функционирование (SPPB) и сила нижних конечностей (разгибание голени 1-RM)
Никаких статистических анализов изменений от исходного значения не проводили для SPPB или разгибания голени 1-RM, но, как правило, связанные с AMG 745 эффекты не были выявлены в этом коротком исследование четырех доз.
Биохимические параметры
Отсутствуют видимые различия между группами лечения (AMG 745 по сравнению с плацебо) в отношении содержания глюкозы, инсулина, холестерина, липопротеина низкой плотности, липопротеина высокой плотности или триглицеридов в плазме натощак.
Безопасность
О неблагоприятных явлениях сообщили для 25 из 31 субъекта (81%), которые получили AMG 745 в любой дозе, и для 12 из 23 субъектов (52%), которые получили плацебо (таблица 4). Отсутствовала очевидная взаимосвязь между появлением у субъекта неблагоприятных явлений и дозой AMG 745.
Четыре неблагоприятных явления зарегистрированы у более чем 2 субъектов: диарея (AMG 745, 4/31 = 13%; плацебо, 2/23 = 9%); усталость (AMG 745, 4/31 = 13%; плацебо, 1/23 = 4%); гематома (все AMG745 [3/31 = 10%]); и кровоподтек в месте инъекции (AMG 745, 2/31 = 6%; плацебо, 1/23 = 4%).
Все неблагоприятные явления зарегистрированы как характеризующиеся слабой или умеренной тяжести и являются несерьезными за исключением 1 серьезного неблагоприятного явления обморока (для субъекта, который получил AMG 745 в получающей дозу Зм г/кг когорту и у которого был обморок в анамнезе), которое рассматривалось исследователем как не относящееся к лечению. Явление появилось через 2 недели после последней дозы.
Относящиеся к лечению неблагоприятные явления зарегистрированы для 7 из 31 субъекта (23%), которые получали AMG 745 в любой дозе, и для 1 из 23 субъектов (4%), которые получали плацебо. Ни одно из связанных с лечением неблагоприятных явлений не зарегистрировано более чем для 1 субъекта.
Для 1 субъекта, который получал AMG 745 в когорте дозы 3 мг/кг, введение исследуемого продукта прекратили после второй дозы из-за неблагоприятных явлений покраснения в области живота, зарегистрированных как средней тяжести (2 степень согласно СТСАЕ v3.0), снижающихся до слабой тяжести (1 степень согласно СТСАЕ v3.0) и отнесенных к исследуемому продукту.
Как правило, не наблюдались клинически важные эффекты AMG 745 на лабораторные показатели, ЭКГ, основные показатели жизнедеятельности, содержания тестостерона или содержания специфического для предстательной железы антигена. Слегка повышенные значения печеночных проб рассматривали как неблагоприятное явление для 1 субъекта, получающего AMG 745 (0,3 мг/кг) (самые высокие показатели аспартатаминотрансферазы [AST], аланинаминотрансферазы [ALT] и щелочной фосфатазы [АР] были в 2,2, 1,7 и 1,5 раз выше верхней границы нормы (ULN), соответственно), и неблагоприятное явление изменения в ЭКГ (средней тяжести [2 степень согласно СТСАЕ v3.0]) зарегистрировано совместно с серьезным неблагоприятным явлением обморока, отмеченным выше. Обобщение неблагоприятных явлений показано в таблице 5.
Настоящее рандомизированное, двойное слепое, плацебо-контролируемое, многодозовое исследование у мужчин с раком предстательной железы, получающих АДТ, продемонстрировало, что AMG 745, вводимый в виде подкожных доз в течение 4 недель, при этом самая высокая доза составляла 3,0 мг/кг, как правило, хорошо переносился. Результаты также предоставляют первое клиническое доказательство фармакодинамических эффектов фармакологического ингибирования миостатина: увеличенная безжировая масса тела, сниженная жировая масса и увеличенный размер мышц нижних конечностей.
Данные, полученные в настоящем исследовании у мужчин с раком предстательной железы, получающих лечение с помощью АДТ, продемонстрировали, что фармакологически ингибирование миостатина с помощью AMG 745 увеличивает безжировую массу тела и снижает жировую массу даже после непродолжительного лечения с продолжительностью, составляющей 29 дней.
исследуемого лекарственного средства, но не менее.
Настоящее изобретение не должно быть ограничено объемом конкретных вариантов осуществления, описанных в настоящем документе, которые предусмотрены в качестве отдельных иллюстраций индивидуальных аспектов настоящего изобретения, и функционально эквивалентные способы и компоненты предусмотрены настоящим изобретением. В действительности, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны в настоящем документе, станут очевидными специалистам в настоящей области техники из предшествующего описания и сопроводительных графических материалов. Предусмотрено, что такие модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или снижения жировая масса и/или увеличения размера мышц нижних конечностей у нуждающегося в этом субъекта - человека, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антагониста миостатина в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, при котором
субъект - человек характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию;
антагонист миостатина состоит из пептитела, содержащего по меньшей мере один полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности согласно SEQ Ш N0:635 (MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE);
антагонист миостатина вводят в состав, содержащий 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс./объем) сахарозы, 0,004% (масс./объем) полисорбата 20, рН 4,75; и
антагонист миостатина вводят подкожно в дозах, составляющих 0,3 мг/кг, 1,0 мг/кг или 3,0 мг/кг один раз в неделю в течение 4 недель.
2. Способ лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или снижения жировой массы и/или увеличения размера мышц нижних конечностей у нуждающегося в этом субъекта - человека, предусматривающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антагониста миостатина в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, при котором субъект - человек характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию, и антагонист миостатина содержит полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:311 (LADHGQCIRWPWMCPPEGWE).
3. Способ по п. 2, при котором антагонист миостатина состоит из пептитела, содержащего по меньшей мере один полипептид, состоящий из аминокислотной
2.
последовательности, представленной в SEQ ID N0:635 (MDKTHTCPPC PAPELLGGPS VFLFPPKPKD TLMISRTPEV TCVVVDVSHE DPEVKFNWYV DGVEVHNAKT KPREEQYNST YRVVSVLTVL HQDWLNGKEY KCKVSNKALP APIEKTISKA KGQPREPQVY TLPPSRDELT KNQVSLTCLV KGFYPSDIAV EWESNGQPEN NYKTTPPVLD SDGSFFLYSK LTVDKSRWQQ GNVFSCSVMH EALHNHYTQK SLSLSPGKGG GGGAQLADHG QCIRWPWMCP PEGWE).
4. Способ по п. 2, при котором антагонист миостатина состоит из пептитела, содержащего по меньшей мере один полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:635.
5. Способ по п. 2, при котором антагонист миостатина представляет собой пептитело, экспрессированное в нерастворимых тельцах включения в Е coli и выделенное посредством сбора клеток, лизирования клеток, солюбилизирования телец включения, рефолдинга, концентрирования и хроматографического очищения.
6. Способ по пп. 2-5, при котором антагонист миостатина конъюгируют с дополнительным соединением.
7. Способ по пп. 2-6, при котором антагонист миостатина вводят в состав фармацевтической композиции.
8. Способ по пп. 2-6, при котором антагонист миостатина вводят в состав фармацевтической композиции, содержащей буфер, антиоксидант, низкомолекулярную молекулу, лекарственное средство, белок, аминокислоту, углевод, липид, хелатирующее средство, стабилизатор или вспомогательное вещество.
9. Способ по пп. 2-6, при котором антагонист миостатина вводят в состав, содержащий 10 мМ ацетата натрия, 9% (масс./объем) сахарозы, 0,004% (масс/объем) полисорбата 20, рН 4,75.
4.
10. Способ по пп. 2-9, при котором антагонист миостатина вводят парентерально или перорально.
11. Способ по пп. 2-9, при котором антагонист миостатина вводят подкожно.
12. Способ по пп. 2-10, при котором антагонист миостатина вводят в дозе, составляющей 0,01 - 10,0 мг/кг, включительно.
13. Способ по пп. 2-10, при котором антагонист миостатина вводят в дозе, составляющей 0,3 - 3,0 мг/кг, включительно.
14. Способ по пп. 2-10, при котором антагонист миостатина вводят в дозе, составляющей 0,3, 1,0 или 3,0 мг/кг.
15. Способ по пп. 2-14, при котором антагонист миостатина вводят два раза в день, один раз в день, два раза в неделю, один раз в неделю, два раза в месяц или один раз в месяц.
16. Способ по пп. 2-14, при котором антагонист миостатина вводят один раз в неделю в течение 4 недель.
17. Способ по пп. 2-16, при котором антагонист миостатина вводят совместно с дополнительным средством.
18. Способ по пп. 2-16, антагонист миостатина вводят совместно с дополнительным средством, содержащим средство против рака предстательной железы.
19. Применение антагониста миостатина для лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или увеличения размера мышц нижних конечностей у субъекта - человека, который характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию, или в производстве лекарственного средства, при котором антагонист миостатина содержит
4.
полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ГО N0:311.
20. Применение антагониста миостатина для лечения или модулирования кахексии и/или увеличения безжировой массы тела и/или увеличения размера мышц нижних конечностей у субъекта - человека, который характеризуется наличием рака предстательной железы и получает андроген-депривационную терапию, или в производстве лекарственного средства, антагониста миостатина, состоящего из пептитела, содержащего полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID N0:635.
HuFc (2/неделя) ¦
1 мг/кг (2/неделя) ¦
3 мг/кг (2/неделя) 1()мг/кг (2/неделя) 10мг/кг (1/неделя)
ФИГ. 2
ФИГ. ЗА
rr::::| HuFc 10 мг/кг (2/неделя)
\^/\ 1 мг/кг 10 мг/кг (1/неделя)
^Scl 3 мг/кг
ФИГ. зв
- 2 x Pb: 3 мг/кг 1 x Pb: 1Мг/кг
нэ- 2 х Pb: 1 мг/кг -•- Hu-Fc
¦е- 1 х Pb: 3 мг/кг
ФИГ. 5А
Безжировая масса по сравнению с массой тела (%)
Жировая масса по сравнению с массой тела (%)
Р3 - Р ~> т1
_J 1 1 1 I 1 J 1
¦-норм. -¦- CIA/Носитель -А- 2x21
ФИГ. 7
STZ+2x-21
STZ+инертный носитель
ФИГ. 8
Содержание альбумина в моче (мкг/мл)
^ ^L.
длллд
•12
-9 -6 -3
Г"
Дни
"т-12 т" 15
"Т-
-¦- норм. + PBS
5-FU+2Wpre2x21 A 5-Fu -В- 5-Fu+PBS A 2Wpre2x21
-О- 5-FU+1Wpre2x21 A 1Wpre2x21
ФИГ. 11
100: 90^ 807060 50 40
2010
ЩЛпк\
-g- норм. 5-FU
1Wpre2X21
-в- 2Wpre2X21
A 5-FU дозировка
О 2
~1 1 1 1 ! 1 1 1 Г-
й 10 12 14 16 18 20 22 24
Дни
ФИГ. 12
Процентное изменение от исходного показателя безжировой массы тела
н а
И О
и о д п о
о S
н о
-2% -4%
-6%
РвО.008
РвО.023
EOS
FUP
Визит
3,0 мг/кг п/к AMG 745 плацебо
ФИГ. 13
105
105
106
106
108
108
109
112
112
119
119
151
1/17
1/17
2/17
2/17
3/17
3/17
4/17
4/17
6/17
6/17
7/17
7/17
10/17
10/17
11/17
11/17
14/17
14/17
15/17
15/17
15/17
15/17
15/17
15/17
15/17
15/17
16/17
16/17
16/17
16/17
16/17
16/17
17/17
17/17
17/17
17/17
17/17
17/17
17/17
17/17
