[RU]

Настоящее изобретение относится к фармакологически активным и стабильным вариантам фактора роста фибробластов 21 (FGF21) человека, фармацевтическим композициям, содержащим варианты FGF21, и способам лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома с применением таких вариантов.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к фармакологически активным и стабильным вариантам фактора роста фибробластов 21 (FGF21) человека, фармацевтическим композициям, содержащим варианты FGF21, и способам лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома с применением таких вариантов.

---

ВАРИАНТЫ ФАКТОРА РОСТА ФИБРОБЛАСТОВ 21
Настоящее изобретение относится к вариантам фактора роста фибробластов 21 (FGF21), фармацевтическим композициям, содержащим варианты FGF21, и способам лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома.
FGF21 представляет собой гормон, функционирующий в качестве важного метаболического регулятора гомеостаза глюкозы и липидов. FGF21 способствует усвоению глюкозы в адипоцитах посредством повышающей регуляции GLUT1 экспрессия, механизма, отличного от механизма действия инсулина. У грызунов и обезьян с диабетом FGF21 человека понижал концентрации глюкозы в сыворотке натощак, и снижал концентрации триглицеридов, инсулина и глюкагона в сыворотке натощак. Также в моделях индуцированного диетой ожирения на грызунах введение FGF21 приводило к кумулятивной потере массы тела дозозависимым образом. Соответственно, FGF21 потенциально подходит для лечения диабета, ожирения, дислипидемии и метаболического синдрома.
Варианты FGF21 человека были описаны в WO2010/084169, WO2010/065439, WO2006/028595 и WO2005/061712.
Проблемы, связанные с FGF21 человека дикого типа и известными вариантами FGF21, заключаются в низкой активности и/или фармацевтической стабильности указанных молекул. Соответственно, все еще существует потребность в альтернативных вариантах FGF21, обладающих активностью и/или стабильностью.
В настоящем изобретении предложены альтернативные варианты FGF21. Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению обладают преимуществами по сравнению с FGF21 человека дикого типа и известными вариантами FGF21, раскрытыми в данной области техники. Указанные преимущества включают повышенную активность и/или повышенную фармацевтическую стабильность. Помимо повышенной активности, варианты FGF21 согласно настоящему изобретению обладают одной или несколькими предпочтительными характеристиками стабильности, подходящими для эффективного получения и/или приготовления состава с терапевтическим белком, включая уменьшение протеолитического разложения in vivo, уменьшение восприимчивости к окислению, снижение тенденции к агрегации при высоких концентрациях, пониженные уровни посттрансляционных модификаций и протеолиза при получении в системах на основе клеток млекопитающих, и/или улучшенную химическую стабильность. Кроме того, варианты FGF21 согласно
настоящему изобретению потенциально подходят для лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома.
В настоящем изобретении предложен вариант FGF21, отличающийся следующей последовательностью аминокислот:
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKAL ICPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLICEDGYNVYQSEAHGLPL HLPGDKSPHRXPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRS PSFE (SEQ IDNO: 1).
Также в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая вариант FGF21 согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
Также в настоящем изобретении предложен способ лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома у пациента, включающий введение указанному пациенту варианта FGF21 согласно настоящему изобретению.
Также в настоящем изобретении предложен способ лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома у пациента, включающий введение указанному пациенту фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению.
Дополнительно в настоящем изобретении предложен вариант FGF21 согласно настоящему изобретению для применения в терапии. Предпочтительно в настоящем изобретении предложен вариант FGF21 согласно настоящему изобретению для применения при лечении диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома.
Дополнительно в настоящем изобретении предложено применение варианта FGF21 согласно настоящему изобретению при получении лекарственного средства для лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома.
Полноразмерный FGF21 человека дикого типа представляет собой полипептид длиной 208 аминокислот, содержащий сигнальный пептид из 27 аминокислот. Зрелый FGF21 человека дикого типа содержит указанный полноразмерный полипептид за вычетом сигнального пептида длиной 27 аминокислот, что дает полипептид длиной в 181 аминокислоту (SEQ ID N0: 2). Изменения аминокислот в положениях вариантов FGF21 согласно настоящему изобретению определяют исходя из положений аминокислот в полипептиде зрелого FGF21 человека дикого типа (SEQ ID N0: 2).
Соответственно, замена, описанная в настоящем документе как "A31С" относится к замене аминокислотой Cys аминокислоты дикого типа Ala в положении 31 варианта зрелого FGF21 человека дикого типа.
Важно отметить, что замена одного аминокислотного остатка в конкретном варианте может влиять на характеристики вариантов в целом, и что общий эффект может быть благоприятным или вредным для фармакологической активности и/или фармацевтической стабильности. Например, одна замена аминокислоты, P115W, повышает активность варианта FGF21, однако считается также, что P115W вносит вклад в самоассоциацию, которая вызывает агрегацию. Таким образом, общий эффект для вариантов является негативным, и, соответственно, замену P115W не включают в варианты FGF21 согласно настоящему изобретению. Другой пример относится к аминокислотной замене R175L, повышающей активность варианта FGF21. Однако варианты FGF21 с заменой R175L, как было обнаружено, подвержены протеолизу, соответственно, общий эффект был негативным. Для решения проблемы С-концевого протеолиза, наблюдаемого во вариантах FGF21 согласно настоящему изобретению, аминокислоты в положениях 180 и 181 (L в положении 180 и G в положении 181) заменяют аминокислотой Е в положении 180, а аминокислоту в положении 181 удаляют. Указанные модификации существенно уменьшают С-концевой протеолиз, но также снижают фармакологическую активность варианта FGF21 в 25 раз, согласно измерениям в анализе на основе клеток человека 293-|3Klotho-SRE luc. Неожиданным образом, активность восстанавливается при обратной замене аминокислотного остатка в положении 175 (R175L) на R дикого типа. Таким образом, общий эффект указанной замены является негативным для вариантов, и, соответственно, замену R175L не включают в предпочтительные варианты FGF21 согласно настоящему изобретению.
Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению представляют собой эффективные биологически активные варианты, что продемонстрировано для последовательности SEQ ID N0:1 в примере 2. Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению содержат замены аминокислот, которые совместно не только повышают активность, но также совместимы с другими изменениями аминокислот, что, в свою очередь, обеспечивает улучшенные характеристики стабильности и повышенную стабильность in vivo. Замены аминокислот во вариантах FGF21 согласно настоящему изобретению, повышающие активность, включают D127K, S167R и G174L (см. пример 2).
Воздействие на концентрированный раствор варианта FGF21 человека дикого типа фармацевтического консерванта, такого как м-крезол, повышает предрасположенность указанного варианта к образованию агрегатов. Структурная стабилизация за счет введения дополнительной дисульфидной связи улучшает совместимость с консервантом, а также температурную стабильность FGF21 человека дикого типа. Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению содержат замены аминокислот A31С и G43C, значительно улучшающие термостабильность и совместимость с консервантом без ущерба для биологической активности. Высокоактивные варианты FGF21, содержащие также замены A31C/G43C, были описаны ранее. Указанные описанные варианты демонстрируют значительно улучшенную совместимость с консервантом по сравнению с FGF21 дикого типа, но все равно склонны к агрегации в присутствии консерванта. Указанная агрегация вариантов увеличивает риск иммуногенности, тем самым снижая приемлемость вариантов в качестве терапевтического белка.
Неожиданным образом, предпочтительные варианты FGF21 согласно настоящему изобретению содержат замены аминокислот L98D и L100K, которые приводят к значительно меньшему образованию высокомолекулярных агрегатов при высоких концентрациях. Благоприятным образом замены аминокислот L98D и L100K не понижают активность вариантов и минимизируют проблему неблагоприятной агрегации.
Предпочтительной коммерческой экспрессионной системой для получения вариантов FGF21 согласно настоящему изобретению является линия клеток млекопитающих СНО-К1. Однако клетки млекопитающих линий СНО-К1 и НЕК293 могут обуславливать посттрансляционные модификации зрелого FGF21 человека дикого типа за счет сульфатирования тирозиновой боковой цепи в положении 179. Сульфатирование остатков тирозина в положениях 179 и 180 (при их наличии) уменьшает активность и является нежелательным источником гетерогенности продукта. Соответственно, если вариант FGF21, содержащий Туг в положении 179 и/или 180, экспрессируется в клетках линий СНО К1 или НЕК293, некоторая часть экспрессируемых вариантов может быть сульфагарована в положении 179, другие могут быть су льф агаров аны в положении 180, некоторые могут быть сульфатированы в обоих положениях и некоторые - ни в одном из положений. Это приводит к образованию совокупности вариантов с неоднородным и непредсказуемым составом и пониженной активностью.
Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению содержат аминокислотную замену, решающую указанную проблему неблагоприятного сульфатирования. Соответственно, аминокислотную замену Y179F включали в указанные варианты. Y179F исключает сульфатирование, обусловленное продуцированием в клетках СНО-К1 и НЕК293. Более того, аминокислотная замена Y179F совместима с другими благоприятными заменами аминокислот согласно настоящему изобретению, и определена как нейтральное в отношении активности изменение.
FGF21 человека дикого типа подвержен протеолитическому разложению in vivo. Основной протеолитический фрагмент, выделяемый из сыворотки после внутривенного или подкожного введения мышам или яванским макакам FGF21 дикого типа, представляет собой фрагмент, заканчивающийся в положении 171. Указанный фрагмент FGF21, захватывающий остатки 1-171, как было определено, приблизительно в 100 раз менее активен в анализах активности in vitro. Устранение этого участка протеолитического расщепления может повысить эффективность лекарственного средства за счет увеличения воздействия активного лекарственного средства. Аминокислотная замена G170E, как было показано, значительно замедляет расщепление у мышей и практически полностью исключает протеолиз в положении 171 при измерении через 24 часа у яванских макаков. Замена G170E не влияет на активность и совместима с нужным профилем физико-химической стабильности. Таким образом, аминокислотную замену G170E включают в варианты FGF21 согласно настоящему изобретению.
FGF21 человека дикого типа также подвержен расщеплению карбоксипептидазой, синтезируемой при получении в клетках СНО-К1; аминокислотная замена А180Е и удаление аминокислоты в положении 181 замедляет указанный процессинг, уменьшая таким образом гетерогенность длины экспрессируемого варианта (т.е. гетерогенность числа аминокислотных остатков в зрелом вариант экспрессируемом клеточной линией). Несмотря на то, что аминокислотная замена А180Е и удаление аминокислоты в положении 181 полностью не исключают С-концевой протеолиз при экспрессии в клетках млекопитающих, это довольно эффективно замедляет протеолиз при сохранении активности в контексте других требуемых замен аминокислот, включенных во варианты FGF21 согласно настоящему изобретению. В связи с указанной благоприятной характеристикой аминокислотную замену А180Е и удаление аминокислоты в положении 181 включают в предпочтительные варианты FGF21 согласно настоящему изобретению.
Настоящее изобретение также охватывает полинуклеотиды, кодирующие описанные выше варианты, которые могут находиться в форме РНК или в форме ДНК, включая кДНК и синтетическую ДНК. Указанная ДНК может быть двуцепочечной или одноцепочечной. Кодирующие последовательности, кодирующие варианты согласно настоящему изобретению, могут варьировать в результате избыточности или вырожденности генетического кода.
Полинуклеотиды, кодирующие варианты согласно настоящему изобретению, могут включать следующие: только кодирующая последовательность для вариантов, кодирующая последовательность для вариантов и дополнительная кодирующая последовательность, например, лидерная или секреторная последовательность или последовательность про-варианта; кодирующая последовательность для вариантов и некодирующая последовательность, например, интроны, или некодирующая последовательность в направлении 5' и/или 3' от кодирующей последовательности для вариантов. Соответственно, термин "полинуклеотид, кодирующий вариант", включает полинуклеотид, который может содержать не только кодирующую последовательность для вариантов, но и полинуклеотид, содержащий дополнительную кодирующую и/или некодирующую последовательность.
Полинуклеотиды согласно настоящему изобретению экспрессируются в клетке-хозяине после функционального связывания последовательностей с контролирующей экспрессию последовательностью. Экспрессионные векторы, как правило, реплицируют в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде составной части хромосомной ДНК хозяина. Обычно экспрессионные векторы содержат селективные маркеры, например, тетрациклиновый, неомициновый и дигидрофолатредуктазный, позволяющие обнаружение клеток, трансформированных нужными последовательностями ДНК.
Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению могут легко быть получены в клетках млекопитающих, таких как клетки СНО, NSO, НЕК293 или COS; в бактериальных клетках, таких как Е. coll, Bacillus subtilis, или Pseudomonas fluorescence; или в клетках грибов или дрожжей. Клетки-хозяева культивируют с применением методик, хорошо известных в данной области техники. Предпочтительными клетками-хозяевами из клеток млекопитающих является линия клеток CHOK1SV, содержащая систему экспрессии глутаминсинтетазы (ГС) (см. US 5122464).
Векторы, содержащие представляющие интерес полинуклеотидные последовательности (например, вариантов FGF21 и последовательностей контроля экспрессии), могут быть перенесены в клетку-хозяина с помощью хорошо известных способов, которые различаются в зависимости от типа клетки-хозяина. Например, в случае прокариотических клеток обычно используют трансформацию с применением хлорида кальция, тогда как для других клеток-хозяев может применяться обработка фосфатом кальция или электропорация.
Могут быть использованы различные способы очистки белка; такие способы известны в данной области техники и описаны, например, в источниках: Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990), и Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Edition, Springer, NY (1994).
Фармацевтические композиции, содержащие варианты FGF21 согласно настоящему изобретению, могут быть введены любыми известными в данной области техники способами, обеспечивающими реализацию основного целевого назначения, лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома. Предпочтительный способ введения - парентеральный. Доза для введения зависит от возраста, состояния здоровья, массы тела реципиента, вида сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты лечения и характера требуемого эффекта. Типичные дозировки могут быть оптимизированы с применением стандартных клинических методик, зависят от способа введения и состояния пациента и могут быть определены средним специалистом в данной области техники.
Фармацевтически приемлемые композиции с вариантами FGF21 согласно настоящему изобретению получают в соответствии с известными способами. Желательно, чтобы состав представлял собой стабильный лиофилизированный продукт, восстанавливаемый с применением подходящего разбавителя или водного раствора высокой степени чистоты, необязательно с фармацевтически приемлемыми носителями, консервантами, вспомогательными веществами или стабилизаторами [Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA 1995].
Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению могут входить в составлекарственного средства совместно с фармацевтически приемлемым буфером, рН может быть скорректирован для получения приемлемой стабильности и приемлемых для введения уровней. Кроме того, композиции с FGF21 согласно настоящему изобретению могут упаковываться в контейнер, такой как флакон,
картридж, шприц-ручка, шприц, трубка для внутривенного введения или пакет для внутривенного введения.
Термин "дислипидемия" означает расстройство метаболизма липопротеинов, в том числе сверхсинтез или дефицит липопротеинов. Дислипидемия может проявляться повышением концентрации общего холестерина, холестерина в форме липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и триглицеридов, и/или уменьшением концентрации холестерина в форме липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) в крови.
Термин "метаболический синдром" характеризуется наличием группы метаболических факторов риска у одного человека. Такие факторы риска включают: абдоминальный жир - объем талии 40 дюймов или более для большинства людей; высокий уровень сахара в крови - по меньшей мере ПО миллиграммов на децилитр (мг/дл) натощак; высокий уровень триглицеридов - по меньшей мере 150 мг/дл в крови; низкий уровень ЛПВП - менее 40 мг/дл; и/или давление крови 130/85 или выше.
Термин "ожирение" определяется как состояние, при котором имеется избыток подкожного жира относительно нежировой массы тела (Stedman's Medical Dictionary 28th edition, 2006, Lippincott Williams & Wilkins).
"Пациент" представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека.
Термин "лечение" (или "лечить") означает замедление, уменьшение или реверсию прогрессирования или тяжести существующего симптома, расстройства, состояния или заболевания.
Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству или дозе предложенного в настоящем изобретении варианта, соответствующего описанию в настоящем документе, которое(ая), при введении пациенту в одной или нескольких дозах, обеспечивает необходимое лечение.
Термин "диабет 2-го типа" характеризуется избыточным синтезом глюкозы, несмотря на наличие инсулина, и сохранением чрезмерно высоких циркулирующих уровней глюкозы в результате неадекватного клиренса глюкозы.
Настоящее изобретение может быть реализовано на основе нижеследующих примеров, однако это не должно толковаться как ограничение объема настоящего изобретения.
Пример 1
Экспрессирование вариантов FGF21 в клетках CHOK1SV
Варианты FGF21 согласно настоящему изобретению синтезировали в экспрессионной системе на основе клеток млекопитающих CHOK1SV. Гены, кодирующие варианты FGF21, субклонировали в содержащие глутаминсинтетазу (ГС) экспрессионные плазмидные конструкции (плазмиды на основе рЕЕ12.4). Последовательность кДНК, кодирующую варианты FGF21, соединяли внутри рамки с кодирующей последовательностью из предпочтительных последовательностей сигнальных пептидов для повышения секреции требуемого продукта в среду для тканевой культуры. Предпочтительные последовательности сигнальных пептидов представлены полипептидами, приведенными в последовательностях аминокислот SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:5, или SEQ ID N0:6.
Экспрессию запускает промотор цитомегаловируса (CMV). Клетки CH0K1SV стабильно трансфицировали с применением электропорации и подходящего количества рекомбинантной экспрессионной плазмиды, и трансфицированные клетки поддерживали в суспензионной культуре при адекватной плотности клеток. Проводили отбор трансфицированных клеток путем культивирования на содержащей метионин-сульфоксимин (MSX) бессывороточной среде, и инкубировали при 35-37 °С и 5-7 % С02.
Полученные клонированием клеточные лини измеряли и определяли с применением проточного цитометра. При экспрессировании варианта FGF21 в клетках млекопитающих, как правило, образуется природная N-концевая последовательность HPIP, т.е. отсутствует остаток метионина на N-конце, например, как во варианте FGF21, представленном последовательностью аминокислот SEQ ID N0:1.
Варианты FGF21, секретируемые в среду клетками СНО, очищали способом, при котором очищенную культуральную среду нагревали до 50-60 SC на протяжении периода времени до двух часов, охлаждали, обрабатывали детергентом (Triton Х-100) для инактивации вирусов и наносили на хроматографическую колонку для смешанного режима Capto ММС (GE Healthcare). Вариант FGF элюировали из колонки с применением буфера с рН 8; рН полученного пула продукта доводили раствором 50 мМ лимонной кислоты, 150 мМ NaCl до значений в диапазоне от 3,2 до 3,5 в течение 1 часа для инактивации вирусов. Значения рН раствора доводили до 6,7-7,3 добавлением Трис-буфера, и дополнительно очищали вариант FGF хроматографией с гидрофобным
взаимодействием с применением фенил-сефарозной смолы Phenyl Sepharose High Performance (GE Healthcare). Колонку для гидрофобной хроматографии элюировали с применением уменьшающегося градиента сульфата натрия при рН 7. Проводили замену буфера очищенного путем ГХ варианта FGF на Трис с рН 8, содержащий NaCl, и дополнительно очищали с помощью анионообменной хроматографии на смоле Source 30Q (GE Healthcare). Анионообменную колонку элюировали с применением возрастающих концентраций хлорида натрия при рН 8. Очищенный вариант FGF пропускали через фильтр для удержания вирусов Planova 20N (Asahi Kasei Medical) с последующей концентрацией/диафильтрацией в 10 мМ цитрате, 150 мМ NaCl, рН 7, с применением ультрафильтрации в тангенциальном потоке на регенерированной целлюлозной мембране (Millipore).
Пример 2
Анализ усвоения глюкозы фибробластами 3T3-Ll-(3Klotho
Фибробласты 3T3-Ll-(3Klotho получали из фибробластов 3T3-L1 путем ретровирусной трансдукции контролируемого CMV экспрессионного вектора для млекопитающих, содержащего кодирующую последовательность (3Klotho мыши дикого типа и маркер устойчивости к бластицидину. Устойчивые к бластицидину клетки отбирали после культивирования в течение 14 дней в присутствии 15 мкМ бластицидина, и подтверждали экспрессию варианта (3Klotho иммуноблоттингом с применением антитела против (3Klotho. Фибробласты 3T3-Ll-(3Klotho поддерживали на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% телячьей сыворотки и 15 мкМ бластицидином до посева с целью использования в экспериментах.
Для усвоения глюкозы фибробласты 3T3-Ll-(3Klotho высевали с плотностью 20 000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 48 часов в среде DMEM с добавлением 10% телячьей сыворотки. Клетки инкубировали в течение 3 часов в DMEM с 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в присутствии или в отсутствие представляющего интерес варианта FGF21, с последующим инкубированием в течение часа 1 в фосфатном буфере Кребса-Рингера (КРФ) (15 мМ HEPES, рН 7,4, 118 мМ NaCl, 4,8 мМ КС1, 1,2 мМ MgS04, 1,3 мМ СаС12, 1,2 мМ КН2РО4, 0,1% БСА), содержащем 100 мкМ 2-дезокси-0-(14С)глюкозу, в присутствии или в отсутствие варианта FGF21. Неспецифическое связывание обнаруживали путем инкубирования выбранных лунок в бикарбонатном/HEPES буфере Кребса-Рингера
(KRBH), содержащем 1 мМ 2-дезокси-0-( С) глюкозу. Реакцию останавливали добавлением к клеткам 20 мкМ цитохалазина, и измеряли усвоение глюкозы с применением жидкостного сцинтилляционного счетчика.
Активность in vitro (ЕС50) варианта FGF21, представленного последовательностью SEQ ID NO: 1, в анализе усвоения глюкозы фибробластами ЗТЗ-Ll-(3Klotho составляет 0,051 нМ.
Пример 3 Физическая стабильность
Физическую стабильность вариантов FGF21 определяли следующим образом. Варианты диализировали и разводили в концентрации 1-2 мг/мл с 10 мМ гистидин, рН7, с 150 мМ NaCl или без 150 мМ NaCl, и анализировали с помощью ЭХ для определения % ВММ (Таблица 1: "Исходный").
Разделение с помощью ЭХ проводили на 5 мкм колонке Tosoh Bioscience 3000SWXL с размерами 30 см х 0,78 см. Подвижная фаза: 0,01 М цитрат, 150 мМ NaCl, рН 7 при скорости потока 0,5 мл/мин. Исходные низкоконцентрированные образцы вводили в виде проб объемом 10 мкл и проводили мониторинг при поглощении на 214 нм, а образцы 30 мг/мл вводили в виде 1 мкл проб и проводили мониторинг при 280 нм.
Затем варианты концентрировали до 30 мг/мл и повторно анализировали (t=0). % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, увеличивался с 0,15 % до 0,9 % при концентрировании в гистидиновом буфере в присутствии соли. % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, увеличивался с 0,15 % до 0,7 % при концентрировании в гистидиновом буфере с солью. В отсутствие соли % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, увеличивался с 0,2 % до 3,2 % при концентрировании, и для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, увеличивался с 0,13 % до 1,0 %. Соответственно, и вариант FGF21, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 7, и вариант FGF21, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 1, содержат более низкий исходный % ВММ и более низкий % ВММ в составах с концентрацией вариантов 30 мг/мл в присутствии 150 мМ NaCl. Эти данные свидетельствуют о важном значении модификации L100K, присутствующей во варианте FGF21, соответствующем
последовательности SEQ ID NO: 1, но отсутствующей во варианте FGF21, соответствующем последовательности SEQ ID NO: 7.
Составы с концентрацией 30 мг/мл инкубировали в течение 4 недель при 4 °С, 25 °С, и 40 °С для оценки долгосрочной стабильности в стрессовых условиях. Как видно из таблицы 1, % ВММ повторно определяли через 4 недели (t=4 недели). % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, увеличивался с 3,2 % до 6,6 % при 40 °С в отсутствие соли. % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, увеличивался с 1 % до 5,3 % при 40 °С. % ВММ для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, увеличивался с 0,9 % до 2,3 % при 40 °С в присутствии соли, и для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, увеличивался с 0,7 % до 1,7 %. Через 4 недели при 25 °С уровни % ВММ составляли всего 1,1 % для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, в то же время составляя 2,9 % для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, в отсутствие соли. Эти данные свидетельствуют о благоприятном влиянии введения модификации L100K, присутствующей во варианте FGF21, соответствующем последовательности SEQ ID NO: 1.
Пример 4
Гетерогенность экспрессии R175 и Е180
Желательным является получение гомогенного продукта варианта, так как это обеспечивает более надежное получение единообразного и точно охарактеризованного
продукта. Для оценки гетерогенности продукта аликвоту образца объемом 10 мкл смешивали с 90 мкл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS). Образец анализировали с помощью жидкостной хроматографии/масс-спектрометрии (ЖХ-МС) с использованием следующих условий: подвижная фаза А: 0,05% ТФУ, подвижная фаза В: 0,04% ТФУ в ацетонитриле, колонка: PLRPS 2,1 х 50 мм, вводимый объем: 15 мкл.
Масс-спектрометр Waters Micromass LCT Premier(tm) настраивали на диапазон масс от 400 до 1990 а.е.м., полярность ЭС+, напряжение на капилляре: 3000, пробоотборный конус: 40 В, апертура 1: 25 В, температура источника: 105 °С, поток газа через конус: 50 л/час, температура десольватации: 150 °С, поток газа десольватации: 600 л/час.
В таблице 3 представлена итоговая гетерогенность каждого варианта FGF21 по оценке с помощью метода ЖХ-МС. Продукт 1-181 представляет собой полноразмерный вариант FGF21, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 7. Вариант FGF21, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 7, подвержен усечению по С-концу, в частности, удалению остатка аминокислоты глицина в положении 181. Как видно из таблицы 3, 33,7 % очищенного продукта для варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 7, представляет собой
целевой полноразмерный 1-181; фрагмент 1-180 представлена наибольшая часть очищенного продукта. Кроме того, обнаруживаются также небольшие количества продукта 1-179.
В варианте FGF21, соответствующем последовательности SEQ ID NO: 1, удален остаток аминокислоты в положении 181 в генной конструкции, и остаток аминокислоты 180 заменен на глутаминовую кислоту (Е). Указанные изменения защищают С-конец от разрушения при экспрессировании в СНО, что позволяет получить 100% однородный очищенный продукт 1-180.
Пример 5
Снижение уровней глюкозы в модели на мышах оЪ/оЪ
Возраст самцов мышей ob/ob и совпадающих по возрасту контрольных ob/m (без ожирения) составлял 7 недель на момент получения и 8-9 недель в момент начала лечения. После прибытия всех мышей размещали поодиночке и позволяли акклиматизироваться в течение 1-2 недель до начала лечения. Мыши получали корм для грызунов Purina Rodent Chow 5015 и водопроводную воду из автоматической поилки в неограниченном количестве. В помещениях для мышей устанавливали 12-тичасовой цикл света/темноты и температуру воздуха 75 °F. За 1-2 дня до начала лечения собирали образцы крови из хвоста. Измеряли уровни глюкозы в крови с помощью глюкометра Accu-Check Avivia (Roche), и собирали образцы сыворотки для анализа на инсулин с применением набора для анализа инсулина Meso Scale для мышей и крыс. В день начала лечения (день 0) мышей распределяли в группы на основании массы тела до лечения, уровня глюкозы в крови и инсулина в сыворотке (программное обеспечение для сортировки BRAT). На 0 и 3 день мышам вводили п/к дозы от 0,1 до 30 нмоль/кг варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 5, в объеме 10 мл/кг. В качестве носителя использовали стерильный ФСБ (от Ну Clone, в модификации Дульбекко (DPBS), без кальция и магния) содержащий 0,03% мышиного сывороточного альбумина (MCA; Sigma A3139). Уровни глюкозы в крови измеряли ежедневно в течение 7 дней и определяют AUC. Расчет ED50 для снижения уровней глюкозы основан на AUC. Собирали гомогенаты печени при умерщвлении, и измеряли уровни триглицеридов печени на клиническом анализаторе Hitachi Modular P.
На 14 день у получавших лечение носителем мышей наблюдалась гипергликемия со средним измеренным уровнем глюкозы в крови 348 ± 19,5 мг/дл
(среднее ± SEM), тогда как у контрольных мышей ob/m без ожирения уровни глюкозы в крови составляли 165 ± 3,2 мг/дл (среднее ± SEM). Вариант FGF21, соответствующий последовательности SEQ ID NO: 1, понижал уровни глюкозы в крови до уровня, сравнимого с контролем ob/m без ожирения. ED50 варианта FGF21, соответствующего последовательности SEQ ID NO: 1, составила 1,296 нмоль/кг (95 % доверительный интервал = -0,07 - 0,30).
Последовательности
SEP ID NO; 1 - Вариант FGF21
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKAL KPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLKEDGYNVYQSEAHGLPL HLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLRS PSFE
SEP ID NO; 2 - FGF21 дикого типа (Homo Sapiens)
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTEAHLEIREDGTVGGAADQSPESLLQLKAL KPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFRELLLEDGYNVYQSEAHGLPL HLPGNKSPHRDPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLSMVGPSQGR SPSYAS
SEP ID NP; 3 - Сигнальный пептид трансферрина человека (hTrf)
MRLAVGALLVCAVLGLCLA
SEP ID NP; 4 - Сигнальный пептид связывающего белка-1 фактора роста фибробластов человека (hFGFP-1)
MKIC S LTLL SFLLL AAQ VLL VEG
SEP ID NP; 5 - Сигнальный пептид бычьего лизоцима
MKALVILGFLFLSVAVQG
SEP ID NP; 6 - Сигнальный пептид легкой цепи мыши (mkappa)
METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEP ID NP; 7 - Вариант FGF21
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLLQLKAL KPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLLEDGYNVYQSEAHGLPL
HLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDVGSSDPLRLVEPSQLLS PSFLG
SEP ID NO; 8 - Вариант FGF21 (ДНЮ
CACCCCATCCCTGACTCCAGTCCTCTCCTGCAATTCGGGGGCCAAGTCCGGCAGC
GGTACCTGTACACCGACGACGCCCAGCAGACCGAGTGCCACCTGGAAATCCGGG
AGGACGGCACCGTGGGCTGTGCCGCCGACCAGTCCCCTGAGTCCCTGCTGCAGCT
GAAGGCCCTGAAGCCTGGCGTGATCCAGATCCTGGGCGTGAAAACCTCCCGGTTC
CTGTGCCAGAGGCCTGATGGCGCCCTGTACGGCTCCCTGCACTTCGACCCTGAGG
CCTGCTCCTTCCGGGAGGACCTGAAGGAAGATGGCTACAACGTGTACCAGTCCGA
GGCTCACGGCCTGCCTCTGCATCTGCCTGGCGACAAGTCCCCCCACCGGAAGCCT
GCTCCTAGGGGCCCTGCCAGATTCCTGCCACTGCCTGGCCTGCCTCCAGCTCTGCC
TGAGCCTCCTGGCATCCTGGCCCCTCAGCCTCCAGACGTGGGCTCCTCCGACCCTC
TGCGGCTGGTCGAGCCTTCCCAGCTGCGGAGCCCTAGCTTCGAG
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вариант фактора роста фибробластов 21 (FGF21), последовательность аминокислот которого представляет собой:
HPIPDSSPLLQFGGQVRQRYLYTDDAQQTECHLEIREDGTVGCAADQSPESLL QLKA.LICPGVIQILGVKTSRFLCQRPDGALYGSLHFDPEACSFREDLICEDGYNV YQSEAHGLPLHLPGDKSPHRKPAPRGPARFLPLPGLPPALPEPPGILAPQPPDV GSSDPLRLVEPSQLRSPSFE (SEQ ID NO: 1).
2. Фармацевтическая композиция, содержащая вариант по п. 1 и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество.
3. Способ лечения диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома, включающий введение варианта по п. 1 нуждающемуся в таком лечении пациенту.
4. Вариант по п. 1 для применения в терапии.
5. Вариант по п. 1 для применения при лечении диабета 2-го типа, ожирения, дислипидемии и/или метаболического синдрома.