[RU]

Изобретение относится к экстрагированному липиду с высокими уровнями, например 90-95% в весовом отношении, олеиновой кислоты. Настоящим изобретением также обеспечиваются генетически модифицированные растения, в частности семена масличных растений, таких как сафлор, которые могут использоваться для продукции липида. Кроме того, обеспечиваются способы генотипирования и отбора растений, которые могут использоваться для продукции липида.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к экстрагированному липиду с высокими уровнями, например 90-95% в весовом отношении, олеиновой кислоты. Настоящим изобретением также обеспечиваются генетически модифицированные растения, в частности семена масличных растений, таких как сафлор, которые могут использоваться для продукции липида. Кроме того, обеспечиваются способы генотипирования и отбора растений, которые могут использоваться для продукции липида.

---

2420-520222ЕА/071 МАСЛА С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к экстрагированному липиду с высокими уровнями, например, 90-95% в весовом отношении, олеиновой кислоты. Настоящим изобретением также обеспечиваются генетически модифицированные растения, в частности, семена масличных растений, таких как сафлор, которые могут использоваться для продукции липида. Кроме того, обеспечиваются способы генотипирования и отбора растений, которые могут использоваться для продукции липида.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Растительные масла являются важным источником жира, входящего в рацион людей, представляя приблизительно 25% калорийности потребляемой пищи в развивающихся странах (Broun et al., 1999) . Мировое производство растительных масел составляет по крайней мере приблизительно 110 миллионов тонн в год, из которых 8 6% используются для потребления людьми. Почти все эти масла получают из масличных культур, таких как соя, канола, сафлор, подсолнечник, хлопчатник и арахис подземный, или выращиваемых на плантациях деревьев, таких как пальма, маслина европейская и кокосовая пальма (Gunstone, 2001; Oil World Annual, 2004). Возрастающее научное понимание и осознание обществом влияния отдельных, жирнокислотных компонентов пищевых жиров на различные аспекты здоровья людей служит причиной разработки модифицированных растительных масел, которые обладают увеличенной пищевой ценностью при сохранении необходимой функциональной возможности для применений в различных продуктах питания. Для этих модификаций необходимо знание метаболических путей для синтеза жирных кислот растений и генов, кодирующих ферменты для этих путей (Liu et al., 2002а; Thelen and Ohlrogge, 2002) .
Немалое внимание уделяется влиянию различных жиров и масел в пище, в частности, влиянию составных частей жиров и масел на сердечнососудистое заболевание, рак и различные воспалительные состояния. Полагают, что высокие уровни холестерина и
насыщенных жирных кислот в рационе увеличивают риск развития болезни сердца, и это привело к рекомендации в отношении питания уменьшить потребление богатых холестерином, насыщенных животных жиров во имя не содержащих холестерин, ненасыщенных растительных масел (Liu et al., 2002а).
Хотя потребление с пищей холестерина, присутствующего в животных жирах, может значительно увеличивать уровни общего холестерина в крови, также было установлено, что жирные кислоты, которые составляют жиры и масла, могут сами оказывать значительные эффекты на уровни холестерина в сыворотке крови. Особый интерес представляет эффект жирных кислот в пище на формы холестерина в крови: нежелательный липопротеин низкой плотности (LDL) и желательный липопротеин высокой плотности
(HDL) . Вообще, насыщенные жирные кислоты, в частности, миристиновая кислота (14:0) и пальмитиновая кислота (16:0), основные насыщенные углеводороды, присутствующие в растительных маслах, обладают нежелательной способность повышать уровни LDL-холестерина в сыворотке и, следовательно, увеличивать риск развития сердечнососудистого заболевания (Zock et al., 1994; Ни et al., 1997) . Однако точно установлено, что стеариновая кислота (18:0), другой основной ненасыщенный углеводород, присутствующих в растительных маслах, не повышает LDL-холестерин и может в действительности понизить общий холестерин
(Bonanome and Grundy, 1988; Dougherty et al. , 1995) . По этой причине, как правило, полагают, что стеариновая кислота является по крайней мере нейтральной, что касается риска развития сердечнососудистого заболевания (Tholstrup, et al., 1994). С другой стороны, ненасыщенные жирные кислоты, такие как мононенасыщенная олеиновая кислота (18:1), обладает целебной способностью понижать LDL-холестерин (Mensink and Katan, 1989; Roche and Gibney, 2000), тем самым уменьшая риск развития сердечнососудистого заболевания.
Богатое олеиновой кислотой масло также имеет множество промышленных применений, таких как, но без ограничения, смазочные материалы часто в форме сложных эфиров жирных кислот, биотопливо, исходные материалы для спиртов жирного ряда,
пластификаторы, воск, стеараты металлов, эмульгаторы, товары для личной гигиены, мыло и детергенты, поверхностно-активные вещества, фармацевтические средства, добавки для обработки металлов, исходные материалы для смягчителей тканей, чернила, прозрачное мыло, стабилизатор ПВХ, алкидные смолы и промежуточные продукты для многих других типов последующих олеохимических производных.
Маслоперерабатывающие предприятия и пищевые предприятия-изготовители традиционно опирались на гидрогенизацию для уменьшения уровня ненасыщенных жирных кислот в маслах, тем самым увеличивая их устойчивость к окислению при жарке, а также обеспечивая твердые жиры для применения в маргарине и для добавлений в тесто для рассыпчатости. Гидрогенизация представляет собой химический процесс, в ходе которого уменьшается степень ненасыщенности масел в результате превращения углерод-углеродных двойных связей в углерод-углеродные одинарные связи. Полная гидрогенизация дает полностью насыщенный жир. Однако процесс частичной гидрогенизации приводит к увеличению уровней и насыщенных жирных кислот, и мононенасыщенных жирных кислот. Некоторые из мононенасыщенных углеводородов, образуемых во время частичной гидрогенизации, находятся в форме трансизомера (такой как элаидиновая кислота, трансизомер олеиновой кислоты), а не во встречающейся в природе форме цис-изомера (Sebedio et al., 1994; Fernandez San Juan, 1995). В настоящее время известно, что в отличие от цис-ненасыщенных жирных кислот, трансжирные кислоты столь же эффективны, как и пальмитиновая кислота, в повышении уровней LDL-холестерина в сыворотке (Mensink and Katan, 1990; Noakes and Clifton, 1998) и понижении HDL-холестерина в сыворотке (Zock and Katan, 1992) и, таким образом, вносят вклад в увеличенный риск развития сердечнососудистого заболевания (Ascherio and Willett, 1997). В результате увеличения информированности об антипитательных эффектах трансжирных кислот, в настоящее время растет тенденция отказа от использования гидрогенизированного жира в пищевой промышленности в пользу жиров и масел, которые являются как
ценными в пищевом отношении, так и могут обеспечить необходимую функциональную возможность без гидрогенизации, в особенности тех, которые богаты или олеиновой кислотой, в случаях, когда требуется жидкие масла, или стеариновой кислотой, в случаях, когда предпочтительным является твердый или полутвердый жир.
Существуют потребность в дополнительных липидах и маслах с высоким содержанием олеиновой кислоты и их источниках.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения создали новые липидные композиции и способы их получения.
В первом аспекте настоящим изобретением обеспечивается липид, экстрагированный из масличного семени, при этом липид включает триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, причем
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении липида составляет TAG,
iii) приблизительно 90% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в липиде
составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 3,1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота, и
v) липид характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP), составляющей менее чем приблизительно 0,037, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,0 63.
В варианте осуществления липид имеет одну или более или все из следующих особенностей,
а) приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,3% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет линолевая кислота,
e) менее чем приблизительно 1%, или менее чем приблизительно 0,5% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет а-линоленовая кислота (ALA),
f) приблизительно 0,5% - приблизительно 1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет 18:1А11,
g) ODP для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01,
h) значение PLO для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,0 63, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,055, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,050, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,055, или приблизительно 0,063, или приблизительно 0,055, или приблизительно 0,050, или приблизительно 0,040, или приблизительно 0,030, или приблизительно 0,02 0,
f)
i) приблизительно 90% - приблизительно 96%, или приблизительно 92% - приблизительно 9 6%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты,
j) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
к) липид находится в форме очищенного масла, и
1) липид является негидрогенизированным.
В варианте осуществления,
1) приблизительно 91% - приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет олеиновая кислота,
2) менее чем приблизительно 2,75% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота,
3) менее чем приблизительно 3% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет линолевая кислота,
4) а-линоленовая кислота является необнаруживаемой в жирнокислотном составе липида,
5) ODP для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,033 - приблизительно 0,023, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,018,
6) значение PLO для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,020 - приблизительно 0,063,
7) приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты, и
8) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно
1)
0,005 -приблизительно 0,02.
В дальнейшем варианте осуществления,
1) приблизительно 91% - приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет олеиновая кислота,
2) менее чем приблизительно 2,75% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота,
3) менее чем приблизительно 3% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет линолевая кислота,
4) а-линоленовая кислота является необнаруживаемой в жирнокислотном составе липида,
5) приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты, и
6) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02.
В варианте осуществления PUFA является линолевая кислота.
В варианте осуществления а-линоленовая кислота является необнаруживаемой в жирнокислотном составе липида.
В дальнейшем варианте осуществления приблизительно 55% -приблизительно 8 0%, или приблизительно 60% - приблизительно 8 0%, или приблизительно 7 0% - приблизительно 8 0%, или по крайней мере приблизительно 60%, или по крайней мере приблизительно 7 0%, или приблизительно 60%, или приблизительно 7 0%, или приблизительно 8 0% от содержания TAG в липиде составляет триолеин.
В другом варианте осуществления менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 2%, или приблизительно 0,1% -приблизительно 5% от содержания олеиновой кислоты в липиде находится в форме диацилглицеринов (DAG).
В дальнейшем варианте осуществления липид находится в форме масла, причем по крайней мере 90%, или по крайней мере 95%, по крайней мере приблизительно 98%, или приблизительно 95% приблизительно 98% в весовом отношении масла составляет липид.
В предпочтительном варианте осуществления масличным семенем является нефотосинтезирующее масличное семя. Примеры нефотосинтезирующего масличного семени включают, но без обязательного ограничения, семя сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной. В предпочтительном варианте осуществления нефотосинтезирующим семенем масличного растения является семя сафлора.
В варианте осуществления липид, кроме того, включает один или более стеролов.
В дальнейшем варианте осуществления липид находится в форме масла, и этот липид включает менее чем приблизительно 5 мг стеролов/г масла, или приблизительно 1,5 мг стеролов/г масла - приблизительно 5 мг стеролов/г масла.
В варианте осуществления липид включает одно или более или все из
a) приблизительно 1,5% - приблизительно 4,5%, или приблизительно 2,3% - приблизительно 4,5% от общего содержания стеролов составляет эргост-7-ен-3|3-ол,
b) приблизительно 0,5% - приблизительно 3%, или приблизительно 1,5% - приблизительно 3% от общего содержания стеролов составляет от общего содержания стеролов составляет тритерпеновый спирт,
c) приблизительно 8,9% - приблизительно 20% от общего содержания стеролов составляет А7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-3|3 -ол, и
d) приблизительно 1,7% - приблизительно 6,1% от общего содержания стеролов составляет А7-авенастерол.
В дальнейшем варианте осуществления липид имеет объем, составляющий по крайней мере 1 литр, и/или вес, составляющий по крайней мере 1 кг, и/или этот липид экстрагирован из масличного
семени, полученного от выращенных в поле растении.
В варианте осуществления липид экстрагирован из масличного
семени посредством раздавливания и включает менее чем
приблизительно 7% воды в весовом отношении. В другом варианте
осуществления липид является очищенным липидом
(экстрагированным растворителем и рафинированным) и включает менее чем приблизительно 0,1%, или менее чем приблизительно 0,05% воды, в весовом отношении.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается композиция, включающая первый компонент, который является липидом настоящего изобретения, и второй компонент, предпочтительно в случаях, когда композиция получена посредством смешивания липида со вторым компонентом.
Как будет понятно квалифицированному специалисту, второй компонент можно выбрать из широкого ряда различных соединений/композиций. В одном примере вторым компонентом является не являющееся липидом вещество, такое как фермент, небелковый (неферментный) катализатор или химическое вещество (например, гидроксид натрия, метанол или метал), или один или более ингредиентов пиши.
Настоящим изобретением также обеспечивается способ получения масла, включающий
i) получение масличного семени, которое включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, которое включает, масло, причем содержимым в виде масла масличного семени является определенный здесь липид, и
ii) экстрагирование масла из масличного семени для того, чтобы получить масло.
В предпочтительном варианте осуществления масличное семя включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся масличном семени по сравнению с соответствующим масличным семенем, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем полинуклеотид функционально связан с промотором, который
управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ получения масла, включающий
i) получение семени сафлора, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
a) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и
олеиновую кислоту,
b) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности семени составляет TAG,
c) приблизительно 75% - приблизительно 95% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
d) менее чем приблизительно 5,1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота, и
e) содержимое в виде масла семени характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP), составляющей менее чем приблизительно 0,17, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,2 6, и
ii) экстрагирование масла из семени сафлора для того, чтобы получить масло,
причем семя сафлора включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся семени сафлора по сравнению с соответствующим семенем сафлора, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся семени сафлора.
В другом варианте осуществления масличное семя или семя
сафлора включает второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует вторую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пальмитоил-АСР-тиоэстеразы (FATB) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует второй экзогенный полинуклеотид, и причем второй экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
В другом варианте осуществления масличное семя или семя сафлора включает третий экзогенный полинуклеотид, который кодирует третью вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пластидной десатуразы со б жирных кислот (FAD6) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует третий экзогенный полинуклеотид, и причем третий экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
В варианте осуществления
1) ген FAD2 представляет собой один или более или каждый из гена CtFAD2-l, гена CtFAD2-2 и гена CtFAD2-10, предпочтительно гена CtFAD2-l и/или гена CtFAD2-2, и/или
2) ген FATB представляет собой ген CtFATB-З, и/или
3) ген FAD6 представляет собой ген CtFAD6.
В варианте осуществления содержимое в виде масла семени сафлора имеет одну или более или все из следующих особенностей,
а) приблизительно 80% - приблизительно 94%, или приблизительно 85% - приблизительно 94%, или приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 4%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 15%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 10%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 7,5%, или приблизительно 0,1% приблизительно 5%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляют полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 15%, или менее чем приблизительно 10%, или менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет линолевая кислота (LA),
e) приблизительно 80% - приблизительно 96%, или приблизительно 90% - приблизительно 96%, или приблизительно 92%
приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты,
f) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,05, или менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,05, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
g) ODP для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,17 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,15 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,1
f)
приблизительно 0,01, или приблизительно 0,075 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01, и
h) значение PLO для содержимого в виде масла семени
составляет приблизительно 0,20 - приблизительно 0,026, или
приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,2, или приблизительно
0,020 - приблизительно 0,15, или приблизительно 0,020
приблизительно 0,1, или приблизительно 0,02 0 и приблизительно
0,075, или приблизительно 0,050 и приблизительно 0,055, или
составляет приблизительно 0,05, или приблизительно 0,040, или
приблизительно 0,030, или приблизительно 0,020.
В варианте осуществления стадия экстракции масла включает раздавливание масличного семени или семени сафлора.
Тем не менее, в другом варианте осуществления способ, кроме того, включает стадию очистки масла, экстрагированного из масличного семени или семени сафлора, причем стадия очистки включает одно или более или все из группы, состоящей из: рафинирования гидратацией, дезодорации, обесцвечивания, сушки и/или фракционирования экстрагированного масла, и/или удаления по крайней мере некоторых, предпочтительно по существу всех, восков и/или восковых эфиров из экстрагированного масла.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности масличного семени составляет TAG,
iii) приблизительно 90% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в
виде масла масличного семени составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 3,1% в весовом отношении от
общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла
масличного семени составляет пальмитиновая кислота, и
v) содержимое в виде масла масличного семени
характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP),
составляющей менее чем приблизительно 0,037, и/или значением
отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую
кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,0 63.
В варианте осуществления масличным семенем является нефотосинтезирующее масличное семя, предпочтительно семя сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной.
В другом варианте осуществления масличное семя включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся масличном семени по сравнению с соответствующим масличным семенем, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем первый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени.
Тем не менее, в другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается семя сафлора, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности семени составляет TAG,
iii) приблизительно 75% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в
виде масла семени составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 5, 1% в весовом отношении от
общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота, и
v) содержимое в виде масла семени характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP) , составляющей менее чем приблизительно 0,17, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,2 6, и
причем семя сафлора включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся семени сафлора по сравнению с соответствующим семенем сафлора, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем первый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся семени сафлора.
В варианте осуществления содержимое в виде масла семени сафлора имеет одну или более из следующих особенностей,
a) приблизительно 80% - приблизительно 94%, или приблизительно 85% - приблизительно 94%, или приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 4%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 15%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 10%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 7,5%, или приблизительно 0,1%
a)
приблизительно 5%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляют полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 15%, или менее чем приблизительно 10%, или менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет линолевая кислота (LA),
e) приблизительно 80% - приблизительно 96%, или приблизительно 90% - приблизительно 96%, или приблизительно 92%
приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты,
f) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,05, или менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,05, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
g) ODP для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,17 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,15 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,1 приблизительно 0,01, или приблизительно 0,075 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01, и
h) значение PLO для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,20 - приблизительно 0,026, или приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,2, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,15, или приблизительно 0,020
f)
приблизительно 0,1, или приблизительно 0,02 0 и приблизительно 0,075, или приблизительно 0,050 и приблизительно 0,055, или составляет приблизительно 0,05, или приблизительно 0,040, или приблизительно 0,030, или приблизительно 0,020.
В дальнейшем варианте осуществления содержимым в виде масла масличного семени или семени сафлора является липид, который, кроме того, характеризуется одной или более вышеупомянутых особенностей.
В другом варианте осуществления масличное семя или семя сафлора включает второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует вторую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пальмитоил-АСР-тиоэстеразы (FATB) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует второй экзогенный полинуклеотид, и причем второй экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
В дальнейшем варианте осуществления масличное семя или семя сафлора включает третий экзогенный полинуклеотид, который способен уменьшить экспрессию гена пластидной десатуразы со б жирных кислот (FAD6) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует третий экзогенный полинуклеотид, и причем третий экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
В другом варианте осуществления первая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию более чем одного эндогенного гена, кодирующего FAD2, в развивающемся масличном семени или семени сафлора, и/или причем вторая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию более чем одного эндогенного гена, кодирующего FATB, в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
Тем не менее, в дальнейшем варианте осуществления первый
экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго
экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного
полинуклеотида ковалентно соединены в одной молекуле ДНК,
необязательно с помощью связывающих последовательностей ДНК
между первым, вторым и/или третьим экзогенными
полинуклеотидами.
В другом варианте осуществления первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного полинуклеотида находятся под контролем одного промотора, так что, когда первый экзогенный полинуклеотид и второй экзогенный полинуклеотид и/или третий экзогенный полинуклеотид транскрибируются в развивающемся масличном семени или семени сафлора, первая вызывающая генный сайленсинг РНК и вторая вызывающая генный сайленсинг РНК и/или третья вызывающая генный сайленсинг РНК ковалентно связаны в виде частей одного РНК-транскрипта.
В другом варианте осуществления масличное семя или семя сафлора включает одну транспортную (перенесенную) ДНК, интегрированную в геном масличного семени или семени сафлора, и причем одна транспортная ДНК включает первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного полинуклеотида.
Предпочтительно масличное семя или семя сафлора является гомозиготным по транспортной ДНК.
В варианте осуществления каждую из первой вызывающей генный сайленсинг РНК, второй вызывающей генный сайленсинг РНК и третьей вызывающей генный сайленсинг РНК независимо выбирают из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микроРНК и двухцепочечной РНК.
В дальнейшем варианте осуществления любой один или более, предпочтительно все, из промоторов являются специфическими для семени и предпочтительно преимущественно экспрессируются в зародыше развивающегося масличного семени или семени сафлора.
В другом варианте осуществления масличное семя или семя
сафлора включает одну или более мутаций в одном или более генов FAD2, причем мутация(и) уменьшает активность одного или более генов FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует мутация(и).
В другом варианте осуществления масличное семя или семя сафлора включает, по сравнению с геном FAD2 дикого типа в соответствующем масличном семени или семени сафлора, мутацию в гене FAD2, которая представляет собой делецию, вставку, инверсию, сдвиг рамки считывания, стоп-кодон преждевременной трансляции или одну или более неконсервативных аминокислотных замен.
В дальнейшем варианте осуществления мутацией является нуль-мутация в гене FAD2.
В другом варианте осуществления по крайней мере одна из мутаций находится в гене FAD2, который кодирует большую степень активности FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора, в котором отсутствует мутация(и), чем любой другой ген FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
В другом варианте осуществления семенем является семя сафлора, и геном FAD2 является ген CtFAD2-l. В этом варианте осуществления также предпочтительно, когда первая вызывающая генный сайленсинг РНК по крайней мере способна уменьшить экспрессию гена CtFAD2-2.
В другом варианте осуществления семенем является семя сафлора, включающее аллель ol гена CtFAD2-l или аллель oil гена CtFAD2-l, или оба аллеля. В варианте осуществления аллель ol или аллель oil гена CtFAD2-l присутствует в гомозиготном состоянии.
В другом варианте осуществления белок FAD2 является необнаруживаемым в масличном семени или семени сафлора.
В другом варианте осуществления семенем является семя сафлора, и первая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию обоих генов CtFAD2-l и CtFAD2-2.
В другом варианте осуществления семенем является семя сафлора, в котором
1) геном FAD2 является один или более из гена CtFAD2-l, гена CtFAD2-2 и гена CtFAD2-10, предпочтительно гена CtFAD2-l и/или гена CtFAD2-2, и/или
2) геном FATB является ген CtFATB-З, и/или
3) геном FAD6 является ген CtFAD6.
Также обеспечивается масличное растение или растение сафлор, способное образовывать семя настоящего изобретения.
В варианте осуществления растение является трансгенным и гомозиготным по каждому экзогенному полинуклеотиду и/или включает первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида или третьего экзогенного полинуклеотида.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается в значительной степени очищенный и/или рекомбинатный полипептид, который включает аминокислоты с последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 27-37, 44, 45 или 48, его биологически активный фрагмент или аминокислотная последовательность, идентичная на по крайней мере 4 0% любой одной или более из SEQ ID NO: 27-37, 44, 45 или 48.
В варианте осуществления полипептидом является модифицирующий жирные кислоты фермент, предпочтительно олеат-А12-десатураза, А12-ацетиленаза, пальмитолеат-А12-десатураза или пальмитоил--АСР-тиоэстераза (FATB).
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается выделенный и/или экзогенный полинуклеотид, включающий одно или более из
i) нуклеотидов, имеющих последовательность, представленную
в любой из SEQ ID NO: 1-25, 40-43, 46 или 47,
ii) нуклеотидов, имеющих последовательность, кодирующую
полипептид настоящего изобретения,
iii) нуклеотидов, которые гибридизуются с
последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 1-25,
40-43, 46 или 47, и
iv) нуклеотидов, имеющих такую последовательность, что
после экспрессии в семени масличного растения уменьшается
экспрессия гена, кодирующего по крайней мере один полипептид настоящего изобретения.
В особенно предпочтительном варианте осуществления
полинуклеотид включает нуклеотиды, имеющие такую
последовательность, что после экспрессии в семени масличного растения уменьшается экспрессия гена, кодирующего по крайней мере один полипептид настоящего изобретения.
В варианте осуществления полинуклеотид элемента iv) включает последовательность нуклеотидов, представленную в любой из SEQ ID N0: 49-51 (в случаях, когда тимин (Т) заменяется урацилом (U)).
В варианте осуществления полинуклеотид элемента iv) выбирают из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микроРНК, молекулы двухцепочечной РНК (дцРНК) и ее подвергнутого процессингу РНК-продукта.
В дальнейшем варианте осуществления полинуклеотидом является молекула дцРНК или ее подвергнутый процессингу РНК-продукт, включающий по крайней мере 19 следующих друг за другом нуклеотидов, которые идентичны на по крайней мере 95% комплементу любой одной или более из SEQ ID N0: 1-25, 40-43, 46, 47 или 49-51 (в случаях, когда тимин (Т) заменяется урацилом (U)).
В другом варианте осуществления молекула дцРНК является предшественником микроРНК, и/или причем ее подвергнутым процессингу РНК-продуктом является микроРНК.
Тем не менее, в дальнейшем варианте осуществления
полинуклеотид транскрибируется в развивающемся масличном семени
или семени сафлора под контролем одного промотора, причем
молекула дцРНК включает комплементарные смысловую и
антисмысловую последовательности, которые способны
гибридизоваться друг с другом, связанные с помощью одноцепочечного участка РНК.
Тем не менее, в дальнейшем варианте осуществления полинуклеотид, в случае присутствия в развивающемся семени сафлора,
i) уменьшает экспрессию эндогенного гена, кодирующего олеат-А12-десатуразу (FAD2), в развивающемся семени, при этом FAD2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой одной или более из SEQ ID N0: 27, 2 8 или 3 6, предпочтительно по крайней мере одной или обеих из SEQ ID N0: 2 7 и 2 8;
ii) уменьшает экспрессию эндогенного гена, кодирующего
пальмитоил-АСР-тиоэстеразу (FATB), в развивающемся семени, при
этом FATB имеет аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 45; и/или
iii) уменьшает экспрессию гена, кодирующего десатуразу со б жирных кислот (FAD6), в развивающемся семени, при этом FAD6 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 48.
Также обеспечивается химерный вектор, включающий полинуклеотид настоящего изобретения, функционально связанный с промотором.
В варианте осуществления промотор является функционирующим
в масличном семени или является специфическим для семени
промотором, предпочтительно является преимущественно
экспрессируемым в зародыше развивающегося масличного семени.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается рекомбинантная клетка, включающая экзогенный полинуклеотид настоящего изобретения и/или вектор настоящего изобретения.
Клеткой может быть клетка любого типа, например, но без ограничения, бактериальная клетка, дрожжевая клетка или клетка растения.
Предпочтительно, клеткой является клетка растения, предпочтительно клетка семени растения. Более предпочтительно клеткой растения является клетка масличного растения. Даже более предпочтительно клеткой растения является клетка нефотосинтезирующего семени, предпочтительно клетка семени сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается трансгенный не являющийся человеком организм, включающий один
или более полинуклеотидов настоящего изобретения, вектор настоящего изобретения и клетку настоящего изобретения.
Предпочтительно трансгенным не являющимся человеком организмом является растение, более предпочтительно масличное растение.
Тем не менее, в другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ создания клетки настоящего изобретения, включающий стадию введения полинуклеотида настоящего изобретения и/или вектора настоящего изобретения в клетку.
Также обеспечивается применение полинуклеотида настоящего изобретения и/или вектора настоящего изобретения для создания рекомбинантной клетки.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ создания трансгенного масличного растения, которое образует семя настоящего изобретения, или его семени, при этом способ включает
i) введение по крайней мере одного полинуклеотида настоящего изобретения и/или по крайней мере одного вектора настоящего изобретения в клетку масличного растения,
ii) регенерацию трансгенного растения из клетки, и
iii) необязательно, получение одного или более растений-потомков трансгенного растения или их семени,
тем самым создавая трансгенное масличное растение или его
семя.
В варианте осуществления семенем является семя сафлора настоящего изобретения.
В дальнейшем варианте осуществления одно или более растений-потомков или его семя включает
i) первый экзогенный полинуклеотид, и/или
ii) второй экзогенный полинуклеотид, и/или
iii) третий экзогенный полинуклеотид,
предпочтительно все три экзогенных полинуклеотида.
В дальнейшем варианте осуществления одно или более растений-потомков или его семя включает одну или более мутаций, определенных выше.
Тем не менее, в дополнительном аспекте настоящим
изобретением обеспечивается способ создания масличного растения, включающий
i) скрещивание первого родительского масличного растения, которое включает первый полинуклеотид настоящего изобретения, или первый вектор настоящего изобретения, со вторым родительским масличным растением, которое включает второй полинуклеотид настоящего изобретения или второй вектор настоящего изобретения,
ii) скрининг растений-потомков, образующихся в результате скрещивания, на присутствие обоих полинуклеотидов или обоих векторов; и
iii) отбор растения-потомка, включающего как (а) первый
полинуклеотид или первый вектор, так и (Ь) второй полинуклеотид
или второй вектор, и, кроме того, характеризующегося
увеличенной долей олеиновой кислотой и уменьшенной долей
пальмитиновой кислоты в составе масла из семени растения.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ генотипирования растения сафлора, включающий детектирования молекулы нуклеиновой кислоты растения, причем молекула нуклеиновой кислоты сцеплена с, и/или включает крайней мере часть, одним (одного) или более генов CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10, предпочтительно по крайней мере одним или обоими из генов CtFAD2-l и CtFAD2-2, или по крайней мере геном CtFAD2-1, растения сафлора.
В варианте осуществления способ включает определение уровня экспрессии и/или последовательности одного или более из генов CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10 растения.
В варианте осуществления способ включает:
i) гибридизацию второй молекулы нуклеиновой кислоты с указанной молекулой нуклеиновой кислоты растения,
ii) необязательно, гибридизацию по крайней мере одной другой молекулы нуклеиновой кислоты с указанной молекулой нуклеиновой кислоты растения; и
iii) детектирование продукта указанной стадии(й)
гибридизации или отсутствие продукта в результате указанной
стадии(й) гибридизации.
Тем не менее, в дальнейшем варианте осуществления вторая молекула нуклеиновой кислоты используется в качестве праймера для обратной транскрипции или репликации по крайней мере части молекулы нуклеиновой кислоты растения.
Нуклеиновую кислоту можно детектировать, используя ряд хорошо известных методов, таких как, но без ограничения, анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов, анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов, амплификация микросателлитных локусов, секвенирование нуклеиновой кислоты и/или амплификация нуклеиновой кислоты.
В варианте осуществления способ детектирует отсутствие или присутствие аллеля гена CtFAD2-l, предпочтительно аллеля ol.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ отбора растения сафлора из популяции растений, включающий:
i) генотипирование указанной популяции растений, используя
способ настоящего изобретения, причем указанная популяция
растений была получена в результате скрещивания между двумя
растениями, по крайней мере одно из которых включает аллель
гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10, предпочтительно по
крайней мере одного или обоих из генов CtFAD2-l и CtFAD2-2, или
по крайней мере гена CtFAD2-l, который наделяет развивающееся
семя указанного растения уменьшенным уровнем активности А12-
десатуразы, по сравнению с соответствующим семенем растения
сафлора, в котором отсутствует указанный аллель, и
ii) отбор растения сафлора на основе присутствия или
отсутствия указанного аллеля.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ введения аллеля гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10 в растение сафлор, в котором отсутствует этот аллель, при этом способ включает;
i) скрещивание первого родительского растения сафлора со вторым родительским растением сафлором, причем второе растение включает указанный аллель гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10, и
ii) возвратное скрещивание потомка, полученного в результате скрещивания стадии i), с растениями с тем же генотипом, что и первое родительское растение, достаточное число раз для получения растения с преобладанием генотипа первого растения, но включающего указанный аллель,
причем аллель наделяет развивающееся семя указанного растения уменьшенным уровнем активности А12-десатуразы, по сравнению с соответствующим семенем растения сафлора, в котором отсутствует указанный аллель, и причем растения-потомков генотипируют на присутствие или отсутствие указанного аллеля, используя способ настоящего изобретения.
Также обеспечивается трансгенное растение, или растения -его потомки, или его семя, созданное, используя способ настоящего изобретения.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ производства семени, включающий
a) выращивание растения настоящего изобретения,
предпочтительно в поле в виде части популяции по крайней мере
1000 таких растений и
b) сбор урожая семян.
Тем не менее, в дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается масло, полученное или получаемое с помощью одного или более способов настоящего изобретения, из масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, из растения или его части настоящего изобретения, из клетки настоящего изобретения и/или из не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается композиция, включающая одно или более из липида настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, полипептида настоящего изобретения, полинуклеотида настоящего изобретения, вектора настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения или масла настоящего изобретения и один или более приемлемых носителей.
Также обеспечивается применение одного или более из липида
настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения, способа настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения для производства промышленного продукта.
В другом аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ производства промышленного продукта, включающий стадии:
i) получения одного или более из липида настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения,
ii) необязательно, физической обработки одного или более из липида настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения, стадии i),
ii) превращения по крайней мере некоторой части липида настоящего изобретения, или липида в одном или более из композиции настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или части растения настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения, или подвергнутого физической обработке продукта стадии ii), в промышленный продукт посредством использования нагревания, химического или ферментативного способа, или любой их комбинации, в отношении липида, и
iii) получения промышленного продукта,
тем самым осуществляя производство промышленного продукта.
Тем не менее, в дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ производства топлива, включающий
i) осуществление реакции одного или более из липида настоящего изобретения, или липида в одном или более из композиции настоящего изобретения, масличном семени или семени сафлора настоящего изобретения, растении или части растения настоящего изобретения, клетке-хозяине настоящего изобретения, не являющемся человеком трансгенном организме или его части настоящего изобретения, или масле настоящего изобретения, со спиртом, необязательно в присутствии катализатора, для образования алкиловых эфиров, и
ii) необязательно, смешивание алкиловых эфиров с топливом на нефтяной основе.
В варианте осуществления алкиловыми эфирами являются метиловые эфиры.
В дальнейшем аспекте настоящим изобретением обеспечивается способ производства продукта питания, включающий смешивание одного или более из липида настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения, с по крайней мере одним другим пищевым ингредиентом.
Также обеспечиваются продукты питания, косметические средства или химические продукты, включающие одно или более из липида настоящего изобретения, композиции настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения.
Тем не менее, в дальнейшем аспекте обеспечивается продукт, полученный из одного или более, или используя одно или более, из липида настоящего изобретения, липида в одном или более из
композиции настоящего изобретения, способа настоящего изобретения, масличного семени или семени сафлора настоящего изобретения, растения или его части настоящего изобретения, клетки-хозяина настоящего изобретения, не являющегося человеком трансгенного организма или его части настоящего изобретения, или масла настоящего изобретения.
Предполагается, что любой вариант осуществления здесь применим с необходимыми изменениями к любому другому варианту осуществления, кроме особо оговоренных случаев.
Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными здесь, которые предназначены лишь для иллюстрации. Функционально эквивалентные продукты, композиции и способы, несомненно, находятся в объеме настоящего изобретения, описанного здесь.
На всем протяжении этого описания, кроме особо оговоренных случаев или, если контекст не подразумевает иное, ссылка на одну стадию, композицию, являющуюся объектом изобретения, группу стадий или группу композиций, являющихся объектами изобретения, как предполагается, охватывает одну или множество (т.е. одну или более) этих стадий, композиций, являющихся объектами изобретения, групп стадий или групп композиций, являющихся объектами изобретения.
Ниже настоящее изобретение описывается через следующие неограничивающие примеры и со ссылкой на сопроводительные фигуры.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СОПРОВОДИТЕЛЬНЫХ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. 1. Филогенетическое сравнение аминокислотных последовательностей, кодируемых семейством ЕАБ2-подобных генов сафлора, и дивергентных FAD2-подобных ферментов из других растений. Представленное филогенетическое древо было построено, используя Vector NTI (Invitrogen). Включенными в процесс совмещения были десатуразы FAD2 (DES), гидролазы (ОН), эпоксигеназы (ЕРОХ), ацетиленазы (АСЕТ) и конъюгазы (CONJ). Идентификационными номерами в GeneBank аминокислотных последовательностей, представленных на филогенетическом древе, являются: coCONJ, ААК26632.1; саАСЕТ, АВС007 69.1; срЕРОХ,
С7АА76156.1; haACET, ABC59684.1; dsACET, AAO38036.1; dcACET, AAO38033.1; hhACET, AAO38031.1; haDES-2, AAL68982.1; haDES-3, AAL68983.1; luDES, ACF49507; haDES-1, AAL68982.1; ntDES, AAT72296.2; oeDES, AAW63040; siDES, AAF80560.1; ghDES-1, CAA65744.1; rcOH, AAC49010.1; atDES, AAM61113.1; pfOH:DES, AAC32755.1; plOH, ABQ01458.1; ghDES-4, AAQ16653.1; ghDES-2, CAA71199.1. (со, Calendula officinalis; ca, Crepis alpine; cp, Crepis palaestina; ha, Helianthus annum; ds, Dimorphotheca sinuate; dc, Daucus carota; hh, Hedera helix; lu, Linum usitatissimum; nt, Nicotiana tabacum; oe, Olea europaea; si, Sesamum indicum; rc, Ricinus communis; at, Arabidopsis thaliana; pf, Physaria fendleri; pi, Physaria lindheimeri.
Фиг. 2. Анализ с помощью блот-гибридизации по Саузерну CtFAD2-noflo6Hoii геномной структуры в генотипе SU сафлора. Геномную ДНК расщепляли восемью различными рестриктазами до разделения в агарозном геле. Этими ферментами были AccI (дорожка 1), ВдШ (2), BamHI (3), EcoRI (4), EcoRV (5), Hindlll (6), Xbal (7) и Xhol (8) . Блот зондировали с использованием меченной радиоактивным изотопом полной кодирующей области CtFAD2-6 и промывали в условиях пониженной жесткости.
Фиг. 3. GC-MS анализ жирнокислотного состава дрожжей, экспрессирующих CtFAD2-l (В), CtFAD2-2 (С), CtFAD2-9 (D), QFAD2-10 (Е) и CtFAD2-ll (F). Пустой вектор (А) и GC кривая для смеси С18:2 изомеров (G).
Фиг. 4. GC-MS анализ жирнокислотного состава после транзиторной экспрессии CtFAD2-ll в листьях N. benthamiana.
Фиг. 5. Анализ с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени экспрессии генов CtFAD2 сафлора.
Фиг. б. Сравнение нуклеотидных последовательностей участка аллелей CtFAD2-l из генотипа дикого типа SU и трех генотипов, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты, а именно S-317, CW99-OL и Lesaf496, демонстрирующее делецию нуклеотида в середине кодирующей CtFAD2-l области у мутантов.
Фиг. 7. Сравнение ДНК-последовательностей интронов в 5'UTR в CtFAD2-l в сорте дикого типа SU и генотипе, определяющем
высокое содержание олеиновой кислоты, S-317. Заключенные в рамку последовательности ДНК использовались для конструирования идеальных ПЦР-маркеров для продуктов ПЦР, специфических для генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, и специфических для дикого типа.
Фиг. 8. Анализ с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени уровней мРНК для CtFAD2-l и CtFAD2-2 в развивающихся зародышах трех стадий развития, ранней (7 DPA) , средней (15 DPA) и поздней (20 DPA). Сорта сафлора включают сорт дикого типа SU и три сорта с высоким содержанием олеиновой кислоты: S-317, CW99-OL и Lesaf496.
Фиг. 9. Анализ с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени генов CtFatB в листе, корне и развивающихся зародышах сафлора сорта SU. Ет-1 (ранняя стадия), Ет-2 (средняя стадия) и Ет-3 (поздняя стадия).
Фиг. 10. Дендрограмма, демонстрирующая филогенетическую связь между последовательностями FAD6 сафлора и типичной пластидной А12 десатуразой FAD6, идентифицированной у высших растений Jatropha curcas (EU106889); Olea europaea (AY733075); Populus trichocarpa (EF147523); Arabidopsis thaliana (AY079039); Descuriana sophia (EF524189); Glycine max (AK243928); Brassica napus (L29214); Portulaca oleracea (EU37 6530); Arachis hypogaea (FJ768730); Ginkgo biloba (HQ694563).
Фиг. 11. Состав диацилглицеринов (DAG) (моль%) в S317 в сравнении с S317+603.9, определенный с использованием анализа с помощью LC-MS одного семени.
Фиг. 12. Состав триацилглицеринов (DAG) (моль%) в S317 в сравнении с S317+603.9, определенный с использованием анализа с помощью LC-MS одного семени.
Фиг. 13. Содержание олеиновой кислоты в сортах сафлора, выращенных в полевых условиях в Narrabri австралийским летом 2011/2012.
Фиг. 14. (А) Базовая структура фитостерола с нумерацией циклов и боковых цепей. (В) Химические структуры некоторых из
зитостеролов.
РАЗЪЯСНЕНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
кДНК, кодирующая FAD2-1 сафлора. кДНК, кодирующая FAD2-2. кДНК, кодирующая FAD2-3 сафлора. кДНК, кодирующая FAD2-4 сафлора. кДНК, кодирующая FAD2-5 сафлора. кДНК, кодирующая FAD2-6 сафлора. кДНК, кодирующая FAD2-7 сафлора.
8 - кДНК, кодирующая FAD2-8 сафлора.
9 - кДНК, кодирующая FAD2-9 сафлора.
10 - кДНК, кодирующая FAD2-10 сафлора
11 - кДНК, кодирующая FAD2-11 сафлора. 12 - Открытая рамка считывания, кодирующая
13 - Открытая рамка считывания, кодирующая
14 - Открытая рамка считывания, кодирующая
15 - Открытая рамка считывания, кодирующая
16 - Открытая рамка считывания, кодирующая
17 - Открытая рамка считывания, кодирующая
18 - Открытая рамка считывания, кодирующая
19 - Открытая рамка считывания, кодирующая
2 0 - Открытая рамка считывания, кодирующая
21 - Открытая рамка считывания, кодирующая
22 - Открытая рамка считывания, кодирующая
Последовательность интрона в гене FAD2-1
сафлора.
SEQ ID NO: 24 - Последовательность интрона в гене FAD2-2 сафлора.
SEQ ID N0: 25 - Последовательность интрона в гене FAD2-10
сафлора.
SEQ ID N0:
кДНК, кодирующая усеченный FAD2-1 сафлора
FATB-2 сафлора.
SEQ ID NO: 43 - Открытая рамка считывания, кодирующая FATB-3 сафлора.
SEQ ID NO: 44 SEQ ID NO: 45 SEQ ID NO: 46 SEQ ID NO: 47
сафлора.
SEQ ID NO: SEQ ID NO:
в вызывающей
конструкции.
SEQ ID NO: 50
FATB-2 сафлора. FATB-3 сафлора.
кДНК, кодирующая FAD6 сафлора.
Открытая рамка считывания, кодирующая FAD6
Последовательность CtFATB-З, используемая
в вызывающей генный сайленсинг, опосредованный РНК, конструкции.
SEQ ID N0: 51 - Последовательность CtFAD6, используемая в вызывающей генный сайленсинг, опосредованный РНК, конструкции.
SEQ ID N0: 52 - Промотор олеозина Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO: 53 - Промотор линина льна.
SEQ ID NO: 54 - Сигнал полиаденилирования Nos.
SEQ ID NO: 55 - Сигнал полиаденилирования Ocs.
SEQ ID NO: 56 - Последовательность CtFAD2-l дикого типа, соответствующая участку аллеля ol.
SEQ ID NO: 57 - Относящаяся к аллелю ol последовательность CtFAD2-2 со сдвигом рамки считывания (то же для S-317, CW99-OL и LeSaf496).
SEQ ID NO: 58-158 - Олигонуклеотидные праймеры.
SEQ ID NO: 159-169 - Мотивы ферментов CtFAD2.
SEQ ID NO: 170 - Интрон в 5'UTR в CtFAD2-l сорта SU сафлора дикого типа.
SEQ ID NO: 171 - Интрон в 5'UTR в CtFAD2-l сорта S-317 сафлора с высоким содержанием олеиновой кислоты.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
Общие методы и определения
Кроме особо оговоренных случаев, предполагается, что все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, что и значение, в котором их обычно понимает специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники (например, культивирования клеток, молекулярной генетики, иммунологии, иммуногистохимии, химии белков и биохимии).
Если не указано иное, методы рекомбинанных белков, культивирования клеток и иммунологические методы, используемые в настоящем изобретении, являются стандартными процедурами, хорошо известными квалифицированным в данной области техники специалистам. Такие методы описаны и объяснены полностью в литературе в таких источниках, как J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring
Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 и 1996), и F.M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, включая все исправленные и дополненные издания до настоящего времени), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), и J.E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (включая все исправленные и дополненные издания до настоящего времени).
Термин "и/или", например, "X и/или Y", как подразумевается, означает или "X и Y", или "X или Y", и, как предполагается, подтверждает в явной форме оба значения или то или другое значение.
Используемый здесь термин "приблизительно", если только не указано иное, относится к +/-10%, более предпочтительно +/-5%, более предпочтительно +/-4%, более предпочтительно +/-3%, более предпочтительно +/-2%, более предпочтительно +/-1,5%, более предпочтительно +/-1%, даже более предпочтительно +/-0,5%, от присвоенного значения.
На протяжении всего этого описания слово "включать" или такие варианты, как "включает" или "включающий", как будет подразумеваться, означает включение определенного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но без исключения любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.
Используемый здесь термин "экстрагированный липид" относится к липидной композиции, которая включает по крайней мере 60% (в весовом отношении) липида и которая была экстрагирована, например, с помощью раздавливания, из трансгенного организма или его части. Кроме того, используемый здесь термин "экстрагированное масло" относится к масляной композиции, которая включает по крайней мере 60% (в весовом отношении) масла и которая была экстрагирована из трансгенного
организма или его части.
Используемый здесь термин "очищенный" при использовании в связи с липидом или маслом настоящего изобретения типично означает, что экстрагированный липид или масло был подвергнут одной или более стадий обработки для увеличения степени чистоты компонента в виде липида/масла. Например, стадия очистки может включать одно или более или все из группы, состоящей из: рафинирования гидратацией, дезодорации, обесцвечивания, сушки и/или фракционирования экстрагированного масла. Однако используемый здесь термин "очищенный" не включает процесс переэтерификации или другой процесс, который изменяет жирнокислотный состав липида или масла настоящего изобретения для увеличения содержания олеиновой кислоты в виде процента от общего содержания жирных кислот. Другими словами, жирнокислотный состав очищенного липида или масла является по существу таким же, как и таковой неочищенного липида или масла. Жирнокислотный состав экстрагированного липида или масла, такой как, например, доли олеиновой, линолевой и пальмитиновой кислот, является по существу таким же, как и жирнокислотный состав липида или масла в семени растения, из которого его получают. В этом контексте "по существу такой же" означает + /1%, или, предпочтительно, +/-0,5%.
Используемый здесь термин "доля десатурации олеиновой кислоты" или "ODP" относится к расчету, который включает деление относительного количества линолевой кислоты и ос-линоленовой кислоты, представленного в виде процента от смеси жирных кислот липида, на сумму относительных количеств олеиновой кислоты, линолевой и а-линоленовой кислоты, каждая из которых представлена в виде процента. Формула является следующей:
ODP=(% линолевой кислоты + % а-линоленовой кислоты)/(% олеиновой кислоты + % линолевой кислоты + % а-линоленовой кислоты). Например, TG603.12(5) примера 15 имеет общее содержание линолевой кислоты и а-линоленовой кислоты, составляющее 2,15%, и содержание линолевой кислоты, а
линоленовой кислоты и олеиновой кислоты, составляющее 93,88%, что составляет ODP=0,0229.
Используемый здесь термин "значение отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту" или "PLO" относится к расчету, который включает деление относительного количества линолевой кислоты и пальмитиновой кислоты, представленного в виде процента от смеси жирных кислот липида, на относительное количество олеиновой кислоты, представленное в виде процента. Формула является следующей:
PLO=(% пальмитиновой кислоты + % линолевой кислоты/% олеиновой кислоты.
Например, TG603.12(5) примера 15 имеет общее содержание линолевой кислоты и пальмитиновой кислоты, составляющее 4,71%, и содержание олеиновой кислоты, составляющее 91,73%, что составляет PLO=0,0513.
Используемый здесь термин "доля олеиновой кислоты в мононенасыщенности" или "ОМР" относится к расчету, который включает деление относительного количества не являющихся олеиновой кислоты мононенасыщенных жирных кислот, представленного в виде процента от смеси жирных кислот липида, на относительное количество олеиновой кислоты, представленное в виде процента. Формула является следующей:
ОМР=(% мононенасыщенных жирных кислот - % олеиновой кислоты)/% олеиновой кислоты.
Например, TG603.12(5) примера 15 имеет общее содержание мононенасыщенных жирных кислот за исключением олеиновой кислоты (0,84% С18:1А11 + 0,29% С20:1), составляющее 1,13%, и содержание олеиновой кислоты, составляющее 91,73%, что составляет ОМР=0,0123.
Термин "соответствующая" относится к клетке, или растению или его части (такой как семя), которая(ое) имеет такой же или схожий генетический фон, что и клетка, или растение или его часть (семя) настоящего изобретения, но которая(ое) не было модифицировано, как здесь описывается (например, клетка, или растение или его часть, в которой(ом) отсутствует экзогенный
полинуклеотид настоящего изобретения). Соответствующая клетка или растение или его часть (семя) может использоваться в качестве контроля для сравнения, например, одного или более количеств продуцированной олеиновой кислоты, активности FAD2, активности FATB или активности FAD6 с клеткой, или растением или его частью (семенем), модифицированной(ым), как здесь описывается. Квалифицированный в данной области техники специалист может без труда определить подходящую "соответствующую" клетку, растение или его часть (семя) для такого сравнения.
Используемый здесь термин "масло из семени" относится к композиции, полученной из семени растения, которая включает по крайней мере 60% (в весовом отношении) липида, или получаемому из семени, если масло из семени все еще присутствует в семени. Т.е. масло из семени настоящего изобретения, или полученное, используя, настоящего изобретения включает масло из семени, которое присутствует в семени или его части, такой как семядоли или зародыш, если только оно не относится к "экстрагированному маслу из семени" или схожим терминам, в случае которых оно представляет собой масло, которое было экстрагировано из семени. Маслом из семени предпочтительно является экстрагированное масло из семени. Масло из семени типично является жидкостью при комнатной температуре. Предпочтительно общим жирнокислотным составом (TFA) масла из семени является > 70% С18 жирных кислот, предпочтительно > 90% олеиновой кислоты (С18:1А9). Жирные кислоты типично находятся в этерифицированной форме, такой как, например, TAG, DAG, ацил-КоА или фосфолипид. Кроме особо оговоренных случаев, жирные кислоты могут быть свободными жирными кислотами и/или находиться в этерифицированной форме. В варианте осуществления по крайней мере 50%, более предпочтительно по крайней мере 7 0%, более предпочтительно по крайней мере 8 0%, более предпочтительно по крайней мере 90%, более предпочтительно по крайней мере 91%, более предпочтительно по крайней мере 92%, более предпочтительно по крайней мере 93%, более предпочтительно по
крайней мере 94%, более предпочтительно по крайней мере 95%, более предпочтительно по крайней мере 96%, более предпочтительно по крайней мере 97%, более предпочтительно по крайней мере 98%, более предпочтительно по крайней мере 99% жирных кислот в масле из семени настоящего изобретения можно обнаружить в виде TAG. В варианте осуществления масло из семени настоящего изобретения является "в значительной степени очищенным" или "очищенным" маслом, которое было отделено от одного или более других липидов, нуклеиновых кислот, полипептидов или других загрязняющих молекул, с которыми оно связано в семени или в неочищенном экстракте. Предпочтительно, когда в значительной степени очищенное масло из семени освобождено на по крайней мере 60%, более предпочтительно освобождено на по крайней мере 75% и более предпочтительно освобождено на по крайней мере 90% от других компонентов, с которыми оно связано в семени или экстракте. Масло из семени настоящего изобретения может, кроме того, включать не являющиеся жирными кислотами молекулы, такие как, но без ограничения, стеролы (см. пример 17) . В варианте осуществления маслом из семени является сафлоровое масло (Carthamus tinctorius), подсолнечное масло (Helianthus annus), хлопковое масло (Gossypium hirsutum), касторовое масло (Ricinus communis), масло канолы {Brassica napus, Brassica тара ssp.), горчичное масло {Brassica juncea), масло из других Brassica
(например, Brassica napobrassica, Brassica camelina), льняное масло {Linum usitatissimum), соевое масло {Glycine max), кукурузное масло {Zea mays), табачное масло {Nicotiana tabacum), арахисовое масло {Arachis hypogaea), пальмовое масло
{Elaeis guineensis) , кокосовое масло {Cocos nucifera) , масло авокадо {Persea americana), оливковое масло {Olea europaea) , масло из анакардии западной {Anacardium occidentale), масло австралийского ореха {Macadamia intergrifolia) , миндальное масло {Prunus amygdalus), масло из семян овса {Avena sativa), рисовое масло {Oryza sativa или Oryza glaberrima), рыжиковое масло {Camelina sativa), масло крамбе {Crambe abyssinica) или масло из семени Arabidopsis {Arabidopsis thaliana) . Масло из
семени можно экстрагировать из семени с помощью любого способа, известного в данной области техники. Это типично включает экстракцию с использованием неполярных растворителей, таких как гексан, диэтиловый эфир, петролейный эфир, смеси хлороформ/метанол или бутанол, обычно связанную с первым раздавливанием или вращением семян. Липиды, связанные с крахмалом в зерне, можно экстрагировать с использованием насыщенного водой бутанола. Масло из семени можно подвергнуть рафинации гидратацией с помощью способов, известных в данной области техники, для удаления полисахаридов и/или фосфолипидов или подвергнуть обработке другими способами для удаления загрязнений или увеличения степени чистоты, стабильности или цвета. TAG и другие сложные эфиры в масле из семени можно гидролизовать для высвобождения свободных жирных кислот, например, с использованием обработки кислотами или щелочами или под действием липаз, или масло из семени гидрогенизируют, подвергают химической или ферментативной обработке, как известно в данной области техники. Однако после обработки масла из семени, так что оно больше не включает TAG, его больше не считают маслом из семени, упоминаемым здесь.
Концентрации свободных и этерифицированных стеролов
(например, ситостерола, кампестерина, стигмастерина,
брассикастерина, А5-авенастерола, ситостанола, кампестанола и холестерина) в очищенном и/или экстрагированном липиде или масле могут быть концентрациями, описанными в Phillips et al.
(2 002) и/или представленными в примере 17. Стеролы в растительных маслах присутствуют в виде свободных спиртов, эфиров жирных кислот (этерифицированные стеролы), гликозидов и ацилированных гликозидов стеролов. Концентрации стеролов во встречающихся в природе растительных маслах (маслах из семян) находятся в пределах вплоть до максимального значения, составляющего приблизительно 1100 мг/100 г. Гидрогенизированное пальмовое масло имеет одну из самых низких концентраций из встречающихся в природе растительных масел, составляющую приблизительно 60 мг/100 г. Извлеченные или экстрагированные
масла из семян настоящего изобретения предпочтительно содержат
между приблизительно 100 и приблизительно 1000 мг всех
стеролов/100 г масла. В случае применения в качестве пищи или
корма предпочтительно, когда стеролы присутствуют в основном в
виде свободных или этерифицированных форм, а не
гликозилированных форм. В маслах из семян настоящего
изобретения предпочтительно по крайней мере 50% стеролов в
маслах присутствуют в виде этерифицированных форм, за
исключением масла из семян сои, которое содержит приблизительно
25% этерифицированных стеролов. Масло из семян сафлора
настоящего изобретения предпочтительно содержит между
приблизительно 150 и приблизительно 400 мг всех стеролов/100 г,
типично приблизительно 300 мг всех стеролов/100 г масла из
семени, при этом ситостерол является основным стеролом. Масло
из семян канолы и рапсовое масло настоящего изобретения
предпочтительно содержит между приблизительно 500 и
приблизительно 800 мг всех стеролов/100 г, при этом ситостерол
является основным стеролом, а кампестерин - следующим из
имеющихся в наибольшем относительном количестве Кукурузное
масло настоящего изобретения предпочтительно содержит между
приблизительно 600 и приблизительно 800 мг всех стеролов/100 г,
при этом ситостерол является основным стеролом. Соевое масло
настоящего изобретения предпочтительно содержит между
приблизительно 150 и приблизительно 350 всех стеролов/100 г,
при этом ситостерол является основным стеролом, а стигмастерин
- следующим из имеющихся в наибольшем относительном количестве,
и оно содержит больше свободных стеролов, чем этерифицированных
стеролов. Хлопковое масло настоящего изобретения
предпочтительно содержит между приблизительно 2 00 и приблизительно 350 всех стеролов/100 г, при этом ситостерол является основным стеролом. Кокосовое масло и пальмовое масло настоящего изобретения предпочтительно содержит между приблизительно 50 и приблизительно 100 мг всех стеролов/100 г, при этом ситостерол является основным стеролом. Арахисовое масло настоящего изобретения предпочтительно содержит между приблизительно 100 и приблизительно 200 мг всех стеролов/100 г,
при этом ситостерол является основным стеролом. Масло из семян кунжута настоящего изобретения предпочтительно содержит между приблизительно 400 и приблизительно 600 мг всех стеролов/100 г, при этом ситостерол является основным стеролом. Масло из семян сафлора настоящего изобретения предпочтительно содержит между приблизительно 200 и 400 мг всех стеролов/100 г, при этом ситостерол является основным стеролом.
Используемый здесь термин "жирная кислота" относится к карбоновой кислоте с длинным алифатическим хвостом длиной по крайней мере 8 атомов углерода, или насыщенной или ненасыщенной. Типично жирные кислоты имеют углеродную цепь длиной по крайней мере 12 атомов углерода. Большинство встречающихся в природе жирных кислот содержат четное число атомов углерода, поскольку в их биосинтезе участвует ацетат, который содержит два атома углерода. Жирные кислоты могут находиться в свободном состоянии (неэтерифицированном) или в этерифицированной форме, такой как связанная часть TAG, DAG, MAG, ацил-КоА (тиоэфира), или другой ковалентно связанной форме. Когда жирная кислота является ковалентно связанной в этерифицированной форме, ее называют здесь "ацильной" группой. Жирная кислота может быть этерифицирована в виде фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (PC), фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозит или дифосфатидилглицерин. Насыщенные жирные кислоты не содержат какие-либо двойные связи или другие функциональные группу вдоль цепи. Термин "насыщенные" относится к водороду, в том плане, что все углероды (кроме карбоксильной группы [-СООН]) содержат максимально возможное число атомов водорода. Другими словами, омега (со) конец содержит 3 водорода (СНЗ-), и каждый углерод в цепи содержит 2 водорода (-СН2-). Ненасыщенные жирные кислоты имеют схожую с насыщенными жирными кислотами форму, за исключением того, что одна или более алкеновых функциональных групп существует вдоль цепи, при этом каждый алкен замещает связанную одинарной связью часть "-СН2-СН2-" цепи связанной двойной связью частью "-CH=CH-" (т.е. углеродом, связанным с
помощью двойной связи с другим углеродом). Два соседних атома углерода в цепи, которые связаны с одной из двух сторон двойной связи, могут встречаться в цис- или транс-конфигурации.
Используемые здесь термины "полиненасыщенная жирная кислота" или "PUFA" относятся к жирной кислоте, которая включает по крайней мере 12 атомов углерода в своей углеродной цепи и по крайней мере две алкеновые группы (углерод-углеродные двойные связи).
Используемый здесь термин "мононенасыщенная жирная кислота" относится к жирной кислоте, которая имеет одну двойную связь в своей ацильной цепи, такой как олеиновая кислота (С18:1А9), C18:1D11 и С20:1.
"Триацилглицерид" или "TAG" является глицеридом, в котором глицерин превращен в сложный эфир с использованием трех жирных кислот. В пути Кеннеди синтеза TAG, образуется DAG, как описано выше, а затем третья ацильная группа образует сложноэфирную связь с остовом глицерина под действием активности DGAT. Альтернативные пути образования TAG включают путь, катализируемый ферментом PDAT, и путь с участием MGAT (PCT/AU2011/000794).
"Диацилглицерид" или "DAG" является глицеридом, в котором
глицерин превращен в сложный эфир с использованием двух жирных
кислот. Как здесь используется, DAG включает гидроксильную
группу в sn-1,3 или sn-1,2/2,3 положении, и, следовательно, DAG
не включает фосфорилированную молекулу, такую как РА или PC.
Таким образом, DAG является компонентом нейтральных липидов в
клетке. В пути Кеннеди синтеза DAG, предшественник sn-глицерин-
3-фосфат (G-3-P) образует сложноэфирные связи с двумя ацильными
группами, каждая из которых происходит из эфира, образованного
из жирной кислоты и коэнзима А, в первой реакции,
катализируемой глицерин-3-фосфат-ацилтрансферазой (GPAT), в
положении sn-1 с образованием LysoPA, с последующим вторым
ацилированием в положении sn-2, катализируемым (лизофосфатидная
кислота)-ацилтрансферазой (LPAAT), с образованием фосфатидной
кислоты (РА) . Этот промежуточный продукт затем
дефосфорилируется с образованием DAG. В альтернативном анаболическом пути, DAG может образоваться в результате ацилирования или sn-1 MAG, или предпочтительно sn-2 MAG, катализируемого MGAT. DAG может также образовываться из TAG в результате удаления ацильной группы липазой, или из PC по существу в результате удаления концевой группы холина любым из ферментов СРТ, PDCT или PLC.
Используемый здесь термин "десатураза" относится к ферменту, который способен вводить углерод-углеродную двойную связь в ацильную группу субстрата, включающего остатки жирных кислот, который типично находится в этерифицированной форме, такой как, например, эфиры, образуемые из КоА и жирной кислоты. Ацильная группа может этерифицироваться до фосфолипида, такого как фосфатидилхолин (PC), или до ацилпереносящего белка (АСР), до КоА, или в предпочтительном варианте осуществления до PC. Десатуразы, как правило, можно распределить по трем группам, соответственно. В одном варианте осуществления десатуразой является десатураза "переднего конца".
Используемые здесь термины "Д12-десатураза" и "FAD2" относится к связанной с мембраной десатуразе жирных кислот, выполняющей удаление атома водорода в А12 положении, которая выполняет реакцию десатурации, превращая олеиновую кислоту (18: 1А9) в линолевую кислоту (С18:2А9,12) . Таким образом, термин "Д12-десатуразная активность" относится к превращению олеиновой кислоты в линолевую кислоту. Эти жирные кислоты могут находиться в этерифицированной форме, например, в виде части фосфолипида, предпочтительно в форме PC. В варианте осуществления фермент FAD2, определенный здесь, включает три богатых гистидином мотива (His-бокса) (см. таблицу 5 ради примеров His-боксов ферментов настоящего изобретения). Такие богатые His мотивы являются в высокой степени консервативными в ферментах FAD2 и, как установлено, вовлечены в образование дижелезного комплекса с молекулярным кислородом, используемым при биохимическом катализе (Shanklin et al., 1998).
Используемые здесь термины "FAD2-1" и "CtFAD2-l" и их
варианты относятся к полипептиду FAD2 сафлора, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID N0: 27, такому как полипептид, кодируемый нуклеотидами, имеющими последовательность, представленную как SEQ ID N0: 12. Как здесь используется, ген FAD2-1 является геном, кодирующим такой полипептид, или его мутантным аллелем. Эти термины также включают встречающиеся в природе или искусственно индуцированные или полученные варианты представленных последовательностей. В варианте осуществления FAD2-1 настоящего изобретения включает аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 95%, более предпочтительно идентична на по крайней мере 99% последовательности, представленной как SEQ ID N0: 27. Гены CtFAD2-l включают аллели, которые являются мутантами, т.е. которые кодируют полипептиды с измененной десатуразной активностью, например, уменьшенной активностью, или не кодируют функциональные полипептиды (молчащие аллели). Такие аллели могут быть встречающими в природе или индуцированными искусственным мутагенезом. Примером такого аллеля является аллель ol FAD2-1, описываемый здесь.
Используемые здесь термины "FAD2-2" и "CtFAD2-2" и их варианты относятся к полипептиду FAD2 сафлора, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID N0: 28, такому как полипептид, кодируемый нуклеотидами, имеющими последовательность, представленную как SEQ ID N0: 13. Как здесь используется, ген FAD2-2 является геном, кодирующим такой полипептид, или его мутантным аллелем. Эти термины также включают встречающиеся в природе или искусственно индуцированные или полученные варианты представленных последовательностей. В варианте осуществления FAD2-2 настоящего изобретения включает аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 95%, более предпочтительно идентична на по крайней мере 99% последовательности, представленной как SEQ ID N0: 28. Гены CtFAD2-2 включают аллели, которые являются мутантами, т.е. которые кодируют полипептиды с измененной десатуразной активностью, например,
уменьшенной активностью, или не кодируют функциональные полипептиды (молчащие аллели). Такие аллели могут быть встречающими в природе или индуцированными искусственным мутагенезом.
Используемые здесь термины "FAD2-10" и "CtFAD2-10" и их варианты относятся к полипептиду FAD2 сафлора, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID N0: 36, такому как полипептид, кодируемый нуклеотидами, имеющими последовательность, представленную как SEQ ID N0: 21. Как здесь используется, ген FAD2-10 является геном, кодирующим такой полипептид, или его мутантным аллелем. Эти термины также включают встречающиеся в природе или искусственно индуцированные или полученные варианты представленной последовательности. В варианте осуществления FAD2-10 настоящего изобретения включает аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 95%, более предпочтительно идентична на по крайней мере 99% последовательности, представленной как SEQ ID N0: 36. Гены CtFAD2-10 включают аллели, которые являются мутантами, т.е. которые кодируют полипептиды с измененной десатуразной активностью, например, уменьшенной активностью, или не кодируют функциональные полипептиды (молчащие аллели). Такие аллели могут быть встречающими в природе или индуцированными искусственным мутагенезом.
Используемый здесь термин "пальмитоил-АСР-тиоэстераза" или "FATB" относится к белку, который гидролизует пальмитоил-АСР с образованием свободной пальмитиновой кислоты. Таким образом, термин "пальмитоил-АСР-тиоэстеразная активность" относится к гидролизу пальмитоил-АСР с образованием свободной пальмитиновой кислоты.
Используемые здесь термины "FATB-З" и "CtFATB-З" и их варианты относятся к полипептиду FATB сафлора, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID N0: 45, такому как полипептид, кодируемый нуклеотидами, имеющими последовательность, представленную как SEQ ID N0: 43. Как здесь используется, ген FATB-З является геном, кодирующим такой
полипептид, или его мутантным аллелем. Эти термины также включают встречающиеся в природе или искусственно индуцированные или полученные варианты представленных последовательностей. В варианте осуществления FATB-З настоящего изобретения включает аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 95%, более предпочтительно идентична на по крайней мере 99% последовательности, представленной как SEQ ID N0: 45. Гены CtFATB-З включают аллели, которые являются мутантами, т.е. которые кодируют полипептиды с измененной пальмитоил-АСР-тиоэстеразной активностью, например, уменьшенной активностью, или не кодируют функциональные полипептиды (молчащие аллели). Такие аллели могут быть встречающими в природе или индуцированными искусственным мутагенезом.
Как здесь используются, "пластидная десатураза со б жирных
кислот", его варианты, и "FAD6" относится к ферменту
хлоропластов, который десатурирует 16:1 и 18:1 жирные кислоты
до 16:2 и 18:2, соответственно, во всех 16:1- или 18:1-
содержащих липидах мембран хлоропластов, включая
фосфатидилглицерин, моногалактозилдиацилглицерин,
дигалактозилдиацилглицерин и сульфогвиновозилдиацилглицерин.
Используемые здесь термины "FAD6" и "CtFAD6" и их варианты относятся к полипептиду FAD6 сафлора, аминокислотная последовательность которого представлена как SEQ ID N0: 48, такому как полипептид, кодируемый нуклеотидами, имеющими последовательность, представленную как SEQ ID N0: 47. Как здесь используется, ген FAD6 является геном, кодирующим такой полипептид, или его мутантным аллелем. Эти термины также включают встречающиеся в природе или искусственно индуцированные или полученные варианты представленных последовательностей. В варианте осуществления FAD6 настоящего изобретения включает аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 95%, более предпочтительно идентична на по крайней мере 99% последовательности, представленной как SEQ ID N0: 48. Гены CtFAD6 включают аллели,
которые являются мутантами, т.е. которые кодирует полипептиды с измененной десатуразной активностью, например, уменьшенной активностью, или не кодируют функциональные полипептиды (молчащие аллели). Такие аллели могут быть встречающими в природе или индуцированными искусственным мутагенезом.
Используемый здесь термин "ацетиленаза" или "ацетиленаза жирных кислот" относится к ферменту, который вводит тройную связь в жирную кислоту, приводя к образованию жирной кислоты ацетиленового ряда.
Термин "Ct" используется здесь перед такими терминами, как FAD2, FATB и FAD6, для указания на то, что фермент/ген происходит из сафлора.
Используемый здесь термин "вызывающая генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию" и его варианты относится к полинуклеотиду, который кодирует молекулу РНК, которая уменьшает (снижает) продукцию и/или активность, (например, кодирующую киРНК, шпилечную и-РНК), или сам снижает продукцию и/или активность (например, является киРНК, которую можно доставить непосредственно, например, в клетку), эндогенного фермента, например, А12 десатуразы, пальмитоил-АСР-тиоэстеразы, пластидной десатуразы со б жирных кислот или комбинации двух или более или всех трех ферментов. В варианте осуществления вызывающей генный сайленсинг РНК является экзогенная РНК, которая образуется с трансгена в клетке и которая транскрипционно и/или посттранскрипционно уменьшает количество эндогенного фермента, который продуцируется в клетке, например, в результате уменьшения количества мРНК, кодирующей эндогенный фермент, или уменьшения его трансляции. Вызывающей генный сайленсинг РНК типично является РНК длиной 21-24 нуклеотида, которая является комплементарной эндогенной мРНК и которая может связываться с комплексом сайленсинга, известным как RISC, в клетке.
Используемый здесь термин "мутация(и), которая уменьшает активность", относится к встречающимся в природе или искусственным мутантам (например, созданным с помощью
химического мутагенеза или сайт-специфического мутагенеза) , которые имеют более низкие уровни определенной ферментативной активности (например, FAD2 ферментативной активности в семени) по сравнению с фенотипически нормальными семенами (например, семенами, в которых образуются ферменты FAD2, которые включают аминокислотные последовательности, представленные как SEQ ID N0: 27, 2 8 и 36). Примеры фенотипически нормальных сортов сафлора включают, но без ограничения, Centennial, Finch, Nutrasaff и Cardinal. Первый идентифицированный признак высокого содержания олеиновой кислоты, обнаруженный при внедрении сафлора из Индии, контролировался частично рецессивным аллелем, обозначенным ol, в одном локусе 0L
(Knowles and Hill, 1964). Как здесь описано, локус 0L соответствует гену CtFAD2-l. Содержание олеиновой кислоты в масле из семени в генотипах olol обычно составляло 71-75% в случае выращиваемых в теплице растений (Knowles, 1989). Knowles
(1968) включил аллель ol в программу селекции сафлора и вывел первый сорт сафлора с высоким содержанием олеиновой кислоты
(НО) "иС-1" в 1966 в США, с последующим выведением улучшенных сортов "01eic Leed" и серии Saffola, в том числе Saffola 317
(S-317), S-517 и S-518. Генотипы olol (высокое содержание олеиновой кислоты) были относительно устойчивыми на уровне олеиновой кислоты при выращивании при различных температурах в поле (Bartholomew, 1971) . Кроме того, Knowles (1972) также описал отличный аллель oli в том же локусе, который порождал в гомозиготном состоянии между 35 и 50% олеиновой кислоты. В отличие от генотипа olol, генотип olioli продемонстрировал сильную реакцию на температуру (Knowles, 1972). Как здесь определено, мутацией аллеля ol, которая наделяет уменьшенной активностью FAD2-1 (и общей FAD2 активностью) в семени сафлора, является мутантный ген FAD2-1, включающий мутацию со сдвигом рамки считывания (вследствие делеции одного нуклеотида) , изображенный на фиг. 6 (см. также пример 7 и SEQ ID N0: 2 6 и 38) .
Используемое здесь выражение "которое способно порождать растение, которое образует семя, содержимое в виде масла
которого включает" или "которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, содержимое в виде масла которого включает" или его варианты означает, что растение, развившееся из семени, предпочтительно масличное растение и более предпочтительно растение сафлор, обладает способность продуцировать масло с определенными компонентами при выращивании в оптимальных условиях, например, в условиях теплицы, таких как те, которые упоминаются в разделе "Примеры". Владея семенем от растения, обычно выращивают растение-потомка из по крайней мере одного из семян в подходящих условиях теплицы и проверяют масличность и жирнокислотный состав масла семени от растения-потомка, используя стандартные процедуры, такие как те, которые здесь описываются. Соответственно, как будет понятно квалифицированному специалисту, хотя семя, выращенное в поле, может не удовлетворять всем требованиям, определенным здесь, вследствие неблагоприятных условий в конкретный год, таких как жара, холод, засуха, заводнение, мороз, воздействие вредителей и т.д., такое семя, тем не менее, охватывается настоящим изобретением, поскольку семя способно породить растение-потомка, которое дает определенную масличность или жирнокислотный состав при выращивании в более благоприятных условиях.
Используемый здесь термин "в весовом отношении" относится к весу вещества (например, олеиновой кислоты, пальмитиновой кислоты или PUFA, такой как линолевая кислота или линоленовая кислота) в виде процента от веса композиции, включающей вещество, или компонента в композиции. Например, вес конкретной жирной кислоты, такой как олеиновая кислота, может определяться как процент от веса общего содержания жирных кислот в липиде или масле из семени, или в семени.
Используемый здесь термин "биотопливо" относится к любому типу топлива, типично используемому для приведения в действие машин, таких как автомобили, грузовые автомобили или приводимые в действие с использованием нефти моторы, энергия для которых возникает в результате биологической фиксации углерода, а не происходит от ископаемого топлива. Биотопливо включает топливо,
возникающее в результате превращения биомассы, а также происходящее из твердой биомассы, жидкого топлива и биогазов. Примеры биотоплива включают биоспирты, биодизель, синтетическое дизельное топливо, растительное масло, биологические простые эфиры, биогаз, сингаз, твердое биотопливо, топливо водорослевого происхождения, биоводород, биометанол, 2,5-диметилфуран (DMF), биодиметиловый эфир (биоБМЕ), дизельное топливо, полученное методом Фишера-Тропша, биоводородный дизель, смешанные спирты и дизельное топливо из древесных отходов.
Используемый здесь термин "промышленный продукт" относится к углеводородному продукту, который в основном изготовлен из углерода и водорода, такому как метиловые и/или этиловые эфиры жирных кислот или алканы, такие как метан, смеси более длинноцепочечных алканов, которые типично являются жидкостями при температурах окружающей среды, биотопливо, окись углерода и/или водород, или биоспирт, такой как этанол, пропанол, или бутанол, или биоуголь. Термин "промышленный продукт", как предполагается, включает промежуточные продукты, которые можно превратить в другие промышленные продукты, например, сам сингаз считается промышленным продуктом, который может использоваться для синтеза углеводородного продукта, который также считается промышленным продуктом. Термин "промышленный продукт", как здесь используется, включает или чистые формы вышеотмеченных соединений, или чаще смеси различных соединений и компонентов, например, углеводородный продукт может содержать диапазон длин углеводных цепей, как это хорошо изучено в данной области техники.
Полинуклеотиды
Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота" используются взаимозаменяемо. Они относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, или дезоксирибонуклеотидов, или рибонуклеотидов. Полинуклеотид настоящего изобретения может быть геномного, кДНК, полусинтетического или синтетического происхождения, двухцепочечным или одноцепочечным, и ввиду своего происхождения или вследствие его обработки он: (1) не
связан со всем полинуклеотидом или его частью, с которым он связан в природе, (2) связан с полинуклеотидом, отличным от такового, с которым он связан в природе, или (3) не встречается в природе. Неограничивающими примерами полинуклеотидов являются следующие полинуклеотиды: кодирующие или некодирующие области гена или фрагмента гена, локусы (локус), определенный в результате анализа групп сцепления, экзоны, интроны, информационная РНК (мРНК), транспортная РНК (тРНК), рибосомная РНК (рРНК), рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, химерная ДНК с любой последовательностью, зонды и праймеры в виде нуклеиновых кислот. Предпочтительные полинуклеотиды настоящего изобретения включают молекулы двухцепочечных ДНК, которые могут быть транскрибированы в клетках растений и молекулы вызывающих генный сайленсинг РНК.
Используемый здесь термин "ген" следует понимать в его
самом широком контексте и включает дезоксирибонуклеотидные
последовательности, включающие транскрибируемый район и, в
случае его трансляции, кодирующую белок область, структурного
гена и включающие последовательности, которые расположены рядом
с кодирующей областью и на 5', и на 3' концах на расстоянии,
составляющем по крайней мере приблизительно 2 т.п.о., на том
или другом конце и которые вовлечены в экспрессию гена. В связи
с этим, ген включает контролирующие сигналы, такие как
промоторы, энхансеры, сигналы терминации и/или
полиаденилирования, которые связаны в природе с конкретным геном, или гетерологичные контрольные сигналы, в этом случае ген называют "химерным геном". Последовательности, которые расположены 5' от кодирующей белок области и которые присутствуют в мРНК, называют 5' нетранслируемыми последовательностями. Последовательности, которые расположены 3' или ниже кодирующей белок области и которые присутствуют в мРНК, называют 3' нетранслируемыми последовательностями. Термин "ген" охватывает и кДНК, и геномные формы гена. Геномная форма или клон гена содержит кодирующую область, которую могут
прерывать некодирующие последовательности, называемые "интронами", "промежуточными районами" или "промежуточными последовательностями". Интроны являются сегментами гена, которые транскрибируются в ядерную РНК (яРНК). Интроны могут содержать регуляторные элементы, такие как энхансеры. Интроны удаляются или "вырезаются" из ядерного или первичного транскрипта; по этой причине интроны отсутствуют в мРНК-транскрипте. мРНК функционирует во время трансляции с установлением последовательности или порядка аминокислот в образующемся полипептиде. Термин "ген" включает синтетическую или слитую молекулу, кодирующую весь белок или его часть настоящего изобретения, описываемый здесь, и нуклеотидную последовательность, комплементарную любой из вышеприведенных последовательностей.
"Аллель" относится к одной конкретной форме генетической последовательности (такой как ген) в клетке, в отдельном растении или в популяции, при этом конкретная форма отличается от других форм того же гена по последовательности по крайней мере одного, а часто более чем одного, вариантного сайта в последовательности гена. Последовательности в этих вариантных сайтах, которые отличаются между различными аллелями, называют "вариансами", "полиморфизмами" или "мутациями".
Как здесь используется, "химерная ДНК" относится к любой молекуле ДНК, которая не встречается в природе; также называемой "ДНК-конструкцией". Типично химерная ДНК включает регуляторные и транскрибируемые или кодирующие белок последовательности, которые не встречаются в природе вместе. Соответственно, химерная ДНК может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из одного и того же источника, но располагаются в порядке, отличающемся от такового, встречающегося в природе. Открытая рамка считывания может или может не быть связана со своими природными 5' и 3' регуляторными элементами. Открытая рамка считывания может быть включена, например, в геном
растения, в неприродном положении, или в репликон или вектор, в котором она не встречается в природе, такой как бактериальная плазмида или вирусный вектор. Термин "химерная ДНК" не ограничивается молекулами ДНК, которые могут реплицироваться в хозяине, но включает ДНК, которую можно подвергнуть лигированию в репликон с использованием, например, специфических адаптерных последовательностей.
"Трансген" является геном, который был введен в геном с
помощью процедуры трансформации. Трансген может присутствовать
в исходном трансформированном растении, полученным посредством
регенерации из трансформированной клетки растения, или в
растениях-потомках, полученных в результате самоопыления или
скрещивания, исходя из исходного трансформанта, или в частях
растения, таких как семена. Термин "генетически
модифицированный" и его варианты включает введение гена в клетку с помощью трансформации или трансдукции, мутирование гена в клетке или генетическое изменение или модуляцию регуляции гена в клетке, или потомстве любой клетки, модифицированной, как описано выше.
"Геномный участок", как здесь используется, относится к месту, в которое трансген или группа трансгенов (также называемая здесь кластером) были введены в клетку, или ее предшественник, так что они являются совместно унаследованными в клетках-потомках после мейоза.
"Рекомбинантный полинуклеотид" или "экзогенный
полинуклеотид" настоящего изобретения относится к молекуле
нуклеиновой кислоты, которая была сконструирована или
модифицирована с использованием методов искусственных
рекомбинантных молекул. Рекомбинантный полинуклеотид может
присутствовать в клетке в измененном количестве или
экспрессироваться в измененной степени (например, в случае
мРНК) по сравнению с его природным состоянием. Экзогенным
полинуклеотидом является полинуклеотид, который был введен в
клетку, которая обычно не включает этот полинуклеотид. Типично
экзогенная ДНК используется в качестве матрицы для транскрипции
мРНК, которая затем транслируется в непрерывную
последовательность аминокислотных остатков, кодирующую полипептид настоящего изобретения в трансформированной клетке. В другом варианте осуществления часть экзогенного полинуклеотида является эндогенной по отношению к клетке, и ее экспрессия изменена рекомбинатным способом, например, экзогенную контролирующую последовательность вводят 5' от эндогенного полинуклеотида, чтобы сделать возможной экспрессию трансформированными клетками полипептида, кодируемого полинуклеотидом. Например, экзогенный полинуклеотид может экспрессировать антисмысловую РНК по отношению к эндогенному полинуклеотиду.
Рекомбинантный полинуклеотид настоящего изобретения
включает полинуклеотиды, которые были отделены от других
компонентов клеточной или бесклеточной экспрессионной системы,
в которой они присутствуют, и полинуклеотиды, продуцированные в
указанной клеточной или бесклеточной экспрессионной системе,
которые впоследствии очищают от по крайней мере некоторых
других компонентов. Полинуклеотид может представлять собой
непрерывный участок нуклеотидов, существующий в природе, или
включать два или более непрерывных участков нуклеотидов из
различных источников (встречающихся в природе и/или
синтетических) , соединенных с образованием одного
полинуклеотида. Типично такие химерные полинуклеотиды включают по крайней мере открытую рамку считывания, кодирующую полипептид настоящего изобретения, функционально связанную с промотором, подходящим для активации транскрипции открытой рамки считывания в представляющей интерес клетке.
Что касается определенных полинуклеотидов, будет понятно,
что процентные значения идентичности, превышающие значения,
предоставленные выше, будут охватывать предпочтительные
варианты осуществления. Таким образом, где применимо, ввиду
минимальных процентных значений идентичности, предпочтительно,
когда полинуклеотид включает полинуклеотидную
последовательность, которая идентична на по крайней мере 50%, более предпочтительно на по крайней мере 60%, более предпочтительно на по крайней мере 65%, более предпочтительно
на по крайней мере 7 0%, более предпочтительно на по крайней мере 75%, более предпочтительно на по крайней мере 80%, более предпочтительно на по крайней мере 85%, более предпочтительно на по крайней мере 90%, более предпочтительно на по крайней мере 91%, более предпочтительно на по крайней мере 92%, более предпочтительно на по крайней мере 93%, более предпочтительно на по крайней мере 94%, более предпочтительно на по крайней мере 95%, более предпочтительно на по крайней мере 96%, более предпочтительно на по крайней мере 97%, более предпочтительно на по крайней мере 98%, более предпочтительно на по крайней мере 99%, более предпочтительно на по крайней мере 99,1%, более предпочтительно на по крайней мере 99,2%, более предпочтительно на по крайней мере 99,3%, более предпочтительно на по крайней мере 99,4%, более предпочтительно на по крайней мере 99,5%, более предпочтительно на по крайней мере 99,6%, более предпочтительно на по крайней мере 99,7%, более предпочтительно на по крайней мере 99, 8% и даже более предпочтительно на по крайней мере 99,9% соответствующей указанной SEQ ID NO.
Полинуклеотид, или применимый для, настоящего изобретения может селективно гибридизоваться, в жестких условиях, с определенным здесь полинуклеотидом. Как здесь используются, жесткие условия представляют собой условия, в которых: (1) используется во время гибридизации денатурирующий агент, такой как формамид, например, 50% (в объемном отношении) формамида вместе с 0,1% (в отношении веса к объему) бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Фикола, 0,1% поливинилпирролидона, 50 мМ натрий-фосфатным буфером при рН 6,5 вместе с 750 мМ NaCl, 75 мМ цитратом натрия при 42°С; или (2) используется 50% формамида, 5 х SSC (0,75М NaCl, 0,075М цитрат натрия), 50 мМ фосфат натрия
(рН 6,8), 0,1% пирофосфата натрия, 5 х раствор Денхардта, озвученная ультразвуком ДНК из молок лососевых (50 г/мл), 0,1% SDS и 10% декстрана сульфата при 42°С в 0,2 х SSC и 0,1% SDS, и/или (3) используется низкая ионная сила и высокая температура для промывки, например, 0,015М NaCl/0,0015M цитрат натрия/0,1% SDS при 50°С.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут обладать, по сравнению со встречающимися в природе молекулами, одной или более мутаций, которые представляют собой делеции, вставки или замены нуклеотидных остатков. Полинуклеотиды, которые имеют мутации по сравнению со ссылочной последовательностью, могут быть или встречающимися в природе (другими словами, выделенными из природного источника) или синтетическими (например, в результате выполнения сайт-направленного мутагенеза или перетасовки участков ДНК на нуклеиновой кислоте, описанной выше).
Полинуклеотиды для уменьшения уровней экспрессии
эндогенных белков
В одном варианте осуществления
клетка/семя/растение/организм настоящего изобретения включает
введенную мутацию или экзогенный полинуклеотид, которая(ый)
снижает продукцию и/или активность эндогенного фермента,
типично которая(ый) приводит к увеличенной продукции олеиновой
кислоты и предпочтительно уменьшенной продукции пальмитиновой
кислоты и PUFA, такой как линолевая кислота, по сравнению с
соответствующей клеткой, в которой отсутствует введенная
мутация или экзогенный полинуклеотид. Примеры таких
полинуклеотидов включают антисмысловой полинуклеотид, смысловой
полинуклеотид, каталитический полинуклеотид, микроРНК,
полинуклеотид, который кодирует полипептид, который связывается с эндогенным ферментом и двухцепочечной РНК.
РНК-интерференция
РНК-интерференция, в частности, применима для
специфического ингибирования продукции конкретного белка. Эта технология основывается на присутствии молекул дцРНК, которые содержат последовательность, которая по существу идентична мРНК с представляющего интерес гена или его части, и комплементарную ей последовательность. Без труда дцРНК можно продуцировать с одного промотора в рекомбинантном векторе или клетке-хозяине, причем смысловая и антисмысловая последовательности ковалентно соединены с помощью последовательности, предпочтительно неродственной последовательности, которая делает возможной
гибридизацию смысловой и антисмысловой последовательностей в
соответствующем транскрипте с образованием молекулы дцРНК с
соединяющей последовательностью, образующей петлевую структуру,
хотя последовательность с идентичностью РНК-мишени или ее
комплементу может образовывать петлевую структуру. Типично
дцРНК кодируется двухцепочечной ДНК-конструкцией, которая
содержит смысловую и антисмысловую последовательности в
структуре инвертированного повтора, организованные в виде
прерванного палиндрома, причем повторяющиеся последовательности
транскрибируются с образованием гибридизующихся
последовательностей в молекуле дцРНК, а последовательность прерывания транскрибируется с образованием петлевого участка в молекуле дцРНК. Разработка и продукция подходящих молекул дцРНК находится полостью в компетентности квалифицированного в данной области техники специалиста, особенно принимая во внимание Waterhouse et al. (1998), Smith et al. (2000), WO 99/32619, WO 99/53050, WO 99/49029 и WO 01/34815.
В одном примере вводят ДНК, которая направляет синтез по
крайней мере продукта(ов) в виде частично двухцепочечной РНК с
гомологией, предпочтительно по крайней мере 19 следующими друг
за другом нуклеотидами, комплементарными участку, РНК-мишени,
который должен быть инактивирован. Следовательно, ДНК включает
и смысловую, и антисмысловую последовательности, которые, после
транскрибирования в РНК, могут гибридизоваться с образованием
района двухцепочечной РНК. В одном варианте осуществления
настоящего изобретения смысловая и антисмысловая
последовательности разделены районом-спейсером, который включает интрон, который, после транскрибирования в РНК, вырезается. Эта организация, как было установлено, приводит к большей эффективности сайленсинга гена. Район двухцепочечной РНК может включать одну или две молекулы РНК, транскрибированные или с одного района РНК, или с двух. Полагают, что присутствие двухцепочечной молекулы инициирует ответную реакцию эндогенной системы, которая разрушает как двухцепочечную РНК, так и гомологичный РНК-транскрипт с гена-мишени, эффективно уменьшая или устраняя активность гена
мишени.
Длина каждой из смысловой и антисмысловой
последовательностей, подвергаемых гибридизации, должна
составлять по крайней мере 19 следующих друг за другом
нуклеотидов, соответствующих части мРНК-мишени. Может
использоваться полноразмерная последовательность,
соответствующая транскрипту со всего гена. Степень идентичности смысловой и антисмысловой последовательностей с заданным транскриптом должна составлять по крайней мере 8 5%, по крайней мере 90% или по крайней мере 95-100%. Молекула РНК может, конечно, включать неродственные последовательности, которые могут функционировать для стабилизации молекулы. Молекула РНК может экспрессироваться под контролем промотора для РНК-полимеразы II или РНК-полимеразы III. Примеры последнего включают промоторы для тРНК или небольшой ядерной РНК.
Предпочтительные молекулы коротких интерферирующих РНК
("киРНК") включают нуклеотидную последовательность, которая
идентична приблизительно 19-21 следующим друг за другом
нуклеотидам мРНК-мишени. Предпочтительно последовательность
киРНК начинается с динуклеотида АА, характеризуется GC-
содержанием, составляющим приблизительно 30-70%
(предпочтительно, 30-60%, более предпочтительно 40-60% и более предпочтительно приблизительно 45-55%), и не обладает высоким процентом идентичности с любой нуклеотидной последовательности, отличной от мишени в геноме организма, в который ее вводят, например, как определено с помощью стандартного поиска BLAST.
В качестве примера, дцРНК настоящего изобретения включает нуклеотидную последовательность, представленную как любая из SEQ ID NO: 49-51 (в случаях, когда Т заменяется U).
микроРНК
МикроРНК (сокращенно миРНК), как правило, представляют собой молекулы (19-25)-нуклеотидных (обычно приблизительно (2024)-нуклеотидных в растениях) некодирующих РНК, которые происходят из более больших предшественников, которые образуют несовершенные структуры "петля на стебле".
МикроРНК связываются с комплементарными
последовательностями в транскриптах - информационных РНК (мРНК), обычно приводя к подавлению трансляции или деградации мишени и сайленсингу гена.
В клетках растений молекулы-предшественники микроРНК, как полагают, вначале подвергаются процессингу в ядре. Исходная микроРНК (содержащая один или более локальных двухцепочечных или "шпилечных" районов, а также обычный 5' "кэп" и полиаденилированный хвост мРНК) подвергаются процессингу до более короткой молекулы-предшественника микроРНК, которая также включает структуру "петля на стебле" или самогибридизующуюся структуру и называется "пре-микроРНК". В растениях, пре-микроРНК расщепляется особыми DICER-подобными (DCL) ферментами, в частности, DCL-1, продуцируя дуплексы микроРНК:микроРНК*. До переноса из ядра, эти дуплексы метилируются. Напротив, молекулы шпилечных РНК, имеющие более длинные районы дцРНК, подвергаются процессингу, в частности, под действием DCL-3 и DCL-4.
В цитоплазме цепь микроРНК из дуплекса микроРНК:микроРНК селективно включается в активный РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC) для распознания мишени. RISC-комплексы содержат особую подгруппу белков Argonautе, которые вызывают специфическую в отношении последовательности репрессию гена посттранскрипционно (см., например, Millar and Waterhouse, 2005; Pasquinelli et al., 2005; Almeida and Allshire, 2005).
Косупрeс сия
Гены могут подавлять экспрессию родственных эндогенных генов и/или трансгенов, уже присутствующих в геноме, феномен, названный зависимым от гомологии сайленсингом генов. Большая часть случаев зависимого от гомологии сайленсинга генов разделяются на два класса - те, которые функционируют на уровне транскрипции трансгена, и те, которые функционируют посттранскрипционно.
Посттранскрипционный зависимый от гомологии сайленсинг генов (т.е. косупрессия) характеризуется уменьшением экспрессии трансгена и родственных эндогенных или вирусных генов в трансгенных растениях. Косупрессия часто, но не всегда, имеет место, когда транскрипты с трансгена присутствуют в большом
количестве, и она, как обычно считают, инициируется на уровне процессинга РНК, ее локализации и/или деградации. Существует несколько моделей, объясняющих, каким образом косупрессия работает (см. в Taylor, 1997).
Косупрессия включает введение дополнительной копии гена или его фрагмента в растение в смысловой ориентации по отношению к промотору для ее экспрессии. Квалифицированному специалисту будет понятно, что размер смыслового фрагмента, его соответствие районам гена-мишеням и степень идентичности его последовательности гену-мишени может варьировать. В некоторых случаях дополнительная копия последовательности гена мешает экспрессии гена-мишени в растении. Приводится ссылка на W0 97/20936 и ЕР 0465572 для способов осуществления методов косупрессии.
Экспрессионный вектор
Как здесь используется, "экспрессионный вектор" представляет собой ДНК или РНК-вектор, который способен трансформировать клетку-хозяина и осуществлять экспрессию одного или более определенных полинуклеотидов. Предпочтительно, когда экспрессионный вектор также способен реплицироваться в клетке-хозяине или интегрироваться в геном клетки-хозяина. Экспрессионные векторы типично являются вирусами или плазмидами. Экспрессионные векторы настоящего изобретения включают любые векторы, которые функционируют (т.е. управляют экспрессией генов) в клетках-хозяевах настоящего изобретения, включая клетки грибов, водорослей и растений.
"Функционально связанные", как здесь используется, относится к функциональной связи между двумя или более сегментами нуклеиновых кислот (например, ДНК). Типично он относится к функциональной связи регулирующего транскрипцию элемента (промотора) с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью полинуклеотида, определенного здесь, если он стимулирует или модулирует транскрипцию кодирующей последовательности в подходящей клетке. Как правило, регулирующие транскрипцию элементы промотора, которые
функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, являются физически соприкасающимися с транскрибируемой последовательностью, т.е. они являются действующими в цис-положении. Однако, некоторые регулирующие транскрипцию элементы, такие как энхансеры, не обязательно должны быть физически соприкасающимися с кодирующими последовательностями, чью транскрипцию они усиливают, или расположенными в непосредственной близости от них.
Экспрессионные векторы настоящего изобретения содержат
регуляторные последовательности, такие как контролирующие
транскрипцию последовательности, контролирующие трансляцию
последовательности, начала репликации и другие регуляторные
последовательности, которые совместимы с клеткой-хозяином и
которые контролируют экспрессию полинуклеотидов настоящего
изобретения. В частности, экспрессионные векторы настоящего
изобретения включают контролирующие транскрипцию
последовательности. Контролирующие транскрипцию
последовательности представляют собой последовательности,
которые контролируют инициацию, элонгацию и терминацию
транскрипции. Особенно важными контролирующими транскрипцию
последовательностями являются те, которые контролируют
инициацию транскрипции, такие как последовательности промотора,
энхансера, оператора и репрессора. Подходящие контролирующие
транскрипции последовательности включают любую контролирующую
транскрипцию последовательность, которая может функционировать
в по крайней мере одной из рекомбинантных клеток настоящего
изобретения. Выбор используемых регуляторных
последовательностей зависит от организма-мишени, такого как
растение, и/или являющегося мишенью органа или ткани,
представляющего интерес. Такие регуляторные последовательности
можно получить из любого эукариотического организма, такого как
растения или вирусы растений, или можно химически
синтезировать. Ряд таких контролирующих транскрипцию
последовательностей известен квалифицированным в данной области
техники специалистам. Особенно предпочтительными
контролирующими транскрипцию последовательностями являются
промоторы, эффективные в управлении транскрипцией в растениях, или конститутивной, или специфической в отношении стадии и/или ткани, в зависимости от использования растения или его части(ей).
Ряд векторов, подходящих для устойчивой трансфекции клеток
растений или для создания трансгенных растений, был описан,
например, в Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory
Manual, 1985, supp. 1987, Weissbach and Weissbach, Methods for
Plant Molecular Biology, Academic Press, 1989, и Gelvin et al,
Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers,
1990. Типично векторы для экспрессии в растениях включают,
например, один или более клонированных генов растений под
транскрипционным контролем 5' и 3' регуляторных
последовательностей и доминантный селектируемый маркер. Такие векторы для экспрессии в растениях также могут содержать промоторный регуляторный район (например, регуляторный район, контролирующий индуцируемую или конститутивную, регулируемую условиями окружающей среды или стадиями развития, или клеточно-или тканеспецифическую экспрессию), сайт начала транскрипции, участок связывания рибосомы, сигнал процессинга РНК, сайт терминации транскрипции и/или сигнал полиаденилирования.
Был описан ряд конститутивных промоторов, которые являются
активными в клетках растений. Подходящие промоторы для
конститутивной экспрессии в растениях включают, но без
ограничения, промотор 35S вируса мозаики цветной капусты
(CaMV), 35S вируса мозаики норичника (FMV), промотор
бактериального вируса сахарного тростника, промотор вируса
желтой мозаики Commelina, светоиндуцируемый промотор из гена
малой субъединицы рибулозо-1,5-бис-фосфат-карбоксилазы,
промотор гена цитозольной триозофосфатизомеразы риса, промотор гена аденин-фосфорибозилтрансферазы Arabidopsis, промотор гена актина 1 риса, промоторы генов моннопинсинтазы и октопинсинтазы, промотор Adh, промотор гена сахарозосинтазы, комплексный промотор гена R и промотор гена хлорофильного а/р связывающего белка. Эти промоторы использовались для создания
ДНК-векторов, которые были экспрессированы в растениях, см., например, W0 84/02913. Все из этих промоторов использовались для создания различных типов экспрессируемых в растениях рекомбинантных ДНК-векторов.
С целью экспрессии в исходных тканях растения, таких как
лист, семя, корень или стебель, предпочтительно, когда
промоторы, используемые в настоящем изобретении,
характеризуются относительно высокой экспрессией в этих конкретных тканях. Для этой цепи может быть выбран промотор из ряда промоторов для генов с ткане- или клеточноспецифической, или увеличенной в ткани(ях) или клетке(ах) экспрессией. Примеры таких промоторов, о которых сообщалось в литературе, включают промотор гена хлоропластной глютаминсинтазы GS2 гороха, промотор гена хлоропластной фруктозо-1,б-бифосфатазы пшеницы, промотор ядерного фотосинтетического гена ST-LS1 картофеля, промотор гена серин/треонин-киназы и промотор гена глюкоамилазы (CHS) из Arabidopsis thaliana.
Для экспрессии генов РНК-связывающих белков в клетках растений может также использоваться ряд промоторов генов растений, которые регулируются в ответ на сигналы окружающей среды, гормональные, химические и/или относящиеся к развитию сигналы, в том числе промоторы, регулируемые с помощью (1) нагревания, (2) освещения (например, промотор RbcS-ЗА гороха, промотор RbcS кукурузы), (3) гормонов, таких как абсцизовая кислота, (4) скарификации (например, WunI) или (5) химических веществ, таких как метилжасмонат, салициловая кислота, стероидные гормоны, спирты, Сафенеры (WO 97/06269), и выгодным может также быть использование (6) органоспецифических промоторов.
Используемый здесь термин "специфический для органа запасания растения промотор" относится к промотору, который предпочтительно, по сравнению с другими тканями, управляет транскрипцией гена в органе запасания растения. Предпочтительно органом запасания является семя. Предпочтительно промотор только управляет экспрессией представляющего интерес гена в органе запасания, и/или экспрессия представляющего интерес гена
в других частях растения, таких как листья, является невыявляемой с помощью анализа с использованием Нозерн-блота и/или ПЦР в режиме реального времени. Типично промотор управляет экспрессией генов во время роста и развития органа запасания, в частности, во время фазы синтеза и накопления запасаемых соединений в органе запасания. Такие промоторы могут управлять экспрессией генов во всем органе запасания растения или только в его части, такой как оболочка семени, зародыш или семядоля(и) в семенах двудольных растений или эндосперм или алейроновый слой семян однодольных растений.
Другие промоторы могут также использоваться для экспрессии белка в конкретных тканях, таких как семена или плоды. Может использоваться промотор для р-конглицинина или другие специфические для семени промоторы, такие как промоторы генов напина, зеина, линина и фазеолина. В одном варианте осуществления промотор управляет экспрессией в тканях и органах, в которых происходит биосинтез липидов. Такие промоторы функционируют в ходе развития семян в подходящий момент времени для модификации состава липидов в семени. В одном варианте осуществления промотором, специфическим для органа запасания растения, является специфический для семени промотор. В более предпочтительном варианте осуществления промотор преимущественно управляет экспрессией в зародыше и/или семядолях двудольного растения или в эндосперме однодольного растения, по сравнению с экспрессией в других органах в растении, таких как листья. Предпочтительные промоторы для специфической в отношении семени экспрессии включают: 1) промоторы из генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе липидов и их накоплении в семенах, такие как десатуразы и элонгазы, 2) промоторы из генов, кодирующих запасаемые в семенах белки, и 3) промоторы из генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе углеводов и их накоплении в семенах. Специфическими для семени промоторами, которые являются подходящими, являются промотор гена линина льна (например, промоторы Cnll или Сп12), промотор гена напина
масличного рапса (патент США с № 5608152), промотор USP Vicia fabar (Baumlein et al., 1991), промотор гена олеозина Arabidopsis (WO 98/45461), промотор гена фазеолина Phaseolus vulgaris (патент США с № 5504200), промотор Все4 Brassica (WO 91/13980) или промотор гена легумина В4 (Baumlein et al. , 1992), и промоторы, которые приводят к специфической в отношении семени экспрессии в однодольных растениях, таких как кукуруза, ячмень, пшеница, рожь, рис и т.п. Известными промоторами, которые являются подходящими, являются промотор гена lpt2 или lptl ячменя (WO 95/15389 и WO 95/23230) или промоторы, описанные в WO 99/168 90 (промоторы из гена гордеина ячменя, гена глютелина риса, гена оризина риса, гена проламина риса, гена глиадина пшеницы, гена глютелина пшеницы, гена зеина кукурузы, гена глютелина овса, гена касирина сорго, гена секалина ржи) . Другие промоторы включают промоторы, описанные Broun et al. (1998), Potenza et al. (2004), в US 20070192902 и US 20030159173. В варианте осуществления специфический для семени промотор преимущественно экспрессируется в определенных частях семени, таких как зародыш, семядоля(и) или эндосперм. Примеры специфических для семядоли промоторов включают, но без ограничения, промотор FP1 (Ellerstrom et al. , 1996), промотор гена легумина гороха (Perrin et al., 2000) и промотор гена фитогемагглютинина фасоли (Perrin et al. , 2000) . В дальнейшем варианте осуществления специфический для семени промотор не экспрессируется или экспрессируется лишь на низком уровне в зародыше и/или после прорастания семени.
В случае присутствия множества промоторов, каждый промотор может быть независимым одинаковым или отличным.
5' нетраслируемая лидерная последовательность может происходить из промотора, выбранного для экспрессии гетерологичной генной последовательности полинуклеотида, или может быть гетерологичной по отношении к области, кодирующей продуцируемый фермент, и может быть специфически модифицированной, при желании, для увеличения трансляции мРНК.
Терминация транскрипция осуществляется с помощью 3' нетранслируемой последовательности ДНК, функционально связанной
в экспрессионном векторе с представляющим интерес полинуклеотидом. 3' нетранслируемый район рекомбинантной молекулы ДНК содержит сигнал полиаденилирования, который функционирует в растениях с вызовом добавления нуклеотидов аденилатов к 3' концу РНК. 3' нетранслируемый район может быть получен из различных генов, которые экспрессируются, например, в клетках растений. 3' нетранслируемый район гена нопалинсинтазы, 3' нетранслируемый район из гена малой субъединицы Rubisco гороха, 3' нетранслируемый район из гена запасаемого в семени белка 7S сои обычно используются в этом объеме. 3' транскрибируемые, нетранслируемые районы, содержащие сигнал полиаденилирования из генов индуцирующей опухоль (Ti) плазмиды Agrobacterium (Ti) также являются подходящими.
Технологии рекомбинантных ДНК могут использоваться для увеличения экспрессии с трансформированного полинуклеотида посредством манипуляции, например, числом копий полинуклеотида в клетке-хозяине, эффективностью, с которой этот полинуклеотид транскрибируется, эффективностью, с которой получающиеся в результате транскрипты транслируются, и эффективностью, посттрансляционных модификаций.
Для облегчения идентификации трансформантов,
рекомбинантный вектор желательно включает селектируемый или
скринабельный ген-маркер в виде, или помимо, нуклеотидной
последовательности полинуклеотида, определенного здесь. Под
"геном-маркером" подразумевается ген, который придает особый
фенотип клеткам, экспрессирующим ген-маркер, и, таким образом,
позволяет отличить трансформированные клетки от клеток, которые
не содержат маркер. Селектируемый ген-маркер придает
особенность, по которой может осуществляться отбор на основе
устойчивости к агенту для отбора (например, гербициду,
антибиотику, излучению, нагреванию или другой обработке,
причиняющей вред нетрансформированным клеткам). Скринабельный
ген-маркер (или ген-репортер) придает особенность, которую
можно идентифицировать благодаря наблюдению или проверке, т.е.
посредством скрининга, (например, р-глюкуронидазную,
люциферазную, GFP или другую ферментативную активность, не присутствующую в нетрансформированных клетках). Ген-маркер и нуклеотидная последовательность, представляющая интерес, не должны быть сцепленными, поскольку котрансформация несцепленных генов, описанная, например, в патенте США с № 4399216, также является эффективным процессом в случае, например, трансформации растений. Фактический выбор маркера не является критическим при условии, что он является функциональным (т.е. селективным) в комбинации с предпочтительными клетками, такими как клетка растения.
Приводимые в качестве примера селектируемые маркеры для отбора растений-трансформантов включают, но без ограничения, ген hyg, который кодирует устойчивость к гигромицину В; ген неомицин-фосфотрансферазы (nptll), придающий устойчивость к канамицину, паромомицину, G418; ген глютатион-Б-трансферазы из печени крысы, придающий устойчивость к гербицидам, являющимся производными глутатиона, который, например, описан в ЕР 256223; ген глютаминсинтетазы, придающий, при сверхэкспрессии, устойчивость к ингибиторам глютаминсинтетазы, таким как фосфинотрицин, который, например, описан в W0 87/05327; ген ацетилтрансферазы из Streptomyces viridochromogenes, придающий устойчивость к агенту для отбора - фосфинотрицину, который, например, описан в ЕР 275957; ген, кодирующий 5-енолшикимат-З-фосфат-синтазу (EPSPS), придающий устойчивость к N-фосфонометилглицину, который, например, описан Hinchee et al.
(1988); ген bar, придающий устойчивость к биалофосу, который, например, описан в W091/02071; ген нитрилазы, такой как bxn из Klebsiella ozaenae, который придает устойчивость к бромоксилину
(Stalker et al., 1988); ген дигидрофолатредуктазы (DHFR), который придает устойчивость к метотрексату (Thillet et al., 1988); мутантный ген ацетолактатсинтазы (ALS), который придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ALS-ингибирующим химическим веществам (ЕР 154204); мутированный ген антранилатсинтазы, который придает устойчивость к 5-метилтриптофану; или ген далапондегалогеназы, который придает устойчивость к гербициду.
Предпочтительные скринабельные маркеры включают, но без ограничения, ген uidA, кодирующий фермент р-глюкуронидазу (GUS), для которого известны различные хромогенные субстраты; ген р-галактозидазы, кодирующий фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты; ген экворина (Prasher et al., 1985), который может использоваться для чувствительного к кальцию биолюминесцентного детектирования; ген зеленого флуоресцентного белка (Niedz et al., 1995) или его производные; или ген люциферазы (luc) (Ow et al., 1986), который создает возможность для биолюминесцентного детектирования. Под "репортерной молекулой" подразумевается молекула, которая, по своей химической природе, обеспечивает аналитически идентифицируемый сигнал, который помогает определению активности промотора согласно белковому продукту.
Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор устойчиво включается в геном клетки, такой как клетка растения. Соответственно, рекомбинантный вектор может включать соответствующие элементы, которые позволяют вектору включиться в геном, или в хромосому клетки.
Транспортные нуклеиновые кислоты
Транспортные нуклеиновые кислоты могут использоваться для доставки экзогенного полинуклеотида в клетку и включают одну, предпочтительно две, пограничные последовательности и представляющий интерес полинуклеотид. Транспортная нуклеиновая кислота может кодировать или может не кодировать селектируемый маркер. Предпочтительно, когда транспортная нуклеиновая кислота образует часть бинарного вектора в бактерии, причем бинарный вектор, кроме того, включает элементы, которые делает возможной репликацию вектора в бактерии, отбор или сохранение бактериальных клеток, содержащих бинарный вектор. После переноса в эукариотическую клетку, являющийся транспортной нуклеиновой кислотой компонент бинарного вектора способен к интеграции в геном эукариотической клетки.
Используемый здесь термин "экстрахромосомная транспортная нуклеиновая кислота" относится к молекуле нуклеиновой кислоты,
которая может быть перенесена из бактерии, такой как
Agrobacterium sp., в эукариотическую клетку, такую как клетка
растения. Экстрахромосомная транспортная нуклеиновая кислота
является генетическим элементом, который широко известен как
элемент, который может быть перенесен, с последующей
интеграцией нуклеотидной последовательности, содержащейся
внутри ее границ, в геном реципиентной клетке. В связи с этим,
транспортная нуклеиновая кислота фланкирована, типично, двумя
"пограничными" последовательностями, хотя в некоторых случаях
одна пограничная последовательность на одном конце может
использоваться, а второй конец перенесенной нуклеиновой кислоты
создается произвольно в процессе переноса. Представляющий
интерес полинуклеотид типично находится между
последовательностью вроде левой пограничной последовательности
и последовательностью вроде правой пограничной
последовательности транспортной нуклеиновой кислоты.
Полинуклеотид, содержащийся в транспортной нуклеиновой кислоте,
может быть функционально связан с рядом различных промоторных и
регулирующих терминации элементов, которые помогают его
экспрессии, т.е. транскрипции и/или трансляции полинуклеотида.
Транспортные ДНК (Т-ДНК) из Agrobacterium sp., например,
Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes, и их
искусственные варианты/мутанты, вероятно, являются наиболее
охарактеризованными примерами транспортных нуклеиновых кислот.
Другим примером является Р-ДНК ("растительная ДНК"), которая
включает последовательности вроде пограничных
последовательностей Т-ДНК из растений.
Как здесь используется, "Т-ДНК" относится, например, к Т-ДНК Ti плазмиды Agrobacterium tumefaciens или из Ri плазмиды Agrobacterium rhizogenes, или их искусственным вариантам, которые функционируют как Т-ДНК. Т-ДНК может включать всю Т-ДНК, включая и правую и левую пограничные последовательности, но должна лишь включать минимальные последовательности, необходимые в цис для переноса, т.е. правую и относящуюся к Т-ДНК пограничную последовательность. Т-ДНК настоящего изобретения содержат вставленный в них, где-нибудь между правой
и левой пограничными последовательностями (в случае их
присутствия), представляющий интерес полинуклеотид.
Последовательности, кодирующие факторы, необходимые в транс для переноса Т-ДНК в клетку растения, такие как гены vir, могут быть вставлены в Т-ДНК, или могут присутствовать в том же репликоне, что и Т-ДНК, или предпочтительно находятся в трансположении в совместимом репликоне в хозяине Agrobacterium. Такие "бинарные векторные системы" хорошо известны в данной области техники.
Как здесь используется, "Р-ДНК" относится к транспортной нуклеиновой кислоте, выделенной из генома растения, или ее искусственным вариантам/мутантам и включает на каждом конце, или только на одном конце, последовательность вроде пограничной последовательности Т-ДНК. Последовательность вроде пограничной последовательности предпочтительно идентична на по крайней мере 50%, по крайней мере 60%, по крайней мере 7 0%, по крайней мере 75%, по крайней мере 80%, по крайней мере 90% или по крайней мере 95%, но менее чем 100% пограничной последовательности Т-ДНК из Agrobacterium sp., например, Agrobacterium tumefaciens или Agrobacterium rhizogenes. Таким образом, Р-ДНК могут использоваться вместо Т-ДНК для переноса нуклеотидной последовательности, содержащейся в Р-ДНК, из, например, Agrobacterium, в другую клетку. Р-ДНК, перед вставкой экзогенного полинуклеотида, который должен быть перенесен, можно модифицировать для облегчения клонирования, и она предпочтительно не должна кодировать какой-либо белок. Р-ДНК характеризуется тем, что она содержит по крайней мере правую пограничную последовательность и предпочтительно также левую пограничную последовательность.
Как здесь используется, "пограничная" последовательность транспортной нуклеиновой кислоты можно быть выделенной из выбранного организма, такого как растение или бактерия, или быть ее искусственным вариантом/мутантом. Пограничная последовательность активизирует и облегчает перенос полинуклеотида, с которым она связана, и может способствовать его интеграции в геном реципиентной клетки. В варианте
осуществления длина пограничной последовательности составляет 5-100 пар оснований (п.о.), 10-80 п.о., 15-75 п.о., 15-60 п.о., 15-50 п.о., 15-40 п.о., 15-30 п.о., 16-30 п.о., 20-30 п.о., 2130 п.о., 22-30 п.о., 23-30 п.о., 24-30 п.о., 25-30 п.о. или 2 630 п. о. Пограничные последовательности из Т-ДНК из Agrobacterium sp. хорошо известны в данной области техники и включают те, которые описаны в Lacroix et al. (2008), Tzfira and Citovsky (2006) и Glevin (2003) .
Хотя традиционно только Agrobacterium sp. использовались для переноса генов в клетки растений, в настоящее время существует большое количество систем, которые были идентифицированы/разработаны, которые работают аналогично Agrobacterium sp. Некоторые не относящиеся к Agrobacterium виды были недавно генетически модифицированы, чтобы быть компетентными для переноса генов (Chung et al., 2006; Broothaerts et al. , 2005) . Они включают Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizobium meliloti и Mezorhizobium loti. Бактерии сделаны компетентными в отношении переноса генов посредством обеспечения бактерии аппаратом, необходимым для процесса трансформации, т.е. рядом генов вирулентности, кодируемых Ti-плазмидой Agrobacterium, и сегментом Т-ДНК, находящимся на отдельной, небольшой бинарной плазмиде. Бактерии, созданные таким образом, способны трансформировать различные ткани растений (листовые диски, каллусы и яйцеклетки), однодольных или двудольных растений, и различные другие виды растений (например, табак, рис).
Как здесь используются, термины "трансфекция", "трансформация" и их вариации, как правило, используются взаимозаменяемо. "Трансфецированные" или "трансформированные" клетки могут быть подвергнуты обработке для введения полинуклеотида(ов), представляющего интерес, или могут быть клетками-потомками, происходящими от них.
Рекомбинантные клетки
Настоящим изобретением также обеспечивается рекомбинантная клетка, например, рекомбинантная клетка растения, которая является клеткой-хозяином, трансформированной одним или более
полинуклеотидов или векторов, определенных здесь, или их комбинацией. Термин "рекомбинатная клетка" используется взаимозаменяемо с термином "трансгенная клетка" здесь. Подходящие клетки настоящего изобретения включают любую клетку, которую можно трансформировать полинуклеотидом или рекомбинантным вектором настоящего изобретения, кодирующим, например, полипептид или фермент, описываемый здесь. Предпочтительно клеткой является клетка, которая в связи с этим может использоваться для продукции липида. Рекомбинантная клетка может представлять собой клетку в культуре, клетку in vitro, или в организме, таком как, например, растение, или в органе, таком как, например, семя или лист. Предпочтительно клетка находится в растении, более предпочтительно в семени растения, более предпочтительно в семени масличного растения, такого как сафлор. В варианте осуществления клетка растения включает липид или масло, имеющий жирнокислотный состав, описываемый здесь.
Клетки-хозяева, в которые вводят полинуклеотид(ы) , могут
быть или нетрансформированными клетками, или клетками, которые
уже трансформированы по крайней мере одной нуклеиновой
кислотой. Такие нуклеиновые кислоты могут быть связаны с
синтезом липидов, или не связаны с ним. Клетки-хозяева
настоящего изобретения или могут быть эндогенно (т.е. по своей
природе) способными к продукции полипептида(ов), определенных
здесь, в этом случае рекомбинантная клетка, происходящая от
них, обладает увеличенной способностью продуцировать
полипептид(ы), или могут быть способны продуцировать указанный
полипептид(ы) только после трансформации по крайней мере одним
полинуклеотидом настоящего изобретения. В варианте
осуществления рекомбинантная клетка настоящего изобретения
обладает увеличенной способностью продуцировать неполярный
липид. Клетки могут быть прокариотическими или
эукариотическими. Предпочтительными клетками-хозяевами являются дрожжевые клетки, клетки водорослей и растений. В предпочтительном варианте осуществления клеткой растения является клетка семени, в частности, клетка в семядоли или
эндосперме семени. Примеры клеток водорослей, применимых в качестве клеток-хозяев настоящего изобретения, включают, например, Chlamydomonas sp. (например, Chlamydomonas reinhardtii), Dunaliella sp., Haematococcus sp., Chlorella sp., Thraustochytrium sp., Schizochytrium sp. и Volvox sp.
Клетки-хозяева могут быть клетками организма, подходящего для процесса сбраживания, такого как, например, Yarrowia lipolytica или другие дрожжи.
Трансгенные растения
Настоящим изобретением также обеспечивается растение, включающее экзогенный полинуклеотид или полипептид настоящего изобретения, клетку настоящего изобретения, вектор настоящего изобретения или их комбинацию. Термин "растение" относится к целым растениям, в то время как термин "его часть" относится к органам растения (например, листьям, стеблям, корням, цветкам, плодам), отдельным клеткам (например, пыльце), семени, частям семени, таким как зародыш, эндосперм, скутеллум или оболочка семени, ткани растения, такой как сосудистая ткань, клеткам растения и их потомках. Как здесь используются, части растения включают клетки растения.
Как здесь используется, термин "растение" используется в самом широком значении. Он включает, но без ограничения, любой вид травы, декоративного растения, культуры или хлебного злака
(например, масличных растений, кукурузы, сои), кормового растения, плодового или овощного растения, лекарственной травы, древесного растения, цветущего растения или дерева. Не подразумевается ограничение растения какой-либо конкретной структурой. Он также относится к одноклеточному растению
(например, микроводорослям) . Термин "его часть" в отношении растения относится клетке растения и ее потомству, множеству клеток растений, которые в значительной мере дифференцированы внутри колонии, (например, вольвоксу), структуре, которая присутствует на любой стадии развития растения, или ткани растения. Такие структуры включают, но без ограничения, листья, стебли, цветки, плоды, орехи, корни, семя, оболочку семени, зародыши. Термин "ткань растения" включает дифференцированные и
недифференцированные ткани растений, в том числе те, которые присутствуют в листьях, стеблях, цветках, плодах, орехах, корнях, семени, например, зародышевую ткань, эндосперм, ткань кожного покрова (например, эпидермис, перидерму), сосудистую ткань (например, ксилему, флоэму) или покровную ткань (включающую паренхиму, колленхиму и/или клетки склеренхимы), а также клетки в культуре (например, отдельные клетки, протопласты, каллус, зародыши и т.д.). Ткань растения может находиться в растении, в органной культуре, культуре тканей или культуре клеток.
"Трансгенное растение", "генетически модифицированное растение" или его варианты относится к растению, которое содержит трансген, не встречающийся в растении дикого типа того же вида, сорта или культивара. Трансгенные растения, определяемые в связи с настоящим изобретением, включают растения и их потомков, которые были генетически модифицированы, используя рекомбинантные методы, для вызова продукции по крайней мере одного полипептида, определенного здесь, в желаемом растении или его части. "Части трансгенного растения" имеют соответствующее значение.
Термины "семя" и "зерно" являются родственными терминами, используемыми здесь, и имеют частично совпадающие значения. "Зерно" относится к зрелому зерну, например, собранному зерну, или зерну, которое все еще находится на растении, но готово для сбора, но может также относится к зерну после насыщения влагой или прорастания, в соответствии с контекстом. Зрелое зерно обычно имеет содержание влаги, составляющее менее чем приблизительно 18-20%. "Семя" включает "развивающееся семя", а также "зерно", которое является зрелым зерном, но не зерном после насыщения влагой или прорастания. "Развивающееся семя", как здесь используется, относится к семени до созревания, типично встречающемуся в репродуктивных структурах растения после опыления или цветения, но может также относиться к таким семенам до созревания, которые выделяют из растения. Развитие семени в растении типично делится на раннюю, среднюю и позднюю фазы развития.
Используемый здесь термин "орган запасания растения" относится к части растения, приспособленной для накапливания энергии в форме, например, белков, углеводов, липидов. Примерами органов запасания растения являются семя, плод, клубневидные корни и клубнеплоды. Предпочтительным органом запасания растения настоящего изобретения является семя.
Как здесь используется, термин "ткань вегетативного органа/части" или "вегетативная часть растения" или его варианты представляет собой любую ткань, орган или часть растения, которая не включает органы полового размножения растений или семяносные органы или близко связанные ткани или органы, такие как цветки, плоды и семена. Ткани вегетативных органов/частей и вегетативные части включают по крайней мере листья, стебли (в том числе стрелки и побеги, но исключая колосья), клубни и корни растений, но исключают цветки, пыльцу, семя, в том числе оболочку семени, зародыш и эндосперм, плод, в том числе ткань межплодника, семянесущие стручки и семянесущие колосья. В одном варианте осуществления вегетативная часть растения является надземной часть растения. В другом или дальнейшем варианте осуществления вегетативная часть растения является зеленой частью, такой как лист или стебель. Вегетативные части включают те части, которые в основном вовлечены в обеспечение или поддержание способности к фотосинтезу растения или связанной функции, или закрепления растения.
Используемый здесь термин "фенотипически нормальное" относится к генетически модифицированному растению или его части, в частности, органу запасания, такому как семя настоящего изобретения, не обладающему значительно уменьшенной способностью расти и репродуцироваться по сравнению с немодифицированным растением или его частью. В варианте осуществления генетически модифицированное растение или его часть, которое является фенотипически нормальным, включает по крайней мере один экзогенный полинуклеотид, определенный здесь, и обладает способностью расти и репродуцироваться, по существу одинаковой с таковой соответствующего растения или его части,
не включающего указанный полинуклеотид(ы). Предпочтительно, когда биомасса, скорость роста, скорость прорастания, размер органов запасания, размер семени и/или количество образуемых жизнеспособных семян составляет не менее 90% от таковой растения, в котором отсутствует указанный экзогенный полинуклеотид, при выращивании в идентичных условиях. Этот термин не охватывает особенности растения, которые могут быть отличными от таковых растения дикого типа, но которые не влияют на применимость растения для коммерческих целей.
Растения, обеспечиваемые настоящим изобретением или предполагаемые для использования при осуществлении на практике настоящего изобретения, включают и однодольные, и двудольные растения. В предпочтительных вариантах осуществления растениями настоящего изобретения являются культурные растения (например, злаки и зернобобовые, кукуруза, пшеница, картофель, маниок, рис, сорго, просо, маниока, ячмень или горох) или другие бобовые растения. Растения могут выращиваться для получения съедобных корней, клубней, листьев, стеблей, цветков или плодов. Растения могут быть овощными или декоративными растениями. Растениями настоящего изобретения могут быть: сафлор {Carthamus tinctorius), кукуруза {Zea mays), канола
{Brassica napus, Brassica rapa ssp.), другие Brassicas, такие как, например, брюква {Brassica napobrassica), горчица
{Brassica juncea), эфиопская горчица {Brassica carinata), крамбе {Crambe abyssinica), рыжик {Camelina sativa) , сахарная свекла {Beta vulgaris), клевер {Trifolium sp.), лен {Linum usitatissimum), люцерна {Medicago sativa), рис {Oryza sativa), рожь {Secale cerale), сорго {Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), подсолнечник {Helianthus annus), пшеница {Tritium aestivum), соя {Glycine max), табак {Nicotiana tabacum), картофель
{Solanum tuberosum), арахис {Arachis hypogaea), хлопчатник
{Gossypium hirsutum), сладкий картофель {Lopmoea batatus), маниока {Manihot esculenta), кофейное дерево {Cofea spp.), кокосовая пальма {Cocos nucifera), ананас {Anana comosus), цитрусовое дерево {Citrus spp.), дерево какао {Theobroma cacao), чай {Camellia senensis), банановое дерево {Musa spp.),
авокадо {Persea americana), фиговое дерево {Ficus casica), гуава (Psidium guajava), манговое дерево (Mangifer indica), маслина европейская {Olea europaea), дынное дерево {Carica papaya), анакард (Anacardium occidentale), макадамия (Macadamia intergrifolia) , миндаль (Prunus amygdalus), ятрофа (Jatropha curcas), люпины, эвкалипты, пальма, орех, шалфей, погамия, овес или ячмень.
Другие предпочтительные растения включают С4-травы, такие как Andropogon gerardi, Bouteloua curtipendula, В. gracilis, Buchloe dactyloides, Panicum virgatum, Schizachyrium scoparium, виды Miscanthus, например, Miscanthus x giganteus и Miscanthus sinensis, Sorghastrum nutans, Sporobolus cryptandrus, просо прутьевидное (Panicum virgatum), сахарный тростник (Saccharum officinarum), Brachyaria; СЗ-травы, такие как Elymus canadensis, бобовые растения Lespedeza capitata и Petalostemum villosum, полукустарник Aster azureus; и древесные растения, такие как Quercus ellipsoidalis и Q. macrocarpa.
В предпочтительном варианте осуществления растением является покрытосеменное растение.
В предпочтительном варианте осуществления растением является масличное растение, предпочтительно масличная культура. Как здесь используется, "масличное растение" представляет собой вид растения, используемый для коммерческого получения липида из семян растения. "Коммерческое получение" здесь означает получение липида, предпочтительно масла, для продажи в обмен на прибыль. Масличным растением может быть масличный рапс (такой как канола), кукуруза, подсолнечник, сафлор, соя, сорго, лен (льняное семя) или сахарная свекла. Кроме того, масличным растением могут быть другие Brassicas, хлопчатник, арахис, мак, брюква, горчица, клещевина обыкновенная, кунжут, сафлор или образующие орехи растения. Растение, такое как маслина европейская, масличная пальма или кокосовая пальма, может продуцировать высокие уровни липида в своем плоде. Плодоовощными растениями, на которые может распространяться настоящее изобретение, являются салат-латук, цикорный салак или овощные Brassicas, включающие капусту,
брокколи или цветную капусту. Настоящее изобретение может распространяться на табак, тыкву, морковь, клубнику, помидор или перец. Более предпочтительными растениями являются масличные растения, развивающиеся семена которых являются нефотосинтезирующими, также называемые растениями с "белыми семенами", такие как сафлор, подсолнечник, хлопчатник и клещевина.
В предпочтительном варианте осуществления трансгенное растение является гомозиготным по каждому и всякому гену, который был введен, (трансгену), так что его потомки не расщепляется по желаемому фенотипу. Трансгенное растение может также быть гетерозиготным по введенному трансгену(ам), предпочтительно равномерно гетерозиготным по трансгену, например, в F1 потомстве, которое было выращено из гибридного семени. Такие растения могут дать преимущества, такие как гибридная сила, хорошо известные в данной области техники.
Трансформация растений
Трансгенные растения можно создать, используя известные в данной области техники методы, такие как те, которые в целом описаны в Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), и Christou and Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004).
Используемые здесь термины "устойчивое трансформирование", "устойчиво трансформированный" и их варианты относятся к интеграции полинуклеотида в геном клетки, так что он передается клеткам-потомкам во время деления клетки без необходимости в позитивной селекции в отношении его присутствия. Устойчивые трансформанты, или их потомков, можно отобрать и/или идентифицировать с помощью любого способа, известного в данной области техники, такого как блоттинг по Саузерну на хромосомной ДНК или in situ гибридизация геномной ДНК.
Agrobacterium-опосредованный перенос является широко применимой системой для введения генов в клетки растений, поскольку ДНК можно ввести в клетки в тканях целого растения, органах растения, или экспланты в культуре тканей, или для
транзиторной экспрессии, или для устойчивой интеграции ДНК в геном клетки растения. Для введения ДНК в клетки растения хорошо известно использование векторов для Agrobacterium-опосредованный интеграции в геном клетки растения (см., например, патенты США с № 5177010, 5104310, 5004863 и 5159135). Район ДНК, который должен быть перенесен, определяется пограничными последовательностями, и промежуточная ДНК (Т-ДНК) обычно встраивается в геном растения. Кроме того, интеграция Т-ДНК является относительно точным процессом, приводящим к небольшому числу перестановок. В случае тех сортов растений, для которых Agrobacterium-опосредованная трансформация является эффективной, она является предпочтительным методом по причине легкого и определенного характера переноса генов. Предпочтительные векторы для Agrobacterium-опосредованной трансформации способны реплицироваться в Е. coli, а также Agrobacterium, создавая возможность для подходящих манипуляций, как описано (Klee et al., In: Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 179-203 (1985)).
Способы ускорения, которые могут использоваться, включают, например, бомбардировку микрочастицами и т.п. Одним примером способа доставки молекул трансформирующих нуклеиновых кислот в клетки растения является бомбардировка микрочастицами. Этот способ был рассмотрен в Yang et al. , Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994). Небиологические частицы (микрочастицы) могут быть покрыты нуклеиновыми кислотами и доставлены в клетки с помощью движущей силы. Такие методы хорошо известны в данной области техники. В другом варианте осуществления можно устойчиво трансформировать пластиды. Способы, описанные для трансформации пластид высших растений, включают доставку с помощью генной пушки ДНК, содержащей селектируемый маркер, и направленную доставку ДНК в геном пластид благодаря гомологичной рекомбинации (патент США с № 5451513, патент США с 5545818, патент США с 5877402, патент США с 5932479 и WO 99/05265).
Трансформации протопластов клеток растений можно достичь,
используя методы на основе преципитации фосфатом кальция, обработки полиэтиленгликолем, электропорации и комбинации этих обработок. Использование этих систем для различных сортов растений зависит от возможности регенерировать эту конкретную линию растений из протопластов. Иллюстративные способы регенерации зерновых из протопластов описаны (Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986).
Другие способы трансформации клеток могут также использоваться и включают, но без ограничения, введение ДНК в растения посредством прямого переноса ДНК в пыльцу, посредством прямой инъекции ДНК в репродуктивные органы растения или посредством прямой инъекции ДНК в клетки недоразвившихся зародышей с последующей регидратацией сухих зародышей.
Регенерация, развитие и выращивание растений из отдельных
трансформантов протопластов клеток растений или из различных
трансформированных эксплантов хорошо известна в данной области
техники (Weissbach et al., In: Methods for Plant Molecular
Biology, Academic Press, San Diego, Calif., (1988)). Этот
процесс регенерации и выращивания типично включает стадии
отбора трансформированных клеток, выращивания этих
индивидуализированных клеток на протяжении обычных стадий развития зародышей вплоть до стадии укорененных ростков. Трансгенные зародыши и семена регенерируют сходно. Полученные в результате трансгенные укорененные ростки впоследствии высаживают в подходящую среду для выращивания растений, такую как почва.
Развитие или регенерация растений, содержащий чужеродный,
экзогенный ген, хорошо известно в данной области техники.
Предпочтительно регенерированные растения являются
самоопыляющимися для обеспечения гомозиготных трансгенных растений. В противном случае, пыльцу, полученную из регенерированных растений, используют для опыления выращенных из семени растений агрономически важных линий. В противном случае, пыльцу от растений этих важных линий используют для опыления регенерированных растений. Трансгенное растение настоящего изобретения, содержащее желаемый полинуклеотид,
выращивают, используя способы, хорошо известные
квалифицированному в данной области техники специалисту.
Способы трансформации двудольных растений, в основном с использованием Agrobacterium tumefaciens, и получения трансгенных растений были опубликованы для хлопчатника (патент США с № 5004863, патент США с № 5159135, патент США с № 5518908), сои (патент США с № 5569834, патент США с № 5416011), Brassica (патент США с № 5463174), арахиса (Cheng et al., 1996) и гороха (Grant et al., 1995).
Способы трансформации хлебных злаков, таких как пшеница и ячмень, для внесения генетической вариации в растения в результате введения экзогенной нуклеиновой кислоты и регенерации растений из протопластов или недоразвившихся зародышей растений хорошо известны в данной области техники, см., например, СА 2092588, AU 61781/94, AU 667939, патент США с № 6100447, PCT/US97/10621, патент США с № 5589617, патент США с № 6541257. Регенерируемые клетки пшеницы предпочтительно происходят из скутеллума недоразвившихся зародышей, зрелых зародышей, происходящего из них каллуса или ткани меристемы.
Для подтверждения присутствия трансгенов в трансгенных клетках и растениях можно выполнить амплификацию с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или анализ с использованием блоттинга по Саузерну, используя методы, известные квалифицированным в данной области техники специалистам. После получения трансгенных растений, их можно выращивать для получения тканей растений или их частей, обладающих желаемым фенотипом. Можно собрать ткань растения или части растения, и/или можно собрать семя. Семя может служить в качестве источника для выращивания дополнительных растений с тканями или частями, обладающими желаемыми характеристиками.
Трансгенное растение, создаваемое, используя методы трансформации с использованием Agrobacterium или другие методы трансформации, типично содержит один трансгенный локус в одном хромосоме. Такие трансгенные растения называют гемизиготными по добавленному гену(ам). Более предпочтительным является трансгенное растение, которое является гомозиготным по
добавленному гену(ам), т.е. трансгенное растение, которое содержит два добавленных гена, один ген в одном и том же локусе в каждой хромосоме пары хромосом. Гомозиготное трансгенное растение может быть получено с помощью самоопыления гемизиготного трансгенного растения, проращивания некоторых из полученных семян и анализа полученных в результате растений на предмет представляющего интерес гена.
Также должно быть понятно, что два различных трансгенных растения, которые содержат два независимо расщепляющихся экзогенных гена или локуса, могут быть также скрещены с получение потомков, которые содержат оба набора генов или локусов. Самоопыление соответствующего F1 потомка может привести к получению растений, которые являются гомозиготными по обоих экзогенным генам или локусам. Также предусматривается возвратное скрещивание с родительским растением и ауткроссинг с нетрансгенным растением, как и вегетативное размножение. Описания других методов скрещивания, которые обычно используются для различных особенностей и культур, можно найти в Fehr, In: Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987).
Для трансформации сафлора особенно применимые способы описаны Belide и др. (2011) .
TILLING
В одном варианте осуществления TILLING (индуцированные в результате направленного воздействия локальные повреждения в геномах) могут использоваться для создания растений, в которых произошел нокаут эндогенных генов, например, генов, кодирующих А12 десатуразу, пальмитоил-АСР-тиоэстеразу, активность десатуразы со б жирных кислот или Аб десатуразы, или комбинацию двух или более из них.
На первом этапе индуцируют вводимые мутации, такие как новые изменения одной пары оснований, в популяции растений посредством обработки семян (или пыльцы) химическим мутагеном и затем развития растений до поколения, в котором мутации будет устойчиво наследоваться. ДНК экстрагируют, и сохраняют семена
от всех членов популяции для создания запасов, к которым можно обратиться повторно с течением времени.
Для анализа TILLING конструируют праймеры для ПЦР для специфической амплификации одного представляющего интерес гена-мишени. Специфичность особенно важна, если мишень является членом семейства генов или частью полиплоидного генома. Затем меченные красителем праймеры могут использоваться для амплификации продуктов ПЦР, исходя из объединенной ДНК множества индивидуумов. Эти продукты ПЦР денатурируют и вновь подвергают отжигу для допуска образования ошибочно спаренных пар оснований. Ошибочные спаривания, или гетеродуплексы, отображают и встречающиеся в природе однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) (т.е. несколько растений из популяции, вероятно, будут иметь один и тот же полиморфизм), и индуцированные SNP (т.е. лишь редкие отдельные растения, вероятно, будет демонстрировать мутацию). После образования гетеродуплексов использование эндонуклеазы, такой как Cell, которая распознает и расщепляет ошибочно спаренную ДНК, является ключом для обнаружения новых SNP в популяции с TILLING.
Используя этот подход, можно скринировать много тысяч растений для идентификации какого-либо индивидуума с заменой одного основания, а также небольшими вставками или делециями (1-30 п.о.) в любом гене или конкретном участке генома. Размер исследуемых геномных фрагментов может колебаться где-то от 0,3 до 1,6 т.п.о. В случае 8-кратного объединения, фрагментов размером 1,4 т.п.о. (не учитывая концы фрагментов, в которых обнаружение SNP является проблематичным из-за шума) и 9 6 дорожек на каждый анализ, эта комбинация позволяет скринировать вплоть до миллиона пар оснований геномной ДНК в одной анализе, что делает анализ TILLING методом с высокой пропускной способностью. Анализ TILLING, кроме того, описан в Slade and Knauf (2005), и Henikoff et al. (2004).
Помимо того, что технология TILLING с высокой пропускной способностью позволяет эффективно детектировать мутации, она является идеальной для детектирования природных полиморфизмов.
Следовательно, исследование неизвестной гомологичной ДНК с
помощью образования гетеродуплекса с известной
последовательностью позволяет установить количество и положение полиморфных сайтов. Идентифицируют как замены нуклеотидов, так и небольшие вставки и делеции, включая по крайней мере некоторые полиморфизмы количества повторов. Это было названо Ecotilling (Comai et al., 2004).
Каждый SNP регистрируется в соответствии с его приблизительным положением в пределах нескольких нуклеотидов. Таким образом, каждый гаплотип может быть заархивирован на основе его изменчивости. Данные о последовательностях можно получить с относительно небольшим инкрементным объемом работы, используя аликвоты той же амплифицированной ДНК, которая используется для анализа расщепления ошибочных спариваний. Левый или правый праймер для секвенирования для одной реакции выбирают в соответствии с его близостью к полиморфизму. Программное обеспечение Sequencher выполняет множество совмещений и обнаруживает изменение основания, которое в каждом случае подтверждено полосой в геле.
Ecotilling можно выполнить дешевле, чем полное секвенирование, способ, используемый в настоящее время для обнаружение большей части SNP. Можно скринировать пластины, содержащие экотипическую ДНК в ранжированных рядах, а не пулы ДНК из подвергнутых мутагенезу растений. Поскольку детектирование осуществляется в гелях с разрешающей способностью почти пара оснований, и фоновые рисунки являются одинаковыми по дорожкам, можно сопоставить полосы с одинаковым размером, таким образом обнаруживая и генотипируя SNP в один прием. Таким образом, завершающее секвенирование SNP является простым и эффективным, сделанным даже в большей степени таким в силу того, что аликвоты тех же продуктов ПЦР, используемых для скрининга, могут подвергаться секвенированию ДНК.
Процедуры мутагенеза
Методы создания мутантных линий растений известны в данной области техники. Примеры мутагенов, которые могут использоваться для создания мутантных растений включают
облучение и химический мутагенез. Мутанты можно также создать с помощью таких методов, как вставка Т-ДНК и транспозон-индуцированный мутагенез. Мутации в любой желаемый ген в растении можно ввести сайт-специфическим образом с использованием искусственных нуклеаз с доменами "цинковые пальцы" (ZFN), эффектора TAL (TALEN) или технологий CRISPR (используя нуклеазу типа Cas9), как известно в данной области техники. Процедуры мутагенеза можно выполнить на любой родительной клетке растения, например, семени или родительской клетке в культуре тканей.
Химические мутагены поддаются классификации в соответствии
с химическими свойствами, например, алкилирующие агенты,
сшивающие агенты и т.д. Применимые химические мутагены
включают, но без ограничения, Ы-этил-Ы-нитрозомочевину (ENU);
Ы-метил-Ы-нитрозомочевину (MNU); прокарбазина гидрохлорид;
хлорамбуцил; циклофосфамид; метилметансульфонат (MMS);
этилметансульфонат (EMS); диэтилсульфат; мономер акриамид;
триэтиленмеламин (ТЕМ); мелфалан; азотистый иприт; винкристин;
диметилнитрозамин; Ы-метил-N'-нитро-нитрозогуанидин (MNNG);
7,12-диметилбензантрацен (DMBA); этиленоксид;
гексаметилфосфорамид и бисульфан.
Примером подходящего облучения для индукции мутаций является облучение гамма-лучами, такое как облучение, обеспечиваемое источником Cesium 137. Облучение гамма-лучами клеток растений предпочтительно обеспечивается в дозе, составляющей приблизительно 60-200 крад, и наиболее предпочтительно в дозе, составляющей приблизительно 60-90 крад.
Растения типично подвергают воздействию мутагена в течение отрезка времени, достаточного для осуществления желаемой генетической модификации, но недостаточного для полного уничтожения жизнеспособности клеток и их способности к регенерации в растение.
Процедуры мутагенеза, описанные выше, типично приводят к созданию мутантов в представляющем интерес гене с частотой, составляющей по крайней мере 1 на 1000 растений, что означает, что скрининг подвергнутых мутагенезу популяций растений
является осуществимым способом для идентификации мутаций в любом представляющем интерес гене. Идентификации мутантов можно также достичь с помощью технологии нуклеотидного секвенировония с массовым параллелизмом.
Отбор с помощью маркера
Отбор с помощью маркера является широко известным способом отбора гетерозиготных растений, необходимым при возвратном скрещивании с возвратным родителем в классической программе скрещивания. Популяция растений в каждом поколении, получаемом при возвратном скрещивании, будет гетерозиготной по представляющему интерес гену, обычно присутствующему в соотношении 1:1 в популяции, полученной в результате возвратного скрещивания, и молекулярный марке может использоваться для различения двух аллелей гена. Экстрагируя ДНК, например, из молодых ростков и проверяя с использованием специфического маркера для являющего результатом интрогрессии желаемого признака, осуществляют ранний отбор растений для дальнейшего возвратного скрещивании при сосредоточении энергии и ресурсов на меньшем количестве растений. Для дальнейшего ускорения программы возвратного скрещивания зародыш из недоразвившихся семян (25 дней после цветения) можно иссечь и выращивать на питательных средах в стерильных условиях, а не допускать полное созревание семени. Этот процесс, названный "спасение зародыша", используемый в комбинации с экстракцией ДНК на стадии трех листьев и анализом в отношении желаемого генотипа, позволяет быстро отобрать растения, имеющие желаемый признак, которые можно выращивать до созревания в теплице или на поле для последующего возвратного скрещивания с возвратным родителем.
Любой молекулярный биологический метод, известный в данной области техники, с помощью которого можно детектировать ген FAD2, FATB или FAD6, может использоваться в способах настоящего изобретения. Такие методы включают, но без ограничения, использование амплификации нуклеиновых кислот, секвенирование нуклеиновых кислот, гибридизацию нуклеиновых кислот с соответственно меченными зондами, анализ одноцепочечного
конформационного полиморфизма (SSCA), электрофорез в градиентном геле в денатурирующих условиях (DGGE), анализ гетеродуплексов (НЕТ), анализ химического расщепления (ССМ), каталитическое расщепление нуклеиновых кислот или их комбинацию
(см., например, Lemieux, 2000; Langridge et al. , 2001) . Настоящее изобретение также включает использование методов с использованием молекулярных маркеров для детектирования полиморфизмов, связанных с аллелями (например) гена FAD2, FATB или FAD6, которые придают желаемый фенотип. Такие методы включают выявление или анализ полиморфизмов длин рестрикционных фрагментов (RFLP), RAPD, полиморфизмов длин амплифицированных фрагментов (AFLP) и полиморфизмов микросателлитных локусов
(повтора простой последовательности, SSR) . Сцепленные маркеры можно получить без труда с помощью методов, хорошо известных в данной области техники, таких как анализ объединенных сегрегантов, которые рассмотрены Langridge и др. (2001) .
"Полимеразная цепная реакция" ("ПЦР") представляет собой реакцию, в ходе которой создаются копии-реплики из полинуклеотида-мишени, используя "пару праймеров" или "набор праймеров", состоящей(его) из "верхнего" (5') и "нижнего" (3') праймера, и катализатор полимеризации, такой как ДНК-полимераза и типично термостабильный фермент полимераза. Способы для ПЦР известны в данной области техники и сообщаются, например, в "PCR" (Ed. M.J. McPherson and S.G Moller (2000) BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford). ПЦР может выполняться на кДНК, полученной в результате обратной транскрипции мРНК, выделенной из клеток растения. Однако будет, как правило, удобнее, если ПЦР будет выполняться на геномной ДНК, выделенной из растения.
Праймер представляет собой олигонуклеотидную
последовательность, которая способна к гибридизации специфическим в отношении последовательности образом с последовательностью-мишенью и к удлинению во время ПЦР. Ампликоны или продукты ПЦР, или фрагменты ПЦР, или продукты амплификации представляют собой продукты удлинения, которые включают праймер и вновь синтезированные копии последовательности-мишени. Мультиплексные системы для ПЦР
содержат множество наборов праймеров, которые приводят к
одновременной продукции более чем одного ампликона. Праймеры
могут быть полностью соответствующими последовательности-
мишени, или они могут содержать внутренние несоответствующие
основания, которые могут приводить к введению сайтов
распознавания/расщепления рестрикционными ферментами или
каталитическими нуклеиновыми кислотами в конкретных
последовательностях-мишенях. Праймеры могут также содержать
дополнительные последовательности и/или содержать
модифицированные или меченые нуклеотиды для облегчения захвата
или детектирования ампликонов. Повторяющиеся циклы термической
денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными им
последовательностями и удлинение подвергнутых отжигу праймеров
с помощью полимеразы приводят к экспоненциальной амплификации
последовательности-мишени. Термины "мишень" или
"последовательность-мишень" или "матрица" относятся к последовательностям нуклеиновых кислот, которые амплифицируют.
Способы прямого секвенирования нуклеотидных
последовательностей хорошо известны квалифицированным в данной
области техники специалистам, и их можно найти, например, в
Ausubel et al. (выше) и Sambrook et al. (выше) . Секвенирование
может выполняться любым подходящим способом, например, с
использованием дидезокси-секвенирования, химического
секвенирования или их вариантов. Прямое секвенирование дает преимущество определения вариации в любой паре оснований конкретной последовательности.
Системы детектирования на основе гибридизации включают, но без ограничения, анализ TaqMan и анализ с использованием молекулярных маяков (патент США с № 5925517). В анализе TaqMan (патент США с № 5962233) используются специфические в отношении аллелей (ASO) зонды с флуорофором-донором на одном конце и флуорофором-акцептором на другом конце, так что пара флуорофоров взаимодействует посредством резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
В одном варианте осуществления способ, описанный в примере 7, используется в программе селекции и скрещивания для
идентификации и отбора растений сафлора с мутацией ol. Например, способ включает выполнение реакции амплификации на геномной ДНК, полученной из растения, используя один или более из следующих наборов праймеров;
i) 5'-ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEQ ID NO: 140) и 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEQ ID NO: 141), and
ii) 5' -AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3' (SEQ ID NO: 142) и 5'-T T G С TATACATAT T GAAG G СAC T -3 (SEQ ID NO: 143) .
Полипептиды
Термины "полипептид" и "белок", как правило, используются взаимозаменяемо.
Полипептид или класс полипептидов может характеризоваться
степенью идентичности (% идентичности) его аминокислотной
последовательности со ссылочной аминокислотной
последовательностью, или наличием большего % идентичности с одной ссылочной аминокислотной последовательностью, чем с другой. % идентичности полипептида со ссылочной аминокислотной последовательностью типично определяют с помощью анализа GAP (Needleman and Wunsch, 1970; программа GCG) с использованием параметров: штрафа за создание пропуска в последовательности=5 и штрафа за расширение пропуска в последовательности^,3. Длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 100 аминокислот, и при анализе GAP совмещаются две последовательности на протяжении участка из по крайней мере 100 аминокислот. Даже более предпочтительно, когда длина запрашиваемой последовательности составляет по крайней мере 250 аминокислот, и при анализе GAP совмещаются две последовательности на протяжении участка из по крайней мере 250 аминокислот. Даже более предпочтительно, когда при анализе GAP совмещаются две последовательности на протяжении всей их полной длины. Полипептид или класс полипептидов может обладать тот же ферментативной активностью, что и ссылочный полипептид, или активностью, отличной от таковой ссылочного полипептида, или не обладать активностью ссылочного полипептида. Предпочтительно, когда полипептид обладает ферментативной активностью, составляющей по крайней мере 10% от активности ссылочного
полипептида.
Как здесь используется, "биологически активный фрагмент" представляет собой часть полипептида настоящего изобретения, в которой сохраняется определенная активность полноразмерного ссылочного полипептида, например, А12 десатуразная, пальмитоил-АСР-тиоэстеразная или Аб десатуразная активность. Биологически активные фрагменты, как здесь используются, исключают полноразмерный полипептид. Биологически активные фрагменты могут быть частью любого размера при условии, что в них сохраняется определенная активность. Предпочтительно, когда в биологически активном фрагменте сохраняется по крайней мере 10% от активности полноразмерного полипептида.
Что касается определенного полипептида или фермента, будет
понятно, что процентные значения идентичности, превышающие
значения, предоставленные здесь, будут охватывать
предпочтительные варианты осуществления. Таким образом, где
применимо, ввиду минимальных процентных значений идентичности,
предпочтительно, когда полипептид/фермент включает
аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 50%, более предпочтительно на по крайней мере 60%, более предпочтительно на по крайней мере 65%, более предпочтительно на по крайней мере 7 0%, более предпочтительно на по крайней мере 7 5%, более предпочтительно на по крайней мере 80%, более предпочтительно на по крайней мере 85%, более предпочтительно на по крайней мере 90%, более предпочтительно на по крайней мере 91%, более предпочтительно на по крайней мере 92%, более предпочтительно на по крайней мере 93%, более предпочтительно на по крайней мере 94%, более предпочтительно на по крайней мере 95%, более предпочтительно на по крайней мере 96%, более предпочтительно на по крайней мере 97%, более предпочтительно на по крайней мере 98%, более предпочтительно на по крайней мере 99%, более предпочтительно на по крайней мере 99,1%, более предпочтительно на по крайней мере 99,2%, более предпочтительно на по крайней мере 99,3%, более предпочтительно на по крайней мере 99,4%, более предпочтительно
на по крайней мере 99,5%, более предпочтительно на по крайней мере 99,6%, более предпочтительно на по крайней мере 99,7%, более предпочтительно на по крайней мере 99, 8% и даже более предпочтительно на по крайней мере 99,9% соответствующей указанной SEQ ID N0.
Мутантные аминокислотные последовательности полипептидов, определенных здесь, можно приготовить посредством введения соответствующих замен нуклеотидов в нуклеиновую кислоту, определенную здесь, или с помощью in vitro синтеза определенного полипептида. Такие мутанты включают, например, делеции, вставки или замены остатков в аминокислотной последовательности. Можно осуществить комбинацию из делеций, вставок и замен, чтобы прийти к конечной конструкции, с условием, что конечный полипептидный продукт обладает желаемыми характеристиками.
Мутантные (измененные) полипептиды можно приготовить, используя любой метод, известный в данной области техники, например, используя стратегии направленного развития или разработки на основе логического обоснования (см. ниже). Продукты, происходящие из мутированной/измененной ДНК, можно без труда скринировать, используя методы, описанные здесь, для определения того, обладают ли они, или не обладают, активностью А12 десатуразы, пальмитоил-АСР-тиоэстеразы или десатуразы со б жирных кислот.
При разработке мутантных аминокислотных
последовательностей, положение места для мутации и природа мутации будут зависеть от характеристик(и), подвергаемой модификации. Места для мутаций можно модифицировать по отдельности или партиями, например, посредством (1) замены сначала консервативными вариантами аминокислот, а затем более радикальными вариантами в зависимости от достигаемых результатов, (2) делеции остатка-мишени, или (3) вставки других остатков рядом с локализованным сайтом. Как будет понятно квалифицированному специалисту, использование неконсервативных замен может использоваться при продуцировании мутанта с
уменьшенной ферментативной активностью.
Делеции в аминокислотной последовательности, как правило, находятся в пределах от приблизительно 1 до 15 остатков, более предпочтительно от приблизительно 1 до 10 остатков и типично от приблизительно 1 до 5 следующих друг за другом остатков, но могут быть намного длиннее, в особенности, когда мутант предназначен для уменьшения ферментативной активности.
Мутанты с заменой(ами) имеют по крайней мере один аминокислотный остаток в полипептиде, удаленный из последовательности, и отличный остаток, вставленный на его место. Места, представляющие наибольший интерес для мутагенеза с заменой(ами) для инактивации фермента, включают места, идентифицированные как активный центр(ы). Другими местами, представляющими интерес, являются места, в которых конкретные остатки, полученные из различных линий (штаммов) или видов, являются идентичными. Эти места могут быть важны для биологической активности. Консервативные замены представлены в таблице 1, в то время как неконсервативными заменами являются замены, которые не являются консервативными заменами.
В одном варианте осуществления полипептидом настоящего изобретения является А12 десатураза, которая включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 27-34, 36 или 37, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 4 0% любой одной или более из SEQ ID NO: NO: 27-34, 36 или 37.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего изобретения является олеат-А12-десатураза, присутствующая в семени (масличном семени) масличного растения, которая включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в любой из SEQ ID NO: 27, 2 8 или 3 6, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 4 0% любой одной или более из SEQ ID N0: 27, 2 8 или 36.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего
изобретения является А12-ацетиленаза, которая включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID N0: 37, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 40% SEQ ID N0: 37.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего
изобретения является пальмитолеат-А12-десатураза, которая
включает аминокислоты, имеющие последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 35, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 4 0% SEQ ID N0: 35.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего
изобретения является пальмитоил-АСР-тиоэстераза (FATB), которая
включает аминокислоты, имеющие последовательность,
представленную в любой из SEQ ID N0: 4 4 или 45, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 4 0% любой одной или более из SEQ ID N0: 44 или 45.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего изобретения является пальмитоил-АСР-тиоэстераза (FATB), присутствующая в семени масличного растения, которая включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 45, ее биологически активный фрагмент, или аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 40% SEQ ID NO: 45.
В другом варианте осуществления полипептидом настоящего изобретения является Аб-десатураза, которая включает аминокислоты, имеющие последовательность, представленную в SEQ ID NO: 48, ее биологически активный фрагмент, или
аминокислотную последовательность, которая идентична на по крайней мере 4 0% SEQ ID N0: 48.
Предпочтительные свойства ферментов настоящего изобретения представлены в разделе "Примеры", в частности, в примере 2, что касается FAD2 сафлора.
Полипептиды, описываемые здесь, можно экспрессировать в виде слияния с по крайней мере одним другим полипептидом. В предпочтительном варианте осуществления по крайней мере один другой полипептид выбирают из группы, состоящей из полипептида, который увеличивает стабильность слитого белка, и полипептида, который содействует очистке слитого белка.
Продукция липидов и/или масел, богатых олеиновой кислотой
Методы, которые обычно осуществляются на практике в данной области техники, могут использоваться для экстракции, обработки, очистки и анализа липидов, продуцированных растениями, в особенности семенами, настоящего изобретения. Такие методы описаны и объяснены полностью в литературе в таких источниках, как Fereidoon Shahidi, Current Protocols in Food Analytical Chemistry, John Wiley & Sons, Inc. (2001) Dl.1.1-DL1.1.11, и Perez-Vich et al. (1998).
Получение масла из семени
Типично семена растений подвергают тепловой обработке, отжиму и/или экстракции для получения неочищенного масла из семени, которое затем подвергают рафинированию гидратацией, рафинированию, обесцвечивания и дезодорации. В целом, методы для раздавливания семени известны в данной области техники. Например, масличные семена можно довести до нужного состояния посредством обрызгивания их водой для увеличения содержания влаги, например, до 8,5%, и отвальцевать, используя гладкий валец с величиной зазора, составляющей 0,23-0,27 мм. В зависимости от типа семени воду можно не добавлять до раздавливания. Применение нагревание дезактивирует ферменты, способствует дальнейшему разрушению клеток, приводит к соединению липидных капелек и агломерации белковых частиц, все это способствует процессу экстракции.
В варианте осуществления большая часть масла из семени
высвобождается при прохождении через винтовой пресс. Жмыхи, вытесненные из винтового пресса, затем подвергают экстракции растворителем, например, гексаном, используя колонку с подогревом. Альтернативно, неочищенное масло из семени, полученное с помощью операции отжима, можно пропустить через отстойник со снабженным щелями, проволочным верхом для стока для удаления твердых частиц, которые выжимаются вместе с маслом из семени во время операции отжима. Твердый остаток от отжима и экстракции, после удаления гексана, представляет собой жмых, который типично используется в качестве корма для животных. Очищенное масло из семени можно пропустить через листовой фильтр в виде рамы для удаления любых остающихся мелких твердых частиц. Если желательно, масло из семени, выделенное в результате процесса экстракции, можно объединить с очищенным маслом из семени для получения смешанного неочищенного масла из семени.
После освобождения неочищенного масла из семени от растворителя, полученные в результате отжима и экстракции части объединяют и подвергают обычным процедурам обработки липидов, таким как, например, рафинирование гидратацией, щелочная рафинация, обесцвечивание и дезодорация. Некоторые или все стадии могут быть пропущены, в зависимости от характера направленности продукта, например, в случае кормового масла может потребоваться ограниченная обработка, тогда как в случае олеохимических применений требуется больше стадий очистки.
Рафинирование гидратацией
Рафинирование гидратацией является ранней стадией при очистке масел, и его основной целью является удаление большей части фосфолипидов из масла, которые могут присутствовать в виде приблизительно 1-2% от всего экстрагированного липида. Добавление ~2% воды, типично содержащей фосфорную кислоту, при 7 0-8 0°С к неочищенному маслу приводит к отделению большей части фосфолипидов, сопровождаемых следами металла и красителями. Нерастворимый материал, который удаляют, представляет собой в основном смесь фосфолипидов и триацилглицеринов и также
известен как лецитин. Рафинирование гидратацией можно выполнить посредством добавления концентрированной фосфорной кислоты к неочищенному маслу из семени для превращения не способных к гидратации фосфатидов в способную к гидратации форму или для хелатирования следов металла, которые присутствуют. Растительный клей отделяют от масла из семени с помощью центрифугирования.
Щелочная рафинация
Щелочная рафинация является одним из процессов очистки для обработки неочищенного масла, иногда также называемым нейтрализацией. Она обычно следует за рафинированием гидратацией и предшествует обесцвечиванию. После рафинирования гидратацией масло из семени можно подвергнуть обработке посредством добавления достаточного количества раствора щелочи для нейтрализации всех из жирных кислот и фосфорных кислот, и удаления мыл, образуемых таким образом. Подходящие материалы в виде щелочей включают гидроксид натрия, гидроксид калия, карбонат натрия, гидроксид лития, гидроксид кальция, карбонат кальция и гидроксид аммония. Этот процесс типично выполняют при комнатной температуре, и с его помощью удаляется фракция свободных жирных кислот. Мыло удаляют с помощью центрифугирования или посредством экстракции в растворитель для мыла, и нейтрализованное масло промывают водой. Если требуется, любое избыточное количество щелочи в масле можно нейтрализовать с использованием подходящей кислоты, такой как соляная кислота или серная кислота.
Обесцвечивание
Обесцвечивание представляет собой процесс очистки, в котором масла нагревают при 90-120°С в течение 10-30 минут в присутствии отбеливающей глины (0,2-2,0%) и в отсутствие кислорода, оперируя азотом или паром или в вакууме. Эта стадия при обработке масла предназначена для удаления нежелательных красителей (каротиноидов, хлорофилла, госсипола и т.д.), и с помощью этого процесса также удаляются продукты окисления, следы металла, сернистые соединения и следы мыла.
Дезодорация
Дезодорация представляет собой обработку масел и жиров при высокой температуре (200-2бО°С) и низком давлении (0,1-1 мм. рт ст) . Она типично достигается при введении пара в масло из семени со скоростью, составляющей приблизительно 0,1 мл/минуту/100 мл масла из семени. После барботажа в течение приблизительно 3 0 минут допускают охлаждение масла из семени под вакуумом. Масло из семени типично переносят в стеклянный контейнер и очищают струей аргона перед хранением при охлаждении. Эта обработка улучшает цвет масла из семени и удаляет большую часть летучих веществ или пахучих соединений, в том числе любых остающихся свободных жирных кислот, моноацилглицеринов и продуктов окисления.
Фракционирование охлаждением
Фракционирование охлаждением является процессом, иногда используемым при коммерческом производстве масел, для разделения масел и жиров на твердую (стеариновую) и жидкую (олеиновую) фракции посредством кристаллизации при низких температурах. Оно сначала использовалось для хлопкового масла для производства продукта без твердых веществ. Оно типично используется для уменьшения содержания насыщенных жирных кислот в маслах.
Переэтерификация
Переэтерификация является процессом обменов жирных кислот в или между TAG, в начале посредством высвобождения жирных кислот из TAG или в виде свободных жирных кислот, или в виде эфиров жирных кислот, обычно этиловых эфиров жирных кислот. В сочетании с процессом фракционирования переэтерификация может использоваться для модификации жирнокислотного состава липидов (Marangoni et al., 1995) . Для переэтерификации могут использоваться или химические, или ферментативные способы, при этом в последнем случае используются липазы, которые могут быть специфическими в отношении положения (sn-1/З- или sn-2-специфическими) жирной кислоты в TAG, или предпочитать некоторые жирные кислоты другим (Speranza et al, 2012) .
Фракционирования жирных кислот для увеличения концентрации LC-
PUFA в масле можно достичь с помощью любого из способов,
известных в данной области техники, таких как, например,
кристаллизация при замораживании, комплексообразование,
используя мочевину, молекулярная дистилляция, сверхкритическая
флюидная экстракция и комплексообразование с ионом серебра.
Комплексообразование, используя мочевину, является
предпочтительным способом из-за его простоты и эффективности в уменьшении уровня насыщенных и мононенасыщенных жирных кислот в масле (Gamez et al., 2003) . В начале, TAG масла расщепляются на являющиеся их составными частями жирные кислоты, часто в форме эфиров жирных кислот, с помощью гидролиза или липаз, и эти свободные жирные кислоты или эфиры жирных кислот затем смешиваются со спиртовым раствором мочевины для комплексообразования. Насыщенные и мононенасыщенные жирные кислоты беспрепятственно образуют комплексы с мочевиной и выкристаллизовываются при охлаждении, и могут быть впоследствии удалены с помощью фильтрации. Не образовавшая комплекс с мочевиной фракция, таким образом, является обогащенной LC-PUFA. Гидрогенизация
Гидрогенизация жирных кислот включает обработку водородом, типично в присутствии катализатора. Некаталитическая гидрогенизация происходит только при очень высоких температурах.
Гидрогенизация обычно используется при обработке растительных масел. Гидрогенизация превращает ненасыщенные жирные кислоты в насыщенные жирные кислоты, и в некоторых случаях, трансжиры. Гидрогенизация приводит к превращению жидких растительных масел в твердые или полутвердые жиры, такие как те, которые присутствуют в маргарине. Изменение степени насыщения жира приводит к изменению некоторых важных физических свойств, таких как диапазон температуры плавления, вот почему жидкие масла становятся полутвердыми. Твердые или полутвердые жиры являются предпочтительными для выпекания, поскольку то, каким образом жир смешивается с мукой, создает более желаемую текстуру в хлебобулочном изделии. Поскольку частично
гидрогенизированные растительные масла дешевле жиров из животных источников, имеются в наличии в широком диапазоне консистенций, и обладают другими желательными характеристиками (например, увеличенной устойчивостью к окислению/более длительным сроком хранения), они являются преобладающими жирами, используемыми в качестве разрыхлителя в большинстве коммерческих хлебобулочных изделиях.
В варианте осуществления липид/масло настоящего изобретения не было подвергнуто гидрогенизации. Признаком того, что липид или масло не было подвергнуто гидрогенизации, является отсутствие каких-либо транс-жирных кислот в его TAG.
Применения липидов
Липиды, такие как масло из семени, предпочтительно масло
из семени сафлора, полученное описанными здесь способами, имеют
ряд применений. В некоторых вариантах осуществления липиды
используется в качестве пищевых масел. В других вариантах
осуществления липиды являются очищенными и используются в
качестве смазочных материалов или для других применений, таких
как синтез пластмасс. Он может использоваться при производстве
косметических средств, мыл, смягчителей тканей,
электроизоляционных материалов или детергентов. Он может использоваться для производства химических веществ для сельского хозяйства, таких как поверхностно-активные вещества или эмульгаторы. В некоторых вариантах осуществления липиды подвергают очистке для производства биодизеля. Масло настоящего изобретения может преимущественно использоваться в красках или лаках, поскольку отсутствие линоленовой кислоты означает, что оно не обесцвечивается легко.
Промышленным продуктом, получаемым, используя способ настоящего изобретения, может быть углеводородный продукт, такой как эфиры жирных кислот, предпочтительно метиловые эфиры жирных кислот и/или этиловые эфиры жирных кислот, алкан, такой как метан, этан или более длинноцепочечный алкан, смесь более длинноцепочечных алканов, алкен, биотопливо, окись углерода и/или газообразный водород, биоспирт, такой как этанол, пропанол или бутанол, биоуголь, или комбинация окиси углерода,
водорода и биоугля. Промышленный продукт может представлять собой смесь любых из этих компонентов, такую как смесь алканов, или алканов и алкенов, предпочтительно смесь, которая представляет собой в основном (> 50%) С4-С8 алканы, или в основном С6-С10 алканы, или в основном С6-С8 алканы. Промышленным продуктом не является углекислый газ и вода, хотя эти молекулы могут образовываться при объединении с промышленным продуктом. Промышленный продукт может представлять собой газ при атмосферном давлении/комнатной температуре, или предпочтительно жидкость или твердое вещество, такое как биоуголь, и в технологическом процессе может образовываться комбинация из газового компонента, жидкого компонента и твердого компонента, такая как окись углерода, газообразный водород, алканы и биоуголь, которые можно впоследствии разделить. В варианте осуществления углеводородный продукт представляет собой в основном метиловые эфиры жирных кислот. В альтернативном варианте осуществления углеводородным продуктом является продукт, отличный от метиловых эфиров жирных кислот.
Нагревание может использоваться в ходе процесса, такого как пиролиз, сгорание, газообразование, или вместе с ферментативным расщеплением (в том числе анаэробным расщеплением, компостированием, сбраживанием). Газообразование при более низких температурах имеет место, например, при температурах от приблизительно 7 0 0°С до приблизительно 1000°С. Газообразование при более высоких температурах имеет место, например, при температурах от приблизительно 1200°С до приблизительно 1600°С. Пиролиз при более низких температурах (более медленный пиролиз) имеет место при приблизительно 4 0 0°С, тогда как пиролиз при более высоких температурах имеет место при приблизительно 500°С. Расщепление с использованием мезофильных бактерий имеет место при температурах между приблизительно 2 0°С и приблизительно 4 0°С. Расщепление с использованием термофильных бактерий имеет место при
температурах от приблизительно 50°С до приблизительно 65°С.
Химические способы включают, но без ограничения,
каталитическое растрескивание, анаэробное расщепление, сбраживание, компостирование и переэтерификацию. В варианте осуществления в химическом способе используется катализатор или смесь катализаторов, который может использоваться вместе с нагреванием. В способе может использоваться гомогенный катализатор, гетерогенный катализатор и/или ферментативный катализатор. В варианте осуществления катализатором является катализатор на основе переходных металлов, катализатор типа цеолита, катализатор на основе активированного оксида алюминия или карбонат натрия в качестве катализатора. Катализаторы включают кислотные катализаторы, такие как серная кислота, или щелочные катализаторы, такие как гидроксид калия или натрия или другие гидроксиды. Химический способ может включать переэтерификацию жирных кислот в липиде, при которой может использоваться гомогенный катализатор, гетерогенный катализатор и/или ферментативный катализатор. Превращение может включать пиролиз, при котором используется нагревание и может использоваться химический способ, и может использоваться катализатор на основе переходных металлов, катализатор типа цеолита, катализатор на основе активированного оксида алюминия и/или карбонат натрия в качестве катализатора.
Ферментативные способы включают, но без ограничения, расщепление микроорганизмами, например, при анаэробном расщеплении, сбраживании или компостировании, или с использованием рекомбинатных ферментативных белков.
Биотопливо
Используемый здесь термин "биотопливо" включает биодизель и биоспирт. Биодизель можно создать из масел, происходящих из растений, водорослей и грибов. Биоспирт образуется при сбраживании сахара. Этот сахар можно экстрагировать непосредственно из растений (например, сахарного тростника), получить из крахмала растений (например, кукурузы или пшеницы) или образовать из целлюлозы (например, древесины, листьев или стеблей).
В настоящее время затраты на производство биотоплива выше таковых на производство нефтяного топлива. Помимо затрат на
переработку, служащие источником биотоплива культуры требуют посадки, внесения удобрений, внесения пестицидов и гербицидов, сбора урожая и транспортировки. Растения, водоросли и грибы настоящего изобретения могут уменьшить затраты на производство биотоплива.
Общие методы для производства биотоплива можно найти, например, в Maher and Bressler (2006), Maher and Bressler (2007), Greenwell et al. (2011), Karmakar et al. (2010), Alonso et al. (2010), Lee and Mohamed (2010), Liu et al. (2010), Gong and Jiang (2011), Endalew et al. (2011) и Semwal et al. (2011).
Биодизель
Производство биодизеля, или алкиловых эфиров, хорошо
известно. Существуют три основных пути образования сложных
эфиров из липидов: 1) катализируемая основанием
переэтерификация липида с использованием спирта; 2) непосредственная, катализируемая кислотой переэтерификация липида с использованием метанола и 3) превращение липида в жирные кислоты, а затем в алкиловые эфиры с помощью кислотного катализа.
Может использоваться любой способ приготовления алкиловых эфиров жирных кислот и глицериловых эфиров (в которых этерифицированы одна, две или три гидроксигруппы в глицерине). Например, жирные кислоты можно приготовить, например, посредством гидролиза или омыления триглицеридов с использованием кислотных или щелочных катализаторов, соответственно, или используя фермент, такой как липаза или эстераза. Алкиловые эфиры жирных кислот можно приготовить посредством осуществления реакции жирной кислоты со спиртом в присутствии кислотного катализатора. Алкиловые эфиры жирных кислот можно также приготовить посредством осуществления реакции триглицерида со спиртом в присутствии кислотного или щелочного катализатора. Глицериловые эфиры можно приготовить, например, посредством осуществления реакции глицерина с алкилгалидом в присутствии основания, или с олефином или спиртом в присутствии кислотного катализатора.
В некоторых предпочтительных вариантах осуществления
липиды подвергают переэтерификации для образования метиловых эфиров и глицерина. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления осуществляют реакцию липидов со спиртом (таким как метанол или этанол) в присутствии катализатора (например, гидроксида калия или натрия) для образования алкиловых эфиров. Алкиловые эфиры могут использоваться для биодизеля и смешиваться с нефтяным топливом.
Алкиловые эфиры могут быть непосредственно смешаны с дизельным топливом или промыты водой или другими растворами на водной основе для удаления различных примесей, в том числе катализаторов, до смешивания. Можно нейтрализовать кислотные катализаторы с помощью основания. Однако этот процесс приводит к образованию соли. Во избежание коррозии мотора предпочтительно свести к минимуму концентрацию соли в топливной композиции с добавкой. Соли можно по существу удалить из композиции, например, с помощью промывки композиции водой.
В другом варианте осуществления композицию сушат после ее промывки, например, посредством пропускания композиции через осушитель, такой как сульфат кальция.
Тем не менее, в другом варианте осуществления нейтральную добавку к топливу получают без образования солей или использования стадии промывки, используя полимерную кислоту, такую как Dowex 50(tm), которая представляет собой полимер, который содержит сульфокислотные группы. Катализатор легко удалить с помощью фильтрации после завершения реакций образования сложного эфира и образования простого эфира.
Триацилглицерины растений в качестве источника биотоплива
Использование триацилглицеринов растений для производства биотоплива рассматривается в Durrett et al. (2008) . Вкратце, растительные масла в основном состоят из различных триацилглицеринов (TAG), молекул, которые состоят из трех жирнокислотных цепей (длиной обычно 18 или 16 углеродов), этерифицированных до глицерина. Ацильные (жирнокислотные) цепи химически схожи с алифатическими углеводородами, которые составляют основную часть молекул, встречающихся в бензине и дизеле. Углеводороды в бензине содержат 5-12 атомов углерода на
молекулу, и это летучее топливо смешивается с воздухом и возгорается от искры в обычном моторе. В отличие от них, компоненты дизельного топлива типично содержат 10-15 атомов углерода на молекулу и возгораются в результате очень сильного сжатия, достигаемого в дизельном моторе. Однако большинство TAG растений имеют диапазон вязкости, который намного выше такового обычно дизеля: 17,3-32,9 мм2 сек-1 по сравнению с 1,9-4,1 мм2 сек-1, соответственно (ASTM D975; Knothe and Steidley, 2005). Эта большая вязкость приводит к плохому распылению топлива в современных дизельных двигателях, что приводит к проблемам, являющихся результатом неполного сгорания, таким как нагарообразование и закоксовывание (Ryan et al., 1984) . Для преодоления этой проблемы TAG превращают в менее вязкие эфиры жирных кислот посредством этерификации с использованием первичного спирта, чаще всего метанола. Получаемое в результате топливо обычно называют биодизелем и имеет динамический диапазон вязкости от 1,9 до 6,0 мм2 сек-1 (ASTM D6751) . Метиловые эфиры жирных кислот (FAME), встречающиеся в биодизеле, характеризуются высокой плотностью энергии, отражением чего является большая энергия, выделяемая в виде тепла при их сгорании, которая является схожей, если не выше,
(с) таковой обычного дизеля (Knothe, 2005). Так же цетановое число (показатель воспламеняемости дизеля) FAME, встречающихся в биодизеле, превышает таковое обычного дизеля (Knothe, 2005).
Растительные масла, главным образом, состоят из пяти распространенных жирных кислот, а именно пальмитата (16:0), стеарата (18:0), олеата (18:1), линолеата (18:2) и линолената
(18:3), хотя, в зависимости от конкретного вида, более длинные или более короткие жирные кислоты могут также быть основными компонентами. Эти жирные кислоты отличаются друг от друга по показателю длины ацильной цепи и числу двойных связей, что приводит к различным физическим свойствам. Следовательно, свойства биодизеля, происходящего из смеси жирных кислот, зависят от этого состава. Поэтому изменение жирнокислотного профиля может привести к улучшению свойств топлива - биодизеля, таких как характеристики текучести при низких температурах,
устойчивость к окислению и NOx выделения. Изменение жирнокислотного состава TAG может привести к уменьшению вязкости растительных масел, исключению необходимости в химической модификации, таким образом увеличивая эффективность по стоимости биотоплива. Продукты питания
Липид/масло настоящего изобретения имеет преимущество в применениях в продуктах питания из-за очень высокого содержания олеиновой кислоты в нем и низких уровней линолевой кислоты
( <3,2%) и насыщенных жирных кислот, таких как пальмитиновая кислота, и по существу нулевого уровня линоленовой кислоты. Это придает маслу высокую устойчивость к окислению, обеспечивая меньшую прогорклость и делая его идеальным для применений в продуктах питания, когда требуется нагревание, таких как жарка, например, для картофельной стружки. Масло имеет высокий OSI
(коэффициент устойчивости к окислению), который определяется как интервал времени, в течение которого масло можно держать при 110°С, такой как более 20 или 25 часов, предпочтительно более 30 часов или более 50 часов. Низкие уровни насыщенных жирных кислот по сравнению с другими растительными маслами приносят пользу для здоровья, поскольку насыщенные жирные кислоты были связаны с вредными эффектами на здоровье. Масла также имеют по существу нулевое содержание транс-жирных кислот, что является желательным на некоторых ранках, поскольку трансжирные кислоты были связаны с негативными эффектами на здоровье сердца или повышением LDL-холестерина. Более того, вследствие очень низкого уровня полиненасыщенных жирных кислот, для масла не требуется гидрогенизация для снижения уровней PUFA - в результате такой гидрогенизации образуются транс-жирные кислоты. Масла также являются преимущественными для снижения заболеваемости или тяжести ожирения и диабета. Они также являются желательными для применений в продуктах питания, поскольку они содержат только встречающиеся в природе жирные кислоты (Scarth and Tang, 2006).
Применительно к целям настоящего изобретения, "продукты
питания" включают любой пищевой продукт или продукт для потребления людьми или животными (в том числе для энтерального и/или парентерального питания), который после поступления в организм: (1) служит для питания или наращивания тканей или поставки энергии, и/или (2) сохраняет, восстанавливает или поддерживает соответствующий алиментарный статус или метаболическую функцию. Продукты питания настоящего изобретения включает составы для младенцев и/или новорожденных.
Продукты питания настоящего изобретения включают, например, клетку настоящего изобретения, растение настоящего изобретения, часть растения настоящего изобретения, семя настоящего изобретения, экстракт настоящего изобретения, продукт способа настоящего изобретения или смесь с подходящим носителем(ями). Термин "носитель" используется в его самом широком значении с охватом любого компонента, который может иметь или может не иметь пищевую ценность. Как будет понятно квалифицированному в данной области техники специалисту, носитель должен быть подходящим для применения (или использоваться в достаточно низкой концентрации) в продукте питания, так чтобы он не оказывал вредный эффект на организм, который потребляет продукт питания.
Продукт питания настоящего изобретения включает липид, продуцированный непосредственно или опосредованно, используя методы, клетки или организмы, описываемые здесь. Смесь может находиться или в твердой, или в жидкой форме. Кроме того, смесь может включать годные в пищу питательные макроэлементы, витамины и/или минеральные вещества в количествах, желаемых для конкретного применения. Количества этих или других ингредиентов будут варьировать в зависимости от того, предназначена ли смесь для употребления нормальными индивидуумами или для употребления индивидуумами со специализированными потребностями, такими как индивидуумы, страдающие метаболическими нарушениями и т.п.
Пищевые продукты можно приготовить посредством смешивания масла с одним или более других ингредиентов, так что пищевой продукт включает масло, или смешан с одним или более других ингредиентов для приготовления добавки к пищевому продукту,
такой как приправа к салату или майонез. Пищевой продукт или добавка к пищевому продукту может включать 1-10% или более масла в весовом отношении. Масло может быть смешано с другими растительными маслами для обеспечения оптимального состава или с твердыми жирами, или с пальмовым маслом для обеспечения полутвердого разрыхлителя. Пищевые продукты или добавки к пищевым продуктам, приготовленные из масла, включают приправу к салату, майонез, маргарин, хлеб, торты, печенье, рогалики, хлебобулочные изделия, блинчики или блинные смеси, сладкие соусы, замороженные десерты, немолочные продукты.
Примеры подходящих носителей с пищевой ценности включают, но без ограничения, питательные макроэлементы, такие как съедобные жиры, углеводы и белки. Примеры таких съедобных жиров включают, но без ограничения, кокосовое масло, масло бурачника, масло из грибов, масло черной смородины, соевое масло и моно- и диглицериды. Примеры таких углеводов включают, но без ограничения, глюкозу, годную в пищу лактозу и гидролизованный крахмал. Кроме того, примеры белков, которые могут использоваться в пищевой смеси настоящего изобретения, включают, но без ограничения, соевые белки, подвергнутую электродиализу сыворотку, подвергнутое электродиализу снятое молоко, молочную сыворотку или гидролизы этих белков.
Что касается витаминов и минеральных веществ, в пищевые смеси настоящего изобретения могут быть добавлены следующие вещества: кальций, фосфор, калий, натрий, хлорид, магний, марганец, железо, медь, цинк, селен, йод и витамины А, Е, D, С и комплекс витаминов группы В. Могут быть также добавлены другие такие витамины.
Компоненты, используемые в пищевых смесях настоящего изобретения, могут быть из полуочищенного или очищенного источника. Под полуочищенным или очищенным подразумевается материал, который был приготовлен с помощью очистки из природного материала.
Пищевая смесь настоящего изобретения может быть добавлена в пищевой продукт, даже когда пополнение рациона не требуется. Например, смесь может быть добавлена в пищевой продукт любого
типа, в том числе, но без ограничения, маргарин, модифицированное масло, сыры, молоко, йогурт, шоколад, конфеты, закуску, масла для салатов, масла для кулинарии, кулинарные жиры, мясо, рыбу и напитки.
Кроме того, липид, продуцированный в соответствии с настоящим изобретением, или клетки-хозяева, трансформированные, чтобы они содержали и экспрессировали рассматриваемые гены, могут также использоваться в качестве добавок к корму для животных для изменения жирнокислотного состава ткани или молока животного или жирнокислотного состава яиц, до состава, более желательного для потребления людьми или животными, или для здоровья и благополучия животных. Примеры таких животных включают овцу, крупный рогатый скот, лошадей, домашнюю птицу, домашних животных, таких как собаки и кошки и т.п.
Кроме того, продукты питания настоящего изобретения могут использоваться при рыборазводе для увеличения уровней жирных кислот у рыб для потребления людьми или животными.
Предпочтительными продуктами питания настоящего
изобретения являются растения, семя и другие части растения, такие как листья, плоды и стебли, которые могут использоваться непосредственно в качестве пищевого продукта или корма для людей или других животных. Например, животные могут пастись непосредственно в поле с такими растениями, или ими могут подаваться более определенные количества при контролируемой подаче корма.
Композиции
Настоящее изобретение также охватывает композиции, в частности, фармацевтияческие композиции, включающие один или более липидов или масел, продуцированных, используя способы настоящего изобретения.
Фармацевтическая композиция может включать один или более
липидов, в комбинации со стандартным, хорошо известным,
нетоксичным фармацевтически приемлемым носителем,
вспомогательным средством или наполнителем, таким как забуференный фосфатом солевой раствор, вода, этанол, полиолы, растительные масла, смачивающий реагент или эмульсия, такая как
эмульсия вода/масло. Композиция может находиться или в жидкой, или твердой форме. Например, композиция может находиться в форме таблетки, капсулы, принимаемой внутрь жидкости, порошка, мази для местного применения или крема. Подходящую текучесть можно поддерживать, например, сохраняя требуемый размер частиц в случае дисперсий и используя поверхностно-активные вещества. Может быть также желательным включение агентов для придания изотоничности, например, Сахаров, хлорида натрия и т.п. Помимо таких инертных растворителей, композиция может также включать вспомогательные средства, такие как смачивающие реагенты, эмульгаторы и суспендирующие средства, подсластители, корригенты и ароматизаторы.
Суспензии, помимо активных соединений, могут включать
суспендирующие агенты, такие как этоксилированные
изостеариловые спирты, полиоксиэтиленовые эфиры сорбита и сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагакант, или смеси этих веществ.
Твердые лекарственные формы, такие как таблетки и капсулы, можно приготовить, используя методы, хорошо известные в данной области техники. Например, липид, продуцированный в соответствии с настоящим изобретением, можно таблетировать с обычными основами для таблеток, такими как лактоза, сахароза и кукурузный крахмал, в комбинации со связующими веществами, такими как аравийская камедь, кукурузный крахмал или желатин, дезинтегрирующими агентами, такими как картофельный крахмал или алгиновая кислота, и смазывающим материалом, таким как стеариновая кислота или стеарат магния. Капсулы можно приготовить посредством включения этих наполнителей в желатиновую капсулу вместе с антиоксидантами и соответствующим липидом(ами).
Для внутривенного введения, липиды, продуцированные в соответствии с настоящим изобретением, или их производные можно включить в коммерческие препараты.
Типичная доза конкретной жирной кислоты составляет от 0,1 мг до 2 0 г, принимаемых от одного до пяти раз в день (вплоть до
100 г ежедневно), и предпочтительно находится в диапазоне от приблизительно 10 мг до приблизительно 1, 2, 5 или 10 г ежедневно (принимаемых в одной или множестве доз). Как известно в данной области техники, минимальное количество, составляющее приблизительно 300 мг/день жирной кислоты, является желательными. Однако будет понятно, что любое количество жирной кислоты принесет пользу субъекту.
Возможные способы введения фармацевтических композиций настоящего изобретения включает, например, энтеральный и парентеральный. Например, жидкий препарат может водиться перорально. Кроме того, гомогенная смесь может быть полностью диспергирована в воде, смешана в стерильных условиях с физиологически приемлемыми разбавителями, консервантами, буферами или газами-вытеснителями для образования аэрозоля или лекарственной формы для ингаляции.
Вводимую субъекту дозу композиции может определить специалист со средним уровнем компетентности в данной области техники, и она зависит от различных факторов, таких как вес, возраст, общее состояние здоровья, анамнез, иммунный статус и т.д. субъекта.
Кроме того, композиции настоящего изобретения могут использоваться с косметической целью. Композиции могут быть добавлены в предсуществующие косметические препараты, так что образуется смесь, или жирная кислота, полученная в соответствии с настоящим изобретением, может использоваться в качестве единственного "активного" ингредиента в косметическом препарате
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Общие материалы и методы Растительные материалы и условия выращивания Растения сафлора (Carthamus tinctorius) генотипы SU, S-317, S-517, LeSaf496, CW99-OL и Ciano-OL выращивали из семени в теплице в перлитной и супесчаной почвенной смеси с использованием цикла дня и ночи 16 часов (25°С)/8 часов (22°С) . Сорт SU дикого типа, который является сортом с высоким содержанием линолевой кислоты, был получен из Heffernan Seeds в
NSW. Семена PI 603208 (LeSaf496, АТС 120562) и CW 99-OL (АТС 120561) были получены из Australian Temperate Field Crops Collection.
Ткани растений для экстракции ДНК и РНК, включающие листья, корни, семядоли и гипокотили, собирали из проростков сафлора через 10 дней после прорастания. Цветочные головки получали в первый день открытия цветка, а развивающиеся зародыши собирали на трех стадиях развития через 7 (ранней), 15 (средней) и 2 0 (поздней) дней после пыления (DPA). Образцы сразу же замораживали в жидком азоте и хранили при -8 0°С до выполнения экстракции ДНК и РНК.
Цветки сафлора являются трубчатыми и в значительной степени самоопыляющимися с составляющим, как правило, менее 10% аутокроссингом (Knowles 1969). Насекомые, но не ветер, могут увеличить степени ауткроссинга в поле. Не подвергнутое опылению рыльце может оставаться рецептивным в течение нескольких дней. Каждая головка (головка сафлора) содержит приблизительно 15-30 семянок. Масса развивающегося семени в растении быстро увеличивается во время первых 15 дней после цветения. Содержание масла увеличивается в 5-10 раз во время периода 1015 дней после DAP и достигает максимального уровня в приблизительно 28 день после DPA (Hill and Knowles 1968). Сафлоровое семя и растения являются физиологически зрелыми через приблизительно 5 недель после цветения, и семя готово к сбору, когда большинство листьев становится коричневыми, и оттенок зеленого цвета остается лишь на прицветниках самых поздних цветочных головок. Семена без труда собирали, растирая головки рукой.
Липидный анализ
Выделение образцов липидов из отдельных семян для быстрого анализа жирнокислотного состава
После сбора по достижении зрелости растения семена сафлора сушили, храня семена в течение 3 дней при 37°С и впоследствии при комнатной температуре, если не анализировали сразу же. Отдельные семена или объединенные семена раздавливали между
фильтровальными бумагами небольшого размера, и образцы выделенного масла из семени, которые впитались в бумаги, анализировали в отношении жирнокислотного состава с помощью способов GC, описанных ниже.
Выделение всех липидов из половин семядолей после прорастания
С целью скрининга, например, семян потомков трансгенных растений семена сафлора проращивали на влажной фильтровальной бумаге в чашке Петри в течение 1 дня. Из каждого пророщенного семени осторожно извлекали семядолю для липидного анализа. Оставшуюся часть каждого проростка переносили в почву, и получающиеся в результате растения выращивали до достижения зрелости с последующим сбором семян для поддержания трансгенной линии.
Экстракция масла из семян, используя устройство Soxhlet. Для количественной экстракции масла из семени собранные
семена сафлора сушили в духовке при 105°С в течение ночи и затем измельчали в Puck Mill в течение 1 мин. Измельченный материал семян (~250 грамм) собирали в предварительно взвешенный стакан и взвешивали до экстракции масла. После добавления слоя хлопковой ваты наверх муки, масло экстрагировали в устройстве для экстракции Soxhlet с использованием растворителя (Уайт-спирита 40-60 С) , в начале при 70-80°С. Затем смесь нагревали в течение ночи в сосуде с обратным холодильником с растворителем, переливающимся через сифон с колбу для экстракции каждые 15-2 0 мин. Растворенное, экстрагированное масло извлекали выпариванием растворителя, используя роторный испаритель, под вакуумом. Вес экстрагированного масла измеряли, и определяли масличность. Для определения жирнокислотного состава экстрагированного масла небольшие аликвоты разводили в хлороформе и анализировали с помощью газовой хроматографии.
Выделение всех липидов из материала листьев Образцы тканей листьев лиофилизировали, взвешивали, и все липиды экстрагировали из образцов с сухим весом, составляющим
приблизительно 10 мг, как описано Bligh и Dyer (1959). Фракционирование липидов
Когда это было необходимо, фракции TAG отделяли от других
липидных компонентов, используя систему для тонкослойной
хроматографии (TLC) на двухфазных, предварительно покрытых
пластинах силикатного геля (Silica gel 60, Merck).
Хроматографию образца экстрагированного липида, эквивалентный
10 мг сухого веса ткани листьев, осуществляли в первой фазе с
использованием гексана/диэтилового эфира (98/2 в объемном
отношении) для удаления неполярных восков и затем во второй
фазе, используя гексан/диэтиловый эфир/уксусную кислоту
(70/30/1 в объемном отношении). Когда это было необходимо,
полярные липиды отделяли от неполярных липидов в образцах
липидов, экстрагированных из эквивалента 5 мг сухого веса
листьев, используя двумерную TLC (Silica gel 60, Merck),
используя хлороформ/метанол/воду (65/25/4 в объемном отношении)
для первого направления и
хлороформ/метанол/ЫЩОН/этилпропиламин (130/70/10/1 в объемном отношении) для второго направления. Липидные споты, и соответствующие стандарты, анализируемые на тех же пластинах для TLC, визуализировали посредством кратковременного подвергания воздействию паров йода, собирали в пробирки и подвергали переэтерификации для получения FAME для анализа с помощью GC, как указано ниже.
Приготовление метиловых эфиров жирных кислот (FAME) и анализ с использованием газовой хроматографии (GC)
Для анализа жирнокислотного состава с помощью GC образцы экстрагированных липидов, приготовленные как описано выше, переносили в стеклянную пробирку и подвергали переметилированию в 2 мл 1М НС1 в метаноле (Supelco) при 80°С в течение 3 часов. После охлаждения при комнатной температуре, в каждую пробирку добавляли 1,3 мл 0,9% NaCl и 800 мкл гексана, и FAME экстрагировали в гексановую фазу. Для определения жирнокислотного состава FAME разделяли с помощью газовой хроматографии (GC), используя газовый хроматограф Agilent
Technologies 7890A (Palo Alto, California, США), снабженный 30-м колонкой ВРХ70, по существу как описано Zhou и др. (2011), за исключением того, что программа вывода на температурный режим была заменена на первоначальную температуру при 150°С, сохранение в течение 1 мин, линейное изменение 3°С/мин до 210°С, затем 50°С/мин до 240°С на протяжении конечного сохранения в течение 2 мин. Пики количественно анализировали, используя программное обеспечение Agilent Technologies ChemStation (Rev В.03.01 (317), Palo Alto, California, США) . Отклики пиков были схожими в случае жирных кислот аутентичного стандарта-411 Nu-Check GLC (Nu-Check Prep Inc, MN, США) , который содержал равные доли 31 метиловых эфиров различных жирных кислот, включая 18:1, 18:0, 20:0 и 22:0, используемого для калибровки. Долю каждой жирной кислоты в образцах рассчитывали на основе отдельных и общих площадей пиков для жирных кислот.
Анализ FAME с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии
Подтверждение положений двойных связей в FAME с помощью модификации с использованием 2,4-диметилоксалозолина (DMOX) и анализа с помощью GC-MS выполняли, как описывалось ранее (Zhou et al., 2011), за исключением использования Shimadzu GC-MS QP2010 Plus, оснащенного 30-м колонкой ВРХ70. Температура в колонке была запрограммирована на первоначальную температуру при 150°С в течение 1 мин, линейное изменение со скоростью 5°С/мин до 200°С, а затем 10°С/мин до 240°С с сохранением в течение 5 мин. Масс-спектры получали и обрабатывали с помощью программного обеспечения GCMSsolution (Shimadzu, Version 2.61). Свободные жирные кислоты и стандарты FAME покупали у Sigma-Aldrich (St. Louis, МО, США).
Анализ видов липидов с помощью LC-MS
Зрелые отдельные семена подвергали липидомному анализу, используя LC-MS, в School of Botany, University of Melbourne. Все липиды экстрагировали, как описано Bligh и Dyer (1959), и растворяли в СНС1з. Аликвоты, каждая составляющая один мг липида, сушили с использованием N2, растворяли в 1 мл 10 мМ
бутилированного гидрокситолуола в смеси бутанол:метанол (1:1 в объемном отношении) и анализировали, используя LC-MS с использованием трех квадруполей и ионизации методом электрораспыления Agilent 1200 серий LC и 6410В. Липиды хроматографически разделяли, используя колонку Ascentis Express RP-Amide (5 см х 2,1 мм, Supelco) и градиент с двумя переменными со скоростью потока, составляющей 0,2 мл/мин. Подвижными фазами были: А, 10 мМ формат аммония в смеси НгО:метанол:тетрагидрофуран (50:20:30, в объемном отношении); В. 10 мМ формат аммония в смеси НгО:метанол:тетрагидрофуран (5:20:75, в объемном отношении). Выбранные нейтральные липиды (TAG и DAG) и фосфохолин (PC) с жирными кислотами 16:0, 16:1 18:0, 18:1, 18:2, 18:3 анализировали посредством мониторинга множественных реакций (MRM), используя энергию столкновения=25 В и фрагментор 135 В. Отдельные TAG и DAG при MRM идентифицировали на основе содержащего аммоний иона-предшественника и иона - продукта потери нейтральной частицы жирной кислоты. TAG и DAG количественно анализировали, используя внешний стандарт - 10 мкМ тристеарин.
Анализ содержания стеролов в образцах масла
Образцы, каждый составляющий приблизительно 10 мг масла,
вместе с добавленной аликвотой С24:0 монола в качестве
внутреннего стандарта подвергали сапонифекации, используя 4 мл
5% КОН в 80% МеОН и нагревая в течение 2 ч при 80°С в
стеклянной пробирке с завинчивающейся крышкой с тефлоновым
покрытием. После охлаждения реакционной смеси добавляли 2 мл
воды Milli-Q, и стеролы экстрагировали в 2 мл смеси
гексан:дихлорметан (4:1 в объемном отношении), встряхивая и
перемешивая на вортексе. Смесь центрифугировали, и экстракт
стеролов извлекали и промывали 2 мл воды Milli-Q. Экстракт
стеролов затем извлекали после встряхивания и
центрифугирования. Экстракт выпаривали, используя струю газообразного азота, и стеролы силилировали, используя 200 мл BSTFA и нагревая в течение 2 ч при 8 0°С.
Для анализа с помощью GC/GC-MS стеролов производные
стерол-OTMSi сушили под струей газообразного азота в термоблоке при 4 0°С и затем вновь растворяли в хлороформе или гексане непосредственно перед анализом с помощью GC/GC-MS. Производные стерол-OTMS анализировали с помощью газовой хроматографии (GC), используя Agilent Technologies 6890А GC (Palo Alto, California, США) , оснащенную кварцевой капиллярной колонкой Supelco
Equity(tm)-1 (15 мх 0,1 мм внутренний диаметр, 0,1 мкм толщина фазы), FID, инжектором для ввода проб с делением/без деления потока и автоматическим дозатором и инжектором Agilent Technologies 7 683В серии. Газом-носителем был гелий. Образцы вводили без деления потока при температурном режиме термостата=120°С. После введения температурный режим термостата повышали до 270°С со скоростью 10°С/мин и наконец, до 300°С со скоростью 5°С/ми. Пики количественно анализировали, используя программное обеспечение Agilent Technologies ChemStation (Palo Alto, California, США) . Результаты GC допускают наличие погрешности, составляющей ±5% от площадей отдельных компонентов.
GC-масс-спектрометрические (GC-MS) анализы выполняли на Thermoquest GCQ GC-MS и Finnigan Thermo Electron Corporation GC-MS; обе системы были оснащены инжектором для ввода пробы непосредственно в колонку и программным обеспечением Thermoquest Xcalibur (Austin, Texas, США). Каждая GC была оснащена капиллярной колонкой с полярностью, схожей с таковой, описанной выше. Отдельные компоненты идентифицировали, используя масс-спектральные данные, и посредством сравнения данных, касающихся времени удержания, с таковыми, полученными для аутентичных и лабораторных стандартов. Относящийся к полной процедуре холостой анализ выполняли одновременно с серией образцов.
Количественный анализ TAG с помощью Iatroscan (ятроскана) Один мкл каждого экстракта из растений наносят на одну пластину Chromarod-SII для TLC-FID Iatroscan(tm) (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Япония). Затем держатель для Chromarod переносят в уравновешенную проявительную камеру,
содержащую 7 0 мл системы растворителей гексан/СНС1з/2-пропанол/муравьиная кислота (85/10,716/0,567/0,0567 в объемном отношении). После инкубации в течение 30 мин держатель для Chromarod затем сушат в течение 3 мин при 100°С и сразу же сканируют в анализаторе Iatroscan MK-6s TLC-FID (Mitsubishi Chemical Medience Corporation - Япония). Площади пиков внутреннего стандарта DAGE и TAG объединяют, используя программное обеспечение для объединения SIC-480II (Version:7.0-Е SIC System instruments Co., LTD - Япония).
Количественный анализ TAG выполняют в два этапа. Сначала, сканируют внутренний стандарт DAGE во всех образцах для внесения поправок в выходы экстракции, после чего сконцентрированные образцы TAG выбирают и разводят. Затем количество TAG определяют в разведенных образцах с помощью второго сканирования в соответствии с калибровкой с использованием глицерилтрилинолеата в качестве внешнего стандарта (Sigma-Aldrich).
Экспрессия генов FAD2 - кандидатов в Saccharomyces cerevisiae
Фрагменты ДНК, содержащие полные открытые рамки считывания кДНК для ЕА02-кандидатов, вырезали из вектора pGEMT-easy в виде EcoRI-фрагментов и встраивали в соответствующий сайт вектора pENTRll (Invitrogen, Carlsbad, СА, США) . Затем вставки клонировали в целевой экспрессионный вектор pYES2-DEST52, с помещением открытых рамок считывания под контроль промотора GAL1 для индуцируемой экспрессии генов в дрожжевых клетках, используя рекомбинационную технологию клонирования Gateway(r) (Stratagene, La Jolla, СА, США) . Последовательности генов в результирующих плазмидах подтверждали с помощью секвенирования ДНК. Результирующие плазмиды и вектор pYES2-DEST52, в котором отсутствует какая-либо вставка кДНК, в качестве контроля вводили в клетки штамм YPH499 дрожжей Saccharomyces cerevisiae посредством трансформации с использованием ацетата лития. Экспрессия этих генов ЕА02-кандидатов в дрожжевых клетках с подачей экзогенного субстрата - жирных кислот или без нее была
по существу такой, которая была описана ранее Zhou и др. (2006). Каждый эксперимент проводили в трех повторах.
Экспрессия генов в клетках растений в системе для транзиторной экспрессии
Гены экспрессировали в клетках листьев Nicotiana benthamiana, используя систему для транзиторной экспрессии, по существу как описано Voinnet и др.. (2003) и Wood и др. (2009). Вектор для конститутивной экспрессии вирусного белка-супрессора сайленсинга, Р19, под контролем промотора CaMV 35S, был получен из лаборатории Peter Waterhouse, CSIRO Plant Industry, Canberra, Австралия. Химерный бинарный вектор 35S:P19 вводили в штамм AGL1 Agrobacterium tumefaciens. Все другие бинарные векторы, содержащие кодирующую область, которая должна быть экспрессирована в клетках растений с промотора, часто промотора 35S, также вводили в штамм AGL1 A. tumefaciens. Рекомбинантные клетки выращивали до стационарной фазы при 2 8°С в 5 мл бульона LB, дополненного 50 мг/л рифампицина и либо 50 мг/л канамицина, либо 8 0 мг/л спектиномицина в соответствии с геном-селектируемым маркером в бинарном векторе. Бактерии из каждой культуры осаждали с помощью центрифугирования при ЗОООхд в течение 5 мин при комнатной температуре до ресуспендирования в 1,0 мл буфера для инфильтрации, содержащего 5 мМ MES, рН 5,7, 5 мМ MgSC> 4 и 100 мкМ ацетосирингон. Культуры ресуспендированных клеток затем инкубировали при 2 8°С со встряхиванием в течение еще 3 часов. 10-кратное разведение каждой культуры в буфере для инфильтрации затем смешивали с равным объемом культуры 35S:P19, разведенной так же, и смеси использовали для инфильтрации в нижнюю сторону полностью развившихся листьев N. benthamiana. Смешанные культуры, включающие гены, которые должны быть экспрессированы, включали конструкцию 35S:P19 в Agrobacterium, кроме особо оговоренных случаев. Контрольные инфильтрации включали только конструкцию 35S:P19 в Agrobacterium.
Инфильтрацию листьев осуществляли с использованием смесей клеток Agrobacterium, и растения типично выращивали в течение еще пяти дней после инфильтрации, до получения листовых дисков
для выделения всех липидов и анализа жирных кислот. Растения N. benthamiana выращивали в камерах для выращивания при постоянной температуре 24°С с использованием цикла свет/темнота - 14/10 с интенсивностью освещения, составляющей приблизительно 200 люкс, используя освещение - флуоресцентные лампы мягкого белого свечения Osram, размещенные непосредственно над растениями. Типично растения возрастом б недель использовали для экспериментов, и осуществляли инфильтрацию надлежащих листьев, которые были почти полностью развившимися. Все не подвергнутые инфильтрации листья удаляли после инфильтрации во избежание затемнения.
Количественная ПЦР в режиме реального времени Анализ экспрессии генов выполняли с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, используя систему для детектирования продуктов ПЦР в режиме реального времени BIORAD СFX9 б(tm) и iQTM SYBR(r) Green Supermix (BioRad, Hercules, СА, США) . Праймеры длиной 19-2 3 нуклеотидов и с температурой плавления (Тт), составляющей приблизительно 65°С, были разработаны для ген-специфических амплификаций, которые будут приводить к продуктам амплификации размером приблизительно 10 02 00 п. о. Реакции ПЦР выполняли в 9б-луночных планшетах. Все реакции количественные ПЦР в режиме реального времени выполняли в трех повторах. Реакционная смесь содержала lxiQTM SYBR(r) Green Supermix (BioRad, Hercules, СА, США), 5 мкМ прямого и обратного праймеров и 400 нг кДНК, и ее использовали в объеме 10 мкл на лунку. Условиями циклического изменения температуры были 95°С в течение 3 мин, с последующими 4 0 циклами 95°С в течение 10 сек,
60°С в течение 30 сек и 68°С в течение 30 сек. Контроль специфичности амплификации с помощью ПЦР осуществляли с помощью анализа кривой плавления, после конечной стадии ПЦР с увеличением температуры от 60°С до 95°С включительно со скоростью 0,1°С/сек. Кроме того, степень чистоты продуктов ПЦР также проверяли с помощью электрофореза в агарозном геле, и продукты ПЦР подтверждали с помощью секвенирования.
Конститутивно экспрессируемый ген KASII использовали в качестве эндогенного контроля для нормализации уровней экспрессии. Данные также калибровали относительно уровня экспрессии
о -AACt г*
соответствующего гена, следуя 2 способу для определения
относительных количеств (Schmittgen, 2 008) . Данные были
представлены в виде среднего значения ± SD
(среднеквадратическое отклонение) трех реакций, выполненных в независимых 9б-луночных планшетах.
Выделение ДНК и анализ с помощью блоттинга по Саузерну Геномную ДНК проростков сафлора, генотип "SU", выделяли из полностью развившихся листьев, используя буфер СТАВ и следуя способу, описанному Paterson и др. (1993) . Дальнейшую очистку выполняли, используя градиенты CsCl, как ранее описывалось (Liu et al. , 1999) . Аликвоты, каждая 10 мкг геномной ДНК сафлора, расщепляли по отдельности с использованием восьми различных рестриктаз, а именно AccI, Bglll, BamHI, EcoRI, EcoRV, Hindlll, Xbal и Xhol. Геномную ДНК, расщепленную каждой рестриктазой, подвергали электрофорезу через 1% агарозный гель. Гель погружали в 0,5М NaOH, 1,5М NaCl на 30 мин, и ДНК блоттировали на нейлоновую мембрану Hybond-N+ (Amersham, Соединенное Королевство). Фильтры зондировали с использованием а-Р3^ dCTP-меченного фрагмента ДНК, соответствующего всей кодирующей области гена CtFAD2-6 сафлора в качестве типичного представителя семейства генов CtFAD2, в условиях гибридизации пониженной жесткости. Гибридизацию выполняли в течение ночи при 65°С в растворе, содержащем бх SSPE, 10% раствор Денхардта, 0,5% SDS и 100 мкг/мл денатурированной ДНК молок лосося. После гибридизации и после кратковременной промывки в 2х SSC/0,1% SDS при 50°С, фильтры трижды промывали, каждый раз в течение 2 0 мин, в 0,2 х SSC/0,1% SDS при 50°С до авторадиографии. Трансформация сафлора и Arabidopsis thaliana Химерные векторы, включающие гены, используемые для трансформации Arabidopsis, вводили в A. tumefaciens штамм AGL1, и клетки культур трансформированных Agrobacterium использовали для обработки растений A. thaliana (экотипа Columbia),
используя способ погружения цветков для трансформации (Clough and Bent, 1998). Трансформированные растения сафлора получали, как описано Belide и др.. (2011), используя трансформированные культуры Agrobacterium.
Пример 2. Выделение кДНК сафлора, которые являются кандидатами на кодирование FAD2
Экстракция тотальной РНК и синтез кДНК
Для продуцирования кДНК из сафлора тотальную РНК выделяли из 100 мг образцов замороженных тканей сафлора, включая развивающиеся зародыши, листья, корни и гипокотили. Это было сделано для каждой ткани в отдельности, используя набор для выделения тотальной РНК растений RNeasy(r) (Qiagen, Hilden, Германия), в соответствии с протоколом поставщика. Концентрацию РНК в препаратах определяли с помощью спектрофотометра ND1000 NanoDrop(tm) (Thermo Fisher Scientific, Victoria, Австралия), и концентрации РНК делали равными до анализа. Качество и относительные количества РНК в каждом препарате визуализировали с помощью гель-электрофореза образцов через 1% (в отношении веса к объему) агарозные гели, содержащие формальдегид. Препараты РНК обрабатывали не содержащей РНКазу RQ1 ДНКазой (Qiagen, Hilden, Германия) для удаления загрязняющей геномной ДНК. Первую цепь кДНК синтезировали из 4 00 нг каждого препарата РНК, не содержащего ДНК, используя систему Superscript III First-Strand Synthesis System (Qiagen, Hilden, Германия) вместе с праймером олиго (dT) гол следуя инструкциям производителя.
Выделение экспрессируемой в семени кДНК для FAD2 из библиотеки кДНК развивающегося семени
В начале, экспрессируемая в семени кДНК для FAD2 сафлора была получена посредством скрининга библиотеки кДНК, происходящих из развивающихся зародышей сафлора генотипа "SU" (дикого типа, с высокими уровнями линолевой кислоты). Конструирование библиотеки начинали с экстракции РНК из смеси недоразвившихся зародышей различных стадий развития, которые собирали и размельчали в порошок в жидком азоте, и экстракцию РНК осуществляли, используя TRIzol, следуя инструкциям
производителя (Invitrogen, Carlsbad, СА, США) . Поли (А) -содержащую РНК выделяли, используя набор для очистки мРНК Qiagen (Qiagen, Hilden, Германия).
Первую цепь кДНК, праймером для синтеза которой служил олиго^Т), синтезировали и превращали в двухцепочечную ДНК, используя набор для синтеза кДНК Stratagene, в соответствии с инструкциями производителя (Stratagen, La Jolla, СА, США) . кДНК с тупыми концами лигировали с EcoRI-адаптерами, фосфорилировали и фракционировали по размерам с помощью гель-фильтрации на колонке Chroma spin+TE-400 (Clontech, СА, США). Количество рекомбинантных кДНК увеличивали в Е. coli штамме XL-1 Blue MRF', используя набор для клонирования Stratagene Predigested Lambda ZAP II/EcoRI/CIAP.
Для идентификации клонов FAD2 библиотеку подвергали скринингу, используя фрагмент ДНК, соответствующий кодирующей области FAD2 Arabidopsis (идентификационный № в GenBank L26296), следуя ранее описанному протоколу (Liu et al. , 1999) . Позитивные бляшки очищали с использованием двух следующих один за другим циклов скрининга, и очищенные фагемиды, содержащие кДНК для предполагаемых FAD2, выделяли, как описано в
руководстве для набора для синтеза кДНК XZAPII Stratagene. Анализ последовательностей FAD2 осуществляли с помощью программы NCBI Blast (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST / ) . Открытая рамка считывания была предсказана, используя VectorNTI. Две различные полноразмерные кДНК были выделены из библиотеки кДНК развивающегося семени и названы CtFAD2-l и CtFAD2-2, соответственно.
Идентификация EST (экспрессируемых маркерных
последовательностей) для генов ЕАР2-кандидатов
Для идентификации дополнительных кДНК для FAD2-кандидатов была детально исследована база данных, касающихся экспрессируемых маркерных последовательностей (EST), сафлора Compositae Genome Project (CGP) (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.), используя программу BLASTp для EST, которые кодировали полипептиды, обладающие сходством с FAD2 A. thaliana
(идентификационный № в GenBank - L2 62 96). По крайней мере одиннадцать различных контингов последовательностей кДНК для FAD2 было идентифицировано, среди которых два континга продемонстрировали идентичные последовательности с CtFAD2-l и CtFAD2-2, выделенными из библиотеки кДНК семени сафлора. Кроме того, девять различных кДНК были идентифицированы и обозначены как CtFAD2-3 - CtFAD2-ll, соответственно.
3'- и 5'-RACE (быстрая амплификация концов кДНК).
Клон самой длинной EST из каждого из 9 контингов (с CtFAD2-3 по CtFAD2-ll, включительно) был выбран в качестве исходной точки для выделения соответствующих полноразмерных последовательностей кДНК. В этом процессе использовалась 3'- и 5'-быстрая амплификация концов кДНК (RACE), используя кДНК, продуцированную с РНК, полученной из различных тканей сафлора, включая развивающиеся зародыши, листья, корни, гипокотили и цветки. Специфические для гена праймеры (GSP) были сконструированы, исходя из клона самой длинной EST из каждого континга. 3'-RACE выполняли, используя набор для ПЦР в режиме реального времени в один прием, следуя инструкциям производителя (Bioline, London, Соединенное Королевство). Специфический для гена праймер (GSP) использовали в первом цикле амплификации с помощью ПЦР для каждой из выбранных EST в комбинации с праймером поли^Т) с сайтом для NotI на его 3'-конце. Второй цикл ПЦР выполняли на продукте первого цикла, используя "вложенный" GSP в комбинации с праймером поли^Т) . GSP для 3' RACE перечислены в таблице 2.
Клонирование 5'-конца кДНК для CtFAD2-6 выполняли с помощью набора 5' RACE System Kit (Invitrogen, Carlsbad, СА, США). Только мРНК для CtFAD2-6 была подвергнута обратной транскрипции в кДНК, используя специфический для гена праймер GSP1, 5'-ACCTAACGACAGTCATGAACAAG-3' (SEQ ID N0: 7 6) . "Вложенный" специфический для гена праймер GSP2, 5'-GTGAGGAAAGCGGAGTGGACAAC-3' (SEQ ID N0: 77), использовался в первой амплификации с помощью ПЦР. В условиях реакции использовался горячий старт при 95°С в течение 4 мин до
добавления полимеразы, 33 циклов денатурации при 94°С в течение 4 5 сек, отжига при 55°С в течение 1 мин и удлинения цепи при
72°С в течение 2 мин.
Амплифицированные 3' и 5' фрагменты субклонировали в вектор pGEM-Teasy и секвенировали в обоих направлениях. Сравнение последовательностей 3'- и 5'-концов клонированных фрагментов с соответствующими EST указало на перекрывающиеся районы, которые совпадали друг с другом, что обеспечило тем самым 3' и 5' последовательности для каждого гена и позволило собрать предполагаемую полноразмерную последовательность для каждой из 11 кДНК.
Выделение полноразмерных последовательностей кДНК для генов CtFAD2-KaHflHflaTOB
Для выделения полноразмерных кодирующих белки областей для девяти генов CtFAD2 ORF (открытые рамки считывания) амплифицировали, используя набор для ПЦР в режиме реального времени в один прием, используя тотальную РНК, происходящую из нескольких тканей сафлора, включая развивающиеся зародыши, листья, корни, гипокотили и цветки (Stratagene, La Jolla, СА, США) . Праймеры (таблица 3), используемые для амплификации ORF, были основаны на последовательностях ДНК, находящихся в 5' и 3' UTR каждой кДНК. Амплифицированные продукты ПЦР клонировали в вектор pGEM-Teasy(r), и их нуклеотидные последовательности получали с помощью секвенирования ДНК.
Характеристики последовательностей ЕАР2-кандидатов из сафлора
Характеристики 11 кДНК суммированы в таблице 4, а полипептидов в таблице 5.
Предсказанные аминокислотные последовательности кодируемых
полипептидов QFAD2-1-QFAD2-11 продемонстрировали большую
степень идентичности последовательностей, составляющую от
приблизительно 44% до 8 6% идентичности друг с другом. Они
продемонстрировали составляющую 53-62% идентичность
последовательностей с FAD2 Arabidopsis. Размеры предсказанных полипептидов находились в диапазоне от 372 до 38 8 аминокислот,
т.е. все они были длиной, составляющей приблизительно 38 0
аминокислотных остатков. кДНК имели уникальные
последовательности 5' и 3' нетранслируемых районов (UTR), по этой причине эндогенные гены можно было легко опознать по их последовательностям UTR. Амплификация кодирующих белки областей из геномной ДНК сафлора привела к последовательностям ДНК, идентичным с соответствующей кДНК, для каждого из 11 генов, что означает, что не было интронов, прерывающих их кодирующие белки области.
Характеристики кДНК для РА02-кандидатов из сафлора
Название Длина кДНК Кодирующая Размер Размер Положение Размер ORF нуклеотидная
гена (нуклеотидов) белок область 5'UTR 3'UTR интрона интрона SEQ ID NO
Характеристики полипептидов С1РА02-кандидатов.
Название Длина полипептида Положение Положение Положение ( & Аминокислотная
гена (количество ( & последовательность) ( & последовательность) последовательность) SEQ ID NO
аминокислот) от первого His-бокса от второго His-бокса от третьего His-бокса
QFAD2-1
380
105
141 HRRHH
315 HVVHH
HECGH*
QFAD2-2
384
106 HECGH
142 HRRHH
316 HVTHH
QFAD2-3
381
104 HECGH
140 HRTHH
314 HAVHH
QFAD2-4
380
103 HECGH
139 HRTHH
313 HAVHH
QFAD2-5
375
102 HDCGH
138 HRTHH
311 HVVHH
QFAD2-6
376
101 HDLGH
137 HRSHH
310 HVVHH
QFAD2-7
372
99 HECGH
135 HRTHH
308 HAVHH
QFAD2-8
382
103 HECGH
139 HRTHH
313 HAVHH
QFAD2-9
387
107 HECGH
143 HRTHH
318 HAVHH
QFAD2-
380
104 HECGH
140 HRRHH
314 HVVHH
QFAD2- 377 100 HECGH 136 HRNHH 310 HVLHH 37
11
* HECGH (SEQ ID NO: 159), HDCGH (SEQ ID NO: 160), HDLGH (SEQ ID NO: 161), HRRHH (SEQ ID NO: 162), HRTHH (SEQ ID NO: 163), HRSHH (SEQ ID NO: 164), HRNHH (SEQ ID NO: 165), HVVHH (SEQ ID NO: 166), HVTHH (SEQ ID NO: 167), HAVHH (SEQ ID NO: 168) и HVLHH (SEQ ID NO: 169).
Для исследования родства полипептидов Г7АБ2-кандидатов сафлора с известными ферментами FAD2, 11 выведенных полипептидных последовательностей были совмещены с последовательностями FAD2 растений, и древо, построенное методом присоединения соседа, было построено, используя Vector NTI (фиг. 1) . Как показано на фиг. 1, аминокислотные последовательности CtFAD2-l и CtFAD2-10 находились в самом близком родстве, прежде всего друг с другом, а затем с экспрессируемым в семени FAD2 из других видов. CtFAD2-2 находится в более близком родстве с конститутивно экспрессируемыми генами из других видов, чем с другими FAD2-кандидатами в сафлоре. CtFAD2-3, -4, -5, -б и -7 образовывали новую ветвь в древе, построенном методом присоединения соседа, по всей вероятности, в результате эволюции, заключающемся в том, что недавно дивергентный ген стал увеличенным в числе в сафлоре. Примечательно, при соотнесении с другими видами, что они находились в самом близком родстве с функционально дивергентной конъюгазой FAD2 из Calendula officinalis. FAD2-11 находился в более близком родстве с ацетиленазами из нескольких видов растений, в том числе VFAD2 сафлора, который был индуцирован грибными элиситорами (Cahoon et al. , 2003) . По-видимому, CtFAD2-8 и -9 были более дивергентными, чем другие FAD2-кандидаты из сафлора. Однако этот анализ также показал, что сравнения последовательностей, хотя они в некоторой степени намекнули о возможной функции, сами не могли дать надежные выводы о функции различных ЕАБ2-кандидатов. По этой причине потребовался функциональный анализ, чтобы сделать выводы о функции каждого гена/полипептида.
Сравнения последовательностей показали, что полипептиды
FAD2-кандидаты сафлора демонстрируют составляющую
приблизительно 50-60% идентичность последовательностей и
составляющую 52-65% схожесть с известными ферментами FAD2 из других видов. Степень несоответствия между нуклеотидными последовательностями генов CtFAD2 сафлора отражала их филогенетическое родство, поскольку все из CtFAD2-3, -4 и -5 являются более схожими друг с другом, чем с CtFAD2-l или CtFAD2-10, и наоборот. Эти значения были близко соответствующими в матрице тождественности аминокислот (таблица б) .
Таблица 6.
Идентичность последовательностей ДНК в кодирующих областях и выведенных аминокислотных последовательностей в генах FAD2 сафлора.
Идентичность выведенных аминокислотных последовательностей (%)
CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA CtFA
D2-1 D2-2 D2-3 D2-4 D2-5 D2-6 D2-7 D2-8 D2-9 D2-10 D2-11
CtFA
D2-1 - 70.3 53.2 52.5 53.5 50.9 54.1 59.7 59.5 80.1 56.4
CtFA
D2-2 70.0 - 54.5 55.0 54.2 51.7 57.8 60.6 62.5 69.5 58.6
CtFA
D2-3 62.0 62.0 - 97.1 62.0 61.8 63.1 52.7 50.9 51.2 56.8
CtFA
D2-4 62.7 63.3 95.1 - 61.4 61.4 63.3 53.1 50.9 50.9 56.9
CtFA
D2-5 61.9 60.3 69.7 70.6 - 63.2 62.0 51.4 51.3 51.7 53.9
CtFA
D2-6 60.6 59.9 68.8 69.6 72.0 - 63.1 49.3 50.8 50.1 56.2
CtFA
D2-7 62.2 65.8 69.4 69.3 66.6 68.2 - 51.7 49.2 51.4 60.7
CtFA
D2-8 65.2 66.2 63.1 62.8 60.8 61.7 61.2 - 58.8 58.1 56.40
CtFA
D2-9 64.9 66.2 59.5 59.5 58.3 59.2 59.5 63.5 - 59.3 55.9
CtFA
D2-10 78.9 72.0 60.7 62.0 59.8 61.0 60.7 64.3 64.1 - 57.2
CtFA
D2-11 60.0 62.9 64.1 64.4 62.4 64.1 62.7 63.9 60.9 61.7 -
Характеристики полипептидов CtFAD2-KaHflHflaTOB
Каждый из предсказанных полипептидов из 11 CtFAD2
кандидатов содержал богатый ароматическими аминокислотами мотив в самом конце С-конца. Такие мотивы были идентифицированы в полипептидах FAD2 других растений и, как полагают, необходимы для сохранения локализации в ER (McCartney et al., 2004). В соответствии со связанными с мембраной ферментами десатуразами жирных кислот других растений каждый предсказанный полипептид CtFAD2 содержал три богатых гистидинами мотива (His-бокса). Такие богатые His мотивы являются в высокой степени консервативными в ферментах FAD2 и, как установлено, вовлечены в образование дижелезного комплекса с молекулярным кислородом, используемым при биохимическом катализе (Shanklin et al., 1998) . В большинстве последовательностей полипептидов CtFAD2-кандидатов первым богатым гистидином мотивом был HECGHH, при этом исключениями были CtFAD2-5 и -б, которые имели HDCGHH и HDLGHH, соответственно. Последней аминокислотой первого His-бокса в CtFAD2-8 (HECGHQ) был Q, а не Н. Авторы настоящего изобретения искали этот мотив в 55 известных ферментах FAD2 растений, и замена Н на Q также присутствует в отклонившемся гомологе FAD2 из Lesquerella lindheimeri в основном с активностью гидролазы жирных кислот (идентификационный № в Genbank - EF432246; Dauk et al., 2007) . Второй богатый гистидином мотив был очень консервативным, в виде аминокислотной последовательности HRRHH, в нескольких FAD2 сафлора-кандидатах, включая CtFAD2-l, -2, -8, -9 и -10. Было отмечено, что в CtFAD2-ll в положении +3 мотива находится аминокислота N, которая также отмечалась в ряде функционально дивергентных ферментов FAD2-(tm)na, включая CREP1 Crepis alpina, Сра12 Crepis palaestina и vFAD2 подсолнечника (AY166773.1), FAC2 Calendula officinalis (AF343064.1), ацетиленазу Rudbeckia hirta (AY166776.1). Аминокислотой в этом положении в CtFAD2-3, -4, -5, -6 или -7 была или S, или Т.
В каждом из полипептидов CtFAD2-l, -2, -9 и -10 аминокислотой, непосредственно предшествующей первому His-боксу, был аланин, так же как и в случае ферментов А12-десатураз жирных кислот других растений. Аминокислота валин
(V) , а не аланин присутствовала в этом положении в CtFAD2-5, в то время как другие шесть полипептидов CtFAD2 имели глицин в этом положении. Cahoon и др. (2003) предположили, что замена аланина на глицин в этом положении встречается в функционально дивергентных ферментах FAD2, кроме А12-гидролазы жирных кислот. Как описано в следующих примерах, последующие эксперименты, связанные с гетерологичной экспрессией, в которых проверялась функция кандидатов, показали, что каждый из полипептидов CtFAD2-l, -2 и -10 был олеат-Д12-десатуразой, в то время как CtFAD2-9 продемонстрировал субстратную специфичность десатуразы к пальмитолеату (С1б:1), а не олеату.
Было отмечено, что из 11 CtFAD2-KaHflHflaTOB только полипептид CtFAD2-ll имел последовательность DVTH в положениях с -5 по -2 третьего His-бокса, которая соответствовала мотиву
(D/N)VX(H/N), который, как полагают, встречается в ацетиленазах всех растений (Blacklock et al, 2010). Пятью аминокислотами сразу же после третьего His-бокса полипептидов CtFAD2-l, -2 и -10 были LFSTM, как и в случае других известных олеатдесатураз FAD2 растений. Напротив, CtFAD2-9, специфическая в отношении пальмитолеата десатураза жирных кислот, имела мотив LFSYI в этом положении с двумя аминокислотными заменами в положении +4 и +5. В полипептидах CtFAD2-3, -4 и -5 S в положении +3 был заменен на Р, который также присутствовал только в других конъюгазах жирных кислот FAD2, включая таковые из Calendula officinalis (FAC2, идентификационный № - ААК2 6 632) и Trichosanthes kirilowii (идентификационный № - АА037 7 51).
Было установлено, что Серин-185 фермента FAD2-1 сои подвергается фосфорилированию во время развития семени в качестве регуляторного механизма для его ферментативной активности (Tang et al. , 2005) . Среди 11 полипептидов CtFAD2-кандидатов, только CtFAD2-l имел серии в соответствующем положении (серин-181) относительно FAD2-1 сои. Был сделан вывод, что тот же посттрансляционный механизм через фосфорилироание серина-185 может работать во время развития семени сафлора и накопления масла, для модуляции А12
десатурации олеиновой кислоты в микросомах в развивающемся семени.
Пример 3. Выделение геномных последовательностей для FAD2-кандидатов
Интрон-экзонные структуры генов FAD2 являются
консервативными во многих цветущих растениях. Все гены FAD2, исследованные до сих пор, содержат только один интрон, который находится в 5'UTR, с одним исключением, являющимся FAD2-1 сои, в случае которого интрон находится в кодирующей области сразу же после первого ATG, инициирующего трансляцию кодона (Liu et al. , 2001; Kim et al., 2006; Mroczka et al., 2010) . Дивергенция последовательностей интронов могла бы использоваться в качестве размера эволюционного расстояния между таксономически близкородственными видами (Liu et al., 2001) .
Для выделения последовательностей ДНК возможных интронов, расположенных в 5'-UTR генов CtFAD2-KaHflHflaTOB, были предсказаны типичные сайты сплайсинга интронов (AG:GT) в 5' UTR каждой последовательности кДНК для CtFAD2, и праймеры для ПЦР были разработаны на основе фланкирующих последовательностей предсказанных сайтов сплайсинга. Праймеры перечислены в таблице 7. Геномную ДНК, выделенную из сафлора генотипа SU, использовали в качестве матрицы в реакциях ПЦР для амплификации геномных участков, соответствующих 5'UTR. Амплификации выполняли в реакциях объемом 50 мкл с использованием 100 нг геномной ДНК, 20 пмоль каждого праймера и Hotstar (Qiagen, Hilden, Германия), поставленного производителем. Циклические изменения температуры для ПЦР выполняли, как указано ниже: 94°С в течение 15 мин в течение одного цикла, 94°С в течение 30 сек, 55°С в течение 1 мин, 72°С в течение 2 мин в течение 35 циклов; 72°С в течение 10 мин, используя Kyratec supercycler SC200 (Kyratec, Queensland, Австралия). Продукты ПЦР клонировали в pGEM-T Easy, а затем секвенировали.
Авторы настоящего изобретения смогли получить предсказанный 5' интрон из 8 из 11 генов CtFAD2-KaHflHflaTOB, а
Выделение интронов в 5'UTR генов С^ГАР2-кандидатов
именно CtFAD2- 1, -2, -3, -4, -5, -7, -10 и -11. Основные особенности этих интронов представлены в таблице 8. Амплификация интрона была неуспешной из CtFAD2-6, -8 и -9, вероятно вследствие недостаточной длины 5' UTR, в которых присутствовали интроны. По-видимому, о FAD2 без интрона не сообщалось, хотя утрата интронов из ядерных генов часто отмечалась у высших растений (Loguercio et al., 1998; Small et al., 2000a;b).
Таблица 7.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации 5'UTR районов генов РА02-кандидатов в сафлоре.
I ен, для амплификации которого Смысловая
Особенность интронов в генах РА02-кандидатах.
Особенность CtFAD2_i OFAD2-2 CtFAD2-3 OFAD2-4 OFAD2-5 CtFAD2-7
CtFAD2-lO
CtFAD2-ll
Положение -13 -12 -11 -11 -33 -29 -38
Длина П44 3090 114 124 122 253 2247
Содержание AT 64.5% 65.8% 73.7% 75.0% 67.2% 62.1% 68.9%
Содержание CG 35.5% 34.2% 26.3% 25.0% 32.8% 37.9% 31.1%
5'E/I
граница AG'GTGCAT AG.GTGAGA AG:GTATGA AG:GTAAGT AG:GTGAAG AG:GTATAC TG:GTTCGT
3-I/E
граница TTGCAG:GT TTGCAG:GT ATGCAG:GT GCGCAG:GT TTTCAG:GT TTGCAG:GT ATATAG:GT TTGCAG:GT
Последовательность интрона в каждом из восьми генов располагалась в 5'-UTR каждого гена, в положениях, находящихся в пределах от 11 до 38 п.о. 5' от предполагаемого кодона начала трансляции, первого ATG в каждой открытой рамке считывания. Длина интрона находилась в пределах от 104 п.о. (CtFAD2-ll) до 3090 п.о. (CtFAD2-2) (таблица 8) . В случае CtFAD2-l размер интрона составлял 1144 п.о., что схоже с размерами интронов, идентифицированных в генах FAD2 из Arabidopsis (The Arabidopsis Information Resource, http://www.arabidopsis.org) , хлопчатника (Liu et al., 2001) и кунжута (Sesamum indicum) (Kim et al. , 2 006) . Динуклеотиды в предполагаемых сайтах сплайсинга, AG и GT, были консервативными во всех восьми исследованных генов CtFAD2, но во всем остальном все последовательности интронов были дивергентными по последовательности без какой-либо значительной гомологии между ними. Все последовательности интронов были А/Т-богатыми с содержанием А/Т между 61% и 75%, что соответствовало многим другим интронным последовательностям из двудольных растений. В случае генов других двудольных растений ген FAD2 Arabidopsis содержал интрон размером 1134 п. о. 5' на расстоянии лишь 5 п. о. от своего инициирующего трансляцию кодона ATG. Размер интрона в 5'-UTR гена FAD2-1 Gossypium, находящегося 5' на расстоянии 9 п.о. от инициирующего трансляцию кодона, составлял 1133 п. о. Напротив, гены FAD2-4 и FAD2-3 хлопчатника содержали более большие интроны размером 2780 п.о. и 2967 п.о., соответственно, находящиеся 5' на расстоянии 12 п.о. от инициирующего трансляцию кодона. Каждый ген CtFAD2-KaHflHflaT можно было отличить по различиям в положении и размере интрона в 5'-UTR в каждом гене. Различия могли быть также важны в обеспечении дифференциальной экспрессии генов. Как сообщалось, такие интроны оказывают положительный эффект на экспрессию генов-репортеров в кунжуте (Kim et al., 2006). Соответствующий интрон, как было установлено, является эффективной мишенью для посттрансляционного сайленсинга гена FAD2 в сое (Mroczka et al. , 2010) .
Было известно, что интроны могут оказывать существенные
воздействия на профили экспрессии генов. Анализ
последовательностей интронов с помощью программы PLACE
(www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) позволил идентифицировать
несколько предполагаемых цис-регуляторных элементов. Например, несколько мотивов, таких как ABRE и SEF4, обычно присутствующих в специфических для семени промоторах, были определены в специфическом для семени CtFAD2-l. AG-мотив, который обычно встречается в промоторе связанных с защитной реакцией генов, индуцируемых различными стрессами, такими как скарификация или обработка элиситорами, был определен в CtFAD2-3, который специфически экспрессируется в гипокотилях и семядолях молодых проростков сафлора.
Пример 4. Анализ с помощью блот-гибридизации по Саузерну генов FAD2 сафлора - кандидатов
Сложность семейства FAD2-подобных генов в сафлоре была исследована с помощью анализа с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Анализ гибридизации в условиях пониженной жесткости показал, что в сафлоре, FAD2 кодируется сложным мультигенным семейством (фиг. 2) . Посредством подсчета гибридизующихся фрагментов, полученных, используя различные рестриктазы для расщепления геномной ДНК, было установлено, что существует более 10 FAD2 или FAD2-подобных генов в сафлоре. Отмечаемые различия в силе гибридизации в случае различных фрагментов, по-видимому, коррелировали с относительными степенями идентичности последовательностей с ДНК зонда, который использовался. Сафлор является двудольным видом и, как полагают, имеет один дикий вид-прародитель, С. palaestinus (Chapman and Burke, 2007). Авторы настоящего изобретения полагают, что необычно большое семейство генов FAD2 в сафлоре, вероятно, является результатом нескольких дупликаций древнего гена, приводящих к специализации и дифференциальной активности различных членов семейства генов.
Пример 5. Функциональный анализ генов-кандидатов в клетках растений
В качестве удобной клетки-хозяина, дрожжи S. cerevisiae
Экспрессия генов CtFAD2-KaHflHflaTOB при анализе функции в дрожжевых клетках
использовались для исследования функциональной экспрессии нескольких FAD2 А12 специфических в отношении олеата десатураз жирных кислот растений (Covello and Reed 1996; Dyer et al. , 2002; Hernandez et al., 2005). S. cerevisiae имеет относительно простой профиль жирных кислот, и он содержит олеиновую кислоту с избытком в своем фосфолипиде, который может использоваться в качестве субстрата для ферментов FAD2. В нем также отсутствует эндогенная активность FAD2. По этой причине 11 генов CtFAD2-кандидатов были проверены в дрожжевом штамме YPH4 99, используя происходящие из pYES2 конструкции, каждая открытая рамка считывания в которых находится под контролем промотора GAL1, как описано в примере 1.
Как продемонстрировано на фиг. 3, когда анализировали жирнокислотный состав в дрожжевых клетках, содержащих "пустой вектор" pYES2, линолевая кислота (18:2) или гексадекадиеновая кислота (16:2) не обнаруживалась, как и ожидалось, поскольку у дрожжей нет эндогенного FAD2. Напротив, на газовой хроматограмме для жирных кислот, полученных из дрожжевых клеток, эспрессирующих каждую из открытых рамок считывания для CtFAD2-l, CtFAD2-2 и CtFAD2-10, выявлялся пик жирной кислоты со временем удержания, составляющим 11,293 мин, соответствующим линолевой кислоте (С18:2), и на газовых хроматограммах для CtFAD2-9 и CtFAD2-10 выявлялся пик жирной кислоты со временем удержания, составляющим 8,513 мин, соответствующим С1б:2. Эти данные указывали на то, что CtFAD2-l, CtFAD2-2 и CtFAD2-10 были способны превращать олеиновую кислоту в линолевую кислоту и, следовательно, были А12 олеатдесатуразами. Однако уровень образованной 18:2 был ниже, чем в случае конструкции AtFAD2 Arabidopsis, которая использовалась в качестве положительного контроля. CtFAD2-10 образовывал как линолевую кислоту (С18:2), так и гексадекадиеновую кислоту (С1б:2), используя олеиновую кислоту (С18:1) и пальмитолеиновую кислоту (С1б:1) в качестве субстратов, соответственно, в то время как CtFAD2-9 десатурировала пальмитолеиновую кислоту и, следовательно, была А12 пальмитолеатдесатуразой. Два новых малых пика, которые
появлялись на хроматограммах для FAME из дрожжевых клеток, экспрессирующих CtFAD2-ll, были идентифицированы как линолевая кислота (18:2 1 '' 1 ') и ее трансизомер (18:2 1 '' 1 ') при GC-MS его пирролидиновых аддуктов, и DMOX (фиг. ЗН) . В таблице 9 суммирован жирнокислотный состав в дрожжевых клетках, экспрессирующих кодирующие CtFAD2 области. Новые пики не были выявлены в дрожжевых клетках, экспрессирующих CtFAD2-3, -4, -5, -б, -7 и -8.
Для исследования, обладал ли какой-либо из полипептидов CtFAD2-KaHflHflaTOB активностью гидролазы жирных кислот, осуществляли реакцию FAME, приготовленных из дрожжевых клеток, экспрессирующих каждую их открытых рамок считывания для CtFAD2, с силилирующим агентом, который превращает гидроксильные остатки в производные TMS-эфиры, исходя из которых можно было исследовать масс-спектры. Однако производные гидроксильных остатков распространяемых жирных кислот, таких как олеиновая кислота, не были выявлены в какой-либо из линий дрожжевых клеток, экспрессирующих открытые рамки считывания для CtFAD2-кандидатов. Это означало, что ни один из 11 генов CtFAD2 не кодировал полипептиды, обладающие активностью гидролазы жирных кислот в дрожжах.
Дополнительные эксперименты были проведены для обнаружения активности А12-эпоксигеназы и А12-ацетиленазы, обе из которых используют линолевую кислоту в качестве жирнокислотного субстрата, посредством дополнения сред для роста тех же линий дрожжевых клеток свободной линолевой кислотой и анализа жирнокислотного состава впоследствии. Дополнение осуществляли после добавления галактозы в культуры для экспрессии конструкций. На газовых хроматограммах не выявлялись новые пики жирных кислот, в том числе те, которые представляли собой производные в виде эпоксикислот и жирных кислот ацетиленого ряда. Гетерологичная экспрессия этих новых жирных кислот в дрожжах, с дополнением экзогенной свободной жирной кислотой, столкнулась с некоторые трудностями в демонстрации активности (Lee et al., 1998; Cahoon et al., 2003). По этой причине
функциональные анализы в клетках растений были проведены, как указано ниже.
Жирнокислотный состав в дрожжевых клетках, экспресирующих выбранные гены CtFAD2.
Транзиторная экспрессия генов CtFAD2-KaHflHflaTOB в N. benthamiana
Для конститутивной экспрессии генов в клетках растений, в частности в листьях растений, каждую из ORF для CtFAD2 встраивали в смысловой ориентации в модифицированных бинарный вектор pORE04 между промотором CaMV-35S с увеличенной активностью и терминатором nos3', содержащим последовательность сигнала полиаденилирования (Coutu et al., 2007) (SEQ ID NO: 54) . Предшествующее исследование показало, что экспрессию трансгенов можно значительно увеличить посредством коэкспрессии вирусного белка-супрессора сайленсинга, Р19, для уменьшения сайленсинга трансгена в хозяине в анализе транзиторной экспрессии на основе листьев N. benthamiana (Voinnet et al., 2003; Wood et al., 2009; Petrie et al., 2010) . Эти эксперименты проводились, как описано в примере 1.
Как описано выше, функцию CtFAD2-ll в начале исследовали посредством экспрессии в S. cerevisiae, и две новые жирные
До / у ) 1 О /у )
кислоты были идентифицированы с помощью GC-MS как 18:2 ' и 18:2 A9 <12 (фиг.
До ( у ) 1 ? f F1
4B) . Новый 18:2 ' обуславливал 0,35% жирных кислот в
листьях после транзиторной экспрессии CtFAD2-ll (таблица 10) . Кроме того, был выявлен другой новый пик, который не был выявлен в дрожжевых культурах. Хроматограмма всех ионов и масс-спектр этой новой жирной кислоты соответствовали крепениновой кислоте (18:2 A9(z).i2(c)j (фиг. 4В и С), что означает, что полипептид CtFAD2-ll обладал А12-ацетиленазной активностью. Как показано в таблице 10, крепениновая кислота обуславливала 0,51% от всех жирных кислот.
Было отмечено, что транзиторная экспрессия CtFAD2-ll в клетках N. benthamiana приводила к уменьшению содержания 18:2 A9(z),i2(z> по СравненИю с нетрансформированным контролем (таблица 10) . Вероятно, это было обусловлено конкуренцией CtFAD2-ll с эндогенной цис-А12 олеатдесатуразой в клетках N. benthamiana за имеющийся в распоряжении пул олеиновой кислоты, субстрата для обоих ферментов. В целом, результаты экспериментов по экспрессии в дрожжах и N. benthamiana показали, что CtFAD2-ll функционировал в основном как специфичная в отношении олеата А12-десатураза без специфичности в отношении стереоизомеров, образуя как линолевую кислоту, так и ее транс-А12 изомеры. Кроме того, он мог также десатурировать А12 двойную связь линолевой кислотой с образованием ацетиленовой связи крепениновой кислоты.
Другие десять полипептидов CtFAD2-KaHflHflaTOB были также транзиторно экспрессированы в листьях N. benthamiana таким же образом, но авторы настоящего изобретения не выявили какие-либо новые жирные кислоты, которые не присутствовали эндогенно в листьях N. benthamiana, которые уже имели высокие уровни FAD2.
Обсуждение
11 генов CtFAD2-KaHflHflaTOB, описанных выше, которые были идентифицированы в сафлоре, представляют собой самое большое семейство генов FAD2, выявленное в каком-либо виде растении, который был исследован до сих пор. Хотя только один ген FAD2 был идентифицирован в Arabidopsis (Okuley et al. , 1994), FAD2, по-видимому, кодируется множеством генов в геномах большинства других растений, исследованных до сих пор. Два отличных гена FAD2 были описаны в сое (Heppard et al., 1996), льне (Fofana et al., 2004; Khadake et al., 2009) и маслине европейской (Hernanze et al. , 2005); три гена в подсолнечнике (Martinez-Rivas et al., 2001) и Camelina sativa (Kang et al. , 2011); и пять генов в хлопчатнике (Liu et al., 1998) . В амфитетраплоидном виде Brassica napus 4-6 различных генов FAD2 были идентифицированы в каждом диплоидном субгеноме (Scheffler et al. , 1997) . Все гены CtFAD2-KaHflHflaTbi были экспрессированы в растениях сафлора, поскольку последовательности были выделены из кДНК. Это в дальнейшем проверяли, как описано в примере б.
Хотя сравнимые исследования отсутствуют, очевидно, что сафлор является необычным, что касается эволюции семейства генов FAD2. Сафлор является самоопыляющимся диплоидным видом растений, который находится в самом близком родстве с диким диплоидным видом Carthamus palaestinus, и он, как известно, не характеризуется дупликацией или реаранжировкой генома в большой степени (Chapman and Burke, 2007) . кДНК для множества FAD2, которые были идентифицированы, не могли быть связаны с альтернативным сплайсингом, поскольку гены FAD2-кандидаты не содержали интроны в последовательностях кодирующих областей.
Скорее, дупликация гена, с большей степенью вероятности, была ответственна за создание сложности в семействе FAD2 в сафлоре. Топология филогенетического древа показала, что дупликации гена могли произойти на нескольких иерархических уровнях. Например, полипептиды CtFAD2-3, -4 и -5 находились в более близком родстве с другими последовательностями в этом кладе, чем с другими последовательностями FAD2 сафлора, что означает, что более недавние дупликации гена могли быть ответственны за появление этого клада.
Пример 6. Уровень экспрессии генов ЕАР2-кандидатов в сафлоре
Профиль экспрессии генов FAD2 в различных тканях Для определения картин экспрессии в тканях различных генов CtFAD2-KaHflHflaTOB были выполнены анализы с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени, как описано в примере 1. Тотальную РНК экстрагировали из семядолей, гипокотилей, тканей корней и листьев, полученных из проростков сафлора 10 DAG генотипа с высоким содержанием линоленовой кислоты SU, и из тканей цветков и развивающихся зародышей из цветущих растений, и использовали в анализах. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для анализа, перечислены в таблице 11.
Олигонуклеотидные праймеры, используемые для количественной ПЦР в режиме реального времени в исследовании профилей экспрессии генов FAD2 сафлора.
Смысловая последовательность
Антисмысловая последовательность
Ген, для амплификации которого использовались праймеры
QFAD2-1 5'- GTGTATGTCTGCCTCCG AG А -3' (SEQ ID NO: 116)
QFAD2-2 5'- GCCTCCAAAGATTCATTCAGGTC - 3' (SEQ ID NO: 118)
QFAD2-3 5'- ACGTGGCGGTCTCAGGTT -3' (SEQ ID NO: 120)
QFAD2-4 5AAGGCAGGCCGTGATGCCGAT -3' (SEQ ID NO: 122)
CtFAD2-5 5'- CAATACGGTAGAGGCCACACAG -3' (SEQ ID NO: 124)
CtFAD2-6 5'- GACATGTGCTCACGTGGTGCAT -3' (SEQ ID NO: 126)
CtFAD2-7 5'- CGAATCACACCCACGGGATC -3' (SEQ ID NO: 128)
CtFAD2-8 5'- GAGCAACGGAGAGAAGTAACC -3' (SEQ ID NO: 130)
OFAD2-9 5'- CATGTGTGGCTGGAGGATTCGA -3' (SEQ ID NO: 132)
QFAD2-10 5'- CCAACAAACAAACCATCTCTCG -3' (SEQ ID NO: 134)
CtFAD2-11 5'- CCATTGATGCACCCTTCACCTTA -3' (SEQ ID NO: 136)
KASI1 5'- CTGAACTGCAATTATCTAGG -3' (SEQ ID NO: 138)
5'- GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG -3' (SEQ ID NO: 117) 5'- CAAGATGGATGCGATGGTAAGG -3' (SEQ ID NO: 119) 5'- AGGCGGTGACAATTATGATATC -3' (SEQ ID NO: 121) 5'-AGTATTTGATCAATCCGCTGG -3' (SEQ ID NO: 123) 5'- ATCATCTCTTCGGTAGGTTATG -3' (SEQ ID NO: 125) 5'- GTTGCTAATATCCACACCCTA -3' (SEQ ID NO: 127) 5'- CTAAAGAATTTCCATGGTGTTAC -3' (SEQ ID NO: 129) 5'- GAGGGATGATAGAAAGAGGTCC -3' (SEQ ID NO: 131) 5'- GCACCGAGTTTAGCCTTTGTCT -3'(SEQ ID NO: 133) 5'- GAGAGACGGTGGAAGTAGGTG -3' (SEQ ID NO: 135) 5'- AAAGACATAGGCAACAACGAGATC -3' (SEQ ID NO: 137) 5'- GGTATTGGTATTGGATGGGCG -3' (SEQ ID NO: 139)
Временная и пространственная картина экспрессии 11 генов CtF7AD2 представлена на фиг. 5. Анализ с использованием количественной ПЦР в режиме реального времени показал, что CtFAD2-l экспрессировался только в развивающихся семенах. Напротив, CtFAD2-2 экспрессировался на низких уровнях в семенах, а также других исследованных тканях. Кроме того, экспрессия CtFAD2-4, -5, -б, -7, -8, -9 не выявлялась в развивающихся зародышах. Низкие, тем не менее, выявляемые, уровни экспрессии CtFAD2-10 и -11 отмечались в развивающихся семенах, особенно на поздней стадии развития, когда семена сафлора достигают зрелости. Все из CtFAD2-4, -б, -7, -9 и -11 продемонстрировали высокие уровни экспрессии в тканях молодых проростков, в том числе в семядолях и гипокотилях. CtFAD2-5 и -8, по-видимому, были специфическими в отношении корней, а CtFAD2-10 преимущественно экспрессировался в тканях цветков, при этом относительно низкие уровни выявлялись в различных других исследованных тканях, включая развивающиеся семена и тканях проростков возрастом десять дней.
Продукты амплификации не детектировались после 4 0 циклов амплификации в контрольных реакциях с использованием матрицы в виде тотальной РНК, но без обратной транскриптазы, что означает отсутствие примесной геномной ДНК в препаратах РНК.
Пример 7. Демонстрация генетической мутации в линии S317 сафлора
Первый идентифицированный признак высокого содержания олеиновой кислоты в сафлоре, обнаруженный при внедрении сафлора из Индии, контролировался частично рецессивным аллелем, обозначенным ol, в одном локусе OL (Knowles and Hill, 1964) . Содержание олеиновой кислоты в генотипах olol обычно составляло 71-75% в случае выращиваемых в теплице растений (Knowles, 1989) . Knowles (1968) включил аллель ol в программу селекции сафлора и вывел первый сорт сафлора с высоким содержанием олеиновой кислоты (НО) "UC-1" в 1966 в США, с последующим выведением улучшенных сортов "01eic Leed" и серии Saffola, в том числе Saffola 317 (S-317), S-517 и S-518. Генотипы olol (высокое содержание олеиновой кислоты) были относительно
устойчивыми при различных температурах (Bartholomew, 1971) . Кроме того, Knowles (1972) также описал отличный аллель oli в том же локусе, который порождал в гомозиготном состоянии между 35 и 50% олеиновой кислоты. В отличие от генотипа olol, генотип olioli продемонстрировал сильную реакцию на температуру (Knowles, 1972).
Сообщалось о дополнительной зародышевой плазме с более высоким содержанием олеиновой кислоты (> 85%) (Fernandez-Martinez et al., 1993; Bergman et al., 2006). Fernandez-Martinez и др. (1993) сообщили о содержании олеиновой кислоты вплоть до 8 9% в сафлоре в поступлении зародышевой плазмы PI401472, первоначально поставленной из Бангладеш. Серия Montola, выведенная Bergman и др. (2006), содержит более 80% олеиновой кислоты, явно ниже самого верхнего уровня олеиновой кислоты в сорте "UC-1", содержащем аллель olol, как описано Knowles и Hill (1964). Генетический анализ на всем протяжении скрещиваний и анализ расщеплений линий с высоким и очень высоким содержанием олеиновой кислоты, свидетельствовал о том, что две линии имеют одинаковые аллели в локусе OL. Очень высокое содержание олеиновой кислоты (85%) было порождено в результате объединения аллелей ol и модификации генов с небольшим положительным эффектом на олеиновую кислоту (Hamdan et al., 2009).
Микросомы сафлора были свежеприготовленны из развивающихся семян генотипа S-317, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, на стадии середины созревания, через приблизительно 15 дней после пыления (DPA), как описано Stymne и Appelqvist (1978) . Стандартная реакционная смесь объемом 90 мкл содержала 40 мкг микросомального белка, 2 нмоль [14С]олеоил-КоА в 0,1 ммоль калий-фосфатном буфере рН 7,2. Затем добавляли 10 мкл 50 мМ NADH, и инкубацию продолжали в течение еще 5, 10 или 20 мин. Реакции останавливали, добавляя 90 мкл 0,15М уксусной кислоты, и липид экстрагировали с использованием 500 мкл СНС1з:МеОН (1:1) . Нижнюю СНС1з фазу получали, и полярные
In vitro биохимическая характеристика мутантной линии S-317 с высоким содержанием олеиновой кислоты
липиды из нее разделяли с помощью тонкослойной хроматографии (TLC) , используя систему растворителей СНС1з/МеОН/НАс/Н.20 (90:15:10:3 в объемном отношении). Слоты, соответствующие PC, выскребали с пластины, и связанные ацильные (жирнокислотные) группы подвергали переметилированию в 2 мл 2% серной кислоты в МеОН при 90°С в течение 3 0 мин. Полученные в результате FAME разделяли на обработанных АдЫОз пластинах для TLC с использованием смеси гексан:DEE:НАс (85:15:1 в объемном отношении). 14С-меченые стандарты метиловых эфиров олеиновой и линоленовой кислот наносили на пластину в качестве контролей. Пластины экспонировали и анализировали с помощью формирователя изображения на люминесцентном фосфорном покрытии Fujifilm FLA-5000. Радиоактивность каждого образца количественно определяли с помощью программного обеспечения Fujifilm Multi Gauge.
После добавления NADH в реакции с микросомами дикого типа отмечали, что добавленный [ 14С]олеоил-КоА быстро исчезает, в пределах 10 мин, в то время, когда появляется [14С]линолеат, что указывает на эффективное превращение олеата в линолеат в микросомах сафлор дикого типа. Напротив, в случае генотипа S-317 с высоким содержанием олеиновой кислоты, значительное большее отношение [14С] олеата к [ 14С] линолеату было обнаружено в vitro реакциях на всем протяжении времени (таблица 12), что означает, что биосинтез линолевой кислоты через десатурацию олеата с помощью микросом был существенно уменьшенным в этом генотипе.
Таблица 12.
Процент С18:2 продукта, образуемого из С18:1 в микросомах сафлора.
Дикий тип
Время (мин)
С18:1 С18:2 С18:1 С18:2
0 99.2+1.1 0.8+1.1 100.0+0.0 0.0+0.0
5 79.6+1.2 20.4+1.2 99.4+0.3 0.6+0.3
10 69.6+0.4 30.4+0.4 95.4+1.6 4.6+1.6
_20 60.6+0.6 39.4+0.6 95.1+1.5 4.9+1.5
п=2
Молекулярная характеристика определяющего высокое
содержание олеиновой кислоты аллеля ol
Для понимания молекулярной основы генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, (olol) в сафлоре кДНК для двух экспрессируемых в семени FAD2, а именно CtFAD2-l и CtFAD2-2, амплифицировали с помощью ПЦР из трех сортов с высоким содержанием олеиновой кислоты: S-317, LeSaf 496 и CW99-OL и секвенировали. кДНК, охватывающие полные кодирующие области генов CtFAD2-l из трех сортов с высоким содержанием олеиновой кислоты, были идентичными по нуклеотидной последовательности друг другу и продемонстрировали составляющую приблизительно 98% идентичность последовательностей с кДНК для CtFAD2-l, происходящей из сорта дикого типа SU, включая делецию одного нуклеотида и 22 замены нуклеотидов в генотипе НО по сравнению с диким типом. Делеция одной пары оснований была обнаружена в положении 60 6 нуклеотида, считая с первого ATG, приблизительно в середине кодирующей области CtFAD2-l. Эта делеция приводила к сдвигу трансляционной рамки считывания, который создавал стоп-кодон вскоре после делеции, так что мутантный ген в трех сортах olol кодировал предсказанный, усеченный полипептид без третьего His-бокса, присутствующего в белке дикого типа (фиг. 6) . Было отмечено, что существовал относительно высокий уровень вариации последовательностей в последовательностях ДНК вблизи места делетированного одного нуклеотида аллеля ol, что наводит на мысль, что дополнительные мутации накопились в мутантном гене.
Районы ДНК, включающие интроны в 5' UTR CtFAD2-l и CtFAD2-2, были также выделены из мутанта olol S-317 и сравнены с интронами дикого типа. Размер интрона в CtFAD2-l из S-317 составлял 1144 п.о., на 61 п.о. больше интрона дикого типа из SU, размер которого составлял 1083 п.о. Сравнение нуклеотидных последовательностей интронов в CtFAD2-l показало, что общая идентичность последовательность составляет 76,8%, при этом интроны отличались по 2 7 вставкам или делециям и 95 однонуклеотидным заменам (фиг. 7).
Примечательно, что замены нуклеотидов в мутантном гене не были распределены равномерно на всем протяжении района длиной 1142 п.о., соответствующего кодирующей области дефектного
CtFAD2-l, поскольку 14 из 22 (63,6%) замен присутствовали вблизи делеции нуклеотида, большинство в пределах 123 п. о. немного 3' от делеции одного нуклеотида. Напротив, интроны в CtFAD2-2 в диком типе и мутантных генотипах продемонстрировали составляющую в общем 99,5% идентичность последовательностей, только с 12 заменами нуклеотидов и одной 2-нуклеотидной делецией. Это означает, что или некоторое давление отбора имело место в дефектном гене CtFAD2-l в мутанте НО, или, возможно, с большей степенью вероятности, что мутация CtFAD2-l была древнего происхождения и могла произойти из вида-прародителя сафлора, такого как С. palaestinus.
EMS мутант (S-901), полученный из коммерческого сорта с высоким содержанием олеиновой кислоты S-518, был описан в патенте США с № 5912416. Хотя генетические исследования показали, что так называемый аллель 0I2 в этом новом генотипе отличен от аллелей ol и oli в локусе 0L, его молекулярная природа не была определена Weisker (патент США с № 5912416) . Генотип S-901 характеризовался увеличением уровня олеиновой кислоты до 89,5-91,5% от общего содержания жирных кислот в зрелых семенах. Отмечалось снижение насыщенных жирных кислот, т.е. пальмитиновой кислоты, вниз до приблизительно 4% и стеариновой кислоты вниз до приблизительно 2,5%. Однако S-901 не проявил фенотип нормального растения и страдал некоторым сниженным ростом и урожайностью. Морфологически он был короче, и цветочные головки были меньше по сравнению с его родительской линией S-518. Он также зацветал позже и содержал меньше масла в семенах.
Разработка идеальных ПЦР-маркеров для селекции признака "высокое содержание олеиновой кислоты"
Различие в делеции одного нуклеотида в последовательности мутантного аллеля CtFAD2-l, которая, как было сделано заключение, являются каузальной мутацией, ответственной за фенотип НО, было положено в качестве молекулярной основы для очень эффективного маркера для отслеживания мутантного аллеля ol. Таким образом, авторы настоящего изобретения разработали анализ молекулярного маркера, который позволял идентифицировать
и отбирать мутантный аллель ol с селекционной целью или с целью идентификации сортов, даже когда он присутствует в гетерозиготном состоянии. Отбор с помощью молекулярного маркера, таким образом, устраняет необходимость в получении дополнительного поколения растений, которые необходимо подвергнуть скринингу в отношении жирнокислотного фенотипа. Простая генетики в сочетании с исследования идеального молекулярного маркера даст возможность селекционерам сафлора быстро включить признак высокого содержания олеиновой кислоты в их селекционную программу.
Представлялось, что существует недостаточная вариация последовательностей в экзонах CtFAD2-l между генотипом дикого типа SU и генотипом S-317, определяющим высокое содержание олеиновой кислоты, чтобы без труда создать дифференциальный маркер на основе реакций ПЦР. Однако авторы настоящего изобретения смогли использовать относительно высокую дивергенцию последовательностей в интроне в 5' UTR CtFAD2-l между аллелями 0L и ol. Существовали участки очень вариабельных последовательностей между этими двумя аллелями, которые позволили разработать уникальные праймеры для ПЦР. Следующие иллюстративные праймеры были разработаны для амплификации специфического продукта размером 315 п. о. из генотипов, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты, содержащих мутантный аллель olol, но не в генотипе дикого типа SU. Н0-смысловой: 5'- ATAAGGCTGTGTTCACGGGTTT-3' (SEQ ID N0: 140); и НО-антисмысловой: 5'-GCTCAGTTGGGGATACAAGGAT-3' (SEQ ID N0: 141)
(фиг. 7). Другая пара иллюстративных праймеров, специфических в отношении гена дикого типа в сорте SU, которая обуславливала продукт ПЦР размером 603 п.о., была следующей: HL-смысловой: 5'-AGTTATGGTTCGATGATCGACG-3' (SEQ ID N0: 142); и HL-антисмысловой: 5'-TTGCTATACATATTGAAGGCACT-3' (SEQ ID N0: 143)
(фиг. 7) . Пару праймеров, происходящих из гена KASII сафлора, ctkasll-смысловой: 5'-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEQ ID N0: 144) и ctkasll-антисмысловой: 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (SEQ ID N0: 145), использовали в качестве положительного контроля для гарантии равного внесения матричной ДНК и хорошего выполнения
ПЦР.
Условиями реакций ПЦР были 94°С в течение 2 мин, с последующими 40 циклами 94°С в течение 30 сек, 58°С в течение 30 сек и 72°С в течение 30 сек. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле и визуализировали под ультрафиолетовым светом после окрашивания геля этидием бромида. Фрагмент размером приблизительно 300 п. о. отмечался в реакциях амплификации в случае всех пяти исследованных генотипов, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты, а именно S-317, S-517, CW99-OL, LeSaf496 и Ciano-OL, в то время как такой фрагмент отсутствовал в случае генотипа дикого типа SU. Наоборот, фрагмент размером приблизительно 600 п. о. присутствовал при амплификациях в случае сафлора дикого типа SU, но не присутствовал в каком-либо из проверенных сортов с высоким содержанием олеиновой кислоты. В качестве положительного контроля, полоса размером 198 п.о., происходящая из гена KASII, была амплифицирована в реакциях в случае всех проверенных линий. Подлинности ампликонов подтверждали с помощью секвенирования ДНК.
Таким образом, дивергенция последовательностей в интроне в
5'UTR гена CtF7AD2-l между определяющим высокое содержание
олеиновой кислоты аллелем и аллелем дикого типа сафлора
способствовала разработке ПЦР-маркера, определяющего
присутствие или отсутствие мутации в CtF7AD2-l. Он был полностью сцеплен с аллелем ol, независимо от генетического фона, т.е. он был полностью сцепленным маркером. Однако этот молекулярный маркер был доминантным маркером, и поэтому использование только этого маркера не позволило бы отличить гомозиготные по аллелю ol генотипы от гетерозиготных по нему генотипов. Для преодоления этого была разработана другая пара праймеров для ПЦР, которая приводила к амплификации только аллеля 01 дикого типа. Следовательно, использование таких специфических для дикого типа праймеров в сочетании с праймерами для ПЦР, специфическими в отношении генотипов, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты, позволило отличить гомозиготные
от гетерозиготных генотипов в локусе CtFAD2-l.
В приведенных выше разделах было показано, что CtFAD2-l экспрессируется только в развивающихся зародышах развивающихся семян и является невыявляемым в различных других исследованных тканях, в том числе листе, корне, цветке, семядоле и гипокотиле, происходящих из молодых проростков сафлора. CtFAD2-1 экспрессировался на высоком уровне в развивающихся семенах, в которых скорость метаболизма жирных кислот была высокой, и приводил к активному накоплению масла, содержащему в основном С18:2, за относительно короткий период времени. CtFAD2-l характеризовался наибольшим уровнем экспрессии приблизительно в середине развития семени, с более умеренным уровнем экспрессии и на ранней, и на поздней стадиях развития семени.
Используя метод анализа с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, уровень нормализованной экспрессии гена CtFAD2-l определяли в трех сортах с высоким содержанием олеиновой кислоты, а именно S-317, Lesaff496 и CW99-OL, и сравнивали с таковым в развивающихся семенах генотипа дикого типа SU. Как видно на фиг. 8, экспрессия CtFAD2-l детектировалась на всех трех стадиях развития зародышей в генотипе сафлора дикого типа SU, при этом наибольший уровень экспрессии отмечался на стадии достижения середины зрелости, в соответствии с предшествующими результатами и с подтверждением временной картины транскрипции этого ключевого гена FAD2. Однако транскрипты CtFAD2-l были едва выявляемыми в трех сортах с высоким содержанием олеиновой кислоты S-317, Lesaff496 и CW99-OL (фиг. 8), что означает высокий уровень нестабильности РНК-транскриптов с этого гена в мутантных зародышах.
Напротив, уровни транскриптов с CtFAD2-2 были схожими в случае генотипа дикого типа и генотипов, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты, что свидетельствует о том, что экспрессия CtFAD2-2 была не затронута в зародышах НО, также о том, что препараты РНК были соответственно чистыми для этих анализов. Поэтому был сделал вывод, что экспрессия CtFAD2-2
Экспрессия CtFAD2-l существенно уменьшена в генотипах, определяющих высокое содержание олеиновой кислоты.
может также вносить вклад в Д12-десатурацию жирных кислот для запасаемых липидов в развивающихся семенах сафлора, но в намного меньшей степени, чем CtFAD2-l в семенах дикого типа, а также быть вовлеченной в А12-десатурацию жирных кислот для мембранных липидов в корне, листе и стебле. Не было данных, что экспрессия CtFAD2-2 была увеличенной в мутанте с высоким содержанием олеиновой кислоты в ответ на, или в качестве компенсации за, уменьшение активности CtFAD2-l в развивающихся семенах сафлора мутанта CtFAD2-l.
Причиной существенно уменьшенного уровня транскриптов CtFAD2-l в линиях НО является опосредованная несмысловым полинуклеотидом деградация мРНК (NMD).
Причиной существенно уменьшенного уровня транскриптов CtFAD2-l в зародышах НО могла бы быть опосредованная несмысловым полинуклеотидом деградация мРНК (NMD) для CtFAD2-l, поскольку стоп-кодон был обнаружен в середине кодирующей последовательности вскоре после делеции одного нуклеотида. Система NMD, как полагают, является механизмом, участвующим в деградации аберрантных мРНК, которые содержат преждевременный стоп-кодон (РТС), являющийся результатом неожиданных ошибок, таких как мутации в геноме, ошибки при транскрипции и неправильный сплайсинг. Она является механизмом, который повсюду присутствует у эукариот, и, в особенности, он был тщательно изучен у дрожжей и млекопитающих. Она сравнительно плохо изучена у высших растений, но существует несколько сообщений, включая ген ингибитора трипсина Кунитца из сои (Kti3), ген фитогемагглютинина (РНА) из фасоли обыкновенной (Jofuku et al., 1989; Voelker et al., 1990), ген ферредоксина из гороха (FED1) (Dickey et al. , 1994) и ген Waxy из риса (Isshiki et al., 2001) .
В этих экспериментах было установлено, что мутация ol, приводящая к признаку высокое содержание олеиновой кислоты в семядоли сафлора, находилась в соответствии с низкими уровнями накопления мРНК для CtFAD2-l в развивающихся семенах. Предшествующее исследование показало, что аллель ol был
полурецессивным, что не соответствовало механизму
посттранскрипционного сайленсинга гена, опосредованного короткими РНК. В генный сайленсинг вовлечены 21-24-нуклеотидные киРНК, образуемые из двухцепочечной РНК, которая является результатом транскрипции антисмысловой или шпилечной РНК и может функционировать генетически как доминантный или полидоминатный локус (Brodersen and Voinnet, 2006). Для подтверждения того, что механизм мутации ol отличен от сайленсинга гена, связанного с РНК-интерференцией, авторы настоящего изобретения выполнили секвенирование коротких РНК, как указано ниже.
Были созданы две библиотеки коротких РНК, происходящих из генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, S-317 и генотипа дикого типа SU, используя объединенные РНК, выделенные из развивающихся зародышей на стадии достижения середины зрелости. Общее секвенирование библиотек коротких РНК выполняли с использованием технологии Solexa (Hafner et al., 2 008) . Секвенирование этих двух библиотек было выполнено в секвенаторе Illumina's Solexa Sequencer, и образцы анализировали одновременно. Секвенирование библиотек коротких РНК SU и S-317 породило в целом 23160261 и 21696852 грубых считываний, соответственно. Анализ трех считываний привел к идентификации 22860098 и 21427392 последовательностей, длина которых находилась в пределах от 18 до 3 0 нуклеотидов, соответственно. Было определено присутствие и распределение коротких РНК, соответствующих CtFAD2-l, в библиотеках SU и S-317. Лишь низкие, едва выявляемые уровни коротких РНК, соответствующих CtFAD2-l, были выявлены исходя из обеих библиотек коротких РНК и распределялись почти равномерно по кодирующим областям генов CtFAD2-l. Не было явного различия между библиотеками, производящими из генотипа дикого типа и генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты.
Исходя из этих данных, был сделан вывод, что механизм опосредованного короткими РНК посттранскрипционного сайленсинга гена не был основным механизмом, с помощью которого было предотвращено накопление транскриптов с мутантного CtFAD2-l.
Исследования транзиторной экспрессии в листьях N. benthamiana
С целью дополнительного изучения феномена NMD авторы настоящего изобретения выполнили эксперименты по транзиторной экспрессии CtF7AD2-l, происходящего и из генотипа дикого типа, и из генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, в листьях N. benthamiana.
Каждую из ORF для CtF7AD2-l встраивали в смысловой ориентации в модифицированный бинарный вектор pORE04 под контроль промотора CaMV-35S. Для инфильтрации в нижнюю сторону полностью развившихся листьев N. benthamiana использовали штамм AGL1 Agrobacterium tumefaciens, содержащий или 35S:CtFAD2-l, или его мутантную форму 35S:CtFAD2-lA, вместе с 35S:P19, как описано в примере 5. После периода выращивания в течение еще 5 дней при 24°С участки с инфильтратами вырезали, из образцов получали тотальную РНК, используя набор RNeasy Mini Kit (Qiagen). Для измерения уровней РНК для CtFAD2-l анализы с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени выполняли в трех повторах, используя Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen), и проводили в ABI 7900HT Sequence Detection System, как описано в примере 1. ПЦР выполняли в следующих условиях: в начале 48°С в течение 30 мин, затем 95°С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами: 95°С в течение 15 сек и 60°С в течение 60 сек. Праймерами для экзогенного гена CtFAD2-l были: смысловой: 5' -GTGTATGTCTGCCTCCGAGA-3' (SEQ ID NO: 146); антисмысловой: 5' -GCAAGGTAGTAGAGGACGAAG-3' (SEQ ID NO: 147) . Контрольный ген, CtKASII сафлора, использовали для нормализации уровней экспрессии; специфическим для него праймерами были: смысловой: 5'-CTGAACTGCAATTATCTAGG-3' (SEQ ID NO: 144); и антисмысловой: 5'-GGTATTGGTATTGGATGGGCG-3' (SEQ ID NO: 145) . Высокие уровни экспрессии CtFAD2-l отмечали в листьях N. benthamiana с гена 35S-CtFAD2-l, происходящего из сорта дикого типа SU. В сравнении, намного более низкие уровни экспрессии
отмечались в случае гена 35S-CtFAD2-lA, происходящего из генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты.
Растения A. thaliana экотипа Col-0 трансформировали с использованием штамма AGL1 A. tumefaciens, содержащего бинарный вектор, содержащий специфический для семени промотор Fpl, управляющий областью, кодирующей или CtFAD2-l, или CtFAD2-lA, в соответствии со способом Clough и Bent (1998). Тотальную РНК выделяли из стручков, содержащих зародыши на стадии достижения середины созревания, потомков полученных в результате трансформированных растений, используя набор RNeasy Mini Kit (Qiagen). Исследования экспрессии генов проводили, используя препараты РНК, с использованием анализов с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, проводимых в трех повторах, как описано выше. Высокие уровни экспрессии CtFAD2-l отмечались в стручках Arabidopsis, экспрессирующих Fpl-CtFAD2-l, происходящий из SU, однако экспрессия Fpl-CtFAD2-1А, происходящего из генотипа, определяющего высокое содержание олеиновой кислоты, была существенно уменьшенной в сравнении.
Было продемонстрировано, что специфические в отношении
CtFAD2-l короткие РНК не продуцировались на значительно более
высоких уровнях в развивающихся семенах сафлора с высоким
содержанием олеиновой кислоты, чем короткие РНК с гена дикого
типа, несмотря на то, что количество транскрипта с мутантного
CtFAD2-l было существенно уменьшенным. Поэтому был сделан
вывод, что уменьшение РНК для CtFAD2-l в генотипе, определяющем
высокое содержание олеиновой кислоты, обусловлено NMD, отличной
от механизма опосредованного короткими РНК
посттранскрипционного сайленсинга гена. Явление NMD также наблюдали, когда мутантную кодирующую область экспрессировали экзогенно или в листьях N. benthamiana, или в стручках Arabidopsis.
Пример 8. Выделение кДНК сафлора, которые являются кандидатами на кодирование FATB
Выделение последовательностей кДНК для FATB сафлора Масло семени сафлора содержит приблизительно 7% пальмитиновой кислоты. Эта жирная кислота синтезируется в пластидах клеток развивающегося семени, из которых она
экспортируется в цитозоль клеток для включения в
триацилглицерины. Основным ферментом для экспорта пальмитиновой
кислоты является пальмитоил-АСР-тиоэстераза, которая
гидролизует тиоэфирную связь между пальмитоильной составляющей и ацилпереносящим белком (АСР), с которым ацильная группа ковалентно связана, когда она синтезируется в пластиде. Фермент пальмитоил-АСР-тиоэстераза относится к группе растворимых, направляемых в пластиды ферментов, названных FATB. В масличных растениях этот фермент проявляет специфичность по отношению к переносящему короткоцепочечные насыщенные ацильные группы АСР в качестве субстрата. Ген, кодирующий фермент FATB, был в начале выделен из видов растений, накапливающих среднецепочечные насыщенные жирные кислоты, такие как лауриновая кислота (С12:0), из калифорнийского лавра (Umbellularia californica) . Последующие исследования показали, что ортологи FATB присутствовали во всех тканях растения, в основном в семенах, с субстратной специфичностью, колеблющейся от С8:0-АСР до С18:0-АСР. В Arabidopsis и большинстве среднеширотных масличных культур, включая сафлор, пальмитиновая кислота является основной насыщенной жирной кислотой в масле семени.
Для выделения кДНК сафлора, которые кодируют кандидаты на FATB, библиотеку кДНК развивающихся семян сафлора подвергали скринингу, используя гетерологичный зонд, состоящий из фрагмента кДНК для FATB из хлопчатника (Gossypium hirsutum), как описано в примере 1. Одна полноразмерная кДНК, названная CtFATB-T12, была выделена из библиотеки кДНК семян сафлора. Эта кДНК содержала открытую рамку считывания длиной приблизительно 1029 нуклеотидов, кодирующую полипептид из 343 аминокислот. Длины ее 5' и 3' UTR составляли 236 нуклеотидов и 336 нуклеотидов, соответственно. В соответствии с предсказаниями полипептид CtFATB-T12 содержит предсказанный, ответственный за перенос пептид длиной приблизительно 60 аминокислот и остов из 210 аминокислотных остатков, который содержит два повтора сложения в виде спирали и многотяжевого листа, характерного для белков с так называемым сложением "хот-дог".
Исходя из базы данных, касающихся экспрессируемых
маркерных последовательностей (EST), сафлора Compositae Genome
Project (CGP) (cgpdb.ucdavis.edu/cgpdb2.), были
идентифицированы три различных EST, гомологичные CtFATB-T12, а именно EL379517, EL389827 и EL396749. Каждая была неполной длины. Соответствующие гены были названы CtFATB-A, CtFATB-B и CtFATB-C, соответственно. Полноразмерная кДНК CtFATB-T12, выделенная из библиотеки кДНК семени сафлора, была идентична по нуклеотидной последовательности EST из CtFATB-C в их перекрывающемся участке. Представлялось, что CtFATB-A был более отличающимся по своей нуклеотидной последовательности, чем другие две последовательности CtFATB.
Профиль экспрессии генов CtFATB, определенный с
использованием анализа с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени.
Профиль экспрессии трех генов CtFATB исследовали с помощью
количественной ПЦР в режиме реального времени, как изложено в
примере 1. Были разработаны олигонуклеотидные праймеры,
соответствующие уникальному району каждого из трех генов,
включая CtFATB-A, смысловой праймер: 5'-
AGAGATCATTGGAGACTAGAGTG-3' (SEQ ID NO: 148); антисмысловой праймер: 5'-CCCATCAAGCACAATTCTTCTTAG-3' (SEQ ID NO: 149); CtFATB-B, смысловой праймер: 5'-CTACACAATCGGACTCTGGTGCT-3' (SEQ ID NO: 150); антисмысловой праймер: 5'-GCCATCCATGACACCTATTCTA-3' (SEQ ID NO: 151); CtFATB-C, смысловой праймер: 5'-CCTCACTCTGGGACCAAGAAAT-3' (SEQ ID NO: 152); антисмысловой праймер: 5'-TTCTTGGGACATGTGACGTAGAA-3' (SEQ ID NO: 153) . Реакции ПЦР проводили в трех повторах, как описано в примере 1.
Как продемонстрировано на фиг. 9, CtFATB-A
продемонстрировал низкие уровни экспрессии в листьях, корнях и на всех трех стадиях развития зародышей, которые были проверены. CtFATB-B был действующим в листьях и корнях, но продемонстрировал экспрессию на более низком уровне в развивающихся зародышах, чем в листьях и корнях. Это наводило на мысль о том, что этот ген, вероятно, играет лишь незначительную роль, если вообще играет, в биосинтезе жирных кислот в развивающихся семенах. Напротив, CtFATB-C
продемонстрировал высокие уровни экспрессии во всех проверенных тканях, в частности, в развивающихся зародышах. Это означало, что CtFATB-C был основным геном, кодирующим FATB для продукции пальмитиновой кислоты в масле семени сафлора. Это не расходится с выделением авторами настоящего изобретения только одного клона кДНК для FATB из библиотеки, происходящей из зародыша семени, а именно CtFATB-T12, который был идентичен по последовательности CtFATB-C. На основе этих данных был выбран фрагмент ДНК размером приблизительно 300 п.о., происходящий из CtFATB-T 12 (CtFATB-C), в качестве последовательности гена, которая должна была использоваться для приготовления конструкций шпилечных РНК для уменьшения экспрессии FATB в семени сафлора, как описано в следующих примерах.
Пример 9: Выделение и экспрессия кДНК сафлора, кодирующей
FAD 6
Выделение последовательности кДНК для FAD6 сафлора
Особые жирнокислотные составы, обнаруживаемые в липидах
мембран микросом и хлоропластов и запасаемых маслах семян,
являются результатом сложной метаболической сети, которая
функционирует с контролированием этого состава, регулируя
биосинтез жирных кислот и постоянное движение по так называемым
прокариотическим и эукариотическим путям. Очевидно, что
микросомальный фермент FAD2 играет основную роль в превращении
олеата в линолеат в ER после экспорта олеиновой кислоты из
пластиды и превращения в эфиры КоА в цитоплазме. Хлоропластная
омега-б десатураза (FAD6) является ферментом, который
десатурирует 16:1 и 18:1 жирные кислоты до 16:2 и 18:2,
соответственно, во всех 16:1- или 18:1-содержащих липидах
мембран хлоропластов, включая фосфатидилглицерин,
моногалактозилдиацилглицерин, дигалактозилдиацилглицерин и сульфогвиновозилдиацилглицерин. Мутант fad6 Arabidopsis, как сообщалось, является слабым в десатурации 16:1 и 18:1 до 16:2 и 18:2, соответственно, во всех липидах хлоропластов (Browse et al., 1989). Когда мутант fad6 выращивали при низкой температуре (5°С), листья становились хлоротическими, и скорость роста была
значительно уменьшенной по сравнению с диким типом (Hugly and Somerville, 1992). Последовательность кДНК, кодирующая FAD6, была сначала выделена из Arabidopsis Falcone и др. (1994) . С того времени кДНК, кодирующая FAD6, и гены FAD6 были выделены из нескольких видов растений, включая Brassica napus, Portulaca oleracea, сою и Ricinus communis.
Для выделения клона кДНК, кодирующего хлоропластную
десатуразу со б жирных кислот, кодируемую геном FAD6 из сафлора,
провели поиск гомологичных последовательностей в базе данных
CPG. Восемь последовательностей EST, а именно EL378905,
EL380564, EL383438, EL385474, EL389341, EL392036, EL393518,
EL411275, были идентифицированы и объединены в
последовательность одного континга размером 808 нуклеотидов. Эта последовательность имела интактный 5'-конец, но была неполной на 3'-конце. Полноразмерная кДНК была впоследствии получена посредством амплификации с помощью ПЦР 3'RACE, используя, в качестве матрицы, ДНК, экстрагированную из библиотеки в лямбда кДНК, полученных их развивающихся семян сафлора (SU) . Условиями ПЦР были условия, описанные в примере 2. Один олигонуклеотидный праймер, обозначенный ctFAD6-s2, использовали в реакции амплификации в сочетании с прямым праймером М13, поскольку последовательность для этого праймера присутствовала в векторе библиотеки кДНК. Последовательностью праймера ctFAD6-s2 была: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3' (SEQ ID NO: 154). Была получена кДНК размером 154 5 п.о., которая имела открытую рамку считывания размером 1305 п.о., которая кодировала полипептид ГАБб-кандидат длиной 435 аминокислот. Этот полипептид имел составляющую 60-74% идентичность аминокислотной последовательности с другими клонированными полипептидами FAD6 растений. Дендрограмма, демонстрирующая филогенетическую связь между последовательностью FAD6 сафлора и типичной пластидной А12 десатуразой FAD6, идентифицированной у высших растений, была создана с помощью Vector NTI (фиг. 10).
Профиль экспрессии CtFAD6, определенный с использованием анализа с помощью количественной ПЦР в режиме реального
времени.
Профиль экспрессии CtFAD6 был исследован с помощью количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, которую проводили, используя Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen), и исследовали в системе ABI 7900НТ Sequence Detection System с использованием параметров по умолчанию, описанных в примере 1. Используемыми праймерами были: ctFAD6-S2: 5'-CATTGAAGTCGGTATTGATATCTG-3' (SEQ ID NO: 155) и ctFAD6-a2: 5'-GTTCCAACAATATCTTCCACCAGT-3' (SEQ ID NO: 156). Реакции выполняли в трех повторах в общих объемах=10 мкл, содержащих 2 0 нг матрицы в виде тотальной РНК, 800 мМ каждого праймера, 0,25 мкл обратной транскриптазы и 5 мкл реагентов мастер-микс для ОТ-ПЦР в один прием. Условиями для обратной транскрипции и амплификации были 4 8°С в течение 3 0 мин, затем 95°С в течение 10 мин, с последующими 40 циклами 95°С в течение 15 сек и 60°С в течение 60 сек. Экспрессию с контрольного гена сафлора CtkasII использовали для нормализации уровней экспрессии FAD6. Расчеты были сделаны, как описано в примере 1.
Этот анализ показал, что CtFAD6 экспрессировался на относительно низких уровнях в листьях, корнях и на трех следующих одна за другой стадиях развития зародышей. Низкие уровни экспрессии, отмечаемые в развивающихся зародышах, не противоречили идеи, что FAD6 может играть относительно незначительную роль в десатурации олеата в семенах.
Пример 10. Разработка и приготовление генетических конструкций для сайленсинга генов биосинтеза жирных кислот в сафлоре
Шпилечные РНК (шРНК) представляют собой тип молекул РНК, которые широко использовались для уменьшения экспрессии генов в растениях. Шпилечные РНК типично транскрибируются в клетках растений с ДНК-конструкции, содержащей инвертированный повтор последовательности, происходящий из гена, подвергаемого сайленсингу. Таким образом, транскрипт в виде шпилечной РНК имеет полностью комплементарные смысловую и антисмысловую последовательности, которые гибридизуются с образованием
участка двухцепочечной РНК (дцРНК), соединенного с помощью
последовательности петли. Такие структуры дцРНК подвергаются
процессингу эндогенными аппаратами сайленсинга в клетках
растений с образованием молекул коротких РНК длиной
приблизительно 21-24 нуклеотида, соответствующих по
последовательности гену, активность которого уменьшается. Эти
короткие РНК могут образовывать комплексы с эндогенными
белками, которые специфически подавляют экспрессию
представляющего интерес гена. Такой сайленсинг может происходить на транскрипционном уровне, с использованием метилирования ДНК частей гена-мишени, на посттранскрипционном уровне посредством деградации мРНК-мишени, или в результате связывания мРНК с ингибированием их трансляции и, таким образом, уменьшением синтеза белка, кодируемого геном. Когда шпилечная РНК включает последовательность, которая является общей между членами семейства генов, шпилечная РНК может подавлять экспрессию каждого из этих генов, которые имеют эту последовательность.
Сафлор имеет большое семейство генов FAD2, при этом по крайней мере 11 членов были идентифицированы, как здесь описано (примеры 2-6) . Сафлор также имеет множество генов, кодирующих полипептиды FATB, при этом по крайней мере три члена были идентифицированы (пример 8), и по крайней мере один ген FAD6 был идентифицирован (пример 9) . Действительно, в результате экспериментов, описанных выше, не смогли идентифицировать все члены семейств генов в сафлоре. Для определения того, какие члены семейства генов FAD2 и FATB участвовали в биосинтезе линолевой кислоты или насыщенных жирных кислот, обнаруживаемых в масле семени сафлора, в частности, пальмитиновой кислоты, и того, был ли FAD6 также таким членом, было создано несколько генетических конструкций для экспрессии молекул шРНК в семени сафлора, для сайленсинга различных комбинаций генов FAD2, FATB и FAD6. Каждая из конструкций для шРНК была разработана для специфической экспрессии в развивающихся семенах сафлора во время периода синтеза масла. Это было осуществлено, используя или чужеродные промоторы, или промоторы, выделенные из сафлора,
для экспрессии конструкций, которые были введены в сафлор посредством трансформации растений. Конструирование pCW600
Бинарный экспрессионный вектор для растений был разработан
для экспрессии трансгенов в семенах, используя промотор гена
Olesoinl Arabidopsis (примечание на Web-сайте TAIR к гену
At4g25140) (SEQ ID NO: 52). Выделенный промотор был длиной 1192
п.о., начиная с нуклеотида 128992 98 в идентификационном №
NC003075.7, за исключением того, что, внутри последовательности
длиной 1198 п.о., б п.о. были пропущены во избежание
расщепляемых распространенными рестриктазами
последовательностей для способствования стадиям клонирования
позже. Промотор AtOleosin ранее использовался для сильной,
специфической для семени экспрессии трансгенов в сафлоре и
видах Brassica (Nykiforuk et al., 1995; Vanrooijen and Moloney,
1995) . Этот промотор, вероятно, был действующим в двух
направлениях промотором, управляя сильной, специфической для
семени экспрессией кодирующих областей, соединенных с обоими
концами фрагмента промотора. Промотор олеозина Arabidopsis
имеет общие особенности с промотором олеозина Brassica napus,
характеризующимся обладанием двунаправленного характера
(Sadanandom et al., 1996). Промотор был химически синтезирован,
клонирован в pGEMT-Easy, и EcoRI-фрагмент, содержащий промотор,
концы которого были затуплены посредством реакции заполнения с
помощью фермента фрагмента Кленова, лигирован в сайт для
HindiII pCW2 65 после затупления концов с помощью фрагмента
Кленова (Belide et al., 2011), создавая pCW600 (AtOleosinP::
пусто). Этот вектор содержал ген - селектируемый маркер,
который кодировал гигромицин-фосфотрансферазу (НРТ),
позволяющий, таким образом, осуществлять отбор на предмет устойчивости к гигромицину в культуре тканей во время процесса трансформации. Вектор также включал 35Э::ген GFP, который позволял осуществлять отбор трансформированных клеток и тканей в соответствии с флуоресценцией при ультрафиолетовом освещении. Посредством встраивания промотора AtOleosin был разработан вектор для экспрессии кодирующей области, представляющей
интерес, которую можно было вставить в сайт множественного клонирования, расположенный 3' от промотора и 5' от сигнала полиаденилирования nos (nos3'). Этот вектор служил в качестве базового вектора для конструкций pCW602 и pCW603, описанных ниже.
Конструирование pXZP410
Промотор линина льна (патент США с № 7642346) (SEQ ID N0: 53) был вставлен в виде NotI-XhoI-фрагмента в бинарный вектор рТ7-HELLSGATE12 (Wesley et al. , 2001), создавая Gateway(tm) приводящий к сайленсингу бинарный вектор pXZP410. Вектор pXZP410 содержал ген - селектируемый маркер, который придавал устойчивость к канамицину во время культивирования тканей, и делал возможной специфическую для семени экспрессию конструкций для шпилечных РНК под контролем промотора линина. Вектор имел два интрона, один в смысловой ориентации, а другой в антисмысловой ориентации относительно промотора, и имел сайты для рекомбиназы AttLl и AttL2, фланкирующие интроны.
Для создания приводящей к сайленсингу конструкции исходя из pXZP410, две копии последовательности из гена-мишени в Gateway исходном векторе, экспрессия которого должна быть подавлена, были вставлены в вектор, одна вставлена 5', другая -3' от двух интронов, в обратных ориентациях относительно друг друга, с образованием инвертированного повтора. Сайты для рекомбиназы позволяли быстро вставить две копии, используя систему для клонирования с использованием рекомбиназы Gateway (Invitrogen, Carlsbad, США), как описывалось ранее (Wesley et al., 2001) . Этот вектор pXZP410 использовался в качестве базового вектора для создания pCW631 и pCW632, как описано ниже.
Конструирование pCW571
Последовательность длиной 300 п.о. (SEQ ID NO: 50), идентичная району гена CtFATB-З сафлора, соответствующему нуклеотидам 485-784 кДНК для CtFATB-З, была химически синтезирована и вставлена в pENTR/D topo (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя, создавая Gateway исходный клон, обозначенный pCW569. Фрагмент размером 756 п. о.
(SEQ ID NO: 49) кДНК для CtFAD2-2, соответствующий нуклеотидам
427-1182, был синтезирован и амплифицирован с помощью ОТ-ПЦР,
исходя из РНК, выделенной из развивающихся семян сафлора.
Праймерами были D2 8-PstI-5 (5'-CCTGCAGGTACCAATGGCTCGACGACACTG-
3') (SEQ ID NO: 157) и D28-AscI-3 (5'-
CGGCGCGCCTTCACCTCCTCATCTTTATCC-3') (SEQ ID NO: 158),
соответственно. Праймеры включали 5' сайт для рестриктазы PstI и 3' сайт для рестриктазы AscI, таким образом позволяющие вставить амплифицированный фрагмент в соответствующие сайты pCW569, создавая pCW570. Этот вектор содержал составные районы из генов CtFATB и CtFAD2-2 в виде фрагмента размером 1080 п.о., фланкированного сайтами для рекомбиназы, AttLl и AttL2. Две копии этого фрагмента FATB-FAD2-2 затем были вставлены в pXZP410, вторая копия инвертировано относительно первой, используя клоназу LR в соответствии с инструкциями поставщика
(Invitrogen, Carlsbad, США). Результирующая плазмида pCW571 содержала промотор линина льна для транскрипции района в виде инвертированного повтора специфическим для семени образом, чтобы продуцировать шРНК для уменьшения экспрессии генов CtFATB и CtFAD2-2 в семенах.
Конструирование pCW603
Фрагмент ДНК из pCW571, содержащий инвертированный повтор фрагментов CtFATB-CtFAD2-2 с двумя промежуточными интронами, был вырезан с помощью Spel, затуплен, используя фрагмент Кленова I ДНК-полимеразы, и лигирован в сайт для EcoRV pCW600, создавая pCW603. Эта конструкция pCW603 была способна экспрессировать шРНК под контролем промотора AtOleosin в семенах сафлора, для уменьшения экспрессии CtFATB и CtFAD2-2.
Конструирование pCW581
Фрагмент размером 590 п. о. (SEQ ID NO: 51) ДНК, состоящий из фрагмента размером 290 п.о. CtFAD6, соответствующего нуклеотидам 451-750 кДНК для CtFAD6, и фрагмента размером 300 п. о. CtFATB, как и в случае pCW571, был химически синтезирован и вставлен в pENTR/D topo, создавая pCW579. Фрагмент размером 780 п.о. CtFAD2-2, описанный выше для pCW57 0, был клонирован в сайт для AscI pCW579, создавая pCW580. Эта конструкция была
исходным клонированным вектором, содержащим последовательности из генов CtFATB, CtFAD6 и CtFAD2-2, соединенные в том же порядке, что и во фрагменте ДНК размером 1370 п. о. с фланкирующими сайтами для рекомбиназы, AttLl и AttL2. Две копии этого фрагмента FATB-FAD6-FAD2-2 были затем вставлены в виде инвертированного повтора в pXZP410, используя клоназу LR, создавая pCW581. Эта конструкция pCW581 представляла собой бинарный вектор, содержащий промотор линина льна, функционально связанный с инвертированным повтором, который после транскрипции в клетках развивающегося семени сафлора был способен экспрессировать шРНК для уменьшения экспрессии генов CtFATB, СtFADб и CtFAD2-2.
Конструирование pCW602
Фрагмент ДНК, содержащий инвертированный повтор
соединенных районов CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2, с двумя
промежуточными интронами, был ферментативно вырезан из pCW571 с помощью NotI, затуплен, используя фрагмент Кленова I, и затем лигирован в сайт для EcoRV pCW600, создавая pCW602. pCW602 содержал последовательности CtFATB-CtFAD6-CtFAD2-2 под контролем промотора AtOleosin, в отличие от pCW581, который имел ту же конструкцию и те же фрагменты генов за исключением промотора линина.
Конструирование pCW631 и pCW632
Хотя промотор линина был применим для экспрессии шРНК в семенах, и pCW571, и pCW581 содержали селектируемый маркер, который придавал устойчивость к канамицину. В предварительных экспериментах, относящихся к трансформации сафлора, авторы настоящего изобретения отметили, что экспланты не были в достаточной степени чувствительными к канамицину. По этой причине генную кассету устойчивости к канамицину pCW571 и pCW581 заменили генной кассетой устойчивости к гигромицину в качестве гена селектируемого маркера. Ген устойчивости к гигромицину, состоящий из промотора enCUP:reH устойчивости к гигромицину:район полиаденилирования nos3', вырезали из pCW265 с помощью расщепления рестриктазами Spel и Avrll и использовали для замены кассеты устойчивости к канамицину в pCW571 и pCW581,
таким образом создавая pCW631 и 632, соответственно.
Суммируя, конструкции, используемые в этом первом ряде трансформаций сафлора, содержали следующие основные элементы.
Вектор Промотор Фрагменты генов в инвертированном повторе
pCW631 гена линина OFAD2-2 и CtFATB
pCW632 гена линина OFAD2-2, OFAD6 и CtFATB
pCW602 AtOleosin OFAD2-2, OFAD6 и CtFATB
pCW603 AtOleosin OFAD2-2 и CtFATB
Эти конструкции вводили в штамм AGL1 Agrobacterium и использовали для трансформации сафлора, как описано в примере 1, со следующими результатами.
Пример 11. Трансформация сафлора приводящими к генному сайленсингу конструкциями
Геномные конструкции использовали для трансформации извлеченных семядолей и гипокотилей сорта S317 сафлора, используя способ с использованием Agrobacterium, со спасением генерированных ростков, используя трансплантацию (Belide et al. , 2011) . Свыше 3 0 независимых трансформированных ростков, выращиваемых на нетрансформированных корневищах, (ниже называемых растениями То) было регенерировано в случае вектора pCW603 и выращено до достижения зрелости, как описано в примере 1. Интеграцию Т-ДНК в побеги сафлора То проверяли с помощью ПЦР, используя специфические для векторной Т-ДНК праймеры, как описано Belide и др. (2011). Большинство растений, в которых, как обнаружено, отсутствовала Т-ДНК, использованная в случае конкретной трансформации, продолжавшие "ускользать" от отбора с помощью гигромицина во время регенерации в культуре тканей, были забракованы. Однако некоторые из них были сохранены в качестве "нулевых" растений или отрицательных контролей для сравнения с трансформированными растениями. Эти контрольные растения обрабатывали в тех же условиях, что и трансформированный материал в условиях культивирования тканей, трансплантации и таблицы.
Пример 12. Анализ жирнокислотного состава масла из семени трансгенного сафлора
Анализы жирных кислот проводили на отдельных семенах Ti, полученных от трансформированных растений сафлора, как указано ниже. 30 независимых растений То, трансформированных pCW603 на генетическом фоне S317, выращивались в теплице и самоопылялись для образования семени. До 10 зрелых семян из одной семенной шапки от каждого растения То анализировали в отношении состава липидов, используя анализ с помощью GC, как описано в примере 1. Результаты анализа жирнокислотного состава семян сафлора, S317, трансформированного pCW603, суммированы в таблице 13. Поскольку каждое трансформированное растение сафлора То, как ожидалось, является гетерозиготным по Т-ДНК и, следовательно, порождает расщепляющуюся популяцию семян Ti, предполагалось, что анализ 5-10 семян от каждого растения будет включать некоторые "нулевые" (сегреганты) семена. Такие семена-нулевые сегреганты были хорошими отрицательными контролями в этом эксперименте, поскольку они выросли и развивались в той же семенной шапке, что и трансформированные семена от того же растения. Как можно заметить, исходя из данных, представленных в таблице 13, уровни олеиновой кислоты, превышающие 87% (в виде вес% от общего содержания жирных кислот), отмечались в б независимых линиях (линиях 9, 12, 14, 20, 34 и 36) из 30 регенерированных линий. Многие из трансформированных семян имели содержание олеиновой кислоты в диапазоне 87-91,7%, с уровнями линолевой кислоты, составляющими 2,15-5,9%, и уровнями пальмитиновой кислоты, составляющими 2,32-3,45%. Уровни других жирных кислот в семенах не отличались значительно от нетрансформированных контролей. Максимальное содержание олеиновой кислоты, отмеченное в семени сафлора Ti, трансформированного pCW603, составляло 91,7%, по сравнению с приблизительно 77% в нетрансформированных контрольных семенах S317 и семенах-нулевых сеграгантах. Примечательно, что липиды в семенах были также значительно уменьшенными по уровням 16:0, уменьшаясь с 4,5% вниз до 2,3%. Профили жирных кислот фракций TAG масел из семян, очищенных на пластинах для TLC, не отличались значительно от таковых для всех липидов, экстрагированных из семян.
Два показателя рассчитывали на основе общего жирнокислотного состава семени сафлора, принимая во внимание самые важные жирные кислоты в масле из семени. Ими были доля десатурации олеиновой кислоты (ODP) и значение отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту
(PLO) . Их рассчитывали для каждого семени, и данные представлены в таблице 13. Семена дикого типа (S317, нетрансформированные) и нулевые сегреганты имели отношение ODP, составляющее приблизительно 0,1500, и значение PLO, составляющее приблизительно 0,2830. Семена, трансформированные Т-ДНК из pCW603, продемонстрировали значительные уменьшения значений ODP и PLO. 13 семян, регенерированных из б независимых случаев, имели значение PLO, составляющее менее 0,1 и ODP, составляющее менее 0,06. Одна трансформированная линия имела ODP, составляющее 0,0229, и PLO, составляющее 0,0514.
Зрелые отдельные семена одной элитной линии, S317,
трансформированной pCW603, строка 9, и нетрансформированной
родительной линии S317 были подвергнуты липидомному анализу,
используя LC-MS. Эти анализы ясно показали, что масло из семян,
трансформированных конструкцией AtOleosinp:шпилька CtFATB-
CtFAD2-2 для РНК-интерференции, имело существенно измененный
состав TAG и DAG (фиг. 11 и 12) . Отмечалось явное увеличение
уровня TAG(54:3) и уменьшение TAG(54:5), которые представляли
собой в основном 18: 1/18:1/18:1-TAG (триолеин) и
18:1/18:2/18:2-TAG, соответственно. Среди семян,
проанализированных с помощью LC-MS, содержание триолеина
(=54:3) в TAG составляло до 64,6% (моль%) при самом высоком уровне олеиновой кислоты (> 90%, таблица 14) для семени из линии с сайленсингом с помощью РНК-интерференции, по сравнению с нетрансформированным (S-317) родителем, который имел уровни триолеина, находящиеся в пределах 47%-53%. Вторым содержащим олеат в наибольшем количестве TAG был 18:0/18:1/18:1, а затем 18:1/18:1/18:2. Наиболее очевидную разницу между этими маслами сафлора можно было также отметить для липидного класса DAG. Уровень DAG(36:1) был удвоенным в масле из трансформированного семени по сравнению с родительским семенем, в то время как
DAG(36:4) был уменьшенным на вплоть до 10%. DAG(36.1) представляет собой в основном 18:0/18:1-DAG, a DAG(36:4) представляет собой 18:2/18:2-DAG (дилинолеат). DAG в липидах семени были лишь минорным компонентом, поскольку уровни всех TAG были в приблизительно 100 раз выше таковых всех DAG (таблица 15).
Рост и морфология трансгенных растений
Трансформанты сафлора То, содержащие Т-ДНК из pCW603, образовывали семя Ti, которое расщеплялось по Т-ДНК, давая совокупность гомозигот, гемизигот и нулевых сегрегантов. Соотношение этих субпопуляций зависело от числа и сцепления событий вставки Т-ДНК в растениях То, как и ожидалось в соответствии с менделеевской генетикой. Поэтому семена Ti от растения Т0 были проанализированы по отдельности. Анализ профилей липидов из отдельных семян ясно показал, что отдельные семенные шапки содержат и нулевые и трансгенные случаи.
Жирнокислотный состав липидов в отдельных семенах сафлора Т1, трансформированных Т-ДНК pCW603 на фоне S-317. Уровень каждой жирной кислоты (%) представлен в виде процента от общего содержания жирных кислот.
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
C18:ldll
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
PLO**
ODP**
S317 (1)
4.60
1.47
75.69
0.69
16.49
0.00
0.31
0.26
0.27867
0.1789
S317 (2)
4.64
1.47
77.02
0.68
15.09
0.00
0.32
0.28
0.25620
0.1638
S317(3)
4.56
1.38
76.20
0.68
16.14
0.00
0.32
0.26
0.27161
0.1748
S317 (4)
4.61
1.57
76.41
0.69
15.64
0.00
0.34
0.26
0.26506
0.1699
S317 (5)
4.55
1.51
77.90
0.69
14.28
0.00
0.33
0.25
0.24176
0.1549
Нулевой (1)
4.77
2.10
78.07
0.85
13.82
0.00
0.38
0.00
0.23815
0.1504
Нулевой (2)
4.93
1.96
76.02
0.89
15.55
0.00
0.38
0.28
0.26942
0.1698
Нулевой (3)
5.59
2.22
75.15
0.92
15.68
0.00
0.45
0.00
0.28302
0.1726
Нулевой (4)
4.61
1.65
78.52
0.78
13.58
0.00
0.35
0.28
0.23163
0.1474
Нулевой (5)
5.57
2.93
78.10
0.93
11.96
0.00
0.51
0.00
0.22445
0.1328
TS603.12(5)
2.56
2.05
91.73
0.84
2.15
0.00
0.37
0.29
0.05136
0.0229
TS6O3.09 (4)
2.32
1.87
91.45
0.74
3.09
0.00
0.20
0.34
0.05911
0.0326
TS603.09 (5)
2.66
2.43
91.41
0.78
2.45
0.00
0.27
0.00
0.05587
0.0261
TS603.09 (1)
2.42
2.08
91.17
0.74
3.02
0.00
0.23
0.33
0.05972
0.0321
TS603.36(1)
2.65
2.40
91.01
0.67
2.25
0.00
0.45
0.32
0.05379
0.0241
TS603.36 (2)
2.73
1.77
90.53
0.69
3.36
0.00
0.36
0.32
0.06728
0.0358
TS603.20 (4)
2.94
1.31
89.63
0.88
4.58
0.00
0.31
0.34
0.08393
0.0486
TS603.34 (4)
3.21
2.55
89.62
0.89
2.92
0.00
0.48
0.32
0.06847
0.0316
TS603.14(2)
2.99
1.74
89.31
0.88
4.39
0.00
0.35
0.34
0.08257
0.0468
TS603.09 (3)
2.90
1.75
89.00
0.83
5.52
0.00
0.00
0.00
0.09465
0.0584
TS603.34 (5)
3.36
2.23
88.92
0.85
3.89
0.00
0.43
0.32
0.08151
0.0419
TS603.34 (2)
3.24
1.76
88.74
1.02
4.51
0.00
0.37
0.37
0.08725
0.0483
TS603.14(1)
3.21
1.51
88.65
0.88
5.05
0.00
0.34
0.37
0.09310
0.0539
Образец*
C16:0
C18:0
C18:l
С18:Id 11
C18:2
C18:3
C20:0
C20:l
PLO**
ODP***
TS603.20 (3)
3.29
1.39
88.44
0.98
5.90
0.00
0.00
0.00
0.10391
0.0625
TS603.12(2)
3.00
1.63
88.42
0.75
5.60
0.00
0.31
0.30
0.09722
0.0595
TS603.20 (2)
3.45
1.66
88.36
0.99
5.54
0.00
0.00
0.00
0.10175
0.0590
TS603.20(1)
3.30
1.46
88.16
0.89
5.53
0.00
0.33
0.31
0.10021
0.0590
TS603.14(5)
3.45
1.66
87.43
0.87
5.88
0.00
0.36
0.35
0.10673
0.0630
TS603.14(4)
3.37
1.84
87.36
0.88
5.81
0.00
0.39
0.35
0.10509
0.0624
TS603.36 (4)
3.24
2.21
87.33
0.67
5.60
0.00
0.42
0.30
0.10117
0.0602
TS603.36 (3)
3.42
2.33
86.82
0.71
5.68
0.00
0.45
0.32
0.10491
0.0614
TS603.14(3)
3.58
1.61
86.50
0.86
6.74
0.00
0.36
0.35
0.11931
0.0723
TS603.12(4)
3.68
1.39
85.46
0.92
7.97
0.00
0.29
0.30
0.13624
0.0853
TS603.12(3)
3.55
2.06
85.01
0.74
8.02
0.00
0.35
0.27
0.13609
0.0862
TS603.23 (5)
4.93
1.75
82.63
1.04
8.75
0.00
0.41
0.31
0.16561
0.0958
TS603.17(5)
4.68
1.57
82.06
0.70
10.37
0.00
0.33
0.31
0.18339
0.1122
TS603.17(4)
4.41
1.31
81.94
0.68
11.11
0.00
0.28
0.28
0.18940
0.1194
TS603.24 (3)
4.24
2.17
81.70
0.68
10.28
0.00
0.42
0.27
0.17772
0.1118
TS603.24 (5)
4.48
2.18
81.15
0.69
10.56
0.00
0.41
0.27
0.18541
0.1152
TS603.24 (4)
4.39
2.16
80.94
0.70
10.88
0.00
0.41
0.25
0.18869
0.1185
TS603.23 (4)
4.38
2.01
80.86
0.82
11.23
0.00
0.40
0.29
0.19312
0.1220
TS603.24 (2)
4.50
2.39
80.70
0.68
10.79
0.00
0.44
0.26
0.18946
0.1180
TS603.17(3)
4.60
1.75
80.65
0.68
11.69
0.00
0.35
0.27
0.20203
0.1266
TS603.24 (1)
4.28
2.01
80.54
0.70
11.53
0.00
0.40
0.27
0.19632
0.1252
TS603.17(2)
4.40
1.75
80.33
0.73
11.92
0.00
0.35
0.28
0.20316
0.1292
TS603.06 (3)
4.38
1.60
80.22
0.88
12.31
0.00
0.34
0.28
0.20803
0.1330
TS603.06 (5)
4.52
1.47
80.11
0.84
12.50
0.00
0.29
0.27
0.21245
0.1350
TS603.15 (3)
4.65
2.01
79.94
0.85
11.92
0.00
0.38
0.26
0.20720
0.1297
TS603.34 (3)
4.77
2.44
79.79
0.86
11.42
0.00
0.45
0.28
0.20281
0.1252
TS603.36 (5)
4.92
2.43
79.78
0.68
11.24
0.00
0.44
0.26
0.20258
0.1235
Образец*
06:0
C18:0
C18:l
C18:ldll
C18:2
C18:3
C20:0
C20:l
PLO**
ODP**
TS603.06(1)
4.49
1.89
79.53
0.82
12.61
0.00
0.38
0.29
0.21495
0.1368
TS603.23 (2)
4.47
1.74
79.45
0.86
12.86
0.00
0.35
0.28
0.21810
0.1393
TS603.28 (4)
4.99
2.08
79.45
0.94
12.14
0.00
0.41
0.00
0.21554
0.1325
TS603.28 (1)
4.73
2.31
79.42
0.85
12.26
0.00
0.43
0.00
0.21390
0.1337
TS603.28 (5)
5.04
1.96
79.37
0.97
12.66
0.00
0.00
0.00
0.22301
0.1376
TS603.28 (2)
4.95
2.16
79.33
0.88
12.29
0.00
0.39
0.00
0.21728
0.1341
TS603.15 (2)
4.55
1.73
79.31
0.89
12.90
0.00
0.36
0.27
0.21995
0.1399
TS603.06 (4)
4.60
1.73
79.25
0.88
12.93
0.00
0.33
0.28
0.22121
0.1403
TS603.15 (1)
4.50
2.11
79.11
0.84
12.79
0.00
0.39
0.26
0.21860
0.1392
TS603.12(1)
4.28
1.33
79.08
0.76
13.82
0.21
0.27
0.26
0.22880
0.1507
TS603.06 (2)
4.63
2.24
79.08
0.78
12.58
0.00
0.42
0.27
0.21765
0.1373
TS603.09 (2)
4.39
1.72
78.80
0.73
13.30
0.19
0.34
0.30
0.22453
0.1462
TS603.23(1)
4.56
2.11
78.63
0.79
13.24
0.00
0.39
0.27
0.22648
0.1442
TS603.17(1)
4.43
1.49
78.47
0.74
13.92
0.37
0.31
0.26
0.23386
0.1540
TS603.15 (4)
4.67
1.99
78.41
0.84
13.48
0.00
0.36
0.26
0.23138
0.1467
TS603.28 (3)
4.89
1.67
78.31
0.88
13.29
0.31
0.35
0.31
0.23208
0.1479
TS603.34(1)
4.65
2.13
77.75
0.83
13.58
0.35
0.41
0.30
0.23441
0.1519
TS603.23 (3)
4.59
1.70
77.28
0.85
14.63
0.31
0.36
0.28
0.24866
0.1620
TS603.15 (5)
4.69
1.64
77.23
0.97
14.85
0.00
0.35
0.27
0.25302
0.1613
* Образцы, помеченные с использование этого условного обозначения: TS603.12(5) означает растение, трансформированное вектором pCW603, случай 12, семя 5. Образцы, помеченные как "нулевые", определены с использованием анализа с помощью ПЦР как нетрансформированные "ускользания" при трансформации растений. ** Показатель PLO, рассчитанный как (16:0+18:2)/18:1 ***Показатель ODP, рассчитанный как (18:2+18:3)/(18:1+18:2+18:3)
Жирнокислотный состав всех липидов одного семени
(% от общего содержания жирных кислот).
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
C18:ldll
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
S317 Семя 1
5.21
2.35
77.36
0.88
14.20
0.00
0.00
0.00
S317 Семя 2
5.08
3.04
77.20
0.80
13.88
0.00
0.00
0.00
S317 Семя 3
5.00
2.65
78.89
0.78
12.67
0.00
0.00
0.00
Т8603.9Семя 1
3.76
3.07
87.93
0.91
4.34
0.00
0.00
0.00
TS603.9 Семя 2
3.33
2.98
89.97
0.93
2.80
0.00
0.00
0.00
TS603.9 Семя 4
3.61
4.28
88.20
0.87
3.05
0.00
0.00
0.00
TS603.9 Семя 5
3.61
3.13
88.45
0.92
3.38
0.00
0.50
0.00
TS603.9 Семя 6
4.45
3.04
85.50
0.90
5.62
0.00
0.51
0.00
Семена от некоторых из трансгенных линий выращивали в контролируемых условиях (температуры, почвы, оптимального полива и внесения удобрений, но при естественном освещении) в теплице для исследования морфологии и скорости роста растений. Фенотипические различия не отмечались между трансформированными растениями Ti и их сибсами - нулевыми сегрегантами. Трансформированные семена прорастали с той же скоростью, что и нетрансформированные семена, и давали проростки, имеющие одинаковую начальную скорость роста проростков (силу). Все посеянные семена укоренялись и вырастали в полностью плодоносящие растения. ДНК экстрагировали из верхушечных концов соответствующих листьев отдельных растений поколения Ti, и анализ с помощью ПЦР проводили для определения соотношения нулевых и трансгенных растений. Как и ожидалось, были идентифицированы нулевые сегреганты.
Этот фенотипический анализ показал, что растения сафлора, трансформированные Т-ДНК pCW603 и экспрессирующие трансгены, не
страдают от каких-либо вредных эффектов по сравнению с нулевыми сегрегантами.
Семена сафлора поколения Т2 проверяли в отношении масличности. Семена от нескольких растений с высокими уровнями олеиновой кислоты (таблица 13) выращивали в зрелые растения, образующие семена второго поколения (семя Т2) . Эти семена собирали при достижении созревания и анализировали в отношении жирнокислотного состава их масла. Данные представлены в таблице 16. Хотя семя Ti продемонстрировало вплоть до приблизительно 92% олеиновой кислоты, в семени Т2 достигалось 94,6% олеиновой кислоты. Отмеченное увеличение в поколении Т2 по сравнению с поколением Ti могло быть обусловлено гомозиготностью трансгена, или просто большим числом проанализированных линий.
Анализ с помощью блот-гибридизации по Саузерну используется для определения числа вставок Т-ДНК в каждой трансформированной линии, и линии с одной вставкой Т-ДНК отбирают. Масличность семян Т2 не отличается значительно от таких контрольных, нетрансформированных семян с тем же генетическим фоном и выращенных в тех же условиях.
Анализ семян сафлора, трансформированных Т-ДНК из pCW631.
Семена Ti сорта сафлора S-317, трансформированного pCW631, анализировали так же в отношении их жирнокислотного состава. В таблице 17 представлены данные и показали ODP и PLO для этих семян. Содержание олеиновой кислоты в липидах этих семян составляло вплоть до 94,19%. Содержание пальмитиновой кислоты в семени TS631-01 Т1 (21) с наибольшим уровнем олеиновой кислоты составляло 2,43%, значение ODP составляло 0,0203, и значение PLO составляло 0,0423. Эти анализы показали, что конструкция для шпилечной РНК в pCW631, как правило, порождала более высокие уровни олеиновой кислоты, чем конструкция в pCW603 после трансформации в сафлор с генетическим фоном S-317. Эти данные наблюдений означали, что промотор линина, используемый в pCW631, экспрессировал шпилечную РНК сильнее или с лучшим согласованием по времени экспрессии, или и то, и другое, по сравнению с промотором AtOleosin, используемом в pCW603.
Семена Т2 сорта сафлора S-317, трансформированного Т-ДНК
из pCW631, были проанализированы с помощью GC. Отмечались уровни олеиновой кислоты вплоть до 94,95% со значением ODP, составляющим 0,01, и значением PLO, составляющим 0,035.
Семена и растения сафлора, трансформированные Т-ДНК из конструкций pCW632 и pCW602, анализируют так же, как и семена и растения, трансформированные pCW603 и pCW631. Анализ с помощью GC семени Ti сорта сафлора S-317, трансформированного pCW632, показал, что уровень олеиновой кислоты составляет вплоть до 94,88%, со значением ODP, составляющим 0,0102, и значением PLO, составляющим 0,0362. Их семена Т2 продемонстрировали вплоть до 93,14% олеиновой кислоты, со значением ODP, составляющим 0,0164, и значением PLO, составляющим 0,0452.
Экстракция более больших объемов масла из семян сафлора
Семена Т4 от гомозиготной трансгенной линии, обозначенной TS603-22.6, собирали, и все масло из семян экстрагировали, используя устройство Soxhlet, как описано в примере 1. Аликвоты экстрагированного масла анализировали с помощью GC (таблица 18). Всего 64 3 грамм масла было выделено. Экстракции 2, 3, 5, и б объединяли, в то время как экстракции 4, 7 и 8 объединяли в обособленной серии. Смеси в дальнейшем анализировали в отношении жирнокислотного состава с помощью GC. Эти данные представлены в таблице 18.
Пример 13. Разработка и приготовление дополнительных, вызывающих генный сайленсинг конструкций
На основе результатов, описанных в примерах 10-12, другие вызывающие генный сайленсинг конструкции были приготовлены, как указано ниже, для увеличения содержания олеиновой кислоты в масле семени сафлора и уменьшения отношений ODP или PL0. Эти вызывающие генный сайленсинг конструкции включали сочетание различных промоторов, из несафлоровых источников, а также сафлоровых источников, для достижения максимального уменьшения экспрессии генов FAD2-2, FATB-З и FAD6 сафлора, и, кроме того, сайленсинга более чем одного гена FAD2 помимо FAD2-2. Эти конструкции используют для трансформации сортов сафлора, которые имели инактивированные варианты эндогенного гена CtFAD2-l, таких как S-317, Ciano-OL и Lesaff496.
Конструирование pCW7 0 0
Этот бинарный экспрессионный вектор для растений содержит два чужеродных (несафлоровых) промоторов с различными, но перекрывающимися картинами экспрессии в семени сафлора, а не один промотор, для образования шпилечной РНК для уменьшения экспрессии эндогенного CtFATB и CtFAD2-2. Двумя промоторами являются промотор AtOleosin и промотор линина льна, и две кассеты для экспрессии шРНК находятся в одной и той же молекуле Т-ДНК. Этот вектор конструируют посредством вырезания рестриктазами кассеты для экспрессии гена для шРНК из pCW631, содержащей промотор линина и область, кодирующую шРНК для сайленсинга CtFAD2-2 и CtFATB, и встраивают ее в Т-ДНК pCW603, таким образом создавая конструкцию, кодирующую шпилечную РНК, направленную против этих двух генов сафлора. Эту конструкцию используют для трансформации сортов сафлора, таких как Lesaff496, Ciano-OL и S-317.
Жирнокислотный состав липида из отдельных семян сафлора Т2, трансформированных Т-ДНК pCW603 на фоне S-317. Уровень каждой жирной кислоты (%) представлен в виде процента от общего содержания жирных кислот.
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
ODP
PLO
TS603-22.3 Т2 (4)
2.4
0.9
94.6
1.7
0.0
0.2
0.0
0.0181
0.043956
TS603-22.6(5)
2.5
1.0
94.5
2.0
0.0
0.0
0.0
0.0214
0.048069
TS603-22.6(2)
2.1
0.9
94.4
2.5
0.0
0.0
0.0
0.0266
0.04934
TS603-22.6(4)
2.4
1.0
94.3
2.3
0.0
0.0
0.0
0.0239
0.049028
TS603-22.4 Т2 (2)
2.2
1.5
94.3
1.8
0.0
0.0
0.1
0.0200
0.042739
TS603-22.6 Т2 (20)
2.2
1.1
94.2
2.4
0.0
0.0
0.0
0.0256
0.048622
TS603-22.05(4)T2
2.2
1.4
94.2
2.0
0.0
0.1
0.0
0.0212
0.044211
TS603-22.8 Т2 (1)
2.1
1.1
93.9
2.5
0.2
0.1
0.0
0.0263
0.04839
TS603-22.6 Т2 (10)
2.8
1.0
93.9
2.1
0.0
0.0
0.0
0.0223
0.052359
TS603-22.6 Т2 (6)
2.9
1.1
93.9
2.0
0.0
0.0
0.0
0.0214
0.052318
TS603-22.05(1)T2
2.2
1.3
93.8
2.2
0.1
0.2
0.0
0.0240
0.04783
TS603-22.6 Т2 (13)
2.9
1.2
93.8
1.7
0.0
0.2
0.0
0.0185
0.049564
TS603-22.6 Т2 (16)
2.9
0.9
93.8
2.3
0.0
0.0
0.0
0.0249
0.055517
TS603-22.4 Т2 (1)
2.5
1.5
93.7
1.9
0.1
0.1
0.0
0.0204
0.046933
TS603-22.6(1)
2.7
1.2
93.7
2.3
0.0
0.0
0.0
0.0241
0.052497
TS603-22.3 Т2 (5)
2.5
1.1
93.6
2.6
0.0
0.0
0.0
0.0278
0.05449
TS603-08.2(4)
2.2
0.8
93.6
3.3
0.0
0.0
0.0
0.0355
0.05861
TS603-22.6 Т2 (9)
2.9
1.2
93.5
2.2
0.0
0.2
0.0
0.0235
0.054815
TS603-22.6 Т2 (19)
2.9
1.1
93.5
2.3
0.0
0.0
0.0
0.0245
0.055483
TS603-22.4 Т2 (3)
2.4
1.0
93.5
2.8
0.1
0.0
0.0
0.0299
0.056044
TS603-22.1 Т2 (2)
2.7
0.9
93.5
2.9
0.0
0.0
0.0
0.0306
0.059281
TS603-22.6 Т2 (14)
3.1
1.5
93.4
2.1
0.0
0.0
0.0
0.0222
0.054943
TS603-08.2(3)
2.7
0.9
93.4
2.9
0.0
0.0
0.0
0.0306
0.059851
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
ODP
PLO
TS603-22.05(5)T2
2.3
1.6
93.4
2.5
0.2
0.0
0.0
0.0267
0.051234
TS603-22.6 Т2 (15)
3.0
1.2
93.3
2.4
0.0
0.0
0.0
0.0261
0.057723
TS603-22.5 Т2 (И)
2.2
1.2
93.3
2.3
0.0
0.3
0.4
0.0285
0.048123
TS603-22.6 Т2 (8)
2.9
1.2
93.3
2.5
0.0
0.0
0.0
0.0265
0.057514
TS603-22.5 Т2 (12)
2.2
1.3
93.3
2.3
0.0
0.3
0.4
0.0289
0.047835
TS603-22.6 Т2 (7)
3.1
1.3
93.2
2.5
0.0
0.0
0.0
0.0265
0.059228
TS603-22.4 Т2 (8)
2.1
1.8
93.2
2.0
0.0
0.3
0.3
0.0254
0.044186
TS603-22.6 Т2 (И)
2.9
1.2
93.1
2.5
0.0
0.1
0.0
0.0271
0.057755
TS603-22.3 Т2 (1)
2.5
1.2
93.1
3.1
0.0
0.0
0.0
0.0335
0.060295
TS603-22.5 Т2 (14)
2.1
1.3
93.1
2.6
0.0
0.2
0.4
0.0318
0.050656
TS603-22.5 Т2 (16)
2.3
1.5
93.0
2.3
0.0
0.3
0.3
0.0283
0.049621
TS603-22.5 Т2 (18)
2.3
1.0
93.0
2.8
0.0
0.2
0.4
0.0341
0.05407
TS603-22.5 Т2 (15)
2.0
0.9
92.9
3.0
0.0
0.3
0.5
0.0381
0.054149
TS603-22.6 Т2 (12)
3.0
1.2
92.9
2.7
0.0
0.0
0.0
0.0294
0.061518
TS603-22.05(3)T2
2.5
1.0
92.9
3.3
0.1
0.2
0.0
0.0350
0.061372
TS603-22.6 Т2 (18)
2.9
0.8
92.9
3.2
0.0
0.0
0.0
0.0349
0.06593
TS603-22.6(3)
2.7
0.7
92.9
3.6
0.0
0.0
0.0
0.0383
0.067112
TS603-22.8 Т2 (4)
2.6
1.2
92.9
3.3
0.0
0.0
0.0
0.0358
0.063416
TS603-22.6 Т2 (17)
2.7
0.8
92.9
3.5
0.0
0.0
0.0
0.0375
0.067028
TS603-22.1 Т2 (1)
2.7
1.1
92.8
3.1
0.2
0.0
0.0
0.0334
0.062312
TS603-22.4T2 (И)
2.2
1.4
92.6
2.7
0.0
0.3
0.4
0.0340
0.053189
TS603-22.4 Т2 (12)
2.1
1.4
92.6
2.9
0.0
0.3
0.4
0.0355
0.054077
TS603-22.1 Т2 (4)
2.4
0.9
92.6
4.0
0.0
0.0
0.0
0.0434
0.069653
TS603-44(2) Т1
2.7
1.1
92.5
3.3
0.0
0.2
0.0
0.0358
0.065506
TS603-22.8 Т2 (5)
2.9
1.1
92.4
3.5
0.0
0.0
0.0
0.0381
0.069194
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
ODP
PLO
TS603-22.5 Т2 (6)
2.1
2.0
92.4
2.4
0.0
0.3
0.4
0.0305
0.049301
TS603-22.4 Т2 (5)
2.8
1.7
92.4
2.9
0.0
0.0
0.0
0.0318
0.062593
TS603-22.4 Т2 (13)
2.3
1.1
92.3
3.3
0.0
0.2
0.4
0.0406
0.060311
TS603-22.3 Т2 (3)
2.7
1.4
92.3
3.4
0.1
0.1
0.0
0.0368
0.065979
TS603-34.3 Т2 (1)
2.6
1.1
92.3
3.9
0.0
0.1
0.0
0.0421
0.070162
TS603-34.3 Т2 (13)
2.4
1.7
92.2
2.7
0.0
0.3
0.3
0.0332
0.055508
TS603-22.5 Т2 (10)
2.4
1.6
92.1
3.0
0.0
0.3
0.3
0.0366
0.058947
TS603-19.02(3)T2
2.5
2.0
92.1
3.2
0.0
0.1
0.0
0.0345
0.061861
TS603-08.2(1)
2.6
1.0
92.1
4.1
0.0
0.0
0.0
0.0444
0.073162
TS603-22.1 Т2 (3)
2.5
1.1
92.1
4.0
0.1
0.2
0.0
0.0435
0.070895
TS603-22.5 Т2 (8)
2.2
1.6
92.1
3.1
0.0
0.3
0.4
0.0381
0.058128
TS603-19.2T2 (11)
2.4
0.9
91.9
3.9
0.0
0.2
0.4
0.0463
0.067902
TS603-44Q) Т1
3.0
0.9
91.9
4.0
0.0
0.1
0.0
0.0439
0.076059
TS603-19.02(1)T2
2.4
1.8
91.7
3.4
0.2
0.2
0.1
0.0384
0.063629
TS603-22.3 Т2 (2)
3.0
1.1
91.7
4.0
0.0
0.0
0.0
0.0434
0.076459
TS603-22.5 Т2 (7)
2.3
1.7
91.7
3.2
0.0
0.3
0.4
0.0392
0.060643
TS603-22.4 Т2 (9)
2.3
1.3
91.7
3.6
0.0
0.3
0.5
0.0442
0.064255
TS603-22.5 Т2 (9)
2.4
1.6
91.6
3.4
0.0
0.3
0.4
0.0414
0.063679
TS603-22.4 Т2 (7)
2.4
1.3
91.5
3.9
0.0
0.3
0.4
0.0462
0.068489
TS603-22.4 Т2 (10)
2.4
1.4
91.5
3.7
0.0
0.3
0.5
0.0453
0.066056
TS603-34.3 Т2 (2)
2.7
1.6
91.4
3.9
0.0
0.1
0.1
0.0442
0.072984
TS603-22.4 Т2 (4)
2.7
1.3
91.4
4.2
0.1
0.1
0.0
0.0461
0.076004
TS603-19.02(5)T2
2.4
1.9
91.4
4.1
0.1
0.2
0.0
0.0445
0.070234
TS603-10.02(2)T2
2.7
1.5
91.2
4.4
0.1
0.1
0.0
0.0480
0.077276
TS603-22.5 Т2 (13)
2.4
1.5
91.2
4.1
0.0
0.2
0.4
0.0489
0.071172
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
ODP
PLO
TS603-19.02(4)
2.6
1.8
91.1
4.3
0.2
0.1
0.0
0.0471
0.075467
TS603-22.4 Т2 (6)
2.4
1.6
91.0
4.1
0.0
0.3
0.4
0.0488
0.07045
TS603-34.4 Т2 (2)
2.7
1.7
90.8
4.4
0.1
0.1
0.0
0.0487
0.078563
TS603-27.5 Т2 (1)
2.7
1.3
90.7
4.3
0.0
0.3
0.3
0.0511
0.076932
TS603-19.02(2)T2
2.7
1.7
90.6
4.8
0.0
0.2
0.0
0.0532
0.083056
TS603-22.5 Т2 (17)
2.7
1.7
90.5
4.0
0.0
0.4
0.4
0.0480
0.074387
TS603-08.2C5)
3.0
1.1
90.5
5.3
0.0
0.0
0.0
0.0583
0.091395
TS603-19.2T2 (17)
2.6
1.8
90.5
4.2
0.0
0.3
0.3
0.0504
0.074894
TS603-19.2T2 (10)
2.5
2.2
90.4
3.9
0.0
0.4
0.3
0.0464
0.070963
TS603-34.3 Т2 (3)
2.8
1.5
90.2
5.2
0.1
0.1
0.0
0.0575
0.088097
TS603-19.2 Т2 (19)
2.5
2.3
90.2
4.0
0.0
0.3
0.3
0.0481
0.073009
TS603-09.8 Т2 (1)
2.8
1.3
90.0
5.0
0.0
0.3
0.3
0.0589
0.086178
Образец
С16:0
С18:0
С18:1
С18:2
С18:3
С20:0
С20:1
ODP
PLO
S317 (1)
5.57
2.93
78.10
11.96
0.00
0.51
0.00
0.1531
0.224455
S317 (2)
4.77
2.10
78.07
13.82
0.00
0.38
0.00
0.1770
0.23815
S317(3)
4.55
1.51
77.90
14.28
0.00
0.33
0.25
0.1865
0.241763
S317 (4)
4.61
1.65
78.52
13.58
0.00
0.35
0.28
0.1764
0.231634
Анализ жирнокислотного состава липида из отдельных семян сафлора 12, трансформированных Т-ДНК pCW631 на фоне S-317. Уровень каждой жирной кислоты (%) представлен в виде процента от общего содержания жирных кислот.
Экстракция масла, используя устройство Soxhlet, и профиль жирных кислот масла
№ экстракции
Сухой вес семян (г)
Вес муки (г)
Извлеченное масло (г)
Масличность (%)
Жирнокислотный состав (вес%)
16:0
16:1
18:0
18:1
18:2
18:3
20:0
20:1
22:0
Экстракция-1
223.00
219.89
68.14
30.99
2.7
0.1
1.3
92.7
2.6
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-2
233.24
232.71
64.68
27.79
2.8
0.1
1.4
91.9
3.0
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-3
240.07
238.72
72.37
30.32
3.1
0.1
1.5
91.9
2.8
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-4
231.59
229.96
66.69
29.00
3.0
0.1
1.5
91.4
3.6
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-5
220.22
219.54
62.64
28.53
2.9
0.1
1.3
92.1
3.0
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-6
288.97
288.20
77.75
26.98
2.7
0.1
1.5
92.3
2.8
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-7
241.10
239.73
71.96
30.02
2.9
0.1
1.4
91.9
3.2
0.0
0.3
0.2
0.1
Экстракция-8
243.68
242.90
67.04
27.60
2.9
0.1
1.6
91.4
3.4
0.0
0.3
0.3
0.1
Экстракция-9
321.26
320.76
92.15
28.73
3.3
0.1
1.6
89.6
4.8
0.0
0.3
0.3
0.1
Смеси
Ext-2/3/5/б
2.9
0.1
1.4
92.0
2.9
0.0
0.3
0.3
0.2
Ext-4/7/8
2.9
0.1
1.5
91.3
3.4
0.0
0.3
0.3
0.2
Конструирование pCW701-pCW710
Промоторы сафлорового происхождения, которые, как полагают, обладают оптимальной активностью в семенах сафлора, выделяют, используя технологии секвенирования ДНК, которые дают точную информацию о последовательностях районов ДНК 5' и 3' от экспрессируемого гена. Предшествующие результаты, описанные в примерах 2-6, свидетельствовали о том, что ген CtFAD2-l экспрессируется на высоком уровне во время развития семян в сафлоре. Поэтому промоторный район этого гена является отличным кандидатом на управление эффективной экспрессии трансгенов в семенах сафлора. Как продемонстрировано в примере б, CtFAD2-2 был активным на генетических фонах, когда CtFAD2-l был инактивирован в результате мутации. По этой причине промотор CtFAD2-2 используется в сафлоре для управления экспрессией шпилечных РНК, мишенью которых является активность CtFAD2-2, среди других генов. Другие элементы промоторов, применимые для экспрессии трансгенов в семенах сафлора, включают эндогенные (т.е. сафлоровые) элементы промоторов в 5' частях генов для олеозина (CtOleosin) и запасаемых в семенах белков, таких как белки 2S и 11S (Ct2S и CtllS) . Элементы промоторов CtFAD2-l, CtOleosin, Ct2S и CtllS выделяют, используя стандартные методы на основе ПЦР, основанные на геномных последовательностях сафлора, и включают в бинарные экспрессионные векторы для растений. Эти элементы промоторов используются для экспрессии вызывающих генный сайленсинг молекул шРНК в конструкциях pCW701-pCW710 или в сочетании с другими несафлоровыми промоторами, экспрессирующими те же или отличные гены для шРНК, такие как в pCW602, pCW603, pCW631 или pCW632. Комбинации генов для шРНК с различными промоторами также получают посредством скрещивания трансформированных отдельными генами растений, типично когда гены для шРНК являются несцепленными.
Для выделения промотора CtFAD2-l фрагмент геномной ДНК размером приблизительно 3000 п.о., расположенный 5' от инициирующего трансляцию CtFAD2-l кодона ATG, выделяют, используя методы на основе ПЦР, и используют для замены промотора AtOleosin из pCW603 и pCW602, таким образом создавая
конструкции pCW701 и pCW702, соответственно.
Для выделения промотора CtFAD2-2 фрагмент геномной ДНК размером приблизительно 3000 п.о., расположенный 5' от инициирующего трансляцию CtFAD2-2 кодона ATG, выделяют, используя методы на основе ПЦР, и используют для замены промотора AtOleosin из pCW603 и pCW602, таким образом создавая конструкции pCW703 и pCW704, соответственно.
Для выделения промотора CtOleosin-1 фрагмент геномной ДНК размером приблизительно 1500 пар оснований, расположенный 5' от инициирующего трансляцию CtOleosin кодона ATG, выделяют, используя методы на основе ПЦР, и используют для замены промотора AtOleosin из pCW603 и pCW602, таким образом создавая конструкции pCW705 и pCW706, соответственно.
Для выделения промотора Ct2S фрагмент геномной ДНК размером приблизительно 1500 пар оснований, расположенный 5' от инициирующего трансляцию Ct2S кодона ATG, выделяют и используют для замены промотора AtOleosin из pCW603 и pCW602, таким образом создавая векторы pCW707 и pCW708, соответственно.
Для выделения промотора CtllS фрагмент геномной ДНК размером приблизительно 1500 пар оснований, расположенный 5' от инициирующего трансляцию CtllS кодона ATG, выделяют из геномной ДНК сафлора, используя методы на основе ПЦР, и используют для замены промотора AtOleosin из pCW603 и pCW602, таким образом создавая векторы pCW709 и pCW710, соответственно.
Каждый из этих векторов используют для трансформации сортов сафлора, как описано в примере 1.
Примеры 14. Характеристики сортов сафлора, полученные в полевых условиях
Ряд нетрансформированных сортов и новых поступлений сафлора выращивали летом 2011-2012 года на полевой опытной станции наблюдения в Narrabri, New South Wales. Семена засевали на полевые участки размером 5 м х 3 м в почву из тяжелой глины, обычно встречающуюся в районе Narrabri. Растения подвергались естественному освещению и атмосферным осадкам, за исключением того, что их поливали один раз после 4 недель роста. Зрелые
семена собирали, и образцы из приблизительно 50 семян анализировали в отношении содержания липида и жирнокислотного состава масла из семени. Содержания олеиновой кислоты в масле из семян различных сортов и новых поступлений представлены в таблице 19 и на фиг. 13.
Данные полевого испытания указывали на то, что существует диапазон содержаний олеиновой кислоты в семени сафлора, неожиданный по протяженности наблюдаемого диапазона. Что особенно важно, различные новые поступления, описанные как "с высоким содержанием олеиновой кислоты" и, как сообщалось ранее, дающие масло из семени с по крайней мере 7 0% олеиновой кислоты, такие как Ciano-OL, продуцировали только приблизительно 42-4 6% олеиновой кислоты. Уровни линолевой кислоты были намного выше, чем ожидалось на основе предшествующих сообщений. Напротив, другие новые поступления, такие как PI-5601698 и PI-560169, которые, как сообщалось, дают высокие содержания олеиновой кислоты, действительно продуцировали высокие уровни олеиновой кислоты (60-7 6%) в маслах из семян в полевых условиях. Полагали, что причина значительно более низких уровней олеиновой кислоты, чем ожидалось, в некоторых новых поступлениях связана с присутствием аллелей CtFAD2-l, а не аллеля ol, такого как, например, аллель oil, который является чувствительным к температуре, и с условиями выращивания, которые были неидеальными в сезоне 2011-12. Дополнительные анализы жирных кислот на семени, полученном от выращенного в поле сафлора, будут проведены для подтверждения вариации, отмеченной в содержании олеиновой кислоты в некоторых новых поступлениях.
Этот эксперимент также показал, что уровень олеиновой кислоты в масле из семени, полученном от растений, выращенных в поле, типично на приблизительно 5-10% ниже, чем из растений, выращенных в теплице, даже в случае новых поступлений с наилучшими характеристиками в поле. Полагали, что причиной этого является то, что условия выращивания в поле были менее идеальными, чем в теплице.
В дальнейшем эксперименте растения сафлора сорта S317 выращивали или в поле, или в теплице для сравнения жирнокислотного состава масла из семени. Даже если полевые
Жирнокислотный состав масла из семени S317, выращенного или в поле, или в теплице.
условия были более благоприятными в сезон выращивания, чем в сезон 2011-12, вес 20 семян от растений, выращенных в поле, составлял 0,977 г по сравнению с 1,202 г от растений, выращенных в теплице. От восемнадцати до 2 0 семян из каждой группы были проанализированы в отношении жирнокислотного состава с использованием анализа с помощью GC. Уровень олеиновой кислоты в семенах растений, выращенных в поле, находился в диапазоне от 74,83 до 80,65, при этом среднее значение (+/- среднеквадратическое отклонение) составляло 78,52 +/-1,53, по сравнению с диапазоном для семян растений, выращенных в теплице, составляющим 75,15-78,44, при этом среднее значение составляло 7б, 33 + /-1.00. Другие жирные кислоты присутствовали на уровне, указанном в таблице 20.
Пример 15. Переход трансгенов в другие сорта сафлора Сорта сафлора вручную скрещивают, используя общепринятые способы, например, описанные в Mundel and Bergman (2009) . Отбирают самые лучшие из трансформированных линий, содержащих конструкции, описанные выше, в частности, трансформированные линии, содержащие только одну вставку Т-ДНК, и их скрещивают с растениями других сортов сафлора, нетрансформированных или уже трансформированных отличной конструкцией, которые обладают оптимальными агрономическими характеристиками. Используя многократные циклы возвратного скрещивания с возвратным
родителем, например, в течение 4 или 5 возвратных скрещиваний, и затем самоопыление, получают растения, которые являются гомозиготными по желаемой конструкции(ям) на генетическом фоне для оптимальных агрономических характеристик. Отбор с помощью маркера, такого как, например, использование идеального маркера для аллеля ol, описанного в примере 7, может использоваться в процессе скрещивания.
Пример 16. Модификация состава масла из семени с помощью опосредованного искусственными микроРНК генного сайленсинга
МикроРНК являются классом регуляторных коротких РНК (кРНК) длиной 20-24 нуклеотида, эндогенных по отношению к растениям и животным, которые регулируют активность эндогенных генов. Трансгенная экспрессия модифицированных РНК-предшественников микроРНК (искусственных предшественников микроРНК) представляет собой недавно разработанную, основанную на РНК и специфическую в отношении последовательности стратегию сайленсинга эндогенных генов. Было установлено, что замена нескольких нуклеотидов в последовательности предшественника микроРНК для создания искусственного предшественника микроРНК не влияет на биогенез микроРНК при условии, если остаются незатронутыми положения соответствий и несоответствий в структуре "петля-на-ножке" предшественника.
CSIRO пакет программ MatchPoint (www.pi.csiro.au/RNAi) (Horn and Waterhouse, 2010) использовали для идентификации специфических 21-нуклеотидных последовательностей в генах FAD2, FATB и FAE1 Arabidopsis, которые были уникальными в геноме Arabidopsis и поэтому с меньшей долей вероятности вызывают сайленсинг не являющихся мишенями генов (воздействие вне гена) при экспрессии в виде искусственных микроРНК. Уникальная 21-нуклеотидная последовательность была отобрана для каждого из 3 генов, при этом 21-нуклеотидная последовательность в каждом случае была полностью комплементарна (антисмысловой) району транскрипта с соответствующего гена. Для каждого была разработана искусственная молекула предшественника микроРНК, на основе последовательности предшественника ara-miR159b А. thaliana. В каждом случае последовательность предшественника
miR159b была модифицирована в ее ножке для размещения антисмысловой 21-нуклеотидной последовательности. Были созданы три конструкции, каждая из которых кодирует одну из РНК-предшественников, каждая под контролем специфического для семени промотора FP1, и их клонировали в бинарный экспрессионный вектор для создания конструкций, названных pJP1106, pJP1109 и pJPlllO.
Три конструкции использовали по отдельности для трансформации штамма AGL1 A. tumefaciens с помощью электропорации, и трансформированные линии использовали для введения генетической конструкции в A. thaliana (экотип Columbia) с использованием метода погружения цветков (пример 1) . Семена (семена Ti) от обработанных растений высевали на чашки со средой MS, дополненной 3,5 мг/л РРТ для отбора трансформированных проростков, которые переносили в почву для укоренения подтвержденных трансгенных растений Ti. Предполагалось, что большинство этих растений Ti будут гетерозиготными по введенной генетической конструкции. Семена Т2 от трансгенных растений собирали при достижении зрелости и анализировали в отношении их жирнокислотного состава. Эти растения Т2 включали линии, которые были гомозиготными по генетической конструкции, а также линии, которые были гетерозиготными. Гомозиготные растения Т2 самоопылялись для получения семени Т3, и растения-потомки Т3, полученные из этих семян, в свою очередь использовались для получения растений-потомков Т4. Поэтому это позволило проанализировать устойчивость генного сайленсинга на протяжении трех поколений растений-потомков.
Профили жирных кислот в масле из семени, полученном из партий семян Т2, Тз и Т4, анализировали с помощью GC, как описано в примере 1. Изменения активности А12-десатуразы, вызванные действием трансгена на основе FAD2, отмечались в виде увеличения количества олеиновой кислоты в профилях для масел из семян. Связанный метод оценки кумулятивных эффектов активности А12-десатуразы во время синтеза жирных кислот в семени
осуществляли посредством расчета показателя доли десатурации
олеиновой кислоты (ODP) для каждого масла из семени,
полученного, используя следующую формулу:
0DP=%18:2+%18:3/%18:1+%18:2+%18:3. Масло из семени Arabidopsis дикого типа типично имело величину ODP, составляющую приблизительно 0,70-0,79, что означает, что 70-79% 18:1, образованной во время синтеза жирных кислоты в семени, были впоследствии превращены в полиненасыщенные С18 жирные кислоты, прежде всего под действием А12-десатуразы с образованием 18:2, а затем в результате дальнейшей десатурации до 18:3. Следовательно, показатель ODP применялся для определения степени сайленсинга гена FAD2 на уровне активности эндогенной Al 2-десатуразы.
Уровни С18:1Л9 (олеиновой кислоты) в семени Т2, трансформированным конструкцией pJP1106 (мишенью которой является FAD2) , находились в пределах от 32,9% до 62,7% в 30 трансгенных случаях по сравнению со средним уровнем С18:1 дикого типа, составляющим 14,0%±0,2. Подвергнутая сайленсингу в высокой степени линия (растение ID-30), которая имела одну вставку трансгена, характеризующаяся коэффициентами сегрегации (3:1) селектируемого маркера растений (РРТ), была переведена в следующее поколение (Тз). Так же в семени Тз отмечались высокие уровни 18:1А9, находящиеся в пределах от 46,0% до 63,8%, при этом среднее значение составляло 57,3+5,0%. В следующем поколении семя Т4 также продемонстрировало схоже высокие уровни 18:1Л9, находящиеся в пределах от 61% до 65,8%, этом среднее
значение составляло 63,3+1,0 6%. Общее содержание PUFA (18:2+18:3) в масле из трансгенного семени Т2 находилось в пределах от 6,1% до 38%, но в масле из семени гомозиготной линии ID-30 общее содержание PUFA было дополнительно уменьшено и находилось в пределах от 4,3 до 5,7%. Масло из семени контрольного Arabidopsis экотипа Columbia имело значение ODP, находящееся в пределах 0,75-0,79, что означает, что более 75% олеиновой кислоты, образованной в развивающемся семени, было впоследствии превращено в 18:2 или 18:3. Напротив, масло из
семени мутанта fad2-l Arabidopsis имело значение ODP, составляющее 0,17, что означает уменьшение на приблизительно 75% А12-десатурации вследствие мутации fad2-l. Значение ODP находилось в пределах от 0,08 до 0,48 в масле из трансгенного семени Т2, 0,07-0,32 в масле из семени Тз и 0,06-0,08 в масле из семени Т4, в отличие от значения=0,75 в масле из контрольного семени Arabidopsis. Существенное уменьшение значений ODP в трансгенных линиях ясно указывало на эффективный сайленсинг эндогенного гена FAD2, используя подход с использованием искусственных микроРНК. Этот эксперимент также свидетельствовал об устойчивости генного сайленсинга на протяжении трех поколений. Схожие степени генного сайленсинга также отмечались в случае двух других конструкций для уменьшений экспрессии соответствующих им генов.
Степень сайленсинга гена FAD2 и количество 18:1Л9 (63,3 ±
1,06%), отмечаемые в этом исследовании, используя искусственную
микроРНК, была выше, чем в хорошо охарактеризованном мутанте
FAD2-2 (59,4%), линии с сайленсингом FAD2, используя подход с
использованием шпилечной РНК (56,9+3,6%) и шпилечный-
антисмысловой подход (61,7+2,0%). Среднее содержание 18:2+18:3%
в масле из семени с сайленсингом FAD2, используя микроРНК,
составляло 4,8+0,37%, что ниже, чем в мутанте FAD2-2, о котором
сообщалось раннее, (7,5+1,1%) и линии с сайленсингом FAD2,
используя шпилечный-антисмысловой подход (7,2+1,4%).
Следовательно, эти данные свидетельствовали о преимуществе искусственных микроРНК по степени сайленсинга, а также об устойчивости сайленсинга на протяжении поколений потомков.
Пример 17. Анализ содержания и состава стеролов в маслах Фитостеролы из 12 образцов растительных масел, приобретенных из коммерческих источников в Австралии, были охарактеризованы с использованием анализа с помощью GC и GC-MS как производные О-триметилсилилилового эфира (OTMSi-эфира), как описано в примере 1. Стеролы были идентифицированы в соответствии с данными о времени удержания, в результате интерпретации масс-спектров и сравнения с литературными и
лабораторными данными, касающимися стандартных масс-спектров. Количество стеролов определяли, используя внутренний стандарт 5 Р(Н)-холан-24-ол. Базовая структура фитостерола и химические структуры некоторых из идентифицированных стеролов представлены на фиг. 14 и в таблице 21.
№ стерола Обычное название(я) Систематическое название
1 холестерин холест-5-ен-Зр-ол
2 брассикастерин 24-метилхолеста-5,22(Е)-диен-Зр-ол
3 халинастерол/24-метиленхолестерин 24-метилхолеста-5,24(28)Е-диен-Зр-ол
4 кампестерол/24-метилхолестерин 24-метилхолест-5-ен-Зр-ол
5 кампестанол/24-метилхолестанол 24-метилхолестан-Зр-ол
7 А5-стигмастерол 24-этилхолеста-5,22Е-диен-ЗР~ол
9 эргост-7-ен-Зр-ол 24-метилхолест-7-ен-Зр-ол
11 эбурикол 4,4,14-триметилэргоста-8,24(28)-диен-Зр-ол
12 р-ситостерол/24-этилхолестерин 24-этилхолест-5-ен-Зр-ол
13 А5-авенастерол/изофукостерол 2 4-этилхолеста-5,2 4(28)Z-диен-Зр-ол
19 А7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-Зр-ол 24-этилхолест-7-ен-Зр-ол
20 А7-авенастерол 24-этилхолеста-7,24(28)-диен-Зр-ол
IUPAC/систематические названия идентифицированных стеролов.
Проанализированные растительные масла были из: кунжута (Sesamum i noli сит) , маслины европейской (Olea europaea) , подсолнечника (Helianthus annus), клещевины обыкновенной {Ricinus communis), канолы {Brassica napus), сафлора {Carthamus tinctorius), арахиса {Arachis hypogaea), льна {Linum usitatissimum) и сои {Glycine max) . В уменьшающемся относительном содержании, для всех образцов масел, основными фитостеролами были: р-ситостерол (диапазон 28-55% от общего содержания стеролов), А5-авенастерол (изофукостерол) (3-24%), кампестерол (2-33%), А5-стигмастерол (0,7-18%), А7-стигмастерол (1-18%) и А7-авенастерол (0,1-5%). Было идентифицировано несколько других, менее значительных по размеру стеролов, ими были холестерин, брассикастерин, халинастерол, кампестанол и эбурикол. Были также детектированы четыре С29:2 и два С30:2 стерола, но необходимо дальнейшее исследование для полной идентификации этих менее значительных по размеру стеролов. Кроме того, несколько других не идентифицированных стеролов присутствовали в некоторых их масел, но вследствие их очень низкого относительного содержания, масс-спектры не были в достаточной степени интенсивными, чтобы сделать возможной идентификацию их структур.
Содержания стеролов, представленные в виде мг/г масла, в уменьшающемся количестве составляли: каноловое масло (6,8 мг/г), кунжутное масло (5,8 мг/г), льняное масло (4,8-5,2 мг/г), подсолнечное масло (3,7-4,1 мг/г), арахисовое масло (3,2 мг/г), сафлоровое масло (3,0 мг/г), соевое масло (3,0 мг/г), оливковое масло (2,4 мг/г), касторое масло (1,9 мг/г). Составы стеролов в % и общее содержание стеролов представлены в таблице 22 .
Во всех образцах масла из семян основным фитостеролом был, как правило, р-ситостерол (диапазон 30-57% от общего содержания стеролов). Среди масел отмечалось колебание в широком диапазоне относительных содержаний других основных стеролов: кампестерола
(2-17%), А5-стигмастерола (0,7-18%), А5-авенастерола (4-23%), А7-стигмастерола (1-18%). Масла из различных видов имели
различные профили стеролов, при этом некоторые имели довольно характерные профили. Каноловое масло имело наибольшее относительное содержание кампестерола (33,6%), в то время как образцы других видов, как правило, имели более низкие уровни, например, вплоть до 17% в арахисовом масле. Сафлоровое масло имело относительно высокую долю А7-стигмастерола (18%), в то время как содержание этого стерола было обычно низким в маслах других видов, вплоть до 9% в подсолнечном масле. Поскольку они были характерными для каждого вида, профили стеров можно, по этой причине, использовать для содействия в идентификации конкретных растительных масел или проверки их подлинности или подмешивания в другие масла.
Были сравнены два образца, каждый из них из подсолнечника и сафлора, в каждом случае один был получен с помощью холодного отжима из семян и был нерафинированным, в то время как другой не был подвернут холодному отжиму и был рафинированным. Хотя отмечались некоторые различия, два источника масел имели схожий состав стеролов и общее содержание стеролов, что говорит о том, что обработка и рафинирование оказывали незначительный эффект на эти два показателя. Содержание стеролов в образцах отличалось в три раза и находилось в пределах от 1,9 мг/г до 6,8 мг/г. Каноловое масло имело наибольшее содержание стеролов, а касторовое масло - наименьшее содержание стеролов.
Был проведен отдельный анализ масел сафлора из контрольного семени тепличного происхождения (S серия), генетически модифицированного семени с высоким содержанием олеиновой кислоты (Т серия) и двух коммерческих сафлоровых масел. Было отмечено несколько особенностей (таблица 23) . Во-первых, существовала высокая степень схожести профиля стеролов между контрольными и модифицированными семенами, и, во-вторых, коммерческие сафлоровые масла относятся к отдельной группе и
поэтому, как было установлено, имеют значительно отличный профиль фитостеролов. Дальнейшее исследование профилей стеролов также свидетельствовало о схожести профилей фитостеролов из образцов контрольных и модифицированных семян сафлора.
Квалифицированным в данной области техники специалистам
будет понятно, что многочисленные вариации и/или модификации
могут быть внесены в настоящее изобретения,
продемонстрированное в конкретных вариантах осуществления, без отступа от сущности или объема настоящего изобретения в широком определении. Поэтому варианты осуществления настоящего изобретения должны рассматриваться во всех аспектах как иллюстративные и не ограничивающие.
Настоящая заявка притязает на приоритет заявки на патент США с № 61/638447, поданной 25 апреля 2012, и заявки AU 2012903992, поданной 11 сентября 2012, обе из которых включены сюда посредством ссылки.
Все публикации, которые здесь обсуждаются и/или на которые здесь ссылаются, включены сюда в их полном объеме.
Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, изделий или т.п., которое было включено в описание настоящей заявки, служит исключительно цели обеспечения контекста для настоящего изобретения. Не следует принимать как допущение, что какие-либо или все из этих материалов образуют часть основы известного уровня техники или были известными общими знаниями в области техники, относящейся к настоящему изобретению, поскольку они существовали до даты приоритета каждого пункта формулы этой заявки.
Состав стеролов (% от всех стеролов) и содержание стеролов (мг/г) в образцах масла из семян сафлора.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ Abdullah et al. (1986) Biotech. 4:1087.
Almeida and Allshire (2005) TRENDS Cell Biol 15: 251-258. Alonso et al. (2010) Green Chem. 12:1493-1513. Ascherio and Willett (1997) Am. J. Clin. Nutr. 66:1006S-1010S.
Bartholomew (1971) Temperature effects on the fatty acid composition of developing seeds in safflower, Carthamus tinctorius L.
Baumlein et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 225:459-467. Baumlein et al. (1992) Plant J. 2:233-239. Beclin et al. (2002) Current Biology 12:684-688. Belide et al. (2011) Plant Methods 7:12. Bergman et al. (2006) Crop Sci. 46:1818-1819. Blacklock et al. (2010) J Biol Chem 285: 28442-28449. Bligh and Dyer (1959) Canadian Journal of Biochemistry and Physiology 37:911-7.
Bonanome andGrundy (1988). N. Engl. Med. 318: 1244-1248.
Brodersen and Voinnet (2006) Trends Genet. 22:268-280.
Broothaerts et al. (2005) Nature 433:629-633.
Broun et al. (1998) Plant J. 13:201-210.
Broun et al. (1999) Annu. Rev. Nutr. 19: 197-216.
Browse et al. (1989) Plant Physiol. 90:522-529.
Cahoon et al. (2003) Plant J. 34:671-683.
Chapman and Burke (2007) Evolution 61:1773-1780.
Cheng et al. (1996) Plant Cell Rep. 15:653-657.
Chung et al. (2006) BMC Genomics 7:120.
Clough and Bent (1998) Plant J. 16:735-743.
Comai et al. (2004) Plant J 37: 778-786.
Coutu et al. (2007) Transgenic Research 16:771-781.
Covello and Reed (1996) Plant Physiol. 111:223-226.
Dauk et al. (2007) Plant Science 173:43-49.
Dickey et al. (1994) Plant Cell 6:1171-1176.
Dougherty et al. (1995). Am. J. Clin. Nutr. 61:112 0-1128.
Durrett et al. (2008) Plant J. 54:593-607.
Dyer et al. (2002) Plant Physiology 130:2027-2038.
Ellerstrom et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32:1019-1027. Endalew et al. (2011) Biomass and Bioenergy 35:3787-3809. Falcone et al. (1994) Plant Physiol. 106:1453-1459. Fenandez San Juan (1995). Alimentaria 33: 93-98. Fernandez-Martinez et al. (1993) Euphytica 69: 115-122. Fofana et al. (2004) Plant Science 166:1487-1496. Fujimura et al. (1985) Plant Tissue Culture Lett. 2:74. Gamez et al. (2003) Food Res International 36: 721-727. Glevin et al. (2003) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:16-37. Gong and Jiang (2011) Biotechnol. Lett. 33:1269-1284. Grant et al. (1995) Plant Cell Rep. 15:254-258. Greenwell et al. (2011) J. R. Soc. Interface 7:703-726. Gunstone (2001) Inform 11: 1287-1289. Hafner et al. (2008) Methods 44:3-12. Hamdan et al. (2009) Euphytica 168: 61-69. Henikoff et al. (2004) Plant Physiol 135: 630-636. Heppard et al. (1996) Plant Physiology 110:311-319. Hernandez et al. (2005) Phytochemistry 66:1417-1426. Hill and Knowles (1968) Crop Sci. 8:275-277. Hinchee et al. (1988) Biotechnology 6:915-922. Hu et al. (1997). N. Engl. J. Med. 337: 1491-1499. Hugly and Somerville (1992) Plant Physiol. 99:197-202. Isshiki et al. (2001) Plant Physiol. 125:1388-1395. Jofuku et al. (1989) Plant Cell 1:427-435.
Kang et al. (2011) Plant Physiology and Biochemistry 49:223-229.
Karmakar et al. (2010) Bioresource Technology 101:72017210 .
Khadake et al. (2009) Mol Biotechnol. 42: 168-174. Kim et al. (2006) Molecular Genetics and Genomics 276:351368 .
Knothe (2005) Fuel Process. Technol. 86:1059-1070. Knothe and Steidley (2005) Fuel 84:1059-1065 Knowles (1968) Economic Botany 22: 195-200. Knowles (1969) Economic Botany 23:324-329.
Knowles (1972) Journal of the American Oil Chemists'
Society 49:27-29.
Knowles (1989) Oil crops of the world: their breeding and utilization/ed G. Robbelen,
R. Keith Downey, A.Ashri. McGraw-Hill, New York.
Knowles and Hill (1964) Crop Science 4:406-409.
Lacroix et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A. 105: 15429-15434.
Langridge et al. (2001) Aust J Agric Res 52: 1043-1077. Lee et al. (1998) Science 280:915-918. Lemieux (2000) Current Genomics 1: 301-311.
Liu (1998) The isolation and characterisation of fatty acid desaturase genes in cotton.
PhD. Thesis University of Sydney.
Liu et al. (1999) Functional Plant Biology 26:101-106. Liu et al. (2001) American Journal of Botany 88:92-102. Liu et al. (2002a). J. Am. Coll. Nutr. 21: 205S-211S. Liu et al. (2002b). Plant Physiol. 129: 1732-1743. Liu et al. (2010) Fuel 89:2735-2740. Loguercio (1998) Current genetics 34:241-249. Maher and Bressler (2007) Bioresource Technology 98:23512368 .
Marangoni et al. (1995) Trends in Food Sci. Technol. 6: 329-335.
Martinez-Rivas et al. (2001) Molecular Breeding 8:159-168. McCartney et al. (2004) Plant J 37: 156-173. Mensink and Katan (1990). N. Engl. J. Med. 323: 439-445. Millar and Waterhouse (2005) Funct Integr Genomics 5:129135.
Mroczka et al. (2010) Plant Physiology 153:882-891. Mundel and Bergman (2009) Safflower. Oil Crops: Handbook of Plant Breeding 4. Ed.
J. Vollman and I. Rajcan. Springer Science. Pp 423-447. Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403. Noakes and Clifton (1998) Am. J. Clin. Nutr. 98: 242-247. Nykiforuk et al. (2011) Plant Biotechnology Journal 9:250-
Oil World Annual (2004) International Seed Testing Association (ISTA) Mielke GmbH, Hamburg, Germany Okuley et al. (1994) Plant Cell 6:147-158. Ow et al. (1986) Science 234:856-859.
Pasquinelli et al. (2005) Curr Opin Genet Develop 15: 200205.
Paterson et al. (1993) Plant Molecular Biology Reporter 11: 122-127.
Perez-Vich et al. (1998) JAOCS 75:547-555 Perrin et al. (2000) Mol Breed 6:345-352.
Peterson et al. (1997) Plant Molecular Biology Reporter 15:148-153.
Petrie et al. (2010) Plant Methods 6: 8-14.
Phillips et al. (2002) Journal of Food Composition and Analysis 12:123-142.
Potenza et al. (2004) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 40:122 .
Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Commun. 127:31-36.
Roche and Gibney (2000) Am. J. Clin. Nutr. 71: 232S-237S.
Ryan et al. (1984) J. Am. Oil Chem. Soc. 61:1610-1619.
Sadanandom et al. (1996) Plant Journal 10:235-242.
Scarth and Tang (2006) Crop Science 46:1225-1236.
Scheffler et al. (1997) TAG Theoretical and Applied Genetics 94:583-591.
Schmittgen (2008) Nature Protocols 3: 1101-1108.
Sebedio et al. (1994) Fett. Wiss. Technol. 96: 235-239.
Semwal et al. (2011) Bioresource Technology 102:2151-2161.
Shanklin and Cahoon (1998) Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology 49:611-641.
Slade and Knauf (2005) Transgenic Res 14: 109-115.
Small (2000a) Genetics 155: 1913-1926.
Small (2000b) Molecular phylogenetics and evolution 16:7384 .
Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320.
Speranza et al. (2012) Process Biochemistry (In Press) Stalker et al. (1988) Science 242: 419-423.
Stymne and Appelqvist (1978) European Journal of Biochemistry 90:223-229.
Tang et al. (2005) The Plant Journal 44:433-446. Taylor (1997) The Plant Cell 9:1245-1249.
Thelen and Ohlrogge (2002) Metabolic Engineering 4: 12-21 Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem 2 63:12500-12508. Tholstrup et al. (1994) Am. J. Clin. Nutr. 59: 371-377. Toriyama et al. (1986) Theor. Appl. Genet. 205:34. Tzfira and Citovsky (2006) Curr. Opin. Biotech. 17:147154 .
Vanrooijen and Moloney (1995) Bio-Technology 13:72-77. Voinnet et al. (2003) Plant Journal 33:949-956. Voinnet et al. (2003) Plant Journal 33: 949-956. Voelker et al. (1990) Plant Cell 2:255-261.
Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964.
Wesley et al. (2001) Plant Journal 27: 581-590. Wood (2009) Plant Biotechnology Journal 7: 914-924. Wood et al. (2009) Plant Biotechnology Journal 7:914-924. Zhou et al. (2006) Plant Science 170:665-673. Zhou et al. (2011) Journal of Biological Chemistry 286:2877-2885.
Zock and Katan (1992) J. Lipid Res. 33:399-410. Zock et al. (1994) Arterioscler Thromb. 14: 567-575.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Липид, экстрагированный из масличного семени, при этом липид включает триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, причем
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении липида составляет TAG,
iii) приблизительно 90% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в липиде
составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 3,1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота, и
v) липид характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP), составляющей менее чем приблизительно 0,037, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,0 63.
2. Липид по пункту 1, который имеет одну или более или все из следующих особенностей,
a) приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91%
приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,3% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют полиненасыщенные жирные
b)
кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет линолевая кислота,
e) менее чем приблизительно 1%, или менее чем приблизительно 0,5% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет а-линоленовая кислота (ALA),
f) приблизительно 0,5% - приблизительно 1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляет 18:1А11,
g) ODP для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01,
h) значение PLO для содержимого в виде жирных кислот липида составляет приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,0 63, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,055, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,050, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,055, или приблизительно 0,063, или приблизительно 0,055, или приблизительно 0,050, или приблизительно 0,040, или приблизительно 0,030, или приблизительно 0,02 0,
i) приблизительно 90% - приблизительно 96%, или
приблизительно 92% - приблизительно 9 6%, или приблизительно
93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего
содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные
жирные кислоты,
j) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
к) липид находится в форме очищенного масла, и
1) липид является негидрогенизированным.
3. Липид по пункту 2, причем PUFA является линолевая кислота.
4. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-3, причем ос-линоленовая кислота является необнаруживаемой в жирнокислотном составе липида.
5. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-4, причем приблизительно 55% - приблизительно 8 0%, или приблизительно 60% - приблизительно 8 0%, или приблизительно 7 0% - приблизительно 8 0%, или по крайней мере приблизительно 60%, или по крайней мере приблизительно 7 0%, или приблизительно 60%, или приблизительно 7 0%, или приблизительно 8 0% от содержания TAG в липиде составляет триолеин.
6. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-5, причем менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 2%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 5% от содержания олеиновой кислоты в липиде находится в форме диацилглицеринов (DAG).
7. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-6, который находится в форме масла, причем по крайней мере 90%, или по крайней мере 95%, по крайней мере приблизительно 98%, или приблизительно 95% - приблизительно 98% в весовом отношении масла составляет липид.
8. Липид по пункту 7, причем масличным семенем является нефотосинтезирующее масличное семя, предпочтительно семя сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной.
9. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-8, который, кроме того, включает один или более стеролов.
10. Липид по пункту 9, который находится в форме масла, и который включает менее чем приблизительно 5 мг стеролов/г масла, или приблизительно 1,5 мг стеролов/г масла приблизительно 5 мг стеролов/г масла.
11. Липид по пункту 10, который включает одно или более или все из
а) приблизительно 1,5% - приблизительно 4,5%, или
приблизительно 2,3% - приблизительно 4,5% от общего содержания стеролов составляет эргост-7-ен-зр-ол,
b) приблизительно 0,5% - приблизительно 3%, или
приблизительно 1,5% - приблизительно 3% от общего содержания
стеролов составляет тритерпеновый спирт,
c) приблизительно 8,9% - приблизительно 20% от общего содержания стеролов составляет А7-стигмастерол/стигмаст-7-ен-зр-ол, и
d) приблизительно 1,7% - приблизительно 6,1% от общего содержания стеролов составляет А7-авенастерол.
12. Липид в соответствии с любым из пунктов 1-11, который
имеет объем, составляющий по крайней мере 1 литр, и/или вес,
составляющий по крайней мере 1 кг, и/или который экстрагирован
из масличного семени, полученного от выращенных в поле
растений.
13. Композиция, включающая первый компонент, который является липидом в соответствии с любым из пунктов 1-12, и второй компонент, предпочтительно в случаях, когда композиция получена посредством смешивания липида со вторым компонентом.
14. Композиция по пункту 13, причем вторым компонентом является не являющееся липидом вещество, такое как фермент, небелковый катализатор или химическое вещество, или один или более ингредиентов пиши.
15. Способ получения масла, включающий
i) получение масличного семени, которое включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, которое включает, масло, причем содержимым в виде масла масличного семени является липид, определенный в любом из пунктов 1-12, и
ii) экстрагирование масла из масличного семени для того, чтобы получить масло.
16. Способ по пункту 15, причем масличное семя включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся масличном
16.
семени по сравнению с соответствующим масличным семенем, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени.
17. Способ получения масла, включающий
i) получение семени сафлора, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
a) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и
олеиновую кислоту,
b) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности семени составляет TAG,
c) приблизительно 75% - приблизительно 95% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
d) менее чем приблизительно 5, 1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота, и
e) содержимое в виде масла семени характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP), составляющей менее чем приблизительно 0,17, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,2 6, и
ii) экстрагирование масла из семени сафлора для того, чтобы получить масло,
причем семя сафлора включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся семени сафлора по сравнению с соответствующим семенем сафлора, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией
полинуклеотида в развивающемся семени сафлора.
18. Способ по пункту 16 или 17, причем масличное семя или семя сафлора включает второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует вторую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пальмитоил-АСР-тиоэстеразы (FATB) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует второй экзогенный полинуклеотид, и причем второй экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
19. Способ в соответствии с любым из пунктов 16-18, причем масличное семя или семя сафлора включает третий экзогенный полинуклеотид, который кодирует третью вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пластидной десатуразы со б жирных кислот (FAD6) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует третий экзогенный полинуклеотид, и причем третий экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
20. Способ в соответствии с любым из пунктов 17-19, причем
1) ген FAD2 представляет собой один или более из гена CtFAD2-l, гена CtFAD2-2 и гена CtFAD2-10, и/или
2) ген FATB представляет собой ген CtFATB-З, и/или
3) ген FAD6 представляет собой ген CtFAD6.
21. Способ в соответствии с любым из пунктов 17-20, причем
содержимое в виде масла семени сафлора имеет одну или более или
все из следующих особенностей,
а) приблизительно 80% - приблизительно 94%, или приблизительно 85% - приблизительно 94%, или приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении
от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 4%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 15%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 10%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 7,5%, или приблизительно 0,1% приблизительно 5%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляют полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 15%, или менее чем приблизительно 10%, или менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет линолевая кислота (LA),
e) приблизительно 80% - приблизительно 96%, или приблизительно 90% - приблизительно 96%, или приблизительно 92%
приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты,
f) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющим менее чем приблизительно 0,05, или менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,05, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
g) ODP для содержимого в виде масла семени составляет
приблизительно 0,17 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,15 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,1 приблизительно 0,01, или приблизительно 0,075 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01, и
h) значение PLO для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,20 - приблизительно 0,026, или приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,2, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,15, или приблизительно 0,020 приблизительно 0,1, или приблизительно 0,02 0 и приблизительно 0,075, или приблизительно 0,050 и приблизительно 0,055, или составляет приблизительно 0,05, или приблизительно 0,040, или приблизительно 0,030, или приблизительно 0,020.
22. Способ в соответствии с любым из пунктов 17-21, причем маслом является липид, который, кроме того, характеризуется одной или более особенностей, описанных в пунктах 3-7 или 9-11.
23. Способ в соответствии с любым из пунктов 16-22, причем стадия экстракции масла включает раздавливание масличного семени или семени сафлора.
24. Способ в соответствии с любым из пунктов 16-23, который, кроме того, включает стадию очистки масла, экстрагированного из масличного семени или семени сафлора, причем стадия очистки включает одно или более или все из группы, состоящей из: рафинирования гидратацией, дезодорации, обесцвечивания, сушки и/или фракционирования экстрагированного масла, и/или удаления по крайней мере некоторых, предпочтительно по существу всех, восков и/или восковых эфиров из экстрагированного масла.
25. Масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует масличное семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
22.
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности масличного семени составляет TAG,
iii) приблизительно 90% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в
виде масла масличного семени составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 3,1% в весовом отношении от
общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла
масличного семени составляет пальмитиновая кислота, и
v) содержимое в виде масла масличного семени
характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP),
составляющей менее чем приблизительно 0,037, и/или значением
отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую
кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,0 63.
26. Масличное семя по пункту 25, которым является нефотосинтезирующее масличное семя, предпочтительно семя сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной.
27. Масличное семя по пункту 2 5 или пункту 2 6, которое включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся масличном семени по сравнению с соответствующим масличным семенем, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем первый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени.
28. Семя сафлора, содержимое в виде масла которого включает, и/или которое способно порождать растение, которое образует семя, содержимое в виде масла которого включает, триацилглицерины (TAG), которые состоят из жирных кислот, этерифицированных до глицерина, и причем
i) жирные кислоты включают пальмитиновую кислоту и олеиновую кислоту,
ii) по крайней мере 95% в весовом отношении от масличности
семени составляет TAG,
iii) приблизительно 75% - приблизительно 95% в весовом
отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в
виде масла семени составляет олеиновая кислота,
iv) менее чем приблизительно 5, 1% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота, и
v) содержимое в виде масла семени характеризуется долей десатурации олеиновой кислоты (ODP) , составляющей менее чем приблизительно 0,17, и/или значением отношения пальмитиновая кислота + линолевая кислота/олеиновую кислоту (PLO), составляющим менее чем приблизительно 0,2 6, и
причем семя сафлора включает первый экзогенный полинуклеотид, который кодирует первую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена А12-десатуразы (FAD2) в развивающемся семени сафлора по сравнению с соответствующим семенем сафлора, в котором отсутствует экзогенный полинуклеотид, и причем первый экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся семени сафлора.
29. Семя сафлора по пункту 28, причем содержимое в виде масла семени имеет одну или более из следующих особенностей,
a) приблизительно 80% - приблизительно 94%, или приблизительно 85% - приблизительно 94%, или приблизительно 90% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 94%, или приблизительно 91% - приблизительно 92%, или приблизительно 92%, или приблизительно 93% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет олеиновая кислота,
b) менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 4%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,75%, или менее чем приблизительно 2,5%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,75%, или приблизительно 2,5% в весовом отношении от общего содержания
a)
жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет пальмитиновая кислота,
c) приблизительно 0,1% - приблизительно 15%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 10%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 7,5%, или приблизительно 0,1% приблизительно 5%, или приблизительно 0,1% - приблизительно 3%, или приблизительно 2% - приблизительно 3%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляют полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA),
d) менее чем приблизительно 15%, или менее чем приблизительно 10%, или менее чем приблизительно 5%, или менее чем приблизительно 3%, или менее чем приблизительно 2,5%, или менее чем приблизительно 2,25%, или приблизительно 3%, или приблизительно 2,5%, или приблизительно 2,25% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в содержимом в виде масла семени составляет линолевая кислота (LA),
e) приблизительно 80% - приблизительно 96%, или приблизительно 90% - приблизительно 96%, или приблизительно 92%
приблизительно 96%, или приблизительно 93%, или приблизительно 94% в весовом отношении от общего содержания жирных кислот в липиде составляют мононенасыщенные жирные кислоты,
f) липид характеризуется долей олеиновой кислоты в мононенасыщенности (ОМР), составляющей менее чем приблизительно 0,05, или менее чем приблизительно 0,02, или менее чем приблизительно 0,015, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,05, или приблизительно 0,005 - приблизительно 0,02,
g) ODP для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,17 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,15 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,1 приблизительно 0,01, или приблизительно 0,075 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,050 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,01, или приблизительно 0,033 - приблизительно 0,016, или приблизительно 0,033 приблизительно 0,023, или составляет приблизительно 0,03, или
f)
приблизительно 0,02, или приблизительно 0,01, и
h) значение PLO для содержимого в виде масла семени составляет приблизительно 0,20 - приблизительно 0,026, или приблизительно 0,02 0 - приблизительно 0,2, или приблизительно 0,020 - приблизительно 0,15, или приблизительно 0,020 приблизительно 0,1, или приблизительно 0,02 0 и приблизительно 0,075, или приблизительно 0,050 и приблизительно 0,055, или составляет приблизительно 0,05, или приблизительно 0,040, или приблизительно 0,030, или приблизительно 0,020.
30. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 2 5-2 9, причем содержимым в виде масла семени является липид, который, кроме того, характеризуется одной или более из особенностей, описанных в пунктах 3-7 или 9-11.
31. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-30, которое включает второй экзогенный полинуклеотид, который кодирует вторую вызывающую генный сайленсинг РНК, которая способна уменьшить экспрессию гена пальмитоил-АСР-тиоэстеразы (FATB) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует второй экзогенный полинуклеотид, и причем второй экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
32. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-31, которое включает третий экзогенный полинуклеотид, который способен уменьшить экспрессию гена пластидной десатуразы со б жирных кислот (FAD6) в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует третий экзогенный полинуклеотид, и причем третий экзогенный полинуклеотид функционально связан с промотором, который управляет экспрессией полинуклеотида в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
33. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым
из пунктов 27-32, причем первая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию более чем одного эндогенного гена, кодирующего FAD2, в развивающемся масличном семени или семени сафлора, и/или причем вторая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию более чем одного эндогенного гена, кодирующего FATB, в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
34. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-33, причем первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного полинуклеотида ковалентно соединены в одной молекуле ДНК, необязательно с помощью связывающих последовательностей ДНК между первым, вторым и/или третьим экзогенными полинуклеотидами.
35. Масличное семя или семя сафлора по пункту 34, причем первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного полинуклеотида находятся под контролем одного промотора, так что, когда первый экзогенный полинуклеотид и второй экзогенный полинуклеотид и/или третий экзогенный полинуклеотид транскрибируются в развивающемся масличном семени или семени сафлора, первая вызывающая генный сайленсинг РНК и вторая вызывающая генный сайленсинг РНК и/или третья вызывающая генный сайленсинг РНК ковалентно связаны в виде частей одного РНК-транскрипта .
36. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-35, которое включает одну транспортную (перенесенную) ДНК, интегрированную в геном масличного семени или семени сафлора, и причем одна транспортная ДНК включает первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида и третьего экзогенного полинуклеотида.
37. Масличное семя или семя сафлора по пункту 36, которое является гомозиготным по транспортной ДНК.
38. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 2 7-37, причем каждую из первой вызывающей генный
34.
сайленсинг РНК, второй вызывающей генный сайленсинг РНК и третьей вызывающей генный сайленсинг РНК независимо выбирают из группы, состоящей из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида, каталитического полинуклеотида, микроРНК и двухцепочечной РНК.
39. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-38, причем любой один или более, предпочтительно все, из промоторов являются специфическими для семени и предпочтительно преимущественно экспрессируются в зародыше развивающегося масличного семени или семени сафлора.
40. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-39, которое включает одну или более мутаций в одном или более генов FAD2, причем мутация(и) уменьшает активность одного или более генов FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора по сравнению с соответствующим масличным семенем или семенем сафлора, в котором отсутствует мутация(и).
41. Масличное семя или семя сафлора по пункту 40, которое включает, по сравнению с геном FAD2 дикого типа в соответствующем масличном семени или семени сафлора, мутацию в гене FAD2, которая представляет собой делецию, вставку, инверсию, сдвиг рамки считывания, стоп-кодон преждевременной трансляции или одну или более неконсервативных аминокислотных замен.
42. Масличное семя или семя сафлора по пункту 40 или пункту 41, причем мутацией является нуль-мутация в гене FAD2.
43. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 40-42, причем по крайней мере одна из мутаций находится в гене FAD2, который кодирует большую степень активности FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора, в котором отсутствует мутация(и), чем любой другой ген FAD2 в развивающемся масличном семени или семени сафлора.
44. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 40-43, которым является семя сафлора, причем геном FAD2 является ген CtFAD2-l.
45. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым
из пунктов 40-44, которым является семя сафлора, включающее аллель ol гена CtFAD2-l или аллель oil гена CtFAD2-l, или оба аллеля.
46. Масличное семя или семя сафлора по пункту 45, причем аллель ol или аллель oil гена CtFAD2-l присутствует в гомозиготном состоянии.
47. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-4 6, причем белок FAD2 является необнаруживаемым в семени.
48. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-47, которым является семя сафлора, и причем первая вызывающая генный сайленсинг РНК уменьшает экспрессию обоих генов CtFAD2-l и CtFAD2-2.
49. Масличное семя или семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 27-4 8, которым является семя сафлора, и причем
1) геном FAD2 является один или более из гена CtFAD2-l, гена CtFAD2-2 и гена CtFAD2-10, и/или
2) геном FATB является ген CtFATB-З, и/или
3) геном FAD6 является ген CtFAD6.
50. Масличное растение или растение сафлор, способное образовывать семя в соответствии с любым из пунктов 25-49.
51. Растение по пункту 50, которое является трансгенным и гомозиготным по каждому экзогенному полинуклеотиду и/или включает первый экзогенный полинуклеотид и один из двух или оба из второго экзогенного полинуклеотида или третьего экзогенного полинуклеотида.
52. В значительной степени очищенный и/или рекомбинатный
полипептид, который включает аминокислоты с
последовательностью, представленной в любой из SEQ ID NO: 27-
37, 44, 4 5 или 48, его биологически активный фрагмент или
аминокислотная последовательность, идентичная на по крайней
мере 40% любой одной или более из SEQ ID NO: 27-37, 44, 45 или
48 .
53. Полипептид по пункту 52, которым является
модифицирующий жирные кислоты фермент, предпочтительно олеат-
А12-десатураза, Д12-ацетиленаза, пальмитолеат-Д12-десатураза или пальмитоил--АСР-тиоэстераза (FATB).
54. Выделенный и/или экзогенный полинуклеотид, включающий одно или более из
i) нуклеотидов, имеющих последовательность, представленную
в любой из SEQ ID N0: 1-25, 40-43, 46 или 47,
ii) нуклеотидов, имеющих последовательность, кодирующую
полипептид по пункту 52 или пункту 53,
iii) нуклеотидов, которые гибридизуются с
последовательностью, представленной в любой из SEQ ID N0: 1-25,
40-43, 46 или 47, и
iv) нуклеотидов, имеющих такую последовательность, что
после экспрессии в семени масличного растения уменьшается
экспрессия гена, кодирующего по крайней мере один полипептид по
пункту 52 или пункту 53.
55. Полинуклеотид элемента iv) пункта 54, который выбирают
из антисмыслового полинуклеотида, смыслового полинуклеотида,
каталитического полинуклеотида, микроРНК, молекулы
двухцепочечной РНК (дцРНК) и ее подвергнутого процессингу РНК-
продукта .
56. Полинуклеотид по пункту 55, которым является молекула дцРНК или ее подвергнутый процессингу РНК-продукт, включающий по крайней мере 19 следующих друг за другом нуклеотидов, которые идентичны на по крайней мере 95% комплементу любой одной или более из SEQ ID N0: 1-25, 40-43, 46, 47 или 49-51 (в случаях, когда тимин (Т) заменяется урацилом (U)).
57. Полинуклеотид по пункту 55 или пункту 56, причем молекула дцРНК является предшественником микроРНК, и/или причем ее подвергнутым процессингу РНК-продуктом является микроРНК.
58. Полинуклеотид в соответствии с любым из пунктов 55-57, который транскрибируется в развивающемся масличном семени или семени сафлора под контролем одного промотора, причем молекула дцРНК включает комплементарные смысловую и антисмысловую последовательности, которые способны гибридизоваться друг с другом, связанные с помощью одноцепочечного участка РНК.
55.
59. Полинуклеотид в соответствии с любым из пунктов 55-58,
который, в случае присутствия в развивающемся семени сафлора,
i) уменьшает экспрессию эндогенного гена, кодирующего олеат-А12-десатуразу (FAD2), в развивающемся семени, при этом FAD2 имеет аминокислотную последовательность, представленную в любой одной или более из SEQ ID N0: 27, 2 8 или 3 6;
ii) уменьшает экспрессию эндогенного гена, кодирующего
пальмитоил-АСР-тиоэстеразу (FATB), в развивающемся семени, при
этом FATB имеет аминокислотную последовательность,
представленную в SEQ ID N0: 4 5; и/или
iii) уменьшает экспрессию гена, кодирующего десатуразу со б жирных кислот (FAD6), в развивающемся семени, при этом FAD6 имеет аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 48.
60. Химерный вектор, включающий полинуклеотид в соответствии с любым из пунктов 55-59, функционально связанный с промотором.
61. Вектор по пункту 60, причем промотор является функционирующим в масличном семени или является специфическим для семени промотором, предпочтительно является преимущественно экспрессируемым в зародыше развивающегося масличного семени.
62. Рекомбинантная клетка, включающая экзогенный полинуклеотид в соответствии с любым из пунктов 54-59 и/или вектор по пункту 60 или пункту 61.
63. Клетка по пункту 62, которой клетка растения, предпочтительно клетка семени растения.
64. Клетка по пункту 63, причем клеткой растения является клетка масличного растения.
65. Клетка по пункту 64, причем клеткой растения является клетка нефотосинтезирующего семени, предпочтительно клетка семени сафлора, подсолнечника, хлопчатника или клещевины обыкновенной.
66. Трансгенный не являющийся человеком организм,
включающий один или более полинуклеотидов в соответствии с
любым из пунктов 54-59, вектор по пункту 60 или пункту 61 и
клетку в соответствии с любым из пунктов 62-65.
67. Трансгенный не являющимся человеком организм по пункту
66, которым является растение.
68. Трансгенный не являющимся человеком организм по пункту
67, которым является масличное растение.
69. Способ создания клетки в соответствии с любым из пунктов 62-65, включающий стадию введения полинуклеотида в соответствии с любым из пунктов 54-59 и/или вектора по пункту 60 или пункту 61 в клетку.
70. Применение полинуклеотида в соответствии с любым из пунктов 54-59 и/или вектора по пункту 60 или пункту 61 для создания рекомбинантной клетки.
71. Способ создания трансгенного масличного растения, которое образует семя в соответствии с любым из пунктов 27-49, или его семени, при этом способ включает
i) введение по крайней мере одного полинуклеотида в соответствии с любым из пунктов 54 (элемент iv) - 59 и/или по крайней мере одного вектора по пункту 60 или пункту 61 в клетку масличного растения,
ii) регенерацию трансгенного растения из клетки, и
iii) необязательно, получение одного или более растений-
потомков трансгенного растения или его семени,
тем самым создавая трансгенное масличное растение или его
семя.
72. Способ по пункту 71, причем семенем является семя сафлора в соответствии с любым из пунктов 2 8-4 9.
73. Способ по пункту 71 или пункту 72, причем одно или более растений-потомков или его семя включает
i) первый экзогенный полинуклеотид, и/или
ii) второй экзогенный полинуклеотид, и/или
iii) третий экзогенный полинуклеотид,
предпочтительно все три экзогенных полинуклеотида.
74. Способ в соответствии с любым из пунктов 71-73, причем одно или более растений-потомков или его семя включает одну или более мутаций, определенных в любом из пунктов 4 0-4 6.
75. Способ создания масличного растения, включающий
i) скрещивание первого родительского масличного растения,
которое включает первый полинуклеотид в соответствии с любым из
пунктов 54 (элемент iv) - 59 или первый вектор по пункту 60 или
пункту 61, со вторым родительским масличным растением, которое
включает второй полинуклеотид в соответствии с любым из пунктов
54 (элемент iv) - 59 или второй вектор по пункту 60 или пункту
61,
ii) скрининг растений-потомков, образующихся в результате
скрещивания, на присутствие обоих полинуклеотидов или обоих
векторов; и
iii) отбор растения-потомка, включающего как (а) первый
полинуклеотид или первый вектор, так и (Ь) второй полинуклеотид
или второй вектор, и, кроме того, характеризующегося
увеличенной долей олеиновой кислотой и уменьшенной долей
пальмитиновой кислоты в составе масла из семени растения.
76. Способ генотипирования растения сафлора, включающий детектирования молекулы нуклеиновой кислоты растения, причем молекула нуклеиновой кислоты сцеплена с, и/или включает по крайней мере часть, одним (одного) или более генов CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10 растения сафлора.
77. Способ по пункту 7 6, причем способ включает определение уровня экспрессии и/или последовательности одного или более из генов CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10 растения.
78. Способ по пункту 7 6 или пункту 77, который включает:
i) гибридизацию второй молекулы нуклеиновой кислоты с указанной молекулой нуклеиновой кислоты растения,
ii) необязательно, гибридизацию по крайней мере одной другой молекулы нуклеиновой кислоты с указанной молекулой нуклеиновой кислоты растения; и
iii) детектирование продукта указанной стадии(й)
гибридизации или отсутствие продукта в результате указанной
стадии(й) гибридизации.
79. Способ по пункту 78, причем вторая молекула нуклеиновой кислоты используется в качестве праймера для обратной транскрипции или репликации по крайней мере части молекулы нуклеиновой кислоты растения.
79.
80. Способ в соответствии с любым из пунктов 76-79, причем
нуклеиновую кислоту детектируют, используя метод, выбираемый из
группы, состоящей из анализа полиморфизма длин рестрикционных
фрагментов, анализа полиморфизма длин амплифицированных
фрагментов, амплификации микросателлитных локусов,
секвенирования нуклеиновой кислоты и/или амплификации
нуклеиновой кислоты.
81. Способ в соответствии с любым из пунктов 76-80, причем способ детектирует отсутствие или присутствие аллеля гена CtFAD2-l, предпочтительно аллеля ol.
82. Способ отбора растения сафлора из популяции растений сафлора, включающий:
i) генотипирование указанной популяции растений, используя
способ в соответствии с любым из пунктов 7 6-81, причем
указанная популяция растений была получена в результате
скрещивания между двумя растениями, по крайней мере одно из
которых включает аллель гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10,
который наделяет развивающееся семя указанного растения
уменьшенным уровнем активности А12-десатуразы, по сравнению с
соответствующим семенем растения сафлора, в котором отсутствует
указанный аллель, и
ii) отбор растения сафлора на основе присутствия или
отсутствия указанного аллеля.
83. Способ введения аллеля гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-10 в растение сафлор, в котором отсутствует этот аллель, при этом способ включает;
i) скрещивание первого родительского растения сафлора со
вторым родительским растением сафлором, причем второе растение
включает указанный аллель гена CtFAD2-l, CtFAD2-2 или CtFAD2-
10, и
ii) возвратное скрещивание потомка, полученного в
результате скрещивания стадии i), с растениями с тем же
генотипом, что и первое родительское растение, достаточное
число раз для получения растения с преобладанием генотипа
первого растения, но включающего указанный аллель,
причем аллель наделяет развивающееся семя указанного растения уменьшенным уровнем активности А12-десатуразы, по сравнению с соответствующим семенем растения сафлора, в котором отсутствует указанный аллель, и причем растения-потомков генотипируют на присутствие или отсутствие указанного аллеля, используя способ в соответствии с любым из пунктов 76-81.
84. Трансгенное растение, или растения - его потомки, или его семя, созданное, используя способ в соответствии с любым из пунктов 71-83.
85. Способ производства семени, включающий
a) выращивание растения в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, предпочтительно в поле в виде части популяции по крайней мере 1000 таких растений и
b) сбор урожая семян.
86. Масло, полученное или получаемое с помощью одного или более способов в соответствии с любым из пунктов 15-24, из масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49, из растения или его части в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки в соответствии с любым из пунктов 62-65 и/или из не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 66.
87. Композиция, включающая одно или более из липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49, полипептида по пункту 52 или пункту 53, полинуклеотида в соответствии с любым из пунктов 54-59, вектора по пункту 60 или пункту 61, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 6265 или масла по пункту 8 6 и один или более приемлемых носителей.
88. Применение одного или более из липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, композиции по пункту 13, 14 или 87, способа в соответствии с любым из пунктов 15-24, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 2 549, растения или его части в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из
86.
пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 8 6 для производства промышленного продукта.
89. Способ производства промышленного продукта, включающий стадии:
i) получения одного или более из липида в соответствии с
любым из пунктов 1-12, композиции по пункту 13, 14 или 87,
масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из
пунктов 25-49, растения или его части в соответствии с любым из
пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с
любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного
организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 8 6,
ii) необязательно, физической обработки одного или более
из липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, композиции по
пункту 13, 14 или 87, масличного семени или семени сафлора в
соответствии с любым из пунктов 25-49, растения или его части в
соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-
хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося
человеком трансгенного организма или его части по пункту 66,
или масла по пункту 8 6, стадии i),
ii) превращения по крайней мере некоторой части липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, или липида в одном или более из композиции по пункту 13, 14 или 87, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49, растения или части растения в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 66, или масла по пункту 8 6, или подвергнутого физической обработке продукта стадии ii) в промышленный продукт посредством использования нагревания, химического или ферментативного способа, или любой их комбинации, в отношении липида, и
iii) получения промышленного продукта,
тем самым осуществляя производство промышленного продукта.
90. Способ производства топлива, включающий
i) осуществление реакции одного или более из липида в
соответствии с любым из пунктов 1-12, или липида в одном или более из композиции по пункту 13, 14 или 87, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49, растения или части растения в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 8 6 со спиртом, необязательно в присутствии катализатора, для образования алкиловых эфиров, и
ii) необязательно, смешивание алкиловых эфиров с топливом на нефтяной основе.
91. Способ по пункту 90, причем алкиловыми эфирами являются метиловые эфиры.
92. Способ производства продукта питания, включающий смешивание одного или более из липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, композиции по пункту 13, 14 или 87, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 2 549, растения или его части в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 8 6 с по крайней мере одним другим пищевым ингредиентом.
93. Продукты питания, косметические средства или химические продукты, включающие одно или более из липида в соответствии с любым из пунктов 1-12, композиции по пункту 13, 14 или 87, масличного семени или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49, растения или его части в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 86.
94. Продукт, полученный из одного или более, или используя
одно или более, из липида в соответствии с любым из пунктов 1-
12 или липида в одном или более из композиции по пункту 13, 14
или 87, способа по любому из пунктов 15-2 4, масличного семени
или семени сафлора в соответствии с любым из пунктов 25-49,
растения или части растения в соответствии с любым из пунктов 50, 51, 67, 68 или 84, клетки-хозяина в соответствии с любым из пунктов 62-65, не являющегося человеком трансгенного организма или его части по пункту 6 6 или масла по пункту 86.
По доверенности
1/16
520222ЕА
coCOMJ p.2555)
r- ctFAD2-3 (0.0089)
J L ctFAD2-4 (0.0068)
г I ctFAD2-7 (0.1698)
- I dFAD2-6 (0.1965)
I ctFAD2-5 (0.1818)
, caAC ET (0.0918)
I cpEPOX (0.1012)
C1FAD2-11 (D.0604)
I I haACET (0.0537)
I dsACET (0.0428)
I dcACET (0.0482)
I hhACET (0.0416)
ctFAD2-8 (0.2242)
ctFAD2-9 (0.1999)
ctFAD2-2 (0.0537)
haDES-2 (0.0495)
haDES-3 (0.0447)
-luDES (0.1114)
dFAD2-1 P0970)
dFAD2-10(0.1030)
haDES-1 (0.1391)
-ntDES (0.0907) -oeDES (0.0785) siDESp.0711)
ghDES-1 (0.1231)
rcOH (0.1649)
- atDES (0.0627)
I pfOH:DES (0.0337)
~~l plOH (0.0524)
-ghDES-4 (0.0709) -ghDES-2 (0.0753)
Фиг. 1
4 5 6 7 8
12 000 1 00 0 0
8 00 0
¦Да,-*!"
5 О О О 400 0
3 00 0
Фиг. 2
2 ООО
1 6БО
1 ООО
30 0
4 6
4 5
Вектор
12 14 16 C1FAD2-2
га О
10 12 14 16 CIFAD2-10
14 16 С18:2 смесь
10 12 Min
Фиг. 3
11Д 44Г'
100
125
140
150
182
175
1Јi62Q8
200
222 27g
¦ 1^ 26,2 I *f 3Q4 31,8 3^3
225 250 275 300 325
100
126
113
222
276
11,01
100
125
150
140
175
200
225
275
300
325
WWlW** \ll^2f l T 304 31,8 33^3
250
m/z
Фиг. 3 (продолжение)
1> л А II
, 1
7.0 8.0 9.0 10.0
Время(мин)
12.0
100-
Новый продукт
75-
100
125
150
175
, 203. . . 721
200 225
250 275
300
100
125
!¦ ii Д,
175 m/z , 204, , 221,
200 225
,2.4? 2У", 250
275
300
ctFAD2-l
200
ctFAD2-7
100
семя- ги по коти ль корень
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
семядоля
гипокотиль корень
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
_Jl
ctFAD2-2
30 -| 20 i1
ю-1
ctFAD2-8
семя- гипокотиль корень доля
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
ctFAD2-3
семядоля
гипокотиль корень
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
ctFAD2-9
семядоля
гипокотиль корень лист
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
семядоля
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
ctFAD24
ctFAD2-10
семядоля
гипокотиль корень
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
семя- гипокотиль корень лист цветок зародыш зародыш зародыш
доля на ранней На средней на поздней
ctFAD2-5
семядоля
гипокотиль корень
цветок зародыш зародыш зародыш на ранней на средней на поздней стадии стадии стадии
семя- гипокотиль корень лист цветок зародыш зародыш зародыш
доля на ранней На средней на поздней
стадии стадии стадии
семя- гипокотиль корень лист цветок зародыш зародыш зародыш
доля на ранней на средней на поздней
стадии стадии стадии
601 650
SU (дикийтип) (601) TCTCTTTCAACGTCTCCGGAAGACCCTATGACCGTTTCGCCTGCCACTAC
S-317 (601) TGTCTTTCAACGTCTCTGGAAGACC-TACAACCGTTTCGCCTGCCACTAT
CW99-OL (601) TGTCTTTCAACGTCTCTGGAAGACC-TACAACCGTTTCGCCTGCCACTAT L"Saf496 (595) TGTCTTTCAACGTCTCTGGAAGACC-TACAACCGTTTCGCCTGCCACTAT
Фиг. 6
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
(1) (1)
1 SO
GTGCAT TCTCTCATT CTCAAAACCT TT CT GCT AT TC АТС TGATCAATGT-
GTGCAT TCTCTCA ACCTTCCTGCTTTTC GTC TGATC AATGTT
HL-смысловой праймер
100
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
(SO) (43)
ATTCi GTTATGGTT-CGATGAT
AATGTATTCA
-CGACGMTA
101 ISO
CtFAD2-l-SU (80) TTGTTTGTTATTTTAATTTTAATTTTTAGGTTGATTTAGCTGCATTGTTG
CtFAD2-l-ol (93) TCGTTTGTTATT TT TT A-TT TT AGGTAGATT TAGCT GCATT GT TG
1S1 200 CtFAD2-l-SU (130) GTC GAT GAATAGATC TGT GGAT TAC GGTC TTC TGCAGTT TCAGT TT - GA CtFAD2-l-ol (137) GTTGATGAATAGATCTGTAGATTACGGTCCTCTGCGCTTTC AGTTTTTGA
201 2SO
Ct FAD2-1-SU (178) TTTATT TCAGTCCGTTTTTCTC CTGTAAATTT GT GTАТС TATCT GT GT TG CtFAD2-l-ol (187) TTCATT TCAC TCCGTTTT-CTTCTGTAAATTT GT GTАТС TATCT GT GC TG
2S1 300 Ct FAD2-1- SU (2 28) CAT GTAAT TT TGT TT CCT TT AGATT AT AGAAATGAAAAT CCATAAT TT ТА CtFAD2-l-ol (236) CAT GTAAT TT TGT TT CCT TTAGATTATAGAAATGAAAAT CCATAAT TT ТА
301 3S0 CtFAD2-l-SU (278) GGGCTGCT TGTCT TGTTT GGAT TTGTGTTATTAGGT TTT GATCACAGTAA CtFAD2-l-ol (286) GGGCTGCTTCTCTTGTTT GGAT TTGTGTTATTAGGT TTTAATTACAGTAA
3S1 400 CtFAD2-l-SU (328) С TT CCGTACGTTTAATAT GT TAAAT GC TAAACAAAATGATT TAT TT TT ТА CtFAD2-l-ol (336) С TT CCGTACGTTTAATAT GT CAAAT GC TAAAC AAAATGATT TGT TT TT ТА
401 4SO
CtFAD2-l-SU (378) TAT TTATGGCTTCTC GGT GGTC GGATT TGTGT TT TTAAT TC CTGAAGT TT CtFAD2-l-ol (386) TATTTATGGCTTCTCGGTGGTCGGATTTGTGTTTTTAATTCCTGAAGTTT
4S1 SOO CtFAD2-l-SU (428) С TGTATACAATGATT TCGAATT TTGGC GATTAGGCATCT CT TTACT TT GG CtFAD2-l-ol (436) СTGTATACAATGATTTCGAATTTTGGC GATTAGGCATCTCTTTACTTTGG
SOI SSO
CtFAD2-l-SU (478) AAGGAATT TC AGATT TTC TT AAT CTCAT AGAGAAGTG
CtFAD2-l-ol (486) AAGGATTTCT AGATT TTC TTTGCCGGATT CCT TAATCTT AT ATAGAAATG
SSI 600
CtFAD2-l-SU (SIS) CTGAT TG GGAATTT GC TT AAAGATATAAGC ACT TT TC AG
CtFAD2-l-ol (S36) ATGATATC AT TGA CAAAT GGCAATT GC TTAAAGATACAA GCATT TT TC AG
601 6SO
CtFAD2-l-SU (SS4) TTCATT GATT GTTTGATGGACATCAGA-TGGTTTTTTTGCTGATGCCATG
CtFAD2-l-ol (S86) TTCATTGAATGTTTGATGGACATCAAAATGGATTTTTTGCTGATG
6S1 ^ HL-антисмысловой праймер
CtFAD2-l-SU (603) ATGTCTAT TGTGT TGAAT GTAT CTT CAATAAGTGCC TTCAATAT GTATAG] 700
CtFAD 2-l-ol (631) T CTACT GT GTT GAATGTACC ТТСЖПШЗЕГ
701
CtFAD2-l-SU CfcFAD2-l-ol
(6S3) (661)
CAAjAAC TGAGCTAAGGCT CT GT TTGGC AAACT AC CT GAT AAGCT AT AT GT
-CTGTGTTCBCG GCTm^GGCAT GCT AGCT GAT AG
-*¦ НО-смысловой праймер
CtFAD2-l-ЈU CtFAD2-l-ol
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
751 800 (7 03) T GACTGATAAGCTAGTTT GT GAATAAATTATGTT TGGCAAAAAC TAGCAT (694) - CTGAT AAGCTAGCTTAT GAATAAATT ATGTT TGGTAAAAM; TAGC TT
801 8SO
(7 S3) ATGAGTAT GTAAAAT GAC TAAAAAGGGTATCT TGGGGTATAATAGT TAAT (741) ATGAGT AT GTAAAAT GAC AAAAAAGG- TACCT CGGAGTGTAATAAT TAAT
8S1 900 (803) ATT GATAAGGATAGAATT GGAGAAGGC TACAAAAAGCCC TT GAAAT GC ТА (7 90) ATTAATAAGGGTATAATT GGAAGAGCC TACTAAAAGCTC CTAGAAC GC ТА
901 9SO
(8 S3) CTC CAACTAGTGT TT CAATAAGCTGG-CT TAT GGTC TAT CCAAACATGTA (840) CTCCAACTAACGTTTCAATAAGCTTAACTTATGGTCCAT CCAAACATGTA
9S1 1000 (902) С TAGAT TATC АТС TAGCT TATT TTT GC CAAACACAGCCTAAATG-T TT GA (890) С TAGCT TATAAGC GAGCT TATT TTT GC CAAACAC AGCCAAAGTACTTT CA
CtFAD2-l-ЈU CtFAD2-l-ol
-TGGCAC-
(9S1)
(940) T GGTTGAtmOCTreTmOCCC]fflCTGBGC|TAAATGGTC CGATGGT CGAC
НО-антисмысловой праймер
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
10S1
(973) AAT TTGAC AT CAT TATAACT GAAACAATAA
(9 90) GAGTTGACAT CAT TATAATTATATATT TT TGAAT CC TTAAGGCTAACGTT
1101 11SO
CtFAD2-l-SU (1003) TATTCACCTT TACAT AACAT TC AC CT
CtFAD2-l-ol (1040) T CC TTAGT TT TTATT TAT GT TGTGATGGT GGCAT TACATAATAT TCAC CT
1151 1200 CtFAD2-l-SU (1029) T TAGCCAAAAACTAGATGTT CACCTAC GAACT GATC CATAT GGAACAT TT CtFAD2-l-ol (1090) T TAGCTAAAAACT ASATGTT CACCTAC GAACT GATC CATAT GGAACAT TT
CtFAD2-l-SU CtFAD2-l-ol
1201 (1079) TGCAG (1140) TGCAG
Фиг. 7 (продолжение)
СП <
a; i-
о о
о о
120
100 ¦;
80 j ;
60
40 j
20 i
ctFAD2-1 ctFAD2-2
ранняя средняя поздняя ранняя средняя поздняя ранняя средняя поздняя ранняя средняя поздняя стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия стадия
SU S-317 CW99-OL Lesaf496
Фиг. 8
корень зародыш на зародыш зародыш
ранней стадии на средней на поздней
стадии стадии
ткани сафлора
Фиг. 9
¦A. hypogaea (0.0689) ¦G. max (0.0986)
•О. europaea (0.1148) -A. thaliana (0.0256)
1-D. sophia (0.0170)
B. napus (0.0308)
G. biloba (0.2363)
P. oleracea (0.1809)
•C. tinctoris (0.1487)
J. curcas (0.0965)
•P. trichocarpa (0.0408)
Фиг. 10
г-1
гч|
Г--
Г-.
т-Н
ONJ
IX)
<
<
<
<
<
Г-Н
<
<с
<с
"if
<
-=с
"Ь-
'-""¦
. ,
г-1
¦ <
•if
<
"it
¦~(tm)"
ГЧ1
<
rsj
<
<
rsi
го о
rvj
о/"Чи01/Ч
ФИГ. 11
о I- о
о > s л
X X
а> с;
CJ Ct Q)
а. с о
of со о
to о
х 5
S. i
о о
" 2
г- О т- X
со сг СО о
m со
1= -I
. ^
х го s g
5 "
5 ш
?¦ °
оа л
го с;
"- о
" с
О о
О s
сэ г-~
o/04U01"
го о. о с;
- &¦
О CSI
го 5
I- СЧ1
О- - ° о
о си
- го > s Ь
О ^
ш о
CD О
m CD 1| О с
G9T09SId
89I09Sld SZOSfSld
зогеоэ id
T7Z.T095 Id ?91095 Id Z0ZЈ09ld ZZI09Sld
99T09Sld GZ.t?t0t7ld eupuouis GZ.Z.SЈSld 10-ONVD
¦jrz.: SG9Z.ЈS Id
ZlUЈS\d rj^/;;'^i';;:::._-i-3rr:; Z.Z. t?T0Ј Id i v_- : _: 08T09S Id j.-- I9I09Sld :: :-: 8UЈTfrld •-- S0Z.ZЈS Id r;":: 0S6TS1? Id i-r--:: 60990Јld • .:¦ 8S6ISt?ld :-.T.~ ?9109? Id r-.. T-T-I-T-Ј-S8t7lD3
: T0cZ.es id г д-.; тгоотэу
eet/zzs id
vrr; St?9ZЈSid
zz9zes id
В Ј9t> ЈT9ld
о о о о о
00 Г~- Ц2 U1
о о о о
no r-j
вс1оифвэ ИНЭ1Л1ЭЭ а июисш иоаониэио эинвжс1эЬ'оэ
Фиг. 14
128
Таблица 2.
128
Таблица 2.
129
Таблица 3.
129
Таблица 3.
130
Таблица 4.
130
Таблица 4.
131
131
136
137
Таблица 8.
136
137
Таблица 8.
138
137
Таблица 8.
139
139
144
Таблица 10.
143
146
Таблица 11.
146
Таблица 11.
146
Таблица 11.
146
Таблица 11.
147
147
172
173
Таблица 13.
172
173
Таблица 13.
176
Таблица 14.
175
178
178
180
Таблица 16.
179
182
182
184
Таблица 17.
184
Таблица 17.
185
Таблица 18.
185
Таблица 18.
186
186
188
189
Таблица 19.
191
191
196
Таблица 21.
195
196
Таблица 21.
195
196
Таблица 21.
197
198
199
Таблица 22.
201
Таблица 23.
201
Таблица 23.
202
202
204
205
263 .
207
207
2/16
2/16
3/16
3/16
3/16
3/16
3/16
3/16
4/16
4/16
4/16
4/16
4/16
4/16
4/16
4/16
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
5/16
5/16
Фиг. 4
Фиг. 4
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
6/16
300
6/16
300
Фиг. 5
Фиг. 5
7/16
7/16
8/16
8/16
Фиг. 7
Фиг. 7
8/16
8/16
Фиг. 7
Фиг. 7
8/16
8/16
Фиг. 7
Фиг. 7
750
9/16
750
9/16
750
9/16
750
9/16
750
9/16
750
9/16
10/16
10/16
10/16
10/16
10/16
10/16
11/16
11/16
12/16
12/16
13/16
13/16
13/16
13/16
13/16
13/16
13/16
13/16
14/16
14/16
Фиг. 12
Фиг. 12
14/16
14/16
Фиг. 12
Фиг. 12
14/16
14/16
Фиг. 12
Фиг. 12
15/16
15/16
Фиг. 13
Фиг. 13
15/16
15/16
Фиг. 13
Фиг. 13
15/16
15/16
Фиг. 13
Фиг. 13
16/16
16/16