|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Изобретение относится к ингибиторам агрегации α-кристаллина и способам использования ингибиторов агрегации α-кристаллина, например, для лечения или профилактики катаракт у индивидуума, страдающего или подвергающегося риску развития катаракт. Изобретение дополнительно относится к высокопроизводительным способам скрининга соединений для модуляции термостабильности белка, где способ включает (a) приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и (b) измерение фазового перехода плавления (T m ) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся T m по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, идентифицируют как фармакологический белок шаперон.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к ингибиторам агрегации α-кристаллина и способам использования ингибиторов агрегации α-кристаллина, например, для лечения или профилактики катаракт у индивидуума, страдающего или подвергающегося риску развития катаракт. Изобретение дополнительно относится к высокопроизводительным способам скрининга соединений для модуляции термостабильности белка, где способ включает (a) приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и (b) измерение фазового перехода плавления (T m ) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся T m по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, идентифицируют как фармакологический белок шаперон.
2420-522099ЕА/071 НЕХИРУРГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ КАТАРАКТЫ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной патентной заявки США № 61/672569, зарегистрированной 17 июля 2012 года, таким образом, полностью включенной посредством ссылки.
ДЕКЛАРАЦИЯ ГОСУДАРСТВЕННОГО ИНТЕРЕСА
[0002] Настоящее изобретение было выполнено при
правительственной поддержке под номером RR024986,
предоставляемой the National Institutes of Health. Правительство обладает определенными правами на изобретение.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Изобретение в основном относится к ингибиторам агрегации а-кристаллина, их применениям и способам скрининга на терапевтически эффективные модуляторы агрегации белка.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ
[0004] Катаракта или помутнение хрусталика глаза представляет собой состояние, поражающее более половины всего взрослого населения в возрасте более 80, где приблизительно 25 миллионов пациентов страдают от этого состояния в Соединенных Штатах Америки. Кроме того, полагают, что катаракты являются основной причиной слепоты во всем мире. аА-кристаллин (сгуАА) и аВ-кристаллин (сгуАВ) составляют тридцать процентов белкового содержимого хрусталика глаза, где они ответственны за поддержание прозрачности хрусталика (Haslbeck et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 12, 842 (2005). сгуАА и сгуАВ принадлежат к семейству малых белков теплового шока (sHSP), которые содержат консервативный домен кристаллина (Bloemendal et al., Prog. Biophys. Mol. Biol., 86, 407 (2004); Haslbeck, выше). После синтеза такие sHSP хрусталика больше не разрушаются, таким образом, различные повреждения накапливаются в течение жизни и в конечном итоге приводят к возрастной катаракте (Haslbeck, выше; Perng et al., J. Biol. Chem., 274, 33235 (1999); Meehan et al., J. Biol. Chem., 279, 3413 (2004); Meehan et al. , J.
Mol. Biol., 372, 470 (2007)) . Аналогично, дестабилизирующие мутации в сгуАВ, такие как R12 0G, приводят к врожденным формам катаракты с ранним началом (Vicart et al., Nat. Genet., 20, 92 (1998)) . При врожденной катаракте сгуАВ склонен к агрегации и образованию амилоидоподобных фибрилл in vitro (Andley et al., PLoS One, 6, el7671 (2011)).
[0005] В настоящее время лечение катаракт включает хирургическую операцию для удаления мутного хрусталика и введения искусственной замены. Хирургическая операция может быть дорогостоящей и не подходит для всех пациентов. Для таких пациентов эффективными являлись бы виды терапии, которые направленно воздействуют на лежащий в основе механизм агрегации белка. Таким образом, в данной области существует потребность в терапевтических средствах и способах скрининга терапевтических средств, которые блокируют образование патологических агрегатов склонных к агрегации белков, таких как сгуАВ (например, агрегатов, ассоциированных с катарактами).
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Изобретение относится к способу лечения или профилактики катаракты, где способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы I:
(I)
где:
оба R1 представляют собой Н, или оба R1 представляют собой
Me;
R2 представляет собой Н или ОН;
пунктирная линия между атомами углерода 5 и б означает необязательную двойную связь;
R3 представляет собой Н или Me; R4 представляет собой Н или Me;
п равно 0 или 1;
R представляет собой
каждый
независимо представляет собой Н или Me, или (b) R6 и один R5 совместно образуют необязательно замещенное б-членное кольцо, и другой R5 представляет собой Me;
пунктирная линия между атомами углерода 12 и 13 представляет собой необязательную двойную связь при условии, что R7 не содержится, когда содержится двойная связь между атомами углерода 12 и 13, и R7 представляет собой Н или Me, когда не содержится двойная связь между атомами углерода 12 и 13;
R8 представляет собой Н или ОН;
оба R9 совместно образуют оксо (=0) , или оба R9 представляют собой водород, и
R10 представляет собой СОгН или линейный или разветвленный Ci-Сбалкил ;
или его пролекарство или фармацевтически приемлемую соль.
[0007] Изобретение также относится к офтальмологической фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый офтальмологический носитель и соединение формулы I.
[0008] В различных аспектах способа и/или композиции соединение формулы I имеет структуру формулы IA или формулы IB:
где каждый R11 независимо представляет собой алкил, СОгН или СОгалкил.
[0009] В более конкретном аспекте способа и/или композиции соединение имеет структуру формулы II:
где R12 представляет собой Н или ОН, и R13 представляет собой или ОН. В одном из аспектов способа и/или композиции соединение представляет собой 5-холестин-ЗЬ,25-диол.
[0010] В различных аспектах способа композицию вводят местно, субконъюнктивально, ретробульбарно, периокулярно, субретинально, супрахороидально или интраокулярно. В различных аспектах способа катаракта представляет собой связанную с возрастом катаракту или диабетическую катаракту. В некоторых аспектах способа индивидуум страдает врожденной формой катаракты с ранним началом. В некоторых конкретных аспектах способа индивидуум имеет мутацию R12 0G и/или мутацию D10 9H в сгуАВ.
[ООН] В некоторых аспектах композиции фармацевтически приемлемый офтальмологический носитель представляет собой циклодекстрин. В конкретном аспекте циклодекстрин представляет собой (2-гидроксипропил)-р-циклодекстрин.
[0012] Кроме того, изобретение относится к
высокопроизводительному способу скрининга соединений для модуляции термостабильности белка, где способ включает: (а) приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и (Ь) измерение фазового перехода плавления (Тт) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся Тт по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, является фармакологическим белком шапероном.
[0013] В различных аспектах способа белок представляет собой образующий амилоид белок или белок, обуславливающий заболевание с потерей функции. В некоторых аспектах образующий амилоид белок выбран из группы, состоящей из Hsp2 7, аА-кристаллина, аВ-кристаллина, (ЗВ2-кристаллина, (ЗВ1-кристаллина,
YD-кристаллина, Hsp22, Hsp2 0, тау, аль фа-синуклеина, IAPP,
бета-амилоида, РгР, хантингтина, кальцитонина, предсердного
натрийуретического фактора, аполипопротеина AI, сывороточного
амилоида А, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2
микроглобулина, гельсолина, кератоэпителина, цистатина, легкой
цепи иммуноглобулина AL и S-IBM. В других аспектах белок,
обуславливающий заболевание с потерей функции, выбран из
группы, состоящей из мутантной р-глюкозидазы, трансмембранного
рецептора кистозного фиброза, гексозаминидазы А,
гексозаминидазы В, р-галактозидазы и альфа-глюкозидазы.
[0014] В некоторых аспектах способа Тт определяют с
использованием устройства для высокопроизводительной
дифференциальной сканирующей флуориметрии.
[0015] В одном из аспектов способа этап измерения включает: (Ы) нагревание белка от 50°С до 80°С в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, (Ь2) охлаждение белка до 25°С, (ЬЗ) поддержание белка при 25°С в течение 10 секунд и (Ь4) измерение флуоресценции белка.
[0016] В различных аспектах способ дополнительно включает повторение этапов (Ы)-(Ь4) от 2 до 30 раз, где каждый повтор этапа (Ы) проводят при постепенно повышающейся температуре. В конкретных аспектах образующий амилоид белок нагревают от 65°С до 8 0°С с шагом повышения температуры на 1°С. В других аспектах (Ы) дополнительно включает после нагревания уравновешивание образующего амилоид белка и тестируемого соединения от 60 до 180 секунд. В различных аспектах способа этап уравновешивания составляет 130 секунд.
[0017] Кроме того, изобретение включает
высокопроизводительную систему скрининга, включающую: (а) образующий амилоид белок; (Ь) устройство, способное измерять фазовый переход плавления (Тт) образующего амилоид белка, и (с) ряд тестируемых соединений.
[0018] В различных аспектах системы скрининга белок выбран из группы, состоящей из Hsp27, аА-кристаллина, аВ-кристаллина, рВ2-кристаллина, рВ1-кристаллина, yD-крисТаллин, Hsp22, Hsp2 0, тау, альфа-синуклеина, IAPP, бета-амилоида, РгР, хантингтина,
кальцитонина, предсердного натрийуретического фактора, аполипопротеина AI, сывороточного амилоида А, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2 микроглобулина, гельсолина, кератоэпителина, цистатина, легкой цепи иммуноглобулина AL и S-IBM.
[0019] В некоторых аспектах системы скрининга устройство представляет собой устройство для высокопроизводительной дифференциальной сканирующей флуориметрии.
[0020] Конкретно предусмотрено использование соединения любой из структурных формул I, IA, IB или II в любых способах, описываемых в настоящем описании, или для получения лекарственных средств для введения в соответствии с любым из способов, описанных в настоящем описании. В связи с этим изобретение относится к соединению из любых соединений со структурными формулами I, IA, IB или II для применения в способе лечения или профилактики катаракты, где способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества соединения.
[0021] Другие признаки и преимущества настоящего
изобретения станут понятны из следующего ниже подробного
описания. Однако следует понимать, что подробное описание и
конкретные примеры, несмотря на то, что указывают на конкретные
варианты осуществления изобретения, приведены только в качестве
иллюстрации, т.к. различные изменения и модификации в рамках
сущности и объема изобретения будут понятны специалистам в
данной области из этого подробного описания. Предполагают, что
весь документ является связанным как единое описание, и следует
понимать, что предусматриваются все комбинации признаков,
описываемых в настоящем описании, даже если комбинация
признаков не встречается вместе в одном и том же предложении
или параграфе, или разделе этого документа. В дополнение к
указанному выше, изобретение в качестве дополнительного аспекта
включает все варианты осуществления изобретения в более узком
объеме каким бы то ни было образом, чем конкретно указанные
выше варианты. Например, если аспекты изобретения описаны как
"включающие" признак, также предусмотрены варианты
осуществления, "состоящие" или "состоящие по существу из" признака.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0022] Изобретение относится к ингибиторам агрегации а-
кристаллина и способам использования ингибиторов агрегации а-
кристаллина, например, для лечения или профилактики катаракты у
индивидуума, страдающего или подвергающегося риску развития
катаракты. Ингибиторы агрегации а-кристаллина по изобретению
представляют собой, например, стеролы, представленные формулой
I, формулой IA, формулой IB и формулой II, и их можно
формулировать в виде офтальмологических фармацевтических
композиций, содержащих фармацевтически приемлемый
офтальмологический носитель. Вследствие того, что катаракты поражают такую большую часть населения (более половины всего взрослого населения в возрасте более 80 лет) и что преобладающим видом лечения является хирургическое вмешательство, описываемые в настоящем описании открытия представляют собой существенное преимущество в нехирургических способах, доступных для лечения катаракт. Кроме того, многие нехирургические виды лечения, используемые в настоящее время, как правило, ингибируют дальнейшую агрегацию а-кристаллина. Следует отметить, что соединения по изобретению способны предотвращать агрегацию а-кристаллина и ингибировать дальнейшую агрегацию а-кристаллина.
[0023] Изобретение дополнительно относится к
высокопроизводительным способам скрининга соединений для модуляции термостабильности белка, где способ включает приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и измерение фазового перехода плавления (Тт) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся Тт по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, идентифицируют как фармакологический белок шаперон.
Способы лечения или профилактики катаракты
[0024] В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способу лечения или профилактики катаракты, где
способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей соединение любой из структурных формул I, IA, IB или II или, например, соединение из таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления катаракта представляет собой связанную с возрастом катаракту, диабетическую катаракту, катаракту, связанную с хирургической операцией, катаракту, возникающую в результате воздействия облучения, катаракту, возникающую в результате генетического заболевания, катаракту, возникающую в результате инфекции, или катаракту, возникающую в результате приема лекарственных средств. В некоторых вариантах осуществления индивидуум страдает наследственной формой катаракты с ранним началом. Например, наследственные формы катаракты включают индивидуумов с мутацией R12 0G и/или мутацией D10 9H в сгуАВ.
[0025] Индивидуум, "нуждающийся" в лечении, по изобретению представляет собой индивидуума, который страдает катарактой. Например, индивидуум может страдать связанной с возрастом катарактой или катарактой, возникающий в результате диабета. Аналогично, индивидуум, "нуждающийся" в лечении, по изобретению представляет собой индивидуума, который подвергается риску развития катаракты. Индивидуумы, подвергающиеся риску развития катаракты, включают, но не ограничиваются ими, индивидуумов с семейным анамнезом развития катаракт, индивидуумов с мутацией, связанной с катарактой с ранним началом, таких как индивидуумы с мутацией R12 0G и/или мутацией D10 9H в сгуАВ, индивидуумов, подвергавшихся облучению, страдающих диабетом и т.п. Например, в одном из аспектов у индивидуума диагностируют катаракту на одном глазе и вводят соединение для профилактики или замедления образования катаракты на противоположном глазе.
[0026] "Лечение" катаракты не предусматривает 100% устранение катаракты. Аналогично, "профилактика" не предусматривает 100% ингибирование образования катаракты. Любое уменьшение помутнения или замедление прогрессирования катаракты представляет собой благоприятное биологическое действие у индивидуума. В связи с этим, изобретение уменьшает катаракту, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере
приблизительно на 10% или по меньшей мере приблизительно на 2 0% по сравнению с уровнями, наблюдаемыми, когда способ по изобретению не применяют (например, у индивидуума группы контроля по биологическим параметрам или в образце, который не подвергают действию соединения способа по изобретению). В некоторых вариантах осуществления катаракта уменьшается по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 4 0%, по меньшей мере приблизительно на 50% или по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере приблизительно на 7 0%, по меньшей мере приблизительно на 8 0%, по меньшей мере приблизительно на 90% или более (приблизительно 100%).
[0027] В некоторых вариантах осуществления "лечение"
катаракт способом по изобретению включает ингибирование
образования катаракты, например, по меньшей мере приблизительно
на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10% или по меньшей
мере приблизительно на 2 0% по сравнению с контрольными
уровнями, наблюдаемыми, когда способ по изобретению не
применяют (например, у индивидуума группы контроля по
биологическим параметрам или в образце, который не подвергают
действию соединения способа по изобретению). В некоторых
вариантах осуществления образование катаракты ингибируют по
меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере
приблизительно на 4 0%, по меньшей мере приблизительно на 50%
или по меньшей мере приблизительно на 60%, по меньшей мере
приблизительно на 7 0%, по меньшей мере приблизительно на 8 0%,
по меньшей мере приблизительно на 90% или более (приблизительно
100%) по сравнению с образованием катаракты при отсутствии
соединения способа по изобретению. Как правило, катаракты
детектируют с использованием любого из ряда оптических тестов,
включая, но не ограничиваясь ими, проверку остроты зрения,
офтальмоскопию, осмотр глаза с помощью щелевой лампы,
кератометрию, тонометрию, проверку контрастной
чувствительности, чувствительности к яркому свету, картирование волнового фронта.
[0028] "Эффективное количество" композиции, содержащей
соединение любой из структурных формул I, IA, IB или II или соединение из таблицы 1, представляет собой количество, которое ингибирует или уменьшает агрегацию образующего амилоид белка, такого как сгуАВ, у индивидуума. Ингибирование агрегации не предусматривает 100% ингибирование агрегации. Любое ингибирование агрегации представляет собой благоприятное биологическое действие у индивидуума. В связи с этим, изобретение ингибирует агрегацию образующего амилоид белка, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10% или по меньшей мере приблизительно на 2 0% по сравнению с контрольными уровнями, наблюдаемыми, когда способ по изобретению не применяют (например, у индивидуума группы контроля по биологическим параметрам или в образце, который не подвергают действию соединения способа по изобретению). В некоторых вариантах осуществления образование агрегатов амилоида ингибируют по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 40%, по меньшей мере приблизительно на 50% или по меньшей мере приблизительно на 60%. В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению ингибирует образование амилоида по меньшей мере приблизительно на 7 0%, по меньшей мере приблизительно на 8 0%, по меньшей мере приблизительно на 90% или более (приблизительно на 100%) по сравнению с образованием амилоида при отсутствии соединения способа по изобретению.
[0029] Аналогично, "эффективное количество" для уменьшения агрегации не предусматривает 100% устранение агрегации. Любое уменьшение агрегации представляет собой благоприятное биологическое действие у индивидуума. В связи с этим, изобретение уменьшает агрегацию образующего амилоид белка, например, по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10% или по меньшей мере приблизительно на 2 0% по сравнению с контрольными уровнями, наблюдаемыми, когда способ по изобретению не проводят (например, у индивидуума группы контроля по биологическим параметрам или в образце, который не подвергают действию соединения способа по изобретению). В некоторых вариантах осуществления агрегаты
амилоида уменьшаются по меньшей мере приблизительно на 30%, по меньшей мере приблизительно на 4 0%, по меньшей мере приблизительно на 50% или по меньшей мере приблизительно на 60%. В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению уменьшает агрегаты амилоида по меньшей мере приблизительно на 7 0%, по меньшей мере приблизительно на 8 0%, по меньшей мере приблизительно на 90% или более (приблизительно на 100%) по сравнению с агрегатами амилоида при отсутствии соединения способа по изобретению. Путь введения
[0030] Как будет понятно специалистам в данной области, наиболее подходящий способ введения соединения индивидууму зависит от ряда факторов. В различных вариантах осуществления соединение по изобретению вводят локально в глаз, например, местно, субконъюнктивально, ретробульбарно, периокулярно, субретинально, супрахороидально или интраокулярно. Например, в различных вариантах осуществления композицию доставляют локально в глаз посредством инъекции. Инъецируемые растворы можно непосредственно инъецировать в роговицу, хрусталик глаза и стекловидное тело или смежные с ним ткани с использованием тонкой иглы. Композицию также можно вводить в виде внутриглазного перфузата.
[0031] Дополнительные предусматриваемые пути введения
включают, но не ограничиваются ими, один или более из
перорального (например, в виде таблетки, капсулы или в виде
раствора для приема внутрь), мукозального (например, в виде
назального спрея или аэрозоля для ингаляции), назального,
парентерального (например, посредством инъецируемой формы),
желудочно-кишечного, интраспинального, интраперитонеального,
внутримышечного, внутривенного, внутриматочного,
интрадермального, внутричерепного, внутритрахеального,
внутривлагалищного, интрацеребровентрикулярного,
интрацеребрального, подкожного, трансдермального, ректального, буккального, эпидурального и сублингвального.
[0032] В некоторых вариантах осуществления способ доставки композиции по изобретению в глаз является таким, как
посредством контактной линзы. Линзу можно предоставлять в предварительно обработанном желаемым соединением виде. Альтернативно, линзу предоставляют в наборе с компонентами для получения покрытой линзы, которые предоставляют в виде лиофилизированных порошков для восстановления или в виде концентрированных или готовых к применению растворов. Композиции можно предоставлять в виде наборов для одноразового или многоразового использования.
[0033] В некоторых вариантах осуществления способ доставки композиции по изобретению в глаз является таким, как посредством офтальмологической палочки (Gwon et al., Ophthalmology, 1986 Sep; 93(9 Suppl) :82-5) . В некоторых вариантах осуществления способ доставки композиции по изобретению в глаз является таким, как посредством введения конструкции на основе гидрогеля в интраокулярную линзу (Garty et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2011 Aug 3; 52 (9): 610916) .
Доза
[0 034] Композицию, содержащую соединение, предоставляют в терапевтически эффективном количестве, которое обеспечивает желаемое биологическое действие на приемлемом с медицинской точки зрения уровне токсичности. Дозирование композиций может изменяться в зависимости от пути введения и тяжести заболевания. Дозирование также можно регулировать в зависимости от массы тела, возраста, пола и/или степени проявления симптомов каждого пациента, подлежащего лечению. Точная доза и путь введения, в конечном итоге, зависят от решения лечащего врача или состояния, подлежащего лечению. Частота введения зависит от состава и указанных выше параметров. Например, желательным может являться применение глазных капель по меньшей мере один раз в сутки, включая 2, 3, 4 или 5 раз в сутки.
[0 035] Иллюстративные дозы соединений для введения человеку (с массой тела приблизительно 7 0 кг) окулярным путем составляют от 0,1 мг до 1 г, например, от 1 мг до 500 мг соединения в стандартной дозе. В различных вариантах осуществления доза составляет приблизительно от 1 мкг/кг массы
тела до 15 мг/кг массы тела. Например, доза может составлять 1 мкг/кг, 5 мкг/кг, 10 мкг/кг, 20 мкг/кг, 30 мкг/кг, 40 мкг/кг, 50 мкг/кг, 60 мкг/кг, 70 мкг/кг, 80 мкг/кг, 90 мкг/кг, 100 мкг/кг, 120 мкг/кг, 140 мкг/кг, 160 мкг/кг, 180 мкг/кг, 200 мкг/кг, 300 мкг/кг, 400 мкг/кг, 500 мкг/кг, 600 мкг/кг, 700 мкг/кг, 800 мкг/кг, 900 мкг/кг, 1 мг/кг, 2 мг/кг, 3 мг/кг, 4 мг/кг, 5 мг/кг, б мг/кг, 7 мг/кг, 8 мг/кг, 9 мг/кг, 10 мг/кг, 11 мг/кг, 12 мг/кг, 13 мг/кг, 14 мг/кг или 15 мг/кг. Иллюстративные дозы соединений для введения человеку (с массой тела приблизительно 7 0 кг) системным путем составляют от 0,1 мг до 5 г, например, от 1 мг до 2,5 г соединения в стандартной дозе.
[0 03б] Предпочтительные концентрации соединения формулы I, IA, IB или II или соединения, приведенного в таблице 1, находятся в диапазоне приблизительно от 1 мкг/мл до 500 мкг/мл, например, приблизительно 1 мкг/мл, приблизительно 2 мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
мкг/мл,
приблизительно
100
мкг/мл,
приблизительно
120
мкг/мл,
приблизительно
140
мкг/мл,
приблизительно
160
мкг/мл,
приблизительно
180
мкг/мл,
приблизительно
200
мкг/мл,
приблизительно
250
мкг/мл,
приблизительно
300
мкг/мл,
приблизительно
350
мкг/мл,
приблизительно
400
мкг/мл,
приблизительно
450
мкг/мл или
приблизительно
500
мкг/мл.
Ингибитор может
содержаться
в комбинации
другими
фармацевтически
активными средствами.
[0037] Композицию по изобретению предоставляют в контейнере в виде концентрированного раствора, который разбавляют перед использованием в подходящем разбавителе, или с готовой к применению концентрацией. Предпочтительно предоставлять однократные дозы в стерильных флаконах.
Соединенияг эффективные для лечения или профилактики катаракты
[0038] В различных вариантах осуществления соединение способа по изобретению или композиция представляет собой соединение формулы I:
(I)
где:
оба R1 представляют собой Н, или оба R1 представляют собой
Me;
R2 представляет собой Н или ОН;
пунктирная линия между атомами углерода 5 и б означает необязательную двойную связь;
R3 представляет собой Н или Me; R4 представляет собой Н или Me; п равно 0 или 1;
(a) R6 представляет собой '2L4-^xR10 г И каждый R5
независимо представляет собой Н или Me, или (b) R6 и один R5 совместно образуют необязательно замещенное б-членное кольцо, и другой R5 представляет собой Me;
пунктирная линия между атомами углерода 12 и 13 представляет собой необязательную двойную связь при условии, что R7 не содержится, когда содержится двойная связь между атомами углерода 12 и 13, и R7 представляет собой Н или Me, когда двойная связь не содержится между атомами углерода 12 и 13;
R8 представляет собой Н или ОН;
оба R9 совместно образуют оксо (=0) , или оба R9 представляют собой водород; и
R10 представляет собой СОгН или линейный или разветвленный
С1-С6алкил.
[0039] Например, соединение способа по изобретению или композиция представляет собой соединение формулы IA или формулы IB:
где каждый R независимо представляет собой алкил, СОгН или С02алкил.
[0040] В различных вариантах осуществления соединение имеет структуру формулы II:
где R12 представляет собой Н или ОН, и R13 представляет собой Н или ОН. В некоторых вариантах осуществления соединение представляет собой 5-холестин-ЗЬ,25-диол.
[0041] Альтернативно, соединение представляет собой соединение, приведенное в таблице 1.
[0042] Предусматривают, что любое пролекарство или фармацевтически приемлемая соль указанных выше соединений входят в объем изобретения.
38362
Диги-токсин
4-[(2S,5S,7R,llS,14R,15R)-5-{ [ (2R,4S,5S,6R)-5-{ [ (2S,4S,5S,6R)-5-{ [ (2S,4S,5S,6R)-4,5-дигидрокси-б-метилоксан-2-ил]окси)-4-гидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-4-гидрокси-б-метилоксан-2-ил]окси)-11-гидрокси-2, 15-
диметилтетрацикло[8.7.0.0Л{2,7} . 0Л {11,15}]гептадекан-14-ил]-2,5-дигидрофуран-2-он
38631
Дезокси-холевая кислота
(4R)-4-[(2S,5R,7R,14R,15R,16S)-5,16-дигидрокси-2,15-
диметилтетрацикло[8.7.0.0Л{2,7} .0Л {11,15}]гептадекан-14-ил]пентановая кислота
H3C CH3
38703
Эноксолон
(2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS,14bR)-10-гидрокси-2,4a,6a,6b,9,9,12a-гептаметил-13-оксо-
1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11, 12,12a,12b,13,14b- икозагидропицен-2-карбоновая кислота
38719
бета-эсцин
(2S,3S,4S,5R,6R)-6-
{ [ (3S,4S,6aR,6bS,8R, 8aR, 9R, 10S, 14bR)
-9-(ацетилOKси)-8-гидрокси-4,8a-
бис(гидроксиметил)-
4,6а,6b,11,11,14Ь-гексаметил-10-
{ [ (2 Z)-2-метилбут-2-еноил]окси}-
1, 2, 3, 4, 4а, 5, 6, 6а, 6Ь, 7, 8, 8а, 9,10,11,
12,12а,14,14а,14Ь-икозагидропицен-3-
ил]окси}-4-гидрокси-З,5-
бис({[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-
тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-
2-ил]окси})оксан-2-карбоновая
кислота
38826
Дигоксин
4-[(2S,5S,7R,llS,14R,15S,16R)-5-{[(2R,4S,5S,6R)-5-{[(2S,4S,5S,6R)-5-{[(2S,4S,5S,6R)-4,5-дигидрокси-б-метилоксан-2-ил]окси)-4-гидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси)-4-гидрокси-б-метилоксан-2-ил]окси)-11,16-дигидрокси-2,15-
диметилтетрацикло[8.7.0.0Л{2,7) . 0Л {11,15}]гептадекан-14-ил]-2,5-дигидрофуран-2-он
38850
Лито-холевая кислота
(4R)-4-[(2S,5R,7R,14R,15R)-5-гидрокси-2,15-
диметилтетрацикло[8.7.0.0Л{2,7) . 0Л {11,15}]гептадекан-14-ил]пентановая кислота
38852
Гитоксин
4-[(2S,5S,7R,10R,llS,13S,14R,15R)-5-{[(2R,4S,5S,6R)-5-{[(4S,5S,6R)-5-{ [ (4S,6R)-4,5-лигидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси)-4-гидрокси-б-метилоксан-2-ил]окси}-4-гидрокси-6-метилоксан-2-ил]окси}-11,13-дигидрокси-2,15-
диметилтетрацикло[8.7.0,0Л{2,7} . 0Л {11,15}]гептадекан-14-ил]-2,5-дигидрофуран-2-он
38857
Глицир-ризи-новая
кислота
(2S,3S,4R,5R,6R)-6-
{ [ (3S, 6aS, 8aS, US, 12aR, 14bS)-11-
карбокси-4,4,6a,8a,11,14b-
гексаметил-14-оксо-
1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11, 12,12a,14,14a,14Ь-икозагидропицен-3-ил]окси)-3-{[(2R,3R,4S,5S,6S)-6-карбокси-3,4,5-тригидроксиоксан-2-ил]окси)-4,5-дигидроксиоксан-2-карбоновая кислота
38866
Лана-тозид С
(2R,3R,4S,6S)-6-{ [ (2R,3S,4S, 6S) -6-{[(2R,3S,4S,6R)-6-{ [ (2S, 5S, US, 14R, 15S, 16R)-11, 16-дигидрокси-2,15-диметил-14-(5-оксо-2,5-дигидрофуран-З-
ил)тетрацикло[8.7.0.0Л)2,7).0Л)11,15 )]гептадекан-5-ил]окси)-4-гидрокси-2-метилоксан-З-ил]окси)-4-гидрокси-2-метилоксан-З-ил]окси)-2-метил-З-{[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-2-ил]окси)оксан-4-илацетат
38894
Кафестол ацетат
[(IS,12R,16R,17R)-17-гидрокси-12-метил-8-
оксапентацикло[14.2.1.0Л{1,13).0Л )4,12).0Л)5,9)]нонадека-5(9),6-диен-17-ил]метилацетат
38938
Кетоко-назол
1- [4- (4-) [ (2R)-2-(2,4-дихлорфенил)
2- (1Н-имидазол-1-илметил)-1,3-диоксолан-4-
ил]метокси)фенил)пиперазин-1-ил]этан-1-он
39166
Хол-11-еновая кислота
(4R)-4-[(2S,7R,14R,15R)-2,15-диметил-5-
оксотетрацикло[8.7.0.0Л)2,7).0' {11,15)]гептадек-16-ен-14-ил]пентановая кислота
39322
Метил-хлорид бензе-тония
бензилдиме тил(2 -{2 -[2-метил-4-(2,4,4-триметилпентан-2-ил)фенокси]этокси)этил)азаний-хлорид
39682
Карбено-ксолон натрия
(2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS,14bR)-10-[(3-карбоксилатопропаноил)окси]-2,4a,6a,6b,9,9,12а-гептаметил-13-
OKCO-
1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11, 12,12a,12b,13,14Ь-икозагидропицен-2-карбоксилат динатрия
h/) сн,
39958
18-альфа-глицир-рети-новая кислота
(2S,4aS,6aS,6bR,10S,12aS,14bS)-10-гидрокси-2,4a,6a,6b,9,9,12a-гептаметил-13-оксо-
1,2,3,4,4a,5,6,6a,6b,7,8,8a,9,10,11, 12,12a,12b,13,14Ь-икозагидропицен-2-карбоновая кислота
40120
Метил-допа
2-амино-З-(3,4-дигидроксифенил)-2-метилпропионовая кислота
40211
Гидрохлорид допамина
Гидрохлорид 4-(2-аминоэтил)бензол-1,2-диола
40270
5-альфа-холес-тан-3-
бета-ол-б-он
(2R,5S,7S,15R)-5-гидрокси-2,15-диметил-14-(б-метилгептан-2-ил)тетрацикло[8.7.0.0Л{2,7).0Л {11,15)]гептадекан-8-он
40274
Урсодиол
(4R)-4-[ (2S,5R,7S,9S,14R,15R)-5, 9-дигидрокси-2,15-
диметилтетрацикло[8.7.0.0Л)2,7).0Л{1 1,15)]гептадекан-14-ил]пентановая кислота
5 ^Y]
,11 хн.
100815
CPD00005
84б0_ Кетокона зол
1- [4- ( 4-{ [ (2R,4S)-2-(2,4-дихлорфенил)-2-(1Н-имидазол-1-илметил)-1,З-диоксолан-4-ил]метокси)фенил)пиперазин-1-ил]этан-1-он
100937
CPD00046
6304_ Финасте-рид
(IS,2R,7R,10S,11S,14S,15S)-N-трет-бутил-2,15-диметил-5-оксо-6-азатетрацикло[8.7.0.0Л{2,7}.0Л{11,15 )]гептадек-З-ен-14-карбоксамид
22428
3-[2-(4-трет-бутилфенил)-2-оксоэтил]-5-хлор-3-гидрокси-2, 3-дигидро-1Н-индол-2-он
22775
метил-4-[(2R,6S,7R)-10-фтор-8-азатрицикло[7.4.0.0Л{2,6)]тридека-1(13),3,9,11-тетраен-7-ил]бензоат
A^NH СН3 /TV У *
108668
N-(4-хлор-2,5-диметоксифенил)-2-[4 -(1Н-1,2,3,4-тетразол-1-ил)фенокси]ацетамид
109888
3-[ (4-хлорфенил)сульфанил]-1-(2,4-диметоксифенил)пирролидин-2,5-дион
112216
1- ( 4-хлорфенил)-3-[ (4,6-
диметилпиримидин-2-
ил)сульфанил]пирролидин-2, 5-дион
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
СНз
0 CI
116781
метил-3-(3-хлорфенил)-4-оксо-10-
окса-3-
азатрицикло[5.2.1.0Л{1,5}]дек-8-ен-6-карбоксилат
Фармацевтические композиции
[0043] Изобретение дополнительно содержит композицию,
содержащую соединение любой из структурных формул I, IA, IB или
II или соединение, приведенное в таблице 1, и фармацевтически
приемлемый офтальмологический носитель, например,
фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, связывающее средство и/или разбавитель. Необязательно композиция содержит свободную кислоту, свободное основание, соль (например, соль присоединения кислоты или основания), гидрат или пролекарство соединения любой из структурных формул I, IA, IB или II, или соединение, приведенное в таблице 1. Пролекарство представляет собой вещество, которое содержит соединение в любой из структурных формул I, IA, IB или II или соединение, приведенное в таблице 1, ковалентно связанное с молекулой носителя. Молекула носителя может отделяться от соединения в любой из структурных формул I, IA, IB или II или соединения, приведенного в таблице 1, in vitro или in vivo, что приводит к получению соединения в любой из структурных формул I, IA, IB или II или соединения, приведенного в таблице 1. Формы пролекарства хорошо известны в данной области, как проиллюстрировано у Sloan К.В., Prodrugs, М. Dekker, New York, 1992; и Testa В. and Mayer J.M., Hydrolysis in drug and prodrug metabolism: chemistry, biochemistry, and enzymology, Wiley-VCH, Zurich, 2003.
[0044] В различных вариантах осуществления композиция содержит соединение любой из структурных формул I, IA, IB или
II или соединение, приведенное в таблице 1, формулируемое в виде глазных капель, инъецируемых растворов или глазных мазей. Такие фармацевтические композиции можно формулировать смешиванием, разбавлением или растворением соединения необязательно с подходящими фармацевтическими добавками, такими как эксципиенты, дезинтегрирующие средства, связывающие средства, смазывающие средства, разбавители, буферы, антисептики, увлажнители, эмульгаторы, диспергирующие средства, стабилизаторы и способствующие растворению средства, в соответствии с общепринятыми способами и формулировать общепринятым способом, который зависит от дозированной формы. Например, глазные капли можно формулировать растворением соединения в стерилизованной воде, в которой растворяют поверхностно-активное средство, и необязательно добавлением подходящих фармацевтических добавок, таких как консервант, стабилизатор, буфер, антиоксидант и улучшитель вязкости. В некоторых вариантах осуществления композиция содержит циклодекстрин. В конкретном варианте осуществления циклодекстрин представляет собой (2-гидроксипропил)-р-циклодекстрин.
[0045] Физиологически приемлемые буферы включают, но не ограничиваются ими, фосфатный буфер или буфер трис-НС1
(содержащий трис(гидроксиметил)аминометан и НС1). Например,
буфер трис-HCl с рН 7,4 содержит 3 г/л
трис (гидроксиметил) аминометана и 0,7 6 г/л НС1. В еще одном аспекте буфер представляет собой 10х фосфатно-солевой буфер
( "PBS") или 5х раствор PBS.
[0046] Другие буферы включают, но не ограничиваются ими,
буферы на основе HEPES (N-{2-гидроксиэтил}пеперазин-N'-{2-
этансульфоновой кислоты}) с рКа 7,5 при 25°С и рН в диапазоне
приблизительно 6,8-8,2; BES (N,N-бис{2-гидроксиэтил}2-
аминоэтансульфоновой кислоты) с рКа 7,1 при 25°С и рН в
диапазоне приблизительно 6,4-7,8; MOPS (3-{N-
морфолино}пропансульфоновой кислоты) с рКа 7,2 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 6,5-7,9; TES (N-трис{гидроксиметил}-метил-2-аминоэтансульфоновой кислоты) с рКа 7,4 при 25°С и рН в
диапазоне приблизительно 6,8-8,2; MOBS (4-{N-
морфолино} бутансульфоновой кислоты) с рКа 7,6 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 6,9-8,3; DIPSO (3-(N,N-бис{2-гидроксиэтил}амино)-2-гидроксипропана) с рКа 7,52 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 7-8,2; TAPSO (2-гидрокси-3{трис(гидроксиметил)метиламино}-1-пропансульфоновой кислоты) с рКа 7,61 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 7-8,2; TAPS
({(2-гидрокси-1,1-бис(гидроксиметил)этил)амино}-1-пропансульфоновой кислоты) с рКа 8,4 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 7,7-9,1; TABS (N-трис(гидроксиметил)метил-4-аминобутансульфоновой кислоты) с рКа 8,9 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 8,2-9,6; AMPSO (N-(1,1-диметил-2-гидроксиэтил)-З-амино-2-гидроксипропансульфоновой кислоты) с рКа 9,0 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 8,3-9,7; CHES
(2-циклогексиламино)этансульфоновой кислоты с рКа 9,5 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 8,6-10,0; CAPSO (3-
(циклогексиламино)-2-гидрокси-1-пропансульфоновой кислоты) с рКа 9,6 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 8,9-10,3; и CAPS (3-(циклогексиламино)-1-пропансульфоновой кислоты) с рКа 10,4 при 25°С и рН в диапазоне приблизительно 9,7-11,1.
[0047] Доступны различные эффективные способы
контролируемого высвобождения активного средства. См., например, Wagh V.D., Inamdar В., Samanta М.К., Polymers used in ocular dosage form and drug delivery systems. Asian J. Pharm., 2, 2008, 12-17 и литературу, цитируемую в них, содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки. Конкретно предусматривают использование полимеров (например, производных целлюлозы, таких как гидроксипропилметилцеллюлоза
(НРМС) и гидроксипропилцеллюлоза (НРС), поли(акриловой кислоты)
(РАА), полиакрилатов, циклодекстринов и природных камедей, полиортоэфиров (РОЕ) и мукоадгезивных полимеров); полутвердных веществ, таких как гели, пленки и другие вставки; смол, таких как ионообменные смолы; ионофоретической системы доставки и коллоидных частиц, таких как микросферы и наночастицы.
[0048] Соединения по изобретению также можно предоставлять в комбинации с другими терапевтическими средствами. В некоторых
вариантах осуществления соединения по изобретению можно
комбинировать с обезболивающим, анестетиком, искусственными
слезами, ингибитором фермента, ингибитором цитокина,
противовоспалительным средством или антибиотиком. В некоторых
вариантах осуществления антибиотик представляет собой
антибактериальное, противовирусное, противогрибковое,
противопротозойное средство или их сочетание.
[0049] В различных вариантах осуществления соединения по
изобретению также можно предоставлять в комбинации с
офтальмологическим терапевтическим средством, выбранным из
группы, состоящей из акулара (Acular) (офтальмологического
раствора кеторолака трометамина) 0,5%, ацуваила (Acuvail)
(кеторолака трометамин), AK-Con-А (офтальмологического раствора
нафазолина), актена (Akten) (лидокаина гидрохлорида), аламаста
(Alamast), альфагана (Alphagan) (бримонидина), алрекса (Alrex),
астепро (Astepro) (назального спрея азеластина гидрохлорида),
азасите (AzaSite) (азитромицина), бепреве (Bepreve)
(офтальмологического раствора бепотастина бесилата), безиванса
(Besivance) (офтальмологической суспензии безифлоксацина),
бетаксона (Betaxon), стерильного раствора для промывания BSS,
косопта (Cosopt), дурезола (Durezol) (дифлупредната), эйлеа
(Eylea) (афлиберцепта), лотемакса (Lotemax), луцентиса
(Lucentis) (ранибизумаба), люмигана (Lumigan)
(офтальмологического раствора биматопроса), макугена (Macugen) (пегаптаниба), окуфлокса (Ocuflox) (офтальмологического раствора офлоксацина) 0,3%, окухиста (OcuHist), озурдекса (Ozurdex) (дексаметазона), квиксина (Quixin) (левофлоксацина), рескула (Rescula) (офтальмологического раствора унопростона изопропила) 0,15%, рестасиса (Restasis) (офтальмологической эмульсии циклоспорина) , таблеток саладжен (Salagen), траватана (Travatan) (офтальмологического раствора травопроста), вальцита (Valcyte) (валганцикловира НС1), вироптика (Viroptic), вистиде (Vistide) (цидофовира), визудина (Visudyne) (вертепорфин для инъекций), имплантата витрасерт (Vitrasert), инъекции витравене (Vitravene), задитора (ZADITOR), зиопатана (Zioptan) (офтальмологического раствора тафлупроста), зиргана (Zirgan)
(офтальмологического геля ганцикловира), зимаксида (Zymaxid)
(офтальмологического раствора гатифлоксацина), атропина, флурбипрофена, физостигмина, азопта, гентамицина, пилокарпина, бацитрацина, гониозола (Goniosol), полимиксина В, бетадина, грамицидина, преднизолона, ветаксолола, хуморсола (Humorsol), проксиметакаина, бетоптика (Betoptic), хилартина (Hylartin), пропина, бринзоламида, гипертонического NaCl, пуралюба
(Puralube), BSS, индоцианина зеленого, бенгальского розового, карбахола, итраконазола, гиалуроната натрия, цефазолина, латанопроста, супрофена, целлювиска, маннита, террамицина, хлорамфеникола, метазоламида, тимолола, цилоксана, миконазола, тобрамицина, ципрофлоксацина, миостата, триамцинолона, косопта
(Cosopt), муро 128, трифлуридина, демекария, неомицина, тропикамида, дексаметазона, нептазана, трусопта, дипивефрина, окфлокса (Ocuflox), видарабина, дорзоламида, офлоксацина, вира-А (Vira-A), эпинефрина, окситетрациклина, вироптика (Viroptic), флуоресцеина, фенилэфрина и ксалатана. Способы и системы скрининга
[0050] В различных вариантах осуществления изобретение включает высокопроизводительный способ скрининга соединения для модуляции термостабильности белка. Способ включает (а) приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и (Ь) измерение фазового перехода плавления (Тт) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся Тт по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, представляет собой фармакологический белок шаперон. В различных вариантах осуществления соединение, которое снижает или повышает кажущуюся Тт по меньшей мере на 3 стандартных отклонения, представляет собой фармакологический белок шаперон.
[0051] Средство, которое модулирует термостабильность белка, можно идентифицировать с использованием дифференциальной сканирующей флуориметрии (DSF). В DSF фазовый переход плавления (Тт) белка-мишени измеряют в присутствии потенциального лиганда. В DSF измеряют тепловое развертывание белка-мишени посредством флуоресценции содержащегося триптофана или
красителя, такого как 1, 8-анилинонафталенсульфонат (бис-ANS)
или Sypro Orange. Связывание лиганда привносит свободную
энергию в связанное состояние или ключевые промежуточные
соединения, что ограничивает развертывание и сдвиг кажущейся
Тт. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления фазовый
переход плавления определяют с использованием устройства для
высокопроизводительной дифференциальной сканирующей
флуориметрии, такого как 384-луночная платформа DSF ThermoFluor(r) или термоциклер для ПЦР с режиме реального времени.
[0052] В различных вариантах осуществления способа скрининга этап, где измеряют фазовый переход плавления, включает следующие этапы: (Ы) нагревание белка от 50°С до 80°С в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, (Ь2) охлаждение белка до 25°С, (ЬЗ) поддержание белка при 25°С в течение 10 секунд и (Ь4) измерение флуоресценции белка. В более конкретных вариантах осуществления способ дополнительно включает повторение этапов (Ы)-(Ь4) от 2 до 30 раз, где каждый повтор этапа (Ы) проводят при постепенно повышающейся температуре. Например, во время первого повторения белок нагревают до 65°С в присутствии тестируемого соединения и охлаждают до 25°С, где перед измерением флуоресценции белка поддерживают его в течение приблизительно 10 секунд. Во время второго повторения белок нагревают до бб°С в присутствии тестируемого соединения и охлаждают до 25°С, где перед измерением флуоресценции белка поддерживают его в течение приблизительно 10 секунд. Этот процесс повторяют (например, от 2 до 3 0 раз) при повышении пиковой температуры, до которой нагревают белок, например, с шагом повышения температуры на 1°С. В некоторых вариантах осуществления во время этапа (Ы) белок уравновешивали при пиковой температуре от 60 до 180 секунд. В конкретных вариантах осуществления способа этап уравновешивания составляет 130 секунд.
[0053] В различных вариантах осуществления способа скрининга этап, где измеряют фазовый переход плавления, включает постепенное нагревание белка в присутствии каждого из
ряда тестируемых соединений до 80°С, при этом постоянно измеряют флуоресценции белка.
[0054] В различных аспектах способа скрининга белок представляет собой образующий амилоид белок. Как правило, когда белок представляет собой образующий амилоид белок, желаемый модулятор снижает фазовый переход плавления белка. Такой модулятор стабилизирует неамилоидную форму белка. В некоторых вариантах осуществления образующий амилоид белок выбран из группы, состоящей из Hsp27, аА-кристаллина (катаракта), аВ-кристаллина (катаракта) , (ЗВ2-кристаллина (катаракта) , (ЗВ1 - кристаллина (катаракта), yD-крисТаллина (катаракта), Hsp22, Hsp20, тау, альфа-синуклеина (болезнь Паркинсона), IAPP
(сахарный диабет 2 типа), бета-амилоида (болезнь Альцгеймера), РгР (трансмиссиваная губчатая энцефалопатия), хантингтина
(болезнь Хантингтона), кальцитонина (медуллярная карцинома щитовидной железы), предсердного натрийуретического фактора
(изолированный амилоидоз предсердия), аполипопротеина AI
(атеросклероз), сывороточного амилоида А (ревматоидный артрит), медина (медиальный амилоидоз аорты), пролактина (пролактинома), транстиретина (семейная амилоидная полинейропатия), лизоцима
(наследственный системный амилоидоз без нейропатии), бета-2-микроглобулина (диализный амилоидоз), гельсолина (амилоидоз финского типа), кератоэпителина (решетчатая дегенерация роговицы), цистатина (церебральная амилоидная ангиопатия: исландского типа), легкой цепи иммуноглобулина AL (системный амилоидоз AL), миоцилина (глаукома) и S-IBM (спорадический миозит с тельцами включения).
[0055] В некоторых вариантах осуществления способа скрининга белок представляет собой белок, обуславливающий заболевание с потерей функции. Как правило, когда белок представляет собой белок, обуславливающий заболевание с потерей функции, желаемый модулятор повышает фазовый переход плавления белка. Такой модулятор стабилизирует мутантную форму белка таким образом, что он остается активным (т.е. деградация белка снижается). Белок, обуславливающий заболевание с потерей функции, может представлять собой, например, мутантную р
глюкозидазу, мутантную глюкозилцерамидазу (болезнь Гоше), мутантный трансмембранный рецептор кистозного фиброза (кистозный фиброз), мутантную гексозаминидазу А (болезнь Тея-Сакса), мутантную гексозаминидазу В (болезнь Сандгоффа), мутантную р-галактозидазу (синдром Моркио) и мутантную альфа-глюкозидазу (т.е. болезнь Помпе).
[0056] В некоторых вариантах осуществления изобретение
относится к высокопроизводительной системе скрининга,
содержащей: (а) образующий амилоид белок; (Ь) устройство,
выполненное с возможностью измерения фазового перехода
плавления (Тт) образующего амилоид белка; и (с) ряд тестируемых
соединений. Устройство, выполненное с возможностью измерения Тт
образующего амилоид белка, может представлять собой любое
устройство, известное в данной области. Как указано выше, в
некоторых вариантах осуществления устройство представляет собой
устройство для дифференциальной сканирующей флуориметрии, такое
как 384-луночная платформа DSF ThermoFluor(r). В различных
аспектах системы скрининга белок выбран из группы, состоящей из
Hsp27, аА-кристаллина, аВ-кристаллина, рВ2-кристаллина, (ЗВ1 -
кристаллина, yD-кристаллина, Hsp22, Hsp2 0, тау, альфа-
синуклеина, IAPP, бета-амилоида, РгР, хантингтина,
кальцитонина, предсердного натрийуретического фактора, аполипопротеина AI, сывороточного амилоида А, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2-микроглобулина, гельсолина, кератоэпителина, цистатина, легкой цепи иммуноглобулина AL и S-IBM.
ПРИМЕРЫ
[0057] Ниже приведены неограничивающие примеры различных аспектов способов, описываемых в настоящем описании. Примеры приведены только с целью иллюстрации, и их не следует интерпретировать как ограничивающие изобретение, т.к. возможными являются многие их изменения. ПРИМЕР 1
[0058] В этом примере описан высокопроизводительный способ скрининга соединений, которые стабилизируют иллюстративный склонный к агрегации белок Hsp27.
[0059] Для идентификации соединений, которые стабилизируют сгуАВ, использовали дифференциальную сканирующую флуориметрию
(DSF). В экспериментах DSF фазовый переход плавления (Тт) белка-мишени измеряют в присутствии потенциальных лигандов
(Cummings et al. , J. Biomol. Screen., 11, 854 (2006)). В DSF измеряют тепловое развертывание белка-мишени посредством флуоресценции содержащегося триптофана или (чаще) красителя, такого как 1, 8-анилинонафталенсульфонат (бис-ANS) или Sypro Orange. Связывание лиганда привносит свободную энергию в свернутое состояние или ключевые промежуточные соединения, которая ограничивает развертывание и сдвиг кажущейся Тт. Эти значения используют для расчета конформационного перехода развертывания. Когда соединения связываются с мишенью перед нагреванием, они становятся более стабильными к развертыванию, сдвигу ДТт. В случае мутанта R12 0G сгуАВ и сгуАВ искали соединения, которые понижают кажущуюся Тт, т.к. амилоиды, как правило, обладают большей кажущейся стабильностью в этой платформе. Например, Тт сгуАВ дикого типа составляла 64,1±0,5°С, тогда как более способный к образованию амилоида мутант R120G сгуАВ обладал кажущейся Тт 68,3±0,2°С (3) . Эта разница коррелировала с повышенной вероятностью образования амилоида R12 0G. Таким образом, был сделан вывод, что скрининг "пиков", которые понижают кажущуюся Тт, может ингибировать агрегацию.
[0060] С использованием сконструированной в меньшем масштабе 384-луночной платформы DSF (ThermoFluor(r)) проводили скрининг 244 6 соединений на способность блокировать агрегацию sHSP. В качестве модели для HTS использовали Hsp27 человека, т.к. он легко образует амилоиды, и он содержит высоко консервативный домен кристаллина, встречающийся во всех sHSP. Hsp2 7 являлся растворимым при комнатной температуре, но при нагревании он подвергался тепловому развертыванию и быстро образовывал амилоиды.
[00 61] Скрининг проводили в объеме 7 мкл с 10 мкМ Hsp2 7 в 50 мМ NaP04, рН 7,4, 700 мМ NaCl, 50 мМ LiCl и 100 мкМ бис-ANS в черных 3 8 4-луночных планшетах для ПЦР Abgene. Реакционные
смеси покрывали силиконовым маслом для ограничения испарения. На основании контрольных тестов предполагали, что в анализе допустимо использовать до 4% DMSO, но в качестве конечной концентрации использовали 1%. Планшеты измеряли в режиме вверх/вниз, который определяли эмпирическим путем, для получения лучшего отношения сигнала к шуму по сравнению с непрерывным линейным режимом. Планшеты нагревали от 65°С до 8 0°С с шагом повышения температуры на 1°С, уравновешивали в течение 130 секунд при каждой высокой температуре, охлаждали до 25°С и поддерживали в течение 10 секунд при 25°С до проведения визуализации с экспонированием в течение 10 секунд для каждого прочтения температуры. В тестах однородности по планшету измеряли Tm Hsp27 при 72,3±0,1б°С. Рассчитывали, что фактор Z изменялся от -0,59 до 0,71, и CV составляли 8%. По-видимому, большая часть вариабельности возникала в результате некоторых "краевых эффектов".
[00 62] Для каждой лунки получали серии флуоресценции в
зависимости от точек температуры, наносили на график и
проводили аппроксимацию для определения Тт. Автоматический
способ разрабатывали в MatLab, в котором проводили отдельные
аппроксимации, а затем ранжировали каждую тестируемую лунку в
зависимости от того, на сколько точно совпадают три независимых
способа аппроксимации (производное Савицкий-Голей,
сигмоидальная кривая и параллельное исходное уравнения Хилла).
[0063] В результате первичного скрининга идентифицировали 4 5 соединений, которые понижали кажущуюся Тт более чем на три стандартных отклонения (-3SD; ~0,б°С), и 45 соединений, которые повышали Тт на +3SD. Все 90 этих соединений исследовали в экспериментах зависимости от дозы для подтверждения их активности, и на основании этих исследований 64 соединения имели активность менее 50 мкМ. 4 5 соединений, для которых было идентифицировано, что они понижают кажущуюся Тт более чем на три стандартных отклонения, тестировали в 12-точечных анализах зависимости дозы, получая 2 8 соединений, что подтверждалось и сдвигало ДТт при концентрациях менее 2 0 мкМ. Следует отметить, что 12 из этих 2 8 соединений являлись частью одного
структурного класса родственных стеролов. Этот остов выбирали для дальнейшего исследования.
[0064] В своей совокупности эти исследования подтверждают, что способ HTS является надежным средством идентификации фармакологических шаперонов для образующих амилоид белков, таких как сгуАВ. Фактически, подтверждают способ HTS для поиска средств, которые модулируют Тт для любого белка, где желательной является повышенная (например, потеря функции белков, таких как мутантная форма альфа-глюкозидазы, обуславливающей болезнь Помпе) или пониженная стабильность (склонные к агрегации белки, такие как хантингтин). ПРИМЕР 2
[00 65] В этом примере описаны исследования зависимости
активности от структуры (SAR) остова стерола,
идентифицированного при первичном скрининге примера 1. Как описано далее, SAR выслало общую химическую структуру (формулу I) для соединений, которые понижают Тт образующего амилоид белка, R120G сгуАВ, по меньшей мере на 2°С.
[00 66] Получали тридцать два стерола с химическими структурами, родственными 17-а-гидроксипрогестерону, и подвергали дальнейшему тестированию (см. таблицу 2) . Эксперименты DSF на этой собранной выборке проводили с использованием R12 0G сгуАВ и идентифицировали два соединения, которые понижали Тт по меньшей мере на 2°С: 5а-холестан-ЗЬ-ол-б-он и 5-холестен-ЗЬ,25-диол. Многие другие родственные стеролы, включая холестерин, являлись неактивными, и получаемое SAR подтверждало достаточно специфическое молекулярное взаимодействие.
Таблица 2
Название
Активность (сдвиг термостабильности при 100 мкМ)
5-холестен-ЗЬ,25-диол
-2,0°С
5а-холестан-ЗЬ-ол-б-он
-3,0°С
5-холестен-ЗЬ-ол
-1,1°С
этиохолан-17Ь-ол-3-он
+1,7°С
Название
Активность (сдвиг термостабильности при 100 мкМ)
17-а-гидроксипрогестерон
от +1°С до -1°С
5а-андростан-ЗЬ,17Ь-диол
от +1°С до -1°С
17а-гидроксипрегненолон
от +1°С до -1°С
5-а-андростан-З,17-дион
от +1°С до -1°С
эпиандростерон
от +1°С до -1°С
прогестерон
от +1°С до -1°С
дегидроизоандростерон
от +1°С до -1°С
В4-андростен-3,17-дион
от +1°С до -1°С
Ь-эстрадиол
от +1°С до -1°С
тестостерон
от +1°С до -1°С
кортикостерон
от +1°С до -1°С
кортизон
от +1°С до -1°С
эстриол
от +1°С до -1°С
4-холестен-З-он
от +1°С до -1°С
холестерин
от +1°С до -1°С
гидрокортизон
от +1°С до -1°С
эстрон
от +1°С до -1°С
В5-прегнен-ЗЬ-ол-20-он
от +1°С до -1°С
ацетат тестостерона
от +1°С до -1°С
дезоксикортикостерон
от +1°С до -1°С
андростерон
от +1°С до -1°С
кортикостерон-21-ацетат
от +1°С до -1°С
дигитонин
от +1°С до -1°С
5-холестен-ЗЬ-ол-7-он
от +1°С до -1°С
урсодезоксихолевая кислота
от +1°С до -1°С
б-кетохолестанол
от +1°С до -1°С
18-а-глицирретиновая кислота
от +1°С до -1°С
[00 67] В дополнительных исследованиях зависимости от дозы с использованием 5а-холестан-ЗЬ-ол-б-она, 5-холестен-ЗЬ,25-диола и холестерина демонстрировали, что 5а-холестан-ЗЬ-ол-б-он и 5-холестен-ЗЬ,25-диол были способны частично восстанавливать Тт дикого типа, что свидетельствует об их пригодности в
качестве фармакологических шаперонов. Для подтверждения прямого
взаимодействия с сгуАВ на другой экспериментальной платформе
использовали интерферометрию биослоя (описываемую в примере 1)
для определения того, что 5-холестен-ЗЬ,25-диол связывается с
R120G сгуАВ с KD 10,1±4,4 мкМ. Измерение аффинности для
тестируемого белка посредством интерферометрии биослоя (Octet
Red) обеспечивало идентификацию ложно-положительных
результатов. В кратком изложении, для получения кажущейся KD
биотинилированный сгуАВ иммобилизуют на покрытых стрептавидином
иглах и анализируют равновесные данные ассоциаций в диапазоне
стократных разведений концентрации. Для контроля
неспецифического связывания ответ блокированной биоцитином иглы вычитают из каждый сенсограммы.
[00 68] В совокупности указанные выше результаты демонстрируют, что соединения формулы I функционируют как фармакологические шапероны для R12 0G сгуАВ in vitro и связываются с высокой аффинностью. Кроме того, результаты свидетельствуют о том, что описываемые способы DSF представляют собой надежную высокопроизводительную систему скрининга для идентификации новых фармакологических шаперонов, не являющихся ферментами.
ПРИМЕР 3
[0069] Этот пример демонстрирует, что соединения, идентифицированные в примере 1, подавляют образование амилоида. Следует отметить, что соединения также способны устранять образование амилоида.
[0070] Исследования DSF подтверждали, что стеролы подавляют образование амилоида R12 0G сгуАВ. Для проверки этой идеи R120G сгуАВ (15 мкМ) обрабатывали 5-холестен-ЗЬ,25-диолом или холестерином (100 мкМ) и измеряли их способность образовывать агрегаты посредством электронной микроскопии. Эти исследования подтверждали, что 5-холестен-ЗЬ,25-диол, но не холестерин или контроль растворителем, значительно подавляет образование амилоида. Визуальное обследование растворов подтверждало это заключение, т.к. только 5-холестен-ЗЬ,25-диол уменьшал мутность смеси R120G сгуАВ. Кроме того, 5-холестен-
ЗЬ,25-диол также устраняет агрегацию амилоидов, ранее образованных R120G сгуАВ, что подтверждает, что он сдвигает равновесие в сторону неамилоидных структур.
[0071] Для исследования механизма действия 5-холестен-ЗЬ, 25-диола исследовали участок связывания на R120G сгуАВ посредством 15N HSQC ЯМР, и анализ получаемых химических сдвигов подтверждал, что он связывается с подвергающейся взаимодействию поверхностью консервативного домена кристаллина. Конкретно, 5-холестен-ЗЬ,25-диол связывается с бороздкой в области контакта димера сгуАВ и образует контакт с остатками около R120 и D109.
[0 072] Указанные выше результаты подтверждают модель, в которой стерол стабилизирует sHSP и уменьшает образование амилоида.
ПРИМЕР 4
[0073] Этот пример демонстрирует, что соединения, идентифицированные в настоящем описании, устраняют фенотип катаракты in vivo.
[0074] Мышь с геном сгуАВ R120G представляет собой клинически приемлемую модель возрастной и врожденной катаракты. В модели на животных развиваются тяжелые катаракты в течение 2 0 недель (Andley et al. , PLoS One, б, el7671 (2011)) . Удаленные глаза от этих мышей обрабатывали 5-холестен-ЗЬ,25-диолом (100 мкМ) или контрольным физиологическим раствором. Обработка 5-холестен-ЗЬ,25-диолом значительно уменьшала агрегацию сгуАВ и улучшала растворимость сгуАВ.
[0075] Затем формулировали 5-холестен-ЗЬ,25-диол в растворе физиологического раствора-циклодекстрина (5 мМ циклодекстран; 5 мМ 5-холестен-ЗЬ,25-диола) и доставляли в глаз посредством пипетки три раза в неделю в течение двух недель живым животным (п=15). Растворимость сгуАВ и прозрачность хрусталика определяли измерением просвечивания хрусталика с использованием щелевой лампы у живых животных и гельпроникающей хроматографией/светорассеянием гомогенатов хрусталика. Такая обработка значительно улучшала растворимость сгуАВ, улучшала прозрачность хрусталика и устраняла фенотипы катаракты у 10/15 обработанных мышей с геном сгуАВ R12 0G. Таким образом, 5
холестен-ЗЬ,25-диол и, в более общем смысле, соединение формулы I представляет собой перспективное терапевтическое средство для лечения катаракты. В более широком смысле эти исследования позволяют предположить, что способы HTS на основе DSF можно использовать для идентификации фармакологических шаперонов для неферментов, таких как сгуАВ. ПРИМЕР 5
[0076] Этот пример демонстрирует, что соединения, идентифицированные в настоящем описании, повышают уровни растворимого а-кристаллина в глазе.
[0077] 5-холестен-ЗЬ,25-диол, формулируемый в
физиологическом растворе-циклодекстрине (5 мМ циклодекстран; 5
мМ 5-холестен-ЗЬ,25-диола) , доставляли в глаз посредством
пипетки три раза в неделю в течение двух недель живым мышам
(п=15). Анализ гель-фильтрации растворимости а-кристаллина
проводили, обрабатывая образцы, как описано ранее Andley et al.
(PLoS ONE, 6:3, 1-13 (2011)) . В кратком изложении, степень
агрегации а-кристаллина определяли с использованием
гельпроникающей хроматографии (GPC) с измерениями
светорассеяния и показателя преломления (RI) . Все данные анализировали с использованием SAS версии 9.3 (SAS Institute; Сагу, NC). Для контроля различия чувствительности анализа среди животных площадь под кривой для а-кристаллина в глазе, который обрабатывали лекарственным средством, сравнивали с площадью под кривой, получаемой из противоположного необработанного глаза, и выражали в виде "процентного" различия площади с использованием необрабатываемого глаза в качестве знаменателя. Процентное различие между обработанными и необработанными глазами сравнивали с использованием знакового рангового критерия Вилкоксона для нулевой гипотезы отсутствия различия. Связь между возрастом и процентным различием рассчитывали с использованием коэффициента ранговой корреляции Спирмена. Для предотвращения отклонений от нормального распределения использовали модели непараметрической статистики.
[0078] Было выявлено, что площадь под кривой а-кристаллина является статистически значимо большей в глазах, обрабатываемых
лекарственным средством, по сравнению с противоположными необрабатываемыми глазами (п=17, среднее процентное различие = 381,2±974,б, медиана = 63,3, значение р = 0,001 в знаковом ранговом критерии Вилкоксона). У более старых мышей демонстрировали большее увеличение а-кристаллина в процентах в обрабатываемых глазах относительно необрабатываемых глаз (коэффициент ранговой корреляции Спирмена = 0,44, р=0,075). Данные в таблице 1 демонстрируют заметное увеличение медианного процентного различия, когда возраст составляет более 200 суток.
Возраст (сутки)
Все
184
192
200
266
Процентное различие площади
между необрабатываемыми и обрабатываемыми глазами
Среднее значение
177,2
98,1
61, 4
22, 7
38,7
1376,3
381,2
Стандартное отклонение
347, 9
2,7
68, 4
25,9
1799,8
974, 6
Медиана
-20,2
98,1
61, 4
55, 8
31,8
679, 0
63, 3
[0079] Данные выявляют, что соединение формулы I 5-холестен-ЗЬ,25-диол значительно увеличивало растворимость а-кристаллина in vivo, в частности у пожилых индивидуумов, таким образом направленно воздействуя на механизм, лежащий в основе образования катаракты.
[008 0] Любой документ, цитируемый в настоящем описании, включая любой используемый в перекрестной ссылке или родственный патент или заявку, таким образом, полностью включен в настоящее описание посредством ссылки, в случае если явно не исключен или иным образом ограничен. Цитирование любого документа не является признанием, что он представляет собой известный уровень техники в отношении любого изобретения, раскрываемого или заявляемого в настоящем описании, или что отдельно или в любой комбинации с любой другой ссылкой или ссылками указывает, предполагает или описывает какое-либо другое изобретение. Кроме того, в тех случаях, когда любое значение или определение термина в этом документе противоречит какому-либо значению или определению этого же термина в документе, включенном посредством ссылки, значение или
определение, присваиваемое этому термину в этом документе, будет являться определяющим.
[0081] Несмотря на то, что проиллюстрированы и описаны конкретные варианты осуществления раскрываемого объекта изобретения, специалистам в данной области будет понятно, что можно проводить различные другие изменения и модификации, не выходя за рамки сущности и объема заявляемого объекта изобретения. Таким образом, предполагают, что все такие изменения и модификации включены в прилагаемую формулу изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или профилактики катаракты, где способ включает введение нуждающемуся в этом индивидууму эффективного количества композиции, содержащей соединение формулы I:
(I)
где:
оба R1 представляют собой Н, или оба R1 представляют собой
Me;
R2 представляет собой Н или ОН;
пунктирная линия между атомами углерода 5 и б означает необязательную двойную связь;
R3 представляет собой Н или Me; R4 представляет собой Н или Me; п равно 0 или 1;
(a) R6 представляет собой 'Ъ4 ^^R10 , и каждый R5
независимо представляет собой Н или Me, или (b) R6 и один R5 совместно образуют необязательно замещенное б-членное кольцо, и другой R5 представляет собой Me;
пунктирная линия между атомами углерода 12 и 13 представляет собой необязательную двойную связь при условии, что R7 не содержится, когда содержится двойная связь между атомами углерода 12 и 13, и R7 представляет собой Н или Me, когда двойная связь не содержится между атомами углерода 12 и 13;
R8 представляет собой Н или ОН;
оба R9 совместно образуют оксо (=0) , или оба R9 представляют собой водород; и
R10 представляет собой СОгН или линейный или разветвленный С1-С6алкил;
или его пролекарство или фармацевтически приемлемую соль. 2. Способ по п.1, где соединение формулы I имеет структуру формулы IA или формулы IB:
где каждый R11 независимо представляет собой алкил, СОгН или С02алкил.
3. Способ по п.1 или 2, где соединение имеет структуру формулы II:
(II)
где R12 представляет собой Н или ОН, и R13 представляет собой Н или ОН.
4. Способ по п.З, где соединение представляет собой 5-холестин-ЗЬ,2 5-диол.
5. Способ по любому из п.п.1-4, где композицию вводят местно, субконъюнктивально, ретробульбарно, периокулярно, субретинально, супрахороидально или интраокулярно.
6. Способ по любому из п.п.1-5, где указанная катаракта представляет собой связанную с возрастом катаракту или диабетическую катаракту.
7. Способ по любому из п.п.1-5, где индивидуум страдает врожденной формой катаракты с ранним началом.
8. Способ по п.7, где индивидуум имеет мутацию R120G и/или мутацию D10 9H в сгуАВ.
9. Офтальмологическая фармацевтическая композиция,
содержащая фармацевтически приемлемый офтальмологический
где:
оба R1 представляют собой Н, или оба R1 представляют собой
Me;
R2 представляет собой Н или ОН;
пунктирная линия между атомами углерода 5 и б означает необязательную двойную связь;
R3 представляет собой Н или Me; R4 представляет собой Н или Me; п равно 0 или 1;
(a) R6 представляет собой ^i^^^R10 , и каждый R5
независимо представляет собой Н или Me, или (b) R6 и один R5 совместно образуют необязательно замещенное б-членное кольцо, и другой R5 представляет собой Me;
пунктирная линия между атомами углерода 12 и 13 представляет собой необязательную двойную связь при условии, что R7 не содержится, когда двойная связь содержится между атомами углерода 12 и 13, и R7 представляет собой Н или Me, когда двойная связь между атомами углерода 12 и 13 не содержится;
R8 представляет собой Н или ОН;
оба R9 совместно образуют оксо (=0) , или оба R9 представляют собой водород; и
R10 представляет собой СО2Н или линейный или разветвленный Ci-Сбалкил ;
или его пролекарство или фармацевтически приемлемую соль. 10. Композиция по п. 9, где соединение формулы I имеет структуру формулы IA или формулы IB:
где каждый R независимо представляет собой алкил, СОгН или С02алкил.
11. Композиция по п.9 или 10, где соединение имеет структуру формулы II:
где R12 представляет собой Н или ОН, и R13 представляет собой Н или ОН.
12. Композиция по п.11, где соединение представляет собой 5-холестин-ЗЬ,25-диол.
13. Композиция по любому из п.п.9-12, где фармацевтически приемлемый офтальмологический носитель представляет собой циклодекстрин.
14. Композиция по п.13, где циклодекстрин представляет собой (2-гидроксипропил)-р-циклодекстрин.
15. Высокопроизводительный способ скрининга соединения для модуляции термостабильности белка, где способ включает:
(a) приведение белка в контакт с каждым из ряда тестируемых соединений и
(b) измерение фазового перехода плавления (Тт) белка в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, где соединение, которое снижает или повышает кажущуюся Тт по меньшей мере на 2 стандартных отклонения, представляет собой фармакологический белок шаперон.
16. Способ по п.15, где белок представляет собой
образующий амилоид белок или белок, обуславливающий заболевание с потерей функции.
17. Способ по п.16, где образующий амилоид белок выбран из группы, состоящей из Hsp27, аА-кристаллина, аВ-кристаллина, (ЗВ2-кристаллина, рВ1-кристаллина, yD-кристаллина, Hsp22, Hsp2 0, тау, альфа-синуклеина, IAPP, бета-амилоида, РгР, хантингтина, кальцитонина, предсердного натрийуретического фактора, аполипопротеина AI, сывороточного амилоида А, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2-микроглобулина, гельсолина, кератоэпителина, цистатина, легкой цепи иммуноглобулина AL и S-IBM.
18. Способ по п.16, где белок, обуславливающий заболевание с потерей функции, выбран из группы, состоящей из мутантной р-глюкозидазы, трансмембранного рецептора кистозного фиброза, гексозаминидазы А, гексозаминидазы В, р-галактозидазы и альфа-глюкозидазы.
19. Способ по любому из п.п.15-18, где Тт определяют с
использованием устройства для высокопроизводительной
дифференциальной сканирующей флуориметрии.
20. Способ по любому из п.п.15-19, где этап измерения включает:
(Ы) нагревание белка от 50°С до 80°С в присутствии каждого из ряда тестируемых соединений, (Ь2) охлаждение белка до 25°С,
(ЬЗ) поддержание белка при 25°С в течение 10 секунд и (Ь4) измерение флуоресценции белка.
21. Способ по п.20, дополнительно включающий повторения этапов (Ы)-(Ь4) от 2 до 30 раз, где каждый повтор этапа (Ы) проводят при постепенно повышающейся температуре.
22. Способ по п.21, где образующий амилоид белок нагревают от 65°С до 80°С с шагом повышения температуры на 1°С.
23. Способ по любому из п.п.20-22, где (Ы) дополнительно включает уравновешивание образующего амилоид белка и тестируемого соединения от 60 до 180 секунд после нагревания.
24. Способ по п.23, где этап уравновешивания составляет 130 секунд.
21.
25. Высокопроизводительная система скрининга, содержащая:
(a) образующий амилоид белок;
(b) устройство, выполненное с возможностью измерения
фазового перехода плавления (Тт) образующего амилоид белка;
(c) ряд тестируемых соединений.
26. Система скрининга по п.25, где белок выбран из группы, состоящей из Hsp27, аА-кристаллина, аВ-кристаллина, (ЗВ2-кристаллина, (ЗВ1-кристаллина, yD-кристаллина, Hsp22, Hsp2 0, тау, альфа-синуклеина, IAPP, бета-амилоида, РгР, хантингтина, кальцитонина, предсердного натрийуретического фактора, аполипопротеина AI, сывороточного амилоида А, медина, пролактина, транстиретина, лизоцима, бета-2-микроглобулина, гельсолина, кератоэпителина, цистатина, легкой цепи иммуноглобулина AL и S-IBM.
27. Система скрининга по п.2 5 или 2 6, где устройство представляет собой устройство для высокопроизводительной дифференциальной сканирующей флуориметрии.
По доверенности
(II)
(II)
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Структура
ИЮПАК
ID CCG Название
Структура
ID CCG
Название
ИЮПАК
Таблица 1
Таблица 1
Таблица 1
Таблица 2
(I)
(I)
(I)
|
