(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение предлагает вакцину против респираторно-синцитиального вируса (RSV), содержащую рекомбинантный аденовирус человека серотипа, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его иммунологически активную часть.
2420-518143ЕА/071
ВАКЦИНА ПРОТИВ RSV
Настоящее изобретение относится к области медицины. Более конкретно, настоящее изобретение относится к вакцинам против RSV.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
После открытия респираторно-синцитиального вируса (RSV) в 1950-ых этот вирус быстро стал признанным патогеном, ассоциированным с инфекциями верхних и нижних дыхательных путей у людей. По оценкам в мире ежегодно наблюдается 64 миллиона инфекций RSV, которые приводят к 160000 смертей (WHO Acute Respiratory Infections Update September 2009). Наиболее тяжело заболевание протекает, в частности, у недоношенных детей, пожилых индивидуумов и индивидуумов с ослабленным иммунитетом. У детей моложе 2 лет RSV является наиболее распространенным патогеном дыхательных путей, ответственным приблизительно за 50% госпитализаций вследствие респираторных инфекций, и пик госпитализаций наблюдается в возрасте 2-4 месяца. Сообщалось, что почти все дети были инфицированы RSV к двум годам. Повторные инфекции в течение жизни связаны с малоэффективным естественным иммунитетом. Уровень тяжести заболевания, вызванного RSV, смертности и заболеваемости у пожилых людей стоят на втором месте после инфекций, вызываемых непандемическим гриппом А.
RSV представляет собой парамиксовирус, принадлежащий к
подсемейству pneumovirinae. Его геном кодирует различные белки,
в том числе мембранные белки, известные как гликопротеин (G)
RSV и белок слияния (F) RSV, которые являются главными
антигенными мишенями для нейтрализующих антител.
Протеолитическое расщепление предшественника белка слияния (F0) дает два полипептида F1 и F2, связанные через дисульфидный мостик. Антитела против опосредующей слияние части белка F1 могут предотвращать поглощение вируса клеткой и, таким образом, обладают нейтрализующим эффектом. Кроме того, что он является
мишенью для нейтрализующих антител, F RSV содержит эпитопы для цитотоксических Т-клеток (Pemberton et al, 1987, J. Gen.Virol. 68: 2177-2182).
Варианты лечения инфекции RSV включают моноклональное антитело против белка F RSV. Высокая стоимость, связанная с такими моноклональными антителами, необходимость применения в условиях больницы делают невозможным их широкомасштабное применение для профилактики у группы риска. Таким образом, существует потребность в RSV-вакцине, которую, предпочтительно, можно применять для педиатрической популяции, а также для пожилых людей.
Несмотря на 50 лет исследований, все еще отсутствует разрешенная к применению вакцина против RSV. Одним из главных препятствий к разработке вакцины является случай усиленного вакциной заболевания в клинических испытаниях в 1960-ых при использовании инактивированной формалином (FI) вакцины против RSV. Дети, вакцинированные FI-RSV, не были защищены от естественной инфекции и у инфицированных детей проявлялась более тяжелая болезнь, чем у невакцинированных детей, в том числе две смерти. Это явление называется "усиленное заболевание".
Со времени испытания FI-RSV-вакцины были предприняты различные подходы для получения RSV-вакцины. Попытки включали классические живые аттенуированные холодом пересеиваемые или чувствительные к температуре мутантные штаммы RSV, вакцины на основе субъединиц (химерных) белков, пептидные вакцины и белки RSV, экспрессированные с помощью рекомбинантных вирусных векторов. Хотя некоторые из этих вакцин показали перспективные данные доклинических исследований, ни одна из вакцин не была разрешена к применению у людей из-за проблем безопасности или отсутствия эффективности.
Аденовирусные векторы применяют для получения вакцин для ряда заболеваний, в том числе заболевания, ассоциированного с инфекциями RSV. В следующих абзацах приведены примеры кандидатных RSV-вакцин на основе аденовируса, которые были описаны.
В одном подходе, RSV.F был вставлен в участок ЕЗ, не являющийся существенно важным, способных к репликации аденовирусных типов 4, 5 и 7. Иммунизация у хлопковых хомяков, интраназальное (i.n.) применение 107 pfu, была умеренно иммуногенной и защищала нижние дыхательные пути от контрольного заражения RSV, но не защищала верхние дыхательные пути от контрольного заражения RSV (Connors et al, 1992, Vaccine 10: 475-484; Collins, P.L., Prince, G.A., Camargo, E., Purcell, R.H., Chanock, R.M. and Murphy, B.R. Evaluation of the protective efficacy of recombinant vaccinia viruses and adenoviruses that express respiratory syncytial virus glycoproteins. B: Vaccines 90: Modern Approaches to New Vaccines including prevention of AIDS (Eds. Brown, F., Chanock, R.M., Ginsberg, H. and Lerner, R.A.) Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1990, pp 79-84). Последующая пероральная иммунизация шимпанзе была слабо иммуногенной (Hsu et al, 1992, J Infect Dis. 66:769-775).
В других исследованиях (Shao et al, 2009, Vaccine 27: 5460-71; US2011/0014220) разработали два рекомбинантных репликативно-некомпетентных вектора на основе аденовируса 5, несущих нуклеиновую кислоту, кодирующую трансмембранную усеченную (rAd-FOATM) или полноразмерную (rAd-F0) версию белка F штамма RSV-B1 и вводили их посредством интраназального пути мышам BALB/c. Животных первично иммунизировали i.n. с помощью 107 pfu и бустерно иммунизировали через 2 8 дней той же самой дозой i.n. Хотя антитела против RSV-B1 были нейтрализующими и перекрестно реагирующими со штаммом RSV-Long и RSV-A2, иммунизация с помощью этих векторов защищала только частично от репликации RSV В1 при контрольном заражении. (Частичная) защита с помощью rAd-FOATM была немного выше, чем с помощью rAd-F0.
В другом исследовании наблюдали, что i.n. иммунизация мышей BALB/c с помощью 1011 вирусных частиц с репликативно-дефицитным аденовирусом FG-Ad (на основе Ad5), экспрессирующим F RSV (FG-Ad-F) дикого типа, снижала вирусные титры в легких только на 1,5 log 10 в сравнении с контрольной группой (Fu et al, 2009, Biochem. Biophys. Res. Commun. 381: 528-532.
В еще одних исследованиях наблюдали, что интраназально применяемый рекомбинантный репликативно-дефицитный аденовектор на основе Ad5, экспрессирующий кодон-оптимизированный растворимый фрагмент F1 белка F RSV А2 (аминокислоты 155-524) (108 PFU), мог снижать репликацию RSV при контрольном заражении в легких мышей BALB/c в сравнении с контрольными мышами, но у мышей, иммунизированных посредством внутримышечного (i.m.) пути, не проявлялась какая-либо защита от контрольного заражения (Kim et al, 2010, Vaccine 28: 3801-3808) .
В других исследованиях аденовекторы на основе Ad5, несущие кодон-оптимизированный полноразмерный F RSV(AdV-F) или растворимую форму гена F RSF (AdV-Fsol), применяли для иммунизации мышей BALB/c дважды из расчета дозы 1x1010 OPU (единицы видимых частиц: доза 1x1010 OPU соответствует 2x108 GTU (единица генной трансдукции)). Эти векторы сильно снижали вирусные нагрузки в легких после i.n. иммунизации, но только частично после подкожного (s.c.) или i.m. применения (Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610; US 2010/0111989).
В еще одних исследованиях наблюдали, что внутримышечно применяемый рекомбинантный репликативно-дефицитный аденовектор на основе Ad5, экспрессирующий секвенированную кДНК белка F штамма RSV А2 (1010 единиц частиц), мог снижать репликацию RSV при контрольном заражении только частично в легких мышей BALB/c в сравнении с контрольными мышами (Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375-386).
Если не принимать во внимание то, что они не являются полностью эффективными во многих случаях, RSV-вакцины, находящиеся на стадии клинических исследований для педиатрического применения, и большинство вакцин, находящихся на стадии доклинических исследований, представляют собой интраназальные вакцины. Наиболее важными преимуществами интраназальной стратегии являются прямая стимуляция локального иммунитета дыхательных путей и отсутствие ассоциированного усиления заболевания. Действительно, в целом эффективность, например, кандидатных RSV-вакцин на основе аденовируса
оказывается лучшей в случае интраназального введения по сравнению с внутримышечным введением. Однако интраназальная вакцинация также приводит к проблемам безопасности у детей младше б месяцев. Наиболее обычными побочными реакциями интраназальных вакцин у всех возрастов являются насморк или заложенность носа. У новорожденные детей имеет место облигатное носовое дыхание, и, таким образом, они должны дышать через нос. Следовательно, заложенность носа у детей первых нескольких месяцев жизни может мешать грудному вскармливанию и, в редких случаях, может вызывать серьезные проблемы с дыханием.
Были идентифицированы более 50 различных серотипов аденовируса человека. В прошлом среди них наиболее всесторонне был изучен аденовирус серотипа 5 (Ad5) для применения в качестве носителя генов. Однако рекомбинантные аденовирусные векторы различных серотипов могут приводить к различным результатам с точки зрения индукции иммунных ответов и защиты. Например, в WO 2012/021730 описано, что аденовирусный вектор серотипа 7 обезьян и аденовирусный вектор серотипа 5 человека, кодирующие белок F, обеспечивают лучшую защиту против RSV, чем аденовирусный вектор серотипа 2 8 человека. В дополнение, дифференциальную иммуногенность наблюдали для векторов, основанных на серотипах, инфицирующих и неинфицирующих человека
(Abbink et al. , 2007, J Virol 81: 4654-4663; Colloca et al. , 2012, Sci Transl Med 4, 115ra2) . Abbink et al. делают заключение, что все изученные векторы rAd на основе редких серотипов человека были менее эффективными, чем векторы rAd5 при отсутствии иммунитета против Ad5. Кроме того, недавно было описано, что в то время как rAd5 с трансгеном гликопротеина
(др) вируса Эбола (EBOV) защищал 100% приматов, кроме человека, rAd35 и rAd2 6 с трансгеном др EBOV обеспечивали только частичную защиту, и в случае этих векторов для получения полной защиты от контрольного заражения вирусом Эбола требовалась стратегия с гетерологичной первичной-бустерной иммунизацией
(Geisbert et al, 2011, J Virol 85: 4222-4233). Таким образом, a priori невозможно предсказать эффективность рекомбинантной аденовирусной вакцины, основываясь исключительно на данных от
другого серотипа аденовируса.
Более того, для RSV-вакцин требуются эксперименты на подходящих моделях болезни, таких как хлопковый хомяк, чтобы определить, является ли вакцина-кандидат достаточно эффективной для предотвращения репликации RSV в носовых путях и легких и, в то же самое время, является безопасной, т.е. не приводит к усиленному заболеванию. Предпочтительно, такие кандидатные вакцины должны быть высокоэффективными на таких моделях, даже при внутримышечном введении.
Следовательно, сохраняется потребность в эффективных вакцинах и способах вакцинации против RSV, которые не приводят к усиленному заболеванию. Настоящее изобретение нацелено на получение таких вакцин и способы вакцинации против RSV безопасным и эффективным способом.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Авторы настоящего изобретения обнаружили, что рекомбинантные аденовирусы серотипа 35 (Ad35), которые содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую белок F RSV, представляют собой очень эффективные вакцины против RSV на общепризнанной модели хлопкового хомяка и обладают улучшенной эффективностью в сравнении с данными, описанными ранее для Ad5, кодирующего F RSV. Продемонстрировано, что даже однократного введения, даже внутримышечно, Ad35, кодирующего F RSV, достаточно для обеспечения полной защиты против репликации RSV при контрольном заражении.
Настоящее изобретение предлагает вакцину против
респираторно-синцитиального вируса (RSV), содержащую
рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV, который содержит аминокислотную последовательность из SEQ ID N0: 1.
В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, является кодон
оптимизированной для экспрессии в клетках человека.
В определенных вариантах осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID N0: 2.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус человека имеет делецию в участке Е1, делецию в участке ЕЗ или делецию в обоих участках Е1 и ЕЗ аденовирусного генома.
В определенных вариантах осуществления рекомбинантный аденовирус имеет геном, содержащий на своих 5'-терминальных концах последовательность СТАТСТАТ.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ вакцинации субъекта против RSV, причем способ включает введение субъекту вакцины согласно настоящему изобретению.
В определенных вариантах осуществления вакцину вводят внутримышечно.
В определенных вариантах осуществления вакцину согласно настоящему изобретению вводят субъекту более одного раза.
В определенных вариантах осуществления способ вакцинации состоит из однократного введения вакцины субъекту.
В определенных вариантах осуществления способ вакцинации субъекта против RSV дополнительно включает введение субъекту вакцины, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 2 6, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
В определенных вариантах осуществления способ вакцинации субъекта против RSV дополнительно включает введение белка F RSV (предпочтительно составленного в виде фармацевтической композиции, таким образом, белковой вакцины) субъекту.
Настоящее изобретение также предлагает способ уменьшения инфекции и/или репликации RSV, например, в носовых ходах и легких субъекта, включающий введение субъекту посредством внутримышечной инъекции композиции, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент. Это будет снижать неблагоприятные эффекты, возникающие в результате
инфекции RSV у субъекта, и, таким образом, способствовать защите субъекта от таких неблагоприятных эффектов при введении вакцины. В определенных вариантах осуществления неблагоприятные эффекты инфекции RSV могут быть фактически предотвращены, т.е. снижены до таких низких уровней, что они не будут клинически значимыми. Рекомбинантный аденовирус может находиться в форме вакцины согласно настоящему изобретению, включая варианты осуществления, описанные выше.
Настоящее изобретение также предлагает выделенную клетку-хозяина, содержащую рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает способ получения вакцины против респираторно-синцитиального вируса (RSV), включающий обеспечение рекомбинантного аденовируса человека серотипа 35, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент, размножение указанного рекомбинантного аденовируса в культуре клеток-хозяев, выделение и очистку рекомбинантного аденовируса и составление рекомбинантного аденовируса в фармацевтически приемлемую композицию. Рекомбинантный аденовирус человека по этому аспекту также может представлять собой любой из аденовирусов, описанных в вариантах осуществления выше.
Настоящее изобретение также предлагает выделенную рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая образует геном рекомбинантного аденовируса человека серотипа 35, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент. Аденовирус также может представлять собой любой из аденовирусов, описанных в вариантах осуществления выше.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
На ФИГ. 1 показан клеточный иммунный ответ на F-пептиды, перекрывающие аминокислоты 1-252 F, и F-пептиды, перекрывающие аминокислоты 241-574 F, у мышей при иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б (А) и rAd35 (В), несущих ген F RSV, через 2 и 8 недель после иммунизации.
На ФИГ. 2 показано образование антител против RSV у мышей
при иммунизации различными дозами векторов на основе rAd2 6 и rAd35, несущих ген F RSV, через 2 и 8 недель после иммунизации.
На ФИГ. 3 показаны результаты соотношения образования антител IgG2a и IgGl против RSV у мышей при иммунизации 1010 vp векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, через 8 недель после иммунизации.
На ФИГ. 4 показана способность к нейтрализации вируса RSV Long у мышей при иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б (А) и rAd35 (В), несущих ген F RSV, через 2 и 8 недель после иммунизации.
На ФИГ. 5 показан клеточный иммунный ответ против (A) F-пептидов, перекрывающих аминокислоты 1-252 F, и (В) F-пептидов, перекрывающих аминокислоты 241-574 F, у мышей при первичной-бустерной иммунизации векторами на основе гАо!2б и rAd35, несущими ген F RSV, через б и 12 недель после первичной иммунизации.
На ФИГ. б показано образование антител против RSV у мышей при первичной-бустерной иммунизации векторами на основе гАо!2б и rAd35, несущими ген F RSV, в различные моменты времени после первой иммунизации.
На ФИГ. 7 показана способность к нейтрализации вируса RSV Long у сыворотки мышей при первичной-бустерной иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, в различные моменты времени после первой иммунизации.
На ФИГ. 8 показана способность к нейтрализации вируса RSV В1 у сыворотки мышей при первичной-бустерной иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, в различные моменты времени после первой иммунизации.
На ФИГ. 9 показаны А) титры RSV в легких и В) титры RSV в носу у хлопковых хомяков после первичной-бустерной иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, через 5 дней после контрольного заражения.
На ФИГ. 10 показана индукция титров вируснейтрализующих антител после первичной-бустерной иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, через А) 2 8 дней и В) 4 9 дней после первой иммунизации.
На ФИГ. 11 показано гистопатологическое исследование легких хлопкового хомяка в день умерщвления после первичной-бустерной иммунизации различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV.
На ФИГ. 12 показаны А) титры RSV в легких и В) титры RSV в носу у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой с различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, введенных посредством различных путей, через 5 дней после контрольного заражения.
На ФИГ. 13 показаны титры индуцированных
вируснейтрализующих антител после иммунизации однократной дозой с различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, введенных посредством различных путей, через 2 8 и 4 9 дней после первой иммунизации.
На ФИГ. 14 показано гистопатологическое исследование легких хлопкового хомяка в день умерщвления после иммунизации однократной дозой (i.m.) с различными дозами векторов на основе гАо!2б и rAd35, несущих ген F RSV, в день умерщвления.
На ФИГ. 15 показаны карты плазмид, содержащих левый конец генома Ad35 и Ad2 6 с последовательностью, кодирующей F RSV:
A. pAdApt35BSU.RSV.F(А2)nat и В. pAdApt2б.RSV.F(А2)nat.
На ФИГ. 16 показаны А) титры RSV в легких и В) титры RSV в носу у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 или день 21 с различными дозами векторов на основе rAd35, несущих ген F RSV. Контрольное заражение проводили в день 49, а животное убивали в день 54.
На ФИГ. 17 показана индукция титров вируснейтрализующих антител после иммунизации однократной дозой с различными дозами rAd35, несущих ген F RSV, через 49 дней после иммунизации, как описано для ФИГ 16.
На ФИГ. 18 показана индукция титров вируснейтрализующих антител после иммунизации однократной дозой с различными дозами rAd35, несущих ген F RSV, с течением времени после иммунизации.
На ФИГ. 19 показаны титры VNA против RSV Long и RSV Bwash через 4 9 дней для сыворотки, полученной от хлопковых хомяков, иммунизированных однократной дозой 1010 Ad-35RSV F или векторами
без трансгена (Ad-e). РВ: первичная-бустерная иммунизация.
На ФИГ. 2 0 показаны титры RSV в легких у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 с различными дозами векторов на основе rAd35, несущих ген F RSV, через 5 дней после контрольного заражения RSV А2 или RSV В15/97.
На ФИГ. 21 показаны титры RSV в носу у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 с различными дозами векторов на основе rAd2 6, несущих ген F RSV, через 5 дней после контрольного заражения RSV А2 или RSV В15/97.
На ФИГ. 22 показаны титры VNA в сыворотке хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 с различными дозами векторов на основе rAd35, несущих ген F RSV, в продолжение времени после иммунизации.
На ФИГ. 2 3 показаны титры RSV в легких у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 с различными дозами векторов на основе rAd35, несущих ген F RSV, через 5 дней после контрольного заражения стандартной дозой (105) или высокой дозой (5x105) RSV А2.
На ФИГ. 2 4 показаны титры RSV в носу у хлопковых хомяков после иммунизации однократной дозой в день 0 с различными дозами векторов на основе rAd35, несущих ген F RSV, через 5 дней после контрольного заражения стандартной дозой (105) или высокой дозой (5x105) RSV А2.
На ФИГ. 2 5 показана индукция титров вируснейтрализующих антител после иммунизации rAd2 6, несущими ген F RSV (Ad2б.RSV.F), с последующей бустерной иммунизацией Ad26.RSV.F или белком F RSV с адъювантами (post-F).
На ФИГ. 2 6 показана индукция антител IgG2a и IgGl и их соотношение после иммунизации Ad2 6.RSV.F с последующей бустерной иммунизацией Ad2 6.RSV.F и бустерной иммунизацией белком F RSV с адъювантами (post-F).
На ФИГ. 2 7 показана выработка IFN-g спленоцитами после иммунизации Ad26.RSV.F с последующей бустерной иммунизацией Ad2 6.RSV.F или белком F RSV с адъювантами (post-F).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Используемое в данном документе выражение по отношению к
аденовирусу "рекомбинантный" подразумевает, что он был модифицирован человеком, например, он имеет измененные концевые области, активно клонированные в него, и/или он содержит гетерологичный ген, то есть он не является встречающимся в природе аденовирусом дикого типа.
В данном документе последовательности приведены в направлении от 5' до 3', как принято в данной области техники.
"Капсидный белок аденовируса" относится к белку на капсиде аденовируса, который участвует в определении серотипа и/или тропизме конкретного аденовируса. Аденовирусные капсидные белки, как правило, включают файбер-, пентон- и/или гексон-белки. Аденовирус определенного серотипа (или "основанный" на таковом) в соответствии с настоящим изобретением, как правило, содержит файбер-, пентон- и/или гексон-белки данного определенного серотипа и предпочтительно содержит файбер-, пентон и гексон-белок данного определенного серотипа. Данные белки, как правило, кодируются геномом рекомбинантного аденовируса. Рекомбинантный аденовирус определенного серотипа необязательно может содержать и/или кодировать другие белки другого серотипа аденовируса. Таким образом, в качестве неограничивающего примера, рекомбинантный аденовирус, который содержит гексон, пентон и файбер Ad35, считается рекомбинантным аденовирусом на основе Ad35.
Как используется в данном документе, рекомбинантный аденовирус "основан" на аденовирусе, полученном из дикого типа, по меньшей мере в отношении последовательности. Этого можно достичь молекулярным клонированием, используя геном дикого типа или его части в качестве исходного материала. Также возможно применение известной последовательности генома аденовируса дикого типа для получения (частей) генома de novo с помощью синтеза ДНК, который может быть выполнен с использованием стандартных процедур компаниями, предоставляющими услуги в области синтеза ДНК и/или молекулярного клонирования (например, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).
Специалисту в данной области понятно, что многочисленные различные полинуклеотиды и нуклеиновые кислоты могут кодировать
один и тот же полипептид в результате вырожденности
генетического кода. Также понятно, что специалисты в данной
области могут при помощи традиционных методик делать
нуклеотидные замены, которые не влияют на полипептидную
последовательность, кодируемую полинуклеотидами, описанными
здесь для отражения частоты использования кодонов любым
конкретным организмом-хозяином, в котором полипептиды будут
экспрессироваться. Следовательно, если не указано иное,
"нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную
последовательность" включает все нуклеотидные
последовательности, которые являются вырожденными версиями друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки, и РНК могут включать интроны.
В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV или его фрагмент, является кодон-оптимизированной для экспрессии в клетках млекопитающих, таких как клетки человека. Способы оптимизации кодонов известны или были описаны ранее (например, W0 96/09378). Пример специфической кодон-оптимизированной последовательности белка F RSV описан в SEQ ID NO: 2 из ЕР 2102345 В1.
В одном варианте осуществления белок F RSV происходит от штамма RSV А2 и имеет аминокислотную последовательность из SEQ ID NO: 1. В особенно предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID NO: 2. Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что данный вариант осуществления приводит к стабильной экспрессии и что вакцина согласно данному варианту осуществления обеспечивает защиту от репликации RSV в носовых ходах и легких даже после однократной дозы, которую вводили внутримышечно.
Используемое в данном документе выражение "фрагмент" относится к пептиду, который имеет амино-терминальную и/или карбокси-терминальную и/или внутреннюю делецию, но в котором остальная аминокислотная последовательность идентична соответствующим положениям в последовательности белка F RSV,
например, полноразмерной последовательность белка F RSV. Понятно, что для индукции иммунного ответа и для целей вакцинации в целом белок не должен быть полноразмерным и не должен иметь все функции белка дикого типа, и фрагменты белка являются в равной мере пригодными. Действительно, было показано, что фрагменты белка F RSV, такие как F1 или растворимый F, эффективны в индукции иммунных ответов аналогично полноразмерному F (Shao et al, 2009, Vaccine 27: 5460-71, Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610) . Использование фрагментов белка F, соответствующих аминокислотам 2 55-2 7 8 или 412-524, в активной иммунизации индуцирует нейтрализующие антитела и некоторую степень защиты против контрольного заражения RSV (Sing et al, 2007, Virol. Immunol. 20, 261-275; Sing et al, 2001, Vaccine 25, 6211-6223).
Фрагмент согласно настоящему изобретению представляет собой иммунологически активный фрагмент, и, как правило, он содержит по меньшей мере 15 аминокислот или по меньшей мере 3 0 аминокислот белка F RSV. В определенных вариантах осуществления он содержит по меньшей мере 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 или 550 аминокислот белка F RSV.
Специалист в данной области также будет понимать, что в белке можно производить изменения, например, с помощью замен, делеций, добавлений аминокислот и т.д, например, применяя традиционные методики молекулярной биологии. В целом консервативные замены аминокислот можно применять без потери функции или иммуногенности полипептида. Это можно легко проверять на основании традиционных методик, хорошо известных специалисту.
Выражение "вакцина" относится к средству или композиции, содержащим активный компонент, эффективный для индукции у субъекта лечебной степени иммунитета против определенного патогена или заболевания. В настоящем изобретении вакцина содержит эффективное количество рекомбинантного аденовируса, который кодирует белок F RSV или его антигенный фрагмент, которое приводит к иммунному ответу против белка F RSV. Это обеспечивает способ предотвращения тяжелого заболевания нижних
дыхательных путей, приводящего к госпитализации, и снижает частоту осложнений, таких как пневмония и бронхиолит вследствие инфекции и репликации RSV у субъекта. Таким образом, настоящее изобретение также предлагает способ предотвращения или уменьшения тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, предотвращения или уменьшения (например, сокращения времени) госпитализации и/или уменьшения частоты и/или тяжести пневмонии или бронхиолита, вызванных RSV у субъекта, включающий введение субъекту посредством внутримышечной инъекции композиции, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент. Выражение "вакцина" согласно настоящему изобретению подразумевает, что она представляет собой фармацевтическую композицию и, таким образом, как правило, включает фармацевтически приемлемый разбавитель, носитель или наполнитель. Она может включать или не включать дополнительные активные ингредиенты. В определенных вариантах осуществления она может представлять собой комбинированную вакцину, которая дополнительно содержит другие компоненты, которые индуцируют иммунный ответ, например, против других белков RSV и/или против других возбудителей инфекции.
Векторы по настоящему изобретению представляют собой
рекомбинантные аденовирусы, также называемые рекомбинантными
аденовирусными векторами. Получение рекомбинантных
аденовирусных векторов хорошо известно в данной области.
В определенных вариантах осуществления в аденовирусном векторе согласно настоящему изобретению имеет место дефицит по меньшей мере одного существенно важного функционального гена участка Е1, например, участка Е1а и/или участка Elb аденовирусного генома, который требуется для вирусной репликации. В определенных вариантах осуществления в аденовирусном векторе в соответствии с настоящим изобретением имеет место дефицит по меньшей мере части участка ЕЗ, не являющегося существенно важным. В определенных вариантах осуществления в данном векторе имеет место дефицит по меньшей мере одного существенно важного функционального гена участка Е1
и по меньшей мере части участка ЕЗ, не являющегося существенно важным. В аденовирусном векторе может иметь место "множественный дефицит", что означает, что в данном аденовирусном векторе имеет место дефицит одного или нескольких существенно важных функциональных генов в каждом из двух или более участков аденовирусного генома. Например, в вышеупомянутых аденовирусных векторах с дефицитом Е1 или с дефицитом Е1, ЕЗ может дополнительно иметь место дефицит по меньшей мере одного существенно важного гена участка Е4 и/или по меньшей мере одного существенно важного гена участка Е2 (например, участка Е2А и/или участка Е2В).
Аденовирусные векторы, способы их конструирования и способы их размножения хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в патентах США №№ 5559099, 5837511, 5846782, 5851806, 5994106, 5994128, 5965541, 5981225, 6040174, 6020191 и 6113913 и Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenoviruses", главах 67 и 68, соответственно, в Virology, В. N. Fields et al., eds., 3d ed., Raven Press, Ltd., New York (1996), а также других источниках, упомянутых в данном документе. Как правило, конструирование аденовирусных векторов включает применение стандартных методик молекулярной биологии, таких как описанные, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning,, a Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2d ed., Scientific American Books (1992) и Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NY (1995), а также других источниках, упомянутых в данном документе.
Согласно настоящему изобретению аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35. Вакцины согласно настоящему изобретению на основе данного серотипа, а также вакцины на основе Ad2 6 оказались более эффективными, чем вакцины, описанные в известном уровне техники, которые были основаны на Ad5, поскольку те не могли обеспечивать полную защиту против репликации RSV при контрольном заражении после однократного внутримышечного введения (Kim et al, 2010, Vaccine
28: 3801-3808; Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610; Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375). Серотип no настоящему изобретению в целом дополнительно характеризуется низким доминированием серотипа и/или низкими титрами предсуществующих нейтрализующих антител в популяции человека. Рекомбинантные аденовирусные векторы данного серотипа и Ad2 6 с различными трансгенами оценивают в клинических испытаниях, и на сегодняшний день показано, что они имеют превосходный профиль безопасности. Получение векторов rAd2 6 описано, например, в WO 2007/104792 и в Abbink et al. , (2007) Virol 81(9): 4654-63. Иллюстративные последовательности генома Ad2 6 указаны в GenBank под инвентарным номером EF 153474 и в SEQ ID N0:1 из WO 2007/104792. Получение векторов rAd35 описано, например, в патенте США № 7270811, в WO 00/70071 и в Vogels et al. , (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Иллюстративные последовательности генома Ad35 указаны в GenBank под инвентарным номером АС_000019 и на Фиг.6 из WO 00/70071.
Рекомбинантный аденовирус в соответствии с настоящим изобретением может быть репликативно-компетентным или репликативно-дефицитным.
В определенных вариантах осуществления данный аденовирус является репликативно-дефицитным, например, потому что он содержит делецию в участке Е1 генома. Как известно специалисту, в случае делеций существенно важных участков из генома аденовируса функциональные элементы, кодируемые данными участками, должны быть обеспечены в транс-положении, предпочтительно клеткой-продуцентом, то есть если части или целые участки El, Е2 и/или Е4 удалены из аденовируса, то они должны присутствовать в клетке-продуценте, например, встроены в ее геном или находятся в форме так называемого вспомогательного аденовируса или вспомогательной плазмиды. Аденовирус также может иметь делецию в участке ЕЗ, который не является существенным для репликации, и, следовательно, такую делецию не следует восполнять.
Клетка-продуцент (также иногда называемая в данной области техники и в данном документе как "пакующая клетка", или
"дополняющая клетка", или "клетка-хозяин"), которую можно использовать, может представлять собой любую клетку-продуцент, в которой требуемый аденовирус может быть размножен. Например, размножение векторов но основе рекомбинантного аденовируса осуществляют в клетках-продуцентах, которые восполняют дефициты в аденовирусе. Предпочтительно такие клетки-продуценты имеют в своем геноме по меньшей мере последовательность Е1 аденовируса и, таким образом, они способны к дополнению рекомбинантных аденовирусов с делецией в участке Е1. Можно использовать любую El-дополняющую клетку-продуцент, например, клетки сетчатки глаза человека, иммортализированные с помощью Е1, например, клетки 911 или PER.C6 (см. патент США № 5994128), El-трансформированные амниоциты (см. патент ЕР № 1230354), Е1-трасформированные клетки А549 (см., например, WO 98/39411, патент США № 5891690), GH329: HeLa (Gao et al, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293 и т.п. В определенных вариантах осуществления клетками-продуцентами являются, например, клетки НЕК293, или клетки PER.C6, или клетки 911, или клетки IT293SF и т.п.
Для El-дефицитных аденовирусов, не относящихся к подгруппе С, таких как Ad35 (подгруппа В) или Ad26 (подгруппа D), предпочтительной является замена кодирующей последовательности E4-orf6 этих аденовирусов, не относящихся к подгруппе С, на Е4-orf6 из аденовируса подгруппы С, такого как Ad5. Это обеспечивает возможность размножения таких аденовирусов в хорошо известных дополняющих линиях клеток, которые экспрессируют гены Е1 из Ad5, таких как клетки 293 или клетки PER.C6 (см., например, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 03/104467, включенные в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки). В определенных вариантах осуществления аденовирус в композиции вакцины представляет собой аденовирус человека серотипа 35 с делецией в участке Е1, в который была клонирована нуклеиновая кислота, кодирующая антиген белка F RSV, и с участком Е4 orf6 из Ad5. В определенных вариантах осуществления аденовирус, который можно использовать, представляет собой аденовирус человека серотипа
2 6 с делецией в участке Е1, в который была клонирована нуклеиновая кислота, кодирующая антиген белка F RSV, и с участком Е4 orf6 из Ad5.
В альтернативных вариантах осуществления отсутствует необходимость помещать гетерологичный участок E4orf6 (например, из Ad5) в аденовирусный вектор, а вместо этого Е1-дефицитный вектор, не относящийся к подгруппе С, размножают в линии клеток, которые экспрессируют как Е1, так и совместимый E4orf6, например, в линии клеток 293-ORF6, которые экспрессируют как Е1, так и E4orf6 из Ad5 (см., например, Brough et al, 1996, J Virol 70: 6497-501, описывающую получение клеток 293-ORF6; Abrahamsen et al, 1997, J Virol 71: 8946-51 и Nan et al, 2003, Gene Therapy 10: 326-36, в каждой из которых описано получение не относящихся к подгруппе С аденовирусных векторов с удаленным Е1) .
В качестве альтернативы, можно использовать дополняющую клетку, которая экспрессирует Е1 из серотипа, подлежащего размножению (см., например, WO 0/70071, WO 02/40665).
Для аденовирусов подгруппы В, таких как Ad35, с делецией в участке Е1 предпочтительным является сохранение 3' конца открытой рамки считывания Е1В 55К в аденовирусе, к примеру, 166 п.о. расположена непосредственно выше открытой рамки считывания pIX, или фрагмент, включающий ее, как, например, фрагмент в 243 п.о. расположен непосредственно выше старт-кодона pIX (ограничен на 5' конце сайтом рестрикции Bsu36I в геноме Ad35), так как это повышает стабильность аденовируса, потому что промотор гена pIX частично расположен в данной области (см., например, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 2004/001032, включенные в данный документ посредством ссылки).
"Гетерологичная нуклеиновая кислота" (также называемая в данном документе "трансгеном") в аденовирусах по настоящему изобретению представляет собой нуклеиновую кислоту, которая в естественных условиях не присутствует в аденовирусе. Ее вводят в аденовирус с помощью, например, стандартных методик молекулярной биологии. В настоящем изобретении гетерологичная нуклеиновая кислота кодирует белок F RSV или его фрагмент.
Например, ее можно клонировать в удаленный участок Е1 или ЕЗ аденовирусного вектора. Трансген обычно функционально связывают с последовательностями, управляющими экспрессией. Это можно выполнить, к примеру, путем помещения нуклеиновой кислоты, кодирующей трансген(ы), под контроль промотора. Можно добавлять дополнительные регуляторные последовательности. Для экспрессии трансгена (ов) можно использовать множество промоторов, и они известны специалистам в данной области. Неограничивающим примером подходящего промотора для получения экспрессии в эукариотических клетках является промотор CMV (патент США № 5385839), например, предранний промотор CMV, например, содержащий нуклеотиды от -735 до +95 из энхансера/промотора предраннего гена CMV. Сигнал полиаденилирования, например, сигнал полиА гена бычьего гормона роста (патент США 5122458) может присутствовать позади трансгена(ов).
В определенных вариантах осуществления рекомбинантные
векторы Ао!2б или Ad35 по настоящему изобретению содержат в
качестве 5'-терминальных нуклеотидов нуклеотидную
последовательность: СТАТСТАТ. Эти варианты осуществления являются преимущественными, поскольку такие векторы демонстрируют улучшенную репликацию при процессах производства, что приводит к партиям аденовируса с улучшенной гомогенностью, по сравнению с векторами, имеющими исходные 5'-терминальные последовательности (обычно САТСАТСА) (см. также патентные заявки №№ РСТ/ЕР2013/054846 и US 13/794318, под заголовком "Партии рекомбинантного аденовируса с измененными терминальными концами" ( ^Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends'), поданные 12 марта 2012 года от имени Crucell Holland B.V.), включенные в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Таким образом, настоящее изобретение также предлагает партии рекомбинантного аденовируса, кодирующие белок F RSV или его часть, где аденовирус представляет собой аденовирус человека серотипа 35 и где практически все (например, по меньшей мере 90%) аденовирусы в партии содержат геном с терминальной нуклеотидной последовательностью СТАТСТАТ.
Согласно настоящему изобретению белок F RSV может быть
получен из любого встречающегося в природе штамма или рекомбинантного RSV, предпочтительно из штаммов RSV человека, таких как штаммы А2, Long или В. В дополнительных вариантах осуществления последовательность может представлять собой консенсусную последовательность, основанную на нескольких аминокислотных последовательностях белка F RSV. В одном примере настоящего изобретения штамм RSV представляет собой штамм RSV-А2 .
Согласно настоящему изобретению белок F из RSV может представлять собой полноразмерный белок F из RSV или его фрагмент. В одном варианте осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F из RSV, кодирует полноразмерный белок F из RSV (F0), такой как аминокислотная последовательность из SEQ ID N0: 1. В одном примере настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая белок F из RSV, имеет нуклеотидную последовательность из SEQ ID N0: 2. В качестве альтернативы, последовательность, кодирующая белок F из RSV, может представлять собой любую последовательность, которая по меньшей мере на приблизительно 8 0%, предпочтительно более чем на приблизительно 90%, более предпочтительно по меньшей мере на приблизительно 95% идентична нуклеотидной последовательности из SEQ ID N0: 2. В других вариантах осуществления могут быть использованы кодон-оптимизированные последовательности, такие как, например, представленные в SEQ ID N0: 2, 4, 5 или б из W0 2012/021730.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, в качестве альтернативы, нуклеотидная последовательность может кодировать фрагмент белка F из RSV. Фрагмент может представлять собой результат какой-либо одной или обеих из амино-терминальной и карбокси-терминальной делеций. Размер делеции может определять специалист в данной области, например, для получения лучшего выхода рекомбинантного аденовируса. Будет выбран такой фрагмент, который включает иммунологически активный фрагмент белка F, т.е. часть, которая будет приводить к иммунному ответу у субъекта. Его можно легко определить с
применением способов in silico, in vitro и/или in vivo, все из которых хорошо известны специалисту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения фрагмент представляет собой кодирующий участок трансмембранного усеченного белка F из RSV (F0ATM, см., например, US 20110014220). Фрагменты белка F также могут представлять собой домен F1 или домен F2 белка F. Фрагменты F также могут представлять собой фрагменты, содержащие нейтрализующие эпитопы и эпитопы для Т-клеток (Sing et al, 2007, Virol. Immunol. 20, 261-275; Sing et al, 2007, Vaccine 25, 6211-6223).
Используемое в настоящем раскрытии для числовых величин выражение "приблизительно" означает величину ±10%.
В определенных вариантах осуществления настоящее
изобретение предлагает способы получения вакцины против
респираторно-синцитиального вируса (RSV), включающие
обеспечение рекомбинантного аденовируса человека серотипа 35, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент, размножение указанного рекомбинантного аденовируса в культуре клеток-хозяев, выделение и очистку рекомбинантного аденовируса и внесение рекомбинантного аденовируса в фармацевтически приемлемую композицию.
Рекомбинантный аденовирус можно получать и размножать в клетках-хозяевах в соответствии с хорошо известными способами, которые предусматривают клеточную культуру клеток-хозяев, которые инфицируют аденовирусом. Культура клеток может представлять собой любой тип культуры клеток, в том числе адгезионную культуру клеток, например, клетки, прикрепленные к поверхности культурального сосуда или к микроносителям, а также суспензионную культуру.
Манипуляции с большинством суспензионных культур крупного масштаба проводят в периодическом или подпитываемом процессах, поскольку они являются наиболее простыми для управления и увеличения масштаба. В настоящее время более распространенными становятся непрерывные процессы на основе принципов перфузии, и они также являются пригодными (см., например, WO 2010/060719 и
WO 2011/098592, оба из которых включены в данный документ посредством ссылки, в которых описаны подходящие способы получения и очистки больших количеств рекомбинантных аденовирусов).
Клетки-продуценты культивируют для увеличения числа клеток и вирусов и/или титров вирусов. Культивирование клетки выполняют для обеспечения для нее возможности метаболизма, и/или роста, и/или деления, и/или продуцирования вируса, представляющего интерес в соответствии с настоящим изобретением. Этого можно достичь с помощью способов, по сути хорошо известных специалистам в данной области, и это включает без ограничений обеспечение питательных веществ для клетки, например, в соответствующих питательных средах. Подходящие питательные среды хорошо известны специалисту в данной области, и они, как правило, могут быть получены из коммерческих источников в больших количествах или произведены по заказу согласно стандартным протоколам. Культивирование может быть выполнено, например, в чашках, роллерных флаконах или в биореакторах, с использованием периодических, подпитываемых, непрерывных систем и т.п. Известны подходящие условия для культивирования клеток (см., например, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), и R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).
Как правило, аденовирус подвергают воздействию соответствующей клетки-продуцента в культуре, обеспечивая возможность поглощения вируса. Обычно оптимальное перемешивание составляет от приблизительно 50 до 300 об./мин., как правило, приблизительно 100-200, например, приблизительно 150, как правило, DO составляет 20-60%, например, 40%, оптимальный рН составляет от 6,7 до 7,7, оптимальная температура составляет от 30 до 39°С, например, 34-37°С, оптимальная MOI составляет от 5 до 1000, например, приблизительно 50-300. Как правило, аденовирус инфицирует клетки-продуценты спонтанно, и приведение в контакт клеток-продуцентов с частицами rAd является
достаточным для инфекции клеток. Обычно посевной материал аденовируса добавляют в культуру для возникновения инфекции, и в дальнейшем аденовирус размножается в клетках-продуцентах. Все это является обычным для специалиста в данной области.
После инфицирования аденовирусом вирус реплицируется внутри клетки и таким образом амплифицируется - процесс, называемый в данном документе размножением аденовируса. Аденовирусная инфекция в итоге приводит к лизису инфицированной клетки. Следовательно, литические характеристики аденовируса обеспечивают возможность получения вируса двумя различными способами. Первый способ представляет собой сбор вируса до лизиса клетки, с использованием внешних факторов для лизирования клетки. Второй способ представляет собой сбор вирусного супернатанта с (практически) полным лизисом клетки продуцируемым вирусом (см., например, патент США № 6485958, в котором описан сбор аденовируса без лизиса клеток-хозяев с помощью внешнего фактора). Предпочтительным является использование внешних факторов для активного лизирования клеток для сбора аденовируса.
Способы, которые можно использовать для активного лизиса клетки, известны специалисту в данной области, и они рассмотрены, например, в W0 98/22588, р. 28-35. Применимыми в этом отношении способами являются, например, замораживание-размораживание, разрушение клеток абразивными материалами, гипертонический и/или гипотонический лизис, жидкий сдвиг, разрушение ультразвуком, экструзия высокого давления, лизис детергентом, комбинации вышеперечисленных и т.п. В одном варианте осуществления настоящего изобретения клетки лизируют с использованием по меньшей мере одного детергента. Преимущество использования детергента для лизиса состоит в том, что этот метод простой и его легко масштабировать.
Детергенты, которые можно использовать, и способ их применения в целом известны специалисту в данной области. Например, несколько примеров рассматриваются в W0 98/22588, р. 29-33. Детергенты могут включать анионные, катионные, цвиттерионные и неионные детергенты. Концентрация детергента
может варьировать, например, в диапазоне приблизительно 0,1-5% (вес/вес). В одном варианте осуществления применяемым детергентом является Triton Х-100.
Нуклеазы можно применять для удаления загрязняющих, то есть в основном из клетки-продуцента, нуклеиновых кислот. Иллюстративные нуклеазы, подходящие для применения в настоящем
изобретении, включают Benzonase(r), Pulmozyme(r) или любую другую ДНКазу и/или РНКазу, широко используемую в данной области. В предпочтительных вариантах осуществления нуклеаза представляет
собой Benzonase(r), которая быстро гидролизирует нуклеиновые кислоты путем гидролиза внутренних фосфодиэфирных связей между определенными нуклеотидами, уменьшая тем самым вязкость
клеточного лизата. Benzonase(r) коммерчески доступна от Merck KGaA (код W214950). Концентрация, при которой используют нуклеазу, предпочтительно находится в диапазоне 1-100 ед./мл. В качестве альтернативы или дополнительно к обработке нуклеазой, также возможно селективно осаждать ДНК клетки-хозяина из препаратов аденовируса во время очистки аденовируса с применением селективных осаждающих средств, таких как домифена бромид (см., например, US 7326555; Goerke et al., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12-21; WO 2011/045378; WO 2011/045381).
Способы сбора аденовируса из культур клеток-продуцентов подробно описаны в WO 2005/080556.
В определенных вариантах осуществления собранный аденовирус дополнительно очищают. Очистку аденовируса можно осуществлять в несколько этапов, включая осветление, ультрафильтрацию, диафильтрацию или разделение с помощью хроматографии, как описано, например, в WO 05/080556, включенном в данный документ посредством ссылки. Осветление можно осуществлять с помощью этапа фильтрации, удаляя клеточный детрит и другие примеси из клеточного лизата. Ультрафильтрацию используют для концентрирования раствора вируса. Диафильтрация или замена буфера с применением ультрафильтров представляет собой способ удаления или замены солей, Сахаров и т.п.
Специалист в данной области знает, как подобрать оптимальные условия для каждого этапа очистки. Также в W0 98/22588, включенном в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте, описаны способы получения и очистки аденовирусных векторов. Способы включают выращивание клеток-хозяев, инфицирование клеток-хозяев аденовирусами, сбор и лизирование клеток-хозяев, концентрирование неочищенного лизата, замену буфера в неочищенном лизате, обработку лизата нуклеазой и дополнительную очистку вируса с использованием хроматографии.
Предпочтительно при очистке используется по меньшей мере один этап хроматографии, как, например, рассматривается в W0 98/22588, р. 61-70. Описано много способов дополнительной очистки аденовирусов, где в способ включены этапы хроматографии. Специалист в данной области будет осведомлен о данных способах и может варьировать точный способ применения хроматографических стадий для оптимизации способа. Например, возможна очистка аденовирусов с помощью этапов анионообменной хроматографии, см., например, WO 2005/080556 и Konz et al, 2005, Hum Gene Ther 16: 1346-1353. Было описано много других способов очистки аденовируса, и они доступны для специалиста. Дополнительные способы получения и очистки аденовирусов раскрыты, например, в (WO 00/32754; WO 04/020971; US 5837520; US 6261823; WO 2006/108707; Konz et al, 2008, Methods Mol Biol 434: 13-23; Altaras et al, 2005, Adv Biochem Eng Biotechnol 99: 193-260), все включенные в данный документ посредством ссылки.
Для введения людям в настоящем изобретении могут быть использованы фармацевтические композиции, содержащие rAd и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель. В настоящем контексте выражение "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель или наполнитель в применяемых дозировках или концентрациях не вызовет каких-либо нежелательных или неблагоприятных эффектов у субъектов, которым их вводят. Такие фармацевтически приемлемые носители и наполнители хорошо известны в данной области (см. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of
Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; и Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press
[2000]) . Очищенный rAd предпочтительно составляют и вводят в виде стерильного раствора, хотя также возможно применение лиофилизированных препаратов. Стерильные растворы получают с помощью стерильной фильтрации или с помощью других способов, известных как таковые в данной области техники. Затем растворы лиофилизируют или разливают по контейнерам, предназначенным для лекарственной формы. рН раствора обычно находится в диапазоне от рН 3,0 до 9,5, например, от рН 5,0 до 7,5. Как правило, rAd находится в растворе с подходящим фармацевтически приемлемым буфером, при этом раствор rAd может также содержать соль. Необязательно может присутствовать стабилизирующее средство, такое как альбумин. В определенных вариантах осуществления добавляют детергент. В определенных вариантах осуществления rAd можно составлять в виде инъекционного препарата. Данные составы, содержащие эффективные количества rAd, являются либо стерильными жидкими растворами, жидкими суспензиями, либо лиофилизированными вариантами и необязательно содержат стабилизаторы и наполнители. Также аденовирусная вакцина может быть в виде аэрозоля для интраназального введения (см., например, WO 2009/117134).
Например, аденовирус можно хранить в буфере, который также используют для Adenovirus World Standard (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vector formulation, Bioprocessing March 2002, p. 43-48) : 20 мМ Трис рН 8, 25 мМ NaCl, 2,5% глицерин. Другой используемый состав буфера, который подходит для введения людям, представляет собой 2 0 мМ Трис, 2 мМ МдС1г, 25 мМ NaCl, сахароза 10% вес/объем, полисорбат-80 0,02% вес/объем. Безусловно можно использовать множество других буферов, при этом некоторые примеры подходящих составов для хранения и для фармацевтического введения препаратов очищенного
(адено)вируса можно, например, найти в Европейском патенте № 0853660, патенте США № 6225289 и в международных заявках на патент WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO
03/049763, WO 03/078592, WO 03/061708.
В определенных вариантах осуществления композиция, содержащая аденовирус, дополнительно содержит один или несколько адъювантов. Адъюванты, известные в данной области для дополнительного повышения иммунного ответа на применяемую антигенную детерминанту, и фармацевтические композиции, содержащие аденовирус и подходящие адъюванты, раскрыты, например, в WO 2007/110409, включенной в данный документ посредством ссылки. Выражения "адьювант" и "иммуностимулятор" используют в данном документе взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, вызывающих стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на аденовирусные векторы по настоящему изобретению. Примеры подходящих адъювантов включают соли алюминия, такие как гидроксид алюминия и/или фосфат алюминия; композиции на основе масляной эмульсии (или композиции масло-вводе) , в том числе эмульсии сквалена в воде, как, например, MF59 (см., например, WO 90/14837); составы на основе сапонина, например, QS21 и иммуностимулирующие комплексы (ISCOM) (см., например, US 5057540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); производные бактерий или микроорганизмов, примерами которых являются монофосфориллипид A (MPL), 3-0-деацетилированный MPL (3dMPL), олигонуклеотиды, содержащие мотив CpG, ADP-рибозилированные бактериальные токсины или их мутанты, такие как термолабильный энтеротоксин LT Е. coli, холерный токсин СТ и т.п. Также возможно использование адъюванта, кодируемого вектором, например, путем использования гетерологичной нуклеиновой кислоты, которая кодирует слияние домена олигомеризации С4-связывающего белка (С4Ьр) с антигеном, представляющим интерес (например, Solabomi et al, 2008, Infect Immun 16: 3817-23). В определенных вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению содержат в качестве адъюванта алюминий, например, в форме гидроксида алюминия, фосфата алюминия, фосфата алюминия-калия или их комбинации в концентрациях 0,05-5 мг, например, 0,075-1,0 мг алюминия на дозу.
В других вариантах осуществления композиции не содержат адъюванты.
Согласно настоящему изобретению также возможно вводить дополнительные активные компоненты в комбинации с вакцинами согласно настоящему изобретению. Такие дополнительные активные компоненты могут включать, например другие антигены RSV или векторы, содержащие кодирующую их нуклеиновую кислоту. Такие векторы могут не относиться к аденовирусным или быть аденовирусными, из которых последние могут относиться к любому серотипу. Пример других антигенов RSV включает белок G RSV или его иммунологически активные части. Например, интраназально применяемый рекомбинантный репликативно-дефицитный аденовектор rAd/3xG на основе Ad5, экспрессирующий растворимый коровый домен гликопротеина G (аминокислоты 130-230), обеспечивал защиту на мышиной модели (Yu et al, 2008, J Virol 82: 23502357), и хотя он не обеспечивал защиту при внутримышечном введении, из этих данных ясно, что G RSV представляет собой подходящий антиген для индукции защитных ответов. Дополнительные активные компоненты могут также включать антигены, не относящиеся к RSV, например, происходить от других патогенов, таких как вирусы, бактерии, паразиты и т.п. Введение дополнительных активных компонентов, например, можно осуществлять с помощью введения по отдельности или с помощью введения комбинированных продуктов из вакцин по настоящему изобретению и дополнительных активных компонентов. В определенных вариантах осуществления дополнительные антигены, не относящиеся к аденовирусам (кроме RSV.F), могут быть закодированы в векторах по настоящему изобретению. В определенных вариантах осуществления может потребоваться экспрессия более одного белка из одного аденовируса, и в таких случаях, например, можно связывать больше кодирующих последовательностей для образования одного транскрипта из одной кассеты экспрессии, или они могут присутствовать в двух отдельных кассетах экспрессии, клонированных в различные части аденовирусного генома.
Композиции аденовирусов можно вводить субъекту, например,
субъекту-человеку. Как известно квалифицированному практику, суммарная доза аденовируса, предоставляемая субъекту при однократном введении, может варьировать и, как правило, составляет от 1х107 вирусных частиц (vp) до lxlO12 vp, предпочтительно от lxlO8 vp до lxlO11 vp, к примеру, от ЗхЮ8 до 5х1010 vp, к примеру, от 109 до ЗхЮ10 vp.
Введение композиций аденовирусов можно осуществлять с использованием стандартных путей введения. Неограничивающие варианты осуществления включают парентеральное введение, такое как инъекция, например, внутрикожная, внутримышечная и т.д., или подкожное, чрескожное введение, или введение через слизистые, например, интраназальное, пероральное и подобные. В целом было отмечено, что интраназальное введение является предпочтительным путем для вакцин против RSV. Наиболее важным преимуществом интраназальной стратегии с живыми вирусами является непосредственная стимуляция локального иммунитета дыхательных путей и отсутствие ассоциированного усиления заболевания. Единственными вакцинами для педиатрического применения, проходящими в настоящее время клинические исследования, являются живые интраназальные вакцины (Collins and Murphy. Vaccines against human respiratory syncytial virus). B: Perspectives in Medical Virology 14: Respiratory Syncytial Virus (Ed. Cane, P.), Elsevier, Amsterdam, the Netherlands, pp. 233-277) . Интраназальное введение также представляет собой подходящий предпочтительный путь согласно настоящему изобретению. Однако согласно настоящему изобретению особенно предпочтительным является введение вакцины внутримышечно, поскольку было обнаружено, что внутримышечное введение вакцины согласно настоящему изобретению приводит к защите от репликации RSV в носу и легких хлопковых хомяков, в отличие от внутримышечных RSV-вакцин, о которых сообщалось ранее, основанных на других серотипах аденовируса. Преимуществом внутримышечного введения является то, что оно является простым и надежным и не имеет проблем безопасности при интраназальном введении у детей младше б месяцев. В одном
варианте осуществления композицию вводят посредством внутримышечной инъекции, например, в дельтовидную мышцу руки или латеральную широкую мышцу бедра. Специалисту известны различные возможности введения композиции, например, вакцины для индуцирования иммунного ответа на антиген(ы) в вакцине.
Субъект, как используется в данном документе, предпочтительно представляет собой млекопитающее, например, грызуна, например, мышь, хлопкового хомяка, или примата, кроме человека, или человека. Предпочтительно субъект представляет собой субъекта-человека. Субъект может быть любого возраста, например, от приблизительно 1 месяца до 100 лет, например, от приблизительно 2 месяцев до приблизительно 80 лет, например, от приблизительно 1 месяца до приблизительно 3 лет, от приблизительно 3 лет до приблизительно 50 лет, от приблизительно 50 лет до приблизительно 75 лет и т.д.
Также возможным является обеспечение одного или нескольких бустерных введений одной или нескольких аденовирусных вакцин по настоящему изобретению. При осуществлении бустерной вакцинации, как правило, такую бустерную вакцину будут вводить одному и тому же субъекту с промежутком от одной недели до одного года, предпочтительно от двух недель до четырех месяцев после введения композиции субъекту в первый раз (которое в данном случае называется "первичной вакцинацией"). В альтернативных бустерных схемах после первичной вакцинации также возможно вводить субъекту различные векторы, например, один или несколько аденовирусов различных серотипов, или другие векторы, такие как MVA, или ДНК, или белок. Например, возможно вводить субъекту рекомбинантный аденовирусный вектор согласно настоящему изобретению в качестве первичной иммунизации и осуществлять бустерную иммунизацию композицией, содержащей белок F RSV.
В определенных вариантах осуществления введение включает первичное и по меньшей мере одно бустерное введение. В определенных вариантах осуществления такового первичное введение производят с помощью rAd35, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV в соответствии с данным
изобретением ("rAd35-RSV.F"), а бустерное введение производят с помощью rAd2 6, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV ("rAd2б-RSV.F"). В других вариантах осуществления такового первичное введение происходит с помощью rAd2б-RSV.F, а бустерное введение происходит с помощью rAd35-RSV.F. В других вариантах осуществления как первичное, так и бустерное введение происходит с помощью rAd35-RSV.F. В определенных вариантах осуществления первичное введение происходит с помощью rAd35-RSV.F, а бустерное введение происходит с помощью белка F RSV. Во всех этих вариантах осуществления возможно обеспечивать дополнительные бустерные введения при помощи того же самого или других векторов или белка. Варианты осуществления, в которых осуществление бустерного введения при помощи белка F RSV может быть особенно полезным, включают, например, у пожилых субъектов из групп риска (например с COPD или астмой) возрастом 50 лет или старше, или, например, у здоровых субъектов 60 лет или старше, или 65 лет или старше.
В определенных вариантах осуществления введение включает однократное введение рекомбинантного аденовируса согласно настоящему изобретению без дополнительных (бустерных) введений. Такие варианты осуществления являются предпочтительными с точки зрения уменьшенных сложности и стоимости схемы с однократным введением в сравнении со схемой первичной-бустерной иммунизации. Полная защита наблюдается уже после однократного введения рекомбинантных аденовирусных векторов по настоящему изобретению без бустерных введений на модели хлопкового хомяка в примерах в данном документе.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Данные примеры не ограничивают настоящее изобретение каким-либо образом. Они служат лишь для пояснения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Получение аденовирусных векторов Клонирование гена F RSV в участок El Ad35 и Ad2 6 Ген RSV.F(А2)nat, кодирующий нативный белок слияния (F) RSV штамма А2 (№ в Genbank АСО83301.1), подвергали оптимизации
гена для экспрессии у человека и синтезировали, согласно
Geneart. Последовательность Козак (5' GCCACC 3') включали
непосредственно перед старт-кодоном ATG и два стоп-кодона (5'
TGA ТАА 3' ) добавляли в конце кодирующей последовательности
RSV.F(А2)nat. Ген RSV.F(A2)nat вставляли в плазмиду pAdApt35BSU
и в плазмиду pAdApt26 по сайтам HindiII и Xbal. Полученные в
результате плазмиды, pAdApt35BSU.RSV.F(А2)nat и
pAdApt2б.RSV.F(A2)nat, изображены на фиг. 15. Аминокислотная
последовательность белка F и кодон-оптимизированная
последовательность, кодирующая такую аминокислотную
последовательность, представлены в таблице 1 как SEQ. ID. N0: 1 и 2, соответственно. КУЛБТУРА КЛЕТОК
Клетки PER.C6 (Fallaux et al. , 1998, Hum Gene Ther 9: 190 9-1917) поддерживали на среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), дополненной 10 мМ МдС12.
Выращивание аденовируса, инфицирования и пересев
Все аденовирусы выращивали в клетках PER.Сб при помощи
однократной гомологичной рекомбинации и получали, как описано
ранее (относительно rAd35: Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol.
87: 2135-2143; относительно rAd26: Abbink et al., 2007, J.
Virol. 81: 4654-4663) . В кратком изложении, клетки PER.C6
трансфицировали с помощью плазмид на основе Ad векторов, с
применением липофектамина согласно инструкциям, представленным
производителем (Life Technologies). Для спасения векторов Ad35,
несущих кассету экспрессии с трансгеном RSV.F(А2)nat,
использовали плазмиду pAdApt35BSU.RSV.F(А2)nat и космиду
pWE/Ad35.pIX-rlTR.dE3.5orfб, тогда как для векторов Ad26,
несущих кассету экспрессии с трасгеном RSV.F(А2)nat,
использовали плазмиду pAdApt2б.RSV.F(А2)nat и космиду
pWE.Ad2б.dE3.5orfб. Клетки собирали через один день после
полного СРЕ, подвергали замораживанию-размораживанию,
центрифугировали в течение 5 мин. при 3000 об./мин. и хранили при -2 0°С. Потом вирусы очищали методом бляшкообразования и
амплифицировали в PER.C6, культивируемых в одной лунке 2 4-луночного планшета для культуры тканей. Дальнейшую амплификацию проводили в PER.C6, культивируемых с применением Т2 5 флакона для культуры тканей и Т17 5 флакона для культуры тканей. Из Т17 5 неочищенные лизаты, 3-5 мл, использовали для инокуляции в 20хТ175 трехслойных флаконов для культуры тканей, содержащих слои клеток PER.C6 с 7 0% конфлюэнтностью. Вирус очищали, применяя способ двухэтапной очистки с использованием CsCl. В
заключение, вирус хранили в аликвотах при 8 5°С.
Пример 2. Индукция иммунитета против F RSV с применением рекомбинантного аденовируса серотипов 26 и 35 in vivo
Это эксперимент для изучения способности рекомбинантного аденовируса серотипа (Ad2 6) и рекомбинантного аденовируса серотипа 35 (Ad35) индуцировать иммунитет против антигена гликопротеина F RSV у мышей BALB/c.
В данном исследовании животных распределяли в экспериментальные группы по 5 мышей. Животных иммунизировали однократной дозой Ad2 6 или Ad35, несущих полноразмерный ген F RSV (Ad26-RSV.F или Ad35- RSV.F), или таковыми без трансгена (Ad2 6e или Ad35e). Три 10-кратных серийных разведения rAd в диапазоне от 1010 до 108 вирусных частиц (vp) вводили внутримышечно. В качестве контроля одна группа из 3 мышей получала пустой вектор Ad2 6e и одна группа получала пустой вектор Ad35e.
Анализ ELISPOT применяли для определения относительного количества белок F-специфичных IFNy-секретирующих Т-клеток в селезенке, и его выполняли, практически как описано Radosevic et al. (Clin Vaccine Immunol. 2010; 17 (11):1687-94.) . Для стимуляции спленоцитов в анализе ELISPOT использовали два пептидных пула, состоящих из 15-аминокислотных пептидов, перекрывающих 11 аминокислот, которые охватывают всю последовательность белка F RSV (А2) . Подсчитывали количество спот-образующих единиц (SFU) на 106 клеток.
Для определения титров антител использовали анализ ELISA. С этой целью планшеты для ELISA (Thermo Scientific) покрывали
25 мкг/мл полностью инактивированным антигеном RSV Long (Virion Serion, кат. № BA113VS). В планшеты добавляли образцы разведенной сыворотки и антитела IgG против RSV определяли с применением меченного биотином антитела к IgG мыши (DAKO, № по кат. Е0413), с применением обнаружения с помощью стрептавидина
(SA) , конъюгированного с пероксидазой (РО) хрена. Титры рассчитывали с помощью линейной интерполяции с применением в качестве граничного значения l,5xOD сигнал от 50х разведенных сывороток от животных, не подвергавшихся воздействию. Титры RSV-специфичных антител IgGl и IgG2a в сыворотке мыши определяли с помощью меченных РО антител к IgGl мыши и меченных РО антител к IgG2a мыши (Southern Biotechnology Associates, №№ по кат. 1070-05 и 1080-05), которые использовали для количественной оценки подклассов.
Вируснейтрализующую активность (VNA) антител определяли с помощью анализа микронейтрализации, выполняемого фактически, как описано Johnson et al. (J Infect Dis. 1999 Jul; 180(1) :35-40.) . Восприимчивые к RSV клетки VERO высевали в 9б-луночные планшеты для культуры клеток за один день до заражения. В день заражения серийно разведенную сыворотку и контроли смешивали с 1200 pfu RSV (Long или В1) и инкубировали 1 час при 37°С. Далее смеси вирус/антитело переносили в 9б-луночные планшеты, содержащие монослои клеток VERO. Три дня спустя монослои фиксировали с помощью 8 0% ледяного ацетона и антиген RSV определяли с помощью моноклонального антитела к F. Титр нейтрализующих антител выражали как разведение сыворотки
(1одг), которое вызывает 50% уменьшение OD450 контрольных лунок, содержащих только вирус (IC50) •
На неделе 2 и неделе 8 после первичного введения животных умерщвляли и клеточные и гуморальные ответы отслеживали, как описано выше.
На фиг. 1 показано, что все дозы Ad2б-RSV. F (фиг. 1А) и Ad35-RSV.F (фиг. 1В) были эффективными для индуцирования сильных клеточных иммунных ответов, и что ответы были стабильны с течением времени. Ни в случае Ad2б-RSV.F, ни в случае Ad35-
RSV.F не наблюдали значимых отличий влияния дозы вектора на Т-клеточный ответ.
На фиг. 2 показаны титры антител в таком же эксперименте, как описано выше. Оба вектора индуцировали очень выраженное время- и дозозависимое повышение титров при ELISA (фиг. 2) . Титры антител к F явно повышались от 2 до 8 недели, что было значимым для дозы 1010. На 8 неделе отсутствовали отличия в титрах между векторами Ad26-RSV.F или Ad35-RSV.F.
Распределение подклассов (IgGl в сравнении с IgG2a) F-специфичных IgG определяли для оценки баланса Thl- и Тп2-ответа. Асимметричный Th2/Thl ответ создает предпосылку у животного для развития усиленного вакциной заболевания RSV, которое наблюдали в случае инактивированного формалином RSV. Как показано на фиг. 3, соотношение IgG2a/IgGl для обоих Ad26-RSV.F и Ad35-RSV.F выше 1. Это убедительно указывает на то, что аденовекторы Ad2 6-RSV.F и Ad35-RSV.F проявляют скорее ответ типа Thl, чем ответ типа Th2.
На фиг. 4 показан титр вируснейтрализующих антител (VNA) той же самой сыворотки, использованной для определения титра антител. Иммунизация с помощью Ad2 6-RSV.F и rAd35-RSV.F приводила к индукции титров нейтрализующих антител. VNA титры сильно увеличивались между второй и восьмой неделей после первичной иммунизации у мышей, которым вводили 1010 vp. На восьмой неделе отсутствовали отличия в титрах между векторами Ad26-RSV.F и Ad35-RSV.F у мышей, которым вводили 1010 vp.
Из этих экспериментов по иммунизации очевидно, что векторы Ad35 и Ad26, несущие трансген RSV.F, индуцируют сильный клеточный и гуморальный ответы против RSV.F.
Пример 3. Иммунитет против RSV. F после гетерологичной первичной-бустерной иммунизации с применением рекомбинантных аденовирусных векторов, кодирующих RSV.F
Данное исследование разрабатывали для изучения способности схем первичной-бустерной иммунизации на основе аденовирусных векторов, происходящих от двух различных серотипов, индуцировать иммунитет против RSV.F.
Данное исследование включало мышей BALB/c, распределенных
в экспериментальные группы по 8 мышей. Животных иммунизировали посредством внутримышечной инъекции 1010 vp, несущих последовательность дикого типа из гена RSV.F, на основе/происходящего из RSV А2 (Ad-RSV.F или Ad35-RSV.F), или таковых без трансгена (Ad2 6e или Ad35e). Одну группу животных первично иммунизировали с помощью Ad2б-RSV.F и бустерно иммунизировали на неделе 4 с помощью Ad35-RSV.F или Ad35e. Другую группу животных первично иммунизировали с помощью Ad35-RSV.F и бустерно иммунизировали на неделе 4 с помощью Ad2 6-RSV.F или Ad2 6e. Контрольную группу мышей первично иммунизировали с помощью Ad35e и бустерно иммунизировали на неделе 4 с помощью Ad2 6e. На неделе б и неделе 12 после первичной иммунизации 8 животных умерщвляли в каждый момент времени и отслеживали клеточный и гуморальный ответы при помощи иммунологических анализов, хорошо известных специалисту в данной области и описанных выше.
На фиг. 5 показан клеточный ответ на б и 12 неделе после первой иммунизации. На б неделе после первичной иммунизации (и 2 неделе после бустерной иммунизации) измеряли значительный бустерный эффект как в случае Ad2б-RSV.F, так и в случае Ad35-RSV.F в отношении Т-клеточных ответов, и величина Т-клеточного ответа была независима от порядка иммунизации с помощью Ad2 6-RSV.F или Ad35-RSV.F в первичной-бустерной иммунизации. На 12 неделе после первичной иммунизации (8 неделе после бустерной иммунизации) у мышей, первично иммунизированных с помощью Ad2 6-RSV.F, сохранялись высокие уровни F-специфичных Т-клеток как в случае только лишь первично иммунизированных, так и случае первично-бустерно иммунизированных животных, в сравнении с животными, первично иммунизированными rAd35-RSV.F. В целом, количества F-специфичных лимфоцитов (SFU) были высокими и стабильными в течение по меньшей мере 12 недель у всех животных, иммунизированных либо rAd26-RSV.F, либо rAd35-RSV.F (первичная иммунизация/или первичная-бустерная иммунизация).
На фиг. б показан гуморальный ответ в различные моменты времени после первичной-бустерной вакцинации аденовирусными векторами. Первичная иммунизация Ad35.RSV.F и Ad2 6.RSV.F была
одинаково хорошей, и был показан значительный бустерный эффект, индуцированный как Ad2 6.RSV.F, так и rAd35.RSV.F, в отношении В-клеточных ответов. Более того, величина В-клеточных ответов на гетерологичную первичную-бустерную иммунизацию не зависела от порядка иммунизации Ad35.RSV.F и Ad2 6.RSV.F, и после бустерной иммунизации титры, определенные с помощью ELISA, оставались стабильными в течение 12 недель.
На фиг. 7 показаны титры вируснейтрализующих антител в различные моменты времени после первичной-бустерной иммунизации. Первичная иммунизация как в случае вектора Ad35.RSV.F, так и в случае вектора Ad2 6.RSV.F была одинаково эффективной для получения явных титров VNA, как наблюдали в отношении титров, определенных с помощью ELISA. Также, повышение титров VNA после гетерологичной первичной-бустерной иммунизации не зависело от порядка иммунизации Ad35.RSV.F и Ad2 6.RSV.F. Бустерный эффект как в случае Ad2 6.RSV.F, так и в случае Ad35.RSV.F в отношении титров VNA был значимым в оба момента времени и максимальным уже на б неделе. У групп, которые получили только первичную иммунизацию Ad.RSV.F, титры VNA повысились на 12 неделе в сравнении с б неделей. Последовательность F RSV в конструктах аденовирусного вектора получена от изолята RSV А2. Анализ нейтрализации, описанный в данной заявке, основан на штамме RSV Long, принадлежащем к подгруппе A RSV, что демонстрирует, что антитела, индуцированные F (А2), способны перекрестно нейтрализовать другой штамм RSV подтипа А.
Поскольку белок F RSV является очень консервативным среди изолятов RSV, тестировали, была ли способна сыворотка от животных, иммунизированных векторами Ad-RSV.F, к перекрестной нейтрализации прототипного изолята RSV штамма В, RSV В1. Как показано на фиг. 8, сыворотка иммунизированных мышей также была способна к перекрестной нейтрализации штамма В1. Способность к перекрестной нейтрализации RSV В1 не зависела от того, какой вектор использовали у групп только с первичной иммунизацией, или порядка первичной-бустерной иммунизации векторами Ad26.RSV.F и Ad35.RSV.F.
В совокупности эти данные показывают, что при схеме первичная-бустерная иммунизация последующие иммунизации с помощью Ad26.RSV.F и Ad35.RSV.F индуцируют сильные гуморальные и клеточные ответы, и что гуморальный иммунный ответ включает способность к нейтрализации изолятов обоих подтипов RSV, А и В.
Пример 4. Индуцирование защиты против инфекции RSV с применением рекомбинантных аденовирусных векторов in vivo на модели хлопкового хомяка
Этот эксперимент осуществляли для изучения способности схем первичная-бустерная иммунизация на основе аденовирусных векторов, полученных из двух различных серотипов, индуцировать защиту против репликации RSV при контрольном заражении у хлопкового хомяка. Хлопковые хомяки (Sigmodon hispidus) восприимчивы к инфекциям RSV как верхних, так и нижних дыхательных путей и, как оказалось, по меньшей мере в 50 раз более пермиссивны, чем линии мышей (Niewiesk et al, 2002, Lab. Anim. 36(4):357-72). Более того, хлопковый хомяк служил первой моделью для оценки эффективности и безопасности кандидатных вакцин, противовирусных препаратов и антител против RSV. Данные доклинических испытаний, полученные на модели хлопкового хомяка, продвинули разработку двух составов на основе антител (RespiGam(r) и Synagis(r)) до клинических испытаний без необходимости промежуточных исследований на приматах, кроме человека.
В исследование включали хлопковых хомяков в
экспериментальных группах по 8 хлопковых хомяков каждая.
Животных иммунизировали посредством внутримышечных инъекций 109
вирусных частиц (vp) или 1010 vp аденовирусных векторов, несущих
полноразмерный ген F RSV (А2) (Ad26.RSV.F или Ad35.RSV.F), или
таковых без трансгена (Ad2 6e или Ad35e). Животных бустерно
иммунизировали через 2 8 дней такой же дозой vp, либо с помощью
того же вектора (гомологичная первичная-бустерная иммунизация),
либо с помощью другого аденовирусного серотипа (гетерологичная
первичная-бустерная иммунизация); контрольные группы
иммунизировали, соответственно, с помощью векторов Ad-e, за
исключением того, что вводили только 1 дозу (1010). Контрольные группы состояли из б животных. Животных, зараженных интраназально с помощью RSV А2 (104 бляшкообразующих единиц
(pfu)), использовали в качестве положительного контроля в отношении защиты от репликации при контрольном заражении, поскольку известно, что первичное заражение с помощью вируса RSV защищает от репликации при вторичном контрольном заражении
(Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). Кроме того, инактивированный формалином RSV (FI-RSV) служил в качестве контроля в отношении усиленного вакциной гистопатологического заболевания. Через три недели после второй (бустерной) иммунизации хлопковых хомяков контрольно заражали посредством интраназального введения 1x105 pfu очищенного с помощью способа бляшкообразования RSV А2. В качестве контроля одну группу хлопковых хомяков не иммунизировали, но производили контрольное заражение вирусом, а другую контрольную группу не иммунизировали и не подвергали контрольному заражению. Хлопковых хомяков умерщвляли через 5 дней после заражения, момент времени, когда вирус RSV при контрольном заражении достигает максимальных титров (Prince. Lab Invest 1999, 79:138 5-13 92), и определяли титры RSV в легких и носу с помощью титрации вируса методом бляшкообразования (Prince et al. 1978, Am J Pathology 93,711-791).
На фиг. 9 показано, что высокие титры вируса RSV в легких и в носу наблюдали у неиммунизированных контролей, а также животных, получавших аденовирусные векторы без трансгена, соответственно, 5,3+/-0,13 1одю pfu/грамм и 5,4+/-0,35 1одю pfu. Напротив, отсутствие вируса контрольного заражения можно было обнаружить в ткани легких и носа от животных, которые получали первичную-бустерную иммунизацию с помощью векторов Ad2 6.RSV.F и/или Ad35.RSV.F, независимо от дозы или схемы.
Эти данные явно демонстрируют, что как векторы на основе Ad35, так и векторы на основе Ad2 6 дают полную защиту от репликации RSV при контрольном заражении на модели хлопкового хомяка. Это было неожиданным, поскольку, как было известно,
аденовирусные векторы на основе Ad5, кодирующие F RSV, не были способны индуцировать полную защиту на животных моделях после внутримышечного введения.
В ходе данного эксперимента образцы крови брали перед иммунизацией (день 0), перед бустерной иммунизацией (день 28), в день контрольного заражения (день 49) и в день умерщвления
(день 54) . Сыворотки тестировали с помощью анализа нейтрализации вируса (VNA) на основе анализа методом бляшкообразования в отношении индукции системных RSV-специфичных нейтрализующих антител, как описано у Prince
(Prince et al. 1978, Am J Pathology 93, 711-791). Титр нейтрализующих антител выражают как разведение сыворотки
(1одг), которое вызывает 50% уменьшение бляшек в сравнении с контрольными лунками, содержащими только вирус (IC50) •
На фиг. 10 показано, что контрольные животные не имели вируснейтрализующих антител в день 2 8 и день 4 9, в то время как высокие титры VNA индуцировались после первичной иммунизации животных с помощью векторов Ad2 6.RSV.F или Ad35.RSV.F. Умеренное повышение титра VNA наблюдали после бустерных иммунизаций. Первичное заражение вирусом RSV А2 приводило к достаточно умеренным титрам VNA, которые со временем постепенно увеличивались.
Для оценки того, может ли вакцина на основе Ad2 6.RSV.F или Ad35.RSV.F обострять заболевание после контрольного заражения с помощью RSV А2, гистопатологические анализы легких проводили через 5 дней после заражения. Легкие собирали, перфузировали формалином, изготавливали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования. Гистопатологический балл определяли вслепую согласно критериям, опубликованным Prince (Prince et al. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), и оценивали в отношении следующих параметров: перибронхиолит, периваскулит, интерстициальный пневмонит и альвеолит. На фиг. 11 показана балльная оценка патологии легких в этом эксперименте. После контрольного заражения RSV у животных, иммунизированных FI-RSV, наблюдали повышенную гистопатологию для всех проверяемых параметров гистопатологии в сравнении с
контрольно-зараженными животными с имитирующей иммунизацией, как и ожидалось, исходя из ранее опубликованных исследований (Prince et al. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). Баллы гистопатологии у животных, иммунизированных Ad2 6.RSV.F и Ad35.RSV.F, в сравнении с животными, иммунизированными rAd-e или с имитирующей иммунизацией, были аналогичными, хотя оказалось, что периваскулит у животных, иммунизированных rAd-RSV.F, был немного ниже. Таким образом, Ad2 6.RSV.F- и Ad35.RSV.F-вакцины не приводили к усиленному заболеванию, в отличие от FI-RSV-вакцин.
Все стратегии вакцинирования приводили к полной защите от репликации RSV при контрольном заражении, индуцировали сильные вируснейтрализующие антитела, и усиленная патология не наблюдалась.
Пример 5. Эффективность защиты векторов rAd при использовании различных путей введения после однократной иммунизации
Это исследование предполагает изучение влияния путей введения на эффективность защиты, индуцированной с помощью Ad26- или Ad35 -векторов, кодирующих RSV.F. Вакцину вводили либо внутримышечно, либо интраназально.
Хлопковых хомяков, которые получали однократную
иммунизацию с помощью lxlO9 или lxlO10 вирусных частиц (vp) Ad26 или Ad35, либо несущих F RSV в качестве трансгена (Ad2 6.RSV.F или Ad35.RSV.F), либо таковых без трансгена (Ad26-e или Ad35-e) в день 0, подвергали контрольному заражению в день 4 9 с помощью 105 RSV pfu и умерщвляли в день 54.
На фиг. 12 показаны результаты экспериментов, в которых определяли количество вируса контрольного заражения в легких и носу. Высокие титры вируса RSV обнаруживали в легких и носах у крыс, которые не были иммунизированы или были иммунизированы аденовирусными векторами без трансгена, соответственно, 4,9+/-0,22 1одю pfu/грамм и 5,4+/-0,1б 1одю pfu. Напротив, в легких и носах животных, которые получали либо Ad35-RSV.F, либо Ad2 6-RSV.F, отсутствовал реплицирующийся вирус контрольного
заражения, независимо от пути введения и дозы.
Эти данные неожиданно продемонстрировали, что каждый из векторов на основе Ао!2б и Ad35, кодирующих белок F RSV, обеспечивает полную защиту в экспериментах с контрольным заражением хлопкового хомяка, независимо от пути введения векторов. Это было неожиданным, так как ни одна из опубликованных RSV-вакцин на основе аденовируса, которые были основаны на других серотипах, не продемонстрировала полной защиты после внутримышечной вакцинации.
Во время эксперимента образцы крови брали перед иммунизацией (день 0), через 4 недели после иммунизации (день 28) и в день контрольного заражения (день 49). Сыворотки тестировали с помощью реакции нейтрализации в отношении индукции RSV-специфичных антител (фиг. 13) . Перед иммунизацией вируснейтрализующих антител у каких-либо хлопковых хомяков не обнаружено. Все стратегии иммунизации аденовирусным вектором, независимо от пути введения, явно индуцировали высокие титры VNA, которые оставались стабильными в течение длительного времени. Эти данные неожиданно продемонстрировали, что каждый из векторов на основе Ad2 6 и Ad35, кодирующих белок F RSV, обеспечивает высокие титры вируснейтрализующих антител в экспериментах с иммунизацией хлопкового хомяка, независимо от пути введения векторов.
Чтобы оценить, может ли однократная иммунизация вакцинами с Ad2 6.RSV.F или Ad35.RSV.F вызывать усиленное вакциной заболевание после контрольного заражения с использованием RSV А2, гистопатологические анализы легких проводили через 5 дней после заражения (фиг. 14) . Однократная иммунизация с помощью rAd2 6.RSV.F или rAd35.RSV.F приводила к аналогичным иммунопатологическим баллам в случае животных, иммунизированных rAd2 6.RSV.F или rAd35.RSV.F, в сравнении с животными, иммунизированными rAd-e или имитацией, как наблюдали в экспериментах с первичной-бустерной иммунизацией, описанных выше. Очевидно, ухудшения болезни не наблюдали в отличие от животных, которые получили первичную иммунизацию FI-RSV. Гистопатологические баллы животных, иммунизированных rAd
векторами, были сравнимы с баллами животных с имитированным заражением.
В заключение, все стратегии иммунизации однократной дозой приводили к полной защите от репликации RSV при контрольном заражении, индуцировали сильные вируснейтрализующие антитела и не показывали усиленной патологии.
Пример 6. Векторы с такими вариантами, как фрагменты F RSV, или с альтернативными промоторами показывают аналогичную иммуногенность
В изложенных выше примерах использовали векторы, экспрессирующие F RSV дикого типа. В других случаях усеченные или модифицированные формы F встраивали в rAd35, обеспечивая варианты осуществления фрагментов F RSV в аденовирусных векторах. Эти усеченные или модифицированные формы F включают усеченную форму RSV-F, в которой отсутствуют цитоплазматический домен и трансмембранный участок (т.е. остался только эктодоменный фрагмент), и форму с фрагментом RSV-F с усечением цитоплазматического домена и трансмембранного участка и дополнительной внутренней делецией в эктодомене и добавлением домена тримеризации. Эти векторы не улучшали ответы в сравнении с rAd35.RSV.F, который имеет полноразмерный белок F.
Кроме того, были разработаны другие гАо!35-векторы с
различными альтернативными промоторами, управляющими
экспрессией F RSV дикого типа.
Иммуногенность модифицированных форм RSV. Было проведено сравнение вариантов F и промоторов на мышиной модели, а также их сравнивали с Ad35.RSV.F, который экспрессирует F дикого типа. Все Ad35-BeKTopbi, несущие эти варианты F или варианты промоторов, показывали ответы с тем же порядком величины, что и Ad35.RSV.F.
Пример 7. Кратковременная защита от инфекции RSV после иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами in vivo на модели хлопкового хомяка
В этом эксперименте определяют потенциал быстрого наступления защиты при помощи аденовирусных векторов, экспрессирующих белок RSV-F, на модели хлопкового хомяка. С
этой целью, хлопковых хомяков в экспериментальных группах по 8 хлопковых хомяков в каждой иммунизировали с помощью однократной внутримышечной инъекции и использованием 107, 108 или 109 вирусных частиц (vp) аденовирусных векторов, несущих полноразмерный ген F RSV (А2) (Ad35.RSV.F), или таковых без трансгена (Ad26e), в день 0 или в день 21. Животных, зараженных интраназально с помощью RSV А2 (104 бляшкообразующих единиц
(pfu)), использовали в качестве положительного контроля в отношении защиты от репликации при контрольном заражении, поскольку известно, что первичное заражение с помощью вируса RSV защищает от репликации при вторичном контрольном заражении
(Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). В день 49, через семь или четыре недели после иммунизации, проводили контрольное заражение хлопковых хомяков интраназально с помощью lxlO5 pfu очищенного методом бляшкообразования RSV А2. Хлопковых хомяков умерщвляли через 5 дней после заражения, момент времени, когда вирус RSV при контрольном заражении достигает максимальных титров (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), и определяли титры RSV в легких и носу с помощью титрации вируса методом бляшкообразования (Prince et al. 1978, Am J Pathology 93,711791) . На фиг. 16 показано, что высокие титры вируса RSV в легких и в носу наблюдали у животных, получавших аденовирусные векторы без трансгена, соответственно, 4,8+/-0,11 1одю pfu/грамм и 5,1+/-0,32 1одю pfu/r. В отличие от этого, легкие и нос всех животных, иммунизированных высокими дозами (109 vp) Ad35.RSV.F-векторов, были полностью защищены от титров RSV через 7 недель после иммунизации и почти полностью защищены через 4 недели после иммунизации. Низкие дозы Ad35.RSV.F-векторов давали полную защиту от титров RSV в легких и частичную защиту от титров в носу через 4 и 7 недель после иммунизации. Образцы крови брали в день контрольного заражения
(день 49) . Сыворотки тестировали с помощью реакции нейтрализации в отношении индукции RSV-специфичных антител
(фиг. 17) . Иммунизация векторами Ad индуцировала титры VNA, которые зависели от дозы. На фиг. 18 показано, что контрольные
животные не имели вируснейтрализующих антител в течение экспериментов, в то время как высокие титры VNA индуцировались у животных через 2 8 или 4 9 дней после иммунизации с использованием 107 - 109 vp Ad35.RSV.F. Перед иммунизацией вируснейтрализующих антител у каких-либо хлопковых хомяков обнаружено не было. Иммунизация аденовирусными векторами индуцировала дозозависимые титры VNA, которые были выше или сравнимы с нейтрализующими титрами, вызванными первичной интраназальной RSV инфекцией. Этот эксперимент явно указывает на быстрое наступление защиты от репликации вируса контрольного заражения с использованием Ad35, экспрессирующих RSV-F.
Пример 8. Защита от инфекции RSV подгруппы А и подгруппы В после иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами in vivo на модели хлопкового хомяка
Штаммы RSV можно разделить на две подгруппы, подгруппы А и В. Это субтипирование основано на различиях в антигенности высоковариабельного гликопротеина G. Последовательность белка F является высококонсервативной, но также ее можно классифицировать в те же самые подгруппы А и В. В патентной заявке 0200 ЕО РОО описано, что сыворотки мышей, иммунизированных Ad-RSV.F-векторами, также были способны к перекрестной нейтрализации штамма Bl in vitro. На фиг. 19 ясно показано, что в сыворотке хлопкового хомяка, полученной от хлопковых хомяков, иммунизированных с использованием Ad35.RSV-FA2, наблюдаются высокие титры VNA в день 4 9 после иммунизации против RSV-A Long (подгруппа А) и Bwash (подгруппа В, № 1540 в АТСС) . Затем определяли in vivo защиту от контрольного заражения вирусом подгруппы А или В у хлопкового хомяка с применением низких доз - от 107 до 108 vp - аденовирусного вектора. С этой целью, хлопковых хомяков разделяли на экспериментальные группы по 8 хлопковых хомяков каждая. Животных иммунизировали в день 0 посредством внутримышечных инъекций 107 или 108 вирусных частиц (vp) аденовирусных векторов, несущих полноразмерный ген F RSV (А2) (Ad35.RSV.F), или таковых без трансгена (Ad2 6e) в день 0. Животных, зараженных интраназально с использованием RSV А2 (104
бляшкообразующих единиц (pfu)), использовали в качестве положительного контроля в отношении защиты от репликации при контрольном заражении. На 4 9 день производили интраназальное контрольное заражение животных либо 105 pfu RSV-A2, подгруппа RSV-A, либо RSV-B 15/97, штамм RSV-B.
На фиг. 2 0 показано, что высокие титры вируса RSV в легких наблюдали у животных, получавших аденовирусные векторы без трансгена. Напротив, отсутствие или ограниченное количество вируса контрольного заражения можно было обнаружить в ткани легких и носа от животных, получавших иммунизацию с использованием Ad35.RSV.F-векторов. При проведении контрольного заражения с помощью либо RSV-A2, либо RSV-B 15/97 различий в защите не наблюдалось. Ad35.RSV.FA2 показал полную защиту от репликации при контрольном заражении легких при использовании 107 и 108 vp (вирусных частиц) . На фиг. 21 видно, что высокие титры вируса RSV в носу наблюдались у животных, получавших аденовирусные векторы без трансгена. Ad35.RSV.FA2 показал частичную защиту от репликации вируса при инфицировании через нос с использованием 108 vp (вирусных частиц). При проведении контрольного заражения с помощью либо RSV-A2, либо RSV -В 15/97 различий в защите не наблюдалось. Во время эксперимента образцы крови брали в день 2 8 ив день контрольного заражения (день 49) . Сыворотки тестировали с помощью реакции нейтрализации в отношении индукции RSV-специфичных антител. На фиг. 22 показаны титры вируснейтрализующих антител в течение времени проведения эксперимента, а также то, что контрольные животные не имели вируснейтрализующих антител в продолжение экспериментов. Высокие титры VNA индуцировались у животных через 2 8 или 4 9 дней после иммунизации при использовании 108 или 107 vp Ad35.RSV.F.
Пример 9. Защита от RSV-A2 при высокой дозе контрольного заражения после иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами in vivo на модели хлопкового хомяка
В этом примере определяли защиту от RSV-A2 при контрольном заражении высокой дозой 5x105 pfu по сравнению со стандартной
дозой 1x105 pfu. В исследование включали хлопковых хомяков в экспериментальных группах по 8 хлопковых хомяков каждая. Животных иммунизировали посредством однократных внутримышечных инъекций 107 или 108 вирусных частиц (vp) аденовирусных векторов, несущих полноразмерный ген F RSV (А2) (Ad35.RSV.F), или таковых без трансгена (Ad26e), в день 0. Животных, зараженных интраназально с помощью RSV А2 (104 бляшкообразующих единиц (pfu)), использовали в качестве положительного контроля в отношении защиты от репликации при контрольном заражении. Хлопковых хомяков умерщвляли через 5 дней после заражения и титры RSV в легких и носу определяли при помощи титрования вируса методом бляшкообразования. На фиг. 23 показано, что более высокая доза контрольного заражения индуцирует более высокую вирусную нагрузку в легких у животных, получающих аденовирусные векторы без трансгена, чем в случае стандартной дозы контрольного заражения. Животные, иммунизированные с использованием 108 vp векторов Ad35.RSV.F, были полностью защищены от инфекции в легких при контрольном заражении стандартными и высокими титрами RSV. На Фигуре 24 показано, что животные, иммунизированные с использованием 108 или 107 vp векторов Ad35.RSV.F, были полностью защищены от инфекции в носу при контрольном заражении стандартными и высокими титрами RSV.
Пример 10. Первичная иммунизация Ао!26. RSV.F с бустерной иммунизацией рекомбинантным белком F приводит к Thl-асимметричному ответу на мышиной модели
В этом примере изучали, может ли иммунный ответ после первичной иммунизации Ad26.RSV.F улучшаться при помощи бустерной иммунизации с помощью рекомбинантного белка F RSV с адъювантами. С этой целью, мышей разделяли на экспериментальные группы по 7 мышей каждая. Животных иммунизировали в день 0 посредством внутримышечных инъекций 1010 вирусных частиц (vp) аденовирусных векторов, несущих полноразмерный ген F RSV (А2) (Ad2 6.RSV.F) или PBS. В день 2 8 животных бустерно иммунизировали i.m. либо с помощью того же вектора при той же дозе, либо с помощью белка F RSV с адъювантами (полноразмерный;
конформация после слияния: post-F) (в 2 дозах: 5 мкг и 0,5
мкг) . На фиг. 2 5 ясно показано, что в сыворотке, полученной от
мышей, иммунизированных с помощью Ad2б.RSV-FA2 и бустерно
иммунизированных с помощью F RSV с адъювантами, обнаружены
высокие титры VNA на 12 неделе после иммунизации против RSV-A
Long (подгруппа А) . На фиг. 26 показано соотношение IgG2a/IgGl
в сыворотках мышей, иммунизированных с помощью Ad2 6.RSV-FA2 и
бустерно иммунизированных с помощью белка F RSV с адъювантами.
Высокое соотношение указывает на Thl-сбалансированные ответы, в
то время как низкое соотношение указывает на Тп2-асимметричный
ответ. Очевидно, бустерная иммунизация животных,
иммунизированнных с помощью Ad2 6.RSV.F, с помощью либо Ad2 6.RSV.F, либо белка F RSV приводила к высокому соотношению IgG2a/IgGl, в то время как иммунизация контрольных мышей с помощью FI-RSV или белка F RSV (без окружения аденовирусных векторов) индуцировала низкое соотношение. Поскольку Thl-асимметричный ответ весьма желателен в случае RSV-вакцины во избежание усиленного заболевания после контрольного заражения, смещенный в сторону Тп2 ответ за счет иммунизации белком может быть направлен в сторону Thl-ответа при применении первичной иммунизации Ad2 6.RSV.F. На фиг. 2 7 показаны клеточные ответы в селезенках, полученных от мышей, иммунизированных с помощью Ad26.RSV-FA2 и бустерно иммунизированных с помощью белка F RSV с адъювантами. Можно явно наблюдать, что проведение бустерной иммунизации с помощью белка F RSV с адъювантами будет к тому же сильно повышать клеточный ответ. На основании более ранних экспериментов, описанных в примерах выше, ожидается, что замена Ad2 6 на Ad35 приведет к похожим результатам.
Таблица 1
Последовательности
SEQ ID NO: 1: аминокислотная последовательность белка слияния RSV (№ по Genbank АСО83301.1):
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVI TIELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRF MNYTLNNAKKTNVTL S KKRKRRFLGFLLGVGSAlAS GVAVS KVLHLEGEVNKIKSAL LSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNN RLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQS YSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSK TDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTL YYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL HNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNI AFSN.
SEQ ID NO: 2: кодон-оптимизированный ген RSV.F(A2)nat, который кодирует белок слияния RSV
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCCGTGACC TTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGC GCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATC ACCATCGAGCTGAGCAACATCAAAAAGAACAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAAATC AAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTG CTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCGGGCCAGACGGGAGCTGCCCCGGTTC ATGAACTACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGAAGCGG AAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTG GCTGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTG CTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGC AAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAG CAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAAC CGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTG TCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATC ACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGC TACTCCATCATGTCCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCC CTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACC ACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTAC TGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAG AGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAAC CTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAG ACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGC AAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAAC GGCTGCGACTACGTGTC CAACAAGGGCGTGGACAC CGTGT CCGTGGGCAACAC С CTG TACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATC AACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAG GTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTG CACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATC GTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAG GCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATC GCCTTCTCCAAC
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Вакцина против респираторно-синцитиального вируса
(RSV), содержащая рекомбинантный аденовирус человека серотипа
35, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F
RSV или его фрагмент.
2. Вакцина по п.1, где рекомбинантный аденовирус содержит
нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV, который содержит
аминокислотную последовательность из SEQ ID N0: 1.
3. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, является кодон-оптимизированной для экспрессии в клетках человека.
4. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID N0: 2.
5. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный аденовирус человека имеет делецию в участке Е1, делецию в участке ЕЗ или делецию в обоих участках Е1 и ЕЗ аденовирусного генома.
6. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный аденовирус имеет геном, содержащий на своих 5'-терминальных концах последовательность СТАТСТАТ.
7. Способ вакцинации субъекта против RSV, причем способ включает введение субъекту вакцины по любому из предыдущих пунктов.
8. Способ по п.7, в котором вакцину вводят внутримышечно.
9. Способ по п. 7 или п. 8, в котором вакцину по любому из пп.1-6 вводят субъекту более одного раза.
10. Способ по любому из пп.7-9, дополнительно включающий введение субъекту вакцины, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 2 6, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
11. Способ по п.7 или п.8, состоящий из однократного введения вакцины субъекту.
12. Способ по любому из пп.7-11, дополнительно включающий введение белка F RSV субъекту.
13. Способ уменьшения инфекции и/или репликации RSV у
10.
субъекта, включающий введение субъекту посредством
внутримышечной инъекции композиции, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
14. Выделенная клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный
аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую
кислоту, кодирующую белок F RSV или его фрагмент.
15. Способ получения вакцины против респираторно-
синцитиального вируса (RSV), включающий обеспечение
рекомбинантного аденовируса человека серотипа 35, который
содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV или его
фрагмент, размножение указанного рекомбинантного аденовируса в
культуре клеток-хозяев, выделение и очистку рекомбинантного
аденовируса и составление рекомбинантного аденовируса в
фармацевтически приемлемую композицию.
16. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая
образует геном рекомбинантного аденовируса человека серотипа
35, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F
RSV или его фрагмент.
По доверенности
ИЗМЕНЕННАЯ ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ, ПРЕДЛОЖЕННАЯ ЗАЯВИТЕЛЕМ ДЛЯ РАССМОТРЕНИЯ (Статья 34 РСТ)
1. Вакцина против респираторно-синцитиального вируса
(RSV), содержащая рекомбинантный аденовирус человека серотипа
35, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F
RSV.
2. Вакцина по п.1, где рекомбинантный аденовирус содержит
нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV, который содержит
аминокислотную последовательность из SEQ ID N0: 1.
3. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, является кодон-оптимизированной для экспрессии в клетках человека.
4. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где нуклеиновая кислота, кодирующая белок F RSV, содержит последовательность нуклеиновой кислоты из SEQ ID N0: 2.
5. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный аденовирус человека имеет делецию в участке Е1, делецию в участке ЕЗ или делецию в обоих участках Е1 и ЕЗ аденовирусного генома.
6. Вакцина по любому из предыдущих пунктов, где рекомбинантный аденовирус имеет геном, содержащий на своих 5'-терминальных концах последовательность СТАТСТАТ.
7. Способ вакцинации субъекта против RSV, причем способ включает введение субъекту вакцины по любому из предыдущих пунктов.
8. Способ по п.7, в котором вакцину вводят внутримышечно.
9. Способ по п. 7 или п. 8, в котором вакцину по любому из пп.1-6 вводят субъекту более одного раза.
10. Способ по любому одному из пп.7-9, дополнительно включающий введение субъекту вакцины, содержащей рекомбинантный аденовирус человека серотипа 2 6, который содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV.
11. Способ по п.7 или п.8, состоящий из однократного введения вакцины субъекту.
12. Способ по любому из пп.7-11, дополнительно включающий введение белка F RSV субъекту.
10.
13. Способ уменьшения инфекции и/или репликации RSV у
субъекта, включающий введение субъекту посредством
внутримышечной инъекции композиции, содержащей рекомбинантный
аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую
кислоту, кодирующую белок F RSV.
14. Выделенная клетка-хозяин, содержащая рекомбинантный аденовирус человека серотипа 35, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV.
15. Способ получения вакцины против респираторно-
синцитиального вируса (RSV), включающий обеспечение
рекомбинантного аденовируса человека серотипа 35, который
содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F RSV,
размножение указанного рекомбинантного аденовируса в культуре
клеток-хозяев, выделение и очистку рекомбинантного аденовируса
и составление рекомбинантного аденовируса в фармацевтически
приемлемую композицию.
16. Выделенная рекомбинантная нуклеиновая кислота, которая
образует геном рекомбинантного аденовируса человека серотипа
35, которая содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок F
RSV.
По доверенности
518143
ее о н
ЮОГОа
F-пептиды [ак] 1-252
X о
кх"
1С"
2 недели
8 недель
я о ж
о о
F-пептиды [ак] 241-574
^ • "Л- ~*
Ю8 Ю9 1010 Е 10Е 109 1010 Е
I 1 I 1
2 недели
8 недель
Фиг. 1А
F-пептиды [ак] 1-252
I I I I -I I I г
10е 10* 10'° Е 10е 10* 10ю Е
1 I 1
2 недели 8 недель
1000D 10ОО 100 10
F-пептиды [ак] 241-574
4? *
¦ I I I I I I I
10е 10е 10'° Е 10* 10е 1010 Е
I 1 I 1
2 недели
8 недель
Фиг. 1В
Фиг. 2
I I I I I I I I
108 109 1010 E Ю8 109 1010 E
I 1 I 1
2 недели 8 недель
В) Ad35-RSV.F 6-1
10Е 109 1010 Ё 10Е 109 1010 Ё
I 1 I 1
2 недели 8 недель
Of) (N
о о U
108-
420-
Фиг. 3
Ad26-RSV.F Ad35-RSV.F
I 1
1010 vp
A) Ad26-RSV.F 1 &1
108 109 1010 10Е IO9 to"
I 11 1
2 недели 8 недель
B)Ad35-RSV.F 1 &1
"l5 109 1 010 1 08 109 10(tm)~
I 11 I
2 недели 8 недель
Фиг. 4
Я О X
100"
о О
10 <
1-"
I I I I I
первичная rAd26-F rAd26-F rAd35-F rAd35-F rAd35-e бустерная rAd35-e rAd35-F rAd26-e rAd26-F rAd26-e
на 12 неделе
X и
IOO0O-1000100
ъ p
^ 1-
первичная Ad26-F AJ26-F Ad35-F Ad35-F Ad35-" бустерная *!"¦• AdW-F Ad2^ Ad26-F AeK6-"
Фиг. 5A
F-пепгиды [ак] 241-574
1О00О 1000 10О 10
I I I I I
первичная ^Ad26 F rAd26~F г Ad 35-F г Ad 35-F rAd35 e
бустерная rAc,35-e rAd35-F rAd26-e rAd2S-F rAd2 &-e
на 12 неделе
10000 1000 100 10
первичная Ad26-F Ad26-F Ad35-F Ad35-F Ad35-e бустерная Ad35-e Ad35-F Ad25-e Ad26-F Ad26-e
Фиг. 5B
Фит. 6
недели
ot ?
О lo-
LLOD
-•- rAOZS-F tM3> f -"- rA035 FrAcl26-F -¦- r-AcCS F rAd35-o -*- rAcSS-F rAd?6-e
Фиг. 7
недели
20i
LLOD
1 I -
первичная *J2S-F M26-F Ad35-F А335-"
бустерная Л134"* W35"F ма*-" Ad"-F Ad26-"
на 12 неделе
2(Ь
~ 15Н О"
8 - н
LL0D О-"
первичная бустерная
Ad36-F AOS-*
M2 &-F
Ad35-F AD26-F
M35e
Фиг. 8
А) Вирусные титры - легкое
контроль
Ao26F-Ad26F(10A9) Ad26F-Ad26F(l0M0) Ad35F-Ad35F(10A9) Ad35F-AcJ33F (10Л10) Ао26-Ас135Р(10л9) Ad26F-Ad35F (10*10) AcD6e-Ad?6e(l0M0) AcB5e-Ad35e(l0M0) Ad2ee/Ad35e (ЮЛЮ)
имитация FI-ftSV(1/25) FI-FtSV (1/125) RSV-A2(10"4)
6 ¦
5 '
10 PF
4 ¦
logl
3 .
В) Вирусные титры - нос
Фиг. 9
.LLQP..S
А) День 28
LLODh-¦
¦|ршнушш^рш^рн^мн^|||а|||н111> <1> > "> > Та
к контроль
• Ас126Р-Ас)2ер(10ЛЭ)
о Ad26F-Ad2BF (10Л1 0>
" Ad35F-Ad35F(1Q*9)
• Ad35F-Ad35F(10M0]
¦ Ad26-Ad3SF <10л9)
(c) Ad26F-Ad35F (10*10)
° Ad26e-Ad26e(10A1O)
* Ad35e-Ad35e(10A1O)
*. о Ad26 **l * имитация
¦'*' ¦ FI-RSV(1/25)
n Fl-RSV (1/125)
-r- * RSV-A2(1CVM)
В) День 49 13 i
-7U Ol
5 Ю •
LLOD
Л * T S "*
3E ¦
Фиг. 10
контроль Ad26 F Ad26-F AJ35-F Ad35-F Ad26-F Ac35-F Ad e имитация Fi-RSV
RSV
Фиг. 11
* контроль
А) Вирусные титры - легкое • AdseF (1 оА9)
о Ad?6F(10A10) Ad35F(10A9)
V j* *t * & * Ad35F(10A10)
^ о *A + * Ad26e(10A9)
¦ " Ad25e(10A10)
* * имитация
" RSV-A2(10'4)
2 2 j"*-* -#гчв"ч****¦ LLOD
внутримышечно интраназально
В) Вирусные титры - нос
? 4 1
¦3 2
LLOD
i i i i i i i i i
-I I 1
внутримышечно интраназально Фиг. 12
A) VNAd28
О) О
о л
LLOD
9" %S V.'^
контроль
A026F (10Л9) Ad26F(10M0) Ad35F (10Л9) Ad35F (1040) Ad26(c)(10*9) Ad35e (1040)
имитация
RSV-A2(10*4)
о ю О
В) VNAd49
15 т
LLO0
о5 '
контроль
Ad26F(10"9)
A426F{10'10)
Ad35F(l0'9)
Ad35F (10*10)
Ad26(c)(10'9)
Ad35e{10'10)
имитация
RSV-A2 110*4)
0 'ill
¦ I I I I
внутримышечно интраназально
Фиг. 13
1 контроль I Ad26F (10A9) I Ad26F (10A10) I AcJ35F (10A9) I Ad35F (10A10) I Ad26e(10A9) I Ad35e(10A10) I имитация I RSV-A2(10A4)
А Пернбронхнолнт
В Периваскулит
С Интерстициальная пневмония
D Альвеолнт
ooO
JuiX
ABCD ABCD ABCD ABCD ABCD ABCD ABCD ABCD ABCD
Фиг. 14
Фиг. 15
А) Вирусные титры - легкое
1- D
Ковтрольвое харажевже через
10*8 МЗв KSV-F 49 дней
10*9 fA43S"
RSV А
in.
io"s
Контрольное ираженне через
10"* M2" RSV F
49*
1в"9 10"" AdM ftSV Г
28 лаея
10*"
RSV А In
Фиг. 16
12i
10-
•n -TFT
10A9 ЮА9 RSV-A
Ad26 Ad-e i.n.
Фиг. 17
Ad26F 10*9 -•- Ad26F 10*8
Ad26F 10*7 -•- Ad26F 10*9 .сокрашенная
Ad26F 10*8 .сокращенная
RSV-A2 10*41.0.
t t t
Первичная Первичная Контрольное
иммунизация иммунизация заражение
(стандартная) (сокращенная)
Фиг. 18
О) О
Ю О 86420-
Ad35-F10A7 RSV А2 i.n.
PB Ad26-F PB rAd-пустой
О О
in О 86420-
Ad35-F 10л7
RSVA2 i.n.
PB Ad26-F PB rAd-пустой
ФИГ. 19
Вирусная нагрузка в легких, контрольное заражение RSV-A2 6-1
******
10Л7 10л8 юА8
Ad35.RSV.FA2 Ad26.e
Вирусная нагрузка в легких, контрольное заражение RSV-B15/97 6i
Ll_ 4' О.
10Л7 10л8 10л8
Ad35.RSV.FA2 Ad26.e
Фиг. 20
Вирусная нагрузка в носу, контрольное заражение RSV-A2
* *
Л А
О) Q.
10А7 10Л8 Ad35.RSV.FA2
10л8 Ad26.e
Вирусная нагрузка в носу, контрольное заражение RSV-B15/97
LL. 4' О.
LLOD
Фиг. 21
10Л7 10А8 Ad35.RSV.FA2
10А8 Ad26.e
10л8 Ad35-F 10л7 Ad35-F 10л8 Ad26e
Первичная иммунизация
контрольное заражение
Фиг. 22
Вирусная нагрузка в легких
стандартная доза контрольного заражения
высокая доза контрольного заражения
Ё4-0-
о> о
-во°-
10*7 10*8 10*3 10*4 FI-RSV 10л7 10л3 10лВ 10a4
Ad35.RSV.F" Ad26.e RSV-A2 Ad35.RSV.F" Ad26.e RSV-A2
Фиг. 23
Вирусная нагрузка в носу
стандартная доза
высокая доза контрольного заражения
-t-н-
10Л7
Ad35.RSV.Fft2
10л8 Ad26.e
10л4 RSV-A2
10л8
Ad35.RSV.Fft2
10л8 Ad26.e
10л4 RSV-A2
Фиг. 24
15-1
- 5
LLoQ
первичная бустерная
ЮА10 юлю Ad26.FAd26.F 10л10 . Ad26.F
10А10 Ad26.F 5 мкг post-F
10А10 Ad26.F 0.5 мкг post-F
PBS
Фиг. 25
ш I
? 31
LLoQ
первичная бустерная
5ug 10А10 ЮА10 10А10 10А10
posf-F Ad26.FAd26.F Ad26.F Ad26.F FI-RSV
10A10 5МКГ 0.5МКГ
- Ad26.F post-F post-F FI-RSV
3" Ш
3 3
LLoQ
первичная бустерная
5ug 10л10 Юл10 10л10 10л10
posf-F Ad26.FAd26.F Ad26.F Ad26.F FI-RSV
10л10 5 МКГ 0.5 МКГ
. Ad26.F post-F post-F FI-RSV
о О
0.01-
первичная бустерная
г. 26
5 ug posf-F
ЮА10 ЮА10 Ad26.FAd26.F 10А10 - Ad26.F
10А10 10А10 Ad26.F Ad26.F FI-RSV 5 МКГ МКГ post-F post-F FI-RSV
ф ц
с о
1000-
~ 500-
первичная
бустерная
Юл10 10л10 10л10 10л10
Ad26.F Ad26.F Ad26.F Ad26.F
10л10 5 мкг 0.5 мкг
Ad26.F post-F post-F
PBS
Фиг. 27
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
ИЗМЕНЕННАЯ СТРАНИЦА
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
1/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
2/29
4/29
4/29
4/29
4/29
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
6/29
на б неделе
8/29
8/29
8/29
8/29
8/29
8/29
10/29
на б неделе
9/29
10/29
на б неделе
9/29
10/29
на б неделе
9/29
10/29
на б неделе
9/29
10/29
на б неделе
9/29
10/29
на б неделе
11/29
10/29
на б неделе
11/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
12/29
13/29
13/29
14/29
14/29
14/29
14/29
14/29
14/29
15/29
15/29
15/29
15/29
16/29
16/29
16/29
16/29
16/29
16/29
17/29
17/29
18/29
18/29
18/29
18/29
18/29
18/29
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
20/29
- 10-
22/29
- 10-
22/29
- 10-
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
23/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
24/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
27/29
29/29
29/29
29/29
