[RU]

В изобретении предлагаются композиции и наборы реагентов, включающие по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или полипептидную молекулу, кодирующую мутантный белок ChR2. Способы по изобретению включат введение объекту композиции, включающей мутантный ChR2, для сохранения, улучшения или восстановления фотопреобразования. Предпочтительно, композиции и способы по изобретению предлагаются объекту с нарушенным зрением, восстанавливая таким образом зрение до нормального уровня.

(57) Реферат / Формула:

В изобретении предлагаются композиции и наборы реагентов, включающие по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты или полипептидную молекулу, кодирующую мутантный белок ChR2. Способы по изобретению включат введение объекту композиции, включающей мутантный ChR2, для сохранения, улучшения или восстановления фотопреобразования. Предпочтительно, композиции и способы по изобретению предлагаются объекту с нарушенным зрением, восстанавливая таким образом зрение до нормального уровня.

---

2420-518734ЕА/061 ИДЕНТИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ КАНАЛ-ОПСИНА-2 (Chop2) И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ
РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Для данной заявки испрашивается приоритет по предварительной заявке № 61/606663, поданной 5 марта 2012 г., содержание которой включено в данный документ путем ссылки в полном объеме.
ГОСУДАРСТВЕННАЯ ПОДДЕРЖКА
Изобретение было осуществлено с помощью поддержки государства в виде гранта NIH EY 17130 Национального Института Здравоохранения/Национального Глазного Института. Государство обладает определенными правами на изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Изобретение относится в основном к области молекулярной биологии. Идентифицированы мутации в гене Канал-опсина-2 (Channelopsin-2)(Chop2). Композиции, включающие мутантный ген Chop2, используются в терапевтических способах для улучшения и восстановления потери зрения.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Сетчатка состоит из фоторецепторов (или фоторецепторных клеток, палочковидных и конусных). Фоторецепторы представляют собой высокоспециализированные нейроны, которые отвечают за фотопреобразование или превращение света (в форме электромагнитного излучения) в электрические и химические сигналы, которые стимулируют каскад событий внутри зрительной системы, генерируя в конечном счете представление нашего мира.
Утрата или дегенерация фоторецепторов подвергает
существенному риску, если не ингибирует полностью,
фотопреобразование визуальной информации внутри сетчатки.
Утрата фоторецепторных клеток и/или утрата функционирования
фоторецепторных клеток представляет собой первичную причину
ослабленной зрительной активности, ослабленной
светочувствительности и слепоты. В данной области назрела необходимость в получении композиций и способа, которые восстанавливают фоточувствительность сетчатки объекта, который
испытал потерю зрения.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В изобретении предлагается решение назревшей необходимости получения способа для восстановления и/или повышения светочувствительности фоторецепторных клеток путем экспрессии предпочтительных мутаций и/или их комбинации, гена Канал-опсина-2 (Chop2), и затем предлагаются способы генной терапии на основе гена Канал-опсина-2 (Chop2).
Генная терапия на основе гена Канал-опсина-2 (Chop2) предлагает превосходную стратегию для восстановления фоточувствительности сетчатки после дегенерации фоторецепторов. Белковый продукт гена Chop2, когда он связывается с изомеризуемыми под действием света хромофорами, все транс-ретинали, образует функциональный светорегулируемый канал, называемый канал-родопсин-2 (ChR2). Нативный ChR2 демонстрирует низкую светочувствительность. Недавно сообщалось, что два мутанта ChR2, L132C и Т159С, значительно повышают их светочувствительность (Kleinlogel et al. (2011) Nat Neurosci. 14:513-8; Berndt et al. (2011) Proc Natl Acad Sci USA. 108:7595-600; Prigge et al. (2012) J Biol Chem. 2 87(38)3104:12; содержание каждой из которых включено в данный документ ссылкой в полном объеме. Свойства этих двух мутантов ChR2 (т.е. L132C и Т159С) исследовали и сравнивали с рядом двойных мутантов в этих двух сайтах для идентификации подходящих кандидатов для терапевтических способов. Композиции, включающие одну или несколько из этих мутаций, предлагаются нуждающемуся в этом объекту с целью восстановления зрения. Конкретно, целевые мутации в гене Chop2 вводятся в клетку и/или интегрируются в геномную ДНК клетки для улучшения или восстановления зрения. Целевые мутации в гене Chop2, которые вводятся в клетку для улучшения или восстановления зрения, также могут оставаться эписомными, не интегрируясь в геномную ДНК.
Мутации в аминокислотных положениях L132 или Т159 Chop2 (и таким образом полученный в результате ChR2) значительно снижают пороговую светочувствительность, которая требуется для того, чтобы вызвать СЬК2-опосредованный фототок. Двойные мутанты в
аминокислотных положениях L132 и Т159 дополнительно повышают
фототок при низких интенсивностях света, превышая значения,
соответствующие одиночным мутациям. Ганглиозные клетки
сетчатки, экспрессирующие двойные мутанты в положениях L132 и
Т159, могут отвечать на интенсивности света, которые попадают в
интервал условий естественного дневного освещения, но все равно
поддерживают адекватное и высокое временное разрешение, которое
подходит для восстановления эффективного зрения. Таким образом,
мутантный белок Chop2 по настоящему изобретению, который
образует мутантные ChR2, обладающие улучшенной
чувствительностью, используется индивидуально или в комбинации для восстановления зрения.
Конкретно, в изобретении предлагается полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L) . В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) или аланин (А) . Когда аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) , полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID N0: 13. Когда аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А) , то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID N0: 20.
В изобретении предлагается полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 159 SEQ ID N0: 2 6 не является треонином (Т). В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С), серии (S), или аланин (А) . Когда аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С) , то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID N0: 14. Когда аминокислота в положении 159 представляет собой серии (S), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID N0: 17. Когда аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А), то полипептидная молекула может включать или состоять из SEQ ID N0: 23.
В изобретении предлагается выделенная полипептидная
молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином
(L). В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином
(L) , и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С), и аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С). В предпочтительном воплощении выделенной полипептидной молекулы, полипептидная молекула включает или состоит из SEQ ID N0: 16. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, включающий или состоящий из SEQ ID N0: 16. Предпочтительно, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, включающий или состоящий из SEQ ID N0: 16, представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая включает или состоит из SEQ ID N0: 15.
В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином
(L) , а аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С), и аминокислота в положении 159 представляет собой серии(S). Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), может включать или состоять из SEQ ID N0: 19. Альтернативно или дополнительно, выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С), и где аминокислота в положении 159 представляет собой серии(S), может включать или состоять из SEQ ID N0: 19. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид,
который включает или состоит из SEQ ID N0: 19. Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID N0: 18 .
В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином
(L) , и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А) , и аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С) . Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 представляет собой треонин (Т), может включать или состоять из SEQ ID N0: 22. Альтернативно или дополнительно, выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А) , и где аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С), может включать или состоять из SEQ ID N0: 22. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, который включает или состоит из SEQ ID N0: 22. Предпочтительно, эта молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID N0: 21.
В некоторых воплощениях выделенной полипептидной молекулы, включающей или состоящей из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином
(L) , и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С), и аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А) . Выделенная полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 26 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т) , может включать или состоять из SEQ ID N0: 25. Альтернативно или дополнительно, выделенная
полипептидная молекула, включающая или состоящая из SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L), и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т), где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) и где аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А) , может включать или состоять из SEQ ID N0: 25. В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид, который включает или состоит из SEQ ID N0: 25. Предпочтительно, эта молекула нуклеиновой кислоты включает или состоит из SEQ ID N0: 24.
В изобретении предлагается любая из выделенных полипептидных молекул, описанных в данном документе, где полипептидная молекула кодирует мутантный белок Chop2, который образует мутантный ChR2, который вызывает ток в ответ на пороговую интенсивность света, которая ниже, чем пороговое значение белка ChR2 дикого типа. Кроме того, ток проводит катионы. Типичные катионы включают в частности, ионы Н+, Na+, К+ и Са2+. ChR2 дикого типа и мутантные белки, описанные в данном документе, неспецифично проводят катионы. Следовательно, ток проводит один или несколько из следующих ионов: Н+, Na+, К+ и Са2+.
В изобретении предлагается любая из выделенных полипептидных молекул, описанных в данном документе, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель. В изобретении также предлагается композиция, включающая, по меньшей мере, одну выделенную полипептидную молекулу, описанную в данном документе. Композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель.
В изобретении предлагается выделенная молекула нуклеиновой
кислоты, которая кодирует любой из выделенных полипептидов,
описанных в данном документе. Кроме того, выделенная молекула
нуклеиновой кислоты может дополнительно включать
фармацевтически приемлемый носитель. В изобретении также предлагается композиция, включающая, по меньшей мере, одну выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, описанную в данном
документе. Композиция может дополнительно включать
фармацевтически приемлемый носитель.
В изобретении предлагается клетка, где клетка включает
выделенную полипептидную молекулу по изобретению или
контактирует с ней. Кроме того, в изобретении предлагается
клетка, которая включает выделенную молекулу нуклеиновой
кислоты, которая кодирует выделенную полипептидную молекулу по
изобретению, или контактирует с ней. В изобретении предлагается
композиция, включающая, по существу состоящая из или состоящая
из клетки, которая включает выделенную полипептидную молекулу
по изобретению или молекулу нуклеиновой кислоты, которая
кодирует выделенную полипептидную молекулу по изобретению.
Клетка по изобретению может контактировать с выделенным
полипептидом in vitro, ex vivo, in vivo, или in situ. В
некоторых воплощениях изобретения клетка представляет собой
фоторецептор; горизонтальную клетку; биполярную клетку;
амакриновую клетку, и, особенно AII-амакриновую клетку; или
ганглиозную клетку сетчатки, включая фоточувствительную
ганглиозную клетку сетчатки. Предпочтительно, клетка
представляет собой ганглиозную клетку сетчатки,
фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки, биполярную клетку, биполярную клетку ON-типа, палочковидную биполярную клетку, или АН амакриновую клетку. В некоторых аспектах изобретения, клетка представляет собой фоторецептор, биполярную клетку, палочковидную биполярную клетку, коническую биполярную клетку ON-типа, ганглиозную клетку сетчатки, фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки, горизонтальную клетку, амакриновую клетку или AII-амакриновую клетку.
В изобретении предлагается способ улучшения или восстановления зрения, включающий введение объекту любой из композиций, описанных в данном документе. В изобретении дополнительно предлагается профилактический способ сохранения зрения, включающий введение объекту любой из композиций, описанных в данном документе.
Способы, описанные в данном документе, также могут применяться к тем объектам, которые являются здоровыми, слепыми
(частично или полностью), и/или к объектам с дегенерацией сетчатки (отличающейся потерей палочковидных и/или конусных фоторецепторных клеток), но могут зависеть от активности фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки для определения уровня освещенности окружающей среды. Например, способы, описанные в данном документе, могут использоваться для сохранения, улучшения или восстановления активности фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки, которые опосредуют преобразование световой информации для синхронизации суточных ритмов с 24-часовым циклом свет/темнота, пупиллярного контроля и рефлексов, и для световой регуляции высвобождения мелатонина.
В некоторых воплощениях способов изобретения объект может иметь нормальное зрение или нарушенное зрение. Альтернативно или дополнительно, объект может повергаться риску развития глазного заболевания, которое приводит к нарушению зрения. Например, объект может иметь наследственную историю глазных заболеваний, включающих макулярную дегенерацию и пигментный ретинит. Объект может иметь риск быть подвергнутым поражению глаз, которое вызывает повреждение фоточувствительных клеток в сетчатке. Объект может иметь генетический маркер или генетическое/врожденное заболевание, которое приводит в результате к нарушенному зрению, слабому зрению, к частичной слепоте, или к полной слепоте. Объект может иметь рефракционный дефект, который приводит в результате к миопии (близорукость) или к гипертрофии (дальнозоркость).
Композиции или способы по изобретению могут вводиться объекту или системно или местно. Предпочтительным путем местного введения является интравитреальная инъекция.
Другие признаки и преимущества изобретения будут понятны на основе следующего подробного описания и формулы изобретения и охвачены ими.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На Фиг. 1 представлены репрезентативные регистрации токов, вызванных светом, из (WT) ChR2 дикого типа, мутантов L132C, L132C/T159C, и L132C/159S в клетках НЕК для сравнения их
светочувствительности (А) . Световые стимулы (фотоны/см2/с при 4 60 нм) генерировали с помощью ксеноновой дуговой лампы и ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND4.0 (2,8хЮ14), ND3.0 (1,4хЮ15), ND2 .5 (4,8хЮ15); ND2 . 0 (1,6хЮ16), ND1.0 (1,ЗхЮ17), ND0 (1,2хЮ18). (В) Те же следы тока представлены при различных шкалах тока. Следы, указанные стрелками, вызваны одной и той же интенсивностью света (ND2.5).
На Фиг. 2 представлены репрезентативные регистрации токов, вызванных светом, из (WT) ChR2 дикого типа, мутантов L132C, L132C/T159C, и L132C/159S, на 10 мс светового пульса (1,2*1018 фотонов/см2/с при 4 60 нм) в клетках НЕК для сравнения временной зависимости их дезактивации (время затухания после выключения света).
На Фиг. 3 представлены репрезентативные регистрации мультиканального чипа опосредованных WT ChR2, L132C, L132C/T159C, и L132C/T159S спайковых активностей из ганглиозных клеток сетчатки в тотальном препарате сетчатки для сравнения их световой чувствительности. Световые стимулы (фотоны/см2/с) генерировали с помощью 473 нм лазера голубой области спектра и ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND0
(6,ЗхЮ16), ND1.0 (7,4хЮ15), ND1.5 (2,7хЮ15), ND2 . 0 (7,ЗхЮ14), ND2.5 (3,2хЮ14), ND3.0 (8,5хЮ13), ND3.5 (3,8хЮ13) и ND4 . 0
(9, 5хЮ12) .
На Фиг. 4 представлены репрезентативные регистрации мультиканального чипа опосредованных WT ChR2, L132C, L132C/T159C, и L132C/T159S спайковых активностей из ганглиозных клеток сетчатки в тотальном препарате сетчатки для сравнения их временной динамики. В каждой панели представлен двумерный массив точек 10 последовательных вызванных светом спайков, происходящих от одного нейрона (верх) и гистограммы средней степени импульсов (низ). Световые импульсы с различной частотой генерировали с помощью лазерного источника 473 нм в голубой области спектра с интенсивностями примерно на одну логарифмическую единицу выше пороговой интенсивности каждого мутанта. Регистрации WT ChR2 и L132C представлены в (А), и регистрации L132C/T159C и L132C/T159S представлены в (В).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ Зрительная система
Центральная нервная система опосредует зрение (также обозначается в данном документе как визуальный образ) посредством специализированных клеток и уникальных способов сигнальной трансдукции, присутствующей в зрительной системе. Принципиальная ответственность зрительной системы заключается в преобразовании света в форме электромагнитного излучения в образ или изображение окружающей среды. Дополнительно к "зрительной" функции системы, зрительная система также регулирует зрачковый световой рефлекс (PLR), подгонку суточного ритма к периодическим циклам свет/темнота, и высвобождение гормона мелатонина.
Клетки сетчатки являются первыми клетками зрительной или
нервной системы, которые встречаются со светом
(электромагнитное излучение различной длины волны и интенсивности). Фотоны проходят через роговую оболочку глаз, зрачок и хрусталик перед достижением сетчатки. Сетчатка имеет уникальную структуру, так как фоторецепторные клетки, которые непосредственно поглощают фотоны, локализованы на внешнем слое сетчатки. Фотоны, которые проходят к хрусталику, сначала встречаются с внутренним слоем ганглиозных клеток сетчатки
(небольшая часть которых является фоточувствительной посредством экспрессии опсина, меланопсина) и промежуточным слоем биполярных клеток перед достижением внешнего слоя фоторецепторных клеток (также известных палочковидные и конусные клетки). Палочковидные фоторецепторы действуют в условиях уменьшения освещения (скотопическое зрение), в то время как фоторецепторы действуют в условиях яркого освещения
(фотопическое зрение) и отвечают за цветовое зрение. Конические фоторецепторы непосредственно соединяются посредством синапса с коническими биполярными клетками ON- и OFF-типа, которые, в свою очередь, непосредственно соединяются посредством синапса с ганглиозными клетками сетчатки ON- и OFF-типа. Палочковидные фоторецепторы соединяются посредством синапса с палочковидными биполярными клетками (уникальный тип клеток, которые относятся
к ON-типу), которые соединяются посредством синапса с AII-амакриновыми клетками. AII-амакриновые клетки затем передают зрительные сигналы на конические биполярные клетки ON-типа посредством щелевидного соединения и на конические биполярные клетки OFF-типа, а также на ганглиозные клетки OFF-типа посредством ингибирующих глицинергических синапсов. Ганглиозные клетки сетчатки отвечают за связывание зрительной информации с нейронами мозга.
Фотопреобразование
Внутри сетчатки фоторецепторные клетки поглощают фотоновые частицы и трансформируют исходные данные частоты и длины волны света в химические и затем в электрические сигналы, которые передают эту исходную информацию посредством зрительной и нервной систем. Конкретно, белок опсин, локализованный на поверхности фоторецептора (палочковидная, коническая и/или фоточувствительная ганглиозная клетка сетчатки) поглощает фотон и инициирует внутриклеточный сигнальный каскад, который приводит к гиперполяризации фоторецептора. В темноте белок опсин не поглощает фотоны, фоторецепторы деполяризованы. Зрительные сигналы фоторецепторов затем передаются через биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки в высшие зрительные центры в мозге. Конкретно, когда палочковидные и конические фоторецепторы деполяризованы (в темноте), они вызывают деполяризацию палочковидных биполярных клеток конических биполярных клеток ON-типа, но вызывают гиперполяризацию конических биполярных клеток OFF-типа, которые, в свою очередь, вызывают деполяризацию AI1-амакриновых клеток и повышают спайки ганглиозных клеток сетчатки ON-типа и уменьшают спайки ганглиозных клеток сетчатки OFF-типа. Противоположный эффект наблюдается (для палочковидных, ON- и OFF-биполярных клеток, AII-амакриновых клеток и ON- и OFF-ганглиозных клеток) , когда палочковидные и конусные фоторецепторы гиперполяризованы (в ответ на свет).
Световая информация обрабатывается и уточняется значительным образом путем функционирования фоторецепторов, биполярных клеток, горизонтальных клеток, амакриновых клеток и
ганглиозных клеток сетчатки. Для усложнения данной системы фоторецепторы обнаружены в трех основных вариациях, включающих палочки, конусы (из которых три типа отвечают особенно существенно за различие длин волн света) и фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки. Таким образом, первый слой обработки информации происходит на уровне фоторецепторов, которые дифференциально отвечают на определенные длины волн и интенсивности света. Биполярные клетки сетчатки получают информацию от обоих типов клеток, фоторецепторных и горизонтальных. Горизонтальные клетки сетчатки получают информацию от множества фоторецепторных клеток и, таким образом, интегрируют информацию между типами клеток и через расстояния в сетчатке. Биполярные клетки дополнительно интегрируют информацию непосредственно из фоторецепторных клеток и горизонтальных клеток путем получения в основном ступенчатых потенциалов к ганглиозным клеткам сетчатки, хотя некоторые недавние исследования указывают на то, что некоторые биполярные клетки могут генерировать потенциалы действия. Конические биполярные клетки образуют соединения посредством синапса с ганглиозными клетками сетчатки и амакриновыми клетками, в то время как палочковидные биполярные клетки образуют соединение посредством синапса с AII-амакриновыми клетками. Аналогично горизонтальным клеткам большинство амакриновых клеток интегрирует информацию латерально внутри сетчатки. В отличие от горизонтальных клеток, большинство амакриновых клеток представляют собой ингибирующие (GABA-эргические) интернейроны. Амакриновые клетки также более специализированы, чем горизонтальные клетки, так как каждая амакриновая клетка образует специфичное соединение посредством синапса с конкретным типом биполярной клетки (одна из десяти разновидностей биполярной клетки). Конкретно, AI1-амакриновая клетка представляет собой критический вставочный нейрон в скотопическом сигнальном пути (при скотопическом зрении, когда конические фоторецепторы не реагируют). АН-амакриновые кетки получают синаптический вход из палочковидных биполярных клеток и затем передают на себе сигналы сигнальному пути конических
клеток посредством ON- и OFF-конических биполярных клеток к 0N-и OFF-ганглиозным клеткам, как описано выше. Таким образом, экспрессия Chop2, и образование в результате ChR2, в палочковидных биполярных клетках или в AII-амакриновых клетках может создавать как 0N-, так и OFF-ответы в ганглиозных клетках сетчаки. Кроме того, ганглиозные клетки сетчатки интегрируют информацию из биполярных клеток и из амакриновых клеток. Хотя ганглиозные клетки сетчатки значительно варьируют по размеру, проводимости и ответу на зрительное стимулирование (например, поле зрения), все ганглиозные клетки сетчатки распространяют длинный аксон в мозг. За исключением минимальной части ганглиозных клеток сетчатки, которые передают не зрительную информацию, касающуюся зрачкового светового рефлекса и "навязывание" суточного ритма, вся совокупность аксонов, распространяющаяся от ганглиозных клеток сетчатки, образует второй черепной нерв, зрительный перекрест и зрительный тракт центральной нервной системы. Следовательно, значительное количество обработки информации происходит в самой сетчатке.
Фоторецепторные клетки экспрессируют эндогенные белки опсины, такие как родопсин. Мутантные белки Chop2 по изобретению могут экспрессироваться в любом типе клеток и образуют функциональные СпК2-каналы. Предпочтительно, клетка представляет собой клетку сетчатки. Типичные клетки включают в частности фоторецепторные клетки (например, палочки, конусы и фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки), горизонтальные клетки, биполярные клетки, амакриновые клетки и ганглиозные клетки сетчатки.
Канал-опсин-2 (Chop2)
Канал-опсин-2 (Chop2) был впервые выделен из зеленых
водорослей Chlamydomonas reinhardtii. Канал-описин-2
представляет собой белок, содержащий семь трансмембранных
доменов, который становится светорегулируемым
(светочувствительным), когда связывается с хромофором полностью-транс-ретиналь. Chop2, будучи связанным с молекулой ретиналя посредством связи с основанием Шиффа, образует светорегулируемый, неспецифичный, выпрямляемый внутри катионный
канал, называемый Канал-родопсином-2 (Chop2 ретинальиден, сокращенно ChR2).
При обозначении в данном документе "канал-опсин-2" или "Спор2" относится к гену, который кодирует канал-опсин-2, который затем образует Канал-родопсин-2 (ChR2), связанный с ретиналем. Генные конструкты по настоящему изобретению относятся главным образом к канал-опсину-2 (т.е., без ретиналя), и все варианты Chop2, раскрытые в данном документе, образуют функциональные варианты каал-родопсина-2. Способы, раскрытые в данном документе, могут включать доставку Chop2 к клеткам без экзогенного ретиналя. Понятно, что при экспрессии Chop2 в клетках (т.е., в нейронах сетчатки), эндогенно доступный ретиналь связывается с Chop2 дикого типа или с мутантными Chop2 по настоящему изобретению с образованием функциональных светорегулируемых каналов, WT ChR2 или мутантных ChR2. Как таковые, белки Chop2, при обозначении в данном документе, также могут быть синонимами с ChR2.
При использовании в данном документе, "канал-родопсин-2"
или "ChR2" относятся к ретиналь-связанному функциональному
светочувствительному каналу. В одном воплощении, связанный
ретиналь может обеспечиваться экзогенно. В предпочтительном
воплощении связанный ретиналь обеспечивается на эндогенном
уровне, доступном в клетке. Настоящее изобретение также
охватывает функциональные каналы канал-родопсина-2,
образованные с помощью полипептидов и полинуклеотидов, кодирующих мутанты Chop2, описанные в данном документе.
При освещении предпочтительной дозой светового излучения, ChR2 открывает пору канала, через который ионы Н+, Na+, К+, и/или Са2+ перетекают в клетку из внеклеточного пространства. Активация канала ChR2, как правило, вызывает деполяризацию клетки, экспрессирующей канал. Деполяризованная клетка продуцирует ступенчатые потенциалы и/или потенциалы действия для переноса информации от Спор2/СпК2-экспрессирующей клетки к другим клеткам сетчатки или мозга.
Форма ChR2 дикого типа или мутантного ChR2 с высокой временной разрешающей способность находятся в центральном
фокусе нейробиологических исследований. При экспрессии в нейроне млекопитающего, ChR2 опосредует светоконтролируемую деполяризацию in vitro или ex vivo культур. ChR2 дикого типа или мутантные ChR2 с высокой временной разрешающей способностью (последние обычно демонстрируют низкую светочувствительность) представляют несколько проблем, которые должны быть разрешены для возможности их применения с целью восстановления зрения. Для цели восстановления зрения ChR2 с высокой светочувствительностью является более целесообразным, чем ChR2 с высокой временной разрешающей способностью.
Белки ChR2 дикого типа требуют для полной активации освещения высокой интенсивности голубой области спектра (т.е. 1018 - 1019 фотонов с-1 см~2 при длине волны 480 нм) . Продолжительное освещение данного типа может разрушить клетки.
Кинетика белка ChR2 дикого типа является недостаточно оптимальной для максимальной эффективности канала. Эффективность может повышаться путем модификации одной или нескольких аминокислот белка ChR2 дикого типа или для удлинения продолжительности открытого состояния канала, или для повышения единиц проводимости канала, или и то и другое. Одноканальная проводимость ChR2 дикого типа небольшая. Таким образом, нейронная активация in vivo будет требовать или высокой экспрессии канала дикого типа, или очень интенсивной активации с использованием предпочтительной длины волны голубой области спектра. Более простое решение может быть найдено путем изменения проводимости канала или удлинения продолжительности времени открытия канала. Каждый из этих механизмов и, конкретно, комбинация этих механизмов, дает возможность использования более низкой и безопасной интенсивности света для достижения одинакового уровня клеточной деполяризации.
Например, мутантные белки ChR2 по изобретению достигают более высокой светочувствительности посредством удлинения продолжительности открытого состояния канала. Следовательно, каждый мутантный канал ChR2 проводит более высокий фототок, чем канал ChR2 дикого типа при активации одинаковых интенсивностей света. Таким образом, мутантные каналы активируются с помощью
интенсивностей света, которые ниже, чем те, что требуются для активации каналов ChR2 дикого типа. Количественно, детектируемая активность спайка ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих мутантные белки ChR2, могут вызываться световой интенсивностью, которая на 1,5-2 log единиц ниже, чем световая интенсивность, требуемая, чтобы вызвать активность спайка из ганглиозных клеток сетчатки, экспресирующих ChR2 дикого типа. Таким образом, световые интенсивности, требуемые для активации мутантных белков ChR2, близки к интервалу нормального дневного освещения или попадают в него.
Следующие последовательности обеспечивают частные примеры мутантных и белков Chop2 дикого типа и полинуклеотиды, кодирующие указанные WT и мутантные белки Chop2 по изобретению, и образующие WT и мутантные ChR2 по изобретению.
Chop2 (WT) дикого типа по изобретению могут кодироваться следующей мРНК-последовательностью светорегулируемого ионного канала хламиопсина 4 Chlamydomonas reinhardtii (С0Р4) (GenBank No. XM_001701673, и SEQ ID NO: 1):
1 gcagcaccat acttgacatc tgtcgccaag caagcattaa acatggatta tggaggcgcc
б 1 ctgagtgccg ttgggcgcga gctgctattt gtaacgaacc cagtagtcgt caatggctct
121 gtacttgtgc ctgaggacca gtgttactgc gcgggctgga ttgagtcgcg tggcacaaac
181 ggtgcccaaa cggcgtcgaa cgtgctccaa tggcttgctg ctggcttctc catcc~actg
241 cttatgtttt acgcctacca aacatgcaag tcaacctgcg gctggcagga gatctatgtg
301 tgcgctatcg aga~ggtcaa ggtgattctc gagttcttct tcgagtttaa gaacccgtcc
361 atgctgtatc tagccacagg ccaccgcgtc cagtggttgc gttacgccga gtggc~tctс
421 acctgcccgg tca"tctcat tcacctgtca aacctgacgg gcttgtccaa cgactacagc
481 aggcgcacca tgggtctgct tgtgtctgat attggcacaa ttgtgtgggg cgccacttcc
541 gccatggcca ccggatacgt caaggtcat с ttcttctgcc tgggtctgtg ttatggtgct
601 aacacgttct ttcacgctgc caaggcctac atcgagggtt accacaccgt gccgaagggc
6 61 cggtgtcgcc agg-ggtgac tgccatcgct tggctcttct tcgtatcatg gggta~gttс
721 cccatcctgt tca~cctcgg ccccgagggc ttcggcgtcc tgagcgtgta cggctccacc
781 gtccgccaca cca~cattga cctgatctcg aagaactgct ggggtctgct cggccactac
841 ctgcgcgtgc tga~ccacga gcatatcctc atccacggcg acattcgcaa gaccaccaaa
901 ttgaacattg gtggcactga gattgaggtc gagacgctgg tggaggacga ggccgaggct
961 ggcgcggtca acaagggcac cgccaagtac gcctcccgcg agtccttcct ggtca~gcgc
1021 gacaagatga aggagaaggg cattgacgtg cgcgcctctc tggacaacag caaggaggtg
1081 gagcaggagc aggccgccag ggctgccatg atgatgatga acggcaatgg catgggtatg
1141 ggaatgggaa tgaacggcat gaacggaatg ggcggtatga acgggatggc tggcggcgcc
1201 aagcccggcc tggagctcac tccgcaccta cagcccggcc gcgtcatcct ggcgg-gccg
1261 gacatcagca tgg~tgactt cttccgcgag cagtttgctc agctatcggt gacgtacgag
1321 ctggtgccgg ccc~gggcgc tgacaacaca ctggcgctgg ttacgcaggc gcagaacctg
1381 ggcggcgtgg act~tgtgtt gattcacccc gagttcctgc gcgaccgctc tagcaccagc
1441 atcctgagcc gcc~gcgcgg cgcgggccag cgtgtggctg cgttcggctg ggcgcagctg
1501 gggcccatgc gtgacctgat cgagtccgca aacctggacg gctggctgga gggcccctcg
1561 ttcggacagg gca~cctgcc ggcccacatc gttgccctgg tggccaagat gcagcagatg
16 21 cgcaagatgc agcagatgca gcagattggc atgatgaccg gcggcatgaa cggca~gggc
1681 ggcggtatgg gcggcggcat gaacggcatg ggcggcggca acggcatgaa caaca~gggc
1741 aaccgcatgg gcggcggcat ggccaacggc atgggcggca atggcatgaa cggaa~gggt
1801 ggcggcaacg gca~gaacaa catgggcggc aacggaatgg ccggcaacgg aatgggcggc
1861 ggcatgggcg gcaacggtat gggtggctcc atgaacggca tgagctccgg cgtgg~ggcc
1921 aacgtgacgc cctccgccgc cggcggcatg ggcggcatga tgaacggcgg catggctgcg
1981 ccccagtcgc ccggcatgaa cggcggccgc ctgggtacca acccgctctt caacgccgcg
2041 ccctcaccgc tcagctcgca gctcggtgcc gaggcaggca tgggcagcat gggaggcatg
2101 ggcggaatga gcggaatggg aggcatgggt ggaatggggg gcatgggcgg cgccggcgcc
2161 gccacgacgc aggctgcggg cgccaacgcg gaggcggaga tgctgcagaa tctca~gaac
2221 gagatcaatc gcc~gaagcg cgagcttggc gagtaaaagg ctggaggccg gtactgcgat
2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541
acctgcgagc cttctcaacc cggtgcgatc catcgtccga cgtagtgcta actgcttcct tttagttaca gcggctatgg aaagtgagct cgaggtaaaa tgtgcggtcc tcggcaactg aaacatttgg gtgcagggac gcttacaaaa atgagtgcat aacaagtgcg gtgtttatga tgtgggccct tgctatgttt gtgtcagccc tcaagccgag tcgcgcgcct tgtgtgcaac ttcccgcctt acggaagggc tggctctgca tttggtggcc tacgctttgc acgaaggtgt tcatctgtgg gtggcacgtc taacacgcga ctctgtgttt gtaacttgag ggtaatcaat acactttgat ggttgcggac cgcgcggcaa gctgccattc tacatggaga tggtaaagcc ggggtaactg tgccgtgcgc gactcgtcgt gtatctagag cgcaccgcaa ggcttgatca cgtaagtggg gaggccctgg ttaacctcga tatcggatgt cttctgttgg tttgtgcaca gtgcaaagcg taaccacagc ggtgattcgt gagctggagc gtcgtggcca gtgcgcaaca cttgattaac tgcgatccgt gttgggtgct ggggccctga gatgccctgg cgctgtatca acacacggct cggcctgtgc gttcccttcc gtaaagcatt cgctgccctg tcccacatca caattgcaac gattaggaat ggtcatcaag acgggcccgt ggcttttctg ttcggaagtc ctggagtcgg tgtgatgctc aactatgcgt attgcatcaa acgccggacg agtgttaggt tcaccacacg agaccgcaac gacatagcta ccaaggcccg caggagcacg gcgaccgtcc tggccctgct gaagactgaa cttactacgc ttcatttgca atgggctgag ctcggttgaa aagaacgacg ggagagtggg gagctgggtt tgggtatgtt acaacatggc accacacgtt gagcaaagag gtatttgacg cagtggtggg tgcgtgtgac gttggcgccg cgtagaaccg ttaatgttga tccta cgcgcgtgga gtgagcattc gcgcctgacg gtcgtgcgac attgcccaag taacgtactg agtccgtacg aggcttcgag gtaaggcaaa ggagtgcatg acggtctggc ttgttggcag tgccgtccgt gcatacccct ttaaagaggc ccttcaagcc ggcgtgtaca gccgcgcggc ctgaagggtg tactgaaagg agtgaagccg
ChR2 (WT) дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью светорегулируемого ионного канала хламиопсина 4 (СОР4) (GenBank No. ХР_001701725, и SEQ ID NO: 2):
121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721
mdyggalsav gfsilllmfу yaewlltcpv glcygantff svygstvght edeaeagavn gngmgmgmgm lsvtyelvpa fgwaglgpmr gmngmgggmg gngmgggmgg plfnaapspl lqnlmneinr grellfvtnp ayqtwkstcg ilihlsnltg haakayiegy iidlmskncw kgtgkyasre ngmngmggmn lgadntlalv dliesanldg ggmngmgggn ngmggsmngm s sqlgaeagm lkrelge vvvngsvlvp weeiyvcaie lsndysrrtm htvpkgrcrq gllghylrvl sflvmrdkmk gmaggakpgl tqaqnlggvd wlegpsfgqg gmnnmgngmg ssgvvanvtp gsmggmggms edqcycagwi mvkvilefff gllvsdigti vvtgmawlff ihehilihgd ekgidvrasl eltpqlqpgr fvlihpeflr ilpahivalv ggmgngmggn saaggmggiran gmggmggmgg esrgtngaqt efknpsmlyl vwgatsamat vswgmfpilf irkttklnig dnskeveqeq vilavpdism drsstsilsr akmqqmrkmq gmngmgggng nggmaapqsp mggagaattq asnvlqwlaa atghrvqwlr gyvkviffcl ilgpegfgvl gteievetlv aar aairararann vdffreqfaq lrgagqrvaa qmqqigirantg mnnmggngma gmnggrlgtn aaggnaeaem
Chop2 (WT) дикого типа по изобретению могут кодироваться следующей последовательностью гена белка, связывающего
ретиналь, Chlamydomonas reinhardtii AF461397, и SEQ ID NO: 3):
!сор4;
IGenBank No,
121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781
gcatctgtcg cgcgagctgc gaccagtgtt tcgaacgtgc taccaaacat gtcaaggtga acaggccacc ctcattcacc ctgcttgtgt tacgtcaagg gctgccaagg gtgactggca ctcggccccg attgacctga ccaagcaagc tatttgtaac actgcgcggg tgcaatggct ggaagtcaac ttctcgagtt gcgtccagtg tgtcaaacct ctgatattgg tcatcttctt cctacatcga tggcttggct agggcttcgg tgtcgaagaa attaaacatg gaacccagta ctggattgag tgctgctggc ctgcggctgg cttcttcgag gttgcgttac gacgggcttg cacaattgtg ctgcctgggt gggttaccac cttcttcgta cgtcctgagc ctgctggggt gattatggag gtcgtcaatg tcgcgtggca ttctccatcc gaggagatct tttaagaacc gccgagtggc tccaacgact tggggcgcca ctgtgttatg accgtgccga tcatggggta gtgtacggct ctgctcggcc gcgccctgag gctctgtact caaacggtgc tactgcttat atgtgtgcgc cgtccatgct ttctcacctg acagcaggcg cttccgccat gtgctaacac agggccggtg tgttccccat ccaccgtcgg actacctgcg tgccgttggg tgtgcctgag ccaaacggcg gttttacgcc tatcgagatg gtatctagcc cccggtcatt caccatgggt ggccaccgga gttctttcac tcgccaggtg cctgttcatc ccacaccatc cgtgctgatc
841 cacgagcata tcctcatcca cggcgacatt cgcaagacca ccaaattgaa cattggtggc
901 actgagattg aggtcgagac gctggtggag gacgaggccg aggctggcgc ggtcaacaag
961 ggcaccggca agtacgcctc ccgcgagtcc ttcctggtca tgcgcgacaa gatgaaggag
1021 aagggcattg acgtgcgcgc ctctctggac aacagcaagg aggtggagca ggagcaggcc
1081 gccagggctg ccatgatgat gatgaacggc aatggcatgg gtatgggaat gggaatgaac
1141 ggcatgaacg gaatgggcgg tatgaacggg atggctggcg gcgccaagcc cggcctggag
1201 ctcactccgc agctacagcc cggccgcgtc atcctggcgg tgccggacat cagcatggtt
1261 gacttcttcc gcgagcagtt tgctcagcta tcggtgacgt acgagctggt gccggccctg
1321 ggcgctgaca acacactggc gctggttacg caggcgcaga acctgggcgg cgtggacttt
1381 gtgttgattc accccgagtt cctgcgcgac cgctctagca ccagcatcct gagccgcctg
1441 cgcggcgcgg gccagcgtgt ggctgcgttc ggctgggcgc agctggggcc catgcgtgac
1501 ctgatcgagt ccgcaaacct ggacggctgg ctggagggcc cctcgttcgg acagggcatc
1561 ctgccggccc acatcgttgc cctggtggcc aagatgcagc agatgcgcaa gatgcagcag
1621 atgcagcaga ttggcatgat gaccggcggc atgaacggca tgggcggcgg tatgggcggc
1681 ggcatgaacg gcatgggcgg cggcaacggc atgaacaaca tgggcaacgg catgggcggc
1741 ggcatgggca acggcatggg cggcaatggc atgaacggaa tgggtggcgg caacggcatg
1801 aacaacatgg gcggcaacgg aatggccggc aacggaatgg gcggcggcat gggcggcaac
1861 ggtatgggtg gctccatgaa cggcatgagc tccggcgtgg tggccaacgt gacgccctcc
1921 gccgccggcg gcatgggcgg catgatgaac ggcggcatgg ctgcgcccca gtcgcccggc
1981 atgaacggcg gccgcctggg taccaacccg ctcttcaacg ccgcgccctc accgctcagc
2041 tcgcagctcg gtgccgaggc aggcatgggc agcatgggag gcatgggcgg aatgagcgga
2101 atgggaggca tgggtggaat ggggggcatg ggcggcgccg gcgccgccac gacgcaggct
2161 gcgggcggca acgcggaggc ggagatgctg cagaatctca tgaacgagat caatcgcctg
2221 aagcgcgagc ttggcgagta a
Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться
следующей аминокислотной последовательностью белка,
связывающего ретиналь, Chlamydomonas reinhardtii (сор4) (GenBank No. ААМ15777, и SEQ ID NO: 4):
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa 61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr 121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl 181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl 241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv 301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn 361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq 421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr lrgagqrvaa 481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg 541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma 601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn 661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem 721 lqnlmneinr lkrelge
Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей мРНК-последовательностью сенсорного опсина В Chlamydomonas reinhardtii (CSOB) (GenBank No. AF508966, и SEQ ID NO: 5):
1 ttgacatctg tcgccaagca agcattaaac atggattatg gaggcgccct gagtgccgtt 61 gggcgcgagc tgctatttgt aacgaaccca gtagtcgtca atggctctgt acttgtgcct 121 gaggaccagt gttactgcgc gggctggatt gagtcgcgtg gcacaaacgg tgcccaaacg 181 gcgtcgaacg tgctgcaatg gcttgctgct ggcttctcca tcctactgct tatgttttac 241 gcctaccaaa catggaagtc aacctgcggc tgggaggaga tctatgtgtg cgctatcgag 301 atggtcaagg tgattctcga gttcttcttc gagtttaaga acccgtccat gctgtatcta 361 gccacaggcc accgcgtcca gtggttgcgt tacgccgagt ggcttctcac ctgcccggtc 421 attctcattc acctgtcaaa cctgacgggc ttgtccaacg actacagcag gcgcaccatg 481 ggtctgcttg tgtctgatat tggcacaatt gtgtggggcg ccacttccgc catggccacc 541 ggatacgtca aggtcatctt cttctgcctg ggtctgtgtt atggtgctaa cacgttcttt
601
661
721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541
cacgctgcca gtggtgactg atcctcggcc atcattgacc atccacgagc ggcactgaga aagggcaccg gagaagggca gccgccaggg aacggcatga gagctcactc gttgacttct ctgggcgctg tttgtgttga ctgcgcggcg gacctgatcg atcctgccgg cagatgcagc ggcggcatga ggcggcatgg atgaacaaca aacggtatgg tccgccgccg ggcatgaacg agctcgcagc ggaatgggag gctgcgggcg ctgaagcgcg gcgcgcctga tgtgcaacgt cccgccttcg ggaagggcgg gctctgcacg tggtggccga cgctttgctt gaaggtgtta ttctgtggct ggcacgtctt acacgcgagt ctgtgtttta aacttgaggg taatcaatga cactttgatg gttgcggacg gcgcggcaac ctgccattct acatggagag ggtaaagccg gggtaactgg gccgtgcgcc aggcctacat gcatggcttg ccgagggctt tgatgtcgaa atatcctcat ttgaggtcga gcaagtacgc ttgacgtgcg ctgccatgat acggaatggg cgcagctaca tccgcgagca acaacacact ttcaccccga cgggccagcg agtccgcaaa cccacatcgt agattggcat acggcatggg gcaacggcat tgggcggcaa gtggctccat gcggcatggg gcggccgcct tcggtgccga gcatgggtgg gcaacgcgga agcttggcga ctcgtcgtac atctagagcg caccgcaagt cttgatcagt taagtgggcg ggccctggtc aacctcgaca tcggatgtga tctgttgggg tgtgcacaac gcaaagcggg accacagctt tgattcgtct agctgaagct tcgtggccaa tgcgcaacaa ttgattaaca gcgatccgta ttgggtgctt gggccctgaa atgccctggg gctgtatcac cgagggttac gctcttcttc cggcgtcctg gaactgctgg ccacggcgac gacgctggtg ctcccgcgag cgcctctctg gatgatgaac cggtatgaac gcccggccgc gtttgctcag ggcgctggtt gttcctgcgc tgtggctgcg cctggacggc tgccctggtg gatgaccggc cggcggcaac gggcggcaat cggaatggcc gaacggcatg cggcatgatg gggtaccaac ggcaggcatg aatggggggc ggcggagatg gtaaaaggct acacggctca gcctgtgcgc tcccttcctg aaagcattga ctgccctgct ccacatcatt attgcaacat ttaggaatct tcatcaagaa gggcccgtgg cttttctgga cggaagtctg ggagtcggac gtgatgctca actatgcgtg ttgcatcaag cgccggacgc gtgttaggtt caccacacgg gaccgcaacc acatagctat caaggcccgt cacaccgtgc gtatcatggg agcgtgtacg ggtctgctcg attcgcaaga gaggacgagg tccttcctgg gacaacagca ggcaatggca gggatggctg gtcatcctgg ctatcggtga acgcaggcgc gaccgctcta ttcggctggg tggctggagg gccaagatgc ggcatgaacg ggcatgaaca ggcatgaacg ggcaacggaa agctccggcg aacggcggca ccgctcttca ggcagcatgg atgggcggcg ctgcagaatc ggaggccggt ggagcacgcg gaccgtccgt gccctgctgc agactgaagt tactacgcat catttgcata gggctgagag cggttgaaag gaacgacggt agagtggggg gctgggttac ggtatgtttt aacatggctg ccacacgttg agcaaagagt tatttgacgc agtggtgggg gcgtgtgacg ttggcgccgc gtagaaccgt taatgttgaa ccaaaaaaaa cgaagggccg gtatgttccc gctccaccgt gccactacct ccaccaaatt ccgaggctgg tcatgcgcga aggaggtgga tgggtatggg gcggcgccaa cggtgccgga cgtacgagct agaacctggg gcaccagcat cgcagctggg gcccctcgtt agcagatgcg gcatgggcgg acatgggcaa gaatgggtgg tgggcggcgg tggtggccaa tggctgcgcc acgccgcgcc gaggcatggg ccggcgccgc tcatgaacga actgcgatac cgcgtggact gagcattccg gcctgacgca cgtgcgaccg tgcccaagac acgtactgtt tccgtacggc gcttcgagaa aaggcaaacg agtgcatgtg ggtctggctc gttggcagaa ccgtccgtgt catacccctg taaagaggca cttcaagcca gcgtgtacag ccgcgcggct tgaagggtgt actgaaaggg gtgaagccgt aaaaaaaaaa gtgtcgccag catcctgttc cggccacacc gcgcgtgctg gaacattggt cgcggtcaac caagatgaag gcaggagcag aatgggaatg gcccggcctg catcagcatg ggtgccggcc cggcgtggac cctgagccgc gcccatgcgt cggacagggc caagatgcag cggtatgggc cggcatgggc cggcaacggc catgggcggc cgtgacgccc ccagtcgccc ctcaccgctc cggaatgagc cacgacgcag gatcaatcgc ctgcgagctc tctcaacctg gtgcgatctt tcgtccgaac tagtgctatg tgcttccttt tagttacata ggctatggac agtgagcttc aggtaaaagt tgcggtccta ggcaactgct acatttgggt gcagggacgg cttacaaaaa tgagtgcatg acaagtgcgc tgtttatgag gtgggccctt gctatgtttt tgtcagcccg caagccgagt aaaaaaaaa
Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью сенсорного опсина В Chlamydomonas reinhardtii (CSOB) (GenBank No. AAM44040, и SEQ ID NO: 6):
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp
61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq
edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa
mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr
gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl
vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl
241 svygstvght
301 edeaeagavn
361 gngmgmgmgm
421 lsvtyelvpa
481 fgwaqlgpmr
541 gmngmgggmg
601 gngmgggmgg
661 plfnaapspl
721 lqnlmneinr
iidlmskncw kgtgkyasre ngmngmggmn lgadntlalv dliesanldg ggmngmgggn ngraggsrangra ssqlgaeagm lkrelge gllghylrvl sflvmrdkmk gmaggakpgl tqaqnlggvd wlegpsfgqg gmnnmgngmg ssgvvanvtp gsmggmggms ihehilihgd ekgidvrasl eltpqlqpgr fvlihpeflr ilpahivalv ggmgngmggn saaggmggmm gmggmggmgg irkttklnig dnskeveqeq vilavpdism drsstsilsr akmqqmrkmq gmngmgggng nggmaapqsp mggagaattq gteievetlv aaraammmmn vdffreqfaq lrgagqrvaa qmqqigmmtg mnnmggngma gmnggrlgtn aaggnaeaem
Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей мРНК-последовательностью опсина-2 простейшего типа Chlamydomonas reinhardtii асор2 (GenBank No. АВ058891, и SEQ ID NO: 7):
l 61
121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401
catctgtcgc gcgagctgct accagtgtta cgaacgtgct accaaacatg tcaaggtgat caggccaccg tcattcacct tgcttgtgtc acgtcaaggt ctgccaaggc tgactggcat tcggccccga ttgacctgat acgagcatat ctgagattga gcaccggcaa agggcattga ccagggctgc gcatgaacgg tcactccgca acttcttccg gcgctgacaa tgttgattca gcggcgcggg tgatcgagtc tgccggccca tgcagcagat gcatgaacgg gcatgggcaa acaacatggg gtatgggtgg ccgccggcgg tgaacggcgg cgcagctcgg tgggaggcat cgggcggcaa agcgcgagct gcctgactcg caacgtatct ccttcgcacc caagcaagca atttgtaacg ctgcgcgggc gcaatggctt gaagtcaacc tctcgagttc cgtccagtgg gtcaaacctg tgatattggc catcttcttc ctacatcgag ggcttggctc gggcttcggc gtcgaagaac cctcatccac ggtcgagacg gtacgcctcc cgtgcgcgcc catgatgatg aatgggcggt gctacagccc cgagcagttt cacactggcg ccccgagttc ccagcgtgtg cgcaaacctg catcgttgcc tggcatgatg catgggcggc cggcatgggc cggcaacgga ctccatgaac catgggcggc ccgcctgggt tgccgaggca gggtggaatg cgcggaggcg tggcgagtaa tcgtacacac agagcggcct gcaagttccc ttaaacatgg aacccagtag tggattgagt gctgctggct tgcggctggg ttcttcgagt ttgcgttacg acgggcttgt acaattgtgt tgcctgggtc ggttaccaca ttcttcgtat gtcctgagcg tgctggggtc ggcgacattc ctggtggagg cgcgagtcct tctctggaca atgaacggca atgaacggga ggccgcgtca gctcagctat ctggttacgc ctgcgcgacc gctgcgttcg gacggctggc ctggtggcca accggcggca ggcaacggca ggcaatggca atggccggca ggcatgagct atgatgaacg accaacccgc ggcatgggca gggggcatgg gagatgctgc aaggctggag ggctcaggag gtgcgcgacc ttcctggccc attatggagg tcgtcaatgg cgcgtggcac tctccatcct aggagatcta ttaagaaccc ccgagtggct ccaacgacta ggggcgccac tgtgttatgg ccgtgccgaa catggggtat tgtacggctc tgctcggcca gcaagaccac acgaggccga tcctggtcat acagcaagga atggcatggg tggctggcgg tcctggcggt cggtgacgta aggcgcagaa gctctagcac gctgggcgca tggagggccc agatgcagca tgaacggcat tgaacaacat tgaacggaat acggaatggg ccggcgtggt gcggcatggc tcttcaacgc gcatgggagg gcggcgccgg agaatctcat gccggtactg cacgcgcgcg gtccgtgagc tgctgcgcct cgccctgagt ctctgtactt aaacggtgcc actgcttatg tgtgtgcgct gtccatgctg tctcacctgc cagcaggcgc ttccgccatg tgctaacacg gggccggtgt gttccccatc caccgtcggc ctacctgcgc caaattgaac ggctggcgcg gcgcgacaag ggtggagcag tatgggaatg cgccaagccc gccggacatc cgagctggtg cctgggcggc cagcatcctg gctggggccc ctcgttcgga gatgcgcaag gggcggcggt gggcaacggc gggtggcggc cggcggcatg ggccaacgtg tgcgccccag cgcgccctca catgggcgga cgccgccacg gaacgagatc cgatacctgc tggacttctc attccggtgc gacgcatc gccgttgggc gtgcctgagg caaacggcgt ttttacgcct atcgagatgg tatctagcca ccggtcattc accatgggtc gccaccggat ttctttcacg cgccaggtgg ctgttcatcc cacaccatca gtgctgatcc attggtggca gtcaacaagg atgaaggaga gagcaggccg ggaatgaacg ggcctggagc agcatggttg ccggccctgg gtggactttg agccgcctgc atgcgtgacc cagggcatcc atgcagcaga atgggcggcg atgggcggcg aacggcatga ggcggcaacg acgccctccg tcgcccggca ccgctcagct atgagcggaa acgcaggctg aatcgcctga gagctcgcgc aacctgtgtg gatcttcccg
Chop2 дикого типа
по изобретению может следующей асор2 мРНК-последовательностью reinhardtii, кодирующей аминокислотную последовательность опсина-2 простейшего типа (GenBank No. ВАВ68567, и SEQ ID NO:
1 mdyggalsav grellfvtnp vvvngsvlvp edqcycagwi esrgtngaqt asnvlqwlaa
61 gfsilllmfy ayqtwkstcg weeiyvcaie mvkvilefff efknpsmlyl atghrvqwlr
121 yaewlltcpv ilihlsnltg lsndysrrtm gllvsdigti vwgatsamat gyvkviffcl
181 glcygantff haakayiegy htvpkgrcrq vvtgmawlff vswgmfpilf ilgpegfgvl
241 svygstvght iidlmskncw gllghylrvl ihehilihgd irkttklnig gteievetlv
301 edeaeagavn kgtgkyasre sflvmrdkmk ekgidvrasl dnskeveqeq aaraammmmn
361 gngmgmgmgm ngmngmggmn gmaggakpgl eltpqlqpgr vilavpdism vdffreqfaq
421 lsvtyelvpa lgadntlalv tqaqnlggvd fvlihpeflr drsstsilsr lrgagqrvaa
481 fgwaqlgpmr dliesanldg wlegpsfgqg ilpahivalv akmqqmrkmq qmqqigmmtg
541 gmngmgggmg ggmngmgggn gmnnmgngmg ggmgngmggn gmngmgggng mnnmggngma
601 gngmgggmgg ngmggsmngm ssgvvanvtp saaggmggmm nggmaapqsp gmnggrlgtn
661 plfnaapspl ssqlgaeagm gsmggmggms gmggmggmgg mggagaattq aaggnaeaem
721 lqnlmneinr lkrelge
ChR2 -тут а н ты
В настоящем изобретении предлагаются Спор2-мутанты, где одна или несколько аминокислот подвергнуты мутации. В некоторых воплощениях Chop2 представляет собой полноразмерный полипептид, такой как SEQ ID NO: 2, 4, б, и 8, содержащие, по меньшей мере, одну аминокислотную мутацию. В некоторых воплощениях, мутация располагается в аминокислоте 132 и/или аминокислоте 159. В некоторых предпочтительных воплощениях, аминокислота в положении 132 подвергается мутации с лейцина на цистеин или аланин. В некоторых предпочтительных воплощениях, аминокислота в положении 159 подвергается мутации с треонина на аланин, цистеин или серии. Во всех воплощениях, Спор2-мутанты образуют функциональный канал ChR2.
Настоящее изобретение также охватывает белки Chop2 и нуклеиновые кислоты, которые кодируют биологически активный фрагмент или консервативную аминокислотную замену или другой мутантный вариант Chop2. Частные примеры применяемых фрагментов включают полипептиды, кодирующие аминокислоты 1-315 дикого типа Chop2, т.е. SEQ ID NO: 2 6, где, по меньшей мере, одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене, например, в аминокислотных положениях 132 и/или 159. Более короткие фрагменты Chop2 дикого типа, где, по меньшей мере, одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене (т.е., в аминокислотных положениях 132 и/или 159), также могут использоваться в настоящем изобретении. Соответственно, полипептиды Chop2 и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению дополнительно включают в частности биологически активные фрагменты, кодирующие аминокислоты 1-315, 1-310, 1
300, 1-275, 1-250, 1-225, 1-200, 1-175, или 1-160 Chop2 дикого типа, где, по меньшей мере, одна аминокислота подвергнута мутации или консервативной замене, например в аминокислотных положениях 132 и/или 159. В других воплощениях, полипептиды Chop2 и нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению могут составлять по длине примерно или до 315 аминокислот, 310 аминокислот, 300 аминокислот, 275 аминокислот, 2 50 аминокислот, 22 5 аминокислот, 2 00 аминокислот, 175 аминокислот, или 1бОаминокислот.
Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться следующим синтетическим конструктом генной последовательности hVChRl-mKate-betahChR2(L132C) (GenBank No. JN836746, и SEQ ID NO: 9), содержащим следующие аннотации, GFP последовательность обозначена жирным, последовательность L132C Chop2 подчеркнута:
1 atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga
61 accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact
121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc
181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac
241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca
301 gccacactct ggctcagcag tgggaatggc gtagtgtgga tgagatatgg agagtggctg
361 ctgacctgtc ccgtcctgct cattcatctg tccaatctga ccgggctgaa agatgactac
421 tccaagagaa caatgggact gctggtgagt gacgtggggt gtattgtgtg gggagccacc
481 tccgccatgt gcactggatg gaccaagatc ctctttttcc tgatttccct ctcctatggg
541 atgtatacat acttccacgc cgctaaggtg tatattgagg ccttccacac tgtacctaaa
601 ggcatctgta gggagctcgt gcgggtgatg gcatggacct tctttgtggc ctgggggatg
661 ttccccgtgc tgttcctcct cggcactgag ggatttggcc acattagtcc ttacgggtcc
721 gcaattggac actccatcct ggatctgatt gccaagaata tgtggggggt gctgggaaat
781 tatctgcggg taaagatcca cgagcatatc ctgctgtatg gcgatatcag aaagaagcag
841 aaaatcacca ttgctggaca ggaaatggag gtggagacac tggtagcaga ggaggaggac
901 gggaccgcgg tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac
961 atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc
1021 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct
1081 ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aaccttcatc
1141 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg
12 01 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc
1261 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttccc atccaacggc
1321 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggcctcca ccgagatgct gtaccccgct
13 81 gacggcggcc tggaaggcag agccgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggccacctg
1441 atctgcaact tgaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc
1501 ggcgtctact atgtggacag aagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac
1561 gtcgagcagc acgaggtggc tgtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac
1621 aaacttaatt gcctgcagga gaagaagtca tgcagccagc gcatggccga attccggcaa
1681 tactgttgga acccggacac tgggcagatg ctgggccgca ccccagcccg gtgggtgtgg
1741 atcagcctgt actatgcagc tttctacgtg gtcatgactg ggctctttgc cttgtgcatc
1801 tatgtgctga tgcagaccat tgatccctac acccccgact accaggacca gttaaagtca
1861 ccgggggtaa ccttgagacc ggatgtgtat ggggaaagag ggctgcagat ttcctacaac
1921 atctctgaaa acagctctag acaggcccag atcaccggac gtccggagac tgagacattg
1981 ccaccggtgg actacggggg ggccctgagc gctgtgggca gagaactcct gttcgtgaca
2 0 41 aatccagtcg tggtgaacgg ctccgtactc gtacccgagg atcagtgcta ttgcgcagga
2101
tggatcgaga
gcagaggcac
aaacggcgca
cagactgcat
ccaacgtgct
ccagtggttg
2161
gccgcaggct
tttccattct
cctgctcatg
ttttacgcct
accagacttg
gaagtccaca
2221
tgtggctggg
aggaaatcta
cgtgtgtgca
atcgaaatgg
tgaaggtgat
cctggagttt
2281
ttcttcgaat
ttaaaaaccc
aagcatgctg
tacctggcta
ctggccacag
agtgcagtgg
2341
ctgcggtatg
ccgaatggct
gctgacttgc
ccagtgattt
gcatccacct
gtccaacctg
2401
actgggctgt
ctaacgatta
cagtaggaga
acaatgggac
tgctcgtatc
cgacatcggc
2461
actatcgtat
ggggcgcaac
tagtgccatg
gccactggat
acgtgaaagt
gatcttcttc
2821 qqcqatatcc qqaaaactac caagctcaat atcgggggca ccgagattga agtggagaca 2881 ctcgtggagg acgaggccga ggccggagca gtgaacaaag gcactggcaa gtatgcctcc 2941 agagaatcct ttctggtgat gcgggacaaa atgaaggaga aaggcattga tgtacggtgc 3001 agtaatgcca aagccgtcga gactgatgtg tag
Одиночный мутант ChR2 по изобретению может кодироваться
следующим синтетическим конструктом аминокислотной
последовательности hVChRl-mKate-betahChR2(L132C) (GenBank No.
AER29839, и SEQ ID NO: 10), содержащим следующие аннотации,
GFP-последовательность обозначена жирным шрифтом,
последовательность L132C Chop2 подчеркнута:
1 mdypvarsli vryptdlgng tvcmprgqcy cegwlrsrgt siektiaitl qwvvfalsva
61 clgwyayqaw ratcgweevy valiemmksi ieafhefdsp atlwlssgng vvwmrygewl
121 ltcpvllihl snltglkddy skrtmgllvs dvgcivwgat samctgwtki lfflislsyg
181 mytyfhaakv yieafhtvpk gicrelvrvm awtffvawgm fpvlfllgte gfghispygs
241 aighsildli aknmwgvlgn ylrvkihehi llygdirkkq kitiagqeme vetlvaeeed
301 gtavatmvsk geelikenmh mklymegtvn nhhfkctseg egkpyegtqt mrikweggp
361 lpfafdilat sfmygsktfi nhtqgipdff kqsfpegftw ervttyedgg vltatqdtsl
421 qdgcliynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl
481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh
541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm lgrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci
601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl
661 ppvdyggals avgrellfvt npvvvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl
721 aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw
781 lryaewlltc pvicihlsnl tglsndysrr tmgllvsdig tivwgatsam atgyvkviff
841 clglcygant ffhaakayie gyhtvpkgrc rqvvtgmawl ffvswgmfpi lfilgpegfg
901 vlsvygstvg htiidlmskn cwgllghylr vlihehilih gdirkttkln iggteievet
961 lvedeaeaga vnkgtgkyas resflvmrdk mkekgidvrc snakavetdv
Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться
следующей генной последовательностью синтетического конструкта
hVChRl-mKate-betahChR2(L132C) (GenBank No. JN836745, и SEQ ID
NO: 11), содержащего следующие аннотации, GFP-
последовательность обозначена жирным шрифтом,
последовательность L132C Chop2 подчеркнута:
1 atggattacc ctgtggcccg gtccctgatt gtaagatacc ccaccgatct gggcaatgga
61 accgtgtgca tgcccagagg acaatgctac tgcgaggggt ggctgaggag ccggggcact
121 agtatcgaaa aaaccatcgc tatcaccctc cagtgggtag tgttcgctct gtccgtagcc
181 tgtctcggct ggtatgcata ccaagcctgg agggctacct gtgggtggga ggaagtatac
241 gtggccctga tcgagatgat gaagtccatc atcgaggctt tccatgagtt cgactcccca
301 gccacactct ggctcagcag tgggaatggc gtagtgtgga tgagatatgg agagtggctg
361 ctgacctgtc ccgtcctgct cattcatctg tccaatctga ccgggctgaa agatgactac
421 tccaagagaa caatgggact gctggtgagt gacgtggggt gtattgtgtg gggagccacc
481 tccgccatgt gcactggatg gaccaagatc ctctttttcc tgatttccct ctcctatggg
541 atgtatacat acttccacgc cgctaaggtg tatattgagg ccttccacac tgtacctaaa
601 ggcatctgta gggagctcgt gcgggtgatg gcatggacct tctttgtggc ctgggggatg
661 ttccccgtgc tgttcctcct cggcactgag ggatttggcc acattagtcc ttacgggtcc
721 gcaattggac actccatcct ggatctgatt gccaagaata tgtggggggt gctgggaaat
781 tatctgcggg taaagatcca cgagcatatc ctgctgtatg gcgatatcag aaagaagcag
841 aaaatcacca ttgctggaca ggaaatggag gtggagacac tggtagcaga ggaggaggac
901 gggaccgcgg tcgccaccat ggtgtctaag ggcgaagagc tgattaagga gaacatgcac
961 atgaagctgt acatggaggg caccgtgaac aaccaccact tcaagtgcac atccgagggc 1021 gaaggcaagc cctacgaggg cacccagacc atgagaatca aggtggtcga gggcggccct 1081 ctccccttcg ccttcgacat cctggctacc agcttcatgt acggcagcaa aaccttcatc 1141 aaccacaccc agggcatccc cgacttcttt aagcagtcct tccctgaggg cttcacatgg
12 01 gagagagtca ccacatacga agacgggggc gtgctgaccg ctacccagga caccagcctc 1261 caggacggct gcctcatcta caacgtcaag atcagagggg tgaacttccc atccaacggc 1321 cctgtgatgc agaagaaaac actcggctgg gaggcctcca ccgagatgct gtaccccgct
13 81 gacggcggcc tggaaggcag agccgacatg gccctgaagc tcgtgggcgg gggccacctg 1441 atctgcaact tgaagaccac atacagatcc aagaaacccg ctaagaacct caagatgccc 1501 ggcgtctact atgtggacag aagactggaa agaatcaagg aggccgacaa agagacctac 1561 gtcgagcagc acgaggtggc tgtggccaga tactgcgacc tccctagcaa actggggcac 1621 aaacttaatt gcctgcagga gaagaagtca tgcagccagc gcatggccga attccggcaa 1681 tactgttgga acccggacac tgggcagatg ctgggccgca ccccagcccg gtgggtgtgg 1741 atcagcctgt actatgcagc tttctacgtg gtcatgactg ggctctttgc cttgtgcatc 1801 tatgtgctga tgcagaccat tgatccctac acccccgact accaggacca gttaaagtca 1861 ccgggggtaa ccttgagacc ggatgtgtat ggggaaagag ggctgcagat ttcctacaac 1921 atctctgaaa acagctctag acaggcccag atcaccggac gtccggagac tgagacattg 1981 ccaccggtgg actacggggg ggccctgagc gctgtgggca gagaactcct gttcgtgaca 2 0 41 aatccaqtcq tqqtqaacqq ctccqtactc qtacccqaqq atcaqtqcta ttqcqcaqqa 2101 tggatcgaga gcagaggcac aaacggcgca cagactgcat ccaacgtgct ccagtggttg 2161 gccgcaggct tttccattct cctgctcatg ttttacgcct accagacttg gaagtccaca 2221 tgtggctggg aggaaatcta cgtgtgtgca atcgaaatgg tgaaggtgat cctggagttt 22 81 ttcttcgaat ttaaaaaccc aagcatgctg tacctggcta ctggccacag agtgcagtgg 2341 ctgcggtatg ccgaatggct gctgacttgc ccagtgattc tgatccacct gtccaacctg 2401 actgggctgt ctaacgatta cagtaggaga acaatgggac tgctcgtatc cgacatcggc 2461 actatcgtat ggggcgcaac tagtgccatg gccactggat acgtgaaagt gatcttcttc 2521 tqcctqqqac tctqctacqq aqcaaacaca ttttttcatq ccqcaaaaqc atatatcqaq 2581 gggtatcata ccgtcccaaa gggccggtgt agacaagtgg tgactggcat ggcttggctg 2641 ttcttcgtgt cctgggggat gtttcccatc ctctttatcc tgggcccaga aggcttcggg 2701 gtgctgagtg tgtatggcag taccgtagga cacactatca ttgacctgat gagcaaaaac 2761 tgctgggggc tgctcggcca ctacctgaga gtactcatcc acgagcatat cctgattcat 2821 ggcgatatcc ggaaaactac caagctcaat atcgggggca ccgagattga agtggagaca 2 8 81 ctcgtggagg acgaggccga ggccggagca gtgaacaaag gcactggcaa gtatgcctcc 2941 agagaatcct ttctggtgat gcgggacaaa atgaaggaga aaggcattga tgtacggtgc 3001 agtaatgcca aagccgtcga gactgatgtg tag
Одиночный мутант Chop2 по изобретению может кодироваться
следующей аминокислотной последовательностью синтетического
конструкта hVChRl-mKate-betahChR2(L132C) (GenBank No. AER29838
и SEQ ID NO: 12) , содержащего следующие аннотации, GFP-
последовательность обозначена жирным шрифтом,
последовательность L132C Chop2 подчеркнута:
1 mdypvarsli vryptdlgng tvcmprgqcy cegwlrsrgt siektiaitl qwvvfalsva
61 clgwyayqaw ratcgweevy valiemmksi ieafhefdsp atlwlssgng vvwmrygewl
121 ltcpvllihl snltglkddy skrtmgllvs dvgcivwgat samctgwtki lfflislsyg
181 mytyfhaakv yieafhtvpk gicrelvrvm awtffvawgm fpvlfllgte gfghispygs
241 aighsildli aknmwgvlgn ylrvkihehi llygdirkkq kitiagqeme vetlvaeeed
301 gtavatmvsk geelikenmh mklymegtvn nhhfkctseg egkpyegtqt mrikweggp
361 lpfafdilat sfmygsktfi nhtqgipdff kqsfpegftw ervttyedgg vltatqdtsl
421 qdgcliynvk irgvnfpsng pvmqkktlgw eastemlypa dgglegradm alklvggghl
481 icnlkttyrs kkpaknlkmp gvyyvdrrle rikeadkety veqhevavar ycdlpsklgh
541 klnclqekks csqrmaefrq ycwnpdtgqm lgrtparwvw islyyaafyv vmtglfalci
601 yvlmqtidpy tpdyqdqlks pgvtlrpdvy gerglqisyn isenssrqaq itgrpetetl
661 ppvdyggals avgrellfvt npvvvngsvl vpedqcycag wiesrgtnga qtasnvlqwl
lryaewlltc
pvilihlsnl
tglsndysrr
tmgllvsdig
tivwgatsam
atgyvkviff
clglcygant
ffhaakayie
gyhtvpkgrс
rqvvtgmawl
ffvswgmfpi
If ilgpegfg
vlsvygstvg
htiidlmskn
cwgllghylr
vlihehilih
gdirkttkln
iggteievet
721 aagfsilllm fyayqtwkst cgweeiyvca iemvkvilef ffefknpsml ylatghrvqw
841 _ 901 v
961 lvedeaeaga vnkgtgkyas resflvrardk mkekgidvrc snakavetdv
Одиночный мутант L132C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью
(положение 132 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID N0: 13):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGATSAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Одиночный мутант T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 14):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Двойной мутант L132C/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 15):
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct 61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc 121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct 181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc 241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc 301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga 361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc 421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggctgcatt 481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg 541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat 601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc 661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg 721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg 781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat 841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg 901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Двойной мутант L132C/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID NO: 16):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Одиночный мутант T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью
(положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID N0: 17):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGSI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Двойной мутант L132C/T159S Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID NO: 18):
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct
61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc
121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct
181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc
241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc
301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga
361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc
421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcagcatt
481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg
541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat
601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc
661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg
721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg
781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat
841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg
901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Двойной мутант L132C/T159S Chop2 по изобретению может
кодироваться следующей аминокислотной последовательностью
(положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ
ID N0:19):
1 MDYGGALSAV 61 GFSILLLMFY 121 YAEWLLTCPV 181 GLCYGANTFF 241 SVYGSTVGHT 301 EDEAEAGAVN
GRELLFVTNP AYQTWKSTCG ICIHLSNLTG HAAKAYIEGY IIDLMSKNCW KGTGK
VWNGSVLVP WEEIYVCAIE LSNDYSRRTM HTVPKGRCRQ GLLGHYLRVL
EDQCYCAGWI MVKVILEFFF GLLVSDIGSI WTGMAWLFF IHEHILIHGD
ESRGTNGAQT EFKNPSMLYL VWGATSAMAT VSWGMFPILF IRKTTKLNIG
ASNVLQWLAA ATGHRVQWLR GYVKVIFFCL ILGPEGFGVL GTEIEVETLV
Одиночный мутант L132A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 132 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 20):
1 MDYGGALSAV 61 GFSILLLMFY 121 YAEWLLTCPV 181 GLCYGANTFF 241 SVYGSTVGHT 301 EDEAEAGAVN
GRELLFVTNP AYQTWKSTCG IAIHLSNLTG HAAKAYIEGY IIDLMSKNCW KGTGK
VWNGSVLVP WEEIYVCAIE LSNDYSRRTM HTVPKGRCRQ GLLGHYLRVL
EDQCYCAGWI MVKVILEFFF GLLVSDIGTI WTGMAWLFF IHEHILIHGD
ESRGTNGAQT EFKNPSMLYL VWGATSAMAT VSWGMFPILF IRKTTKLNIG
ASNVLQWLAA ATGHRVQWLR GYVKVIFFCL ILGPEGFGVL GTEIEVETLV
Двойной мутант L132A/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID
NO: 21):
1 ATGGACTACG GGGGGGCTCT GTCTGCTGTC GGGAGGGAAC TGCTGTTTGT GACTAACCCT 61 GTCGTCGTGA ACGGGAGTGT GCTGGTCCCT GAGGACCAGT GCTACTGTGC CGGCTGGATC 121 GAATCACGCG GAACCAACGG GGCCCAGACA GCTAGCAATG TGCTGCAGTG GCTGGCCGCT 181 GGGTTTAGTA TCCTGCTGCT GATGTTCTAC GCCTATCAGA CTTGGAAGTC AACCTGCGGC 241 TGGGAGGAAA TCTACGTGTG CGCTATTGAG ATGGTGAAAG TGATCCTGGA GTTCTTCTTC 301 GAGTTCAAGA ACCCAAGCAT GCTGTACCTG GCTACTGGAC ACCGAGTGCA GTGGCTGAGA 361 TATGCAGAAT GGCTGCTGAC ATGCCCCGTC ATCGCCATTC ACCTGTCCAA CCTGACAGGC 421 CTGAGCAATG ACTACTCCAG GAGAACTATG GGACTGCTGG TGTCCGACAT CGGCTGCATT 481 GTCTGGGGAG CAACTTCTGC TATGGCAACC GGATACGTGA AGGTCATCTT TTTCTGCCTG 541 GGGCTGTGCT ATGGCGCAAA TACCTTTTTC CACGCAGCCA AGGCCTACAT TGAGGGGTAT 601 CATACCGTGC CAAAAGGCCG GTGCCGACAG GTGGTCACAG GAATGGCTTG GCTGTTTTTC 661 GTCTCTTGGG GAATGTTTCC CATCCTGTTC ATTCTGGGGC CTGAAGGGTT CGGCGTGCTG 721 TCTGTCTACG GAAGTACAGT GGGGCATACT ATCATTGACC TGATGTCCAA AAACTGTTGG 781 GGCCTGCTGG GACACTATCT GAGAGTGCTG ATCCACGAGC ATATCCTGAT TCATGGCGAT 841 ATTCGGAAGA CCACAAAACT GAATATCGGC GGAACCGAGA TTGAAGTGGA AACACTGGTG 901 GAAGACGAGG CTGAGGCTGG GGCTGTGAAC AAGGGGACTG GCAAA
Двойной мутант L132A/T159C Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID N0:22):
1 MDYGGALSAV 61 GFSILLLMFY 121 YAEWLLTCPV 181 GLCYGANTFF 241 SVYGSTVGHT 301 EDEAEAGAVN
GRELLFVTNP AYQTWKSTCG IAIHLSNLTG HAAKAYIEGY IIDLMSKNCW KGTGK
VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA
WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR
LSNDYSRRTM GLLVSDIGCI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL
HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL
GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV
Одиночный мутант T159A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положение 159 подчеркнуто и выделено жирным шрифтом, SEQ ID NO: 23):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGAI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Двойной мутант L132C/T159A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью (SEQ ID
NO: 24)
1 atggactacg ggggggctct gtctgctgtc gggagggaac tgctgtttgt gactaaccct 61 gtcgtcgtga acgggagtgt gctggtccct gaggaccagt gctactgtgc cggctggatc 121 gaatcacgcg gaaccaacgg ggcccagaca gctagcaatg tgctgcagtg gctggccgct 181 gggtttagta tcctgctgct gatgttctac gcctatcaga cttggaagtc aacctgcggc 241 tgggaggaaa tctacgtgtg cgctattgag atggtgaaag tgatcctgga gttcttcttc 301 gagttcaaga acccaagcat gctgtacctg gctactggac accgagtgca gtggctgaga 361 tatgcagaat ggctgctgac atgccccgtc atctgcattc acctgtccaa cctgacaggc 421 ctgagcaatg actactccag gagaactatg ggactgctgg tgtccgacat cggcgccatt 481 gtctggggag caacttctgc tatggcaacc ggatacgtga aggtcatctt tttctgcctg 541 gggctgtgct atggcgcaaa tacctttttc cacgcagcca aggcctacat tgaggggtat 601 cataccgtgc caaaaggccg gtgccgacag gtggtcacag gaatggcttg gctgtttttc 661 gtctcttggg gaatgtttcc catcctgttc attctggggc ctgaagggtt cggcgtgctg 721 tctgtctacg gaagtacagt ggggcatact atcattgacc tgatgtccaa aaactgttgg 781 ggcctgctgg gacactatct gagagtgctg atccacgagc atatcctgat tcatggcgat 841 attcggaaga ccacaaaact gaatatcggc ggaaccgaga ttgaagtgga aacactggtg 901 gaagacgagg ctgaggctgg ggctgtgaac aaggggactg gcaaa
Двойной мутант L132C/T159A Chop2 по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (положения 132 и 159 подчеркнуты и выделены жирным шрифтом, SEQ ID N0:25):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ICIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGAI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Chop2 дикого типа по изобретению может кодироваться следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 2 6):
1 MDYGGALSAV GRELLFVTNP VWNGSVLVP EDQCYCAGWI ESRGTNGAQT ASNVLQWLAA 61 GFSILLLMFY AYQTWKSTCG WEEIYVCAIE MVKVILEFFF EFKNPSMLYL ATGHRVQWLR 121 YAEWLLTCPV ILIHLSNLTG LSNDYSRRTM GLLVSDIGTI VWGAT SAMAT GYVKVIFFCL 181 GLCYGANTFF HAAKAYIEGY HTVPKGRCRQ WTGMAWLFF VSWGMFPILF ILGPEGFGVL 241 SVYGSTVGHT IIDLMSKNCW GLLGHYLRVL IHEHILIHGD IRKTTKLNIG GTEIEVETLV 301 EDEAEAGAVN KGTGK
Мутантные белки ChR2 по изобретению также демонстрируют
более медленную кинетику каналов. Было обнаружено, что более
высокая светочувствительность коррелирует с каналами с более
медленной кинетикой, выявляя соотношение между
светочувствительностью и кинетикой каналов. Белки Chop2, которые образуют белки ChR2 по настоящему изобретению, также могут включать дополнительные мутации или модификации, которые могут улучшать кинетику каналов, или повышать степень дезактивации ChR2. Особенно предпочтительные мутанты ChR2 уравновешивают порог светочувствительности с кинетикой каналов.
Композиции и наборы реагентов
Композиции и наборы реагентов по изобретению включают, по меньшей мере, одну молекулу нуклеиновой кислоты или
полипептидную молекулу, которая кодирует мутантный белок Chop2, и полученный в результате ChR2, по изобретению. По меньшей мере, одна молекула нуклеиновой кислоты или полипептидная молекула, которая кодирует мутантный белок Chop2 по изобретению, может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. Наборы реагентов по изобретению дополнительно включают инструкции по введению объекту композиции по изобретению.
Терапевтические применения
Мутации осуществляли на кодон-оптимизированном сшитом белке Chop2-GFP для создания одиночных и двойных мутаций в сайтах L132 (Лейцин 132) и Т159 (треонин 159) . Функциональные свойства каждого мутанта ChR2, или их комбинации сначала исследовали в клетках НЕК. Получали AAV2-вирусные векторы, несущие конструкты мутантного Chop2-GFP, управляемые CAG-промотором, и инъецировали интравитреально в глаза взрослой мыши. Опосредованный мутантным Chop2 ответ на свет исследовали с помощью регистрации мультиэлектродных чипов из тотального препарата сетчатки.
Одиночный мутант ChR2, т.е., L132 и Т159С, значительно
снижал пороговую светочувствительность, которая требуется для
того, чтобы вызвать СпК2-опосредованный фототок. Кроме того,
было обнаружено, что несколько вариантов двойных мутантов ChR2,
включающих L132C/T159C, L132A/T159C, и L132C/T159S
дополнительно повышают фототок выше результатов любого одиночного мутанта ChR2 при низкой интенсивности света. Двойные мутанты демонстрировали более медленное выключение, которое, вероятно, способствует повышенному фототоку при низкой интенсивности света. Спайковую активность ганглиозных клеток сетчатки, опосредованную двойным мутантом L132C/T159C, наблюдали при интенсивности света 1013 фотонов/см2/с и при длине волны 473 нм. Данный уровень света составляет примерно на 1,5-2 log единиц ниже, чем уровень света, который требуется для того, чтобы вызвать спайковую активность с помощью ChR2 дикого типа. Запуск спайковой активности ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих L132C/T159C, может следовать за частотой
мерцания света до 15 Гц. Продолжающиеся исследования представляют собой оценку продолжительной экспрессии и безопасность мутантных ChR2 по изобретению в нейронах сетчатки.
Кроме того, было обнаружено, что экспрессия мутантых белков Chop2 и полученных в результате белков ChR2 по настоящему изобретению не вызывает нейротоксичности до двух месяцев после вирусной инфекции мышей, демонстрируя безопасность настоящего изобретения для терапевтического применения.
Векторы для применения в настоящем изобретении, могут
включать различные вирусные векторы, такие как плазмиды и
рекомбинантные вирусы, т.е., рекомбинантный адено-
ассоциированный вирус (rAAV), рекомбинантные аденовирусы, рекомбинантные ретровирусы, рекомбинантные лентивирусы и другие вирусы, известные в данной области.
В некоторых воплощениях, экспрессия белков Chop2 по
настоящему изобретению управляется конститутивным промотором,
т.е., CAG-промотором, CMV-промотором, LTR. В других
воплощениях, промотор является индуцируемым или
клеточноспецифичным. Клеточноспецифичные промоторы, которые дают возможность экспрессии белка Chop2 в специфических субпопуляциях клеток, т.е. в нейронных клетках сетчатки или в деградирующих клетках может быть предпочтительным. Эти клетки могут включать, в частности ганглиозные клетки сетчатки, фоторецепторные клетки, биполярные клетки, палочковидные биполярные клетки, конические биполярные клетки ON-типа, фоточувствительные ганглиозные клетки сетчатки, горизонтальные клетки, амакриновые клетки или АН-амакриновые клетки. Клеточноспецифичные промоторы известны в данной области. Особенно предпочтительные клеточноспецифичные промоторы включают в частности mGluR6, NK-3, и Pcp2(L7).
В некоторых воплощениях использование различных генов опсина дополнительно к мутантным белкам Chop2 по настоящему изобретению и направленная генная экспрессия могут дополнительно повышать светочувствительность или улучшать зрение. Зрительная информация обрабатывается посредством
сетчатки двумя путями: ON-путь, который передает сигнал включения света ON, и OFF-путь, который передает сигнал выключения света OFF. Существование ON- и OFF-пути важно для усиления контрастной чувствительности. Зрительный сигнал в 0N-пути является переключателем из ON-конусных биполярных клеток на ON-ганглиозные клетки. И ON-конусные биполярные клетки, и ON-ганглиозные клетки деполяризуются в ответ на свет. С другой стороны, зрительный сигнал в OFF-пути переносится от OFF-конусных биполярных клеток к OFF-ганглиозным клеткам. И OFF-конусные биполярные клетки, и OFF-ганглиозные клетки гиперполяризуются в ответ на свет. Палочковидные биполярные клетки, которые отвечают за способность видеть при слабом свете (скотопическое зрение), представляют собой ON биполярные клетки (деполяризованные в ответ на свет). Палочковидные биполярные клетки передают зрительный сигнал через AII-амаркриновые клетки (клетки сетчатки ON-типа) к ON- и OFF-конусным биполярны клеткам.
Соответственно, дуалистическая родопсиновая система может использоваться для суммирования ON- и OFF-путей в целом с зрительной обработкой и остротой зрения. Вкратце, белок Chop2 по настоящему изобретению может специфично направляться к нейронам сетчатки ON-типа (т.е., ганглиозные клетки ON-типа и/или биполярные клетки ON-типа), в то время как сенсор гипополяризации света (т.е. галогенродопсин или другой хлоридный насос, известный в данной области) может направляться к нейронам сетчатки OFF-типа (т.е. ганглиозные клетки OFF-типа и/или биполярные клетки OFF-типа) для создания ON- и OFF-пути. Специфическая направленность к предпочтительным субпопуляциям может достигаться посредством использования различных клеточноспецифичных промоторов. Например, экспрессия Chop2 может управляться mGluR6-npoMOTopoM для направленной экспрессии в нейронах сетчатки ON-типа (т.е., ганглиозные клетки ON-типа и/или биполярные клетки ON-типа), в то время как экспрессия канала гиперполяризации, такого как галогенродопсин, управляется NK-3-промотором для направленной экспрессии в нейронах сетчатки OFF-типа (т.е. ганглиозные клетки OFF-типа
и/или биполярные клетки OFF-типа).
Альтернативный способ для восстановления ON- и OFF-путей в сетчатке достигается с помощью экспрессии сенсора деполяризации света, такого как ChR2, в палочковидных биполярных клетках или в AI I-амакриновых клетках. В данном способе деполяризация палочковидных биполярных клеток или AII-амакриновых клеток может приводить к ON- и OFF-ответу на уровень конусных биполярных клеток и ниже по сигнальным путям ганглиозных клеток сетчатки. Таким образом, поддерживаются ON- и OFF-пути, которые свойственны сетчатке.
Настоящее изобретение может относиться к фармацевтической композиции или к лекарственному средству, подходящему для введения объекту или пациенту. Подходящие пути введения включают, например, интравитреальную, внутриглазную или субретинальную инъекцию.
Такие составы включают фармацевтически и/или
физиологически приемлемый переносчик, разбавитель, носитель или эксципиент, такой как буферная соль или другие буферы, например, HEPES, для поддержания физиологического рН. Для обсуждения таких компонентов и их состава, см., в основном, Gennaro, АЕ., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins Publishers; 2003 или последнее издание). См., также WO00/15822. Если препарат должен храниться в течение продолжительного времени, то он может быть заморожен, например, в присутствии глицерина.
Фармацевтическая композиция, описанная выше, вводится объекту, имеющему зрительное заболевание или слепоту, с помощью подходящего пути, предпочтительно, интравитреальной или субретинальной инъекцией в зависимости от слоя сетчатки, который является мишенью.
Описание Bennett и сотрудников (процитировано в данном документе) касается направленного воздействия на пигментный эпителий сетчатки - наиболее дистальный слой от витреального пространства. Согласно настоящему изобретению, конструкт Chop2 или полипептид направленно воздействует на клетки сетчатки, т.е. ганлиозные клетки сетчатки или биполярные клетки. Такие
клетки, как известно, в достаточной степени хорошо доступны для интравитреальной инъекции, как раскрыто в данном документе. Интравитреальная и/или субретинальная инъекция может обеспечивать необходимый доступ к биполярным клеткам, особенно в обстоятельствах, в которых слой фоторецепторных клеток отсутствует, благодаря дегенерации, что происходит в некоторых формах дегенерации, которые предназначено преодолеть с помощью настоящего изобретения.
Для тестирования способности вектора экспрессировать
Спор2-мутанты по настоящему изобретению, специфически в
нейронах сетчатки млекопитающего, с помощью AAV-опосредованной
доставки, комбинация предпочтительной промоторной
последовательности, связанной с репортерным геном, таким как LacZ или GFP, связанным с SV4 0 поли А-последовательностью, может быть вставлена в плазмиду и упакована в rAAV вирусные частицы, сконцентрирована, тестирована на аденовирусную контаминацию и определен титр rAAV с использованием анализа инфекции. В правые глаза ряда тестированных объектов, предпочтительно, инбредных мышей может инъецироваться субретинально примерно 1 мкл препарата rAAV (например, выше, чем примерно 1010 инфекционных единиц на 1 мл) . Две недели спустя правые (тестируемые) и левые (контроли) глаза половины животных можно удалить, фиксировать и окрасить с помощью подходящего субстрата или антитела или другого вещества для обнаружения присутствия репортерного гена. Большинство тестируемых сетчаток в инъецированных глазах демонстрируют фокально окрашенный участок, например, синий для LacZ/Xgal, или зеленый для GFP согласно субретинальной полости инъецированного вируса, создавая локализованное отслоение сетчатки. Все контрольные глаза могут быть негативными по отношению к продукту репортерного гена. Экспрессию репортерного гена, исследованную на мышах, умерщвленных в латеральные периоды, детектировали в течение, по меньшей мере, 10 недель после инъекции, что предполагает стабильную экспрессию репортерного трансгена.
В одном воплощении конструкты Chop2 упаковываются в
аденовирусные векторы для трансгенной доставки. Эффективное
количество rAAV-вирионов, несущих последовательность,
кодирующую Спор2-ДНК под контролем выбранного промотора,
предпочтительно, конститутивного CMV-промотора или
клеточноспецифичного промотора, такого как mGluR6,
предпочтительно находится в интервале примерно от 1010 примерно до 1013 rAAV-инфекционных единиц в объеме примерно от 150 примерно до 8 00 мкл на инъекцию. rAAV-инфекционные единицы могут измеряться согласно McLaughlin, SK et al., 1988, J Virol 62:1963. Более предпочтительно, эффективное количество составляет примерно от 1010 примерно до 1012 rAAV-инфекционных единиц, и объем инъекции предпочтительно составляет примерно от 2 50 примерно до 50 0 мкл. Другие дозировки и объемы, предпочтительно внутри этих интервалов, но возможно и вне их, могут быть выбраны врачом-практиком, принимая во внимание физическое состояние объекта (предпочтительно, человека), который повергается лечению, включая возраст, вес, состояние здоровья и характер и тяжесть конкретного зрительного расстройства.
Также может быть целесообразно введение дополнительных доз ("бустеров") нуклеиновой кислоты или rAAV-композиций. Например, в зависимости от продолжительности трансгенной экспрессии в глазной клетке-мишени может вводиться второй курс лечения через б месяцев или ежегодно, и может повторяться аналогичным образом. Нейтрализующие антитела к AAV, как ожидается, не будут генерироваться благодаря используемым дозам и путям введения, позволяя таким образом повторные раунды лечения.
Необходимость таких дополнительных доз моет отслеживаться врачами-практиками с использованием, например, хорошо известных электрофизиологических и других тестов функции сетчатки и зрения и тестов зрительного поведения. Профессиональный врач будет способен выбрать подходящие тесты, применяя стандартные навыки, известные в данной области. Может быть целесообразным инъецировать больший объем композиции или в однократной дозе или в многократных дозах для дальнейшего улучшения соответствующих конечных параметров.
Глазные заболевания
Глазные расстройства, для которых предназначены настоящие белки Chop2 , и полученные в результате белки ChR2, которые могут использоваться для улучшения одного или нескольких параметров зрения, включают в частности аномалии развития, которые влияют как на ранние, так и на поздние сегменты глаза. Расстройства передних сегментов включает глаукому, катаракту, дистрофию роговицы кератоконус. Расстройства задних сегментов включают расстройства со слепотой, вызванные некорректным функционированием и/или гибелью фоторецепторов, что вызвано дистрофией и деградацией сетчатки. Расстройства сетчатки включают врожденную постоянную ночную слепоту, возрастную макулярную дегенерацию, врожденные конические дистрофии и большую группу расстройств, связанных с пигментным ретинитом
(RP). Эти расстройства включают генетически предрасположенную гибель фоторецепторных клеток, палочек и конусов в сетчатке, наблюдаемую в разном возрасте. Среди них встречаются тяжелые ретинопатии, такие как подтипы RP, которые прогрессируют с возрастом и вызывают слепоту в детстве и в ранней молодости, и RP-ассоциированные заболевания, такие как генетические подтипы LCA, которые часто приводят в результате к потере зрения в детстве уже на первом году жизни. Более поздние расстройства, как правило, характеризуются существенным уменьшением и часто полной потерей фоторецепторных клеток, палочек и конусов.
(Trabulsi, EI, ed., Genetic Diseases of the Eye, Oxford University Press, NY, 1998).
Конкретно, белки Chop2 и ChR2 по настоящему изобретению,
применяемые для лечения и/или восстановления, по меньшей мере,
частичного зрения у объектов, которые потеряли зрение благодаря
глазным расстройствам, таким как RPE-ассоциированные
ретинопатии, которые характеризуются продолжительным
сохранением структуры глазной ткани, несмотря на потерю функции, и ассоциацией между функциональной потерей и дефектом или отсутствием нормального гена в глазных клетках объекта. Известно множество таких глазных расстройств, таких как детский приступ онхоцеркоза, пигментный ретинит, макулярная дегенерация
и диабетическая ретинопатия, а также глазные заболевания со слепотой, известные в данной области. Понятно, что эти и другие расстройства, а также расстройства со слепотой по неизвестной в настоящее время причине, которые позже характеризуются с помощью такого же описания, как приведено выше, также могут подвергаться успешному лечению с помощью белков Chop2 и ChR2 по настоящему изобретению. Таким образом, конкретное глазное расстройство, подвергаемое лечению с помощью настоящего изобретения, может включать вышеупомянутые расстройства и ряд заболеваний, которые еще не охарактеризованы должным образом. Оптогенетика
Перспективная область оптогенетики включает комбинацию генетических и оптических методов для контроля специфических событий в клетках-мишенях живой ткани. Оптогенетика может использоваться для диких млекопитающих и других животных. Кроме того, временная точность (временная шкала - милисекунды) оптогенетических методов достаточна для функционирования в интактных биологических системах.
В настоящем изобретении предлагается Спор2-генная терапия для сохранения тканей сетчатки глаза путем введения в клетки сетчатки нуклеиновой кислоты или полипептида, кодирующего, по меньшей мере, одну мутантную форму Chop2. Мутантные белки Chop2/ChR2 по изобретению конкретно адаптированы для активации светом при более низкой интенсивности света, чем соответствующие белки дикого типа. Соответственно, мутантные белки Chop2/ChR2 по изобретению могут использоваться для активации клеток сетчатки и зрительной системы с использованием менее разрушительных источников освещения. Мутантные белки Chop2/ChR2 также проводят больше фототока при активации, приводя в результате к более стойкому или эффективному ответу клеток, экспрессирующих мутантные Chop2/ChR2.
Например, мутантные белки Chop2 по изобретению вводят
объекту посредством местной интравитреальной или
субретинальной, инъекции молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептидную молекулу мутантного Chop2, мутантного Chop2, или клетки, экспрессирующей Chop2/ChR2. Клетки сетчатки
объекта экспрессируют мутантные белки Chop2 в плазматической мембране. Когда трансфицированные или трансформированные клетки сетчатки встречаются со световым излучением, то трансфицированные или трансформированные клетки сетчатки передают улучшенный или восстановленный сигнал.
Эти способы могут использоваться у объектов с нормальным и/или нарушенным зрением. Мутанты Chop2/ChR2 по изобретению могут сохранять, улучшать или восстанавливать зрение. Кроме того, мутанты Chop2/ChR2 по изобретению используются для сохранения, улучшения или восстановления передачи не зрительной информации от фоточувствительных ганглиозных клеток сетчатки в мозг.
Термин "зрение", при использовании в данном документе, определяется как способность организма эффективно детектировать свет в виде стимула для дифференцировки или функционирования. Подразумевается, что зрение охватывает следующее:
1. Детектирование или восприятие света - способность заметить присутствие или отсутствие света;
2. Светопроекция - способность заметить направление, от которого исходит световой стимул;
3. Разрешение - способность детектировать различные уровни яркости (т.е., контраст) на дифракционной или буквенной мишени; и
4. Распознавание - способность распознать форму зрительной мишени путем отнесения к различным уровням контраста на мишени.
Таким образом, "зрение" включает способность облегчать детектирование присутствия или отсутствия света. Полипептиды и полинуклеотиды, кодирующие мутантный Chop2 по настоящему изобретению, могут использоваться для улучшения или восстановления зрения, где улучшение или восстановление зрения включает, например, повышение детектирования и восприятия света, повышение светочувствительности или фоточувствительности в ответ на световой стимул, повышение способности замечать направление, от которого исходит источник света, повышение способности детектирования различных уровней яркости, повышение способности распознавать форму зрительной мишени, и повышение
индуцированного зрительного потенциала или передачи от сетчатки
в кору головного мозга. Как таковое, улучшение или
восстановление зрения может или не может включать полное
восстановление зрения, т.е. где зрение пациента, подвергнутого
лечению с помощью настоящего изобретения, восстанавливается до
степени зрения здорового индивидуума. Зрительное
восстановление, описанное в исследованиях на животных ниже, может по отношению к людям помещать индивидуума на нижний предел зрительной функции путем повышения одного аспекта зрения (т.е. светочувствительности или индуцированного зрительного потенциала) без восстановления полноты зрения. Тем не менее, помещение на такой уровень имело бы существенную пользу, так как данные индивидуумы могли бы тренироваться двигаться и потенциально могли бы решать задачи низкого порядка, которые обеспечили бы им гораздо более высокий уровень зрительной независимости по сравнению с полной слепотой. Даже общее распознавание света может использоваться индивидуумами с нарушением зрения, которое улучшается с использованием композиций и способов по настоящему изобретению, для выполнения конкретных ежедневных задач и улучшает общую мобильность, возможности и качество жизни.
Степень восстановления зрения может определяться посредством измерения зрения перед и предпочтительно после введения вектора, включающего, например, ДНК, кодирующую Chop2. Зрение может измеряться с использованием любого из ряда методов, хорошо известных в данной области, и способов, которые еще не разработаны. Зрение, улучшенное или восстановленное с помощью настоящего изобретения, может измеряться с помощью любого из следующих зрительных ответов:
1. ответ в виде детектирования света объектом после экспонирования со световым стимулом - в котором искомые данные надежного ответа представляют собой проявления или движения в общем направлении света объектом при включении света;
2. ответ в виде проецирования света объектом после экспонирования со световым стимулом, где искомые данные представляют собой надежный ответ проявления или движения
1.
индивидуума в конкретном направлении света при включении света;
3. разрешение объектом светового по сравнению с темным зрительным стимулом, что измеряют по способности объекта разрешать световой по сравнению с темным зрительным стимулом, которую выявляют с помощью:
a. присутствия демонстрируемого надежного оптокинетически полученного нистагмоидного движения взгляда и/или связанных с этим движений головы или тела, что демонстрирует слежение за целью (см. выше) и/или
b. присутствия надежной способности различать зрительный стимул и проявлять такое различие вербальными или не вербальными способами, включающими, например, указание или нажатие на ручку или кнопку; или
4. электрической регистрации ответа зрительной коры головного мозга на стимул в виде вспышки света или на эталонный зрительный стимул, этот ответ представляет собой конечную точку электрической передачи от восстановленной сетчатки к зрительной коре, также обозначается как индуцированный зрительный потенциал (VEP). Измерение может быть представлено с помощью электрической регистрации на поверхности кожи головы в участке зрительной коры головного мозга, на кортикальной поверхности и/или регистрации внутри клеток зрительной коры головного мозга.
Таким образом, улучшение или восстановление зрения согласно настоящему изобретению может включать в частности: повышение амплитуды или кинетики фототоков или электрического ответа на световые стимулы в клетках сетчатки, повышение светочувствительности (т.е., снижение порога интенсивности света, требуемого для инициации фототока или электрического ответа на световой стимул, требуя таким образом, свет меньше или слабее, чтобы вызвать фототок) клеток сетчатки, повышение количества или амплитуды вызванного светом спайка или возбуждений спайка, повышение ответа на свет зрительной коры головного мозга, который включает повышение индуцированного зрительного потенциала, передаваемого из сетчатки или клеток сетчатки в зрительную кору головного мозга или в мозг.
Могут использоваться как in vitro, так и in vivo исследования для оценки различных параметров настоящего изобретения, включая известные животные модели человеческих глазных расстройств со слепотой. Используются многочисленные животные модели человеческой ретинопатии, например, детской слепоты. Примеры, предлагаемые в данном документе, позволяют специалисту в данной области легко определить, что данный метод может аналогично использоваться при лечении ряда расстройств сетчатки.
В то время как более ранние чужие исследования демонстрировали, что дегенерация сетчатки может быть замедлена с помощью методов генной терапии, настоящее изобретение демонстрирует определенное физиологическое восстановление функции, которое, как ожидается, генерирует или улучшает различные параметры зрения, включая поведенческие параметры.
Измерение поведения может быть получено с использованием известных животных моделей и тестов, например, действия в водном лабиринте, где объект, которому проводят сохранение или восстановление зрения до различной степени, плывет на свет (Hayes, JM et al., 1993, Behav Genet 23:395-403).
В моделях, в которых слепота индуцируется во взрослом возрасте, или наследственная слепота развивается достаточно медленно, так что индивидуум видел до потери зрения, может проводиться тренировка объекта на различных тестах. В этом случае, когда эти тесты вводят повторно после потери зрения для тестирования эффективности настоящих композиций и способов на предмет их восстанавливающих зрение эффектов, животным не нужно разучивать задачи de novo, как в слепом состоянии. Другие поведенческие тесты не требуют обучения и основаны на инстинктивности некоторых поведенческих черт. Примером является тест оптокинетический нистагм (Balkema GW et al. , 1984, Invest Ophthalmol Vis Sci. 25:795-800; Mitchiner JC et al. , 1976, Vision Res. 16:1169-71).
Настоящее изобретение также может использоваться в комбинации с другими формами терапии зрения, известными в данной области, для улучшения или восстановления зрения.
Например, использование зрительных протезов, которые включают имплантаты сетчатки, кортикальные имплантаты, имплантаты бокового коленчатого ядра или имплантаты зрительного нерва. Таким образом, дополнительно к генетической модификации живых нейронов сетчатки с использованием настоящих способов, объект, который подвергается лечению, может обеспечиваться зрительным протезом до, во время или после применения молекулярного метода. Эффективность зрительного протезирования может быть улучшена путем тренировки индивидуума, усиливая таким образом потенциальный вклад трансформации Chop2 клеток пациента, как предполагается в данном документе. Методы тренировки, такие как обучающая тренировка, характеризующаяся тренировкой объекта для распознавания (i) различных уровней светового и/или эталонного стимулирования, и/или (ii) стимулы окружающей среды от обычного источника света или объекта, как понятно специалисту в данной области; и тренировки ориентации и мобильности, характеризующиеся тренировкой объекта для зрительного детектирования локальных субъектов и более эффективного движения среди указанных субъектов, чем без тренировки. Фактически, здесь применимы любые методы зрительного стимулирования, которые обычно используются в области реабилитации слабого зрения. ПРИМЕРЫ
Пример 1: Генерирование конструктов меченного мутантного
Chop2
Мутации осуществляли на кодон-оптимизированном сшитом белке Chop2-GFP для создания одиночных и двойных мутаций в сайтах L132 (Лейцин 132) и Т159 (треонин 159). Несколько мутантов генерировали, например, одиночные мутанты, такие как L132A, L132C, Т159А, Т159С, и Т 159S, и двойные мутанты, такие как L132C/T159C, L132C/T159S, L132A/T159C, и L132C/T159A. Трансгены Chop2-GFP клонировали в вектор rAAV под контролем промотора CAG с использованием методов, известных в данной области.
Пример 2: In vitro анализ конструктов мутантных Chop2 Функциональные свойства каждого мутанта Chop2, или их
комбинации сначала исследовали в клетках НЕК. Конструкты Chop2
доставляли к клеткам НЕК с помощью, например, аденовирусной
инфекции. При экспрессии WT или мутантного Chop2, образуются
функциональные каналы WT и мутантный ChR2. Измерения
светочувствительности и другие свойства каналов ChR2 оценивали,
как описано в данном документе. Световые стимулы (фотоны/см2/с
при 4 60 нм) генерировали с помощью ксеноновой дуговой лампы и
ослабляли с помощью нейтрально-серого светофильтра: ND4.0
(2,8хЮ14), ND3.0 (1,4хЮ15), ND2 .5 (4,8хЮ15); ND2 . 0 (1,6хЮ16),
ND1.0 (1,ЗхЮ17), ND0 (1,2хЮ18). Ток, вызванный светом,
измеряли из ChR2 дикого типа, Т159С, L132C, L132C/T159C, и
L132C/T159S. Пэтч-клемп регистрацию осуществляли с
использованием методов, известных в данной области.
Репрезентативные регистрации из этого эксперимента, сравнивающего светочувствительность между конструктами Chop2, показывали, что мутации только в L132 или в комбинации с мутацией в Т159 демонстрируют повышенный фототок по сравнению с WT (Фиг. 1А и 1В) . На Фиг. 1В представлены одинаковые следы тока в различном масштабе для более ясной иллюстрации различия в амплитуде фототока между WT ChR2 и мутантными ChR2. Фиг. 1В специфично сравнивает следы тока, полученные в результате светостимулирования с использованием нейтрально-серого светофильтра (ND 2.5), что эквивалентно 4,8хЮ15 фотонов/см2/с; следы обозначали стрелками. Амплитуда фототока мутанта L132C выше, чем WT; амплитуда фототока двойного мутанта L132C/T159C выше, чем L132C; и амплитуда фототока мутанта L132C/T159S выше, чем L132/T159C. Следы тока мутантов ChR2, особенно двойных мутантов L132C/T159C и L132C/T159S, также демонстрируют более медленную дезактивацию по сравнению с WT и L132C.
На Фиг. 2 представлены репрезентативные регистрации вызванных светом токов из WT ChR2, L132C, L132C/T159C, и L132C/T159S после стимулирования с помощью 10 мс светового импульса (1,2хЮ18 фотонов/см2/с при длине волны 4 60 нм) для сравнения временной зависимости дезактивации после выключения света. Мутант ChR2 демонстрирует динамику дезактивации, причем двойной мутант L132C/T159S имеет самую продолжительную
дезактивацию. Более высокая светочувствительность, как продемонстрировано с помощью L132C/T159C и L132C/T159S, может коррелировать с каналом с более медленной кинетикой.
Пример 3: In vivo глазное введение и анализ конструктов мутантных Chop2
Получали AAV2-вирусные векторы, несущие конструкты мутантного Chop2-GFP, управляемые CAG-промотором, и инъецировали интравитреально в глаза взрослой мыши C57BL/6J. Взрослую мышь анестезировали с помощью IP-инъекции кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) . Под препаровальной лупой делали разрез с помощью ножниц через веко для экспонирования склеры. Делали небольшое отверстие в участке склеры позади зрачка с помощью иглы и инъецировали суспензию вирусного вектора 0,8-1,5 мкл в концентрации приблизительно 1011 геномных частиц/мл в интравитреальное пространство через отверстие с использованием шприца Hamilton с тупоконечной иглой калибра 32-gauge. Для каждого животного обычно инъецировали только в один глаз с использованием вирусного вектора, несущего конструкт Chop2, а в другой глаз не инъецировали или инъецировали с использованием контрольных вирусных векторов, несущих только GFP. При экспрессии WT или мутантного Chop2 по настоящему изобретению образуются функциональные WT или мутантные ChR2 каналы, применяющие эндогенный ретиналь, и свойства этих белков ChR2 оценивали, как описано в данном документе.
ChR2-onocpeflOBaHHbie ответы на свет исследовали с помощью регистраций мультиэлектродного чипа из цельных препаратов сетчатки. Световые стимулы (фотоны/см2/с) генерировали с помощью лазера голубой области света 473 нм и ослабляли с помощью нейтрально-серых светофильтров: ND0 (б,3> <1016), ND1.0 (7,4хЮ15), ND1.5 (2,7хЮ15), ND2 .0 (7,ЗхЮ14), ND2 .5 (3,2хЮ14), ND3.0 (8,5хЮ13), ND3.5 (3,8хЮ13) и ND4 . 0 (9,5хЮ12).
Регистрации мультиэлектродного чипа основаны на процедурах, опубликованных Tian and Copenhagen (2003) . Вкратце, сетчатку иссекали и помещали фоторецепторами вниз на нитроцеллюлозную фильтровальную бумагу (Millipore Corp., Bedford, MA) . Закрепленную сетчатку помещали в регистрирующую
камеру МЕА-60 мультиэлектродного чипа с диаметром камеры 30 мкм, с электродами, разделенными на 2 00 мкм (Multi Channel System MCS GmbH, Reutlingen, Germany), вместе со слоем ганглиозных клеток, обращенным к регистрирующим электродам. Сетчатку продолжительно перфузировали в кислородосодержащем внеклеточном растворе при 34°С во время всех экспериментов. Внеклеточный раствор содержал (в мМ) : NaCl, 124; КС1, 2,5; СаС12, 2; МдС12, 2; NaH2P04, 1, 25; NaHC03, 26; и глюкозу, 22 (рН 7,35 с 95% 02 и 5% С02). Регистрации обычно начинали через 60 мин после помещения сетчатки в регистрационную камеру. Интервал между началом каждого светового стимула составлял 10-15 с. Сигналы фильтровали в интервале 200 Гц (низкий порог) и 20 кГц
(высокий порог). Ответы от индивидуальных нейронов анализировали с использованием пакета программ Offline Sorter
(Plexon, Inc., Dallas, TX).
Одиночные мутанты Chop2/ChR2, т.е. L132 и T159C, значительно снижали пороговую интенсивность света, чем требовалось для того, чтобы вызвать СпК2-опосредованный фототок. Кроме того, несколько двойных мутантов, включающих L132C/T159C, L132A/T159C и L132C/T159S, как было обнаружено, дополнительно повышают фототок при низких интенсивностях света. Различные нейтрально-серые светофильтры использовали для ослабления световых стимулов для дифференцировки вызванных светом ответов конструктов Chop2 при слабом свете. Спайковую активность ганглиозных клеток сетчатки, опосредованную мутантами по настоящему изобретению, наблюдали при интенсивностях света примерно на 1,5-2 log единицы ниже, чем уровень света, который требуется для того, чтобы вызывать спайковую активность с помощью ChR2 дикого типа (Фиг. 3). Конкретно, WT ChR2 не демонстрировал никакой спайковой активности в ответ на световые стимулы с нейтрально-серыми светофильтром 2,5 (3,2> <1014 фотонов/см2/с) , в то время как мутанты ChR2 (L132C, L132C/T159C, и L132C/T159S) демонстрируют спайковую активность. Фактически, мутанты ChR2 еще демонстрировали спайковую активность в ответ на свет с нейтрально-серым светофильтрами 3,0 и 3,5. Таким образом,
мутанты ChR2 по настоящему изобретению обладают более высокой светочувствительностью и, таким образом, требуется значительно более низкая интенсивность света, чтобы вызывать ChR2-опосредованный фототок. Кроме того, двойные мутанты ChR2 обладают более высокой светочувствительностью, чем одиночные мутанты, т.е. L132C. Кроме того, возбуждение спайка ганглиозных клеток сетчатки, экспрессирующих L132C/T159C и L132/T159S, может следовать за частотой мерцания света до 15 Гц и 5 Гц, соответственно (Фиг. 4).
Мутант L132C/T159A демонстрирует высокую
светочувствительность, вероятно, он наиболее
светочувствительный среди этих мутантов, но он также демонстрирует исключительно медленное выключение (канал продолжает быть открытым в течение многих секунд после выключения света). Интересно, что он может быть выключен быстрее с использованием света длинной длины волны, такого как свет желтой области спектра. Мутант L132C/T159A (кодируемый SEQ ID N0: 2 4 и 25) демонстрирует значительный потенциал.
С учетом соотношения между светочувствительностью и кинетикой канала мутанты Chop2/ChR2, которые демонстрируют баланс между светочувствительностью и кинетикой канала, такие как L132C/T159C или L132C/T159S, могут подходить для применения в восстановлении зрения.
Пример 4: Анализ конструктов мутантов Chop2 в мышиных моделях заболевания
Мышиные модели дегенеративных глазных заболеваний известны в данной области. Например, гомозиготные rdl (rdl/rdl) мыши широко применяются для модели фоторецепторной дегенерации. Мыши Rdl несут нуль-мутацию в фосфодиэстеразе циклического GMP, PDE6, аналогично некоторым формам пигментного ретинита у людей. Другие хорошо изученные мышиные модели глазного заболевания, которые могут представлять конкретный интерес для демонстрации безопасности и эффективности мутанта ChR2, включают rds (также известные KaKPrphRd2) , ro!3 r ro!4 r ro!5 r rd6r rollr ro!8, ro!9 г Pde6brdl° или cpfll.
Конструкты Chop2-GFP по настоящему изобретению могут быть
инъецированы интравитреально в глаза новорожденных (Р1) или взрослых мышей в возрасте 2-12 месяцев. Сигнал GFP может наблюдаться в Спор2-СГР-инъецированной сетчатке для определения уровня экспрессии ChR2 или экспрессии в конкретной популяции клеток, таких как ганглиозные клетки сетчатки. Экспрессию мутантного Chop2-GFP можно отслеживать в течение определенного времени, т.е. 3-6 месяцев или 1 год после вирусной инфекции. Регистрации патч-клемп и мультиканального чипа можно осуществлять с использованием методов, известных в данной области и описанных в данном документе для измерения вызванных светом ответов мутантный Спор2-6ЕР-экспрессирующих клеток in vivo.
Дополнительные методы и тесты для тестирования восстановления светочувствительности зрения хорошо изучены в данной области. Индуцированные зрительные потенциалы от Chop2-GFP-экспрессирующих клеток или зрительной коры головного мозга можно исследовать, как описано в РСТ-публикации W0 2007/131180. Другие тесты включают поведенческую оценку остроты зрения у мышей, т.е., виртуальный оптомоторный тест и визуальный водный лабиринт.
Пример 5: Анализ продолжительной экспрессии и безопасности введения конструктов мутантных Chop2 в нейроны сетчатки
Нейротоксичность оценивали на C57BL/6J взрослых мышах, инъецированных конструктами Chop2 по настоящему изобретению. Безопасность экспрессии мутантов Chop2 в сетчатке оценивали с помощью иммуноокрашивания и подсчета клеток после экспонирования с жестким ультрафиолетом в течение двух недель. Было обнаружено, что ни одна из мышей не проявила симптомов нейротоксичности в течение периода до двух месяцев после инъекции.
Дополнительные продолжающиеся исследования представляют собой оценку продолжительной экспрессии и безопасности мутантов Chop2/ChR2no изобретению в нейронах сетчатки.
ДРУГИЕ ВОПЛОЩЕНИЯ
Хотя изобретение дано вместе с подробным описанием, представленное выше описание предназначено для иллюстрации и не
ограничивает объем притязаний изобретения, который определен объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации находятся в пределах представленной ниже формулы изобретения.
Патентная и научная литература, на которую делались ссылки в данном документе, представляет собой знания, доступные специалистам в данной области. Все патенты США и опубликованные и не опубликованные патентные заявки США, процитированные в данном документе, включены ссылкой. Все опубликованные иностранные патенты и патентные заявки, процитированные в данном документе, включены ссылкой. Все опубликованные ссылки, документы, рукописи и научная литература, процитированная в данном документе, включены в данный документ ссылкой.
Хотя настоящее изобретение было конкретно показано и описано со ссылкой на его предпочтительные воплощения, специалистам в данной области будет понятно, что различные изменения в форме и деталях могут быть внесены без отхода от объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенная полипептидная молекула, включающая SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L).
2. Полипептидная молекула по п. 1, где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) или аланин (А).
3. Полипептидная молекула по п. 2, где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) , и где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 13.
4. Полипептидная молекула по п. 2, где аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А), и где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 20.
5. Выделенная полипептидная молекула, включающая SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 159 SEQ ID N0: 2 6 не является треонином (Т).
6. Полипептидная молекула по п. 5, где аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С) , серии (S) , или аланин (А).
7. Полипептидная молекула по п. 6, где аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С) , и где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 14.
8. Полипептидная молекула по п. 6, где аминокислота в положении 159 представляет собой серии (S), и где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 17.
9. Полипептидная молекула по п. 6, где аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А), и где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 23.
10. Выделенная полипептидная молекула, включающая SEQ ID N0: 2 6, в которой аминокислота в положении 132 SEQ ID N0: 2 6 не является лейцином (L) , и аминокислота в положении 159 не является треонином (Т).
11. Полипептидная молекула по п. 10, где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) , где аминокислота в положении 159 представляет собой (С).
12. Полипептидная молекула по п. 10 или 11, где
полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 16.
13. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид по п. 12.
14. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 13, где молекула нуклеиновой кислоты включает SEQ ID N0: 15.
15. Полипептидная молекула по п. 10, где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) , где аминокислота в положении 159 представляет собой серии (S).
16. Полипептидная молекула по п. 10 или 15, где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 19.
17. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид по п. 16.
18. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 17, где молекула нуклеиновой кислоты включает SEQ ID N0: 18.
19. Полипептидная молекула по п. 10, где аминокислота в положении 132 представляет собой аланин (А), где аминокислота в положении 159 представляет собой цистеин (С).
20. Полипептидная молекула по п. 10 или 19, где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 22.
21. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид по п. 22.
22. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 21, где молекула нуклеиновой кислоты включает SEQ ID N0: 21.
23. Полипептидная молекула по п. 10, где аминокислота в положении 132 представляет собой цистеин (С) , где аминокислота в положении 159 представляет собой аланин (А).
24. Полипептидная молекула по п. 10 или 23, где полипептидная молекула включает SEQ ID N0: 25.
25. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид по п. 24.
26. Молекула нуклеиновой кислоты по п. 25, где молекула нуклеиновой кислоты включает SEQ ID N0: 24.
27. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенный полипептид по любому из пп. 1, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 16, 19, 20, 23 и 24.
28. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 27, где
выделенный полипептид имеет длину примерно 315, 310, 300, 275,
250, 225, 200, 175 или 160 аминокислот.
29. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты по п. 2 7 или 28, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.
30. Выделенная полипептидная молекула по любому из пп. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 23 и 24, где полипептидная молекула кодирует мутантный белок ChR2, который вызывает ток в ответ на пороговую интенсивность света, которая ниже, чем порог белка ChR2 дикого типа.
31. Выделенная полипептидная молекула по п. 30, где длина полипептидной молекулы составляет примерно 315, 310, 300, 275, 250, 225, 200, 175 или 160 аминокислот.
32. Выделенная полипептидная молекула по п. 30 или 31, дополнительно включающая фармацевтически приемлемый носитель.
33. Композиция, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 27, 2 8 и 29.
34. Композиция, включающая выделенную полипептидную
молекулу по любому из пп. 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11,
12, 13, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 29, 30 и 31.
35. Клетка, включающая выделенную полипептидную молекулу по любому из пп. 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 29, 30 и 31.
36. Клетка, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует выделенную полипептидную молекулу по любому изпп. 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 15, 16, 19, 20, 23, 24, 29, 30 и 31.
37. Клетка, включающая выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 27 или 28.
38. Композиция, включающая клетку по любому из пп. 35, 36
и 37 .
39. Клетка по п. 35, 36 и 37, где клетка контактирует с выделенным полипептидом или с выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, in vitro, ex vivo, in vivo или in situ.
40. Клетка по n. 35, 36 и 37, где клетка представляет собой фоторецептор, биполярную клетку, палочковидную биполярную клетку, коническую биполяную клетку ON-типа, ганглиозную клетку
39.
сетчатки, фоточувствительную ганглиозную клетку сетчатки, горизонтальную клетку, амакриновую клетку, или AII-амакриновую клетку.
Клетка по п. 40, где клетка представляет собой
ганглио
зную клетку сетчатки или фоточувствительную ганглиозную
клетку
сетчатки.
Способ улучшения или восстановления зрения, включающий
введени
объекту композиции по п. 33.
Способ улучшения или восстановления зрения, включающий
введени
объекту композиции по п. 34.
Способ улучшения или сохранения зрения, включающий
введени
объекту композиции по п. 38.
Способ по п. 42, 43 и 44, где у объекта нормальное
зрение.
Способ по п. 42, 43 и 44, где объект имеет нарушенное
зрение.
Способ по п. 42, 43 и 44, где объект страдает глазным
заболев
анием.
Способ по п. 47, где глазное заболевание представляет
собой макулярную дегенерацию или пигментный ретинит.
49. Способ по п. 42, 43 и 44, где композицию вводят с помощью интравитреальной или субретинальной инъекции.
50. Способ по п. 42, 43 и 44, где указанное улучшение или восстановление зрения включает любое из следующего: повышение светочувствительности; снижение порога интенсивности света, требуемого для вызова фототока; и повышение индуцированного зрительного потенциала в зрительной коре головного мозга.
По доверенности
518734
* 5 J ii ' * * ' t
* * y. + ; . * * 4
* X * t. "/ > 4;
:" * ? t f v i *
5 * x * * > * *
?;:> ;*> ; + (.:*
¦> *¦*¦> x ¦ ft t* V
> { * Z t /. f X
:"jHf *!" ¦i * ft ? S: * * ?
л * -*
:> * й ¦:- i * г V A*ft***v* ********
* Л * + ? ^ * *
iHllll
"J CN:
i * f Z i.'i'i 't i i
tit i%'i> , i '. i 4 i "/. i i.'; * 5 > !
> jf " " } $ ?: * % i
H! tit it ft*'ii
tn*'ut*.n
4**"ШИМ|
zr l_
ill iHiii]
Ф ж
it*
zr l_
zr l_
. * > x < ; * ;
8 4 " *
1/5
1/5
3/5
4/5
4/5
4/5
4/5
4/5
4/5
5/5
5/5
5/5
5/5