[RU]

Антитела к CD40 составлены в виде лиофилизата или жидкого состава. Лиофилизаты могут восстанавливаться с получением раствора с высокой концентрацией антительного активного ингредиента для доставки пациенту, избегая высокого уровня антительной агрегации. Лиофилизат может быть восстановлен с использованием водного восстановителя с получением водной композиции, в которой антитело имеет концентрацию по меньшей мере 50 мг/мл. Лиофилизат или водная фармацевтическая композиция может включать один или несколько из следующих компонентов: сахара, буферного агента, поверхностно-активного вещества и/или свободной аминокислоты.

(57) Реферат / Формула:

Антитела к CD40 составлены в виде лиофилизата или жидкого состава. Лиофилизаты могут восстанавливаться с получением раствора с высокой концентрацией антительного активного ингредиента для доставки пациенту, избегая высокого уровня антительной агрегации. Лиофилизат может быть восстановлен с использованием водного восстановителя с получением водной композиции, в которой антитело имеет концентрацию по меньшей мере 50 мг/мл. Лиофилизат или водная фармацевтическая композиция может включать один или несколько из следующих компонентов: сахара, буферного агента, поверхностно-активного вещества и/или свободной аминокислоты.

---

2420-519529ЕА/022
АНТИТЕЛЬНЫЙ СОСТАВ
Область техники
Настоящее изобретение относится к фармацевтическому составу антитела против CD4 0, к способу его получения и к применениям состава.
Уровень техники
Несмотря на доступность нескольких иммуносупрессирующих терапий для аутоиммунных заболеваний, при этом остается неудовлетворенной потребность получения более эффективных и безопасных лекарственных средств для большей части популяции пациентов. Например, несмотря на известную эффективность терапий В-клеточного истощения/ингибирования типа Ритуксимаба и Белимумаба при лечении ревматоидного артрита, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, и рассеянного склероза, они эффективны только у части больных индивидуумов, и при использовании Ритуксимаба сопровождаются риском развития прогрессирующей мультифокальной лейкоцеребральной дистрофии. Кроме того, часто в патологию этих аутоиммунных заболеваний вовлечено множество других клеточных типов лейкоцитов, таких как макрофаги, дендритные клетки и Т-клетки, таким образом, может быть полезным терапевтическое лечение, направленное на дополнительные клеточные типы или ключевые иммунологические сигнальные пути, которые будут ингибировать их функцию. Принимая во внимание данные о множестве иммунологически релевантных ролей CD4 0-CD154 в активации и функционировании этих клеточных типов, вероятно, что помимо имеющихся в настоящее время терапий антитело к CD4 0 будет давать терапевтическую пользу пациентам, страдающим аутоиммунными заболеваниями, перечисленными выше. Кроме того, центральная роль взаимодействий CD4 0-CD154 в кишечных воспалительных расстройствах, таких как болезнь Крона и язвенный колит, и механические связи пути CD4 0 с патологией в более редких расстройствах, таких как аутоиммунный васкулит, пузырчатка обыкновенная и идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура
(ITP) также выявляют потенциал антител к CD40 при этих проявлениях.
Доступные в настоящее время иммуносупрессанты, используемые после трансплантации паренхиматозных органов, обеспечивают отличную краткосрочную эффективность. Острое отторжение в период de novo наблюдаются у 5%-20% реципиентов (в зависимости от органа, популяции пациентов и режима) и пропорция графтов, которая теряется до острого отторжения в течение периода de novo, составляет менее 5% для любого случая. В настоящее время имеется ключевая неудовлетворенная потребность в обеспечении переносимости иммуносупрессии пациентом и жизнеспособности графта в течение продолжительного времени. После почечной трансплантации 33% пациентов умирает и/или теряет свой графт в течение 5 лет; средний возраст смерти пациентов с трансплантатами составляет 58 лет. Ингибиторы кальцинеурина (CNI) составляют основу иммуносупрессирующей терапии для огромного большинства пациентов с трансплантатами. В то время как смертность, связанная с нефротоксичностью и с сердечно-сосудистыми заболеваниями, ассоциированными с CNI, представляет собой один из факторов, способствующих хронической нефропатии аллографта, а также смерти пациента с функционирующим графтом, альтернативная иммуносупрессия не способна заместить CNI. В общем, существует пространство для улучшения по части продолжительности иммуносупрессии трансплантата. Опосредованное В-клетками иммунологическое нарушение трансплантированных почек может способствовать получению менее продолжительного положительного результата, и медицинскому сообществу все больше и больше очевидна необходимость получения новых агентов для направленного воздействия на В-клеточное отторжение.
Антитела против CD40 известны в данной области. Chirl2.12
представляет собой полностью гуманизированное, не
антагонистическое антитело к CD40 (IgGl, каппа), которое
блокирует CD154 (также известный как лиганд CD4 0; CD4 0L)
опосредованную активацию лейкоцитов и может опосредовать
антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC)
человеческих лейкоцитов и В-клеточных лимфом in vitro (см. WO 2006/073443). WO 2005/044306 описывает антагонистические антитела к CD40, включающие Chirl2.12, для конкретного применения в лечении аутоимунных и воспалительных расстройств. Кроме того, Chirl2.12 является эффективным в замедлении отторжения аллотрансплантата при введении в виде монотерапии у Масаса fascicularis (макак-крабоед) [Li et al. (2008) Transplantation; 86 (1) :10-15] . Однако Chirl2.12 также может опосредовать истощение периферических В-клеток у приматов, отличных от человека (NHP).
Считается, что антитело mAb к CD4 0 с сайленсированной активностью ADCC обладают улучшенным профилем безопасности ADCC относительно родительских антител к CD40, и, конкретно, могут быть более подходящими для не онкологических показаний, таких как аутоиммунные заболевания и применение в процессе трансплантации. Заявитель разработал три молчащих антитела к CD40 на основе Chirl2.12 антитела. Эти антитела, далее обозначаемые тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ, характеризуются определенными аминокислотными мутациями в Fc-участке, которые подвергают сайленсингу активность ADCC.
тАЫ включает мутацию N2 97A в аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела. Антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID N0: б, 7 и 8, соответственно. тАЫ включает Ун-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и Уь-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. тАЫ включает полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0: 9 и полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID NO: 10.
mAb2 включает мутацию D2 65A в аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела. Антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID N0: б, 7 и 8, соответственно. тАЬ2 включает Ун-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и Уь-домен с аминокислотной
последовательностью SEQ ID NO: 2. mAb2 включает полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0: 13 и включает полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0: 14.
тАЬЗ включает мутацию L2 34A, L2 3 5A (LALA) в аминокислотной последовательности тяжелой цепи антитела. Антитело включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID N0: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID N0: б, 7 и 8, соответственно. тАЬЗ включает Ун-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0: 1 и Уь-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID N0: 2. тАЬЗ включает полноразмерную аминокислотную последовательность тяжелой цепи SEQ ID N0: 17 и включает полноразмерную аминокислотную последовательность легкой цепи SEQ ID N0: 18.
Составы с высокой концентрацией антитела могут иметь короткий срок годности, и антительные составы могут терять биологическую активность в результате химической и физической нестабильности в процессе хранения. Среди прочего известно, что агрегация, дезамидирование и окисление являются наиболее распространенными причинами антительной деградации. Конкретно, агрегация потенциально может приводить к повышенному иммунному ответу у пациентов, приводя к проблемам безопасности. Таким образом, эти факторы должны быть минимизированы или предотвращены.
Целью изобретения является предложение дополнительных и улучшенных составов антител к CD40 и, конкретно, составов с высокой концентрацией антител к CD4 0 и низким уровнем антительной агрегации.
Описание изобретения
Терапевтические антитела, как правило, составлены либо в форме водного раствора, готового для парентерального введения, или в виде лиофилизатов для восстановления с использованием подходящего разбавителя перед введением. Согласно изобретению, антитело к CD4 0 может быть составлено в виде лиофилизата или в виде водной композиции, например, в предварительно заполненных шприцах. Подходящий состав может обеспечивать фармацевтическая
композиция или лиофилизат, который может быть восстановлен с получением раствора с высокой концентрацией антительного активного ингредиента и с низким уровнем антительной агрегации, для доставки пациенту. Применяют высокие концентрации антитела, поскольку они уменьшают количество материала, который должен быть доставлен пациенту. Уменьшенные объемы дозирования минимизируют время, затраченное на доставку фиксированной дозы пациенту. Водные композиции по изобретению с высокой концентрацией антител к CD4 0 особенно подходят для подкожного введения.
Таким образом, в изобретении предлагается водная фармацевтическая композиция, включающая антитело к CD4 0, подходящая для парентерального введения объекту, например, для подкожного введения.
Описаны следующие конкретные воплощения изобретения, перечисленные ниже:
1. Водная фармацевтическая композиция, подходящая для подкожного введения объекту, включающая антитело к CD4 0, в которой антитело имеет концентрацию, по меньшей мере, 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает: (i) один или несколько CDR тяжелой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, 4 и 5; и/или (ii) один или несколько CDR легкой цепи, выбранных из группы, состоящей из SEQ ID NO: б, 7 и 8.
2. Водная фармацевтическая композиция, подходящая для подкожного введения объекту согласно воплощению 1, где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID NO: б, 7 и 8.
3. Водная фармацевтическая композиция воплощения 1 или 2, где антитело к CD4 0 включает Ун-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1 и Уь-домен с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.
4. Водная фармацевтическая композиция воплощения 1, 2 или 3, где антитело к CD4 0 включает участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 9 и участок легкой цепи SEQ ID NO: 10, или участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 13 и участок легкой цепи SEQ ID NO: 14, или участок
3.
тяжелой цепи SEQ ID NO: 17 и участок легкой цепи SEQ ID N0: 18.
5. Водная фармацевтическая композиция любого из воплощений 1-4, где менее чем 5% антитела к CD40 находится в агрегированном или в деградированном состоянии.
6. Водная фармацевтическая композиция любого из воплощений 1-5, включающая один или несколько из следующих компонентов, выбранных среди группы, состоящей из: стабилизатора, буферного агента и поверхностно-активного вещества.
7. Водная фармацевтическая композиция воплощения б, где стабилизатором является сахар.
8. Водная фармацевтическая композиция воплощения б или 7, включающая: сахар, буферный агент и поверхностно-активное вещество.
9. Водная фармацевтическая композиция воплощения б или 7, дополнительно включающая свободную аминокислоту.
10. Водная фармацевтическая композиция воплощения 7-9, включающая сахарозу в качестве сахара.
11. Водная фармацевтическая композиция воплощения 10, включающая 200-300 мМ сахарозу.
12. Водная фармацевтическая композиция Воплощений 6-11, включающая гистидиновый буфер в качестве буферного агента.
13. Водная фармацевтическая композиция воплощения 12, включающая 25-35 мМ гистидиновый буфер.
14. Водная фармацевтическая композиция Воплощений 6-13, включающая полисорбат 2 0 в качестве поверхностно-активного вещества.
15. Водная фармацевтическая композиция воплощения 14, включающая 0,01-0,2% полисорбат 20.
16. Водная фармацевтическая композиция воплощения 9, дополнительно включающая аргинин и/или метионин в качестве свободной аминокислоты.
17. Водная фармацевтическая композиция воплощения 16, включающая 4 0-80 мМ аргинин.
18. Водная фармацевтическая композиция любого из
предыдущих Воплощений, включающая сахарозу, гистидиновый буфер,
полисорбат 2 0 и аргинин.
19. Водная фармацевтическая композиция любого из предыдущих Воплощений, включающая сахарозу, гистидиновый буфер, полисорбат 2 0 и метионин.
20. Водная фармацевтическая композиция любого из предыдущих Воплощений, включающая сахарозу, гистидиновый буфер, полисорбат 2 0 аргинин и метионин.
21. Лиофилизат, подходящий для получения водной фармацевтической композиции любого из предыдущих воплощений.
22. Лиофилизат согласно воплощению 21, включающий сахарозу, гистидиновый буфер и полисорбат 20.
23. Способ получения лиофилизата, включающий стадии: (i) получения водного раствора, включающего антитело к CD4 0, сахар, буферный агент, поверхностно-активное вещество и необязательно свободную аминокислоту; и (ii) лиофилизации водного раствора.
24. Средство доставки, включающее водную фармацевтическую композицию любого из воплощений 1-20.
25. Предварительно заполненный шприц, включающий водную фармацевтическую композицию любого из воплощений 1-20.
26. Способ доставки моноклонального антитела к CD4 0 млекопитающему, включающий стадию введения пациенту фармацевтической композиции любого из воплощений 1-20.
27. Композиция любого из воплощений 1-20 для применения в лечении заболевания или расстройства, которое опосредовано CD40 .
28. Композиция воплощения 2 7 для лечения аутоиммунных заболеваний.
29. Композиция воплощения 2 8 для лечения ревматоидного артрита, системной красной волчанки или обыкновенной пузырчатки.
Водная фармацевтическая композиция любого из воплощений 120, в которой антитело имеет концентрации, по меньшей мере, 50 мг/мл, по меньшей мере, 100 мг/мл, по меньшей мере, 150 мг/мл, по меньшей мере, 200 мг/мл, по меньшей мере, 250 мг/мл, или, по меньшей мере, 300 мг/мл.
В изобретении также предлагается водная фармацевтическая композиция, включающая: моноклональное антитело к CD4 0, как
описано выше, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, особенно тАЫ; стабилизатор; буферный агент и поверхностно-активное вещество. Композиция также предпочтительно включает свободную аминокислоту.
В изобретении также предлагается лиофилизат, включающий:
моноклональное антитело к CD40, как описано выше, например,
тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, особенно, тАЫ; сахар, буферный агент и
поверхностно-активное вещество. Лиофилизат также
предпочтительно включает свободную аминокислоту.
В изобретении также предлагается лиофилизат, включающий моноклональное антитело к CD40, как описано выше, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, особенно тАЫ; где лиофилизат может восстанавливаться с использованием водного восстанавливающего агента с получением одной композиции, в которой антитело имеет концентрацию, по меньшей мере, 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 200 мг/мл, 250 мг/мл, или 300 мг/мл, после восстановления в водном растворе.
В изобретении также предлагается водная фармацевтическая композиция, включающая высокую концентрацию моноклонального антитела к CD40, как описано выше, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, особенно тАЫ; где менее чем 5%, 4%, 3%, 2% или 1% антитела к CD4 0 находится в агрегированном или в деградированном состоянии.
В изобретении также предлагается способ получения лиофилизата, включающий стадии: (i) получения водного раствора, включающего моноклональное антитело к CD4 0, сахар, буферный агент, поверхностно-активное вещество и необязательно свободную аминокислоту; и (ii) лиофилизации водного раствора.
В изобретении также предлагается способ получения фармацевтической композиции, включающий стадию смешивания лиофилизата с водным восстанавливающим агентом, где лиофилизат включает моноклональное антитело к CD40, сахар, буферный агент, поверхностно-активное вещество и необязательно свободную аминокислоту.
Более конкретно, в изобретении предлагается
лиофилизированный состав, полученный с помощью лиофилизации
водного состава, имеющего рН 5-7 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) стабилизатор,
(iii) буферный агент,
(iv) поверхностно-активное вещество и необязательно
(v) аминокислоту.
В одном воплощении указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 5,0-7,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) гистидин в качестве буферного агента,
(iv) полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) аминокислоту, выбранную из аргинина, метионина и глицина.
В одном воплощении указанный лиофилизированный состав получают из водного состава, имеющего рН 5,0-7,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0-
150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2
и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и
CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 3-300 мМ сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) 1-60 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) до 0,2% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) 2-80 мМ аргинин, метионин или глицин.
В одном воплощении указанный лиофилизированный состав получают из водного состава, имеющего рН б,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50
мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 90 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 10 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,02% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества
В одном воплощении указанный лиофилизированный состав получают из водного состава, имеющего рН б,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 90 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 10 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,02% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и
(v) 17 мМ аргинин.
В одном воплощении указанный лиофилизированный состав получают из водного состава, имеющего рН б,0 и включающего
(i) антитело к CD40, где антитело имеет концентрацию 150 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента, и
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
В изобретении также предлагается водная фармацевтическая композиция, полученная путем восстановления лиофилизированного состава, как описано выше, где фактор восстановления находится в интервале от 1:0,5 до 1:6.
В одном воплощении фактор восстановления составляет 1:3.
В изобретении также предлагается водная фармацевтическая композиция, имеющая рН 5,0-7,0, и включающая
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50
мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID N0: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) стабилизатор,
(iii) буферный агент,
(iv) поверхностно-активное вещество и необязательно
(v) аминокислоту.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция, имеющая рН 5,0-7,0, включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID N0: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) гистидин в качестве буферного агента,
(iv) полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) аминокислоту, выбранную из аргинина, метионина или
глицина.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция, имеющая рН 5,0-7,0, включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID N0: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 200-300 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 25-35 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) до 0,2% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) 10-8 0 мМ аргинин, метионин или глицин.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция имеет рН 6,0 и включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID N0: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента, и
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция имеет рН 6,0 и включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и
(v) 51 мМ аргинин.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению имеет концентрацию антитела к CD40 150 мг/мл.
В одном воплощении лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает Ун-домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и VL-домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 2.
В одном воплощении, лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD4 0, включающее участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 9, и участок легкой цепи SEQ ID NO: 10.
В одном воплощении, лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD4 0 Chirl2.12, имеющее мутацию N2 97A.
В одном воплощении лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD4 0, включающее участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 13 и участок легкой цепи SEQ ID NO: 14.
В одном воплощении лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD4 0 Chirl2.12, имеющее мутацию D2 65A.
В одном воплощении, лиофилизированный состав или водная
фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD4 0, включающее участок тяжелой цепи SEQ ID N0: 17, и участок легкой цепи SEQ ID N0: 18.
В одном воплощении, лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению включает антитело к CD40 Chirl2.12, имеющее мутацию L234A L235A.
Изобретение также включает средство доставки, включающее водную фармацевтическую композицию по изобретению.
Изобретение также включает предварительно заполненный шприц, включающий водную фармацевтическую композицию по изобретению.
Изобретение также включает способ доставки антитела к CD4 0 млекопитающему, включающий стадию введения пациенту водной фармацевтической композиции по изобретению.
Изобретение также включает лиофилизированный состав или водную фармацевтическую композицию по изобретению для применения в лечении заболевания или расстройства, которое опосредовано CD40.
Изобретение также включает лиофилизированный состава или водную фармацевтическую композицию по изобретению для применения в лечении аутоиммунных заболеваний.
В изобретении также предлагается лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по изобретению для лечения аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз, системная красная волчанка, синдром Шегрена, ревматоидный артрит, отторжение трансплантата; заболевание "трансплантат против хозяина", пузырчатка обыкновенная.
Водная фармацевтическая композиция с высокой концентрацией антител к CD40
Изобретение основано, по меньшей мере, частично на свойствах антительных составов, как например, антител тАЫ, которые сохраняют значительную стабильность и биоактивные свойства при создании состава с высокой концентрацией как в виде жидкой композиции (водной), так и в виде лиофилизированной композиции.
При использовании в данном документе термин "водная"
фармацевтическая композиция обозначает композицию, подходящую
для фармацевтического применения, где водный носитель
представляет собой дистиллированную воду. Композиция,
подходящая для фармацевтического применения, может быть
стерильной, гомогенной и/или изотонической. Водные
фармацевтические композиции могут быть получены или непосредственно в водной форме, например, в предварительно заполненном шприце, готовом к применению ("жидкие составы") или в виде лиофилизатов, которые восстанавливают сразу перед применением. При использовании в данном документе, термин "водная фармацевтическая композиция" относится к жидкому составу или к восстанавливаемому лиофилизированному составу. В некоторых воплощениях, водные фармацевтические композиции по изобретению подходят для парентерального введения объекту-человеку. В конкретном воплощении, водные фармацевтические композиции по изобретению подходят для подкожного введения.
При использовании в данном документе, термин
"парентеральное введение" означает режимы введения, отличные от
энтерального или местного введения, обычно с помощью инъекции,
и включает, в частности, внутривенное, внутримышечное,
внутриартериальную, внутритрахеальную, внутрикапсулярную,
внутриорбитальную, внутрикардиальную, внутрикожную,
внутрибрюшинную, транстрахеальную, подкожную, внутрисуставную,
субкапсулярную, субарахноидальную, внутриспинальную,
эпидуральную и надчревную инъекцию или инфузию.
В настоящее время широко распространено использование антител в качестве активного ингредиента лекарственного средства, включая продукты HERCEPTIN(tm) (трастузумаб), RITUXAN(tm) (ритуксимаб), SYNAGIS(tm) (паливизумаб), и т.д. Методы очистки терапевтических антител до фармацевтического класса хорошо известны в данной области.
Композиция обычно не является пирогенной, например, содержит <1 ЭЕ (единица эндотоксина, стандартная мера измерения) на дозу, и предпочтительно, <0,1 ЭЕ на дозу. Композиция предпочтительно не содержит глютен.
В конкретных воплощениях, водные фармацевтические композиции по изобретению демонстрируют уровень антительной агрегации или деградации от низкого до не детектируемого с очень небольшой потерей биологической активности или с полным отсутствием потери активности в процессе производства, получения, транспортировки и длительного периода хранения, причем концентрация антитела к CD40 составляет, по меньшей мере, примерно 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл, 2 00 мг/мл, 2 50 мг/мл, или 30 0 мг/мл.
В одном аспекте, изобретение относится к водной фармацевтической композиции с высокой концентрацией антител к CD40 .
В данной области известно, что такая высокая концентрация водных фармацевтических композиций может быть разведена перед инъекцией, например, если требуются более низкие концентрации для конкретных терапевтических мероприятий или когда подвергаются лечению пациенты с более низкой массой тела, включая детей. Подходящие концентрации могут составлять 25 мг/мл или 10 мг/мл. Альтернативно, исходный состав может быть получен с такой низкой концентрацией.
Термин "антитело", упоминаемый в данном документе,
включает цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент
(т.е., "антигенсвязывающая часть") или их одиночные цепи.
Натуральное "антитело" является гликопротеином, содержащим, по
меньшей мере две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L) ,
взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь
состоит из вариабельного участка тяжелой цепи (обозначенного в
данном документе как VH) и константного участка тяжелой цепи.
Константная область тяжелой цепи содержит три или четыре домена
в зависимости от изотипа, Сн1, Сн2, и Сн3 и Сн4. Каждая легкая
цепь состоит из вариабельного участка легкой цепи (сокращенно
обозначенную в данном документе как VL) и константного участка
легкой цепи. Константный участок легкой цепи содержит один
домен, CL. Участки VH и VL могут быть далее разделены на участки
гипервариабельности, участками, отвечающими за
комплементарность связывания (CDR), перемежаются с участками,
которые являются более консервативными, называемыми каркасными участками (FR). Каждый VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат домен связывания, который взаимодействует с антигеном. Константные участки антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.
При использовании в данном документе, термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "антигенная часть") относится к полноразмерному антителу или одному или нескольким его фрагментам, которые сохраняют способность специфического связывания с антигеном (например, с частью CD4 0) . Было показано, что антигенсвязывающая функция антитела может быть осуществлена с помощью фрагментов полноразмерного антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антигенсвязывающая область" антитела, включают Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и Сн1; F (ab) 2~Фрагмент, двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирном участке; Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и Сн2; Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одиночного плеча антитела, dAb-фрагмент (Ward et al. , Nature 1989, 341-544
(546)), который состоит из домена VH; и выделенный гипервариабельный участок (CDR).
Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть объединены с помощью рекомбинантных методов, посредством синтетического линкера, который позволяет им создать отдельную белковую цепь, в которой пара участков VL и VH сливаются с образованием моновалентных молекул (известных как одноцепочечные антитела Fv
(scFv); см. например, Bird et al. , Science 242, 423-426 (1988) и Huston et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также предназначены для
охватывания термином "антигенсвязывающая область" антитела. Эти фрагменты антител получаются с помощью традиционных методов известных специалистам в данной области, и фрагменты проверяются на пригодность также, как и интактные антитела.
При использовании в данном документе, термин "выделенное
антитело" относится к антителу, которое по существу свободно от
других антител, обладающих отличными антигенными
специфичностями, например, выделенное антитело, которое специфично связывается с человеческим CD4 0, по существу свободно от антител, которые специфично связываются с антигенами, отличными от CD40. Однако выделенное антитело, которое специфично связывается с CD4 0, обладает перекрестной реактивностью с другими антигенами, такими как молекулы CD4 0 из других видов. Кроме того, выделенное антитело может быть по существу свободным от другого клеточного материала и/или химических веществ.
При использовании в данном документе, термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител" относятся к препарату антительных молекул одиночной молекулярной композиции. Композиция моноклонального антитела демонстрирует уникальную специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу.
При использовании в данном документе, термин "человеческое
антитело" включает антитела, содержащие вариабельные участки, в
которых как каркасные, так и CDR-участки происходят из
последовательностей, имеющих человеческое происхождение. Кроме
того, если антитело содержит константный участок, то он также
происходит из таких человеческих последовательностей, например,
человеческих зародышевых последовательностей, или мутированных
версий человеческих зародышевых последовательностей или
антитела, содержащего консенсусные каркасные
последовательности, которые получены после анализа человеческих зародышевых последовательностей, например, как описано у Knappik, et al. (2000. J Mol Biol 296, 57-86).
Структуры и локализации иммуноглобулиновых вариабельных доменов, например, CDR, могут быть определены с использованием
хорошо известных систем нумерации, например, система нумерации по Rabat, система нумерации по Chothia, комбинация систем по Rabat и Chothia (АЬМ) , и т.д. (см, например, Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services (1991), eds. Rabat et al. ; Al Lazikani et al. (1997) J. Mol. Bio. 273:927 948). На протяжении данной спецификации гипервариабельный участок ("CDR") определяется согласно определению Rabat за исключением CDRH1, который представляет собой протяжку аминокислот, определяемых комбинацией определений по Rabat и Chothia для данного CDR.
Человеческие антитела по изобретению могут включать аминокислотные остатки, не кодируемые человеческими последовательностями (например, мутации, введенные случайным или сайт-направленным мутагенезом in vitro или с помощью соматической мутации in vivo). Однако, при использовании в настоящем документе, подразумевается, что термин "человеческое антитело" не включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из зародышевой линии других видов млекопитающих, таких как мыши, были пересажены в человеческие каркасные последовательности.
Термин "человеческое моноклональное антитело" относится к антителам, демонстрирующим уникальную специфичность связывания, которые содержат вариабельные участки, в которых и каркасные и CDR-участки выделены из человеческих последовательностей.
При использовании в данном документе, термин "рекомбинантное человеческое антитело" включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными средствами, как например, антитела, выделенные из животных (например, мышей), которые являются трансгенными или трансхромосомными по отношению к человеческим иммуноглобулиновым генам, или выделены из полученных из них гибридом, выделены из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии человеческого антитела, например, из трансфектомы, антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной библиотеки человеческих антител, и антитела, полученные, экспрессированные, созданные или
выделенные с помощью любого средства, которое включает сплайсинг всех или части последовательностей человеческого гена иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные участки, в которых каркасные и CDR-участки происходят из человеческих зародышевых последовательностей иммуноглобулинов. В некоторых воплощениях, однако, такие рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвергнуты мутагенезу, in vitro мутагенезу (или, если используются трансгенные по отношению к человеку последовательности иммуноглобулинов животных, то соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности участков VH и VL рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые хотя и происходят из и относятся к человеческим зародышевым последовательностям VH и VL, тем не менее не могут существовать в естественных условиях в зародышевом репертуаре человеческих антител in vivo.
При использовании в данном документе, термин "изотип" относится к любому классу антител (например, IgM, IgA, IgD, IgE и IgG, таким как IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4), которые обеспечиваются генами константных участков тяжелых цепей.
Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное к антигену" используются взаимозаменяемо с термином "антитело, которое связывается специфично с антигеном".
При использовании в данном документе, антитело, которое "специфично связывается с полипептидом CD4 0" или "антитело к CD4 0" относятся к антителу, которое связывается с полипептидом человеческого CD40 SEQ ID N0: 21 с KD 100 нМ или менее, 10 нМ или менее, 1 нМ или менее. Антитело, которое "перекрестно реактивно с антигеном, отличным от CD4 0", относится к антителу, которое связывается с антигеном с KD 0,5х10~8М или менее, 5х10~9М или менее или 2х10~9М или менее. Подразумевается, что антитело, которое "не перекрестно реактивно с конкретным антигеном", относится к антителу, которое связывается с таким антигеном с KD 1,5х10~8М или выше, или KD 5-10х10~8 М или 1х10~7М или выше. В
некоторых воплощениях, такие антитела, которые не перекрестно реактивны с антигеном, демонстрируют по существу недетектируемое связывание по отношению к этим белкам в стандартных анализах связывания.
В одном воплощении, высокая концентрация антитела к CD4 0 в водной фармацевтической композиции по изобретению составляет, по меньшей мере, 50 мг/мл. В одном воплощении, высокая концентрация составляет, по меньшей мере, 100 мг/мл. В одном воплощении, высокая концентрация составляет, по меньшей мере, 150 мг/мл. В одном воплощении, высокая концентрация составляет, по меньшей мере, 2 00 мг/мл. В одном воплощении, высокая концентрация составляет, по меньшей мере, 250 мг/мл. В одном воплощении, высокая концентрация составляет, по меньшей мере, 300 мг/мл.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению включает от 50 мг/мл до 300 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению включает от 75 мг/мл до 250 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению включает от 100 мг/мл до 250 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению включает от 100 мг/мл до 200 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению включает 150 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по
изобретению
включает
примерно
мг/мл,
примерно
мг/мл,
примерно
мг/мл,
примерно
мг/мл,
примерно
мг/мл,
примерно
100
мг/мл,
примерно
110
мг/мл,
примерно
120
мг/мл,
примерно
130
мг/мл,
примерно
140
мг/мл,
примерно
150
мг/мл,
примерно
160
мг/мл,
примерно
170
мг/мл,
примерно
180
мг/мл,
примерно
190
мг/мл,
примерно
200
мг/мл,
примерно
210
мг/мл,
примерно
220
мг/мл,
примерно
230
мг/мл,
примерно
240
мг/мл
примерно 250 мг/мл или примерно 300 мг/мл антитела к CD40, например, тАЫ.
Кроме того, водные фармацевтические композиции стабильны, так что даже после хранения в течение 4 недель при 2-8°С, менее чем 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,05% или 0,01% суммарного антитела к CD4 0 находится в агрегированном состоянии по измерениям с помощью SEC-HPLC.
Водные фармацевтические композиции могут включать дополнительно к антителу к CD4 0 дополнительные компоненты, такие как один или несколько из следующих: (i) стабилизатор; (ii) буферный агент; (iii) поверхностно-активное вещество; и (iv) свободная аминокислота. Включение таких дополнительных компонентов может давать на выходе композиции с низкой степенью агрегации антитела к CD4 0.
Подходящие стабилизаторы для применения по изобретению могут действовать, например, в качестве агентов, усиливающих вязкость, наполнителей, стабилизирующих агентов и/или тому подобное. Стабилизатор может быть ионным или не ионным (например, сахара). Такие сахара включают, не ограничиваясь, моносахариды, например, фруктозу, мальтозу, галактозу, глюкозу, D-маннозу, сорбозу и так далее; дисахариды, например, лактозу, сахарозу, трегалозу, целлобиозу и так далее; полисахариды, например, раффинозу, мелезитозу, мальтодекстрины, декстраны, крахмалы и так далее; и альдиты, такие как маннит, ксилит, мальтит, лактит, ксилит, сорбит (глюцит) и так далее. Например, сахаром может быть сахароза, трегалоза, раффиноза, мальтоза, сорбит или маннит. Сахаром может быть сахарный спирт или амино-сахар. Особенно применяется сахароза. В качестве ионных стабилизаторов они включают соли, такие как NaCl, или аминокислотные компоненты, такие как аргинин-НС1.
Подходящие буферные агенты для применения по изобретению включают, не ограничиваясь, соли органических кислот, такие как соли лимонной кислоты, аскорбиновой кислоты, глюконовой кислоты, карбоновой кислоты, тартаровой кислоты, янтарной кислоты, уксусной кислоты или фталевой кислоты; Tris, тометамин
гидрохлорид или фосфатный буфер. Кроме того, аминокислотные компоненты также могут использоваться в качестве буферного агента. Такие аминокислотные компоненты включают, не ограничиваясь, глицин и гистидин. Особенно применяется гистидиновый буфер.
Водные фармацевтические композиции включают буферный агент или агент, регулирующий рН, для обеспечения улучшенного контроля рН. В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция по изобретению имеет рН от 5 до 8, от 5,5 до 7,5, от 5 до 7, от б до 8, или от б до 7. В конкретном воплощении водная фармацевтическая композиция по изобретению имеет рН примерно б.
При использовании в данном документе термин "поверхностно-активное вещество"" относится к органическим веществам, имеющим амфипатические структуры; т.е., они состоят из групп с противоположными тенденциями растворимости, как правило, жирорастворимой углеводородной цепи и водорастворимой ионной группы. Поверхностно-активные вещества классифицируют в зависимости от заряда поверхностно-активного компонента, анионного, катионного и диспергирующих агентов для различных фармацевтических композиций и препаратов биологических материалов.
Подходящие поверхностно-активные вещества для применения по изобретению включают, не ограничиваясь, не ионные поверхностно-активные вещества, ионные поврехностно-активные вещества и цвиттерионные поверхностно-активные вещества. Типичные поверхностно-активные вещества для использования по изобретению, включают, не ограничиваясь, сложные эфиры сорбитана и жирных кислот (например, сорбитан монокаприлат, сорбитан монолаурат, сорбитан монопальмитат), триолеат сорбитана, сложные эфиры глицерина и жирных кислот (например, глицерин монокаприлат, глицерин мономиристат, глицерин моностеарат), полиглицериновые эфиры жирных кислот (например, моностеарат декаглицерил, дистеарат декаглицерил, монолинолеат декаглицерил), сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот (например, монолаурат полиоксиэтиленсорбитана, моноолеат
полиоксиэтиленсорбитана, моностеарат полиоксиэтиленсорбитана, полиоксиэтиленсорбитана монопальмитат, полиоксиэтиленсорбитана триолеат, полиоксиэтиленсорбитана тристеарат), сложные эфиры жирных кислот и полиоксиэтиленсорбита (например, полиоксиэтилен сорбит тетрастеарат, полиоксиэтилен сорбит тетраолеат), полиоксиэтиленовые сложные эфиры жирных кислот глицерина
(например, полиоксиэтилен моностеарат глицерина),
полиэтиленгликолевые эфиры жирных кислот (например, полиэтиленгликоль дистеарат), полиоксиэтилналкиловые эфиры
(например, лауриловый эфир полиоксиэтилена), полиоксиэтилен и
полиоксипропилен алкиловые простые эфиры (например,
полиоксиэтиленполиоксипропиленгликоль, полиоксиэтилен
полиоксипропилен пропиловый эфир, полиоксиэтилен
полиоксипропилен цетиловый эфир), полиоксиэтилен алкилфениловые
эфиры (например, полиоксиэтиленнонилфениловый эфир),
полиоксиэтилен гидрогенизированное касторовое масло (например,
касторовое масло, полиоксиэтилен, полиоксиэтилен
гидрогенизированное касторовое масло), производные
полиоксиэтилена пчелиного воска (например, амиды полиоксиэтилен сорбита пчелиного воска), полиоксиэтиленовые производные ланолина (например, полиоксиэтилен ланолин), и полиоксиэтилена и жирных кислот (например, полиоксиэтилен амид стеариновой кислоты); С10-18 алкил сульфаты (например, цетилсульфат натрия, лаурилсульфат натрия, олеилсульфат натрия), полиоксиэтиленовый эфир С10-18 алкилсульфата, с добавлением примерно 2-4 молей этиленоксидных звеньев, (например, полиоксиэтиленлаурилсульфат натрия), и сульфосукцинатные соли С1-С18 алкиловых эфиров
(например, сульфосукцинатный эфир лаурилсульфата натрия); и природные поверхностно-активные вещества, такие как лецитин, глицерофосфолипид, сфингофосфолипид (например, сфингомиелин), и сложные эфиры сахарозы и С12-18 жирных кислот. Композиция может включать одно или несколько поверхностно-активных веществ. Предпочтительные поверхностно-активные вещества представляют собой полиоксиэтиленсорбитановые эфиры жирных кислот, например, полисорбат 20, 40, 60 или 80. Особенно применяется полисорбат 8 0 (Tween 80).
Подходящие свободные аминокислоты для применения по изобретению включают, не ограничиваясь, аргинин, лизин, гистидин, метионин, орнитин, изолейцин, лейцин, аланин, глицин, глутаминовую кислоту или аспарагиновую кислоту. Включение основной аминокислоты является предпочтительным, т.е. аргинина, лизина и/или гистидина. Если композиция включает гистидин, то он может затем функционировать и как буферный агент, и как свободная аминокислота, но когда используется гистидиновый буфер, то он, как правило, включает свободную аминокислоту, отличную от гистидина, например, лизин. Аминокислота может присутствовать в D- /или L- форме, но L-форма является типичной. Аминокислота может присутствовать в виде любой подходящей соли, например, гидрохлорида, такого как аргинин-НС1.
Если они присутствуют, то компоненты (i)-(iv) будут присутствовать в концентрации, достаточной для поддержания антитела к CD40 в форме, которая активна и растворима после каждого из:
(i) лиофилизации и хранения и восстановления (для лиофилизатов), или
(ii) поддержания в дозированных единицах и хранения (для жидких составов).
Таким образом, сахар может присутствовать в водной фармацевтической композиции по изобретению, например, после восстановления лиофилизата в воде в концентрации от 3 до 400 мМ, например, 50-380 мМ, 100-350 мМ, 200-300 мМ. Для сахарозы применяется концентрация 27 0 мМ.
Буферный агент может присутствовать в водной фармацевтической композиции по изобретению, например, после восстановления лиофилизата в воде в концентрации от 1 до 60 мМ, например, 10-50 мМ, 20-40 мМ, 25-35 мМ. Для гистидина применяется концентрация 3 0 мМ.
Поверхностно-активное вещество может присутствовать в водной фармацевтической композиции по изобретению, например, после восстановления лиофилизата в воде в концентрации до 0,2% (по объему), например, 0,01-0,1%, 0,03-0,08%, 0,04-0,08%.
Применяется концентрация полисорбата 2 0 0,0 6%. В некоторых воплощениях может использоваться полисорбат 80.
Свободная аминокислота может присутствовать в водной фармацевтической композиции по изобретению, например, после восстановления лиофилизата в воде в концентрации от 2 до 100 мМ, например, 10-80 мМ, 20-70 мМ, 30-60 мМ, 40-60 мМ. Аргинин применяется в концентрации 51 мМ (например, аргинин-НС1), или метионин или глицин применяются в концентрации 60 мМ, (например, глицин-НС1).
Было продемонстрировано, что состав, содержащий гистидиновый буфер, сахарозу и полисорбат 20, подходит для лиофилизации антитела тАЫ в концентрации, по меньшей мере, 150 мг/мл после восстановления.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция состоит из 150 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы и 0,06% полисорбата 20.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция состоит из 150 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы, 0,06% полисорбата 20 и 51 мМ аргинина-НС1.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция состоит из 150 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы, 0,06% полисорбата 20 и 60 мМ глицина-НС1.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция состоит из 200 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы и 0,06% полисорбата 20.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция состоит из 200 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы, 0,06% полисорбата 20 и 51 мМ аргинина-НС1.
В одном воплощении, водная фармацевтическая композиция состоит из 75 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы и 0,06% полисорбата 20.
В одном воплощении водная фармацевтическая композиция состоит из 75 мг/мл тАЫ, 30 мМ гистидина, 270 мМ сахарозы, 0,06% полисорбата 20 и 51 мМ аргинина-НС1.
Другие предполагаемые вспомогательные вещества, которые могут применяться в водных фармацевтических композициях по
изобретению, включают, например, ароматизаторы, антимикробные агенты, подсластители, антиоксиданты, антистатики, липиды, такие как фосфолипиды жирных кислот, стероиды, такие как холестерин, белковые вспомогательные вещества, такие как сывороточный альбумин (человеческий сывороточный альбумин), рекомбинантный человеческий альбумин, желатин, казеин, солеобразующие противоионы, такие как соли натрия и тому подобное. Эти и дополнительные известные фармацевтические вспомогательные вещества и/или добавки, подходящие для применения в составах по изобретению, известны в данной области, например, перечислены в "The Handbook of Pharmaceutical Excipients", 4th edition, Rowe et al., Eds., American Pharmaceuticals Association (2003); и Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 21th edition, Gennaro, Ed., Lippincott Williams & Wilkins (2005).
Водные фармацевтические композиции по изобретению могут включать дополнительные активные ингредиенты дополнительно к антителу к CD4 0. Дополнительные фармакологические агенты могут включать, например, химиотерапевтические соединения.
Лио филиз а ты
Методы лиофилизации антител хорошо известны в данной области, см., например, John F. Carpenter and Michael J. Pikal, 1997 (Pharm. Res. 14, 969-975); Xialin (Charlie) Tang and Michael J. Pikal, 2004 (Pharm. Res. 21, 191-200) . Например, продукты в виде моноклональных антител SYNAGIS(tm), REMICADE(tm), RAPTIVA(tm), SIMULECT(tm), XOLAIR(tm) и HERCEPTIN(tm) обеспечиваются в виде лиофилизатов. Эти антитела восстанавливаются до конечных концентраций, например, SIMULECT(tm) восстанавливается до концентрации антитела 4 мг/мл, REMICADE(tm) восстанавливается до концентрации 10 мг/мл, HERCEPTIN(tm) до 21 мг/мл, SYNAGIS(tm) и
RAPTIVA(tm) до 100 мг/мл, и XOLAIR(tm) до 125 мг/мл.
Пре-лиофилизаты, лиофилизаты и водное восстановление
Перед введением пациенту лиофилизат должен быть восстановлен в водном восстановителе. Эта стадия дает возможность антителу и другим компонентам лиофилизата
растворяться с получением раствора, который подходит для инъекции пациенту.
Объем водного материала, используемого для восстановления, диктуется концентрацией антитела в конечной фармацевтической композиции. Восстановление с использованием меньшего объема восстановителя, чем объем пре-лиофилизации, дает получение композиции, которая является более концентрированной, чем перед лиофилизацией. Фактор восстановления (объем состава после лиофилизации:объем состава перед лиофиизацией) может составлять от 1:0,5 до 1:6. Используется фактор восстановления 1:3. Как упомянуто выше, лиофилизаты по изобретению могут восстанавливаться с получением водной композиции, содержащей антитело к CD40 с концентрацией, по меньшей мере, 50 мг/мл, 100 мг/мл, 150 мг/мл. 200 мг/мл, 250 мг/мл или 300 мг/мл, и объем восстановителя выбирается соответственно. Если требуется, то восстанавливаемый состав может разводиться перед введением пациенту согласно требованию доставки назначенной дозы.
Типичные восстановители для лиофилизированных антител включают стерильную воду или буфер, необязательно содержащий консервант. Если лиофилизат включает буферный агент, то восстановитель может включать дополнительный буферный агент (который может быть таким же или отличным от буферного агента лиофилизата) или, вместо этого, он может включать буферный агент (например, WFI (вода для инъекции), или физиологический солевой раствор).
Если они присутствуют, то компоненты (i)-(iv) будут присутствовать в концентрации пре-лиофилизации, достаточной для поддержания антитела к CD40 в форме, которая активна и растворима после хранения (при нормальных условиях) и восстановления. Компоненты также будут присутствовать после восстановления.
Таким образом, сахар, такой как трегалоза, может присутствовать перед лиофилизацией в концентрации от 3 до 300 мМ, например, 15-200 мМ, 30-150 мМ, 80-100 мМ. Для сахарозы применяется концентрация 90 мМ. Буферный агент, такой как гистидин, может присутствовать перед лиофилизацией в
концентрации от 1 до 60 мМ, например, 3-30 мМ, 5-20 мМ, 5-15 мМ. Для гистидина применяется концентрация 10 мМ. Поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80 или полисорбат 20, может присутствовать перед лиофилизацией в концентрации до 0,2% (по объему), например, 0,01-0,1%, 0,01-0,08%, 0,01-0,04%. Полисорбат 8 0 или полисорбат 2 0 применяется в концентрации 0,02%. Свободная аминокислота, такая как аргинин, метионин или глицин может присутствовать перед лиофилизацией в концентрации от 2 до 80 мМ, например, 3-60 мМ, 3-50 мМ, 6-30 мМ, 10-25 мМ, 15-20 мМ. Для аргинина-HCl применяется концентрация 17 мМ, для глицина-HCl 20мМ или для метионина 60 мМ. Антитело к CD40 присутствует перед лиофилизацией в концентрации от 2 0 мг/мл до 12 0 мг/мл, например, 2 0 мг/мл, 3 0 мг/мл, 4 0 мг/мл, 50 мг/мл, 60 мг/мл, 6 6,6 мг/мл, 7 0 мг/мл, 8 0 мг/мл, 90 мг/мл, 100 мг/мл, 110 мг/мл, или 12 0 мг/мл. Применяется концентрация 50 мг/мл.
Пре-лиофилизат по изобретению имеет рН от 5 до 8, от 5 до 7, от 5,5 до 6,5. В конкретных воплощениях пре-лиофиизат по изобретению имеет рН примерно 6.
В одном воплощении пре-лиофилизат по изобретению имеет молярное соотношение сахароза:антитело 90:1 и молярное соотношение гистидин:антитело 10:1.
В одном воплощении пре-лиофилизат по изобретению имеет молярное соотношение сахароза:антитело 90:1, молярное соотношение гистидин:антитело 10:1, и молярное соотношение аргинин-НС1:антитело 17:1.
В одном воплощении пре-лиофилизат по изобретению имеет молярное соотношение сахароза:антитело 90:1, молярное соотношение гистидин:антитело 10:1, и молярное соотношение глицин-HCl:антитело 60:1.
Было продемонстрировано, что состав, содержащий гистидиновый буфер, сахарозу, полисорбат 20 и, необязательно, аргинин, метионин или глицин, подходит для лиофилизации антитела тАЫ. После восстановления компоненты лиофилизата могут присутствовать в водных фармацевтических композициях в концентрациях, как описано выше.
Заболевания и расстройства направленного воздействия
Водные фармацевтические композиции по изобретению, включающие антитела к CD4 0, могут использоваться для лечения, улучшения состояния или предотвращения связанных с CD4 0 аутоиммунных расстройств, связанных с CD4 0 воспалительных расстройств и/или для предотвращения или уменьшения риска отторжения трансплантата при трансплантации. Для целей настоящего изобретения термин "воспалительные расстройства" включает "аутоиммунные расстройства".
При использовании в данном документе, понятно, что термин
"аутоиммунность" охватывает воспалительные иммуно-
опосредованные процессы, включающие "собственные" антигены. В аутоиммунных заболеваниях, собственный(е) антиген(ы) передают иммунный ответ хозяина.
Фармацевтические композиции, включающие антитела к CD4 0, конкретно используются для лечения рассеянного склероза, системной красной волчанки, синдрома Шегрена, ревматоидного артрита, отторжения трансплантата; заболевания "трансплантат против хозяина", пузырчатки обыкновенной; и В-клеточных неопластических образований, таких как острый лимфобластный лейкоз (ALL) и В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз (CLL).
Кроме того, настоящее изобретение включает лечение воспаления, ассоциированного с отторжением при тканевой трансплантации. "Отторжение трансплантата" или "отторжение графта" относится к любому исходящему от хозяина иммунному ответу против графта, включая, не ограничиваясь, HLA-антигены, антигены группы крови и тому подобные.
Изобретение также может использоваться для лечения реакции "трансплантат против хозяина", такой, которая например, ассоциирована с трансплантацией костного мозга. В такой реакции "трансплантат против хозяина" донорный костный мозг включает лимфоциты и клетки, которые созревают в лимфоциты. Донорные лимфоциты распознают антигены реципиента как чужие и запускают воспалительный иммунный ответ. Следовательно, при использовании в данном документе, заболевание "трансплантат против хозяина" или реакция "трансплантат против хозяина" относится к
опосредованному Т-клетками иммунному ответу, в котором донорные лимфоциты реагируют с антигенами хозяина.
Антагонистические антитела к CD4 0 или белки, описанные в данном документе, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ, могут быть использованы в соответствии со способами по изобретению для лечения аутоиммунных и/или воспалительных расстройств, включая, в частности, системную красную волчанку (SLE), дискоидную красную волчанку, волчаночный нефрит, саркоидоз, воспалительный артрит, включая ювенильный артрит, ревматоидный артрит, псориатический артрит, синдром Рейтера, анкилозирующий спондилит, и подагрический артрит, отторжение трансплантации органов или тканей, гипер-острое, острое или хроническое отторжение и/или реакцию трансплантат против хозяина, рассеянный склероз, синдром гипер-IgE, узелковый полиартериит, первичный билиарный цирроз печени, воспалительные заболевания кишечника, болезнь Крона, целиакию (глютен-чувствительная энтеропатия), первичный синдром Шегрена (PSS), аутоиммунный гепатит, пернициозную анемию, аутоиммунную гемолитическую анемию, псориаз, склеродермию, миастению, аутоиммунную тромбоцитопеническую пурпуру, аутоиммунный тиреоидит, болезнь Грейвса, тиреоидит Хасимото в, иммунный комплекс болезней, хроническую усталость, синдром иммунной дисфункции (CFIDS), полимиозит и дерматомиозит, криоглобулинемию, тромболизис, кардиомиопатию, пузырчатку обыкновенную, интерстициальный фиброз легких, сахарный диабет типа I и типа II, гиперчувствительность замедленного типа 1, 2, 3, 4, аллергию или аллергические расстройства, нежелательные/непреднамеренные иммунные ответы на терапевтические белки (см. например, патентную заявку США No. US 2002/0119151 и Koren, et al. (2002) Curr. Pharm. Biotechnol. 3: 349-60), астму, синдром Чарга-Стросса (аллергический гранулематоз), атопический дерматит, аллергический и раздражающий контактный дерматит, уртикарию, IgE-опосредованную аллергию, атеросклероз, ANCA-ассоциированные васкулиты, васкулит, идиопатические воспалительные миопатии, гемолитическое заболевание, болезнь Альцгеймера, хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию и тому
подобное.
Генетическое разрушение или фармакологическое
ингибирование сигнального пути CD40-CD154 демонстрировало ранее терапевтический эффект как в клинических, так и в пре-клинических моделях SLE, pSS, ITP, MS, болезни Крона, пузырчатки обыкновенной, аутоиммунного васкулита и RA (Law CL, Grewal IS. (2009). Adv. Exp. Med. Biol. 2009;647:8-36); необходимость чего с медицинской точки подробно описана ниже.
В предпочтительных воплощениях, антитела к CD4 0 или белки
по настоящему изобретению применяются при лечении: (i)
системной красной волчанки (волчаночный нефрит),
предпочтительно в обеспечении эффективной стероид-угнетающей
терапии для индукции и поддержания ремиссии, и предотвращения
терминальной стадии заболевания почек; (ii) первичного синдрома
Шегрена, предпочтительно для предотвращения разрушения слюнных
и слезных желез, и индукции и поддержания ремиссии
экстрагландулярных проявлений; (iii) аутоиммунной
тромбоцитопенической пурпуры, предпочтительно при лечении
пациентов, невосприимчивых к стандартной медицинской помощи;
(iv) ANCA-ассоциированного васкулита, предпочтительно
стимулировании и поддержании ремиссии у пациентов, невосприимчивых к кортикостероидам, и при лечении с помощью стероид-угнетающей терапии; (v) пузырчатки обыкновенной, предпочтительно в индукции и поддержании ремиссии у больных, невосприимчивых к кортикостероидам, и к стероид-угнетающей терапии; (vi) рассеянного склероза, предпочтительно в обеспечении более эффективного лечения для профилактики рецидивов и прогрессирования нетрудоспособности и достижения безрецидивного состояния; и (vii) болезни Крона, предпочтительно в обеспечении более эффективной терапии для поддержания ремиссии, и лечении пациентов, невосприимчивых к анти-TNF.
В некоторых других воплощениях, антитела к CD4 0 или белки по настоящему изобретению применяются для лечения легочного воспаления, включая, не ограничиваясь, отторжение трансплантата легких, астмы, саркоидоза, эмфиземы, муковисцидоза,
идиопатического легочного фиброза, хронического бронхита, аллергического ринита и аллергических заболеваний легких, таких как аллергический пневмонит, эозинофильная пневмония, облитерирующий бронхиолит, вызванный трансплантацией костного мозга и/или легких или другими причинами, атеросклероза трансплантата/флебофиброза трансплантата, а также фиброза легких, вызванного заболеваниями, связанными с коллагеном, сосудистой системой и аутоиммунными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит, склеродермия и системная красная волчанка.
"Лечение" определяется в данном документе как применение или введение антитела к CD4 0 или белка согласно изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела, объекту, или применение или введение фармацевтической композиции, включающей указанное антитело к CD4 0 или белок по настоящему изобретению в изолированную ткань или клеточную линию от объекта, где объект имеет аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где целью является излечение, исцеление, облегчение, уменьшение, изменение, исправление, выздоровление, улучшение или воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Под "лечением" также понимают применение или введение фармацевтической композиции, включающей антитела к CD4 0 или белки согласно изобретению, например, тАЫ, тАЬ2 или тАЬЗ антитела, объекту, или применение или введение фармацевтической композиции, включающей указанное антитело к CD4 0 или белок по настоящему изобретению в изолированную ткань или клеточную линию от объекта, где объект имеет аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, симптом, ассоциированный с аутоиммунным заболеванием и/или воспалительным заболеванием или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или
воспалительного заболевания, где целью является излечение, исцеление, облегчение, уменьшение, изменение, исправление, выздоровление, улучшение или воздействие на аутоиммунное заболевание и/или воспалительное заболевание, любые ассоциированные симптомы аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, или предрасположенность к развитию аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания.
Под "противовоспалительной активностью" понимают уменьшение или предотвращение воспаления. Терапия с использованием, по меньшей мере, одного антитела к CD40 или белка согласно изобретению вызывает физиологический ответ, который полезен по отношению к лечению аутоиммунного заболевания и/или воспалительного заболевания, где заболевание включает клетки, экспрессирующие CD40-антиген. Это означает, что способы по изобретению могут использоваться в предотвращении фенотипического изменения в клетках, такого как пролиферация, активация и тому подобное.
Введение пациенту
Фармацевтическая композиция по изобретению может вводиться пациенту. Введение, как правило, осуществляется посредством шприца. Таким образом, в изобретении предлагается средство доставки (например, шприц), включающее фармацевтическую композицию по изобретению (например, предварительно заполненный шприц). Пациенты будут получать эффективное количество антитела к CD4 0, которое является основным активным ингредиентом, т.е. количество, которого достаточно для лечения, улучшения или предотвращения рассматриваемого заболевания или расстройства. Терапевтические эффекты также могут включать уменьшение физических симптомов. Оптимальное эффективное количество и концентрация антитела для любого конкретного объекта зависит от различных факторов, включающих возраст, массу, состояние здоровья пациента и/или пол, характер и степень патологического состояния, активность конкретного антитела, скорость выведения из организма, а также от введения любого возможного терапевтического средства в комбинации с антителом. Эффективное количество, доставляемое в данном случае, может определяться
решением врача. Для целей настоящего изобретения эффективная доза может составлять примерно от 0,005 мг/кг примерно до 50 мг/кг, или примерно от 0,05 мг/кг примерно до 10 мг/кг. Известные лекарственные средства на основе антител обеспечивает руководство в данном отношении, например, HERCEPTIN(tm) вводят с исходной дозовой нагрузкой 4 мг/кг массы тела и с еженедельной поддерживающей дозой 2 мг/кг массы тела; RITUXAN(tm) вводят раз в неделю по 375 мг/м2; SYNAGIS(tm) вводят внутримышечно в количестве 15 мг/кг массы тела; и т.д.
В изобретении предлагается способ доставки моноклонального антитела млекопитающему, включающий стадию введения пациенту фармацевтической композиции по изобретению.
В изобретении также предлагается способ доставки моноклонального антитела млекопитающему, включающий стадии: (i) восстановления лиофилизата по изобретению с получением водного состава, и (ii) введения водного состава пациенту. Стадия (ii) в идеале имеет место в течение 24 часов после стадии (i) например, в течение 12 часов, в течение б часов, в течение 3 часов, в течение 1 часа.
В изобретении также предлагаются составы по изобретению для применения в качестве лекарственных средств, например, для применения в доставке антитела млекопитающему или для применения в лечении, предотвращении или улучшении одного или нескольких заболеваний и расстройств, описанных выше.
Млекопитающее предпочтительно представляет собой человека, но также может быть, например, лошадью или коровой, или собакой, или кошкой. Антитела в идеале выбраны для направленного воздействия на соответствующие виды, например, человеческое антитело для введения человеку, лошадиное антитело для лошадей, собачье антитело для собак и т.д. Если нативные антитела хозяев не доступны, то перенос антительной специфичности от одного вида к другому может быть достигнут путем переноса CDR-остатков (и, как правило, дополнительно одного или нескольких каркасных остатков) из донорного антитела в каркас реципиента от вида хозяина, например, как при
гуманизации. В данной области известны аналогичные гуманизированным антитела лошадей, коров, собак и кошек. Антитело будет связываться с CD4 0 из видов-мишеней, но также могут быть перекрестно-реактивными с CD4 0 из других видов.
Дозирование может представлять собой режим однократной дозы или режим многократных доз
Ингредиенты для образования композиций по изобретению (например, лиофилизаты и восстановители) могут поставляться в герметично закрытых контейнерах.
Антитело к CD40
Изобретение относится к составу антител к CD40 и более конкретно к антителам, обозначенным как тАЫ, тАЬ2, и тАЬЗ, особенно к тАЫ .
Одно подходящее антитело, которое может быть включено в
фармацевтические композиции по изобретению, представляет собой
человеческое рекомбинантное антитело тАЫ со структурными
характеристиками, как описано ниже. Аминокислотная
последовательность VH такого выделенного антитела к CD4 0 представлена в SEQ ID N0: 1. Аминокислотная последовательность VL такого выделенного антитела к CD4 0 представлена в SEQ ID N0: 2. Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой цепи такого выделенного антитела к CD4 0 представлена в SEQ ID N0: 9. Полноразмерная аминокислотная последовательность легкой цепи такого выделенного антитела к CD4 0 представлена в SEQ ID N0: 10. Другой пример аминокислотных последовательностей тяжелой и легкой цепей таких выделенных антител к CD4 0 представляет собой последовательности, кодируемые нуклеотидные последовательностями SEQ ID N0: 11 и SEQ ID N0: 12, соответственно.
Другие антитела к CD4 0, которые могут использоваться для получения фармацевтических композиций по изобретению, включают антитела к CD4 0 с аминокислотами, которые были мутированы с помощью аминокислотной делеции, вставки или замены, имея не более чем 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных делеций, вставок или замен или в участках тяжелой, или легкой цепи, как описано выше. В конкретном воплощении, такие аминокислотные замены
появляются только в каркасном и/или в константном участке, и CDR-участки на 100% идентичны участкам CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи SEQ ID N0: 3, 4 и 5, и участкам CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи SEQ ID N0: б, 7, и 8, соответственно. В более конкретном воплощении, замены, которые были сделаны, представляют собой только замены на консервативные аминокислоты вне границ участков CDR.
Консервативные аминокислотные замены представляют собой такие, в которых аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, имеющий сходную боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, известны с данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями
(например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями
(например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями
(например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или несколько аминокислотных остатков вне границ участков CDR антитела к CD4 0 могут быть заменены другими аминокислотными остатками из одного семейства боковых цепей, и измененное антитело может быть протестировано на предмет сохранения функции, конкретно, свойств связывания с CD40.
Антитела, как правило, могут быть гликозилированными. N-связанные гликаны, присоединенные к Сн2-домену тяжелой цепи, например, могут влиять на связывание Clq и FcR, и не гликозилированные антитела (например, включающие мутацию N2 97A) могут иметь более низкую или отличную аффинность к данным рецепторам. Структура гликана также может воздействовать на активность, например, различия в комплемент-опосредованной клеточной смерти в зависимости от количества галактозных Сахаров (0, 1 или 2) на конце биантенарной гликановой цепи. Антительные гликаны предпочтительно не приводят к иммуногенному
ответу у человека после введения.
Другая модификация антител к CD4 0 в данном документе, которая предполагается изобретением, представляет собой пэгилирование. Антитело может быть пэгилированным, например, для повышения биологического (например, сывороточного) периода полужизни антитела. Для пэгилирования антитела, антитело или его фрагмент как правило, может реагировать с полиэтиленгликолем (PEG), таким как реакционноспособный эфир или альдегидное производное PEG, при условиях, в которых одна или несколько групп PEG становятся присоединенными к антителу или антительному фрагменту. Пэгилирование может проводиться с помощью реакции ацилирования или алкилирования с реакционноспособной молекулой PEG (или с аналогичным реакционноспособным водорастворимым полимером).
При использовании в данном документе подразумевается, что
термин "полиэтиленгликоль" охватывает любые формы PEG, которые
использовались для модификации других белков, такие как моно
(С1-С10) алкокси- или арилокси-полиэтиленгликоль или
полиэтиленгликоль-малеимид. В некоторых воплощениях,
пэгилируемое антитело представляет собой не гликозилированное антитело. Методы пэгилирования белков известны в данной области и могут применяться к антителам по изобретению. См., например, ЕР 0154316 от Nishimura et al. и ЕР 0401384 от Ishikawa et al.
Любая другая естественная или синтетическая посттрансляционная модификация антител к CD4 0 (например, тАЫ) дополнительно рассматривается в конкретных воплощениях антител к CD4 0, которые могут быть использованы для получения фармацевтических композиций по изобретению.
Антитела могут быть получены в форме, свободной от продуктов, с которыми они ассоциированы в естественной среде. Загрязняющие компоненты естественной среды антител включают материалы, такие как ферменты, гормоны, или другие белки клетки-хозяина.
Различные признаки и воплощения настоящего изобретения, упомянутые в отдельных разделах и воплощениях выше, применимы, в случае необходимости, к другим разделам и воплощениям, с
соответствующими изменениями. Следовательно, признаки, определенные в одном разделе или в воплощении, могут быть при необходимости объединены с признаками, определенными в других разделах или воплощениях. ПРИМЕРЫ
Получение антител к CD40
CHIR-12.12, и тАЫ (N297A CHIR-12.12), тАЬ2 (D265A CHIR-12.12), и тАЬЗ (CHIR-12.12 LALA) связываются специфически с CD4 0. Таблицы 1 и 2 ниже суммируют характеристики последовательностей этих антител. Эти антитела могут продуцироваться в клетках-хозяевах млекопитающих, таких как клеточная линия СНО, трансфецированной экспрессирующими векторами, несущими последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи, под подходящими экспрессирующими промоторами.
Аминокислотая последовательность LCDR3 из CHIR-12.12, тАЫ, тАЬ2 и тАЬЗ
Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЫ
Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЫ
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь тАЫ (SEQ ID N0:9)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЫ (SEQ ID N0:10)
Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЬ2
Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЬ2
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь тАЬ2 (SEQ ID N0: 13)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЬ2 (SEQ ID N0: 14)
Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи тАЬЗ
Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи тАЬЗ
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную тяжелую цепь тАЬЗ (SEQ ID N0:17)
Нуклеотидная последовательность, кодирующая полноразмерную легкую цепь тАЬЗ (SEQ ID N0:18)
Аминокислотная последовательность человеческого CD40
Таблица 2
Перечень последовательностей
SEQ ID NO:
Аминокислотная или нуклеотидная последовательность
QVQLVE S GGGWQPGRS LRLSCAAS G FT FS S YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS Y EESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPG PDYWGQGTLVTVSS
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPG TKVDIR
SYGMH
VISYEESNRYHADSVKG
DGGIAAPGPDY
RSSQSLLYSNGYNYLD
LGSNRAS
MQARQTPFT
QVQLVE S GGGWQPGRS LRLS CAAS GFT FS S YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS Y
EESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPG
PDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRWSVLT
VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPVLDSDGSFFLY
SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPG TKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGGTCCCT
GAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACT
GGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCTAC
GAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTC
CCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCG
AGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGA
CCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAA
GGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCA
CCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTG
TCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCT
GCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCT
CTCTGGGCACC СAGAC CTACATCTG СAAC G T GAAC СACAAG С С С T С СAACAC С
AAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCC
CCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCC
CAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG
GTGGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGA
С G G С G T G GAAG T G СACAAC G С СAAGAC СAAG С С СAGAGAG GAACAG TAC G С С T
CCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGA
AAAGAC СAT С T С СAAG G С СAAG GGCCAGCCCCGC GAG CCACAGGTGTACACAC
TGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTG
GTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACA
GCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAAC
GTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAA
GTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGCGAGCC TGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACA ACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATC TCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGGTTCTCCGGCTCTGG CTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGC ACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCC CCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGA ACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG СAGAG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С СAC С TACAG CCT GAG СAG СAC С С T GAC С С T GAG СAAG G С С GAC TAC GAGAAG СATA AGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG AGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
QVQLVE S GGGWQPGRS LRLS CAAS GFT FS S YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS Y EESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPG PDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV WAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPG TKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGGTCCCT
GAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACT
GGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCTAC
GAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTC
CCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCG
AGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGA
CCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAA
GGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTCCAGCAAGTCCACCTCTGGCGGCA
CCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAAGACTACTTCCCCGAGCCCGTGACCGTG
TCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCT
GCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCTAGCT
CTCTGGGCACC СAGAC CTACATCTG СAAC G T GAAC СACAAG С С С T С СAACAC С
AAGGTGGACAAGCGGGTGGAACCCAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCC
CCCCTGCCCTGCCCCTGAACTGCTGGGCGGACCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCC
CAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGTG
GTGGTGGCCGTGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGA
С G G С G T G GAAG T G СACAAC G С СAAGAC СAAG С С СAGAGAG GAACAG TACAAC T
CCACCTACCGGGTGGTGTCTGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCCATCGA
AAAGAC СAT С T С СAAG G С СAAG GGCCAGCCCCGC GAG CCACAGGTGTACACAC
TGCCCCCCAGCCGGGAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTG
GTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGACA
GCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCAT
TCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAAC
GTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAA
GTCCCTGTCCCTGAGCCCCGGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGCGAGCC TGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACA ACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATC TCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGGTTCTCCGGCTCTGG CTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGC ACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCC CCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGA ACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG СAGAG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С СAC С TACAG CCT GAG СAG СAC С С T GAC С С T GAG СAAG G С С GAC TAC GAGAAG СATA AGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG AGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
QVQLVE S GGGWQPGRS LRLS CAAS GFT FS S YGMHWVRQAPGKGLEWVAVIS Y
EESNRYHADSVKGRFTISRDNSKITLYLQMNSLRTEDTAVYYCARDGGIAAPG
PDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTV
SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNT
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV
WDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLN
GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKL
TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
DIVMTQSPLSLTVTPGEPASISCRSSQSLLYSNGYNYLDWYLQKPGQSPQVLI SLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQARQTPFTFGPG TKVDIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTK SFNRGEC
CAGGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGAGTGGTGCAGCCTGGCCGGTCCCT
GAGACTGTCTTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCAGCTACGGCATGCACT
GGGTGCGACAGGCCCCTGGCAAGGGACTGGAATGGGTGGCCGTGATCTCCTAC
GAGGAATCCAACAGATACCACGCTGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACAATCTC
CCGGGACAACTCCAAGATCACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGACCG
AGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCAGGGACGGAGGAATCGCCGCTCCTGGA
CCTGATTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCCGCTAGCACCAA
GGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTCCAGCAAGTCTACCTCCGGCGGCA
CAGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTG
TCCTGGAACTCTGGCGCCCTGACCTCTGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCT
GCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTCACAGTGCCTTCAAGCA
GCCTGGGCACCCAGACCTATATCTGCAACGTGAACCACAAGCCTTCCAACACC
AAGGTGGACAAGCGGGTGGAGCCTAAGTCCTGCGACAAGACCCACACCTGTCC
TCCCTGCCCTGCTCCTGAAGCTGCTGGCGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTC
CAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAAGTGACCTGCGTG
GTGGTGGACGTGTCCCACGAGGATCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGA
С G G С G T G GAG G T G СACAAC G С СAAGAC СAAG С С T С G G GAG GAACAG TACAAC T
CCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAAC
GGCAAAGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCCTATCGA
AAAGACAATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAACCCCAGGTGTACACCC
TGCCACCCAGCCGGGAGGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTG
GTCAAGGGCTTCTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCTAACGGCCA
GCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT
TCTTCCTGTACTCCAAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAAC
GTGTTCTCCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAA
GTCCCTGTCCCTGTCTCCCGGCAAG
GACATCGTGATGACCCAGTCCCCCCTGTCCCTGACCGTGACACCTGGCGAGCC TGCCTCTATCTCCTGCAGATCCTCCCAGTCCCTGCTGTACTCCAACGGCTACA ACTACCTGGACTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAGTCCCCACAGGTGCTGATC TCCCTGGGCTCCAACAGAGCCTCTGGCGTGCCCGACCGGTTCTCCGGCTCTGG CTCTGGCACCGACTTCACACTGAAGATCTCACGGGTGGAAGCCGAGGACGTGG GCGTGTACTACTGCATGCAGGCCCGGCAGACCCCCTTCACCTTCGGCCCTGGC ACCAAGGTGGACATCCGGCGTACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCC CCCCAGCGACGAGCAGCTGAAGAGCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGCCTGCTGA ACAACTTCTACCCCCGGGAGGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAACGCCCTG СAGAG С G G СAACAG С СAG GAGAG С G T СAC С GAG СAG GACAG СAAG GAC T С СAC С TACAG CCT GAG СAG СAC С С T GAC С С T GAG СAAG G С С GAC TAC GAGAAG СATA AGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGTCCAGCCCCGTGACCAAG AGCTTCAACAGGGGCGAGTGC
MVRLPLQCVLWGCLLTAVHPEPPTACREKQYLINSQCCSLCQPGQKLVSDCTE FTETECLPCGESEFLDTWNRETHCHQHKYCDPNLGLRVQQKGTSETDTICTCE EGWHCTSEACESCVLHRSCSPGFGVKQIATGVSDTICEPCPVGFFSNVSSAFE KCHPWTSCETKDLWQQAGTNKTDWCGPQDRLRALWIPIIFGILFAILLVL VFIKKVAKKPTNKAPHPKQEPQEINFPDDLPGSNTAAPVQETLHGCQPVTQED GKESRISVQERQ
Примеры составов
Целевой является высокая концентрация лиофилизированного
или жидкого состава тАЫ, поэтому были проведены исследования
состава. Лиофилизированный состав, содержащий сахар, буферный
агент и поверхностно-активное вещество, был стабилен и мог
поддерживать высокие концентрации антитела после
восстановления.
Пять составов (Fl, F2, F3, F4 и F5) тАЫ оценивали на предмет стабильности. F1 был жидким составом с 50 мг/мл тАЫ при рН 6,0. Составы F2, F3, F4 и F5 имели перед лиофилизацией концентрацию 50 мг/мл тАЫ. Составы F2, F3, F4 и F5 имели перед лиофилизацией концентрацию 50 мг/мл тАЫ при рН 6,0. Составы F2, F3, F4 и F5 имели номинальный объем 3,6 мл. Пять составов включающих буфер, сахар, поверхностно-активное вещество и свободную аминокислоту перечислены в Таблице 3:
Примеры составов
тАЫ
ГИСТИДИНОВЫЙ буфер
Стабилизатор
Поверхностно-активное вещество
Аминокислота
50 мг/мл
10 мМ
190 мМ трегалоза
0,02% полисорбат 20
4 0 мМ аргинин-НС1
50 мг/мл
10 мМ
90 мМ трегалоза
0, 02% полисорбат 20
17 мМ аргинин-НС1
50 мг/мл
10 мМ
90 мМ сахароза
0, 02% полисорбат 20
17 мМ аргинин-НС1
50 мг/мл
10 мМ
90 мМ трегалоза
0, 02% полисорбат 20
50 мг/мл
10 мМ
90 мМ сахароза
0, 02% полисорбат 20
Примеры составов
Использованный цикл лиофилизации представлен в таблице 5.
Лиофилизаты F2, F3, F4 и F5 восстанавливали с помощью WFI (1,0 мл) с получением восстановленного объема 1,2 мл (1/3 исходного водного объема). Восстановленные композиции были перечислены в таблице 4:
отфильтрованного азота. Давление определяли инструментами на
основе измерений емкости.
Пять составов тестировали на стабильность в различные временные точки после составления/восстановления, как перечислено ниже.
Жидкостную хроматографию высокого давления с гель-фильтрацией (SEC-HPLC) использовали для оценки количества тАЫ в каждом составе в момент приготовления состава (ТО), через 4 недели ( (25°С) , 4 недели (40°С), б месяцев (2-8°С) , б месяцев (2 5°С) и б месяцев (4 0°С) . Количество антитела выражено в виде процента от начального количества, как перечислено в таблице б. Состав F1 остается близким к 50 мг/мл ± 5 мг/мл (100% ± 10%), составы F2, F3, F4 и F5 остаются близкими к 150 мг/мл ± 15 мг/мл (100% ± 10%).
Эффективность антитела, измеренная с помощью тИФА
Эффективность mAbl-антитела в каждом составе измеряли с помощью анализа тИФА при ТО, 4 недели (25°С) , 4 недели (40°С), б месяцев (2-8°С) , б месяцев (25°С) и б месяцев (40°С) . Результаты, выраженные как процент начальной эффективности (100%) перечислены в таблице 7. Эффективность состава F1 снижается с течением времени и увеличивается с температурой; через б м при 4 0°С было обнаружено, что эффективность составляет 7 9%. Наиболее низкое измеренное значение составило 8 5% для F4 (б м при 25°С) и 8 6% для F3 (б м при 4 0°С)
Стабильность составов оценивали по % примесей, измеренному с помощью жидкостной хроматографии высокого давления с гель-фильтрацией (SEC-HPLC) и динамического рассеяния света (DLS). Результаты показаны в таблицах 8 и 9.
Состав F1 продемонстрировал увеличение продуктов агрегации с увеличением температуры и времени. Для составов F2-F5 добавление аргинина (F2 и F3) незначительно снизило уровень агрегации; и сахароза (F3 и F5) была лучше чем трегалоза.
Продукты агрегации также оценивали измерением мутности. Состав F1 демонстрирует увеличение мутности при росте температуры и с течением времени. Составы F2-F5 демонстрировали незначительно повышенные значения мутности для составов, содержащих аргинин (F2 и F3).
Стабильность составов оценивали по % продуктов деградации, измеренному SEC-HPLC. При добавлении аргинина к составам F2-F5 незначительно понизило деградацию. Результаты представлены в таблице 11.
Таблица 11
Результаты продуктов деградации, полученные с помощью SEC-
Четыре лиофилизированных состава F2, F3, F4 и F5 оценивали на предмет визуальной прозрачности после восстановления.
Результаты представлены в таблице 12.
Визуальная прозрачность
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
прозрачный без частиц
Оценивали физико-химические свойства составов; результаты
представлены в таблице 13. Значения вязкости являются
значениями составов, в которых было 50 мг/мл антитела до
лиофилизации. Значения осмоляльности соответствуют
восстановленным композициям, содержащим 150 мг/мл антитела.
Физико-химические свойства
Выводы
В целом, протестированные составы показали хорошие результаты. Биоанализы (SEC и тИФА) показали, что составы сравнимы. Растворимые агрегаты незначительно снизились в присутствии аргинина и были незначительно ниже для сахароза-содержащих составов по сравнению с трегалоза-содержащими составами. Мутность незначительно повысилась в присутствии аргинина; не было отличий между трегалоза- или сахароза-содержащими составами. Деградация снизилась в присутствии аргинина. Что касается физико-химических свойств, то рН, вязкость, остаточная влажность, и визуальные аспекты были сравнимы для всех составов. Осмоляльность составляла > 300 мОсм/кг для всех составов, и была даже выше в присутствии аргинина-HCl (F2 и F3). Желательно иметь состав, который является изотоническим к плазме (2 90 мОсм/кг), или настолько
близким к этому значению, насколько это возможно. Составы, имеющие сахарозу (F3 и F5) считались предпочтительней тех, что содержат трегалозу. Хотя определенное благоприятное воздействие на деградацию наблюдалось с аргинином (F3), более низкая осмоляльность состава F5 рассматривалась как более важный фактор. Состав F5 сочли наиболее оптимальным составом.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Лиофилизированный состав, полученный с помощью
лиофилизации водного состава, имеющего рН 5,0-7,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) стабилизатор,
(iii) буферный агент,
(iv) поверхностно-активное вещество и необязательно
(v) аминокислоту.
2. Лиофилизированный состав по п.1, где указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 5,0-7,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) гистидин в качестве буферного агента,
(iv) полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) аминокислоту, выбранную из аргинина, метионина и глицина.
3. Лиофилизированный состав по п.1 или по п.2, где указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 5,07,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 2 0-
150 мг/мл, и где указанное антитело к CD40 включает CDR1, CDR2
и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и
CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 3-300 мМ сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) 1-60 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) до 0,2% полисорбата 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) 2-80 мМ аргинин, метионин или глицин.
4. Лиофилизированный состав по любому из предыдущих пунктов, где указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 6,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 90 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 10 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,02% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества
5. Лиофилизированный состав по любому из предыдущих пунктов, где указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 6,0 и включающего
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 90 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 10 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,02% полисорбата 20 в качестве поверхностно-активного вещества и
(v) 17 мМ аргинин.
6. Лиофилизированный состав по любому из предыдущих пунктов, где указанный состав получают из водного состава, имеющего рН 6,0 и включающего
(i) антитело к CD40, где антитело имеет концентрацию 150 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента, и
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
7. Водная фармацевтическая композиция, получаемая путем восстановления лиофилизированного состава по любому из
7.
предыдущих пунктов, где фактор восстановления находится в интервале от 1:0,5 до 1:6.
8. Водная фармацевтическая композиция по п. 8, где фактор восстановления составляет 1:3.
9. Водная фармацевтическая композиция, имеющая рН 5,0-7,0, включающая
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) стабилизатор,
(iii) буферный агент,
(iv) поверхностно-активное вещество и необязательно
(v) аминокислоту.
10. Водная фармацевтическая композиция по п.9, включающая
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) сахарозу или трегалозу в качестве стабилизатора,
(iii) гистидин в качестве буферного агента,
(iv) полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) аминокислоту, выбранную из аргинина, метионина или
глицина.
11. Водная фармацевтическая композиция по п. 9 или 10, включающая
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 200-300 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 25-35 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) до 0,2% полисорбата 20 в качестве поверхностно-активного вещества и необязательно
(v) 10-8 0 мМ аргинин, метионин или глицин.
12. Водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.9-11, где композиция имеет рН б,0 и включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: 6, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента, и
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества.
13. Водная фармацевтическая композиция по любому из пп.9-11, где композиция имеет рН б,0 и включает
(i) антитело к CD4 0, где антитело имеет концентрацию 50 мг/мл, и где указанное антитело к CD4 0 включает CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи из SEQ ID NO: 3, 4 и 5, соответственно, и CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи из SEQ ID N0: б, 7 и 8,
(ii) 270 мМ сахарозу в качестве стабилизатора,
(iii) 30 мМ гистидин в качестве буферного агента,
(iv) 0,06% полисорбат 20 в качестве поверхностно-активного вещества и
(v) 51 мМ аргинин.
14. Водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.9-13, где антитело к CD40 имеет концентрацию 150 мг/мл.
15. Лиофилизированный состав по любому из п.п.1-6 или водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.7-14, где антитело к CD4 0 включает Ун-ДОмен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и Уь-домен, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
16. Лиофилизированный состав по любому из п.п.1-6 или водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.7-14, где антитело к CD4 0 включает участок тяжелой цепи SEQ ID N0: 9 и участок легкой цепи SEQ ID NO: 10.
17. Лиофилизированный состав по любому из п.п.1-6 или водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.7-14, где антитело к CD40 включает участок тяжелой цепи SEQ ID NO: 13 и участок легкой цепи SEQ ID NO: 14.
14.
18. Лиофилизированный состав по любому из пп.1-6 или водная фармацевтическая композиция по любому из пп.7-14, где антитело к CD40 включает участок тяжелой цепи SEQ ID N0: 17 и участок легкой цепи SEQ ID N0: 18.
19. Средство доставки, включающее водную фармацевтическую композицию по любому из пп.7-18.
20. Предварительно заполненный шприц, включающий водную фармацевтическую композицию по любому из п.п.7-18.
21. Способ доставки антитела к CD4 0 млекопитающему,
включающий стадию введения млекопитающему водной
фармацевтической композиции по любому из пп.7-18.
22. Лиофилизированный состав по любому из п.п.1-6 или водная фармацевтическая композиция по любому из п.п.7-14 для применения в лечении заболевания или расстройства, которое опосредовано с помощью CD4 0.
23. Лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по п.22 для применения в лечении аутоиммунных заболеваний.
24. Лиофилизированный состав или водная фармацевтическая композиция по п.2 3 для применения в лечении ревматоидного артрита, системной красной волчанки или пузырчатки обыкновенной.
По доверенности
Таблица 3
Таблица 3
Таблица 5
Таблица 5
Таблица б
Таблица б
Таблица 8
Таблица 8
Таблица 10
Таблица 10