(57) Реферат / Формула:
Настоящее раскрытие относится к соединениям сшивающих агентов, применимых при ковалентном сшивании биологически активных молекул с лигандами. Описываемые соединения также относятся к биологически активным молекулам и конъюгатам лигандов, где биологически активная молекула сшита с лигандом с помощью сшивающего агента. В раскрытии также приводятся составы, включающие в себя конъюгаты биологически активной молекулы-лиганда, методы изменения роста идиобласта и методы лечения с помощью конъюгатов или составов.
Евразийское (2D 201500905 (13) А1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. A61K47/48 (2006.01)
2017.02.28 A61P 35/00 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2014.03.14
(54) БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ИХ КОНЪЮГАТЫ И ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
(31) 61/792,216
(32) 2013.03.15
(33) US
(86) PCT/US2014/029757
(87) WO 2014/145090 2014.09.18
(71) Заявитель:
РЕГЕНЕРОН ФАРМАСЬЮТИКАЛЗ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель: Ниттоли Томас (US)
(74) Представитель:
Безрукова О.М. (RU) (57) Настоящее раскрытие относится к соединениям сшивающих агентов, применимых при кова-лентном сшивании биологически активных молекул с лигандами. Описываемые соединения также относятся к биологически активным молекулам и конъюгатам лигандов, где биологически активная молекула сшита с лигандом с помощью сшивающего агента. В раскрытии также приводятся составы, включающие в себя конъюгаты биологически активной молекулы-лиганда, методы изменения роста идиобласта и методы лечения с помощью конъюгатов или составов.
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ МОЛЕКУЛЫ, ИХ КОНЬЮГАТЫ, И ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] В настоящем раскрытии приводятся коньюгаты лиганда -биологически активной молекулы, где лиганд соединен с биологически активной молекулой с помощью сшивающего агента. В настоящем раскрытии также приводятся коньюгатные соединения в лекарственных препаратах для применения в различных терапевтических целях.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Пролиферативные заболевания характеризуются
неконтролируемым ростом и распространением идиобластов. Если распространение не контролируется, это может привести к смерти. Патологическое разрастание, например, рак, вызывается как внешними факторами (напр., табак, химические вещества, радиация и возбудители инфекции), так и внутренними факторами (наследственные мутации, состояние иммунной системы, мутации, возникшие вследствие метаболизма). Эти причинные факторы могут действовать вместе или последовательно для возбуждения или ускорения патологического разрастания клеток. Рак лечится хирургией, радиотерапией, химиотерапией, гормонами и иммунотерапией. Тем не менее, существует потребность в более эффективных лекарствах против разрастания клеток.
[0003] Идеальной терапией разрастания клеток было бы обеспечение нацеленной доставки крайне цитотоксических средств в клетки опухоли и оставление нормальных клеток нетронутыми. Обычное химиотерапевтическое лечение, например, с помощью майтансина, является ограниченным в силу токсичных побочных эффектов, возникающих из-за
воздействия препарата на нераковые клетки. Были испробованы различные подходы к целевой доставке лекарств, включая применение коньюгатов, нацеленных на опухоль зондов (таких как антитела или факторы роста) с токсинами, такими как токсины синегнойной палочки или дифтерии, останавливающими синтез белков и клеток. Однако, побочные эффекты включали в себя реакцию иммунной системы из-за нечеловеческих компонентов коньюгатов. Более того, полураспад коньюгатов лекарства был ограниченным в силу устранения из сосудистого русла через почечное фильтрование и краткое разрушение, поглощение ретикулоэндотелиапьной системой (РЭС), а также накопления в нецелевых органах и тканях.
[0004] В другом подходе, чтобы использовать преимущества гиперпроницаемости эндотелия сосудов опухолевой ткани, применяются пассивные переносчики лекарственного препарата, такие как полимеры, липосомы и полимерные мицеллы. Полимерные препараты и макромолекулы накапливаются в плотных опухолях в силу увеличенной проницаемости и механизма удержания. Однако, барьерами на пути применения таких целевых доставок являются быстрая очистка крови от посторонних веществ, а также технологические преграды в получении высоко стандартизированных, фармацевтически приемлемых систем доставки препарата с требуемой специфичностью и избирательностью для фиксации опухолевых клеток.
[0005] Таким образом, существует потребность в целевых лекарственных препаратах против разрастания клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0006] Настоящее раскрытие относится к коньюгатным соединениям, представленным следующей структурной формулой (I):
Z2 A W
(1)
где:
"L" отсутствует, или является лигандом; далее, где:
когда "L" является лигандом, "L" способно связываться с клеткой или клеточной популяцией;
"а" является целым числом от 1 до 10;
Z2 и Z, каждый независимо являются отсутствующими или буферами; "D" является биологически активной молекулой;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W " отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
далее, где: R4, Rs, и R6 каждый независимо являются "Н", или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил необязательно замещенные; и
"Y" отсутствует, или является буфером.
[0007] В настоящем раскрытии также приводятся сшивающий агент, биологически активные вещества, представленные следующей структурной формулой (V):
Z2 А W X Y Z,-D (V)
где:
Z2 и Z, каждый независимо являются отсутствующими или буферами; "D" является биологически активной молекулой;
"А"является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"^"отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
далее, где: R4, R5, и R6 каждый независимо являются "Н", или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
"Х"является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными; и
"Уотсутствует, или является буфером.
[0008] В настоящем раскрытии также приводятся сшивающие агенты, представленные следующей структурной формулой (VI).
[0009] В одном примере осуществления, соединения сшиваюидего агента представлены формулой (VI):
Z2 А W X Y Z, (VI)
где:
Z2 и Ъ\ каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"А"является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
где Аь A3, R, и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рг, -С(=0)-0-(СНх)рг, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рГ, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -S-C(=S)-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
A4 и A5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NRi8-, -CR5R6-;
R]7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NRi8, CR5Re,;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и "х"является 0, 1 или 2.
[0010] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где Z2 представлено следующей структурной формулой:
-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D-,
где:
Z2a, Z2B, Z2c и Z2D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -О С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)рГС(=0)-, -(СНх)р1~С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рГ, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-. -SO-, -SO2-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-,
-N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(-0)-N(R4),
Л О ,! О
A/4 JJ
-0-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, или ,
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, атеенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[ООП] Настоящее раскрытие также относится к фармацевтическому препарату, содержащему терапевтически эффективный объем соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых переносчиков, разбавителей или субстанций.
[0012] В настоящем раскрытии также приводится метод снижения, замедления или остановки роста идиобластов, состоящий из взаимодействия соединения формулы (I) с идиобластом в объеме, достаточном для замедления, снижения или остановки роста идиобласта, и при котором рост идиобластов замедляется, снижается или останавливается.
[0013] В настоящем раскрытии также приводится метод ликвидации клетки, состоящий из взаимодействия соединения формулы (I), в объеме, достаточном для гибели клетки, и при котором клетка погибает.
[0014] В настоящем раскрытии также приводится метод лечения заболевания у физического лица, страдающего от болезни, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формулы (I).
[0015] В настоящем раскрытии также приводится метод уменьшения размера опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения прогрессии опухоли, или предотвращения прогрессии опухоли у соответствующего лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата для уменьшения размера опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения прогрессии опухоли, или предотвращения прогрессии опухоли, при котором препарат содержит в своем составе соединение формулы (I).
[0016] Настоящее раскрытие также относится к прекурсору Соединений Биологически Активной Молекулы со сшивающим агентом, в виде, представленном формулой (V). Соединения формулы (V) предоставляют структурные элементы для сопряженных соединений формулы (I). В дополнение, соединения формулы (V) могут быть представлены в виде препаратов, лекарственных препаратов и их фармацевтически приемлемых солей.
[0017] Кроме этого, в настоящее раскрытие включено применение любого из препаратов, имеющих в составе соединения формулы (I) и/или фармацевтические композиции при производстве медикаментов для лечения, профилактики и/или улучшения состояния при заболевании.
[0018] Кроме этого, в настоящее раскрытие включено применение любого из препаратов, имеющих в составе соединения формулы (I) и/или фармацевтические композиции при производстве медикаментов для лечения, профилактики и/или улучшения состояния при опухоли.
КРАТКОЕ ПОЯСНЕНИЕ К ФИГУРАМ
[0019] Фиг.1-8 показывают результаты испытаний жизнеспособности клетки, в которых, в искусственных условиях, были выращены различные линии раковых клеток, и подвергнуты воздействию антител серийного
разведения, лекарственного вещества, не связанного с белками плазмы крови, или, как показано, коньюгатов антитело-медикамент. Процент жизнеспособности был установлен в соответствии с методами, приведенными в Примере 14.
[0020] ФигЛА показывает результаты жизнеспособности клеток С4-2 (линия клеток рака предстательной железы), подвергшихся воздействию соединения 2, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 3 ("Изотопический контроль-3"), анти-ПСМА (простатического специфического мембранного антигена) антитела, сопряженного с соединением 3 ("ПСМА-3"), и не сопряженного анти-ПСМА антитела ("ПСМА").
[0021] ФигЛВ показывает результаты жизнеспособности клеток С4-2 (линия клеток рака предстательной железы), подвергшихся воздействию соединения 6, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотопический контроль-7"), анти-ПСМА антитела, сопряженного с соединением 7 ("ПСМА-7"), и не сопряженного анти-ПСМА антитела ("ПСМА").
[0022] ФигЛС показывает результаты жизнеспособности клеток С4-2 (линия клеток рака предстательной железы), подвергшихся воздействию соединения 25, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 21 ("Изотопический контроль-21"), анти-ПСМА (простатического специфического мембранного антигена) антитела, сопряженного с соединением 21 ("ПСМА-21"), и не сопряженного анти-ПСМА антитела ("ПСМА").
[0023] Фиг.2 показывает результаты жизнеспособности клеток РСЗ/hSTEAPl (линия клеток рака предстательной железы, выражающая экзогенный hSTEAPl), подвергшихся воздействию соединения 6,
изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотипический контроль-7"), анти-STEAPl антитела, сопряженного с соединением 7 ("STEAP1-7"), и не сопряженного анти-STEAPl антитела ("STEAP1").
[0024] Фиг.З показывает результаты жизнеспособности клеток T47D (линия клеток рака молочной железы) подвергшихся воздействию соединения 6, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотипический контроль-7"), анти-PRLR антитела, сопряженного с соединением 7 ("PRLR-7"), и не сопряженного анти-PRLR антитела ("PRLR").
[0025] Фиг.4 показывает результаты жизнеспособности клеток HEK293/hEGFRvIII (клетки НЕК293, выражающие экзогенный hELGFRvIII), подвергшихся воздействию соединения 6, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотипический контроль-7"), анти-EGFRvIII антитела, сопряженного с соединением 7 ("EGFRvIII-7"), и не сопряженного анти-EGFRvIII антитела ("EGFRvIII").
[0026] Фиг.5 показывает результаты жизнеспособности клеток MMT/hEGFRvIII (клетки ММТ, выражающие экзогенный hEGFRvIII), подвергшихся воздействию соединения 6, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотипический контроль-7"), анти-EGFRvIII антитела, сопряженного с соединением 7 ("EGFRvIII-V), и не сопряженного анти-EGFRvIII антитела ("EGFRvIII").
[0027] Фиг.6 показывает результаты жизнеспособности клеток U251/hEGFRvIII (клетки U251, выражающие экзогенный hliGFRvIII), подвергшихся воздействию соединения 6, изотипического контроля антитела, сопряженного с соединением 7 ("Изотипический контроль-7"),
анти-EGFRvIII антитела, сопряженного с соединением 7 ("EGFRvIII-7"), и не сопряженного анти-EGFRvIII антитела ("EGFRvIII").
[0028] Фиг.7, части А и В показывают, соответственно, результаты жизнеспособности клеток НЕК293 и U87MG, подвергшихся воздействию соединений 6, 27, 29, и 31 (все несопряженные).
[0029] Фиг.8, части А-Е показывают, соответственно, результаты жизнеспособности клеток НЕК293, U251, С4-2, РСЗ и ММТ, подвергшихся воздействию соединений 6, 9, 33, и 35 (все несопряженные).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0030] Приведенные в данном описании ссылки на определенные примеры осуществления считаются только наглядными пояснениями принципов настоящего раскрытия. Более того, так как для специалистов многочисленные варианты и изменения будут очевидно выраженными, то ограничение раскрытия описанными в настоящем документе конкретными конструкциями и процессами, не предполагается. Соответствующим образом, можно будет прибегать ко всем подходящим вариантам и аналогам, попадающим в сферу раскрытия, и определенным последующими формулами изобретения.
[0031] Слова "содержать", "состоящий из", "включать" и "включая", при использовании в настоящем описании и в последующих формулах изобретения, предназначены для уточнения наличия указанных свойств, целых чисел, компонентов или этапов, но они не исключают наггачия или добавления одного или нескольких их дополнительных свойств, целых чисел, компонентов или этапов.
[0032] Общие термины, использованные в любом из примеров осуществления в настоящем документе, могут быть определены следующим
образом; однако, указанное значение не должно толковаться как ограничивающее состав термина самим собой.
[0033] Термин "коньюгатный", как используется в настоящем документе, относится к Лиганду, сшивающему агенту и Биологически Активной Молекуле. Наглядные примеры включают в себя соединения формул (I), (III) и (IV).
[0034] Термин "буфер", как используется в настоящем документе, относится к химическим структурным элементам сшивающего агента, используемого для пространственного отделения лиганда от биологически активной молекулы, а также для получения возможности разложения сшивающего агента внутри клеток. Буфер может быть представлен Ъ\ и Z2.
[0035] Термин "макролид", как используется в настоящем документе, относится к любой биологически активной молекуле, имеющей макролидное кольцо.
[0036] Термин "алкил", как используется в настоящем документе, относится к группе углеводородов, имеющей общую формулу СпН2л +(. Примеры алкила включают в себя: метил, этил, 1-пропил, 2-пропил, 1-бутил и им подобные. Типичный алкил имеет от одного до десяти атомов уг лерода, от одного до девяти атомов углерода, от одного до восьми атомов углерода, от одного до семи атомов углерода, от одного до шести атомов углерода, от одного до пяти атомов углерода, от одного до четырех атомов углерода, от одного до трех атомов углерода, от одного до двух атомов уг лерода или один атом углерода.
[0037] Термин "арил", как используется в настоящем документе, относится к одновалентным или полициклическим ароматическим углеводородам, имеющих, как правило, от 6 до 18 атомов углерода.
Примерами арила являются фенил (подобный бензолу), замещенные бензолы, нафтален, антрацен, инденил, тетрагидронафтил, и им подобные.
[0038] Термин "алкенил", как используется в настоящем документе, относится к алифатическому линейному или разветвленному одновалентному углеводородному радикалу из двух или нескольких атомов углерода, с, как минимум, одним местом ненасыщенности. Алкенил имеет общую формулу R2C=CR2. Примеры алкенила включают в себя: этиленил, винил, аллил и тому подобные.
[0039] Термин "алкинил", как используется в настоящем документе, относится к одновалентному алифатическому углеводородному радикалу, имеющему тройную связь. Типичный алкинил состоит из двух и до двадцати атомов углерода (и имеет, как минимум, одну тройную связь). Примеры алкинила включают в себя этинил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1-пентинил, гексинил и тому подобные.
[0040] Термин "циклоалкил", как используется в настоящем документе, относится к одновалентному насыщенному радикалу карбоциклического кольца. Типичный циклоалкил состоит из от 3 до 7 элементных моноциклических кольцевых радикалов. Одним примером циклоалкила является циклогексил.
[0041] Термин "гетероарил", как используется в настоящем документе, относится к одновалентному ароматическому радикалу из 5 или 6 элементных колец. Гетероарил включает в себя системы с сочлененными кольцами (как минимум одна должна быть ароматической), имеющих вплоть до от 5 до 18 атомов, содержащие один или несколько гетероатомов, выбранных из азота, серы или кислорода. Наглядными примерами гетероарила являются пиридииил, триазолил, фурил, пиразинил, тиенил,
изоксазолил, индазолил, фуразанил, бензотиазофил, квиназолинил и фуропиридинил.
[0042] Термин "гетероциклил", как используется в настоящем документе, относится к насыщенному или частично насыщенному карбоциклическому радикалу, как правило, из от 3 до 18 атомов углерода, в котором, как минимум, один кольцевой атом является гетероатомом, выбранным из азота, кислорода, фосфора и серы. Гетероциклил может быть, например, моноциклическим или бициклическим. Примерами гетероциклила являются пиролидинил, тетрагидрофуранил, дигидропиранил, тиоксанил, 2Н-пиранил, диоксанил, дитипнил, пиперидин и им подобные.
[0043] Фраза "фармацевтически приемлемая соль", как используется в настоящем документе, относится как к органическим, так и неорганическим солям описанных в настоящем документе коньюгатных соединений, например, соединениям формул (I), (III), (IV) и (V). Соли являются фармацевтически приемлемыми, и включают в себя: сульфаты, цитраты, нитраты, фосфаты, аскорбаты, бромиды, глюконаты, бензоаты, оксалаты, пантотенаты и им подобные. Следует обратить внимание на то, что фармацевтически приемлемые соли настоящего документа могут в своей структуре иметь более одного заряженного атома, а также один или несколько противоионов. Приготовление коньюгатных соединений из настоящего документа в виде фармацевтически приемлемых солей хорошо известно специалистам.
[0044] Термин "человеческое антитело", как используется в настоящем документе, предназначен для охвата антител, имеющих переменные и постоянные области, полученные из цепочек человеческого иммуноглобулина.
Человеческие моноклональные антитела (mAbs) изобретения могут включать в себя остатки аминокислот, некодированные цепочками человеческого иммуноглобулина (напр., мутации, вызванные случайным или зависящим от местных условий мутагенезом в искусственных условиях, или соматической мутацией в естественных условиях), например, в комплементарно определяемых областях (CDR), в частности, в CDR3. Однако, термин "человеческое антитело1' как используется в настоящем документе, не предназначен для охвата моноклональных антител, в которых цепочки CDR полученных из генеративных линий других млекопитающих видов, привитых к человеческим FR цепочкам.
[0045] Термин "терапевтически эффективный объем", как используется в настоящем документе, относится к объему, дающему необходимый эффект, для которого он назначается. Точный объем будет зависеть от цели лечения, и будет определенным специалистом с использованием известных методик (см., например, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Лиганды и партнеры по связыванию
[0046] Эффективность коньюгатного соединения из описанных в настоящем документе примеров осуществления зависит от избирательности Лиганда связываться со своим партнером по связыванию лиганда.
[0047] В одном примере осуществления, Лигандами являются любые молекулы, способные, с некоторой специфичностью, к связыванию с заданным партнером по связыванию в млекопитающем, где взаимодействие может выразиться в терапевтическом применении. В некоторых аспектах, Лиганд способен связываться с клеткой или клеточной популяцией.
[0048] Используемыми в настоящем документе Лигандами являются антитела, лимфокины, гормоны, факторы роста, вирусные рецепторы, интерлейкины, или любые другие, связывающие клетки или пептиды молекулы или вещества.
[0049] В одном примере осуществления, Лигандом является антитело. Как установлено в настоящем документе, антитело относится к моноклональным антителам, поликлональным антителам, фрагментам антитела (Fab, Fab', и F(ab)2, мини антителам, дителам, триотелам и им подобным), и биспецифическим антителам. В настоящем документе, антитела могут очеловечиваться с помощью методов, описанных в патенте США № 6,596,541, и патентной заявке США №2012/0096572, каждый из которых полностью включен посредством ссылки.
[0050] Когда Лиганд является антителом, он связывается со связывающим партнером антигена, являющимся полипептидом, и может являться трансмембранной молекулой (напр., рецептором) или фактором роста. Примеры антигенов включают в себя, но не ограничиваются, молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, стимулирующий выделение гормона роста; гормон паращитовидной железы; тиреостимулирующий гормон; липопротеины; альфал-антитрипсин; инсулин А-цеиочки; инсулин В-цепочки; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; тиреокальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор "vmc", фактор IX, тканевой тромбопластин (ТТ), и фактор фон Виллебранда; факторы, препятствующие свертыванию крови, такие как протеин С; предсердный натрийуретический фактор; легочный сурфактант; активатор плазмогена, такой как урокиназа или человеческая моча или тканевой активатор плазминогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический
фактор роста; факторы некроза опухолей альфа и бета; энкефалиназа; RANTES, хемокин, выделяемый Т-клетками при активации (регулируемый при активации обычно выраженных и выделяемых Т-клеток); человеческий макрофагальный белок воспаления (М1Р-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; мюллерова ингибирующая субстанция; релаксин А-цепочки; релаксин В-цепочки; прорелаксин; мышиный гонадотропин-связанный пептид; микробный белок, такой как бета-лактамаза; DNase; 19Е; цитотоксический Т-лимфоцит связанный антиген (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; фактор роста эндотелия сосудов (VEGF); рецепторы гормонов или факторы роста; протеин А или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как производимый из костей нейротрофический фактор (BDNF), нейротропин-3, -4, -5, или -6 (NT-3, NT4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов такой как NGF-P; фактор роста тромбоцитов (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; рецептор 2 фактора роста фибробластов (FGFR2), эпидермальный фактор роста (ЭФР); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-fH, TGF-P2, TGF-133, TGF-(34 или TGF-H5; инсулиноподобный ростовой фактор-I и -II (ИФР-I и ИФР-П) (IGF-I ; IGF-II); des(I-3)-IGF-I (мозговой ИФР-1), инсулиноподобный ростовой фактор связывающий белок, ЕрСАМ, GD3, FLT3, PSMA, PSCA, MUCI, MUCI6, STEAP, СЕА, TENB2, рецепторы EphA, рецепторы EphB, фолатный рецептор, FOLRI, мезотелин, крипто, альфаубетаб, интегрины, VEGF, VEGFR, EGFR, трансферриновый рецептор, 1RTAI, 1RTA2,1RTA3,1RTА4,1RTА5; CD такие протеины, как CD2, CD3, CD4, CD5, CD6, CD8, CDII, CDI4, CDI9, CD20, CD21, CD22, CD25, CD26, CD28, CD30, CD33, CD36, CD37, CD38, CD40, CD44, CD52, CD55, CD56, CD59, CD70, CD79, CD80. CD81, CD 103, CD105, CD134, CD137, CD138, CDI52, или антитело, которое связывается с одним или несколькими связанными с опухолью антигенами, или
рецепторами клеточной поверхности, как раскрыто в публикациях США№2008/0171040 или №2008/0305044, и полностью включенные в данный документ посредством ссылок; эритропоэтин; остеиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как интерферон-альфа, -бета и -гамма; колониестимулирующие факторы (CSF), напр., M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлейкины (IL), напр., от IL-1 до IL-10; супероксиддисмутаза; Т-клеточные рецепторы; белки оболочки; фактор распада; вирусный антиген, например, часть оболочки герпесвируса кошек; транспортные белки; "хоминг' -рецепторы; адресины; регуляторные белки; интегрины, такие как CDlla, CDllb, CDllc, CDI8, молекулы межклеточной адгезии (ICAM), VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как белки AFP, ALK, В7Н4, В AGE, бета-катенин, ген "brc-abl", BRCA1, BORIS, СА9 (карбоангидраза IX), каспаза-8, CD20, CD40, CD123, CDK4, СЕА, CLEC12A, рецепторная тирозинкиназа, продукт гена KIT, сМЕТ, CTLA4, циклин-В 1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, эндоглин, адгезивная молекула эпителиальных клеток, EphA2, ErbB2/Fler2, ЕгЬВЗ/НегЗ, ErbB4/HeR4, ETV6-AML, Fra-1, FOLR1, белки GAGE (напр., GAGE-1, -2), GD2, GD3, GloboH, глипикан-3, GM3, gplOO, Her2, HLA/B-raf, HLA/EBNA1, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, IGF1R, LGR5, LMP2, белки MAGE (напр., MAGE-1, -2, -3, -4, -6, и -12), MART-1, мезотелин, ML-IAP, Mucl, Mucl6 (CA-125), MUM1, NA17, NGEP, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESOl, OX40, pl5, p53, PAP, РАХЗ, PAX5, PCTA-1, PDGFR-a, PDGFR-p, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, PLAC1, PRLR, PRAME, PSCA, PSGR, PSMA (FOLH1), белки RAGE, Ras, RGS5, Rho, SART-I, SART-3, Steap-1, Steap-2, STn, сурвивин, TAG-72, TGF-p, TMPRSS2, Tn, TNFRSF17, TRP-l, TRP-2, тирозиназа и уроплакин-3, и фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
[0051] Лиганды также могут включать в себя белки с анкириновым повтором, интерфероны, лимфокины такие как IL-2 или IL-3, гормоны, такие как инсулин и глюкокортикоиды, факторы роста, такие как ЭФР (EGF), трансферрин, фибронектин типа III, и т.п.
[0052] Приведенные в настоящем документе примеры осуществления являются направленными на терапевтическое применение. В одном примере осуществления, Лиганды готовятся для взаимодействия и связывания с антигенами, определенными как опухолевые антигены, в том числе антигены, специфичные для вида опухоли, или антигены, которые распределены, сверхэкспрессированы или модифицированы в конкретном типе опухоли. Примеры включают в себя: альфа-актинин-4 при раке легких, ARTC1 при меланоме, BCR-ABL фузоген при хроническом миелолейкозе, B-RAF, CLPP или Cdc27 при меланоме, CASP-8 при плоскоклеточной карциноме, и hsp70-2 при почечно-клеточной карциноме, а также следующие распределенные опухолевые специфические антигены, например: BAGE-1, GAGE, GnTV, KK-LC-1, MAGE-A2, NA88-A, TRP2-INT2.
Биологически активные молекулы
[0053] В настоящем документе, биологически активные молекулы включают в себя любые молекулы, имеющие терапевтический эффект на млекопитающих. В типичных примерах осуществления, молекула успешно доставляется до цели в млекопитающем, и, в частности, успешно доставляется до, и внутрь клетки (напр., эндоцитоз), по сравнению с молекулами, выпускающимися в сосудистую или лимфатическую системы.
[0054] С одной стороны, биологически активные молекулы являются соединениями, приводящими к угнетению, замедлению, снижению и/или предотвращению! пролиферации клеток. Биологически Активные Молекулы
также могут приводить к гибели клеток путем их некроза или апоптоза. Наглядным примером Биологически Активных Молекул для использования в описанных в настоящем документе коньюгатных соединениях являются: майтанзиноид (напр., DM1, DM4 и т.п.), ауристатин (напр., ММАЕ, MMAD, MMAF и т.п.), дуокармицин (напр., MGBA), доластатин, токсоиды и другие химиотерапевтически эффективные лекарства.
[0055] Другими конкретными примерами биологически активных молекул для использования в контексте настоящего изобретения, являются, например, 1-дегидротестостерон, 2- пирролинодоксорубицин, 5-флуороурацил, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, актиномицин D, антрациклин, антрамицин (АМС), блеомицин, бусульфан, калихемицины, кармустин цисплатин, колхицин, цианоморфолино-доксорубицин, циклофосфамид, цитарабин, цитохалазин В, дактиномицин, даунорубицин, декарбазин, дибромоманмтол, дигидрокси антрацин дион, доксорубицин, эметин, эпирубицин, этидия бромид, этопозид, грамицидин D, глюкокортикоиды, лидокаин, ломустин (CCNU), мехлоретамин, мелфалан, метотрексат, митрамицин, митомицин, митоксантрон, морфолино-доксорубицин, прокаин, пропранолол, пуромицин, пиррол обензодиазапины, сибиромицин, стрептозотоцин, таксол, тенопозид, тетракаин, тиоэпа хлорамбуцил, трихотхецины, губулизин, винкристин, а также стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные от любого из вышеупомянутых.
[0056] В одном примере осуществления, Биологически Активной Молекулой является майтанзиноид или аналог майтанзиноида. Примеры майтанзиноидов для использования в настоящем документе описаны Widdison и др., в J. Med. Chem., 2006, 49, стр. 4392-4408, для всех целей включенные в данный документ посредством ссылок.
Материалы сшивающего агента
[0057] В настоящее раскрытие включено соединение сшивающего агента, химически способного к ковалентной связи двух разнесенных химических молекул. Сшивающий агент разносит и связывает две молекулы. Например, сшивающий агент может связать Лиганд и Биологически Активную Молекулу. С одной стороны, сшивающий агент является саморасщепляющимся, в случае связи сшивающим агентом двух или более химических молекул, и выпускает, как минимум, одну из указанных химических молекул в присутствии фермента. С другой стороны, сшивающий агент может прикрепляться к другим химическим молекулам, включая, но не ограничиваясь, аналитические средства, биомолекулы, нацеливающие средства, детектируемые метки, диагностические средства, и тому подобные. В одном примере осуществления, сшивающий агент соединяет биологически активную молекулу с Лигандом. В другом примере осуществления, сшивающий агент соединяет биологически активный макролид с Лигандом. В еще одном примере осуществления, сшивающий агент соединяет биологически активный макролид с антителом, или их комбинациями.
[0058] С одной стороны, сшивающие агенты полезны для ковалентной связи лигандов с терапевтическими средствами и маркерами. С другой стороны, сшивающие агенты улучшают химическую и/или системную устойчивость прикрепленных молекул. С другой стороны, сшивающие агенты снижают физиологическую токсичность прикрепленных молекул. С другой стороны, сшивающие агенты улучшают фармакокинетику, фармакодинамику и/или биологическую доступность прикрепленных молекул. С одной стороны, сшивающие агенты раскалывают и высвобождают Биологически Активную Молекулу в месте, или вблизи целевой клетки или клеточной популяции в фармакологически эффективной
форме. С одной стороны, раскалывание производится ферментами. С одной стороны, раскалываемые на сшивающих агентах группы для ферментного раскалывания включают в себя, но не ограничиваются, пептидные связи, сложные эфирные связи и бисульфидные соединения. С другой стороны, сшивающий агент раскалывается с помощью изменений уровня кислотности, рН.
[0059] В одном примере осуществления, соединения сшивающего агента представлены формулой (VI):
Z2 А W X Y Z, (VI)
где:
Z2 и Z) каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5FL6-, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
где Аь A3, Ri и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СБх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C:(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NRi8-, -CR5R6-;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR|8, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, Ri, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и "х" является 0, 1 или 2.
[0060] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где Z2 представлено следующей структурной формулой:
-Z2A-Z2B-Z2c-Z2n-,
где:
Z2A, Z2B, Z2C и Z2D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-,
-О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНХ)Р1,
-С(=0)-0-(СНХ)Р1, -(СНХ)Р1-С(=0)-, -(СНХ)Р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)Р2- )Р3-,
-((СН2)Р2-0-)Р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S )-S-, -S-,
-SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -Г^)-С(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-,
-C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-С(=0)-Ы^), -0-C(=S)-N(R4)-,
s о < о
-C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, 0х или Ox
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0061] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где Z) представлено следующей структурной формулой:
-ZIA-ZIB-ZIC-ZIO-,
где:
ZIA, Z|B, Z,c и Z|D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНХ)РЬ -С(=0)-0-(СНХ)Р1, -(СНХ)Р1-С(=0)-, -(СНХ)Р1-С(=0)-0-,
-(0-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)P2-0-)p3-t -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -
S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -
N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(==0)-N(R4),
j о . о
Лу 1 U
-0-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, или cr ,
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0062] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где А является аминокислотой, выбираемой из группы, в которую входят аланин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серии, треонин, валин, триптофан, тирозин, цистеин и цитруллин.
[0063] С другой стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где А является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруилин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин.
[0064] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (VI), где X является арилом, выбираемым из группы, состоящей из:
где к9, Rio, Rn, и R|2 каждый независимо являются Н, алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, галогеном, NRi3R|4, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R,s, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-R15, -C(=0)-NR13 R,4; и далее, где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
Rn и R14 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a Ri5 является необязательно замещенным алкилом.
[0065] В соответствии с определенными примерами осуществления, сшивающие агенты, биологически активные молекулы и другие соединения настоящего раскрытия, могут соединяться с антителом или антигенсвязывающей молекулой путем прикрепления к определенной аминокислоте антитела или антигенсвязывающей молекулы. Примеры прикрепления к аминокислоте, которые могут использоваться в контексте раскрытия, включают в себя, напр., лизин (см. напр., US 5,208,020; US2010/0129314; Hollander и др., Bioconjugate Chem., 2008, 19:358-361; WO 2005/089808; US 5,714,586; US 2013/0101546; и US 2012/0585592), цистеин (см., напр., US 2007/0258987; WO 2013/055993; WO 2013/055990; WO 2013/053873; WO 2013/053872; WO 2011/130598; US 2013/0101546; и US 7,750,116), селеноцистеин {см., напр., WO 2008/122039; и Hofer и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 2008, 105:12451-12456), формил глицин (см., напр., Carrico и др., Nat. Chem. Biol., 2007, 3:321-322; Agarwal и др., Proc.
Natl. Acad. Sci., USA, 2013, 110:46-51, и Rabuka и др., Nat. Protocols, 2012, 10:1052-1067), искусственные аминокислоты (см., напр., WO 2013/068874, и WO 2012/166559), и кислые аминокислоты (см., напр., WO 2012/05982). Сшивающие агенты также могут быть сопряжены с антигенсвязывающим белком путем прикрепления к углеводам (см., напр., патентную заявку США 2008/0305497, и Ryan и др., Food & Agriculture Immunol., 2001, 13:127130), и дисульфидным сшивающим агентам (см., напр., WO 2013/085925, WO 2010/010324, WO 2011/018611, и Shaunak и др., Nat. Chem. Biol, 2006, 2:312-313).
[0066] В соответствии с другими определенными примерами осуществления, сшивающие агенты, биологически активные молекулы, такие как лекарственные препараты, могут соединяться с антителом или антигенсвязывающей молекулой путем прикрепления к определенной аминокислоте антитела или антигенсвязывающей молекулы, образуя коньюгат антитела с лекарственным препаратом (ADC).
Соединения
[0067] С одной стороны, в настоящем раскрытии приводятся коньюгаты биологически активной молекулы и Лиганда, представленные следующей структурной формулой (I):
-Z2 А W X Y D
где:
Ъ" отсутствует, или является Лигандом;
далее, где:
когда "L" является Лигандом, "L" способно связываться с клеткой или клеточной популяцией;
"а" является целым числом от 1 до 10;
Z2 и Zi каждый независимо являются отсутствующими или буферами; "D" является Биологически Активной Молекулой;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являться необязательно замещенными;
где Аь А3, R] и R3 каждый независимо отсутствуют, являются
аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом,
алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-,
-0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-,
-N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4> -, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NRi8-, -CR5R6-;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR18, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкил а, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и "х" является 0, 1 или 2.
[0068] С другой стороны, настоящее раскрытие относится к соединениям, в которых биологически активной молекулой является цитотоксичный биологически активный макролид.
[0069] С еще одной стороны, в настоящем раскрытии, как биологически активные макролиды, приводятся майтанзиноиды, в виде, представленном формулой (И):
(И),
где А6, А7, А8, А9 каждый независимо отсутствуют, являются аминокислотой, N-алкильной аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкенилом, алкинилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, и гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(-О)-
0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ -С(=0)-0-(СНх)рЬ -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-NH-, -C(=S)-S-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-f -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -O-C(=0)-NR4,
где при этом алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, и гетероциклил являются необязательно замещенными, и R^, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0070] В другом примере осуществления, майтанзиноид представлен следующей структурной формулой (П)(а):
(И)(а).
[0071] С одной стороны, в раскрытии приводится соединене по формуле (I), гдле Лиганд (L) способен связываться с клеткой или клеточной популяцией.
[0072] С другой стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (I), где Лиганд (L) выбирается из группы, состоящей из белков, антител, фрагментов антител, нуклеиновых кислот, антигенсвязывающих остовов и углеводов.
[0073] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (1), где Лигандом (L) является антитело или его фрагмент.
[0074] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (I), где Лигандом (L) является антитело или его фрагмент, специфически связывающие опухолевый специфический антиген.
[0075] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (I), где антитело или его фрагмент имеют сернистую группу, прикрепленную ковалентной связью к Z2.
[0076] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (I), где Z2 представлено следующей структурной формулой:
-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D-,
где:
Z2A, Z2B, Z2C И Z2D каждый независимо являются отсутствующими,
аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом,
алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR -О-, -С(=ОК -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ
-C(=0)-0-(CHx)pl, -(CHx)prC(=0)-, -(CHx)p,-C(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-,
-((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-,
-SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(Rg)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-,
-C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-N(R4> , -0-C(=S)-N(R4)-, -
j о . о
C(=S)-N(R4> -, -N=C=S, -N=C=0, о или сг , где алкил, алкинил,
алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0077] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (I), где антитело или его фрагмент имеют сернистую группу, прикрепленную ковалентной связью к Z2A-
[0078] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (I), где Z| представлено следующей структурной формулой:
-ZiA-ZiB-Zic-Zii)-,
где:
Z|A, Z|B, Zic и Z1D каждый независимо отсутствуют, являются аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-,-0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ -С(=0)-0-(СНх)рЬ -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-,
-C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-N(R4), -0-C(=S)-N(R4)-,
j о < о
-C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, 0х или 0х ,
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a Rj, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0079] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (I), где Биологически Активная Молекула (D) прикреплена ковалентной связью к
[0080] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (I), где А является аминокислотой, выбираемой из группы, в которую входят аланин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин, аргинин, серии, треонин, валин, триптофан, тирозин, цистеин и цитруллин.
[0081] С другой стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (I), где А является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруилин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин.
[0082] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (I), где "X" является арилом, выбираемым из группы, состоящей из
где R9, R,o, Rn и Ri2 каждый независимо являются Н, алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, галогеном, NR^R^, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R,5, -C(=0)-0-R15, -C(=0)-NR13 R14; и
далее, где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R,3 и R14Ka^ibni независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R15 является необязательно замещенным алкилом.
[0083] С другой стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (III):
(Ш),
где:
АЬ является антителом или его фрагментом;
ААГАА2 является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруилин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин
аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10; "q" является "0" или целым числом от 1 до 5
А3, R[ и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CRiR6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1-, -С(=0)-0-(СНх)р|-, -(СНх)р,-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, и гетероциклил являются необязательно замещенными;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR|8, CR5R6;
R4, R5, R3 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R(), R,o, Rn, и R]2 каждый независимо являются Н, галогеном, NR^R^, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R,5, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-R15, -C(=0)-NR,3 R|4 , замещенными или незамещенными: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом;
R,3 и R!4 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R15 является необязательно замещенным алкилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
"х" является 0, 1 или 2; a DM представлен следующей структурой (напр., соединением формулы (П)(а)):
[0084] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (III) где:
"q" равно 4;
R) и R3 каждый независимо являются -О-, -S-, NR4, -CR5R6-;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR18, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, ал кила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5,R6,R9, Rio, Rn, R12 каждый независимо являются Н или алкилом; и А3 является алкилом.
[0085] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (III), представленные следующими структурами (Ш)(а) и (Ш)(Ь):
CyNH2
О Н ° Г н
Ab'S V^Q О Ж Н О lUCoYri_^DM
О о
CyNH2 ^NH
s о (III)(a) и (III)(b), где Ab является антителом или его фрагментом.
[0086] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения
формулы (IV):
(IV)
где:
Ab является антителом или его фрагментом;
ААГАА2 является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруилин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин
фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10;
"q" является "0" или целым числом от 1 до 5;
Ri являются отсутствующим, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, апкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-,
-С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)рГС(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -so2-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4> -,
-C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R4, является "Н", или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R9, Rio, Rn, и R)2 каждый независимо являются Н, галогеном, NR|3Ri4, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-Rls, -C(=0)-R,5, -C(=0)-0-R15, -C(=0)-NR13 R]4, замещенными или незамещенными: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом; и
DM представляется следующей структурой:
[0087] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (IV), где:
"q" равно 4; а
выбирается из группы, состоящей из -О-, -S-, NR4, и -CR5R6-; и далее, где R4, R3 и R6 каждый независимо являются Н или алкилом.
[0088] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (IV), представленные следующей структурой (IV)(a):
Где Ab является антителом или его фрагментом.
[0089] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (V)
Z7 А W X Y Z,- D (V)
где:
Z2 и Z, каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"D" является Биологически Активной Молекулой;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, или -NRr;
"X" отсутствует или является замещенными или незамещенными: арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом;
где Аь А3, R| и R3 каждый независимо отсутствуют, являются аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1-, -С(=0)-0-(СНх)р1-, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где
алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NR|8-, -CR5R6-; Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR!8, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и "х" является 0, 1 или 2.
[0090] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится соединение формулы (V), где:
Z2 представлено Формулой (VII):
-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D- (VII), далее, где:
Z2A, Z2B, Z2c и Z2D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(.=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ -С(=0)-0-(СНх)р|, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, (О-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-N(R4), -O-
где
алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил
являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, аткенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
Ъ\ представлено Формулой (VIII):
"ZIA-ZIB-ZIC-ZID"
(VIII),
где:
ZIA, ZIB, Zic и ZJD каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом,
-CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р|-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, -N=C=S, -N=C=0,
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, и R4, R5, R6, R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными: алкилом, аткенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
"А" является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-ватин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин
аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота- аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин; и
"X" является арилом, выбираемым из группы, состоящей из
где R9, Rio, Rn, и R12 каждый независимо являются Н, алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, галогеном, NR13R14, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-R,5, -C(=0)-NR13 R14, где далее алкил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R]3 и R14 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R15 является необязательно замещенным алкилом.
[0091] Биологически Активные Молекулы (D) могут быть необязательно замещенным майтанзиноид ом Формулы II:
(П), где:
А6, А7, А8, А9 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, N-алкильной аминокислотой, пептидом, имеющим, 2-20 аминокислот, алкилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -C(=0)-, -0-C(=0)-, -C(=0)-0-, -0-C(=0)-0-, -C(=0)-(CHx)pb -C(=0)-0-(CHx)pl, -(CHx)prC(=0)-, -(CHx)prC(=0)-0-, -(0-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)p2-0-)p3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, 0-C(=0)-NR4, где далее
гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4. R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0092]
В другом примере осуществления, в раскрытии приводятся
соединения формулы (V), где биологически активной молекулой является необязательно замещенный майтанзиноид, представленный следующей структурной формулой:
(II), где:
А6, А7, А8, А9 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, N-алкильной аминокислотой, пептидом, имеющим, 2-20 аминокислот, алкилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом ,
-CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)Рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR,-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -г^)-С(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, 0-C(=0)-NR4, где далее алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8, каждый независимо являются
H, или замещенными или незамещенными: алкилом, алкенилом, апкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0093] В еще одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (V), где Биологически Активной Молекулой является майтанзиноид, представленный следующей структурной формулой:
[0094] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (V), представленные следующими структурами (V)(a), (V)(b), (V)(c), (V)(d) и (V)(e):
[0095] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (IX):
Y, Z, D (IX)
где:
"D" является Биологически Активной Молекулой; Y| является
где R3a и А3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р,-С(=0)-, -(СНх)рГ-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где
далее алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, и
Z, представлено следующей структурной формулой:
-Z|A-ZiB-Zic-Z|[)-,
где:
ZlA, Z1B, Zic и Z1D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0> , -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(----S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(Rg)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(==0)-N(R4),
f 0 f 0
-0-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, или ,
где далее алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
[0096] С другой стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (IX), где Биологически Активной Молекулой является цитотоксичный биологически активный макролид. С еще одной стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (IX), где биологически активным макролидом является майтанзиноид. С еще одной стороны, в
раскрытии приводится соединение формулы (IX), где майтанзиноид представлен формулой (II). С другой стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (IX), где майтанзиноид представлен формулой (П)(а).
[0097] Со стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (IX), где 1С50 соединения превышает примерно 10 нМ.
[0098] Со стороны, в раскрытии приводится соединение формулы (IX), где соединение примерно в 10 раз менее цитотоксично, чем соответствующее соединение формулы (I).
[0099] С другой стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (X):
где:
"Ab" является антителом или его фрагментом; "а" является целым числом от 1 до 10;
Z2 и Zi каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
ИЛИ
где Аь A3, Ri и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р|-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(О-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NR18-, -CR5R6-;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR18, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом:
pi, p2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
"х" является 0, 1 или 2; и
DM представлен следующей структурой:
[00100] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (X), представленные следующей структурой (Х)(а):
где "а" является целым числом от 1 до 10.
где:
[00101] С еще одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формулы (XI):
"Ab" является антителом или его фрагментом;
АА1-АА2 является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруилин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота- аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10;
"q" является "0" или целым числом от 1 до 5;
А3, R, и R3 каждый являются независимо отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(-0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рг, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)Р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(-0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил. алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил являются необязательно замещенными;
R(7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR!8, CR5R6;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R9, Rio, Rn, и R12 каждый независимо являются H, галогеном, NRi(Rl4, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-R15, -C(=0)-NR13 R]4, замещенными или незамещенными: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом;
Ri3 и R[4 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R[5 является необязательно замещенным алкилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
"х" является 0, 1 или 2; и
DM представлен следующей структурой:
[00102] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формулы (XI), представленные следующей структурой (Х1)(а):
/ а (Х[)(а)
где "а" является целым числом от 1 до 10;
[00103] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формул (I), (III), (IV) (V), и (X), где А является пептидом, расщепляемым с помощью протеазы.
[00104] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединение формулы (XI), где пептид расщепляется с помощью протеазы.
[00105] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединения формул (I), (III), (IV) (V), и (X), где "А" является пептидом, расщепляемым с помощью протеазы, в эквиваленте опухолевой ткани.
[00106] С одной стороны, в раскрытии приводятся соединение формулы (XI), где пептид является расщепляемым с помощью протеазы, в эквиваленте опухолевой ткани.
[00107] В примере осуществления, в раскрытии приводятся соединения формул (I), (III), (IV), (V), (X) где "А" является пептидом, расщепляемым с помощью протеазы, где далее протеаза является катепсином или плазмином.
[00108] В примере осуществления, в раскрытии приводятся соединение формулы (XI), где пептид является расщепляемым с помощью протеазы, где далее протеаза является катепсином или плазмином.
Составы
[00109] Примеры осуществления из настоящего документа включают в себя составы, включающие в себя коньюгатные соединения формул (I), (III),
(IV) , (V), (X), или (XI), а также их смеси. С некоторых сторон, соединение
далее представлено соединением формул (III)(a), (III)(b), (IV)(a), (V)(a),
(V) (b), (V)(c), (V)(d) (V)(e), (X)(a) или (XI)(a).
[00110] Примеры осуществления из настоящего документа включают в себя составы, включающие в себя соединения формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X), или (XI), а также их см!еси.
[00111] Составами могут быть лекарственные препараты, далее включающие в себя один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или субстанций. С некоторых сторон, лекарственным препаратом является фармацевтически приемлемая соль составов формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) или (XI), или их смесей. С некоторых других сторон, лекарственным препаратом является фармацевтически приемлемая соль составов формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) или (XI), или их смесей.
[00112] Подходящие фармацевтически приемлемые носители, разбавители и субстанции известны специалистам, и могут быть определены средним специалистом как обоснование клинической ситуации. Примерами подходящих носителей, разбавителей и субстанций включают в себя: буферы для сохранения правильной кислотности состава (напр., цитратные буферы, сукцинатные буферы, ацетатные буферы, фосфатные буферы, лактатные буферы, оксалатные буферы и т. п.), белки-носители (напр., человеческий сывороточный альбумин), физиологический раствор, полиолы (напр., трегалоза, сахароза, ксилит, сорбит и т. п.), сурфактанты (напр., полисорбат 20, полисорбат 80, полиоксолат, и т.п.), антибактериальные препараты и антиоксиданты.
[00113] По желанию, лекарственные препараты настоящего документа могут включать в себя второе или последующие лечебные средства (напр., стимулятор коньюгатных соединений формул (I), (III), (IV), (X) и/или (XI), противоопухолевые вещества, антибиотики, противовоспалительные средства, и т. п.). Второе лечебное средство может быть включено в тот же состав, что и соединения формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI), или может вводиться отдельно от соединений формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI) (по времени, или типу и месту введения).
[00114] Специалист в области биологически активных молекул поймет, что каждое из соединений формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI) может быть изменено таким образом, что получившееся соединение по-прежнему сохранить специфичность и/или активность, идентичную начальному соединению. В этом свете, Биологически Активная Молекула (D) соединений формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI), может включать в себя все возможные аналоги и производные биологически активных молекул. В одном примере осуществления, Биологически Активными Молекулами являются макролид, а далее и майтансин, или аналог майтансина, как описано в публикации Widdison и др., J. Med. Chem., 2006, 49(14), 4392-4408.
[00115] С одной стороны, в раскрытии приводится лекарственный препарат, состоящий из терапевтически эффективного объема соединения формул (I), (III), (IV), (X), (XI), включая (III)(a), (III)(b) (IV)(a), (Х)(а) и (Х1)(а), или его фармацевтически приемлемая соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
[00116] С одной стороны, в раскрытии приводится лекарственный препарат, состоящий из терапевтически эффективного объема соединения формул (I), (III), (IV), (V), (IX), (X), (XI), включая (Ш)(а), (III)(b), (IV)(a), (V)(a), (V)(b), (V)(c), (V)(d) и (V)(e), (X)(a) и (XI)(a), или его фармацевтически приемлемая соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
[00117] С другой стороны., в раскрытии приводится лекарственный препарат, состоящий из терапевтически эффективного объема соединения формулы (V), включая (V)(a), (V)(b), (V)(c), (V)(d) и (V)(e), или его фармацевтически приемлемая соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
[00118] С другой стороны, в раскрытии приводится лекарственный препарат, состоящий из терапевтически эффективного объема соединения формулы (IX), или его фармацевтически приемлемая соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
[00119] С другой стороны, в раскрытии приводится лекарственный препарат, состоящий из терапевтически эффективного объема соединения формул (V) и (IX), включая (V)(a), (V)(b), (V)(c), (V)(d) и (V)(e), или его фармацевтически приемлемая соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
Способ применения
[00120] Как описано выше, коньюгатные соединения формул (I), (III), (IV), (X) и (XI) могут быть получены с различными функциональными группами, в результате чего Лиганд (L) прикрепляется к сшивающему агенту, и посредством этого Биологически Активная Молекула образует ковалентный коньюгат. Лиганд специально нацеливается на сопряжение соединения с партнером по связыванию Лиганда, как правило, полипептидом, или другим подобным антигеном. В типичном примере осуществления, коньюгат предназначен для включения Лиганда, имеющего партнера по связыванию, находящегося в клетках, испытывающих рост идиобластов, или клеток, соучаствующих в пролиферативном заболевании. Как ни странно, коньюгатные соединения формул (I), (III), (IV), (X) и (XI) были созданы так, чтобы сшивающий агент каждого соединения катаболизировался внутри клетки, связанной посредством коньюгата. В таком качестве, доставка биологически активной молекулы при помощи коньюгата, описанного в примерах осуществления настоящего документа, дает возможность доставки биологически активных молекул которые, в
обычных условиях, были бы слишком токсичными для обычного введения. Примеры осуществления настоящего документа, дают возможность высоко избирательной и специфической доставки этих молекул в клетки, испытывающие рост идиобластов, или клетки, соучаствующие в пролиферативном заболевании (по сравнению с катаболизмом вне клетки, выпуская, посредством этого, биологически активное соединение в кровь или лимфатическую систему, например).
[00121] Как может быть предусмотрено специалистом, описанные в настоящем документе ковалентные коньюгатные соединения также могут использоваться для доставки любого типа полезных биологически активных молекул, и могз/т быть избирательно нацелены на любой тип клеточной популяции. Например, коньюгат может использоваться для доставки противопролиферативных лекарств к клеткам, переживающим патологический рост, или противовирусных препаратов к клеткам, инфицированных вирусом, пока выбранный Лиганд распознает корректного партнера по связыванию клеток.
[00122] В данном свете, способы применения приводятся для описанных в настоящем документе примеров осуществления коньюгатных соединений.
[00123] Описанные в настоящем документе лекарственные препараты полезны для задержки, замедления и/или предотвращения роста идиобластов, или при лечении различных пролиферативных заболеваний или болезней у млекопитающих. В типичных примерах осуществления, млекопитающим является человек (описанные в настоящем документе примеры осуществления относятся к человеку). В число других млекопитающих входят любые млекопитающие, которые могут страдать от диагностируемых пролиферативных заболеваний, в том числе: приматы,
собаки, кошки, лошади, козы, овцы, крупный рогатый скот, верблюды и им подобные. Кроме этого, известно, что коньюгатные соединения лекарственных средств предназначены для избирательного воздействия на клетки, переживающие рост идиобластов или лечения различных пролиферативных заболеваний или болезней, описанных в настоящем документе.
[00124] В связи с этим, описанные в настоящем документе примеры осуществления включают в себя методы задержки роста идиобластов или лечения пролиферативных заболеваний человека, включающие введение в организм человека терапевтически эффективного количества лекарственного средства, описанного в настоящем документе.
[00125] Введение описанного в настоящем документе терапевтически эффективного количества лекарственного средства может осуществляться несколькими путями, напр., путем внутривенного, внутрибрюшинного, подкожного, внутримышечного, топического, внутрикожного, интраназального или эндобронхиального введения. Описанные в настоящем документе лекарственные средства также могут вводиться непосредственно в место роста идиобластов (прямо и косвенно соприкасаясь с ростом идиобластов) путем, например, биолистической доставки (биолистическая доставка описанных в настоящем документе лекарственных средств в легочную или мозговую опухоль, например). Рекомендуемая дозировка для введения описанных в настоящем документе лекарственных средств будет определяться лечащим врачом или другим специалистом этой области, а также основываться на конкретной клинической ситуации. Как известно специалистам в фармацевтике, дозировки для любого человека, т.е., пациента, зависят от нескольких факторов, в том числе от размеров пациента, площади тела пациента, его возраста и общего состояния здоровья, пола пациента, времени и способа введения, а также наличия
второго лекарственного средства. В некоторых случаях, коньюгатные соединения формул (I), (III), (IV), (X) и/или (XI) могут присутствовать в количестве от 1 мкг до 100 мг/кг массы тела на дозу (обратите внимание на то, что когда рассматривается способ введения путем непрерывной инфузии, может рассматриваться введение всего 1 мкг/кг массы тела в минуту). Фармацевтические композиции могут вводиться один или несколько раз в день и в течение нескольких дней, недель, месяцев или лет.
[00126] Лечение пролиферативной патологии или заболевания, например, опухоли, включает в себя методы уменьшения размера опухоли, вызывающие некроз или апоптоз в опухоли, цитолиз опухоли, остановку увеличения размера опухоли, и/или предотвращения инвазивности или метастаз опухоли.
[00127] Примеры состояний здоровья, которые могут быть вылечены в соответствии с методами задержки роста идиобластов, или лечения пролиферативных патологий, включают в себя: злокачественные опухоли любого типа, напр., рак легкого, толстой кишки, предстательной железы, почек, поджелудочной железы, печени, яичника, кожи, лимфома, лейкемия и т.п.; аутоиммунные заболевания, напр., системная волчанка, ревматоидный артрит, рассеянный склероз; вирусные инфекции, напр., цитомегаловирусная инфекция, ВИЧ инфекция, СПИД, Гепатит, ВПЧ (вирус папилломы человека); боль; психические расстройства и воспалительное заболевания.
[00128] Как отмечалось выше, описанные в настоящем документе фармацевтические композиции также полезны при профилактике или лечении вирусных инфекций, болей, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний и т. п. у млекопитающих.
[00129] С одной стороны, в раскрытии приводится метод снижения, замедления или остановки роста идиобластов, состоящий из взаимодействия соединения формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI) с идиобластом в объеме, достаточном для замедления, снижения или остановки роста идиобласта, и при котором рост идиобластов замедляется, снижается или останавливается.
[00130] С одной стороны, в раскрытии приводится метод ликвидации клетки, состоящий из взаимодействия соединения формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI) с клеткой в объеме, достаточном для гибели клетки, и при котором клетка погибает.
[00131] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится метод ликвидации клетки, состоящий из взаимодействия соединения формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI) с клеткой в объеме, достаточном для гибели клетки, и при котором клетка погибает, и где клеткой является опухолевая клетка.
[00132] С одной стороны, в раскрытии приводится метод лечения болезни у страдающего от болезни лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI).
[00133] С другой стороны, в раскрытии приводится метод лечения болезни у страдающего от болезни лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формул (I), (III) (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI).
[00134] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится метод лечения болезни у страдающего от болезни лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI), и далее состоящий из
секвенциального или последовательного назначения дополнительной терапии.
[00135] В одном примере осуществления, в раскрытии приводятся методы, при которых дополнительной терапией является лучевая терапия, химиотерапия или сочетание обеих.
[00136] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится метод лечения болезни у страдающего от болезни лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI), и далее состоящий из секвенциального или последовательного назначения дополнительной терапии, а также назначение как минимум одного дополнительного лекарственного препарата.
[00137] В одном примере осуществления, в раскрытии приводится метод лечения болезни у страдающего от болезни лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение формул (I), (III) (IV), (X) и/или (XI), и далее состоящий из секвенциального или последовательного назначения дополнительной терапии, или назначение как минимум одного дополнительного лекарственного препарата.
[00138] С одной стороны, санируемое заболевание выбирается из опухолей, рака, инфекционных болезней, нейродегенеративных болезней, поражений костей и сердечно-сосудистых заболеваний.
[00139] В описанных в настоящем документе примерах осуществления также приводятся методы получения соединений формулы (I) из прекурсора, или построения блочных соединений формулы (V). С некоторых сторон, соединения формулы (V) также могут применяться в
терапевтических целях, где соединение формулы (V) является фармацевтической композицией. С некоторых сторон, соединения формулы (V) могут включаться в составы фармацевтических композиций соединения (I), (III), (IV), (IX), (X) и/или (XI).
[00140] Наконец, описанные в настоящем документе примеры осуществления могут включать в себя смеси соединений, как представлено формулами (I), (III), (IV), (V), (IX), (X) и/или (XI).
Получение коньюгатов
[00141] Коньюгатные соединения Лиганд-Биологически Активная Молекула могут формироваться с помощью любой известной специалистам технологии. Коньюгатные соединения Лиганд-Биологически Активная Молекула имеют элемент Лиганда, Биологически Активную Молекулу, и, дополнительно, сшивающий агент, соединяющий Биологически Активную Молекулу с Лигандом. Ковалентное соединение Биологически Активных Молекул и/или сшивающих агентов с Лигандом может осуществляться с помощью множества реакций, использующих аминокислотные остатки Лиганда, напр., антитело, включая аминогруппы лизина, свободные группы карбоновой кислоты глутаминовой и аспарагиновой кислот, сульфгидрильные группы цистеина и различные молекулы ароматических аминокислот.
[00142] Кроме того, коныогаты в соответствии с описанными в настоящем документе примерами осуществления могут быть получены любым методом, известным специалистам. Пояснительный протокол получения коньюгатов приводится ниже, в Примерах. Тем не менее, могут использоваться и другие известные способы, включая, например, протоколы, описанные в публикации международной заявки WO 2009/134977, Патенте США US№7,811,572 и Патенте США
US№6,441,163, пока они используются для получения соединений, описанных в настоящем документе. Эти справки включены посредством отсылки на их целевое назначение.
[00143] В одном примере осуществления, коньюгаты могут быть получены путем i) реакции Лиганда со сшивающим агентом для получения модифицированного соединения Лиганд-Сшивающий агент; ii) необязательной очистки соединения Лиганд-Сшивающий агент; iii) сопряжения биологически активной молекулы, напр., макролида, с Лигандом-Сшивающим агентом для получения коньюгата формул (I), (III), (IV), (X) или (XI); и iv) очистки коньюгата.
[00144] В альтернативном примере осуществления, коньюгаты могут быть получены путем реакции биологически активной молекулы с первым компонентом Сшивающего агента (Z]), с последующими реакциями для построения Сшивающего агента, включая добавление Y, X, W, А и Z2, или любых их комбинаций.
[00145] В альтернативном примере осуществления, коньюгаты могут быть получены путем реакции Лиганда, Сшивающего агента и биологически активного макролида в одной реакции. Сразу после получения, коньюгаты в соответствии с настоящим изобретением могут быть очищены.
Определение цитотоксичности коньюгатных соединений
[00146] В одном примере осуществления, описанные в настоящем документе коньюгатные соединения могут оцениваться по их способности подавлять размножение различных линий раковых клеток вне организма. Анализы цитотоксичности вне организма могут производиться с помощью известных специалистам методов (см. Widdison и др., J. Med. Chem., 2006,
49(14), 4392-408), и как показано в Примере 7 настоящего документа. Например, коньюгатные соединения могут применяться вне организма к посеянным на чашке раковым меткам в течение предустановленного числа дней, а выжившие клетки могут измеряться анализами с помощью известных методов. Для обеспечения действительности результатов, могут применяться надлежащие средства контроля, как могут значения 1С50. Примеры эффективности коньюгатных соединений настоящего документа вне организма можно увидеть на ФИГ.1 и ФИГ.2. Дополнительная эффективность в организме может использоваться для подтверждения эффективности предлагаемого коньюгатного соединения, например, используя модель "голой" мыши.
[00147] Приведенные выше формулировка, примеры и данные дают полное описание получения и использования состава настоящего изобретения. Так как многие примеры осуществления изобретения могут быть сделаны без отступления от существа и объема настоящего изобретения, изобретение заключается в приложенных далее по тексту формулах изобретения.
[00148] Все ссылки, процитированные в настоящем документе и последующих Примерах, явным образом полностью включены в данный документ посредством ссылок.
[00149] Представленные ниже описание и Примеры сделаны для иллюстрации рассматриваемого изобретения. Специалисту будет понятно, что эти Примеры приводятся только для наглядности, а не с целью ограничения данного изобретения.
PCT/US2014/029757
Подробности экспериментов
[00150] Протонный спектры ЯМР (для соединений, которые невозможно обнаружить УФ-излучением) были получены с помощью оборудования "Varian Inova" 300 МГц, а массовые спектры были собраны на оборудовании масс-селективного детектора/жидкостной хроматографии "Agilent" серии 1100 с источником электрораспылительной ионизации и анализатором с тройной квадрупольной ионной ловушкой. Соответствующие коньюгаты были анализированы с помощью масс-спектрометра времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы "Bruker ultraFleXtreme". Все исходные материалы и растворители были приобретены на открытом рынке, и, если не указано иное, использовались без очистки.
ПРИМЕР 1
[00151] Этап 1: Майтансин-З-Ы-метш-Ь-аланин (2)
[00152] Титульное соединение было получено как твердое вещество золотого цвета из майтансинола (1) с помощью методов, описанных в заявке на патент США US 2007/0037972 Al. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитан для С C32H44ClN30y, 649,3; полученный 650,6 (М+Н).
[00153] Этап 2: Майтансин-3-Ы-метил-Ъ-(^)-аланин-Ы-[4-{амино-цитруллин-валин-гексанамид-6-малеимидил) бензил]карбамат (3):
[00154] Продукт из предыдущего этапа (2, 0,020 г, 0,031 ммоль) и p-No2-Рп-карбонато-Вп-Сп-Уа1-малеимид (MA-VC-PAB-PNP, 0,027г, 0,037 ммоль; компания "Concords Biosystems") были растворены в N,N
диметилформамиде (DMF, ок. 0,25 мл) в конической пробирке, обработаны щелочным оксидом алюминия "Brockmann I" (0,10 г). Пробирка была прочищена аргоном, а реакция перемешивалась при комнатной температуре в течение 4 дней. После этого, смесь была отфильтрована, твердые частицы промыты смесью ацетонитрила с водой, а фильтрат очищен непосредственно в 5и, 30x150 мм колонне "Phenomenex Gemini С18" через ЖХВД (30-90% ацетонитрила в воде, 0,1% трифторуксусной кислоты в обоих, в течение 25 мин., 15 мл/мин.). Лиофилизация химически чистой фракции на следующий день дала титульное соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (0,021 г, 55%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для QiH^ClNgO^, 1247,6; получено 1248,8 (М+Н), 1270,7 (M+Na), 1231,5 (М-Н20+Н).
ПРИМЕР 2
[00155] Этап 1: N-mpem-Бутоксикарбонил-бета-аланин сукцинат эфир (4)
[00156] Титульное соединение было получено из имеющегося на рынке трет-бутоксикарбонил-бета-аланина с помощью метода, хорошо известного
специалистам (для сравнения - Widdison и др., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4401). 'Н ЯМР (300 МГц, CDCh): 8 3,62 (bm, 2Н), 2,88 (m, 9Н), 1,47 (s, 9Н).
[00157] Этап 2: Майтансин-3^-метил-Ь-(8)-аланин-трет-бутоксикарбонил-бета-аланин аминокислота (5)
[00158] Продукт из предыдущего этапа (4, 0,45 г, 1,51 ммоль) и майтансин-З-Ы-метил-Г-аланин (2, 0,30 г, 0,23 ммоль) были растворены в смеси (3:1) ацетонитрила с водой (8 мл), обработанной 1М водного NaHC03 (0,5 мл), и перемешаны при комнатной температуре в течение 18 часов. Когда реакция была завершена тонкослойной хроматографией, она затем была перемешана с соляным раствором в течение 10 минут, и трижды экстрагирована с этилацетатом (EtOAc). После этого, объединенные органические слои были высушены на Na2S04, отфильтрованы, а фильтрат сконцентрирован и высушен в вакууме до состояния золотистого сиропа, который был очищен путем колоночной флэш-хроматографии на кассете с 2()г силикагеля (0-10% МеОН в этилацетате в течение 15 мин.), с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,084 г, 43%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C4lH59ClN4Ol2, 834,4; получено 835,2 (М+Н), 857,2 (M+Na), 817,4 (М-Н20+Н).
[00159] Этап 3: Майтансин-3^-метил-Ь-(5)-аланин-бе,та-аланин аминокислота (6)
[00160] Продукт из предыдущего этапа (5, 0,080 г, 0,095 ммоль) был растворен в смеси (3:1:1) ацетоггитрил/вода/трифторуксусная кислота (4 мл) и перемешан при комнатггой температуре в течение 26 часов. Необработанная реакционная смесь была впрыснута непосредственно в колонну с 40 г силикагеля С18 и элюирована через систему очистки "ISCO CombiFlash" (10-90% ацетонитрила в воде, 0,1 % трифторуксусной кислоты
(TFA) в каждом растворителе, в течение 18мин., 40мл/мин), а объединенные химически чистые фракции были сублимированы для получения титульного соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (0,025 г, 31 %). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитан для СзбН51СШ40[о, 734,3; получено 735,5 (М+Н).
[00161] Этап 4: Майтансин-3-М-метш-Ь-(5)-аланин-пропанамидич-3-N-Memm-N-[ 4-(амино-цитруллин-валия-гексанамид-6-малегшидил)бензил]карбамат (7)
[00162] Продукт из предыдущего этапа (6, 0,014 г, 0,019 ммоль) и MA-VC-PAB-PNP (0,020 г, 0,027 ммоль; компания "Concortis Biosystems") были растворены в смеси (4:1) ацетонитрил/вода (2,5 мл), обработаны ОДМ водного NaHC03 (0,5 мл), и перемешаны при комнатной температуре в течение 18 часов. Реакция была очищена напрямую с помощью хроматографии с обращенной фазой на силикагеле С18 (с применением 0,1% трифторуксусной кислоты в градиентах ацетонитр ила/воды). Сублимационная сушка заключительных колонных фракций дала титульное соединение в виде твердого вещества белого цвета (0,002 г, 8%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C65HS!9ClNioOl8, 1332,6; получено 1333,9 (М+Н), 1316,5 (М- Н20+Н), 1355,9 (M+Na).
PCT/US201^/029757
[00163] Этап 1: З-Метшдигио пропионовой кислоты сукцинат эфир (8)
[00164] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества белого цвета из 3-меркаптопропионовой кислоты с помощью методов Widdison и др. J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4392-4408. 1Н ЯМР (300 МГц, CDC13) 5 3,09 (m, 2Н), 3,01 (m, 2Н); 2,86 (s, 4Н); 2,44 (s, ЗН).
[00165] Этап 2: Майтансин-3-М-метил-Ь-(8)-аланин-пропанамидил-3-метшдисулъфид (9)
[00166] Продукт из предыдущего этапа (8, 2,96 г, 11,9 ммоль) и майтансин-З-М-метил-Ь-аланин (2, 1,54 г, 2,37 ммоль) были растворены в смеси (4:1) ацетонитрил/вода (25 мл), обработаны насыщенным водным NaHC03 (2 мл), и перемешаны при комнатной температуре в течение 24 часов. Реакционная смесь подверглась обработке солевым раствором, была трижды экстрагирована с этилацетатом, водный слой был насыщен NaCl, экстрагирован повторно с этилацетатом, а объединенные органические слои высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Фильтрат был сконцентрирован в вакууме до получения сиропа золотистого цвета (ок. 4,5г), который был очищен путем колоночной флэш-хроматографии на кассете с 80 г силикагеля (0 -100% этилацетата в гексанах в течение 30 мин), с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (1,14 г, 61%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C36HS0ClN3Ol0S2, 783,3; получено 784,3 (М+Н), 766,6 (М-Н20+Н).
[00167] Этап 3: Майтансин-3-М-метил-Ь-(Б)-аланин-пропанамид-3-тиол (10)
[00168] Титульное соединение было получено с помощью измененного метода, описанного Whitesides и др. (J. Org. Chem., 1991, 56, 2648-2650).
Продукт из предыдущего этапа (9, 2,42 г, 3,09 ммоль) был растворен в ацетонитриле (30 мл), обработан раствором трис(2-карбоксиэтил)фосфин гидрохлорида (8,23 г, 28,7 ммоль) в воде (30 мл), показатель кислотности рН был увеличен до 3 с добавлением насыщенного водного NaHC03 (5 мл), очищен в колбе с помощью аргона, и реакционная смесь перемешивалась при комнатной температуре под резиновой диафрагмой (вентилируемой вследствие бурного выделения газов). Через 2 часа, реакция была обработана солевым раствором (ок. 100 мл), газирована аргоном в течение 5 минут (для удаления свободного метилмеркаптана), а фазы были разделены. Водная фаза была дважды экстрагирована с помощью этилацетата, насыщена NaCl, и еще дважды экстрагирована с помощью этилацетата. После этого, объединенные органические слои были высушены на Na2S04, отфильтрованы, а фильтрат сконцентрирован и высушен в вакууме для получения титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (2,24 г, 98%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C35H48CIN3O10S, 737,3; получено 738,3 (М+Н), 720,3 (М-Н20+Н).
[00169] Этап 4: 4-Амшо-(Ы-бензшоксикарбонил)бензшамин (14)
[00170] 4-Аминобензиламин (1,00 г, 8,18 ммоль) и триэтиламин (1,20 мл, 8,61 ммоль) были растворены в безводном тетрагидрофуране (THF, 10 мл) в атмосфере N2, охлаждены в соляно-ледяной ванне с перемешиванием, и капельно обработаны в течение 20 минут раствором бензил хлорформиата (1,20 мл, 8,41 ммоль) в безводном THF (10 мл). По завершению добавления, ледяная баня была удалена, и реакция перемешивалась при комнатной температуре в течение 20 часов, после чего фильтровалась через стеклокерамическую воронку для удаления нерастворимых веществ. Твердые вещества были промыты с помощью этилацетата, фильтрат был выпарен в вакууме, а осадок очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 40г силикагеля (0-100% этилацетата в
гексанах, в течение 20 минут, 40 мл/мин). Выпаривание химически чистых средних фракций в вакууме дало титульное соединение в виде бледно-желтого твердого вещества (1,47 г, 70%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для Ci5Hi6N202, 256,1; получено 256,9 (М+Н), 278,9 (M+Na).
[00171] Этап 5: 6-Малеимидикапроновой кислоты сукцинат эфир (20)
[00172] Титульное соединение было получено в виде бесцветной смолы из имеющейся на рынке 6-аминокапроновой кислоты методом, схожим с описанным Marnett и др. (J. Med. Chem., 1996, 39, 1692-1703). 1Н ЯМ? (300 МГц, CDC13) 6 6,72 (s, 2Н); 3,56 (t, 2Н, J = 7 Гц); 2,86 (s, 4Н); 2,64 (t, 2Н, J = 1 Гц); 1.81 (пентет, 2Н, J= 8 Гц); 1,66 (m, 2Н); 1,45 (т, 2Н).
[00173] Этап 6: Трет-бутоксикарбонил-валин-сукцинат (11)
[00174] Титульное соединение было получено из трет-бутоксикарбонил-валина-ОН с помощью метода, хорошо известного специалистам (для сравнения - Widdison и др., J. Med. Chem., 2006, 49 (14), 4401 ).Ш ЯМР (300 МГц, CDCI3) 5 5,03 (d, 1Н, J = 10 Гц); 4,60 (dd, 1Н, J = 9 Гц, 5 Гц); 2,85 (s, 4Н); 2,32 (m, 1Н); 1,47 (s, 9Н); 1,05 (т, 6Н).
[00175] Этап 7: Трет-бутоксикарбонш-валин-цитруллин (12)
[00176] Продукт из предыдущего этапа (11, 4,23 г, 13,5 ммоль) был растворен в ацетонитриле (70 мл), обработан раствором L-цитруллина (3,20г, 18,3 ммоль) в воде (30 мл) и насыщенным раствором NaHC03 (18мл), очищен в колбе с помощью N2, и реакция перемешивалась при комнатной температуре в течение 24 часов. Смесь была сконцентрирована в вакууме для удаления ацетонитрила, однократно промыта с этилацетатом для удаления неполярных загрязнений, а водный слой насыщен NaCl и подкислен до уровня рНЗ с помощью 10% НС1. Получившаяся
непрозрачный смесь была четырежды экстрагирована с помощью 10% изопропанола в этилацетате, объединенные органические слои высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Концентрация и высушивание фильтрата в вакууме дали титульное соединение в виде твердого вещества желтого цвета (4,53 г, 90%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C16H30N4O6, 374,2; получено 373,0 (М-Н).
[00177] Этап 8: Трет-бутоксикарбонил-еалин-цитруллин-амино-4-бензиламино-И-бензшоксикарбамат (15)
[00178] Продукт из предыдущего этапа (12, 3,08 г, 8,23 ммоль) был растворен в М,Ы-диметилформамиде (DMF, 30 мл, высушен на молекулярных ситах), обработан дициклогексилкарбодиимидом (DCC, 2,31г, 11,2 ммоль) и 1-гидроксибензотриазол гидратом (HOBt, 1,51 г, 11,2 ммоль), колба продута N2 и перемешан при комнатной температуре в течение 1 часа. После этого, был добавлен раствор 4-амино-(Ы-бензилоксикарбонила)бензиламина (14, 2,30 г, 8,97 ммоль) в DMF (15 мл), реакция перемешивалась еще 3 дня, была отфильтрована через стеклокерамическую воронку, а твердые вещества вымыты с помощью этилацетата. Фильтрат был промыт смесью (1:1) воды и насыщенного NaHC03 (100 мл), водный слой трижды экстрагирован с помощью 10% изопропанола/этилацетата, а органические слои промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Во время фильтрации образовался нерастворимый гель, который был растворен смесью метанола/этил ацетата. Концентрация фильтрата в вакууме дала смолистый гель золотого цвета, который был обработан диэтиловым эфиром (50 мл), соникацией, отфильтрован и высушен разряжением для получения твердого вещества бледно-желтого цвета. Оно было очищено с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 330 г силикагеля (0 - 10% метанола в дихлорметане, 100 мл/мин) с получением титульного соединения в виде
-72010-8168-4573/2/АМЕ RIC AS
твердого вещества бледно-желтого цвета (4,07 г, 81%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для С^Р^^Оу, 612,3; получено 613,4 (М+Н)
[00179] Этап 9: Трет-бутоксикарбонш-валин-цитруллин-амино-4-бензиламин (16)
[00180] Продукт из предыдущего этапа (15, 3,04 г, 4,96 ммоль) и 10% палладий (0) на активированном угле (0,286 г, 0,269 ммоль) были обработаны в атмосфере N2 метанолом (50 мл) и ледяной уксусной кислотой (0,57 мл, 9,95 ммоль). Реакция газировалась несколько минут с помощью N2 и водорода, и активно перемешивалась под водородным баллоном при комнатной температуре и давлении в течение 1 часа. По завершении реакции с тонкослойной хроматографией, баллон был удален, суспензия газировалась несколько минут с помощью N2, и далее на фильтрующем агенте "Celite 521". Фильтрующий агент "Celite" был промыт метанолом, фильтрат выпарен насухо в вакууме, а остаток однократно растерт в порошок с диэтиловым эфиром, и высушен в вакууме, с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (2,95 г, 99%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для С2зНз8ГЧ605, 478,3; получено 479,2 (М+Н).
[00181] Этап 10: Трет-бутоксикарбонш-валин-цитруллш-амино-4-бензилизотиоцианат (17)
[00182] Продукт из предыдущего этапа (16, 0,586 г, 0,979 ммоль) был растворен в сухом тетрагидрофуране (20 мл) и сухом N,N-диметилформамиде (5 мл) в атмосфере N2, обработан триэтиламином (0,40 мл, 2,87 ммоль), охлажден в ледяной бане, и капельно обработан сероуглеродом (0,10 мл, 1,66 ммоль) в течение 5 мин. Реакция была подогрета до комнатной температуры и перемешана в течение 2 часов,
снова охлаждена во льду, и обработана р-толуолсульфонил хлоридом (0,281 г, 1,47 ммоль). После нагрева до комнатной температуры и перемешивания в течение 18 часов, реакция была промыта смесью (1:1) воды/соляного раствора, дважды экстрагирована этилацетатом, водный слой был насыщен NaCl, еще дважды экстрагирована этилацетатом, а объединенные органические слои были промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Выпаренный фильтрат был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 20 г силикагеля (0-100% ацетонитрила в этилацетате, 35 мл/мин), с получением титульного соединения в виде твердого вещества золотого цвета (0,391 г, 77%) после азеотропии с дихлорметаном и высушивания под глубоким вакуумом. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C24H36N605S, 520,3; получено 521,1 (М+Н).
[00183] Этап 11: Майтансин-3^-метш-Ь-(8)-аланин-пропанамидил-3-Ы-метш-И-[4-(амино-цитруллип-трет-бутоксикарбон11л-вал11н)-бензш] -дитиокарбамат (18)
[00184] Продукт из предыдущего этапа (17, 0,068 г, 0,131 ммоль) и майтансин-3-Н-метил-Ь-(5)-аланин-пропанамид-3-тиол (10, 0,048 г, 0,065 ммоль) были растворены в безводном THF (3 мл) в атмосфере аргона, обработаны триэтиламином (0,050 мл, 0,359 ммоль) через шприц, и перемешивались при комнатной температуре под резиновой диафрагмой в течение 18 часов. Реакция была концентрирована в вакууме, растворена в 10% изопропаноле/этилцегате, и промыта с помощью 0,5Н водной НО. Водный слой был трижды экстрагирован с помощью 10% изопропанола/этилцетата, объединенные органические слои были промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Выпаренный фильтрат был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 12 г силикагеля (0-20% метанола в этилацетате, 30 мл/мин) с
получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,042 г, 51%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C59H84C1N90I5S2, 1257,5; получено 1258,8 (М+Н), 1241,5 (М-Н20+Н), 1280,6 (M+Na).
[185] Этап 12: Майтансин-3-^-метил-Ь-($)-аланин-пропанамидил-3-М-[4-(амино-цитруллин-валин)-бензш]-дитиокарбамат (19)
[00186] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества золотистого цвета (0,016 г, 100%) из продукта предыдущего этапа (18, 0,014 г, 0,011 ммоль) методом из Примера 2, Этап 3 (соединение 6). Соединение использовалось без дополнительной очистки. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для С^НтоСПЧ^О^Бг, 1157,5; получено 1159,4 (М+Н).
[00187] Этап 13: Майтансин-3-М-метил-Ь-(Я)-аланин-пропанамидил-3-N-[4-( амино-цитруллин-валин-гексанамид-6-малеимидил )-беязил ]-дитиокарбамат (21)
[00188] Продукт из предыдущего этапа (19, 0,055 г, 0,032 ммоль) был растворен в смеси (1:1) ацетонитрил/вода (4 мл), обработан 1N водной NaHC03 (0,5 мл) и раствором 6-малеимидилкапроновая кислоты сукцинат эфира (20, 0,070 г, 2,27 ммоль) в ацетонитриле (6 мл), и очищен в колбе аргоном под резиновой диафрагмой. После перемешивания реакции при комнатной температуре в течение 5 часов, перед последующим нагреванием до комнатной температуры и растворения солевым раствором, она была оставлена на 3 дня при температуре в -20°С. Смесь была трижды экстрагирована этилацетатом, объединенные органические слои были промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Выпаренный фильтрат был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 12 г силикагеля (0 - 20% метанола в
этилацетате, в течение 18 минут, 25 мл/мин) с получением титульного соединения в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (0,011 г, 26%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C64H87ClN10O16S2, 1350,5; получено 1352,0 (М+Н), 1334,5 (М-Н20+Н), 1373,5 (M+Na).
Boc
о V
Л0л
L-Citrulline, NaHC03 MeCN/H,0
O^NH2
H2N 14
I Cbz-CI, I THF
Cbz
,NH
BOC'^NV" ~" ' BOCSYV
Л H Ji DCC, HOBt, DMF i H
O^NH2 ,MH
^ Cta: NH
H2, Pd/C, AcOH
MeOH
PCT/US2014/029757
[00189] Этап 1: М-(4-аминометил-фенил)-ацетамид гидрохлорид (23)
[00190] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества светло-желтого цвета из 4-аминобензиламина с помощью метода King и др. (J. Am. Chem. Soc, 1992,114 (8), 3033), 1Н ЯМР (300 МГц, DMSO-d6): 8 10,18 (s, 1H); 8,36 (br s, 3H); 7,63 (d, 2H, J = 8,7 Гц); 7,41 (d, 2H, J = 8,7 Гц); 3,95 (s, 2H); 2,06 (s, 3H).
[00191] Этап 2: Ы-(4-Изотиоцианатометил-фенил)-ацетамид (24)
[00192] Продукт из предыдущего этапа (23, 0,277 г, 1,38 ммоль) был растворен в THF (4,5 мл) и DMF (2,0 мл), охлажден в ледяной бане в атмосфере N2, обработан триэтиламином (0,66 мл, 4,73 ммоль), после чего капельно обработан сероуглеродом (0,125 мл, 2,07 ммоль). Реакция была подогрета до комнатной температуры, перемешивалась в течение 3 часов, после чего снова охлаждена во льду. После обработки р-толуолсульфонил хлоридом (0,274 г, 1,45 ммоль), реакция была медленно подогрета до комнатной температуры с одновременным перемешиванием в течение 18 часов. Смесь была разбавлена водой, подкислена до рН2 с помощью 10% водной НС1, и трижды экстрагирована с этилацетатом. Объединенные органические слои были промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. Выпаренный фильтрат был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 20 г силикагеля (0 - 50% ацетонитрила в этилацетате, в течение 20 минут, 30 мл/мин) с получением титульного соединения в виде твердого вещества кремового цвета (0,157 г, 55%). 1Н ЯМР (300 МГц, CDCI3) S 7,55 (d, 2Н, J = 8,7 Гц); 7,29 (m, ЗН); 4,70 (s, 2Н); 2,23 (s, ЗН).
[00193] Этап 3: Майтансин-3-^-метил-Ь-{8)-аланин-пропакамидьт-3-N-[4-{auemaMudtm) бензил]-дитиокарбамат (25)
[00194] Продукт из предыдущего этапа (24, 0,093 г, 0,45 ммоль) и продукт из Примера 3, Этап 3 (10, 0,070 г, 0,095 ммоль) были растворены в ацетонитриле (MeCN, 2 мл) и безводном DMF (1 мл), и обработаны щелочным оксидом алюминия (активированным, Brockmann I, 0,357 г). После продувки колбы аргоном, реакция перемешивалась при комнатной температуре в течение 2 дней, была отфильтрована, а твердые вещества промыты метанолом/ацетонитрилом. Выпаренный фильтрат был очищен с помощью колоночной флэш-хроматографии на колонне с 12 г силикагеля (0-50% ацетонитрила в этилацетате, в течение 15 минут, 25 мл/мин), а более медленные фракции продукта были сконцентрированы в вакууме до неочищенной смолы бледно-желтого цвета. Она была очищена путем обращено-фазовой высоко эффективной жидкостной хроматографии (Phenomenex Gemini С18, колонна 30x150 мм, 30-90% ацетонитрила в воде, 0,1% трифторуксусной кислоты в обоих веществах), а чистые фракции были сублимированы с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,016 г, 18%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для С45Н58СШ5Оп82, 943,3; получено 944,7 (М+Н), 927,1 (М-Н20+Н), 966,6 (M+Na).
PCT/US2014/029757
[00195] MaumaHCUH-3-N-Memm-L-(S)-wiaHUH-6ema-maHUH (27)
[00196] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества бледно-желтого цвета из 2,5-диоксопиролидин-1-ил 3-((трет-бутоксикарбонил)амино)пропаноат (26) методом из Примера 2, Этапы 1-3. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C35H49C1N4O10, 720.3; получено 721,4 (М+Н).
ПРИМЕР 6
[00197] MaUmaHCUH-3-N-Memm-L-(S)-anaHUH-2aMMa-aMUHo6ymiipaMud (29)
[00198] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества бледно-желтого цвета из ГЧ-трет-бутоксикарбонил-САВ А-ОН (28) методом из Примера 2, Этапы 1-3. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C36H5iClN4O10, 734,3; получено 735,5 (М+Н).
PCT7US2014/029757
[00199] MaumaHCUH-3-N-Memim-L-(S)-cuiaHUH-N-Me-zaMMa-аминобутирамид (31)
[00200] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества бледно-желтого цвета из М-трет-бутоксикарбонил-> }-Ме GABA-OH (30) методом из Примера 2, Этапы 1-3. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C37H53C1N4O10, 748,4; получено 749,5 (М+Н).
ПРИМЕР 8
[00201] Этап 1: MaumaHCUH-3-N-Memm-L-(S)-anaHUH-N-Kap6oKcit-6-[3,4-дигидро-2-(трет-бутоксикарбонил)-1Н-изохинолин ]
[00202] Майтан-3-М-метил-Ь-(8)-аланин (2, 0,034 г, 0,052 ммоль), техническая N-трет-бутоксикарбонил-1,2,3,4-теграгидроизохинолин-6-карбоновая кислота (32, 0,019 г,0,069 ммоль), и 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC, 0,024 г, 0,125 ммоль) были взвешены в круглодонной лабораторной колбе с магнитным мешальником, растворены в дихлорметане (3 мл), колба продута аргоном и запечатана резиновой диафрагмой. Реакция перемешивалась при комнатной температуре. Через 2 дня реакция была разбавлена этилацетатом, и промыта раствором водного NaHC03, а водный слой был дважды экстрагирован этилацетатом. Объединенные органические слои были промыты солевым раствором, высушены на Na2S04, и отфильтрованы. После этого,
выпаренный фильтрат был очищен на колонне с 12 г силикагеля "RediSep Gold" через систему "ISCO" (этилацетат- 5:5:1 этилацетат/дихлорметан/МеОН в течение 12 минут, 30 мл/мин), а объединенные, чистые по тонкослойной хроматографии, фракции были выпарены и высушены в вакууме с получением титульного соединения в виде твердого вещества палевого цвета (0,026 г, 55%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C47H61C1N4012, 908,4; получено 909,2 (М+Н), 891,2 (М-Н20+Н).
[00203] Этап 2: Майтансин-3-№-метил-Ь-($)-аланин-1Я-карбокси-6-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин) (33)
[00204] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества золотистого цвета (0,013 г, 52%) из продукта предыдущего этапа (0,025 г, 0,027 ммоль) методом из Примера 2, Этап 3 (соединение 6). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C42H.53CIN4O10, 808,3; получено 809,2 (М+Н).
ПРИМЕР 9
[00205] Этап 1: Майтансин-3-Ы-метил-Ь-(5)-аланин- Ы-карбокси-4-[1-(трет-бутоксикарбонил) -пиперидин]
[00206] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества белого цвета (0,027 г, 46%) из майтан-3-1Ч-метил-Ь-(8)-аланина (2, 0,045 г,
0,069 ммоль) и технического 1-1-бутоксикарбонилпиперидина-4-карбоновая кислоты (34, 0,024 г, 0,105 ммоль) методом из Примера 8, Этап 1. МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C43H6iClN4012, 860,4; получено 861,2 (М+Н), 843,2 (М-Н20+Н).
[00207] Этап 2: Майтансин-3-№-метил-Ь-($)-аланин-1Я-карбокси-4-пиперидин (35)
[00208] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества золотистого цвета (0,012 г, 50%) из продукта предыдущего этапа (0,025 г, 0,029 ммоль) методом из Примера 2, Этап 3 (соединение 6). Соединение было очищено на колонне С18 с использованием другого градиента и модификатора (20-80% MeCN в воде, 0,05% уксусной кислоты в обоих). Лиофилизация чистых фракций дала титульное соединение (0,008 г, 35%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C38H53ClN4O10, 760,3; получено 761,2 (М+Н).
ПРИМЕР 10
[00209] Этап 1: Майтансин-3-№-метил-Ь-($)-аланин-Ы-метил-бета-аланин-N-f 4-( трет-бутоксикарбонил-валин-цитруллин-амино )бензшокси ]-карбамат
[00210] Трет-бутоксикарбонил-валин-цитруллин-р-аминобензилокси-(р-нитрофенилоксиькарбонат (36), полученный в соответствии с публикацией
международной заявки WO2005112919, (0,092 г, 0,143 ммоль), продукт из Примера 2, Этап 3 (6, 0,110 г, 0,130 ммоль), и 1-гидрокси-7-азабензотриазол (НОАТ, 0,037 г, 0,272 ммоль) были растворены в DMF (7 мл), обработаны метиламином (0,100 мл, 0,717 ммоль), и перемешаны при комнатной температуре в колбе с пробкой. Через 18 часов, реакционная смесь была сконцентрирована в вакууме до состояния масла, растворена в дихлорметане, и очищена на 24 г колонным "RediSep Gold" через "ISCO Combiflash" (0-20% метанола в этилацетате).
После этого, выпаривание фракций продукта в вакууме дало титульное соединение в виде твердого вещества бледно-желтого цвета (0,129 г, 80%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C60H86ClN9O17, 1239,6; получено 1240,8 (М+Н).
[00211] Этап 2: Майтансин-3^-метш-Ь-(5)-аланин- N-метил-бета-аланин-N-[4-(валин-цитруллин-амино)бензшокси]-карбамат (37)
[00212] Титульное соединение было получено в виде твердого вещества белого цвета (0,074 г, 63%) из продукта предыдущего этапа (0,128 г, 0,103 ммоль) методом из Примера 2, Этап 3 (соединение 6). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C55H78ClNgOl5, 1139,5; получено 1141,4 (М+Н).
[00213] Этап 3: Майтансин-3-Ы-метил-Ъ-(8)-аланин- N-метш-бета-аланин-Ы-[4-(4-{изотиоцианато-фенил}-тиоуреидо-валин-цитруллин-амино) бензилокси]-карбамат (39)
[00214] Продукт из предыдущего этапа (37, 0,037 г, 0,029 ммоль) был растворен в тетрагидрофуране (THF, 5 мл) в пробирке, обработан триэтиламином (0,020 мл, 0,143 ммоль), а получившийся раствор был капельно добавлен в колбу, содержащую перемешанный раствор 1,4- 83
фенилендиизотиоцианата (38, 0,055 г, 0,286 ммоль) в THF (10 мл) в течение 15 мин. Пробирка была промыта THF (2 мл), и раствор был добавлен в реакционную колбу, которая была закрыта резиновой диафрагмой. После перемешивания при комнатной температуре в течение 24 часов, реакция была сконцентрирована в вакууме до осушения, неочищенный продукт растворен в ацетонитриле, и отфильтрован через тефлоновую мембрану с размером ячейки в 0,45 мкм. После этого, фильтрат был очищен на 30 г колонны С18 "RediSep Gold" через "ISCO" (20-80% MeCN в воде, 0,05% НОАс в обоих растворителях), а химически чистые фракции (но жидкостной хроматографии) объединены, заморожены при температуре -78°С, и лиофилизованы с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,023 г, 59%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C63H82C1N,]015S2, 1331,5; получено 1332,0
(М+Н).
PCT/US20 К/029757
[00215] Этап I: 1-(4-Амино-бутил)-малегшид
[00216] Раствор технического трет-бутоксикарбонил-1-аминобутил-4-малеимида (0,304 г, 1,13 ммоль) в дихлорметане (10 ил) был обработан трифторуксусной кислотой (1,00 мл, 13,1 ммоль), колба продута аргоном, запечатана резиновой диафрагмой и воздуховодом, и перемешивалась при комнатной температуре. Через 18 часов реакция завершилась тонкослойной хроматографией, поэтому она была концентрирована в вакууме, дважды растерта в порошок с диэтиловым эфиром, и высушена в вакууме до состояния смолы. Смола была еще дважды растерта в порошок с эфиром (с одновременным выскабливанием шпателем), осажена, и снова высушена в вакууме с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,321 г, 100%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C8H,2N202, 168,1; получено 169,0 (М+Н).
[00217] Этап 2: 1-(4-изотиоцианато-бутил)-малеимид (41)
[00218] Продукт из предыдущего этапа был растворен в ацетонитриле (MeCN, 3x40 мл) и концентрирован в вакууме при 60°С с помощью ротационного испарителя. Высушенный продукт (0,650 г, 2,45 ммоль) был растворен в MeCN (75 мл) и хлороформе (30 мл) в колбе, обработан триэтиламином (1,0 мл, 7,35 ммоль), а полученный раствор был капельно добавлен в колбу, содержащую 1,Г-тиокарбонилди-2,2'-пиридон (0,68 г, 2,94 ммоль) в хлороформе (25 мл) в атмосфере азота в течение 10 мин. Реакция перемешивалась при комнатной температуре в течение 18 часов, концентрирована в вакууме до осушения. Неочищенный продукт был растворен в дихлорметане (DCM) и очищен на колонне с 120 г силикагеля "RediSep Gold" путем колоночной флэш-хроматографии (0-10% МеОН в DCM). Технически чистые фракции (по LC) были объединены и
концентрированы до осушения с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,26 г, 50%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для C9HioN202S, 210,0; получено 211,2 (М+Н).
[00219] Этап 3: Майтансин-3^-метш-Ь-(8)-аланин- N-метш-бета-аланин-М-[4-(4-(малеимидшбутил}-тиоуреидо-валин-цитруллин-амино) бензгшокси]-карбамат (42)
[00220] Продукт из Примера 10, Этап 2 (37, 0,029 г, 0,023 ммоль) был растворен в безводном DMF (2 мл), обработан диизопропилэтиламином (0,020 мл, 0,115 ммоль) с помощью сухого шприца, после чего раствором продукта из предыдущего этапа (41, 0,026 г, 0,124 ммоль) в сухом DMF (2 мл). Реакционная колба была продута аргоном, закрыта резиновой диафрагмой, а реакция перемешана при комнатной температуре. Через 18 часов реакция оказалась на 80% завершенной с помощью жидкостной хромато-масс спектрометрии, поэтому она была выпарена в вакууме, до состояния масла, растворена в смеси MeCN/вода, и очищена на колонне с 30 г С18 "RediSep Gold" с помощью колоночной флэш-хроматографии (2080% MeCN в воде, 0,05% НОАс в обоих растворителях). Химически чистые (по жидкостной хромато масс-спектрометрии) фракции были объединены, быстро выпарены ротационным способом, заморожены на сухом льду, и лиофилизованы за ночь с получением титульного соединения в виде твердого вещества белого цвета (0,020 г, 65%). МС (электрораспылительная ионизация, поз.): рассчитано для С64Н88^|0|7SC1, 1349,6; получено 1351.1 (М+Н), 1372.9 (M+Na), 1333.6 (М-Н20+Н).
ПРИМЕР 12
[00221] Получение коньюгата и определение характеристик
[00222] Для начальной серии опытов, с помощью описанной ниже процедуры, четыре антитела были сопряжены с различными соединениями сшивающего агента с лекарственным препаратом настоящего раскрытия. Четырьмя антителами, использованными в этих экспериментах, были: (1) антитело PSMA (простатический специфический мембранный антиген), имеющее тяжелые и легкие цепные вариабельные домены клона AB-PG1-XG1-006, как указано в публикации международной заявки WО 2007002222А2, (2) антитело STEAP1 (Шесть трансмембранных эпителиальных антигенов простаты 1), имеющее тяжелые и легкие цепные вариабельные домены клона mul20, выраженное в виде "hlgGl", как указано в публикации международной заявки WO 2008052187А2, (3) антитело "EGFRvIII", имеющее тяжелые и легкие цепные вариабельные домены клона 131, как указано в публикации международной заявки WO 2013075048А1, и (4) PRLR (рецептор пролактина), имеющее тяжелые и легкие цепные вариабельные домены клона H1H6953N, как указано в публикации заявки США с серийным номером 61/868,185;
зарегистрированной 21 августа 2013 г. (раскрытие которой настоящим включено путем отсылки полностью). Все моноклональные антитела были выражены в виде клеток яичника китайского хомячка (СНО), и очищены белком А. Также использован не имеющий обязательной силы контроль, полученный иммунологического антигена, не имеющего отношения к онкологии.
[00223] Метод коньюгации для соединений 3, 7, 21 и 42
[00224] Антитело (10 мг/мл) в 50 мМ ГЭПЭС (HEPES), 150 мМ NaCl, Ph 7,5, было обработано 1 мМ дитиотреитола при 37°С в течение 30 мин. После гель-фильтрации (G-25, рН 4,5 ацетат натрия), к ослабленному антителу и смеси, доведенной до рН 7,0 с помощью 1 М ГЭПЭС (рН 7,4) было добавлено производное полезной нагрузки малеимидного сшивающего агента (1,2 эквивалента/группа инокуляционного гепатита) в ДМСО (DMSO) (10 мг/мл). Через 1 час, реакция была резко охлаждена с помощью избыточного N-этил малеимида. Коньюгаты были очищены путем эксклюзионной хроматографии и стерильно отфильтрованы. Концентрации белка и полезной нагрузки сшивающего агента были определены с помощью ультрафиолетового спектрального анализа. Эксклюзионная ЖХВД установила, что все использованные коньюгаты были более чем на 95% мономерными, а обращенно-фазовая высоко эффективная жидкостная хроматография установила наличие менее чем 0,5% неконьюгированной полезной нагрузки сшивающего агента. Результаты приводятся в Таблице 1 на основе белка. Все коньюгированные антитела были анализированы с помощью ультрафиолета на значения загруженности полезной нагрузки сшивающего агента в соответствии с Hamblett и др., Cancer Res., 2004 10 7063. Результаты обобщены в Таблице 1.
[00225] Метод коньюгации для соединения 39
[00226] К антителу (2-5 мг/мл) в 50 мМ карбоната, 150 мМ NaCl, рН 9,0, было добавлено 15% по объему диметилацетамида. К антителу было добавлено производное полезной нагрузки сшивающего агента 39 (5-10 эквивалентов) в ДМСО (10 мг/мл), и смесь инкубировалась при 37°С в течение 4-12 часов. Коньюгаты были очищены путем эксклюзионной хроматографии и стерильно отфильтрованы. Концентрации белка и полезной нагрузки сшивающего агента были определены с помощью ультрафиолетового спектрального анализа. Эксклюзионная ЖХВД установила, что все использованные коньюгаты были более чем на 95% мономерными, а обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография установила наличие менее чем 0,5% неконьютированной полезной нагрузки сшивающего агента. Для этих коньюгатов, отношение полезной нагрузки к антителу было установлено с помощью времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (Таблица 1).
[00227] Бесклеточный ферментный анализ коньюгат антитела-лекарственного препарата (ADC) вне организма
[00228] Инкубация Катепсина В
[00229] Процедура бесклеточного ферментного анализа вне организма была принята от Dubowchik, и др., Bioconjugate Chem. 2002 13 855. Скорректированная коэффициентом абсорбции концентрация PRLR-7 и Изотипического контроля-7 была задана как 7,00 мкМ в 25 мМ буфере ацетата натрия, I мМ ЭДТК (EDTA), рН 5,0 и предварительно инкубирована при 37°С. Катепсин В (Sigma #С8571) был активирован при комнатной температуре в течение 15 минут с 1 эквивалентом 30 мМ ДТТ (DTT), 15 мМ ЭДТК на 2 эквивалента исходного раствора Катепсина В. Активированный раствор Катепсина В был добавлен к растворам коньюгатов антитела с лекарственным препаратом в молярном отношении 1:750. Образцы были инкубированы при 37°С в течение 24 часов и аликвотированы либо для выявления путем ЖХВД (HISEP)-YO, или для выявления путем жидкостной хроматографии масс-спектрометрии, см. ниже.
01C-8168-4573/2/AMERICAS
[00230] Выявление путем жидкостной хромато масс-спектрометрии
[00231] В установленные моменты времени, небольшая аликвота вынималась, и сравнивалась с 2 объемными эквивалентами холодного метанола. Супернатант восстанавливался, и анализировался с помощью жидкостной хроматографии масс-спектрометрии для расщепления произведенного соединения 6 полезной нагрузки сшивающего агента Катепсина В с помощью колонны "Merck Chromolith FastGradierit RP-18e", 2x50 мм, от 10 до 90% MeCN в течение 5 минут, в Н20 с 0,05% НО Ас в обоих растворителях и расходом в 1 мл. Профиль элюции наблюдался при длине волны в 254 нм. Все аликвоты, инкубированные при 37°С с Катепсином В, содержали соединение 6, элюировавшее в 5,1 минуты с массой в 735 М+Н (рассчитано для C36H51C1N4O10, 734,3), и ни одна из аликвот без Катепсина В не содержала соединения 6. Это также было подтверждено инъекцией чистого соединения 6 из Примера 2, этан 3.
[00232] Выявление путем ЖХВД (HISEPl-УФ
[00233] Растворы впрыскивались без изменений в установленные моменты времени. Использовался следующий градиентный метод: буфер "А", 100% 100 мМ NH4OAc, рН 7,0 и буфер "В", 100%" ацетонитрил, скорость потока 0,4 мл/мин., от 5 до 70% буфера "В", в колонне ЖХ "Supelco HISEP"; 150 мм х 4,6 мм. Профиль элюции наблюдался при длине волны в 280 нм и 252 нм. Все аликвоты коньюгатов антитела с лекарственным препаратом, инкубированные с Катепсином В, содержали продукты, которые элютировали через 19,4 минуты. В идентичных условиях градиента, чистое соединение 6 элютирует с таким же временем удержания. Образцы со временем в 19,4 минуты отсутствовали в аликвотах без Катепсина В.
-91
[00234] Результаты данного Примера являются важными в некоторой степени, так как протеолиз Катепсина В в 6 должен происходить только после интернализации коньюгата антитела с лекарственным препаратом в клетке, в которой имеются ферменты. Нецелевые результаты должны быть уменьшены, так как антитело доставляет цитотоксичную полезную нагрузку напрямую в адресные клетки.
ПРИМЕР 14
[00235] Реакции цитотоксичности вне организма
[00236] В данном Примере, была произведена оценка способности различных коньюгатов антитела с лекарственным препаратом к уничтожению антиген отжимающих опухолевых клеток вне организма.
[00237] Клетки были посеяны в 96-луночные плашки с поли-D-лизиновым покрытием в количестве 375 (MMT/hEGFRvIII), 1500 (U251/hEGFRvIII), 2000 (HEK293/hEGFRvIII) или 3000 (С4-2, РСЗ/hSTEAPl, T47D и U87-MG) клеток на плашку в комплексную среду для роста, и выращивались за один день. Для кривых жизнеспособное ги клетки, к клеткам добавлялись последовательно разбавленные коньюгаты или свободно репрезентативные полезные нагрузки в конечной концентрации в диапазоне от 500 нМ до 1 пМ, и инкубировались в течение 3 суток. Для измерения жизнеспособности в MMT/hEGFRvIII, U251/hEGFRvIII, HEK293/hEGFRvIII, С4-2, РСЗ/hSTEAPl и U87-MG, клетки инкубировались с холецистокинин октапептидом ССК8 ("Dojindo") в течение последних 1-3 часов, а поглощение при длине волны в 450 нм (OD450) было определено с помощью спектрофотометра "Flexstation 3" (компания "Molecular Devices"). Для измерения жизнеспособности в T47D, клетки инкубировались на льду в течение 30 минут в 4% формальдегид + 3 мкг/мл хехста. Изображения окрашенных хехстом ядер были получены системой "ImageXpress Micro
XL" (компания "Molecular Devices"), а число ядер было определено с помощью аналитического ПО "Columbus" (компания "Perkin Elmer"). Фоновые уровни OD450 (ССК8) или число ядер от дигитонина (40 нМ) обработанных клеток были вычтены из всех плашек и жизнеспособность была выражена как процент от необработанных контрольных образцов. Значения 1С50 были установлены на основе четырех-параметрического логистического уравнения на 10-точечной характеристической кривой (ПО "GraphPad Prism"). Все кривые и значения 1С50 были скорректированы на эквиваленты полезной нагрузки.
[00238] В клетках С4-2 (линия рака предстательной железы), по умолчанию выражающих PSMA при 271 кратности выше фиксации изотипического контроля, майганзиноидные коньюгаты PSMA-3, PSMA-7 и PSMA-21 имеют значения IC50 равные 3.8; 0.5 и 8.3 нМ соответственно (ФИГ.1). Голое антитело PSMA было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00239] В клетках РСЗ/hSTEAPl (линия рака предстательной железы), выражающих hSTEAPl при 352 кратности выше фиксации изотипического контроля, майтанзиноидный коньюгат STEAP1-7 имеет значение 1СЗД в 4 нМ (ФИГ.2). Голое антитело STEAP1 было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00240] В клетках T47D (линия рака молочной железы), по умолчанию выражающих PRLR при 14 кратности выше фиксации изотипического контроля, майтанзиноидный коньюгат PRLR-7 имеет значение 1С50 в 1,0 нМ (ФИГ.З). Голое антитело T47D было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00241] В клетках HEK293/hEGFRvIII, выражающих hEGFRvHI при 360 кратности выше фиксации изотипического контроля, майтанзиноидный
коньюгат EGFRvIII-7 имеет значение 1С50 в 0,4 нМ (ФИГ.4). Голое антитело EGFRvIII было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00242] В клетках MMT/hEGFRvIII, выражающих hEGFRvIII при 280 кратности выше фиксации изотипического контроля, майтанзиноидный коньюгат EGFRvIII-7 имеет значение 1С50 в 0,3 нМ (ФИГ.5). Голое антитело EGFRvIII было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00243] В клетках U251 /hEGFRvIII (линия глиобластомы), выражающих hEGFRvIII при 165 кратности выше фиксации изотипического контроля, майтанзиноидный коньюгат hEGFRvIII-7 имеет значение 1С50 в 0.3 нМ (ФИГ.6). Голое антитело EGFRvIII было лишено какой-либо анти-пролиферативной активности.
[00244] Вне организма цитотоксичность предположительно выпускаемых полезных нагрузок ("лекарственные вещества, не связанные с белками плазмы крови") была также проверена в описанных выше различных клеточных линиях, и нанесена вдоль коньюгированных антител для сравнения (см. замкнутые квадраты (¦) на ФИГ. 1-6). Для полезных нагрузок сшивающих агентов 3 и 7, предлагаемые выпускаемые полезные нагрузки 2 и 6, соответственно, могут использоваться в цитологических анализах напрямую, так как являются стабильными. Тем не менее, для полезной нагрузки сшивающего агента 21, предлагаемой выпускаемой полезной нагрузкой является сульфгидрильное соединение 10 Так как соединение 10 может быть сильно химически активным, что могло бы привести к ненадежным результатам, в этих анализах, для представления выпускаемой полезной нагрузки, было выбрано соединение 25.
[00245] В отдельной серии опытов, соединение 6, вместе с аминовыми аналогами 27, 29 и 31 было проанализировано в НЕК293 и U87MG на предмет анти-пролиферативной активности (ФИГ.7). Все эти соединения
имеют значения 1С5() более 30 нМ, указывая на то, что они высоко цитотоксичны только в случае прикрепления к антителу с помощью соответствующего сшивающего агента. (Для этих экспериментов, фоновая коррекция с помощью дигитонина не производилась).
[00246] В еще одной серии опытов, соединения 6, 9, 33 и 35 были проанализированы в НЕК293, U251, С4-2, РСЗ и ММТ на предмет анти-пролиферативной активности (ФИГ.8). Аминосоединения 6, 33, и 35 имели переменные значения 1С50, как показано в Таблице 2. Тенденция в эффективности следует 9> 33> 35> 6, и соответствует 5 проанализированным клеточным линиям.
[00247] Не будучи привязанными к какой-либо теории, результаты этих экспериментов демонстрируют, что "выпущенная" или "не связанная с белками плазмы крови" версии соединений настоящего раскрытия (т.е., соединения, не сопряженные с антителом) были, в большинстве случаев, значительно менее цитотоксичными, чем будучи коньюгированными с антителом против клетки-мишени. Это свойство настоящего раскрытия означает, что коньюгаты антитела с лекарственным препаратом, составляющие соединения изобретения, дадут меньше побочных эффектов и меньше нежелательной токсичности, так как свойства уничтожения клетки будут специально сконцентрированы в месте целевого антигена.
PCT7US20 К/029757
[00248] Коньюгаты антитела с лекарственным препаратом против EGFRvIII являются эффективными ингибиторами роста опухоли в физиологических моделях аллотрансплантатов, положительных на рак молочной железы EGFRvIII
[00249] В этом Примере., два различных коньюгата антитела с лекарственным препаратом иллюстративного антитела H1H1863N2 против EGFRvIII были испытаны на их способность замедлять рост опухоли в организме. (Аминокислотная последовательность и различные свойства H1H1863N2 установлены в патенте США US61/950.963, зарегистрированном 11 марта 2014, настоящим включенным путем ссылки во всей полноте). H1H1863N2 содержит область вариабельности тяжелой цепи (HCVR), имеющую идентификатор последовательности №1; область вариабельности легкой цени (LCVR), имеющую идентификатор последовательности №5; антигенсвязывающие участки тяжелой цепи (HCDR1, HCDR2 и HCDR3), имеющие идентификаторы последовательности №№: 2, 3 и 4 соответственно; и антигенсвязывающие участки легкой цепи (LCDR1, LCDR2 и LCDR3), имеющие идентификаторы последовательности №№: 6, 7 и 8, соответственно.
[00250] Первый коньюгат антитела с лекарственным препаратом был получен путем сопряжения H1H1863N2 с майтанзиноидом DM1 с участием не расщепляемого сшивающего агента МСС (см., напр., патент США US№5,208,020 и патентную заявку США US№ 20100129314) для получения "HlH1863N2-MCC-DMr\ Второй коньюгат антитела с лекарственным препаратом был получен путем сопряжения H1H1863N2 с 7 для получения "Н1Н1863N2-7". При испытании на цитотоксичность вне организма против клеток MMT/EGFRvIII с помощью формата анализа, описанного в
Примере 14, H1H1863N2-MCC--DM1 показал значение 1С50 в 12 нМ, тогда как H1H1863N2-7 показал значение 1С50 только в 0,8 нМ. Таким образом, вне организма, коньюгат антитела с лекарственным препаратом против EGFRvIII, H1H1863N2-7, показал значительно более эффективную способность уничтожения опухолевых клеток, чем соответствующее антитело, сопряженное с DM1 с участием не сшивающего агента МСС.
[00251] Для сравнения действенности антител, коньюгированных с MCC-DM1 и 7 против EGFRvIII в организме, были проведены исследования на мышах с ослабленной иммунной системой, несущих аллотрансплантаты, положительные на рак молочной железы EGFRvIII. Вкратце, опухолевые аллотрансплантаты были установлены путем подкожной пересадки 0,5х106 MMT/EGFRvIII клеток в левую боковую поверхность самок мышей с ТКИН СВ17 (Taconic, Hudson, NY). После достижения опухолями среднего объема в 140 мм (примерно на 8 день), мыши были случайным порядком разделены на группы по семь особей, и получили коньюгаты антител с лекарственным препаратом против EGFRvIII, полученными с форматами сшивающего агента-препарата либо с MCC-DM1, либо с 7. Также анализировались и контрольные реактивы, включая несвязанные коньюгаты антител с лекарственным препаратом, полученными с форматами сшивающего агента-препарата либо с MCC-DM1, либо с 7, и "проводник", фосфатно-солевой буферный раствор. Коньюгаты антител с лекарственным препаратом вводились с дозировкой в 1 и 5 мг/кг три раза в день в течение одной недели, и впоследствии контролировались вплоть до достижения опухолями среднего объема около 2000 мм в группе, получавшей только "проводник". В этот момент было рассчитано угнетение роста опухоли.
[00252] Средний размер опухоли по сравнению с группой, получавшей только "проводник", рассчитывался следующим образом: опухоли измерялись дважды в неделю с помощью циркулей до достижения среднего
размера у контрольной группы в 1000 мм3; размер опухоли был рассчитан с помощью формулы (длина х ширина2)/2. Угнетение роста опухоли было рассчитано в соответствии со следующей формулой: (1-((Т0конч.-Тнач.)/(С оконч.-С "ач.)))*100, где "Т" (группа лечения) и "С" (контрольная группа) представляют среднюю массу опухоли на день, когда опухоль у группы, получавшей только "проводник", достигла 1000 ммЗ. Результаты обобщены в Таблице 3.
[00253] Как показано в данном Примере, наибольшее угнетение опухоли наблюдалось у мышей, получавших 5 мг/кг HI HI 863N2-7, у которых была отмечена регрессия первоначальной опухоли. Угнетение роста опухоли в 102% в результате лечения 5 мг/кг H1H1863N2-7 было
-98010-8168-4573/2/АМ ERICAS
значительно больше по сравнению с наблюдаемым последующим лечением опухоли 5 мг/кг H1H1862N2-MCC-DM1 (83%). Превосходство угнетения роста опухоли, вызванного H1H1863N2-7 по сравнению с H1H1863N2-MCC-DM1, также сохранилось и при дозировке в 1 мг/кг. Никакого влияния на опухоль не наблюдалось в группах, получавших контрольный коньюгат антитела с лекарственным препаратом с использованием MCC-DM1 или 7.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Соединение Формулы (I)
Z2 А W
(I)
где:
"L" отсутствует, или является Лигандом; при этом:
когда "L" является Лигандом, "L" способно связываться с клеткой или клеточной популяцией;
"а" является целым числом от 1 до 10;
Z2 и Ъ\ каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"D" является Биологически Активной Молекулой;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 амино кислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
ИЛИ
где Аь A3, Ri и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(:=S)-, -C(=S)-S-, -S-C(=S)-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(-0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5; каждый независимо являются -О-, -S-, -NR18-, -CR'iRf,-;
R17 выбирается из 1Труппы, состоящей из О, S, NR18, CR5R6;
Ris выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арил а, гетероарил а, гетероциклил а и ацила, где алюил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются H, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и "х" является 0, 1 или 2.
2. Соединение по п.1, где "D" является цитотоксическим средством.
3. Соединение по п.2, где цитотоксическим средством является майтанзиноид формулы II:
(П),
где А6, А7, А8, А9 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, N-алкильной аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкенилом, алкинилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-. -С(-О)-,
-0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р,-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4, далее,
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6, R8 являются указанными в п. 1.
010-8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
5. Соединение.по п.1, где "L", способен связываться со специально выбранной клеточной популяцией.
6. Соединение по п.1, где "L" выбирается из группы, состоящей из белков, антител, фрагментов антител, нуклеиновых кислот, антигенсвязывающих остовов и углеводов.
7. Соединение по п.6, где "L" является антителом или его фрагментом.
8. Соединение по п.7, где "L" является антителом или его фрагментом, специфически связывающие опухолевый специфический антиген.
9. Соединение по п.7, где антитело или его фрагмент имеют сернистую группу, прикрепленную ковалентной связью к Z2.
10. Соединение по п.1, где Z2 представлено следующей структурной формулой:
-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D",
где:
Z2A, Z2B, Z2C и Z2D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рЬ -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(О- 103
(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N1R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0> , -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -O-C(=0)-N(R4), -0-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0,
о или О , где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил,
арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6, R8 являются указанными в п. 1.
11. Соединение по п. 10, где антитело или его фрагмент имеют сернистую группу, прикрепленную ковалентной связью к 2^А.
12. Соединение по п.1, где Z| представлено следующей структурной формулой:
-Z1A-Z|B-Zic-Z1D-, где:
Z1A, Zib, Zic и Z|D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
-CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)рЬ -(СНх)рГС(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(FL4)-C(=0)-, -0-C(=0)-N(R4), -0-C(=S)-N(R4)-, -C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0,
, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил,
арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6, R8 являются указанными в п. 1.
где R9, Rio, Rn, И Rl2 каждый независимо являются Н, алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, галогеном,
13. Соединение по п. 1, где "D" ковалентно соединяется с Ъх.
14. Соединение по п.1, где "А" является аминокислотой, выбираемой из группы, в которую входят аланин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, фенилаланин, глицин, гистидин, изолейцин, лизин, лейцин, метионин, аспарагин, пролин, глутамин. аргинин, серии, треонин, валин, триптофан, тирозин, цистеин и цитруллин.
15. Соединение по п.1, где "А" является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, еюпарагин-аланин.
16. Соединение по п.1, где "X" является арилом, выбираемым из группы, состоящей из:
13.
NR13R14, нитро, циано, -OH, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R13, -C(=0)-0-R,5, -C(=0)-NR13 Rl4; и
далее, где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R13 и R)4 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R15 является необязательно замещенным алкилом.
17. Соединение Формулы (III):
где:
"Ab" является антителом или его фрагментом;
ААГАА2 является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10;
"q" является "0" или целым числом от 1 до 5;
A3, Ri и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(----0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4> -C(=0)-, -C(==0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NRr, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R17 выбирается из группы, состоящей из О, S, NRi8, CR5R6;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R9, Rio, Rn, и R!2 каждый независимо являются Н, галогеном, NR13Ri4, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R,5, -C(=0)-0-R,5, -C(=0)-NRi3 R14, замещенными или незамещенными: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом;
R13 и Еч4 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R!5 является необязательно замещенным алкилом;
р 1, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
- 107010-8168-4573/2/AMERICAS
18. Соединение по п. 17, где: "q" равно 4;
R, и R3 каждый независимо являются -О-, -S-, NR4, -CR5R6-;
R17 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR)8, CR5R6;
R,b выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и анила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6R9, Rio, Rib R12 каждый независимо являются Н или алкилом: а
А3 является алкилом.
19. Соединение по п. 18, представленное следующей структурой:
19.
s о
где Ab является антителом или его фрагментом. 20. Соединение Формулы (IV):
где:
Ab является антителом или его фрагментом;
ААГАА2 является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота- аспарагин,
аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10;
"q" является "0" или целым числом от 1 до 5;
R, являются отсутствующим, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SOr, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R4, является "Н", или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R9, Rio, Rn, и R)2 каждый независимо являются Н, галогеном, NR13R14, нитро, циано, -ОН, -0-C(-0)-R,5, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-R,5, -C(=0)-NRi3R14, замещенным или незамещенным: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом; и
DM представлен следующей структурой:
-ПО-
21. Соединение по п.2(), где:
"q" равно 4; а
R, выбирается из группы, состоящей из -О-, -S-, NR4, и -CR5R6-; и далее, где R4, R5, и R6 каждый независимо являются Н или алкилом.
22. Соединение по п.21 представлено следующей формулой
Где Ab является антителом или его фрагментом.
23. Соединение по п.1, где "А" является пептидом, расщепляемым протеазой.
24. Соединение по п.1, где "А" является пептидом, расщепляемым протеазой, выраженной опухолевой тканью.
25. Соединение по п.24, где протеазой является катепсин или плазмин.
23.
26. Фармацевтическая композиция, которая включает терапевтически эффективный объем соединения по п.1, или его фармацевтически приемлемую соль, и один или несколько фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или субстанций.
27. Метод снижения, замедления или остановки роста идиобластов, состоящий из взаимодействия соединения по п.1 с идиобластом в объеме, достаточном для замедления, снижения или остановки роста идиобласта, и при котором рост идиобластов замедляется, снижается или останавливается.
28. Метод ликвидации клетки, состоящий из взаимодействия соединения по п.1 с клеткой в объеме, достаточном для гибели клетки, и при котором клетка погибает.
29. Метод по п.28, где клетка является опухолевой клеткой.
30. Метод лечения заболевания у страдающего от болезни физического лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема препарата, содержащего соединение по п. 1.
31. Метод по п.30, где физическое лицо является млекопитающим.
32. Метод по любому из п.п.30-31, дополнительно состоящий из секвенциального или последовательного назначения дополнительной терапии.
33. Метод по п.32, где дополнительной терапией является лучевая терапия, химиотерапия или сочетание обеих.
34. Метод по любому из п.п.30-31, дополнительно состоящий из назначения, как минимум одного, дополнительного лекарственного препарата.
35. Метод по п.30, где заболевание выбирается из группы, состоящей из опухолей, раковых заболеваний, инфекционных заболеваний,
23.
нейродегенеративных болезней, поражений костей и сердечнососудистых заболеваний.
36. Метод уменьшения размера опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения прогрессии опухоли, или предотвращения прогрессии опухоли у физического лица, состоящий из назначения этому лицу эффективного объема композиции для уменьшения размера опухоли, остановки роста опухоли, уменьшения прогрессии опухоли, или предотвращения прогрессии опухоли, при котором композиция содержит в своем составе соединение по п. 1.
37. Соединение Формулы (V)
36.
-А W X Y Zi D
Формула (V)
где:
Z2 и Z] каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"D" является Биологически Активной Молекулой;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5R6-, или -NR4-;
"X" отсутствует или является замещенными или незамещенными: арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом; и
или
где A|, A3, R, и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)р1-, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рГ, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -SOr, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(I^)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где дополнительно алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NR,8-, -CR5FL6-;
R,7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NRi8, CR5R6;
Ri8 выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются H, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100; и
"х" является 0, 1 или 2. 38. Соединение по п.37,
где:
Z2 представлено Формулой (VII):
-Z2A-Z2B-Z2C-Z2D- (VII) далее, где:
Z2A, Z2B, Z2C и Z2D каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом. циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-,
-0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-,
-C(=0)-N(R4)-C(=0)-,
-0-C(=0)-N(R4),
-0-C(=S)-N(R4)-,
-C(=S)-N(R4)-, -N=C=S, -N=C=0, o'
или О
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, и R4" R5, R6, R8 являются указанными в формуле 37;
Z\ представлено Формулой (VIII):
-Z1A-Z1B-Z1C-Z1D- (VIII)
где:
Z1A, Z,B, Z|C и Z|D каждый независимо являются отсутствующими,
аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом,
алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-,
-0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р1, -(СНх)р1-С(=0)-,
-(СНх)р1-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)рГ, -C(=S)-, -C(=S)-S-,
-C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-,
-N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-,
< о
-C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, -N=C=S, -N=C=0, Ъ или о
где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, и R4, R5, R6, R8 являются указанными в п.37;
"А" является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин
аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота- аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"X" является арилом, выбираемым из группы, состоящей из
где R9, R10, Rn, и R,2 каждый независимо являются Н, алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, галогеном, NR13R14, нитро, циано, -ОН, -0-C(=0)-R15, -C(=0)-R15, -C(=0)-0-Ri5, -C(=0)NRl3R14,
далее, где алкил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
R13 и R|4 каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; a R)5, является необязательно замещенным алкилом; и
"D" является необязательно замещенным майтанзиноидом Формулы II:
(II),
где:
А6, А7, А8, А9 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, N-алкильной аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, и гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-,
-С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)р1, -С(=0)-0-(СНх)р|, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р,-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)рГ, -((СН2)р2-0-)р3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(==S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -so-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(:=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(EU)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, 0-C(=0)-NR4, где
дополнительно алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, и R4, R5, R6. R8 являются указанными в п.37.
39. Соединение по п.38, где майтанзиноид представлен следующей структурной формулой:
40.
Соединение по п.39, имеющее структуру:
41. Соединение Формулы (IX):
Yl Zl D Формула (IX)
где:
"D" является Биологически Активной Молекулой; Yl является
Н R3a-А3а-jj
где дополнительно R3a и А3а каждый независимо являнзтся
отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20
аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом,
арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-,
-0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СН,)Рг,
-С(=0)-0-(СНх)рГ, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р1-С(=0)-0-,
-(0-(СН2)р2-)рз-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(Rg)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4)-, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными; и
Zi представлено следующей структурной формулой:
-Z1 д-Z 1 в-2,1 c-Z | у-,
где:
Z1A, Z1B, Zic и Zm каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом,
гетероциклилом, -CR;iR6-, -О-, -C(=0)-, -0-C(=0)-, C(=0)-0-, -0-C(=0)-0-, -C(=0)-(CHx)pl, -C(=0)-0-(CHx)pl, -(CHx)pl-C(=0)-, -(CHx)pl-C(=0)-0-, -(0-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)p2-0-)P3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(Rg)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(1^)-, C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-N(R4), -0-C(=S)-N(R4)-, -C(-S)-N(R4)-,
алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными, a R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенными или незамещенными алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом.
42. Соединение по п.41, где 1С50 соединения превышает примерно
10 нМ.
43. Соединение по п.41, где соединение примерно в 10 раз менее цитотоксично, чем соответствующее соединение п.1.
44. Соединение Формулы (X):
43.
(X)
где:
"Ab" является антителом или его фрагментом; "а" является целым числом от 1 до 10;
Z2 и Z| каждый независимо являются отсутствующими или буферами;
"А" является природной или искусственной аминокислотой, или пептидом, имеющим 2-20 аминокислот;
"W" отсутствует, -О-, -S-, -CR5r6, -NR4-;
"X" является отсутствующим, арилом, гетероарилом, циклоалкилом, гетероциклилом, где арил, гетероарил, циклоалкил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
ИЛИ
где А], А3, R, и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом. циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-, -0-С(=0)-0-, -С(=0)-(СНх)рГ, -С(=0)-0-(СНх)Рг, -(СНх)р1-С(=0)-, -(СНх)р|-С(=0)-0-, -(0-(СН2)р2-)р3-, -((СН2)р2-0-)рз-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -SO-, -S02-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -И(^)-С(=0)0-, -N(R4)-C(=0)-, -C(=0)-N(R4> -, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
А4 и А5 каждый независимо являются -О-, -S-, -NRi8, -CR5R()
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NRi8, CR5R6;
Ris выбирается из группы, состоящей из Н, алкила, алкинила, алкенила, циклоалкила, арила, гетероарила, гетероциклила и ацила, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил и ацил являются необязательно замещенными;
R4, R5, R6 и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
"х" является 0, 1 или 2; и
45. Соединение по п.44, представленное следующей структурой:
DM представлен следующей структурой:
Ab является антителом или его фрагментом;
ААрААг является пептидом, выбираемым из группы, в которую входят валин-цитруллин, цитруллин-валин, лизин-фенилаланин, фенилаланин-лизин, валин-аспарагин, аспарагин-валин, треонин-аспарагин, серин-аспарагин, аспарагин-серин, фенилаланин-аспарагин, аспарагин-фенилаланин, лейцин-аспарагин, аспарагин-лейцин, изолейцин-аспарагин, аспарагин-изолейцин, глицин-аспарагин, аспарагин-глицин, глутаминовая кислота-аспарагин, аспарагин-глутаминовая кислота, цитруллин-аспарагин, аспарагин-цитруллин, аланин-аспарагин, аспарагин-аланин;
"а" является целым числом от 1 до 10;
"q" является "0" или целым числом от 1 до 5;
A3, R, и R3 каждый независимо являются отсутствующими, аминокислотой, пептидом, имеющим 2-20 аминокислот, алкилом, алкинилом, алкенилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом, гетероциклилом, -CR5R6-, -О-, -С(=0)-, -0-С(=0)-, -С(=0)-0-,
-0-C(=0)-0-, -C(=0)-(CHx)pr, -C(=0)-0-(CHx)pl-, -(CHx)pl-C(=0)-, -(CHx)prC(=0)-0-, -(0-(CH2)p2-)p3-, -((CH2)P2-0-)P3-, -C(=S)-, -C(=S)-S-, -C(=S)-NH-, -S-C(=S)-, -S-C(=S)-S-, -S-, -so-, -so2-, -NR4-, -N(R4)-C(=0)-N(R8)-, -N(R4)-C(=0)0-, -N(R4)-C(=:0)-, -C(=0)-N(R4> -, -C(=0)-N(R4)-C(=0)-, -0-C(=0)-NR4-, где алкил, алкинил, алкенил, циклоалкил, арил, гетероарил и гетероциклил являются необязательно замещенными;
Ri7 выбирается из группы, состоящей из О, S, NR)8, CR5R6;
R4, R5, Re и R8 каждый независимо являются Н, или замещенным или незамещенным: алкилом, алкенилом, алкинилом, арилом, гетероарилом или гетероциклилом;
R9, R|0, Rn и R|2 каждый независимо являются Н, галогеном, NR,3R14, нитро, циано, -ОН, - 0-C(=0)-R,5, -C(=0)-R15, -C0=O)-O-R,5, -C(=0)-NRi3R|4, замещенными или незамещенными: алкилом, циклоалкилом, арилом, гетероарилом и гетероциклилом;
Ri3 и Rn каждый независимо являются Н или необязательно замещенным алкилом; и R15 является необязательно замещенным алкилом;
pi, р2 и рЗ каждый независимо являются 0, или целым числом от 1 до 100;
"х" является 0, 1 или 2; и
DM представлен следующей структурой:
47. Соединение по п.46, представленное следующей структурой:
С4-2
о о
to о
о >
О О
С4-2
2 о >
4^ о
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
Логю [MJ Полезная нагрузка Q
ФИГ. 1С |
о го О
РСЗ/hSTEAPl
\ 1
• isotype Controi-O STEAP1-7 ? STEAP1
201
-1?
-11
-1С
Логю [M] Полезная нагрузка
ФИГ. 2
ФЙ1.4
120
I 100'
5 80'
60-
40-
о и о с u о в о S
^ 20
-11
-10
7 1
¦XL.-е о-•-^
-П 1 \ I I I 1 iri-
-9 -а • Isoiype Control-7 О EGFRvlll-7 ? EGFRvIII
l-к О 13 П
Логю [М] Препарат
to о
ФИГ. 5
о to
140120-100-j 806040 20
Д ¦ I
'ill 1
m isotype Control-7 О EGFRvlll-7 G EGFRvIII
-11 -'0 Лог ю [М] Препарат
in . \t
43 П H
GO to о
О to ЧО
-o -о
to О
2 о >
2 120! о
о о С
40'
20-
= К
-1^ о
-12 -'1 -1G -9 -S -/ -6
Логц) |М| Препарат, не связанный с белками плазмы крови
-J-I-I-
U87MG
if 8 Т
g 8 j i
¦ 31
Об • 29
? 27
I-к о
О Ч
оо го о
-12 -11 -10 -9 -8 -7 -6
Логю jM] Препарат, не связанный с белками плазмы крови
о го
ФИГ. 7
to О
о >
но-
120
,100'
ап-
40'
20-
НЕК293
I '.
140*
Z 170-
х аО'
1 60 о
X 40-
U251
скЗ-'Li К
чО О
"им rn (ivij nujiejHaM нш рузкц
Логц> [М j Полета я нагрузка
if 160'
? 140-
= 100 О
g so--
I SO-40-
PC3
_i z_
i I
T 1
,'Ior.,, IMI 11ОЛРЧНЯя narnvtwa
1 \
MMT
120'
: loo
ID 60-
Логц|[М| Полезная нагрузка
ФИГ. 8
43 П Ч
сл го о
-J -о
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 1 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 1 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 1 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 1 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 2 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 1 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-2-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-3-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-4 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-3 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-3 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-3 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-3 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-3 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
_4_
010-8168-4573/2/AMERICAS
_4_
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-5-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-5-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-6-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-6-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 8-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 8-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-9010-8168-4573/2/AMERICAS
-9010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 10-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 10-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 11 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 11 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 12-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 12-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
- 13 -
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
- 13 -
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 15 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 14010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 17 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 17 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 19-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 19-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-20-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-20-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT7US2014/029757
WO 2014/145090 PCT7US2014/029757
-21 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-21 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-22-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-22-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-23 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-23 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/02975 7
WO 2014/145090
PCT/US2014/02975 7
-24-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-24-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-25 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-25 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
-26-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-26-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-27 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-27 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-28-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-28-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-30-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-30-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 31 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 31 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014./029757
WO 2014/145090 PCT/US2014./029757
- 32 -
010-8168-4573/2/AM E R 1С AS
- 32 -
010-8168-4573/2/AM E R 1С AS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-33 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-33 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-34-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-34-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
- 35 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 35 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-36-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-36-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-37-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-38-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-38-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-39010-8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
-39010-8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
-40-
010 8168-4573/2/AMERICAS
-40-
010 8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-41 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-43
010 -8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
-42-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-43
010 -8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
-42-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-43
010 -8168-4573/2/АМ Е R 1С AS
-42-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-45 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-45 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-46-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-46-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-47-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-47-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-48 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-48 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
-49-
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
-49-
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090 PCTAJS2014/029757
-49-
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
-49-
010-8168-4573/2/АМ ER 1С AS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-50-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-50-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-51 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-52-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-54-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-54-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 55 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 55 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-56-
010-816B-4573/2/AMERICAS
-56-
010-816B-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
WO 2014/145090 PCT/US2014/02975 7
-57010-8168-4573/2/AMERICAS
-57010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-59-
010- 8168-4573/2/AMERICAS
-58-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-61 -
010-8168-4573/2/АМЕ НЮ AS
-61 -
010-8168-4573/2/АМЕ НЮ AS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-62-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-62-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-63 -
010-8168-4573/2/АМЕ RICAS
-63 -
010-8168-4573/2/АМЕ RICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-64-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-64-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕРЫ
WO 2014/145090 ПРИМЕРЫ
-65 -
010-8168-4573/2/АМЕ PICAS
-65 -
010-8168-4573/2/АМЕ PICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-66-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-66-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 67 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 67 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-68
010-8168-4573/2/AMERICAS
-68
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 3
WO 2014/145090 ПРИМЕР 3
-69-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-69-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-70-
010 8168-4573/2/AMERICAS
-70-
010 8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-71 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-74-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-74-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-75 -
010-8168-4573/2/АМ Е RIC AS
-75 -
010-8168-4573/2/АМ Е RIC AS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
-76-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 4
WO 2014/145090 ПРИМЕР 4
-77 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-77 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-78 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-78 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 5
WO 2014/145090 ПРИМЕР 5
-79-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-79-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 7
WO 2014/145090 ПРИМЕР 7
- 80-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 80-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT7US2014/029757
WO 2014/145090 PCT7US2014/029757
- 81 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 81 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-82-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-82-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
010-8168-4573/2/AMERICAS
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-84-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-84-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 11
WO 2014/145090 ПРИМЕР 11
- 85 -
010-S168-4573/2/AMERICAS
- 85 -
010-S168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-86-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-86-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
-87-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
-87-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 88 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 88 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-89-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-89-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-90-
-90-
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
010-8168-4573/2/AMERICAS
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-92-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-92-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-93 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-93 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-94-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-94-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-95 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
-95 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 ПРИМЕР 15
WO 2014/145090 ПРИМЕР 15
-96-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-96-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-97-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-97-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
-99-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-99-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 100-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 101 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 101 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 101 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 101 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 102-
- 102-
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
010-8168-4573/2/AMERICAS
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 104 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 104 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 105 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 105 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-106-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-106-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
WO 2014/145090
PCT7US2014/029757
- 108-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 108-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
- 109-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
- 109-
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
010-8168-4573/2/AMERICAS
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
- 111 -
010-8168-4573/2/AMERIC AS
- 111 -
010-8168-4573/2/AMERIC AS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 112-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 112-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 113 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
-114-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-114-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
-114-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-114-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-115-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
116
010-8168-4573/2./АМ ERICAS
116
010-8168-4573/2./АМ ERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 117-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 117-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
WO 2014/145090
PCTAJS2014/029757
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 118-
010-8168-4573/2/AMERICAS
-119-
010-8168-4573/2/АМ ERICAS
-119-
010-8168-4573/2/АМ ERICAS
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
WO 2014/145090 PCT/US2014/029757
120
010-8168-4573/2/AMERICAS
120
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 121 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 122-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 122-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
WO 2014/145090
PCT/US20 К/029757
- 123 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 123 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 124-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 124-
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 125 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 125 -
010-8168-4573/2/AMERICAS
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
WO 2014/145090
PCT/US2014/029757
- 126-
010-8168-4573/2/AMERICAS
- 126-
010-8168-4573/2/AMERICAS
