[RU]

Изобретение относится к способам получения химических соединений, в частности, но не исключительно, этанола, путем микробной ферментации. Также описаны генетически модифицированные микроорганизмы, способные использовать моноксид углерода для получения одного или более продуктов, в частности, но не исключительно, этанола в качестве основного продукта, и вырабатывать сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или, по существу, не вырабатывать 2,3-бутандиол и/или его предшественник.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к способам получения химических соединений, в частности, но не исключительно, этанола, путем микробной ферментации. Также описаны генетически модифицированные микроорганизмы, способные использовать моноксид углерода для получения одного или более продуктов, в частности, но не исключительно, этанола в качестве основного продукта, и вырабатывать сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или, по существу, не вырабатывать 2,3-бутандиол и/или его предшественник.

---

РЕКОМБИНАНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Настоящее изобретение относится к способам получения химических соединений, в частности, но не исключительно, этанола, путем микробной 5 ферментации и генетически модифицированным микроорганизмам, применяемым в таких способах.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Известно, что ацетогенные микроорганизмы пригодны для получения топлива (например, этанола или бутанола) и других химических соединений
10 путем ферментации субстратов, включая, например, моноксид углерода, диоксид углерода, водород и метанол. В природе многие из данных микроорганизмов вырабатывают по меньшей мере два продукта, если не больше. Однако, в том случае, когда микроорганизмы используются для получения продуктов, особенно в промышленном масштабе, не всегда является желательным, чтобы
15 микроорганизмы вырабатывали большое количество продуктов. Например, выработка большого количества продуктов может наносить ущерб эффективности выработки и выходу продукта, представляющего особую ценность, так как побочные продукты могут отводить углерод из путей, вовлеченных в получение главного желательного продукта. Помимо этого,
20 побочные продукты могут являться токсичными по отношению к микроорганизму, получение большого количества продуктов может затруднять выделение и разделение желательных продуктов, и создавать сложности для контроля условий ферментации в пользу получения определенного продукта. Побочные продукты могут также являться потенциальным источником контаминации в
25 ферментере, так как они могут представлять собой субстраты для нежелательных организмов.
В случае получения этанола путем микробиологической ферментации субстратов, содержащих моноксид углерода, в качестве побочного продукта, как правило, вырабатывается 2,3-бутандиол. Это может снижать выход и
30 эффективность выработки этанола, а также вызывать другие проблемы, указанные выше.
Цель настоящего изобретения заключается в преодолении одного или более недостатков предшествующего уровня техники или по меньшей мере в обеспечении общества подходящей альтернативой.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Изобретение, в частности, относится к новым, генетически модифицированным микроорганизмам, способным использовать моноксид углерода для получения одного или более продуктов и вырабатывать сниженное 5 количество 2,3-будандиола и/или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации изобретения генетически модифицированный микроорганизм по существу не вырабатывает 2,3-бутандиол и/или его предшественник, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному конкретному варианту реализации 10 изобретения микроорганизм в качестве основного продукта вырабатывает этанол.
Согласно первому аспекту изобретения предложен карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, адаптированный для получения одного или более продуктов и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника, 15 или по существу отсутствия 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, при этом микроорганизм содержит одну или более генетических модификаций, которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола, по сравнению с исходным микроорганизмом.
20 Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения
предложен карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, адаптированный для получения этанола в качестве основного продукта и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника, или по существу отсутствия 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата,
25 содержащего моноксид углерода, при этом микроорганизм содержит одну или более генетических модификаций, которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола, по сравнению с исходным микроорганизмом.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для дополнительного выработки одного или более из: формиата,
30 лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для получения повышенного количества одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина,
35 ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата, по сравнению с исходным микроорганизмом.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм
содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает
экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных
превращать пируват в ацетолактат.
5 Согласно одному варианту реализации изобретения один или более
ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS).
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает 10 экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более
ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой
ацетолактатдекарбоксилазу (budA).
15 Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм
содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более 20 ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоинредуктазы, первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает 25 экспрессию и/или активность комбинации двух или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и/или ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения генетическая модификация нарушает экспрессию и/или активность одного или более из 30 следующих ферментов:
Ацетолактатсинтаза (alsS);
Ацетолактатдекарбоксилаза (BudA);
2,3-Бутандиолдегидрогеназа (2,3 bdh);
Ацетоинредуктаза; и
35 Первичная:вторичная алкогольдегидрогеназа.
Согласно одному варианту реализации изобретения генетическая модификация нарушает экспрессию и/или активность одного или более из:
Ацетолактатсинтазы (alsS); Ацетолактатдекарбоксилазы (BudA); и 2,3-Бутандиолдегидрогеназы (2,3 bdh);
Согласно одному варианту реализации изобретения одна или более 5 генетических модификаций нарушает один или более генов, кодирующих один или более из приведенных выше ферментов. Согласно одному варианту реализации изобретения одна или более генетических модификаций нарушает активность соединения, требуемого для экспрессии или активности одного или более приведенных выше ферментов. Согласно одному варианту реализации 10 изобретения одна или более генетических модификаций повышает уровень экспрессии или активность одного или более соединений, которые ингибируют экспрессию или активность одного или более из вышеприведенных ферментов.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм выбран из группы, включающей Clostridium autoethanogenum, Clostridium 15 ljungdahlii и Clostridium ragsdalei и родственные изоляты. Согласно другому варианту реализации изобретения указанная группа также включает Clostridium coskatii.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
20 Согласно второму аспекту изобретения предложен способ получения
карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, адаптированного для выработки одного или более продуктов и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника, или к отсутствию выработки 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата, содержащего моноксид
25 углерода, при этом указанный способ включает генетическое модифицирование карбоксидотрофного ацетогенного исходного микроорганизма с нарушением пути биосинтеза 2,3-бутандиола.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ приводит к повышенной выработки одного или более продуктов, по сравнению с исходным
30 микроорганизмом.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения предложен способ получения карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, адаптировнного для выработки этанола в качестве основного продукта и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника, или к
35 отсутствию выработки 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, при этом способ
включает генетическое модифицирование карбоксидотрофного ацетогенного исходного микроорганизма с нарушением пути биосинтеза 2,3-бутандиола.
Согласно изобретению также предложены микроорганизмы, полученные
способом согласно второму аспекту.
5 Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает
введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат. Согласно одному варианту реализации изобретения одним или более ферментов, 10 способных превращать пируват в ацетолактат, является ацетолактатсинтаза (alsS).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или 15 более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин. Согласно одному варианту реализации изобретения одним или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, является ацетолактдекарбоксилаза (budA).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает 20 введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, выбрано из 2,325 бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоин редуктазы, первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают комбинацию двух или более генов, кодирующих 30 фермент, способный превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и/или ацетоин в 2,3-бутандиол.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение в исходный микроорганизму одной или более модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более из: 35 ацетолактатсинтазы (alaS), ацетолактадекарбоксилазы (BudA) и 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3 bdh).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает введение генетической модификации, которая нарушает активность соединения, требуемого для экспрессии или активности одного или более из вышеупомянутых ферментов.
5 Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает
введение генетической модификации, которая повышает уровень экспрессии или активность одного или более соединений, которые ингибируют экспрессию или активность одного или более вышеупомянутых ферментов.
Согласно третьему аспекту изобретения предложен способ получения 10 одного или более продуктов. Согласно одному варианту реализации изобретения способ предназначен для получения одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения 15 предложен способ получения одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации изобретения, включая этанол и один или более других продуктов) путем микробной ферментации, включающий ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением одного или более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения и/или полученных способом согласно 20 второму аспекту изобретения. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более продуктов выбрано из группы, включающей сукцинат, лактат, формиат, валин, лейцин, пируват, изолейцин, ацетолактат, малат, фумарат, 2-оксоглутарат, цитрат.
Согласно изобретению также предложен способ снижения общего уровня 25 эмиссии в атмосферу углерода в результате производственного процесса.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает следующие стадии:
(а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий
культуру одного или более микроорганизмов согласно первому аспекту
30 изобретения и/или полученных способом согласно второму аспекту изобретения; и
(б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе с получением
одного или более из вышеупомянутых продуктов, предпочтительно включая
этанол.
35 Согласно другому варианту реализации изобретения способ включает
следующие стадии:
захват СО-содержащего газа, образованного в результате производственного процесса до высвобождения газа в атмосферу;
анаэробная ферментация СО-содержащего газа с получением одного или более из приведенных выше продуктов, предпочтительно включая этанол, с 5 помощью культуры, содержащей один или более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения и/или полученных способом согласно второму аспекту изобретения.
Согласно конкретным вариантам реализации аспектов способа микроорганизм поддерживают в водной культуральной среде.
10 Согласно конкретным вариантам реализации аспектов способа
ферментация субстрата происходит в биореакторе.
В предпочтительном варианте субстрат, содержащий СО, представляет собой газовый субстрат, содержащий СО. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит промышленный отработанный газ. Согласно
15 определенным вариантам реализации газ представляет собой отработанный газ со сталелитейного завода или синтез-газ.
Согласно одному варианту реализации субстрат в основном содержит большую долю СО, например, по меньшей мере примерно от 20% до примерно 100% СО по объему, от 20% до 70% СО по объему, от 30% до 60% СО по
20 объему и от 40% до 55% СО по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения субстрат содержит примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СО, или примерно 55% СО, или примерно 60% СО по объему.
Несмотря на то, что необязательно, чтобы субстрат содержал какое-либо
25 количество водорода, присутствие Н2 не является неблагоприятным для образования продукта согласно способам нястоящего изобретения. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения присутствие водорода приводит к улучшенной общей эффективности выработки спирта. Например, в конкретных вариантах реализации изобретения субстрат может содержать Н2:СО в
30 соотношении, равном приблизительно 2:1 или 1:1, или 1:2. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит примерно 30% или менее Н2 по объему, 20% или менее Н2 по объему, примерно 15% или менее Н2 по объему или примерно 10% или менее Н2 по объему. Согласно другим вариантам реализации изобретения субстратная фракция содержит низкие концентрации Н2,
35 например, меньше, чем 5%, или меньше, чем 4%, или меньше, чем 3%, или меньше, чем 2%, или меньше, чем 1%, или по существу не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество С02, например, такое как
от примерно 1% до примерно 80% С02 по объему, или от 1% до примерно 30% С02 по объему.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения способы дополнительно включают стадию выделения одного или более продуктов из 5 ферментативного бульона. Согласно одному варианту реализации изобретения этанол выделяют из ферментативного бульона. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более продуктов выделяют из ферментативного бульона, включая формиат, лактат, пируват, сукцинат, валин, лейцин, изолейцин, ацетолактат, малат, фумарат, цитрат и 2-оксоглутарат.
10 Согласно четвертому аспекту изобретения предложен один или более
продуктов, полученных способом согласно третьему аспекту. Согласно одному варианту реализации изобретения один или более продуктов выбраны из группы, состоящей из этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, цитрата и 2-оксоглутарата.
15 Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения один или более продуктов по меньшей мере включают этанол.
Согласно пятому аспекту изобретения предложен карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, у которого был нарушен один или более несущественных генов, по сравнению с исходным микроорганизмом.
20 Согласно шестому аспекту изобретения предложен способ получения
карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, у которого был нарушен один или более несущественных генов, при этом способ включает генетическое модифицирование одного или более несущественных генов у исходного микроорганизма.
25 Также согласно изобретению предложены микроорганизмы, полученные
способами согласно шестому аспекту.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более
несущественных генов представляет собой ген, кодирующий фермент, который
превращает ацетолактат в ацетоин и/или кодирующий фермент, который 30 превращает ацетоин в 2,3-бутандиол. Согласно одному варианту реализации
изобретения ферменты представляют собой ферменты, описанные в настоящей
заявке.
В определенных вариантах реализации изобретения микроорганизм выбран из группы, включающей Clostridium autoethanogenum, Clostridium 35 ljungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii, Butyribacterium limosum, Butyribacterium methylotrophicum, Acetobacterium woodii, Alkalibaculum bacchii,
Blautia producta, Eubacterium limosum, Moorella thermoacetica, Moorella thermautotrophica, Oxobacter pfennigii и Thermoanaerobacter kiuvi.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм выбран из группы, включающей Clostridium autoethanogenum, 5 Clostridium ljungdahlii и Clostridium ragsdalei. Согласно другому варианту реализации изобретения указанная группа также включает Clostridium coskatii.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Согласно седьмому аспекту изобретения предложен способ получения 10 одного или более продуктов путем микробной ферментации с применением одного или более микроорганизмов согласно пятому аспекту и/или полученных способом согласно шестому аспекту.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения предложен способ получения этанола и одного или более других продуктов путем 15 микробной ферментации, включающий ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением одного или более микроорганизмов согласно пятому аспекту и/или полученных способом согласно шестому аспекту.
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает следующие стадии:
20 (а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий
культуру одного или более микроорганизмов согласно пятому аспекту и/или
полученных способом согласно шестому аспекту; и
(б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе, с получением
одного или более продуктов.
25 Согласно другому варианту реализации изобретения способ включает
следующие стадии:
(а) захват СО-содержащего газа, полученного в результате
производственного процесса, до высвобождения газа в атмосферу;
(б) анаэробная ферментация СО-содержащего газа с получением одного
30 или более продуктов с помощью культуры, содержащей один или более
микроорганизмов согласно пятому аспекту и/или полученных способом согласно шестому аспекту.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более
продуктов представляет собой продукты, описанные в настоящей заявке.
35 Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат,
содержащий СО, представляет собой субстрат, описанный в настоящей заявке.
Также можно сказать, что изобретение в целом состоит из частей, элементов и признаков, посредством сслыки или прямо указанных в описании заявки, по отдельности или совместно, в любой или во всех комбинациях двух или более указанных частей, элементов или признаков, и при этом в настоящей 5 заявке упоминаются конкретные целые числа, которые имеют известные эквиваленты в области, к которой относится настоящее изобретение, причем такие известные эквиваленты считаются включенными в настоящую заявку, как если бы они были изложены по отдельности.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
10 Данные и другие аспекты настоящего изобретения, которые необходимо
учитывать во всех его новых аспектах, станут очевидными из следующего описания, которое приведено только в качестве примера, со ссылкой на сопровождающие фигуры, где:
На фигуре 1 показан метаболический путь от СО до 2,3-бутандиола у 2,315 бутандиол-вырабатывающих карбоксидотрофных ацетогенов (например, С. autoethanogenum DSM23693).
На фигуре 16 проиллюстрированы эффекты нокаутирования пути
биосинтеза 2,3-бутандиола у 2,3-бутандиол-вырабатывающих
карбоксидотрофных ацетогенов с перераспределением потока углерода в 20 сторону этанола, и показано получение из СО новых продуктов, например, сукцината, 2-оксоглутарата, формиата, валина, лейцина.
На фигуре 2 показан ген budA и его 5'- и З'-фланкирующие области в геноме С. autoethanogenum DSM23693. Также указаны праймеры, использованные для амплификации с помощью ПЦР (полимеразная цепная 25 реакция) и последующего клонирования фланкирующих фрагментов в плазмиду PMTL85141.
На фигуре 3 показана типичная плазмида pMTL85141-budA-ko, несущая 5'-и З'-фрагменты ДНК, фланкирующие ген budA, разделенные геном lacZ, для нокаута гена budA у С. autoethanogenum DSM23693.
30 На фигуре 4 показана типичная, используемая в изобретении плазмида
для метилирования.
На фигуре 5 показаны (А): графическое представление геномного участка С. autoethanogenum DSM23693 после нокаута гена budA и также указаны положение праймеров, используемых для скрининга мутантов с нокаутированным
35 геном budA С. autoethanogenum DSM23693, и ожидаемый размер ПЦР-продуктов из дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 и его соответствующего мутанта с
нокаутированным геном budA. (Б) Изображение электрофореза в агарозном геле при ПЦР-скрининге мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693. Полосы 1 и 9 демонстрируют ДНК-маркер на 1 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов) GeneRuler(tm) 1 kb Plus. Полосы 2-6 демонстрируют ПЦР-5 амплификацию целевого участка budA из геномной ДНК, выделенной из дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 (+ve, 2,7 т.п.н.) и из шести потенциальных мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693 (1-6, 2,2 т.п.н.), с праймерами Од09 и Од12г. Полосы 10-16 демонстрируют ПЦР с геномной ДНК, выделенной из дикого типа (+ve) С. autoethanogenum DSM23693 и
10 шести потенциальных мутантов с нокаутированным геном budA С. autoethanogenum DSM23693, с праймерами Og44f и Og45r, специфичными к внутреннему участку гена budA размером 273 п.н. (пар нуклеотидов) (*).
Фигура 6: подтверждение с помощью ПЦР вставки RAM в гены budA и 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693 с использованием праймеров Og44f /
15 Og45r и Og42f / Og43r.
На фигуре 7 показана скорость превращения ацетоина в бутандиол, осуществляемого при ферментации С. autoethanogenum DSM23693 и мутантом A2,3bdh ClosTron.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
20 Данное описание изобретения сопровождается перечнем
последовательностей, в котором перечислены следующие последовательности:
Seq. ID 1: нуклеотидная последовательность нуклеотидной последовательности гена budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 2: аминокислотная последовательность белка budA С. 25 autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 3: нуклеотидная последовательность 5'-фланкирующей области гена budA С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 4: нуклеотидная последовательность З'-фланкирующей
последовательности гена budA.
30 Seq ID 5-8 и 10 и 11: описаны ниже в таблице 1 настоящей заявки.
Seq. ID 9: нуклеотидная последовательность челночного вектора-плазмиды pMTL85141 Е. coli-Clostridium.
Seq. ID. 12: результат секвенирования нуклеотидной последовательности pMTL85141-budA-ko, демонстрирующий, что фланкирующие ДНК-фрагменты, 35 обнаруженные в плазмиде, не содержат мутаций.
Seq ID 13: ген 16S рРНКС. autoethanogenum (Y18178, Gl:7271109)
Seq ID 14: ген 16S pPHK колонии 1 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: идентичность (93%)
Seq. ID 15: ген 16S pPHK колонии 2 потенциального трансформанта с
нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (94%)
5 Seq. ID 16: ген 16S pPHK колонии 3 потенциального трансформанта с
нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (95%)
Seq. ID 17: ген 16S pPHK колонии 4 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (93%)
Seq. ID 18: ген 16S pPHK колонии 5 потенциального трансформанта с 10 нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (94%)
Seq. ID 19: ген 16S pPHK колонии 6 потенциального трансформанта с нокаутом по budA С. autoethanogenum DSM23693: (92%)
Seq ID 20. результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 1 С. 15 autoethanogenum DSM23693 с праймером Og09f. (92%)
Seq ID 21. результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 1 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Од 12г. (92%)
Seq ID 22. результат секвенирования нуклеотидной последовательности 20 ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 3 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Од 12г. (92%)
Seq ID 23. результат секвенирования нуклеотидной последовательности
ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 4 С.
autoethanogenum DSM23693 с праймером Од 12г. (92%)
25 Seq ID 24. результат секвенирования нуклеотидной последовательности
ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 5 С. autoethanogenum DSM23693 с праймером Og12r
Seq ID 25. результат секвенирования нуклеотидной последовательности ПЦР-продукта потенциального трансформанта с нокаутом по budA колонии 6 С. 30 autoethanogenum DSM23693 с праймером Og09f.
Seq ID 26. результат секвенирования нуклеотидной последовательности целевого участка budA С. autoethanogenum DSM23693 из клона 6 с праймером Од 12г.
Seq ID 27 и 28: описаны ниже в таблице 4 настоящей заявки
35 Seq 29 и 30: описаны ниже в таблице 4 настоящей заявки
SEQ ID 31: нуклеотидная последовательность нового гена метилтрансферазы, слитого с индуцибельным lac-промотором.
SEQ ID 32: последовательность белка новой метилтрансферазы.
SEQ ID 33: нуклеотидная последовательность плазмиды pGS20.
SEQJD NO 34: аминокислотная последовательность новой
алкогольдегидрогеназы из С. autoethanogeum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei.
5 SEQJD NO 35: нуклеотидная последовательность нового гена
алкогольдегидрогеназы из С. autoethanogeum.
SEQJD NO 36: нуклеотидная последовательность нового гена алкогольдегидрогеназы из С. Ijungdahlii.
SEQJD NO 37: нуклеотидная последовательность нового гена 10 алкогольдегидрогеназы из С. ragsdalei.
Seq. ID. 38: нуклеотидная последовательность малик-энзима 1 С. autoethanogenum
Seq. ID. 39: аминокислотная последовательность малик-энзима 1 С. autoethanogenum.
15 Seq. ID. 40: нуклеотидная последовательность малик-энзима 2 С.
autoethanogenum
Seq. ID. 41: аминокислотная последовательность малик-энзима 2 С. autoethanogenum
Seq. ID. 42: нуклеотидная последовательность малатдегидрогеназы С. 20 autoethanogenum
Seq. ID. 43: аминокислотная последовательность малатдегидрогеназы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 44: нуклеотидная последовательность пируватфосфатдикиназы С. autoethanogenum.
25 Seq. ID. 45: аминокислотная последовательность пируватфосфатдикиназы
С. autoethanogenum.
Seq. ID. 46: нуклеотидная последовательность пируваткарбоксилазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 47: аминокислотная последовательность пируваткарбоксилазы С. 30 autoethanogenum
Seq. ID. 48: нуклеотидная последовательность ФЕП-карбоксикиназы (фосфоенолпируват-карбоксикиназа) С. autoethanogenum.
Seq. ID. 49: аминокислотная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С. autoethanogenum
35 Seq. ID. 50: нуклеотидная последовательность субъединицы А
фумаратгидратазы С. autoethanogenum
Seq. ID. 51: аминокислотная последовательность субъединицы А фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 52: нуклеотидная последовательность субъединицы В
фумаратгидратазы С. autoethanogenum
5 Seq. ID. 53: аминокислотная последовательность субъединицы В
фумаратгидратазы С. autoethanogenum.
Seq. ID. 54: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 1 С. autoethanogenum
Seq. ID. 55: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 1 С. 10 autoethanogenum.
Seq. ID. 56: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 2 С. autoethanogenum.
Seq. ID. 57: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 2 С. autoethanogenum
15 Seq. ID. 58: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 3 С.
autoethanogenum.
Seq. ID. 59: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 3 С. autoethanogenum
Seq. ID. 60: нуклеотидная последовательность малик-энзима 1 С. 20 ragsdalei.
Seq. ID. 61: аминокислотная последовательность малик-энзима 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 62: нуклеотидная последовательность малатдегидрогеназы С. ragsdalei
25 Seq. ID. 63: аминокислотная последовательность малатдегидрогеназы С.
ragsdalei.
Seq. ID. 64: нуклеотидная последовательность пируватфосфатдикиназы С. ragsdalei.
Seq. ID. 65: аминокислотная последовательность пируватфосфатдикиназы 30 of С. ragsdalei.
Seq. ID. 66: нуклеотидная последовательность пируваткарбоксилазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 67: аминокислотная последовательность пируваткарбоксилазы С. ragsdalei
35 Seq. ID. 68: нуклеотидная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С.
ragsdalei.
Seq. ID. 69: аминокислотная последовательность ФЕП-карбоксикиназы С. ragsdalei
Seq. ID. 70: нуклеотидная последовательность субъединицы А
фумаратгидратазы С. ragsdalei
5 Seq. ID. 71: аминокислотная последовательность субъединицы А
фумаратгидратазы С. ragsdalei
Seq. ID. 72: нуклеотидная последовательность субъединицы В фумаратгидратазы С. ragsdalei.
Seq. ID. 73: аминокислотная последовательность субъединицы В 10 фумаратгидратазы С. ragsdalei
Seq. ID. 74: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 1 С. ragsdalei.
Seq. ID. 75: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 1 С. ragsdalei
15 Seq. ID. 76: нуклеотидная последовательность фумаратредуктазы 2 С.
ragsdalei
Seq. ID. 77: аминокислотная последовательность фумаратредуктазы 2 С. ragsdalei
Seq. ID 78: 5'-последовательность, расположенная выше гена budA, или 20 гомологичное плечо гена budA Clostridium Ijungdahlii
Seq. ID 79: З'-последовательность, расположенная ниже гена budA, или гомологичное плечо гена budA Clostridium Ijungdahlii
Seq. ID 80: 5'-последовательность, расположенная выше гена budA, или
гомологичное плечо гена budA Clostridium ragsdalei
25 Seq. ID 81: З'-последовательность, расположенная ниже гена budA, или
гомологичное плечо гена budA Clostridium ragsdalei
Seq ID 82: нуклеотидная последовательность направляющего участка ClosTron в budA С. autoethanogenum DSM23693
Seq ID 83: нуклеотидная последовательность направляющего участка 30 ClosTron в 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 84: олигонуклеотид Og42f, использованный для проведения скрининга мутантов A2,3bdh ClosTron.
Seq ID 85: олигонуклеотид Og43r, использованный для проведения
скрининга мутантов A2,3bdh ClosTron.
35 Seq. ID 86: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S pPHK,
амплифицированного из клона 2 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 87: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S pPHK, амплифицированного из клона 2 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера гР2.
Seq. ID 88: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК 5 клона 4 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1
Seq ID 89: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК
клона 4 A2,3bdh ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с
использованием праймера гР2
10 Seq. ID 90: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК
клона 1 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 91: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 1 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с 15 использованием праймера гР2.
Seq. ID 92: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК клона 3 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера fD1.
Seq ID 93: нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта 16S рРНК 20 клона 3 AbudA ClosTron С. autoethanogenum DSM23693, полученного с использованием праймера гР2.
Seq ID 94: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 95: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча гена 25 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 96 и 97: праймеры, использованные для амплификации 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 98 и 99: праймеры, использованные для амплификации З'-
гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
30 Seq. ID 100 и 101: фланкирующие праймеры, которые можно применять
для подтверждения нокаута гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 102: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 103: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча 35 гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 104 и 105: праймеры, использованные для амплификации 5'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 106 и 107: праймеры, использованные для амплификации З'-гомологичного плеча гена 2,3bdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 108 и 109: праймеры, которые можно применять для
подтверждения нокаута гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
5 Seq ID 110: нуклеотидная последовательность кассеты, направляющей
интрон группы II, для гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 111 и 112: фланкирующие праймеры, которые можно применять для подтверждения инсерционной инактивации гена SecAdh С. autoethanogenum DSM23693.
10 Seq ID 113: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча
гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 114: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 115 и 116: последовательности праймеров, использованных для 15 амплификации 5'-гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 117 и 118: последовательности праймеров, использованных для амплификации З'-гомологичного плеча гена alsS С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 119 и 120: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена alsS С. 20 autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 120: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 121: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча
гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
25 Seq. ID 123 и 124: последовательности праймеров, использованных для
амплификации 5'-гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 125 и 126: последовательности праймеров, использованных для амплификации З'-гомологичного плеча гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 127 и 128: последовательности фланкирующих праймеров, 30 которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvC С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 129: нуклеотидная последовательность 5'-гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 130: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча 35 гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 131 и 132: последовательности праймеров, использованных для амплификации 5'-гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 133 и 134: последовательности праймеров, использованных для амплификации З'-гомологичного плеча гена ilvl С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 135 и 136: последовательности фланкирующих праймеров, которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvl С. 5 autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 137: нуклеотидная последовательность 5'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 138: нуклеотидная последовательность З'-гомологичного плеча
гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
10 Seq. ID 139 и 140: последовательности праймеров, использованных для
амплификации 5'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 141 и 142: последовательности праймеров, использованных для амплификации 3'- гомологичного плеча гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq. ID 143 и 144: последовательности фланкирующих праймеров, 15 которые можно применять для подтверждения нокаута гена ilvB С. autoethanogenum DSM23693.
Seq ID 145: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, alsS
Seq ID 146: пример нуклеотидной последовательности, направляющей 20 интрон группы II ClosTron, ilvC
Seq ID 147: пример нуклеотидной последовательности, направляющей интрон группы II ClosTron, ilvl
Seq ID 148: пример нуклеотидной последовательности, направляющей
интрон группы II ClosTron, ilvB
25 Seq ID 149 и 150: олигонуклеотиды, которые можно применять для
скрининга мутантов ClosTron по alsS.
Seq ID 151 и 152: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron по ilvC.
Seq ID 153 и 154: олигонуклеотиды, которые можно применять для 30 скрининга мутантов ClosTron по ilvl.
Seq ID 155 и 156: олигонуклеотиды, которые можно применять для скрининга мутантов ClosTron по ilvB.
Для всех последовательностей использованы стандартные сокращения IUPAC (Международный союз теоретической и прикладной химии), см. 35 http://en.m.wikipedia.org/wiki/Nucleic acid notation#section 1. В качестве примера:
А Аденозин
С Цитидин G Гуанозин Т Тимидин
W А или Т
S С или G
М А или С
К G или Т
R А или G
Y С или Т
В С, G или Т
D A, G или Т
Н А, С или Т
V А, С или G
N или - любое основание (не пробел), А, С, G, Т
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее представлено описание настоящего изобретения, включающее его предпочтительные варианты реализации, данные в общих терминах. Изобретение дополнительно освещается в описании, представленном ниже в 5 настоящей заявке под заголовком "Примеры", в котором предложены экспериментальные данные, поддерживающие изобретение, конкретные примеры разных аспектов изобретения и средства реализации изобретения.
Согласно изобретению предложены микроорганизмы, способные вырабатывать один или более продуктов путем ферментации субстрата,
содержащего СО. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения предложены микроорганизмы, способные вырабатывать этанол или этанол и один или более других продуктов, путем ферментации субстрата, содержащего СО. Рекомбинантный микроорганизм вырабатывает по меньшей 5 мере сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм по существу не вырабатывает 2,3-бутандиол или его предшественника, по сравнению с исходным микроорганизмом.
С помощью исследований нокаута разных генов авторы настоящего
10 изобретения неожиданно обнаружили, что в том случае, когда у карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма нарушается путь биосинтеза 2,3-бутандиола, данный микроорганизм способен вырабатывать повышенные уровни формиата, лактата, сукцината, 2-оксоглутарата, валина, лейцина, изолейцина и этанола, по сравнению с исходным микроорганизмом. Авторы
15 настоящего изобретения также полагают, что микроорганизмы вырабатывают повышенные уровни пирувата и промежуточных соединений цикла ТКК (цикл трикарбоновых кислот): ацетолактата, малата, фумарата, цитрата, так данные соединения представляют собой предшественники выработки сукцината, 2-оксоглутарата и валина, лейцина и изолейцина. Это имеет ряд значительных
20 преимуществ. Одним главным преимуществом является повышение эффективности выработки этанола, включая более высокие уровни выработанного этанола. Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что повышенные уровни валина, лейцина, формиата, лактата и пирувата приводят к тому что, более
25 данных химических соединений являются доступными для микроорганизмов с поддержанием выработки этанола. Помимо этого ферментативные бульоны необходимо часто пополнять аминокислотами и другими химическими соединениями для обеспечения жизнеспособности и эффективности выработки микроорганизмов во время ферментации. Выработка валина, лейцина,
30 формиата, лактата и пирувата рекомбинантным микроорганизмом согласно изобретению избавляет от необходимости дополнять ферментативный бульон данными химическими соединениями, что может приводить к сокращению издержек. Кроме того, снижение или исключение выработки 2,3-бутандиола у микроорганизмов согласно изобретению имеет преимущества. 2,3-Бутандиол
35 может быть токсичным по отношению к микроорганизмам и, таким образом, может оказывать отрицательное действие на ферментацию и рост. Снижение или исключение 2,3-бутандиола из ферментативного бульона также создает
возможность для более легкого выделения этанола из бульона; обычно, и этанол и 2,3-бутандиол выделяют совместно и затем разделяют на последующей стадии. 2,3-Бутандиол также представляет собой источник потенциальной микробной контаминации в ферментере, так как он представляет собой субстрат 5 для многих нежелательных организмов. Помимо этого, сукцинат, 2-оксоглутарат, формиат, лактат, пируват, валин, лейцин и изолейцин имеют независимое экономическое значение, так как их можно использовать в целом ряде промышленных процессов и в качестве промежуточных соединений при получении получаемых из них химических продуктов.
10 Авторы настоящего изобретения впервые продемонстрировали
разрушение или нокаут гена, не являющегося существенным, у карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма. Соответственно, согласно другому аспекту изобретения также предложены карбоксидотрофные ацетогенные микроорганизмы, у которых, по сравнению с исходным
15 микроорганизмом, был нарушен один или более генов, не являющихся существенными, наряду со способами получения таких микроорганизмов и способами применения данных микроорганизмов. "Несущественный" ген представляет собой ген, который кодирует белок, не являющийся необходимым для выживания микроорганизма, так что микроорганизм может выживать без
20 добавления белка. Примеры несущественных генов включают гены, кодирующие ацетолактатдекарбоксилазу и 2,3-битандиолдегидрогеназу. Специалисты смогут идентифицировать несущественные гены с использованием стандартных методик в данной области техники, включая методы генной инженерии с нарушением генов (как описано в настоящей заявке), наряду со стандартными
25 анализами для исследования того, оказывают ли такие генетические модификации действие на выживаемость микроорганизмов.
Несмотря на то, что описание изобретения ниже в настоящей заявке фокусируется на нарушении пути биосинтеза 2,3-бутандиола в результате генетической модификации, следует учесть, что микроорганизмы согласно
30 изобретению при желании могут также включать одну или более дополнительных генетических модификаций (включая повреждение одного или более несущественных генов, не ассоциированных с путем биосинтеза 2,3-бутандиола). В случае аспекта изобретения, связанного с нарушением несущественных генов, следует учесть, что охвачены генетические модификации в генах, кодирующих
35 ферменты, отличные от тех, которые участвуют в пути 2,3-бутандиола.
Помимо этого, в то время как ниже описание в настоящей заявке может фокусироваться на выработки и выделении этанола в качестве основного
продукта, следует учесть, что изобретение можно применять для повышения уровня выработки одного или более продуктов, отличных от этанола или дополнительно к этанолу.
Определения
5 Термин "ферментативный бульон", как используется в настоящей заявка,
представляет собой культуральную среду, содержащую по меньшей мере питательную среду и бактериальные клетки.
Термин "челночный микроорганизм", как используется в настоящей заявке, представляет собой микроорганизм, у которого экспрессируется фермент
10 метилтрансфераза, и который отличается от целевого микроорганизма.
Термин "целевой микроорганизм", как используется в настоящей заявке, представляет собой микроорганизм, у которого экспрессируются гены, включенные в экспрессионную конструкцию/вектор, и который отличается от челночного микроорганизма.
15 Термин "основной продукт ферментации" предназначен для обозначения
одного продукта ферментации, который вырабатывается в самой высокой концентрации и/или с самым высоким выходом.
Термины "повышающаяся эффективность", "повышенная эффективность" и тому подобное, при использовании в связи с процессом
20 ферментации, включают повышение одной или более скоростей роста микроорганизмов, катализирующих ферментацию, скорости роста и/или выработки продукта, объема желательного продукта (такого как спирты), вырабатываемого на объем потребляемого субстрата, скорости выработки или уровня выработки желательного продукта, и относительной доли желательного
25 вырабатываемого продукта, по сравнению с другими продуктами ферментации, но не ограничиваются этим.
Следует понимать, что фраза "субстрат, содержащий моноксид углерода" и подобные термины включают любой субстрат, в котором моноксид углерода является доступным одному или более штаммам бактерий, например, для роста
30 и/или ферментации.
Фраза "газовый субстрат, содержащий моноксид углерода" и подобные фразы и термины включают любой газ, который содержит уровень моноксида углерода. В некоторых вариантах реализации изобретения субстрат содержит по меньшей мере от примерно 20% до примерно 100% СО по объему, от 20% до
35 70% СО по объему, от 30% до 60% СО по объему, и от 40% до 55% СО по объему. В конкретных вариантах реализации изобретения субстрат содержит
примерно 25%, или примерно 30%, или примерно 35%, или примерно 40%, или примерно 45%, или примерно 50% СО, или примерно 55% СО, или примерно 60% СО по объему.
Несмотря на то, что нет необходимости в том, чтобы субстрат содержал 5 какое-либо количество водорода, присутствие Н2 не является неблагоприятным для образования продукта согласно способам согласно изобретению. В конкретных вариантах реализации изобретения присутствие водорода приводит к улучшенной общей эффективности выработки спирта. Например, в конкретных вариантах реализации субстрат может иметь отношение Н2:СО, равное
10 приблизительно 2:1 или 1:1, или 1:2. Согласно одному варианту реализации субстрат содержит примерно 30% или менее Н2 по объему, 20% или менее Н2 по объему, примерно 15% или менее Н2 по объему или примерно 10% или менее Н2 по объему. Согласно другим вариантам реализации изобретения субстратная фракция содержит низкие концентрации Н2, например, меньше, чем 5%, или
15 меньше, чем 4%, или меньше, чем 3%, или меньше, чем 2%, или меньше, чем 1%, или по существу не содержит водорода. Субстрат может также содержать некоторое количество С02, например, такое, как от примерно 1% до примерно 80% С02 по объему, или от 1% до примерно 30% С02 по объему. Согласно одному варианту реализации изобретения субстрат содержит количество,
20 меньшее или равное примерно 20% С02 по объему. Согласно конкретным вариантам реализации изобретения субстрат содержит количество, меньшее или равное примерно 15% С02по объему, меньшее или равное примерно 10% С02по объему, меньшее или равное примерно 5% С02 по объему или по существу не содержит С02.
25 Согласно описанию, которое следует далее, варианты реализации
изобретения описаны в отношении доставки и ферментирования "газового субстрата, содержащего СО". Однако следует учесть, что газовый субстрат может быть предложен в альтернативных формах. Например, газовый субстрат, содержащий СО, может быть предложен растворенным в жидкости. По существу,
30 жидкость насыщена газом, содержащим моноксид углерода, и затем данную жидкость добавляют в биореактор. Этого можно достигнуть с применением стандартной методологии. В качестве примера, можно было бы использовать генератор дисперсии микропузырьков (Hensirisak et. al. Scale-up of microbubble dispersion generator for aerobic fermentation; Applied Biochemistry and Biotechnology
35 Volume 101, Number 3 / October, 2002). В качестве примера, газовый субстрат, содержащий СО, может быть адсорбирован на твердой подложке. Такие
альтернативные способы охвачены с помощью термина "субстрат, содержащий СО" и тому подобное.
Согласно конкретным вариантам реализации изобретения СО-содержащий газовый субстрат представляет собой промышленный отходящий 5 или отработанный газ. Следует понимать в широком смысле, что термин "промышленные отработанные или отходящие газы", включает любые СО-содержащие газы, полученные в результате производственного процесса, и включает газы, полученные в результате производства продуктов на основе черных металлов, производства продуктов на основе цветных металлов,
10 процессов переработки нефти, газификации угля, газификации биомассы, получения электрической энергии, получения сажи и производства кокса. Дополнительные примеры могут быть предложены по тексту настоящей заявки.
Если в контексте не указано иначе, фразы "ферментация", "процесс ферментации" или "реакция ферментации" и тому подобное, как используются в
15 настоящей заявке, предназначены для того, чтобы охватывать как фазу роста, так и фазу биосинтеза продукта процесса. Как будет описано далее в настоящей заявке, согласно некоторым вариантам реализации изобретения биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для ферментации. В связи с этим, следует понимать, что добавление металлов или композиций в
20 реакцию ферментации включает добавление либо в один из двух, либо в оба данных реактора.
Термин "биореактор" включает устройство для ферментации, состоящее из одного или более сосудов и/или конструкций башенного типа или расположения трубопроводов, которое включает корпусный реактор с
25 непрерывным перемешиванием (CSTR), реактор с иммобилизированными клетками (ICR), реактор со слоем со струйным течением жидкости (TBR), барботажную колонну, газлифтный ферментер, статический смеситель или другой сосуд или другое устройство, подходящее для контакта газ-жидкость. Как описано далее в настоящей заявке, согласно некоторым вариантам реализации
30 изобретения биореактор может содержать первый реактор для роста и второй реактор для ферментации. В связи с этим, при ссылке на добавление субстрата в биореактор или реакцию ферментации, под этим следует понимать добавление либо в один из двух, либо в оба данных реактора, где это уместно.
При использовании в отношении продуктов ферментации согласно
35 изобретению, фраза "один или более продуктов" и подобные фразы предназначены для того, чтобы включать, например, этанол, сукцинат, пируват, лактат, валин, формиат, изолейцин и лейцин. Согласно одному варианту
реализации изобретения фраза "один или более продуктов" может также включать один или более из: ацетолактата, малата, фумарата, цитрата и 2-оксоглутарата. Следует учесть, что способы согласно изобретению применимы к способам, предназначенным для получения или выделения этанола (отдельно 5 или в комбинации с другими продуктами) или получения и выделения продуктов, отличных от этанола.
Термин "ацетат" включает как отдельно ацетатную соль, так и смесь молекулярной или свободной уксусной кислоты и ацетатной соли, например, смесь ацетатной соли и свободной уксусной кислоты, присутствующую в
10 ферментативном бульоне, описанном в настоящей заявке. Отношение молекулярной уксусной кислоты к ацетату в ферментативном бульоне зависит от рН системы. Термины "сукцинат, пируват, лактат, формиат, ацетолактат, малат, фумарат, цитрат и 2-оксоглутарат" следует толковать аналогичным образом.
Если в контексте не указано иначе, ссылку на любое соединение
15 настоящей заявки, которое может существовать в одной или более изомерных форм (например, в D-, L-, мезо-, S-, R-, цис- или транс-форме), следует понимать в общем смысле, как включающую ссылку на любой один или более таких изомеров соединения. Например, следует понимать, что ссылка на "ацетоин" включает ссылку на один из двух или оба его D- и L-изомера.
20 "Экзогенные нуклеиновые кислоты" представляют собой нуклеиновые
кислоты, которые получены вне микроорганизма, в который их вводят. Экзогенные нуклеиновые кислоты могут происходить из любого соответствующего источника, включая, микроорганизм, в который они должны быть введены, штаммы или виды организмов, которые отличаются от организма,
25 в который они должны быть введены, но не ограничиваясь ими, или они могут быть искусственно или рекомбинантно созданы. Экзогенная нуклеиновая кислота может быть адаптирована для интеграции в геном микроорганизма, в который она должна быть введена, или к тому, чтобы оставаться в экстрахромосомном состоянии.
30 "Путь биосинтеза 2,3-бутандиола" представляет собой путь, состоящий из
реакций, включающих превращение пирувата в ацетолактат, ацетолактата в
ацетоин и ацетоина в 2,3-бутандиол.
"Нарушение пути биосинтеза 2,3-бутандиола" и подобные фразы, как
используются в настоящей заявке, предназначены для обозначения того, что 35 выработка 2,3-бутандиола снижена, или согласно одному варианту реализации
по существо исключена.
Подразумевается, что термин "предшественник 2,3-бутандиола" охватывает ацетоин и ацетолактат.
Фермент "способен превращать" первое соединение или субстрат во второе соединение или продукт, в том случае, если в своей активной форме он 5 может катализировать реакцию, в которой по меньшей мере часть первого соединения превращается во второе соединение.
Следует учитывать, что ссылка на "алкогольдегидрогеназу" включает алкогольдегидрогеназы, которые способны катализировать превращение кетонов (таких, как ацетоин) во вторичные спирты (такие, как 2,3-бутандиол) или
10 наоборот. Такие алкогольдегидрогеназы включают вторичные алкогольдегидрогеназы и первичные алкогольдегидрогеназы. "Вторичная алкогольдегидрогеназа" представляет собой алкогольдегидрогеназу, которая может превращать кетоны (такие как ацетоин) во вторичные спирты" (такие как 2,3-бутандиол) или наоборот. "Первичная алкогольдегидрогеназа" представляет
15 собой алкогольдегидрогеназу, которая может превращать альдегиды в первичные спирты или наоборот; однако, ряд первичных алкогольдегидрогеназ также способен катализировать превращение кетонов во вторичные спирты или наоборот. Данные алкогольдегидрогеназы могут также называться "первично-вторичными алкогольдегидрогеназами". Соответственно, согласно
20 определенным вариантам реализации изобретения следует учитывать, что ссылка на "2,3-бутандиолдкгидрогеназу" включает ссылку на 2,3-бутандиолдегидрогеназы, которые могут относиться к категории первичных, вторичных или первично-вторичных алкогольдегидрогеназ.
Следует понимать в широком смысле, что фраза "генетическая
25 модификация, которая нарушает" путь биосинтеза 2,3-бутандиола или экспрессию, или активность одного или более ферментов согласно изобретению включает любую генетическую модификацию, которая по меньшей мере снижает уровень биосинтеза 2,3-бутандиола, экспрессии или активность одного или более ферментов, или согласно одному варианту реализации изобретения по существу
30 блокирует экспрессию или активность одного или более ферментов или по существу предотвращает продукцию 2,3-бутандиола. Следует учитывать, что фраза включает, например: модификацию гена, кодирующего один или более ферментов, включая модификацию генетического регуляторного элемента, вовлеченного в экспрессию гена; введение нуклеиновой кислоты, которая
35 приводит в образованию белка, который снижает или ингибирует активность одного или более ферментов, или который снижает или предотвращает экспрессию одного или более ферментов; введение нуклеиновой кислоты,
которая экспрессирует нуклеиновую кислоту, которая адаптирована для блокирования экспрессии гена (например, антисмысловая РНК, миРНК (малая интерферирующая РНК), CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами)); снижение уровня или ингибирование белка, который 5 требуется для экспрессии или активности одного или более ферментов путем введения модификации в ген, кодирующий белок. Следует учесть, что белок, который требуется для экспрессии или активности одного или более ферментов, может действовать непосредственно на ген или один или более ферментов, или может действовать косвенно через другое соединение. Аналогичным образом,
10 белок, который снижает или ингибирует активность или экспрессию одного или более ферментов, может действовать непосредственно на ген или один или более ферментов, или может действовать косвенно через другое соединение.
Термин "генетическая модификация" следует понимать в широком смысле, и предполагается, что он включает, например, введение микроорганизму
15 одной или более экзогенных нуклеиновых кислот, введение мутации в сайт гена, добавление в геном или удаление из него одного или более нуклеотидов, замену одного или более нуклеотидов разными нуклеотидами, замену гена, удаление гена, добавление гена и тому подобное.
"Исходный микроорганизм" представляет собой микроорганизм,
20 использованный для получения рекомбинантного микроорганизма согласно изобретению. Согласно одному варианту реализации исходный микроорганизм может представлять собой микроорганизм, который встречается в природе (то есть микроорганизм дикого типа) или микроорганизм, который был предварительно модифицирован (генетически модифицированный или
25 рекомбинантный микроорганизм). Согласно вариантам реализации изобретения, связанным с микроорганизмами, которые вырабатывают сниженное количество 2,3-бутандиола или по существу его не вырабатывают, исходный микроорганизм представляет собой микроорганизм, который включает функциональный путь 2,3-бутандиола (включая микроорганизмы, которые встречаются в природе или
30 микроорганизмы, которые были предварительно модифицированы). Примеры исходных микроорганизмов, которые включают фуркциональный путь биосинтеза 2,3-бутандиола, включают Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei, Clostridium coskatii и родственные изоляты.
"Функциональный" путь биосинтеза 2,3-бутандиола представляет собой
35 путь биосинтеза 2,3-бутандиола, в котором микроорганизм может преворащать пируват в 2,3-бутандиол. Согалсно одному конкретному варианту реализации изобретения путь включает превращение пирувата в ацетолактат, ацетолактата в
ацетоин и ацетоина в 2,3-бутандиол. Согласно одному конкретному варианту реализации превращение пирувата в ацетолактат катализируется ацетолактатсинтазой, превращение ацетолактата в ацетоин катализируется ацетолактатдекарбоксилазой и превращение ацетоина в 2,3-бутанлиол 5 катализируется 2,3-бутандиолдегидрогеназой или ацетоинредуктазой.
Следует понимать в широком смысле, что термины "конструкции" или "векторы" нуклеиновой кислоты и подобные термины включают любую нуклеиновую кислоту (включая ДНК и РНК), подходящую для применения в качестве средства для переноса генетического материала в клетку. Следует
10 учитывать, что данные термины включают плазмиды, вирусы (включая бактериофаг), космиды и искусственные хромосомы. Конструкции или векторы могут включать один или более регуляторных элементов, точку начала репликации, сайт множественного клонирования и/или селектируемый маркер, наряду с другими элементами, сайтами и маркерами. Согласно одному
15 конкретному варианту реализации изобретения конструкции или векторы адаптированы для обеспечения повреждения гена, являющегося нативным для исходного микроорганизма. Согласно другому варианту реализации изобретения конструкции или векторы адаптированы для осуществления возможности экспрессии одного или более генов, кодируемых конструкцией или вектором.
20 Конструкции или векторы нуклеиновой кислоты включают голые нуклеиновые кислоты, а также нуклеиновые кислоты, приготовленные с одним или более агентов для облегчения доставки в клетку (например, нуклеиновая кислота, конъюгированная с липосомой, организм, в котором содержится нуклеиновая кислота).
25 По всему объему данного описания изобретения типичная информация о
последовательностях предоставлена для ферментов, применимых к изобретению (например, ацетолактатсинтаза, ацетолактатдекарбоксилаза, 2,3-бутандиолдегидрогеназа, ацетоинредуктаза). Данная информация предложена для идентификации типичных ферментов, применимых к изобретению, и для
30 того, чтобы позволить специалисту реализовывать конкретные варианты реализации изобретения на практике без неоправданного экспериментирования. Следует учесть, что нуклеотидные и аминокислотные последовательности для ферментов могут отличаться от одного микроорганизма к другому. Соответственно, изобретение не следует толковать, как ограничивающееся
35 данными конкретными вариантами реализации, а скорее как распространяющееся на нарушение ферментов, имеющих разные последовательности, но которые способны катализировать превращение
пирувата в ацетолактат, превращение ацетолактата в ацетоин и/или превращение ацетоина в 2,3-бутандиол. Типично, такие ферменты будут обладать по меньшей мере приблизительно 75% идентичностью аминокислотной последовательности с ферментом, приведенным в настоящей заявке в качестве 5 примера. Согласно конкретным вариантам реализации такие ферменты будут обладать по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью последовательности с ферментом, приведенным в настоящей заявке в качестве примера. На уровне нуклеиновой кислоты гены, кодирующие такие различные ферменты, будут обладать по меньшей мере приблизительно
10 75% гомологией последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент, приведенной в настоящей заявке в качестве примера. Согласно конкретным вариантам реализации такие нуклеиновые кислоты будут обладать по меньшей мере приблизительно 80%, 85%, 90%, 95% или 99% гомологией последовательности с нуклеиновой кислотой, кодирующей фермент,
15 приведенной в в настоящей заявке качестве примера.
Следует также учесть, что отличный фермент не обязательно должен иметь такой же уровень активности, как фермент, который конкретно приведен в настоящей заявке в качестве примера. Требуется лишь чтобы фермент имел некоторый уровень активности при катализе представляющего интерес
20 превращения. Специалисты быстро оценят другие такие ферменты, в частности, с учетом информации, содержащейся в настоящей заявке. Используемые анализы ферментов при оценке активностей ферментов для пути 2,3-бутандиола включают, например, анализ на основе теста Фогеса-Проскауэра, описанный Speckman и Collins (Specificity of the Westerfeld Adaptation of the Voges-Proskauer
25 Test, 1982, Appl. Environ. Microbiol. 44: 40-43) или Dulieu и Poncelet (Spectrophotometric assay of a-acetolactate decarboxylase, 1999, Enzy and Microbiol Technol, 25, 537-42).
Микроорганизмы
Как описано выше в настоящей заявке, согласно изобретению предложен 30 рекомбинантный микроорганизм, способный использовать моноксид углерода для выработки одного или более продуктов (согласно одному конкретному варианту реализации, этанола в качестве основного продукта) и вырабатывать сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или по существу не вырабатывать 2,3-бутандиол и/или его предшественника, по 35 сравнению с исходным микроорганизмом. Микроорганизм содержит одну или
более генетических модификаций (по сравнению с исходным микроорганизмом), которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола.
Как указано выше, согласно одному варианту реализации в качестве основного продукта микроорганизм вырабатывает этанол. Согласно одному 5 варианту реализации микроорганизм также вырабатывает один или более из: формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для выработки повышенного количества одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина,
10 по сравнению с исходным микроорганизмом. Согласно определенным вариантам реализации изобретения микроорганизм вырабатывает один или более из: ацетолактата, малата, цинтрата, фумарата, 2-оксоглутарата. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения микроорганизм адаптирован для получения повышенного количества одного или более из: ацетолактата, малата,
15 фумарата, 2-оксоглутарата.
Одна или более генетических модификаций предпочтительно нарушают экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин, ацетоин в 2,3-бутандиол. Согласно определенным вариантам реализации изобретения одна
20 или более генетических модификаций нарушают только превращение пирувата в ацетолактат, только превращение ацетолактата в ацетоин или только превращение ацетоина в 2,3-бутандиол. Согласно другим вариантам реализации изобретения одна или более генетических модификаций нарушают два или три из данных превращений.
25 Согласно одному варианту реализации один или более ферментов,
способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS).
Активность ацетолактатсинтазы способна превращать пируват в ацетолактат и является существенной для выработки аминокислот с
30 разветвленной цепью (включая валин, лейцин, изолейцин) (фигура 1). Один или более ферментов, обладающих активностью ацетолактатсинтазы, могут экспрессироваться в исходном микроорганизме. Типичную аминокислотную последовательность из С. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), С. Ijungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1,
35 ADK15400.1, ADK15400.1) и С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С. autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), С. Ijungdahlii
(СР001666.1 - CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) и С. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) могут быть получены из GenBank (генбанк). Однако, как ранее показано в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность 5 ферментов могут варьировать от одного микроорганизма к другому.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм может содержать более, чем один фермент, который способен превращать пируват в ацетолактат. В том случае, когда исходный микроорганизм содержит более, чем один фермент, который способен превращать пируват в
10 ацетолактат, можно вводить одну или более генетических модификаций так, чтобы нарушалась экспрессия и/или активность двух или более данных ферментов. В том случае, когда у исходного микроорганизма присутствует больше, чем один фермент, нарушение более одного такого фермента может приводить к повышению выработки сукцината, одного или более промежуточных
15 соединений цикла ТКК и/или этанола выше уровня, который может быть достигнут в случае, если нарушен только один фермент. Уровни выработки могут быть дополнительно повышены в результате нарушения каждого дополнительного фермента, присутствующего в исходном микроорганизме. Несмотря на то, что экспрессия и/или активность всех таких ферментов может
20 обеспечивать некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов, авторы настоящего изобретения не считают обязательным нарушать экспрессию и/или активность всех таких ферментов для получения пользы согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения нарушены по
25 меньшей мере два, три, четыре или пять ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат.
Согласно вариантам реализации изобретения, в которых превращение пирувата в ацетолактат по существу или полностью блокировано, рост микроорганизма и ферментация, осуществляемая с его помощью, могут
30 требовать добавления одной или более аминокислот, включая, например, валин, лейцин и изолейцин. Это может быть достигнуто любым способом, который обеспечивает доступность аминокислоты(т) для микроорганизма. В качестве примера, в культуральную среду, среды для роста или ферментации, в культуру микроорганизмов и/или ферментативный бульон можно добавлять одну или
35 более аминокислот. Согласно определенным вариантам реализации изобретения аминукислоту(ты) можно добавлять непосредственно в среды или бульон или добавлять в форме экстракта, например, дрожжевого экстракта.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу (bubA).
Активность ацетолактатдекарбоксилазы способна превращать
5 ацетолактат в ацетоин (фигура 1). Один или более ферментов, обладающих
активностью ацетолактатдекарбоксилазы, может экспрессироваться у исходного
микроорганизма. Информацию о типичной аминокислотной (AEI90717.1,
ADK13906.1, AEI90718.1) и нуклеотидной (HQ876011.1, СР001666.1 -
CLJU_c08380, HQ876012.1) последовательностях для
10 ацетолактатдекарбоксилазы из С. autoethanogeum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei можно получить из GenBank. Однако, как указано ранее в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность ферментов могут варьировать от одного микроорганизма к другому.
15 Согласно определенным вариантам реализации изобретения исходный
микроорганизм может содержать больше, чем один фермент, который способен превращать ацетолактат в ацетоин. Когда исходный микроорганизм содержит более, чем один такой фермент, одну или более генетических модификаций можно вводить таким образом, чтобы была нарушена экспрессия и/или
20 активность двух или более ферментов. В том случае, когда у исходного микроорганизма представлен более, чем один фермент, нарушение более, чем одного фермента может приводить к повышению выработки валина, лейцина, изолейцина, этанола, лактата, формиата и сукцината, и/или одного или более промежуточных соединений цикла ТКК выше уровня, которого можно достичь в
25 том случае, когда нарушен только один фермент. Уровни выработки могут быть дополнительно повышены путем нарушения каждого дополнительного фермента, представленного у исходного микроорганизма. В то время как нарушение экспрессии и/или активности всех таких ферментов может предоставлять некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов,
30 авторы настоящего изобретения не считают необходимым нарушать экспрессию и/или активность всех таких ферментов для достижения положительного эффекта согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, выбраны из группы,
35 включающей 2,3-бутандиолдегидрогеназу (2,3 bdh) и ацетоинредуктазу.
Активность 2,3-бутандиолдегидрогеназы способна превращать ацетоин в 2,3-бутандиол (фигура 1). Информацию о типичной аминокислотной (AEI90715.1,
ADK15380.1, AEI90716.1) и нуклеотидной последовательности (HQ876009.1,
СР001666.1 - CLJU_c23220, HQ876010.1) для 2,3-бутандиолдегидрогеназы из С.
autoethanogeum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei можно получить из GenBank. Один
или более ферментов, обладающих активностью ацетолактатсинтазы, может
5 экспрессироваться в исходном микроорганизме. В качестве примера авторы
настоящего изобретения обнаружили, что С. autoethanogenum, С. ragsdalei и С.
Ljungdahlii содержат дополнительную первично-вторичную
алкогольдегидрогеназу, способную превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Информация о типичной последовательности для данного фермента предложена 10 в SEQ ID NO 34, 35, 36 и 37. Однако, как указано выше в настоящей заявке, последовательность гена, кодирующего такие ферменты, и аминокислотная последовательность ферментов может варьировать от одного микроорганизма к другому.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения исходный
15 микроорганизм может содержать более одного фермента, который способен превращать ацетоин в 2,3-бутандиол. Когда исходный микроорганизм содержит больше, чем один такой фермент, можно вводить одну или более генетических модификаций таким образом, чтобы нарушалась экспрессия и/или активность двух или более ферментов. В случае, когда у исходного микроорганизма
20 представлен больше, чем один такой фермент, нарушение более одного такого фермента может приводить к повышению выработки валина, лейцина, изолейцина, этенола, лактата, формиата и сукцината, и/или одного или более промежуточных соединений цикла ТКК выше уровня, который может быть достигнут, если нарушен только один фермент. Уровни выработки можно
25 дополнительно повышать путем нарушения каждого дополнительного фермента, присутствующего у исходного микроорганизма. Несмотря на то, что нарушение экспрессии и/или активности всех таких ферментов может давать некоторое преимущество в отношении выработки желательных продуктов, авторы настоящего изобретения не считают необходимым нарушать экспрессию и/или
30 активность всех таких ферментов для достижения поожительного эффекта согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации изобретения нарушены по меньшей мере два или три фермента, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
35 Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм
выбран из группы ацетогенных карбоксидотрофных организмов, включающей виды Clostridium autoethanogenum, Clostridium Ijungdahlii, Clostridium ragsdalei,
Clostridium carboxidivorans, Clostridium drakei, Clostridium scatologenes, Clostridium
aceticum, Clostridium formicoaceticum, Clostridium magnum, Acetobacterium woodii,
Alkalibaculum bacchii, Moorella thermoacetica, Sporomusa ovate, Butyribacterium
methylotrophicum, Blautia producta, Eubacterium limosum, Thermoanaerobacter kiuvi.
5 Данные карбоксидотрофные ацетогены определяются способностью
использовать и хемоавтотрофно расти на газовом одноуглеродном (С1) источнике, таком как моноксид углерода (СО) и диоксид углерода (С02) с моноксидом углерода (СО) и/или водородом (Н2) в качестве источника энергии в анаэробных условиях с образованием ацетил-КоА, ацетата и других продуктов.
10 Они имеют один и тот же общий путь ферментации, путь Вуда-Льюнгдаля или восстановительный путь ацетил-КоА, и определяются наличием набора ферментов, содержащего следующие: моноксид углерода-дегидрогеназа (CODH), гидрогеназа, формиатдегидрогеназа, формилтетрагидрофолатсинтетаза, метилентетрагидрофолатдегидрогеназа,
15 формилтетрагидрофолатциклогидролаза, метилентетрагидрофолатредуктаза и моноксид углерода-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза (CODH/ACS), причем данная комбинация является характерной и уникальной для данного типа бактерий (Drake, Kusel, Matthies, Wood, & Ljungdahl, 2006). В отличие от хемогетеротрофного роста сахаросбраживающих бактерий, которые превращают
20 субстрат в биомассу, вторичные метаболиты и пируват, из которых образуются продукты (либо через ацетил-КоА или прямо), у ацетогенов субстрат направляется прямо на ацетил-КоА, из которого образуются продукты, биомасса и вторичные метаболиты.
Согласно одному варианту реализации изобретения микроорганизм
25 выбран из кластера карбоксидотрофных клостридий, содержащего виды С. autoethanogenum, С. Ijungdahlii и "С. ragsdalei" и родственные изоляты. Данные виды включают штаммы С. autoethanogenum JAI-1т (DSM10061) (Abrini, Naveau, & Nyns, 1994), С. autoethanogenum LBS1560 (DSM19630) (WO/2009/064200), С. autoethanogenum LBS1561 (DSM23693), С. Ijungdahlii PETCT (DSM13528 = ATCC
30 55383) (Tanner, Miller, & Yang, 1993), C. Ijungdahlii ERI-2 (ATCC 55380) (патент США 5593886), С. Ijungdahlii C-01 (ATCC 55988) (патент США 6368819), С. Ijungdahlii 0-52 (ATCC 55989) (патент США 6368819) или "С. ragsdalei Р11т" (ATCC ВАА-622) (WO 2008/028055) и родственные изоляты, такие как "С. coskatii" (патент США 2011/0229947) и их мутантные штаммы, такие как С. Ijungdahlii ОТА-1
35 (Tirado-Acevedo О. Production of Bioethanol from Synthesis Gas Using Clostridium Ijungdahlii. PhD thesis, North Carolina State University, 2010), но не ограничиваются ими.
Данные штаммы образуют подкластер в пределах кластера I клостридиальной рРНК (Collins et al., 1994), характеризующийся по меньшей мере 99% идентичностью на уровне гена 16S рРНК, несмотря на принадлежность к разным видам, как определено экспериментами по ДНК-ДНК-реассоциации и 5 ДНК-фингерпринтингу (WO 2008/028055, патент США 2011/0229947).
Штаммы данного кластера определяются общими характеристиками, имея как похожий генотип, так и фенотип, и все они имеют общий путь сохранения энергии и метаболизма на основе ферментации. У штаммов данного кластера отсутствуют цитохромы, и они сохраняют энергию через Rnf-комплекс.
10 Все штаммы данного кластера имеют размер генома около 4,2 млн.п.н.
(миллион пар нуклеотидов) (Корке et al., 2010) и состав GC около 32 мол.% (Abrini et al., 1994; Корке et al., 2010; Tanner et al., 1993) (WO 2008/028055; патент США 2011/0229947), и опероны консервативных основных существенных генов, кодирующих ферменты пути Вуда-Льюнгдаля (моноксид углерода-дегидрогеназа,
15 формилтетрагидрофолатсинтетаза, метилентетрагидрофолатдегидрогеназа,
формилтетрагидрофолатциклогидролаза, метилантетрагидрофолатредуктаза и
моноксид углерода-дегидрогеназа/ацетил-КоА-синтаза), гидрогеназу,
формиатдедирогеназу, Rnf-комплекс (rnfCDGEAB), пируват:
ферредоксиноксидоредуктазу, альдегид:ферредоксиноксидоредуктазу (Корке et
20 al., 2010, 2011). Было обнаружено, что организация и число генов пути Вуда-Льюнгдаля, ответственных за поглощение газа, является одинаковой у всех видов, несмотря на различия в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях (Корке et al., 2011).
Все штаммы имеют похожую морфологию и размер (клетки, находящиеся
25 на логарифмической фазе роста, имеют размер между 0,5-0,7 х 3-5 мкм), являются мезофильными (оптимальная температура для роста составляет 30-37°С) и строгими анаэробами (Abrini et al., 1994; Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). Кроме того, все они имеют одинаковые основные филогенетические характеристики, такие как один и тот же диапазон рН (рН 4-7,5,
30 с оптимальным исходным рН 5,5-6), сильный автотрофный рост на СО-содержащих газах с похожими скоростями роста и метаболический профиль с этанолом и уксусной кислотой в качестве основных конечных продуктов ферментации, с небольшими количествами 2,3-бутандиола и молочной кислоты, образующимися в определенных условиях (Abrini et al., 1994; Корке et al., 2011;
35 Tanner et al., 1993)(WO 2008/028055). Продукцию индола наблюдали для всех видов. Однако, виды отличаются по использованию в качестве субстрата разных Сахаров (например, рамнозы, арабинозы), кислот (например, глюконата, цитрата),
аминокислот (например, аргинина, гистидина) или других субстратов (например, бетаина, бутанола). Было обнаружено, что некоторые виды являются ауксотрофными в отношении определенных витаминов (например, тиамина, биотина), в то время как другие не являются. В ряду данных микроорганизмов 5 было показано восстановление карбоксильных кислот до их соответствующих спиртов (Perez, Richter, Loftus, & Angenent, 2012).
Вследствие этого, описанные характеристики не являются специфичными по отношению к одному организму, такому как С. autoethanogenum или С. Ijungdahlii, а скорее являются общими характеристиками для карбоксидотрофных,
10 синтезирующих этанол клостридий. Таким образом, можно ожидать, что изобретение работает со всеми данными штаммами, хотя могут существовать различия в реализации.
Согласно некоторым вариантам реализации изобретения исходный микроорганизм выбран из группы, включающей Clostridium autoethanogenum,
15 Clostridium Ijungdahlii и Clostridium ragsdalei. Согласно одному варианту реализации изобретения группа также включает Clostridium coskatii. Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
Исходные микроорганизмы можно модифицировать с получением
20 микроорганизмов согласно изобретению, используя любое число известных методик трансформации и генной инженерии нуклеиновых кислот. Такие методики описаны, например, у Sambrook et al, (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). В качестве другого примера, можно использовать методологию, описанную ниже в
25 настоящей заявке в разделе "Примеры".
В качестве общего примера, в случае введения в ген мутации или другого нарушения или нокаутирования гена, для нарушения гена может быть сконструирована соответствующая конструкция или вектор нуклеиновой кислоты для интеграции в геном исходного микроорганизма. Такие конструкции типично
30 будут содержать последовательности (плечи) нуклеиновых кислот, гомологичные участку в пределах гена или фланкирующему ген, подлежащий нарушению, что обеспечивает прохождение гомологичной рекомбинации, и введение мутации, вырезание участка нуклеиновой кислоты из гена или, наоборот, замену участка гена нуклеотидной последовательностью. Несмотря на то, что предпочтительным
35 является, чтобы плечи в конструкциях обладали 100% комплементарностью по отношению к участку в геноме, на который они нацелены, это не является обязательным, при условии, что последовательность достаточно
комплементарна для обеспечения нацеленной рекомбинации с интересующим
участком гена. Типично, плечи будут иметь уровень гомологии, который
обеспечит гибридизацию с участком-мишенью в жестких условиях, как
определено у Sambrook et al 1989.
5 Специалисты определят последовательности нуклеиновых кислот,
достаточные для обеспечения нацеленной гомологичной комбинации и интеграции экзогенной нуклеиновой кислоты в геном исходного микроорганизма, учитывая доступную информацию о последовательностях для ферментов, вовлеченных в путь биосинтеза 2,3-бутандиола. Однако, в качестве примера, в
10 случае budA, можно использовать фланкирующие гомологичные плечи, описанные в настоящей заявке (например, Seq ID 3, 4 и 78-81), или в случае С. Ljungdahlii, сконструированные на основе информации о нуклеотидной последовательности в Genbank (СР001666.1). "В качестве другого примера, фланкирующие области генов, кодирующих ферменты, подлежащие нарушению,
15 согласно изобретению можно определять на основе информации о геномных последовательностях из соответствующих микроорганизмов. В качестве конкретного примера, фланкирующую последовательность в C.ljundahlii можно определить на основе информации в CP001666.1GenBank.
В качестве другого общего примера, где в исходный микроорганизм вводят
20 нуклеиновую кислоту для экспрессии белка или нуклеиновую кислоту, которая ингибирует экспрессию или активность фермента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, или для экспрессии белка, который повышает экспрессию соединения, которое ингибирует экспрессию или активность фермента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, конструкцию будут конструировать таким образом,
25 чтобы обеспечить экспрессию белка в микроорганизме. Типично, конструкция будет включать соответствующие регуляторные элементы, включая промотор. Можно использовать конститутивный или индуцибельный промоторы.
Когда в изобретении используется прямое нарушение гена путем введения мутации или тому подобное, конструкция или вектор, применяемые для
30 трансформации исходного микроорганизма, будут адаптированы для интеграции в геном микроорганизма, как указано выше. В случае экспрессии белка или нуклеиновой кислоты, которая адаптирована для нарушения экспрессии или активности фермента в пути биосинтеза 2,3-бутандиола, или повышения экспрессии или активности ингибитора фермента, вовлеченного в данный путь,
35 конструкции могут оставаться экстрахромосомными при трансформации исходного микроорганизма или могут быть адаптированы для интеграции в геном микроорганизма. Соответственно, используемые в изобертении конструкции
могут содержать нуклеотидные последовательности, адаптированные для содействия интеграции (например, область, которая обеспечивает гомологичную рекомбинацию и нацеленную интеграцию в геном хозяина) или экспрессии и репликации экстрахромосомной конструкции (например, точка начала 5 репликации, промотор и другие регуляторные последовательности).
Конструкции нуклеиновой кислоты, применяемые в изобретении, можно конструировать с использованием любого числа методик, являющихся стандартными в данной области техники. Например, можно использовать методики химического синтеза или генной инженерии. Такие методики описаны,
10 например, у Sambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Другие типичные методики описаны в настоящей заявке ниже в разделе "Примеры". По существу, отдельные гены, регуляторные элементы, гомологичные плечи и тому подобное будут функционально связаны один с другим, так чтобы они могли осуществлять
15 свою желательную функцию. Подходящие векторы для применения в изобретении будут определены обычными специалистами в данной области техники. Однако в качестве примера могут быть подходящими следующие векторы: pMTL, pIMP, pJIR и плазмиды, приведенные ниже в настоящей заявке в качестве примера в разделе "Примеры".
20 Следует учесть, что нуклеиновые кислоты, применяемые для получения
микроорганизмов согласно изобретению, могут быть представлены в любой соответствующей форме, включая РНК, ДНК или кДНК (комплементарная ДНК), включая двухцепочечные и одноцепочечные нуклеиновые кислоты.
Одну или более экзогенных нуклеиновых кислот можно доставлять в
25 исходный микроорганизм в виде голых нуклеиновых кислот или можно приготовить с одним или более агентов для облегчения процесса трансформации (например, нуклеиновая кислота, конъюгированная с липосомой, организм, в котором содержится нуклеиновая кислота). Одна или более нуклеиновых кислот может представлять собой ДНК, РНК или их комбинации, в зависимости от
30 ситуации.
Микроорганизмы согласно изобретению можно получать из исходного микроорганизма и одной или более экзогенных нуклеиновых кислот с использованием любого числа методик, известных в данной области техники, для получения рекомбинантных микроорганизмов. Только в качестве примера, 35 трансформация (включая трансдукцию или трансфекцию) может быть достигнута с помощью электропорации, конъюгации, индукции профага или химической и естественной компетентности. Подходящие методы трансформации описаны,
например, в Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbour Labrotary Press, Cold Spring Harbour, 1989.
В качестве другого примера, можно использовать методы электропорации, описанные в: Koepke et al. 2010, Рос. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 107: 13087-92; 5 PCT/NZ2011/000203; WO2012/053905; Straetz et al., 1994, Appl. Environ. Microbiol. 60:1033-37; Mermelstein etal., 1992, Biotechnology, 10, 190-195; Jennert et al., 2000, Microbiology, 146: 3071-3080; Tyurin et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70: 883890; В качестве другого примера, возможно использовать методы индукции профага, описанные в Prasanna Tamarapu Parthasarathy, 2010, Development of a 10 Genetic Modification System in Clostridium scatologenes ATCC 25775 for Generation of Mutants, Masters Project Western Kentucky University. В качестве другого примеравозможно использовать методы конъюгации, описанные в Herbert et al., 2003, FEMS Microbiol. Lett. 229: 103-110 или Williams et al., 1990, J. Gen. Microbiol. 136: 819-826.
15 Согласно определенным вариантам реализации, благодаря
рестрикционным системам, которые активны в микроорганизме, подлежащем трансформации, необходимо метилировать нуклеиновую кислоту, подлежащую введению в микроорганизм. Это может быть выполнено с использованием множества методик, включая методики, описанные ниже и дополнительно
20 приведенные в качестве примера в настоящей заявке ниже в разделе "Примеры".
В качестве примера, согласно одному варианту реализации
рекомбинантный микроорганизм согласно изобретению получают способом,
который включает следующие стадии:
25 введение в челночный микроорганизм (i) конструкции/вектора,
подлежащего введению в исходный микроорганизм, как описано в настоящей заявке, и (и) конструкцию/вектор для метилирования, содержащий ген метилтрансферазы;
экспрессия гена метилтрансферазы;
30 выделение одной или более конструкций/векторов из челночного
микроорганизма;
введение одной или более конструкций/векторов в целевой микроорганизм.
35 Согласно одному варианту реализации ген метилтрансферазы стадии Б
экспрессируется конститутивно. Согласно другому варианту реализации экспрессию гена метилтрансферазы стадии Б индуцируют.
Челночный микроорганизм представляет собой микроорганизм, предпочтительно микроорганизм, негативный по отношению к рестрикции, который облегчает метилирование нуклеотидных последовательностей, которые составляют экспрессионную конструкцию/вектор. Согласно конкретному варианту 5 реализации челночный микроорганизм представляет собой негативные по отношению к рестрикции Е. coli, Bacillus subtillis или Lactococcus lactis.
Конструкция/вектор для метилирования содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую метилтрансферазу.
При введении в челночный микроорганизм экспрессионной
10 конструкции/вектора и конструкции/вектора для метилирования, индуцируют ген метилтрансферазы, находящийся в конструкции/векторе для метилирования Индукция может осуществляться с помощью любой подходящей промоторной системы, хотя согласно одному конкретному варианту реализации изобретения конструкция/вектор для метилирования содержит индуцибельный lac-промотор
15 (например, как в SEQJD NO 31) и индуцируется в результате добавления лактозы или ее аналога, более предпочтительно изопропил-р-О-тио-галактозида (IPTG). Другие подходящие промоторы включают систему ara, tet или Т7. Согласно другому варианту реализации изобретения промотор конструкции/вектора для метилирования представляет собой конститутивный
20 промотор.
Согласно конкретному варианту реализации конструкция/вектор для метитилирования имеет точку начала репликации, специфичную для идентификации челночного микроорганизма, так чтобы любые гены, находящиеся в конструкции/векторе для метилирования, экспрессировались в 25 челночном микроорганизме. Предпочтительно, конструкция/вектор, подлежащие введению в исходный микроорганизм, имеют точку начала репликации, специфичную для идентификации микроорганизма.
Экспрессия фермента метилтрансферазы приводит к метилированию генов, находящихся в конструкции/векторе, подлежащем введению в исходный 30 микроорганизм. Конструкцию/вектор можно затем выделять из челночного микроорганизма согласно любому из ряда известных способов. Только в качестве примера для выделения конструкции/вектора можно использовать методологию, описанную в разделе "Примеры", описанном ниже в настоящей заявке.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения 35 параллельно выделяют как конструкцию, так и вектор.
Конструкцию/вектор, сконструированные для исходного микроорганизма, можно вводить в микроорганизм с использованием любого числа известных
способов. Однако, в качестве примера, можно использовать методологию, описанную ниже в настоящей заявке в разделе "Примеры".
Предполагается, что ген метилтрансферазы можно вводить в челночный микроорганизм и сверхэкспрессировать. Таким образом, согласно одному 5 варианту реализации изобретения полученный фермент метилтрансфераза можно собирать с применением известных способов и применять in vitro для метилирования конструкции, подлежащей введению в исходный микроорганизм. Конструкцию/вектор можно затем вводить в целевой (исходный) микроорганизм. Согласно другому варианту реализации ген метилтрансферазы вводят в геном 10 челночного микроорганизма с последующим введением конструкции, сконструированной для исходного микроорганизма, в челночный микроорганизм, выделением одной или более конструкций/векторов из челночного микроорганизма и затем введением конструкции/вектора в целевой (исходный) микроорганизм.
15 Предполагается, что конструкцию/вектор, сконструированный для
исходного микроорганизма, и конструкцию/вектор для метилирования, как определено выше, можно объединять для получения композиции материала. Такая композиция имеет особенную практическую ценность в преодолении барьерных механизмов по отношению к рестрикции для получения
20 рекомбинантных микроорганизмов согласно изобретению.
Согласно одному конкретному варианту реализации изобретения конструкция/вектор, описанные выше в настоящей заявке, представляют собой плазмиды.
Специалист определит ряд подходящих метилтрансфераз, используемых 25 при получении микроорганизмов согласно изобретению. Однако в качестве примера можно применять метилтрансферазу фага ФТ1 Bacillus subtilis и метилтрансферазу, описанную ниже в настоящей заявке в разделе "Примеры". Нуклеиновые кислоты, кодирующие подходящие метилтрансферазы, будут быстро оценены с учетом последовательности желательной метилтрансферазы 30 и генетического кода. Согласно одному варианту реализации нуклеиновая кислота, кодирующая метилтрансферазу, описана ниже в настоящей заявке в разделе "Примеры" (например, нуклеиновая кислота SEQJD NO. 31).
Любое число конструкций/векторов, адаптированных для обеспечения экспрессии гена метилтрансферазы, можно применять для получения 35 конструкции/вектора для метилирования. Однако, в качестве примера, можно применять плазмиду, описанную ниже в настоящей заявке в разделе "Примеры".
Из информации, содержащейся в настоящей заявке, следует учесть, что можно разрабатывать генетическую модификацию исходного микроорганизма для содействия выработки одного или более продуктов, превышающей продукцию одного или более других продуктов. Например, нарушение 5 превращения пирувата в ацетолактат способствует выработки лактата, формиата, малата, фумарата, цитрата, сукцината и 2-оксоглутарата с превышением выработки валина, лейцина и изолейцина.
Способ получения
Согласно изобретению предложен способ получения одного или более 10 продуктов путем микробной ферментации, включаяющий ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением микроорганизма согласно изобретению. Согласно одному конкретному варианту реализации способ предназначен для получения этанола или одного или более других продуктов в результате микробной ферментации, включающий ферментацию субстрата, 15 содержащего СО, с применением микроорганизма согласно изобретению. Способы согласно изобретению можно применять для снижения общего уровня эмиссии углерода в атмосферу, являющейся результатом производственного процесса.
Предпочтительно, ферментация включает стадии ферментации субстрата 20 в биореакторе в анаэробных условиях с получением одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации этанола или этанола и одного или более других продуктов) с применением рекомбинантного микроорганизма согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации способ включает следующие 25 стадии:
(а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий
культуру одного или более микроорганизмов согласно первому аспекту
изобретения; и
(б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе, с получением
30 одного или более продуктов (согласно одному варианту реализации изобретения,
включая этанол).
Согласно одному варианту реализации изобретения способ включает следующие стадии:
i. захват СО-содержащего газа, образованного в результате 35 производственного процесса, перед высвобождением газа в атмосферу;
ii. ферментация в анаэробных условиях СО-содержащего газа с
образованием одного или более продуктов (согласно одному варианту
реализации, включая этанол), осуществляемая культурой, содержащей один или
более микроорганизмов согласно первому аспекту изобретения.
5 Согласно варианту реализации изобретения газовый субстрат,
подвергающийся ферментации микроорганизмом, представляет собой газовый субстрат, содержащий СО. Газовый субстрат может представлять собой СО-содержащий отработанный газ, полученный в качестве побочного продукта производственного процесса или из какого-либо другого источника, например, из
10 автомобильных выхлопных газов. Согласно некоторым вариантам реализации производственный процесс выбран из группы, состоящей из производства продуктов на основе черных металлов, например, сталелитейного завода, производства продуктов на основе цветных металлов, процессов переработки нефти, газификации угля, получения электрической энергии, получения сажи,
15 получения аммиака, очистки природного газа, получения метанола и производства кокса. Согласно данным вариантам реализации СО-содержащий газ можно захватывать из производственного процесса перед тем, как он высвободится в атмосферу, используя любой удобный способ. СО может представлять собой компонент синтез-газа (газа, содержащего моноксид
20 углерода и водород). СО, полученный из производственных процессов, обычно сжигают с получением С02 и, вследствие этого, изобретение имеет конкретную практическую ценность, заключающуюся в снижении эмиссии парникового газа С02 и получении бутанола для применения в качестве биотоплива. В зависимости от состава газового СО-содержащего субстрата, может быть также
25 желательным его обрабатывать для удаления каких-либо нежелательных примесей, таких как частицы пыли, перед введением его в ферментацию. Например, газовый субстрат можно фильтровать или промывать с использованием известных способов.
Следует принимать во внимание, что для того, чтобы происходил рост
30 бактерий и превращение СО в этанол (и/или другой(гие) продукт(ты)), помимо СО-содержащего субстратного газа в биореактор будет нужно подавать подходящую жидкую питательную среду. В биореактор субстрат и среды можно подавать непрерывно, партиями или в виде периодической ферментации с добавлением субстрата. Питательная среда будет содержать витамины и
35 минеральные вещества, достаточные для обеспечения роста используемого микроорганизма. Анаэробные среды, подходящие для ферментации для получения этанола (или возможно одного или более других пролуктов) с
использованием СО, известны в данной области техники. Например, подходящие среды описаны у Biebel (Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (2001) 27, 18-26). Субстрат и среды можно подавать в биореактор непрерывно, партиями или в виде периодической ферментации с добавлением субстрата. Согласно 5 одному варианту реализации изобретения среды представляют собой среды, описанные ниже в данной заявке в разделе "Примеры".
Ферментацию желательно проводить в соответствующих условиях для прохождения ферментации с получением из СО этанола (и/или другого(их) продукта(тов)). Условия реакции, которые следует рассматривать, включают
10 давление, температуру, расход газа, расход жидкости, рН сред, окислительно-восстановительный потенциал сред, скорость перемешивания (при использовании корпусного реактора с непрерывным перемешиванием), размер инокулята, максимальные концентрации газового субстрата для обеспечения того, чтобы СО в жидкой фазе не становился лимитирующим, и максимальные
15 концентрации продукта для того, чтобы избежать ингибирования конечным продуктом.
Помимо этого, часто желательно повышать концентрацию СО фракции субстрата (или парциальное давление СО в газовом субстрате) и, таким образом, повышать эффективность реакций ферментации, в случае, когда СО является
20 субстратом. Работа при повышенных давлениях позволяет значительно повысить скорость переноса СО из газовой фазы в жидкую фазу, где он может поглощаться микроорганизмом в качестве источника углерода для выработки этанола (и/или другого(гих) пролукта(ов)). Это, в свою очередь, означает, что время удерживания (определенное, как объем жидкости в биореакторе, деленный на
25 расход газа на входе) может быть снижено, когда биореакторы поддерживают скорее при повышенном давлении, нежели при атмосферном давлении. Оптимальные условия реакции будут зависеть частично от конкретного микроорганизма согласно используемому изобретению.
Однако, в целом, предпочтительно, чтобы ферментацию проводили при
30 давлении, выше, чем давление окружающей среды. Также, так как при условии, что скорость превращения СО в этанол (и/или другой(гие) продукт(ты)) представляет собой частично функцию времени удерживания субстрата, и достижение желательного времени удерживания, в свою очередь, обуславливает требуемый объем биореактора, применение вытеснительных систем может
35 значительно уменьшить требуемый объем реактора, и следовательно, капитальную стоимость оборудования для ферментации. Согласно примерам, данным в патенте США № 5593886, объем реактора можно уменьшать линейно
пропорционально увеличениям рабочего давления реактора, то есть
биореакторы, работающие при давлении 10 атмосфер, должны иметь объем,
составляющий лишь одну десятую от объема биореакторов, работающих при
давлении 1 атмосфера.
5 Польза проведения ферментации газ-этанол при повышенном давлении
описана далее. Например, в WO 02/08438 описаны ферментации газ-этанол, проводимые при давлениях 30 фунт/кв. дюйм (давление водного столба, приборное) и 75 фунт/кв. дюйм, приводящие к выходам выработки этанола, равным 150 г/л/день и 369 г/л/день соответственно. Однако, было обнаружено,
10 что в результате типичных ферментаций, проведенных с использованием аналогичных сред и составов газа на входе при атмосферном давлении, получается в 10-20 раз меньше этанола на литр в день.
Также желательно, чтобы скорость введения СО-содержащего газового субстрата была такой, чтобы обеспечивать, чтобы концентрация СО в жидкой
15 фазе не становилась лимитирующей. Это обусловлено тем, что следствием условий огрониченной концентрации СО может быть то, что продукт этанол будет потребляться культурой.
Состав газовых фракций, используемых для подачи в реакцию ферментации, может иметь значительное влияние на эффективность и/или
20 стоимость реакции. Например, 02 может снижать эффективность анаэробного процесса ферментации. Обработка нежелательных или ненужных газов в несколько стадий процесса ферментации перед ферментацией или после нее может повышать нагрузку на такие стадии (например, в том случае, когда фракцию газа сжимают перед подачей в биореактор, ненужную энергию можно
25 применять для сжатия газов, которые не требуются в ферментации). Соответственно, может быть желательным обрабатывать субстратные фракции, особенно субстратные фракции, полученные из промышленных источников, для удаления нежелательных компонентов и повышения концентрации желательных компонентов.
30 Согласно определенным вариантам реализации культуру бактерии
согласно изобретению поддерживают в водной культуральной среде. В предпочтительном варианте, водная культуральная среда представляет собой минимальную анаэробную микробиологическую среду для роста. Подходящие среды известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США
35 № 5173429 и 5593886 и WO 02/08438 и описаны ниже в настоящей заявке, в разделе "Примеры".
Один или более продуктов, полученных способом согласно изобретению (согласно одному варианту реализации этанол или смешанная фракция спиртов, содержащая этанол и/или один или более других продуктов) можно выделять из ферментативного бульона способами, известными в данной области техники, 5 такими как фракционная дистилляция или упаривание, испарение через полупроницаемую перегородку и экстрактивная ферментация, включая, например, экстракцию жидкости жидкостью. Побочные продукты, такие как кислоты, включая ацетат, можно также выделять из ферментативного бульона с использованием способов, известных в данной области техники. Например,
10 можно использовать адсорбционную систему, включающую фильтр с активированным углем, или электродиализ. В качестве альтернативы, можно также использовать непрерывную отдувку газом.
Согласно определенным вариантам реализации изобретения этанол и/или один или более других продуктов выделяют из ферментативного бульона путем
15 непрерывного удаления части бульона из биореактора, отделяя клетки микроорганизмов от бульона (удобно путем фильтрации) и выделяя один или более продуктов из бульона. Спирты можно выделять, например, путем дистилляции, а кислоты можно выделять, например, путем адсорбции на активированном угле. Отделенные клетки микроорганизмов предпочтительно
20 возвращают в ферментативный биореактор. Бесклеточный фильтрат, оставшийся после удаления какого-либо спирта(тов) и кислоты(т) также предпочтительно возвращают в ферментативный биореактор. Дополнительные питательные элементы (такие как витамины В) можно добавлять в бесклеточный фильтрат для восполнения питательной среды перед ее возвращением в
25 биореактор.
Также, если рН бульона устанавливали, как описано выше, для усиления адсорбции уксусной кислоты на активированном угле, рН следует повторно устанавливать до рН, аналогичного рН бульона в ферментативном биореакторе, перед возвращением в биореактор.
30 Сукцинат можно выделять из ферментативного бульона с использованием
ряда методик, таких как подкисление, электродиализ, в сочетании с ионообменной хроматографией (Song and Lee, 2006, Enzyme Microb Technol 39, 352-361), осаждение Ca(OH)2 в сочетании с фильтрацией и добавлением серной кислоты (Lee et al 2008, Appl Microbiol Biotechnol 79, 11-22) или экстракция
35 посредством реакции с экстрагентами на основе аминов, такими как три-н-октиламин (Huhet al, 2006, Proc Biochem 41, 1461-1465). Для всех способов крайне важным является применение формы свободной кислоты, а не соли. В
большинстве биотехнологических способов получения янтарной кислоты, однако, работают в нейтральном или слегка кислом диапазоне рН 6-7. Принимая во внимание рКа янтарной кислоты (рКа = 4,16 и 5,61), в данных условиях большинство находится в виде соли, а не в виде свободной кислоты. Известно, 5 что С. autoethanogenum и карбоксидотрофные ацетогены, однако, выдерживают и растут в желательном низком диапазоне рН, рН 4-6.
Аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин, можно относительно легко выделять из ферментативного бульона путем концентрирования (например, обратный осмос) и кристаллизации или удаления
10 биомассы (например, ультрафильтрация или центрифугирование), и ионообменной хроматографии (Ikeda, А., 2003, Amino Acid Production Processes, in R. Faurie and J. Thommel (eds.) Microbial production of L-amin acids, 1-35).
Лактат, формиат, 2-оксоглутарат и другие продукты можно выделять из ферментативного бульона любым известным способом. Однако, в качестве
15 примера, в случае лактата, в традиционном способе ферментации получают осадок лактата кальция, который можно собирать и повторно подкислять. В качестве альтернативы, для отделения лактата можно привлекать мембранные методы, такие как электродиализ. Низкие концентрации лактата можно выделять из ферментативного бульона, применяя подходящий потенциал к селективной
20 ионопроницаемой мембране. Другие подходящие методики включают нанофильтрацию, где одновалентные ионы могут селективно проходить через мембрану под давлением.
Следует принимать во внимание, что в некоторых ситуациях способ можно осуществлять для получения и выделения продуктов, отличных от этанола
25 (например, одного или более продуктов, содержащих валин, лейцин, сукцинат, пируват, лактат и формиат). Соответственно, следует понимать, что изобретение включает способы получения одного или более из данных продуктов.
ПРИМЕРЫ:
Ниже изобретение более подробно описано со ссылкой на следующие 30 неограничивающие примеры.
Пример 1:
Удаление гена budA С. autoethanogenum путем гомологичной рекомбинации
Генетические модификации проводили, применяя плазмиду, содержащую 5'- и З'-гомологичные плечи гена budA С. autoethanogenum DSM23693 (фиг. 1-2).
Данную плазмиду метилировали in vivo с использованием новой метилтрансферазы, и затем ею трансформировали С. autoethanogenum DSM23693 (DSMZ, Германия). Нокаут гена budA демонстрировали ПЦР и путем ингибирования выработки 2,3-бутандиола в штаммах С. autoethanogenum 5 DSM23693 AbudA.
Конструирование экспрессионной плазмиды:
В данном изобретении использовали стандартные методики генной инженерии и молекулярного клонирования, и они описаны Sambrook et al, 1989 и Ausubel et al, 1987. Последовательности ДНК 5'-фланкирующего гомологичного
10 плеча, расположенного в направлении 5' (Seq. ID 3), и З'-фланкирующего гомологичного плеча, расположенного в направлении 3' (Seq. ID 4), гена budA Clostridum autoethanogenum DSM23693 получали из NCBI (национальный центр биотехнологической информации).
Геномную ДНК из Clostridum autoethanogenum DSM23693 выделяли,
15 используя набор Purelink Genomic DNA mini из Invitrogen, согласно инструкции от изготовителя.
5'-(Seq. ID. 3 ) и 3'-(Seq. ID. 4 ) фланкирующие гомологичные плечи амплифицировали с помощью ПЦР с олигонуклеотидами, приведенными в таблице 1, с использованием геномной ДНК Clostridum autoethanogenum
20 DSM23693 в качестве матрицы, ДНК-полимеразы iProof High Fidelity (Bio-Rad Labratories) и следующей последовательности действий: первоначальная денатурация при 98°С в течение 30 секунд, за которой следуют 25 циклов с денатурацией (98°С в течение 10 секунд), отжигом (60°С в течение 15 секунд) и элонгацией (72°С в течение 30 секунд) перед стадией финальной элонгации
25 (72°С в течение 7 минут).
плечо
TGTCATTATAAC
З'-гомологичное
Og11f
atttgctagcACTAGACAGTGCTAATAA
плечо
CAATGTCTAG
З'-гомологичное плечо
Og12r
atatgg eg eg ccTC AT AA ACCTG G ATA A СATAAGС
плазмида
M13f
GTAAAACGACGGCCAG
плазмида
M13r
CAGGAAACAGCTATGACC
Амплифицированное 5'-фланкирующее гомологичное плечо (5'НА) гена budA размером 964 п.н. резали рестриктазами Sbf1 и Not1 и клонировали в челночный вектор pMTL 85141 Е. coli-Clostridium (Seq. ID 9; FJ797651.1; Nigel 5 Minton, University of Nottingham; Heap et al., 2009) с использованием рестрикционных сайтов Sbfl и Notl и штамма XL1-Blue MRF' Kan E. coli (Stratagene). И созданную плазмиду pMTL85141-budA-5'HA, и ПЦР-продукт З'-гомологичного плеча гена budA размером 977 п.н. резали Nhel и Ascl. Лигирование данных расщепленных фрагментов ДНК осуществляли в Е. coli XL1-10 Blue MRF' Kan (Stratagene), получая плазмиду pMTL85141-budA-ko. Вставку в полученной плазмиде pMTL85141-budA-ko (SEQJD No. 12) полностью секвенировали, используя олигонуклеотиды, данные в таблице 1, и результаты секвенирования подтверждали, что как 5'-, так и З'-гомологичные плечи не содержали мутаций.
15 Метилирование ДНК:
Гибридный ген метилтрансферазы, слитый с индуцибельным lac-промотором (SEQ ID No. 31), конструировали путем выравнивания генов метилтрансферазы из С. autoethanogenum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei, как описано в патентной заявке США 13/049263. Экспрессия метилтрансферазы
20 приводит к образованию белка, имеющего последовательность SEQ ID No. 32. Гибридный ген метилтрансферазы химически синтезировали и клонировали в вектор pGS20 (ATG:biosynthetics GmbH, Merzhausen, Германия - SEQ ID No. 33), используюя EcoRI. Негативный по отношению к рестрикции штамм XL1-Blue MRF' Kan E. coli (Stratagene) дважды трансформировали полученной плазмидой для
25 метилирования рС520-метилтрансфераза и плазмидой pMTL85141-budA-ko. Метилирование in vivo индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, и
метилированные плазмиды выделяли с использованием набора Zymo mini prep (Zymo). Полученную композицию метилированной плазмиды использовали для трансформации С. autoethanogenum DSM23693.
Трансформация:
На протяжении всего эксперимента по трансформации С. autoethanogenum DSM23693 выращивали в среде YTF (табл. 2) в присутствии восстанавливающих агентов и с отработанным газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм (собранным со сталелитейного завода Новой Зиландии в Glenbrook (Гленбрук), Н.З.; состав: 44% СО, 32% N2, 22% С02, 2% Н2) при 37°С с использованием стандартных анаэробных методов, описанных Hungate (1969) и Wolfe (1971).
Таблица 2: среда YTF
Компонент среды на л маточного раствора
Дрожжевой экстракт 10 г
Триптон 16 г
Хлорид натрия 0,2 г
Фруктоза 10 г
Дистиллированная вода до 1 л
Маточный раствор восстанавливающего агента
NaOH на 100 мл маточного раствора
0,9 г
Цистеин.НС! Na2S
4 г
4 г
Дистиллированная вода
до 100 мл
Для получения компетентных клеток 50 мл культуры С. autoethanogenum DSM23693 пересевали на свежую среду YTF в течение 5 дней подряд. Данные клетки использовали для инокуляции 50 мл YTF среды, содержащей 40 мМ DL-5 треонина при OD6oo нм (оптическая плотность) 0,05. Когда культура достигала СЮбоонм 0,5, клетки инкубировали на льду в течение 30 минут и затем переносили в анаэробную камеру и собирали при 4700 х g и 4°С. Культуру дважды промывали ледяным буфером для электропорации (270 мМ сахарозы, 1 мМ MgCI2, 7 мМ фосфата натрия, рН 7,4) и, наконец, суспендировали в свежем
10 буфере для электропорации объемом 600 мкл. Данную смесь переносили в заранее охлажденную кювету для электропорации с межэлектродным зазором 0,4 см, содержащую 2 мкг смеси метилированной плазмиды и 1 мкл ингибитора рестрикции 1 типа (Epicentre Biotechnologies), и сразу же генерировали импульс, используя систему для электропорации Gene pulser Xcell (Bio-Rad) со
15 следующими устанавливаемыми параметрами: 2,5 кВ, 600 Q и 25 мкФ. Достигали временных констант, равных 3,7-4,0 мс. Культуру переносили в 5 мл свежей среды YTF. За восстановлением клеток наблюдали при длине волны 600 нм с использованием спектрофотометра Spectronic Helios Epsilon (Thermo), оснащенного штативом для пробирок. После первоначального падения биомассы
20 клетки снова начинали расти. Как только биомасса удваивалась относительно данного значения, примерно 200 мкл культуры распределяли по чашкам с агаризованной YTF и чашкам с агаризованной РЕТС, содержащим 5 г/л фруктозы (таблица 3) (обе среды содержали 1,2% агар Bacto(tm) (BD) и 15 мкг/мл тиамфеникола). После 3-4 дней инкубации с отработанным газом со
25 сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37°С уже были отчетливо видны 500 колоний на чашку.
Таблица 3: среда РЕТС (среда АТСС 1754; atcc.org/Attachments/2940.pdf)
Компонент среды
Концентрация на 1,0 л среды
NH4CI
1 г
KCI
0,1 г
MgS04.7H20
0,2 г
NaCI
KH2PO4
CaCI2
Раствор микроэлементов
Раствор витаминов Вулфа
Дрожжевой экстракт
Резазурин (2 г/л маточного раствора)
MES
Восстанавливающий агент Дистиллированная вода
Раствор витаминов Вулфа Биотин 0,8 г 0,1 г 0,02 г 10 мл 10 мл
1 г
0,5 мл
2 г
0,006-0,008 % (об./об.)
Вплоть до 1 л, рН 5,5 (подведен HCI)
на л маточного раствора 2 мг
Фолиевая кислота
2 мг
Пиридоксина гидрохлорид
10 мг
Тиамин.HCI
5 мг
Рибофлавин
Никотиновая кислота
Кальций 0-(+)-пантотенат
5 мг 5 мг 5 мг
Витамин В
0,1 мг
п-аминобензойная кислота
Тиоктовая кислота
Дистиллированная вода
Раствор микроэлементов
Нитрилотриуксусная кислота
MnS04.H20
Fe (S04)2(NH4)2.6H20
CoCI2.6H20
ZnS04.7H20
CuCI2.2H20
NaMo04.2H20
Na2Se03
NiCI2.6H20
Na2W04.2H20
Дистиллированная вода
Маточный раствор восстанавливающего агента
NaOH
Цистеин.НС! Na2S
5 мг 5 мг до 1 л
на л маточного раствора
2 г
1 г
0,8 г
0,2 г
0,2 мг
0,02 г
0,02 г
0,02 г
0,02 г
0,02 г
до 1 л
на 100 мл маточного раствора
0,9 г 4 г 4 г
Дистиллированная вода до 100 мл
Колонии пересевали штрихом на чашки со свежей агаризованной средой РЕТС, также содержащей 5 г/л фруктозы и 15 мкг/мл тиамфеникола. После 2 дней инкубации с газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37°С 5 единичные колонии из данных чашек повторно пересевали штрихом на чашки со свежей неселективной агаризованной средой РЕТС, содержащей только 5 г/л фруктозы. Пересев штрихом на чашки с агаризованной средой РЕТС с 5 г/л фруктозы повторяли еще раз, и чашки инкубировали с газом со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм при 37°С. Спустя 3 дня 6 единичных колоний, 10 растущих на неселективной среде, вносили в качестве инокулята в 2 мл жидкой среды РЕТС, содержащей 5 г/л фруктозы. Когда культура подростала, ее последовательно доводили до 5 мл, 25 мл и затем до 50 мл среды РЕТС, содержащей 5 г/л фруктозы и газ со сталелитейного завода при 30 фунт/кв. дюйм в качестве источника углерода.
15 Подтверждение успешной трансформации:
С. autoethanogenum: для проверки идентичности шести клонов и переноса ДНК геномную ДНК выделяли из 6 колоний/клонов в жидкой среде РЕТС с использованием набора Purelink(tm) Genomic DNA mini (Invitrogen) согласно инструкции изготовителя. Данные геномные ДНК наряду с геномной С.
20 autoethanogenum DSM23693 дикого типа использовали в качестве матрицы в ПЦР. ПЦР проводили с ДНК-полимеразой iproof High Fidelity (Bio-Rad Labratories), праймерами, перечисленными в таблице 4, и следующей последовательностью действий: первоначальная денатурация при 98°С в течение 2 минут, за которой следуют 25 циклов с денатурацией (98°С в течение 10 секунд), отжигом (61 °С в
25 течение 15 секунд) и элонгацией (72°С в течение 90 секунд) перед стадией финальной элонгации (72°С в течение 7 минут). Геномную ДНК из С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа использовали в качестве матрицы в контрольной ПЦР.
30 Таблица 4: Олигонуклеотиды для подтверждения плазмиды и видов с помощью
тида
Ген 16S рРНК
fD1
CCGAATTCGTCGACAACAGAGTTTGATCC TGGCTCAG
Ген 16S рРНК
гР2
CCCGGGATCCAAGCTTACGGCTACCTTG TTACGACTT
Гомологи
чное
плечо
og09f
attcatcctgcagg I I I CTTCACAGGAAAATATA CTTCAG
Гомологи
чное
плечо
Og12r
atatggcgcgccTCATAAACCTGGATAACATAA GC
Ген budA
Og44f
TTGCTGTAGTCACTGAACTGGAAAA
Ген budA
Og45r
AATCAGGACACCTAAATCCAACCAC
Для подтверждения идентичности 6 клонов ПЦР проводили с амплификацией гена 16S рРНК, используя праймеры fD1 (Seq. ID. 27) и rP2 (Seq. ID 28), и с использованием описанных выше условий для ПЦР. ПЦР-продукты
5 очищали, используя набор Zymo Clean and Concentrator(tm) и секвенировали, используя праймер rP2 (Seq. ID 28). Последовательности всех 6 клонов (Seq. ID. 13-19) демонстрировали по меньшей мере 90% идентичность с геном 16S рРНК С. autoethanogenum (Seq. ID 15; Y18178, Gl:7271109).
ПЦР 6 анализируемых клонов с праймерами, специфичными к целевому
10 участку budA, с использованием праймеров Og09f (Seq. ID. 5) и Og12r (Seq. ID. 8), приводила к амплификации ДНК-фрагмента размером 2,2 т.п.н. (тысяча пар нуклеотидов) у 5 из 6 клонов. ПЦР-продукт размером 2,7 т.п.н. амплифицировали с геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа. Идентичность ПЦР-продуктов размером 2,2 т.п.н. из клонов потенциальных нокаутов по budA
15 подтверждали путем секвенирования (Seq ID 20-26) с праймерами, перечисленными в таблице 5, и последовательность гена budA в данных фрагментах не детектировали. ДНК-фрагмент lacZ замещал ген budA. Отсутствие гена budA в данных 6 клонах еще раз подтверждали ПЦР с праймерами Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), специфичными к внутреннему участку гена
budA С. autoethanogenum DSM23693 размером 275 п.н., который амплифицировали только у С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа.
Отсутствие выработки 2,3-бутандиола и увеличение выхода этанола:
Для того, чтобы показать отсутствие ацетоина и, как следствие, выработки 5 2,3-бутандиола с клоном 1 проводили эксперименты с бутылкой с сывороткой в трехкратной повторности с отработанным газом со сталелитейного завода (состав: 44% СО, 32% N2, 22% С02 и 2% Н2; отобран со сталелитейного завода в Glenbrook, Новая Зеландия) и средой РЕТС, описанной выше. Немодифицированный штамм дикого типа С. autoethanogenum DSM23693
10 выращивали в таких же условиях, как контроль.
Анализ метаболитов проводили с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), используя систему ВЭЖХ Agilent 1100 Series, оснащенную RID (рефрактометрический детектор), работающим при 35°С, и колонкой для определения органических кислот Alltech ЮА-2000 (150 х 6,5 мм,
15 размер частиц 5 мкм), хранящейся при 32°С. В качестве подвижной фазы использовали слегка подкисленную воду (0,005 М H2S04) со скоростью потока 0,25 мл/мин. Для удаления белков и других клеточных остатков образцы объемом 400 мкл смешивали со 100 мкл 2% (масс/об.) 5-сульфосалициловой кислоты и центрифугировали при 14000 х g в течение 3 мин для отделения
20 преципитированных осадков. 10 мкл супернатанта затем вводили в ВЭЖХ для анализов.
Результаты экспериментов с бутылкой с сывороткой с клоном 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693 и немодифицированным диким типом С. autoethanogenum DSM23693 показаны в таблице 5. Максимальная биомасса
25 штамма AbudA С. autoethanogenum DSM23693 характеризовалась OD600HM 0,32, относительно более низкой, чем у немодифицированного дикого типа, который вырастал до OD6OOHM 0,58. По сравнению с диким типом 2,3-бутандиол не детектировали в культуре клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, и выход этанола был значительно выше у клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693,
30 чем у немодифицированного С. autoethanogenum DSM23693 (таблица 5).
Таблица 5: Метаболиты, вырабатываемые клоном 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693 и немодифицированным диким типом С. autoethanogenum DSM23693, в расчете на биомассу
Метаболит Среда Дикий тип AbudA
(г/л) Клон 1
Этанол 1,395 2,500
Уксусная 2,296 0,180
кислота
2,3-бутандиол 0,085 0,000
Молочная 0,020 0,197
кислота
Муравьиная 0,002 1,647
кислота
Янтарная 0,002 0,344
кислота
Выработка других метаболитов - лактата, формиата, сукцината, 2-оксиглутарата, валина, лейцина, изолейцина:
В то же время, неожиданно, несмотря на то, что немодифицированный С. autoethanogenum DSM23693 вырабатывал только 0,02 г/л молочной кислоты в 5 качестве другого побочного продукта, AbudA С. autoethanogenum DSM23693 вырабатывал значительно более высокое количество молочной кислоты 0,07 г/л (0,197 г/л, отнесенное к биомассе), а также 0,53 г/л (1,647 г/л, отнесенное к биомассе) муравьиной кислоты и 0,13 г/л (0,344 г/л, отнесенное к биомассе) янтарной кислоты (таблица 5). Данное увеличение вероятно происходит в 10 результате аккумуляции пирувата, раннего предшественника 2,3-бутандиола (фигура 1), из-за нокаута гена budA, который блокировал продукцию 2,3-бутандиола.
Продукцию сукцината и лактата AbudA С. autoethanogenum DSM23693 также подтверждали с помощью газовой хроматографии - масс-спектрометрии
15 (ГХ-МС). Для этого, примерно 2,5 мл культуры клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, выращенного с отработанным газом со сталелитейного завода (состав: 44% СО, 32% N2, 22% С02 и 2% Н2; собран со сталелитейного завода в Glenbrook, Новая Зеландия) при оптической плотности 0,32 центрифугировали, и супернатант фильтровали через 0,2 мкм фильтр (Smart KF, Aggio RB, Van Houtte
20 JR, Villas-Boas SG, аналитическая платформа для метаболомного анализа микробных клеток с использованием дериватизации метилхлорформиата с
последующей газовой хроматографией-масс-спектрометрией, Nat Protoc. 2010
Sep;5(10): 1709-29. 2010). Примерно 0,65 мл культуры дикого типа С.
autoethanogenum DSM23693 и 2,5 мл холостой пробы со средой обрабатывали
аналогичным образом. Образцы сушили сублимацией и анализировали ГХ-МС в
5 трехкратной повторности в университете Auckland (Окленд). Как видно из
таблицы 6, интенсивность пика сигнала сукцината и лактата была выше у клона 1
AbudA С. autoethanogenum DSM23693, по сравнению с немодифицированным С.
autoethanogenum DSM23693 и контрольной холостой пробой со средой.
Результаты ГХ-МС по сукцинату и лактату согласуются с результатами ВЭЖХ.
10 Результаты ГХ-МС (таблица 6) не только подтвердили выработку лактата
и сукцината у клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693, но также демонстрируют выработку 2-оксоглутарата, другого конечного продукта незамкнутого цикла ТКК помимо сукцината, и аминокислот с разветвленной цепью, валина, лейцина, изолейцина, которые образуются из пирувата и 15 ацетолактата, предшественников 2,3-бутандиола, которые вероятно будут находиться в повышенных количествах у штамма the AbudA С. autoethanogenum. Промежуточные соединения цикла ТКК, такие как малат, фумарат, цитрат, цис-аконитат, изоцитрат, не тестировали, но их уровни, вероятно, будут повышены, так как обнаружили, что вырабатываются конечные продукты сукцинат и 220 оксоглутарат (фигура 16).
Таблица 6: анализ метаболитов клона 1 AbudA С. autoethanogenum DSM23693 (AbudA) и немодифицированного дикого типа С. autoethanogenum DSM23693 (дикий тип) с помощью ГХ-МС. Среду включали в анализы в качестве контроля. 25 Значения, приведенные в таблице, соответствуют нормированной интенсивности пиков, полученной для каждой повторности (R). н.о. = не определено.
Метаболит
Среда
Среднее
Лактат
0,547053273
0,474988
0,431645
0,48
Сукцинат
1,036264929
0,960478
1,243932
1,08
Оксоглутарат
н.о.
н.о.
н.о.
0,00
Валин
5,970408365
5,446962
5,937764
5,79
Лейцин
3,418425725
3,154261
3,237803
3,27
Изолейцин
н.о.
н.о.
0,607184
0,20
Метаболит
Дикий тип
Среднее
Лактат
0,801302932
0,691344
0,853559
0,78
Сукцинат
0,547053273
0,474988
0,431645
0,48
Оксоглутарат
н.о.
0,003092
0,0028
0,00
Валин
0,018545724
0,011764
0,014182
0,01
Лейцин 0,0307755 0,024291 0,023099 0,03
Изолейцин 0,008136206 0,005305 0,00643 0,01
Метаболит Клон 1 AbudA (образец 1) Клон 1 AbudA (образец 2) среднее
Лактат 5,017350825 5,672474 5,237064 5,987887 5,138095 4,39521 5,24
Сукцинат 2,535447097 2,984226 2,516218 5,017351 5,672474 5,237064 3,99
Оксоглутарат 0,522265764 0,462277 н.о. 1,22281 0,021205 н.о. 0,37
Валин 11,13216958 9,419048 7,824351 10,08887 10,66202 9,192138 9,72
Лейцин 10,92981831 5,478571 4,497006 4,70419 11,36585 4,441235 6,90
Изолейцин 6,087638048 9,397619 0,895459 10,59162 2,912456 9,976735 6,64
Получение ацетоина и 2,3-бутандиола обычно связано с понижением кислотности, обусловленной сильной пировиноградной кислотой (Xiao, Z., and P. Xu. 2007. Acetoin metabolism in bacteria. Crit. Rev. Biochem. Microbiol. 33:127-140), которая может 5 представлять серьезную угрозу для клетки в результате нарушения внутреннего рН и протонного градиента, необходимого для сохранения энергии. Как ацетоин, так и 2,3-бутандиол представляют собой соединения, характеризующиеся нейтральным рН. Выработка 2,3-бутандиола также служит в качестве стока электронов для разгрузки избыточных восстанавливающих эквивалентов, образующихся во время
10 ферментационного процесса.
Не желая быть связанными какой-либо определенной теорией, авторы настоящего изобретения полагают, что при нокаутировании выработки ацетоина и 2,3-бутандиола, клетка вынуждена находить другие способы снижения кислотности, обусловленной пировиноградной кислотой (рКа = 2,50), и разгрузки восстанавливающих эквивалентов и,
15 таким образом, сдвигает свой метаболизм в сторону выработки других (новых) продуктов, таких как разветвленные аминокислоты, валин, лейцин или изолейцин, сукцинат (рКа1 = 4,20, рКа2 = 5,60), молочная кислота (рКа = 3,86) и муравьиная кислота (рКа = 3,77). Выработка янтарной кислоты также дает возможность разгружать 4 восстанавливающих эквивалента, в то время как 2 восстанавливающих эквивалента можно разгружать в
20 результате выработки молочной кислоты.
Пример 2: Путь сукцината
Путь выработки сукцината описан на фигуре 16. Соответственные гены идентифицировали в Clostridium autoethanogenum, и демонстрировали ферментативную активность.
25 На первой стадии пируват превращается в малат, либо прямо при катализе малик-
энзимом, либо через оксалоацетат, при катализе малатдегидрогеназой. Оксалоацетат (ОАА) может образовываться из пирувата в результате работы пируваткарбоксилазы, или через фосфоенолпируват (ФЕП) за двухстадийное превращение, катализируемое пируватфосфатдикиназой (PPDK) и ФЕП-карбоксикиназой (РСК). Далее малат
30 превращается в сукцинат в двухстадийном процессе, катализируемом фумаратгидратазой и фумаратредуктазой. Соответствующие гены идентифицировали у С. autoethanogenum, а гомологичные гены присутствуют в других карбоксидотрофных ацетогенах, таких как С. Ijungdahlii и С. ragsdalei (таблица 7).
35 Таблица 7: Гены и ферменты, которые идентифицированы, как вовлеченные в продукцию сукцината
autoethanogenum
C. Ijungdahlii
C. ragsdalei
Малик-энзим 1
Seq. ID 38-39
CP001666.1 CLJU_c04160; ADK13498.1
Seq. ID 60-61
Малик-энзим 2
Seq. ID 40-41
CP001666.1 CLJU_c38460;
ADK16871.1
Малатдегидрогеназа
Seq. ID 42-43
CP001666.1 CLJU_c05920; ADK13674.1
Seq. ID 62-63
Пируватфосфатдикиназа (PPDK)
Seq. ID 44-45
CP001666.1
CLJU_c08140;
ADK13882.1
Seq. ID 64-65
Пируваткарбоксилаза (PYC)
Seq. ID 46-47
CP001666.1
CLJU_c37390;
ADK16765.1
Seq. ID 66-67
ФЕП-карбоксикиназа (РСК)
Seq. ID 48-49
CP001666.1 CLJU_c06210;
ADK13703.1
Seq. ID 68-69
Субъединица А фумаратгидратазы
Seq. ID 50-51
CP001666.1 CLJU_c40600; ADK17084.1
Seq. ID 70-71
Субъединица В фумаратгидратазы
Seq. ID 52-53
CP001666.1
CLJU_c40590;
ADK17083.1
Seq. ID 72-73
Фумаратредуктаза 1, флавопротеин
Seq. ID 54-55
CP001666.1
CLJU_c22800;
ADK15338.1
Seq. ID 74-75
Фумаратредуктаза 2,
Seq. ID 56-57
CP001666.1 CLJU_c30250;
флавопротеин
ADK16073.1
Фумаратредуктаза 3, флавопротеин
Seq. ID 58-59
СР001666.1
CLJU_c08670;
ADK13935.1
Seq. ID 76-77
Анализ ферментативной активности:
Клетки (Clostridium autoethanogenum) собирали в экспоненциальную фазу анаэробного роста. Культуры (А6оо ~ 0,45) осаждали при 8000 х д, 4°С в течение 10 мин. 5 Супернатант отбрасывали, и осадок два раза промывали в промывочном буфере (0,1 М Трис-HCI (трис(гидроксиметил)аминометан), 10 мМ дитиотреитол (ДТТ), рН 6,5, 4 °С). Наконец, осадок ресуспендировали в промывочном буфере, содержащем ингибитор протеаз, и смешивали с 1,44 г циркониевых шариков (набор Ambion RiboPure Bacteria). Пробирки охлаждали на льду в течение 5 минут перед измельчением содержимого на
10 Vortex Mixer с адаптером для vortex (Vortex Genie 2, Scientific Industries, Inc.) за 5 циклов разбивки в течение 1 мин при 3200 об/мин, между которыми следовало выдерживание на льду в течение 1 мин. После лизиса образец центрифугировали (13000 * д, 4 °С в течение 10 мин), и супернатант делили на аликвоты и хранили при -80°С до анализа.
Все анализы основывались на окислении NADH (восстановленный
15 никотинамидадениндинуклеотид) в NAD (никотинамидадениндинуклеотид) (е = 6,2 мМ"1 см"1) в аэробных условиях в кювете с длиной оптического пути 1 см. Активности ферментов получали в результате трех повторностей по меньшей мере двух независимых клеточных экстракций. Содержание белка экстрактов определяли с использованием коммерческого набора (Pierce(r) Microplate ВСА Protein Assay Kit-Reducing
20 Agent Compatible, Thermo Scientific). Одну единицу ферментативной активности определяли, как количество фермента, которое может превращать наномоль субстрата в продукт в минуту на мг общего белка.
Активность малатдегидрогеназы измеряли спектрофотометрически путем следующего окисления восстановленных пиридиннуклеотидов оксалоацетатом (ОАА)
25 (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). Реакционная смесь содержала следующее: 0,1 М Трис-HCI рН 6,5, 10 мМ ДТТ, 0,15 мМ NADH, 5 мМ фумарат, 0,3 мМ NADH и бесклеточный экстракт. Реакцию инициировали добавлением ОАА, и следили за ней при комнатной температуре. Удельную активность данного
30 фермента в бесклеточных экстрактах Clostridium autoethanogenum измеряли, как 160 ± 17 нмоль мин"1 мг"1 белка. Данная активность была сравнима с малатдегидрогеназой, обнаруженной в Clostridium thermosuccinogenes, измеренной при 37°С (Sridhar J. et al,
2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51).
Активность фумаратредуктазы измеряли на основе превращения фумарата в сукцинат (Sridhar J. et al, 2000, Elucidation of enzymes in fermentation pathways used by 5 Clostridium thermosuccinogenes growing on inulin. Appl. Environ. Microbiol. 66, 246-51). Реакционная смесь содержала следующее: 0,1 М Tris-CI рН 6,5, 10 мМ ДТТ, 0,15 мМ NADH, 5 мМ фумарат и бесклеточный экстракт. Реакцию инициировали добавлением фумарата, и за ней следили при комнатной температуре. Удельную активность данного фермента в бесклеточных экстрактах Clostridium autoethanogenum измеряли, как 17,3 ± 10 1,3 нмоль мин"1 мг"1 белка.
Анализы подтвердили, что Clostridium autoethanogenum обладает малатдегидрогеназной активностью, фумаратредуктазой/сукцинатдегидрогеназой.
Как описано в настоящей заявке, согласно изобретению предложены микроорганизмы и способы, которые делают возможным получение этанола путем 15 микробной ферментации субстратов, содержащих моноксид углерода. Согласно изобретению также предложено получение сукцината. Ранее не было сообщений о получении сукцината с помощью ацетогенов, тем более карбоксидотрофных ацетогенов. Возможность получать сукцинат с помощью микробной ферментации может иметь ряд преимуществ, по сравнению с современными нефтехимическими способами получения. 20 Микроорганизмы также вырабатывают формиат и аминокислоты с разветвленной цепью, которые ранее не были описаны в качестве продуктов ферментации, осуществляемой ацетогенными микроорганизмами.
Сукцинат применяют в качестве массового платформенного химического
соединения для получения целого ряда промышленных химикатов, включая 1,4-
25 бутандиол, тетрагидрофуран, гамма-бутиролактон, этилендиаминдисукцинат,
диэтилсукцинат и адипиновую кислоту. Формиат используют при сохранении животного
корма и в процессах дубления кожи, а также в качестве отбеливающего раствора в
целлюлозно-бумажной промышленности. Аминокислоты с разветвленной цепью имеют
целый ряд назначений в промышленной биотехнологии.
30 Микроорганизмы согласно изобретению также вырабатывают один или более
других продуктов. Применение данных продуктов описано по тексту настоящей заявки.
Пример 3: Инсерционная инактивация генов, вовлеченных в биосинтез 2,3-БДО (2,3-бутандиол), у С. autoethanogenum DSM23693 на основе интронов группы II
Дизайн и конструирование конструкций ClosTron, нацеленных на ген budA и 2,3bdh:
35 Гены ацетолактатдекарбоксилазы (budA) и 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3-bdh),
вовлеченные в продукцию 2,3-бутандиола у С. autoethanogenum DSM23693,
инактивировали с применением инструмента ClosTron для повреждения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации участка-мишени для интрона группы II между основаниями 450 / 451 и 468 / 469 на смысловой нити генов budA и 2,3-bdh 5 соответственно. Такой же алгоритм применяли для конструирования участков, направляющих интрон (Seq. ID. 82 и 83), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E5. Итоговые векторы pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику
10 кларитромицину при вставке в место-мишень.
Плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводили в С. autoethanogenum DSM23693 путем конъюгирования с донором, штаммом СА434 Е. coli в качестве донора. Вкратце, штамм-донор выращивали в течение ночи в среде LB с добавлением 25 мкг/мл хлорамфеникола и 100 мкг/мл спектиномицина. Клетки из 1,5 мл
15 культуры собирали и промывали в фосфатно-солевом буферном растворе. Осадок из донорных клеток ресуспендировали в 200 мкл культуры реципиента С. autoethanogenum DSM23693, находящегося на экспоненциальной фазе роста. Смесь помещали на агаризованную среду РЕСТ с добавлением фруктозы и инкубировали при 37° С в сосуде с газом под давлением. Спустя 24 часа клетки соскребали и ресуспендировали в 500 мкл
20 бульона РЕТС и распределяли по агаризованной среде РЕТС с добавлением 15 мкг/мл тиамфеникола (Sigma) и 10 мкг/мл триметоприма (Sigma). Проводили отбор трансконъюгантов С. autoethanogenum с использованием 15 мкг/мл тиамфеникола, и проводили противоотбор штамма СА434 Е. coli с использованием 10 мкг/мл триметоприма. Колонии наблюдали спустя 3 суток инкубации при 37° С в сосудах с газом
25 под давлением.
Штрихи единичных колоний наносили последовательно сначала на среду РЕТС-MES, содержащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкг/мл триметоприма с последующим нанесением на чашки с агаризованной средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Случайным образом проводили скрининг 4 колоний на плазмиду на
30 предмет вставки интрона группы II с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене 2,3-bdh. Для ПЦР использовали набор Maxime PCR PreMix. 16S рДНК также амплифицировали с помощью ПЦР с использованием праймеров fD1 (Seq.
35 ID. 27) и rP2 (Seq. ID.28) и набора Maxime PCR PreMix.
Подтверждение нарушения гена budA и 2,3bdh с использованием инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II:
Амплификация ПЦР-продуктов размерами 273 и 375 п.н. с праймерами Og44f / Og45r и Og42f / Of43r указывает на гены budA и 2,3-bdh немодифицированного дикого типа соответственно. Амплификация ПЦР-продуктов размером ~ 2 т.п.н. с использованием такого же набора праймеров указывает на вставку интрона группы II 5 ClosTron в гены-мишени. В случае клонов с нацеливанием на ген budA, клоны 1 и 3 имели полосы ожидаемого размера. Клон 4, по-видимому, представляет собой смесь, как дикого типа, так и мутанта с нарушенным геном (фигура 6). Все 4 клона с нацеливанием на ген 2,3-bdh , представляются позитивными по отношению к повреждению гена, как видно по амплификации ПЦР-продукта размером ~ 2 т.п.н. (фигура 6). Данные результаты 10 подтверждают нарушение генов budA и 2,3-bdh у С. autoethanogenum DSM23693.
ПЦР-продукт 16S рДНК клонов 2 A2,3bdh ClosTron (Seq ID. 86 и 87) и 4 (Seq ID. 88 и 89) и клонов 1 AbudA ClosTron (Seq ID. 90 и 91) и 3 (Seq ID. 92 и 93), как было подтверждено секвенированием, принадлежат к С. autoethanogenum DSM23693.
Таким образом, авторы настоящего изобретения продемонстрировали нарушение 15 гена-мишени у ацетогенного С. autoethanogenum DSM23693 с использованием двух разных подходов - (i) нокаут гена в результате гомологичной рекомбинации и (и) нарушение гена с применением инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II.
Исследование мутантов AbudA и A2,3bdhClosTron на предмет выработки 2,3-БДО:
20 Метаболиты из мутантов AbudA и A2,3bdh, выращиваемых в бутылках с
сывороткой, анализировали с помощью ВЭЖХ (как объяснено ранее). Мутант AbudA Clostron подобно нокаутному мутанту AbudA не вырабатывал 2,3-БДО (таблица 8). Нарушение гена budA двумя разными способами у С. autoethanogenum подтверждает роль гена budA в биосинтезе 2,3-БДО.
Мутант A2,3bdh ClosTron еще вырабатывал 2,3-БДО (таблица 8), указывая на
участие второго гена в превращении ацетоина в 2,3-БДО.
5 Yan et al показали, что вторичная алкогольдегидрогеназа из С. beijerinckii и трех
других организмов может также превращать ацетоин в 2,3-БДО (Yan. Lee & Liao, 2009). Аналогичный ген вторичной алкогольдегидрогеназы (SecAdh) обнаружен у С. autothenogenum DSM23693 (Seq ID 34 и 35), С. Ijungdahlii (Seq ID 36) и С. ragsdalei (Seq ID 37).
10 При отсутствии гена 2,3-bdh у С. autoethanogenum DSM23693 SecAdh наиболее
вероятно превращала бы ацетоин в 2,3-БДО.
Роль второй дегидрогеназы в превращении ацетоина в 2,3-БДО:
Для исследования роли второго гена в превращении ацетоина в 2,3-БДО С. autoethanogenum DSM23693 дикого типа и мутанту A2,3bdh ClosTron в экспериментах по 15 ферментации давали 10 г/л ацетоина.
Ферментация с диким типом и мутантом A2,3bdh ClosTron:
Ферментации проводили в биореакторах объемом 1,5 л при 37°С и с СО-содержащим газом со сталелитейного завода в качестве единственного источника энергии и углерода, как описано ниже. Для роста культуры применяли определенную
20 среду, содержащуя на литр: MgCI, CaCI2 (0,5 мМ), KCI (2 мМ), Н3Р04 (5 мМ), Fe (100 мкМ), Ni, Zn (5 мкМ), Мп, В, W, Mo, Se (2 мкМ). Затем среду переносили в биореактор и автоклавировали при 121 °С в течение 45 минут. После автоклавирования в среду добавляли тиамин, пантотенат (0,05 мг), биотин (0,02 мг), и ее восстанавливали 3 мМ цистеином-HCI. Для достижения анаэробных условий сосуд реактора продували азотом
25 через 0,2 мкм фильтр. Перед инокуляцией газ меняли на СО-содержащий газ со сталелитейного завода, при непрерывной подаче в реактор. Состав подаваемого газа представлял собой: 2% Н2, 42% СО, 20% С02, 36% N2. рН культуры поддерживали между 5 и 5,2. Газовый поток исходно устанавливали на уровне 80 мл/мин, с возрастанием до 200 мл/мин во время середины экспоненциальной фазы роста, в то время как
30 встряхивание повышали с 200 об/мин до 350. Na2S подавали дозами в биореактор при 0,25 мл/ч. Когда OD6oo достигала 0,5, биореактор переводили на непрерывный режим при скорости 1,0 мл/мин (скорость разбавления 0,96 д"1). Когда рост становисля стабильным, в реактор вводили 10 г/л рацемической смеси ацетоина. Образцы сред отбирали для измерения биомассы и метаболитов с помощью ВЭЖХ.
35 Метаболиты анализировали ВЭЖХ регулярно до исчезновения ацетоина. С.
autoethanogenum DSM23693 дикого типа превращал весь ацетоин в мезо-БДО и 2,3-БДО
менее, чем через 1 ч (фигура 7). У мутанта A2,3bdh ClosTron скорость превращения ацетоина в мезо-БДО и 2,3-БДО была относительно низкой. Мутант A2,3bdh ClosTron снижал уровень ацетоина, составляющий 10 г/л, более, чем через 2 ч. Данные результаты указывают на роль второй дегидрогеназы в компенсации нарушения гена 5 2,3bdh, хотя и при более низкой скорости.
Пример 4: Модифицированный штамм DSM23693 С. Autoethanogenum, вырабатывающий только ацетоин
Промышленное отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с получаемым из него продуктом 2,3-БДО. Таким
10 образом, желательно получать штамм С. autoethanogenum, вырабатывающий ацетоин, а не его восстановленную форму 2,3-БДО. Так как мутант A2,3bdh ClosTron еще вырабатывает 2,3-БДО, желательно получать штамм DSM23693 С. autoethanogenum, у которого нарушены оба гена 2,3bdh и SecAdh. Это может быть достигнуто двумя способами: (а) гомологичной рекомбинацией и (б) безмаркерным нарушением гена с
15 применением инструмента ClosTron, как объяснено в примере 1 и примере 3.
(а) штамм DSM23693 С. autoethanogenum с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh, полученный в результате гомологичной рекомбинации:
5'-(Seq. ID. 94) и 3'-(Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С.
20 autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) и Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693, либо путем конъюгации, либо путем
25 электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. ID.100) и Og34r (Seq. ID.101), которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Плазмиду для нокаута гена SecAdh конструировали аналогичным образом. 5'-
30 (Seq. ID. 102) и 3'- (Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами
35 Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с
использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID.108) и SecOr (Seq. ID.109), которые фланкируют гомологичные плечи гена SecAdh.
Достигнув у С. autoethanogenum DSM23693 нокаута или гена 2,3bdh, или гена SecAdh, у данных мутантов по одному гену оказывали направленной действие на второй 5 ген, с применением либо плазмилы pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды рМТ1_85151-SecAdh-KO. Плазмиду вводили в мутант с одним нокаутированным геном либо путем электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 1 и 3. Проводили скрининг трансформантов на нокаут второго гена с использованием праймеров, фланкирующих гомологичные плечи соответствующих генов.
10 (б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh с использованием ClosTron:
Кассету ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкировали сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы- флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron, либо путем конъюгации, либо путем электропорации, маркер ermB RAM размером ~ 1,3 т.п.н. удаляли из генома мутанта и,
15 таким образом, маркер ermB используют повторно. Фрагмент интрона группы II размером ~ 0,8 т.п.н. оставлен в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его чувствительности к кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85) и секвенирования ПЦР-продукта. Получив мутант A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM
20 (A2,3bdh-ermB ClosTron), аналогичным образом оказывают направленное действие на ген SecAdh у мутанта, применяя инструмент ClosTron для инсерционной инактивации с помощью интрона группы II. В гене SecAdh идентифицировали место интронной вставки между основаниями 399 и 400 на смысловой нити, используя алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, и конструируют кассету, направляющую интрон (Seq. ID.
25 110). Кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводят скрининг с помощью ПЦР с праймерами
30 SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено ранее в примере 3.
Мутант С. autoethanogenum DSM23693 с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh создавали, применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо с помощью инструмента ClosTron для инсерционной инактивации с использованием интрона группы II, как объяснено в приведенных выше абзацах.
35 Нарушение генов 2,3bdh и SecAdh и выработки ацетоина, других метаболитов и
2,3-БДО подтверждали проведением анализов ферментативной активности для
превращения ацетоина в 2,3-БДО и также с помощью анализа продуктов, вырабатываемых мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
Пример 5: Модифицированный штамм DSM23693 С. autoethanogenum, вырабатывающий сниженное количество 2,3-БДО или не вырабатывающий 2,3-БДО
5 Как показано на фигуре 1, ацетолактат представляет собой одно из
промежуточных соединений в биосинтезе 2,3-БДО и также представляет собой предшественник для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в целом
10 классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, вовлеченными в синтез аминокислот с разветвленной цепью, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (и) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезом 2,3-БДО (alsS; аминокислота - AEI90719.1 и нуклеиновая кислота - HQ876013.1).
Геном С. autoethanogenum DSM23693 имеет 3 предпологаемых гена
15 анаболической ацетолактатсинтазы, ilvC, ilvl и ilvB. Типичная аминокислотная последовательность из С. autoethanogenum (AEI90719.1, AEI90730.1, AEI90731.1, AEI90713.1, AEI90714.1), С. Ijungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) и С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С.
20 autoethanogenum (HQ876013.1, HQ876023.1, HQ876021.1), С. Ijungdahlii (СР001666.1 -CLJU_c38920, CLJU_c32420, CLJU_c20420-30) и С. ragsdalei (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4 генов должно приводить к снижению в выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения
25 роста данных мутантов в среду добавляля три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
Как описано в примерах 1, 3 и 4, мутантов по одному гену С. autoethanogenum DSM23693, alsS, ilvC, ilvl и ilvB, можно получать либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
30 Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB:
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB сконструированы, как объяснено выше. 5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали 35 праймеры alsS5f (Seq. ID. 115) / alsS5r (Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между
сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут alsS с использованием 5 праймеров alsSOf (Seq. ID.119) и alsSOr (Seq. ID.120), которые фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvC 5'- (Seq. ID. 121) и 3'- (Seq. ID. 122) гомологичные плечи гена ilvC размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием
10 геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID. 126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvC-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо
15 электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID. 127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные
20 плечи гена ilvl размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч используют праймеры ilvl5f (Seq. ID. 131) / ilvl5r (Seq. ID. 132) и ilvl3f (Seq. ID. 133) / ilvl3r (Seq. ID. 134) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvl-KO.
25 Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом можно проводить скрининг трансформантов на нокаут ilvl с писпользованием праймеров ilvlOf (Seq. ID. 135) и ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-
30 продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'- (Seq. ID. 137) и 3'- (Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. autoethanogenum DSM23693. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 35 141) / ilvB3r (Seq. ID. 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvB-KO. Данную плазмиду вводили в С. autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на
чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvB, используя праймеры ilvBOf (Seq. ID.143) и ilvBOr (Seq. ID.144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB, для ПЦР и секвенирования ПЦР-продукта.
После получения мутантов с нокаутом одного гена последовательно оказывали 5 направленное действие на другие 3 гена ацетолактатсинтазы для получения мутанта, характеризующегося удалением всех 4 генов ацетолактатсинтазы. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным по отношению к аминокислотам с разветвленной цепью. Выработку или отсутствие выработки ацетоина, 2-3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано для приведенных выше 10 примеров. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak & Chipman, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Конструирование кассет ClosTron, направляющих интрон группы II, для генов alsS, ilvC, 15 ilvl и ilvB:
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. autoethanogenum DSM23693 можно также нарушать или инактивировать с применением инструмента ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяют для идентификации сайта-мишени для интрона группы II
20 между основаниями 303/ 304, 228 / 229, 975 / 976 и 157 / 158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и на антисмысловой нити гена ilvB соответственно. Можно также нацеливаться на другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма. Тот же алгоритм применяли для конструирования интрон-направляющих участков (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvl - Seq. ID.147 и ilvB - Seq. ID.148), которые можно
25 коммерчески синтезировать в DNA2.0 и доставлять в векторе pMTL007C-E2. Итоговые векторы, pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvl-975!976s и pMTL007C-E2-ilvB-157!158a сождержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С.
30 autoethanogenum DSM23693 либо путем конъюгации, либо электропорации. Проводили последовательную селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг с помощью ПЦР с использованием праймеров alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для
35 инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
После получения мутантов ClosTron с одним нарушенным геном, кассету ermB RAM удаляли из генома данных мутантов с применением плазмид pMTL, несущих ген
флиппазы, которую вводили в мутант либо путем электропорации, либо путем конъюгации. Проводили скрининг полученных трансформантов на потерю кассеты ermB путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и 5 alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvBICTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvB1 и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов.
После подтверждения потери кассеты ermB на мутанов ClosTron, подобно 10 нокаутным, оказывают направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации изобретения данные мутанты ClosTron выращивают в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в привденных выше 15 примерах. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittman et al, 2005; Vinogradov et al, 2006).
Пример 6: Нарушение генов пути 2,3-БДО у С. Ijungdhalii и С. ragsdalei
20 Путь получения 2,3-БДО является консервативным среди ацетогенов, включая С.
autoethanogenum, С. Ijungdahlii и С. ragsdalei. Гены alsS, ilvC, ilvl ilvB, budA, 2,3bdh и SecAdh у трех ацетогенов имеют высокую степень гомологии последовательностей. Следовательно, данные гены можно генетически модифицировать для повышения или снижения уровня выработки 2,3-БДО у данных трех ацетогенов. Описан способ
25 генетической модификации С. Ijungdahlii путем электропорации (Корке et al., 2010) (PCT/NZ2011/000203). Для С. ragsdalei любой специалист может применять способы электропорации и конъюгации, которые описаны выше для С. autoethanogenum.
Аминокислотные и нуклеотидные последовательности для генов alsS, ilvC, ilvB1, ilvB2, budA и 2,3bdh С. Ijungdahlii и С. ragsdalei могут быть получены из GenBank.
30 Предложены нуклеотидные последовательности SecAdh С. Ijungdahlii (Seq. ID. 36) и С. ragsdalei (Seq. ID. 37).
Плазмиды для нокаутирования и плазмиды ClosTron, которые применяли для нарушения генов alsS, ilvC, ilvB1 ilvB2, budA, 2,3bdh и SecAdh путем гомологичной рекомбинации и инсерционной инактивации на основе интрона группы II ClosTron у С.
35 Autoethanogenum, можно также применять для нарушения тех же генов С. Ijungdahlii и С. ragsdalei. Например, pMTL85141-budA-ko, pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s можно вводить в С. Ijungdahlii (объяснено ниже, в примере 6а) и С.
ragsdalei (объяснено ниже, в примере 66) или путем электропорации, или конъюгации, как описано выше для С. autoethanogenum в примере 1 и 3. Аналогичный скрининг мутантов и способы характеризации можно применять для С. Ijungdahlii и С. ragsdalei.
Пример 6а: Нарушение генов budA и 2,3bdh у С. Ljungdahlii с помощью гомологичной 5 рекомбинации и инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II для достижения отсутствия выработки 2,3-БДО и ее снижения
Плазмиды pMTL85141-budA-ko вводили в С. Ijungdahlii путем электропорации (Koepke et al 2010). Проводили отбор трансформантов на чашках с агаризованной средой РЕТС, содержащей 15 мкг/мл тиамфеникола, и скрининг на нокаут budA с
10 использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30).
Для нарушений генов budA и 2,3bdh у С. Ljungdahlii, с применением инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводят в С. ljungdahlii путем конъюгации. Штрихи единичных колоний после конъюгации последовательно наносили
15 сначала на агаризованную среду РЕТС, содержащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкл/мл триметоприма, с посдедующим нанесением на чашки с агаризованной средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Скрининг колоний на плазмиду на предмет вставки интрона группы II проводили случайным образом с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих
20 место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене 2,3-bdh.
Мутантов с нокаутированными budA и 2,3bdh и мутантов по budA и 2,3bdh ClosTron С. ljungdahlii, полученных выше, анализировали на предмет выработки 2,3-БДО и ацетоина с помощью ВЭЖХ и ферментации в биореакторах, как объяснено в примерах 1
25 и 3.
Пример 66: Нарушение генов budA и 2,3bdh у С. ragsdalei путем гомологичной рекомбинации и инструмента для инсерционной инактивации на основе интрона группы II для достижения отсутствия выработки 2,3-БДО и ее снижения
Плазмиды pMTL85141-budA-ko вводили в С. ragsdalei путем электропорации, как 30 описано выше для С. autoethaogenum или С. ljungdahlii, либо путем электропорации, либо конъюгации. Отбор трансформантов проводили на чашках с агаризованной средой РЕТС, содержащей 15 мкг/мл тиамфеникола, и проводят скрининг на нокаут budA с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30).
Для нарушений генов budA и 2,3bdh у С. ragsdalei с применением инструмента 35 ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II плазмиды pMTL007C-E5-budA-450!451s и pMTL007C-E5-2,3bdh-468!469s вводят в С. ragsdalei путем
конъюгации. Штрихи единичных колоний после конъюгации последовательно наносили сначала на агаризованную среду РЕТС, содуржащую 15 мкг/мл тиамфеникола и 10 мкг/мл триметоприма, с последующим нанесением на чашки с агаризованный средой РЕТС, содержащей 5 мкг/мл кларитромицина. Скрининг колоний на плазмиду на вставку интрона 5 группы II проводили случайным образом с помощью ПЦР с использованием праймеров Og44f (Seq. ID. 29) и Og45r (Seq. ID. 30), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене budA, и праймеров Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), фланкирующих место вставки интрона группы II в гене 2,3-bdh.
Мутантов с нокаутированными budA and 2,3bdh и мутантов по budA и 2,3bdh 10 ClosTron, полученных выше, анализировали на предмет выработки 2,3-БДО и ацетоина с помощью ВЭЖХ и ферментации в биореакторах, как объяснено в примерах 1 и 3.
Пример 7: Модифицированный С. ljungdahlii, вырабатывающий только ацетоин
Как объяснено ранее, отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с 2,3-БДО. Таким образом, желательно иметь штамм С. 15 ljungdahlii, вырабатывающий ацетоин, а не 2,3-БДО. Это может быть достигнуто путем удаления или нарушения как гена 2,3bdh, так и гена SecAdh, двумя способами, как объяснено в примере 6а: (а) гомологичной рекомбинацией и (б) безмаркерным нарушением гена с применением инструмента ClosTron.
(а) Штамм С. ljungdahlii с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh, полученный в результате 20 гомологичной рекомбинации:
5'- (Seq. ID. 94) и 3'- (Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером ~1 т.п.н. амплифицируют с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) и Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-
25 продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. ljungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенном выше примере 6а. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. ID.100) и Og34r (Seq. ID.101),
30 которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Плазмиду для нокаутирования гена SecAdh конструировали аналогичным образом. 5'- (Seq. ID. 102) и 3'- (Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером ~1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ljungdahlii. Для 35 амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР
продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID.108) и SecOr (Seq. ID.109), которые фланкируют гомологичные 5 плечи гена SecAdh.
Сразу после получения нокаута либо гена 2,3bdh, либо гена SecAdh у С. ljungdahlii, у данных мутантов по одному гену оказывали направленное действие на второй ген с применением либо плазмиды pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды pMTL85151-SecAdh-КО. В мутант с одним нокаутированным геном вводили плазмиду либо путем 10 электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 6а. Скрининг трансформантов на нокаут второго гена проводят с использованием праймеров, фланкирующих гомологичные плечи соответствующих генов.
(б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh у С. ljungdahlii с применением ClosTron:
Кассета ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкирована
15 сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы-флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron либо путем конъюгации, либо путем электропорации, маркер ermB RAM размером ~1,3 т.п.н. удаляют из генома мутанта и, таким образом, маркер ermB можно использовать повторно. Фрагмент интрона группы II размером ~0,8 т.п.н. останется в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его
20 чувствительности в кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85), и секвенирования ПЦР-продукта. Сразу после получения мутанта A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM (A2,3bdh-ermB ClosTron), подобным образом оказывали направленное действие на ген SecAdh у мутанта, применяя инструмент ClosTron для
25 инсерционной инактивации с помощью интрона группы II. В гене SecAdh идентифицировали место интронной вставки между основаниями 399 и 400 на смысловой нити с применением алгоритма, размещенного на ClosTron.com, и кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-
30 ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводят скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено выше в примере 6а.
Мутант с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh С. ljungdahlii получали,
35 применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо инструмент ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, как объяснено в приведенных выше абзацах.
Нарушение генов 2,3bdh and SecAdh и выработки метаболитов и 2,3-БДО подтверждали путем проведения анализов ферментативной активности в отношении превращения ацетоина в 2,3-БДО и также путем анализа продуктов, вырабатываемых мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
5 Пример 8: Модифицированный штамм С. ljungdahlii, вырабатывающий сниженное количество 2,3-БДО или не вырабатывающий 2,3-БДО
Как показано на фигуре 1, ацетолактат является одним из промежуточных соединений в биосинтезе 2,3-БДО и также представляет собой предшественник для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует
10 реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в общем классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, участвующими в синтезе разветвленных аминокислот, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (и) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезем 2,3-БДО.
15 Геном С. ljungdahlii имеет 3 предполагаемых гена анаболической
ацетолактатсинтазы, ilvC, ilvl и ilvB, и 1 ген катаболической ацетолактатсинтазы, alsS. Типичная аминокислотная последовательность из С. ljungdahlii (ADK15104.1, ADK15104.1, ADK15105.1, ADK15400.1, ADK15400.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности из С. ljungdahlii (СР001666.1, CLJU_c38920, CLJU_c32420,
20 CLJU_c20420-30) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4 генов будет приводить к снижению выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения роста данных мутантов в среду добавляют три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
25 Как описано в примерах 6а и 7, мутанты С. ljungdahlii по одному гену alsS, ilvC, ilvl
и ilvB могут быть получены либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB:
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB конструировали, как 30 объяснено выше.
5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч применяли праймеры alsS5f (Seq. ID. 115) / alsSr (Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-35 продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. ljungdahlii либо путем
конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах.
После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на
нокаут alsS, используя праймеры alsSOf (Seq. ID.119) и alsSOr (Seq. ID.120), которые
фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
5 Для нокаутирования гена ilvC 5'- (Seq. ID. 121) и 3'- (Seq. ID. 122) гомологичные
плечи гена ilvC размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID.
126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между 10 Sbf1/ Not1 and Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvC-KO. Данную плазмиду вводили в
С. ljungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID.
127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и 15 секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные плечи гена ilvl размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч используют праймеры ilvl5f (Seq. ID. 131) / ilvl5r (Seq. ID. 132) и ilvl3f (Seq. ID. 133) / ilvl3r (Seq. ID. 134)
20 соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтеми Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvl-KO. Данные плазмиды вводили в С. ljungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvl с использованием праймеров ilvlOf (Seq. ID.135) и
25 ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и секвенирования ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'- (Seq. ID. 137) и 3'- (Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ljungdahlii. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали
30 праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 141) / ilvB3r (Seq. ID. 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvB-KO. Данную плазмиду вводили в С. ljungdahlii либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в вышеприведенных примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили
35 скрининг трансформантов на нокаут ilvB с использованием праймеров ilvBOf (Seq. ID. 143) и ilvBOr (Seq. ID.144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Сразу после получения мутантов с нокаутом одного гена, последовательно оказывали направленное действие на другие три гена ацетолактатсинтазы с получением мутанта, у которого все 4 гена ацетолактатсинтазы удалены. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным по отношению к аминокислотам с разветвленной цепью. 5 Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов у данных мутантов можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в предшествующих примерах. Анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов 10 (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
Конструирование кассет, направляющих интрон группы II ClosTron, для генов alsS, ilvC, ilvl и ilv:
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. ljungdahlii можно также нарушать или инактивировать, применяя инструмент ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы
15 II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации сайта-мишени для интрона группы II между основаниями 303/ 304, 228 / 229, 975 / 976 и 157 / 158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и антисмысловой нити гена ilvB соответственно. На другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма, можно также нацеливаться. Тот же алгоритм применяют для конструирования участков,
20 направляющих интрон (alsS - Seq. ID. 145; ilvC - Seq. ID. 146; ilvl - Seq. ID. 147 и ilvB - Seq. ID.148), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляют в векторе PMTL007C-E2. Итоговые векторы pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-2281229s, pMTL007C-E2-ilvl-975!976s и pMTL007C-E2-ilvB-157!158a содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к
25 антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С. ljungdahlii любо путем конъюгации, либо электропорации. Проводили последовательную селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином, и проводили скрининг трансформантов с помощью ПЦР с использованием праймеров alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID.
30 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
Сразу после получения мутантов ClosTron с одним нарушенным геном, кассету с ermB RAM удаляли из генома данных мутантов с применением плазмид pMTL, несущих ген флиппазы, которые вводили в мутант либо путем электропорации, либо путем
35 конъюгации. Проводили скрининг полученных трансформантов на потерю кассеты ermB путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими сайт вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и
alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvB1 и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов. После подтверждения потери кассеты ermB, на мутанты ClosTron, подобно 5 мутантам-нокаутам, последовательно оказывали направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации изобретения данных мутантов ClosTron выращивали в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Выработку или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов у данных мутантов анализировали с помощью ВЭЖХ, как описано в 10 предшествующих примерах и изучали проведением анализов ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов, которые можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
15 Пример 9: Модифицированный С. ragsdalei, вырабатывающий только ацетоин
Как объяснено ранее, отделение ацетоина от этанола является технически более целесообразным, по сравнению с 2,3-БДО. Таким образом, желательно иметь штамм С. ragsdalei, вырабатывающий ацетоин, а не 2,3-БДО. Данный штамм может быть получен удалением или нарушением как гена 2,3bdh, так и гена SecAdh, двумя способами, как 20 объяснено в примере 66: (а) гомологической рекомбинацией и (6) безмаркерным нарушением генов с применением инструмента ClosTron.
(а) Штамм с нокаутом двух генов A2,3bdh ASecAdh С. ragsdalei, полученный в результате гомологичной рекомбинации:
5'- (Seq. ID. 94) и 3'- (Seq. ID. 95) гомологичные плечи генов 2,3bdh размером ~ 1 25 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Og13f (Seq. ID. 96) / Og14r (Seq. ID. 97) и Og15f (Seq. ID. 98) / Og16r (Seq. ID. 99) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-2,3bdh-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем 30 конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенном выше примере 66. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут 2,3bdh с использованием праймеров Og33f (Seq. ID.100) и Og34r (Seq. ID.101), которые фланкируют гомологичные плечи 2,3bdh, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
35 Плазмиду для нокаутирования гена SecAdh конструировали подобным образом. 5'-
(Seq. ID. 102) и 3'- (Seq. ID. 103) гомологичные плечи генов SecAdh размером ~ 1 т.п.н.
амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры Sec5f (Seq. ID. 104) / Sec5r (Seq. ID. 105) и Sec3f (Seq. ID. 106) / Sec3r (Seq. ID. 107) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с 5 получением pMTL85151-SecAdh-KO. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут SecAdh с использованием для ПЦР праймеров SecOf (Seq. ID.108) и SecOr (Seq. ID.109), которые фланкируют гомологичные плечи гена SecAdh.
Сразу после получения нокаута либо гена 2,3bdh, либо гена SecAdh, у С. ragsdalei, 10 оказывали направленное действие на второй ген у данных мутантов по одному гену с применением либо плазмиды pMTL85151-2,3bdh-KO, либо плазмиды pMTL85151-SecAdh-КО. Плазмиду вводили в мутант с нокаутом одного гена либо путем электропорации, либо путем конъюгации, как уже описано в примере 66. Проводили скрининг трансформантов на нокаут второго гена с использованием праймеров, фланкирующих 15 гомологичные плечи соответствующих генов.
(б) Нарушение двух генов A2,3bdh ASecAdh у С. ragsdalei с применением ClosTron:
Кассету с ermB RAM в конструкции с интроном группы II ClosTron фланкировали сайтами рекомбинации, распознаваемыми флиппазой (Frt). Путем введения рекомбиназы-флиппазы в мутант A2,3bdh ClosTron либо путем конъюгации, либо путем
20 электропорации, маркер ermB RAM размером ~1,3 т.п.н удаляют из генома мутанта, и, таким образом, маркер ermB можно использовать повторно. Фрагмент интрона группы II размером ~0,8 т.п.н. останется в геноме. Этот факт подтверждали (i) тестированием его чувствительности к кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, с праймерами Og42f (Seq. ID. 84) и Og43r (Seq. ID. 85) и
25 секвенирования ПЦР-продукта. Сразу после получения мутанта A2,3bdh ClosTron без маркера ermB RAM (A2,3bdh-ermB ClosTron), подобным образом оказывали направленное действие на ген SecAdh у мутанта с применением инструмента ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II. Место вставки интрона между основаниями 399 и 400 на смысловой нити в гене SecAdh идентифицировали с
30 применением алгоритма Perutka, размещенного на ClosTron.com, и конструируют кассету, направляющую интрон (Seq. ID. 110). Кассету, направляющую интрон, коммерчески синтезировали в DNA2.0 и доставляли в векторе pMTL007C-E2 в виде pMTL007C-E5-SecAdh-399!400s, который вводили в мутант A2,3bdh-ermB ClosTron либо путем конъюгации, либо электропорации. Можно последовательно проводить селекцию
35 тарнсформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами SecCTf (Seq. ID. 111) и SecCTr (Seq. ID. 112), как объяснено ранее в примере 66.
Мутанта С. ragsdalei с нарушением двух генов A2,3bdh ASecAdh получали, применяя либо метод гомологичной рекомбинации, либо инструмент ClosTron для инсерционной инактивации на основе интрона группы II, как объяснено в приведенном выше абзаце.
5 Нарушение генов 2,3bdh и SecAdh подтверждали проведением анализов
ферментативной активности в отношении превращения ацетоина в 2,3-БДО, а также анализом метаболитов и 2,3-БДО, выработанных мутантом, с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.
Пример 10: Модифицированный штамм С. ragsdalei, вырабатывающий сниженное 10 количество 2,3-БДО или не вырабатывающий его
Как показано на фигуре 1, ацетолактат является одним из промежуточных соединений в биосинтезе 2,3-БДО и также является предшественником для синтеза аминокислот с разветвленной цепью. Фермент ацетолактатсинтаза катализирует реакцию, ведущую к образованию ацетолактата из 2 молекул пирувата в качестве
15 субстратов. Фермент ацетолактатсинтаза в общем классифицируют на две группы: (i) анаболическая ацетолактатсинтаза связана с генами, участвующими в синтезе аминокислот с разветвленной цепью, таких как валин, изолейцин и лейцин, и (и) катаболическая ацетолактатсинтаза связана с синтезом 2,3-БДО.
Геном С. ragsdalei имеет 3 предпологаемых гена анаболической
20 ацетолактатсинтазы ilvC, ilvl и ilvB и 1 ген катаболической ацетолактатсинтазы alsS. Типичная аминокислотная последовательность из С. ragsdalei (AEI90734.1, AEI90734.1, AEI90735.1, AEI90727.1, AEI90727.1) и соответствующие нуклеотидные последовательности (HQ876014.1, HQ876024.1, HQ876022.1) получены из GenBank.
Нарушение всех 4 генов ацетолактатсинтазы или любой комбинации данных 4
25 генов будет приводить к снижению выработки ацетоина и 2,3-БДО. Для обеспечения роста данных мутантов в среду добавляют три аминокислоты с разветвленной цепью, валин, лейцин и изолейцин.
Как описано в примерах 66 и 9, мутантов по одному гену alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. ragsdalei можно получать либо путем гомологичной рекомбинации, либо применяя
30 инструмент ClosTron для мутагенеза на основе интрона группы II.
Конструирование кассет для нокаутирования alsS, ilvC, ilvl и ilvB:
Конструкции для нокаутирования генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB конструировали, как объяснено выше.
5'- (Seq. ID. 113) и 3'- (Seq. ID. 114) гомологичные плечи гена alsS размером ~ 1 35 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры alsS5f (Seq. ID. 115) /
alsSr (Seq. ID. 116) и alsS3f (Seq. ID. 117) / alsS3r (Seq. ID. 118) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-alsS-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. 5 После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут alsS с использованием праймеров alsSOf (Seq. ID. 119) и alsSOr (Seq. ID. 120), которые фланкируют гомологичные плечи alsS, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvC 5'- (Seq. ID. 121) и 3'- (Seq. ID. 122) гомологичные 10 плечи гена ilvC размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvC5f (Seq. ID. 123) / ilvC5r (Seq. ID. 124) и ilvC3f (Seq. ID. 125) / ilvC3r (Seq. ID.
126) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/ Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvC-KO. Данную плазмиду
15 вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvC с использованием праймеров ilvCOf (Seq. ID.
127) и ilvCOr (Seq. ID. 128), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvC, для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
20 Для нокаутирования гена ilvl 5'- (Seq. ID. 129) и 3'- (Seq. ID. 130) гомологичные
плечи гена ilvl размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР, используя геномную ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvl5f (Seq. ID. 131) / ilvl5r (Seq. ID. 132) и ilvl3f (Seq. ID. 133) / ilvl3r (Seq. ID. 134) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами
25 Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvl-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили скрининг трансформантов на нокаут ilvl с использованием праймеров ilvlOf (Seq. ID. 135) и ilvlOr (Seq. ID. 136), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvl, для ПЦР и
30 секвенирования данного ПЦР-продукта.
Для нокаутирования гена ilvB 5'- (Seq. ID. 137) и 3'- (Seq. ID. 138) гомологичные плечи гена ilvB размером ~ 1 т.п.н. амплифицировали с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК С. ragsdalei. Для амплификации 5'- и З'-гомологичных плеч использовали праймеры ilvB5f (Seq. ID. 139) / ilvB5r (Seq. ID. 140) и ilvB3f (Seq. ID. 141) / ilvB3r (Seq. ID.
35 142) соответственно. Два ПЦР-продукта клонировали в плазмиды рМТ1_85151 между сайтами Sbf1/Not1 и Nhe1/Asc1 с получением pMTL85151-ilvB-KO. Данную плазмиду вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо путем электропорации, как описано в приведенных выше примерах. После селекции на чашках с тиамфениколом проводили
скрининг трансформантов на нокаут ilvB с использованием праймеров ilvBOf (Seq. ID.143) и ilvBOr (Seq. ID.144), которые фланкируют гомологичные плечи гена ilvB для ПЦР и секвенирования данного ПЦР-продукта.
Сразу после получения нокаутных мутантов по одному гену, последовательно 5 оказывали направленное действие на другие 3 гена ацетолактатсинтазы с получением мутанта, у которого удалены все 4 гена ацетолактатсинтазы. Рост данных мутантов может быть ауксотрофным в отношении аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах можно анализировать с помощью ВЭЖХ, как описано в предшествующих примерах. Для 10 подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов можно проводить анализы ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов (Tittmann, Vyazmensky, Hubner, Barak, & Chipman, 2005; Vinogradov et al., 2006).
Конструирование кассет, направляющих интрон группы II ClosTron, для генов alsS, ilvC, 15 ilvl и ilvB:
Гены alsS, ilvC, ilvl и ilvB С. ragsdalei можно также нарушать или инактивировать, применяя инструмент ClosTron для нарушения генов, опосредованного интроном группы II (Heap et al., 2010). Алгоритм Perutka, размещенный на ClosTron.com, применяли для идентификации сайта-мишени для интрона группы II между основаниями 303/ 304, 228 /
20 229, 975 / 976 и 157 / 158 на смысловой нити генов alsS, ilvC, ilvl и антисмысловой нити гена ilvB соответственно. Можно также нацеливаться на другие сайты, идентифицированные с помощью алгоритма. Тот же алгоритм применяли для конструирования интрон-направляющих участков (alsS - Seq. ID.145; ilvC - Seq. ID.146; ilvl - Seq. ID.147 и ilvB - Seq. ID.148), которые коммерчески синтезировали в DNA2.0 и
25 доставляли в векторе pMTL007C-E2. Итоговые векторы pMTL007C-E2-alsS-303!304s, pMTL007C-E2-ilvC-228!229s, pMTL007C-E2-ilvl-975!976s и pMTL007C-E2-ilvB-157!158a содержат маркер ermB, активируемый ретротранспозицией (RAM), который придает устойчивость к антибиотику кларитромицину при вставке в сайт-мишень. Данные плазмиды вводили в С. ragsdalei либо путем конъюгации, либо электропорации.
30 Последовательно проводили селекцию трансформантов на чашках с агаром с тиамфениколом и кларитромицином и скрининг трансформантов с помощью ПЦР с праймерами alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) для инактивации генов alsS, ilvC, ilvl и ilvB соответственно.
35 Сразу после получения мутантов ClosTron с одним разрушенным геном, кассету
ermB RAM удаляли из генома данных мутантов, применяя плазмиды pMTL, несущие ген флиппазы, которых вводят в мутант либо путем электропорации, либо путем конъюгации.
Проводили скрининг полученных трансформантов на предмет потери кассеты ermB путем тестирования их чувствительности к кларитромицину и (и) с помощью ПЦР с праймерами, фланкирующими место вставки интрона группы II, alsSCTf (Seq. ID. 149) и alsSCTr (Seq. ID. 150), ilvCCTf (Seq. ID. 151) и ilvCCTr (Seq. ID. 152), ilvlCTf (Seq. ID. 153) и ilvlCTr (Seq. 5 ID. 154) и ilvBCTf (Seq. ID. 155) и ilvBCTr (Seq. ID. 156) в генах alsS, ilvC, ilvB и ilvB2 соответственно и путем дополнительного секвенирования данных ПЦР-продуктов.
После подтверждения потери кассеты ermB на мутантов ClosTron, подобно нокаутным мутантам, последовательно оказывают направленное действие для инактивации других генов ацетолактатсинтазы. Согласно одному варианту реализации
10 данных мутантов ClosTron выращивают в присутствии аминокислот с разветвленной цепью. Продукцию или отсутствие выработки ацетоина, 2,3-БДО и других метаболитов в данных мутантах анализируют с помощью ВЭЖХ, как описано в предыдущих примерах, и изучают путем проведения анализов ферментативной активности с пируватом в качестве субстрата и тиаминдифосфатом и флавинадениндинуклеотидом в качестве кофакторов,
15 которые можно проводить для подтверждения потери активности ацетолактатсинтазы у данных мутантов (Tittmann et al., 2005; Vinogradov et al., 2006).
В настоящей заявке описано изобретение со ссылкой на определенные предпочтительные варианты реализации для того, чтобы позволить читателю использовать настоящее изобретение на практике без чрезмерного
20 экспериментирования. Однако средний специалист в данной области техники быстро осознает, что многие компоненты и параметры могут быть изменены или модифицированы до определенной степени или заменены на известные эквиваленты без отступления от объема настоящего изобретения. Следует учесть, что такие модификации и эквиваленты включаны в настоящую заявку, как если бы они были изложены по
25 отдельности. Названия, заголовки или тому подобное предложены для улучшения понимания данного документа читателем, и их не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Полные описания всех заявок, патентов и публикаций, процитированных выше и ниже, в случае необходимости, включены в настоящую заявку посредством ссылки.
30 Однако ссылка на любые заявки, патенты и публикации в данном описании изобретения не является, и ее не следует воспринимать как признание или любую форму указания на то, что они составляют действующий уровень техники или образуют часть общего знания в любой стране мира.
По всему объему данного описания изобретения и следующей далее формулы
35 изобретения, если в контексте не указано иное, слова "содержит", "содержащий" и тому подобное следует истолковывать во включительном смысле, в отличие от исключительного смысла, то есть, в смысле "включающий, но не ограничивающийся указанными".
Источники:
Abrini, J, Naveau, H. & Nyns, E.J., 1994. Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Archives of microbiology, 161(4), pp.345-351. Available at:
http://www.springerlink.com/index/vl43151w30423660.pdf [Accessed September 4,
2011].
Collins, M. D., Lawson, P. A., Willems, A., Cordoba, J. J., Fernandez-Garayzabal, J., Garcia, P., Cai, J., et al. (1994). The phylogeny of the genus Clostridium: proposal of five new genera and eleven new species combinations. International journal of systematic bacteriology, 44(4), 812-26. Retrieved from http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7981107
Drake, H. L, Kusel, K., Matthies, C, Wood, H. G., & Ljungdahl, L. G. (2006). Acetogenic Prokaryotes. In M. Dworkin, S. Falkow, E. Rosenberg, K.-H. Schleifer, & E. Stackebrandt (Eds.), The Prokaryotes (3rd Editio., pp. 354^20). New York, NY: Springer. doi:10.1007/0-387-307427
Корке, M., Mihalcea, C, Liew, F., Tizard, J. H., AN, M. S., Conolly, J. J., Al-Sinawi, В., et al. (2011). 2,3-Butanediol Production By Acetogenic Bacteria, an Alternative Route To Chemical Synthesis, Using Industrial Waste Gas. Applied and environmental microbiology, 77(15), 546775. doi:10.1128/AEM.00355-11
Perez, J. M., Richter, H., Loftus, S. E., & Angenent, L. T. (2012). Biocatalytic reduction of short-chain carboxylic acids into their corresponding alcohols with syngas fermentation. Biotechnology and bioengineering, 1-30. doi:10.1002/bit.24786
Smart KF, Aggio RB, Van Houtte JR, Villas-Boas SG, Analytical platform for metabolome analysis of microbial cells using methyl chloroformate derivatization followed by gas chromatography-mass spectrometry, Nat Protoc. 2010 Sep;5(10): 1709-29. 2010
Tanner, R. S., Miller, L. M., & Yang, D. (1993). Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial rRNA homology group I. International journal of systematic bacteriology, 43(2), 232. Retrieved from http://ijs.sgmjournals.Org/content/43/2/232.short
Heap, J. Т., Kuehne, S. a, Ehsaan, M., Cartman, S. Т., Cooksley, С. M., Scott, J. C, & Minton, N. P. (2010). The ClosTron: Mutagenesis in Clostridium refined and streamlined. Journal of microbiological methods, 80(1), 49-55. doi:10.1016/j.mimet.2009.10.018
Корке, M., Held, C, Hujer, S., Liesegang, H., Wiezer, A., Wollherr, A., Ehrenreich, A., et al. (2010). Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(29), 13087-92. doi: 10.1073/pnas. 1004716107
Tittmann, K., Vyazmensky, M., Hubner, G., Barak, Z., & Chipman, D. M. (2005). The carboligation reaction of acetohydroxyacid synthase II: steady-state intermediate distributions in wild type and mutants by NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102(3), 553-8. doi:10.1073/pnas.0408210101
Vinogradov, V., Vyazmensky, M., Engel, S., Belenky, I., Kaplun, A., Kryukov, O., Barak, Z., et al. (2006). Acetohydroxyacid synthase isozyme I from Escherichia coli has unique catalytic and regulatory properties. Biochimica et biophysica acta, 1760(3), 356-63. doi: 10.1016/j.bbagen.2005.10.008
Yan, Y., Lee, C.-C, & Liao, J. C. (2009). Enantioselective synthesis of pure (R,R)-2,3-butanediol in Escherichia coli with stereospecific secondary alcohol dehydrogenases. Organic & biomolecular chemistry, 7(19), 3914-7. doi: 10.1039/b913501 d
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Lanzatech New Zealand Limited коерке, Michael Chen, Wendy Y Nagaraju, Shi 1 pa
<120> РЕКОМБИНАНТНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ <130> LT74PCT <150> US 61/593269 <151> 2012-01-31 <160> 156
<170> патент в версии 3.5 <210> 1 <211> 719 <212> ДНК
<213> Clostridia autoethanogenum <400> 1
atggatgatg aggtgaaagt cccaaaccat atatatcaaa tgtctacaat aaatgcactt 60 gtttcggggc tgtatgatgg ctgtgtttca ttatctaaac ttcttaaaaa aggaaacttt 120 ggtataggta cttttaaagg tctagatggt gaactaactc ttttaaatgg aactttttat 180 aggactaaac ctgatggcag cgtatacgta tgttccaaaa acgtatccgt tccttttgct 240 gtagtcactg aactggaaaa ttataatact tataatattc aaaatcgtac ttcttatgaa 300 gatataagaa aagaattgga cagctttata gaaagcaaaa atatatttta tgctttctat 360 atggaaggta aatttaatta tgtaaaaaca cgtactgttg taaaacagaa tatgccttat 420 aagcctatgg ctgaagttgt taaagatcag cctatgtttg aatataacgg tgttgatgga 480 tatgtggttg gatttaggtg tcctgattat gttgaaggcc ttaatgtccc tggatatcat 540 tttcatttca taaataaaga taagaaattt ggtggacata taagtgaatt ttccattgaa 600 aatgcgaagg tttatgtaca gaactgttct tgctttagga tggaacttcc taaaaagaaa 660 gtttttataa tatggaagta caagatagaa acgatgagat aacaagtgtt gaaaaataa 719 <210> 2 <211> 239 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 2
Met Asp Asp Glu val Lys val Pro Asn His lie Tyr Gin Met Ser Thr
15 10 15
lie Asn Ala Leu val Ser Gly Leu Tyr Asp Gly Cys val Ser Leu Ser
20 25 30
Lys Leu Leu Lys Lys Gly Asn Phe Gly lie Gly Thr Phe Lys Gly Leu
35 40 45
Asp Gly Glu Leu Thr Leu Leu Asn Gly Thr Phe Tyr Arg Thr Lys Pro
50 55 60
Asp Gly Ser val Tyr val Cys Ser Lys Asn val Ser val Pro Phe Ala
65 70 75 80
val val Thr Glu Leu Glu Asn Tyr Asn Thr Tyr Asn lie Gin Asn Arg
85 90 95
Thr Ser Tyr Glu Asp lie Arg Lys Glu Leu Asp Ser Phe lie Glu Ser
100 105 110
Lys Asn lie Phe Tyr Ala Phe Tyr Met Glu Gly Lys Phe Asn Tyr val
115 120 125
Lys Thr Arg Thr val val Lys Gin Asn Met Pro Tyr Lys Pro Met Ala
130 135 140
Glu val val Lys Asp Gin Pro Met Phe Glu Tyr Asn Gly val Asp Gly
145 150 155 160
Tyr val val Gly Phe Arg Cys Pro Asp Tyr val Glu Gly Leu Asn val
165 170 175
Pro Gly Tyr His Phe His Phe lie Asn Lys Asp Lys Lys Phe Gly Gly
180 185 190
His lie Ser Glu Phe Ser lie Glu Asn Ala Lys val Tyr val Gin Asn
195 200 205
Cys Ser Cys Phe Arg Met Glu Leu Pro Lys Asn Glu Ser Phe Tyr Asn
210 215 220
Met Glu val Gin Asp Arg Asn Asp Glu lie Thr Ser val Glu Lys
225 230 235
<210> 3 <211> 964 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 3
tttcttcaca ggaaaatata cttcagtaac aagatcttta ggaatggtga cttggtgggg 60 gtcagttaca tatacttcat atggtgggtt tgtaagttta tatccttcat tttctaccca 120 ttccctcaac ttagcatata cagagatgtt aattctgaat atgagcccct taaaacagac 180 ttcgcacaaa ggactccagg caagtatctt gttcccttta caatctcctt tatcggaatg 240 gcaagttctg tatcattgcc agaaggattg tattcagcgc tgtgataaat agttattggc 300 ttaccaagaa agtcaattac aaaaatatat ataaagaaag caaagctaca tatattaaag 360 catttaaggt aaaactaaaa atattataaa aatgaaatta ttttttctca tagctaaagt 420
tacataatac gaggaggatt tataatgaaa aaagtaatag gaattataag tattgtacta 480 tttgtactcg tagcacttca atcctgtgct gcaggagtag gaaatgcatt aagtaataac 540 aaagaagcta gtggatctgc tggattattt ttatctgtat gtatgcttat tgctggaata 600 atagcaataa tatcaaaata tagtaaaggt atgactataa cagctatagt attttatttg 660 ttagcttttg ttgtagggat tgctaatgtt gggcattttt cagatttgca aatttggtca 720 atcattaact tgatatttgc tggactattg atatttcatt tgcttaaaaa taagcaatta 780 tataatagca gtgggaaaaa gtagaatcat atattgtaat tatttttaat tatgttggca 840 aaattgaaat tgtcactgaa acacctctaa atgttttaaa tacatatgtt taattattgt 900 gacagattct aatagtagaa agtagaaatt tgctatgtta taatgacata gaggtgaatg 960 taat 964 <210> 4 <211> 977 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 4
actagacagt gctaataaca atgtctagtg ctttttatct tgctcaattt tttcattgag 60 ttcatttaag taagtccacc tgtccatctt ttcgtctagc tctttttcca gtgaattctt 120
ttcggataag agatcttcaa gaagtgcata atcagatgaa gcagcttcca tttctatttt 180
cttttcagat atagattttt ctagatgttc aattacctca tctattttgt caaactccat 240
ttgttctgca taggtaaatt ttagaggctt ttctttttgc aacttatagt tgtttttagc 300
tgtatttttc ttagagctta ttttttcctc tgatattttt gcagttttgt gaaaatagga 360
atagtttcct gtatattgag tgattttacc gtttccttca aaagaaaata ttttatcaac 420
tgttttgtca aggaagtacc tgtcatgaga tacagctata acagctcctt caaaatcgtt 480
aatataatct tctaggattg taagtgtttc tatatccaga tcatttgttg gttcgtccag 540
caaaagtaca ttagggtaat tcatcagtat ttttagaaga tataatcttc ttcgttctcc 600
tcctgaaagt tttccaaggg gagtccattg aactgaaggt tcaaataaaa aattttcaag 660
tacagcagaa gcacttattt tttcacccga tgaagttgac gcatattctg atgtcccacg 720
tatgtattca attacccttt cgttcatatc catatcagaa attccctgag aatagtatcc 780
tatctttact gtttcaccta tatctatagt gccgctgtcc ggcagaattt tttgaactaa 840
aatattcata agagtggatt taccacttcc attaggtcca ataataccta ttctgtcatt 900
atttagtatg ttataagtga aatttttaat taatgtcttt tcaccaaaac ttttgcttat 960
gttatccagg tttatga 977
<210> 5
<211> 40
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 5
attcatcctg caggtttctt cacaggaaaa tatacttcag 40 <210> 6 <211> 40 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 6
gactgcggcc gcattacatt cacctctatg tcattataac 40 <210> 7 <211> 38 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 7
atttgctagc actagacagt gctaataaca atgtctag 38 <210> 8 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 8
atatggcgcg cctcataaac ctggataaca taagc 3 5 <210> 9 <211> 2963 <212> ДНК
<213> Escherichia coli <400> 9
cctgcaggat aaaaaaattg tagataaatt ttataaaata gttttatcta caattttttt 60 atcaggaaac agctatgacc gcggccgctg tatccatatg accatgatta cgaattcgag 120 ctcggtaccc ggggatcctc tagagtcgac gtcacgcgtc catggagatc tcgaggcctg 180 cagacatgca agcttggcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 240 cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga 300 agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatggcgcta 360 gcataaaaat aagaagcctg catttgcagg cttcttattt ttatggcgcg ccgcattcac 420 ttcttttcta tataaatatg agcgaagcga ataagcgtcg gaaaagcagc aaaaagtttc 480 ctttttgctg ttggagcatg ggggttcagg gggtgcagta tctgacgtca atgccgagcg 540 aaagcgagcc gaagggtagc atttacgtta gataaccccc tgatatgctc cgacgcttta 600
tatagaaaag aagattcaac taggtaaaat cttaatatag gttgagatga taaggtttat 660 aaggaatttg tttgttctaa tttttcactc attttgttct aatttctttt aacaaatgtt 720 cttttttttt tagaacagtt atgatatagt tagaatagtt taaaataagg agtgagaaaa 780 agatgaaaga aagatatgga acagtctata aaggctctca gaggctcata gacgaagaaa 840 gtggagaagt catagaggta gacaagttat accgtaaaca aacgtctggt aacttcgtaa 900 aggcatatat agtgcaatta ataagtatgt tagatatgat tggcggaaaa aaacttaaaa 960 tcgttaacta tatcctagat aatgtccact taagtaacaa tacaatgata gctacaacaa 1020 gagaaatagc aaaagctaca ggaacaagtc tacaaacagt aataacaaca cttaaaatct 1080 tagaagaagg aaatattata aaaagaaaaa ctggagtatt aatgttaaac cctgaactac 1140 taatgagagg cgacgaccaa aaacaaaaat acctcttact cgaatttggg aactttgagc 1200 aagaggcaaa tgaaatagat tgacctccca ataacaccac gtagttattg ggaggtcaat 1260 ctatgaaatg cgattaaggg ccggccagtg ggcaagttga aaaattcaca aaaatgtggt 1320 ataatatctt tgttcattag agcgataaac ttgaatttga gagggaactt agatggtatt 1380 tgaaaaaatt gataaaaata gttggaacag aaaagagtat tttgaccact actttgcaag 1440 tgtaccttgt acctacagca tgaccgttaa agtggatatc acacaaataa aggaaaaggg 1500 aatgaaacta tatcctgcaa tgctttatta tattgcaatg attgtaaacc gccattcaga 1560 gtttaggacg gcaatcaatc aagatggtga attggggata tatgatgaga tgataccaag 1620 ctatacaata tttcacaatg atactgaaac attttccagc ctttggactg agtgtaagtc 1680 tgactttaaa tcatttttag cagattatga aagtgatacg caacggtatg gaaacaatca 1740 tagaatggaa ggaaagccaa atgctccgga aaacattttt aatgtatcta tgataccgtg 1800 gtcaaccttc gatggcttta atctgaattt gcagaaagga tatgattatt tgattcctat 1860 ttttactatg gggaaatatt ataaagaaga taacaaaatt atacttcctt tggcaattca 1920 agttcatcac gcagtatgtg acggatttca catttgccgt tttgtaaacg aattgcagga 1980 attgataaat agttaacttc aggtttgtct gtaactaaaa acaagtattt aagcaaaaac 2040 atcgtagaaa tacggtgttt tttgttaccc taagtttaaa ctcctttttg ataatctcat 2100 gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat 2160 caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa 2220 accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa 2280 ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt 2340 aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt 2400
accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata 2460
gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt 2520
ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac 2580
gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga 2640
gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg 2700 ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa 2760 aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat 2820 gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 2880 tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 2940 agagcgccca atacgcaggg ccc 2963 <210> 10 <211> 16 <212> днк
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 10
gtaaaacgac ggccag 16 <210> 11 <211> 18 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 11
caggaaacag ctatgacc 18 <210> 12 <211> 4819 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Плазмида pMTl_85141-budA-ko для нокаутирования гена budA <400> 12
cctgcaggtt tcttcacagg aaaatatact tcagtaacaa gatctttagg aatggtgact 60 tggtgggggt cagttacata tacttcatat ggtgggtttg taagtttata tccttcattt 120 tctacccatt ccctcaactt agcatataca gagatgttaa ttctgaatat gagcccctta 180 aaacagactt cgcacaaagg actccaggca agtatcttgt tccctttaca atctccttta 240 tcggaatggc aagttctgta tcattgccag aaggattgta ttcagcgctg tgataaatag 300 ttattggctt accaagaaag tcaattacaa aaatatatat aaagaaagca aagctacata 360 tattaaagca tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata 420 gctaaagtta cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta 480 ttgtactatt tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa 540 gtaataacaa agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg 600 ctggaataat agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat 660
tttatttgtt agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa 720 tttggtcaat cattaacttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata 780 agcaattata taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta 840 tgttggcaaa attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta 900 attattgtga cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga 960 ggtgaatgta atgcggccgc tgtatccata tgaccatgat tacgaattcg agctcggtac 1020 ccggggatcc tctagagtcg acgtcacgcg tccatggaga tctcgaggcc tgcagacatg 1080 caagcttggc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc 1140 aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc gaagaggccc 1200 gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc tagcagtatt 1260 gatagaaaaa aacactagac agtgctaata acaatgtcta gtgcttttta tcttgctcaa 1320 ttttttcatt gagttcattt aagtaagtcc acctgtccat cttttcgtct agctcttttt 1380 ccagtgaatt cttttcggat aagagatctt caagaagtgc ataatcagat gaagcagctt 1440 ccatttctat tttcttttca gatatagatt tttctagatg ttcaattacc tcatctattt 1500 tgtcaaactc catttgttct gcataggtaa attttagagg cttttctttt tgcaacttat 1560 agttgttttt agctgtattt ttcttagagc ttattttttc ctctgatatt tttgcagttt 1620 tgtgaaaata ggaatagttt cctgtatatt gagtgatttt accgtttcct tcaaaagaaa 1680 atattttatc aactgttttg tcaaggaagt acctgtcatg agatacagct ataacagctc 1740 cttcaaaatc gttaatataa tcttctagga ttgtaagtgt ttctatatcc agatcatttg 1800 ttggttcgtc cagcaaaagt acattagggt aattcatcag tatttttaga agatataatc 1860 ttcttcgttc tcctcctgaa agttttccaa ggggagtcca ttgaactgaa ggttcaaata 1920 aaaaattttc aagtacagca gaagcactta ttttttcacc cgatgaagtt gacgcatatt 1980 ctgatgtccc acgtatgtat tcaattaccc tttcgttcat atccatatca gaaattccct 2040 gagaatagta tcctatcttt actgtttcac ctatatctat agtgccgctg tccggcagaa 2100 ttttttgaac taaaatattc ataagagtgg atttaccact tccattaggt ccaataatac 2160 ctattctgtc attatttagt atgttataag tgaaattttt aattaatgtc ttttcaccaa 2220 aacttttgct tatgttatcc aggtttatga cttttttacc ggcgcgccgc attcacttct 2280 tttctatata aatatgagcg aagcgaataa gcgtcggaaa agcagcaaaa agtttccttt 2340 ttgctgttgg agcatggggg ttcagggggt gcagtatctg acgtcaatgc cgagcgaaag 2400 cgagccgaag ggtagcattt acgttagata accccctgat atgctccgac gctttatata 2460 gaaaagaaga ttcaactagg taaaatctta atataggttg agatgataag gtttataagg 2520 aatttgtttg ttctaatttt tcactcattt tgttctaatt tcttttaaca aatgttcttt 2580 tttttttaga acagttatga tatagttaga atagtttaaa ataaggagtg agaaaaagat 2640 gaaagaaaga tatggaacag tctataaagg ctctcagagg ctcatagacg aagaaagtgg 2700
agaagtcata gaggtagaca agttataccg taaacaaacg tctggtaact tcgtaaaggc 2760 atatatagtg caattaataa gtatgttaga tatgattggc ggaaaaaaac ttaaaatcgt 2820 taactatatc ctagataatg tccacttaag taacaataca atgatagcta caacaagaga 2880 aatagcaaaa gctacaggaa caagtctaca aacagtaata acaacactta aaatcttaga 2940 agaaggaaat attataaaaa gaaaaactgg agtattaatg ttaaaccctg aactactaat 3000 gagaggcgac gaccaaaaac aaaaatacct cttactcgaa tttgggaact ttgagcaaga 3060 ggcaaatgaa atagattgac ctcccaataa caccacgtag ttattgggag gtcaatctat 3120 gaaatgcgat taagggccgg ccagtgggca agttgaaaaa ttcacaaaaa tgtggtataa 3180 tatctttgtt cattagagcg ataaacttga atttgagagg gaacttagat ggtatttgaa 3240 aaaattgata aaaatagttg gaacagaaaa gagtattttg accactactt tgcaagtgta 3300 ccttgtacct acagcatgac cgttaaagtg gatatcacac aaataaagga aaagggaatg 3360 aaactatatc ctgcaatgct ttattatatt gcaatgattg taaaccgcca ttcagagttt 3420
aggacggcaa tcaatcaaga tggtgaattg gggatatatg atgagatgat accaagctat 3480 acaatatttc acaatgatac tgaaacattt tccagccttt ggactgagtg taagtctgac 3540 tttaaatcat ttttagcaga ttatgaaagt gatacgcaac ggtatggaaa caatcataga 3600 atggaaggaa agccaaatgc tccggaaaac atttttaatg tatctatgat accgtggtca 3660 accttcgatg gctttaatct gaatttgcag aaaggatatg attatttgat tcctattttt 3720 actatgggga aatattataa agaagataac aaaattatac ttcctttggc aattcaagtt 3780 catcacgcag tatgtgacgg atttcacatt tgccgttttg taaacgaatt gcaggaattg 3840 ataaatagtt aacttcaggt ttgtctgtaa ctaaaaacaa gtatttaagc aaaaacatcg 3900 tagaaatacg gtgttttttg ttaccctaag tttaaactcc tttttgataa tctcatgacc 3960 aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa 4020 ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca 4080 ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta 4140 actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc tagtgtagcc gtagttaggc 4200 caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca 4260 gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta 4320 ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag 4380 cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt 4440 cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc 4500 acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac 4560 ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac 4620 gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc 4680 tttcctgcgt tatcccctga ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat 4740
accgctcgcc gcagccgaac gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag 4800 cgcccaatac gcagggccc 4819 <210> 13 <211> 1460 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 13
ggctcaggac gaacgctggc ggcgtgctta acacatgcaa gtcgagcgat gaagctcctt 60 cgggagtgga ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctacct caaagagggg 120 gatagcctcc cgaaagggag attaataccg cataataatc agttttcaca tggagactga 180 tttaaaggag taatccgctt tgagatggac ccgcggcgca ttagctagtt ggtagggtaa 240 cggcctacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg tgatcggcca cattggaact 300 gagagacggt ccagactcct acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa 360 gcctgatgca gcaacgccgc gtgagtgaag aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt 420 ggggacgata atgacggtac ccaaggagga agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcgag cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagt gcgtaggcgg 540 atatttaagt gagatgtgaa atacccgggc ttaacccggg cactgcattt caaactggat 600 atctagagtg cgggagagga gaatggaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtagagatt 660 aggaagaaca ccagtggcga aggcgattct ctggaccgta actgacgctg aggcacgaaa 720 gcgtgggtag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtacta 780 ggtgtaggag gtatcgaccc cttctgtgcc gcagtaaaca caataagtac tccgcctggg 840 aagtacgatc gcaagattaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcagcggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttacctg gacttgacat accctgaata 960 tcttagagat aagagaagcc cttcggggca gggatacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag 1020
ctcgtgtcgt gagatgttag gttaagtcct gcaacgagcg caacccctgt tgttagttgc 1080 taacatttag ttgagcactc tagcaagact gccgcggtta acgcggagga aggtggggat 1140 gacgtcaaat catcatgccc cttatgtcca gggcaacaca cgtgctacaa tgggcagtac 1200 agagagaagc aagaccgcaa ggtggagcaa acctcaaaaa ctgcccccag ttcggattgc 1260 aggctgaaac tcgcctacat gaagttggag ttgctagtaa tcgcgaatca gaatgtcgcg 1320 gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccatgagagc tggcaacacc 1380 cgaagtccgt agtctaactt aggaggacgc ggccgaaggt ggggttagta attggggtga 1440 agtcgtaaca aggtagccgt 1460 <210> 14 <211> 677 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 14
aagaacmttg saaaktccst racsatggwg asycstwmgc kkagkrrmyy mgcrrysgac 60 gggtgagtma cacgtgggta acctaccycr rrgaggggga tagcctcccs aaagggagat 120 taataccgca taataatcag ttttcacatg gagaytgwtt taaaggagta atccgctttg 180 agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tagggtaacg gcctaccaag gcgackatgc 240 gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttggaactga sagacggtcc asactcctac 300 gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc aacgccgcgt 360 gagtgaagaa ggttttcgga ttgtaaagct ctgtctttgg ggacgataat gacggtaccc 420 aaggaggaag ccacggstaa ctacgkgcca scakccgcgg taatacgtas gtggcgagcg 480 ttgtccggaa ttactgggcg taaakastgc gtakgcggat atttaaktga satgtgaaat 540 asccgggctt aaccygggyw ctgywtttca mactggatat ctakagtgcg ggagaggasa 600 atgkaattcy taktgtascg gtgaartgcs takasattak gaasaacacc mktggcgaak 660 gcgattckct ggaccgt 677 <210> 15 <211> 720 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 15
trarakkgak cyysgrtccc kkgrmswcst ggyarggtaa csgymwrcyw rgrysacgak 60 gcgtmgycra cctgaraggg tgatcggcca cmttggaact gagagacggt ccaractcct 120 acgggaggca gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcaacgccgc 180 gtgagtgaag aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt ggggacgata atgacggtmc 240 ccaaggagga agccacggct aactacgtgc cascagccgc ggtaatacgt aggtggcrag 300 cgttgtccgg aattactggg cgtaaagagt gcgtaggcgg atatttaagt gagatgtgaa 360 atacccgggc ttaacccggg cactgcwttt caaactggat atctakagtg cgggagagga 420 gaatgkaatt cctagtgtag cggtgaaatg cgtakagatt aggaagaaca ccmgtggcga 480 akgcgattct ctggaccgta actgayrctg akgcacgaag cgtggggtak cawacakgat 540 tagatacyct ggtrstccac rccgtaaacg atgagtayta kgtgtakgag kwtcsacccc 600 cttctgtgcc ssmmtaraca ymmyaaktac tcccgcckcr aagtmsawcg cmagatkaaa 660 amtcrwmgsa rtkrwggggg ggcsgcmcta acatcgsast wrkwkkttsr attawarcaa 720 <210> 16 <211> 960 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 16
taaaggagta atccgytttg agatggaccc gcggcgcatt agctwgttgg tagggtaacg 60 gcctaccmwg gcgackatgc gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ttggaactga 120 gagacggtcc aractcctac gggaggcagc agtggggaat attgcacaat gggcgaaagc 180
ctgatgcagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga ttgtaaagct ctgtctttgg 240 ggacgataat gacggtaccc aaggaggaag ccacggstaa ctacgtgcca scagccgcgg 300 taatacgtag gtggcgagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagtgc gtaggcggat 360 atttaagtga gatgtgaaat acccgggctt aacccgggyw ctgcatttca aactggatat 420 ctagagtgcg ggagaggaga atggaattcc tagtgtagcg gtgaartgcg takagattak 480 gaagaacacc agtggcgaag gcgattctct ggaccgtrac tgacgctgag gcacgaaagc 540 gtgggtagca aacaggatta gataccctgg tagtccacrc cgtaaacgat gagtactakg 600 tgtaggaggt atcgacccct tctgtgccgc agtaaacaca ataagtacty ckcctgggaa 660 gtacgatcgc aagattaaaa ctcaasgaak tgacaggsgc ccgcacwagc akcgasyatg 720 tggtttattc gaagcacgcg aagaacctta cctggacttg acataccctg mwatctwtas 780 ataagagagc scttcgggtc aggatrcagt cgtgcatggt gtcgtcwgct cgtgtcrtga 840 gatgtagtar tctgcaacsa kcgyacyctg tggyagtgct acatgmtsag cmtctagcag 900 actgcgmgta sccgsagagy ggggatgacg tcgakcatca tgycctyagt cmcgyctacr 960 <210> 17 <211> 676 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 17
atttkggsar aktccgkakg caaggtgasc cgtargcttg gatccyggga akksryrgsw 60 grgtamcysk kgkstwrswt mccssgraga rggggawags ctcccgaaag ggagattamt 120 accgcataat aatcagtttt cacatggaga ctgatttaaa ggagtaatcc gctttgagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtagg gtaacggcct accaaggcga ckatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacwttgg aactgagaga cggtccasac tcctacggga 300 ggcagcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga tgcagcaacg ccgcgtgagt 360 gaagaaggtt ttcggattgt aaagctctgt ctttggggac gataatgacg gtacccmasg 420 aggargccmc ggsyaactac gkgccwscmk ccgcggtaat acrtaggtgg cragcgttgt 480 ccggaattac tgggcgtaaa kagtgcgtak gcggatattt aaktgagatg tgaaryascc 540 gggcttaacc cgggcwctgy atttcwmayt ggatatctmk agtgcgggrg aggagaatgg 600 awgtyctakk gtamcsgtga artgcstaka satwmkgmas aacaycwstg gcgwarrcgr 660 ytcgswggac cgtawc 676 <210> 18 <211> 1040 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 18
tagsaaaktc ytakrcaatg gtarycstwa gcttgkatrm krmwmgrsgg acgggtgagt 60 aacmckkggg taamctacyt crragarggg gatagcctcc csaaagggag attaataccg 120
cataataatc agttttcaca tggagactga tttaaaggag taatccgctt tgagatggac 180 ccgcggcgca ttagctagtt ggtagggtaa cggcctacca aggcgackat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cattggaact gagagacggt ccagactcct acgggaggca 300
gcagtgggga atattgcaca atgggcgaaa gcctgatgca gcaacgccgc gtgagtgaag 360 aaggttttcg gattgtaaag ctctgtcttt ggggacgata atgacggtac ccaaggagga 420 rgccacggst aactacgkgc cascmkccgc ggtaatacgt asgtggcgag cgttgtccgg 480 aattactggg cgtaaagagt gcgtakgcgg atatttaagt gagatgtgaa atasccggsc 540 ttaacccggg cactgcattt camactggat atctakagtg cgggagagga saatgkratt 600 cctakkgtas cggtgaaatg cstatasatt akgaasaaca ccmktgkcga akgcgawtck 660 ctggaccrtr rctgacrcts akgcaygywa gcstsgstwk cwwrcmksat yatatacccy 720 ggkrgtcmcr wcrymwmcat sagtactakg tgtmkkaggt atckmcmcct yctytgcssc 780 mkwaraamaa yawkmwcytc csccysssgr rkwacaawcr mwakatkaat agwmatggsa 840 kkkamggssg gccsccswma catcysmkct rwtrktkwat ttcaykcamk ymmsmaamka 900 acctgkmytg rsmtasccyg cycysswwtw awctaagmam agcmtcscss tamgrgwkmr 960 gwsrygsstk ygytsrtggc tmtcgtcayy tmgsrymgar aratratwst awacsmwsms 1020 aamccmykyc ywycctkstk 1040 <210> 19 <211> 674 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 19
ggggrtakcc tcccsaawgg garaytaatw ccgcataata atcagttttc acatggagac 60 tgatttaaag gagtaatccg ctttgagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtaggg 120 taacggccta ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg scacattgga 180 actgagagac ggtccaract cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg 240 aaagcctgat gcagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggattgta aagctctgtc 300 tttggggacg atratgacgg tacccaagga ggaagccacg gstaactacg tgccascakc 360 cgcggtaata cgtaggtggc gagcgttgtc cggaattact gggcgtaaak agtgcgtarg 420 cggatattta agtgagatgt gaaatasccg gscttaaccc gggcwctgca tttcwaactg 480 gatatctaka gtgcgggaga ggagwatkta wttcctagtg trscggtgaa atgsgkasam 540 atyakgmaga acmccagtgk cgaaggcgay tckstggacc ryractgamg ctsawgcwcg 600 maagcgwgss tagcaaasat gattagatay mcyggtagwc mcamcrmmaa csatgagkac 660 trkgtgtmsk asgt 674 <210> 20 <211> 1226 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 20
crgrwycttt mggatkgkwg ttgtargttt atatccttca taayyckraa tatgarcccc kgttcccttt acawtctcct gwwttcascg ctkygwtaaa tataaagaaa gcaaagctac aawwgaamtt attttttctc aaaagtaata ggawttataa kgcmkgakwa ggaartgymt tttatytkka tgkatgctka tatgacyata acagctatag acttgskggg ggtcagtwmc ttttctaccc attccctcra ttaaaacrga sttcsmacaa twaysrraat ggmaakttct tagttattgg cttaccwmka wkatwtyaaa ksattwaagg wtakstaawg ttacwtaata ryattgwmct atttgkactm yaagwaatra cmwwsawksw ttgctggaat aatakmmatr katttwattt gttakctttt
awatactkcm
wawggwgggt
mtwakywwat
wcaragatgt
120
aggactccwg
gyaakywtct
180
gyatcmttgc
casawggatt
240
aagtcmwtta
caaaaatata
300
taaarmtaaa
aatatwataa
360
cgaggaggat
ttataatgaa
420
ktagcacttc
aatcctgtgc
480
mgwgratctg
cwggatwatt
540
awaycawamy
wwwktamagg
600
gttgyaggga
twgctaaygw
660
tgggcatttt wcagatttgc awatttgrtc aaycwttaac twgatatttg ctggactatw 720 gatatttcat ttrctkaama wtaagmaatt atatwatakc agtggraaaa agwakaatca 780 tatrttgtaa ttatttttaa ttatgtkrrc aamwytgawa ttgwcacwga waacayctct 840 aaatgtttwr aatacatatg tttmaktakt gtgacakatw ctaatastak aaagwagaar 900 wtygctatrw watratgaca tagwggtgaa tgtaatgcsg mckctgwryc catatsacca 960 tgatrcgaat tmsagctsgg tacscsggrk atcctctrga stcgwcgtya ckcgtccatg 1020 kagatmwcga gcctggmgac atgcagctta gcwckggtcg tcatkttacw cgtcgtsact 1080 rsgtaaaacc atgacgtmcc rctgtcgcat gcwgcacrtc yccrtatcgt cagctrcgta 1140 wcgcgacyag ccgatcgatc gcctgccwcg atgccractg atgcatgcct gmcakacggc 1200 aywacaagtc taggcattac tggcca 1226 <210> 21 <211> 1236 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 21
twwttwwacm ttactaaata atgacagaat aggtattatt ggacctaatg gaagtggtaa 60 atccactctt atgaatattt tarttcaaaa aattctgccg gacagcggca ctatagatat 120 aggtgaaaca gtaaagatag gatactattc tcagggaatt tctgatatgg atatgaacga 180 aagggtaatt gaatacatac gtgggacatc rraatatgcg tcaacttcat cgggtgaaaa 240 aakaaktgct tctgctgtac ttgaaaattt tttatttgaa ccttcagttc aatggactcc 300 ccttggaaaa ctktcaggag gagaacgaar aagattatat cttctaaaaa tactgatgaa 360 ttaccctaat gtacttttgc tggacgaacc aacaaatgat ctggatatag aaacacttac 420 aatcctagaa gattatatta acgattttga aggagctgtt atagctgtat ctcatgacag 480 gtacttcctt gacaaaacag ttgataaaat attttctttt gaaggaaacg gtaaaatcac 540
tcaatataca ggaaactatt cctattttca caaaactgca aaaatatcag aggaaaaaat 600 aagctctaag aaaaatacag ctaaaaacaa ctatragttg caaaaagaaa agcctctaaa 660 atttacctat gcagaacaaa tggagtttga caaaatagat gaggtaattg aacatctaga 720 aaaatctata tctgaaaaga aaatagaaat ggaagctgct tcatctgatt atgcacttct 780 tgaagatctc ttatccgaaa agaattcact ggaaaaagag ctagacgaaa agatggacag 840 gtggacttac ttaatgaact caatgaaaaa attgagcaag ataaaagcac tagacattgt 900 tattagcact gtctagtgct agcgccattc gccattcatg ctgcgcaact gtgggaaggg 960 cgatcggtgc ggcctcttcg ctaytacgcc agctggcgaa gggatgtgct gcaagscgat 1020 aagttggtac gccaggtttc cagtcacgac gtagwaaacg acgtcagtgc tagctgcatg 1080 tctgcagctc gagattctca tggascgtka cgtcgacytr asgatcctgg tactrrctcg 1140 attcgtatcm tggwcawtgg atmgcggcgc atamctcccc tatgcattaa catgcaattc 1200 acgtctacta tagagtctgt tccaaaatra acgcgt 1236 <210> 22 <211> 1224 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 22
gawtttttcm acttttataa catactaaat aatgacagaa taggtattat tggacctaat 60 ggaagtggta aatccactct tatgaatatt ttarttcaaa aaattctgcc ggacagcggc 120 actatagata taggtgaaac agtaaagata ggatactatt ctcagggaat ttctgatatg 180 gatatgaacg aaagggtaat tgaatacata cgtgggacat caraatatgc gtcaacttca 240 tcgggtgaaa aaataagtgc ttctgctgta cttgaaaatt ttttatttga accttcagtt 300
caatggactc cccttggaaa actttcagga ggagaacgaa raagattata tcttctaaaa 360
atactgatga attaccctaa tgtacttttg ctggacgaac caacaaatga tctggatata 420
gaaacactta caatcctaga agattatatt aacgattttg aaggagctgt tatagctgta 480
tctcatgaca ggtacttcct tgacaaaaca gttgataaaa tattttcttt tgaaggaaac 540
ggtaaaatca ctcaatatac aggaaactat tcctattttc acaaaactgc aaaaatatca 600
gaggaaaaaa taagctctaa gaaaaataca gctaaaaaca actataagtt gcaaaaagaa 660
aagcctctaa aatttaccta tgcagaacaa atggagtttg acaaaataga tgaggtaatt 720
gaacatctag aaaaatctat atctgaaaag aaaatagaaa tggaagctgc ttcatctgat 780
tatgcacttc ttgaagatct cttatccgaa aagaattcac tggaaaaaga gctagacgaa 840
aagatggaca ggtggactta cttaaatgaa ctcaatgaaa aaattgagca agataaaagc 900
actagacatt gttattagca ctgtctagtg ctagcgccat tcgccattca ggctgmgcaa 960
ctgtgggagg cgatcggtgc gggcctyttc gctattacgc cagctgcgaa aggggatgtg 1020
ctgcaagcga ttagttgggt aacsccaggc tttcccagtc mcgacgtgta aacgacgcag 1080
tgcagctgca tgtctgcagc tcgagatctc atgacgckac gtcgactcta rgatccctgt 1140 wcgagctcga ttcgaatcat gcawtggatc msggccgatc tgmccctakg cataacatgc 1200 aattcmcttt ctcattagaa aygt 1224 <210> 23 <211> 1120 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 23
grrammttkw aawttaaraa attkcactta tracatacta aataatgaca gartaggkat 60 tattggacct aatggaagtg gtaaatccac tcttatgaat attttarttc aaaaaattct 120 gccsgacagc ggcactmtwk atataggtga aacagtaaag ataggatact attctcaggg 180 aatttctgat atggatatga acgaaagggk aattgaatac atacktggga catcrraata 240 tgcgtcaact tcrtcgggtg aaaaaakaag tgcttctgct gtacttgaaa attttttatt 300 tgaaccttca gttcaatgga ctycccttgg aaaamtktca ggaggagaac raaraagatt 360 atatcttcta aaaatactga tgaattaccc taatgtactt ttgctggacg aaccaacaaa 420 tgatctggat atagaaacac ttacmatcct agaagattat attwacgatt ttgaaggagc 480 tgttatagct gtrtctcatg acaggtactt ccwtgacaar acagttgatr aaatattttc 540 ttttgaagga aacggtaaaa tcactcaata tacasgaaac tattcctatt ttcacrraac 600 tgcawaaata tcagaggaaa aaatwagctc taagaaaaat acagctaaaa caactatrag 660 ttgcaaaaag aawagcctct aaatttacct atgcagaaca aatggagttt gacaaaatag 720 atgaggtaay tgaacatcta gaaaatctat atctgaaaga aaatagaatg gaagctgctt 780 catctgatta tgcacttctt garatctctt atccgaaaas rattcmctgg aaaagagcta 840 gacgaaagat ggwcagkkga cttactwaat gactcatgaa aatgakcara tawagcmcta 900 gamttgttat tagcactgtc trkgstagcg ccatcgcatt cagctgmgca actgtgggac 960 ggcgatcgtk cggctcytcg ctattacgcc agctggcaag ggaktgcctg caggcatagt 1020 gttacscwgc ttccagtccm srtkaamgac gcakgccagc tgcatgtygc agcctggatc 1080 catggacgka gctcaacyta agaatccggt ccgrcactgt 1120 <210> 24 <211> 1210 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 24
traaaawttk tcactkkata acatactaaa taatgmcaga rtaggtatta ttggacctaa 60
tggaagtggt aawtccactc ttatgaatat tttarttcaa aaaattctgc cggacagcgg 120 cacymtagat ataggtgaaa cagyaaagat aggatactat tctcagggaa tttctgatat 180 ggatatgaac saaagggkaa ttgaatacat mcktgggaca tcrraakatg cstcaacttc 240 rtcgggtgaa aaaakaaktg cttctgctgt acttgaaaat tttttatttg aaccttcagt 300
tcaatggact ccccttggaa aactktcarg aggagaacga araarattat atcttctaaa 360 aatactgatg aattacccta atgtactttt gctggacgaa ccaacaaatg atctggatat 420 agaaacactt acaatcctag aagattatat taacgatttt gaaggagctg ttatagctgt 480 rtctcatgac aggtacttcc ttgacaarac agttgataaa atattttctt ttgaaggaaa 540 cggtaaratc actcaatata caggaaacta ttcctatttt cacaaaactg cawaaatatc 600 agaggaaaaa ataagctcta agaaaaatac agctaaaaac aackatragt tgcaaaaaga 660 aaagcctcta aratttacct atgcagaaca aatggagttt gacaaaatag atgaggtaat 720 tgaacatcta gaaaaatcta tatctgaaaa gaaaatagaa atggaagctg cttcatctga 780 ttatgcactt cttgaagatc tcttatccga aaagaattca ctggaaaaag agctagacka 840 aaagatggac aggtggactt acttaaatga actcaatgaa raaattgagc aagataaaag 900 cactagacat tgttattagc actgtctagt gctagcgcca ttcgccattm agctgmgcac 960 tgtgggaagg cgatcggtgc gggctctcgc tatacgcagc tggcgaaggg gatgtgctgc 1020 agcgatagtg gtacgcakgt ttccagtcac gacgwgaaaa cgacgtcagt gcwagctgca 1080 kkctgcagct cgratctcat ggacgctkac gtcgayctra cgatcccwgt wckrctcgat 1140 cgtatcctgt cawtgatacc gggcgcatac atgccctagt cagttaacat gcaagtckac 1200 cttctcagtg 1210 <210> 25 <211> 1206 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 25
aamywaatwr ggwggggttt sycaakktta tatcsttcat kttctaccca ytccctcrac 60 twagcwwatw cararatgtt arttckraat atgagcccct taaaacrgac ttcscacaaa 120 ggactccwgg yaakywyctk gwtcccttta cawtctcctt waycgraakg gmaakktctg 180 yatcyttgcc agaaggattg wwttcagcgc tgygwtaaat agttattggc ttrccwmkaa 240 agtcaattac aaaaatatat ataaagaaag caaagctacw tatwtyamwk srttwaaggt 300 aaarmtaaaa atattataaa awtgaamttw ttttttctcw takctaaagt tacwtaatac 360 gaggaggatt wataatgaaa aaagtaatwg gaattataar yattgwmcww tttgtactmk 420 tagcacttca atcytgtgck gcakgakwwg gaartgymty awgwaatrac mwwsawkswa 480 gwgratctgc wggatwattt ttatytgkat gkatgctkat tgctggaata atagcaatra 540 waycawamyw wwktamaggt atswctataa cagctatagk atwtwatttg ttakcttttg 600 ttgyagggat wgctaaygwt gggcattttw cagattwgcm wmtttgrtca aycwttrmct 660 tgatatttgc tggactatwg atattkmatt trctkaamaw yaagcaatta tatwatakca 720 gwggraaaaa gtagaatcat atrttgtaat tatttttaat tatgttgrca amtytgawmy 780 trwcacwgaw acmcctmtaa atgttttram tacatrtgtt waaktwtkgt gacakatwct 840 aatagtakra agwagaarwt ygctatgtwa tratgacata gwggtgaatg taatgcggms 900
gctgwrtcca tatsaccatg atrcgamtyc gagctcggta csssggrgat sctctrgast 960
ckacgtcack cgtccatgka gatcwcgagg ctgcmgwcwg cagmtrcwct ggtmcgtcga 1020
tktaywcgtc gtgactrsga aaaccatgac gtmctrctay ggcatgcwgc artcyccgwt 1080
tckcagstag gtawagcgac akgcgatcsm aygcccttgc cacrttgcca tctgaatgyg 1140
akgcctgaca kmcgkccmta cagctagcat gactgaattt catgackcyt agaagacmct 1200 gtgaca 1206 <210> 26 <211> 1232 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 26
accymwaaat aattgmcaga ataggtatta ttggacctaa tggaagtggt aaatccactc 60 ttatgaatat tttarttcaa aaaattctgc cggacagcgg cactmtagat ataggtgaaa 120 cagtaaagat aggatactat tctcagggaa tttctgatat ggatatgaac gaaagggtaa 180 ttgaatacat acktgggaca tcrraakatg cstcaacttc atcgggtgaa aaaataaktg 240 cttctgctgt acttgaaaat tttttatttg aaccttcagt tcaatggact ccccttggaa 300 aactktcarg aggagaacra araarattat atcttctaaa aatactgatg aattacccta 360 atgtactttt gctggacgaa ccaacaaatg atctggatat agaaacactt acaatcctag 420 aagattatat taacgatttt gaaggagctg ttatagctgt atctcatgac aggtacttcc 480 ttgacaaaac asttgataaa atattttctt ttgaaggaaa cggtwaaatc actcaatata 540 caggaaacta ttcctatttt cacaaaactg caaaaatatc agaggaaaaa ataagctcta 600 agaaaaatac agctaaaaac aactatragt tgcwaaaaga aaagcctcta aaatttacct 660 atgcagaaca aatggagttt gacaaartag atgaggtaat tgaacatcta gaaaaatcta 720 tatctgaaaa gaaaatagaa atggaagctg cttcatctga ttatgcactt cttgaagatc 780 tcttatccga aaasaattca ctggaaaaag agctagacga aaagatggac aggtggactt 840 acttawatga actcatgaaa aaatwgagca gataaaagca ctagacattg ttattagcac 900 tgtstagtgc tagcgccatt cgmcattcag ctgmgcacwg ytgggaaggg cgatmgygck 960 ggcctcttcg ctwytacgyc akctggcraa ggggatgtgc wgcaagmcga tagttgggta 1020 acgcaggwtw tcccagtcac kacgtagtam aygacgtcmg trctagctgc atgtctgcag 1080 cytsrgatct catgtacgct gacgtcgacy trrmggatcc cwggtacyga gctcgattcg 1140 tatcatgayr atggatgmgc ggcgcataac tcccttatgc mttaacrttc aattsacgtc 1200 ttcwtataga tckctcatag ttgarcmccg gg 1232 <210> 27 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер <400> 27
ccgaattcgt cgacaacaga gtttgatcct ggctcag 37 <210> 28 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 28
cccgggatcc aagcttacgg ctaccttgtt acgactt 37 <210> 29 <211> 25
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 29
ttgctgtagt cactgaactg gaaaa 25 <210> 30 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 30
aatcaggaca cctaaatcca accac 25 <210> 31 <211> 1940 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> новый ген метилтрансферазы, слитый с индуцибельным 1 ас-промотором <400> 31
gcggccgcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca 60 ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg 120 aaacacatat gtttccgtgc aatgcctata tcgaatatgg tgataaaaat atgaacagct 180 ttatcgaaga tgtggaacag atctacaact tcattaaaaa gaacattgat gtggaagaaa 240 agatgcattt cattgaaacc tataaacaga aaagcaacat gaagaaagag attagcttta 300 gcgaagaata ctataaacag aagattatga acggcaaaaa tggcgttgtg tacaccccgc 360 cggaaatggc ggcctttatg gttaaaaatc tgatcaacgt taacgatgtt attggcaatc 420 cgtttattaa aatcattgac ccgagctgcg gtagcggcaa tctgatttgc aaatgttttc 480
tgtatctgaa tcgcatcttt attaagaaca ttgaggtgat taacagcaaa aataacctga 540
atctgaaact ggaagacatc agctaccaca tcgttcgcaa caatctgttt ggcttcgata 600
ttgacgaaac cgcgatcaaa gtgctgaaaa ttgatctgtt tctgatcagc aaccaattta 660
gcgagaaaaa tttccaggtt aaagactttc tggtggaaaa tattgatcgc aaatatgacg 720
tgttcattgg taatccgccg tatatcggtc acaaaagcgt ggacagcagc tacagctacg 780
tgctgcgcaa aatctacggc agcatctacc gcgacaaagg cgatatcagc tattgtttct 840
ttcagaagag cctgaaatgt ctgaaggaag gtggcaaact ggtgtttgtg accagccgct 900
acttctgcga gagctgcagc ggtaaagaac tgcgtaaatt cctgatcgaa aacacgagca 960
tttacaagat cattgatttt tacggcatcc gcccgttcaa acgcgtgggt atcgatccga 1020
tgattatttt tctggttcgt acgaagaact ggaacaataa cattgaaatt attcgcccga 1080
acaagattga aaagaacgaa aagaacaaat tcctggatag cctgttcctg gacaaaagcg 1140
aaaagtgtaa aaagtttagc attagccaga aaagcattaa taacgatggc tgggttttcg 1200
tggacgaagt ggagaaaaac attatcgaca aaatcaaaga gaaaagcaag ttcattctga 1260
aagatatttg ccatagctgt caaggcatta tcaccggttg tgatcgcgcc tttattgtgg 1320
accgtgatat catcaatagc cgtaagatcg aactgcgtct gattaaaccg tggattaaaa 1380
gcagccatat ccgtaagaat gaagttatta agggcgaaaa attcatcatc tatagcaacc 1440
tgattgagaa tgaaaccgag tgtccgaatg cgattaaata tatcgaacag tacaagaaac 1500
gtctgatgga gcgccgcgaa tgcaaaaagg gcacgcgtaa gtggtatgaa ctgcaatggg 1560 gccgtaaacc ggaaatcttc gaagaaaaga aaattgtttt cccgtataaa agctgtgaca 1620 atcgttttgc actggataag ggtagctatt ttagcgcaga catttatagc ctggttctga 1680 agaaaaatgt gccgttcacc tatgagatcc tgctgaatat cctgaatagc ccgctgtacg 1740 agttttactt taagaccttc gcgaaaaagc tgggcgagaa tctgtacgag tactatccga 1800 acaacctgat gaagctgtgc atcccgagca tcgatttcgg cggtgagaac aatattgaga 1860 aaaagctgta tgatttcttt ggtctgacgg ataaagaaat tgagattgtg gagaagatca 1920 aagataactg ctaagaattc 1940 <210> 32 <211> 601 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 32
Met Phe Pro Cys Asn Ala Tyr lie Glu Tyr Gly Asp Lys Asn Met Asn
15 10 15
Ser Phe lie Glu Asp val Glu Gin lie Tyr Asn Phe lie Lys Lys Asn
20 25 30
lie Asp val Glu Glu Lys Met His Phe lie Glu Thr Tyr Lys Gin Lys
35 40 45
Ser Asn Met Lys 50
Lys lie Met Asn 65
Ala Ala Phe Met
Asn Pro Phe lie 100
lie Cys Lys Cys 115
Glu val lie Asn 130
Ser Tyr His lie 145
Thr Ala lie Lys
Phe Ser Glu Lys 180
Asp Arg Lys Tyr 195
Lys Ser val Asp 210
Ser lie Tyr Arg 225
Ser Leu Lys Cys Arg Tyr Phe Cys
Lys Glu lie 55
Gly Lys Asn 70
val Lys Asn 85
Lys lie lie
Phe Leu Tyr
Ser Lys Asn 135
val Arg Asn
150 val Leu Lys 165
Asn Phe Gin
Asp val Phe
Ser Ser Tyr 215
Asp Lys Gly
230 Leu Lys Glu 245
Glu Ser Cys
Ser Phe Ser
Gly val val
Leu lie Asn 90
Asp Pro Ser
105 Leu Asn Arg 120
Asn Leu Asn
Asn Leu Phe
lie Asp Leu 170
val Lys Asp
185 lie Gly Asn 200
Ser Tyr val
Asp lie ser
Gly Gly Lys 250
Ser Gly Lys
Glu Glu Tyr 60
Tyr Thr Pro 75
val Asn Asp
Cys Gly ser
lie Phe lie 125
Leu Lys Leu
140 Gly Phe Asp
155 Phe Leu lie
Phe Leu val
Pro Pro Tyr 205
Leu Arg Lys
220 Tyr Cys Phe 235
Leu val Phe Glu Leu Arg
Tyr Lys Gin
Pro Glu Met 80
val lie Gly 95
Gly Asn Leu 110
Lys Asn lie
Glu Asp lie
lie Asp Glu 160
Ser Asn Gin 175
Glu Asn lie 190
lie Gly His
lie Tyr Gly
Phe Gin Lys 240
val Thr ser
255 Lys Phe Leu
260 265 270
lie Glu Asn Thr Ser lie Tyr Lys lie lie Asp Phe Tyr Gly lie Arg
275 280 285
Pro Phe Lys Arg val Gly lie Asp Pro Met lie lie Phe Leu val Arg
290 295 300
Thr Lys Asn Trp Asn Asn Asn lie Glu lie lie Arg Pro Asn Lys lie
305 310 315 320
Glu Lys Asn Glu Lys Asn Lys Phe Leu Asp Ser Leu Phe Leu Asp Lys
325 330 335
Ser Glu Lys Cys Lys Lys Phe Ser lie Ser Gin Lys Ser lie Asn Asn
340 345 350
Asp Gly Trp val Phe val Asp Glu val Glu Lys Asn lie lie Asp Lys
355 360 365
lie Lys Glu Lys Ser Lys Phe lie Leu Lys Asp lie Cys His Ser Cys
370 375 380
Gin Gly lie lie Thr Gly Cys Asp Arg Ala Phe lie val Asp Arg Asp
385 390 395 400
lie lie Asn Ser Arg Lys lie Glu Leu Arg Leu lie Lys Pro Trp lie
405 410 415
Lys Ser Ser His lie Arg Lys Asn Glu val lie Lys Gly Glu Lys Phe
420 425 430
lie lie Tyr Ser Asn Leu lie Glu Asn Glu Thr Glu Cys Pro Asn Ala
435 440 445
lie Lys Tyr lie Glu Gin Tyr Lys Lys Arg Leu Met Glu Arg Arg Glu
450 455 460
Cys Lys Lys Gly Thr Arg Lys Trp Tyr Glu Leu Gin Trp Gly Arg Lys
465 470 475 480
Pro Glu lie Phe Glu Glu Lys Lys lie val Phe Pro Tyr Lys Ser Cys
485 490 495
Asp Asn Arg Phe Ala Leu Asp Lys Gly Ser Tyr Phe Ser Ala Asp lie
500 505 510
Tyr Ser Leu val Leu Lys Lys Asn val Pro Phe Thr Tyr Glu lie Leu
515 520 525
Leu Asn lie Leu Asn Ser Pro Leu Tyr Glu Phe Tyr Phe Lys Thr Phe
530 535 540
Ala Lys Lys Leu Gly Glu Asn Leu Tyr Glu Tyr Tyr Pro Asn Asn Leu
545 550 555 560
Met Lys Leu Cys lie Pro Ser lie Asp Phe Gly Gly Glu Asn Asn lie
565 570 575
Glu Lys Lys Leu Tyr Asp Phe Phe Gly Leu Thr Asp Lys Glu lie Glu
580 585 590
lie val Glu Lys lie Lys Asp Asn Cys 595 600 <210> 33
<211> 2781 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> синтетическая плазмида <400> 33
tttgccacct gacgtctaag aaaaggaata ttcagcaatt tgcccgtgcc gaagaaaggc 60 ccacccgtga aggtgagcca gtgagttgat tgctacgtaa ttagttagtt agcccttagt 120 gactcgtaat acgactcact atagggctcg agtctagaga attcgatatc acccgggaac 180 tagtctgcag ccctttagtg agggttaatt ggagtcacta agggttagtt agttagatta 240 gcagaaagtc aaaagcctcc gaccggaggc ttttgactaa aacttccctt ggggttatca 300 ttggggctca ctcaaaggcg gtaatcagat aaaaaaaatc cttagctttc gctaaggatg 360 atttctgcta gagatggaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 420 cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 480 tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 540 tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 600 gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 660 gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 720 atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cttaataaga 780 tgatcttctt gagatcgttt tggtctgcgc gtaatctctt gctctgaaaa cgaaaaaacc 840 gccttgcagg gcggtttttc gaaggttctc tgagctacca actctttgaa ccgaggtaac 900 tggcttggag gagcgcagtc accaaaactt gtcctttcag tttagcctta accggcgcat 960 gacttcaaga ctaactcctc taaatcaatt accagtggct gctgccagtg gtgcttttgc 1020 atgtctttcc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcggactg 1080 aacggggggt tcgtgcatac agtccagctt ggagcgaact gcctacccgg aactgagtgt 1140 caggcgtgga atgagacaaa cgcggccata acagcggaat gacaccggta aaccgaaagg 1200 caggaacagg agagcgcacg agggagccgc caggggaaac gcctggtatc tttatagtcc 1260 tgtcgggttt cgccaccact gatttgagcg tcagatttcg tgatgcttgt caggggggcg 1320 gagcctatgg aaaaacggct ttgccgcggc cctctcactt ccctgttaag tatcttcctg 1380 gcatcttcca ggaaatctcc gccccgttcg taagccattt ccgctcgccg cagtcgaacg 1440 accgagcgta gcgagtcagt gagcgaggaa gcggaatata tcctgtatca catattctgc 1500 tgacgcaccg gtgcagcctt ttttctcctg ccacatgaag cacttcactg acaccctcat 1560 cagtgccaac atagtaagcc agtatacact ccgctagcgc tgaggtctgc ctcgtgaaga 1620
aggtgttgct gactcatacc aggcctgaat cgccccatca tccagccaga aagtgaggga 1680 gccacggttg atgagagctt tgttgtaggt ggaccagttg gtgattttga acttttgctt 1740 tgccacggaa cggtctgcgt tgtcgggaag atgcgtgatc tgatccttca actcagcaaa 1800 agttcgattt attcaacaaa gccacgttgt gtctcaaaat ctctgatgtt acattgcaca 1860 agataaaaat atatcatcat gaacaataaa actgtctgct tacataaaca gtaatacaag 1920 gggtgtttac tagaggttga tcgggcacgt aagaggttcc aactttcacc ataatgaaat 1980 aagatcacta ccgggcgtat tttttgagtt atcgagattt tcaggagcta aggaagctaa 2040 aatggagaaa aaaatcacgg gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga 2100 acattttgag gcatttcagt cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga 2160 tattacggcc tttttaaaga ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat 2220 tcacattctt gcccgcctga tgaacgctca cccggagttt cgtatggcca tgaaagacgg 2280 tgagctggtg atctgggata gtgttcaccc ttgttacacc gttttccatg agcaaactga 2340 aacgttttcg tccctctgga gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tccacatata 2400
ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat ttccctaaag ggtttattga 2460 gaatatgttt tttgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc accagttttg atttaaacgt 2520 ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcacgatg ggcaaatatt atacgcaagg 2580 cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgatcca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca 2640 tgtcggccgc atgcttaatg aattacaaca gtactgtgat gagtggcagg gcggggcgta 2700 ataatactag ctccggcaaa aaaacgggca aggtgtcacc accctgccct ttttctttaa 2760 aaccgaaaag attacttcgc g 2781 <210> 34 <211> 351 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 34
Met Lys Gly Phe Ala Met Leu Gly lie Asn Lys Leu Gly Trp lie Glu
15 10 15
Lys Lys Asn Pro val Pro Gly Pro Tyr Asp Ala lie val His Pro Leu
20 25 30
Ala val Ser Pro Cys Thr Ser Asp lie His Thr val Phe Glu Gly Ala
35 40 45
Leu Gly Asn Arg Glu Asn Met lie Leu Gly His Glu Ala val Gly Glu
50 55 60
lie Ala Glu val Gly Ser Glu val Lys Asp Phe Lys val Gly Asp Arg
65 70 75 80
val lie val
Ala Gly Phe
Ser Asn Phe 115
Ala Asp Met
130 Ala val Met 145
Leu Ala Asp
Ala val Gly 180
Arg lie lie 195
Phe Tyr Gly
210 Glu Gin lie 225
Met Ala Gly Lys Pro Gly
Pro Cys Thr Thr 85
Gin Gin His Ser 100
Lys Asp Gly val
Asn Leu Ala lie 135
Met Thr Asp Met 150
lie Lys Met Gly 165
Leu Met Gly lie
Gly val Gly ser
Ala Thr Asp lie 215
Met Asp Leu Thr 230
Gly Gly Ala Glu 245
Gly val lie ser 260
РГО Asp Trp
Asn Gly Met
105 Phe Ala Asp 120
Leu Pro Asp
Met Thr Thr
Ser ser val 170
Ala Gly ser
185 Arg Pro val 200
val Asn Tyr
His Gly Lys
Thr Leu Ala 250
Asn lie Asn 265
Arg Ser Leu Glu
Leu Ala Gly Trp 110
Tyr Phe His val 125
Glu lie Pro Leu 140
Gly Phe His Gly 155
val val lie Gly
Lys Leu Arg Gly 190
Cys val Glu Thr 205
Lys Asn Gly Asp 220
Gly val Asp Arg 235
Gin Ala val Thr
Tyr His Gly ser 270
val Gin 95
Lys Phe
Asn Asp
Glu Ser
Ala Glu 160 lie Gly 175
Ala Gly
Ala Lys
lie val
val lie 240 Met val 255
Gly Asp
Thr Leu Pro lie Pro Arg val Gin Trp Gly Cys Gly Met Ala His Lys
275 280 285
Thr lie Arg Gly Gly Leu Cys Pro Gly Gly Arg Leu Arg Met Glu Met
290 295 300
Leu Arg Asp Leu val Leu Tyr Lys Arg val Asp Leu Ser Lys Leu val
305 310 315 320
Thr His val Phe Asp Gly Ala Glu Asn lie Glu Lys Ala Leu Leu Leu
325 330 335
Met Lys Asn Lys Pro Lys Asp Leu lie Lys Ser val val Thr Phe
340 345 350
<210> 35 <211> 1056 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 35
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aaattaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60 gtgccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120 atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180 gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240 gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300 cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga cggtgtattt 360 gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420 cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480 cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540 atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600 cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660 ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720 atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780 gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840 tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900 agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960 actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020 ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056 <210> 36 <211> 1056 <212> ДНК
<213> Clostridium ljungdahlii <400> 36
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aaattaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60 gtgccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120 atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggccatgaa 180 gctgtaggtg aaatagccga agttggcagc gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240 gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatctttag aagtccaagc tggttttcag 300 cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga tggtgtattt 360 gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg ccatactccc agatgaaata 420 cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggagcagaa 480
cttgcagaca taaaaatggg ctccagcgtt gtagtaattg gtataggagc tgttggatta 540
atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggcagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600 cctgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660 ggtgatatag ttgaacaaat catggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720 atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780 gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt taccaatacc tcgtgttcaa 840 tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggaggat tatgccccgg cggacgtctt 900 agaatggaaa tgctaagaga tcttgttcta tataaacgtg ttgatttgag taaacttgtt 960 actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020 ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056 <210> 37 <211> 1056 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 37
atgaaaggtt ttgcaatgtt aggtattaac aagttaggat ggattgaaaa gaaaaaccca 60 gtaccaggtc cttatgatgc gattgtacat cctctagctg tatccccatg tacatcagat 120 atacatacgg tttttgaagg agcacttggt aatagggaaa atatgatttt aggtcacgaa 180 gctgtaggtg aaatagctga agttggcagt gaagttaaag attttaaagt tggcgataga 240 gttatcgtac catgcacaac acctgactgg agatccttag aagtccaagc tggttttcaa 300 cagcattcaa acggtatgct tgcaggatgg aagttttcca attttaaaga cggtgtattt 360 gcagattact ttcatgtaaa cgatgcagat atgaatcttg caatacttcc agatgaaata 420 cctttagaaa gtgcagttat gatgacagac atgatgacta ctggttttca tggggcagaa 480 cttgctgaca taaaaatggg ttccagtgtt gtcgtaattg gtataggagc tgttggatta 540 atgggaatag ccggttccaa acttcgagga gcaggtagaa ttatcggtgt tggaagcaga 600 cccgtttgtg ttgaaacagc taaattttat ggagcaactg atattgtaaa ttataaaaat 660 ggtgatatag ttgaacaaat aatggactta actcatggta aaggtgtaga ccgtgtaatc 720 atggcaggcg gtggtgctga aacactagca caagcagtaa ctatggttaa acctggcggc 780 gtaatttcta acatcaacta ccatggaagc ggtgatactt tgccaatacc tcgtgttcaa 840 tggggctgcg gcatggctca caaaactata agaggagggt tatgtcccgg cggacgtctt 900 agaatggaaa tgctaagaga ccttgttcta tataaacgtg ttgatttgag caaacttgtt 960 actcatgtat ttgatggtgc agaaaatatt gaaaaggccc ttttgcttat gaaaaataag 1020 ccaaaagatt taattaaatc agtagttaca ttctaa 1056 <210> 38 <211> 1230 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 38
atgaacaatt taaaggaaga agcattaaag tttcataaag aacatgaagg taaaatagca 60 cttaaaagta aagtatctgt taaaactaga gaggacctag gcttagcata tactccaggt 120 gttgctgaac catgtcttga aatcaacagg gactataata cgttatacga ttatacttct 180 aagggaaatt atgtagcagt agtaactaac ggcagtgcag ttttgggact tggaaatata 240 ggtgctgcag ctggcttacc tgtaatggaa ggtaaatcta ttctatttaa gacttttgca 300 ggagtagacg cttttcctat ttgtgttgac agcaaagatc ctgacaagat tgtagaaaca 360
gtaaaattaa tagaatccac atttggagga ataaacctag aagatataaa agcacctgag 420 tgctttgaaa tagaagataa attaaaaaag gtctgcaata taccagtttt tcatgacgac 480 cagcacggaa cagcagtagt aactttagct gctatgataa atgcacttaa aatagtaaac 540 aaaaaatttg aagacttaaa agtaataata aatggtgcag gagctgcagg tacagcaatt 600 gcaaaactgc ttgtaagtag aggagttaaa aacattattg tatgcgatag aaaaggtgct 660 atatcaaaag atagagaaaa tttaagtgct gcaaaaaaag acctagcaga agttacaaat 720 cctagtatga taaaaggtgc acttaaagat gtactaaaag aagctgatgt attcataggt 780 gtatctgctc ctggagtaat tactcctgaa atgataaaaa caatggctaa agatcccctc 840 atttttgcta tggccaatcc taagcctgaa atctaccctg atgaagcaaa agctgcaggt 900 gccagagtag ttggtacggg aagatcagat ttcccaaatc aaataaataa tgttcttgca 960 tttcctggaa tatttagagg agcacttgat gtaagggcat caaaaataaa tgaagaaatg 1020 aaaatagctg ctgcatgtgc tatagcagac ataataactg aaaaagaact taatgaagat 1080 tatgttatac cagatgcttt tgactcaaga atagcaccaa aggtagctta ttatgtagca 1140 aaggctgcca tagaaagtgg agttgcaaga agaactgaca tcactcctga aatggtagaa 1200 gaacatacta aaaagcttgt acaagcataa 1230 <210> 39 <211> 409 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 39
Met Asn Asn Leu Lys Glu Glu Ala Leu Lys Phe His Lys Glu His Glu
15 10 15
Gly Lys lie Ala Leu Lys Ser Lys val Ser val Lys Thr Arg Glu Asp
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Tyr Thr Pro Gly val Ala Glu Pro Cys Leu Glu lie
35 40 45
Asn Arg Asp Tyr Asn Thr Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Lys Gly Asn Tyr
50 55 60
val Ala val val Thr Asn Gly Ser Ala val Leu Gly Leu Gly Asn lie
65 70 75 80
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Pro val Met Glu Gly Lys Ser lie Leu Phe
85 90 95
Lys Thr Phe Ala Gly val Asp Ala Phe Pro lie Cys val Asp Ser Lys
100 105 110
Asp Pro Asp Lys lie val Glu Thr val Lys Leu lie Glu Ser Thr Phe
115 120 125
Gly Gly lie Asn Leu Glu Asp lie Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu lie
130 135 140
Glu Asp Lys Leu Lys Lys val Cys Asn lie Pro val Phe His Asp Asp
145 150 155 160
Gin His Gly Thr Ala val val Thr Leu Ala Ala Met lie Asn Ala Leu
165 170 175
Lys lie val Asn Lys Lys Phe Glu Asp Leu Lys val lie lie Asn Gly
180 185 190
Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala lie Ala Lys Leu Leu val Ser Arg Gly
195 200 205
val Lys Asn
210 Arg Glu Asn 225
Pro ser Met
val Phe lie
Lys Thr Met 275
Pro Glu lie
290 Gly Thr Gly 305
Phe Pro Gly Asn Glu Glu
lie lie
Leu Ser
lie Lys 245 Gly val 260
Ala Lys
Tyr Pro
Arg Ser
lie Phe 325 Met Lys 340
val Cys 215 Ala Ala 230
Gly Ala
Ser Ala
Asp Pro
Asp Glu 295 Asp Phe 310
Arg Gly
Asp Arg Lys Gly
Lys Lys Asp Leu 235
Leu Lys Asp val 250
pro Gly val lie 265
Leu lie Phe Ala 280
Ala Lys Ala Ala
Ala lie ser 220
Ala Glu val
Leu Lys Glu
Thr Pro Glu 270
Met Ala Asn
285 Gly Ala Arg 300
Asn Asn val
Lys Asp
Thr Asn 240 Ala Asp 255
Met lie
Pro Lys
val val
Leu Ala 320 Lys lie 335
lie lie
Thr Glu Lys Glu Leu Asn Glu Asp Tyr val lie Pro Asp Ala Phe Asp
355 360 365
Ser Arg lie Ala Pro Lys val Ala Tyr Tyr val Ala Lys Ala Ala lie
370 375 380
Glu Ser Gly val Ala Arg Arg Thr Asp lie Thr Pro Glu Met val Glu
385 390 395 400
Glu His Thr Lys Lys Leu val Gin Ala 405
<210> 40 <211> 1230 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 40
atgaatctaa gagaaactgc attaaaattt cacaaagaca acgaaggtaa aattgcacta 60 aaatgcaagg tgccggttaa aaacaaagaa gacctaacgt tagcatatac acctggagtt 120 gcagaacctt gcttagaaat taataaaaat ccagaatgca tttatgacta tacatcaaaa 180 gggaattggg tagctgttgt aacaaatggt acagctgttc ttggccttgg aaatataggt 240 gcaggtgcag gacttcctgt tatggaggga aaatccgttt tatttaaaac ttttgctgga 300 gtagatgcat ttccaatatg tctggaaagc aaggatatca atgaaattgt agcagctgta 360 aaacttatgg aaccaacttt tggaggaata aatctagagg acatcaaagc tccagaatgc 420 tttgaaattg aatcaaagct taaagaagtt tgtaacatcc ctgtatttca tgacgatcaa 480 catggaacgg cagttgtttc atcagcctgt cttataaatg cattaaagat agtaaataaa 540 aaatttgaag acttaaaaat tgttgtaaat ggagcaggag cagcaggaac tgccattaca 600 aaacttttaa taaagatggg aacaaaaaat gtaatacttt gcgacactaa aggtgctata 660 tacaagagaa gaccaattgg aatgaataag tttaaggatg aaatggcaga aataacaaat 720 cctaatcttc agaaaggaac tcttgctgat gttttaaaag gtgcagatgt atttttagga 780 gtatctgcag ctaattgtgt aactgaagaa atggtaaagt ccatgaataa agattcaata 840
attatggcaa tggcaaatcc aaatccagaa gctaaagtgg tatgtacagg aaggtcggat tttccaggaa tatttagggg agctttagat aaaatagctg cagcatatgc aatagcagaa tatataatac ctaatgcttt tgacttgaga aaagctgcta ttgatacagg tgttgcgagg aaacatacta agactttgct tggaatctaa <210> 41 atacttcctg atttagctat aaaagctgga 900 tttccaaatc aggttaacaa tgtacttgct 960 gtaagggcaa gtgaaataaa tgatgagatg 1020 cttgtaagtg aagaagaatt gaaaccagac 1080 atagccccaa aagtagccgc atacgtagca 1140 aaaaaggatg tcactccaga gatggttgaa 1200 1230
<211> 409 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 41
Met Asn Leu Arg Glu Thr Ala Leu Lys Phe His Lys Asp Asn Glu Gly
15 10 15
Lys lie Ala Leu Lys Cys Lys val Pro val Lys Asn Lys Glu Asp Leu
20 25 30
Thr Leu Ala Tyr Thr Pro Gly val Ala Glu Pro Cys Leu Glu lie Asn
35 40 45
Lys Asn Pro Glu Cys lie Tyr Asp Tyr Thr Ser Lys Gly Asn Trp val
50 55 60
Ala val val Thr Asn Gly Thr Ala val Leu Gly Leu Gly Asn lie Gly
65 70 75 80
Ala Gly Ala Gly Leu Pro val Met Glu Gly Lys Ser val Leu Phe Lys
85 90 95
Thr Phe Ala Gly val Asp Ala Phe Pro lie Cys Leu Glu Ser Lys Asp
100 105 110
lie Asn Glu lie val Ala Ala val Lys Leu Met Glu Pro Thr Phe Gly
115 120 125
Gly lie Asn Leu Glu Asp lie Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu lie Glu
130 135 140
Ser Lys Leu Lys Glu val Cys Asn lie Pro val Phe His Asp Asp Gin
145 150 155 160
His Gly Thr Ala val val Ser Ser Ala Cys Leu lie Asn Ala Leu Lys
165 170 175
lie val Asn Lys Lys Phe Glu Asp Leu Lys lie val val Asn Gly Ala
180 185 190
Gly Ala Ala Gly Thr Ala lie Thr Lys Leu Leu lie Lys Met Gly Thr
195 200 205
Lys Asn val lie Leu Cys Asp Thr Lys Gly Ala lie Tyr Lys Arg Arg
210 215 220
Pro lie Gly Met Asn Lys Phe Lys Asp Glu Met Ala Glu lie Thr Asn
225 230 235 240
Pro Asn Leu Gin Lys Gly Thr Leu Ala Asp val Leu Lys Gly Ala Asp
245 250 255
val Phe Leu Gly val Ser Ala Ala Asn Cys val Thr Glu Glu Met val
260 265 270
Lys Ser Met Asn Lys Asp Ser lie lie Met Ala Met Ala Asn Pro Asn
275 280 285
Pro Glu lie Leu Pro Asp Leu Ala lie Lys Ala Gly Ala Lys val val
290 295 300
Cys Thr Gly Arg Ser Asp Phe Pro Asn Gin val Asn Asn val Leu Ala
305 310 315 320
Phe Pro Gly lie Phe Arg Gly Ala Leu Asp val Arg Ala Ser Glu lie
325 330 335
Asn Asp Glu Met Lys lie Ala Ala Ala Tyr Ala lie Ala Glu Leu val
340 345 350
Ser Glu Glu Glu Leu Lys Pro Asp Tyr lie lie Pro Asn Ala Phe Asp
355 360 365
Leu Arg lie Ala Pro Lys val Ala Ala Tyr val Ala Lys Ala Ala lie
370 375 380
Asp Thr Gly val Ala Arg Lys Lys Asp val Thr Pro Glu Met val Glu
385 390 395 400
Lys His Thr Lys Thr Leu Leu Gly lie 405
<210> 42 <211> 1098 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 42
atgtcataca ccaaagttaa atatgaagat ataaaaaagc tgtgtaattt ggtctttgag 60 aaatttggat tcaaccggga agatagtgaa accataacta gcgttttgct tttatcagat 120 ctatatggaa ttgaatccca tggtattcaa aggctggtaa agtactacag tgaaataaaa 180 agtggtctta taaatatcaa ttctaaaata aaaatagtaa aggaaacacc tgtatctgca 240 acaatagatg gcatgggcgg tatgggacag ctaattggta aaaaagctat gaatctggca 300 attaaaaaag ctaaaacttc aggaatgagt atggtagtgg ttagaaattc aaatcactat 360 ggtattgcag gctactatgc caaaatggct gaggaggaag gacttcttgg aatttcaatg 420 accaactctc cagctgtaat ggtaccaacc tttggaaaag atgctatgct tggcacaaat 480 cctattgcca tatcttttcc agctaaaccc tacccatttt taatggatat ggctactagc 540 gtagttacta ggggaaaaat tgaagtttat aacaaaaggc atgaacctct tccccttggt 600
ctagctttaa atagtgatgg tgaagatact acagatccct tagatgtact tcttaatgta 660 cgaaaaaatt ctggaggagg actgcttcct cttggaggat caaaagaatc aactggagga 720 cataaaggtt atggatttgc acttgcagtt gaaatgttta cagcaatttt atctggagga 780 tttactgcaa ataaagttag cttagatagg gaaaatggat ctggaacatg tcattatttc 840 tttgcagtgg attatggtat atttggggat aaacaatcca ttgaagagaa cttttccagc 900 tacctaaatg aacttagaaa ttcaaagaaa gcaaaaggcg ccacaagaat atatactcat 960 ggtgagaaag aagtagaatc ctataaggat aaaatgaaaa atggaattcc agtaaacgac 1020 actactctta aagaaatata cgacatatgt gactacttta gcataaaagc tagtgactat 1080 gtaactaaag tagtataa 1098 <210> 43 <211> 365
<212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 43
Met Ser туг Thr Lys val Lys Tyr Glu Asp lie Lys Lys Leu Cys Asn
15 10 15
Leu val Phe Glu Lys Phe Gly Phe Asn Arg Glu Asp Ser Glu Thr lie
20 25 30
Thr Ser val Leu Leu Leu Ser Asp Leu Tyr Gly lie Glu Ser His Gly
35 40 45
lie Gin Arg Leu val Lys Tyr Tyr Ser Glu lie Lys Ser Gly Leu lie
50 55 60
Asn lie Asn Ser Lys lie Lys lie val Lys Glu Thr Pro val Ser Ala
65 70 75 80
Thr lie Asp Gly Met Gly Gly Met Gly Gin Leu lie Gly Lys Lys Ala
85 90 95
Met Asn Leu Ala lie Lys Lys Ala Lys Thr Ser Gly Met Ser Met val
100 105 110
val val Arg Asn Ser Asn His Tyr Gly lie Ala Gly Tyr Tyr Ala Lys
115 120 125
Met Ala Glu Glu Glu Gly Leu Leu Gly lie Ser Met Thr Asn Ser Pro
130 135 140
Ala val Met val Pro Thr Phe Gly Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr Asn
145 150 155 160
Pro lie Ala lie Ser Phe Pro Ala Lys Pro Tyr Pro Phe Leu Met Asp
165 170 175
Met Ala Thr Ser val val Thr Arg Gly Lys lie Glu val Tyr Asn Lys
180 185 190
Arg His Glu Pro Leu Pro Leu Gly Leu Ala Leu Asn Ser Asp Gly Glu
195 200 205
Asp Thr Thr Asp Pro Leu Asp val Leu Leu Asn val Arg Lys Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Leu Pro Leu Gly Gly Ser Lys Glu Ser Thr Gly Gly
225 230 235 240
His Lys Gly Tyr Gly Phe Ala Leu Ala val Glu Met Phe Thr Ala lie
245 250 255
Leu Ser Gly Gly Phe Thr Ala Asn Lys val Ser Leu Asp Arg Glu Asn
260 265 270
Gly Ser Gly Thr Cys His Tyr Phe Phe Ala val Asp Tyr Gly lie Phe
275 280 285
Gly Asp Lys Gin Ser lie Glu Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Leu Asn Glu
290 295 300
Leu Arg Asn Ser Lys Lys Ala Lys Gly Ala Thr Arg lie Tyr Thr His
305 310 315 320
Gly Glu Lys Glu val Glu Ser Tyr Lys Asp Lys Met Lys Asn Gly lie
325 330 335
Pro val Asn Asp Thr Thr Leu Lys Glu lie Tyr Asp lie Cys Asp Tyr
340 345 350
Phe Ser lie Lys Ala Ser Asp Tyr val Thr Lys val val
355 360 365
<210> 44 <211> 2640 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 44
atgaatggta agaagtacgt ttatcttttc aatgaaggaa atgctggcat gagaaattta 60 cttggaggca agggagctaa tcttgcagaa atgaccaatc ttggcatacc cgttcccggt 120 ggatttacta tatccacaga ggcatgtacc aaatattatg aagatggtaa atctatatcg 180 cagcaagtta tagatcaaat ttatgatgca cttaaaaatg tggaagagac aacaggaaaa 240 aaatttggaa gcatagaaaa tccattgtta gtttcagtaa gatcaggagc cagagtttct 300 atgccaggaa tgatggatac tatattaaat ttaggattaa atgatgatac tgtaatagga 360
cttaaaaagt tgacaggaaa tgaaagattt gcgtatgatt cttatagaag atttattcaa 420 atgttttcag atgtagttat gggaattgaa aagagagaat ttgaagatgt attggatgat 480 gtaaaaaatg ctaaaggagt aaaatacgat acagatttag atgagtccga tttaaagaat 540 ataatccaga gatttaagga tatttataaa aaagaagtaa aggaagactt tcctcaagat 600 cctaaagaac aattaattca gtcagttact gcagtattca gatcttggga aaatcctaga 660 gcaataattt atagaaggtt aaacgacata tcaggtgatt ggggaactgc agtaaatgtt 720 caatcaatgg tatttggaaa tatgggagaa acttcaggaa ctggagttgc atttactaga 780 aatccatcta caggagaaaa gtccatattt ggtgaatatc tcataaatgc tcaaggagag 840 gatgtagttg caggaataag aacacctcaa cctataacaa agctaaaaga agaccttcca 900 gaatgttatt ctcaatttat gagtatagca aataagcttg aaaatcatta taaagatatg 960 caggatatgg agttcactat agaacaggga aaattgtatt tccttcagac aagaaacggt 1020 aagagaacag ctcaagctgc acttagaata gcagtaaata tggtagatga aggtctcatc 1080 actaaagaag aggccatact taaagttgag cctaaacagc tcgatacact attgcatcca 1140 aactttgaca gtgatgaatt gaaacgggca gttgtaatag caaatggact tcctgcatca 1200 ccaggagcag cttgtggtaa gatatatttt acagcagatg atgctaagaa acatcatgat 1260 caaggtgaaa aggtaatact tgtaaggcta gagacttctc cagaagatat agaaggaatg 1320 gcagcttctg aaggaatact tacagttaga ggaggcatga catctcatgc agctgttgta 1380 gcaagaggta tgggaacatg ctgtgtagct ggatgtggtg atcttatcgt aagtgaaaag 1440 gaaaagcttt tcaaaagatt agataaggtt tacaaagaag gggattacat atctttagat 1500 ggaagtactg gaaatgtata tggagagcct ataaagactg tagcaccaga aatatcagga 1560 gattttggaa tcttcatggg atgggctgac aatataagaa aattgggagt tagaacaaat 1620 gcagatacac caagagatgc aaaccaggct attagctttg gtgccgaagg aataggactt 1680 tgtagaacag agcatatgtt ctttgatgaa gatagaatac cagaaatgag ggaaatgata 1740 gtttcaaaaa cggaagagca gaggagaaaa gctttagata aattactacc aagacaaaag 1800 aaagatttta ttggaatata tgaggcaatg gaaggaaaac ctgtcacaat tagatttttg 1860 gatccaccac ttcatgaatt cttacctact gaaactgagg atatagagtc tttagccaag 1920 gaaatgggag taagttttca agaactaaaa gatactatag attctctaca tgaatttaat 1980 cctatgatgg ggcatagagg atgcaggctt actgtttcat atccagaaat agctgaaatg 2040 caaacaaggg ctattataga agcagctata gatgttaaaa agagaaaagg gtatgatata 2100 gttccagaaa ttatgatacc tcttgtagga gaaataaaag aattaaaata tgttaaagac 2160 gtagttgtga gggtagcaga tgaaataata caaaaagagg gaatcaattt aaaatatgaa 2220 gtaggaacta tgatagaaat tccaagagca gctattacag ctgatgaaat agctaaagaa 2280
gctgagttct tctcatttgg aactaatgat ttaactcaaa tgacttttgg attttcaaga 2340 gatgatgcag gtaaattttt gaatgattat tatgataaaa aagtatatga gtttgatcca 2400
ttccaaaggt tagatcaagt tggagtagga aaacttgtag agactgctgt aaaattaggt 2460 aaaaagacta gacctgacat tcatcttgga atatgtggag aacatggagg agatccatct 2520 tctgtagagt ttttccacaa tgtaggactt gactatgtat cttgttcacc atttagggta 2580 cctgtggcaa gacttgctgc agctcaggct cagataaaga atccaagacc aatcaaataa 2640 <210> 45 <211> 879 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 45
Met Asn Gly Lys Lys Tyr val Tyr Leu Phe Asn Glu Gly Asn Ala Gly
1 5 10 15
Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Thr
20 25 30
Asn Leu Gly lie Pro val Pro Gly Gly Phe Thr lie Ser Thr Glu Ala
35 40 45
Cys Thr Lys Tyr Tyr Glu Asp Gly Lys Ser lie Ser Gin Gin val lie
50 55 60
Asp Gin lie Tyr Asp Ala Leu Lys Asn val Glu Glu Thr Thr Gly Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Ser lie Glu Asn Pro Leu Leu val Ser val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Arg val Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr lie Leu Asn Leu Gly
100 105 110
Leu Asn Asp Asp Thr val lie Gly Leu Lys Lys Leu Thr Gly Asn Glu
115 120 125
Arg Phe Ala Tyr Asp Ser Tyr Arg Arg Phe lie Gin Met Phe Ser Asp
130 135 140
val val Met Gly lie Glu Lys Arg Glu Phe Glu Asp val Leu Asp Asp
145 150 155 160
val Lys Asn Ala Lys Gly val Lys Tyr Asp Thr Asp Leu Asp Glu Ser
165 170 175
Asp Leu Lys Asn lie lie Gin Arg Phe Lys Asp lie Tyr Lys Lys Glu
180 185 190
val Lys Glu Asp Phe Pro Gin Asp Pro Lys Glu Gin Leu lie Gin Ser
195 200 205
val Thr Ala val Phe Arg ser Trp
210 215 Arg Arg Leu Asn Asp lie Ser Gly 225 230 Gin Ser Met val Phe Gly Asn Met 245
Ala Phe Thr Arg Asn Pro Ser Thr
Glu Asn Pro Arg Ala lie lie Tyr
220
Asp Trp Gly Thr Ala val Asn val
235 240
Gly Glu Thr ser Gly Thr Gly val
250 255
Gly Glu Lys Ser lie Phe Gly Glu
260
Туг Leu lie Asn 275
Pro Gin Pro lie 290
Gin Phe Met Ser 305
Gin Asp Met Glu
Thr Arg Asn Gly 340
Asn Met val Asp 355
val Glu Pro Lys 370
Asp Glu Leu Lys 385
Pro Gly Ala Ala
Lys His His Asp 420
Ser Pro Glu Asp 435
val Arg Gly Gly 450
Gly Thr Cys Cys 465
Ala Gin Gly
Thr Lys Leu 295
lie Ala Asn
310 Phe Thr lie 325
Lys Arg Thr
Glu Gly Leu
Gin Leu Asp 375
Arg Ala val 390
CyS Gly LyS
405
Gin Gly Glu
lie Glu Gly
Met Thr Ser 455
val Ala Gly 470
265 Glu Asp 280
Lys Glu
Lys Leu
Glu Gin
Ala Gin 345 lie Thr 360
Thr Leu
val lie
lie туг
Lys val 425 Met Ala 440
His Ala Cys Gly val val
Asp Leu
Glu Asn 315
Gly Lys
330 Ala Ala
Lys Glu
Leu His
Ala Asn 395 Phe Thr 410
lie Leu
Ala Ser
Ala val
Asp Leu 475
Ala Gly 285 Pro Glu 300
His туг
Leu Tyr
Leu Arg
Glu Ala 365
РГО Asn
380
Gly Leu
Ala Asp
val Arg
Glu Gly 445 val Ala 460
lie val
270
lie Arg Thr
Cys туг ser
Lys Asp Met 320
Phe Leu Gin
335 lie Ala val 350
lie Leu Lys
Phe Asp Ser
Pro Ala Ser 400
Asp Ala Lys
415 Leu Glu Thr 430
lie Leu Thr
Arg Gly Met
Ser Glu Lys 480
Glu Lys Leu
lie Ser Leu
Thr val Ala 515
Ala Asp Asn
530 Arg Asp Ala 545
Cys Arg Thr
Arg Glu Met
Asp Lys Leu 595
Ala Met Glu
610 His Glu Phe
Phe Lys 485 Asp Gly 500
Pro Glu
lie Arg
Asn Gin
Glu His 565 lie val 580
Leu Pro Gly Lys Leu Pro
Arg Leu Asp
Ser Thr Gly
lie Ser Gly 520
Lys Leu Gly 535
Ala lie Ser 550
Met Phe Phe
Ser Lys Thr
Arg Gln Lys 600
Pro val Thr
615 Thr Glu Thr
Lys val 490 Asn val 505
Asp Phe
val Arg
Phe Gly
Asp Glu 570 Glu Glu 585
Lys Asp
lie Arg Glu Asp
Tyr Lys Glu
Tyr Gly Glu
Gly lie Phe 525
Thr Asn Ala
540 Ala Glu Gly 555
Asp Arg lie
Gin Arg Arg
Phe lie Gly 605
Phe Leu Asp
620 lie Glu Ser
Gly Asp Tyr
495 Pro lie Lys 510
Met Gly Trp
Asp Thr Pro
lie Gly Leu 560
Pro Glu Met 575
Lys Ala Leu 590
lie Tyr Glu Pro Pro Leu Leu Ala Lys
625
Glu Met Gly val
His Glu Phe Asn 660
Ser Tyr Pro Glu 675
Ala lie Asp val 690
Met lie Pro Leu 705
val val val Arg
Leu Lys Tyr Glu 740
630
Ser Phe Gin Glu 645
Pro Met Met Gly
lie Ala Glu Met 680
Lys Lys Arg Lys 695
val Gly Glu lie 710
val Ala Asp Glu 725
val Gly Thr Met
635
Leu Lys Asp Thr 650
His Arg Gly Cys 665
Gin Thr Arg Ala
Gly Tyr Asp lie 700
Lys Glu Leu Lys 715
lie lie Gin Lys 730
lie Glu lie Pro 745 640
lie Asp Ser Leu 655
Arg Leu Thr val 670
lie lie Glu Ala 685
val Pro Glu lie
Tyr val Lys Asp 720
Glu Gly lie Asn 735
Arg Ala Ala lie 750
Thr Ala Asp Glu lie Ala Lys Glu Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr
755 760 765
Asn Asp Leu Thr Gin Met Thr Phe Gly Phe Ser Arg Asp Asp Ala Gly
770 775 780
Lys Phe Leu Asn Asp туг Tyr Asp Lys Lys val Tyr Glu Phe Asp Pro
785 790 795 800
Phe Gin Arg Leu Asp Gin val Gly val Gly Lys Leu val Glu Thr Ala
805 810 815
val Lys Leu Gly Lys Lys Thr Arg Pro Asp lie His Leu Gly lie Cys
820 825 830
Gly Glu His Gly Gly Asp Pro Ser Ser val Glu Phe Phe His Asn val
835 840 845
Gly Leu Asp Tyr val Ser Cys Ser Pro Phe Arg val Pro val Ala Arg
850 855 860
Leu Ala Ala Ala Gin Ala Gin lie Lys Asn Pro Arg Pro lie Lys
865 870 875
<210> 46 <211> 3447 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 46
atggattact tgttaaagag gtttaagagg gttcttgtag cgaatagagg agaaatagcc 60 ataagaatat tcagagcatg caaagaattg ggaataacta ctgtagcaat atattcaaat 120 gaggataaga gatctctttt cagaactaaa gctgatgaat cctatatgat agggaaaaat 180 aagggacctg tagaagcata tttggatatt gatgaaataa tagatatagc tttgaagaaa 240 aatgtagatg caatacatcc gggttatgga ttcctatcag aaaatcctga attggcaaaa 300 aagtgtaaag aagcaggtat tgaatttata ggacctacat cagatatgat ggagatgctt 360 ggtgataaga taaaatctaa aattgttgca caaaaggctg gagtaccaac aataccagga 420 gttcaagaag ctataaagac agaagaagaa gctttaaaat ttgctaactt ctgtggatat 480 cctgttatga ttaaagcagc tgacggtggc ggcggcagag gaatgagaat agtaagggaa 540 gaaaaagatc tcatagaatc ctataacagt gctaaaaatg aatctagaaa agcttttggt 600
tcagaaaaaa tatacattga aaaatatatt gaaaatccaa aacacataga ggtgcaggta 660
cttggagata agtacggcaa tattgttcat ctatatgaaa gagattgttc catacagaga 720
agacatcaaa aggttataga atttacacca tctttagccc tctcagaaga aaaaagacaa 780
caaatatgtg aagatgcttt aaaaattgcg agaactgtag gatatacaag tgcaggtacc 840
ttggagtttt tagttgacaa aaatgaaaat cactatttta tagagatgaa tactagaatt 900
caggtagaac acactgtaac tgaaatggtt acaggaatag atatagttca agatcaaata 960 cttattgcag aagggcattc acttgattct aaggaaatag gaataaaatc tcaagatgat 1020 atagagttaa aaggatatgc aatacaatgc agaattacta cagaagatcc tttaaataat 1080 tttgcgccag atacaggaag aatagatatg tatagaactg gttctggatt tggtataaga 1140 cttgatggag gaaatggatt tacaggtgca gtaataagtc cttattatga tagcttactg 1200 gtaaaaactg tatcttggtc aagaactttt gaagatgcta taagaaaggc aataaggtct 1260 ataaatgaga ctgttatatc aggggtaaag acaaatgcag actttataat aaaagtgtta 1320 agtcatgaaa agtttataaa aggtgaatgt gatactaatt ttattgaaga taatccagat 1380 ttatttgata taaaaccaaa attagataaa gaaatgagtg tacttaaatt tataggaaat 1440 aaagtagtaa atgagactcg tggaaagaag aagaaattta atatacctat tgtaccaaaa 1500 gtagaagaaa atattaaatt gagtggaaca aagcaaatac ttgatacaaa aggagcagat 1560 ggattagttg attggataaa atcacaagat aagcttctta ttacagatac tactatgaga 1620 gacgctcatc agtcacttat ggcaactagg gtgagaacta gagatttgct taagatagca 1680 aaagcccaat cagctttggc aaacgatctt ttctccatgg aaatgtgggg aggagcaact 1740 tttgatgtag cgtatagatt tttaaatgaa tctccttggg aaagacttga aaaacttaga 1800 gaaaaggttc ctaatatact attccagatg ctcataagag gagctaatgc agtaggatat 1860 aagaactatc ctgataatgt tattagagaa tttataaaac aatcttcaac ttcaggcatt 1920 gatgtattta gaatatttga ttcactaaac tggcttaaag gaatgaaagt tgctatagat 1980 cagacattaa aagaaggaaa gatagctgaa gcatgcatgt gctatacagg agatgtatta 2040 gatgacaagg aggataaata tacgcttcag tactatataa acttagctaa agaaatagag 2100 aaaactggag cacagattct tggaataaag gatatgtctg ctttgttaaa gccatattct 2160 gcttataaac ttgtaaaagc acttaagaat gaaatctcta ttccaataca tcttcatact 2220 catgatacta caggtaatgg tgtggcaaca gtacttatgg ctgctgatgc aggacttgat 2280 atagctgata ctgcattcaa tagtatgtct gggcttacta gccagccagc tttgaattca 2340 atagcagcag cacttaaaaa tacaaataga gatactaagt tagatgcaga taatcttcaa 2400 aaaatatcta actactggga agatgtaaga cctatatata gtcagtttga gtcgggactt 2460 aagtcaagta ctgcagaaat atacaagtat gagataccag gaggccagta ttcaaactta 2520 aaacctcagg ttgaaagttt tgggttggga gatcgttttg aagatgtaaa agaaatgtat 2580 aagagagtta ataaaatgct tggaaatata attaaagtaa ctccttcttc aaaaatggta 2640 ggagatctgg ctatatttat gatacaaaat gatttggatg aaaagaatat ttatgaaaaa 2700 ggtaagaatt taactttccc agattctaca atttctttct tcaagggaat gatgggtcag 2760 cctatgggag gatttccaaa agaacttcaa aaaatagttc taaagggaga ggaaccttta 2820 aagggaagac caggagaatt tttgccacca gaagattttg gcaagataga agatcattta 2880 actaaaaaat ataagagaaa atttgaaaat aaagaactct tgagttatgc tatgtatcct 2940
gatgtatttg aaaattacct taaattcata gatgaatatg gtgatctcag cagaatggaa 3000
agtgaaacat tcttctatgg acttgcagaa ggagaacttt gtgaagttga aataggagaa 3060
ggaaaaagtt tatttgtaca attactagag attacaaaag ttgacgatga aggatataga 3120
ttcttagtgt ttgaggttaa tggtattaag agagacataa ggataaaaga taacttggct 3180
ttctctggat caggaataaa agaaaattca tgtgttatgg cagatgaaga taatgaaaaa 3240
gaaataggat caagtatacc tggaaacatt gttaaagtac ttgtaaaacc aggagataaa 3300 gtagaagagg gccagagctt aattgtaata gaagctatga aaatggaaac aaatgtttca 3360 gctgctgaag caggagtaat tgatggagta tttgtaaaag aaggccagag agttaaaact 3420 ggagaacttt taattaaatt aaagtaa 3447 <210> 47 <211> 1148 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 47
Met Asp Tyr Leu Leu Lys Arg Phe Lys Arg val Leu val Ala Asn Arg
15 10 15
Gly Glu lie Ala lie Arg lie Phe Arg Ala Cys Lys Glu Leu Gly lie
20 25 30
Thr Thr val Ala lie Tyr Ser Asn Glu Asp Lys Arg Ser Leu Phe Arg
35 40 45
Thr Lys Ala Asp Glu Ser Tyr Met lie Gly Lys Asn Lys Gly Pro val
50 55 60
Glu Ala Tyr Leu Asp lie Asp Glu lie lie Asp lie Ala Leu Lys Lys
65 70 75 80
Asn val Asp Ala lie His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Pro
85 90 95
Glu Leu Ala Lys Lys Cys Lys Glu Ala Gly lie Glu Phe lie Gly Pro
100 105 110
Thr Ser Asp Met Met Glu Met Leu Gly Asp Lys lie Lys Ser Lys lie
115 120 125
val Ala Gin Lys Ala Gly val Pro Thr lie Pro Gly val Gin Glu Ala
130 135 140
lie Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Lys Phe Ala Asn Phe Cys Gly Tyr
145 150 155 160
Pro val Met lie Lys Ala Ala Asp Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg
165 170 175
lie val Arg Glu Glu Lys Asp Leu
180
Asn Glu Ser Arg Lys Ala Phe Gly
195 200
Tyr lie Glu Asn Pro Lys His lie
210 215
Tyr Gly Asn lie val His Leu Tyr
225 230
Arg His Gin Lys val lie Glu Phe
245
Glu Lys Arg Gin Gin lie Cys Glu
260
val Gly Tyr Thr ser Ala Gly Thr
275 280
Glu Asn His Tyr Phe lie Glu Met
lie Glu Ser Tyr Asn Ser Ala Lys 185 190 Ser Glu Lys lie Tyr lie Glu Lys 205
Glu val Gin val Leu Gly Asp Lys 220
Glu Arg Asp Cys Ser lie Gin Arg 235 240 Thr Pro Ser Leu Ala Leu Ser Glu
250 255 Asp Ala Leu Lys lie Ala Arg Thr 265 270 Leu Glu Phe Leu val Asp Lys Asn 285
Asn Thr Arg lie Gin val Glu His
290 295 300
Thr val Thr Glu Met val Thr Gly lie Asp lie val Gin Asp Gin lie
305 310 315 320
Leu lie Ala Glu Gly His Ser Leu Asp Ser Lys Glu lie Gly lie Lys
325 330 335
Ser Gin Asp Asp lie Glu Leu Lys Gly Tyr Ala lie Gin Cys Arg lie
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Leu Asn Asn Phe Ala Pro Asp Thr Gly Arg lie
355 360 365
Asp Met Tyr Arg Thr Gly Ser Gly Phe Gly lie Arg Leu Asp Gly Gly
370 375 380
Asn Gly Phe Thr Gly Ala val lie Ser Pro туг Tyr Asp Ser Leu Leu
385 390 395 400
val Lys Thr val Ser Trp Ser Arg Thr Phe Glu Asp Ala lie Arg Lys
405 410 415
Ala lie Arg Ser lie Asn Glu Thr val lie Ser Gly val Lys Thr Asn
420 425 430
Ala Asp Phe lie lie Lys val Leu Ser His Glu Lys Phe lie Lys Gly
435 440 445
Glu Cys Asp Thr 450
Lys Pro Lys Leu 465
Lys val val Asn
lie val Pro Lys 500
lie Leu Asp Thr 515
Gin Asp Lys Leu 530
Ser Leu Met Ala 545
Lys Ala Gin Ser
Gly Gly Ala Thr 580
Trp Glu Arg Leu 595
Gin Met Leu lie 610
Asp Asn val lie 625
Asp val Phe Arg val Ala lie Asp
Asn Phe lie 455
Asp Lys Glu
470 Glu Thr Arg 485
val Glu Glu
Lys Gly Ala
Leu lie Thr 535
Thr Arg val
550 Ala Leu Ala 565
Phe Asp val
Glu Lys Leu
Arg Gly Ala 615
Arg Glu Phe
630 lie Phe Asp 645
Gin Thr Leu
Glu Asp Asn
Met ser val
Gly Lys Lys 490
Asn lie Lys 505
Asp Gly Leu 520
Asp Thr Thr
Arg Thr Arg
Asn Asp Leu 570
Ala Tyr Arg 585
Arg Glu Lys 600
Asn Ala val
lie Lys Gin
Ser Leu Asn 650
Lys Glu Gly
Pro Asp Leu
460 Leu Lys Phe 475
Lys Lys Phe
Leu Ser Gly
val Asp Trp 525
Met Arg Asp
540 Asp Leu Leu 555
Phe Ser Met
Phe Leu Asn
val Pro Asn 605
Gly Tyr Lys
620 Ser Ser Thr 635
Trp Leu Lys Lys lie Ala
Phe Asp lie
lie Gly Asn 480
Asn lie Pro
495 Thr Lys Gin 510
lie Lys Ser
Ala His Gin
Lys lie Ala 560
Glu Met Trp 575
Glu Ser Pro 590
lie Leu Phe
Asn Tyr Pro
Ser Gly lie 640
Gly Met Lys
655 Glu Ala Cys
660 665 670
Met Cys туг Thr Gly Asp val Leu Asp Asp Lys Glu Asp Lys Tyr Thr
675 680 685
Leu Gin Tyr Tyr lie Asn Leu Ala Lys Glu lie Glu Lys Thr Gly Ala
690 695 700
Gin lie Leu Gly lie Lys Asp Met Ser Ala Leu Leu Lys Pro Tyr Ser
705 710 715 720
Ala Tyr Lys Leu
His Leu His Thr 740
Met Ala Ala Asp 755
Met Ser Gly Leu 770
Leu Lys Asn Thr 785
Lys lie Ser Asn
Glu Ser Gly Leu 820
Pro Gly Gly Gin 835
Leu Gly Asp Arg 850
Lys Met Leu Gly 865
Gly Asp Leu Ala
lie Tyr Glu Lys 900
Phe Phe Lys Gly 915
Leu Gin Lys lie 930
Gly Glu Phe Leu 945
Thr Lys Lys Tyr
Ala Met туг Pro 980
val Lys Ala 725
His Asp Thr
Ala Gly Leu
Thr ser Gin 775
Asn Arg Asp 790
Tyr Trp Glu
805
Lys Ser Ser
туг ser Asn
Phe Glu Asp 855
Asn lie lie
870 lie Phe Met 885
Gly Lys Asn
Met Met Gly
val Leu Lys 935
Pro Pro Glu
950 Lys Arg Lys 965
Asp val Phe
Leu Lys
Thr Gly 745 Asp lie 760
Pro Ala
Thr Lys
Asp val
Thr Ala 825 Leu Lys 840
val Lys
Lys val
lie Gin
Leu Thr 905 Gin Pro 920
Gly Glu
Asp Phe
Phe Glu
Glu Asn 985
Asn Glu lie Ser 730
Asn Gly val Ala
Ala Asp Thr Ala 765
Leu Asn Ser lie 780
Leu Asp Ala Asp 795
Arg Pro lie Tyr 810
Glu lie Tyr Lys
Pro Gin val Glu 845
Glu Met Tyr Lys 860
Thr Pro ser ser 875
Asn Asp Leu Asp 890
Phe Pro Asp Ser
Met Gly Gly Phe 925
Glu Pro Leu Lys 940
Gly Lys lie Glu 955
Asn Lys Glu Leu 970
Tyr Leu Lys Phe
lie Pro lie 735
Thr val Leu 750
Phe Asn Ser
Ala Ala Ala
Asn Leu Gin 800
Ser Gin Phe
815 Tyr Glu lie 830
Ser Phe Gly
Arg val Asn
Lys Met val 880
Glu Lys Asn
895 Thr lie Ser 910
Pro Lys Glu
Gly Arg Pro
Asp His Leu 960
Leu Ser Tyr
975 lie Asp Glu 990
Tyr Gly Asp Leu Ser Arg Met Glu Ser Glu Thr Phe Phe Tyr Gly Leu
995 1000 1005
Ala Glu Gly Glu Leu Cys Glu val Glu lie Gly Glu Gly Lys Ser
1010 1015 1020
Leu Phe val Gin Leu Leu Glu lie Thr Lys val Asp Asp Glu Gly
1025 1030 1035
Tyr Arg Phe Leu val Phe Glu val Asn Gly lie Lys Arg Asp lie
1040 1045 1050
Arg lie Lys Asp Asn Leu Ala Phe Ser Gly Ser Gly lie Lys Glu
1055 1060 1065
Asn Ser Cys val Met Ala Asp Glu Asp Asn Glu Lys Glu lie Gly
1070 1075 1080
Ser Ser lie Pro Gly Asn lie val Lys val Leu val Lys Pro Gly
1085 1090 1095
Asp Lys val Glu Glu Gly Gin Ser Leu lie val lie Glu Ala Met
1100 1105 1110
Lys Met Glu Thr Asn val Ser Ala Ala Glu Ala Gly val lie Asp
1115 1120 1125
Gly val Phe val Lys Glu Gly Gin Arg val Lys Thr Gly Glu Leu
1130 1135 1140
Leu lie Lys Leu Lys
1145 <210> 48 <211> 1524 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 48
atgtataaaa atttatcacc atcagaatta acggaatttt caattaaaag aggagaagga 60 tttttatcaa ataagggagc tcttatgatt aatactggaa agtacacagg aagatctcct 120 aaagatagat ttatagttaa tcaagaaagc attaggaaca aaataaactg gggaaatgta 180 aatctttcta tagaagaaga tatttttaat aaaatgtatg ataagatttt aaattatata 240 agtgataaag atatttttgt gtttgatgga tttgttggag ctttaaaaaa atataccctt 300 cctataagag taatatgcga aagggcatcc caggcgttgt ttgcaaatca attgtttaga 360 agaccaacgg aggaggattt aaagtgtttt actcctgaat ttaatattat atcggcacct 420 ggatttaagg ctaagggcaa agaagacggt ttaaattcag atgcctttat tttagtaaat 480
ttcgataaaa aaattatatt aataggtgga accagttact cgggagaaat aaaaaaatca 540 gtattttcag taatgaactt cttgcttcca caaaaaggag tcatgcctat gcactgttct 600 gctaatatag gacaagataa taaaacttgc ttattttttg gattgtcagg aacaggaaaa 660 actactttat cagcagatgg tgaaagaaga ctgattggtg atgacgaaca tggatggtct 720 aatgaaggtg tatttaattt tgagggtgga tgttatgcta aaactataag acttgataag 780 gaaaaggaaa gtcagatata caatgccata aaatttggaa ctgtagttga aaatgtagtg 840 gcagatggga atagagtacc tgattataat gatgctagat atactgaaaa tacaagggca 900 gcatatccta taaattatat agataatata gaagaaagtg gtgtaggagg aaatccagag 960 actataatat ttttaaccgc agatgctttt ggtgtaatgc cacctatatc aaggctttct 1020 aaagaagcag caatgtatca ctttatgtct ggatatacta gcaagatagc tggaactgaa 1080 agaggaataa ttgaacctca agctactttt tcctcttgct ttggtgaacc gtttatgtta 1140 atgaatcctg ctgtctatgc aaaattgtta ggcgaaagaa tagacaagta taacactcag 1200 gtatatttag tgaatactgg atggctatct ggaggatatg gaaatggaga tagaataaaa 1260 ctttcctata caagggctat gattagagaa gctttgaaag ggaagttcaa ggatgttgaa 1320
tttgtggaac atcctgtatt taaagtaatg atgcctaaaa gatgtccagg tgtacctgat 1380 gaaatattaa atcctagaaa tatatgggaa gataaagaag catatgatga gacagcgaga 1440 aagctggcgc tgaagtttag taaaaacttt gagaagttta aagatgtttc cgaagatata 1500 gcaaaagctg gacctgaagc ttaa 1524 <210> 49 <211> 507 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 49
Met Tyr Lys Asn Leu Ser Pro Ser Glu Leu Thr Glu Phe Ser lie Lys
15 10 15
Arg Gly Glu Gly Phe Leu Ser Asn Lys Gly Ala Leu Met lie Asn Thr
20 25 30
Gly Lys Tyr Thr Gly Arg Ser Pro Lys Asp Arg Phe lie val Asn Gin
35 40 45
Glu Ser lie Arg Asn Lys lie Asn Trp Gly Asn val Asn Leu Ser lie
50 55 60
Glu Glu Asp lie Phe Asn Lys Met Tyr Asp Lys lie Leu Asn Tyr lie
65 70 75 80
Ser Asp Lys Asp lie Phe val Phe Asp Gly Phe val Gly Ala Leu Lys
85 90 95
Lys Tyr Thr Leu 100
Leu Phe Ala Asn 115
Cys Phe Thr Pro 130
Lys Gly Lys Glu 145
Phe Asp Lys Lys
lie Lys Lys Ser 180
Gly val Met Pro 195
Thr Cys Leu Phe 210
Ala Asp Gly Glu 225
Asn Glu Gly val
Arg Leu Asp Lys 260
Gly Thr val val 275
Tyr Asn Asp Ala
Pro lie Arg val
Gin Leu Phe Arg 120
Glu Phe Asn lie 135
Asp Gly Leu Asn 150
lie lie Leu lie 165
val Phe ser val
Met His Cys ser 200
Phe Gly Leu Ser 215
Arg Arg Leu lie 230
Phe Asn Phe Glu 245
Glu Lys Glu Ser
Glu Asn val val 280
Arg Tyr Thr Glu
lie Cys Glu Arg 105
Arg Pro Thr Glu
lie Ser Ala Pro 140
Ser Asp Ala Phe 155
Gly Gly Thr Ser 170
Met Asn Phe Leu 185
Ala Asn lie Gly
Gly Thr Gly Lys 220
Gly Asp Asp GlU 235
Gly Gly Cys Tyr 250
Gin lie Tyr Asn 265
Ala Asp Gly Asn Asn Thr Arg Ala
Ala ser Gin Ala 110
Glu Asp Leu Lys 125
Gly Phe Lys Ala
lie Leu val Asn 160
Tyr Ser Gly Glu 175
Leu Pro Gin Lys 190
Gin Asp Asn Lys 205
Thr Thr Leu Ser
His Gly Trp Ser 240
Ala Lys Thr lie 255
Ala lie Lys Phe 270
Arg val Pro Asp 285
Ala Tyr Pro lie
290 295 300
Asn Туг lie Asp Asn lie Glu Glu Ser Gly val Gly Gly Asn Pro Glu
305 310 315 320
Thr lie lie Phe Leu Thr Ala Asp Ala Phe Gly val Met Pro Pro lie
325 330 335
Ser Arg Leu Ser Lys Glu Ala Ala Met Tyr His Phe Met Ser Gly Tyr
340 345 350
Thr Ser Lys lie Ala Gly Thr Glu Arg Gly lie lie Glu Pro Gin Ala
355 360 365
Thr Phe Ser Ser Cys Phe Gly Glu Pro Phe Met Leu Met Asn Pro Ala
370 375 380
val Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Glu Arg lie Asp Lys Tyr Asn Thr Gin
385 390 395 400
val Tyr Leu val Asn Thr Gly Trp Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Asn Gly
405 410 415
Asp Arg lie Lys Leu Ser Tyr Thr Arg Ala Met lie Arg Glu Ala Leu
420 425 430
Lys Gly Lys Phe Lys Asp val Glu Phe val Glu His Pro val Phe Lys
435 440 445
val Met Met Pro Lys Arg Cys Pro Gly val Pro Asp Glu lie Leu Asn
450 455 460
Pro Arg Asn lie Trp Glu Asp Lys Glu Ala Tyr Asp Glu Thr Ala Arg
465 470 475 480
Lys Leu Ala Leu Lys Phe Ser Lys Asn Phe Glu Lys Phe Lys Asp val
485 490 495
Ser Glu Asp lie Ala Lys Ala Gly Pro Glu Ala 500 505
<210> 50 <211> 843 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 50
atgagagaag tagatgtatc cactataact aaagctgtta gaaatctctg tatagatgcc 60 aattattatc tttcggagga tgttaagaaa aagataaaag aatgtgaaga ggacgaaaaa 120 tggcctactg caaaagacat tttaggtaaa atacttgaaa atatagatat atctaaaaat 180 gaagatgtgc ctatgtgtca agatacagga atggcttgtg tatttataac aattggccag 240 gatgttcata tagtaggagg aagtttagaa gacgcaataa ataagggagt aggccagggg 300 tatgtagaag ggtatttaag aaaatctgta gtctctgatc ctataaatag agttaatact 360 aaggacaata ctcctgcagt aatatattat gaaatagttc caggagataa acttaacata 420 aaagtggctc ctaaaggatt tggatcagaa aatatgagtc agataaaaat gcttaaacca 480 gcagatggtc ttaagggtgt taaagatttt gtaataaaag tagtaaagga cgcaggacca 540 aatccatgtc ctcctatggt tgtaggagta ggtataggag gaacttttga caaggctgca 600 aatcttgcaa agaaagctct tgtaagacca ttatctgaaa gaaataaaaa taagttttat 660 tcagatttag aaaatgaact tttagacaaa ataaatctcc ttggtatagg acctcaagga 720 ctagggggaa agactacagc tcttgcagta aatatagaaa cttatcctac ccatatagca 780
ggattacctg tagccgtaaa tataaattgt cacgttacaa gacataagga aatagaattg 840 taa 843 <210> 51 <211> 280 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 51
Met Arg Glu val Asp val Ser Thr lie Thr Lys Ala val Arg Asn Leu
15 10 15
Cys lie Asp Ala Asn Tyr Tyr Leu Ser Glu Asp val Lys Lys Lys lie
20 25 30
Lys Glu Cys Glu Glu Asp Glu Lys Trp Pro Thr Ala Lys Asp lie Leu
35 40 45
Gly Lys lie Leu Glu Asn lie Asp lie Ser Lys Asn Glu Asp val Pro
50 55 60
Met Cys Gin Asp Thr Gly Met Ala Cys val Phe lie Thr lie Gly Gin
65 70 75 80
Asp val His lie val Gly Gly Ser Leu Glu Asp Ala lie Asn Lys Gly
85 90 95
val Gly Gin Gly Tyr val Glu Gly Tyr Leu Arg Lys Ser val val Ser
100 105 110
Asp Pro lie Asn Arg val Asn Thr Lys Asp Asn Thr Pro Ala val lie
115 120 125
Tyr Tyr Glu lie val Pro Gly Asp Lys Leu Asn lie Lys val Ala Pro
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Ser Glu Asn Met Ser Gin lie Lys Met Leu Lys Pro
145 150 155 160
Ala Asp Gly Leu Lys Gly val Lys Asp Phe val lie Lys val val Lys
165 170 175
Asp Ala Gly Pro Asn Pro Cys Pro Pro Met val val Gly val Gly lie
180 185 190
Gly Gly Thr Phe Asp Lys Ala Ala Asn Leu Ala Lys Lys Ala Leu val
195 200 205
Arg Pro Leu Ser Glu Arg Asn Lys Asn Lys Phe Tyr Ser Asp Leu Glu
210 215 220
Asn Glu Leu Leu Asp Lys lie Asn Leu Leu Gly lie Gly Pro Gin Gly
225 230 235 240
Leu Gly Gly Lys Thr Thr Ala Leu Ala val Asn lie Glu Thr Tyr Pro
245 250 255
Thr His lie Ala Gly Leu Pro val Ala val Asn lie Asn Cys His val
260 265 270
Thr Arg His Lys Glu lie Glu Leu 275 280
<210> 52
<211> 573 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 52
atgtatatgg aaaaaaagat aactactccg ttaacggaag aaaaggttaa aactttaaaa 60 gcaggggata gtgttttaat atcagggaca atatatactg ctagagatgc tgctcataag 120 agattagttg aattattaga tgaaggtaaa tcacttccta taaatgtaaa agatgaaata 180 atatattacg caggaccaag tcctgcaaaa ccaggccatg taataggttc agcaggacca 240 acaagtagtt atagaatgga tccatttgca ccaagactgc ttgatatagg tttaaaggga 300 atgataggaa aaggccttcg ttcaaaagaa gttatagaat ccatgaagaa aaataaagct 360 gtttactttg ctgcaatagg cggggctgca gcacttgtag caaaatccat aaagaaagca 420 gaagtagtag cttatgaaga tttggattct gaagctataa gaaaattaga agtaaaagac 480 ttacctgtaa ttgtagtaat agattcagag ggcaataatt tatatgaatc aggacgaaaa 540 gagtacttgg actctgtgga ccagtctaag tag 573 <210> 53 <211> 190 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 53
Met Tyr Met Glu Lys Lys lie Thr Thr Pro Leu Thr Glu Glu Lys val
15 10 15
Lys Thr Leu Lys Ala Gly Asp Ser val Leu lie Ser Gly Thr lie Tyr
20 25 30
Thr Ala Arg Asp Ala Ala His Lys Arg Leu val Glu Leu Leu Asp Glu
35 40 45
Gly Lys Ser Leu Pro lie Asn val Lys Asp Glu lie lie Tyr Tyr Ala
50 55 60
Gly Pro Ser Pro Ala Lys Pro Gly His val lie Gly Ser Ala Gly Pro
65 70 75 80
Thr Ser Ser Tyr Arg Met Asp Pro Phe Ala Pro Arg Leu Leu Asp lie
85 90 95
Gly Leu Lys Gly Met lie Gly Lys Gly Leu Arg Ser Lys Glu val lie
100 105 110
Glu Ser Met Lys Lys Asn Lys Ala val Tyr Phe Ala Ala lie Gly Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Leu val Ala Lys Ser lie Lys Lys Ala Glu val val Ala
130 135 140
Tyr Glu Asp Leu Asp Ser Glu Ala lie Arg Lys Leu Glu val Lys Asp
145 150 155 160
Leu Pro val lie val val lie Asp Ser Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Glu
165 170 175
Ser Gly Arg Lys Glu Tyr Leu Asp Ser val Asp Gin Ser Lys
180 185 190
<210> 54 <211> 1797 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 54
atgcaaatag ataagataat tgatactgac atattagttg ttggaggttc tggagcagga 60 tcaatggcag ctgtaacagc tgcgagaaaa ggagcaaaag tactacttgc agtaaaaggg 120 aagcttggaa aaagcggaaa tgccattatg gcaggggcag gattttctat ggatggagaa 180 acagcatatt ataaatatgg actcaaggaa gcagatccta aaaatacaaa gggaaaatta 240 tttgaacaaa ttgtaaaaca gtctttttat ttaagtgatc aaaatatggt tgagcagttt 300 gtaagtgatt gtgatgagtg ctgctgggaa cttaaacagt ggattgaaaa agcaggacac 360 aaggttgtat tttttggaga agaaggatat ataagctcgg gtaaagctgt gggagttggc 420 tgccgatatg gagtttcaaa agcaggtggt attgatgtta tagaagattt tatagcagtg 480 gatattttaa tggaagataa aaaagctgta ggtgcagtgg gcatagaagt atatacagga 540 aaaattattg aaatcagatc aaagtcagtt attttagcta ctggcggata tcagccttat 600 tcctttaaat gtactgtttc cgatatgact ggcgatggaa tggctatggc ataccgtgca 660 ggagccaagc ttgcagatat ggaattttta ttatatatac cagcagttgc cctttcacca 720 tcagtatata aaggttcaat ttatcccttc ttacactcca gtatgttaat gcctattgtt 780 aaaaatggta agggagaatc aattttagat aatatacctg aaaatttact taaaatggcc 840 aaggaaagtg aaatgggaaa gcttatattt acgtattatt atggagatca aattgcaaga 900 ggaaaaggaa ctccaaatgg aggagtatat tttgattatt ccaatgtacc ttttgatatt 960
tatgaaaaag ctttaaaaaa agctgaacca ttaatgaaca tatggtatag aaaaggattc 1020 tatcaaggaa acaacttgga tacttttgtt gaaaatatta gaaagggcat tccatgggaa 1080 gtaggtattg gcagtgaata cagcatgggc ggcattgaag tagacgaaaa tatgtacact 1140 ggagtaccag gactttatgc agctggtgag actacaagtg gtgtatttgg agctatgagg 1200 gttgcagatg gacttattga aatgcttgta cagggttata gagcagcatt gtccgcttgc 1260 aaatatatac aaaatgtaaa tgagccaagt atgaaaaata ccaatattga tagtataatt 1320 aaagatattt tttcacctct tgaaagaaaa gaaggagtta gtcctataaa aatacacaga 1380 aatatagaaa aaacggctga tgttggattc aactttagaa gaaatgaaga gggacttaca 1440 aaagctttag atgaaatttt aaaaatacac aaatatgaca taagcgcaat gagtactaaa 1500 agtaaaaata gagtttataa ctatgaatgg atagaatcag tacaggctcg aaatctttta 1560 acttgtacag aagcaggtgt aagagctgcc cttatgagaa aggaaagtag gggtacacac 1620 atacgtgatg attatgaatt tgtagataat gataactggc ttttaaggat tatgagttcg 1680 aaaggtgaag acgaaaccat gaaattatca accagaaagc ctaaagtaac aacaatggaa 1740 cttccaggtg gtaaaaataa gaatattcct gattatatgc tttcaatgtt aaagtaa 1797 <210> 55 <211> 598 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 55
Met Gin lie Asp Lys lie lie Asp Thr Asp lie Leu val val Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Met Ala Ala val Thr Ala Ala Arg Lys Gly Ala
20 25 30
Lys val Leu Leu Ala val Lys Gly Lys Leu Gly Lys Ser Gly Asn Ala
35 40 45
lie Met Ala Gly Ala Gly Phe Ser Met Asp Gly Glu Thr Ala Tyr Tyr
50 55 60
Lys Tyr Gly Leu Lys Glu Ala Asp Pro Lys Asn Thr Lys Gly Lys Leu
65 70 75 80
Phe Glu Gin lie val Lys Gin Ser Phe Tyr Leu Ser Asp Gin Asn Met
85 90 95
val Glu Gin Phe val Ser Asp Cys Asp Glu Cys Cys Trp Glu Leu Lys
100 105 110
Gin Trp lie Glu Lys Ala Gly His Lys val val Phe Phe Gly Glu Glu
115 120 125
Gly Tyr lie Ser 130
val ser Lys Ala 145
Asp lie Leu Met
val туг Thr Gly 180
Ala Thr Gly Gly 195
Met Thr Gly Asp 210
Ala Asp Met Glu 225
Ser val Tyr Lys
Met Pro lie val 260
Pro Glu Asn Leu 275
lie Phe Thr Tyr 290
РГО Asn Gly Gly
305
Tyr Glu Lys Ala
Arg Lys Gly Phe 340
lie Arg Lys Gly 355
Met Gly Gly lie 370
Leu Tyr Ala Ala 385
Ser Gly Lys 135
Gly Gly lie
150 Glu Asp Lys 165
Lys lie lie
Tyr Gin Pro
Gly Met Ala 215
Phe Leu Leu
230 Gly Ser lie 245
Lys Asn Gly
Leu Lys Met
туг Tyr Gly 295
val туг Phe
310 Leu Lys Lys 325
Tyr Gin Gly
lie Pro Trp
Glu val Asp 375
Gly Glu Thr 390
Glu lie 185 туг Ser 200
Met Ala
туг lie
туг Pro
Lys Gly 265 Ala Lys 280
Asp Gin Asp Tyr
Ala Glu
Asn Asn 345 Glu val 360
Glu Asn
Thr ser lie Glu 155 val Gly
170 Arg Ser
Phe Lys
Tyr Arg
Pro Ala 235 Phe Leu 250
Glu Ser
Glu Ser
lie Ala
Ser Asn 315 Pro Leu 330
Leu Asp
Gly lie
Met Tyr
Gly val 395
Gly Cys 140
Asp Phe
Ala val
Lys Ser
Cys Thr 205 Ala Gly 220
val Ala
His Ser
lie Leu
Glu Met 285 Arg Gly 300
val Pro
Met Asn
Thr Phe
Gly Ser
365 Thr Gly 380
Phe Gly
Arg Tyr Gly
lie Ala val 160
Gly lie Glu 175
val lie Leu 190
val ser Asp
Ala Lys Leu
Leu Ser Pro 240
Ser Met Leu 255
Asp Asn lie 270
Gly Lys Leu
Lys Gly Thr
Phe Asp lie 320
lie тгр туг 335
val Glu Asn 350
Glu Tyr Ser
val Pro Gly
Ala Met Arg 400
val Ala Asp Gly Leu lie Glu Met Leu val Gin Gly Tyr Arg Ala Ala
405 410 415
Leu Ser Ala Cys Lys Tyr lie Gin Asn val Asn Glu Pro Ser Met Lys
420 425 430
Asn Thr Asn lie Asp Ser lie lie Lys Asp lie Phe Ser Pro Leu Glu
435 440 445
Arg Lys Glu Gly val Ser Pro lie Lys lie His Arg Asn lie Glu Lys
450 455 460
Thr Ala Asp val Gly Phe Asn Phe Arg Arg Asn Glu Glu Gly Leu Thr
465 470 475 480
Lys Ala Leu Asp Glu lie Leu Lys lie His Lys Tyr Asp lie Ser Ala
485 490 495
Met Ser Thr Lys Ser Lys Asn Arg val Tyr Asn Tyr Glu Trp lie Glu
500 505 510
Ser val Gin Ala Arg Asn Leu Leu Thr Cys Thr Glu Ala Gly val Arg
515 520 525
Ala Ala Leu Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly Thr His lie Arg Asp Asp
530 535 540
Tyr Glu Phe val Asp Asn Asp Asn Trp Leu Leu Arg lie Met Ser Ser
545 550 555 560
Lys Gly Glu Asp Glu Thr Met Lys Leu Ser Thr Arg Lys Pro Lys val
565 570 575
Thr Thr Met Glu Leu Pro Gly Gly Lys Asn Lys Asn lie Pro Asp Tyr
580 585 590
Met Leu Ser Met Leu Lys 595
<210> 56 <211> 2781 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 56
atgctaacta ataatactga ggcacttata ttggcagaaa agattggaaa agaagctgca 60 ctatcatgtt tacagggaat gtatgattat ggcacaagtc ctatgaaagt tttagatatg 120 ataaaggaaa aacctaattg taaagttata gttggagcac taaacaattc ggatacagat 180 ggaatgctta atattttggc aaaaacaaat ccagctggac ttgcagcagg tctttcagta 240 ttagcaaagg catcaggagc agaagaggcc ctattagaac ttcgtaatac ggataatgaa 300
gctgaattat tagccagtgc aaaaacagca ggagtaaaac ttagagtaga agtaggtgaa 360 ctagttgatg taagggcaca taaagagcat attattttta atttagaaac tttagccgga 420 attgccgata aaattacggg cacagcacca ggaattatta tagcagtaga tgaagatgta 480 cctaaggaag ttaaattcgg tacaaaactt gtggattttt tagacacagc taaggttaaa 540 tcggttatga ttaaccacca tttttataga ttagatgtat taaataatgg cattataaag 600 gaaaactcct atggaagtgg tgttattcat ataatttacg aaaatgattg catagtagaa 660 aaaacaaaaa aagaactaga aaatcttaga aagcaaagct gtggaaaatg tactttttgc 720 cgtgaaggat tatatcagct tgatgttata tttgatgaca tgataaaagg cagatcagag 780 aaagaggatc ttgctatggt agaagagtta acaagtgcaa tgaaattttc atgtaattgc 840 tcattaggaa aatgctcagg agaaccagca gcaagtgcaa taacagaatt taaattagaa 900 gtagagcagc atataaagaa gaggggatgt cctgctggcc agtgtttagc ctttacaaat 960 atatacgtag atcctagaaa atgcaaaggt tgtggaaaat gcttggaagt ttgtccagag 1020 gattgtattg aagcaaaaaa gggctatatt tccatgattg acgaatttga ttgcactaaa 1080
tgcggcatat gtatagatga atgtcccaat aatgcaattg ttaaggtaaa tggcaaaacc 1140 cctaaacttc ctacaaaact aacaagagta aaaggaagta aaaatataac agaagaggac 1200 acagagaaga aaaaacggca caatttaaaa agacacagaa ctaagcttgt tattccactt 1260 aaaaaagata ataataaagc atctgagaaa atatcagaga ttaaaaagtc aaaggagggt 1320 actattatga aaaagatgga aacagatatt ataatcgcag caggaggccc agcaggactg 1380 gcagcagcta ttacagctgg agagaacaat ttaaaatcta ttctttttga aaaatctagt 1440 acaacaggtg gagcagcaaa catgggtatg ggaccacttg gaatagatac taaaattcag 1500 aaagataact ttaacaatat aagtgtagca gaagcccttg acatgcatat gaaatatact 1560 cattatcgtg tagatgagga tttagttcag acatacttta ataagagtgc agaaacaatt 1620 gaatggttac aggatatggg agtagaattt gcaggagcat ttcgctattt taaagaatca 1680 gcggcaactt ggcatatagt taagccggaa aatggagtta ttggaccacg tgcagctagt 1740 ggaatggcaa aaataatgac agaacgtgca aaagaacttg gaacaaaaat cctattggaa 1800 acaccagtgg tttctttaat aaaggaaaat ggaagaatat gtggtgttaa agcacaagat 1860 agtgaaggta atattattga agtcagggca aaagctgtta ttgttgcaac tggtggtttt 1920 ggcaataaca agaatatgat aaaatctgaa tttggtttga caattggaga agattatttc 1980 ccatttatgg ttcctggaat aacaggtgat ggcttgaaaa tgatgtggga agcaggtgca 2040 atgaaatatg gagaaaatat tgaggcaatt tatcagcttc ctgataattt aaactggttt 2100 ttactagatg cagtgctgcg tcagccaaat cttttaatta atcaacttgg tgatcgtttt 2160 atgaatgaag gagatatggg aaatactaca tttactggaa atgccattgc aatgcagccg 2220 ggcaattatg cttactgcat tatggatgaa ggaattttaa aacattataa aaagaatggt 2280 ccagatattt ttgatattgt tcatccagca gatgctttcc ttgcagttga tggagagatt 2340
gctaaggcag tagaacaagg ttatgaatca tattttgaag cacgaacagt agaagagctt 2400 gctaaaaaac ttaatattga tgctgaaaaa ttacaagata ctattgatga atataatgaa 2460 gcctgtgaaa cgggagtaga cactaaattc cataaaaaac aggcatatct ccatcctatc 2520 actggaaagg gaaaatattt agttggaaaa ttctaccttg gagcttatgg aacaattggt 2580 ggtgttcgta tcaataaata ttgtgaagtt ttagatgaaa gctttaatcc aattgaggga 2640 ctttatagcg ctggtactga tgctaataca atttatggag acagctataa ttttactctt 2700 cctggtaaca gcatgggatt tgcaattaat tcaggacgta tggctggaga aagtgccgca 2760 gagtatattg aagaagtata a 2781 <210> 57 <211> 926 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 57
Met Leu Thr Asn Asn Thr Glu Ala Leu lie Leu Ala Glu Lys lie Gly
15 10 15
Lys Glu Ala Ala Leu Ser Cys Leu Gin Gly Met Tyr Asp Tyr Gly Thr
20 25 30
Ser Pro Met Lys val Leu Asp Met lie Lys Glu Lys Pro Asn Cys Lys
35 40 45
val lie val Gly Ala Leu Asn Asn Ser Asp Thr Asp Gly Met Leu Asn
50 55 60
lie Leu Ala Lys Thr Asn Pro Ala Gly Leu Ala Ala Gly Leu Ser val
65 70 75 80
Leu Ala Lys Ala Ser Gly Ala Glu Glu Ala Leu Leu Glu Leu Arg Asn
85 90 95
Thr Asp Asn Glu Ala Glu Leu Leu Ala Ser Ala Lys Thr Ala Gly val
100 105 110
Lys Leu Arg val Glu val Gly Glu Leu val Asp val Arg Ala His Lys
115 120 125
Glu His lie lie Phe Asn Leu Glu Thr Leu Ala Gly lie Ala Asp Lys
130 135 140
lie Thr Gly Thr Ala Pro Gly lie lie lie Ala val Asp Glu Asp val
145 150 155 160
Pro Lys Glu val Lys Phe Gly Thr Lys Leu val Asp Phe Leu Asp Thr
165 170 175
Ala Lys val Lys Ser val Met lie Asn His His Phe Tyr Arg Leu Asp
180 185 190
val Leu Asn Asn Gly lie lie Lys Glu Asn Ser Tyr Gly Ser Gly val
195 200 205
lie His lie lie Tyr Glu Asn Asp Cys lie val Glu Lys Thr Lys Lys
210 215 220
Glu Leu Glu Asn Leu Arg Lys Gin Ser Cys Gly Lys Cys Thr Phe Cys
225 230 235 240
Arg Glu Gly Leu Tyr Gin Leu Asp val lie Phe Asp Asp Met lie Lys
245 250 255
Gly Arg Ser
Ala Met Lys 275
Pro Ala Ala
290 lie Lys Lys 305
lie туг val
val Cys Pro
lie Asp Glu 355
РГО Asn Asn
370 Thr Lys Leu 385
Thr Glu Lys
val lie Pro
Glu lie Lys 435
Glu Lys Glu Asp 260
Phe Ser Cys Asn
Ser Ala lie Thr 295
Arg Gly Cys Pro 310
Asp Pro Arg Lys 325
Glu Asp Cys lie 340
Phe Asp Cys Thr
Leu Ala 265 Cys Ser 280
Glu Phe
Ala Gly
Cys Lys
Glu Ala 345 Lys Cys 360
val Asn
Gin Cys 315 Gly Cys 330
Lys Lys
Gly lie Gly Lys
Lys Asn
395 Lys Arg 410
Lys Ala lie Met
Lys Cys 285 Glu val 300
Leu Ala
Gly Lys
Gly Tyr
Cys lie 365 Thr Pro 380
lie Thr
His Arg
Ser Glu
Lys Lys 445
Leu Thr Ser 270
Ser Gly Glu
Glu Gin His
Phe Thr Asn 320 Cys Leu Glu 335
lie Ser Met 350
Asp Glu Cys
Lys Leu Pro
Glu Glu Asp 400
Thr Lys Leu
415 Lys lie Ser 430
Met Glu Thr
lie lie
Gly Glu
Gly Gly 495
lie Gin 500 Met His 515
Thr туг Gly val Thr Trp
Arg Ala Ala ser 580
Leu Gly Thr Lys 595
Glu Asn Gly Arg 610
lie lie Glu val 625
Gly Asn Asn Lys
Glu Asp Tyr Phe 660
Lys Met Met Trp 675
Ala lie Tyr Gin 690
val Leu Arg Gin 705
Lys Asp Asn
Met Lys Tyr
Phe Asn Lys 535
Glu Phe Ala
550 His lie val 565
Gly Met Ala
lie Leu Leu
lie Cys Gly 615
Arg Ala Lys
630 Asn Met lie 645
Pro Phe Met
Glu Ala Gly
Leu Pro Asp 695
Pro Asn Leu 710
Phe Asn 505 Thr His 520
Ser Ala
Gly Ala
Lys Pro
Lys lie 585 Glu Thr 600
val Lys
Ala val
Lys Ser
val Pro 665 Ala Met 680
Asn Leu Leu lie
Phe Arg 555 Glu Asn 570
Met Thr
Pro val
Ala Gin
lie val 635 Glu Phe 650
Gly lie Lys Tyr Asn Trp
Asn Gin
715 val Asp 525 lie Glu 540
Tyr Phe
Gly val
Glu Arg
val ser 605 Asp Ser 620
Ala Thr
Gly Leu
Thr Gly
Gly Glu 685 Phe Leu 700
Leu Gly
Ala Glu Ala 510
Glu Asp Leu
Trp Leu Gin
Lys Glu Ser 560
lie Gly Pro 575
Ala Lys Glu 590
Leu lie Lys
Glu Gly Asn
Gly Gly Phe 640
Thr lie Gly 655
Asp Gly Leu 670
Asn lie Glu
Leu Asp Ala
Asp Arg Phe 720
Met Asn Glu Gly Asp Met Gly Asn Thr Thr Phe Thr Gly Asn Ala lie
725 730 735
Ala Met Gin Pro Gly Asn Tyr Ala Tyr Cys lie Met Asp Glu Gly lie
740 745 750
Leu Lys His Tyr Lys Lys Asn Gly Pro Asp lie Phe Asp lie val His
755 760 765
Pro Ala Asp Ala Phe Leu Ala val Asp Gly Glu lie Ala Lys Ala val
770 775 780
Glu Gin Gly Tyr Glu Ser Tyr Phe Glu Ala Arg Thr val Glu Glu Leu
785 790 795 800
Ala Lys Lys Leu Asn lie Asp Ala Glu Lys Leu Gin Asp Thr lie Asp
805 810 815
Glu Туг Asn Glu Ala Cys Glu Thr Gly val Asp Thr Lys Phe His Lys
820 825 830
Lys Gin Ala Tyr Leu His Pro lie Thr Gly Lys Gly Lys Tyr Leu val
835 840 845
Gly Lys Phe Tyr Leu Gly Ala Tyr Gly Thr lie Gly Gly val Arg lie
850 855 860
Asn Lys Tyr Cys Glu val Leu Asp Glu Ser Phe Asn Pro lie Glu Gly
865 870 875 880
Leu Tyr Ser Ala Gly Thr Asp Ala Asn Thr lie Tyr Gly Asp Ser Tyr
885 890 895
Asn Phe Thr Leu Pro Gly Asn Ser Met Gly Phe Ala lie Asn Ser Gly
900 905 910
Arg Met Ala Gly Glu Ser Ala Ala Glu Tyr lie Glu Glu val
915 920 925
<210> 58 <211> 1461 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 58
atgagagaat ttgaaacaga tgtagttgtt gttggtggag gagcatcagg gctagctgca 60 gcagttactg ctgcagaaaa tggtgcaaaa gtaatggtgc ttgaaaaagc taatactaca 120 ggtggatgtg ctaatatggc aatggggcct ctaggtgttg aaacaagaat gcaaagagaa 180 agacttatag atatctctgt agatagagct tttaataagt tcatggaata ttctcactgg 240 agatcagatg caagattgat aagaagatat ttggagcagt cagcaggaac tattgaatgg 300
ttagaaaata tgggagtaga attcgcatta ccttcaaagt attttccagc ttcagaagca 360 acctggcata ttgttaaacc taaaacaggg aaaccgggac ttcgtgcagc tgctactatg 420 attaaaatta tgacagaaag agcagaagaa ttaggcgtta aaatattatt agaaacacct 480 gtaaaaagta ttattaaaga tcaaggagaa gtaattggcg taacagctag tgataaagat 540 ggtgaattag aagtatatgc tggagcagtt atcatcggta caggtggatt tggtgataat 600 ccagacttta ttaagaagta tgttggactt gaatggggaa aagatttgtt ctcatataga 660 attcctggat taactggaga tggaatccag atggcttggg atgctggtgc ttcaaaagat 720 tttatgacta tggaaatggt attttttgct cctaacactg gtggatatgc tcctatagag 780 ttacctttcc gtcaacctaa tctcttagtt aacctggacg gtgaaagatt tataaatgaa 840 gaagttatag aaaatcctgt atttaccgca aatgctattg aaaaacaaaa aagaaaaatt 900 gcatattcta taatagatga agaactaatc aagcattatg aagaaaaggg cttagatctt 960 ataaatgtgg ttacttctag tatggatatg agttatttta gacaagaaga agaagaagct 1020 aagaaaaatg gaagtgatgt attatttatt gctgattcta tagaagagtt agctgaaaaa 1080 actggcattg atgcagaaaa cttaaaaaat accattgata cttataattc ttattgtgat 1140 tcaaaagatg agttattcca taaaaatcct aaatacttat taccaattaa aggctctaaa 1200 tattacgcat taaaacttgg tttaagtgca tatggaagtg ctggcggtat aaaaataaac 1260 tataatactg aagttcttaa tgatgattta aatgttataa agggacttta tgctgctgga 1320 actgatgcta attcactata taatcctgat tatgcttttg tactacctgg aaattcccta 1380 ggttttgctt tgaacagcgg aagaatagca gggtctagcg ctgttgaata tattaaagca 1440 aatcttatgg aagaacaata a 1461 <210> 59
<211> 486 <212> ПРТ
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 59
Met Arg Glu Phe Glu Thr Asp val val val val Gly Gly Gly Ala Ser
15 10 15
Gly Leu Ala Ala Ala val Thr Ala Ala Glu Asn Gly Ala Lys val Met
20 25 30
val Leu Glu Lys Ala Asn Thr Thr Gly Gly Cys Ala Asn Met Ala Met
35 40 45
Gly Pro Leu Gly val Glu Thr Arg Met Gin Arg Glu Arg Leu lie Asp
50 55 60
lie Ser val Asp Arg Ala Phe Asn Lys Phe Met Glu Tyr Ser His Trp
65 70 75 80
Arg Ser Asp Ala Arg Leu lie Arg Arg Tyr Leu Glu Gin Ser Ala Gly
85 90 95
Thr lie Glu Trp Leu Glu Asn Met Gly val Glu Phe Ala Leu Pro Ser
100 105 110
Lys Tyr Phe Pro Ala Ser Glu Ala Thr Trp His lie val Lys Pro Lys
115 120 125
Thr Gly Lys
130 Thr Glu Arg 145
val Lys Ser
ser Asp Lys
Gly Thr Gly 195
Gly Leu Glu
210 Thr Gly Asp 225
Phe Met Thr
Ala Pro lie
Asp Gly Glu 275
Thr Ala Asn
290 lie Asp Glu 305
lie Asn val
pro Gly
Ala Glu
lie lie 165 Asp Gly 180
Gly Phe
Trp Gly
Gly lie
Met Glu 245 Glu Leu 260
Arg Phe Ala lie Glu Leu val Thr
Leu Arg 135 Glu Leu 150
Lys Asp
Glu Leu
Gly Asp
Lys Asp 215 Gin Met 230
Met val
pro Phe
lie Asn
Glu Lys 295 lie Lys 310
Ser ser
Ala Ala
Gly val
Gin Gly
Glu val 185
Asn РГО
200
Leu Phe
Ala Trp
Phe Phe
Arg Gin 265 Glu Glu 280
Gin Lys
His Tyr Met Asp
Ala Thr Met lie 140
Lys lie Leu Leu 155
Glu val lie Gly 170
Tyr Ala Gly Ala
Asp Phe lie Lys 205
Ser Tyr Arg lie 220
Asp Ala Gly Ala 235
Ala Pro Asn Thr 250
Pro Asn Leu Leu
val lie Glu Asn 285
Arg Lys lie Ala 300
Glu Glu Lys Gly 315
Met Ser Tyr Phe
Lys lie Met
Glu Thr Pro 160
val Thr Ala 175
val lie lie 190
Lys Tyr val
Pro Gly Leu
Ser Lys Asp
240 Gly Gly Tyr 255
val Asn Leu 270
Pro val Phe
Tyr ser lie
Leu Asp Leu 320
Arg Gin Glu
325 330 335
Glu Glu Glu Ala Lys Lys Asn Gly Ser Asp val Leu Phe lie Ala Asp
340 345 350
Ser lie Glu Glu Leu Ala Glu Lys Thr Gly lie Asp Ala Glu Asn Leu
355 360 365
Lys Asn Thr lie Asp Thr Tyr Asn Ser Tyr Cys Asp Ser Lys Asp Glu
370 375 380
Leu Phe His Lys Asn Pro Lys Tyr Leu Leu Pro lie Lys Gly Ser Lys
385 390 395 400
Туг Tyr Ala Leu Lys Leu Gly Leu Ser Ala Tyr Gly Ser Ala Gly Gly
405 410 415
lie Lys lie Asn Tyr Asn Thr Glu val Leu Asn Asp Asp Leu Asn val
420 425 430
lie Lys Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Thr Asp Ala Asn Ser Leu Tyr Asn
435 440 445
Pro Asp Tyr Ala Phe val Leu Pro Gly Asn Ser Leu Gly Phe Ala Leu
450 455 460
Asn Ser Gly Arg lie Ala Gly Ser Ser Ala val Glu Tyr lie Lys Ala
465 470 475 480
Asn Leu Met Glu Glu Gin 485
<210> 60 <211> 1230 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 60
atgaacaatt taaaagaaga agcattaaag tttcataaag aacatgaagg taaaatagaa 60 cttaaaagta aagtagctgt taaaacaaga gaggatctgg gtttagcata tactccaggt 120 gttgctgaac catgtcttga aatcaacaaa aactataatg ccctatacga ttatacttct 180 aagggaaatt atgtagcagt agtaactaac ggcagtgcag ttttgggact tggaaatata 240 ggtgctgcag ctggcttgcc tgtaatggaa ggtaaatcta ttctatttaa gacttttgca 300 ggagtagacg cttttcctat ttgtgttgac agcaaagatc ctgacaagat tgtagaaaca 360 gtaaaattaa tagaatccac atttggagga ataaacctag aagatataaa agcccctgaa 420 tgctttgaaa tagaagataa attaaaaaag gtctgcaata taccagtttt tcatgacgac 480 caacacggaa cagcagtagt aactttagct gctatgataa acgcgcttaa aatagtaaac 540 aaaaaatttg aagacttaaa agtaataata aatggtgcag gagctgcagg tacagcaatc 600 gcaaagctgc ttgtaagtag aggagttaaa aacattattg tatgcgatag aaaaggtgct 660 atatcaaaag atagagaaaa tttaagtgct gcaaaaaaag acctggcaga aattacaaat 720 cctagcatgg taaaaggtgc gcttaaagat gtactaaaag aagctgatgt atttataggt 780
gtatctgctc ctggagtaat tactcctgaa atgataaaaa caatggataa agatcccctc 840 atttttgcta tggccaatcc taaacctgaa atctaccctg atgaagcaaa agctgcaggt 900 gccagagtag ttggtacagg aagatcggat tttccaaatc aaataaataa tgttcttgca 960 ttccctggaa tatttagagg agcacttgat gtaagagcat caaaaataaa cgaagaaatg 1020 aaaatagctg ctgcatgtgc tatagcagat ataataactg aaaaagaact taatgaagat 1080
tatgttatac cagatgcttt cgactcaaga atagcaccaa aggtagctta ctatgtagca 1140 aaagctgcca tagaaagtgg agttgcaaga agaactgaca tcactcctga aatggtagaa 1200 gaacatacta aaaagcttgt acaagcataa 1230 <210> 61 <211> 409 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 61
Met Asn Asn Leu Lys Glu Glu Ala Leu Lys Phe His Lys Glu His Glu
1 5 10 15
Gly Lys lie Glu Leu Lys Ser Lys val Ala val Lys Thr Arg Glu Asp
20 25 30
Leu Gly Leu Ala Tyr Thr Pro Gly val Ala Glu Pro Cys Leu Glu lie
35 40 45
Asn Lys Asn Tyr Asn Ala Leu Tyr Asp Tyr Thr Ser Lys Gly Asn Tyr
50 55 60
val Ala val val Thr Asn Gly Ser Ala val Leu Gly Leu Gly Asn lie
65 70 75 80
Gly Ala Ala Ala Gly Leu Pro val Met Glu Gly Lys Ser lie Leu Phe
85 90 95
Lys Thr Phe Ala Gly val Asp Ala Phe Pro lie Cys val Asp Ser Lys
100 105 110
Asp Pro Asp Lys lie val Glu Thr val Lys Leu lie Glu Ser Thr Phe
115 120 125
Gly Gly lie Asn Leu Glu Asp lie Lys Ala Pro Glu Cys Phe Glu lie
130 135 140
Glu Asp Lys Leu Lys Lys val Cys Asn lie Pro val Phe His Asp Asp
145 150 155 160
Gin His Gly Thr Ala val val Thr Leu Ala Ala Met lie Asn Ala Leu
165 170 175
Lys lie val Asn Lys Lys Phe Glu Asp Leu Lys val lie lie Asn Gly
180 185 190
Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala lie Ala Lys Leu Leu val Ser Arg Gly
195 200 205
val Lys Asn lie lie val Cys Asp Arg Lys Gly Ala lie Ser Lys Asp
210 215 220
Arg Glu Asn Leu Ser Ala Ala Lys Lys Asp Leu Ala Glu lie Thr Asn
225 230 235 240
Pro Ser Met val Lys Gly Ala Leu Lys Asp val Leu Lys Glu Ala Asp
245 250 255
val Phe lie Gly val Ser Ala Pro Gly val lie Thr Pro Glu Met lie
260 265 270
Lys Thr Met Asp Lys Asp Pro Leu lie Phe Ala Met Ala Asn Pro Lys
275 280 285
Pro Glu lie Tyr Pro Asp Glu Ala Lys Ala Ala Gly Ala Arg val val
290 295 300
Gly Thr Gly Arg Ser Asp Phe Pro Asn Gin lie Asn Asn val Leu Ala
305 310 315 320
Phe Pro Gly lie Phe Arg Gly Ala Leu Asp val Arg Ala Ser Lys lie
325 330 335
Asn Glu Glu Met Lys lie Ala Ala Ala Cys Ala lie Ala Asp lie lie
340 345 350
Thr Glu Lys Glu Leu Asn Glu Asp Tyr val lie Pro Asp Ala Phe Asp
355 360 365
Ser Arg lie Ala Pro Lys val Ala Tyr Tyr val Ala Lys Ala Ala lie
370 375 380
Glu Ser Gly val Ala Arg Arg Thr Asp lie Thr Pro Glu Met val Glu
385 390 395 400
Glu His Thr Lys Lys Leu val Gin Ala 405
<210> 62 <211> 1098 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 62
atgtcataca ccaaggttaa gtatgaagat ataaaaaagt tgtgtaattt ggtttttgag 60
aaatttggat tcaaccagga agatagtaaa accataacta gcgttttgct tttatcagat 120 ctatatggaa ttgaatcaca tggtatccaa aggctagtca aatactacag tgaaataaaa 180 agtggcctta taaatatcaa ttctaaaatg aaaatagtaa aggaaacacc tgtatctgca 240 acaatagatg gcatgggagg tatgggacaa ctaattggta aaaaagccat gaatctggca 300 attaaaaaag ctaaaacttc aggaatgggt atggtagtag ttagaaattc aaatcactat 360 ggtattgcag gctactatgc caaaatggct gaggaggaag gacttcttgg aatttcaatg 420 accaattctc cagctgtaat ggtaccaacc tttggaaaag atgctatgct tggtacaaat 480 cctattgcca tatcttttcc agctaaaccc tacccatttt taatggatat ggctactagc 540 gtagttacca gaggaaaaat tgaagtttat aacaaaaggc atgaacctct tccacttggt 600 ctcgctttaa atagtgacgg tgaagatact acagatcccc tagatgtact tcttaatgta 660 cgaaaaaatt ctggaggagg cctgcttcct cttggaggat caaaagaatc aactggagga 720 cataaaggtt atggatttgc acttgcagtt gaaatgttta cagcaatttt gtctggagga 780 tttactgcaa ataaagttag cttagataga gaaaatggat ctggaacatg tcattatttc 840 tttgcagtgg attatggtat atttggggat aaacaatcca ttgaagagaa cttttccagt 900 tacctaaatg aacttagaaa ttcaaaaaaa gcaaaaggcg ccacaagaat atatactcat 960 ggtgagaaag aagtagaatc ctataaggat aaaatggaaa atggaattcc agtaaatgag 1020 actactctta aagaaatata cgacatatgt gactacttta atataaaagc tagtgattat 1080 gtaactaaag taatataa 1098 <210> 63 <211> 365 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 63
Met Ser Tyr Thr Lys val Lys Tyr Glu Asp lie Lys Lys Leu Cys Asn
1 5 10 15
Leu val Phe Glu Lys Phe Gly Phe Asn Gin Glu Asp Ser Lys Thr lie
Thr Ser val Leu Leu Leu Ser Asp Leu Tyr Gly lie Glu Ser His Gly
35 40 45
lie Gin Arg Leu val Lys Tyr Tyr Ser Glu lie Lys Ser Gly Leu lie
50 55 60
Asn lie Asn Ser Lys Met Lys lie val Lys Glu Thr Pro val Ser Ala
65 70 75 80
Thr lie Asp Gly Met Gly Gly Met Gly Gin Leu lie Gly Lys Lys Ala
Met Asn Leu Ala lie Lys Lys Ala Lys Thr Ser Gly Met Gly Met val
100 105 110
val val Arg Asn Ser Asn His Tyr Gly lie Ala Gly туг Tyr Ala Lys
115 120 125
Met Ala Glu Glu Glu Gly Leu Leu Gly lie Ser Met Thr Asn Ser Pro
130 135 140
Ala val Met val Pro Thr Phe Gly Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr Asn
145 150 155 160
Pro lie Ala lie Ser Phe Pro Ala Lys Pro Tyr Pro Phe Leu Met Asp
165 170 175
Met Ala Thr Ser val val Thr Arg Gly Lys lie Glu val Tyr Asn Lys
180 185 190
Arg His Glu Pro Leu Pro Leu Gly Leu Ala Leu Asn Ser Asp Gly Glu
195 200 205
Asp Thr Thr Asp Pro Leu Asp val Leu Leu Asn val Arg Lys Asn Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Leu Leu Pro Leu Gly Gly Ser Lys Glu Ser Thr Gly Gly
225 230 235 240
His Lys Gly Tyr Gly Phe Ala Leu Ala val Glu Met Phe Thr Ala lie
245 250 255
Leu Ser Gly Gly Phe Thr Ala Asn Lys val Ser Leu Asp Arg Glu Asn
260 265 270
Gly Ser Gly Thr Cys His Tyr Phe Phe Ala val Asp Tyr Gly lie Phe
275 280 285
Gly Asp Lys Gin Ser lie Glu Glu Asn Phe Ser Ser Tyr Leu Asn Glu
290 295 300
Leu Arg Asn Ser Lys Lys Ala Lys Gly Ala Thr Arg lie Tyr Thr His
305 310 315 320
Gly Glu Lys Glu val Glu Ser Tyr Lys Asp Lys Met Glu Asn Gly lie
325 330 335
Pro val Asn Glu Thr Thr Leu Lys Glu lie Tyr Asp lie Cys Asp Tyr
340 345 350
Phe Asn lie Lys Ala Ser Asp Tyr val Thr Lys val lie
355
360
365
<210> 64
<211> 2634 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 64
atgaatggta agaagtacgt ttatcttttc aatgaaggaa atgctggcat gagaaattta 60 cttggaggca agggagctaa tcttgcagaa atgaccaatc ttggcatacc cgttcctggt 120 ggatttacta tatccacaga ggcatgtacc aaatattatg aagatggtaa atccatatca 180 cagcaagtta tagatcaaat ttatgatgca cttaaaaatg tggaagagac aacaggaaaa 240 aagtttggaa gtatagagaa tccactgtta gtttcagtaa ggtcaggagc cagagtttct 300 atgccaggaa tgatggatac tatattaaat ttgggattaa atgatgatac tgtaatagga 360 cttaaaaagc taacaggaaa tgaaagattt gcgtatgatt cttatagaag atttattcaa 420 atgttttcag atgtagttat gggaattgaa aagagagaat ttgaagatgt gctggatgac 480 gtaaaaaatg ctaaaggagt aaaatacgat acagatttag atgaatccga tttaaaggat 540 ataatccaga aatttaaaga tatttacaaa aaagaagtaa aggaagactt tcctcaagat 600 cctaaggaac agttaattca gtcagttact gcagtgttta gatcttggga aaaccctaga 660 gcaataattt acagaaggtt aaacgatata tcaggtgatt ggggaactgc agtaaatgtt 720 caatcaatgg tatttggaaa tatgggagag acttcaggaa caggagttgc atttactaga 780 aacccatcta caggggaaaa gtccatattt ggtgaatatc tcataaacgc tcaaggagag 840 gatgtagttg cagggataag aacacctcaa cctataacaa agctaaaaga agaccttcca 900 aaatgttatt ctcaatttat gagtatagcg aataaactcg aaaatcatta taaagatatg 960 caggatatgg agtttactat agagcagggg aaattatatt tccttcagac gagaaacggt 1020 aagagaacag ctcaggctgc acttagaata gcagtaaata tggtagatga aggtctcatc 1080 actaaagaag aggccatact taaagttgag cctaaacagc ttgacacact attgcatcca 1140 aactttgaca gtgatgaatt gaaacgggca gctgtaatag caaatggact tcctgcatca 1200 ccaggagcag cttgtggtaa gatatatttt acagcagatg atgctaagaa acatcatgat 1260 caaggtgaaa aggtaatact tgtaaggtta gagacttccc cagaagatat agaaggaatg 1320 gcagcttctg aaggaatact tacagttaga ggaggtatga catctcatgc agctgttgta 1380 gcaagaggta tgggaacatg ctgtgtagct ggatgtggtg atcttatagt aagtgaaaag 1440 gaaaagcttt tcaaaagatt agataaggtt tataaagaag gagattacat atctttagat 1500 ggaagtactg gaaatgttta tggagagcct ataaagactg tagcaccaga aatatcggga 1560 gattttggaa tcttcatggg atgggctgat aatataagaa aattaggagt tagaaccaat 1620 gcagatacac caagagatgc aaaccaggct attagttttg gtgccgaagg aataggactt 1680 tgtagaacag agcatatgtt cttcgatgaa gatagaatac cagaaatgag agaaatgata 1740 gtttcaaaaa cggaagagca gagaagaaaa gctttagata aattgctacc aagacaaaag 1800 aaagatttta ttggaatata tgaggcaatg gaaggaaaac ctgtcacaat tagatttttg 1860
gatccaccac ttcatgaatt cttacctact gaaactgagg atatagaggc tttagcaaag 1920 gaagtgggag taagttttca agaattgaaa gatactatag attctctaca tgaatttaat 1980 cctatgatgg gacatagagg atgcaggctt actgtttcat atccagaaat agctgaaatg 2040 caaacaaggg ctattataga agcagctata gatgttaaga agagaaaagg gtatgatata 2100 gttccagaaa ttatgatacc tcttgtagga gaagtaaaag aattaaaata tgttaaagat 2160 gtagttgtaa aggtagcaga tgaaataata caaaaagagg gagtcaattt aaaatatgaa 2220 gtaggaacta tgatagaaat tccaagagcg gctattacag ctgatgaaat agcaaaagaa 2280 gctgagttct tctcatttgg aactaatgat ttaactcaaa tgacttttgg attttcaaga 2340 gatgatgcag gtaaattttt aaatgattat tatgataaaa aagtatatga gtttgatcca 2400 ttccaaaagt tagatcagat tggagtagga aaacttgtag agactgctgt aaaattaggt 2460 aaaaagacta gacctgacat tcatcttgga atatgtggag aacatggagg ggatccatct 2520
tctgtagaat ttttccacaa tgtaggactt gactatgtat cttgttcacc atttagggta 2580 cctgtggcaa gacttgctgc agctcaagct caaataaaga atccaagaaa gtaa 2634 <210> 65 <211> 877 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 65
Met Asn Gly Lys Lys Tyr val Tyr Leu Phe Asn Glu Gly Asn Ala Gly
15 10 15
Met Arg Asn Leu Leu Gly Gly Lys Gly Ala Asn Leu Ala Glu Met Thr
20 25 30
Asn Leu Gly lie Pro val Pro Gly Gly Phe Thr lie Ser Thr Glu Ala
35 40 45
Cys Thr Lys Tyr Tyr Glu Asp Gly Lys Ser lie Ser Gin Gin val lie
50 55 60
Asp Gin lie Tyr Asp Ala Leu Lys Asn val Glu Glu Thr Thr Gly Lys
65 70 75 80
Lys Phe Gly Ser lie Glu Asn Pro Leu Leu val Ser val Arg Ser Gly
85 90 95
Ala Arg val Ser Met Pro Gly Met Met Asp Thr lie Leu Asn Leu Gly
100 105 110
Leu Asn Asp Asp Thr val lie Gly Leu Lys Lys Leu Thr Gly Asn Glu
115 120 125
Arg Phe Ala Tyr Asp Ser Tyr Arg Arg Phe lie Gin Met Phe Ser Asp
130 135 140
val val Met 145
val Lys Asn
Asp Leu Lys
val Lys Glu 195
val Thr Ala
210 Arg Arg Leu 225
Gin Ser Met
Ala Phe Thr
Tyr Leu lie 275
Pro Gin Pro
290 Gin Phe Met
Gly lie
Ala Lys 165 Asp lie 180
Asp Phe
val Phe
Asn Asp
val Phe 245 Arg Asn 260
Asn Ala lie Thr Ser lie
Glu Lys 150
Gly val
lie Gin
Pro Gin
Arg Ser 215 lie Ser 230
Gly Asn
Pro Ser
Gin Gly
Lys Leu 295 Ala Asn
Arg Glu
Lys Tyr
Lys Phe 185
Asp РГО
200
Trp Glu
Gly Asp
Met Gly
Thr Gly 265 Glu Asp 280
Lys Glu
Phe Glu 155 Asp Thr 170
Lys Asp Lys Glu Asn РГО
Trp Gly 235 Glu Thr 250
Glu Lys
Asp val
Asp Leu
lie Tyr
Gin Leu 205 Arg Ala 220
Thr Ala
Ser Gly
Ser lie
Ala Gly 285
РГО Lys
300
His Tyr
Leu Asp Asp 160
Asp Glu Ser
175 Lys Lys Glu 190
lie Gin Ser
lie lie Tyr
val Asn val 240
Thr Gly val
255 Phe Gly Glu 270
lie Arg Thr Cys Tyr ser Lys Asp Met
305
Gin Asp Met
Thr Arg Asn
Asn Met val 355
val Glu Pro
370 Asp Glu Leu 385
Pro Gly Ala
310
Glu Phe Thr lie Glu 325
Gly Lys Arg Thr Ala 340
Asp Glu Gly Leu lie 360
Lys Gin Leu Asp Thr 375
Lys Arg Ala Ala val 390
Ala Cys Gly Lys lie 405
315
Gin Gly Lys Leu Tyr 330
Gin Ala Ala Leu Arg 345
Thr Lys Glu Glu Ala 365
Leu Leu His Pro Asn 380
lie Ala Asn Gly Leu 395
Tyr Phe Thr Ala Asp 410
320
Phe Leu Gin
335 lie Ala val 350
lie Leu Lys
Phe Asp Ser
Pro Ala Ser 400
Asp Ala Lys 415
Lys His His
ser Pro Glu 435
val Arg Gly
450 Gly Thr Cys 465
Glu Lys Leu
lie Ser Leu
Thr val Ala 515
Ala Asp Asn
530 Arg Asp Ala 545
Cys Arg Thr
Arg Glu Met
Asp Lys Leu 595
Ala Met Glu
610 His Glu Phe 625
Glu val Gly His Glu Phe Ser туг Pro
Asp Gin 420
Asp lie
Gly Met
Cys val
Phe Lys 485 Asp Gly 500
Pro Glu
lie Arg
Asn Gin
Glu His 565 lie val 580
Leu Pro
Gly Lys
Leu Pro
val ser 645
Asn РГО
660
Glu lie
Gly Glu
Glu Gly
Thr Ser 455 Ala Gly 470
Arg Leu
Ser Thr
lie Ser
Lys Leu 535 Ala lie 550
Met Phe
Ser Lys
Arg Gin
Pro val 615 Thr Glu 630
Phe Gin Met Met Ala Glu
Lys val 425 Met Ala 440
His Ala
Cys Gly
Asp Lys
Gly Asn 505 Gly Asp 520
Gly val
Ser Phe
Phe Asp
Thr Glu 585
Lys Lys
600
Thr lie
Thr Glu
Glu Leu
Gly His 665 Met Gin
Asp Leu 475 val туг 490
val туг
Phe Gly
Arg Thr
Gly Ala 555 Glu Asp 570
Glu Gin
Asp Phe
Arg Phe
Asp lie 635
Lys Asp 650
Arg Gly
Glu Gly 445 val Ala 460
lie val
Lys Glu
Gly Glu
lie Phe 525 Asn Ala 540
Glu Gly
Arg lie
Arg Arg
lie Gly 605 Leu Asp 620
Glu Ala
Leu Glu Thr 430
lie Leu Thr
Arg Gly Met
Ser Glu Lys 480
Gly Asp Tyr
495 Pro lie Lys 510
Met Gly Trp
Asp Thr Pro
lie Gly Leu 560
Pro Glu Met 575
Lys Ala Leu 590
lie Tyr Glu
Pro Pro Leu
Leu Ala Lys 640
Asp Ser Leu
655 Leu Thr val 670
lie Glu Ala
675
680 685
Ala lie Asp val Lys Lys Arg Lys Gly Tyr Asp lie val Pro Glu lie
690 695 700
Met lie Pro Leu val Gly Glu val Lys Glu Leu Lys Tyr val Lys Asp
705 710 715 720
val val val Lys val Ala Asp Glu lie lie Gin Lys Glu Gly val Asn
725 730 735
Leu Lys Tyr Glu val Gly Thr Met lie Glu lie Pro Arg Ala Ala lie
740 745 750
Thr Ala Asp Glu lie Ala Lys Glu Ala Glu Phe Phe Ser Phe Gly Thr
755 760 765
Asn Asp Leu Thr Gin Met Thr Phe Gly Phe Ser Arg Asp Asp Ala Gly
770 775 780
Lys Phe Leu Asn Asp туг Tyr Asp Lys Lys val Tyr Glu Phe Asp Pro
785 790 795 800
Phe Gin Lys Leu Asp Gin lie Gly val Gly Lys Leu val Glu Thr Ala
805 810 815
val Lys Leu Gly Lys Lys Thr Arg Pro Asp lie His Leu Gly lie Cys
820 825 830
Gly Glu His Gly Gly Asp Pro Ser Ser val Glu Phe Phe His Asn val
835 840 845
Gly Leu Asp Tyr val Ser Cys Ser Pro Phe Arg val Pro val Ala Arg
850 855 860
Leu Ala Ala Ala Gin Ala Gin lie Lys Asn Pro Arg Lys
865 870 875
<210> 66 <211> 3447 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 66
atggcgtact tgttaaagag gtttaagagg gttcttgtag cgaatagagg agaaatagcc 60 ataagaatat tcagagcatg taaagaattg ggaataacta ctgtagcagt atattcaaat 120 gaggataaga gatctctttt cagaactaaa gctgatgaat cctatatgat agggaaaaat 180 aagggacctg tagaagcata tttagatatt gatgaaataa tagatatagc tttgaagaaa 240 aatgtagatg caatacatcc gggttatgga tttctatcag aaaatcctga attggcaaaa 300 aagtgtaaag aagcaggtat tgaatttata ggacctacat cagatatgat ggagatgctt 360
ggtgataaga taaaatctaa gattgttgca caaaaggctg gggttccaac aataccagga 420
gttcaagagg ctataaagac agaagaagaa gctttaaaat ttgctaagtt ctgtggatat 480
cctgtcatga ttaaagcagc tgatggcggt ggcggcagag gaatgagaat agtaagggaa 540
gaaaaagatc tcgtagaatc ctacaacagt gctaaaaacg aatccagaaa agcttttggt 600
tcagaaaaaa tatatattga aaaatatatt gaaagtccaa aacacataga ggtgcaggta 660
ctcggagata agtacggcaa tattgtccat ctgtatgaaa gagattgttc tatacagagg 720
agacatcaaa aggtgataga atttacacca tctttagccc tctcagaaga aaaaagacaa 780
caaatatgtg aagatgcttt aaaaattgca agaactgtag gatatacaag tgcaggtacc 840
ttggagtttt tggttgataa aaacggaaat cactatttca tagagatgaa tactagaatt 900 caggtagaac atactgtaac tgaaatggtt acaggaatag atatagttca agatcaaata 960 cttattgcag aagggcattc acttgattct aaggaaatag gaataaaatc tcaagatgat 1020 atagagttaa aaggatatgc aatacaatgc agaattacga cagaagatcc tttaaataat 1080 tttgcaccag atacaggaag aatagatatg tatagaactg gttctggatt tggtataaga 1140 cttgatggag ggaatggatt tacaggcgca gtaataagtc ctcattatga tagtttgcta 1200 gtaaaaactg tatcttggtc aagaactttt gaagatgcca taagaaaggc aataaggtct 1260 ataaatgaga ctgttatatc aggagtaaag acaaatgcag actttataat aaaagtgtta 1320 agtcatgaaa agtttataaa aggtgaatgt gatactaatt ttattgaaga taatccagat 1380 ttatttgata taaaaccaaa actagataaa gagatgagtg tacttaaatt tataggaaat 1440 aaagtagtaa atgagactcg tggaaagaag aagaaattta atatacctat tgtaccaaaa 1500 gtagaagaaa atattaaatt gagtggaacg aagcagatac ttgataccaa aggagcagat 1560 ggattagttg attggataaa atcacaagat aagcttctta ttacagatac tactatgaga 1620 gatgcccatc agtcgcttat ggcaactagg gtgagaacta gagatttgct taagatagca 1680 aaagcacaat cagtattgac aaacgatctt ttctccatgg aaatgtgggg aggagcaact 1740 tttgatgtag cttatagatt tttaaatgaa tctccttggg aaagactaga aaaacttaga 1800 gaaaaggttc ctaatatact attccagatg ctcataagag gagctaatgc agtaggatat 1860 aagaactatc ctgataatgt tattagagaa tttataaaac aatctgcagc ttcaggtatt 1920 gatgtattta gagtatttga tgctttaaac tggcttaaag gaatggaagt ttctatagat 1980 cagacattaa aagaaggaaa aatagctgaa gcatgtatgt gctatacagg agatgtatta 2040 gatgacaagg aagataaata tacacttcag tactatgtaa acttagctaa agaaatagag 2100 aaaactggag cacagattct tggaataaag gatatgtctg ccctattaaa gccatattct 2160 gcttataaac ttgtaaaagc acttaagaat gaggtatcta ttccaataca tcttcatact 2220 catgatacta caggtaatgg tgtggcaaca gtactcatgg ctgccgatgc aggacttgat 2280 atagctgata ctgcattcaa tagtatgtct gggcttacta gccagccagc tttgaattca 2340 atagcagcag cacttaaaaa tacacctaga gatactaagt tagatgcaga taatcttcaa 2400
aaaatatcta actattggga agatgtaagg cctatataca gtcagtttga gtcaggactt 2460 aagtcgagta ctgcagaaat atacaagtat gagataccag gaggtcaata ttcaaactta 2520 aaacctcagg ttgaaagttt tgggttgggg gatcgttttg aagatgtaaa ggaaatgtat 2580 aagagagtta ataaaatgct tggcaacata attaaagtaa ctccttcttc aaaaatggta 2640 ggagacctgg ctatattcat gatacaaaat gatttagatg aaaagaatat ttatgaaaaa 2700 ggtaagagct taactttccc agattctaca atttcttact ttaagggaat gatgggtcag 2760 cctatgggag gattcccaaa ggaacttcaa aaagtagttt taaagggaga agaacctttt 2820 acggtaagac caggagaact tttaccacca gaagattttg ccaaaataaa agagtattta 2880 actaaaaaat ataagagaga atttaataat aaagaactta taagctatgc tatgtatcct 2940 gatgtatatg aaggttatct taaattctta agtgaatatg gtgatcttag cagaatggaa 3000 agtgaaacat tcttctatgg acttgcggaa ggagaacttt gtgaagttga aataggagaa 3060 ggaaagagtt tatttgtaca gttattagag attacaaaag ttgatgatga aggatacaga 3120 ttcttagtat ttgaggtaaa tggtattaag agagacataa ggataaaaga taacttggct 3180 ttctctggat caggaataaa agaaaattca tgtgttatgg cagatgaaga tgatgaaaaa 3240 gaaataggat caagtatacc tggaaacatt gttaaagtac ttgtaaaacc aggagataaa 3300 gtagaagagg gccagagctt aattgtaata gaagctatga aaatggaaac aaatgtttca 3360 gctgctgaag caggagtaat tgatggagta tttgtaaaag aaggccagag agttaaaact 3420 ggagaacttt taattagatt aaaatag 3447 <210> 67 <211> 1148
<212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 67
Met Ala туг Leu Leu Lys Arg Phe Lys Arg val Leu val Ala Asn Arg
15 10 15
Gly Glu lie Ala lie Arg lie Phe Arg Ala Cys Lys Glu Leu Gly lie
20 25 30
Thr Thr val Ala val Tyr Ser Asn Glu Asp Lys Arg Ser Leu Phe Arg
35 40 45
Thr Lys Ala Asp Glu Ser Tyr Met lie Gly Lys Asn Lys Gly Pro val
50 55 60
Glu Ala Tyr Leu Asp lie Asp Glu lie lie Asp lie Ala Leu Lys Lys
65 70 75 80
Asn val Asp Ala lie His Pro Gly Tyr Gly Phe Leu Ser Glu Asn Pro
85 90 95
Glu Leu Ala Lys Lys Cys Lys Glu Ala Gly lie Glu Phe lie Gly Pro
100 105 110
Thr Ser Asp Met Met Glu Met Leu Gly Asp Lys lie Lys Ser Lys lie
115 120 125
val Ala Gin Lys Ala Gly val Pro Thr lie Pro Gly val Gin Glu Ala
130 135 140
lie Lys Thr Glu Glu Glu Ala Leu Lys Phe Ala Lys Phe Cys Gly Tyr
145 150 155 160
Pro val Met lie Lys Ala Ala Asp Gly Gly Gly Gly Arg Gly Met Arg
165 170 175
lie val Arg Glu Glu Lys Asp Leu val Glu Ser Tyr Asn Ser Ala Lys
180 185 190
Asn Glu Ser Arg Lys Ala Phe Gly Ser Glu Lys lie Tyr lie Glu Lys
195 200 205
Tyr lie Glu Ser Pro Lys His lie Glu val Gin val Leu Gly Asp Lys
210 215 220
Tyr Gly Asn lie val His Leu Tyr Glu Arg Asp Cys Ser lie Gin Arg
225 230 235 240
Arg His Gin Lys val lie Glu Phe Thr Pro Ser Leu Ala Leu Ser Glu
245 250 255
Glu Lys Arg Gin Gin lie Cys Glu Asp Ala Leu Lys lie Ala Arg Thr
260 265 270
val Gly Tyr Thr Ser Ala Gly Thr Leu Glu Phe Leu val Asp Lys Asn
275 280 285
Gly Asn His Tyr Phe lie Glu Met Asn Thr Arg lie Gin val Glu His
290 295 300
Thr val Thr Glu Met val Thr Gly lie Asp lie val Gin Asp Gin lie
305 310 315 320
Leu lie Ala Glu Gly His Ser Leu Asp Ser Lys Glu lie Gly lie Lys
325 330 335
Ser Gin Asp Asp lie Glu Leu Lys Gly Tyr Ala lie Gin Cys Arg lie
340 345 350
Thr Thr Glu Asp Pro Leu Asn Asn Phe Ala Pro Asp Thr Gly Arg lie
355 360 365
Asp Met туг
370 Asn Gly Phe 385
val Lys Thr
Ala lie Arg
Ala Asp Phe 435
Glu Cys Asp
450 Lys РГО Lys
465
Lys val val
lie val Pro
lie Leu Asp 515
Gin Asp Lys
530 Ser Leu Met 545
Lys Ala Gin
Gly Gly Ala
Trp Glu Arg 595
Gin Met Leu
610 Asp Asn val 625
Arg Thr
Thr Gly
val ser 405 Ser lie 420
lie lie
Thr Asn
Leu Asp
Asn Glu 485 Lys val 500
Thr Lys
ser val 565 Thr Phe 580
Leu Glu lie Arg lie Arg
Gly ser 375 Ala val 390
Trp ser
Asn Glu
Lys val
Phe lie 455 Lys GlU 470
Thr Arg Glu Glu Gly Ala
Asp val
Lys Leu
Gly Ala 615 Glu Phe 630
Thr val 425 Leu Ser 440
Glu Asp
Met Ser
Gly Lys
Asn lie 505 Asp Gly 520
Asp Thr Arg Thr
Asn Asp
Ala туг 585 Arg Glu 600
Asn Ala lie Lys
Pro His 395 Phe Glu 410
lie Ser
His Glu
Asn Pro
val Leu 475
Lys Lys
490
Lys Leu
Leu val
Thr Met
Arg Asp 555 Leu Phe 570
Arg Phe
Lys val
val Gly
Gin ser 635
Arg Leu 380
Tyr Asp
Asp Ala
Gly val
Lys Phe 445 Asp Leu 460
Lys Phe
Lys Phe
Ser Gly
Asp Trp 525 Arg Asp 540
Leu Leu
Ser Met
Leu Asn
Pro Asn 605
Tyr Lys
620
Ala Ala
Asp Gly Gly
Ser Leu Leu 400
lie Arg Lys
415 Lys Thr Asn 430
lie Lys Gly
Phe Asp lie
lie Gly Asn 480
Asn lie Pro
495 Thr Lys Gin 510
lie Lys Ser
Ala His Gin
Lys lie Ala 560
Glu Met Trp 575
Glu Ser Pro 590
lie Leu Phe
Asn Tyr Pro
Ser Gly lie 640
Asp val Phe Arg val Phe Asp Ala Leu Asn Trp Leu Lys Gly Met Glu
645 650 655
val Ser lie Asp Gin Thr Leu Lys Glu Gly Lys lie Ala Glu Ala Cys
660 665 670
Met Cys Tyr Thr Gly Asp val Leu Asp Asp Lys Glu Asp Lys Tyr Thr
675 680 685
Leu Gin Tyr Tyr val Asn Leu Ala Lys Glu lie Glu Lys Thr Gly Ala
690 Gin lie Leu 705
Ala Tyr Lys
His Leu His
Met Ala Ala 755
Met ser Gly
770 Leu Lys Asn 785
Lys lie Ser
Glu Ser Gly
Pro Gly Gly 835
Leu Gly Asp
850 Lys Met Leu 865
Gly Asp Leu lie Tyr Glu
Gly lie
Leu val 725 Thr His 740
Asp Ala
Leu Thr
Thr Pro
Asn туг 805 Leu Lys 820
Gin Tyr
Arg Phe
Gly Asn
Ala lie 885
Lys Gly
900 695
Lys Asp 710
Lys Ala
Asp Thr
Gly Leu
Ser Gin 775 Arg Asp 790
Trp Glu
Ser ser
ser Asn
Glu Asp 855 lie lie 870
Phe Met Lys Ser
Met Ser
Leu Lys
Thr Gly 745 Asp lie 760
Pro Ala
Thr Lys
Asp val
Thr Ala 825 Leu Lys
840 val Lys
Lys val
lie Gin
Leu Thr 905
Ala Leu 715
Asn Glu
730
Asn Gly
Ala Asp
Leu Asn
Leu Asp 795 Arg Pro 810
Glu lie
Pro Gin
Glu Met
Thr Pro 875
Asn Asp
890
Phe Pro
700
Leu Lys
val ser
val Ala
Thr Ala 765 Ser lie 780
Ala Asp
lie Tyr
Tyr Lys
val Glu 845
Tyr Lys
860
Ser ser Leu Asp Asp Ser
Pro туг ser 720
lie Pro lie 735
Thr val Leu 750
Phe Asn Ser
Ala Ala Ala
Asn Leu Gin 800
Ser Gin Phe
815 Tyr Glu lie 830
Ser Phe Gly
Arg val Asn
Lys Met val 880
Glu Lys Asn
895 Thr lie Ser 910
Tyr Phe Lys 915
Leu Gin Lys
930 Gly Glu Leu 945
Thr Lys Lys
Ala Met Tyr
Tyr Gly Asp 995
Ala Glu Gly
1010 Leu Phe val
1025 Tyr Arg Phe
1040 Arg lie Lys
Gly Met
val val
Leu Pro
Tyr Lys 965
РГО Asp
980
Leu Ser Glu Leu Gin Leu Leu val Asp Asn
Met Gly Gin 920
Leu Lys Gly 935
РГО Glu Asp
950
Arg Glu Phe
val туг Glu
Arg Met Glu 1000 Cys Glu val
1015 Leu Glu lie
1030 Phe Glu val
1045 Leu Ala Phe
Asn Asn 970 Gly Tyr 985
Ser Glu Glu lie Thr Lys Asn Gly Ser Gly
Leu Lys Phe Leu 990
Thr Phe Phe Tyr 1005
Gly Glu Gly Lys
1020 val Asp Asp Glu
1035 lie Lys Arg Asp
1050 Ser Gly lie Lys
Lys Glu
Arg Pro
Tyr Leu 960 Ser туг 975
Ser Glu
Gly Leu
Ser
Gly
Glu
1055 1060 1065
Asn Ser Cys val Met Ala Asp Glu Asp Asp Glu Lys Glu lie Gly
1070 1075 1080
Ser Ser lie Pro Gly Asn lie val Lys val Leu val Lys Pro Gly
1085 1090 1095
Asp Lys val Glu Glu Gly Gin Ser Leu lie val lie Glu Ala Met
1100 1105 1110
Lys Met Glu Thr Asn val Ser Ala Ala Glu Ala Gly val lie Asp
1115 1120 1125
Gly val Phe val Lys Glu Gly Gin Arg val Lys Thr Gly Glu Leu
1130 113 5 1140
Leu lie Arg Leu Lys
1145 <210> 68 <211> 1506 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei
<400> 68
ttgaatatta ataaatatag aaatatgtat aaaaatttat caccatcgga attaacggaa 60 ttttcaatta aaaggggaga aggattttta tcaaataagg gagctcttat gattaatact 120 ggaaagtata caggaagatc tcctaaagat agatttatag ttaatcaaga aagcattagg 180 aacaaaataa actggggaaa tgtaaatctt tctatagaag aagatatttt taataaaatg 240 tatgataaga ttttaaatta tataagtgat aaagacattt ttgtgtttga tggatttgtt 300 ggagctttaa aaaaatatac ccttcctata agagtaatat gcgaaagagc atcccaggcg 360 ttgtttgcaa atcaattgtt tagaaggcca acggaggagg atttaaagtg ttttactcct 420 gaatttaata ttatatcggt acctggattt aaagctaagg ggaaagagga cggtttaaat 480 tcagatgcct ttattttagt aaattttgat aaaaaaatta tattaatagg gggaaccagt 540 tactcgggag aaataaaaaa atcagtattt tcagtaatga actttttgct tccacaaaaa 600 ggggtcatgc ctatgcactg ttctgctaat ataggacaag acaataaaac ttgcttattt 660 tttgggttgt caggaacagg aaaaaccact ttatcagcag atggtgaaag aagattaatt 720 ggtgatgacg aacatggatg gtctaatgaa ggtgtattta attttgaggg tggatgttat 780 gctaaaacta taaggcttga taaggaaaag gaaagccaga tatacaatgc cataaaattt 840 ggaactgtag ttgaaaatgt agtggcagat gagaataggg tacctgatta taatgatggt 900 aggtatactg aaaatacaag ggcagcatat cctataaatt atatagataa tatagaagaa 960 agcggtgtag gaggaaatcc agagactata atatttttaa ctgcagatgc ttttggtgta 1020 atgccaccta tatcaagact ttctaaagaa gcagcaatgt atcactttat gtctggatat 1080 accagcaaga tagctggaac tgaaagagga ataattgaac ctcaagctac tttttcctct 1140 tgctttggtg aaccttttat gttaatgaat cctgctgtct atgcaaagct gttaggcgaa 1200 agaatagaca agtataacac ccaggtatat ttagtgaata ctggatggct atctggagga 1260 tatggaaatg gagatagaat aaaactttcc tatacaagaa ctatgattag agaagctttg 1320 aaaggaaaat tcaaagatgt tgattttgtg gaacatcctg tgtttaaagt aatgatgcct 1380 acaagatgtc caggtgtacc tgatgaaata ttaaacccta gaaatacatg gcaagataaa 1440 gaagcgtatg atgagacagc gagaaagctg gcaatgaagt ttagtaaaaa ctttgagaag 1500 ttttaa 1506 <210> 69 <211> 501
<212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 69
Met Asn lie Asn Lys Tyr Arg Asn Met Tyr Lys Asn Leu Ser Pro Ser
15 10 15
Glu Leu Thr Glu Phe Ser lie Lys Arg Gly Glu Gly Phe Leu Ser Asn
20 25 30
Lys Gly Ala Leu Met lie Asn Thr Gly Lys Tyr Thr Gly Arg Ser Pro
35 40 45
Lys Asp Arg Phe lie val Asn Gin Glu Ser lie Arg Asn Lys lie Asn
50 55 60
Trp Gly Asn val Asn Leu Ser lie Glu Glu Asp lie Phe Asn Lys Met
65 70 75 80
Tyr Asp Lys lie Leu Asn Tyr lie Ser Asp Lys Asp lie Phe val Phe
85 90 95
Asp Gly Phe val Gly Ala Leu Lys Lys Tyr Thr Leu Pro lie Arg val
100 105 110
lie Cys Glu Arg Ala Ser Gin Ala Leu Phe Ala Asn Gin Leu Phe Arg
115 120 125
Arg Pro Thr Glu Glu Asp Leu Lys Cys Phe Thr Pro Glu Phe Asn lie
130 135 140
lie Ser val Pro Gly Phe Lys Ala Lys Gly Lys Glu Asp Gly Leu Asn
145 150 155 160
Ser Asp Ala Phe lie Leu val Asn Phe Asp Lys Lys lie lie Leu lie
165 170 175
Gly Gly Thr Ser Tyr Ser Gly Glu lie Lys Lys Ser val Phe Ser val
180 185 190
Met Asn Phe Leu Leu Pro Gin Lys Gly val Met Pro Met His Cys Ser
195 200 205
Ala Asn lie Gly Gin Asp Asn Lys Thr Cys Leu Phe Phe Gly Leu Ser
210 215 220
Gly Thr Gly Lys Thr Thr Leu Ser Ala Asp Gly Glu Arg Arg Leu lie
225 230 235 240
Gly Asp Asp Glu His Gly Trp Ser Asn Glu Gly val Phe Asn Phe Glu
245 250 255
Gly Gly Cys Tyr Ala Lys Thr lie Arg Leu Asp Lys Glu Lys Glu Ser
260 265 270
Gin lie Tyr Asn Ala lie Lys Phe Gly Thr val val Glu Asn val val
275 280 285
Ala Asp Glu Asn Arg val Pro Asp Tyr Asn Asp Gly Arg Tyr Thr Glu
290 295 300
Asn Thr Arg Ala Ala Tyr Pro lie Asn Tyr lie Asp Asn lie Glu Glu
305 310 315 320
Ser Gly val Gly Gly Asn Pro Glu Thr lie lie Phe Leu Thr Ala Asp
325 330 335
Ala Phe Gly val Met Pro Pro lie Ser Arg Leu Ser Lys Glu Ala Ala
340 345 350
Met Tyr His Phe Met Ser Gly Tyr Thr Ser Lys lie Ala Gly Thr Glu
355 360 365
Arg Gly lie lie Glu Pro Gin Ala Thr Phe Ser Ser Cys Phe Gly Glu
370 375 380
Pro Phe Met Leu Met Asn Pro Ala val Tyr Ala Lys Leu Leu Gly Glu
385 390 395 400
Arg lie Asp Lys Tyr Asn Thr Gin val Tyr Leu val Asn Thr Gly Trp
405 410 415
Leu Ser Gly Gly Tyr Gly Asn Gly Asp Arg lie Lys Leu Ser Tyr Thr
420 425 430
Arg Thr Met lie Arg Glu Ala Leu Lys Gly Lys Phe Lys Asp val Asp
435 440 445
Phe val Glu His Pro val Phe Lys val Met Met Pro Thr Arg Cys Pro
450 455 460
Gly val Pro Asp Glu lie Leu Asn Pro Arg Asn Thr Trp Gin Asp Lys
465 470 475 480
Glu Ala Tyr Asp Glu Thr Ala Arg Lys Leu Ala Met Lys Phe Ser Lys
485 490 495
Asn Phe Glu Lys Phe 500
<210> 70 <211> 843 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 70
atgagagaag tagatgtatc cactataaca aaagctgtta gaaatctctg tatagatgcc 60 aattattatc tttcggagga tgttaagaaa aagataaaag aatgtgaaga ggacgaaaaa 120 tggcctactg caaaagacat tttaggtaaa atacttgaaa atatagatat atctaaaaat 180 gaagatgtgc ctatgtgtca ggatacagga atggcttgtg tatttgtaac aattggccag 240
gatgttcata tagtaggagg aagtttagaa gacgcaataa ataagggagt aagtcaggga 300 tatgtagaag ggtatttaag aaagtctgta gtctctgatc ctataaatag agttaatact 360 aaggataata ctcctgcagt aatatattat gaaatagttc caggagataa acttaacata 420 aaagtggctc ctaaaggatt tggatcagaa aatatgagcc agataaaaat gcttaaacca 480 gcagatggac ttaagggtgt taaagatttc gtaataaaag tagtaaagga cgcaggacca 540 aatccatgtc ctcctatggt tgtaggagta ggtataggag gaacttttga caaggctgca 600 aatcttgcaa agaaagctct tgtaagacca ttatctgaaa gaaataaaaa taagttttat 660 tcagatttag aaaatgaact tttagacaaa ataaatttcc taggtatagg acctcaagga 720 ctagggggaa agactacagc tcttgcagta aatatagaaa cttatcctac gcatatagca 780 ggattacctg tagccgtaaa tataaattgc catgttacaa gacataagga aatagaattg 840 taa 843 <210> 71 <211> 280 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 71
Met Arg Glu val Asp val Ser Thr lie Thr Lys Ala val Arg Asn Leu
15 10 15
Cys lie Asp Ala Asn Tyr Tyr Leu Ser Glu Asp val Lys Lys Lys lie
20 25 30
Lys Glu Cys Glu Glu Asp Glu Lys Trp Pro Thr Ala Lys Asp lie Leu
35 40 45
Gly Lys lie Leu Glu Asn lie Asp lie Ser Lys Asn Glu Asp val Pro
50 55 60
Met Cys Gin Asp Thr Gly Met Ala Cys val Phe val Thr lie Gly Gin
65 70 75 80
Asp val His lie val Gly Gly Ser Leu Glu Asp Ala lie Asn Lys Gly
85 90 95
val Ser Gin Gly Tyr val Glu Gly Tyr Leu Arg Lys Ser val val Ser
100 105 110
Asp Pro lie Asn Arg val Asn Thr Lys Asp Asn Thr Pro Ala val lie
115 120 125
Tyr Tyr Glu lie val Pro Gly Asp Lys Leu Asn lie Lys val Ala Pro
130 135 140
Lys Gly Phe Gly Ser Glu Asn Met Ser Gin lie Lys Met Leu Lys Pro
145 150 155 160
Ala Asp Gly Leu Lys Gly val Lys Asp Phe val lie Lys val val Lys
165 170 175
Asp Ala Gly Pro Asn Pro Cys Pro Pro Met val val Gly val Gly lie
180 185 190
Gly Gly Thr Phe Asp Lys Ala Ala Asn Leu Ala Lys Lys Ala Leu val
195 200 205
Arg Pro Leu Ser Glu Arg Asn Lys Asn Lys Phe Tyr Ser Asp Leu Glu
210 215 220
Asn Glu Leu Leu Asp Lys lie Asn Phe Leu Gly lie Gly Pro Gin Gly
225 230 235 240
Leu Gly Gly Lys Thr Thr Ala Leu Ala val Asn lie Glu Thr Tyr Pro
245 250 255
Thr His lie Ala Gly Leu Pro val Ala val Asn lie Asn Cys His val
260 265 270
Thr Arg His Lys Glu lie Glu Leu 275 280
<210> 72 <211> 574 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 72
atgtatatgg aaaaaaagat aactactccg ttaacggaag waaaaggtta aaactttaaa 60 agcaggggat agtgttttaa tatcagggac aatatatact gctagagatg ctgctcataa 120 gagattggtc gagttattag atgaaggtaa atctcttcct atagatgtaa aagatgcaat 180
aatatattac gcaggaccaa gtcctgcaaa accaggccat gtaataggtt cagctggacc 240 aacaagtagt tatagaatgg acccatttgc accaagactg cttgatatag ggttaaaagg 300 aatgatagga aaaggccttc gttcaaaaga agttatagaa tccatgaaga aaaatggagc 360 tgtttacttt gctgcaatag gcggggctgc agcacttgta gcaaaatcca taaagaaagc 420 agaagtagta gcttatgaag atttggattc tgaagctata agaaaattag aagtaaaaga 480 tttacctgta attgtagtaa tagattcaga gggcaataat ttatatgaat caggacgaaa 540 agagtacttg gactctgtgg gccagtctaa gtaa 574 <210> 73 <211> 190 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 73
Met Tyr Met Glu Lys Lys lie Thr Thr Pro Leu Thr Glu Glu Lys val
15 10 15
Lys Thr Leu Lys Ala Gly Asp Ser val Leu lie Ser Gly Thr lie Tyr
20 25 30
Thr Ala Arg Asp Ala Ala His Lys Arg Leu val Glu Leu Leu Asp Glu
35 40 45
Gly Lys Ser Leu Pro lie Asp val Lys Asp Ala lie lie Tyr Tyr Ala
50 5 5 60
Gly Pro Ser Pro Ala Lys Pro Gly His val lie Gly Ser Ala Gly Pro
65 70 75 80
Thr Ser Ser Tyr Arg Met Asp Pro Phe Ala Pro Arg Leu Leu Asp lie
85 90 95
Gly Leu Lys Gly Met lie Gly Lys Gly Leu Arg Ser Lys Glu val lie
100 105 110
Glu Ser Met Lys Lys Asn Gly Ala val Tyr Phe Ala Ala lie Gly Gly
115 120 125
Ala Ala Ala Leu val Ala Lys Ser lie Lys Lys Ala Glu val val Ala
130 135 140
Tyr Glu Asp Leu Asp Ser Glu Ala lie Arg Lys Leu Glu val Lys Asp
145 150 155 160
Leu Pro val lie val val lie Asp Ser Glu Gly Asn Asn Leu Tyr Glu
165 170 175
Ser Gly Arg Lys Glu Tyr Leu Asp Ser val Gly Gin Ser Lys
180 185 190
<210> 74 <211> 1797 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 74
atgcaaatag ataagataat tgatactgac atattagttg ttggaggctc tggagcaggg 60 tcaatggcag ctgtaacagc tgctgaaaaa ggagcaaaag tactgcttgc attaaaagga 120 aagcttggga aaagtggtaa tgctattatg gcaggagcag gattttctat ggatggagaa 180 actgcatatt ataaatatgg actcaaggaa gcagatccta gaaatacgaa ggaaaaatta 240 tttgaacaaa ttgtaaagca gtctttttat ctaagtgatc aaaatatggt tgagcagttt 300
gttaatgatt gtggtgaatg ctgctggaaa cttaaacagt ggattgaaaa agcaggacat 360 aaggttgcat tctttggaga agaaggatat ataacatcag gtaaagctgt tgcagatgga 420
tgccgatatg gagtttctga ggcaggcagc attgatgtta tacaagattt tatggttgca 480 gatgttttga tggaagatgg aagagctgta ggtgcagttg gaatagatat atattcagga 540 gagattattg aaattagatc aaagtcagtt attttagcta ctggcggata tcagccctat 600 tcctttaaat gcactgtttc cgatatgact ggcgatggaa tggctatggc gtaccgtgca 660 ggagtcaagc ttgcagatat ggaattttta ttatatatac cagcagttgc cctttcacca 720 tcagtatata aaggttcaat ttatcctttc ttacattcca gtatgcttat gcccattgtt 780 aaaaatggca aaggagaatc aattttagac aatatacctg aaactttact taaaatggcc 840 aaggaaagtg aaatgggaaa gcttatattt acgtattatt atggagatca aattgcaaaa 900 ggaaaagcaa ctccaaatgg aggagtatat tttgattatt ccaatgtacc ttttgatatt 960 tatgaaaaag ccttaaaaaa atctgagcca ttaatgaaca tgtggtatag aaaaggattc 1020 tatcaaggaa acaacttgga tacttttgtt gaaaatataa gaaagggcat tccatgggaa 1080 gtaggtattg gctcagaata cagcatgggt ggcattgaag tagacgaaaa tatgtacact 1140 ggagtaccag gactttatgc agctggtgag actacaagtg gtgtatttgg agctatgagg 1200 gttgcagacg gacttattga aatgcttgta catggttata gagcagcatt gtccgcttgc 1260 aaatatatac aaaatgtaaa tgagccaagt atgaaaaata ctaatattga tagtataatt 1320 aaagatattt tttcacctct tgaaagaaaa gaagggataa gtcctataaa aatacacaga 1380 aatatagaaa agacagctga tgctggattc aactttagaa gaaatgaaga gggacttaca 1440 aaagctttag atgatatttt aaaaatacac aaatatgaca taagcgcaat gagtactaaa 1500 agtaaaaata gagtttataa ctatgaatgg atagaatcag tacaggttcg aaatctttta 1560 acttgcacag aagcaggtgt aagagctgcc cttatgagaa aagaaagtag gggtacacat 1620 atacgtgatg attatgaatt tgtagataat gataactggc ttttaaggat tatgagttta 1680 aaaagtgaag acggaactat gaaattatca accagaaagc ctaaagtaac aacaatggaa 1740 ctcccaaatg gtaaaaataa gaatattcct gattatatgc tttcaatgtt aaagtaa 1797 <210> 75 <211> 598 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 75
Met Gin lie Asp Lys lie lie Asp Thr Asp lie Leu val val Gly Gly
15 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Met Ala Ala val Thr Ala Ala Glu Lys Gly Ala
20 25 30
Lys val Leu Leu Ala Leu Lys Gly Lys Leu Gly Lys Ser Gly Asn Ala
35 40 45
lie Met Ala Gly Ala Gly Phe Ser Met Asp Gly Glu Thr Ala Tyr Tyr
50 55 60
Lys Tyr Gly Leu Lys Glu Ala Asp Pro Arg Asn Thr Lys Glu Lys Leu
65 70 75 80
Phe Glu Gin lie val Lys Gin Ser Phe Tyr Leu Ser Asp Gin Asn Met
85 90 95
val Glu Gin Phe val Asn Asp Cys Gly Glu Cys Cys Trp Lys Leu Lys
100 105 110
Gin Trp lie 115
Gly Tyr lie
130 val ser Glu 145
Asp val Leu
lie туг Ser
Ala Thr Gly 195
Met Thr Gly
210 Ala Asp Met 225
Ser val туг
Met Pro lie
pro Glu Thr 275
lie Phe Thr 290
РГО Asn Gly
305
Tyr Glu Lys
Met Glu 165 Gly Glu 180
Gly Tyr
Asp Gly
Glu Phe
Lys Gly 245 val Lys 260
Leu Leu
туг Tyr
Gly val
Ala Leu 325
Gly Lys
135 Ser lie 150
Asp Gly
lie lie
Gin Pro
Met Ala 215 Leu Leu 230
Ser lie
Asn Gly
Lys Met
Tyr Gly 295 Tyr Phe 310
Lys Lys
His Lys 120
Ala val
Asp val
Arg Ala
Glu lie 185 туг ser 200
Met Ala
туг lie
туг Pro
Lys Gly 265 Ala Lys 280
Asp Gin Asp Tyr
Ser Glu 66
val Ala
Ala Asp
lie Gin 155 val Gly 170
Arg Ser
Phe Lys
Tyr Arg
Pro Ala 235 Phe Leu 250
Glu Ser
Glu Ser
lie Ala
Ser Asn 315 Pro Leu 330
Phe Phe 125 Gly Cys 140
Asp Phe
Ala val
Lys Ser
Cys Thr 205 Ala Gly 220
val Ala
His Ser
lie Leu
Glu Met 285 Lys Gly 300
val Pro Met Asn
Gly Glu Glu
Arg Tyr Gly
Met val Ala 160
Gly lie Asp 175
val lie Leu 190
val ser Asp
val Lys Leu
Leu Ser Pro 240
Ser Met Leu 255
Asp Asn lie 270
Gly Lys Leu
Lys Ala Thr
Phe Asp lie 320
Met тгр туг 335
Arg Lys Gly
lie Arg Lys 355
Met Gly Gly
370 Leu Tyr Ala 385
val Ala Asp
Leu Ser Ala
Asn Thr Asn 435
Arg Lys Glu 450
Phe Tyr 340
Gly lie
lie Glu
Ala Gly
Gly Leu 405 Cys Lys 420
lie Asp Gly lie
Gin Gly
Pro Trp
val Asp 375 Glu Thr 390
lie Glu
Tyr lie
Ser lie
Ser Pro 455
Asn Asn 345
Glu val 360
Glu Asn
Thr ser
Met Leu
Gin Asn 425 lie Lys 440
lie Lys
Leu Asp
Gly lie
Met Tyr
Gly val 395 val His 410
val Asn Asp lie lie His
Thr Phe
Gly Ser 365 Thr Gly 380
Phe Gly
Gly Tyr
Glu Pro
Phe Ser 445 Arg Asn 460
val Glu Asn 350
Glu Tyr Ser
val Pro Gly
Ala Met Arg 400
Arg Ala Ala
415 Ser Met Lys 430
Pro Leu Glu lie Glu Lys
Thr Ala Asp Ala Gly Phe Asn Phe Arg Arg Asn Glu Glu Gly Leu Thr
465 470 475 480
Lys Ala Leu Asp Asp lie Leu Lys lie His Lys Tyr Asp lie Ser Ala
485 490 495
Met Ser Thr Lys Ser Lys Asn Arg val Tyr Asn Tyr Glu Trp lie Glu
500 505 510
Ser val Gin val Arg Asn Leu Leu Thr Cys Thr Glu Ala Gly val Arg
515 520 525
Ala Ala Leu Met Arg Lys Glu Ser Arg Gly Thr His lie Arg Asp Asp
530 535 540
Tyr Glu Phe val Asp Asn Asp Asn Trp Leu Leu Arg lie Met Ser Leu
545 550 555 560
Lys Ser Glu Asp Gly Thr Met Lys Leu Ser Thr Arg Lys Pro Lys val
565 570 575
Thr Thr Met Glu Leu Pro Asn Gly Lys Asn Lys Asn lie Pro Asp Tyr
580 585 590
Met Leu Ser Met Leu Lys 595
<210> 76 <211> 912 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 76
atgagagagt ttgaaacaga tgttgttgtt gttggaggag gagcatcagg gcttgctgca 60 gcagttactg ctgctgaaaa tggtgcaaaa gtaatggtgc ttgaaaaagc taatactaca 120 ggtggatgtg ctaatatggc aatgggccct ctaggtgttg aaacaagaat gcaaagagaa 180 aggcttatag atatatctgt agatagagca tttaataagt tcatggaata ttctcactgg 240 agatcagatg caagattgat aagaagatat ttagagcagt cagcaggaac tattgaatgg 300 ttagaaaata tgggagtaga attcgcatta ccttcaaaat attttccagc ttcagaagca 360 acttggcata ttgttaaacc taaaactgga aaaccaggac tccgtgcagc tgctactatg 420 attaaaatca tgacagaaag agcagaagaa ttaggcgtta aaatattatt agaaacacct 480 gtaaagagta ttattaaaga tcaaggagag ataattggcg taacagctag cgataaagat 540 ggtgaattag aagtatatgc tggagcagtt atcatcggta caggcggatt tggtgataat 600 ccagatttta ttaagaagta tgttggactt gaatggggaa aagatttgtt ctcatataga 660 attcctggat taactggaga tggaatccag atggcttggg atgctggcgc ttcaaaagat 720 tttatgacta tggaaatggt attctttgct cctaacactg gtggatatgc tcctatagag 780 ttacccttcc gtcaacctaa ccttttagtt aacctggatg gtgaaagatt tataaatgaa 840 gaagttatag aaaatcctgt atttaccgca aatgctattg aaaaacaaaa aagaaagttg 900 catattctat aa 912 <210> 77 <211> 303 <212> ПРТ
<213> Clostridium ragsdalei <400> 77
Met Arg Glu Phe Glu Thr Asp val val val val Gly Gly Gly Ala Ser
15 10 15
Gly Leu Ala Ala Ala val Thr Ala Ala Glu Asn Gly Ala Lys val Met
20 25 30
val Leu Glu Lys Ala Asn Thr Thr Gly Gly Cys Ala Asn Met Ala Met
35 40 45
Gly Pro Leu Gly val Glu Thr Arg Met Gin Arg Glu Arg Leu lie Asp
50 5 5 60
lie Ser val Asp Arg Ala Phe Asn Lys Phe Met Glu Tyr Ser His Trp
65 70 75 80
Arg Ser Asp Ala Arg Leu lie Arg Arg Tyr Leu Glu Gin Ser Ala Gly
85 90 95
Thr lie Glu Trp Leu Glu Asn Met Gly val Glu Phe Ala Leu Pro Ser
100 105 110
Lys Tyr Phe Pro Ala Ser Glu Ala Thr Trp His lie val Lys Pro Lys
115 120 125
Thr Gly Lys Pro Gly Leu Arg Ala Ala Ala Thr Met lie Lys lie Met
130 135 140
Thr Glu Arg Ala Glu Glu Leu Gly val Lys lie Leu Leu Glu Thr Pro
145 150 155 160
val Lys Ser lie lie Lys Asp Gin Gly Glu lie lie Gly val Thr Ala
165 170 175
Ser Asp Lys Asp Gly Glu Leu Glu val Tyr Ala Gly Ala val lie lie
180 185 190
Gly Thr Gly Gly Phe Gly Asp Asn Pro Asp Phe lie Lys Lys Tyr val
195 200 205
Gly Leu Glu Trp Gly Lys Asp Leu Phe Ser Tyr Arg lie Pro Gly Leu
210 215 220
Thr Gly Asp Gly lie Gin Met Ala Trp Asp Ala Gly Ala Ser Lys Asp
225 230 235 240
Phe Met Thr Met Glu Met val Phe Phe Ala Pro Asn Thr Gly Gly Tyr
245 250 255
Ala Pro lie Glu Leu Pro Phe Arg Gin Pro Asn Leu Leu val Asn Leu
260 265 270
Asp Gly Glu Arg Phe lie Asn Glu Glu val lie Glu Asn Pro val Phe
275 280 285
Thr Ala Asn Ala lie Glu Lys Gin Lys Arg Lys Leu His lie Leu
290 295 300
<210> 78 <211> 962 <212> ДНК
<213> Clostridium ljungdahlii <400> 78
tttcttcaca ggaaaatata cttcagtaac aagatcttta ggaatggtga cttggtgggg 60 gtcagttaca tatacttcat atggtgggtt tgtaagttta tatccttcat tttctaccca 120 ttccctcaac ttagcatata cagatgttaa ttctgaatat gagcccctta aaacagactt 180
cgcacaaagg actccaggca agtatcttgt tccctttaca atctccttta tcggaatggc 240
aagttctgta tcattgccag aaggattgta ttcagcgctg tgataaatag ttattggctt 300 accaagaaag tcaattacaa aaatatatat aaagaaagca aagctacata tattaaagca 360 tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata gctaaagtta 420 cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta ttgtactatt 480 tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa gtaataacaa 540 agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg ctggaataat 600 agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat tttatttgtt 660 agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa tttggtcaat 720 cattaacttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata agcaattata 780 taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta tgttggcaaa 840 attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta attattgtga 900 cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga ggtgaatgta 960 at 962 <210> 79 <211> 977 <212> ДНК
<213> Clostridium ljungdahlii <400> 79
actagacagt gctaataaca atgtctagtg ctttttatct tgctcaattt tttcattgag 60 ttcatttaag taagtccacc tgtccatctt ttcgtctagc tctttttcca gtgaattctt 120 ttcggataag agatcttcaa gaagtgcata atcagatgaa gcagcttcca tttctatttt 180 cttttcagat atagattttt ctagatgttc aattacctca tctattttgt caaactccat 240 ttgttctgca taggtaaatt ttagaggctt ttctttttgc aacttatagt tgtttttagc 300 tgtatttttc ttagagctta ttttttcctc tgatattttt gcagttttgt gaaaatagga 360 atagtttcct gtatattgag tgattttacc gtttccttca aaagaaaata ttttatcaac 420 tgttttgtca aggaagtacc tgtcatgaga tacagctata acagctcctt caaaatcgtt 480 aatataatct tctaggattg taagtgtttc tatatccaga tcatttgttg gttcgtccag 540 caaaagtaca ttagggtaat tcatcaatat ttttagaaga tataatcttc ttcgttctcc 600 tcctgaaagt tttccaaggg gagtccattg aactgaaggt tcaaataaaa aattttcaag 660 tacagcagaa gcacttattt tttcacccga tgaagttgac gcatattctg atgtcccacg 720 tatgtattca attacccttt cgttcatatc catatcagaa attccctgag aatagtatcc 780 tatctttact gtttcaccta tatctatagt gccgctgtcc ggcagaattt tttgaactaa 840 aatattcata agagtggatt taccacttcc attaggtcca ataataccta ttctgtcatt 900 atttagtatg ttataagtga aatttttaat taatgtcttt tcaccaaaac ttttgcttat 960 gttatccagg tttatga 977
<210> 80 <211> 962 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 80
tttcttcaca ggaaaatata cttcagtaac aagatcttta ggaatggtga cttggtgggg 60 gtcagttaca tatacttcat atggtgggtt tgtaagttta tatccttcat tttctaccca 120 ttccctcaac ttagcatata cagatgttaa ttctgaatat gagcccctta aaacagactt 180 cgcacaaagg actccaggca agtatcttgt tccctttaca atctccttta tcggaatggc 240 aagttctgta tcattgccag aaggattgta ttcagcgctg tgataaatag ttattggctt 300 accaagaaag tcaattacaa aaatatatat aaagaaagca aagctacata tattaaagca 360
tttaaggtaa aactaaaaat attataaaaa tgaaattatt ttttctcata gctaaagtta 420 cataatacga ggaggattta taatgaaaaa agtaatagga attataagta ttgtactatt 480 tgtactcgta gcacttcaat cctgtgctgc aggagtagga aatgcattaa gtaataacaa 540 agaagctagt ggatctgctg gattattttt atctgtatgt atgcttattg ctggaataat 600 agcaataata tcaaaatata gtaaaggtat gactataaca gctatagtat tttatttgtt 660 agcttttgtt gtagggattg ctaatgttgg gcatttttca gatttgcaaa tttggtcaat 720 cattaacttg atatttgctg gactattgat atttcatttg cttaaaaata agcaattata 780 taatagcagt gggaaaaagt agaatcatat attgtaatta tttttaatta tgttggcaaa 840 attgaaattg tcactgaaac acctctaaat gttttaaata catatgttta attattgtga 900 cagattctaa tagtagaaag tagaaatttg ctatgttata atgacataga ggtgaatgta 960 at 962 <210> 81 <211> 975 <212> ДНК
<213> Clostridium ragsdalei <400> 81
ctagacagtg ttaataacaa tgtctagtgt ttttctcttg ttcaattttt tcattgagtt 60 catttaggta agtccacctg tccatctttt cttctaattc tttttccagt gaattctttt 120 cagataagag atcttcaaga agtgcataat cagatgaagc agcttccatt tctattttct 180 tttcagatat agatttttct agattttcaa ttacctcatc tattttgtca aactccattt 240 gttctgcata ggtaaatttt aaaggctttt ctttttgcaa cctataattg tttttagctg 300 tattgttctt agtggttatt ttttcttgtg gtatttttgc agtttcgtga aaatgggagt 360 agtttcctgt atattgagcg attttaccat ttccttcaaa agaaaatatt ttatcaactg 420 ttttgtcaag gaagtatctg tcatgggata cagctataac agttccttca aaatcattaa 480 tataatcctc taggattgta agtgtttcta tatccagatc atttgttggt tcgtccagta 540 aaagtacatt aggataattc atcagtattt ttagaaggta taatcttctt cgttcccctc 600
ctgaaagttt tccaagggga gtccattgaa ctgaaggttc aaatagaaaa ttttcaagta 660 cagcagaagc acttattttt tcacccgatg aagttgaggc atattctgat gtcccacgta 720 tgtattcaat taccctttcg ttcatatcca tatcagaaat tccctgagaa tagtatccta 780 tttttactgt ttcacctata tctatagtac cgctgtccgg cagaattttt tgagttaaaa 840 tattcataag agtggattta ccacttccat taggtccaat aatacctatt ctatcattat 900 ttagtacgtt ataagtgaaa tttttaatta atgttttttc accaaaactt ttgcttatgt 960 tatccaggtt tatga 975 <210> 82 <211> 353 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 82
aaaaaagctt ataattatcc ttagttaacg atcaggtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcgatttta actcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt aggctgatcg acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 353 <210> 83 <211> 353
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 83
aaaaaagctt ataattatcc ttagcactcg ttgaggtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcgattagt gctcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt aggctcaacg acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 3 53 <210> 84 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 84
ctgcacctaa aaccaaagca gtatt 25 <210> 85 <211> 25
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 85
atcctttaag caagagtact gcacc 25 <210> 86 <211> 520 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 86
ccggatwgka ysctrwgmgw gmarrcytwa saymtksgmk ycsssrcsag gkagccgtaa 60 gcttggatcc cgggawtmgk rgrwggkwsy ckgtksktgs mtccygggra gagggggatw 120 scctcccgaa agggaratta mtacsgcata ataatcagtt ttcwcatgga gactgattta 180 aaggagtaat ccsctttgag atggacccgc ggcgcattag ctagttggta gggtaacggc 240 ctaccaaggc gacratgcgt agcckacctg agagggtgat cggccmcmtt ggaactgaga 300 gacggtccmg actyctacgg gaggcakcag kggggaatwt tgcacaatgg gcgaaagcct 360 gatgcarcaa csccgcgtga gtgaagaagg ttttcggatt gtaaagctwt gtctttgggg 420 acgataatga cggtwcckwa ggaggaagcc mcsgstaact acgtgyywgc mkcckcggta 480 atacgtyggt ggmgagygtt gtyyggaatm wckwgkykta 520 <210> 87 <211> 639 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 87
gggrraystr amyscwgycr wrmmymmssm tmssskkmrw ckragmcrgr wtcaarctct 60 gttgtcgacr aattcgamwr awccrggatc aaactctgtt gtcgamsaat kcsgrkwaac 120
swaktyacmr cymcrttkts attcrmkatt actagcaact ccaacttcwt gtaggcgagt 180 ttcagcctgc aatccgaact gggggcagtt tttgaggttt gctccacctt gcggtcttgc 240 ttctctctgt actgcccatt gtarcacgtg kgttgccctg racataaggg gcatgatgat 300 ttwacstcwt ccccaccttc ytccgcgtta accmcggcag tcttgctara rtgctcaact 360 aaatgttakc aactaacamc aggggttgck ctckttgcag gacttaacct aacwtctcac 420 gacacgagct gacracaacc atgcaccacc tgtatycctg ccccgaaggg yttctcttat 480 ctctaarata ttmagggtat gtcmwgtcca ggwawggttc ttcgcgttgc ttcgaattaa 540 accacatgct ccgctgcttg tgcgggcccc cgtcaattcc tttgagtttt aatmttgcga 600 tcgtacttcc caggcggagt acttattgtg tttactgcg 639 <210> 88 <211> 1028 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum
<400> 88
ccgatwgwaa ysctsgmrgc asrsytwasa ymtksarkyc sysrcaaggk agccgtaagc 60 ttggatcccg ggaaccgsrg aaggkasccs krgsktgsmt mccgggraga gggggatagc 120 cwcccsaaag ggagawtmmy rssrcataat awtcagtttt cacwtggaga ctgwtttaaa 180 ggaktaatcc gctttgagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtagg gtaacggcct 240 accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacattgg aactgagaga 300 cggyccarac tcctacggga ggcakcagtg gggaatattg cacaatgggc gaaagcctga 360 tgcagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggattgt aaagctctgt ctttggggac 420 gataatgacg gtacccaagg aggaagccac ggstaactac gkgccascag ccgcggtaat 480 acgtaggtgg cgagcgttgt ccggaattac tggkcgtaaa gagtgcgtag gcggatattt 540 aagtgasatg tgaaataccc gggcttaacy cgggcactgc wtttyaaact ggatatctar 600 agtgcgggag aggakaatgg aattcctwkt gtagcggrtg aaatgcgtak agattaggaa 660 gaacaccagt ggcgaargcg attctctgga ccrtaactga crctgaggya cgaaagcrtg 720 ggtagcaakm aggattagat accctggkta gwccacrccg taaacratga ktactakktg 780 twggaggtwt caccccttyt ktgccrsmkt aaacacaata aktactccsc cckggraagt 840 ackatygcaa gawttaaaac tcaaaggrwt tgaygggggs cccgcycaag yagcggaagc 900 atgtggkttw wttycaakca mtsckaykaa ccttwcctkg rayttkrwmt wmccmgcaww 960 cytwataawt aaagaakccc ttysgkgymr gggwawmmgg gkkggtgyat gkktkgtygt 1020 ywatmycg 1028 <210> 89 <211> 716 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 89
gggtaygtsa ayswgyyatr mrysyskmtm rwskkmrwck ragmcrgrat caarctctgt 60 tgtckacraa ttcggmkrak ccrggatcaa actctgttgk cgacsaattc sgrkgaaccy 120 rkwymcmrck mcrttstsat ycrckaytac tagcaactcc aacttcatgt aggcgagttt 180 cagcctgcaa tccgaactgg gggcagtttt tgaggtttgc tccmccttgc ggtcttgctt 240 ctctctgtac tgcccattgt ascacgtgtg ttgccctgga cataaggggc atgatgattt 300 gacgtcatcc ccaccttcct ccgcgttaac cgcggcagtc ttgctagagt gctcaactaa 360 atgttagcaa ctaacaacag gggttgcgct cgttgcagga cttaacctaa catctcacga 420 cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tatccctgyc ccraagggyt tctcttatct 480 ctaagatawt cagggtatkt yaagtccagg waaggttctt cscrttgytt csaattaaac 540
cacatgctcc gctgcttgtg cgggcccccg tcaattcctt tgagttttaa tcttgcgatc 600 gtacttccya ggcggagtac twattgtgtt tactgyggca sasaarrggt cgatacctcc 660 tacacctagt actcatcgtt tackgmgtgy actaccaggr watstaatwc tgtttg 716
<210> 90 <211> 556 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 90
ccggatwkaw awsctmsmgg cwrrcytwas aymtksgmky csyrrcaagg kagccgtaag 60 cttggatccc gggawscgkr gswggkagcc skwksktgsm tccysggrrg agggggrwws 120 ccwcccgrrr gggagaytmm yrssgsataa taatcakttt tcwcatggar actgatttaa 180 aggagtaatc csctttgaga tggacccscg gcgcattakc tagkkggtag ggtaacggyc 240 taccaaggcg acrktgcgta gccgacctga ragggtgatc ggscacattg kaactgagag 300 amggtccara ctcytacggg aygyagcart ggggaatatt gmacaatggg cgaaagccmg 360 atgcagcaac gccscgtgag tgaagaaggt tttcggattg twaarytctg tctttgggga 420 mgataatgac kgtacccaag gasyaagccw cggstaacta cgtgccagya kyckcggtaa 480 tamktaggtg gcgagcgttg tccggaatta cygggmgtaa agartgcgta rgcggatatt 540 tarkgakatg tgaaat 556 <210> 91 <211> 478 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 91
gggwayytsa mkcwgycrwr maykyrgwta rcskkmrwck ragmcrgrat caarctctgt 60 tgtckacraa ttcgakwrar ccrggatcaa actctgttgt csacmaattc sgmkraawcm 120 rgwyymmact myrttstsaw ycamtwytac tagcaactcc aacttcwtgt akgcgagttt 180 cagcctgcaa tccraactgg gggcagtttt tgaggtttgc tccmccttgc ggtcttgctt 240 ctcyctgtac tgcccattgt agcmcgtgtg ttgcwctggw mataaggggc atgatgattt 300 gacgtcatcc ccaccttcct ccgcgtkaac cgcggsagtc ttgcyagagw gytcaaytaa 360 atgttrscra cwaacaacag gggttgcgct cgttgcagga cmtaamctaa yatctcayga 420 camgagctga cgamaayyat gcaccaccty tatccctgwc yckaagggct tctyttat 478 <210> 92 <211> 561 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 92
ccgawwrgka aygstmwsmr wgcwrrsktw asaymsksam kycskrrcaa ggkagccgta 60 agcttggatc ccgggawycg krgraggkas ycskkksktr sawmyykggr ararggggat 120 wsccwcccgr awggmarawt amtascrcat aataatcagt tttcmcatgg agactgattt 180 awaggagtaa tccgctttga gatggacccg cggcgcwtta gcwagttggt agggtaacgg 240 cctaccaagg cgacgatgcg takccsacct gasagggtga tcggccacat tggaactgar 300
agacggtcca ractcctacg ggaggyakca gtggggaata ttgcacaatg ggcgaaagcc 360 tgatgcakca acgccgcgtg agtgaagaag gttttcsgat tgyaaagctc tgtctttggg 420 gacgataatg acggwaccca aggaggaarc cacggctrac tacgtgccws csgycgyggt 480
aatacrtagg tggkkagcgt tgtccggaat tyctyggckt aatgagtgcg wargcggatm 540 yttaagtgas atstgaaama с 561 <210> 93 <211> 362 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 93
agggwaaysk maakgawgat matrmatgas katarcskka awckragmcr ggatcaarct 60 ctgttgtcga craattcgmk wrakccagga tcaaactctg ttgtcgacma attcsgmwra 120 accwaktcmm crckmcrttc tgatyrkmkw ctactagcaa ctccaacttc atgtaggcga 180 gtttcakcct gsaatccgaa ytgggggyag tttttgaggt tyyctccayc ttgcggtctt 240 gcttctytct gtactgccca ttgtakcacg tgtgttgccc tggacataag gggcatgatg 300 atttgacgtc atccccawct tyctccgmgt waaccgcggc agtyttycta rartgctyaa 360 yt 362 <210> 94 <211> 1160 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 94
agtggcactg gaaaagaact cttagctcaa tctattcaca attatagtga aagatgtgaa 60 ggcccttttg tagctataaa ttgtagttct atacctagag aacttgtaga aagtgagctt 120 tttggttatg aaaaaggagc ttttacggga gctttaaagc aaggaaagcc tggaaagttt 180 gaattagcag atggaggaac tatttttttg gatgaagtag gagagcttcc tcttgatata 240 cagtcaaagc ttttaagggt tcttgataat aataaaatta caagagttgg aggaacttat 300 gaaaaacagc taaatgtaag gataatagga gctacaaaca gggtgctcaa ggatgaaatt 360 aaaaagaaaa atttcagaag tgacctttat tatagattga gtgtgatgaa tataaaaact 420 gtcccactta gggaaagaaa agaagatata gagcttttaa ttaaatattt tatggaagaa 480 ttgaattcta aaagtttgtg taagaagaaa gtagtggaaa aagcatacat agaaaagatt 540 aaagcttatg attggcctgg aaatgttaga gaacttagaa atgtaataga gagggattac 600 tatttaagtg aggataagat ggcccctttg gattatttag aaaaagaagt ttatgaaaaa 660 aatgtctcct ctgatccagt aaatattagt gtgcttccaa tggatgtttt agaaaaagaa 720 aacattgaaa atgcacttaa aaagtgtaag ggaaatatat taaaagctgc aaaatcttta 780 aatatcagta gatctaccat gtatagaaaa atgaaaaagt atggaataaa aagtgtgtca 840 aaatgaccag aaaagagtaa gattctcaaa ataggacact aagtatgtgt cataatggca 900
catagtgatt ttaaatgtct ttttaacagg tttcttgttt ttggtatggc ttttgcttat 960 aaaatatagt gaatatatta acaggtatat gtaaatttta atattgccat actattataa 1020 aaaaggagag ataattatga aagctgtatt gtggtatgat aaaaaagatg taagagtaga 1080 ggaaattgag gaacctaagg taaaagaaaa tgctgtaaaa attaaagtga aatggtgtgg 1140 tatatgtggt tctgacttgc 1160 <210> 95 <211> 834 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 95
tattgaggag gccaaaaatg agctttaaga aaaatgtata cgatacaatg agggaactaa 60 tatctgtgcc aagcatatct ggtacaaaag aagagtgtgc ggcagcagaa aaaatatatg 120
aaaaaatttt ggaaatacct tattttaagg acaatcctga aaatctagga ttgaagatga tcctttagga agaagctttg tatgggcagt agtaaatgga caccaaattc gtttatactt tcaggtcatt tggatgtagt tggagtagaa atttaaaatc tatggctttt gatgtagatg aatgtactaa aagaatctca tagatgaaga tgctatggag gattttaaat caggagattg gatatttgga cagacatgaa gtttggagtg gccctcaata tggaactttt aagagaattc gaaactttaa gggaaactta ttacttttag tagttcctgg tgaagagagt gaatgattgc tgcagctcca tttcttctta aattaaagga agagaggaag gtggtatgat aatatcagag ccaagtatac ctgaaagagg agaaaaagaa tatatatagg tagtgtaggt aaaattatgc ctttattttt ttgtgtggga atgtagggga atctttaaga ggattgaatc caaatttgct agtttcagag taatggaatg taatccagat ctctcagata gcgtttatga tactgtgact
atagagcaaa 180 aatgaaaatt 240 gaatttggac 300 gaattgaatt 360 aggggaactg 420 agtaaagaga 480 aattccgaag 540 tacaattact 600 ggcaagagat 660 aaagaaactc 720 ataaacaaat 780 ccac 834
<211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 96
attcatcctg caggagtggc actggaaaag aactcttag 39 <210> 97 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 97
gactgcggcc gcgcaagtca gaaccacata taccaca 37
<210> 98 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 98
atatgctagc tattgaggag gccaaaaatg agctt 3 5 <210> 99 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 99
gactggcgcg ccgtggagtc acagtatcat aaacgct 37 <210> 100 <211> 25
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 100
aatggcaggg cagataattg taatg 25 <210> 101 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 101
aaggcattct gagccagttc tttta 25 <210> 102 <211> 1062 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 102
acagttaaaa agcatatcta acagtccttc cactgtacta attcaaggcg aaagcggtac 60 aggtaaagaa cttattgcgc agtccatcca caatgacagc agcagaaaaa ataacagctt 120 tatagcaata aattgcggtg ccatacccaa aaatttaata gaaagtgaat tattcggata 180 tgaagatgga tcattcacag gtgcaaaaca tggagggcgt gcaggaaaat ttgaacttgc 240 aaatggtggt actttatttt tagatgaaat tggggaaatg cctttagata tgcaagtaaa 300 tcttttaaga gttctccaag aaaactgtat tacaagaata ggcgggaaca gatgtgtaaa 360
aatagatata agaatcattg cagctactaa taaaaatttg agggaagaaa tacataaagg 420 aacttttcgc gaagatttat actatagact aaatgtaata cctatatatg taccaccact 480 gcgggaaaga gatatggata ttaaaatact gataaactat tttttaaaga taaaagcttt 540 taaacttaaa aaacctattc caatagtaag acctgatata tatcaaaagc tcttaaatta 600 taattggccc ggaaatgtaa gagaattgga aaattgtatt gaaaatatcg taaatatgaa 660 tggaaataca tctttcaact tcgaaaatag tatttcagta aatacgcaaa ctagtccttg 720 tactacaaaa tttaaatatg atatgtattc attaaaagag ttggaaaaag aagcaataac 780 aaattgtatg agtaattgca atggtaacat tgcaaaagct tctaaaattc tgggaataaa 840 tagaagtact ttgtatacaa aaataaaaaa atatcaaatt aatttttctt aaagtgtatg 900 taaacacaac tttgttgtaa aaagcaacat tattttctta aaaaatgttg ctttttacag 960 catttttcaa ttatatatat taaccttata aagtcctacc cccctaaatt caaccttttc 1020 atgataaaaa acatactggc acaacatttg cttatatatt ta 1062 <210> 103 <211> 823 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 103
cgtattttta attgcgaact taagatttaa ttaatatcta ctatgagtaa gtcaacatat 60 atacctaaat tatgataaaa ttatatatta taatttcaaa ataaacataa ctataataat 120 acactaagat aaagctattt atctgatggc tacctactgt aacactccct cttctatcaa 180 agtgagagat aacagtagct acgcccctag ataattcatc taaacttagt gggagaaaca 240
aaactctaaa gagaaagcga ttcactttaa atcaaagatt tgagatatct gcttctccca 300 ctaagtaaga ttcattgata taaaaaggaa ggtaatctaa taatgtttaa accatttact 360 catagtgaaa tagtcagtag gtctcttaat agatgcatta aataccatat agaaaaaggt 420 ataccaaaac ctaaacgaac acttagtcgc aaagaattgg acaacttaat aaaagaaaac 480 aacgatatta taaaaatagc aaaaccattt atggaaatac tttatgattt tttaagtgga 540 tcaggtttct cattatatct cacagacaaa aatggaattg tattaactat cataggtgac 600 aaagatattg taatggagca ggcaaaggct ggaatagcag aaggtattga tctgagtgaa 660 caaagtgcag gtacaaatgc agcaggaact gctatttttg aaaatttgtc agttcaactt 720 tcaggcaaag aacattttat aaatactttt cagatttata cctgctctgc atctgtcata 780 cataacgaac aaggaaatat aatcggatgt ctaactttaa ctg 823 <210> 104 <211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер
<400> 104
attcatcctg caggacagtt aaaaagcata tctaacagt 39 <210> 105 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 105
gactgcggcc gctaaatata taagcaaatg ttgtgcc 37 <210> 106 <211> 34 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 106
atatgctagc gtatttttaa ttgcgaactt aaga 34 <210> 107 <211> 36 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 107
gactggcgcg ccagttaaag ttagacatcc gattat 36 <210> 108 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер <400> 108
ttggaatttt agctgtagat aacaa 25 <210> 109 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 109
taagtgattt tcaatggact ttact 25 <210> 110 <211> 344 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> кассета, направляющая интрон <400> 110
aagcttataa ttatccttag atatcaatct tgtgcgccca gatagggtgt taagtcaagt 60 agtttaaggt actactctgt aagataacac agaaaacagc caacctaacc gaaaagcgaa 120 agctgatacg ggaacagagc acggttggaa agcgatgagt tacctaaaga caatcgggta 180 cgactgagtc gcaatgttaa tcagatataa ggtataagtt gtgtttactg aacgcaagtt 240 tctaatttcg attatatctc gatagaggaa agtgtctgaa acctctagta caaagaaagg 300 taagttagca agattgactt atctgttatc accacatttg taca 344 <210> 111 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 111
tgattttagg ccatgaagct gtagg 25 <210> 112 <211> 24 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 112
catgatttgt tcaactatat cacc 24 <210> 113 <211> 1005 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 113
catatgcact tttaggtaaa taagcatgct tccctgcttc cacagataaa tctggagata 60 atccaagcat aaccaagtct ttttttggac tttgtgaatt tttcaaaata ccgtaaaaaa 120 ctgaattaaa ttttgtatct acaccacaag agctatcaat tttacaatat actcctttta 180 cataaaaaat taacgttaga gtagtaataa caagaaatat attagtttta ttaaaaattt 240 gttttctatc aattttcact atccttagca taataagaac tacaagtggc aattcaacaa 300 aacattgggc tttagctcca agaaacaaaa tggacgagat aaatataaat aaaaattttt 360 tataagacct atcttctcta tgttttaaaa agtaaataat acttgaaata aacaaaagaa 420 aacctacaat catcattggt tctccataaa ggctgttaaa ccatacaata tagtttccat 480 ctactaatat tattatagat aatatactaa aaaaaactgc tgcagctata tttttaaaat 540 gaatacagct aaagcatata tataatcctg tcatatacaa aattaagtaa ataaaagcta 600
aaattctagt gtcaaaataa ttataaccaa ttaccttaca taataatttt ccaaatgtaa 660 taggataaat catgcttgta gttggaataa ttcctaaaag ccttgaaaaa ctggttggaa 720 gcattttata ttcagttaca acatacttaa accagtgagc tgaatctttc cctttggcat 780 ctgttaaacc agtagctttc attactcttt caaaatctcc ttgatctgct atacctggca 840 taggaggata aaaaagtata aataaagctg ctatgaaagc tcctaggata ctaataattg 900 gtatatatct acataaactt gaattttccc taagagacca cctattttct ttcatatttt 960 agtaataact ctcccctttc ctgggactta tccaaaaata taaca 1005 <210> 114 <211> 959 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 114
attacaagtg agcatactta tgtttcatat ttttctaaat ataaccttga taccaatgta 60 atctttatta gaaaatacgg cactggagag ccaagtgata caatggtaga agcaatttgt 120 aaggatataa aagatattac ttataaaaga gtaattgcta ttggcggcgg aagtgtcctt 180 gacgtttcaa aattgtttgc attaaagaaa gtctcgccag tacttgattt atttgatcac 240 aaattagaat ttgtaaaaga taaggaattg atcctaattc caacaacttg cggaacaggc 300 agtgaagtaa ctaatatttc tattcttgaa ttgaagtcaa gacatacaaa attaggtctt 360 gctatagatg aactatatgc agattttgct gttatgattc cagaacttct agagaattta 420 ccctttaaat tttttgcaac tagttccatt gatgccttga ttcattccat tgaatccagt 480 gtttcaccaa aagctacaag ctatacagaa atgttttcct ataaagcaat ggaaatgatc 540 ttaaaaggat atcaggagat ttcaaaaaat ggcccagacg ccaggttttc cttgttagat 600 aaatttttac ttgcaagcaa ttatgctgga attgcatttg gcaatgcagg gtgtggtgca 660 gtacatgcta tgagttatcc tttaggtgct aattaccatg ttcctcatgg agaagcaaat 720 tatcaaatgt tcattggagt atttaaaacc tattatcgtt taaaaccaca aggtaaaatt 780 acaaaactaa ataaattctt agcatccatt ttaaactgca aagaaaatga agtttacatt 840 aaaatagaag agttattaaa tgtattgatt cctaaaaaac aattacgtga gtatggggta 900 aaagaaaaag aattaaagga atttacacaa agtgttatga ctaaacaagg tcgtttaat 959 <210> 115 <211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 115
attcatcctg caggcatatg cacttttagg taaataagc 39
<210> 116 <211> 37
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический пептид <400> 116
gactgcggcc gctgttatat ttttggataa gtcccag 37 <210> 117 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 117
atatgctagc attacaagtg agcatactta tgttt 3 5 <210> 118 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 118
gactggcgcg ccattaaacg accttgttta gtcataa 37 <210> 119 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 119
agaattttgc aagttttata ttgct 25 <210> 120 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 120
aagtcaagct ctaactttga aatat 25 <210> 121 <211> 1041 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 121
tacatacaca cactaaattt ttcgataaaa taaatttaaa aacaaataaa cttaaaatag 60
agtataaaaa aaacagacat acaccccaat ggggcgaagg tctgtcgctg taccacccaa 120
attattactc gtatatataa cggctgtgcc ggcataactt actttatata aagttcagtc 180 tgcaacttag gagtgatttt caacaactgt agcttatggg ttcccaccaa atccccattc 240 tctgaaagca tatttttgtt tactcttctc cgtcatcgtt tttttatttg cactaactat 300 actataaaaa aatatgtatg tcaacaattt ttttgaaata tataattaac tctataaaga 360 aatcctaaat aaaaaatcaa ggtacaattc aaatattttt acaatcttca gctcggttaa 420 atattttgat aagcctaagc aataaattct aaaaagctaa aagtttaaat tgagtatttg 480 cttttataaa attatgaaaa atatttttta cggtaatata atgtaagaaa aacataatgc 540 aataaaaaaa taaaaaaatt ttaaaaaaac tattgacatt attctcataa ggtattatta 600 tcgtcacata cactaaatat tgataaagta aatttcaaaa acaaataaat ttttcaaagt 660 gatttaaaac caattaggtt tattttagtt ttaataaaat aaatgatatt tattagtcat 720 atccatgggg gttatttcta attgatattt tgaattggta caattgtaga gtacaaagac 780 aatgataggg aagagtaaat aggaagtatt ttttagagag tgagattttg gtgaaaactc 840 ataaatatga ctattgaagg tagccttgga gtcgtgagct gaaactaagt aggctttacc 900 ggtaaaaccg ttattacttt gagtaaaaaa ttgggtggta ccgcgcgacc aaacttctcg 960 ccccaagcag agaatgttgg ttgttttttt atacaaaaaa ttagtggtaa ttgctcaaat 1020 gctggttctt aaaattgaaa t 1041 <210> 122 <211> 1016 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 122
agattcattg attaaattgg ggtaatattt taacagtata tcaataagaa aatacttatg 60 aataacgctt atgaataagg gggcttatca tttagcggat gacttaaatt tacaggagaa 120 gtaggggagg tacttttccc cactaattcc tgtaatgtaa atatctatct ttttaggggc 180 aaaataatta taggtagata ttacttgtaa ataaaaaagg gcttataaat ataaattttt 240 ttataaaatg tgcgaaaatt attacgaaat tatatatagg tattataaaa actatgatgg 300 agaagagtaa atagtggagt atttttagag aattgggata aggtgaaaac ccatgaatac 360 gaaacttttg aaaatcactc ctaagttaca agctgaaatt agtaagctgt gtcggtatta 420 ccgttattag aattagaaaa aagttgggtg gtaccgcaaa gcttcttgcc ctaggcaggc 480 ggttattttt ttacaaaaaa tttccagatt taaggaggat actaaaaatg aaaagtgatt 540 cagtaaaaaa ggggattaag gcagctccag caagagcact tatgtatgga atgggatata 600 caaaagagga aattgaaaga cctcttatag gaatagtaaa ttcacaaaac gaaatagttg 660 caggtcacat gcatttagat gaaatagcaa aagctgcaaa acttggagta gcaatgtctg 720 ggggtactcc tatagagttt cctgctattg cagtttgcga tggaattgca atgggtcatg 780 ttggaatgaa gtattctctt gcttcaagag aactaatagc agattcaatt gaagctatgg 840 caacagctca tggttttgac ggattggtac tcatacctaa ctgtgacaaa attgtacctg 900
gaatgcttat ggcagctgca agacttaata taccagctgt tgtagtaagt ggaggaccta 960 tgagggcagg taagctaaat aacaaagcac ttgattttag cacttgtatt gaaaag 1016 <210> 123 <211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 123
attcatcctg caggtacata cacacactaa atttttcga 39 <210> 124 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 124
gactgcggcc gcatttcaat tttaagaacc agcattt 37 <210> 125 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 125
atatgctagc agattcattg attaaattgg ggtaa 3 5 <210> 126 <211> 36 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 126
gactggcgcg ccttttcaat acaagtgcta aaatca 36 <210> 127 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 127
tgagagttag tatttactct caact 25 <210> 128 <211> 25
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 128
ttctttacac aatccattac ataca 25 <210> 129 <211> 978 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 129
taaggctata tttggcaatg aaataaataa aggcgatgta attgtaataa gatatgaagg 60 accaaaaggc ggacctggaa tgagagaaat gctttcacca acttctgcta tagcaggtat 120 gggtttagat aaagatgtag cacttttaac agatggaaga ttctcaggag ctacaagagg 180 ggcatctata ggccatgtgt caccagaagc tatggaaggt ggactaatag gacttgtaga 240 agaaggagat actatatttg tagatattac aaataaaaaa ttagagctaa aagtaagtga 300 ggaagaactt gaaaagagaa gaaagaacta tgtaaagcct gaacctaaga taaaaacagg 360 atatttatca agatatgcaa aattggttac ttctgcaaat acaggtgcag ttcttaaata 420 attggagttt cttaatgtac ttttaatttg taaatatact caactttcaa ctaaaaatat 480 ttcatatatg tgaaagttga gtaaatatat tatttaataa aaattcagaa taaactattg 540 acatttaagt tgttttatag taacatatac tcatatttaa ataataaaag ctttgacagg 600 gactattaaa tatgatgtat attttaaagc gagtgggatc tggtgtaaac ccataaatat 660 ttcatattga aactcaccct tgagctgtaa gctgaaatta tagtaagctg tgccggtgtg 720 aatcgttatt gaattaagta ataaaattgg gtggtaccgc gaacagactt ctcgcctcaa 780 gagaaaggct gtttttttgt gctaattttt aacctaaaat tacctatatt aattactttg 840 aattataaat atttagtgtg tatcaagttt aaatttgatt taagtaattt aatttttaga 900 aactatttat aaatgtaaat tagaaagtat aaaatacgta ttaatatatg aaagctttga 960 aagggataag tagatatt 978 <210> 130 <211> 1002 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 130
aagttataga tgaaatgcca taagggtggt atgaaaatta aatttagagg agggacacag 60 acatggacaa tacaatatta ttgagtaaga tatcccaggg cttaatggaa tgctgtaaat 120 caaaaaattt ttcaagagta aataaattaa ctgtgaatgt aaatgaaaac agcaatatta 180 attcttgtaa tctttatgag tatcttaaaa attttaataa aggcatagta gatgaatcta 240 cagaaattaa aattgaaatt gaagatttgc cggatcaagt tgtaatcata agcagcatag 300 aaggtgatat atcacaagag tgcatataaa gtatgtataa ggtttccaca cgaaaaatca 360
aggaaatggg tatagatttg gtttttacac aaatctatac ccattcccac taagcaagat 420 taaatttctt tctaatcata ttaactaata cttttgctgt atcatcaact ccgccgaaca 480 ggctgctgtt aattaagatg tctttgtaaa gtacattatc actgtatgac tttgcataac 540 ttaggctgta tagctgacgc gcttcatcaa cttctttaat caacttatca gcttcatctg 600 gctttatatg aagtatattg atacaatttt cctttcgtat ctcataggga gcatagataa 660 atatgctgaa atgatttgaa tggtttctta aaatatagtc agaacacctt cctacaaata 720 tacaggatga tttatctgcc agatcacaga tgattttctt ttgggcttca aatatttctt 780 cttgtgtctt ttctgaacta gttcctagtg gaaatttcat ttttttgtat tcatttttat 840 ctatttcttc tccactgtca atagtagata caggcaaatt catctttttt gcagcttctt 900 caacgatatc cctgtcgtaa tattcaacgc ctaacaattc agccattttt ttagcaatgg 960 gacgtcccag actcccgaat tgacgggaaa tagttattac at 1002 <210> 131 <211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 131
attcatcctg caggtaaggc tatatttggc aatgaaata 39 <210> 132 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 132
gactgcggcc gcaatatcta cttatccctt tcaaagc 37 <210> 133 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 133
atatgctagc aagttataga tgaaatgcca taagg 3 5 <210> 134 <211> 37 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер
<400> 134
gactggcgcg ccatgtaata actatttccc gtcaatt 37 <210> 135 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 135
ataaatgaag atgcacttac tgtta 25 <210> 136 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 136
aaaatttctc cattttacga tccta 25 <210> 137 <211> 1115 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 137
agtaaatatt acgcgtaaag tgttagagaa tgggaggttg tctctaaacg aaaagcttaa 60 ataattttac tttataattt aaagcttatg atgtgatatt gcttccgctg ttacattaaa 120 gagattttgt acttacctct tttctcttta atgtgactac attaaagaga aaagaggtgt 180 ttctatgtag attttttgct ctgtgtaaat taatttaata ttataacact gggggtaaaa 240 agtatgaaaa gtagaatgaa cacaaaattt cttgttacta ccgctgtttt tgttgccgtc 300 gcagttgttt tgagatcgtt ttctatagca atagctgcag gtggcatact cactatgaga 360 ataagttttg acgccatatg ttatataatg cctggtatat tatttggacc attatatggg 420 ggaatttcag gtggattaat cgatatactt ggctatataa taagacctat gggtggatac 480 atccctttgt ttactataac taatatagca gctggtattt tgcctgcact tatatggaga 540 tatattaaaa atgctaaaga atataaagta aggaattgtt atattgcttt ctttggattg 600 ctcttagtag taggtttttt taattttatc ataatgaaat ttgcatatca tactacttta 660 ggacaactgc tatcatcttt aggaaaaaaa tctcaatacc ttagtaccgg acttatgtta 720 ataggtgcta taggcgttat tatatttata ataaatgtat ttattaagaa aagcatggta 780 aaatcctatg attttgtaaa taacaattat tttaaattaa taattgcaat tggtatatct 840 ggaattttaa tatgcactat aaatacttat atattgctta tatttactcc tgctctcatt 900 gccaaaggct ttatgttctt atggatacct agaataattg aggctcttct tatgactata 960 gtaaattcct atataacctg tatgattatg tactgttata gcttatttca aggtagggta 1020
gtaaaaaaag cttaaaacgt aaaagaaatg gggtcaaaca aatgtcccca ttttttattt 1080 ctctgtttac tcttctacta aatctgatat agccg 1115 <210> 138 <211> 956 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 138
atctaagtcc cccttttatt tatatattaa tcaattattt tatcaaataa tataataatt 60 tatacttagt tagactaaaa aatagattgc ttgttatttt tttcacatac ttatttattc 120 tttttttaca cttatttact tagctaagtt agaattacac cttttatatt atatttatat 180 aatataaaag accaaacttc tcccctctgg ggcgagaagt ttggtccgcg gtaccaccca 240 attttttact taattcaatt aacggctctg ccggtataac ttacttatat ttcagttaaa 300 caactccagg gtgattttca ctagctaata atttatgagc tttcacctaa cctcattctc 360 tttgaaatct ttcaccaatt acttttccct atcctcattt ttactatcta attttcaatt 420 taattacact ttcacattta gtatatattt taataatact atcttatttt ttaaatgtca 480 atagcttttt taaattttta gaaaataaat tcaaaaatat acatgaatac ctaggttgtt 540 aaaaaatcag accatataaa catggtctga taagcagaaa ttattttgct gcatcttgtg 600 tacttgcaaa atcttcatcg ttcataacac tatgactatt cccatataca aagtatatta 660 taagtccaac aacaagccat actgcaaatc tcaccaaagt taccttttgc agattatata 720 tcaagaaagc acaagctgcc atagcaaaaa caggtgtaac cggtgaaaat ggaactttaa 780 atgatctagg tctatccggt tctctttttc ttaaaactat aactgatgca gatactatta 840 taaatgctgc tagtgtacct atattagtta gttctgaaac aacacttatt ggtgtaaatc 900 cagctattat catagttata atgccaacaa gtaaagtact ttttacaggt gtatgg 956 <210> 139 <211> 39 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер <400> 139
attcatcctg caggagtaaa tattacgcgt aaagtgtta 39 <210> 140 <211> 36 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 140
gactgcggcc gcggctatat cagatttagt agaaga 36
<210> 141 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 141
atatgctagc atctaagtcc cccttttatt tatat 35 <210> 142 <211> 35 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 142
gactggcgcg ccatacacct gtaaaaagta cttta 3 5 <210> 143 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 143
atgctggtat atcaaatgtt ttagt 25 <210> 144 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 144
attgcagtat cagctatatt aacag 25 <210> 145 <211> 353
<212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 145
aaaaaagctt ataattatcc ttagatggcg ctccggtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcgattcca tctcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt aaccggagcg acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 3 53 <210> 146
<211> 353 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 146
aaaaaagctt ataattatcc ttagttaacc aagcagtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcgatttta actcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt atctgcttgg acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 353 <210> 147 <211> 353 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 147
aaaaaagctt ataattatcc ttaagtgtct tatcggtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcgattaca cttcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt atccgataag acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 3 53 <210> 148 <211> 353 <212> ДНК
<213> Clostridium autoethanogenum <400> 148
aaaaaagctt ataattatcc ttacatgacc agcccgtgcg cccagatagg gtgttaagtc 60 aagtagttta aggtactact ctgtaagata acacagaaaa cagccaacct aaccgaaaag 120 cgaaagctga tacgggaaca gagcacggtt ggaaagcgat gagttaccta aagacaatcg 180 ggtacgactg agtcgcaatg ttaatcagat ataaggtata agttgtgttt actgaacgca 240 agtttctaat ttcggtttca tgtcgataga ggaaagtgtc tgaaacctct agtacaaaga 300 aaggtaagtt aaggggctgg acttatctgt tatcaccaca tttgtacaat ctg 353 <210> 149 <211> 24 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический праймер <400> 149
cacaacccgt catgagcaag gtgc 24
<210> 150 <211> 19 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 150
tgtaattact aaatcagcc 19 <210> 151 <211> 24 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 151
ggaagtcagg gacatgcaca tgct 24 <210> 152 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 152
cattttcagg agcatatcca gcttc 25 <210> 153 <211> 25 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 153
gtgcaggtgg cggagttata ctggc 25 <210> 154 <211> 21 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 154
ccatagttcc gaggcctcca g 21 <210> 155 <211> 23
<212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 155
ggagctgaag tactattaaa atg 23 <210> 156 <211> 22 <212> ДНК
<213> искусственная последовательность <220>
<223> Синтетический праймер <400> 156
ctacttcagc tgattgtacg tc 22
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, адаптированный для выработки одного или более продуктов и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника или по существу отсутствия выработки 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, причем указанный микроорганизм содержит одну или более генетических модификаций, которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола, по сравнению с исходным микроорганизмом.
2. Рекомбинантный карбоксидотрофный ацетогенный микроорганизм, адаптированный для выработки этанола в качестве основного продукта и сниженного количества 2,3-бутандиола и/или его предшественника или по существу отсутствия выработки 2,3-бутандиола и/или его предшественника при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, причем укаханный микроорганизм содержит одну или более генетических модификаций, которые нарушают путь биосинтеза 2,3-бутандиола, по сравнению с исходным микроорганизмом.
3. Рекомбинантный микроорганизм по п. 2, отличающийся тем, что микроорганизм адаптирован для дополнительной выработки одного или более из: формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата.
4. Рекомбинантный микроорганизм по п. 2 или 3, отличающийся тем, что указанный микроорганизм адаптирован для выработки повышенного количества одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата, по сравнению с исходным микроорганизмом.
5. Рекомбинантный микроорганизм по любому из п.п. 1-4, отличающийся тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат.
1.
6. Рекомбинантный микроорганизм по любому из п.п. 1-4, отличающийся
тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую
модификацию, которая нарушает экспрессию и/или активность одного или более
ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин.
7. Рекомбинантный микроорганизм по любому из п.п. 1-4, отличающийся тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает экспрессию и/или активность одного или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол.
8. Рекомбинантный микроорганизм по любому из п.п. 1-4, отличающийся тем, что указанный микроорганизм содержит по меньшей мере одну генетическую модификацию, которая нарушает экспрессию и/или активность комбинации двух или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и ацетоин в 2,3-бутандиол.
9. Рекомбинантный микроорганизм по п. 5 или 8, отличающийся тем, что один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS).
10. Рекомбинантный микроорганизм по п. 6 или 8, отличающийся тем, что указанный один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу (budA).
11. Рекомбинантный микроорганизм по п. 7 или 8, отличающийся тем, что один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3-bdh), ацетоинредуктазы, первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы.
12. Рекомбинантный микроорганизм по любому одному или более чем одному из п.п. 1-11, отличающийся тем, что одна или более генетических модификаций нарушают экспрессию и/или активность одного или более из: ацетолактатсинтазы (alsS), ацетолактатдекарбоксилазы (BudA), 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоинредуктазы и первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы.
7.
13. Рекомбинантный микроорганизм по любому из п.п. 1-12,
отличающийся тем, что исходный микроорганизм выбран из группы, включающей
Clostridium autoethanogenum, Clostridium ljungdahlii, Clostridium ragsdalei и
Clostridium coskatii.
14. Рекомбинантный микроорганизм по п. 12, отличающийся тем, что исходный микроорганизм представляет собой Clostridium autoethanogenum DSM23693.
15. Способ получения рекомбинантного карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, который способен вырабатывать один или более продуктов и сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или по существу не вырабатывает 2,3-бутандиол и/или его предшественник, при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, причем указанный способ включает генетическое модифицирование исходного карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма с нарушением пути биосинтеза 2,3-бутандиола.
16. Способ получения рекомбинантного карбоксидотрофного ацетогенного микроорганизма, который способен вырабатывать этанол в качестве основного продукта и сниженное количество 2,3-бутандиола и/или его предшественника или не вырабатывает 2,3-бутандиол и/или его предшественник, при ферментации субстрата, содержащего моноксид углерода, причем указанный способ включает генетическое модифицирование карбоксидотрофного ацетогенного исходного микроорганизма с нарушением пути биосинтеза 2,3-бутандиола.
17. Способ по п. 15 или 16, отличающийся тем, что указанный способ включает введение в исходный микроорганизму одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и/или ацетоин в 2,3-бутандиол.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что указанный способ включает введение в исходный микроорганизму одной или более генетических модификаций, которые нарушают комбинацию двух или более генов, кодирующих фермент, способный превращать пируват в ацетолактат, ацетолактат в ацетоин и/или ацетоин в 2,3-бутандиол.
14.
19. Способ по п. 17 или 18, отличающийся тем, что один или более ферментов, способных превращать пируват в ацетолактат, представляет собой ацетолактатсинтазу (alsS), один или более ферментов, способных превращать ацетолактат в ацетоин, представляет собой ацетолактатдекарбоксилазу (budA) и/или один или более ферментов, способных превращать ацетоин в 2,3-бутандиол, представляет собой фермент, выбранный из 2,3-бутандиолдегидрогеназы (2,3bdh), ацетоинредуктазы, первичной:вторичной алкогольдегидрогеназы.
20. Способ по п. 15-19, отличающийся тем, что указанный способ включает введение в исходный микроорганизм одной или более генетических модификаций, которые нарушают один или более генов, кодирующих одну или более : ацетолактатсинтазу (alsS), ацетолактатдекарбоксилазу (BudA) и 2,3-бутандиолдегидрогеназу (2,3 bdh).
21. Рекомбинантный микроорганизм, полученный способом по любому из п.п. 15-20.
22. Способ получения одного или более продуктов, причем указанный способ включает ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением микроорганизма по любому из п.п. 1-14 и 21.
23. Способ получения одного или более из: этанола, формиата, лактата, пирувата, сукцината, валина, лейцина, изолейцина, ацетолактата, малата, фумарата, 2-оксоглутарата, цитрата, причем указанный способ включает ферментацию субстрата, содержащего СО, с применением микроорганизма по любому из п.п. 1-14 и 21.
24. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
(а) помещение субстрата, содержащего СО, в биореактор, содержащий
культуру одного или более микроорганизмов по любому из п.п 1-13 и 19; и
(б) анаэробная ферментация культуры в биореакторе с получением
одного или более продуктов, предпочтительно включающих этанол.
25. Способ по п. 22 или 23, отличающийся тем, что указанный способ
включает следующие стадии:
(а) захват СО-содержащего газа, полученного в результате
производственного процесса, до высвобождения газа в атмосферу;
(б) анаэробная ферментация СО-содержащего газа с получением одного
или более продуктов, предпочтительно включающих этанол,
осуществляемаякультурой, содержащей один или более микроорганизмов по
любому из п.п. 1-13 и 19.
26. Способ по любому из п.п. 22-25, отличающийся тем, что субстрат содержит по меньшей мере от примерно 20% до примерно 100% СО по объему.
27. Способ по любому из п.п. 22-26, отличающийся тем, что способ дополнительно включает стадию выделения одного или более продуктов из феремнтативного бульона.
28. Один или более продуктов, полученных способом по любому из п.п. 2227.
29. Один или более продуктов по п. 28, отличающихся тем, что указанные один или более продуктов выбраны из группы, включающей этанол, формиат, лактат, пируват, сукцинат, валин, лейцин, изолейцин, ацетолактат, малат, фумарат, цитрат и 2-оксоглутарат.
28.
со2
со2
Путь Вуда-Льюнгдаля
формиат
[СНО]=ТНР
[CHj-THF
[CH2]=THF
[CH,]-THF
[CHj]-CoFeS-P
Ацетат, Этанол Ацетил-КоА
Лактатдегидрогеназа (IdhA) У C02
Лактат < Пируват
I ВСАА-путь I
Валин,
Ацетолактатсинтаза (alsS)
Ацетолактат
Лейцин
Ацетолактдекарбоксилаза (budA)
Ацетоин
2,3-бутандиолдегидрогеназа У (2,3bdh)
2,3-Бутандиол
Путь 2,3-бутандиола
Фиг. 1а
Путь Вуда-Льюнгдаля
со,
формиат
[CHGJETHF"
[CH1-THF [CH2J=THF [CHJ-1HF [CHjj-CoFeS-P
Ацетат, Этанол^
Ацетил-КоА
ФЕП
Цитрат лиаза
Ацетоин
2,3 -бутандиолдегидрогеназа (2,3bdh)
2,3-Бутандиол Путь
I 2,3-бутандиола
I детищ
/ Малат-дегидрогеназа
Незамкнутый цикл ТКК
Малат
Фумарат-гидратаза^
Фумарат
Сукцинат-дегидрогеназа
Сукцинат
Цитрат Аконитаза I
цис- Аконит ат
Аконитаза
Изоцитрат
Изоцитрат-дегидрогеназа
2-Оксоглутарат
Фиг. 16
д.т./ко 2,7 т.п.н./ 2,2 т.п.н.
9f 12r Wt/ko
2.7 kb/2.2 kb
Фиг. 5
Og44f/ Og45r Qg42f/ Og43r
1 2 3 4 wt Д-т. 1 2 3 4 +ve
Дикий тип
80,00 ;"
70,00
"й 60,00
I 50,00 i
^ " ^Ацетоин I 40-00 шМезо-БДО
U ШЮ 1)-ВДО
| 20.00
^ I ill ill ii в
10,00., § И Щ Щ-
0,00 ., Mjmk Шт^ Иц Иц
0,00 0,24 0,50 0,76 1,00 час
100,00
90,00
^ 80,00 ч -
g 70,00 I 60,00) 50,00 140,00 I 30,00 о 20,00
10,00 0,00
Мутант A2,3bdh ClosTron
0,53 1,00 1,48 2,03 2,48 час
ш /Ацетоин ^Мезо-БДО
шО-БДО
Фиг. 7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ ОПИСАНИЯ В ОТВЕТ НА УВЕДОМЛЕНИЕ ОТ 22.09.2014 Г.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ ОПИСАНИЯ В ОТВЕТ НА УВЕДОМЛЕНИЕ ОТ 22.09.2014 Г.