[RU]

Уровни кислорода в биологической ткани или системах могут быть измерены способом гашения фосфоресценции порфирина, используя фосфоресцентные порфириновые зонды, также упоминаемые как дендритные кислородные зонды, с контролируемыми параметрами гашения и определенными биораспределениями. Указанные зонды являются кислородными датчиками "следующего поколения" с существенно улучшенной фосфоресцентной эмиссией, что улучшает возможность визуализации, они просты в использовании, повышается квантовая эффективность (интенсивность фосфоресценции) и расширяется их спектр применения, включая создание класса кислородных датчиков для проведения измерений в органической среде. Кроме того, предложены способы синтеза новых структур порфирина, в которых порфирин является менее гибким и более плоским, при этом уменьшается внутреннее гашение и за счет этого увеличивается фосфоресцентная эмиссия, используемая для измерения кислорода. Представлены дополнительные способы структурного модифицирования дендримера, используемого для инкапсуляции порфиринового фосфора, чтобы обеспечить внутреннее гашение молекул синглетного кислорода, образующегося при измерении кислорода.

(57) Реферат / Формула:

Уровни кислорода в биологической ткани или системах могут быть измерены способом гашения фосфоресценции порфирина, используя фосфоресцентные порфириновые зонды, также упоминаемые как дендритные кислородные зонды, с контролируемыми параметрами гашения и определенными биораспределениями. Указанные зонды являются кислородными датчиками "следующего поколения" с существенно улучшенной фосфоресцентной эмиссией, что улучшает возможность визуализации, они просты в использовании, повышается квантовая эффективность (интенсивность фосфоресценции) и расширяется их спектр применения, включая создание класса кислородных датчиков для проведения измерений в органической среде. Кроме того, предложены способы синтеза новых структур порфирина, в которых порфирин является менее гибким и более плоским, при этом уменьшается внутреннее гашение и за счет этого увеличивается фосфоресцентная эмиссия, используемая для измерения кислорода. Представлены дополнительные способы структурного модифицирования дендримера, используемого для инкапсуляции порфиринового фосфора, чтобы обеспечить внутреннее гашение молекул синглетного кислорода, образующегося при измерении кислорода.

---

К заявке № ЕА201491551
УЛУЧШЕННЫЕ ФОСФОРЕСЦЕНТНЫЕ МОЛЕКУЛЫ ДЛЯ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ КИСЛОРОДА И СПОСОБЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ
ПРАВИТЕЛЬСТВЕННЫЙ ИНТЕРЕС
5 Это изобретение было частично поддержано за счет средств Правительства
США (National Institutes of Health) грант № HL0812273, R01EB007279, и Правительство США, следовательно, может иметь определенные права на изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к высокоточному и универсальному 10 оптическому способу для измерения содержания кислорода, особенно полезному в применениях для живых тканей человека и животного, в частности, к новым фосфоресцентным молекулярным зондам, которые характеризуются более ярким сигналом, хорошо определенным химическим составом и могут быть потенциально использованы в клинической практике.
15 УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Надежное и точное измерение поступления кислорода в ткани млекопитающего важно для адекватного обеспечения поступления кислорода. Кровеносная система использует специализированные белковые молекулы, переносящие кислород в красных кровяных клетках, чтобы кислород из легких доставить по всему телу. После
20 диссоциации от гемоглобина кислород поступает в места своего потребления в клетках путем диффузии. Именно измерение этого растворенного несвязанного кислорода является наиболее важным для количественной оценки физиологического состояния тканей. Способ гашения фосфоресценции, лежащий в основе этой заявки на патент, является уникальным по своей способности выполнить такое измерение. Этот способ
25 основан на использовании специальных фосфоресцентных молекулярных зондов, которые сообщают о концентрации кислорода в окружающей их среде с высокой специфичностью и точностью.
Измерение кислорода с помощью гашения фосфоресценции, используя фосфоресцентные зонды, не только обеспечивает измерение потребления кислорода 30 тканью, но также позволяет провести оценку состояния пораженных тканей. Кислород является одним из ключевых метаболитов, и тканевая гипоксия является критическим параметром в отношении различных патологий тканей, таких как заболевание сетчатки (Berkowitz et al. Invest. Ophthalmol. Visual Sci. 40:2100-2105 (1999); Linsenmeier et al, Ophthalmol. Visual Sci. 39:1647-1657 (1998)), аномалии мозга (Vannucci et al. J. Exp. Biol.
207:3149-3154 (2004); Brunei et al, J. Neuroradiology 31:123-137 (2004); Johnston et al, Neuroscientist 8:212-220 (2002)) и рак (Evans et al, J. Appl. Physiol. 98:1503-1510 (2005)). Различие в уровнях кислорода в тканях могут свидетельствовать об аномалиях структуры ткани, дефектах, будь то внешних, или вызванных генетическими 5 проявлениями, в результате болезни.
Визуализация тканевого кислорода in vivo представляет сложную и важную задачу. Тем не менее, развивающиеся в настоящее время технологии визуализации для отображения оксигенации ткани (Rajendran et al, Radiol. Clin. North Am. 43:169-187 (2005)) (например, ЯМР/ЭПР (Subramanian et al. NMR Biomed. 17:263-294 (2004)), ПЭТ
10 (Piert et al, Nucl. Med. 46: 106-113 (2005); Apisarnthanarax et al., Rad. Res. 163:1-25 (2005)), томографические методы в ближней инфракрасной области (Fenton et al, Brit. J. Cancer 79:464-471 (1999); Liu et al, Appl. Opt. 39:5231-5243 (2000)) и т.д. (Ballinger, Sem. Nucl. Med. 31:321-329 (2001); Foo et al, Mol. Imag. Biol. 6:291-305 (2004)) страдают от многих недостатков, в том числе инвазивности, низкого пространственного и/или
15 временного разрешения, отсутствия абсолютной калибровки, плохой специфичности и т.д., и остаются еще недостаточно развитыми.
Способ гашения фосфоресценции (Vanderkooi et al, J. Biol. Chem. 262:5476-5483 (1987); Wilson & Vinogradov в Handbook of Biomedical Fluorescence. Mycek M-A, Pogue BW, eds. Marcel Dekker; New York: 2003. Ch. 17) превосходит по своей способности
20 непосредственно обнаруживать кислород в ткани. Подробный обзор дан в Vinogradov & Wilson (2012) "Porphyrin-dendrimers as biological oxygen sensors," в Designing Dendrimers (Capagna, Ceroni, Eds.), Wiley, New York), опубликованный после даты приоритета настоящего изобретения. Когда фосфоресцентный зонд растворяют в крови и возбуждают с помощью соответствующего освещения, то время жизни
25 фосфоресценции и ее интенсивность являются надежными индикаторами концентрации кислорода в окружающей среде. Гашение фосфоресценции исключительно чувствительно и селективно к кислороду, обладает превосходным временным разрешением и может быть реализовано для 2D визуализации гипоксии с высоким разрешением (Rumsey et al, Science. 241 : 1649-1652 (1988); Vinogradov et al,
30 Biophys. J. 70:1609-1617 (1996); Shonat et al, Annal. Biomed. Eng. 31:1084-1096 (2003)).
Попытки разработки 3D ближней инфракрасной томографической модальности описаны в Soloviev et al, Applied Optics 42: 113 (2003); Soloviev et al, Applied Optics 43:564 (2004); Apreleva et al, Optics Letters 31 : 1082 (2006); Apreleva et al, Applied Optics 45:8547 (2006); Apreleva et al, Optics Letters 33:782 (2008), а последние клинически 35 значимые разработки в радиационной фосфоресценции Черенкова описаны в (Zhang
et al, Biomedical Optics Express 3:2381 (2012), но очень точные и универсальные способы измерения кислорода нуждаются в дальнейшем развитии.
Чтобы фосфоресцирующие соединения были пригодными для применения в качестве фосфоресцентного кислородного зонда (так называемый "фосфор" или 5 "оксифор") для определения оксигенации тканей, они желательно должны иметь: (1) высокое поглощение в ближней инфракрасной области спектра, где естественные хромофоры ткани, такие как гемоглобин или миоглобин, имеют только очень слабое поглощение; (2) фосфоресценцию с высоким квантовым выходом при комнатной температуре, предпочтительно более чем 0,02; и (3) подходящие времена жизни, 10 предпочтительно примерно от 0,1 до примерно 1 миллисекунд.
О новых классах фосфоресцентных зондов, пригодных для измерения кислорода, сообщалось ранее в Vinogradov and Wilson, J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2, 103-111 (1995), в патенте США № 4947850 "Method and Apparatus for Imaging an Internal Body Portion of a Host Animal" by Vanderkooi and Wilson и патенте США № 5837865
15 "Phosphorescent Dendritic Macromolecular Compounds for Imaging Tissue Oxygen," by Vinogradov and Wilson, которые включены здесь в качестве ссылки. В общем, фосфоресцентные зонды для измерения кислорода состоят из трех функциональных частей: 1) фосфоресцентного ядра; 2) инкапсулирующих и защищающих лигандов и 3) гидрофильного внешнего слоя, который, как правило, выполнен из
20 монометилолигоэтиленгликольных или просто полиэтиленгликольных (ПЭГ) остатков. Части 2 и 3 представляют собой так называемое ближайшее "окружение" фосфоресцентного хромофора.
Функции трех частей состоят в следующем: а) фосфоресцентное ядро обеспечивает оптический сигнал (фосфоресценцию), индуцируемый источниками
25 возбуждения в красной/ближней инфракрасной областях, и реагирующий на изменения парциального давления кислорода р02; б) инкапсулирующие лиганды позволяют настроить доступность ядра для кислорода для оптимизирования чувствительности зонда в физиологическом диапазоне р02; и в) внешний слой обеспечивает растворимость и изолирует зонд от взаимодействия с эндогенными биологическими
30 частицами (белки, нуклеиновые кислоты, мембраны и т.д.) с целью поддержания калибровочных констант для количественного измерения р02в биологических средах.
В обоих вышеупомянутых патентах описаны соединения на основе комплексов металлов, таких как Pd и Pt, с порфиринами и ароматическими тт-протяженными порфиринами, такими как, например, тетрабензопорфирин, тетранафталопорфирин, 35 тетраантрапорфирин и различные их производные, которые играют роль фосфоресцентных ядер (часть 1). Эти комплексы обладают яркой фосфоресценцией
К заявке № ЕА201491551
при комнатной температуре, и Pd и Pt комплексы тетрабензопорфиринов и тетранафталопорфиринов являются особенно желательными, поскольку они демонстрируют сильное поглощение света в ближней ИК-области (610-650 нм и 700720 нм, соответственно), в которой ткани практически прозрачны. Кроме того, Pd 5 тетрабензопорфирины (PdTBP) и их производные, как было показано, имеют долгоживущую фосфоресценцию (~ 250 микросекунд) с квантовыми выходами 0,080,10 %. Эти значения были позже измерены снова относительно улучшенных стандартов флуоресценции, использованных на протяжении оставшейся части этого описания, и, как показано, составляют 0,0015-0.04 (см. Esipova et al, Anal. Chem. 10 83:8756 (опубликовано 11 октября 2011 года).
В целом, окружение определяет свойства фосфоресцентного зонда по отношению к измерению кислорода, в том числе растворимость в воде, токсичность, константу гашения кислорода, чувствительность измерений к химически активным компонентам ткани и простоту выведения зонда из организма через почки. 15 Желательно также проектировать окружение таким образом, чтобы оно представляло собой инертную глобулярную структуру вокруг фосфоресцентного зонда, через которую только небольшие незаряженные молекулы, например, кислород могут диффундировать в непосредственную близость от фосфоресцентного ядра для эффективного гашения.
20 В вышеуказанном патенте '865 описано, что оптимальное окружение для
фосфоресцентного ядра выполнено из дендронов в качестве инкапсулирующих лигандов (часть 2) и полиэтиленгликоля (или олигоэтиленгликолей) в качестве внешнего слоя зонда (часть 3). (Следует обратить внимание, что вместе инкапсулированные дендроны, как говорят, образуют дендример. Соответственно,
25 соответствующие фосфоресцентные зонды называются дендритными.) Дендритные зонды до сих пор показывали себя превосходящими фосфоресцентными зондами для измерения кислорода в биологических системах. Многие лаборатории во всем мире в настоящее время используют эти молекулы для измерения кислорода в крови, тканевом интерстициальном пространстве, различных органах, примененяя различные
30 способы гашения фосфоресценции (см. выше). См., например, Sakadzic et al., Nat. Methods 7:755 (2010); Devor et al, J. Neuroscience 31:13676 (2011); Lecoq et al., Nature Medicine 17:893 (2011); и после даты приоритета настоящей заявки Parpaleix et al, Nature Medicine 19:241-246 (2013), которые использовали дендритные кислородные зонды, чтобы расшифровать энергетический метаболизм мозга в области
35 нейробиологии. Таким образом, предшествующий и настоящий уровень техники четко установил огромную ценность дендритных кислородных зондов, обосновывая их дальнейшее совершенствование и оптимизацию.
Поэтому в данной области техники существует постоянная необходимость дальнейшего улучшения структуры дендритных фосфоресцентных зондов, путем изменения и улучшения их химической структуры, обеспечивая тем самым датчики кислорода "следующего поколения" с существенно улучшенной фосфоресцентной 5 эмиссией для лучших возможностей визуализации, легкостью использования и диапазоном применимости. Кроме того, некоторые из новых молекул в данном описании обеспечивают измерение кислорода не только в водной среде, но также в жидкой органической среде, такой как органические растворители и/или масла.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
10 Настоящее изобретение относится к фосфоресцентным зондам,
представляющим собой новый класс оксифоров на основе порфирина, причем порфирин сделан менее гибким и более плоским, две модификации, которые, как показано авторами изобретения, значительно увеличивают квантовый выход (в 5-10 раз) по сравнению с известными зондами, и, следовательно, служат в качестве
15 основы для значительно улучшенных кислородных датчиков. Эти структурно улучшенные расширенные порфирины затем образуют комплекс с дендримерами для того, чтобы окружить фосфоресцентное ядро супрамолекулярными структурами, которые хорошо растворимы в средах на основе воды или в жидкой органической среде, такой как органические растворители и/или масла. Они обеспечивают
20 дополнительные востребованные характеристики фосфоресцентных зондов, такие как длительная фосфоресценция и высокие квантовые выходы.
В оксифорах R4 и G4 и в предшествующем уровне техники в изобретательских лабораториях порфириновые зонды всегда представляли собой мезо-тетра-арил замещенные порфирины (имеющие четыре арильных кольца, радиально торчащих из
25 металлопорфириновой структуры), которые, например, имели Pt или Pd ядра. К этим кольцам прикреплены дендроны, образуя дендример. Для сравнения, задача настоящего изобретения заключается в создании ди-арил порфиринов, в которых порфириновая структура является уникальной тем, что конструкция имеет только два арильных кольца, которые всегда расположены противоположно друг другу (например,
30 5, 15-диарил-замещенные тетрабензопорфирины (TBPs) или совсем не имеет мезо-арильных колец (например, Pd мезо-незамещенные порфирины). Такое изменение в структуре порфирина приводит к значительному увеличению (в 5-10 раз) квантового выхода фосфоресценции (выше 0,2- 0,4 при нулевом кислороде) и увеличивает время жизни триплетного состояния (до 60-700 микросекунд), обеспечивая более высокую
35 чувствительность к кислороду, чем предыдущие модели. Структуры, имеющие меньшее число арилов, казалось бы, можно легче синтезировать, но это обманчивое
предположение, так как построение тетраарилпорфиринов значительно легче. Однако разработка и использование диарилпорфиринов и мезо-незамещенных порфиринов приведет к значительно улучшенным датчикам кислорода.
Второй задачей изобретения является обеспечение усовершенствованного 5 способа присоединения дендронов к порфирину. Способ выглядит простым, но на самом деле он не был осуществлен ранее. В усовершенствованном способе сначала присоединяют "удлиняющие фрагменты" (то есть, например, аминобутиратные линкеры) к арильным кольцам порфиринов, а затем дендроны присоединяют к концам присоединенных "удлиняющих фрагментов". В предшествующем уровне техники
10 группы, к которым напрямую присоединены дендроны арильных колец порфирина, располагаются слишком близко друг к другу, в результате объемные дендроны мешают друг другу и вся реакция присоединения становится неэффективной. Однако, когда "удлиняющие фрагменты" присоединяют перед присоединением дендронов, точки, где будут присоединены дендроны, в достаточной степени разделены в
15 пространстве, и, таким образом, реакция присоединения протекает легче.
Третьей задачей изобретения является повышение сечения процесса возбуждения зонда, используя внутримолекулярный резонансный перенос энергии Форстеровского (Forster) типа (FRET) путем использования антенных хромофоров в структуре порфирин-дендример. Антенные хромофоры захватывают возбуждающие 20 фотоны и передают энергию порфирину путем (FRET). Оставшийся флуоресцентный сигнал, хорошо разделенный спектрально от фосфоресценции, доступен для радиометрического обнаружения кислорода, что позволяет использовать несколько доступных диапазонов лазера, и зонды эффективно становятся по меньшей мере в 5 -7, максимально в 10 раз ярче без увеличения их фототоксичности.
25 Четвертой задачей изобретения является создание дендритных
фосфоресцентных зондов, пригодных для измерения кислорода в среде, выбранной либо из водной или жидкой органической среды, например, масла, насыщенных углеводородов, ароматических минеральных масел и тому подобного. Путем добавления трехмерного супрамолекулярного гидрофобного внешнего слоя к концам
30 дендримеров вся молекула остается сложенной, но становится хорошо растворимой в некоторых органических растворителях, таким образом, впервые становится возможным измерять кислород в таких органических растворителях.
Дополнительные цели, преимущества и новые признаки изобретения будут изложены частично в описании, примерах и рисунках, которые последуют, и все из 35 которых предназначены только для иллюстративных целей и они не ограничивают каким-либо образом изобретение, а частично станут очевидными для специалистов в
К заявке № ЕА201491551
данной области при рассмотрении нижеследующего или они могут быть изучены при практическом использовании изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Предшествующее краткое описание, а также последующее подробное описание 5 настоящего изобретения будут лучше поняты при прочтении совместно с прилагаемыми чертежами. Следует понимать, однако, что изобретение не ограничивается приведенными точными структурами и средствами.
На Фиг. 1А и 1В показаны рентгеновские кристаллические структуры PdPh2TBP на рис. 1А и PdAr4TBP на рис. 1В, соответственно.
10 На Фиг. 2 показан пример синтеза 5,15-диарилтетрабензо- и
тетранафтопорфиринов.
На Фиг. 3 показан пример синтеза мезо-незамещенного ТВР.
На Фиг. 4 показан пример дендримеризации порфиринов: i) пептидное сочетание; и) гидролиз.
15 На Фиг. 5А показана иллюстрация FRET-улучшенных зондов; на Фиг. 5В
показана диаграмма Яблонского (Jablonski) и на Фиг. 5С показаны соответствующие спектры.
На Фиг. 6 показан пример дендритного фосфоресцентного зонда, модифицированного гидрофобными остатками, что позволяет измерять кислород в 20 жидких органических растворах, например, насыщенных алканах, минеральных маслах и т.д.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НЕКОТОРЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к высокоэффективным и хорошо 25 растворимым фосфоресцентным зондам, подходящим для измерения кислорода в ткани животных и человека. Зонды по изобретатению окружены инертной глобулярной структурой, примером которой являются производные PdTBP (Pd тетрабензопорфирины), окруженные трехмерной супрамолекулярной структурой, известной как "дендример", который хорошо известен в этой области.
30 Уровень кислорода в биологических системах может, таким образом, быть
измерен с помощью способа гашения фосфоресценции с использованием зондов с контролируемыми параметрами гашения и определенными биораспределениями.
Предложен общий подход к созданию фосфоресцентных наносенсоров с настраиваемыми спектральными характеристиками, различной степенью гашения и высокой селективностью по отношению к кислороду, которые растворимы в водных или органических растворителях (например, бензоле, толуоле, гексане, октане, 5 тетрагидрофуране, минеральном масле и т.п.), что позволяет измерять фосфоресценцию во всем диапазоне окружающего кислорода: р02 = 0-160 мм. рт. столба. Зонды основаны на яркой фосфоресценции порфириновых комплексов платины и палладия и симметрично тт-протяженных порфиринов (тетрабензопорфирины и тетранафтопорфирины).
10 В некоторых вариантах осуществления изобретения тт-протяжение основного
макроцикла обеспечивает настройку спектральных параметров зондов для соответствия требованиям конкретного применения визуализации изображений (например, кислородная томография по сравнению с плоскими микроскопическими изображениями). Металлопорфирины инкапсулированы в поли (арилглициновые)
15 дендримеры, которые сворачиваются в водных средах и создают диффузионные барьеры для кислорода, что дает возможность регулировать чувствительность и динамический диапазон способа. Дендримеры на периферии модифицированы поли (этиленгликольными) остатками, которые увеличивают растворимость зонда, уменьшают токсичность и помогают предотвратить взаимодействие зондов с
20 биологической средой. Параметры зонда измеряли в физиологических условиях, и было показано, что они не зависят от наличия биомакромолекул.
Эффективность зондов была показана в применениях, в том числе in vivo микроскопии сосудистого р02 в головном мозге крыс.
I. Принципы способа гашения фосфоресценции и требования к 25 кислородным зондам in vivo.
Гашение фосфоресценции основано на способности молекулярного кислорода, который является триплетной молекулой в основном состоянии (02X3Ig~), реагировать с молекулами, которые находятся в возбужденных состояниях, гася их люминесценцию. Столкновительное гашение синглетных возбужденных состояний
30 (наносекунды) гораздо менее вероятно по временной шкале, чем триплетных состояний (от микросекунд до миллисекунд), что делает фосфоресценцию значительно более чувствительной к кислороду, чем флуоресценцию. Предполаяя большой избыток кислорода по сравнению с концентрацией триплетных эмиттеров -условие, которое как правило, выполнено в биологических средах - зависимость
35 интенсивности фосфоресценции от времени жизни концентрации кислорода описывается следующим уравнением Штерна-Фольмера:
|0/| = т0/т = 1 + KSv[02] [Уравнение 1]
где I и т представляют собой интенсивность фосфоресценции и время жизни фосфоресценции при концентрации кислорода [02], а в отсутствие кислорода (l0, т0); и KSv представляют собой постоянную гашения Штерна-Фольмера.
5 На практике, использование в качестве аналитического сигнала времени жизни т
для [02] является более точным, так как время жизни не зависит от распределения зонда и любых других хромофоров, присутствующих в биологической системе, где т -время жизни фосфоресценции при концентрации кислорода при удельном давлении кислорода [р02]; т0- время жизни фосфоресценции в отсутствие кислорода [р02] = 0]; и 10 kq - постоянная гашения Штерна-Фольмера. См. Lebedev et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 1 : 1292 (2009); Finikova etal, ChemPhysChem 9: 1673 (2008); Sakad et al, Nat. Methods 7:755 (2010); Lecoq et al, Nat. Med. 17:893 (2011); Vinogradov & Wilson, In Designing Dendrimers. Campagna, Ceroni, Puntoriero, Eds.; Wiley: 2012.
Привлекательными особенностями способа гашения фосфоресценции 15 являются его высокая специфичность, субмиллисекундный временной отклик, высокая чувствительность и относительная простота аппаратуры. Когда используют растворимые зонды, калибровка в этом способе является абсолютной в том смысле, что параметры гашения зонда должны быть определены только один раз, а затем они могут быть использованы в дальнейшем для измерений в тех же условиях.
20 Принято выражать содержание кислорода в единицах давления (мм. рт. ст.), а
не концентрации (М), так как в большинстве биологических экспериментов парциальное давление кислорода (р02) является на самом деле контролируемым экспериментальным параметром. При 298 К и давлении воздуха 760 мм. рт. ст. (доля кислорода в воздухе составляет 21 % или его давление составляет 159,6 мм. рт. ст.)
25 водные растворы, находящиеся в равновесии с воздухом, имеют концентрацию 02 252 uM (Fogg, et al., "Solubility of gases in liquids. Wiley, New York, 2001). Тем не менее для простоты, давлением паров воды над раствором пренебрегают, хотя при более высоких температурах оно будет расти и, следовательно, парциальное давление кислорода (р02) будет уменьшаться. Это предполагает, что закон Генри выполняется в
30 физиологическом диапазоне концентраций кислорода: [02] = ар02, где а -коэффициент растворимости кислорода (Мхмм. рт. ст.) для объемной фазы. Учитывая, что Ksv = к2т0, где k2- константа скорости бимолекулярной реакции гашения, Уравнение 1 может быть записано так:
1/Ti = 1/т0 + kq(p02) [Уравнение 2]
где kq = ак2 и имеет размерность мм. рт. ст. Уравнение 2 содержит два параметра, специфичных для молекулярного зонда: константа kq и время жизни т0. Их взаимосвязь определяет чувствительность и динамический диапазон способа. Для аналитических целей желательно, чтобы измеряемый параметр, который является 5 временем жизни фосфоресценции т в данном описании, охватывал наибольший возможный интервал значений во всем диапазоне аналитических концентраций, обеспечивая максимально возможную разрешающую способность. Для количественной оценки динамического времени жизни используют параметр R = т0-Твозд/То, где т0 (р02 = 0 мм. рт. ст.) и тв03д (р02 = 159,6 мм. рт. ст.) являются 10 максимальным и минимальным значениями времени жизни фосфоресценции в физиологических экспериментах. Другим важным параметром является отношение сигнал-шум (SNR), который, очевидно, выше для зондов с большими квантовыми выходами эмиссии (в пределах той же длины волны излучения).
Pt и Pd порфирины, как правило, используют в качестве фосфоресцентных 15 хромофоров для измерения кислорода в биологических системах (см. ниже). Триплетные времена жизни Pd порфиринов в дезоксигенированных растворах при температуре окружающей среды составляют в диапазоне от сотен микросекунд (сокращения имеют свое обычное значение в данном описании, но микросекунды специально обозначены "us" или "usee" в данном описании), а их квантовые выходы 20 фосфоресценции в отсутствие кислорода (Ф0), как правило, составляют 0,05-0,1 (Eastwood et al, J. Molecular Spectroscopy 35:359 (1970)). Для Pt порфиринов соответствующие значения составляют десятки микросекунд и 0,10-0,25 (Id.; Kim et al, J. Amer. Chem. Soc. 106:4015 (1984)), соответственно. Константы kq для "незащищенных" металлопорфиринов в водных растворах составляют ~3000 мм. рт. 25 ст. с"1. Чтобы проиллюстрировать, как константа гашения kq и времена жизни т0 влияют на измерение кислорода, рассмотрим два зонда, PdP и PtP, представляющие некие Pd и Pt порфирины: To(PdP) = 500 us, T0(PtP) = 50 us; 0o(PdP) = 0,05; 0o(PtP) = 0,10, где индекс "0" указывает, что р02 = 0 мм. рт. ст.
Когда константа гашения высока, например, kq = 3000 мм. рт. ст.с"1, время жизни 30 PdP уменьшается от т0 = 500 us до тВОзД = 2,1 us, приводя в результате к большому динамическому диапазону (R ~ 0,996). Тем не менее, примерно между 20 мм. рт. ст. и насыщенным воздухом время жизни изменяется не более чем на 3% от общего значения и находится между 16 us и 2,1 us. Более того, уже при 10 мм. рт. ст. квантовый выход зонда становится крайне низким (Ф < 0,003) из-за чрезмерного 35 гашения.
Следовательно, зонд типа PdP полезен только в очень низком диапазоне концентраций кислорода, вероятно, не выше, чем при р02 ~ 5 мм. рт.ст.
Благодаря высокому квантовому выходу и меньшему т0 PtP зонд может быть использован примерно до 50 мм. рт. ст. (т = 5,9 us), но выше этого предела его время 5 жизни также меняется очень слабо, не более чем на ~ 3 us. Динамический диапазон времени жизни PtP (R ~ 0,96) не очень отличается от такового у PdP; но если бы константа гашения была уменьшена или уменьшалась, что неизбежно при связывании зонда с белками in vivo (см. ниже), этот зонд стал бы нечувствительным к изменениям при оксигенации.
10 Для более высокой чувствительности, зонды с большим т0 являются
предпочтительными, но только если их фосфоресценция изменяется постепенно, а не быстро гаснет уже при очень низких концентрациях кислорода. Такая регулировка чувствительности может быть достигнута путем изменения константы kq. В целом, очевидно, что контроль над значениями констант гашения и способность сохранять их
15 неизменными в условиях измерения являются ключом к точности измерений кислорода. Все сравнительные термины, например, более высокий, более низкий, увеличенный, уменьшенный, расширенный, сокращенный, быстрее, медленнее и т.д. предполагают свои принятые стандартные словарные значения в данном описании, предпочтительно по сравнению с указанной молекулой, зондом, соединением или тому
20 подобным.
Гашение фосфоресценции кислородом обычно происходит гораздо быстрее, чем диффузия реагентов и образование сталкивающихся комплексов; и в большинстве случаев диффузию можно считать лимитирующей стадией при реакции гашения кислородом. (Turro, Modern Molecular Photochemistry, University Science Books, 25 Sausalito, CA, 1991). Изменяя коэффициенты диффузии кислорода в непосредственной близости от фосфоресцентных хромофоров, константы kq можно регулировать. Такая настройка может быть достигнута посредством дендритной инкапсуляции.
Дополнительные требования к фосфоресцентным зондам для медицинской 30 визуализации кислорода включают отсутствие токсичности и предпочтительную экскретируемость из крови после завершения визуализации. Глобулярные незаряженные молекулы с молекулярной массой примерно до 15 кДа, как правило, экскретируются почками (Caliceti et al, Advanced Drug Delivery Reviews 55: 1261-1277 (2003). Если зонд удовлетворяет этому критерию и по-прежнему локализован 35 внутрисосудистым пространством (не диффундирует из кровеносных сосудов), он, вероятно, будет удален из крови с помощью почечно-опосредованного диализа, и
К заявке № ЕА201491551
возможность длительных эффектов токсичности можно избежать. Конечно, при исследованиии на животных к экскретируемости предъявляют не такие жесткие требования, в то время как локализация в отделе конкретной ткани (внутрисосудистой, интерстициальной или внутриклеточной) может быть очень важна. В этом случае 5 зонды больших размеров могут стать предпочтительными.
Это приводит к молекулярному дизайну, включающему яркий фосфоресцентный хромофор с достаточно большим триплетным временем жизни т0 и защитную оболочку, цель которой состоит в сдерживании диффузии кислорода в локальное окружение хромофора. Сам дендример должен быть гидрофобными, чтобы иметь способность
10 складываться (или свертываться) в полярных растворителях, таких как вода, вокруг порфирина. В противном случае, если бы он был гидрофильным, то его цепи будут раскрываться свободно и не создадут эффективный барьер для диффузии кислорода к порфирину. Важно отметить, что "гидрофобный" не обязательно означает липофильный. Другими словами, соединение, которое "не любит воду" (типа
15 арилглициновые (AG) дендримеры, определенные ниже), не всегда "любит" все возможные типы органических сред. Например, арилглициновые дендримеры по изобретению сворачиваются как в воде, так и во многих органических растворителях, таких как, но не ограничиваясь ими, тетрагидрофуран (ТГФ), масла, гексаны и тому подобное. Тем не менее, в других органических растворителях, таких как
20 диметилформамид (ДМФ) или диметилсульфоксид (ДМСО), они будут раскрывать ветви и не будут сворачмваться. В результате, такие дендримеры не обеспечивают барьер для кислорода в ДМФ и ДМСО; но они будут делать это в воде, ТГФ, маслах, алканах и т.д.
Периферия зонда должна быть гидрофильной и инертной, чтобы предотвратить 25 взаимодействие с компонентами биологической системы (например, биомакромолекулами, клеточными мембранами). Общий размер молекулы должны быть достаточно большим, чтобы не происходила утечка зонда через стенки сосудов, но также быть достаточно малым, чтобы происходило удаление через почки, если экскретируемость желательна. Альтернативно, периферия зонда должна быть 30 гидрофобной, если измерение должны проводить в маслах, алканах и т.д.
Новизна данного изобретения заключается в том, чтобы придать свернутым молекулам растворимость. Это достигают путем добавления внешнего слоя к дендримеру, и этот внешний слой затем переводит зонд в раствор, даже если сам дендример свернут и плохо растворим. Следовательно, в настоящем изобретении, 35 чтобы растворить свернутый дендример в воде, добавляют гидрофильный внешний слой из полиэтиленгликолей (ПЭГ), чтобы произошло растворение; но когда,
например, к внешнему слою добавляют масла или длинные алкильные цепи, дендример тогда становится растворим в жидких органических соединениях.
В целом, проблема поддержания постоянной диффузионной доступности фосфоресцентного хромофора к кислороду в биологических средах на протяжении 5 всего исследуемого объекта и неизменной калибровки на сегодняшний день является самой большой проблемой при проектировании фосфоресцентных кислородных зондов. Более того, эта проблема присуща всем способам, основанным на кинетике диффузии кислорода. Чтобы преодолеть эту трудность, дизайн молекулярного датчика кислорода влечет за собой создание четко определенной микросреды вокруг
10 фосфоресцентного хромофора, чтобы изолировать его от взаимодействия с другими молекулами, за исключением кислорода. Дендритная инкапсуляция (Hecht & Frechet, Angewandte Chemie-lnternational Edition 40:74 (2001); Gorman & Smith, J. Amer. Chem. Soc. 122:9342 (2000)), возможно, представляет собой один из самых простых способов создать монодисперсные четко определенные молекулярные оболочки вокруг
15 люминесцентных хромофоров (Balzani et al., Functional and Hyperbranched Building Block, Photophysical Properties, Applications in Materials and Life Sciences 228: 159 (2003); Ceroni etai, Progress in Polymer Science 30:453 (2005)).
II. Фосфоресцентные ядра дендритных кислородных зондов
Ключевыми фотофизическими свойствами, необходимыми для биологического 20 зондирования кислорода, являются сильное поглощение, предпочтительно в ближней инфракрасной области спектра (поглощение в ближней инфракрасной области ткани происходит примерно от 600 нм до 1000 нм, но для возбуждения необходим интервал от ~ 600 или ~ 620 до ~ 900 или ~1000 нм), чтобы минимизировать вмешательство естественных тканевых хромофоров (например, гемсодержащих белков, 25 каротиноидов), и сильная долгоживущая фосфоресценция в растворах при комнатной температуре. Очень немногие хромофоры обладают такими свойствами. Среди них металлопорфирины, испускающие при (тт-тт *) переходах и показывающие значительно большее триплетное время жизни (Eastwood et al, J. Mol. Spectroscopy 35:359 (1970)), таким образом, они обладают гораздо более высокой внутренней чувствительностью к 30 кислороду.
Обычные мезо-тетраарилированные Pt и Pd порфирины с различными периферийными заместителями могут быть легко синтезированы способами, например, Линдси (Lindsey et al, J. Organic Chem. 52: 827 (1987)) или Сенге (Senge, Accounts of Chemical Research 38:733 (2005)). Термодинамические стабильности этих 35 комплексов являются чрезвычайно высокими (Buchler, Ch. 5 in Porphyrins and Metalloporphyrins. Smith, К. M. Ed., Elsevier, 1975, New York), полностью исключающие
К заявке № ЕА201491551
высвобождение свободных ионов металлов в биологических средах и связанную с этим токсичность. Основной недостаток использования обычных Pt и Pd порфиринов для применений in vivo состоит в том, что их полосы поглощения, так называемые Q-полосы, которые расположены в видимом диапазоне (AQ~ 520-530 нм; ? ~ 20000 М"1 5 см"1), таким образом, перекрываясь с поглощением природных хромофоров. Тем не менее, поглощение в видимой области может быть полезным в планарной широкопольной фосфоресцентной визуализации, где менее диффузный характер возбуждения служит для улучшения пространственного разрешения. Кроме того, поглощение около 500 нм перекрывается с эмиссией многих двухфотонных (2Р) 10 хромофоров, что полезно в создании FRET-усовершенствованных зондов для двухфотонной кислородной микроскопии (см. ниже) (Finikova et al., ChemPhysChem 9: 1673 (2008)).
Многие порфириноиды обладают рядом инфракрасных полос поглощения; Однако, очень немногие из них имеют характеристики, подходящие для определения
15 кислорода (Vinogradov & Wilson, J. Chem. Soc, Perkin Trans. II 103 (1995)). Самыми полезными на сегодняшней день являются производные так называемых латерально тт-протяженных (или тт-продленных) порфиринов. Латеральное тт-протяжение Pt и Pd порфиринов путем аннелирования их пиррольных остатков внешними ароматическими кольцами дает в результате хромофоры с резко выраженным красным смещением
20 полос поглощения и сильной фосфоресценций при комнатной температуре (Ibid; Tsvirko et al, Optika i Spektroskopiya (Russ) 34: 1094 (1973); Rozhkov et al, Inorganic Chemistry 42:4253 (2003)). Спектры Pt аналогов очень похожи по форме, но сдвинуты в синюю область на ~ 10 -15 нм по сравнению Pd аналогами.
Важной особенностью всех зондов на основе порфирина является их очень 25 большое различие между поглощением и фосфоресценцией, достижимое посредством возбуждения полос Соре (например, 9329 см"1 для Pd порфиринов). Эффективная внутренняя конверсия S2 -> Si (Tripathy et al., J. Phys. Chem. A 112:5824 (2008)) в сочетании с чрезвычайно высокими коэффициентами экстинкции S0 - S2 переходов (~ 3 х 105 М"1см"1) делает этот путь превосходящим, чем прямое возбуждение S0-Si в тех 30 случаях, когда биологические объекты могут быть устойчивыми к ближнему УФ-излучению.
До недавнего времени синтез тт- протяженных порфиринов не представлял сложную проблему. Все синтетические методы были основаны на конденсации при высоких температурах фталимида (или нафталимида) и арилуксусных кислот, или 35 аналогичных доноров бензо- и фенильных- групп (Kopranenkov et al, J. Gen. Chem. (Russ) 51:2165 (1981); Edwards et al, J. Amer. Chem. Soc. 98:7638 (1976); Ichimura et al,
Inorganica Chimica Acta 176:31 (1990)). В жестких условиях конденсации (плавление при 300-400 °С) можно получить соединения лишь с несколькими инертными заместителями, такими как алкильные группы или атомы галогена (Kopranenkov et al, Khimiya Geterotsiklicheskikh Soedinenii 773 (1988)), которые вводятся в порфириновый 5 макроцикл. Кроме того, из-за низких выходов и образования сложной, неразделимой смеси продуктов этот подход является непрактичным.
Недавно появившиеся подходы к тт- протяженным порфиринам опираются на способ Бартона-Зарда (Barton et al, Tetrahedron 46:7587 (1990)) для синтеза порфириногенных пирролов, который приводит к предшественникам порфиринов,
10 которые требуют окончательной ароматизации. Два способа были разработаны в виде практических синтетических схем: в одном способе используют ретро-реакцию Дильса Альдера (Ito et al, Chemical Communications 1661 (1998); Ito et al, Chem. Comm. 893 (2000)), другой опирается на простую и эффективную стратегию окислительной ароматизации (Finikova et al, Chem. Commun. 261 (2001); Finikova et al, J. Organ. Chem.
15 69:522 (2004)). Последний способ используют сегодня для синтеза тетрабензо- и тетранафтопорфиринов для создания фосфоресцентных кислородных зондов, а также в некоторых других применениях.
Хотя мезо-тетраарилированные тт- протяженные порфирины являются наиболее распространенными, в первую очередь из-за соображений растворимости,
20 мезо-незамещенные тетрабензопорфирины (ТБФ), и тетранафтопорфирины (ТНП), которые на самом деле имеют более высокие квантовые выходы фосфоресценции и большее время жизни, также могут быть синтезированы с помощью способа окислительной ароматизации (Finikova et al, J. Org. Chem. 70:9562 (2005)). Кроме того, недавнее введение 4,7-дигидроизоиндола (Filatov et ah, Europ. J. Org. Chem. 3468
25 (2007)) открыло практический маршрут для 5,15-диарил-тетрабензопорфиринов (Filatov, et al, J. Org. Chem. 73:4175 (2008)). Последние порфирины являются особенно привлекательными для создания кислородных зондов, так как они сочетают в себе более высокую эмиссионную способность (Lebedev et al, J. Phys. Chem. A 112:7723 (2008)) с возможностью присоединения дендронов к якорным точкам в мезо- арильных
30 кольцах, которые, отсутствуют у мезо-незамещенных порфиринов. Примечательно, что примеры порфириновых дендримеров на основе 5,15- диарилпорфиринов хорошо известны (Dandliker et al, Angewandte Chemie-lnternational (Edition in English) 33:1739 (1994); Dandliker et al, Angewandte Chemie-lnternational (Edition in English) 34:2725 (1996)).
35 III. Полиглутаминовые Pd порфириновые дендримеры
Полиглутаминовые Pd порфириновые дендримеры составили первое поколение дендритных кислородных зондов (Vanderkooi et al, J. Biol. Chem. 262:5476 (1987); Vinogradov & Wilson J. Chem. Soc, Perkin Trans. 2:103 (1995); Papkovsky et al, J. Fluoresc. 15:569 (2005)). Соединения описаны общей формулой, например, PdP-5 (GlunOH)b если первое поколение, где п = 1-4 (поколение дендримера) и GliTOH -глутаминовый слой. Подобные сокращения для обозначения порфириновых дендримеров различных типов и поколений, оканчивающихся различными группами, используются в данном описании. Но полиглутаминовые Pd порфириновые дендримеры требовали предварительного связывания с высокомолекулярными
10 носителями (например, альбумином) для повышения их растворимости в воде и приведения их параметров гашения (т0 и kQ, уравнение 1) к диапазону, совместимому с физиологическими концентрациями кислорода (см. Vinogradov & Wilson, In Designing Dendrimers. chap 14, Campagna, Ceroni, Puntoriero, Eds.; Wiley: 2012) for discussion). Тем не менее, чужеродный альбумин являлся потенциальным источником токсичности и
15 иммуногенных реакций.
Введение полиглутаминовых дендритных порфиринов Vinogradov et al, Chem. Eur. J. 5:1338 (1999); Vinogradov et al, Adv. Exp. Med. Biol. 428:657 (1997); Rietveld et al, Tetrahedron 59:3821 (2003), которые являлись поколением 2 (ген 2) полиглутаминовых Pd порфириновых дендримеров, известных как Oxyphors R2 и G2 (Dunphy et al, Anal.
20 Biochem. 310:191 (2002)), частично решило эту проблему, и они были использованы во многих биологических исследованиях на протяжении многих лет, в которых инкапсулированные дендриты были необходимы для защиты триплетных состояний Pd порфиринов от гашения кислородом. Полиглутаминовые зонды имеют высокую собственную растворимость в воде и могут быть введены в кровь непосредственно без
25 предварительного связывания с альбумином. Когда в крови они образуют комплексы с эндогенным альбумином, то эти комплексы служат в качестве конечных кислородных датчиков. Но в результате, использование Oxyphors R2 и G2 ограничивается средами, богатыми альбумином, такими как плазма крови (> 2 % масс, альбумина). Но даже в таких условиях неполное связывание с альбумином, которое может легко встречаться
30 при более высоких концентрациях зонда (например, выше ~ 10~5 М), может привести к неоднородности сигнала зонда, искажая измерение (Vinogradov et al, Applied Spectroscopy 54:849 (2000)).
Примечательно, что недавно были представлены комбинации полиглутаминовых зондов с полимерными носителями на основе наночастиц 35 (например, Lee et al, Anal. Chem. 82:8446 (2010)), у которых уменьшена необходимость связывания с альбумином, что позволяет измерять кислород в культивируемых клетках.
Таким образом, недостатки, связанные с использованием дендритных полиглутаминовых порфиринов, ясно показывают, что зонды с альбуминнезависимым временем жизни фосфоресценции и константами гашения кислорода значительно бы упростили анализ данных и расширили применимость способа (например, позволили 5 бы проводить измерения в окружающей среде, свободной от альбумина). Хотя использование полиглутаминовых дендримеров было ограничено, эксперименты показали, что состав дендритной матрицы по меньшей мере так же важен для экранирования, как и размер самого дендримера, что привело к изучению взаимосвязи между составом дендримера, его размером и инкапсулирующей эффективностью и 10 измеряемой диффузией кислорода и гашением фосфоресценции.
IV. Влияние размера и состава дендритной матрицы на эффективность экранирования кислорода
Для того чтобы определить, какие дендримеры обеспечивают оптимальное ослабление гашения фосфоресценции порфиринов кислородом, было проведено 15 исследование (Rozhkov et al, Macromolecules 35:1991 (2002)), которое включало в себя три типа порфириновых дендримера: Фречетовские поли(арил эфиры) (Hawker et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1287 (1993)), Ньюкомовские поли(эфир амиды) (Newkome et al, Macromolecules 24:1443 (1991); Newkome et al, Synlett 53 (1992)) и полиглутаматы (Vinogradov et al, Chemistry-A European J. 5:1338 (1999)).
20 Pd-мета-октагидроксифенилпорфирины и Pd-мета-октакарбоксифенил-
порфирины, аналогичные Уильямсоновским (Fr) или пептидным (Nw, Glu), были использованы в качестве фосфоресцентных ядер. Исследования проводили в диметилформамиде (ДМФА), тетрагидрофуране (ТГФ) и воде. Чтобы обеспечить надлежащую растворимость в воде, концы дендримеров были модифицированы
25 олигоэтиленгликольными остатками, например, ПЭГ (полиэтиленгликольными), которые придают способность незаряженным молекулам растворяться как в органических растворителях, так и в воде.
Было установлено, что в органических растворителях уменьшение скорости гашения согласуется с увеличением размера дендримера, и эти изменения были
30 весьма незначительны. Как и ожидалось, более объемные поли(эфир амиды) демонстрируют более сильный эффект, но все же уменьшение гашения составило только примерно 75% для G2 дендримера, масса которого равна более 12 кДа, что более чем в 12 раз выше, чем масса порфиринового ядра. Следует отметить, что в случае полиглутаминовых производных PdTCPP, дендроны были присоеденены к
35 пара-положениям в мезо-арильных кольцах порфирина, расширяя макроцикл, а не закрывая его сверху и снизу, и, таким образом, экранирующий эффект был
К заявке № ЕА201491551
значительно слабее для дендронов того же размера. Гораздо большая разница в скоростях гашения наблюдалась в воде.
Практическое определение состояло в том, что дендримеры, построенные из ароматических строительных блоков, потенциально имеют намного более высокую 5 эффективность экранирования в водных средах, чем другие типы дендримеров. Кроме того, было установлено, что для того, чтобы предотвратить взаимодействие дендримеров с биологическими макромолекулами, их периферии должны быть модифицированы PEG остатками (см. ниже), упоминают как "периферическое ПЭГ-илирование" дендримеров.
10 Другие ссылки, относящиеся к дендритным макромолекулам и способам их
получкния, можно найти в патентах США. №№ 5418301; 4568737; 5393795; 5256193; 5393797; 5393795; 5393797; 5098475; 5041516 и 4568737, полный список которых включен здесь в качестве ссылки. Фосфоры описанные, например, в патенте США № 5837865 и Vinogradov and Wilson, J. Chem. Soc, Perkin trans. 2: 103-111 (1995),
15 предпочтительно имели общую формулу, в которой Ри является водородом (Н) или замещенным или незамещенным арилом. R2 и R3 независимо друг от друга являются водородом или они связаны вместе с образованием замещенного или незамещенного арила. Когда R2 и R3 связаны вместе с образованием арильной системы, то арильная система обязательно конденсирована с соответствующим пиррольным субстратом. М
20 является Н2 или предпочтительно металлом, выбранным из группы, состоящей из Lu, Pd, Pt, Zn, Al, Sn, Y, La и их производных, наиболее предпочтительны производные с Pd, Pt и Lu.
Соответственно, все формулы предшествующего уровня техники были основаны на мезо-замещенных тетраарил-металлопорфиринах, но изобретатели 25 установили, что непланарная деформация порфиринового макроцикла в результате замещения в тетра-ариле привела к потере эмиссии фосфоресценции. Таким образом, полученные дендритные кислородные зонды были эффективны, но ограничены их прямым назначением.
У. Защищенные дендритные зонды: Оксифоры G4 и R4
30 Затем, однако, изобретатели определили общий подход к получению
защищенных молекулярных кислородных зондов, для которых не требуется альбумин или любые другие вспомогательные высокомолекулярные носители или нанокомпозиции (см. Lebedev et al, ACS Appl. Mater. Interfaces 1:1292 (2009); Finikova et al. ChemPhysChem 9:1673 (2008); Ceroni, et al., Photochem. Photobiol. Sci. 10: 1056
35 (2011)). В этих зондах фосфоресцентные металлопорфирины инкапсулированы внутри
гидрофобных дендримеров, которые образуют защитные оболочки, обволакивая хромофоры и контролируя диффузию кислорода к возбужденным триплетным состояниям, что позволяет контролировать чувствительность способа. Периферийное ПЭГ-илирование дендримеров обеспечивает высокую растворимость в воде и 5 предотвращает взаимодействие зондов с биологическими макромолекулами.
Синтез и подробная характеристика двух новых зондов, Оксифоров R4 и G4, производных фосфоресцентных Рс1-мезо-тетра-(3,5-дикарбоксифенил)-порфирина (PDP) или Рс1-мезо-тетра-(3,5-дикарбоксифенил)-тетрабензопорфирина (PdTBP), соответственно, как сообщает Esipova et al, Anal. Chem. 83:8756 (опубликовано 11 октября 2011), которые включены сюда в качестве ссылки. Эти зонды построены в соответствии с вышеприведенной общей схемой и обладают общими признаками для защищенных дендритных зондов, т.е. у них имеется гидрофобно-дендритная инкапсуляция фосфоресцентных металлопорфиринов и гидрофильная ПЭГ-илированная периферия. Новые Оксифоры R4 и G 4 хорошо растворимы в водных средах и не проникают через биологические мембраны. Зонды были откалиброваны в физиологических условиях (рН 6,4-7,8) и температурах (22-38 °С), показывая высокую стабильность и воспроизводимость сигналов, а из-за отсутствия взаимодействия с биологическими растворенными веществами они рекомендованы для широкого использования в биологических исследованиях. Тем не менее, структурные элементы зондов дополнительно оптимизированы: улучшен выход при синтезе, монодисперсность в 1- 2 раза выше, чем чистых монодисперсных дендритных кислородных зондов, отсутствует агрегация в водных растворах и в целом лучшая химическая стабильность.
Как указано выше, побочным продуктом при измерениях биологического 25 кислорода с помощью гашения фосфоресценции, используя экзогенные фосфоресцентные зонды, вводимые непосредственно в интересующую среду (например, кровь или тканевую жидкость), является синглет - высоко реакционноспособные формы, вызывающие повреждение биологической ткани. Следовательно, из-за потенциальной фототоксичности зонд является проблемой для 30 биологических применений по сравнению со способностью покрытых полиэтиленгликолем (ПЭГ) на основе Pd тетрабензопорфириновых (PdTBP) дендритных нанозондов трех последовательных поколений сенсибилизировать синглетный кислород. В результате было показано, что размер дендримера практически не влияет на эффективность сенсибилизации синглетного кислорода, 35 несмотря на сильное затухание скорости гашения триплета с увеличением генерации дендримера.
Тем не менее, несмотря на их способность сенсибилизировать синглетный кислород, фосфоресцентные зонды оказались нефототоксичными по сравнению с обычно используемым фотодинамическим препаратом Photofrin при стандартном анализе клеточной выживаемости (Ceroni et al, Photochem. Photobiol. Sci. 10: 1056-1065 5 (2011)). Отсутствие фототоксичности предположительно связано с неспособностью ПЭГ-илированных зондов связываться с клеточной поверхностью и/или проникать в клеточные мембраны. Напротив, обычные фотосенсибилизаторы связываются с клеточными компонентами и генерируют синглетный кислород внутри или в непосредственной близости от клеточных органелл. Таким образом, дендритные ПЭГ-10 илированные зонды являются безопасными для использования при измерении тканевого кислорода до тех пор, пока световые дозы меньше или равны тем, которые обычно используют в фотодинамической терапии.
Один из зондов, Оксифор G4, был применен для визуализации распределения кислорода в опухолях, как внутривенно, так и в интерстициальном пространстве. Зонд 15 позволил динамически визуализировать уровни р02 в ткани опухоли и в окружающей мышце, так как оксигенация отвечает на изменение глубины анестезии. Фосфоресценция зонда может быть также обнаружена в трансиллюминирующей геометрии, т.е. по всему телу животного, тем самым демонстрируя осуществимость in vivo кислородной томографии всего тела.
20 VI. Влияние дендримерного внешнего слоя
Критически важно, чтобы характеристики гашения фосфоресцентных зондов не менялись в присутствии белков плазмы крови и других биологических макромолекул. Было обнаружено, что константы гашения всех зондов с концевыми карбоксилатными группами очень чувствительны к альбумину. Например, kq для порфиринового
25 дендримера Ген 2 Фречетовского типа в растворе альбумина (2 % масс.) в пять раз меньше (30 мм. рт. ст."1 с"1), чем в водном буфере без альбумина (151 мм. рт. ст."1 с"1) (Gorman et al, J. Amer. Chem. Soc. 122:9342 (2000)). Напротив, однако, гашение порфириновых дендримеров, модифицированных олигоэтиленгликольными остатками (PEG 350, средний MW = 350), по-видимому, не зависит от сывороточных белков.
30 Таким образом, kq для ПЭГ-илированного аналога порфиринового дендримера Ген 2 Фречетовского типа, как было установлено, имеет то же самое значение (130 мм. рт. ст."1 с"1) в присутствии и в отсутствие альбумина (Estrada et al, Optics Letters 33:1038 (2008)).
Таким образом, важно провести различие между влиянием гидрофобных 35 дендронов и влиянием внешних ПЭГ остатков. В то время как последние также способствуют защите от гашения, особенно у ранних дендритных поколений,
К заявке № ЕА201491551
результирующее влияние ПЭГ очень мало, как отмечалось выше, по сравнению с экранированием дендритными цепями. Кроме того, влияние ПЭГ быстро уменьшается с удлинением линейных цепей. Было показано, что внешние ПЭГ цепи с массой 300000 Да практически не влияют на константы гашения кислородом этих молекул. Кроме 5 того, помимо возможности предотвращать взаимодействие дендримеров с белками, периферийные ПЭГ группы также сильно влияют на биораспределение и скорость экскреции дендритных макромолекул (Newkome, см.выше 1992).
VII. Арил-глициновые дендримеры и полностью защищенные фосфоресцентные зонды
Среди известных дендримеров с ароматическими цепями дендритные ариламиды были очень привлекательны из-за их высокой химической стойкости, низкой стоимости и наличием эффективных методик для их синтеза. В частности, были выбраны ариламидные дендримеры на основе 5-аминоизофталевой кислоты (5-AIPA), чтобы сделать фокальную функциональную группу более реакционноспособной и одновременно повысить гибкость дендритной основной цепи путем добавления к аминогруппе молекулы 5-AIPA гибкого фрагмента, который оканчивается алифатической аминогруппой. Эта возможность была исследована на примере построения арил-глициновых (AG) дендронов и дендримеров (Vinogradov, Organic Letters 7: 1761 (2005)). Следующие сокращения использованы для обозначения арил-глициновых дендронов и дендримеров. Дендроны обозначены X-AGnR, где AG обозначает дендритный арил-глициновый скелет, п - число поколения дендримера, X -фокальная функциональная группа и R - концевая группа. Дендримеры обозначены С-(AGnR)m, где С обозначает ядро дендримера, AG обозначает дендритный арил-глициновый скелет, п - число поколения, R - концевая группа и m - число дендритных связей, присоединенных к ядру.
Разработанный синтез AG-дендронов опирается на классический метод Фишера с использованием галогенсодеожащего галоацильного соединения (Miller et al, Chem. Mater. 2:346 (1990)) для синтеза билдинг-блоков. Синтез AG-дендронов в принципе также может быть реализован с использованием метода Фишера, однако, более 30 надежные схемы основываются на последовательных реакциях: защита, сочетание, снятие защиты, используя реакции пептидного синтеза (Lebedev et al, ACS Applied Materials & Interfaces 1 : 1292 (2009)). Смотрите также синтез и реакции пептидного синтеза, описанные более подробно в (Vinogradov & Wilson, In Designing Dendrimers. chap 14, Campagna, Ceroni, Puntoriero, Eds.; Wiley: 2012).
35 Каждая стадия в последовательности реакций была тщательно оптимизирована
с целью обеспечения максимальных выходов и монодисперсности зондов.
К заявке № ЕА201491551
Порфирины, модифицированные AG1 и AG2 (арил-глицины первого и второго поколения) дендронами, могут быть выделены с высокой степенью чистоты, но модификация порфиринов AG-дендронами (третьего поколения) оказалась чрезвычайно сложной, давая в результате всегда смесь дендримеров с шестью, семью 5 и восемью ветвями дендримеров. Периферийные эфирные группы гидролизуют с помощью специальной двухступенчатой процедуры (Lebedev et al, см. выше, 2009), которая параллельно разрушает непрореагировавшие дендроны, что не позволяет полностью избежать хроматографической очистки. Полученные периферические карбоксильные группы в дендримерах этерифицируют PEG остатками нужной длины и
10 после простого переосаждения из ТГФ при добавлении диэтилового эфира получают чистые ПЭГ-илированные дендримеры. Величина затухающего эффекта аналогична той, что и у поли(арил эфир) дендримеров. В результате, Gen-2 Pd порфириновые дендримеры с такими константами гашения и временами жизни хорошо подходят для измерения биологического кислорода. Эти зонды имеют хороший динамический
15 диапазон и высокую чувствительность. Например, в случае Gen 2 дендримера на основе PdP относительная чувствительность коэффициента R (см. выше) достигает 0,9. Кроме того, покрытые ПЭГ AG порфириновые дендримеры обладают свойством, что их константы гашения кислородом kq и времена жизни абсолютно нечувствительны к присутствию биологических макромолекул.
20 VIII. Усовершенствование кислородных датчиков "Следующего
поколения": варианты осуществления 5,15-диарил и мезо-незамещенного порфирина.
А) Увеличение выхода эмиссии (квантового выхода) фосфоресцентных зондов на основе порфирина.
25 Систематическое сравнение структуры/свойств у различных замещенных
порфиринов показало, что дендритные кислородные зонды могут быть построены с использованием Pd мезо-незамещенных или 5,15-диарил-замещенных тт- протяженных порфиринов (это означает, что ароматический макроцикл порфирина продлевают с помощью протяжения его тт-электронной системы). Но 5,15-диарил-замещенные тт-
30 протяженные порфирины имеют значительно более высокие квантовые выходы фосфоресценции (на 50% больше), чем тетраарил тт- протяженные порфирины, и достаточно долгие времена жизни триплета, что делает их более чувствительными к кислороду.
Зонды на основе тт-протяженных порфиринов являются оптимальными для
35 применения в томографической визуализации тканевого кислорода (Apreleva et al.,
Applied Optics 45:8547-8559 (2006); Apreleva etai, Optics Letters 33:782-784 (2008)), где
К заявке № EA201491551
требуется возбуждение в ближнем инфракрасном диапазоне. Для применения в микроскопии высокого разрешения предпочтительно возбуждение в видимом диапазоне (Golub et al, Am. J. Physiol.-Heart and Circulatory Physiol. 294 (1):H21 (2008); Yaseen et al., J. Cerebral Blood Flow and Metabolism 29:S381-S393 (2009); Yaseen et al., 5 Opt. Express 17:22341 -22350 (2009)).
В обоих случаях, однако, увеличение квантового выхода фосфоресценции является важной задачей. Pd мезо-тетраарилпорфирины имеют собственные квантовые выходы при нулевом кислороде в диапазоне 0,02-0,08 и времена жизни триплета составляют 300-700 us, в зависимости от типа тт-протяжения, то есть тт-10 протяжение в тетрабензо- или тетранафтопорфиринах по отношению к основному 18-тетрапиррольному макроциклу (Rozhkov etai, Inorg. Chem. 42:4253-4255 (2003); Rogers et al., J. Physical Chem. A 107: 11331-11339 (2003).) Аналогичные Pt порфирины имеют квантовые выходы 0,10-0,20, если их измеряют с помощью утвержденных способов измерений, а их времена жизни составляют 30-60 us.
15 Изобретатели провели подробные фотофизические, структурные и расчетные
исследования с целью очертить взаимосвязь между излучательными и безизлучательными процессами дезактивации триплета в Pd порфиринах и тетрабензопорфиринах (см. Lebedev et al., J. Physical Chem. A, 112:7723-77336 (2008)). На самом деле, внеплоскостные искажения порфиринового макроцикла, как было
20 показано, уменьшают выход эмиссии триплета в PdTBP при конкуренции безызлучательных переходов триплетного состояния в основное синглетное состояние, то есть, кросс-релаксация. Это происходит потому, что время жизни триплетного состояния у PdTBP в отсутствие кислорода возрастает с дендритным поколением, тем самым происходит компенсация сопутствующего снижения скорости
25 гашения. На самом деле, внеплоскостные искажения порфиринового макроцикла, как было показано, уменьшают выход эмиссии триплета в PdTBP путем увеличения скорости перехода -> S0, относящегося к внутреннему, безызлучательному гашению триплетного состояния (Т^ (возвращение его в основное состояние (S0). Увеличение доли этого безызлучательного перехода уменьшает эмиссию фосфоресценции.
30 Однако этот эффект значительно слабее, чем у обычных, не протяженных порфиринов (см. Фиг. 1). На Фиг. 1 ясно показано гораздо в меньшей степени внеплоскостное искажение макроцикла в случае PdPh2TBP. Фотофизические измерения показывают, что внеплоскостные деформации имеют вредное воздействие на излучательную способность триплета порфирина. Поэтому даже весьма оседланные тетраарил-ТВР,
35 которые используют в качестве ядер сегодняшних зондов, способны фосфоресцировать.
Было также установлено в результате исследований изобретателей, что Pd (и Pt) ТВР без мезо-заместителей (Finikova et al, J. Org. Chem. 70:9562-9572 (2005A)) and 5,15-диарил-ТВР (Filatov et al, J. Org. Chem. 73:4175-4185 (2008)) имеют гораздо более высокие квантовые выходы эмиссии по сравнению с соответствующими 5 тетрабензопорфиринами. В случае мезо-незамещенных Pt ТВР квантовые выходы фосфоресценции достигают 0,5 при комнатной температуре, полученные с помощью утвержденных способов измерений. Те же тенденции характерны для TNP.
Основываясь на этих выводах, Pt и Pd мезо-незамещенные, а также 5,15-диарилзамещенные ТВР и TNP, используют также для создания вариантов
10 осуществления зондов нового поколения по настоящему изобретению. Синтез 5,15-диарилзамещенных порфиринов основан на недавно разработанном способе с использованием 4,7-дигидроизоиндола (Filatov et al., (2008) см. выше; Cheprakov et al, J. Porphyrins and Phthalocyanines 13:291-303 (2009)), и на аналогичной стратегии, разработанной ранее для синтеза предшественников ТВР (Finikova et al, (2005А) см.
15 выше; Finikova et al, J. Org. Chem. 68:7517-7520 (2003); Finikova et al, J. Org. Chem. 70:4617-4628 (2005В)). См. Фиг. 2.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения порфириногены получают, используя 2 + 2 циклоприсоединение (Filatov et al., "Synthesis of 5,15-diaryltetrabenzoporphyrins," J. Org. Chem. 73:4175. (2008)) и окисление с помощью DDQ 20 (дихлордициано-п-бензохинон) в целевой предшественник тетрацикло-гексенопорфирин (ТСНР) (см. там же). После введения Pd (или Pt) ТСНР окисляют также с помощью DDQ в целевые ТВР (Finikova et al., "Novel versatile synthesis of substituted tetrabenzoporphyrins," J. Org. Chem. 69:522 (2004)).
Ранее был разработан синтез мезо-незамещенных ТВР и TNP с заместителями 25 в конденсированных кольцах (Finikova et al., "Synthesis and luminescence of soluble meso-unsubstituted tetrabenzo- and tetranaphtho [2,3] porphyrins," J. Org. Chem. 70:9562 (2005)). Тем не менее, эти позиции стерически затруднены, особенно по отношению к присоединению объемных дендритных лигандов, необходимых для "защиты" ядра порфирина от чрезмерного гашения кислородом.
30 В одном из вариантов осуществления изобретения схему, изображенную на
Фиг. 3, используют для синтеза мезо-незамещенных ТВР с соответствующими анкерными группами, расположенными как указано. На схеме показаны два пути, использующие малеинимид в качестве общего предшественника. Один из путей был основан на модифицированном синтезе Бартона-Зарда сульфоленпиррола (способ
35 синтеза пиррола путем циклизации между нитроалкеном и изоцианоацетатом в основных условиях), разработанном ранее Vicente et al, Tetrahedron Letters 38:3639-
K заявке № EA201491551
3642 (1997). Второй путь был также возможен; однако, условия реакции Бартона-Зарда (Barton, Zard, "A new synthesis of pyrroles from nitroalkenes," J. Chem. Soc. 1098 (1985)) необходимо корректировать в каждом конкретном случае, так как ее результат, скорее всего, будет зависеть от присутствия ароматической имидной группы. Устойчивость 5 этого имида зависит от заместителей R и их положения (при условии, что электронно-акцепторные заместители в 3- и 5-положениях будут дестабилизировать имид по отношению к гидролитическому расщеплению). Соответственно, чтобы обеспечить лучшую защиту мезо-незамещенных порфиринов уже на ранних дендритных поколениях, по меньшей мере, в одном варианте осуществления были использованы 10 2,6-заместители, которые направляют дендроны под плоскость и над плоскость порфирина.
В) Улучшенная процедура для дендримеризации порфиринов.
Варианты осуществления настоящего изобретения показали, что присоединение линкеров расширения к анкерным группам или в мезо-арильных
15 кольцах, или непосредственно в порфириновом макроцикле, существенно облегчает присоединение защитных дендронов. В частности, ввод карбоксильных групп с помощью у-амин°бутиратных связей ("удлиненные плечи") позволяет получить высокий синтетический выход монодисперсных дендритных кислородных зондов или улучшенную чувствительность и высокую чистоту (см. фундаментальные
20 фотофизические исследования, лежащие в основе определения значительно более высоких квантовых выходов фосфоресценции у 5,15-диарил-замещенных тт-протяженных порфиринов, по сравнению с тетраарилпорфиринами Esipova et al., "Two new "protected" oxyphors for biological oximetry: properties and application in tumor imaging," Analytical Chem. 83:8756 (опубликовано 11 октября 2011).
25 Дендримеризация фосфоресцентных порфиринов включает гидролиз
периферийных сложноэфирных групп порфирина, присоединение дендронов, гидролиз их периферийных сложноэфирных групп и ПЭГ-илирование образующихся свободных карбоксильных групп. См. Фиг. 3. Эти способы были разработаны авторами настоящего изобретения и описаны в предыдущих патентах, приведенных выше, и включены в
30 настоящее описание в качестве ссылки. Одним из важнейших улучшений, которое, однако, только недавно было установлено, и относится к выходу и определяющей чистоту при синтезе стадии, является присоединение объемных дендритных заместителей к порфириновому ядру. Эту стадию, как правило, осуществляют с помощью стандартных реакций пептидного сочетания или с помощью любых других
35 подходящих химических реакций. Тем не менее, стерические препятствия, создаваемые крупными сложенными дендритными группами, замедляют реакцию.
Однако если анкерные группы удлинены с помощью гибких линкеров, объемный субстрат реагирует медленно из-за неблагоприятных стерических факторов, и, таким образом, фактические участки, где происходит реакция, размещены на большем расстоянии друг от друга, и они становятся более доступными для нуклеофильной 5 атаки. Следовательно, результирующая реакция происходит с более высокой скоростью, т.е. полной дендримеризации достигают в течение ночи (примерно в течение 24 часов), когда в случае порфиринов без "удлиненных плеч" нужно 7 дней, и получают чистый окта-дендримеризованный порфирин, тогда как в случае порфиринов без "удлиненных плеч" получают смесь, состоящую из гекса-, гепта- и окта-10 дендримеризованных порфиринов (не полностью реагирующие загрязненные дендримеры).
Общая схема синтеза показана на Фиг. 4 в случае 5,15-диарил-тт-протяженных порфиринов (см. выше). Стадия удлинения является первой стадией в последовательности реакций и добавление элементов AG3 (третье поколение (Gen 3) 15 арилглициновых дендримеров.
С) Увеличение сечений возбуждения зонда посредством внутримолекулярного резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET).
Один из подходов к повышению сечений возбуждения у металлопорфиринов 20 без непосредственного изменения их электронных свойств включает в себя улавливание энергии возбуждения электроннонесвязанной антенной и передачу ее фосфоресцентному ядру посредством внутримолекулярного резонансного переноса энергии Форстеровского типа (Forster) (FRET) (см, Brinas etal., J. Amer. Chem. Soc. 127: 11851 (2005)). В такой системе антенна-ядро, построенной вокруг дендримера, 25 последний регулирует скорость диффузии кислорода к ядру, как и в обычных дендритных зондах (см. выше), в то время как дендримерные концы контролируют биораспределение зонда.
Резонансный перенос энергии представляет собой безызлучательную передачу кванта энергии от ее места поглощения к месту ее использования в молекуле или в
30 системе молекул путем резонансного взаимодействия хромофоров на расстояниях, значительно больших, чем межатомное расстояние, без преобразования в тепловую энергию и без донорно-акцепторного кинетического столкновения. Донор является маркером, который изначально поглощает энергию, а акцептор является хромофором, в который энергия впоследствии будет переведена (from Van Der Meer, Coker, and
35 Chen, Resonance Energy Transfer Theory and Data, VCH, New York, 1994).
Форстеровский (Forster) (Флуоресцентный) резонансный перенос энергии (FRET), резонансный перенос энергии (RET) или электронный перенос энергии (ЕЕТ) является механизмом, описывающим перенос энергии между двумя хромофорами. [1] Донорный хромофор, находящийся первоначально в своем электронном 5 возбужденном состоянии, может передавать энергию к акцепторному хромофору посредством безызлучательного диполь-дипольного взаимодействия. [2] Эффективность этого переноса энергии обратно пропорциональна шестой степени расстояния между донором и акцептором, делая FRET очень чувствительным к малым расстояниям. [3] Измерение эффективности FRET можно использовать для
10 определения того, находятся ли два флуорофора на определенном расстоянии друг от друга. [4] Такие измерения используют в качестве исследовательского инструмента в областях, включая биологию и химию. Когда оба хромофора являются флуоресцентными, термин "флуоресцентный резонансный перенос энергии" часто предпочтителен, хотя энергия фактически не передается с помощью флуоресценции.
15 Для того, чтобы избежать ошибочной интерпретации феномена, его всегда считают безызлучательной передачей энергии (даже тогда, когда она происходит между двумя флуоресцентными хромофорами).
FRET аналогична связи ближнего поля, так как радиус взаимодействия намного меньше, чем длина волны излучаемого света. В области ближнего поля возбужденный
20 хромофор испускает виртуальный фотон, который мгновенно поглощается принимающим хромофором. Эти виртуальные фотоны невозможно обнаружить, поскольку их существование нарушает закон сохранения энергии и импульса и, следовательно, FRET известен как безызлучательный механизм. Квантовые электродинамические расчеты показали, что безызлучательный (FRET) и
25 радиационный переносы энергии являются близко- и дальнедействующими асимптотами одного единого механизма. Диаграммы Яблонского иллюстрируют электронные состояния молекулы и переходы между ними. Состояния расположены вертикально по энергиям и сгруппированы горизонтально по кратности спина (Jablonski, Aleksander "Efficiency of Anti-Stokes Fluorescence in Dyes" Nature 131:839-840
30 (1933)).
1) Теоретические основы FRET: Когда донорный зонд является флуоресцентной молекулой и когда свет возбуждает флуорофор при соответствующей длине волны (250-500 нм), то электроны переходят из основного состояния (S) на более высокий колебательный уровень (S, S0, Sb и т.д.). В течение пикосекунд эти 35 электроны падают на самый нижний из этих колебательных уровней (S), а затем падают медленнее (в течение наносекунд) на одно из S состояний, при этом излучается фотон света, длина волны которого больше, чем длина волны
К заявке № ЕА201491551
возбуждающего света. Акцепторный зонд может быть флуоресцентным или нефлуоресцентным.
Эффективность FRET зависит от многих физических параметров, которые могут быть сгруппированы следующим образом:
5 • Донорный зонд должен иметь высокий квантовый выход.
• Спектральное перекрывание спектра излучения донора и спектра поглощения акцептора. Спектр излучения донорного зонда должен значительно перекрывать спектр поглощения акцепторного зонда (интеграл перекрытия).
• Существует соответствующая ориентация поглощающего и излучающего 10 моментов и их относительный вектор (воплощенный в каппа площади).
• Расстояние между донором и акцептором. Донор и акцептор должны быть в пределах 1 ± 0,5 х г0 друг от друга, где г = разделительное расстояние донор- акцептор.
• Относительная ориентация дипольного момента излучения донора и дипольного момента поглощения акцептора.
15 Соответственно, эффективность FRET относится к квантовому выходу и
времени жизни флуоресценции донорной молекулы, как описано (см., например, Majoul et al. (2006). "Practical Fluorescence Resonance Energy Transfer or Molecular Nanobioscopy of Living Cells." In Pawley, Handbook of Biological Confocal Microscopy (3rd ed.). New York, NY: Springer, pp. 788-808). В флуоресцентной микроскопии,
20 флуоресцентной конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, а также в области молекулярной биологии, FRET является полезным инструментом для количественной оценки молекулярной динамики в биофизике и биохимии, например, белок-белковые взаимодействия, взаимодействия белок-ДНК и конформационные изменения белка. Для контроля за образованием комплекса между двумя молекулами
25 одну помечают донором, а другую акцептором. Эффективность FRET измеряют и используют для определения взаимосвязи между мечеными комплексами. После возбуждения состояния антенны (aS2p) заполняются и внутренне преобразуются в низшее возбужденное синглетное состояние (aSi), а избыточная энергия передается ядру.
30 Форстеровский механизм передачи энергии предполагает, что флуоресценция
(aSi -> aS0) донора (2Р антенны) перекрывается с полосой поглощения (cSn <- CS0) (n =
1, 2 ...) акцептора (ядро). Таким образом, ядро должно иметь линейные полосы
поглощения где-то в области, распространяющейся от 400 нм до красной области.
Точные позиции этих полос определяют по сдвигу флуоресценции (сдвиг Стокса)
К заявке № ЕА201491551
антенны по отношению к его поглощению при 400 нм. В результате переноса энергии (FRET) от антенны к ядру происходит заполнение его синглетного возбужденного состояния cSi, которое расселяется путем кросс-релаксации ("isc") с получением триплетного состояния СТЬ в результате чего происходит гашение кислородом или 5 фосфоресценция. Таким образом, эффективность FRET состоит в квантовом выходе переноса энергии, т.е. доли события переноса энергии, происходящая в случае события возбуждения донора. Существует несколько способов измерения эффективности FRET путем наблюдения за изменениями в спектрах флуоресценции, испускаемой донором или акцептором, или за изменениями интенсивности излучения 10 акцептора (Clegg, R. (2009). In Gadella, Theodorus, FRET and FLIM Techniques-Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 33, Elsevier, pp. 1-57). Когда донор и акцептор находятся в непосредственной близости (1-10 нм), из-за взаимодействия двух молекул увеличивается излучение акцептора, так как происходит межмолекулярный перенос энергии FRET от донора к акцептору.
15 Пример способа внутримолекулярного флуоресцентного резонансного переноса
энергии (FRET) показан на Фиг. 5. Арил-глициновые дендримеры модифицированы путем включения функциональных групп в их молекулы. Хотя кумарины (Brinas et al., J. Amer. Chem. Soc. 127:11851 (2005)) являются весьма умеренными 2P поглотителями, их 2РА сечения (десятки GM единиц) по-прежнему выше, чем у Pt порфиринов, и
20 эмиссия некоторых кумаринов, например, кумарина-343 (С343), сходна с поглощением в области Q-полос Pt порфиринов (Лмакс = 510 нм, ? = 25800 М"1см"1), что подтверждает высокую эффективность FRET. С343 флуоресцирует с квантовым выходом Ффп = 0,75 в ДМФ и его значение о2 составляет около 25 GM. Brinas и др. показали, что четыре С343 фрагмента могут быть присоединены к PiTCPP (Pt мезо-тетра(4-карбоксифенил)
25 порфирин) посредством этилендиаминовых линкеров с использованием стандартной химии пептидов, получая простой FRET-улучшенный двухфотонный поглощающий фосфоресцентный зонд.
В этом случае кумариновые-343 (С343) фрагменты работают как антенные хромофоры, повышая абсорбцию дендритных зондов. Спектральное перекрывание
30 между флуоресценцией С343 и поглощением PdTBP в области Q-полос не большое, и Форстеровское разделительное расстояние г донор-акцептор (см. уравнение 2 выше) для этой пары оценивается в ~ 10А. Тем не менее, С343 фрагменты в молекуле (Фиг. 5) были отведены от порфирина на расстояние не более Форстеровского и когда наблюдается FRET с эффективностью > 95%. Остаточная флуоресценция С343,
35 которая зависит от кислорода, обеспечивает эталонный сигнал. Поглощение С343 будет распространяться на поглощение PdTBP в области полос Соре (УФ-видимый электронный спектр поглощения типичного порфиринового макроцикла состоит из
К заявке № ЕА201491551
сильного перехода ко второму возбужденному состоянию (S0 -> S2), демонстрируя ярко выраженную особенность (коэффициент экстинкции > 200000) примерно при 400 нм (полосы Соре или В-полосы) и слабый переход в первое возбужденное состояние (S0 -> Si) примерно при 550 нм (Q-полосы).) См. четырехорбитальную модель Гутермана 5 спектров поглощения порфиринов, например, Milgrom, "The Colours of Life: An Introduction to the Chemistry of Porphyrins and Related Compounds," Oxford, 1997; The Porphyrins, ed. D. Dolphin, Academic Press, New York, 1978). Это усовершенствование позволяет использовать несколько имеющихся лазерных диапазонов (различные длинноволновые лазеры для возбуждения).
10 Наконец, С343 содержит аминогруппу, свободная электронная пара которой
должна обеспечить хорошую мишень для синглетного кислорода, который образуется в результате гашения фосфоресценции, таким образом, обеззараживая и вызывая детоксикацию измеряемой среды. Синглетный кислород может образовываться при гашении фосфоресценции и он будет инактивировать любой синглетный кислород,
15 который образуется, прежде чем он может покинуть регион фосфора. Важно отметить, что, поскольку С343 является ароматическим амином (анилином), он не протонируется в физиологических условиях. Действительно, спектры флуоресценции зондов на основе С343, в том числе спектры двухфотонных улучшенных фосфоресцентных зондов (Brinas et al., J. Amer. Chem. Soc. 2005, 127:11851-11862 (2005); Finikova et al., J.
20 Physical Chem. Л 111:6977-6990 (2007); Finikova et al., Chem. Phys. Chem. 9: 1673-1679 (2008A)) не зависят от изменения рН в физиологическом диапазоне. Это не было бы так, если аминогруппы были протонированы.
D) Дендритные фосфоресцентные зонды, пригодные для измерения кислорода в жидких органических средах, например, органических 25 растворителях и маслах.
Настоящее изобретение относится к кислородным датчикам, которые могут быть предназначены для растворения в водной среде (для использования в биологических системах) или могут быть предназначены для растворения в органических средах (для использования в специальных кислородных датчиках для
30 любого процесса, в котором могут быть использованы органические среды, в том числе те, которые требуют органических сред). Этот специальный раздел служит для тех датчиков, которые лучше всего должны растворяться в органических средах, у которых внешняя оболочка отличается от оболочек, которые используют в среде на водной основе. Для достижения растворимости дендритных зондов в органических
35 средах концы дендримеров (например, карбоксильные группы) амидируют, используя 1-аминоалканы, или этерифицируют, используя 1-гидроксиалканы, для создания
супрамолекулярного гидрофобного внешнего слоя (Фиг. 6). Химические реакции для такой модификации и способы очистки напоминают вышеописанные процедуры для покрытия поверхности дендримеров ПЭГ группами. Но в результате добавления гидрофобного надмолекулярного внешнего слоя, датчики показали чрезвычайно 5 высокую растворимость в насыщенных углеводородах, ароматических минеральных маслах и других органических растворителях, тогда как без присоединения нового внешнего слоя зонд остается полностью нерастворимым в таких жидкостях.
Для того чтобы константа гашения кислорода (константа Штерна-Фольмера) зонда подходила для измерения кислорода в физиологическом диапазоне р02, были
10 испытаны полиарилглициновые или другие полиамидные дендримеры (а именно, полиглутаминовые, полиэфирамидные, полиариламидные). Эти дендримеры, хорошо складывающиеся в водных средах, а также в органических средах, служат для ослабления доступа кислорода к фосфоресцентным ядрам. Таким образом, по существу, одни и те же дендримеры могут быть использованы как в водных, так и в
15 гидрофобных средах, и только наружные слои ("супрамолекулярные") должны быть изменены.
В целом, представлены способы для существенного улучшения доступных в настоящее время чувствительных к кислороду фосфоров путем увеличения квантовой эффективности (интенсивности фосфоресценции) и расширения их области
20 применимости путем создания класса кислородных датчиков для измерений в органических средах. Таким образом, представлены способы по настоящему изобретению для синтеза новых структур порфирина, в которых порфирин является менее гибким и более плоским, с уменьшенным внутреннем гашением, и, таким образом, с увеличенной эмиссией фосфоресценции, используемой для зондирования
25 кислорода. Дополнительные способы представлены для структурного модифицирования дендримера, используемого для инкапсуляции порфиринового фомфора, чтобы обеспечить внутреннее гашения любого синглетного кислорода, образующегося при измерении кислорода. Кроме того, в настоящем изобретении представлен внешний слой, который контролирует растворимость зонда в целом. Если
30 зонд должен быть растворим в воде - добавляют внешний водорастворимый слой; тогда как, если зонд должен быть растворим в органических средах - добавляют внешний слой, который делает его совместимым с органикой. Эксперименты изобретателей показали, что арилглициновые дендримеры Gen 2 на основе Pd и Pt порфирина (AG2), модифицированные на периферии 1-гексадециламином, обладают
35 высокой (примерно мМ концентрация) растворимостью в различных органических растворителях (например, маслах, насыщенных углеводородах, ароматических минеральных маслах, бензоле, толуоле, гексане, октане, тетрагидрофуране,
К заявке № ЕА201491551
насыщенных алканах, минеральном масле, кулинарных жирах, маслах, используемых в пищевых продуктах или косметике, и органических жидкостях, используемых в анализах ткани и биологических анализах, а также в любых их эквивалентах), позволяющих измерять фосфоресценцию во всем диапазоне кислорода окружающей 5 среды: р02 = 0-160 мм. рт. ст.
Раскрытие каждого патента, патентной заявки и публикации, цитируемых или описанных в этом документе, включены здесь посредством ссылки во всей ее полноте.
Хотя вышеприведенное описание было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов и многие детали были изложены с целью иллюстрации
10 без отступления от сущности и объема изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что изобретение может быть объектом различных изменений и дополнительных вариантов и что некоторые из деталей, описанных в данном документе, могут значительно варьировать без отхода от основных принципов изобретения. Такие модификации и дополнительные варианты также входят в объем
15 прилагаемой формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фосфоресцентный порфириновый зонд, также упоминаемый как дендритный кислородный зонд, эффективный для измерения кислорода в тканях человека или животного, указанный дендритный кислородный зонд содержит порфирин, 5 включающий палладиевое или платиновое ядро и единственную систему из двух тт-арильных ароматических удлиняющих фрагментов, расположенных напротив друг друга по обе стороны от порфиринового ядра и радиально торчащих из него, и к которым периферически присоединены содержащие ди-арильные кольца дендроны, образуя дендримеры.
10 2. Фосфоресцентный зонд по п.1, в котором ди-арильные кольца добавляют к
мезо-незамещенным или 5,15 ди-арил-замещенным тт-протяженным порфиринам, причем арильные заместители находятся в мезо-незамещенном или 5,15 ди-арил замещенном тт-протяженном порфирине, который имеет ароматические удлиняющие фрагменты, расположенные напротив друг друга по обе стороны от порфиринового
15 ядра, затем присоединяют дендроны к свободным концам ди-арильных колец, таким образом, получая дендримеры, а затем вводят Pd или Pt в порфириновое ядро для создания фосфоресцентного зонда.
3. Способ применения палладиевого- или платиновогопорфиринового зонда по п.1, согласно которому при возбуждении зонд проявляет сильное поглощение света в
20 ближней инфракрасной области спектра, обеспечивая квантовый выход в 5-10 раз выше по сравнению с соответствующими тетраарилпорфиринами при измерении в тех же условиях и при той же температуре.
4. Способ улучшения дендримеризации палладиевого или платинового порфиринов, включающий следующие стадии: во время синтеза присоединение гибких
25 удлиняющих линкеров к якорным группам на мезо-арильных кольцах или непосредственно к порфириновому макроциклу, таким образом, дистанцируя реакционные центры на достаточное расстояние друг от друга, чтобы облегчить нуклеофильную атаку и уменьшение количества примесей из-за не полностью реагирующих дендримеров на стадии, увеличивающей выход и чистоту.
30 5. Способ улучшения дендримеризации порфиринов по п.4, дополнительно
включающий удлинение карбоксильных групп, используя аминобутиратные линкеры с тем, чтобы обеспечить синтез с высоким выходом монодисперсных дендритных кислородных зондов и/или улучшенную чувствительность и/или более высокую чистоту по сравнению с соответствующими фосфоресцентными порфиринами,
35 синтезированными с помощью тех же стадий: гидролиз периферийных сложноэфирных
групп, присоединение дендронов, гидролиз их периферийных сложноэфирных групп и ПЭГ-илирование, но без присоединения гибких удлиняющих линкеров к якорным группам в ходе синтеза.
6. Способ применения способа дендримеризации по п.5, используя
5 палладиевый или платиновый порфириновый зонд, согласно которому добавление
линкеров обеспечивает выход чистых монодисперсных дендритных кислородных зондов в 1 - 2 раза выше по сравнению с соответствующими фосфоресцентными порфиринами, синтезированными с помощью тех же стадий: гидролиз периферийных сложноэфирных групп, присоединение дендронов, гидролиз их периферийных 10 сложноэфирных групп и ПЭГ-илирование, но без присоединения гибких удлиненных линкеров к якорным группам в ходе синтеза в тех же условиях и при той же температуре.
7. Способ по п.5, дополнительно применяемый на первой стадии реакции в
синтезе 5, 15 диарил-тт-протяженных порфиринов.
15 8. Дендримеризовынный фосфоресцентный порфириновый зонд, также
упоминаемый как дендритный кислородный зонд, эффективный для измерения кислорода в тканях человека или животного, указанный дендритный кислородный зонд, полученный с помощью способа по п.5, содержащий добавленные гибкие удлиняющие линкеры присоединенные к якорной группе мезо-арильных колец или непосредственно
20 к порфириновому макроциклу, таким образом, дистанцируя реакционные центры на достаточное расстояние друг от друга, чтобы облегчить нуклеофильную атаку и уменьшить количество примесей из-за не полностью реагирующих дендримеров после реакции проходящей только в течение ночи при комнатной температуре.
9. Способ увеличения сечения процесса возбуждения фосфоресцентного
25 порфиринового зонда, включающий: добавление антенных хромофоров в
дендримерную порфириновую структуру для увеличения сечения процесса возбуждения зонда посредством внутримолекулярного флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET).
10. Способ увеличения сечений возбуждения фосфоресцентного
30 порфиринового зонда по п.9, дополнительно включающий стадии захвата
возбужденных фотонов антенными хромофорами и передачи энергии к порфирину
посредством FRET для спектрального разделения флуоресцентных сигналов от
фосфоресценции для того, чтобы обеспечить радиометрическое обнаружение
кислорода.
11. Применение способа по п. 10 для обеспечения возможности использования
имеющихся нескольких доступных диапазонов лазера, что эффективно делает датчики
в 5-10 раз ярче без увеличения их фототоксичности.
12. Фосфоресцентный порфириновый зонд, также упоминаемый как дендритный
5 кислородный зонд, эффективный для измерения кислорода в тканях человека или
животного, указанный дендритный кислородный зонд, полученный с помощью способа по п.8, содержит дендримеры, модифицированные путем включения в них функциональных групп в качестве антенных хромофоров для повышения абсорбции дендритным зондом.
10 13. Фосфоресцентный порфириновый зонд по п.12, дополнительно содержащий
функциональные хромофорные группы для предоставления электронных пар в качестве мишени для синглетного кислорода, а также для удаления синглетного кислорода из реакции.
14. Фосфоресцентный порфириновый зонд по п.12, дополнительно содержащий
15 функциональные хромофорные группы для уменьшения или исключения гашения как
синглета антенны (aSi), так и порфиринового триплета °Ti путем восстановительного фотоиндуцированного переноса электрона (ЕТ), который в противном случае может выступать в качестве конкурирующего нежелательного процесса гашения.
15. Фосфоресцентный порфириновый зонд по п.12, содержащий арил-
20 глициновые дендримеры, имеющие фрагменты кумарина-343 (С343) в качестве
антенных хромофоров для повышения абсорбции дендритными зондами.
16. Способ, делающий дендритный фосфоресцентный зонд подходящим для измерения кислорода в водных жидкостях, путем селективного добавления трехмерного супрамолекулярного гидрофильного внешнего слоя к концам
25 гидрофобных дендримеров.
17. Способ, делающий дендритный фосфоресцентный зонд подходящим для измерения кислорода в органических жидкостях, путем селективного добавления трехмерного супрамолекулярного гидрофобного внешнего слоя к концам гидрофобных дендримеров, в результате чего молекулы продолжают оставаться сложенными, но
30 становятся хорошо растворимыми в некоторых органических растворителях, что позволяет в них измерять кислород.
18. Способ по п.17, в котором органические растворители выбраны из группы, состоящей из масел, насыщенных углеводородов, минерального масла и ароматических минеральных масел, бензола, насыщенных алканов, тетрагидрофурана
18.
(ТГФ), толуола, гексана, октана, кулинарных масел, масел, используемых в пище или косметике, и органических жидкостей, используемых при анализе ткани и биологическом анализе.
19. Дендритный фосфоресцентный зонд, полученный с помощью способа по 5 п.17, содержащий избирательно добавляемый трехмерный супрамолекулярный гидрофобный внешний слой, прикрепленный к концам гидрофобных дендримеров, в результате чего молекула по-прежнему остается сложенной и в высшей степени растворяется в некоторых органических растворителях.
R = алкил, арил
Фиг. 2
Фиг. 3
ч**Ч -
Ч\ v v . v ¦•ЬЖс-
у ^
FRET, но нет ЕТ
О л,/
VMS1?4*-
Фиг. 5А
Фиг. 5С
H2N-(CH2)15CH3
HBTU, DIPEA DMF/CH2CI2,
комн. темп 7 дней
NH(CH2)15CH3 /=П NH(CH2)16CH3
n HN-
i/K b
H3C(H2C)15HN
H3C(H2C)16HN °
( P о t
HhA°
H3C(H2C)16HN H3C(H2C)15HN /4,
HJ о о н"7
W NH(CH2)16CH3 ° NH(CH2)15CH3 г
H3C(H2C)16HN H3C(H2C)16HN,/4
0 NH
cvNH
NHH о о > =y_4
4 У/ NH(CH2)15CH3
о o= <
NH(CH2)15CH3
NH(CH2)15CH3
NH (K, NH(CH2)16CH3
ГН oo w/i
VW" 0
O^NH
<*>
H3C(H2C)16HN W H3C(H2C)16HN °
Фиг. 6
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № EA201491551
К заявке № EA201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № EA201491551
К заявке № EA201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
1/7
1/7
К заявке № EA201491551
К заявке № EA201491551
2/7
2/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
3/7
3/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
4/7
4/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
5/7
5/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
5/7
5/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
5/7
5/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
5/7
5/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
6/7
6/7
К заявке № ЕА201491551
К заявке № ЕА201491551
7/7
7/7
К заявке № EA201491551
К заявке № EA201491551