[RU]

Описывают иммуномодулирующие средства, применимые для лечения или профилактики повреждения сустава. Более конкретно, описывают иммуномодуляторы для применения в вызывании антиген-специфичного толерогенного ответа на полипептид аггрекан, включая его цитруллинированные формы, для лечения или профилактики повреждения сустава, включая повреждение сустава у индивидуумов с ранним RA или RA на ранней стадии.

(57) Реферат / Формула:

Описывают иммуномодулирующие средства, применимые для лечения или профилактики повреждения сустава. Более конкретно, описывают иммуномодуляторы для применения в вызывании антиген-специфичного толерогенного ответа на полипептид аггрекан, включая его цитруллинированные формы, для лечения или профилактики повреждения сустава, включая повреждение сустава у индивидуумов с ранним RA или RA на ранней стадии.

---

2420-519086ЕА/052 ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
По настоящей заявке испрашивается приоритет австралийской предварительной заявки № 2012901189 под названием "Immunomodulatory Agents and Uses Therefor", поданной 23 марта 2012 года, полное содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение, главным образом, относится к иммуномодулирующим средствам, применимым для лечения или профилактики повреждения сустава. Более конкретно, настоящее изобретение относится к применению иммуномодуляторов, вызывающих антиген-специфичный толерогенный ответ на полипептид аггрекан, включая его цитруллинированные формы, для лечения или профилактики повреждения сустава, включая повреждение сустава у индивидуумов с ранним RA или RA на ранней стадии.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Воспалительный артрит является значительным клиническим проявлением при различных аутоиммунных нарушениях, включая ревматоидный артрит (RA), псориатический артрит (PsA), системную красную волчанку (SLE), синдром Шегрена и полимиозит. У большинства пациентов с этими нарушениями при физикальном осмотре обнаруживают деформации суставов, но, как правило, только у пациентов с RA и PsA обнаруживают эрозию костей при визуализации.
Патогенез хронических воспалительных заболеваний костей,
таких как RA, до конца не ясен. Такие заболевания
сопровождаются утратой костной ткани вокруг пораженных суставов
по причине повышенной остеокластической резорбции, главным
образом, опосредованной повышенной локальной продукцией
провоспалительных цитокинов (Teitelbaum, 2000. Science
289:1504-1508; Goldring and Gravallese, 2000. Arthritis Res.
2(1):33-37). Эти цитокины могут действовать непосредственно на
клетки остеокластической линии или косвенно, влияя на продукцию
остеобластами/стромальными клетками важного фактора
дифференцировки остеокластов, активатора рецептора лиганда NF
кВ (RANKL), и/или его растворимого рецептора-ловушки, остеопротегерина (OPG), (Hossbauer et al. , 2000. J. Bone Min. Res. 15(1):2-12).
RA является системным воспалительным заболеванием,
поражающим приблизительно от 0,5 до 1% взрослого населения в
северной Европе и Северной Америке и немного меньшую часть
населения в других частях мира (Alamanos and Drosos, 2005.
Autoimmun. Rev. 4: 130-136). Он характеризуется хроническим
воспалением синовиальной ткани сустава, что в конечном итоге
приводит к утрате повседневной активности по причине
хронической боли и утомляемости. Он является хроническим
воспалительным заболеванием. У большинства пациентов также
развивается прогрессирующая деградация хряща и кости в
поврежденных суставах, что в конечном итоге может приводить к
постоянной нетрудоспособности. Долговременный прогноз RA
является неблагоприятным, при этом приблизительно у 50%
пациентов развивается значительная функциональная
недееспособность в течение 10 лет с момента постановки диагноза.
В случае RA описано несколько аутоантигенов, включая ряд белков, становящихся цитруллинированными в пораженных суставах. Цитруллинизация является физиологическим процессом деиминации аргинина, происходящим при апоптозе и воспалении. Этот процесс приводит к модификации аргинин-содержащих белков, что может приводить к образованию наборов нео-аутоантигенов у индивидуумов, несущих аллели риска HLA (Vossenaar ER, et al. , 2004. Arthritis Res. Ther. 6: 107-11). Конкретные варианты гена HLA-DR, картированные по аминокислотам 70-74 третьей гипервариабельной области цепей DRp, значимо связаны с RA (Gregersen РК, et al. , 1987. Arthritis Rheum. 30: 1205-1213). Эта область кодирует консервативную аминокислотную последовательность, образующую четвертый якорный карман (Р4) в связывающей антиген борозде HLA-DR. Этот "общий эпитоп предрасположенности" (SE) обнаруживают во множестве связанных с RA аллелей DR, включая DRB1*0401, DRB1*0404 и DRB*0101 у европеоидов (Gregersen РК, et al., 1987, выше). Кодирующие SE
аллели HLA, в частности, связаны с АСРА-положительным RA (Klareskog L, et al. , 2006. Arthritis Rheum. 54:38-46; van Gaalen FA, et al. , 2004. Arthritis Rheum. 50:2113-21; Hida S, et al., 2004. J. Autoimmun. 23:141-50; Hill JA, et al., 2003, J. Immunol 171:538-41).
SE сильно положительно заряжен, находится в области цепи DRp, что влияет на специфичность аминокислоты в Р4 к связываемому лиганду, и, таким образом, он будет предпочтительно связываться с пептидами, содержащими отрицательно заряженную или неполярную аминокислоту в этом положении. При цитруллинизации заряженные боковые аминогруппы аргинина замещаются незаряженной карбонильной группой, и повышается аффинность связывания эпитопа пептида виментина человека с молекулами SE+ HLA DR (Hill JA, et al. , 2003, выше; Snir 0, et al., 2011. Arthritis Rheum., n/a-n/a).
Сыворотки приблизительно 7 0% пациентов с RA содержат аутоантитела против цитруллинированного белка (АСРА) (Meyer О, et al. , 2006. Arthritis Res. Ther. 8:R40) . Эта реактивность отражает продукцию аутоантител против группы цитруллинированных аутоантигенов, модифицированных посттрансляционно, включая фибриноген, виментин, коллаген типа II и енолазу (Wegner N, et al. , 2010. Immunol Rev. 233:34-54) . АСРА образуются за 15 лет до начала RA с повышением титров и реактивности пептидов с приближением начала заболевания (van de Stadt LA, et al., 2011. Arthritis Rheum., n/a-n/a). При RA в воспаленных тканях обнаруживают цитруллинированные белки, и в ряде моделей воспалительного артрита на мышах индуцировали АСРА (Masson-Bessiere С, et al. , 2001. J. Immunol. 166:4177-84; Vossenaar ER, et al., 2003. Arthritis Rheum. 48:2489-500; Kuhn KA, et al., 2006. J. Clin. Invest. 116:961-73; Giant TT, et al., 2011. Arthritis Rheum. 63: 1312-1321). Хотя цитруллинизация является повсеместной при ответе на стресс и воспаление, АСРА являются высоко специфичными для RA и связаны с более тяжелым повреждением сустава и рентгенографическими данными (Klareskog L, et al., 2006, выше; van Gaalen FA, et al., 2004, выше; Meyer 0, et al., 2006, выше).
Иммунизация мышей, трансгенных по HLA-DRB1*0401, с
использованием цитруллинированного фибриногена, но не нативного
фибриногена, индуцировала воспалительный артрит, отличающийся
одновременной аутореактивностью В-клеток и Т-клеток в отношении
цитруллинированных и нативных HLA-DR-ограниченных эпитопов
фибриногена, чего не наблюдали у наивных мышей, трансгенных по
HLA-DRB1*0401. Способность цитруллинированного, а не нативного
фибриногена, индуцировать артрит позволяет предполагать, что
один или несколько цитруллинированных нео-аутоэпитопов нарушают
толерантность Т-клеток к соответствующим нативным эпитопам при
примировании или в результате распространения эпитопов (Hill
JA, et al., 2008. J. Exp. Med. 205:967-979). Кроме того,
недавние исследования позволяют предполагать, что доставка
абатасепта может восстанавливать толерантность к
цитруллинированным антигенам (Yue D, et al. , 2010. Arthritis
Rheum. 62:2 941-2 952). Несмотря на эти исследования на
трансгенных мышах, цитруллин-специфичные аутореактивные Т-
клетки трудно обнаруживать у пациентов с RA по причине слабых
пролиферативных ответов, вызываемых аутореактивными
эффекторными Т-клетками памяти in vitro. Однако в нескольких недавних статьях показаны убедительные цитокиновые ответы, вызываемые Т-клетками пациентов с RA в ответ на эпитопы цитруллинированного виментина и аггрекана (Snir О, et al. , 2011, выше; von Delwig A, et al. , 2010. Arthritis Rheum. 62: 143-149). В случае виментина иммуногенность эпитопа зависела от локализации цитруллиновой модификации в пептидной последовательности (Snir О, et al., 2011, выше).
Далее авторы настоящего изобретения представляют ответы
SE+ здоровых контролей и пациентов с RA на ряд
цитруллинированных и немодифицированных (нативных)
аутоантигенов и охарактеризовывают отвечающие Т-клетки. Их целью являлось: (1) идентифицировать цитруллинированные эпитопы, которые могут иметь конкретное значение при АСРА+ RA; (2) определить степень индивидуальной вариабельности среди Т-клеточных ответов на цитруллинированные аутоантигены; и (3) идентифицировать Т-клетки, участвующие в развитии АСРА+ RA.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично обусловлено неожиданным открытием того, что у пациентов с RA с длительно текущим заболеванием более вероятно возникает Т-лимфоцитарный ответ на многочисленные цитруллинированные аутоантигены, тогда как пациенты с недавно развившимся RA (включая ранее не подвергнутых лечению) более вероятно отвечают на отсутствие антигена или только на цитруллинированный аггрекан. Основываясь на этих наблюдениях, предполагают, что антигены, полностью или частично соответствующие аггрекану, включая цитруллинированный аггрекан, будут применимыми в иммунотерапевтических подходах для лечения или профилактики повреждения сустава, включая индивидуумов с ранним RA (например, случаи, когда клинические симптомы, такие как опухание суставов или боль, еще не присутствуют) или индивидуумов с риском развития RA (например, RA на ранней стадии).
Таким образом, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики повреждения сустава у индивидуума. Эти способы, как правило, включают, состоят или, по существу, состоят из вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа на полипептид аггрекан
(например, цитруллинированный полипептид аггрекан, также взаимозаменяемо обозначаемый в настоящем описании как полипептид "cit-аггрекан" или "cit-agg") у индивидуума, таким образом, чтобы осуществлять лечение или профилактику повреждения сустава. В некоторых вариантах осуществления индивидуум имеет ранний RA или RA на ранней стадии, и в иллюстративных примерах этого типа способы дополнительно включают определение того, что индивидуум имеет ранний RA или RA на ранней стадии, соответственно, до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа. В некоторых вариантах осуществления индивидуум является положительным на общий эпитоп
(SE), и в иллюстративных примерах этого типа способы дополнительно включают определение того, что индивидуум является положительным на SE до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа. Соответственно, индивидуум имеет иммунный
ответ или имеет риск развития иммунного ответа, включая эффекторный иммунный ответ (например, эффекторный Т-лимфоцитарный ответ, такой как, в качестве неограничивающего примера, ответ эффекторных CD4+ Т-лимфоцитов), на полипептид аггрекан (например, полипептид cit-agg) или его фрагменты. В неограничивающих примерах иммунный ответ включает продукцию (например, секрецию) по меньшей мере одного цитокина, выбранного из группы, состоящей из интерлейкина-б (IL-6), интерферона у (IFNy), фактора некроза опухоли (TNF) и интерлейкина-10 (IL-10). В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ включает провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ, включающий, состоящий или, по существу, состоящий из продукции (например, секреции) по меньшей мере одного цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-б, IFNy и TNF. В иллюстративных примерах этого типа провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ включает, состоит или, по существу, состоит из продукции (например, секреции) IL-б. Соответственно, иммунный ответ осуществляется, по меньшей мере, частично CD4+ CD2 8~ Т-лимфоцитами. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ осуществляется, по меньшей мере, частично CD4+ CD2 8+ Т-лимфоцитами. В конкретных вариантах осуществления, иммунный ответ осуществляется, по меньшей мере, частично CD4+ CD2 8~ Т-лимфоцитами и CD4+ CD2 8+ Т-лимфоцитами.
Антиген-специфичного толерогенного ответа можно достигать с использованием любой подходящей стратегии, иллюстративные примеры которой включают:
(1) повышение количества толерогенных
антигенпрезентирующих клеток у индивидуума, презентирующих
пептид (например, аутоантиген), соответствующий части
полипептида аггрекана (также обозначаемых в настоящем описании
как "аггрекан-специфичные толерогенные антигенпрезентирующие
клетки" или "agg-tolAPC"), где часть связана с
провоспалительным или аутореактивным Т-лимфоцитарным ответом на
полипептид аггрекан (например, полипептид cit-agg);
(2) индуцирование анергии или апоптоза провоспалительных
или аутореактивных Т-лимфоцитов (например, эффекторных Т-
лимфоцитов) у индивидуума, реактивных в отношении полипептида аггрекана (например, полипептида cit-agg) или его части; и
(3) повышение количества регуляторных или супрессорных Т-лимфоцитов у индивидуума, супрессирующих или иным образом снижающих провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ на полипептид аггрекан.
Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы
по настоящему изобретению включают, состоят или, по существу,
состоят из повышения количества agg-tolAPC у индивидуума,
чтобы, таким образом, осуществлять лечение или профилактику
повреждения сустава. В некоторых вариантах осуществления agg-
tolAPC стимулируют образование регуляторных или супрессорных Т-
лимфоцитов, супрессирующих или иным образом снижающих
провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ на
полипептид аггрекан (например, полипептид cit-аггрекан).
Соответственно, регуляторный или супрессорный Т-лимфоцит
экспрессирует по меньшей мере один маркер (например, 1, 2, 3,
4, 5 и т.д.) конститутивного регуляторного или супрессорного Т-
лимфоцита (например, по меньшей мере один маркер, выбранный из
CD4, CD25, CD62L, GITR, CTLA4) и фактор транскрипции Forkhead
box РЗ (FoxP3). Иллюстративные регуляторные или супрессорные Т-
лимфоциты включают, в качестве неограничивающих примеров,
CD4+CD2 5+ регуляторные Т-лимфоциты, Trl-лимфоциты, Т^З-
лимфоциты, и CD8+ регуляторные Т-лимфоциты. В конкретных
вариантах осуществления, регуляторный Т-лимфоцит является
CD4+CD2 5+ Т-лимфоцитом. Неограничивающие примеры
антигенпрезентирующих клеток включают дендритные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса, В-лимфоциты и искусственные антигенпрезентирующие клетки.
Аггрекан-специфичные толерогенные антигенпрезентирующие клетки можно получать с использованием любой подходящей стратегии. В некоторых вариантах осуществления их получают, приводя антигенпрезентирующие клетки (например, дендритные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса, В-клетки и т.д.) в контакт с: (1) по меньшей мере одним ингибитором NF-кВ В количестве, достаточном для ингибирования пути NF-кВ В
антигенпрезентирующих клетках; и/или (2) по меньшей мере одним
ингибитором mTOR в количестве, достаточном для ингибирования
mTOR в антигенпрезентирующих клетках; и/или (3) по меньшей мере
одним ингибитором Syk в количестве, достаточном для
ингибирования пути Syk в антигенпрезентирующих клетках, и с
молекулой антигена, выбранной из антигена, соответствующего
полностью или частично полипептиду аггрекану (например,
полипептиду cit-аггрекану), или молекулой нуклеиновой кислоты,
с которой экспрессируется антиген, в количестве, достаточном
для антигенпрезентирующих клеток, чтобы презентировать антиген
или его процессированную форму на своей поверхности. В
иллюстративных примерах этого типа способы включают, состоят
или, по существу, состоят из совместного введения индивидууму
(например, индивидууму, имеющему повреждение сустава или
имеющему риск развития повреждения сустава, такому как
индивидуум с ранним RA или RA на ранней стадии) ингибитора NF-
кВ и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего
полностью или частично полипептиду аггрекану (например,
полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с
которой экспрессируется антиген, где ингибитор вводят в
количестве, достаточном для ингибирования активности NF-кВ В
антигенпрезентирующей клетке индивидуума, и где молекулу
антигена вводят в количестве, достаточном для
антигенпрезентирующей клетки с ингибированной активностью NF-кВ, чтобы презентировать антиген или его процессированную форму иммунной системе индивидуума. В других иллюстративных примерах способы включают, состоят или, по существу, состоят из совместного введения индивидууму (например, индивидууму, имеющему повреждение сустава или имеющему риск развития повреждения сустава, такому как индивидуум с ранним RA или RA на ранней стадии) ингибитора mTOR и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, где ингибитор вводят в количестве, достаточном для ингибирования активности mTOR в антигенпрезентирующей клетке
индивидуума, и где молекулу антигена вводят в количестве,
достаточном для антигенпрезентирующей клетки с ингибированной
активностью mTOR, чтобы презентировать антиген или его
процессированную форму иммунной системе индивидуума. В других
иллюстративных примерах способы включают, состоят или, по
существу, состоят из совместного введения индивидууму
(например, индивидууму, имеющему повреждение сустава или
имеющему риск развития повреждения сустава, такому как
индивидуум с ранним RA или RA на ранней стадии) ингибитора Syk
и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего
полностью или частично полипептиду аггрекану (например,
полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с
которой экспрессируется антиген, где ингибитор вводят в
количестве, достаточном для ингибирования активности Syk в
антигенпрезентирующей клетке индивидуума, и где молекулу
антигена вводят в количестве, достаточном для
антигенпрезентирующей клетки с ингибированной активностью NF-
кВ, чтобы презентировать антиген или его процессированную форму
иммунной системе индивидуума. Соответственно, если молекула
антигена является молекулой нуклеиновой кислоты, с которой
экспрессируется антиген, молекула нуклеиновой кислоты, как
правило, находится в форме конструкции нуклеиновой кислоты,
содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген
и функционально связанную с регуляторным элементом, являющимся
функциональным в антигенпрезентирующей клетке. В этих вариантах
осуществления один или несколько ингибиторов (например, по
меньшей мере один ингибитор NF-кВ, И/ИЛИ ПО меньшей мере один
ингибитор mTOR, и/или по меньшей мере один ингибитор Syk) и/или
молекула антигена, как правило, находятся в форме, подходящей
для встраивания (например, посредством трансформации,
интернализации, эндоцитоза или фагоцитоза) в
антигенпрезентирующие клетки или их предшественников, включающей растворимые формы ингибитора и/или молекулы антигена и формы частиц.
В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки приводят в контакт по меньшей мере с одним ингибитором
пути NF-кВ, иллюстративные примеры которых представлены в таблицах 2, ЗА, ЗВ или 4 ниже. В конкретных вариантах осуществления ингибитором NF-кВ является куркумин или производное куркумина.
Аггрекановый антиген может содержать, состоять или, по
существу, состоять из аминокислотной последовательности,
соответствующей предполагаемому полноразмерному
цитруллинированному полипептиду аггрекану, включая его
непроцессированные, частично процессированные и зрелые формы.
Альтернативно, аггрекановый антиген может содержать, состоять
или, по существу, состоять из домена цитруллинированного
полипептида аггрекана, такого как, в качестве неограничивающих
примеров, домены Gl, G2 и G3. В некоторых вариантах
осуществления антиген содержит, состоит или, по существу,
состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей
эпитопу Т-клетки. В других вариантах осуществления антиген
содержит, состоит или, по существу, состоит из множества
пептидов, где отдельные пептиды содержат различные части
аминокислотной последовательности, соответствующей полипептиду
аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану). В
иллюстративных примерах этого типа пептиды являются перекрывающимися пептидами.
В родственных вариантах осуществления ингибитор (например, ингибитор NF-кВ, ингибитор mTOR, и/или ингибитор Syk) и молекулу антигена вводят совместно в растворимой форме или в форме частиц (например, молекула антигена и ингибитор находятся в растворимой форме, или один из молекулы антигена или ингибитора находится в растворимой форме, а другой находится в форме частиц, или молекула антигена и ингибитор находятся в форме частиц). В конкретных вариантах осуществления ингибитор и молекулу антигена вводят совместно в форме частиц. Например, ингибитор и молекула антигена могут содержаться в одной или нескольких частицах (например, наночастицах или микрочастицах, таких как липосомы и полимерные частицы), соответствующим образом способных быть захваченными антигенпрезентирующей клеткой. В конкретных вариантах осуществления ингибитор и
молекула антигена содержаться в одной частице. Ингибитор и молекулу антигена можно вводить посредством инъекции, местного применения или назальным или пероральным путем, включая способы введения с замедленным высвобождением, в течение периода времени и в количествах, соответствующим образом, эффективных для супрессии или иного снижения Т-лимфоцитарного ответа на полипептид аггрекан или для облегчения симптомов RA. В конкретных вариантах осуществления ингибитор и молекулу антигена вводят совместно подкожно.
В других вариантах осуществления agg-tolAPC получают посредством экспрессии в В-лимфоцитах молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, соответствующий полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану) , где экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к презентированию антигена или его процессированной формы на поверхности В-лимфоцитов. Желательно, в этих примерах молекула нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует иммуноглобулин (например, IgG) или фрагмент иммуноглобулина (например, фрагменты иммуноглобулина Fv, Fab, Fab' и F(ab')2/ тяжелую цепь иммуноглобулина и т.д.), слитый непосредственно или опосредованно с антигеном (например, смежный с С-концом антигена).
В некоторых вариантах осуществления способы включают, состоят или, по существу, состоят из введения agg-tolAPC или их предшественников индивидууму в количестве, эффективном для супрессии или иного снижения провоспалительного или аутореактивного Т-лимфоцитарного ответа на полипептид аггрекан
(например, полипептид cit-аггрекан) или для ингибирования
развития ответа. В иллюстративных примерах этого типа agg-
tolAPC или их предшественников получают посредством забора
антигенпрезентирующих клеток или предшественников
антигенпрезентирующей клетки у индивидуума или
гистосовместимого донора и подвергания их ex vivo воздействию:
(А1) по меньшей мере одного ингибитора NF-кВ В количестве,
достаточном для ингибирования пути NF-кВ В
антигенпрезентирующих клетках; и/или (А2) по меньшей мере
одного ингибитора mTOR в количествах, достаточных для ингибирования mTOR в антигенпрезентирующих клетках; и/или (A3) по меньшей мере одного ингибитора Syk в количестве, достаточном для ингибирования пути Syk в антигенпрезентирующих клетках, и (В) молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, в количестве, достаточном для антигенпрезентирующих клеток или их предшественников, чтобы презентировать антиген или его процессированную форму иммунной системе индивидуума.
В других иллюстративных примерах agg-tolAPC или их предшественников получают посредством забора В-лимфоцитов или предшественников В-лимфоцитов у индивидуума или у гистосовместимого донора и встраивания в них ex vivo молекулы нуклеиновой кислоты, функционально связанной с регуляторным элементом, являющимся функциональным в В-лимфоцитах, и кодирующей антиген, соответствующий полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), где экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к презентированию антигена или его процессированной формы на поверхности В-лимфоцитов. В конкретных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, слитый непосредственно или опосредованно с антигеном. Соответственно, при использовании предшественников их культивируют в течение периода времени и в условиях, достаточных для дифференцировки антигенпрезентирующих клеток из предшественников.
В других вариантах осуществления способы включают, состоят или, по существу, состоят из введения индивидууму комплекса МНС-пептид, по существу, состоящего из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), и выделенного (например, растворимому) компонента МНС, имеющего антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком.
В других вариантах осуществления способы включают, состоят
или, по существу, состоят из введения индивидууму химерной
конструкции, содержащей иммуномодулирующий пептид и
иммунологический или связывающийся с Т-клетками лиганд
(I/TCBL), где иммуномодулирующий пептид содержит, состоит или,
по существу, состоит из аминокислотной последовательности,
соответствующей части (например, аутоантигену) полипептида
аггрекана (например, полипептида cit-аггрекана),
соответственно, связанного с ревматоидным артритом (RA) и связывающегося с рецептором антигена (например, Т-клеточным рецептором) на провоспалительных или аутореактивных Т-лимфоцитах, и где I/TCBL связывается с классом или подклассом Т-клеток, выбранным из группы, состоящей из хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и цитотоксических Т-клеток, и модулирует активность Т-клеток. Соответственно, I/TCBL содержит, по меньшей мере, часть молекулы, выбранной из молекулы МНС класса I, молекулы МНС класса II, акцессорной молекулы, такой как (32-микроглобулин, молекулы функционально-связанного антигена лимфоцитов-3 (LFA-3), Fc-области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, молекул 1а+, антител против CD2, антител против CD3, антител против CD4, антител против CD8, антител против лектина, лимфокина.
В других вариантах осуществления способы включают, состоят
или, по существу, состоят из введения индивидууму измененного
пептидного лиганда (APL), содержащего, состоящего или, по
существу, состоящего из аминокислотной последовательности,
соответствующей части (например, аутоантигену) полипептида
аггрекана (например, полипептида cit-аггрекана),
соответственно, связанного с ревматоидным артритом (RA) и связывающегося с рецептором антигена (например, Т-клеточным рецептором) на провоспалительных или аутореактивных Т-лимфоцитах, где аминокислотная последовательность APL отличается от аминокислотной последовательности части по меньшей мере на одну замену, делецию или вставку аминокислоты, мешает нормальной передаче сигнала через рецептор антигена и обладает по меньшей мере одной активностью, выбранной из: (i) противодействия ответу Т-лимфоцитов на полипептид аггрекан
(например, полипептид cit-аггрекан), (ii) индуцирования анергии в аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана Т-лимфоцитах, (iii) индуцирования апоптоза в аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана Т-лимфоцитах, (iv) стимулирования или индуцирования аггрекан-специфичного или специфичного для цитруллинированного аггрекана Тй2-иммунного ответа, (v) супрессии развития аггрекан-специфичного или специфичного для цитруллинированного аггрекана Тй1-иммунного ответа, включая супрессию продукции провоспалительных цитокинов, (vi) стимулирования активации аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана регуляторных лимфоцитов (например, Т-регуляторных лимфоцитов (Treg)), или (vii) предотвращения или ингибирования активации аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана антигенпрезентирующих клеток в ответ на воспалительный стимул.
В родственных аспектах изобретение распространяется на применение средства для лечения или профилактики заболевания суставов (например, раннего RA или RA на ранней стадии) или в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики заболевания суставов (например, раннего RA или RA на ранней стадии), где средство выбрано из: (1) ингибитора пути NF-кВ И молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану
(например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (2) ингибитора mTOR и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (3) ингибитора пути Syk и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану) , или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (4) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, соответствующий
полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), для встраивания в В-лимфоциты, подробно описанной выше; (5) комплекса МНС-пептид, по существу, состоящего из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), и выделенного (например, растворимого) компонента МНС, имеющего антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком, подробно описанного выше; (б) химерной конструкции, подробно описанной выше; (7) аггрекан-специфичных толерогенных антигенпрезентирующих клеток, подробно описанных выше; или (8) APL, содержащего, состоящего или, по существу, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей части полипептида аггрекана (например, полипептида cit-аггрекана), подробно описанного выше.
Другой аспект настоящего изобретения относится к композициям, соответствующим образом применимым для лечения или профилактики повреждения сустава у индивидуума. Эти композиции, как правило, содержат, состоят или, по существу, состоят из средства, выбранного из: (1) ингибитора пути NF-кВ И молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану) , или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (2) ингибитора mTOR и молекулы антигена, выбранного из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (3) ингибитора пути Syk и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, подробно описанных выше; (4) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, соответствующий полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), для встраивания в В-лимфоциты, подробно описанной выше; (5) комплекса МНС-пептид, по существу, состоящего из антигена,
соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), и выделенного (например, растворимого) компонента МНС, имеющего антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком, подробно описанного выше; (6) химерной конструкции, подробно описанной выше; (7) аггрекан-специфичных толерогенных антигенпрезентирующих клеток, подробно описанных выше; или (8) APL, содержащего, состоящего или, по существу, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей части полипептида аггрекана (например, полипептида cit-аггрекана), подробно описанного выше.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фигура 1 является графическим представлением Т-клеточного пролиферативного ответа здоровых контролей и пациентов с RA, стимулированных цитруллинированными и нативными пептидами. РВМС и SFMC 2 0 пациентов с RA и б здоровых контролей инкубировали с 0, 3 или 30 мкг/мл пептидов или 4 Lfi/мл столбнячного токсина, как показано, в течение 5 дней. Пролиферацию Т-клеток оценивали по захвату [3Н]-тимидина. Каждая точка представляет одного индивидуума. ***р <0,001 в случае пациентов с RA и **р <0,01 в случае здоровых контролей при сравнении множества средних значений (тест Краскела-Уоллиса), **р <0,01 при сравнении РВМС здоровых контролей и пациентов с RA по ответу на столбнячный токсин (тест Манна-Уитни). *р <0,05 при сравнении ответа пациентов с RA на цитруллинированные и нативные пептиды аггрекана (тест Манна-Уитни).
Фигура 2 является графическим представлением сравнения нестимулированной секреции цитокинов и суммарной секреции IL-б мононуклеарными клетками пациентов с RA и здоровых контролей, стимулированными цитруллинированными и нативными пептидами. А: РВМС 17 пациентов с RA и б здоровых контролей инкубировали в среднем в течение 5 дней и оценивали цитокины в супернатантах посредством СВА. **р <0,01 при сравнении продукции IFNy с другими цитокинами (тест Краскела-Уоллиса с апостериорной коррекцией по Данну) . В: РВМС 17 пациентов с RA и б здоровых контролей инкубировали с 0, 3 или 30 мкг/мл пептидов, как
показано, и оценивали IL-б в супернатантах посредством СВА. Суммарную секрецию цитокинов вычисляли как [концентрация IL-б при стимуляция пептидом] минус [концентрация IL-б без стимуляции пептидом]. Каждая точка представляет собой одного индивидуума. *р <0,05, **р <0,01 при сравнении ответа с продукцией IL-б на цитруллинированные и нативные пептиды (критерий знаковых рангов Вилкоксона).
Фигура 3 является графическим представлением суммарной секреции TNF, IFNy, IL-10 и IL-17 РВМС пациентов с RA и здоровых контролей, стимулированных цитруллинированными и нативными пептидами. РВМС 17 пациентов с RA и б здоровых контролей инкубировали с 0, 3 или 30 мкг/мл пептидов, как показано, и оценивали цитокины в супернатантах посредством СВА. Суммарную секрецию цитокинов вычисляли, как показано на фигуре 2В. Каждая точка представляет собой одного индивидуума. *р <0,05 при сравнении ответа с продукцией IL-10 на цитруллинированный и нативный аггрекан (критерий знаковых рангов Вилкоксона).
Фигура 4 является графическим представлением цитокинов, продуцируемых клетками пациентов с RA и здоровыми контролями. Процентную долю пациентов с RA или здоровых контролей с положительными ответами (> 2 SD выше среднего ответа на соответствующий нативный пептид) вычисляли для каждого цитокина и строили графики для ответов на цитруллинированный фибриноген, аггрекан и коллаген типа II.
Фигура 5 является графическим представлением разнообразия реактивного ответа с продукцией IL-б на цитруллинированный пептид среди пациентов с RA и здоровых контролей. А: РВМС и SFMC 17 пациентов с RA и б здоровых контролей инкубировали с 0, 3 или 3 0 мкг/мл пептидов, как показано, и строили графики ответа с продукцией IL-б каждого индивидуума в супернатанте. Указывали длительность заболевания и тип HLA. В: Представлена частота пациентов с недавно начавшимся RA или длительным заболеванием с положительными ответами (> 2 SD выше среднего ответа на соответствующий нативный пептид) для каждого пептида.
Фигура б является графическим представлением секреции цитокинов субпопуляциями CD4+ Т-клеток. РВМС HLA-DR SE+
пациентов с RA и здоровых контролей инкубировали с 0 или 3 0 мкг/мл цитруллинированного фибриногена или цитруллинированного аггрекана, окрашивали с использованием mAb против CD4, CD2 8, IFNy и IL-б (А), или CD4, CD45RO, IL-б и IFNy (Е) , затем анализировали с помощью проточной цитометрии. В: Представлена стратегия гейтирования. С: График "флуоресценция минус один" (FMO), на котором показано фоновое окрашивание для внутриклеточного окрашивания на цитокины, гейтированное по CD4+ Т-клеткам. D: Окрашивание на IL-б гейтированных CD4~ не-Т-клеток. Доли (Е) IL-6+CD4+CD45RO+ Т-клеток составляли 2,2%, 5,3% и 7,1%, и доли IL-6+CD4+CD45RO~ Т-клеток составляли 0,8%, 2,1% и 4% в ответ на инкубацию без пептида, с цитруллинированным фибриногеном и цитруллинированным аггреканом, соответственно. Представлены два отдельных пациента с RA и 1 здоровый контроль. Представлены данные для 2 здоровых контролей и 5 пациентов с RA.
Фигура 7 является графическим представлением того, что ингибирование антигенпрезентирующих клеток пациента с RA с использованием ингибиторов NF-кВ, mTOR или Syk супрессирует их способность индуцировать продукцию цитокинов Т-клетками в ответ на цитруллинированный пептид аггрекан.
Фигура 8 является графическим представлением цитокинового ответа на эпитоп G1 цитруллинированного аггрекана у пациента с RA.
Фигура 9 является графическим представлением того, что специфичные для цитруллинированного аггрекана Т-клетки присутствуют в периферической крови пациентов с ревматоидным артритом, что определяют посредством окрашивания с использованием тетрамер.
Фигура 10 является графическим представлением количества и интенсивности флуоресценции cit-аггрекан-специфичных Т-клеток в периферической крови.
ТАБЛИЦА А
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
Идентификационный номер
последовательности
Последовательность
Длина
SEQ ID N0:1
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 1, приведенный в регистрационном номере GenBank NM 001135
7296 н.
SEQ ID N0:2
Полипептид, кодируемый SEQ ID N0:1
2431 а/к
SEQ ID N0:3
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 2, приведенный в регистрационном номере GenBank NM 013227
7593 н.
SEQ ID N0:4
Полипептид, кодируемый SEQ ID N0:3
2530 а/к
SEQ ID N0:5
Пептид Р22/25-36/39, соответствующий петле Gl А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:6
Пептид Р4 9-63, соответствующий петле G1 А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:7
Пептид Р70-84, соответствующий петле G1 А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:8
Пептид Р136-150, соответствующий петле G1 А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
16 а/к
SEQ ID N0:9
Пептид Р268-282, соответствующий петле G1 В' аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:10
Пептид P13-27, соответствующий петле Gl А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:11
Пептид P97-112, соответствующий петле Gl А аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID NO:12
Пептид Р155-169, соответствующий петле G1 В аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID NO:13
Пептид Р322-336, соответствующий петле G1 В' аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID NO:14
Пептид Р1530-1543, соответствующий области хондроитин сульфата (CS) аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID NO:15
Пептид Р2074-2086, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
13 а/к
SEQ ID N0:16
Пептид Р2205-2219, соответствующий домену G3 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID NO:17
Пептид Р2373-2387, соответствующий домену G3 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:18
Пептид Р2382-2396, соответствующий домену G3 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:19
Пептид Р570-582, соответствующий домену G2 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
13 а/к
SEQ ID N0:20
Пептид Р694-705, соответствующий домену кератан сульфата (KS) аггрекана, как описано в Buzas et al.*
12 а/к
SEQ ID N0:21
Пептид P846-859, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:22
Пептид Р968-978, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
11 а/к
SEQ ID N0:23
Пептид Р1055-1066, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
12 а/к
SEQ ID N0:24
Пептид Р1651-1664, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:25
Пептид Р1770-1783, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:26
Пептид Р1822-1835, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:27
Пептид Р18462-1858, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:28
Пептид Р1903-1916, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
14 а/к
SEQ ID N0:29
Пептид Р1989-2003, соответствующий области CS аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:30
Пептид Р2217-2231, соответствующий домену G3 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
15 а/к
SEQ ID N0:31
Пептид Р2363-2378, соответствующий домену G3 аггрекана, как описано в Buzas et al.*
16 а/к
SEQ ID N0:32
Пептид Р84-103, соответствующий
20 а/к
петле Gl А аггрекана
SEQ ID N0:33
Пептид P84-103, соответствующий петле Gl А аггрекана, с заменой R93Cit
20 а/к
SEQ ID N0:34
Пептид Р84-103, соответствующий петле G1 А аггрекана, с заменой R95Cit
20 а/к
SEQ ID N0:35
Пептид Р84-103, соответствующий петле G1 А аггрекана, с заменами R93Cit и R95Cit
20 а/к
SEQ ID N0:36
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 1, зрелый полипептид, приведенный в регистрационном номере GenBank NM 001135
7239 н.
SEQ ID N0:37
Зрелый полипептид, кодируемый SEQ ID N0:36
2412 а/к
SEQ ID N0:38
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 1, зрелый полипептид, приведенный в регистрационном номере GenBank NM 001135
7536 н.
SEQ ID N0:39
Зрелый полипептид, кодируемый SEQ ID N0:38
2511 а/к
SEQ ID N0:40
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 1, домен G1
906 н.
SEQ ID N0:41
Домен G1 аггрекана, кодируемый SEQ ID N0:40
302 а/к
SEQ ID N0:42
Нуклеотидная последовательность, соответствующая аггрекану человека (ACAN), вариант транскрипта 1,
591 н.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1. Определения
Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое общепринято понимают специалисты в области, к которой принадлежит изобретение. Хотя в практическом осуществлении или тестировании настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описываемым в настоящем описании, описывают предпочтительные способы и материалы. В целях по настоящему изобретению следующие термины описывают ниже.
В настоящем описании единственное число используют для обозначения от одного или до нескольких (т.е. по меньшей мере
одного) грамматических объектов. Например, "элемент" означает один элемент или несколько элементов.
В настоящем описании термин "приблизительно" используют для обозначения условий (например, количеств, концентраций, времени и т.д.), варьирующихся на целых 15% и, соответственно, на целых 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% указанного параметра.
Термины "одновременное введение" или "совместное введение" и т.п. относятся к введению одной композиции, содержащей два или более активных веществ, или введению каждого активного вещества в виде отдельных композиций и/или доставляемых отдельными путями одновременно или последовательно в течение достаточно короткого периода времени, такого, что эффективный результат эквивалентен получаемому в случае, когда все такие активные вещества вводят в виде одной композиции. С помощью термина "одновременно" обозначают, что активные средства вводят, по существу, в одно время и, желательно, совместно в одном составе. "Одновременно" означает, что активные средства вводят близко по времени, например, одно средство вводят в пределах приблизительно от одной минуты до приблизительно одного дня до или после другого. Применимы любые одновременные периоды времени. Однако, часто при неодновременном введении средства будут вводить в пределах от приблизительно одной минуты до приблизительно восьми часов, и, предпочтительно, в пределах менее чем приблизительно от одного до приблизительно четырех часов. При одновременном введении средства соответствующим образом вводят индивидууму в одно и то же место. Термин "одно и то же место" включает конкретную локализацию, но может включать в пределах от приблизительно 0,5 до приблизительно 15 сантиметров, предпочтительно, в пределах приблизительно от 0,5 до приблизительно 5 сантиметров. Как используют в настоящем описании, термин "раздельно" означает, что средства вводят с интервалом, например, с интервалом приблизительно от дня до нескольких недель или месяцев. Активные средства можно вводить в любом порядке. Как используют в настоящем описании, термин "последовательно" означает, что
средства вводят в последовательности, например, с интервалом или интервалами в минуты, часы, дни или недели. Если подходящие активные средства можно вводить в регулярном повторяющемся цикле.
Как используют в настоящем описании, термин "анергия" относится к супрессированному ответу или состоянию неотвечаемости иммунной системы на конкретный антиген или группу антигенов. Например, Т-лимфоциты и В-лимфоциты являются энергичными, если они не могут отвечать на их специфичный антиген в оптимальных условиях стимуляции.
Термин "антиген" означает весь белок или часть белка, пептида или другой молекулы или макромолекулы, способной вызывать иммунный ответ у позвоночного животного, в частности, млекопитающего. Такие антигены также являются реактивными в отношении антител животных, иммунизированных таким белком, пептидом или другой молекулой или макромолекулой.
Термин "антигенсвязывающая молекула" означает молекулу,
обладающую аффинностью связывания в отношении антигена-мишени.
Следует понимать, что этот термин распространяется на
иммуноглобулины, фрагменты иммуноглобулинов и полученные не из
иммуноглобулинов белковые каркасы, проявляющие
антигенсвязывающую активность.
Термин "аутологичный" означает что-либо (например, клетки, ткани и т.д.), полученное из одного организма.
Как применяют в настоящем описании, термин "аллогенный" относится к клеткам, тканям, организмам и т.д., имеющим разную генетическую структуру.
Термин "аллоантиген" означает антиген, обнаруживаемый только у некоторых особей вида, такой как антигены группы крови. В отличие от этого, "ксеноантиген" относится к антигену, присутствующему у особей одного вида, но не у особей другого. Соответственно, "аллотрансплантат" является трансплантатом для особей одного и того же вида, и "ксенотрансплантат" является трансплантатом для особей разных видов.
Как используют в настоящем описании, термин "биологический образец" относится к образцу индивидуума, который можно
экстрагировать, не обрабатывать, обрабатывать, разводить или концентрировать. Биологический образец может включать биологическую жидкость, такую как цельная кровь, сыворотка, плазма, слюна, моча, пот, асцитическая жидкость, перитонеальная жидкость, синовиальная жидкость, амниотическая жидкость, цереброспинальная жидкость, биоптат и т.п. В определенных вариантах осуществления биологический образец выбран из синовиальной жидкости и крови, включая периферическую кровь.
"Клиническое улучшение" относится к профилактике дальнейшего прогрессирования RA или повреждения сустава или любому улучшению RA или повреждения сустава в результате лечения, определяемому посредством различных тестов, включая рентгенографические тесты. Таким образом, клиническое улучшение, например, можно определять, оценивая количество болезненных или опухших суставов, оценивая баллы по шкалам Disease Activity Score (DAS) или American College of Rheumatology (ACR), осуществляя общее клиническое обследование индивидуума, оценивая скорость оседания эритроцитов или уровень С-реактивного белка.
На всем протяжении настоящего описания, если контекст не требует иного, слова "содержат", "содержит" и "содержащий" следует понимать как подразумевающие включение указанной стадии или элемента или группы стадий или элементов, но не исключение любой другой стадии или элемента или группы стадий или элементов. Таким образом, использование термина "содержащий" и т.п. указывает на то, что указанные элементы являются необходимыми или обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать. Термин "состоящий из" означает неограничивающее включение всего, что следует за фразой "состоящий из". Таким образом, фраза "состоящий из" указывает на то, что приведенные элементы являются необходимыми или обязательные, и что другие элементы не могут присутствовать. Термин "по существу, состоящий из" означает включение любых элементов, приведенных после фразы, и ограничен другими элементами, которые не мешают или участвуют в активности или действии, указанном в описании для приведенных
элементов. Таким образом, фраза "по существу, состоящий из" указывает на то, что элементы являются необходимыми или обязательными, но другие элементы являются необязательными и могут присутствовать или не присутствовать, в зависимости от того, влияют ли они или нет на активность или действие приведенных элементов.
Термин "соответствует" или "соответствующий" означает, что
антиген, кодирующий аминокислотную последовательность,
проявляет существенную схожесть с аминокислотной
последовательностью антигена-мишени. В основном, антиген будет проявлять по меньшей мере приблизительно 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% схожесть по меньшей мере с частью антигена-мишени.
Термины "цитруллин" и "Cit" относятся к 2-амино-5-(карбамоиламино)пентаноевой кислоте и означают а-аминокислоту с формулой : H2NC (О) NH (СН2) 3СН (NH2) С02Н .
Выражение "эффективное количество" относится к количеству средства или лекарственного средства в однократной дозе или представляющему часть серии, являющемуся эффективным для лечения или профилактики RA или повреждения сустава. Оно будет включать количество, являющееся эффективным для достижения снижения RA или повреждения сустава по сравнению с исходным уровнем до введения такого количества, например, как определяют посредством рентгенографического или другого тестирования. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, подлежащего лечению, таксономической группы индивидуума, подлежащего лечению, состава композиции, оценки медицинской обстановки и других соответствующих факторов. Ожидают, что количество будет попадать в относительно широкий диапазон, который можно определять с помощью общепринятых способов исследований.
Как используют в настоящем описании, "генотерапия" относится к встраиванию ex vivo или in vivo гена или генов в отдельные клетки или группы клеток (такие как ткани или органы), посредством чего экспрессия гена или генов в клетках
или группах клеток обеспечивает терапевтический эффект. Такие "терапевтические гены", как правило, доставляют с использованием вектора. Клетки, на которые воздействуют посредством генотерапии, могут являться соматическими клетками, или половыми клетками, или клеточными линиями. Генотерапия включает и охватывает использование векторов для доставки ех vivo или in vivo гена, для которого необходима гиперэкспрессия или эктопическая экспрессия в клетке или группе клеток. Вектор может облегчать интеграцию нового гена в ядре или может приводить к эписомальной экспрессии этого гена.
Термин "иммунные эффекторные клетки" относится к клеткам, способным связывать антиген и опосредующим иммунный ответ, избирательный для антигена. Эти клетки включают, в качестве неограничивающих примеров, Т-клетки (Т-лимфоциты), В-клетки (В-лимфоциты), моноциты, макрофаги, природные киллеры (NK) и цитотоксические Т-лимфоциты (CTL), например, линии CTL, клоны CTL и CTL из опухолевого, воспалительного или других инфильтратов.
Упоминание в настоящем описании термина "иммунореактивный" включает указание на любое взаимодействие, реакцию или другую форму взаимосвязи молекул, в частности, когда одна из молекул является компонентом иммунной системы или имитирует его.
Термин "повреждение сустава" используют в настоящем описании в самом широком смысле, и он относится к повреждению или частичной или полной деструкции любой части одного или нескольких суставов, включая соединительную ткань и хрящ, где повреждение включает структурное и/или функциональное повреждение любой этиологии, и может вызывать или не вызывать боль в суставе или артралгию. Оно включает, в качестве неограничивающих примеров, повреждение сустава, связанное с или возникшее в результате воспалительного заболевания сустава, а также невоспалительного заболевания сустава. Это повреждение может быть вызвано любым состоянием, таким как аутоиммунное заболевание, в частности, артрит, и особенно RA. Примеры состояний этого типа включают острый и хронический артрит, RA, включая ювенильный RA, ювенильный идиопатический артрит (JIA)
или ювенильный RA (JRA), и состояния, такие как ревматоидный
синовит, подагру или подагрический артрит, острый артрит
иммунологического генеза, хронический воспалительный артрит,
дегенеративный артрит, артрит, индуцированный коллагеном типа
II, инфекционный артрит, септический артрит, Лайм-артрит,
пролиферативный артрит, псориатический артрит, болезнь Стилла,
вертебральный артрит, остеоартрит, хронический прогредиентный
артрит, деформирующий артрит, первичный хронический полиартрит,
реактивный артрит, менопаузальный артрит, артрит в результате
снижения уровня эстрогена и анкилозирующий
спондилит/ревматоидный спондилит, ревматическое аутоиммунное заболевание, иное, чем RA, и значительные системные изменения, вторичные относительно RA (включая, в качестве неограничивающих примеров, васкулит, легочный фиброз или синдром Фелти). В целях по настоящему описанию суставы являются участками контакта между элементами скелета (позвоночного, такого как животного) с частями, окружающими и поддерживающими его, и включают, в качестве неограничивающих примеров, например, тазобедренные суставы, суставы между позвонками, суставы между позвоночником и тазом (крестцово-подвздошные сочленения), суставы, где сухожилия и связки прикрепляются к костям, суставы между ребрами и позвоночником, плечевые суставы, коленные суставы, суставы стопы, локтевые суставы, суставы кисти рук, суставы пальцев рук, голеностопные суставы и суставы пальцев ног, но особенно суставы кистей рук и стоп.
В настоящем описании термин "уровень" или "функциональная активность" в отношении продукта экспрессии генов (например, белка или транскрипта), продуцируемого конкретной клеткой, следует понимать в самом широком смысле, и он включает уровень или функциональную активность продукта экспрессии, продуцируемого одной клеткой или множеством или популяцией клеток. Таким образом, в последнем случае следует понимать, что фраза будет включать средний уровень или функциональную активность белка, продуцируемого множеством или популяцией клеток.
Термин "фармацевтически приемлемый носитель" означает
твердый или жидкий носитель, растворитель или инкапсулирующее вещество, которое можно безопасно использовать при местном или системном введении.
Термины "полиартрит" и "синовит" в настоящем описании используют взаимозаменяемо в отношении воспаления, т.е. отека, болезненности или гипертермии, в одном или несколько суставов индивидуума.
В настоящем описании термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют взаимозаменяемо в отношении полимера аминокислотных остатков и его вариантов и синтетических аналогов. Таким образом, эти термины используют в отношении аминокислотных полимеров, в которых один или несколько аминокислотных остатков являются синтетической неприродной аминокислотой, такой как химический аналог соответствующей природной аминокислоты, а также в отношении природных аминокислотных полимеров.
Как используют в настоящем описании, термин "профилактика" относится к профилактическим или превентивным мерам. Нуждающиеся в профилактике включают тех, у кого RA или повреждение сустава подлежат профилактике, и в некоторых вариантах осуществления они могут иметь предрасположенность к RA или повреждению сустава, например, индивидуумы с семейным анамнезом RA или индивидуумы, имеющие HLA-SE и антитела против цитруллинированных пептидов, но не соответствующие критериям ACR/EULAR 2010 года для RA. В настоящем описании профилактику считают успешной, если полностью или частично предотвращают или замедляют развитие RA или повреждения сустава по сравнению с развитием RA, или повреждения сустава или структурного повреждения в отсутствие толерогенеза.
Термин "регуляторный лимфоцит" означает лимфоцит, участвующий в регуляции или супрессии ответов и действий других клеток, особенно других иммунных клеток, таких как В-лимфоциты, Т-хелперы и врожденные лимфоциты (включая NKT и гамма-дельта Т-клетки).
Как используют в настоящем описании, термин "ревматоидный артрит" или "RA" относится к общепризнанному болезненному
состоянию, которое можно диагностировать в соответствии с
пересмотренными в 2 000 году критериями American Rheumatoid
Association для классификации RA или любыми аналогичными
критериями. Термин включает не только активный и ранний RA, но
также и RA на ранней стадии, как определено ниже.
Физиологические показатели RA включают симметричное опухание
суставов, что характерно, и при этом неизменно при RA.
Развивается веретенообразное опухание проксимальных
межфаланговых (PIP) суставов кистей рук, а также, как правило, затрагиваются пястно-фаланговые (МСР), лучезапястные, локтевые, коленные, голеностопные и плюснефаланговые (МТР) суставы, и их опухание легко определять. Боль при пассивном движении является наиболее чувствительным тестом для воспаления суставов, и воспаление и структурная деформация часто ограничивают диапазон движения в пораженном суставе. Типичные видимые изменения включают локтевое отведение пальцев в МСР-суставах, гиперэкстензию или гиперфлексию МСР- и Р1Р-суставов, сгибательные контрактуры локтевых суставов и подвывих костей запястья и пальцев ног. RA включает, например, ювенильный RA, ювенильный идиопатический артрит (JIA) или ювенильный RA (JRA). Пациент с "активным ревматоидным артритом" означает пациента с активными и нелатентными симптомами RA. Индивидуумы с "ранним ревматоидным артритом" являются индивидуумами, кого диагностировали как имеющих "определенный" RA в течение не более четырех лет, не более трех лет, не более двух лет, не более одного года, не более шести месяцев, где определенный RA диагностировали, когда клинические параметры индивидуума представляли > б/10 баллов согласно пересмотренным в 2010 году критериям American College of Rheumatology (ACR)/European League Against Rheumatism (EULAR) для классификации RA (Aletaha et al., 2010. Arthritis & Rheumatism 62 (9):2569-2581, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Пациенты с "RA на ранней стадии" имеют ранний полиартрит (синовит), который не полностью соответствует критериям ACR/EULAR для диагностики определенного RA (например, < 6/10 баллов). В конкретных примерах полиартрит связан с
наличием RA-специфичных прогностических биомаркеров, таких как антитела против циклических цитруллинированных пептидов (ССР) и SE+.
Как используют в настоящем описании, термины "общий
эпитоп", или "SE", или "ревматоидный эпитоп" означают мотивы
последовательностей в остатках с 70 по 74 третьей
гипервариабельной области цепи HLA-DRB1, кодируемой аллелями
HLA-DRB1*0401, *0404/0408, *0405, *0409, *0410, *0413, *0416,
*0101, *0102, *0104, *1001, *1402 и *1406, с
предрасположенностью к RA. В частности, мотивы
последовательностей отличаются последовательностью, кодирующей аминокислоты QKRAA (SEQ ID N0:46), или QRRAA (SEQ ID N0:47) или RRRAA (SEQ ID N0:48) в третьей гипервариабельной области, включающей аминокислотные остатки с 7 0 по 7 4 цепи HLA-DRB1 молекулы класса II главного комплекса гистосовместимости. Т.к. при типировании ДНК исследуют аллели в указанном локусе, название локуса предшествует обозначению конкретного аллеля (при этом два термина разделяют звездочкой); например, HLA-DRB1*0401 относится к аллелю 0401 локуса HLA-DRB1. Один конкретный HLA-DR кодируется несколькими аллелями HLA-DRB1 в комбинации с продуктом локуса HLA-DRA1; например, более 11 аллелей HLA-DRB1 (HLA-DRB1 с *0401 по *0411) могут кодировать В-цепь HLA-DR4. В целях по настоящему изобретению отвечаемость на лечение RA с использованием аггрекан-специфичной толерогенной терапии положительно коррелирует с встречаемостью или наличием этого генетического биомаркера у пациентов с аллелями SE, являющихся гомозиготами или гетерозиготами.
Термины "индивидуум", "пациент", используемые в настоящем описании взаимозаменяемо, относятся к любому индивидууму, в частности, индивидууму из подтипа позвоночных, и даже более конкретно, индивидууму из класса млекопитающих, для которого желательна терапия или профилактика. Подходящие позвоночные животные, попадающие в объем изобретения, включают, в качестве неограничивающих примеров, любую особь подвида Хордовые, включая людей, а также не являющихся человеком приматов, грызунов (например, мышей крыс, морских свинок), зайцеобразных
(например, кроликов, зайцев), бычьих (например, крупный рогатый скот), баранов (например, овцу), козьих (например, коз) , свиньих (например, свиней), лошадиных (например, лошадей), собачьих (например, собак), кошачьих (например, кошек), птичьих
(например, кур, индеек, уток, гусей, птиц-компаньонов, таких как канарейки, волнистые попугайчики и т.д.), морских млекопитающих (например, дельфинов, китов), пресмыкающихся
(змей, лягушек, ящериц и т.д.) и рыб. В конкретных вариантах осуществления "индивидуум" или "пациент" является человеком, нуждающимся в лечении или профилактике повреждения сустава, включая индивидуумов с ранним RA или индивидуумов с риском развития RA (например, RA на ранней стадии). В конкретных вариантах осуществления термины "индивидуум" или "пациент" относятся к любому одному человеку, включая пациента, подходящего для лечения, имеющего один или несколько признаков, симптомов или других показателей RA или повреждения сустава, например, недавно диагностированных или диагностированных ранее, и в настоящее время испытывающего рецидив или имеющего риск развития RA или повреждения сустава независимо от причины. Предназначенными для включения в качестве "индивидуумов" или "пациентов" являются любые индивидуумы, участвующие в клинических научных исследованиях, не демонстрирующие каких-либо клинических признаков заболевания, или индивидуумы, участвующие в эпидемиологических исследованиях, или индивидуумы, используемые в качестве контролей. "Индивидуума" или "пациента" могли ранее подвергать лечению с использованием лекарственного средства от RA или повреждения сустава или не подвергать такому лечению.
Термин "супрессия", "супрессирующий" и т.п. означает любую аттенуацию или регуляцию иммунного ответа, включая В-лимфоцитарный и Т-лимфоцитарный иммунные ответы, на антиген или группу антигенов. В некоторых вариантах осуществления аттенуация опосредована, по меньшей мере, частично супрессорными Т-лимфоцитами (например, CD4+CD2 5+ регуляторными Т-лимфоцитами).
Как используют в настоящем описании, термин "поверхностно
активное вещество" относится к любому средству, предпочтительно, абсорбирующемуся на поверхности раздела между двумя несмешивающимися фазами, такой как поверхность раздела между водой и раствором органического полимера, поверхность раздела вода/воздух или поверхность раздела органический растворитель/воздух. Поверхностно-активные вещества, как правило, содержат гидрофильный остаток и липофильный остаток, таким образом, что после абсорбции на микрочастицах, они имеют тенденцию экспонировать во внешнее окружение остатки, не притягивающие аналогично покрытые частицы, таким образом, снижая агломерацию частиц. Поверхностно-активные вещества также могут способствовать абсорбции терапевтического или диагностического средства и повышать биодоступность средства.
Как используют в настоящем описании, термин частица, "включающая поверхностно-активное вещество", относится к частице с поверхностно-активным веществом, по меньшей мере, на поверхности частицы. Поверхностно-активное вещество можно включать во всю частицу и на ее поверхности при получении частицы, или им можно покрывать частицу после ее получения. Поверхностно-активным веществом можно покрывать поверхность частицы посредством абсорбции, ионного или ковалентного присоединения или подвергать физическому "захвату" окружающей матрицей. Например, поверхностно-активное вещество можно включать в частицы с контролируемым высвобождением, такие как полимерные микросферы.
"Симптом" RA или повреждения сустава является любым патологическим явлением или отклонением от нормы по структуре, функции или ощущению, испытываемому индивидуумом и свидетельствующему об RA или повреждении сустава, таким, как указано выше, включая болезненность или опухание суставов.
"Общая модифицированная шкала Шарпа" означает баллы, получаемые при оценке рентгенограмм с использованием способа Шарпа, модифицированного по Genant (1983, Am. J. Med., 30:3547). Первичной оценкой будет являться изменение общих баллов по шкале Шарпа-Генанта при скрининге. В шкале Шарпа-Генанта комбинируют баллы при оценке эрозии и баллы при оценке сужения
полостей суставов кистей рук и стоп. В этом тесте повреждение сустава измеряют, подсчитывая баллы среднего изменения, меньшие, чем баллы при первоначальной оценке (когда пациента подвергают скринингу или тестируют до первого введения толерогенной композиции, как представлено в настоящем описании).
Как используют в настоящем описании, термин "трансдукция" или "трансдуцированный" в отношении встраивания чужеродной или экзогенной нуклеиновой кислоты, как правило, ДНК, в клетку включает "стабильную трансдукцию" и "транзиентную трансдукцию". "Стабильная трансдукция" или "стабильно трансдуцированный" относится к встраиванию и интеграции чужеродной или экзогенной нуклеиновой кислоты в геном трансдуцированной клетки. Термин "стабильный трансдуктант" относится к "клетке, содержащей стабильную встроенную чужеродную ДНК в геномной ДНК". Напротив, термин "транзиентная трансдукция" или "транзиентно трансдуцированный" относится к встраиванию чужеродной или экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку, где чужеродная или экзогенная ДНК не может интегрироваться в геном трансдуцированной клетки. Чужеродная или экзогенная ДНК присутствует в ядре трансдуцированной клетки в течение нескольких дней. В течение этого времени чужеродная или экзогенная ДНК подвергается регуляторному контролю, управляющему экспрессией эндогенных генов в хромосомах. Термин "транзиентный трансдуктант" относится к клеткам, захватывающим чужеродную или экзогенную ДНК, но не интегрирующим эту ДНК.
В настоящем описании термин "лечение" индивидуума относится к терапевтическому лечению. Нуждающиеся в лечении включают уже имеющих RA или повреждение сустава, а также тех, у кого прогрессирование RA или повреждения сустава подлежит профилактике. Таким образом, индивидуума можно диагностировать, как имеющего RA или повреждение сустава, или он может иметь симптомы RA или повреждения сустава, которое, вероятно, будет прогрессировать в отсутствие лечения. Альтернативно, индивидуум может не иметь симптомов, но имеет факторы риска развития RA, например, положительный семейный анамнез и/или наличие
аутоантител, таких как АСРА или ревматоидный фактор, или доказательство воспалительного фенотипа в периферической крови. По настоящему изобретению лечение является удачным, если RA или повреждение сустава облегчают или излечивают, или прогрессирование RA или повреждения сустава, включая его признаки и симптомы и/или структурное повреждение, останавливают или замедляют по сравнению с состоянием индивидуума до введения. Удачное лечение дополнительно включает полную или частичную профилактику развития повреждения сустава или структурного повреждения. В целях по настоящему изобретению замедление или снижение RA или повреждения сустава или прогрессирования повреждения сустава является тем же, что и задержка, снижение или реверсирование RA или повреждения сустава.
Термины "дикий тип" и "норма" используют взаимозаменяемо для обозначения фенотипа, характерного для большинства особей вида, имеющего место в природе и противоположного, например, фенотипу мутанта.
Как используют в настоящем описании, подчеркивание или выделение курсивом названия гена должно указывать на ген, в отличие от его белкового продукта, который указывают по названию гена в отсутствие подчеркивания или выделения курсивом. Например, аббревиатура "ACAN" должна означать ген ACAN (т.е. ген, кодирующий аггрекан), в то время как аббревиатура "ACAN" должна означать белковый продукт или продукты, образующиеся при транскрипции и трансляции и альтернативном сплайсинге гена "ACAN".
2. Сокращения
Следующие сокращения используют на всем протяжении заявки:
а/к = аминокислоты
ACAN = ген аггрекана
ACAN = полипептид аггрекан
АСРА = антитела против цитруллинированных пептидов agg-tolAPC = аггрекан-специфичные антигенпрезентирующие клетки
АРС = антигенпрезентирующие клетки
cit-agg = цитруллинированный аггрекан д = день
ГМ-КСФ = гранулоцитарно-макрофагальный
колониестимулирующий фактор ч = час
IL-2 = интерлейкин 2
IL-3 = интерлейкин 3
IL-б = интерлейкин б
IL-10 = интерлейкин 10
IL-12 = интерлейкин 12
IL-17 = интерлейкин 17
т.п.н. = тысяча пар нуклеотидов
кДа = килодальтоны
н. = нуклеотид
РВ = периферическая кровь
РВМС = мононуклеарные клетки периферической крови
RA = ревматоидный артрит
с = секунды
SE = общий эпитоп
TCR = Т-клеточный рецептор
tolAPC = толерогенные антигенпрезентирующие клетки
TNF = фактор некроза опухоли
3. Способы осуществления изобретения
Настоящее изобретение частично основано на обнаружении того, что у пациентов с ранним RA, по всей вероятности, развивается Т-лимфоцитарный ответ, включая провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ, в отсутствие аутоантигена или на цитруллинированный аггрекан в отдельности, в то время как у пациентов с длительным RA, по всей вероятности, развивается Т-лимфоцитарный ответ, включая провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ, на множество аутоантигенов. Эти результаты позволяют предполагать, что Т-лимфоцитарные ответы на цитруллинированный аггрекан, включая провоспалительные Т-лимфоцитарные ответы, предшествуют гетерогенному развитию Т-лимфоцитарного ответа на другие цитруллинированные аутоэпитопы при прогрессировании RA. Также обнаружено, что пациенты с RA с любой длительностью
заболевания, более вероятно, отвечают на цитруллинированный
аггрекан, а не на другие цитруллинированные аутоэпитопы.
Основываясь на этих данных, авторы настоящего изобретения
предполагают, что антигены, полностью или частично
соответствующие полипептиду аггрекану, включая его
цитруллинированные формы, будут делать возможным более ранее терапевтическое и/или профилактическое вмешательство в отношении повреждения сустава у пораженных или предрасположенных индивидуумов, включая индивидуумов с ранним RA и индивидуумов с риском развития RA, соответственно, до прогрессирования заболевания в хроническую и инвалидизирующую форму RA, и что терапевтическое применение цитруллинированных аггрекановых антигенов, в целом, будет обеспечивать более широкий охват популяции индивидуумов с RA, чем другие цитруллинированные антигены.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способам лечения или профилактики повреждения сустава у индивидуума посредством антиген-специфичной супрессии иммунного ответа (также обозначаемой в настоящем описании как "антиген-специфичный толерогенный ответ") на полипептид аггрекан.
3.1 Аггрекан-специфичный иммунный ответ и пораженные индивидуумы
Полипептид аггрекан, как правило, является
цитруллинированным, в котором по меньшей мере один остаток аргинина в последовательности аггрекана преобразован в цитруллин. При желании, наличие цитруллинированного полипептида аггрекана можно определять с использованием анализов, в которых напрямую определяют цитруллинированный аггрекан, иллюстративные примеры которых включают масс-спектрометрический анализ, как описано, например, в Goeb et al. (2009, Arthritis Research & Therapy 11:R38), Stensland et al. (2009, Rapid Commun Mass Spectrom. 23 (17):2754-2762), Hermansson et al. (2010, Proteomics Clin Appl. 4 (5) : 511-518), van Beers et al. (2010, Arthritis Res Ther. 12(6):R219), and De Ceuleneer et al. (2011, Rapid Commun Mass Spectrom. 25(11):153б-1542), включенных, таким образом, в качестве ссылок в настоящее описание в полном
объеме. Альтернативно, можно использовать иммунологические анализы, например, в которых используют антитела против модифицированного цитруллина для определения остатков цитруллина в интересующем антигене и, необязательно, антиген-специфичные антитела для определения самого интересующего антигена (т.е. цитруллинированного или нет) . Неограничивающие примеры иммунологических анализов этого типа описаны Tilleman et al. (2008, Rheumatology 47:597-604), Tabushi et al. (2008, Annals of Clinical Biochemistry 45:413-417) и в патентной заявке США № 2011/0244492, включенных, таким образом, в качестве ссылок в настоящее описание в полном объеме. В других примерах наличие цитруллинированного аггрекана можно определять косвенно, определяя АСРА, специфичные для цитруллинированного аггрекана. Соответствующие анализы этого типа можно осуществлять с использованием одного или нескольких пептидов, соответствующих цитруллинированному полипептиду аггрекану, (cit-agg-специфичных пептидов) или белка, соответствующего цитруллинированному полипептиду аггрекану в качестве антигена, и определением связывания cit-agg-специфичных АСРА, содержащихся в образце, с пептидным антигеном с помощью соответствующих средств. АСРА можно определять с помощью гомогенных форматов анализа (например, посредством агглютинации латексных частиц, покрытых пептидом cit-agg), с помощью гетерогенных иммунологических анализов (например, на основе прямого или непрямого покрывания пептидом cit-agg твердой фазы, инкубации твердой фазы с образцом, который, как известно или предположительно, содержит cit-agg-специфичные АСРА в условиях, делающих возможным связывание антител АСРА с пептидным антигеном, и прямого или косвенного определения связавшихся АСРА) или с использованием двойного анализа с антигенным мостиком, в котором пептид cit-agg используют как со стороны твердой фазы, так и со стороны детектирования. Неограничивающие примеры анализов с антиген-специфичными АСРА этого типа описывают, например, в Wegner et al. (2010, выше) и указанных в ней библиографических ссылках, включенных, таким образом, в качестве ссылок в настоящее описание в полном объеме.
В конкретных вариантах осуществления индивидуума определяют как имеющего категорию RA, выбранную из раннего RA или RA на ранней стадии, как представлено в настоящем описании, и в иллюстративных примерах этого типа способы дополнительно включают определение того, что индивидуум имеет категорию RA до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа. Категорию RA можно определять с использованием любых подходящих клинических параметров, известных специалистам в данной области, неограничивающие примеры которых включают: 1) возраст; 2) пол; 3) распределение пораженных суставов; 4) длительность утренней тугоподвижности; 5) количество болезненных суставов (например, с положительным результатом при сдавливании пястно-фаланговых или плюснефаланговых суставов); б) количество опухших суставов; 7) боль в суставах; 8) предыдущие эпизоды; 9) семейный анамнез RA; 10) наличие или отсутствие системных подобных простуде признаков и утомляемости; 11) симметричное вовлечение суставов кистей рук и/или стоп; 12) скорость оседания эритроцитов; 13) уровень С-реактивного белка; 14) уровень высокочувствительного С-реактивного белка; 15) уровень ревматоидного фактора (RF); 16) наличие, отсутствие или уровень антител АСРА; 17) наличие, отсутствие или уровень антител против мутантного цитруллинированного виментина (антитела против MCV); 18) наличие или отсутствие SE; 19) наличие, отсутствие или уровень J-белка, Hdj 2 (например, в синовиальной жидкости); 20) ревматоидные узелки или 21) рентгенографические изменения. В конкретных вариантах осуществления наличие или отсутствие RA оценивают с использованием критериев классификации RA ACR/EULAR 2010 года, как описывают в Aletaha et al. (2010, выше), представленных в таблице 1.
Таблица 1
Целевая популяция для тестирования: Пациенты, которые
1. имеют по меньшей мере 1 сустав с определенным
клиническим синовитом (опухание)*
2. с синовитом, не объясняемым другим заболеванием+
Баллы
Критерии классификации RA (алгоритм на основе баллов:
что и в Aletaha et al. (2010, выше).
В иллюстративных примерах индивидуума определяют как имеющего ранний RA, если индивидуума идентифицировали, как имеющего "определенный" RA в течение не более четырех лет, не более трех лет, не более двух лет, не более одного года, не более шести месяцев, где определенный RA идентифицируют, если оцениваемые клинические параметры индивидуума составляют > б/10 баллов согласно критериям ACR/EULAR 2 010 года. В других
иллюстративных примерах индивидуума определяют, как имеющего RA на ранней стадии, если индивидуум имеет полиартрит (синовит), но не полностью соответствует критериям ACR/EULAR для диагностики определенного RA (например, <б/10 баллов). В конкретных примерах полиартрит связан с наличием RA-специфичных прогностических биомаркеров, таких как антитела АСРА и положительный общий эпитоп (SE+) . Индивидуумы с RA на ранней стадии включают положительных по антителам АСРА пациентов с полиартритом, не имеющих диагноз определенного RA, но имеющих высокий риск развития определенного RA согласно критериям ACR/EULAR 2010 года (например, с 95% вероятностью).
В конкретных вариантах осуществления индивидуум является SE+. Положительность по общему эпитопу можно тестировать с использованием любого подходящего анализа, в котором определяют мотивы последовательности в остатках с 70 по 74 третьей гипервариабельной области цепи HLA-DRB1 молекулы класса II главного комплекса гистосовместимости, что делает индивидуума предрасположенным к RA. Например, мотивы последовательности могут отличаться последовательностью, кодирующей аминокислоты QKRAA (SEQ ID N0:4 6) или QRRAA (SEQ ID N0:47) или RRRAA (SEQ ID N0:48), кодируемой, например, аллелями HLA-DRB1*0401, *0404/0408, *0405, *0409, *0410, *0413, *0416, *0101, *0102, *0104, * 1001, *1402 и *1406. Анализы могут включать генотипирование с использованием, например, анализа последовательности, типирования с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или гибридизации олигонуклеотидного зонда (например, обратной гибридизации) и иммунологических анализов, известных в данной области. В этих вариантах осуществления способы могут дополнительно включать определение того, что индивидуум является SE+, до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа.
Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что Т-лимфоцитарный (например, С04+-Т-лимфоцитарный) ответ на цитруллинированные аутоэпитопы, включая цитруллинированный аггрекан, у индивидуумов с ранним RA или с риском развития RA включает продукцию (например, секрецию) по меньшей мере 1, 2,
или 3 цитокинов. В конкретных вариантах осуществления цитокины выбраны из IL-б, IFNy, TNF и IL-10. Т-лимфоцитарный ответ, главным образом, включает провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ, отличающийся продукцией (например, секрецией) по меньшей мере 1, 2 или 3 провоспалительных
(например, Тй1 или Тй17) цитокинов. В конкретных вариантах осуществления провоспалительные цитокины выбраны из IL-б, IFNy и TNF. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно могут включать определение того, что у индивидуума развивается провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ (например, продукции по меньшей мере 1, 2 или 3 провоспалительных цитокинов, выбранных из IL-б, IFNy и TNF) до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа. Однако авторы настоящего изобретения также наблюдали, что у индивидуумов с ранним RA или с риском развития RA с большей вероятностью продуцируется IL-б в ответ на отсутствие эпитопа или цитруллинированный аггрекан в отдельности, и, таким образом, Т-лимфоцитарный ответ у этих индивидуумов может отличаться, по существу, продукцией IL-б. Таким образом, в конкретных вариантах осуществления способы по настоящему изобретению дополнительно могут включать определение того, что у индивидуума продуцируется IL-б до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа.
Для определения того, развивается ли у индивидуума Т-лимфоцитарный ответ, в способах по изобретению можно использовать анализы для определения или оценки высвобождения цитокина(ов). Цитокины можно анализировать с использованием любого подходящего способа. Стандартные анализы для определения уровней цитокинов включают способы оценки функциональной активности, такие как, в качестве неограничивающих примеров:
(а) цитокин-индуцированная пролиферация индикаторных клеточных
линий; (Ь) цитокин-индуцированный апоптоз; (с) цитокин-
индуцированная защита от вирусной инфекции и (d) цитокин-
индуцированная продукция цитокинов. Такие анализы хорошо
известны специалисту в данной области, и их можно найти,
например, в "Cytokine Bioassays"
(www.ebioscience.com/ebioscience/appls/BAC.htm), включенном в настоящее описание в качестве ссылки. Альтернативно, уровни цитокинов можно определять с использованием общепринятых анализов высвобождения цитокинов, анализов внутриклеточной секреции цитокинов, определения активации путей передачи сигнала ниже Т-клеточного рецептора и определения мРНК для молекул белков, указывающих на Т-клеточный ответ, таких как мРНК цитокинов, с помощью микрочипов, ELISA, анализов с использованием микрочастиц или мультиплексных анализов, хорошо известных специалисту в данной области. Неограничивающие примеры биологических анализов для IL-б, IFNy, TNF и IL-10 описывают в "Примерах".
Авторы настоящего изобретения также определяли, что Т-лимфоцитарный ответ у индивидуумов с ранним RA или с риском развития RA осуществляется, по меньшей мере, частично CD4+CD28~ Т-лимфоцитами и/или CD4+CD2 8+ Т-лимфоцитами. Такие Т-лимфоциты общепринято можно определять с использованием стандартных иммунологических анализов включая, например, проточную цитометрию (например, с использованием активируемой флуоресценцией сортировки клеток (FACS)), иммуногистохимию, иммуномагнитное разделение и т.п. Неограничивающие примеры иммунологических анализов этого типа описывают в примерах. Т-лимфоциты для анализа можно получать из любого подходящего биологического образца от индивидуума, типичные примеры которого включают кровь (например, периферическую кровь) и синовиальную жидкость.
3.2 Иммуномодуляторы для получения аггрекан-специфичного толерогенного ответа
Антиген-специфичный толерогенный ответ можно вызывать с использованием любой подходящей стратегии, иллюстративные примеры которой включают: (1) повышение количества толерогенных антигенпрезентирующих клеток у индивидуума, презентирующих пептид (например, аутоантиген), соответствующий части полипептида аггрекана (также обозначаемых в настоящем описании как "аггрекан-специфичные толерогенные антигенпрезентирующие клетки" или "agg-tolAPC"), где часть связана с
провоспалительным или аутореактивным Т-лимфоцитарным ответом на полипептид аггрекан (например, полипептид cit-agg); (2) индуцирование анергии или апоптоза аутореактивных эффекторных лимфоцитов у индивидуума, реактивных в отношении полипептида аггрекана (например, полипептида cit-agg) или его части; и (3) повышение количества регуляторных или супрессорных Т-лимфоцитов у индивидуума, супрессирующих или иным образом снижающих аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ.
Аггрекан-специфичные tolAPC можно получать, приводя антигенпрезентирующие клетки (например, дендритные клетки, макрофаги, клетки Лангерганса и т.д.) в контакт с ингибитором пути NF-кВ В количестве, достаточном для ингибирования пути NF-кВ антигенпрезентирующих клеток, и с молекулой антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану) , или молекулой нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, в количестве, достаточном для антигенпрезентирующих клеток, чтобы презентировать антиген или его процессированную форму на своей поверхности. Неограничивающие примеры способов получения толерогенных АРС in vivo и/или in vitro описывают в публикациях патентных заявок США №№ 20030153518, 20060182726, 20100151000 и европейской патентной заявке № 1462111. В других вариантах осуществления аггрекан-специфичные tolAPC получают посредством приведения антигенпрезентирующих клеток в контакт с ингибитором mTOR или ингибитором пути Syk в количестве, достаточном для ингибирования mTOR или пути Syk в антигенпрезентирующих клетках, вместе с молекулой антигена, как описано выше.
Антигенпрезентирующие клетки включают профессиональные и
факультативные типы антигенпрезентирующих клеток.
Профессиональные антигенпрезентирующие клетки включают, в качестве неограничивающих примеров, макрофаги, моноциты, В-лимфоциты, клетки миелоидной линии, включая моноцитарно-гранулоцитарных предшественников DC, Купферовские клетки маргинальной зоны, микроглию, Т-клетки, клетки Лангерганса и дендритные клетки, включая интердигитальные дендритные клетки и
фолликулярные дендритные клетки. Примеры факультативных
антигенпрезентирующих клеток включают, в качестве
неограничивающих примеров, активированные Т-клетки, астроциты, фолликулярные клетки, эндотелий и фибробласты. В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующая клетка выбрана из моноцитов, макрофагов, В-лимфоцитов, клеток миелоидной линии, дендритных клеток или клеток Лангерганса. 3.2.1 Аггрекановый антиген
Аггрекановый антиген может содержать, состоять или, по существу, состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей предполагаемому полноразмерному полипептиду аггрекану (например, приведенному в SEQ ID N0:2 или 4, включая его цитруллинированные формы). Альтернативно, антиген может содержать, состоять или, по существу, состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей зрелому полипептиду аггрекану (например, приведенному в SEQ ID N0:37 или 39, включая его цитруллинированные формы) или его домену, такому как, в качестве неограничивающих примеров, домен G1
(например, приведенный в SEQ ID N0:41, включая его цитруллинированные формы), домен G2 (например, приведенный в SEQ ID N0:43, включая его цитруллинированные формы) или домен G3 (например, приведенный в SEQ ID N0:43, включая его цитруллинированные формы). В других вариантах осуществления антиген может содержать, состоять или, по существу, состоять из аминокислотной последовательности, соответствующей Т-клеточному эпитопу (например, аутоантигену) полипептида аггрекана
(например, приведенного в любой из SEQ ID N0:5-35, включая его
цитруллинированные формы). В конкретных вариантах
осуществления, антиген содержит, состоит или, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID N0:32-35. В неограничивающих примерах антиген является HLA-DR-ограниченным и, индивидуум, соответственно, является положительным по аллелю HLA-DR. В этих примерах HLA-DR-связывающие пептиды (например, HLA-DRB-связывающие пептиды) можно прогнозировать с использованием любого подходящего подхода включая использование прогностических алгоритмов, как
описывают, например, в James et al. (2009, J Immunol 183:32493258; and 2010, Arthritis Rheum. 62 (10) :2909-2918), Knapp et al. (2011, BMC Bioinformatics 12:241), Honeyman et al. (1997, Алл. Med. 29:401-404) and Hu et al. (2010, Nucleic Acids Research 38:Web Server issue W474-W479).
В некоторых вариантах осуществления антиген находится в
форме одного или нескольких пептидов, соответствующих полностью
или частично полипептиду аггрекану, включая его
цитруллинированные формы. Как правило, такие пептиды составляют
по меньшей мере б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30
аминокислотных остатков в длину и, соответственно, не более
приблизительно 500, 200, 100, 80, 60, 50, 40 аминокислотных
остатков в длину. В некоторых вариантах осуществления, в
которых используют два или более пептидов, они могут находиться
в форме множества смежных перекрывающихся пептидов, чьи
последовательности перекрывают, по меньшей мере, часть
полипептида аггрекана, включая его цитруллинированные формы.
Соответственно, пептидные последовательности получают из, по
меньшей мере, приблизительно 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91,
92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% последовательности,
соответствующей полипептиду аггрекан, включая его
цитруллинированные формы. В некоторых вариантах осуществления каждый пептид из множества смежных перекрывающихся пептидных фрагментов может составлять 30-90 аминокислот в длину, например, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 81, 85, 8 6 и 90 аминокислот в длину. В различных вариантах осуществления аминокислотные последовательности смежных перекрывающихся пептидных фрагментов из множества перекрываются на приблизительно от 10 до приблизительно 15 аминокислот, например, 10, 11, 12, 13, 14 и 15 аминокислот. Соответственно, длину пептидов выбирают для презентирования цитотоксическим Т-лимфоцитам (например, пептиды от приблизительно 8 до приблизительно 10 аминокислот в длину), или для презентирования Т-хелперным лимфоцитам (например, пептиды от приблизительно 12 до приблизительно 2 0 аминокислот в длину). Примеры способов получения таких пептидных антигенов описывают, например, в
Astori et al. (2000, J. Immunol. 165:34 97-3505; и цитируемых в них ссылках) и в публикации патентной заявки США № 2004/241178. При желании, аггрекановый антиген можно модифицировать, например, посредством липидной модификации, для модифицирования его физико-химических свойств. Неограничивающие примеры перекрывающихся пептидов, перекрывающих, по существу, всю длину полипептида аггрекана, приведены в SEQ ID N0:49-531.
Аггрекановые антигены можно выделять из природного источника (например, из индивидуума). Альтернативно, их можно получать в рекомбинантной форме с использованием стандартных протоколов, как, например, описывают в: Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING. A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, 1989), в частности, разделах 16 и 17; Ausubel et al. , CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (John Wiley & Sons, Inc.
1994- 1998), в частности, главах 10 и 16; и Coligan et al. , CURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE (John Wiley & Sons, Inc.
1995- 1997), в частности, главах 1, 5 и 6. В типичных примерах
аггрекановые антигены можно получать способом, включающим
стадии (а) получения вектора экспрессии, с которого
экспрессируется нуклеотидная последовательность, кодирующая
аггрекановый антиген; (Ь) встраивания вектора в подходящую
клетку-хозяина; (с) культивирования клетки-хозяина для
экспрессии рекомбинантного полипептида с вектора; и (d)
выделения рекомбинантного антигена. В конкретных вариантах
осуществления аггрекановые антигены соответствуют
последовательности полипептида аггрекана, цитруллинированного
или нет, продуцируемого видом животных, к которому принадлежит
индивидуум.
Альтернативно, аггрекановые антигены синтезируют с использованием жидкостного синтеза или твердофазного синтеза, как описывают, например, Atherton и Sheppard (Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, England, 1989) или Roberge et al. (1995, Science 269:202) .
В некоторых вариантах осуществления аггрекановый антиген содержит по меньшей мере один остаток цитруллина.
Цитруллинированные антигены, например, можно получать из природных, рекомбинантных или синтетических форм аггреканового антигена посредством воздействия пептидиларгининдеиминазы (PAD) ; их также можно получать посредством пептидного синтеза, посредством прямого встраивания одного или нескольких остатков цитруллина в синтезированный пептид аггрекан. Эти способы хорошо известны специалистам в данной области. Иллюстративные способы использования ферментов PAD для получения цитруллинированных антигенов описывают в публикации патентной заявки США № 2011/0028399. Примеры способов синтеза цитруллинированных антигенов описывают в Perez et al., 2006. Chem Biol Drug Res 68: 194-200.
В других вариантах осуществления аггрекановые антигены
предоставляют в форме нуклеиновой кислоты, как правило,
нуклеотидной последовательности, кодирующей антигены,
функционально связанной с промотором, который может являться конститутивным или индуцибельным, и являющимся функциональным в интересующих антигенпрезентирующих клетках, для образования конструкции нуклеиновой кислоты. Доставку конструкций нуклеиновой кислоты в антигенпрезентирующие клетки или их предшественников можно осуществлять, напрямую подвергая пациента воздействию конструкции нуклеиновой кислоты или сначала трансформируя антигенпрезентирующие клетки или их предшественников с использованием конструкции нуклеиновой кислоты in vitro, а затем трансплантируя трансформированные антигенпрезентирующие клетки или предшественники пациенту.
Конструкцию нуклеиновой кислоты можно встраивать в антигенпрезентирующую клетку любыми подходящими способами, включая, например, приведение антигенпрезентирующей клетки в контакт с конструкцией нуклеиновой кислоты, электропорацию, трансформацию, трансдукцию, конъюгацию или трехкомпонентное спаривание, трансфекцию, подобное инфицированию слияние мембран с использованием катионных липидов, высокоскоростную бомбардировку покрытыми ДНК микрочастицами, инкубацию с преципитатом фосфат кальция-ДНК, прямую микроинъекцию в отдельные клетки и т.п. Другие способы также доступны и
известны специалистам в данной области. В конкретных вариантах осуществления конструкции нуклеиновой кислоты встраивают с помощью катионных липидов, например, липосом. Такие липосомы являются коммерчески доступными (например, Lipofectin(r), Lipofectamine(tm) и т.п., поставляемые Life Technologies, Gibco BRL, Gaithersburg, Md.).
Кодирующая антиген нуклеотидная последовательность
конструкции может содержать природную последовательность или ее
вариант, сконструированный с использованием рекомбинантных
способов. В одном примере варианта осуществления кодирующую
антиген нуклеотидную последовательность оптимизируют по кодонам
для обеспечения повышенной экспрессии антигена в интересующей
антигенпрезентирующей клетке. Иллюстративные способы
оптимизации кодонов описывают, например, в патенте США № 5795737, WO 99/02694 и WO 00/42215.
Доставку аггреканового антигена в антигенпрезентирующую клетку или ее предшественника можно повышать с помощью способов, известных специалистам в данной области. Например, разработано несколько различных стратегий для доставки экзогенного антигена через путь эндогенного процессинга в антигенпрезентирующих клетках, особенно, дендритных клетках. Эти способы включают встраивание антигена в рН-чувствительные липосомы (Zhou and Huang, 1994. Immunomethods 4:229-235), осмотический лизис пиносом после пиноцитозного захвата растворимого антигена (Moore et al., 1988. Cell 54:777-785), соединение антигенов с сильными адъювантами (Aichele et al., 1990. J. Exp. Med. 171:1815-1820; Gao et al., 1991. J. Immunol. 147:3268-3273; Schulz et al. , 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:991-993; Kuzu et al. , 1993. Euro. J. Immunol. 23:1397-1400; and Jondal et al. , 1996. Immunity 5:295-302), использование экзосом (Zitvogel et al. , 1998. Nat Med. 4:594-600; 2002, Nat Rev Immunol. 2:569-79), и доставку антигена с помощью апоптотических клеток (Albert et al. , 1998. Nature 392:86-89; Albert et al., 1998, Nature Med. 4:1321-1324; и в международных патентных публикациях № WO 99/42564 и WO 01/85207). Для доставки антигена дендритные клетки можно сенсибилизировать
рекомбинантными бактериями (например, Е. coli) или трансфицированными клетками-хозяевами млекопитающих (антигеном в виде частиц или апоптотическими тельцами, соответственно). Также в качестве средств доставки экзогенного гетерологичного антигена через путь процессинга МНС класса I линии дендритных клеток используют рекомбинантные химерные вирусоподобные частицы (VLP) (Bachmann et al. , 1996. Eur. J. Immunol. 26(11):2595-2600).
Альтернативно или дополнительно, аггрекановый антиген можно соединять или иным образом связывать с цитолизином для повышения переноса антигена в цитозоль антигенпрезентирующей клетки по изобретению для доставки через путь МНС класса I. Примеры цитолизинов включают соединения сапонина, такие как содержащие сапонин иммуностимулирующие комплексы (ISCOM) (см., например, Сох and Coulter, 1997. Vaccine 15(3):248-256 и патент США № 6352697), фосфолипазы (см., например, Camilli et al., 1991. J. Exp. Med. 173:751-754), порообразующие токсины
(например, альфа-токсин), природные цитолизины
грамположительных бактерий, такие как листериолизин О (LLO, например, Mengaud et al. , 1988. Infect. Immun. 56:766-772 и Portnoy et al., 1992. Infect. Immun. 60:2710-2717), стрептолизин О (SLO, например, Palmer et al. , 1998. Biochemistry 37(8) :2378-2383) и перфринголизин О (PFO, например, Rossjohn et al., Cell 89(5), 685-692). Если антигенпрезентирующая клетка является фагоцитирующей, предпочтительно, можно использовать цитолизины, активируемые в кислых условиях. Например, листериолизин проявляет более высокую способность к порообразованию при слабокислом рН
(условиях рН внутри фагосомы), таким образом, облегчая доставку содержимого вакуоли (включая фагосому и эндосому) в цитоплазму
(см., например, Portnoy et al. , 1992. Infect. Immun. 60:27102717) .
Цитолизин можно предоставлять вместе с аггрекановым антигеном в форме одной композиции или можно предоставлять в виде отдельной композиции для приведения в контакт с антигенпрезентирующими клетками. В одном из вариантов
осуществления цитолизин является слитным или иным образом
связанным с антигеном, где слияние или соединение делает
возможным доставку антигена в цитозоль клетки-мишени. В другом
варианте осуществления цитолизин и антиген предоставляют в
форме средства доставки, в качестве неограничивающих примеров,
такого как липосома или микробиологическое средство доставки,
выбранное из вируса, бактерии или дрожжей. Соответственно, если
средство доставки является микробиологическим средством
доставки, средство доставки является невирулентным. В
предпочтительном варианте осуществления этого типа средством
доставки является невирулентная бактерия, например, как
описывают Portnoy et al. в патенте США № 6287556, содержащая
первый полинуклеотид, кодирующий несекретируемый функциональный
цитолизин, функционально связанный с регуляторным
полинуклеотидом, с которого в бактерии экспрессируется цитолизин, и второй полинуклеотид, кодирующий один или несколько предварительно выбранных антигенов. Несекретируемые цитолизины можно предоставлять посредством различных механизмов, например, посредством отсутствия функциональной сигнальной последовательности, некомпетентного в отношении секреции микроорганизма, такого как микроорганизмы с генетическими повреждениями (например, мутацией функциональной сигнальной последовательности) или поврежденные микроорганизмы и т.д. Можно использовать широкий спектр невирулентных, непатогенных бактерий; предпочтительные микроорганизмы представляют собой относительно хорошо описанные штаммы, в частности, лабораторные штаммы Е. coli, такие как МС4100, МС10 61, DH5a и т.д. Другие бактерии, которые можно конструировать по изобретению, включают хорошо описанные, невирулентные, непатогенные штаммы Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, микобактерий, Salmonella, Bacillus subtilis и т.д. В конкретном варианте осуществления бактерии аттенюируют, чтобы они были нереплицирующимися, невстраивающими свой генетический материал в геном клетки-хозяина и/или неподвижными внутри- или межклеточно.
Описываемые выше средства доставки можно использовать для
доставки одного или нескольких аггрекановых антигенов, по
существу, в любую антигенпрезентирующую клетку, способную к
эндоцитозу указанного средства, включая фагоцитирующие и
нефагоцитирующие антигенпрезентирующие клетки. В вариантах
осуществления, когда средство доставки является
микроорганизмом, в указанных способах, как правило, необходим захват микроорганизма клеткой-мишенью и последующий лизис внутри вакуоли антигенпрезентирующей клетки (включая фагосомы и эндосомы).
3.2.2 Измененные пептидные лиганды
В некоторых вариантах осуществления для стимуляции
аггрекан-специфичного толерогенеза используют измененный
пептидный лиганд (APL). Соответственно, APL содержит, состоит
или, по существу, состоит из аминокислотной последовательности,
соответствующей части (например, аутоантигену) полипептида
аггрекана (например, полипептида cit-аггрекана),
соответственно, связанного с ревматоидным артритом (RA) и связывающегося с рецептором антигена (например, Т-клеточным рецептором) на провоспалительных или аутореактивных Т-лимфоцитах. Как правило, аминокислотная последовательность APL отличается от аминокислотной последовательности части полипептида аггрекана по меньшей мере на одну замену, делецию или вставку аминокислоты, и, соответственно, мешает нормальной передаче сигнала через рецептор антигена.
Можно конструировать APL на основе природных пептидных эпитопов аггрекана, идентифицированных с использованием любого известного в данной области способа. Например, для идентификации пептидов, связывающихся с молекулами МНС, можно использовать способы, включающие выделение и анализ молекул МНС из антигенпрезентирующих клеток (Chicz and Urban, 1994. Immunol. Today 1-5: 155-160). Также можно конструировать бактериофаговые библиотеки "фагового дисплея". Используя "фаговый способ" (Scott and Smith, 1990. Science 249:386-390; Cwirla et al. , 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382; Devlin et al., 1990. Science 249:404-406), можно конструировать очень обширные библиотеки (106-108 химических веществ) . Другие
способы идентификации пептидных эпитопов, которые можно использовать, включают, главным образом, химические способы, среди них примерами являются способ Geysen (Geysen et al.,
1986. Molecular Immunology 23:709-715; Geysen et al. , 1987; J.
Immunologic Method 102:259-274 и способ no Fodor et al., 1991.
Science 251:7 67-773). В Furka et al., 1988. 14th, International
Congress of Biochemistry, Volume 5. Abstract FR:013; Furka,
1991. Int. J. Peptide Protein Res. 37:487-493), Houghton
(патент США № 4631211) и Rutter et al. (патент США № 5101175)
описывают способы получения смеси пептидов, которые можно
тестировать в качестве агонистов или антагонистов. Другие
способы, которые можно использовать, включают использование
синтетических библиотек (Needels et al., 1993. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10700-4; Ohlmeyer et al. , 1993. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 90: 10922-10926; Lam et al. , международная
патентная публикация № WO 92/00252, каждая из которых включена
в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме) и т.п.,
которые можно использовать для скрининга на лиганды рецептора.
В литературе подробно описаны способы на основе выделения кДНК
или дифференциального дисплея, и их также можно использовать,
см., например, Hedrick et al., 1984. Nature 308:149; и Lian and
Pardee, 1992. Science 257:967. Подход маркера экспрессируемой
последовательности (EST) представляет собой полезный инструмент
для обнаружения генов (Adams et al., 1991. Science 252: 1651),
также как и "нозерн"-блоттинг, защита от РНКазы и анализ
посредством полимеразной цепной реакции с обратной
транскрипцией (RT-ПЦР) (Alwine et al. , 1977. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74:5350; Zinn et al., 1983. Cell 34:865; Veres et al.,
1987. Science 237:415). Другим способом, который можно
использовать, является способ "пепскан" (Van der Zee, 1989.
Eur. J. Immunol. 19:43-47), в котором несколько десятков
пептидов синтезируют одновременно на полиэтиленовых стержнях,
расположенных в 9б-луночном планшете для микротитрования,
аналогично упорядоченной библиотеке, в которой положение
каждого стержня определяет историю синтеза, проводимого на нем.
Затем пептиды химически открепляют от твердой подложки и
доставляют в облученные сингенные тимоциты для презентирования антигена. Затем клонированную линию CTL тестируют на реактивность в анализе пролиферации, контролируя встраивание 3Н-тимидина.
SPHERE описывают в W0 97/35035. В этом подходе используют комбинаторные пептидные библиотеки, синтезированные на частицах полистирола, где каждая частица содержит чистую популяцию уникального пептида, который можно химически отделять от частиц в отдельных аликвотах. Выделенный пептид из объединенного множества частиц подвергают скринингу с использованием способов определения Т-клеточной активации, включая, например, встраивание 3Н-тимидина (для CD4+ или CD8+ Т-клеток), анализа высвобождения 51Сг (для CTL) или продукции IL-2 (для CD4+ Т-клеток) для идентификации совокупности пептидов, способных активировать интересующие Т-клетки. Используя стратегию многократного получения совокупностей пептидов/высвобождения, можно подвергать скринингу более 107 пептидов всего за несколько дней. Анализ остаточных пептидов на соответствующих положительных частицах (> 100 пмоль) делает возможной быструю и однозначную идентификацию последовательности эпитопа.
Краткий обзор анализа для идентификации аггрекановых пептидов, связывающихся с CTL, является следующим: грубо говоря, десять 9б-луночных планшетов с 1000 частиц на лунку будут вмещать 106 частиц; десять 9б-луночных планшетов с 100 частиц на лунку будут вмещать 105 частиц. Для минимизации количества клеток CTL, необходимых для скрининга, и количества ручных манипуляций элюированные пептиды можно дополнительно объединять для получения лунок с любой желаемой сложностью. Например, основываясь на экспериментах с растворимыми библиотеками, можно подвергать скринингу 107 пептидов в 96-луночных планшетах (10000 пептидов на лунку) всего с использованием 2> <106 клеток CTL. После открепления части пептидов от частиц, инкубируя их с гамма-облученными культивируемыми АРС и линиями клонов CTL, дополнительно исследуют положительные лунки, определяемые по встраиванию 3Н-тимидина. Альтернативно, как указано выше, можно использовать
анализы продукции цитокинов или цитолитического высвобождения 51Cr (Coulie et al. , 1992. Int. J. Cancer 50:289-291). Частицы из каждой положительной лунки будут разделять и по-прежнему анализировать отдельно, используя дополнительную часть пептида из каждой частицы. Затем будут расшифровывать отдельные положительные частицы, определяя реагирующую аминокислотную последовательность. С помощью анализа всех положительных результатов будут получать частичный профиль консервативно замещенных эпитопов, стимулирующих тестируемый клон CTL. На этой стадии пептид можно заново синтезировать и тестировать. Кроме того, можно синтезировать вторую библиотеку (минимальной сложности) с представлением всех консервативных замен для регистрации полного спектра производных, толерантных для конкретного CTL. Посредством одновременного скрининга множества CTL (с тем же ограничением по МНС) значительно облегчается поиск перекрестно-реагирующих эпитопов.
Описываемый способ идентификации эпитопов CD8+ CTL, ограниченных по МНС класса I, можно использовать для идентификации эпитопов CD4+ Т-клеток, ограниченных по МНС класса II. В этом случае библиотеки, специфичные для аллелей МНС класса II, синтезируют таким образом, что гаплотип-специфичные якорные остатки представлены в соответствующих положениях. Для распространенных аллелей идентифицированы агретопные мотивы МНС класса II (см., например, Rammensee, 1995. Curr. Opin. Immunol. 7:85-96; Altuvia et al. , 1994. Mol. Immunol. 24:375-379; Reay et al. , 1994. J. Immunol. 152:39463957; Verreck et al., 1994. Eur. J. Immunol. 24:375-379; Sinigaglia and Hammer, 1994. Curr. Opin. Immunol. 6:52-56; Rotzschke and Falk, 1994. Curr. Opin. Immunol. 6:45-51) . Общая длина пептидов, как правило, будет составлять 12-20 аминокислотных остатков, и для ограничения сложности библиотеки можно использовать ранее описываемые способы. Аггрекановые APL можно синтезировать с использованием жидкостного синтеза или твердофазного синтеза, как описывают, например, в Atherton and Sheppard (1989, выше) или Roberge et al. (1995, выше).
В конкретных вариантах осуществления APL обладает по
меньшей мере одной активностью, выбранной из: (i)
противодействия ответу Т-лимфоцитов на полипептид аггрекан
(например, полипептид cit-аггрекан), (ii) индуцирования анергии
аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного
аггрекана Т-лимфоцитов, (iii) индуцирования апоптоза аггрекан-
специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана
Т-лимфоцитов, (iv) стимуляции или индуцирования аггрекан-
специфичного или специфичного для цитруллинированного аггрекана
Тп2-иммунного ответа, (v) супрессии развития аггрекан-
специфичного или специфичного для цитруллинированного аггрекана
Thi-иммунного ответа, включая супрессию продукции
провоспалительных цитокинов, (vi) стимуляции активации аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана регуляторных лимфоцитов (например, Т-регуляторных лимфоцитов (Treg)), или (vii) предотвращения или ингибирования активации аггрекан-специфичных или специфичных для цитруллинированного аггрекана антигенпрезентирующих клеток в ответ на воспалительный стимул. 3.2.3 Ингибиторы NF-KB
Ингибитор NF-кВ включает любую молекулу или соединение, снижающее уровень или функциональную активность NF-кВ В иммунных клетках, особенно, антигенпрезентирующих клетках. Ингибиторы NF-кВ могут принимать различные формы, неограничивающие примеры которых включают низкомолекулярные соединения, нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды, пептидомиметики и т.д.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор NF-KB снижает уровень или функциональную активность компонента пути NF-кВ, соответственно, выбранного из ВТК, LYN, BCR Iga, BCR Ig(3, Syk, Blnk, PLCy2, PKC(3, DAG, CARMA1, BCL10, MALT1, PI3K, PIP3, АКТ, p38 МАРК, ERK, COT, IKKa, IKK(3, IKKy, NIK, RelA/p65, pl05/p50, c-Rel, RelB, p52, Leul3, CD81, CD19, CD21 и их лиганды в каскаде компонентов комплемента и коагуляции, TRAF6, убиквитинлигазы, ТаЬ2, ТАК1, NEMO, N0D2, RIP2, Lck, fyn, Zap7 0, LAT, GRB2, SOS, CD3 zeta, Slp-76, GADS, ITK, PLCyl, PKC6, ICOS, CD28, SHP2, SAP, SLAM и 2B4. В иллюстративных примерах этого
типа ингибитор NF-кВ снижает уровень или функциональную активность любого одного или нескольких из RelA/p65, р105/р50, c-Rel, RelB или р52. Соответственно, в этих вариантах осуществления ингибитор NF-кВ блокирует, ингибирует или иным образом противодействует по меньшей мере одной функции или активности компонента. В других вариантах осуществления ингибитор NF-кВ повышает уровень или функциональную активность компонента пути NF-КВ, соответственно, выбранного из SHP1, SHIP, PIR-B, CD22, CD72, FcgRIIB, 1кВ, Р100, CTLA4, PD-1, СЫ, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR2DL и Csk. В этих вариантах осуществления ингибитор NF-кВ повышает, стимулирует или иным образом агонистически действует по меньшей мере на одну функцию или активность компонента.
В литературе описано множество ингибиторов NF-кВ, И ИХ типичные примеры представлены в следующих таблицах:
аллопуринол
Gomez-Cabrera et al. , 2006 Aug; Br J Nutr; 96 Suppl l:S31-3
анетолдитиолтион
Sen et al. , 1996 Jan 5; Biochem Biophys Res Commun; 218 (1):148-53
апоцинин
Barbieri et al., 2004 Jul 15; Free Radic Biol Med; 37(2): 156-
65.
сок/экстракты яблока
Shi & Jiang, 2002; J Environ Pathol Toxicol Oncol; 21(3):233-
42 .
Davis et al. , 2006 May; Exp Biol Med (Maywood); 231(5):594-8
p7F артемизии (5,6,3',5'-тетраметокси-7,4'-гидроксифлавон)
Lee et al. , 2004 Dec; Ann N Y Acad Sci;1030:555-68
Астаксантин
Lee et al., 2003 Aug 31; Mol Cells; 16(1):97-105.
Бенидипин
Matsubara & Hazegawa, Eur J Pharmacol. 2004 Sep 13;498(1-3):303-14
Бис-эвгенол
Murakami et al. , Biochem Pharmacol. 2003 Sep 15; 66 (6) :1061-6
Соединения Bruguiera gymnorrhiza
Homhual et al. , Planta Med. 2006 Feb;72(3):255-60.
Бутилированный гидроксианизол (ВНА)
Israel et al. , J Immunol. 1992 Nov 15;149(10):3386-93. Schulze-Osthof f et al. , EMBO J. 1993 Aug; 12(8) :3095-104 .
Цефарантин
Okamoto et al. , J Biol Chem. 1994 Mar 18;269 (11) :8582-9.
Фенилэтиловый эфир кофейной кислоты (3,4-дигидроксикоричная кислота, САРЕ)
Natarajan et al. , Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Aug 20; 93 (17) :9090-5
Карнозол
Lo et al., Carcinogenesis. 2002 Jun;23(6):983-91
Huang et al. , Biochem Pharmacol. 2005 Jan 15; 69 (2) :221-32 . Epub 2004 Nov 23.
Бета-каротин
Bai et al., Exp Mol Med. 2005 Aug 31;37 (4) :323-34
Карведилол
Yang et al., Cardiovasc Res. 2003 Sep 1;59(3):776-87
Производные катехола
Suzuki & Packer, Biochem Mol Biol Int. 1994 Feb;32(2):299-305
Хлорогеновая кислота
Feng et al. , J Biol Chem. 2005 Jul 29;280 (30) :27888-95. Epub 2005 Jun 8.
Полифенолы какао
Lee et al., J Nutr. 2006 May;136(5):1150-5.
Куркумин (диферулоилметан)
Singh & Aggarwal, J Biol Chem. 1995 Oct 20;270 (42) :24995-5000
Дегидроэпиандростенон (DHEA) и DHEA-сульфат (DHEAS)
Iwasaki et al. , J Clin Endocrinol Metab. 2004 Jul;89(7):3449-54 Liu et al. , Cancer Res. 2005 Mar 15;65(6):2269-76
Дибензилбутиролактоновые лигнаны
Cho et al. , Int Immunopharmacol. 2002 Jan;2(1):105-16
Диэтилдитиокарбамат (DDC)
Schreck et al. , J Exp Med. 1992 May 1; 175 (5) : 1181-94.
Дифероксамин
Sappey et al. , AIDS Res Hum Retroviruses. 1995 Sep;11(9):1049-61;
Schreck et al., Free Radic Res Commun. 1992;17 (4) :221-37
Дигидроизоэвгенол
Murakami et al. , Arch Biochem Biophys. 2005 Feb 15;434 (2) : 32632
Дигидролипоевая кислота
Suzuki et al., Biochem Biophys Res Commun. 1992 Dec 30;189(3):1709-15;
Suzuki et al. , Biochem Mol Biol Int. 1995 Jun;36(2):241-6
Дилазеп + фенофибриновая кислота
Sonoki et al. , Eur J Pharmacol. 2003 Aug 15;475(1-3):139-47; Yang et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2005
May;371(5) :401-7 . Epub 2005 May 25
Диметилдитиокарбаматы (DMDTC)
Pyatt et al., Toxicology. 1998 Jul 3; 128 (2) :83-90.
Диметилсульфоксид (DMSO)
Kelly et al., Infect Immun. 1994 Aug;62(8):3122-8.
Дисульфирам
Schreck et al., Free Radic Res Commun. 1992; 17 (4) :221-37 .
Эбселен
Schreck et al., Free Radic Res Commun. 1992;17 (4) :221-37
Эдаравон
Kokura et al., Cancer Lett. 2005 Nov 18;229 (2) :223-33. Epub 2005 Aug 10
ЕРС-К1 (фосфодиэфирное соединение витамина Е и витамина С)
Hirano et al. , Immunopharmacology. 1998 Mar;39(1):31-8
эпигаллокатехин-3-галлат (EGCG; полифенолы зеленого чая)
Lin & Lin, Mol Pharmacol. 1997 Sep;52(3):465-72;
Yang et al., J Nutr. 1998 Dec; 128 (12) :2334-40.
Эрготионеин
Rahman et al., Biochem Biophys Res Commun. 2003 Mar 21; 302 (4) :860-4
Этилпируват (истощение глутатиона)
Song et al. , J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jan;308(1):307-16. Epub 2003 Oct 20 . ;
Tsung et al. , Transplantation. 2005 Jan 27;79 (2) :196-204
Этиленгликоль тетрауксусная кислота (EGTA)
Janssen et al. , Methods Enzymol. 1999;300:363-74
Флавоноиды (боярышник; корень Boerhaavia diffusa; ксантогумол)
Zhang et al. , J Neurochem. 2004 Jul;90(1):211-9;
Chen et al., Mol Pharmacol. 2004 Sep;66(3):683-93.;
Pandey et al., Int Immunopharmacol. 2005 Mar;5(3):541-53;
Albini et al. , FASEB J. 2006 Mar;20(3) :527-9 . Epub 2005 Dec 30;
Colgate et al., Cancer Lett. 2006 Mar 22; [Epub ahead of print]
фолиевая кислота
Au-Yeung et al. , Can J Physiol Pharmacol. 2006 Jan;84(1) : 141-7
Гамма-
глутамилцистеинсинтетаза (gamma-GCS)
Manna et al. , Oncogene. 1999 Jul 29;18(30):4371-82
Полисахариды Ganoderma 1 ucidum
Zhang et al. , Life Sci. 2003 Sep 19; 73(18) :2307-19.
Гарцинол (из экстракта кожуры плодов Garcinia indica)
Liao et al. , Mol Carcinog. 2004 Nov;41(3):140-9
Экстракт гинкго билоба
Chen et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2003 Sep 1;23 ( 9) :155966. Epub 2003 Jul 31
Глутатион
Cho et al., Biochem Biophys Res Commun. 1998 Dec 9;253 (1) :104-8; Schreck et al., Free Radic Res Commun. 1992;17 (4) :221-37
Гематеин
Choi et al., J Cardiovasc Pharmacol. 2003 Aug; 42(2):287-95
Гидрохинон
Pyatt et al., Toxicol Appl Pharmacol. 1998 Apr;149(2):17884 . ;
Yang et al., Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi . 2006 Aug; 14(4): 804-7
2 3-гидроксиурсоловая кислота
Shin et al., Planta Med. 2004 Sep;70(9):803-7
IRFI 042 (соединение, подобное витамину Е)
Altavilla et al. , Free Radic Biol Med. 2001 May 15;30(10):1055-66
Тетракис железа
Kang et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2003 Sep 1;191 (2) :14755.
Изовитексин
Lin et al., Planta Med. 2005 Aug;71(8):748-53
Экстракт Kangen-karyu
Satoh et al. , J Pharm Pharmacol. 2005 Oct;57(10):1335-43
L-цистеин
Mihm et al., AIDS. 1991 May;5(5):497-503
Лацидипин
Cominacini et al. , J Hypertens. 1997 Dec;15(12 Pt 2):1633-40
Лазароиды
Marubayashi et al. , Transplant Proc. 2002 Nov;34(7):2662-3
Клюква
Wang et al., J Agric Food Chem. 2005 Apr 20;53(8):3156-66
Лупеол
Saleem et al., Oncogene. 2004 Jul 1;23 (30) :5203-14
Магнолол
Chen et al. , Br J Pharmacol. 2002 Jan; 135 (1) :37-47
Мальтол
Yang et al., J Biochem Mol Biol. 2 00 6 Mar 31,-39(2):145-9
Марганец-зависимая супероксиддисмутаза (Мп-SOD)
Manna et al. , J Biol Chem. 1998 May 22;273 (21) :13245-54
Экстракт коры стебля Mangifera indica L.
Leiro et al., Int Immunopharmacol. 2004 Aug;4(8):991-1003;
Garrido et al., Phytother Res. 2005 Mar;19(3):211-5
Мелатонин
Gilad et al. , FASEB J. 1998 Jun;12(9):685-93;
Mohan et al. , Biochem Mol Biol Int. 1995 Dec; 37 (6) :1063-70; Li et al., Mediators Inflamm. 2005 Aug 31;2005(4):185-93
Антоцианины шелковицы
Chen et al., Cancer Lett. 2006 Apr 28;235 (2) :248-59. Epub 2005 Jun 22
N-ацетил-Ъ-цистеин (NAC)
Schreck et al. , EMBO J. 1991 Aug;10(8):2247-58
Нациселин (NAL)
Antonicelli et al., Free Radic Biol Med. 2002 Mar 15; 32 (6) : 492502
Нордигидрогваяретовая кислота (NDGA)
Brennan & O'Neill, Biochem Pharmacol. 1998 Apr 1;55(7):965-73;
Israel et al. , J Immunol. 1992 Nov 15;149(10):3386-93; Schulze-Osthof f et al. , EMBO J. 1993 Aug;12(8):3095-104; Staal et al. , AIDS Res Hum Retroviruses. 1993 Apr;9(4):299306
Охнафлавон
Sun et al. , Arch Biochem Biophys.
2006 Mar 15;447(2):136-46. Epub 2 00 6 Feb 10
Ортофенантролин
Schreck et al., Free Radic Res Commun. 1992;17 (4) :221-37
Феноловые антиоксиданты (гидрохинон и трет-бутилгидрохинон)
Ma et al., 2003
альфа-фенил-н-трет-бутилнитрон (PBN)
Kotake et al. , Biochim Biophys Acta. 1998 Nov 19; 1448 (1):77-84; Lin et al. , Neurosci Lett. 2006 Sep 11; 405 (1-2): 52-6. Epub 2006 Jul 28
Оксид фениларсина (РАО, ингибитор тирозинфосфатазы)
Arbault et al., Biomed Pharmacother. 1997;51(10):430-8
Phyllanthus urinaria
Chularo jmontri et al. , Biol Pharm Bull. 2005 Jul;28(7):1165-71
Пирролиндитиокарбамат (PDTC)
Schreck et al. , J Exp Med. 1992 May 1;175 (5) :1181-94
Кверцетин (низкие концентрации)
Musonda & Chipman, Carcinogenesis. 1998 Sep;19(9):1583-9;
Shih et al., Eur J Pharmacol. 2004 Aug 2 ; 496 (1-3) :41-8
Красное вино
Blanco-Colio et al. , Circulation.
2 000 Aug 29;102(9):1020-6;
Cui & He, Zhonghua Yu Fang Yi Xue
Za Zhi. 2004 Mar;38(2):103-6
Ref-1 (редокс-фактор-1)
Ozaki et al. , FASEB J. 2002 Jun; 16 (8) :889-90. Epub 2002 Apr 23
Rg(3), производные соединений, входящих в состав женьшеня
Keum et al., Mutat Res. 2003 Feb-Mar;523-524:75-85
Ротенон
Schulze-Osthof f et al. , EMBO J. 1993 Aug;12(8):3095-104
Рокситромицин
Ueno et al., Clin Cancer Res. 2005 Aug 1;11 (15) :5645-50
S-аллил-цистеин (SAC, соединение чеснока)
Geng et al. , Free Radic Biol Med. 1997;23(2):345-50
Sauchinone
Lee et al. , Br J Pharmacol. 2003 May;139(1):11-20.;
Hwang et al., Planta Med. 2003 Dec;69(12):1096-101
Спиронолактон
Han et al., J Am Soc Nephrol. 2006 May; 17(5) : 1362-72. Epub 2006 Mar 2 9
Экстракты клубники
Wang et al., J Agric Food Chem. 2005 May 18;53(10):4187-93
Таксифолин
Wang et al., J Biomed Sci. 2006 Jan;13(1) : 127-41. Epub 2005 Nov 9
Темпол
Cuzzocrea et al. , Free Radic Res. 2004 Aug;38(8):813-9
Тепоксалин (5-(4-хлорфенил)-N-гидрокси-(4-метоксифенил) -N-метил-Ш-пиразол-3-пропанамид))
Kazmi et al., J Cell Biochem. 1995 Feb;57(2):299-310.; Ritchie et al. , Int J Immunopharmacol. 1995 Oct;17(10):805-12
Витамин С
Staal et al. , AIDS Res Hum Retroviruses. 1993 Apr;9(4):29930 6;
Son et al., Arch Pharm Res. 2004 Oct;27 (10) :1073-9
Витамин Вб
Yanaka et al., Int J Mol Med. 2005 Dec;16(6):1071-5
производные витамина Е
Suzuki & Packer, Biochem Biophys Res Commun. 1993 May 28; 193 (1) :277-83
Z-LLL
(карбобензоксил-лейцинил-лейцинил-лейциналь, MG132)
лактацистин, бета-лактон
Fenteany & Schreiber, J Biol Chem. 1998 Apr 10; 273 (15) : 85458;
Grisham et al. , Methods Enzymol.
1999;300:345-63
Пептидное соединение бороновой кислоты
Grisham et al. , Methods Enzymol.
1999;300:345-63;
Iqbal et al., J Med Chem. 1995 Jun 23; 38 (13) :2276-7
Ингибиторы убиквитинлигазы
Yaron et al. , EMBO J. 1997 Nov 3; 16 (21) :6486-94
PS-341 (бортезомиб)
Adams, Cancer Cell. 2004 May;5(5):417-21
Салиноспорамид А (1, NPI-0052)
Macherla et al., J Med Chem.
2005 Jun 2; 48 (11) :3684-7
циклоспорин А
Frantz et al. , EMBO J. 1994 Feb 15;13(4):861-70;
Kunz et al. , Biochem Biophys Res
Commun. 1995 Nov 13;216 (2) :4384 6;
Marienfeld et al., Eur J Immunol. 1997 Jul;27(7):1601-9; McCaffrey et al. , Nucleic Acids
Res. 1994 Jun 11;22 (11):2134-42; Meyer et al., FEBS Lett. 1997 Aug 18;413 (2) :354-8; Wechsler et al. , J Immunol. 1994 Sep 15;153(6):2515-23
FK50 6 (такролимус)
Okamoto et al., J Biol Chem.
1994 Mar 18;269(11):8582-9; Venkataraman et al. , J Exp Med.
1995 Mar 1;181 (3) :1091-9
ИНГИБИТОРЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ И/ИЛИ ДЕГРАДАЦИИ 1кВа
Молекула
Путь ингибирования
Ссылки
BAY 11-7082
фосфорилирование 1кВа
Pierce et al. J. Biol Chem 1997; 272, 2109621103
BioMol, Plymouth Meeting, PA
BAY 11-7085
фосфорилирование 1кВа
Pierce et al. J. Biol Chem 1997; 272, 2109621103
BioMol, Plymouth Meeting, PA
Дезлоратадин
гистаминовый Н1-рецептор
Wu et al., Int Arch Allergy Immunol. 2004
Dec;135(4) :313-8 . Epub 2004 Nov 24
Сальметерол, флутиказон пропионат
бета2-агонисты
Baouz et al. , Int Immunol. 2 0 05 Nov;17(11):1473-81. Epub 2005 Oct 6
CPU0213
антагонист рецептора эндотелина
He et al. , Acta Pharmacol Sin. 2006
Sep;27(9):1213-21
Гиперэкспрессия эрбина
ингибитор NOD2
McDonald et al., J Biol Chem. 2005 Dec
2;280 (48) :40301-9. Epub 2005 Oct 3
Белок-связывающий полисахарид базидомицетов
взаимодействие LPS-CD14
Asai et al., FEMS Immunol Med Microbiol.
2005 Jan 1;43 (1) :91-8.
Калагуалин (производное
соединения папоротника)
выше IKK в каскаде (TRAF2-NIK)
Manna et al. , Cancer Lett. 2003 Feb 20;190 (2) :171-82
NS3/4A (протеаза HCV)
выше IKK в каскаде
Karayiannis, J Hepatol. 2005 Oct;43(4):743-5
golli BG21 (продукт основного белка миелина)
выше IKK в каскаде (РКС)
Feng et al., J Neuroimmunol. 2004 Jul;152(1-2):57-66
онкопротеин NPM-ALK
ингибирование Traf2
Horie et al. , Cancer Cell. 2004 Apr;5(4):353-64
NS5A (вирус гепатита С) )
ингибирование Traf2
Park et al., J Biol Chem. 2002 Apr 12;277 (15) :13122-8. Epub 2002 Jan 30
LY29 и LY30
ингибиторы киназы PI3
Choi et al., FEBS Lett. 2004 Feb 13;559(1-3):141-4
эводиамин (компонент Evodiae fructus)
взаимодействие AKT-IKK
Takada et al. , J Biol Chem. 2005 Apr 29;280 (17) :17203-12. Epub 2005 Feb 14
ритуксимаб (антитело против CD2 0)
ингибитор повышено регулируемой киназы Raf-1
Jazirehi et al., Cancer Res. 2005 Jan 1; 65 (1) :264-76
киназный супрессор ras (KSR2)
ингибитор МЕККЗ
Channavajhala et al. , Biochem Biophys Res
Commun. 2 0 05 Sep 9;334 (4) :1214-8
M2L (вирус Vaccinia)
ингибитор ERK2
Gedey et al., J Virol.
2006 Sep;80(17):8676-85
Пефаблок (ингибитор сериновых протеаз)
выше IKK в каскаде
Tando et al.,
Digestion.
2002;66(4):237-45
Рокагламиды (производные соединений Aglaia)
выше IKK в каскаде
Baumann et al., J Biol Chem. 2002 Nov 22;277 (47) :44791-800. Epub 2002 Sep 16
Бетаин
NIK/IKK
Hu et al. , J Biol Chem. 2004 Aug 20;279(34):35975-83. Epub 2004 Jun 18
TNAP
NIK
Go et al., J Gerontol A Biol Sci Med Sci.
2005 Oct;60(10):125264
Гелданамицин
образование комплекса IKK
Chen et al., Mol Cell. 2002 Feb;9(2):401-10
Проантоцианидины семян винограда
активность IKKa
Mantena & Katiyar, Free Radic Biol Med.
2006 May 1;40(9):160314. Epub 2 00 6 Jan 2 6
МС160 (вирус
Molluscum contagiosum)
активность IKKa
Nichols & Shisler , J Virol. 2006 Jan;80(2):578-86
NS5B (белок гепатита С)
активность IKKa
Choi et al., Mol Cell Biol. 2006 Apr;26(8):3048-59
Экстракт плодов граната
активность IKKa
Afaq et al., Photochem Photobiol. 2005 Jan-Feb;81(1):38-45; Khan et al., Carcinogenesis. 2006 Aug 18; [Epub ahead of print]
Тетрандин (растительный алкалоид)
активность IKKa
Ho et al., Br J Pharmacol. 2004 Dec; 143 (7) :919-27 . Epub 2004 Oct 25
BMS-345541 (4(2'-аминоэтил)амино-1,8-диметилимидазо-(1,2-а)хиноксалин)
киназная активность IKKa и IKKb
Burke et al., J Biol Chem. 2003 Jan 17;278 (3) :1450-6. Epub 2 0 02 Oct 25; Yang et al., 2006
Производные 2-амино-З-циано-4-арил-б-(2-гидрокси-фенил)пиридина
активность IKKb
Murata et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2003
Mar 10;13(5):913-8, Murata et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2004
Aug 2;14 (15) : 4013-7, Murata et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2004
Aug 2;14 (15) :4019-22
Акролеин
активность IKKb
Vallacchi et al., Antioxid Redox Signal.
2005 Jan-Feb;7(12):25-31
Анандамид
активность IKKb
Sancho et al. , Mol Pharmacol. 2003 Feb;63(2):429-38
AS602868
активность IKKb
Frelin et al., Oncogene. 2003 Nov 6;22 (50) :8187-94
Кобротоксин
активность IKKb и связывание ДНК р50
Park et al., Biochemistry. 2005 Jun 14; 44 (23) :8326-36
Коровый белок (гепатит С)
активность IKKb
Joo et al., J Virol. 2005 Jun;79(12):7648-57; Shrivastava et al. , J Virol. 1998 Dec;72(12):9722-8
Дигидроксифенилэтано л
активность IKKb
Guichard et al., Carcinogenesis. 2006 Sep;27(9) :1812-27 . Epub 2 00 6 Mar 7
Гербимицин А
активность IKKb
Iwasaki et al. , FEBS Lett. 1992 Feb 24;298 (2-3) :240-4; Mahon & O'Neill, Biochem Soc Trans.
1995 Feb;23 (1) : HIS; Ogino et al., Mol Pharmacol. 2004 Jun; 65 (6) :1344-51
Ингибитор 22
активность IKKb
Baxter et al., Bioorg Med Chem Lett. 2004 Jun 7;14 (11) :2817-22
Изорапонтигенин
активность IKKb
Li et al. , Free Radic Biol Med. 2005 Jan 15;38(2):243-57
Манумицин А
активность IKKb
Bernier et al., J Biol Chem. 2 00 6 Feb 3;281 (5) :2551-61. Epub 2005 Nov 30; Frassanito et al., Clin Exp Med. 2005 Mar;4(4):174-82
MLB120 (низкомолекулярный)
активность IKKb
Nagashima et al., Blood. 2006 Jun 1; 107 (11) :4266-73. Epub 2 00 6 Jan 2 6
Новый ингибитор
активность IKKb
Kamon et al. , Biochem Biophys Res Commun.
2004 Oct 8;323 (1) :2428
vIRF3 (KSHV)
активность IKKb
Seo et al. , Oncogene.
2004 Aug 12;23 (36) :6146-55
Оксид азота
активность IKKb/ фосфорилирование IkB
Katsuyama et al. , Arterioscler Thromb
Vase Biol. 1998 Nov;18(11):17 96-8 02; Matthews et al. , Nucleic Acids Res.
1996 Jun 15;24 (12) :2236-42; Spieker & Liao, Methods Enzymol.
1999;300:374-88; Reynaert et al. , Proc Natl Acad Sci USA.
2004 Jun 15; 101 (24) :8945-50. Epub 2004 Jun 7
SC-514 (низкомолекулярный)
активность IKKb
Kishore et al., J Biol Chem. 2003 Aug 29;278(35):32861-71. Epub 2 003 Jun 17
Тиенопиридин
активность IKKb
Morwick et al., J Med Chem. 2 00 6 May 18; 49 (10) :2898-908
Ацетил-босвеллиевые кислоты
активность IKK
Syrovets et al., J Biol Chem. 2005 Feb 18;280 (7) :6170-80. Epub 2004 Dec 2; Syrovets et al., J Immunol. 2 0 05 Jan 1; 174 (1) :498-506
Производное аминопиримидина
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
Производное бензоимидазола
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
BMS-345541
активность IKK
Burke et al., J Biol Chem. 2003 Jan 17;278(3):1450-6. Epub 2002 Oct 25.
Бета-карболин
активность IKK
Yoon et al., J Toxicol Environ Health A. 2005 Dec 10; 68 (23-24) :200517
CYL-19S и CYL-26Z, два синтетических производных альфа-метил ен- г амма-бутиролактона
активность IKK
Huang et al. , Carcinogenesis. 2004 Oct;25(10):1925-34. Epub 2004 Jun 24
АСНР (2-амино-б-[2-(циклопропилметокси) -б-гидроксифенил]-4-пиперидин-4-ил никотинонитрил
активность IKKb (аналог АТФ)
Sanda et al. , Leukemia. 2006 Apr;20(4):590-8
соединение А
активность IKKb (аналог АТФ)
Ziegelbauer et al., Br J Pharmacol. 2005
May;145(2):178-92
Флавопиридол
активность IKK и фосфорилирование RelA
Takada & Aggarwal, J Biol Chem. 2004 Feb
6;279 (6) :4750-9. Epub 2003 Nov 20
Циклопентоны
активность IKKb
Bickley et al., Bioorg Med Chem. 2 0 04 Jun
15;12(12):3221-7
Дегидроаскорбиновая кислота (витамин С)
активность IKKb
Carcamo et al. , Mol Cell Biol. 2004
Aug;24(15):6645-52
IMD-0354
активность IKKb
Tanaka et al. , Blood. 2005 Mar 15;105(6):2324-31. Epub 2004 Nov 23, Tanaka et al. , Cancer Res. 2006 Jan 1; 66 (1) :419-2 6; Inayama et al. , Am J Respir Crit Care Med.
2006 May 1;173(9):101622. Epub 2 00 6 Feb 2
Jesterona dimer
Активность IKKb; связывание ДНК
Liang et al. , Mol Pharmacol. 2003 Jul; 64 (1) :123-31; Liang et al., 2006
PS-1145 (MLN1145)
активность IKKb
Hideshima et al., J Biol Chem. 2002 May
10;277 (19) :16639-47. Epub 2 0 02 Feb 2 8
2- [ (аминокарбонил)-
амино]-5-ацетиленил-
3- тиофенкарбоксамиды
(ТРСА-1)
активность IKKb
Bonafoux et al. , Bioorg Med Chem Lett.
2005 Jun 2; 15 (11) :2870-5; Podolin et al., 2005
1'-ацетоксихавикол ацетат (Languas galanga)
активность IKK
Ichikawa et al., J Immunol. 2 0 05 Jun 1; 174 (11) :7383-92; Ito et al. , Cancer Res. 2005 May 15;65(10):4417-24
Апигенин (растительный флавоноид)
активность IKK
Shukla & Gupta, Clin Cancer Res. 2004 May 1; 10 (9) :3169-78; Yoon et al., Mol Pharmacol. 2006 Sep; 70(3) :1033-44 . Epub 2 00 6 Jun 16
Кардамомин
активность IKK
Lee et al., J Pharmacol Exp Ther.
2006 Jan;316(1) :271-8 . Epub 2005 Sep 23
CDDO-Me (синтетический тритерпеноид)
активность IKK
Shishodia et al., Clin Cancer Res. 2006 Mar 15; 12(6) : 1828-38
CHS 828 (противоопухолевое лекарственное средство)
активность IKK
Olsen et al., Int J Cancer. 2004 Aug 20;111(2):198-205
CML-1
активность IKK
Mo et al., J
Ethnopharmacol. 2006 Jul 11; [Epub ahead of print]
соединение 5 (производное уредио-тиофенкарбоксамида)
активность IKK
Roshak et al., Curr Opin Pharmacol. 2002
Jun;2(3):316-21
Производное диаилпиридина
активность IKK
Murata et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2003
Mar 10;13 (5) :913-8
Диосгенин
активность IKK
Shishodia & Aggarwal, Oncogene. 2006 Mar 9;25(10):1463-73; Liagre et al. , Int J Mol Med. 2005
Dec;16(6):1095-101
ЕЗ-14.7К (Аденовирус)
активность IKK
Li et al., Proc Natl Acad Sci USA. 1999
Feb 2; 96 (3) :1042-7
ЕЗ-10.4К/14.5К (Аденовирус)
активность IKK
Friedman & Horwitz, J Virol. 2002 Jun;76(11):5515-21
Е7 (папилломавирус человека)
активность IKK
Spitkovsky et al., J Biol Chem. 2002 Jul
12;277 (28) :25576-82. Epub 2 002 May 1
Фуронафтохинон
активность IKK
Shin et al., Int Immunopharmacol. 2006 Jun;6(6):916-23. Epub 2 00 6 Feb 3
Гуггулстерон
активность IKK
Ichikawa & Aggarwal, Clin Cancer Res. 2006
Jan 15;12(2):662-8
HB-EGF (гепарин-связывающий фактор роста, подобный эпидермальному фактору роста)
активность IKK
Mehta & Besner, J Immunol. 2003 Dec 1;171 (11) :6014-22
Фалькаринол
активность IKK
Shiao et al. , Br J Pharmacol. 2005 Jan; 144 (1) :42-51
Фактор роста гепатоцитов
активность IKK
Min et al. , Circ Res.
2005 Feb 18;96(3):300-
7. Epub 2005 Jan 6;
Gong et al. , J Am Soc
Nephrol. 2006
Sep;17(9):2464-73. Epub
2006 Aug 2
Гонокиол
активность IKK
Tse et al., Biochem Pharmacol. 2005 Nov 15; 70 (10) :1443-57. Epub 2005 Sep 21
Гипоэстоксид
активность IKK
Ojo-Amaize et al., Cell Immunol. 2001 May 1;209 (2) :149-57
Производное индолкарбоксамида
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
LF15-0195 (аналог 15-
дезоксиспергуалина)
активность IKK
Yang et al. , J Leukoc Biol. 2003 Sep;74(3):438-47
Гамма-мангостин (из Garcinia mangostana)
активность IKK
Nakatani et al., Mol Pharmacol. 2004 Sep;66(3):667-74
Гарцинон В
активность IKK
Yamakuni et al., Neurosci Lett. 2006 Feb 20;3 94(3):2 06-10. Epub 2005 Nov 2
Производное (амино)имидазолилкар боксальдегида
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26.
Производное имидазолилхинолинкар боксальдегида
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
Кавеол
активность IKK
Kim et al. , Cancer Lett. 2004 Sep 30;213(2):147-54
Производные соединений кавы {Piper methysticum)
активность IKK
Folmer et al., Biochem Pharmacol. 2 00 6 Apr 14; 71 (8) :1206-18 . Epub 2 00 6 Feb 7
Свинец
активность IKK
Xu et al., Cell Biol Toxicol. 2006 May;22(3):189-98
Умеренная гипотермия
активность IKK
Han et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2003 May;23(5):589-98
ML120B
активность IKK
Catley et al. , Mol Pharmacol. 2006 Aug;70(2):697-705.
Epub 2 00 6 May 10
МХ7 81 (антагонист ретиноидов)
активность IKK
Bayon et al., Mol Cell Biol. 2003 Feb;23(3):1061-74
N-ацетилцистеин
активность IKK
Oka et al., FEBS Lett. 2000 Apr 28;472(2-3):196-202
Нитрозилкобаламин (аналог витамина В12)
активность IKK
Chawla-Sarkar et al., J Biol Chem. 2003 Oct 10;278(41):39461-9. Epub 2003 Jul 24
НПВС
активность IKK
Takada et al., Oncogene. 2004 Dec 9;23 (57) :9247-58
NS5B вируса гепатита С
активность IKK
Choi et al., Mol Cell Biol. 2006 Apr;26(8):3048-59
PAN1 (также известный как NALP2 или PYPAF2)
активность IKK
Bruey et al., J Biol Chem. 2004 Dec 10;279 (50) :51897-907. Epub 2004 Sep 28
Пектин (цитрусовый)
активность IKK
Chen et al., Biochem Pharmacol. 2006 Oct 16;72(8):1001-9. Epub 2006 Aug 2 2
производное пиразоло [4,3-с]хинолин
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
Производное пиридооксазинона
активность IKK
Karin et al. , Nat Rev Drug Discov. 2004 Jan;3(1):17-26
N-(4-гидроксифенил)-ретинамид
активность IKK
Shishodia et al. , Cancer Res. 2005 Oct 15; 65 (20) :9555-65
Сцитонемин
активность IKK
Stevenson et al. , Inflamm Res. 2002 Feb;51(2):112-4
экстракт Semecarpus anacardiит
активность IKK
Singh et al., J Ethnopharmacol. 2006 Jun 2; [Epub ahead of print]
SPC-839
активность IKK
Palanki et al., Bioorg Med Chem Lett. 2002 Sep 16;12(18):2573-7
Сульфорафан и фенилизотиоцианат
активность IKK
Xu et al., Oncogene.
2005 Jun 30;24 (28) :4486-95
Survanta (сурфактантный продукт)
активность IKK
Raychaudhuri et al. , Am J Respir Cell Mol
Biol. 2004 Feb;30(2):228-32. Epub 2003 Aug 14
Пикеатаннол
активность IKK
Islam et al. , Microbiol Immunol.
2004; 48 (10) :729-36
Плюмбагин (5-гидрокси-2-метил-1,4-нафтохинон)
активность IKK
Sandur et al. , J Biol Chem. 2 00 6 Jun 23;281(25):17023-33. Epub 2 00 6 Apr 19
Пептид IKKb к NEMO-связывающему домену
взаимодействие IKK-NEMO
May et al. , Science.
2000 Sep 1; 289 (5484) :1550-4
Пептид NEMO CC2-LZ
олигомеризация NEMO
Agou et al. , 2004
AGRO10 0 (G-квадруплексы олигодезоксинуклеоти дов)
связывание NEMO
Girvan et al. , Mol Cancer Ther. 2006
Jul;5(7):1790-9
PTEN (опухолевый супрессор)
активация IKK
Gustin et al. , J Biol Chem. 2 001 Jul 20;276 (29) :27740-4. Epub 2 001 May 16
Теафлавин (компонент черного чая)
активация IKK
Aneja et al. , Crit Care Med. 2004
Oct;32 (10) :2097-103; Ukil et al., Br J Pharmacol. 2006 Sep;149(1):121-31. Epub 2006 Jul 31
Тилианин
активация IKK
Nam et al.,
Atherosclerosis. 2005 May;180(1):27-35. Epub 2005 Jan 19
Витанолиды
активация IKK
Ichikawa et al., Mol Cancer Ther. 2006 Jun;5(6):1434-45
Зерумбон
активация IKK
Takada et al., Oncogene. 2005 Oct 20;24 (46) :6957-69
Силибинин
активность IKKa; ядерная транслокация
Dhanalakshmi et al. , Oncogene. 2002 Mar 7;21 (11) :1759-67; Singh et al. , Oncogene. 2005 Feb 10;24 (7) :1188-202
Сульфасалазин
киназная активность IKKa и IKKb
Wahl et al., J Clin Invest. 1998 Mar 1;101 (5) :1163-74 Weber et al., Gastroenterology. 2000 Nov;119(5):1209-18
Аналоги сульфасалазина
киназная активность IKK
Habens et al. , Apoptosis. 2005 May;10(3):481-91
Кверцетин
активность IKK
Peet & Li, J Biol Chem. 1999 Nov 12;274 (46) :32655-61
Розмариновая кислота
активность IKK
Lee et al. , Br J Pharmacol. 2006 Jun;148(3):366-75
Стауроспорин
активность IKK
Peet & Li, J Biol Chem. 1999 Nov 12;274 (46) :32655-61
Гамма-токотриенол
активность IKK
Shah & Sylvester, Exp Biol Med (Maywood) .
2005 Apr;230(4):235-41
Веделолактон
активность IKK
Kobori et al., Cell Death Differ. 2004 Jan;11(1):123-30
Бетулиновая кислота
активность IKKa и
фосфорилирование рб5
Takada & Aggarwal, J Immunol. 2 0 03 Sep 15; 171 (6) :3278-86
урсоловая кислота
активность IKKa и
фосфорилирование рб5
Shishodia et al. , Cancer Res. 2003 Aug 1;63(15):4375-83
Талидомид (и аналоги талидомида)
активность IKK
Keifer et al., J Biol
Chem. 2 001 Jun
22;276 (25) :22382-7.
Epub 2 001 Apr 10;
Ge et al., Blood. 2006
Aug 2 9; [Epub ahead of
print]
Интерлейкин-10
сниженная экспрессия IKKa и IKKb
Tabary et al. , Am J Pathol. 2003 Jan;162(1):293-302
МС160 (molluscum contagiosum virus)
сниженная экспрессия IKKa
Nichols & Shisler, J Virol. 2006 Jan;80(2):578-86
Монохлорамин и глицин хлорамин (NH2C1)
окисляет IkB
Kim et al., Biochim Biophys Acta. 2005 Dec 15;1746(2):135-42. Epub 2005 Oct 28; Midwinter et al., Biochem J. 2006 May 15;396 (1) :71-8
Chainy et al. ,
Анетол
фосфорилирование
Oncogene. 2 000 Jun 8; 19 (25) :2943-50
Oelschlager et al.,
Антитромбин III
фосфорилирование
Blood. 2002 Jun 1; 99(11) :4015-20
Sun et al., Int J Mol
Artemisia vestita
фосфорилирование
Med. 2006 May;17(5):957-62
Frantz & O'Neill,
Science. 1995 Dec
22;270 (5244) :2017-9;
Аспирин, салицилат натрия
фосфорилирование , 1ККбета
Kopp & Ghosh, Science. 1994 Aug 12;265 (5174) :956-9; Yin et al., Nature. 1998 Nov 5;396(6706):77-80
Ghosh et al., Blood.
2003 Mar
15; 101 (6) :2321-7. Epub
Азидотимидин (AZT)
фосфорилирование
2 0 02 Oct 2 4.; Kurokawa et al., Blood. 2005 Jul 1; 106 (1) :235-40 . Epub 2005 Mar 24
Tan et al. , Zhongguo
Baoganning
Zhong Xi Yi Jie He Za
фосфорилирование
Zhi. 2005 Sep;25(9):804-7
BAY-11-7082 (Е3((4-
метилфенил)-сульфонил)-2-пропен-нитрил)
фосфорилирование
Pierce et al., J Biol Chem. 1997 Aug 22;272 (34) :21096-103.
BAY-117 083 (ЕЗ( (4-трет-бутилфенил)-сульфонил)-2-пропен-нитрил)
фосфорилирование
Pierce et al., J Biol Chem. 1997 Aug 22;272 (34) :21096-103
Бензилизотиоцианат
фосфорилирование
Srivastava & Singh, Carcinogenesis. 2004 Sep;25(9):1701-9. Epub 2004 Apr 29
экстракты малиноежевики (цианидин-3-0-глюкозид, цианидин-
3-0-(2(G)-ксилозилрутинозид), цианидин-3-0-рутинозид)
фосфорилирование
Huang et al. , Cancer Res. 2002 Dec 1; 62 (23) :6857-63 . ; Hecht et al. , Carcinogenesis. 2006 Aug;27(8):1617-26. Epub 2 00 6 Mar 7
Сапонин IV будлеи
фосфорилирование
Won et al. , Br J Pharmacol. 2006 May;148(2):216-25
Какоспонгионолид В
фосфорилирование
Posadas et al. , Br J Pharmacol. 2003 Apr;138(8):1571-9
Calagualine
фосфорилирование
Manna et al., Cancer Lett. 2003 Feb 20;190(2):171-82
Монооксид углерода
фосфорилирование
Sarady et al. , Am J Respir Cell Mol Biol.
2002 Dec;27(6):739-45
Карбоплатин
фосфорилирование
Singh & Bhat, Biochem Biophys Res Commun.
2004 May 28; 318 (2) : 346-53
Кардамонин
фосфорилирование
Israf et al., Mol Immunol. 2 0 07 Feb;44 (5) :673-9 . Epub 2 00 6 Jun 13
Хорионический гонадотропный гормон
фосфорилирование
Manna et al., J Biol Chem. 2 000 May 5;275 (18) :13307-14
Кордицепин
фосфорилирование
Kim et al. , Eur J Pharmacol. 2006 Sep 18;545 (2-3) :192-9. Epub 2006 Jun 2 8
циклоэпоксидон; 1-гидрокси-2-гидроксиметил-3-пент-1-енилбензен
фосфорилирование
Gehrt et al., J Antibiot (Tokyo). 1998
May;51(5):455-63
Цитомегаловирус
фосфорилирование
Jarvis et al., 2006
Декурсин
фосфорилирование
Kim et al., Mol Pharmacol. 2006 Jun;69(6):1783-90.
Epub 2 00 6 Mar 1
Дексанабинол
фосфорилирование
Juttler et al., Neuropharmacology. 2004 Sep;47(4):580-92
Дигитоксин
фосфорилирование
Srivastava et al., Proc Natl Acad Sci U S
A. 2004 May 18;101(20):7693-8. Epub 2004 May 10
Дитерпены (синтетические)
фосфорилирование
Chao et al., Chembiochem. 2005 Jan;6(1):133-44
Докозагексановая кислота
фосфорилирование
Chen et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.
2005 Nov;46(11):4342-7
Entamoeba histolytica
фосфорилирование
Kammanadiminti & Chadee, J Biol Chem. 2006 Sep 8;281 (36) :26112-20. Epub 2 00 6 Jul 13
Интенсивно окисленные липопротеины низкой плотности (ox-LDL), 4-гидроксиноненаль (HNE)
фосфорилирование
Brand et al. , Arterioscler Thromb
Vase Biol. 1997 Oct;17(10):1901-9; Page et al., J Biol Chem. 1999 Apr 23;274 (17) :11611-8
FHIT (белок ломкой гистидиновой триады)
фосфорилирование
Nakagawa & Akao, Exp Cell Res. 2006 Aug 1;312 (13) :2433-42 . Epub 2 00 6 Apr 2 5
Габексат мезилат
фосфорилирование
Uchiba et al., Crit Care Med. 2003 Apr;31(4):1147-53
[б]-гингерол; каспарол
фосфорилирование
Kim et al. , Oncogene.
2005 Apr
7;24 (15) :2558-67. ;
Aktan et al., Planta
Med. 2006
Jun;72(8):727-34. Epub
2006 May 29
Гливек (иматаниб)
фосфорилирование
Wolf et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2005 Sep 20;102(38):136227. Epub 2005 Sep 8
Glossogyne tenuifolia
фосфорилирование
Wu et al., J Biomed Sci. 2004 Mar-Apr; 11 (2):186-99; Ha et al. , J Ethnopharmacol. 2006 Aug 11;107(1):116-25. Epub 2 00 6 Apr 3
Guggulsterone
фосфорилирование
Shishodia & Aggarwal, J Biol Chem. 2004 Nov 5;279 (45) :47148-58. Epub 2004 Aug 17
Гидрохинон
фосфорилирование
Kerzic et al., Toxicology. 2003 May 3; 187 (2-3) :127-37
Ибупрофен
фосфорилирование
Palayoor et al., Oncogene. 1999 Dec 2; 18 (51) :7389-94
Индирубин-3'-оксим
фосфорилирование
Mak et al., Biochem Pharmacol. 2004 Jan 1; 67 (1) :167-74
Интерферон-альфа
фосфорилирование
Manna et al. , J Immunol. 2 000 Nov 1; 165 (9) :4927-34
Ингалируемый изобутилнитрит
фосфорилирование
Ponnappan et al. , Int Immunopharmacol. 2004 Aug;4(8):1075-82
Экстракты лакрицы
фосфорилирование
Kim et al., Biochem Biophys Res Commun.
2 00 6 Jul 7; 345 (3) : 1215-23. Epub 2006 May 15
Мелатонин
фосфорилирование
Alonso et al., J Pineal Res. 2006 Aug;41(1) : 8-14
Метотрексат
фосфорилирование
Majumdar & Aggarwal, J Immunol. 2 001 Sep 1; 167 (5) :2911-20; Yozai et al., J Am Soc Nephrol. 2005 Nov;16(11):3326-38. Epub 2005 Sep 21
Монохлорамин
фосфорилирование
Omori et al. , Free Radic Res. 2002 Aug; 36 (8) :845-52
Мезилат нафамостата
фосфорилирование
Noguchi et al. , Int Immunopharmacol. 2003 Sep;3(9):1335-44
Олеандрин
фосфорилирование
Manna et al. , Cancer Res. 2000 Jul 15;60(14):3838-47; Sreeivasan et al. , Biochem Pharmacol.
2003 Dec 1;66(11):2223-39
Омега-3-жирные кислоты
фосфорилирование
Novak et al. , Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. 2003 Jan;284(1):L84-9. Epub 2 0 02 Aug 3 0
пандуратин А (из Каempferia pandurata, Zingiberaceae)
фосфорилирование
Yun et al. , Planta Med. 2003 Dec;69(12):1102-8
Петросаспонгиолид M
фосфорилирование
Posadas et al., Biochem Pharmacol.
2003 Mar 1;65(5):88795
Пиносильвин
фосфорилирование
Lee et al. , Planta Med. 2006 Jul;72(9):801-6. Epub 2 00 6 Jun 19
экстракт Plagius flosculosus
полиацетиленовый спирокеталь
фосфорилирование
Calzado et al., Biochim Biophys Acta.
2005 Jun 30; 1729 (2) :88-93
Фитиновая кислота (инозитол гексакисфосфат)
фосфорилирование
Ferry et al. , Carcinogenesis. 2002 Dec;23 (12) :2031-41
Фруктовый экстракт граната
фосфорилирование
Ahmed et al. , J Nutr.
2005 Sep; 135 (9) :2096102
Простагландин А1
фосфорилирование / IKK
Rossi et al. , Proc Natl Acad Sci USA.
1997 Jan 21; 94 (2) :74650;
Rossi et al. , Nature.
2 000 Jan 6; 403 (6765) :103-8
20 (S) -протопанаксатриол (гинзенозидный метаболит)
фосфорилирование
Oh et al., Cancer Lett. 2004 Mar 8;205 (1) :23-9; Lee et al. , Planta Med. 2005 Dec;71(12):1167-70
Ренгиолон
фосфорилирование
Kim et al., Biochem Pharmacol. 2 00 6 Apr 14; 71 (8) :1198-205.
Epub 2 00 6 Feb 2
Ротлерин
фосфорилирование
Kim et al., Biochem Biophys Res Commun.
2005 Nov 11;337 (1) :110-5
Сайкосапонин-d
фосфорилирование
Leung et al. , Biochem Biophys Res Commun.
2005 Dec 30; 338 (4) :1920-7. Epub 2005 Nov 11.
Солевой раствор (изотонический, с низким содержанием Na+)
фосфорилирование
Tabary et al., Biochem Biophys Res Commun.
2003 Sep 19;309(2):310-6
Водорастворимый экстракт Salvia miltiorrhizae
фосфорилирование
Kim et al. , Clin Exp Immunol. 2 0 05 Aug;141(2):288-97.
Сангвинарин (псевдохелеритрин, 13-метил-[1,3]-бензодиоксоло-[5,6-с]-1,З-диоксоло-4,5-фенантридиний)
фосфорилирование
Chaturvedi et al., J Biol Chem. 1997 Nov
28;272 (48) :30129-34
Скопарон
фосфорилирование
Jang et al., Life Sci. 2006 May 15;78(25):2937-43. Epub 2005 Dec 22
Сезаминоловые глюкозиды
фосфорилирование
Lee et al., Neurosci Res. 2006 Oct;56(2):204-12. Epub 2006 Jul 13
Силимарин
фосфорилирование
Manna et al., J Immunol. 1999 Dec 15;163(12):6800-9; Saliou et al., FEBS Lett. 1998 Nov 27; 440 (1-2) :8-12
S0CS1
фосфорилирование
Kinj уо et al. , Immunity. 2002 Nov;17(5):583-91; Nakagawa et al., Immunity. 2002 Nov;17(5):677-87
Статины (некоторые)
фосфорилирование
Hilgendorff et al., Int J Clin Pharmacol
Ther. 2003 Sep;41(9):397-401; Han et al., 2004; Planavila et al., Biochim Biophys Acta.
2005 Feb 21;1687(1-3):76-83
Сулиндак
1КК/
фосфорилирование
Yamamato et al., J Biol Chem. 1999 Sep
17;274 (38) :27307-14
THI 52 (1-нафтилэтил-б,7-дигидрокси-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин )
фосфорилирование
Kang et al. , Biochem Pharmacol. 2003 Feb 1; 65 (3) :457-64
Производные 1,2,4-тиадиазолидина
фосфорилирование
Manna et al., Int J Cancer. 2005 Feb 10; 113 (4) :549-60
Веснаринон
фосфорилирование
Manna & Aggarwal, J Immunol. 2 000 Jun 1; 164 (11) :5815-25; Harada et al. , Int J Oncol. 2005 Dec;27(6):1489-97
Ксантоангелол D
фосфорилирование
Sugii et al. , Biol Pharm Bull. 2005
Apr;28(4):607-10.
YC-1
фосфорилирование
Huang et al., Mol Cancer Ther. 2005 Oct;4(10):1628-35
YopJ (кодируемый Yersinia pseudotuberculosis)
деубиквитиназа IkBa
Schesser et al. , Mol Microbiol. 1998 Jun;2 8 (6) :1067-79; Zhou et al., J Exp Med. 2005 Nov 21;202(10):1327-32
Ацетаминофен
деградация
Mancini et al. , Neurosci Lett. 2003 Dec 19;353(2):79-82
Активированный протеин С (АРС)
деградация
Yuksel et al. , Thromb Haemost. 2002 Aug;88(2):267-73
Алахлор
деградация
Shimomura-Shimizu et al., Biochem Biophys Res Commun. 2 0 05 Jul 8;332 (3) :793-9
а-меланоцит-стимулирующий гормон (a-MSH)
деградация
Manna & Aggarwal, J Immunol. 1998 Sep 15;161(6):2873-80
Аментофлавон
деградация
Banerjee et al. , Mol Cell Biochem. 2002 Sep;238(1-2):105-10
Экстракт Artemisia capillaris Thunb.
деградация
Hong et al., Int J Mol Med. 2004 May;13(5):717-20
Экстракт Artemisia iwayomogi
деградация
Kim et al. , Exp Biol Med (Maywood). 2005 Jan;230 (1) :82-8
L-аскорбиновая кислота
деградация
Han et al., J Cell Biochem. 2004 Oct 1; 93 (2) :257-70
Antrodia camphorata
деградация
Hseu et al., Int Immunopharmacol. 2005 Dec;5(13-14):1914-25. Epub 2005 Jul 18
Аукубин
деградация
Jeong et al., Cytokine. 2002 Jun 7; 18 (5) :252-9.
Байкалин
деградация
Ma et al., Blood. 2005 Apr 15;105(8):3312-8. Epub 2004 Dec 30
Бета-лапахон
деградация
Manna et al. , Biochem Pharmacol. 1999 Apr 1; 57 (7) :763-74
Экстракт ежевики
деградация
Pergola et al., Nitric Oxide. 2006 Aug;15(1):30-9. Epub 2006 Mar 6
1-бромпропан
деградация
Yoshida et al. , Neurotoxicology. 2006 Jun 2; [Epub ahead of print]
Buchang-tang
деградация
Shin et al., J Ethnopharmacol. 2005 Oct 31; 102 (1) :95-101
Капсаицин (8-метил-N-ванилил-6-ноненамид)
деградация
Singh et al., J Immunol. 199 6 Nov 15; 157 (10) :4412-20; Mori et al., Cancer Res. 2006 Mar 15;66(6):3222-9
Каталпозид
деградация
Kim et al., Inflamm Bowel Dis. 2004 Sep; 10 (5) :564-72
Циклолинтеинон (сестертерпен губок)
деградация
D'Acquisto et al., Biochem J. 2000 Mar 15;346 Pt 3:793-8
DA-9601 (экстракт Artemisia asiatica)
деградация
Choi et al. , World J Gastroenterol. 2006 Aug 14; 12 (30) :4850-8
Диамид (ингибитор тирозинфосфатазы)
деградация
Toledano & Leonard, Proc Natl Acad Sci U S
A. 1991 May 15; 88 (10) :4328-32; Singh & Aggarwal, J Biol Chem. 1995 May 5;270 (18) :10631-9.
Dihydroarteanniun
деградация
Li et al., Int Immunopharmacol. 2006 Aug;6(8):1243-50. Epub 2 00 6 Apr 7
Добутамин
деградация
Loop et al., Anesth Analg. 2004 Nov;99(5):1508-15; table of contents.
Докозагексаеновая кислота
деградация
Weldon et al. , J Nutr Biochem. 2 00 6 Jun 15; [Epub ahead of print]
Е-73 (аналог циклогексимида)
деградация
Sugimoto et al., Biochem Biophys Res
Commun. 2 000 Oct 22;277(2):330-3
Экабет натрия
деградация
Kim et al., Helicobacter. 2003;8(5):542-53
Электрическая стимуляция блуждающего нерва
деградация
Guarini et al., Circulation. 2003 Mar 4; 107 (8) :1189-94
Эмодин (3-метил-1,6,8-
тригидроксиантрахино н)
деградация
Kumar et al., Oncogene. 1998 Aug 20;17 (7) :913-8; Huang et al. , Biochem Pharmacol. 2004 Jul 15; 68 (2) :361-71
Ephedrae herba (Мао)
деградация
Aoki et al., J Pharmacol Sci. 2005
Jul; 98 (3) :327-30 . Epub 2005 Jul 9
Эквол
деградация
Kang et al. , Biochem Pharmacol. 2005 Dec 19;71 (1-2) :136-43 . Epub 2005 Nov 10
Эрбстатин (ингибитор тирозинкиназы)
деградация
Natarajan et al., Arch Biochem Biophys. 1998
Apr 1;352(1):59-70
Эстроген (Е2)
деградация/и различные другие стадии
Sun et al., Biochem Biophys Res Commun.
1998 Mar 27;244(3):691-5; Kalaitzidis & Gilmore, Trends Endocrinol
Metab. 2005 Mar;16(2):46-52; Steffan et al. , Curr Top Med Chem.
2006;6(2):103-11.
Этакриновая кислота
деградация (и связывание ДНК)
Han et al., 2004
Фосфомицин
деградация
Yoneshima et al. , Int J Antimicrob Agents.
2003 Jun;21(6):589-92
Грибковый глиотоксин
деградация
Pahl et al., Oncogene.
1999 Nov 22; 18 (49) :6853-66
Габексат мезилата
деградация
Yuksel et al. , J Pharmacol Exp Ther.
2003 Apr;305(1) :298-305
Gamisanghyulyunbueum
деградация
Shin et al., Biol Pharm Bull. 2005 Jul;28(7):1177-82
Генистеин (ингибитор тирозинкиназы)
деградация; расщепление IkBa каспазами
Natarajan et al., Arch Biochem Biophys. 1998 Apr 1;352(1):59-7 0; Baxa & Yoshimura, Biochem Pharmacol.
2003 Sep 15;66(6):1009-18.
Генипин
деградация
Koo et al. , Eur J Pharmacol. 2004 Jul 14;495 (2-3) :201-8
Глабридин
деградация
Kang et al., J Pharmacol Exp Ther.
2005 Mar;312(3) :118794. Epub 2004 Nov 10
Глимепирид
деградация
Schiekofer et al. , Diabetes Obes Metab.
2003 Jul;5(4):251-61
Глюкозаминсульфат
деградация
Largo et al., Osteoarthritis Cartilage. 2003 Apr;11(4):290-8
Гамма-глутамилцистеинсинте таза
деградация
Manna et al. , Oncogene. 1999 Jul 29;18(30):4371-82.
Глутамин
деградация
Singleton et al., Shock. 2005 Dec;24(6):583-9
Gumiganghwaltang
деградация
Kim et al., Biol Pharm Bull. 2005 Feb;28(2):233-7
Белок теплового шока 70
деградация
Chan et al., Circulation. 2004 Dec 7;110(23):3560-6. Epub 2004 Nov 22.; Shi et al. , Shock. 2006 Sep;26(3):277-84
Гипохлорит
деградация
Mohri et al., Invest Ophthalmol Vis Sci.
2002 Oct;43(10):31905.
IL-13
деградация
Manna & Aggarwal, J Immunol. 1998 Sep 15;161(6):2863-72
Внутривенное введение иммуноглобулина
деградация
Ichiyama et al., Inflamm Res. 2004 Jun;53(6):2 53-6. Epub 2004 May 12
Изомаллотохроманол и изомаллотохромен
деградация
Ishii et al. , Biochim Biophys Acta. 2003 Mar 17;1620(1-3):108-18
K1L (белок вируса Vaccinia)
деградация
Shisler & Jin, J Virol. 2004 Apr;78(7):3553-60
Плод Kochia scoparia (метаноловый экстракт)
деградация
Shin et al., Biol Pharm Bull. 2004 Apr;27(4):538-43
Метаболит лефлуномида (А7 7 1726)
деградация
Manna & Aggarwal, J Immunol. 1999 Feb 15;162(4):2095-102
Лозартин
деградация
Chen et al. , 2002
Низкоуровневая лазерная терапия
деградация
Rizzi et al., Lasers Surg Med. 2006 Aug;38(7):704-13
LY294002 (ингибитор киназы PI3) [2- (4-морфолинил)-8-фенилхромон]
деградация
Park et al., Cell Biol Toxicol.
2002;18 (2) :121-30.
МС159 (Molluscum contagiosum virus)
деградация IkBb
Murao & Shisler, 2005
Мелатонин
деградация
Zhang et al., Eur J Pharmacol. 2004 Oct 6;501(1-3):25-30
5'-метилтиоаденозин
деградация
Hevia et al., Hepatology. 2004 Apr;39(4):1088-98.
Мидазолам
деградация
Kim et al., Anesthesiology. 2006 Jul; 105 (1) :105-10
Момордин I
деградация
Hwang et al. , Biochem Biophys Res Commun.
2005 Nov 25;337(3):815-23. Epub 2005 Sep 28.
Экстракт Morinda officinalis
деградация
Kim et al., J Pharm Pharmacol. 2005 May;57(5):607-15
Экстракт Mosla dianthera
деградация
Lee et al., Toxicol Appl Pharmacol. 2006 Jun 22; [Epub ahead of print]
Продукт гена Murrl
деградация
Ganesh et al. , Nature. 2003 Dec 18;426(6968):853-7.
Белок нейрофиброматоза-2 (NF-2; merlin)
деградация
Kim et al., Biochem Biophys Res Commun.
2002 Sep 6;296 (5) :1295-302
Экстракт Opuntia ficus indica var. saboten
деградация
Lee et al., 2006
Пенентратин
деградация
Letoya et al. , Mol Pharmacol. 2006 Jun;69(6):2027-36. Epub 2 00 6 Feb 27.
Перванадат (ингибитор тирозинфосфатазы)
деградация
Singh & Aggarwal, J Biol Chem. 1995 May 5;270 (18) :10631-9; Singh et al. , J Biol Chem. 1996 Dec 6;271 (49) :31049-54
Фениларсин оксид (РАО, ингибитор тирозинфосфатазы)
деградация
Mahboubi et al. , J Pharmacol Exp Ther.
1998 May;285(2):862-8; Singh & Aggarwal, J Biol Chem. 1995 May 5;270 (18) :10631-9
Бета-фенилэтил-(PEITC) и 8-метилсульфинилоктил-изотиоцианаты (MSO) (кресс водяной)
деградация
Rose et al., Nitric Oxide. 2005 Jun;12(4):237-43
Фенитоин
деградация
Kato et al., 2005
Платикодиновые сапонины
деградация
Ahn et al. , Life Sci. 2005 Apr 1;76 (20) :2315-28
Полимиксин В
деградация
Jiang et al., Chin Med J (Engl) . 2006 Mar 5; 119 (5) :384-90.
Экстракт плодов Poncirus trifoliata
деградация
Shin et al., Toxicol In vitro. 2 00 6 Oct;20(7):1071-6. Epub 2006 Mar 6
Пробиотики
деградация
Petrof et al., Gastroenterology. 2004 Nov; 127(5) :1474-87 .
Гипофизарный активирующий аденилатциклазу полипептид (РАСАР)
деградация
Delgado & Ganea, J Biol Chem. 2001 Jan 5;276 (1) :369-80
Простагландин 15-дезокси-дельта(12,14)-PGJ(2)
деградация
Cuzzocrea et al., Br J Pharmacol. 2003 Feb; 138 (4) :678-88; Chatterjee et al., Cardiovasc Res. 2004 Feb 15;61(3):630-43
PS-341
деградация/ протеасома
Hideshima et al., J Biol Chem. 2002 May 10;277 (19) :16639-47. Epub 2 0 02 Feb 2 8
Ресинифератоксин
деградация
Singh et al., J Immunol. 199 6 Nov 15; 157 (10) : 4412-20
Sabaeksan
деградация
Choi et al., Exp Mol Pathol. 2005 Jun;78(3):257-62. Epub 2005 Feb 17
SAIF
(противовоспалительн ый фактор Saccharomyces boulardii)
деградация
Sougioultzis et al. , Biochem Biophys Res
Commun. 2 00 6 Apr 28; 343 (1) :69-76. Epub 2 00 6 Feb 23.
Hehner et al. , J Biol
Chem. 1998 Jan
Сесквитерпен-лактон (партенолид;
эрголид; гвайянолиды)
деградация
16;273(3):1288-97; Whan Han et al. , Br J Pharmacol. 2001 Jun; 133 (4) :503-12 . ; Schorr et al., Phytochemistry. 2002 Aug;60(7):733-40
Takezako et al.,
ST2 (IL-1-подобная
Biochem Biophys Res
рецепторная
деградация
Commun. 2 00 6 Mar
секретируемая форма)
10;341(2):425-32. Epub 2 00 6 Jan 11
Loop et al.,
Тиопентал
деградация
Anesthesiology. 2002 May;96(5):1202-13
Xue et al., J
Pharmacol Exp Ther.
Типифарниб
деградация
2006 Apr;317(1):53-60. Epub 2005 Dec 13
Yang et al. , J Biomed
Титан
деградация
Mater Res A. 2003 Sep
15;66(4):802-10
TNP-470 (ингибитор
деградация
Mauriz et al., Free Radic Res. 2003
ангиогенеза)
Aug;37(8):841-8
Экстракты растения
Riehemann et al., FEBS
крапивы жгучей
деградация
Lett. 1999 Jan
{Urtica dioica)
8; 442 (1) :89-94
Инфекция Trichomomas vaginalis
деградация
Chang et al., Mol Cells. 2004 Oct 31;18 (2) :177-85
Триглицерид-богатые липопротеины
деградация
Kumwenda et al. , Shock. 2002 Aug;18(2) : 182-8
U0126 (ингибитор МЕК)
деградация
Takaya et al. , Am J Physiol Renal Physiol.
2003 May;284(5) :F1037-45. Epub 2003 Jan 7
Урсодезоксихолевая кислота
деградация
Joo et al., Arch Pharm Res. 2004 Sep;27(9):954-60
Xanthium strumarium L. (метаноловый экстракт)
деградация
Kim et al., Biol Pharm Bull. 2005 Jan;28(1):94-100
Цинк
деградация
Uzzo et al., Carcinogenesis. 2006 Oct;27(10):1980-90. Epub 2 00 6 Apr 10; Bao et al., Toxicol Lett. 2006 Oct 25;166(3):222-8. Epub 2006 Jul 18
Белок МС159 вируса Molluscum contagiosum
деградация 1кВбета
Murao & Shisler, Virology. 2005 Sep 30;340(2):255-64
Вазоактивный интестинальный пептид
деградация (и взаимодействие CBP-RelA)
Delgado & Ganea, J Biol Chem. 2001 Jan 5;276 (1) :369-80; Delgado, Biochem Biophys Res Commun.
2002 Oct 11;297 (5) :1181-5
белок Vpu ВИЧ-1
ингибитор убиквитинлигазы ТгСР
Bour et al., J Biol Chem. 2 001 May 11;276(19):15920-8. Epub 2 001 Feb 16
Мономер эпоксихинона А
IKKb/связывание ДНК
Liang et al. , Biochem Pharmacol. 2006 Feb 28;71(5):634-45. Epub 2005 Dec 19
RO106-9920 (низкомолекулярный)
ингибитор убиквитинилирова ния IkBa
Swinney et al., J Biol Chem. 2 0 02 Jun 28;277 (26) :23573-81. Epub 2 0 02 Apr 11
Рейн
активация NF-KB МЕКК
Martin et al. , Inflammation. 2003 Aug;27(4):233-46; Domagala et al., Biorheology. 2006;43(3-4) :577-87.
15-дезокси-простагландин J(2)
активация NF-KB PPARg
Boyault et al., FEBS Lett. 2004 Aug 13;572(1-3) :33-40 .
экстракт Antrodia camphor ata
повышающая регуляция IkBa
Hsu et al. , Cancer Lett. 2005 Apr 18;221 (1) : 77-89.
апигенин (4',5, 7-тригидроксифлавон)
повышающая регуляция IkBa
Shukla & Gupta, Clin Cancer Res. 2004 May 1; 10 (9) :3169-78 .
Бета-амилоидный белок
повышающая регуляция IkBa
Bales et al., Brain Res Mol Brain Res.
1998 Jun 1;57 (1) :63-72
грудное молоко человека
повышающая регуляция IkBa
Minekawa et al. , Am J Physiol Cell Physiol.
2004 Nov;287(5):C1404-11. Epub 2004 Jun 30
белок сурфактанта А (SP-A)
повышающая регуляция IkBa
Wu et al., Am J Respir Cell Mol Biol. 2004
Dec;31(6):587-94. Epub 2004 Aug 12
DQ 65-79 (65-79 а/к альфа спирали
альфа-цепи молекулы HLA класса II DQA03011)
повышающая регуляция IkBa и ингибирование IKK
Jiang et al. , J Immunol. 2 0 02 Apr 1;168(7):3323-8.
С5а
повышающая регуляция IkBa
Riedemann et al. , Immunity. 2003 Aug;19(2):193-202.
Auphan et al. ,
Science. 1995 Oct
13;270 (5234) :286-90;
Brostjan et al., J
Biol Chem. 1996 Aug
глюкокортикостероид ы (дексаметазон, преднизон,
повышающая регуляция IkBa
9;271 (32) :19612-6; Ray & Prefontaine, Proc Natl Acad Sci U S
метилпреднизолон)
A. 1994 Jan 18;91(2):752-6; Scheinman et al. , Mol Cell Biol. 1995
Feb;15(2):943-53.
Ehrlich et al. ,
Neuroreport. 1998 Jun
1; 9 (8) :1723-6;
IL-10
повышающая регуляция IkBa
Lentsch et al., J Clin Invest. 1997 Nov 15;100(10): 2443-8; Shames et al. , Shock. 1998 Dec;10(6):389-94
Ehrlich et al.,
Neuroreport. 1998 Jun
1; 9 (8) :1723-6;
IL-13
повышающая регуляция IkBa
Lentsch et al., J Clin Invest. 1997 Nov 15;100(10):244 3-8; Manna & Aggarwal, J Immunol. 1998 Sep 15;161(6):2863-72.
IL-11
IKKa; повышающая регуляция IkBa,IkBb
Trepicchio & Dorner, Ann N Y Acad Sci. 1998 Sep 29;856:12-21; Lgssiar et al., Exp Biol Med (Maywood) .
2004 May;229(5):42536.
Альфа-пинен
повышающая регуляция IkBa
Zhou et al., Acta Pharmacol Sin. 2004 Apr;25 (4) :480-4 .
NEF (ВИЧ-1)
повышающая регуляция IkBa
Qiao et al., Nat Immunol. 2 006 Mar;7(3):302-10. Epub 2006 Jan 22.
R-этодолак
повышающая регуляция IkBa
Neri et al. , Br J Haematol. 2006 Jul; 134 (1) :37-44 .
Витамин D
повышающая регуляция IkBa
Cohen-Lahav et al., Nephrol Dial
Transplant. 2006 Apr;21(4):889-97. Epub 2 00 6 Feb 2.
Foxl j
повышающая регуляция IkBb
Lin et al., 2004
Диоксин
ядерный транспорт RelA
Ruby et al., Mol Pharmacol. 2002 Sep;62(3):722-8
экстракт листьев Agastache rugosa
ядерная транслокация
Oh et al., Arch Pharm Res. 2005 Mar;28(3):305-10.
Альгиновая кислота
ядерная транслокация
Jeong et al., Clin Exp Allergy. 2006 Jun; 36 (6) :785-94.
Астрагалозид IV
ядерная транслокация
Zhang et al. , Thromb Haemost. 2003 Nov;90(5):904-14.
Аторвастатин
ядерная транслокация
Haloui et al. , Eur J Pharmacol. 2003 Aug 8; 474 (2-3) :175-84 .
Экстракт синей жимолости
ядерная транслокация
Jin et al. , Exp Eye Res. 2006 May;82(5):860-7. Epub 2005 Nov 23.
BMD (N(1)-бензил-4-метилбензен-1,2-диамин)
ядерная транслокация
Shin et al., Eur J Pharmacol. 2005 Oct 3;521 (1-3) :1-8 . Epub 2005 Sep 23.
Экстракт Buthus martensi Karsch
ядерная транслокация
Kim et al., 2005
Вирус собачьей чумы
ядерная транслокация
Friess et al., J Comp Pathol. 2005 Jan; 132 (1) :82-9.
Карбарил
ядерная транслокация
Shimomura-Shimizu et al. , Biochem Biophys Res Commun. 2 0 05 Jul 8;332 (3) :793-9.
Целастрол
ядерная транслокация
Pinna et al., Biochem Biophys Res Commun.
2004 Sep 24;322(3):778-86.
Хизанозид
ядерная транслокация RelA
Won et al. , Biol Pharm Bull. 2005 Oct;28(10):1919-24.
СР-1158
ядерная транслокация
Kim et al., Eur J Pharmacol. 2006 Aug 14;543 (1-3) :158-65. Epub 2006 Jun 2.
дегидроксиметилэпок сихиномицин (DHMEQ)
ядерная транслокация
Chaicharoenpong et al. , Bioorg Med Chem. 2002 Dec;10(12):3933-9
15-деоксиспергуалин
ядерная транслокация
Hutchings et al., Transpl Immunol. 2003 Jul-Sep;11(3-4):33544 .
Дипиридамол
ядерная транслокация
Weyrich et al., Circulation. 2005 Feb 8;111 (5) :633-42. Epub 2005 Jan 24.
Дисульфирам
ядерная транслокация
Wang et al., Int J Cancer. 2003 Apr 20; 104 (4) :504-11.
Дилтиазем
ядерная транслокация; индуцированная транслокация димеров р50
Severa et al., Biochem Pharmacol.
2005 Feb 1; 69 (3) :42532. Epub 2004 Dec 9.
Эриокаликсин В
ядерная транслокация/ Связывание ДНК
Wang et al., Cell Death Differ. 2006 Jun 16; [Epub ahead of print];
Leung et al., Mol Pharmacol. 2006 Aug 29; [Epub ahead of print]
Эстроген-зависимый транскрипт
ядерная транслокация
Jin et al. , Cell Immunol. 2 0 03 May;223(1):26-34.
FAK-родственная нуль-киназа
ядерная транслокация
Qin & Liu, Acta Pharmacol Sin. 2006 Sep;27(9):1159-64
Ганглиозиды
ядерная транслокация
Caldwell et al., J Immunol. 2 0 03 Aug 15;171(4):1676-83.
Глюкокортикоид-индуцируемый белок с "лейциновой молнией" (GILZ)
ядерная транслокация
Riccardi et al., Adv Exp Med Biol.
2001;495:31-9.
экстракт Harpagophytum
procumbens (гарпагофитума)
ядерная транслокация
Kaszkin et al., Phytomedicine. 2004 Nov;11(7-8):585-95.
Белок теплового шока 72
ядерная транслокация
Meldrum et al. , Circ Res. 2003 Feb 21;92(3):293-9
Гирсутенин
ядерная транслокация
Kim et al., FEBS Lett.
2 00 6 Jan 23;580(2):385-92. Epub 2005 Dec 19
Индол-3-карбинол
ядерная транслокация
Rahman & Sarkar, Cancer Res. 2005 Jan 1; 65 (1) :364-71
JM34 (производное бензамида)
ядерная транслокация
Carbonnelle et al. , 2005
JSH-23 (4-метил- (3-фенил-пропил)-бензен-1,2-диамин)
ядерная транслокация
Shin et al., FEBS Lett. 2004 Jul 30;571(1-3):50-4
KIOM-7 9 (комбинированные растительные экстракты)
ядерная транслокация
Jeon et al., J Ethnopharmacol. 2006 Apr 28; [Epub ahead of print]
KL-1156 (фениламид б-гидрокси-7-метоксихроман-2-карбоновой кислоты)
ядерная транслокация
Kim et al., Biochem Biophys Res Commun.
2004 Dec 3;325(1):2238 .
Лептомицин В (LMB)
ядерная транслокация
Rodriguez et al. , J Biol Chem. 1999 Mar
26;274(13):9108-15.
Левамизол
ядерная транслокация
Liu et al., J Surg Res. 2004 Apr;117(2):223-31.
МЕВ (2-(4-морфолинил)-
этилбутират гидрохлорид)
ядерная транслокация
Soderberg et al. , Int Immunopharmacol. 2004 Sep;4(9):1231-9.
MNF (1кВ-подобный белок вируса миксомы)
ядерная транслокация
Camus-Bouclainville et al., J Virol. 2004 Mar;78(5):2510-6.
Монтелукаст
ядерная транслокация
Wu et al. , Can J Physiol Pharmacol.
2006 May;84(5):531-7.
Клеточно-проникающие пептиды с NLS (SN50)
ядерная транслокация
Lin et al., J Biol Chem. 1995 Jun 16;270(24):14255-8.
2 ' ,8"-биапигенин
ядерная транслокация RelA
Woo et al., Biol Pharm Bull. 2006 May;29(5):976-80.
Нуклинг
ядерная транслокация RelA
Liu et al., Biochem J. 2004 May 15;380(Pt 1):31-41.
о, о' -
бисмиристоилтиамин дисульфид (ВМТ)
ядерная транслокация
Shoji et al. , Biochem Biophys Res Commun.
1998 Aug 28;249(3):745-53.
Орегонин
ядерная транслокация RelA
Lee et al. , Br J Pharmacol. 2005 Oct;146(3):378-88
1,2,3,4,б-пента-О-галлоил-бета-d-глюкоза
ядерная транслокация RelA
Kang et al., Eur J Pharmacol. 2005 Nov 7;524 (1-3) :111-9. Epub 2005 Oct 25
экстракт корня Platycodon grandiflorus
ядерная транслокация RelA
Lee et al. , Int J Mol
Med. 2004 Jun;13(6):843-7
Фаллацидин
ядерная транслокация
Papakonstanti & Strounaras, Mol Biol Cell. 2004 Mar;15(3):1273-86. Epub 2003 Dec 29
Пиперин
ядерная транслокация
Pradeep & Kuttan, Int Immunopharmacol. 2004 Dec 20; 4 (14) :1795-803
Питавастатин
ядерная транслокация
Wang et al., Biol Pharm Bull. 2006
Apr;29(4):634-9
PN-50
ядерная транслокация
Letoha et al., World J Gastroenterol. 2005 Feb 21; 11 (7) :990-9
Пробиотики
ядерная транслокация RelA
Bai et al., World J Gastroenterol. 2004 Feb 1; 10(3) :455-7.
пептиды RelA (PI и Рб)
ядерная транслокация
Takada et al. , J Biol Chem. 2004 Apr 9;279 (15) :15096-104. Epub 2004 Jan 7.
Родственный рецептору ретиноевой кислоты орфановый рецептор альфа
ядерная транслокация
Migita et al., FEBS Lett. 2004 Jan 16;557 (1-3) :269-74
экстракт Rhubarb aqueous
ядерная транслокация RelA
Moon et al., Life Sci. 2 00 6 Feb 28; 78 (14) :1550-7. Epub 2005 Nov 2
Ролипрам
ядерная транслокация
Sanchez et al., J Neuroimmunol. 2005 Nov;168(1-2):13-20. Epub 2005 Sep 22; Ikezoe et al. , Cancer Res. 2004 Oct 15; 64 (20) :7426-31.
Экстракт Salvia miltirrhoza Bunge
ядерная транслокация
Ding et al., J Cardiovasc Pharmacol.
2005 Jun;45 (6) :516-24
SC2 3 6 (селективный ингибитор СОХ-2)
ядерная транслокация
Wong et al., Oncogene.
2003 Feb 27;22 (8) :1189-97
Селенометионин
ядерная транслокация
Cherukuri et al. , Cancer Biol Ther. 2005
Feb;4(2):175-8 0. Epub 2005 Feb 8
Состав соединения ShenQi
ядерная транслокация RelA
Zhang et al., Zhong Yao Cai. 2006
Mar;29(3):249-53
Экстракт корня Sophora flavescens
ядерная транслокация
Kwon et al., Clin Chim Acta. 2004 Oct; 348(l-2) : 79-86
Sopoongsan
ядерная транслокация
Na et al., Int Arch Allergy Immunol.
2006;139(1):31-7. Epub 2005 Nov 3
Сфондин (производное фуранокумарина из Heracleum laciniatum)
ядерная транслокация
Yang et al., Life Sci. 2002 Nov 29;72(2):199213
TAT-SR-IkBa; MTS-SR-IkBa
ядерная транслокация
Blackwell et al., Arthritis Rheum. 2004
Aug;50(8):2675-84; Mora et al. , Am J Physiol Lung Cell Mol
Physiol. 2005 Oct;289(4):L536-44.
Epub 2005 Jun 10
Лечение ингаляционными анестетиками
ядерная транслокация
Lee et al., Anesthesiology. 2004 Dec;101(6):1313-24
Younggaechulgam-tang
ядерная транслокация
Shin et al., Immunopharmacol Immunotoxicol. 2004;26(4):545-58
Белок ZUD
активация NF-KB; связывание pl05/RelA
Zhang et al. , J Biol Chem. 2004 Apr 23;279 (17) :17819-25. Epub 2004 Feb 9
Белок ZAS3
ядерная транслокация RelA; конкуренция за связывание с ДНК
Hong et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2003
Oct 14; 100 (21) :123016. Epub 2003 Oct 6
Клэритромицин
ядерная экспрессия
Ichiyama et al., Antimicrob Agents
Chemother. 2001 Jan;45(1):44-7
Флувастатин
ядерная экспрессия
Azuma et al., Cardiovasc Res. 2004 Dec 1;64(3):412-20
Лефлуномид
ядерная экспрессия RelA
Yao et al., Acta Pharmacol Sin. 2004
Jul;25 (7) :915-20
Сверхэкспрессия гена RASSF1A
ядерная экспрессия RelA
Deng et al., Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue
Ban. 2005 Apr;3 0(2):193-6
окисленный 1-пальмитоил-2-арахидоноил-sn-глицеро-3-фосфорилхолин (ОХРАРС)
экспрессия RelA
Li et al., Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2004 Aug 2; 84 (15) :1235-9
протеаза ЗС (полиовирус)
экспрессия RelA (расщепление)
Neznanov et al., J Biol Chem. 2005 Jun 24;280 (25) :24153-8. Epub 2 0 05 Apr 21.
5F (из Pteri syeminpinnata L.)
экспрессия RelA
He et al. , Zhong Yao Cai. 2005 Aug;28(8):672-6
АТ514 (серратамолид)
экспрессия RelA
Escobar-Diaz et al. , Leukemia. 2005 Apr;19(4):572-9
кора Sorbus
commixta (метаноловый экстракт)
экспрессия RelA
Sohn et al., Biol Pharm Bull. 2005 Aug;28(8):1444-9
Кантаридин
экспрессия NF-KB
He et al. , Ai Zheng. 2005 Apr;24(4):443-7
экстракт Cornus officinalis
экспрессия NF-KB
Li et al., Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2005 Nov;30(21):1667-70
Неомицин
экспрессия NF-KB
Garcia-Trapero et al. , Neurol Res. 2004 Dec;26(8):816-24
омапатрилат, эналаприл, CGS 25462
экспрессия NF-KB
Pu et al., J
Hypertens. 2005 Feb;23(2):401-9
онконаза (ранпирназа)
экспрессия NF-KB
Tsai et al., Int J Oncol. 2004 Dec;25(6):1745-52
Пеонифлорин
экспрессия NF-KB
Liu et al., Brain Res. 2006 May 17;1089(1):162-70. Epub 2 00 6 May 5
Рапамицин
экспрессия NF-KB
Lawrence et al., J Vase Surg. 2004
Aug;40(2):334-8
метаноловый экстракт Sargassum hemiphyllum
экспрессия NF-KB
Na et al. , J Pharmacol Sci. 2005 Feb;97(2):219-26. Epub 2005 Feb 5
Shenfu
экспрессия NF-KB
Zhang et al. , Chin J Traumatol. 2005 Aug 1; 8 (4) :200-4
Полигликозиды из растений рода Tripterygiит
экспрессия NF-KB
Zhou et al. , Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za
Zhi. 2005 Aug;25(8):723-6
Трифлузал
ядерная экспрессия
Acarin et al., Neurosci Lett. 2000
Jul 7;288 (1) :41-4
HSCO (гепатомный белок)
усиливает экспорт RelA из ядра
Higashitsuji et al. , Cancer Cell. 2002
Oct;2(4):335-46
Андрографолид
Ковалентное связывание с Cys63 р50
Xia et al., J Immunol.
2004 Sep 15; 173 (6) :4207-17
Пчелиный яд (мелиттин)
связывание ДНК посредством связывания с р50
Park et al., Arthritis Rheum. 2004 Nov;50(11):3504-15
Этилпируват
связывание ДНК RelA через Cys38
Han et al., J Pharmacol Exp Ther.
2005 Mar;312(3) :1097105. Epub 2004 Nov 3
1'-ацетоксихавикол ацетат
Связывание ДНК
Ito et al., Biochem Biophys Res Commun.
2005 Dec 30; 338 (4) :1702-10. Epub 2005 Nov 2
ацетиламинофлуорен
Связывание ДНК
Kang et al., Cancer Lett. 2004 Jan 8;203 (1) :91-8; Jeon et al. , Toxicol Lett. 1999 Feb 22; 104 (3) :195-202
Актинодафнин (из
Ci ппатотит insularimontanum)
Связывание ДНК
Hsieh et al. , Food Chem Toxicol. 2006
Mar;44(3):344-54. Epub 2005 Sep 15
Адипонектин
Связывание ДНК
Ajuwon & Spurlock, Am J Physiol Regul Integr
Comp Physiol. 2005
May;288(5):R1220-5.
Epub 2004 Dec 16
Ингибиторы рибозилирования АДФ (никотинамид, 3-аминобензамид)
Связывание ДНК
Le Page et al. , Biochem Biophys Res
Commun. 1998 Feb 13;243(2):451-7
сверхэкспрессия AIM2
(отсутствующего при меланоме белка)
Связывание ДНК
Chen et al. , Mol Cancer Ther. 2006
Jan;5 (1) :1-7
Умеренное потребление алкоголя
Связывание ДНК
Mandrekar et al., Alcohol Clin Exp Res.
2006 Jan;30(1):135-9
7-амино-4-ме тилкумарин
Связывание ДНК
Kurokawa et al. , Eur J Pharmacol. 2003 Aug 8;474(2-3):283-93
Амринон
Связывание ДНК
Chanani et al., Circulation. 2002 Sep 24;106(12 Suppl 1):1284-9.
Ангиопоэтин-1
Связывание ДНК
Jeon et al., Circ Res. 2003 Apr 4; 92 (6) :586-8
Антоцианины (соевых бобов)
Связывание ДНК
Kim et al., FEBS Lett. 2 00 6 Feb 20;580 (5) :1391-7. Epub 2 00 6 Jan 2 6
Экстракт Arnica
montana (сесквитерпеновые лактоны)
Связывание ДНК
Kos et al. , Planta Med. 2005 Nov;71(11):1044-52
Артемизин
Связывание ДНК
Aldieri et al., FEBS Lett. 2003 Sep 25;552(2-3):141-4; Wang et al. , Antimicrob Agents
Chemother. 2006 Jul;50(7):2420-7
Предсердный натрийуретический пептид (ПНП)
Связывание ДНК;
повышающая регуляция IkBa
Gerbes et al., Hepatology. 1998 Nov;2 8(5):1309-17; Kiemer et al., Biochem Biophys Res Commun.
2 0 02 Aug 2;295 (5) :1068-76.
Атровастат (ингибитор HMG-CoA-редуктазы)
Связывание ДНК
Bustos et al., J Am Coll Cardiol. 1998 Dec;32(7):2057-64; Hernandez-Presa et al., Am J Pathol. 1998 Dec;153(6):1825-37
Белок AvrA (сальмонеллы)
Связывание ДНК
Collier-Hyams et al., J Immunol. 2 0 02 Sep 15; 169 (6) :2846-50
Байкалин (5,6,7-тригидроксифлавон)
Связывание ДНК
Suk et al., J Pharmacol Exp Ther.
2003 May;305(2):63845. Epub 2003 Jan 21
Земляные бобы
(Vignea subterranean)
Связывание ДНК
Na et al., Biofactors. 2004;21(1-4):149-53
Бенфотиамин (производное тиамина)
Связывание ДНК
Hammes et al. , Nat Med. 2003 Mar;9(3):294-9. Epub 2003 Feb 18
Бета-катенин
Связывание ДНК
Deng et al., Cancer Cell. 2002 Oct;2 (4) :323-34
Бета-лапахон (1,2-нафтохинон)
Связывание ДНК
Tzeng et al. , Am J Respir Crit Care Med.
2003 Jul 1; 168 (1) :8591. Epub 2003 Apr 30
Биливердин
Связывание ДНК
Yamashita et al. , FASEB J. 2004 Apr; 18 ( 6) :765-7 . Epub 2004 Feb 20
Бисфенол А
Связывание ДНК
Kim & Jeong, Cancer Lett. 2003 Jun 30; 196 (1) :69-76
Бычий сывороточный альбумин
Связывание ДНК
Zhang & Frei, Cardiovasc Res. 2002 Sep;55(4):820-9
Бразильский зеленый прополис
Связывание ДНК
Bae et al. , Eur J Pharmacol. 2005 Apr 25;513 (3) :237-42 . Epub
2005 Apr 15;
Paulino et al., Planta Med. 2006 Aug;72(10):899-906. Epub
2006 Aug 10
Бромелаин
Связывание ДНК
Hou et al., J Agric Food Chem. 2006 Mar 22;54 (6) :2193-8
Киназа кальций/кальмодулин -зависимой киназы (СаМКК) (и повышенное внутриклеточное содержание кальция
при действии иономицина, УТФ и тапсигаргина)
Связывание ДНК
Chen et al., J Biol Chem. 2002 Jul 5;277 (27) :24169-79. Epub 2 0 02 Apr 2 5
Кальцитриол (1а,25-дигидроксивитамин D3)
Связывание ДНК
Harant et al. , Eur J Biochem. 1997 Nov 15;250(1):63-71
Камптотецин
Связывание ДНК
Hentze et al., Hepatology. 2004 May;39(5):1311-20
Сутерландия кустарниковая (Sutherlandia
frutescens)
Связывание ДНК
Na et al., Biofactors. 2004;21 (1-4) :149-53
Капрофен
Связывание ДНК
Bryant et al. , Am J Vet Res. 2003
Feb;64 (2) :211-5
Capsiate
Связывание ДНК
Sancho et al. , Eur J Immunol. 2 0 02 Jun;32(6):1753-63
Карбоцистеин
Связывание ДНК
Yasuda et al. , Eur Respir J. 2006 Jul;28(1):51-8. Epub 2006 Mar 1
Каталпозид (кора)
Связывание ДНК
Oh et al., Planta Med. 2002 Aug;68(8):685-9
Кора Унарии опушенной (Uncaria tomentosa; Rubiaceae); мака
Связывание ДНК
Aguilar et al. , J Ethnopharmacol. 2002 Jul;81(2):271-6; Valerio & Gonzales, Toxicol Rev.
2005;24 (1) :11-35
Сверхэкспрессия CD43
Связывание ДНК (RelA)
Laos et al., Int J Oncol. 2006 Mar;28(3):695-704
Целекоксиб и гемцитабин
Связывание ДНК
El-Rayes et al. , Mol Cancer Ther. 2004
Nov;3(11):1421-6
Cheongyeolsaseuptan
Связывание ДНК
Kim et al., J Ethnopharmacol. 2005 Feb 10; 97 (1) :83-8 . Epub 2004 Dec 10
Хитозан
Связывание ДНК
Seo et al., Biol Pharm Bull. 2003 May;26(5) :717-21
Циннамальдегид, 2-метоксициннамальдег
ид, 2-гидроксициннамальде гид
Связывание ДНК
Reddy et al. , Planta Med. 2004 Sep;70(9):823-7; Lee et al., Biochem Pharmacol. 2005 Mar 1; 69 (5) :791-9. Epub 2005 Jan 16
Корень цикория (гвайянолид 8-дезоксилактуцин)
Связывание ДНК
Cavin et al. , Biochem Biophys Res Commun.
2005 Feb 18;327 (3) :742-9
Хлорофиллин
Связывание ДНК
Yun et al. , Int Immunopharmacol. 2005 Dec;5(13-14):1926-35. Epub 2 0 05 Jul 6.
Продукт деградации
протеогликана хондроитинсульфата
Связывание ДНК
Rolls et al., FASEB J. 2006 Mar;20(3):547-9. Epub 2 00 6 Jan 5
Клэритромицин
Связывание ДНК
Miyanohara et al., Laryngoscope. 2000 Jan;110(1):126-31
Клорихромен
Связывание ДНК
Ianaro et al. , Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol. 2004 Aug;370(2):140-5. Epub 2004 Jul 30
Кокаэтилен
Связывание ДНК
Tacker et al., Clin Chem. 2 00 6 Oct; 52 (10) :1926-33. Epub 2006 Aug 17
Коммерческий раствор для перитонеального диализа
Связывание ДНК
Douvdevani et al., Kidney Int. 1995
Jun;47(6):1537-45
соединение К (из Panax ginseng)
Связывание ДНК
Park et al., Biol Pharm Bull. 2005
Apr;28(4):652-6.
Экстракт коры Коричника китайского
Связывание ДНК
Kwon et al. , World J Gastroenterol. 2006 Jul 21;12(27):4331-7
соединение CP (фениламид 6-гидрокси-7-метоксихроман-2-карбоновой кислоты)
Связывание ДНК
Rak Min et al. , Life Sci. 2005 Nov 4; 77 (25) :3242-57. Epub 2005 Jun 22
Криптотаншинон
Связывание ДНК
Zhou et al., Biochim Biophys Acta. 2006
Jan;1760(1):1-9. Epub 2005 Oct 3.
Цианогуанидин CHS 828
Связывание ДНК
Johanson et al., Neuroendocrinelogy. 2005;82(3-4):171-6. Epub 2 00 6 Feb 2 4
Цитохалазин D
Связывание ДНК
Kim et al., J Biol Chem. 2003 Oct 24;278 (43) :42448-56. Epub 2003 Aug 7
DA-9201 (из черного риса)
Связывание ДНК
Lee et al., Arch Pharm Res. 2005 Dec;28(12):1350-7.
Danshenshu
Связывание ДНК
Jiang et al., Zhonghua Shao Shang Za Zhi.
2 001 Feb;17(1):3 6-8
Олигонуклеотидные ловушки (к участку кВ)
Связывание ДНК
Kupatt et al., Gene Ther. 2002 Apr;9(8):518-26; Morishita et al. , Nat Med. 1997 Aug;3(8):894-9
Диамид
Связывание ДНК
Toledano & Leonard, Proc Natl Acad Sci U S
A. 1991 May 15; 88 (10) :4328-32
Диарилгептаноид 7-(4'-гидрокси-3'-метоксифенил)-1-
фенилгепт-4-ен-З-он
Связывание ДНК
Yadav et al., J Pharmacol Exp Ther.
2003 Jun;305(3):92531. Epub 2003 Mar 6
Альфа-дифторметилорнитин (истощение полиаминов)
Связывание ДНК
Facchini et al., J Cell Physiol. 2005
Sep;204(3):956-63
DIM/13C
Связывание ДНК
Li et al., Front Biosci. 2005 Jan l;10:236-43. Print 2005 Jan 1
Дитерпеноиды из Isodon rubescens или Liverwort Jungermannia
Связывание ДНК
Leung et al., Mol Pharmacol. 2005 Aug; 68 (2) :286-97 . Epub 2005 May 4;
Kondoh et al. , Planta Med. 2005 Nov;71(11):1005-9
DTD (4,10-дихлоропиридо-[5,6:4,5]тиено[3,2-d':3,2-d]-1,2,3-дитриазин)
Связывание ДНК
Rioja et al. , Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol. 2002 May;365(5):357-64. Epub 2002 Mar 19.
E1B (аденовирус)
Связывание ДНК
Limbourg et al., J Biol Chem. 1996 Aug
23;271(34):20392-8
ЕЗЗЗО (производное хинона)
Связывание ДНК
Hiramoto et al., J Immunol. 1998 Jan 15;160 (2) :810-9; Kimura et al. , Biochem Biophys Res Commun.
1997 Feb 24;231 (3) :557-60
энт-каурановые дитерпеноиды (из листьев Croton tonkinensis)
Связывание ДНК
Giang et al., J Nat Prod. 2003 Sep;66(9):1217-20
Эпинастин гидрохлорид
Связывание ДНК
Kanai et al., Int Arch Allergy Immunol.
2006; 140 (1) :43-52. Epub 2 00 6 Mar 13
Эпоксихинол А (грибковый метаболит)
Связывание ДНК
Li et al. , Org Lett.
2002 Sep 19; 4(19) : 3267-70
Эритромицин
Связывание ДНК/ трансактивация
Ren et al., J Orthop Res. 2004 Jan;22(1):21-9; Desaki et al., Antimicrob Agents
Chemother. 2004 May;48(5):1581-5
Голубой краситель Эванса
Связывание ДНК
Sharma et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2004
Dec 20;14(24):6123-7
Эводиамин
Связывание ДНК
Choi et al., Arch Pharm Res. 2006
Apr;29 (4) :293-7
Фенолдопам
Связывание ДНК
Aravindan et al., J Cardiothorac Vase
Anesth. 2006 Apr;20(2):179-8 6. Epub 2 00 6 Jan 6
Фексофенадин гидрохлорид
Связывание ДНК
Asano et al., Clin Exp Allergy. 2004 Dec;34(12):1890-8
Фибраты
Связывание ДНК
Hirano et al. , Int Immunopharmacol. 2003 Feb;3(2):225-32
Потребление рыбьего жира
Связывание ДНК
Fan et al., J Immunol.
2004 Nov 15;173(10):6151-60
FK7 7 8
Связывание ДНК
Zeyda et al., Transplant Proc. 2005 May;37(4):1968-9
Сверхэкспрессия FLN2 9
Связывание ДНК
Mashima et al., J Biol Chem. 2005 Dec 16;280 (50) :41289-97. Epub 2005 Oct 12
FLICE-подобный ингибиторный белок (FLIP)
Связывание ДНК
Bannerman et al., Am J Pathol. 2004 Oct;165(4):1423-31
Флуниксин меглумин
Связывание ДНК
Bryant et al. , Am J Vet Res. 2003 Feb;64 (2) :211-5
Флурбипрофен
Связывание ДНК
Fratelli et al., Antioxid Redox Signal.
2003 Apr;5(2):229-35
Метаноловые экстракты Fomes fomentarius
Связывание ДНК
Park et al., Biol Pharm Bull. 2004 Oct;27(10):1588-93
Фукоидан
Связывание ДНК
Haneji et al., Nutr Cancer.
2005;52 (2) :189-201
G-120 (гликопротеин из Ulmus davidiana Nakai)
Связывание ДНК; повышение IkB
Son et al., Mol Cells. 2004 Oct 31;18 (2) :1637 0. ;
Lee et al. , Food Chem Toxicol. 2005 Jun;43(6):961-8
Галлиевая кислота
Связывание ДНК
Kim et al., Toxicol Sci. 2006 May;91(1):123-31. Epub 2005 Dec 1
Ganoderma lucidum (высушенные споры или плодовое тело гриба)
Связывание ДНК
Sliva et al. , Biochem Biophys Res Commun.
2002 Nov 8;298(4):60312 .
Гарцинол (из кожуры плодов Garcinia spp. )
Связывание ДНК
Hong et al. , Carcinogenesis. 2006 Feb;27(2):278-86. Epub 2005 Aug 10
Gax (белок, кодируемый гомеобоксом)
Связывание ДНК
Patel et al. , Cancer Res. 2005 Feb 15;65(4):1414-24
Геранилгераниол
Связывание ДНК
Espindola et al., Carcinogenesis. 2005 Jun;26(6):1091-9. Epub 2005 Feb 17
Грелин
Связывание ДНК
Li et al., Circulation. 2004 May 11; 109 (18) :2221-6. Epub 2004 Apr 26
Гигантол (Cymbidium georingii)
Связывание ДНК
Won et al. , Planta Med. 2006 Aug 21; [Epub ahead of print]
Гинкголид В
Связывание ДНК
Nie et al., Yao Xue Xue Bao. 2004 Jun;39(6):415-8.
Глициризин
Связывание ДНК
Wang et al., Liver. 1998 Jun;18(3):180-5; Yuan et al. , World J Gastroenterol. 2006 Jul 28;12(28):4578-81
H4/N5 (IkB-подобные белки браковируса Microplitis demolitor)
Связывание ДНК
Thoetkiattikul et al. , Proc Natl Acad Sci U S
A. 2005 Aug 9;102(32):11426-31. Epub 2 0 05 Aug 1
Галофугинон
Связывание ДНК
Leiba et al., J Leukoc Biol. 2006 Aug;80(2):399-406.
Epub 2006 Jun 12
Жар (подобный лихорадке)
Связывание ДНК
Salanova et al., FASEB J^ 2005 May;19(7):8168. Epub 2005 Mar 8
Геленалин (сесквитерпеновый лактон)
Связывание ДНК
Kim et al. , Eur J Pharmacol. 2005 Mar 28;511(2-3):89-97
Гематеин (соединение растительного происхождения)
Связывание ДНК
Oh et al., Atherosclerosis. 2001 Nov;159(1):17-26
Соединение растительного происхождения 8 61
Связывание ДНК
You et al. , Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi.
2001 Apr;9(2):73-4
Гесперетин
Связывание ДНК
Kim et al., Aging Cell. 2006 Oct;5(5):401-11. Epub 2006 Aug 2 5
Фактор устойчивости ВИЧ-1
Связывание ДНК
Lesner et al., J Immunol. 2 0 05 Aug 15;175(4):2548-54
Гидроксиэтилкрахмал
Связывание ДНК
Tian et al. , Ann Clin Lab Sci. 2003 Fall;33(4):451-8; Feng et al., J Surg Res. 2006 Sep;135(1):129-36. Epub 2 00 6 Apr 17
Гидроксиэтилпуэрари н
Связывание ДНК
Lou et al., Chin J Physiol. 2004 Dec 31; 47 (4) :197-201
Респираторный ацидоз
Связывание ДНК
Chonghaile et al. , Curr Opin Crit Care.
2005 Feb;11 (1) :56-62
Гиперицин
Связывание ДНК
Bork et al., Planta Med. 1999 May;65(4):297-300
Гиперосмолярность
Связывание ДНК
Lang et al. , Am J Physiol Cell Physiol.
2003 Jan;284(1):C200-8
Гипотермия
Связывание ДНК
Hassoun et al., J Surg Res. 2003 Nov;115(1):121-6
Гидрохинон (HQ)
Связывание ДНК
Pyatt et al. , Toxicol Appl Pharmacol. 1998 Apr;149(2):178-84
ICP27 (HSV-1)
Связывание ДНК
Melchjorsen et al. , J Gen Virol. 2006 May;87(Pt 5):1099-108
Интерлейкин 4 (IL-4)
Связывание ДНК
Manna & Aggarwal, J Biol Chem. 1998 Dec 11;273 (50) :33333-41
IkB-подобный белок A2 3 8L (кодируемый ASFV)
Связывание ДНК
Powell et al. , J Virol. 1996 Dec;70(12):8527-33; Revilla et al., J Biol Chem. 1998 Feb 27;273(9):5405-11
Белок 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста
Связывание ДНК
Williams et al. , Cell Death Differ. 2006 Apr
28; [Epub ahead of print]
JSH-21 (Nl-бензил-4-метилбензен-1,2-диамин)
Связывание ДНК
Min et al., Arch Pharm Res. 2004 Oct;27(10):1053-9
Камебакаурин
Связывание ДНК
Lee et al., J Biol Chem. 2002 May 24;277 (21) : 18411-20. Epub 2002 Mar 4
Белок К1 герпесвируса, связанного с саркомой Капоши
Связывание ДНК
Lee et al., J Virol.
2002 Dec;76(23) : 1218599
Кетамин
Связывание ДНК
Sun et al., Inflamm Res. 2004 Jul; 53(7) :304-8 . Epub 2004 Jun 25
КТ-90 (синтетическое производное морфина)
Связывание ДНК
Sueoka et al., Biochem Biophys Res Commun.
1998 Nov 27;252(3):566-70
Линолевая кислота
Связывание ДНК
Zhao et al., Arch Anim Nutr. 2005 Dec;59(6):429-38
Корень литоспермума
Связывание ДНК
Chung et al., J Ethnopharmacol. 2005 Dec 1;102 (3) :412-7 . Epub 2005 Jul 28
Ловастатин
Связывание ДНК
Sun & Fernandes, Cell Immunol. 2 0 03 May;223(1):52-62
Макролидные антибиотики
Связывание ДНК
Nguyen et al., Curr Opin Pulm Med. 2002 Nov;8(6):521-8
Экстракты средиземноморских растений
Связывание ДНК
Stalinska et al. , J Physiol Pharmacol.
2005 Mar; 56 Suppl 1: 157-69
Меркаптопиразин
Связывание ДНК
Lim et al., Biochem Pharmacol. 2004 Aug 15;68(4):719-28
2-метоксиэстрадиол
Связывание ДНК; Трансактивация
Shimada et al., Mol Carcinog. 2004 Jan;39(1):1-9; Takada et al., Acta Med Okayama. 2004 Aug;58(4):181-7
б-(метилсульфинил)-гексилизотиоцианат (из васаби)
Связывание ДНК; Трансактивация
Uto et al. , Biochem Pharmacol. 2005 Dec 5; 70 (12) :1772-84 . Epub 2005 Oct 27
Металлы (хром, кадмий, золото, свинец, ртуть, цинк, мышьяк)
Связывание ДНК
Shumilla et al. , Arch Biochem Biophys. 1998 Jan 15;349 (2) :356-62; Yang et al., 1995; Zuscik et al., J Orthop Res. 2002 Jul;20(4):811-8
мевинолин, 5'-метилтиоаденозин (МТА)
Связывание ДНК
Law et al., Mol Cell Biol. 1992 Jan;12(1):103-11
Монометилфумарат
Связывание ДНК
Litjens et al. , Eur J Immunol. 2004 Feb;34(2):565-75
Моксифлоксацин
Связывание ДНК
Werber et al., J Antimicrob Chemother.
2005 Mar;55(3):293300. Epub 2005 Jan 19; Shalit et al., J Antimicrob Chemother.
2006 Feb;57(2):230-5. Epub 2005 Dec 13
Мирицетин
Связывание ДНК
Kang et al., Arch Pharm Res. 2005 Mar;28(3):274-9.
NDPP1 (белок CARD)
Связывание ДНК
Zhang & Fu, Int J Oncol. 2002 May;20(5):1035-40
N-этил-малеинимид (NEM)
Связывание ДНК
Toledano & Leonard, Proc Natl Acad Sci U S
A. 1991 May 15;88(10):4328-32
Наринген
Связывание ДНК
Kanno et al. , Life Sci. 2006 Jan 11; 78 (7) :673-81. Epub 2005 Aug 31
Никорандил
Связывание ДНК
Katamura et al., Shock. 2005 Aug;24(2):103-8
Никотин
Связывание ДНК
Sugano et al., Biochem Biophys Res Commun.
1998 Nov 9;252(1):25-8
Лекарственные средства, содержащие аспирин, выделяющие оксид азота
Связывание ДНК
Kashfi & Rigas, Biochem Soc Trans.
2005 Aug;33(Pt 4):7014 .
Нилвадипин
Связывание ДНК
Iwasaki et al., Clin Chim Acta. 2004 Dec;350(1-2):151-7
Нитрозоглутатион
Связывание ДНК
Kuo et al. , J Trauma. 2004 Nov;57(5):102531;
Khan et al., J Cereb Blood Flow Metab. 2005 Feb;25(2):177-92
NS1 (вирус гриппа А)
Связывание ДНК
Wang et al., J Virol. 2000 Dec;74(24) : 11566-73
NS3/4A (вирус гепатита С)
Связывание ДНК
Karayiannis, J Hepatol. 2005 Oct;43(4):743-5
Экстракты коры Ochna macrocalyx
Связывание ДНК
Tang et al., Planta Med. 2003 Mar;69(3):247-53
Богатые лейцином эффекторные белки сальмонелл и шигелл (SspHl и 1раН9.8)
Связывание ДНК
Haraga & Miller, Infect Immun. 2003 Jul;71(7):4052-8
Омега-3-жирные кислоты
Связывание ДНК
Sethi, Redox Rep. 2002;7(6):369-78
Оридонин (дитерпеноид из Rabdosia rubescens)
Связывание ДНК
Ikezoe et al. , Mol Cancer Ther. 2005 Apr;4(4):578-86
Связывание ДНК
Vasseur et al., J Biol Chem. 2004 Feb 20;279(8):7199-207. Epub 2003 Dec 1
1,2,3,4,б-пента-О-галлоил-бета-D-глюкоза
Связывание ДНК
Oh et al., Cancer Lett. 2001 Dec 10;174 (1) :17-24
р202а (интерферон-индуцибельный белок)
связывание ДНК с рб5 и р50/рб5; повышение р50
Ma et al., J Biol Chem. 2003 Jun 20;278 (25) :23008-19. Epub 2003 Apr 3
р21
(рекомбинантный)
Связывание ДНК
Khanna et al. , J Immunol. 2 0 05 Jun 15;174(12):7610-7
PC-SPES (смесь 8 растений)
Связывание ДНК
Ikezoe et al. , Mol Pharmacol. 2003 Dec;64(6):1521-9; Ikezoe et al.Int J Oncol. 2006 Aug;29(2):453-61
Панэпоксидон
Связывание ДНК
Erkel et al. , Biochem Biophys Res Commun.
1996 Sep 4;226 (1) :214-21
ДНК-ловушка для пептид-нуклеиновых кислот
Связывание ДНК
Penolazzi et al. , Int J Mol Med. 2004
Aug;14(2) : 145-52
Пентоксифиллин (1-(5'-оксогексил)3,7-диметилксантин, РТХ)
Связывание ДНК
Biswas et al., J Acquir Immune Defic
Syndr. 1993 Jul;6(7):778-86; Wang et al., Immunity. 1997 Feb;6(2):165-74; Ji et al., Ann Clin Lab Sci. 2004
Autumn;34(4):427-36
Пептид YY
Связывание ДНК
Vona-Davis et al., J Am Coll Surg. 2004
Jul;199(1):87-95
Пеплуанон
Связывание ДНК
Corea et al., J Med Chem. 2005 Nov 3; 48 (22) : 7055-62
Периндоприл
Связывание ДНК
Li et al., World J Gastroenterol. 2005 Aug 21; 11 (31) :4807-11
6(5Н)-фенантридинон и бензамид
Связывание ДНК
Chiarugi, Br J Pharmacol. 2002 Nov;137(6):761-70
Экстракты Phyllanthus amarus
Связывание ДНК
Kiemer et al. , J Hepatol. 2003 Mar;38(3):289-97
PIAS1 (белок-ингибитор активированного S TAT1)
связывание ДНК RelA
Liu et al., Mol Cell Biol. 2005 Feb;25(3):1113-23
Пиоглитазон (лиганд Р PAR г амма)
Связывание ДНК
Takagi et al., Redox Rep. 2002;7 (5) :283-9
Пирфенидон
Связывание ДНК
Tsuchiya et al., J Hepatol. 2004 Jan;40(1):94-101; Nakanishi et al., J Hepatol. 2004 Nov;41(5):730-6
Полиозеллин
Связывание ДНК
Jin et al. , Planta Med. 2006 Jul;72(9):857-9. Epub 2 00 6 Jun 19.
Фенилбизаболан 3 (из Croton eluteria Bennett)
Связывание ДНК
Campagnuoloe et al., Bioorg Med Chem. 2005 Jul 1;13(13):4238-42
Проопиомеланокортин
Связывание ДНК
Liu et al., Mol Pharmacol. 2006 Feb;69(2):440-51. Epub 2005 Nov 3
Простагландин Е2
сязывание ДНК и ядерная транслокация RelA
Min et al., J Rheumatol. 2002 Jul;29(7):1366-76.; Gomez et al., J Immunol. 2 0 05 Nov 15;175(10):6924-30
Белок-связывающий полисахарид (PSK)
Связывание ДНК
Zhang et al. , Oncogene. 2003 Apr 10;22 (14) :2088-96
Белок PYPAF1
Связывание ДНК
Jeru et al., Arthritis Rheum. 2 00 6 Feb;54 (2) :508-14
Производные N-оксида пиридина
Связывание ДНК
Stevens et al. , Biochem Pharmacol.
2 00 6 Apr 14;71 (8) :1122-35. Epub 2 00 6 Jan 2 4
Пиритион
Связывание ДНК
Kim et al., Biochem Biophys Res Commun.
1999 Jun 16;259(3):505-9
Пиррол-имидазольные полиамиды
Связывание ДНК
Wurtz et al., Biochemistry. 2002 Jun 18; 41 (24) :7604-9.
Квинадрил (ингибитор АПФ)
Связывание ДНК
Bustos et al., J Am Coll Cardiol. 1998 Dec;32(7):2057-64;
Hernandez-Presa et al., Am J Pathol. 1998 Dec;153(6):1825-37
Хинная кислота
Связывание ДНК
Akesson et al., Int Immunopharmacol. 2005 Jan;5(1):219-29
Белок-ингибитор киназы Raf (RKIP)
Связывание ДНК
Keller, Anticancer Drugs. 2004 Aug;15(7):663-9
Рапомицин
Связывание ДНК
Dichtl et al., Atherosclerosis. 2006 Jun;186(2):321-30. Epub 2005 Sep 23.
Ралоксифен
связывание ДНК RelA
Olivier et al., Mol Pharmacol. 2006 May;69(5):1615-23. Epub 2 00 6 Feb 2 3
Раксофеласт
Связывание ДНК
Altavilla et al., Free Radic Res. 2003 Apr;37(4):425-35
Ребамипид
Связывание ДНК
Hahm et al., Aliment Pharmacol Ther. 2003 Jul;18 Suppl 1:24-38
Гликопротеин 3 6 кДа
из плодов Rhus verniciflua Stokes
Связывание ДНК
Ко et al. , Toxicol In vitro. 2005 Apr;19(3):353-63. Epub 2004 Dec 24
Рибавирин
Связывание ДНК
Fiedler et al., J Virol. 1996 Dec; 70 (12) :9079-82 .
Рифамиды
Связывание ДНК
Pahlevan et al., J Antimicrob Chemother.
2002 Mar;49(3):531-4
Ритонавир
Связывание ДНК
Ikezoe et al. , Cancer Res. 2004 Oct 15; 64 (20) :7426-31
Росиглитазон
Связывание ДНК
Gruden et al., J Am Soc Nephrol. 2005 Mar;16(3):688-96. Epub 2005 Jan 26
Рокситромицин
Связывание ДНК
Kim et al., Pharmacology. 2004 Sep;72(1):6-11
Санггенон С
Связывание ДНК
Li et al. , Acta Pharmacol Sin. 2002 Feb;23 (2) :138-42
Диацетокси-ацеталевые производные сантонина
Связывание ДНК
Kim et al., J Biol Chem. 2 00 6 May 12;281(19):13117-25. Epub 2006 Mar 22
Ингибитор секреторной протеазы лейкоцитов (SLPI)
Связывание ДНК
Jin et al., Cell. 1997 Feb 7;88 (3) :417-26 Greene et al. , Infect Immun. 2004 Jun;72(6):3684-7; Taggart et al., J Exp Med. 2005 Dec 19;202(12):1659-68. Epub 2005 Dec 13.
Производное серотонина (N-(п-кумароил)серотонин, SC)
Связывание ДНК
Kawashima et al. , J Interferon Cytokine
Res. 1998 Jun;18(6):423-8
Сезамин (из сезамового масла)
Связывание ДНК
Jeng et al. , Immunol Lett. 2005 Feb 15;97(1):101-6.
Shen-Fu
Связывание ДНК
Qian et al., Am J Chin Med. 2006;34(4):613-21.
Siah2
Связывание ДНК
Habelhah et al. , EMBO J. 2002 Nov 1;21(21):5756-65
Силибинин
Связывание ДНК
Schumann et al., J Hepatol. 2003 Sep;39(3):333-40.
Симвастатин
Связывание ДНК
Li et al., J Pharmacol Exp Ther. 2002 Aug;302(2):601-5.; Kalyanasundaram et al., J Vase Surg. 2006 Jan; 43(1) :117-24 .
Синоменин
Связывание ДНК
Chen et al. , Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2004 Sep;29(9):900-3.
Сверхэкспрессия деацетилазы SIRT1
Связывание ДНК
Chen et al., J Biol Chem. 2005 Dec 2;280 (48) :40364-74. Epub 2005 Sep 23.
Siva-1
Связывание ДНК
Gudi et al., Oncogene. 2 0 0 6 Jun 8;25 (24) :3458-62. Epub 2 00 6 Feb 20.
SM-7368 (низкомолекулярный)
Связывание ДНК
Lee et al., Biochem Biophys Res Commun.
2005 Oct 21;336 (2) :716-22.
Гликопротеин 150 кДа из Solana nigrum L.
Связывание ДНК
Heo et al., Toxicol In vitro. 2004 Dec;18(6):755-63.; Lee & Lim, Toxicol In vitro. 2 00 6 Oct;20(7):1088-97. Epub 2 00 6 Mar 9.
Сульфасалазин
Связывание ДНК
Egan & Sandborn, Gastroenterology. 1998 Nov;115(5):1295-6.
SUN С8079
Связывание ДНК
Matsumori et al. , Eur J Heart Fail. 2004 Mar 1; 6 (2) :137-44.
Сурфактантный белок А
Связывание ДНК
Alcorn & Wright, J Biol Chem. 2004 Jul 16;279(29):30871-9. Epub 2004 May 3.
Экстракт Pteris ensiformis
Связывание ДНК
Wu et al., J Ethnopharmacol. 2005 Apr 8; 98 (1-2) : 73-81.
Т-614
(противоартритный ингибитор метансульфонанилид а)
Связывание ДНК
Aikawa et al., Inflamm Res. 2002 Apr;51(4):188-94
Экстракт Tanacetum larvatum
Связывание ДНК
Petrovic et al., J Ethnopharmacol. 2003 Jul;87(1):109-13
Таншиноны (из корней Salvia miltiorrhiza Bunge, Labiatae)
Связывание ДНК
Choi et al., Arch Pharm Res. 2004 Dec;27 (12) :1233-7 .
Таурин + ниацин
Связывание ДНК
Giri, Adv Exp Med Biol. 2003;526:381-94 . ;
Kim & Kim, Biochem Pharmacol. 2005 Nov 1;70 (9) :1352-60 .
Тетраметилпиразин
Связывание ДНК
Cheng et al., Planta Med. 2006 Aug;72(10):888-93. Epub 2006 Aug 10.
Табачный дым
Связывание ДНК
Zhong et al. , Am J Respir Crit Care Med.
2 00 6 Aug 15;174(4):428-36. Epub 2006 May 18
Сверхэкспрессия
Связывание
ДНК
Yamakami & Yokosawa, Biol Pharm Bull. 2004
Toml (мишени Myb-1)
Apr;27(4):564-6.
Kurebayashi et al. ,
Тиазолидиндион MCC-555
Связывание
ДНК
Atherosclerosis. 2005 Sep;182(1):71-7. Epub 2005 Mar 4.
Трансдоминантный р50
Связывание
ДНК
Logeat et al., EMBO J. 1991 Jul;10(7):1827-32.
Трихостатин А
связывание RelA
ДНК
Hu & Colburn, 2005
Триклозан и
Kim et al., J
це тилпиридиний
Связывание
ДНК
Periodontol. 2005
хлорид
Oct;76(10):1735-42.
Qiu et al., J Biol
Chem. 1999 May
7;274 (19) :13443-50;
Триптолид (PG4 90,
Kim et al. , Eur J
экстракт китайских
Связывание
ДНК
Pharmacol. 2004 Jun
трав)
21;494 (1) :1-9.; Yinjun et al., Leuk Res. 2005 Jan;29(1):99-105.
Тирфостин AG-12 6
Связывание
ДНК
Moore et al., 2003
Hsu et al. , Life Sci.
Урсоловая кислота
Связывание
ДНК
2004 Sep 24;75 (19) :2303-16.
Mandal et al., J Exp
Утероглобин
Связывание
ДНК
Med. 2004 May 17; 199 (10) :1317-30.
Белки V, С (вируса Сендаи)
Связывание
ДНК
Komatsu et al., Virology. 2004 Jul 20;325 (1) :137-48 .
Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)
Связывание ДНК
Oyama et al., J Immunol. 1998 Feb 1; 160 (3) :1224-32 . ; Gabrilovich et al., Blood. 1998 Dec 1;92(11):4150-66
Верапамил
Связывание ДНК
Li et al. , Inflamm Res. 2006 Mar;55(3):108-13.
Витаферин А
Связывание ДНК
Mohan et al. , Angiogenesis. 2004;7 (2) :115-22 .
Вогонин (5,7-дигидрокси-8-метоксифлавон)
Связывание ДНК
Lee et al. , FASEB J. 2003 Oct;17(13):19434. Epub 2 0 03 Aug 1; Piao et al., Arch Pharm Res. 2004 Sep;27 (9) :930-6.
Ксантогумол (пренилфлавоноид хмеля)
Связывание ДНК
Colgate et al. , Cancer Lett. 2006 Mar 22; [Epub ahead of print]
Ксилитол
Связывание ДНК
Han et al., Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Nov;12(11):1285-91
Yan-gan-wan
Связывание ДНК
Yang et al. , Hepatol Res. 2005 Aug;32(4):202-212. Epub 2005 Aug 16
Yin-Chen-Hao
Связывание ДНК
Cai et al., J Pharm Pharmacol. 2006 May;58(5):677-84.
Экстракт Yucca schidigera
Связывание ДНК
Marzocco et al. , Life Sci. 2004 Aug 6;75 (12) :1491-501.; Cheeke et al., J Inflamm (Lond). 2006 Mar 2 9;3:6.
Сверхэкспрессия ZIP1
Связывание ДНК
Khadeer et al. , Bone. 2005 Sep;37(3):296304 .
Растительное соединение А (предшественник фенилазиридина)
Связывание ДНК и трансактивация
De Bosscher et al., Proc Natl Acad Sci U S
A. 2005 Nov 1; 102 (44) :15827-32 . Epub 2005 Oct 21.
8-ацетокси-5-гидроксиумбеллипрен ин (из Asafetida)
Трансактивация
Appendino et al., J Nat Prod. 2006 Jul;69(7):1101-4.
АМФ-активируемая протеинкиназа
Трансактивация
Cacicedo et al., Biochem Biophys Res
Commun. 2 0 04 Nov 26;324(4):1204-9.
АРС0576
Трансактивация
Yuzawa et al. , Transplantation. 2003 May 15;75(9):1463-8.
Сесквитерпеновые лактоны из Artemisia sylvatica
Трансактивация (репортерные анализы)
Jin et al., Phytochemistry. 2004 Aug;65(15):2247-53.
Артемизолид
Трансактивация
Reddy et al. , Arch Pharm Res. 2006 Jul;2 9(7):591-7.
BSASM (смесь растительных экстрактов)
Трансактивация (репортерные анализы)
Lee et al., J Ethnopharmacol. 2005 Jan 4;96 (1-2) :211-9.
Бифидобактерии
Трансактивация
Riedel et al., World J Gastroenterol. 2006 Jun 21; 12(23) :3729-35.
Фенилпропаноиды Bupleurum fruticosum
Трансактивация
Bremner et al., Planta Med. 2004 Oct;70(10):914-8.
Черника и смесь ягод (Optiberry)
Трансактивация
Atalay et al., FEBS Lett. 2003 Jun 5;544(1-3):252-7
BZLF1 (белок EBV)
Трансактивация
Morrison et al., Virology. 2004 Oct 25;328(2):219-32
Производные хромена
Трансактивация
Cheng et al. , Bioorg Med Chem Lett. 2003 Nov 3; 13 (21) :3647-50.
D609 (ингибитор фосфатидилхолин-фосфолипазы С)
Трансактивация
Bergmann et al., J Biol Chem. 1998 Mar 20;273 (12) :6607-10
Дегидроэводиамин
Трансактивация
Noh et al. , Life Sci. 2006 Jul 10;79(7):6957 01. Epub 2 00 6 Mar 6
4'-деметил-6-метоксиподофиллоток син (лигнан из Li пит tauricum Willd. spp. tauricum)
Трансактивация
Vailev et al., Neoplasma. 2005;52(5):425-9.
Этил-2-[(3-метил-2,5-диоксо(3-пирролинил))амино]-4-(трифторметил)-пиримидин-5-карбоксилат
Трансактивация
Palanki et al., Bioorg Med Chem Lett. 2002 Sep 16;12(18):2573-7
Циклопродигиозин гидрохлорид
Трансактивация
Kamata et al., FEBS Lett. 2001 Oct 19;507(1):74-80.
Диметилфумарат (DMF)
Ядерная транслокация
Loewe et al., J Immunol. 2002 May 1; 168 (9) :4781-7 .
Е1А (аденовирус)
Трансактивация
Cook et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2002
Jul 23; 99 (15) :9966-71. Epub 2002 Jul 15.
Экол/диэкол (из морских водорослей Е. stolonifera)
Трансактивация
Joe et al., Biol Pharm Bull. 2006 Aug;29(8):1735-9.
экстракт Fructus Benincasae Recens
Трансактивация
Kwon et al., Immunopharmacol Immunotoxicol. 2003 Nov;25(4):615-25.
Глюкокортикоиды (дексаметазон, преднизон, метилпреднизолон)
Трансактивация и повышение уровней IkBa
Auphan et al., Science. 1995 Oct 13;270 (5234) :286-90;
Brostjan et al., J Biol Chem. 1996 Aug
9;271 (32) :19612-6; Ray & Prefontaine, Proc Natl Acad Sci U S
A. 1994 Jan 18;91(2):752-6;
Scheinman et al., Mol Cell Biol. 1995
Feb;15(2):943-53
Гипенозид XLIX (из Gynostemma pent aphy Пит)
Трансактивация (PPAR-альфа-зависимый)
Huang et al., J Biomed Sci. 2006 Jul;13(4):535-48. Epub 2006 Mar 10.
Son et al., FEBS Lett.
Гистидин
Трансактивация
2005 Aug 29;579(21):4671-7.
Ингибиторы протеазы
Equils et al. ,
ВИЧ-1 (нелфинавир,
Antimicrob Agents
ритонавир или
Трансактивация
Chemother. 2004
саквинавир)
Oct;48(10):3905-11.
Kwei Ling Ко
Yip et al.,
(Tortoise shell-
Трансактивация
Phytomedicine. 2005
Rhizome jelly)
Nov;12(10):748-59.
корень Ligusticum chuaxiong Hort.
Трансактивация
Liu et al. , Planta Med. 2005 Sep;71(9):808-13.
Boonyaratanakornkit et
Низкая гравитация
Трансактивация
al., FASEB J. 2 0 05 Dec; 19(14):2020-2. Epub 2005 Oct 6
Murakami et al., J
Нобилетин
Трансактивация
Nutr. 2005 Dec;135(12 Suppl):2987S-2992S
NRF (репрессорный фактор NF-кВ)
Трансактивация
Jianfeng et al., Mol Cells. 2003 Dec 31;16(3):397-401
Ishiguro et al. ,
Пенол (из коры
Трансактивация
Toxicol Appl
пиона горного)
Pharmacol. 2006 Jul 14; [Epub ahead of print]
Gerhauser et al.,
Фенэтилизотиоцианат
Трансактивация
Mutat Res. 2003 Feb-Mar;523-524:163-72.
4-фенилкумарины (из
Bedoya et al. , Bioorg
Маг Па
Трансактивация
Med Chem Lett. 2005
pluricostata)
Oct 15;15(20):4447-50.
Фомол
Трансактивация
Weber et al. , J Antibiot (Tokyo). 2004 Sep;57(9):559-63.
PIAS3
Трансактивация
Jang et al., J Biol Chem. 2004 Jun 4;279 (23) :2487 3-80. Epub 2004 Mar 26.
Пранлукаст
Трансактивация
Ichiyama et al. , Clin Exp Allergy. 2003 Jun; 33 (6) :802-7;
Ishinaga et al. , Pharmacology. 2005 Feb;73(2):89-96. Epub 2004 Oct 5.
Психозин
Трансактивация
Haq et al., J Neurochem. 2003 Sep;86(6):1428-40.
Хиназолины
Трансактивация
Tobe et al., Bioorg Med Chem. 2003 Sep 1; 11 (18) :3869-78.
Ресвератрол
Ядерная локализация RelA и трансактивация
Manna et al., J Immunol. 2 000 Jun 15;164(12):6509-19; Pendurthi et al. , Thromb Haemost. 2002 Jan;87(1):155-62.
RO31-8220 (ингибитор РКС)
Трансактивация
Bergmann et al., J Biol Chem. 1998 Mar 20;273 (12) :6607-10.
Сауцернеол D и сауцернеол Е
Трансактивация
Hwang et al. , Phytochemistry. 2003 Oct;64(3):765-71
SB203580 (ингибитор МАРК р3 8)
Трансактивация
Bergmann et al., J Biol Chem. 1998 Mar 20;273 (12) :6607-10.
Белок SH (вируса эпидемического паротита)
Трансактивация
Wilson et al., J Virol. 2006 Feb;80(4):1700-9.
траниласт [N-(3,4-диметоксициннамоил) антраниловая кислота]
Трансактивация
Spiecker et al. , Mol Pharmacol. 2002 Oct; 62 (4) :856-63.
3,4,5-триметокси-4'-фторхалькон
Трансактивация
Rojas et al., Naunyn Schmiedebergs Arch
Pharmacol. 2003 Sep;368(3):225-33. Epub 2003 Aug 2.
Экстракт растения Uncaria tomentosum
Трансактивация
Akesson et al., Int Immunopharmacol. 2003 Dec;3(13-14):1889-900.
LY294,002
Трансактивация
Sizemore et al., Mol Cell Biol. 1999 Jul;19(7):4798-805.
Месаламин
RelA
phosphorylation и трансактивация
Egan et al., J Biol Chem. 1999 Sep 10;274 (37) :26448-53.
Месуол
фосфорилирование и трансактивация RelA
Marquez et al., Antiviral Res. 2005 Jun; 66 (2-3) :137-45. Epub 2005 Apr 20
РТХ-В (белок, связывающий коклюшный токсин)
фосфорилирование и трансактивация RelA
Iordanskiy et al., Virology. 2002 Oct 10;302 (1) :195-206
производные 9-аминоакридина (9АА) (включая противомалярийное
лекарственное средство хинакрин)
фосфорилирование и трансактивация RelA
Gurova et al., Proc Natl Acad Sci USA.
2005 Nov 29; 102 (48) :17448-53 . Epub 2005 Nov 15.
Аденозин и циклоАМФ
Трансактивация
Majumdar & Aggarwal, Oncogene. 2003 Feb 27;22 (8) :1206-18.; Minguet et al. , Eur J Immunol. 2 0 05 Jan;35(1):31-41
17-аллиламино-17-деметоксигелданамиц ин
Трансактивация
Rakitina et al., Cancer Res. 2003 Dec 15; 63 (24) :8600-5
производные 6-аминохиназолина
Трансактивация
Tobe et al., Bioorg Med Chem. 2003 Sep 1; 11 (18) :3869-78
Лютеолин
трансактивация рб5
Kim et al., Biochem Pharmacol. 2003 Sep 15;66(6):955-63
Манассантины А и В
трансактивация рб5
Lee et al., Biochem Pharmacol. 2003 Nov 15; 66(10) :1925-33 . ; Son et al., Mol Cells. 2005 Aug 31;20 (1) :10511.
Продукты гена SH парамиксовирусов
Трансактивация
Wilson et al., J Virol. 2006 Feb;8 0(4):17 00-9
Qingkailing и Shuanghuanglian (китайские лекарственные препараты)
Трансактивация
Chen et al., Life Sci. 2002 May 3; 70 (24) :2897-913.
экстракт Smilax bockii Warb. (флавеноиды)
Трансактивация
Xu et al. , Arch Pharm Res. 2005 Apr;28(4):3 95-9.
Тетрациклический аденозин
Трансактивация (продукция АФК)
Turbyville et al., Mol Cancer Ther. 2005 Oct;4(10):1569-76.
Тетратиомолебдат
Трансактивация
Pan et al. , Cancer Res. 2002 Sep 1;62(17):4854-9
Трилинолеин
Трансактивация
Liu et al. , Eur J Pharmacol. 2004 Jan 19; 484 (1) :1-8 .
Троглитазон
Трансактивация
Ruan et al., J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28181-92. Epub 2003 May 5.
Валереновая кислота/ ацетилвалереноловая кислота
Трансактивация
Jacobo-Herrera et al., Phytother Res. 2006 Oct;20(10):917-9.
Экстракты листьев Wi theringia solanacea
Трансактивация
Jacobo-Herrera et al., J Nat Prod. 2006
Mar;69(3):328-31
Вортманнин (грибковый метаболит)
Трансактивация
Reddy et al., J Biol Chem. 1997 Nov 14;272 (46) :29167-73.; Manna & Aggarwal, FEBS Lett. 2000 May 4; 473(1) :113-8 .
Xia-Bai-San
Трансактивация
Yeh et al. , Int Immunopharmacol. 2006 Sep;6(9):1506-14. Epub 2006 Jun 2.
Альфа-зеараленол
Трансактивация
Li et al., Biomed Environ Sci. 2005
Oct;18 (5) :314-20.
Антитромбин
взаимодействие RelA-рЗОО
Uchiba et al., Thromb Haemost. 2004 Dec; 92 (6) :1420-7 .
Экстракт коры стебля Magnifera indica L.
экспрессия мРНК NF-KB
Leiro et al., Int Immunopharmacol. 2004 Aug;4(8):991-1003
Рифампицин
модуляция рецепторов глюкокортикоидов
Yerramesetti et al., J Clin Immunol. 2002
Jan;22(1) :37-47 .
Мангиферин
ингибирование экспрессии RelA и RelB
Leiro et al., Int Immunopharmacol. 2004 Jun;4(6):763-78
В конкретных вариантах осуществления ингибитор NF-кВ
является ингибитором фосфорилирования IkB, таким как BAY 11-
7082 и BAY 11-7085 (BioMol, Plymouth Meeting, PA) , куркумин и
производные или аналоги куркумина. В данной области известно
множество производных и аналогов куркумина, и их можно
использовать в настоящем изобретении (см., например, WO
2007/051314; патент США № 2006/0276536). Такие производные
могут иметь повышенную растворимость или активность. Примеры
производных куркумина включают диметоксикуркумин (Jeong et al.,
2009. J. Clin. Biochem. Nutr. 44:79-84), 3,5-бис(2-
фторбензилиден)-4-пиперидон (EF24) (публикация патентной заявки
США № 20110059157), бис(арилметилиден)ацетон (WO 2007/000998),
десметоксикуркумин и бисдесметоксикуркумин (WO 2006/117077).
Другие аналоги куркумина, которые можно использовать, включают
дигидрокуркумин, тетрагидрокуркумин, гексагидрокуркумин,
дигидрокситетрагидрокуркумин, якухинон А и якухинон В, и их
соли, окисленные формы, восстановленные формы, гликозиды и
сложные эфиры (публикация патентной заявки США № 20030147979;
патент США № 58 91924). Дополнительные примеры аналогов
куркумина включают, в качестве неограничивающих примеров, (а)
феруловую кислоту, (например, 4-гидрокси-З-метоксикоричную
кислоту; 3,4-метилендиоксикоричную кислоту и 3,4-
диметоксикоричную кислоту); (Ь) ароматические кетоны (например,
4-(4-гидрокси-З-метоксифенил)-З-бутен-2-он; зингерон; 4-(3,4-
метилендиоксифенил)-2-бутанон; 4- (п-гидроксифенил)-З-бутен-2-
он; 4-гидроксивалерофенон; 4-гидроксибензилактон; 4-
гидроксибензофенон; 1,5-бис(4-диметиламинофенил)-1,4-пентадиен-
3-он); (с) ароматические дикетоны (например, 6-
гидроксидибензоилметан) (d) соединения кофейной кислоты
(например, 3,4-дигидроксикоричную кислоту); (е) коричную
кислоту; (i) ароматические карбоновые кислоты (например, 3,4-
дигидроксигидрокоричную кислоту; 2-гидроксикоричную кислоту; 3-
гидроксикоричную кислоту и 4-гидроксикоричную кислоту); (д)
ароматические кетокарбоновые кислоты (например, 4-
гидроксифенилпировиноградную кислоту); и (h) ароматические спирты (например, 4-гидроксифенэтиловый спирт). Эти аналоги и другие типичные аналоги, которые можно использовать в настоящем изобретении, дополнительно описаны в W0 95/18 60 6 и WO 01/040188. Также можно использовать другие производные и аналоги куркумина, включая димеры, декстрановые и дендримерные конъюгаты (см., например, публикацию патентной заявки № США 20100240905; Shi, W. et al., 2007. Org. Lett. 9 (26) :5461-5464) .
Куркумин, или производное, или аналог куркумина можно предоставлять в виде конъюгата, такого как пролекарство. Известны примеры пролекарств куркумина (см., например, Lu, Р., et al. , 2005. J Huazhong Univ Sci Technolog Med. Sci. 25(6):668-670, 678, Kapoor, N., et al. 2007. Cancer Lett. 248(2):245-250) и способы получения пролекарств (см., например, WO 2006/076734; патент США № 5952294; Balant, L. P., et al. , 1990. Eur. J. Drug Metab. Pharmacokinet. 15:143-153; Bundgaard, H., et al., 1991. Drugs of the Future 16:443-458). Также см. опубликованную патентную заявку США № 2007/0270464.
Желательно, ингибитор NF-кВ является нетоксичным для хозяина с минимальными или незначительными побочными эффектами. Соответственно, ингибитор NF-кВ блокирует альтернативный путь NF-кВ, ИЛИ И классический, и альтернативный путь NF-KB.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор NF-KB находится в форме нуклеиновой кислоты, как правило, с функциональной связью нуклеотидной последовательности, кодирующей ингибитор, и промотора, который может являться конститутивным или индуцибельным и является функциональным в интересующих антигенпрезентирующих клетках, для образования
конструкции нуклеиновой кислоты. Доставку конструкций нуклеиновой кислоты в антигенпрезентирующие клетки или их предшественников можно осуществлять, напрямую подвергая пациента воздействию конструкции нуклеиновой кислоты или сначала трансформируя антигенпрезентирующие клетки или их предшественников с использованием конструкции нуклеиновой кислоты in vitro, а затем трансплантируя трансформированные антигенпрезентирующие клетки или предшественников пациенту.
Обсуждение встраивания конструкций нуклеиновой кислоты в антигенпрезентирующие клетки и получения вариантов нуклеотидных последовательностей, приведенное в разделе 3.2.1 для кодирующих антиген конструкций нуклеиновой кислоты, в равной степени применимо к конструкциям нуклеиновой кислоты, с которых экспрессируются ингибирующие NF-кВ пептиды/полипептиды.
3.2.4 Ингибиторы mTOR
Известно, что ингибирование пути mTOR стимулирует толерогенность в антигенпрезентирующих клетках (например, дендритных клетках, В-клетках и т.д.), как описывают, например, Delgoffe и Powell (2009. Immunology 127 (4) :459-465) и Fischer et al. (2009, Handb Exp Pharmacol. 188:215-232). Таким образом, настоящее изобретение относится к применению ингибиторов пути mTOR совместно с молекулой антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану), или молекулой нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, для супрессии иммунного ответа на полипептид аггрекан при лечении или профилактике повреждения сустава у индивидуума.
Как используют в настоящем описании, ингибиторы mTOR включают любую молекулу или соединение, снижающее уровень или функциональную активность mTOR в иммунных клетках, особенно антигенпрезентирующих клетках. Ингибиторы mTOR могут иметь различные формы, неограничивающие примеры которых включают низкомолекулярные соединения, нуклеиновые кислоты, пептиды, полипептиды, пептидомиметики и т.д.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор mTOR выбран из рапамицина, являющегося известным макролидным антибиотиком,
продуцируемым Streptomyces hygroscopicus, и производных рапамицина, например, рапамицина, замещенного в положении 40, и/или 16, и/или 32, например, соединения формулы (I):
где Ri является СН3 или Сз-6-алкинилом,
R2 является Н, -СН2-СН2-ОН, или -СН2-СН2-0-СН2-СН3.
З-гидрокси-2-(гидроксиметил)-2-метил-пропаноил или тетразолил, например, тетразол-1-ил, и X является =0, (Н, Н) или (Н, ОН) , при условии, что R2 является иным, чем Н, если X является =0 и Ri является СН3.
Если R2 в соединении формулы I является -СН2-СН2-ОН, соединение формулы I включает его физиологически гидролизуемый простой эфир, например -CH2-CH2-0-Ci-8) алкил.
Типичные примеры соединений формулы I включают, например,
40-О-(2-гидрокси)этил-рапамицин (также известный как
эверолимус), 32-деоксорапамицин, 1б-0-замещенные рапамицины, такие как 1б-пент-2-инилокси-32-деоксорапамицин, 1б-пент-2-инилокси-32(S или R)-дигидро-рапамицин, 1б-пент-2-инилокси-32(S или R)-дигидро-40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицин, 40-[3-гидрокси-2-(гидрокси-метил)-2-метилпропаноат]-рапамицин (также известный как CCI779), 40-эпи-(тетразолил)-рапамицин (также известный как АВТ57 8) или 4О-0-этоксиэтил-рапамицин (также известный как
биолимус 9).
Ингибиторы mTOR также включают так называемые рапалоги, например, как описано в WO9802441, WO0114387 и WO0364383 (включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме), такие как АР23573, например, 40-О-(диметилфосфиноил)-рапамицин, соединения, описываемые в WO2005047295 в примере 1, также обозначаемые как биолимус А9, и соединения, описываемые под названием TAFA-93. Другие ингибиторы mTOR описывают, например, в W02004101583, WO92 0517 9, WO9402136, WO9402385, W09613273, включенных, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме.
В некоторых вариантах осуществления ингибиторы mTOR включают рапамицин, соединение формулы I, например, включая рапалог, TAFA-93, более предпочтительно, рапамицин, соединение формулы I или рапалог.
В конкретных вариантах осуществления ингибитор mTOR является 40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицином, описываемым в примере 8 в WO9409010.
В других вариантах осуществления ингибитор mTOR является 32-деоксорапамицином или 1б-пент-2-инилокси-32(S)-дигидро-рапамицином, описываемым, например, в WO9641807, или соединением, описываемым в W09516691.
Примеры ингибиторов mTOR включают: рапамицин, и/или 4 0-О-
(2-гидроксиэтил)-рапамицин, и/или 32-деоксорапамицин, и/или 16-
пент-2-инилокси-32-деоксорапамицин, и/или 1б-пент-2-инилокси-32
(S или R)-дигидро-рапамицин, и/или 1б-пент-2-инилокси-32(S или
R)-дигидро-40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицин, и/или 40-[3-
гидрокси-2-(гидрокси-метил)-2-метилпропаноат]-рапамицин (также известный как CCI779) и/или 40-эпи-(тетразолил)-рапамицин (также известный как АВТ578), и/или АР23573, и/или, например, биолимус А9, и/или соединения, описываемые под названием TAFA-93, такие как 40-О-(2-гидроксиэтил)-рапамицин, и/или 32-деоксорапамицин, и/или CCI779, и/или АВТ578, и/или АР23573.
В других вариантах осуществления ингибиторы mTOR выбраны из производных пиразолопиримидина, включая, в качестве неограничивающих примеров, соединения, имеющие структуру
следующей формулы (II) и формулы (III!
(III)
В некоторых вариантах осуществления соединений формулы (II) или (III) R1, R3 и R4 независимо представляют собой водород, галоген, CN, -CF3, -ОН, -NH2, -SO2, -СООН, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из R3 или R4 представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления R1, R3 и R4 независимо представляют собой водород или замещенный или незамещенный Ci-Сю-алкил (например, Ci-05-алкил или С1-С3-алкил). R', R3 и R4 также могут независимо представлять собой водород или незамещенный Ci-Сю-алкил (например, Ci-05-алкил или Ci-Сз-алкил) .
В некоторых вариантах осуществления формулы (II) или (III) R1, R3 и R4 независимо представляют собой водород, галоген, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, _S02, -СООН, R7-замещенный или незамещенный алкил, R7-замещенный или незамещенный гетероалкил, R7-замещенный или незамещенный циклоалкил, R7-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R7-3aMeni;eHHbri/[ или незамещенный арил или R7-замещенный или незамещенный гетероарил. R7 независимо представляет собой оксо-группу, галоген, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, R8-замещенный или незамещенный алкил, R8-замещенный или незамещенный гетероалкил, R8-замещенный или незамещенный циклоалкил, R8-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R8-замещенный или незамещенный арил или R8-замещенный или незамещенный гетероарил. R8 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, незамещенный алкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный циклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, незамещенный арил или незамещенный гетероарил. В некоторых вариантах осуществления R1 представляет собой замещенный или незамещенный алкил или замещенный или незамещенный гетероциклоалкил (например морфолино). В некоторых вариантах осуществления R1 является замещенным -C(0)R8A, где R8A представляет собой незамещенный алкил.
В некоторых вариантах осуществления формулы (II) R2 независимо представляет собой водород, галоген, - CN, -CF3, -OR5, -NH2, -S02, -СООН, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил. В некоторых вариантах осуществления R2 независимо представляет собой водород, -OR5, -CN, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02 или замещенный или незамещенный алкил. R5 независимо представляет собой водород, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил. В некоторых
вариантах осуществления R5 представляет собой водород или замещенный или незамещенный алкил (например, незамещенный С1-С5-алкил).
R2 независимо может представлять собой водород, галоген, -OR5, -CN, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, К9-замещенный или незамещенный алкил, R9-зaмeщeнный или незамещенный гетероалкил, R9-3aMem;eHHbn/[ или незамещенный циклоалкил, R9-зaмeщeнный или незамещенный гетероциклоалкил, R9-3aMem;eHHbri/[ или незамещенный арил или R9-3aMem;eHHbn/[ или незамещенный гетероарил. R9 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, R10-зaмeщeнный или незамещенный алкил, R10-3aMeii];eHHbn/[ или незамещенный гетероалкил, R10-замещенный или незамещенный циклоалкил, R10-3aMeii];eHHbri/[ или незамещенный гетероциклоалкил, R10-3aMeii];eHHbri/[ или незамещенный арил или R10-замещенный или незамещенный гетероарил. R10 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, незамещенный алкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный циклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, незамещенный арил или незамещенный гетероарил. В других вариантах осуществления R2 представляет собой -OR5. В некоторых родственных вариантах осуществления R5 представляет собой водород или незамещенный С1-С5-алкил (например, водород).
В некоторых вариантах осуществления формул (II) или (III) R5 независимо представляет собой водород, R^-saMenieHHbn/t или незамещенный алкил, R^-saMenieHHbn/t или незамещенный гетероалкил, R^-saMenieHHbn/t или незамещенный циклоалкил, R11-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R^-saMenieHHbn/t или незамещенный арил или R^-saMenieHHbn/t или незамещенный гетероарил. R11 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, R12-замещенный или незамещенный алкил, R12-замещенный или незамещенный гетероалкил, R12-замещенный или незамещенный циклоалкил, R12-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R12-замещенный или незамещенный арил или R12-замещенный или незамещенный гетероарил. R12 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, незамещенный алкил, незамещенный гетероалкил,
незамещенный циклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, незамещенный арил или незамещенный гетероарил.
В некоторых вариантах осуществления формулы (III) R6 независимо представляет собой водород, галоген, -CN, -CF3, -OR5, -NH2, -S02, -СООН, замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный гетероалкил, замещенный или незамещенный циклоалкил, замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, замещенный или незамещенный арил или замещенный или незамещенный гетероарил. R6 также может независимо представлять собой водород, -OR5, -CN, галоген, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, галоген или замещенный или незамещенный алкил (например, незамещенный С1-С5-алкил). R5 является таким, как определено выше в описании формулы (I). В некоторых вариантах осуществления R6 независимо представляет собой водород, -OR5, -CN, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, К13-замещенный или незамещенный алкил, R13-3aMem;eHHbn/[ или незамещенный гетероалкил, R13-замещенный или незамещенный циклоалкил, R13-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R13-3aMem;eHHbri/[ или незамещенный арил или R13-3aMem;eHHbn/[ или незамещенный гетероарил. R13 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, R14-замещенный или незамещенный алкил, R13-3aMem;eHHbn/[ или незамещенный гетероалкил, R14-замещенный или незамещенный циклоалкил, R14-замещенный или незамещенный гетероциклоалкил, R14-замещенный или незамещенный арил, или R14-замещенный или незамещенный гетероарил. R14 независимо представляет собой галоген, оксо-группу, -CN, -CF3, -ОН, -NH2, -S02, -СООН, незамещенный алкил, незамещенный гетероалкил, незамещенный циклоалкил, незамещенный гетероциклоалкил, незамещенный арил или незамещенный гетероарил. R6 также может независимо представлять собой водород, -OR5, -CN, галоген, -NH2, -SH, -CN, -CF3, -N02, галоген или незамещенный С1-С5~алкил. В некоторых вариантах осуществления R6 представляет собой водород.
В некоторых вариантах осуществления формул (II) или (III), R3 и R4 представляют собой водород. В некоторых вариантах осуществления формулы (II) п представляет собой 1 или 2. В
некоторых родственных вариантах осуществления формулы (II) п представляет собой 1. В других родственных вариантах осуществления R2 представляет собой -OR5, а п представляет собой 1. В других родственных вариантах осуществления R5 представляет собой водород. В некоторых вариантах осуществления формулы (III) z является целым числом от 1 до 2. В некоторых вариантах осуществления z представляет собой 1.
В некоторых вариантах осуществления R1, R2, R3, R4, R5, R6,
R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 и/или R14 являются ограниченными по
размеру заместителями. В некоторых вариантах осуществления R1,
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 и/или R14
представляют собой Ci-Сю-, С1-С5-алкил или Ci-Сз-алкил, например,
метил, этил, пропил, изопропил, бутил и т.п., необязательно,
замещенный, как представлено в настоящем описании. В некоторых
вариантах осуществления R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10,
R11, R12, R13 и/или R14 представляют 2-10-членный, 2-5-членный или
2-3-членный гетероалкил, необязательно, замещенный, как
представлено в настоящем описании. В некоторых вариантах
осуществления R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13
и/или R14 представляют собой Сз-Сю-, Сз-Cs-, Сз-Сб~ или С3-С5-
циклоалкил, включая, в качестве неограничивающих примеров,
циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил,
циклооктил и т.п., необязательно, замещенный, как представлено
в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления R1,
R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 и/или R14
представляют собой 3-членный, 4-членный, 5-членный, б-членный,
7-членный, 8-членный, 9-членный или 10-членный
гетероциклоалкил, включая, в качестве неограничивающих примеров, азиридин, оксиран, тииран, азетидин, окситан, тиэтан, пирролидин, дигидрофуран, тетрагидропиран, дигидротиофен, тетрагидротиофен, пиперидин, дигидропиран, тетрагидропиран, дигидротиопиран, тетрагидротиопиран, необязательно, замещенный, как представлено в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 и/или R14 представляют собой Сб_Сю-арил, включая, в качестве неограничивающих примеров, фенил или нафтил, необязательно,
замещенный, как представлено в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13 и/или R14 представляют собой 5-10-членный, 5-6-членный гетероарил, как представлено в настоящем описании, необязательно, замещенный, как представлено в настоящем описании.
В других вариантах осуществления биологически активное средство (например, соединения формул (II) или (III)) выбраны из следующих соединений:
.он
3.2.5 Ингибиторы Syk
Альтернативно или дополнительно, можно стимулировать толерогенность в антигенпрезентирующих клетках (например, дендритных клетках, В-клетках и т.д.), ингибируя путь Syk, как описано, например, в Colonna et al. (2010. J Immunol. 185(3) : 1532-43), Matsubara et al. (2006. Am JRespir Cell Mol Biol. 34(4):426-433) и Nakashima et al. (2004. Eur J Pharmacol. 505(1-3) :223-228) . Таким образом, настоящее изобретение также включает применение ингибиторов Syk в комбинации с молекулой антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану (например, полипептиду cit-аггрекану) , или молекулой нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, для супрессии иммунного ответа на полипептид аггрекан и для лечения или профилактики повреждения сустава у индивидуума.
Как используют в настоящем описании, ингибиторы пути Syk
включают любую молекулу или соединение, снижающее передачу
сигнала через путь Syk или снижающее уровень или функциональную
активность Syk в иммунных клетках, особенно
антигенпрезентирующих клетках. Ингибиторы Syk могут иметь различные формы, неограничивающие примеры которых включают низкомолекулярные соединения, нуклеиновые кислоты, пептиды,
полипептиды, пептидомиметики и т.д.
В некоторых вариантах осуществления ингибитор Syk выбран
из соединений, описываемых в патенте США № 64 32 9 63, таким
образом, включенном в настоящее описание в качестве ссылки в
полном объеме. Примеры соединений включены по определению,
приведенному между колонкой 3, строкой 4 5 и колонкой б, строкой
22, и, в частности, соединение, выбранное из группы, состоящей
из 2-(2-аминоэтиламино)-4-(3-метиланилино)пиримидин-5-
карбоксамида, 2-(2-аминоэтиламино)-4-(3-
трифторметиланилино)пиримидин-5-карбоксамида, 2- (4-
аминобутиламино)-4-(3-трифторметиланилино)пиримидин-5-
карбоксамида, 2-(2-аминоэтиламино)-4-(3-броманилино)пиримидин-
5-карбоксамида, 2-(2-аминоэтиламино)-4-(3-
нитроанилино)пиримидин-5-карбоксамида, 2-(2-аминоэтиламино-4-
(3,5-диметиланилино)пиримидин-5-карбоксамида, 2- (2-
аминоэтиламино)-4-(2-нафтиламино)пиримидин-5-карбоксамида, 2-
(цис-2-аминоциклогексиламино)-4-(3-метиланилино)пиримидин-5-
карбоксамида, 2-(цис-2-аминоциклогексиламино)-4-(3-бром-
анилино ) пиримидин- 5-карбоксамида, 2-(цис-2-
аминоциклогексиламино)-4-(3,5-дихлоранилино)пиримидин-5-
карбоксамида и 2-(цис-2-аминоциклогексиламино)-4-(3, 4, 5-
триметоксианилино)пиримидин-5-карбоксамида или их солей. Способы синтеза таких соединений приведены между колонкой б, строкой 43 и колонкой 13, строкой 17.
Как используют в настоящем изобретении, ингибиторы Syk также включают соединения, описываемые в публикации патентной заявки США № 2004/0029902, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме; включая соединения, включенные по определению, приведенному между параграфами [0109] и [0218], и, в частности, соединение, выбранное из группы, состоящей из N2,N4-[(2,2-диметил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он)- б-ил]-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, N4-
(3,4-дихлорфенил)-5-фтор-Ы2-(индазолин-б-ил)-2,4-
пиримидиндиамина, N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-(1-
метил-индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамина, N2,Ы4-бис(3-
гидроксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, N2,Ы4-бис(3,4-
этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, N4-(1,4
бензоксазин-б-ил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина,
N2,N4-бис(3-аминофенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4
этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-метиламино)-
карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(3 гидроксифенил)-N2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4- (3-гидроксифенил)-5-трифторметил-Ы2 [3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-
пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-[(1Н)-индол-б-ил]-N2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5 фтор-Ы4-(3-гидроксифенил)-N2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5 фтор-Ы2-(3-метиламинокарбонилметиленоксифенил)-N4-[2-Н-пиридо[3,2-b]-1,4-оксазин-З(4Н)-он-б-ил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-(2-гидроксиэтил-амино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор N4-(3-гидроксифенил)-N2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина,
Ы2,Ы4-бис(индол-б-ил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы2
[2-(2-гидрокси-1,1-диметилэтиламино)карбонилбензофуран-5-ил]--
N4-(3-гидроксифенил)-2,4-пиримидиндиамина, N2-[3-(N2,3
дигидроксипропиламино)карбонилметиленоксифенил]-N4-(3,4-
этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-пиримидиндиамина, N2-(3,5
диметоксифенил)-N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-2,4-
пиримидиндиамина, N4- (3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-(1, 3
оксазол-5-ил)фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4
этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5
фтор-Ы2-(3-гидроксифенил)-N4-[4-(З-фенил-1,2-4-оксадиазол-5-
ил)метиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4
этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-(индазолин-б-ил)-2, 4-
пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(3-гидроксифенил)-N2-(индазолин-б
ил)-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2
(1-метил-индазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(3
гидроксифенил)-N2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамина,
N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[4-(З-фенил-1,2,4-
оксадиазол-5-ил)метиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4
(3,5-диметил-4-гидроксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-[2-(N-
морфолино)этиленокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,5
диметил-4-гидроксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-[2-(N-
морфолино)этилокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(З-хлор-4 гидрокси-5-метилфенил)-5-фтор-Ы2-[3-[2-(N-
морфолино)этилокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N2-(3-трет
бутилкарбониламинофенил)-N4-(3-гидроксифенил)-5-фтор-2, 4-
пиримидиндиамина, N4- (3-трет-бутилфенил)-N2-[3-(N
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-
пиримидиндиамина, N4- (3-трет-бутилфенил)-N2-[3-(N2, 3
дигидроксипропиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-2,4-
пиримидиндиаминa, N2-[3-(N2,3
дигидроксипропиламино)карбонилметиленоксифенил]-5-фтор-Ы4-(3-
изопропилфенил)-2,4-пиримидиндиамина, N4- [4
(цианометиленокси)фенил]-5-фтор-Ы2-(3-гидроксифенил)-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,5-диметил-4-гидроксифенил)-5-фтор-Ы2
[3-(N-пиперазино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-
пиримидиндиамина, бис-гидрохлоридной соли N4-(3,5-диметил-4
гидроксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-[2-(N-пиперазино)этокси]-фенил]-
2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[4
(2-гидроксиэтилокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(1,4
бензоксазине-3-он-б-ил)-5-фтор-Ы2-(3-гидроксифенил)-2,4-
пиримидиндиамина, ( + /-)-5-фтор-Ы2-[(Ы-метилацетамидо-2)-3
фенокси]-N4-(2-метил-1,4-бензоксазин-б-ил)-2,4-
пиримидиндиамина, N2- (1,4-бензоксазин-З-он-б-ил)-5-фтор-Ы4-(3
гидроксифенил)-2,4-пиримидиндиамина, N4-(З-хлор-4
трифторметоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5 фтор-Ы4-(З-гидрокси-4-метилфенил)-N2-[3-
[(метиламино)карбонилметиленокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(3-гидроксифенил)-N2-[4-метил-З-[(N-
метиламино)карбонилметиленокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5 фтор-Ы4-(З-гидрокси-4-метоксифенил)-N2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4
(З-хлор-4-метилфенил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-метиламино)-карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(З-хлор-4-метоксифенил)-5-фтор-Ы2-[3-[(N-
метиламино)карбонилметиленокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-1(1Н)-индол- 5-ил]-N2-[3-[ (N-
метиламино)карбонилметиленокси]-фенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-
фтор-Ы4-(3-гидроксифенил)-N2-[1-(метоксикарбонил)метил-
индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(3-
гидроксифенил)-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-б-ил]-2,4-
пиримидиндиамина, N4- (3,4-этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[1-(3-
гидроксипропил)индазолин-5--ил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-
N4-(3-гидроксифенил)-N2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-5-ил]-
2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы2-[1-(3-гидроксипропил)индазолин-
5-ил]-N4-(4-изопропоксифенил)-2,4-пиримидиндиамина, N4-(3,4-
этилендиоксифенил)-5-фтор-Ы2-[1-[2(N-метиламинокарбонил)этил]-
индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы4-(4-
изопропоксифенил)-N2-[1-[2(N-метиламинокарбонил)этил]-
индазолин-5-ил]-2,4-пиримидиндиамина, N4- [ (2,2-диметил-4Н-
бензо[1,4]оксазин-3-он)-б-ил]-5-фтор-Ы2-[3-(метил-аминокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4- [ (2,2-диметил-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он)-б-ил]-5-фтор-Ы2-(1-метилиндазолин-5-ил)-2,4-пиримидиндиамина, N4-[ (2,2-дифтор-4Н-бензо[1,4]оксазин-3-он)-б-ил]-5-фтор-Ы2-[3-(метил-аминокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-1(2,2-диметил-4Н-5-пиридол-1,4]оксазин-3-он)-б-ил]-5-фтор-Ы2-[3-
(метиламинокарбонилметиленокси)фенил]-2,4-пиримидиндиамина, 5-фтор-Ы2-(3-метиламинокарбонилметиленоксифенил)-N4-[2Н-пиридо[3,2b]-1,4-оксазин-З(4Н)-он-б-ил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-(4-амино-З,4-дигидро-2Н-1-бензопиран-б-ил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина, N4-
(3-хлор-4-гидрокси-5-метилфенил)-5-фтор-Ы2-[3-[2-
пиперазино)этокси]фенил]-2,4-пиримидиндиамина и N4-(3-
метилкарбонилоксимефенил)-5-фтор-Ы2-[3-(N-
метиламино)карбонилметиленоксифенил]-2,4-пиримидиндиамина или их солей. Такие соединения можно синтезировать, например, способами, приведенными между параграфами [0218] и [02 60]
публикации патентной заявки США № 2004/0029902, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В других вариантах осуществления ингибиторы Syk выбраны из соединений, описываемых в публикации патентной заявки США № 2010/0316649, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Характерные соединения этого типа представлены следующими формулами Iz и lb.
Соединения формулы Iz являются такими, как представлено
ниже:
где
R1 выбран из арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, циклоалкенила, замещенного циклоалкенила, гетероциклила, замещенного гетероциклила, аралкила, гетероаралкила, водорода, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, ацила, ациламиногруппы и ацилоксигруппы;
R2a и R2b независимо выбраны из водорода, алкила, замещенного алкила, ацила, ациламиногруппы, ацилоксигруппы, SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -Э02-алкила, -БС^-арила, -302-гетероарила, арила, замещенного арила, гетероарила, гетероциклила, аралкила и гетероаралкила; и где присутствует R2a или R2b;
R3 выбран из водорода, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, галогена, нитрогруппы, цианогруппы, гидроксигруппы, алкоксигруппы, карбоксила, ацила, ациламиногруппы, аминоацила, ацилоксигруппы, оксиацила,
аминогруппы, замещенной аминогруппы, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;
R5 выбран из водорода, алкила и замещенного алкила; и
R6 выбран из водорода, алкила, замещенного алкила,
алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила,
ацила, ациламиногруппы, ацилоксигруппы, циклоалкила,
замещенного циклоалкила, циклоалкенила, замещенного
циклоалкенила, аралкила, гетероаралкила, арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, гетероциклила и замещенного гетероциклила;
или их солями или стереоизомерами.
Соединения формулы lb представлены ниже:
где
R1 выбран из арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, циклоалкенила, замещенного циклоалкенила, гетероциклила, замещенного гетероциклила, аралкила, гетероаралкила, водорода, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, ацила, ациламиногруппы и ацилоксигруппы;
R2a и R2b независимо выбраны из водорода, алкила, замещенного алкила, ацила, ациламиногруппы, ацилоксигруппы, SO-алкила, -SO-арила, -SO-гетероарила, -БОг-алкила, -БОг-арила, -БОг-гетероарила, арила, замещенного арила, гетероарила, гетероциклила, аралкила и гетероаралкила, и где присутствует R2a или R2b;
R3 выбран из водорода, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, галогена, нитрогруппы, цианогруппы, гидроксигруппы, алкоксигруппы, карбоксила, ацила,
ациламиногруппы, аминоацила, ацилоксигруппы, оксиацила, аминогруппы, замещенной аминогруппы, арила, замещенного арила, гетероарила и замещенного гетероарила;
R4 выбран из водорода, алкила, замещенного алкила, аминогруппы или -NR5R6;
R5 выбран из водорода, алкила и замещенного алкила; и
R6 выбран из арила, замещенного арила, гетероарила, замещенного гетероарила, циклоалкила, замещенного циклоалкила, циклоалкенила, замещенного циклоалкенила, гетероциклила, замещенного гетероциклила, аралкила, гетероаралкила, водорода, алкила, замещенного алкила, алкенила, замещенного алкенила, алкинила, замещенного алкинила, ацила, ациламиногруппы и ацилоксигруппы;
или их солей или стереоизомеров.
Иллюстративные примеры соединений формулы Iz можно
выбирать из: 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(2,4-дигидро-2-оксо-
1Н-бензо[d][1,3]оксазин-7-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; N- (4- (3-(3,4-диметоксифениламино)-7-циано-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-фенил)ацетамида; N-(4-(3-(3-
(трифторметил)фениламино)-7-циано-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)фенил)ацетамида; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(5-метокси-lH-индол-З-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь-]пиразол-7-карбонитрила; 3-
(3,4-диметоксифениламино)-2-(1Н-индол-5-ил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(lH-
индол- б-ил ) -1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4-
дихлорфениламино)-2-(2,4-дигидро-2-оксо-1Н-
бензо[d][1,3]оксазин-7-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(4-феноксифенил)-
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3-цианофениламино)-
2-(3,4-дигидро-3-оксо-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол- 7-карбонитрила; метил-3-(7-циано-2-(3, 4-
дигидро-3-оксо-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1-,2-
Ь]пиразол-3-иламино)бензоата; 3-(2,4,4-триметилпентан-2-
иламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо-[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; N- (7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)-2,2,-2-трифторацетамида; метил-4
(7-циано-2-(2,4-дигидро-2-оксо-1Н-бензо[d][1,3]оксазин-7-ил)-
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензоата; 3- (3
метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3-метоксифениламино)-2-(2,4
дигидро-2-оксо-1Н-бензо[d][1,3]оксазин-7-ил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(2,4
дигидро-2-оксо-1Н-бензо[d] [1,3]оксазин-7-ил)- б-метил-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-амино-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N- (7 циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)-
3- фтор-4-(трифторметил)бензамида; N-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)бензамида; N- (7
циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил) -
4- фторбензамида; N- (7-циано-2- (3,4,5-триметоксифенил)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)-3-метоксибензамида; 3- (3,4
дихлорфениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(4-бромфениламино)-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3
(3,4-диметоксифениламино)-2-(б-метокси-1Н-индол-3-ил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь-]пиразол-7-карбонитрила; 3- (4
морфолинофениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4,5-триметоксифениламино)-2-(1Н
индол-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (4
морфолинофениламино)-2-(1Н-индол-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7--карбонитрила; 3- (3,4-диметоксифениламино)-2
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]-пиразол-7-
карбонитрила; 3- (3,4,5-триметоксифениламино)-2-(3, 4, 5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N- (3
(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; N-(3-(7-циано-2-(3,4-дигидро-З-оксо
2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; N-(3-(7-циано-2-(3,4-диметоксифенил)
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)-фенил)ацетамида; N-(3-(7
циано-2-(4-(метилтио)фенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино-
)фенил)ацетамида; N- (4- (7-циано-З-(3-ацетамидофениламино)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)фенил)ацетамида; 3- (3
метоксибензиламино)-2-(3,4-дигидро-3-оксо-2Н-
бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(2,4-дифторфенил)
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-(3,4-дифторфенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(2,3
дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-7-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; N- (7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)-5-фенил-1,3,4-оксадиазол-2-
карбоксамида; 3-(3,4-диметоксифенэтиламино)-2-(3,4-дигидро-З
оксо-2Н-бензо[Ь] [1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифенэтиламино) -2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N- (7 циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил) -2- (3,4-диметоксифенил)ацетамида; 3- (4-морфолинофениламино)-2 (3,4-дигидро-3-оксо-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3-метоксифениламино)
2- (lH-индол-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3 (4-бромфениламино)-2-(3,4-дигидро-3-оксо-2Н-
бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (3-метоксибензиламино)-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N- (3
(7-циано-2-(lH-индол-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; 3- ( 3,4-диметоксифениламино)-2-(4
(метилсульфонил)фенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила;
3- (2,3-дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б-иламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3
(2,3-дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б-иламино)-2-(3,4-дигидро-З-
оксо-2Н-бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (3,4-диметоксифениламино-2
(бензо[d][1,3]диоксол-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-
карбонитрила; 3- (3,4-диметоксифениламино)-2-(З-фтор-4
метоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2-бром
N-(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-
3-ил)ацетамида; N- (7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)-2-феноксиацетамида; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-бензил-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 2-(3,4-дихлорфенил)-N-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил)ацетамида; 3
(3,4-диметоксифениламино)-2-(3,4,5-трифторфенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-(З-хлор-4,5-диметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-(4-фтор-З-метоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(2,3-дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б
иламино)-2-(lH-индол-б-ил)-1Н-имидазо-[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)фенил)ацетамида; N-(4-(7-циано
2-(б-метокси-1Н-индол-3-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; N-(4-(7-циано-2-(2, 3
дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-7-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; 3-(3,4-дифторфениламино)-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; трет
бутил-4-(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-3-иламино)-бензилкарбамат; 3- (4
(Аминометил)фениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; метил-3-(7-циано-2
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)-
бензоата; N- (4- (7-циано-2-(3,4-дигидро-3-оксо-2Н
бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)фенил)ацетамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4-диметоксифенил)
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)-фенил)ацетамида; 3-(2,3
дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б-иламино)-2-(З-гидрокси-4,5-
диметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; метил
4-(7-циано-2-(З-гидрокси-4,5-диметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-3-иламино)бензоат; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)бензил)ацетамида; трет-бутил-4-((7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)метил)пиперидин-1-карбоксилата; 3-( (Пиперидин-4
ил)метиламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (З-фтор-4-(4-(пирролидин-1
ил)пиперидин-1-ил)фениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; (S)-метил-2-(7-циано-2
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)-3-
фенилпропаноата; метил-3-(7-циано-2-(3,4-диметоксифенил) -1Н
имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензоата; метил-3-(2-(3-хлор
4,5-диметоксифенил)-7-циано-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-ил-
амино)бензоата; 3- (3,4,5-триметоксифениламино)-2-(4
морфолинофенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (4
бромфениламино)-2-(4-морфолинофенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-
7--карбонитрила; 4- (3- (3,4,5-триметоксифениламино)-7-циано-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-бензамида; 3-амино-2-(3,4,5
триметоксифенил)-5-(4-метоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил) -5Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)никотинамида; метил-3
(2- (4- ( (метоксикарбонил)метокси)-3-метоксифенил)-7-циано-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензоата; 3- (2,3
дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б-иламино)-2-(4-
((метоксикарбонил)метокси)-3-метоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2-(5-(7-Циано-З-(3
(метоксикарбонил)фениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)уксусной кислоты; 3-(4-фтор-3
метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; б-(4-хлорфенил)-2-(3,4
диметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N- (4
(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-3,4-диметоксибензамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5 триметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-3-
(4-гидроксифенил)пропанамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-3-
(пиперидин-1-ил)пропанамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-4-
цианобензамид; N- (4-(7-циано-2-(3,4,5-триметоксифенил) -5Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-1-метилпиперидин-4-
карбоксамида; N- (4-(7-Циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-5Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-1Н-индазол-3-
карбоксамида; N- (4 - (7-Циано-2-(3,4,5-триметоксифенил)-5Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-1,б-дигидро-б-
оксопиридин-3-карбоксамида; 3-( (1-никотиноилпиперидин-4
ил)метиламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-5Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 4- (3- (2,3
дигидробензо[Ь][1,4]диоксин-б-иламино)-7-циано-1Н-имидазо[1,2-
Ь]-пиразол-2-ил)бензамида; 4- (3- (4-бромфениламино)-7-циано-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)бензамида; метил-2-(4-(7-циано-З
(3,4-диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)ацетата; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(3
гидрокси-4,5-диметоксифенил)-1Н-имидазо-[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 2- (4-(2-гидроксиэтокси)-3-метоксифенил)-3-(3, 4
диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила;
3-(4-фтор-З-метоксифениламино)-2-(3,4-диметоксифенил)-5Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 4 - (3- (3,4
диметоксифениламино)-7-циано-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-
ил)бензамида; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(4-морфолинофенил)
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-(3-морфолинофенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(3
(циклопентилокси)-4-метоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(3,4-диметоксифениламино)-2-(4-(2-пирролидин-1
ил)этокси)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2- (4 - (2
метоксиэтокси)-3-метоксифенил)-3-(3,4-диметоксифениламино)-1Н-
имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (4-фтор-З
метоксифениламино)-2-(3,4-дигидро-3-оксо-2Н-
бензо[Ь][1,4]оксазин-б-ил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (3- (трифторметокси)фениламино)-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо-[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3
(З-хлор-4-метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4
диметоксифениламино)-2-(3-гидроксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; метил-2-(4-(7-циано-З-(3,4
диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-
фенокси)ацетата; N- (3-(7-циано-З-(3,4-диметоксифениламино) -1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-фенил)метансульфонамида; 3- (3
(циклопентилокси)-4-метоксифениламино)-2-(3,4,5-
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2-
(2-гидроксиэтокси)-3-метоксифенил)-3-(4-фтор-З-метоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила;
(3-(4-фтор-3-метоксифениламино)-7-циано-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-2-ил)бензамида; 3- (4-фтор-З-метоксифениламино)-2-
гидрокси-4,5-диметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (4-фтор-3-метоксифениламино-2-
(циклопентилокси)-4-метоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(4-фтор-З-метилфениламино)-2-(3,4
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-
фтор-4-метилфениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2-(4-(2-метоксиэтокси)
метоксифенил)-3-(4-фтор-З-метоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; метил-2-(4-(7-циано-З-(4-фтор
метоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)ацетата; 2- (4- (2-морфолиноэтокси)фенил)-3-(3
диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила,
2-(5-(7-циано-З-(3,4-диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-2-ил)-2-метоксифенокси)ацетамида; 3-(3-изопропокси
метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(З-фтор-4-метоксифениламино)
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3-(4-(циклопентилокси)-3-метоксифениламино)
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (4-(2-(пирролидин-1-ил)этокси)
метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (4-фтор
(трифторметил)фениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-
(трифторметокси)фениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо- [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(4-хлор
метоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3-(4-фтор-З-изопропоксифениламино)
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (З-фтор-4-(пирролидин-1-ил)фениламино)
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7
карбонитрила; 2- (4- (7-циано-З-(3,4-диметоксифениламино)-1Н
имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-метоксифенокси)ацетамида; 3-(3,4
диметоксифениламино)-2-(4-метокси-З,5-диметилфенил)-1Н-
имидазо [ 1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,4-дигидро-3-оксо-2Н
бензо[Ь][1,4]оксазин-б-иламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 2-(5-(7-циано-З-(4-фтор
3-метоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)ацетамида; 2-(4-(7-циано-З-(4-фтор-З
метоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)ацетамида; 2-(4-(7-циано-З-(3,4
диметоксифениламино)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-2-ил)-2-
метоксифенокси)-N-циклопропилацетамида; 3-(З-хлор-4
изопропоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-
имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,5
диметоксифениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-
Ь]-пиразол-7-карбонитрила; 3- (3,5-дифтор-4-метоксифениламино)
2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-
карбонитрила; 3- (З-этокси-4-фторфениламино)-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; 3- (3
(циклопентилокси)-4-фторфениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-
1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила; N-(3-(7-циано-2
(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)бензил)никотинамида; N-(3-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-З-
ил амино) бензил)пиколинамида; N-(3-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)бензил)изоникотинамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-З-
ил амино) бензил)пиколинамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-
иламино)бензил)изоникотинамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)- б-
цианопиридин-3-карбоксамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-2-
метилпиридин-3-карбоксамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-2
метоксипиридин-3-карбоксамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5-
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)- б-
метилпиридин-3-карбоксамида; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5-
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-4-
(трифторметил)пиридин-3-карбоксамидa; N-(4-(7-циано-2-(3,4,5-
триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-3-иламино)бензил)-б-
(трифторметил)пиридин-3-карбоксамида и 3-(3-фтор-4-
(метилтио)фениламино)-2-(3,4,5-триметоксифенил)-1Н-имидазо[1,2-Ь]пиразол-7-карбонитрила.
В других вариантах осуществления ингибиторы Syk можно выбирать из аминопиримидиновых соединений, как описывают, например, в публикации патентной заявки США № 2011/0245205, включенной, таким образом, в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме. Неограничивающие ингибиторные соединения этого типа представлены формулой (IV) или ее фармацевтически приемлемой солью:
где:
R1 выбран из группы, состоящей из (а) водорода, (Ь) галогена, (с) CN, (d) Ci-6-алкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из группы, состоящей из ORa, Сз-б-циклоалкила и галогена, (е) Сг-6-алкенила, необязательно, замещенного OCi-6-алкилом, (f) С2-6-алкинила, (д) Сз-б-циклоалкила, (h) ОН, (i) -O-Ci-6-алкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) арила, (ii) 5- или б-членного гетероарила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из алкила, (iii) 4-8-членного гетероциклила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами независимо выбранными из оксогруппы, галогена, Ci-б
алкила, (iv) -C02Ra, (v) -CONRbRc, (vi) -NRbRc и (vii) -0Ra, (j)
-A-X, где А является связью или О, X выбран из группы,
состоящей из (i) 4-8-членного гетероциклила, необязательно,
замещенного одной или несколькими группами, независимо
выбранными из галогена, Ci-6-алкила, -Ci-6-галогеналкила, -Ci-6-
гидроксиалкила, CORa, C02Ra, (ii) С3-6-циклоалкила,
необязательно, замещенного одной или несколькими группами,
независимо выбранными из Ci-6-алкила, -0Ra, -C02Ra, -NRbRc, (iii)
гетероарила, необязательно, замещенного бензилом,
необязательно, замещенным 0Ra, (k) 0-СН2С.ident.С-пиримидинила, (1) -S (О) п-С1-6-алкила, (m) -CORa, (n) -C02Ra, (о) -CONRbRc, (р) -NRbRc;
R2 выбран из группы, состоящей из (а) Н, (Ь) галогена, (с) Ci-6-алкила, (d) O-Ci-6-алкила, (е) Ci-6-галогеналкила и (f) O-Ci-6-галогеналкила; или R1 и R2 на смежных атомах углерода вместе представляю собой (СН2)3-4;
R3 представляет собой Н, галоген, 0Ra или Ci-4-аллил;
R4 выбран из группы, состоящей из (а) Н, (Ь) галогена, (с) С1-б-алкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) галогена, (ii) 0Ra, (iii) OC(0)Ra, (iv) NRbRc, (v) NHC(0)Ra, и (vi) NHC (0) NHRb, (d) С2-б_алкенила, (e) С2-б-алкинила, (f) Сз-6-циклоалкила, (g) 0Ra, (h) N02, (i) NRbRc, (j) NHC(0)Ra, (k) NHC (0) NHRb, (1) NHC (0) NHC (0) NRbRc;
R5 выбран из группы, состоящей из (а) Н, (Ь) галогена, (с) С1-8-алкила, С2-б-алкенила, С2-б-алкинил, каждый из которых, необязательно, замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из RY, (d) С3-12-карбоцикла или 3-12-членного гетероциклила с углеродными связями, каждый из которых, необязательно, замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из Rz, (е) гетероарила, необязательно, замещенного С1-3-алкилом (необязательно, замещенным одним или несколькими из ОН, или CN, или гетероцикла); (f) -C(0)Ra, (g) -C(0)2Ran (h) -C(0)NRbRc;
R5(l) выбран из группы, состоящей из Н и С1-3-алкила;
Ra выбран из группы, состоящей из (а) Н, (Ь) Ci-6-алкила,
необязательно, замещенный одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) галогена, (ii) CN, (iii) ОН, (iv) OCi-4-алкила, (v) гетероциклила, необязательно, замещенного оксогруппой, (vi) С(О)С1-6~алкила, необязательно, замещенного ОН, (vii) C02H, (viii) С02С1-6-алкила, (ix) CONRb (i) Rc (i) , (x) Э02С1-6-алкила, (xi) -NRb (i) Rc (i) , (xii) NRb (i) С (0) NRb (i) Rc (i) ; (xiii) фенила и (xiv) гетероарила, необязательно, замещенного ОН, (с) С2-6-алкенила, (d) С3-6-циклоалкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) ОН, (ii) C02H, (iii) С02С1-б_алкила, (iv) C0NRb (i) Rc (i) (e) фенила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) С2-6-алкинила, (ii) CN, (iii) галогена, (iv) ОН, (vi) 0C(0)Ci-6-алкила, (vii) C02H, (viii) СОгСьб-галогеналкила, (f) гетероарила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из Ci-6-алкила, Ci-б-галогеналкила, (СН2) i-8C02H, ОН, галогена, фенила, необязательно, замещенного С02Н, и (д) гетероциклила, необязательно, замещенного оксогруппой;
Rb и Rc независимо выбраны из группы, состоящей из (а) Н,
(Ь) Ci-6-алкила, необязательно, замещенного одной или
несколькими группами, независимо выбранными из (i) 0Ra, (ii)
галогена, (iii) гетероциклила, необязательно, замещенного
оксогруппой, ОН, С1-б-алкилом (необязательно, замещенным ОН) ,
(iv) Сз-б-Циклоалкила, необязательно, замещенного одной или
двумя группами, выбранными из Ci-4-алкила, СН20Н, C0NRb (i) Rc (i) и
C02Ra, (v) гетероарила, необязательно, замещенного Ci-6-алкилом,
необязательно, замещенным ОН, С02Н или гетероарилом,
необязательно, замещенным гетероарилом, (vi) S02NRb (i) Rc (i) ,
(vii) 302С1-4-алкила, (viii) C0NRb (i) Rc (i) , (ix) NRb(i)Rc(i), (x)
C02Ra, (xi) арила, необязательно, замещенного одной или
несколькими группами, выбранными из галогена, 0Ra, Ci-6-алкила
(необязательно, замещенного галогеном, гетероциклом
(необязательно, замещенным оксогруппой) или 0Ra) , S02NH2 и гетероарила, необязательно, замещенного СН20Н, (xii) SO3H, (xiii) NRb (i) C0NRb (i) Rc (i) , (xiv) CN и (xv) NHC(0)Ra, (c) C3-6
алкенила, необязательно, замещенного F; (d) Сз-б-циклоалкила
(необязательно, слитого с бензольным кольцом), необязательно,
замещенного одной или несколькими группами, независимо
выбранными из (i) Ci-4-алкила, (ii) 0Ra, (iii) CH2OH, (iv) C02Ra
и (v) CONRb(i) Rc ( i) , (e) арила, необязательно, замещенного одной
или двумя группами, независимо выбранными из (i) Ci-6-алкила
(необязательно, замещенного 0Ra) , (ii) CN, (iii) 0Ra, (iv)
галогена и (v) OCOCi-4-алкила; (f) гетероарила, необязательно,
замещенного одной или несколькими группами, независимо
выбранными из (i) 0Ra, (ii) C02Ra и (iii) Ci-6-алкила,
необязательно, замещенного ОН, (д) гетероциклила,
необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) оксогруппы, (ii) ОН и (iii) С1-6-алкила; или
Rb, Rc и атом азота, с которым они соединены, вместе образуют 5-, б- или 7-членный гетероцикл, имеющий 0 или 1 дополнительный гетероатом, выбранный из О, Р(0) (Ci-6-алкила) , S(0)n и N-Rx, и, необязательно, замещенный одной или несколькими группами, независимо выбранными из (а) оксогруппы, (Ь) тиоксогруппы, (с) С1-б-алкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) 0Ra, (ii) C02Ra, (iii) 0P(0) (Ci-6-алкила) 2, (iv) арила и (v) галогена, (d) 0Ra, (e) C(0)Ra, (f) C(0)2Ra, (r) CONRb (i) Rc (i) , (h) P(0) (OH) 2, (i) S02Ra и (j) CN, или Rb, Rc и атом азота, с которым они соединены совместно образуют
Rb(l) и Rc(l) независимо выбраны из группы, состоящей из (а) Н и (Ь) С1-б~алкила, необязательно, замещенного ОН, СОгН или С02С1-6-алкила; или
Rb(l), RC(I)H атом азота, с которым они соединены, совместно образуют 5- или б-членный гетероцикл, имеющий 0 или 1 дополнительный гетероатом, выбранный из О, S и N-Rx и, необязательно, замещенный одной или несколькими группами, независимо выбранными из оксогруппы;
Ru выбран из группы, состоящей из (а) Ci-6-алкила, необязательно, замещенного 1-3 группами, выбранными из галогена, ОН, S02Ra, CONRbRc, NRbRc, фенила, гетероциклила и гетероарила, (Ь) С3-8-циклоалкила, необязательно, замещенного ОН, C02Ra, -CONH2, (с) гетероцикла, необязательно, замещенного оксогруппой, (d) арила, необязательно, замещенного С2-6-алкинилом, CN, галогеном, 0Ra, (е) гетероарила, необязательно, замещенного ОН;
Rx выбран из группы, состоящей из (а) Н, (Ь) Ci-6-алкила,
необязательно, замещенного гетероциклом, (с) фенила,
необязательно, замещенного ОН или OCi-4-алкилом, (d) -C(0)-Ci-6-
алкила, (е) -С (О) 2-С1-б-алкила, (f) -C(0)NH2, -С (О) NH-Ci-6-алкила,
-С (О) N (Ci-6-алкил) 2, (д) -С (О) 2NHC (О) NH2, -С (О) 2NHC (О) NH-Ci-6-
алкила, -С (О) 2NHC (О) N (Ci-6-алкил) 2, (h) -Б02С1-б-алкила
(необязательно, замещенного галогеном), -Б02-гетероарила (необязательно, замещенного алкилом) , (i) -S(0)2NH2, -S(0)2NH-Ci-б-алкила, -S (О) 2N (Ci-6-алкил) 2, j) -S02NHC (О) 2-С1-б_алкила;
RY выбран из группы, состоящей из (а) арила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) галогена, (ii) Ci-6-аллила, необязательно, замещенного ОН или C02Ra, (iii) С2-б~алкенила, необязательно, замещенного C02Ra, (iv) фенила, необязательно, замещенного C02Ra, (v) CORa, (vi) C02Ra, (vii) CONRbRc, (viii) 0Ra, (ix) S(0)nRa, (x) S02NRbRc, (xi) S02NHC(0)Ra, (xii) N02 и (xiii) NHC(0)Ra, (b) гетероарила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) галогена, (ii) Ci-6-алкила, необязательно, замещенного C02Ra, (iii) Сз-б_Циклоалкила, (iv) арила, необязательно, замещенного
C02Ra, (v) CONRbRc, (vi) 0Ra, (vii) S02Ra и (viii) C02Ra, (c) C3-8-циклоалкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из (i) Ci-6-алкила, (ii) C02Ra, и
(iii) NRbRc, (d) Сб-8~Циклоалкенила (необязательно, замещенного C02Ra) , (е) галогена, (f) CN, (g) -C(0)Ra, (h) -C(0)2Ra, (i) C(0)C02Ra, (j) -C(0)NRbRc, (k) -C (0) NHC (0) NRbRc, (1) -0Ra, (m) -0C(0)Ra, (n) -NRbRc, (o) -NHC(0)Ru, (p) -NHC (0) NRbRc, (q) -NHC (0) NHC (0) NH2, (r) -NHSO. sub. mRa (s) -NHS02NRbRc, (t) SOnRa,
(u) -S02NRbRc, (v) - S02NHC(0)Ra, (w) -S02NHC (0) 2Ra, (x) S03H, (y) -P(0)(0Ra)2, и (z) CONHOH; (aa) гетероциклила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из оксогруппы, тиоксогруппы, С1-б~алкила и C02Ra;
Rz выбран из группы, состоящей из (а) группы, выбранной из RY, (b) Ci-6-алкила, необязательно, замещенного одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, NRbRc, 0Ra, CN, фенила (необязательно, замещенного Ci-6-алкановой кислотой) , C0NRbRc и -C02Ra, (с) оксогруппы и (d) N0Ra, m представляет собой 1 или 2, п представляет собой 0, 1 или 2.
Типичные соединения формулы IV включают, в качестве неограничивающих примеров: (1R, 4S)-4-[5-(З-циклопропил-5-{[4-
(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]-4-гидрокси-2,2-диметилциклогексанкарбоновую кислоту; (lS,4R)-4-
[5-(З-циклопропил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]-4-гидрокси-2,2-
диметилциклогексанкарбоновую кислоту; (IS,4R)-4-гидрокси-2,2-диметил-4-{5-[З-метил-5-(4-метил-пиримидин-2-иламино)-фенил]-1,З-тиазол-2-ил}-циклогексанкарбоновую кислоту; (IS,4R)-4-[5-
(3-{[4-(дифторметил)пиримидин-2-ил]амино}-5-метилфенил)-1,3-
тиазол-2-ил]-4-гидрокси-2,2-диметилциклогексанкарбоновую
кислоту; транс-4-гидрокси-4-[5-(З-метил-5-{[4-
(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоновую кислоту; цис-4-гидрокси-4-[5-(3-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}-фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоновую кислоту; 5-гидрокси-5-[5-(З-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]азепан-2-он; цис-4-[(гидроксиацетил)амино]-1-[5-(З-метил-5
{[4-(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоксамид и (IS,4R)-4-гидрокси-2,2-диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]-N-[3-(2-оксопирролидин-1-
ил)пропил]циклогексанкарбоксамид; (IS,4R)-4-гидрокси-2,2-
диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-
ил]амино}-фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоновую кислоту;
(1R,4S)-4-гидрокси-2,2-диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-
(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-
ил]циклогексанкарбоновую кислоту; (IS,4S)-4-гидрокси-2,2-
диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-
ил]амино}-фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоновую кислоту;
(1R,4R)-4-гидрокси-2,2-диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-
(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}-фенил)-1,З-тиазол-2-
ил]циклогексанкарбоновую кислоту; (1R,4S)-4-гидрокси-2 , 2-
диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-(трифторметил)пиримидин-2-
ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-ил]циклогексанкарбоксамид;
(IS,4R)-4-гидрокси-2,2-диметил-4-[5-(З-метил-5-{[4-
(трифторметил)пиримидин-2-ил]амино}фенил)-1,З-тиазол-2-
ил]циклогексанкарбоксамид; (1S,4R) 4-{5-[3-({4-[ (1R)-1-
фторэтил]пиримидин-2-ил}амино)-5-метилфенил]-1,3--тиазол-2-ил}-4-гидрокси-2,2-диметилциклогексанкарбоновая кислота; (1S,4R) 4-(5-[3-({4-[(lS)-1-фторэтил]пиримидин-2-ил}амино)-5-метилфенил]-1,3--тиазол-2-ил}-4-гидрокси-2,2-диметилциклогексанкарбоновую кислоту или их фармацевтически приемлемые соли.
3.2.6 Варианты осуществления иммуномодулирукщих частиц В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один аггрекановый антиген, описываемый, например, в разделе 3.2.1, совместно с одним или несколькими ингибиторами, описываемыми выше (например, по меньшей мере одним ингибитором NF-KB, описываемым, например, в разделе 3.2.3, и/или по меньшей мере одним ингибитором mTOR, описываемым, например, в разделе 3.2.4, и/или по меньшей мере одним ингибитором Syk, описываемым, например, в разделе 3.2.5), или, альтернативно, по меньшей мере одним или аггрекановым APL, описываемым, например, в разделе
3.2.2, (в совокупности обозначаемые в настоящем описании как
"биоактивные средства") предоставляют в форме частиц,
облегчающих доставку антигена и ингибитора в
антигенпрезентирующие клетки in vivo или in vitro. Ингибиторы и антигены или APL могут содержаться в одной частице или различных частицах, или быть иным образом связанными с ними. В практическом осуществлении настоящего изобретения можно использовать множество частиц, включая, в качестве неограничивающих примеров, липосомы, мицеллы, липидные частицы, керамические/неорганические частицы, и, как правило, они выбраны из наночастиц и микрочастиц. Частицы имеют соответствующий размер для захвата (например, посредством фагоцитоза или эндоцитоза) антигенпрезентирующими клетками. В иллюстративных примерах частицы имеют размеры менее приблизительно 100 мкм, более предпочтительно - в диапазоне до приблизительно <500 нм, хотя частицы могут достигать приблизительно 10 мкм и нескольких нм.
В основном, липосомы состоят из фосфолипидного бислоя,
образующего оболочку вокруг водного ядра. Их преимущества
включают липофильность внешних слоев, "имитирующих" внешние
слои мембраны клеток, и то, что они относительно легко
захватываются многими клетками. Полимерные средства, как
правило, состоят из микро/наносфер и микро/нанокапсул,
состоящих из биосовместимых полимеров, являющихся
биодеградируемыми (например, полимолочной кислоты) или бионедеградируемыми (например, этиленвинилацетата). Некоторыми из преимуществ полимерных средств являются простота производства и высокая вместимость, диапазон размеров от нанометра до микрометра, а также контролируемый профиль высвобождения и деградации.
В некоторых вариантах осуществления частицы содержат на своей поверхности антигенсвязывающую молекулу, иммунологически взаимодействующую с маркером, больше экспрессирующимся на антигенпрезентирующих клетках (например, дендритных клетках), чем на неантигенпрезентирующих клетках. Иллюстративные маркеры этого типа включают MGL, DCL-1, DEC-205, маннозный рецептор
макрофагов, DC-SIGN или другие рецепторы, специфичные для DC или миелоидных клеток, (лектин), например, как описывают в Hawiger et al. (2001, J Exp Med 194:769), Kato et al. 2003, J Biol Chem 278:34035), Benito et al. (2004, J Am Chem Soc 126:10355), Schjetne, et al. (2002, Int Immunol 14:1423) and van Vliet et al. , 2006, Nat Immunol 7(11) :1200-1208; Immunobiology 211:577-585).
Иммуномодулирующие частицы по настоящему изобретению можно получать, комбинируя биоактивные средства и поверхностно-активное вещество, эксципиент или полимерный материал. В некоторых вариантах осуществления частицы являются биодеградируемыми и биосовместимыми и, необязательно, способными к биодеградации с контролируемой скоростью для доставки терапевтического или диагностического средства. Частицы можно получать из множества материалов. Можно использовать и неорганические, и органические материалы. Можно использовать полимерные и неполимерные материалы, такие как жирные кислоты. Другие подходящие материалы включают, в качестве неограничивающих примеров, желатин, полиэтиленгликоль, трегалулозу, декстран и хитозан. Частицы с временем деградации и высвобождения в диапазоне от секунд до месяцев можно получать и производить с учетом таких факторов, как материал частиц.
3.2.6.1 Полимерные частицы
Полимерные частицы можно получать из любого биосовместимого и, желательно, биодеградируемого полимера, сополимера или смеси. Полимеры можно адаптировать для оптимизации различных характеристик частицы, включая: i) взаимодействия между биоактивными средствами, подлежащими доставке, и полимером для обеспечения стабилизации биоактивных средств и сохранения активности после доставки; ii) скорость деградации полимера и, таким образом, профили скорости высвобождения средства; iii) поверхностные характеристики и способность к направленной доставке посредством химической модификации; и iv) пористость частицы.
Для получения частиц можно использовать поверхностно-эродирующие полимеры, такие как полиангидриды. Например, можно
использовать полиангидриды, такие как поли[(п-карбоксифенокси)-гексановый ангидрид] (РСРН). Биодеградируемые полиангидриды описывают в патенте США № 4857311.
В других вариантах осуществления можно использовать объемно-эродирующие полимеры, такие как полимеры на основе полиэфиров, включая поли(гидроксикислоты) или поли(сложные эфиры). Например, для получения частиц можно использовать полигликолевую кислоту (PGA), полимолочную кислоту (PLA) или их сополимеры. Полиэфир также может содержать заряженную или функциональную группу, такую как аминокислота. В иллюстративных примерах частицы с контролируемым высвобождением можно получать из поли(D,L-молочной кислоты) и/или сополимера Б,Ъ-молочной и гликолевой кислот ("PLGA"), включающих поверхностно-активное вещество, такое как DPPC.
Другие полимеры включают поли(алкилцианоакрилаты),
полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, такие как полиэтилен,
полипропилен, поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид),
поли(этилентерефталат), поливиниловые соединения, такие как поливиниловые спирты, поливиниловые простые эфиры и поливиниловые сложные эфиры, полимеры акриловой и метакриловой кислот, целлюлозы и другие полисахариды и пептиды или белки, или их сополимеры или смеси. Полимеры можно выбирать или модифицировать так, чтобы они имели подходящую стабильность и скорость деградации in vivo для применения в различных контролируемых средствах доставки лекарственных средств.
В некоторых вариантах осуществления частицы получают из графт-сополимеров полиэфиров с функциональными группами, как описано в Hrkach et al. (1995, Macromolecules, 28:4736-4739; and "Poly(L-Lactic acid-co-amino acid) Graft Copolymers: A Class of Functional Biodegradable Biomaterials" in Hydrogels and Biodegradable Polymers for Bioapplications, ACS Symposium Series No. 627, Raphael M. Ottenbrite et al. , Eds., American Chemical Society, Chapter 8, pp. 93-101, 1996.)
Для получения частиц можно использовать материалы, иные, чем биодеградируемые полимеры. Подходящие материалы включают различные небиодеградируемые полимеры и различные эксципиенты.
Частицы также можно получать из биоактивных средств и поверхностно-активного вещества в отдельности.
Полимерные частицы можно получать с использованием выпаривания растворителя из одиночной и двойной эмульсии, сушки распылением, экстракции растворителем, испарения растворителем, разделения фаз, простой и комплексной коацервации, интерфазной полимеризации и других способов, хорошо известных специалистам в данной области. Частицы можно получать с использованием способов получения микросфер или микрокапсул, известных в данной области, с учетом того, что условия оптимизируют для получения частиц с желаемым диаметром.
Способы, разработанные для получения микросфер для доставки инкапсулируемых средств, описаны в литературе, например, в Doubrow, М., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992. Способы также описывают Mathiowitz и Langer (1987, J. Controlled Release 5: 13-22); Mathiowitz et al. (1987, Reactive Polymers 6:275-283); и Mathiowitz et al. (1988, J. Appl. Polymer Sci. 3: 755-774), а также в патенте США № 5213812, патенте США № 5417986, патенте США № 5360610 и патенте США № 5384133. Выбор способа зависит от выбора полимера, размера, внешней структуры и кристалличности, являющейся желаемой, как описано, например, в Mathiowitz et al. (1990, Scanning Microscopy 4:329-340; 1992, J. Appl. Polymer Sci. 45: 125-134) и Benita et al. (1984. J. Pharm. Sci. 73: 1721-1724) .
При выпаривании растворителя, описываемом, например, в Mathiowitz et al. , (1990), Benita и патенте США № 4272398 Jaffe, полимер растворяют в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Можно использовать несколько различных концентраций полимера, например, от 0,05 до 2,0 г/мл. Биоактивные средства, находящиеся в растворимой форме или диспергированные в виде тонкодисперсных частиц, добавляют в раствор полимера и смесь суспендируют в водной фазе, содержащей поверхностно-активное средство, такое как поли(виниловый спирт). Водная фаза может иметь концентрацию, например, 1% поли(винилового спирта) масс./об. в дистиллированной воде.
Получаемую эмульсию перемешивают до тех пор, пока большая часть органического растворителя не выпарится, оставляя твердые микросферы, которые можно промывать водой и высушивать в течение ночи в лиофилизаторе. С помощью этого способа можно получать микросферы различного размера (от 1 до 1000 мкм).
Удаление растворителя, главным образом, разработано для использования с менее стабильными полимерами, такими как полиангидриды. В этом способе средство диспергируют или растворяют в растворе выбранного полимера в летучем органическом растворителе, таком как метиленхлорид. Затем смесь суспендируют в масле, таком как силиконовое масло, посредством перемешивания для получения эмульсии. В течение 2 4 часов растворитель диффундирует в масляную фазу, и капли эмульсии затвердевают в твердые полимерные микросферы. В отличие от способа микрокапсулирования в расплаве, описываемого, например, в Mathiowitz et al. (1987, Reactive Polymers 6:275), этот способ можно использовать для получения микросфер из полимеров с высокой температурой плавления и широким диапазоном молекулярных масс. С помощью этого способа можно получать микросферы, имеющие диаметр, например, от одного до 300 микрометров.
В некоторых полимерных системах полимерные частицы, полученные с использованием способа одиночной или двойной эмульсии, варьируются по размеру в зависимости от размера капель. Если капли в эмульсиях "вода-в-масле" не имеют подходящего малого размера для получения частиц с желаемым диапазоном размера, можно получать меньшие капли, например, посредством обработки ультразвуком, или гомогенизации эмульсии, или добавления поверхностно-активных веществ.
Если частицы, получаемые любым из указанных выше способов, имеют диапазон размеров вне желаемого диапазона, частицы можно отбирать по размеру, например, с использованием фильтра и дополнительно разделять по плотности с использованием способов, известных специалистам в данной области.
Полимерные частицы можно получать с помощью сушки распылением. Описывают способы сушки распылением, такие как
описано в WO 96/09814 Sutton и Johnson, с получением гладких сферических микрочастиц из водорастворимого материала, при этом по меньшей мере 90% частиц имеют средний размер от 1 до 10 мкм. 3.2. 6.2 Липосомы
Липосомы можно получать стандартными способами, такими как описано Kim et al. (1983, Biochim. Biophys. Acta 728:339-348); Liu et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta 1104:95-101); Lee et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103: 185-197), Brey et al.
(публикации патентной заявки США № 2 0020041861), Hass et al.
(публикации патентной заявки США № 20050232984), Kisak et al.
(публикации патентной заявки США № 20050260260) и Smyth-Templeton et al. (публикации патентной заявки США № 20060204566). Дополнительно, можно ссылаться на Copeland et al.
(2005, Immunol. Cell Biol. 83:95-105), которые описывают составы частиц на основе липидов для доставки антигена, и на Bramwell et al. (2005, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 22(2): 151-214; 2006, J Pharm Pharmacol. 58 (6) :717-728), которые описывают системы доставки в виде частиц для вакцин, включая способы получения липосом, нагруженных белком. В различных экспериментах на культурах клеток in vitro и животных используют множество составов липосом с использованием множества различных липидных компонентов. Параметры, определяющие свойства липосом, идентифицированы и описаны в литературе, например, в Lee et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1103: 185-197); Liu et al. (1992, Biochim. Biophys. Acta. 1104:95-101) и Wang et al. (1989, Biochem. 28:9508-9510).
В кратком изложении, выбранные липиды (и любое биоактивное средство, растворимое в органических растворителях), растворенное в органическом растворителе, смешивают и высушивают на дне стеклянной пробирки в вакууме. Липидную пленку регидратируют с использованием водного буферного раствора, содержащего любые водорастворимые биоактивные средства, подлежащие инкапсуляции, посредством осторожного вращения сосуда. Затем гидратированные липидные средства дополнительно обрабатывают посредством экструзии, подвергают серии циклов замораживания-размораживания или дегидратируют, а
затем регидратируют для усиления инкапсуляции биоактивных средств. Затем липосомы можно промывать посредством центрифугирования или нагружать ими колонку для эксклюзионной хроматографии для удаления несвязавшегося биоактивного средства из состава липосом и хранить при 4°С. Основной способ получения липосомы более подробно описан Thierry et al. (1992, Nuc. Acids Res. 20:5691-5698).
Частицу, несущую нагрузку биоактивных средств, можно получать с использованием способа, описанного Pautot et al. (2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(19): 10718-21). Используя способ Pautot et al., для производства липосом можно использовать покрытые стрептавидином липиды (DPPC, DSPC, и аналогичные липиды). Способ инкапсуляции лекарственных средств, описываемый Needham et al. (2 001, Advanced Drug Delivery Reviews 53(3) :285-305), можно использовать для нагрузки этих средств одним или несколькими активными средствами.
Липосомы можно получать, подвергая раствор различных
смесей липидов в хлороформе воздействию высокого вакуума, а
затем гидратируя полученные липидные пленки (DSPC/CHOL)
буферами с рН 4 и экструдируя их через поликарбонатные фильтры
после замораживания и размораживания. Для повышения
эффективности инкапсуляции или повышения стабильности и т.д.
можно использовать DPPC, дополненный DSPC или холестерином.
Трансмембранный градиент рН получают, корректируя рН
экстравезикулярной среды до 7,5, добавляя подщелачивающее
средство. Затем биоактивное средство (например,
низкомолекулярное соединение ингибиторов NF-кВ, ингибиторов mTOR или ингибиторов Syk, являющихся, например, слабыми основаниями) можно заключать, добавляя раствор биоактивного средства в небольшие аликвоты раствора средства при повышенной температуре, чтобы сделать возможным накопление биоактивного средства в липосомах.
Другие частицы на основе липидов, подходящие для доставки биоактивных средств по настоящему изобретению, такие как ниосомы, описывают в Copeland et al. (2005, Immunol. Cell Biol. 83:95-105).
3.2.6.3 Керамические частицы
Для доставки биоактивных средств по изобретению также можно использовать керамические частицы. Эти частицы, как правило, получают с использованием способов, аналогичных хорошо известному золь-гелевому способу, и для этого, как правило, необходимы простые условия и комнатная температура, как описывают, например, Brinker et al. ("Sol-Gel Science: The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing;" Academic Press: San Diego, 1990, p-60) и Avnir et al. (1994, Chem. Mater. 6, 1605). Можно получать керамические частицы с желаемым размером, формой и пористостью и крайне стабильные. Они также эффективно защищают разбавленные молекулы (полипептиды, лекарственные средства и т.д.) от денатурации, индуцированной экстремальными значениями рН и температуры (Jain et al. , 1998. J. Am. Chem. Soc. 120: 11092-11095). Кроме того, их поверхности можно легко функционализировать с использованием различных групп (Lai et al., 2000. Chem. Mater. 12:2632-2639; Badley et al. , 1990, Langmuir 6:792-801), и, таким образом, их можно связывать со множеством моноклональных антител и других лигандов для направленной доставки в желаемые участки in vivo.
Для доставки in vivo нагрузки, содержащей активное средство, описаны различные керамические частицы. Например, в патенте Великобритании № 1590574 описывают включение биологически активных компонентов в золь-гелевую матрицу. В международной патентной публикации WO 97/4 53 67 описывают контролируемо растворяющиеся ксерогели диоксида кремния, получаемые с помощью золь-гелевого способа, в которые включают биологически активное средство посредством импрегнирования в предварительно спеченные частицы (от 1 до 50 0 мкм) или диски. В международной патентной публикации WO 0 05034 9 описывают контролируемо биодеградируемые волокна из диоксида кремния, получаемые с помощью золь-гелевого способа, в которые включают биологически активное средство при синтезе волокна. В публикации патентной заявки США № 20040180096 описывают керамические наночастицы, в которые включают биоактивное вещество. Керамические наночастицы получают посредством
образования мицеллярной композиции красителя. В мицеллярную композицию добавляют керамический материал и осаждают керамические наночастицы посредством щелочного гидролиза. В публикации патентной заявки США № 20050123611 описывают керамические частицы с контролируемым высвобождением, содержащие активный материал, по существу, гомогенно диспергированный по всем частицам. Эти частицы получают, смешивая поверхностно-активное вещество с неполярным растворителем для получения раствора обратных мицелл; (Ь) растворяя прекурсор геля, катализатор, конденсирующее средство и растворимый активный материал в полярном растворителе для получения раствора прекурсора; (с) комбинируя раствор обратных мицелл и раствор прекурсора для получения эмульсии и (d) конденсируя прекурсор в эмульсии. В публикации патентной заявки США № 20060210634 описывают адсорбцию биоактивных веществ на керамических частицах, содержащих оксид металла (например, оксид титана, оксид циркония, оксид скандия, оксид церия и оксид иттрия), посредством выпаривания. Kortesuo et al. (2000, Int J Pharm. 200(2) :223-229) описывают способ сушки распылением для получения сферических частиц из силикагеля с узким диапазоном размера частиц для контролируемой доставки лекарственных средств, таких как торемифен цитрат и дексмедетомидин гидрохлорид. Wang et al. (2 00 6, Int J Pharm. 308(1-2) : 160-167) описывают комбинацию адсорбции пористыми микрочастицами СаСОз и инкапсуляции полиэлектролитных многослойных пленок для доставки биоактивных средств. 3.2.6.4 Баллистические частицы
Биоактивные средства по настоящему изобретению можно
прикреплять (например, посредством покрывания или конъюгации)
или иным образом связывать с частицами, подходящими для
использования в безыгольной или "баллистической"
(биолистической) доставке. Иллюстративные частицы для баллистической доставки описывают, например, в: WO 02/101412; WO 02/100380; WO 02/43774; WO 02/19989; WO 01/93829; WO 01/83528; WO 00/63385; WO 00/26385; W0 00/19982; WO 99/01168; WO 98/10750; и WO 97/48485. Однако следует понимать, что такие
частицы не ограничены их использованием с устройством для баллистической доставки, и их можно иным образом использовать с помощью альтернативного способа (например, инъекции или доставки с помощью микроигл), посредством которого частицы можно доставлять в иммунные клетки.
Биоактивные средства можно покрывать или химически соединять с частицами носителя (например, коровых носителей) с использованием множества способов, известных в данной области. Частицы носителя выбраны из материалов, имеющих подходящую плотность в диапазоне размеров частиц, как правило, используемых для внутриклеточной доставки. Оптимальный размер частиц носителя, разумеется, будет зависеть от диаметра клеток-мишеней. Иллюстративные частицы имеют размер в диапазоне от приблизительно 0,01 до приблизительно 250 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 150 мкм и от приблизительно 2 0 до приблизительно 60 мкм, и плотность частиц в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 25 г/см3 и объемную плотность от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0 г/см3 или выше. Неограничивающие частицы этого типа включают частицы металла, такие как частицы носителя вольфрама, золота, платины и иридия. Широко доступны частицы вольфрама со средним размером от 0,5 до 2,0 мкм в диаметре. Также можно использовать частицы золота или микрокристаллическое золото (например, порошок золота А1570, поставляемый Engelhard Corp., East Newark, N.J.). Частицы золота обеспечивают однородность по размеру
(поставляемые Alpha Chemicals с размером частиц 1-3 мкм или поставляемые Degussa, South Plainfield, N.J. с диапазоном размеров частиц, включая 0,95 мкм) и низкую токсичность. Микрокристаллическое золото обеспечивает разнообразное распределение размера частиц, как правило, в диапазоне 0,1-5 мкм. Неоднородная площадь поверхности микрокристаллического золота обеспечивает высокоэффективное покрывание активными средствами по настоящему изобретению.
Описано и известно множество способов адсорбции, присоединения или иного связывания биоактивных молекул
(например, гидрофильных молекул, таких как белки и нуклеиновые
кислоты) с частицами, такими как частицы золота или вольфрама. В иллюстративных примерах в таких способах комбинируют заранее определенное количество золота или вольфрама с биоактивными молекулами, СаС1г и спермидином. В других примерах для преципитации биоактивных молекул на частицах золота или вольфрама используют этанол (см., например, Jumar et al., 2004, Phys Med. Biol. 49:3603-3612). Полученный раствор соответствующим образом центрифугируют на центрифуге типа вортекс непрерывно в течение покрывания для обеспечения однородности реакционной смеси. После присоединения биоактивных молекул частицы можно переносить, например, на подходящие мембраны и позволять им высыхать перед использованием, покрывать поверхность модуля для пробоподготовки или кассеты или нагружать кассету для доставки для применения в конкретных устройствах для доставки, опосредуемой частицами.
Составленные композиции можно получать соответствующим образом в виде частиц с использованием стандартных способов, таких как простое выпаривание (сушка воздухом), вакуумная сушка, сушка распылением, лиофилизация, покрытие распылением, осаждение, образование частиц суперкритической жидкости и т.п. При желании, полученные частицы можно дополнять с использованием способов, описываемых в международной патентной публикации WO 97/48485.
3.2.6.5 Поверхностно-активные вещества
Поверхностно-активные вещества, которые можно включать в частицы, включают фосфоглицериды. Примеры фосфоглицеридов включают фосфатидилхолины, такие как природное поверхностно-активное вещество, L-a-фосфатидилхолин дипальмитоил ("DPPC"). Поверхностно-активные вещества, преимущественно, улучшают поверхностные свойства, например, снижая взаимодействия между частицами, и могут сохранять поверхность частиц менее адгезивной. При использовании поверхностно-активных веществ, эндогенных для легких, можно избегать потребности в использовании нефизиологических поверхностно-активных веществ.
Предоставление поверхностно-активного вещества на
поверхности частиц может снижать тенденцию частиц к скоплению по причине взаимодействий, таких как электростатические взаимодействия, ван-дер-ваальсовы силы и капиллярный эффект. Наличие поверхностно-активного вещества на поверхности частицы может обеспечивать повышенную шероховатость поверхности (неровность), таким образом, улучшая аэрозолизацию, снижая площадь поверхности для близкого взаимодействия между частицами.
Можно использовать поверхностно-активные вещества, известные в данной области, включая любое природное поверхностно-активное вещество. Другие примеры поверхностно-активных веществ включают дифосфатидилглицерин (DPPG); гексадеканол; жирные спирты, такие как полиэтиленгликоль (PEG); полиоксиэтилен-9-лауриловый простой эфир; поверхностно-активную жирную кислоту, такую как пальмитиновая кислота или олеиновая кислота; сорбитан триолеат (Span 85) ; гликохолат; сурфактин; полоксамер; сложный эфир сорбитана и жирной кислоты, такой как сорбитан триолеат; тилоксапол и фосфолипид.
Частицы можно использовать в качестве средств доставки ингибитора и аггреканового антигена в антигенпрезентирующие клетки ex vivo. Однако в предпочтительных вариантах осуществления частицы используют для доставки биоактивных соединений в антигенпрезентирующие клетки in vivo, как описывают, например, в публикации патентной заявки США № 20100151000, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
3.2.7 Варианты осуществления антигенпрезентирующей клетки ex vi vo
Ингибитор и аггрекановый антиген можно доставлять ex vivo
в антигенпрезентирующие клетки в различных формах, и по своей
природе они могут быть растворимыми или в виде частиц.
Антигенпрезентирующие клетки или их предшественников можно
получать от индивидуума, нуждающегося в лечении (т.е.
аутологичные антигенпрезентирующие клетки или предшественники).
Альтернативно, антигенпрезентирующие клетки или их
предшественников получают от донора, являющегося совпадающим
или несовпадающим с индивидуумом по МНС (т.е. аллогенные антигенпрезентирующие клетки). Соответственно, в этих вариантах осуществления, донор является гистосовместимым с индивидуумом.
В указанных выше вариантах осуществления
антигенпрезентирующие клетки приводят в контакт с одним или несколькими ингибиторами, описываемыми, например, в разделах 3.2.3, 3.2.4 и 3.2.5, или с полинуклеотидом, с которого экспрессируется ингибитор, в течение периода времени и в условиях, достаточных для ингибирования, снижения или иного нарушения активности NF-кВ, И/ИЛИ активности mTOR, и/или активности Syk в антигенпрезентирующей клетке. Количество растворимого ингибитора или ингибитора в виде частиц, подлежащих приведению в контакт с антигенпрезентирующими клетками или их предшественниками, можно определять эмпирически общепринятыми способами, известными специалистам в данной области. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки инкубируют в присутствие ингибитора по меньшей мере в течение приблизительно 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов или в течение менее приблизительно 96, 84, 72, 60, 48, 36, 24, 12, 8, 7, б, 5, 4, 3 или 2 часов. В конкретных вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки инкубируют с ингибитором (например, ингибитором NF-кВ, ИЛИ ингибитором mTOR или ингибитором Syk) в течение от приблизительно 4 8 до приблизительно 60 часов при 35°С -38°С или в течение времени, необходимого для ингибирования, снижения или иного нарушения активности NF-кВ, mTOR или Syk. В иллюстративных примерах этого типа антигенпрезентирующие клетки можно инкубировать в присутствие активатора антигенпрезентирующих клеток, такого как липополисахарид (LPS) и, необязательно, дополнительных ингибиторов (например, дополнительных ингибиторов NF-кВ, таких как витамин D и дексаметазон).
Антигенпрезентирующие клетки или их предшественников также приводят в контакт с аггрекановым антигеном, описываемым, например, в разделе 3.2.1, или с аггрекановым APL, описываемым, например, в разделе 3.2.2, или с полинуклеотидом, с которого
экспрессируется антиген или APL, в течение периода времени и в условиях, достаточных для презентации антигена или его процессированной формы антигенпрезентирующими клетками. Соответственно, ингибитор, и/или антиген или полинуклеотид, с которого они экспрессируются, находятся в растворимой форме или форме частиц, описываемых, например, в разделе 3.2.6. Количество растворимого антигена или APL или антигена или APL в виде частиц, подлежащего приведению в контакт с антигенпрезентирующими клетками или их предшественниками, можно определять эмпирически общепринятыми способами, известными специалистам в данной области. В некоторых преимущественных вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки инкубируют в присутствие аггреканового антигена по меньшей мере в течение приблизительно 2, 3, 5, б, 7, 8, 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 часов, или в течение менее приблизительно 96, 84, 72, 60, 48, 36, 24, 12, 8, 7, б, 5, 4, 3 или 2 часов или даже в течение менее приблизительно 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3 или 2 минут. Время и дозу полипептида или пептидов, необходимые для клеток, чтобы, необязательно, процессировать и презентировать аггрекановый антиген, можно определять с использованием способов вытеснения метки, при которых после воздействия аггреканового антигена следует период вымывания и обработка системой считывания, например, по способности вызывать супрессию или ингибирование ответа специфичных для аггреканового антигена эффекторных лимфоцитов. При определении оптимального времени и дозы, необходимых для клеток, чтобы экспрессировать аггрекановый антиген или его процессированную форму на своей поверхности, можно использовать способ получения клеток и аггреканового антигена для индуцирования толерогенных ответов. При этом специалистам в данной области будет понятно, что время, необходимое для антигенпрезентирующей клетки, чтобы презентировать антиген на своей поверхности, может варьироваться в зависимости от антигена или используемой формы антигена, его дозы и используемой антигенпрезентирующей клетки, а также условий, в которых нагруженный антиген подвергается захвату. Эти параметры могут определять специалисты в данной
области с использованием общепринятых способов.
В некоторых вариантах осуществления антигенпрезентирующие клетки инкубируют с антигеном или APL в течение от приблизительно 1 до б часов при 37°С, хотя также можно подвергать антигенпрезентирующие клетки воздействию антигена в течение инкубации с факторами роста и ингибитором. Как правило, в случае очищенных антигенов и пептидов для получения антиген-специфичных антигенпрезентирующих клеток подходит концентрация 0,1-10 мкг/мл. В иллюстративных примерах презентации пептида антигена можно достигать с использованием гораздо более короткой инкубации (например, приблизительно 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 минут) с использованием антигена в концентрации приблизительно 10-2 0 мкг/мл.
3.2.7.1 Источники антигенпрезентирующих клеток и их предшественников
Антигенпрезентирующие клетки или их предшественников можно выделять способами, известными специалистам в данной области. Источник таких клеток будет отличаться в зависимости от антигенпрезентирующей клетки, необходимой для модуляции специфического иммунного ответа. В этом контексте антигенпрезентирующую клетку можно выбирать из дендритных клеток, макрофагов, моноцитов и других клеток миелоидного ряда.
Как правило, предшественников антигенпрезентирующих клеток можно выделять из любой ткани, но легче всего выделять их из крови, пуповинной крови или костного мозга (Sorg et al. , 2001. Exp Hematol 29: 1289-1294; Zheng et al. , 2000. J Hematother Stem cell Res 9:453-4 64) . Также можно получать подходящих предшественников из пораженных тканей, таких как ревматоидная синовиальная ткань или жидкость после биопсии или откачивания жидкости из сустава (Thomas et al., 1994а, J Immunol 153:40164028; Thomas et al. , 1994b, Arthritis Rheum 37(4)). Другие примеры включают, в качестве неограничивающих примеров, печень, селезенку, сердце, почку, кишечник и миндалины (Lu et al. , 1994. J Exp Med 179:1823-1834; Mcllroy et al. , 2001. Blood 97:3470-3477; Vremec et al. , 2000. J Immunol 159:565-573; Hart and Fabre, 1981. J Exp Med 154 (2): 347-361; Hart and McKenzie,
1988. J Exp Med 168 (1): 157-170; Pavli et al. , 1990. Immunology 70(1) :40-47) .
Основной источник предшественников антигенпрезентирующих
клеток представляют лейкоциты, выделенные непосредственно из
ткани. Как правило, эти предшественники могут
дифференцироваться только в антигенпрезентирующие клетки при
культивировании в присутствие или отсутствие различных факторов
роста. Согласно практическому осуществлению настоящего
изобретения, антигенпрезентирующие клетки могут
дифференцироваться таким образом из сырых смесей или из частично или в значительной степени очищенных препаратов предшественников. Лейкоциты можно легко выделять из крови или костного мозга посредством центрифугирования в градиенте плотности с использованием, например, фиколл гипака, при котором удаляют нейтрофилы и эритроциты (мононуклеарные клетки периферической крови или РВМС), или посредством лизиса хлоридом аммония эритроцитов (лейкоцитов). Многие предшественники антигенпрезентирующих клеток присутствуют в периферической крови в виде непролиферирующих моноцитов, которые могут дифференцироваться в конкретные антигенпрезентирующие клетки, включая макрофагов и дендритные клетки, при культивировании в присутствие конкретных цитокинов.
Полученных из ткани предшественников, таких как предшественники тканевых дендритных клеток или клеток Лангерганса, как правило, получают, измельчая ткань (например, базальный слой эпидермиса) и обрабатывая ее коллагеназой или диспазой после разделения в градиенте плотности или выбирая из предшественников с учетом их экспрессии поверхностных клеточных маркеров. Например, предшественники клеток Лангерганса экспрессируют молекулы CD1, а также HLA-DR, и их можно выделять с учетом этого.
В некоторых вариантах осуществления предшественник антигенпрезентирующей клетки является предшественником макрофагов. Как правило, эти предшественники можно получать из моноцитов из любого источника, и они могут дифференцироваться в макрофаги при длительной инкубации в присутствие среды и
макрофагального колониестимулирующего фактора (М-КСФ) (Erickson-Miller et al. , 1990. Int J Cell Cloning 8:346-356; Metcalf and Burgess, 1982. J Cell Physiol 111:275-283).
В других вариантах осуществления предшественник
антигенпрезентирующей клетки является предшественником клеток
Лангерганса. Как правило, клетки Лангерганса можно получать из
моноцитов человека или CD34+ предшественников из костного мозга
в присутствие гранулоцитарно-макрофагального
колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), IL-4/TNFa и TGFp (Geissmann et al., 1998. J Exp Med 187:961-966; Strobl et al. , 1997a. Blood 90:1425-1434; Strobl et al., 1997b. dv Exp Med Biol 417: 161-165; Strobl et al. , 1996. J Immunol 157: 14991507).
В других вариантах осуществления предшественник антигенпрезентирующей клетки является предшественником дендритных клеток. Несколько потенциальных предшественников дендритных клеток можно получать из периферической крови, пуповинной крови или костного мозга. Они включают моноциты, CD34+ стволовые клетки, гранулоциты, CD33+CDllc+ предшественники DC и коммитированные миелоидные прогениторные клетки, описываемые ниже.
Моноциты:
Моноциты можно выделять посредством адгезии к пластику в течение 1-2 часов в присутствие среды для культивирования ткани
(например, RPMI) и сыворотки (например, человеческой или эмбриональной телячьей сыворотки) или в среде без сыворотки
(Anton et al., 1998. Scand J Immunol 47:116-121; Araki et al. , 2001. Br J Haematol 114:681-689; Mackensen et al., 2000. Int J Cancer 86:385-392; Nestle et al. , 1998. Nat Med 4:328-332; Romani et al. , 1996. J Immunol Meth 196:137-151; Thurner et al. , 1999. J Immunol Methods 223:1-15) . Моноциты также можно выделять из периферической крови (Garderet et al., 2001. J Hematother Stem Cell Res 10:553-567). Моноциты также можно выделять с помощью иммуноаффинных способов, включая иммуномагнитное разделение, проточно-цитометрический сортинг
или пэннинг (Araki et al., 2 001, выше; Battye and Shortman,
1991. Curr. Opin. Immunol. 3:238-241) с использованием антител
против CD14 для получения CD14hi клеток. Количество (и таким
образом, выход) циркулирующих моноцитов можно повышать с
использованием in vivo различных цитокинов, включая ГМ-КСФ
(Groopman et al. , 1987. N Engl J Med 317:593-598; Hill et al. ,
1995. J Leukoc Biol 58:634-642) . Моноциты могут
дифференцироваться в дендритные клетки при длительной инкубации
в присутствие ГМ-КСФ и IL-4 (Romani et al. , 1994. J Exp Med
180, 83-93; Romani et al. , 1996, выше) . С помощью комбинации
ГМ-КСФ и IL-4 в концентрации от приблизительно 200 до
приблизительно 2000 Ед/мл каждого, более предпочтительно, от
приблизительно 500 до приблизительно 1000 Ед/мл, и даже более
предпочтительно - от приблизительно 800 Ед/мл (ГМ-КСФ) и 1000
Ед/мл (IL-4) получают значительные количества незрелых
дендритных клеток, т.е. захватывающих антиген фагоцитирующих
дендритных клеток. Другие цитокины, стимулирующие
дифференцировку моноцитов в захватывающие антиген
фагоцитирующие дендритные клетки, включают, например, IL-13. СР34+ стволовые клетки:
Дендритные клетки также можно получать из CD34+ предшественников из костного мозга в присутствие ГМ-КСФ, TNF ± фактор стволовых клеток (SCF, c-kitL), или ГМ-КСФ, IL-4 ± flt3L
(Bai et al., 2002. Int J Oncol 20:247-53; Chen et al. , 2001. Clin Immunol 98:280-292; Loudovaris et al., 2001. J Hematother Stem Cell Res. 10:569-578) . CD34+ клетки можно получать из аспирата костного мозга или из крови и можно их обогащать, как моноциты, с использованием, например, иммуномагнитного разделения или иммунологических колонок (Davis et al., 1994. J Immunol Meth 175:247-257). Долю CD34+ клеток в крови можно повышать с использованием различных цитокинов in vivo, включая
(чаще всего) Г-КСФ, но также flt3L и прогенипоэтин (Fleming et al., 2001. Exp Hematol 29:943-951; Pulendran et al. , 2000. J Immunol 165:566-572; Robinson et al. , 2000. J Hematother Stem Cell Res. 9:71 1-720) .
Другие миелоидные предшественники:
DC можно получать из коммитированных ранних миелоидных предшественников аналогично CD34+ стволовым клеткам в присутствие ГМ-КСФ и IL-4/TNF. Такие миелоидные предшественники инфильтрируют многие ткани при воспалении, включая синовиальную жидкость при ревматоидном артрите (Santiago-Schwarz et al. , 2001. J Immunol. 167: 1758-1768). Экспансии всех миелоидных клеток организма, включая циркулирующие предшественники дендритных клеток и моноциты, можно достигать с использованием конкретных цитокинов, включая лиганд flt-З, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) или прогенипоэтин (pro-GP) (Fleming et al., 2 001, выше; Pulendran et al., 2 000, выше; Robinson et al., 2000, выше). Введение таких цитокинов человеку или другому млекопитающему в течение нескольких дней может позволить получать большее количество предшественников, получаемых из периферической крови или костного мозга, для манипуляции in vitro. Дендритные клетки также можно получать из предшественников нейтрофилов из периферической крови в
присутствие ГМ-КСФ, IL-4 и TNFa (Kelly et al. , 2001. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 47, 43-54; Oehler et al. , 1998. J Exp Med. 187:1019-1028) . Следует отметить, что дендритные клетки также можно получать с использованием аналогичных способов из клеток при остром миелолейкозе (Oehler et al., 2000. Алл Hematol. 79, 355-62).
Тканевые предшественники DC и другие источники предшественников АРС:
Существуют другие способы получения DC, например, из
тимусных предшественников в присутствие IL-3 ± ГМ-КСФ и
почечных предшественников DC в присутствие ГМ-КСФ и
коллагенового матрикса. Трансформированные или
иммортализированные дендритные клеточные линии можно получать с использованием онкогенов, таких как v-myc, например, как описывают в (Paglia et al., 1993, выше), или myb (Banyer and Hapel, 1999, выше; Gonda et al., 1993, выше).
Циркулирующие предшественники DC:
Их описывают в периферической крови человека и мыши. Можно
также использовать преимущество конкретных поверхностных
клеточных маркеров для идентификации подходящих
предшественников дендритных клеток. В частности, различные популяции предшественников дендритных клеток можно определять в крови с помощью экспрессии CDllc и отсутствия или низкой экспрессии CD14, CD19, CD56 и CD3 (O'Doherty et al. , 1994. Immunology 82, 487-493; O'Doherty et al. , 1993. J Exp Med 178:1067-1078). Эти клетки также можно идентифицировать с помощью поверхностных клеточных маркеров CD13 и CD33 (Thomas et al., 1993b. J Immunol 151(12):6840-6852). Вторая субпопуляция, у которой отсутствуют CD14, CD19, CD56 и CD3, известная как плазмацитоидные предшественники дендритных клеток, не экспрессирует CDllc, но экспрессирует CD123 (цепь IL-3R) и HLA-DR (Farkas et al. , 2001. Am J Pathol 159. 237-243; Grouard et al., 1997. J Exp Med 185:1101-1111; Rissoan et al. , 1999. Science 283: 1183-1186). Большинство циркулирующих CDllc+ предшественников дендритных клеток являются HLA-DR+, однако некоторые предшественники могут являться HLA-DR". Отсутствие экспрессии МНС класса II четко показано для предшественников дендритных клеток в периферической крови (del Hoyo et al., 2002. Nature 415: 1043-1047).
Необязательно, CD33+CD14~/lG или CD1 lc+HLA~DR+ линия маркер-
негативных предшественников дендритных клеток, описываемых
выше, может дифференцироваться в более зрелые
антигенпрезентирующие клетки при инкубации в течение 18-36
часов в среде для культивирования или в моноцит-
кондиционированной среде (Thomas et al., 1993, выше; Thomas and
Lipsky, 1994. J Immunol 153:4 016-4 02 8) (O'Doherty et al., 1993,
выше) . Альтернативно, после инкубации не-Т-клеток
периферической крови или неочищенных РВМС зрелые дендритные клетки периферической крови отличаются низкой плотностью, и, таким образом, их можно выделять с использованием градиента плотности, включая метризамид и Nycodenz (Freudenthal and Steinman, 1990. Proc Natl Acad Sci USA 87:7 698-77 02; Vremec and Shortman, 1997. J Immunol 159:565-573), или с помощью специфичных моноклональных антител, таких как, в качестве
неограничивающих примеров, mAb CMRF-44 (Fearnley et al. , 1999. Blood 93:728-736; Vuckovic et al., 1998. Exp Hematol 26: 125512 64) . Плазмацитоидные дендритные клетки можно выделять напрямую из периферической крови с учетом поверхностных клеточных маркеров, а затем инкубировать в присутствии IL-3 (Grouard et al., 1997, выше; Rissoan et al. , 1999, выше) . Альтернативно, плазмацитоидные DC можно выделять с помощью градиента плотности или разделения с помощью CMRF-44 инкубируемых клеток периферической крови, как указано выше.
В основном, в случае дендритных клеток, полученных из любого предшественника, при инкубации в присутствие факторов активации, таких как моноцитарные цитокины, липополисахарид и ДНК, содержащая CpG-повторы, цитокины, такие как TNFa, IL-б, IFNa, IL-lp, некротические клетки, повторная адгезия, целые бактерии, компоненты мембраны, РНК или polylC, незрелые дендритные клетки станут активированными (Clark, 2002. J Leukoc Biol 71:388-400; Hacker et al. , 2002. Immunology 105:245-251; Kaisho and Akira, 2002. Biochim Biophys Acta 1589: 1-13; Koski et al. , 2001. Crit Rev Immunol 21: 179-189) . Этот процесс активации дендритных клеток ингибируется в присутствие ингибиторов NF-кВ (О'Sullivan and Thomas, 2002. J Immunol 168:5491-5498).
3.2.8 Варианты осуществления антигенпрезентирующих клеток in vivo
В других вариантах осуществления количество аггрекан-специфичных толерогенных антигенпрезентирующих клеток у индивидуума повышают посредством совместного введения индивидууму ингибитора NF-кВ, И/ИЛИ ингибитора mTOR, и/или ингибитора Syk (иногда в совокупности обозначаемых в настоящем описании как "ингибиторы") совместно с аггрекановым антигеном, соответствующим полностью или частично полипептиду аггрекану, включая его цитруллинированные формы. Ингибиторы и/или антиген могут находиться в форме нуклеиновой кислоты (т.е. в которой они продуцируются с конструкции нуклеиновой кислоты) или не в форме нуклеиновой кислоты. Ингибиторы и антиген можно совместно
вводить в растворимой форме или форме частиц (например, антиген и ингибитор находятся в растворимой форме, или один из антигена или ингибитора находится в растворимой форме, а другой находится в форме частиц, или антиген и ингибитор находятся в форме частиц). В конкретных вариантах осуществления, и ингибиторы, и антиген вводят совместно в форме частиц. Желательно, ингибиторы и антиген содержаться в одной частице. При введении частицы захватываются антигенпрезентирующими клетками индивидуума (например, посредством фагоцитоза или эндоцитоза) и нагрузка ингибиторами/антигеном высвобождается внутри клетки.
3.2.9 Варианты осуществления регуляторных лимфоцитов ех
vivo
Аггрекан-специфичные антигенпрезентирующие клетки,
получаемые ex vivo согласно разделу 3.2.7, применимы для модуляции других иммунных клеток, включая Т-лимфоциты и В-лимфоциты, и, в частности, для получения Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, проявляющих толерантность или анергию в отношении аггреканового антигена (включая его цитруллинированные формы). Эффективность индуцирования лимфоцитов, в частности, Т-лимфоцитов, для проявления толерантности/анергии в отношении аггреканового антигена можно определять с помощью анализа иммунных ответов на этот антиген, включая, в качестве неограничивающих примеров, анализ цитолитической активности Т-лимфоцитов in vitro с использованием, например, аггрекан-специфичных антигенпрезентирующих клеток в качестве мишеней аггрекан-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL); анализ пролиферации аггрекан-специфичных Т-лимфоцитов и цитокинового ответа и анализ Т-регуляторной супрессорной функции (см., например, Vollenweider and Groseurth, 1992, J. Immunol. Meth. 149: 133-135), измерение В-клеточного ответа на антиген с использованием, например, анализов ELISPOT и ELISA; исследование цитокиновых профилей; или измерение ответов гиперчувствительности замедленного типа (DTH) с помощью теста реактивности кожи на аггрекановый антиген (см., например, Chang et al. (1993, Cancer Res. 53: 1043-1050) . Другие способы,
известные специалистам в данной области, с помощью которых можно определять наличие антигена на поверхности антигенпрезентирующих клеток после подвергания воздействию антигена, также включены в настоящее изобретение.
Вызывающие толерантность/анергию антигенпрезентирующие клетки обладают способностью эффективно презентировать аггрекановый антиген или его процессированную форму на одной из молекул МНС класса I и молекул МНС класса II или обеих. Таким образом, и CD4+ Т-хелперные лимфоциты, и CTL можно делать толерантными/энергичными с помощью agg-tolAPC по изобретению. Кроме того, agg-tolAPC по настоящему изобретению можно нагружать многочисленными аггрекановыми антигенами на множестве МНС для получения поликлональных или олигоклональных толерантных/энергичных Т-лимфоцитов.
Таким образом, настоящее изобретение также относится к аггрекан-специфичным толерантным/энергичным или регуляторным Вили Т-лимфоцитам, в частности, Т-лимфоцитам, которые не смогут отвечать антиген-специфичным образом на презентирование аггреканового антигена или активно регулировать первичные иммунные ответы или последующее примирование аггрекановым антигеном. Регуляция, как правило, является длительной и сохраняется, например, в течение по меньшей мере приблизительно 3 месяцев и, соответственно, лет.
В конкретных вариантах осуществления аггрекан-специфичные
регуляторные Т-лимфоциты получают, приводя аггрекан-специфичную
антигенпрезентирующую клетку, как определено выше, в контакт с
популяцией Т-лимфоцитов, которые можно получать из любого
подходящего источника, такого как селезенка или
миндалины/лимфоузлы, но, предпочтительно, их получают из периферической крови. Т-лимфоциты можно использовать в качестве неочищенных препаратов или в качестве частично очищенных или в значительной степени очищенных препаратов, соответствующим образом получаемых с использованием стандартных способов, например, как описывают в "Immunochemical Techniques, Part G: Separation and Characterization of Lymphoid Cells" (Meth. in Enzymol. 108, Edited by Di Sabato et al. , 1984, Academic
Press). Они включают розеткообразование с эритроцитами овцы,
пассирование на колонке с нейлоновой ватой или адгезию к
пластику для удаления адгезирующих клеток, иммуномагнитное или
проточно-цитометрическое разделение с использованием
соответствующих моноклональных антител, как описывают в (Cavanagh et al. , 1998. Blood 92(5) 1598-1607; Thomas et al. , 1993. J Immunol 150, 821-834) .
Препарат Т-лимфоцитов приводят в контакт с аггрекан-специфичными антигенпрезентирующими клетками, описываемыми, например, в разделе 3.2.7, в течение периода времени, достаточного для индуцирования регуляторной функции Т-лимфоцитов в отношении антигена или антигенов, презентируемых этими антигенпрезентирующими клетками. Этот период, как правило, будет составлять по меньшей мере приблизительно 1 день и приблизительно до 5 дней. Как правило, пролиферация регуляторных Т-лимфоцитов, получаемых после этой процедуры, является кратковременной, зависящей от концентрации IL-2 в культуре. Получаемые таким способом регуляторные лимфоциты, как правило, будут продуцировать IL-10 и/или другие регуляторные цитокины антиген-специфичным образом.
В некоторых вариантах осуществления популяцию
предшественников аггрекан-специфичных антигенпрезентирующих
клеток культивируют в присутствие гетерогенной популяции Т-
лимфоцитов, соответствующим образом получаемых из
периферической крови, и по меньшей мере одного ингибитора, описываемого, например, в разделах 3.2.3, 3.2.4 и 3.2.5, совместно с аггрекановым антигеном или полинуклеотидом, с которого экспрессируется аггрекановый антиген. Эти клетки культивируют в течение периода времени и в условиях, достаточных для: (1) дифференцировки предшественников в антигенпрезентирующие клетки; (2) обнуления или иного снижения уровня и/или функциональной активности NF-кВ, И/ИЛИ mTOR, и/или Syk в этих антигенпрезентирующих клетках; (3) презентирования аггреканового антигена или его процессированной формы антигенпрезентирующими клетками; и (4) индуцирования антигенпрезентирующими клетками субпопуляции Т-лимфоцитов,
проявляющих регуляторную функцию в отношении аггреканового антигена, где субпопуляция отличается супрессией аггрекан-специфичного Т-клеточного ответа. Этого можно достигать с использованием очищенных с помощью фиколла РВМС с аггрекановым антигеном и ингибитором (например, ингибиторами NF-кВ, И/ИЛИ mTOR, и/или Syk), т.к. такой препарат содержит и предшественников антигенпрезентирующих клеток (например, предшественников дендритных клеток), и Т-лимфоциты.
Соответственно, получаемые таким способом аггрекан-специфичные антигенпрезентирующие клетки индуцируют один или несколько типов антиген-специфичных регуляторных лимфоцитов, в частности, регуляторные Т-лимфоциты (также обозначаемые в настоящем описании как "Treg"). Описано несколько популяций или субпопуляций Treg (Shevach, 2006. Immunity 25: 195-201; Lee et al. 2011, Adv Immunol. 112:25-71; Sakaguchi, 2011. Methods Mol Biol. 707:3-17), включая, например, существующую в природе отдельную популяцию CD4+CD25+Foxp3+ Treg, известную как природные Treg (nTreg), развивающиеся в тимусе и присутствующие у здоровых индивидуумов с момента рождения. Специфичность Т-клеточного рецептора (TCR) nTreg, в основном, является аутореактивной. Дополнительно, популяцию CD4+CD25+Foxp3+ Treg можно индуцировать in vivo в периферической крови в различных условиях, таких как конкретные определенные условия презентации антигена и стимуляции цитокинами, и можно индуцировать толерантность (обзор в Roncarolo et al., 2007. Nat Rev Immunol. 7: 58 5-598). Сообщают о дополнительных субпопуляциях индуцибельных Treg, включая Тй3-клетки и Trl-клетки, и CD4+CD25+ Treg. Тй3-клетки продуцируют TGFp и различные количества IL-4 и IL-10 (Chen et al. , 1994. Science 265(5176): 1237-1240). Trl-клетки секретируют IL-10 (Groux et al., 1997. Nature 389(6652): 737-742). Также сообщают о CD8+ Treg, экспрессирующих низкие уровни Foxp3 (см., например, Smith et al., 2008. Trends Immunol. 29(7) :337-342; Guillonneau et al. , 2010. Curr Opin Organ Transplant 15:751-756; Filaci et al. , 2011. Autoimmunity 44(1):51-57; Picarda et al., 2011. Immunotherapy 3(4 Suppl): 35-37).
В данной области известно множество способов выделения и экспансирования Treg, и они включают, например, описываемые в Brusko et al. (2008. Immunological Reviews 223:371-390), Gregori et al. (2011. Methods Mol Biol.677:31-46) , Gregori et al. (2007. Methods Mol Biol. 380:83-105), Menoret et al., 2011. Methods Mol Biol. 677: 63-83), Wang, L. (2010. Methods Mol Biol. 595:403-412) and Daniel et al. (2011. Methods Mol Biol. 707:173-185).
Таким образом, настоящее изобретение относится к способам получения больших количеств антиген-специфичных лимфоцитов посредством стимуляции лимфоцитов с использованием аггрекан-специфичных антигенпрезентирующих клеток по изобретению например, в течение по меньшей мере приблизительно 3 дней, соответственно, по меньшей мере, приблизительно 5 дней.
Аггрекан-специфичной толерантности также можно достигать посредством экспрессии в В-лимфоцитах (также обозначаемых в настоящем описании как В-клетки) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей аггрекановый антиген, где экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к презентированию антигена или его процессированной формы на поверхности В-лимфоцитов.
В конкретных вариантах осуществления молекула нуклеиновой
кислоты дополнительно кодирует иммуноглобулин (например, IgG)
или фрагмент иммуноглобулина (например, фрагменты
иммуноглобулина Fv, Fab, Fab' и F(ab')2, тяжелую цепь иммуноглобулина и т.д.), подвергнутые прямому или опосредованному слиянию с аггрекановым антигеном (например, смежные с С-концом антигена). В иллюстративных примерах этого типа иммуноглобулины (например, IgG) используют в качестве носителей для презентирования аггреканового антигена иммунной системе, где аггрекановый антиген подвергнут слиянию с N-концом каркаса тяжелой цепи иммуноглобулина для образования слитого белка. Слитый белок продуцируется в "активированных" В-клетках посредством трансдукции (например, посредством инфицирования ретровирусом) гематопоэтических клеток (например, клеток, полученных из костного мозга) или лимфоидных клеток (например, В-клеток, включая бластные В-клетки, стимулированные
липополисахаридом) с использованием молекулы нуклеиновой кислоты, с которой продуцируется слитый белок, чтобы, таким образом, получать толерогенные АРС. Аггрекановый антиген или его процессированная форма презентируется главным комплексом гистосовместимости (МНС) хозяина на этих В-клетках, что приводит к толерантности благодаря презентированию и длительной экспрессии in vivo иммуноглобулиновых (например, IgG) слитых белков. Соответственно, эти В-клетки экспрессируют МНС класса II и костимуляторные молекулы (например, В7.1 и В7.2), способствующие рекрутированию и активации регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD25, посредством связывания с CTLA-4. Иммуноглобулиновые слитые белки этого типа описывают, например, в публикации патентной заявки США № 2002/0048562, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
В иллюстративных примерах этого типа антиген-специфичную толерантность индуцируют с использованием слитого белка антиген-Ig, доставляемого с помощью ретровирусного вектора в В-клетки, как описывают, например, в (Zambidis et al., 1996. Proc Natl Acad Sci USA 93 (10): 5019-5024; Rang et al. , 1999. Proc Natl Acad Sci USA 96 (15): 8 609-8 614; Agarwal et al. , 2000. Clin Invest 106 (2) :245-252; El-Amine et al., 2002. Int Immunol 14 (7) :761-766; Melo et al. , 2002. J Immunol 168(9) :4788-4795; Song et al., 2004. Селе Ther 11 (20) : 1487-1496; Lei et al. , 2005. Blood 105 (12) :4865-4870; Xu et al., 2006. Mol Ther 13(l):42-48; Satpute et al. , 2007. Arthritis Rheum 56(5):1490-1496; Scott, 2010. Haemophilia 16 (102) :89-94) .
Этот подход В-клеточно-опосредованной генотерапии успешно используют в моделях заболеваний, таких как экспериментальный аутоиммунный увеит (EAU) (Agarwal et al. , 2000, выше), ЕАЕ [индуцированный основным белком миелина (МВР) или миелин-олигодендроцитарным гликопротеином (MOG) ] (Melo et al. , 2002, выше), и модели диабета на не страдающих ожирением мышах с диабетом (NOD) (Melo et al. , 2002, выше; Song et al. , 2004, выше). Этот подход также успешно используют в индуцировании толерантности в отношении ингибиторов фактора VIII при
гемофилии A (Lei et al., 2005, выше) и (в комбинации с трансплантацией костного мозга (ВМ) ) в лечении ЕАЕ (Xu et al. , 2006, выше). В-клеточно-опосредованную генотерапию также успешно используют в модели индуцированного адъювантами артрита (АА) (Satpute et al., 2007, выше).
Слитый белок также можно доставлять любыми подходящими способами, включая введение нуждающемуся в этом индивидууму молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется слитый белок. В конкретных вариантах осуществления индивидууму вводят гемопоэтические или лимфоидные клетки, трансдуцированные с использованием молекулы нуклеиновой кислоты.
В некоторых вариантах осуществления В-лимфоциты, экспрессирующие кодирующую аггрекановый антиген молекулу нуклеиновой кислоты, являются регуляторными В-лимфоцитами (также обозначаемыми в настоящем описании как клетки "Breg"), включая, в качестве неограничивающих примеров, субпопуляцию CDldhighCD5+ В-клеток, регулирующую опосредованные Т-клетками воспалительные и иммунные ответы посредством секреции IL-10, как описывает, например, Tedder в публикации патентной заявки США № 2011/013566, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
3.2.10 Варианты осуществления комплекса МНС-пептид
Настоящее изобретение также включает применение комплексов главный комплекс гистосовместимости (МНС)-пептид для индуцирования аггрекан-специфичного толерогенеза. Эти комплексы, как правило, содержат пептид аггрекан (например, пептид cit-аггрекан) и выделенный (например, растворимый) компонент МНС, содержащий антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком. Комплексы МНС-пептид эффективно заменяют антигенпрезентирующую клетку и вызывают неотвечаемость в аутореактивных антиген-специфичных Т-лимфоцитах и других клетках иммунной системы. Компонент МНС может являться молекулой класса I или класса II. При желании, также можно включать трансмембранные и/или внутриклеточные домены молекул МНС. Связь между антигенным пептидом и антигенсвязывающими участками белка МНС может являться
ковалентной или нековалентной связью.
Молекулы МНС можно выделять с использованием любого
подходящего способа, иллюстративные примеры которого включают
солюбилизацию клеток (например, лимфоцитов) с помощью обработки
папаином, обработки ЗМ КС1 или обработки детергентом. В
иллюстративном примере используют экстракцию молекул МНС
(например, класса II) детергентом из лимфоцитов с последующей
аффинной очисткой. Затем детергент можно удалять с помощью
диализа или избирательно связывающих частиц, например, Bio
Beads. Альтернативно, известна аминокислотная
последовательность каждой из ряда молекул МНС класса I и II, и соответствующие им кодирующие последовательности клонированы, что, таким образом, делает возможным рекомбинантную продукцию белков МНС.
Аггрекановый антиген, как правило, является пептидом
(например, от приблизительно 8 до приблизительно 15 аминокислот
в длину), прогнозируемым для молекулы МНС с использованием
стандартных алгоритмов, известных в данной области.
Альтернативно, можно использовать пептиды (например, от
приблизительно 8 до приблизительно 15 аминокислот в длину),
соответствующие перекрывающимся частям аминокислотной
последовательности аггрекана. Пептиды могут быть
нецитруллинированными или цитруллинированными.
Элементы комплекса можно связывать стандартными способами, известными в данной области. Антигенные пептиды можно связывать нековалентно с частью кармана белка МНС, например, смешивая два компонента. Их также можно ковалентно связывать с использованием стандартных способов, например, фотоаффинного мечения, (см. например, Hall et al. , 1985. Biochemistry 24:5702-5711) .
Комплексы, содержащие молекулы МНС, содержащие трансмембранную часть, удобно вводить после встраивания в липидные монослои или бислои. Как правило, для этих целей используют липосомы, но можно использовать любую форму липидной мембраны, такую как плоские липидные мембраны или клеточная мембрана (например, эритроцита). Также удобно встраивать
комплексы в мицеллы.
Липосомы можно получать стандартными способами, описываемыми, например, в разделе 3.2.6.2. Однако если удаляют трансмембранную область, комплекс можно вводить способом, общепринято используемым для пептид-содержащих фармацевтических средств.
Мицеллы являются общеупотребительными в данной области для повышения растворимости молекул, содержащих неполярные области, и их, преимущественно, можно использовать для встраивания комплексов МНС-пептид с использованием способов, хорошо известных в этой области (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985), таким образом, включенную в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме). Как правило, мицеллы, содержащие комплексы, получают с использованием стандартных поверхностно-активных веществ или детергентов.
Примеры способов получения комплексов МНС-пептид описывают, например, в публикации патентной заявки США № 2003/0068363, таким образом, включенной в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
3.2.11 Химерные конструкции на основе системы, презентирукщей лиганд эпитопа антигена
Настоящее изобретение также включает применение технологии системы, презентирующей лиганд эпитопа антигена, (L.E.A.P.S.) для индуцирования аггрекан-специфичного толерогенеза. С помощью этой технологии небольшой пептид, содержащий аутоантиген, преобразуют в толероген посредством его прикрепления к иммунологическому или связывающемуся с Т-клетками лиганду (I/TCBL) и презентирования его на иммунной клетке (Cihakova et al. , 2008. Int Immunopharmacol 8:624; Rosenthal et al. , 1998. Vaccine 17:535-542; Goel et al., 2003. Vaccine 21:4410; Goel et al. , 2005. Front Biosci 966; Zimmerman et al. , 1996. Vac Res 5:91-102; Zimmerman et al. , 1996. Vac Res 5:103-13; Zimmerman et al., 1985. DNA. Med Virol 15:215-22. Charoenvit et al. , 2004. Antimicrob Agents Chemother 48:2455; Charoenvit et al. , 2004. Vaccine 10:2368; and Zimmerman et al. , 2001. Vaccine
19(32):4750-4759). Как правило, I/TCBL получают из молекул иммунной системы, о которых известно, что они связываются Т-клетками, или предполагают это, примеры которых включают части МНС класса I и II или акцессорные молекулы, такие как J3 2 - микроглобулин, части LFA-3, части Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулинов и молекулы 1а+. В конкретных вариантах осуществления в качестве I/TCBL используют (32-микроглобулин (J) и связывают его с интересующим аутоантигеном. Слитые конструкции этого типа успешно используют для прекращения прогрессирования заболевания в модели коллаген-индуцированного артрита, как описывают, например, Zimmerman et al. (2010, Int Immunopharmacol 10:412-421), с повышением IL-12p70 и IL-10, a также снижением IL-17 и TNFa в сыворотке исследуемых животных.
Примеры способов получения конструкций L.E.A.P.S. описывают, например, в патенте США № 5652342 и патентной заявке США № 2011/0098444, таким образом, включенных в качестве ссылок в настоящее описание в полном объеме.
3.3 Клеточная терапия или профилактика
Аггрекан-специфичные антигенпрезентирующие клетки,
описываемые, например, в разделе 3.2.7, или аггрекан-специфичные регуляторные Т- или В-лимфоциты или толерогенные В-лимфоциты, описываемые, например, в разделе 3.2.9, можно вводить пациенту в отдельности или в комбинации для супрессии иммунного ответа на аггрекановый антиген, включая его цитруллинированные формы. Эти композиции на основе клеток применимы для лечения или профилактики повреждения сустава у больных или предрасположенных к этому индивидуумов, включая индивидуумов с ранним RA и индивидуумов с риском развития RA, соответственно, до прогрессирования заболевания в хроническую и инвалидизирующую форму RA. Клетки по изобретению можно вводить пациенту любыми способами (например, посредством инъекции), с помощью которых достигают антиген-специфичного толерогенного ответа на аггрекановый антиген. Клетки можно получать от пациента (т.е. аутологичный клетки) или от индивидуума или индивидуумов, совпадающих или несовпадающих по МНС с пациентом
(т.е. аллогенные). Как правило, аутологичный клетки инъецируют
обратно пациенту, от которого клетки получали. Инъекция может
являться подкожной, интраперитонеальной, внутримышечной,
внутрикожной, внутривенной или внутрилимфоидной. Клетки можно
вводить пациенту, уже страдающему повреждением сустава (включая
индивидуумов с ранним RA и индивидуумов с риском развития RA)
или предрасположенному к повреждению сустава, в количестве,
достаточном для достижения клинического улучшения у индивидуума
или для профилактики повреждения сустава или симптомов
повреждения сустава у индивидуума с риском развития повреждения
сустава (включая индивидуумов с риском развития RA) . Количество
клеток, инъецируемых нуждающемуся в лечении или профилактике
пациенту, помимо прочего, может варьироваться в зависимости от
аггреканового антигена или антигенов и массы индивидуума. Это
количество может находиться в диапазоне, например,
приблизительно от 103 до 1011, и, как правило, приблизительно от
105 до 107 клеток (например, в форме крови, РМВС или очищенных
дендритных клеток, Т-лимфоцитов, гемопоэтических или лимфоидных
клеток, В-лимфоцитов и т.д.). Можно осуществлять однократное
или многократное введение (2, 3, 4 или 5) клеток, при этом
количества клеток и режим выбирает лечащий врач. Клетки
необходимо вводить в фармацевтически приемлемом носителе,
нетоксичном для клеток и индивидуума. Такой носитель может
являться средой для выращивания, в котором клетки выращивали,
или любой подходящей буферной средой, такой как фосфатно-
солевой буфер. Клетки можно вводить в отдельности или в
качестве вспомогательной терапии в комбинации с другими
терапевтическими средствами, известными в этой области, для
лечения или профилактики нежелательных иммунных ответов,
например, в качестве неограничивающих примеров,
глюкокортикоидами, метотрексатом, D-пеницилламином,
гидроксихлорхиноном, солями золота, сульфасалазином,
ингибиторами TNFa или IL-1 и/или другими формами специфической иммунотерапии.
3.4 Фармацевтические композиции
По настоящему изобретению аггрекановые антигены, описываемые, например, в разделе 3.2.1, аггрекановый APL, описываемый, например, в разделе 3.2.2, ингибиторы NF-KB, описываемые, например, в разделе 3.2.3, ингибиторы mTOR описываемые, например, в разделе 3.2.4, ингибиторы Syk, описываемые, например, в разделе 3.2.5, иммуномодулирующие частицы, описываемые, например, в разделе 3.2.6, антигенпрезентирующие клетки, описываемые, например, в разделе 3.2.7, регуляторные Т- или В-лимфоциты или толерогенные В-лимфоциты, описываемые, например, в разделе 3.2.9, комплексы МНС-пептид, описываемые, например, в разделе 3.2.10, и химерные конструкции, описываемые, например, в разделе 3.2.11 (также в совокупности обозначаемые в настоящем описании как "иммуномодуляторы") , применимы в композициях и способах супрессии иммунного ответа на аггрекановый антиген, включая его цитруллинированные формы, и, в частности, применимы для лечения или профилактики повреждения сустава у больных или предрасположенных индивидуумов, включая индивидуумов с ранним RA и индивидуумов с риском развития RA.
Содержащие иммуномодуляторы композиции по настоящему
изобретению, как правило, находятся в форме фармацевтических
композиций, которые могут содержать фармацевтически приемлемый
носитель или разбавитель. В зависимости от конкретных
состояний, подвергаемых лечению, иммуномодулятор можно
составлять и вводить системно или местно. Способы составления и
введения можно найти в последнем издании "Remington's
Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa.
Подходящие способы могут включать, например, пероральное,
ректальное, черезслизистое или внутрикишечное введение;
парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные,
интрамедуллярные инъекции, а также интратрахеальное, прямое
внутрижелудочковое, внутривенное, интраперитонеальное,
интраназальное или интраокулярное введение. В случае инъекции иммуномодуляторы по изобретению можно составлять в водных растворах, предпочтительно, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или
физиологический буферный раствор. В случае черезслизистого введения в составе используют пенетранты, подходящие для преодолеваемого барьера. Такие пенетранты, как правило, известны в данной области. Внутримышечная и подкожная инъекция подходит, например, для введения иммуногенных композиций, вакцин и ДНК-вакцин.
Иммуномодуляторы можно легко составлять с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в дозах, подходящих для перорального введения. Такие носители делают возможным составление соединений по изобретению в лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, жидкости, гели, сиропы, суспензии и т.п., для перорального введения подвергаемому лечению пациенту. Эти носители можно выбирать из Сахаров, крахмалов, целлюлозы и ее производных, мальтозы, желатина, талька, сульфата кальция, растительных масел, синтетических масел, полиспиртов, альгиновой кислоты, растворов с фосфатным буфером, эмульгаторов, изотонического физиологического раствора и несодержащей пирогены воды.
Фармацевтические составы для парентерального введения
включают водные растворы активных соединений в водорастворимой
форме. Дополнительно, в случае необходимости масляных суспензий
для инъекций можно получать суспензии активных соединений.
Подходящие липофильные растворители или наполнители включают
жирные масла, такие как сезамовое масло, или синтетические
сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или
триглицериды, или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут
содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как
натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран.
Необязательно, суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства, повышающие растворимость соединений, что делает возможным получение сильно концентрированных растворов.
Фармацевтические препараты для перорального применения можно получать, комбинируя активные соединения с твердым эксципиентом, необязательно, измельчая полученную смесь и измельчая смесь гранул после добавления подходящих
вспомогательных средств, при желании, для получения сердцевин
таблеток или драже. Подходящими эксципиентами, в частности,
являются наполнители, такие как сахара, включая лактозу,
сахарозу, маннит или сорбит; препараты целлюлозы такие как,
например, кукурузный крахмал, пшеничный крахмал, рисовый
крахмал, картофельный крахмал, желатин, трагакантовая камедь,
метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, натрий-
карбоксиметилцеллюлоза, или поливинилпирролидон (PVP). При желании, можно добавлять средства для улучшения распадаемости, такие как поперечно-сшитый поливинилпирролидон, агар или альгиновая кислота или ее соли, такие как альгинат натрия. Такие композиции можно получать любыми фармацевтическими способами, но все способы включают стадию связывания одного или нескольких иммуномодуляторов, описываемых выше, с носителем, представляющих собой один или несколько необходимых ингредиентов. В основном, фармацевтические композиции по настоящему изобретению можно производить известным способом, например, посредством общепринятого смешивания, растворения, гранулирования, получения драже, растирания в порошок, эмульсификации, инкапсулирования, включения или лиофилизации.
Сердцевины драже покрывают подходящими покрытиями. Для
этой цели можно использовать концентрированные растворы
Сахаров, которые, необязательно, могут содержать гуммиарабик,
тальк, поливинилпирролидон, карбополовый гель,
полиэтиленгликоль или диоксид титана, лаковые растворы и подходящие органические растворители или смеси растворителей. В покрытия таблеток или драже можно добавлять красители или пигменты для идентификации или определения свойств различных комбинаций доз активных соединений.
Фармацевтические средства, которые можно использовать перорально, включают твердые капсулы, полученные из желатина, а также мягкие, герметичные капсулы, полученные из желатина и пластификатора, такого как глицерин или сорбит. Твердые капсулы могут содержать активные ингредиенты в смеси с наполнителем, таким как лактоза, связывающие средства, такие как крахмалы, или смазочные средства, такие как тальк или стеарат магния, и,
необязательно, стабилизаторы. В случае мягких капсул активные соединения можно растворять или суспендировать в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, парафиновое масло или жидкие полиэтиленгликоли. Кроме того, можно добавлять стабилизаторы.
Лекарственные формы лекарственных средств по изобретению также могут включать инъецируемые или имплантируемые устройства с контролируемым высвобождением, сконструированные специально для этой цели, или другие формы имплантатов, дополнительно модифицированные для этой цели. Можно достигать контролируемого высвобождения иммуномодулятора по изобретению посредством его покрывания, например, гидрофобными полимерами, включая акриловые смолы, воски, высшие алифатические спирты, полимолочную и полигликолевую кислоты и конкретные производные целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза. Кроме того, можно достигать контролируемого высвобождения с использованием других полимерных матриц, липосом или микросфер.
Иммуномодуляторы по настоящему изобретению также можно вводить в дыхательные пути в виде аэрозоля для назальной или легочной ингаляции, или раствора для небулайзера, или в виде микродисперсного порошка для инсуффляции, в отдельности или в комбинации с инертным носителем, таким как лактоза, или с другими фармацевтически приемлемыми эксципиентами. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения частицы состава, предпочтительно, могут иметь диаметр менее 50 мкм, предпочтительно, менее 10 мкм.
В некоторых конкретных вариантах осуществления вводят иммуномодуляторы для активного захвата АРС, например, посредством фагоцитоза, описываемые, например, в патенте США № 5783567 (Pangaea). Фагоцитоз этими клетками можно улучшать, поддерживая размер частиц, как правило, менее приблизительно 2 0 мкм, и предпочтительно, менее приблизительно 11 мкм.
В конкретных вариантах осуществления иммуномодуляторы в форме частиц доставляют непосредственно в кровоток (т.е. посредством внутривенной или внутриартериальной инъекции или вливания), если желателен захват фагоцитирующими клетками ретикулоэндотелиальной системы (RES), включая клетки печени и
селезенки. Альтернативно, с помощью подкожной инъекции можно достигать захвата фагоцитирующими АРС дренирующих лимфоузлов. Частицы также можно вводить внутрикожно (т.е. в АРС кожи, такие как дендритные клетки и клетки Лангерганса), например, с использованием баллистической доставки или доставки с помощью микроигл. Иллюстративные способы доставки, опосредуемые частицами, включают импульсную, электрическую или газоразрядную доставку доставляемых частиц носителя в клетки-мишени, описываемую, например, в патентах США №№ 4945050, 5120657, 5149655 и 5630796. Неограничивающие примеры доставки с помощью микроигл описывают в международных патентных публикациях №№ WO 2005/069736 и WO 2005/072630 и патентах США №№ 6503231 и 5457041.
В других конкретных вариантах осуществления путем доставки частиц является доставка через желудочно-кишечный тракт, например, перорально. Альтернативно, частицы можно вводить в органы, такие как легкое (например, посредством ингаляции порошка микрочастиц или распыляемого или аэрозольного раствора, содержащего микрочастицы) , где частицы захватываются альвеолярными макрофагами, или их можно вводить интраназально или буккально. При фагоцитозе частиц фагоцитирующими АРС ингибитор NF-кВ И, необязательно, аггрекановый антиген высвобождаются внутри клетки.
Подходящие пути для доставки частиц включают, например, пероральное, ректальное, черезкожное или внутрикишечное введение; парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные, интрамедуллярные инъекции, а также интратрахеальное, прямое внутрижелудочковое, внутривенное, интраперитонеальное, интраназальное или интраокулярное введение. В случае инъекции частицы можно составлять в водных растворах, соответственно, в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенкса, раствор Рингера или физиологический буферный раствор. В случае черезкожного введения в составе используют пенетранты, подходящие для преодолеваемого барьера. Такие пенетранты, как правило, известны в данной области.
Фармацевтические составы для парентерального введения
частиц включают водные растворы частиц в водорастворимой форме. Дополнительно, в случае необходимости инъекции масляных суспензий можно получать суспензии частиц. Подходящие липофильные растворители или наполнители включают жирные масла, такие как сезамовое масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат или триглицериды. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, повышающие вязкость суспензии, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно, суспензия также может содержать подходящие стабилизаторы или средства, повышающие растворимость соединений, что позволяет получать сильно концентрированные растворы.
Примеры способов доставки частиц ингибитора (например, ингибитора NF-кВ) И антигена описывают, например, в публикации патентной заявки США № 20100151000.
Иммуномодуляторы по изобретению (например, ингибиторы, антиген, АРС, лимфоциты, слитые белки, частицы и т.д.) можно предоставлять в виде солей с фармацевтически совместимыми противоионами. Фармацевтически приемлемые соли можно получать из многих кислот, включая, в качестве неограничивающих примеров, соляную, серную, уксусную, молочную, винную, яблочную, янтарную и т.д. Соли имеют тенденцию быть более растворимыми в водных или других протонных растворителях, что соответствует формам свободных оснований.
Фармацевтические композиции, подходящие для использования в настоящем изобретении, включают композиции, где иммуномодуляторы содержатся в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. Доза иммуномодулятора, вводимого пациенту, должна быть достаточной для достижения клинического улучшения у индивидуума или профилактики повреждения сустава или симптомов повреждения сустава у индивидуума с риском развития повреждения сустава (включая индивидуумов с риском развития RA). Количество или частота введения иммуномодуляторов, подлежащих введению, может зависеть от индивидуума, подлежащего лечению, включая способ введения, возраст, пол, массу тела и общее состояние здоровья. В связи с
этим, точные количества иммуномодуляторов для введения будут зависеть от решения специалиста. При определении эффективного количества иммуномодуляторов, подлежащих введению при лечении или профилактике повреждения сустава, специалист может оценивать воспаление, уровни провоспалительных цитокинов, пролиферацию лимфоцитов, активность цитотоксических Т-лимфоцитов и функцию регуляторных Т-лимфоцитов, специфичных к аггрекану. В любом случае, специалисты в данной области могут легко определять подходящие дозы иммуномодуляторов.
В случае любого иммуномодулятора, используемого в способах
по настоящему изобретению, терапевтически эффективную дозу
первоначально можно оценивать с использованием анализа культуры
клеток. Например, дозу можно определять с помощью моделей на
животных для достижения диапазона концентрации в кровотоке,
включающего IC50, определяемую в культуре клеток (например,
концентрацию тестируемого средства, достигающую
полумаксимального снижения активности NF-кВ, ИЛИ активности mTOR, или активности Syk, максимального повышения аггрекан-специфичных антигенпрезентирующих клеток и т.д.). Такую информацию можно использовать для более точного определения доз, применимых у людей.
Токсичность и терапевтическую эффективность таких
иммуномодуляторов можно определять стандартными
фармацевтическими способами в культурах клеток или на
экспериментальных животных, например, для определения LD50
(дозы, летальной для 50% популяции) и ED50 (дозы, терапевтически
эффективной для 50% популяции). Соотношение доз между
токсическими и терапевтическими эффектами представляет собой
терапевтический индекс, и его можно выражать как соотношение
LD50/ED50. Предпочтительными являются иммуномодуляторы,
демонстрирующие высокие терапевтические индексы. Данные, получаемые с использованием этих анализов культур клеток и исследований на животных, можно использовать в составлении диапазона доз для применения у человека. Предпочтительно, доза таких иммуномодуляторов попадает в диапазон концентраций в кровотоке, включающий ED50, с низкой токсичностью или ее
отсутствием. Доза может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от используемой лекарственной формы и используемого пути введения. Точный состав, путь введения и дозу может выбирать специалист с учетом состояния пациента (См., например, Fingl et al., 1975, in "Pharmacological Basis of Therapeuticals", Ch. 1 pi).
Количество доз и интервал можно корректировать индивидуально для достижения уровней иммуномодулятора в плазме, достаточных для повышения супрессии иммунного ответа или толерогенеза в отношении аггреканового антигена. Общепринятые дозировки неклеточных иммуномодуляторов по настоящему изобретению для пациента для системного введения находятся в диапазоне 0,0001-2000 мг/день, как правило, 0,0001-250 мг/день и, как правило, 0,001-150 мг/день.
Композиции по изобретению можно вводить в течение часов, дней, недель или месяцев в зависимости от некоторых факторов, включая тяжесть состояния (например, повреждение сустава, включая RA) , подвергаемого лечению, если рецидивирование состояния считают вероятным, и т.д. Введение может являться постоянным, например, непрерывным вливанием в течение часов, дней, недель, месяцев и т.д. Альтернативно, введение может являться прерывистым, например, иммуномодуляторы можно вводить один раз в день в течение нескольких дней, один раз в час в течение нескольких часов, или в любом другом таком режиме, считающимся подходящим. В конкретных вариантах осуществления иммуномодуляторы по настоящему изобретению вводят по регулярной схеме лечения, такой как еженедельное введение, введение один раз в две недели, ежемесячное, ежеквартальное введение, введение один раз в полгода или ежегодное введение одним из следующих путей: внутрикожным, внутримышечным или подкожным, а также с помощью накожной, трансдермальной или назальной доставки в количествах 1-100, как правило, 10-50 микрограммов на килограмм массы тела.
3.5 Способы оценки антиген-специфичного толерогенеза
Эффективность индуцирования эффекторных лимфоцитов, особенно эффекторных Т-лимфоцитов, для проявления толерантности
в отношении аггреканового антигена можно оценивать посредством оценки иммунных ответов на этот антиген, включая, в качестве неограничивающих примеров, анализ активности эффекторных цитотоксических Т-лимфоцитов in vitro с использованием, например, аггрекан-специфичных антигенпрезентирующих клеток в качестве мишеней для антиген-специфичных цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL); анализ пролиферации аггрекан-специфичных Т-лимфоцитов, апоптоза или продукции цитокинов (см., например, Vollenweider and Groscurth, 1992. J. Immunol. Meth. 149: 133135) , антиген-специфичную супрессию эффекторных Т-клеток, измерение гуморального ответа В-клеток на антиген с использованием, например, анализов ELISPOT и анализов ELISA; исследование профиля цитокинов или измерение ответов гиперчувствительности замедленного типа (DTH) с помощью теста реактивности кожи на конкретный антиген (см., например, Chang et al. 1993, Cancer Res. 53, 1043-1050).
В некоторых вариантах осуществления антиген-специфичная толерантность/анергия, индуцируемая аггрекан-специфичными регуляторными Т-лимфоцитами, отражает неспособность антиген-специфичных эффекторных иммунных клеток (например, антиген-специфичных эффекторных Т- и/или В-лимфоцитов) отвечать на последующую повторную стимуляцию аггрекановым антигеном. Эти антиген-специфичные регуляторные лимфоциты могут отличаться продукцией цитокинов, таких как IL-10 или IFNy, антиген-специфичным образом. IL-10 и IFNy являются цитокинами с сильными иммуносупрессивными свойствами, продуцируемыми CD2 5~ CD127dimCD4+ индуцированными регуляторными Т-клетками у людей. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления наличие энергичных Т-лимфоцитов можно определять, анализируя продукцию цитокинов с использованием стандартных анализов, известных в данной области, таких как внутриклеточное окрашивание (Haringer et al., 2009. J Exp Med 206(5): 1009-1017). Альтернативно, можно наблюдать изменения пропорции CD4+ регуляторных Т-клеток, экспрессирующих CD25 и FoxP3, являющихся CD127dim (Fazekas de St Groth В et al., 2011. Methods Mol Biol 707:263-79).
Альтернативно или дополнительно, антиген-специфичную
толерантность/анергию можно косвенно определять, проводя
подвергаемому лечению индивидууму по меньшей мере
приблизительно через один месяц после введения
иммуномодулирующей/толерогенной композиции рентгенографического
теста, при котором измеряют снижение или заживление повреждения
сустава или замедление прогрессирования повреждения сустава,
включая его признаки и симптомы и/или структурное повреждение,
по сравнению с исходным уровнем перед введением, где количество
вводимой иммуномодулирующей/толерогенной композиции является
эффективным для достижения снижения или заживления повреждения
сустава или замедления прогрессирования повреждения сустава,
включая его признаки и симптомы и/или структурное повреждение,
что свидетельствует о том, что индивидуума подвергали успешному
лечению от повреждения сустава. В конкретных вариантах
осуществления рентгенографическое тестирование после введения
иммуномодулирующей/толерогенной композиции проводят по меньшей
мере приблизительно через два месяца, по меньшей мере
приблизительно через 10 недель, по меньшей мере приблизительно
через три месяца, по меньшей мере приблизительно через четыре
месяца, по меньшей мере приблизительно через пять месяцев, по
меньшей мере приблизительно через 2 4 недели, по меньшей мере
приблизительно через шесть месяцев или по меньшей мере
приблизительно через 52 недели после введения
иммуномодулирующей/толерогенной композиции. В иллюстративных примерах этого типа при тестировании используют общую модифицированную шкалу Шарпа.
Для более легкого понимания изобретения и осуществления его на практике конкретные предпочтительные варианты осуществления далее описывают с помощью следующих неограничивающих примеров.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Т-КЛЕТКИ ПЛОХО ПРОЛИФЕРИРОВАЛИ, НО ПРОДУЦИРОВАЛИ ЦИТОКИНЫ В ОТВЕТ НА ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫЕ АУТОАНТИГЕННЫЕ ПЕПТИДЫ
Цитруллинированные или немодифицированные антигенные пептиды синтезировали из белковых последовательностей
фибриногена, виментина, коллагена и аггрекана,
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПЕПТИДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРИМЕРАХ
идентифицированных с учетом их прогнозируемой способности связываться с RA-связанными молекулами DR в молекулярной модели, с помощью которой цитруллин позиционировали в Р4, или с помощью предыдущих исследований на НЪА-БК4-1Е-трансгенных мышах (таблица 5) (Hida et al., 2004. J. Autoimmun. 23: 141-150; Hill et al., 2008. J Exp. Med. 205:967-979; von Delwig et al., 2010. Arthritis Rheum. 62: 143-149).
Всего исследовали 21 SE пациентов с RA и б SE здоровых контролей. Все, за исключением 4 пациентов с RA, также являлись АСРА+ (таблица б) . Сорок три процента пациентов с RA не являлись курильщиками, 38% курили в прошлом, и 19% в настоящее время являлись курильщиками. Один здоровый контроль в настоящее время является курильщиком, и 2 имели семейный анамнез RA. Анализировали пролиферативный ответ мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) у SE+ пациентов с RA и SE+ здоровых контролей на различные концентрации цитруллинированного или немодифицированного антигенного пептида. Пролиферативные ответы на антигенные пептиды и столбнячный токсин выражали как SI. SI > 2 считали значимым. Средний пролиферативный SI на цитруллинированные и немодифицированные пептиды, как правило, составлял от 1 до 2 у пациентов с RA и здоровых контролей, и в каждом случае он был значительно ниже, чем ответы на столбнячный токсин (фигура 1). У пациентов с RA пролиферативный
SI в ответ на цитруллинированный пептид аггрекан был значительно выше, чем на нативный пептид аггрекан (фигура 1) . Пролиферативные ответы на столбнячный токсин были значительно ниже при сравнении РВМС пациентов с RA со здоровыми контролями.
В начальных экспериментах авторы настоящего изобретения
определяли, что фоновая секреция цитокинов и пролиферативные
ответы были, как правило, ниже, если ответы на пептиды
анализировали в присутствие эмбриональной сыворотки человека, а
не эмбриональной телячьей сыворотки. Кроме того, не наблюдали
различий в продукции цитокинов при сравнении анализов,
проведенных в присутствие 10% сыворотки здорового донора или
аутологичного или аллогенного донора с RA, при условии, что
добавляли Hetero Block, если титры ревматоидного фактора (RF)
составляли > 100 Ед/мл, для предотвращения связывания RF и
определения антител в реакциях ELISA (Todd et al. , 2011.
Arthritis & Rheumatism 63:894-903). В отсутствие стимуляции
пептидом РВМС пациентов с RA секретировали значимо большие
концентрации IFNy и IL-б, чем других цитокинов в отсутствие
пептидов (фигура 2А) . Суммарную секрецию цитокинов оценивали
как цитокины, секретируемые после стимуляции
цитруллинированными пептидами, минус цитокины, секретируемые в отсутствие пептидов. Секреция IL-б являлась наибольшей среди измеряемых цитокинов с суммарной продукцией 60 нг/мл в ответ на 30 мкг/мл цитруллинированного аггрекана. В соответствии с отсутствием связывания нативных эпитопов с продуктами аллелей общего эпитопа HLA-DR (Snir et al. , 2011, выше) у пациентов с RA продуцировались значимо большие количества IL-б, TNF и IL-10 в ответ на цитруллинированные пептиды, чем на нативные аггрекановые пептиды (фигура 2В, фигура 3). IL-17 и, в некоторой степени, IFNy также секретировались в ответ на некоторые цитруллинированные пептиды, но в этом случае наблюдали существенную вариабельность среди индивидуумов, и ни одно из различий не являлось статистически значимым (фигура 3). Ответы с продукцией IL-2 и IL-4, как правило, являлись низкими. При сравнении пациентов с RA и здоровых контролей у пациентов с RA секретировалось значимо больше IL-10 и TNF в ответ на
цитруллинированный аггрекан, чем у здоровых контролей (р <0,05), и наблюдали аналогичную тенденцию для секреции IL-17 в ответ на цитруллинированный аггрекан (р = 0,065) и цитруллинированный фибриноген (р = 0,08). Учитывая отсутствие стабильного связывания HLA-DR и нативных аутоантигенных пептидов, авторы настоящего изобретения определяли, что положительные ответы на цитруллинированные пептиды были выше, чем порог среднего и на 2 SD выше ответов на соответствующие нативные пептиды (ответы на цитруллинированный виментин нельзя оценивать, т.к. ответы на нативный виментин не измеряли). По сравнению с SE+ здоровыми контролями при ответах SE+ пациентов с RA на цитруллинированный пептид продуцировался более широкий спектр цитокинов. Причем, при построении графиков процентной доли пациентов с RA и здоровых контролей с положительными ответами на каждый цитруллинированный пептид, регуляторные цитокины IL-10 и IFNy в ответ на тестируемые эпитопы продуцировались только у пациентов с RA (фигура 4). ПРИМЕР 2
ОТВЕТ С ПРОДУКЦИЕЙ IL-б СРЕДИ ПАЦИЕНТОВ С RA ВАРЬИРУЕТСЯ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЛИТЕЛЬНОСТИ ЗАБОЛЕВАНИЯ
Для лучшего понимания профиля ответа на цитруллинированные пептиды у отдельных пациентов с RA и SE+ здоровых контролей строили кривые дозозависимого ответа с продукцией IL-б для каждого пептида в случае каждого индивидуума в исследовании. РВМС от 4/6 здоровых контролей дозозависимо секретировали IL-б в ответ на цитруллинированный аггрекан, и З/б секретировали IL-б в ответ на цитруллинированный фибриноген. Используя тот же порог для положительного ответа, как описано выше, обнаруживали, что из РВМС 17 пациентов с RA б секретировали IL-б в ответ на отсутствие эпитопов, 8 - в ответ только на цитруллинированный аггрекан, О-в ответ на цитруллинированный фибриноген, О-в ответ только на цитруллинированный коллаген типа II, и 3 - в ответ на множественные цитруллинированные эпитопы. Таким образом, ответы с продукцией IL-б являлись самыми высокими, и их наиболее часто наблюдали в ответ на цитруллинированный аггрекан и у пациентов с RA, и у здоровых
контролей, что позволяет предполагать, что он является наиболее иммуногенным из тестируемых эпитопов. Ответ с продукцией IL-б на множественные цитруллинированные эпитопы наиболее часто развивался у пациентов, которым ставили диагноз RA по меньшей мере за 5 лет до этого (фигура 5В). ПРИМЕР 3
ЭФФЕКТОРНЫЕ CD4+ Т-КЛЕТКИ ПАМЯТИ СЕКРЕТИРУЮТ ЦИТОКИНЫ В ОТВЕТ НА ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫЕ ПЕПТИДЫ
IL-б является важным цитокином при RA, который может
продуцироваться после стимуляции РВМС Т-клетками или
антигенпрезентирующими клетками. Для определения источника
цитокинов, секретируемых в супернатанты РВМС, стимулированных
цитруллинированными пептидами, РВМС пациентов с RA инкубировали
с цитруллинированными или нативными пептидами в течение 5 дней
с добавлением брефелдина-А в течение последних 18 часов перед
внутриклеточным окрашиванием на цитокины вместе с анализом
поверхностных клеточных маркеров. CD3+CD4+ Т-клетки
продуцировали больше внутриклеточного IFNy и IL-б при инкубации с цитруллинированным аггреканом или фибриногеном относительно инкубации только в среде (фигура 6А, В) . Окрашивание "флуоресценция минус один" (FMO) показало стратегию гейтирования для определения порога для положительного окрашивания, описываемую в (Herzenberg et al. , 2006. Nat Immunol 7(7):681 -685) (фигура 6C). В этих анализах не наблюдали внутриклеточного окрашивания на цитокины в CD4~CD2 8~ клетках, большая часть из которых представляет собой антигенпрезентирующие клетки (фигура 6D) . Показано, что дифференцированные или стареющие CD4 5RO~ клетки памяти реэкспрессируют CD45RA и отличаются утратой CD27 и CD28 (Weng et al. , 2009. Trends Immunol 30(7) :30б-312) . У здоровых контролей CD2 8~ клетки содержали лишь малую часть CD4+ Т-клеток, и клетки, секретирующие цитокины, являлись исключительно CD4+CD2 8+. CD2 8~ клетки являлись наиболее многочисленными среди CD4+ Т-клеток РВ у некоторых, но не у всех, пациентов с RA. В случае присутствия CD4+CD28~ Т-клеток IL-б и IFNy секретировались и CD28~, и CD28+CD4+ Т-клетками в ответ на
цитруллинированные пептиды. В этих культурах наблюдали высокую фоновую секрецию цитокинов, которую авторы настоящего изобретения наблюдали ранее в анализе супернатантов (фигуры 2А и 6А) . IFNy+CD4+ и IL-6+CD4+ Т-клетки включали и CD45RO+, и CD4 5RCT клетки (фигура 6Е) . CXCR5+ фолликулярные хелперные Т-клетки не экспрессировали IL-б или IFNy в ответ на цитруллинированные пептиды.
ОБСУЖДЕНИЕ ПРИМЕРОВ 1-3
В настоящем описании авторы настоящего изобретения
показали, что провоспалительные и регуляторные цитокины,
включая IL-б, IFNy, IL-10 и TNF, продуцировались CD4+ Т-
клетками у SE+ пациентов с RA в ответ на цитруллинированные
аутоэпитопы, из которых цитруллинированный аггрекан являлся
наиболее иммуногенным. Эти цитокиновые ответы наблюдали,
несмотря на слабые пептид-специфичные Т-клеточные
пролиферативные ответы. Клетки SE+ здоровых контролей также продуцировали цитокины в ответ на цитруллинированный аггрекан и цитруллинированный фибриноген. Такие Т-клеточные ответы необязательно причинно связаны с RA - скорее они демонстрируют аутореактивность, присутствующую у SE+ индивидуумов в отношении цитруллинированных аутоантигенных пептидов даже в отсутствие АСРА. Однако цитокиновые ответы на цитруллинированные аутоэпитопы были более разнообразными у пациентов с RA, чем у здоровых контролей. Фактически, только клетки пациентов с RA секретировали регуляторные цитокины IL-10 и IFNy в ответ на аутоэпитопы (Haringer et al. , 2009. J Exp Med 206(5) : 10091017). Продукция IFNy Т-клетками PB и синовиальными Т-клетками хорошо описана (Steiner et al., 1999. Rheumatology 38(3) :202-213), и показано, что гены, регулируемые IFN, являются прогностическими в отношении развития RA у АСРА+ пациентов с артралгией (van Baarsen et al. , 2010. Arthritis & Rheumatism 62(3):694-704). С помощью внутриклеточного окрашивания авторы настоящего изобретения показали продукцию IL-б и IFNy CD4+ Т-клетками памяти, но не CD4~ антигенпрезентирующими клетками в этих культурах, по меньшей мере, при исследовании после 5 дней стимуляции пептидами. Эти данные показывают, что CD4+ Т-клетки
способны продуцировать цитокины, но нельзя исключать возможность того, что CD4~ антигенпрезентирующие клетки, такие как моноциты, В-клетки и дендритные клетки, при культивировании также могут продуцировать эти цитокины, которые могут секретироваться в супернатант. Ответы с продукцией IL-б повышались дозозависимым образом в ответ на цитруллинированные пептиды. С помощью внутриклеточного окрашивания на цитокины также подтверждали широкий профиль цитокиновых ответов, соответствующий фенотипу CD4+ Т-клеток памяти.
В низком пролиферативном ответе, проявляемом аутореактивными Т-клетками в ответ на аутоантигенные и антиген столбнячного токсина при RA, могут участвовать различные механизмы. Например, в ряде исследований предполагали дефектную передачу сигнала в Т-клетках при RA через комплекс Т-клеточный рецептор-СБЗ (Emery et al. , 1984. Clin. Exp. Immunol. 57:123129; Seitz et al., 1988. Rheumatol. Int. 8:189-196; Allen et al., 1995. Eur. J. Immunol. 25:1547-1554; Thomas et al. , 1992. Arthritis Rheum. 35:1455-1465; Berg et al. , 2000. Arthritis Res. 2:75-84; Maurice et al. , 1997. J. Immunol. 159:2973-2978; Berg et al., 2000. Clin. Exp. Immunol. 120:174-182). IL-2 может быстро израсходоваться посредством связывания с рецептором CD25 с высокой авидностью, экспрессируемым регуляторными Т-клетками и эффекторными Т-клетками памяти после активации. Это может ограничивать доступность IL-2 для Т клеточной пролиферации в культуре ткани (Wolf et al. , 2001. Eur. J. Immunol. 31: 16371645; Ishimaru et al., 2006. Nat. Immunol. 7:763-772) . Кроме того, аутореактивные Т-клетки подвержены влиянию регуляторных клеток и цитокинов, как показано в (Berg et al., 2001. Ann. Rheum. Dis. 60: 133-139; van Amelsfort et al. , 2004. Arthritis Rheum. 50:2775-2785) . С другой стороны, эффекторные клетки памяти продуцируют высокие уровни провоспалительных и регуляторных цитокинов, и продукция цитокинов более эффективно отражает наличие высокодифференцированных аутореактивных эффекторных Т-клеток памяти и у людей, и у мышей (Garcia de Тепа et al., 2006. J. Clin. Immunol. 26:233-242; Nanki et al., 2000. Arthritis Res. 2:415-423; Morita et al., 1998. Arthritis
Rheum. 41:1669-1676).
Провоспалительный цитокин IL-б стимулирует продукцию антител В-клетками и играет критическую роль в патогенезе RA (Assier et al., 2010. Joint Bone Spine 77:532-536). У пациентов с RA внутриклеточные IL-б и IFNy продуцируются CD2 8+ и CD2 8~ и CD45RO+ и CD45RO" CD4+ Т-клетками РВ. В соответствии с плохим пролиферативным, но хорошим цитокиновым ответом Т-клеток при RA в ответ на цитруллинированные пептиды, показанных в настоящем исследовании, ранее показано, что CD4+CD4 5RBdimCD2 7~ Т-клетки памяти от здоровых доноров пролиферируют плохо, но продуцируют большое количество IL-4 и IL-10 в ответ на митоген и обеспечивают эффективную помощь В-клеткам в продукции иммуноглобулинов (Tortorella et al. , 1995. J. Immunol. 155: 14 9-162). В отличие от этого, типичные фолликулярные хелперные CXCR5+ Т-клетки, которые, как показано, стимулируют продукцию антител в лимфоидной ткани in vivo (Chevalier et al., 2011. J Immunol 18 6:5556-5568), не экспрессировали цитокины в ответ на цитруллинированные пептиды. Интересно, что, когда CD2 8~ Т-клетки присутствовали в РВ пациентов с RA, они также продуцировали цитокины в ответ на цитруллинированные пептиды. CD2 8~ Т-клетки отражают важный ответ с повышением эффекторных клеток памяти в синовиальном микроокружении, и показано, что они являются более устойчивыми к супрессии регуляторными Т-клетками (Weng et al., 2009. Trends Immunol. 30:306-312; Thewissen et al. , 2007. J. Immunol 179:6514-6523). В совокупности, данные, представленные в настоящем описании, подтверждают гипотезу о том, что эффекторные Т-клетки памяти реагируют со многими цитруллинированными аутоантигенными пептидами и имеют потенциал для помощи В-клеткам, циркулируют в периферической крови и присутствуют в синовиальной жидкости SE+ индивидуумов.
В предыдущих исследованиях на пациентах с RA анализировали ответ CD4+ Т-клеток РВ на специфичность к одному цитруллинированному пептиду. Пролиферативный CD4+ Т-клеточный ответ и ответ с продукцией IL-17 на цитруллинированный аггрекан 84-103 показан у пациентов с RA, но не у здоровых контролей,
что свидетельствует об иммуногенности этого эпитопа цитруллинированного аггрекана (von Delwig et al., 2010. Arthritis Rheum 62(1): 143-149). Немодифицированный эпитоп аггрекана является иммунодоминантой у мышей BALB/c, иммунизированных аггреканом/протеогликаном (Buzas et al., 2005. Cell Immunol, 235(2):98-108). Этот цитруллинированный пептид аггрекан также является наиболее иммуногенным эпитопом в настоящем исследовании - с наибольшей частотой у респондеров и наибольшей величиной ответа с продукцией IL-б. Однако необходимо отметить, что в исследовании Buzas не сравнивали пациентов с ранним RA и длительным RA и не исследовали иммунный ответ хозяина на любой другой антиген, помимо аггрекана.
Авторы настоящего изобретения также обнаруживали у
пациентов с длительным RA высокую продукцию цитокинов в ответ
на цитруллинированный фибриноген-а 79-91, который, как
показано, является иммунодоминантным эпитопом у трансгенных по
HLA-DR4-IE мышей, иммунизированных цитруллинированным
фибриногеном человека (Hill et al., 2008. J. Exp. Med. 205:967979) . В настоящем исследовании стимуляция эпитопом цитруллинированного виментина 66-78 приводила к гораздо более слабым цитокиновым ответам, как наблюдали Snir et al. (2011, выше), которые обнаруживали, что Т-клетки HLA-DRB1*0401+ пациентов RA продуцировали ряд цитокинов при инкубации с цитруллинированным виментином 59-7 8, но не 6 6-7 8. В этом исследовании IFNy и TNF экспрессировались внутриклеточно небольшой частью CD154+CD4+ Т-клеток пациентов с RA в ответ на цитруллинированный, но не нативный виментин 59-78. Часть Т-клеток, окрашиваемых на внутриклеточные цитокины, была значительно ниже в настоящем исследовании, в котором авторы настоящего изобретения осуществляли окрашивание через 5 дней после стимуляции антигеном и без второй рестимуляции. Возможно, что анергию может индуцировать рестимуляция пептидом после исходного 5-дневного культивирования с пептидом, или, учитывая их эффекторный фенотип памяти (Di Mitri et al. 2011. "Reversible Senescence in Human CD4+CD45RA+CD27- Memory T Cells." J. Immunol), что немногие из Т-клеток способны
реэкспрессировать CD154 после длительного культивирования in vitro. Аналогично настоящему исследованию, Snir et al. (2011, выше) не наблюдали сильного пролиферативного или ответа с продукцией IL-17A, в отличие от von Delwig et al. (2010, выше). Различия в секреции цитокинов могут относиться к включению в настоящее исследование сыворотки здорового человека или Hetero Block и аутологичной сыворотки (Todd et al. , 2011. Arthritis & Rheumatism 63:894-903). Наконец, благодаря гидрофобным аминокислотам в положениях 84-8 8, цитруллинированный пептид аггрекан являлся относительно нерастворимым в водной среде, что также могло повлиять на чистоту, концентрацию и клеточный захват антигена в различных лабораториях.
Авторы настоящего изобретения также наблюдали Т-клеточные
цитокиновые ответы на цитруллинированные аутоэпитопы у SE+
пациентов с RA, являющихся АСРА+ или нет, а также у АСРА"
здоровых контролей. Также наблюдали, что Т-клетки HLA-
DRB1*0401+ здоровых контролей продуцировали цитокины в ответ на
цитруллинированный виментин 59-78 (Snir et al., 2011, выше).
После иммунизации трансгенных по DR4-IE мышей
цитруллинированным фибриногеном человека ответы на немодифицированные нативные эпитопы стимулировали параллельно ответам на цитруллинированные эпитопы. Учитывая предыдущий и настоящий анализ связывания HLA-DR и ответов на немодифицированные эпитопы, ответы на цитруллинированные эпитопы, по-видимому, являются более специфичными для РВ SE+ RA. В отличие от этого, величина и разнообразие ответов на цитруллинированные эпитопы у здоровых контролей являлись неожиданными. Не наблюдали Т-клеточной аутореактивности в отношении цитруллинированного фибриногена у трансгенных по DR4-IE мышей, примированных нативным фибриногеном человека (Hill et al., 2008, выше). Не тестировали спонтанную аутореактивность в отношении цитруллинированного фибриногена у наивных или подвергнутых стрессу трансгенных по DR4-IE мышей. Однако показано, что CD4+ Т-клетки и SE+ пациентов с RA, и HLA-DR4+ здоровых контролей имели сниженные эксцизионные циклы Т-клеточного рецептора, общее укорачивание теломер и сниженную
способность к репликации, что, в совокупность, позволяет предполагать HLA-DR SE-связанное снижение вовлечения Т-клеток в периферический репертуар, повышение пролиферативной активности наивных Т-клеток против периферических аутоантигенов и снижение разнообразия репертуара TCR (Fujii et al., 2009. Proc Natl Acad Sci USA 106:4360-4365; Koetz et al. , 2000. Proc Natl Acad Sci USA 97:9203-9208; Schonland et al. , 2003. Proc Natl Acad Sci USA 100: 13471-13476) . Настоящее и предыдущие исследования на людях в совокупности позволили предполагать, что Т-клетки РВ HLA-DR SE+ индивидуумов могут являться предрасположенными к аутореактивности в отношении аутоантигенов, включая модифицированные посредством цитруллинизации, потенциально подверженными воздействию стресса или провоспалительных условий, включая травму сустава или курение (Klareskog et al., 2006. Arthritis Rheum. 54:38-46; de Jong et al. , 2010. Ann. Rheum. Dis. 69:255-262). Кроме того, в отличие от аутореактивности Т-клеток, развитие аутореактивности В-клеток в отношении цитруллинированных эпитопов, по-видимому, является значительной контрольной точкой в прогрессировании RA. Предполагают, что инфекция, например, Porphyromonas gingivalis у пациентов с периодонтитом, может являться критическим пусковым механизмом для прогрессирования через эту контрольную точку, потенциально, в результате перекрестной реактивности с бактериальными антигенами, адъювантными эффектами патоген-связанных молекулярных паттернов, воздействия на альтернативные антигенпрезентирующие клетки или их комбинаций (Wegner et, 2010. Immunol. Rev. 233:34-54). Карбамоилирование остатков лизина до гомоцитруллина может являться другим фактором, повышающим иммуногенность аутоантигенов при RA, включая цитруллинированные антигены (Mydel et al. , 2010. J Immunol. 184:6882-6890).
Данные, представленные в настоящем описании,
свидетельствуют о том, что пациенты с RA с длительным заболеванием более вероятно отвечают на множественные цитруллинированные эпитопы, в то время как пациенты с ранним началом RA (включая ранее неподвергавшихся лечению) более
вероятно отвечают на отсутствие антигена или только на цитруллинированный аггрекан. Эти данные также свидетельствуют о том, что распространение эпитопа происходит при прогрессировании заболевания. Анализ, представленный в настоящем описании, в котором продукцию цитокинов Т-клетками подробно исследовали в присутствие различных концентраций панели цитруллинированных эпитопов, как предполагают, является полезным биомаркером для идентификации наиболее иммуногенных пептидных эпитопов, и позволяет определять корреляцию специфичных Т-клеточных ответов с соответствующими "точными специфичностями" АСРА (Willemze et al. , 2011. Arthritis Rheum. 63: 1823-1832). Предпочтительно, эти анализы можно осуществлять в комбинации с анализом тетрамер-специфичных Т-клеток. Рассматриваемые способы применения включают сравнение серийных образцов РВМС от пациентов от момента перед развитием RA до момента постановки диагноза (Deane et al., 2010. Arthritis Rheum. 62:3161-3172) и анализ РВМС в клинических испытаниях антиген-специфичной или неспецифичной иммунотерапии, такой как абатацепт (Yue et al. , 2010. Arthritis Rheum. 62:2 941-2 952). Наконец, анализ специфичной реактивности в отношении пептида, как предполагают, будет полезным для стратификации пациентов и для идентификации подходящих эпитопов для персонализированной антиген-специфичной иммунотерапии.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
ПАЦИЕНТЫ
Включали двадцать одного пациента, удовлетворявшего критериям RA American College of Rheumatology (ACR) 1987 года (Aletaha et al. , 2 010, выше) и б некурящих АСРА" SE+ здоровых контролей. У всех индивидуумов брали образцы периферической крови (РВ), хотя в некоторых случаях количество являлось недостаточным для всех анализов. Демографические данные о пациентах представлены в таблице б. Генотипирование по HLA-DR осуществляли в Queensland Health Pathology Services. Исследование было одобрено Human Research Ethics Committee в Princess Alexandra Hospital, и от каждого пациента получали информированное согласие.
RA13 С
RA14 С
RA15 С
RA16 С
RA17 С
RA18 С
RA19 С
RA2 0 С
RA21 С
НС1 С
НС2 С
НСЗ С
НС4 С
НС5 С
0101, 1301 0408, 11 0401, 0408 0101, 0408 0401, 03 0401, 03 0101, 0103 0401, 1501 0401, 0101 01 03, 04 0401, 0701 0101, 08 1301, 0401
> 5 > 5 0
> 5 3
М, S, Н 4,6
Nil 1
Nil 6
М, А 33
М 2
М. S . Н 5, 3
_ 9, 9 М, Р 2
1-6
1-6 1-6
1-6
1-5 1-5
1-5
1-5
1-5 1-5 1-5
1-5 1-6
0401, 1-6
НС б с
1301
CRP измеряли в момент забора крови для ответа на пептид.
М: метотрексат, S: сульфасалазин, Н: гидроксихлорохинон, L: лефлуномид, А: абатацепт. С: европеоид, А: азиат, I: уроженец островов Тихого Океана
* Получали РВ и SF. Для пациентов с RA средний возраст = 50 лет (диапазон 22-65 лет), из которых 89% являлись женщинами, и для контролей средний возраст = 38 лет (40-45 лет), 50% женщин.
ПОЛУЧЕНИЕ ПЕПТИДОВ
Цитруллин- или аргинин-содержащие SE-связывающие эпитопы, соответствующие виментину, коллагену типа II, фибриногену и аггрекану, синтезировали в Auspep (NSW, Australia). Все пептиды подвергали фильтрации, разводили до концентрации 300 мкг/мл в стерильной воде и хранили при -7 0°С. Конечные разведения для рабочего раствора получали с использованием среды.
ОЧИСТКА МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК РВ И АНАЛИЗЫ ПРЕЗЕНТАЦИИ АНТИГЕНА
Мононуклеарные клетки (МС) выделяли из РВ и SF с использованием градиента плотности фиколл-пака (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) и промывали 0,9% физиологическим раствором, затем ресуспендировали в RPMI и 10% сыворотке человека от здоровых доноров или аутологичных или аллогенных доноров с RA. Столбнячный токсин использовали в концентрации 4 Lfi/мл (Chiron Vaccinese) . Два * 105 РВМС или SFMC инкубировали с 0,3 и 30 мкг/мл каждого пептида в присутствие RPMI, содержащей 10% сыворотки человека, в конечном объеме 2 00 мкл в круглодонных лунках в течение 5 дней. Т-клеточную пролиферацию оценивали посредством добавления 1 мкКи/лунку [3Н]тимидина (ICN Biochemicals) в течение последних 18 часов. Клетки собирали на плоских стекловолоконных фильтрах и определяли встраивание [ 3Н]-тимидина с помощью жидкостной сцинтилляционной спектроскопии (Packard Topcount, Packard Instrument Co.). IL-2, IL-4, IFNy, IL-10, IL-6, IL-17 и TNF измеряли в супернатантах в день 5 с использованием наборов BD Cytometric Bead Array (СВА) (BD Bioscience). Начальные кинетические эксперименты показали, что стимуляция пептидами в течение 5 дней оптимально индуцировала антиген-специфичный пролиферативный и цитокиновый ответы, и что более длительное культивирование не приводило к более сильным ответам. Если в анализах продукции цитокинов использовали сыворотку пациентов с RA, при измерении СВА добавляли 150 мкг/мл HeteroBlock (Omega Biologicals) (Todd et al., 2011, выше). Образцы анализировали с помощью биоаналитической системы BD FACSArray(tm). Индексы стимуляции (SI) для пролиферативных ответов вычисляли как
кратное повышение в ответ на пептид по сравнению с фоном. Суммарную секрецию цитокинов вычисляли для каждого ответа как [концентрация при стимуляции пептидом] минус [концентрация без стимуляции пептидом]. Пороги положительного ответа составляли 2 SD выше цитокиновых ответов в отношении соответствующего нативного пептида и для пациентов с RA, и для здоровых контролей.
ПРОТОЧНАЯ ЦИТОМЕТРИЯ И ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ ОКРАШИВАНИЕ НА ЦИТОКИНЫ
РВМС SE+ пациентов с RA или здоровых контролей инкубировали с пептидами в концентрациях 3 и 30 мкг/мл или без пептидов в течение 5 дней с добавлением брефелдина A (Sigma Aldrich) перед последними 18 часами. Клетки окрашивали на CD3-FITC, CD4-APC/Cy7, CD28-FITC, CXCR5-PerCP/Cy5.5 и CD45RO-PerCP/Cy5.5 (Biolegend) с последующей пермеабилизацией и окрашиванием на внутриклеточные IL-б-АРС и IFNy-APC (Biolegend). Данные собирали с помощью проточного цитометра Gallios и анализировали с использованием программного обеспечения Kaluza (Beckman Coulter).
СТАТИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ
С помощью одностороннего непараметрического ANOVA с апостериорной коррекцией осуществляли множественные сравнения средних. С помощью непарных тестов Манна-Уитни сравнивали пролиферативные ответы на столбнячный токсин у пациентов с RA и здоровых контролей и специфические цитокиновые ответы на цитруллинированные и нативные пептиды. Уровень значимости указывали как *Р <0,05, **Р <0,005 и **Р <0,001. Все планки погрешностей представляют SEM.
ПРИМЕР 4
ИНГИБИРОВАНИЕ АРС ПАЦИЕНТА С RA С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРОВ NF-кВ, mTOR ИЛИ SYK СУПРЕССИРУЕТ ИХ СПОСОБНОСТЬ ИНДУЦИРОВАТЬ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ Т-КЛЕТКАМИ В ОТВЕТ НА ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫЙ ПЕПТИД АГГРЕКАН
Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из пациента с RA с длительностью заболевания 18 лет, положительного на анти-ССР и общий эпитоп HLA-DRB1*0401.
Аутологичные CD4+ Т-клетки выделяли с использованием иммуномагнитных бус. Не-Т-клеточная фракция состоит из антигенпрезентирующих клеток (АРС), включая дендритные клетки, моноциты и В-клетки; их обрабатывали митомицином С для предотвращения пролиферации. АРС предварительно инкубировали в течение 1 часа с 3 мкМ BAY7011-82, 20 мкг/мл куркумина (оба ингибируют NF-KB), 10 нг/мл рапамицина (ингибирует mTOR) или 4 0 мкМ пикеаттанола (ингибирует Syk) или без них, затем инкубировали с 100 нг/мл LPS в течение 1 часа. АРС 3 раза промывали, затем инкубировали в течение 5 дней с CD4+ Т-клетками в присутствие 0 мкг/мл, 3 мкг/мл или 30 мкг/мл пептида аггрекана 84-103 cit 93. Цитокины анализировали в супернатантах культур с помощью анализа цитокинов с использованием бус. Данные представляют суммарную (лунки с пептидом минус лунки без пептида) продукцию IL-6 и TNF в ответ на 3 или 3 0 мкг/мл пептида.
Результаты, представленные на фигуре 7, свидетельствуют о том, что предварительная инкубация АРС с Bayll-7082 частично супрессирует, а другие ингибиторы полностью супрессируют способность АРС, презентирующих cit-пептид, индуцировать продукцию IL-б Т-клетками. Все ингибиторы полностью супрессировали способность АРС, презентирующих cit-пептид, индуцировать продукцию TNF Т-клетками.
ПРИМЕР 5
ЦИТОКИНОВЫЙ ОТВЕТ НА ЭПИТОП G1 ЦИТРУЛЛИНИРОВАННОГО АГГРЕКАНА У ПАЦИЕНТА С RA
РВМС от пациента с RA, описанного в примере 4, инкубировали с нативной или цитруниллированной формой эпитопа G1 аггрекана человека размером 351 аминокислота (содержит доминантные и субдоминантные эпитопы у мышей) в течение 5 дней при концентрации 1 мкг/мл, затем в супернатанте измеряли IL-б. Суммарная продукция IL-б (лунки с антигеном минус лунки без антигена), представленная на фигуре 8, четко свидетельствует о значимо более высоком ответе с продукцией IL-б на цитруллинированный эпитоп G1 по сравнению с соответствующим нецитруллинированным эпитопом.
ПРИМЕР б
CIT-АГГРЕКАН-СПЕЦИФИЧНЫЕ Т-КЛЕТКИ ПРИСУТСТВУЮТ В
ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПАЦИЕНТОВ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ
РВМС от 2 HLA-DRB1*0401+ АСРА+ пациентов с RA окрашивали с использованием CLIP, гемагглютинина вируса гриппа (НА) , аггрекан 89-103 cit 93, 95 или виментин 59-71 cit 64, 69, 71 БКВ1*0401-тетрамерами в присутствие дазатиниба. Графики гейтировали по живым клеткам, CD4+ Т-клеткам, обогащенным тетрамер+ клеткам с использованием иммуномагнитных бус. % тетрамер+ клеток из обогащенных РВМС представлен на фигуре 9 для каждого графика. Эти результаты четко свидетельствуют о том, что специфичные к цитруллинированному аггрекану Т-клетки присутствуют в периферической крови пациентов с ревматоидным артритом.
ПРИМЕР 7
КОЛИЧЕСТВО И ИНТЕНСИВНОСТЬ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ С1Т-АГГРЕКАН-СПЕЦИФИЧНЫХ Т-КЛЕТОК В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ
РВМС от б пациентов с RA и 3 здоровых контролей окрашивали, как описано в примере б, за исключением флуоресцентных бус для подсчета, затем вычисляли количество тетрамер+ Т-клеток на мл крови. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) при окрашивании на тетрамеры является индикатором аффинности Т-клеточного рецептора для антигена, презентируемого молекулой HLA-DR. Cit-аггрекан-специфичные Т-клетки находились в кровотоке пациентов с RA и здоровых контролей с этим генотипом. Результаты, представленные на фигуре 10, свидетельствуют о том, что количество cit-аггрекан-специфичных Т-клеток является более высоким у части пациентов с RA относительно среднего для здоровых контролей, и у некоторых пациентов с RA эти Ад-специфичные Т-клетки имеют более высокую аффинность для cit-аггрекана.
Описание каждого патента, патентной заявки и публикации, процитированных в настоящем описании, таким образом, включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.
Цитирование каждой ссылки в настоящем описании нельзя истолковывать как признание того, что такая ссылка доступна в
качестве "предшествующего уровня техники" относительно настоящей заявки.
На всем протяжении заявки целью являлось описание предпочтительных вариантов осуществления изобретения без ограничения изобретения любым из вариантов осуществления или конкретным набором черт. Таким образом, специалистам в данной области будет понятно, что с учетом настоящего описания можно осуществлять различные модификации и изменения в конкретных вариантах осуществления, приведенных в качестве примеров без отклонения от объема настоящего изобретения. Все такие модификации и изменения предназначены для включения в объем по заявленной формуле изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения или профилактики повреждения сустава у индивидуума, включающий, состоящий или, по существу, состоящий из вызывания у индивидуума антиген-специфичного толерогенного ответа на полипептид аггрекан, таким образом, приводящего к лечению или профилактике повреждения сустава.
2. Способ по п.1, где полипептид аггрекан является цитруллинированным полипептидом аггреканом.
3. Способ по п.1 или п. 2, где индивидуум имеет ранний RA или RA на ранней стадии.
4. Способ по п.З, дополнительно включающий определение того, что индивидуум имеет ранний RA или RA на ранней стадии до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа.
5. Способ по любому из пп.1-4, где индивидуум является положительным на общий эпитоп (SE).
6. Способ по п. 5, дополнительно включающий определение того, что индивидуум является положительным по SE до вызывания антиген-специфичного толерогенного ответа.
7. Способ по любому из пп.1-6, где индивидуум имеет иммунный ответ на полипептид аггрекан или риск его развития.
8. Способ по п. 7, где иммунный ответ включает ответ эффекторных Т-лимфоцитов.
9. Способ по п.8, где иммунный ответ включает продукцию по меньшей мере одного цитокина, выбранного из группы, состоящей из интерлейкина-б (IL-б), интерферона-у (IFNy), фактора некроза опухоли (TNF) и интерлейкина-10 (IL-10).
10. Способ по п. 7, где иммунный ответ включает
провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ, включающий, состоящий
или, по существу, состоящий из продукции по меньшей мере одного
цитокина, выбранного из группы, состоящей из IL-б, IFNy и TNF.
11. Способ по п. 10, где провоспалительный Т-лимфоцитарный ответ включает, состоит или, по существу, состоит из продукции IL-б.
12. Способ по п. 7, где иммунный ответ осуществляется, по меньшей мере, частично CD4+ лимфоцитами.
13. Способ по любому из пп.1-12, где антиген-специфичный
11.
толерогенный ответ вызывают посредством:
(1) повышения у индивидуума количества толерогенных антигенпрезентирующих клеток (agg-tolAPC), презентирующих пептид, соответствующий части полипептида аггрекана, где часть связана с провоспалительным или аутореактивным Т-лимфоцитарным ответом на полипептид аггрекан;
(2) индуцирования у индивидуума анергии или апоптоза провоспалительных или аутореактивных Т-лимфоцитов, реактивных в отношении полипептида аггрекана; и
(3) повышения у индивидуума количества регуляторных или супрессорных Т-лимфоцитов, супрессирующих или иным образом снижающих провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ на полипептид аггрекан.
14. Способ по п.13, включающий, состоящий или, по
существу, состоящий из повышения количества agg-tolAPC у
индивидуума, чтобы, таким образом, осуществлять лечение или
профилактику повреждения сустава.
15. Способ по п.14, где agg-tolAPC стимулируют образование регуляторных или супрессорных Т-лимфоцитов, супрессирующих или иным образом снижающих провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ на полипептид аггрекан.
16. Способ по п. 14 или п.15, где agg-tolAPC получают посредством приведения антигенпрезентирующих клеток индивидуума в контакт с (1) ингибитором NF-кВ В количестве, достаточном для ингибирования активности NF-кВ В антигенпрезентирующих клетках, и/или (2) ингибитором mTOR в количестве, достаточном для ингибирования активности mTOR в антигенпрезентирующих клетках, и/или (3) ингибитором Syk в количестве, достаточном для ингибирования активности Syk в антигенпрезентирующих клетках, совместно с молекулой антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, или молекулой нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген, в количестве, достаточном для антигенпрезентирующих клеток, чтобы презентировать антиген или его процессированную форму на своей поверхности.
17. Способ по п.16, где антиген содержит аминокислотную
последовательность, соответствующую полноразмерному полипептиду аггрекану.
18. Способ по п.16, где антиген содержит аминокислотную последовательность, соответствующую зрелому полипептиду аггрекану.
19. Способ по п.16, где антиген содержит аминокислотную последовательность, соответствующую домену полипептида аггрекана, выбранному из домена G1, домена G2 или домена G3.
20. Способ по п.16, где антиген содержит аминокислотную последовательность, соответствующую Т-клеточному эпитопу полипептида аггрекана.
21. Способ по п.20, где аминокислотная последовательность выбрана из любой из SEQ ID N0:5-35, включая их цитруллинированные формы.
22. Способ по п.20, где аминокислотная последовательность выбрана из любой из SEQ ID N0:32-35.
23. Способ по п.16, где антиген является HLA-DR-
ограниченным, и индивидуум является положительным по аллелю
HLA-DR.
24. Способ по п.16, где антиген находится в форме одного или нескольких пептидов, соответствующих полностью или частично полипептиду аггрекану, включая его цитруллинированные формы.
25. Способ по п.16, где антиген находится в форме множества смежных перекрывающихся пептидов, последовательности которых перекрывают по меньшей мере часть полипептида аггрекана, включая его цитруллинированные формы.
26. Способ по п. 16, где перекрывающиеся пептиды содержат, состоят или, по существу, состоят из аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID N0:49-531, включая их цитруллинированные формы.
27. Способ по п.16, где ингибитор является ингибитором NF-кВ (например, ингибитором NF-кВ, выбранным из любого из ингибиторов, представленных в таблицах 2, ЗА, ЗВ или 4).
28. Способ по п.27, где ингибитором NF-кВ является куркумин или производное куркумина.
29. Способ по п.16, где ингибитор и молекулу антигена
24.
вводят совместно в растворимой форме.
30. Способ по п.16, где ингибитор и молекулу антигена вводят совместно в форме частиц.
31. Способ по п.30, где ингибитор и молекулу антигена вводят совместно в одной частице.
32. Способ по п.30, где частица является полимерной частицей.
33. Способ по п.30, где частица является липосомой.
34. Способ по п. 13, где agg-tolAPC получают посредством экспрессии в В-лимфоцитах молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, соответствующий полностью или частично полипептиду аггрекану, где экспрессия молекулы нуклеиновой кислоты приводит к презентированию антигена или его процессированной формы на поверхности В-лимфоцитов.
35. Способ по п.34, где молекула нуклеиновой кислоты дополнительно кодирует иммуноглобулин или фрагмент иммуноглобулина, слитый прямо или опосредованно с антигеном.
36. Способ по п.13, включающий введение индивидууму регуляторных или супрессорных Т-лимфоцитов, супрессирующих или иным образом снижающих провоспалительный или аутореактивный Т-лимфоцитарный ответ на полипептид аггрекан.
37. Способ по п.1, включающий введение индивидууму комплекса МНС-пептид, по существу, состоящего из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, и выделенного компонента МНС, имеющего антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком.
38. Способ по п.1, включающий введение индивидууму химерной конструкции, содержащей иммуномодулирующий пептид и иммунологический или связывающий Т-клетки лиганд (I/TCBL), где иммуномодулирующий пептид содержит, состоит или, по существу, состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей части полипептида аггрекана и связывающейся с рецептором антигена на провоспалительных или аутореактивных Т-лимфоцитах, и где I/TCBL связывается с классом или подклассом Т-клеток, выбранным из группы, состоящей из хелперных Т-клеток, супрессорных Т-клеток и цитотоксических Т-клеток, и модулирует
30.
Т-клеточную активность.
39. Способ по п.38, где I/TCBL содержит по меньшей мере часть молекулы, выбранной из молекулы МНС класса I, молекулы МНС класса II, акцессорной молекулы, такой как J3 2 - микроглобулин, молекулы функционально-связанного антигена лимфоцитов-3 (LFA-3), Fc-области тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина, молекул 1а+, антитела против CD2, антитела против CD3, антитела против CD4, антитела против CD8, антитела против лектина, лимфокина.
40. Композиция, содержащая, состоящая или, по существу, состоящая из средства или комбинации средств, вызывающих антиген-специфичный толерогенный ответ на полипептид аггрекан.
41. Композиция по п.40, где средство или комбинация средств выбрана из: (1) ингибитора пути NF-кВ И молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген; (2) ингибитора mTOR и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген; (3) ингибитора пути Syk и молекулы антигена, выбранной из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, или молекулы нуклеиновой кислоты, с которой экспрессируется антиген; (4) молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, соответствующий полностью или частично полипептиду аггрекану, для встраивания в В-лимфоциты; (5) комплекса МНС-пептид, состоящего, по существу, из антигена, соответствующего полностью или частично полипептиду аггрекану, и выделенного компонента МНС, имеющего антигенсвязывающий участок, где антиген связан с антигенсвязывающим участком; (б) химерной конструкции, представленной в настоящем описании; (7) аггрекан-специфичных толерогенных антигенпрезентирующих клеток; или (8) APL, содержащего, состоящего или, по существу, состоящего из аминокислотной последовательности, соответствующей части полипептида аггрекана.
39.
42. Средство или комбинация средств, вызывающих антиген-специфичный толерогенный ответ на полипептид аггрекан по п. 4 0 или п. 41 для применения в лечении или профилактике повреждения сустава.
43. Применение средства или комбинации средств, вызывающих антиген-специфичный толерогенный ответ на полипептид аггрекан по п. 40 или п. 41 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики повреждение сустава.
По доверенности
< а:
15 I-
HZ CD X
CD о со
> >
1 '
= CO
ro 5
CD CL
CO 03
CL ^
ro ?-
CL ID
-80
1^ ^Stii
со _ СО
CD О. ГО 1= ГО
2 ?
CL ID
ro о
"о ^;
О СО
CD СО
I- со
11 11
CD ^ -Л
\- го
о о
m I-
со -8-О CD
г О
т ¦ 2
. О
К И
CD О
CN I-H"
-0SI
"W1 §
-OS т!-
о оо
ю -8-о
го ? с го
Й с
О. I ^
ю -8-о
¦"-
¦в *7
m 1-н"
я е
о со ¦во ю
¦во
с; "Зг-
О СО
¦е-
СО ср 2 ш
ю ¦во
СО .Л
о ^
к и
О О
"3~
ш о
со -~.
СО ю
<р ? ш ш ro s
:~ со != ^ Q.
¦е-
Ш CD СО СО
^ х t о
О СО
¦во
Я я = =
ш m СО
со со
1 ё
CD О А со
-8-О
О со с
ел с; с; о
с: о
CD -О
m о
< о
=г со
Й о
D ?
а> оа н о
л ш о
Уихиэи И1янаи1вн вн i/\i9h 'emiqa os2 < вн tfrnusu-jp вн 1лю±эаю
о aoiHsnhBU виоЬ1 KBHiHshodu
CD О
CD CD P- S
CO ф
О О О О
<
О <
о ¦ч-о
¦ ¦ S
о <
lb 8
О X
ю О X
¦3-
О х /
о <
<
О < СО
1Г) 1-й"
я е
< а. о < ¦ч-о <
о <
<
о <
о С
< Е ?_ о.
ОЙ2
< я *
CD J)
00 О Ш
о о о
и СО
(L/IAI/JH) 9-П1
+ О см О О
-X.
/I;
Li.
(Di О'
¦ ш
1-н"
О ,
1-1
О s О °
CD CL
CD О
ь " Я*' *
Do1*
U i .
+ Q-
CD CL
8200
ш е-
О -t;
со со
? I
CD CD
CD Q_
о; . .
s со
=г :r
со со
о. ^
со о
К- Ш
о ~
5 s
-= о оо со
? I
CD \- CD CD
CD Q_
CO CD
CO CD
о о
8 о см см
(LTIAI/JU) g-ц и1янс1в1Л11Л|Ло ф
(LTIAI/JU) JNI MNHCIBIAIIAIAQ ^
m о
m О
CL CO
CL CO
О О
CO CL
О О
CO CL
(LTIAI/JU) g-ц bMhMAtfodu BBHCIBIAIIAIAQ
эиньэээвс1о1эаэ эояомод
CD СО
О l-ч"
CD -О
m о
о со
о ^-о
<
ВЮЭСШв-ЦЭ 1ЧС1Э1Л1ВС11Э1 ВН
иинваитвс1> 10 ис1и |-||/\|
о > >
§ i
g +
R- °
СС о
со *
<
ш о: о
< i
ТТЛ
иаос1> 1 т/м/мохэих +d9i/\iBdi9i хнньифиЬэиэ^еяэсШе-до оаюэьиио"
<
163
163
163
163
2/18
2/18
3/18
3/18
3/18
3/18
5/18
5/18
6/18
6/18
6/18
6/18
7/18
7/18
7/18
7/18
7/18
7/18
9/18
8/18
9/18
8/18
9/18
8/18
9/18
8/18
9/18
8/18
9/18
8/18
9/18
10/18
9/18
10/18
9/18
10/18
9/18
10/18
9/18
10/18
9/18
10/18
11/18
11/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
12/18
13/18
13/18
14/18
14/18
14/18
14/18
14/18
14/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
15/18
16/18
16/18
17/18
17/18
18/18
18/18
18/18
18/18
18/18
18/18
18/18
18/18