|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Было выявлено, что дисульфат 5-холестен-3 β,25-диола (25HCDS) представляет собой оригинальный агонист PPAR γ и антагонист LXR, его используют для терапии расстройств обмена липидов и воспалительных заболеваний, включая без ограничения жировые болезни печени, воспалительные заболевания кишечника и атеросклеротические болезни. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Было выявлено, что дисульфат 5-холестен-3 β,25-диола (25HCDS) представляет собой оригинальный агонист PPAR γ и антагонист LXR, его используют для терапии расстройств обмена липидов и воспалительных заболеваний, включая без ограничения жировые болезни печени, воспалительные заболевания кишечника и атеросклеротические болезни.
2420-519184ЕА/032 НОВЫЙ МЕТАБОЛИТ ХОЛЕСТЕРИНА ДИСУЛЬФАТ 5-ХОЛЕСТЕН-3|3 ,25-ДИОЛА (25HCDS) ДЛЯ ТЕРАПИИ НАРУШЕНИЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ, ГИПЕРЛИПИДЕМИИ, ДИАБЕТА, ЖИРОВЫХ БОЛЕЗНЕЙ ПЕЧЕНИ И АТЕРОСКЛЕРОЗА
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
По настоящей заявке испрашивается приоритет
предварительных патентных заявок США 61/623203 и 61/623414, зарегистрированных 12 апреля 2012 года. Полные содержания обеих предварительных заявок, таким образом, включены посредством ссылки.
ОПИСАНИЕ ОБЛАСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение в основном относится к новому метаболиту холестерина дисульфату 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS) и его применениям. В частности, изобретение относится к 25HCDS для предупреждения и лечения заболеваний, таких как нарушения липидного обмена и воспалительные нарушения, например, гиперлипидемия, диабет, жировые болезни печени и атеросклероз. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ ИЗОБРЕТЕНИЮ Печень играет основную роль в поддержании гомеостаза липидов. Накопление липидов в тканях печени приводит к неалкогольным жировым болезням печени (NAFLD). NAFLD поражает практически четверть всего населения США и может прогрессировать до выраженного цирроза и печеночноклеточной карциномы. Спектр NAFLD находится в диапазоне от простого непрогрессирующего стеатоза до прогрессирующего неалкогольного стеатогепатита (NASH), что приводит к циррозу печени и печеночноклеточной карциноме. Патогенез NAFLD рассматривают в виде двухстадийного процесса. Первая стадия представляет собой накопление триглицеридов и ассоциированных липидов в гепатоцитах. Вторая стадия представляет собой возникновение воспаления печени. Отличительный признак NAFLD характеризуется повышением накопления внутрипеченочных триглицеридов. Снижение уровней липидов является важным элементом успешной терапии NAFLD. У млекопитающих связывающий стеролрегулирующие элементы белок lc (SREBP-lc) предпочтительно контролирует экспрессию
липогенных генов и регулирует гомеостаз жирных кислот и триглицеридов. Документально доказана его роль в биосинтезе жирных кислот и развитии жировой болезни печени. Однако в настоящее время не существует утвержденного лечения NAFLD.
Оксистеролы могут действовать во многих точках гомеостаза холестерина и метаболизма липидов. Рецептор оксистеролов, LXR, представляет собой регулируемый стеролом фактор транскрипции метаболизма липидов. Активация LXR стимулирует экспрессию АВСА1 и ABCG5/8, опосредующих отток и клиренс холестерина, а также она повышает экспрессию SREBP-lc, который в свою очередь регулирует по меньшей мере 32 гена, участвующих в биосинтезе и транспорте липидов. Таким образом, несмотря на то, что активация LXR синтетическими лигандами может снижать уровень холестерина в сыворотке, обеспечивая защиту от атеросклероза, активация также приводит к жировому гепатозу и гипертриглицеридемии вследствие индукции синтеза жирных кислот и триглицеридов через активацию SREBP-lc. Гепатоциты обладают ограниченной способностью хранить жирные кислоты в форме триглицеридов. После того как способность становится перегруженной происходит повреждение клетка. Избыток количества внутриклеточных свободных жирных кислоты инициирует продукцию активных форм кислорода (ROS), приводящих к липотоксичности и активации воспалительного пути передачи сигнала, что в конечном итоге приводит к апоптозу.
5-холестен-Зр,25-диол-З-сульфат (25HC3S) представляет
собой оксистерол, который недавно идентифицировали в ядре
первичных гапатоцитов крысы. 25HCDS описан в W0 2006/047022.
Этот оксистерол можно синтезировать посредством стероидной
сульфотрансферазы SULT2Blb из 25-гидроксихолестерина (25НС)
сульфатированием оксистерола. Экзогенное введение сходного
метаболита холестерина 5-холестен-Зр,25-диол-Зр-сульфата
(2 5HCPS) приводит к снижению экспрессии SREBP-1 и SREBP-2; блокирует процессинг SREBP-lc и подавляет экспрессию ключевых ферментов, участвующих в метаболизме липидов, включая ацетил-СоА-карбоксилазу-1 (АСС-1), синтез жирных кислот (FAS) и 3-гидрокси-З-метилглутарил-СоА-редуктазу (HMGR), соответственно
снижая уровни нейтральных липидов и холестерина.
Результаты указывают на то, что 25HC3S действует как антагонист LXR и как сигнал насыщения холестерина, подавляя пути синтеза жирных кислот и триглицеридов через ингибирование передачи сигналов LXR/SREBP. Кроме того, 25HC3S повышает экспрессию IkBp, блокирует индуцируемую TNFa деградацию IkBp и снижает уровни NFkB в ядре. В отличие от этого, 25НС действует противоположным образом, индуцируя деградацию IkBp и накопление NFkB в ядре. Эти результаты указывают на то, что 25HC3S также участвует в воспалительных ответах и может представлять собой связь между воспалительными путями и регуляцией гомеостаза липидов.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящее время идентифицирован другой регуляторный метаболит холестерина - дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS). Исследования 25HCDS свидетельствуют о том, что пониженная экспрессия этого природного метаболита играет важную роль в накоплении липидов и клеточном повреждении в гепатоцитах и макрофагах, таким образом, способствуя патогенезу нарушений обмена веществ. Добавление 25HCDS в среды для культивирования гепатоцитов и макрофагов приводило к снижению уровней иРНК белка, связывающего стеролрегулирующие элементы (SREBP), ингибировало процессинг SREBPs, а затем подавляло ключевые ферменты, участвующие в биосинтезе липидов, приводя к пониженным внутриклеточным уровням липидов в гепатоцитах и макрофагах. 25HCDS также повышал экспрессию рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PPAR), IkB и уровни иРНК коактиватора 1-альфа рецептора, активируемого пролифератором пероксисом (PGC-la), снижало уровни NFkB в ядре и снижало экспрессию и секрецию провоспалительных цитокинов. Следует отметить, что исследования in vivo продемонстрировали, что введение 2 5HCDS снижало нейтральные липиды в гепатоцитах на 2 0-35%, не вызывая токсичности.
Таким образом, недавно открытый метаболит холестерина 2 5HCDS функционирует как настоящий агонист PPARy и антагонист LXR, который ингибирует биосинтез холестерина и липидов в
гепатоцитах и макрофагах in vitro и in vivo наряду с подавлением воспалительных ответов через путь передачи сигнала PPARY/IkB/NFkB. Таким образом, 2 5HCDS, который химически синтезировали, как описано в разделе "примеры" в настоящем описании, можно применять в качестве лекарственного средства для лечения и предупреждения нарушений метаболизма липидов и воспалительных нарушений, включая гиперлипидемию, атеросклероз, диабет, жировые болезни печени и т.д.
Другие признаки и преимущества настоящего изобретения указаны в описании изобретения, которое следует ниже, и частично будут понятны из описания или могут быть понятны в результате практического осуществления изобретения. Изобретение осуществляют и получают посредством композиций и способами, в частности указанными в письменном описании и его формуле изобретения.
В одном из аспектов изобретение относится к применению соединения, которое представляет собой (i) дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS) формулы
HO3SO
и/или его фармацевтически приемлемые соли в качестве лекарственного средства. В некоторых аспектах соединение представляет собой
H03S0
В некоторых аспектах изобретение относится к применению соединения в способах: понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума и/или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. В дополнительных аспектах изобретение относится к применению соединения
HO3SO
или
H03SO
для получения лекарственного средства для: понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
В других аспектах изобретение относится к способам лечения индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества соединения
HO3SO
или
H03SO
где способ выбран из: способа понижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа понижения биосинтеза холестерина и липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения гиперлипидемии у нуждающегося в
этом индивидуума; способа лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума и способа лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. В некоторых аспектах соединение вводят в количестве в диапазоне от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела указанного индивидуума или соединение вводят в количестве в диапазоне от 1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела указанного индивидуума, и/или введение включает по меньшей мере одно пероральное введение, энтеральное введение, сублингвальное введение, трансдермальное введение, внутривенное введение, перитонеальное введение, парентеральное введение, введение посредством инъекции, подкожной инъекции и внутримышечной инъекции.
В одном из аспектов изобретение относится к соединению, которое представляет собой: (i) дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (2 5HCDS) формулы H03SOv
и/или его фармацевтически приемлемым солям. Один из аспектов относится к самому соединению и его фармацевтически приемлемым солям. Другой аспект относится к применению соединения и его фармацевтически приемлемых солей в качестве лекарственного средства.
В некоторых аспектах соединение представляет собой
HOoSO'
В некоторых аспектах соединение представляет собой выделенное соединение. В других аспектах соединение является по существу чистым. В еще одних других аспектах соединение находится в твердой форме. Твердая форма может находиться в форме порошка и/или в лиофилизированной форме.
Изобретение дополнительно относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение, которое представляет собой: (i) дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS) формулы H03SCX
HO3SO
и (ii) физиологически приемлем эксципиент, разбавитель или носитель. В некоторых аспектах соединение представляет собой
III
H03SO*
В некоторых аспектах фармацевтическую композицию формулируют в стандартной лекарственной форме. В других аспектах фармацевтическая композиция находится в твердой форме.
Твердые формы композиции включают формы, в которых: фармацевтическая композиция находится в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца, или композиция содержит соединение в лиофилизированной форме совместно с наполнителем, где композиция необязательно содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке. В некоторых аспектах фармацевтическая композиция содержит носитель, который представляет собой жидкость. В этом аспекте соединение можно растворять в жидкости или диспергировать в жидкости; и/или жидкость является водной, и/или жидкость представляет собой стерильную воду для инъекций или фосфатно-солевой буфер, и/или композиция содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.
Изобретение также относится к способу получения соединения
где способ включает взаимодействие 25-гидроксихолестерина с источником триоксида серы и необязательно образование фармацевтически приемлемой соли из получаемого дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS). В некоторых аспектах источник триоксида серы представляет собой аминный комплекс триоксида
серы. В других аспектах способ включает объединение соединения с физиологически приемлемым эксципиентом, разбавителем или носителем.
Как указано выше, настоящее изобретение в числе прочего относится к конкретным соединениям для применения в способе снижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума, снижения уровней холестерина и биосинтеза липидов у нуждающегося в этом индивидуума, уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума, лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума, лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума, лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума, лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума. Во избежание неоднозначности толкования, в этом аспекте настоящее изобретение может относиться к конкретному соединению для применения в качестве лекарственного средства в конкретном способе. Кроме того, настоящее изобретение может относиться к указанному соединению в качестве активного терапевтического ингредиента в конкретном способе. Кроме того, настоящее изобретение может относиться к указанному соединению для применения в способе лечения организма человека или животного терапией, способом, включая указанный способ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 показано, что характеризация ядерного
оксистерола в виде дисульфата 5-холестен-Зр,25-диола
посредством тройной квадрупольной масс-спектрометрии
отрицательных ионов. Представлен спектр ВЭЖХ/МС полного сканирования в режиме отрицательных ионов, профиль элюции ВЭЖХ-МС в зависимости от массы иона 8 0, полученный при сканировании продукта m/z 583 и m/z 561.
На Фиг. 2 показаны результаты анализа химически синтезированного 25HCDS. МС-спектр продукта.
На Фиг. 3 представлен спектр 1Н ЯМР 25HCDS. Стрелками указан протон в положении 3 соединения и его химический сдвиг резонанса в исходном веществе и в продукте.
На Фиг. 4 представлен спектр 13С ЯМР 25HCDS. Стрелками указаны положения 3 и 25 углерода соединения и его химический сдвиг резонанса в исходном веществе и в продукте.
На Фиг. 5A-D показано, как 2 5HCDS регулирует экспрессию генов биосинтеза липидов. 5А - анализ ПЦР с обратной транскрипцией в режиме реального времени уровней иРНК SREBP-lc, АСС и FAS в клетках ТНР-1, обработанных 2 5HCDS в указанных концентрациях; 5В - SREBP-2, HMG-CoA-редуктаза и LDLR; уровни иРНК PPARg и ЕкВ в клетках ТНР-1, обработанных 2 5HCDS в указанные моменты времени (5С) и в указанных концентрациях (5D). Уровни экспрессии нормализовали на GAPDH. Каждое значение представляет собой среднее трех отдельных измерений ± стандартное отклонение.
На Фиг. б показано, что введение 25HCD3S уменьшает накопление липидов в ткани печени на моделях NAFLD на мышах. Животным перитонеально вводили 2 5HCDS один раз в 3 суток в течение б недель. Триглицерид, свободную жирную кислоту, общий холестерин, свободный холестерин и сложный эфир холестерина, свободную жирную кислоту и триглицерид в печени определяли, как описано в примере. Каждый отдельный уровень нормализовали на концентрацию белка. Все значения выражают в виде среднего значения ± SD; символ * означает р <0,05 в сравнении с печенью мышей, обрабатываемых HFD-пищевым носителем.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
В настоящее время идентифицирован новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS). Введение 25HCDS существенно повышало экспрессию PPARy, коактиватора 1-альфа PPARy (PGC-la) и IkB и снижало уровни триглицеридов и холестерина в печени через путь передачи сигнала LXR-SREBP-lc in vivo на моделях NAFLD на мышах. Эти открытия демонстрируют, что 2 5HCDS является эффективным регулятором, участвующим в метаболизме липидов и воспалительных ответах.
Таким образом, изобретение относится к способам применения 2 5HCDS для лечения и предупреждения нарушений метаболизма липидов и воспалительных нарушений. В некоторых аспектах способы включают введение терапевтически эффективной дозы
2 5HCDS индивидуумам, нуждающимся в таком лечении, для повышения уровня 2 5HCDS у индивидуума и/или для обеспечения благоприятных изменений метаболизма липидов. Реализация способов, как правило, включает идентификацию пациентов, страдающих или подвергающихся риску развития нарушений липидного обмена и ассоциированных с этим состояний, и/или идентификацию пациентов, страдающих или подвергающихся риску развития аномального воспаления, и введение 25HCDS в приемлемой форме подходящим путем. Идентификацию подходящих индивидуумов можно проводить, например, с использованием различных тестов крови, результатов биопсии печени, наличия манифестирующих симптомов заболевания и т.д., как известно в данной области. Индивидуумы, для которых подходит лечение, включают индивидуумов, у которых идентифицируют, что они страдают или с большой вероятностью страдают нарушением обмена липидов и/или воспалением. Также по настоящему изобретению предоставлены 2 5HCDS и родственные фармацевтические композиции. Их можно использовать в способах лечения.
25HCDS может находиться в форме фармацевтически приемлемой соли. Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой соль диприсоединения или соль моноприсоединения. Соль диприсоединения образуется в результате потери атомов водорода в каждой из двух сульфатных групп молекулы 25HCDS. Соль моноприсоединения образуется в результате потери атома водорода только в одной из двух сульфатных группах молекулы 2 5HCDS (в положении Зр или положении 2 5 молекулы).
Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой, например, соль щелочного металла (например, соль лития, натрия или калия), соль щелочноземельного металла (например, соль кальция) или аммонийную соль. Фармацевтически приемлемая соль может представлять собой, например, соль натрия, калия, кальция, лития или аммония.
Один из примеров такой соли представляет собой натриевую соль 25HCDS, например, натриевую соль моноприсоединения 25HCDS, такую как соль моноприсоединения, образуемая в результате потери атома водорода в сульфатной группе в положении 2 5
Во избежание неоднозначности толкования, следует подчеркнуть, что на всем протяжении настоящего описания "2 5HCDS" включает фармацевтически приемлемые соли 2 5HCDS, если явно не указано иное.
Холестерин содержит восемь хиральных центров, таким образом, являясь источником большого числа различимых стереоизомеров. Эти восемь хиральных центров также содержатся в 25HCDS. Как правило, 25HCDS, используемый в настоящем изобретении, может находиться в любой одной стереоизомерной форме или может представлять собой смесь любых двух или более таких стереоизомерных форм. Однако по меньшей мере 50% масс, предпочтительно по меньшей мере 90% масс. и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95% масс. 25HCDS может иметь формулу
Следует понимать, что хиральность в каждом из восьми хиральных центров в этой формулу является сходной с хиральностью, встречающейся в нативном холестерине. Таким образом, этот стереоизомер соответствует стереизомерной форме метаболита нативного 25HCDS in vivo.
2 5HCDS или его фармацевтически приемлемую соль может представлять собой выделенный 2 5HCDS или его фармацевтически приемлемую соль. "Выделенный" означает, что он не содержится в тканевом веществе, содержащемся или экстрагируемом у индивидуума, являющегося человеком или животным. Например, выделенный 2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль не содержится в клетке. Таким образом, выделенный 25HCDS или его фармацевтически приемлемая соль можно явно отличать от нативного 25HCDS, который содержится в тканевом веществе (например, клетке), которое само по себе содержится, или его экстрагируют у являющегося человеком или животным индивидуума.
2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль может по существу являться чистой. Например, 25HCDS или его фармацевтически приемлемую соль можно предоставлять в значительной степени очищенной форме для применения в способах лечения.
В случае когда он является "по существу чистым" или "в значительной степени очищенным", дисульфатированный оксистерол (2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль) может находиться в форме, в которой по меньшей мере приблизительно 75%, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 80%, более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере приблизительно 95% или более не содержит других химических соединений. По существу чистый 2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль может содержать, в частности, по меньшей мере приблизительно 90% масс, или по меньшей мере приблизительно 95% и более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 98% масс, по меньшей мере приблизительно 99% масс, или даже более предпочтительно по меньшей мере приблизительно 99,5% масс, или по меньшей мере приблизительно 99,8% масс. 25HCDS или его фармацевтически приемлемой соли.
2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль может представлять собой твердое вещество. Например, 25HCDS или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в форме порошка.
2 5HCDS или его фармацевтически приемлемая соль может находиться в лиофилизированной форме. Как хорошо известно, лиофилизация представляет собой способ дегидратации, как правило, используемый для сохранения скоропортящегося вещества или для того, чтобы делать вещество более удобным для транспортировки. Существует три основные стадии этого способа, а именно замораживание, первичная сушка и вторичная сушка. Замораживание, как правило, проводят с использованием устройства для лиофильной сушки. Во время первичной сушки давление контролируют применением соответствующих уровней вакуума, при этом подают достаточно теплоты для обеспечения сублимации любой содержащейся воды. В процессе вторичной сушки удаляют воду гидратации дальнейшим применением тепла. Как правило, для поддержания дальнейшей сушки также понижают давление. После завершения процесса лиофилизации вакуум можно заполнять инертным газом, таким как азот, перед герметичным запечатыванием или вещество можно герметично запечатывать в вакууме.
Несмотря на то, что возможно выделять и очищать 2 5HCDS из живых клеток, специалистам в данной области понятно, что для получения достаточных количеств дисульфатированного оксистерола соединение, как правило, синтезируют способами синтеза химического вещества или способами, которые включают применение технологии рекомбинантных ДНК (например, с использованием клонированных ферментов для проведения подходящих модификаций холестерина). Иллюстративная схема синтеза предоставлена в разделе "примеры" ниже.
В более общем смысле 2 5HCDS или его фармацевтически приемлемую соль можно получать синтетически посредством взаимодействия 25-гидроксихолестерина с источником триоксида серы и необязательно с получением фармацевтически приемлемой соли из получаемого продукта.
Для преобразования двух гидроксильных групп (-ОН) , содержащихся в 2 5-гидроксихолестерине, в сульфатные группы (-OSO3H) можно использовать любой подходящий источник триоксида серы. Комплексы триоксид серы-амин представляют собой одну из
иллюстративных групп источников триоксида серы. Примеры таких комплексов включают комплекс триоксида серы и триметиламина
(TMAS), комплекс триоксида серы и триэтиламина (TEAS), комплекса триоксида серы диметиланилина (DMAS), комплекс триоксида серы и диметилформамида (DMFS), комплекс триоксида серы и пиридина (PSS) и комплекс триоксида серы и поливинилпиридина (PVPS) . Как правило, на моль 2 5-гидроксихолестерина используют от одного до двадцати моль, например, от двух до десяти моль выбранного источника триоксида серы (такого как комплекс триоксид серы-амин).
Реакцию, как правило, проводят в инертном растворителе. Растворитель может представлять собой, например, безводный растворитель. Один из таких иллюстративных растворителей представляет собой безводный пиридин.
Также можно добавлять основание, например, для получения желаемой фармацевтически приемлемой соли из продукта дисульфата. Одно из таких оснований представляет собой NaOH, который можно использовать для получения натриевой соли 25HCDS. Следует понимать, что для получения других фармацевтически приемлемых солей можно использовать альтернативные реагенты
(обладающие различными валентностями и/или содержащие различные катионы).
Температура реакции, как правило, может составлять от 10 до 100°С, например, от 20 до 80°С. Время реакции, как правило, может составлять от 0,1 до 24 часов, например, от 0,25 до 5 часов.
При желании продукт можно очищать от реакционной смеси после прохождения реакции. При желании продукт можно выделять из реакционной смеси после прохождения реакции.
Исходное вещество 25-гидроксихолестерина представляют собой коммерчески доступный продукт. Альтернативно, его можно получать гидроксилированием холестерина (см., например, Ogawa et al., Steroids, 74:81-87). Таким образом, способ может дополнительно включать начальный этап гидроксилирования холестерина с получением 25-гидроксихолестерина.
2 5HCDS можно вводить в чистой форме или в фармацевтически
приемлемом составе. Такие составы (композиции), как правило, содержат 2 5HCDS или его фармацевтически приемлемую соль и физиологически приемлемый (совместимый) эксципиент, разбавитель или носитель/основу. 25HCDS может находиться, например, в форме фармацевтически приемлемой соли (например, соли щелочного металла, такого как натрий, калий, кальций, литий, аммоний и т.д.) или другого комплекса.
Фармацевтическая композиция является стерильной. Стерильная означает, что по существу не содержатся жизнеспособные микроорганизмы, например, как определяют с испытанием на стерильность USP (см. "The United States Pharmacopeia", 30th Revision, The United States Pharmacopeial Convention: 2008) . Для сохранения стерильности фармацевтическую композицию можно предоставлять в герметично запечатанной упаковке, которая может предотвращать проникновение жизнеспособных микроорганизмов. Например, в случае жидкой фармацевтической композиции, композицию можно герметично запечатывать во флаконе или ампуле.
Следует понимать, что фармацевтически приемлемые составы
(композиции) содержат жидкие и твердые вещества, общепринято
используемые для получения инъецируемых лекарственных форм и
твердых лекарственных форм, таких как таблетки, таблетки-
леденцы, порошки и капсулы, а также аэрозольных лекарственных
форм. Соединения можно формулировать с водными или масляными
основными носителями. Воду можно использовать в качестве
носителя для получения композиций (например, инъецируемых
композиций), которые также могут содержать общепринятые буферы
и средства для придания изотонических свойств композиции и для
поддержания физиологически приемлемого рН. Другие возможные
добавки (предпочтительно добавки, которые, как правило,
считаются безопасными [GRAS]) включают: красители,
ароматизаторы, поверхностно-активные вещества (TWEEN, олеиновую кислоту и т.д.), растворители, стабилизаторы, эликсиры и связывающие средства или инкапсулирующие средства (лактозу, липосомы и т.д.). Твердые разбавители и эксципиенты включают лактозу, крахмал, общепринятые дезинтегрирующие средства,
покрытия и т.п. Также можно использовать консерванты, такие как метилпарабен или бензалкония хлорид.
Более подробно, когда композиция находится в твердой форме, она может находиться в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца. Когда композиция находится в твердой форме, композиция может содержать 2 5HCDS в лиофилизированной форме совместно с наполнителем. Наполнитель представляет собой фармацевтически неактивное и, как правило, химически инертное вещество, которое можно добавлять к композиции для увеличения ее объема. Общепринятые наполнители для применения в препарате лиофилизированных фармацевтических композициях и являющиеся подходящими для настоящего изобретения включают маннит и глицин. Когда композиция находится в твердой форме, она может необязательно содержаться в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.
В случае, когда фармацевтическая композиция содержит жидкий носитель, 2 5HCDS можно растворять в указанной жидкости или диспергировать в указанной жидкости, и/или жидкость может являться водной, и/или жидкость может представлять собой стерильную воду для инъекций или фосфатно-солевой буфер. В случае, когда фармацевтическая композиция содержит жидкий носитель, композиция может содержаться в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.
В зависимости от состава рассчитывают, что активное
средство 25HCDS составляет приблизительно от 1% приблизительно
до 99% по массе композиции, и подвижный "носитель" составляет
приблизительно от 1% приблизительно до 99% по массе композиции.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут
содержать любые подходящие фармацевтически приемлемые добавки
или дополнительные средства в тех случаях, когда они не
препятствуют или нарушают терапевтический эффект
сульфатированного оксистерола.
Введение может представлять собой по меньшей мере одно из перорального введения, энтерального введения, сублингвального введения, трансдермального введения, внутривенного введения, перитонеального введения, парентерального введения, введения
посредством инъекции, подкожной инъекции и внутримышечной
инъекции. Например, введение может быть пероральным или
парентеральным, включая внутривенную, внутримышечную,
подкожную, интрадермальную инъекцию, интраперитонеальную инъекцию и т.д., или можно проводить другими путями (например, трансдермальной, сублингвальной, пероральной, ректальной и буккальной доставкой, ингаляцией аэрозоля и т.д.). В предпочтительном варианте осуществления введение является пероральным. Кроме того, введение соединения можно проводить в виде одного вида терапии или в сочетании с другими видами терапии, например, с лекарственными средствами, снижающими уровень липидов или холестерина, схемами лечения на основе физической нагрузки и рациона питания и т.д., как описано выше для схем лечения, которые может применять индивидуум после детекции нарушение обмена липидов. Введение 2 5HCDS пациенту может быть периодическим или с поэтапной или непрерывной, постоянной или контролируемой скоростью. Кроме того, время суток и число раз в сутки, с которыми вводят фармацевтический состав, может изменяться, и их лучше всего определяет практикующий специалист в данной области, такой как врач.
Точная доза 25HCDS, которую необходимо вводить, может изменяться в зависимости от возраста, пола, массы, общего состояния здоровья индивидуального пациента и т.д., а также от конкретной этиологии заболевания. Однако в основном для введения млекопитающим (например, людям) терапевтически эффективные дозы находятся в диапазоне приблизительно от 0,1 приблизительно до 100 мг или более соединения на кг массы тела в течение 24 часов и, как правило, эффективными являются приблизительно от 0,5 приблизительно до 50 мг соединения на кг массы тела в течение 24 часов и часто приблизительно от 1 приблизительно до 10 мг соединения на кг массы тела в течение 24 часов.
Фармацевтическую композицию по изобретению можно формулировать в стандартной лекарственной форме, т.е. фармацевтическая композиция может находиться в форме дискретных порций, где каждая порция содержит стандартную дозу 25HCDS. В
этом контексте стандартная доза может содержать, например, приблизительно от 0,1 мг приблизительно до 100 мг или приблизительно от 0,5 мг приблизительно до 50 мг, или приблизительно от 1 мг приблизительно до 10 мг 2 5HCDS.
Фармацевтическую композицию можно получать объединением 2 5HCDS с выбранными физиологически приемлемыми эксципиентами, разбавителями и/или носителями.
Несмотря на то, что индивидуумы, как правило, являются людьми, также предусматривают применения технологии в ветеринарии.
В других аспектах уровень 2 5HCDS повышают у нуждающегося в этом индивидуума посредством увеличения эндогенной экспрессии/продукции 2 5HCDS. Иллюстративные способы получения такого результата включают предоставление индивидууму одного или нескольких ферментов, ответственных за синтез 25HCDS. В некоторых вариантах осуществления предоставляют сами ферменты; в других вариантах осуществления предоставляют нуклеиновые кислоты, которые кодируют ферменты. Ферменты, которые участвуют в синтезе 25HCDS, представляют собой SULT2Bab и SULT2Bla, и для повышения эндогенных уровней 2 5HCDS можно вводить один или оба из этих ферментов. Например, можно предоставлять векторы, которые содержат и экспрессируют один или оба этих фермента. Иллюстративные векторы включают, но не ограничиваются ими, аденовирусные векторы, ретровирусные векторы, репликационно-компетентные векторы, векторы на основе вируса герпеса и т.д.
Нарушения липидного обмена, в отношении которых можно
проводить предупреждение или лечение посредством повышения
уровней 25HCDS у индивидуума, как описано в настоящем описании,
включают, но не ограничиваются ими: гепатит (воспаление
печени), вызываемый в основном различными вирусами, а также
некоторыми бактериальными инфекциями, лекарственными средствами
или химическими веществами (например, ядами, спиртом), а также
связанные осложнения, такие как фиброз печени; аутоиммунную
реакцию (аутоиммунный гепатит) или наследственные
патологические состояния; неалкогольную жировую болезнь печени (NAFLD), спектр заболеваний, связанных с ожирением и
характеризующихся избытком жира в печени, и различные синдромы, ассоциированные с NAFLD (например, гепатит, неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз, заболевание печени на терминальной стадии и т.д.); цирроз, т.е. образование ткани фиброзных рубцов в печени вследствие замены погибших клетки печени (гибель клеток печени может быть вызвана, например, вирусным гепатитом, алкоголизмом или контактированием с другими токсичными для печени химическими веществами); гемохроматоз, наследственное заболевание, вызываемое накоплением железа в организме, в конечном итоге приводящее к повреждению печени; злокачественную опухоль печени (например, первичную печеночноклеточную карциному или холангиокарциному и метастатические злокачественные опухоли, как правило, из других отделов желудочно-кишечного тракта); болезнь Вильсона, наследственное заболевание, которое приводит к накоплению меди в организме; первичный склерозирующий холангит, воспалительное заболевание желчного протока с большой вероятностью аутоиммунное по природе; первичный биллиарный цирроз, аутоиммунное заболевание малых желчных протоков; синдром Бадда-Киари (окклюзия печеночной вены); синдром Жильбера, генетическое нарушение метаболизма билирубина, встречающееся приблизительно у 5% популяции; гликогеновую болезнь накопления II типа, а также различные заболевания печени у детей, например, включая атрезию желчных протоков, дефицит ингибитора трипсина альфа-1, синдром Алажиля и прогрессирующий семейный внутрипеченочный холестаз и т.д. Кроме того, также можно лечить повреждение печени в результате травмы, например, повреждение, вызванное несчастными случаями, огнестрельными ранениями и т.д. Кроме того, можно проводить предупреждение или лечение повреждений печени, вызываемых определенными лекарственными препаратами, например, известно, что лекарственные средства, такими как антиаритмическое средство амиодарон, различные противовирусные лекарственные средства (например, аналоги нуклеозидов), аспирин (редко при синдроме Рейе у детей), кортикостероиды, метотрексат, тамоксифен, тетрациклин и т.д., вызывают повреждение печени. В некоторых вариантах
осуществления способы диагностики и лечения проводят в сочетании (например, до, во время или после) с хирургической операцией на печени у индивидуума. Например, хирургическая операция на печени может представлять собой операцию по трансплантации печени, и индивидуум, для которого проводят лечение, может являться донором или реципиентом, или хирургическая операция на печени может представлять собой хирургическую операцию, в ходе которой удаляют пораженную или поврежденную ткань печени или удаляют злокачественные опухоли и т.д.
В некоторых вариантах осуществления заболевание или
состояние, для которого проводят предупреждение или лечение,
представляет собой гиперлипидемию или обусловлено ей. Под
"гиперлипидемией" авторы подразумевают состояние аномально
повышенных уровней любого или всех липидов и/или липопротеинов
в крови. Гиперлипидемия включает первичные и вторичные подтипы,
где первичная гиперлипидемия, как правило, обусловлена
генетическими причинами (такими как мутация в рецепторном
белке), а вторичная гиперлипидемия возникает в результате
других первопричин, таких как диабет. Липиды и композиции
липидов, которые могут повышаться и понижаться у индивидуума в
результате лечений, описываемых в настоящем описании, включают,
но не ограничиваются ими, хиломикроны, липопротеины очень
низкой плотности, липопротеины промежуточной плотности,
липопротеины низкой плотности (LDL) и липопротеины высокой
плотности (HDL). В частности, известно, что повышенные уровни
холестерина (гиперхолестеринемия) и триглицеридов
(гипертриглицеридемия) являются факторами риска заболевания кровеносных сосудов и сердечно-сосудистого заболевания вследствие их влияния на атеросклероз. Повышение уровня липидов также может провоцировать у индивидуума другие состояния, такие как острый панкреатит. Таким образом, способы по изобретению также можно применять для лечения или предупреждения (например, профилактического лечения) состояний, которые сопровождаются или ассоциированы с повышенным уровнем липидов. Такие состояния включают, но не ограничиваются ими, например, гиперлипидемию,
гиперхолестеринемию, гипертриглицеридемию, жировую печень (жировой гепатоз) , метаболический синдром, сердечно-сосудистые заболевания, ишемическую болезнь сердца, атеросклероз (т.е. поражение сосудов с атеросклерозом или ASVD) и родственные заболевания, острый панкреатит, различные нарушения обмена веществ, такие как синдром резистентности к инсулину, диабет, синдром поликистозных яичников, жировую болезнь печени, кахексию, ожирение, атеросклероз, инсульт, желчные камни, воспалительное заболевание кишечника, наследственные нарушения обмена веществ, такие как нарушения накопления липидов и т.п. Кроме того, различные состояния, ассоциированные с гиперлипидемией, включают состояния, описанные в опубликованных патентах США 8003795 (Liu et al. ) и 8044243 (Sharma et al. ) , полное содержание которых полностью включено в настоящее описании посредством ссылки.
В некоторых вариантах осуществления заболевания и состояния, в отношении которых проводят предупреждение или лечение, включают воспаление и/или заболевания и состояния, ассоциированные, характеризующиеся или вызываемые воспалением. Они включают широкую группу нарушений, которые лежат в основе многих заболеваний человека. В некоторых вариантах осуществления воспаление является острым, возникающим в результате, например, инфекции, повреждения и т.д. В других вариантах осуществления воспаление является хроническим. В некоторых вариантах осуществления иммунная система участвует в воспалительном нарушении, как можно видеть в случае аллергических реакциях и некоторых миопатий. Однако также можно лечить различные неиммунные заболевания с воспалительными процессами в качестве этиологических причин, включая злокачественную опухоль, атеросклероз и ишемическую болезнь сердца, а также другие перечисленные ниже заболевания.
Примеры нарушений, ассоциированных с аномальным воспалением, в отношении которого можно проводить предупреждение или лечение, включая 2 5HCDS, включают, но не ограничиваются ими, обыкновенные угри, астму, различные аутоиммунные заболевания, глютеиновую болезнь, хронический
простатит, гломерулонефрит, различные виды
гиперчувствительности, воспалительные заболевания кишечника, воспалительное заболевание органов таза, реперфузионное повреждение, ревматоидный артрит, саркоидоз, отторжение трансплантата, васкулит и интерстициальный цистит. Также включены воспаление нарушения, которые возникают в результате применения легально выписанных и запрещенных лекарственных средств, а также воспаление, инициируемое негативными состояниями или их последствиями, например, вызываемые стрессом, насилием или депривацией.
В одном из аспектов воспалительное нарушение, в отношении которого проводят предупреждение или лечение, представляет собой аллергическую реакцию (гиперчувствительность 1 типа), результат неадекватного иммунного ответа, который инициирует воспаление. Общеизвестным примером является сенная лихорадка, которая обусловлена гиперчувствительным ответом тучных клеток кожи на аллергены. Тяжелые воспалительные ответы могут переходить в системную реакцию, известную как анафилаксия. Другие реакции гиперчувствительности (2 типа и 3 типа) опосредуются реакциями антител и индуцируют воспаление привлечением лейкоцитов, которые повреждают окружающую ткань, и их также можно лечить, как описано в настоящем описании.
В других аспектах проводят предупреждение и лечение воспалительных миопатий. Такие миопатии обусловлены иммунной системой, несоответствующим образом атакующей компоненты мышцы, приводящей к проявлению признакам воспаления мышц. Они могут возникать в сочетании с другими иммунными нарушениями, такими как системный склероз, и включают дерматомиозит, полимиозит и миозит с тельцами включения.
В одном из аспектов способы и композиции по изобретению используют для предупреждения или лечения системного воспаления, такого как, ассоциированное с ожирением воспаление. При таком воспалении вовлеченные процессы являются идентичными воспалению тканей, но системное воспаление не ограничивается конкретной тканью, а включает эндотелий и другие системы органов. Системное воспаление может быть хроническим, и часто
встречается при ожирении, при котором наблюдают повышенные многие маркеры воспаления, включая: IL-6 (интерлейкин-б), IL-8 (интерлейкин-8), EL-18 (интерлейкин-18), TNF-a(фактор некроза опухоли-альфа), CRP (С-реактивный белок), инсулин, глюкозу в крови и лептин. В отношении состояний или заболеваний, ассоциированных с повышенными уровнями этих маркеров, можно проводить предупреждение или лечение, как описано в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления воспаление можно классифицировать как "слабо выраженное хроническое воспаление", при котором наблюдают двух-трех кратное повышение общих концентраций цитокинов, таких как TNF-a, IL-6 и CRP. Окружность талии также значительно коррелирует с системными воспалительными ответами, преобладающий фактор это корреляции обусловлен аутоиммунным ответом, инициируемым ожирением, при котором иммунные клетки "ошибочно принимают" жировые отложения за возбудителей инфекции, таких как бактерии и грибы. Системное воспаление также может быть инициировано перееданием. Была установлена связь пищи с высоким содержанием насыщенного жира, а также пищи с высоким содержанием калорий с повышениями уровней воспалительных маркеров, и ответ может становиться хроническим, если переедание является хроническим.
Различные аспекты изобретения описаны в примере ниже. Однако предоставленную в примере информацию не следует расценивать как каким-либо образом ограничивающую объем изобретения.
ПРИМЕР
Новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS) понижает биосинтез липидов и подавляет воспалительные ответы in vitro и in vivo
ВВЕДЕНИЕ
Показано, что широко распространено изменение метаболизма липидов при неалкогольных жировых болезнях печени (NAFLD), в частности наблюдают существенные нарушение метаболизма холестерина. Потенциальные механизмы, в результате которых такие изменения могут приводить к NAFLD через путь передачи сигналов ядерного рецептора остаются неясными. В настоящем
исследовании в первичных гепатоцитах крыс идентифицировали новый метаболит холестерина дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS). Как описано в настоящем описании, в настоящее время 2 5HCDS химически синтезировали и исследовали его биологическую функцию. Введение 2 5HCDS (25 мкМ) в клетки ТНР-1 макрофагов человека и HepG2 и на модели на животных NAFLD in vivo на мышах повышало экспрессию PPARy и коактиватора 1-альфа PPARy (PGC-la) и понижало экспрессию ключевых белков, участвующих в биосинтезе липидов и провоспалительных ответах. Введение заметно понижало уровни печеночных липидов и подавляло воспалительные ответы. Количественная ПЦР с обратной транскрипцией и анализ вестерн-блоттинга демонстрировали, что 2 5HCDS приводило к значительному снижению уровней иРНК SREBP-1/2 и подавлению экспрессии их соответствующих генов, включая АСС, FAS и HMG-CoA-редуктазу и к повышению IkB и снижению уровней иРНК TNFa и ILp. Результаты позволяют предположить, что ингибирование биосинтеза липидов возникает в результате блокирования передачи сигналов SREBP и подавления воспалительных ответов путем повышения экспрессии PPARy, PGC-la и IkB. Анализ профилей липидов в тканях печени демонстрировал, что введение 2 5HCDS один раз каждые трое суток в течение б недель значительно снижало уровень общего холестерина, свободных жирных кислот и триглицеридов на 30, 25 и 20%, соответственно. Таким образом, 25HCDS является эффективным регулятором метаболизма липидов и воспалительных ответов.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
Материалы
Реагенты для культивирования клеток и вспомогательные вещества приобретали от GIBCO BRL (Grand Island, NY) ; 25-гидроксихолестерин от New England Nuclear (Boston, MA) . Клетки ТНР-1 и HepG2 получали от American Type Culture Collection (Rockville, MD). Реагенты для ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией приобретали от АВ Applied Biosystems (Warrington WA14 SR, UK). Химические соединения, используемые в этом исследовании получали от Sigma Chemical Co. (St. Louis, МО) или Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA) . Поликлональные антитела
кролика против SREBP1, SREBP-2 и HMG-CoA-редуктазы приобретали от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) . Все растворители получали от Fisher (Fair Lawn, NJ) , если не указано иное. Реагенты для усиленной хемилюминесценции (ECL) приобретали от Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Тестостерон и 27-гидроксихолестерин получали от Research Plus Inc. (Bayonne, NJ). Планшеты LK6 2 0x2 0 см для тонкослойной хроматографии (ТСХ) приобретали от Whatman Inc. (Clifton, NJ). Способы
Химический синтез дисульфата 5-холестен-Зр,25-диола
Общий способ: 2 5-гидроксихолестерин получали из холестерина ранее описанным способом (Ogawa et al., Steroids, 74:81-87) . Спектры ИК получали в пластинах КВг на спектрометре JASCO FT-IR 460 plus (Tokyo, Japan) . ЯМР-спектры гЕ и 13С а получали с использованием прибора Varian 500 Inova (AS500) при 499,62 МГц и 125,64 МГц, соответственно. Масс-спектры низкого разрешения (LR-MS) с впрыском в поток регистрировали посредством Thermo Scientific TSQ Quantum Ultra MS, оборудованного зондом ионизации распылением в электрическом поле (ESI) в режиме отрицательных ионов. Масс-спектры высокого разрешения (HR-MS) измеряли с использованием Thermo Scientific LTQ Qrbitrap Discovery MS с зондом ESI в режиме отрицательных ионов. Обращено-фазовую ТСХ проводили на предварительно покрытых планшетах RP-18F254S с применением смеси метанол-вода-уксусная кислота (90:10:1 об./об./об.) в качестве проявляющего растворителя. Пятна визуализировали посредством 50% H2SO4 с нагреванием при 110°С. Для очистки образцов использовали картридж С18 Bond Elute (10 г, Varian) . OXONE(r) (пероксимоносульфат калия) и ацетон приобретали от Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA), и все другие используемые реагенты являлись высшей степени чистоты за исключением органических растворителей, которые являлись степени чистоты для ВЭЖХ.
Синтез дисульфата 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS): к раствору 25-гидроксихолестерина (30 мг, 0,07 ммоль) в безводном
пиридине (300 мкл) добавляли комплекс триоксид серы-триметиламин (45 мг) и перемешивали суспензию при 50°С в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляли 0,1н. метанольного NaOH (100 мкл) и наносили смесь на картридж С18 Sep Рак, который обрабатывали метанолом (10 мл) и водой (10 мл). Картридж последовательно промывали PBS (25 мл) и водой (25 мл), а затем элюировали удерживаемый 25HCDS 60% метанолом (10 мл) . После 10Х разбавления ацетонитрилом выпаривали растворители досуха под потоком N2 при температуре ниже 4 0°С и получали 2 5HCDS в порошкообразной форме. Выход продукта 2 5 мг (60%) .
Культура клеток
Моноциты ТНР-1 человека и клетки HepG2 приобретали от American Type Culture Collection (АТСС, Manassas, VA) и поддерживали согласно протоколам поставщика. Моноциты ТНР-1 дифференцировали в макрофаги добавлением 100 нМ форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) . Когда клетки достигали -90% конфлуэнтности, добавляли 25HCDS в этаноле (конечная концентрация этанола в среде составляла 0,1%) . Клетки собирали в указанные периоды времени для анализа белков, иРНК и липидов.
Для исследования регуляции экспрессии HMG-CoA культивировали HepG2 или РНН в среде, как описано выше, в присутствии или отсутствие мевинолина (50 мкМ) и мавалоната (0,5 мкМ) . После культивирования в течение 48 часов добавляли оксистеролы и культивировали еще в течение б часов, а затем собирали клетки для определения уровней иРНК и белка.
Определение биосинтеза холестерина ТСХ и ВЭЖХ
После инкубации макрофагов ТНР-1 или клеток HepG2 в среде, содержащей различные концентрации 2 5HCDS, как указано, в течение б часов, к клеткам в 60 мм чашках добавляли 3 мл той же свежей среды, содержащей 5 MKCi [1-14С]-ацетата. После 2 часов инкубации при 37°С удаляли среду и дважды промывали клетки фосфатно-солевым буфером (PBS), отбирали с использованием резинового скребка, как описано, и собирали в микроцентрифужные пробирки. Осаждали клетки центрифугированием и промывали осадки три раза посредством ресуспендирования и седиментации.
Субклеточную фракцию (микросомальную, цитозольную и ядерную) выделяли, как описано ранее (2) . Клеточные или субклеточные осадки ресуспендировали в 0,3 мл PBS. К каждому образцу добавляли 1,5 мкг тестостерона в качестве внутреннего стандарта. Общие липиды экстрагировали и отделяли добавлением 3 объемов хлороформа:метанола (1:1). [14С] холестерин и гидроксихолестерины выделяли в хлороформной фазе и отделяли TLC (толуол:ацетилацетат, 2/3, об./об.). Производные [1-14С]-ацетата визуализировали посредством Image Reader Fujifilm BAS-1800 II, как описано ранее (1).
Для анализа немеченных продуктов стерола экстрагированные липиды инкубировали с 2 единицами холестериноксидазы при 37°С в течение 2 0 минут. Реакцию окисление останавливали добавлением 1,5 мл метанола с последующим добавлением 0,5 мл насыщенного КС1. Стеролы дважды экстрагировали с применением 3 мл гексана. Собирали гексановую фазу и выпаривали под потоком азота. Остатки растворяли в подвижной фазе растворители для анализа ВЭЖХ, как описано ранее (3).
Производные [1-14С]-ацетата в хлороформной фазе
анализировали ВЭЖХ на колонке с диоксидом кремния (5 мкх4,б
ммх2 5 см; Beckman, USA) с применением растворителя системы
доставки растворителя HP серия 1100 (Hewlett Packard) при
скорости потока 1,3 мл/минуту. Колонку уравновешивали и
проводили анализ в смеси растворителей
гексан:изопропанол:ледяная уксусная кислота (965:25:10, об./об./об.) в качестве подвижной фазы. Элюаты собирали каждые 0,5 минут (0,65 мл на фракцию) за исключением указанных случаев. Число импульсов в производных [14С]-ацетата определяли подсчетом сцинтилляций. Колонку калибровали [14С]-холестерином, [3Н]-25-гидроксихолестерином и [14С]-27-гидроксихолестерином.
Определение уровней иРНК ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией
Тотальную РНК выделяли с использованием набора SV Total RNA Isolation (Promega, Madison, WI), который включал обработку ДНКазой. Тотальную РНК 2 мкг использовали для синтеза первой
цепи кДНК в соответствии с рекомендациями производителя
(Invitrogen, Carlsbad, СА) . ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией проводили с применением подходящего красителя в качестве индикатора в системе ABI 7500 Fast Real-Time PCR
(Applied Biosystems, Foster City, СА) . Все наборы праймеров/зондов для ПЦР в реальном времени появлялись для анализов экспрессии генов TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, СА) . Амплификации р-актина и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) использовали в качестве внутренних контролей. Относительную экспрессию информационной РНК (иРНК) количественно определяли способом сравнения пороговых циклов
(Ct) и выражали в виде 2~AACt. Последовательности подходящих для амплификации праймеров описаны, например, у Ren et al., 2007
(1) •
Анализ вестерн-блоттинга
Микросомальную фракцию выделяли, как описано ранее (4) . Микросомальные или общие экстрагированные белки из обработанных клеток разделяли на 7,5% SDS-полиакриламидном денатурирующем геле. После SDS-PAGE проводили электрофоретически перенос белков на поливинилиденфторидные (PVDF) мембраны (Millipore). Затем мембраны блокировали при 25° С в течение 60 минут в блокирующем буфере [PBS, рН 7,4, 0,1% TWEEN(r) 2 0 (солюбилизирующее мембранные белки неионное поверхностно-активное вещество, С58Н114О26) i 5% обезжиренное сухое молоко) . Затем белки инкубировали при 4°С в течение ночи с поликлональным IgG кролика против SREBP1, SREBP-2 или HMG-CoA-редуктазы человека. Поле промывания PBS рН 7,4, содержащим 0,05% TWEEN(r) 20, в промывающий раствор добавляли конъюгат антитела коза против IgG кролика с пероксидазой хрена 1:2500 и инкубировали в течение 60 минут. Полосы белка детектировали с использованием набора Amersham ECL plus, положительные полосы количественно определяли посредством анализатора Advanced Image Data (Aida Inc., Straubenhardt, Germany).
Исследования на животных
Исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием McGuire
Veterans Affairs Medical Center, и их проводили в соответствии с Хельсинской декларацией, руководством по содержанию и использованию лабораторных животных и всех действующих регулирующих документов. Для анализа эффективности 2 5HCDS по отношению к обусловленному рационом накоплению липидов в сыворотке и печени самок мышей C57BL/6J (Charles River, Wilmington, MA) в возрасте 8 недель содержали на рационе с высоким содержанием жиров (HFD) (Harlan Teklad, Madison, WI), содержащем 42% ккал от жиров, 43% ккал от углеводов, 15% ккал от белков и 0,2% холестерина, в течение 10 недель. Всех мышей содержали в одинаковых условиях в стерильном помещении и обеспечивали свободный доступ к воде и корму. В конце каждого периода мышам интраперитонеально инъецировали раствор носителя
(этанол/PBS, носитель) или 25HCDS (25 мг/кг) один раз каждые трое суток в течение б недель и лишали корма в течение ночи; и собирали образцы крови. Уровни триглицеридов, общего холестерина, липопротеина высокой плотности-холестерина, глюкозы, щелочной фосфатазы (ALK), аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (AST) в сыворотке измеряли стандартными ферментативными способами в клинической лаборатории в McGuire Veterans Affairs Medical Center. Профили липопротеинов в сыворотке анализировали ВЭЖХ, как описано ниже. Количественное определение печеночных липидов Ткани печени гомогенизировали и экстрагировали липиды смесью хлороформа и метанола (2:1) и фильтровали. Экстракты 0,2 мл выпаривали досуха и растворяли в 100 мкл изопропанола, содержащего 10% TRITON(tm) Х-100 (Ci4H220 (С2Н40) п) , неионное поверхностно-активное вещество) для анализа холестерина (Wako Chemicals USA, Richmond, VA), раствор NEFA (0,5 г EDTA-Na2, 2 г TRITON(tm) X-100, 0,76 мл 1н. NaOH и 0,5 г азида натрия/л, рН 6,5) для анализа свободных жирных кислот (Wako Chemicals USA, Richmond, VA) или только изопропанол для анализа триглицеридов
(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) . Все анализы проводили по инструкциям производителя соответственно. Каждую концентрацию липидов нормализовали на массу печени.
Статистика
Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. В тех случаях, где указано, данные подвергали анализу с использованием t-критерия и определяли как достоверно различные при р <0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Детекция нового метаболита холестерина в ядрах первичных гепатоцитах крыс
Для определения наличия новых метаболитов холестерина в ядрах гепатоцитов из первичных гепатоцитов крыс выделяли ядерные фракции. Оксистеролы в метанольных/водных фразах в каждой фракции анализировали посредством LC-MS. Результаты демонстрируют, что два основных молекулярных иона m/z 5 61 и m/z 583 (561+Na) хорошо соответствуют молекуле дисульфата 5-холестен-Зр,25-диола (фигура 1). Молекула вероятнее всего синтезируется SULT2Blb и SULT2Bla.
Химический синтез ядерного оксистерола, дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола
Для подтверждения его структуры и исследования его роли в клеточном гомеостазе липидов и воспалительных ответах химически синтезировали, как описано выше, и очищали 25HCDS.
Анализ MS синтезируемого соединения демонстрирует такую же молекулярную массу иона m/z 561 и m/z 583 (+Na), как в оригинальном ядерном оксистероле, и очищенный продукт не был загрязнен исходным веществом 25-гидроксихолестерином m/z 401. LR-MS (ESI-отрицательный), m/z 583,4 (M+Na-2H, 88%), 561,3 (М-
H, 46%), 481,4 (M-SO3-H, 11%), 463, 4 (M-H2S04-H, 34%), 431,82
(14%), 381, 27 (100%) (Фиг. 2). ХЕ ЯМР (CD3OD) 5: 0,72 (ЗН, с,
I8-CH3), 0,97 (ЗН, д, J5,0 Гц, 21-СН3), 1,03 (ЗН, с, 19-СН3),
I, 14 (6Н, с, 26- и 27-СНз) , 4,14 (1Н, уш.м, За-Н) , 5,39 (1Н,
уш.с, 6-Н) (Фиг. 3). 13С ЯМР (CD3OD) 5: 12, 45, 19, 37, 19, 90
21, 82, 22, 29, 25, 45, 25, 51, 27, 05, 27, 12, 29, 39, 29, 44, 30, 13,
33, 16, 33, 37, 37, 26, 37, 32, 37, 50, 38, 60, 40, 52, 41, 27, 43, 65,
51,78, 57,71, 58,37, 79,98, 85,93, 123,44, 141,71 (Фиг. 4).
Результаты свидетельствуют о том, что синтезированная
молекула представляет собой дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS), и что он "соответствует" указанной молекуле в ядерной фракции гепатоцитов.
25HCDS ингибирует биосинтез липидов, снижая уровни иРНК АСС, FAS и HMG-CoA-редуктаЗы через путь передачи сигналов SREBP
Для исследования, как 25HCDS ингибирует биосинтез липидов, из обработанных макрофагов ТНР-1 выделяли тотальную РНК. Уровни иРНК АСС и FAS для синтеза триглицеридов и HMG-CoA редуктазы для синтеза холестерина в макрофагах и клетках hepG2 определяли ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией. Как представлено на фигуре 5, понижения уровней иРНК АСС и FAS (фигура 5А) и HMG-CoA редуктазы (фигура 5В) после добавления 25HCDS к клеткам в культуре зависели от концентрации, как продемонстрировано, и зависели от времени (данные не показаны). Такие понижения согласовывались с понижениями экспрессии SREBP1/2, продемонстрированными на фигуре 5А и 5В. Эти результаты свидетельствуют о том, что 25HCDS снижает передачу сигналов SREBP и в дальнейшем снижает биосинтез липидов. Следует отметить, что 2 5HCDS линейно повышал уровни иРНК PPARy и одновременно повышал экспрессию 1кВа на раннем этапе и при низких концентрациях. Результаты позволяют предположить, что 25HCDS подавляет воспалительные ответы через путь передачи сигнала PPARy/lKBa, равно как и 25HC3S.
Эффекты введения 25HCDS на гомеостаз липидов у мышей, содержащихся на рационе HFD
Для исследования эффектов длительной обработки 25HCDS на гомеостаз липидов самок мышей C57BL/6J в возрасте 8 недель содержали на рационе HFD в течение 10 недель, а затем разделяли на две группы. Одну группу обрабатывали 2 5HCDS, а другую носителем посредством перитонеальной инъекции один раз каждые трое суток в течение шести недель. Во время обработки мышей содержали на рационе HFD и наблюдали за массой тела и потреблением калорий. Не наблюдали значимых отличий этих двух параметров (данные не показаны). После б недель инъекций мышей содержали без корма в течение ночи и умерщвляли. Не наблюдали значимый различий масс печени мышей независимо от рациона
(данные не показаны).
Для исследования эффекта 25HCDS на метаболизм липидов в печени определяли уровни липидов в печени и уровни экспрессии соответствующих генов. Как сообщалось ранее, у мышей, содержащихся на рационе HFD, выявляли повышенные уровни триглицеридов, общего холестерина, свободных жирных кислот и триглицеридов в печени по сравнению с мышами, содержащимися на стандартном рационе (данные не показаны). Эти повышения значительно снижались при введении 2 5HCDS, например, на 3 0%, 20% и 18% (р <0,05), соответственно, как представлено на фигуре б. Кроме того, анализ экспрессии генов демонстрировал, что введение 2 5HCDS значительно снижало экспрессию ключевых ферментов и рецепторов, участвующих в синтезе свободных жирных кислот, триглицеридов и холестерина, как представлено в таблице 1.
Нарушение регуляции метаболизма липидов часто ассоциировано с воспалительными состояниями. Обработка 25HCDS значительно подавляла экспрессию TNFa, и ILlp на 50%, 36% соответственно (таблица 2) . Эти результаты соответствуют анализам функции печени, которые демонстрировали, что 2 5HC3S подавляет воспалительные реакции печени, уменьшая повреждение печени и активность щелочной фосфатазы в сыворотке (данные не показаны). Следует отметить, что 25HCDS повышал экспрессию PGC-la в 2 раза в печени. Таким образом, 2 5HCDS, по-видимому, регулирует метаболизм липидов и воспалительные ответы через путь передачи сигналов LXR, PPARy и PGC-la.
Таблица 1
Относительная экспрессия иРНК в печени участвовала в метаболизме липидов у мышей, содержащихся на рационе HFD с
25HCDS или без него
Название гена
Описание гена
HFD (п=б)
HFD+25HCDS (п=7)
Биосинтез жирных кислот
SREBP-lc
Связывающий стеролрегулирующие элементы белок 1с
1,0±0,36
0,64±0,14*
АСС1
Ацетил-СоА-карбоксилаза 1
1,0±0,31
0,8б±0,18
в виде среднего значения ±SD; п=б-7.
*р <0,05 по сравнению с мышами, содержащимися на HFD. Сокращенные обозначения: HFD, рацион с высоким содержанием
в виде среднего значения ±SD; *р <0,05,
**р <0,01 по сравнению с мышами, содержащимися на HFD. Сокращенные обозначения: HFD, рацион с высоким содержанием жиров.
ОБСУЖДЕНИЕ
Метаболизм холестерина и метаболизм триглицеридов являются тесно связанными. Ядерные рецепторы-сироты представляют собой активируемые лигандом факторы транскрипции, которые регулируют экспрессию ключевых генов-мишеней, которые являются важными регуляторами многих биологических событий. Рецепторы жирных кислот (PPAR), оксистеролов (LXR), ретиноевых кислот (RXR) и SREBP функционируют как сенсоры клеточного уровня липидов, вызывая изменения экспрессии генов для поддержания гомеостаза липидов и защиты клеток от повреждений в результате накопления липидов. Однако взаимное влияние сигналов в видах рецепторной активности остается неясным. Как продемонстрировано в настоящем описании, метаболит холестерина 25HCDS ингибирует экспрессию, процессинг и активность SREBP-lc in vitro и in vivo и повышает экспрессию PPARy и PGC-la. Убедительно подтверждено документальными доказательствами, что SREBP контролируют биосинтез липидов, PPARy регулирует воспалительные ответы, и PGC-la контролирует энергетический баланс. Таким образом, результаты демонстрируют, что 25HCDS представляет собой эффективный регулятор этих процессов и играет важную роль в поддержании гомеостаза липидов в печени и воспалительных ответов. Введение 25HC3S повышает уровни ядерного белка PPARy и подавляет воспалительные ответы, но только незначительно повышает уровни иРНК PPARy. В противоположность этому, 2 5HCDS значительно повышает экспрессию иРНК PPARy и PGC-la в зависимости от времени и концентрации, свидетельствуя, что 2 5HCDS является более эффективным при регуляции метаболизма липидов и воспалительных ответов по сравнению с 25HC3S.
Реакции биосинтеза 25HCDS и сульфатирования оксистерола представляют собой новый регуляторный путь, который опосредует активность ядерного рецептора в гепатоцитах. Ключевые
компоненты такого пути обобщены следующим образом: 1) когда
уровни внутриклеточного холестерина повышаются,
митохондриальный белок, обеспечивающий доставку холестерина, StAR доставляет холестерин в митохондрии, где синтезируются регуляторные оксистеролы, такие как 25НС, посредством CYP27A1. В свою очередь эти оксистеролы активируют LXR и затем повышают экспрессию его генов-мишеней, участвующих в биосинтезе жирных кислот и триглицеридов. Кроме того, 2 5НС активирует LXR, подавляет синтез вновь синтезируемого холестерина путем ингибирования экспрессии HMGR и увеличивает опосредуемую АВСА1 секрецию холестерина клетками (образование HDL) . 2) 25HC3S и 25HCDS инактивируют LXR и подавляют процессинг SREBP-lc, свидетельствуя о том, что эти сульфатированные оксистеролы снижают уровни внутриклеточных липидов, ингибируя синтез; 3) эффекты 2 5НС на метаболизм липидов являются противоположными эффектам 25HC3S и 25HCDS. Таким образом, сульфатирование внутриклеточного оксистерола представляет собой новый механизм регуляции, участвующий в метаболизме липидов и в развитии NAFLD.
Обработка 2 5HCDS на модели NAFLD на мышах приводила к понижению уровней липид в печени. Было исследовано большое число видов лечения NAFLD. Несмотря на то, что многие, по-видимому, улучшают биохимические маркеры, такие как уровни аланинтрансаминазы, для большинства из них не было продемонстрировано, что они улучшают гистологические аномалии или уменьшают клинические конечные точки. 2 5HCDS подавляет экспрессии ключевых генов, участвующих в биосинтезе липидов, на транскрипционном уровне путем блокирования активации ядерного рецептора LXR и SREBP, подавляя провоспалительные цитокины, индуцируемые HFD, и контролируя энергетический баланс через PGCla. Таким образом, 25HCDS служит в качестве эффективного регулятора для эффективного снижения уровней липид в печени и, таким образом, представляет собой новое средство для терапии NALFD и других заболеваний, связанных с метаболизмом липидов.
ССЫЛКИ
1. Ren,S., Li,X., Rodriguez-Agudo,D., Gil,G., Hylemon,P., and Pandak,W.M. 2007. Sulfated oxysterol, 25HC3S, is a potent regulator of lipid metabolism in human hepatocytes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 360:802-808.
2. Ren,S., Hylemon, P., Zhang,Z.P., Rodriguez-Agudo,D., Marques,D., Li,X., Zhou,H., Gil,G, and Pandak,W.M. 2006. Identification of a novel sulfonated oxysterol, 5-cholesten-3beta, 25-diol 3-sulfonate, in hepatocyte nuclei and mitochondria. J. Lipid Res. 47:1081-1090.
3. Pandak,W.M., Ren,S., Marques,D., Hall,E., Redford,K., Mallonee,D., Bohdan,P., Heuman,D., Gil,G., and Hylemon,P. 2002. Transport of cholesterol into mitochondria is rate-limiting for bile acid synthesis via the alternative pathway in primary rat hepatocytes. J. Biol. Chem. 277:48158-48164.
4. Ren,S., Hylemon,P., Marques,D., Hall,E., Redford,K., Gil,G., and Pandak,W.M. 2004. Effect of increasing the expression of cholesterol transporters (StAR, MLN64, and SCP-2) on bile acid synthesis. J. Lipid Res. 45:2123-2131.
Несмотря на то, что изобретение описано в отношении его предпочтительных вариантов осуществления, специалистам в данной области понятно, что изобретение можно практически осуществлять с модификацией, входящей в рамки сущности и объема прилагаемой формулы изобретения. Таким образом, настоящее изобретение не должно ограничиваться вариантами осуществления, как описано выше, а должно дополнительно включать все модификации и их эквиваленты, входящие в рамки сущности и объема описания, предоставленного в настоящем описании.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединение, которое представляет собой: (i) дисульфат 5-холестен-Зр,25-диола (25HCDS) формулы
или (ii) его фармацевтически приемлемую соль; для применения в качестве лекарственного средства. 2. Соединение для применения по п. 1, где соединение представляет собой
HO3SO
3. Соединение по п. 1 или 2 для применения в способе снижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
4. Применение соединения по п. 1 или 2 для получения лекарственного средства для снижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов у нуждающегося в этом индивидуума; уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума или лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
5. Способ лечения индивидуума, где способ включает введение указанному индивидууму эффективного количества соединения по п. 1 или 2, где указанный способ выбран из способа снижения уровней липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа снижения уровня холестерина и биосинтеза липидов у нуждающегося в этом индивидуума; способа уменьшения воспаления у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения диабета у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения гиперлипидемии у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения атеросклероза у нуждающегося в этом индивидуума; способа лечения жировой болезни печени у нуждающегося в этом индивидуума и способа лечения воспалительного заболевания у нуждающегося в этом индивидуума.
6. Способ по п. 5, где:
- указанное соединение вводят в количестве в диапазоне от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг массы тела указанного индивидуума или указанное соединение вводят в количестве в диапазоне от 1 мг/кг до 10 мг/кг массы тела указанного индивидуума и/или
введение включает по меньшей мере одно пероральное введение, энтеральное введение, сублингвальное введение, трансдермальное введение, внутривенное введение, перитонеальное введение, парентеральное введение, введение посредством инъекции, подкожной инъекции и внутримышечной инъекции.
7. Соединение по п. 1 или 2.
8. Соединение по п. 7, которое представляет собой
выделенное соединение.
9. Соединение по п. 7 или 8, которое является по существу чистым.
10. Соединение по любому из пп. 7-9, которое находится в твердой форме.
11. Соединение по п. 10, которое находится
- в порошкообразной форме и/или
- в лиофилизированной форме.
12. Фармацевтическая композиция, содержащая: (i)
соединение по п. 1 или 2 и (ii) физиологически приемлемый
эксципиент, разбавитель или носитель.
13. Фармацевтическая композиция по п. 12, где композицию формулируют в стандартной лекарственной форме.
14. Фармацевтическая композиция по п. 12 или 13, где композиция находится в твердой форме.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14, где:
- композиция находится в форме порошка, таблетки, капсулы или таблетки-леденца, или
- композиция содержит соединение в лиофилизированной форме совместно с наполнителем, где композиция необязательно содержится в герметично запечатанном флаконе, ампуле, шприце или мешке.
16. Фармацевтическая композиция по п. 12 или 13, которая содержит носитель, который является жидкостью.
17. Фармацевтическая композиция по п. 16, где:
соединение солюбилизируют в указанной жидкости или
диспергируют в указанной жидкости, и/или
- указанная жидкость является водной, и/или
- указанная жидкость представляет собой стерильную воду для инъекций или фосфатно-солевой буфер, и/или
указанная композиция содержится в герметично запечатанном флаконе, ампула, шприце или мешке.
18. Способ получения соединения по п. 1 или 2, где способ
включает приведение во взаимодействие 25-гидроксихолестерина с
источником триоксида серы и необязательно получение
фармацевтически приемлемой соли из получаемого дисульфата 5-
холестен-Зр,25-диола (25HCDS).
19. Способ по п. 18, где источник триоксида серы
представляет собой комплекс триоксида серы и амина.
20. Способ получения фармацевтической композиции по любому
из пп. 12-17, где способ включает объединение указанного
соединения с указанным физиологически приемлемым эксципиентом,
разбавителем или носителем.
По доверенности
О О) 00 N (О Ю ^ П (N г
эинвжс^эУоо эончиэ±иэон±о
2/6
2/6
3/6
3/6
5/6
5/6
6/6
6/6
|
