|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Настоящее изобретение относится к способу количественного определения примеси, присутствующей в пептидном продукте после синтеза, где примесь не может быть отделена от других примесей или основного продукта. Способ, в частности, включает применение детектирования с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (МС) с или без высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ может применяться для исследования качества пептидов и белков, в частности фармацевтических пептидов и белков.
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение относится к способу количественного определения примеси, присутствующей в пептидном продукте после синтеза, где примесь не может быть отделена от других примесей или основного продукта. Способ, в частности, включает применение детектирования с использованием масс-спектрометрии высокого разрешения (МС) с или без высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ может применяться для исследования качества пептидов и белков, в частности фармацевтических пептидов и белков.
2420-519319ЕА/032 КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ ДЛЯ ПРОМЫШЛЕННОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ПЕПТИДНЫХ ПРОДУКТОВ
Описание
Настоящее изобретение относится к способу количественного определения примеси, присутствующей в пептидном продукте, в котором указанная примесь не может быть отделена от основного продукта и, необязательно, от других примесей. Способ, в частности, включает применение детектирования при помощи масс-спектрометрии высокого разрешения (МС) с использованием или без использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Способ может применяться для исследования качества пептидов и белков, в особенности фармацевтических пептидов и белков, и их составов.
С применением хорошо-известных технологий рекомбинантных ДНК и химического твердофазного синтеза были синтезированы некоторые белки и пептиды для фармацевтического использования. Производство этих белков и пептидов, однако, часто приводит к множеству нежелательных побочных продуктов синтеза. В особенности это имеет место в случае, когда их производят путем твердофазного синтеза. При увеличении длины пептида/белка, приводящем к увеличению количества стадий синтеза, эти побочные продукты могут составлять 50-7 0% неочищенного продукта.
Таким образом, важной частью синтеза является очистка основного продукта от побочных продуктов синтеза. Эта очистка осуществляется, главным образом, при помощи хроматографических процедур. Для использования в фармацевтическом продукте в качестве активного ингредиента, конечный очищенный пептидный продукт необходимо проанализировать с точки зрения чистоты, что также делается в основном с помощью хроматографических процедур. Поскольку различия в молекулярной структуре требуемого пептидного продукта и нежелательных побочных продуктов синтеза часто являются очень незначительными при сравнении общей структуры, хроматографические свойства этих продуктов могут быть идентичными или почти идентичными. Это часто приводит к совместному элюированию этих примесей с
другими примесями и собственно основным продуктом при процедуре хроматографического разделения.
Разработка селективных аналитических способов является одним из ключевых аспектов для промышленного тестирования композиций пептидных продуктов, используемых в качестве фармацевтических соединений. Однако вследствие описанных выше причин даже значительные усилия не могут привести к отделению всех соответствующих примесей при помощи хроматографических методов. Таким образом, существует необходимость в создании новых способов определения количеств примесей в пептидных продуктах, в особенности количества примесей, которые не могут быть количественно отделены от требуемого основного продукта при помощи хроматографических методов.
Настоящее изобретение предоставляет способ количественного определения примесей в композициях пептидных продуктов, которые не могут быть отделены хроматографически от основного продукта или которые элюируются совместно с другими примесями или ингредиентами композиции. Этот способ проиллюстрирован в качестве примера для пептида ликсисенатида (AVE0010), агониста GLP-1, имеющего 4 4 аминокислот в длину. Последовательность аминокислот ликсисенатида показана в SEQ ID N0:1:
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-1-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2
Ликсисенатид продуцируют методом химического твердофазного синтеза. С использованием процедур хроматографической очистки большинство примесей могут быть отделены от требуемого основного продукта.
Но, тем не менее, две примеси, Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala(35)-AVE0010, не могут быть разделены хроматографическими методами. Аминокислотные последовательности этих примесей представляют собой следующее:
Di-Ser(33)-AVE0010 (SEQ ID N0:2):
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-l-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2,
Di-Ala(35)-AVE0010 (SEQ ID N0:3):
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-l-E-W-L-K-N-G-
G-P-S-S-G-A-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2 .
Поскольку ликсисенатид используется в качестве фармацевтического препарата, в частности, при лечении пациентов с сахарным диабетом, присутствие и количество описанных выше примесей должны определяться для того, чтобы обеспечить серийный выпуск. Авторы настоящего изобретения в настоящее время обнаружили, что количественное определение описанных выше примесей может быть достигнуто при использовании процедур масс-спектрометрии высокого разрешения, с или без предварительной хроматографии.
Предметом настоящего изобретения является способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(a) предоставления композиции пептидного продукта, содержащей пептидный продукт и неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, где указанная примесь не может быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции с помощью хроматографической процедуры,
(b) предоставления, по меньшей мере, одного образца указанной композиции пептидного продукта без указанной добавленной примеси и необязательно, по меньшей мере, другого образца указанной композиции с известным количеством указанной добавленной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанном, по меньшей мере, одном образце стадии (Ь) при помощи масс-спектрометрии, и
(d) расчета количества указанной примеси в указанной композиции пептидного продукта на основании результатов (с).
Еще одним предметом настоящего изобретения является способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(а) предоставления композиции пептидного продукта, содержащей пептидный продукт и неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, где указанная примесь не может быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента указанной композиции при помощи хроматографической процедуры,
(b) предоставления, по меньшей мере, трех образцов указанной композиции пептидного продукта, где первый образец содержит композицию пептидного продукта без указанной добавленной примеси, и где, по меньшей мере, два дополнительных образца содержат композицию пептидного продукта, каждый с различным известным количеством указанной добавленной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанных, по меньшей мере, трех образцах со стадии (Ь) методом масс-спектрометрии и
(d) расчета количества указанной примеси в композиции пептидного продукта на основании результатов (с).
Еще одним предметом настоящего изобретения является набор реагентов для определения количества примесей в композиции продукта ликсисенатида (AVE0010), включающий:
(i) по меньшей мере, один препарат Di-Ser(33)-AVE0010 и/или (ii), по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ala(35)-AVE0010.
Еще одним предметом настоящего изобретения является способ контроля качества композиции, содержащей пептидный продукт эксендин, включающий аминокислотную последовательность S-S-G-A, предпочтительно композиции, содержащей продукт ликсисенатид (AVE0010), включающий количественное определение количества Di-Ser (33)-пептида, например, Di-Ser(33)-AVE0010, и/или Di-Ala(35)-пептида, например, Di-Ala(35)-AVE0010, в указанной композиции.
Настоящее изобретение относится к определению примеси,
присутствующей в композиции пептидного продукта. Термин
"пептидный продукт" включает пептиды и белки, имеющие длину, по
меньшей мере, 5 или, по меньшей мере, 10 аминокислот и до 50
или до 100 аминокислот, или даже больше. Пептидный продукт
может состоять из генетически кодируемых аминокислотных
структурных блоков или может содержать генетически некодируемые
аминокислотные структурные блоки, например, не встречающиеся в
природе аминокислоты, D-аминокислоты или химически
модифицированные аминокислоты, или может состоять из нескольких пептидных цепей, связанных, например, дисульфидными мостиками.
Пептидный продукт может дополнительно содержать модификации на N- и/или С-конце, и/или в боковых цепях, например, ацилирование, амидирование или добавление групп непептидных боковых цепей, таких как липофильные группы. Пептидный продукт может быть линейным или циклическим. Предпочтительно, пептидный продукт имеет длину от 5 до 100 аминокислот.
Синтез пептидного продукта может включать процессы на
основе рекомбинантных ДНК и/или процессы химического синтеза.
Предпочтительно, пептидный продукт синтезирован химически, в
частности, путем твердофазного синтеза, который хорошо известен
в данной области техники, например, предусматривающего
ступенчатое удлинение пептидной цепи, соединенной с носителем,
например, синтетической смолой. В предпочтительном варианте
осуществления изобретения пептидный продукт представляет собой
пептид эксендин, например, эксендин-4, лираглютид или
ликсисенатид (AVE0010). Другими примерами пептидных продуктов
являются инсулины и аналоги инсулина или ингибиторы DPP-4.
Более предпочтительно, пептидный продукт представляет собой
пептид эксендин, например, пептид эксендин, включающий
аминокислотную последовательность S-S-G-A, наиболее
предпочтительно ликсисенатид (AVE0010).
Способ по настоящему изобретению включает количественное определение примеси, присутствующей в пептидном продукте после синтеза, например, после его синтеза методом твердофазного синтеза или в качестве продукта деградации после хранения. Примесь, как правило, представляет собой пептидную примесь, например, пептид, который отличается от требуемого основного пептидного продукта, по меньшей мере, одним аминокислотным структурным элементом и/или химической модификацией. Например, примесь может представлять собой пептид, который отличается от требуемого пептидного продукта, по меньшей мере, одним структурным элементом димерных аминокислот, т.е. структурным элементом Di-серином или Di-аланином. В случае пептида эксендина, например, пептида эксендина, включающего аминокислотную последовательность S-S-G-A, примесь может представлять собой, например, пептид Di-Ser(33)-эксендин,
пептид Di-Ala(35)-эксендин или их комбинации. В случае ликсисенатида, примесь может представлять собой, например, Di-Ser (33) -AVE0010, Di-Ala(35)-AVE0010 или их комбинации.
Способ по настоящему изобретению включает количественное
определение, по меньшей мере, одной примеси в композиции
пептидного продукта. Композиция пептидного продукта содержит,
по меньшей мере, один пептидный продукт и, по меньшей мере,
одну примесь, которую нужно определить. Далее, композиция может
включать другие ингредиенты, например, пептидные ингредиенты
или ингредиенты, отличные от пептидных, включая другие примеси.
Композиция пептидного продукта может представлять собой,
например, фармацевтический состав или композицию,
предназначенную для производства фармацевтического состава, например, синтезированную партию пептидного продукта.
В способе по настоящему изобретению пептидный продукт содержит неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, которая не может быть количественно отделена от пептидного продукта с помощью хроматографической процедуры или которая элюируется совместно с другими примесями и ингредиентами, присутствующими в образце пептидного продукта. В некоторых случаях, композиция пептидного продукта содержит неизвестные количества одной примеси. В других случаях, композиция пептидного продукта содержит неизвестные количества, по меньшей мере, двух, например, 2, 3, 4, 5 или даже больше примесей, которые не могут быть количественно отделены от пептидного продукта с помощью хроматографии или которые элюируются совместно с другими примесями и ингредиентами, присутствующими в образце пептидного продукта. Предпочтительно, по меньшей мере, одна примесь не может быть количественно отделена от пептидного продукта.
Термин "хроматографическая процедура" включает
хроматографическую процедуру, пригодную для очистки пептидных
продуктов, включая, например, ионообменную хроматографию,
хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную
хроматографию, эксклюзионную хроматографию и особенно высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), и, в
частности, ВЭЖХ с обращенной фазой или комбинацию нескольких процедур.
Примесь, которая определяется способом по настоящему изобретению, не может быть количественно отделена от пептидного продукта или других ингредиентов композиции. Это означает, что примесь элюируется совместно или по существу элюируется совместно с требуемым пептидным продуктом или с другими примесями или ингредиентами после процедуры хроматографического разделения, особенно после процедуры хроматографического разделения, как описано выше, таким образом, что количественное определение оптическими методами, например, УФ-детектирование или детектирование по флуоресценции, не представляется возможным. Это означает, что примесь не может быть отделена от требуемого пептидного продукта или других ингредиентов, включая примеси, при помощи разумных усилий, и его количественная величина в данной партии композиции пептидного продукта должна быть количественно определена способом по настоящему изобретению.
Стадия (а) способа по изобретению включает предоставление композиции пептидного продукта, содержащей неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, где примесь может быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции путем хроматографической процедуры, как описано выше. Пептидный продукт может представлять собой, например, продукт для фармацевтических применений, например, для применения в качестве лекарственного средства в медицине или ветеринарии.
Стадия (Ь) способа по изобретению включает предоставление, по меньшей мере, одного образца указанной композиции пептидного продукта без добавленной примеси и необязательно, по меньшей мере, еще одного дополнительного образца указанной композиции пептидного продукта с известным количеством добавленной примеси. В предпочтительном варианте осуществления стадия (Ь) включает предоставление, по меньшей мере, трех образцов указанной композиции пептидного продукта, где первый образец содержит композицию пептидного продукта без добавленной примеси
и где, по меньшей мере, два дополнительных образца включают композицию пептидного продукта, и каждый из этих образцов дополнительно содержит различное известное количество добавленной примеси.
По меньшей мере, один образец представляет собой образец, который включает композицию пептидного продукта без добавленной примеси, т.е. неконтрольный образец, содержащий неизвестное количество примеси, которую нужно определить. В дополнение к этому образцу, может быть предоставлен, по меньшей мере, один, например, по меньшей мере, два, три или четыре дополнительных образца, которые представляют собой контрольные образцы, содержащие композицию пептидного продукта с неизвестным количеством примеси, и дополнительно с различными известными количествами добавленной примеси, которые нужно определить. Эти контрольные образцы могут быть подготовлены путем добавления примеси к неконтрольным образцам композиции пептидного продукта из исходного препарата примеси, предпочтительно, по меньшей мере, из двух исходных препаратов, содержащих различные концентрации указанной примеси. Исходные препараты могут находиться в любой подходящей форме, например, препараты в сухом или жидком виде. Предпочтительно, исходные препараты представляют собой исходные растворы.
Тестируемые образцы содержат пептидный продукт с неизвестным количеством примеси, которое нужно определить, и необязательно, добавленную примесь. Эти вещества присутствуют в концентрациях, которые позволяют выполнять анализ методом масс-спектрометрии. Концентрация пептидного продукта может в значительной степени варьировать. Она может находиться, например, в диапазоне от 0,001 до 50 мг/мл, предпочтительно от 0,01 до 10 мг/мл и более, предпочтительно от 0,02 до 5,0 мг/мл, например, примерно 1,0 мг/мл. В контрольных образцах количество добавленной примеси находится предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 5%, предпочтительно от 0,1 до 2%, в зависимости от концентрации пептидного продукта в образце.
В предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению включает тестирование неконтрольного образца
пептидного продукта вместе, по меньшей мере, с одним, предпочтительно, по меньшей мере, двумя, тремя, четырьмя или даже больше образцами пептидных продуктов, содержащими, по меньшей мере, одну примесь. В другом варианте осуществления способ по изобретению включает тестирование только неконтрольного образца пептидного продукта. Неизвестное количество примеси, присутствующее в неконтрольном образце, может быть определено путем контрольных определений контрольных образцов и/или путем сравнения измеренного значения примеси в неконтрольном образце при сравнении, например, со стандартной или калибровочной кривой.
Стадия (с) способа по изобретению включает количественное определение указанной примеси в указанном, по меньшей мере, одном образце со стадии (Ь) с помощью масс-спектрометрии высокого разрешения. В дополнение к масс-спектрометрии, определение может включать предварительную хроматографическую процедуру, например, для отделения других примесей от пептидных продуктов или других ингредиентов композиции. Предпочтительно, масс-спектрометрию комбинируют с ВЭЖХ. Каждый образец может быть подвергнут нескольким индивидуальным определениям в целях повышения точности измерения.
Масс-спектрометрия основана на определении соотношения
массы к заряду заряженных частиц. В обычной процедуре масс-
спектрометрии образец загружают в прибор для масс-спектрометрии
и испаряют. Компоненты образца ионизируют, и образовавшиеся
ионы разделяют в масс-анализаторе при помощи электромагнитных
полей. Полученные ионы детектируют, и сигнал процессируется в
масс-спектр. Для ионизации пептидных продуктов можно
использовать ионизацию электрораспылением (ESI) и лазерную
десорбцию/ионизацию (MALDI). Полученные ионы можно
детектировать высокочувствительными методами, такими как системы детекции Orbitrap или ионного циклотронного резонанса (ICR) с преобразованием Фурье (FT).
В соответствии со стадией (с), по меньшей мере, один пик, ассоциированный с примесью, которую нужно определить, анализируют методом масс-спектрометрии. Этот пик может быть
получен либо из деконволюционного или недеконволюционного масс-
спектра. Предпочтительно, способ включает определение одного
или нескольких моноизотопных пиков, ассоциированных с примесью,
которую нужно определить. В случае примеси Di-Ser(33)-AVE0010,
можно использовать четырехкратно заряженный пик
недеконволюционного масс-спектра, например, в 1237.1529 Да или
деконволюционного масс-спектра в 4944.5822 Да. В случае примеси
Di-Ala(35)-AVE0010, можно анализировать четырехкратно
заряженный пик недеконволюционного масс-спектра в 1233.1550 Да или деконволюционного масс-спектра в 4928.5908 Да.
По меньшей мере, один пик для анализа может быть выявлен в масс-спектре примеси с использованием настроек высокого разрешения и высокочувствительного детектирования, как описано выше.
Стадия (d) включает подсчет количества примеси в композиции пептидного продукта на основании результатов масс-спектрометрического анализа. В предпочтительном варианте осуществления расчет осуществляют способом, включающим регрессионный анализ, в частности, линейный регрессионный анализ. Регрессионный анализ может включать образование кривой, например, прямой линии, от измеренных значений примеси, по меньшей мере, в двух контрольных образцах, т.е. образцах, содержащих пептидный продукт с неизвестным количеством примеси и содержащих два различных известных добавленных количеств примесей (или от исходных значений таких образцов, которые были генерированы в стандартных и калибровочных определениях). В эту кривую, например прямую линию, вставляют измеренное значение примеси в неконтрольном образце, обеспечивая тем самым количественное определение неизвестного количества примеси, присутствующей в этом образце.
Предпочтительно, расчет осуществляют в соответствии с линейным уравнением прямой линии:
у=ах+Ь,
где у соответствует определенной площади пика примеси в образце (либо в контрольном, либо в неконтрольном образце), х соответствует известному добавленному количеству примеси в
контрольном образце, а представляет собой наклон прямой линии, и b представляет собой точку пересечения с осью ординат, которая соответствует измеренному сигналу примеси в образце без добавленной примеси (х=0). Количественное количество примеси в неконтрольном образце xt может быть получено с использованием полученных параметров регрессии следующим образом:
xt=b • а"1
Изобретение также включает набор реагентов для определения количества примесей в продукте ликсисенатид, который содержит, по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ser(33)-AVE0010 и/или Di-Ala(35)-AVE0010 и, необязательно, дополнительные реагенты, такие как растворители, буферы и др. Набор реагентов может быть использован в способе контроля качества продукта ликсисенатида для количественного определения количества Di-Ser (33)-AVE0010 и/или Di-Ala(35)-AVE0010 в указанном продукте ликсисенатиде. Предпочтительно, количественное определение проводят в соответствии с масс-спектрометрическим методом, например, масс-спектрометрическим методом, как описано выше.
Настоящее изобретение поясняется более подробно следующими фигурами и примерами.
Пояснения к фигурам:
на фиг.1 показано совместное элюирование пиков ликсисенатида (AVE0010), Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala(35)-AVE0010 в ВЭЖХ-хроматограмме;
на фиг.2 показан масс-спектр четырехкратно заряженных молекулярных ионов AVE0010 и примесей Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala (35)-AVE0010;
на фиг.3 показано сравнение масс-спектров неконтрольного и контрольного (1% каждой примеси) препаратов AVE0010;
на фиг.4 показан развернутый вид массового диапазона Di-Ser (33)-AVE0010 при значениях разрешения 60000 и 100000, соответственно, при m/z 400, и теоретически рассчитанный профиль наложенных типов;
на фиг.5 показаны деконволюционные масс-спектры с теоретически рассчитанными структурами наложенных типов;
на фиг.б показан развернутый вид примесного пика,
используемого для количественного определения Di-Ser(33)-AVE0010;
на фиг.7 показана извлеченная одноионная хроматограмма четырехкратно заряженного изотопа Di-Ala(35)-AVE0010 и Di-Ser (33) -AV0010 в тестируемом образце в качестве недеконволюционного масс-спектра;
на фиг.8 показана извлеченная одноионная хроматограмма Di-Ala (35)-AVE0010 и Di-Ser(33)-AV0010 в тестируемом образце в качестве деконволюционного масс-спектра;
на фиг.9 показан пример расчета концентрации указанной примеси Di-Ala(35)-AVE0010 в тестируемом образце.
Примеры
Аналитическая процедура для количественного определения ди-Ser(33)-ликсисенатида и Di-Ala(35)-ликсисенатида методом
ВЭЖХ/масс-спектрометрии
1. Материалы и способы
1.1 Контрольные материалы
Контрольный материал ликсисенатид (AVE0010); произведенный путем твердофазного синтеза, с последующей очисткой.
Контрольный материал Di-Ser(33)-AVE0010; произведенный способом твердофазного синтеза со стадиями двойного присоединения защищенной аминокислоты серина в положении 33, с последующей очисткой.
Контрольный материал Di-Ala(35)-AVE0010; произведенный способом твердофазного синтеза со стадиями двойного присоединения защищенной аминокислоты аланина в положении 35, с последующей очисткой.
Препарат неконтрольного образца ликсисенатида (содержащего
неизвестные количества примесей Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-
Ala (35)-AVE0010) получали в концентрации 1,0 мг
ликсисенатида/мл.
Четыре препарата контрольных образцов для каждой из примесей получали путем включения 0,2%, 0,4%, 0,6% и 0,8% по массе примесей Di-Ser(33)-AVE0010 или Di-Ala(35)-AVE0010, соответственно, в препарат образца с 1,0 мг ликсисенатида/мл.
1.2 Аналитические условия
1.2
Использовали систему градиентной высокоэффективной жидкостной хроматографии, состоящую из двойного ВЭЖХ-насоса, автодозатора, колонной печи и масс-спектрометра высокого разрешения, например, LTQ-Orbitrap (ThermoFisher) с разрешением 100000 (при m/z 400) или эквивалентного.
Хроматографию проводили с использованием аналитической ВЭЖХ-колонки С18 с обращенной фазой (Jupiter С18 3 мкм 3 0 0А) длиной 150 мм и внутренним диаметром 2,0 мм.
Подвижная фаза А состояла из 850 объемных частей воды, 150 объемных частей ацетонитрила и 1 объемной части трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В состояла из 250 объемных частей воды, 750 объемных частей ацетонитрила и одной объемной части трифторуксусной кислоты. Градиент настраивали следующим образом:
Время
Подвижная фаза А
Подвижная фаза В
[минуты]
[%]
[%]
0,00
77, 5
22,5
17, 50
28,0
72, 0
17, 51
77, 5
22,5
26,00
77, 5
22,5
Масс-спектрометр функционировал в режиме положительной ионизации электрораспылением и сканировал таким образом, чтобы измерять ионные сигналы аналитов, которые нужно определить.
Условия тестирования были следующими:
Скорость тока: 0,25 мл/мин
Впрыскиваемый объем: 10 мкл
Температура автодозатора: установка температуры
автодозатора при +10°С±2°С
Температура колонки: установка температуры печи при + 25°С±2°С
Метод ионизации: ESI положительный
Определение/ детектирование: ITMS
FTMS
режим:
диапазон масс: режим: диапазон масс (SIM) 12320-12390 разрешение: 100000
Отклоняющий
клапан: потеря: 0-1,5 мин
инъекция: 1,5, 2,2, 5,5 мин
Общая сканограмма PDA (УФ), необязательно
Процедура была основана на способах, описанных в Ph. Eur 7.0 (2011) (2.2.43 Mass Spectrometry) и USP 34 (2011) ( <73б> Mass Spectrometry).
1.3 интеграция
Определения выполняли либо по деконволюционным масс-спектрам или недеконволюционным масс-спектрам четырехкратно заряженных ионов [М+4Н+]4+.
После выбора точной массы отдельного изотопного пика диаграммы:
а) с использованием четырехкратно заряженного пика недеконволюционных масс-спектров:
DiSer(33)-AVE0010: например, 1237.1529 Да
DiAla(35)-AVE0010: например, 1233.1550 Да,
или Ь) с использованием деконволюционных масс-спектров:
DiSer(33)-AVE0010: например, 4944.5822 Да
DiAla (35)-AVE0010: например, 4928.5908 Да, представляли извлеченные ионные хроматограммы. Был извлечен только представляющий интерес изотоп. Пики из извлеченных ионных хроматограмм интегрировали.
2. Результаты
На фиг.1 показано совместное элюирование пиков для ликсисенатида и примесей Di-Ala(35)-AVE0010 и Di-Ser(33)-AVE0010 в ВЭЖХ-хроматограмме. Из-за этих перекрываний в хроматографических пиках Di-Ala(35)-AVE0010 и Di-Ser(33)-AVE0010 составляют примеси, которые не могут быть количественно отделены от требуемого пептидного продукта AVE0010 с помощью хроматографической процедуры.
Для разработки способа были приняты во внимание некоторые
специфические особенности масс-спектрометрии. Масс-спектр
ликсисенатида показывает, кроме того, многократно
протонированные частицы, как правило, образующие кластеры с катионами, которые распространены по всему раствору, например,
натрий или калий. На фиг.2 показан спектральный раздел четырехкратно заряженных ионов AVE0010, который перекрывается с масс-спектрами примесей и тем самым скрывает аналит.
На фиг.3 образец AVE0010 с содержанием 1% двух примесей сравнивается с неконтрольным образцом, содержащим еще небольшое количество примесей. В развернутом виде врезки можно видеть, что там может иметь место перекрывание молекулярных профилей с выделенными кластерами. В случае Di-Ser(33)-AVE0010 увеличение массы относительно ликсисенатида составляет 87 Да. С другой стороны, ликсисенатид может ассоциироваться с 4 ионами натрия, что приводит к массовому сдвигу в 8 8 Да. Эти два профиля перекрываются и должны быть отделены масс-спектрометрически, в противном случае, примесь Di-Ser-AV0010 не может быть точно количественно определена.
Как видно на фиг.4, перекрывающиеся пики не были разделены при разрешении 60000, и только при разрешении 100000. В нижней части фиг.4 показан теоретический спектр перекрывания Di-Ser-AVE0010 с натриевым кластером ликсисенатида. Такие высокие разрешения предпочтительно достигаются при помощи масс-спектрометрии с преобразованием Фурье, или FT-ICR или, как используется в настоящем описании, при помощи масс-спектрометра FT-Orbitrap.
После деконволюции и центроидирования спектров, эти две разновидности могут быть разделены масс-спектроскопически, см. фиг.5.
На фиг.б были добавлены все измеренные индивидуальные масс-спектры полного хроматографического пика. Массовый пик, используемый для измерения Di-Ser(33)-AVE0010, представлен в развернутом виде. Он находится на достаточном удалении от пика, соответствующего натриевому кластеру AVE0010, для обеспечения точного измерения. Все массовые пики аналита попадают в узкое окно масс, показывающего массовую стабильность прибора, хорошо отделенное от какого-либо интерферирующего пика. Поэтому этот способ подходит для точного определения количеств Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala(35)-AVE0010 в пептидном продукте ликсисенатида.
Извлеченные ионные хроматограммы четырехкратно заряженного изотопа Di-Ala(35)-AVE0010 и Di-Ser(33)-AV0010 в тестируемом образце показаны в виде недеконволюционных масс-спектров на фиг.7 и деконволюционных масс-спектров на фиг.8.
Количество Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala(35)-AVE0010 может быть вычислено путем линейного регрессионного анализа. С помощью отдельного впрыска контрольных и неконтрольных тестируемых растворов кривая регрессии может быть построена в соответствии с уравнением:
у=ах+Ь,
а = наклон
у = площадь пика тестируемых растворов (неконтрольные и контрольные тестируемые растворы)
х = добавленное количество Di-Ser(33)-AVE0010 или DiAla (35)-AVE0010 в тестируемых растворах (неконтрольные и контрольные тестируемые растворы)
b = отсекаемый отрезок на оси ординат
Концентрация xt Di-Ser(33)-AVE0010 и Di-Ala(35)-AVE0010 в тестируемом образце может быть рассчитана с помощью параметров регрессии, полученных следующим образом:
xt=b • а"1
На фиг.9 показан пример расчета концентрации Di-Ala(35)-AVE0010 в тестируемом образце.
Окончательный результат определяется как среднее арифметическое всех индивидуальных определений, выраженное в процентах ликсисенатида. В конкретном случае, среднее значение примеси Di-Ala(35)-AVE0010 в образце было определено как 0,4260%, исходя из количества ликсисенатида.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(a) предоставления композиции пептидного продукта,
содержащей пептидный продукт и неизвестное количество, по
меньшей мере, одной примеси, где указанная примесь не может
быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента
композиции путем хроматографической процедуры,
(b) предоставления, по меньшей мере, одного образца указанной композиции пептидного продукта без указанной добавленной примеси и необязательно, по меньшей мере, еще одного образца указанной композиции пептидного продукта с известным количеством добавленной указанной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанном образце со стадии (Ь) методом масс-спектрометрии, и
(d) расчета количества указанной примеси в композиции пептидного продукта на основании результатов (с).
2. Способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(a) предоставления композиции пептидного продукта, содержащей пептидный продукт и неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, где указанная примесь не может быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции путем хроматографической процедуры,
(b) предоставления, по меньшей мере, трех образцов указанной композиции пептидного продукта, где первый образец содержит композицию пептидного продукта без указанной добавленной примеси, и где, по меньшей мере, два дополнительных образца содержат композицию пептидного продукта, каждый с различным известным количеством указанной добавленной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанных образцах со стадии (Ь) методом масс-спектрометрии, и
(d) расчета количества указанной примеси в композиции
пептидного продукта на основании результатов (с).
3. Способ по п.1 или 2, где пептидный продукт имеет длину от 5 до 100 аминокислот.
4. Способ по любому из п.п.1-3, где пептидный продукт был химически синтезирован, в частности, путем процедуры твердофазного синтеза, или получен методами рекомбинантных ДНК.
5. Способ по любому из п.п.1-4, где композиция пептидного продукта представляет собой фармацевтический состав или композицию, предназначенную для производства фармацевтического состава.
6. Способ по любому из п.п.1-5, где пептидный продукт представляет собой пептид эксендин, в частности, ликсисенатид (AVE0010).
7. Способ по любому из п.п.1-6, где примесь представляет собой пептидную примесь.
8. Способ по любому из п.п. 1-7, где примесь не может быть количественно отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции с помощью процедуры ВЭЖХ, в частности, с помощью процедуры ВЭЖХ с обращенной фазой.
9. Способ по любому из п.п.1-8, где пептидный продукт содержит неизвестные количества, по меньшей мере, 2 примесей, которые не могут быть количественно отделены от пептидного продукта или от другого ингредиента композиции с помощью хроматографической процедуры.
10. Способ по любому из п.п.1-9, где примесь добавляют, по меньшей мере, к одному образцу композиции пептидного продукта из исходного препарата, предпочтительно, по меньшей мере, из двух исходных препаратов, содержащих различные концентрации указанной примеси.
11. Способ по любому из п.п.1-10, где обеспечивают, по меньшей мере, 3 или 4 дополнительных образца с различными известными количествами добавленной примеси и подвергают масс-спектрометрическому определению.
12. Способ по любому из п.п.1-11, где масс-спектрометрия представляет собой масс-спектрометрию высокого разрешения, например, включая масс-спектрометрию с преобразованием Фурье.
13. Способ по любому из п.п.1-12, где расчет включает
линейный регрессионный анализ.
14. Способ по п.13, где расчет проводят в соответствии с уравнением:
у=ах+Ь,
где а = наклон
у = определенная площадь пика примеси в образце х = добавленное количество примеси в образце b = отсекаемый отрезок на оси ординат,
и неизвестное количество примеси xt получают следующим образом:
xt=b • а-1
15. Набор реагентов для определения количества примесей в композиции продукта ликсисенатида (AVE0010), включающий:
(i) по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ser(33)-AVE0010 и/или
(ii) по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ala(35)-AVE0010.
16. Способ контроля качества композиции, содержащей пептидный продукт эксендин, включающий аминокислотную последовательность S-S-G-A, предпочтительно композиции, содержащей продукт ликсисенатид (AVE0010), который включает количественное определение количества Di-Ser(33)-пептида, например, Di-Ser(33)-AVE0010, и/или Di-Ala(35)-пептида, например, Di-Ala(35)-AVE0010, в указанной композиции.
17. Способ по п.16, где количественное определение проводят в соответствии со способом по любому из п.п.1-14.
По доверенности
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, ПРЕДЛОЖЕННАЯ ЗАЯВИТЕЛЕМ ДЛЯ
РАССМОТРЕНИЯ
1. Способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(a) предоставления композиции пептидного продукта,
содержащей пептидный продукт, который представляет собой
пептидный продукт эксендин, содержащий аминокислотную
последовательность S-S-G-A и неизвестное количество, по меньшей
мере, одной примеси, которая представляет собой Di-Ser(33)-
пептид и/или Di-Ala(35)-пептид, где указанная примесь не может
быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента
композиции при помощи хроматографической процедуры, и где
указанная примесь совместно элюируется или по существу
совместно элюируется с требуемым пептидным продуктом после
процедуры хроматографического разделения,
(b) предоставления, по меньшей мере, одного образца указанной композиции пептидного продукта без указанной добавленной примеси и, по меньшей мере, одного дополнительного образца указанной композиции пептидного продукта с известным количеством добавленной указанной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанном образце со стадии (Ь) методом масс-спектрометрии, и
(d) расчета количества указанной примеси в композиции пептидного продукта на основании результатов (с).
2. Способ количественного определения примеси, присутствующей в композиции пептидного продукта, включающий стадии:
(а) предоставления композиции пептидного продукта, содержащей пептидный продукт, который представляет собой пептидный продукт эксендин, содержащий аминокислотную последовательность S-S-G-A и неизвестное количество, по меньшей мере, одной примеси, которая представляет собой Di-Ser(33)-пептид и/или Di-Ala(35)-пептид, где указанная примесь не может быть отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции путем хроматографической процедуры,
(b) предоставления, по меньшей мере, трех образцов указанной композиции пептидного продукта, где первый образец содержит композицию пептидного продукта без указанной добавленной примеси, и где, по меньшей мере, два дополнительных образца содержат композицию пептидного продукта, каждый с различным известным количеством указанной добавленной примеси,
(c) количественного определения указанной примеси в указанных образцах со стадии (Ь) методом масс-спектрометрии, и
(d) расчета количества указанной примеси в композиции пептидного продукта на основании результатов (с).
3. Способ по п.1 или 2, где пептидный продукт имеет длину от 5 до 100 аминокислот.
4. Способ по любому из п.п.1-3, где пептидный продукт был химически синтезирован, в частности, путем процедуры твердофазного синтеза, или получен методами рекомбинантных ДНК.
5. Способ по любому из п.п.1-4, где композиция пептидного продукта представляет собой фармацевтический состав или композицию, предназначенную для производства фармацевтического состава.
6. Способ по любому из п.п.1-5, где пептидный продукт эксендин представляет собой ликсисенатид (AVE0010).
7. Способ по любому из п.п.1-6, где примесь не может быть количественно отделена от пептидного продукта или другого ингредиента композиции с помощью процедуры ВЭЖХ, в частности, с помощью процедуры ВЭЖХ с обращенной фазой.
8. Способ по любому из п.п.1-7, где пептидный продукт содержит неизвестные количества, по меньшей мере, 2 примесей, которые не могут быть количественно отделены от пептидного продукта или от другого ингредиента композиции с помощью хроматографической процедуры.
9. Способ по любому из п.п.1-8, где примесь добавляют, по меньшей мере, к одному образцу композиции пептидного продукта из исходного препарата, предпочтительно, по меньшей мере, из двух исходных препаратов, содержащих различные концентрации указанной примеси.
10. Способ по любому из п.п.1-9, где обеспечивают, по
меньшей мере, 3 или 4 дополнительных образца с различными известными количествами добавленной примеси и подвергают масс-спектрометрическому определению.
11. Способ по любому из п.п.1-10, где масс-спектрометрия представляет собой масс-спектрометрию высокого разрешения, например, с использованием масс-спектрометрии с преобразованием Фурье.
12. Способ по любому из п.п.1-11, где расчет включает линейный регрессионный анализ.
13. Способ по п.12, где расчет проводят в соответствии с уравнением:
у=ах+Ь,
где а = наклон
у = определенная площадь пика примеси в образце х = добавленное количество примеси в образце b = отсекаемый отрезок на оси ординат,
и неизвестное количество примеси xt получают следующим образом:
xt=b • а-1.
14. Набор реагентов для определения количества примесей в композиции продукта ликсисенатида (AVE0010), включающий:
(i) по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ser(33)-AVE0010 (SEQ ID N0:2):
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-l-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-S-G-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2, и /или
(ii) по меньшей мере, один исходный препарат Di-Ala(35)-AVE0010 (SEQ ID N0:3):
H-G-E-G-T-F-T-S-D-L-S-K-Q-M-E-E-E-A-V-R-L-F-l-E-W-L-K-N-G-G-P-S-S-G-A-A-P-P-S-K-K-K-K-K-K-NH2 .
15. Способ контроля качества композиции, содержащей
пептидный продукт эксендин, включающий аминокислотную
последовательность S-S-G-A, предпочтительно композиции,
содержащей продукт ликсисенатид (AVE0010), где способ включает
количественное определение количества Di-Ser(33)-пептида,
например, Di-Ser(33)-AVE0010, и/или Di-Ala(35)-пептида,
19-1
например, Di-Ala(35)-AVE0010, в указанной композиции.
16. Способ по п.15, где количественное определение осуществляют согласно способу по любому из п.п.1-13.
По доверенности
1/11
519319
qiooHH9HBdiooduoBd венчиэхиэошо
ю ш
.. см Z N
* I .. fflO>
ffl L. U.
01 "Ой
r- "о и
oo о a:
*it- 3
" <ч -
О N + Or-w
ON,-
см U-
И NЈM_" _| r- CM N3,,
10" 05
Ю N
J10
со COL
sj- 05
0) 4 ¦*
03 ^
со ш ю-
^ 10 C3) ш
о со
СО 10
05 N
05 03 Ю
05 Ю
СМ °> L
ю 05
СО N
см'
атт
тер
I 1 I I | I 1 I | ! I I | I I I | II ! I I I | I I I i . I I | I I I | III | II I | II I | I I I j II I| I И
ооооо ооооо о о о о о
О СО (О 'Г СМ О Ю О * N О СО СО ^- СМ
г- v г-
qiooHHaHBdiooduoBd ввнчиэ-шоошо
О О)
ю со
(1)
m Ф
S О. t-
со X о о Ш
<
1 <0 Ф 1^ I
(illim[m,4i,iiiii'4|ii"n"i,f4"l"i4"41iHiimTim)inii'
OIDDIOOlpeUIOIfiO
qiooHH9HBdiooduoed ьеняиэ±иоон10
t I I i 8 i И S S S 8 5 S " ?
qiooHHaHBdiooduoed веняиэхиэошо
1233.0 1233.1 1233.2 1233.3
m/z
ФИГ.7
Время (мин)
100 _
20 0
1237.1
1237.2
i1111 i'111 1233.3
m/z
ФИГ.7 (продолжение)
о о
го о. 1-о о о. с= о го о.
о; го п: _о
о о
100 я
RT: 12.12 АА 1491701
Время (мин)
Di-Ala (35)-AVE0010
4928.3 4928.4 4928.5 4928.6 4928.7 4928.8
m/z
ФИГ.8
4944.58219
Di-Ser (33)-AVE0010
4944.46934
•" 4" " 4"'i" ''" 111"'" 4" '''' '''"l" 1 t'L''" '"' Г" '"''"''"''"' l"''"''"''"''"' Г" '" ч'
.3 4944.4 4944.5 4944.6 4944.7 4944.8
m/z
ФИГ.8 (продолжение)
ю о о о tz
111
^3"
csi
аз О
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
3/11
3/11
4/11
4/11
5/11
5/11
5/11
5/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
6/11
7/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
7/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
8/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
8/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
8/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
8/11
RT: 11.00 - 15.00 SM: 7G
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
9/11
SM: 7G
RT: 11.00-15.00
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
10/11
10/11
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
11/11
11/11
|
