[RU]

Человеческие антитела, иммуноспецифические для человеческого CD27, способны блокировать связывание CD27 с его лигандом CD70 и нейтрализовать биологическую активность CD27, включая, но не ограничиваясь следующим: внутриклеточное сигнализирование CD27, пролиферацию и активацию Т-клеток, пролиферацию и дифференциацию В-клеток, образование бластных клеток плазмы и облегчение ответов антител, стимулирование опухолевых клеток при помощи CD70, а также выработку растворимых медиаторов из Т и В-клеток. Антитела могут быть использованы в диагностике или лечении заболеваний и состояний, ассоциируемых с активностью CD27.

(57) Реферат / Формула:

Человеческие антитела, иммуноспецифические для человеческого CD27, способны блокировать связывание CD27 с его лигандом CD70 и нейтрализовать биологическую активность CD27, включая, но не ограничиваясь следующим: внутриклеточное сигнализирование CD27, пролиферацию и активацию Т-клеток, пролиферацию и дифференциацию В-клеток, образование бластных клеток плазмы и облегчение ответов антител, стимулирование опухолевых клеток при помощи CD70, а также выработку растворимых медиаторов из Т и В-клеток. Антитела могут быть использованы в диагностике или лечении заболеваний и состояний, ассоциируемых с активностью CD27.

---

2420-518707ЕА/015 ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К CD27, МЕТОДЫ И ПРИМЕНЕНИЕ
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к человеческим антителам к белку CD27 и методам их применения, в частности к человеческим антителам к белку человека CD2 7 и методам их применения в лечении воспалительных заболеваний.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
CD27 является трансмембранным белком 1-го типа и членом суперсемейства рецептора ФНО (TNFSF27), который экспрессируется в качестве поверхностного антигена на большинстве Т-клеток, естественных киллерных клеток и антителосекретирующих плазматических клеток и В-клеток памяти. CD7 0 представляет собой цитокин, также называемый членом суперсемейства лигандов фактора некроза опухоли 7 (TNFSF7) и когнатным лигандом для CD27. Взаимодействия лиганда TNFSF с рецептором способны регулировать дифференциацию Т-зависимых В-клеток (Jacquot S. 2000 Immunol Res. 21(1):23-30) и индуцируют апоптоз клеток в различных клетках.
CD27:результаты лигирования CD70 в активации канонических и неканонических NF-K|3 сигнальных путей, что в свою очередь стимулирует пролиферацию В- и Т-клеток, дифференциацию плазматических клеток и последующую секрецию антител (Yamamoto, Н. 1998 J Immunol. 161(9):4753-9). Костимуляция CD27 при помощи ОХ40, 4-1ВВ также способствует выживанию активированных Т-клеток (Croft, М. 2003 Cytokine Growth Factor Rev. 14(3-4): 265-73), тем самым регулируя количество эффекторных клеток и Т-клеток памяти, а также управляет функцией Т-клеток непосредственно стимулируя выработку цитокинов, таких как ИЛ-4 и Интерферон-гамма или модулируя ответы Т-клеток на действия других цитокинов, таких как ИЛ-2 и ИЛ-12.
Исследования, проведенные как на людях, так и животных свидетельствуют о важной роли пути CD27:CD70 в различных иммунных заболеваниях, включая системную красную волчанку (SLE)
(Doerner T Lupus 2004 13(5):283-9), ревматоидный артрит (Так,
РР et al. 1996 clin Immunol Immunopathol 80(2): 129-38) и
рассеянный склероз (Hintzen RQ et al.1991 J Neuroimmunol 35(1-
3) :211-7) . С другой стороны, CD7 0, как сообщалось,
экспрессируется в различной степени на злокачественных В-
клетках и комплекс CD70:CD27 способен опосредовать
противоопухолевый ответ посредством активации
противоопухолевого иммунитета и снижения роста опухоли (Borst J, Hendriks J and Xiao Y. 2005. Curr Opin Immunol. 17(3):275-81) . CD27 также может контролировать накопление CD4 + и CD8 + Т-клеток в местах инфекции (Hendricks et al. 2000 Nature Immunol 1, 433-440) .
CD7 0 не экспрессируется на нормальных, не кроветворных клетках. Экспрессия CD7 0, по-видимому, временно ограничена антиген-активированными Т- и В-клетками и его экспрессия подавляется при прекращении антигенной стимуляции. Данные из экспериментальная модель на животных показывают, что CD7 0 может способствовать развитию иммунологических расстройств, таких как, например, ревматоидный артрит (Brugnoni et al. , 1997 Immunol. Lett. 55:99-104), псориатический артрит (Brugnoni et al. , 1997, Immunol. Lett. 55:99-104) и волчанка (Oelke et al. , 2004, Arthritis Rheum. 50:1850-60). В дополнение к своей возможной роли в воспалительных ответах, CD7 0 также экспрессируется на различных трансформированных клетках, включая В-клетки лимфомы, клетки Ходжкина и Рида-Штернберга, злокачественные клетки неврального происхождения и ряд карцином.
Агонист-связывающие антитела к CD2 7, описанные в патенте W02008/051424 (Univ. South Hampton), были отмечены в качестве полезных для стимуляции Т-клеточного иммунитета и такие антитела имеют связывающий эпитоп, который обеспечивает их неизменность (отсутствие ингибирования) CD70.
В то время как исследования на грызунах, связанные с изменением CD2 7 и/или CD7 0 продемонстрировали потенциально важную роль взаимодействия этого лиганда рецептора, есть необходимость в создании человеческих антител, специфичных для
человеческого CD2 7 и других блокирующих агентов взаимодействия CD2 7:CD7 0, которые могут оказывать клинически полезное цитотоксическое, цитостатическое или иммуномодулирующее действие на СБ2 7-экспрессирующие клетки, в частности, не оказывая нежелательного агонистического воздействия на CD27-экспрессирующие клетки при отсутствии CD7 0. Такие соединения могут быть полезными лекарственными средствами для модулирования развития неопластических клеток или иммунных заболеваний, которые опосредованы С02 7-экспрессирующими клетками.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение предлагает человеческие,
моноклональные антитела, связывающиеся с CD27, способные блокировать действия, связанные с взаимодействием CD27-CD70 с клетками, тканями или органами субъекта-носителя. Предлагаются последовательности аминокислот примерных моноклональных антител, связывающихся с CD2 7, которые кодируются нуклеиновыми кислотами для экспрессии в клетке-хозяине. Кроме того, CD27 моноклональные антитела данного изобретения определяют по меньшей мере три неперекрывающихся эпитопа на внеклеточном домене CD2 7, у которых при зацеплении с антителом данного изобретения, предотвращается активация сигнального пути лигирования лиганда типа CD7 0 и нисходящей биологической активности.
Другим аспектом настоящего изобретения является выделенное анти-СБ2 7 антитело, вступающее в реакцию с эпитопом белка CD2 7, определенного остатками между позициями 21-191 белка CD27.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой выделенное антитело, имеющее последовательность вариабельного участка тяжелой цепи, выбранного из последовательностей, представленных под SEQ ID N0: 76, 78, 80, 102-126, 128-136 и 145-147, а также последовательность вариабельного участка легкой цепи, выбранную из последовательностей, представленных под SEQ ID N0: 77, 79, 81-101, 127, 137-144 и 148, включая варианты этих последовательностей, например, консервативные замены.
Еще один аспект настоящего изобретения представляет собой выделенное антитело, имеющее CDR последовательности тяжелой и легкой цепи, выбранные из последовательностей, представленных под SEQ ID N0: 1-75 и 151-158, включая варианты этих последовательностей, например, консервативные замены.
Другим аспектом настоящего изобретения является выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело данного изобретения.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к антителу, которое связывается с общим эпитопом, определенным участком белка, с которым связываются антитела С2177 и/или С218 6 или человеческие антитела, полученные из них, описанные в таблицах 30-39, или которые конкурируют за связывание с белком CD2 7 с антителами С2177 и/ или С218 6 или человеческими антителами, полученными из них, которые описаны в таблицах 3039. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данное изобретение относится к антителу, которое связывается с эпитопом внеклеточного домена CD27, определенного участком белка, с которым связывается антитело С2191 или человеческие антитела, полученные из него, которые описаны в таблицах 30-39 и конкурирует за связывание с белком CD27 с антителом С2191 или человеческими антителами, полученными из них, которые описаны в таблицах 30-39. В другом варианте осуществления настоящего изобретения данное изобретение относится к антителу, которое связывается с эпитопом внеклеточного домена CD27, определенного участком белка, с которым связывается антитело С2192 или человеческие антитела, полученные из него, которые описаны в таблицах 30-39 и конкурирует за связывание с белком CD27 с антителом С2192 или человеческими антителами, полученными из них, которые описаны в таблицах 30-39. В другом аспекте изобретение содержит антитело или его фрагмент, полученный из одного или более, чем одного антитела С2177, С2186, С2191 и С2192 или человеческих антител, полученных из них, которые описаны в таблицах 3 0-3 9, которые имеют другие функциональные характеристики связывания, представленные одним или более, чем одним антителом С2177, С2186, С2191 и С2192 или человеческими антителами, полученными из них, которые описаны в таблицах 30
39, такие как ингибирование связывания CD27 с CD70-положительными клетками.
Таким образом, один аспект настоящего изобретения
относится к сконструированному антителу, включающее
сконструированную (например, гуманизированную или
адаптированную к человеку) тяжелую и легкую цепь, где:
(1) вариабельный участок сконструированной тяжелой цепи содержит или получен из одного или нескольких участков, определяющих комплементарность (CDR) из тяжелой цепи мышиных антител С2177, С2191, С2192 и С2186 и каркасного участка из тяжелой цепи человеческого акцепторного антитела, а также дополнительно имеет одну или несколько замен остатков человеческого каркасного участка, а также
(2) вариабельный участок сконструированной легкой цепи содержит один или несколько участков, определяющих комплементарность из легкой цепи мышиных антител С2177, С2191, С2192 и С2186 и каркасного участка из легкой цепи человеческого акцепторного антитела, а также дополнительно имеет одну или несколько замен остатков человеческого каркасного участка; и
(3) сконструированное антитело специфически связывается с человеческим CD27 и препятствует его взаимодействию с CD70.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения сконструированное антитело может состоять из одной или нескольких CDR, которые затем конструируются при помощи одной или нескольких замен или делеций, например, те, которые на 90%, 95%, 98% или 99,5% идентичны одной или нескольким CDR антител С2177, С2191, С2192 и/или С2186.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к лечению или профилактике патологических состояний, связанных с биологической активностью CD27 путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества антитела по настоящему изобретению, его части, или смеси антител по настоящему изобретению или их частей пациенту, который нуждается в таком лечении.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение включает эпитопы антигена в качестве компонента вакцины.
Полипептиды или полинуклеотиды, кодирующие полипептидные эпитопы, описанные выше, включающие субфрагменты или трехмерные аналоги некоторых или всех из последовательностей под SEQ ID N0: 1 остатки 21-191 или консервативные изменения их, признаются антителами по данному изобретению. Полипептиды и полинуклеотиды могут быть использованы для активной иммунизации носителя, чтобы вызывать выработку антител против CD27, способных побороть или предотвратить патологические состояния, связанные с биологической активностью CD27.
Изобретение также относится к способам получения, очищения, разработки и упаковки антитела по изобретению для применения в лечении или профилактике патологических состояний, связанных с биологической активностью CD27 путем введения терапевтически или профилактически эффективного количества антитела или его части.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР
Фиг. 1 представляет собой график, показывающий эффекты антитела С2177 на пролиферацию Т-клеток.
Фиг. 2 показывает кристаллическую структуру тройного комплекса CD27:С2177:С2191. N-и С-концевые участки фрагмента CD2 7 помечены. Тяжелые цепи Fab-фрагментов темнее, чем их легкие цепи.
Фиг. 3 представляет собой схему контактов белка CD27 антитела С2177 с остатками белка CD27 (эпитопами), обведенными кругами и остатками антитела С2177 (паратопами) в прямоугольниках.
Фиг. 4 представляет собой схему контактов белка CD27 антитела С2191 с остатками белка CD27 (эпитопами), обведенными кругами и остатками антитела С2191 (паратопами) в прямоугольниках.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Сокращения
CDR - участок, определяющий комплементарность; CFSE карбоксифлуоресцеин диацетат, сукцинимидил эфир; ECD внеклеточный домен; FR - каркасный участок; Н - тяжелая цепь; GvHD реакция "трансплантат против хозяина"; L - легкая цепь;
IFN - интерферон (г, гамма); Ig - иммуноглобулин; Mab моноклональное антитело; ММР - матриксная металлопротеиназа; РВМС - мононуклеарные клетки периферической крови; VL вариабельный участок легкой цепи; VH - вариабельный участок тяжелой цепи.
Определения
В настоящем документе термин "антитело" включает в себя цельные антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент или его одиночную цепь. Таким образом, антитело включает в себя любой белок или пептид, содержащий молекулу, которая содержит по меньшей мере часть молекулы иммуноглобулина, включая, но не ограничиваясь, содержащими по меньшей мере один участок, определяющий комплементарность (CDR), тяжелой или легкой цепи или его лигандсвязывающая часть, вариабельный участок тяжелой цепи или легкой цепи, константный участок тяжелой цепи или легкой цепи, каркасный (FR) участок или любая его часть или по меньшей мере одна часть связывающего белка, которая может быть встроена в антитело настоящего изобретения. Предполагается, что термин "антитело" дополнительно охватывает антитела, фрагменты расщепления, их конкретные части и варианты, включая антитела-миметики или антитела, содержащие фрагменты антител, имитирующие структуру и/или функцию антитела или его конкретного фрагмента или части, включая одноцепочечные и однодоменные антитела и их фрагменты. Функциональные фрагменты включают в себя антигенсвязывающие фрагменты для предварительно выбранной мишени. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают в себя (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН; (ii) F(ab')2-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и СН; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) dAb-фрагмент (Ward et al., (1989 г.) Nature 341:544-546), состоящий из домена VH; и (vi) выделенный участок, определяющий комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента (VL и VH) кодируются отдельными генами,
с использованием рекомбинантных способов их можно соединять синтетическим линкером в единую белковую цепь со спаренными областями VL и VH, образующими моновалентные молекулы
(известные как одноцепочечная Fv (scFv); см., например, Bird et al. (I 988) Science 242:423-426, and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883). Также предполагается, что такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антигенсвязывающая часть" антитела. Такие фрагменты антител получают с использованием традиционных методов, известных специалистам в данной области, а отбор фрагментов на возможность использования проводят таким же образом, как и интактные антитела. С другой стороны, можно использовать библиотеки конструктов scFv для отбора на антигенсвязывающую способность, а затем, используя традиционные методы, провести их сплайсинг с другими ДНК, кодирующими человеческие последовательности зародышевой линии. Одним из примеров такой библиотеки является HuCAL: Human Combinatorial Antibody Library
(Knappik, A. et al. J Mol Biol (2000 r.) 296(1) :57-86) .
Термин "CDR" означает участок, определяющий
комплементарность или гипервариабельный участок аминокислотного остатка антитела, который участвует в или отвечает за связывание с антигеном. Гипервариабельный участок или CDR человеческого подтипа IgG антитела содержит остатки аминокислот из остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в вариабельном домене легкой цепи 31-35 (HI), 50-65 (Н2) и 95-102 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано Rabat et al.
(1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.) и/или те остатки из гипервариабельной петли (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в вариабельном домене легкой цепи и 26-32 (HI), 53-55 (Н2) или текущее определение Н2 Chothia 52-57 и 96-101 (НЗ) в вариабельном домене тяжелой цепи, как описано (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)).
Каркасный участок или остатки FR1-4 являются остатками вариабельного домена, отличающиеся от и заключающие в скобки
гипервариабельные участки. В последнее время была разработана и широко внедрена универсальная система нумерации - международная информационная система ImMunoGeneTics(r) (IMGT) (LaFranc, et al., 2005 г., Nucl Acids Res. 33:D593-D597).
В настоящем документе CDR обозначают как по аминокислотной
последовательности, так и по положению в легкой или тяжелой
цепи в последовательной нумерации. Поскольку "положение" CDR в
структуре вариабельного домена иммуноглобулина сохраняется
между видами и присутствует в структурах, называемых петлями, с
помощью системы нумерации, которая выравнивает
последовательности вариабельного домена в соответствии со структурными особенностями, CDR и каркасные остатки легко идентифицируются. Эта информация используется в трансплантации и замене остатков CDR иммуноглобулинов одного вида на каркасный участок акцептора, как правило, из человеческого антитела.
Термин "CD27" относится к суперсемейству человеческого рецептора ФИО (TNFSF27), продукту человеческого гена 939 (гена CD27), также именуемого человеческим рецептором CD27L, MGC20393, S152, Т14, Т-клеточному активационному антигену CD27 и включает все варианты, изоформы и гомологи видов CD27. Экспресированный человеческий CD27 (Национальный центр биотехнологической информации. Номер доступа NP_001233) является полипептидом 2 60 аминокислот, которые на N-конечном фрагменте имеют 2О-аминокислотный сигнал секреции. Таким образом, антитела по данному изобретению в некоторых случаях могут вступать в перекрестную реакцию с CD2 7 других видов помимо человеческого. В других случаях антитела могут быть полностью специфичными для человеческого CD27 и не показывать видовую перекрестную реактивность или перекрестную реактивность других типов. Под биологической активностью CD27 подразумеваются любые нисходящие активности, возникающие в результате связывания и/или активации рецептора CD27 в результате активации CD27 одним или несколькими лигандами, в особенности полипептидами CD70 (TNFSF7, NP_001243) или другими лигандами, такими как SIVA. CD27 переобразует сигналы, что
приводит к активации NF-K--|3 И MAPK8/JNK. Адапторные белки TRAF2 и TRAF5 показали опосредование процесса сигнализирования данного рецептора. Биологические активности CD27 могут также возникать в результате связывания определенных процессированных форм CD2 7 или фрагментов CD2 7 с лигандами, которые сами по себе проявляют биологическую активность, например, полипептид, состоящий из приблизительно 21-191 остатка непроцессированного белка может связываться с CD70. Цитоплазматический концевой сегмент антигена CD27, остатки 213-260, связывается с N-концевым фрагментом белка SIVA (также именуемым фактором, индуцирующим апоптоз: CD27BP; SIVA1, Siva-1, NP_006418 (175 аа)); и Siva-2, SIVA2, NP_068355 (110 аа).
Термин "эпитоп" означает белковую детерминанту, способную к специфическому связыванию с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностно расположенных групп молекул, таких как аминокислотные или сахарные боковые цепи, а также обычно имеют специфическую трехмерную структуру, а также специфические зарядовые характеристики. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что в присутствии денатурирующих растворителей теряется связывание с первыми, но не теряется связывание со вторыми.
"Гуманизация" (также именуемая реконструированием или CDR-трансплантацией) или "инженерия" включает установленные методы снижения иммуногенности моноклональных антител (mAbs) из ксеногенных источников (как правило, грызунов) и улучшения аффинности или эффекторной функции (ADCC, активация комплемента, связывание Clq) . Сконструированное моноклональное антитело можно вырабатывать с использованием методов молекулярной биологии, при помощи рандомизированных последовательностей, отображаемых фагом или синтезированных de novo. Например, с целью создания гуманизированного антитела с включенными участками CDR нечеловеческих видов, проект может содержать вариации, такие как консервативные замены аминокислот в остатках CDR и обратную замену остатков нечеловеческого моноклонального антитела на человеческие каркасные участки
(обратные мутации). Позиции можно различать или
идентифицировать при помощи методов сравнения
последовательностей, анализа согласованной последовательности
или структурного анализа 3D структуры вариабельных участков.
Существуют компьютерные программы, которые иллюстрируют и
отображают возможные трехмерные конформационные структуры
выбранных потенциальных последовательностей иммуноглобулинов.
Изучение этих изображений позволяет проанализировать вероятную
роль остатков в функционировании потенциальной
последовательности иммуноглобулина, то есть провести анализ
остатков, которые влияют на способность потенциального
иммуноглобулина к связыванию со своим антигеном. Таким же
образом или посредством алгоритмов выравнивания простых
последовательностей (например, Clustal W) можно выбирать
остатки FR (каркасного участка) из известных
последовательностей атитела, которые можно найти в таких
общедоступных базах данных как VBASE или Rabat, а согласованные
последовательности оптимизированы таким образом, что для
целевого(-ых) антигена(-ов) архивируется желаемая
характеристика антитела, такая как афинность. Поскольку наборы данных известных параметров структур антитела увеличиваются, тоже самое происходит с софистикацией и усовершенствованием данных технологий. Другим подходом к гуманизации является изменение только поверхностных остатков последовательностей грызунов с наиболее распространенными остатками, обнаруженными в человеческих моноклональных антителах и называется термином "изменение поверхности" или "венирование". На сегодняшний день известно и общедоступно большое количество последовательностей как человеческих, так и нечеловеческих иммуноглообулинов, которые применяются специалистами в данной области, например, база данных и инструменты, разработанные LeFranc et al можно найти под названием IMGT; веб-сайт, который курирует Национальный Центр Биологии США (NCBI); Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983) на сегодняшний день также значительно расширена и доступна в режиме онлайн, каждая из них включена в данный документ по
ссылке. Гуманизацию или инженерию антител можно выполнять с использованем любого известного метода или разработанного с использованием информации о последовательностях человеческого иммуноглобулина. Такие методы описаны, например, в патентах Winter U.S. Pat No. 6982361 and Bowdish et al. WO03/025019, содержания кторых включены в данный документ по ссылке.
При использовании в настоящем документе KD означает константу диссоциации, в частности KD антитела для заданного антигена. Она представляет собой меру аффинности антитела к конкретной мишени. Высокоаффинные антитела имеют KD = 1СГ8 М или менее, более предпочтительно 1СГ9 М или менее, еще более предпочтительно 1СГ10 М или менее в отношении заданного антигена. Величиной, обратной KD, является КА, константа ассоциации. Предполагается, что используемые в настоящем документе термины "kdis", или "к2", или "kd" означают скорость диссоциации конкретного взаимодействия антитело-антиген. "KD" -это отношение скорости диссоциации (к2), также называемой "скоростью диссоциации koff", к скорости ассоциации (ki) или "скорости ассоциации kon". Таким образом, величина KD равна k2/ki или koff/kon и выражается в виде молярной концентрации (М) . Следовательно, чем меньше значение KD, тем сильнее связывание. Таким образом, KD, равный 1СГ6 М (или 1 микроМ) , указывает на более слабое связывание, чем при 1СГ9 М (или 1 нМ). Эти значения можно рассчитать с использованием поверхностного плазмонного резонанса и/или метода Kinexa, как известно в данной области техники.
При использовании в настоящем документе термины "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител" означают препарат молекул антитела мономолекулярной композиции. Композиция моноклональных антител отображает одну специфичность связывания и аффинность к конкретному эпитопу. Этот термин также включает в себя "рекомбинантное антитело" и "рекомбинантное моноклональное антитело", так как все антитела получают, экспрессируют, создают или выделяют с использованием рекомбинантных средств, таких как (а) антитела, выделенные из животного или гибридомы, которые получают посредством слияния
секретирующих антитело клеток животных с клетками-партнерами слияния, (Ь) антитела, выделенные из клетки-хозяина, трансформированной для экспрессии антитела, например, из трансфектомы, (с) антитела, выделенные из рекомбинантной, комбинаторной человеческой библиотеки антител или библиотеки антител другого вида, а также (d) антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми иными средствами, включающими сплайсинг генных последовательностей иммуноглобулина с другими последовательностями ДНК. Предполагается, что при использовании в настоящем документе "выделенное антитело" означает антитело, по существу свободное от других антител с различными характеристиками антигенной специфичности. Выделенное антитело, которое специфически связывается с эпитопом, изоформой или вариантом человеческого CD27, тем не менее, иметь перекрестную реактивность с другими родственными антигенами, например, других видов (например, видовых гомологов). Кроме того, изолированное антитело может быть практически свободным от постороннего клеточного материала и (или) химических веществ. В одном варианте осуществления настоящего изобретения "выделенные" моноклональные антитела, имеющие различные характеристики специфичности, комбинируются в композиции тщательно определенного состава.
Используемые в настоящем документе термины "специфическое связывание", "иммуноспецифическое связывание" и "связывается иммуноспецифически" означают связывание антитела с заданным антигеном. Как правило, связывание антитела характеризуется константой диссоциации (KD) 1СГ7 М или менее. Связывание с предопределенным антигеном происходит при KD, в два раза меньшей, чем KD связывания с неспецифичным антигеном (например, BSA, казеин, или любой другой полипептид), отличным от предопределенного антигена. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфичное к антигену" используют в настоящем документе на взаимозаменяемой основе с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном" При использовании в настоящем документе "высокоспецифичное" связывание означает, что относительная KD антитела к
конкретному эпитопу-мишени по меньшей мере в 10 раз меньше, чем KD связывания этого антитела с другими лигандами.
При использовании в настоящем документе "изотип" означает класс антител (например, IgM или IgG), кодируемый генами константного участка тяжелой цепи. Некоторые классы антител дополнительно охватывают подклассы, которые также кодируются константными участками тяжелой цепи и дополнительно связываются с олигосахаридами по конкретным остаткам в доменах константного участка (например, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4), что дополнительно задает биологические функции антитела. Например, в человеческом антителе изотипы IgGl, IgG3 и в меньшей степени IgG2 демонстрируют эффекторные функции, как и мышиные антитела IgG2a.
Под "эффекторными" функциями и выражением "эффекторно положительный" понимается то, что антитело содержит домены, отличные от специфичных антигенсвязывающих доменов, которые могут взаимодействовать с рецепторами или другими компонентами крови, такими как система комплемента, что ведет, например, к привлечению макрофагов и событиям, ведущим к разрушению клеток, связанных с антигенсвязывающими доменами антитела. Антитела обладают несколькими эффекторными функциями, опосредованными связыванием с эффекторными молекулами. Например, связывание компонента С1 комплемента с антителами активирует систему комплемента. Активация системы комплемента важна для опсонизации и лизиса клеточных патогенов. Активация системы комплемента стимулирует воспалительный ответ и также может быть вовлечена в развитие аутоиммунной гиперчувствительности. Дополнительно антитела связываются с клетками с помощью Fc-участка, причем сайт Fc-рецептора на Fc-участке антитела связывается с Fc-рецептором (FcR) на клетке. Существуют множество Fc-рецепторов, специфичных для различных классов антител, включая IgG (гамма-рецепторы), IgE (эта-рецепторы), IgA (альфа-рецепторы) и IgM (мю-рецепторы). Связывание антитела с Fc-рецепторами на поверхностях клеток инициирует множество важных разнообразных биологических реакций, включая поглощение и деструкцию покрытых антителами частиц, выведение иммунных
комплексов, лизис покрытых антителами клеток-мишеней клетками-
киллерами (это называется антителозависимой
клеточноопосредованной цитотоксичностью, или ADCC),
высвобождение медиаторов воспаления, прохождение через плаценту
и контроль продукции иммуноглобулинов.
1. Состав антитела по изобретению
CD27-нейтрализующее антитело по изобретению представляет собой антитело, которое ингибирует, блокирует или препятствует по меньшей мере одной активности CD2 7 или связыванию с CD7 0 in vitro, in situ и/или in vivo и не способствует, не стимулирует, не индуцируют или не выступают в роли агониста активности CD2 7 или связывания лиганда и не имитирует связывания антител по нисходящему эффекту СБ27-лиганд лигирования, в частности взаимодействия CD7 0 с CD2 7, как сигнальной трансдукции в клетке-хозяине. Подходящее CD27-нейтрализующие антитело, определенная часть, или вариант может также, дополнительно влиять по меньшей мере на одину активность или функцию CD27,такую как, без ограничения, РНК, ДНК или синтез белка, высвобождение белка, активация Т-клеток, пролиферация или дифференциация В-клеток, секреция антитела, сигнализирование рецептора CD27, деградация CD27, связывание с лигандом CD27, индукция CD27 или CD7 0, синтез или секреция.
Лечение аутоиммунных заболеваний с повышенными эффекторными функциями Т-или В-клеток может быть полезным в отношении костимулирующей блокирующей активности пути CD2 7:CD7 0 CD27-нейтрализующих антител по настоящему изобретению.
Настоящее изобретение основано на открытии античеловеческих CD2 7 моноклональных антител, способных ингибировать активацию CD2 7 лигандом CD7 0 и не способных к самоактивации в отсутствие стимулятора CD7 0. Были получены гибридомы и трансфектомы, способные секретировать такие антитела. Применялся анализ репортерного гена NF-K(3 ДЛЯ определения нескольких потенциальных антител, способных ингибировать CD7О-опосредованную активацию гена-репортера NF-K|3 клеток-хозяев, экспрессирующих CD27. Во-вторых, антитела были
охарактеризованы как неспособные индуцировать дозозависимую агонистическую активность при инкубации с CD2 7 в сочетании с клетками, трансфецированными репортером люциферазы при отсутствии стимулятора CD70. В-третьих, было показано, что антитела в зависимости от дозы ингибируют CD7О-зависимую пролиферацию человеческих наивных CD4 Т-клеток. В-четвертых, полученные CD27-нейтрализующие антитела, способны уменьшать CD7О-опосредованную стимуляцию генерации плазматических клеток из человеческих первичных В-клеток в зависимости от дозы. В-пятых, при исследовании антител к CD27 не наблюдалась значительная дозозависимая агонистическая активность в первичных Т- или В-клетках.
Антитела по изобретению могут препятствовать лигированию CD27:CD70, ингибировать как эффекторные функции Т-клеток, так и дифференциацию В-клеток в плазматические клетки в культуре клеток и, таким образом, могут быть полезными для лечения иммуноопосредованных заболеваний, включая, но не ограничиваясь, следующими: ревматоидный артрит, системная красная волчанка, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, хроническая обструктивная болезнь легких или другой синдром, патологию, заболевание или расстройство, связанные с аберрантными функциями или активацией клеточных популяций, экспрессирующих CD27. С027-связывающие антитела, описанные в данном документе, распознают по меньшей мере три отдельных участка на внеклеточном домене человеческого CD27, что указывает на дополнительное открытие нескольких мест на CD2 7, подходящих для нацеливания антител или других соединений с возможностями блокирования аналогичной функции. Таким образом, экспрессия и очистка антителосвязывающих доменов, представленных в данном документа в качестве аминокислотных последовательностей, дополнительно предлагает инструмент, который может быть средством для отбора новых молекул, проявляющих CD27-нейтрализующую активность.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения анти-человеческое CD27 антитело имеет связывающий участок, содержащий вариабельный участок легкой цепи (VL) или
вариабельный участок тяжелой цепи (VH), имеющий аминокислотную последовательность, как показано в SEQ ID N0: 76-144 и антитело которого или связывающая часть иммуноспецифически связывается с CD27. В другом варианте осуществления настоящего изобретения, антитело или его часть, связывающая антиген, связывается с белком CD2 7 и, кроме того, антитела обладают указанными функциональными свойствами антител по изобретению, например:
связывание с иммобилизованным человеческим CD2 7;
ингибирование человеческого растворимого связывания CD27 с клетками, экспрессирующими CD7 0;
ингибирование человеческого CD7 0, опосредывающего сигнализирование CD2 7, измеренного с применением анализа репортерного гена NF-kappaB на уровне IC50 менее 0,5 мкг/мл;
ингибирование CD7О-опосредованной пролиферации наивных Т-клеток;
ингибирование CD7О-опосредованного образования бластных клеток плазмы из первичных В-клеток человека;
ингибирование человеческого CD7О-опосредованного
высвобождения растворимого медиатора из первичных клеток или клеточных линий Т и В;
связывание с человеческим CD27 с Kd менее 100 нМ (10~7 М);
минимальная активации сигнализирования CD2 7 в отсутствие стимулятора CD7 0; и
связывание с эпитопом на человеческом внеклеточном домене CD2 7, с которым связываются моноклональные антитела, имеющие одну или несколько последовательностей вариабельных участков из SEQ ID N0: 76-144 и конкурирует за связывание с моноклональными антителами, имеющими одну или несколько последовательностей вариабельных участков из SEQ ID N0: 7 6-144.
Поскольку хорошо известно в данной области техники, что CDR домены антител тяжелой и легкой цепей играют особенно важную роль в специфичности/аффинности привязки антитела к антигену, рекомбинантные антитела по изобретению, которые описываются здесь, предпочтительно содержат один или несколько CDR тяжелой и легкой цепи из SEQ ID N0: 1-75. Такие антитела можно получить путем химического соединения различных частей
(например, CDR, каркасный участок) антитела с использованием обычных методов, путем подготовки и экспрессии (т.е. одной или нескольких) молекул нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, с использованием обычных методов технологии рекомбинантной ДНК или с использованием любого другого подходящего метода.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения человеческие антитела по изобретению имеют последовательность одного или нескольких CDR тяжелой и легкой цепи SEQ ID N0: 175. В дополнение к этим последовательностям CDR, специалисту в данной области будет понятно, что возможны или желаемы некоторые отклонения от точных последовательностей CDR, в то время, как сохраняется способность к связыванию антитела с CD27 (например, консервативные замены). Соответственно, в другом варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело может состоять из одного или нескольких CDR, которые, например, на 90%, 95%, 98% или 99,5% идентичны с CDR, перечисленным в SEQ ID N0: 1-75.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения, эпитоп, связанный с антителами по изобретению, содержит всего лишь пять из всех остатков 21-191 белка CD27 или его последовательность, кодирующую нуклеиновую кислоту, можно использовать для иммунизации пациента для выработки антител по изобретению непосредственно в носителе с целью лечения, профилактики, или облегчения заболевания или симптомов заболевания, связанного с выработкой CD27.
2. Генерация CD27-нейтрализующих антител
С02 7-нейтрализирующее антитело, проявляющее желаемый спектр биоактивности, как приведено в качестве примера в данном документе, в качестве раскрытых и описанных антител, может быть получено с использование различных методик, в том числе метода стандартной гибридизации соматических клеток (метод гибридомы) согласно Kohler и Milstein (1975) Nature 256:495. При получении гибридомы мышь или другое подходящее животное, например, хомячка или макаку, иммунизируют описанным в настоящем документе способом, чтобы выделить лимфоциты, производящие или
способные производить антитела, специфически связывающиеся с белками, используемыми для иммунизации. Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro. Затем проводят слияние лимфоцитов с клетками миеломы с использованием подходящего агента слияния, такого как полиэтиленгликоль, для образования клетки гибридомы (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, C.59-103 (Academic Press, 1986)).
СБ2 7-нейтрализирующее антитело также можно дополнительно генерировать путем иммунизации трансгенных животных (например, мышей, крыс, хомяков, нечеловекоподобных приматов, и т.п.), способных продуцировать спектр человеческих антител, как описано здесь и/или как известно в данной области техники. Клетки, продуцирующие человеческие антитела к CD2 7, можно выделить из организма таких животных и сделать бессмертными с помощью подходящих методов, например, таких, которые описаны в данном документе. В другом случае, последовательности, кодирующие антитело, можно клонировать, ввести в подходящий вектор и использовать для трансфекции клетки-хозяина, чтобы экспрессировать и выделить антитела описанными в настоящем документе методами и другими методами, известными специалистам в данной области.
С помощью трансгенных мышей, несущих в зародышевых клетках локус человеческого иммуноглобулина (Ig), можно получить высокоаффинные полностью человеческие моноклональные антитела к ряду мишеней, в том числе к человеческим аутоантигенам, к которым нормальная человеческая иммунная система толерантна (Lonberg, N. et al., US5569825, US6300129 and 1994, Nature 368:856-9; Green, L. et al. , 1994, Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Мед. 188:483-95; Lonberg, N and Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Kucherlapati, et al. US6713610; Bruggemann, M. et al. , 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-1326; Fishwild, D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez, M. et al. , 1997, Nat. Genet. 15:146-156; Green, L., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23; Yang, X. et al. , 1999, Cancer Res. 59:1236-1243; Bruggemann, M. and Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997;
Tomizuka et al. WO02043478). Эндогенный локус иммуноглобулина у таких мышей можно разрушить или подвергнуть делеции, чтобы таким образом лишить животное способности образовывать антитела, кодируемые эндогенным генами. Кроме того, человеческие антитела к избранным антигенам можно заказать в компаниях, например, в Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) или Medarex (San Jose, Calif.), которые изготовят их с помощью методов, описанных выше.
В варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело выбрали из фаговой библиотеки, где фаг содержал гены человеческого иммуноглобулина, экспрессирующей связывающие домены человеческого антитела, например, одноцепочечных антител (scFv) типа или других конструктов со спаренными или неспаренными вариабельными участками (Vaughan et lo al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. PITAS (USA) 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al. J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Человеческие моноклональные антитела по данному изобретения можно приготовить с использованием методов фагового дисплея для скриннинга библиотек генов человеческих иммуноглобулинов. Такое применение метода фагового дисплея для выделения человеческих антител хорошо известно в данной области. См., например патенты США: В патентах США №№ 52234 09; 5403484; и 5571698 к Ladner et al. ; патенты США №№ 5427908 и 5580717 к Dower et al.; патенты США №№ 5969108 и 6172197 к McCafferty et al. ; патенты США №№ 5885793; 6521404; 6544731; 6555313; 6582915 и 6593081 к Griffiths et al.
Получение иммуногенных антигенов и моноклональных антител можно осуществить с использованием любой подходящей технологии, такой как выработка рекомбинантного белка. Иммуногенные антигены можно вводить в организм животного в виде очищенного белка или смесей белков, в том числе цельных клеток или клеточных или тканевых экстрактов или антиген можно создать de novo в теле животного из нуклеиновых кислот, кодирующих указанный антиген или его часть.
Как хорошо известно специалистам, выделенные нуклеиновые
кислоты, составляющие предмет настоящего изобретения, могут быть получены с использованием (а) рекомбинантных способов, (Ь) синтетических способов, (с) способов очистки или их сочетаний. ДНК, кодирующую моноклональные антитела, легко выделяют и секвенируют с использованием методов, известных в данной области техники (например, с использованием олигонуклеотидных зондов, которые способны специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи мышиных антител). При создании гибридом такие клетки могут служить источником такой ДНК. В альтернативном случае, при использовании метода дисплея со слиянием кодирующей последовательности и продукта трансляции (например, фаговых или рибосомальных библиотек), селекция связующего звена и нуклеиновой кислоты упрощена. После фаговой селекции участки фага, кодирующие антитело, можно изолировать и использовать для синтеза целых антител, включая человеческие, или любых других желаемых антигенсвязывающих фрагментов, и экспрессировать в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжи и бактерии.
Гуманизированные антитела
Кроме того, изобретение предлагает гуманизированные
(сконструированные или адаптированные к человеку)
иммуноглобулины (или антитела), которые связываются с
человеческим CD27. Гуманизированные формы иммуноглобулинов
имеют вариабельные каркасные участки, в основном из
человеческого иммуноглобулина (называемого акцепторным
иммуноглобулином) и CDR в основном из нечеловеческого
моноклонального антитела, которое специфически связывается с
CD27. Константный участок (участки), пи наличии, также по
существу происходят от человеческого иммуноглобулина.
Гуманизированные антитела показывают KD для CD2 7 равную по
меньшей мере приблизительно 1СГ6 М (1 микроМ), приблизительно
1СГ7 М (100 нМ) или ниже. Аффинность связывания гуманизированных
антител может быть больше или меньше, чем таковая у антител
мыши, из которого они были получены. Для обеспечения изменения
аффинности, например, для повышения аффинности
гуманизированного антитела к CD2 7, могут быть сделаны замены либо в остатках CDR, либо в человеческих остатках.
Замещение мышиных CDR на вариабельный каркасный участок домена человека, скорее всего, приведет к удержанию их правильной ориентации в пространстве, если вариабельный каркасный участок домена человека адаптирует такую же или аналогичную конформацию к мышиному вариабельному каркасному участку, из которого происходит CDR. Это достигается за счет получения человеческих вариабельных доменов антител человека, каркасные последовательности которых проявляют высокую степень идентичности последовательности с мышиными вариабельными доменами каркасных участков, из которых происходят CDR. Вариабельные участки каркаса тяжелой и легкой цепей могут происходить от тех же или других последовательностей человеческого антитела. Последовательности человеческого антитела могут представлять собой последовательности человеческих антител природного происхождения, могут быть получены из последовательностей человеческого иммуноглобулина зародышевой линии или могут быть общими типичными последовательностями из нескольких человеческих антител и/или последовательностей зародышевой линии.
Подходящие последовательности человеческого антитела определяют путем компьютерного сравнения аминокислотных последовательностей мышиных вариабельных участков с последовательностями известных человеческих антител. Сравнение проводится отдельно для тяжелой и легкой цепей, но принципы в обоих случаях аналогичны.
В одном примере, аминокислотная последовательность CD27-нейтрализующего моноклонального антитела используется для запроса в базу данных человеческих антител, составленной из общедоступных баз данных последовательностей антител. Вариабельные участки тяжелой цепи, раскрытые или описанные здесь, можно использовать для поиска человеческого вариабельного участка с самой высокой идентичностью последовательностей. Вариабельный участок легкой цепи, раскрытый или описанный здесь, также можно использовать для
поиска человеческого вариабельного участка с самой высокой идентичностью последовательностей. ДНК-конструкцию, в которой участки, кодирующие CDR одного из вариабельных участков тяжелой цепи донора мышиного моноклонального антитела, перемещают в выбранную вариабельную последовательность человеческой тяжелой цепи, заменяя CDR человеческого вариабельногого участка, получают для каждого мышиного вариабельного участка.
Неестественное соседство мышиных участков CDR с
человеческим вариабельным каркасным участком может приводить к
неестественным конформационным ограничениям, которые, если их
не скорректировать посредством замещения некоторых
аминокислотных остатков, могут привести к потере аффинности
связывания. Как отмечалось выше, гуманизированные антитела по
изобретению содержат вариабельный каркасный участок, в основном
из человеческого иммуноглобулина, а также CDR, в основном из
мышиного иммуноглобулина (например, мышиные антитела С2177,
С2186, С2191 или С2192). После определения CDR мышиных антител
и соответствующих последовательностей акцепторного
иммуноглобулина человека, следующим шагом является определение, какие (либо никаких) остатки этих компонентов следует заместить, чтобы оптимизировать свойства полученного гуманизированного антитела. В целом, замена аминокислотных остатков человека мышиными должна быть сведена к минимуму, поскольку введение мышиных остатков увеличивает риск того, что антитело может вызвать НАМА-ответ в организме человека. Аминокислоты для замещения выбирают на основе их возможного влияния на конформацию CDR и/или связывание с антигеном. Исследование такого возможного влияния можно провести путем моделирования, исследования характеристик аминокислот в конкретных позициях или эмпирического наблюдения эффектов замещения или мутагенеза конкретных аминокислот. Эмпирическим способом было обнаружено, что особенно удобно создать библиотеку вариантов последовательностей, которые можно проверять на требуемую активность, аффинность связывания или специфичность. Одним форматом создания такой библиотеки вариантов является вектор фагового дисплея. В альтернативном
варианте осуществления варианты могут быть получены с использованием других способов изменения положения нуклеотидной последовательности, кодирующей целевые остатки в вариабельном домене.
Другой способ определения необходимости в дополнительных
заменах и выбор аминокислотных остатков для замены может быть
реализован с использованием компьютерного моделирования. Широко
доступно компьютерное аппаратное и программное обеспечение для
получения трехмерных изображений молекул иммуноглобулина. Как
правило, молекулярные модели получают, начиная с рассчитанных
структур иммуноглобулиновых цепей или их доменов. Моделируемые
цепи сравнивают по сходству аминокислотной последовательности с
цепями или доменами с рассчитанными трехмерными структурами, и
цепи или домены, имеющие наибольшее сходство
последовательности, отбирают в качестве исходных точек для построения молекулярной модели. Рассчитанные трехмерные структуры модифицируют, чтобы учесть различия между фактическими аминокислотами иммуноглобулиновых цепей или моделируемыми доменами, а также различия в исходной структуре. Затем модифицированные структуры собирают в составной иммуноглобулин. Наконец, модель уточняют путем минимизации энергии и проверки того, что все атомы находятся на соответствующих расстояниях друг от друга, а длины и углы связи находятся в допустимых с химической точки зрения пределах.
Обычно участки CDR в гуманизированных антителах являются в основном идентичными и чаще всего идентичны соответствующим участкам CDR в мышином антителе, из которого они были получены. Хотя это нежелательно, иногда возможно сделать одну или несколько консервативных аминокислотных замен остатков CDR без заметного влияния на аффинность связывания полученного гуманизированного иммуноглобулина. Иногда замены участков CDR могут повысить афинность связывания.
В отличии от специфичных аминокислотных замен, рассматриваемых выше, каркасные участки гуманизированных иммуноглобулинов обычно в основном идентичны и чаще всего идентичны каркасным участкам человеческих антител, из которых
они были получены. Разумеется, многие аминокислоты в каркасных участках вносят минимальный вклад или не вносят никакого вклада в специфичность или аффинность антитела. Таким образом, многие отдельные консервативные замены аминокислотных остатков каркасного участка практически не отражаются на специфичности или аффинности полученного гуманизированного иммуноглобулина.
Так как код является вырожденным, аминокислотную
последовательность каждого иммуноглобулина будут кодировать
различные нуклеотидные последовательности. Требуемую
нуклеотидную последовательность можно получить твердофазным синтезом ДНК de nova или с помощью ПЦР-мутагенеза ранее полученного варианта требуемого полинуклеотида. Все нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, описанные в настоящей заявке, явным образом включены в настоящее изобретение.
Вариабельные сегменты гуманизированных антител,
сконструированных вышеописанным способом, обычно соединены как минимум с частью константной области человеческого иммуноглобулина. В составе антитела будут константные участки и легкой, и тяжелой цепи. Константный участок тяжелой цепи обычно содержит домены СН1, шарнирный, СН2, СНЗ и иногда СН4.
Гуманизированные антитела могут содержать константные
домены любого типа из любого класса антител, включая IgM, IgG,
IgD, IgA и IgE, а также любого подкласса (изотипа), включая
IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. Когда требуется, чтобы
гуманизированное антитело показывало цитотоксическую
активность, константный домен, как правило, представляет собой
комплементсвязывающий константный домен, а класс, как правило,
представляет собой IgGi. Когда такая цитотоксическая активность
нежелательна, в качестве константного домена можно использовать
IgG2. Гуманизированное антитело может содержать
последовательности более чем из одного класса или изотипа.
В векторы экспрессии вставляют нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные вариабельные участки легкой и тяжелой цепей, необязательно соединенные с константными участками. Легкую и тяжелую цепи можно клонировать в одном или в разных векторах экспрессии. ДНК-сегменты, кодирующие
иммуноглобулиновые цепи, функционально соединяют в векторе (векторах) экспрессии с контрольными последовательностями, обеспечивающими экспрессию иммуноглобулиновых полипептидов. Такие контрольные последовательности включают сигнальную последовательность, промотор, энхансер и последовательность терминатора транскрипции (см. Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989 г.); WO 90/07861, Co et al. , J. Immunol. 148, 1149 (1992), которые включены во всей полноте в настоящий документ посредством ссылки).
Эффективность терапевтического белка может быть ограничена
нежелательными иммунными реакциями. Нечеловеческие
моноклональные антитела могут иметь значительные протяженности линейных аминокислотных последовательностей и локальные структурные конформации, способные вызвать у человека иммунный ответ. Первой попыткой снизить иммуногенность нечеловеческих антител было создание химер человеческо-мышиных антител, за которым последовала разработка методов гуманизации этих химер в конце 198 0-х гг. (рассмотрено в публикации Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 1619-1633, 2008) .
Одним из наиболее часто используемых подходов гуманизации является так называемая "трансплантация участков, определяющих комплементарность (CDR)", в котором мышиные CDR трансплантируют на каркасные участки (FR) человеческого антитела. Тем не менее, применение этого метода чаще приводит, чем не приводит к существенной потере связывания с антигеном и, следовательно, к снижению иммуногенного потенциала препарата, изготовленного на основе антител. Следовательно, крайне важно использовать четкие принципы создания молекул антитела, проявляющего минимальные иммуногенные реакции и при этом сохраняющего связывающие и биофизические свойства материнской нечеловеческой молекулы при введении человеку.
Описана гуманизация двух мышиных моноклональных антител (mAb) 2177 и 2191 со специфичностью связывания с CD27. Каркасные участки (FR) этих антител были заменены каркасными участками человеческого гена зародышевой линии с использованием первого шага собственной технологии гуманизации Janssen под
названием Адаптация человеческого каркасного участка (HFA), раскрытой в заявке на патент Raghunathan, G., US20090118127 Al и далее приведенной в качестве примера в публикации Fransson et al (J Mol Biol 398:214-231, 2010). Данная технология обеспечивает набор моноклональных антител, специфичных для CD2 7 с улучшенными свойствами связывания и ингибирования относительно измеренных у родительских мышиных антител 2177 и 2191.
3. Способы применения анти-СБ27 антитела
Как подробно описано ниже, настоящее изобретение демонстрирует, что четыре выделенных моноклональных антитела (С2177, С2186, С2191 и С2192) связываются с тремя неперекрывающимися эпитопами на CD2 7 и отображают действие, ингибирующее CD2 7 in vitro и/или in vivo. Важно отметить, что реакционная способность моноклональных антител включает в себя способность блокировать взаимодействие CD27 с CD70 в зависимости от дозы, понижать сигнализацию CD2 7 в присутствии CD70, уменьшать выработку ИЛ-4 и IFNg Т-клетками и ингибировать CD70-зависимую пролиферацию человеческих наивных CD4 + Т-клеток, CD70-зависимую пролиферацию В-клеток и генерацию плазматических клеток. Кроме того, отдельные антитела существенно не индуцируют активацию CD2 7 при отсутствии стимулятора CD7 0.
С учетом свойств моноклональных антител, как описано в настоящем изобретении, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты подходят в качестве терапевтических и профилактических средств для лечения или профилактики CD27-ассоциированных состояний в организме человека и животных.
В общем, применение будет включать в себя введение терапевтически или профилактически эффективного количества одного или нескольких моноклональных антител или антигенсвязывающих фрагментов по данному изобретению или выбранных антител или молекул с аналогичным спектром связывания и биологической активности, восприимчивому пациенту или такому, у которого проявляется состояние, в котором активность CD27, как известно, имеет патологические осложнения, например,
иммунологическое заболевание или рост опухоли и метастаз. Вводить можно любую активную форму антитела, в том числе фрагменты Fab и F(ab')2.
Предпочтительно использовать антитела, совместимые с видом реципиента, чтобы действие МАЬ не было слишком коротким или не индуцировало у субъекта иммунный ответ на МАЬ. Введенные моноклональные антитела могут демонстрировать некоторые вспомогательные функции, такие как связывание с Fc-рецепторами пациента и активацию механизмов ADCC, для того, чтобы истощить популяцию клеток-мишеней с использованием цитолитических или цитотоксичесих механизмов или они могут быть разработаны с ограниченными или отсутствующими вторичными эффекторными функциями в целях сохранения популяции клеток-мишеней. Лечение индивидуумов может заключаться во введении терапевтически эффективного количества антител настоящего изобретения. Антитела могут быть в составе набора, описанного ниже. Антитела можно использовать или вводить в виде смесей, например, в равных количествах, или по отдельности, в определенной последовательности, или вводить все одновременно. При назначении пациенту антител или их фрагментов, способных связываться с CD27, или антитела, обеспечивающего защиту от CD27, требуется коррекция дозы лекарственного средства в зависимости от таких факторов как возраст пациента, вес, рост, пол, общее состояние, предшествующий анамнез и т.д.
При похожей методике другим способом терапевтического применения моноклонального антитела настоящего изобретения может быть активная иммунизация пациента антиидиотипическим антителом к одному из представленных моноклональных антител. Иммунизация антиидиотипом, который имитирует структуру эпитопа, может вызвать активный ответ анти-СБ27 (Linthicum, D. S. and Farid, N. R., Anti-idiotypes, Receptors, and Molecular Mimicry (1988), C. 1-5 и 285-300).
Более того, активную иммунизацию можно индуцировать, включив в состав вакцины один и более антигенных и (или) иммуногенных эпитопов. Вакцинацию в целях профилактики или терапии можно проводить орально или парентерально, в
количестве, достаточном для генерации реципиентом защитных антител к этим биологически активным участкам. Хозяина можно активно иммунизировать антигенным/иммуногенным пептидом в чистом виде, фрагментом этого пептида, или модифицированной формой пептида. К N-или С-концу оригинального пептида или его части можно добавить одну и более аминокислот, отсутствующих в оригинальной последовательности белка. Такие дополнительные аминокислоты обычно включают для обеспечения взаимодействия пептида с другим пептидом, с белком-носителем или с подложкой. Аминокислоты, которые являются полезными для этих целей, включают: тирозин, лизин, глутаминовую кислоту, аспарагиновую кислоту, цистеин и их производные. Можно использовать альтернативные методы модификации белка, например, NH2-ацетилирование или СООН-концевое амидирование, чтобы обеспечить дополнительные средства для соединения или слияния пептида с другой молекулой белка или пептида, или с подложкой.
Пациенты должны получать антитела, способные защищать от нежелательной биоактивности CD27, в количестве, достаточном для того, чтобы уменьшать, лечить или облегчать связанные с CD27 симптомы или патологии. Если при данной дозировке, способе введения и графике приема лекарственного средства возможно добиться облегчения симптомов, то количество лекарственного средства можно считать достаточным или "терапевтически эффективным количеством". Ответную реакцию на введение антитела можно измерить, анализируя ткани, органы или клетки субъекта методами визуализации или получая образцы тканей и изучая их ех vivo. Вещество считается физиологически значимым, если его присутствие вызывает поддающиеся обнаружению изменения физиологии реципиента.
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
CD27-нейтрализующие антитела по настоящему изобретению, антигенсвязывающие фрагменты или их указанные варианты можно использовать для измерения или вызова действия в клетке, ткани, органе или животном (включая млекопитающих и людей), для диагностики, мониторинга, модулирования, лечения, облегчения, помощи в предотвращении заболеваемости или уменьшения симптомов
состояния, опосредованного, затрагиваемого или модулированного CD27 или клетками, экспрессирующими CD27. Таким образом, предметом настоящего изобретения является также метод подавления или лечения по меньшей мере одного связанного с CD27 заболевания с помощью по меньшей мере одного антитела CD27 настоящего изобретения, в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, как известно специалистам в данной области или раскрыто в настоящем документе. Особые указания будут рассмотрены ниже.
Иммунологические заболевания
Предметом настоящего изобретения является также метод
подавления или лечения связанных с иммунитетом заболеваний в
клетке, ткани, органе, организме животного или пациента,
включая, но не ограничиваясь следующими:ревматоидный артрит,
ювенильный ревматоидный артрит, ювенильный ревматоидный артрит
с системным началом, псориатический артрит, анкилозирующий
спондилит, язва желудка, серонегативные артропатии,
остеоартрит, воспалительное заболевание кишечника, язвенный
колит, системная красная волчанка, антифосфолипидный синдром,
иридоциклит/увеит/ретробульбарный неврит, идиопатический
пневмосклероз, системный васкулит/гранулематоз Вегенера,
саркоидоз, орхит/процедуры реверсивной вазэктомии,
аллергические/атопические заболевания, астма, аллергический
ринит, атопический дерматит (экзема), аллергический контактный
дерматит, аллергический конъюнктивит, гиперчувствительный
пневмонит, трансплантаты, отторжение пересаженного органа,
реакция "трансплантат против хозяина", синдром системной
воспалительной реакции, синдром сепсиса, грамположительный
сепсис, грамотрицательный сепсис, негативный сепсис культуры,
грибковый сепсис, нейтропеническая лихорадка, уросепсис,
менингококкемия, травма/кровотечение, ожоги, облучение
ионизирующим излучением, острый панкреатит, респираторный
дистресс-синдром взрослых, ревматоидный артрит,
спровоцированный алкоголем гепатит, хронические воспалительные патологии, болезнь Крона, серповидноклеточная анемия, сахарный диабет, нефроз, другие атопические заболевания, реакции
гиперчувствительности, аллергический ринит, поллиноз,
хронический аллергический ринит, конъюнктивит, эндометриоз,
астма, крапивница, общая анафилактическая реакция, дерматит,
пернициозная анемия, гемолитические болезни, тромбоцитопения,
отторжение трансплантата любого органа или ткани, отторжение
пересаженной почки, отторжение пересаженного сердца, отторжение
пересаженной печени, отторжение пересаженной поджелудочной
железы, отторжение пересаженного легкого, отторжение
пересаженного костного мозга (ВМТ), отторжение кожных
аллотрансплантатов, отторжение пересаженного хряща, отторжение
пересаженной кости, отторжение пересаженной тонкой кишки,
отторжение пересаженного эмбрионального тимуса, отторжение
пересаженной околощитовидной железы, отторжение
ксенотрансплантата любого органа или ткани, отторжение
аллотрансплантата, антирецепторные реакции
гиперчувствительности, базедова болезнь, болезнь Рейно,
инсулинорезистентный диабет В-типа, астма, миастения гравис,
опосредованная антителами цитотоксичность, реакции
гиперчувствительности III типа, системная красная волчанка,
POEMS-синдром (полинейропатия, органомегалия, эндокринопатия,
моноклональная гаммопатия и кожные изменения),
антифосфолипидный синдром, пузырчатка, склеродермия, смешанное
поражение соединительной ткани, идиопатическая болезнь
Аддисона, сахарный диабет, хронический активный гепатит,
первичный билиарный цирроз, витилиго, васкулит,
посткардиотомный синдром, гиперчувствительность IV типа,
контактный дерматит, гиперчувствительный пневмонит, отторжение
аллотрансплантата, гранулема из-за внутриклеточных организмов,
метаболическая или идиопатическая чувствительность к
лекарствам, болезнь Вильсона, гемохроматоз, альфа-1-
антитрипсиновая недостаточность, диабетическая ретинопатия,
тиреоидит Хашимото, остеопороз, нарушение функционирования
гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, первичный
биллиарный цирроз, тиреоидит, энцефаломиелит, истощение, муковисцидоз, хроническое заболевание легких новорожденных, хроническая обструктивная болезнь легких (COPD), наследственный
гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, дерматологические состояния,
псориаз, алопеция, нефротический синдром, нефрит, гломерулярный
нефрит, острая почечная недостаточность, гемодиализ, уремия,
токсичность, преэклампсия и воспаление вследствие анти-СБЗ
терапии, терапии ОКТЗ, цитокинами, химиотерапии, лучевой
терапии (например, включая, но не ограничиваясь
следующими:астении, анемии, кахексии и подобных заболеваний), хроническую интоксикацию салицилатом. Заболевания легких
Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции
или лечения заболевания легких или плевры в клетке, ткани,
органе, организме животного или пациента, включая, но не
ограничиваясь, следующими:модуляция иммунного ответа на
ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные
процессы с вовлечением CD27, например, пневмония; абсцесс
легкого; профессиональные заболевания легких, вызванные
агентами в форме пыли, газа или аэрозолей; астма, фиброзно-
облитерирующий бронхиолит, дыхательная недостаточность,
аллергические заболевания легких, включая аллергический
пневмонит (экзогенный аллергический альвеолит), аллергический
бронхолегочный аспергиллез и медикаментозная аллергия;
респираторный дистресс-синдром у взрослых (ARDS), синдром
Гудпасчера, хронические обструктивные болезни легких (ХОБЛ),
идиопатические интерстициальные заболевания легких, такие как
идиопатический легочный фиброз, саркоидоз, десквамативная
интерстициальная пневмония, острая интерстициальная пневмония,
интерстициальная болезнь легких, ассоциированная с
респираторным бронхиолитом, идиопатический облитерирующий бронхиолит с организующейся пневмонией, лимфоцитарный интерстициальный пневмонит, гранулематоз из клеток Лангерганса, идиопатический легочный гемосидероз; острый бронхит, легочный альвеолярный протеиноз, бронхоэктаз, заболевания плевры, коллапс легкого, кистозный фиброз и опухоли легких, а также легочная эмболия.
Злокачественные заболевания
Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции
или лечения злокачественного заболевания в клетке, ткани,
органе, организме животного или пациента, включая, но не
ограничиваясь, следующими: модуляцию иммунного ответа на
ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные
процессы с вовлечением CD2 7, по меньшей мере, одного из
следующих: лейкоз, острый лейкоз, острый лимфобластный лейкоз,
В-лимфобластный, либо Т-лимфобластный, либо FAB ОЛЛ, острый
мелиелоидный лейкоз (ОМЛ), хронический мелиелоидный лейкоз
(ХМЛ), хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ),
волосатоклеточный лейкоз, миелодиспластический синдром (МДС),
лимфома, болезнь Ходжкина, злокачественная лимфома,
неходжкинская лимфома, лимфома Беркитта, множественная миелома,
солидные опухоли в качестве первичного или метастатического
заболевания, саркома Капоши, колоректальная карцинома,
карцинома поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, включая
мезотелиому, рак молочной железы, назофарингеальная карцинома,
злокачественный гистиоцитоз, паранеопластический
синдром/гиперкальциемия, связанная со злокачественным ростом,
аденокарциномы, плоскоклеточные карциномы, саркомы,
злокачественная меланома, в особенности метастатическая меланома, гемангиома, метастазирующая опухоль, связанная с раком резорбция костной ткани и связанная с раком боль в костях и т.п.
Сердечно-сосудистые заболевания
Настоящее изобретение также относится к методу модулирования или лечения сердечно-сосудистого заболевания в клетках, тканях, органах, животных либо у пациентов, включая, но не ограничиваясь следующими: модулирование иммунного ответа ассоциированным или вспомогательным клеткам или клеточным процессам, вовлекающим CD2 7, по меньшей мере одного из следующего ряда заболеваний: инфаркт миокарда, застойная сердечная недостаточность, инсульт, ишемический инсульт, кровоизлияние, артериосклероз, атеросклероз, рестеноз, диабетический артериосклероз, гипертония, артериальная гипертензия, вазоренальная гипертензия, обморок, шок, сифилис сердечно-сосудистой системы, сердечная недостаточность,
легочное сердце, первичная легочная гипертензия, сердечная
аритмия, предсердная экстрасистола, трепетание предсердий,
фибрилляция предсердий (постоянная или пароксизмальная),
постперфузионный синдром, воспаление на фоне искусственного
кровообращения, хаотическая или мультифокальная предсердная
тахикардия, регулярная тахикардия с узкими QRS-комплексами,
специфические аритмии, фибрилляция желудочков, аритмии пучка
Гиса, атриовентрикулярная блокада, блокада ножки пучка Гиса,
ишемические нарушения миокарда, ишемическая болезнь сердца,
стенокардия, инфаркт миокарда, кардиомиопатия, дилатационная
застойная кардиомиопатия, рестриктивная кардиомиопатия, пороки
сердца, эндокардит, заболевание перикарда, сердечные опухоли,
аневризмы аорты и периферийных артерий, расслоение аорты,
воспаление аорты, окклюзия брюшной аорты и ее ветвей,
периферические сосудистые расстройства, окклюзионные
расстройства артериального кровообращения, атеросклеротическое
заболевание периферических артерий, облитерирующий тромбангиит,
функциональные расстройства периферических артерий, явление и
болезнь Рейно, акроцианоз, эритромелалгия, венозные
заболевания, венозный тромбоз, варикозные вены, артериовенозная
фистула, лимфедема, жировой отек, нестабильная стенокардия,
реперфузионное повреждение, синдром полиорганной
недостаточности после искусственного кровообращения,
ишемически-реперфузионное повреждение и т.п. Неврологические заболевания
Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения неврологического заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, включая, но не ограничиваясь, следующими: модуляция иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD2 7 в одном из следующих заболеваний: нейродегенеративные заболевания, рассеянный склероз, мигрень, комплекс СПИД-деменция, демиелинизирующие заболевания, такие как рассеянный склероз и острый поперечный миелит; экстрапирамидные и мозжечковые расстройства, такие как поражения кортикоспинальной системы; расстройства базальных
ганглиев или мозжечковые расстройства; гиперкинетические
двигательные расстройства, такие как хорея Гентингтона и
старческая хорея; двигательные расстройства, вызванные приемом
лекарственных препаратов, такие как индуцированные
лекарственными препаратами, которые блокируют дофаминовые
рецепторы ЦНС; гипокинетические двигательные расстройства,
такие как болезнь Паркинсона; прогрессирующий надъядерный
паралич; структурные поражения мозжечка; спинномозговые и
мозжечковые дегенерации, такие как спинальные атаксии, атаксия
Фридрейха, мозжечковые корковые дегенерации, дегенерации
нескольких систем (синдром Мэнселла, Дежерина-Томаса, Шая-
Драгера и Мачадо-Джозефа); системные нарушения (болезнь
Рефсума, абеталипопротеинемия, атаксия, телеангиэктазия и
митохондриальное мультисистемное расстройство);
демиелинизирующие основные заболевания, таких как рассеянный склероз, острый поперечный миелит; и расстройства двигательной единицы, такие как нейрогенные мышечные атрофии (клеточная дегенерация переднего рога, такая как боковой амиотрофический склероз, спинальная мышечная атрофия у детей и ювенильная спинальная мышечная атрофия); болезнь Альцгеймера; синдром Дауна; болезнь диффузных телец Леви; старческая деменция, связанная с развитием телец Леви; синдром Вернике-Корсакова; хронический алкоголизм; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; подострый склерозирующий панэнцефалит, болезнь Галлервордена-Шпатца; а также деменция боксеров и т.п. Такой способ может необязательно включать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно антитело к TNF, указанную часть или вариант, в клетки, ткани, органы, животным либо пациентам, которым требуется такого рода модулирование, лечение или терапия.
Другие способы терапевтического применения CD27-
нейтрализующих антител
В дополнение к описанным выше состояниям и заболеваниям, настоящее изобретение также предлагает способ модуляции или лечения фиброзных состояний различной этиологии путем модуляции иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки
или клеточные процессы с вовлечением CD2 7, например: фиброз печени (включая, но не ограничиваясь, следующими:алкогольный цирроз, вирусный цирроз печени, аутоиммунный гепатит); фиброз легких (включая, но не ограничиваясь, следующими:склеродермия, идиопатический фиброз легких); фиброз почек (включая, но не ограничиваясь, следующими:склеродермия, диабетической нефрит, клубочковой нефрит, волчаночный нефрит); кожный фиброз (включая, но не ограничиваясь, следующими:склеродермия, гипертрофические и келоидные рубцы, ожоги); миелофиброз; нейрофиброматоз; фиброма; кишечный фиброз; и фиброзные спайки, возникшие в результате хирургических процедур. Настоящее изобретение также предлагает способ модуляции, лечения или облегчения симптомов инфекционного заболевания в клетке, ткани, органе, организме животного или пациента, путем модуляции иммунного ответа на ассоциированные или вспомогательные клетки или клеточные процессы с вовлечением CD2 7 в таких заболеваниях как, например: острые или хронические бактериальные инфекции, острые или хронические паразитарные или инфекционные процессы, включая бактериальные, вирусные и грибковые инфекции, ВИЧ-инфекцию/ВИЧ-нейропатию, менингит, гепатит (А, В, С или др.), септический артрит, перитонит, пневмония, воспаление надгортанника, кишечная палочка, болезнь Гассера, малярия, геморрагическая форма лихорадки денге, лейшманиоз, проказа, токсический шок, стрептококковый миозит, газовая гангрена, туберкулез, комплекс Mycobacterium avium, пневмоцистная пневмония, воспалительные заболевания органов таза, орхит/эпидидимит, легионелла, болезнь Лайма, грипп А, вирус Эпштейна-Барр, угрожающий жизни гемофагоцитарный синдром, энцефалит/вирусный менингит и т.д.
Все упомянутые работы (в том числе книги, патенты, опубликованные патентные заявки на патент и патентные заявки, одновременно находящиеся на рассмотрении) включены в текст данной заявки посредством ссылки.
Другие свойства изобретения будут описаны ниже в примерах воплощений, приведенных для иллюстрации изобретения и не ограничивающих его объем и сущность.
4. Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение представляет стабильные композиции
СБ2 7-нейтрализирующих антител, которые предпочтительно
представляют собой водный раствор на основе фосфатного буферного раствора или смешанного солевого раствора, а также растворы и композиции с консервантами, композиции с консервантами для многоразового использования, которые можно использовать в фармацевтических или ветеринарных целях, содержащие по меньшей мере одно СБ2 7-нейтрализирующее антитело в фармацевтически приемлемой композиции. Допустимые для целей настоящего изобретения несущие среды и их композиция с возможностью введения других белков человека, например, сывороточный альбумин человека, описаны, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21~e изд, под ред. Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006 г., Часть 5.
Для создания фармацевтической композиции, пригодной для эффективного введения, такие композиции должны содержать эффективное количество описанных выше соединений, вместе с подходящим количеством несущей среды. Для контроля продолжительности действия антител можно использовать дополнительные фармацевтические методы. С использованием полимеров, образующих комплексы или абсорбирующих компоненты, можно готовить препараты с контролируемым высвобождением. Другой возможный метод контроля продолжительности действия препаратов с контролируемым высвобождением - это включение компонентов настоящего изобретения в частицы полимерного материала, например, полиэстера, полиаминокислот, гидрогелей, (поли)молочной кислоты или сополимера этилена с винилацетатом. В альтернативном варианте, вместо включения агентов в полимерные частицы, можно упаковывать их в микрокапсулы, изготовленные методом межфазной полимеризации, например, в микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина или поли(метилметацилат)а, или использовать антитела в коллоидных системах доставки, например, в липосомах, микросферах из альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах или
макроэмульсиях. Такие методы описаны в публикации Remington г указанной выше (2006).
5. Введение CD27-нейтрализующих антител
По меньшей мере одно CD27-нейтрализующее антитело либо в
стабильной рецептуре, либо с добавлением консервантов или
растворов описаных в настоящем документе, можно вводить
пациенту в соответствии с настоящим изобретением с помощью
различных способов введения, включая внутривенно (в/в),
внутримышечно (в/м); подкожно (п/к); также есть
трансдермальный, легочный, чрезслизистый пути введения, с использованием композиции в имплантате, осмотическом насосе, картридже, микронасосе или других средствах, признанными специалистами, всеобщеизвестными в данной области техники.В одном из способов введения CD27-нейтрализующих антител лекарственное вещество вводится внутривенно через ранее установленный катетер, снабженный инфузионным мешком. CD2 7-нейтрализующее антитело поставляется в 2 0-мл флаконах одноразового использования, таких как поставляемые компанией ImmunoGen, Inc. (Кембридж, Массачусетс). Каждый флакон содержит белок в концентрации от 0,05 до примерно 2,0 мг/мл в буферном растворе (рН 6,5+0,5), состоящем в основном из одноосновного фосфата калия (0,57 мг/мл), моногидрата одноосновного фосфата натрия (0,20 мг/мл), двухосновного фосфата натрия (0,555 мг/мл) и хлорида натрия (8,16 мг/мл) в очищенной воде согласно Фармакопее США. Лекарственное средство предварительно дважды отфильтровывается до вливания объема дозы в инфузионный мешок методом пропускания его через 5-мк фильтр с низкой способностью к связыванию белка, после чего вводится пациентам через внутренний 0,22 мкм фильтр в течение 8 ч подготовки. После инфузии внутривенную линию следует промыть жидкостью для обеспечения доставки полной дозы препарата. В целом, при системном введении антител желательно давать реципиенту дозу антител в диапазоне 1 нг/кг-100 нг/кг, 100 нг/кг-500 нг/кг, 500 нг/кг-1 мкг/кг, 1 мкг/кг-100 мкг/кг, 100 мкг/кг-500 мкг/кг, 500 мкг/кг-1 мг/кг, 1 мг/кг-50 мг/кг, 50 мг/кг-100 мг/кг, 100
мг/кг-500 мг/кг (веса тела реципиента), хотя возможно применение более низких или более высоких доз. Дозировки, составляющие около 1,0 мг/кг, уже могут быть в некоторой степени эффективными. Предпочтительной считается дозировка 5 мг/кг, хотя также предпочтительными считаются дозы до 50 мг/кг, особенно при терапевтическом применении. В иных случаях возможно введение указанного количества антител, не зависимого от веса тела пациента, например, в диапазоне 1 мкг-100 мкг, 1 мг-100 мг или 1 г-100 г. Например, возможно направленное введение в ту или иную часть тела или полость, такое как внутрисуставное введение, внутрь бронха, внутрибрюшинное, внутрь капсулы, хряща, полости, интрацелиальное, внутрь мозжечка, желудочка мозга, внутрь толстой кишки, шейки, желудка, печени, миокарда, внутрь кости, таза, перикарда, полости живота, плевры, простаты, легких, внутрь прямой кишки, внутрь почки, сетчатки, позвоночника, суставной сумки, грудной клетки, внутрь матки, мочевого пузыря, внутрь поврежденной ткани, вагинально, ректально, за щеку, под язык, интраназально или трансдермально.
Лечить пациента можно однократной дозой, или - что предпочтительнее - по схеме с многократным введением препарата, при этом первичный курс лечения может состоять из 1-10 доз, и далее, через определенные промежутки времени, так, чтобы иммунный ответ сохранялся или усиливался (например, через 1-4 месяца - вторая серия доз и, при необходимости, еще через несколько месяцев - следующая серия). Примеры подходящих схем лечения включают: (i) 0, 1 месяц и б месяцев, (ii) 0, 7 дней и 1 месяц, (iii) 0 и 1 месяц, (iv) 0 и б месяцев, или другие схемы, позволяющие получить желаемый ответ, при котором ожидается ослабление симптомов заболевания или степени тяжести заболевания.
6. Готовые продукты, включающие CD27-нейтрализующее антитело
Изобретение включает готовый продукт, содержащий вещества, пригодные для лечения расстройств, описанных выше, содержащее CD27-нейтрализующее антитело, контейнер и этикетку или листок
вкладыш на контейнере или прикрепленный к контейнеру. Готовое
изделие предпочтительно содержит по меньшей мере один флакон,
содержащий раствор по меньшей мере одного С027-нейтрализующего
антитела с предписанными буферными растворами и/или
консервантами, возможно в водном разбавителе, где указанный
упаковочный материал содержит этикетку, которая указывает, что
такой раствор может хранится в течение определенного периода
времени. Изобретение может включать готовое изделие, включая
упаковочный материал, первый флакон, содержащий
лиофилизированное С027-нейтрализующее антитело и второй флакон, содержащий водный разбавитель установленного буферного раствора или консерванта, отличающийся тем, что упаковочный материал содержит этикетку, которая предоставляет инструкцию врачу или пациенту по восстановлению С027-нейтрализующего антитела в водном разбавителе для приготовления раствора.
Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер может иметь стерильный доступ через порт (например, контейнером может быть пакет раствора для внутривенного вливания или флакон с пробкой, дополнительно его можно проколоть иглой для подкожных инъекций).
По меньшей мере одним из активных веществ в композиции является СБ27-нейтрализующее антитело. На этикетке или листке-вкладыше указано, что композиция используется для лечения по назначению, например, СКВ. Листок-вкладыш здесь может указывать, что антитело или композиция используется для лечения состояния, которое не дает ответа или проявляет плохую ответную реакцию на лечение и использование стандартных методов оказания медицинской помощи, как указано в настоящем документе для конкретных заболеваний и диагнозов. В других вариантах осуществления настоящего изобретения листок-вкладыш может указывать, что антитело, антитело-конъюгат или композицию можно также использовать для лечения заболевания, характеризующегося необходимостью модулировать иммунный ответ клеточных процессов с вовлечением CD27.
Еще одним аспектом настоящего изобретения является набор для обнаружения CD27 в биологическом образце. В состав набора входят упаковки с одним или большим количеством антител, связывающихся с эпитопом CD2 7 и инструкции по использованию антител для связывания с образованием иммунологического CD2 7 комплекса, который затем можно обнаружить, при этом наличие или отсутствие иммунологического комплекса коррелирует с присутствием или отсутствием в образце CD2 7. Примеры упаковок:многолуночные планшеты, которые позволяют обнаруживать CD2 7 одновременно во многих образцах.
Хотя изобретение описано в общем виде, осуществления изобретения будут более подробно рассмотрены в приведенных далее примерах.
ПРИМЕР 1. CD27:РЕАГЕНТЫ И МЕТОДЫ С целью получения и тестирования CD27-связывающих моноклональных антител были получены конструкты белков, которые представляют собой всю длину человеческого CD70 и человеческого CD27, а также внеклеточного домена (ECD) человеческого CD27.
Человеческий CD27 (SEQ ID N0: 149) является
трансмембранным белком 1-го типа, который состоит из
сигнального пептида (остатки 1-20), внеклеточного (ECD, остатки
21-191), трансмембранного (ТМ, остатки 191-212) и
внутриклеточного (ICD, остатки 213-260) доменов. Человеческий
CD7 0 (SEQ ID N0: 2) - трансмембранный полипептид длиной в 193
аминокислот, состоящей из N-концевого фрагмента,
внутриклеточного домена (ICD, остатки 1-17), трансмембранного (ТМ, остатки 18-38) и внеклеточного домена (ECD, остатки 39193). Вся последовательность, кодирующая CD7 0, была клонально экспрессирована на поверхности клеток НЕК 2 93.
Для проведения анализа моноклональных антител методом ИФА и протеомного анализа прямого связывания, аминокислоты 1-121 из ECD CD27 временно экспрессировали в клетках НЕК293 с С-концевым His6-tag пептидом и очищали с использованием хроматографии ионов металлов. Для анализа фагов методами "пэннинг" и ИФА, аминокислоты 1-173 из ECD с С-концевым His6-tag экспрессировали с использованием НЕК и очищали с использованием хроматографии с
ионами металлов, за чем следовало применение вытеснительной хроматографии на колонке Superdex 75. Оба этих белка CD27 биотинилировали с использованием химического анализа NHS-эфира, направленного на аминовые остатки на белке. Для кристаллизации, аминокислоты 1-101 с С-концевым His6-tag экспрессировали в системе бакуловируса и очищали с использованием хроматографии с ионами металлов Proteose, Inc. Для иммунизации мышей был приобретен белок CD27-FC компании R &D systems. Для некоторых исследований, всю последовательность, кодирующую CD2 7, клонально экспрессировали на поверхности клеток НЕК 2 93.
Человеческий CD27 и клоны кДНК человеческого CD70 заказали в компании Open Biosystems. Для создания экспрессирующих конструкций использовали стандартные методы молекулярной биологии. Вкратце, открытые рамки считывания генов CD2 7 и CD7 0 амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих методом переваривания и лигирования рестрикционной эндонуклеазы или с использованием независимого от лигирования клонирования (LIC). Полноразмерные гены CD2 7 и CD7 0 клонировали в экспрессирующие векторы и клонально экспрессировали на поверхности клеток млекопитающих. Внеклеточный домен CD2 7 клонировали в экспрессирующие векторы млекопитающих и временно экспрессировали в клетках НЕК2 93 с reKca-his-концевым фрагментом.
ПРИМЕР 2. ПОЛУЧЕНИЕ CD27-НЕЙТРАЛИЗУЮЩИХ АНТИТЕЛ Мышиные анти-человеческие CD2 7 антитела получали методом гибридом по методу Kohler и Milstein (1975). Десять мышей СЗН/HeJ в возрасте 12-14 недель приобрели у компании Charles River Laboratories. Мышей иммунизировали подкожно (п/к) в основание хвоста (ОХ) с использованием 50 мкгм Ни CD27 Fc (R &D Systems) в сочетании с 0,33х105 единицами мышиного интерферона-альфа и -бета (Biosource) в конечном объеме 100 мкл в первый день. На 2-й и 3-й день мышам вводили интерфероны подкожно в основание хвоста (с применением той же дозы, что и в 1-й день). Мышам вводили бустер-инъекции с использованием 50 мкгм Ни CD2 7-Fc в сочетании с 50 мкгм антимышиного агонистического
моноклонального антитела CD40 (R &D Systems, МАВ440) методом подкожной инъекции в основание хвоста в ФСБ на 14-й день; за четыре дня до сбора клеток селезенки для слияния.
Для анализа титров был выполнен фазовый ИФА с захватом. Вкратце, планшетки (Nunc-Maxisorp) покрывали 0,1 мкгм козьего антимышиного Fc (Jackson Immunotech) и оставляли на ночь в
бикарбонатном буфере при температуре 4°С. После этапов блокирования и промывки добавляли растворы сыворотки и планшеты инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре. После этапов промывки, планшеты инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре с 0,2 5 мкгм/мл биотинилированного Ни CD27-ECD в блокирующем буфере и зондировали с использованием HRP помеченного стрептавидина (Jackson Immunotech), разведенного в концентрации 1:40000 БСА/ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали, как описано выше; затем добавляли раствор субстрата ОФД (Sigma fast tabs), инкубировали в течение 10 минут при комнатной температуре, проявление цвета субстрата останавливали добавлением 4N серной кислоты 2 5 мкл/лунку и измеряли поглощение при 4 90 нм.
Клеточный банк клеток несекретирующей мышиной миеломы для слияния был куплен в АТСС (# CRL-164 6). Один замороженный флакон фолликулярных клеток оттаивали и перерастворяли в среде DMEM с (модифицированной) средой Glutamax(tm) (Invitrogen) с добавлением 10% (об/об) ФБС (Hyclone) . В Charles River Laboratories клетки были выращены, криоконсервированы и были признаны стерильными и не содержащими микоплазмы. Клеточная линия С1833А (Centocor) также применялась при проведении данного слияния. Эта клеточная линия была получена на месте методом подавления экспрессии гена СНОР(БЯКХ) в фолликулярной клеточной линии, поэтому она требует роста в условиях селекции с использованием генетицина. Клетки обрабатывали так же, как описанные выше фолликуллярные, за исключением тех, которые выращивали в среде DMEM с использованием среды Glutamax(tm) (модифицированной) с добавлением 10% (об/об) ФБС (Hyclone) и 500 мкг/мл генетицина. Обе клеточные линии, как фолликулярная,
так и С1833А были подвергнуты синхронизации клеток до слияния. Вкратце, 1,5-2x108 клеток высевали в 180 мл среды DMEM со средой Glutamax(tm) (модифицированной) с добавлением 0,25% (объем/объем) ФБС (Hyclone) и инкубировали при температуре 37°С в течение 13 часов. Дополнительно 20 мл ФБС добавляли до конечной концентрации ФБС 10% и инкубировали до применения в
течение дополнительных 13 часов при температуре 37°С. С1833А клетки постоянно находились под воздействием селекции генетицина в течение процесса синхронизации клеток. Клетки миеломы промывали в ФСБ, подсчитывали и определяли их жизнеспособность с помощью программного обеспечения Guava Viacount до слияния.
В день слияния животные были умерщвлены методом асфиксии СОг • Селезенки удаляли асептически и погружали в 10 мл холодного фосфатно-солевого буферного раствора (ФСБ) , содержащего антибиотики (PSA) (Sigma).
Суспензию отдельных клеток спленоцитов приготавливали и подвергали РБК лизису с использованием РБК буфера для лизиса (Sigma). Промытые клетки были помечены для магнитной сортировки в соответствии с указаниями изготовителя, с использованием анти-мышиных Thyl.2, анти-мышиных/человеческих CDllb и антимышиных IgM магнитных шариков (Miltenyi Biotec #130-049-101, 130-149-601 и 130-047-301 соответственно), а затем сортировали с помощью инструмента AutoMacs Pro, запустив программу Deplete. Как непомеченные (блазмобласты, обогащенные В-клетками), так и помеченные фракции клеток собирали, затем подсчитывали с помощью Guava РСА. Положительно помеченные клетки выбрасывали. Непомеченные клетки были разделены пополам для слияния с обоими партнерами слияния, FO и С18 33А. Слияния проводили при соотношении 1:1 мышиных миеломных клеток к жизнеспособным клеткам селезенки в соответствии с методом De St. Groth (J Immunological Methods. 35:1-21. 1980) . Вкратце, клетки селезенки и миеломные клетки смешивали, осаждали и промывали один раз в 50 мл ФСБ. Осадок ресуспендировали в 1 мл раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) (2 г ПЭГ с молекулярной массой 4000, 2
мл DMEM, и 0,4 мл DMSO) при температуре 37°С в течение 30 секунд. Клеточную/слитую смесь затем погружали в водяную баню при температуре 37°С в течение примерно 60 секунд и при мягком помешивании. Реакции слияния была остановлена путем медленного добавления DMEM при температуре 37°С в течение 1 минуты. Слитые клетки оставляли в покое или на 5 минут при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 150 мкг в течение 5 минут. Затем клетки перерастворяли в среде HAT [DMEM с Glutamax(tm) (модифицированной), с добавлением 2 0% ФСБ, 5% Ориген, 25 мкг/мл гентамицина (Sigma) и HAT (100 мкМ гипоксантина, 0,4 мкМ аминоптерина, и 16 мкМ тимидина (Sigma) и высевали в 96-луночные плоскодонные планшеты из полистирола для выращивания тканевых культур (Corning #3997) или метилцеллюлозную среду
(StemCell Technologies, MediumD cat #03804), содержащую -2,25 мкг/мл AF488 человеческого CD27 (Janssen Research & Development, LLC). Планшеты инкубировали в увлажненном инкубаторе при температуре 37°С с содержанием 7% С02 в течение 7-10 дней. Единичные колонии были отобраны из метилцеллюлозных планшет для скрининга с использованием ClonepixFL или под микроскопом при белом свете.
ПРИМЕР 3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ
Способность связывающих доменов из мышиных антител связываться с CD27 и блокировать определенные биоактивности CD2 7 была проанализирована с помощью различных анализов in vitro, как описано ниже.
Твердофазный ИФА использовали для скрининга гибридомных супернатантов на наличие антител, способных связываться с человеческим CD27. Планшеты (Nunc-Maxisorp #44 6612) покрывали и оставляли на ночь 4 мкг/мл Fab козьего антитела huFc (Jackson # 109-006-098) в бикарбонатном буфере О/N при температуре 4°С. Не промывая, лунки блокировали с использованием 200 мкл 0,4%
(масса/объем) бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания с использованием 0,15 М солевого раствора, содержащего 0,02%
(масса/объем) Tween 20, на планшетки добавляли 50 мкл huCD27-Fc в 0,4% БСА/ФСБ в течение 1 ч при комнатной температуре. Снова после промывания, 50 мкл неразбавленных супернатантов гибридомы инкубировали на покрытых планшетах в течение 3 0 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза, а затем инкубировали с использованием 50 мкл козьего антимышиного Fc HRP (Jackson #115-036-071), разбавленного в соотношении 1:10000, в течение 3 0 минут при комнатной температуре. Планшеты снова промывали и проявляли, как описано выше для оценки титров. Для оценки относительной связывающей способности моноклональных антител гибридомы, проводили аналогичный анализ с использованием 384-луночных планшет MaxiSorp (NUNC 464718) с использованием серийно разведенных супернатантов гибридомы
(нормализованных до начальной концентрации 5 мкг/мл. Этот анализ определил 38 6 положительных гибридом.
Все 38 6 СБ27-специфичные гибридомы подвергали скринингу на способность ингибировать связывание huCD27 с huCD70 с использованием биохимических анализов связывания с IM-9 клетками, В-лимфобластоидная клеточная линия показала эндогенную экспрессию человеческого CD70. Планшеты Maxisorp
(VWR # 62409-314) покрывали рекомбинантным человеческим CD27/FC
(R &D Systems, Cat# 382-CD) при 250 нг (нг/мл) и инкубировали в течение ночи при температуре 4°С. На следующий день планшеты блокировали блокирующим буферным раствором (Pierce, Cat # 37543), а затем промывали промывочным буферным раствором I, который содержит БСА без Са++ и Мд++, 0,01% Tween-20. Контрольные смеси (мышиное моноклональное антитело к hCD27, R &D Systems, Cat# МАВ382; Изотипический контроль мышиного IgGl, R &D Systems, Cat# МАВ002; изотипический контроль мышиного IgG2a, R &D Systems, Cat# МАВ003) включали в каждый планшет. 50 мкл/лунку образца гибридомы или контрольных веществ смешивали с 50 мкл/лунку собранных IM-9 клеток, человеческой В-лимфобластоидной клеточной линии (АТСС, CCL-159) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре без встряхивания. В конце инкубации планшеты промывали промывочным буферным
раствором II, чтобы удалить все несвязанные ячейки, а затем
лизировали с использованием 50 мкл/лунку реагента Cell Titer
Glo (Promega, Cat #G7571). Через 10 минут инкубации при
встряхивании, планшеты считывали на системе Envisionn
(PerkinElmer, 2102 Multilabel reader). Полученный
люминесцентный сигнал пропорционален количеству присутствующего АТР и непосредственно коррелирует с количеством живых клеток, присутствующих в захваченной лунке при связывании с CD2 7. На основе результатов биохимического анализа связывания, около 50% СБ27-специфических клонов были нейтрализующими.
Для устранения избытка нейтрализующих клонов проводили
конкурентный анализ связывания для распределения антител по
конкурентным группам. При проведении данного анализа,
супернатанты гибридомы оценивали по отдельности, как реагенты
захвата и обнаружения для каждой из положительных гибридом в
панели. Антитела, образующие эффективные реагенты
захвата/обнаружения друг с другом, скорее всего, идентифицируют пространственно разделенные эпитопы на белке CD2 7, таким образом, позволяя обоим антителам в то же время связываться с белком-мишенью. Группы клонов, обладающие аналогичными моделями активности по всей панели, вероятно, связываются с аналогичными эпитопами. Выбор клонов из различных групп, следовательно, предлагает антитела, идентифицирующие различные эпитопы. Вкратце, 384-луночные планшеты Nunc Maxisorp (464718) покрывали козьими антимышиными антителами Fc (JIR115-005-071) в покрывающем буфере в течение ночи при 4°С. Затем планшеты блокировали с использованием 0,4% БСА в ФСБ в течение 30 минут при комнатной температуре. На этом этапе и на всех последующих этапах планшеты промывали с использованием ФСБ, 0,02% Tween-20. Каждая лунка ряда (один ряд на супернатант) получила 2 0 мкл супернатанта (чистый супернатант использовали для начального скриннинга, а для повторного скриннинга подклоны нормализировали до 2 мкг/мл мАт) вместе с контрольными веществами (мышиный анти-пиСБ27, R &D Systems, Cat# МАВ382;. мышиный изотопный контроль Cat#555439, Becton-Dickenson), затем
инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре. После промывания, 25 мкл немеченого Ни CD27-ECD-His-tag приготовили в ФСБ плюс 10% мышиной сыворотки (мышиная сыворотка Bioreclamation CD-I партия № MSEBREC.18565) при 0,3 (или 0,8 для нормализированной концентрации) мкг/мл было добавлено во все лунки, затем их 3 0 минут инкубировали при комнатной температуре, затем промывали. Каждый супернатант добавляли вниз по колонке и инкубировали в течение 3 0 минут при комнатной температуре с использованием 25 мкл смеси, приготовленной следующим образом: (-предварительно инкубированные супернатанты с козьим антимышиным антителом Fc HRP (Jackson 115-036-008), смесь 150 мкл козьего антимышиного антитела Fc HRP в соотношении 1:1000 с каждыми 1000 мкл супернатанта (для первичного скрининга) или 90 мкл в соотношении 1:2000 на 600 мкл супернатанта с доведением до 2 мкг/мл: (для подклонов повторного скриннинга). Через 3 0 минут инкубации при комнатной температуре добавили 2 00 мкл 10 0% нормальной мышиной сыворотки на мл и инкубировали еще 3 0 минут при комнатной температуре. Планшеты промывали, затем инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре с использованием 100 мкл/лунку цитрат-фосфатного раствора субстрата (0,1 М лимонной кислоты и 0,2 М фосфата натрия, 0,01% Н2Ог и 1 мг/мл ОФД). Проявление субстрата останавливали добавлением 2 5 мкл 4N серной кислоты и измеряли поглощение при 4 90 нм с использованием автоматического спектрофотометра для прочтения планшет. Этот анализ связывания определил три группы, которые идентифицируют неперекрывающиеся позиции связывания на антигене huCD2 7. Отобранные антитела из всех трех групп были расширены для производства антител, очистки и дальнейшего тестирования в функциональных анализах. Ингибирование клеточной сигнализации
Связывание CD7 0 с CD2 7 вызывает сигнализацию, что приводит к нисходящей активации фактора транскрипции, NF-кр. Был создан
анализ репортера NF-K|3 ДЛЯ дальнейшей характеристики антител. Анализ проводили в двух режимах: (1) для оценки антагонизма антител методом нейтрализации CD7 0, индуцированной активации
CD2 7 и (2) для оценки агонизма антител методом активации сигнализации CD27 без лигирования CD70. HEK-293F клетки трансфицировали с общим количеством ДНК 3 6 нг, содержащей как человеческий CD2 7, так и конструкты люциферазы, под контролем промотора NF-чф. Трансфектанты HEK-2 93F наносили на планшет 5x10 клеток на лунку в 40 мкл среды Freestyle (Gibco) на 96-луночные планшеты. Растворы CD27-нейтрализующих гибридомных моноклональных антител были добавлены на аналитический планшет в средах Freestyle (Gibco) для конечной концентрации 50 мкг/мл с разведением в соотношении 1:3 и планшеты инкубировали при температуре 37°С (95% Ог/5% СОг) в течение 1 часа. Для анализа способности моноклональных антител гибридомы нейтрализовать сигнализацию CD7 0:CD2 7, окончательно облученные (4 000 рад) эписомные клетки НЕК - 2 93Е CD7 0 добавляли в концентрации 2 0% от числа трансфектантных клеток CD2 7 на аналитический планшет. Для тестирования активности агониста гибридомных моноклональных антител не проводилось добавление эписомальных клеток CD7 0. Аналитические планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 37°С (95% Ог/5% СОг) и проявляли с использованием системы для анализа люциферазы Steady-Glo(r) Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Четыре CD27-нейтрализующих моноклональных антитела гибридомы, С2177, С2186, С2191 и С2192, которые в зависимости от дозы блокировали CD70-опосредованную сигнализацию CD2 7, не вызывая значительную дозозависимую агонистическую активацию рецептора CD2 7 в отсутствие стимулятора CD7 0, были выбраны для проведения дальнейшей характеристики. IC50S для блокирования связывания IM-9 клеток с опосредованной сигнализацией CD27 и CD70 в анализе гена-репортера NF-кР ДЛЯ ЭТИХ четырех антител приведены в таблице 1. Агонистическая активность в анализе гена-репортера NF-кР показана как кратное увеличение сигнализации CD2 7 относительно постороннего контрольного изотипа антитела (мышиный IgGl к крысиному белку ЕМР) в отсутствие стимулятора CD7 0 при максимальной протестированной концентрации антител.
Афинность для CD2 7
Антитела KD С2177, С2186, С2191 и С2192 для мономерно растворимого CD2 7 при температуре 2 5°С были измерены с помощью Biacore и представлены в таблице 1. Анализы проводились на системе BIACORE 3000 (BIAcore, Inc.), инструменте поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Образцы готовили в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко с рН 7,4, содержащем 0,005% поверхностно-активного вещества (полисорбат 20) . Козье анти-мышиное Fc-специфичное антитело (Jackson Immunoresearch laboratories Prod #115-005-071) было ковалентно присоединено на золотые поверхности, покрытые карбоксиметил декстраном (СМ-5 Chip, Biacore). Сенсор перед иммобилизацией предварительно обрабатывали растворами 50 мМ NaOH, 100 мМ НС1 и 0,1% додецилсульфата натрия с инъекцией деионизированной воды между этапами предварительной обработки. Антитела разбавили в 10 мМ буферного раствора ацетата натрия рН 4,5 и связали с карбоксиметилированной поверхностью декстрана сенсора согласно инструкции производителя в отношении химических процессов сопряжения аминов. Оставшиеся реакционноспособные групп на поверхности дезактивировали при помощи этаноламина-НС1. Моноклональные антитела были захвачены на поверхности датчика через домен Fc. Ассоциации ECD человеческого CD27, вводимые в возрастающих концентрациях (0,6-150 нм, 4-кратные серийные разведения) наблюдали в течение трех минут, а диссоциации - в течение десяти минут. Регенерация захвата поверхностей до исходной была оптимизирована с помощью двух трехсекундных воздействий 100 мм фосфорной кислоты. Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения Scrubber, версия 1.1 г (BioLogic Software). Двойную субстракцию данных проводили для коррекции влияния буфера на шум от сигнала и инструмента. Кинетический анализ обработанных данных проводили с использованием программного обеспечения Biaevaluation 4.0.1 (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Sweden). Профили связывания описывали при помощи модели связывания 1:1 с указанием моновалентного связывания CD27.
IC50 для ингибирования моноклональными антителами в анализе гена-репортера
3Агонистическая активность моноклональных антител при 50 мкг/мл в отсутствии CD7 0, измеренная как кратное увеличение в сигнале гена-репортера по отношению к антителам изотипического контроля.
Ингибирование клеточной пролиферации
Пролиферация Т-клеток, субоптимально активированная в культуре с антителам анти-СБЗ плюс анти-СБ2 8, усиливается CD7 0-лигированием CD2 7, экспрессируемого на Т-клетках. Четыре мышиные нейтрализующие антитела оценивали по их способности ингибировать пролиферацию Т-клеток в присутствии CD7 0 и индуцировать пролиферацию в отсутствие CD7 0. Замороженные CD4 + Т-клетки были приобретены у AllCells, LLC. Клетки оттаивали и помещали в IMDM среду, содержащую 10% ФБС, 1% 1-глутамина и 1% пенициллина со стрептомицином. Перед посевом клеток, антитело анти-СБЗ (ОКТЗ) наносили на U-образное дно планшеты в концентрации 1 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при температуре 4°С. Клетки подсчитывали, доводили до концентрации 1x106 клеток/мл и высевали при концентрации 1x105 клеток/лунку. Растворимый анти-CD2 8 добавляли в качестве вторичного сигнала активации при концентрации 1 мкг/мл на лунку. Облученные (6000 рад) НЕК
клетки, трансфицированные человеческим CD7 0 или только вектором (макетом), добавляли в соответствующие лунки по 2x104 клетки/лунку (20%). Клетки стимулировали в течение 3 дней, 0,9 мкКи тимидина [метил-ЗН] добавляли в лунки всех образцов и клетки инкубировали в течение 18-24 часов. На четвертый день стимуляции клетки собирали на фильтровальный планшет с помощью сборщика клеток РЕ Filtermate Harvester. Планшету дали высохнуть и добавили 30 мкл MicroScintTM-20 во все лунки образцов. Данные считывали с планшеты с помощью РЕ TopCount NXT и собранные данные были представлены в виде СРМ. Антитело С2177 показывает дозозависимое ингибирование CD70-опосредованной пролиферации Т-клеток и очень слабую внутреннюю агонистическую активностью в отсутствие CD70 (Фиг. 1) . Аналогичные результаты были получены для антител С2186, С2191 и С2192. IC50 и максимальный % ингибирования этих антител представлены в таблице 2. Ни одно из антител не показало последовательной стимуляции пролиферации в отсутствие лигирования CD7 0, что указывает на отсутствие внутренней агонистической активности.
Кроме того, антитела С2177, С2186, С2191 и С2192 показали
дозозависимое ингибирование CD70-опосредованной пролиферации Т-
клеток согласно результатам измерений при проведении анализа с
использованием CSFE (сукцинимидильного эфира
карбоксифлуоресцеина) при отсутствии эффекта на пролиферацию в отсутствие стимулятора CD70. Замороженные СБЗ+Т-клетки были приобретены у AllCells, LLC. Клетки оттаивали и поместили в IMDM среду, содержащую 10% ФБС, 1% L-глутамина и 1% пенициллина со стрептомицином. Клетки предварительно пометили 2,5 мМ CFSE (Invitrogen), погасили добавлением ФБС и промыли Т-клеточной средой. CFSE является красителем, который пассивно диффундирует в клетки и становится высокофлуоресцентным при связывании с внутриклеточными аминами. При деление клеток, каждая дочерняя клетка будет содержать половину CFSE-метки материнской клетки, таким образом, пролиферацию клеток можно контролировать, отслеживания количество клеток с различной интенсивностью CFSE. Клетки доводили до концентрации 1х106 клеток/мл и высевали 1х105
клеток/лунку. Перед посевом клеток, антитело анти-СБЗ (ОКТЗ) наносили на U-образное дно планшета при концентрации 0,5 мкг/мл в ФСБ в течение ночи при 4°С. Растворимый анти-СБ2 8 добавляли в качестве вторичного сигнала активации при концентрации 1 мкг/мл на лунку. Облученные (6000 рад) НЕК-клетки, трансфицированные человеческим CD7 0 или только вектором (макетом), добавляли в
соответствующие лунки по 2x104 клетки/лунку (20%) . Клетки стимулировали в течение 4 дней и анализировали с помощью анализа FACS для расчета разделенных клеток, содержащих различные уровни интенсивностей CFSE-метки.
Ингибирование дифференциации бластных клеток плазмы CD27-нейтрализующие моноклональные антитела гибридомы были также протестированы методом анализа дифференциации бластных клеток плазмы с использованием первичных В-клеток человека. CD19 + В-лимфоциты человека, которые были негативно отобраны из периферической крови здоровых доноров (приобретенной у AllCells), культивировали в течение б дней при наличии либо 1 мкг/мл антитела анти-СБ40 (клон МАВ89, Abeam) и 100 нг/мл интерлейкина 21 (Invitrogen), или 1 мкг/мл растворимого человеческого рекомбинантного CD40-лиганда, 2 мкг/мл "усилителя для лиганда" (оба Alexis Biochemicals) и 100 нг/мл интерлейкина 21 в 9б-луночных планшетах при концентрации 105 В-клеток на лунку. CD27-нейтрализующие антитела гибридомы или антитела для изотипического контроля добавляли при наличии или отсутствии 2х104 облученных (6000 рад) CD70-экспрессирующих клеток НЕК 293 или МОСК-трансформированных клеток НЕК 293. CD27-нейтрализующие моноклональные антитела гибридомы и соответствующие изотипические контроли использовали при концентрации 25, 2,5 и 0,25 мкг/мл. На б-й день образцы клеток анализировали методом потоковой цитометрии и иденцифицировали фракции бластных клеток плазмы как прямое светорассеяние/высокое, IgD минус, CD38 яркое, CD2 0 низкое. Эффект CD27-нейтрализующих моноклональных антител рассчитывали как частоту проявления бластных клеток плазмы в В-клеточных культурах, содержащих CD70-экспрессирующие клетки и моноклональные антитела гибридомы, нормированные к
частоте бластных клеток плазмы в соответствующих В-клеточных культурах, содержащих ложнотрансфицированные клетки. Процент ингибирования моноклональными антителами С2177, С2186, С2191 или С2192 при концентрации 2,5 мкг/мл показан в таблице 2. Агонистическая активность при отсутствии стимулятора CD7 0 не наблюдалась ни для одного из этих моноклональных антител.
ПРИМЕР 4. КАРТИРОВАНИЕ ЭПИТОПОВ И ГРУППИРОВКА Для более тщательной оценки первоначального связывания были проведены анализы конкуренции с использованием некоторых очищенных нейтрализующих моноклональных антител и с использованием С027-нейтрализующего антитела, МАВ 382 (R &D Systems). Вкратце, 5 мкл (10 мкг/мл) химерного белка CD27-FC (R &D Sysytems, Cat# 382-CD) наносили на планшет MSD HighBind (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) в течение 2 ч при комнатной температуре. В каждую лунку добавляли 5% блокирующего буфера A MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали три раза с использованием 0,1 М буферного раствора HEPES, рН 7,4, с последующим добавлением смеси 10 нМ помеченного антитела CD2 7 с различными концентрациями конкурирующего антитела (1 нМ - 2 мкМ) . Антитела были помечены с использованием NHS-эфира MSD Sulfo-Tagr(tm), амино-реактивного N-гидроксисукцинимидного эфира, который соединяется с
первичными аминогруппами белков для образования стабильной амидной связи. После 2-часовой инкубации при осторожном встряхивании при комнатной температуре, планшеты промывали 3 раза с использованием 0,1 М буферного раствора HEPES (рН 7,4) . Буферный раствор MSD Read Buffer Т четырехкратно разводили дистиллированной водой и вносили в лунки в объеме 150 мкл/лунку. Планшеты анализировали с использованием анализатора SECTOR Imager 6000, который определяет электрохемилюминесценцию при помощи меток Sulfo-Tag, которые излучают свет при электрохимической стимуляции, инициированной на электродных поверхностях микропланшеток MSD.
Исследования конкуренции определили три конкурирующие группы для антител, приведенные в таблице 3, подтверждая результаты начальных анализов связывания. С2179, С2192 и МАВ382 составляют первую группу; С2177, С2182, С2186 и С2193 - вторая группа; и С2191 составляет отдельную группу.
ПРИМЕР 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭПИТОПОВ И ПАРАТОПОВ МЕТОДОМ РЕНТГЕНОВСКОЙ КРИСТАЛЛОГРАФИИ
Подробные эпитопы и паратопы антител С2177 и С2191 были определены путем совместной кристаллизации их соответствующих Fabs с ECD фрагментом CD27 (остатки 1-101) как определение тримерного комплекса и структуры методом рентгеновской кристаллографии. His-меченные химерные варианты (мышиный вариабельный домен, человеческий константный домен) С2177 Fab и
С2191 Fab экспрессировали в клетках НЕК2 93 и очищали с использованием афинной и вытеснительной хроматографии. His-меченный фрагмент ECD (остатки 1-101) человеческого CD27 затем очищали с использованием анионообменной хроматографии. Тройной комплекс CD27:C2177 Fab:C2191 Fab получали путем смешения CD2 7 с избытком Fab в молярном соотношении 1:1,25:1,25. Комплекс инкубировали в течение 2 ч при температуре 4°С, отделяли от незакомплексованных видов с использованием вытеснительной хроматографии и доводили до концентрации до 12 мг/мл в 2 0 мМ Трис рН 8,5, 250 мМ NaCl. Кристаллизацию комплекса проводили с помощью метода диффузии пара в положении сидячих капель при
температуре 2 0°С. Кристаллы комплекса были получены из 24% ПЭГ 3350, 0,2 М раствора хлорида аммония, 0,1 М Трис-буфера, рН 8,5. Для рентгеновского сбора данных, один кристалл смачивали в течение нескольких секунд в криозащитном растворе, содержащем раствор для кристаллизации с добавлением 2 0% глицерина и мгновенно замораживали в потоке азота при 100 К. Дифракционные данные собирали с использованием рентгеновского генератора Rigaku MicroMaxTM-007HF, оснащенного детектором Saturn 944 CCD и криоохлаждающей системой X-Stream 2000 (Rigaku) с вращением кристалла более 2 4 0° с экспозициями в течение 2 минут на 0,2 5° -изображение и обрабатывали с помощью программы XDS (Kabsch W. 2010. Acta Crystallogr. D66:125-132). Кристаллы принадлежат к моноклинной пространственной группе Р21 со следующими параметрами элементарной ячейки: а=141,1 А, Ь=53,0 А, с=143,4 А, а=90°, р=112,2°, у=90°.
Кристаллическая структура тройного комплекса была определена при разрешении 3,5 А и очищена до кристаллографического R-фактора 26%. Fabs С2177 и С2191 связываются с CD2 7 на пространственно отличающихся неперекрывающихся эпитопах (Фиг. 2). Fab С2177 связывается с N-концевым участком (расположенным дистально от поверхности клетки)CD27. Эпитоп покрывает 700 А2 и включает 9 остатков: К5, S6, Р8, НИ, W13, G16, К17, Н36, R37 (Фиг. 3) . Паратоп определяется как остатки антител, контактирующие (в пределах 4
А) с антигеном. Паратоп С2177 включает 5 остатков из VL (Y31, Y36, Y53, N57, N96) и 9 остатков из VH (S31, W33, Y52, D55, D57, Y101, Y102, D104, Y105) (Фиг. 3) . Все 6 CDR вовлечены в процесс распознавания антигена. НЗб и R37 являются центральными остатками эпитопа. Они накладываются на Y31 из VL и Y102 из VH; НЗб также образует солевой мостик к D104 из VH.
С2191 Fab связывается с CD27 на "боковой" поверхности
(Фиг. 2) и покрывает 800 А2 поверхности. Эпитоп включает в себя 10 остатков: F28, D43, Р44, 146, Р47, G48, V49, Н60, S63, Н66. Паратоп С2191 включает 7 остатков из VL (Y34, F36, Y53, L54, R96, L98, W100) и 8 остатков из VH (S31, Y32, Y50, N57, Y59, R100, G101, N102) (Фиг. 4) . Взаимодействия антиген-антитело доминируют при гидрофобных взаимодействиях между остатками 4 44 9 CD2 7 и гидрофобным "пэтчем" CDR из VL.
Разное расположение эпитопов С2177 и С2191 предполагает различный механизм действия данных антител. С2191, вероятно, непосредственно конкурирует с ECD CD7 0 за перекрыване эпитопов на "боковой" поверхности CD27. Антитело С2177, наоборот, не вступает в борьбу за тот же эпитоп, а предотвращает подход клеток, несущих CD27 и CD70. Это наблюдение подтверждается тем фактом, что С2191 предотвращает связывание растворимого ECD CD70 с CD27, тогда как С2177 не предотвращает его.
ПРИМЕР 6. МОДУЛИРОВАННИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА ОТ ЛИМФОЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПРИ ПРИ ПОМОЩИ АНТИТЕЛА
Иммунодефицитная мышиная модель мыши NOD/SCID-IL2Rynu11
(NSG) быларазработана с целью изучения аспектов контроля человеческой иммунной системы ответами Т-клеток (Markus G Manz & James Р Di Santo Renaissance for mouse models of human hematopoiesis and immunobiology Nature Immunology 10, 1039-1042
(2 009)). Адоптивный перенос человеческого МНПК мышам с ослабленным иммунитетом (NSG) использовали для оценки влияния анти-СБ27-антитела на приживление и/или пролиферацию клеток человека. Модель позволяет оценить эффект от нацеливания человеческого CD27 на выработку антител и опосредованные Т-клетками ответы.
Антитела С2177 и С2191 вводили в момент переноса клеток, а затем дважды в неделю в течение 3 недель. На 21-й день мышей умерщвляли, клетки крови и селезенки очищали и впоследствии характеризовали с помощью проточной цитометрии. CTLA4-Ig (Orencia, BMS) был включен в виде положительного контроля иммуносупрессии. Приживление/распределение человеческих клеток измеряли методом оценки наличия CD4 5+ клеток в образцах крови и селезенки.
Проводили тщательный мониторинг мышей, а время умерщвления
определяли на основании симптомов XGVH в соответствии с
руководящими принципами благополучия животных.
Экспериментальные показатели использовали для оценки эффектов лечения с применением анти-СБ2 7, которые включали: массу тела (еженедельно дважды), наблюдаемые признаки по системе XGVH (еженедельно дважды), такие как положение тела, уровень активности, уход за поверхностью тела, кожные поражения (в частности, вокруг глаз и ушей) с использованием 1-5 балльной системы, абсолютное количество подмножеств человеческих клеток и статус активации с помощью анализа методом проточной цитометрии (1) введенных человеческих МКПК, (2) мышиной ПК (один раз в неделю) и (3) селезенки, а также костного мозга; определение общего человеческого Ig, IgM и IgG в сыворотке, селезенке и КМ с помощью анализа ИФА, а после умерщвления -проведение гистологического и иммуногистохимического анализа для определения уровня инфильтрации человеческих клеток в органах-мишенях, таких как печень, почки, легкие и селезенка. Группы лечения были следующими:
1. МКПК (2 0-4 0 миллионов клеток на мышь, и/п.)
2. МКПК + CTLA4-Ig (10 мг/кг)
3. МКПК + антитело для изотопического контроля, дважды в неделю в течение 3 недель
4. МКПК + анти-СБ2 7 антитело, дважды в неделю в течение 3 недель
Мыши, которым вводили моноклональные антитела анти-СБ2 7 дозой 10 мг/кг, С2177 и С2191, (антитела гибридомы, химеризованные на человеческом IgG4 (ala/ala, ser-> pro)
клеточном каркасе), имели меньшее статистически значимое количество человеческих CD45+ клеток в сравнении отдельно с МКПК или изотопическим контролем в МКПК, изолированного из образцов крови или селезенки.
ПРИМЕР 7 . АДАПТАЦИЯ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО КАРКАСНОГО УЧАСТКА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С2177 И С2191
Антигенсвязывающий участок, а также участки, используемые
для передачи антигенной специфичности от антител С2177 и С2191
человеческим каркасным участкам, были повторно
классифицированы, как указано в патенте, опубликованном Raghunathan G. US20090118127 Al, 2009. Вкратце, антиген-связывающие участки определяли с использованием различных терминов (обзор в Almagro and Fransson, Front Biosci 13: 16191633, 2008). Термин "Участки, определяющие комплементарность (CDRs)" основывается на вариабельности последовательности (Wu and Rabat, J. Exp. Мед. 132:211-250, 1970). Существует 6 CDR; три для VH (H-CDR1, H-CDR2, H-CDR3) и 3 для VL (L-CDR1, L-CDR2, L-CDR3) (Rabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). Термин "Гипервариабельные участки", "HVR's", или "HVL's" относится к участкам вариабельного домена антитела, которые являются вариабельными в своей структуре, как определено в публикации Chothia и Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Существует шесть HVR, три для VH (HI, H2 и НЗ) и три для VL (LI, L2 и L3).
В методе адаптации человеческого каркасного участка, участки, нацеленные на перенос специфичности нечеловеческих антител на человеческие каркасные участки (HFR) - это CDR, как определено в публикации Rabat (Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), за исключением участка, соответствующего CDR-1 из VH. Для этого участка переносят комбинацию CDR и HVL (расширенную CDR-1 из VH) из нечеловеческого антитела на человеческий каркасный участок (как указано в таблицах 30, 31, 34, 35) . Кроме того, были получены и протестированы варианты с более короткими
перенесенными CDR-H2 (именуемые Kabat-7 [Raghunathan G. US20090118127 Al, 2009]).
Выбор человеческого FR
Человеческие FR, определяемые как участки в вариабельных участках, не содержащиеся в антигенсвязывающем сайте, выбирали из репертуара функциональных человеческих генов зародышевой линии IGHV, IGKV, IGKJ и IGHJ. Репертуар последовательностей генов человеческой зародышевой линии был получен посредством поиска в базе данных IMGT(Kaas, et al. , Nucl. Acids. Ост. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al. , Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005) и составления всех аллелей "01" по состоянию на 01 октября 2 0 07 года. Из этой компиляции удалили избыточные гены (на 100% идентичные на аминокислотном уровне), а также гены с непарными цистеиновыми остатками.
Первичный выбор человеческих последовательностей для HFR участка был основан на сходстве последовательности человеческих генов зародышевой IGHV линии с полноразмерным мышиным участком VH, включающим FR с 1 по 3, а также H-CDR-1 и H-CDR-2. На следующем этапе выбранные человеческие последовательности были упорядочены по рангам с использованием оценочной шкалы, которая учитывает как длину CDR, так и сходства CDR мышиных и человеческих последовательностей. Стандартную матрицу мутации, например, матрицу замещения BLOSUM 62 (Henikoff and Henikoff, Proc Natl Acad Sci USA. 89, 10915-9, 1992) использовали для выравнивания по балльной шкале CDR мышиных и человеческих последовательностей, а также применяли большие штрафы при выявлении вставки и/или делеции в петлях CDR. FR-4 был выбран на основании сходства последовательностей генной зародышевой линии IGHJ (Kaas, et al. , Nucl. Acids. Ост. 32, D208-D210, 2004; Lefranc M.-P et al. , Nucl. Acids Res., 33, D593-D597, 2005) с последовательностями мышиных антител С2177 и С2191. Аналогичную процедуру использовали для выбора человеческих FR для VL. Гены зародышевой линии IGVK использовали для выбора FR 1-3 и L-CDR 1-3. Гены зародышевой линии IGJK использовали для выбора FR-4.
В дополнение к критериям последовательностей, для
фрагментов Fv была создана гомологичная ЗБ-модель с использованием программы моделирования (Sali and Blundell. J. Mol. Biol. 234: 779,1993) из программного пакета компании Accelrys, Inc. Модели использовали для анализа вариантов HFR, включая характеристику CDR и оценку проявляющих способностей. Дополнительные аспекты выбора вариантов HFR заключались к сведению к минимуму количества остатков метионина и триптофана, устранению потенциальных сайтов N-гликозилирования и поддержанию человеческой зародышевой линии с самым высоким профилем экспрессии in silico (de Wildt, J. Mol. Biol. 185: 895, 1999).
Для первого пути адаптации каркасного участка и оптимизации С2177 в библиотеку были включены шесть VH и четыре VL вариантов HFR. VH и VL варианты HFR были объединены по парам комбинаторным способом для получения 2 4 вариантов HFR плюс 10 контрольных пар всех вариантов HFR с прототипом V участка С2177 плюс материнской С2177 для получения в общей сложности 35 комбинаций. Аналогично для С2191 пять VH и четыре VL вариантов HFR были объединены по парам комбинаторным способом для получения 2 0 вариантов HFR плюс 9 контрольных пар всех вариантов HFR с прототипом V участка С2191 плюс материнской С2191 для получения в общей сложности 3 0 комбинаций. ДНК, кодирующая выбранные вариабельные домены, была перекомпонована с использованием стандартных методов для сборки всех моноклональных антител с человеческим IgGl и константным участком kappa. Полученное контрольное химерное антитело С2177, отмеченное М4 0, состоит из вариабельных участков Н7 и L18. Полученное контрольное химерное антитело С2191, отмеченное М41, состоит из вариабельных участков НЮ и L2 0. Моноклональные антитела временно экспрессировали в 4 8-луночных планшетах в клетках НЕК 2 93Е. Надосадочную жидкость из культур протестировали на экспрессию и активность связывания через 96 часов после трансфекции. Уровень экспрессии оценивали с использованием технологии Octet для измерения скорости связывания антител с биосенсорами белка А. Уровень экспрессии измеряли путем сравнения с эталонными образцами с известной
концентрацией антител. Была собрана стандартная кривая из 8 точек, состоящая из серийного разведения антитела идентичного изотипа в соотношении 1:2, начиная с 100 мкг/мл. Биосенсоры гидратировали в течение 10 минут в выработанной среде, а скорость связывания стандартов и неизвестных образцов измеряли в течение 2 минут. Данные были проанализированы с использованием уравнения из 5 параметров взвешенного дозозавсимого эффекта и алгоритма скорости связывания начального наклона. Образцы с экспрессией 1 мкг/мл были разбавлены до 1 мкг/мл с использованием выработанной среды, а также был проведен скриннинг с использованием одной точки ИФА. Для данного анализа ИФА на 9б-луночные черные планшеты maxisorp наносили 100 мкл козьих антител к человеческому IgG FC с концентрацией 4 мкг/мл, разведенных в карбонатно-бикарбонатном
буфере, рН 9.4, при температуре 4°С в течение ночи, затем промывали трижды промывным буферным раствором (0,05% раствор Tween-20 в ФСБ) и блокировали 300 мкл раствора StartingBlock
(Thermo Scientific) в течение 1 часа с последующей промывкой, описанной выше. Образцы или стандарты разводили до концентрации 100 нг/мл в отработанной среде и 100 мкл добавили на планшет для анализа при комнатной температуре в течение 1 часа со встряхиванием. Планшеты промывали трижды и добавляли 50 мкл на лунку человеческого ECD CD27 с His-меткой при разведении 60 нг/мл в анализируемый буферный раствор (ФСБ с 1% и 0,05% Tween-20) и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После промывки добавляли по 50 мкл в лунку конъюгированного с пероксидазой пентагистидина Qiagen с разведением 1:2000 в буферном растворе для анализа и инкубировали 1 час при комнатной температуре со встряхиванием. Субстрат ВМ ChemiLum
(ВМ Chemilum, POD, Roche) смешивали в соответствии с инструкциями производителя и после окончательной промывки на планшеты добавляли в объеме 50 мкл. Через 10 минут планшеты считывали на устройстве для прочтения планшетов Perkin Elmer Envision Reader.
Результаты скриннинга комбинаторной библиотеки С2177
показали, что все V-участки связываются с CD27 с разной силой. Несколько вариантов HFR показали более высокий сигнал связывания, чем материнская С2177, в то время как остальные показали связывание, которое было сравнимо или ниже материнского. Все VL связывались с антигеном на обнаруживаемых уровнях и не влияли на связывание вариантов HFR, выраженное на приемлемых уровнях, но ниже материнского. Двадцать четыре антитела С2177 HFR (комбинации VH, VL) показали связывание с CD27 и экспрессию на уровне 1 мкг/мл.
Результаты скриннинга комбинаторной библиотеки С2191 показали, что все кроме одного VH связывались с CD2 7 с разными сигналами. Все VL показали связывание с CD2 7 за исключением объединенных в пары с VH. Несколько вариантов HFR показали более высокий сигнал связывания, чем материнская С2177, в то время как остальные показали связывание, которое было сравнимо или ниже материнского. Семнадцать антител С2191 HFR (комбинации VH, VL) продемонстрировали связывание с CD2 7 и экспрессию > 1 мкг/мл.
На основании относительной афинности связывания для CD27, измеренного методом ИФА, пятнадцать С2177 и одиннадцать С2191 вариантов были отобраны для проведения экспериментальной экспрессии и очистки. Экспериментальная экспрессия проводилась во временном режиме в клетках CHO-S при объеме 750 мл. Собранные супернатанты очищали хроматографией с белком А, и очищенные белки оценивали на аффинность и функциональную активность.
Афинности вариантов человеческих моноклональных антител HFR С2177 измеряли методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием матричной системы взаимодействия белков ProteOn XPR36 (BioRad). Скорости ассоциации и диссоциации CD27 измеряли для каждого варианта. Поверхность биосенсора получали путем ковалентного присоединения козьего античеловеческого антитела IgG (Fc) к поверхности чипа GLC (BioRad) с использованием инструкции производителя для аминосвязывающего химического анализа. Приблизительно 5000 ЕО (единиц ответа) антитела были иммобилизованы. Кинетические эксперименты
проводились при температуре 2 5°С в рабочем буферном растворе (ФСБ, 0,01% Р20, 0,01% БСА) . Серийные разведения 1:3 человеческого ECD CD27 готовили начиная с 300 нМ. Приблизительно 350 ЕО моноклонального антитела были получены на каждом канале сенсорного чипа. Изотипически сходный контроль антитела иммобилизировали и применяли в качестве эталонной поверхности. После захвата моноклонального антитела проводили трехминутную инъекцию (фаза ассоциации) раствора в концентрации антигена 3 0 мкл/мин, затем - 10-минутную инъекцию проточного буферного раствора (фаза диссоциации). Поверхность датчика регенеровали путем инъекции 0,85% фосфорной кислоты со скоростью 100 мкл/мин. Данные обрабатывали на программном обеспечении прибора. Проводили двойное эталонное вычитание данных, вычитая графики, полученные при инъекции буфера, из эталонных графиков, полученных при инъекциях анализируемых веществ. Затем проводили кинетический анализ данных с помощью модели связывания 1:1 Langmuir с точным соответствием. Результат для каждого моноклонального антитела сообщали в формате Ка (скорость ассоциации), Kd (скорость диссоциации), KD (равновесная константа диссоциации) и процент активности. Афинности вариантов С2177 HFR были аналогичными с материнским моноклональным антителом М4 0, показывая менее чем трехкратное изменение KD для всех вариантов. Аналогично, афинности вариантов человеческих моноклональных антител HFR С2191 показали менее чем двукратную разницу с материнским моноклональным антителом М41.
Биологическую активность вариантов HFR измеряли методом их
ингибирования CD70-опосредованной индукции NFkB при проведении
анализа репортерного гена люциферазы. НЕК-клетки
трансфицировали с использованием индуцируемого NFK|3 вектора экспрессии люциферазы pGL4-32-NFK|3-Luc2 (Promega) и плазмиды экспрессии CD27 или пустого вектора, и инкубировали в течение ночи в среде экспрессии Freestyle (Gibco, #12338). На следующий день клетки помещали в 9б-луночные культуральные планшеты по 4 0 мкл и 50 0 00 клеток на лунку. Затем 4 0 мкл антител или
контрольных растворов добавляли к клеткам с помощью серийного разведения 1:3, начиная с 30 мкг/мл конечной концентрации в лунке и инкубировали в течение от 1 до 2 часов. В течение данной инкубации эписомные клетки CD7 0 готовили для стимуляции. Вкратце, адгезивные клетки перерастворяли с использованием стандартных методов культивирования клеток и инкубировали в течение 1 часа с использованием митомицина С с концентрацией 25 мкг/мл, чтобы остановить рост клеток. После инкубации CD7 0 + клетки отмывали в среде, разбавляли и 4 0 мкл добавляли при концентрации 10000 клеток на лунку. Планшеты инкубировали в течение ночи. На следующий день реагент Steady Glo (Promega) был подготовлен в соответствии с инструкциями изготовителя и добавлен по 12 0 мкл в каждую лунку. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 2 0 минут при встряхивании. Люминесценцию измеряли с помощью считывающего устройства Perkin Elmer Envision Reader. IC50 из вариантов С2177 HFR были аналогичны друг другу и материнскому моноклональному антителу М4 0 в диапазоне от 0,11 нМ до 0,21 нМ. IC50 из вариантов C2191HFR были аналогичны друг другу и материнскому моноклональному антителу М41 в диапазоне от 0,13 нМ до 1,3 нМ.
Рассмотрение афинности, биологической активности и биофизических свойств привело к выбору варианта М69 С2177, состоящего из вариабельных участков Н28 (SEQ ID NO: 111) и L35 (SEQ ID NO: 82), варианта M91 C2191, состоящего из вариабельных участков Н31 (SEQ ID NO: 131) и L42 (SEQ ID NO: 140), для созревания афинности. Обзор KD, выброс очистки, связывания с CD2 7 ECD для супернатантов клеточной культуры ("ИФА"), а также ингибирование (IC50) из С027-опосредованного ответа NFKp CD70 для материнского М4 0 и его варианта М69 HFR, а также для материнского М41 и его варианта М91, приведены в таблице 4.
ИН белка
Протеон KD (нМ)
Вход (мг)
Сигнал ИФА
NFK|3 IC50 (нМ)
С2177 материнской М4 0
L18
0, 96
определяется
1, 00
0,14
М69
Н2 8
L35
0, 77
10, 08
1,09
0,11
С2191 материнский М41
L20
10,3
определяется
1, 00
0,30
М91
Н31
L42
7,9
5, 64
1,09
0,28
ПРИМЕР 8. ОПТИМИЗАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА М69 ИЗ С2177 HFR
М69 имеет аффинность около 1 нМ к человеческому ECD CD27 и содержит одинаковое количество CDR, как и С2177 и HFA материнского CD27M40. Оптимизация М69 включала множество библиотек для увеличения аффинности и удаления сайтов РТМ, введенных или идентифицированных в процессе.
Как описано в примере 9, параллельный подход к библиотеке фагового дисплея для HFR и оптимизация С2177 идентифицировали различие в пролине в позиции 52а CDR-H2. Эта позиция не была рандомизирована в проекте библиотеки. Совместная структура Fab С2177 и С2191 с CD27 (пример 5) указывает на то, что Р52а не вовлечен прямым образом в процесс связывания с антигеном. Тем не менее, мутация на этой позиции может изменить конформацию петли CDR-H2 и способствовать более оптимальным взаимодействиям окружающих остатков D27 с CD27. Поэтому библиотека была создана, чтобы произвольно разнообразить Р52а и его окружающие остатки Y52, G53 и D54 с использованием мутагенеза NNK
(библиотекаС2 7Н2 8Ъ2). Также во втором пути оптимизации мутация Y32 на F в CDR-L1 показала улучшенное связывание. Поэтому вторая библиотека была создана с произвольным разнообразием Y32 вместе с разнообразием в остатках Y30a, D30d, А50, которые располагаются в той же структурной плоскости, как и Y32
(библиотека C27L35L2).
Проект созревания аффинности с ограниченным разнообразием для
CDR-H3 (C27H28L3)
Кроме того, была проведена оценка петель CDR-H3 и CDR-L1 с использованием библиотек ограниченного разнообразия. Таблицы 5 и б показывают структуру данных библиотек.
Таблица б
Проект созревания аффинности с ограниченным разнообразием для
CDR-L1 (C27L35L3)
Материнская аминокислота VH и позиция
Различие
Lys24
А, К,E,T
А1а25
A, G
Ser26
A, S
Gln27
A,Q,E,P
Ser28
A, S
Val29
A, V
Asp30
A, D
ТугЗОа
A, D, S
Ala30b
A, G
Gly30c
A, G
Asp30d
A, D
Ser31
A, S
Tyr32
A, D, S
Met33
A, M, T, V
Asn34
A, N, D, T
Библиотеки Fab были созданы в системе pIX фагового дисплея Fab, как описано в патенте WO2009/085462, Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010), and Tornetta et al. J Immunol Methods 360: 3 9-46 (2010) с внесением минимальных изменений в сайты рестрикционных ферментов. Эти библиотеки разделяли методом пэннинга относительно CD27-ECD в соответствии со схемами пэннинга, известными в данной области техники, например, такими как описано в патенте WO2009/085462 и в публикации Shi et al, J Mol Biol 397: 385-396 (2010), направленными на увеличение афинности методом выбора более низкой скорости диссоциации или более высокой скорости ассоциации. Фаги получали с помощью инфекции фага-помощника. Связывающие фаги извлекали путем добавления гранул с образованием комплекса гранула/антиген/фаг. После последней отмывки фаг высвобождали путем инфицирования экспоненциально растущих клеток Escherichia coli TG-1. Фаг снова получали и подвергали дополнительным циклам пэннинга.
Для последующего скриннинга ДНК приготавливали из хранимых в глицерине циклов пэннинга фагов, а ген pIX отделяли методом переваривания Nhel/Spel. После повторного лигирования ДНК трансформировали в клетки TG-1 и выращивали на планшетах LB/Agar в течение ночи. На следующий день собирали колонии, выросшие за ночь, и культуры использовали (i) для проведения ПЦР колонии и секвенирования V-участков, а также (ii) для индукции получения Fab. Для получения Fab выросшую за ночь культуру разводили 10-100-кратно в новой среде и выращивали в течение 5-6 часов при 37°С. Получение Fab индуцировали путем добавления свежей среды, содержащей IPTG, и культуры выращивали в течение ночи при 30°С. На следующий день культуры осаждали, а супернатанты, содержащие растворимые Fab-белки, использовали для ИФА на Fab. Для проведения анализа ИФА, растворимые Fab-белки захватывали на планшеты с помощью поликлонального
антитела анти-Fd(CHI). После отмывки и блокирования, добавляли биотинилированный человеческий ECD CD2 7 в концентрации 0,2 нМ. Такая концентрация позволяет ранжировать Fab-варианты, определенные как процентное отношение связывания материнского антитела, причем определено, что материнский Fab, находящийся в качестве контроля на всех планшетах, имеет 100% связывание. Биотинилированный CD2 7 ECD обнаруживали стрептавидином, конъюгированным с HRP и анализом хемилюминисценции планшетов в спектрофотометре. При такой концентрации CD2 7 возможно ранжирование Fab-вариантов, нормализированных до материнской Fab. При помощи данного критерия были выбраны 10 тяжелых и б легких цепей, связывающих человеческий CD27 на 100% или более относительно М69 Fab.
Из библиотеки CDR-H2 (C27H28L2) материнский Y преимущественно выбирали в положении 52, что указывает на предпочтение для этого остатка. В положении 52а, Р был заменен на остатки A, S, V и G среди Fab с лучшей активностью связывания. В положении 53 был выбран материнский G вместе с R и N. В положении 54 восстанавливали только материнский D. Девять клонов из этой библиотеки (таблица 7) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики как моноклональных антител.
Таблица 7
Девять VH клонов, выбранных из полного разнообразия
библиотеки C27H28L2
Единственный VH клон, выбранный из C2 7H2 8L3
библиотеки CDR-H3 (C27H28L3), было S95A и A101G. Один клон из этой библиотеки, содержащей обе мутации (таблица 8), субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклонального антитела.
Для библиотеки L-CDR1, состоящей из четырех позиций (C27L35L2), положение 30а показало обогащение материнских Y и W. В положении 3 0d, остатки S, Н и Е были обогащены вместе с материнским D. В положении 32 материнский Y был заменен на F и W. В положении 50 было отдано предпочтение Т над материнским А. В целом, лучшие клоны имели более гидрофобные боковые цепи по сравнению с материнскими. Пять клонов из этой библиотеки (таблица 9) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклональных антител.
Шесть VL клонов, выбранных из C27L35L1 и C27L35L2
Для полной библиотеки CDR-L1 с ограниченным разнообразием (C27L35L3) была восстановлена только одна последовательность с единственным отличием от материнской, поскольку Y32 был заменен на F, аналогично описанной выше VL библиотеке с четырьмя положениями. Эта полная библиотека CDR-L1 не включала F в положении 32, и, таким образом, восстановленный клон, вероятнее всего является контаминантом из библиотеки VL, состоящей из четырех позиций. Этот клон (L255) субклонировали в векторы IgG для экспрессии и характеристики в качестве моноклонального антитела (таблица 9).
L260
L261
б-вариантные легкие цепи были объединены в пары с 10-вариантными тяжелыми цепями, чтобы получить 60 комбинаций, которые которые экспрессировали клетки НЕК2 93Е. Супернатанты подвергали скринингу на предмет уровня экспрессии, связывания с человеческим CD2 7 ECD, как было измерено при проведении анализа ИФА, а также афинности, как было измерено с использованием инструмента ProteOn. Уровень экспрессии всех вариантов был достаточным для целей проведения скрининга. Для некоторых вариантов афинность была увеличена до 4 0 раз. Два моноклональных антитела М59 6 и Мб 0 0 были отобраны для дальнейшего мутагенеза, чтобы устранить возможные сайты посттрансляционной модификации. Комбинации цепей VH и VL для этих моноклональных антител приведены в таблице 10. Антитела отличаются только двумя остатками в их легких цепях.
Таблица 10
Объединение в пары тяжелых и легких цепей выбранных созревших
M596 отличается от материнской молекулы, М69, в трех положениях: Р52аА в CDR-H2, Y32W в CDR-L1 и А50Т в CDR-L2. М600 отличается от М69 в двух положениях: мутация Р52аА в CDR-H2 и Y32F в CDR-L1.
Три разделенные сайта потенциальной посттрансляционной модификации были определены в М596 и М600. Существует потенциальный N-связанный сайт гликозилирования в положении N58
в CDR-H2 и два потенциальных сайта изомеризации в CDR-H2 и CDR-L1, кодированные "DG" и "DS" соответственно. Кроме того, М596 содержит остаток триптофана не зародышевой линии в CDR-L1, который может быть подвержен окислению.
С целью устранения риска гликозилирования были созданы три отдельные единичные замены в N5 8 и одна в S60 (таблица 11) . Конструкты экспрессировали в клетках НЕК2 93Е, супернатанты оценивали на аффинность к CD27 с использованием инструмента ProteOn. Все варианты имели аффинности, близкие к материнским, которые составляли 25 пМ и 49 пМ для М596 и М600 соответственно. Варианты М680 и М678, которые оба происходят из М60 0, были отобраны для оценки дальнейших замещений с целью устранения сайтов изомеризации. Варианты М68 0 и М67 8 имеют А в положениях 60 и 58, соответственно и имеют дополнительное преимущество в нехватке триптофана в CDR-L1, который присутствовал в материнском М596.
Для оценки влияния мутации потенциальных сайтов изомеризации в М67 8 и М68 0 была разработана небольшая библиотека, чтобы параллельно удалить оба сайта. Каждая мутация была заменена индивидуально на CDR-H2 тяжелых цепей или CDR-L1 общей легкой цепи, а затем объединена в пары в комбинаторной библиотеке. Разнообразие этой библиотеки представлено в таблице
12 .
Материнская аминокислота VL и
ПОЗИЦИЯ
Разнообразие
Asp34
D, Е
Были экспрессированы данные моноклональные антитела и была оценена аффинность как для вариантов сайтов гликозилирования. Мутация D34E в потенциальном сайте изомеризации CDR-L1 привела к последовательному двукратному увеличению афинности и, следовательно, этот сайт был успешно удален. Мутация D54E в потенциальном сайте изомеризации CDR-H2 снизила аффинность более чем в десять раз. Однако, мутация G55A существенно не повлияла на аффинность. Варианты М703 и М706 сохраняют аффинность материнского Мб00 и имеют пониженный риск воздействия на функции из РТМ. Таблица 13 показывает выбранные варианты из каждой стадии оценки РТМ-рисков, объединение в пары их тяжелых и легких цепей, афинность и изменения последовательности в CDR. Мутация, выбранная для удаления потенциального сайта гликозилирования, подчеркнута. Мутации для удаления двух потенциальных сайтов изомеризации выделены жирным шрифтом и подчеркнуты двойной линией.
ПРИМЕР 9. КОМБИНИРОВАННЫЕ HFR И ОПТИМИЗАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С2177
В этом подходе ограниченный набор вариантов HFR оценивали в формате Fab на предмет экспрессии, отображения pIX и связывания, а затем лучших кандидатов продвигали для оптимизации. CDR из С2177 были адаптированы к человеческим каркасным участкам в две тяжелые цепи VH5-51 (SEQ ID N0: 102 Н24) и VH1-46 (SEQ ID N0: 106 Н25) и две легкие цепи Vk4-1 и Vk012 (SEQ ID NO: : 90 L36) . Эти вариабельные домены HFA были соединены попарно в матрицу 2x2 в качестве Fabc человеческим СН1 и Ск константными участками в векторе дисплея фагов Fab pIX. Вариант VHl-46/Vk012 (М55, H25/L36) показал связывание с CD2 7 и хорошие характеристики отображения и был выбран для создания библиотек созревания аффинности.
Библиотеки Fab для отображения pIX фагов были созданы, как описано выше в примере 8. На основе экспериментальных совместных структур CD2 7 с С2191 и С2177 (пример 5), библиотеки разнообразия были разработаны в остатках CDR в и вокруг паратопов антител. Акцент на изменении был сделан в CDR-L1, L3 и Н2. В общей сложности 4-6 остатков в пределах отдельного CDR были диверсифицированы с использованием кодона NNK, кодирующего для всех 2 0 аминокислот. Размер каждой библиотеки оценивали в <6х107 вариантов, что может быть охвачено стандартными методиками рестрикционного клонирования библиотек. Таблица 14 показывает остатки, которые были подвергнуты полной диверсификации в различных библиотеках CDR.
CDR-H3
Y97
Y98
D100
YlOOa
VL CDR
Материнская аминокислота и позиция
CDR-L1
Y30a
A3 Ob
G30c
D30d
Y32
CDR-L3
Q90
N92
E93
D94
Y96
Fab библиотеки, отображаемые на белке IX оболочки фага, разделяли методом пэннинга на биотинилированный hCD2 7ECD/Fc. Фаг получали с использованием инфекции фага-хелпера плазмидной библиотеки вариантов. Связующие фаги извлекали путем добавления покрытых стрептавидином магнитных гранул для создания комплекса гранула/антиген/фаг. После последней отмывки фаг высвобождали путем инфицирования экспоненциально растущих клеток Escherichia coli MC1061F. Фаг снова получали и подвергали дополнительным циклам пэннинга. Растворимый Fab из выбранных клонов был выработан и оценен на предмет активности связывания, как описано для пути 1. Результаты были получены только из библиотек CDR-L1 и CDR-L2. Двадцать один клон из этих двух библиотек продемонстрировал связывание больше, чем у материнских HFR Fab. Клоны, содержащие С или М в самых разнообразных последовательностях, были отбракованы. Десять Fab конвертировали для экспрессии на фоне IgG4SPAAa/kappa для дальнейшего исследования. Тяжелая цепь IgG4PAA - это человеческий IgG4, содержащий замену серина на пролин в шарнирной области (Angal et al. , Mol Immunol 30: 105 (1993) и замены аланина в двух позициях в СН2 (ML Alegre et al,
Transplantation; 57: 1537-43 (1994)). Моноклональные антитела получали в клетках НЕК2 93Е в качестве реплик Fab и в виде матрицы из комбинаций тяжелых и легких цепей. Аффинность измеряли на приборе ProteOn с использованием культуральных супернатантов (таблица 15) . Мутация Р52а на Q (М158) или S (Ml57) в CDR-H2 уменьшила KD в б раз по сравнению с материнским моноклональным антителом (М159). Мутация Y36F в CDR-L1 (М149) уменьшила KD в 4 раза, а добавление мутаций G33H и D34E (Ml55) привело к б-кратному уменьшению KD. Комбинация мутации P52S либо с Y36F (М160), либо с Y36F плюс G33H и D34E уменьшила KD в 20 раз до 100 пМ. Комбинации замен в Ml 58, Ml 60 и Ml б б были отобраны для дальнейшей характеристики.
клеток НЕК2 93, очищали и анализировали на кинетику связывания с CD27-His на аппарате Biacore. Значения KD были на 1 лог выше, чем измеренные при помощи аппарата ProteOn с неочищенными супернатантами, но показали одинаковые значения по отношению друг к другу (таблица 16).
При повторной оценке оригинальных комбинаций HFA, VH, адаптированные VH5-51, показали значение KD в 2 раза меньше значений каркаса VH1-4 6. Мутация P52aS в H-CDR2 была введена в VH5-51 VH для создания Н221. Н221 экспрессировали легкие цепи L220, L219 и L217 из материнского моноклонального антитела HFA
(Ml59) и аффинность улучшила варианты Ml 60 и Ml 66, соответственно, для получения моноклональных антител М171, М169 и М170. Измерения кинетики при помощи аппарата BIAcore на очищенных моноклональных антителах показали двукратное улучшение KD по сравнению с соответствующими вариантами VH1-4 6
(сравните таблицы 16 и 17).
Анализ последовательностей М160, М169 и М170 выявил потенциальный сайт изомеризации на D54-G55 и потенциальный сайт дезаминирования на N61-G62 в CDR-H2 из Н196 и Н221. Кроме того, потенциальный сайт изомеризации был выявлен на D34 в CDR-L1 из L219. Мутации были введены с целью удаления этих сайтов и оценены по их влиянию на активность (таблица 18) . Очищенные моноклональные антитела были проанализированы на аффинность к CD27-His на аппарате ProteOn. Мутации либо не имели вообще никакого эффекта, либо не имели положительного эффекта на KD. Например, как М668, так и М671 имели KD почти в 2 раза ниже, чем их материнские моноклональные антитела, Ml 60 и СМ169 соответственно.
ПРИМЕР 10. ОПТИМИЗАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА М91 ИЗ С2191 HFR
Методы, применяемые для оптимизации М91 (H31/L42) были такими же, как описано в примере 8, если не указано иначе. Сканирование аланина/зародышевой линии CDR из С2191 проводилось в формате Fab для оценки позиций, важных для взаимодействия с CD27 с использованием материнских VH и VL участков С2191 в формате Fab с константными человеческими Chi и Ск участками. Библиотеки заменяли остатки в CDR аланином или остатком соответствующей последовательности зародышевой линии. Некоторые позиции в CDR были исключены, поскольку они имели низкую степень проявления или не проявлялись под воздействием растворителя при моделировании, а затем на определенной структуре (пример 5) . Предполагаемые соматические мутации мутировали к первоначальному виду, к аминокислотам мышиной
зародышевой линии, для оценки их вклада в аффинность антител.
Вкратце, мышиные V участки клонировали в вектор дисплея Fab pIX
и было проведено тестирование связывания материнского с
биотинилированным человеческим белком CD27 - ECD методом ИФА.
Одиночные мутации (в соответствии с проектом библиотеки) были
введены с помощью мутагенеза, направленного на сайт, что было
проведено соответственно описанному в публикации Stratagene (La
Jolla, СА, USA). Мутантов с подтвержденными
последовательностями тщательно отбирали на новые планшеты и выращивали вместе с материнским Fab и отрицательным контролем Fabs. Окончательные варианты отдельных аминокслотных замен были получены в Е. coli, а затем был проведен их скрининг на экспрессию и связывание с CD27 методом ИФА. Сигналы экспрессии и связывания для материнских клонов были усреднены и установлены на 1,0, а сигналы мутантов были нормализованы относительно материнских. Две формы антигена использовали при проведении анализов методом ИФА: CD27 ECD (остатки 1-173) и химеру CD27 ECD-Fc (R &D Systems).
Результаты этого сканирования в сочетании с совместной кристаллической структурой послужили основой для проектирования библиотек созревания аффинности. Для тяжелой цепи; Позиции, выбранные для изменения были следующими: ТЗЗ в H-CDR1 и Y50, S52, S52a N56 и Y58 в CDR-H2 (таблица 23) . ТЗЗ не является контактным остатком, но мутация ТЗЗА улучшила связывание. Позиции S52 и S52A не являются контактными остатками, но замены в сканировании показали некоторое повышение связывания. Тирозины в положениях 50 и 58 являются контактными сайтами и замены на этих сайтах были выбраны в параллельном пути оптимизации, описанном в примере 11. Позиция N56 не оценивалась в сканировании аланина/зародышевой линии, но она является контактным сайтом и прилегает к ТЗЗ, S52 и S52a в кристаллической структуре. Для легкой цепи были выбраны следующие позиции для изменения: 30а, S30b, G30c и Y30d в CDR-L1 и L50 и N53 в CDR-L2 (таблица 23). Ни один из этих остатков не контактирует с антигеном непосредственно, но они примыкают к контактирующим остаткам, которые, как показало сканирование, имеют существенное негативное влияние на связывание. Мутация L50A имела умеренное действие на связывание и в кристаллической
структуре является единственным остатком в CDR-L2, который, возможно, контактирует с антигеном. Кроме того, N53 был выбран для ограниченной диверсификации. Были созданы две параллельные библиотеки, одна с Y3 0d, мутирующим до W и другая с Y3 0d, который сохранился как Y, так как W может сделать паратоп более гидрофобным и, следовательно, менее способным к проявлению. Таблицы 19 и 20, приведенные ниже, показывают проекты библиотек созревания афинности VH и VL для М91.
Y, либо W в данной позиции
Fab библиотеки, отображаемые на белке IX оболочки фага,
разделяли методом пэннинга на биотинилированный CD2 7-ECD. Было
отобрано всего 12 вариантов тяжелых и 12 вариантов легких
цепей, которые связывались с CD2 7 в равной степени или лучше,
чем материнский химерный Fab из С2191. Варианты были
преобразованы в IgGl/kappa антитела, вырабатываемые в клетках
НЕК293Е в виде 144 комбинаций и супернатанты культуры оценивали
на предмет связывания с использованием ProteOn. Для некоторых
вариантов наблюдались значительные (100-кратные) увеличения
аффинности. Из 144 пар VH и VL для дополнительной
характеризации были выбраны 8 (таблица 21) . Эти моноклональные
антитела были разделены на три подгруппы. Варианты из группы 1,
которые имеют одну и ту же тяжелую цепь (Н227, SEQ ID N0: 133),
объединяли в пары с четырьмя различными легкими цепями, в то
время как варианты группы 2 и группы 3, каждая из которых имеет
по одной легкой цепи, объединяли в пары с двумя различными
тяжелыми цепями. Четыре выбранные легкие цепи менялись на всех
четырех позициях, диверсифицированных в CDR-L1
(RASKSVSX1X2X3X4SFMH) (SEQ ID N0: 158); где Xi - это А, Е, Н или L; Х2 - это D, G, V или W; Х3 - это G или R; и Х4 - это W или Y) . Они также менялись в обеих позициях, диверсифицированных в CDR-L2 (XiASX2LES) (SEQ ID N0:171); где Xi - это L или V; и где Х2 - это К, N или R) . CDR-L3 не был изменен из последовательности L42 (SEQ ID N0: 140) и представляет собой QHSRELPWT.
М489
C27L250
RASKSVSLDR WSFMH (63)
LASNLES (67)
C27H227
GFTFSSYGMS (44)
YIDEGGGQTIYP
DSVKG (47)
М492
C27L249
RASKSVSEGR WSFMH (62)
VASRLES
(68)
C27H228
GFTFSSYSMS (45)
YIDAGGGFTIYP DSVKG (48)
М493
C27L250
RASKSVSLDR WSFMH (63)
LASNLES (67)
C27H228
GFTFSSYSMS (45)
YIDAGGGFTIYP DSVKG (48)
М501
C27L250
RASKSVSLDR WSFMH (63)
LASNLES (67)
C27H231
GFTFSSYSMS (45)
HIDAGGGRTWY PDSVKG (49)
М526
C27L249
RASKSVSEGR WSFMH (62)
VASRLES
(68)
C27H222
GFTFSSYGMS (44)
YIDRGGGVTIYP
DSVKG (50)
Эти восемь вариантов были получены путем временной экспрессии в клетках НЕК293Е в объеме 750 мл. Собранные супернатанты очищали с помощью хроматографии белка А и каждый вариант анализировали с использованием метода SDS-PAGE и SE-HPLC для определения чистоты образца и процентного содержания мономера в очищенной пробе. Все варианты имели значение чистоты более чем 90% и значение содержания мономеров также было более чем 90%. Для оценки свойств ассоциации антител, удерживающие факторы (к') были определены путем выполнения перекрестного взаимодействия хроматографии для каждого очищенного варианта (Jacobs SA, Wu SJ, Feng Y, Bethea D & O'Neil KT (2010) Cross-interaction chromatography: a rapid method to identify highly soluble monoclonal antibody candidates. Pharm Res 27, 65-71). В этом способе образец антител пропускали через колонку в сочетании с человеческим IgG и оценивали на предмет удерживания по сравнению с контрольными антителами. Кратко, 50 мг человеческого IgG (Sigma Aldrich) соединяли с колонкой NHS-сефароза объемом 1 мл (GE Healthcare) в соответствии с инструкциями производителя. Несвязанный IgG удаляли путем отмывки 0,1 М Tris, рН 8, 0,5 М NaCl, а непрореагировавшие группы NHS блокировали тем же буферным раствором. Эффективность связывания определяли путем измерения концентрации белка, оставшегося в непрореагировавшем связывающем буфере и смывах, с использованием набора Coomassie Plus Assay Kit (Thermo Pierce) и вычитания этого значения из количества белка до иммобилизации. Контрольную колонку также получали с использованием того же протокола, но без конъюгации IgG к
Анализ серии очищенных созревших вариантов
смоле. Контрольную колонку сначала обрабатывали на приборе для ВЭЖХ Dionex UltiMate 3000 после достижения равновесия в условиях ФБС, рН 7 и при скорости потока 0,1 мл/мин. Сначала на колонку наносили 2 0 мкл маточного раствора белка, чтобы обеспечить блокировку неспецифических сайтов связывания, после чего наносили 2 0 мкл 10% ацетона для проверки целостности колонки. Образцы для анализа разводили до концентрации 0,1 мг/мл в ФСБ, рН 7. 20 мкл каждого образца наносили на каждую колонку и оставляли для обработки со скоростью 0,1 мл/мин в течение 3 0 мин. Регистрировали время удержания и для каждого варианта рассчитывали коэффициент удержания (к') . Значение к рассчитывали как разницу времени удерживания на колонке с IgG и пустой колонке. Все варианты очищали до достижения чистоты более чем 90% на основе SDS-PAGE и вытеснительной хроматографии. Все значения к рассчитывали так, чтобы они были меньше, чем 0,3, что свидетельствует о хороших свойствах раствора (таблица 22).
Восемь различных моноклональных антител и материнский HFR были оценены на предмет их аффинности к CD2 7 ECD с использованием BIAcore, а также их IC50 в анализе к|3-репортера. Кинетические константы и аффинность измеряли с использованием BIAcore. В таблице 2 3 обобщены данные, собранные по этим вариантам. Сигнал экспрессии и ИФА на связывание с CD27 согласно измерениям от начальных малых супернатантов культуры
ПРИМЕР 11. КОМБИНИРОВАННЫЙ HFR И ОПТИМИЗАЦИЯ
МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА С2191
В этом подходе ограниченный набор вариантов HFR оценивали в формате Fab на предмет экспрессии, дисплея pIX и связывания, а затем лучших кандидатов продвигали для оптимизации. CDR из С2191 были адаптированы к человеческому каркасному участку в две тяжелые цепи (VH3-23 и VH3-11) и две легкие цепи (Vk4-1 и Vk012). Эти вариабельные домены HFA были соединены попарно в
матрицу 2x2 в качестве Fabc с человеческими СН1 и Ск константными участками в векторе дисплея фагов Fab pIX. Вариант VH3-23/Vk012 (Н39 (SEQ ID NO: 145)) и L40 (SEQ ID NO: 137) показал связывание с CD27 и хорошие характеристики отображения и был выбран для создания библиотек созревания аффинности. Этот Fab называется "материнским".
Для выбора антител с улучшенной аффинностью, несколько остатков во всех CDR, кроме CDR-H3 из Н39, были полностью диверсифицированы с помощью вырожденных кодонов NNK (таблица 24). Каждая библиотека CDR создавалась отдельно и подвергалась фаговому разделению методом пэннинга для выбора созревших вариантов аффинности.
Библиотеки С2191 с разнообразием в CDR-H2, CDR-L1 или CDR-L2 выпустили 50 уникальных Fab с улучшенным связыванием с человеческим CD27 относительно материнского HFR Fab, как измерено методом ИФА по одной точке. Данные клоны затем ранжировали по нескольким точкам методом ИФА и было выбрано семнадцать клонов для конвертации на человеческий IgG4alaala/kappa для дальнейшей характеристики (таблица 25).
Fab с созревшей аффинностью, выбранные для конвертации на IgG
Идентификатор Fab
Идентификатор белка НС
Идентификатор белка LC
CDR-H2 (SEQ ID NO:)
CDR-L1 (SEQ ID NO:)
CDR-L2 (SEQ ID NO:)
Материнский
Н39
L40
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F116
Н39
L59
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VGNRLED (70)
F119
Н39
L62
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VGDRRQE (71)
F178
Н145
L40
YISGGGGQTLYP DSVKG (54)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F18
Н40
L40
AIDHGGGRTYYP DSVKG (51)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F19
Н41
L40
AIDHGGGRTWYP DSVKG (52)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F243
Н39
L124
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VGSRMAF (72)
F250
Н39
L131
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VGDRANW (73)
F256
Н39
L137
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VGSRLDY (74)
F279
Н39
L160
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSYVRWSFMH (64)
LASNLES (67)
F291
Н39
L172
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSHIRWSFMH (65)
LASNLES (67)
F292
Н39
L173
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSHVRWSFMH (61)
LASNLES (67)
F295
Н39
L176
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
VADRVEV (173)
F297
Н190
L40
TIDRGGGSTWYP DSVKG (55)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F298
Н191
L40
AIDGGGGATYYP DSVKG (56)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F299
Н192
L40
VIDHGGGSTHYP DSVKG (57)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
F302
Н39
L179
YISSGGGNTYYP DSVKG (46)
RASKSVSLIRWSFMH (172)
LASNLES (67)
F57
Н79
L40
AIDHGGGQTLYP DSVKG (53)
RASKSVSTSGYSFMH (59)
LASNLES (67)
Моноклональные антитела IgGl/к mAbs были созданы в виде реплик Fabs и в виде матрицы вариабельных участков тяжелых и легких цепей (таблица 2 6), а также протестированы на предмет аффинности и свойств раствора. Форма моноклонального антитела материнского Fab обозначается как М131. М141 и М408 были выбраны для дальнейшей характеризации.
Моноклональные антитела, полученные из созревания аффинности
Fab
Идентификатор Fab
Идентификатор mAb
Н & Идентификатор белка L
Материнский
М131
Н39, L40
F18
М132
Н40, L40
F57
М133
Н79, L40
F298
М134
Н191, L40
F299
М135
Н192, L40
F292
М136
Н39, L173
F279
М137
Н39, L160
F256
М138
Н39, L137
Комбинация
М139
С27Н40, L173
Комбинация
М140
С27Н40, L160
Комбинация
М141
С27Н79, L173
Комбинация
М142
С27Н79, L160
Комбинация
М143
С27Н191, L160
Комбинация
М144
С27Н191, L173
Комбинация
М145
С27Н192, L173
Комбинация
М146
Н192, L160
Комбинация
М408
Н192, L137
ПРИМЕР 12. ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С СОЗРЕВШЕЙ АФФИННОСТЬЮ
Выбранные моноклональные антитела с созревшей аффинностью, полученные из материнских С2177 и С2191 антител гибридом, оптимизировали кодоном, вводили в другой вектор для достижения двойной экспрессии тяжелых и легких цепей, экспрессирующих в клеточной культуре CHO-GS, а затем очищали для дальнейшей характеризации. Идентификаторы этих антител в отношении зрелых вариантов, описанных в приведенных выше примерах, показаны в таблице 27.
Материнский
Идентификатор пДНК
Идентификатор единичного гена ДНК
Идентификатор пептида LC
Идентификатор пептида НС
2191
429
696
27L245
27Н227
2191
492
695
27L249
27Н228
2191
488
694
27L249
27Н227
2191
141
707
27Н79
27L173
2191
408
708
27Н192
27L137
2177
703
709
27Н270
27L267
2177
706
710
27Н272
27L267
2177
671
711
27Н258
27L266
2177
668
713
27Н255
27L266
Обобщенные данные для этих моноклональных антител представлены ниже для анализа KD с использованием Biacore и IC50 измерен при проведении анализа репортерного гена NF-K|3 (Таблицы 2 8 и 29) . Для данного анализа репортерного гена NF-K|3 клетки HEK-2 93F трансфецировали в общей сложности 3 6 нг ДНК, содержащей как конструкты человеческого CD27, так и конструкт люциферазы под контролем промотора NF-K|3 . Трансфектанты НЕК-2 93F высевали при концентрации 5x104 клеток на лунку и в 40 мкл среды Freestyle (Gibco) на 9б-луночные планшеты.Растворы гибридомных моноклональных анител анти-СБ2 7 добавляли на аналитический планшет в средах Freestyle для конечной концентрации 50 мкг/мл с разведением в соотношении 1:3 и планшеты инкубировали при температуре 37°(5% СОг) в течение 1 часа. Для тестирования способности моноклональных антител нейтрализовать сигнализирование CD70:CD27, добавляли временно облученные (4 000 рад) эписомальные клетки НЕК-2 93Е CD7 0 при концентрации 2 0% от количества трансфектантных клеток на планшет. Для тестирования агонистческой активности гибридомных моноклональных антител, добавление эписомальных клеток CD7 0 не проводилось. Аналитические планшеты инкубировали в течение ночи при температуре 37°С (5% СОг) и проявляли с использованием
системы для анализа люциферазы Steady-GloO Luciferase Assay System (Promega) в соответствии с инструкциями производителя.
Характеризация зрелых вариантов, полученных из С2177
Характеризация зрелых вариантов, полученных из С2191
Последовательности CDR и V участков
2177 путь 1
CDR-H1 (SEQ ID NO:)
CDR-H2 (SEQ ID NO:)
CDR-H3 (SEQ ID NO:)
Кабат
Кабат
Кабат
материнский М4 0
SSWMN (1)
RIYPGDGDTNYNGKFKG (3)
SDYYGDYGFAY (23)
Расширенный CDR-H1
Кабат-7 (+2 HFR
остатки для демонстрации мутаций РМТ)
Кабат
Н28
HFR(М69)
GYAFSSSWMN (2)
RIYPGDGDTNYS (4)
SDYYGDYGFAY (23)
Н236
GYAFSSSWMN(2)
RIYPGDGDTNYS
ADYYGDYGFGY
(162)
Н237
GYAFSSSWMN(2)
RIFVRDGDTNYS (5)
SDYYGDYGFAY (23)
Н238
GYAFSSSWMN(2)
RIYVGDGDTNYS (6)
SDYYGDYGFAY (23)
Н239
М596, М600
GYAFSSSWMN(2)
RIYAGDGDTNYS (7)
SDYYGDYGFAY (23)
Н240
GYAFSSSWMN(2)
RIYARDGDTNYS (8)
SDYYGDYGFAY (23)
Н241
GYAFSSSWMN(2)
RIYGRDGDTNYS (9)
SDYYGDYGFAY (23)
Н242
GYAFSSSWMN(2)
RIYANDGDTNYS (10)
SDYYGDYGFAY (23)
Н243
GYAFSSSWMN(2)
RIYGGDGDTNYS (11)
SDYYGDYGFAY (23)
Н244
GYAFSSSWMN(2)
RIYSGDGDTNYS (12)
SDYYGDYGFAY (23)
Н245
GYAFSSSWMN(2)
RIYSRDGDTNYS (13)
SDYYGDYGFAY (23)
Н259
М678
GYAFSSSWMN(2)
RIYAGDGDTAYS (14)
SDYYGDYGFAY (23)
Н260
М680
GYAFSSSWMN(2)
RIYAGDGDTNYA (15)
SDYYGDYGFAY (23)
Н270
М7 03=М7 0 9
GYAFSSSWMN (2)
RIYAGDADTAYS (16)
SDYYGDYGFAY (23)
Н272
М7 06=М710
GYAFSSSWMN (2)
RIYAGDADTNYA (17)
SDYYGDYGFAY (23)
RIXxXzXsD^DTXsYXg (151)
Для последовательности SEQ ID N0:151, Xi представляет
2177 путь 2
собой F или Y; X2 представляет собой A, G, S или V; X3 представляет собой G, N или R; X4 представляет собой А или G; X5 представляет собой А или N; а Хб представляет собой А или S
Н197
М157
GYAFSSSWMN (2)
RIYQGDGDTNYNGKFKG (22)
SDYYGDYGFAY (23)
RIYX1GDX2DTNYX3X4KFKG (152)
Для последовательности SEQ ID N0:152, Xi представляет собой
2177 путь 1
P, Q или S; X2 представляет собой А или G; X3 представляет собой А или N; X4 представляет собой G или Q.
Для последовательности SEQ ID N0:153, Xi представляет собой
W или Y; Хг представляет собой D, E, S или H; X3 представляет собой F, W или Y.
Для последовательности SEQ ID N0:154, Xiпредставляет собой A, E, T или V;
2177 путь 2
CDR-L1 (SEQ ID NO:)
CDR-L2 (SEQ ID NO:)
CDR-L3 (SEQ ID NO:)
Кабат
Кабат
Кабат
L18
материнский мышиный М4 0
KASQSVDYAGDSYMN (24)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L36
HFR (М55;
М5 0)
KASQSVDYAGDSYMN (24)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L216
М156; М167
KASQSVDYFSESYMN (30)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L217
М155; М166; М17 0; М672;
М673
KASQSVDYAHESFMN (31)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L218
М150; М161
KASQSVDYFGDSLMN (32)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L219
М149; М160;
М169
KASQSVDYAGDSFMN (25)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L266
М668=М713; М669; М670; М671=М711;
KASQSVDYAGESFMN (31)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L220
М157; М171; М158; М159
KASQSVDYAGDSYMN (24)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L221
М154
KASQSVDYFRTSFMN (33)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L222
М153
KASQSVDYVGTSFMN (34)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L223
М152; М163
KASQSVDYWSDSFMN (35)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
L224
М151; М162
KASQSVDYYNSSFMN (36)
AASNLES (37)
QQSNEDPYT (41)
KASQSVDYX!X2X3MSX4MN (155)
Для последовательности SEQ ID N0:155, Xi представляет
собой A, F, V, W или Y; Хг представляет собой G, H, N, R или S; X3 представляет собой D, E, S или T; X4 представляет собой F, L или Y.
2191 путь 1
CDR-H1 (SEQ ID NO:)
CDR-H2 (SEQ ID NO:)
CDR-H3 (SEQ ID NO: )
Кабат
Кабат
Кабат
материнский М41
SYTMS (42)
YISSGGGNTYYPDSVKG (46)
HRGNPFDY (58)
Расширенный CDR-H1
Кабат
Кабат
Н31
HFR (М91)
GFTFSSYTMS (43)
YISSGGGNTYYPDSVKG (46)
HRGNPFDY (58)
Н227
М427, М42 9=М69б; М488=М694; М489
GFTFSSYGMS (44)
YIDEGGGQTIY PDSVKG (47)
HRGNPFDY (58)
Н228
М492=М695; М493
GFTFSSYSMS (45)
YIDAGGGFTIY PDSVKG (48)
HRGNPFDY (58)
Н231
М5 01
GFTFSSYSMS (45)
HIDAGGGRTWYPDSVKG (49)
HRGNPFDY (58)
Н222
М526
GFTFSSYGMS (44)
YIDRGGGVTIY PDSVKG (50)
HRGNPFDY (58)
Н227
Определенный Кабат CDR-H1
SYGMS (161)
X1IX2X3GGGX4TX5Y PDSVKG (156)
Для последовательности SEQ ID N0:156, Xi представляет
2191 путь 2
собой H или Y; Х2 представляет собой D или S; Х3 представляет собой А, Е, R или S; а Х4 представляет собой I, W или Y.
Расширенный CDR-HI
Кабат
Кабат
Н39
HFR ; M131; M136-138
GFTFSSYTMS (43)
YISSGGGNTYYPDSVKG (46)
HRGNPFDY (58)
Н40
M132; M139;
M140
GFTFSSYTMS (43)
AIDHGGGRTYYPDSVKG (51)
HRGNPFDY (58)
Н41
GFTFSSYTMS (43)
AIDHGGGRTWYPDSVKG (52)
HRGNPFDY (58)
Н7 9
M133; M141=M7 07; M142
GFTFSSYTMS (43)
AIDHGGGQTLYPDSVKG (53)
HRGNPFDY (58)
Н145
GFTFSSYTMS (43)
YISGGGGQTLYPDSVKG (54)
HRGNPFDY (58)
Н190
GFTFSSYTMS (43)
TIDRGGGSTWYPDSVKG (55)
HRGNPFDY (58)
Н191
M134; M143; Ml 4 4 ;
GFTFSSYTMS (43)
AIDGGGGATYYPDSVKG (56)
HRGNPFDY (58)
Н192
M135; M145; Ml 4 6; M408=M708
GFTFSSYTMS (43)
VIDHGGGSTHYPDSVKG (57)
HRGNPFDY (58)
X1IX2X3GGGX4TX5Y PDSVKG (157)
Для последовательности SEQ ID N0:157, Xi представляет собой
2191 путь 1
A, T, V или Y; X2 представляет собой D или S; X3 представляет собой G, H, R или S; X4 представляет собой A, N, Q, R или S; a X5 представляет собой H, L, W или Y.
(60)
(68)
L245
М429=М69б
RASKSVSHVRWS FMH
(61)
LASKLES
(69)
QHSRELPWT (75)
L249
М4 8 8=М6 94; М492=М695; М5 2 6
RASKSVSEGRWS FMH
(62)
VASRLES
(68)
QHSRELPWT (75)
L250
М4 8 9; М4 93; М501
RASKSVSLDRWS FMH
(63)
LASNLES (67)
QHSRELPWT (75)
RASKSVSXiX2X3X4SFMH (158)
Для последовательности SEQ ID N0:158, Xi представляет собой
2191 путь 2
A, E, H, L, T или Y; X2 представляет собой D, G, I, S, V или W; X3 представляет собой G или R; a X4 представляет собой W или Y.
М136; М139;
RASKSVSHVRWS FMH
QHSRELPWT
L173
М141=М7 07; М144; М145
(66)
LASNLES
(75)
Последовательности вариабельных участков белков и антител
С2192
Вариабельный
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAF SSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDT NYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLT
мышиный
участок тяжелой цепи (НС)
SEDSAVYFCARRWDGGNYFFDYWGQGTTL TVSS
С2192
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCMASQDV
Вариабельный
GTAVAWYQRRPGQSPKLLIYWTSTRHTGV
участок легкой цепи (LC)
PDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYF CQQYSSYPLTFGSGTKLEIK
мышиный
С2177
Вариабельный
QVQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYAF SSSWMNWVKQRPGKGLEWIGRIYPGDGDT NYNGKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLT
мышиный
участок тяжелой цепи (НС)
SEDSAVYFCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSA
С2177
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSV
Вариабельный
DYAGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL
участок легкой цепи (LC)
ESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDA ATYYCQQSNEDPYTFGGGTKLEIK
L18
мышиный
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
HFR
L35
DYAGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL
4-1/2
выбранный
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
для С2177 AM пути 1
VL в
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGDSFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL
клонах М584,
L255
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
М600 AM; в вариантах М678, Мб 80 РТМ
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
путь 1 созрева-
L256
DYAGDSWMNWYQQKPGQPPKLLIYVASNL
ния
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
аффинности С2177
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
VL в
DYAGDSWMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL
клонах
L257
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLLAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
М558, М596 AM
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV DYAGSSFMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL
путь 1 созрева-
L258
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
ния афинности С2177
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
путь 1
L260
DWAGHSWMNWYQQKPGQPPKLLIYTASNL
созрева-
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
ния афинности C2177
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
путь 1
DYAGSSFMNWYQQKPGQPPKLLIYEASNL
созрева-
L261
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
ния афинности С2177
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQSV
VL в
DYAGESFMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNL
вариантах
L267
ESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDV AVYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
М703, М7 06 РТМ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
HFR
L36
DYAGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
012/2
выбранный
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKLEIK
для С2177 AM пути 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
L216
DYFSESYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAHESFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
VL в
L217
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
клоне М166 AM
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
DYFGDSLMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
L218
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
VL в
L219
DYAGDSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
клонах
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
М160, М169 AM
VL в
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
вариантах
L219 РТМ
DYAGESFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
М668,
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
М669, М670, Мб 71 РТМ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
VL в вариантах
DYAGeSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
M668,
L266
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
M669, M670, Мб 71 РТМ
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV DYAGDSYMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
VL в
L220
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
клоне М158 AM
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
L221
DYFRTSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
L222
DYVGTSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSV
DYWSDSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
100
L223
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVAITCKASQSV
DYYNSSFMNWYQQKPGKAPKLLIYAASNL
С2177 AM
101
L224
ESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDF ATYYCQQSNEDPYTFGQGTKVEIK
путь 2
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT
Выбранный
102
Н24
NYNGKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
IGHV5-51/4
HFR С2177 AM путь 2
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF
SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDGDT
VH в
103
Н221
NYNGKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клонах М169 AM
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF
SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDaDT
VH в
104
Н257
NYaqKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
варианте Мб 70 РТМ
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF
SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDaDT
VH в
105
H258
NYNqKFKGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
варианте Мб 71 РТМ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF
HFR,
SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYPGDGDT
выбранный
106
H25
NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
IGHV1-4 6/4
для С2177 AM, путь 2
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDGDT
VH в
107
H196
NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клонах М158, М160 AM
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDADT
VH в
108
H255
NYAQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
вариантах
М668, Мб 72 РТМ
QVQLVQS GAEVKKP GASVKVS С KAS GYAF SSSWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYSGDADT
VH в
109
H256
NYNQKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
вариантах
М669, Мб 73 РТМ
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYAF
110
H197
S S SWMNWVRQAPGQGLEWMGRIYQGDGDT NYNGKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLR SEDTAVYYCARSDYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон С2177 AM
HFR,
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF
выбранный
ДЛЯ
SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT
созревания аффинности
С2177 (AM) путь 1
111
H2 8
NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
IGHV5-51c/4
112
Н236
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYPGDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK ASDTAMYYCARADYYGDYGFGYWGQGTLV TVSS
VH в клоне M584 AM путь 1
113
Н237
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIFVRDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон C2177 AM путь 1
114
Н238
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYVGDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон С2177 AM путь 1
115
Н239
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в клоне М596 AM путь 1
116
Н240
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYARDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в клонах М558, М600 AM, путь 1
117
Н241
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYGRDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон С2177 AM путь 1
118
Н242
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYANDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон С2177 AM путь 1
119
Н243
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYGGDGDT NYS P S FQGQVTISAD KSIS TAYLQWS S L К AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон С2177 AM путь 1
120
Н244
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSGDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон V217 7 AM путь 1
121
Н245
EVQLVQSVAEVKKPGESLKISCKGSGYAF SSSWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYSRDGDT NYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
клон C2177 AM путь 1
122
Н259
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT AYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в мутанте M67 8 РТМ
123
Н260
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDGDT NYAP S FQGQVTISAD KSIS TAYLQW S S LK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в мутанте М68 0 РТМ
124
Н270
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDADT AYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в мутанте М7 03 РТМ
125
Н272
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYAF S S SWMNWVRQMPGKGLEWMGRIYAGDADT NYAP S FQGQVTISAD KSIS TAYLQW S S LK AS DTAMYYCARS DYYGDYGFAYWGQGTLV TVSS
VH в мутанте М7 06 РТМ
SEQ ID
Клон
Последовательность
Характерис-
тики или происхожде-ние
Комментарии
126
C2191 Вариабель ный
участок тяжелой цепи (НС)
EVKLVESGGGLVKPGGSLKLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQTPEKRLE WVAYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNARNTLYLQMSSLRSEDTA MYYCSRHRGNPFDYWGQGTTLTV SS
мышиный
127
С2191 Вариабель ный
участок легкой цепи (LC)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQ PPKLLIYLASNLESGVPARFSGS GSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC QHSRELPWTFGGGTKLEIK
L2 0
мышиный
128
НЗО
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCAKHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
IGHV3-23/4
HFR, выбранный для С2191 AM путь 2
129
Н79
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE WVSAIDHGGGQTLYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в варианте М141 AM, путь 2. Таблица 29
130
Н192
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE WVSVIDHGGGSTHYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в варианте М408 AM, путь 2. Таблица 29
131
Н31
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYTMSWIRQAPGKGLE WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
IGHV3-11/4
HFR выбранный для C2191 AM путь 1
132
Н222
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYGMSWIRQAPGKGLE WVSYIDRGGGVTIYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в варианте M526 AM, путь 1
133
Н227
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYGMSWIRQAPGKGLE WVSYIDEGGGQTIYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в вариантах М427, М429, М488, М489 AM, путь 1
134
Н228
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYSMSWIRQAPGKGLE WVS YIDAGGG FTIYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в вариантах М492, М493 AM, путь 1
135
Н231
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASGFTFSSYSMSWIRQAPGKGLE WVSHIDAGGGRTWYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
VH в варианте М501 AM, путь 1
136
Н232
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCA ASG FT FS SYPMSWIRQAPGKGLE WVSHIATGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
клон С2191 AM, путь 1
137
L40
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIТС RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
IGKV012/1
HFR, выбранный для C2191 AM, путь 2
138
L137
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYVGSRLDYGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в варианте M408 AM, путь 2. Таблица 29
139
L173
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RAS KSVS HVRWS FMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в варианте М141 AM, путь 2. Таблица 29
140
L42
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
IGKV08/1
HFR, выбранный для С2191 AM путь 1
141
L244
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSAWGYSFMHWYQQKPGK APKLLIYVASRLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в варианте М427 AM, путь 1
142
L245
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RAS KSVS HVRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASKLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в варианте М429 AM, путь 1
143
L249
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSEGRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYVASRLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в вариантах М488,
М492, М526 AM, путь 1
144
L250
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSLDRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
VL в вариантах M489,
M493, M501 AM, путь 1
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA
HFR; VH в
ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE
M131;
145
Н39
WVSYISSGGGNTYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
клоны M136-138 AM, путь 2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA
VH в
ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE
M132;
146
Н40
WVSAIDHGGGRTYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
M13 9; клоны M140 AM, путь 2
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCA
VH в
ASGFTFSSYTMSWVRQAPGKGLE
M134;
147
Н191
WVSAIDGGGGATYYPDSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARHRGNPFDYWGQGTLVTV SS
M143; M14 4; клоны AM, путь 2
VL в
148
L160
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC RASKSVSYVRWSFMHWYQQKPGK APKLLIYLASNLESGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC QHSRELPWTFGQGTKVEIK
М137; М160; М142; М143; клоны М146, путь 2
Белки CD27 и CD70
SEQ ID NO
Описание
Характеристики, аббревиатуры
149
Человеческий CD27 прополипептид
1-20 сигнал, 21-191 внеклеточный домен, 192-212 трансмембранный, 2132 60 внутриклеточный TPAPKSCPER HYWAQGKLCC QMCEPGTFLV KDCDQHRKAA QCDPCIPGVS
FSPDHHTRPH CESCRHCNSG LLVRNCTITA NAECACRNGW QCRDKECTEC
DPLPNPSLTA RSSQALSPHP QPTHLPYVSE MLEARTAGHM QTLADFRQLP
ARTLSTHWPP QRSLCSSDFI RILVIFSGMF LVFTLAGALF LHQRRKYRSN
KGESPVEPAE PCRYSCPREE EGSTIPIQED YRKPEPACSP
150
Человеческий CD7 0 прополипептид
1-17 внутриклеточный, 18-38 трансмембранный и 3 9-193 внеклеточный MPEEGSGCSV RRRPYGCVLR AALVPLVAGL VICLVVCIQR FAQAQQQLPL
ESLGWDVAEL QLNHTGPQQD PRLYWQGGPA LGRSFLHGPE LDKGQLRIHR
DGIYMVHIQV TLAICSSTTA SRHHPTTLAV GICSPASRSI SLLRLSFHQG
CTIASQRLTP LARGDTLCTN LTGTLLPSRN TDETFFGVQW VRP
Нуклеотидные последовательности антитела
Последовательности константных участков антитела
Описание
Последовательность
SEQ ID NO:
Константный
участок человеческой тяжелой цепи IgG4 Ala/Ala Ser - Pro
astkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvt vswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpsssl gtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapea aggpsvf lfppkpkdtlmisrtpevtcvwdvsqedpe vqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlh qdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqv ytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngq pennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfs csvmhealhnhytqkslslslgk
159
Константный
участок человеческой легкой цепи kappa
rtvaapsvf ifppsdeqlksgtaswcllnnf ypreak vqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlsk adyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
160
AAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
CAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCGGCGGCCTGGTGAAGCCC
GGCGGCAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCACC
TTCAGCAGCTACGGGATGAGCTGGATCCGGCAGGCCCCCGGC
AAGGGCCTGGAGTGGGTGAGCTACATCGATGAGGGCGGCGGC
CAGACCATCTACCCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATC
AGCCGGGACAACGCCAAGAACAGCCTGTACCTGCAGATGAAC
AGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGG
CACCGGGGCAACCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTG
GTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCATCCGTCTTC
CCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCC
GCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTG
Последова-
ACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC
тельность ,
ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTC
коодирующая
AGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACGAAA
тяжелую цепь
ACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAG
(кодирует последова-
GTGGACAAGAGAGTTGAGTCCAAATATGGTCCCCCATGCCCA CCATGCCCAGCACCTGAGGCCGCCGGGGGACCATCAGTCTTC
164
тельность
CTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGG
тяжелой цепи
ACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAA
SEQ ID N0:
GACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAG
159)
GTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAAC AGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAG GACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCC AAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGC CTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCT CCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGG CTAACCGTGGACAAGAGCAGGT GGCAGGAGGGGAAT GT СТ ТС TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACA CAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCTGGGTAAA
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенное человеческое антитело CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок легкой цепи, указанный вариабельный участок легкой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность легкой цепи участка, определяющего комплементарность 1 (CDRL1), выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 59-66 и 158;
аминокислотную последовательность CDRL2, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 67-74; и
аминокислотную последовательность CDRL3 из группы последовательностей SEQ ID N0: 75.
2. Выделеннное человеческое CD27 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, дополнительно содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность CDRH1, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 42-45 и 161;
аминокислотную последовательность CDRH2, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 4 6-57, 156 и 157; и
аминокислотную последовательность CDRH3 из SEQ ID N0: 58.
3. Выделенное человеческое антитело CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, указанный вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность тяжелой цепи участка, определяющего комплиментаность1 (CDRH1), выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 42-45 и 161;
аминокислотную последовательность CDRH2, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 4 6-57, 156 и 157; и
аминокислотную последовательность CDRH3 из SEQ ID N0: 58.
4. Изолированное человеческое CD27 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи, указанная
4.
вариабельный участок легкой цепи, содержащая:
аминокислотную последовательность CDRL1, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 59-66 и 158;
аминокислотную последовательность CDRL2, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 67-74; и
аминокислотную последовательность CDRL3 из SEQ ID N0: 75, и указанный вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: аминокислотную последовательность CDRH1, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 42-45;
аминокислотную последовательность CDRH2, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 4 6-57, 156 и 157; и
аминокислотную последовательность CDRH3 из SEQ ID N0: 58.
5. Изолированное человеческое CD27 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи, указанная вариабельный участок легкой цепи, содержащая:
аминокислотную CDRL1 последовательность из SEQ ID N0: 62; аминокислотную CDRL2 последовательность из SEQ ID N0: 68;
аминокислотную последовательность CDRL3 из SEQ ID N0: 75, и указанный вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий: аминокислотную последовательность CDRH1, выбранную из группы, состоящей из последовательностей SEQ ID N0: 44 и 161;
аминокислотную CDRH2 последовательность из SEQ ID N0: 47;
аминокислотную CDRH3 последовательность из SEQ ID N0: 58.
6. Выделенное человеческое CD27 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную
аминокислотную последовательность легкой цепи и вариабельную
аминокислотную последовательность тяжелой цепи, где
вариабельная аминокислотная последовательность легкой цепи
содержит SEQ ID N0: 143 и вариабельная аминокислотная
последовательность тяжелой цепи содержит SEQ ID N0: 133.
7. Выделенное антитело по п. 6, дополнительно содержащее
константный участок тяжелой цепи IgG4 и константный участок легкой цепи IgG4.
8. Выделенное антитело по п.7, отличающееся тем, что константный участок тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:159 и константный участок легкой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0:160 .
9. Выделенное человеческое С02 7-нейтрализующиее антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, связывающиеся с эпитопом, связанным с антителом по п.6, как определено путем связывания с иммобилизованным внеклеточным доменом CD27.
10. Выделенное антитело по п. 6, отличающееся тем, что указанное антитело связывается с человеческим CD27 с KD 1х10~7 М или менее, как определено поверхностным плазмонным резонансом.
11. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из (i) нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело или его антигенсвязывающий участок п. 6, (ii) нуклеотидной последовательности легкой цепи SEQ ID N0: 163 и/или нуклеотидной последовательности тяжелой цепи SEQ ID N0: 164 или (iii) нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного участка легкой цепи SEQ ID N0: 143 и/или нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность вариабельного участка тяжелой цепи SEQ ID N0: 133.
12. Вектор выделенной нуклеиновой кислоты или векторы, содержащие выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п.11.
13. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая изолированный вектор нуклеиновой кислоты или векторы по п.12 .
14. Клетка-хозяин по п. 13, представляющая собой по меньшей мере одну клетку, выбранную из C0S-1, C0S-7, НЕК293, ВНК21, CH0, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, миеломных и лимфомных клеток либо их производных, иммортализованных или трансформированных клеток.
15. Способ получения CD27 антитела, содержащий включение
молекулы нуклеиновой кислоты по п.11 в вектор, трансформирующий клетку-хозяина, трансгенное животное или трансгенное растение для экспрессии антитела и восстановления экспрессированного антитела.
16. Способ ингибирования продукции антител В-клеток,
опосредованной Т-клетками, включающий контактирование с частью
Т-клеток пациента с эффективным количеством антитела или его
антигенсвязывающего фрагмента по п.6; и антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент ингибирует активацию CD2 7 на
указанных человеческих Т-клетках в присутствии человеческого
белка CD70 или части человеческого белка CD70.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что пациент страдает от воспалительного заболевания.
18. Способ по п.17, отличающийся тем, что воспалительным заболеванием является системная красная волчанка.
19. Способ по п.16, отличающийся тем, что при условии, если пациент проявляет антиген-специфический гуморальный иммунный ответ, связанный с расстройством, выбранным из группы, состоящей из заболеваний легочной или плевральной системы, заболевания центральной или периферической нервной системы, болезни глаз или зрительной системы, заболевания желудочно-кишечного тракта и пищеварительной системы, заболевания сердечно-сосудистой системы, инфекционного заболевания и паразитарной инфекции.
20. Способ по п.16, отличающийся тем, что антитело или его антигенсвязывающую часть вводят пациенту системно.
21. Способ ингибирования пролиферации наивных Т-клеток, включающий контактирование ткани с эффективным количеством антитела или его антигенсвязывающей части по п.6; и антитело антигенсвязывающего участка ингибирует активацию CD2 7 на указанных человеческих Т-клетках в присутствии человеческого белка CD70 или части человеческого белка CD70.
22. Готовое изделие, включающее фармацевтически приемлемую лекарственную форму, содержащую антитело по п.6.
23. Выделенное человеческое антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок
антитела, связывающийся с эпитопом на человеческом белке CD27, связанном с антителом, выбранным из группы, состоящей из антител С2177, CD2186, CD2191 и CD2192.
24. Выделенное человеческое антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок
антитела, конкурирующего за связывание с человеческим белком
CD2 7, выбранным из группы, состоящей из антител С2177, CD218 6,
CD2191 и CD2192.
25. Выделенное человеческое антитело CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок легкой цепи, указанный вариабельный участок легкой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность участка легкой цепи, определяющего комплементарность 1 (CDRL1), выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 24-36, 153 и 155;
аминокислотную последовательность CDRL2, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 37-40 и 154; и
аминокислотную последовательность CDRL3 из SEQ ID N0: 41.
26. Выделенное человеческое антитело CD27 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельный участок тяжелой цепи, указанный вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность тяжелой цепи участка, определяющего комплементарность 1 (CDRH1), выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 1 и 2;
аминокислотную последовательность CDRH2, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 3-22, 151 и 152; и
аминокислотную последовательность CDRH3, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 23 и 162.
27. Изолированное человеческое CD27 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный участок легкой цепи и вариабельный участок тяжелой цепи, указанный вариабельный участок легкой цепи, содержащий:
аминокислотную последовательность легкой цепи участка, определяющего комплементарность 1 (CDRL1), выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 24-36, 153 и 155;
аминокислотную последовательность CDRL2, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 37-40 и 154; и
аминокислотную последовательность CDRL3 из SEQ ID N0: 41, и указанный вариабельный участок тяжелой цепи содержит: аминокислотную последовательность CDRH1, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 1 и 2;
аминокислотную последовательность CDRH2, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 3-22, 151 и 152; и
аминокислотную последовательность CDRH3, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 23 and 162.
28. Выделенное человеческое CD27 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную
аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из
группы последовательностей SEQ ID N0: 137-144 и 148.
29. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.28, дополнительно содержащее вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 128-136 и 145-147.
30. Выделенное человеческое CD27 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную
аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из
группы последовательностей SEQ ID N0: 128-136 и 145-147.
31. Выделенное человеческое CD27 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную
аминокислотную последовательность легкой цепи, выбранную из
группы последовательностей SEQ ID N0: 82-101.
32. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.31, дополнительно содержащее вариабельную аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID N0: 102-125.
33. Выделенное человеческое CD27 антитело или его
антигенсвязывающий фрагмент, содержащий вариабельную
аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из
группы последовательностей SEQ ID N0: 102-125.
34. Выделенное CD27 антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент, содержащий вариабельную аминокислотную
28.
последовательность легкой цепи, выбранную из группы последовательностей SEQ ID N0: 77, 79, 81 и 127.
35. Выделенное антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент по п.34, дополнительно содержащее вариабельную
аминокислотную последовательность тяжелой цепи, выбранную из
группы, состоящей из SEQ ID N0: 76, 78, 80 и 126.
36. Выделенное CD2 7 антитело или его антигенсвязывающий
фрагмент, содержащий вариабельную аминокислотную
последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы
последовательностей SEQ ID N0: 76, 78, 80 и 126.
По доверенности
Фиг. 1
518707
Fab217T
Фиг. 2
Фиг. 3
Таблица 1
Таблица 4
Таблица 4
Таблица 18
Таблица 23
Таблица 23
Таблица 2 4
Таблица 2 4
Таблица 25.
Таблица 25.
Таблица 2 6
Таблица 2 6
Таблица 2 7
Таблица 2 7
Таблица 3 0
Таблица 33
Таблица 33
Таблица 34
Таблица 34
104
105
Таблица 3 9
107
107
109
Таблица 4 0
109
Таблица 4 0
110
Таблица 41
110
Таблица 41
Ill
Ill
1/4
1/4
2/4
2/4
3/4
3/4