[RU]

В настоящей заявке предлагаются последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие коровые белки вируса гепатита В (HBV), поверхностные антигенные белки, их фрагменты и комбинации, а также генетические конструкты/векторы и вакцины, которые экспрессируют указанные белковые последовательности. Эти вакцины способны индуцировать иммунный ответ периферически и в печени с помощью набора клеточных и гуморальных агентов. В настоящей заявке предлагаются также способы профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против HBV. Комбинированная вакцина также может быть использована для разработки индивидуальных вакцин для отдельных уровней иммунных ответов на заражение HBV.

(57) Реферат / Формула:

В настоящей заявке предлагаются последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие коровые белки вируса гепатита В (HBV), поверхностные антигенные белки, их фрагменты и комбинации, а также генетические конструкты/векторы и вакцины, которые экспрессируют указанные белковые последовательности. Эти вакцины способны индуцировать иммунный ответ периферически и в печени с помощью набора клеточных и гуморальных агентов. В настоящей заявке предлагаются также способы профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против HBV. Комбинированная вакцина также может быть использована для разработки индивидуальных вакцин для отдельных уровней иммунных ответов на заражение HBV.

---

КОРОВЫЙ БЕЛОК ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ПОВЕРХНОСТНЫЙ АНТИГЕННЫЙ
БЕЛОК И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ ВАКЦИНА
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение относится к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим коровые белки вируса гепатита В (HBV) поверхностные антигенные белки, их фрагменты и комбинации, к коровым белкам вируса гепатита В (HBV) , поверхностным антигенным белкам, их фрагментам и комбинациям, к улучшенным HBV-вакцинам, к улучшенным способам индукции иммунного ответа на HBV и к улучшенным способам профилактической и/или терапевтической иммунизации индивидуумов против HBV.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Гепатит В является общей инфекцией, распространенной по всему земному шару, которая приводит к развитию цирроза, печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциноме. Значительное число случаев гепатита не сообщается из-за бессимптомного характера заболевания. Тем не менее, сообщается об около 350 миллионов хронических случаев гепатита В каждый год. Большая часть зараженного гепатитом населения находится в слаборазвитых и развивающихся странах.
[0003] Вирус подразделяется на четыре основных серотипа (adr, adw, ayr, ayw), исходя из антигенных эпитопов, присутствующих на его белковых оболочках. Имеется по меньшей мере восемь генотипов (А-Н) вируса гепатита согласно изменениям геномных последовательностей. Альтернативные генотипы HBV имеют превалирующее географическое распределение.
[0004] В Таблице 1 показано географическое распределение генотипов HBV.
[0005] Геном HBV представляет собой круговую молекулу ДНК, в основном двухцепочечную, но имеет одноцепочечную область, вытекающую из одной нити, более длинной, чем другая. Двухцепочечная область возникает из-за гибридизации короткой цепи, составляющей приблизительно 3020 нуклеотидов, с более длительнной цепью, составляющей приблизительно 3320 нуклеотидов. Одноцепочечной область на не-гибридизированных нуклеотидах более длинной цепи связана с ДНК-полимеразой HBV. Геномная ДНК HBV и ДНК-полимераза НВУобе содержатся в нуклеокапсиде, образованном множеством молекул корового белка HBV (HBcAg). Коровый белок HBV окутан HBV-поверхностным белком или антигеном (HBsAgs) и липидными молекулами. [0006] ГГеном HBV содержит четыре открытые рамки считывания (ORF), которые кодируют семь различных белков: 1) ORF, которая кодирует ДНК-полимеразу HBV, 2) ORF,
которая имеет два стартовых кодона, причем последовательность, присоединенная к второму стартовому кодону, кодирует коровый белок, а последовательность, которая содержит дополнительный апстрим стартовый кодон, кодирует последовательность, названную пре-С; 3) ORF, которая имеет три стартовых кодона, причем один кодирует поверхностный белок (S белок; gp27), один включает апстрим стартовый кодон, который кодирует последовательность, названную npe-S2 (gp36), а другой, который включает дополнительный апстрим стартовый кодон, который кодирует последовательность, названную pre-Sl (GP42); и 4) ORF, которая кодирует HBxAg, белок, функция которого менее понятна (Фигура 1). Эти белки включают 3 поверхностных белка или антигена (HBsAg): preSl, preS2 и основной S.
[0007] ХХарактеристики HBsAgs проиллюстрированы на Фигуре 2. Эпитопы HBsAgs, участвующие в экспрессии подтипов специфичности, расположены в области, которая включает две внешние петли молекул поверхностного антигена HBV (т.е., аминокислоты 110-180 из S-белка) и являются тем, что, что делает штаммы HBV антигенно разнообразными. Эта же область содержит неизвестное количество эпитопов, которые определяют "какую-то" детерминанту HBsAg, которая является общей для всех известных штаммов HBV дикого типа.
[0008] Профилактические вакцины и методы лечения HBV-инфекции включают введение субвирусных частиц, выделенных из плазмы хронических носителей, или субвирусных частиц, продуцируемых в виде рекомбинантных белков в стабильно трансфицированных эукариотических клеточных линиях. Субвирусные частицы представляют собой вирусные белки и такие вакцины часто называют субъединичными вакцинами. Белки HBV вводят индивидууму и они становятся мишенями для иммунной системы индивидуума. У неинфицированных индивидуумов иммунный ответ на субединичную вакцину защищает неинфицированного индивидуума от HBV-инфекции. У инфицированных индивидуумов, иммунный ответ, индуцированный вакциной, может иметь терапевтический эффект.
[0009] CChisari F.V., Am J Pathol., 2000. 156:1117-1132 и Pumpeus P. et al. Intervirology 2001. 44:98-114 раскрывают геномную организацию HBV. Deny P. и F. Zoulim, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):245 53 обсудили диагностику и лечение вируса гепатита В. Michel M.L. и P. Tiollais, Pathologie Biologie 2010, Aug, 58(4):288 95 обсуждают вакцины гепатита В и их защитеую эффективность и терапевтический потенциал. Публикация РСТ WO2004026899 раскрывает использование иммуногена, содержащего полипептидную последовательность с аминокислотной последовательностью HBV. Опубликованная заявка РСТ WO2008093976 раскрывает HBV-кодирующие последовательности, белки и вакцины,
включая вакцину, содержащую рекомбинантный полноразмерный поверхностный антиген HBV и коровый антиген HBV. Полноразмерный поверхностный антиген HBV состоит из трех типов поверхностного белка (L белка, М белка и S белка). Опубликованная заявка РСТ WO2009130588 раскрывает HBV-кодирующие последовательности, белки и вакцины, включая нуклеиновую кислоту, кодирующую коровый антиген вируса гепатита В, который оптимизирован по кодонам для экспрессии в организме человека. Публикация РСТ WO2010127115 раскрывает доставку последовательностей HBV с использованием рекомбинантных векторов.
[0010] Доступные вакцины HBV демонстрируют некоторую эффективность, но являются дорогостоящими в производстве. Кроме того, полученные из плазмы субъединичные вакцины также сомнительны относительно безопасности. Несколько вакцинных подходов были изучены, в том числе на основе рекомбинантных живых векторов, синтетических пептидов и ДНК-вакцин, которые содержат кодон-оптимизированные кодирующие последовательности белков HBV. Эти и другие подходы до сих пор были ограничены различной эффективностью. Кроме того, из-за геномных различий некоторые вакцины HBV демонстрировали положительную эффективность в некоторых географических районах и ограниченную эффективность в других регионах.
[ООН] ИИмеющиеся в настоящее время вакцины на основе HBsAg, полученные из дрожжей, трансфецированных ДНК, кодирующей S-белок (например, ENGERIX-B, доступная от SmithKline Biologicals, находящейся в Бельгии, и RECOMBIVAX/HB-VAX II, доступная от Merck & Co., находящейся в США) не вызывают реакцию у приблизительно 5 %-10 % пациентов (С. Belloni, Immunogenicity of hepatitis В vaccine in term and preterm infants. Acta Paediatrica, 1998. 87: p. 336-338). Кроме того, уровень отсутствия ответа увеличивается до 30 % у пожилых лиц и иммунитет против HBV может снизиться через несколько лет после вакцинации. Также для достижения полной защиты используются многократные дозы. Безопасность представляет проблему с основанной на HBsAg вакциной ENGERIX-B поскольку ENGERIX-B увеличивает риск воспалительной демиелинизации центральной нервной системы (ЦНС) в три раза.
[0012] Остальные HBsAg-вакцины, полученные из клеток млекопитающих, используют npe-Sl и npe-S2 в дополнение к S-белку. Антигены npe-Sl и npe-S2 экспрессируют высокоимуногенные Т и В-клеточные эпитопы и одна такая вакцина вызывает иммунную реакцию у приблизительно 80 % неотвечающих или слабо отвечающих индивидуумов (Rendi-Wagner, P. et al., Comparative immunogenicity of PreS/S hepatitis В vaccine in non- and low responders to conventional vaccine. Vaccine, 2006. 24: p. 2781-9.).
[0013] Было изучено прямое введение последовательностей нуклеиновых кислот для вакцинации против заболеваний животных и человека и много усилий было сосредоточено на эффективных и действенных средствах доставки нуклеиновой кислоты с целью получения необходимой экспрессии желательных антигенов, приводящих к иммунному ответу, и, в конечном счете, к успеху этого способа.
[0014] Д ДНК-вакцины делают возможным эндогенный антигенный синтез, который индуцирует CD8 + гистосовместимый комплекс, цитотоксические Т-лимфоциты, рестриктированные I классом комплекса гистосовместимости, которые редко получают с субъединичными вакцинами. Кроме того, антигенный синтез, который происходит в течение длительного периода, может помочь преодолеть низкую чувствительность и устранить или уменьшить потребность в бустер-инъекциях. Кроме того, ДНК-вакцины, по всей видимости, очень стабильны и просты в изготовлении.
[0015] ДНК-вакцины являются безопасными, стабильными, легко получаемыми и хорошо переносятся пациентами в доклинических испытаниях, указывая на отсутствие признаков интеграции плазмиды [Martin, Т., et al., Plasmid DNA malaria vaccine: the potential for genomic integration after intramuscular injection. Hum Gene Ther, 1999. 10(5): p. 759-68; Nichols, W.W., et al., Potential DNA vaccine integration into host cell genome. Ann N Y Acad Sci, 1995. 772: p. 30-9]. Кроме того, ДНК-вакцины хорошо подходят для повторного введения в связи с тем, что эффективность вакцины не зависит от уже существующих титров антител к вектору [Chattergoon, М., J. Boyer, and D.B. Weiner, Genetic immunization: a new era in vaccines and immune therapeutics. FASEB J, 1997. 11(10): p. 753-63]. Однако, одни из основных препятствий для клинического принятия ДНК-вакцин было снижение иммуногенности при переходе на более крупных животных [Liu, М.А. and J.B. Ulmer, Human clinical trials of plasmid DNA vaccines. Adv Genet, 2005. 55: p. 25-40]. [0016] ППоследние технологические достижения в проектировании ДНК-вакцинного иммуногена улучшили экспрессию и иммуногенность ДНК-вакцин, такие как кодонная оптимизация, РНК-оптимизации и добавление иммуноглобулиновых лидерных последовательностей [Andre, S., et al., Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. J Virol, 1998. 72(2): p. 1497-503; Demi, L., et al., Multiple effects of codon usage optimization on expression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding the human immunodeficiency virus type 1 Gag protein. J Virol, 2001. 75(22): p. 10991-1001; Laddy, D.J., et al., Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against avian influenza. Vaccine, 2007. 25(16): p. 2984-9; Frelin, L., et al., Codon optimization and mRNA amplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis С virus nonstructural 3/4A gene. Gene Ther, 2004. 11(6): p. 522-33], а также, в последнее время
разработаны технологии систем доставки плазмид, такие как электропорация [Hirao, L.A., et al., Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improves plasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques. Vaccine, 2008. 26(3): p. 440-8; Luckay, A., et al., Effect of plasmid DNA vaccine design and in vivo electroporation on the resulting vaccine-specific immune responses in rhesus macaques. J Virol, 2007. 81(10): p. 5257-69; Ahlen, G., et al., In vivo electroporation enhances the immunogenicity of hepatitis С virus nonstructural 3/4A DNA by increased local DNA uptake, protein expression, inflammation, and infiltration of CD3+ T cells. J Immunol, 2007. 179(7): p. 4741-53]. In vivo технология электропорации была использована в клинических испытаниях на людях для доставки противораковых препаратов, таких как блеомицин, и во многих доклинических исследований на большом числе видов животных. Кроме того, исследования показали, что использование консенсусных иммуногенов может увеличить широту клеточного иммунного ответа по сравнению с только нативными антигенами [Yan, J., et al., Enhanced cellular immune responses elicited by an engineered HIV-1 subtype В consensus-based envelope DNA vaccine. Mol Ther, 2007. 15(2): p. 411-21; Rolland, M., et al., Reconstruction and function of ancestral center-of-tree human immunodeficiency virus type 1 proteins. J Virol, 2007. 81(16): p. 8507-14]. [0017] ААнтитела и цитотоксические Т-клетки (ЦТЛ) к различным антигенам HBV могут принимать участие в снижении вирусной нагрузки и очистки HBV-инфицированных клеток из печени.Основная задача для современных вакцин-кандидатов состоит в индукции как гуморального, так и клеточного иммунитета к множественным HBV-антигенам-мишеням и против основных генотипов HBV. По этой причине сохраняется потребность в конструктах нуклеиновых кислот, которые кодируют белок HBV, и композициях, пригодных для индукции иммунного ответа против HBV. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах против HBV, которые экономичны и эффективны. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах, которые увеличивают нейтрализующие титры антител и вовлекают компонент Т-клеток. Сохраняется потребность в эффективных вакцинах против HBV, в том числе тех, которые эффективны против штаммов HBV, имеющих широкий спектр генотипов, и предпочтительно, в универсальной вакцине, которая будет глобально эффективной.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0018] Настоящее изобретение относится к вакцине, содержащей: (а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 и SEQ Ш N0:6; (Ь) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ
ID N0:10, SEQ ID N0:14, белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ Ш N0:14; и (с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0: 12, SEQ Ш N0:16, белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:12, и белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:16. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ГО N0:5, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 и SEQ ID N0:15.
[0019] Настоящее изобретение также может быть направлено на вакцину, содержащую
(а) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из
группы, состоящей из: SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 и SEQ ID N0:6; (b) молекулы
нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более белков, выбранных из группы,
состоящей из: SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:14, белка, который на 95 % идентичен по всей
длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной
последовательности SEQ ID N0:10, белка, который на 95 % идентичен по всей длине
аминокислотной последовательности полноразмернойаминокислотной
последовательности SEQ ID N0:14; и (с) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ГО N0: 12, SEQ ID N0:16, белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ГО N0:12, и белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:16.
[0020] Вакцина может быть плазмидой, содержащей нуклеиновые кислоты, описанные выше. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть включены в вирусные частицы. Вакцина может дополнительно содержать адъювантную молекулу. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, СТАСК, ТЕСК, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинация; и в некоторых вариантах реализации изобретения IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
[0021] Настоящее изобретение также относится к способу индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
[0022] Настоящее изобретение также относится к способу защиты субъекта от HBV-инфекции, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
[0023] Настоящее изобретение дополнительно относится к способу защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающему введение вакцины согласно настоящему изобретению субъекту.
[0024] Настоящее изобретение дополнительно включает вакцины, полезные для индукции иммунного ответа против HBV. Разработка HBV- иммунной терапевтической вакцины с широкой эффективностью против множества генотипов может быть обеспечена с помощью терапевтической ДНК-вакцины HBV, основанной на направленном воздействии на универсально консервативные короспецифические антигены HBV. Использование консенсусных HBV-иммуногенов индуцирует более широкие клеточный иммунный ответы и может быть полезно, чтобы свести к минимуму степень несходства последовательностей между различными штаммами вируса.
[0025] В настоящей заявке предлагаются белки, выбранные из группы, состоящей из: белков, содержащихБЕС) ID N0:2, белков, которые на 95 % идентичены по всей длине аминокислотной последовательности SEQ Ш N0:2; фрагментов SEQ ID N0:2; белков, которые на 95 % идентичны фрагментам SEQ ID N0:2; SEQ ID N0:4, белков, которые на 95 % идентичены по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:4; фрагментов SEQ ID N0:4; белков, которые на 95 % идентичны фрагментам SEQ ID N0:4 SEQ ID N0:6, белков, которые на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:6; фрагментов SEQ ID N0:6; и белков, которые на 95 % идентичны фрагментам SEQ Ш N0:6. [0026]
В настоящей заявке предлагается белок, выбранный из группы, состоящей из (a) SEQ ID N0:2; (b) белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности, указанной в SEQ ID N0:2; (с) иммуногенного фрагмента SEQ ID N0:2, содержащего 20 или более аминокислот SEQ ID N0:2; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, содержащего 20 или более аминокислот.
[0027] Молекулы нуклеиновых кислот, содержащие последовательности, которые кодируют одну или несколько молекул белка, указанных выше, также предоставляются. В некоторых вариантах реализации изобретения молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID N0:1;
последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:1; фрагмента SEQ ID N0:1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична фрагменту SEQ ID N0:1; SEQ ID N0:3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:3; фрагмента SEQ ID N0:3; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична фрагменту SEQ ID N0:3; SEQ ID N0:5; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:5; фрагмента SEQ ID N0:5; и последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 95 % идентична фрагменту SEQ ID N0:5.
[0028] Некоторые аспекты изобретения предлагают способы индуцирования иммунной реакции HBV, включающие этап введения индивидууму молекул корового антигена HBV и/или поверхностного антигена HBV и/или композиций.
[0029] Дополнительные аспекты изобретения предлагают способы защиты индивидуума против HBV-инфекции. Способы включают этап введения указанному индивидууму профилактически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, содержащей такую последовательность нуклеиновой кислоты, или композиций, где последовательность нуклеиновой кислоты экспрессируется в клетках указанного индивидуума и защитная иммунная реакция индуцируется против белка, кодируемого указанной последовательностью нуклеиновой кислоты.
[0030] В некоторых аспектах изобретения предлагаются способы для лечения индивидуума, инфицированного HBV. Способ включает этап введения указанному индивидууму терапевтически эффективного количества таких молекул нуклеиновых кислот и/или композиции.
[0031] В другом аспекте настоящее изобретение предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: (а) белка, содержащего SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ Ш N0:16; (b) белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16; (с) иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот.
[0032] Молекула нуклеиновой кислоты может содержать одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: (а) последовательности нуклеиновой кислоты, содержащей SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13 или SEQ ID N0:15; (b) последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 98 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ Ш N0:13 или SEQ Ш N0:15; (с) их фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот, кодируемых последовательностью SEQ Ш N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 или SEQ ID N0:15; и (d) их фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности белка, кодируемого последовательностью SEQ Ш N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ Ш N0:13 или SEQ Ш N0:15. Молекула нуклеиновой кислоты может быть плазмидой. Молекула нуклеиновой кислоты может быть вектором экспрессии, и последовательности, кодирующие указанный один или более белков, функционально связанны с регуляторными элементами. Молекула нуклеиновой кислоты может быть инкорпорированной в вирусную частицу.
[0033] Некоторые аспекты изобретения предлагают способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению субъекту.
[0034] Некоторые аспекты изобретения предлагают способ защиты субъекта от HBV-инфекции, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно изобретению субъекту.
[0035] Некоторые аспекты изобретения предлагают способ защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению субъекту.
[0036] В еще одном аспекте настоящее изобретение предлагает белок, выбранный из группы, состоящей из: (a) SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ Ш N0:16; (b) белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ Ш N0:16; (с) иммуногенного фрагмента последовательности SEQ Ш N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, содержащего 20 или более аминокислот; и (d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, содержащего 20 или более аминокислот.
[0037] Некоторые аспекты изобретения предлагают вакцину, полезную для генерации иммунного ответа против HBV у субъекта, содержащую: молекулу нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению, и адъювантную молекулу. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, СТАСК, ТЕСК, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинация; и в некоторых вариантах реализации изобретения - IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0038] Фигура 1 представляет собой карту, показывающую организацию генома HBV, который состоит из четырех перекрывающихся ORF.
[0039] Фигура 2 иллюстрирует организацию и особенности поверхностных антигенов HBV.
[0040] Фигура 3 иллюстрирует IgELS и эндопротеолитический сайт расщепления в консенсусном поверхностном антигене HBV.
[0041] Фигура 4 иллюстрирует длинный консенсусный поверхностный антиген HBV
(LHBs) и небольшой консенсусный поверхностный антиген HBV (SHBs).
[0042] Фигура 5 представляет собой карту вектора pGX1801 НерВ - Mcore (SEQ ID
N0:17).
[0043] Фигура 6 представляет собой карту вектора pGX1802 НерВ pLHBs-A (SEQ ID N0:18).
[0044] Фигура 7 представляет собой карту вектора pGX1803 НерВ pLHBs-C (SEQ Ш N0:19).
[0045] Фигура 8 представляет собой карту вектора pGX1804 НерВ pSHBs-A (SEQ ID NO:20).
[0046] Фигура 9 представляет собой карту вектора pGX1805 НерВ SHBs-C (SEQ ID N0:21).
[0047] Фигура 10 иллюстрирует филогенетический анализ консенсусной последовательности HBcAg по сравнению с индивидуальными генотипами А, В, С, D и Е. [0048] Фигуры ПА и 11В демонстрируют результаты экспериментов по поводу экспрессии рМ Core. Фигура ПА показывает результаты in vitro трансляционного протокола. Фигура 11В показывает результаты вестерн-блоттинга.
[0049] Фигура 12 представляет собой график, иллюстрирующий плазмидную карту и последовательность рМСоге.
[0050] Фигура 13 показывает реакцию транскрипции/трансляции с использованием плазмиды рМСоге, в которой полученный М-коровый белок иммуно-осаждался с анти-НА моноклональным антителом и был разогнан в геле SDS-PAGE.
[0051] Фигура 14 показывает обнаружение М-корового белка во временно трансфицированных клетках с использованием первичного моноклонального НА маркерного антитела с последующим обнаружением DyLight 594-меченным противокроличьим вторичным антителом. Hoechst-окраску также использовали для флуоресцентного мечения клеточного ядра. Экспрессия МСоге по большей части локализировалась в цитоплазме, как показано окрашиванием вне ядра. [0052] Фигура 15 иллюстрирует схему иммунизации. 4 мышей иммунизировали внутримышечно 30 мкг рМСоге.
[0053] Фигура 16 показывает увеличенную амплитуду секреции IFN-y в CD 8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0054] Фигура 17 показывает увеличенную амплитуду секреции IFN-y в CD 8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0055] Фигура 18 показывает увеличенную амплитуду секреции TNF-a в CD8+ и CD4+ Т-клетках из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0056] Фигура 19 показывает увеличенную амплитуду секреции TNF-a в CD8+ и CD4+
Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0057] Фигура 20 показывает увеличенную амплитуду секреции CD 107а в CD8+ и CD4+
Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0058] Фигура 21 показывает увеличенную амплитуду секреции f CD 107а в CD8+ и
CD4+ Т-клетках из из селезенок мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0059] Фигура 22 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8
IFN-y+, TNF-a+ секретирующих клеток от мышей Balb/с, иммунизированных контролем
pVAX или консенсусным коровым антигеном рМСоге.
[0060] Фигура 23 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8 дважды положительно продуцирующих клеток от мышей Balb/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном рМСоге.
[0061] Фигура 24 показывает интерферон-гамма Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0062] Фигура 25 показывает интерферон-гамма Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0063] Фигура 26 показывает фактора-a некроза опухоли Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0064] Фигура 27 показывает фактора-а некроза опухоли Т-клеточный ответ в печени мышей Balb/C, вакцинированных рМ-Соге.
[0065] Фигура 28 показывает процент HBcAg-специфических CD4 и CD8 IFN-y+, TNF-a+ продуцирующих клеток в печени мышей Balb/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном рМСоге.
[0066] Фигура 29 показывает средний процент HBcAg-специфических CD4 или CD8 дважды положительных продуцирующих клеток в печени мышей Ва1Ь/с, иммунизированных контролем pVAX или консенсусным коровым антигеном рМСоге. [0067] Фигура 30 показывает спленоциты, продуцирующие антиген-специфическое антитело. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно /-тесту Стьюдента. [0068] Фигура 31 показывает данные анализа ELISPOT.
[0069] Фигура 32 показывает частоту HBcAg-специфических IFN-y пятнообразующих единиц (SFU) на миллион спленоцитов после стимуляции клеток селезенки иммунизированных мышей.
[0070] Фигура 33 показывает данные экспериментов с использованием CSFE-меченных клеток для сравнения элиминации пептида обработанных клеток-мишеней in vivo с помощью CD8 Т-клеток у вакцинированных и невакцинированных животных. [0071] Фигура 34 показывает in vivo специфический киллинг. Две группы мышей, иммунизированых pVax (контроль) или рМСоге, получали CFSE-меченные клетки-мишени (CFSEhl пульсировали с иррелевантным пептидом или CFSEhl пульсировали с эпитоп-специфическим пептидом) через хвостовую вену. CFSE-меченные клетки, востанавленные и проанализированные с помощью FACS, использовали для определения процента киллинга.
[0072] Фигура 35 показывает сравнение процента пролиферации CD3+CD4+ клеток и CD3+CD8+, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой рМСоге, которая экспрессирует HBV М-кор.
[0073] Фигура 36 показывает процент пролиферации CD4 и CD8 Т-клеток. [0074] Фигурав 37А и 37В показывает сравнение анти-HBV кора IgG и IgA в серийном разведении сыворотки от животных, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой рМСог, которая экспрессирует HBV М-кор.
[0075] Фигура 38 показывает HBcAg-специфический гуморальный иммунный ответ, вызванный рМСоге, в сыворотке и спленоцитах. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно /-тесту Стьюдента.
[0076] Фигура 39 показывает HBcAg-специфический гуморальный иммунный ответ, вызванный рМСоге, в сыворотке и спленоцитах. Значения представляют собой среднее ± стандартную ошибку среднего. Значимость определяли согласно /-тесту Стьюдента. [0077] Фигура 40 показывает процент TNF-a и IFN-y из CD4+ и CD8+ клеток селезенки и печени.
[0078] Фигура 41 показывает данные экспериментов по определению того, воздействует ли клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, на печень, путем измерения уровней ALT в сыворотке.
[0079] Фигура 42 показывает иммунное окрашивание отделов печени, взятых через три дня после гидродинамической инъекции PBS, рМСоге (HBcAg) или pNS3/4A (HCV NS3-4A) от наивных мышей и мышей, которые были иммунизированы рМсоге. Клиренс очень высокий для pMCore-иммунизированой печени по сравнению с ^3/4а-трансфектированной контрольной печенью. Экспрессию РМсоге или NS3/4A обнаруживали с помощью антитела к НА (белые/светло-серые клетки). [0080] Фигура 43 показывает 3 дня после трансфекции, в которые клетки анализировали по поводу экспрессии маркера дегрануляции, экспрессии CD 107а и IFN-y+ после стимуляции пептидами HBcAg.
[0081] Фигура 44 показывает уровни ALT в сыворотке в день 3, 6 и 12 после трансфекции, уровни были измерены и не доказали повышения у релевантных вакцинированных животных.
[0082] Фигура 45 показывает общие клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами. [0083] Фигура 46 показывает короспецифические клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
[0084] Фигура 47 показывает клеточные иммунные ответы, специфические к поверхностному антигену А, у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
[0085] Фигура 48 показывает данные анализа ELISPOT клеточных иммунных ответов, специфических к поверхностному антигену С, у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
[0086] Фигура 49 показывает общие клеточные иммунные ответы у обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами. [0087] Фигура 50 показывает сравнение анти-HBV антител в серийном разведении сыворотки от обезьян, иммунизированных небольшой (т.е., рМСоге, pSHb А и pSHb С), длинной (т.е., рМСоге, pLHb А и pLHb С) и длинной+1Ь-12 (т.е., рМСоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакцинами.
[0088] Фигура 51 показывает сравнение анти-НВУантител в серийном разведении сыворотки от животных, иммунизированных длинной+1Ь-12 (т.е., рМсоге, pLHb A, pLHb С и prlIL-12) вакциной.
[0089] Фигура 52 показывает ДНК-конструкт поверхностного антигена HBV и его экспрессию. (А) Филогенетический анализ консенсусных последовательностей HBs генотипов А и С по сравнению с природным HBs. Консенсусные последовательности обозначены звездочками. (В) Схематическая диаграмма генных вставок HBs в ДНК-плазмиды. pLHBs и pSHBs представляют большие и небольшие белковые антигены HBs. Белки preSl, preS2 и основной S присоединены к сайтам эндопротеолитического расщепления. (С) Выявление pLHBs и pSHBs с помощью внутриклеточного окрашивания трансфектированных клеток RD моноклональным антителом и поликлональной мышиной сывороткой.
[0090] ФФигура 53 показывает, что pLHBs и SHBs вызывают мощные антителопродуцирующий и Т-клеточные ответы у BALB/c. По пять мышей линии Balb/c на группу иммунизировали в трех различных экспериментах и проанализировали их по поводу индукции как гуморального, так и клеточного ответа. (А) HBs-специфические IgG реакции, измеренные через одну неделю после каждой иммунизации. Стрелка указывает время иммунизации. (В) Общие IFN-y реакции, вызванные каждым конструктом к синтетическим preS 1/S2 и основному S пептидам. (С) Характеристика HBs-специфических иммуногенные детерминант с помощью использования отдельных пептидов HBs в 16 и 12-матричных пулах LHBs и SHBs соответственно. Это показывает повышенную ширину клеточно-опосредованного иммунного ответа.
[0091] Фигура 54 показывает in vivo специфический киллинг. Различные группы мышей, иммунизированные либо pVax (контроль), или любым из четырех конструктов HBs, получили CFSE-меченные клетки-мишени (CFSE10, пульсирующие с иррелевантным пептидом, или CFSEhl, пульсирующие с эпитоп-специфическим пептидом) через хвостовую вену. CFSE-меченые клетки извлекали и анализ с помощью FACS
(флуоресцентно-активированный клеточный сортинг) использовали для количественной оценки процента киллинга.
[0092] Фигура 55 показывает, что вакцинный коктейль HBc/HBs вызывает устойчивые иммунные реакции. (А) HBs-специфические реакции антител из сывороток от мышей, иммунизированных вакцинным коктейлем HBs/HBc в различные моменты времени иммунизации (стрелка). (В) IFN-y ответы после ex vivo стимуляции спленоцитов от мышей, имунизированных коктейлем HBs/HBc. Иммунизированные мыши отвечали как на коровые, так и поверхностные антигенные пептиды.
[0093] ФФигура 56 показывает, что антиген-специфические CD8 Т-клетки индуцируют противовирусные цитокины. Внутриклеточное окрашивание анти-вирусных цитокинов после ex-vivo стимуляции спленоцитов от мышей BALB/c из различных иммунизированных групп (Таблица 3). Лимфоциты окрашивали антителами к CD3, CD4, CD8, IFN-y, TNF-a, IL-2 и CD 107а. Эти данные представлены 4 мышами из каждой группы в 3 различных экспериментах.
[0094] Фигура 57 показывает иммуногенность у нечеловекообразных приматов. Пять макак-резусов иммунизировали внутримышечно pSHBs/pMCore, pLHBs/pMCore или pLHBs/pMCore + pIL-12 (Таблица 4), а затем с помощью электропорации. Обезьяны получили три прививки. (А) Высокие титры антител к HBs наблюдались только после 2 прививки. (В) Ответы IFN-y измеряли один раз перед первой иммунизацией и через 2 недели после каждой иммунизации. (С) Многие положительные HBs матричные пептидные пулы наблюдались у большинства обезьян из разных групп, подтверждая широкие Т-клеточные ответы у иммунизированных макак. (D) Внутриклеточное окрашивание (IFN-y, TNF-a, ИЛ-2) PBMCs после последней иммунизации показывает продуцирование HBs и НВс-специфических антивирусных цитокинов как в CD4, так и в CD8. [0095] Фигуры 58A-58D показывают безопасность терапевтической HBV-вакцины у макак-резусов. Образцы анализировали до вакцинации (pre), после третьей вакцинации (3rd), перед четвертой вакцинацией (pre4th), после четвертой вакцинации (4th). Была ошибка анализа на щелочную фосфатазу после третьей вакцинации. Нормальный диапазон для всех измерений изображен пунктирными линиями. (А) Сывороточная щелочная фосфатаза. (В) Уровни сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT). (С) Уровни сывороточной аспартатаминотрансферазы (AST). (D) Уровни общего билирубина в сыворотке. (Е) Уровни сывороточного креатинина. (F) сывороточные уровни азота мочевины крови.
[0096] Фигуры 59A-59D показывают аннотацию последовательностей для четырех плазмид HBs. Последовательности лидера IgE, эндопротеолитического сайта расщепления
и С-концевой НА-метки подчеркнуты. Четыре HBs плазмиды: большой поверхностный белок генотипа A (pLHBs-A) (А) и небольшой поверхностный белок (pSHBs-A) (В) и большой поверхностный белок генотипа С (pLHBs-C) (С), и небольшой поверхностный белок (pSHBs-C) (D).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0097] ННастоящее изобретение относится к высокооптимизированным поливалентным синтетическим иммуногенам вируса гепатита В (HBV), которые вызывают продукцию антител и клеточно-опосредованный иммунитет против HBV-поверхностных (HBs) и HBV-коровых (НВс) антигенов. Эти плазмиды, которые кодируют наиболее распространенные генотипы вируса, индуцируют связывающие антитела к HBs-антигенам и возбуждают надежный клеточный иммунитет (CMI) к обоим НВс и HBs антигенам. Плазмиды независимо вызвали широкие кросс-реактивные Т-клеточные ответы и ответы с высоким титром антител, а также вакциноиндуцированную цитотоксическую активность. Плазмидные коктейли, содержащие оба поверхностных антигена, индуцируют сильный и широкий клеточный иммунный ответ по нескольким антигенным эпитопам, в частности, широкую перекрестную реактивность между генотипами А и С вируса. Оптимизированные плазмидные коктейли, кодирующие антигены HBs и НВс, индуцировали сильный гуморальный и клеточный ответ, нацеленный на S-антиген, и повлекли различные мультиэпитопные реакции, связанные с очисткой инфицированных гепатоцитов. [0098] В частности, настоящее изобретение относится к вакцинам для вируса гепатита В (HBV), которые могут быть использованы для защиты человека от HBV-инфекции и обеспечить терапевтические преимущества индивидууму с диагнозом HBV-инфекции. Такие вакцины также могут быть использованы для индукции иммунного ответа против антигена HBV. HBV-вакцины согласно настоящему изобретению содержат одну или несколько молекул нуклеиновых кислот. В частности, молекула нуклеиновой кислоты кодирует один или несколько консенсусных коровых белков HBV. Консенсусные коровые белки HBV получают из последовательностей коровых белков генотипов А, В, С, D м Е HBV, и, следовательно, консенсусные коровые белки HBV являются уникальными. Молекулы нуклеиновых кислот могут также кодировать один или более иммуногенных фрагментов консенсусных коровых белков HBV.
[0099] Кроме того, молекулы нуклеиновых кислот могут кодировать один или более консенсусных поверхностных антигенов HBV. Консенсусные поверхностные антигены HBV получают из последовательностей поверхностных антигенов из изолятов генотипа А HBV, и, следовательно, консенсусные поверхностные антигены HBV являются
уникальными. Консенсусные поверхностные антигены HBV также могут быть получены из последовательностей поверхностных антигенов из изолятов генотипа С HBV, давая уникальные поверхностные антигены HBV. Молекулы нуклеиновой кислоты могут также кодировать один или более иммуногенных фрагментов консенсусных поверхностных антигенов HBV.
[00100] Вакцина согласно настоящему изобретению может включать любую комбинацию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный коровый белок HBV, и/или молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих консенсусный поверхностный антиген HBV. Вакцина также может включать любую комбинацию молекул нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные фрагменты консенсусного корового белка HBV, и/или молекул нуклеиновых кислот, кодирующих иммуногенные фрагменты консенсусного поверхностного антигена HBV.
[00101] Эти комбинации корового белка HBV и поверхностного антигена HBV удивительно и неожиданно индуцируют дифференциальный иммунный ответ на коровый белок HBV и поверхностный антиген HBV. Другими словами, сила иммунного ответа на коровый белок HBV и поверхностный антиген HBV отличается в зависимости от конкретной комбинации, вводимой субъекту. Соответственно, любой пользователь вакцины согласно настоящему изобретению может создать вакцину, которая содержит определенную комбинацию, чтобы вызвать желаемый иммунный ответ у субъекта, которому вводят такую разработанную вакцину. Таким образом, любой пользователь может адаптировать вакцину согласно настоящему изобретению, чтобы контролировать уровень иммунного ответа у субъекта.
[00102] Вакцина согласно настоящему изобретению широко применяется для различных типов HBV благодаря уникальным последовательностям консенсусного корового белка HBV и поверхностного антигена HBV.
[00103] Вакцина согласно настоящему изобретению может дополнительно включать одну или несколько молекул нуклеиновых кислот, как описано выше, и один или несколько белков, кодируемых такой молекулой нуклеиновой кислотыз.
1. Определения
[00104] Терминология, использованная в настоящем документе с целью описания конкретных вариантов осуществления, не предназначена для ограничения. Как используется в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если из контекста явно не следует иное.
[00105] Для чтения числовых диапазонов в данном документе каждое промежуточное число между ними с той же степенью точности явно предусмотрено. Например, для диапазона 6-9 числа 7 и 8 рассматриваются в дополнение к 6 и 9, а для диапазона 6,0-7,0, числа 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, и 7,0 явно предусмотрены. [00106] "Адъювант", как используется в данном документе, означает любую молекулу, добавленную к ДНК-плазмидным вакцинам, описанным в настоящем документе, для повышения иммуногенности антигенов, кодируемых ДНК-плазмидами и кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот, описанными в настоящем документе ниже. [00107] "Антитело", как используется в данном документе, означает антитело классов IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, или фрагменты, или их фрагменты или производные, включая Fab, F (ab ') 2, Fd и одноцепочечные антитела, диатела, биспецифические антитела, бифункциональные антитела и их производные. Антитело может представлять собой антитело, выделенное из сыворотки образца млекопитающего, поликлональное антитело, аффинно-очищенное антитело или их смеси, которые обладает достаточной специфичностью связывания с нужным эпитопом или последовательностью, полученной из него.
[00108] "Кодирующая последовательность" или "кодирующая нуклеиновая кислота", как используется в данном документе, означает нуклеиновые кислоты (РНК или ДНК-молекула), которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность может дополнительно включать сигналы инициации и терминации, функционально связанный с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способными управлять экспрессией в клетках человека или млекопитающих, которым вводят нуклеиновою кислоту. [00109] "Комплемент" или "комплементарный", как используется в данном документе, означает нуклеиновую кислоту, может означать спаривание оснований Уотсона-Крика (например, A-T/U и C-G) или Хугстена между нуклеотидами или нуклеотидными аналогами молекул нуклеиновых кислот.
[00110] "Консенсус" или "консенсусная последовательность", как используется в данном документе, означает полипептидную последовательность, основанную на анализе выравнивания нескольких подтипов конкретного HBV-антигена, такого как коровый или поверхностный антиген HBV. Могут быть получены последовательности нуклеиновых кислот, которые кодируют консенсусную полипептидную последовательности. Вакцины, содержащие белки, которые содержат консенсусные последовательности и/или молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют такие белки, могут быть использованы для
индуцирования иммунитета против широкого множества подтипов или серотипов конкретного антигена НВV.
[00111] "Электропорация", "электро-пермеабилизация" или "электро-кинетический энхансмент" ("ЕР"), как используется в данном документе взаимозаменяемо, означает использование импульса трансмембранного электрического поля, чтобы вызвать микроскопические пути (поры) в биомембранах; их присутствие позволяет биомолекулам, таким как плазмиды, олигонуклеотиды, миРНК, лекарства, ионы и вода, пройти с одной стороны клеточной мембраны на другую.
[00112] "Фрагмент", как используется в данном документе относительно последовательности нуклеиновой кислоты, означает последовательность нуклеиновой кислоты, или ее часть, которая кодирует полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, которые перекрестно реагируют с полноразмерным антигеном штамма HBV дикого типа. Фрагменты могут быть фрагментами ДНК, выбранными из по меньшей мере одной из различных нуклеотидных последовательностей, которые кодируют белковые фрагменты, описанные ниже.
[00113] "Фрагмент" или "иммуногенный фрагмент" относительно полипептидных последовательностей означает полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, который перекрестно реагирует с полноразмерным антигеном штамма HBV дикого типа. Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 50 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 90 % или по меньшей мере 95 % консенсусного белка. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 20 аминокислот или более по меньшей мере 30 аминокислот или более, по меньшей мере 40 аминокислот или более по меньшей мере 50 аминокислот или более по меньшей мере 60 аминокислот или более по меньшей мере 70 аминокислот или более по меньшей мере 80 аминокислот или более по меньшей мере 90 аминокислот или более по меньшей мере 100 аминокислот или более по меньшей мере 110 аминокислот или более по меньшей мере 120 аминокислот или более по меньшей мере 130 аминокислот или более по меньшей мере 140 аминокислот или более по меньшей мере 150 аминокислот или более по меньшей мере 160 аминокислот или более по меньшей мере 170 аминокислот или более по меньшей мере 180 аминокислот или более по меньшей мере 190 аминокислот или более по меньшей мере 200 аминокислот или более по меньшей мере 210 аминокислот или более по меньшей мере 220 аминокислот или более по меньшей мере 230 аминокислот или более, или по меньшей мере 240 аминокислот или более консенсусного белка.
[00114] Как используется в данном документе, термин "генетический конструкт" относится к молекулам ДНК или РНК, которые содержат нуклеотидную последовательность, которая кодирует белок. Кодирующая последовательность включает сигналы инициации и терминации, функционально связанные с регуляторными элементами, включая промотор и сигнал полиаденилирования, способные управлять экспрессией в клетках индивидуума, которому молекулу нуклеиновой кислоты вводят. Как используется в данном документе, термин "экспрессирующая форма" относится к генным конструктам, содержащим необходимые регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей последовательностью, которая кодирует белок, таким образом, что когда они присутствуют в клетке индивидуума, кодирующая последовательность будет экспрессироваться.
[00115] Термин "гомология", как используется в данном документе, относится к степени комплементарности. Может быть частичная гомология или полная гомология (т.е., идентичность). Частично комплементарная последовательность, которая по меньшей мере частично ингибирует полностью комплементарную последовательность из гибридизации с нуклеиновой кислотой-мишенью, называют с помощью функционального термина "по существу гомологичными". При использовании касательно последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты, такой как кДНК или геномный клон, термин "по существу гомологичные", как используется в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с цепью последовательности двухцепочечной нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. При использовании касательно последовательности одноцепочечной нуклеиновой кислоты термин "по существу гомологичные", как используется в данном документе, относится к зонду, который может гибридизироваться с (т.е., является комплементом) матричной последовательностью одноцепочечной нуклеиновой кислоты в условиях низкой жесткости. [00116] "Идентичные" или "идентичность", как используется в данном документе в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей, означает, что последовательности имеют определенный процент остатков, которые являются такими же в пределах определенной области. Процент может быть рассчитан путем оптимального выравнивания двух последовательностей, сравнения двух последовательностей в указанной области, определения числа положений, в которых идентичные остатки присутствуют в обеих последовательностях с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее количество положенийв указанной области, и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. В тех случаях, когда эти две последовательности
имеют разную длину или выравнивание производит один или несколько расположенных в шахматном порядке концов и определенная область сравнения включает только одну последовательность, остатки одной последовательности включены в знаменатель, но не числитель расчета. При сравнении ДНК и РНК, тимин (Т) и урацил (U) можно считать эквивалентными. Идентичность может быть выполнена вручную или с помощью компьютерного алгоритма последовательностей, такого как BLAST или BLAST 2.0. [00117] "Иммунный ответ", как используется в данном документе, означает активацию иммунной системы хозяина, например, млекопитающего, в ответ на введение антигена, такого как консенсусный антиген HBV. Иммунный ответ может быть в виде клеточного или гуморального ответа, или того и другого.
[00118] "Нуклеиновая кислота" или "олигонуклеотид" или "полинуклеотид", как используется в данном документе означает, по меньшей мерепо меньшей мере два нуклеотида, ковалентно связанных друг с другом. Описание одной цепи также определяет последовательность комплементарной цепи. Таким образом, нуклеиновая кислота включает также комплементарную цепь описанной одной цепи. Многие варианты нуклеиновой кислоты могут быть использованы с той же целью как и данная нуклеиновая кислота. Таким образом, нуклеиновая кислота включает также по сути идентичные нуклеиновые кислоты и их комплементы. Одна цепь обеспечивает зонд, который может гибридизоваться с последовательностью-мишенью в жестких условиях гибридизации. Таким образом, нуклеиновая кислота также включает зонд, который гибридизуется в жестких условиях гибридизации.
[00119] Нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечными или двухцепочечными, или могут содержать участки как двухцепочечной, так и одноцепочечной последовательности. Нуклеиновая кислота может представлять собой ДНК, как геномные, так и кДНК, РНК или гибрид, в котором нуклеиновая кислота может содержать комбинации дезоксирибо- и рибонуклеотидов, и комбинации оснований, включая урацил, аденин, тимин, цитозин, гуанин, инозин, ксантин гипоксантин, изоцитозина и изогуанин. Нуклеиновые кислоты могут быть получены методами химического синтеза или рекомбинантными способами. [00120] Термин "функционально связанный", как используется в данном документе, означает, что экспрессия гена находится под контролем промотора, с которым он пространственно связан. Промотор можно расположить в положении 5 '(апстрим) или 3' (даунстрим) гена под его контролем. Расстояние между промотором и геном может быть примерно таким же, как расстояние между указанным промотором и геном, который он контролирует, в гене, из которого промотор получен. Как известно в данной области
техники, изменение этого расстояния может обеспечиваться без потери функции промотора.
[00121] "Промотор", как используется в данном документе, означает синтетическую или природно-полученную молекулу, которая способна придавать, активировать или усиливать экспрессию нуклеиновой кислоты в клетке. Промотор может включать одну или более конкретных последовательностей, регулирующих транскрипцию, чтобы дополнительно усилить экспрессию и/или изменить пространственную экспрессию и/или временную экспрессию нуклеиновой кислоты. Промотор может также содержать дистальные энхансерные или репрессорные элементы, которые могут размещаться нарасстоянии до несколько тысяч пар оснований от стартового сайта транскрипции. Промотор может быть получен из источников, включая вирусные, бактериальные, грибковые, растения, насекомых и животных. Промотор может регулировать экспрессию генного компонента конститутивно, либо дифференцированно по отношению к клетке, ткани или органу, в котором происходит экспрессия или по отношению к стадии развития, при которой происходит экспрессия, либо в ответ на внешние раздражители, такие как физиологические стрессы , патогенные микроорганизмы, ионы металлов или индуцирующие агенты. Репрезентативные примеры промотеров включают промотор бактериофага Т7, промотор бактериофага ТЗ, промотор SP6, промотор 1ас-оператора, tac-промотор, поздний промотор SV40, ранний промотор SV40, промотор RSV-LTR, промотор CMV Ш, ранний промотор SV40 или поздний промотор SV40 и промотор CMV Ш.
[00122] "Сигнальный пептид" и "лидерная последовательность" используются здесь взаимозаменяемо и относятся к аминокислотной последовательности, которая может связываться с амино-концом белка HBV, указанного в данном документе. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, как правило, направляют локализацию белка. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности, используемые в настоящем описании, предпочтительно облегчают секрецию белка из клетки, в которой он произведен. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности часто отщепляется от остальной части белка, часто упоминаемого как зрелый белок, при секреции из клетки. Сигнальные пептиды/лидерные последовательности присоединяются к N-концу белка. [00123] "Жесткие условия гибридизации", как используется в данном документе, означают условия, при которых первая последовательность нуклеиновой кислоты (например, зонд) гибридизирует со второй последовательностью нуклеиновой кислоты (например, мишенью), такой как в сложной смеси нуклеиновых кислот. Жесткие условия зависят от последовательности и будут отличаться в разных обстоятельствах. Жесткие условия могут быть выбраны, чтобы составлять приблизительно на 5-10 °С ниже, чем точка
плавления (Tm) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и рН. Тт может быть температурой (при определенных ионной силе, рН и концентрации нуклеиновой кислоты), при которой 50 % зондов, комплементарных мишени, гибридизируют с последовательностью-мишенью в равновесии (так как последовательности-мишени присутствуют в избытке, при Тт, 50 % зондов заняты в равновесии). Жесткие условия могут быть такими, при которых концентрация соли составляет менее чем приблизительно 1,0 М иона натрия, например, приблизительно 0,01-1,0 М концентрация иона натрия (или других солей) при рН от 7,0 до 8,3, атемпература составляет, по меньшей мерепо меньшей мере приблизительно 30 °С для коротких зондов (например, приблизительно 10-50 нуклеотидов) и, по меньшей мерепо меньшей мере приблизительно 60 °С для длинных зондов (например, более чем приблизительно 50 нуклеотидовЖесткие условия могут быть также достигнуты при добавлении дестабилизирующих агентов, таких как формамид. Для селективной или специфической гибридизации, положительный сигнал может составлять, по меньшей мерепо меньшей мере от 2 до 10 раз фоновой гибридизации. Примеры жестких условий гибридизации включают следующее: 50 % формамид, 5-кратный SSC и 1 % SDS, инкубация при 42 °С, или, 5х SSC, 1 % SDS, инкубация при 65 °С, с промывкой в 0,2 х SSC и 0,1 % SDS при 65 °С.
[00124] "Практически комплементарные", как используется в данном документе, означает, что первая последовательность, по меньшей мерепо меньшей мере на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична комплементу второй последовательности по области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот, или что две последовательности гибридизируют в жестких условиях гибридизации.
[00125] "Практически идентичные", как используется в данном документе, означает, что первая последовательность, по меньшей мерепо меньшей мере на 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 98 % или 99 % идентична по области из 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 180, 270, 360, 450, 540 или более нуклеотидов или аминокислот или относительно к нуклеиновым кислотам, если первая последовательность, по существу, дополняет состав второй последовательности.
[00126] "Подтип" или "серотип": как используется в данном документе, взаимозаменяемы, и относительно HBV означает генетические варианты HBV, так что один подтип распознается иммунной системой отдельно от другого подтипа.
[00127] "Вариант", используемый здесь в связи с нуклеиновой кислотой, означает (I) часть или фрагмент указанной нуклеотидной последовательности; (II) комплемент указанной нуклеотидной последовательности или ее части; (III) нуклеиновую кислоту, которая по существу идентична указанной нуклеиновой кислоте или ее комплементу; или (IV) нуклеиновую кислоту, которая гибридизирует в жестких условиях с указанной нуклеиновой кислотой, ее комплементом, или последовательности, по существу, идентичные ей.
[00128] "Вариант" относительно пептида или полипептида, который отличается по аминокислотной последовательности вставкой, делецией или консервативным замещением аминокислот, но сохраняет, по меньшей мерепо меньшей мере одну биологическую активность. Вариант может также означать белок с аминокислотной последовательностью, которая по существу идентична указанному белку с аминокислотной последовательностью, которая сохраняет, по меньшей мерепо меньшей мере одну биологическую активность. Консервативное замещение аминокислоты, то есть, замена аминокислоты другой аминокислотой со сходными свойствами (например, гидрофильностью, степенью и распределением заряженных участков), признается в уровне техники, как правило, таким, что включает незначительные изменения. Эти незначительные изменения могут быть определены, в частности, при рассмотрении индекса гидропатичности аминокислот, как известно в данной области. Kyte et al., J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982). Индекс гидропатичности аминокислот Гидропатический индекс аминокислоты основан на рассмотрении его гидрофобности и заряда. Как известно в данной области техники, аминокислоты с подобными индексами гидропатичности могут быть замещенными и по-прежнему сохранять функцию белка. В одном аспекте аминокислоты, имеющие индексы гидропатичности ± 2 замещаются.Гидрофильность аминокислот может быть также использована для выявления замещений, которые могли бы дать белки, сохраняющие биологическую функцию. Рассмотрение гидрофильности аминокислот в контексте пептида позволяет рассчитать наибольшую локальную среднюю гидрофильность этого пептида, полезное измерение, которое, как сообщалось, хорошо коррелирует с антигенностью и иммуногенностью. Патент США № 4 554 101, включенный в данный документ в полном объеме путем ссылки. Замещение аминокислот, имеющих аналогичные величины гидрофильности, может привести к пептидам, сохраняющим биологическую активность, например, иммуногенность, как известно в данной области. Замещения могут быть выполнены с аминокислотами, имеющими значения гидрофильности в пределах ± 2 относительно друг друга. Как индекс гидрофобности, так и значение гидрофильности аминокислот зависят от конкретной боковой цепи этой
аминокислоты. В соответствии с этим наблюдением, аминокислотные замещения, которые совместимы с биологической функцией, как подразумевается, зависят от относительного сходства аминокислот и, в частности, боковых цепей этих аминокислот, как обнаружено с помощью гидрофобности, гидрофильности, заряда, размера и других свойств. [00129] "Вектор", как используется в данном документе, означает последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую точку начала репликации. Вектор может быть вирусным вектором, бактериофагом, бактериальной искусственной хромосомой или искусственной хромосомой дрожжей. Вектор может быть ДНК или РНК вектором. Вектор может быть самовоспроизводящимся экстрахромосомным вектором, и предпочтительно, представляет собой плазмидную ДНК.
2. Вакцины
[00130] Настоящее изобретение относится к вакцине против гепатита В. Вакцина против гепатита В (HBV) может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую коровый антиген HBV, поверхностный антиген HBV или их комбинацию; коровый антиген HBV , поверхностный антиген HBV или их комбинации, или комбинацию (1) нуклеиновой кислоты, кодирующей коровый антиген HBV и/или поверхностный антиген HBV, и (2) корового антигена HBV и/или поверхностного антигена HBV, или (3) их комбинации. Коровый антиген HBV может содержать консенсусный белок, полученный из аминокислотных последовательностей капсидных белков от различных генотипов HBV. Аналогичным образом, поверхностный антиген HBV может содержать консенсусный белок, полученный из аминокислотных последовательностей поверхностных антигенов от нескольких генотипов HBV. Такой коровый белок HBV и консенсусные поверхностные антигены HBV являются уникальными и имеют сходство с коровыми и поверхностными антигенами, соответственно, в целом по нескольким генотипам HBV. Таким образом, вакцина согласно настоящему изобретению применима к нескольким типам HBV и подходит для распространенных популяций. Кроме того, вакцина согласно настоящему изобретению может быть приспособлена к конкретным нуклеиновым кислотам, кодирующим консенсусный коровый белок HBV, консенсусный поверхностный белок HBV или их комбинацию. Другими словами, вакцина согласно настоящему изобретению может быть предназначена для контроля уровня или силы иммунного ответа у субъекта против одного или нескольких серотипов HBV.
[00131] Вакцина может быть ДНК-вакциной. ДНК-вакцины раскрыты в патентах США № 5 593 972, 5 739 118, 5 817 637, 5 830 876, 5 962 428, 5 981 505, 5 580 859, 5 703 055 и 5 676 594, которые включены в настоящее описание полностью в качестве ссылки. ДНК-вакцина
может дополнительно содержать элементы или реагенты, которые ингибируют ее интеграцию в хромосому.
[00132] Вакцина может быть РНК капсидного белка HBV и/или белком поверхностного антигена HBV. РНК-вакцина может быть введена в клетку.
а. Коровый антиген HBV [00133] Вакцина согласно настоящему изобретению может содержать коровый белок HBV. Коровый белок HBV является мишенью для иммунно опосредованного вирусного клиренса, вызывая 1) ЦТ Л ответы цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТ Л), 2) Т-хелперные ответы и/или 3) ответы В-клеток или, предпочтительно, все вышеуказанные для перекрестной презентации.
[00134] Таблица 2 показывает сходство между генотипами корового антигена из генотипов HBV-A, HBV-B, HBV-C, HBV-D и HBV-E с консенсусным коровым белком HBV, названным в графе как "HBV-M-core". Для некоторых вариантов осуществления М-коровый конструкт НВ V был разработан для увеличения гомологии для широкого круга коровых мишеней HBV. Сходства генотипов для корового антигена с разработанным М-коровым конструктом увеличили гомологии для широкого круга коровых мишеней HBV. Все генотипы должны быть представлены в универсальной иммунной терапевтической вакцине для HBV.
[00135] Антиген может содержать эпитопы корового белка, которые делают их эффективными, в частности, в качестве иммуногенов, против которих анти-HBV иммунные ответы могут быть индуцированы. Антиген HBV может содержать полноразмерный продукт, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
[00136] Коровый антиген HBV может содержать консенсусный белок. Консенсусный коровый антиген HBV индуцирует антиген-специфическую Т-клетку и высокий титр антител как системно, так и в печени. Таким образом, защитный иммунный ответ обеспечивается в печени с помощью вакцин, содержащих консенсусный коровый антиген HBV. Соответственно, любой пользователь может создать вакцину согласно настоящему изобретению, которая включает консенсусный коровый антиген HBV, чтобы обеспечить иммунную терапию и/или защиту печени.
[00137] В частности, в индуцированной иммунной реакции, консенсусный коровый антиген HBV стимулирует спленоциты, в частности CD4+ клетки и CD8+ клетки, секретировать или производить аналогичные количества интерферона-гамма (INF-y), но различные количества фактора некроза опухоли-альфа (TNF-a). Интересно, индуцированный иммунный ответ отличается в селезенке и печени. В селезенке, CD8+ клетки продуцируют как INF-y , так и TNF-a больше, чем CD4+ клетки, однако в печени происходит обратное. Другими словами, CD4+ клетки продуцируют как INF-y, так и TNF-a больше, чем CD8+ клетки в печени. Кроме того, в печени продуцируется больше антиген-специфических IgA чем IgG, а защитный иммунный ответ удивительно и неожиданно включает антиген-специфический ответ ЦТЛ, который не вызывает повреждения печени. Соответственно, вакцина согласно настоящему изобретению, содержащая консенсусный коровый антиген HBV, может быть доставлена на периферию, чтобы наладить антиген-специфическое нацеливание в печень для очистки или устранения HBV-инфицированных клеток без повреждения или воспаления печени. [00138] Последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие консенсусные коровые белки HBV, представляют собой SEQ ГО N0:1, SEQ ID N0:3 и SEQ ГО N0:5. SEQ ID N0:1 кодирует консенсусный коровый белок HBV. SEQ ГО N0:3 кодирует консенсусный коровый белок HBV, присоединенный к лидеру IgE. SEQ ID N0:5 кодирует консенсусный коровый белок HBV, присоединенный к лидеру IgE и метке НА.
[00139] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих белки, идентичные или гомологичные консенсусному белку HBV, иммуногенному фрагменту из консенсусного белка HBV, и их иммуногенные фрагменты гомологичных белков. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют до 95 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, вплоть до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 97 % идентичности по всей
длине аминокислотной последовательности в консенсусной последовательности, до 98 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности из консенсусной последовательности и до 99 % могут быть предоставлены. Кроме того, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, указанные в данном документе, и иммуногенные фрагменты белков, идентичных белкам, указанным в данном описании, также предоставляются.
[00140] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 95 % гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 96 % гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 97 % гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 98 % гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 99 % гомологию с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, описанными в настоящем документе, которые гомологичны кодирующей последовательности консенсусного белка, раскрытого в настоящем документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует гомологичные белковые последовательности, описанные в настоящем документе.
[00141] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующих белки с определенной процентной идентичностью по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового консенсусного белка HBV, иммуногенный фрагмент из корового консенсусного белка HBV и иммуногенные фрагменты коровых консенсусных белков HBV. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют до 80 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной
коровой консенсусной последовательности HBV, до 85 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 90 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 91 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 92 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 93 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 94 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 95 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 97 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 98 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV, до 99 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной коровой консенсусной последовательности HBV могут быть обеспечены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, указанные в настоящем документе, и иммуногенные фрагменты белков с аналогичным процентом идентичности, как указано выше, с коровыми белками HBV, описанными в данном документе. [00142] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 80 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 83 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 85 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно
данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 90 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 91 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 92 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 93 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 94 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 95 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 96 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 97 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 98 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного
корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенный белок, который имеет 99 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного корового белка HBV, кодируемого последовательностями нуклеиновых кислот согласно данному документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, описанными в настоящем документе, которые гомологичны кодирующей последовательности консенсусного корового белка HBV, раскрытого в настоящем документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует гомологичные белковые последовательности, описанные в настоящем документе.
[00143] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидер IgE.
[00144] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к фрагментам SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3 и SEQ ID N0:5. Фрагменты могут составлять по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % от последовательностей SEQ Ш N0:1, SEQ Ш N0:3 и SEQ ID N0:5. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3 и SEQ ID N0:5. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 91 % по меньшей мере 92 % по меньшей мере 93 % по меньшей мере 94 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID N0:1, SEQ Ш N0:3 и SEQ ID N0:5. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают последовательности, которые кодируют лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах
реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодирует лидерную последовательность, такую как, например, лидер IgE.
[00145] Кроме того, аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV представляет собой SEQ ID N0:2. Аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV, присоединенная к лидеру IgE, представляет собой SEQ ID N0:4. В частности, в SEQ Ш N0:4, лидер ^Еприсоединен к амино-концу консенсусного корового белка HBV. Аминокислотная последовательность консенсусного корового белка HBV, присоединенного к лидеру IgE и метке НА, представляет собой SEQ ID N0:6. Bn SEQ ID N0:6, лидер IgE и метка НА присоединены к амино-концу и карбокси-концу, соответственно, консенсусного корового белка HBV. [00146] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые гомологичны SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 и SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 95 % гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 96 % гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 97 % гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 98 % гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 99 % гомологию с консенсусными белковыми последовательностями, как указано в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. [00147] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые идентичны SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 80 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 85 % идентична по всей длине
аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 90 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 91 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 92 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 93 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 94 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 95 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ ID N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 96 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 97 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые
имеют аминокислотную последовательность, которая на 98 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 99 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ Ш N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ ID N0:6. [00148] В некоторых вариантах реализации изобретения белок свободен от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения белок свободен от лидера IgE. Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % консенсусного белка. Иммуногенные фрагменты последовательностей SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6 могут быть обеспечены. Иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % последовательности SEQ Ш N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ ID N0:6. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE.
[00149] Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, гомологичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 или SEQ Ш N0:6 могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по
меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % белков, которые на 95 % гомологичны последовательностям SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ Ш N0:6. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 96 % гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 97 % гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 98 % гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 99 % гомологию с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE. [00150] Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 и SEQ Ш N0:6 могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % белков, которые на 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % идентичны по всей длине аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:2, SEQ Ш N0:4 или SEQ ID N0:6. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от
лидерной последовательности. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от лидерной последовательности, такой как, например, лидер IgE. [00151] Как указано в данном описании относительно присоединения сигнального пептида или лидерной последовательности к N-концу белка, сигнальный пептид/лидерная последовательность заменяет N-концевой метионин белка, который кодируется старт-кодоном последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует белок без кодирующих последовательностей сигнального пептида. Таким образом, например, SEQ ID N0:4 представляет собой SEQ ID N0:2 с сигнальным пептидом/лидерной последовательностью, присоединенным к N-концу последовательности SEQ ID N0:2, т.е. SEQ Ш N0:4 является белком, содержащим сигнальный пептид, присоединенный к N-концу последовательности SEQ ID N0:2. Первый остаток в SEQ Ш N0:2, "Хаа", как правило, является метионином в отсутствие сигнального пептида. Однако, белки, которые содержат сигнальные пептиды, присоединенные к SEQ ID N0:2, такие как SEQ ID N0:4, заменяют остаток 1 метионина в Хаа остатком, который присоединяет сигнальный пептид к белку. Соответственно, N-концевой остаток последовательности SEQ ID N0:2 может быть любым, но если он кодируется последовательностью инициации, то это метионин. Связь сигнального пептида/лидерной последовательности с N-концом на SEQ Ш N0: 2, как правило, исключает N-концевой метионин. Как используется в данном документе, предполагается, что SEQ Ш N0: 4 содержит SEQ Ш N0: 2 с сигнальным пептидом/ лидерной последовательностью, связанной с N-концом на SEQ Ш N0: 2, несмотря на устранение N-концевого Хаа-остатка последовательности SEQ Ш N0: 2. Аналогичным образом, кодирующие последовательности для SEQ Ш N0: 4 содержат последовательности, кодирующие SEQ Ш N0: 2 с последовательностями, кодирующими сигнальный пептид/лидерную последовательность, присоединяющиеся к 5'-концу последовательностей, кодирующих SEQ Ш N0: 2. Инициирующий кодон может быть "ппп" в кодирующих последовательностях для SEQ Ш N0: 2, но он элиминируется, когда кодирующие последовательности сигнального пептида/лидерной последовательности, связанного с 5'-концом кодирующих последовательностей, которые кодируют SEQ Ш N0: 2. Как используется в данном документе, предполагается, что кодирующие последовательности для SEQ Ш N0: 4 содержат кодирующие последовательности для SEQ Ш N0: 2 с кодирующими последовательности для сигнального пептида/лидерной последовательности, присоединенной к 5'-концу кодирующей последовательности SEQ Ш N0: 2, где встречается ппп. Таким образом, например, предполагается, что SEQ Ш N0: 3 содержит SEQ Ш NO: 1 с кодирующими последовательностями для сигнального пептида/лидерной последовательности, присоединенной к 5'-концу последовательности
SEQ Ш NO: 1 вместо nnn. В некоторых вариантах реализации изобретения ппп является кодоном инициации на 5'-конце последовательности SEQ Ш NO: 1.
Ь. Поверхностный антиген HBV [00152] Вакцина может содержать поверхностный антиген HBV. Настоящая заявка предлагает поверхностные антигены HBV, способные вызывать иммунную реакцию у млекопитающих против одного или более серотипов HBV. Поверхностные антигены могут содержать эпитопы поверхностных белков, которые делают их эффективными, в частности, в качестве иммуногенов, против которыхо анти-HBV может быть вызвана иммунная реакция. Поверхностный антиген HBV может содержать полноразмерный трансляционный продукт, его вариант, его фрагмент или их комбинацию.
[00153] Поверхностный антиген HBV может содержать консенсусный белок. Консенсусные поверхностные антигены HBV получают из последовательностей поверхностных антигенов первичных изолятов генотипа А или С HBV. В частности, консенсусные поверхностные антигены HBV включают S-белок или комбинацию S-белка, npe-S2 и npe-Sl (Фигуры 3 и 4). Эндопротеолитические сайты расщепления вводятся в консенсусные поверхностные антигены HBV для обеспечения правильного белкового фолдинга и лучшего ЦТЛ-процессирования. Использование кодонов в консенсусных поверхностных антигенах НВV было модифицировано, чтобы отразить кодонное смещение человеческих генов. Кроме того, удалось избежать областей с очень высоким (например, больше, чем 80 процентов) или очень низким (например, меньше, чем 30 процентов) содержанием GC, где находились цис-действующие мотивы, такие как внутренние ТАТА-боксы, повторные последовательности и структурированные последовательности. Последовательность Козак ввели в консенсусные поверхностные антигены НВУдля повышения инициации трансляции и лидерную последовательность IgE добавили для повышения экспрессии белка.
[00154] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая консенсусные поверхностные антигены HBV, представляет собой SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13, и SEQ Ш N0:15. SEQ ID N0:9 кодирует белок длинного консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа А, и включает S-белок, npe-S2 и npe-Sl (LHBs-A). SEQ ID N0:11 кодирует белок длинного консенсусного поверхностного антигена HBV, полученного из генотипа С, и включает S-белок, npe-S2 и npe-Sl (LHBs-C). SEQ ID N0:13 кодирует белок короткого консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа А, и включает S-белок (SHBs-A). SEQ ID N0:15 кодирует белок
короткого консенсусного поверхностного антигена HBV, полученный из генотипа С, и включает S-белок (SHBs-C).
[00155] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки, идентичные по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных поверхностных антигенов HBV, иммуногенным фрагментам консенсусных поверхностных антигенов HBV и иммуногенным фрагментам идентичных белков. Таким образом, молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, которые имеют до 95 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена НВV, до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена НВV, до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV, до 97 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена НВ V, до 98 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV и до 99 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности с последовательностью консенсусного поверхностного антигена HBV могут быть обеспечены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, описанные в настоящей заявке, и иммуногенные фрагменты белков, идентичных по всей длине аминокислотной последовательности белкам поверхностного антигена HBV, описанным в настоящей заявке.
[00156] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 95 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV сгласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
96 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV сгласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
97 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV сгласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к
молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
98 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV сгласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
99 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности с кодирующими последовательностями нуклеиновых кислот поверхностных антигенов HBV сгласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями, раскрытыми в настоящем документе, которые идентичны по всей длине аминокислотной последовательности кодирующей последовательности белка консенсусного поверхностного антигена HBV, раскрытого в настоящем документе, включает последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует идентичные белковые последовательности, раскрытые в настоящем документе
[00157] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим белки с определенным процентом идентичности по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерного консенсусного белка поверхностного антигена HBV, иммуногенного фрагмента консенсусного белка поверхностного антигена HBV и иммуногенных фрагментов консенсусных белков поверхностного антигена HBV. Такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют белки, которые имеют до 80 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 85 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 90 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 91 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 92 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 93 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 94 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 95 %
идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 96 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 97 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 98 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV, до 99 % идентичности по всей длине аминокислотной последовательности консенсусной последовательности полноразмерного поверхностного антигена HBV могут быть предоставлены. Кроме того, предлагаются также последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие иммуногенные фрагменты, описанные в настоящей заявке, и иммуногенные фрагменты белков с похожим процентом идентичности, как указано выше, с белками поверхностных антигенов HBV, описанными в настоящей заявке.
[00158] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 80 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 83 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют 85 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
90 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
91 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к
молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
92 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
93 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
94 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
95 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
96 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
97 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
98 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к молекулам нуклеиновых кислот, которые кодируют иммуногенные белки, которые имеют
99 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности кодирующих последовательностей полноразмерных поверхностных антигенов HBV согласно настоящему документу. В некоторых вариантах реализации изобретения молекулы нуклеиновых кислот с кодирующими последовательностями поверхностных антигенов HBV, раскрытых в данном документе, идентичны по всей длине аминокслотной последовательности кодирующей последовательности белка консенсусного
поверхностного антигена HBV, раскрытого в данном документе, включают последовательности, кодирующие лидерную последовательность IgE, присоединенную к 5'-концу кодирующей последовательности, которая кодирует идентичные белковые последовательности, раскрытые в данном документе.
[00159] В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения последовательность нуклеиновой кислоты свободна от кодирующей последовательности, которая кодирует лидер IgE.
[00160] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к фрагментам последовательностей SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 11, SEQ Ш N0:13 и SEQ Ш N0:15. Фрагменты могут составлять по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % последовательности SEQ Ш N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ Ш N0:13 или SEQ Ш N0:15. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере
97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 или SEQ Ш N0:15. Фрагменты могут быть по меньшей мере на 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 91 % по меньшей мере 92 % по меньшей мере 93 % по меньшей мере 94 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере
98 % или по меньшей мере 99 % идентичными фрагментам последовательностей SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ Ш NO: 13 или SEQ Ш NO: 15. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты включают последовательности, которые кодируют лидерную последовательность, такую как, например, иммуноглобулиновый лидер, такой как лидер IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодируют лидерную последовательность. В некоторых вариантах реализации изобретения фрагменты свободны от кодирующих последовательностей, которые кодируют лидерную последовательность, такую как лидер IgE.
[00161] Кроме того, аминокислотные последовательности консенсусных поверхностных антигенов HBV, LHBs-A, LHBs-C, SHBs-A и SHBs-C представляют собойе SEQ ID N0:10, SEQ Ш N0:12, SEQ ID N0:14 и SEQ Ш N0:16, соответственно.
[00162] Белки могут быть идентичными последовательностям SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 95 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 96 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 97 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 98 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют 99 % идентичность по всей длине аминокислотной последовательности консенсусных белковых последовательностей согласно настоящему документу.
[00163] Некоторые варианты реализации изобретения относятся к белкам, которые идентичны последовательностям SEQ Ш N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 80 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ Ш N0:10, SEQ Ш N0:12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 85 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 90 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты
реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 91 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 92 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ Ш N0:10, SEQ Ш N0:12, SEQ ID N0: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 93 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 94 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 95 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 96 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ Ш N0:10, SEQ Ш N0:12, SEQ ID N0: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 97 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют аминокислотную последовательность, которая на 98 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ Ш N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным белкам, которые имеют
аминокислотную последовательность, которая на 99 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности непроцесированным консенсусным аминокислотным последовательностям, указанным в SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш NO: 14 или SEQ ID N0:16.
[00164] Фрагменты консенсусных белков могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % консенсусного белка. Иммуногенные фрагменты последовательностей SEQ ID NO:10, SEQ Ш N0:12, SEQ Ш N0:14 и SEQ ID N0:16 могут быть обеспечены. Иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16.
[00165] Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш N0:14 или SEQ Ш N0:16, могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере 20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % белков, которые на 95 % идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16.
[00166] Иммуногенные фрагменты белков с аминокислотными последовательностями, идентичными иммуногенным фрагментам последовательностей SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш N0:14 или SEQ Ш N0:16, могут быть обеспечены. Такие иммуногенные фрагменты могут содержать по меньшей мере 10 % по меньшей мере 15 % по меньшей мере
20 % по меньшей мере 25 % по меньшей мере 30 % по меньшей мере 35 % по меньшей мере 40 % по меньшей мере 45 % по меньшей мере 50 % или по меньшей мере 55 % по меньшей мере 60 % по меньшей мере 65 % по меньшей мере 70 % по меньшей мере 75 % по меньшей мере 80 % по меньшей мере 85 % по меньшей мере 90 % по меньшей мере 95 % по меньшей мере 96 % по меньшей мере 97 % по меньшей мере 98 % или по меньшей мере 99 % белков, которые на 95 % идентичны по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш N0:14 или SEQ ID N0:16. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 96 % идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей соглано настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 97 % идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей соглано настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 98 % идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей соглано настоящему документу. Некоторые варианты реализации изобретения относятся к иммуногенным фрагментам, которые имеют 99 % идентичность с иммуногенными фрагментами консенсусных белковых последовательностей соглано настоящему документу.
с. Комбинация коровых и поверхностных антигенов HBV [00167] Вакцина может содержать комбинацию коровых и поверхностных антигенов HBV, как описано выше. Эта комбинация антигенов HBV способна вызывать иммунный ответ у млекопитающего на один или более серотипов HBV. Вакцина может быть разработана с учетом или иметь определенную комбинацию антигенов HBV, которые, в свою очередь, обеспечивают возможность контролировать уровень или силу иммунного ответа у млекопитающего.
[00168] Комбинации могут содержать одну али более нуклеиновых кислот, кодирующих (1) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (2) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A и LHBs-C; (3) HBV-M-Core, LHBs-A, и SHBs-A; (4) HBV-M-Core и LHBs-A; (5) HBV-M-Core, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (6) HBV-M-Core, LHBs-C, и SHBs-C; (7) HBV-M-Core и SHBs-C; (8) HBV-M-Core, LHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (9) HBV-M-core, LHBs-A, и SHBs-C; (10) HBV-M-Core и SHBs-C; (11) HBV-M-Core, LHBs-A, SHBs-A, и SHBs-C; (12) HBV-M-Core, LHBs-A, и SHBs-C; (13) HBV-M-Core, SHBs-A, и SHBs-C; (14) LHBs-A, SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (15) LHBs-A, SHBs-A, и LHBs-C; (16) LHBs-A и SHBs-A; (17) SHBs-A, LHBs-C, и SHBs-C; (18) LHBs-C и SHBs-C; (19) LHBs-A, LHBs-C, и
SHBs-C; (20) LHBs-A и SHBs-C; (21) LHBs-A, SHBs-A, и SHBs-C; (22) LHBs-A и SHBs-C; (23) SHBs-A и SHBs-C; (24) HBV-M-Core и SHBs-A; (25) HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C; или (26) LHBs-A и LHBs-C.
[00169] Примерный вариант осуществления изобретения относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C. Другой иллюстративный вариант осуществления относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBV-M-Core, SHBs-A и SHBs-C. Еще один вариант осуществления относится к вакцине, включая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих HBV-M-Core, LHBs-A и LHBs-C и адъювант, такой как IL-12. [00170] Комбинационная вакцина также содержит один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV в виде одной или нескольких белковых субъединиц, одну или более убитых вирусных частиц, содержащих один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок консенсусного поверхностного антигена HBV, или одну или более ослабленных вирусных частиц, содержащих один или более консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV. Ослабленная вакцина может быть ослабленной живой вакциной, убитой вакциной и вакцинами, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных генов, которые кодируют один или несколько консенсусных коровых белков HBV и/или белок поверхностного антигена HBV, а также субъединицы и гликопротеиновые вакцины. Примеры ослабленных живых вакцин, тех, которые используют рекомбинантные векторы для доставки чужеродных антигенов, субъединичных вакцин и вакцин гликопротеинов, описаны в патентах США №: 4 510 245; 4 797 368; 4 722 848; 4 790 987; 4 920 209; 5 017 487; 5 077 044; 5 ПО 587; 5 112 749; 5 174 993; 5 223 424; 5 225 336; 5 240 703; 5 242 829; 5 294 441; 5 294 548; 5 310 668; 5 387 744; 5 389 368; 5 424 065; 5 451 499; 5 453 364; 5 462 734; 5 470 734; 5 474 935; 5 482 713; 5 591 439; 5 643 579; 5 650 309; 5 698 202; 5 955 088; 6 034 298; 6 042 836; 6 156 319 b 6 589 529, каждый из которых включен в настоящее описание в качестве ссылки.
d. Вакцинные продукты и плазмиды [00171] Вакцина может содержать конструкты нуклеиновой кислоты или плазмиды, которые кодируют коровые белки HBV, поверхностные антигены HBV, и комбинации коровые белкоки HBV/поверхностные антигены. Предлагаемыми в настоящей заявке являются генетические конструкты, которые могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует коровый антиген HBV, описанный в настоящем документе, включая консенсусные белковые последовательности, последовательности,
гомологичные консенсусным белковым последовательностям, фрагменты консенсусных белковых последовательностей и последовательности, гомологичные фрагментам консенсусных белковых последовательностей. Кроме того, предлагаемыми в настоящей заявке являются генетические конструкты, которые могут содержать последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует поверхностный антиген HBV, описанный в настоящем документе, последовательности, гомологичные консенсусным белковым последовательностям, фрагменты консенсусных белковых последовательностей и последовательности, гомологичные фрагментам консенсусных белковых последовательностей. Генетический конструкт может присутствовать в клетке в виде функционирующей экстрахромосомальной молекулы. Генетический конструкт может быть линейной минихромосомой, включая центромеры, теломеры или плазмиды или космиды. [00172] Генетический конструкт может также быть частью генома рекомбинантного вирусного вектора, включая рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус ассоциированный вирус и рекомбинантный вирус осповакцины. Генетический конструкт может быть частью генетического материала в ослабленных живых микроорганизмах или рекомбинантных микробных векторов, которые живут в клетках.
[00173] Генетические конструкты могут содержать регулятор ные элементы для экспрессии генов, кодирующих последовательности нуклеиновой кислоты. Регулирующие элементы могут быть промотором, энхансерным инициирующим кодоном, стоп-кодоном или сигналом полиаденилирования.
[00174] Последовательности нуклеиновых кислот могут составить генетический конструкт, который может быть вектором. Вектор может быть способен экспрессировать антиген в клетке млекопитающего в количестве, эффективном для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Вектор может быть рекомбинантным. Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген. Вектор может быть плазмидой. Вектор может быть полезным для трансфекции клеток нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, который культивируют с трансформированной клеткой-хозяином и выдерживают в условиях, в которых экспрессия антигена имеет место. [00175] Кодирующие последовательности можно оптимизировать для стабильности и высоких уровней экспрессии. В некоторых случаях, кодоны выбирают так, чтобы уменьшить образование вторичной структуры РНК, такой как та, что формируется за счет внутримолекулярной связи.
[00176] Вектор может содержать гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую антиген, и может дополнительно содержать инициирующий кодон, который может располагаться по ходу транскрипции антигенкодирующей последовательности, и
стоп-кодон, который может располагаться против хода транскрипции антигенкодирующей последовательности. Кодон инициации и стоп-кодон может располагаться в рамке с антигенкодирующей последовательностью. Вектор может также содержать промотор, который функционально связан с антигенкодирующей последовательностью. Промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей антиген, может быть промотором из вируса обезьян 40 (SV40), вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV), промотором вируса иммунодефицита человека (HIV) промотором, таким как промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса бычьего иммунодефицита (BIV), промотором вируса Молони, промотором вируса птичьего лейкоза (ALV), промотором цитомегаловируса (CMV), промотором, таким как непосредственно ранний промотор CMV, промотором вируса Эпштейна-Барра (EBV) или промотором вируса саркомы Рауса (RSV). Промотор может быть также промотором человеческого гена, такого как человеческий актин, миозин человека, гемоглобин человека, человеческий мышечный креатин или металлотионеин. Промотор может быть также тканеспецифическим промотором, таким мышечно или кожно специфическим промотором, природным или искусственным, цы или кожи конкретного промотора, природные или синтетические. Примеры таких промоторов описаны в публикации патентной заявки США № US20040175727, содержание которой включено в настоящее описание во всей своей полноте.
[00177] Вектор может также содержать сигнал полиаденилирования, который может располагаться против хода транскрипции последовательности, кодирующей коровый белок HBV. Сигнал полиаденилирования может быть сигналом полиаденилирования SV40, сигналом полиаденилирования LTR, сигналом полиаденилирования бычьего гормона роста (bGH), сигналом полиаденилирования человеческого гормона роста (hGH) или сигналом полиаденилирования Р-глобина. Сигнал полиаденилирования SV40 может быть сигналом полиаденилирования из вектора рСЕР4 (Invitrogen, San Diego, СА).
[00178] Вектор может также содержать энхансер, расположенный против хода транскрипции последовательности, кодирующей консенсусный коровый белок HBV, или последовательности, кодирующей белок консенсусного поверхностного антигена HBV. Энхансер может быть необходим для экспрессии ДНК. Энхансер может быть человеческим актином, человеческим миозином, человеческим гемоглобином, человеческим мышечным креатином или вирусным энхансером, таким как энхансер из CMV, НА, RSV или EBV. Энхансеры функции полинуклеотида описаны в патентах США № 5 593 972, 5 962 428, а также WO 94/016737, содержание каждого из них в полном объеме включено в качестве ссылки.
[00179] Вектор может также содержать точку начала репликации от млекопитающих, чтобы поддерживать вектор экстрахромосомально и продуцировать несколько копий вектора в клетке. Вектор может быть pVAXl, рСЕР4 или pREP4 от Invitrogen (San Diego, СА), который может содержать точку начала репликации вируса Эпштейн-Барра и кодирующую область ядерного антигена EBNA-1, которые могут продуцировать высокого копирования эписомную репликацию без интеграции. Вектор может быть pVAXl или вариантом pVaxl с изменениями, таким как вариантная плазмида, описанная в данном документе. Вариантной плазмидой pVaxl является вариант из 2998 пар оснований скелетной векторной плазмиды pVAXl (Invitrogen, Carlsbad СА). Промотор CMV расположен у оснований137-724. Промотор/сайт примирования Т7 расположен у оснований 664-683. Несколько сайтов клонирования расположены у оснований 696-811. Сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста расположен у оснований 829-1053. Ген устойчивости к канамицину находится у оснований 1226-2020. Точка начала репликации pUC расположена у оснований 2320-2993.
[00180] Исходя из последовательности pVAXl, доступной от Invitrogen, 1следующие
мутации могут быть обнаружены в последовательности pVAXl, которая используется в
качестве скелета для плазмид 1-6, указанных в настоящем документе:
[00181] C> G 241 в промоторе CMV
[00182] С> Т1942 скелет, по ходу транскрипции сигнала полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpolyA)
[00183] А> -2876 скелет, по ходу транскрипции гена устойчивости к канамицину [00184] С> Т3277 в точке начала репликации pUC (Ori), мутация с высоким числом копий (смотри Nucleic Acid Research 1985)
[00185] G> C 3753 в самом конце pUC Ori против хода транскрипции сайта
RNASeH
[00186] Пары оснований 2, 3 и 4 изменяются от ACT до CTG в скелете, против хода транскрипции промотора CMV.
[00187] Скелетом вектора может быть pAV0242. Вектор может быть типом 5 вектора аденовируса, дефектного по репликации (Ad5).
[00188] Вектор может также содержать регуляторную последовательность, которая может хорошо подходить для экспрессии генов в клетках млекопитающих или человека, в которые вводят вектор. Консенсусная кодирующая последовательность HBV может содержать кодон, который может позволить более эффективную транскрипцию кодирующей последовательности в клетке-хозяине.
[00189] Вектором может быть pSE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для продуцирования белка в Escherichia coli (Е. coli). Вектором также может быть pYES2 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для продуцирования белка в штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Вектором также может быть полная бакуловирусная экспрессионная система МАХВАС(tm) (Invitrogen, San Diego, Calif.), которая может быть использована для продуцирования белка в клетках насекомых. Вектором также может быть pcDNA I или pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.), которые могут быть использованы для продуцирования белка в млекопитающих клетках, таких как овариальные клетки китайского хомячка (СНО). Вектором могут быть векторы экспрессии или системы для продуцирования белка с помощью рутинных технологий и легко доступных исходных материалов, включая Sambrook et al., Molecular Cloning and Laboratory Manual, Second Ed. , Cold Spring Harbor (1989), которые включены в полном объеме в виде ссылки.
[00190] В некоторых вариантах реализации изобретения вектор может содержать последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID N0:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID N0:20 или SEQ ID N0:21. SEQ ID N0:17 кодирует консенсусный коровый белок HBV, a SEQ ID NOS: 18-21 кодируют консенсусный поверхностный антиген HBV. Карты векторов SEQ ID NOS: 17-21 показаны на Фигурах 5-9, соответственно.
е. Фармацевтические композиции вакцины [00191] Вакцина может быть в виде фармацевтической композиции.Фармацевтическая композиция может содержать вакцину.
[00192] Фармацевтические композиции могут содержать приблизительно от 5 нанограмм до приблизительно 10 мг вакцинной ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции согласно настоящем изобретению содержат приблизительно от 25 нанограмм до приблизительно 5 мг вакцинной ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 50 нанограмм до приблизительно 1 мг ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 0,1 до приблизительно 500 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 1 до приблизительно 350 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 5 до приблизительно 250 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 10 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах
реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 15 до приблизительно 150 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 20 до приблизительно 100 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 25 до приблизительно 75 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 30 до приблизительно 50 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 35 до приблизительно 40 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции содержат приблизительно от 100 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 10 микрограм до приблизительно 100 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 20 микрограмм до приблизительно 80 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 25 микрограмм до приблизительно 60 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 30 нанограмм до приблизительно 50 микрограмм ДНК. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит приблизительно от 35 нанограмм до приблизительно 45 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретенияфармацевтическая композиция содержит от приблизительно 0,1 до приблизительно 500 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретенияфармацевтическая композиция содержит от приблизительно 1 до приблизительно 350 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 25 до приблизительно 250 микрограмм ДНК. В некоторых предпочтительных вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция содержит от приблизительно 100 до приблизительно 200 микрограмм ДНК. [00193] В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нанограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтические композиции могут содержать по меньшей мере 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, ПО, 115,120,125,130,135,140,145,150,155,160,165,170,175,180,185,190,195,200,205, 210, 215, 220, 225,230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305,
310, 315, 320, 325,330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395,400,405, 410, 415, 420, 425,430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 605, 610, 615, 620, 625,630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665, 670, 675, 680, 685, 690, 695,700,705, 710, 715, 720, 725,730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785, 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг или более ДНК вакцины.
[00194] В других вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 нанограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95,100, 105, ПО, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150,155,160,165,170,175,180,185,190,195,200,205,210,215,220,225,230,235,240,245, 250,255,260,265,270,275,280,285,290,295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365,370, 375, 380, 385, 390, 395,400,405,410,415,420,425,430,435,440,445, 450,455,460,465,470,475,480,485,490,495, 500, 605, 610, 615, 620, 625, 630, 635, 640, 645, 650, 655, 660, 665,670, 675, 680, 685, 690, 695,700,705,710,715,720,725,730,735,740,745, 750,755,760,765,770,775,780,785,790,795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845, 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895. 900, 905, 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965, 970, 975, 980, 985, 990, 995 или 1000 микрограмм ДНК вакцины. В некоторых вариантах реализации изобретения фармацевтическая композиция может содержать вплоть до и включая 1,5, 2,2,5, 3, 3,5, 4,4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5 или 10 мг ДНК вакцины.
[00195] Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать другие агенты для целей разработки в соответствии с режимом введения, который будет использоваться. В тех случаях, когда фармацевтические композиции представляют собой инъекционные фармацевтические композиции, они являются стерильными, пирогенными и свободными от частиц. Предпочтительно используют изотонический препарат. Как правило, добавки для изотоничности могут включать хлорид натрия, декстрозу, маннит, сорбит и лактозу. В некоторых случаях, предпочтительными являются изотонические растворы, такие как фосфатно-буферный раствор. Стабилизаторы включают желатин и альбумин. В некоторых вариантах реализации изобретения в композицию добавляют агент для сужение сосудов.
[00196] Вакцина может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый наполнитель. Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть функциональными молекулами в качестве наполнителей, адъювантов, носителей или разбавителей. Фармацевтически приемлемый эксципиент может быть агентом для облегчения трансфекции, который может включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона, везикулы, такие как сквален, и сквален, гиалуроновая кислота, липиды, липосомы, ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы, или другие известные агенты для облегчения трансфекции.
[00197] Облегчающим трансфекцию агентом является полианион, поликатион, в том числе поли-Е-глутамат LGS), или липид. Облегчающим трансфекцию агентом является поли-Е-глутамат, и более предпочтительно, поли-Е-глутамат присутствует в вакцине в концентрации менее 6 мг/мл. Облегчающий трансфекцию агент может также включать поверхностно-активные вещества, такие как иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS), неполный адъювант Фрейнда, аналог LPS, включая монофосфориллипид А, мурамилпептиды, аналоги хинона и везикулы, такие как сквален, и сквален и гиалуроновая кислота также могут вводиться в сочетании с генетическим конструктом. В некоторых вариантах реализации изобретения ДНК-векторные вакцины могут также включать облегчающие трансфекцию агенты, такие как липиды, липосомы, в том числе лецитин, липосомы или другие липосомы, известные в данной области техники, как ДНК-липосомные смеси (см. например W09324640), ионы кальция, вирусные белки, полианионы, поликатионы или наночастицы или другие известные агенты для облегчения трансфекции. Предпочтительно, облегчающим трансфекцию агентом является полианион, поликатион, включая поли-Е-глутамат (LGS), или липид. Концентрирование агента трансфекции в вакцине составляет менее 4 мг/мл, менее 2 мг/мл, менее 1 мг/мл, менее 0,750 мг/мл, менее 0,500 мг/мл, менее 0,250 мг/мл, менее 0,100 мг/мл, менее 0,050 мг/мл или менее 0,010 мг/мл.
[00198] Фармацевтически приемлемый наполнитель может быть адъювантом. Адъювантом могут быть другие гены, которые экспрессируются в альтернативной плазмиде или доставляются как белки в комбинации с указанной выше плазмидой в вакцине. Адъювант может быть выбранным из группы, содержащей: а-интерферон (IFN- а), Р-интерферон (IFN-P), у-интерферон фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNFP, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), кожный Т-клеточный проводящий хемокин (СТАСК), эпителиальный тимус-экспрессированный хемокин (ТЕСК),
мукозо-асоциированный эпителиальный хемокин (МЕС), IL-12, IL-15, МНС, CD80,CD86, включая IL-15, имеющий удаленную сигнальную последовательность и необязательно включающий сигнальный пептид от IgE. Адъювантом может быть IL-12, IL-15, IL-28, СТАСК, ТЕСК, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNF(3, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-18, IL-21, IL-31, IL-33 или их комбинации. Примерным вариантом осуществления адъюванта является IL-12. [00199] Другие гены, которые могут быть полезными адъювантами, включают те, которые кодируют: МСР-1, М1Р-1а, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, Р-селектин, Е-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18 , CD40, CD40L, васкулярный фактор роста, фибробластный фактор роста, IL-7, фактор роста нервов, васкулярный эндотелиальный фактор роста, Fas, рецептор TNF, Fit, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, Inactive NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа интерферона, NFkB, В ax, TRAIL, TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, Ox40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1, TAP2 и их функциональные фрагменты.
f. Способы доставки вакцины [00200] В настоящей заявке предлагается способ доставки фармацевтической композиции для обеспечения генетическиго конструкта и белков корового белка HBV и/или поверхностного антигена HBV, которые содержат эпитопы, которые делают их особенно эффективными иммуногенами, против которых иммунный ответ на вирусные HBV-инфекции может быть вызван. С целью индукции терапевтического и/или профилактического иммунного ответа может быть предложен способ доставки вакцины, или вакцинация. Процесс вакцинации может генерировать у млекопитающего иммунный ответ против множества генотипов HBV. Вакцина может быть доставлена индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы млекопитающего и усилить иммунный ответ. Доставка вакцины может быть трансфекцией антигеном НА в качестве молекулы нуклеиновой кислоты, которая экспрессируется в клетке и доставляется на поверхность клетки, на которой иммунная система распознает и индуцирует клеточный, гуморальный или клеточный и гуморальный ответ. Доставка вакцины может быть использована, чтобы индуцировать или вызвать иммунный ответ у млекопитающего против множества вирусов HBV путем введения млекопитающему вакцины, как описано в данном документе.
[00201] При доставке вакцины млекопитающему, и вслед за этим вектора в клетки млекопитающего, трансфицированные клетки будут экспрессировать и секретировать консенсусный коровый белок HBV и консенсусный поверхностный антиген HBV. Эти секретируемые белки или искусственные антигены, будут признаны в качестве чужеродных иммунной системой, которая будет поднимать иммунный ответ, который может включать: антитела, полученные против антигенов, и Т-клеточный ответ именно против антигена. В некоторых примерах, млекопитающее привито вакцинами, обсуждаемыми в данном документе, будет иметь примированную иммунную систему и при заражении вирусным штаммом HBV примированная иммунная система позволяет быстро очистить последующие вирусы HBV, будь то через гуморальную, или клеточную, или обе системы. Вакцина может быть доставлен индивидууму, чтобы модулировать активность иммунной системы индивидуума, тем самым повышая иммунный ответ. [00202] Способы доставки ДНК вакцины описаны в патенте США №. 4 945 050 и 5 036 006, оба из которых включены в настоящее описание во всей своей полноте в качестве ссылки.
[00203] С целью индукции иммунного ответа у млекопитающего вакцина может быть введена в организм млекопитающего.. Млекопитающее может быть человеком, нечеловекообразным приматом, коровой, свиньей, овцой, козой, антилопой, бизоном, буйволом, полорогим, оленем, ежем, слоном, ламой, альпака, мышами, крысами или курицей, и, предпочтительно, человеком, коровой, свиньей или курицей.
g. Доставка вакцины с адъювантами [00204] Фармацевтические композиции, предпочтительно вакцины, описанные в данном документе, могут быть введены в комбинации с белками или генами, кодирующими адъюванты, которые могут включать: а-интерферон (IFN- а), Р-интерферон (IFN-P), у-интерферон, IL-12, IL-15, IL-28, СТАСК, ТЕСК, фактор роста тромбоцитов (PDGF), TNFa, TNFp, GM-CSF, эпидермальный фактор роста (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, МСР-1, М1Р-1а, MIP-lp, IL-8, RANTES, L-селектин, Р-селектин, Е-селектин, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, мутантные формы IL-18, CD40, CD40L, васкулярный фактор роста, фибробластный фактор роста, IL-7, фактор роста нервов, васкулярный эндотелиальный фактор роста, Fas, рецептор TNF, Fit, Аро-1, р55, WSL-1, DR3, TRAMP, Аро-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6, Caspase ICE, Fos, c-jun, Sp-1, Ap-1, Ap-2, p38, p65Rel, MyD88, IRAK, TRAF6, IkB, неактивный NIK, SAP K, SAP-1, JNK, гены ответа интерферона, NFkB, Bax, TRAIL,
TRAILrec, TRAILrecDRC5, TRAIL-R3, TRAIL-R4, RANK, RANK LIGAND, 0x40, Ox40 LIGAND, NKG2D, MICA, MICB, NKG2A, NKG2B, NKG2C, NKG2E, NKG2F, TAP1 или TAP2 или их функциональные фрагменты. В примерных вариантах реализации изобретения адъювантом является IL-12.
h. Способ генерации иммунного ответа на вакцину
[00205] Вакцина может быть использована для генерации иммунного ответа у млекопитающего, в том числе терапевтического или профилактического иммунного ответа. Иммунный ответ может генерировать антитела и/или киллерные Т-клетки, которые направлены на коровый антиген HBV, поверхностный антиген HBV или их комбинации. Такие антитела и Т-клетки могут быть выделенными.
[00206] Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы генерации иммунных реакций против коровых белков HBV, поверхностных антигенных белков HBV и их комбинации, которые включают введение индивидууму вакцины. Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы профилактической вакцинации индивидуума против HBV-инфекции, которые включают введение вакцины. Некоторые варианты реализации изобретения обеспечивают способы терапевтической вакцинации индивидуума, который был заражен HBV, которые включают введение вакцины. Диагностика HBV-инфекции до введения вакцины может быть осуществлена в установленном порядке.
i. Способ лечения вакциной
[00207] Вакцина может быть использована для получения иммунного ответа у млекопитающего, который защищает печень. Иммунный ответ может создавать антиген-специфический ЦТЛ ответ, который не вызывает повреждения или воспаления печени. В некоторых вариантах реализации изобретения вакцина может быть доставлена к периферии для вызова антиген-специфического иммунного ответа, нацеленного на печень, чтобы очистить или устранить HBV-инфицированные клетки, не повреждая и не вызывая воспаление печени. В некоторых вариантах реализации изобретения лечение может включать доставку вакцины, содержащей консенсусный коровый антиген HBV, к периферии для создания антиген-специфического иммунного ответа, нацеленного на печень, чтобы очистить или устранить HBV-инфицированные клетки, не нанося вреда или не вызывая воспаления печени.
3. Пути введения
[00208] Вакцину или фармацевтическую композицию можно вводить различными способами, в том числе перорально, парентерально, подъязычно, чрескожно, ректально, через слизистую, местно, путем ингаляции, посредством трансбуккального введения, внутриплеврально, внутривенно, внутриартериально, внутрибрюшинно, подкожно, внутримышечно, интраназально, интратекально и внутрисуставным способом или их комбинациями. Для применения в ветеринарии, композиция может быть введена в виде соответствующим образом приемлемой композиции в соответствии с обычной ветеринарной практикой. Ветеринар может легко определить схему дозирования и способ введения, который является наиболее подходящим для конкретного животного. Вакцина может быть введена с помощью традиционных шприцов, безыгольных инъекционных устройств, "пистолетов для бомбардировки микрочастицами" или другими физическими методами, такими как электропораци ("ЕР"), "гидродинамический метод" или ультразвук. [00209] Вектор вакцины может быть доставлен млекопитающему с помощью нескольких хорошо известных технологий, включая инъекции ДНК (также упоминается как ДНК-вакцинация) с и без in vivo электропорации, липосомально опосредованные, наночастицы, рекомбинантные векторы, такие как рекомбинантный аденовирус, рекомбинантный аденовирус ассоциированный вирус и рекомбинантный вирус коровьей оспы. Антиген HBV может быть доставлен посредством инъекции ДНК и вместе с in vivo электропорацией.
а. Электропорация
[00210] Вакцина или фармацевтическая композиция могут быть введены путем электропорации. Введение вакцины посредством электропорации плазмидами вакцины может быть осуществлено с помощью электропорационных устройств, которые могут быть сформированы для доставки к целевой ткани млекопитающего импульса энергии, эффективного для создания обратимых пор, образующихся в клеточных мембранах, а предпочтительным импульсом энергии является постоянный ток, подобный заданному току, введенному пользователем. Устройство для электропорации может содержать компонент электропорации и электродный узел или узел ручки. Компонент электропорации может включать и содержать один или более различных элементов электропорационного устройств, включая: контроллер, генератор импульсов тока заданной формы, тестер импеданса, регистратор сигнала, входной элемент, элемент создание отчётов о состоянии, порт связи, компоненты памяти, источник питания и выключатель питания. Электропорация может быть осуществлена с использованием in vivo электропорационного
устройства, например системы CELLECTRA(r) ЕР (Inovio Pharmaceuticals, Inc., Blue Bell, PA) или электропоратора Elgen (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) для содействия трансфекции клеток плазмидой.
[00211] Примеры электропорационных устройств и способов электропорации, которые могут содействовать в получении ДНК-вакцин согласно настоящему изобретению, включают те, которые описаны в патенте США № 7 245 963, представленном Draghia-Akli, et al., патентной публикации США 2005/0052630, представленной Smith, et al., содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки во всей их полноте. Другие устройства для электропорация и методы электропорации, которые могут быть использованы для облегчения доставки вакцин ДНК, включают предлагаемые в одновременно находящейся на рассмотрении заявке того же заявителя на патент США, серийный номер 11/874072, поданной 17 октября 2007, которая заявляет приоритет в соответствии с 35 USC 119 (е) предварительных заявок США № 60/852149, поданной 17 октября 2006, и 60/978982, поданной 10 октября 2007, все из которых включены в данное описание во всей своей полноте.
[00212] Патент США № 7 245 963 от Draghia-Akli и др. описывает модульные электродные системы и их применение для облегчения ввода биомолекулы в клетки выбранной ткани в теле или растении. Модульные электродные системы могут содержать множество игольчатых электродов; гиподермическую иглу;электрический соединитель, который обеспечивает связь от программируемым контроллером импульса постоянного тока к множеству игольчатых электродов; и источник питания. Оператор может захватить множество игольчатых электродов, которые установлены на опорной конструкции, и прочно вставить их в выбранную ткань в теле или растении. Биомолекулы затем доставляются с помощью подкожной иглы в выбранную ткань. Контроллер программируемого импульса постоянного тока активируется и электрический импульс постоянного тока подается на множество игольчатых электродов. Применяемый электрический импульс постоянного тока облегчает введение биомолекулы в клетку между множеством электродов. Полное содержание патента США N 7 245 963 включено в данный документ в качестве ссылки.
[00213] Патентная публикация США 2005/0052630, представленная Smith, et al., описывает электропорационное устройство, которое может быть использовано, чтобы эффективно облегчить введение биомолекулы в клетки выбранной ткани в теле или растении. Электропорационное устройство содержит электро-кинетическое устройство ("EKD устройство"), работа которого определяется программным обеспечением или прошивкой. Устройство EKD выпускает серию модулей программируемых импульсов
постоянного тока между электродами в массиве на основе пользовательского элемента управления и ввода параметров импульса, и позволяет хранить и получать данные данных формы сигнала. Электропорационное устройство также содержит сменный электродный диск, имеющий множество игольчатых электродов, центральный канал впрыска для инъекционной иглы и съемный направляющий диск. Полное содержание патентной публикации США 2005/0052630 включено в данное описание в качестве ссылки. [00214] Электродные массивы и способы, описанные в патенте США № 7 245 963 и патентной публикации США 2005/0052630, могут быть адаптированы для глубокого проникновения не только в ткани, таких как мышцы, но и в другие ткани или органы. Из-за конфигурации матрицы электродов, инъекционная игла (для доставки выбранной биомолекулы) также вставляется до упора в орган-мишень и инъекцию вводят перпендикулярно к целевой проблеме, в область, которая предварительно очерчена электродами. Электроды, описанные в патенте США № 7 245 963 и патентной публикации США 2005/005263, предпочтительно имеют длину 20 мм и 21 калибр. [00215] Кроме того, некоторые варианты реализации изобретения включающие электропорационные устройства и способы их использования, реализации изобретения предполагают электропорационные устройства, описанные в следующих патентах: патент США № 5 273 525, выданный 28 декабря 1993, патент США № 6 ПО 161, выданный 29 августа 2000, № 6 261 281, выданный 17 июля 2001, и патент США № 6 958 060, выданный 25 октября 2005, и патент США 6 939 862, выданный 6 сентября 2005. Кроме того, патенты, относящиеся к предмету, представленному в патенте США 6 697 669, выданном 24 февраля 2004, который касается доставки ДНК с использованием любого из множества устройств, и в патенте США 7 328 064, выданном 5 февраля 2008, который касается метода инъекцирования ДНК, рассматриваются в настоящем документе. Указанные выше патенты включены в качестве ссылки во всей их полноте в данный документ.
4. Способ приготовления вакцины
[00216] В настоящей заявке предлагаются способы получения ДНК-плазмид, которые содержат вакцины, описанные в данном документе. Плазмиды ДНК, после финальной стадии субклонирования в плазмиду экспрессии млекопитающего могут быть использованы для инокуляции клеток культуры в крупномасштабном ферментационном чане с использованием известных методов в данной области техники. [00217] ДНК-плазмиды для использования с ЕР-устройствами согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены либо изготовлены с использованием комбинации известных устройств и методов, но, предпочтительно, они изготовливаются с
использованием оптимизированной технологии производства плазмид, описанной в опубликованной заявке США № 20090004716, которая была подана 23 мая 2007 года. В некоторых примерах ДНК-плазмиды, использованные в этих исследованиях, могут быть получены в концентрациях, превышающих или равных 10 мг/мл. Технологии изготовления также включают или модержат различные устройства и протоколы, которые, как правило, известны специалистам в данной области техники, в дополнение к тем, которые описаны в патенте США с серийным номером 60/939792, в том числе те, которые описаны в лицензированном патенте, патент США № 7 238 522, который был выдан 3 июля 2007 года. Указанные выше заявка и патент США с серийным номером 60/939792 и патент США № 7 238 522, соответственно, включены в данное описание во всей своей полноте.
ПРИМЕРЫ
[00218] Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами. Следует понимать, что эти примеры, показывающие предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, даны только в качестве иллюстрации. Исходя из приведенного выше обсуждения и примеров, специалист в данной области техники может установить существенные характеристики настоящего изобретения и, не отступая от сущности и объема изобретения, может сделать различные изменения и модификации изобретения, чтобы приспособить его к различным применениям и условиям. Таким образом, различные модификации изобретения в дополнение к тем, которые показаны и описаны здесь, будут очевидны специалистам в данной области из вышеприведенного описания. Такие модификации также подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.
ПРИМЕР 1 Коровый белок HBV
[00219] Консенсусный коровый белок HBV, также именуемый как HBV модифицированный, М-кор или М-коровый конструкт, был сконструирован из эпитопных последовательностей от генотипов А, В, С, D и Е HBV. Последовательности капсидных белков HBV от этих генотипов были отобраны для включения в конструкцию консенсусного кора, который может индуцировать иммунитет против широкого спектра генотипов, тем самым обеспечивая универсальную вакцину для HBV. В некоторых вариантах реализации изобретения модификации М-корового конструкта включали добавление лидерной последовательности IgE. В некоторых вариантах реализации изобретения М-коровый белок кодируется с использованием кодоновой оптимизации и РНК-оптимизации для повышенной экспрессии.
1. Конструирование и экспрессия консенсусного корового антигена
[00220] Коровые консенсусные нуклеотидные последовательности генотипа А, В, С, D, и Е FfflV были сконструированы путем получения консенсусных последовательностей коровых генов каждого генотипа, а затем путем получения консенсусной последовательности консенсусов всех пяти генотипов, таким образом избежав смещения к сильно секвенированным генотипам. Кроме того, последовательности были собраны из разных стран, чтобы избежать отбора образцов сильно сиквенированных генотипов. Последовательности выравнивали, используя программное обеспечение CLUSTAL X для составления окончательной консенсусной последовательности HBcAg. Как показано на Фигуре 10, наблюдалась относительная близость мультигенотипной консенсусной HBcAg-последовательности для всех выбранных последовательностей из разных генотипов.
[00221] После получения консенсусной последовательности было осуществлено несколько модификаций для увеличения уровней экспрессии антигена из плазмид. В частности, были добавлены высокоэффективная лидерная последовательность IgE и С-концевая НА-метка, а конструкт был оптимизирован относительно РНК и кодона. Это привело к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей М-коровую последовательность с IgE-лидером и НА-меткой (SEQ ID N0:5), которая переваривается EcoRI и NotI, и клонируется в вектор экспрессии pVAX (Invitrogen) под контролем цитомегаловирусного предраннего промотора. Полученный конструкт затем был назван рМСоге (SEQ ID N0:17).
[00222] In vitro испытания экспрессии были выполнены с использованием конструкта рМСоге и pVAX, который использовали в качестве контроля. Результаты, демонстрирующие положительную экспрессию, указаны на изображениях гелей, показанных на Фигурах ПА и 11В.
[00223] Кроме того, белок HBcAg экспрессировался ДНК-плазмидой, трансфектированной рМСоге, содержащим коровый ген гепатита В (Фигура 12). Экспрессию рМСоге обнаруживали, используя TNT(r) Quick Coupled Expression of
Transcription/Translation System, содержащую S-метионин (Promega, Madison, WI). Синтезированный генный продукт осаждали, используя моноклональное антитело к НА, направленное на закодированный эпитоп НА, клон НА-7 (Sigma-Aldrich). Иммунно осажденный белок подвергли электрофорезу на 12 % геле SDS-PAGE, а затем
зафиксировали и высушили. Синтезированный белок со вставкой радиоактивной S обнаруживали с помощью авторадиографии. Этот in vitro трансляционный анализ на лизате показал обнаруживаемый HBcAg при ожидаемой молекулярной массе 28 кДа (Фигура 13).
[00224] Экспрессия была дополнительно подтверждена с использованием анти-НА меченного моноклонального антитела с помощью иммунофлюоресцентного анализа. Рабдомиосаркомные (RD) клеточные линии трансфицировали рМСоге, используя TURBOFECT (Thermo Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Сначала клетки фиксировали 2 % формальдегидом, а затем анализировали по поводу экспрессии белка. Зафиксированные клетки инкубировали с кроличьей моноклональной НА-меткой (Invitrogen), разведенной "первичным стандартным раствором" (0,1 % BSA, 0,2 % сапонина, 0,02 % азида натрия) в течение одного часа при комнатной температуре, затем клетки инкубировали с DyLight 594-меченым противокроличьим вторичным антителом (Thermo Scientific) в течение 20 минут при комнатной температуре, конфокальное изображение использовали для визуализации HBcAg в цитоплазме и вокруг ядра трансфицированных RD-клеток, как показано на Фигуре 14. Профиль экспрессии подтвердил, что ДНК-плазмида, несущая консенсусный коровый ген, может высоко экспрессироваться в различных клетках in vitro. В частности, изображения были получены с использованием инвертированного конфокального микроскопа Zeiss Axiovert 100. Анализ и количественная оценка интенсивности флюоресценции проводились с использованием программного обеспечения Image J (NIH, Rockville, MD).
2. Иммунизация мышей
[00225] Трансгенные мыши C57BL/6 были разделены на две группы по четыре мыши в каждой и трижды иммунизированы 20 мкг ДНК с помощью электропорации с двухнедельными интервалами (группа 1 - контрольный вектор pVAX; группа 2 рМ-Соге). Мышей иммунизировали в день 0, день 14, день 28 и умерщвляли в день 35. Селезенку, печень и сыворотку из умерщвленных животных брали для исследования. [00226] Кроме того, чтобы оценить получение Т и В-клеточных иммунных ответов, мышей Balb/c иммунизировали и измеряли по поводу обоих ответов в различных периферических тканях. Мыши получили три внутримышечные иммынизации 30 мкг рМСоге или pVax с последующей электропорацией, как указано на иммунизационной схеме (Фигура 15). В частности, шести-восьми недельные самки мышей Balb/c были приобретены у Jackson Laboratories. Животных содержали в соответствии с нормами National Institutes of Health и the University of Pennsylvania Institutional Care и Use Committee (IACUC). Для исследования ДНК-иммунизации восемь животных разделили на две группы. Каждое животное в группе иммунизации получило в общей сложности по три иммунизации 30 мкг рМСоге с интервалом в две недели в большеберцовую (ТА) мышцу. Каждая иммунизация сопровождалась in vivo электропорацией с устройством CELLECTRA
для адаптивной постояннотоковой электропорации (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). По два 0,2 амперных постояннотоковых прямоугольных импульса были доставлены через треугольную 3-электродную решетку, состоящую из 26-калиберных твердых электродов из нержавеющей стали, полностью погруженных в мышцу. Каждый импульс был длительностью в 52 миллисекунды с 1-секундной задержкой между импульсами. [00227] In vivo изучение мышей Balb/C показало повышение амплитуды секреции фактора некроза опухоли (TNF-a), интерферона гамма Т-клеток (IFN-y) и CD 107а в CD8 и CD4 Т-клетках, изъятых из селезенки. Фигуры 16 и 17 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/C рМ-Соге повышала амплитуду секреции IFN-y в CD8+ и CD4+ Т-клетках селезенки. Фигуры 18 и 19 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/C рМ-Соге повышала амплитуду секреции TNF-a в CD8+ и CD4+ Т-клетках селезенки. Фигуры 20 и 21 демонстрируют, что вакцинация мышей Balb/C рМ-Соге повышала амплитуду секреции CD 107а в CD8+ и CD4+ Т-клетках селезенки.
[00228] В дополнительных экспериментах, секрецию IFN-y и TNF-a проверяли в Т-клетках. Для получения спленоцитов для этих дополнительных эеспериментов, мышей умерщвляли через неделю после последней иммунизации, а селезенки изымали и помещали в среду R10 (среда RPMI, обогащенная 10 % FBS и 1х антибиотиком-антимикотиком). Селезенки измельчали индивидуально, процеживали через 40 мкМ клеточный фильтр и обрабатывали 1 мл лизисного буфера АСК в течение 5 минут для лизиса эритроцитов. Спленоциты ресуспендировали в полной среде R10 и использовали для дополнительных иммунологических анализов.
[00229] Субпопуляцию спленоцитов ресуспендировали в среде R10 в концентрации 107 на мл и по 100 мкл высевали на 96-луночный кругл од онный планшет. 100 мкл среды, содержащей объединенные пептиды рМСоге или 10 нг/мл РМА (Sigma, St. Louis, МО, USA), и 500 нг/мл иономицина (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, СА, USA) смешали в качестве положительного контроля или 0,1 % диметилсульфоксид (Sigma, St. Louis, МО, USA) в качестве отрицательного контроля. Все лунки содержали по 5 мкл/мл двух ингибиторов транспорта белков, брефелдин A (GolgiPlug) и моненсин (Golgistop) (All from BD Bioscience). Клетки инкубировали при 37 °С в 5 % СОг в течение 5 часов и окрашивали LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen) в течение 10 минут при 37 °С. Внеклеточное окрашивание проводили, используя антитела, специфичные к мышиным CD3, CD4 и CD8. Спленоциты затем пермеабилизировали и промывали, используя BD CYTOFIX/CYTOPERM и PERM/WASH (BD Bioscience), соответственно. [00230] Внутриклеточное окрашивание цитокинов.
[00231] Внутриклеточные цитокины затем окрашивали антителами к мышиному интерферону-гамма и фактору-альфа некроза опухоли. Субпопуляцию лимфоцитов ресуспендировали в среде R10 в концентрации 10 на мл и по 100 мкл высевали на 96-луночный круглодонный планшет. 100 мкл среды, содержащей объединенные пептиды рМСоге, или 10 нг/мл РМА (Sigma, St. Louis, МО, USA) и 500 нг/мл иономицина (Calbiochem, Novabiochem, La Jolla, СА, USA) смешали в качестве положительного контроля или 0,1 % диметилсульфоксид (Sigma, St. Louis, МО, USA) в качестве отрицательного контроля. Все лунки содержали по 5 мкл/мл двух ингибиторов транспорта белков, брефелдин A (GolgiPlug) и моненсин (Golgistop) (All from BD Bioscience). Клетки инкубировали при 37 °С в 5 % СОгв течение 5 часов и окрашивали LIVE/DEAD(r) Fixable Dead Cell Stain (Invitrogen) в течение 10 минут при 37 °С. Внеклеточное окрашивание проводили, используя антитела, специфичные к мышиным CD3, CD4 и CD 8. Спленоциты
тм тм
затем пермеабилизировали и промывали, используя BD Cytofix/Cytoperm и Perm/Wash (BD Bioscience), соответственно. Клетки затем окрашивали внутриклеточно антителами к интерферону-гамма, фактору-альфа некроза опухоли, интрелейкину-2 и лизосомно-ассоциированному мембранному белку 1.
[00232] Конъюгированные противомышиные антитела использовали во время внеклеточного и внутриклеточного окрашивания, включая: СОЗ-фикоэритрин/Су7 (РЕ/Су7), С04-перидинин хлорофилловый белок (РегСР), С08-аллофикоцианин (АРС), IFN-y-Alexa Fluor 700, TNF-a-флюоросцеина изотиоцианат (FITC) и IL-2-фикоэритриноцианин (РЕ) (все от BD Biosciences, San Jose, СА).
[00233] Средний индуцированный HBcAg-специфический IFN-y Т-клеточный ответ был сильным при 2000 (±210) SFU на миллион спленоцитов. Интересно, что внутриклеточное окрашивание стимулированных спленоцитов показало, что клетки CD4+ и CD8+ продуцируют почти подобное количество антигенспецифического IFN-y, 0,74 и 0,94, соответственно, но разные уровни TNF-a с примерно 0,3 % и 1,5 % клеток CD4+ hCD8+, соответственно (Фигура 22). Аналогичная тенденция наблюдалась с клетками, которые были дважды положительными для обеих цитокинов. Наблюдалось меньше дважды положительных клеток CD4+, приблизительно 0,2 %, в селезенке, чем дважды положительных клеток CD8+, которые составляют 0,7 % (Фигура 23). [00234] Миграция HBV специфических Т-клеток в печень также была продемонстрирована у животных, которым вводили ДНК-вакцину рМСоге. Нацеливание Т-клеток, специфических к коровому антигену HBV, с высокой частотой и эффекторной функцией к печени является целью для развития HBV-иммунной терапии. После иммунизации животных умерщвляли и их печень удаляли и определяли миграцию
HBV-специфических эффекторных Т-клеток в печень. Результаты показали, что вакцина рМСоге приводит эффекторные Т-клетки в печень in vivo. Фигуры 24 и-25 демонстрируют интерферон-у Т-клеточный ответ в печени, а Фигуры 26 и 27 демонстрируют иммунный ответ фактора-а некроза опухоли в печени и повышенную реакцию, которая возникает в результате вакцинации рМСоге.
[00235] М-коровый консенсусный иммуноген, кодируемый ДНК-конструктом рМСоге, приводит к строго уравновешенным CD4+/CD8+ Т-клеточным иммунным ответам. Индуцированные Т-клетки движутся к печени с высокой частотой и демонстрируют корректный эффекторный фенотип иммунного клиренса после HBV-инфекции, поддерживая дальнейшее развитие этой иммунной терапевтической вакцины. [00236] Также исследовали способность внутрипеченочных антиген-специфических Т-клеток продуцировать цитокины после ДНК-иммунизации. В каждую печень путем непосредственной инъекции вводили 1мл PBS в печеночную вену каждой мыши. В частности, изымали печень, измельчали и ресуспендировали в 5 мл 44 % изотонического Percoll. Смеси заливали 3 мл 66 % изотонического Percoll и центрифугировали в течение 20 минут при 2000 оборотов в минуту для градиентного разделения. Лимфоциты собирали и промывали 10 мл R10 и обрабатывали лизисным буфером АСК по мере необходимости. Как CD4, так и CD8 Т-клетки, выделенные из печени, продуцировали IFN-y и TNF-a, когда стимулировались in vitro пептидом HBcAg (Фигуры 28 и 29). В то время как CD4 Т-клетки демонстрировали высокий процент двойных продуцентов, С08демонстрировали незначительное количество или отсутствие IFN-y+TNF-a+ продуцирующих клеток. Зато, большинство CD8 Т-клеток продуцировало или только IFN-y или TNF-a. В печени наблюдалось накопление HBcAg-специфических CD4 Т-клеток в противоположность селезенке. Процент HBcAg-специфических CD4 Т дважды положительных Т-клеток в покоящейся печени был сопоставимым с клетками, наблюдаемыми в селезенке. Более того, переферические CD8 Т-клетки были убедительно лучшими двойными продуцентами, чем резидентные CD8 Т-клетки печени. Также наблюдались антитело-продуцирующие способности резидентных В-клеток печени иммунизированных мышей. Интересно, что печень в качестве слизистого органа продуцировала больше антиген-специфических IgA, чем IgG (Фигура 30), наблюдение, которое ранее не исследовалось.
[00237] На Фигуре 31 показаны клеточные иммунные реакции, вызванные рМ-Соге с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISPOT). Спленоциты стимулировали двумя пулами 15-мерных пептидов, охватывающих полную длину рМСоге и перекрывающихся 8 аминокислотами. 200000 спленоцитами в среде R10 засевали 96-луночный планшет, покрытый IFN-y-захватывающим антителом (система R &D),
стимулировали в течение ночи в присутствии специфического пептидного пула при 37°С в 5 % СОг- Клетки смыли, а планшеты инкубировали в течение ночи с биотинилированным противомышиным IFN-y-обнаруживающим антителом (система R &D). Стрептавидин-щелочную фосфатазу и 5-бром-4-хлор-3'-индолилфосфат р-толуидиновую соль и нитросиний тетразолия хлорид использовали для обнаружения пятен. Пятна подсчитывали, используя автоматизированный ELISPOT-ридер (ЦТЛ Limited). Как показано на Фигуре 31, иммунизация рМСоге вызывает сильные клеточные иммунные реакции. Среднее HBcAg-специфических IFN-y Т-клеточных реакций составляло приблизительно 2000 (±210) SFU на миллион спленоцитов.
[00238] Анализ ELISPOT использовали для дальнейшего исследования IFN-y. В частности, спленоциты стимулировали двумя пулами 15-мерных пептидов, охватывающих полную длину HBcAg и перекрывающихся 8 аминокислотами. Всего было 33 индивидуальных пептидов, которые были объединены случайным образом с первыми 17 пептидами в пул 1 и последними 16 в пул 2. IgEL и НА-метка исключались, чтобы сделать пептид как можно более ближе к природному антигену. 200000 спленоцитами в среде R10 засевали 96-луночный планшет, покрытую IFN-y-захватывающим антителом (система R &D), стимулировали в течение ночи в присутствии специфического пептидного пула при 37°С в 5 % СО2. Клетки смыли, а планшеты инкубировали в течение ночи с биотинилированным противомышиным IFN-y-обнаруживающим антителом (система R &D). Стрептавидин-щелочную фосфатазу и 5-бром-4-хлор-3'-индолилфосфат р-толуидиновую соль и нитросиний тетразолия хлорид использовали для обнаружения пятен. Пятна подсчитывали, используя автоматизированный ELISPOT-ридер (ЦТЛ Limited). Наблюдалось, что через одну неделю после финальной иммунизации pMCore-иммунизированные мыши демонстрировали признаки сильных HBcAg Т-клеточных реакций, как было определено с помощью IFN-y ELISPOT-анализа после ех vivo стимуляции. На Фигуре 32 показано, что доминантные эпитопы смещены в сторону пептидного пула 2.
[00239] Исследования in vivo цитотоксичности проводили, используя мечение карбоксифлюоросцеиндиацетатсукцинимидным эфиром (CFSE) в сочетании с проточной цитометрией. Спленоциты взяли от мишей, не использовавшихся ранее в опытах, и распределили в две популяции. Одна популяция, CFSE-сильно меченные,пульсировала с релевантным пептидом (например, капсидными пептидами HBV). Другая популяция, CFSE-слабо меченные, пульсировала с иррелевантным пептидом (например, NS3-пептидами HCV). Объединяли меченные, обработанные пептидом клетки и использовали в экспериментах адоптивных пересадок, в которых проводили проточный
анализ. Объединенные популяции обработанных, меченных клеток-мишеней вводили двум группам мышей, контрольной группе и иммунизированной группе. Спленоциты выделяли от каждой группы мышей и образцы прогоняли на проточном цитометре. Измеряли количество CFSE. Как правило, в таких экспериментах образуется два пика, первый отвечает иррелевантному пептиду; второй отвечает иммунизируетему пептиду на пике, указывающем больший CFSE.
[00240] Фигура 33 демонстрирует, что CD8 Т-клетка, индуцированная вакцинацией, может специфически элиминировать клетки-мишени in vivo. Результаты демонстрируют, что образцы селезенки и печени от мышей, ранее не использовавшихся в опытах, содержали почти равные количества клеток, которые были на пиках иррелевантного и релевантного пептидов, между тем, как результаты показали, что среди иммунизированных групп пики клеток, полученных из селезенки и печени, пульсирующие с релевантным пептидом, были значительно меньше, чем с иррелевантным пептидом. Эти данные демонстрируют, что клетки-мишени, обработанные HBV-пептидом, специфически элиминировались у мышей, иммунизированных HBV-вакциной, но не у неиммунизированных мышей. Любая элиминация клеток-мишеней, обработанных иррелевантным пептидом, если вообще происходила, была такой же у мышей, иммунизированных HBV-вакциной , и неиммунизированных мышей и значительно ниже, чем элиминация клеток-мишеней, обработанных HBV-пептидом.
[00241] Способность HBV-специфических CD8 Т-клеток, индуцированных после ДНК-иммунизации, специфически элиминировать клетки-мишени in vivo исследовалась дополнительно. Человеческие ЦТЛ, которые имеют целью коровый антиген, являются важными в сильном клиренсе HBV в сравнении с хронической инфекцией. Через одну неделю после финальной иммунизации 4 мышам из каждой группы, иммунизированной pVax или рМСоге, адопционно пересаживали спленоциты-мишени, которые пульсируют с HBcAg (релевантный) или HCV-NS3/4A (иррелевантный) пептидами. Кратко, спленоциты от мышей, ранее не использовавшихся в опытах (наивные), окрашивали либо 1 мкМ или 1 нМ CFDA SE (invitrogen). Затем меченные спленоциты покрывали индикаторными пептидами (1мкМ) и по 10 клеток из каждой популяции внутривенно инъецировали наивным или иммунизированным мышам. Спустя 24 или 90 часов, клетки из селезенки и печени выделяли и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса клеток подсчитывали следующим образом: 100 - ([( % релевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках / % иррелевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках)/( % релевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках / % иррелевантного пептида, пульсирующего в
неинфицированных клетках)] х 100). С помощью селекции на CFSE-меченных спленоцитах, чтобы проследить лизис клеток, наблюдалось, что pMCore-вакцинированные мыши способны индуцировать сильный специфический лизис атиген-пульсирующих клеток-мишеней, как показано на Фигуре 34. Средний процент лизиса клеток, наблюдаемый в селезенке, составил приблизительно 83 %, между тем, как средний процент лизиса клеток в печени составил 76 %, демонстрируя, что индуцированные вакцинацией ЦТЛ, которые мигрируют и удерживаются в печени, способны лизировать HBV-пептид-пульсирующие клетки-мишени. Это было первое исследование для демонстрации индуцирования HBcAg-специфических ЦТЛ реакций в печени с помощью любого метода и, в частности, с помощью системной иммунизации. Эти данные свидетельствуют о том, что периферическая иммунизация может индуцировать эффекторные клетки, которые могут мигрировать в печень и лизировать клетки-мишени. [00242] Фигура 35 показывает данные, собранные из анализа Т-клеточной пролиферации с использованием CFSE-мечения. Сравнивали процент пролиферации клеток CD3+CD4+ и клеток CD3+CD8+, обработанных вектором pVax (контроль) или плазмидой рМСоге, которая экспрессирует HBV М-кор. Кратко, выделенные спленоциты окрашивали карбоксифлюоросцеиндиацетатом, сукцинимидиловым эфиром (CFDA-SE) Cell Tracer Kit (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Окрашенные клетки трижды промывали солевым раствором и стимулировали pMCore-специфическими перекрывающимися пептидами. Клетки инкубировали при 37 °С в течение 96 часов. Спустя 48 часов, 50 % культуральной среды удаляли и помещали в свежую R10. На 4 день, клетки собирали и окрашивали CD3, CD4 и CDS-специфическими моноклональными антителами (BD Pharmingen). Клетки фиксировали PBS с 1 % параформальдегидом (PFA) и приобретенным FACScalibur Becton Dickinson). Данные анализировали, используя программу Flow Jo. CFSE низкая и CFSE средняя популяция была признана в качестве пролиферировавших клеток. Как показано на Фигуре 35, CD3+CD8+ Т-клетки, выделенные из селезенки, пролиферировали больше по сравнению с CD3+CD4+ Т-клетками.
[00243] Дальнейшие эксперименты с анализом Т-клеточной пролиферации также использовали CFSE-мечение. В частности, выделенные спленоциты окрашивали карбоксифлюоросцеиндиацетатом, сукцинимидиловым эфиром (CFDA-SE) Cell Tracer Kit (Invitrogen) согласно инструкциям производителя. Окрашенные клетки трижды промывали солевым раствором и засевали в 96-луночный U-донный планшет в общем объеме 200 мкл среды, содержащей HBcAg объединенных пептидов в концентрации 1 мкг/мл. клетки инкубировали при 37 °С в течение 96 часов. Спустя 48 часов, 50 % культуральной среды отбирали и переносили в свежую R10. Разница в продуцировании цитокинов между CD4 и
CD8 Т-клетками, как описано выше, была сравнима с их максимальной пролиферативной способностью. После 4 дней стимуляции антиген-специфическими пептидами CD8 + Т-клетки, пролиферирующие более чем в 2 раза выше, чем CD4+ клетки (Фигура 36), показывают четкое CD8 Т-клеточное смещение в ответ.
[00244] На Фигурах 37А и 37В представлены данные ELISA, демонстрирующие сравнение антитела к кору HBV в серийном разведении сыворотки от животных, обработанных вектором pVax vector (контроль) или плазмидой рМСоге, которая экспрессирует HBV М-кор. Кратко, высокосвязывающие планшеты ELISA (Costar, Corning, NY) покрывали 1мкг/мл белка HBcAg в PBS при 4 °С в течение 24 часов, а затем промывали PBS-Tween и блокировали PBS, содержащим 1 % BSA, в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания связанное сывороточное антитело было обнаружено с помощью HRP-меченого козьего противомышиного IgG (Фигура 37А) или IgA (Фигура 37В). Пероксидазоконъюгированные АЬ были обнаружены с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, a OD при 450 нм была измерена с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера. Наблюдали антиген-специфический гуморальный ответ в сыворотках иммунизированных мышей. [00245] Для дальнейшего изучения иммунного ответа, индуцированного у pMCore-иммунизированных мышей, антиген-специфические IgG и IgA реакции анализировали с помощью В-клеточного ELISpot, а также в ELISA с использованием спленоцитов и сывороток, соответственно, собранных после вакцинации. Спленоциты выделяли и очищали, как описано выше. Для ELISA, высокосвязывающие планшеты ELISA (Costar, Corning, NY) покрывали 1 мкг/мл белка HBcAg в PBS при 4 °С в течение 24 ч, а затем промывали 0,1 % PBS-Tween, а затем блокировали PBS, содержащим 1 % BSA, в течение 2 часов при комнатной температуре. Серийно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывания связанное сывороточное антитело было обнаружено с помощью HRP-меченого козьего противомышиного IgGrnin IgA. Пероксидазоконъюгированные АЬ были обнаружены с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, a OD при 450 нм была измерена с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера.. Высокий IgG и IgA титр наблюдался в сыворотке иммунизированных мышей по сравнению с контрольными животными (Фигура 38). В-клеточный ELISpot иммунизированных мышей (Фигура 39) демонстрирует HBcAg-специфические IgG и IgA приблизительно в 200 SFU и 100 SFU на миллион клеток, соответственно. Это иллюстрирует активацию В-клеточного компартмента иммунизацией рМСоге. Исскуственная плазмида HBcAg эффективно
индуцировала антиген-специфические клеточные и гуморальные реакций после 3 иммунизаций.
[00246] Фигура 40 демонстрирует процент TNF-a и IFN-y из CD4+ и CD8+ клеток селезенки и печени.
[00247] В отсутствие небольших модельных животных для HBV, был использован FIBcAg для временной трансфекции печени мышей путем гидродинамической инъекции. Печени мммунизированных мышей трансфицировали рМСоге или HCV NS3/4A. Иммуногистохимическое окрашивание через три дня после трансфекции показало клиренс HBcAg-трансфицированных гепатоцитов по сравнению с М83/4А-трансфицированными гепатоцитами. Уровни ALT в сыворотке измеряли чтобы гарантировать, что клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, не вызывал повреждение печени. Результаты на Фигуре 41 показали, что клиренс, индуцированный иммунизированными мышами, не вызывал повреждение печени.
[00248] Прямая гидродинамическая инъекция была также использована для временной трансфекции печени мышей. Здесь иммунизированные или наивные печени мышей трансфицировались либо рМСоге или иррелевантной плазмидой, кодирующей антигены гепатита С (HCV NS3/4A) Кратко, иммунизированных мышей инъецировали внутривенно 100 мкг плазмиды в 2 мл (около 10 % объема веса мыши) раствора Рингера в течение 7 секунд для временной трансфекции печени. Экспрессию или клиренс плазмиды определяли путем окрашивания печени моноклональными антителами к НА. Иммуногистохимическое окрашивание через три дня после трансфекции (Фигура 42) показало клиренс HBcAg-трансфецированных гепатоцитов по сравнению с М83/4А-трансфицированными печенями животных. CD8 Т-клетки, выделенные из рМСоге гидродинамически инъецированных мышей, на Фигуре 43 показали более высокую частоту IFN-y+ CD107a+, маркера дегрануляции, по сравнению с иммунизированными печенями животных, трансфицированных иррелевантной плазмиды.
[00249] Так как клиренс pMCore-трансфицированных гепатоцитов, кажется, включает дегрануляцию, считалось, что лизис клеток может привести к повреждению печени. Чтобы исследовать, способны ли иммунизированные мыши очищаться от трансфицированных гепатоцитов, не вызывая значительного повреждение печени, был использован анализ измерения активности фермента аланинаминотрансферазы (ALT), чтобы указать на наличие повреждений печени при повышенных уровнях фермента в сыворотке (Фигура 44). В частности, активность сывороточной аланинаминотрансферазы (ALT) измеряли с использованием анализа, базирующегося на оптической плотности (Stanbio Laboratory), на BioTek Synergy 2 микропланшет-ридере. Результаты представлены в виде единиц на литр
(Ед./л) и представляют собой количество фермента, который окисляет один мкмоль/л NADH в минуту. Эти исследования показали, что удельный клиренс HBcAg-трансфецированных гепатоцитов не повышает уровни ALT у трансфицированных иммунизированных животных за пределы нормального диапазона 5-30 Ед./л (Фигура 44).
ПРИМЕР 2 Поверхностные белки HBV 1. Конструирование HBsAg ДНК-вакцины
[00250] Использование консенсусных иммуногенов в контексте вариабельных патогенов с сильно изменяющимися антигенными последовательностями может быть эффективным в индукции более прямого иммунного ответа на борьбу с природным вирусным разнообразием по сравнению с иммунизацией одним природным иммуногеном. Восемдесят две последовательности больших поверхностных антигенов генотипа А гепатита и семьдесят последовательностей больших поверхностных антигенов генотипа С гепатита были собраны из GenBank, а консенсусные последовательности генотип-специфических поверхностных антигенов и небольших поверхностных антигенов были получены после выполнения нескольких выравниваний. Программное обеспечение Clustal X (версия 1.8), используемое для создания нескольких выравниваний, использовали для создания консенсусной последовательности.
[00251] Были получены ДНК-конструкты, кодирующие только основной S или preSl/S2 плюс основной S поверхностный белок оболочки HBV с использованием консенсусных последовательностей, кодирующих генотипы А или С, которые являются одними из наиболее распространенных генотипов в мире (Фигура 52А, Фигуры 59A-59D). Разницу в иммунных ответах, вызванных конструктами, кодирующими полноразмерные НВ или только основной S, исследовали по поводу того, как амино-концевой домен в preS 1 может помочь вирусному прикреплению и вхождению, тогда, как карбоксильный концевой preS2 может быть вовлечен в инфекционность. конструкты только основного S были названы небольшими НВ (SHB), тогда как плазмиды, которые содержали preSl/S2 были названы большими НВ (LHB).
[00252] Консенсусные поверхностные белки HBV были разработаны с эпитопными последовательностями из первичных изолятов генотипа A HBV, так что полученный консенсусный белок имел идентичность последовательности, составляющую от 94,2 процента до 99,8 процента, с поверхностными белками первичных изолятов генотипа А HBV. В частности, были разработаны две версии такого консенсусного белка (Фигура 4 и Фигура 52В). Один включал белок S, также упоминается как SHBs-A, в котором
последовательность SEQ Ш NO: 13 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ Ш N0: 14 представляет собой аминокислотную последовательность. Второй включал белок S, npe-S2 и пре-81,также упоминается как LHBs-A, в котором последовательность SEQ Ш N0: 9 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ Ш N0: 10 представляет собой аминокислотную последовательность. [00253] Консенсусные поверхностные белки HBV также были разработаны из эпитопных последовательностей первичных изолятов генотипа С HBV, так что полученный консенсусный белок имел идентичность последовательности, составляющую от 96,5 процента до 99,8 процента, с поверхностными белками первичных изолятов генотипа С HBV. В частности, было разработано две версии такого консенсусного белка (Фигура 4). ). Один включал белок S, также упоминается как SHBs-C, в котором SEQ ID N0:15 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID N0:16 представляет собой аминокислотную последовательность. Второй включал белок S, npe-S2 и пре-81,также упоминается как LHBs-C, в котором SEQ Ш N0:11 представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты и SEQ ID N0:12 представляет собой аминокислотную последовательность.
[00254] После получения консенсусных последовательностей больших и небольших поверхностных антигенов консенсусных генотипов А или С проводили кодон-оптимизацию и РНК-оптимизацию. Для указанных выше консенсусных поверхностных антигенов НВУ,эндопротеолитические сайты расщепления были введены в консенсусные поверхностные антигены HBV для обеспечения надлежащего фолдинга белка и лучшего процессирования антигена (Фигура 3). Использование кодонов в консенсусных поверхностных антигенах HBV было модифицировано, чтобы отразить кодонное смещение человеческих генов. Кроме того, удалось избежать областей с очень высоким (например, больше, чем 80 процентов) или очень низким (например, меньше, чем 30 процентов) содержанием GC, где находились цис-действующие мотивы, такие как внутренние ТАТА-боксы, повторные последовательности и структурированные последовательности. Последовательность Козак ввели в консенсусные поверхностные антигены НВУдля повышения инициации трансляции. Высокоэффективную лидерную последовательность IgE добавили против хода транскрипции стартового кодона для повышения и увеличения белковой экспрессии, как описано ранее (Yan et al., Vaccine (2008) 26:5210-5215) (смотри Фигуры 3 и 52В). Были синтезированы оптимизированные гены и подтверждены последовательности.
[00255] Консенсусные HBV-поверхностные антигены SHBs-A, LHBs-A, SHBs-C и LHBs-C были клонированы в вектор экспрессии для получения конструктов pSHb А (также
упоминается как pSHb-A), pLHb А (также упоминается как pLHb-A), pSHb С (также упоминается как pSHb-C) и pLHb С (также упоминается как pLHb-C), соответственно (Фигура 4). Синтезированные гены больших и небольшых поверхностных антигенов генотипа А субклонировали в вектор экспрессии pGXOOOl в сайты ВатШ и Xhol, тогда как синтезированные гены больших и небольшых поверхностных антигенов генотипа С субклонировали в pGXOOOl в сайты EcoRI и Notl. Получение плазмиды HBcAg (рМСоге) описано в Примере 1.
2. In vitro экспрессия комбинированных ДНК-вакцин HBsAg
[00256] Клеточные линии рабдосаркомы (RD) и карциномы печени человека (Hep G2) трансфицировали pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A и pSHBs-C, используя TurboFect(tm) (Thermo Scientific) согласно инструкциям производителя. Для внутриклеточного анализа клетки промывали и фиксировали, используя Cytofix/Cytoperm kit (BD PharMingen, San Diego, CA) согласно инструкциям производителя. После фиксации клетки окрашивали сывороткой от иммунизированных мышей или мышиным моноклональным антителом к поверхности вируса гепатита В (Abeam, Cambridge, MA). Затем клетки окрашивали вторичным противомышиным антителом, конъюгированным с изотиоцианатом флуоресцеина (BD Biosciences, San Jose, СА). клетки промывали и фиксировали 2 % параформальдегидом. Окрашенные и зафиксированные клетки были получены на приборе LSR с использованием программного обеспечения CellQuest (BD Biosciences) и проанализированы с использованием программного обеспечения Flow Jo (Tree Star, Ashland, OR). [00257] После конструирования и оптимизации четырех конструктов, экспрессия белка из каждой плазмиды была подтверждена внутриклеточным окрашиванием. RD или Hep G2 клетки временно трансфицировали отдельными конструктами или пустым вектором pGXOOOl в качестве контроля. Клетки окрашивали внутриклеточно через 48 часов с помощью анти-HBsAg поликлональной мышиной сыворотки или коммерчески приобретенного мышиного моноклонального антитела. Экспрессия была подтверждена с помощью проточной цитометрии (Фигура 52С). Повышенные уровни экспрессии белка HBs наблюдались в клетках, трансфицированных каждым конструктом, по сравнению с клетками, трансфицированными пустыми векторами (pGXOOOl).
ПРИМЕР 3
Иммуногенность отдельных искусственных HBsAg ДНК-плазмид в моделях
небольших животных
[00258] После исследований экспрессии, способность отдельных плазмид индуцировать антигенспецифические гуморальные и клеточные реакции оценивали in vivo. Шести-восьми недельные самки мышей Balb/c были приобретены у Jackson Laboratories. Животных содержали в соответствии с нормами National Institutes of Health and the University of Pennsylvania Institutional Care and Use Committee (IACUC). Мышей Balb/c иммунизировали трижды внутримышечно (PM) иммунизировали три раза с 2-недельным интервалом в недели 0, 2 и 4 15 мкг плазмид, экспрессирующих небольшой или большой S-антиген, или контрольной pGXOOOl. Каждый вакцинация была сразу после электропорации в месте инфекции, как описано выше (Hirao et al., Vaccine (2008) 26:440-448).
[00259] Для иммунизации все ДНК разбавляли водой без нуклеазы (Qiagen, Valencia, СА 91355). Каждое животное в группе иммунизации получило в общей сложности три внутримышечные иммунизации по 15 мкг соответствующей плазмиды. Для комплексного изучения, каждое животное получило в общей сложности по 45 мкг ДНК в обе передние болыпеберцовые (ТА) мышцы. Каждая иммунизация сопровождалась in vivo электропорацией с устройством CELLECTRA(r) для адаптивной постояннотоковой электропорации (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA). По два 0,2 амперных постояннотоковых прямоугольных импульса были доставлены через треугольную 3-электродную решетку, состоящую из 26-калиберных твердых электродов из нержавеющей стали, полностью погруженных в мышцу. Каждый импульс был длительностью в 52 миллисекунды с 1-секундной задержкой между импульсами. Индуцированные вакциной гуморальные ответы были рассмотрены впервые, поскольку давнишние ДНК-вакцины не были в состоянии вызывать значительные реакции антител.
1. Анализ антител с помощью ELISA
[00260] ELISA проводили для анализа антиген-специфических IgG реакций в сыворотке, собранной от мышей спустя 7 дней после каждой иммунизации с использованием полноразмерного белка HBsAg в качестве антигена-мишени. Высокосвязывающие планшеты ELISA plates (Costar, Corning, NY) покрывали 1 мкг/мл рекомбинантного белка в PBS при 4 °С в течение 24 часов, а затем промывали 0,1 % PBS-Tween и блокировали PBS, содержащим 1 % BSA в течение 2 часов при комнатной температуре, стерильно разведенные образцы сыворотки добавили в лунки и инкубировали в течение 1 часа при
комнатной температуре, после промывания связанный IgG обнаруживали с помощью HRP-меченного козьего противомышиного IgG. Пероксидазно конъюгированные антитела обнаруживали с использованием тетраметилбензидина (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата, а значения OD при 450 нм измеряли с помощью Multiscan ELISA планшет-ридера.
[00261] Обе pLHBs и pSHBs из любого генотипа были высоко иммуногенными. Дополнительная иммунизация повысила эти реакции с реакциями антител, демонстрируя наибольшее увеличение спустя две недели после третьей иммунизации (Фигура 53А). В противоположность этому, мыши, иммунизированные только контрольной pGXOOOl, демонстрировали фоновый уровень реакций IgG. Хотя некоторые различия в амплитуде реакции IgG были обнаружены в каждой группе, постепенное повышение после каждой иммунизации было постоянным в пределах групп.
2. IFN-y ELISPOT
[00262] Способность конструктов pLHBs-A, pLHBs-C, pSHBs-A и pSHBs-C индуцировать клеточные иммунные реакции исследовалась с помощью IFN-y ELISPOT. Matching НерВ consensus core, 15-мерные пептиды поверхностного антигена А и поверхностного антигена С синтезировали с помощью Genescript (Piscataway, NJ) и ресуспендировали в DMSO и объединяли в пул при приблизительно конечной концентрации 1 мкг/мл каждого пептида. Клеточные реакции измеряли с использованием IFN-y ELISpot (MabTech, Sweden) согласно инструкциям производителя. Образцы были проведены в трех повторностях с R10 (RPMI 1640, содержащей L-глутамин с 10 % инактивированной нагреванием фетальной бычьей сывороткой и 1 % пенициллина/стрептомицина) и контролем PMA/EVI (РМА 0,1 мкг/мл и иономицином 0,5 мкг/мл, Sigma Aldrich, St. Louis, МО).
[00263] HBsAg-специфические IFN-y секретирующие клетки проанализировали в ответ на два пула исскуственных пептидов, полученных из консенсусного большого поверхностного белка HBV. Первый пептидный пул содержал пептиды, охватывающие preS 1 и preS2 белки, тогда как второй пептидный пул состоял из пептидов, охватывающих основной S-белок. Все четыре консенсусные конструкты были способны индуцировать сильные реакции Т-клеток, а перекрестная иммунная реактивность наблюдалась в пределах двух генотипов (Фигура 53В). Хотя, вместе preS белки почти одинаковы по размеру с основным S-белком, было эпитопное смещения в клеточноопосредованных иммунитетных (CMI) реакциях по отношению к основному S-белку. Эти результаты указывают, что искусственные ДНК-иммуногены, кодирующие полноразмерный поверхностный антиген или только основную S-часть поверхностного антигена HBV, демонстрируют
иммуногенность, которая является достаточно разнотипной, чтобы нацелиться на основные генотипы HBV. Полноразмерные конструкты не продемонстрировали существенных отличий в индукции IgG к природному белку HBV по сравнению с более короткими конструктами.
3. Картирование поверхностных антигенных (15-мерных) пептидов HBV
[00264] После подтверждения амплитуды CMI была исследована ширина клеточных реакций на генотип-специфические мишени. Соответственно, наборы Интерферон-гамма ELISPOT анализов проводили против различных пулов матриксных пептидов. Два комплекта пептидов, охватывающих белок LBHs-A или LHBs-C, каждый из которых содержал 15 аминокислотных остатков, перекрывающихся 8 аминокислотами, были синтезированы с помощью GenScript (Piscataway, NJ). Для того, чтобы отобразить иммуно-доминантные эпитопы, два комплекта пептидов были объединены в 16 или 12 пулов для больших или малых групп HBsAg соответственно. IFN-y ELISpot анализ осуществляли, как описано выше. Эти различные комплекты объединенных пептидов были использованы в матриксном анализе для картирования эпитопов каждого конструкта. Реакции в более 50 SFU на миллион клеток считались положительными. [00265] Эти данные показывают, что различные эпитопные реакции были вызваны этими искуственными плазмидами поверхностного антигена у мышей линии BALB/c. Наблюдались в 12 из 16 положительных LHBs-A матриксных пулов у pLHBs-A-иммунизированных мышей и 8 из 16 положительных LHBs-C матриксных пулов у pLHBs-C-иммунизированных мышей. Небольшие плазмиды HBS показали более высокие количества реакций с pSHBs-A-иммунизированными мышами, отвечая на 9 из 12 SHBs-A матриксных пептидов, в то время как pSHBs-C-иммунизированные мыши демонстрировали ответы на все матричные пулы SHBs-C (Фигура 53С). Эти данные указывают на высокую степень широких перекрестно-реактивных клеточные реакции, вызванных этими 4 HBs-конструктами. В результате, эти генотип-специфические консенсусные вакцины могут быть способны индуцировать перекрестно-реактивные клеточные реакции против различных первичных поверхностных антигенных изолятов, которые до 8 % отличаются от этих генотипов.
ПРИМЕР 4
Анализ цитотоксичности и антиген-специфических ЦТЛ, обнаруженных в печени и
селезенках вакцинированных мышей
[00266] Противовирусные эффекторные CD8 Т-клетки индуцируют цитотоксичность, которая представляет собой клеточную активность для элиминирования HBV-инфицированных гепатоцитов. Способность конструктов генерировать HBs-специфические ЦТЛ в периферии, которые могут также является родными для печени иммунизированных мышей, оценивали с помощью in vivo анализа цитотоксичности. Спленоциты наивных мышей окрашивали либо 1 мкМ (высокая) или 1 нМ (низкая) CFDA SE (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Меченые спленоциты затем покрывали указанными пептидами (релевантными или иррелевантными пептидами) (1 мкМ) и по 107 клеток каждой популяции внутривенно вводили наивным или иммунизированным мышам. Спустя 90 часов, выделяли клетки из крови, селезенки или печени и анализировали с помощью проточной цитометрии. Процент лизиса клеток рассчитывали следующим образом: 100 -([( % релевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках / % иррелевантного пептида, пульсирующего в инфицированных клетках)/( % релевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках / % иррелевантного пептида, пульсирующего в неинфицированных клетках)] х 100).
[00267] Миграция HBV-специфических ЦТЛ в печень имеет важное значение для внутрипеченочного элиминирования инфицированных клеток. Антиген-специфическая элиминация адоптивно пересаженных спленоцитов-мишеней, которые пульсировали с искусственными пептидами HBsAg, не наблюдалась. Средний процент лизиса клеток-мишеней в селезенке у мышей, иммунизированных конструктами SHBs, составлял 39 % и 48 % для генотипа А и С, соответственно. Средняя элиминация клеток-мишеней для конструктов LHBs составила 35 % для генотипа А и 51 % для генотипа С. Клиренс был сильным, но не столь мощным, как реакция, наблюдаемая у мышей, которые были иммунизированы только коровой Ag-плазмидой, как описано в Примере 1, у которых 83 % и 76 % целевой коиренс был отмечен в селезенке и печени, соответственно. Демонстрация того, что ЦТЛ, генерированные против HBs, могут устранять антиген-мишень в печени, способствует тому, что она поддерживает комбинацию HBs и НВс для дальнейшего расширения клеточной силы и ограничения утечки. Процент элиминации клеток-мишеней в печени составил 45 % и 66 % для SHBs-A и SHBs-C, и 60 % и 74 % в группах LHBs-A и LHBs-C (Фигура 54). Имея вакциноспецифический ЦТЛ трафик в печень, орган, как
известно, подавляет Т-клеточный ответ и индуцирует толерантность, подчеркивает эффективность конструктов в стимулировании функционального CMI.
ПРИМЕР 5
Иммуногенность HBsAg-HBcAg ДНК-коктейля
[00268] Поскольку иммунизация каждой искусственной HBsAg-плазмидой вызвала широкие перекрестно-реактивные иммунные ответы, ответы были расширены за пределы поверхностного антигена для дальнейшего повышения иммуногенности в отношении различных антигенов в пределах вируса. Плазмиды HBs объединили с плазмидой, кодирующей HBcAg (рМСоге), для создания HBs-HBc ДНК-вакцинных коктейлей для иммунизации, чтобы определить, повысит ли коктейль клеточную реакцию путей повышения количества иммунных эпитопов, которые Т-клетка будет распознавать для элиминирования, так как коровый антиген HBV участвует в вирусном клиренсе через индукцию HBcAg-специфических ЦТЛ реакций.
[00270] Для дальнейшего изучения иммунного ответа, вызываемого HBS-HBc-иммунизированными мышами, оценивали продуцирование IFN-y из каждой
[00269] Пять групп мышей, иммунизированных вакцинными коктейлями только антигенов HBs или объединенных антигенов HBs и НВс. Каждая мышь получила две инъекции с последующей электропорацией в обеих ТА. Мышей иммунизировали либо коктейлями,содержащими только поверхностные антигены (обеих генотипов), или коктейлями, содержащими как поверхностные антигены, так и консенсусную плазмиду корового антигена (рМСоге), описанную в Примере 1 (смотри Таблицу 3). Мыши, иммунизированные только HBsAg, генерировали высокий титр IgG в своих сыворотках. Интересно, похожие титры наблюдались в группе SHBs-pMCore, но были менее сильными в группе коктейлей LHBs-pMCore (Фигура 55А). Увеличение антигена-мишени, возможно, вызвало некоторое торможение антител.
иммунизированной группы. Средняе SFU на миллион спленоцитов для групп, не имеющих рМСоге, составило 689 и 666 для генотипа А и 1160 и 1312 против пептидов генотипа С, соответственно. Кроме того, добавление рМСоге в среднем увеличило общее SFU на миллион спленоцитов на 400 точек против генотипа Сив два раза реакцию, когда спленоциты стимулировали пептидами генотипа А (Фигура 55В).
[00271] CD8 Т-клетки, как известно, являются основными эффекторными клетками, ответственными за клиренс HBV. Важно определить, какой тип Т-клеток является причиной наблюдаемого производства IFN-y и изучить, могут ли эти Т-клетки вызывать несколько противовирусных функций в ответ на антигенное повторное столкновение, высвобождая другие противовирусные цитокины, такие как TNF-a и IL -2 и маркеры дегрануляции, такие как CD 107а. Способность CD8 Т-клеток от иммунизированных мышей индуцировать эти цитокины и маркеры оценивали после ex vivo стимуляции пригодными пептидами. Разноцветный проточный анализ показал, что значительный процент CD8 Т-клеток из каждой группы были полифункциональными (т.е. продуцируется несколько цитокинов), активированные CD8 Т-клетки во всех группах (Фигуры 56А - F). Также наблюдалась антиген-специфическая индукция маркера лимфоцитной дегрануляции, CD107a, в этих CD8 Т-клетках. CD8 Т-клетки из группы коктейлей FЈBS-FЈBc показали высокую полифункциональную активность при стимуляции петидом поверхностного антигена, что подтверждает синергетический эффект в CD8 Т-клеточных противовирусных цитокинах, таких как IFN-y TNF-a и IL-2, и маркера дегрануляции, CD 107а. Также наблюдалась индукция ЦТЛ через клиренс пересаженных антигенпульсирующих клеток. В то время как имелось уменьшение ответов антител к HBs для коктейлей, включая конструкты LHBs, коктейли вакцин SHBs-pMCore поддерживали гуморальные ответы, обнаруженные у животных, иммунизированных только SHBs.
ПРИМЕР 6
Иммунизация резус-макак коктейлем индуцирует сильные клеточные НВс- и HBs-специфические и гуморальные HBs-специфические иммунные реакции
[00272] Эфективность ДНК-вакцины предыдущих ДНК-конструктов была последовательно слабой у крупных животных и людей. Сильные ответы антител и Т-клеточные ответы, стимулированные комбинацией pLHBs или pSHBs и рМСоге у мышей приводят к оценке иммуногенности этих конструктов в модели нечеловекообразных приматов (NHP), который более точно имитируют иммунный ответ человека. Это препятствие для иммуногенности вакцины в качестве большего размера и аутбредной МНС-популяции NHP, как правило, приводит к снижению или отсутствию
иммуногенности по сравнению с мышиными моделями. Для этих исследований L-12, Th-1 -ведущий цитокин, был добавлен для анализа. Было показано, что IL-12 приводит CMI, способствуя примированию и экспансии CD8 Т-клеток, при добавлении к иммунизации в качестве адъюванта для усиления иммунного ответа против различных антигенов из различных патогенов. Этот адъювант увеличивает Т-клеточные ответы ДНК-вакцины у мышей и макак, и человека.
1. Вакцинация
[00273] Пятнадцать индийских макак-резусов были размещены в Bioqual (Rockville, MD) в соответствии со стандартами Американской ассоциации по аккредитации в области лабораторных животных. Обезьяны резус-макак были помещены в группы, где каждая группа содержит 5 обезьян. Смотри Таблицу 4.
[00274] Одной группе вводили путем внутримышечной (EVI) доставки (также известной как in vivo электропорация) вакцину, содержащую 1,0 мг каждого из конструктов рМСоге, pSHb А и pSHb С; эта группа называется "небольшой" группой. Второй группе вводили посредством EVI доставки вакцину, содержащую 1,0 мг каждого из конструктов рМСоге, pLHb А и pLHb С; эта группа называется "длинной" группой. Третьей группе вводили через EVI доставку вакцину, содержащую по 1,0 мг каждого из конструктов рМСоге, pLHb А и pLHb С и 0,4 мг prhIL-12 (плазмида, экспрессирующая оптимизированный резус IL-12); эта группа упоминается как "длинная+1Х-12" или "pLHBs+12" группа. Конструкт prhIL-12 кодирует белок IL-12 резус-макаки. ДНК была доставлена к единичному сайту в четырехглавой мышце с последующей in vivo ЕР с помощью устройства постоянного тока CELLECTRA(r) (Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA) 3 импульсами при 0,5 А постоянного тока, длительность импульса 52 мс и 1 с отдыха между импульсы. Животные были вакцинированы в недели 0, 4, 12 и 30.
2. Отбор проб
[00275] Образцы брали от обезьян до иммунизации в неделю 0, а также после каждой иммунизации (т.е., после недель 0, 4 и 12). У животных брали кровь через 2 недели после каждой иммунизации. Кровь (20 мл в каждый момент времени) собирали в пробирки с
ЭДТА, а РВМС выделяли с использованием стандартной процедуры фиколл-гипак с пробирками Accuspin (Sigma-Aldrich). Дополнительные 5 мл крови собирали в пробирки для отделения плазмы, а сыворотку делили на аликвоты для анализа.
[00276] Реакции с высоким титром антител против HBsAg наблюдались после двух иммунизаций pSHBs/pMCore, но не с pLHBs/pMCore. Этот ответ был сопоставим с данными мышиного антитела на Фигуре 55 А. Ответ против pLHBs/pMCore поднялся после третьей иммунизации. Адъювант IL-12 повысил титр антител иммунизации коктейлем pLHBs/pMCore уже после всего лишь двух иммунизаций (Фигура 57А). [00277] Клеточные иммунные реакции от РВМС показывают практически отсутствие HBs или НВС-специфических ответов после первой иммунизации. Однако, ответы наблюдались после второй иммунизации и увеличивались после каждой последующей иммунизации. Сильные ответы свышге 2000 SFU на миллион РВМС наблюдались во всех группах после третьей иммунизации и были в значительной степени направлены против корового антигена. Добавление адъюванта IL-12 усиливало амплитуду Т-клеточного ответа 1000 SFUHa миллио РВМС по сравнению с только коктейлем pLHBs/pMCore (Фигура 57В). Для дальнейшего определения широты клеточного ответа были созданы матриксные пулы консенсусных коровых пептидов для определения количества возможных эпитопов. Реакции Т-клеток охватили несколько пептидных пулов со средним ответом на 12 пептидных эпитопов (Фигура 57С). Эти ответы совпадают с полученными ранее, как показано на небольших животных моделях. Эти результаты позволяют предположить, что коктейли способны индуцировать клеточный ответ с сильной амплитудой и шириной, и что амплитуда этих ответов может быть расширена путем добавления IL-12.
[00278] На Фигурах 45-48 показаны клеточные иммунные реакции, вызванные вакцинами, введенными в небольших, длинных и длинная+1Ь-12 группах. Анализ иммуноферментных пятен (ELISPOT) был использован для определения клеточного иммунного ответа, как описано выше в Примере 1. Как показано на Фигурах 45-48 Т-клеточный ответ повышался с каждой вакцинацией. Однако, коровый антиген HBV был более иммуногенным, чем HBV-поверхностный антиген А и HBV-поверхностныйо антиген С. Эти данные также показывают, что более длинный консенсусный поверхностный антиген HBV (т.е. включает белок S, preS2 и preSl) является иммуногенным в качестве небольшого поверхностного антигена HBV (т.е. включает белок S).
[00279] Подобно Фигурам 45-48, на Фигуре 49 показаны клеточные иммунные ответы, вызванные вакцинами, введенными в небольших, длинных и длинная+1Х-12 группах, как измерено с помощью анализа ELISPOT, кроме того были исследованы различные пулы
пептидов, охватывающие коровый антиген, поверхностный антиген А и поверхностный антиген С. Опять же, ответ Т-клеток повышался с каждой вакцинацией, добавление IL-12 усиливало клеточный иммунный ответ, а длинные и короткие консенсусные поверхностные антигены HBV были аналогично иммуногенными.
[00280] На Фигуре 50 показаны данные ELISA, сравнивающие ответы антител против HBV для небольших, длинных и длинная+1Х-12 групп. ELISA были выполнены, как описано выше в Примере 1. Наблюдались антиген-специфические гуморальные реакции в сыворотке, полученной от иммунизированных обезьян. В частности, вакцины, включающие длинный консенсусный поверхностный антиген (т.е. S-белок, preS2 и preSl) имеют лучшую реакцию антитела, которая может быть из-за дополнительных эпитопов, присутствующих в вакцине.
[00281] На Фигуре 51 показаны данные ELISA, сравнивающие ответы антител против HBV для группы длинная+1Х-12 до иммунизации (prevac) и после иммунизации в неделю 0, неделю 4 и неделю 12 (то есть, после 1-й, после 2-й и после 3-ей иммунизации, соответственно). ELISA проводили, как описано выше в Примере 1. Данные на Фигуре 51 показывают, что две иммунизации или дозы необходимы для измеримого продуцирования антител. Кроме того, значительное повышение ответа антитела к HBV наблюдали после третьей иммунизации или дозы.
ПРИМЕР 7
[00282] Как и в экспериментах с мышами в Примере 5, спленоциты, т.е. CD8 и CD4 Т-клетки, были выделены от иммунизированных макак резус в Примере 6 для исследования уровней INF-y и секреции TNF-a в ответ на введение комбинации консенсусных коровых и консенсусных поверхностных антигенов. CD8 и CD4 Т-клетки были изучены с помощью полифункционального и фенотипического анализа потока, чтобы изучить секрецию фактора некроза опухоли, гамма-интерферона и CD 107а из этих CD8 и CD4 Т-клеток, чтобы определить, имеют ли CD8 и CD4 Т-клетки иммунизированных обезьян из Примера 6 сходные характеристики с мышиными CD8 и CD4 Т-клетками, изученными в Примере 1. [00283] Для дальнейшего определения функции клеточного иммунного ответа, внутриклеточное окрашивание противовирусных цитокинов проводили после стимуляции коровых и поверхностных антигенов из генотипов А и С. Внутриклеточное окрашивание антителами к противовирусным цитокинам показало, что антиген-специфическое продуцирование противовирусных цитокинов (IFN-y, TNF-a и IL-2) индуцировалось в обеих CD4 и CD8 Т-клетках от иммунизированных обезьян. Фигура 57D показывает, что после трех иммунизаций наблюдались HBV-специфические CD4 и CD8 Т-клеточные
реакции. Подобно результатам, показанным в IFN-y ELISpot, ответы против корового антигена доминировали. Добавление IL-12 усиливало общую амплитуду отклика, однако, как ожидалось, этот эффект был более выраженным для CD8 Т-клеток. Индукция как CD4, так и CD8 ответов, составляющая в среднем 1 %, предполагает индукцию широкого иммунного ответа, состоящего из Thl и Th2 иммунитета и является сильно обнадеживающей для продвижения этой стратегии в испытаниях на людях. [00284] Антитела и Т-клеточные ответы на антигены HBs и НВс были аналогичны результатам, полученным с мышами в Примере 5. Эти ответы были еще более впечатляющими, когда IL-12, Thl поляризационный цитокиновый адъювант был добавлен в коктейль pLHBs-pMCore. Похоже, что pLHBs-pMCore + IL-12 рецептура была весьма эффективной в качестве предпочтительной комбинации. Следует отметить, что ни один вакцинный препарат не привел к повышению параметров, связанных с повреждением печени.
ПРИМЕР 8
Анализ функции печени у нечеловекообразных приматов после вакцинации с использованием панелей для химического анлиза крови из печени
[00285] Поскольку клинические исследования пациентов, активно инфицированных НВV, предположили возможность того, что Т-клеточный ответ может быть связанным с патологией печени в течение болезни, то проводили предварительный анализ общей безопасности этих поливалентных вакцин в отношении функции печени. Для того чтобы исследовать функцию печени, сывороточные уровни щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и общего билирубина были проанализированы у вакцинированных животных до иммунизации, после третьей вакцинации и непосредственно перед четвертой вакцинацией и после четвертой вакцинации. Панели для химического анализа крови были прогнаны ШЕХХ Laboratories и содержали щелочную фосфатазу, аланинаминотрансферазу, аспартатаминотрансферазу и общий билирубин. Результаты этого анализа показаны на Фигуре 58. Отсутствие повышения щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы и общего билирубина в тестах на функцию печени до, во время и после завершения периода иммунизации предположил, что индукция HBV-специфического иммунного ответа не вызывала значительный ущерба печени вакцинированных животных. [00286] Взятые вместе, эти данные подтверждают, что введение этого искусственного ДНК-вакцинного коктейля, кодирующего сконструированные антигены HBV, в комбинации со специфической электропорацией приводит к сильным и разнообразным
клеточным и гуморальным реакциям у мышей и NHP, избегая при этом ощутимой токсичности.
[00287] Понятно, что приведенное выше подробное описание и сопровождающие примеры являются только иллюстративными и не должны рассматриваться как ограничивающие объем изобретения, который определен исключительно прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.
[00288] Различные изменения и модификации раскрытых вариантов осуществления будут очевидны специалистам в данной области техники. Такие изменения и модификации, в том числе, без ограничения, касающиеся химической структуры, заместителей, производных, промежуточных соединений, композиций, составов или способов использования изобретения, могут быть сделаны без отступления от сущности и объема изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вакцина, содержащая:
(a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:14, белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, и белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:14; или
(b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:16, белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:12, и белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:16.
2. Вакцина по п. 1, дополнительно содержащая:
(с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4 и SEQ ID N0:6.
3. Вакцина по п. 1, дополнительно содержащая:
(a) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:14, белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, и белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:14;
(b) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0: 12, SEQ ID N0:16, белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной
(a)
последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:12, и белок, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:16; и
(с) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:4, и SEQ ID N0:6.
4. Вакцина по п. 3, отличающаяся тем, что молекулы нуклеиновой кислоты
содержат одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:5, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 и SEQ ID N0:15.
5. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что молекулами нуклеиновой кислоты являются плазмиды.
6. Вакцина по п. 1, что молекулы нуклеиновой кислоты включены в вирусные частицы.
7. Вакцина по п. 1, дополнительно содержащая адъювантную молекулу.
8. Вакцина по п. 7, отличающаяся тем, что адъювантом является IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
9. Способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий
введение субъекту вакцины по п. 1.
10. Способ защиты субъекта от HBV-инфекции, включающий введение субъекту
вакцины по п. 1.
11. Способ защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение субъекту вакцины по п. 1.
12. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: белка, содержащего SEQ ID N0:2; белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2; иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот.
13. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, дополнительно содержащая сигнальный пептид, присоединенный к N-концу белков.
14. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, кодирующая один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:2; SEQ ID N0:4 и SEQ ID N0:6.
15. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, содержащая одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей SEQ ID N0:1; последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 98 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ Ш N0:1; ее фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот, кодируемых последовательностью SEQ Ш N0:1; и ее фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности белка, кодируемого последовательностью SEQ ID N0:1.
11.
16. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, дополнительно содержащая сигнальный пептид, присоединенный к 5' -концу последовательности нуклеиновой кислоты.
17. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, содержащая одну или более нуклеотидных последовательностей, выбранных из группы, состоящей из: SEQ ID N0:1; SEQ ID N0:3 и SEQ ID N0:5.
18. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является плазмидой.
19. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является вектором экспрессии, и последовательности, кодирующие один или более белков, функционально связаны с регуляторными элементами.
20. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включена в вирусную частицу.
21. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 60 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 60 аминокислот.
22. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 120 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине
11.
аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 120 аминокислот.
23. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 12, отличающаяся тем, что указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 180 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, которая состоит из по меньшей мере 180 аминокислот.
24. Способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 12.
25. Способ защиты человека от HBV-инфекции, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 12.
26. Способ защиты индивидуума, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 12.
27. Белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) SEQ ID N0:2;
(b) белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности полноразмерной последовательности, указанной в SEQ ID N0:2;
(c) иммуногенного фрагмента SEQ ГО N0:2, содержащего 20 или более аминокислот из SEQ ID N0:2;
(d) иммуногенного фрагмента белка, который на 95 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, содержащего 20 или более аминокислот.
(a)
28. Белок по п. 27, отличающийся тем, что указанный белок выбирают из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, который состоит из по меньшей мере 60 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ Ш N0:2, который состоит из по меньшей мере 60 аминокислот.
29. Белок по п. 27, отличающийся тем, что указанный белок выбирают из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2, который состоит из по меньшей мере 120 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ Ш N0:2, который состоит из по меньшей мере 120 аминокислот.
30. Белок по п. 27, отличающийся тем, что указанный белок выбирают из группы, состоящей из: иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ ID N0:2 , который состоит из, по меньшей мере 180 аминокислот; и иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:2, который состоит из по меньшей мере 180 аминокислот.
31. Способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 27.
32. Способ защиты индивидуума от HBV-инфекции, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 27.
33. Способ защиты индивидуума, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты по п. 27.
34. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая кодирующую последовательность, которая кодирует один или более белков, выбранных из группы, состоящей из:
(а) белка, содержащего SEQ ID NO: 10, SEQ Ш NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID N0:16;
(b) белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16;
(c) иммуногенного фрагмента белка, содержащего SEQ Ш NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот; и
(d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ Ш N0:14 или SEQ ID NO: 16, который состоит из по меньшей мере 20 аминокислот.
35. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 34, содержащая одну или более последовательностей, выбранных из группы, состоящей из:
(a) нуклеиновой последовательности, содержащей SEQ ID N0:9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID N0:13 или SEQ ID N0:15;
(b) последовательности нуклеиновой кислоты, которая на 98 % идентична по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 или SEQ ID N0:15;
(c) ее фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот, кодируемых последовательностью SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ ID N0:13 или SEQ ID N0:15; и
(d) ее фрагментов, которые содержат последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую иммуногенные фрагменты, содержащие по меньшей мере 20 аминокислот белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности белку, кодируемому последовательностью SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11, SEQ Ш N0:13 или SEQ ID N0:15.
36. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 34, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является плазмидой.
36.
37. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 34, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты является вектором экспрессии, и последовательности, кодирующие указанный один или более белков, функционально связаны с регуляторными элементами.
38. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 34, отличающаяся тем, что молекула нуклеиновой кислоты включена в вирусную частицу.
39. Способ индукции иммунного ответа против антигена HBV, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по п. 34.
40. Способ защиты субъекта от HBV-инфекции, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по п. 34.
41. Способ защиты субъекта, у которого была диагностирована HBV-инфекция, включающий введение субъекту молекулы нуклеиновой кислоты по п. 34.
42. Белок, выбранный из группы, состоящей из:
(a) SEQ ГО NO: 10, SEQ TD NO: 12, SEQ TD NO: 14 или SEQ ГО NO: 16;
(b) белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ID N0:14 или SEQ ID N0:16;
(c) иммуногенного фрагмента SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID N0:16, содержащего 20 или более аминокислот; и
(d) иммуногенного фрагмента белка, который на 98 % идентичен по всей длине аминокислотной последовательности SEQ ID N0:10, SEQ ID N0:12, SEQ ГО N0:14 или SEQ ID N0:16, содержащего 20 или более аминокислот.
43. Вакцина, полезная для генерирования иммунного ответа против HBV у субъекта, содержащая:
молекулу нуклеиновой кислоты по п. 34 и
адъювантную молекулу.
44. Вакцина по п. 43, отличающаяся тем, что указанным адъювантом является IL-12, IL-15, IL-28 или RANTES.
По доверенности
га о.
25 KD
оо О
> s л
DQ О Q. О
2- "
О сч
О. со
= г
(О го
т- о.
то о
О. ~
> % с
J ш о а. о
ГО X
1111
eo о" о" о" о" о"
лохэил-! +КЮ ва-л ojatngo ю +A-Ndl %
ГО X
I * I V 1
<53 *yi> -""^ Й55>
ч-5 "5 О О CS 8"
М01Э1Л1-1 +8Q0 еа-м ojatngo ю +Л-|\Ы1 %
л с
<и н
о ц. о с
ГО X
I-го и
S Q. I-
00 Q U
а •- о
ш -О
lib ^
го X
о чг <=L "г
СО CV л < ^
с*. "1 <=L (c) о
М01Э1Ш-1 +КЮ вя-м ojBtngo ±о +o-|\jdl %
го X
"г о. "г
Л1 (N т
=1. "г
<=1 О
Hoiaira-i +8frO ва-я ojetngo ±о +o-Ndl %
¦ О
л с. ф I-
о с о п.
¦ О
- О
со Q U
см с, > с
ш о
¦ О
- О
-ргт,
см о -ггг
л ш о
-[ТТ,
ом О
ТТГ
""f го
"~ О
xoiaim-i +8Q0 ва-л ojatngo ю иохэии +Dzoi см га
1Л Ч"
го X
'Г 1 1 "' 1
Jioiaim-i +8Q0 вя-я ojatngo ю иохэии +DZ0l"QO %
Фигура 23
pVAX
Фигура
(Страница 1
из 3)
рМСоге
(Страница 2 из 3)
Pos. Контроль
* 1 к
о и е
> с
"Т"
IS*
яо±э1Л1-1 +8Q0 ва_я ojatngo ±о +A-|\jdl %
Я01Э1Ш-1 +КЮ ва-я ojsnigo ю +A-NJI %
10л
1 II
2 :"|
0 1(T
103
10*
10=
Фигура 26
(Страница 1 из 3)
10л
104
105
Фигура 26, продолжение
(Страница 2 из 3)
Pos. Контроль
(Страница 3 из 3)
* *¦ о
8 V
2- 2* 2- ? (c)- J 2 (c)"
ЯОХЭ1Л1-1 +8Q0 ва-я ojatngo ю +A-NJI %
-г irt
п "м ?м
-т-
-т-ift о
о о
яохэия-! +КЮ ва-я ojahigo ю +A-[\idl %
¦A-tUI
CD3+ CD4+ IFN-V+
CD3+ CD8+ IFN-Y+
Фигура 29
л I л
<и IS
о ц. о с
со > "
О ее
С Q.
О Ф
I- О
СМ О
Q. S
о о о со
О О
о о
CN т
о о
Г\|
о о
яошпонэииэ ок вн ndS
S0iAJ9d gCH/ndS
\ \ % \
# \
о 3
ц о ю
о о 6
8 о о
sowad9ot/rids
н и о
X X
а о
X X S
О 3
о ю
о о о о о о со о о о см о о о
Ч \Ч
\\ -
ч> %\
° ч
Q. S
S3Wad9(H/ndS
QSfrQO
091? ею
о о
СО СО
ю см см со со
ю см см
о см (О ф
(Л ф
СО (О
со со
о см
и s т =
и г- ев о о. о- н
О (В
"3 о
о ш
се Q.
со ш
ш 00
СО Q.
lAIHOSfOO
О го с
2! Ъ
¦ А;
го о о со
о о о
о о о см
аохипонэииэ
а(Н ВН H9XKU-A-|\Jj|
о V
со ю
(С Q.
о- о
0) |_
8 8
О о СМ т-
аохипонэииэ 01- вн HaiHU-A-NJi
О оооооооо ооооошою
О 1Л О 1Л ГМ т- т-СМ т- т-
аохипонэииэ о0к вн нэ1ии-Л-|\|Л
< "
ооооооооо оооооизою о m о m см т- т-
СМ т- т-
аохипонэииэ "01, вн нэхви-Л-Ndl
9> <
-fl ,
1 J2
ей Ш
ГО (f)
1 а.
¦ ?
6 6 6 6
о о о о о ю о
О Ю О Й СМ г- т-
СМ т- ч-
1111
о о о о о о о о о m
О 1П О 1Л СМ ч-СМ т- т
о о.
5, о с со ю
(Т5 Q.
аохипонэииэ ,0к вн нэ±ки-Л-|\у|
аохипонэииэ "01 вн нэхки-Л-Ndl
У 9) С
си п
с; си О
- и
A i A A A А 1
О CO (О ТГ см
ихэоньиэяо±охиЛ iHetiodu
5 , <¦> т- (N
Ж 2 5 со со m
ООО X Q. Q.
¦- " О о О. О ^
BDID
•-с
О т- ГМ
го о о
-го о о
-1-
-го о ю
аохипонэииэ 01 вн нэхки-Л-Ndl
X X ш
(О Q.
о- О
Q. Q.
О о
HZZ3-
К х
• I I I
8 8 8 8
о m о m см т- *-
аохипонэииэ О к вн нэхьи-Л-|мл
^ S
00 о
00 о
1 S
< I
0 со СО и
1 о
1а?
о о
О О со
СО СО 0) СО
О ¦
¦S3
QQ X сл а.
<
Ш X
со а.
гз с с > " а.
(О Q.
?1 S
(0 00 00 СО
<
< S
СЯ ICQ О
i i ^ S
со р СО о
<
"о"
HBsAg
(генотип
HBsAg
(генотип
HBcAg
(Консенсу
2? о О
О ¦
со m
О О
см 00
О О
(Л СО I СО
со с с
I со
(О Ю
ГО Q.
?¦ S
<
"о"
О) с
< 5
О) (J *f т
ся н
ел ь
онсе!
со о х ?
со 1
X со
< ш о
со со го
• т <
4 I
<
СО Q.
• 4
и."
S Ё
Я 8
• ч <
1 I i J 1
Я 8 Я
• • I-1"
о СЕ
О Ю
Q. S
•3N8d "OUndS
* a s ? s
гм "- "у о (-> ф О Ф Ф Ф
чг Л "г ¦2?
Л "р U3) Ф
" I $ а я
Ё Ф
< о
z z
О) О)
|_ |_
Лист 76 из 81
га со
> s > s
2 2
z z
1з d
E z ?
л x x
о a. a.
о at at
O, ED ID
ooo
iЈ С С
о о
[ I
I I I I I
см ем
нохэия-!. +8QO хихээьифиУ1еиэ-дс1эн %
о о
I I I I I
m о ю о ю
СМ* ОТ -г-" т-1
яохэш!-! +i?ao хииээьифи*1эиэ-ас!эн %
СО Z
< о
_| О х
О CL U-LL
О _| О. Z О. > СО
I-о
со со
X <
ц> со
1- О (О см СМ 00 со t
Q. О о
CM СО Tt ч- т- СМ
а а.
со z < CD
CD СО О а.
Q _i
О I о а.
CD _i
OL > CO
CD CD
CD CD
со i J>
сю >
О to
CD О
а to
CD _J
CD со
e> Ј
I °-
CL CL
CD CL CD
LL <
<
CD > О z
LL О t- CD
a> c, с
ET о
CO Q.
CQ О
CD CO CO
CO CD CD
ce:
CL О
CL X
to а
се: _i
CL CL CO CL I-CL О
I Ф
Ц с а)
3" о со
1-> S CO
CL I-СО *
LL О
СО q LL
оо -ч- о ю см т- см со со -n-
О со
?* S
ч UJ I
f\ СО LL.
a: LL
(c)
см оо
1з?
2WSd ,01/ndS
3WSd ,01/ndS
Лист 1 из 81
Лист 1 из 81
Лист 3 из 81
Лист 3 из 81
Лист 4 из 81
Лист 4 из 81
Лист 5 из 81
Лист 5 из 81
Лист 11 из 81
Лист 11 из 81
Лист 12 из 81
Лист 12 из 81
Лист 13 из 81
Лист 13 из 81
Лист 13 из 81
Лист 13 из 81
Лист 14 из 81
Лист 14 из 81
Лист 15 из 81
Лист 15 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 16 из 81
Лист 18 из 81
Лист 18 из 81
Лист 18 из 81
Лист 18 из 81
Лист 19 из 81
Лист 19 из 81
Лист 19 из 81
Лист 19 из 81
Лист 19 из 81
Лист 19 из 81
Лист 21 из 81
Лист 21 из 81
Лист 21 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 22 из 81
Лист 23 из 81
Лист 23 из 81
Лист 23 из 81
Лист 23 из 81
Лист 24 из 81
Лист 24 из 81
Лист 25 из 81
Лист 25 из 81
Лист 25 из 81
Лист 25 из 81
Лист 26 из 81
Лист 26 из 81
Лист 26 из 81
Лист 26 из 81
ист 27 из 81
ист 27 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 30 из 81
Лист 31 из 81
Лист 31 из 81
Лист 31 из 81
Лист 31 из 81
Лист 32 из 81
Лист 32 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 33 из 81
Лист 34 из 81
Лист 34 из 81
Лист 37 из 81
Лист 37 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 38 из 81
Лист 39 из 81
Лист 39 из 81
Лист 44 из 81
Лист 44 из 81
Лист 45 из 81
Лист 45 из 81
Лист 47 из 81
Лист 47 из 81
Лист 49 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 52 из 81
Лист 53 из 81
Лист 53 из 81
Лист 53 из 81
Лист 53 из 81
Лист 55 из 81
Лист 56 из 81
Лист 56 из 81
Лист 57 из 81
Лист 57 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 58 из 81
Лист 59 из 81
Лист 59 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 61 из 81
Лист 62 из 81
Лист 62 из 81
Лист 63 из 81
Лист 63 из 81
Лист 63 из 81
Лист 63 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 64 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 66 из 81
Лист 68 из 81
Лист 68 из 81
Лист 70 из 81
Лист 70 из 81
Лист 70 из 81
Лист 70 из 81
Лист 71 из 81
Лист 71 из 81
Лист 72 из 81
Лист 72 из 81
Лист 72 из 81
Лист 72 из 81
Лист 72 из 81
Лист 72 из 81
Лист 73 из 81
Лист 73 из 81
Лист 73 из 81
Лист 73 из 81
Лист 73 из 81
Лист 73 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 75 из 81
Лист 78 из 81
Лист 78 из 81
Лист 78 из 81
Лист 78 из 81
Лист 78 из 81
Лист 78 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 79 из 81
Лист 80 из 81
Лист 80 из 81
Лист 80 из 81
Лист 80 из 81
Лист 80 из 81
Лист 80 из 81
Лист 81 из 81
Лист 81 из 81
Лист 81 из 81
Лист 81 из 81
Лист 81 из 81
Лист 81 из 81