[RU]

Настоящее изобретение относится к растению пшеницы, несущему аллель Rht-B1, кодирующий полипептид Rht-B1. Полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, в котором аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность полипептида Rht-B1 отличается от последовательности, указанной как SEQ ID NO: 5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID NO: 5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID NO: 5.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к растению пшеницы, несущему аллель Rht-B1, кодирующий полипептид Rht-B1. Полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, в котором аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID NO: 5. Аминокислотная последовательность полипептида Rht-B1 отличается от последовательности, указанной как SEQ ID NO: 5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID NO: 5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID NO: 5.

---

2420-523046ЕА/17 ПШЕНИЦА С НОВЫМИ АЛЛЕЛЯМИ RHT-B1 ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0001] Настоящее изобретение относится к мутантам пшеницы с усиленным ростом, несущим измененный аллель Rht-Blc. Дополнительно настоящее изобретение относится к зерну таких растений и к продуктам, получаемым из такого зерна. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0002] Растения реагируют на стимулы развития, физиологические стимулы и внешние стимулы изменением скорости роста своих частей или в целом. Описано множество механизмов, которые включают изменения содержания классов растительных гормонов гиббереллинов (GA) (рассмотрено в Yamaguchi, 2 008) или сигнальных компонентов, которые включают GA, таких как белки GID1 и DELLA (рассмотрено в Sun, 2010) . Это приводит к динамической регуляции передачи сигнала GA так, что рост скоординирован с передачей сигнала от других гормональных регуляторных путей и с факторами окружающей среды, такими как свет, температура и доступность воды (Hartweck, 2008; Achard and Genschik, 2009; Kuppusamy et al. , 2009) . Для объяснения суточных различий в скорости роста была предположена синхронизация передачи сигнала GA циркадными часами (Arana et al., 2011) .
[0003] У растений охарактеризован ряд мутантов по гиббереллинам (GA), самопроизвольных по происхождению или идентифицированных после мутагенеза. Они включают четко выраженные карликовые и удлиненные ("утонченные", "slender") фенотипы, которые, как правило, являются результатом изменений содержания GA или передачи сигнала GA. Идентификация участвующих генов и анализ белков, которых они кодируют, способствовал достижению понимания регуляции роста посредством GA, в частности у модельных видов риса и Arabidopsis. Биоактивные GA связываются с белком-рецептором GA ("GID1", Ueguchi-Tanaka et al., 2005; Murase et al., 2008; Shimada et al., 2008) и формируют комплекс, который затем связывается белками DELLA, которые идентифицированы как подсемейство
семейства факторов транскрипции GRAS (Griffiths et al. , 2006; Willige et al., 2007; Hirano et al., 2010), которое функционирует в качестве ингибиторов роста. В одном из случаев факты позволяют предполагать, что связывание DELLA с факторами транскрипции PIF предотвращает стимуляцию ими экспрессии генов, необходимых для усиленного роста (de Lucas et al., 2 008; Feng et al., 2008).
[0004] Особый интерес представляют мутанты Delia ячменя и риса, так как они включают два существенно различающихся фенотипа: сильно удлиненные "утонченные" типы и "нечувствительные к GA" карликовые формы. Первый признак является рецессивным и характеризуется экстремальным ответом на GA, тогда как последний признак является доминантным или полудоминантным. К этим совершенно разным фенотипам ("удлиненный утонченный" или "карликовый утонченный", Ikeda et al. , 2001; Chandler et al., 2002; Asano et al., 2009) приводят различные однонуклеотидные замены в гене Slenderl, кодирующим DELLA. Первый из фенотипов включает мутации, которые устраняют способность DELLA репрессировать рост, а последний проявляется вследствие накопления DELLA вследствие неспособности связываться с комплексом GA-GID1.
[0005] Как правило, пшеница является гексаплоидной, и DELLA кодируют три гомологичных гена (Rht-Alr Rht-Blr Rht-Dl) в хромосомах 4AL, 4BS и 4DS геномов пшеницы А, В и D, соответственно, где "L" означает длинное плечо хромосомы, a "S" означает короткое плечо хромосомы. Это делало изучение мутантов пшеницы более сложным, и, таким образом, в отношении пшеницы известно меньше по сравнению с рисом и ячменем. Для геномов В и D описаны "нечувствительные к GA" аллели полукарликовости (Peng et al., 1999; Pearce et al., 2011) . Один из примеров аллеля экстремальной карликовости является аллель Rht-Blc в геноме В, который является результатом вставки элемента ДНК. Теоретически рассчитано, что большинство этой вставки в транскрипте гена подвергается сплайсингу, но остаются 90 нуклеотидов, и это приводит к ожидаемой вставке в рамку считывания DELLA 3 0 аминокислот (Pearce et al., 2011; Wu et al., 2011) .
[ОООб] Гены полукарликовости были замечены при разведении пшеницы и риса со времени сельскохозяйственной революции ввиду их положительного воздействия на урожайность. Умеренное (102 0%) уменьшение высоты полукарликов происходит вследствие дефицита стимуляции роста эндогенным GA. У риса это происходит в результате такой мутации в гене биосинтеза GA, что присутствует меньше активного GA (Monna et al., 2002; Sasaki et al. , 2002; Spielmeyer et al. , 2002) . В отличие от этого, у пшеницы мутации карликовости в гене Delia приводят к росту, который относительно "нечувствителен" к GA (Peng et al., 1999). Исходные мутации полукарликовости по происхождению были спонтанными, и их агротехническое значение очевидно ввиду их продолжающегося широкого использования в современных сортах через 50 лет после первого применения. Однако существующие аллели Rht имеют несколько недостатков.
[0007] Таким образом, остается необходимость в улучшенных сортах полукарликовой пшеницы.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В первом аспекте настоящее изобретение относится к растению пшеницы, несущему аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
[0009] Во втором аспекте настоящее изобретение относится к растению пшеницы, несущему аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5,,
по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
[0010] В третьем аспекте настоящее изобретение относится к зерну пшеницы, несущему аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
[ООН] В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к зерну пшеницы, несущему аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
[0012] В пятом аспекте настоящее изобретение относится к клетке пшеницы, несущей аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот
между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. В предпочтительном варианте осуществления клетка пшеницы представляет собой клетку эндосперма пшеницы. Такие клетки эндосперма пшеницы не способны к регенерации в растение пшеницы.
[0013] В шестом аспекте настоящее изобретение относится к клетке пшеницы, несущей аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона. В предпочтительном варианте осуществления клетка пшеницы представляет собой клетку эндосперма пшеницы. Такие клетки эндосперма пшеницы не способны к регенерации в растение пшеницы.
[0014] В седьмом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не встречаются в природе. Молекула нуклеиновой кислоты может быть выделена или находиться в качестве трансгена в трансгенном растении.
[0015] В восьмом аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона. Такие молекулы нуклеиновой кислоты не встречаются в природе. Молекула нуклеиновой кислоты может быть выделена или находиться в качестве трансгена в трансгенном растении.
[0016] В девятом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду Rht-Bl, содержащему N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
[0017] В десятом аспекте настоящее изобретение относится к выделенному олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов полинуклеотида по седьмому или восьмому аспектам настоящего изобретения, где 19 смежных нуклеотидов содержат по меньшей мере одну из замен нуклеотидов, выбранных из группы, состоящей из G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, С2865Т, С2966Т, С2972Т, G3065A, С3117Т, G3477A, С3507Т, С3519Т, G3624A, G2792A, СС2108ТА, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A и G2083A, относительно SEQ ID N0:1 или полностью комплементарны ему.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
[0018] Фигура 1: Пример выделения мутантов пшеницы с усиленным ростом посредством скрининга в лотках. Один из мутантных проростков, характеризующийся увеличенной скоростью роста, указан стрелкой.
[0019] Фигура 2: Мутанты пшеницы с усиленным ростом, выращиваемые в контролируемых условиях, по сравнению с родительскими (карликовыми) растениями и растениями дикого типа (высокорослыми). Слева направо: производные Maringa, несущие Rht-Blс (карликовость), Rht-Blа (высокорослость) или три различных производные Rht-Blс с усиленным ростом. Три производных с усиленным ростом отличаются по их конечной высоте, и стрелки указывают на верхушку каждой линии. Два из производных являются полукарликовыми, третье является высокорослым как дикий тип.
[0020] Фигура 3: Схематическое изображение участков замен аминокислот у мутантов ячменя с усиленным ростом (верхние стрелки) и пшеницы (нижние стрелки) в С-концевом домене GRAS полипептидов DELLA. Указаны консервативные аминокислотные области.
[0021] Фигура 4: Проростки ячменя одного и того же возраста (слева направо) Himalaya (WT) , М463 (grd2b), TR261 (grd2b, slnlm), M240 (slnlm), M640 (Slnld), TR107 (Slnld.10), TR60 {Slnld. 8) .
[0022] Фигура 5: Измененная морфология в некоторых мутантных линиях пшеницы. Пример нормальной (слева) и аномальной (справа) морфологии, где последний случай характеризуется узкими листьями, тонкими стеблями, слабо развитой корневой системой и, в некоторых случаях, колосьями с зернами, меньшими, чем нормальные.
[0023] Фигура 6: Анализ ПЦР дуплексов ДНК (от 1 до г) : контрольных rht-1 Maringa, Rht-Blс Maringa; двух линий с усиленным ростом с аномальной морфологией; двух линии с усиленным ростом с нормальной морфологией; контроля без матричной ДНК. Слева представлены маркеры размера. Верхняя полоса представляет собой амплификацию фрагмента аллеля Rht-
Blc, а нижняя полоса представляет собой продукт гена Rht-Dl.
[0024] Фигура 7: Выравнивание ClustalW аминокислотных последовательностей, кодируемых Rht-Ala (JF930277), Rht-Bl (JF930278) и Rht-Dla(JF930281) у пшеницы.
[0025] Фигура 8: Выравнивание полипептида Rht-Bla пшеницы (SEQ ID NO: 5, верхняя последовательность) и белка GAI Arabidopsis thaliana (номер доступа САА75492, нижняя последовательность) посредством Blastp. Звездочки указывают аминокислоты, которые являются идентичными (консервативными) в двух полипептидах, а символы "+" означают сходные, но не идентичные аминокислоты.
Примечания к списку последовательностей:
[0026] SEQ ID N0:1 демонстрирует нуклеотидную последовательность длиной 3892 нуклеотидов гена Rht-Blc Maringa/Rht-Blc, начиная от ATG кодирующей области белка до TGA на конце кодирующей области. Вставка ретротранспозона длиной 2 02 6 нуклеотидов в ген Rht-Bl с получением Rht-Blc находится непосредственно после первых 147 нуклеотидов.
[0027] SEQ ID N0:2 демонстрирует нуклеотидную
последовательность кДНК длиной 1956 нуклеотидов,
соответствующую аллелю Rht-Blc у пшеницы Maringa/Rht-Blc.
Последовательность почти идентична нуклеотидной
последовательности, предоставленной под номером доступа GeneBank JN857971 (Wu et al. , 2011), отличаясь только по 2 нуклеотидам в положениях 813 и 1851. Вставка 90 нуклеотидов в кДНК относительно кДНК аллеля Rht-Bla соответствует нуклеотидам 148-237 SEQ ID N0: 2.
[0028] SEQ ID N0:3 демонстрирует аминокислотную последовательность полипептида длиной 651 аминокислот, кодируемого аллелем Rht-Blc, т.е. кодируемого геном с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 и кДНК SEQ ID NO: 2. Вставку длиной 3 0 аминокислот в полипептид относительно полипептида Rht-Bla представляют собой аминокислоты 50-7 9 SEQ ID N0:3.
[0029] SEQ ID N0:4 демонстрирует нуклеотидную последовательность кДНК, соответствующую аллелю Rht-Bla (дикого
типа), начиная с кодона старта трансляции ATG (Pearce et al., 2011) (номер доступа GeneBank JF930278).
[0030] SEQ ID N0:5 демонстрирует аминокислотную последовательность полипептида Rht-Bla (дикого типа) (номер доступа Genbank JF930278), 621 аминокислота.
[0031] SEQ ID N0:6 демонстрирует нуклеотидную последовательность длиной 7057 нуклеотидов гена Rhtl-Blb Triticum aestivum для (номера доступа GeneBank FN649763) из культивара Xiaoyan54. Нуклеотиды 1-2136 соответствуют промотору и 5'-UTR Rht-Blb, нуклеотиды 2137-4002 соответствуют кодирующей области белка, которая прерывается нуклеотидной заменой с С на Т в положении 2326 относительно дикого типа, и нуклеотиды 40037057 соответствуют 3'-UTR Rht-Blb и 3'-области гена.
[0032] SEQ ID N0:7 демонстрирует последовательность полипептида длиной 555 аминокислот, кодируемого Rht-Blb, которая представляет собой укороченный на N-конце белок Rht-Bl, с удаленными первыми 66 аминокислотами относительно Rht-Bla дикого типа. Трансляция реинициируется с аминокислоты 67.
[0 033] SEQ ID N0:8 демонстрирует нуклеотидную последовательность гена Rht-Ala Triticum aestivum (Rht-Al дикого типа) длиной 34 63 нуклеотидов (номер доступа GeneBank JF930277). Нуклеотиды 1-1600 соответствуют промотору и 5'-UTR Rht-Ala, а нуклеотиды 1601-34 63 соответствуют кодирующей области белка Rht-Ala. Кодирующая область белка на 9 6% идентична кодирующей области Rht-Bla.
[0034] SEQ ID N0:9 демонстрирует последовательность полипептида Rht-Ala (дикого типа) длиной 620 аминокислот.
[0035] SEQ ID N0:10 демонстрирует последовательность длиной 1872 нуклеотида кДНК, соответствующей гену Rht-Dla (номер доступа Genbank AJ242531).
[0036] SEQ ID N0:11 демонстрирует последовательность полипептида Rht-Dl длиной 623 аминокислоты (номер доступа JF930281).
[0037] SEQ ID N0:12 демонстрирует последовательность гена ячменя Slnl длиной 618 аминокислот (номер доступа АК372 0 64).
[0038] SEQ ID N0:13 демонстрирует последовательность
полипептида GAI Arabidopsis thaliana (номер доступа CAA75492).
[0039] SEQ ID N0:14 демонстрирует аминокислотную последовательность вставки 30 аминокислот в полипептид Rht-Blc.
[0040] SEQ ID N0:15 демонстрирует последовательность длиной 11 аминокислот мотива "Delia" в полипептиде Rht-Bla дикого типа пшеницы, который прерывается в полипептиде Rht-Blc.
[0041] SEQ ID N0:16 демонстрирует нуклеотидную последовательность гена Rht-Blc (номер доступа JN857970, Wu et al., 2011). кДНК соответствует нуклеотидам 206-352 объединенным с 2289-4097.
[0042] SEQ ID NOs:17-30 демонстрирует нуклеотидные последовательности олигонуклеотидных праймеров. ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Растения
[0043] Настоящее изобретение относится к растениям пшеницы, их частям, таким как зерно пшеницы, продуктам, получаемым из этих растений и зерна, таким как пищевые ингредиенты и пищевые продукты, и к способам их получения и использования. Как используют в настоящем документе, термин "пшеница" означает растение, часть растения, зерно или получаемый из них продукт, относящиеся к видам Triticum aestivum L. или Triticum turgidum подвида durum или тритикале. Triticum aestivum L., также известная как хлебопекарная пшеница, представляет собой гексаплоидную пшеницу с организацией генома AABBDD, содержащую 42 хромосомы. Субгеномы "А", "В" и "D" Triticum aestivum L. часто обозначают как "геномы". Triticum turgidum подвида durum, часто обозначаемый как пшеница твердых сортов представляет собой тетраплоидную пшеницу с организацией генома ААВВ, содержащую 2 8 хромосом. Диплоидные предки гексаплоидной или тетраплоидной пшеницы включают вид Triticum, такой как Т. uartur Т. monococcum или Т. boeoticum для генома A, Aegilops speltoides для генома В и Т. tauschii (также известная как Aegilops squarrosa или Aegilops tauschii) для генома D, но они не включены в "пшеницу", как ее используют в настоящем документе. Однако растения, которые получают общепринятыми способами с использованием Triticum
aestivum L. в качестве родителя в половом скрещивании с не являющимся Triticum видом Secale cereale (рожь), где это гибридное потомство обозначают в настоящем документе как тритикале, включены в "пшеницу", как ее используют в настоящем документе. Предпочтительно, для коммерческого получения зерна подходит такое растение пшеницы, как коммерческие сорта хлебопекарной пшеницы или пшеницы твердых сортов с подходящими агрономическими характеристиками, которые известны специалистам в данной области.
[0044] В первом аспекте настоящее изобретение относится к растению пшеницы, несущему аллель Rht-Bl, кодирующий вариант (не являющийся диким типом) полипептида Rht-Bl, предпочтительно гомозиготному по аллелю Rht-Bl. В вариантах осуществления растение пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.1, Rht-Blc.2, Rht-Blc.3, Rht-Blc.4, Rht-Blc.5, Rht-Blc. 6, Rht-Blc. 7, Rht-Blc.8, Rht-Blc.9, Rht-Blc. 10, Rht-Blc.12, Rht-Blc.15 , Rht-Blc.16, Rht-Blc.17 , Rht-Blc.18, Rht-Blc.21 , Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 , Rht-Blc.26, Rht-Blc. 27, Rht-Blc. 28, Rht-Blc. 29, Rht-Blc. 30 и Rht-Blc. 32, и предпочтительно гомозиготно по этому аллелю. В предпочтительных вариантах осуществления растение пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc. 24 и Rht-Blc. 26, и предпочтительно гомозиготно по этому аллелю. В одном из вариантов осуществления полипептид Rht-Bl содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. В SEQ ID N0:5 указана аминокислотная последовательность белка пшеницы Rht-Bla дикого типа с длиной в 621 аминокислоту, который у пшеницы кодирует аллель Rht-Bla дикого типа, и который используют в настоящем
документе в качестве исходной последовательности полипептида Rht-Bl дикого типа.
[0045] Альтернативно, аминокислотная последовательность варианта полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот приблизительно между аминокислот 49 и 50 SEQ ID N0:5, а нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl, кодирующая вариант полипептида Rht-Bl, отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации в участке сплайсинга интрона или радом с ним так, что затрагивает интрон сплайсинг транскрипта РНК аллеля Rht-Bl. Как используют в настоящем документе, "участок сплайсинга интрона" означает 4 нуклеотида, составляющие экзон-интронное сочленение, а именно 2 нуклеотида с 5'-конца и 2 нуклеотида с 3'-конца от экзон-интронного сочленения. Как используют в настоящем документе, "примыкающие к участку сплайсинга интрона" означает 3 нуклеотида с 5'-конца и 3 нуклеотида с 3'-конца от участка сплайсинга интрона. В SEQ ID N0:1 указана нуклеотидная последовательность кодирующей области белка аллеля Rht-Blc, полученная на генетической основе сорта пшеницы Maringa, начиная с кодона инициации трансляции ATG до кодона терминации трансляции TGA. SEQ ID N0:1 содержит ретротранспозонную вставку длиной 2 02 6 нуклеотидов (нуклеотиды 148-2173), которая вставлена в ген Rht-Bl с формированием аллеля Rht-Blc (Wu et al., 2011). В этом варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого аллелем Rht-Bl, может быть идентична SEQ ID N0:3, или она может отличаться. Аллель Rht-Bl может содержать мутацию сплайсинга интронов и кодировать полипептид с отличиями (i) и (ii), описанными в предыдущем абзаце, или, в предпочтительном варианте осуществления, полипептид содержит отличия (i) и (ii), описанные выше, и не содержит никакой мутации участка сплайсинга интрона.
[0046] Как используют в настоящем документе, "полипептид Rht-Bl" означает полипептид, который в пшенице кодирует аллель Rht-Bl. Как правило, полипептид Rht-Bl содержит N-концевой
домен, связанный с С-концевым доменом приблизительно из 572 аминокислот, который по меньшей мере на 98% идентичен по аминокислотной последовательности с аминокислотами 50-621 SEQ ID N0:5. С-концевой домен содержит то, что обычно обозначают как домен GRAS. В одном из вариантов осуществления длина N-концевого домена составляет приблизительно от 49 до приблизительно 7 9 аминокислот. В предпочтительном варианте осуществления длина N-концевого домена составляет приблизительно 7 9 аминокислот с последовательностью, как, например, аминокислоты 1-79 SEQ ID N0:3 или вариант с 1-5 заменами аминокислот относительно аминокислот 1-7 9 SEQ ID N0:3. В альтернативном варианте осуществления полипептид Rht-Bl получен из полипептида Rht-Bl дикого типа посредством укорочения на N-конце, например, как полипептид Rht-Blb (SEQ ID N0:7), кодируемый аллелем Rht-Blb, также известным как ген Rhtl. В одном из вариантов осуществления аллель Rht-Bl кодирует полипептид Rht-Bl, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID N0:3.
[0047] В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl не идентична SEQ ID N0:5 и не идентична SEQ ID N0:7, хотя она может содержать SEQ ID N0:7. В одном из вариантов осуществления, если аминокислотная последовательность полипептида идентична SEQ ID N0:3, тогда аллель Rht-Bl не содержит нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1; вместо этого он кодирует вариант последовательности SEQ ID N0:1 с мутацией в участке сплайсинга интрона или рядом с ним относительно SEQ ID N0:1. В предпочтительном варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида не идентична SEQ ID N0:3. Таким образом, полипептид отличается по последовательности от каждого из полипептида Rht-Bla (дикого типа), полипептида Rht-Blb и полипептида Rht-Blc. В одном из вариантов осуществления аминокислотная последовательность полипептида отличается от аминокислотной последовательности Rht-Bla, указанной как SEQ ID N0:5 по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii)
одной или несколькими заменами аминокислот в области полипептида, соответствующей аминокислотам 200-621 SEQ ID N0:5. Эта область полипептида Rht-Bla соответствует домену GRAS полипептида.
[0048] В предпочтительном варианте осуществления вставка
одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50
SEQ ID N0:5 относительно полипептида Rht-Bla ((i) выше)
представляет собой вставку приблизительно 30 аминокислот,
последовательность которых предпочтительно представляет собой
DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID N0:14; соответствующая
аминокислотам 50-79 SEQ ID N0:3), или ее вариант, где
последовательность варианта отличается от SEQ ID N0:14
заменами, вставками или удалениями не более 5 аминокислот,
предпочтительно 1 или 2 заменами аминокислот.
Последовательность DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID N0:14) представляет собой последовательность вставки в полипептид Rht-Blc относительно полипептида Rht-Bla. Эта вставка 30 аминокислот является результатом вставки в ген Rht-Bl, которая формирует аллель Rht-Blc. Эта вставка находится в пределах так называемого мотива DELLA (DELLAALGYKV; SEQ ID N0:15) полипептида Rht-Bl, который предположительно необходим для взаимодействия с рецепторным белком GA, GID1, так, что полипептид со вставкой больше не связывает GID1. Посредством мутагенеза можно получать варианты этой вставленной последовательности, и полагают, что замены, вставки или делеции 1-5 аминокислот не влияют на потерю взаимодействия полипептида с GID1.
[0049] В одном из вариантов осуществления полипептид растения пшеницы дополнительно содержит одну или несколько замен аминокислот, предпочтительно консервативные замены аминокислот, в области полипептида, соответствующей аминокислотам 1-200 SEQ ID N0:5, также обозначаемой как домен DELLA полипептида Rht-Bl дикого типа, так как она содержит аминокислотную последовательность DELLAALGYKV (SEQ ID N0:15), также обозначаемую как мотив DELLA. Однако предпочтительно аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl по
изобретению идентична SEQ ID N0:3 в мутантном домене DELLA, т.е. содержит аминокислоты 1-230 SEQ ID N0:3.
[0050] В дополнительных предпочтительных вариантах
осуществления проводят одну или несколько замен аминокислот в
С-концевом домене в области полипептида, соответствующей
аминокислотам 200-621 SEQ ID N0:5. В предпочтительном варианте
осуществления одна или несколько замен аминокислот включают
замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из G2 60,
V264, А271, G298, А299, А305, А310, Р344, L346, G377, Р394,
R514, Т524, S528, G563, V286, D371, А310, Е579, S493, R283,
R271, G274, А280, V234, R484, V285, G230, S488 и С240
относительно SEQ ID N0:3. Предпочтительно замена выбрана из
группы, состоящей из G260E, V264M, А271Т, G298D, А299Т, А305Т,
A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D,
V286M, D371N, А310Т, Е579К, S493F, R283H, R271H, G274D, А280Т,
V234M, R484H, V285F, G230E, S488F и C240Y. В более
предпочтительном варианте осуществления аллель Rht-Bl растения
пшеницы содержит вариант последовательности относительно SEQ ID
N0:1, где вариант последовательности выбран из группы,
состоящей из G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A,
С2865Т, С2966Т, С2972Т, G3065A, С3117Т, G3477A, С3507Т, С3519Т,
G3624A, G2792A, СС2108ТА, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T,
G147A, G2084A и G2083A. Эти варианты последовательности
соответствуют заменам аминокислот, перечисленным
непосредственно выше, см. таблицу 3.
[0051] Предпочтительно растения пшеницы по изобретению обладают увеличенной высотой растения относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и сниженной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, когда растения выращивают в одинаковых условиях. Таким образом, растение пшеницы по изобретению обозначают как "полукарликовое". В предпочтительном варианте осуществления высота растения пшеницы по изобретению приблизительно составляет от 70% до приблизительно 94% от высоты контрольного растения, гомозиготного по аллелю Rht-Bla ("высокорослый фенотип"), более предпочтительно приблизительно от 75% до
приблизительно 90% от высоты растения, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. Для сравнения высота растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc ("карликовое растение") составляет приблизительно 42% от высоты растения, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. Высота растения пшеницы по изобретению может быть приблизительно такой же или по существу такой же, как высота растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blb, которая составляет приблизительно 8 0-81% от высоты высокорослых растений, или может быть меньше высоты растения Rht-Blb или больше высоты растения Rht-Blb. Как используют в настоящем документе, "высота растения" означает высоту зрелого растения от уровня грунта до верха наиболее высокого стебля, т.е. до основания колоса. Растения, гомозиготные по аллелям Rht-Blc, Rht-Bla или Rht-Blb, и которые используют в качестве контролей при сравнении, предпочтительно обладают по существу одной и той же генетической основой, более предпочтительно являются почти изогенными линиями относительно растения пшеницы по изобретению; таким образом, их обозначают "соответствующее растение пшеницы, гомозиготное по аллелю Rht-Blc (или Rht-Bla, или Rht-Blb)". Специалисты в данной области могут легко выбрать соответствующее растение пшеницы, которое подходит для сравнения. Для проведения сравнения растение по изобретению и контрольное растение выращивают по существу в одинаковых временных условиях и условиях окружающей среды, например, в повторных полевых испытаниях, включая одинаковые температурный режим, условия освещения, подачу питательных веществ и воды и характеристики почвы. Предпочтительно высоту растения измеряют у выращиваемых в полевых условиях растений, хотя для сравнения также можно использовать растения, выращиваемые в теплицах и растущие в соответствии с полевыми испытаниями, как известно в данной области. Высоту растений можно измерять в любой момент цикла роста, но предпочтительно ее измеряют при созревании растений.
[0052] Кроме того растение пшеницы предпочтительно обладает повышенной фертильностью и/или продуцирует увеличенное количество зерна относительно растения пшеницы, гомозиготного
по аллелю Rht-Blc, и/или обладает увеличенной длиной колеоптиля относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и/или способно продуцировать зерно с более длительным состоянием покоя относительно зерна, получаемого из растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. Предпочтительно, количество зерна, продуцируемого растением, является по существу таким же или большим, чем у соответствующего растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blb. Как используют в настоящем документе, "фертильность" определяют как количество зерен в колосе, а "количество зерен" или "выход зерна, продуцируемого растением", означает массу зрелого зерна, которую можно собрать с растения. Как правило, содержание влаги каждого зерна составляет приблизительно от 10% до приблизительно 15 масс.%. Растения пшеницы по настоящему изобретению также предпочтительно обладают увеличенной длиной колеоптиля относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc. Предпочтительно длина колеоптиля растения пшеницы по настоящему изобретению составляет от 7 0% до 12 0%, предпочтительно от 80% до 100% от длины колеоптиля растения, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. Другим предпочтительным признаком растений пшеницы по настоящему изобретению является состояние покоя зерна, получаемого из растения. Предпочтительно, растения обладают более длительным состоянием покоя зерна относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. Предпочтительно, растение пшеницы обладает от 50% до 100%, предпочтительно 60% до 100% от уровня состояния покоя растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc. В одном из вариантов осуществления доля прорастания зерна, получаемого из растения пшеницы по изобретению, является промежуточной между долей прорастания зерна растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, и зерна растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc. Долю прорастания можно оценивать, как описано в примере 1. Например, можно оценивать время, необходимое популяциям зерен для достижения 50% прорастания. В предпочтительном варианте осуществления зерну растения пшеницы по изобретению для достижения 50% доли
прорастания относительно зерна соответствующего растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, необходимо на 1-8 недель больше, предпочтительно на 2-5 недель больше, хранения при комнатной температуре ("периода дозревания").
[0053] Как можно понять, когда проводят сравнение между растениями или зерном по настоящему изобретению и растениями или зерном, гомозиготными по аллелю Rht-Blc или гомозиготными по аллелю Rht-Bla, сравнение проводят с растениями, выращиваемыми по существу с идентичными условиями роста, временем выращивания, температурой, подачей воды и питательных веществ, и т.п. и для зерна, получаемого у таких растений.
[0054] Зерно. Во втором аспекте изобретение относится к зерну пшеницы, которое получают или которое можно получать у растений пшеницы по изобретению или которое является частью растений пшеницы по изобретению. Как используют в настоящем документе, "зерно" означает зерно, которое обычно собирают земледельцы у зрелых растений пшеницы, выращиваемых в поле, включая зерно, используемое для производства пищевых продуктов или в пищевых продуктах, и проросшее зерно после высевания, но до всхода проростков. Зерно также включает зерно, обработанное для производства пищевых продуктов или являющееся ингредиентом в пищевом продукте. Как правило, содержание влаги собранного зерна пшеницы по изобретению составляет приблизительно от 10% до приблизительно 15 масс.%. В одном из вариантов осуществления зерно пшеницы несет аллель Rht-Bl, кодирующий вариант (не являющийся диким типом) полипептида Rht-Bl, где предпочтительно зерно гомозиготно по этому аллелю. В одном из вариантов осуществления полипептид Rht-Bl содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. В вариантах
осуществления зерно пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.1, Rht-Blc.2, Rht-Blc. 3, Rht-Blc.4, Rht-Blc. 5, Rht-Blc.6, Rht-Blc.1, Rht-Blc.8, Rht-Blc.9, Rht-Blc. 10 , Rht-Blc. 12 , Rht-Blc. 15 , Rht-Blc. 16, Rht-Blc. 17, Rht-Blc. 18 , Rht-Blc. 21 , Rht-Blc. 22 , Rht-Blc. 23 , Rht-Blc. 24 , Rht-Blc. 26, Rht-Blc.21, Rht-Blc. 28, Rht-Blc. 29, Rht-Blc. 30 и Rht-Blc.32, и предпочтительно гомозиготно по этому аллелю. В предпочтительных вариантах осуществления зерно пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 и Rht-Blc.26, и предпочтительно гомозиготно по этому аллелю.
[0055] Альтернативно, аминокислотная последовательность варианта полипептида Rht-Bl зерна отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, а нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl, кодирующая вариант полипептида Rht-Bl, отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации в участке сплайсинга интрона или рядом с ним так, что затрагивает интрон сплайсинг транскрипта РНК аллеля Rht-Bl. В этом варианте осуществления аминокислотная последовательность полипептида, кодируемого аллелем Rht-Bl, может быть идентична SEQ ID N0:3, или она может отличаться. Аллель Rht-Bl может содержать мутацию сплайсинга интронов и кодировать полипептид с отличиями (i) и (ii), описанными в предыдущем абзаце, или, в предпочтительном варианте осуществления, полипептид содержит отличия (i) и (ii), описанные выше, и не содержит никакой мутации участка сплайсинга интрона относительно SEQ ID N0:1.
[0056] Вариант полипептида Rht-Bl зерна и аллель Rht-Bl, кодирующий его, можно дополнительно определять, как описано в абзацах выше в отношении растения пшеницы. В предпочтительном варианте осуществления зерно обладает более длительным состоянием покоя относительно зерна, получаемого из растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla. В одном из вариантов осуществления доля прорастания зерна по изобретению является
промежуточной между долей прорастания зерна растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, и зерна растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc. Долю прорастания можно оценивать, как описано в примере 1. Например, можно оценивать время, необходимое популяциям зерен для достижения 50% прорастания. В предпочтительном варианте осуществления зерну по изобретению, демонстрирующему "более длительное состояние покоя" для достижения 50% доли прорастания относительно зерна соответствующего растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, необходимо на 1-8 недель больше, предпочтительно на 2-5 недель больше, хранения при комнатной температуре ("периода дозревания"). Также зерно пшеницы по изобретению при высевании зерна в почву предпочтительно способно к развитию в растение пшеницы, где растение обладает увеличенной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и сниженной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, когда растения выращивают в одинаковых условиях. Растение пшеницы, развивающееся из этого зерна, может обладать повышенной фертильностью и/или продуцирует увеличенное количество зерна относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и/или обладает увеличенной длиной колеоптиля относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc.
[0057] Настоящее изобретение также относится к способу получения зерна по изобретению, где способ включает (i) выращивание растения пшеницы по настоящему изобретению и (ii) сбор зерна у растения. В некоторых вариантах осуществления зерно пшеницы обрабатывают так, чтобы оно больше не было способным к прорастанию. Этого можно достигать удалением из зерна зародыша, например, посредством перемалывания, или посредством тепловой обработки, или посредством другой обработки зерна. Зерно можно дробить, раскалывать, ошпаривать кипятком, расплющивать, гранулировать, размалывать или дробить.
[0058] Настоящее изобретение также относится к способу получения муки тонкого помола, непросеянной муки, крахмала, гранулу крахмала или отрубей, где способ включает получение зерна по настоящему изобретению и обработку зерна с получением
муки тонкого помола, непросеянной муки, крахмала, гранул крахмала или отрубей. Способы такой обработки хорошо известны в данной области. Этап получения зерна может включать, например, сбор зерна растения пшеницы по изобретению или приобретение этого зерна.
[0059] Настоящее изобретение также относится к продуктам, получаемым из растений или зерна по настоящему изобретению, таким как пищевые продукты, которые могут быть ингредиентами пищевых продуктов. Примеры пищевых продуктов включают муку тонкого помола, крахмал, квасной или пресный хлеб, макароны, лапшу, зоокорма, зерновой завтрак, закуски, пироги, солод, кондитерские изделия и пищевые продукты, содержащие соусы на основе муки тонкого помола. Пищевой продукт может представлять собой бейгл, бисквит, хлеб, сдобную булку, круассан, вареник, английскую булочку, кекс, питу, бездрожжевой хлеб, охлажденную/замороженную тестовую заготовку, тесто, печеные бобы, бурито, чили, тако, тамале, тортилью, закрытый пирог, готовый к употреблению зерновой продукт, готовый к употреблению продукт, начинку, предназначенный для приготовления в микроволновой печи продукт, брауни, пирог, сырный пирог, булочка к кофе, булочку, десерт, пирожное, сдобную булку, сладкий батончик, корж пирога, наполнение пирога, детское питание, смесь для запекания, тесто, панировку, смесь для подливки, наполнитель для мяса, заменитель мяса, смесь специй, суповую смесь, подливку, заправку для соуса, приправу к салату, суп, сметану, лапшу, макароны, лапшу рамен, лапшу для рагу по-китайски, лапшу для ломейн, включения в мороженое, брикет мороженого, рожок для мороженого, многослойное мороженое, сухое печение, гренок, пончик, продукт в кляре, экструдированную закуску, плодовый и зерновой батончик, предназначенный для приготовления в микроволновой печи продукт для закуски, питательный батончик, блин, замороженный хлебобулочный полуфабрикат, сушку, пудинг, продукт на основе мюсли, закуску из чипсов, закуску, смесь для закуски, вафли, основу для пиццы, корм для животных или корм для домашних животных. Пищевой продукт можно получать смешивая зерно или муку тонкого помола,
непросеянную муку или отруби указанного зерна с другим ингредиентом. Другим продуктом является корм для животных, такой как собранное зерно, сено, солома или силос. Растения по изобретению можно использовать непосредственно в качестве корма для животных, например, при выращивании в поле.
[0060] Полинуклеотиды. В третьем аспекте настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид Rht-Bl по изобретению. Молекулу нуклеиновой кислоты можно выделять из растения пшеницы, или она может содержаться в растении пшеницы или в качестве экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты в растении, которое может представлять собой любое растение, такое как злаковое растение или растение, отличное от пшеницы. В одном из вариантов осуществления полипептид Rht-Bl содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. Полипептид Rht-Bl по изобретению можно дополнительно определить, как описано в абзацах выше в отношении растения пшеницы. В предпочтительных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc. 1, Rht-Blc. 2, Rht-Blc. 3, Rht-Blc.4, Rht-Blc. 5, Rht-Blc.6, Rht-Blc. 7, Rht-Blc.8, Rht-Blc.9, Rht-Blc. 10, Rht-Blc.12, Rht-Blc. 15, Rht-Blc. 16, Rht-Blc. 17 , Rht-Blc.18, Rht-Blc.21, Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 , Rht-Blc.26, Rht-Blc.27 , Rht-Blc.28, Rht-Blc.29, Rht-Blc.30 и Rht-Blc.32. В более предпочтительных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 и Rht-Blc.26.
[0061] Полипептиды. В четвертом аспекте настоящее изобретение относится к полипептиду Rht-Bl, который содержит N
концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5. Полипептид Rht-Bl по изобретению можно дополнительно определить, как описано в абзацах выше в отношении растения пшеницы.
[0062] Настоящее изобретение также относится к способу генотипирования растения пшеницы, где способ включает (i) получение образца, содержащего нуклеиновую кислоту или белок, выделенные из растения пшеницы и (ii) детекцию молекулы нуклеиновой кислоты или полипептида по настоящему изобретению в образце. В предпочтительных вариантах осуществления растение пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc. 1, Rht-Blc. 2, Rht-Blc. 3, Rht-Blc.4, Rht-Blc. 5, Rht-Blc.6r Rht-Blc. 7, Rht-Blc.8, Rht-Blc.9, Rht-Blc. 10, Rht-Blc.12, Rht-Blc. 15, Rht-Blc. 16, Rht-Blc. 17 , Rht-Blc.18, Rht-Blc.21, Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 , Rht-Blc.26, Rht-Blc.27 , Rht-Blc.28, Rht-Blc.29, Rht-Blc.30 и Rht-Blc.32.
[0063] Настоящее изобретение также относится к способу введения аллеля Rht-Bl в растение пшеницы с отсутствием указанного аллеля, где способ включает i) скрещивание первого родительского растения пшеницы со вторым родительским растением пшеницы, где второе растение представляет собой растение пшеницы по настоящему изобретению, и ii) возвратное скрещивание растения-потомка скрещивания на этапе i) с растением того же генотипа что и первое родительское растение с получением растения с большинством генотипа первого родителя, но содержащего указанный аллель Rht-Bl.
[00 64] Молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может быть функционально связана с промотором, способным контролировать экспрессию молекулы нуклеиновой
кислоты в растительной клетке. Также предоставлен вектор, содержащий или кодирующий молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и клетки-хозяева, содержащие этот вектор и/или молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению.
[0065] Настоящее изобретение также относится к генетически модифицированному растению, где растение трансформировано молекулой нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, и к его растениям-потомкам, содержащим эту молекулу нуклеиновой кислоты. В определенных вариантах осуществления генетически модифицированное растение представляет собой растение пшеницы или ячменя.
[0066] Как используют в настоящем документе, злаковые означают растения или зерно семейств однодольных Роасеае или Graminae, которые культивируют для получения пищевых компонентов их зерен, и включают пшеницу, ячмень, кукурузу, овес, рожь, рис, сорго, тритикале, просо, гречиху. Предпочтительно, злаковое растение или зерно представляет собой растение или зерно пшеницы или ячменя, более предпочтительно растение или зерно пшеницы. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления злаковое растение не является рисом или кукурузой или любым из них.
[0067] Как используют в настоящем документе, термин "ячмень" относится к любому виду рода Hordeum, включая его предков, а также его потомство, получаемое посредством скрещивания с другими видами. Предпочтительно, растение представляет собой растение вида Hordeum, которое культивируют коммерчески, такое как, например, линия, или культивар, или сорт Hordeum vulgare, или которое подходит для коммерческого получения зерна.
[0068] Растения пшеницы по изобретению можно использовать множеством способов, отличных от использования для пищевых продуктов или корма для животных, например, использовать в исследованиях или разведении. В выращиваемых на семена зерновых, таких как пшеница, растения можно подвергать самоскрещиванию с получением растений, гомозиготных по желаемым
генам, или в гаплоидных тканях, таких как развивающиеся половые клетки можно индуцировать удвоение набора хромосом с получением гомозиготного растения.
[0069] Растения пшеницы по изобретению можно скрещивать с растениями, содержащими более желательную генетическую основу. Желательная генетическая основа может включать подходящую комбинацию генов, обеспечивающую урожайность при коммерческом производстве и другие характеристики, такие как агрономические характеристики или устойчивость к абиотическому стрессу. Генетическая основа также может включать другие измененные гены биосинтеза или модификации крахмала, например, гены других линий пшеницы. Генетическая основа может содержать один или несколько трансгенов, таких как, например, ген, придающий устойчивость к гербициду, такому как глифосат.
[0070] Как используют в настоящем документе, термин "сцепленные" относится к маркерному локусу и второму локусу, расположенному в хромосоме в достаточной близости так, что они наследуются вместе более чем в 50% мейозов, например, не случайно. Это определение включает случай, когда маркерный локус и второй локус формируют части одного гена. Кроме того, это определение включает случай, когда маркерный локус содержит полиморфизм, ответственный за представляющий интерес признак (другими словами маркерный локус непосредственно "сцеплен" с фенотипом). Как используют в настоящем документе, термин "генетически сцепленные" является более узким, и его используют только по отношению к случаю, когда маркерный локус и второй локус находятся в достаточной близости в хромосоме так, что они наследуются вместе более чем в 50% мейозов. Таким образом, процент рекомбинации, наблюдаемый между локусами на одно поколение (сантиморган (сМ)), составляет менее 50. В конкретных вариантах осуществления изобретения генетически сцепленные локусы могут располагаться в хромосоме на расстоянии 45, 35, 25, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 или менее сМ. Предпочтительно, маркеры находятся на расстоянии менее 5 сМ или 2 сМ и наиболее предпочтительно - на расстоянии приблизительно 0 сМ.
[0071] Как используют в настоящем документе, "другие
генетические маркеры" могут представлять собой любые молекулы, которые сцеплены с желательным признаком злакового растения, такого как пшеница. Такие маркеры хорошо известны специалистам в данной области и включают молекулярные маркеры, сцепленные с генами, определяющими такие признаки, как устойчивость к заболеваниям, урожайность, морфология растения, качество зерна, другие признаки состояния покоя, такие как цвет зерна, содержание гибберелловой кислоты в зерне, высота растения, цвет муки тонкого помола и т.п. Примеры таких генов представляют собой гены устойчивости к стеблевой ржавчине Sr2 или Sr 38, гены устойчивости к желтой ржавчине YrlO или Yr 17, гены устойчивости к нематодам, такие как Crel и СгеЗ, аллели глютениновых локусов, которые определяют упругое сопротивление теста, такие как аллели Ах, Вх, Dx, Ay, By и Dy. В конкретном отношении к состоянию покоя зерна другие маркеры включают ген R красной окраски зерна (Himi et al., 2002), а также маркеры, описанные Mares et al. (2005), Li et al. (2004), Kato et al.
(2001), Mori et al. (2005) и Prada et al. (2004).
[0072] Как используют в настоящем документе, термин "растение" в качестве существительного относится ко всему растению, но как используют в качестве прилагательного относится к любому объекту, который находится в растении, получают, происходит из растения или связан с растением, такому как например, органы растений (например, листья, стебли, корни, цветы), одиночные клетки (например, пыльца), семена, растительные клетки и т.п. Растения, предоставляемые или предусматриваемые для применения в практическом осуществлении настоящего изобретения, включают однодольные и двудольные. В предпочтительных вариантах осуществления растения по настоящему изобретению представляют собой сельскохозяйственные культуры
(например, злаки и бобовые, кукурузу, пшеницу, картофель, тапиоку, рис, сорго, сою, просо, маниок, ячмень или горох) или бобовые. Растения можно выращивать для получения пригодных в пищу корней, клубней, листьев, стеблей, цветов или плодов.
[0073] Как используют в настоящем документе, термины "семя" и "зерно" имеют перекрывающиеся значения. "Зерно"
включает семя, которое собрали у растения и в основном относится к зрелому, собранному зерну, но также может относиться к зерну после набухания или прорастания, в зависимости от контекста. "Семя" может относиться или к зрелому зерну, до или после сбора, или к незрелым семенам, которые развиваются в растениях. Как правило, содержание влаги зрелого зерна составляет менее чем приблизительно 10-15%.
[0074] Как используют в настоящем документе, термин "ген" следует рассматривать в его наиболее широком смысле, и он включает дезоксирибонуклеотидные последовательности, содержащие кодирующую область белка структурного гена и содержащие последовательности, расположенные рядом с кодирующей областью на обоих 5'- и 3'-концах на расстоянии по меньшей мере приблизительно 2 т.п.н. на каждом конце. Последовательности, расположенные с 5'-конца от кодирующей области и присутствующие в иРНК, обозначают как 5'-нетранслируемые последовательности. Последовательности, расположенные с 3'-конца или ниже кодирующей области и присутствующие в иРНК, обозначают как 3' -нетранслируемые последовательности. Термин "ген" включает кДНК и геномную формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, которая может прерываться некодирующими последовательностями, называемыми "интронами" или "вставочными областями" или "вставочными последовательностями". Интроны представляют собой участки гена, транскрибируемые в ядерную РНК (гяРНК); интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Интроны удаляются или "сплайсируются" из ядерного или первичного транскрипта; таким образом, интроны отсутствуют в транскрипте информационной РНК (иРНК). иРНК функционирует при трансляции с определением последовательности или порядка аминокислот в образующемся полипептиде. Термин "ген" включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую все или часть белков по изобретению, описываемых в настоящем документе, и комплементарную нуклеотидную последовательность к любому из указанных выше.
[0075] Аллель представляет собой вариант гена по одному генетическому локусу. Гексаплоидная пшеница, такая как Triticum
aestivum L. содержит шесть наборов хромосом с организацией генома AABBDD. Каждая хромосома содержит одну копию каждого гена (один аллель). Если оба аллеля пары хромосом являются одинаковыми, организм является гомозиготным по этому гену, если аллели являются различными, организм является гетерозиготным по этому гену. Взаимоотношения между аллелями в локусе, как правило, описывают как доминантные или рецессивные.
[0076] Растения пшеницы по изобретению можно получать и идентифицировать после мутагенеза. Это может обеспечивать растение пшеницы, которое не является трансгенным, что желательно на определенных рынках, или которое не содержит экзогенной молекулы нуклеиновой кислоты. Как правило, мутагенезу можно подвергать предковые растительные клетки, ткань, семя или растение с получением одной или нескольких мутаций, таких как замены, удаления, добавления нуклеотидов и/или модификации кодонов.
[0077] Мутагенез можно проводить химическими или радиационными средствами, например, посредством обработки семян EMS или азидом натрия (Zwar and Chandler, 1995), или посредством гамма-излучения, хорошо известных в данной области. Химический мутагенез имеет тенденцию к предпочтению замен нуклеотидов делециям. В качестве эффективного способа мутационной селекции с получением новых сортов растений известно облучение пучком тяжелых ионов (HIB), см. например, Hayashi et al., 2007 и Kazama et al, 2008. Облучение пучком ионов для биологического действия, которое определяет степень повреждения ДНК и размер делеций ДНК, содержит два физических фактора: дозу (Гр) и LET (линейный перенос энергии, кэВ/мкм), и их можно регулировать в зависимости от желаемой степени мутагенеза.
[0078] Биологические средства, пригодные для получения сайт-специфических мутантов, включают ферменты, которые вносят двухцепочечные разрывы в ДНК, которые стимулируют эндогенные механизмы репарации. Они включают эндонуклеазы, нуклеазы с цинковыми пальцами, эффекторы TAL, транспозазы и сайт-специфические рекомбиназы. Нуклеазы с цинковыми пальцами (ZFN),
например, облегчают сайт-специфическое расщепление в геноме, позволяя эндогенным или другим сращивающим концы механизмам репарации осуществлять удаления или вставки для репарации пропуска. Технология нуклеаз с цинковыми пальцами рассмотрена в Le Provost et al., 2009, также см. Durai et al., 2005 и Liu et al., 2010.
[0079] Выделение мутантов можно проводить посредством скрининга мутировавших растений или семян. Например, мутировавшую популяцию пшеницы можно подвергать скринингу непосредственно на желаемый генотип или опосредовано посредством скрининга фенотипа, такого как высота растения. Скрининг непосредственно на генотип предпочтительно включает анализ присутствия мутаций, которое можно наблюдать в анализах ПЦР по отсутствию маркеров, как и ожидается, когда некоторые гены подвергают удалению, или в анализах на основе гетеродуплексов, как в Tilling, или посредством глубокого секвенирования. Скрининг фенотипа может включать скрининг прорастания, как описано в примерах. С использованием этой методологии скринингу на усиленный рост, обеспечивающий увеличенную высоту растения, можно подвергать большие группы мутировавших семян.
[008 0] Затем идентифицированные мутации можно вводить в желаемую генетическую основу посредством скрещивания мутанта с растением с желательной генетической основой и проведения подходящего количества возвратных скрещиваний для удаления исходной нежелательной родительской основы.
[0081] В контексте настоящей заявки "индуцированная мутация" или "внесенная мутация" представляет собой искусственно индуцированную генетическую вариацию, которая может представлять собой результат химической или радиационной обработки предкового семени или растения. Производные со вставками нуклеотидов включают 5'- и 3'-концевые слияния, а также вставки одного или нескольких нуклеотидов внутрь последовательности. Варианты со вставками в нуклеотидную последовательность представляют собой варианты, у которых в участок нуклеотидной последовательности, или в предопределенный
участок, как это возможно в способах с нуклеазами с цинковыми пальцами (ZFN), эффекторами TAL или способах гомологичной рекомбинации, или посредством случайной вставки с подходящим скринингом полученного продукта, введены один или несколько нуклеотидов. Варианты с делециями характеризуются удалением одного или нескольких нуклеотидов из последовательности. Предпочтительно, мутантный ген содержит только одну вставку последовательности нуклеотидов относительно гена дикого типа и одну или несколько мутаций замен. Варианты с заменами нуклеотидов представляют собой варианты, у которых в последовательности удален по меньшей мере один нуклеотид, а на его место вставлен другой нуклеотид. Предпочтительное количество нуклеотидов, затронутых заменами в мутантном гене относительно гена дикого типа, составляет максимум десять нуклеотидов, более предпочтительно максимум 9, 8, 7, б, 5, 4, 3 или 2 или, наиболее предпочтительно, только один нуклеотид.
[0082] Как используют в настоящем документе, термин "мутация" не включает молчащие замены нуклеотидов, которые не влияют на активность гена, и, таким образом, включает только изменения в последовательности ген, которые влияют на активность гена. Термин "полиморфизм" относится к любому изменению нуклеотидной последовательности, включая такие молчащие замены нуклеотидов. Способы скрининга могут вначале включать скрининг на полиморфизмы, а затем - на мутации в группе полиморфных вариантов.
[0083] Отбор при помощи маркера представляет собой хорошо
известный способ отбора гетерозиготных растений, необходимый
при возвратном скрещивании с рекуррентным родителем в
классической селекционной программе. Популяция растений в
каждом поколении возвратного скрещивания является
гетерозиготной по представляющему интерес гену, в норме присутствующему в популяции после возвратного скрещивания в отношении 1:1, и молекулярный маркер можно использовать для различения двух аллелей гена. Выделяя ДНК, например, из молодых побегов, и тестируя введение желаемого признака с использованием специфического маркера, проводят раннюю селекцию
растений для дальнейшего возвратного скрещивания, при этом концентрируя энергию и ресурсы на меньшем количестве растений. Для дополнительного ускорения программы возвратного скрещивания можно выделять зародыши из незрелых семян (25 суток после цветения) и выращивать на питательных средах в стерильных условиях, а не доводить до полной зрелости семян.
[0084] В способах по настоящему изобретению можно использовать любой молекулярно-биологический способ, известный в данной области, который способен детектировать аллели Rht-Bl. Такие способы в качестве неограничивающих примеров включают использование амплификации нуклеиновой кислоты, секвенирования нуклеиновой кислоты, гибридизации нуклеиновой кислоты с подходящим образом мечеными зондами, анализ конформации одиночных цепей (SSCA), электрофорез в градиенте денатурирующего геля (DGGE), анализ гетеродуплексов (НЕТ), анализ химического расщепления (ССМ), каталитическое расщепление нуклеиновой кислоты или их сочетание (см., например, Lemieux, 2000; Langridge et al., 2001) .
[0085] "Полимеразная цепная реакция" ("ПНР") представляет собой реакцию, в которой получают идентичные копии полинуклеотида-мишени с использованием "пары праймеров" или "набора праймеров", состоящего из "прямого" и "обратного" праймеров, и катализатора полимеризация, такого как ДНК-полимераза, и, как правило, термостабильного полимеразного фермента. Способы ПЦР известны в данной области и рассмотрены, например, в "PCR" (Ed. MJ. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford).
[008 6] Праймер представляет собой олигонуклеотидную последовательность, способную к гибридизации специфичным для последовательностей способом с последовательностью-мишенью и достраивающийся при ПЦР. Ампликоны или продукты ПЦР, или фрагменты ПЦР, или продукты амплификации представляют собой продукты достройки, которые содержат праймер и вновь синтезированные копии последовательностей-мишеней. Системы мультиплексной ПЦР содержат несколько наборов праймеров, которые приводят к одновременному получению более одного
ампликона. Праймеры могут полностью соответствовать
последовательности-мишени или они могут содержать внутренние
несоответствующие основания, которые могут приводить к внесению
в конкретные последовательности-мишени рестрикционных ферментов
или участков распознавания/расщепления каталитических
нуклеиновых кислот. Также праймеры могут содержать
дополнительные последовательности и/или содержать
модифицированные или меченые нуклеотиды для облегчения захвата
или детекции ампликонов. Повторяющиеся циклы тепловой
денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными им
последовательностями и достройки отожженных праймеров
полимеразой приводят к экспоненциальной амплификации
последовательности-мишени. Термины мишень или
последовательность-мишень или матрица относятся к
амплифицируемым последовательностям нуклеиновых кислот.
[0087] Как используют в настоящем документе, термины "трансгенное растение" и "трансгенное растение пшеницы" относятся к растению, которое содержит генную конструкцию
("трансген"), отсутствующую у растения дикого типа того же вида, сорта или культивара. Таким образом, трансгенные растения
(трансформированные растения) содержат генетический материал,
который они не содержали до трансформации. Как указано в
настоящем документе, "трансген" имеет обычное для области
биотехнологии значение и относится к генетической
последовательности, которая получена или изменена посредством
технологии рекомбинантных ДНК или РНК и которая введена в
растительную клетку-предка, где эту клетку используют для
получения нового растения. Трансген может содержать
генетические последовательности, получаемые или происходящие из
клетки растения, или из клетки другого растения, или из
нерастительного источника, или из синтетической
последовательности. Как правило, трансген введен в растение посредством манипуляций человека, например, таких как трансформация, но можно использовать любой способ, известный специалисту в данной области. Как правило, генетический материал стабильно интегрирован в геном растения. Вносимый
генетический материал может содержать последовательности, встречающиеся у того же вида в природе, но в переставленном порядке или в другом расположении элементов, например, антисмысловая последовательность или последовательность, кодирующая двухцепочечную РНК или искусственный предшественник микроРНК. Растения, содержащие такие последовательности, включены в настоящем документе в "трансгенные растения". Как определено в настоящем документе, трансгенные растения включают все потомство исходного трансформированного и регенерированного растения (растение ТО), которое генетически модифицировано рекомбинантными способами, где потомство содержит трансген. Такое потомство можно получать посредством самооплодотворения первичного трансгенного растения или посредством скрещивания такого растения с другим растением того же вида. В одном из вариантов осуществления трансгенные растения являются гомозиготными по каждому и любому вносимому гену (трансгену) так, что их потомство не сегрегирует по желательному фенотипу. Части трансгенного растения включают все части и клетки указанного растения, которые содержат трансген, такие как, например, семена, культивируемые ткани, каллюс и протопласты. "Нетрансгенное растение", предпочтительно нетрансгенное растение пшеницы, представляет собой растение, которое генетически не модифицировано посредством введения генетического материала посредством технологии рекомбинантных ДНК.
[0088] Как используют в настоящем документе, термин
"соответствующее нетрансгенное растение" относится к растению,
которое является такими же или сходным по большинству
характеристик, предпочтительно изогенным или почти изогенным
относительно трансгенного растения, но не содержит
представляющий интерес трансген. Предпочтительно,
соответствующее нетрансгенное растение принадлежит тому же культивару или сорту, что и предок представляющего интерес трансгенного растения, или сестринской линии растений, у которой отсутствует конструкция, часто называемой "сегрегант", или представляет собой растение того же культивара или сорта,
трансформированное конструкцией "пустого вектора", и может представлять собой нетрансгенное растение. Как используют в настоящем документе, "дикий тип" относится к клетке, ткани или растению, которые не модифицированы по изобретению. Клетки, ткани или растения дикого типа известны в данной области и их можно использовать в качестве контролей для сравнения уровней экспрессии экзогенных нуклеиновых кислот или степени и характера модификации признака с клетками, тканями или растениями, модифицированными, как описано в настоящем документе. Как используют в настоящем документе, "зерно пшеницы дикого типа" означает соответствующее немутированное, нетрансгенное зерно пшеницы. Как используют в настоящем документе, конкретное зерно пшеницы дикого типа в качестве неограничивающих примеров включает Sunstate.
[0089] Для определения присутствия трансгена в
трансформированном растении можно использовать любой из
нескольких способов. Например, можно использовать полимеразную
цепную реакцию (ПЦР) для амплификации последовательностей,
которые уникальны у трансформированного растения, с детекцией
продуктов амплификации посредством электрофореза в геле или
другими способами. ДНК можно выделять из растений общепринятыми
способами, а реакцию ПЦР проводить с использованием праймеров,
посредством которых можно различать трансформированные и
нетрансформированные растения. Альтернативный способ
подтверждения положительного трансформанта представляет собой гибридизацию способом саузерн-блоттинга, хорошо известную в данной области. Трансформированные растения пшеницы также можно идентифицировать, т.е. отличать от нетрансформированных растений пшеницы или растений пшеницы дикого типа, по их фенотипу, например, обеспечиваемому присутствием гена селективного маркера, или посредством иммунологических анализов, посредством которых детектируют или количественно определяют экспрессию фермента, кодируемого трансгеном, или по любому другому фенотипу, обеспечиваемому трансгеном.
[0090] Растения пшеницы по настоящему изобретению можно выращивать или собирать на зерно преимущественно для применения
в качестве пищевых продуктов для потребления человеком, или в качестве корма для животных, или для ферментации или для получения промышленного сырья, в том числе такого, как получение этанола. Альтернативно, растения пшеницы можно использовать непосредственно в качестве корма. Растение по настоящему изобретению предпочтительно пригодно для производства пищевых продуктов и, в частности, для коммерческого производства пищевых продуктов. Такое производство пищевых продуктов может включать получение муки тонкого помола, теста, крупы или других продуктов из зерна, которые могут быть ингредиентами при коммерческом производстве пищевых продуктов. Изобретение также относится к муке тонкого помола, муке грубого помола или другим продуктам, получаемым из зерна. Они могут быть необработанными или обработанными, например, посредством фракционирования или отбеливания.
[0091] Термины "полипептид" и "белок" в настоящем документе, как правило, используют взаимозаменяемо. Как используют в настоящем документе, термины "белки" и "полипептиды" также включают варианты, мутанты, модификации и/или производные полипептидов по изобретению, как описано в настоящем документе. Как используют в настоящем документе, "в значительной степени очищенный полипептид" относится к полипептиду, который отделен от липидов, нуклеиновых кислот, других пептидов и других молекул, с которыми он ассоциирован в его природном состоянии. Предпочтительно, в значительной степени очищенный полипептид по меньшей мере на 60% очищен, более предпочтительно по меньшей мере на 75% очищен и более предпочтительно по меньшей мере на 90% очищен от других компонентов, с которыми он ассоциирован в природе. Под "рекомбинантным полипептидом" подразумевают полипептид, получаемый рекомбинантными способами, т.е. посредством экспрессии рекомбинантного полинуклеотида в клетке, предпочтительно в клетке растения и более предпочтительно в клетке пшеницы.
[0092] % идентичности полипептида с другим полипептидом можно определять посредством анализа GAP (Нидлмана и Вунша,
1970) (программа GCG) со штрафом за создание пропуска = 5, и штрафом за продление пропуска = 0,3. Длина анализируемой последовательности составляет по меньшей мере 250 аминокислот, и анализ GAP выравнивает две последовательности на протяжении области по меньшей мере из 250 аминокислот. Наиболее предпочтительно два анализируемых полипептида выравнивают на протяжении их полноразмерной аминокислотной последовательности.
[0093] Применительно к определяемому полипептиду следует понимать, что показатели % идентичности, большие, чем % идентичности предоставленные выше, включают предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, когда применимо, с учетом минимальных показателей % идентичности, полипептид предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 8 0%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99, 8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична соответствующей указанной SEQ ID NO.
[0094] Делеции в аминокислотных последовательностях, как правило, находятся в пределах приблизительно от 1 до 15 остатков, более предпочтительно приблизительно от 1 до 10 остатков и, как правило, приблизительно от 1 до 5 смежных остатков. У мутантов с заменами в молекуле полипептида удален
по меньшей мере один аминокислотный остаток и на его место вставлен другой остаток.
[0095] Под "выделенным" подразумевают вещество, которое в значительной степени или по существу очищено от компонентов, которые в норме находятся вместе с ним в его природном состоянии. Как используют в настоящем документе, "выделенный полинуклеотид" или "выделенная молекула нуклеиновой кислоты" означает полинуклеотид, который по меньшей мере частично отделен, предпочтительно в значительной степени или по существу очищен от полинуклеотидных последовательностей того же типа, с которыми он ассоциирован или связан в его природном состоянии. Например, "выделенный полинуклеотид" включает полинуклеотид, который очищен или отделен от последовательностей, которые фланкируют его в природном состоянии, например, фрагмент ДНК, который отделен от последовательностей, которые в норме граничат с фрагментом. Предпочтительно, выделенный полинуклеотид также по меньшей мере на 90% очищен от других компонентов, таких как белки, углеводы, липиды и т.д. Как используют в настоящем документе, термин "рекомбинантный полинуклеотид" относится к полинуклеотиду, получаемому in vitro посредством манипуляций с нуклеиновыми кислотами в форме, в норме не встречающейся в природе. Например, рекомбинантный полинуклеотид может находиться в форме экспрессирующего вектора. Как правило, такие экспрессирующие векторы включают регулирующие транскрипцию и трансляцию нуклеиновые кислоты, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которую необходимо транскрибировать в клетке.
[0096] Настоящее изобретение относится к применению олигонуклеотидов, которые можно использовать в качестве "зондов" или "праймеров". Как используют в настоящем документе, "олигонуклеотиды" представляют собой полинуклеотиды длиной до 50 нуклеотидов. Они могут представлять собой РНК, ДНК или их комбинации или производные. Как правило, олигонуклеотиды представляют собой относительно короткие одноцепочечные молекулы длиной от 10 до 3 0 нуклеотидов, как правило, 15-2 5 нуклеотидов, как правило, содержащие 10-30 или 15-25
нуклеотидов, идентичных или комплементарных представляющей интерес последовательности. Когда его используют в качестве зонда или в качестве праймера в реакции амплификации, минимальным размером такого олигонуклеотида является размер, необходимый для формирования стабильного гибрида между олигонуклеотидом и комплементарной последовательностью в молекуле нуклеиновой кислоты-мишени. Предпочтительно, длина олигонуклеотидов составляет по меньшей мере 15 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 18 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 19 нуклеотидов, более предпочтительно по меньшей мере 2 0 нуклеотидов, даже более предпочтительно по меньшей мере 2 5 нуклеотидов. Полинуклеотиды, используемые в качестве зонда, как правило конъюгируют с детектируемой меткой, такой как радиоактивный изотоп, фермент, биотин, флуоресцентная молекула или хемилюминесцентная молекула.
[0097] Термины "вариант полинуклеотида" и "вариант" и т.п. относятся к полинуклеотидам, демонстрирующим значительную идентичность последовательности с исходной полинуклеотидной последовательностью и способным функционировать аналогичным образом с такой же активностью, что и исходная последовательность. Эти термины также включают полинуклеотиды, которые отличаются от исходного полинуклеотида добавлением, удалением или заменой по меньшей мере одного нуклеотида, или которые при сравнении с природными молекулами содержат одну или несколько мутаций. Таким образом, термины "вариант полинуклеотида" и "вариант" включают полинуклеотиды, в которых добавлены, или удалены, или замещены другими нуклеотидами один или несколько нуклеотидов. В этом отношении, в данной области хорошо известно, что с исходным полинуклеотидом можно провести определенные изменения, включая мутации, добавления, делеции и замены, при этом измененный полинуклеотид сохранит биологическую функцию или активность исходного полинуклеотида. Таким образом, эти термины включают полинуклеотиды, которые кодируют полипептиды, демонстрирующие ферментативную или другую регулирующую активность, или полинуклеотиды, способные служить
в качестве селективных зондов или других гибридизующихся средств. Термины "вариант полинуклеотида" и "вариант" также включают природные аллельные варианты. Мутанты могут быть природными (таким образом, выделенными из природного источника) или синтетическими (например, посредством проведения сайт-специфического мутагенеза у нуклеиновой кислоты). Предпочтительно, длина варианта полинуклеотида по изобретению, кодирующего полипептид с ферментативной активностью, составляет более 400, более предпочтительно более 500, более предпочтительно более 600, более предпочтительно более 700, более предпочтительно более 800, более предпочтительно более 900 и даже более предпочтительно более 1000 нуклеотидов, вплоть до полноразмерного гена.
[0098] Вариант олигонуклеотида по изобретению включает молекулы различных размеров, которые способны к гибридизации, например, с геномом пшеницы в положении, близком к положению молекулы специфического олигонуклеотида, определенного в настоящем документе. Например, варианты могут содержать дополнительные нуклеотиды (например, 1, 2, 3, 4 или более) или меньше нуклеотидов при условии, что они все еще гибризизуются с областью-мишенью. Кроме того, можно заменить несколько нуклеотидов без влияния на способность олигонуклеотида к гибридизации с областью-мишенью. Кроме того, можно легко сконструировать варианты, которые гибридизуются рядом (в качестве неограничивающих примеров, в пределах 50 нуклеотидов) с областью генома растения, где гибридизуются специфические олигонуклеотиды, определенные в настоящем документе.
[0099] Под "соответствует" или "соответствующий" в отношении полинуклеотидов или полипептидов подразумевают полинуклеотид (а) содержащий нуклеотидную последовательность, которая по существу идентична или комплементарна всей или части исходной полинуклеотидной последовательности или (Ь) кодирует аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательность в пептиде или белке. Эта фраза также включает в своем объеме пептид или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая по существу
идентична последовательности аминокислот в исходном пептиде или белке. Термины, используемые для описания отношения последовательностей у двух или более полинуклеотидов или полипептидов, включают "исходную последовательность", "окно сравнения", "идентичность последовательностей", "процент идентичности последовательностей", "идентичность по существу" и "идентичность" и определены в отношении определенного минимального количества нуклеотидов или аминокислотных остатков или предпочтительно на всей длине. Термины "идентичность последовательностей" и "идентичность" в настоящем документе используют взаимозаменяемо для обозначения тех случаев, когда последовательности в окне сравнения идентичны понуклеотидно или поаминокислотно. Таким образом, "процент идентичности последовательностей" рассчитывают, сравнивая две оптимально выровненные последовательности в окне сравнения, определяя количество положений, в которых в обеих последовательностях находятся идентичные нуклеиновые основания (например, А, Т, С, G, U) или идентичные аминокислотные остатки (например, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gin, Cys и Met) с получением количества совпадающих положений, деля количество совпадающих положений на общее количество положений в окне сравнения (т.е. на размер окна), и умножая результат на 100 с получением процента идентичности последовательностей.
[0100] % идентичности полинуклеотида можно определять
посредством анализа GAP (Нидлмана и Вунша, 1970) (программа
GCG) со штрафом за создание пропуска = 5 и штрафом за продление
пропуска = 0,3. Если не указано иначе, длина анализируемой
последовательности составляет по меньшей мере 45 нуклеотидов, и
в анализе GAP выравнивают две в области по меньшей мере 4 5
нуклеотидов. Предпочтительно, длина анализируемой
последовательности составляет по меньшей мере 150 нуклеотидов, в анализе GAP выравнивают две последовательности в области по меньшей мере 150 нуклеотидов. Более предпочтительно, длина анализируемой последовательности составляет по меньшей мере 300 нуклеотидов, и в анализе GAP выравнивают две последовательности
в области по меньшей мере 300 нуклеотидов или по меньшей мере 4 00, 50 0 или 60 0 нуклеотидов в каждом случае. Также можно привести ссылку на семейство программ BLAST, как, например, описано в Altschul et al., 1997. Подробное обсуждение анализа последовательностей можно найти в разделе 19.3 Ausubel et al., 1994-1998, глава 15.
[0101] Нуклеотидные или аминокислотные последовательности
обозначают как "в значительной степени сходные", когда
идентичность таких последовательностей составляет по меньшей
мере приблизительно 98%, более конкретно по меньшей мере
приблизительно 98,5%, очень конкретно приблизительно 99%,
особенно приблизительно 99,5%, более конкретно приблизительно
100%, очень конкретно они являются идентичными. Понятно, что
когда последовательности РНК описаны как в значительной степени
сходные или обладающие определенной идентичностью
последовательности с последовательностями ДНК, тимин (Т) в последовательности ДНК считают эквивалентным урацилу (U) в последовательности РНК.
[0102] Применительно к определяемым полинуклеотидам следует понимать, что показатели % идентичности, большие, чем % идентичности предоставленные выше, включают предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, когда применимо, с учетом минимальных показателей % идентичности, полинуклеотид предпочтительно содержит полинуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 75%, более предпочтительно по меньшей мере на 8 0%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 91%, более предпочтительно по меньшей мере на 92%, более предпочтительно по меньшей мере на 93%, более предпочтительно по меньшей мере на 94%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, более предпочтительно по меньшей мере на 96%, более предпочтительно по меньшей мере на 97%, более предпочтительно по меньшей мере на 98%, более предпочтительно по меньшей мере на 99%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,1%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,2%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,3%, более
предпочтительно по меньшей мере на 99,4%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,5%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,6%, более предпочтительно по меньшей мере на 99,7%, более предпочтительно по меньшей мере на 99, 8% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 99,9% идентична соответствующей указанной SEQ ID N0.
[0103] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к жесткости условий гибридизации для определения степени комплементарности двух полинуклеотидов. Как используют в настоящем документе, "жесткость", относится к температурным условиям и условиям ионной силы и присутствию или отсутствию определенных органических растворителей в течение гибридизация. Чем выше жесткость, тем выше степень комплементарности между нуклеотидной последовательностью-мишенью и меченой полинуклеотидной последовательностью. "Жесткие условия" относятся к температуре и ионным условиям в которых гибридизуются только нуклеотидные последовательности с высокой частотой комплементарных оснований. Как используют в настоящем документе, термин "гибридизуются в условиях с низкой жесткостью, средней жесткостью, высокой жесткостью или очень высокой жесткостью" описывает условия гибридизации и отмывки. Руководства по проведению реакций гибридизации можно найти в Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6, включенный в настоящий документ в качестве ссылки. Конкретные условия гибридизации, указываемые в настоящем документе являются следующими: 1) условия гибридизации с низкой жесткостью в б X хлориде натрия/цитрате натрия (SSC) приблизительно при 45°С с последующими двумя отмывками d 0,2 X SSC, 0,1% SDS при 50-55°С; 2) условия гибридизации со средней жесткостью в б X SSC приблизительно при 45°С с последующими одной или несколькими отмывками в 0,2 X SSC, 0,1% SDS при 60°С; 3) условия гибридизации с высокой жесткостью в б X SSC приблизительно при 4 5°С с последующими одной или несколькими отмывками в 0,2 X SSC, 0,1% SDS при 65°С; и 4) условия гибридизации с очень высокой жесткостью представляют
собой 0,5 М фосфат натрия, 7% SDS при 65°С с последующими одной или несколькими отмывками в 0,2 X SSC, 1% SDS при 65°С.
[0104] Как используют в настоящем документе, "химерный
ген" или "генетическая конструкция" относятся к любому гену,
который не является природным геном в его природном положении,
т.е. с ним проводили искусственные манипуляции, включая
химерный ген или генетическую конструкцию, которые
интегрированы в геном пшеницы. Как правило, химерный ген или
генетическая конструкция содержат регуляторные и
транскрибируемые или кодирующие белок последовательности,
которые вместе в природе не встречаются. Таким образом,
химерный ген или генетическая конструкция могут содержать
регуляторные последовательности и кодирующие
последовательности, которые происходят из разных источников,
или регуляторные последовательности и кодирующие
последовательности, происходящие из одного и того же источника,
но организованные отлично от того, как они существуют в
природе. Термин "эндогенный" применяют в настоящем документе
для обозначения вещества, которое в норме продуцирует
немодифицированное растение на той же стадии развития, как
исследуемое растение, предпочтительно растение пшеницы.
"Эндогенный ген" относится к природному гену в его природном
положении в геноме организма, предпочтительно в растении
пшеницы. Как используют в настоящем документе, "рекомбинантная
молекула нуклеиновой кислоты" относится к молекуле нуклеиновой
кислоты, которая сконструирована или модифицирована посредством
технологии рекомбинантных ДНК. Термины "чужеродный
полинуклеотид", или "экзогенный полинуклеотид", или "гетерологичный полинуклеотид" и т.п. относятся к любой нуклеиновой кислоте, которую вводят в геном клетки, предпочтительно геном пшеницы, посредством экспериментальных манипуляций, но которая в природе не встречается в этой клетке. Они включают модифицированные формы генных последовательностей, находящиеся в этой клетке при условии, что вводимый ген относительно природного гена содержит определенную модификацию,
например, внесенную мутацию или присутствие гена селективного маркера. Чужеродные или экзогенные гены могут представлять собой гены, существующие в природе, которые вводят в неприродный организм, природные гены, вводимые в новое положение у природного хозяина, или химерные гены или генетические конструкции. "Трансген" представляет собой ген, который вводят в геном способом трансформации. Термин "генетически модифицированный" включает введение генов в клетки, мутацию генов в клетках и изменение или модуляцию регуляции гена в клетках или организмах, в которых проводят эти действия, или их потомстве.
[0105] "Функционально связанный" с транскрибируемым полинуклеотидом промотор или энхансерный элемент означает помещение транскрибируемого полинуклеотида (например, кодирующего белок полинуклеотида или другого транскрипта) под регуляторный контроль промотора, который затем контролирует транскрипцию этого полинуклеотида. При конструировании комбинаций гетерологичный промотор/структурный ген, как правило, предпочтительно помещать промотор или его вариант на расстоянии от участка старта транскрипции транскрибируемого полинуклеотида, которое является приблизительно таким же, как расстояние между этим промотором и геном, который он контролирует в его природных условиях; т.е. геном, из которого получен промотор. Как известно в данной области, проводить определенное изменение этого расстояния без потери функции.
[0106] Как используют в настоящем документе относительно злаковых растений, термин "прорастание" относится к появлению колеоризы из семенной оболочки после набухания.
[0107] "Доля прорастания" семян относится к проценту семян в популяции, которые прорастают за определенный период времени, например, до 21 суток, или в период от 1 до 10 суток после начала набухания. Для определения процента прорастания в зависимости от времени популяцию семян можно оценивать каждые сутки в течение нескольких суток. Определенные аспекты изобретения относятся к изменению/модуляции доли прорастания семян. Эти изменение/модуляция могут быть транзиторными в
течение жизни семян. Например, после сбора семена трансгенного растения по изобретению могут иметь измененную долю прорастания при сравнении с семенами соответствующего нетрансгенного растения после сбора, однако после шести месяцев хранения в элеваторе семена того же трансгенного растения по изобретению могут обладать такой же долей прорастания при сравнении с семенами соответствующего нетрансгенного растения после шести месяцев хранения в элеваторе, или наоборот. Другими словами, в один и тот же момент в течение жизни семян они обладают измененной долей прорастания при сравнении с подходящим контролем (нетрансгенным или дикого типа и т.д.), который подвергался воздействию тех же условий.
[0108] Как используют в настоящем документе, термин "находящийся в состоянии покоя" относится к неспособности жизнеспособных, интактных семян растения прорастать в конкретных подходящих условиях, в частности в отношении температуры и присутствия влаги. Состояние покоя представляет собой количественный признак. Относительно ячменя и пшеницы, семена растения считают покоящимися, если после начала набухания через 7 суток при 2 0°С прорастают менее 90% жизнеспособных, интактных семян. Жизнеспособные семена представляют собой семена, которые способны прорастать после нарушения состояния покоя, например, после значительного периода (недели или месяцы) хранения при комнатной температуре или тепловой обработки, хорошо известных в данной области.
[0109] Как используют в настоящем документе, термин "не находящийся в состоянии покоя" относится к способности семян растения прорастать в конкретных подходящих условиях. Относительно ячменя и пшеницы, семена растения считают не находящимися в состоянии покоя, если после начала набухания через 7 суток при 2 0°С прорастают по меньшей мере 90% жизнеспособных, интактных семян.
[ОНО] Как используют в настоящем документе, термин "амплификация нуклеиновой кислоты" относится к любому способу in vitro для увеличения количества копий молекулы нуклеиновой
кислоты с использованием ДНК-полимеразы. Амплификация нуклеиновой кислоты приводит к встраиванию нуклеотидов в молекулу ДНК или праймер, таким образом, образуя новую молекулу ДНК, комплементарную матричной ДНК. Вновь образованную молекулу ДНК можно использовать в качестве матрицы для синтеза дополнительных молекул ДНК.
[0111] Настоящее изобретение относится к получению различных трансгенных растений. В качестве неограничивающих примеров они включают растения, которые несут один или несколько желаемых признаков, демонстрируемых растениями пшеницы по настоящему изобретению.
[0112] Конструкции нуклеиновых кислот, пригодные для
получения указанных выше трансгенных растений, можно легко
получать стандартными способами. Для обеспечения
соответствующей экспрессии гена, кодирующего представляющую интерес иРНК, конструкция нуклеиновой кислоты, как правило, содержит один или несколько регуляторных элементов, таких как промоторы, энхансеры, а также последовательности терминации транскрипции или полиаденилирования. Такие элементы хорошо известны в данной области. Область инициации транскрипции, содержащая регуляторный элемент(ы), может обеспечивать регулируемую или конститутивную экспрессию в растении. Регуляторные элементы можно выбирать, например, из специфичных для семян промоторов или промоторов, не специфичных для клеток семян (таких как промотор убиквитина или промотор CaMV35S или усиленный промотор 35S) . Примеры специфичных для семян промоторов, пригодных по настоящему изобретению, в качестве неограничивающих примеров включают промотор низкомолекулярного глютенина пшеницы (Colot et al., 1987), промотор экспрессии ос-амилазы в семенах пшеницы (Stefanov et al., 1991) и промотор гордеина (Brandt et al. , 1985) . Промотор могут регулировать такие факторы, как температура, свет или стресс. Как правило, регуляторные элементы находятся с 5'-конца подлежащей экспрессии генной последовательности. Также конструкция может содержать другие элементы, которые усиливают транскрипцию,
такие как области полиаденилирования nos 3' или ocs 3', или терминаторы транскрипции.
[0113] Как правило, конструкция нуклеиновой кислоты содержит селективный маркер. Селективные маркеры помогают в идентификации и скрининге растений или клеток, которые трансформированы экзогенной молекулой нуклеиновой кислоты. Ген селективного маркера может обеспечивать клеткам пшеницы устойчивость к антибиотику или гербициду или обеспечивать утилизацию таких субстратов, как манноза. Селективный маркер предпочтительно придает клеткам пшеницы устойчивость к гигромицину.
[0114] Предпочтительно, конструкция нуклеиновой кислоты стабильно встроена в геном растения. Таким образом, нуклеиновая кислота содержит соответствующие элементы, которые обеспечивают встраивание молекулы в геном, или конструкцию помещают в соответствующий вектор, который может встраиваться в хромосому клетки растения.
[0115] Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к рекомбинантному вектору, который содержит по меньшей мере одну полинуклеотидную молекулу по настоящему изобретению, встроенную в любой вектор, способный к доставке молекулы нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Такой вектор содержит гетерологичные последовательности нуклеиновых кислот, которые представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, которые в природе не граничат с молекулами нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению и которые предпочтительно происходят из видов, отличных от видов, из которых происходит молекула(ы) нуклеиновой кислоты. Вектор может представлять собой РНК или ДНК, быть прокариотическим или эукариотическим, и, как правило, он представляет собой вирус или плазмиду.
[0116] Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к рекомбинантной клетке, включающей клетку-хозяина, трансформированную одной или несколькими рекомбинантными молекулами по настоящему изобретению. Трансформацию молекулы нуклеиновой кислоты в клетку можно проводить любым способом, которым молекулу нуклеиновой кислоты можно ввести в клетку.
Способы трансформации в качестве неограничивающих примеров
включают трансфекцию, электропорацию, микроинъекцию,
липофекцию, адсорбцию и слияние протопластов. Рекомбинантная клетка может оставаться одноклеточной или может развиваться в ткань, орган или многоклеточный организм. Трансформированные молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут оставаться внехромосомными или могут интегрироваться в один или несколько участков хромосомы трансформированной (т.е. рекомбинантной) клетки таким образом, что сохраняется их способность к экспрессии. Предпочтительно клетки-хозяева представляют собой растительные клетки, более предпочтительно клетки злакового растения, более предпочтительно клетки ячменя или пшеницы, и даже более предпочтительно клетки пшеницы.
[0117] Предпочтительно, трансгенное растение представляет собой злаковое растение. Примеры злаковых растений в качестве неограничивающих примеров включают пшеницу, ячмень, сорго, овес и рожь. Более предпочтительно, злаковое растение представляет собой пшеницу или ячмень. В дополнительном предпочтительном варианте осуществления злаковое растение не является рисом.
[0118] Трансгенные растения, как определено в контексте настоящего изобретения, включают растения и их потомство, которые генетически модифицированы рекомбинантными способами. Как правило, это модулирует продукцию в желаемых растении или органе растения по меньшей мере одного полипептида, определенного в настоящем документе. Части трансгенного растения включают все части и клетки указанного растения, такие как, например, культивируемые ткани, каллюс и протопласты. Трансформированные растения содержат генетический материал, который они не содержали до трансформации. Генетический материал предпочтительно стабильно интегрирован в геном растения. Внесенный генетический материал может содержать последовательности, которые в природе находятся в том же виде, но в переставленном порядке или в другом расположении элементов, например, антисмысловая последовательность. Такие растения включены в настоящий документе как "трансгенные растения". "Нетрансгенное растение" представляет собой
растение, которое генетически немодифицировано введением генетического материала посредством технологий рекомбинантных ДНК. В предпочтительном варианте осуществления трансгенные растения являются гомозиготными по каждому и любому вносимому гену (трансгену) так, что их потомство не сегрегирует по желательному фенотипу.
[0119] Существует несколько способов введения чужеродного генетического материала в растительную клетку. Такие способы включают ускорение покрытых генетическим материалом микрочастиц непосредственно в клетки (см., например, US 4945050 и US 5141131). Растения можно трансформировать с использованием технологии агробактерий (см., например, US 5177010, US 5104310, US 5004863, US 5159135). Для трансформации растений также можно использовать технологию электропорации (см., например, WO 87/06614, US 5472869, 5384253, WO 92/09696 и WO 93/21335). В дополнение к многочисленным способам трансформации растений также можно варьировать тип ткани, который контактирует с чужеродными генами. Такая ткань может включать, но не ограничиваться ими, эмбриогенную ткань, ткань каллюса типа I и II, гипокотиль, меристему и т.п. В течение развития и/или дифференцировки соответствующими способами, описываемыми в настоящем документе трансформировать можно почти все ткани растения.
[0120] Ряд векторов, подходящих для стабильной трансфекции растительных клеток или для получения трансгенных растений, описан, например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Manual, 1985, supp. 1987; Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989; и Gelvin et al., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers, 1990. Как правило, экспрессирующие векторы растения включают, например, один или несколько клонируемых генов растения под транскрипционным контролем 5'- и 3'-регуляторных последовательностей и доминантный селективный маркер. Такие экспрессирующие векторы растений также могут содержать регуляторную область промотора (например, регуляторную область, контролирующую индуцируемую или конститутивную, регулируемую
окружающей средой или развитием, или клеточно- или тканеспецифическую экспрессию), участок инициации транскрипции, участок связывания рибосомы, сигнал процессинга РНК, участок терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.
[0121] Для определения присутствия трансформированного растения можно применять любой из нескольких способов. Например, можно использовать полимеразную цепную реакцию (ПЦР) для амплификации последовательностей, которые уникальны у трансформированного растения, с детекцией продуктов амплификации посредством электрофореза в геле или другими способами. ДНК можно выделять из растений общепринятыми способами, а реакцию ПЦР проводить с использованием праймеров, посредством которых можно различать трансформированные и нетрансформированные растения. Например, можно конструировать праймеры, посредством которых амплифицируют область ДНК от трансформирующего вектора, считывая в направлении конструкции, а обратный праймер конструируют на основе представляющего интерес гена. Эти праймеры позволяют амплифицировать фрагмент, только если растение успешно трансформировано. Альтернативный способ подтверждения положительного трансформанта представляет собой гибридизацию способом саузерн-блоттинга, хорошо известную в данной области. Трансформированные растения также можно идентифицировать, т.е. отличать от нетрансформированных растений или растений дикого типа, по их фенотипу, например, обеспечиваемому присутствием гена селективного маркера или обеспечиваемому фенотипом желаемого состояния покоя семян.
[0122] Способы трансформации злаковых растений, таких как пшеница и ячмень с внесением генетической вариации в растения посредством введения экзогенной нуклеиновой кислоты и регенерации растений из протопластов или незрелых зародышей растений, хорошо известны в данной области, см. например, Wan and Lemaux (1994), Tingay et al. , (1997), патентная заявка Канады № 2092588, патентная заявка Австралии № 61781/94, патент Австралии № 667939, патент США № 6100447, международную патентную заявку PCT/US97/10621, патент США № 5589617, патент США № 6541257 и другие способы, указанные в описании патента
W099/14314. Предпочтительно, трансгенные растения пшеницы или ячменя получают способами опосредованной Agrobacterium tumefaciens трансформации. Векторы, несущие желаемые конструкции нуклеиновой кислоты, можно вводить в регенерируемые клетки пшеницы культивируемых в виде тканей растений или эксплантов, или подходящие растительные системы, такие как протопласты.
[0123] Регенерируемые клетки пшеницы предпочтительно получают из щитка зародыша незрелых зародышей, зрелых зародышей, каллюса, полученного из них, или меристемной ткани.
[0124] Отбор при помощи маркера представляет собой широко
признанный способ отбора гетерозиготных растений, необходимый
при возвратном скрещивании с рекуррентным родителем в
классической селекционной программе. Популяция растении в
каждом поколении возвратного скрещивания является
гетерозиготной по представляющему интерес гену, в норме присутствующему в популяции возвратного скрещивания в соотношении 1:1, и молекулярный маркер можно использовать для различения двух аллелей гена. Выделяя ДНК, например, из молодых побегов, и тестируя введение желаемого признака с использованием специфического маркера, проводят раннюю селекцию растений для дальнейшего возвратного скрещивания, при этом концентрируя энергию и ресурсы на меньшем количестве растений. Для дополнительного ускорения программы возвратного скрещивания можно выделять зародыши из незрелых семян (25 суток после цветения) и выращивать на питательных средах в стерильных условиях, а не доводить до полной зрелости семян.
[0125] В способах по настоящему изобретению можно использовать любой молекулярно-биологический способ, известный в данной области, которым можно детектировать аллели Rht-Bl. Такие способы в качестве неограничивающих примеров включают использование амплификации нуклеиновых кислот, секвенирования нуклеиновых кислот, гибридизации нуклеиновых кислот с подходящим образом мечеными зондами, анализ конформации одиночных цепей (SSCA), электрофорез в градиенте денатурирующего геля (DGGE), анализ гетеродуплексов (НЕТ),
анализ химического расщепления (ССМ), каталитическое
расщепление нуклеиновой кислоты или их сочетание (см.,
например, Lemieux, 2000; Langridge et al. , 2001) . Изобретение
также включает использование способов с молекулярными маркерами
для детекции полиморфизмов, сцепленных с аллелями Rht-Bl. Такие
способы включают детекцию или анализ полиморфизма длин
рестрикционных фрагментов (ПДРФ), RAPD, полиморфизма длины
амплифицированных фрагментов (AFLP) и полиморфизма
микросателлитов (простого повтора последовательности, SSR). Тесно сцепленные маркеры можно легко получать хорошо известными в данной области способами, такими как анализ объединенных сегрегантов, как описано в Langridge et al., (2001) .
[0126] На всем протяжении настоящего описания слово "содержать" или его варианты, такие как "содержит" или "содержащий", следует понимать, как означающее включение указанного элемента, числа или этапа или группы элементов, чисел или этапов, но не исключение каких-либо других элемента, числа или этапа, или группы элементов, чисел или этапов.
[0127] Все публикации, указанные в настоящем описании, включены в настоящий документ в качестве ссылки. Любое описание документов, действий, материалов, устройств, изделий или т.п., которое включено в настоящее описание, приведено исключительно с целью предоставления контекста настоящего изобретения. Не следует рассматривать в качестве признания, что любой или все эти положения составляют часть основы известного уровня техники или являются общеизвестными фактами в области, соответствующей настоящему изобретению, как это существовало в Австралии или в других регионах до даты приоритета каждого пункта формулы данной заявки.
[0128] Как используют в описании темы, если из контекста явно не следует иначе, формы единственного числа включают формы множественного числа. Таким образом, например, указание единственного числа включает один, а также два или более.
[0129] После общего описания изобретения, его можно более легко понять на основе приводимых ниже примеров, которые предоставлены в качестве иллюстрации и не предназначены для
ограничения. ПРИМЕРЫ
Пример 1. Материалы и методы Растительный материал
[0130] Зерна высокорослой пшеницы сорта Maringa {Rht-Bla) и почти изогенной карликовой линии {Rht-Blc) на генетической основе Maringa получали из Australian Winter Cereals Collection, Tamworth, NSW, Australia. Maringa представляет собой сорт бразильской хлебопекарной пшеницы. Почти изогенную карликовую линию получали посредством семи возвратных скрещиваний (ВС7) с рекуррентным отбором карликового аллеля {Rht-Blc) в Maringa (Hoogendoorn et al. 1988).
[0131] В таблице 1 описаны ячмень Himalaya и три ранее охарактеризованных производных карликовых мутанта. Растения выращивали в теплице в 2 0 см горшках, содержащих смесь на основе компоста с природным освещением с продлением продолжительности дня до 14 часов, обеспечиваемым в зимние месяцы, или в поле в Black Mountain или на экспериментальной станции Ginninderra Experimental Station, расположенных в Канберре, Австралия. Мутагенез
[0132] Способ мутагенеза зерна ячменя и пшеницы представлял собой упрощение способа, используемого ранее (Zwar and Chandler, 1995). 1-2 кг зерен каждой линии впитывали воду до удвоения их массы при 4°С в течение ночи. Их переносили в 2-литровые мерные цилиндры, заполненные водой и аэрировали сжатым воздухом в течение 8 часов с одной заменой на чистую воду, проведенной через 4 часа. Затем зерна инкубировали в течение 2 час в свежеполученном 1 мМ азиде Na, растворенном в 0,1 М К-фосфатном буфере с рН 3,0, а затем тщательно промывали в проточной воде в течение 2 часов, помещали в вытяжной шкаф для сушки в течение ночи и высевали в поле в пределах периода нескольких суток после обработки.
Конструирование производных линий, несущих аллели усиленного роста
[0133] Аллели усиленного роста ячменя подвергали возвратному скрещиванию, интеркроссингу и ауткроссингу с получением набора линий, подходящих для подробной физиологической характеристики. Выявили четыре новых аллеля усиленного роста Slnl на основе карликов grd2b или gseln и два поколения подвергли их возвратному скрещиванию с WT, обеспечивая фенотипы с усиленным ростом для сравнения в высокорослых и карликовых основах. Потерю исходного аллеля карликовости подтверждали ПЦР. Оставшиеся семь новых аллелей усиленного роста Slnl выявили на основе карлика Slnld и четыре из них {Slnld. 7, Slnld.8, Slnld.9 и TR103) два поколения подвергали возвратному скрещиванию с WT.
Продукция а-амилазы полузернами с эндоспермом
[0134] Получали полузерна с эндоспермом и инкубировали с GA3 (1 мкМ) или без него при 22°С в течение 0, 42 или 72 часов. В каждый образец добавляли 1,5 мл раствора 10 мм СаС1г, полузерна гомогенизировали и очищали аликвоту 1 мл посредством центрифугирования (20000д в течение 5 мин) . Супернатант анализировали на активность а-амилазы с использованием способа определения активности альфа-амилазы Megazyme (Ceralpha).
Оценка состояние покоя зерна
[0135] Растения выращивали в виде одиночных рядов в поле и колосья проверяли дважды в неделю для мониторинга высыхания. Когда колосья теряли всю зеленую окраску, их считали физиологически зрелыми и срезали и забирали в лабораторию. Колосья помещали в вытяжной шкаф на срок 4 8 часов для проведения конечной сушки, особенно базальных зерен, которые имеют тенденцию оставаться влажными, а затем молотили вручную. Зерна помещали в конверт из оберточной бумаги и оставляли в лабораторных условиях в течение различных периодов послеуборочного дозревания. Прорастание оценивали, инкубируя 100 зерен каждой линии на влажной фильтровальной бумаге в среде при 2 0°С при низкоинтенсивном флуоресцентном освещении. Процент прорастания каждого образца зерен оценивали через 7 суток инкубации. Прорастание в этом контексте определяют как
появление зародышевого корня из семенной оболочки. В эксперименте первого сезона, многие образцы зерен, особенно высокорослых растений пшеницы, демонстрировали кратковременное состояние покоя и наблюдали значительное прорастание (по меньшей мере 50% проросших зерен) всего через 13-19 суток дозревания. Эти линии, как правило, больше не тестировали. Другие образцы зерен через 13-19 суток дозревания демонстрировали незначительное прорастание, и их тестировали снова через 32-33 суток, и если прорастание все еще оставалось незначительным, снова через 48-49 суток дозревания. Относительные оценки состояние покоя давали по шкале от 1 (наименьшее состояние покоя) до 4 (наибольшее состояние покоя).
[0136] В эксперименте второго сезона оценки состояния покоя сфокусировали на полукарликовых и контрольных линиях, и прорастание определяли еженедельно, начиная от сбора до потери состояние покоя, или до 12 недель дозревания. Пример результатов тестирования состояния покоя зерен приведен на фигуре 9. Одну из мер состояния покоя зерен определяли как количество недель хранения зерен (также обозначаемого как "дозревание") при комнатной температуре для того, чтобы в популяции зерен проросло по меньшей мере 50% зерен, как оценивали способом, описанным в предыдущем абзаце.
Длина колеоптиля линий ячменя и пшеницы с усиленным ростом [0137] Длину колеоптиля определяли у проростков пшеницы и ячменя через 21 сутки роста в темноте с программой суточной температуры 12 час при 12°С и 12 час при 8°С в присутствии полностью достаточной подачи воды.
Выход на поверхность после глубокого засева в сухих условиях
[0138] Образцы зерен высевали в почву (стандартная почвенная горшечная смесь) в теплице на глубину 10 см. Исходное содержание влаги в почве составляло 12-14% (масс./масс.). Прорастание, рост на раннем этапе и образование проростка после появления третьего листа происходили без какого-либо дополнительного полива для имитации сухих условий посева в
поле. Оценивали процент зерен, дающих выходящие на поверхность проростки, и время выхода на поверхность.
Скорости удлинения листьев и кривые зависимости "доза-эффект" для GA
[0139] Способы описаны ранее (Chandler and Robertson, 1999) . Кривые аппроксимировали по точкам данных с использованием 4-параметрического уравнения Хилла. Измерения длины корней
[014 0] Рост корней оценивают в контролируемых условиях и у растений, растущих в поле. В первом случае длину корней оценивают посредством сканирования, тогда как в поле берут 2 м стержни и количество корней оценивают с 10 см интервалами вдоль стержней.
Амплификация ДНК посредством ПЦР и секвенирование
[0141] ДНК получали из листьев ячменя или пшеницы способом Ellis et al., 2005. Последовательности пшеницы амплифицировали с использованием пар праймеров, в которых один из праймеров был специфичен для гена Rht-Bl (таблица 2) . 3'-часть гена амплифицировали с использованием консервативных прямых праймеров и обратных праймеров, которые были специфичны к генным последовательностям В в 3'-UT области. При амплификации ПЦР последовательностей ячменя использовали праймеры, специфичные для генов Slnl, Spyl и Gsel. Амплифицированные фрагменты обрабатывали Exosap-IT (Affymetrix) для удаления праймеров, а затем секвенировали с использованием Big Dye Terminator (Applied Biosystems). Последовательности ДНК
[0142] Последовательности генов Rht-Ala, Rht-Bla и Rht-Dlb пшеницы и, таким образом, кодируемых белков представлены номерами доступа JF930277, JF930278 и JF930281 соответственно. Аминокислотные последовательности выравнивают ClustalW, демонстрируя отличающиеся аминокислоты (фигура 7) . Часть нуклеотидной последовательности гена Rht3-Blc карликового производного Maringa представлена в SEQ ID NO. 1.
[0143] Последовательность белка Rht-Blc, кодируемого аллелем Rht-Blc, представлена в SEQ ID NO. 3.
[0144] Номера доступа последовательностей для генов Slnl и Spyl ячменя представляют собой АК372 0 64 и AF03582 0, соответственно.
Пример 2. Выделение мутантов пшеницы, содержащих новые аллели Rht-Bl
[0145] Зерна пшеницы сорта Maringa, содержащего аллель Rht-Blc, вызывающего тяжелую карликовость растений, обрабатывали азидом натрия, как описано в примере 1. Мутировавшие зерна высевали в поле и полученным растениям Mi позволяли самооплодотворяться. После созревания из растений Mi собирали зерна Мг. Зерна Мг высевали в поле или при высокой плотности в лотки (фигура 1) в теплице и подвергали скринингу на увеличенную высоту в течение роста на раннем этапе или при созревании в поле. Этими способами скринингу подвергли приблизительно 1,6 миллионов растений М2. На фигуре 1 представлено как легко можно идентифицировать мутантов. Выбирали приблизительно 4 00 растений, которые демонстрировали скорости удлинения раннего листа или высоту зрелого растения, которое находилось в диапазоне от немного большего, чем карликовый родитель сорта Maringa {Rht-Blc) до такого же высокорослого, как почти изогенные растения Rht-Bla (аллель дикого типа). Их самооплодотворяли и растения-потомки выращивали в контролируемых условиях и сравнивали с родительскими растениями {Rht-Blc) и растениями дикого типа {Rht-Bla) (фигура 2). Эти растения назвали "мутанты с усиленным ростом", так как они росли с повышенными скоростями или до увеличенной высоты зрелого растения относительно родительского сорта.
[014 6] Мутация карликовости в аллеле Rht-Blc являлась следствием вставки 2026 пар нуклеотидов в ген Rht-Bl Maringa (Wu et al., 2011) . Тестирование ПЦР выявило, что приблизительно половина из 4 00 выбранных мутантных растений были положительными на наличие вставки в этом гене; такие растения сохранили ген Rht-Bl. Оставшиеся выбранные растения были отрицательными в анализе ПЦР и очевидно полностью теряли ген Rht-Bl, хотя гомеологичный ген, кодируемый в геноме D (Rht-Dl) ,
основываясь на положительных амплификациях ПЦР, все еще присутствовал. Многие растения в этой последней группе обладали явными морфологическими изменениями и плохой фертильностью колоса. Вероятно, что они представляли делеции гена Rht-Bl наряду с варьирующими количествами фланкирующей хромосомной ДНК. Линии с этими делениями дальше не изучали.
[0147] Ген Rht-Bl у каждого из 139 мутантов без делеций секвенировали посредством амплификации областей гена посредством ПЦР. Идентифицировано тридцать пять новых производных аллелей Rht-Blc, каждый представляющий собой один вариант аллеля Rht-Blc Maringa. Их обозначили Rht-Blc.1, Rht-Blc. 2, Rht-Blc.3 и т.д. Они перечислены в таблице 3. Многие из 35 аллелей представлены в нескольких линиях, содержащих идентичные специфические мутации. В некоторых случаях эти несколько линий могут являться сестринскими, тогда как в других случаях они могут представлять независимые события мутирования. Всего наблюдали 62 независимых события, которые породили 35 аллелей.
[014 8] Мутанты демонстрировали три различных класса мутаций, ответственных за фенотип усиленного роста. В первом классе десять аллелей содержали преждевременные кодоны терминации трансляции в гене Rht-Bl. В большинстве случаев мутантный кодон представляет собой замену кодона TGG (кодирующего Тгр) на TGA (стоп-кодон). В ячмене преждевременные стоп-кодоны в DELLA приводят к удлиненному утонченному фенотипу и мужской стерильности. В отличие от этого, растения этих десяти мутантных линий пшеницы, за одним исключением, росли до высоты, которая являлась такой же или почти такой же, как у высокорослой (дикого типа) изолинии и демонстрировали сходную с диким типом фертильность. Предположительно экспрессия белков Rht-1 геномов А и/или D у этих мутантов обеспечивала генетическую компенсацию нуль-мутантов генов генома В и ограничивала фенотипическую экспрессию до "высокорослой", а не "утонченной". Одно исключение, растения единственного представителя Rht-Blc.22 representative (линия TR544), были полукарликовыми, а не "высокорослыми". Этот фенотип мог быть
результатом альтернативного сплайсинга мутантного гена Rht-Blc. 22 в этих растениях, который приводил к образованию белка Rht-Bl с другой вставкой в рамку считывания (описано ниже).
[014 9] Второй класс включал замены аминокислот в белке Rht-Bl, кодируемом геномом В. Двадцать примеров перечислены в таблице 3. Интерес представляет сравнение этих 2 0 замен с мутантами DELLA с заменами, полученными у ячменя (пример 5) , см. фигуру 3. У двух видов существует 31 одиночная замена аминокислот, включая четыре участка, где произошли идентичные замены аминокислот. Также замечено, что у ячменя и у пшеницы произошли идентичные, хотя и независимые, мутации, где одну и ту же мутацию выявляли в соответствующих положениях в линиях, происходящих из разных субпопуляций зерен Мг.
[0150] Фигура 3 схематически демонстрирует участки замен аминокислот у мутантов относительно положений консервативных мотивов в С-концевой области белков ячменя и пшеницы. Наблюдение, что мутации с усиленным ростом расположены на всем протяжении большей части С-концевой области, означает, что существует существенный потенциал для изменений связывания белков DELLA с взаимодействующими белковыми партнерами.
[0151] Третий класс мутантов включал 5 аллелей, где каждый содержал мутации в областях Rht-Bl, для которых теоретически рассчитано, что они вовлечены в вырезание большинства вставок в ген Rht-Bl, которые образовывали аллель Rht-Blc (таблица 3) . Каждый из этих аллелей затрагивал один из четырех нуклеотидов, непосредственно граничащих с донорным и акцепторным участками сплайсинга. В некоторых случаях, включая аллель Rht-Blc.22, и в зависимости от того, какое программное обеспечение предсказания сплайсинга использовали, для этих изменений последовательности существовал потенциал изменения предпочтительного участка сплайсинга, таким образом, получая белки Rht-Bl с немного большими или меньшими вставками в рамку считывания. Эти аллели сплайсинга предположительно приводили к продукции меньшего количества белка Rht-Bl, содержащего вставку 30 аминокислот, и/или приводили к продукции модифицированных белков Rht-Bl с измененными вставками в рамку считывания. Экспериментальные
данные по изменению эффективности сплайсинга получали, исследуя РНК способами ОТ-ПЦР.
Пример 3. Фенотипическое тестирование мутантов пшеницы, содержащих новые аллели Rht-Bl
[0152] Мутанты пшеницы с усиленным ростом, содержащие новые аллели Rht-Bl, тестировали на ряд признаков, которые значимы для практического применения в поле для коммерческого получения пшеницы. Измеряли длину зрелых стеблей, длину колеоптилей и относительное состояние покоя зерна для зерна, получаемого из мутантных растений, и сравнивали с контрольными растениями. Данные приведены в таблице 4. Длину стебля зрелых растений оценивали в различных условиях орошаемых полей (т.е. с хорошим водоснабжением) и в различных сезонах. В большинстве случаев получали четыре независимых точки данных и использовали для расчета средних, представленных в таблице 4, которые выражены в виде процентов относительно растений Rht-Bla. Различные аллели приводят к различной длине стебля, где некоторые примеры (например, Rht-Blc. 6, с. 8, с.21) являются вполне карликовыми, а другие {Rht-Blc.11, с.25, с.31) являются такими высокорослыми, как изолиния Rht-Bla. В большинстве случаев между линиями, которые несут один и тот же аллель, существуют небольшие вариации. На основе полукарликовости, наблюдаемой у растений изолинии Rht-Blb, которая составляла приблизительно 81% высоты растения дикого типа (высокорослого), выявили 15 новых аллелей, которые приводили к той же степени карликовости, например, в диапазоне 75-91% от высокорослого растения.
[0153] Также у мутантных растений измеряли длину колеоптилей и рассчитывали как процент от средней длины колеоптиля у растений Rht-Bla. Значения средней 2-4 независимых измерений приведены в таблице 4. Наблюдали большую вариацию длины колеоптилей в линии, чем выявили для длины стебля. Частично это может быть связано с различиями между зернами, происходящими с поля и из теплицы. Выращиваемые в поле зерна доступны для абсолютного большинства линий в следующий сезон выращивания, и проводят дополнительные измерения колеоптилей.
Ожидают, что они продемонстрируют меньшую вариацию. В целом наблюдали общую положительную корреляцию между длиной стебля и длиной колеоптиля. В некоторых случаях необходима дополнительная работа для оценки статистической значимости различий, где наблюдали нарушение корреляции.
[0154] Состояние покоя зерен большинства мутантных линий оценивали для зерна, собираемого за два полевых сезона. В обоих сезонах высокорослые изолинии Maringa и изолинии Maringa Rht-Blb демонстрировали кратковременное состояние покоя, тогда как изолиния Rht-Blc обладала относительно долговременным состоянием покоя. Наблюдали существенные различия в относительных показателях состояния покоя зерна между различными линиями с усиленным ростом. На фигуре 9 представлены данные для некоторых линий в сравнении с контролем. Особый интерес представляли аллели, которые обеспечивали подходящую полукарликовую высоту растений и сохраняли существенное состояние покоя зерна, такие как Rht-Blc.9, с.17, с.22, с. 23, с. 24, с. 26, с.27) . Они включают четыре полукарликовые линии, в настоящее время подвергающиеся возвратному скрещиванию с элитными линиями.
[0155] Многие из линий на третий сезон тестировали в поле. Данные по высоте растений и показатели состояния покоя представлены в таблице 8. Результаты согласовывались с трендом предыдущих двух сезонов, демонстрируя, что зерну некоторых мутантных линий необходимо значительно более длительное хранение ("дозревание") для прорастания 50% зерен в стандартном тесте прорастания (пример 1). Хотя тренд в отношении состояния покоя между линиями и контролем оставался одинаковым от сезона к сезону, абсолютные количества для любой линии от сезона к сезону варьировали.
Пример 4. Выделение мутантов ячменя с усиленным ростом
[0156] Для выделения мутантов ячменя с усиленным ростом в качестве исходного материала выбирали три карликовых мутанта ячменя "Himalaya". Каждый мутант содержал определенную однонуклеотидную замену в гене, вовлеченном в (i) биосинтез GA, а именно Grd2, кодирующем САЗ-оксидазу, (ii) рецептор GA
"GID1", кодируемый геном Gsel, и (iii) ответ на GA, а именно ген Slnl, кодирующий белок DELLA ячменя. Зерна каждой карликовой линии обрабатывали азидом натрия, высевали в поле и позволяли самооплодотворяться с получением семян Ml. Их высаживали с получением растений Ml, из которых собирали зерна Мг. Полученные проростки Мг выращиваемые в почве подвергали скринингу на стадии второго листа на проростки, демонстрирующие более быстрый рост, чем их карликовые сибсы. Всего из высеянных приблизительно 106 зерен получили три различных категории мутантов, представляющие приблизительно 50000 колосьев Mi.
[0157] Первая категория, наиболее соответствующая настоящей заявке, включала 22 растения, которые росли более быстро, чем их карликовые сибсы. Они были полностью фертильны и их растения-потомки были однородны и демонстрировали быстрый рост. В каждом случае присутствие исходной мутации карликовости подтверждали посредством секвенирования соответствующего фрагмента ПЦР. Их скорости удлинения листьев были выше, чем ожидалось на основе присутствия мутации карликовости. Они демонстрировали диапазон степени усиления роста от некоторых растений со скоростями удлинения листьев незначительно, но значимо большими, чем у их карликового родителя, до других, у которых удлинение происходило также быстро или даже немного быстрее, чем соответствующие высокорослые растения дикого типа (см. ниже). Высота различных мутантов с усиленным ростом при достижении зрелости находилась в диапазоне от промежуточной между карликовым родителем и диким типом до такой же высокорослости как у дикого типа.
[0158] Вторая категория, получаемая только на генетической основе карлика Slnld, включала три растения, которые росли более быстро, чем их карликовые сибсы, но все еще сохраняли определенную степень карликовости. В следующем поколении потомство этих растений состояло из карликовых и типичных удлиненных утонченных растений в соотношении приблизительно 3:1. Дополнительный анализ (ниже) продемонстрировал, что они содержали новые аллели slnl, у которых вторая мутация функционировала в качестве внутригенного супрессора мутации
Slnld.
[0159] Третья категория, наблюдаемая на основе карликов с затронутым биосинтезом GA и рецептором GA, состояла из типичных удлиненных утонченных мутантов. Их легко распознавали по их характерному сильно удлиненному фенотипу и бледно-зеленой окраске и, после пересадки, по их сильно удлиненным стеблям и стерильности. Этот класс мутантов ожидался, так как нуль-аллели удлиненности slnl являются эпистатическими для дефектов в биосинтезе GA или функции рецепторов GA (Chandler and Robertson, 1999).
Пример 5. Идентификация мутаций ячменя и исследования генетического сцепления
[0160] Из утонченных растений трех сегрегирующих линий на основе карлика Slnld (вторая категория выше) получали ДНК и секвенировали ген Slnl. Растения каждой линии содержали различные новые мутации в гене Slnl, приводящие к преждевременному кодону терминации трансляции в открытой рамке считывания (ORF). Новые мутантные аллели представляли собой производные Slnld и, таким образом, названы Slnld.1, Slnld.2r Slnld.3 (таблица 1) . Они представляют собой новые внутриаллельные мутации, где вторая мутация преобразует локус карликовости Slnld в типичный аллель с потерей функции, аллель удлиненности slnl. Эти растения далее не исследовали.
[0161] У каждого из мутантов с усиленным ростом (первая категория выше) секвенировали весь ген Slnl с подтверждением сохраняющегося присутствия аллеля Slnld и для определения возникновения других мутаций в этом гене, так как он являлся одним из нескольких генов-кандидатов, у которых новая мутация могла приводить к фенотипу усиленного роста. Новые мутации в ORF Slnl найдены в 2 0 из 22 растений. Мутации определяли одиннадцать новых аллелей гена Slnl. Некоторые из растений несли идентичные мутации и предположительно являлись сибсами. Семь из новых аллелей усиленного роста Slnl возникли на основе карлика Slnld и, таким образом, представляли собой аллели, содержащие внутригенные супрессорные мутации. Их назвали Slnld.4 - Slnld.10. Три мутации возникли на основе grd2b
{slnlm, slnlo, slnls) и одна возникла на основе gseln (slnln). Каждый из новых аллелей отличался от своего родительского аллеля однонуклеотидной заменой, которая приводила к замене одной аминокислоты в последовательности белка SLN1. Полученные замены аминокислот приведены в таблице 1 (линии TR). Они возникали в С-концевых 60% белка SLN1, соответствующих домену GRAS, и все соответствовали аналогичным мутациям у мутантов пшеницы, описанных выше. Наблюдали два идентичных события мутации, которые приводили к замене аминокислоты G82 9A, одна происходила в популяции мутантов Slnld. 7, а другая в популяции slnls. Они представляли собой независимые события мутаций, так как первый представлял собой производное аллеля Slnld, тогда как второй возникал в гене Slnl дикого типа на основе карлика grd2b.
[0162] В двух оставшихся линиях с усиленным ростом (TR2 6, TR103) отсутствовали какие-либо новые мутации в ORF Slnl и потенциально присутствовали мутации в других генах. Они возникали на основе карлика Slnld. Растения этих линий скрещивали с Himalaya вместе с Slnld.5 в качестве положительного контроля для оценки генетического сцепления аллеля карликовости Slnld и нового аллеля усиленного роста. Популяция F2 после скрещивания контрольного WT * Slnld.5 демонстрировала ожидаемое распределение максимальной скорости удлинения листьев 3:1 {Slnld.5:WT). Индивидуальных растений F2 с замедленной скоростью скорость роста родительского Slnld не наблюдали, что указывало на полное сцепление исходной мутации карликовости и вторичной мутации усиленного роста в этой относительно небольшой популяции. Таким образом, вторичная мутация представляла собой внутригенную супрессорную мутацию. Подобный результат наблюдали для популяции F2 TR103 * WT, что указывало на то что мутация усиленного роста у TR103 демонстрировала полное сцепление с Slnld. В отличие от этого популяция F2 TR2 6 * WT содержала большинство проростков со скоростями роста, такими же, как Slnld, приблизительно 25% со скоростями роста, такими же, как у WT, и некоторые проростки с промежуточными скоростями роста. Эти результаты согласуются с
тем, что мутация усиленного роста в TR2 6 находится в гене, который не сцеплен с Slnl.
[0163] У TR2 6 секвенировали несколько других генов-кандидатов передачи сигнала GA. Ген-кандидат рецептора GA
(Gsel) и два гена-кандидата F-box имели такую же последовательность как и у дикого типа, но в последовательности Spindlyl выявили однонуклеотидную замену (spyla, таблица 1), которая приводила к замене аминокислоты в шестом мотиве TPR SPY1. У Arabidopsis эта область важна для активности SPY, так как она содержит несколько мутантных аллелей (Silverstone et al. , 2007) . SPY1 кодирует отрицательный регулятор передачи сигнала GA, который впервые идентифицирован у Arabidopsis, но позже показано, что в ячмене (Robertson et al., 1998) и рисе
(Shimada et al., 2 006) существуют функционально родственные гены.
[0164] В итоге, 22 мутанта ячменя с усиленным ростом представляли 13 независимых событий мутаций. Одиннадцать из них представляли собой новые аллели Slnl, которые вызывали замены одиночных аминокислот в SLN1. Двенадцатая была тесно сцеплена с Slnl, но находилась в неопределенной области, возможно представляя собой мутацию промотора, и тринадцатая представляла собой новый аллель в несцепленном гене, Spyl.
Пример 6. Скорости удлинения листьев ячменя, несущего новые аллели Slnl
[0165] Надежную меру восприимчивости к GA представляла собой максимальная суточная скорость удлинения (LERmax) , достигаемая первым листом в стандартных условиях, (Chandler and Robertson, 1999) и, таким образом, ее определяли для всех линий ячменя с усиленным ростом и их предков (таблица 5) . У всех тринадцати исходных линий с усиленным ростом наблюдали значимо более высокие величины LERmax, чем у их соответствующих карликовых родителей, хотя степень усиления роста варьировала в зависимости от аллеля. Три аллеля усиленного роста {slnlm,. slnln и slnls) сравнивали в их исходной карликовой генетической основе, а также после возвратного скрещивания с высокорослым растением на основе WT. Скорости роста были систематически ниже
в карликовых основах, указывая на то, что аллели усиленного роста все еще находились под влиянием сниженной передачи сигнала GA, являющейся результатом поврежденного биосинтеза GA или поврежденной функции рецептора GA. В основе дикого типа аллели усиленного роста имели тенденцию увеличивать скорости роста.
Пример 7. Продукция а-амилазы полузернами с эндоспермом
[0166] Продукция а-амилазы полузернами с эндоспермом ячменя дикого типа зависит от присутствия активного GA. Таким образом, мониторинг а-амилазной активности в отсутствие активного GA обеспечивает удобную меру степени "базальной" передачи сигнала GA у мутантов. Две контрольные линии с нормальной чувствительностью к GA (WT, grd2b) через 72 часа инкубации с GA3 демонстрировали почти 15-кратное увеличение а-амилазной активности по сравнению с базальными уровнями
(таблица 5) . Когда исследовали мутантов с усиленным ростом и их карликовых родителей, исходный уровень а-амилазной активности у зрелых полузерен с эндоспермом был очень низким, но при инкубации некоторых линий с усиленным ростом {Slnld.4, Slnld.lr Slnld.8r Slnld.9; Slnld,spyla; grd2b,slnlm; grd2b,slnlo; grd2b,slnls) демонстрировали увеличенную продукцию а-амилазы относительно из карликового родителя, тогда как у других
{Slnld. 5, Slnld. 6, Slnld. 10; gseln, slnln) этого не наблюдали. Среди производных Slnld с усиленным ростом, производное Slnld.9 было необычным, накапливая очень высокие уровни а-амилазы через и 42 часа, и через 72 часа инкубации, несмотря на то, что эта линия демонстрировала только умеренное восстановление скорости роста (таблица 5) .
Пример 8. Другие признаки, ассоциированные с аллелями усиленного роста
[0167] Растения линий с усиленным ростом по виду в течение роста и при созревании были близки к нормальным за исключением различий в общей высоте. Существует диапазон высот у девяти производных Slnld с усиленным ростом, хотя ни одно при созревании не было таким же высокорослым как дикий тип. Длина колеоптиля линий с усиленным ростом варьировала в общем
соответствии со значениями LERmax и с конечной высотой растения.
[0168] Одной общей характеристикой мутантных растений ячменя с усиленным ростом было то, что они продуцировали более крупные зерна, чем их карликовые родители. В различных урожаях в различных сезонах роста размеры зерен в основном были промежуточными между родительским карликом (масса зерна приблизительно 4 0 мг) и высокорослым диким типом (масса зерна приблизительно 55 мг). Однако несколько линий с усиленным ростом, которые при созревании были такими же высокорослыми как дикий тип обладали значительно большими колосьями и зернами. В различных тепличных поколениях зерна дго!2Ь и slnlm в среднем были на 40% больше, чем зерна карликового родителя дго!2Ь. Когда проводили возвратное скрещивание с основой Himalaya, наблюдали 2 0% среднее увеличение наблюдаемой массы зерна, а при ауткроссинге с коммерческим сортом Sloop, наблюдали 15% увеличение в материале ВС2. Полный анализ проводили, когда стали доступны сестринские линии Sloop ВСз.
Пример 9. Описание некоторых совершенных маркеров [0169] Новые аллели Rht-Blc у пшеницы или ячменя легко вводить в селекционные программы и их можно отслеживать посредством отбора при помощи маркера с использованием универсального совершенного маркера для аллелей усиленного роста. Например, для пшеницы это включает амплификацию ПЦР между двумя праймерами, один из которых находится в области вставки 2062 нуклеотидов в гене Rht-Blc, а другой находится вне вставки, например, в кодирующей области Rht-Bl. Амплификация соответствующего продукта происходит только когда матричная ДНК происходит из растительного материала, который содержит по меньшей мере одну копию аллеля усиленного роста. Два их примера приведены в таблице 2. Эти амплификации можно использовать для простого различения новых аллелей, происходящих из Rht-Blc, с другим аллелем полукарликовости Rht-Blb и геном полукарликовости Rht-Dlb. Маркеры для гена Rht-Bl, отличного от аллеля Rht-Blc или его производных аллелей можно легко получать с использованием пары праймеров, которая фланкирует участок вставки в Rht-Blc.
Пример 10. Возвратное скрещивание выбранных аллелей с другими сортами пшеницы
[0170] Исследования скрещивания у ячменя, как описано выше, продемонстрировали 100% совместное наследование у мутантных аллелей Rht-Bl и фенотипом усиленного роста. У пшеницы проводили два эксперимента по скрещиванию. В первом растении шести линий с усиленным ростом скрещивали с гомозиготами Maringa по аллелю Rht-Blb (полукарликовость), а растения других четырех линий скрещивали с гомозиготами Maringa по аллелю Rht-Bla дикого типа (высокий рост). Потомство F1 подвергали самоопылению с получением растений F2. Наличия карликовых (гомозиготных по Rht-Blc) растений в поколении F2 не детектировали ни в одном случае, что указывает на то, что для каждой из десяти линий наблюдали 100% генетическое сцепление между новыми аллелями Rht-Bl и фенотипом усиленного роста, и новая мутация, подавляющая карликовость, находилась в гене Rht-Bl, а не в другом месте генома. В скрещиваниях с Rht-Blb в потомстве F2 продемонстрированы ожидаемые профили наследования для аллелей усиленного роста и Rht-Blb, т.е. соотношение гомозигот:гетерозигот:гомозигот 1:2:1. В одном из скрещиваний родитель с усиленным ростом (линия TR550, Rht-Blc.8) наблюдали в значительной степени более карликовым, чем Rht-Blb, и популяция F2 демонстрировала сегрегацию по высоте (гомозиготы с усиленным ростом = 65 см, гетерозиготы = 8 0-85 см, гомозиготы Rht-Blb = 95-100 см) в соотношении, не значимо отличающемся от 1:2:1, что означает, что фенотип определяли по различию в одном гене. Важно, что этот умеренно карликовый аллель усиленного роста в линии TR550 был ассоциирован с длительным состоянием покоя. Кроме того, популяция F3 зерен выращенных в поле растений F2 демонстрировала длительное состояние покоя для гомозиготных по Rht-Blc.8 растений F2, промежуточное состояние покоя для гетерозиготных по Rht-Blc.8/Rht-Blb растений F2 и кратковременное состояние покоя для гомозиготных по Rht-Blb растений F2. Этот результат означает, что аллель усиленного роста после скрещивания является определяющим для фенотипов высоты и состояния покоя.
[0171] Четыре линии, скрещиваемые с Rht-Bla Maringa, представляли собой линии, обозначаемые 544, 612, 705 и 791 (таблица 4), несущие аллели Rht-Bl Rht-Blc.22, RhtBlc.23, Rht-Blc. 24 и Rht-Blc.26, соответственно. В каждом случае в поколении F2 наблюдали ожидаемое соотношение генотипической сегрегации. Растения F2, гомозиготные по аллелю усиленного роста, демонстрировали ожидаемое уменьшение высоты и увеличение состояния покоя, что означало, что мутантные аллели Rht-Bl можно скрещивать с другими генетическими основами и они сохранят фенотипический эффект. Это также означало генетическое сцепление двух фенотипов, а именно полукарликовой высоты растений и более длительного состояния покоя, обуславливаемых мутантными аллелями Rht-Bl.
[0172] Во втором эксперименте выбранные аллели усиленного роста вводили в элитные селекционные линии посредством возвратного скрещивания с целью замещения их существующего гена полукарликовости {Rht-Blb или Rht-Dlb) новым аллелем усиленного роста. Это проводили для комбинации фенотипа полукарликовой высоты при созревании с другими благоприятными признаками, такими как улучшенная всхожесть и увеличенные уровни состояния покоя зерен. Скрещивания проводили с использованием растений линий 544, 612, 705 и 791 в качестве доноров пыльцы с растениями 10 различных элитных сортов пшеницы, а именно Crusader, EGA Gregory, Espada, Lincoln, Magenta, Yitpi, Young, KWS Chasmin, KWS Scirocco, McNeal и Outlook. После всех скрещиваний получали зерна Fi, и высевали для дополнительного возвратного скрещивания трех донорных аллелей с рекуррентными родителями. Для подтверждения гибридности растений F1 использовали маркеры ПЦР. Один из четырех доноров был немного выше, чем растения, несущие Rht-Blb, но три из четырех доноров были очень сходны по высоте друг с другом и с растениями, несущими Rht-Blb (полукарликами). В эксперименты по скрещиванию включают один или два дополнительных аллеля, которые являются немного более карликовыми, чем Rht-Blb, и которые обладают прекрасным состоянием покоя зерна, такие как Rht-Blc.3 и/или Rht-Blc. 17.
Обсуждение
[0173] После мутагенеза карликовых сортов, несущих аллель тяжелой карликовости, выделяли мутанты ячменя и пшеницы с усиленным ростом. Представляющие интерес мутанты сохраняли мутацию, вызывающую тяжелую карликовость в родительских сортах, но росли быстрее, чем родительские растения, вследствие вновь индуцированной мутация в тех же генах Rht-Bl или Slnl. Они характеризуются усиленной передачей сигнала GA, хотя степень усиления была специфична для обоих аллелей и рассматриваемого ответа GA. Результаты указывают на то, что гены Delia {Slnl в ячмене, Rht-Bl в пшенице) являются наиболее частыми участками мутаций усиленного роста. Только в одном случае был вовлечен другой ген - у ячменя один из мутантов с усиленным ростом являлся следствием новой мутации в Spyl.
[0174] Пять независимых свидетельствующих линий поддерживают заключение, что за фенотипы усиленного роста отвечали новые мутации в генах Delia, идентифицированные в настоящей работе, а не несцепленная мутация или мутация в другом гене или просто общее следствие обработки мутагеном. Во-первых, для каждого из 13 мутантов ячменя секвенирован "контрольный" ген {Gsel) приблизительно такой же длины, как и Slnl, и ни в одном случае не детектировали замен оснований. Во-вторых, наблюдаемые мутации были почти исключительно (у 30 из 31 мутанта) заменами G на А, при условии, что С на Т представляет G на А в противоположной цепи ДНК, сходно с предыдущими наблюдениями за индуцированными азидом мутантами по другим локусам, включая Gsel (рецептор G) , Slnl, гены биосинтеза GA и биосинтеза крахмала. Вследствие вырожденности генетического кода можно спрогнозировать, что при случайных заменах G на А, 33% не приведут к соответствующим заменам аминокислот. Однако у более чем 90 вновь индуцированных мутантов, где каждый содержал мутацию в открытой рамке считывания в этих различных генах ячменя не наблюдали ни одного случая молчащей замены нуклеотида. Это отсутствие указывает на то, что мутации отбирали только когда аминокислотная замена нарушала функцию белка, приводя к изменениям фенотипа. В
третьих, идентифицированные мутации почти всегда затрагивали
аминокислотные остатки, которые являлись консервативными.
Например, мутации DELLA у видов злаков и таксономически
далекого Arabidopsis затрагивали аминокислотные остатки,
которые были идентичными, только с двумя или тремя
исключениями. Это можно наблюдать на фигуре 8, которая
демонстрирует выравнивание белков GAI пшеницы Rht-Bla и
Arabidopsis, демонстрируя идентичные консервативные
аминокислоты в двух последовательностях. Замена
высококонсервативных аминокислотных остатков с намного большей вероятностью приводит к функциональному нарушению активности белка, чем замены низкоконсервативных остатков. В-четвертых, независимые схемы мутагенеза давали примеры идентичных мутаций и, таким образом, соответствующих идентичных замен аминокислот, индуцированных у ячменя, у ячменя и пшеницы и у пшеницы. В-пятых, когда проводили исследования сцепления, после скрещивания и последующей сегрегации, всегда наблюдали 100% сцепление между мутантными фенотипами и мутантными последовательностями генов.
[0175] Аллели усиленного роста усиливают передачу сигнала GA и, таким образом, наиболее вероятно снижают количество белка DELLA или его функциональную активность, последнее вероятно затрагивает его взаимодействия с другими белками. В некоторых случаях дифференциального сплайсинга, также существовал потенциал образования белков DELLA с различными вставками аминокислот в рамку считывания. Например, мутанты иногда продуцировали вставки, более короткие или более длинные, чем вставка 30 аминокислот в белок Rht-Blc. Замены аминокислот могут приводить к увеличенному разрушению DELLA, если они приводили к более сильной аффинности к комплексу GA-GID1 или к субъединице F-box. Маловероятно, что случайные замены усилят белковые взаимодействия, хотя при эффективном скрининге мутантов все-таки можно получать очень редкие события. Предыдущие попытки определить содержание белка DELLA в различных частях растений пшеницы посредством способов с антителами были безуспешными (Pearce et al., 2011) . Авторы
изобретения полагают, что более вероятным является то, что мутантные белки DELLA, полученные, как описано выше, обладают сниженной аффинностью к другим взаимодействующим белковым партнерам. Значительное количество замен аминокислот происходило в мотиве LHR1, области, которая у Arabidopsis вовлечена во взаимодействия с PIF4 и PIL5 (de Lucas et al., 2 008; Feng et al. , 2 008) . Различное воздействие конкретных аллелей усиленного роста на рост в сравнении с продукцией ос-амилазы у ячменя свидетельствует, что различные области белка DELLA для регуляции этих двух ответов взаимодействуют с различными белковыми партнерами.
[0176] Неожиданным оказалось то, что почти все идентифицированные мутации усиленного роста были в одном гене, особенно в гене, для которого показано, что он фундаментально важен для контроля роста в ряде видов растений в контролируемых и полевых условиях. Преобладание новых аллелей в гене Delia, закодированного у пшеницы и ячменя, подчеркнуло важность этого гена для контроля роста. Например, среди производных карлика с изменением биосинтеза GA с усиленным ростом, мутантов, которые могли увеличить содержание активных GA, например, таких как, мутации в генах катаболизма GA, не идентифицировали, несмотря на большие количества проанализированных мутантов. Успех в получении множества новых мутантов у пшеницы является следствием того факта, что карликовость вследствие полудоминантных аллелей, таких как Rht-Blc, фактически являлась диплоидным признаком, затрагивающим только один из трех геномов. Это обеспечило отбор ряда производных аллелей с потерей функции (относительно Rht-Blc) , многие из которых включают внутригенные вторичные мутации.
[0177] В обоих видах новые аллели выявляли по агрономически важному признаку, а именно высоте растения. Кроме того, наблюдали вариацию других зависимых от GA признаков, некоторые из которых представляли практический интерес. У ячменя наблюдали более крупный размер зерна и увеличенную продукцию а-амилазы без необходимости в добавлении GA. Оба
признака считают полезными, например, для увеличенной жизнеспособности раннего проростка и улучшенной эффективности соложения, соответственно. Большая коллекция мутантов пшеницы включала мутанты с диапазоном в степени карликовости кроме существования аллелей полукарликовости Rht-1, что по ожиданиям имеет значение в направление конкретных аллелей в конкретные окружающие среды (Flintham et al., 1997) . Также наблюдали значительную вариацию других зависимых от GA признаков с практическим значением, например, увеличенной длины колеоптиля относительно растений, гомозиготных по Rht-1, и более длительное состояние покоя зерна относительно растений, гомозиготных по Rht-Bla или Rht-Blb. Эти аллели должны функционировать в качестве основных генетических детерминант при введении ряда признаков в селекционные линии под контролем совершенных молекулярных маркеров, доступных для гена.
Линии, генотипы и мутации ячменя
[0178] Гены Delia являются высококонсервативными у различных видов. Сравнения последовательностей белка пшеницы Rht-Bla белков Arabidopsis thaliana GAI представлено на фигуре 8. Как можно видеть, существовала большая степень идентичности между этими белковыми последовательностями у различных видов. Важно, что из 2 0 замен аминокислот, найденных у мутантов пшеницы с усиленным ростом, все, за исключением двух или трех, находились в аминокислотах, консервативных в полипептидах, кодируемых генами пшеницы и Arabidopsis. Это убедительно поддерживает то, что остатки в этих конкретных положениях в белках DELLA у различных видов являются особенно важными для активности.
M763seg2
Slnld/Slnld. 1
G2 94A3
W98ter3
Это
исследование
M778seg2
Slnld/Slnld.2
G1041A3
W347ter3
M783seg2
Slnld/Slnld.3
G18 3 9A3
W613ter3
TR1
Slnld. 4
C1469T3
S490F3
TR9
Slnld. 5
G8 3 9A3
R2 8 0H3
TR13
Slnld. 6
G8 03A3
R268H3
TR2 6
Slnld, spy la
G812A (Spyl)
G271D (SPY1)
TR564
Slnld. 7
G82 9A3
A277T3
TR604
Slnld. 8
G691A3
V2 31M3
TR1004
Slnld. 9
G14 42A3
R481H3
TR1034
TR107
Slnld.10
G844T3
V282F3
grd2b и производные
M463
grd2b
Wolbang et al., 2004
TR216
grd2b, slnls
G829A
A277T
Это
исследование
TR261
grd2b, slnlm
G680A
G227E
тт гт
TR305
grd2b, slnlо
C1454T
S485F
тт гт
gseln и производные
M693
gseln
Chandler et al., 2008
TR407
gseln, slnln
G710A
C237Y
Это
исследование
Другие производные линии
M2404
slnlm
Как указано выше
Это
исследование
M2424
slnln
M2434
slnl s
M244seg2
slnls/Slnld. 7
M2474
spy la
M2 4 8
grd2b, spy la
Координаты относятся к положениям в кодирующей последовательности HvSlnl или аминокислотной последовательности SLN1 Himalaya (номер доступа Genbank АК372064), начиная от ATG и заканчивая TGA. Для TR26 координата относится к положению в кодирующей последовательности HvSpyl (AF03582 0) или аминокислотной последовательности SPY1, начиная от ATG и заканчивая TGA.
2 Зерна представляют собой потомство гетерозигот, сегрегирующих по локусу Slnl как указано (гомозиготные удлиненные утонченные растения являются стерильными).
3 Slnld.1-Slnld.10 представляют собой производные Slnld и в дополнение к указанным новым заменам содержат исходную мутацию Slnld. Только линии с усиленным ростом {Slnld.4-Slnld.10) могут поддерживаться в качестве гомозигот.
4 Показаны линии, полученные после двух возвратных скрещиваний с Himalaya перед отбором на гомозиготность аллеля.
Таблица 2
Нуклеотидные последовательности праймеров для ПЦР,
Линии пшеницы, генотип Rht-Bl и мутации
Аллель Rht-Bl
Мутация в Rht-Blc
Замена аминокислоты или эффект
Rht-Bla
дикий тип
нет
Rht-Blb
Rht-Blc
Вставка
Вставка
Rht-Blc.1
G2 715A
G260E
Rht-Blc.2
G2726A
V2 64M
Rht-Blc.3
G2 7 4 7A
А271Т
Rht-Blc.4
G2829A
G298D
Rht-Blc.5
G2 8 31A
А299Т
Rht-Blc. 6
G2 8 4 9A
А305Т
Rht-Blc. 7
С2865Т
A310V
Rht-Blc. 8
С2966Т
P344S
Rht-Blc. 9
С2972Т
L346F
Rht-Blc.10
G3065A
G377R
Rht-Blc. 11
G3076A
W380ter
Rht-Blc. 12
С3117Т
P394L
Rht-Blc. 13
G3190A
W418ter
Rht-Blc. 15
G3477A
R514H
Rht-Blc.16
С3507Т
T524I
Rht-Blc. 1 7
С3519Т
S528F
Rht-Blc. 18
G3624A
G563D
Rht-Blc. 19
G3697A
W587ter
Rht-Blc. 20
G3874A
W646ter
Rht-Blc. 21
G2792A
V2 8 6M
Rht-Blc. 22
СС2108ТА
P58ter
Rht-Blc. 23
G3047A
D371N
Rht-Blc. 24
G2864A
A310T
Rht-Blc.25
C3071T
Q379ter
Rht-Blc.26
G3671A
E579K
Rht-Blc.27
G148A
сплайсинг
Rht-Blc.28
G148T
сплайсинг
Rht-Blc.29
G147A
сплайсинг
Rht-Blc.30
G2 0 8 4A
сплайсинг
Rht-Blc.31
G2335A
W133ter
Rht-Blc.32
G2 0 8 3A
сплайсинг
Rht-Blc.33
G3841A
W635ter
Rht-Blc.34
G3290T
E452ter
Rht-Blc.35
C2705T
Q257ter
793
2, 0
804
1,0
811
1,0
813
101
827
2, 0
830
845
873
879
1,0
Rht-Blc. 1
Среднее
1,5
2,0
Rht-
610
102
2, 0
Blc. 2
618
1,0
675
1,0
881
884
105
947
2, 0
982
Rht-Blc. 2
Среднее
1,3
Rht-
917
4,0
2, 0
Blc. 3
920
2, 0
2, 0
Rht-Blc. 3
Среднее
3,0
2,0
Rht-
885
4,0
Blc. 4
Rht-
725
3, 0
Blc. 5
Rht-
875
2, 0
Blc. 6
983
2, 0
Rht-Blc. 6
Среднее
2,0
Rht-
543
1,0
2, 0
Blc. 7
602
1,0
606
1,0
608
3, 0
641
646
3, 0
679
1,0
680
1,0
710
2, 0
784
102
1,0
785
1,0
790
1,0
943
1,0
1,0
950
108
1,0
Rht-Blc. 7
Среднее
1,4
Rht-
550
4,0
3, 0
Blc. 8
770
Rht-Blc. 8
Среднее
4,0
3,0
Rht-
703
3, 0
3, 0
Blc. 9
730
2, 0
2, 0
Rht-Blc. 9
Среднее
2,5
2,5
Rht-
886
3, 0
Blc. 10
Rht-
615
100
1,0
Blc. 11
701
1,0
712
2, 0
771
102
1,0
111
103
1,0
782
1,0
786
1,0
792
100
875
Rht-Blc. 11
Среднее
Rht-Blc. 12
687
4,0
Rht-Blc. 13
692
104
1,0
810
103
1,0
846
101
1,0
870
108
1,0
882
1,0
890
100
979
105
1,0
990
Rht-Blc. 13
Среднее
1,0
Rht-Blc. 14
973
4,0
Rht-Blc. 15
911
3, 0
Rht-Blc. 16
510
2, 0
2, 0
Rht-Blc. 17
603
1,0
3, 0
672
3, 0
3, 0
686
2, 0
3, 0
842
2, 0
3, 0
Rht-Blc. 17
Среднее
2,0
3,0
Rht-Blc. 18
613
4,0
671
3, 0
783
1,0
805
105
1,0
Rht-Blc. 18
Среднее
2,3
Rht-Blc. 19
508
2, 0
2, 0
611
1,0
648
112
2, 0
667
1,0
Rht-Blc. 19
Среднее
100
1,5
Rht-Blc. 20
601
614
1,0
622
1,0
647
2,0
649
102
1,0
664
1,0
6 66
1,0
674
1,0
677
1,0
682
1,0
683
1,0
684
1,0
685
103
889
910
1,0
986
122
989
Rht-Blc. 20
Среднее
Rht-
878
3, 0
Blc.21
981
2, 0
Rht-Blc. 21
Среднее
2,5
Rht-
544
4,0
1,0
Blc. 22
Rht-
612
2, 0
3, 0
Blc. 23
623
3, 0
3, 0
Rht-Blc. 23
Среднее
2,5
3,0
Rht-
542
Blc. 24
688
3, 0
705
3, 0
3, 0
722
4,0
3, 0
723
2, 0
3, 0
741
1,0
877
3, 0
2, 0
Rht-Blc. 24
Среднее
2,6
2,8
Rht-
774
102
1,0
Blc. 25
776
100
1,0
Rht-Blc. 25
Среднее
101
1,0
Rht-
717
2, 0
3, 0
Blc. 26
773
2, 0
791
3, 0
3, 0
815
3, 0
Rht-Blc. 26
Среднее
2,7
2,7
Rht-Blc. 27
507
1,0
1,0
605
4,0
1,0
624
2, 0
1,0
880
1,0
1,0
Rht-Blc.27
Среднее
2,0
1,0
Rht-Blc. 28
645
1,0
1,0
Rht-Blc. 29
901
1,0
1,0
Rht-Blc. 30
670
1,0
1,0
678
1,0
1,0
690
1,0
752
1,0
1,0
Rht-Blc. 30
Среднее
1,0
1,0
Rht-Blc. 31
872
102
902
100
912
101
Rht-Blc. 31
Среднее
101
88,3
1,0
Rht-Blc. 32
913
1,0
987
Rht-Blc. 32
Среднее
87,5
1,0
Rht-Blc. 33
644
101
1,0
729
112
1,0
Скорости удлинения листьев и продукция а-амилазы у мутантов
ячменя с усиленным ростом
Линия
Генотип LER
LERmax
а-Амилаза (Ceralpha единицы/зерно) через:
(мм. сут"1)
0 час (xlO3)
42 час
72 час
Him
34,6±0,9
1, 6
0,36±0,08
1,7±0,09
Him (GA3)
52,3±0,1
н. д.
9,81±0,86
23,1±2,8
М640
Slnld
9,2±0,2
1,6
0,21±0,01
0,19±0,05
М640 (GA3)
Slnld
12,1±0,3
н. д.
н. д.
н. д.
TR1
Slnld. 4
23,8±0,5
2,5
0,26±0,01
2, 88±0,27
TR9
Slnld. 5
15,5±0,7
1, 6
0,21±0,01
0,16±0,04
TR13
Slnld. 6
15,8±0,6
1,8
0,20±0,02
0,19±0,04
TR2 6
См. таблицу 6
TR56
Slnld. 7
16,7±0,6
2,7
0,93±0,22
3,24±0,47
TR60
Slnld. 8
28,6±0,9
3, 6
0,82±0,13
3, 76±0, 23
Действие spyla на скорости роста и продукцию а-амилазы
Линия
Генотип
LERmax
(Х-Амилаза (Ceralpha единиц/зерно) через:
(мм. сут
0 час (хЮ3)
42 час
72 час
Himalaya
34,6±0,9
1, 6
0,36±0,08
1,7±0,09
М2 4 7
spyla
37,6±0,7
4, 6
3,33±0,22
12,5±1,2
М640
Slnld
9,2±0,2
1, 6
0,21±0,01
0,19±0,05
TR2 6
Slnld, spyla
17,1±0,4
2,3
0,66±0,10
2,84±0,46
М463
grd2b
17,7±0,6
2,1
0,53±0,1
3,7±0,3
Длина колеоптилей (в мм) линий ячменя с усиленным ростом
Линия
Генотип
Длина колеоптиля (мм)
Himalaya
100,3±1,6
М640
Slnld
32,б±1,8
TR1
Slnld. 4
65,8±3,1
TR9
Slnld. 5
40,7±2,4
TR13
Slnld. 6
45,2±1,8
TR2 6
Slnld, spyla
50,9±1,0
TR56
Slnld. 7
60,7±2, 1
TR60
Slnld. 8
80,7±2,5
TR100
Slnld. 9
66,9±1,7
TR103
58,5±1,5
TR107
Slnld.10
44,6±2,0
М463
grd2b
62,4±2,2
TR216
grd2br slnls
84,1±1, 7
TR261
grd2br slnlm
96,4±3,5
TR305
grd2br slnlо
104,4±2,0
М693
gseln
72,0±1,5
TR407
gseln,. slnln
89,7±1,5
М2 4 0
slnlm
123,3±2,7
М242
slnln
119,8±2,3
М2 4 3
slnl s
112,9±4,6
М2 4 7
spyla
101,6±2,5
Таблица 8
Высота растения относительно высокорослого сорта (аллель Rht-Bla) и показатели состояния покоя зерна для растений пшеницы
мутантных линий
Аллель Rht
Высота (% от
Показатель состояния
высокорослого)
покоя*
2012
Rht-Bla
100
Rht-Blb
Rht-Blc
Rht-Blc.1
Rht-Blc.2
Rht-Blc.3
Rht-Blc.4
Rht-Blc.5
Rht-Blc.6
Rht-Blc. 7
1,5
Rht-Blc. 8
Rht-Blc. 9
Rht-Blc. 14
Rht-Blc.15
0,5
Rht-Blc.16
Rht-Blc. 1 7
Rht-Blc. 18
1,5
Rht-Blc. 21
Rht-Blc. 22
Rht-Blc. 23
Rht-Blc. 24
3,5
Rht-Blc.26
3,5
Rht-Blc. 27
1,5
Rht-Blc. 28
Rht-Blc.29
0,5
Rht-Blc. 30
Rht-Blc.36
* Показатель состояние покоя рассчитывали как количество недель хранения зерна до прорастания 50% зерен в тесте прорастания
ссылки
Achard et al., (2009). J. Exptl Bot. 60, 1085-1092. Arana et al. , (2011). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108, 9292-9297.
Asano et al., (2009). Mol. Genet Genomics 281, 223-231.
Carol et al., (1995). Planta 197, 414-417.
Chandler et al., (1999). Plant Physiol. 120, 623-632.
Chandler et al., (2002). Plant Physiol 129, 181-190.
Chandler et al., (2008). Mol. Plant. 1, 285-294.
de Lucas M et al., (2008). Nature 451, 480-484.
Dill et al., (2004). Plant Cell 16, 1392-1405.
Ellis et al., (2005). Theor Appl Genet 111, 423-430.
Feng et al., (2008). Nature 451, 475-479.
Flintham et al., (1997). J. Agric. Sci. 128, 11-25.
Fu et al., (2002). Plant Cell 14, 3191-3200.
Griffiths et al., (2006). Plant Cell 18, 3399-3414.
Hartweck, (2008) . Planta 229, 1-13.
Hirano et al., (2010). Plant Cell 22, 2680-2696.
Hoogendoorn et al. , (1988) . In Miller Т.Е., Koebner, R.M.D., Proceedings of the Seventh International Wheat Genetics Symposium, Institute of Plant Science Research, Cambridge, U.K., pp. 1093-1100.
Ikeda et al., (2001). Plant Cell, 13, 999-1010.
Kuppusamy et al., (2009). Plant Mol. Biol. 69, 375-381.
Monna et al., (2002). DNA Res. 9, 11-17.
Murase et al., (2008). Nature 456, 459-463.
Pearce et al., (2011). Plant Physiol.
DOI:10.1104/pp.Ill.18 3657 .
Peng et al., (1999). Nature 400, 256-261.
Robertson et al., (1998). Plant Cell 10, 995-1007.
Sasaki et al., (2002). Nature 416, 701-702.
Sasaki et al., (2003). Science 299, 1896-1898.
Shimada et al., (2006). Plant J. 48, 390-402.
Shimada et al., (2008). Nature 456, 520-544.
Silverstone et al., (1997). Genetics 146, 1087-1099.
Silverstone et al., (2007). Plant Physiol. 143, 987-1000.
Spielmeyer et al. , (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 99, 9043-9048.
Sun, (2010). Plant Physiol 154, 567-570.
Ueguchi-Tanaka et al., (2005). Nature 437, 693-698.
Willige et al., (2007). Plant Cell 19, 1209-1220.
Wilson et al., (1995). Plant Physiol 108: 495-502.
Wolbang et al., (2004). Plant Physiol 134, 769-776.
Wu et al., (2011). Plant Physiol
DOI:10.1104/pp.Ill.18 52 72.
Yamaguchi, (2008). Annu. Rev. Plant Biol. 59, 225-251.
Yamamoto et al., (2010). Plant Cell 22, 3589-3602.
Zwar et al., (1995). Planta 197, 39-48.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Растение пшеницы, несущее аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
2. Растение пшеницы, несущее аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
3. Растение пшеницы по п.1 или п. 2, где растение пшеницы обладает увеличенной высотой растения относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и сниженной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, когда растения выращивают в одинаковых условиях.
4. Растение пшеницы по любому из п.п.1-3, где растение обладает увеличенной фертильностью и/или дает увеличенный урожай зерна относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc.
5. Растение пшеницы по п. 4, где выход зерна является приблизительно таким же или большим, чем у растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blb.
6. Растение пшеницы по любому из п.п.1-5 с увеличенной длиной колеоптиля относительно растения пшеницы, гомозиготного
1.
по аллелю Rht-Blc, и где длина колеоптиля составляет 80-100%, предпочтительно 85-100% от длины колеоптиля растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla.
7. Растение пшеницы по любому из п.п.1-6, способное к продукции зерна, которое обладает более длительным состоянием покоя относительно зерна, получаемого у растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla.
8. Растение пшеницы по любому из п.п.1-7, где полипептид Rht-Bl содержит одну или несколько замен аминокислот в N-концевом домене относительно аминокислот 1-4 9 SEQ ID N0:5.
9. Растение пшеницы по любому из п.п.1-8, где вставка одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 представляет собой вставку приблизительно 30 аминокислот, последовательность которых предпочтительно представляет собой DSATPPDAPLVAAAGLAANETTHIKISANK (SEQ ID N0:14) или ее вариант, где последовательность варианта отличается от SEQ ID N0:14 заменами, вставками или удалениями не более 5 аминокислот.
10. Растение пшеницы по любому из п.п.1 или 3-9, у которого одна или несколько замен аминокислот в С-концевом домене полипептида Rht-Bl включают замену аминокислоты G2 60, V264, А271, G298, А299, А305, А310, Р344, L346, G377, Р394, R514, Т524, S528, G563, V286, D371, А310, Е579, S493, R283, R271, G274, А280, V234, R484, V285, G230, S488 или С240 относительно SEQ ID N0:5.
11. Растение пшеницы по п.10, у которого замена выбрана из группы, состоящей из G260E, V264M, А271Т, G298D, А299Т, А305Т, A310V, P344S, L346F, G377R, P394L, R514H, T524I, S528F, G563D, V286M, D371N, А310Т, Е579К, S493F, R283H, R271H, G274D, А280Т, V234M, R484H, V285F, G230E, S488F и C240Y.
12. Растение пшеницы по любому из п.п.1 или 3-11, где аллель Rht-Bl содержит вариант последовательности относительно SEQ ID N0:1, где вариант последовательности выбран из группы, состоящей из G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, С2865Т, С2966Т, С2972Т, G3065A, С3117Т, G3477A, С3507Т, С3519Т, G3624A, G2792A, СС2108ТА, G3047A, G2864A и G3671A.
10.
13. Растение пшеницы по любому из п.п.2-11, где аллель Rht-Bl содержит вариант последовательности относительно SEQ ID N0:1, где вариант последовательности выбран из группы, состоящей из G148A, G148T, G147A, G2084A и G2083A.
14. Растение пшеницы по любому из п.п.1-13, гомозиготное по аллелю Rht-Bl.
15. Растение пшеницы по любому из п.п.1-14 с генетической основой, отличной от пшеницы сорта Maringa.
16. Способ получения зерна пшеницы, включающий (i)
выращивание растения пшеницы по любому из п.п.1-15,
предпочтительно в поле в качестве части популяции по меньшей
мере из 1000 таких растений или на площади по меньшей мере 1
гектара, выращиваемых при стандартной плотности выращивания, и
(ii) сбор зерна растений.
17. Способ получения закромов зерна пшеницы, включающий:
a) сбор наземных частей растений пшеницы по любому из п.п.1-15,
b) обмолот и/или провеивание частей растений пшеницы с
отделением зерна от остальных частей растений и с) просеивание
и/или сортировка зерна, отделенного на этапе Ь) , и загрузка
просеянного и/или сортированного зерна в закрома, таким образом
получая закрома зерна.
18. Зерно пшеницы, получаемое из растений пшеницы по любому из п.п.1-15 или получаемое способом по п.16 или 17, несущее аллель Rht-Bl.
19. Зерно пшеницы, несущее аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
20. Зерно пшеницы, несущее аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и
18.
С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
21. Зерно пшеницы по п. 19 или п.20, из которого способно развиться растение пшеницы, когда зерно высевают в почву, где растение обладает увеличенной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc, и сниженной высотой относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla, когда растения выращивают в одинаковых условиях.
22. Зерно пшеницы по любому из п.п.19-21, из которого способно развиться растение пшеницы, когда зерно высаживают в почву, где растение обладает увеличенной фертильностью и/или дает увеличенный выход зерна относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc.
23. Зерно пшеницы по п.22, где выход зерна является приблизительно таким же или большим, чем у растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blb.
24. Зерно пшеницы по любому из п.п.19-2 3, из которого способно развиться растение пшеницы, когда зерно высаживают в почву, где растение обладает увеличенной длиной колеоптиля относительно растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Blc.
25. Зерно пшеницы по любому из п.п.19-2 4, которое обладает более длительным состоянием покоя относительно зерна, получаемого из растения пшеницы, гомозиготного по аллелю Rht-Bla.
26. Зерно пшеницы по любому из п.п.19-2 5, которое
дополнительно характеризуется свойствами растения пшеницы по
любому из п.п.8-15.
27. Зерно пшеницы по п. 19 или п.20, которое обрабатывают
так, что оно больше не может прорастать, которое
предпочтительно представляет собой дробленое, расколотое,
ошпаренное кипятком, расплющенное, гранулированное,
измельченное или размолотое зерно.
28. Клетка пшеницы, несущая аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
29. Клетка пшеницы, несущая аллель Rht-Bl, кодирующий полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
30. Клетка пшеницы по п.2 8 или п.2 9, которая дополнительно характеризуется признаками, определенными в любом из п.п.8-15.
31. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 4 9 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
28.
32. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид Rht-Bl, где полипептид содержит N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5, и где нуклеотидная последовательность аллеля Rht-Bl отличается от нуклеотидной последовательности, указанной как SEQ ID N0:1, по меньшей мере присутствием мутации участка сплайсинга интрона.
33. Молекула нуклеиновой кислоты по п.31 или п.32, которая дополнительно характеризуется признаками, определенными в любом из п.п.8-15.
34. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из п.п.31-33, которая находится в клетке, предпочтительно в клетке пшеницы, такой как клетка эндосперма пшеницы, или в пищевом продукте.
35. Полипептид Rht-Bl, содержащий N-концевой домен и С-концевой домен, где аминокислотная последовательность С-концевого домена по меньшей мере на 98% идентична аминокислотам 50-621 SEQ ID N0:5, и где аминокислотная последовательность полипептида Rht-Bl отличается от последовательности, указанной как SEQ ID N0:5, по меньшей мере (i) вставкой одной или нескольких аминокислот между аминокислотами 49 и 50 SEQ ID N0:5 и (ii) одной или несколькими заменами аминокислот в С-концевом домене относительно аминокислот 50-621 SEQ ID N0:5.
36. Полипептид по п.35, который дополнительно
характеризуется признаками, определенными в любом из п.п.8-11.
37. Полипептид по п. 35 или п.3 6, который находится в клетке, предпочтительно в клетке пшеницы, такой как клетка эндосперма пшеницы, или в пищевом продукте.
38. Способ получения муки пшеницы тонкого помола, непросеянной муки, крахмала, гранул крахмала или отрубей, где способ включает получение зерна по любому из п.п.18-27 и обработку зерна с получением муки тонкого помола, непросеянной муки, крахмала, гранул крахмала или отрубей.
37.
39. Мука пшеницы тонкого помола, непросеянная мука, крахмал, гранулы крахмала или отруби, получаемые способом по п. 3 8 или содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по любому из п.п.31-34 и/или полипептид по любому из п.п.35-37.
40. Способ получения пищевого продукта, включающий смешивание зерна по любому из п.п.18-27 или муки пшеницы тонкого помола, непросеянной муки, крахмала, гранул крахмала или отрубей по п.3 9 по меньшей мере с любым другим пищевым ингредиентом с получением пищевого продукта.
41. Способ получения крахмала, где способ включает получение зерна по любому из п.п.18-27 и обработку зерна с получением крахмала.
42. Способ получения этанола, где способ включает ферментацию крахмала, получаемого из зерна по любому из п.п.18-27, таким образом получая этанол.
43. Способ кормления животного, включающий предоставление животному растения пшеницы по любому из п.п.1-15, зерна пшеницы по любому из п.п.18-27, клеток пшеницы по любому из п.п.28-30 или кормового продукта, содержащего муку пшеницы тонкого помола, непросеянную муку, крахмал, гранулы крахмала или отруби по п.39.
44. Пищевой продукт, содержащий растение пшеницы по любому из п.п.1-15 или его часть, зерно пшеницы по любому из п.п.18-27, клетки пшеницы по любому из п.п.28-30, молекулу нуклеиновой кислоты по любому из п.п.31-33, полипептид по любому из п.п.35 или 3 6 или ингредиент, который представляет собой муку пшеницы тонкого помола, непросеянную муку, крахмал, гранулы крахмала или отруби по п.39.
45. Пищевой продукт по п.44, где пищевой продукт представляет собой квасной хлеб или пресный хлеб, макароны, лапшу, зерновой завтрак, закуску, пирог, пирожное или соусы на основе муки тонкого помола.
46. Способ генотипирования растения или зерна пшеницы, где
способ включает (i) получение образца, содержащего нуклеиновую
кислоту или белок, выделенные из растения или зерна пшеницы и
(ii) детекцию в образце молекулы нуклеиновой кислоты по п. 32
или 33 или полипептида по п.35 или 36.
47. Способ по п.4 6, в котором растение пшеницы несет аллель Rht-Bl, выбранный из группы, состоящей из Rht-Blc.1, Rht-Blc. 2, Rht-Blc.3, Rht-Blc.4, Rht-Blc. 5, Rht-Blc. 6, Rht-Blc.lr Rht-Blc.8, Rht-Blc.9, Rht-Blc. 10, Rht-Blc.12, Rht-Blc.15, Rht-Blc. 16, Rht-Blc. 17 , Rht-Blc.18, Rht-Blc.21 , Rht-Blc.22, Rht-Blc.23, Rht-Blc.24 , Rht-Blc.26, Rht-Blc.27 , Rht-Blc.28, Rht-Blc.29, Rht-Blc.30 и Rht-Blc.32.
48. Способ отбора растения пшеницы из популяции растений пшеницы, где способ включает; i) генотипирование каждого растения в указанной популяции растений пшеницы способом по п. 4 6 или п.47, где указанная популяция растений получена путем скрещивания двух растений, из которых по меньшей мере одно растение представляло собой растение пшеницы по любому из п.п.1-15, и ii) отбор указанного растения пшеницы на основе генотипирования.
49. Способ введения аллеля Rht-Bl в растение пшеницы, где отсутствует указанный аллель, где способ включает;
i) скрещивание первого родительского растения пшеницы со
вторым родительским растением пшеницы, где второе растение
представляет собой растение пшеницы по любому из п.п.1-15, и
ii) возвратное скрещивание потомства растения после
скрещивания на этапе i) с растением того же генотипа что и
первое родительское растение с получением растения с
большинством генотипа первого родителя, но содержащее указанный
аллель Rht-Bl.
50. Способ по п.48, где потомство растения генотипируют на присутствие или отсутствие указанного аллеля способом по п. 4 6 или п.4 7.
51. Способ продажи зерна пшеницы, включающий (а) получение зерна по любому из п.п.18-27, необязательно включающее этапы
(i) культивирования растения по любому из п.п.1-15 и сбора
зерна у растения,
(ii) помещение зерна в контейнер и/или хранение зерна,
и/или
(iii) транспортировки зерна в другое место,
(iii)
и (b) продажу полученного зерна с целью материальной выгоды.
52. Выделенный олигонуклеотид, который содержит по меньшей мере 19 смежных нуклеотидов из полинуклеотида по любому из п.п.31-34, где 19 смежных нуклеотидов включают по меньшей мере одну из замен нуклеотидов, выбранную из группы, состоящей из G2715A, G2726A, G2747A, G2829A, G2831A, G2849A, С2865Т, С2966Т, С2972Т, G3065A, С3117Т, G3477A, С3507Т, С3519Т, G3624A, G2792A, СС2108ТА, G3047A, G2864A, G3671A, G148A, G148T, G147A, G2084A и G2083A, относительно SEQ ID N0:1, или который полностью комплементарен ему.
53. Молекула нуклеиновой кислоты по любому из п.п.31-34, которая функционально связана с промотором, способным контролировать экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты в растительной клетке, или которая находится в векторе или клетке-хозяине.
54. Трансгенное растение, содержащее трансген, который содержит молекулу нуклеиновой кислоты по любому из п.п.31-34, или его растение-потомок, содержащее эту молекулу нуклеиновой кислоты.
По доверенности
Фиг. 3
•V"'
Фиг. 5
4.-
Фиг. 6
консенсус MKREYQDAGGSGGGGGGMGSSEDKMMVS--AAAGEGEEVDELLAALGYKV
JF930277JR -
JF930278_R GS
JF930281_R
51 61 71 81 91
консенсус RASDMADVAQKLEQLEMAMGMGGVGAGAAPDDSFATHIATDTVHYNPTDL
JF930277_R
JF930278~R
JP930281_R
101 111 121 131 141
консенсус SSWreSMLSEbNAPPPPLPPAP-QLNASTSSTVTG-GGYFDbPPSVDSSC
JF930277_R Q
JP930278_R
JF930281_R S S
151 161 171 181 191
консенсус STYALRPIPSPAGAVAPADLSADS-VRDPKRMRTGGSSTSSSSSSSSSLG
JF930277_R G
JF930278~R -- V LG.
JF930281_R .1 T
201 211 221 231 241
консенсус GGARSSWEAAPPVAAAANA- PALPWWDTQEAGIRLVHALIACAEAVQ
JF930277_R G. .
JF930278_R G ' ....
JF930281_R T
251 261 271 281 291
консенсус QENFSAAEALVKQIPLLAASQGGAMRKVAAYFGEALARRVFRFRPQPDSS
JF930277_R '.
JF930278_R
JF930281_R ...b
301 311 321 331 341
консенсус LLDAAFADLLHAHFYESCPYLKFAHFTANQAILEAFAGCRRVHWDFGIK
JF930277_R
JF930278_R ,
JF930281_R
351 361 371 381 391
консенсус QGMQWPALLQALALRPGGPPSFRLTGVGPPQPDETDALQQVGWKLAQFAH
JF930277_R
JF930278_R
JF930281_R •
401 411 421 431 441
консенсус TIRVDFQYRGLVAATLADLEPFMLQPEGEEDPNEEPEVIAVNSVFEMHRli
JF930277_R
JF930278_R •
JF930281_R •
Фиг. 7a
консенсус JF930277_R JF930278JR JF930281~R
451 461 471 481 491
LAQPGALEKVbGTVRAVRPRIVTVVEOEANHNSQTFLDRFTESLHYYSTM
консенсус JF930277_R JF930278_R JF930281~R
501 511 521 531 541
FDSLEGGS SGG - PSEVS SGAAAAPAAAGTDQVMS EVYLGRQICNWACEG
консенсус JF930277_R JF930278J* JF930281~R
551 561 571 581 591
AERTERHETLGQWRNRLGNAGFETVHLGSNAYKQASTLIALFAGGDGYKV
консенсус JF930277_R JF930278JR JF930281~R
601 611 621
EEKEGCLTLGWHTRPLIATSAWRLAAP
Фиг. 7b
о *
+ и
s + >
М * W 0*0
ш + w
й: Й
о * а
Q. + И сл * сл Ц + со
1-5 *
ы * w
Сч I
и * о о + и
о w и
Q X Ы + Q
.и га
н m
¦О1
о о и
СО сл
ь со
,1-5 о 01
1-5
04 Р. <
и5 S
со w
л к
4->
га <и л *
vt>
¦41
<
<
¦ fa
<
00 U
1Л m
к) со
и * а * и *
ей а
fa н о. со 8
+ н
+ о
о ш
fa > и е
го ">
N 1Л
(б и m
ПЗ Щ
сч о
(%) xoododjj
2/11
2/11
3/11
3/11
5/11
6/11
6/11
7/11
7/11
9/11
8/11
9/11
8/11
9/11
8/11
9/11
10/11
9/11
10/11
9/11
10/11
9/11
10/11
9/11
10/11
9/11
10/11
11/11
11/11