[RU]

Предусмотрен способ получения вирусоподобных частиц (VLP) в растении. Способ предусматривает введение первой нуклеиновой кислоты в растение или часть растения. Первая нуклеиновая кислота, содержащая первую регуляторную область, активную в растении, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP2. Нуклеотидная последовательность может дополнительно содержать один или более чем один элемент амплификации и/или нацелено воздействующую на компартмент последовательность. Вторая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP6. Необязательно, третья нуклеиновая кислота и/или четвертая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Третья нуклеиновая кислота содержит третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP4. Четвертая нуклеиновая кислота содержит четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP7. Растение или часть растения инкубируют в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновых кислот, таким образом получая VLP.

(57) Реферат / Формула:

Предусмотрен способ получения вирусоподобных частиц (VLP) в растении. Способ предусматривает введение первой нуклеиновой кислоты в растение или часть растения. Первая нуклеиновая кислота, содержащая первую регуляторную область, активную в растении, функционально связана с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP2. Нуклеотидная последовательность может дополнительно содержать один или более чем один элемент амплификации и/или нацелено воздействующую на компартмент последовательность. Вторая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP6. Необязательно, третья нуклеиновая кислота и/или четвертая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения. Третья нуклеиновая кислота содержит третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP4. Четвертая нуклеиновая кислота содержит четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, ротавирусный белок VP7. Растение или часть растения инкубируют в условиях, которые позволяют экспрессию нуклеиновых кислот, таким образом получая VLP.

---

ПОЛУЧЕНИЕ РОТАВИРУС-ПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ В РАСТЕНИЯХ
Область техники, к которой относится настоящее изобретение
Настоящее изобретение относится к производству ротавирусных структурных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих ротавирусный структурный белок в растениях.
Предшествующий уровень техники настоящего изобретения
Ротавирусная инфекция представляет собой глобальную проблему, главным образом, влияющую на детей в возрасте до пяти лет. Это приводит к тяжелому гастроэнтериту и, в худшем случае, к смерти.
Ротавирусы представляют собой представителей семейства Reoviridae вирусов (род Rotavirus), которые влияют на желудочно-кишечный тракт и дыхательную систему. Название происходит от подобного колесу внешнего вида вирионов при просмотре с помощью отрицательной контрастной электронной микроскопии (фиг. 1А; предшествующий уровень техники). Ротавирус обычно шаровидной формы и назван в честь внешних и внутренних слоев или двухслойной структуры капсида. Наружный капсид составляет около 70 нм, а внутренний капсид составляет около 55 нм в диаметре, соответственно. Двухслойный капсид ротавируса окружает сердцевину, включающую в себя внутренний белковый слой и геном. Геном ротавируса состоит из двухцепочечных сегментов РНК, кодирующих по меньшей мере 11 ротавирусных белков.
дцРНК кодирует шесть структурных белков (VP) и шесть неструктурных белков (NSP) (фиг. 1с; предшествующий уровень техники). Структурные белки содержат VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 и VP7 (фиг. lb; предшествующий уровень техники). Три концентрических слоя образуются путем сборки VP2, VP6 и VP7, соответственно, с VP4, образующим "шипы" на поверхности вирусной структуры. NSP синтезируются в инфицированных клетках и функционируют в различных частях цикла репликации или взаимодействуют с некоторыми из хозяйских белков для влияния на патогенез или иммунный ответ на инфекцию (Greenberg and Estes, 2009).
VP2 представляет собой белок размером 102 к Да, и это наиболее распространенный белок вирусной сердцевины. Он образует внутренний - наиболее
структурированный слой белка и обеспечивает остов для правильной сборки компонентов и ферментов транскрипции вирусной сердцевины (Lawton, 2000). VP1, самый большой вирусный белок размером 125 кДа, действует как РНК-зависимая полимераза для ротавируса, создавая промежуточный продукт репликации сердцевины, и ассоциирует с VP2 на своих икосаэдрических вершинах (Varani and Allain, 2002; Vende et al, 2002). VP3, белок размером 98кДа, также непосредственно связан с вирусным геномом, действуя как кэппирующий мРНК фермент, который добавляет структуру 5' кэпа к вирусным мРНК. VP1 и VP3 вместе образуют комплекс, который крепится к наружным 5-кратным вершинам капсидного слоя VP2 (Angel, 2007). VP6 представляет собой белок размером 42 кДа, который образует среднюю оболочку вирусной сердцевины, представляет собой основной белок капсида и составляет более 50% от общей массы белков вириона (Gonzalez et al, 2004; Estes, 1996). Он необходим для транскрипции генов и может играть определенную роль в инкапсуляции ротавирусной РНК путем заякоривания VP1 к VP2 в сердцевине, как видно у вируса катаральной лихорадки овец, другого представителя семейства Reoviridae. Он также определяет классификацию ротавирусов на пять групп (А-Е) с группой А, наиболее часто воздействующей на людей (Palombo, 1999). VP6 в группе А ротавирусов содержит по меньшей мере четыре подгруппы (SG), которые зависят от наличия или отсутствия специфических эпитопов SG: SG I, SG II, SG (I + II) и SG не-(I+II). Группы В и С не содержат антиген общей группы А, но, как известно, заражают людей, в то время как группа D оказывает влияние только на животных, например, кур и коров (Thongprachum, 2010).
Два белка внешнего капсида VP7, гликопротеин (G) размером 37 кДа и чувствительный к протеазе VP4 (Р) размером 87 кДа, определяют серотипы вирусов. Эти два белка индуцируют нейтрализующие антитела реакции и, таким образом, используются для классификации серотипов ротавирусов в двойной номенклатурной системе в зависимости от комбинации антигенов G-P (например, G1 Р[8] или G2 Р[4]) (Sanchez-Padilla et al, 2009). Белок VP4 димеризуется для образования 60 шипов на внешней оболочке вируса, которые непосредственно участвуют в начальных стадиях проникновения в клетки-хозяева. Белок шипов содержит сайт расщепления в аминокислотном (АА) положении 248. При заражении он расщепляется протеазой трипсином и производит VP5 (529 аа, 60 кДа) и VP8 (246 аа, 28 кДа) (Denisova et al, 1999). Этот процесс усиливает инфекционность вируса (прикрепление к клеткам и вторжение в клетку-хозяина) и стабилизирует структуру шипов (Glass, 2006).
Гликопротеин VP7 образует третий или наружный слой вируса. В настоящее время известны генотипы 27 G и 35 Р (Greenberg and Estes, 2009). VP4 и VP7 представляют собой основные антигены, участвующие в нейтрализации вируса и представляют собой важные мишени для разработки вакцин (Dennehy, 2007).
В инфицированных клетках млекопитающих ротавирусы подвергаются уникальному виду морфогенеза для образования полных трехслойных вирусных частиц VP2/6/4/7 (Lopez et al, 2005). Трехслойный капсид представляет собой очень стабильный комплекс, который позволяет фекально-оральную передачу и доставку вируса в тонкий кишечник, где он инфицирует неделящиеся дифференцированные энтероциты возле кончиков ворсинок (Greenberg and Estes, 2009). Сначала интактный вирус прикрепляется к независимым от сиаловой кислоты рецепторам через 60 димерных шипов VP4 на поверхности вируса (Lundgren and Svensson, 2001). 60 димерных шипов VP4 на поверхности вируса позволяют вирусу прикрепиться к этим клеточным рецепторам. VP4 восприимчив к протеолитическому расщеплению трипсином, что приводит к конформационному изменению, которое предоставляет дополнительные сайты крепления на поверхности гликопротеина для взаимодействия с серией корецепторов.
Многостадийное прикрепление и процесс вхождения, однако, не совсем понятны, но вирус доставляется через плазматическую мембрану хозяина. Внешняя капсидная оболочка VP7, которая также участвует в процессе входа, удаляется в процессе, и двухслойные частицы (DLP) доставляются в цитоплазму клеток в везикулах (фиг. 2; предшествующий уровень техники). DLP выходит из везикулы и переходит в немембраносвязанные цитоплазматические включения. Ранняя транскрипция генома с помощью VP1 начинается в частицах, так что дцРНК никогда не экспонируется в цитоплазму. Репликация РНК и образование сердцевины происходит в этих не связанных с мембраной цитоплазматических включениях. Возникающие (+)РНК затем транспортируются в цитоплазму и служат матрицами для синтеза вирусных белков. VP4 производится в цитозоле и транспортируется к шероховатому эндоплазматическому ретикулуму (RER), и VP7 секретируется в RER. VP2 и VP6 производятся и собираются в цитозоле в виросомах и впоследствии почкуются в компартментах RER, получая временную мембранную оболочку в процессе (Lopez et al, 2005; Tian et al, 1996). В RER временные оболочки вирусных частиц удаляются и заменяются белковыми мономерами VP4 и VP7 с критическим участием ротавирусного гликопротеина NSP4 (Tian et al, 1996; Lopez et al, 2005;
Gonzalez et al., 2000). NSP4 функционирует как внутриклеточный рецептор в мембране ER и связывается с вновь произведенными субвирусными частицами и, возможно, также с белком шипов VP4 (Tian et al., 1996). NSP4 также токсичен для людей и представляет собой возбудителя диареи. Полные, зрелые частицы затем передаются от RER через аппарат Гольджи к плазматической мембране для секреции (Lopez et al., 2005).
Было предпринято множество различных подходов для создания ротавирусной вакцины, подходящий для защиты человеческих популяций от различных серотипов ротавируса. Эти подходы включают в себя различные подходы по Дженнеру, использование живых ослабленных вирусов, использование вирусоподобных частиц, вакцин на основе нуклеиновых кислот и вирусных субъединиц в качестве иммуногенов. В настоящее время существует две пероральные вакцины, доступные на рынке, однако, они характеризуются низкой эффективностью в некоторых развивающихся странах из-за изменчивости штаммов и наличия других патогенов.
В каждом из патентов США № 4624850, 4636385, 4704275, 4751080, 4927628, 5474773 и 5695767 описаны разнообразные ротавирусные вакцины и/или способы их получения. Общность, разделенная представителями этой группы, представляет собой то, что каждая из этих вакцин основывается на использовании целых вирусных частиц для создания окончательной вакцины ротавируса. Учитывая давнюю потребность в эффективной, поливалентной вакцине, ясно, что этот объем работы был лишь частично успешным в решении необходимости такой вакцины.
Исходя из традиционных методов создания вакцин, достижения в области молекулярной биологии дали возможность экспрессии отдельных ротавирусных белков. Crawford et al. (J Virol. 1994 September; 68(9): 5945-5952) клонировали VP2, VP4, VP6 и VP7, кодирующие основной капсидный белок, в системе экспрессии бакуловируса, и экспрессировали каждый белок в клетках насекомых. Коэкспрессия различных комбинаций основных структурных белков ротавируса приводила к образованию устойчивых вирусоподобных частиц (VLP). Коэкспрессия VP2 и одного VP6 или с VP4 приводила к получению VP2/6 или VP2/4/6 VLP, которые были похожи на двухслойные частицы ротавируса. Коэкспрессия VP2, VP6 и VP7 с или без VP4, приводила к образованию трехслойных VP2/6/7 или VP2/4/6/7 VLP, которые были похожи на нативные инфекционные частицы ротавируса. VLP поддерживали структурные и функциональные характеристики нативных частиц, что определено с помощью электронной микроскопии частиц, присутствие не-нейтрализующих и
нейтрализующих эпитопов на VP4 и VP7 и активность гемагглютинации VP2/4/6/7 VLP.
Кандидатные вакцины, полученные от вирусоподобных частиц различных белковых композиций, показали потенциал в качестве субъединичных вакцин. O'Neal et al. ("Rotavirus Virus-like Particles Administered Mucosally Induce Protective Immunity," J. Virology, 71(11):8707-8717 (1997)) показал, что VLP, содержащие VP2 и 6 или VP2, 6 и 7 при введении мышам с и без добавления холерного токсина индуцировали защитный иммунитет у иммунизированных мышей, хотя защита была более эффективной, когда VLP вводили с токсином холеры (СТ).
Сердцевиноподобные частицы (CLP) и VLP также были использованы для иммунизации коров. Fernandez, et al, ("Passive Immunity to Bovine Rotavirus in Newborn Calves Fed Colostrum Supplements From Cows Immunized with Recombinant SA11 rotavirus core-like particle (CLP) or virus-like particle (VLP) vaccines," Vaccine, 16(5):507-516 (1998)). В данном исследовании изучалась способность CLP и VLP создавать пассивный иммунитет. Это группа пришла к выводу, что VLP были более эффективными, чем CLP в индуцировании пассивного иммунитета.
Растения все чаще используются для крупномасштабного производства рекомбинантных белков. Например, в патенте США 2003/0175303 раскрыта экспрессия рекомбинантного ротавирусного структурного белка VP6, VP2, VP4 или VP7 в стабильных трансформированных растениях томата.
Saldana et al. экспрессировали VP2 и VP6 в цитоплазме растений томата с использованием промотора 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и рекомбинантного A. tumefaciens (Saldana et al, 2006). Электронно-микроскопические исследования показали, что небольшая доля частиц собиралась в 2/6 VLP. У мышей был обнаружен защитный иммунный ответ, и это могло до некоторой степени вносить вклад в несобранные VP. Как было показано, отдельные белки вызывают иммунный ответ у мышей, как и в случае с VP8 и VP6 (Zhou et al, 2010).
Matsumura et al. (2002) были первыми, кто сообщил об экспрессии VP6 и сборке бычьего ротавируса А в трансгенных растениях картофеля. В их исследовании они использовали трансгенные растения картофеля, регулируемые промотором 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV) и рекомбинантным Agrobacterium tumefaciens, несущим ген VP6. Белок экспрессировали, очищали и выполняли иммуногенные исследования. Иммунный ответ у взрослых мышей показал наличие антител VP6 в сыворотке. Тем не менее, они не показали доказательства собранных белков VP6.
Возможно, это были простые мономеры или тримеры, которые могли вызывать иммунный ответ у мышей. Работа другой группы показала сборку VP6 в Nicotiana benthamiana с использованием вектора вируса X картофеля (PVX) (O'Brien et al., 20000). Когда экспрессировали белок VP6 в растениях, было обнаружено, что он собирается только, когда слит с белковыми стержнями PVX. После того, как произошло расщепление, VP6 собираются в икосаэдрические VLP, как показано в аналогичном исследовании HIV-PVX Marusic et al, (2001). Этот результат, вероятно, предполагает, что белки ротавируса могут требовать дополнительный фактор или активацию для образования VLP.
Производство VLP представляет собой сложную задачу, так как требуются и синтез, и сборка одного или нескольких рекомбинантных белков. Это представляет собой случай VLP ротавируса, который представляет собой РНК-содержащий вирус с капсидом, образованным 1860 мономерами четырех различных белков. Для производства VLP необходима одновременная экспрессия и сборка от 2 до 3 рекомбинантных белков. Они включают 120 молекул VP2 (внутренний слой), 780 молекул VP6 (средний слой) и 780 молекулы гликопротеина VP7 (наружный слой), в конечном счете, образуя двухслойную или трехслойную частицу. Кроме того, производство большинства VLP требует одновременной экспрессии и сборки нескольких рекомбинантных белков, которые - в случае подобных ротавирусу частиц (RLP)- должны происходить в одной клетке-хозяине.
Более позднее исследование показало успешную экспрессию кодон-оптимизированного VP6 ротавируса человека в Chenopodium amaranticolor с использованием опосредованной вирусом черного ожога свеклы (BBSV) системы экспрессии. Белок был разработан в качестве замены белка оболочки открытой рамки считывания BBSV. Пероральная иммунизация самок мышей BALB/c основанным на растениях белком VP6 индуцировала высокие титры слизистых IgA и сывороточных IgG к VP6 (Zhou et al, 2010). Группа, однако, не упоминала, собирались ли белки VP6 VLP или частицы.
VP7 ротавируса также успешно экспрессировался в растениях табака, и было показано, что он сохраняет свой нейтрализующий иммунный ответ у мышей (Yu and Langridge, 2001). Другое исследование с использованием трансгенных растений картофеля для экспрессии VP7 показало, что ген VP7 был стабильным в течение 50 поколений в трансформированных растениях. Белок VP7 из 50-го поколения
индуцировал как защитные, так и нейтрализующие антитела у взрослых мышей (Li et al, 2006).
Yang с соавт. (Yang Y M, Li X, Yang H, et al. 2011) коэкспрессировали три ротавирусных белка капсида VP2, VP6 и VP7 группы A RV (P[8]G1) в растениях табака и изучали уровни экспрессии этих белков, а также образование ротавирус-подобных частиц и иммуногенность. VLP очищали от трансгенных растений табака и анализировали с помощью электронной микроскопии и Вестерн-блоттинга. Результаты Yang с соавт. показывают, что полученный из растений белок VP2, VP6 и VP7 самособирается в ротавирус-подобную частицу 2/6 или 2/6/7 с диаметром 60-80 нм.
Краткое раскрытие настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к области получения ротавирусных структурных белков в растениях. Более конкретно, настоящее изобретение также относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих ротавирусный структурный белок в растениях.
В соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ (А) получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, предусматривающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того четвертая нуклеиновая кислота, содержащая четвертую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, может быть введена в растение, часть растения или клетку
растения на стадии а), и экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
В описаном выше способе (А) первый ротавирусный структурный белок может представлять собой VP2, второй ротавирусный структурный белок может представлять собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок может представлять собой VP4 или VP7. Кроме того, четвертый ротавирусный структурный белок может представлять собой VP7 или VP4. VP4 может процессировать или расщепляться для получения VP5 и VP8. Расщепление VP4 может быть выполнено с использованием протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы или субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ (В) получения ротавирус-подобной частицы (RLP), предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Описанный выше способ (В) может дополнительно предусматривать введение (на стадии а) второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, и экспрессирующей вторую нуклеиновую кислоту при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
Описанный выше способ (В) может дополнительно предусматривать введение (на стадии а) третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область активную в растении и функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, инкубированной в растении, части растения или клетке растения на стадии а), и экспрессирующей третью нуклеиновую кислоту при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
Кроме того, в способе (А) или (В) дополнительная нуклеиновая кислота может быть экспрессирована в растении, части растения или клетке растения, и причем дополнительная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей супрессор сайленсинга.
Использование кодонов в нуклеотидной последовательности может быть приведено к предпочтительному использованию кодонов человека, повышенному содержанию GC или их комбинации.
Ротавирусный структурный белок может содержать усеченный, нативный или ненативный сигнальный пептид. Ненативный сигнальный пептид может представлять собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (PDI).
Первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их сочетание могут быть функционально связаны с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
Описанный выше способ (А) или (В) может дополнительно предусматривать стадии:
c) сбора растения, части растения или клетки растения и
d) очистки RLP из растения, части растения или клетки растения.
На стадии сбора или очистки в способе (А) или (В) VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 с использованием трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
RLP может находиться в диапазоне размеров от 70-100 нм и может быть очищен в присутствии кальция.
В настоящем изобретении предусмотрен RLP, полученный описанными выше способами (А) или (В). Произведенная RLP может содержать по меньшей мере ротавирусный структурный белок VP4. VP4 может расщепляться на VP5 и VP8 с использованием протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении или добавлена во время сбора, очистки или того и другого. Кроме того RLP, полученная способом (А) или (В), может представлять собой двухслойную RLP и/или трехслойную RLP.
Кроме того, предусмотрены нуклеотидные последовательности. Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, может характеризоваться от 80% до 100%
идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45. Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность VP6, может характеризоваться от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46. Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность VP7, может характеризоваться от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57. И нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, может характеризоваться от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51. Кроме того, VP2 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 25. VP6 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 31. VP7 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 4, 39, 43 или 59. VP4 может кодироваться аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной с помощью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 36. 33. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут представлять собой VP2, VP4, VP6 и/или VP7. VP4 может быть процессирован до VP5 и VP8. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть выбраны из ротавирусного штамма G9 Р[6], штамм WA ротавируса А, штамма CinA/Rotarix-A41CB052A/1988/GlPlA[8] вакцины ротавируса А и штамма SA11 ротавируса.
В описанном выше способе (А) первая, вторая или третья последовательности нуклеиновой кислоты или их сочетание может содержать регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем одним энхансером вируса мозаики, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структурный белок ротавируса, и
причем четвертая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, может быть введена в растение, часть растения или клетку растения.
В описанном выше способе (В) первая, вторая, третья или четвертая последовательность нуклеиновой кислоты или их сочетание может содержать регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем одним энхансером вируса мозаики, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей структурный белок ротавируса, и причем пятая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, может быть введена в растение, часть растения или клетку растения.
Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением предусмотрен способ (С) производства ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того, вторая нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения, вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регулирующую область, которая активна в растении и функционально связана со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, и причем вторая нуклеиновая кислота экспрессируется при инкубировании растения или части растения на стадии Ь).
Кроме того, третья нуклеиновая кислота может быть введена в растение или часть растения, третья нуклеиновая кислота содержит третью регулирующую область, которая активна в растении и функционально связана с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, и причем третья нуклеиновая кислота экспрессируется при инкубировании растения или части растения на стадии Ь).
Описанный выше способ (С) может дополнительно предусматривать стадию сбора растения и экстрагирования RLP.
Один или несколько ротавирусных структурных белков способа (С) могут представлять собой ротавирусный белок VP2, VP4 или VP6. Один или несколько
ротавирусных структурных белков, кодируемых первой или второй нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP2 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых третьей нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP4. VP4 может расщепляться для получения VP5 и VP8.
Первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность может дополнительно кодировать, содержать или кодировать и содержать одну или более чем одну нацеливающую последовательность и/или элемент амплификации компартмента. Одна или несколько нацеливающих последовательностей и/или элементов амплификации компартмента направляет один или несколько ротавирусных структурных белков в эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт, пластиду или апопласт растительной клетки.
Настоящее изобретение также предусматривает способ (D) получения ротавирус-подобной частицы (RLP), предусматривающий:
a) обеспечение растения или части растения, содержащего нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков;
b) инкубирование растения, части растений или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
Кроме того, растение или часть растения в способе (D) может дополнительно содержать;
i) вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков или,
й) вторую и третью нуклеиновую кислоту, причем вторая нуклеиновая кислота содержит вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, и третья нуклеиновая кислота содержит третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков,
причем вторая или вторая и третья нуклеиновые кислоты экспрессируются при инкубации растения или части растения на стадии Ь).
Один или несколько структурных белков в способе (D) могут представлять собой ротавирусный белок VP2, VP4 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых первой или второй нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP2 или VP6. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых третьей нуклеотидной последовательностью, могут представлять собой VP4. VP4 может расщепляться для получения VP5 и VP8 с использованием трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Протеаза может быть коэкспрессирована в растении или добавлена во время сбора, очистки или того и другого.
Настоящее изобретение предусматривает RLP, полученную способами (А), способом (В), способом (С), способом (D) или их комбинацией, как описано выше. RLP может содержать один или несколько ротавирусных структурных белков, которые могут содержать специфические для растения N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
Настоящее изобретение включает в себя композицию, содержащую эффективную дозу RLP, произведенную способом (А), способом (В), способом (С), способом (D) или их комбинацией, как описано выше, для индуцирования иммунного ответа, и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение также включает в себя способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение описанного выше RLP субъекту. RLP может быть введена субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Настоящее изобретение также предусматривает растительное вещество, содержащее RLP, полученную способом (А), способом (В), способом (С), способом (D) или их комбинацией, как описано выше. Растительное вещество может быть использовано для индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта. Растительный материал также может быть подмешан в качестве пищевой добавки.
В описанных выше способах (способы А, В, С или D) растение или часть растения могут дополнительно вводиться с или могут дополнительно содержать
другую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую супрессор сайленсинга.
Кроме того, настоящее изобретение также предусматривает способ (Е) производства ротавирусного структурного белка в растении, предусматривающий
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область,
активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной
последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных
белков, в растение или часть растения;
b) инкубирование растения или части растения в условиях, которые позволяют
временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом один или
несколько ротавирусных структурных белков.
Это краткое раскрытие настоящего изобретения не обязательно описывает все особенности настоящего изобретения.
Краткое описание графических материалов
Эти и другие особенности настоящего изобретения станут более очевидными из следующего описания, в котором сделана ссылка на прилагаемые графические материалы, на которых:
На фиг. 1 показана структура ротавируса и распределение генов-белков. (А) Трансмиссионная электронная микроскопия ротавирусной частиц (черта представляет собой 100 нм). (В) Организация вирусных белков капсида, содержащих внутренние, средние и внешние. (С) Сегменты ротавирусной дцРНК, расположенные в соответствии с размером и функцией. ДцРНК могут быть разделены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (D). Белки в (С) обозначены сегментами дцРНК в (D). Изображения предоставлены Crawford et al.,1997 (A), Swiss Institute of Bioinformatics, 2008 (B) and Greenberg and Estes, 2009 (D).
На фиг. 2 показан вход ротавируса в клетку и репликация. Когда ротавирус входит в клетку, VP4 и VP7 теряются, образуя двухслойную частицу (DLP). Начинается транскрипция дцРНК, приводя к трансляции VP2, VP4, VP6 и VP7. Результирующие серцевины с репликазной активностьью производятся на вирусных фабриках (также называемых вироплазмы). Поздняя транскрипция происходит в этих результирующих серцевинах. На периферии вирусных фабрик эти сердцевины покрываются VP6, образуя незрелые DLP, которые почкуются через мембрану эндоплазматического ретикулума, приобретая переходную липидную мембрану,
которая модифицируется с постоянными вирусными гликопротеинами NSP4 и VP7 ER; эти окутанные частицы также содержат VP4. По мере того как частицы движутся по направлению к внутренней части цистерн ER, переходная липидная мембрана и неструктурный белок NSP4 теряются, в то время как вирусные поверхностные белки VP4 и VP7 переставляются для образования самого внешнего вирусного белкового слоя, что дает зрелые инфекционные трехслойные частицы (смотрите Swiss Institute of Bioinformatics (ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html).
На фиг. 3 показаны векторы pTRAc, pTRAkc-rbcsl-cTP и pTRAkc-ERH Agrobacterium. P35SS, промотор 35S CaMV с дублированным энхансером транскрипции; CHS, 5'-нетранслируемая область халконсинтазы; pA35S, CaMV 35S сигнал полиаденилирования; SAR, каркас области прикрепления гена RB7 табака; LB и RB, левые и правые границы для интеграции Т-ДНК; ColElori, начало репликации для Е. coli; RK2ori, начало репликации для Agrobacterium; Ыа, ген Ыа устойчивости к ампициллину/карбенициллину; LPH, последовательность сигнального пептида из мышиной тяжелой цепи шАЬ24; his6, 6 х последовательность тегов His; SEKDEL, сигнальная последовательность ER-удерживания; rbcsl-cTP, хлоропласт-транзитная пептидная последовательность из гена малой субъединицы Rubisco (rbcSl) из Solanum tuberosum; npt II, устойчивость к канамицину гена npt II; Pnos и pAnos, промотор и сигнал полиаденилирования гена нопалинсинтазы (Maclean et al., 2007).
На фиг. 4 показан обзор процедуры ротавирусного клонирования и инфильтрации.
На фиг. 5 показана процедура экстракции белков апопласта. (А) Иллюстрация растительной клетки и расположения апопласта. VP белки экспрессируются в цитозоле и направляются к апопласту (красная стрелка). (В) - После времени испытания лист растения пропитывают под вакуумом с PBS (1) и помещают в перфорированную спиновую колонку (2), затем центрифугируют в 2 мл пробирке Эппендорфа, чтобы собрать сок (3).
На фиг. 6 показан вестерн-блот экспрессии ротавирусного белка VP6 в компартментах клеток листьев растения в течение 7 дней. Мышиное антитело VP6 к ротавирусу (1:5000) использовали для исследования мембран. (+) и (-) обозначает экспрессию с или без супрессора сайленсинга, соответственно. Красные линии обозначают положение VP6 белков в различных проанализированных образцах (~ 40 кДа). Экспрессия и эффективность экстракции VP6 была лучшей в цитоплазме.
На фиг. 7 показан вестерн-блот, показывающий индивидуальную экспрессию меченых his ротавирусных белков в день 3 в цитоплазме листьев растения N. benthamiana. +ve - бактериально экспрессированный ротавирусный VP2; М - маркер молекулярного веса; VP - ротавирусный белок капсида. Инфильтрация VP7 приводила к пожелтению листьев (Ь).
На фиг. 8 показана экспрессия ротавирусных VP2 (а) и VP4 (Ь), нацелено воздействующих на различные компартменты клеток листьев растения N. benthamiana в день 3. Соответствующую сыворотку цыпленка к ротавирусу (1: 2000) для VP2 и VP4 использовали для зондирования белков. сТр - хлоропласты; ER - эндоплазматический ретикулум; pTRAc - цитоплазма; А - апопласт; отрицательный контроль (-ve) -растения, инфильтрованные только с супрессором сайленсинга; положительный контроль (+ve) в (а) - бактериальные экспрессированные VP2, (Ь) - бактериальные экспрессированные VP4; (- и +) с или без супрессора сайленсинга; М - маркер молекулярного веса. Стрелки указывают положение рассматриваемых белковых полос.
На фиг. 9 показан анализ вестерн-блоттинг 3-го дня экстрактов, коэкспрессированных VP2/6/4 в цитоплазме листьев N. benthamiana. Белки исследовали со смесью сыворотки цыпленка к ротавирусу (к VP2 (1/5000) и к VP4 (1/5000)) и мышиного антитела к VP6 (1: 5000). Инфильтрацию рекомбинантного Agrobacterium проводили с супрессором сайленсинга. Отрицательный контроль (-ve) -целые растения, инфильтрованные только с супрессором сайленсинга; М - маркер молекулярного веса.
На фиг. 10 показаны электронные микрофотографии на 3-й день экстрагированных из цитоплазмы ротавирусных белков, окрашенных уранилацетатом. (а) Отрицательный экстракт образца белка с супрессором сайленсинга; (Ь) экстракт белка VP6; (с) экстракт белка VP2/6 и (d) экстракт белка VP2/6/4. Полосы = 200 нм. Все обнаруженные RLP составляли от 70 до 100 нм в диаметре. Стрелка в (Ь) указывает на оболочку/переплетение VP6. Стрелка в (с) показывает пример aRLP. Все белки экспрессировали в присутствии супрессора сайленсинга. Все захватывали с мышиным антителом к VP6 (1: 2000).
На фиг. 11 показана очистка градиентом сахарозы коэкспрессированных VP2/6 и VP2/6/4 (а). Дот-блоты очищенных с помощью градиента сахарозы VP2/6 (Ь) и VP2/6/4 (с). Белковые экстракты загружали на градиент сахарозы (10 - 60%) и ультрацентрифугировали. Фракции анализировали путем зондирования с (Ь) мышиным антителом к VP6 (1: 5000) и (с) сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 (1: 5000).
На фиг. 12 показан анализ вестерн-блоттинг фракций VP2/6 (а), фотография окрашенного кумасси ДСН-ПААГ геля фракций VP2/6 фракций 16 и 17 (Ь), и анализ вестерн-блоттинг фракций 16 и 17 (с). Мышиную сыворотку к VP6 (1: 5000) и сыворотку цыпленка к VP2 (1: 5000) использовали в вестерн-блоттинге (а), и только мышиную к VP6 (1: 5000) в (с). Отрицательный контроль (-ve) в (а) и (с) -бактериальный экспрессированный VP4, и в (Ь) - растения, инфильтрованные с супрессором сайленсинга и очищенные в градиенте сахарозы; сырой - неочищенный экстракт VP2/6; положительный контроль (+ve) в (а) - бактериальный экспрессированный VP2, (Ь) и (с) - экспрессированный в растении VP6; VP6-SF9 -белок VP6 с известной концентрацией, экспрессированный в клетках насекомых SF9. Стрелки указывают на представляющие интерес белковые полосы.
На фиг. 13 показан анализ общего растворимого белка на фракциях градиента плотности сахарозы очищенных VP2/6. (а) - стандартная кривая IgG, (b) - показания оптической плотности фракций, снятых при 750 нм. Представляющие интерес точки: фракции от 16 до 19.
На фиг. 14 показан анализ в градиенте плотности сахарозы коэкспрессированных в цитоплазме фракций VP2/6/4. Сырые показания оптической плотности при 750 нм брали для проверки белковых пиков, ранее обнаруженных на дот-блоттинге ВБ2/6/4.
На фиг. 15 показаны трансмиссионные электронные микрофотографии очищенных в градиенте плотности сахарозы частиц VP2/6. Как (а), так и (Ь) показывают две различные секции, просмотренные на медной сетке. Все обнаруженные RLP были от 70 до 100 нм в диаметре. Образцы захватывали с мышиным антителом к VP6 (1: 2000). Полосы представляют собой 200 нм.
На фиг. 16а показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 1) и нуклеотидные последовательности VP2 ротавируса (SEQ ID NO: 13 и 14). На фиг. 16Ь показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 2) и нуклеотидные последовательности VP4 ротавируса (SEQ ID NO: 15 и 16). На фиг. 16с показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 3) и нуклеотидные последовательности VP6 ротавируса (SEQ ID NO: 17 и 18). На фиг. 16d показана аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 4) и нуклеотидные последовательности VP7 ротавируса (SEQ ID NO: 19 и 20).
На фиг. 17а показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP2(opt).sl+3c (SEQ ID NO: 21). На фиг. 17b показана нуклеотидная
последовательность праймера IF-WA_VP2(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 22). На фиг. 17c показано схематическое представление конструкта 1191. Сайты рестрикционных эндонуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении.
На фиг. 18 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 23) конструкта 1191 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин.
На фиг. 19 показана нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 45).
На фиг. 20 показана аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 25).
На фиг. 21 показано схематическое представление конструкта номер 1710.
На фиг. 22А показано схематическое представление конструкта 193. Сайты рестрикционных эндонуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении. На фиг. 22В показана нуклеотидная последовательность конструкта 193 (SEQ ID NO: 26). Конструкт 193 показан от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) + репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р 19-пластоцианин.
На фиг. 23 показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты 1710 (SEQ ID NO: 27). Экспрессионная кассета номер 1710 показана от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
На фиг. 24 показано схематическое представление конструкта номер 1711.
На фиг. 25А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP6(opt).sl+3c (SEQ ID NO: 28). На фиг. 25В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-WA_VP6(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 29). На фиг. 25с показана экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S до терминатора NOS (SEQ ID NO: 30). VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут. На фиг. 25d показана нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 46).
На фиг. 26 показана аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 31).
На фиг. 27 показано схематическое представление конструкта номер 1713.
На фиг. 28 показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 32). VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
На фиг. 29 показано схематическое представление конструкта номер 1714.
На фиг. ЗОА показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c (SEQ ID NO: 33). На фиг. ЗОВ показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 34).
На фиг. 31А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 35). VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут. На фиг. 31В показана оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 47). На фиг. 31С показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1730 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 44). VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
На фиг. 32 показана аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавируса A (SEQ ID NO: 36).
На фиг. ЗЗА показано схематическое представление конструкта номер 1730. На фиг. 33В показано схематическое представление конструкта номер 1731.
На фиг. 34А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c (SEQ ID NO: 37). На фиг. 34В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_ VP7(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 38). На фиг. 34C показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут (SEQ ID NO: 24). На фиг. 34D показана нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 48). На фиг. 34Е показана оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO 54).
На фиг. 35 показана аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 39). На фиг. 36 показано схематическое представление конструкта номер 1733.
На фиг. 37 показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).s2+4C (SEQ ID NO: 40).
На фиг. 38 показано схематическое представление конструкта 1192. Сайты рестрикционных эндонуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении.
На фиг. 39 показана нуклеотидная последовательность конструкта 1192 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут) (SEQ ID NO: 41). Показаны 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пл астоцианин-Р 19-пл астоцианин.
На фиг. 40А показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1735 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO: 42). PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут. На фиг. 40В показана нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 49).
На фиг. 41 показана аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 43).
На фиг. 42 показано схематическое представление конструкта номер 1735.
На фиг. 43А показана кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 50). На фиг. 43В показана оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 51). На фиг. 43С показана кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 52). На фиг. 43D показана оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 53).
На фиг. 44А показана нуклеотидная последовательность праймера IF-TRSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c (SEQ ID НП: 55). На фиг. 44В показана нуклеотидная последовательность праймера IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (SEQ ID NO: 56). На фиг. 44С показана нуклеотидная последовательность оптимизированной кодирующей последовательности VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 57). На фиг. 44D показана нуклеотидная последовательность экспрессионной кассеты номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS (SEQ ID NO 58). VP 7 из штамма USA/Rotarix-
A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут. На фиг. 44Е показана аминокислотная последовательность TrSp-VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 59). На фиг. 44F показано схематическое представление конструкта номер 1734.
На фиг. 45 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6, с помощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 45А показан анализ окрашенной кумасси ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1-10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 45В показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 45С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP2.
На фиг. 46 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP6 и VP7 с помощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 46А показан анализ окрашенной кумасси ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1 - 10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 46В показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 46С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP7.
На фиг. 47 показана очистка ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7 с помощью центрифугирования в градиенте плотности иодиксанола. На фиг. 47А показан анализ окрашенной кумасси ДСН-ПААГ загрузки перед центрифугированием и фракций 1 - 10 (фракция 1 находится в нижней части пробирки). Положения ротавирусных антигенов показаны стрелками. На фиг. 47В показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к ротавирусу. На фиг. 47С показан анализ Вестерн-блоттинг тех же фракций, что и в (А) с использованием кроличьего поликлонального антитела к VP7.
На фиг. 48 показана оценка содержания VP4 в очищенных ротавирус-подобных частицах, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7, с помощью специфического анализа ELISA к VP4.
На фиг. 49 показано изображение крио-электронной микроскопии очищенных ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6 (левая панель) и VP2, VP4, VP6 и VP7 (правая панель).
Подробное описание настоящего изобретения
Нижеследующее описание представляет собой предпочтительный вариант осуществления.
Настоящее изобретение относится к вирусоподобным частицам (VLP), содержащим один или несколько ротавирусных структурных белков (т.е. ротавирус-подобная частица, ротавирусная VLP или RLP), и способам получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растениях. Ротавирус-подобная частица (RLP) может, соответственно, содержать один или несколько ротавирусных структурных белков. RLP могут быть двухслойными или трехслойными.
В настоящем изобретении частично предусмотрен способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении. Способ может предусматривать введение одной или нескольких нуклеиновых кислот, содержащих регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков в растении или части растения. После чего следует инкубирование растения или части растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновых кислот, таким образом, создавая RLP.
Кроме того, в настоящем изобретении частично предусмотрен способ получения кандидатной вакцины ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении. Способ может предусматривать введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растение, часть растения или клетку растения. После чего следует инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй или третьей
нуклеиновой кислоты, таким образом, создавая RLP. RLP могут быть одно-, двух- или трехслойными.
"Ротавирусный структурный белок" может относиться ко всей или части последовательности ротавирусного структурного белка, выделенного из ротавируса, присутствующего в любом встречающемся в природе или вариантном ротавирусном штамме или изоляте. Таким образом, термин ротавирусный структурный белок и подобные включает в себя природные варианты последовательностей ротавирусных структурных белков, полученных путем мутации в течение жизненного цикла вируса или произведенных в ответ на селективное давление (например, терапию лекарственными средствами, расширение тропизма или инфекционности клетки-хозяина и т.д.). Как очевидно специалисту в настоящей области техники, такие последовательности ротавирусных структурных белков и их варианты могут быть также получены с использованием рекомбинантных техник.
Кроме того, структурные белки могут включать в себя такие белки капсида, как, например, VP2 и VP6, и/или такие поверхностные белки, как, например, VP4. Структурный белок может дополнительно включать в себя, например, VP7.
Не ограничивающие примеры ротавирусного структурного белка представляют собой ротавирусный белок VP2, VP4, VP6 и VP7, и фрагмент VP2, VP4, VP6 и VP7. Не ограничивающие примеры VP2, VP4, VP6 и VP7 или фрагментов VP2, VP4, VP6 и VP7 белка, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают в себя VP2 VP4 VP6 и VP7 белок из штамма G9 Р[6] ротавируса, штамма WA ротавируса А, штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А и штамма SAl 1 ротавируса.
Пример структурного белка VP2, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 25. Кроме того, структурный белок VP2 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP2 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 13, 14, 25 или 45, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих
пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP4, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 36. Кроме того, структурный белок VP4 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 36, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP4 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP6, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 31. Кроме того, структурный белок VP6 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 31, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP6 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 17, 18 или 46, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Пример структурного белка VP7, который не следует рассматривать как ограничивающий, представлен в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 47. Кроме того, структурный белок VP7 может содержать последовательность, представленную в SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 43, или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере приблизительно 90-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым
процентом сходства в этих пределах, например, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним. Кроме того, структурный белок VP7 может кодироваться нуклеотидной последовательностью, как представлено в SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53 или 54, или последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80-100% сходством последовательности с ним, в том числе любым процентом сходства в этих пределах, например, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% сходства последовательности с ним.
Сходство или идентичность аминокислотной последовательности может быть вычислено с использованием программ BLASTP и TBLASTN, которые используют алгоритм 2.0 BLAST (основной инструмент поиска локального выравнивания). Техники для вычислений сходства или идентичности аминокислотных последовательностей хорошо известны специалистам в настоящей области техники, а также использование алгоритма BLAST описано в ALTSCHUL et al. (1990, J Mol. Biol. 215: 403- 410) and ALTSCHUL et al. (1997, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402).
Термин "вирусоподобная частица" (VLP) или "вирусоподобные частицы" или "VLP" относится к структурам, которые самособираются и содержат один или несколько структурных белков, таких как, например, ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, структурный белок VP2 VP4, VP6 и/или VP7. VLP, содержащие ротавирусный структурный белок, могут также называться "ротавирусный VLP", "ротавирус-подобная частица (RVLP)", "ротавирус-подобная частица (RLP)", "ротавирус-подобная частица", "RVLP" или "RLP". VLP или RLP, как правило, морфологически и антигенно похожи на вирионов, полученных при инфекции, но не содержат достаточную генетическую информацию для репликации и таким образом представляют собой неинфекционные. VLP могут быть получены в подходящих клетках-хозяевах, включающих в себя клетки растения-хозяина. После экстракции из клетки-хозяина и при выделении и дальнейшей очистке в подходящих условиях, VLP могут быть очищены как интактные структуры. RLP может быть одно-, двух- или трехслойным RLP. Однослойные RLP могут быть получены путем экспрессии одного ротавирусного структурного белка, такого как VP2 или VP6. Двухслойные RLP могут быть получены путем экспрессии двух ротавирусных структурных белков, таких как например, коэкспрессия VP2 и VP6 с или без VP4. Трехслойные RLP могут быть получены путем одновременной экспрессии по меньшей мере трех ротавирусных структурных белков, например, коэкспрессии VP2, VP6 и VP7 с или без VP4. Коэкспрессия VP4 приводит к частице с шипами, которая напоминает
нативный ротавирус. VP4 могут быть процессированы или расщеплены для производства VP5 и VP8. Этот процессинг может проходить в пределах хозяина с использованием эндогенных протеаз или путем коэкспрессии подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина. Альтернативно, VP4 могут быть процессированы для получения VP5 и VP 8 путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина на протяжении любой стадии процедуры экстракции RLP или после очистки RLP.
Каждый из ротавирусных структурных белков содержит различные характеристики и размер и требуется в различных количествах для сборки в RLP. Термин "ротавирусная VLP", "ротавирусная вирусоподобная частица (RVLP)", "ротавирусная вирусоподобная частица (RLP)", "ротавирусная вирусоподобная частица", "RVLP" или "RLP" относится к вирусоподобной частице (VLP), содержащей один или несколько ротавирусных структурных белков. Пример ротавирусных структурных белков может включать в себя без ограничения структурный белок VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6 и VP7.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения RLP в растении, причем первая нуклеиновая кислота (первая нуклеиновая кислота), кодирующая первый ротавирусный структурный белок, например белок VP2 или VP6, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, например, белок VP6 или VP2. Кроме того, третья нуклеиновая кислота, кодирующая третий ротавирусный структурный белок, например VP4 или VP7, может быть коэкспрессирована с первой и второй нуклеиновой кислотой, так, чтобы первая, вторая и третья нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. Первая нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной и той же стадии или могут быть введены в растения последовательно. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в хозяине путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы,
например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Кроме того, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий ротавирусный структурный белок, может быть дополнительно трансформировано с четвертой нуклеиновой кислотой, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, например, белок VP7 или VP4, так что первая, вторая нуклеиновые кислоты, третья и четвертая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в хозяине путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Кроме того, первое растение, экспрессирующее первую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, белок VP2 или VP6, может быть скрещено со вторым растением, экспрессирующим вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, белок VP6 или VP2, чтобы произвести потомственное растение (третье растение), которое коэкспрессирует первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2 и VP6 или VP6 и VP2, соответственно. Кроме того, третье растение, экспрессирующее первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2 и VP6 или VP6 и VP2, соответственно, может быть скрещено с четвертым растений, экспрессирующим третью нуклеиновую кислоту, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, VP4 или VP7, чтобы произвести дальнейшие потомство растения (пятое растение), которое коэкспрессирует первую, вторую и третью нуклеиновые кислоты, кодирующие VP2, VP6 и VP4 или VP7, соответственно. VP4 может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 в растении с использованием протеазы хозяина или путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую
протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
Как описано более подробно ниже, RLP могут быть получены в растении путем экспрессии нуклеиновой кислоты (первой нуклеиновой кислоты), кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, например, без ограничения VP2, VP6 или VP7. Вторая нуклеиновая кислота, кодирующая второй ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 VP6 или VP2, может быть коэкспрессирована в растении. Кроме того, третья нуклеиновая кислота, кодирующая третий ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP6, VP7 или VP2, может быть коэкспрессирована в растении. Нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение на одной и той же стадии, или они могут быть введены в растение последовательно. Нуклеиновая кислота, вторая нуклеиновая кислота и третья нуклеиновая кислота могут быть введены в растение временным образом или на постоянной основе.
Кроме того, растение, которое экспрессирует первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый ротавирусный структурный белок, например, белок VP2, может быть трансформировано со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP6 или VP7 таким образом, что как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. Растение может быть дополнительно трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 или VP6.
Альтернативно, растение, которое экспрессирует белок VP6 или VP7 (вторая нуклеиновая кислота), могут быть трансформированы с первой нуклеиновой кислотой, кодирующей белок VP2, так что как первая, так и вторая нуклеиновые кислоты коэкспрессируют в растении. Растение может быть дополнительно трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, но без ограничения, VP7 или VP6.
Кроме того, растение, экспрессирующее первую и вторую нуклеиновые кислоты, кодирующие первый и второй ротавирусный структурный белок, например, белок VP2 и VP6, может быть трансформировано с третьей нуклеиновой кислотой, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, например, VP4 или VP7. VP4
может быть процессирован или расщеплен для получения VP5 и VP8 путем коэкспрессии нуклеиновой кислоты, кодирующей подходящую протеазу, например, трипсин, трипсин-подобную протеазу, сериновую протеазу, химотрипсин-подобную протеазу, субтилизин. Альтернативно, VP4 может быть процессирован на протяжении любой стадии экстракции RLP или после очистки RLP путем добавления подходящей протеазы, например, трипсина, трипсин-подобной протеазы, сериновой протеазы, химотрипсин-подобной протеазы, субтилизина.
В настоящем изобретении также предусмотрен способ получения RLP в растении, который предусматривает введение одной или нескольких нуклеиновых кислот, кодирующих один или несколько ротавирусных структурных белков, функционально связанных с регуляторной областью, активной в растении, а также одну или более чем одну нацелено воздействующую на компартмент последовательность и/или элементы амплификации в растении, части растения или клетке растения. Растение, часть растения или клетку растения затем инкубировали в условиях, которые позволяют экспрессию одной или нескольких нуклеиновых кислот, тем самым производя RLP. Один или несколько ротавирусных структурных белков могут представлять собой VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7, фрагмент VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7 или их комбинацию.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена RLP, содержащая один или несколько ротавирусных структурных белков, например, но без ограничения, VP2, VP4 (или VP5 и VP8), VP6, VP7 или их комбинация. RLP может быть получена с помощью одного или нескольких способов, как это предусмотрено согласно настоящему изобретению.
Возникновение RLP может быть обнаружено с использованием любого подходящего способа, например центрифугирования в градиенте плотности или гель-фильтрационной хроматографии. RLP могут быть оценены по структуре и размеру с помощью, например, электронной микроскопии либо с помощью гель-фильтрационной хроматографии.
Для гель-фильтрационной хроматографии все растворимые белки могут быть экстрагированы из растительной ткани путем гомогенизации (Polytron) образца замороженного-измельченного растительного материала в экстракционном буфере и удаления нерастворимого материала центрифугированием. Осадки с ледяным ацетоном или ПЭГ могут также быть полезными. Растворимый белок определяют количественно, и экстракт пропускают через колонку SephacrylTM, например, колонку
SephacrylTM S500. Blue Dextran 2000 может быть использован в качестве калибровочного стандарта. После хроматографии фракции могут быть дополнительно проанализированы при помощи иммуноблоттинга для определения белкового комплемента фракции.
Выделенная фракция может представлять собой, например, супернатант (если центрифугируют, осаждают или преципитируют) или фильтрат (если фильтруют), и обогащена белками или такими супраструктурными белками, как, например, нанотрубки, наносферы или такими частицами более высокого порядка с более высокой молекулярной массой, как однослойная (si), двухслойная (dl) или трехслойная (tl) RLP.
Выделенная фракция может быть дополнительно процессирована для выделения, очистки, концентрирования или их комбинации белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка с помощью, например, дополнительных стадий центрифугирования, преципитации, хроматографических стадий (например, гель-фильтрационной, ионообменной, аффинной хроматографии), фильтрации с тангенциальным потоком или их комбинации. Наличие очищенных белков, супраструктурных белков или частиц более высокого порядка, таких как RLP, может быть подтверждено с помощью, например, нативного или ДСН-ПААГ Вестерн-анализа с использованием соответствующего антитела обнаружения, капиллярного электрофореза, электронной микроскопии или любого другого способа, который будет очевиден для специалиста в настоящей области техники.
RLP, полученные в соответствии с настоящим изобретением, могут быть очищены, частично очищены от растения, части растения или растительного материала, или могут быть введены в виде пероральной вакцины, с использованием способов, известных специалистам в настоящей области техники.
Очистка RLP может включать в себя центрифугирование в градиенте, например, градиенты плотности сахарозы, иодиксанола, OptiPrep(tm) или хлорида цезия (CsCl) могут быть использованы для очистки или частичной очистки RLP из трансформированной растительной биомассы. Как показано, например, на фиг. 45, ступенчатый градиент иодиксанола или непрерывный градиент иодиксанола может быть использован для очистки RLP и/или экспрессированных ротавирусных структурных белков.
Было показано, что концентрация кальция (Са2+) важна для трансформации трехслойной частицы (TLP) в двухслойную частицу (DLP) и характеризуется
зависимостью от штамма (смотрите, например, Martin et al. Journal of Virology, Jan 2002, которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Полная потеря белков внешнего капсида с TLP (декапсидация TLP) происходит в наномолярном диапазоне [Са2+]. Поэтому очистка и/или экстракция RLP может быть осуществлена в присутствии кальция, и стадия центрифугирования в градиенте может быть выполнена в присутствии кальция, например, в присутствии СаСЬ. Концентрация СаСЬ может составлять, например, от 1 мМ и до 1000 мМ, или характеризоваться любым значением между ними, таким как 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 50, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 мМ или любым значением между ними.
Растения или фрагменты растений могут быть минимально процессированы. Под термином "минимальный процессинг" подразумевается растительное вещество, например, растение или его часть, содержащее представляющий интерес белок и/или RLP, которое частично очищено с получением растительного экстракта, гомогената, фракции гомогената растения и т.п. (т.е. минимально процессированных). Частичная очистка может включать в себя без ограничения разрушение растительных клеточных структур, тем самым создавая композицию, содержащую растворимые растительные компоненты и нерастворимые растительные компоненты, которые могут быть разделены, например, но без ограничения, с помощью центрифугирования, фильтрации или их комбинации. В связи с этим, белки, секретируемые во внеклеточном пространстве листа или других тканях, могут быть легко получены с использованием экстракции вакуумом или центрифугированием, или ткани могут быть экстрагированы под давлением при прохождении через ролики или шлифованием или тому подобного для выжимания или освобождения свободных белков от внеклеточного пространства. Минимальный процессинг может также включать в себя подготовку неочищенных экстрактов растворимых белков, так как эти препараты будут содержать незначительное загрязнение от вторичных растительных продуктов. Кроме того, минимальный процессинг может включать в себя водную экстракцию растворимого белка из листьев, с последующей преципитацией с любой подходящей солью. Другие способы могут включать в себя крупномасштабную мацерацию и экстракцию сока для разрешения прямого использования экстракта. RLP могут быть очищены или извлечены с использованием любого подходящего способа, например механической или биохимической экстракции.
Один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть синтезированы в количестве до 2 г на килограмм массы свежего растения. Например, количество синтезированного структурного белка может составлять от 1 до 2 г на килограмм свежего веса или характеризоваться любым значением между ними, таким как 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2 г на килограмм свежего веса или любым значением между ними. Например, структурный белок может быть синтезирован в количестве до 1,54 г на килограмм массы свежего растения.
Кроме того, RLP могут быть синтезированы в количестве до 1,5 г на килограмм массы свежего растения. Например, количество синтезированного RLP может составлять от 0,5 до 1,5 г на килограмм свежего веса или характеризоваться любым значением между ними, таким как 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 г на килограмм свежего веса. Например, RLP могут быть синтезированы в количестве до 1,1 г на килограмм массы свежего растения.
Размер (т.е. диаметр) определенных выше RLP может быть определен, например, с помощью техник динамического светорассеяния (DLS) или электронного микроскопа (ЭМ), и составляет, как правило, от 50 до ПО нм или любой размер между этими значениями. Например, размер структуры интактного RLP может находиться в пределах от приблизительно 70 нм до приблизительно 110 нм или характеризоваться любым размером между ними, таким как 75 нм, 80 нм, 85 нм, 90 нм, 95 нм, 100 нм, 105 нм или любым размером между ними.
В настоящем изобретении дополнительно предусмотрена нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, кодирующую один или несколько ротавирусных структурных белков, функционально связанных с регуляторной областью, активной в растении. Нуклеотидная последовательность может быть оптимизирована, например, для использования кодонов человека или использования кодонов растений. Кроме того один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть функционально связаны с одним или более чем одним элементом амплификации. Кроме того один или несколько ротавирусных структурных белков могут быть функционально связаны с одной или более чем одной нацелено воздействующей на компартмент последовательностью. Один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностиью, могут представлять собой, например, VP2, VP4, VP6 или VP7. Кроме того, один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, могут быть, например, из любой ротавирусной группы от А до
G, но более предпочтительно - от ротавируса группы А. Кроме того, один или несколько ротавирусных структурных белков, кодируемых нуклеотидной последовательностью, могут быть из любого ротавирусного штамма, содержащего генотип любых комбинаций G- и Р- типов от G1 до G27 и от Р1 до Р34, и более предпочтительно, от G1 до G19 и от Р1 до Р27, включая в себя без ограничения G1P[8], G2P[4], G2P[8], G3P[8], G4P[8], G9P[6], G9P[8], штамм WA ротавируса А, штамм USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] вакцины ротавируса А или штамм SA11 ротавирус.
Последовательность нуклеиновой кислоты, упоминаемая в настоящем изобретении, может быть "по существу гомологична", "по существу сходна" или "по существу идентична" последовательности или комплименту последовательности, если последовательность нуклеиновой кислоты гибридизирует с одной или более чем одной нуклеотидной последовательностью или комплиментом последовательности нуклеиновой кислоты, как определено в настоящем документе, в строгих условиях гибридизации. Последовательности "по существу гомологичны", "по существу аналогичны", "по существу идентичны", когда по меньшей мере приблизительно 70% или от 70 до 100%, или любое значение между ними, например, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100% или любое значение между ними, нуклеотидов совпадает на протяжении определенной длины нуклеотидной последовательности, при условии, что такие гомологичные последовательности демонстрируют одно или более чем одно из свойств последовательности или кодируются описанным в настоящем документе продуктом.
Так, например, в настоящем изобретении предусмотрен выделенный полинуклеотид, содержащий нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или несколько ротавирусных структурных белков, которые по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87 %, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или на любое значение между ними идентичны последовательностям, определенным, например, в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54. Полинуклеотид может представлять собой человеческий кодон, оптимизированный любым из известных в настоящей области техники способов.
Кроме того, в настоящем изобретении предусмотрены RLP, которые содержат ротавирусные структурные белки, которые, например, кодируются нуклеиновыми кислотами, которые по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% или на любое
значение между ними идентичны последовательностям, определенным, например, в SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 45, 46, 47, 49, 50, 51, 52, 53, 54.
Такое сходство или идентичность последовательностей могут быть определены с использованием программы сравнения нуклеотидных последовательностей, например, такое, как проводимое DNASIS (с использованием, например, но без ограничения, следующих параметров: штраф за пропуск в последовательности 5, # верхних диагоналей 5, фиксированный штраф за пропуск в последовательности 10, к строка 2, плавающий пропуск в последовательности 10 и размер окна 5). Тем не менее, другие способы выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в настоящей области техники, например, алгоритмы Smith & Waterman (1981, Adv Appl Math 2: 482), Needleman & Wunsch (J. Mol Biol 48: 443, 1970), Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444), и с помощью компьютеризированных реализаций этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и BLAST, доступных через NIH), или с помощью ручного выравнивания и визуального осмотра (смотрите, например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al, eds. 1995 supplement), или с использованием саузерн или нозерн гибридизации в строгих условиях (смотрите Maniatis et al, in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Предпочтительно, последовательности, которые по существу гомологичны, проявляют по меньшей мере приблизительно 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90% сходства последовательности на протяжении определенной длины молекулы.
Пример одного из таких строгих условий гибридизации может представлять собой гибридизацию в течение ночи (приблизительно 16-20 часов) в 4 х SSC при 65°С, с последующим отмыванием в 0,1 х SSC при 65°С в течение часа или 2 отмываниями в 0,1 х SSC при 65°С каждое в течение 20 или 30 минут. Альтернативно, иллюстративное условие строгой гибридизации может представлять собой гибридизацию в течение ночи (16-20 часов) в 50% -ном формамиде, 4 х SSC при 42°С с последующим отмыванием в 0,1 х SSC при 65°С в течение часа, или 2 отмываниями в 0,1 х SSC при 65°С каждое в течение 20 или 30 минут или в течение ночи (16-20 часов), или гибридизацию в водном фосфатном буфере Church (7% ДСН; 0,5 М NaP04 буфер с рН 7,2; 10 мМ ЭДТА) при 65°С, с 2 отмываниями либо при 50°С в 0,1 X SSC, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 минут каждое, или 2 отмываниями при 65°С в 2 х SSC, 0,1% ДСН в течение 20 или 30 минут каждое для уникальных областей последовательностей.
Нуклеиновая кислота, кодирующая ротавирусный структурный полипептид, может быть описана как "ротавирусная нуклеиновая кислота" или "ротавирусная нуклеотидная последовательность". Пример, который не должен рассматриваться как ограничивающий, представляет собой вирусоподобную частицу, содержащую один или несколько ротавирусных структурных белков или ротавирусных структурных полипептидов, которая может быть описана как "ротавирусная VLP", "RVLP" или "RLP".
Многие организмы отображают случайность использования определенных кодонов для кодирования вставки конкретной аминокислоты в растущую пептидную цепь. Предпочтение кодона или случайное использование кодона, различия в использовании кодонов между организмами, представляет собой вырожденность генетического кода и хорошо известно у многих организмов. Случайность использования кодона часто коррелирует с эффективностью трансляции РНК (мРНК), которая, полагают, что в свою очередь зависит, в частности, от свойств транслируемых кодонов и наличия определенных транспортных молекул РНК (тРНК). Преобладание выбранных тРНК в клетке представляет собой, как правило, отражение кодонов, используемых наиболее часто в синтезе пептидов. Соответственно, гены могут быть приспособлены для оптимальной экспрессии генов в данном организме на основе оптимизации кодонов. Процесс оптимизации нуклеотидной последовательности, кодирующей гетерологично экспрессированный белок, может стать важным шагом для повышения выхода экспрессии. Требования к оптимизации могут включать в себя стадии по улучшению способности хозяина производить чужеродный белок.
"Оптимизация кодона" определяется как модификация последовательности нуклеиновой кислоты для усиления экспрессии в представляющих интерес клетках путем замещения по меньшей мере одного, более одного или значительного количества кодонов нативной последовательности на кодоны, которые могут более часто или наиболее часто использоваться в генах другого организма или вида. Различные виды демонстрируют определенную случайность использования для определенных кодонов конкретной аминокислоты.
Настоящее изобретение включает в себя синтетические полинуклеотидные последовательности, которые были оптимизированы в отношении кодонов, например, последовательности, которые были оптимизированы для использования кодонов человека или кодонов растений. Полинуклеотидные последовательности с оптимизированными кодонами затем могут быть экспрессированы в растениях. Более
конкретно, последовательности, оптимизированные в отношении использования кодонов человека или использования кодонов растений, могут быть экспрессированы в растениях. Не желая быть связанными теорией, полагают, что последовательности, оптимизированные в отношении человеческого кодона, увеличивают содержание гуанина-цитозина (содержание GC) в последовательности и повышают экспрессионный выход в растениях.
Существуют различные известные в настоящей области техники способы оптимизации кодонов для улучшения трансляционной кинетики трансляционно неэффективных белковых кодирующих областей. Эти техники в основном опираются на идентификацию использования кодонов у определенного организма-хозяина. Если определенный ген или последовательность должны быть экспрессированы в этом организме, кодирующая последовательность таких генов и последовательностей будет затем модифицирована таким образом, что она будет замещать кодоны представляющей интерес последовательности более часто используемыми кодонами организма-хозяина.
Ротавирусный структурный белок или полипептид могут быть экспрессированы в системе экспрессии, содержащей основанную на вирусе, ДНК или РНК систему экспрессии, например, но без ограничения, основанную на комовирусе экспрессионную кассету или основанный на геминивирусе элемент амплификации.
Описанная в настоящем документе система экспрессии может содержать экспрессионную кассету, основанную на двойном вирусе или вирусе с двойным геномом. Например, двойные вирусы могут быть из семейства Comoviridae. Рода семейства Comoviridae включают в себя Comovirus, Nepovirus, Fabavirus, Cheravirus и Sadwavirus. Comoviruses включают в себя вирус мозаики коровьего гороха (CPMV), вирус тяжелой мозаики коровьего гороха (CPSMV), вирус мозаики тыквы (SqMV), вирус крапчатости красного клевера (RCMV), вирус крапчатости стручков (BPMV), вирус кольцевой пятнистости турнепса (TuRSV), вирус обыкновенной мозаики кормовых бобов (BBtMV), вирус пятнистости кормовых бобов (BBSV), вирус мозаики редьки (RaMV). Примеры последовательностей РНК-2 комовирусов, содержащих энхансерные элементы, которые могут быть применимы для различных аспектов настоящего изобретения, включают в себя без ограничения: CPMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC_003550), RCMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC_003738), BPMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC 003495), CPSMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC_003544), SqMV РНК-2 (GenBank, номер доступа NC_003800), TuRSV
PHK-2 (GenBank, номер доступа NC 013219.1), BBtMV РНК-2 (GenBank, номер доступа GU810904), BBSV РНК2 (GenBank, номер доступа FJ028650), RaMV (GenBank, номер доступа NC_003800).
Сегменты двойного комовирусного РНК-генома, называются РНК-1 и РНК-2. РНК-1 кодирует белки, вовлеченные в репликацию, в то время как РНК-2 кодирует белки, необходимые для перемещения от клетки к клетке, и два капсидных белка. Может быть использована любая подходящая основанная на комовирусе кассета, в том числе CPMV, CPSMV, SqMV, RCMV или BPMV, например, экспрессионная кассета может быть основана на CPMV.
"Экспрессионная кассета" относится к нуклеотидной последовательности, содержащей представляющую интерес нуклеиновую кислоту под контролем, и функционально (или оперативно) связанную с соответствующим промотором или другими регуляторными элементами для транскрипции представляющей интерес нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Системы экспрессии могут также содержать элементы амплификации из геминивируса, например, элемент амплификации от вируса желтой карликовости фасоли (BeYDV). BeYDV принадлежит к роду Mastreviruses, адаптированному к двудольным растениям. BeYDV представляет собой одинарный вирус, содержащий одноцепочечную круговую ДНК генома, и может реплицировать очень большое число копий по механизму катящегося кольца. Векторные системы, полученные от BeYDV репликонов ДНК, были использованы для быстрого высокоэффективного производства белка в растениях.
Используемая в настоящем документе фраза "элементы амплификации" относится к сегменту нуклеиновой кислоты, содержащему по меньшей мере часть одного или нескольких длинных межгенных областей или длинных межгенных повторов (LIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе "длинная межгенная область" или "длинный межгенный повтор" относится к области длительной межгенной области, которая содержит сайт связывания повторений, способный опосредовать иссечение и репликацию посредством белка Rep геминивируса. Согласно некоторым аспектам сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий один или несколько LIR, может дополнительно содержать короткую межгенную область или небольшую межгенную область (SIR) генома геминивируса. Используемая в настоящем документе "короткая межгенная область" или "небольшая межгенная область" относится к комплементарной цепи (короткая IR (SIR)
Mastreviruses). Любой подходящий полученный из геминивируса элемент амплификации может быть использован в настоящем документе. Смотрите, например, WO2000/20557; WO2010/025285; Zhang X. et al. (2005, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 93, 271-279), Huang Z. et al. (2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 103, 706-714), Huang Z. et al.(2009, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 106, 9-17); которые включены в настоящий документ посредством ссылки). Если в конструкте используется более чем один LIR, например, два LIR, то промотор, области CMPV-HT и последовательность представляющей интерес нуклеиновой кислоты и терминатора разграничиваются каждой из двух LIR. Кроме того, элемент амплификации может, например, происходить из последовательности, описанной в Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, размещенной в Gen Bank под номером доступа DQ458791, который включен в настоящий документ посредством ссылки. Сегменты нуклеиновой кислоты, содержащие LIR, соединяют нуклеотиды с 2401 по 2566 и с 1 по 128. Сегменты нуклеиновой кислоты, содержащие SIR, представляют собой нуклеотиды с 1154 по 1212.
Как описано в настоящем документе, совместная доставка происходящего от вируса желтой карликовости фасоли (BeYDV) вектора и поставляющего Rep/RepA вектора с помощью агроинфильтрации листьев Nicotiana benthamiana приводит к эффективной амплификации репликона и надежной продукции белка.
Основанная на комовирусе экспрессионная кассета и происходящий из гемивируса элемент амплификации могут содержаться в отдельных векторах или составные части могут быть включены в один вектор. Если используются два вектора, первый и второй векторы могут быть введены в клетку растения одновременно или по отдельности.
Вирусная репликаза может также быть включена в систему экспрессии, как описано в настоящем документе, чтобы увеличить экспрессию представляющей интерес нуклеиновой кислоты. Неограничивающий пример репликазы представляет собой репликазу BeYDV (pREPHO), кодирующую Rep и RepA BeYDV (С2/С1; Huang et al, 2009, Biotechnol. Bioeng. 103, 706-714, который включен в настоящий документ посредством ссылки). Другой неограничивающий пример репликазы раскрыт в Halley-Stott et al. (2007) Archives of Virology 152: 1237-1240, размещенной в Gen Bank под номером доступа DQ458791, которые включены в настоящий документ посредством ссылки. Сегмент нуклеиновой кислоты, содержащий ген С1:С2, представляет собой нуклеотиды с 1310 по 2400.
Термин "коэкспрессированные" означает, что две или более чем две нуклеотидные последовательности экспрессируются приблизительно в одно и то же время в растении и в пределах одной и той же ткани растения. Тем не менее, нуклеотидные последовательности не должны экспрессироваться в одно и то же время. Скорее, эти две или более нуклеотидные последовательности экспрессируются таким образом, чтобы кодируемые продукты характеризовались возможностью взаимодействовать. Две или более чем две нуклеотидные последовательности могут быть коэкспрессированы с использованием систем временной экспрессии, где две или более последовательностей вводятся в растение приблизительно в одно и то же время в условиях, при которых обе последовательности экспрессируются. Альтернативно, платформенное растение, содержащее одну из нуклеотидных последовательностей, может быть трансформировано в стабильной форме с дополнительной последовательностью, кодирующей представляющий интерес белок, например, один или несколько ротавирусных структурных белков, введенных в платформенное растение временным образом.
Правильная укладка белка может характеризоваться важным значением для стабильности белка, образования мультимеров, образования RLP и функционирования. Укладка белка может зависеть от одного или нескольких факторов, включающих в себя без ограничения последовательность белка, относительное содержание белка, степень внутриклеточной концентрации, доступность кофакторов, которые могут связывать или быть временно связанными с уложенным, частично уложенным или развернутым белком. Кроме того, компартмент или суб-компартмент внутри растения, где экспрессируется белок, может влиять на уровни экспрессии и укладку белка.
Экспрессия одного или нескольких ротавирусных структурных белков может быть нацелена на специфический компартмент растительных клеток и/или суб-компартментов путем агроинфильтрации в трансгенных растениях. Компартмент или суб-компартменты могут представлять собой, например пластиды, эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт или апопласт. Не желая быть связанными теорией, нацеленное на компартмент или суб-компартменты воздействие может увеличивать накопление белка в нацеленом компартменте или суб-компартментах выше цитоплазматического накопления. Накопление в компартменте или суб-компартментах может защитить белок от деградации протеазами, присутствующими в цитоплазме и/или позволить ему накапливаться в более высокой концентрации, не влияя на функцию растительной клетки.
Таким образом, экспрессионная кассета или вектор могут быть адаптированы для направления вектора или ротавирусного структурного белка или полипептида, экспрессированного из вектора, в требуемый компартмент или суб-компартмент в растении.
Например, экспрессионная кассета или вектор могут быть адаптированы к пластидам-мишеням, что может приводить к тому, что экспрессированный ротавирусный структурный белок или полипептид включает в себя часть, способную взаимодействовать с тилакоидными мембранами пластид, в частности с механизмом передачи тилакоидных мембран. Это взаимодействие может приводить к тому, что ротавирусный структурный белок или полипептид импортируется в пластиду из цитоплазмы, где он экспрессируется. Не желая быть связанными теорией, механизм импорта из цитоплазмы может быть важным для правильной укладки белков. Следует иметь в виду, что экспрессионная кассета или вектор могут быть сами адаптированы к пластидам-мишеням, чтобы стать трансформированными, и экспрессия ротавирусного структурного белка или полипептида может происходить полностью внутри пластиды.
Термин "нацеливающая последовательность" означает, что нацеливающие последовательности могут быть включены в вектор или экспрессионную кассету. Такие нацеливающие последовательности могут быть транслированы в пептид, который направляет вектор или его продукт в требуемый компартмент или суб-компартмент в растении, такой как пластида. Например, пластидные сигнальные пептиды (также называемые как "пластидные транзитные пептиды" в настоящей области техники) для нацеливания белков в пластиды известны в настоящей области техники. Не ограничивающий пример пластидного транзитного пептида, который может быть использован, представляет собой rbcsl-cTP. В качестве подходящего примера последовательности хлоропластного транзитного пептида представляет собой ген малой субъединицы Rubisco (rbcSl), например, из Solanum tuberosum.
Таким образом, ротавирусный структурный белок или полипептид может включать в себя сигнальный пептид, который представляет собой такой же как, или гетерологичный с, оставшейся частью полипептида или белка. Термин "сигнальный пептид" хорошо известен в настоящей области техники и, как правило, относится к короткой (приблизительно 5-30 аминокислот) последовательности аминокислот, найденной, как правило, на N-конце полипептида, который может направлять транслокацию вновь транслированного полипептида к конкретной органелле, или помогать в позиционировании специфических доменов полипептидной цепи по
отношению к другим. В качестве неограничивающего примера, сигнальный пептид может нацеливать транслокацию белка в эндоплазматический ретикулум и/или облегчать позиционирование проксимального N-концевого домена по отношению к мембранному якорному домену растущего полипептида, чтобы помочь в расщеплении и укладывании зрелого белка, в качестве примера, который не должен рассматриваться как ограничивающий, ротавирусный структурный белок.
Сигнальный пептид (SP) может быть нативным к белку или вирусному белку, или сигнальный пептид может быть гетерологичным по отношению к первичной последовательности экспрессируемого белка или вирусного белка. Например, нативный сигнальный пептид ротавирусного структурного белка может быть использован для экспрессии ротавирусного структурного белка в системе растения.
Сигнальный пептид может быть также ненативным, например, из белка, вирусного белка или нативного структурного белка вируса, отличного от ротавирусного белка, или из растительного, животного или бактериального полипептида. Не ограничивающий пример сигнального пептида, который может быть использован, представляет собой таковой протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDISP) (нуклеотиды 32-103 учетный номер Z11499). Кроме того, сигнальный пептид может быть полностью удален или усечен. Усечение или усеченный означает, что 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или любое значение между ними аминокислотных остатков удалены из сигнального пептида. Предпочтительно, усеченные аминокислотные остатки непрерывны, и усечение происходят от второго метионина вперед.
В настоящем изобретении, следовательно, предусмотрен ротавирусный структурный белок, такой как, например, VP2 VP4, VP6 и/или VP7, содержащий нативный, ненативный сигнальный пептид или усеченный сигнальный пептид, и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие ротавирусные структурные белки.
Один или более чем один генетический конструкт согласно настоящему изобретению может быть экспрессирован в любом подходящем растении-хозяине, которое трансформируют нуклеотидной последовательностью или конструктами, или векторами согласно настоящему изобретению. Примеры подходящих хозяев включают в себя без ограничения сельскохозяйственные культуры, включающие в себя люцерну, рапс, Brassica spp., кукурузу, Nicotiana spp., картофель, женьшень, горох, овес, рис, соевые бобы, пшеницу, ячмень, подсолнечник, хлопок и подобные.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие ротавирусные структурные белки, могут быть переданы в растения-хозяева с использованием 1, 2, 3, 4 или 5 бинарных плазмидных векторов. Таким образом, каждый бинарный плазмидный вектор может содержать 1, 2, 3, 4 или 5 нуклеотидных последовательностей, кодирующих ротавирусный структурный белок.
Один или несколько генетических конструктов согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать 3' нетранслируемую область. 3' нетранслируемая область относится к той части гена, содержащего сегмент ДНК, который содержит сигнал полиаденилирования и любые другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно характеризуется осуществлением добавления треков полиадениловой кислоты к З'-концу предшественника мРНК. Сигналы полиаденилирования обычно распознаются по наличию гомологии к каноническому виду 5' ААТААА-3', хотя вариации не редкость. Неограничивающие примеры подходящих 3' областей представляют собой 3' транскрибируемые нетранслируемые области, содержащие сигнал полиаденилирования опухоли Agrobacterium, индуцирующей (Ti) плазмидные гены, такие как ген нопалинсинтазы (NOS), такие растительные гены, как гены запасных белков сои, малая субъединица рибулозы-I, ген 5-бисфосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO; США 4962028; которая включена в настоящий документ посредством ссылки), промотор, используемый в регулировании экспрессии пластоцианина, описанный в патенте США 7125978 (который включен в настоящий документ посредством ссылки).
Один или несколько из генетических конструктов согласно настоящему изобретению также могут включать дополнительные энхансеры либо энхансеры транскрипции, либо трансляции, если это может потребоваться. Энхансеры могут быть расположены на 5' или 3' конце транскрибируемой последовательности. Области энхансеров хорошо известны специалистам в настоящей области техники и могут включать в себя инициирующий кодон ATG, прилегающие последовательности или тому подобное. Инициирующий кодон, если он присутствует, может быть в фазе с рамкой считывания ("в рамке"), кодирующей последовательности для обеспечения правильной трансляции транскрибируемой последовательности.
Конструкты согласно настоящему изобретению могут быть введены в клетки растений с использованием плазмиды Ti, плазмиды Ri, растительных вирусных векторов, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Для
обзоров таких способов смотрите, например Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, New York VIII, pp. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2d Ed. (1988) и Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2d Ed. DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell (eds), Addison Wesly, Langmans Ltd. London, pp. 561-579 (1997). Другие способы включают в себя прямой захват ДНК, применение липосом, электропорации, например, с использованием протопластов, микроинъекций, микроснарядов или микроигл и вакуумной инфильтрации. Смотрите, например, Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991), Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991), Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987), Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987), Klein et al, Nature 327: 70-73 (1987); Howell et al. (Science 208: 1265, 1980), Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985), DeBlock et al, Plant Physiology 91: 694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J Virol Meth, 105:343-348, 2002,), патент США. № 4945050; 5036006 и 5100792, заявку на патент США № 08/438666, поданную 10 мая 1995 г., и 07/951715, поданную 25 сентября 1992 г. (все из которых включены в настоящий документ посредством ссылки). Временная экспрессия
Не желая быть связанными теорией, концентрация белка и соотношение различных ротавирусных структурных белков может характеризоваться важным значением для эффективности сборки RLP. Поэтому множественность и время инфекции может быть важным, чтобы манипулировать концентрацией белка и общей эффективностью сборки RLP в растениях.
Конструкт согласно настоящему изобретению может быть временно экспрессирован в растении или части растения. Система временной экспрессии, основанная на эпихромосомной экспрессии рекомбинантных Agrobacterium tumefaciens в растении, части растения или клетки растения, может быть использована для экспрессии ротавирусного структурного белка, нацелено воздействующего на различные клеточные компартменты или субкомпартменты. Система временной экспрессии позволяет высокую скорость производства. Кроме того, большие количества белка могут быть достигнуты в течение нескольких дней после инфильтрации рекомбинантного Agrobacterium в растениях (Rybicki, 2010; Fischer et al., 1999). Также возможно экспрессировать длинные последовательности генов и
содержать более чем один одновременно экспрессированный ген в той же клетке, что позволяет эффективную сборку мультимерных белков (Lombardi et al, 2009).
Нуклеотидные последовательности, кодирующие ротавирусные структурные белки, могут быть переданы в растения-хозяева в 1, 2, 3, 4 или 5 трансформированных штаммах Agrobacterium tumefaciens.
Однако, на протяжении временной экспрессии пост-транскрипционный сайленсинг генов может ограничить экспрессию гетерологичных белков в растениях. Коэкспрессия супрессора сайленсинга, например, но без ограничения, Nss из вируса пятнистого увядания томатов может быть использован для противодействования специфической деградации трансгенных мРНК (Brigneti et al., 1998). Альтернативные супрессоры сайленсинга хорошо известны в настоящей области техники и могут быть использованы, как описано в настоящем документе (Chiba et al., 2006, Virology 346:714; которая включена в настоящий документ посредством ссылки), например, но без ограничения, HCPro TEV- pl/HC-Pro (вирус гравировки табака-Pl/HC-Pro), BYV -р21, р19 из вируса кустистой карликовости томатов (TBSV р19), белок капсида вируса морщинистости томатов (TCV -CP), 2b вируса мозаики огурцов; CMV-2b), р25 вируса X картофеля (PVX-p25), pll вируса М картофеля (PVM-pll), pll вируса S картофеля (PVS -РП), р16 вируса костра голубики, (BScV -р16), р23 вируса тристеца цитрусовых (CTV-P23), р24 связанного со скручиванием листьев виноградной лозы вируса-2, (GLRaV-2 р24), р10 из вируса А виноградной лозы, (GVA-plO), р14 вируса В виноградной лозы (GVB-pl4), р10 латентного вируса борщевика (HLV-plO) или р16 общего латентного вируса чеснока (GCLV-pl6). Таким образом, супрессор сайленсинга, например HCPro, TEV- pl/HC-Pro, BYV -р21, TBSV р19, TCV-CP, CMV -2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GVB-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 или GVA-plO, может быть коэкспрессирован наряду с одним или несколькими ротавирусными структурными белками, например, VP2, VP4, VP6 или их комбинацией, чтобы в дальнейшем обеспечить высокие уровни производства белка в растении или части растения.
В настоящем изобретении также предусмотрены описанные выше способы, в которых дополнительная (вторая, третья, четвертая или пятая) нуклеотидная последовательность экспрессируется в растении, дополнительная (вторая, третья, четвертая или пятая) нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, функционально связанный с дополнительной (второй, третьей, четвертой или пятой) регуляторной областью, которая активна в растении. Нуклеотидная
последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, может представлять собой, например, Nss, HcPro, TEV -pl/HC-Pro, BYV-p21, TBSV pi9, TCV-CP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-pll, PVS-pll, BScV-pl6, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-pl4, HLV-plO, GCLV-pl6 or GVA-plO.
Как описано ниже, способы временной экспрессии могут быть использованы для экспрессии конструкта согласно настоящему изобретению (смотрите Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; которая включена в настоящий документ посредством ссылки). С другой стороны, может быть использован способ основанной на вакууме временной экспрессии, как описано Kapila et al, 1997, которая включена в настоящий документ посредством ссылки). Эти способы могут включать в себя, например, без ограничения, способ агроинокуляции или агроинфильтрации, инфильтрации шприцом, однако, и другие временные способы также могут быть использованы, как отмечалось выше. С агроинокуляцией, агроинфильтрацией или инфильтрацией шприцом смесь Agrobacteria, содержащая нужную нуклеиновую кислоту, входит в межклеточные пространства ткани, например листьев, воздушной части растения (включающей в себя ствол, листья и цветок), другие части растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После пересечения эпидермиса Agrobacteria инфицируют и передают копии т-ДНК в клетки. т-ДНК транскрибируется эписомально и мРНК транслируется, что приводит к получению представляющего интерес белка в инфицированных клетках, однако, прохождение т-ДНК внутри ядра характеризуется временностью.
Для помощи в идентификации трансформированных растительных клеток, на конструкты согласно настоящему изобретению можно дополнительно воздействовать, чтобы включить в себя растительные селективные маркеры. Полезные селективные маркеры включают в себя ферменты, которые обеспечивают устойчивость к таким химическим веществам, как антибиотик, например, гентамицин, гигромицин, канамицин, или такие гербициды, как фосфинотрицин, глифосат, хлоросульфурон и тому подобное. Аналогичным образом, могут быть использованы ферменты, обеспечивающие получение соединения, идентифицируемого посредством изменения цвета, такие как GUS (бета-глюкуронидазы), или люминесценции, такие как люцифераза или GFP.
Кроме того, рассматриваемая часть настоящего изобретения представляет собой трансгенные растения, растительные клетки или семена, содержащие генный конструкт по настоящему изобретению. Способы регенерации целых растений из
растительных клеток также известны в настоящей области техники. В общем, трансформированные растительные клетки культивируют в подходящей среде, которая может содержать селективные средства, такие как антибиотики, где используются селективные маркеры для облегчения идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллуса можно стимулировать образование побега, используя соответствующие гормоны растений в соответствии с известными способами, и переносить побеги на субстрат для выращивания растений для регенерации растений. Растения могут быть использованы для установления повторяющихся поколений либо из семян, либо с помощью вегетативных способов распространения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования тканевых культур.
Использование терминов "регуляторная область", "регуляторный элемент" или "промотор" в настоящей заявке призвано отражать часть нуклеиновой кислоты, как правило, но не всегда, выше по ходу транскрипции от кодирующей белок области гена, которая может быть образована либо ДНК или РНК, либо ДНК и РНК. Когда регуляторная область активна и в функциональной связи или функционально связана с представляющим интерес геном, это может приводить к экспрессии представляющего интерес гена. Регуляторный элемент может быть способен опосредовать органную специфичность или контролировать развитие или временную активацию гена. "Регуляторная область" может включать в себя промоторные элементы, сердцевинные промоторные элементы, проявляющие базальную активность промотора, элементы, которые индуцируются в ответ на внешний стимул, элементы, которые опосредуют промоторную активность, такие как отрицательные регуляторные элементы или транскрипционные энхансеры. Используемая в настоящем документе "регуляторная область" может также включает в себя элементы, которые активны после транскрипции, например, регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию генов, такие как трансляционные и транскрипционные энхансеры, трансляционные и транскрипционные репрессоры, вышележащие активирующие последовательности, а также детерминанты нестабильности мРНК. Некоторые из этих последних элементов могут быть расположены проксимально к кодирующей области.
В контексте настоящего раскрытия термин "регуляторный элемент" или "регуляторная область" обычно относится к последовательности ДНК, как правило, но не всегда, выше по ходу транскрипции (5') к кодирующей последовательности структурного гена, который контролирует экспрессию кодирующей области путем
предоставления распознавания для РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на конкретном участке. Тем не менее, следует понимать, что другие нуклеотидные последовательности, расположенные в пределах интронов или 3' последовательности, также могут вносить свой вклад в регуляцию экспрессии представляющей интерес кодирующей области. Пример регуляторного элемента, который обеспечивает распознавание РНК-полимеразы или других транскрипционных факторов для обеспечения инициации в конкретном сайте представляет собой промоторный элемент. Большинство, но не все, эукариотические промоторные элементы содержат ТАТА-бокс, консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из нуклеотидных пар оснований аденозина и тимидин, как правило, расположенных приблизительно в 25 парах нуклеотидов выше по ходу транскрипции от стартового сайта транскрипции. Промоторный элемент содержит базальный промоторный элемент, ответственный за инициацию транскрипции, а также другие регуляторные элементы (как указано выше) для модификации генной экспрессии.
Существует несколько типов регуляторных областей, включающие в себя те, которые представляют собой регулируемые, индуцируемые или конститутивные с развитием. Регуляторная область, которая с развитием регулируется или контролирует дифференциальную экспрессию гена под его контролем, активируется в определенных органах или тканях органа в определенное время в ходе развития этого органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные области, которые с развитием регулируются, могут преимущественно быть активными в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, они также могут быть активными регулируемыми в процессе развития или на базальном уровне в других органах или тканях в растении. Примеры тканеспецифичных регуляторных областей, например, смотрите специфическую регуляторную область, включают в себя промотор напина и промотора круциферина (Rask et al, 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al, 1994, Plant Cell 14: 125-130). Пример, специфического для листа промотора включает в себя промотор пластоцианина (смотрите патент США 7125978, который включен в настоящий документ посредством ссылки).
Индуцируемая регуляторная область представляет собой ту, которая способна прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или нескольких последовательностей ДНК или генов в ответ на индуктор. При отсутствии индуктора последовательности ДНК или гены не будут транскрибироваться. Как правило,
белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемой регуляторной областью для активирования транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем непосредственно или косвенно преобразуется в активную форму с помощью индуктора. Тем не менее, белковый фактор также может отсутствовать. Индуктор может представлять собой химическое вещество, такое как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или фенольное соединение или физиологический стресс, воздействующий непосредственно теплом, холодом, солью или токсичными элементами, или косвенно через действие патогена или возбудителя заболевания, такого как вирус. Растительная клетка, содержащая индуцируемую регуляторную область, может подвергаться воздействию индуктора путем внешнего применения индуктора к клетке или растению, например, путем распыления, полива, нагрева или подобными способами. Индуцируемые регуляторные элементы могут быть получены из растительных или нерастительных генов (например, Gatz, С. and Lenk, LR.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; которая включена посредством ссылки). Примеры потенциальных индуцируемых промоторов включают в себя без ограничения индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, С, 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48,89-108, которая включена посредством ссылки), индуцируемый стероидом промотор (Aoyama. Т. and Chua, N.H.,1997, Plant 1. 2, 397-404; которая включена посредством ссылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G, et al, 1998, Plant lOurnal 16, 127-132; Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180; которые включены посредством ссылки), индуцируемые цитокинином гены IB6 и CKI 1 (Brandstatter, I. and K.ieber, 1.1.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019; Kakimoto, Т., 1996, Science 274,982-985; которые включены посредством ссылки) и индуцируемый ауксином элемент, DR5 (Ulmasov, Т., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971; которая включена посредством ссылки).
Конститутивная регуляторная область направляет собой экспрессию гена в различных частях растения и непрерывно в течение развития растений. Примеры известных конститутивных регуляторных элементов включают в себя промоторы, связанные с транскриптом 35S CaMV (Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812), актином 1 риса (Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165), актином 2 (An et al, 1996, Plant J., 10: 107-121) или tms 2 (патент США 5428147, который включен в настоящий документ посредством ссылки) и генами триозофосфатизомеразы 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467), геном убикитина 1 кукурузы (Cornejo et ai, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637646), генами убикитина 1 и 6 Arabidopsis (Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637
646) и геном фактора инициации трансляции 4А табака (Mandel et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 995-1004).
Используемый в настоящем документе термин "конститутивный" не обязательно означает, что ген под контролем конститутивной регуляторной области экспрессируется на том же уровне во всех типах клеток, а то, что ген экспрессируется в широком диапазоне типов клеток даже хотя часто наблюдается изменение в изобилии. Конститутивные регуляторные элементы могут быть соединены с другими последовательностями для дальнейшего усиления транскрипции и/или трансляции нуклеотидной последовательности, с которой они функционально связаны. Например, система CPMV-HT происходит от нетранслируемых областей вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и демонстрирует усиленную трансляцию соответствующей кодирующей последовательности. "Нативная" означает, что последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислоты характеризуется природным происхождением или представляет собой "дикого типа". Под "функционально связанный" подразумевается то, что конкретные последовательности, например, регуляторный элемент и представляющая интерес кодирующая область, взаимодействуют непосредственно или опосредовано для осуществления намеченной функции, такой как опосредование или модуляция генной экспрессии. Взаимодействие функционально связанных последовательностей может, например, быть опосредовано белками, которые взаимодействуют с функционально связанными последовательностями.
Произведенная в растении RLP может индуцировать ротавирусный структурный белок VP7, содержащий специфические для растения N-гликаны. Таким образом, в настоящем изобретении также предусмотрена RLP, содержащая VP7, содержащий специфические для растения N-гликаны.
Кроме того, известна модификация N-гликанов в растениях (смотрите, например, US 60/944344; который включен в настоящий документ посредством ссылки) и могут быть получены VP7 с модифицированными N-гликанами. Могут быть получены VP7, содержащие модифицированный паттерн гликозилирования N-гликанов, например с пониженным фукозилированием, ксилозилированием или как фукозилированием, так и ксилозилированием, или могут быть получены VP7, содержащие модифицированный паттерн гликозилирования, в котором белок не содержит фукозилирования, ксилозилирования, или обоих, и содержит повышенное галактозилирование. Кроме того, модуляция посттрансляционных модификаций,
например, добавление терминальной галактозы, может приводить к понижению фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного VP7, по сравнению с экспрессирующим VP7 растением дикого типа.
Для примера, который не следует рассматривать как ограничивающий, синтез VP7, содержащего модифицированный паттерн гликозилирования, может быть достигнут путем коэкспрессирования VP7 вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей бета-1,4-галактозилтрансферазу (GalT), например, но без ограничения, GalT млекопитающих или GalT человека, однако GalT из других источников также может быть использован. Каталитический домен GalT может быть также слит с доменом CTS (т.е. цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стволовой областью) из N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1), для получения гибридного фермента GNTl-GalT, и гибридный фермент может быть коэкспрессирован с VP7. VP7 также может быть коэкспрессирован вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-ацетилглюкозаминил трансферазу III (GnT-III), например, но без ограничения, GnT-III млекопитающих или GnT-III человека, GnT-III из других источников также может быть использована. Кроме того, также может быть использован гибридный фермент GNT1-GnT-III, содержащий CTS GNT1, слитый с GnT-III.
Таким образом, в настоящем изобретении также предусмотрены RLP, содержащие VP7, характеризующиеся наличием модифицированных N-гликанов.
Не желая быть связанными теорией, наличие растительных N-гликанов на VP7 может стимулировать иммунный ответ, способствовать связыванию VP7 с помощью антиген представляющих клеток. Стимуляция иммунного ответа с использованием N гликана растений была предложена Saint-Jore-Dupas et al. (2007).
Настоящее изобретение будет дополнительно проиллюстрировано следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Экспрессия ротавирусных белков и производство VLP в листьях растения N. benthamiana
В следующем анализе использовали ротавирусные белки капсида от штамма ротавируса G9 Р[6], и оценивали, образовывались ли ротавирус-подобные частицы в
различных компартментах клеток листьев табака N. benthamiana. Исследовали коэкспрессию VP2 и VP6, а также различные комбинации VP2, VP6, VP7 и VP4 в листьях растений табака.
Материалы и способы
Конструирование плазмид
Оптимизированные растительными кодонами ротавирусные кДНК для VP2, VP4, VP6 и VP7 поставлялись Geneart, Germany. ДНК плазмиды трансформировали в DH5-a химически компетентные клетки E.coli (Е. cloni(tm), Lucigen) в соответствии с инструкциями производителя. В настоящем исследовании использовали новые бинарные векторы Agrobacterium pTRAc (цитоплазматические), pTRAkc-rbcsl-CTP (нацелено воздействующие на хлоропласт) и pTRAkc-эр (нацелено воздействующие на эндоплазматический ретикулум), поставляемые Rainer Fischer (Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, IME, Germany). Дополнительный вектор, pTRAkc-(aпoплacтa) получали из модификации pTRAkc-РГР с помощью расщепления рестриктазой (RE) в сайтах Ncol и Xhol в сайте множественного клонирования (фиг. 3). Это устраняет гистидиновый тег и последовательность KDEL, которая сохраняет белки в ER. Белки вместо этого направляют к апопласту.
кДНК VP2, VP4 и VP6 расщепляли рестриктазами (RE) с Ncol/Xhol, в то время как VP7 разрезали с Afllll/Xhol. Ферменты рестрикции Afllll, Ncol и Mlul характеризуются наличием совместимых липких концов. Для прямого клонирования ДНК в pTRAc, pTRAkc-rbcs-cTP и pTRAkc-A, каждый из векторов расщепляли RE в сайтах Afllll/Xhol, Mlul/Xhol и Ncol/Xhol, соответственно. Клонирование ДНК в векторах проводилось в соответствии со стандартным протоколом с последующей трансформацией в химически компетентные клетки E.coli DH5-a (Е. cloni(tm), Lucigen). Отдельные рекомбинантные колонии проверяли с помощью ГЩР колоний. Для клонирования в pTRAkc-ERH, сайт фермента рестрикции NotI добавляли для замещения стоп-кодона каждой из четырех ротавирусных кДНК с помощью ГЩР-амплификации. кДНК амплифицировали с использованием праймеров, как описано в таблице 1. Условия реакции ГЩР включали в себя денатурацию при 95°С в течение 5 мин, после чего пять циклов денатурации при 95°С в течение 30 сек, отжиг при 52°С в течение 1 мин и элонгацию при 72°С в течение 1,5 мин. Следующие 20 циклов выполняли следующим образом: 95°С в течение 30 сек, 57°С в течение 1 мин, 72°С в течение 1,5 мин и 72°С в течение 5 мин. Амплифицированные фрагменты затем клонировали в pGEM-T-Easy (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Трансформацию проводили в химически компетентных клетках DH5-a E.coli (Е. cloni(tm), Lucigen). ГЩР колонии затем проводили на выбранных колониях, как это было сделано для других трех конструктов.
ДНК pGEM-VP из положительных колоний секвенировали для проверки верности ГЩР. ДНК расщепляли с NcoI/NotI и соответствующий фрагмент ДНК, клонировали в pTRAkc-ERH в сайты Ncol и Notl для образования pTRAkc-ERH-VP. Трансформацию затем проводили в клетках DH5-a E.coli, как выполняли ранее. Способ колоний ГЩР проводили также для проверки ротавирусной ДНК в отдельных колониях.
Трансформация Agrobacterium
Штамм GV3101 Agrobacterium tumefaciens был предоставлен профессором Rainer Fischer (Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Aachen, Germany) и сделан электрокомпетентным, как описано ранее (Shen and Forde, 1989). Триста нанограмм выделенных ротавирусных PTRA-VP конструктов смешивали с 100 мкл электрокомпетентных GV3101 клеток в 0,1 см кювете для электропорации (BioRadTM), затем электропорировали в GenePulser (BioRad) при следующих настройках: 1,8 кВ, 25 MKF И 200 XX Инкубирование проводили в течение 1 часа при 27°С в 900 мкл LB перед высевом на планшеты, содержащие LA 50 мкг/мл карбенициллина (carb), 30 мкг/мл канамицина (кап) и 50 мкг/мл рифампицина (rif). Планшеты инкубировали при 27°С в течение 3 дней. Для проверки положительных трансформантов, ДНК плазмиду выделяли из рекомбинантных колоний Agrobacterium и обратно-трансформировали в компетентные клетки DH5-a E.coli. Затем их отбирали на 100 мкг/мл ампициллина (amp) LA. Способ колоний ГЩР и расщепление рестриктазами по кДНК осуществляли, чтобы проверить успешных трансформантов.
Запасы в глицерине соответствующего рекомбинантного Agrobacterium выполняли и хранили при -70°С.
Инфильтрация рекомбинантного Agrobacterium
Используемый в настоящем исследовании LBA 4404 A. tumefeciens (рВГМ-НЗ) получали из Marcel Prins (Laboratory of Virology, Wageningen University, Binnenhaven, Netherlands). Он содержит суперссор сайленсинга NSs, найденный в вирусе пятнистого увядания томатов (TSWV). Рекомбинантный Agrobacterium (pTRA-VPs) из запасов в глицерине выращивали при 27°С в течение ночи в LB с 50 мкг/мл carb, 30 мкг/мл кап и 50 МКГ/МЛ rif. Рекомбинантный Agrobacterium и LBA4404 (pBIN-NSs) затем каждый инокулировали в индукционной среде (LB, 10 мМ 2-(М-морфолино)этансульфоновой кислоты MES, 2 мМ MgS04, 20 мкМ ацетосирингон, 50 мкг/мл carb, 30 мкг/мл кап и 50 МКГ/МЛ rif, и рН 5,6).
Культуры инкубировали при 27°С в течение ночи. Клетки Agrobacterium собирали центрифугированием при 4000 оборотах в минуту в течение 5 минут при 4°С, а затем ресуспендировали в 2 мл среды инфильтрации (10 мМ MES, 10 мМ MgCb, 3% сахароза, рН 5,6, 200 мкМ ацетосирингон и стерильную вода). Проверяли оптическую плотность (OD600) клеток и разбавляли средой инфильтрации для получения OD600 0,25. Для каждого конструкта PTRA-VP LBA4404 смешивали с рекомбинантными Agrobacterium до конечного OD600 0,5. Для исследования коэкспрессии каждый конструкт добавляли до общей OD 600 0,5, например; VP2 - 0,25 и VP6 - 0,25, пока OD 600 для смеси составила 0,5. Ацетосирингон, использованный в индукционной и инфильтрационной среде, помогает в активации генов vir в Agrobacterium.
Поврежденные растительные клетки выпускают фенольные соединения, которые обнаруживаются генами Vir А и G Vir в Agrobacterium, впоследствии приводя к индукции экспрессии белка в клетках-хозяевах (Zupan, J. et al., 2000). Затем клетки инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч, чтобы позволить ацетосирингону индуцировать гены vir. Растения дикого типа N. benthamiana возрастом 3 недели подвергали инфильтрации с рекомбинантной Agrobacterium, экспрессирующей белки VP. Это включало в себ или вакуум-инфильтрацию целых растений, или инъекцию рекомбинантной Agrobacterium (PTRA-VP) в абаксиальные воздушные пространства на нижней стороне листьев растений. Рекомбинантную агробактерию подвергали инфильтарации с или без супрессора сайленсинга LBA 4404 (pBIN-NSS).
Первоначально, 2 мл суспензии среды инфильтрации Agrobacterium вводили в каждое растение с использованием шприца на конструкт. Одно растение использовали на конструкт в течение семидневного периода. Также проводили коэкспрессию ротавирусных белков, в которых VP2, VP6 и VP4 одновременно экспрессировались в цитоплазме листьев растений N. benthamiana. Исследуемые комбинации представляли собой VP2/6 и VP2/6/4. Белок "шип" VP4 может связываться с VP6, и, таким образом, существует возможность, что они могли бы добавлять к структурам RLP. Были попытки клонирования VP7, но вопросы токсичности к клеткам-хозяевам оказались проблемой. Рекомбинантный VP7 Agrobacterium уничтожал клетки листьев в течение суток после инфильтрации. Чтобы избежать это испытывали несколько способов, такие как инфильтрация растений при низкой температуре 17°С и инфильтрация через 3 дня и/или 5 дней периода исследований. Таким образом, VP7 был опущен в исследованиях коэкспрессии из-за его токсичной природы в растениях табака.
Экстракция белка
Собирали целые листья или два листовых диска на конструкт и измельчали в жидком азоте. Вещество измельченного листа ресуспендировали в стерильном PBS, содержащем полный ингибитор протеазы (без ЭДТА; Roche). Затем смесь центрифугировали в течение 5 мин при 13000 оборотах в минуту, и гранулы (вещество листа растения) выбрасывали. 100 мкл каждого конструкта затем смешивали с 5Х ДСН-ПААГ загрузочного буфера и кипятили в течение 2 мин при 95°С, подготавливая для дальнейшего анализа на ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Остальные образцы хранили при -20°С для последующего использования. На фиг. 4 показан обзор процедуры клонирования и инфильтрации для ротавирусной кДНК.
Экстракции белков апопласта
Дополнительную процедуру экстракции проводили на pTRAkc-A, конструктах апопласта. Апопласт представляет собой свободное диффузионное пространство между плазматической мембраной и клеточными стенками растительных клеток (фиг. 5А). Белки, экспрессированные в цитоплазме, содержат последовательность экспорта, которая нацеливает их на апопласт, следовательно, они накапливаются в нем. В последующей процедуре экстракции целые листья от каждого дня экстракции подвергали либо вакуум-инфильтрации, либо инъекционной инфильтрации со стерильным PBS, содержащим полный ингибиторов протеазы. Для вакуумной инфильтрации отдельные листья растений суспендировали в PBS и помещали под вакуум при 100 мбар в течение 10 мин в вакуумной камере. Листья затем перекатывали
и осторожно помещали в спиновые колонки (по аналогии со спиновыми колонками Qiagen) с отверстием в нижней части (фиг. 5Ь2). Отверстия позволяют легко проходить текучей жидкости из листьев, не позволяя проходить твердому веществу листа. Спиновые колонки помещали в пробирки Эппендорфа объемом 2 мл и центрифугирование проводили при 4000 оборотах в минуту в течение 15 мин (фиг. 5ЬЗ). Фильтрат собирали и добавляли краситель загружаемого белка для гелей ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга к 100 мкл каждого образца фильтрата. Вестерн-блоты и окрашивание кумасси
Вестерн-блоты и окрашенные кумасси синим ДСН-ПААГ использовали, как описано выше. Мышиное антитело к VP6 ротавируса (US Biologicals) (1: 5000), антитело к мышиному тегу гистидина (Sigma(r)) (1: 2000), сыворотки цыпленка к VP2 и к VP4 (1: 2000) использовали для исследования каждого из соответствующих белков в вестерн-блоттинге. Окрашенные кумасси синим гели ДСН-ПААГ использовали для количественной оценки белков путем сканирования плотности полос с использованием Syngene Gel Documentation System.
Электронная микроскопия
Для определения, собираются ли экспрессированные белки в RLP, проводили трансмиссионную электронную микроскопию (ТЕМ) иммуно-захваченных частиц на 3-й день экспрессии экспрессированных в цитоплазме VP6, VP2/6 и VP2/6/4, все в присутствии супрессора сайленсинга Nss. Углеродно/медные сетки, обработанные в тлеющем разряде, размещали на 20 мкл мышиного антитела к VP6 ротавируса (1: 5000) в течение 5 мин, а затем промывали три раза стерильной дистиллированной водой. Сетки затем помещали на 10 мкл белковых экстрактов и оставляли на 2 мин, а затем промывали три раза снова стерильной дистиллированной водой. Наконец, сетки размещали на 20 мкл 2% уранилацетата в течение 1 мин перед просмотром под ТЕМ (Zeiss 912 OMEGA Energy Filter Transmission Electron Microscope, University of Cape Town).
Для выделенных из градиентов сахарозы образцов, сахароза сначала должна быть удалена с помощью диализа до иммунно-захвата на медных сетках. Если не удалить, кристаллы сахарозы ингибируют окончательный просмотр образцов под ТЕМ, поскольку она образует кристаллы на сетках, нарушая структуру связанного углерода и материала. Фракции сахарозы помещали в 10 000 МВт диализные кассеты и подвергали диализу в стерильном PBS, содержащем 0,4 М NaCl в течение 4 часов перед заменой буфера и оставляли на ночь при 4°С при перемешивании. Поскольку
объем увеличивается с диализом, образцы белка требуют концентрирования. Образцы подвергали вакуумной сушке вымораживанием в течение 3 часов и ресуспендировали в 2 мл стерильного PBS, готовые для дальнейшего анализа. Очистка RLP в градиенте сахарозы
Белковые растительные экстракты первоначально фильтровали через мираклос для удаления твердого растительного вещества. Градиенты сахарозы от 10 до 60% сахарозы создавали в 40 мл пробирках, каждая путем создания шести слоев по 5 мл сахарозы, растворенной в стерильном PBS (рН 7,4). Очищенные образцы белка в объемах от 5 до 10 мл затем загружали в верхнюю часть каждой градиентной колонки.
Ультрацентрифугирование при 150 ООО g (бакет-ротор SWTi28, Beckman Coulter) проводили при 4°С в течение 1 ч 30 мин. В конце центрифугирования 2 мл фракции собирали со дна каждой колонки с помощью пункции пробирки. Дот блоты затем выполняли для определения фракциий с представляющими интерес белками. Для каждой фракции 1 мкл образца наносили в виде сетки на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем блокировали блокирующим буфером BSA. Вестерн-блоттинг затем выполняли как обычно. Белки изучали с мышиным антителом к VP6 (1: 5000) для VP6 или сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 (1: 5000) для двух других белков.
Анализ всех растворимых белков
Все растворимые белки (TSP) определяли по анализу Бредфорда. Его выполняли для сравнения содержания накопленных в цитоплазме белков, коэкспрессированных VP2/6. Белок IgG (маточный раствор 1,43 мг/мл) использовали в сериях разведений в качестве стандарта. 5 мкл стандарта и каждый образец добавляли на чистый сухой планшет для микротитрования. Реагенты А и В для определения всего растворимого белка добавляли в соответствии с инструкциями производителя (Bio-Rad Dc Protein Assay). Все эксперименты проводили в трех повторениях. Оптическую плотность регистрировали при 750 нм с использованием микропланшетного ридера (Bio-tek PowerWave XS).
Результаты
Экспрессия VP6 в клеточных компартментах листьях растений
VP6 экспрессировали и нацеливали на все клеточные компартменты (фиг. 6; (линия отмечает VP6, при ~ 42 кДа)), с и без супрессора сайленсинга. В цитоплазме белок экспрессировали с первого дня периода исследований с увеличением накопления белка в цитоплазме на протяжении недельного исследования (фиг. 6а). В ER накопление белка было отчетливо видно только на 3-й день (фиг. 6Ь). Белок пробегал в
полосе более высокого размера (приблизительно 11 кДа и более), чем другие белки. Это может быть результатом добавленного к С-концевой части, а также к сайту расщепления (относится к вектору последовательности рРгоЕх) белка тега гистидина 6.
Накопление белка в хлоропластах происходило между 1 и 3 днями (фиг. 6 "хлоропласты"). Супрессор сайленсинга оказывал влияние на белки, поскольку никаких белков не было обнаружено в его отсутствие. Не было экспрессии белка в дни 5 и 7. Апопласт, так же, как и ER, характеризовался наилучшим накоплением белка между 3 и 5 дням периода испытания (фиг. 6 "апопласт") и его отсутствием в 1 и 7 день. Супрессор сайленсинга характеризовался положительным эффектом, особенно на 3-й день, приводя к более высокому содержанию белков, по сравнению с тем, когда он был исключен. Также видно, что две полосы видны на отметке ~ 40 кДа, вероятно, в результате отщепления сигнального тега от белка VP6.
ER, хлоропласты и апопласт все проявляли самую высокую экспрессию белка на 3-й день с самым сильным накоплением белка в присутствии супрессора сайленсинга. Цитоплазма была лучшей с точки зрения накопления белка, как это показано высокой и повышающейся экспрессией белка в течение всего периода исследования.
Экспрессия меченых гистидином ротавирусных белков в цитоплазме
Четыре ротавирусные VPs клонировали в дополнительный вектор, pTRAc-HT. Этот вектор включает в себя тег 6-гистидин к белкам, нацеленных на цитоплазму, и делает обнаружение легким с использованием антитела к гистидиновому тегу, если антитела к представляющим интерес белкам недоступны. В случае авторов настоящего изобретения только VP6 характеризуется наличием коммерчески доступного антитела и, следовательно, авторы настоящего изобретения попробовали эту процедуру для раннего выявления всех белков в ожидании сыворотки. Цитоплазма также хорошо работала для экспрессии VP6 и мотивировала авторов настоящего изобретения попробовать использовать другие белки.
Результаты вестерн-блоттинга экстрактов на 3-й день из 7-дневного периода исследования показали успешную экспрессию VP2, VP4 и VP6 (фиг. 7а). Для того, чтобы получить экспрессию VP7 в растениях, были опробованы различные способы. Тем не менее, инфильтрованные с VP7 растения проявляли пожелтение листьев с 1-го дня и продолжали слабеть в течение периода исследования (фиг. 7Ь). Экспрессию белка не обнаружили в этих условиях даже после 1-го дня инфильтрации, когда растение еще выглядело достаточно хорошо.
Экспрессия VP2 и VP4 в растениях
VP2 и VP4 подвергали инфильтрации в листья растения N. benthamiana и нацеливали на ER, хлоропласт, цитоплазму и апопласт. Авторы настоящего изобретения были не в состоянии экспрессировать нацеленный на вектор апопласта VP2, поскольку они не могли получить никаких позитивных клонов в E.coli. Тем не менее, белок успешно экспрессировали и нацеливали на все 3 другие компартмента (фиг. 8а). Сыворотку цыпленка к VP2 и к VP4 (1:2000) использовали в вестерн-блоттинге экстрактов. Полосы VP2 и VP4 были видны чуть ниже метки 100 кДа (полосы белка, указанные стрелкой), как показано на фиг. 8а и 8Ь, соответственно. Экспрессия оказалась лучшей в цитоплазме и ER для VP2, в то время как для VP4 - в цитоплазме и апопласте. Супрессор сайленсинга не оказывал значительного влияния на экспрессию белков. Он лишь немного повышал экспрессию в конструкте ER VP2 и не так сильно в остальных, как видно из вестерн-блота. Конструкты VP4 все экспрессировались в присутствии супрессора сайленсинга.
Коэкспрессия VP2/6 и VP2/6/4 в цитоплазме
Цитоплазма оказалась лучшей для экспрессии ротавирусного белка капсида и проявила самую высокую эффективность экстракции. Поэтому все дальнейшие работы по экспрессии осуществляли с белками, нацелено воздействующими на цитоплазму.
Как было показано, VP2 и VP6 образуют RLP с защитными иммуногенными реакциями у мышей и, следовательно, исследовали коэкспрессию VP2/6 и VP2/6/4 в цитоплазме. Экстракты 3-го дня коэкспрессированных VP2/6/4 обнаруживали с помощью вестерн-блоттинга с сывороткой к VP2 и VP4 (1/5000) и мышиным антителом к VP6 (1:5000) (фиг. 9). Экспрессия VP6 была очень высокой, как определено ранее, но экспрессия VP2 и VP4 была очень низкой, как видно из очень слабой полосы на метке 100 кДа. Это, возможно, было обусловлено коэкспрессией, в результате которой больше ресурсов клеток-хозяев использовалось при гиперэкспрессии VP6, оставляя меньше для VP2 и/или VP4. Также было не легко определить, представляют ли собой обнаруженная полоса VP2 и VP4 или любой из этих 2 белков. Очень заметная полоса, проходящая над 130 кДа, может представлять собой димеризованные белки VP6. Полоса, видимая на метке 55 кДа, скорее всего, представляет собой обильный растительный фермент Rubisco.
Анализ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии на экспрессированные в цитоплазме VP6, а также на коэкспрессированные VP2/6 и VP2/6/4, проводили для проверки белковых частиц и собранных RLP (фиг. 10). Также
определяли, действительно ли VP2 и/или VP4 успешно коэкспрессируются. VP6 при экспрессии отдельно собирался для образования оболочки белка, как указано стрелкой на фиг. 10Ь. При добавлении VP2 частицы собирались для образования RLP (фиг. 10с). VP2 выступает в качестве поддерживающего белка, что позволяет другим белкам собираться и в конечном итоге образовывать полную структуру ротавируса. VP6 как таковой связывался с VP2, но было все также не легко определить структуры VP4 в коэкспрессированном VP2/6/4. Электронная микрофотография на фиг. 10d может представлять собой чисто собранные частицы VP2/6. Было показано, однако, что VP4 связывается с VP6 во время сборки белка, и это происходит до связывания VP7. Вполне вероятно, что эти структуры VP4 не стабильны и могут разрушать структуру RLP в ходе процедур подготовки к электронной микроскопии. Очистка VP2/6 и VP2/6/4 в градиенте сахарозы
VP2/6 и VP2/6/4 очищали на градиенте сахарозы в интервале от 10 до 60% сахарозы (фиг. Па). 2 мл фракции собирали со дна каждой пробирки и исследовали с помощью мышиного антитела к VP6 и/или сыворотки цыпленка к VP2 и VP4 для определения того, какие фракции содержат белки. Для VP2/6, белки были найдены во фракциях 16 и 17, поскольку они были положительными на VP6 белок на блоте (фиг. lib). Блот-анализ VP2/6/4 с сывороткой цыпленка к VP2 и VP4 показал положительные результаты на всех фракциях. Это может быть следствием высокого содержания обнаруженного фонового белка в сыворотке цыпленка. Тем не менее, интенсивность дотов была самой высокой во фракциях 17 и 18, как показано на фиг. 11с, возможно из-за более высокой концентрации представляющих интерес белков в этих фракциях.
Соединяя эти результаты вместе (фиг. lib и 11с), ротавирусные белки были в фракциях в диапазоне от 16 до 20.
Вестерн-блоттинг и окраска фракций кумасси
Вестерн-блоттинг и ДСН-ПААГ коэкспрессированных VP2/6 выполняли для проверки наличия белков VP2 и VP6 во фракциях от 13 до 20. Вестерн-блоттинг для белка VP6, проводимый с мышиным антителом к VP6, был положительным во фракциях от 16 вплоть до 20 (фиг. 12а, нижняя стрелка и фиг. 12с). Белок VP2, проанализированный с сывороткой цыпленка к VP2, был обнаружен во фракциях от 17 до 20 (фиг. 12а, верхняя стрелка). В прошлых исследованиях коэкспрессии было показано, что VP2 экспрессируется меньше, чем VP6, и это также показано в
настоящем изобретении на фиг. 12а, на которой полосы белка VP2 характеризуются более низкой интенсивностью, по сравнению с VP6.
Фракции 16 и 17 коэкспрессированных VP2/6, как было определено ранее с помощью дот блотов как содержащие белок VP6 (фиг. lib), подвергали электрофорезу на ДСН-ПААГ геле. Белок известной концентрации, клетку насекомого SF9, экспрессирующую VP6 (0,91 мкг/мкл), включали таким образом, чтобы определить концентрацию VP2/6 неочищенных белков (фиг. lib и с). Это выполняли путем сканирования плотности полосы неочищенного белка (линия, помеченная неочищ.), с использованием Syngene Gel Documentation System и, следовательно, позволило авторам настоящего изобретения определить количество VP2/6 на килограмм листьев исходного растения. Выход белка установили на уровне приблизительно 1,54 г/кг сырого веса (FW). 1,1 мг очищенного RLP получали из 1 г растительного материала (1,1 г/кг).
Анализ всего растворимого белка VP2/6
Весть растворимый белок (TSP) определяли в коэкспрессированных VP2/6 фракциях для определения относительных количеств белка VP2/6 (фиг. 13). Концентрации белка рассчитывали как 0,538 мг/мл и 1,012 мг/мл для фракций 17 и 18, соответственно, с использованием стандарта IgG (фиг. 13а). Полосы белка, соответствующие VP2/6 в этих фракциях, рассчитывали путем сканирования плотности на Syngene Gel Documentation System, и определяли как приблизительно 0,108 мг/мл и 0,202 мг/мл, соответственно.
Таким образом, TSP для VP2/6 в фракциях 17 и 18 оба составляли приблизительно 20% TSP. Большинство RLP в колонке сахарозы было определено, как находящиеся между 15 и 25% сахарозы, соответствуя фракциям с 15 до приблизительно 20, где граф отмечал внезапный пик, а затем спад. Различия в плотности различных материалов в экстракте позволило авторам настоящего изобретения отделить и таким образом очистить представляющие интерес белки. Гели ДСН-ПААГ, окрашенные кумасси синим, показали только одну заметную полосу, указывающую на то, что белки относительно чистые (фиг. 12Ь).
ТЕМ очищенных VP2/6
Очищенные фракции VP2/6 объединяли вместе и диализовали в PBS с высоким содержанием соли для удаления сахарозы перед просмотром на трансмиссионном электронном микроскопе. ТЕМ выполняли для определения чистоты и проверки того, остаются ли RLP интактными после процедуры очистки. Как видно на фиг. 15,
большинство из фонового материала, который в основном состоял из продуктов клетки-хозяина (фиг. 10Ь, с и d), удаляли, оставляя за RLP. Большинство из RLP оставались нетронутыми, но некоторые, казалось, потеряли форму, вероятно, в результате деформации из-за условий на сетке ЕМ.
Предварительный анализ экспрессии ротавирусных структурных белков в листьях N. benthamiana
Этот предварительный анализ фокусировался на экспрессии ротавирусных структурных белков VP2 (SEQ ID NO: 1), VP4 (SEQ ID NO: 2), VP6 (SEQ ID NO: 3) и VP7 (SEQ ID NO: 4) в листьях N. benthamiana в качестве системы экспрессии хозяина. Штамм выбранного в настоящем документе ротавируса представлял собой штамм G9 Р[6], который циркулирует преимущественно в Южной Африке и других регионах к югу от Сахары. Вакцина RLP, нацеленно воздействующая на этот штамм, поможет в облегчении бремени заболеваний в странах Африки южнее Сахары.
Экспрессия гликопротеина VP7 не наблюдалась, возможно, из-за его токсического эффекта на клетки растений. Стоит отметить, что для этого
В настоящем анализе использовали систему опосредованной Agrobacterium временной экспрессии. Временная экспрессия, в отличие от трансгенной экспрессии, позволяет быстро экспрессировать белки в относительно короткий промежуток времени без интеграции ротавирусных генов белков капсида в хромосоме хозяина. Большинство белков экспрессировались и накапливались в заметных количествах к 3-му дню инфильтрации рекомбинантного Agrobacterium в листья N. Benthamiana. Как показано ниже, наблюдалась удачная экспрессия нескольких ротавирусных структурных белков, включающая в себя VP2, VP4 и VP6 в клеточных компартментах листьев растений, как указано в таблице 2:
предварительного исследования использовали VP7, содержащий его родной сигнальный пептид. Также пытались осуществить инфильтрацию на 3-й день во время испытаний коэкспрессии. Это была попытка посмотреть, экспрессировался ли белок и вскоре после собирался с VP2 и VP6 для образования RLP. Токсическая природа рекомбинантного VP7, как отмечено в настоящем исследовании, была описана ранее (Williams et al, 1995; McCorquodale, 1987; Arias et al, 1986).
О прошлых исследованиях экспрессии VP7 в трансгенных растениях картофеля сообщалось (Li et al, 2006; Choi et al, 2005; Wu et al, 2003). Choi с соавт. (2005) использовали обезьяний ротавирусный VP7 и Li et. al. and Wu с соавт. (Li et al, 2006; Wu et al., 2003) использовали VP7 Gl группы А человека. В описанных в настоящем документе результатах использовался VP7 G9 ротавируса человека.
VP2 экспрессировали и нацеливали на все компартменты, кроме апопласта, так как авторы настоящего изобретения были не в состоянии клонировать соответствующую кДНК, и временные ограничения давали возможность авторам настоящего изобретения только нескольких попыток, прежде чем приступить к другим конструктам. Уровни экспрессии VP2, как было отмечено, быть довольно низкими во всех компартментах. В прошлом исследовании, цитируемом Saldana с соавт. 2006, был сделан вывод о том, что VP2, содержащий свою оптимизированную последовательность для экспрессии в растении, было невозможно экспрессировать, несмотря на обнаружения мРНК в растительных клетках. Им, однако, удалось экспрессировать его в клетках растения томата с использованием синтетической ДНК. Причина трудностей в экспрессии VP2, скорее всего, заключается в результате неправильной трансляции мРНК или в том, что мРНК содержит некоторые мотивы последовательности, которые дестабилизируют растительные клетки (Kawaguchi and Bailey-Serres, 2002). Доказательство низких уровней экспрессии VP2, по сравнению с VP6, было замечено в исследованиях экспрессии как на клетках растений, так и на клетках насекомых такими авторами, как Мепа с соавт. (2006), Saldana с соавт. (2006), Vieira с соавт. (2005) и Labbe с соавт. (1991).
Белок внешнего капсида, VP4, который образует шипы на поверхности структуры вириона, экспрессировали и нацеливали на накопление в цитоплазме, ER и апопласте. Никакого накопления белка не было обнаружено в хлоропластах. Как наблюдалось для VP2, уровни экспрессии белка для VP4 были ниже, чем обнаруженные для VP6 на вестерн-блотах. Белок содержит сайт расщепления трипсином, который приводит к образованию двух белков, VP5 и VP8. Возможно,
местный трипсин в листьях N. benthamiana расщепляет некоторые из белков, как только они производятся, приводя к более низким уровням концентрации накопленного, неповрежденного VP4 в указанных компартментах. Было показано, что белок представляет собой важный нейтрализующий антиген, но было несколько попыток клонировать целый белок для разработки вакцины (Khodabandehloo et al., 2009; Mahajan et al, 1995; Nishikawa et al, 1989). Однако, были некоторые исследования в системе экспрессии клеток насекомых и дрожжей, показывающие экспрессию либо VP5, либо VP8 субъединиц VP4 (Andres et al., 2006; Favacho et al, 2006; Kovacs-Nolan et al, 2001). На сегодняшний день, настоящее исследование представляет собой первое исследование, показывающее экспрессию целого белка в растительной системе экспрессии.
VP6 экспрессировался во всех компартментах со сверхэкспрессией, наблюдаемой в цитоплазме с накоплением белка, наблюдаемым с 1-го дня до 7-го дня в этом компартменте. Это противоречит некоторой литературе, которая предполагает, что активность протеазы и сайленсинг генов уменьшают или препятствуют накоплению чужеродного белка в цитоплазме (Fischer et al., 2004). Кроме того, при правильных условиях рН, VP6, как известно, самостоятельно собирается в трубчатые или спиральные частицы, очень похожие на частицы, наблюдаемые в исследовании авторов настоящего изобретения (фиг. 9В) (Estes et al, 1987). VP6 составляет приблизительно 50% вирусной сердцевины и, следовательно, представляет собой основной антиген в разработке ротавирусной вакцины. Достигнутый выше результат позволил авторам настоящего изобретения дополнительно исследовать коэкспрессию VP2, VP6 и VP4 в цитоплазме.
При коэкспрессии в цитоплазме, VP2 и VP6 собирались с образованием RLP. Наблюдался очень высокий выход белка из системы временной экспрессии, составляющий от 1,27 до 1,54 г/кг FW. При очистке на колонке сахарозы количество сохраненных VP составляло 1,1 г/кг FW. Этот выход сравним с полученным для производства антитела, IgG, с использованием системы временной экспрессии в N. benthamiana, с выходом до 1,5 г/кг FW (Vezina et al, 2009). Saldana с соавт. (2006) до сих пор представляли собой единственную группу, известную тем, что они успешно выполнили коэкспрессию ротавирусных VP2 и VP6 в трансгенных растениях томата и до уровней, составляющих приблизительно 1% общего растворимого белка. Сборка VP2/6 в системе экспрессии клеток насекомых хорошо описана (Vieira et al, 2005; O'Brien et al., 2000). Также было показано, что эти VP2/6 RLP обеспечивают защитный
иммунитет против ротавирусной инфекции (Zhou et al., 2011, Saldana et al., 2006). Таким образом, RLP VP2/6, произведенные авторами настоящего изобретения в растительной системе экспрессии, представляют собой подходящих кандидатов для разработки вакцины ротавирусных субъединиц.
Также коэкспрессировали и обнаруживали VP2/6/4. Первый пик, обнаруживаемый (фиг. 14, фракция 16) в прочтении абсорбции общего белка коэкспрессированных белков, может представлять собой собранный VP2/6/4, но при рассмотрении этой фракции под ТЕМ, никаких RLP выявлено не было. Наблюдаемый пик белка может представлять собой результат накопления мономеров VP4 или его соответствующих субъединиц VP5 и VP8. Второй пик (фракция 18), при исследовании под ТЕМ, показал структуры RLP, очень похожие на увиденные в образце VP2/6. Тем не менее, Crawford с соавт. ранее сообщали, что VP4 не может быть виден под ТЕМ и что частицы VP2/6/4 и VP2/6/4/7 характеризуются одинаковой структурой и диаметром под ТЕМ (Crawford, 1994). Авторы настоящего изобретения сделали такое же наблюдение для RLP VP2/6/7, RLP VP2/6/4/7 и RLP VP2/6, которые все выглядят похожими под регулярным ТЕМ.
Пример 2
Конструкты
A-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP2 (optVNOS (конструкт номер 1710) Оптимизированную последовательность, кодирующую VP2 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP2(opt).sl+3c (фиг. 17А, SEQ ID NO: 21) и IF-WA_VP2(opt).sl-4r (фиг. 17В, SEQ ID NO: 22) с использованием оптимизированной последовательности гена VP2 (фиг. 19, SEQ ID NO: 45) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP2 (GenBank, номер доступа САА33074) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17С) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion.
Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов, в основанной на CPMV-НТ экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательности с левой к правой границе т-ДНК представлены на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1710 (фиг. 23, SEQ ID NO: 27). Аминокислотная последовательность VP2 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 20 (SEQ ID NO: 25). Представление плазмиды 1710 представлено на фиг. 21.
B-2X35S/CPMV-HT/RVA (WA) VP2(opt)/NOS в ВеУРУ(т)+система амплификации репликаз (контрукт номер 1711)
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP2 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую ВеУОУ(т)+систему амплификации репликазы в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP2 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP2(opt).sl +3с (фиг. 17А, SEQ ID NO: 21) и IF-WA_VP2(opt).sl-4r (фиг. 17В, SEQ ID NO: 22) с использованием оптимизированной последовательности гена VP2 (фиг. 19, SEQ ID NO: 45) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP2 (GenBank, номер доступа САА33074) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 193 (фиг. 22A) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1711 (фиг. 23, SEQ ID NO: 27).
Аминокислотная последовательность VP2 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 20 (SEQ ID NO: 25). Представление плазмиды 1711 представлено на фиг. 24.
C-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (конструкт номер 1713)
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP6 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP6 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-WA_VP6(opt).sl +3с (фиг. 25а, SEQ ID NO: 28) и IF-WA_VP6(opt).sl-4r (фиг. 25b, SEQ ID NO: 29) с использованием оптимизированной последовательности гена VP6 (фиг. 46) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP6 (GenBank, номер доступа ААА47311) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17с) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1713 (фиг. 25с, SEQ ID NO: 30). Аминокислотная последовательность VP6 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 26 (SEQ ID NO: 31). Представление плазмиды 1713 представлено на фиг. 27.
D-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS в BeYDV(m) + система амплификации репликазы (конструкт номер 1714)
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP6 из штамма WA ротавируса А, клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую BeYDV(m)+cncTeMy амплификации репликазы в плазмиде, содержащей экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP6 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-
WA_VP6(opt).sl+3c (фиг. 25a, SEQ ID NO: 28) и IF-WA_VP6(opt).sl-4r (фиг. 25b, SEQ ID NO: 29) с использованием оптимизированной последовательности гена VP6 (SEQ ID NO: 46) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP6 (GenBank, номер доступа САА47311) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 193 (фиг. 22A) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1714 (фиг. 28, SEQ ID NO: 32). Аминокислотная последовательность VP6 от штамма WA ротавируса А представлена на фиг. 26 (SEQ ID NO: 31). Представление плазмиды 1714 представлено на фиг. 29. C-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS (конструкт номер 1730) Оптимизированную последовательность, кодирующую VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS, содержащую BeYDV(т)+систему амплификации репликазы, в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP4 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c (фиг. 30А, SEQ ID NO: 33) и IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r (фиг. ЗОВ, SEQ ID NO: 34) с использованием оптимизированной последовательности гена VP4 (SEQ ID NO: 47) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP4 (GenBank, номер доступа АЕХ30660) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт 1191 (фиг. 18, SEQ ID NO: 23) расщепляли
рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV PI9 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе т-ДНК представлена на (фиг. 18, SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1730 (фиг. 31С, SEQ ID NO: 50). Аминокислотная последовательность VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 32 (SEQ ID NO: 36). Представление плазмиды 1730 представлено на фиг. ЗЗА.
E-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP4(opt)/NOS в ВеУРУ(т)+система амплификации репликаз (контрукт номер 1731)
Оптимизированную последовательность, кодирующую VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP4 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c (фиг. 30А, SEQ ID NO: 33) и IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r (фиг. ЗОВ, SEQ ID NO: 34) с использованием оптимизированной последовательности гена VP4 (фиг. 31В, SEQ ID NO: 47) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP4 (GenBank, номер доступа АЕХ30660) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в экспрессионную кассету 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 193 (фиг. 22А) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 193 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете в системе амплификации BeYDV(m). Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV PI9 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с
левой к правой границе т-ДНК представлена на фиг. 22В (SEQ ID NO: 26). Полученному конструкту был дан номер 1731 (фиг. 31, SEQ ID NO: 35). Аминокислотная последовательность VP4 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 32 (SEQ ID NO: 36). Представление плазмиды 1731 представлено на фиг. 33В.
F-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (конструкт номер 1733) Оптимизированную последовательность, кодирующую VP7 с нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c (фиг. 34А, SEQ ID NO: 37) и IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (фиг. 34В, SEQ ID NO: 38) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (SEQ ID NO: 54) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17А) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность слева направо границ Т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1733 (фиг. 34С, SEQ ID NO: 24). Аминокислотная последовательность VP7 с нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 35 (SEQ ID NO: 39). Представление плазмиды 1733 представлено на фиг. 36. D-2X35S/CPMV-HT/TRSP-RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (конструкт номер 1734) Оптимизированную последовательность, кодирующую VP7 с усеченной версией нативного сигнального пептида из штамма USA/Rotarix-
A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность, амплифицировали с использованием праймеров IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c (фиг. 44А, SEQ ID NO: 55) и IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (фиг. 44В, SEQ ID NO: 56) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (относящегося к нуклеотидам 88-891 из фиг. 44С, SEQ ID NO: 57) в качестве матрицы. Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1191 (фиг. 17С) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1191 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой к правой границе Т-ДНК представлена на фиг. 18 (SEQ ID NO: 23). Полученному конструкту был дан номер 1734 (фиг. 44D, SEQ ID NO: 58). Аминокислотная последовательность VP7 с усеченным нативным сигнальным пептидом из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 44Е (SEQ ID NO: 59). Представление плазмиды 1734 представлено на фиг. 44F.
G-2X35S/CPMV-HT/PDISP/RVA(WA) VP7(opt)/NOS в ВеУРУ(т)+система амплификации репликаз (контрукт номер 1735)
Последовательность, кодирующую VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А клонировали в систему экспрессии 2X35S-CPMV-HT-NOS в плазмиду, содержащую экспрессионную кассету Plasto_pro/P19/Plasto_ter, с использованием следующего основанного на ПЦР способа. Фрагмент, содержащий кодирующую VP7 последовательность без его сигнального пептида дикого типа, амплифицировали с использованием праймеров IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c (фиг. 37А, SEQ ID NO: 40) и IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r (фиг. 34В, SEQ
ID NO: 38) с использованием оптимизированной последовательности гена VP7 (фиг. 54). Для оптимизации последовательности, последовательность белка VP7 (GenBank, номер доступа АЕХ30682) обратно транслировали и оптимизировали в отношении использования человеческого кодона, содержания GC и структуры мРНК. Продукт ПЦР клонировали в рамку с сигнальным пептидом PDI люцерны в систему экспрессии 2X35S/CPMV-HT/NOS с использованием системы клонирования In-Fusion (Clontech, Mountain View, CA). Конструкт номер 1192 (фиг. 38) расщепляли рестриктазой SacII и StuI, и линеаризованную плазмиду использовали для реакции сборки In-Fusion. Конструкт номер 1192 представляет собой акцепторную плазмиду, предназначенную для клонирования "In-Fusion" представляющих интерес генов в рамке с сигнальным пептидом PDI люцерны в основанной на CPMV-HT экспрессионной кассете. Он также включает генный конструкт для коэкспрессии супрессора TBSV Р19 сайленсинга под промотором и терминатором гена пластоцианина люцерны. Каркас представляет собой бинарную плазмиду pCAMBIA и последовательность с левой до правой границы т-ДНК представлена на фиг. 39 (SEQ ID NO: 41). Полученному конструкту был дан номер 1735 (фиг. 40, SEQ ID NO: 42). Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 с из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А представлена на фиг. 41 (SEQ ID NO: 43). Представление плазмиды 1735 представлено на фиг. 42.
Оптимизированные последовательности модифицировали в отношении
преимущественного использования предпочтительных кодонов человека и увеличения содержания GC
CPMV НТ BeYDV(m)+rep SpPDI
CPMV HT - WtSp
CPMV HT - TrSp
CPMV HT - SpPDI
CPMV HT BeYDV(m)+rep WtSp
CPMV HT BeYDV(m)+rep TrSp
CPMV HT BeYDV(m)+rep SpPDI
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1768
NO: 53
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1773
[оптимизированный] NO: 52
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1774
[оптимизированный] NO: 52
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1775
[оптимизированный] NO: 52
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1776
[оптимизированный] NO: 52
RVA(SAll) SEQ ID 1777
УР7[оптимизирован NO: 52
ный]
RVA(SA11)VP7 SEQ ID 1778
[оптимизированный] NO: 52
t WtSp: сигнальный пептид дикого типа, SpPDI: сигнальный пептид
растительного происхождения, клонированная форма гена
протеиндисульфидизомеразы люцерны, TrSp: усеченный сигнальный пептид дикого типа, TrSp начинается со 2-го метионина в WtSp (МЗО).
* [оптимизированный] означает, что последовательность была оптимизирована в отношении использования кодонов, содержания GC и структуры РНК.
Пример 3
Сборка генных конструктов и трансформация Agrobacterium Все плазмиды, включающие в себя плазмиды 1710, 1713, 1730 и 1734, использовали для трансформации Agrobacterium tumefaciens (AGL1; АТСС, Manassas, VA 20108, USA), путем электропорации (Mattanovich et al., 1989, Nucleic Acid Res. 17:6747), альтернативно, может быть использован тепловой шок с использованием подготовленных с СаСЬ компетентных клеток (XU et al, 2008, Plant Methods 4). Целостность плазмид в созданных штаммах A. tumefaciens подтверждали с помощью рестрикционного картирования. Трансформированный с данной бинарной плазмидой штамм A. tumefaciens называют AGLl/''номер плазмиды". Например, штамм А. tumefaciens, трансформированный с конструктом номер 1710, называется "AGL1/1710".
Подготовка биомассы растений, посевного материала, агроинфильтрация и сбор Растения Nicotiana benthamiana выращивали из семян на платформах, наполненных коммерческой торфяной подложкой. Растения оставляли расти в теплице при 16/8 фотопериоде и температурном режиме 25°С день/20°С ночь. Через три недели после посева, отдельные проростки пикировали, пересаживали в горшки и оставляли
расти в теплице в течение трех дополнительных недель при тех же условиях окружающей среды.
Трансфицированые каждым конструктом Agrobacteria выращивали в среде LB с растительным происхождением и с добавлением 10 мМ 2-(N-морфолино)этансульфоновой кислоты (MES) и 50 мкг/мл канамицина рН5.6, пока они не достигали OD600 между 0,6 и 2,5. Суспензию Agrobacterium смешивали до достижения соответствующего соотношения для каждого конструкта и приводили к 2.5Х OD 600 с инфильтрационной средой (10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES рН 5,6). Суспензию A. tumefaciens хранили в течение ночи при 4°С. В день инфильтрации серии культур разводили средой инфильтрации в 2,5 объемах суспензии и давали нагреться до использования. Целые растения N. benthamiana помещали вверх дном в бактериальную суспензию в герметичный резервуар из нержавеющей стали под вакуумом 20-40 Торр в течение 2 мин. После инфильтрации, растения возвращали в теплицу на 3-12-дневный инкубационный период до сбора. Собранную биомассу замораживали (-80°С) до использования для очистки частиц.
Экстракция и очистка ротавирус-подобных частиц
Белки экстрагировали из замороженной биомассы путем механической экстракции в блендере с 3 объемами буфера для экстракции (TNC: 10 мМ Трис, рН 7,4, 140 мМ NaCl, 10 мМ СаСЬ). Суспензию фильтровали через большое отверстие с нейлоновым фильтром для удаления крупных примесей и центрифугировали при 5000 g в течение 5 мин при 4°С. Супернатант собирали и центрифугировали снова при 5000 g в течение 30 мин (4°С) для удаления дополнительных примесей. Супернатант подвергали глубокой фильтрации и ультра-фильтрации, и фильтрат центрифугировали при 75 000 g в течение 20 мин (4°С) для концентрирования ротавирус-подобных частиц. Содержащий частицы осадок ресуспендировали в 1/12 объема TNC и нерастворимый удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 5 минут. Супернатант фильтровали на Miracloth перед загрузкой на градиенты плотности иодиксанола.
Центрифугирование в градиенте плотности проводили следующим образом. Подготавливали пробирки, содержащие пошаговые градиенты от 5% до 45% иодиксанола, и покрывали отфильтрованными экстрактами, содержащими ротавирус-подобные частицы. Градиенты центрифугировали при 120000 g в течение 4 часов (4°С). После центрифугирования 1 мл фракции собирали со дна до верха и анализировали с помощью окраски кумасси ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга. Чтобы
удалить иодиксанол для фракций, выбранных для дальнейшего анализа, выбранные фракции центрифугировали при 75 ООО g в течение 20 мин (4°С) и осажденные частицы ресуспендировали в свежем буфере TNC. ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг
Концентрации белка определяли с помощью белкового анализа ВСА (Pierce Biochemicals, Rockport IL). Белки разделяли с помощью ДСН-ПААГ в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях и окрашивали кумасси синим. Окрашенные гели сканировали, и анализ денситометрии осуществляли с помощью программного обеспечения ImageJ (NIH).
Для иммуноблоттинга подвергнутые электрофорезу белки переносили на мембраны из поливинилиденфторида (ПВДФ) (Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN). До иммуноблоттинга мембраны блокировали 5% снятым латексом и 0,1% Твин-20 в Трис-солевом буфере (TBS-T) на протяжении 16-18 ч при 4°С.
Иммуноблоттинг проводили путем инкубирования с соответствующим антителом (таблица 5) в 2 мкг/мл в 2% снятом латексе в TBS-Tween 20 0,1%. Вторичные антитела, используемые для обнаружения хемилюминесценции представляли собой указанные в таблице 5, разбавляли, как указано в 2% снятом латексе в 0,1% TBS-Tween 20. Иммунореактивные комплексы обнаруживали с помощью хемилюминесценции с использованием люминола в качестве субстрата (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгации фермента пероксидазы хрена антител IgG человека проводили с использованием набора конъюгации активированной пероксидазы EZ-Link Plus(r) (Pierce, Rockford, IL).
VP6
Восстанавлива ющий
ABIN 308233
1:20000
Козье антитело к кроличьему (JIR 111-035144)
1:10 000
VP7
Невосстанавли вающий
Поликлональное кроличье антитело к VP7 (любезно предоставлено профессором Koki Taniguchi)
1:2000
Козье антитело к кроличьему (JIR 111-035144)
1:10 000
Фермент-связанный иммуносорбентный анализ к VP4 (ELISA) 96-луночные планшеты для микротитрования с U-дном покрывали мышиными моноклональными антителами к VP4 (любезно предоставленные профессором Koki Taniguchi), разведенными 1:100000 в 10 мМ PBS рН 7,4 (фосфатно-солевой буфер), 150 мМ NaCl в течение 16-18 часов при 4°С. После инкубации планшеты промывали три раза 10 мМ PBS рН 7,4, 1 М NaCl, содержащим 0,1% Твин-20 и блокировали 5% БСА в 10 мМ PBS рН 7,4, 150 мМ NaCl, содержащим 0,1% Твин-20 в течение 1 часа при 37°С. После стадии блокирования планшеты трижды промывали 10 мМ PBS рН 7,4, 1 М NaCl, содержащим 0,1% Твин-20. Образцы добавляли, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. Планшет затем промывали 3 раза 10 мМ PBS рН 7,4, 1 М NaCl, 1 мМ СаС12, 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Tween-20. Для всех остальных стадий промывки, промывочный буфер остается тем же и в ходе третьей промывки планшеты инкубировали 10 минут при комнатной температуре перед полным удалением моющего раствора. Добавляли поликлональное антитело кролика против ротавируса (любезно предоставленное профессором Koki Taniguchi), разведенный 1:10000 с 3% БСА в 10 мМ PBS рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Твин-20, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. Затем планшеты промывали 3 раза и добавляли конъюгированное с пероксидазой хрена козье антитело против кроличьего антитела (111-035-144, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA), разведенное 1: 5000 с 3% БСА в 10 мМ PBS рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ СаС12, 0,5 мМ MgCl2, содержащим 0,1% Твин-20, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при температуре 37°С. Планшеты промывали 3 раза. После заключительных промывок планшеты инкубировали с субстратом пероксидазы ТМВ SureBlue (KPL, Gaithersburg, MD) в течение 20 минут при комнатной
температуре. Реакцию останавливали добавлением IN НС1 и значения А450 измеряли с использованием планшет-ридера Multiskan Ascent (Thermo Scientific, Waltham, MA).
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2 и VP6.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2 и VP6, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агроинфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710 и 1713/AGL1 в пропорции 1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротавирус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола первые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фиг. 45А, ротавирусные антигены (VP2 и VP6) в основном обнаруживали во фракциях 2 и 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Вестерн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP2 подтвердил идентичность VP2 и VP6 в градиенте плотности фракций (фиг. 45В и 45С). Фракции 2 и 3 объединяли и удаляли иодиксанол высокоскоростным центрифугированием и ресуспендированием, и очищенные частицы направляли на крио-электронный микроскопический анализ (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) для подтверждения сборки VP2 и VP6 в частицы, напоминающие ротавирусную частицу. Как показано на фиг. 49 (левая панель) изображения сгуоЕМ частиц VP2/VP6 подтверждало правильную сборку антигенов в ротавирус-подобные частицы.
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP6 и VP7.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2, VP6 и VP7, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агроинфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710, AGL1/1713, AGL1/1734 в пропорции 1:1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротавирус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола первые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фиг. 46А, ротавирусные антигены (VP2, VP6 и VP7) в основном обнаруживали во фракциях
2 и 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Вестерн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP7 подтвердил идентичность VP6 и VP7 в градиенте плотности фракций (фиг. 46В и 46С).
Получение ротавирус-подобных частиц, содержащих VP2, VP4, VP6 и VP7.
Ротавирус-подобные частицы, содержащие VP2, VP4, VP6 и VP7, получали с помощью временной экспрессии в Nicotiana benthamiana. Растения подвергали агроинфильтрации с инокулятом Agrobacteria, содержащим смесь AGL1/1710, AGL1/1730, AGL1/1713, AGL1/1734 в пропорции 1:1:1:1 и инкубировали в течение 7 дней до сбора. Ротавирус-подобные частицы очищали от биомассы, используя методологию, описанную в разделе Материалы и способы. После центрифугирования осветленных экстрактов на градиенте плотности иодиксанола первые десять фракции из нижней части пробирки анализированы с помощью окрашенного кумасси ДСН-ПААГ. Как показано на фигуре 47А, 3 из 4 ротавирусных антигенов (VP2, VP6 и VP7) были видны и, главным образом, были обнаружены во фракци 3 градиента плотности, где концентрация иодиксанола составляет приблизительно 35%, концентрация, в которой ожидалось обнаружение ротавирус-подобных частиц. В этих фракциях было обнаружено очень незначительное загрязнение растительными белками. Ожидалось, отсутствие детектируемого уровня VP4 в окрашенном кумасси геле, так как VP4 не могут наблюдаться, когда тот же анализ выполняется на очищенном человеческом ротавирусном вирионе. Вестерн-блоттинг фракций с гипериммунной кроличьей сывороткой к ротавирусу и поликлональными кроличьими антителами к VP7 подтвердил идентичность VP6 и VP7 в градиенте плотности фракций (фиг. 47В и 47С). Иодиксанол удаляли из фракции 3 с помощью высокоскоростного центрифугирования и ресуспендирования и очищенные частицы анализировали с помощью ELISA для подтверждения наличия VP4. Представленные на фиг. 48 результаты наглядно показывают, что анализ ELISA специфически распознает VP4 как частицы отрицательного контроля, содержащие VP2/VP6 и VP7 только на уровне фонового сигнала. В противоположность этому, анализ 3-х различных лотов очищенных частиц, содержащих антигены VP2, VP4, VP6 и VP7, показал сильные и единые сигналы при анализе в тех же условиях. Очищенные RLP VP2/VP4/VP6/VP7 направляли на крио-электронный микроскопический анализ (Nanolmaging Services Inc., La Jolla, CA) для
подтверждения сборки четырех антигенов в частицы, напоминающие ротавирусную частицу. Как показано на фиг. 49 (справа) изображения сгуоЕМ частиц VP2/VP4/VP6/VP7 подтверждало правильную сборку антигенов в ротавирус-подобные частицы.
В таблице 6 перечислены последовательности, представленные в различных вариантах осуществления настоящего изобретения.
Экспрессионная кассета номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 34С
Аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса А
Фигура 20
Конструкт 193 от левой до правой границы тДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HTVNOS в ВеУОУ(т)+систему амплификации репликазы с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин
Фигура 22В
Экспрессионная кассета номер 1710 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 23
Праймер IF-WA_VP6(opt).sl+3c
Фигура 25а
Праймер IF-WA_VP6(opt).sl-4r
Фигура 25Ь
Экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 25с
Аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса А
Фигура 26
Экспрессионная кассета номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 28
Праймер lF-Rtx_VP4(opt).sl+3c
Фигура ЗОА
Праймер IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r
Фигура ЗОВ
Экспрессионная кассета номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
Фигура 31А
Аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавирус А
Фигура 32
Праймер lF-Rtx_VP7(opt).sl+3c
Фигура 34А
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
Фигура 34В
Аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 35
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c
Фигура 37А
Конструкт 1192 от левой до правой границы тДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р 19-пластоцианин
Фигура 39
Экспрессионная кассета номер 1735 от промотора 2X35S к терминатору NOS. PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 40А
Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Экспрессионная кассета номер 1730 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP4(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
Фигура 31С
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA ротавируса А
Фигура 19
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса А
Фигура 25 d
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 31В
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 34D
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 40В
Кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43А
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43В
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43С
Кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2]
Фигура 43D
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 34Е
Праймер IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c
Фигура 44А
Праймер IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
Фигура 44В
Нуклеотидная последовательность оптимизированной кодирующей последовательности VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
Фигура 44С
Экспрессионная кассета номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
Фигура 44D
Аминокислотная последовательность TrSp-VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А
Фигура 44Е
Ссылки
Yang Y М, Li X, Yang Н, et al. Immunogenicity and virus-like particle formation of rotavirus capsid produced in transgenic plants. Sci China Life Sci, 2011, 54: 82-89
Angel, J., Franco, M.A. and Greenberg, H.B. (2007). Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations. Nature reviews: Microbiology 5, 529-539
Araujo, I.T., Ferreira, M.S.R. and Failho, A.M. (2001). Rotavirus genotypes [4]G9, P[6]G9, and P[8]G9 in hospitalized children with acute gastroenteritis in Rio de Janeiro, Brazil. J Clin Microbiol 39 1999-2001.
Arias, C.F., Ballado, T. and Plebafiski, M. (1986). Synthesis of the outer-capsid glycoprotein of the simian rotavirus SA11 in Escherichia coli. Gene 47, 211-219
Au K.S., Mattion N.M., Estes M.K., (1993). A Subviral Particle Binding Domain on the Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NS28. Virology 194, 665-67
Balen B, Krsnik-Rasol M, (2007). N-glycosylation of recombinant therapeutic glycoproteins in plant systems. Food Technology and Biotechnology 45 1-10.
Bardor, M., Faveeuw, C, Fitchette, A.C., Gilbert,D., Galas, L., Trottein, F., Faye, L. and Lerouge P. (2003). Immunoreactivity in mammals of two typical plant glycoepitopes, core alpha (l,3)-fucose and core xylose. Glycobiology 13 427-434
Berois, M., Sapin, С, Erk, I., Poncet, D. and Cohen, J. (2003). Rotavirus Nonstructural Protein NSP5 Interacts with Major Core Protein VP2. Journal of virology 77, 1757
Bertolotti-Ciarlet, A., Ciarlet, M., Crawford, S.E., Conner, M E. and Estes, M.K. (2003). Immunogenicity and protective efficacy of rotavirus 2/6-virus-like particles produced by a dual baculovirus expression vector and administered intramuscularly, intranasally, or orally to mice. Vaccine 21, 3885-3900
Chen, J.Z., Settembre, E.C., Aoki, A.T., Zhang, X., Bellamy, A.R, Dormitzer, P.R., Harrison, S.C. and Grigorieff, N. (2009). Molecular interactions in rotavirus assembly and uncoating seen by high-resolution cryo-EM. PNAS 106, 10644-10648
Crawford, S.E., Estes, M.K., Ciarlet, M., Barone, C, O'Neal, СМ., Cohen, J. and Conner, M.E. (1999). Heterotypic protection and induction of a broad heterotypic neutralization response by rotavirus-like particles. Journal of Virology 73, 4813- 4822
Crawford, S.E., Labbe, M., Cohen, J., Burroughs, M.H., Zhou, Y.J. and Estes, M.K. (1994). Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells. Journal of virology 68, 5945-5952
Denisova, E.R., Dowling, W., LaMonica, R., Shaw, R., Scarlata, S., Ruggeri, F. and Mackow, E.R. (1999). Rotavirus Capsid Protein VP5* Permeabilizes Membranes. Journal of Virology 73 3147-3153
Dennehy, P.H. (2007). Rotavirus vaccines - An update. Vaccine 25, 3137-3141
Estes M.K (1996). Rotavirus and their replication. Fields Virology 2, 1625-1655 Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F. and Burrone, O.R. (1999). Two nonstructural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. J Gen Virol 80 333-9.
Favacho, A.R., Kurtenbach, E., Sardi, S.I. and Gouvea, V.S. (2006). Cloning, expression, and purification of recombinant bovine rotavirus hemagglutinin, VP8*, in Escherichia coli. Protein Expression and Purification 46, 196-203
Gentsch, J.R., Laird, A.R., Bielfelt, В., Griffin, D.D., Banyai, K., Ramachandran, M., Jain, V., Cunliffe, N.A., Nakagomi, O., Kirkwood, CD., Fischer, Т.К., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Jiang, B. and Glass, R.I. (2005). Serotype Diversity and Reassortment between Human and Animal Rotavirus Strains: Implications for Rotavirus Vaccine Programs J Infect Dis. 192, S146-59
Glass, R.I., Parashar, U.D., Bresee, J.S., Turcios, R., Fischer, Т.К., Widdowson, MA., Jiang, B. amd Gentsch, J.R. (2006). Rotavirus vaccines: current prospects and future challenges. Lancet 368, 323-32
Gonzalez, A.M., Nguyen, T.V., Azevedo, M.S. P., Jeong, K., Agarib, F., Iosef, C, Chang, K., Lovgren-Bengtsson, K., Morein, B. and Saif, L.J. (2004). Antibody responses to human rotavirus (HRV) in gnotobiotic pigs following a new prime/boost vaccine strategy using oral attenuated HRV priming and intranasal VP2/6 rotavirus-like particle (VLP) boosting with ISCOM. Clinical & Experimental Immunology 135 361-372
Gonzalez, R.A., Espinosa, R., Romero, P., Lopez, S. and Arias CF. (2000). Relative localization of viroplasmic and endoplasmic reticulum-resident rotavirus proteins in infected cells. Archives of Virology 145, 1963-1973
Greenberg, H.B. and Estes, M.K. (2009). Rotaviruses: From Pathogenesis to Vaccination. Gastroenterology 136, 1939-1951
Hoshino, Y., Jones, R.W. and Kapikian, A.Z. (1998). Serotypic characterization of outer capsid spike protein VP4 of vervet monkey rotavirus SA11 strain. Archives of Virology 143, 1233-1244
Istrate, C, Hinkula, J., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J., Svensson, L. and Johansen, K. (2008). Parenteral administration of RF 8-2/6/7 rotavirus-like particles in a one-dose regimen induce protective immunity in mice. Vaccine 26, 4594-4601
Khodabandehloo, M., Shamsi, S.M., Shahrabadi, Keyvani, H. and Bambai, B. (2009). Cloning and Expression of Simian Rotavirus Spike Protein (VP4) in Insect Cells by Baculovirus Expression System. Iranian Biomedical Journal 13 9-18
Kim, Y., Nielsen, P.R., Hodgins, D., Chang, K.O. and Saif, L.J. (2002). Lactogenic antibody responses in cows vaccinated with recombinant bovine rotavirus-like particles (VLPs) of two serotypes or inactivated bovine rotavirus vaccines. Vaccine 20, 1248-1258
Kovacs-Nolan J., Erika Sasaki, Dongwan Yoo, Yoshinori Mine, Cloning and Expression of Human Rotavirus Spike Protein, VP8*, in Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications, 282, 1183-1188
Lawton, J.A., Estes, M.K. and Venkataram, P.B.V. (2000). Mechanism of genome transcription in segmented dsRNA viruses. Advances in Virus Research 55, 185-214
Lopez, Т., Camacho M., Zayas M., Najera R., Sanchez R., Arias C. F. and Lopez S. (2005). Silencing the Morphogenesis of Rotavirus. Journal of Virology 79, 184-92
Lundgren, O. and Svensson, L. (2001). Pathogenesis of Rotavirus diarrhoea. Microbes and Infection 3 1145-1156
Madore, H.P., Estes, M.K., Zarley, CD., Ни, В., Parsons, S., Digravio, D., Greiner, S., Smith, R, Jiang, В., Corsaro, В., Barniak, V., Crawford, S. and Conner, M E. (1999). Biochemical and immunologic comparison of virus-like particles for a rotavirus subunit vaccine. Vaccine 17, 2461-2471
Marusic, C, Rizza, P., Lattanzi, L., Mancini, C, Spada, M., Belardelli, F., Benvenuto, E. and Capone, I. (2001). Chimeric plant virus particles as immunogens for inducing murine and human immune responses against human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology 75, 8434-8439.
Matsumura, Т., Itchoda, N. and Tsunemitsu, H. (2002). Production of immunogenic VP6 protein of bovine group A rotavirus in transgenic potato plants. Archives of Virology 147, 1263-1270
Mena, J.A., Ramirez, O.T. and Palomares, L.A. (2006). Intracellular distribution of rotavirus structural proteins and virus-like particles expressed in the insect cellbaculovirus system. Journal of Biotechnology 122, 443-452
Meyer, J.C, Bergmann, C.C. and Bellamy, A.R. (1989). Interaction of rotavirus cores with the nonstructural glycoprotein NS28. Virology 171, 98-107
Molinari, P., Peralta, A. and Taboga, O. (2008). Production of rotavirus-like particles in Spodoptera frugiperda larvae. Journal of Virological Methods 147, 364-367
Nilsson, M., von Bonsdorff, C.H., Weclewicz, K., Cohen, J. and Svensson, L. (1998). Assembly of viroplasm and virus-like particles of rotavirus by a Semliki Forest virus replicon. Virology 242, 255-265
Nishikawa, К., Fukuhara, N., Liprandi, F., Green, K., Kapikian, A., Chanock, R. and Gorziglia, M. (1989). VP4 protein of porcine rotavirus strain OSU expressed by a baculovirus recombinant induces neutralizing antibodies. Virology 173, 631-637
O'Brien, G.J., Bryant, C.J., Voogd, C, Greenberg, H.B., Gardner, R.C. and Bellamy, A.R. (2000). Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into virus-like particles. Virology 270, 444-453
Palombo, E.A. (1999). Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on the success of candidate vaccines. FEMS Microbiology Letters 181, 1-8
Palomares, L.A. and Ramirez, O.T. (2009). Challenges for the production of viruslike particles in insect cells: The case of rotavirus-like particles. BiochemicalEngineering Journal 45(3), 158-167
Peralta, A., Molinari, P. and Taboga, O. (2009). Chimeric recombinant rotavirus-like particles as a vehicle for the display of heterologous epitopes. Virology Journal 6, 192
Ramachandran, M., Kirkwood, CD., Unicomb, L., Cunliffe, N.A., Ward, R.L., Bhan, M.K., Clark, H.F., Glass, RI. and Gentsch, J.R. (2000). Molecular characterization of serotype G9 rotavirus strains from a global collection. Virology 278, 436-444
Ribes, J.M., Ortego, J., Ceriani, J., Montava, R., Enjuanes, L. and Buesa, J. (2011). Transmissible gastroenteritis virus (TGEV)-based vectors with engineered murine tropism express the rotavirus VP7 protein and immunize mice against rotavirus. Virology 410 107118
Rodriguez-Limas, W.A., Tyo, K.E.J., Nielsen, J., Ramirez, O.T. and Palomares, L.A. (2011). Molecular and process design for rotavirus-like particle production in Saccharomyces cerevisiae. Microb Cell Fact. 10, 33
Saldana, S., Esquivel Guadarrama, F., Olivera Flores Tde, J., Arias, N., Lopez, S., Arias, C, Ruiz-Medrano, R., Mason, H., Мог, Т., Richter, L., Amtzen, C.J. and Gomez Lim, M.A. (2006). Production of rotavirus-like particles in tomato (Lycopersicon esculentum L.) fruit by expression of capsid proteins VP2 and VP6 and immunological studies. Viral Immunology 19, 42-53
Sanchez-Padilla, E., Grais, R.F., Guerin, P.J., Steele, A.D., Burny, M.E. and Luquero, F.J. (2009). Burden of disease and circulating serotypes of rotavirus infection in sub-Saharan Africa: systematic review and meta-analysis. Lancet Infectious Diseases 9, 567-576.
Steele, A.D., Ivanoff, B. and African Rotavirus Network (2003). Rotavirus strains circulating in Africa during 1996-1999: emergence of G9 strains and P[6] strains. Vaccine 21, 361-367
Tian, P., Ball, J.M., Zeng, C.Q.Y. and Estes, M.K. (1996). The Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NSP4 Possesses Membrane Destabilization Activity. Journal of Vriology 70, 6973-6981
Thongprachum, A., Chaimongkol, N., Khamrin, P., Pantip, C, Mizuguchi, M., Ushijima, H. and Maneekarn, N. (2010). A novel multiplex RT-PCR for identification of VP6 subgroups of human and porcine rotaviruses, Journal of Virological Methods, 168, 191196
Trabelsi, A., Peenze, I., Pager, C, Jeddi, M. and Steele, D. (2000). Distribution of Rotavirus VP7 Serotypes and VP4 Genotypes Circulating in Sousse, Tunisia, from 1995 to 1999: Emergence of Natural Human Reassortants. Journal of Clinical Microbiology 38, 3415-3419
Varani, G. and Allain, F.H-T. (2002). How a rotavirus hijacks the human protein synthesis machinery. Nature Structural Biology 9, 158 - 160.
Vende, P., Taraporewala, Z.F. and Patton, J.T. (2002). RNA-Binding Activity of the Rotavirus Phosphoprotein NSP5 Includes Affinity for Double-Stranded RNA. Journal of Virology 76, 5291-5299.
Vesikari, Т., Karvonen, A., Korhonen, Т., Espo, M., Lebacq, E., Forster, J., Zepp, F., Delem, A. and De Vos, B. (2004). Safety and immunogenicity of RIX4414 live attenuated human rotavirus vaccine in adults, toddlers and previously uninfected infants. Vaccine 22, 2836-2842
Vezina, L.-P., Faye, L., Lerouge, P., D'Aoust, M.-A., Marquet-Blouin, E., Burel, C, Lavoie, P.-O., Bardor, M. and Gomord, V. (2009), Transient co-expression for fast and high-yield production of antibodies with human-like N-glycans in plants. Plant Biotechnology Journal 7, 442-455.
Zhou, В., Zhang, Y., Wang, X., Dong, I, Wang, В., Han, C, Yu, I, Li, D. (2010). Oral administration of plant-based rotavirus VP6 induces antigen-specific IgAs, IgGs and passive protection in mice. Vaccine 28, 6021-6027
Zhou, H., Guo, L., Wang, M., Qu, J., Zhao, Z., Wang, J. and Hung, T. (2011). Prime immunization with rotavirus VLP 2/6 followed by boosting with an adenovirus expressing VP6 induces protective immunization against rotavirus in mice. Virology Journal 8, 3
Все цитаты включены в настоящее описание посредством ссылки.
Настоящее изобретение было описано применительно к одному или нескольким вариантам осуществления. Тем не менее, специалистам в настоящей области техники будет очевидно, что довольно много вариаций и модификаций может быть сделано без
отступления от сущности и объема изобретения, как определено в формуле изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, предусматривающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
2. Способ по п. 1, при котором четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
3. Способ по п. 1, при котором первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP4.
4. Способ по п. 1, при котором первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP7.
2.
5. Способ по п. 2, при котором первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6, третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP4 и четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP7.
6. Способ по п. 1 или 2, при котором дополнительная нуклеиновая кислота экспрессируется в растении, части растения или клетке растения, и при котором дополнительная нуклеиновая кислота содержит регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей супрессор сайленсинга.
7. Способ по п. 1 или 2, при котором использование кодонов нуклеотидной последовательности доводят до предпочтительного использования кодонов человека, повышенного содержания GC или их комбинации.
8. Способ по п. 1 или 2, при котором ротавирусный структурный белок содержит усеченный, нативный или ненативный сигнальный пептид.
9. Способ по п. 8, при котором ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (PDI).
10. Способ по п. 1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
11. Способ по п. 2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
12. Способ по п. 1 или 2, дополнительно предусматривающий стадии:
c) сбора растения, части растения или клетки растения и
d) очистки RLP от растения, части растения или клетки растения, причем размер RLP находятся в диапазоне размеров 70-100 нм.
c)
13. Способ по п. 12, при котором RLP очищают в присутствии кальция.
14. RLP, полученная способом по п. 1 или 2, при котором RLP содержит по меньшей мере ротавирусный структурный белок aVP4.
15. RLP, полученная способом по п. 3, при котором RLP представляет собой двухслойную RLP.
16. RLP, полученная способом по п. 4 или 5, при котором RLP представляет собой трехслойную RLP.
17. Способ по п. 1 или 2, при котором ротавирусный структурный белок выбирают из штамма G9 Р[6] ротавируса, штамма WA ротавируса А, штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А и штамма SA11 ротавируса.
18. Способ по любому из пп. 3, 4 и 5, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45.
19. Способ по любому из пп. 3, 4 и 5, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46.
20. Способ по любому из пп. 4 и 5, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57.
21. Способ по любому из пп. 3 и 5, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, характеризуется от 80% до 100% идентичности
20.
по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51.
22. Способ по любому из пп. 3, 4 и 5, при котором VP2 кодируется аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 25.
23. Способ по любому из пп. 3, 4 и 5, при котором VP6 кодируется аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 31.
24. Способ по любому из пп. 4 и 5, при котором VP7 кодируется аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 4, 39, 43 или 59.
25. Способ по любому из пп. 3 и 5, при котором VP4 кодируется аминокислотной последовательностью, характеризующейся от 80% до 100% идентичности по отношению к аминокислотной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 36.
26. Способ по п. 1, при котором первая, вторая или третья последовательность нуклеиновой кислоты или их комбинация содержит регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем одним энхансером комовируса, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ротавирусный структурный белок, и при котором четвертая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, вводится в растение, часть растения или клетку растения.
27. Способ по п. 2, при котором первая, вторая, третья или четвертая последовательность нуклеиновой кислоты или их комбинация содержит регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с одним или более чем
22.
одним энхансером комовируса, с одним или более чем одним элементом амплификации и с нуклеотидной последовательностью, кодирующей ротавирусный структурный белок, и при котором пятая нуклеиновая кислота, кодирующая репликазу, вводится в растение, часть растения или клетку растения.
28. Способ по п. 1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация дополнительно функционально связана с нацелено воздействующей на компартмент последовательностью.
29. Способ по п. 2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация дополнительно функционально связана с нацелено воздействующей на компартмент последовательностью.
30. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, предусматривающий:
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
31. Способ по п. 30, при котором вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении и функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
32. Способ по п. 31, при котором третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении и функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, вводят в растение, часть растения или клетку
31.
растения на стадии а) и экспрессируют при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
33. Способ по любому из пп. 30-32, при котором один или несколько ротавирусных структурных белков выбирают из группы, содержащей VP2, VP4, VP6 и VP7.
34. Способ по любому из пп. 30-33, при котором дополнительная нуклеотидная последовательность экспрессируется в растении, части растения или клетке растения, дополнительная нуклеотидная последовательность, кодирующая супрессор сайленсинга, дополнительная нуклеотидная последовательность, функционально связанная с регуляторной областью, которая активна в растении.
35. Способ любому из пп. 30-34, при котором один или несколько ротавирусных структурных белков происходят из штамма G9 Р[6] ротавируса.
36. Способ по любому из пп. 30-35, при котором нуклеотидная последовательность дополнительно функционально связана с нацелено воздействующей на компартмент последовательностью.
37. Способ по любому из п. 28, 29 и 36, при котором нацелено воздействующая на компартмент последовательность направляет один или несколько ротавирусных структурных белков в эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт, пластиду или апопласт растительной клетки.
38. Способ по п. 37, при котором нацелено воздействующая на компартмент последовательность кодирует сигнальный пептид апопласта или сигнальный пептид пластиды.
39. Способ по любому из пп. 30-38, дополнительно предусматривающий стадии:
c) сбора растения, части растения или клетки растения и
d) очистки RLP от растения, части растения или клетки растения, причем размер RLP находятся в диапазоне размеров 70-100 нм.
c)
40. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, предусматривающий:
a) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
41. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, предусматривающий:
a) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растении, части растения или клетке растения; и
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP.
42. Способ по п. 41, при котором растение, часть растения или клетка растения обеспечивается четвертой нуклеиновой кислотой, содержащей четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, введенный в растение, часть растения или клетку растения на стадии а), а четвертый ротавирусный структурный белок экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
42.
43. RLP, полученная способом по любому из пп. 30-42, причем RLP, содержащая по меньшей мере ротавирусный структурный белок aVP4.
44. Композиция, содержащая эффективную дозу RLP по любому из пп. 14, 15, 16 и 43 для индуцирования иммунного ответа у субъекта, и фармацевтически приемлемый носитель.
45. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п. 44.
46. Способ по п. 45, при котором композицию вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
47. Растительный материал, содержащий RLP, полученную способом по любому из пп. 1-13 и 17-42.
48. Способ получения ротавирусного структурного белка в растении, части растения или клетки растения, предусматривающий
a) введение нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с нуклеотидной последовательностью, кодирующей один или несколько ротавирусных структурных белков, в растение, часть растения или клетку растения;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию нуклеиновой кислоты, получая таким образом один или несколько ротавирусных структурных белков.
49. Способ по п. 48, при котором нуклеотидная последовательность дополнительно функционально связана с нацелено воздействующей на компартмент последовательностью.
50. Способ по п. 48, при котором один или несколько ротавирусных структурных белков представляют собой VP2, VP4, VP6 или VP7.
49.
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий:
a) введение первой нуклеиновой кислоты, содержащей первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, второй нуклеиновой кислоты, содержащей вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третьей нуклеиновой кислоты, содержащей третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растение, часть растения или клетку растения,
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP,
c) сбор растения, части растения или клетки растения и
d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии кальция.
2. Способ по п. 1, при котором четвертую нуклеиновую кислоту, содержащую четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, вводят в растение, часть растения или клетку растения на стадии а) и экспрессируют при инкубировании растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
3. Способ по п. 1, при котором первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой VP6 и третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP4 или VP7.
4. Способ по п. 2, при котором первый ротавирусный структурный белок представляет собой VP2, второй ротавирусный структурный белок представляет собой
2.
VP6, третий ротавирусный структурный белок представляет собой VP4 и четвертый ротавирусный структурный белок представляет собой VP7.
5. Способ по п. 1, при котором первая, вторая или третья нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
6. Способ по п. 2, при котором первая, вторая, третья или четвертая нуклеотидная последовательность или их комбинация функционально связана с регуляторной областью вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
7. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п. 3, причем RLP содержит ротавирусный структурный белок VP4, размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм и причем RLP содержит один или несколько ротавирусных структурных белков, которые содержат специфические для растений N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
8. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п. 4, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм и RLP содержит один или несколько ротавирусных структурных белков, которые содержат специфические для растений N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
9. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п. 7 для индуцирования иммунного ответа у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
10. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п. 8 для индуцирования иммунного ответа у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
11. Способ по п. 3, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, характеризуется от 80% до
5.
100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51.
12. Способ по п. 4, при котором нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 45, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 46, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 19, 20, 48, 49, 52, 53, 54 или 57, нуклеотидная последовательность, кодирующая VP4, характеризуется от 80% до 100% идентичности по отношению к нуклеотидной последовательности, определенной как SEQ ID NO: 15, 16, 47, 50 или 51.
13. Способ получения ротавирус-подобной частицы (RLP) в растении, части растения или клетке растения, включающий:
а) обеспечение растения, части растения или клетки растения, содержащей первую нуклеиновую кислоту, содержащую первую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с первой нуклеотидной последовательностью, кодирующей первый ротавирусный структурный белок, вторую нуклеиновую кислоту, содержащую вторую регуляторную область, активную в растении, функционально связанную со второй нуклеотидной последовательностью, кодирующей второй ротавирусный структурный белок, и третью нуклеиновую кислоту, содержащую третью регуляторную область, активную в растении, функционально связанную с третьей нуклеотидной последовательностью, кодирующей третий ротавирусный структурный белок, в растении, части растения или клетке растения;
b) инкубирование растения, части растения или клетки растения в условиях, которые позволяют временную экспрессию первой, второй и третьей нуклеиновой кислоты, получая таким образом RLP
c) сбор растения, части растения или клетки растения и
d) экстракцию и очистку RLP от растения, части растения или клетки растения в присутствии кальция.
14. Способ по п. 13, при котором растение, часть растения или клетка растения обеспечивается четвертой нуклеиновой кислотой, содержащей четвертую регуляторную область, активную в растении и оперативно связанную с четвертой нуклеотидной последовательностью, кодирующей четвертый ротавирусный структурный белок, введенной в растение, часть растения или клетку растения на стадии а), а четвертый ротавирусный структурный белок экспрессируется при инкубации растения, части растения или клетки растения на стадии Ь).
15. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п. 13, причем RLP содержит ротавирусный структурный белок VP4, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм и причем RLP содержит один или несколько ротавирусных структурных белков, которые содержат специфические для растений N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
16. Ротавирус-подобная частица (RLP), полученная способом по п. 14, причем размер RLP находится в диапазоне размеров 70-100 нм и причем RLP содержит один или несколько ротавирусных структурных белков, которые содержат специфические для растений N-гликаны или модифицированные N-гликаны.
17. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п. 15 для индуцирования иммунного ответа у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
18. Композиция, содержащая эффективную дозу ротавирус-подобных частиц (RLP) по п. 16 для индуцирования иммунного ответа у субъекта и фармацевтически приемлемый носитель.
14.
19. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п. 17.
20. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п. 9.
21. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п. 10.
22. Способ индуцирования иммунитета к ротавирусной инфекции у субъекта, предусматривающий введение композиции по п. 18.
14.
1/73 В
VM vpi сегмент дцРНК
Средний Внутренний Средний капсид капсид - капсид
VP1
Внутренний
капсид
_) 3490П.Н.
J 2531 П.Н.
J ЗЗЫП.Н.
сегмент
лиРНК
1 _
2 -
5 -
6 -
1011
Белок
VPl
VP2
- VP3 VP*
NSP1 VP6
NSP3
Nspa
VP7
NSP4
№P5 NSPS
Фиг. 1
-клеточная стенка -клеточная мембрана
-апопласт "цитозоль
Белки, экспрессированные в цитозоле, направляются к апопласту
Фиг. 5
День
_L 5 7
+ - + - +
-ve
Цитоплазма День
М +
День
1 з М -ve - + - + кДа ШПЫ^Ш
День
1 з 5
М -ve - + - + -
кДа • 1*1 '
70 55
401 -
70 55
Хлоропласты
Апопласт
Фиг. 6
Фиг. 7
кДа
130 100
сТр ER pTRAc М -ve +ve • + • + - +
и I.-MS
VP2
М +ve -ve сТр ER pTRAc A b) J VP4
Фиг. 8
Фиг. 9
VP6 антитело
Фиг. 11
Фракция
Фиг. 14
Ротавирусный VP2
Название гена: 9P6_VP2 Длина гена: 2700 п.н.
Оптимизирован для экспрессии в: Nicotiana tabacum
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTCCATGGCTTACCGTAAAAGGGGTGCTAGGCGTGAA
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAAGGTACCGAATGGCATTTTCCCCACGATCCGCACTT
SEQ ID N0:1 G R V R S M A Y R К R G A R R E
GCTAACCTCAACAACAACGATAGGATGCAAGAGAAGATCGATGAGAAGCAGGATTCCAAC
CGATTGGAGTTGTTGTTGCTATCCTACGTTCTCTTCTAGCTACTCTTCGTCCTAAGGTTG
A N L N N N D R M О E К I D E К Q D S N
AAGATCCAGCTCTCCGATAAGGTGCTCTCCAAGAAAGAAGAGATCGTTACTGATTCCCAC
TTCTAGGTCGAGAGGCTATTCCACGAGAGGTTCTTTCTTCTCTAGCAATGACTAAGGGTG
К I Q L S D К V L S К К E E I V T D S H
GAAGAGGTGAAGGTGACAGATGAGCTTAAGAAGTCCACAAAAGAAGAGTCCAAGCAGCTC
CTTCTCCACTTCCACTGTCTACTCGAATTCTTCAGGTGTTTTCTTCTCAGGTTCGTCGAG
E E V К V T D E L К К S T К E E S К Q L
CTTGAGGTGCTCAAGACAAAAGAGGAACACCAGAAAGAGATCCAGTACGAGATCCTCCAA
GAACTCCACGAGTTCTGTTTTCTCCTTGTGGTCTTTCTCTAGGTCATGCTCTAGGAGGTT
L E V L К T К E E H ОКЕ I Q Y E I L Q
AAGACTATCCCAACTTTCGAGCCAAAAGAGACTATCCTCAGGAAGCTTGAGGATATCCAG
TTCTGATAGGGTTGAAAGCTCGGTTTTCTCTGATAGGAGTCCTTCGAACTCCTATAGGTC
KTIPTFEPKETILRKLEDI Q
CCAGAGCTTGCTAAGAAGCAGACTAAGCTCTTCAGGATCTTCGAGCCAAAGCAGCTCCCA
GGTCTCGAACGATTCTTCGTCTGATTCGAGAAGTCCTAGAAGCTCGGTTTCGTCGAGGGT
P E L А К К Q T К L F R I F E P К Q L P
ATCTACCGTGCTAACGGTGAAAGGGAACTTAGGAACAGGTGGTACTGGAAGCTCAAGAAG
TAGATGGCACGATTGCCACTTTCCCTTGAATCCTTGTCCACCATGACCTTCGAGTTCTTC
I Y RAN G E R E L R N R W Y W К L К К
GATACTCTCCCAGACGGTGATTACGATGTGAGAGAGTACTTCCTCAACCTCTACGATCAG
CTATGAGAGGGTCTGCCACTAATGCTACACTCTCTCATGAAGGAGTTGGAGATGCTAGTC
D T L P D G D Y D V R E Y F L N L Y D Q
GTGCTCACTGAGATGCCAGATTACCTCCTCCTCAAGGATATGGCTGTGGAGAACAAGAAC
CACGAGTGACTCTACGGTCTAATGGAGGAGGAGTTCCTATACCGACACCTCTTGTTCTTG VLTEMPDYLLLKDMAVENKN
TCCAGGGATGCTGGAAAGGTGGTGGATTCCGAGACTGCTTCCATCTGTGATGCTATCTTC
AGGTCCCTACGACCTTTCCACCACCTAAGGCTCTGACGAAGGTAGACACTACGATAGAAG SRDAGKVVDSETAS ICDAIF
CAGGATGAAGAGACTGAGGGTGCTGTGAGGCGTTTCATTGCTGAGATGAGGCAGAGGGTT
GTCCTACTTCTCTGACTCCCACGACACTCCGCAAAGTAACGACTCTACTCCGTCTCCCAA
Q D E E T E G A V R R F I A E M R Q R V
CAGGCTGATAGGAACGTGGTGAACTACCCATCCATCCTCCACCCAATCGATTACGCTTTC
GTCCGACTATCCTTGCACCACTTGATGGGTAGGTAGGAGGTGGGTTAGCTAATGCGAAAG
OADRNVVNY P S I L H P I D Y A F
AACGAGTACTTCCTTCAGCACCAGCTTGTGGAGCCACTCAACAACGATATCATCTTCAAC
TTGCTCATGAAGGAAGTCGTGGTCGAACACCTCGGTGAGTTGTTGCTATAGTAGAAGTTG
N E Y F L Q H Q L V E P L N N D I I F N
TACATCCCAGAGAGGATTAGGAACGACGTTAACTACATCCTCAACATGGATAGGAACCTC
ATGTAGGGTCTCTCCTAATCCTTGCTGCAATTGATGTAGGAGTTGTACCTATCCTTGGAG
Y I P E R I R N D V N Y I L N M D R N L
CCATCCACTGCTCGTTACATCAGGCCAAACCTCCTCCAGGATAGGCTCAACCTCCACGAT
GGTAGGTGACGAGCAATGTAGTCCGGTTTGGAGGAGGTCCTATCCGAGTTGGAGGTGCTA
P S TAR Y I R P N L L Q D R L N L H D
AACTTCGAGTCCCTCTGGGATACAATCACTACTTCCAACTACATTCTCGCTCGTTCCGTG
TTGAAGCTCAGGGAGACCCTATGTTAGTGATGAAGGTTGATGTAAGAGCGAGCAAGGCAC
N F E S L W D T I T T S N Y I L A R S V
GTGCCAGATCTCAAAGAACTCGTGTCCACTGAGGCTCAGATCCAGAAGATGTCCCAGGAT
CACGGTCTAGAGTTTCTTGAGCACAGGTGACTCCGAGTCTAGGTCTTCTACAGGGTCCTA
V P D L К E L V S T E A 0 I Q К M S Q D
CTCCAGCTTGAGGCTCTCACTATCCAGTCCGAGACTCAGTTCCTCACTGGTATCAACTCC
GAGGTCGAACTCCGAGAGTGATAGGTCAGGCTCTGAGTCAAGGAGTGACCATAGTTGAGG
L Q L E A L T I Q S E T Q F L T G I N S
CAGGCTGCTAACGATTGCTTCAAGACTCTCATTGCTGCTATGCTCTCCCAGAGGACTATG
GTCCGACGATTGCTAACGAAGTTCTGAGAGTAACGACGATACGAGAGGGTCTCCTGATAC
0 A A N D С F К T L I A A M L S Q R T M
TCCCTCGATTTCGTGACTACTAACTATATGTCCCTCATCTCCGGAATGTGGCTCTTGACT
AGGGAGCTAAAGCACTGATGATTGATATACAGGGAGTAGAGGCCTTACACCGAGAACTGA
S L D F V T T N Y M S L I S G M W L L T
GTGGTGCCAAACGATATGTTCATCCGTGAGTCCCTTGTGGCTTGCCAGCTCGCTATCGTG
CACCACGGTTTGCTATACAAGTAGGCACTCAGGGAACACCGAACGGTCGAGCGATAGCAC
V V P N D M F I R E S L V А С Q L A I V
AACACTATCATCTACCCAGCTTTCGGAATGCAAAGGATGCACTACCGTAACGGTGATCCA
TTGTGATAGTAGATGGGTCGAAAGCCTTACGTTTCCTACGTGATGGCATTGCCACTAGGT
N T I I Y P A F G M 0 R M H Y R N G D P
CAGACTCCATTCCAGATCGCAGAGCAGCAGATCCAGAACTTCCAGGTGGCAAACTGGCTC
GTCTGAGGTAAGGTCTAGCGTCTCGTCGTCTAGGTCTTGAAGGTCCACCGTTTGACCGAG
Q T P F Q I A E Q Q I 0 N F О V A N W L
CACTTCGTGAACAACAACCAGTTCAGGCAGGCTGTGATCGATGGTGTGTTGAACCAGGTG
GTGAAGCACTTGTTGTTGGTCAAGTCCGTCCGACACTAGCTACCACACAACTTGGTCCAC
H F V N N N 0 F R О A V I D G V L N О V
CTCAACGATAACATCCGTAACGGTCACGTGATCAACCAGCTCATGGAAGCTCTCATGCAA
GAGTTGCTATTGTAGGCATTGCCAGTGCACTAGTTGGTCGAGTACCTTCGAGAGTACGTT
L N D N I R N G H V I N Q L M E A L M 0
CTCTCCAGGCAGCAGTTCCCAACTATGCCTATCGATTACAAGCGTTCCATCCAGAGGGGA
GAGAGGTCCGTCGTCAAGGGTTGATACGGATAGCTAATGTTCGCAAGGTAGGTCTCCCCT
L S R 0 Q F P T M P I D Y К R S I ORG
ATCCTCCTCCTTTCCAACAGGCTTGGACAGCTCGTGGATCTCACTAGGCTCCTCGCTTAC
TAGGAGGAGGAAAGGTTGTCCGAACCTGTCGAGCACCTAGAGTGATCCGAGGAGCGAATG
I L L L S N R L G Q LVD L T R L LAY
AACTACGAGACTCTCATGGCTTGCATCACTATGAACATGCAGCACGTTCAGACTCTCACT
TTGATGCTCTGAGAGTACCGAACGTAGTGATACTTGTACGTCGTGCAAGTCTGAGAGTGA
N Y E T L M А С I T M N M О H V О T L T
ACTGAGAAGCTCCAGCTCACTTCCGTGACTTCCCTCTGCATGCTCATCGGAAACGCTACT
TGACTCTTCGAGGTCGAGTGAAGGCACTGAAGGGAGACGTACGAGTAGCCTTTGCGATGA
T E К L Q L T S V T S L С M L I G NAT
GTGATCCCATCCCCACAGACACTCTTCCACTACTACAACGTGAACGTGAACTTCCACTCC
CACTAGGGTAGGGGTGTCTGTGAGAAGGTGATGATGTTGCACTTGCACTTGAAGGTGAGG
V I P S P Q T L F H Y Y N V N V N F H S
AACTACAACGAGAGGATCAACGATGCTGTGGCTATCATCACTGCTGCTAACAGGCTTAAC
TTGATGTTGCTCTCCTAGTTGCTACGACACCGATAGTAGTGACGACGATTGTCCGAATTG
N Y_N_E R I N D A V A I I T A A N R L N
CTCTACCAAAAGAAGATGAAGGCTATCGTTGAGGATTTCCTCAAGAGGCTCTACATCTTC
GAGATGGTTTTCTTCTACTTCCGATAGCAACTCCTAAAGGAGTTCTCCGAGATGTAGAAG
L Y Q К К M К A I V Е D F L К R L Y I F
GATGTGTCCAGGGTGCCAGATGATCAGATGTACCGTCTTAGGGATAGGCTTAGGCТССТС
CTACACAGGTCCCACGGTCTACTAGTCTACATGGCAGAATCCCTATCCGAATCCGAGGAG
D V S R V Р D D О М Y R L R D R L R L L
CCAGTGGAGATCAGAAGGCTCGATATCTTCAACCTCATCCTTATGAACATGGATCAGATC
GGTCACCTCTAGTCTTCCGAGCTATAGAAGTTGGAGTAGGAATACTTGTACCTAGTCTAG
Р V Е I R R L D I F N L I L М N М D Q I
GAGAGGGCTTCCGATAAGATCGCTCAGGGTGTTATTATCGCTTACCGTGATATGCACCTT
CTCTCCCGAAGGCTATTCTAGCGAGTCCCACAATAATAGCGAATGGCACTATACGTGGAA
Е R A S D К I А О G V I I A Y R D М Н L
GAGAGGGATGAGATGTACGGATACGTGAACATTGCTAGGAACCTTGAGGGATTCCAGCAG
CTCTCCCTACTCTACATGCCTATGCACTTGTAACGATCCTTGGAACTCCCTAAGGTCGTC
Е R D ЕМУ G Y V N I A R N L Е G F Q Q
ATCAACCTTGAAGAGCTTATGCGTTCCGGTGATTACGCTCAGATCACTAACATGCTCCTC
TAGTTGGAACTTCTCGAATACGCAAGGCCACTAATGCGAGTCTAGTGATTGTACGAGGAG
I N L Е Е L М R S G D Y А О I Т N М L L
AACAACCAGCCAGTGGCTCTTGTTGGTGCTCTCCCATTCATCACTGATTCCTCCGTGATC
TTGTTGGTCGGTCACCGAGAACAACCACGAGAGGGTAAGTAGTGACTAAGGAGGCACTAG
N N Q PVALVGAL Р F I Т D S S V I
TCCCTCATTGCTAAGTTGGATGCTACTGTGTTCGCTCAGATCGTGAAGCTCAGGAAAGTG
AGGGAGTAACGATTCAACCTACGATGACACAAGCGAGTCTAGCACTTCGAGTCCTTTCAC
S L IAK L D А Т V F А О I V К L R К V
GATACTCTCAAGCCAATCCTCTACAAGATCAACTCCGATTCCAACGATTTCTACCTCGTG
CTATGAGAGTTCGGTTAGGAGATGTTCTAGTTGAGGCTAAGGTTGCTAAAGATGGAGCAC
D Т L К Р I L Y К I N S D S N D F Y L V
GCTAACTACGATTGGGTGCCAACTTCCACTACAAAGGTGTACAAGCAGGTGCCACAGCAG
CGATTGATGCTAACCCACGGTTGAAGGTGATGTTTCCACATGTTCGTCCACGGTGTCGTC
A N Y D W V P T S T T К V Y К О V P Q Q
TTCGATTTCCGTAACTCCATGCACATGCTCACTTCCAACCTCACTTTCACTGTGTACTCC
AAGCTAAAGGCATTGAGGTACGTGTACGAGTGAAGGTTGGAGTGAAAGTGACACATGAGG
F D F R N S M H M L T S N L T F T V Y S
GATCTCCTCGCTTTCGTGTCCGCTGATACTGTGGAGCCTATCAACGCTGTGGCTTTCGAT
CTAGAGGAGCGAAAGCACAGGCGACTATGACACCTCGGATAGTTGCGACACCGAAAGCTA
D L L A F V S A D T V E P I N A V A F D
AACATGAGGATTATGAACGAGCTTTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAA
TTGTACTCCTAATACTTGCTCGAAACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTT
N M R I M N E L * * SEQ ID NO: 1
TTCGAGCTC SEQ ID NO: 13
AAGCTCGAG SEQ ID NO: 14
Ротавирусный VP4
Название G9P6VP4 гена:
Длина гена: 2388 п.н.
Оптимизирован для Nicotiana tabacum
экспрессии в:
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTCCATGGCTTCCCTCATCTACCGTCAGTTGCTCACT
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAAGGTACCGAAGGGAGTAGATGGCAGTCAACGAGTGA
SEQ ID NO 2 GRVRSMAS L I Y R Q L L T
AACTCCTACACTGTGGAGCTTTCCGATGAGATCAACACTATCGGTTCCGAGAAGTCCCAG
TTGAGGATGTGACACCTCGAAAGGCTACTCTAGTTGTGATAGCCAAGGCTCTTCAGGGTC
N S Y T V E L S D E I N T I G S E К S Q
AACGTGACTATCAACCCAGGACCATTCGCTCAGACTAACTACGCTCCAGTGACTTGGTCA
TTGCACTGATAGTTGGGTCCTGGTAAGCGAGTCTGATTGATGCGAGGTCACTGAACCAGT
N V T I N P G P FAQ TNYAPVTWS
CACGGTGAAGTGAACGATTCCACTACTATCGAGCCAGTGCTCGATGGACCATACCAGCCA
GTGCCACTTCACTTGCTAAGGTGATGATAGCTCGGTCACGAGCTACCTGGTATGGTCGGT
H G E V N D S T T I E P V L D G P Y Q P
ACTAACTTCAAGCCACCAAACGATTACTGGATTCTCCTCAACCCAACTAACCAGCAGGTG
TGATTGAAGTTCGGTGGTTTGCTAATGACCTAAGAGGAGTTGGGTTGATTGGTCGTCCAC
T N F К P P N D Y W I L L N P T N Q О V
GTGCTTGAGGGAACTAACAAGACTGATATCTGGGTGGCACTCCTTCTTGTGGAGCCAAAC
CACGAACTCCCTTGATTGTTCTGACTATAGACCCACCGTGAGGAAGAACACCTCGGTTTG
V L E G T N К T D I W V A L L L V E P N
GTGACTAACCAGTCCAGGCAGTACACTCTCTTCGGAGAGACTAAGCAGATCACTGTGGAG
CACTGATTGGTCAGGTCCGTCATGTGAGAGAAGCCTCTCTGATTCGTCTAGTGACACCTC
V T N Q S R Q Y T L F G E T К Q I T V E
AACAACACTAACAAGTGGAAGTTCTTCGAGATGTTCAGGTCCAACGTGAACGCTGAGTTC
TTGTTGTGATTGTTCACCTTCAAGAAGCTCTACAAGTCCAGGTTGCACTTGCGACTCAAG
N N Т N К W К F F Е М F R S N V N А Е F
CAGCACAAGAGGACTCTCACTTCCGATACAAAGCTCGCTGGTTTTATGAAGTTCTACAAC
GTCGTGTTCTCCTGAGAGTGAAGGCTATGTTTCGAGCGACCAAAATACTTCAAGATGTTG
Q Н К R Т L Т S D Т К L А G F М К F Y N
TCTGTGTGGACTTTCCACGGTGAAACTCCACACGCTACTACTGATTACTCCTCCACTTCC
AGACACACCTGAAAGGTGCCACTTTGAGGTGTGCGATGATGACTAATGAGGAGGTGAAGG
S V W Т F Н G Е Т Р HAT Т D Y S S Т S
AACCTTTCCGAGGTGGAGACTGTGATCCACGTGGAGTTCTACATCATCCCAAGGTCCCAA
TTGGAAAGGCTCCACCTCTGACACTAGGTGCACCTCAAGATGTAGTAGGGTTCCAGGGTT
N L S Е V Е ТУТ Н V Е F Y I I Р R S Q
GAGTCTAAGTGCTCCGAGTACATCAACACTGGACTCCCACCAATGCAAAACACTAGGAAC
CTCAGATTCACGAGGCTCATGTAGTTGTGACCTGAGGGTGGTTACGTTTTGTGATCCTTG
Е S К С S Е Y I N Т G L Р Р М О N Т R N
ATCGTGCCAGTGGCTTTGTCCTCTCGTTCCGTGACTTACCAGAGGGCTCAGGTGAACGAG
TAGCACGGTCACCGAAACAGGAGAGCAAGGCACTGAATGGTCTCCCGAGTCCACTTGCTC
I V Р V А L S S R S V Т Y Q R А Q V N Е
GATATCATCATCTCCAAGACTTCCCTCTGGAAAGAGATGCAGTACAACAGGGATATTATC
CTATAGTAGTAGAGGTTCTGAAGGGAGACCTTTCTCTACGTCATGTTGTCCCTATAATAG
D I I I S К Т S L W К Е М Q Y N R D I I
ATCAGGTTCAAGTTCAACAACTCCATCGTGAAGCTCGGAGGACTCGGATACAAGTGGAGT
TAGTCCAAGTTCAAGTTGTTGAGGTAGCACTTCGAGCCTCCTGAGCCTATGTTCACCTCA
I R F К F N N S I V К L G G L G Y К W S
GAGATCTCCTTCAAGGCTGCTAACTACCAGTACTCCTACCTCAGGGATGGTGAACAGGTG
CTCTAGAGGAAGTTCCGACGATTGATGGTCATGAGGATGGAGTCCCTACCACTTGTCCAC
Е I S F К А А N Y Q Y S Y L R D G Е Q V
ACAGCTCACACTACTTGCTCCGTGAACGGTGTTAACAACTTCTCCTACAACGGTGGTTCC
TGTCGAGTGTGATGAACGAGGCACTTGCCACAATTGTTGAAGAGGATGTTGCCACCAAGG
T A H T Т С S V N G V N N F S Y N G G S
CTCCCAACTGATTTCTCCGTGTCCCGTTACGAGGTGATCAAAGAGAACTCCTACGTTTAC
GAGGGTTGACTAAAGAGGCACAGGGCAATGCTCCACTAGTTTCTCTTGAGGATGCAAATG LPTDFSVSRYEVIKENSYVY
GTGGATTACTGGGATGATTCCCAGGCTTTCAGGAACATGGTGTATGTTAGATCCCTCGCT
CACCTAATGACCCTACTAAGGGTCCGAAAGTCCTTGTACCACATACAATCTAGGGAGCGA
V D Y W D D S С) A FRNMVYVRSLA
GCTAACCTCAACTCCGTGAAGTGCTCCGGTGGAAACTACAACTTCCAGATCCCAGTGGGA
CGATTGGAGTTGAGGCACTTCACGAGGCCACCTTTGATGTTGAAGGTCTAGGGTCACCCT ANLNSVKCSGGNYNFQIPVG
GCTTGGCCAGTGATGTCTGGTGGAGCTGTGTCTCTCCACTTCGCTGGTGTTACACTCTCC
CGAACCGGTCACTACAGACCACCTCGACACAGAGAGGTGAAGCGACCACAATGTGAGAGG AWPVMSGGAVSLHFAGVTLS
ACTCAGTTCACTGATTTCGTGTCCCTCAACTCCCTCAGGTTCAGGTTCTCCCTCACTGTG
TGAGTCAAGTGACTAAAGCACAGGGAGTTGAGGGAGTCCAAGTCCAAGAGGGAGTGACAC
Т С) F TDFVSLNSLRFRFSLTV
GAAGAGCCACCATTCTCCATCCTCAGGACTAGGGTGTCCGGACTTTACGGACTCCCAGCT
CTTCTCGGTGGTAAGAGGTAGGAGTCCTGATCCCACAGGCCTGAAATGCCTGAGGGTCGA EEPPFSILRTRVSGLYGLPA
TTCAACCCAAACAACGGACACGAGTACTACGAGATCGCTGGACGTTTCTCCCTTATCTCC
AAGTTGGGTTTGTTGCCTGTGCTCATGATGCTCTAGCGACCTGCAAAGAGGGAATAGAGG FNPNNGHEYYEIAGRFSLIS
CTCGTGCCATCCAACGATGATTACCAGACTCCAATTATGAACTCCGTGACTGTGAGGCAG
GAGCACGGTAGGTTGCTACTAATGGTCTGAGGTTAATACTTGAGGCACTGACACTCCGTC
L V Р S N D D Y Q Т Р I М N S V Т V R Q
GATCTTGAGAGGCAGCTCGGAGATCTCAGGGAAGAGTTCAACTCCCTCTCCCAAGAGATC
CTAGAACTCTCCGTCGAGCCTCTAGAGTCCCTTCTCAAGTTGAGGGAGAGGGTTCTCTAG
D L E R Q L G D L R E E F N S L S Q E I
GCTATGACTCAGCTCATCGATCTCGCTCTCCTCCCACTCGATATGTTCTCCATGTTCTCT
CGATACTGAGTCGAGTAGCTAGAGCGAGAGGAGGGTGAGCTATACAAGAGGTACAAGAGA
A M T Q L I D L A L L P L D M F S M F S
GGTATCAAGTCCACTATCGATGTGGCTAAGTCTATGGTGACTAAGGTGATGAAGAAGTTC
CCATAGTTCAGGTGATAGCTACACCGATTCAGATACCACTGATTCCACTACTTCTTCAAG
G I К S T I DVAKSMVTKVMK К F
AAGAAGTCCGGACTCGCTACTTCCATCTCCGAGCTTACTGGATCTCTCTCCAACGCTGCT
TTCTTCAGGCCTGAGCGATGAAGGTAGAGGCTCGAATGACCTAGAGAGAGGTTGCGACGA
К К S G L A T S I S E L T G S L S N A A
TCTTCTGTGTCTAGGTCCTCCTCCATCAGGTCCAACATCTCCTCCATCTCAGTGTGGACT
AGAAGACACAGATCCAGGAGGAGGTAGTCCAGGTTGTAGAGGAGGTAGAGTCACACCTGA
S S V S R S S S I R S N I S S I S_V_W_T
GATGTGTCCGAGCAGATCGCTGGATCTTCCGATTCCGTGCGTAACATCTCCACTCAGACT
CTACACAGGCTCGTCTAGCGACCTAGAAGGCTAAGGCACGCATTGTAGAGGTGAGTCTGA
D V S E Q I A G S S D S V R N I S T Q T
TCCGCTATCTCCAAGAGGCTTAGGCTCAGAGAGATCACTACTCAGACTGAGGGAATGAAC
AGGCGATAGAGGTTCTCCGAATCCGAGTCTCTCTAGTGATGAGTCTGACTCCCTTACTTG
S A I S К R L R L R E I T T Q T E G M N
TTCGATGATATCTCCGCTGCTGTGCTCAAGACTAAGATCGATAGGTCCACTCACATCTCC
AAGCTACTATAGAGGCGACGACACGAGTTCTGATTCTAGCTATCCAGGTGAGTGTAGAGG
F D D I S A A V L К T К I D R S T H I S
CCAGATACTCTCCCAGATATCATCACTGAGTCCTCCGAGAAGTTCATCCCAAAGCGTGCT
GGTCTATGAGAGGGTCTATAGTAGTGACTCAGGAGGCTCTTCAAGTAGGGTTTCGCACGA
P D T L P D I I T E S S E К F I P К R A
TACCGTGTTCTCAAGGATGATGAGGTGATGGAAGCTGATGTGGATGGAAAGTTCTTCGCT
ATGGCACAAGAGTTCCTACTACTCCACTACCTTCGACTACACCTACCTTTCAAGAAGCGA YRVLKDDEVMEADVDGKFFA
TACAAAGTGGGAACTTTCGAAGAGGTGCCATTCGATGTGGATAAGTTCGTGGATCTCGTG
ATGTTTCACCCTTGAAAGCTTCTCCACGGTAAGCTACACCTATTCAAGCACCTAGAGCAC YKVGTFEEVPFDVDKFVDLV
ACTGATTCCCCAGTGATCTCCGCTATCATCGATTTCAAGACTCTCAAGAACCTCAACGAT
TGACTAAGGGGTCACTAGAGGCGATAGTAGCTAAAGTTCTGAGAGTTCTTGGAGTTGCTA TDSPVISAIIDFKTLKNLND
AACTACGGAATCACTAGGTCCCAGGCTCTCGATCTCATCCGTTCCGATCCAAGGGTGCTC
TTGATGCCTTAGTGATCCAGGGTCCGAGAGCTAGAGTAGGCAAGGCTAGGTTCCCACGAG NYGITRSQALDLIRSDPRVL
AGGGATTTCATCAACCAGAACAACCCAATCATCAAGAACAGGATCGAGCAGCTCATTCTC
TCCCTAAAGTAGTTGGTCTTGTTGGGTTAGTAGTTCTTGTCCTAGCTCGTCGAGTAAGAG
R D F I N Q N N P I I К N R I E Q L I L
CAGTGCCGTCTTTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAATTCGAGCTC SEQ ID NO: 15
GTCACGGCAGAAACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTTAAGCTCGAG SEQ ID NO: 16
Q С R L * * SEQ ID NO: 2
Ротавирусный VP6
Название G9P6_VP6 гена:
Длина гена: 1254 п.н.
Оптимизирован для Nicotiana tabacum
экспрессии в:
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTCCATGGATGTGCTCTACTCCCTCTCCAAGACTCTC
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAAGGTACCTACACGAGATGAGGGAGAGGTTCTGAGAG
G R V R S М D V L Y S L S К Т L
AAGGATGCTAGGGATAAGATCGTGGAGGGAACTCTCTACTCCAACGTTTCCGATCTCATC
TTCCTACGATCCCTATTCTAGCACCTCCCTTGAGAGATGAGGTTGCAAAGGCTAGAGTAG
К D A R D К I V Е G Т L Y S N V S D L I
CAGCAGTTCAACCAGATGATCATCACTATGAACGGAAACGAGTTCCAGACTGGTGGAATC
GTCGTCAAGTTGGTCTACTAGTAGTGATACTTGCCTTTGCTCAAGGTCTGACCACCTTAG
Q Q F N О М I I Т М N G N Е F Q Т G G I
GGAAACCTCCCAATCAGGAACTGGAACTTCGATTTCGGACTCCTCGGAACТАСТСТССТС
CCTTTGGAGGGTTAGTCCTTGACCTTGAAGCTAAAGCCTGAGGAGCCTTGATGAGAGGAG
G N L Р I R N W N F D F G L L G Т Т L L
AACCTCGATGCTAACTACGTGGAGACTGCTAGGAACACTATCGATTACTTCGTTGATTTC
TTGGAGCTACGATTGATGCACCTCTGACGATCCTTGTGATAGCTAATGAAGCAACTAAAG NLDANYVETARNTIDYFVDF
GTGGATAATGTGTGCATGGATGAGATGGTTCGTGAGTCCCAGAGGAACGGAATTGCTCCA
CACCTATTACACACGTACCTACTCTACCAAGCACTCAGGGTCTCCTTGCCTTAACGAGGT
V D N V С М D Е М V R Е S Q R N G ТАР
CAGTCCGATTCCCTCAGGAAGCTCTCCGGTATCAAGTTCAAGAGGATCAACTTCGATAAC
GTCAGGCTAAGGGAGTCCTTCGAGAGGCCATAGTTCAAGTTCTCCTAGTTGAAGCTATTG
Q S D S L R К L S G I К F К R I N F D N
TCCTCCGAGTACATCGAGAACTGGAACCTCCAGAACAGAAGGCAGAGGACTGGATTCACT
AGGAGGCTCATGTAGCTCTTGACCTTGGAGGTCTTGTCTTCCGTCTCCTGACCTAAGTGA
S S Е Y I Е N W N L Q N R R Q R Т G F Т
TTCCACAAGCCAAACATCTTCCCATACTCCGCTTCCTTCACTCTCAACAGGTCCCAGCCA
AAGGTGTTCGGTTTGTAGAAGGGTATGAGGCGAAGGAAGTGAGAGTTGTCCAGGGTCGGT
F H К P N I F P Y S A S F T L N R S Q P
GCTCACGATAACCTCATGGGAACTATGTGGCTCAACGCTGGTTCTGAGATCCAGGTGGCA
CGAGTGCTATTGGAGTACCCTTGATACACCGAGTTGCGACCAAGACTCTAGGTCCACCGT
A H D N L M G T M W L NAG S E I OVA
GGATTCGATTACTCCTGCGCTATCAACGCTCCAGCTAACACTCAGCAGTTCGAGCACATC
CCTAAGCTAATGAGGACGCGATAGTTGCGAGGTCGATTGTGAGTCGTCAAGCTCGTGTAG
G F D Y S С A I N A P A N T Q Q F E H I
GTTCAGCTCAGAAGGGTGCTCACTACTGCTACTATCACTCTCCTCCCAGATGCTGAGAGG
CAAGTCGAGTCTTCCCACGAGTGATGACGATGATAGTGAGAGGAGGGTCTACGACTCTCC
V Q L R R V L T TAT I T L L P D A E R
TTCTCCTTCCCAAGGGTGATCAACTCCGCTGATGGTGCTACTACTTGGTACTTCAACCCA
AAGAGGAAGGGTTCCCACTAGTTGAGGCGACTACCACGATGATGAACCATGAAGTTGGGT
F S F P R V I N S A D GAT T W Y F N P
GTGATCCTCAGGCCAAACAACGTGGAGGTGGAGTTCCTTCTCAACGGACAGATCATCAAC
CACTAGGAGTCCGGTTTGTTGCACCTCCACCTCAAGGAAGAGTTGCCTGTCTAGTAGTTG
V I LRPNNVEVE F L L N G Q I I N
ACTTACCAGGCTCGTTTCGGAACTATCGTGGCTAGGAACTTCGATACAATCAGGCTCTCC
TGAATGGTCCGAGCAAAGCCTTGATAGCACCGATCCTTGAAGCTATGTTAGTCCGAGAGG
T Y OAR F G T I V A R N F D T I R L S
TTCCAGCTTATGAGGCCACCAAACATGACTCCATCCGTGGCTGCACTCTTCCCAAACGCA
AAGGTCGAATACTCCGGTGGTTTGTACTGAGGTAGGCACCGACGTGAGAAGGGTTTGCGT
F Q L M R P P N M T P S_V_A_A_L F P N A
CAGCCATTCGAGCACCACGCTACTGTGGGACTCACTCTCAAGATCGAGTCCGCTGTGTGC
GTCGGTAAGCTCGTGGTGCGATGACACCCTGAGTGAGAGTTCTAGCTCAGGCGACACACG
Q P F E H H A T V G L T L К I E S A V С
GAGTCTGTGCTCGCTGATGCTTCCGAGACTATGCTCGCTAACGTGACTTCTGTGAGGCAA
CTCAGACACGAGCGACTACGAAGGCTCTGATACGAGCGATTGCACTGAAGACACTCCGTT
ESVLADASETMLANVTSVR С)
GAGTACGCTATCCCAGTGGGACCAGTGTTTCCACCAGGAATGAACTGGACTGATCTCATC
CTCATGCGATAGGGTCACCCTGGTCACAAAGGTGGTCCTTACTTGACCTGACTAGAGTAG EYAIPVGPVFPPGMNWTDLI
ACTAACTACTCCCCATCCAGAGAGGATAACCTCCAGAGGGTGTTCACTGTGGCTTCCATC
TGATTGATGAGGGGTAGGTCTCTCCTATTGGAGGTCTCCCACAAGTGACACCGAAGGTAG
T N Y S P S R E D N L Q R V F T V A S I
CGTTCCATGCTCGTGAAGTGATGACTCGAGGGATCCTCTAGAGAA
GCAAGGTACGAGCACTTCACTACTGAGCTCCCTAGGAGATCTCTT
R S M L V К * * SEQ ID NO: 3
TTCGAGCTC SEQ ID NO: 17 AAGCTCGAG SEQ ID NO: 18
Ротавирусный VP 7
Название гена: G9P6_VP7 Длина гена: 1041 п.н.
Оптимизирован для экспрессии в: Nicotiana tabacum
GGTACCGAATTCGGACGCGTTCGTTGCATGTACGGAATCGAGTACACТАСТАТССТСАСТ
CCATGGCTTAAGCCTGCGCAAGCAACGTACATGCCTTAGCTCATGTGATGATAGGAGTGA
SEQ ID N0:4 G R V R С M Y G I E Y T T I L T
TTCCTCATCTCCATCGTGCTCCTCAACTACATCCTCAAGTCCCTCACTTCCGCTATGGAT
AAGGAGTAGAGGTAGCACGAGGAGTTGATGTAGGAGTTCAGGGAGTGAAGGCGATACCTA
F L I S I V L L N Y I L К S L T SAMP
TTCATCATCTACCGTTTCCTCCTCCTCATCGTGATCGCTTCCCCATTCGTTAAGACTCAG
AAGTAGTAGATGGCAAAGGAGGAGGAGTAGCACTAGCGAAGGGGTAAGCAATTCTGAGTC
F I I Y R F L L L I V I A S P F V К T Q
AACTACGGTATCAACCTCCCAATCACTGGATCTATGGATACTGCTTACGCTAACTCCTCC
TTGATGCCATAGTTGGAGGGTTAGTGACCTAGATACCTATGACGAATGCGATTGAGGAGG
N Y G I N L P I T G S M D T A Y A N S S
CAGCAAGAGACTTTCCTCACTTCCACACTCTGCCTCTACTACCCAACTGAGGCATCCACA
GTCGTTCTCTGAAAGGAGTGAAGGTGTGAGACGGAGATGATGGGTTGACTCCGTAGGTGT
Q Q E T F L T S T L С L Y Y P T E A S T
CAGATCGGAGATACAGAGTGGAAGGATACTCTCTCCCAGCTCTTCCTCACTAAGGGATGG
GTCTAGCCTCTATGTCTCACCTTCCTATGAGAGAGGGTCGAGAAGGAGTGATTCCCTACC
Q I G D T E W К D T L S Q L F L T К G W
CCAACTGGTTCCGTGTACTTCAAAGAGTACACTGATATCGCTTCCTTCTCCATCGATCCA
GGTTGACCAAGGCACATGAAGTTTCTCATGTGACTATAGCGAAGGAAGAGGTAGCTAGGT
P T G S V Y F К E Y T D IAS F S I D P
CAGCTCTACTGCGATTACAACGTGGTGCTTATGAAGTACGATTCCACTCTTGAGCTTGAT
GTCGAGATGACGCTAATGTTGCACCACGAATACTTCATGCTAAGGTGAGAACTCGAACТА
Q L Y С D Y N V V L M К Y D S T L E L D
ATGTCCGAGCTTGCTGATCTCATCCTCAACGAGTGGCTCTGCAACCCAATGGATATCACT
TACAGGCTCGAACGACTAGAGTAGGAGTTGCTCACCGAGACGTTGGGTTACCTATAGTGA MSELADLILNEWLCNPMDIT
CTCTACTACTACCAGCAGACTGATGAGGCTAACAAGTGGATCTCTATGGGACAGTCCTGC
GAGATGATGATGGTCGTCTGACTACTCCGATTGTTCACCTAGAGATACCCTGTCAGGACG
L Y Y Y Q Q T D E A N К W I S M G Q S С
ACTATCAAAGTGTGCCCACTCAACACTCAGACTCTCGGAATCGGATGCATCACTACTAAC
TGATAGTTTCACACGGGTGAGTTGTGAGTCTGAGAGCCTTAGCCTACGTAGTGATGATTG
T I К V С P L N T Q T L G I G С I T T N
ACTGCTACTTTCGAGGAAGTGGCTACTTCCGAGAAGCTCGTGATCACTGATGTGGTGGAT
TGACGATGAAAGCTCCTTCACCGATGAAGGCTCTTCGAGCACTAGTGACTACACCACCTA
TAT F E E V A T S E К L V I T D V V D
GGTGTTAACCACAAGCTCGATGTGACTACTAACACATGCACAATCAGGAACTGCAAGAAG
CCACAATTGGTGTTCGAGCTACACTGATGATTGTGTACGTGTTAGTCCTTGACGTTCTTC
G V N H К L DVT T N T С T I R N С К К
CTCGGACCAAGGGAAAACGTGGCTATCATCCAAGTGGGAGGTTCCGATGTGCTCGATATC
GAGCCTGGTTCCCTTTTGCACCGATAGTAGGTTCACCCTCCAAGGCTACACGAGCTATAG
L G P R E N V A I I 0 V G G S D V L D I
ACTGCTGATCCAACTACTGCTCCACAGACTGAGAGGATGATGAGGGTGAACTGGAAGAAG
TGACGACTAGGTTGATGACGAGGTGTCTGACTCTCCTACTACTCCCACTTGACCTTCTTC
TAD P T TAP Q T E RMMRVNWKK
TGGTGGCAGGTTTTCTACACTGTGGTGGATTACATCAACCAGATCGTTCAGGTGATGTCC
ACCACCGTCCAAAAGATGTGACACCACCTAATGTAGTTGGTCTAGCAAGTCCACTACAGG
W W 0 V F Y T V V D Y I N 0 I V 0 V M S
AAGAGGTCCCGTTCTCTCAACTCCGCTGCTTTCTACTACCGTGTGTGATGACTCGAGGGA
TTCTCCAGGGCAAGAGAGTTGAGGCGACGAAAGATGATGGCACACACTACTGAGCTCCCT
К R S R S L N S A A F Y Y R V * * SEQ ID NO: 4
TCCTCTAGAGAATTCGAGCTC SEQ ID NO: 19
1021 + +-
AGGAGATCTCTTAAGCTCGAG SEQ ID NO: 2 0
A-2X35S/CPMV-HT/ RVA(WA) VP2(opt)/ NOS (конструкт номер 1710)
ФИГ. 17А, SEQ ID NO: 21
IF-WA_VP2(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCAAAGCGCGAA
ФИГ. 17B, SEQ ID NO: 22
IF-WA_VP2(opt).sl-4r
ACT A A AGAAAAT AGGC CTTTAAAGC TC GTTC ATT ATTC GC ATATTGTC GA
Фиг. 17C
Левая граница Т-ДНК I
ФИГ. 18, SEQ ID NO: 23
Конструкт 1191 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин.
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
CCATTCTATAAAAAATCACACTTTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAG
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCT
ACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAA
TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGA
AGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGT
GGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA
AAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGAT
ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGA
TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCC
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCC
CACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTG
ATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG
AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCG
AACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGC
GATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAG
ATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCT
TGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTC
GGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTG
ATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAG
ATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCGCGGATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCG
GCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCCTGCAGGCTCCTCAGCCAAAACGACA
CCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCT
GGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCAC
ACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTG
GCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGT
GCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCC
CAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAA
GGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCC
CGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCA
ATGGCAAGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTT
TGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTT
TATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTT
AATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTT
CAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTT
CTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTAT
GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAA
ATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAGTCTCAAGCTTGGCGCGCCCACGTGACTAG
TGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGC
AGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTG
CGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTA
AACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA
Фиг. 19
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP2(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 45).
ATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCA7AAGCGCGA7A7AACCTGCCGCAACAGAACGAGAGACTG СAAGAAAAAGAGATAGAGAAAGAT GT С GAC GTAACAAT GGAAAACAAGAATAACAATAGG AAACAACAGСTGTССGACAAAGTTСTGTСССAGAAGGAGGAAATTATСACTGACGСССAG GAC GATAT TAAAAT T GC С GGAGAAATAAAGAAGAGC T С GAAAGAAGAAT С TAAACAGC T G С T С GAAAT T С T GAAAACAAAAGAAGAC СAT СAGAAAGAGAT T СAATAT GAAAT T T T GCAA AAAACAATACCTACATTTGAGTCCAAAGAAAGTATCCTCAAGAAGCTTGAAGACATAAGA CCGGAGCAGGCAAAAAAACAGATGAAACTCTTTCGCATTTTCGAGCCAAAACAGCTCCCT ATATATCGCGCCAATGGCGAGAAGGAGCTACGCAACCGGTGGTACTGGAAGTTGAAAAAA GACACCCTGCCAGATGGAGATTATGACGTCCGGGAGTATTTCCTCAATCTCTATGATCAG ATCCTCATCGAAATGCCGGACTATCTGCTCCTCAAGGACATGGCCGTGGAGAACAAAAAT AGCAGAGACGCCGGCAAAGTTGTCGACTCTGAGACTGCCAATATTTGTGATGCCATCTTC CAGGATGAGGAGACCGAGGGAGTCGTCCGTAGATTCATCGCTGATATGCGGCAACAGGTC CAGGCTGATCGTAACATTGTCAATTACCCTTCCATCCTTCACCCTATTGATCATGCATTC AATGAGTATTTTCTTAACCACCAGTTGGTGGAGCCGCTGAACAATGAGATAATCTTCAAT TACATAC СAGAGAGGATAAGGAAT GAC G T GAAT TACAT С С T GAACAT G GATAT GAAT С T G CCATCTACAGCCAGGTATATCAGGCCAAACTTGTTGCAGGATAGACTGAATCTTCACGAT AATTTTGAGTCCCTGTGGGATACCATCACAACATCCAACTACATTCTGGCCAGGTCCGTC GTTCCCGATTTGAAGGAGAAGGAGCTGGTCTCCACCGAAGCACAGATCCAGAAAATGAGC CAGGACCTGCAGCTGGAGGCCCTCACTATTCAGAGCGAGACACAGTTTTTAGCCGGGATT AACAGTCAGGCTGCCAATGATTGTTTCAAGACCCTCATAGCCGCCATGCTGTCTCAAAGA ACCATGTCTTTGGACTTTGTGACCACGAACTATATGAGCCTAATCTCCGGAATGTGGCTA CTTACAGTGATTCCCAACGATATGTTCCTCCGGGAGTCACTAGTGGCCTGTGAGCTGGCG ATCATCAACACCATCGTGTATCCAGCATTCGGAATGCAGAGAATGCATTACCGGAATGGC GAC CCTCAGACACCCTTC СAGAT С G СAGAACAG СAGAT ССAGAAT TTCCAGGTGGC GAAC TGGCTCCATTTTATTAACAATAACAGATTCAGGCAAGTTGTGATTGATGGAGTTCTGAAT CAGACTС T GAAC GACAATATAC G GAAT G GACAGGT СAT СAAC СAGC T GAT G GAAG CAT T G ATGCAACTCAGCAGACAGCAGTTCCCCACGATGCCTGTGGATTACAAACGGAGCATCCAA CGGGGCATTCTGCTTCTCTCCAATAGGCTGGGGCAGCTTGTCGACTTAACCCGACTGGTC TCCTATAACTACGAGACGCTAATGGCTTGTGTGACCATGAACATGCAGCACGTGCAAACC CTGACAACTGAGAAGTTGCAGCTCACTTCTGTGACTTCGCTTTGTATGTTAATTGGTAAC ACAAC С GTGATTCCGTCCC СACAGACAC TGTTCCACTAC TACAACAT СAAC G TGAAT T T С CACTCCAATTATAATGAGCGGATCAACGACGCCGTCGCCATAATTACCGCAGCAAATAGG СTGAATСTTTATСAGAAAAAAATGAAGTССATAGTGGAAGACTTTСTGAAACGGСTССAG ATTTTCGACGTACCACGAGTGCCTGACGACCAAATGTACAGGCTGAGGGATCGCCTTCGG CTCTTACCCGTTGAACGGAGACGGCTTGACATATTCAACTTGATCCTGATGAATATGGAG CAGATCGAACGCGCTTCTGATAAGATTGCTCAGGGGGTTATCATCGCATACCGAGATATG CAGCTGGAACGCGACGAGATGTACGGATATGTTAATATTGCACGGAATCTTGATGGCTAC CAGCAAATTAACTTGGAGGAACTCATGCGCACCGGTGATTACGGACAAATTACGAACATG CTTCTCAACAATCAACCCGTTGCCCTTGTGGGTGCATTGCCCTTCGTTACGGACTCATCC GTGATCAGTCTAATCGCCAAGCTCGACGCAACCGTCTTCGCTCAGATAGTGAAGCTCAGG AAAG T T GACACAC T GAAG С С СATAC T GTACAAAATAAAC T CGGATT С СAAT GAC T T T TAC CTTGTGGCCAACTACGACTGGATCCCCACAAGTACAACTAAGGTCTACAAACAGGTGCCA CAACCATTCGACTTTAGAGCCAGCATGCACATGCTGACTTCTAACCTTACGTTTACCGTC TACTCTGACCTACTGTCATTTGTTTCAGCGGACACGGTAGAGCCCATTAACGCAGTCGCA TTCGACAATATGC GAATAAT GAAC GAG С T T TAA
Figure 20, SEQ ID NO: 25
Аминокислотная последовательность VP2 из штамма WA ротавируса А
MAYRKRGAKRENLPQQNERLQEKEIEKDVDVTMENKNNNRKQQLSDKVLSQKEEIITDAQDDIKIAGEIKKSS
KEESKQLLEILKTKEDHQKEIQYEILQKTIPTFESKESILKKLEDIRPEQAKKQMKLFRIFEPKQLPIYRANGEKE
LRNRWYWKLKKDTLPDGDYDWEWLNLYDQILIEMPDYLLLKDMAVENKNSRDAGKVVDSETANICDAIF
QDEETEGVWPJIADMRQQVQADRNIWYPSILHPIDHAFNEYFLNHQLVEPLNNEIIFNYIPERIRNDVNYILN
MDMNLPSTARYIRPNLLQDPXNLHDNFESLWDTITTSNYILARSVVPDLKEKELVSTEAQIQKMSQDLQLEAL
TIQSETQFLAGINSQAANDCЖTLIAAMLSQRTMSLDFVTTNYMSLISGMWLLTVIPNDMFLRESLVACELAII
NTIVYPAFGMQRMHYRNGDPQTPFQIAEQQIQNFQVANWLHFINNNRFRQWroGVLNQTLNDNIRNGQVIN
QLMEALMQLSRQQFPTMPVDYKT LQLTSVTSLCMLIGNTTVIPSPQTLFHYYNINVNFHSNYNERINDAVAIITAANRLNLYQKKMKSIVEDFLKRLQ
IFDWRWDDQMYRLRDRLRLLPVERRRLDIFNLILMNMEQIERASDKIAQGVIIAYRDMQLERDEMYGYVNI
ARNLDGYQQINLEELMRTGDYGQITNMLLNNQPVALVGALPFVTDSSVISLIAKLDATWAQIVKLRKVDTLK
PIL YKIN SD SNDF YL VAN YD WIPT ЭТЖ WKQ WQPFDFR A SMHMLT SNLTFT VY SDLL SF VS ADT VEPIN A VA
roNMRIMNEL
Фиг. 21
Схематическое представление конструкта номер 1710.
Левая граница Т-ДНК
B-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP2(opf)/NOS в систему амплификации BeYDV(т)+репликаза (конструкт номер 1711).
Фиг. 22А
Левая граница Т-ДНК I
ФИГ. 22В, SEQ ID NO: 26
Конструкт 193 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/NOS в систему амплификации BeYDV(m) + репликаза с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин.
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
CCATTCTATAAAAAATCACACTTTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAG
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGAGACGCGTTGTTGTTGTGACTCCGAGGGGTTGCCTCAAACTCTATCTT
ATAACCGGCGTGGAGGCATGGAGGCAGGGGTATTTTGGTCATTTTAATAGATAGTGGAAAATGACGTGG
AATTTACTTAAAGACGAAGTCTTTGCGACAAGGGGGGGCCCACGCCGAATTTAATATTACCGGCGTGGCC
CCCCCTTATCGCGAGTGCTTTAGCACGAGCGGTCCAGATTTAAAGTAGAAAATTTCCCGCCCACTAGGGT
TAAAGGTGTTCACACTATAAAAGCATATACGATGTGATGGTATTTGGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCA
ACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGG
CAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCA
CTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGC
CATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGA
AAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACAC
ACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAA
AGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGG
AAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTG
CCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCA
CGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCC
TTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTT
GATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAA
ACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACG
TTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGT
ACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATAC
ATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTG
CCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTT
TTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCG
CGGATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTC
GCCTGCAGGCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAA
ACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGA
ACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGC
AGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCA
GCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCC
AGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGG
TCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGT
GGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGA
ACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACC
ATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAG
CGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCG
TCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCG
ATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTG
CCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGC
ATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAA
ACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAG
TCTCAAGCTTGGCGCGCCATAAAATGATTATTTTATGAATATATTTCATTGTGCAAGTAGATAGAAATTAC
ATATGTTACATAACACACGAAATAAACAAAAAAAGACAATCCAAAAACAAACACCCCAAAAAAAATAA
TCACTTTAGATAAACTCGTATGAGGAGAGGCACGTTCAGTGACTCGACGATTCCCGAGCAAAAAAAGTCT
CCCCGTCACACATATAGTGGGTGACGCAATTATCTTTAAAGTAATCCTTCTGTTGACTTGTCATTGATAAC
ATCCAGTCTTCGTCAGGATTGCAAAGAATTATAGAAGGGATCCCACCTTTTATTTTCTTCTTTTTTCCATAT
TTAGGGTTGACAGTGAAATCAGACTGGCAACCTATTAATTGCTTCCACAATGGGACGAACTTGAAGGGGA
TGTCGTCGATGATATTATAGGTGGCGTGTTCATCGTAGTTGGTGAAATCGATGGTACCGTTCCAATAGTTG
TGTCGTCCGAGACTTCTAGCCCAGGTGGTCTTTCCGGTACGAGTTGGTCCGCAGATGTAGAGGCTGGGGT
GTCGGATTCCATTCCTTCCATTGTCCTGGTTAAATCGGCCATCCATTCAAGGTCAGATTGAGCTTGTTGGT
ATGAGACAGGATGTATGTAAGTATAAGCGTCTATGCTTACATGGTATAGATGGGTTTCCCTCCAGGAGTG
TAGATCTTCGTGGCAGCGAAGATCTGATTCTGTGAAGGGCGACACATACGGTTCAGGTTGTGGAGGGAAT
AATTTGTTGGCTGAATATTCCAGCCATTGAAGTTTTGTTGCCCATTCATGAGGGAATTCTTCCTTGATCAT
GTCAAGATATTCCTCCTTAGACGTTGCAGTCTGGATAATAGTTCTCCATCGTGCGTCAGATTTGCGAGGAG
AGACCTTATGATCTCGGAAATCTCCTCTGGTTTTAATATCTCCGTCCTTTGATATGTAATCAAGGACTTGT
TTAGAGTTTCTAGCTGGCTGGATATTAGGGTGATTTCCTTCAAAATCGAAAAAAGAAGGATCCCTAATAC
AAGGTTTTTTATCAAGCTGGAGAAGAGCATGATAGTGGGTAGTGCCATCTTGATGAAGCTCAGAAGCAAC
ACCAAGGAAGAAAATAAGAAAAGGTGTGAGTTTCTCCCAGAGAAACTGGAATAAATCATCTCTTTGAGA
TGAGCACTTGGGATAGGTAAGGAAAACATATTTAGATTGGAGTCTGAAGTTCTTACTAGCAGAAGGCATG
TTGTTGTGACTCCGAGGGGTTGCCTCAAACTCTATCTTATAACCGGCGTGGAGGCATGGAGGCAGGGGTA
TTTTGGTCATTTTAATAGATAGTGGAAAATGACGTGGAATTTACTTAAAGACGAAGTCTTTGCGACAAGG
GGGGGCCCACGCCGAATTTAATATTACCGGCGTGGCCCCCCCTTATCGCGAGTGCTTTAGCACGAGCGGT
CCAGATTTAAAGTAGAAAATTTCCCGCCCACTAGGGTTAAAGGTGTTCACACTATAAAAGCATATACGAT
GTGATGGTATTTGACTAGTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTAC
CCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGAT
CGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCG
TTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTATCAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAG
CGTTTA
ФИГ. 23, SEQ ID NO: 27
Экспрессионная кассета номер 1710 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCATACCGGAAGAGAGGAGCAAAGCGCGAAAACCTGCCGCAACAGAACGAGAGACTGCAAGAA
AAAGAGATAGAGAAAGATGTCGACGTAACAATGGAAAACAAGAATAACAATAGGAAACAACAGCTGTC
CGACAAAGTTCTGTCCCAGAAGGAGGAAATTATCACTGACGCCCAGGACGATATTAAAATTGCCGGAGA
AATAAAGAAGAGCTCGAAAGAAGAATCTAAACAGCTGCTCGAAATTCTGAAAACAAAAGAAGACCATC
AGAAAGAGATTCAATATGAAATTTTGCAAAAAACAATACCTACATTTGAGTCCAAAGAAAGTATCCTCA
AGAAGCTTGAAGACATAAGACCGGAGCAGGCAAAAAAACAGATGAAACTCTTTCGCATTTTCGAGCCAA
AACAGCTCCCTATATATCGCGCCAATGGCGAGAAGGAGCTACGCAACCGGTGGTACTGGAAGTTGAAAA
AAGACACCCTGCCAGATGGAGATTATGACGTCCGGGAGTATTTCCTCAATCTCTATGATCAGATCCTCAT
CGAAATGCCGGACTATCTGCTCCTCAAGGACATGGCCGTGGAGAACAAAAATAGCAGAGACGCCGGCAA
AGTTGTCGACTCTGAGACTGCCAATATTTGTGATGCCATCTTCCAGGATGAGGAGACCGAGGGAGTCGTC
CGTAGATTCATCGCTGATATGCGGCAACAGGTCCAGGCTGATCGTAACATTGTCAATTACCCTTCCATCCT
TCACCCTATTGATCATGCATTCAATGAGTATTTTCTTAACCACCAGTTGGTGGAGCCGCTGAACAATGAG
ATAATCTTCAATTACATACCAGAGAGGATAAGGAATGACGTGAATTACATCCTGAACATGGATATGAATC
TGCCATCTACAGCCAGGTATATCAGGCCAAACTTGTTGCAGGATAGACTGAATCTTCACGATAATTTTGA
GTCCCTGTGGGATACCATCACAACATCCAACTACATTCTGGCCAGGTCCGTCGTTCCCGATTTGAAGGAG
AAGGAGCTGGTCTCCACCGAAGCACAGATCCAGAAAATGAGCCAGGACCTGCAGCTGGAGGCCCTCACT
ATTCAGAGCGAGACACAGTTTTTAGCCGGGATTAACAGTCAGGCTGCCAATGATTGTTTCAAGACCCTCA
TAGCCGCCATGCTGTCTCAAAGAACCATGTCTTTGGACTTTGTGACCACGAACTATATGAGCCTAATCTCC
GGAATGTGGCTACTTACAGTGATTCCCAACGATATGTTCCTCCGGGAGTCACTAGTGGCCTGTGAGCTGG
CGATCATCAACACCATCGTGTATCCAGCATTCGGAATGCAGAGAATGCATTACCGGAATGGCGACCCTCA
GACACCCTTCCAGATCGCAGAACAGCAGATCCAGAATTTCCAGGTGGCGAACTGGCTCCATTTTATTAAC
AATAACAGATTCAGGCAAGTTGTGATTGATGGAGTTCTGAATCAGACTCTGAACGACAATATACGGAATG
GACAGGTCATCAACCAGCTGATGGAAGCATTGATGCAACTCAGCAGACAGCAGTTCCCCACGATGCCTGT
GGATTACAAACGGAGCATCCAACGGGGCATTCTGCTTCTCTCCAATAGGCTGGGGCAGCTTGTCGACTTA
ACCCGACTGGTCTCCTATAACTACGAGACGCTAATGGCTTGTGTGACCATGAACATGCAGCACGTGCAAA
CCCTGACAACTGAGAAGTTGCAGCTCACTTCTGTGACTTCGCTTTGTATGTTAATTGGTAACACAACCGTG
ATTCCGTCCCCACAGACACTGTTCCACTACTACAACATCAACGTGAATTTCCACTCCAATTATAATGAGCG
GATCAACGACGCCGTCGCCATAATTACCGCAGCAAATAGGCTGAATCTTTATCAGAAAAAAATGAAGTC
CATAGTGGAAGACTTTCTGAAACGGCTCCAGATTTTCGACGTACCACGAGTGCCTGACGACCAAATGTAC
AGGCTGAGGGATCGCCTTCGGCTCTTACCCGTTGAACGGAGACGGCTTGACATATTCAACTTGATCCTGA
TGAATATGGAGCAGATCGAACGCGCTTCTGATAAGATTGCTCAGGGGGTTATCATCGCATACCGAGATAT
GCAGCTGGAACGCGACGAGATGTACGGATATGTTAATATTGCACGGAATCTTGATGGCTACCAGCAAATT
AACTTGGAGGAACTCATGCGCACCGGTGATTACGGACAAATTACGAACATGCTTCTCAACAATCAACCCG
TTGCCCTTGTGGGTGCATTGCCCTTCGTTACGGACTCATCCGTGATCAGTCTAATCGCCAAGCTCGACGCA
ACCGTCTTCGCTCAGATAGTGAAGCTCAGGAAAGTTGACACACTGAAGCCCATACTGTACAAAATAAACT
CGGATTCCAATGACTTTTACCTTGTGGCCAACTACGACTGGATCCCCACAAGTACAACTAAGGTCTACAA
ACAGGTGCCACAACCATTCGACTTTAGAGCCAGCATGCACATGCTGACTTCTAACCTTACGTTTACCGTCT
ACTCTGACCTACTGTCATTTGTTTCAGCGGACACGGTAGAGCCCATTAACGCAGTCGCATTCGACAATAT
GCGAATAATGAACGAGCTTTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCT
ATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTG
TTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAG
ACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGA
TTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAAT TAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAAT ACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACT AGAT
Левая граница Т-ДНК J
C-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opt)/NOS (конструкт номер 1713)
ФИГ. 25а, SEQ ID NO: 28
IF-WA_VP6(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGA
ФИГ. 25Ь, SEQ ID NO: 29
IF-WA_VP6(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTACTTGATCAACATACTCCGGATAGAGGCCACA
ФИГ. 25c, SEQ ID NO: 30
Экспрессионная кассета номер 1713 от промотора 2X35S до терминатора NOS. VP6(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAGGGTACACT
TTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACAATGAATGGGAATGATTTC
CAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACATTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTC
TCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAACGCCAGAACGATTATCGAGTACTTTATCGATTTCATTGAT
AACGTTTGTATGGATGAGATGGCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTC
GGAAACTCGCCGGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAA
CTTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTATAGCGCCTCAT
TCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATGTGGCTGAATGCGGGGAGTG
AAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAATGCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACA
TATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACCGCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCC
TTTCCCCGCGTAATCAACTCAGCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAA
CAACGTAGAGGTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT
ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATGACTCCCGCTG
TGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTCGGCTTGACTCTTCGAATAGAG
AGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAGACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGG
CAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTGTTTCCACCCGGCATGAACTGGACTGAACTAATTACTAACT
ATAGCCCATCCAGAGAAGACAACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAA
GTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTT
CTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTC
AGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAA
GCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCT
TGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT
TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAAT
ATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP6(opt) из штамма WA ротавируса A (SEQ ID NO: 46)
ATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAG GGTACACTTTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACA ATGAATGGGAATGATTTCCAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACA TTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTCTCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAAC G С СAGAAC GAT TAT С GAG TACTTTATCGATTTCATT GATAAC G TTTGTATG GAT GAGAT G GCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTCGGAAACTCGCC GGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAAC TTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTAT AGCGCCTCATTCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATG TGGCTGAATGCGGGGAGTGAAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAAT GCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACATATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACC GCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCCTTTCCCCGCGTAATCAACTCA GCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAACAACGTAGAG GTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATG ACTCCCGCTGTGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTC GGCTTGACTCTTCGAATAGAGAGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAG ACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGGCAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTG T T T С СAC С С GGCAT GAAC TGGACT GAAC TAAT TAC TAAC TATAGC С СAT С СAGAGAAGAC AACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAAGTAG
ФИГ. 26, SEQ ID NO: 31
Аминокислотная последовательность VP6 из штамма WA ротавируса А.
MEVLYSLSKTLKDARDKIVEGTLYSNVSDLIQQFNQMIWMNGNDFQTGGIGNLPVRNWTFDFGLLGTTLLN
LDANYVENARTIffiYFIDFmNVCMDEMARESQRNGVAPQSEALRKLAGIKFKRINFDNSSEYIENWNLQNRRQ
RTGFVFHKPNIFPYSASFTLNRSQPMHDNLMGTMWLNAGSEIQVAGroYSCAINAPANIQQFEHIVQLRRALT
TATITLLPDAEPJSFPRVINSADGATTWFFNPVILRPNNVEVEFLLNGQIINTYQARFGTIIARNFDAIRLLFQLM
RPPNMTPAWALFPQAQPFQHHATVGLTLRffiSAVCESVLADANETLLANVTAWQEYAIPVGPVFPPGMNW
TELITNY SP SREDNLQR VFT VA SIRSMLIK
Левая граница Т-ДНК I
D-2X35S/CPMV-HT/RVA(WA) VP6(opf)/NOS в систему амплификации
BeYDV (m)+ репликаза (конструкт номер 1714)
ФИГ. 28, SEQ ID NO: 32
Экспрессионная кассета номер 1714 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма WA ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGAGGTCCTTTATAGTCTCTCCAAAACGCTGAAGGACGCTAGGGACAAGATCGTGGAGGGTACACT
TTATAGCAATGTCAGCGACCTAATACAGCAGTTTAATCAAATGATCGTTACAATGAATGGGAATGATTTC
CAAACTGGCGGTATTGGTAATCTGCCCGTGAGGAACTGGACATTCGATTTCGGCCTGCTGGGCACGACTC
TCCTTAATCTCGATGCAAATTATGTAGAAAACGCCAGAACGATTATCGAGTACTTTATCGATTTCATTGAT
AACGTTTGTATGGATGAGATGGCCCGCGAGTCACAACGGAACGGAGTTGCTCCACAGTCCGAGGCCCTTC
GGAAACTCGCCGGCATTAAGTTCAAGCGTATTAATTTCGACAACTCCTCCGAATATATAGAGAACTGGAA
CTTGCAGAATCGTCGACAGAGAACCGGCTTCGTGTTCCATAAACCTAATATCTTTCCGTATAGCGCCTCAT
TCACCCTGAATAGGAGTCAGCCCATGCACGACAACCTCATGGGTACAATGTGGCTGAATGCGGGGAGTG
AAATACAGGTCGCCGGGTTCGATTACTCCTGTGCCATTAATGCACCCGCAAACATCCAGCAGTTCGAACA
TATCGTGCAACTAAGACGGGCTCTCACGACCGCGACAATTACACTCCTGCCCGACGCCGAGCGCTTCTCC
TTTCCCCGCGTAATCAACTCAGCTGATGGCGCCACCACTTGGTTCTTCAACCCTGTTATATTGCGCCCTAA
CAACGTAGAGGTGGAGTTTCTCTTAAACGGACAGATCATCAATACCTACCAAGCCAGGTTCGGCACGATT
ATTGCAAGAAATTTCGACGCTATCAGGCTGCTCTTCCAACTGATGAGGCCCCCCAATATGACTCCCGCTG
TGAACGCTTTGTTTCCGCAGGCTCAGCCTTTCCAGCACCACGCCACCGTCGGCTTGACTCTTCGAATAGAG
AGCGCGGTCTGCGAATCAGTGCTGGCAGACGCCAACGAGACGCTGCTGGCAAACGTTACCGCCGTGCGG
CAAGAGTATGCCATCCCAGTAGGGCCTGTGTTTCCACCCGGCATGAACTGGACTGAACTAATTACTAACT
ATAGCCCATCCAGAGAAGACAACTTGCAGCGGGTCTTCACTGTGGCCTCTATCCGGAGTATGTTGATCAA
GTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTT
CTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTC
AGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAA
GCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCT
TGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGT
TATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAAT
ATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Левая граница Т-ДНК J
E-2X35S/CPMV-HT/ RVA(Rtx) VP4(optVNOS (конструкт номер 1731) ФИГ. ЗОА, SEQ ID NO: 33 IF-Rtx_VP4(opt). s 1+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTC
ФИГ. ЗОВ, SEQ ID NO: 34
IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTTCAGAGTTTACATTGCAGGATTAATTGCTCAATC СТА
ФИГ. 31A, SEQ ID NO: 35
Экспрессионная кассета номер 1731 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGA
GCAGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCC
CCTGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATAC
CAACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCT
ACGAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGA
TCGCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTT
CTGGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGAC
TCGTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGA
CTCCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGA
TCTCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTG
GTGCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGA
GCAAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTC
TATCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTAT
AACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTA
GCTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTA
TGTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCT
AATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCAT
GAATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTC
TGAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACT
GTCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCT
TCTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAG
ACAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAAT
GGCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTA
TAGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCA
TATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAA
TCTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTA
TGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGT
TTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGA
CCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGAT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT
AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA
CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA
GAT
Фиг. 31B
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] (SEQ ID NO: 47)
ATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGAGC
AGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCCCC
TGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATACCA
ACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCTAC
GAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGATC
GCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTTCT
GGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGACTC
GTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGACT
CCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGATC
TCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTGGT
GCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGAGC
AAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTCTA
TCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTATA
ACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTAG
CTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTAT
GTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCTA
ATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCATG
AATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTCT
GAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACTG
TCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCTT
CTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAGA
CAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAATG
GCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTAT
AGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCAT
ATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAAT
CTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGA
ФИГ. 31С (SEQ ID NO: 44)
Экспрессионная кассета номер 1730 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP2(opt) из штамма Rotarix ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCTAGCCTGATCTACAGACAACTCTTGACCAATTCATATTCTGTGGATCTTCATGACGAAATCGA
GCAGATTGGGTCCGAGAAGACCCAGAACGTGACCATCAACCCTGGACCTTTTGCTCAGACCCGCTATGCC
CCTGTGAATTGGGATCACGGAGAAATCAACGACAGTACGACCGTCGAACCCATTCTGGACGGGCCATAC
CAACCCACCACCTTCACCCCACCTAATGATTATTGGATTTTAATCAACTCCAACACAAACGGAGTGGTCT
ACGAGTCCACTAATAACTCCGATTTTTGGACCGCCGTTGTAGCCATCGAGCCACACGTCAATCCTGTCGA
TCGCCAGTATATGATATTCGGCGAGTCCAAACAGTTTAACGTTTCCAATGACAGCAACAAATGGAAGTTT
CTGGAGATGTTTCGCAGCTCCTCTCAGAACGAATTCTATAATAGACGGACCCTTACCTCCGATACACGAC
TCGTGGGTATTTTTAAGTACGGCGGCAGGGTGTGGACATTTCACGGTGAAACCCCTCGAGCAACCACTGA
CTCCAGTAGCACTGCAAACCTGAACAATATATCTATTACCATCCACAGCGAATTCTACATAATCCCAAGA
TCTCAGGAAAGTAAGTGTAACGAATATATCAACAACGGACTCCCCCCAATTCAGAATACACGGAACGTG
GTGCCTCTCCCACTCAGTTCTCGGTCTATCCAGTATAAGAGAGCACAAGTGAATGAGGACATTATTGTGA
GCAAGACTAGCCTTTGGAAAGAAATGCAGTACAACAGAGACATTATCATCCGGTTTAAGTTTGGGAACTC
TATCGTGAAGATGGGCGGCCTGGGGTACAAATGGTCAGAAATCTCATATAAAGCCGCCAACTATCAGTAT
AACTACTTGAGAGACGGCGAGCAGGTAACCGCCCACACAACATGCTCTGTCAACGGCGTTAATAACTTTA
GCTACAACGGAGGCTTCCTTCCCACCGACTTCGGTATCAGCCGGTATGAAGTCATCAAGGAAAATTCTTA
TGTGTACGTAGATTACTGGGATGATAGCAAAGCGTTCCGCAACATGGTGTATGTTAGGAGCCTGGCTGCT
AATCTCAATTCTGTGAAGTGTACTGGTGGATCATATTATTTCTCAATTCCCGTGGGGGCTTGGCCAGTCAT
GAATGGCGGGGCAGTCTCCCTCCATTTTGCTGGCGTGACGTTGAGCACTCAGTTTACCGATTTCGTGTCTC
TGAACTCCCTGAGGTTCCGGTTTTCCCTTACTGTCGACGAGCCCCCATTCAGCATTCTGCGTACAAGAACT
GTCAACCTCTACGGGTTACCTGCCGCGAATCCAAACAACGGCAATGAATACTATGAAATTTCGGGCCGCT
TCTCTTTGATAAGTCTGGTACCAACTAATGACGACTATCAGACACCCATCATGAACAGCGTGACTGTCAG
ACAGGACCTGGAAAGACAACTTACAGATCTGCGGGAAGAATTCAATTCTCTCAGTCAGGAGATTGCAAT
GGCCCAATTGATAGATCTTGCCCTACTGCCTCTCGATATGTTTAGTATGTTCTCCGGCATCAAATCAACTA
TAGATCTGACAAAGAGCATGGCTACTTCTGTGATGAAGAAGTTCAGGAAATCAAAACTTGCCACGAGCA
TATCAGAAATGACGAACTCTCTGAGTGATGCAGCATCATCAGCGTCACGCAACGTTTCCATTCGGTCGAA
TCTCAGCGCCATCAGCAACTGGACAAACGTGTCCAACGACGTCAGCAACGTGACCAACTCCTTGAACGAT
ATTTCTACCCAGACGTCAACGATCAGTAAGAAACTCCGCTTGAAAGAAATGATCACCCAGACTGAGGGA
ATGTCTTTCGACGACATTTCCGCCGCCGTGCTAAAAACCAAAATCGATATGTCTACTCAGATCGGCAAGA
ACACTCTGCCGGATATCGTAACCGAAGCCTCCGAAAAGTTTATCCCTAAGCGCAGCTACAGAATATTGAA
AGATGACGAGGTCATGGAGATCAACACAGAAGGGAAGTTCTTCGCTTATAAGATCAACACCTTTGACGA
GGTTCCGTTTGACGTCAATAAGTTTGCAGAGCTCGTGACAGATAGTCCAGTGATTTCTGCCATCATTGACT
TTAAGACTTTGAAGAACCTGAACGACAACTATGGAATAACACGGACCGAAGCGTTGAACCTCATTAAGT
CCAATCCCAATATGTTGCGCAATTTCATTAACCAGAACAATCCAATCATAAGAAATAGGATTGAGCAATT
AATCCTGCAATGTAAACTCTGAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTA
TGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGT
TTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGA
CCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGAT
TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATT
AACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATA
CGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTA
GAT
ФИГ. 32, SEQ ID NO: 36
Аминокислотная последовательность VP4 из штамма Rotarix ротавируса А.
MASLIYRQLLTNSYSVDLHDEffiQIGSEKTQNVTINPGPFAQTRYAPVNWDHGEINDSTTVEPILDGPYQPTTFT
PPNDYWILINSNraGVVYESraNSDFWTAVVAIEPHVNPVDRQYMIFGESKQFNVSNDSNKWKFLEMFRSSS
QNEFYNRRTLTSDTRLVGIFKYGGRVWTFHGETPRATTDSSSTANLNNISITfflSEFYIIPRSQESKCNEYINNGL
PPIQNTRN VVPLPL S SR SIQYKR AQ VNEDIIVSKTSLWKEMQYNRDIIIRFKFGN SI VKMG GL GYKW SEIS YK AA
NYQYNYLRDGEQWAHTTCSWGWNFSYNGGFLPTDFGISRYEVTKENSYWVDYWDDSKAFRNM
LAANLNSVKCTGGSYYFSIPVGAWVMNGGAVSLHFAGVTLSTQFTDFVSLNSLRFRFSLTVDEPPFSILRTRT
VNLYGLPAANPNNGNEYYEISGRFSLISLWTNDDYQTPIMNSVTWQDLERQLTDLREEFNSLSQEIAMAQLI
DLALLPLDMFSMFSGIKSTIDLmSMATSVMKKPPJCSKLATSISEMTNSLSDAASSASRNVSIRSNLSAISNWTN
VSNDVSNVTOSLNDISTQTSTISKKLRLKEMITQTEGMSroDISAAVLKTKIDMSTQIGKNTLPDIVTEASEKFIP
KRSYRILKDDEVMEINTEGKFFAYKINTroEWroVNKFAELVTDSPVTSAIIDFKTLKNLNDNYGIT^
KSNPNMLRNFINQNNPIIRNRIEQLILQCKL
Левая граница Т-ДНК
Правая граница Т-ДНК
F-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(0pt)/N0S (конструкт номер 1733)
ФИГ. 34А, SEQ ID NO: 37
IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c
AAATTTGTCGGGCCCATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTC
ФИГ. 34B, SEQ ID NO: 38
IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTAAACGCGATAATAGAAGGCTGCTGAGTTCAGG GA
ФИГ. 34C, SEQ ID NO: 24
Экспрессионная кассета номер 1733 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACATCCTT
AAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTACGTGGCCCTTTTTGCCCT
GACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCC
ACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCA
ATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTA
CTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTAC
TTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCT
GTGCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATG
GGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTA
ATGTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTA
ACCACAAGATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGA
ACGTCGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACA
GACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATT
AACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTT
AGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCT
GTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAG
CAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGC
TTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTG
CGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTA
TTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATAT
AGCGCGCAAACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Нуклеотидная последовательность, кодирующая VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 48).
ATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACATCCTTAA
GTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTACGTGGCCCTTTTTGCCCTGA
CCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCAC
TCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAAT
GATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACT
TCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTT
ATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGT
GCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGG
CTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAAT
GTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAAC
CACAAGATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAAC
GTCGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGA
CGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAA
CCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAG
Фиг. 34E
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A [8] (SEQ ID NO 54).
ATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTT^TTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTT7AAAC TACATCCTTAAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATC TACGTGGCCCTTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACC GGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACC CTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGAT AGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAA TACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTA CTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTC AATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAA TCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACC CAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGTTTGAAATGGTAGCCGAA AACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGATCAATCTGACT ACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG ATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAG ACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTG GACTACATTAACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCA GCCTTCTATTATCGCGTTTAG
ФИГ. 35, SEQ ID NO: 39
Аминокислотная последовательность VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А.
MYGIEYTTILIFLISIILLNYILKSVTRIMDYIIYRSLLIYVALFALTRAQNYGLNLPITGSMDTVYANSTQEGIFLT
STLCLYYPTEASTQINDGEWKDSLSQMFLTKGWPTGSVWKEYSSIVDFSVDPQLYCDYNLVLMKYDQNLEL
DMSELADLILNEWLCNPMDITLYYYQQSGESNKWISMGSSCTWVCPLNTQMLGIGCQTTNVDSFEMVAENE
KLAIVDWDGINHKINLTTTTCTmNCKK^
VF YTIVD YINQIVQVMSKR SR SLN S A AF YYR V
Фиг. 36
Схематическое представление конструкта номер 1733.
Левая граница Т-ДНК I
G-2X35S/CPMV-НТ/ RVA(Rtx) VP7(opt)/NOS (конструкт номер 1735) ФИГ. 37, SEQ ID NO: 40
IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c
TCTCAGATCTTCGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAAT GGATACC
Фиг. 38
Схематическое представление конструкта 1192. Сайты рестрикционных эндонуклеаз SacII и StuI, используемые для линеаризации плазмиды, аннотированы на представлении.
Левая граница Т-ДНК
ФИГ. 39, SEQ ID NO: 41
Конструкт 1192 от левой до правой границы т-ДНК (подчеркнут). 2X35S/CPMV-HT/PDISP/NOS с экспрессионной кассетой ингибитора сайленсинга пластоцианин-Р19-пластоцианин.
TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTA
ATGTACTGAATTAACGCCGAATCCCGGGCTGGTATATTTATATGTTGTCAAATAACTCAAAAACCATAAA
AGTTTAAGTTAGCAAGTGTGTACATTTTTACTTGAACAAAAATATTCACCTACTACTGTTATAAATCATTA
TTAAACATTAGAGTAAAGAAATATGGATGATAAGAACAAGAGTAGTGATATTTTGACAACAATTTTGTTG
CAACATTTGAGAAAATTTTGTTGTTCTCTCTTTTCATTGGTCAAAAACAATAGAGAGAGAAAAAGGAAGA
GGGAGAATAAAAACATAATGTGAGTATGAGAGAGAAAGTTGTACAAAAGTTGTACCAAAATAGTTGTAC
AAATATCATTGAGGAATTTGACAAAAGCTACACAAATAAGGGTTAATTGCTGTAAATAAATAAGGATGA
CGCATTAGAGAGATGTACCATTAGAGAATTTTTGGCAAGTCATTAAAAAGAAAGAATAAATTATTTTTAA
AATTAAAAGTTGAGTCATTTGATTAAACATGTGATTATTTAATGAATTGATGAAAGAGTTGGATTAAAGT
TGTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTCAAATTTAATTTGACATTTGATCTTTTCCTATATATTGCCCCATAGA
GTCAGTTAACTCATTTTTATATTTCATAGATCAAATAAGAGAAATAACGGTATATTAATCCCTCCAAAAA
AAAAAAACGGTATATTTACTAAAAAATCTAAGCCACGTAGGAGGATAACAGGATCCCCGTAGGAGGATA
ACATCCAATCCAACCAATCACAACAATCCTGATGAGATAACCCACTTTAAGCCCACGCATCTGTGGCACA
TCTACATTATCTAAATCACACATTCTTCCACACATCTGAGCCACACAAAAACCAATCCACATCTTTATCAC
CCATTCTATAAAAAATCACACTTTGTGAGTCTACACTTTGATTCCCTTCAAACACATACAAAGAGAAGAG
ACTAATTAATTAATTAATCATCTTGAGAGAAAATGGAACGAGCTATACAAGGAAACGACGCTAGGGAAC
AAGCTAACAGTGAACGTTGGGATGGAGGATCAGGAGGTACCACTTCTCCCTTCAAACTTCCTGACGAAAG
TCCGAGTTGGACTGAGTGGCGGCTACATAACGATGAGACGAATTCGAATCAAGATAATCCCCTTGGTTTC
AAGGAAAGCTGGGGTTTCGGGAAAGTTGTATTTAAGAGATATCTCAGATACGACAGGACGGAAGCTTCA
CTGCACAGAGTCCTTGGATCTTGGACGGGAGATTCGGTTAACTATGCAGCATCTCGATTTTTCGGTTTCGA
CCAGATCGGATGTACCTATAGTATTCGGTTTCGAGGAGTTAGTATCACCGTTTCTGGAGGGTCGCGAACT
CTTCAGCATCTCTGTGAGATGGCAATTCGGTCTAAGCAAGAACTGCTACAGCTTGCCCCAATCGAAGTGG
AAAGTAATGTATCAAGAGGATGCCCTGAAGGTACTCAAACCTTCGAAAAAGAAAGCGAGTAAGTTAAAA
TGCTTCTTCGTCTCCTATTTATAATATGGTTTGTTATTGTTAATTTTGTTCTTGTAGAAGAGCTTAATTAAT
CGTTGTTGTTATGAAATACTATTTGTATGAGATGAACTGGTGTAATGTAATTCATTTACATAAGTGGAGTC
AGAATCAGAATGTTTCCTCCATAACTAACTAGACATGAAGACCTGCCGCGTACAATTGTCTTATATTTGA
ACAACTAAAATTGAACATCTTTTGCCACAACTTTATAAGTGGTTAATATAGCTCAAATATATGGTCAAGTT
CAATAGATTAATAATGGAAATATCAGTTATCGAAATTCATTAACAATCAACTTAACGTTATTAACTACTA
ATTTTATATCATCCCCTTTGATAAATGATAGTACACCAATTAGGAAGGAGCATGCTCGCCTAGGAGATTG
TCGTTTCCCGCCTTCAGTTTGCAAGCTGCTCTAGCCGTGTAGCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCG
TTGGGAATTACTAGCGCGTGTCGACAAGCTTGCATGCCGGTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCT
ACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAA
TATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGA
AGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGT
GGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCA
AAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGAT
ACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGA
TTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCC
ATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCC
CACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTG
ATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGG
AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCG
AACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGC
GATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAG
ATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCT
TGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTC
GGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTG
ATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAG
ATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTT
ATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCCGCGGCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCA
TCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAA
GGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTC
CCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAG
CGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAG
GGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGC
CCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGA
TCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAG
GAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCA
AGGAGCGATCGCTCACCATCACCATCACCATCACCATCACCATTAAAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATT
TACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTA
ATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTT
ATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACA
TTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTG
AATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATTAG
AGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAAATTATC
GCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGATCTCTAGAGTCTCAAGCTTGGCGCGCCCACGTGACTAGTGGCA
CTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCAC
ATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAG
CCTGAATGGCGAATGCTAGAGCAGCTTGAGCTTGGATCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCAGTTTAAACTAT
CAGTGTTTGACAGGATATATTGGCGGGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGTTTA
ФИГ. 40A, SEQ ID N0:42
Экспрессионная кассета номер 1735 от промотора 2X35S к терминатору NOS. PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAA
AGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCT
GTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAA
AGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCG
TGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATAACATGGTGGAGCACG
ACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCA
ACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATA
GTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCC
TCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCA
ACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACT
ATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGG
TTTTGATAAAAGCGAACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAG
CAAACTTCTCTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACA
ACGTTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAACG
TGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTTCAGCCCCA
TACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGCTTGACGAGGTATTG
TTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATCTAGTATTTTCTTTGAAACAGA
GTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTCTGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGC
CCATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCG
CCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGA
GGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGG
GAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGG
AATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAA
TACGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACC
CCATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAG
TTGCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGAT
TCGTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAG
ATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCG
TGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGAAC
GGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAACCAGAT
TGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAGAGGCCT
ATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATGTTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAG
AGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCTCCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACA
CAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAAAAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGAC
CTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATT
ATCATATAATTTCTGTTGAATTACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAG
ATGGGTTTTTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCA
AACTAGGATAAATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
Нуклеотидная последовательность, кодирующая PDISP/VP7(opt) из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A (SEQ ID NO: 49)
ATGGCGAAAAACGTTGCGATTTTCGGCTTATTGTTTTCTCTTCTTGTGTTGGTTCCTTCTCAGATCTTCGCC CAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGG GGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGA GTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAA TACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATA CGACCAGAACCTGGAGCTGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCC ATGGACATCACATTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTT GCACCGTGAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTC GTTTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGAT CAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG ATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGAACGG ATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTAACCAGATTG TGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGCGTTTAG
ФИГ. 41, SEQ ID NO: 43
Аминокислотная последовательность PDISP/VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса A
MAKNVAIFGLLFSLLVLWSQIFAQNYGLNLPITGSMDTVYANSTQEGIFLTSTLCLYYPTEASTQINDGEWKD
SLSQMFLmGWTGSVYFKEYSSIVDFSVDPQLYCDYNLVLMKYDQNLELDMSELADLILNEWLCNPMDITL
YYYQQSGESNKWISMGSSCTWVCPLNTQMLGIGCQTTNVDSFEMVAENEKLAIVDVVDGINHKINLTTTTC
TIRNCKKLGPRENVAVIQVGGSNVLDITADPTTOPQTERM^
LNSAAFYYRV
Кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 50).
ATGGCTTCGCTCATTTATAGACAATTGCTCACGAATTCTTATACAGTAGATTTATCCGATGAGAT ACAAGAGATTGGATCAACTAAATCACAAAATGTCACAATTAATCCTGGACCATTTGCGCAAACAG GTTATGCTCCAGTTAACTGGGGACCTGGAGAAATTAATGATTCTACGACAGTTGAACCATTGCTG GATGGGCCTTATCAACCAACGACATTCAATCCACCAGTCGATTATTGGATGTTACTGGCTCCAAC GACACCTGGCGTAATTGTTGAAGGTACAAATAATACAGATAGATGGTTAGCCACAATTTTAATCG AGCCAAATGTTCAGTCTGAAAATAGAACTTACACTATATTTGGTATTCAAGAACAATTAACGGTA TCCAATACTTCACAAGACCAGTGGAAATTTATTGATGTCGTAAAAACAACTGCAAATGGAAGTAT AGGACAATATGGACCATTACTATCCAGTCCGAAATTATATGCAGTTATGAAGCATAATGAAAAAT TATATACATATGAAGGACAGACACCTAACGCTAGGACAGCACATTATTCAACAACGAATTATGAT TCTGTTAATATGACTGCTTTTTGTGACTTTTATATAATTCCTAGATCTGAAGAGTCTAAATGTAC GGAATACATTAATAATGGATTACCACCAATACAAAATACTAGAAATGTTGTACCATTATCGTTGA CTGCTAGAGATGTAATACACTATAGAGCTCAAGCTAATGAAGATATTGTGATATCCAAGACATCA TTGTGGAAAGAAATGCAATATAATAGAGATATAACTATTAGATTTAAATTTGCAAATACAATTAT AAAATCAGGAGGGCTGGGATATAAGTGGTCAGAAATATCATTTAAGCCAGCGAATTATCAATACA CATATACTCGTGATGGTGAAGAAGTTACCGCACATACTACTTGTTCAGTGAATGGCGTTAATGAC TTCAGTTTTAATGGAGGATATTTACCAACTGATTTTGTTGTATCTAAATTTGAAGTAATTAAAGA GAATTCATACGTCTATATCGATTACTGGGATGATTCACAAGCATTTCGTAACGTGGTGTATGTCC GATCGTTAGCAGCAAACTTGAATTCAGTTATGTGTACTGGAGGCAGCTATAATTTTAGTCTACCA GTTGGACAATGGCCTGTTTTAACTGGGGGAGCAGTTTCTTTACATTCAGCTGGTGTAACACTATC TACTCAATTTACAGATTTCGTATCATTAAATTCATTAAGATTTAGATTTAGACTAGCTGTCGAAG AACCACACTTTAAACTGACTAGAACTAGATTAGATAGATTGTATGGTCTGCCTGCTGCAGATCCA AATAATGGTAAAGAATATTATGAAATTGCTGGACGATTTTCACTTATATCATTAGTGCCATCAAA TGATGACTATCAGACTCCTATAGCAAACTCAGTTACTGTACGACAAGATTTAGAAAGGCAGTTAG GAGAACTAAGAGAAGAGTTTAACGCTTTGTCTCAAGAAATTGCAATGTCGCAGTTAATCGATTTA GCGCTTCTACCATTAGATATGTTCTCAATGTTTTCTGGCATTAAAAGTACTATTGATGCTGCAAA ATCAATGGCTACTAATGTTATGAAAAAATTCAAAAAGTCAGGATTAGCGAATTCAGTTTCAACAC TGACAGATTCTTTATCAGACGCAGCATCATCAATATCAAGAGGTTCATCTATACGTTCGATTGGA TCTTCAGCATCAGCATGGACGGATGTATCAACACAAATAACTGATATATCGTCATCAGTAAGTTC AGTTTCGACACAAACGTCAACTATCAGTAGAAGATTGAGACTAAAGGAAATGGCAACACAAACTG AGGGTATGAATTTTGATGATATATCAGCGGCTGTTTTGAAGACTAAGATAGATAAATCGACTCAA ATATCACCAAACACAATACCTGACATTGTTACTGAAGCATCGGAAAAATTCATACCAAATAGGGC TTACCGTGTTATAAACAACGATGATGTGTTTGAAGCTGGAATTGATGGAAAATTTTTTGCTTATA AAGTGGATACATTTGAGGAAATACCATTTGATGTACAAAAATTCGCTGACTTAGTTACAGATTCT CCAGTAATATCCGCTATAATTGATTTTAAAACACTTAAAAATTTGAACGATAATTACGGCATTAC TAAGCAACAAGCATTTAATCTTTTAAGATCTGACCCAAGAGTTTTACGTGAATTCATTAATCAGG ACAATCCTATAATTAGAAATAGAATTGAACAACTGATTATGCAATGCAGGTTGTGA
Фиг. 43B
Оптимизированная кодирующая последовательность VP4 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-Н96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 51).
ATGGCTTCATTGATATATCGCCAGTTGCTGACTAATAGCTATACTGTGGATTTGTCAGACGAAAT CCAGGAAATAGGATCCACAAAGAGTCAGAACGTGACCATAAACCCCGGACCGTTCGCCCAGACTG GGTATGCCCCCGTAAACTGGGGCCCCGGCGAGATTAACGACAGCACCACCGTGGAGCCACTGCTG GATGGACCCTACCAACCCACTACTTTTAATCCTCCAGTGGACTACTGGATGTTGTTGGCTCCCAC GACACCTGGTGTAATTGTAGAGGGCACCAACAATACCGATCGCTGGCTGGCGACAATACTGATAG AACCCAACGTGCAGTCCGAGAACAGAACCTATACCATTTTCGGCATCCAGGAACAGCTAACCGTG AGCAATACGAGCCAGGACCAGTGGAAGTTTATCGATGTAGTGAAAACTACGGCCAATGGATCTAT CGGGCAATACGGGCCGCTGCTGTCCTCACCTAAGCTCTACGCCGTGATGAAACATAATGAGAAAC TGTACACTTACGAGGGCCAAACCCCCAATGCCAGAACTGCCCACTACAGTACAACCAACTATGAC TCGGTGAACATGACAGCGTTCTGTGATTTTTATATTATTCCAAGATCAGAAGAATCCAAGTGTAC TGAGTACATCAACAATGGACTTCCACCCATCCAGAACACTCGAAATGTCGTCCCACTGTCTCTAA CTGCTCGGGATGTGATCCACTATCGCGCCCAAGCTAATGAGGATATAGTCATTTCAAAGACGAGC TTATGGAAGGAAATGCAGTATAACAGAGACATCACAATCAGGTTCAAGTTCGCCAATACTATTAT TAAGTCCGGGGGACTGGGGTACAAATGGAGTGAGATCAGTTTTAAGCCCGCTAACTATCAGTACA CCTATACTCGCGACGGCGAAGAGGTAACCGCCCACACAACTTGCTCGGTTAATGGCGTGAACGAT TTTAGCTTCAACGGGGGCTACCTGCCTACTGATTTCGTGGTGAGCAAGTTTGAAGTCATCAAGGA AAATTCCTACGTGTATATTGACTACTGGGATGATAGCCAGGCCTTCCGAAATGTTGTGTATGTTA GATCACTGGCCGCAAACCTTAATTCAGTCATGTGCACAGGAGGTTCTTACAATTTTAGTCTTCCC GTCGGGCAGTGGCCAGTGCTCACAGGGGGCGCTGTGAGCTTGCATTCCGCCGGAGTCACCTTGAG TACTCAGTTCACAGACTTTGTGTCTCTGAATAGCCTAAGGTTCAGGTTTAGACTTGCAGTAGAAG AGCCTCACTTTAAGCTCACTCGTACGAGGCTGGATCGGCTGTACGGCCTGCCGGCCGCTGATCCC AATAACGGCAAGGAATATTACGAGATAGCCGGGAGATTTTCGCTGATCAGTCTGGTGCCGTCAAA CGATGATTACCAGACCCCAATTGCCAACAGTGTCACTGTCAGGCAAGATCTGGAGAGACAACTTG GCGAGCTGAGAGAGGAGTTCAACGCCCTGTCTCAAGAGATCGCAATGTCTCAGCTCATTGACCTG GCCCTGTTACCCCTCGACATGTTCTCAATGTTCTCCGGCATAAAATCCACTATCGACGCTGCAAA GTCCATGGCCACAAATGTGATGAAGAAGTTTAAGAAGAGCGGTCTGGCAAATAGCGTGTCTACGC TGACCGATAGTTTGTCGGATGCCGCCAGTTCCATTAGCCGTGGATCCAGCATTAGGTCCATTGGC TCTTCCGCCTCTGCTTGGACTGACGTGAGTACACAGATAACTGACATTTCCTCTTCTGTCTCCAG TGTGAGCACACAAACTTCCACGATATCAAGACGACTGAGGCTCAAAGAGATGGCAACGCAAACGG AAGGTATGAATTTTGATGACATCAGCGCCGCAGTTTTGAAGACAAAGATCGATAAAAGCACTCAA ATTAGCCCCAATACGATCCCTGACATTGTGACTGAGGCATCTGAAAAGTTCATTCCCAACCGTGC TTATCGGGTCATTAACAATGATGATGTCTTCGAGGCCGGCATCGATGGCAAGTTTTTTGCTTATA AAGTGGATACCTTCGAGGAGATTCCTTTCGATGTACAGAAGTTTGCTGACCTCGTAACGGATAGC CCAGTGATAAGCGCCATTATAGACTTCAAAACATTGAAAAATTTGAACGATAATTATGGTATTAC CAAGCAGCAGGCTTTTAACTTGTTAAGATCTGACCCTCGCGTGCTCAGAGAGTTTATTAACCAGG ACAACCCCATCATCAGAAACAGGATCGAGCAGCTGATTATGCAGTGTCGCCTGTAA
Фиг. 43C
Кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-H96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 52).
ATGTATGGTATTGAATATACCACAGTTCTAACCTTTCTGATATCGATTATTCTACTAA
ATTACATACTTAAATCATTAACTAGAATAATGGACTTTATAATTTATAGATTTCTTTTT
ATAATTGTGATATTGTCACCATTTCTCAGAGCACAAAATTATGGTATTAATCTTCCAA
TCACAGGCTCCATGGACACTGCATACGCTAATTCAACGCAAGAAGAAACATTCCTCA
CTTCTACACTTTGCCTATATTATCCGACTGAGGCTGCGACTGAAATAAACGATAATTC
ATGGAAAGACACACTGTCACAACTATTTCTTACGAAAGGGTGGCCAACTGGATCCGT
ATATTTTAAAGAATATACTAACATTGCATCGTTTTCTGTTGATCCGCAGTTGTATTGT
GATTATAACGTAGTACTAATGAAATATGACGCGACGTTGCAATTGGATATGTCAGAA
CTTGCGGATCTAATATTAAACGAATGGTTGTGTAATCCAATGGATATTACTCTGTATT
ATTATCAGCAAACTGACGAAGCGAATAAATGGATATCAATGGGCTCATCATGTACAA
TTAAAGTATGTCCACTTAATACACAAACTCTTGGAATTGGATGCTTGACAACTGATGC
TACAACTTTTGAAGAAGTTGCGACAGCTGAAAAGTTGGTAATTACTGACGTGGTTGA
TGGCGTTAATCATAAGCTGGATGTCACAACAGCAACGTGTACTATTAGAAACTGTAA
GAAATTGGGACCAAGAGAAAACGTAGCCGTTATACAAGTTGGTGGTTCTGACATCCT
CGATATAACTGCTGATCCAACTACTGCACCACAGACAGAACGGATGATGCGAATTAA
CTGGAAAAAATGGTGGCAAGTTTTTTATACTGTAGTAGACTATGTAGATCAGATAAT
ACAAGTTATGTCCAAAAGATCAAGATCACTAAATTCAGCAGCATTTTATTACAGAGT
GTAG
Фиг. 43D
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Simian-tc/ZAF/SAl 1-Н96/1958/G3P5B[2] (SEQ ID NO: 53).
ATGTACGGAATCGAGTATACCACCGTTCTGACATTTCTTATTAGTATTATCCTCTTGA
ACTATATTCTGAAGTCACTTACCCGGATAATGGATTTTATTATATATAGGTTTCTGTT
CATCATTGTAATTCTGAGCCCTTTCCTGAGGGCCCAGAATTACGGCATAAACCTACCA
ATCACCGGTTCTATGGATACCGCTTATGCTAACTCTACACAAGAGGAGACATTCCTC
ACATCAACCCTATGCCTGTACTATCCGACTGAAGCAGCCACAGAGATAAACGATAAC
TCTTGGAAAGATACATTGAGCCAGCTCTTCCTGACTAAGGGATGGCCCACCGGATCG
GTCTACTTTAAGGAGTACACAAACATCGCAAGTTTCAGCGTGGATCCCCAGCTGTAT
TGTGATTATAACGTTGTGCTGATGAAATACGACGCAACCCTCCAGCTTGACATGAGC
GAGTTGGCAGACCTAATCCTCAATGAGTGGCTGTGTAACCCAATGGATATAACACTG
TACTATTATCAGCAGACCGATGAAGCAAACAAATGGATTTCAATGGGAAGCAGCTGT
ACCATCAAAGTTTGTCCTCTCAACACCCAAACTCTCGGCATAGGGTGTCTGACCACA
GACGCTACTACCTTTGAAGAAGTTGCGACCGCGGAAAAGCTGGTTATCACAGATGTG
GTAGATGGCGTTAACCACAAATTGGACGTAACCACAGCAACATGCACAATTAGGAA
CTGCAAGAAGCTAGGACCCAGGGAAAACGTAGCCGTCATCCAAGTGGGCGGCAGTG
ACATCCTAGACATCACCGCAGACCCAACAACAGCACCACAAACCGAGAGGATGATG
CGCATTAATTGGAAGAAATGGTGGCAGGTGTTTTACACTGTCGTTGACTATGTGGAC
CAGATCATTCAGGTGATGAGCAAGCGGAGTCGCTCATTGAATAGTGCTGCCTTTTATT
ACAGAGTCTAA
D-2X35S/CPMV-HT/RVA(Rtx) VP7(Opt)/NOS (конструкт номер 1734) ФИГ. 44A (SEQ ID NO: 55)
IF-TrSP+Rtx_VP7(opt) .s 1 +3c
AAATTTGTCGGGCCCATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTA
ФИГ. 44B, (SEQ ID NO: 56) IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r
ACTAAAGAAAATAGGCCTCTAAACGCGATAATAGAAGGCTGCTGAGTTCAGGGA
ФИГ. 44С, (SEQ ID NO: 57)
Оптимизированная кодирующая последовательность VP7 ротавируса А из штамма RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]
ATGTACGGCATCGAGTATACAACAATTTTAATTTTCCTGATTTCCATCATTCTGTTAAACTACAT CCTTAAGTCCGTGACCAGAATTATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTACGTGGCCC TTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAATGGATACC GTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATTATCCAAC AGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTCCTAACCA AGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTCAGTTGAC CCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGCTGGATAT GTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACATTATATT ACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGTGAAGGTG TGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGTTTGAAAT GGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAGATCAATC TGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGTCGCCGTG ATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCACAGACGGA ACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGACTACATTA ACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTATTATCGC GTTTAG
ФИГ. 44D, (SEQ ID NO: 58)
Экспрессионная кассета номер 1734 от промотора 2X35S к терминатору NOS. VP7 из штамма USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] вакцины ротавируса А подчеркнут.
GTCAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAAGA CCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTGCC CAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCAT TGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCC ACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGAT GTGATAACATGGTGGAGCACGACACACTTGTCTACTCCAAAAATATCAAAGATACAGTCTCAGAA GACCAAAGGGCAATTGAGACTTTTCAACAAAGGGTAATATCCGGAAACCTCCTCGGATTCCATTG CCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATC ATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCC CCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTG ATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCT CTATATAAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGTATTAAAATCTTAATAGGTTTTGATAAAAGCGA ACGTGGGGAAACCCGAACCAAACCTTCTTCTAAACTCTCTCTCATCTCTCTTAAAGCAAACTTCT CTCTTGTCTTTCTTGCGTGAGCGATCTTCAACGTTGTCAGATCGTGCTTCGGCACCAGTACAACG TTTTCTTTCACTGAAGCGAAATCAAAGATCTCTTTGTGGACACGTAGTGCGGCGCCATTAAATAA CGTGTACTTGTCCTATTCTTGTCGGTGTGGTCTTGGGAAAAGAAAGCTTGCTGGAGGCTGCTGTT CAGCCCCATACATTACTTGTTACGATTCTGCTGACTTTCGGCGGGTGCAATATCTCTACTTCTGC TTGACGAGGTATTGTTGCCTGTACTTCTTTCTTCTTCTTCTTGCTGATTGGTTCTATAAGAAATC TAGTATTTTCTTTGAAACAGAGTTTTCCCGTGGTTTTCGAACTTGGAGAAAGATTGTTAAGCTTC TGTATATTCTGCCCAAATTTGTCGGGCCCATGGATTATATTATCTATCGTAGCCTCCTCATCTAC GTGGCCCTTTTTGCCCTGACCAGGGCCCAGAACTATGGCCTGAACTTACCAATCACCGGTTCAAT GGATACCGTTTACGCTAATTCCACTCAAGAGGGGATATTTCTGACAAGTACCCTGTGCCTGTATT
ATCCAACAGAAGCCTCTACCCAGATCAATGATGGGGAGTGGAAGGATAGTCTCTCACAGATGTTC CTAACCAAGGGCTGGCCCACCGGTTCCGTCTACTTCAAGGAATACTCTAGTATTGTCGACTTCTC AGTTGACCCCCAGCTTTATTGCGACTACAACCTGGTACTTATGAAATACGACCAGAACCTGGAGC TGGATATGTCCGAGCTGGCTGACCTGATCCTCAATGAGTGGCTGTGCAACCCCATGGACATCACA TTATATTACTACCAGCAGTCTGGAGAATCCAACAAGTGGATCAGTATGGGCTCAAGTTGCACCGT GAAGGTGTGTCCCTTGAACACCCAAATGCTGGGCATTGGTTGTCAGACAACTAATGTGGATTCGT TTGAAATGGTAGCCGAAAACGAGAAGCTGGCTATAGTGGACGTAGTCGATGGGATTAACCACAAG ATCAATCTGACTACCACCACTTGTACCATCAGAAACTGTAAAAAGCTCGGCCCCCGGGAGAACGT CGCCGTGATCCAGGTGGGGGGGAGCAATGTGCTCGACATTACTGCCGACCCTACCACCAATCCAC AGACGGAACGGATGATGAGAGTCAACTGGAAGAAATGGTGGCAGGTCTTTTATACCATTGTGGAC TACATTAACCAGATTGTGCAAGTCATGAGTAAACGGTCCAGATCCCTGAACTCAGCAGCCTTCTA TTATCGCGTTTAGAGGCCTATTTTCTTTAGTTTGAATTTACTGTTATTCGGTGTGCATTTCTATG TTTGGTGAGCGGTTTTCTGTGCTCAGAGTGTGTTTATTTTATGTAATTTAATTTCTTTGTGAGCT CCTGTTTAGCAGGTCGTCCCTTCAGCAAGGACACAAAAAGATTTTAATTTTATTAAAAAAAAAAA AAAAAAAGACCGGGAATTCGATATCAAGCTTATCGACCTGCAGATCGTTCAAACATTTGGCAATA AAGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAATTTCTGTTGAATT ACGTTAAGCATGTAATAATTAACATGTAATGCATGACGTTATTTATGAGATGGGTTTTTATGATT AGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAACAAAATATAGCGCGCAAACTAGGATAA ATTATCGCGCGCGGTGTCATCTATGTTACTAGAT
ФИГ. 44E, SEQ ID NO: 59
Аминокислотная последовательность TrSp-VP7 ротавируса А из штамма US A/Rotarix-A41CB052A/198 8/G1P1 A[8]
MDYIIYRSLLIYVALFALTRAQNYGLNLPITGSMDTVYANSTQEGIFLTSTLCLYYPTEASTQIN DGEWKDSLSQMFLTKGWPTGSVYFKEYSSIVDFSVDPQLYCDYNLVLMKYDQNLELDMSELADLI LNEWLCNPMDITLYYYQQSGESNKWISMGSSCTVKVCPLNTQMLGIGCQTTNVDSFEMVAENEKL AIVDVVDGINHKINLTTTTCTIRNCKKLGPRENVAVIQVGGSNVLDITADPTTNPQTERMMRVNW KKWWQVFYTIVDYINQIVQVMSKRSRSLNSAAFYYRV
Левая граница Т-ДНК I
VP2/VP6 RLPs
Фиг. 45
<-VP2
VP2/VP6/VP7 RLPs
Фиг. 46
кда !."!????¦?. Е??? 1" _1
VP2/VP4/VP6 /VP7 RLPs
Фиг. 47
Фиг. 49
VP2/VP6/VP4/VP7
2/73
2/73
4/73
4/73
5/73
5/73
5/73
5/73
5/73
5/73
6/73
6/73
6/73
6/73
6/73
6/73
6/73
6/73
7/73
7/73
8/73
8/73
9/73
9/73
10/73
10/73
11/73
11/73
11/73
11/73
12/73
12/73
13/73
13/73
16/73
Фиг. 16А -1
16/73
Фиг. 16А -1
17/73
Фиг. 16А -2
17/73
Фиг. 16А -2
18/73
Фиг. 16А -3
18/73
Фиг. 16А -3
19/73
Фиг. 16А -4
19/73
Фиг. 16А -4
20/73
Фиг. 16А-5
20/73
Фиг. 16А-5
21/73
Фиг. 16А-6
21/73
Фиг. 16А-6
22/73
Фиг. 16В-1
22/73
Фиг. 16В-1
23/73
Фиг. 16В -2
23/73
Фиг. 16В -2
24/73
Фиг. 16В-3
24/73
Фиг. 16В-3
25/73
Фиг. 16В-4
25/73
Фиг. 16В-4
26/73
Фиг. 16В-5
26/73
Фиг. 16В-5
27/73
Фиг. 16С -1
27/73
Фиг. 16С -1
28/73
Фиг. 16С -2
28/73
Фиг. 16С -2
29/73
Фиг. 16С-3
29/73
Фиг. 16С-3
30/73
Фиг. 16D -1
30/73
Фиг. 16D -1
31/73
Фиг. 16D-2
31/73
Фиг. 16D-2
32/73
Фиг. 16D-3
32/73
Фиг. 16D-3
33/73
Фиг. 17
33/73
Фиг. 17
34/73
34/73
42/73
43/73
Фиг. 24
Схематическое представление конструкта номер 1711.
45/73
Фиг. 25d
45/73
Фиг. 25d
Фиг. 27
46/73
Схематическое представление конструкта номер 1713
Фиг. 27
46/73
Схематическое представление конструкта номер 1713
48/73
Фиг. 29
Схематическое представление конструкта номер 1714.
47/73
50/73
50/73
Фиг. ЗЗА
53/73
Схематическое представление конструкта номер 1
Фиг. ЗЗА
53/73
Схематическое представление конструкта номер 1
Фиг. 33В
54/73
Схематическое представление конструкта номер 1731
Фиг. 33В
54/73
Схематическое представление конструкта номер 1731
Фиг. 33В
54/73
Схематическое представление конструкта номер 1731
Фиг. 33В
54/73
Схематическое представление конструкта номер 1731
56/73
Фиг. 34D
55/73
58/73
58/73
61/73
Фиг. 40В
61/73
Фиг. 40В
Фиг. 42
62/73
Схематическое представление конструкта номер 1735.
Фиг. 42
62/73
Схематическое представление конструкта номер 1735.
63/73
Фиг. 43А
63/73
Фиг. 43А
64/73
64/73
Фиг. 44F
68/73
Схематическое представление конструкта номер 1734.
67/73
Фиг. 44F
68/73
Схематическое представление конструкта номер 1734.
69/73
70/73
70/73
71/73
71/73
72/73
72/73
73/73
73/73