[RU]

Изобретение относится, частично, к способам диагностики поражения β-клеток поджелудочной железы, прогнозирования для субъекта риска развития поражения β-клеток поджелудочной железы, мониторинга функции β-клеток поджелудочной железы или массы β-клеток поджелудочной железы у субъекта, имеющего риск развития поражения β-клеток поджелудочной железы, мониторинга эффективности лечения поражения β-клеток поджелудочной железы у субъекта, идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения β-клеток поджелудочной железы, выбор субъекта для лечения поражения β-клеток поджелудочной железы, выбор субъекта для участия в клиническом исследовании и обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума в β-клетке поджелудочной железы. Данные способы включают определение по меньшей мере одного уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие растворимый белок MANF, и наборы, содержащие антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с растворимым MANF.

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится, частично, к способам диагностики поражения β-клеток поджелудочной железы, прогнозирования для субъекта риска развития поражения β-клеток поджелудочной железы, мониторинга функции β-клеток поджелудочной железы или массы β-клеток поджелудочной железы у субъекта, имеющего риск развития поражения β-клеток поджелудочной железы, мониторинга эффективности лечения поражения β-клеток поджелудочной железы у субъекта, идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения β-клеток поджелудочной железы, выбор субъекта для лечения поражения β-клеток поджелудочной железы, выбор субъекта для участия в клиническом исследовании и обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума в β-клетке поджелудочной железы. Данные способы включают определение по меньшей мере одного уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта. Также предложены фармацевтические композиции, содержащие растворимый белок MANF, и наборы, содержащие антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с растворимым MANF.

---

2420-517699RU/042 РАСТВОРИМЫЙ MANF ПРИ ПОРАЖЕНИЯХ БЕТА-КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ
ЖЕЛЕЗЫ
Описание
Заявленный приоритет
По данной заявке испрашивается приоритет согласно патентной заявке США с серийным № 61/590021, поданной 24 января 2 012 г. Полное содержание патентной заявки США с серийным № 61/590021 включено в настоящее описание посредством ссылки.
Предпосылки создания изобретения
Потеря функции или количества р-клеток поджелудочной железы у субъекта вносит вклад в патогенез некоторых заболеваний, включая диабет 1 типа (сахарный диабет), диабет 2 типа и синдром Вольфрама. При диабете 1 типа пациент имеет высокие уровни глюкозы в крови из-за дефицита инсулина. Вообще говоря, абсолютный дефицит инсулина имеет место у пациентов с диабетом 1 типа, тогда как у пациентов с диабетом 2 типа имеет место относительный дефицит инсулина. Появляется все больше данных, указывающих на то, что уменьшение массы функциональных Р-клеток поджелудочной железы является общей чертой как диабета
1 типа, так и диабета 2 типа, а также генетических форм диабета, таких как синдром Вольфрама (Pipeleers et al. , Novartis Found Symp. 2 92: 19-2 4, 2 008) . В процессе прогрессирования диабета 1 типа или 2 типа постепенно снижается функция и масса р-клеток поджелудочной железы, в конечном итоге приводя к дефициту инсулина и гипергликемии. Последние данные показывают, что "находящиеся в состоянии стресса" р-клетки поджелудочной железы подвержены дисфункции и гибели (Oslowski et al. , Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 17: 107-112, 2010; Oslowski et al. , Curr. Opin. Cell Biol. 23: 207-215, 2011; Fonseca et al., Trends Endocrinol. Metab. 22: 266-274,
2 011) . Диагностические маркеры, которые помогают в прогнозировании восприимчивости субъекта к развитию дисфункции и гибели р-клеток поджелудочной железы, будут полезны для лечения или задержки прогрессирования заболеваний, связанных с
поражением р-клеток поджелудочной железы (например, диабета 1 типа и 2 типа) у субъектов. Сущность изобретения
Изобретение основано, частично, на том открытии, что находящиеся в состоянии стресса р-клетки поджелудочной железы продуцируют и секретируют растворимый мезенцефалический нейротрофический фактор астроцитов (MANF), растворимый MANF защищает р-клетки поджелудочной железы от индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза, и растворимый MANF поддерживает окислительно-восстановительный гомеостаз
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы.
В свете этих открытий, в настоящем изобретении предложены способы (например, in vitro способы) диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы, мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта (например, субъекта с риском развития поражения р-клеток поджелудочной железы), идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для участия в клиническом исследовании, а также обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы включают определение по меньшей мере одного уровня растворимого MANF (например, эндогенных уровней растворимого MANF в биологическом образце от субъекта или в культуральной среде).
В настоящем изобретении также предложены способы (например, in vitro способы) диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающие определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с
эталонным уровнем растворимого MANF и идентификацию субъекта, имеющего повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, как имеющего поражение р-клеток поджелудочной железы.
В настоящем изобретении также предложены способы
(например, in vitro способы) прогнозирования для субъекта риска
развития поражения р-клеток поджелудочной железы, включающие:
определение уровня растворимого мезенцефалического
нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF и идентификацию субъекта, имеющего повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, как имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, или идентификацию субъекта, имеющего понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, как имеющего обычный или пониженный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы.
В настоящем изобретении также предложены способы (например, in vitro способы) мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающие: определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта в первый момент времени; определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени и идентификацию субъекта, имеющего повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени, как имеющего снижение функции р-клеток поджелудочной железы или снижение
количества р-клеток поджелудочной железы, или идентификацию субъекта, имеющего понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени, как не имеющего изменений или имеющего возрастание функции р-клеток поджелудочной железы, или не имеющего изменений или имеющего увеличение массы р-клеток поджелудочной железы субъекта.
В настоящем изобретении также предложены способы
(например, in vitro способы) мониторинга эффективности лечения поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Данные способы включают определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта в первый момент времени, определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени и сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени, где (i) первый момент времени выбирают до начала лечения, и второй момент времени выбирают в любое время после начала лечения или (ii) первый момент времени выбирают в период после начала лечения, и второй момент времени выбирают в более поздний период во время или после лечения; и пониженный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени указывает на то, что лечение было эффективным для субъекта.
Также предложены способы лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, способы
(например, in vitro способы) понижения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или способы (например, in vitro способы) понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза клеток в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы. Данные способы включают введение эффективного количества растворимого MANF или апоморфина
субъекту или приведение р-клетки поджелудочной железы или популяции р-клеток поджелудочной железы в контакт с растворимым MANF или апоморфином. В некоторых вариантах осуществления растворимый MANF содержит последовательность, которая по меньшей мере на 80% (например, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична последовательности растворимого белка MANF млекопитающих (например, любой из SEQ ID N0:2 и 4-7) . В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона.
В настоящем изобретении также предложены способы
применения любого из растворимых MANF, описанных в настоящем
описании (например, растворимого MANF, содержащего
последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична SEQ ID N0:2), или апоморфина в производстве лекарственного средства для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В настоящем изобретении также предложен выделенный растворимый MANF (например, выделенный растворимый MANF, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID N0:2), или апоморфин для применения в лечении или задержке начала поражения Р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
В настоящем изобретении также предложены способы (например, in vitro способы) скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, способы (например, in vitro способы) понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и способы (например, in vitro способы) понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы включают получение Р~ клетки поджелудочной железы, приведение р-клетки поджелудочной железы в контакт с соединением-кандидатом, определение уровня растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной
железы в присутствии соединения-кандидата, сравнение уровня
растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной
железы, с эталонным уровнем растворимого MANF и выбор
соединения, которое связано с повышенным уровнем растворимого
MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, по
сравнению с эталонным уровнем, в качестве соединения-кандидата
для лечения или задержки начала поражения р-клеток
поджелудочной железы у субъекта. В данных способах повышенный
уровень растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой
поджелудочной железы, по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы.
Предложены также способы (например, in vitro способы) скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы
включают получение клетки млекопитающего (например, р-клетки
поджелудочной железы), экспрессирующей репортерный белок,
содержащий сигнальную последовательность BiP, чувствительный к
окислению-восстановлению флуоресцентный белок (например,
чувствительный к окислению-восстановлению зеленый
флуоресцентный белок) и аминокислотную последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с тестируемым соединением; определение количества окисленного репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение количества окисленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным
уровнем; где повышенный уровень окисленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой количество окисленного репортерного белка, присутствующего в клетке млекопитающего в отсутствие соединения-кандидата. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой пороговый уровень окисленного репортерного белка.
Предложены также способы (например, in vitro способы) скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у
субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы
включают получение клетки млекопитающего (например, р-клетки
поджелудочной железы), экспрессирующей репортерный белок,
содержащий сигнальную последовательность BiP, чувствительный к
окислению-восстановлению флуоресцентный белок (например,
чувствительный к окислению-восстановлению зеленый
флуоресцентный белок) и аминокислотную последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с тестируемым соединением; определение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным уровнем; где пониженный уровень восстановленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой количество восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке млекопитающего в отсутствие соединения-кандидата. В некоторых
вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой пороговый уровень восстановленного репортерного белка.
Предложены также наборы, включающие антитело или
антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые связываются
специфически с растворимым MANF (например, растворимым MANF
человека) , и по меньшей мере одно антитело или один
антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые связываются с
белком, выбранным из инсулина, С-белка и островкового
амилоидного полипептида (IAPP). Предложены также
фармацевтические композиции, содержащие растворимый белок MANF
(например, растворимый белок MANF, содержащий
последовательность, по меньшей мере на 8 0% идентичную SEQ ID
N0:2) и/или апоморфин и по меньшей мере одно дополнительное
средство для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы
(например, пиоглитазон, TUDCA, GLP-1 или ингибитор DPP-4
(например, ситаглиптин, вилдаглиптин, саксаглиптин,
линаглиптин, дутоглиптин, гемиглиптин и алоглиптин)).
Термин "поражение р-клеток поджелудочной железы" означает заболевание, которое включает, как часть его патогенеза, снижение функции р-клеток поджелудочной железы (например, секреции инсулина) или уменьшение количества жизнеспособных инсулин-секретирующих р-клеток поджелудочной железы, имеющихся у субъекта (массы р-клеток поджелудочной железы). В некоторых вариантах осуществления поражение р-клеток поджелудочной железы может быть дополнительно охарактеризовано увеличением стресса эндоплазматического ретикулума в популяции р-клеток поджелудочной железы (например, в двух или более р-клетках поджелудочной железы) у субъекта. Как описано в настоящем описании, снижение функции р-клеток поджелудочной железы, уменьшение количества жизнеспособных р-клеток поджелудочной железы (массы р-клеток поджелудочной железы) или повышение стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы у субъекта могут быть обнаружены косвенно с использованием способов, описанных в настоящем описании, или
других способов, известных в данной области. Неограничивающие примеры поражения р-клеток поджелудочной железы включают диабет 1 типа (сахарный диабет), диабет 2 типа и синдром Вольфрама.
Термин "функция р-клеток поджелудочной железы" означает биологическую активность, используемую для характеристики р-клеток поджелудочной железы млекопитающего (например, человека) (например, активность, которая уникальна именно для р-клеток поджелудочной железы). Неограничивающие примеры функции р-клеток поджелудочной железы включают синтез и секрецию инсулина, синтез и секрецию островкового амилоидного полипептида (IAPP), а также синтез и секрецию С-пептида. Способы определения синтеза и секреции инсулина, IAPP и С-пептида известны в данной области. Функцию р-клеток поджелудочной железы можно также определять косвенно с использованием способов, описанных в настоящем описании, а также способов, известных в данной области (например, определения уровней глюкозы в крови и определения уровней гликированного гемоглобина А1с) .
Термин "масса р-клеток поджелудочной железы" означает общее количество жизнеспособных инсулин-секретирующих р-клеток поджелудочной железы у млекопитающего (например, человека). Способы косвенного определения массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта описаны в настоящем описании. Дополнительные способы косвенного определения массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта известны в данной области (например, определение уровней глюкозы в крови и определение уровней гликированного гемоглобина А1с) .
Масса р-клеток поджелудочной железы может представлять собой общее количество эндогенных жизнеспособных р-клеток поджелудочной железы у субъекта или может представлять собой сумму количества эндогенных жизнеспособных р-клеток поджелудочной железы у субъекта плюс количество жизнеспособных Р-клеток поджелудочной железы, трансплантированных субъекту (например, аутотрансплантированных, аллотрансплантированных или
ксенотрансплантированных жизнеспособных р-клеток поджелудочной железы).
Термин "растворимый MANF" означает белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична последовательности характерной для млекопитающих формы растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF). Например, растворимый MANF может представлять собой белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична (например, по меньшей мере на 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична) любой из SEQ ID N0:2 и 4-7, то есть, полной длине SEQ ID N0:2 или 4-7. В некоторых вариантах осуществления растворимый MANF может представлять собой растворимый MANF дикого типа млекопитающих (например, SEQ ID N0:2 и 4-7).
Растворимый белок MANF можно вводить в качестве терапевтического лечения (например, в виде рекомбинантного или очищенного эндогенного белка с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании). Очищенный растворимый белок MANF может быть, например, по меньшей мере на 80% (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95% или 99%) чистым, в расчете на сухую массу. Дополнительные модифицированные формы растворимого MANF описаны в настоящем описании.
Термины " повышение" или "повышенный" означают измеримое, поддающееся обнаружению или значительное увеличение уровня по сравнению с эталонным уровнем или уровнем, измеренным в более ранний или поздний момент времени у одного и того же субъекта (например, в биологическом образце от одного и того же субъекта).
Термин "понижение" означает измеримое, поддающееся обнаружению или значительное снижение уровня по сравнению с эталонным уровнем или уровнем, измеренным в более ранний или поздний момент времени у одного и того же субъекта (например, в биологическом образце от одного и того же субъекта).
Фраза "соединение, которое связано с повышенным уровнем растворимого MANF" означает соединение, которое индуцирует или приводит к повышению уровня присутствующего растворимого MANF (например, белка или мРНК), продуцируемого или секретируемого клеткой млекопитающего, находящейся в контакте с соединением, по сравнению с уровнем присутствующего растворимого MANF (например, белка или мРНК), продуцируемого или секретируемого контрольной клеткой млекопитающего (например, той же самой или того же типа клеткой млекопитающего) в отсутствие соединения.
Фраза "риск развития заболевания" означает относительную вероятность того, что у субъекта разовьется поражение р-клеток поджелудочной железы в будущем, по сравнению с контрольным субъектом или популяцией (например, здоровым субъектом или популяцией, или субъектом или популяцией без поражения р-клеток поджелудочной железы в семейном анамнезе). В настоящем изобретении предложены способы определения для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы (в будущем), которые включают определение уровня растворимого MANF.
Термин "лечение" включает уменьшение числа симптомов или снижение тяжести, длительности или частоты одного или более симптомов заболевания (например, поражения Р-клеток поджелудочной железы) у субъекта. Термин "лечение" также включает снижение риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта (в будущем) или задержку появления одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
Фраза "задержка начала поражения р-клеток поджелудочной железы" означает увеличение продолжительности времени до того, как один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы будут наблюдаться у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект может быть ранее идентифицирован, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Как описано в настоящем описании, субъект может быть идентифицирован, как имеющий повышенный риск
развития поражения р-клеток поджелудочной железы, с использованием способов, описанных в настоящем описании, или путем изучения семейного анамнеза с точки зрения поражения р-клеток поджелудочной железы (например, диабета 2 типа).
Термин "биологический образец" включает любой образец, полученный от субъекта, включая биологическую жидкость. В неограничивающих примерах образцов, биологический образец может включать кровь, сыворотку, плазму, мочу, цереброспинальную жидкость, слюну, желчь, желудочный сок или грудное молоко.
Фраза "стресс эндоплазматического ретикулума" означает дисбаланс в эндоплазматическом ретикулуме между продукцией активных форм кислорода (прооксидантных форм) и способностью клетки или клеточной органеллы обезвреживать (удалять) активные формы кислорода (или их промежуточные соединения), который приводит к сдвигу окислительно-восстановительного потенциала просвета эндоплазматического ретикулума и/или накоплению неправильно свернутых или несвернутых белков в просвете эндоплазматического ретикулума. Стресс эндоплазматического ретикулума запускает уникальный стрессовый путь, называемый реакцией несвернутых белков (РНБ, UPR) (далее описанный в настоящем описании).
Стресс эндоплазматического ретикулума в р-клетках
поджелудочной железы может быть вызван рядом молекулярных
событий (например, повышением уровня свободных жирных кислот в
эндоплазматическом ретикулуме, гиперинсулинемией,
гиперпродукцией VEGF, гипоксией, депривацией глюкозы, мутантным островковым амилоидным полипептидом, мутантным инсулином, повышением уровней IL-1, повышением уровней IFN-y или вирусной инфекцией). Можно также использовать множество различных химических средств для индукции стресса эндоплазматического ретикулума (например, тапсигаргин или туникамицин). Показано, что стресс эндоплазматического ретикулума сдвигает среду эндоплазматического ретикулума от окислительного состояния в сторону более восстановительного состояния. В некоторых вариантах осуществления средства, обладающие способностью
сдвигать среду эндоплазматического ретикулума от
восстановительного в сторону окислительного состояния в условиях стресса ЭР, будут помогать уменьшать стресс ЭР и/или могут уменьшать или предотвращать индуцированный стрессом ЭР апоптоз клеток.
Стресс эндоплазматического ретикулума можно детектировать с использованием множества различных способов, известных в данной области. Иллюстративные способы детектировавания, понижения или задержки начала развития стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы описаны в настоящем описании.
Фраза "популяция р-клеток поджелудочной железы" означает две или более р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления популяция р-клеток поджелудочной железы может находиться в организме субъекта-млекопитающего (например, человека) (например, эндогенные р-клетки поджелудочной железы субъекта, аутотрансплантированные, аллотрансплантированные или ксенотрансплантированные р-клетки поджелудочной железы). В некоторых вариантах осуществления популяцию р-клеток поджелудочной железы можно культивировать in vitro (культура ткани). В некоторых вариантах осуществления популяция р-клеток поджелудочной железы представляет собой линию р-клеток поджелудочной железы (например, такие линии р-клеток поджелудочной железы, которые описаны в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы могут быть получены от млекопитающего любого вида (например, человека, обезьяны (например, шимпанзе), мыши, свиньи, крысы или человекообразной обезьяны). В некоторых вариантах осуществления популяция р-клеток поджелудочной железы может представлять собой линию первичных клеток или линию иммортализованных клеток.
Термин "Р-клетка поджелудочной железы" означает инсулин-продуцирующую клетку, которая обычно находится в поджелудочной железе млекопитающего в островке Лангерганса. Используемый в
настоящем описании термин "Р-клетки поджелудочной железы"
охватывает р-клетки поджелудочной железы, находящиеся в
организме млекопитающего (например, эндогенные р-клетки
поджелудочной железы или аутотрансплантированные,
аллотрансплантированные или ксенотрансплантированные Р-клетки поджелудочной железы), или р-клетки поджелудочной железы, культивируемые in vitro (например, ex vivo (например, первичная) культура р-клеток поджелудочной железы от млекопитающего любого вида, описанная в настоящем описании, или линия р-клеток поджелудочной железы (например, линия первичных или иммортализованных клеток)). В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы, находящиеся в организме млекопитающего, находятся в поджелудочной железе. В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы, находящиеся в организме млекопитающего, локализованы в ткани, отличной от ткани поджелудочной железы (например, в ткани печени). В других вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы инкапсулированы в устройстве (например, биосовместимом полимере), которое имплантировано в организм субъекта. Термин "Р-клетки поджелудочной железы" также охватывает р-клетки поджелудочной железы в линии клеток млекопитающего (например, человека, свиньи, крысы и мыши) или в культуре первичных клеток млекопитающего (например, человека, свиньи, крысы и мыши). В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы могут быть генетически изменены с помощью молекулярно-биологических методов экспрессии одного или более рекомбинантных белков (например, инсулина) и/или снижения экспрессии одного или более эндогенных белков.
Термин "индуцированный эндоплазматическим ретикулумом апоптоз" означает программируемую клеточную гибель, которая запускается стрессом в эндоплазматическом ретикулуме клетки (например, р-клетки поджелудочной железы). В некоторых вариантах осуществления стресс эндоплазматического ретикулума, который индуцирует апоптоз, индуцирует путь реакции несвернутых
белков (РНБ) в клетке (например, р-клетке поджелудочной железы). Иллюстративные компоненты пути РНБ описаны в настоящем описании. Как описано в настоящем описании, стресс эндоплазматического ретикулума может быть вызван рядом веществ (например, биологических и химических веществ). Способы обнаружения, измерения, понижения и задержки начала развития индуцированного эндоплазматическим ретикулумом апоптоза в р-клетках поджелудочной железы описаны в настоящем описании. Дополнительные способы обнаружения и измерения индуцированного эндоплазматическим ретикулумом апоптоза известны в данной области.
Термин "определение уровня" означает использование одного или более научных методов (например, молекулярно-биологических, молекулярно-генетических, иммунологических и биохимических методов или анализов) оценки уровня конкретной молекулы
(например, в биологическом образце или культуральной среде клеток). Термин "определение уровня" включает создание физического контакта одного или более реагентов, которые специфически связываются с конкретной молекулой (например, антитела или антигенсвязывающего фрагмента антитела) с образцом
(например, биологическим образцом или культуральной средой клеток).
Термин "второй момент времени", как правило, означает любой момент во времени, который имеет место после первого момента времени (например, времени госпитализации). Второй момент времени может иметь место, например, по меньшей мере через б часов, 12 часов, 24 часов, 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, б дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 4 недели, б недель, 2 месяца, б месяцев, 1 год или 2 года после первого момента времени. В некоторых вариантах осуществления субъект может получать лечение между первым моментом времени и вторым моментом времени.
Термин "чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок" означает белок, у которого изменяются его флуоресцентные свойства (например, происходят изменения в
спектре возбуждения и/или излучения (например, в длинах волн
пика возбуждения или излучения) при изменении в его
окислительно-восстановительном окружении (например, изменении в
окислительно-восстановительном окружении эндоплазматического
ретикулума)). В некоторых вариантах осуществления это изменение
флуоресцентных свойств белка может происходить, например, в
результате образования и/или разрыва одной или более
дисульфидных связей. Неограничивающие примеры чувствительных к
окислению-восстановлению флуоресцентных белков включают
чувствительный к окислению-восстановлению зеленый
флуоресцентный белок (roGFP) и чувствительный к окислению-
восстановлению желтый флуоресцентный белок (rxYFP).
Дополнительные чувствительные к окислению-восстановлению
флуоресцентные белки известны в данной области.
Другие определения появляются в контексте на протяжении данного описания. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое им обычно придают специалисты в области, к которой относится изобретение. Способы и материалы описаны в настоящем описании для применения в настоящем изобретении; можно также использовать другие подходящие способы и материалы, известные в данной области. Материалы, способы и примеры являются только иллюстративными и не должны быть ограничивающими. Все публикации, патентные заявки, патенты, последовательности, записи в базе данных и другие литературные источники, приведенные в настоящем описании, включены в полном объеме посредством ссылок. В случае конфликта, настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.
Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего далее подробного описания и фигур, а также из формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг.1 приведен иммуноблот, демонстрирующий уровни белка M7ANF в концентрированной среде от культивируемой линии [3-клеток
поджелудочной железы крысы (INS-1 832/13) или в лизате от линии |3-клеток поджелудочной железы крысы (INS-1 832/13) после отсутствия обработки или обработки тапсигаргином (50 нМ) или туникамицином (0,5 мкг/мл) в течение 24 часов.
На фиг.2 приведен график, демонстрирующий относительную экспрессию мРНК MANF в линии р-клеток поджелудочной железы крысы (INS-1 832/13), культивированных в следующих условиях: 11 мМ глюкозы (24 часа) ; 2 5 мМ глюкозы (24 часа) ; 2 5 мМ глюкозы (48 часов) ; 2 5 мМ глюкозы (72 часа) ; 11 мМ глюкозы и 5 мкМ туникамицина (ТМ) (24 часа); или 11 мМ глюкозы и 2 0 нМ тапсигаргина (ТГ) (24 часа). Приведенные данные получены с использованием количественной ПЦР в реальном времени (п=3, S . D. ) .
На фиг.3 приведен график, демонстрирующий относительную экспрессию мРНК MANF, WFS1, TXNIP и CHOP в первичных островковых клетках мыши, культивированных в течение пяти дней с 5 мМ глюкозой (НГ) , 11 мМ глюкозой (СГ) или 25 мМ глюкозой (ВГ), или в течение пяти дней с 5 мМ глюкозой (НГ) и б часов с 0,5 мкМ тапсигаргином (ТГ). Приведенные данные получены с использованием количественной ПЦР в реальном времени (п=3; S . D. ) .
На фиг.4 приведен график, демонстрирующий относительную экспрессию мРНК MANF в первичных островковых клетках человека от двух человек-доноров (НР11139-01 и HI 11-20) после 24-часовой обработки 5,5 мМ глюкозой (НО), 25 мМ глюкозой (ВГ) , 0,25 мкМ тапсигаргином (ТГ), 10 мкМ островковым амилоидным полипептидом (IAPP) или 50 0 мкМ пальмитатом с бычьим сывороточным альбумином (пальмитат). Приведенные данные получены с использованием количественной ПЦР в реальном времени (n=3; S.D.) .
На фиг.5 приведен иммуноблот, демонстрирующий уровень растворимого MANF в среде от первичных островковых клеток человека после отсутствия дополнительной обработки или обработки 25 мМ глюкозой (24 часа), 0,25 мкМ тапсигаргином (24 часа) или 0,5 мМ пальмитатом (24 часа).
На фиг.б приведен иммуноблот, демонстрирующий уровень
растворимого MANF, иммунопреципитированного из среды от
первичных островковых клеток человека после отсутствия
дополнительной обработки или обработки 25 мМ глюкозой (24
часа), 0,2 5 мкМ тапсигаргином (24 часа) или 0,5 мМ пальмитатом
(24 часа). В этом эксперименте MANF человека
иммунопреципитировали с использованием антитела кролика против MANF человека (Proteintech), и то же самое антитело использовали для проявления иммуноблота.
На фиг.7 приведен график, демонстрирующий относительную экспрессию мРНК BiP в линии р-клеток поджелудочной железы мыши (MIN6), трансфицированных в качестве отрицательного контроля миРНК (ОК) или одной из трех различных молекул миРНК, нацеленных на мРНК MANF (MHMANF#1, MHMANF#2 ИЛИ MHMANF#3) после отсутствия обработки или обработки 2 мкМ туникамицином в течение 24 часов. Эти данные были получены с использованием количественной ПЦР в реальном времени (n=3; S.D.).
На фиг.8 приведен иммуноблот, демонстрирующий уровни расщепленной каспазы-3 в линии р-клеток поджелудочной железы мыши (MIN6), необработанных или обработанных в течение 2 4 часов 1 мкМ туникамицином или 100 нМ тапсигаргином, и дополнительно обработанных растворимым MANF в концентрации 0, 4 0 или 2 00 нМ.
На фиг.9А приведена диаграмма локализованного в эндоплазматическом ретикулуме млекопитающего чувствительного к окислению-восстановлению GFP (MEROS-GFP).
На фиг.9В приведены два конфокальных изображения клеток COS7. Флуоресценция MEROS-GFP показана на левой панели, и флуоресценция трекера DsRed-ER показана на правой панели.
На фиг.10А приведен набор спектров возбуждения MEROS-GFP после отсутствия обработки или обработки DTT в различных концентрациях (длина волны излучения 510 нм).
На фиг.10В приведен спектр излучения окисленного MEROS-GFP в необработанных клетках NSC34 (длина волны возбуждения 394 нм) .
На фиг.ЮС приведен спектр излучения восстановленного
MEROS-GFP в клетках NSC34, обработанных 2 мМ DTT (длина волны возбуждения 473 нм).
На фиг.11 приведен набор четырех конфокальных микроскопических изображений MEROS-GFP, полученных с использованием длины волны возбуждения 47 6 нм (две нижние панели) или длины волны возбуждения 4 05 нм (две верхние панели), в клетках INS-1 832/13, обработанных (две правые панели) или не обработанных (две левые панели) 2 мМ DTT.
На фиг.12 приведен график коэффициента MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, оставленных необработанными (без метки) или обработанных Н202 (1 или 0,1 мМ Н202) или DTT (0,1, 0,2, 0,5, 1, 2, 5 или 10 мМ DTT). Коэффициент MEROS-GFP определяли с использованием планшет-ридера. Приведенные данные представляют собой среднее+S.D. (п=3).
На фиг.13 приведена фотография результатов электрофореза в
полиакриламидном геле в невосстанавливающих условиях (ПААГ)
модифицированного 4-ацетамидо-4'-малеимидилстильбен-2, 2 ' -
дисульфоновой кислотой (AMS) MEROS-GFP в лизате клеток, оставленных необработанными (левая дорожка) или обработанных 2 мМ DTT (правая дорожка). Лизаты либо оставляли необработанными (-|ЗМЕ) (верх) , либо обрабатывали р-меркаптоэтанолом (+РМЕ) (низ) до проведения электрофореза.
На фиг.14 приведен график, демонстрирующий динамику коэффициента MEROS-GFP в клетках NSC34, обработанных 1 мМ DTT в течение 10 минут и затем промытых. Коэффициент MEROS-GFP рассчитывали с минутным интервалом, начиная с одной минуты до обработки до четырех минут после промывания. Нижняя линия представляет флуоресценцию, наблюдаемую с возбуждением при длине волны 473 нм, черная линия представляет коэффициент MEROS-GFP и светло-серая линия представляет флуоресценцию с возбуждением при длине волны 394 нм (n=3; S.D.).
На фиг.15 приведены данные сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS) для клеток INS-1 832/13, стабильно трансфицированных MEROS-GFP, после отсутствия обработки или обработки DTT (0,2, 0,5 или 10 мМ DTT) . Данные
получали с использованием длин волн возбуждения 488 нм и 4 05 нм, и спектра излучения 510 нм. Снизу вверх, приведены различные наборы данных для необработанных, обработанных 0,2 мМ DTT, 0,5 мМ DTT и 10 мМ DTT клеток (демонстрирующих переход к более восстановленному состоянию после обработки возрастающими концентрациями DTT).
На фиг.16 приведена гистограмма данных FACS анализа клеток INS-1 832/13, стабильно трансфицированных MEROS-GFP, после отсутствия обработки или обработки DTT (0,2 мМ, 0,5 мМ или 10 мМ DTT). Горизонтальная ось представляет коэффициент MEROS-GFP, и вертикальная ось представляет количество клеток. Пики слева направо представляют клетки, оставленные необработанными, обработанные 0,2 мМ DTT, обработанные 0,5 мМ DTT и обработанные 10 мМ DTT.
На фиг.17 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, стабильно трансфицированных MEROS-GFP, после отсутствия обработки или обработки DTT (0,2, 0,5 или 10 мМ DTT). Приведенные значения MEROS-GFP нормированы на значения для необработанных клеток.
На фиг.18 приведены два графика, демонстрирующие данные FACS анализа клеток INS-1 832/13, стабильно трансфицированных MEROS-GFP, после отсутствия обработки или обработки 1 мМ Н2Ог в течение 3 0 минут. Правый график представляет собой гистограмму коэффициента MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, не обработанных или обработанных 1 мМ Н2Ог. Левый график показывает средний коэффициент MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, не обработанных
(слева) или обработанных 1 мМ Н2О2 в течение 3 0 минут.
На фиг.19 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP, рассчитанного для клеток INS-1 832/13 с использованием FACS анализа после отсутствия обработки или обработки туникамицином
(ТМ) (5 мкМ; 24 часа), тапсигаргином (ТГ) (10 нМ; 24 часа), ТГ
(1 мкМ; 4 часа), брефелдином А (БреА) (100 нг/мл; 24 часа) или MG132 (100 нм; 24 часа). Планки погрешностей представляют +S.D.
(*р <0,01). Данные нормированы на средний коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный для необработанных клеток.
На фиг.20 приведена гистограмма, демонстрирующая коэффициент MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, оставленных необработанными или обработанных 1 мкМ тапсигаргином (ТГ) в течение 4 часов.
На фиг.21 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP, рассчитанного для клеток INS-1 832/13 с использованием FACS анализа после обработки 11 мМ глюкозой (24 часа) или 25 мМ глюкозой в течение 24, 4 8 или 7 2 часов. Планки погрешностей представляют +S.D. Данные нормированы на средний коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный для клеток, обработанных 11 мМ глюкозой в течение 24 часов.
На фиг.22 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP, рассчитанного для клеток INS-1 832/13 с использованием FACS анализа после отсутствия обработки, лишения сыворотки или лишения глюкозы. Планки погрешностей представляют +S.D. (*р <0,01). Данные нормированы на средний коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный для необработанных клеток.
На фиг.23 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, оставленных необработанными или обработанных пальмитиновой кислотой (0,2 мМ; 24 часа), пальмитиновой кислотой (0,2 мМ) и глюкозой в высокой концентрации (25 мМ) (24 часа), пальмитиновой кислотой (0,5 мМ; 24 часа), олеиновой кислотой (0,5 мМ; 24 часа) или линолевой кислотой (0,5 мМ; 24 часа). Планки погрешностей представляют +S.D. Данные нормированы на средний коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный для необработанных клеток.
На фиг.24 приведен график среднего коэффициента MEROS-GFP в клетках INS-1 832/13, оставленных необработанными или обработанных островковым амилоидным полипептидом человека (IAPP) (10 мкМ; 24 часа), мышиным IAPP (10 мкМ; 24 часа) или цитокинами (интерлейкин-ip (5 нг/мл), IFN-y (100 нг/мл) и TNFa (25 нг/мл); 24 часа)). Планки погрешностей представляют +S.D. Данные нормированы на средний коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный для необработанных клеток.
На фиг.25 приведены два графика данных FACS анализа для
клеток INS-1 832/13, оставленных необработанными (слева) или обработанными 0,5 мМ пальмитатом (ПА) в течение 2 4 часов. Ось у представляет флуоресценцию после возбуждения при длине волны 488 нм, и ось х представляет флуоресценцию после возбуждения при длине волны 4 05 нм.
На фиг.2 6 приведен график, демонстрирующий коэффициент MEROS-GFP, рассчитанный с использованием FACS анализа, в клетках INS-1 832/13 после отсутствия обработки или обработки 0,5 мМ пальмитатом (ПА) или 0,5 мМ олеиновой кислотой (ОК) в течение 24 часов. Данные для клеток, обработанных пальмитатом, сдвинуты вправо.
На фиг.27 приведен график, демонстрирующий процент восстановленных клеток в популяции клеток INS-1 832/13 после обработки 11 мМ глюкозой в течение 24 часов или 25 мМ глюкозой в течение 24, 48 или 72 часов. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение (**р <0,01).
На фиг.28 приведен график, демонстрирующий процент восстановленных клеток в популяции клеток INS-1 832/13 после отсутствия обработки, лишения сыворотки в течение 24 часов или лишения глюкозы в течение 2 4 часов. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение (**р <0,01).
На фиг.29 приведен график, демонстрирующий процент восстановленных клеток в популяции клеток INS-1 832/13 после отсутствия обработки или обработки 10 мкМ IAPP человека, 10 мкМ мышиным IAPP или сочетанием интерлейкин-ip (5 нг/мл), IFNy (100 нг/мл) и TNFa (25 нг/мл) в течение 24 часов. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение (**р <0,01).
На фиг.30 приведен график, демонстрирующий процент восстановленных клеток в популяции клеток INS-1 832/13 после отсутствия обработки или обработки в течение 24 часов 0,2 мМ пальмитатом, 0,2 мМ пальмитатом и 25 мМ глюкозой, 0,5 мМ пальмитатом, 0,5 мМ олеиновой кислотой, 0,5 мМ линолевой кислотой, бычьим сывороточным альбумином и 0,5 мМ пальмитатом, 0,5 мМ пальмитатом и 0,5 мМ олеиновой кислотой, и 0,5 мМ пальмитатом и 0,5 мМ линолевой кислотой. Планки погрешностей
представляют ±стандартное отклонение (**р <0,01).
На фиг.31 приведена диаграмма клеток, трансфицированных BiP-P-mCherry, и схема, показывающая конфигурацию лазерных линий и фильтров проточного цитометра.
На фиг.32 приведен график средней экспрессии BiP-P-mCherry в окисленных или восстановленных клетках INS-1 832/13. Клетки либо оставляли необработанными, либо обрабатывали в течение 24 часов 10 нМ тапсигаргином, 5 мкМ туникамицином, 2 5 мМ глюкозой, депривацией сыворотки, депривацией глюкозы, 0,5 мМ пальмитатом, 10 мкМ человеческим IAPP или сочетанием интерлейкин-ip (5
нг/мл), IFNy (100 нг/мл) и TNFa (25 нг/мл) . Экспрессию BiP-P-mCherry определяли с использованием FACS анализа. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение.
На фиг.33 приведены две гистограммы, демонстрирующие окисленные и восстановленные клетки INS-1 832/13, обработанные 5 мкМ туникамицином (ТМ, верхняя гистограмма) или депривацией глюкозы (нижняя гистограмма) в течение 24 часов. Ось х представляет уровень экспрессии mCherry, направляемой промотором BiP человека.
На фиг.34 приведена гистограмма данных FACS анализа для клеток INS-1 832/13, обработанных 0,5 мМ пальмитатом в течение 24 часов.
На фиг.35 приведена гистограмма, демонстрирующая чистоту разделенных с помощью FACS окисленных и восстановленных клеток INS-1 832/13.
На фиг.3 6 приведены два графика, демонстрирующие уровни экспрессии BiP (левый график) и сплайсированного ХВР1 (сХВР) (правый график) в клетках INS-1 832/13, обработанных 0,5 мМ пальмитатом в течение 24 часов. Уровни экспрессии BiP и сХВР измеряли с использованием ПЦР в реальном времени. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение.
На фиг.37 приведена таблица, показывающая уровни экспрессии Derlin3, BiP, Негр и PDla5 в эндоплазматическом ретикулуме, очищенном из окисленных или восстановленных клеток INS-1 832/13. Данные по экспрессии получали путем анализа ДНК
микрочипов.
На фиг.38 приведены два графика, демонстрирующие процент
мертвых клеток (левый график) или средний коэффициент MEROS-GFP
(правый график) для клеток INS-1 832/13, обработанных только
ДМСО, 10 нМ тапсигаргином (ТГ), 10 нМ ТГ и 10 мкМ
пиоглитазоном, или 10 нМ ТГ и 500 мкг/мл
тауроурсодезоксихолевой кислотой (TUDCA).
На фиг.39 приведена диаграмма, демонстрирующая систему скрининга, в которой используется система MEROS-GFP.
На фиг.4 0 приведены две гистограммы, демонстрирующие данные FACS анализа, полученные для клеток INS-1 832/13-MEROS-GFP после обработки 0,5 мМ пальмитатом в отсутствие (верхний левый график) или в присутствии (верхний правый график) 10 мкМ апоморфина (Апо), и график, показывающий процент восстановленных клеток в клетках INS-1 832/13 MEROS-GFP после отсутствия обработки или обработки 0,5 мМ пальмитатом в отсутствие или в присутствии 10 мкМ апоморфина. Планки погрешностей представляют ±стандартное отклонение.
На фиг.41 приведена гистограмма данных FACS анализа, полученных для клеток INS-1 832/13-MEROS-GFP, окрашенных красителем Mitoprobe после обработки 0,5 мМ пальмитатом (Па) в комбинации с 10 нМ или 50 нМ апоморфином (Апо), или без него.
На фиг.42 приведены два графика, демонстрирующие процент клеток с низким Л\|яп (левый график) и процент мертвых клеток (правый график), разделенных с помощью FACS анализа после отсутствия обработки или обработки только 0,5 мМ пальмитатом или 0,5 мМ пальмитатом и 10 нМ апоморфином.
На фиг.43 приведен график, отражающий процент мертвых клеток после отсутствия обработки или обработки 10 нМ тапсигаргином (ТГ) или обработки 10 нМ ТГ и 10 нМ апоморфином.
На фиг.44 приведены два иммуноблота, демонстрирующие количество расщепленной каспазы-3 (р-каспазаЗ) и расщепленного PARP (p-PARP), присутствующих в обработанных 10 нМ тапсигаргином первичных островковых клетках человека (правый иммуноблот) и в обработанных 2 мкМ доксицилином клетках INS-1
832/13 с нокдауном WFS1 (KIIIWFSI) (левый иммуноблот), обработанных 10 нМ апоморфином или 10 мкМ пиоглитазоном.
На фиг.4 5 приведен график данных сортировки клеток с активированной флуоресценцией, демонстрирующий процент клеток INS-1 832/13 (линия р-клеток поджелудочной железы) , содержащих восстановленную форму EroGFP в эндоплазматическом ретикулуме, после культивирования в 11 мМ глюкозе или 25 мМ глюкозе (24 часа) (верхние панели и нижние панели, соответственно) и обработки растворимым MANF в концентрации 0 или 0,5 мкг/мл в течение 4 8 часов (левые панели и правые панели, соответственно). Клетки возбуждали при длине волны 473 нм и спектре излучения 510 нм.
Подробное описание изобретения
Изобретение основано, по меньшей мере частично, на том открытии, что растворимый MANF секретируется находящимися в состоянии стресса р-клетками поджелудочной железы, и что растворимый MANF вызывает задержку индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза р-клеток поджелудочной железы и уменьшает флуктуации в окислительно-восстановительном состоянии эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы, находящихся под воздействием средств или условий, которые вызывают стресс эндоплазматического ретикулума. В свете этих открытий, предложены способы диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы, прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы, мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы и массы р-клеток поджелудочной железы у
субъекта (например, субъекта с риском развития поражения р-клеток поджелудочной железы), мониторинга эффективности лечения поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для участия в клиническом исследовании, а также
обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы включают определение по меньшей мере одного уровня растворимого MANF (например, в биологическом образце от субъекта или в культуральной среде).
Также предложены способы лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза клеток в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы. Данные способы включают введение эффективного количества растворимого MANF или апоморфина субъекту или приведение Р~ клетки поджелудочной железы или популяции р-клеток поджелудочной железы в контакт с растворимым MANF. В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона.
Также предложены способы скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления данные способы включают получение р-клетки поджелудочной железы, приведение р-клетки поджелудочной железы в контакт с соединением-кандидатом, определение уровня растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы в присутствии соединения-кандидата, и сравнение уровня растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, с эталонным уровнем растворимого MANF. В некоторых вариантах осуществления данные способы включают получение клетки млекопитающего (например, р-клетки поджелудочной железы), экспрессирующей репортерный белок, содержащий сигнальную последовательность
BiP, чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный
белок (например, чувствительный к окислению-восстановлению
зеленый флуоресцентный белок или чувствительный к окислению-
восстановлению желтый флуоресцентный белок) и аминокислотную
последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с
тестируемым соединением; определение количества окисленного
репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение
количества окисленного репортерного белка, присутствующего в
клетке, с эталонным уровнем; где повышенный уровень окисленного
репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем
указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным
для лечения или задержки начала поражения р-клеток
поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы
и/или понижения или задержки индуцированного стрессом
эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках
поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления
данные способы включают получение клетки млекопитающего
(например, р-клетки поджелудочной железы), экспрессирующей
репортерный белок, содержащий сигнальную последовательность
BiP, чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный
белок (например, чувствительный к окислению-восстановлению
зеленый флуоресцентный белок или чувствительный к окислению-
восстановлению желтый флуоресцентный белок) и аминокислотную
последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с
тестируемым соединением; определение количества
восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным уровнем; где пониженный уровень восстановленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и/или понижения или задержки
индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы.
Поражения Р-клеток поджелудочной железы
Поражения р-клеток поджелудочной железы относятся к классу заболеваний, которые характеризуются прогрессирующим снижением функций р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Функции р-клеток поджелудочной железы, которые могут снижаться у субъекта, имеющего поражение Р-клеток поджелудочной железы, включают, но без ограничения, продукцию и секрецию инсулина, продукцию и секрецию С-пептида, а также продукцию и секрецию островкового амилоидного полипептида (IAPP). Неограничивающие примеры поражений р-клеток поджелудочной железы включают диабет 1 типа (сахарный диабет), диабет 2 типа и синдром Вольфрама. Поражения р-клеток поджелудочной железы могут возникать у человека в любом возрасте, например, у младенцев, детей, взрослых и пожилых субъектов. Например, поражение р-клеток поджелудочной железы может возникать у субъекта в возрасте старше 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90 лет.
Профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, ассистент медсестры или лаборант) может диагностировать у субъекта наличие поражения р-клеток поджелудочной железы на основании оценки одного или более
(например, двух, трех, четырех или пяти) симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Неограничивающие примеры симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта включают значительное повышение уровней глюкозы в крови (например, уровней глюкозы в крови натощак) по сравнению со здоровым индивидуумом или популяцией (например, уровень глюкозы в крови натощак более 100 мг/дл или более 12 0 мг/дл), значительное повышение уровней гликированного гемоглобина
(уровень гемоглобина А1с) по сравнению со здоровым индивидуумом или популяцией (например, уровень гемоглобина А1с более 6,5%, более 7,0% или более 8,0%), повышенную жажду, частое
мочеиспускание, острый голод, необъяснимую потерю веса, наличие кетонов в моче, утомляемость, нечеткость зрения, медленно заживающие язвы, умеренно повышенное кровяное давление и частые инфекции. Профессионал в области здравоохранения может также основывать диагноз, частично, на наличии в семейном анамнезе поражения р-клеток поджелудочной железы. Профессионал в области здравоохранения может диагностировать у субъекта наличие поражения р-клеток поджелудочной железы при посещении субъектом медицинского учреждения (например, клиники или больницы). В некоторых случаях профессионал в области здравоохранения может диагностировать у субъекта наличие поражения р-клеток поджелудочной железы, когда субъект поступает в дом престарелых. Как правило, врач диагностирует поражение р-клеток поджелудочной железы у субъекта после наблюдения или обнаружения одного или более симптомов у субъекта.
Профессионал в области здравоохранения может также идентифицировать субъекта, как имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, на основании одного или более следующих факторов: повышенная масса тела
(например, индекс массы тела > 25 или > 30), вялость, поражение Р-клеток поджелудочной железы в семейном анамнезе, раса, возраст, диагноз синдрома поликистоза яичников, высокое кровяное давление, снижение уровней липопротеинов высокой плотности (например, ниже 35 мг/дл) и высокие уровни триглицеридов (например, выше 250 мг/дл).
В настоящем изобретении предложены дополнительные способы диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта
(например, субъекта, проявляющего один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, или субъекта, не проявляющего симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы
(например, не диагностированного и/или бессимптомного субъекта)). Также предложены дополнительные способы идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. В настоящем
изобретении также предложены способы лечения поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
Мезенцефалический нейротрофический фактор астроцитов (MANF)
Эндогенный уровень растворимого белка MANF, как описано в настоящем описании, можно определять любым из способов, описанных в настоящем описании, например, в качестве маркера для диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы, прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы, мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы и массы р-клеток поджелудочной железы у
субъекта (например, субъекта с риском развития поражения р-клеток поджелудочной железы) , идентификации субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы, выбора субъекта для участия в клиническом исследовании и обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы. Очищенный, выделенный и/или рекомбинантный растворимый белок MANF можно также использовать в способах лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы.
Белок MANF транслируется в виде белка-предшественника, который затем расщепляется и высвобождается в виде растворимого белка из клетки (например, р-клетки поджелудочной железы). Последовательности полноразмерного белка (предшественника) MANF человека и растворимого белка MANF человека приведены ниже. Сигнальная 2 5-аминокислотная последовательность в белке-предшественнике MANF человека подчеркнута. Ниже также приведена последовательность мРНК, кодирующей белок-предшественник MANF человека.
Белок-предшественник MANF человека (SEQ ID N0:1): MRRMWATOGLAVALALSVLPGSRALRPGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPATI ENELIKFCREARGKENRLCYYIGATDDAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQI CELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKELKKILDDWGETCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPK AASARTDL
Растворимый белок MANF человека (SEQ ID N0:2): LRPGD CEVCIS YLGRF YQD LKDRD VTF SPATIENELIKFCRE ARGKENRLC YYIG ATD DAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKEL KKILDD WGETCKGCAEKS D YIRKINELMPKYAPKAAS ARTD L
мРНК MANF человека (SEQ ID N0:3):
ggaggcggtg cggcgcggcg ggtgcggttc agtcggtcgg cggcggcagc ggaggaggag gaggaggagg
aggaggagga ggatgaggag gatgtgggcc acgcaggggc tggcggtggc gctggctctg agcgtgctgc
cgggcagccg ggcgctgcgg ccgggcgact gcgaagtttg tatttcttat ctgggaagat tttaccagga cctcaaagac
agagatgtca cattctcacc agccactatt gaaaacgaac ttataaagtt ctgccgggaa gcaagaggca aagagaatcg
gttgtgctac tatatcgggg ccacagatga tgcagccacc aaaatcatca atgaggtatc aaagcctctg gcccaccaca
tccctgtgga gaagatctgt gagaagctta agaagaagga cagccagata tgtgagctta agtatgacaa gcagatcgac
ctgagcacag tggacctgaa gaagctccga gttaaagagc tgaagaagat tctggatgac tggggggaga catgcaaagg
ctgtgcagaa aagtctgact acatccggaa gataaatgaa ctgatgccta aatatgcccc caaggcagcc agtgcacgga
ccgatttgta gtctgctcaa tctctgttgc acctgagggg gaaaaaacag ttcaactgct tactcccaaa acagcctttt
tgtaatttat tttttaagtg ggctcctgac aatactgtat cagatgtgaa gcctggagct ttcctgatga tgctggccct
acagtacccc catgagggga ttcccttcct tctgttgctg gtgtactcta ggacttcaaa gtgtgtctgg gattttttta ttaaagaaaa aaaatttcta gctgtccttg cagaattata gtgaatacca aaatggggtt ttgccccagg aggctcctaa
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa
Последовательности растворимого белка MANF коровы, крысы, мыши, свиньи, мухи и рыбы данио также были описаны, и они приведены ниже.
Растворимый MANF коровы (SEQ ID N0:4): LRQGDCEVCISYLGRFYQDLKDRDVTFSPASIEKELIKFCREARGKENRLCYYIGATE DAATKIINEVSKPLSHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQroLSTVDLKKLRVKELK KILDD WGETCKGC AEKSD YIRKINELMP К Y APKAAS SRTDL
Растворимый MANF крысы (SEQ ID N0:5): LRPGDCEVCIS YL GRFYQDLKDRDVTF SPATIEEELIKFCREARGKENRLC YYIGATD DAATKIINEVSKPLAHHIPVE KICEKLKKKDSQICELKYGECD
Растворимый MANF мыши (SEQ ID N0:6): LRPGD CEVCIS YLGRF YQD LKDRD VTF SP ATIEEELIKF CRE ARGKENRLCY YIG ATD DAATKITNEVSbCPLAHHIPVEKICEKLKKKX)SQICELKYDKQIDLSTVDLKJCLRVBCEL KKI LDDWGEMCKGCAEKSDYIRKINELMPKYAPKAASARTDL
Растворимый MANF свиньи (SEQ ID NO:7): LRPGDCEVCISYLGRFYQD LKDRD VTFSPASIEK.ELTK.FCREARGKENRLCYYIGATD DAATKIINEVSKPLAHHIPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQIDLSTVDLKKLRVKEL KKILDDWGETCKGCAEICSDYIRKINELIVIPKYAPICAASSRTD
Растворимый MANF Drosophila melanogaster (SEQ ID N0:8): LKEEDCEVCVKTVRRFADSLDDSTKKDYKQIETAFKKFCKAQKNKEHRFCYYLGGL EESATGILNELSKPLSWSMPAEKICEKLKKKDAQICDLRYEKQIDLNSVDLKKLKVR DLKKILNDWDE SCD GCLEKGDFIKRIEELKPKY SR SEL Растворимый MANF данио (SEQ ID N0:9): LKDGECEVCVGFLQRLYQTIQENNVKFDSDSIEKALLKSCKDAKGKENRFCYYIGAT SDAATKITNEVSKPMSYHVPVEKICEKLKKKDSQICELKYDKQVDLSSVDLKKLKVK DLKKILEEWGESCKGCVEKSDFIRKINELMPKYAPSAAKARTDL
Растворимые белки MANF млекопитающих высоко консервативны, где растворимые белки MANF человека и коровы имеют 9 6% идентичность, растворимые белки MANF человека и мыши имеют 99% идентичность, и растворимые белки MANF человека и свиньи имеют 97% идентичность. Растворимый белок MANF человека также имеет 72% идентичность и 88% сходства с растворимым белком MANF рыбы данио.
Способы диагностики
В настоящем изобретении предложены способы диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Данные способы включают определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта и сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF. В данных способах повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем растворимого MANF указывает на то, что субъект имеет поражение р-клеток поджелудочной железы, и понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем растворимого MANF указывает на то, что субъект не имеет поражения р-клеток поджелудочной железы.
Используемый в настоящем описании термин "эталонный уровень растворимого MANF" может представлять собой пороговый
уровень растворимого MANF, уровень растворимого MANF, имеющийся у контрольного субъекта или популяции (например, субъекта или популяции, у которых не диагностировано заболевание (здорового субъекта или здоровой популяции), которые не имеют одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы и/или не имеют в семейном анамнезе поражения р-клеток поджелудочной железы), или уровень растворимого MANF у одного и того же субъекта в более ранний момент времени.
Уровни растворимого MANF можно определять методами, известными в данной области. Например, уровни растворимого MANF можно определять при помощи ряда методов, известных в данной области, в которых используют антитела, специфически связывающиеся с растворимым MANF (например, метода твердофазного иммуноферментного анализа). Ряд антител, которые специфически связываются с растворимым MANF человека, коммерчески доступны (например, антитела кролика против растворимого MANF человека, поставляемые компаниями Sigma-Aldrich и Proteintech).
Любые способы, описанные в настоящем описании, могут дополнительно включать получение или сбор образца от субъекта (например, биологического образца, содержащего биологическую жидкость, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку или цереброспинальную жидкость). В любых из способов, описанных в настоящем описании, биологический образец можно хранить в течение некоторого периода времени (например, по меньшей мере одного часа или по меньшей мере 24 часов) до определения уровня
растворимого MANF (например, хранить при, или ниже 10°С) .
Любые способы, описанные в настоящем описании, можно применять к пациентам, посещающим медицинское учреждение (например, больницу, клинику или дом престарелых). Субъекты могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъект может, предположительно, иметь поражение р-клеток поджелудочной железы. Субъект может также не проявлять каких
либо симптомов (бессимптомный субъект) или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может иметь в семейном анамнезе поражение р-клеток поджелудочной железы (например, диабет 2 типа). Субъект может также иметь повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъектом может быть младенец, ребенок, подросток, взрослый человек или пожилой человек.
В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы (например, субъекту, который не утратил полностью массу р-клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы). Способы определения функции р-клеток поджелудочной железы описаны в настоящем описании. Массу р-клеток поджелудочной железы можно определять косвенно путем измерения функции р-клеток поджелудочной железы у субъекта или с использованием методов, известных в данной области (например, методов, описанных в публикации патентной заявки США № 20110123443).
Способы диагностики, описанные в настоящем описании, может применять любой профессионал в области здравоохранения
(например, врач, лаборант, медсестра, ассистент врача и ассистент медсестры). Способы диагностики, описанные в настоящем описании, можно использовать в комбинации с одним или более дополнительными способами диагностического тестирования, известными в данной области или описанными в настоящем описании
(например, наблюдением или оценкой одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, например, мониторингом уровня глюкозы, анализом гликированного гемоглобина, уровня инсулина, уровня IAPP, уровня С-пептида или кетонов в моче). Способы диагностики, описанные в настоящем описании, можно применять к субъекту, идентифицированному, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток
поджелудочной железы (например, субъекту, идентифицированному, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления способы диагностики, описанные в настоящем описании, можно применять периодически (например, по меньшей мере раз в месяц, в два месяца, шесть месяцев или год) к субъекту, который был идентифицирован, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают сбор биологического образца от субъекта.
Некоторые варианты осуществления дополнительно включают введение субъекту, идентифицированному как имеющий или имеющий риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, лекарственного средства от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, выделенного, очищенного или рекомбинантного растворимого белка MANF, пиоглитазона, GLP-1 или ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптина, вилдаглиптина, саксаглиптина, линаглиптина, дутоглиптина, гемиглиптина и алоглиптина), или любой из композиций, описанных в настоящем описании, например, терапевтически эффективной дозы растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID N0:2, и/или апоморфина). Некоторые варианты осуществления дополнительно включают проведение дополнительных тестов для подтверждения диагноза поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Некоторые варианты осуществления включают выбор субъекта для периодического мониторинга глюкозы (например, периодического самостоятельного мониторинга глюкозы с помощью глюкометра) или мониторинга любым из способов, описанных в настоящем описании. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор субъекта для периодического медицинского обследования врачом или профессионалом в области медицины (например, для периодических посещений врача по меньшей мере раз в год, по меньшей мере раз в шесть месяцев, по меньшей мере раз в три месяца, по меньшей
мере раз в два месяца или по меньшей мере раз в месяц) . Некоторые варианты осуществления дополнительно включают запись результатов диагностического тестирования в историю болезни субъекта или проведение диагностического тестирования на поражение р-клеток поджелудочной железы для одного или более прямых родственников субъекта, диагностированных, как имеющие поражение р-клеток поджелудочной железы, с использованием способов, описанных в настоящем описании.
Способы прогнозирования риска развития поражения Р-клеток поджелудочной железы
Предложены также способы прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Данные способы включают определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта и сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF. Повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем растворимого MANF указывает на то, что субъект имеет повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, и понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что субъект имеет пониженный или незначительный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. В данных способах можно использовать любой из эталонных уровней растворимого MANF, описанных в настоящем описании. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают получение биологического образца от субъекта.
Уровни растворимого MANF можно определять методами, известными в данной области. Например, уровни растворимого MANF можно определять при помощи ряда методов, известных в данной области, в которых используют антитела, специфически связывающиеся с растворимым MANF (например, метода твердофазного иммуноферментного анализа). В некоторых вариантах осуществления методы дополнительно включают получение или сбор
образца от субъекта (например, биологического образца, содержащего биологическую жидкость, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку или цереброспинальную жидкость).
Любые способы, описанные в настоящем описании, можно применять к пациентам, посещающим медицинское учреждение
(например, больницу, клинику или дом престарелых). В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту как часть периодического физического обследования профессионалом в области здравоохранения. Субъекты могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы
(например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъект может, предположительно, иметь поражение р-клеток поджелудочной железы. Субъект может также не проявлять каких-либо симптомов
(бессимптомный субъект) или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может иметь в семейном анамнезе поражение р-клеток поджелудочной железы
(например, диабет 2 типа). Субъектом может быть младенец, ребенок, подросток, взрослый человек или пожилой человек.
Способы, описанные в настоящем описании, может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, лаборант, медсестра, ассистент врача и ассистент медсестры). Эти способы можно использовать в комбинации с любыми дополнительными способами, известными в данной области для идентификации субъекта с риском развития поражения р-клеток поджелудочной железы (например, оценкой одного или более из следующих факторов: повышенная масса тела, вялость, поражение Р-клеток поджелудочной железы в семейном анамнезе, раса, возраст, диагноз синдрома поликистоза яичников, высокое кровяное давление, снижение уровней липопротеинов высокой плотности (например, ниже 35 мг/дл) и высокие уровни триглицеридов (например, выше 250 мг/дл). Можно проводить мониторинг для субъекта, идентифицированного, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, с использованием любого из способов, описанных в
настоящем описании (см., например, следующий раздел).
Некоторые варианты осуществления дополнительно включают введение субъекту, идентифицированному, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, лекарственного средства от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, выделенного, очищенного или рекомбинантного растворимого белка MANF, пиоглитазона, GLP-1 или ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптина, вилдаглиптина, саксаглиптина, линаглиптина, дутоглиптина, гемиглиптина и алоглиптина), или любой из композиций, описанных в настоящем описании, например, терапевтически эффективной дозы растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID N0:2, и/или апоморфина). Некоторые варианты осуществления включают выбор субъекта, идентифицированного, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, для периодического мониторинга глюкозы
(например, периодического самостоятельного мониторинга глюкозы с помощью глюкометра). Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор субъекта, идентифицированного, как имеющий повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, для периодического медицинского обследования врачом или профессионалом в области медицины
(например, для периодических посещений врача по меньшей мере раз в год, по меньшей мере раз в шесть месяцев, по меньшей мере раз в три месяца, по меньшей мере раз в два месяца или по меньшей мере раз в месяц). Некоторые варианты осуществления дополнительно включают запись результатов диагностического тестирования в историю болезни субъекта или проведение аналогичного теста или любого известного в данной области теста для определения риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы для одного или более прямых родственников субъекта, диагностированных, как имеющие поражение р-клеток поджелудочной железы, с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании.
Способы мониторинга дисфункции Р-клеток поджелудочной
железы и массы Р-клеток поджелудочной железы
Предложены также способы мониторинга дисфункции р-клеток поджелудочной железы у субъекта (например, субъекта, имеющего риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, субъекта, имеющего поражение Р-клеток поджелудочной железы, или субъекта, получившего трансплантат р-клеток поджелудочной железы). Данные способы включают определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта в первый момент времени, определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени и сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени. Повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в первый момент времени указывает на снижение (например, значительное, измеримое или поддающееся обнаружению снижение) функции р-клеток поджелудочной железы или снижение массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта. Понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени указывает на отсутствие изменения или на возрастание функции р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы в первый и во второй момент времени (например, субъекту, который не утратил полностью массу Р~ клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы в первый и во второй момент времени).
В некоторых вариантах осуществления второй момент времени
может быть выбран по меньшей мере через б часов (например, по меньшей мере 12 часов, 18 часов, 24 часа, 1 день, 2 дня, 3 дня,
4 дня, 5 дней, б дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, б месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или
5 лет) после первого момента времени. В некоторых вариантах осуществления первый момент времени может быть моментом госпитализации или в пределах 1 недели от первого проявления по меньшей мере одного симптома поражения р-клеток поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления способы могут
дополнительно включать определение (анализ) уровня растворимого
MANF в биологическом образце от субъекта в один или более
дополнительные более поздние моменты времени. В данных способах
повышенный уровень растворимого MANF в более позднем образце
(собранном хронологически позднее) по сравнению с уровнем
растворимого MANF в более раннем (например, непосредственно
предшествующем) образце (собранном хронологически раньше)
указывает на снижение (например, значительное, измеримое или
поддающееся обнаружению снижение) функции р-клеток
поджелудочной железы или снижение массы р-клеток поджелудочной
железы у субъекта. Аналогично, понижение или отсутствие
существенного отличия уровня растворимого MANF в более позднем
образце (собранном хронологически позднее) по сравнению с
уровнем растворимого MANF в более раннем (например,
непосредственно предшествующем) образце (собранном
хронологически раньше) указывает на отсутствие изменения или на возрастание функции р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы в первый, во второй и в один или более дополнительные моменты времени (например, например, субъекту, который не утратил полностью массу р-клеток поджелудочной железы или функцию Р~
клеток поджелудочной железы в первый, во второй и в один или более дополнительные моменты времени).
В некоторых вариантах осуществления субъект может иметь
ранее полученный трансплантат р-клеток поджелудочной железы,
так что с помощью данных способов проводят мониторинг,
частично, функции р-клеток поджелудочной железы и массы р-
клеток поджелудочной железы в р-клетках поджелудочной железы
трансплантированных субъекту. В некоторых вариантах
осуществления трансплантированные р-клетки поджелудочной железы
являются аутотрансплантированными, аллотрансплантированными или
ксенотрансплантированными р-клетками поджелудочной железы. В
некоторых вариантах осуществления трансплантированные р-клетки
поджелудочной железы находятся внутри устройства или окружены
биосовместимым полимером, или помещены в него. В некоторых
вариантах осуществления трансплантированные р-клетки
поджелудочной железы находятся в ткани, отличной от ткани поджелудочной железы (например, ткани печени). В некоторых вариантах осуществления данные способы применяют к субъекту в пределах 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, б месяцев или 1 года после трансплантации р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления первый момент времени выбирают вскоре после (например, в пределах 1 недели или 2 недель) процедуры трансплантации.
Уровни растворимого MANF можно определять методами, известными в данной области. Например, уровни растворимого MANF можно определять при помощи ряда методов, известных в данной области, в которых используют антитела, специфически связывающиеся с растворимым MANF (например, метода твердофазного иммуноферментного анализа). В некоторых вариантах осуществления методы дополнительно включают получение или сбор образца или по меньшей мере двух образцов от субъекта (например, биологического образца, содержащего биологическую жидкость, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку или цереброспинальную жидкость).
Любые способы, описанные в настоящем описании, можно применять к пациентам, посещающим медицинское учреждение
(например, больницу, клинику или дом престарелых). В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту как часть периодического физического обследования профессионалом в области здравоохранения. Субъекты могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы
(например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъект может также не проявлять каких-либо симптомов (бессимптомный субъект) или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может иметь в семейном анамнезе поражение Р~ клеток поджелудочной железы (например, диабет 2 типа). Субъектом может быть младенец, ребенок, подросток, взрослый человек или пожилой человек.
Данные способы может применять любой профессионал в
области здравоохранения (например, врач, лаборант, медсестра,
ассистент врача и ассистент медсестры). Субъекту,
идентифицированному, как имеющий снижение (например,
значительное, измеримое или поддающееся обнаружению снижение)
функции р-клеток поджелудочной железы или снижение массы Р~
клеток поджелудочной железы, можно вводить лекарственное
средство от поражения р-клеток поджелудочной железы (например,
выделенный, очищенный или рекомбинантный растворимый белок
MANF, пиоглитазон, GLP-1 или ингибитор DPP-4 (например,
ситаглиптин, вилдаглиптин, саксаглиптин, линаглиптин,
дутоглиптин, гемиглиптин и алоглиптин), или любую из композиций, описанных в настоящем описании, например, терапевтически эффективную дозу растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID N0:2, и/или апоморфин). В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона.
Некоторые варианты осуществления, кроме того, включают
дополнительное обнаружение или оценку одного или более (например, двух, трех или четырех) других маркеров дисфункции |3-клеток поджелудочной железы у субъекта (например, пониженную продукцию и секрецию С-пептида, пониженную продукцию и секрецию инсулина, пониженную продукцию и секрецию IAPP, повышенные уровни глюкозы в крови, повышенные уровни гликированного гемоглобина и наличие кетонов в биологической жидкости субъекта (например, в моче)). Методы определения одного или более дополнительных маркеров дисфункции р-клеток поджелудочной железы известны в данной области.
Некоторые варианты осуществления дополнительно включают введение субъекту, идентифицированному, как имеющий снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы, лекарственного средства от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, выделенного, очищенного или рекомбинантного растворимого белка MANF, пиоглитазона, GLP-1 или ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптина, вилдаглиптина, саксаглиптина, линаглиптина, дутоглиптина, гемиглиптина и алоглиптина), или любой из композиций, описанных в настоящем описании, например, терапевтически эффективной дозы растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID N0:2, и/или апоморфина). Некоторые варианты осуществления включают выбор субъекта, идентифицированного, как имеющий снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы, для периодического мониторинга глюкозы (например, периодического самостоятельного мониторинга глюкозы с помощью глюкометра). Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор
субъекта, идентифицированного, как имеющий снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы, для периодического медицинского обследования врачом или профессионалом в области медицины (например, для периодических посещений врача по меньшей мере раз в год, по меньшей мере раз в шесть месяцев, по меньшей мере
раз в три месяца, по меньшей мере раз в два месяца, по меньшей мере раз в месяц или по меньшей мере раз в неделю) . Некоторые варианты осуществления дополнительно включают запись результатов диагностического тестирования в историю болезни субъекта или проведение аналогичного теста или любого известного в данной области теста для мониторинга функции |3-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы для одного или более прямых родственников субъекта, идентифицированных, как имеющие снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор субъекта, идентифицированного, как имеющий снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы, для трансплантации р-клеток поджелудочной железы.
Способы мониторинга эффективности лечения поражения Р~ клеток поджелудочной железы
Предложены также способы мониторинга эффективности лечения дисфункции р-клеток поджелудочной железы у субъекта (например,
субъекта, диагностированного, как имеющий поражение р-клеток поджелудочной железы). Данные способы включают определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта в первый момент времени, определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени и сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени, где (i) первый момент времени выбирают до начала лечения, и второй момент времени выбирают в любое время после начала лечения или (ii) первый момент времени выбирают в период после начала лечения, и второй момент времени выбирают в более поздний период во время или после лечения; и пониженный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в
биологическом образце в первый момент времени указывает на то, что лечение было эффективным для субъекта. В некоторых вариантах осуществления лечение поражения р-клеток поджелудочной железы представляет собой введение одного или более из инсулина (например, любой из форм инсулина, описанных в настоящем описании), пиоглитазона и TUDCA. В некоторых вариантах осуществления лечение представляет собой трансплантацию р-клеток поджелудочной железы субъекту
(например, как описано в настоящем описании).
Пониженный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в первый момент времени указывает на эффективность лечения для субъекта. Повышенный уровень или существенно не изменившийся уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в первый момент времени указывает на то, что лечение было неэффективным и/или что настоящее лечение должно быть прекращено, и/или альтернативное лекарственное средство должно быть введено субъекту. В некоторых вариантах осуществления повышение уровня или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в первый момент времени указывает на то, что субъекту следует вводить повышенную дозу лекарственного средства или что лекарственное средство следует вводить более часто и/или более продолжительное время.
В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы в первый и во второй момент времени
(например, например, субъекту, который не утратил полностью массу р-клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы в первый и во второй момент времени). В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту,
который ранее был идентифицирован или диагностирован, как имеющий поражение р-клеток поджелудочной железы. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор субъекта, который имеет поражение р-клеток поджелудочной железы. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают получение образца от субъекта. Некоторые варианты осуществления дополнительно включают введение одной или более доз лекарственного средства субъекту.
В некоторых вариантах осуществления второй момент времени может быть выбран по меньшей мере через б часов (например, по меньшей мере 12 часов, 18 часов, 24 часа, 1 день, 2 дня, 3 дня,
4 дня, 5 дней, б дней, 1 неделю, 2 недели, 3 недели, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, б месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года или
5 лет) после первого момента времени. В некоторых вариантах осуществления первый момент времени может быть моментом госпитализации или в пределах 1 недели от первого проявления по меньшей мере одного симптома поражения р-клеток поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления способы могут дополнительно включать определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта в один или более дополнительные более поздние моменты времени. В данных способах пониженный уровень растворимого MANF в более позднем образце (собранном хронологически позднее) по сравнению с уровнем растворимого MANF в более раннем (например, непосредственно предшествующем) образце (собранном хронологически раньше) указывает на эффективность лечения для субъекта. Аналогично, повышение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в более позднем образце (собранном хронологически позднее) по сравнению с уровнем растворимого MANF в более раннем (например, непосредственно предшествующем) образце (собранном хронологически раньше) указывает на то, что лечение было неэффективным для субъекта. В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток
поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы в первый, во второй и в один или более дополнительные моменты времени (например, субъекту, который не утратил полностью массу Р-клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы в первый, во второй и в один или более дополнительные моменты времени).
В некоторых вариантах осуществления субъект может иметь
ранее полученный трансплантат р-клеток поджелудочной железы,
так что с помощью данных способов проводят мониторинг,
частично, эффективности трансплантации р-клеток поджелудочной
железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления
трансплантированные р-клетки поджелудочной железы являются
аутотрансплантированными, аллотрансплантированными или
ксенотрансплантированными р-клетками поджелудочной железы. В
некоторых вариантах осуществления трансплантированные р-клетки
поджелудочной железы находятся внутри устройства или окружены
биосовместимым полимером, или помещены в него. В некоторых
вариантах осуществления трансплантированные р-клетки
поджелудочной железы находятся в ткани, отличной от ткани поджелудочной железы (например, ткани печени). В некоторых вариантах осуществления данные способы применяют к субъекту в пределах 1 недели, 2 недель, 3 недель, 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 5 месяцев, б месяцев или 1 года после трансплантации р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления первый момент времени выбирают вскоре после (например, в пределах 1 недели или 2 недель) процедуры трансплантации.
Уровни растворимого MANF можно определять методами, известными в данной области. Например, уровни растворимого MANF можно определять при помощи ряда методов, известных в данной области, в которых используют антитела, специфически связывающиеся с растворимым MANF (например, метода твердофазного иммуноферментного анализа). В некоторых вариантах
осуществления методы дополнительно включают получение или сбор образца или по меньшей мере двух образцов от субъекта (например, биологического образца, содержащего биологическую жидкость, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку или цереброспинальную жидкость). Любые способы, описанные в настоящем описании, можно применять к пациентам, посещающим медицинское учреждение (например, больницу, клинику или дом престарелых). В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту как часть периодического физического обследования профессионалом в области здравоохранения. У субъектов может быть ранее диагностировано поражение р-клеток поджелудочной железы и/или они могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъектом может быть младенец, ребенок, подросток, взрослый человек или пожилой человек.
Данные способы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, лаборант, медсестра, ассистент врача и ассистент медсестры). Некоторые варианты осуществления, кроме того, включают дополнительное обнаружение или оценку одного или более (например, двух, трех или четырех) других маркеров поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта (например, где повышенная продукция и секреция С-пептида, повышенная продукция и секреция инсулина, повышенная продукция и секреция IAPP, пониженные уровни глюкозы в крови, пониженные уровни гликированного гемоглобина и отсутствие или незначительный уровень кетонов в биологической жидкости субъекта (например, в моче) во второй момент времени по сравнению с соответствующими уровнями в первый момент времени дополнительно указывают на то, что лечение является эффективным). Методы обнаружения одного или более дополнительных маркеров поражения р-клеток поджелудочной железы известны в данной области.
Способы выбора субъекта для лечения
Предложены также способы выбора субъекта для лечения
поражения р-клеток поджелудочной железы. Данные способы включают определение (анализ) уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF и выбор субъекта, имеющего повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы. В данных способах субъектов, имеющих понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, не выбирают для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы.
Некоторые варианты осуществления могут дополнительно включать оценку или определение уровня одного или более дополнительных маркеров поражения р-клеток поджелудочной железы, где обнаружение одного или более дополнительных маркеров поражения р-клеток поджелудочной железы дополнительно указывает на то, что субъект должен быть выбран для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы. Эти один или более дополнительных маркеров поражения р-клеток поджелудочной железы включают пониженный уровень С-пептида в биологическом образце от субъекта, пониженный уровень IAPP в биологическом образце от субъекта, пониженный уровень инсулина в биологическом образце от субъекта, повышенные один или более уровней глюкозы в крови у субъекта, повышенный уровень гликированного гемоглобина у субъекта или обнаружение кетонов в биологическом образце от субъекта (например, в моче). Методы определения уровней С-пептида, IAPP, инсулина, глюкозы в крови, гликированного гемоглобина и кетонов в биологическом образце от субъекта известны в данной области.
Уровни растворимого MANF можно определять методами, известными в данной области. Например, уровни растворимого MANF можно определять при помощи ряда методов, известных в данной области, в которых используют антитела, специфически связывающиеся с растворимым MANF (например, метода твердофазного иммуноферментного анализа). В некоторых вариантах
осуществления методы дополнительно включают получение или сбор образца от субъекта (например, биологического образца, содержащего биологическую жидкость, например, мочу, кровь, плазму, сыворотку или цереброспинальную жидкость). Данные методы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, лаборант или ассистент медсестры).
Субъекты могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъект может также не проявлять каких-либо симптомов (бессимптомный субъект) или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может, предположительно, иметь поражение р-клеток поджелудочной железы или субъект может иметь повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может иметь в семейном анамнезе поражение р-клеток поджелудочной железы (например, диабет 2 типа). У субъекта может быть ранее диагностировано поражение р-клеток поджелудочной железы.
В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы (например, субъекту, который не утратил полностью массу р-клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы).
Лекарственные средства от поражения р-клеток поджелудочной железы, которые можно вводить субъекту, включают, но без ограничения: растворимый MANF (например, растворимый белок MANF, который содержит последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID N0:2, то есть, полной длине SEQ ID N0:2), апоморфин, инсулин быстрого действия (например, инсулин аспарт или лиспро), инсулин короткого действия (например, обычный инсулин), инсулин среднего действия (например, нейтральный
протамин Хагедорна, или инсулин NPH), инсулин длительного действия (например, инсулин ультраленте), инсулин гларгин, инсулин детемир, прамлинтид, миметики инкретина (например, экзенатид), сульфонилмочевины (например, хлорпропамид, глипизид, глибурид и глимепирид), меглитиниды (например, репаглинид и натеглинид), бигуаниды (например, метформин), тиазолидиндионы (например, розиглитазон и пиоглитазон), ингибиторы альфа-глюкозидазы (например, акарбоза и меглитол), а также ингибитор DPP-4 (например, ситаглиптин и саксаглиптин). Лекарственные средства от поражения р-клеток поджелудочной железы могут включать одно или более (например, два, три или четыре) указанных выше средств в любой комбинации. В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона.
Некоторые варианты осуществления данных способов дополнительно включают введение субъекту по меньшей мере одного (например, по меньшей мере двух, трех или четырех) лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, одного или более лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании или известных в данной области). Например, некоторые варианты осуществления данных способов дополнительно включают введение по меньшей мере одной (например, по меньшей мере двух, четырех, шести, восьми или десяти) дозы любой из фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании. Лечение от поражения р-клеток поджелудочной железы может продолжаться на протяжении периода времени по меньшей мере 1 неделя, 1 месяц, б месяцев, 1 год, 2 года, 3 года, 4 года, 5 лет или 10 лет. Лекарственное средство можно вводить субъекту периодически (например, один раз в сутки, два раза в сутки, три раза в сутки, четыре раза в сутки, раз в неделю, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю, раз в месяц, два раза в месяц, три раза в месяц или четыре раза в месяц).
В некоторых вариантах осуществления субъекта, имеющего
повышенный уровень растворимого MANF по сравнению с эталонным уровнем, выбирают для периодического медицинского обследования врачом или профессионалом в области медицины (например, для периодических посещений врача по меньшей мере раз в год, по меньшей мере раз в шесть месяцев, по меньшей мере раз в три месяца, по меньшей мере раз в два месяца, по меньшей мере раз в месяц или по меньшей мере раз в неделю) . Некоторые варианты осуществления дополнительно включают запись в историю болезни субъекта о том, что субъекту следует вводить или назначено одно или более лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любое из иллюстративных лекарственных средств, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления субъекта, имеющего повышенный уровень растворимого MANF по сравнению с эталонным уровнем, выбирают для трансплантации р-клеток поджелудочной железы.
Способы идентификации субъекта, имеющего риск развития поражения Р-клеток поджелудочной железы
Предложены также способы идентификации субъекта, имеющего риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы. Данные способы включают определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта с эталонным уровнем растворимого MANF. Субъекта идентифицируют, как имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, если уровень растворимого MANF в биологическом образце от субъекта повышен по сравнению с эталонным уровнем. Субъекта идентифицируют, как имеющего пониженный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, если уровень растворимого MANF в биологическом образце от субъекта понижен или существенно не изменен по сравнению с эталонным уровнем.
В любом из способов, описанных в настоящем описании, повышенный риск является относительным для субъекта, у которого отсутствует значительное или измеримое повышение уровня растворимого MANF (например, субъекта, для которого не было
диагностировано поражение р-клеток поджелудочной железы с помощью любого из способов, описанных в настоящем описании, здорового субъекта без диагностированного заболевания или субъекта, у которого отсутствует симптом поражения р-клеток поджелудочной железы или поражение р-клеток поджелудочной железы в семейном анамнезе).
Уровни растворимого MANF можно определять стандартными методами (например, любым из методов на основе антител, известных в данной области). Данные методы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, лаборант или ассистент медсестры).
Субъекты могут проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). Субъект может также, предположительно, иметь поражение р-клеток поджелудочной железы. Субъект может также не проявлять каких-либо симптомов или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъект может иметь в семейном анамнезе поражение р-клеток поджелудочной железы (например, диабет 2 типа).
В некоторых вариантах осуществления способы применяют к субъекту, у которого имеется поддающаяся обнаружению или измерению масса р-клеток поджелудочной железы и/или имеется поддающаяся обнаружению или измерению некоторая функция р-клеток поджелудочной железы (например, субъекту, который не утратил полностью массу р-клеток поджелудочной железы или функцию р-клеток поджелудочной железы).
Субъектам, идентифицированным, как имеющие повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, можно вводить лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любое из лекарственных средств, описанных в настоящем описании) или можно вводить новое или альтернативное лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы. Субъекты, идентифицированные, как имеющие повышенный
риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, могут также получать более агрессивное терапевтическое лечение (например, с повышенной периодичностью посещения клиники или больницы).
Некоторые варианты осуществления дополнительно включают введение субъекту, идентифицированному, как имеющему повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, лекарственного средства от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, выделенного, очищенного или рекомбинантного растворимого белка MANF, пиоглитазона, GLP-1 или ингибитора DPP-4 (например, ситаглиптина, вилдаглиптина, саксаглиптина, линаглиптина, дутоглиптина, гемиглиптина и алоглиптина), или любой из композиций, описанных в настоящем описании, например, терапевтически эффективной дозы растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную SEQ ID N0:2, и/или апоморфина). Некоторые варианты осуществления включают выбор субъекта, имеющего повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, для мониторинга глюкозы (например, самостоятельного мониторинга глюкозы с помощью глюкометра). Некоторые варианты осуществления дополнительно включают выбор субъекта для периодического медицинского обследования врачом или профессионалом в области медицины (например, для периодических посещений врача по меньшей мере раз в год, по меньшей мере раз в шесть месяцев, по меньшей мере раз в три месяца, по меньшей мере раз в два месяца или по меньшей мере раз в месяц) . Некоторые варианты осуществления дополнительно включают запись результатов теста в историю болезни субъекта или проведение аналогичного теста или любого известного в данной области теста для определения риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы для одного или более прямых родственников субъекта, идентифицированных, как имеющие повышенный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы, с использованием способов, описанных в настоящем описании.
Способы выбора субъекта для участия в клиническом
исследовании
Предложены также способы выбора субъекта для участия в клиническом исследовании. Данные способы включают определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта; сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта с эталонным уровнем растворимого MANF и выбор субъекта, имеющего повышенный или пониженный, или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем (например, любым из эталонных уровней растворимого MANF, описанных в настоящем описании), для участия в клиническом исследовании.
Уровни растворимого MANF можно определять с помощью стандартных молекулярно-биологических методов (например, любых из описанных в настоящем описании методов на основе антител). Данные методы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, лаборант или ассистент медсестры).
В некоторых вариантах осуществления субъект может проявлять один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любой из симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления субъект может также не проявлять каких-либо симптомов или проявлять только один симптом поражения р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления субъект может иметь в семейном анамнезе поражение р-клеток поджелудочной железы (например, диабет 2 типа). В некоторых вариантах осуществления у субъекта уже может быть диагностировано поражение р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления субъект принимает лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят новое или альтернативное лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы в процессе клинического исследования.
Способы обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума
в |3-клетках поджелудочной железы
Предложены также способы обнаружения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной
железы, которые включают определение уровня растворимого MANF,
продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, и сравнение
уровня продуцируемого растворимого MANF с эталонным уровнем
(например, любым из эталонных уровней растворимого MANF,
описанных в настоящем описании) растворимого MANF. Повышенный
уровень растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой
поджелудочной железы, по сравнению с эталонным уровнем растворимого MANF указывает на повышение стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетке поджелудочной железы. Понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, по сравнению с эталонным уровнем растворимого MANF указывает на то, что р-клетка поджелудочной железы не испытывает стресс эндоплазматического ретикулума на поддающемся обнаружению уровне.
Уровни растворимого MANF можно определять с помощью стандартных молекулярно-биологических методов (например, любых описанных в настоящем описании методов на основе антител). Данные методы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, лаборант или ассистент медсестры) или ученый.
В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы находится в организме млекопитающего (например, человека), и уровни растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, можно определять в биологическом образце от млекопитающего (например, образце, содержащем кровь, сыворотку или плазму). В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы может быть эндогенной р-клеткой поджелудочной железы или трансплантированной р-клеткой поджелудочной железы (например, аутотрансплантированной, аллотрансплантированной или ксенотрансплантированной р-клеткой
поджелудочной железы) . В некоторых вариантах осуществления |3-
клетка поджелудочной железы представляет собой
аутотрансплантированную р-клетку поджелудочной железы, которая была генетически модифицирована. В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы могут находиться в поджелудочной железе млекопитающего или могут находиться в ткани, отличной от ткани поджелудочной железы (например, в печени). В некоторых вариантах осуществления р-клетки поджелудочной железы могут находиться в устройстве или в биосовместимом материале или полимере.
В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы находится in vitro (например, в культуре ткани). Например, первичную р-клетку поджелудочной железы, полученную от млекопитающего, можно культивировать ex vivo. В некоторых вариантах осуществления культивируемые р-клетки поджелудочной железы представляют собой линию первичных р-клеток поджелудочной железы млекопитающего (например, человека, крысы, обезьяны, коровы или свиньи). В некоторых вариантах осуществления культивируемую р-клетку поджелудочной железы млекопитающего можно генетически изменять (например, генетически модифицировать для экспрессии одного или более белков или генетически модифицировать для понижения экспрессии одного или более белков) или химически обрабатывать (например, одним или более из факторов роста). В некоторых вариантах осуществления р-клетку поджелудочной железы можно культивировать в присутствии одного или более биосовместимых полимеров или биосинтетических материалов (например, полимеров или материалов, вспомогательных при трансплантации р-клеток поджелудочной железы млекопитающему (например, человеку)). Разнообразные биосовместимые полимеры и биосинтетические материалы известны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления за обнаружением
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы в организме субъекта следует одно или
более из следующего: идентификация субъекта, имеющего повышенный уровень стресса эндоплазматического ретикулума в его или ее |3-клетках поджелудочной железы, введение лекарственного средства (например, средства, которое будет уменьшать стресс эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы, например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании, и/или апоморфина); мониторинг функции р-клеток поджелудочной железы (например, любым из способов мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании) у субъекта и увеличение частоты посещений клиники или уровня мониторинга состояния здоровья (например, увеличение частоты проверки уровня глюкозы в крови) субъекта. В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона.
В некоторых вариантах осуществления за обнаружением повышенного стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы in vitro следует приведение р-клеток поджелудочной железы в контакт с лекарственным средством (например, средством, которое будет снижать стресс эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы, например, любым из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании, или апоморфином), и/или мониторинг функции Р-клеток поджелудочной железы (например, любым из способов мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании). В любом из способов, описанных в настоящем описании, р-клетки поджелудочной железы можно культивировать in vitro по меньшей мере с одним другим типом клеток или по меньшей мере одной другой линией клеток (например, совместное культивирование или фидерная культура).
Способы лечения
Предложены также способы лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающие введение субъекту эффективного количества растворимого MANF
(например, очищенного, выделенного или рекомбинантного растворимого белка MANF (например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании)) и/или апоморфина. В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к снижению числа симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любых из симптомов, описанных в настоящем описании) у субъекта или снижению тяжести, интенсивности или частоты одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любых из симптомов, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления лечение может приводить к задержке появления одного или более симптомов (увеличению времени до фактического появления одного или более симптомов у субъекта, не получающего лечение, по сравнению с субъектом, получающим лечение).
Например, лечение может приводить к одному или более из следующего: снижению уровня(ей) глюкозы в крови у субъекта, снижению уровня гликированного гемоглобина у субъекта, снижению темпов потери продукции инсулина у субъекта, снижению темпов потери функции р-клеток поджелудочной железы у субъекта и снижению темпов потери массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления, например, в которых способ включает введение апоморфина, субъект не имеет эректильной дисфункции или болезни Паркинсона. Растворимый MANF
Например, в некоторых вариантах осуществления растворимый MANF, вводимый субъекту, содержит последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична) любой из SEQ ID N0:2 и 4-7, то есть, полной длине SEQ ID N0:2 или 4-7, и необязательно, обладает биологической активностью растворимого белка MANF (описанной в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления растворимый MANF, вводимый субъекту, содержит последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична (например, по меньшей мере на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична) SEQ ID N0:2 (растворимый
MANF человека), то есть, полной длине SEQ ID N0:2, и необязательно обладает биологической активностью растворимого белка MANF (описанной в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления растворимый MANF, вводимый субъекту, представляет собой SEQ ID N0:2 или эндогенную (дикого типа) форму растворимого MANF. В любом из этих вариантов осуществления растворимый MANF может быть очищен или выделен. В любом из этих вариантов осуществления растворимым MANF может быть рекомбинантный белок.
Сравнение последовательностей и определение процента
идентичности между двумя последовательностями проводят с
помощью математического алгоритма. Процент идентичности между
двумя аминокислотными последовательностями определяют с помощью
алгоритма Нидельмана-Вунша (Needleman and Wunsch, J. Mol.
Biol., 48: 444-453, 1970), который включен в программу GAP в
пакете программ GCG (доступную в интернете на сайте gcg.com), с
использованием либо матрицы Blossum 62, либо матрицы РАМ250, и
штрафа за открытие разрыва 16 и штрафа за удлинение разрыва 1.
Процент идентичности между двумя нуклеотидными
последовательностями определяют с помощью программы GAP в пакете программ GCG (также доступной в интернете на сайте gcg.com) с использованием матрицы NWSgapdna.CMP, штраф за открытие разрыва 4 0 и штраф за удлинение разрыва 1.
Как правило, процент идентичности между аминокислотными
последовательностями, указанными в настоящем описании,
определяют при помощи программы BLAST 2.0, которая доступна для
общего пользования на вебсайте Национального центра
биотехнологической информации (NCBI). Сравнение
последовательностей проводят с использованием выравнивания без разрывов и с использованием параметров по умолчанию (матрица Blossum 62, штраф за открытие разрыва 11, штраф за удлинение разрыва на каждый остаток 1 и отношение лямбда 0,85) . Математический алгоритм, используемый в программах BLAST, описан в статье Altschul et al. r Nucleic Acid Research 25: 3389-3402, 1997.
Как отмечалось в настоящем описании, формы растворимого
белка MANF млекопитающих имеют высокую степень идентичности последовательностей. Специалисту в данной области очевидно, что, вообще говоря, для того, чтобы получить варианты растворимого MANF, которые обладают биологической активностью (например, способностью лечить или вызывать задержку начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, снижать
стресс эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы или уменьшать или вызывать задержку индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы), остатки растворимого MANF, которые не являются консервативными у различных видов млекопитающих, можно изменять или удалять, тогда как остатки, которые являются высоко консервативными, не следует изменять или удалять. Специалист в данной области может проводить известными в данной области методами выравнивание последовательностей растворимых белков MANF млекопитающих, приведенных в настоящем описании, для выявления остатков, которые являются высоко консервативными, и остатков, которые не являются консервативными.
Биологическую активность различных форм растворимого MANF можно тестировать, проводя различные анализы на биологическую активность, описанные в настоящем описании, или которые известны в данной области. Например, биологическую активность растворимого белка MANF можно тестировать путем обработки Р~ клеток поджелудочной железы, культивированных в присутствии или в отсутствие растворимого MANF (например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании), и воздействия на Р-клетки поджелудочной железы средством, индуцирующим стресс
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы. Растворимый MANF, обладающий биологической активностью, будет снижать степень стресса эндоплазматического ретикулума или индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза, наблюдаемого в клетках, контактирующих с растворимым MANF и средством, по сравнению с клетками, не контактирующими с растворимым MANF и обработанными средством. Например,
растворимый MANF, обладающий биологической активностью, может
снижать количество одного или более маркеров стресса
эндоплазматического ретикулума в клетках, обработанных
средством, индуцирующим стресс эндоплазматического ретикулума,
по сравнению с клетками, не обработанными растворимым MANF и
обработанными средством (например, снижать индукцию
регулируемого глюкозой белка 7 8 (также известного как grp7 8 или
BiP) или экспрессию bcl-2-ассоциированного атаногена-1 (bag-1);
снижать активацию, транслокацию в аппарат Гольджи, расщепление
протеазой или транслокацию в ядро активирующего
транскрипционного фактора б (ATF6); снижать активацию,
олигомеризацию или аутофосфорилирование протеинкиназа РНК-
подобной киназы эндоплазматического ретикулума (PERK); снижать
активацию IRE1; уменьшать фосфорилирование eIF2a; уменьшать
процессинг интронов мРНК ХВР1; снижать активацию сигнального
пути JNK; предотвращать активацию и расщепление прокаспазы 4 и
предотвращать или уменьшать сдвиг окислительно-
восстановительного состояния среды эндоплазматического
ретикулума (например, измеренного с использованием
чувствительного к окислению-восстановлению белка eroGFP, как описано в примерах)).
Растворимый MANF, вводимый субъекту, может также содержать одну или более (например, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15) вставок, дополнений, делеций или модификаций. Например, растворимый MANF может быть ковалентно связан с химическим фрагментом (например, белком (например, альбумином), сахаром (например, N-связанными гликанами или 0-связанными гликанами, например, маннозой) (см., например, Sola et al. , J. Pharm. Sci. 98: 1123-1245, 2009) или полимером (например, полиэтиленгликолем)), который по существу увеличивает время полураспада растворимого MANF в организме субъекта или повышает термостабильность растворимого MANF (например, в процессе хранения). Растворимый белок MANF, используемый в данных способах, может также содержать белок tat ВИЧ или любой другой фрагмент, который увеличивает клеточную проницаемость для
растворимого белка MANF.
Разнообразные способы получения рекомбинантного белка (например, рекомбинантного растворимого MANF) с использованием методов молекулярной биологии и культивирования клеток известны в данной области. Например, растворимый MANF, кодируемый последовательностью мРНК (например, мРНК, содержащей последовательность по меньшей мере на 8 0% идентичную (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную) SEQ ID N0:3), можно трансфицировать в клетку бактерий, дрожжей или млекопитающих (с использованием экспрессионной плазмиды или вирусного вектора для белка), что позволяет экспрессировать растворимый MANF в трансфицированной клетке. Трансфицированные клетки или культуральную среду можно собирать, и рекомбинантный растворимый белок MANF очищать с использованием методов, известных в данной области. Ряд дополнительных нуклеиновых кислот (мРНК), кодирующих другие растворимые белки MANF млекопитающих, известны в данной области.
В некоторых вариантах осуществления субъекта сначала идентифицируют или выбирают для лечения с использованием любого из диагностических способов, описанных в настоящем описании, или любого из способов прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании или известных в данной области.
Субъекту можно вводить по меньшей мере одну (например, по меньшей мере 2, 3, 4 или 5) дозу растворимого MANF (например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании) и/или апоморфина. Растворимый MANF и/или апоморфин можно вводить субъекту по меньшей мере один раз в сутки (например, два раза в сутки, три раза в сутки и четыре раза в сутки), по меньшей мере один раз в неделю (например, два раза в неделю, три раза в неделю, четыре раза в неделю) и/или по меньшей мере один раз в месяц. Субъекта можно лечить (например, периодически вводить растворимый MANF) в течение длительного периода времени (например, по меньшей мере один месяц, два
месяца, полгода, год, два года, три года, четыре года или пять
лет). Как подробно описано в настоящем описании, дозировку
растворимого MANF и/или апоморфина для введения субъекту может
определять врач при рассмотрении ряда физиологических факторов,
включая, но, не ограничиваясь ими, пол субъекта, массу тела
субъекта, возраст субъекта и наличие других медицинских
состояний. Растворимый MANF и/или апоморфин можно вводить
субъекту перорально, внутривенно, внутриартериально, подкожно,
внутримышечно, интракраниально или инъекцией в
цереброспинальную жидкость. Кроме того, средство может быть
сформулировано в твердой форме (например, для перорального
введения) или в физиологически приемлемом жидком носителе
(например, солевом растворе) (например, для внутривенного,
внутриартериального, подкожного, внутримышечного или
цереброспинального введения).
В некоторых вариантах осуществления субъекту дополнительно вводят по меньшей мере одно (например, два, три, четыре или пять) другое лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, любое из лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании, например, любой из инсулинов, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления растворимый MANF и/или апоморфин сформулированы вместе по меньшей мере с одним (например, двумя, тремя или четырьмя) другим лекарственным средством от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, сформулированы в физиологически приемлемом буфере или среде для системного введения) (например, любая из фармацевтических композиций, описанных в настоящем описании).
Способы понижения стресса эндоплазматического ретикулума в Р-клетках поджелудочной железы
Предложены также способы понижения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетке поджелудочной железы. Данные способы включают приведение р-клетки поджелудочной железы в контакт с эффективным количеством одного или более
(например, двух или трех) растворимых белков MANF (например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании, например, рекомбинантного, очищенного или выделенного растворимого белка MANF, содержащего последовательность, по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID N0:2), апоморфина и пиоглитазона. В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы находится in vitro (культура ткани). В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы может находиться в организме субъекта, р-клеткой поджелудочной железы, используемой в данных способах, может быть любая р-клетка поджелудочной железы, описанная в настоящем описании.
В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы может быть приведена в контакт с одним или более
(например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном в течение продолжительного периода времени (например, по меньшей мере 15 минут, 3 0 минут, 1 час, 2 часа, б часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов или 24 часа) . В некоторых вариантах осуществления р-клетку поджелудочной железы приводят в контакт с несколькими дозами одного или более
(например, двух или трех) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном (например, по меньшей мере двумя дозами, тремя дозами, четырьмя дозами или пятью дозами), например, через регулярные интервалы времени (например, примерно один раз в сутки, один раз в неделю или один раз в месяц).
Понижение стресса эндоплазматического ретикулума можно
определять с использованием любых способов, известных в данной
области для обнаружения стресса эндоплазматического ретикулума
в клетке (например, путем обнаружения или оценки любого из
маркеров стресса эндоплазматического ретикулума, описанных в
настоящем описании). Например, понижение стресса
эндоплазматического ретикулума можно обнаруживать по уменьшению
содержания одного или более маркеров стресса
эндоплазматического ретикулума в клетке. В некоторых вариантах осуществления понижение стресса эндоплазматического ретикулума
можно определять на основании одного или более из следующих событий: снижения индукции grp78 (BiP) или экспрессии bag-1; снижения активации, транслокации в аппарат Гольджи, расщепления протеазой или транслокации в ядро ATF6; снижения активации, олигомеризации или аутофосфорилирования PERK; снижения активации IRE1; снижения фосфорилирования eIF2a; снижения процессинга интронов мРНК ХВР 1; снижения активации сигнального пути JNK; снижения активации и расщепления прокаспазы 4 и уменьшения сдвига окислительно-восстановительного состояния среды эндоплазматического ретикулума, вызванного воздействием средства, индуцирующего стресс ЭР (например, по сравнению с контрольными |3-клетками поджелудочной железы, подвергнутыми воздействию средства, индуцирующего стресс ЭР, но не обработанными одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном). Уменьшение сдвига окислительно-восстановительного состояния среды эндоплазматического ретикулума можно измерять с использованием чувствительных к окислению-восстановлению красителей или белков, например, репортерного белка, описанного в примерах. В некоторых вариантах осуществления понижение
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках
поджелудочной железы можно сравнивать со степенью стресса
эндоплазматического ретикулума, наблюдаемого или
обнаруживаемого в р-клетках поджелудочной железы, не подвергнутых контакту с одним или более растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном, соответственно (например, in vitro или в организме субъекта). В некоторых вариантах осуществления понижение стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы происходит относительно контрольных р-клеток поджелудочной железы, которые не подвергнуты контакту с растворимым белком MANF, апоморфином или пиоглитазоном, но подвергнуты контакту со средством, индуцирующим стресс эндоплазматического ретикулума (например, тапсигаргином).
Данные способы может применять профессионал в области
здравоохранения (например, любой профессионал в области здравоохранения, описанный в настоящем описании) или ученый.
Способы понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза
В |3-клетках поджелудочной железы со стрессом
эндоплазматического ретикулума могут активироваться
внутриклеточные пути апоптоза. В настоящем изобретении также предложены способы понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы, включающие приведение популяции р-клеток поджелудочной железы в контакт с эффективным количеством одного или более (например, двух или трех) растворимых MANF (например, любого из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании), апоморфина и пиоглитазона.
В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной
железы находятся in vitro (культура ткани). В некоторых
вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы может
находиться в организме субъекта (например, в
трансплантированном биосовместимом материале или полимере). Р~ клетки поджелудочной железы, используемые в данных способах, могут быть любыми р-клетками поджелудочной железы, описанными в настоящем описании. В некоторых вариантах осуществления р-клетка поджелудочной железы может быть приведена в контакт с одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном в течение продолжительного периода времени (например, по меньшей мере 15 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, б часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов или 24 часа). В некоторых вариантах осуществления р-клетку поджелудочной железы приводят в контакт с несколькими дозами одного или более (например, двух или трех) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном (например, по меньшей мере двумя дозами, тремя дозами, четырьмя дозами или пятью дозами), например, через регулярные интервалы времени.
Начало и сроки апоптоза в популяции р-клеток поджелудочной железы можно определять с использованием любого из способов, описанных в настоящем описании или которые известны в данной области. Контакт популяции р-клеток поджелудочной железы с одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном может опосредовать снижение процентной доли р-клеток поджелудочной железы в популяции, которая подвергается апоптозу (например, индуцированному стрессом эндоплазматического ретикулума апоптозу), или задержку начала апоптоза в популяции р-клеток поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления понижение или задержку начала индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в клетках, обработанных одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном, можно сравнивать с ситуацией в популяции р-клеток поджелудочной железы, которые не обработаны одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном. В некоторых вариантах осуществления понижение или задержку начала индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в клетках, обработанных одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном, можно сравнивать с ситуацией в контрольной популяции р-клеток поджелудочной железы, не обработанных одним или более (например, двумя или тремя) растворимыми белками MANF, апоморфином и пиоглитазоном, но подвергнутых контакту со средством, которое индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума (например, тапсигаргином).
Методы обнаружения апоптоза клеток хорошо известны в данной области и включают, но без ограничения, расщепление клеточных каспаз (например, прокаспазы-3 и прокаспазы-4) , поглощение красителя Hoescht и 7-аминоактиномицина, анализ опосредованного TdT введения концевой метки dUTP и окрашивание мембраны аннексином. Разнообразные наборы для определения апоптоза коммерчески доступны.
Фармацевтические композиции
В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере один растворимый MANF (например, любой из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании, например, очищенный, выделенный или рекомбинантный растворимый MANF) и/или апоморфин, и по меньшей
мере одно другое лекарственное средство от поражения р-клеток поджелудочной железы (например, одно или более из любых лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании, например, пиоглитазон, TUDCA и любой из инсулинов, описанных в настоящем описании).
В некоторых вариантах осуществления композиции сформулированы с фармацевтически приемлемым носителем. Фармацевтические композиции и препараты можно вводить парентерально, перорально или локально, например, при помощи аэрозоля или чрескожно. Фармацевтические композиции можно формулировать любым способом и можно вводить в разнообразных стандартных лекарственных формах в зависимости от состояния или заболевания и степени тяжести болезни, общего медицинского состояния каждого пациента, предпочтительного способа введения и подобного. Более подробная информация о способах формулирования и введения фармацевтических препаратов досконально описана в научной и патентной литературе, см., например, Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 21e издание, 2005 г.
Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть сформулированы для введения, для использования любым удобным способом в медицине и ветеринарии. Смачивающие средства, эмульгаторы и лубриканты, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, а также красители, разделительные средства, покрывающие средства, подсластители, вкусовые и ароматизирующие средства, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композиции.
Препараты композиций по изобретению включают такие, которые подходят для внутрикожного введения, ингаляции,
перорального/назального, локального и/или парентерального введения. Препараты могут быть для удобства предложены в единичной дозированной форме и могут быть получены любыми способами, хорошо известными в данной области фармацевтики. Количество активного ингредиента (например, растворимого MANF и/или апоморфина, и одного или более дополнительных
лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы), которое может быть объединено с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьироваться в зависимости от пациента, которого подвергают лечению, конкретного способа введения, например, внутрикожного или ингаляции. Количество активного ингредиента, которое можно объединять с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, как правило, будет таким количеством соединения, которое создает терапевтический эффект (например, один или более любых терапевтических эффектов, описанных в настоящем описании).
Фармацевтические препараты по данному изобретению можно получать любым способом, известным в данной области для производства фармацевтических препаратов. Такие лекарственные средства могут содержать подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Препарат можно смешивать с нетоксичными фармацевтически приемлемыми эксципиентами, подходящими для производства. Препараты могут содержать один или более разбавителей, эмульгаторов, консервантов, буферов, эксципиентов и т.д., и могут быть предоставлены в таких формах, как жидкости, порошки, эмульсии, лиофилизированные порошки, спреи, кремы, лосьоны, препараты с контролируемым высвобождением, таблетки, пилюли, гели, нанесенными на пластыри, помещенными в имплантаты и т.д.
Фармацевтические препараты для перорального введения можно формулировать с использованием фармацевтически приемлемых носителей, хорошо известных в данной области, в соответствующих и подходящих дозах. Такие носители позволяют формулировать фармацевтические препараты в единичные дозированные формы,
такие как таблетки, пилюли, порошок, драже, капсулы, жидкости,
пастилки, гели, сиропы, густые суспензии, суспензии и так
далее, подходящие для приема внутрь пациентом. Фармацевтические
препараты для перорального введения можно формулировать с
твердым эксципиентом, необязательно измельчать полученную смесь
и обрабатывать смесь гранул после добавления подходящих
дополнительных соединений, при желании, для получения ядер
таблеток или драже. Подходящие твердые эксципиенты представляют
собой углеводные или белковые наполнители, включая, например,
сахара, в том числе лактозу, сахарозу, маннит или сорбит;
крахмал из кукурузы, пшеницы, риса, картофеля или других
растений; целлюлозу, такую как метилцеллюлоза,
гидроксипропилметилцеллюлоза или натрийкарбоксиметилцеллюлоза;
и камеди, включая гуммиарабик и трагакант; а также белки,
например, желатин и коллаген. Можно добавлять дезинтегрирующие
или солюбилизирующие средства, такие как сшитый
поливинилпирролидон, агар, альгиновая кислота или ее соль, например, альгинат натрия. Твердые капсулы могут содержать активные средства, смешанные с наполнителем или связующими средствами, такими как лактоза или крахмалы, лубрикантами, такими как тальк или стеарат магния, и, необязательно, стабилизаторами. В мягких капсулах активные средства могут быть растворены или суспендированы в подходящих жидкостях, таких как жирные масла, вазелиновое масло или жидкий полиэтиленгликоль, со стабилизаторами или без них.
Водные суспензии могут содержать активное средство
(например, растворимый M7ANF и/или апоморфин, и одно или более
дополнительных лекарственных средств от поражения р-клеток) в
смеси с эксципиентами, подходящими для производства водных
суспензий, например, для водных внутрикожных инъекций. Такие
эксципиенты включают суспендирующее средство, такое как
натрийкарбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза,
гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия,
поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и гуммиарабик, и диспергирующие или смачивающие средства, такие как природный
фосфатид (например, лецитин), продукт конденсации алкиленоксида
с жирной кислотой (например, стеарат полиоксиэтилена), продукт
конденсации этиленоксида с длинноцепочечным алифатическим
спиртом (например, гептадекаэтиленоксицетанол), продукт
конденсации этиленоксида с неполным сложным эфиром, полученным
из жирной кислоты и гексита (например, моноолеат
полиоксиэтиленсорбита), или продукт конденсации этиленоксида с
неполным сложным эфиром, полученным из жирной кислоты и
ангидрида гексита (например, моноолеат
полиоксиэтиленсорбитана) . Водная суспензия может также содержать один или более консервантов, таких как этил или н-пропил-п-гидроксибензоат, один или более красителей, один или более ароматизаторов и один или более подсластителей, таких как сахароза, аспартам или сахарин. Можно регулировать осмолярность препаратов.
В некоторых вариантах осуществления для введения используют фармацевтические препараты на основе масла. Суспензии на основе масла можно формулировать путем суспендирования активных средств в растительном масле, таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло, или в минеральном масле, таком как вазелиновое масло; или в их смеси. См., например, патент США 5716928, в котором описано использование эфирных масел или компонентов эфирных масел для увеличения биодоступности и снижения вариабельности между индивидуумами и в организме одного индивидуума перорально введенных гидрофобных фармацевтических соединений (см. также патент США 58584 01). Масляные суспензии могут содержать загуститель, такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Можно добавлять подсластители, такие как глицерин, сорбит или сахароза, для получения приятного на вкус перорального препарата. Можно обеспечивать сохранность данных препаратов путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота. Для примера инъекционного масляного носителя см. статью Minto, J. Pharmacol. Exp. Ther. 281: 93-102, 1997.
Фармацевтические препараты могут также быть в форме
эмульсий типа масло-в-воде. Масляная фаза может представлять собой растительное масло или минеральное масло, описанные выше, или их смесь. Подходящие эмульгаторы включают природные камеди, такие как гуммиарабик и трагакантовая камедь, природные фосфатиды, такие как соевый лецитин, сложные эфиры или неполные сложные эфиры, полученные из жирных кислот и ангидридов гексита, такие как моноолеат сорбитана, а также продукты конденсации таких неполных сложных эфиров с этиленоксидом, такие как моноолеат полиоксиэтиленсорбитана. Эмульсия может также содержать подсластители и ароматизаторы, как в препарате сиропов и эликсиров. Такие препараты могут также содержать мягчитель, консервант или краситель. В альтернативных вариантах осуществления эти инъекционные эмульсии типа масло-в-воде по изобретению содержат парафиновое масло, моноолеат сорбитана, этоксилированный моноолеат сорбитана и/или этоксилированный триолеат сорбитана.
Фармацевтические соединения можно также вводить интраназальным или внутриглазным способом введения, включая вдувание порошков и аэрозольных препаратов (для примеров стероидных ингаляционных препаратов см., например, статьи Rohatagi, J. Clin. Pharmacol. 35: 1187-1193, 1995; Tjwa, Алл. Allergy Asthma Immunol. 75: 107-111, 1995) .
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические соединения можно доставлять чрескожно, локальным способом, сформулированным в виде карандаша-аппликатора, растворов, суспензий, эмульсий, гелей, кремов, мазей, паст, желе, препаратов в вязком носителе, порошков и аэрозолей.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические соединения могут также доставляться в виде микросфер для медленного высвобождения в организме. Например, микросферы можно вводить путем внутрикожной инъекции лекарственного средства, которое медленно высвобождается подкожно; см. Rao, J. Biomater Sci Polym. Ed. 7: 623-645, 1995; в виде биоразлагаемых и инъекционных гелевых препаратов, см., например, Gao, Pharm. Res. 12: 857-863, 1995; или в виде микросфер для перорального введения, см., например, Eyles, J. Pharm. Pharmacol. 49: 669
674, 1997.
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические
соединения можно вводить парентерально, например, внутривенным
(в/в), внутримышечным, внутрибрюшинным или подкожным введением,
или введением в полость тела, просвет органа или в
цереброспинальную жидкость субъекта. Такие препараты могут
содержать раствор активного средства, растворенного в
фармацевтически приемлемом носителе. Приемлемыми носителями и
растворителями, которые можно использовать, являются вода и
раствор Рингера или изотонический раствор хлорида натрия. Кроме
того, стерильные жирные масла можно использовать в качестве
растворителя или суспензионной среды. Для этой цели можно
использовать любое мягкое жирное масло, включая синтетические
моно- или диглицериды. Кроме того, жирные кислоты, такие как
олеиновая кислота, также могут быть использованы для получения
инъекционных препаратов. Эти растворы являются стерильными и,
как правило, свободными от нежелательного материала. Эти
препараты можно стерилизовать общепринятыми, хорошо известными
методами стерилизации. Препараты могут содержать
фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, по мере необходимости, для приближения к физиологическим условиям, например, средства регулировки рН и буферы, регулирующие токсичность средства, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и тому подобное. Концентрация активного средства в этих препаратах может варьироваться в широких пределах и будет выбрана, главным образом, на основании объемов жидкости, вязкости, массы тела и подобного, в соответствии с конкретным выбранным способом введения и потребностями пациента. Для в/в введения препарат может быть стерильным инъекционным препаратом, таким как стерильная инъекционная водная или масляная суспензия. Такую суспензию можно формулировать с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств. Стерильный инъекционный препарат может также представлять собой суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, таком как раствор 1,3
бутандиола. Введение может быть болюсным или непрерывным (например, практически бесперебойным введением в кровеносный сосуд в течение определенного периода времени).
В некоторых вариантах осуществления фармацевтические соединения и препараты могут быть лиофилизированными. Стабильные лиофилизированные препараты, содержащие растворимый MANF и/или апоморфин и одно или более дополнительных лекарственных средств от поражения р-клеток поджелудочной железы, можно получать путем лиофилизации раствора, содержащего растворимый MANF и/или апоморфин и одно или более дополнительных лекарственных средств, а также наполнитель, например, маннит, трегалозу, рафинозу и сахарозу или их смеси. Способ получения стабильного лиофилизированного препарата может включать лиофилизацию раствора, содержащего примерно 2,5 мг/мл белка, примерно 15 мг/мл сахарозы, примерно 19 мг/мл NaCl и буфер цитрат натрия с рН более 5,5, но менее 6,5. См., например, US 2004/0028670.
Композиции и препараты можно доставлять при помощи липосом. При использовании липосом, особенно когда поверхность липосом несет лиганды, специфичные для целевых клеток, или они иным образом предпочтительно направлены на конкретный орган, можно сфокусировать доставку активного средства в целевые клетки in vivo. См., например, патенты США 6063400 и 6007839; Al-Muhammed, J. Microencapsul. 13: 293-306, 1996; Chonn, Curr. Opin. Biotechnol. 6: 698-708, 1995; и Ostro, Am. J. Hosp. Pharm. 46: 1576-1587, 1989.
Препараты по изобретению можно вводить для профилактического и/или терапевтического видов лечения. В некоторых вариантах осуществления для терапевтического применения композиции вводят субъекту, который имеет риск или имеет заболевание, описанное в настоящем описании, в количестве, достаточном для лечения, облегчения или частичной остановки клинических проявлений заболевания или его осложнений; это можно назвать терапевтически эффективным количеством. Например, в некоторых вариантах осуществления
фармацевтические композиции по изобретению вводят в количестве, достаточном для снижения числа симптомов или уменьшения тяжести, продолжительности или частоты одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
Количество фармацевтической композиции, адекватное для достижения этой цели, представляет собой терапевтически эффективную дозу. Схема применения и количества, эффективные для этого применения, то есть, режим дозирования, будет зависеть от множества факторов, включая стадию заболевания или состояния, тяжесть заболевания или состояния, общее состояние здоровья пациента, физическое состояние пациента, возраст и тому подобное. При расчете режима дозирования для пациента способ введения также принимают во внимание.
Для режима дозирования также принимают во внимание фармакокинетические параметры, хорошо известные в данной области, то есть, скорость абсорбции активного средства, биодоступность, метаболизм, клиренс и тому подобное (см., например, Hidalgo-Aragones, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58: 611-617, 1996; Groning, Pharmazie 51: 337-341, 1996; Fotherby, Contraception 54: 59-69, 1996; Johnson, J. Pharm. Sci. 84: 1144-1146, 1995; Rohatagi, Pharmazie 50: 610-613, 1995; Brophy, Eur. J. Clin. Pharmacol. 24: 103-108, 1983; Remington: The Science и Practice of Pharmacy, 21e издание, 2 0 05). Современный уровень техники позволяет врачу определять режим дозирования для каждого отдельного пациента, активных средств, а также заболевания или состояния, которое подвергается лечению. Руководства, имеющиеся для аналогичных композиций, используемых в качестве фармацевтических препаратов, можно использовать в качестве руководства для определения режима дозирования, то есть, схемы введения доз и уровня доз, вводимых при осуществлении на практике способов по изобретению, которые являются правильными и подходящими.
Можно проводить однократное или многократное введение препаратов в зависимости, например, от: дозировки и частоты введения в соответствии с потребностями и переносимостью для
пациента, и подобного. Препараты должны обеспечивать достаточное количество активных средств для эффективного лечения, предотвращения или ослабления состояний, заболеваний или симптомов.
В альтернативных вариантах осуществления суточное количество фармацевтических препаратов для перорального введения составляет примерно от 1 до 100 или более мг на килограмм массы тела в сутки. В отличие от перорального введения, при введении в кровь, в полость тела или в просвет органа можно использовать более низкие дозы. Гораздо более высокие дозы можно использовать при локальном или пероральном введении, или введении в виде порошков, спреев или путем ингаляции. Фактические способы получения парентерально или не парентерально вводимых препаратов известны или будут очевидны специалистам в данной области и описаны более подробно в таких публикациях, как Remington: The Science и Practice of Pharmacy. 21e издание, 2005 г.
Наборы
Предложены также наборы, содержащие по меньшей мере одно антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела (например, Fab, F(ab')2f Fab', scFv, ди-scFv или sdAb), которые специфически связываются с растворимым белком MANF (например, любым из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании) , и по меньшей мере одно (например, два, три, или четыре) антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с одним другим маркером поражения р-клеток поджелудочной железы (например, инсулином, С-белком и IAPP). В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающие фрагменты антител, включенные в наборы, локализованы на субстрате (например, для твердофазного иммуноферментного анализа). В некоторых вариантах осуществления наборы могут дополнительно включать выделенный, очищенный или рекомбинантный растворимый белок MANF (например, любой из растворимых белков MANF, описанных в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления одно или более антител или
антигенсвязывающих фрагментов антител являются мечеными (например, радиоизотопом, флуорофором или связывающим белком (например, авидином)). Эти наборы могут быть полезны, например, для диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы, идентификации субъекта, имеющего риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, или мониторинга функции Р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта. В некоторых вариантах осуществления наборы могут дополнительно содержать инструкции по осуществлению любого из способов, описанных в настоящем описании. Репортерные белки
В способах, предложенных в настоящем изобретении, используют репортерные белки, которые содержат сигнальную последовательность связывающего белка (BiP) (например, сигнальную последовательность BiP мыши или человека), чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок (например, чувствительный к окислению-восстановлению зеленый флуоресцентный белок и чувствительный к окислению-восстановлению желтый флуоресцентный белок) и аминокислотную последовательность KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) . В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность BiP находится на N-конце, чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок является С-концевым по отношению к сигнальной последовательности BiP, и аминокислотная последовательность KDEL является С-концевой по отношению к чувствительному к окислению-восстановлению флуоресцентному белку. В некоторых вариантах осуществления имеется от 1 до 100 аминокислот (например, 1-50, 1-40, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15 и 110 аминокислот) между двумя или более отдельными элементами белка, присутствующими в репортерном белке (например, между сигнальной последовательностью BiP, чувствительным к окислению-восстановлению флуоресцентным белком и последовательностью KDEL) . Аминокислотная последовательность чувствительного к окислению-восстановлению зеленого флуоресцентного белка приведена ниже.
Чувствительный к окислению-восстановлению зеленый флуоресцентный белок (SEQ ID N0:10):
MSKGEELFTG WPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYG KLTLKFIVTT GKLPVPWPTL VTTFXLQCFA RYPDHMKRHD FFKSAMPEGY VQERTIFFKD DGNYKTRAEV KFEGDTLVNR IELKGIDFKE DGNILGHKLE YNYNSHCVYI VADKQKNGIK VNFKIRHNIE DGSVQLADHY QQNTPIGDGP VLLPDNHYLC YQSALSKDPN EKRDHMVLLE FVTAAGITHG MDELYK
Репортерные белки, описанные в настоящем описании, могут содержать последовательность, по меньшей мере на 8 0% идентичную (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%) последовательности SEQ ID N0:10 (при условии, что полученный белок сохраняет свое чувствительное к окислению-восстановлению флуоресцентное свойство). Например, мутации, внесенные в чувствительный к окислению-восстановлению зеленый флуоресцентный белок или чувствительный к окислению-восстановлению желтый флуоресцентный белок, не должны включать мутации в остатках цистеина. В некоторых вариантах осуществления чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок представляет собой чувствительный к окислению-восстановлению желтый флуоресцентный белок (например, rxYFP; описанный в статье Ostergaard et al. , EMBO J. 20: 5853-5862, 2001). Дополнительные примеры чувствительных к окислению-восстановлению флуоресцентных белков описаны в статьях Merksamer et al. {Cell 135: 933-947, 2008) и Dooley et al. (J. Biol. Chem. 279: 22284-22293, 2004) .
Иллюстративные сигнальные последовательности BiP человека и мыши, которые могут присутствовать в репортерном белке, приведены ниже. Репортерные белки, используемые в способах, описанных в настоящем описании, могут содержать любую сигнальную последовательность BiP млекопитающего (например, сигнальную последовательность BiP человека или мыши).
В некоторых вариантах осуществления репортерный белок и
нуклеиновые кислоты, кодирующие эти репортерные белки,
предоставляют возможность чувствительного (например,
значительно улучшенного) обнаружения тонких флуктуаций в окислительно-восстановительном состоянии внутри интактной |3
клетки поджелудочной железы.
Сигнальная последовательность BiP человека (SEQ ID N0:12): MKLSLVAAMLLLLSAARA
Сигнальная последовательность BiP мыши (SEQ ID N0:13): MMKFTVAAALLLLGAVRA
В некоторых вариантах осуществления репортерный белок
содержит последовательность, которая по меньшей мере на 8 0%
идентична (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 91%, 92% 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична) репортерному
белку, содержащему последовательность SEQ ID N0:14 (приведена
ниже). В некоторых вариантах осуществления репортерный белок
кодирован нуклеиновой кислотой, содержащей последовательность,
которая по меньшей мере на 8 0% идентична (например, по меньшей
мере на 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
или 100% идентична) SEQ ID N0:15. Например, мутации в
репортерном белке с SEQ ID N0:14 не должны включать мутации в
остатках цистеина. Различные мутации SEQ ID N0:14 можно
тестировать с использованием любого из способов, описанных в
настоящем описании, для определения того, сохраняют ли мутанты
свои чувствительные к окислению-восстановлению флуоресцентные
свойства. Конкретные чувствительные к окислению-восстановлению
флуоресцентные свойства белка, содержащего последовательность,
по меньшей мере на 80% идентичную SEQ ID N0:14 (MEROS-GFP),
описаны подробно в примерах.
Белок MEROS-GFP (SEQ ID N0:14):
MMKFTVVAAALLLLGAVRAEEEDPPVATMSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKF
SVSGEGEGDATYGKLTLKFISTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKRHDFF
KSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKL EYNYNCHKVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPD
NHYLKT CS ALSKDPNEKRDHMVLLERVTA AGITHGMDELYKTS GGPPPTGEEDT SE
KDEL
мРНК MEROS-GFP (SEQ ID N0:15): atgatgaagttcactgtggtggcggcggcgttgctgctgctgggcgcggtgcgggccgaggaggaggatccaccggtcgccaccat gagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggag agggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttccactactggaaaactacctgttccatggccaacacttgtcact actttcagttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaaacggcatgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgta caggaaagaactatatttttcaaagatgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgttaatagaatc gagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaac attcttggac ac aaattggaatacaactataactgcc acaaggtatacatc atggcagac aaac aaaagaatggaatc aaagttaacttc aaaattagacacaac attgaagatggaagc gttcaact agcagaccatta tcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgaagacatgctctgccctttcgaaagatcccaac gaaaagagagaccacatggtccttcttgagcgcgtaacagctgctgggattac ac atggc atggatgaactatacaaaactagtggag gccctcccccaactggtgaagaggatacatcagaaaaagatgagttgtag
Способы скрининга на средства-кандидаты
Предложены также способы скрининга на соединение-кандидат, полезное для одного или более из следующего: лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у
субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы включают получение р-клетки поджелудочной железы, приведение Р~ клетки поджелудочной железы в контакт с соединением-кандидатом и определение уровня растворимого M7ANF, продуцируемого Р~ клеткой поджелудочной железы в присутствии соединения-кандидата, а также сравнение уровня растворимого M7ANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, с эталонным уровнем растворимого M7ANF. В данных способах повышенный уровень растворимого M7ANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы, по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для одного или более из следующего: лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы.
|3-клетка (и) , используемая (ые) в данных способах, может быть любой из р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании (например, линией р-клеток поджелудочной железы (например, любой из линий р-клеток поджелудочной железы, описанных в настоящем описании) или первичной р-клеткой поджелудочной железы).
Уровни растворимого MANF можно определять с помощью стандартных молекулярно-биологических методов (например, любых из описанных в настоящем описании методов на основе антител). Данные методы может применять любой профессионал в области здравоохранения (например, врач, медсестра, ассистент врача, лаборант или ассистент медсестры) или ученый.
В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой уровень растворимого MANF, продуцируемого Р~ клеткой поджелудочной железы в отсутствие соединения-кандидата. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой уровень растворимого MANF, имеющийся у субъекта, который не имеет поражения р-клеток поджелудочной железы, не имеет симптома поражения р-клеток поджелудочной железы или поражения р-клеток поджелудочной железы в семейном анамнезе. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой уровень растворимого MANF, продуцируемого в первичных р-клетках поджелудочной железы млекопитающего или в линии р-клеток поджелудочной железы млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой пороговый уровень растворимого MANF.
Предложены также способы скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и/или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. Данные способы включают получение клетки млекопитающего (например, р-клетки поджелудочной железы
млекопитающего или линии р-клеток поджелудочной железы),
экспрессирующей репортерный белок, содержащий сигнальную
последовательность BiP, чувствительный к окислению-
восстановлению флуоресцентный белок и аминокислотную
последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с
тестируемым соединением; определение количества окисленного
репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение
количества окисленного репортерного белка, присутствующего в
клетке, с эталонным уровнем; где повышенный уровень окисленного
репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем
указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным
для лечения или задержки начала поражения р-клеток
поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы
и/или понижения или задержки индуцированного стрессом
эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках
поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления
эталонный уровень представляет собой количество окисленного
репортерного белка, присутствующего в клетке млекопитающего в
отсутствие средства-кандидата. В некоторых вариантах
осуществления клетку приводят в контакт как со средством-
кандидатом, так и со средством, которое индуцирует стресс ЭР, и
эталонный уровень представляет собой уровень окисленного
репортерного белка, присутствующего в клетке, обработанной
только средством, которое индуцирует стресс ЭР.
Неограничивающие примеры средств, которые индуцируют стресс ЭР, описаны в настоящем описании. Дополнительные примеры средств, которые индуцируют стресс ЭР, известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой пороговый уровень окисленного репортерного белка. Используемыми клетками могут быть клетки человека, мыши, крысы, свиньи, обезьяны или крупного рогатого скота. Клетки могут быть любой линией р-клеток поджелудочной железы, описанной в настоящем описании или известной в данной области. В некоторых вариантах осуществления репортерный белок
представляет собой SEQ ID N0:14 или белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична) SEQ ID N0:14.
Предложены также способы скрининга на соединение-кандидат,
полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток
поджелудочной железы у субъекта, понижения стресса
эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы
и/или понижения или задержки индуцированного стрессом
эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках
поджелудочной железы. Данные способы включают получение клетки
млекопитающего (например, р-клетки поджелудочной железы
млекопитающего), экспрессирующей репортерный белок, содержащий
сигнальную последовательность BiP, чувствительный к окислению-
восстановлению флуоресцентный белок и аминокислотную
последовательность KDEL; приведение клетки в контакт с
тестируемым соединением; определение количества
восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, и сравнение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным уровнем; где пониженный уровень восстановленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что соединение-кандидат может быть полезным для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, понижения
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы и/или понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в р-клетках поджелудочной железы. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой количество восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке млекопитающего в отсутствие соединения-кандидата. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт как со средством-кандидатом, так и со средством, которое индуцирует стресс ЭР, и эталонный уровень представляет собой уровень восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке,
обработанной только средством, которое индуцирует стресс ЭР. Неограничивающие примеры средств, которые индуцируют стресс ЭР, описаны в настоящем описании. Дополнительные примеры средств, которые индуцируют стресс ЭР, известны в данной области. В некоторых вариантах осуществления эталонный уровень представляет собой пороговый уровень восстановленного репортерного белка. Используемыми клетками могут быть клетки человека, мыши, крысы, свиньи, обезьяны или крупного рогатого скота. Клетки могут быть любой линией р-клеток поджелудочной железы, описанной в настоящем описании или известной в данной области. В некоторых вариантах осуществления репортерный белок представляет собой SEQ ID N0:14 или белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична (например, по меньшей мере на 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична) SEQ ID N0:14.
В некоторых вариантах осуществления определение проводят путем обнаружения одного или более флуоресцентных свойств репортерного белка в клетке (например, обнаружения спектральных особенностей, которые уникальны для восстановленной или окисленной формы репортерного белка). В некоторых вариантах осуществления уровень восстановленной или окисленной формы репортерного белка определяют с использованием флуоресцентного планшет-ридера или с использованием сортировки клеток с активированной флуоресценцией (FACS).
Например, р-клетки поджелудочной железы (например, INS-1 832/13), экспрессирующие репортерный белок, можно высевать в 6-луночные планшеты, создавать контакт с соединением-кандидатом, и затем собирать клетки после обработки трипсином. После промывания забуференным фосфатном солевым раствором клетки можно суспендировать в подходящей среде (например, буферном солевом растворе Хенкса с 11 мМ глюкозы) и проводить FACS с LSRII (BD) для определения уровней восстановленной или окисленной формы репортерного белка, присутствующего в клетке.
В некоторых вариантах осуществления можно использовать флуоресцентный планшет-ридер для определения уровня
восстановленной или окисленной формы репортерного белка, присутствующего в клетке. Например, клетки линии р-клеток поджелудочной железы (например, клетки INS-1 832/13) можно высевать в 9б-луночные планшеты и обрабатывать соединением-кандидатом. Уровни восстановленной или окисленной формы репортерного белка можно определять при помощи флуоресцентного планшет-ридера. В таких вариантах осуществления следует проводить вычитание фонового сигнала до определения уровня восстановленной или окисленной формы репортерного белка.
В некоторых вариантах осуществления репортерный белок содержит SEQ ID N0:14 или белок, содержащий последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID N0:14. В этих вариантах осуществления восстановленная форма репортерного белка имеет длину волны возбуждения 473 нм и длину волны излучения 510 нм, и окисленная форма репортерного белка имеет длину волны возбуждения 394 нм и длину волны излучения 510 нм.
В некоторых вариантах осуществления данных способов можно определять отношение уровня восстановленной формы репортерного белка к уровню окисленной формы репортерного белка в клетке. В данных способах рассчитанное отношение можно сравнивать с эталонным отношением. Эталонное отношение может представлять собой отношение, полученное от клетки, которая не обработана соединением-кандидатом. Эталонное отношение может также представлять собой пороговое отношение. В некоторых вариантах осуществления клетку приводят в контакт с соединением-кандидатом и средством, которое индуцирует стресс ЭР, определяют отношение уровня восстановленной формы репортерного белка к уровню окисленной формы репортерного белка в клетке, и отношение в клетке сравнивают с эталонным отношением, полученным для клетки, обработанной только средством, которое индуцирует стресс ЭР. В данных способах соединение-кандидат, которое снижает отношение в клетке по сравнению с эталонным отношением, идентифицируют как средство-кандидат для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
Некоторые варианты осуществления указанных выше способов
дополнительно включают тестирование соединения-кандидата на животной модели поражения р-клеток поджелудочной железы
(например, определение того, будет ли введение соединения-кандидата лечить (например, уменьшать тяжесть, частоту или продолжительность) один или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у животной модели или задерживать начало развития одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы у животной модели). Неограничивающие примеры животных моделей диабета 2 типа включают тучных крыс Цукера (ZFR), ob/ob (тучных) мышей, ср (тучных) крыс, диабетических тучных крыс Цукера (ZDF), песчаных крыс
(Psammomys obesus), тучных макак-резус, мышей КК и мышей КК-АУ
(описанных в статье Srinivasan et al., Indian J. Med. Res. 125: 451-472, 2007). Неограничивающие примеры животных моделей диабета 1 типа включают не страдающих ожирением диабетических
(NOD) мышей и крыс линии BioBreeding (ВВ) (описанных в статье Rees et al., Diabetic Med. 22: 359-370, 2005) . Тяжесть или начало развития одного или более симптомов поражения р-клеток поджелудочной железы можно определять или измерять у этих животных с использованием способов, описанных в настоящем описании, или способов, известных в данной области.
Некоторые варианты осуществления указанных выше способов дополнительно включают тестирование того, будет ли соединение-кандидат уменьшать или вызывать задержку индуцированного
стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции р-клеток поджелудочной железы (например, вызывать понижение или задержку индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции р-клеток поджелудочной железы, обработанных средством-кандидатом и средством, которое индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума, по сравнению с популяцией р-клеток поджелудочной железы, обработанных средством, которое индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума, в отсутствие средства-кандидата). Методы обнаружения апоптоза клеток хорошо известны в данной области и включают, но без ограничения, расщепление клеточных каспаз
(например, прокаспазы-3 и прокаспазы-4), поглощение красителя Hoescht и 7-аминоактиномицина, анализ опосредованного TdT введения концевой метки dUTP и окрашивание мембраны аннексином. Различные наборы для определения апоптоза клеток коммерчески доступны.
Некоторые варианты осуществления указанных выше способов дополнительно включают проверку того, способно ли соединение-кандидат предотвращать или задерживать индукцию других маркеров
стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках
поджелудочной железы (например, способно ли соединение-кандидат
снижать индукцию grp78 (BiP) или экспрессию bag-1; снижать
активацию, транслокацию в аппарат Гольджи, расщепление
протеазой или транслокацию в ядро ATF6; снижать активацию,
олигомеризацию или аутофосфорилирование PERK; снижать активацию
IRE1; уменьшать фосфорилирование eIF2a; уменьшать процессинг
интронов мРНК ХВР1; снижать активацию сигнального пути JNK;
предотвращать активацию и расщепление прокаспазы 4 и/или
предотвращать или уменьшать сдвиг окислительно-
восстановительного состояния среды эндоплазматического ретикулума (например, измеренного с использованием любого из репортерных белков, описанных в настоящем описании)). Уровни экспрессии BiP и Вад-1 можно определять методом количественной ПЦР в реальном времени с набором праймеров, которые сконструированы для гибридизации с фрагментами BiP или Вад-1. Уровни экспрессии или процессинг, активацию, фосфорилирование или клеточную локализацию BiP, Вад-1, PERK, IRE1, eIF2a, ХВР1 и ATF6 можно также определять при помощи антител, которые специфически связываются с BiP, Вад-1, PERK, IRE1, eIF2a, ХВР1 или ATF6, используя методы, известные в данной области. В некоторых вариантах осуществления предотвращение или задержку появления одного или более маркеров стресса эндоплазматического ретикулума в клетках, обработанных средством-кандидатом и средством, которое индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума, сравнивают с ситуацией в р-клетке(ах) поджелудочной железы, обработанных средством, которое индуцирует стресс
эндоплазматического ретикулума, в отсутствие средства-кандидата .
Любой тип соединения-кандидата можно использовать в
указанных выше способах. Соединением-кандидатом, например,
может быть белок, пептид, нуклеиновая кислота (например, РНК
или ДНК) , неорганическое соединение, липид, олигосахарид или
любая их комбинация. Библиотеки соединений-кандидатов, которые
можно использовать в указанных выше способах, коммерчески
доступны. Соединения-кандидаты для скрининга можно получать,
используя любой из многочисленных подходов к методам получения
комбинаторных библиотек, известных в данной области, включая:
биологические библиотеки; пространственно адресуемые
параллельные твердофазные или жидкофазные библиотеки; методы синтетических библиотек с необходимостью деконволюции; метод получения библиотек по принципу "одна гранула - одно соединение"; и синтетические методы получения библиотек с использованием селекции методом аффинной хроматографии. Биологический подход к библиотекам ограничен пептидными библиотеками, тогда как другие четыре подхода применимы к пептидным, непептидным олигомерным библиотекам или библиотекам низкомолекулярных соединений (Lam, Anticancer Drug Des., 12: 145, 1997).
Примеры методов синтеза молекулярных библиотек можно найти в литературе, например, в статьях: DeWitt et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 6909, 1993; Erb et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 11422, 1994; Zuckermann et al., J. Med. Chem. , 37: 2678, 1994; Cho et al. , Science, 261: 1303, 1993; Carrell et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl, 33: 2059, 1994; Carell et al. , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 33: 2061, 1994; и Gallop et al., J. Med. Chem., 37: 1233, 1994.
Библиотеки соединений можно предоставлять в растворе
(например, Houghten, Bio/Techniques, 13: 412-421, 1992) или на гранулах (Lam, Nature, 354: 82-84, 1991), чипах (Fodor, Nature 364: 555-556, 1993), бактериях (патент США 5223409), спорах
(патент США 5571698, 5403484 и 5223409), плазмидах (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 1865-1869, 1992) или
фагах (Scott and Smith, Science, 249: 386-390, 1990; Devlin, Science, 249: 404-406, 1990; Cwirla et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 6378-6382, 1990; и Felici, J. Mol. Biol., 222: 301-310, 1991). ПРИМЕРЫ
Пример 1. Экспрессия растворимого MANF повышена при стрессе ЭР в р-клетках поджелудочной железы
Проводили эксперименты для определения того, индуцируется
ли экспрессия растворимого MANF в р-клетках поджелудочной
железы в ответ на стресс эндоплазматического ретикулума. Данные
эксперименты проводили с использованием линий р-клеток
поджелудочной железы грызунов (INS-1 832/13 и MIN6), первичных
клеток островков мыши и человека, а также двух различных
химических средств, которые индуцируют стресс
эндоплазматического ретикулума (тапсигаргина и туникамицина). Клетки INS-1 832/13 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, пенициллин, стрептомицин, пируват натрия и 0,1% р-меркаптоэтанол. Первичные клетки островков получали от Prodo, высевали в б-луночные планшеты, предварительно покрытые ламинином V, продуцируемым клетками 8 04G, и культивировали в среде CMRL с добавлением фетальной телячьей сыворотки, заменимых аминокислот, пирувата натрия и антибиотиков.
Растворимый белок MANF обнаруживали в среде от культивируемой линии р-клеток поджелудочной железы крысы (INS-1 832/13) после обработки тапсигаргином (50 нМ) (фиг.1). Повышенные уровни мРНК MANF обнаруживали в той же линии клеток после обработки либо 5 мкМ туникамицином, либо 2 0 нМ тапсигаргином в течение 24 часов (фиг.2).
Данные, полученные в экспериментах с первичными клетками островков мыши, дополнительно показали, что обработка клеток мышиных островков 0,5 мкМ тапсигаргином в течение б часов приводит к значительному возрастанию экспрессии мРНК MANF (фиг.З). Вторую серию экспериментов проводили с первичными клетками островков, полученных от двух людей-доноров. Эти
данные также показали, что обработка клеток островков человека тапсигаргином (0,25 мкМ) приводит к значительному возрастанию экспрессии мРНК MANF (фиг.4) и к продукции и высвобождению растворимого белка MANF во внеклеточную среду (фиг.5 и б).
Проводили эксперименты для определения того, защищает ли растворимый MANF р-клетки поджелудочной железы от стресса эндоплазматического ретикулума. В первой серии экспериментов экспрессию MANF подавляли при помощи одного из трех различных конструктов миРНК, нацеленных на мРНК MANF. Липофектамин 2 000 использовали в соответствии с протоколом производителя для проведения трансфекций. Данные, полученные в этих экспериментах, показали, что подавление экспрессии MANF приводит к увеличению стресса эндоплазматического ретикулума
(на что указывает возрастание уровней мРНК BiP), когда клетки обрабатывают в течение 2 4 часов туникамицином (2 мкМ), по сравнению с контрольными клетками, трансфицированными контрольной миРНК и обработанными таким же количеством туникамицина (фиг.7). Эти данные свидетельствуют о том, что растворимый MANF играет роль в предотвращении или понижении стресса эндоплазматического ретикулума в р-клетках поджелудочной железы.
Проводили дополнительные эксперименты для определения того, будет ли растворимый MANF понижать или задерживать индуцированный стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоз в р-клетках поджелудочной железы, обработанных химическим средством, индуцирующим стресс эндоплазматического ретикулума. Данные, полученные в этих экспериментах, показали, что обработка линии р-клеток поджелудочной железы мыши (MIN6) растворимым MANF значительно снижала степень расщепления каспазы-3, наблюдаемого в клетках после обработки туникамицином
(1 мкМ, 24 часа) (фиг.8). Эти данные свидетельствуют о том, что растворимый MANF способен предотвращать или задерживать индуцированный стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоз в р-клетках поджелудочной железы.
Пример 2. Система для мониторинга окислительно
восстановительного состояния в ЭР
Разработана новая система для мониторинга окислительно-
восстановительного состояния ЭР в клетке. В данной системе
сигнальную последовательность BiP мыши и сигнал для удержания
белка в ЭР (KDEL) млекопитающих присоединяли к N- и С-концу
чувствительного к окислению-восстановлению зеленого
флуоресцентного белка (GFP), соответственно (фиг.9А). Рекомбинантный белок получил название MEROS-GFP (локализованный в эндоплазматическом ретикулуме млекопитающих чувствительный к окислению-восстановлению GFP). Использовали флуоресцентную микроскопию для подтверждения того, что MEROS-GFP был локализован в ЭР (фиг.9В). У MEROS-GFP наблюдались четко отличающиеся спектры возбуждения в полностью окисленной и восстановленной форме в клетках NSC34, с максимумами при 394 нм и 473 нм (фиг.1 OA) . Клетки NSC34 культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальную телячью сыворотку, пенициллин и стрептомицин.
Спектры излучения от двух различных длин волн возбуждения, 50 8 нм и 510 нм, были сопоставимы (фиг. 10В и ЮС) . Анализ с помощью конфокальной микроскопии подтвердил, что флуоресценция от возбуждения при 47 6 нм значительно возрастала, тогда, как флуоресценция при 4 05 нм незначительно снижалась в клетках, обработанных сильным восстановителем дитиотреитолом (DTT) (фиг.11).
Соотношение между флуоресценцией от возбуждения при 473 нм и 394 нм, нормированное на необработанные клетки дикого типа, называется коэффициентом MEROS-GFP. Коэффициент MEROS-GFP определяли с использованием флуоресцентного планшет-ридера. В этих экспериментах клетки INS-1 832/13 высевали на 9б-луночный планшет при плотности 50000 клеток/лунка, клетки обрабатывали Н2О2 или DTT при различных концентрациях в течение 3 0 минут и измеряли флуоресценцию при длине волны возбуждения 473 нм и длине волны излучения 510 нм (для восстановленного MEROS-GFP) или при длине волны возбуждения 3 94 нм и длине волны излучения 510 нм (для окисленного MEROS-GFP). Коэффициент MEROS-GFP определяли после вычитания фонового сигнала. Полученные данные
показали, что окислитель, Н20г, не изменял коэффициент MEROS-GFP, что указывало на то, что MEROS-GFP являлся почти на 100% окисленным in vivo (фиг.12). Напротив, обработка DTT приводила к увеличению коэффициента MEROS-GFP зависимым от дозы образом (фиг.12).
Проводили дополнительные эксперименты для подтверждения
того, что коэффициент MEROS-GFP отражал изменения его
окислительно-восстановительного состояния in vivo. В этих
экспериментах окислительно-восстановительное состояние MEROS-
GFP отслеживали с использованием SDS-ПААГ в невосстанавливающих
условиях в комбинации с тиол-алкилирующим реагентом, 4-
ацетамидо-4'-малеимидилстильбен-2,2'-дисульфоновой кислотой
(AMS) . В этих экспериментах клетки INS-1 832/13, оставленные
необработанными или обработанные 2 мМ DTT, лизировали 1х
буфером для образцов SDS-ПААГ, содержащим 2 5 мМ AMS с
содержанием или без содержания 2-|3-меркаптоэтанола, кипятили
при 95°С в течение 10 минут, электрофоретически разделяли в
SDS-ПААГ и подвергали иммуноблоттингу с использованием анти-GFP
антитела. Как и следовало ожидать, SDS-ПААГ в
невосстанавливающих условиях лизатов из обработанных DTT клеток продемонстрировал только одну медленно мигрирующую форму MEROS-GFP, свидетельствуя о том, что обработка DTT полностью восстанавливала MEROS-GFP in vivo (фиг.13).
Также проводили мониторинг коэффициента MEROS-GFP в обработанных DTT клетках в различные моменты времени. На фиг.14 показано, что среда ЭР может переходить в восстановленное состояние в течение нескольких минут обработки DTT и возвращаться в окисленное состояние в течение одной минуты после вымывания DTT. Эти результаты свидетельствуют о том, что MEROS-GFP можно использовать для того, чтобы в реальном времени вживую проводить мониторинг окислительно-восстановительного состояния в ЭР клеток млекопитающих.
Для того чтобы точно отслеживать коэффициент MEROS-GFP in vivo, использовали проточную цитометрию. Полученные данные показали, что обработка линии р-клеток поджелудочной железы,
INS-1 832/13, DTT приводила к зависимому от дозы увеличению соотношения флуоресценции от возбуждения при 488 нм и при 4 05 нм (фиг.15 и 16) . Для дальнейшего анализа этого наблюдения изучали средний коэффициент MEROS-GFP в обработанных DTT клетках. Данные показали, что обработка DTT приводила к увеличению среднего коэффициента MEROS-GFP зависимым от дозы образом (фиг.17). Однако обработка Н2О2 не изменяла коэффициент MEROS-GFP (фиг.18), свидетельствуя о том, что MEROS-GFP был почти полностью окислен в ЭР на базальных уровнях. Средний коэффициент MEROS-GFP также повышали как экспериментальные, так и физиологические индукторы стресса ЭР, включая туникамицин, тапсигаргин, брефельдин A, MG 132 (фиг.19 и 20), хронически высокие уровни глюкозы (фиг.21), лишение сыворотки, депривацию глюкозы (фиг.22), пальмитат, человеческий островковый амилоидный полипептид (ч1АРР) и воспалительные цитокины (фиг.23 и 24) .
Пример 3. Гетерогенность окислительно-восстановительных состояний ЭР в клетках с находящимся в состоянии стресса ЭР
Две различные популяции клеток наблюдали с помощью метода проточной цитометрии после обработки клеток INS-1 832/13 пальмитатом (сильным индуктором стресса ЭР для р-клеток поджелудочной железы): одну, в которой сохранялось окисленное состояние ЭР, и другую, в которой ЭР был в сильно восстановленном состоянии (фиг.25 и 26) . Для дальнейшего изучения этих гетерогенных популяций клеток, клетки, которые имели коэффициент MEROS-GFP более чем 2, были классифицированы как "восстановленные клетки". Эти две различные популяции клеток также наблюдали после обработки другими известными индукторами стресса ЭР в р-клетках поджелудочной железы, включая хронически высокие уровни глюкозы (фиг.27), лишение сыворотки, депривацию глюкозы (фиг.28) и IAPP человека (фиг.29). Среди индукторов стресса, обработка пальмитатом приводит к наибольшему увеличению популяции клеток с сильно восстановленным ЭР. Интересно, что ненасыщенные жирные кислоты, олеиновая и линолевая кислоты, которые, как показано ранее,
защищают от индуцированной пальмитатом дисфункции клеток, по существу подавляют способность пальмитата создавать восстановленное состояние ЭР (фиг.30). Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки с ЭР в состоянии стресса являются гетерогенными по их окислительно-восстановительному состоянию.
Пример 4. Активация реакции несвернутых белков (РНБ) в клетках
с восстановленным состоянием ЭР
Проводили эксперименты по изучению взаимоотношения между РНБ и гетерогенностью окислительно-восстановительного состояния. В этих экспериментах в одних и тех же клетках проводили мониторинг как окислительно-восстановительного состояния, так и уровней активации РНБ. Для достижения этой цели был сконструирован репортерный ген РНБ, кодирующий красный флуоресцентный белок, mCherry, под контролем промотора BiP человека. Промотор BiP содержит три элемента реакции несвернутых белков (РНБЭ) и, как показано, эффективно отражает уровни активации РНБ. Эту репортерную плазмиду BiP-mCherry трансфицировали в клетки INS-1 832/13, экспресирующие MEROS-GFP, и использовали FACS анализ для мониторинга коэффициента MEROS-GFP и уровней активации РНБ через BiP-mCherry в одних и тех же клетках (фиг.31). Уровни активации BiP-mCherry и коэффициент MEROS-GFP контролировали после индукции стресса ЭР. В этих экспериментах клетки INS-1 832/13, экспрессирующие MEROS-GFP, высевали на б-луночные планшеты, обрабатывали каждым из соединений в течение указанного времени, и затем собирали после обработки трипсином. После промывания забуференным фосфатном солевым раствором клетки ресуспендировали в буферном солевом растворе Хенкса с 11 мМ глюкозы. Проводили анализы методом проточной цитометрии с LSRII (BD).
Полученные данные показали, что популяция клеток с восстановленным состоянием ЭР (коэффициент MEROS-GFP > 2,0) имела более высокие уровни активации BiP-mCherry по сравнению с клетками, которые были способны поддерживать ЭР в окисленном состоянии, что означало активацию РНБ в популяции клеток с сильно восстановленным состоянием ЭР (фиг.32 и 33).
Проводили дополнительные эксперименты для подтверждения этих данных. В этих экспериментах клетки с окисленным состоянием ЭР и сильно восстановленным состоянием ЭР сортировали методом FACS после обработки пальмитатом (фиг.34 и 35), и экспрессию маркеров РНБ BiP и сплайсированного ХВР-1 измеряли методом ПЦР в реальном времени. В этих экспериментах восстановленные и окисленные клетки сортировали методом FACS, и суммарную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy (Qiagen). Количественную ПЦР с обратной транскриптазой проводили с использованием BioRad iQ5, используя зеленый краситель SYBR.
Полученные данные показали, что уровни экспрессии BiP и сплайсированного ХВР-1 были повышены в клетках с сильно восстановленным состоянием ЭР по сравнению с уровнями в клетках с окисленным состоянием ЭР (фиг.36). Эти данные дополнительно подтверждали, определяя профиль экспрессии в клетках с восстановленным состоянием ЭР и окисленным состоянием ЭР (фиг.37). Эти эксперименты проводили, используя FACS-сортированные клетки INS-1 832/13, обработанные 0,5 мМ пальмитатом в течение 2 4 часов. Суммарную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy (Qiagen). Очищенную РНК наносили на микрочип GeneChip Rat Gene 1,0 ST Array (Affymetrix) в соответствии с протоколом производителя. Полученные данные свидетельствуют о том, что клетки с сильно восстановленным состоянием ЭР также демонстрировали высокую степень активации РНБ, возможно, в качестве регулирующего механизма.
Пример 5. Скрининг малых молекул на соединения, которые сдвигают среду ЭР от восстановленного в сторону окисленного
состояния
Данные, описанные выше, показывают, что химические
соединения и биологические вещества, которые сдвигают среду ЭР
в сторону окисленного состояния, могут быть эффективными для
лечения заболеваний, связанных со стрессом ЭР и дисфункцией ЭР.
Для исследования этой возможности изучали, могут ли два
одобренных FDA лекарственных средства, пиоглитазон (актос) и
тауроурсодезоксихолевая кислота (TUDCA), влиять на
окислительно-восстановительное состояние ЭР и снижать гибель клеток в клеточных моделях заболеваний, связанных с ЭР. Пиоглитазон одобрен для лечения пациентов с диабетом 2 типа и, как показано, способствует сохранению функции р-клеток поджелудочной железы на мышиной модели синдрома Вольфрама. Показано, что пиоглитазон сдвигает среду ЭР в сторону окисленного состояния в р-клетках поджелудочной железы, обработанных тапсигаргином (фиг.38, правая панель) и защищает эти клетки от клеточной гибели (фиг.38, левая панель). Другая малая молекула, TUDCA, используется для лечения желчных камней и билиарного цирроза и, как показано, смягчает стресс ЭР на мышиных моделях диабета. TUDCA, как показано, также сдвигает среду ЭР в сторону окисленного состояния (фиг.38, правая панель) и защищает клетки от гибели в условиях стресса ЭР (фиг.38, левая панель).
Тот факт, что средства, сдвигающие среду ЭР в сторону окисленного состояния, могут обеспечивать защиту от стресса ЭР, позволяет разрабатывать новый скрининговый анализ для выявления новых низкомолекулярных супрессоров восстановленного состояния ЭР с использованием высокопроизводительного подхода. Проводили пилотный скрининг библиотеки из 12 8 0 соединений (MicroSource) , коллекции из 104 0 лекарственных средств, используемых в США, и 24 0 международных лекарственных средств (фиг.39). В этом эксперименте клетки INS-1 832/13, стабильно экспрессирующие MEROS-GFP, высевали (20000 клеток/лунка) в черные оптические 9б-луночные планшеты. Через 2 4 часа добавляли по 2 мкл каждого соединения с использованием манипуляционного робота ТеМо. Еще через 24 часа клетки подвергали воздействию 0,2 мМ DTT, сильного восстановителя, в течение 2 часов, и затем рассчитывали коэффициент MEROS-GFP. Средний коэффициент в необработанных клетках составлял 0, 037 (S.D.=0, 003), и в обработанных DTT клетках составлял 0,069 (S.D.=0,006). Положительными соединениями считали такие, которые были способны поддерживать коэффициент MEROS-GFP ниже, чем 0,05. С использованием этого критерия при скрининге было
идентфицировано 2 0 положительных соединений.
Второй скрининг проводили с использованием 0,4 мМ
пальмитата в комбинации с 2 0 мМ глюкозой для индукции стресса
ЭР. Между двумя скринингами было идентифицировано 9 общих
положительных соединений, из которых 5 были забракованы
вследствие аутофлуоресценции. Для дальнейшей выбраковки
ложноположительных соединений клетки INS-1 832/13, стабильно
экспрессирующие MEROS-GFP, предварительно обрабатывали
оставшимися 4 общими соединениями, подвергали воздействию 0,5 мМ пальмитата в течение 24 часов и измеряли коэффициент MEROS-GFP методом FACS. Эта дополнительная стадия позволила отбросить два соединения, как ложноположительные. Оставшиеся два соединения были используемыми в клинической практике апоморфином и гризеофульвином. Гризеофульвин, при том, что он был положительно идентифицирован во время скрининга, оказывал сильное токсическое влияние на клетки INS-1 832/13.
Пример 6. Апоморфин сдвигает среду ЭР в сторону окисленного состояния и обеспечивает защиту от стресса ЭР
Проводили дополнительные эксперименты для подтверждения того, что апоморфин может сдвигать среду ЭР от восстановленного в сторону окисленного состояния. В этих экспериментах клетки INS-1 832/13, экспрессирующие MEROS-GFP, обрабатывали апоморфином в течение 24 часов и затем подвергали воздействию пальмитата в течение 24 часов. Полученные данные показали, что обработка апоморфином снижает популяцию клеток с восстановленным ЭР (фиг.40). Жизнеспособность клеток и потенциал мембран митохондрий в клетках INS-1 832/13, обработанных пальмитатом, измеряли путем окрашивания пропидиййодидом (PI) и MitoProbe (Invitrogen), соответственно. Апоморфин уменьшал популяцию клеток со сниженным потенциалом мембран митохондрий (фиг.41) и подавлял индуцированную стрессом ЭР гибель клеток (фиг.42). Апоморфин также защищал клетки INS-1 832/13 от опосредованной стрессом ЭР клеточной гибели, индуцированной сильным индуктором стресса ЭР, тапсигаргиом (фиг.43). В совокупности, эти данные показывают, что апоморфин сдвигает среду ЭР в сторону окисленного состояния и
обеспечивает защиту от стресса ЭР.
Пример 7. Малые молекулы, сдвигающие среду ЭР в сторону окисленного состояния, способны облегчать патологию на клеточных моделях стресса ЭР
Приведенные выше данные демонстрируют, что апоморфин и пиоглитазон обладают способностью сдвигать среду ЭР в сторону окисленного состояния и обеспечивать защиту от стресса ЭР. Проводили дополнительные эксперименты для определения того, могут ли апоморфин и пиоглитазон защищать островковые клетки человека от опосредованной стрессом ЭР клеточной гибели. Полученные данные показали, что как апоморфин, так и пиоглитазон, способны защищать островковые клетки человека от опосредованной тапсигаргином клеточной гибели (фиг.44, левая панель).
Дополнительные эксперименты проводили с использованием полученных из INS-1 832/13 клеток с индуцируемым доксицилином нокдауном WFS1, клеточной модели синдрома Вольфрама. Эту модель использовали для проверки того, могут ли апоморфин и пиоглитазон предотвращать гибель клеток. Как сообщалось ранее, опосредованный кшРНК нокдаун WFS1 приводит к гибели клеток, сопровождающейся расщеплением каспазы-3 (Riggs et al., Diabetologia 48: 2313-2321, 2005). На этой модели как апоморфин, так и пиоглитазон, подавляли расщепление каспазы 3 и расщепление субстрата каспазы 3, поли(АДФ)-рибозилирующего фермента (PARP) и были способны защищать [3-клетки с нокдауном WFS1 от клеточной гибели (фиг.44, правая панель). В совокупности, эти данные демонстрируют, что малые молекулы, которые сдвигают среду ЭР в сторону окисленного состояния, способны облегчать патологию на клеточных моделях связанных с ЭР заболеваний.
Пример 8. Растворимый MANF защищает р-клетки поджелудочной железы от стресса ЭР и индуцированного стрессом ЭР апоптоза
клеток
Проводили дополнительные эксперименты для определения того, может ли растворимый MANF предотвращать флуктуации в
окислительно-восстановительном состоянии среды в
эндоплазматическом ретикулуме р-клеток поджелудочной железы в условиях воздействия средства, которое индуцирует стресс эндоплазматического ретикулума. Эксперименты проводили с использованием клеток INS-1 832/13 (линия р-клеток поджелудочной железы), трансфицированных лентивирусным вектором, экспрессирующим MEROS-GFP. Клетки культивировали в условиях 11 мМ или 2 5 мМ глюкозы, и либо оставляли необработанными, либо обрабатывали растворимым M7ANF в концентрации 0,5 мкг/мл. Затем клетки анализировали методом FACS с использованием спектра возбуждения в диапазоне 4 60-4 95 нм и спектра излучения в диапазоне 520-570 нм (оптический фильтр FITC-A), что позволяет специфически детектировать флуоресцентное излучение от восстановленного EroGFP в трансфицированных клетках. Полученные данные показали, что обработка растворимым MANF приводит к сокращению числа клеток, содержащих поддающийся обнаружению уровень восстановленного MEROS-GFP (фиг.4 5; нижняя правая панель против нижней левой панели). В соответствии с приведенными выше данными, эти данные показывают, что обработка р-клеток поджелудочной железы растворимым MANF может сдвигать среду ЭР в сторону окисленного состояния и может быть использована для лечения или предотвращения развития поражения р-клеток у субъекта. Другие варианты осуществления
Следует понимать, что хотя изобретение было изложено в виде его подробного описания, приведенное выше описание предназначено для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, который определяется объемом прилагаемой формулы изобретения. Другие аспекты, преимущества и модификации входят в объем нижеследующей формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ диагностики поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий:
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта; и
сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF,
где повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что субъект имеет поражение р-клеток поджелудочной железы.
2. Способ прогнозирования для субъекта риска развития поражения р-клеток поджелудочной железы, включающий:
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта; и
сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF,
где повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что субъект имеет повышенный риск развития поражения Р-клеток поджелудочной железы, и понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем указывает на то, что субъект имеет обычный или пониженный риск развития поражения р-клеток поджелудочной железы.
3. Способ мониторинга функции р-клеток поджелудочной железы или массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий:
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта в первый момент времени;
определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени; и
сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце
во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени,
где повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени указывает на снижение функции р-клеток поджелудочной железы или уменьшение массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта, и понижение или отсутствие существенного отличия уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени указывает на отсутствие изменения функции р-клеток поджелудочной железы или
ее возрастание, или на отсутствие изменения массы р-клеток поджелудочной железы у субъекта или ее возрастание.
4. Способ выбора субъекта для лечения от поражения р-клеток поджелудочной железы, включающий:
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта;
сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце с эталонным уровнем растворимого MANF; и
выбор субъекта, который имеет повышенный уровень растворимого MANF в биологическом образце по сравнению с эталонным уровнем, для лечения от поражения р-клеток поджелудочной железы.
5. Способ по любому из п.п.1-4, где поражение р-клеток поджелудочной железы выбрано из группы, состоящей из: диабета 1 типа, диабета 2 типа и синдрома Вольфрама.
6. Способ по любому из п.п.1-4, где эталонный уровень представляет собой пороговый уровень растворимого MANF.
7. Способ по любому из п.п.1-4, где эталонный уровень представляет собой уровень растворимого MANF у здорового субъекта.
8. Способ лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий введение субъекту
5.
эффективного количества растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF), содержащего последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична SEQ ID N0:2, или апоморфина.
9. Способ понижения стресса эндоплазматического ретикулума
в |3-клетке поджелудочной железы, включающий приведение р-клетки
поджелудочной железы в контакт с эффективным количеством
растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора
астроцитов (MANF), содержащего последовательность, которая по
меньшей мере на 8 0% идентична SEQ ID N0:2, или апоморфина.
10. Способ по п.9, где р-клетка поджелудочной железы находятся в организме субъекта.
11. Способ понижения или задержки индуцированного стрессом эндоплазматического ретикулума апоптоза в популяции из двух или более р-клеток поджелудочной железы, включающий приведение популяции р-клеток поджелудочной железы в контакт с эффективным количеством растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF), содержащего последовательность, которая по меньшей мере на 8 0% идентична SEQ ID N0:2, или апоморфина.
12. Способ по п.11, где популяция р-клеток поджелудочной железы находится в организме субъекта.
13. Способ по любому из п.п. 1-4, 8, 10 и 12, где субъект представляет собой человека.
14. Способ мониторинга эффективности лечения поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий:
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF) в биологическом образце от субъекта в первый момент времени;
определение уровня растворимого MANF в биологическом образце от субъекта во второй момент времени; и
сравнение уровня растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени,
где (i) первый момент времени выбирают до начала лечения,
и второй момент времени выбирают в любое время после начала лечения, или (ii) первый момент времени выбирают в период после начала лечения, и второй момент времени выбирают в более поздний период во время или после лечения; и
пониженный уровень растворимого MANF в биологическом образце во второй момент времени по сравнению с уровнем растворимого MANF в биологическом образце в первый момент времени указывает на то, что лечение было эффективным для субъекта.
15. Способ скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий:
получение р-клетки поджелудочной железы;
приведение р-клетки поджелудочной железы в контакт с тестируемым соединением;
определение уровня растворимого мезенцефалического нейротрофического фактора астроцитов (MANF), продуцируемого Р~ клеткой поджелудочной железы в присутствии тестируемого соединения; и
сравнение уровня растворимого MANF, продуцируемого Р~ клеткой поджелудочной железы в присутствии тестируемого соединения, с эталонным уровнем растворимого MANF,
выбор соединения, которое связано с повышенным уровнем растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы по сравнению с эталонным уровнем, в качестве соединения-кандидата для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
16. Способ по п.15, где эталонный уровень представляет собой уровень растворимого MANF, продуцируемого р-клеткой поджелудочной железы в отсутствие средства-кандидата.
17. Способ по п.15, где эталонный уровень представляет собой пороговый уровень растворимого MANF.
18. Способ скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной
16.
железы у субъекта, включающий:
получение клетки млекопитающего, экспрессирующей репортерный белок, содержащий сигнальную последовательность BiP, чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок и аминокислотную последовательность KDEL;
приведение клетки в контакт с тестируемым соединением;
определение количества окисленного репортерного белка, присутствующего в клетке; и
сравнение количества окисленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным уровнем;
выбор тестируемого соединения, которое связано с повышенным уровнем окисленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем, в качестве соединения-кандидата для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
19. Способ по п.18, где эталонный уровень представляет
собой количество окисленного репортерного белка,
присутствующего в клетке в отсутствие средства-кандидата.
20. Способ по п.18, где эталонный уровень представляет собой пороговый уровень окисленного репортерного белка.
21. Способ скрининга на соединение-кандидат, полезное для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта, включающий:
получение клетки млекопитающего, экспрессирующей репортерный белок, содержащий сигнальную последовательность BiP, чувствительный к окислению-восстановлению флуоресцентный белок и аминокислотную последовательность KDEL;
приведение клетки в контакт с тестируемым соединением;
определение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке; и
сравнение количества восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке, с эталонным уровнем;
выбор тестируемого соединения, которое связано с понижением уровня восстановленного репортерного белка в клетке по сравнению с эталонным уровнем, в качестве соединения
кандидата для лечения или задержки начала поражения р-клеток поджелудочной железы у субъекта.
22. Способ по п.21, где эталонный уровень представляет собой количество восстановленного репортерного белка, присутствующего в клетке млекопитающего в отсутствие средства-кандидата .
23. Способ по п.21, где эталонный уровень представляет собой пороговый уровень восстановленного репортерного белка.
24. Набор, включающий:
антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые специфически связываются с растворимым MANF; и
по меньшей мере одно антитело или один антигенсвязывающий фрагмент антитела, которые связываются с белком, выбранным из группы: инсулина, С-белка и островкового амилоидного полипептида.
25. Фармацевтическая композиция, содержащая:
растворимый белок MANF, содержащий последовательность, по
меньшей мере на 8 0% идентичную SEQ ID N0:2, или апоморфин; и
по меньшей мере одно дополнительное средство для лечения поражения р-клеток поджелудочной железы.
26. Композиция по п. 25, где по меньшей мере одно
дополнительное средство представляет собой инсулин.
По доверенности
1/25
517699
ТГ (50 нМ) НЬ -ТМ (0,5 мкг/мл) *, 4"
18: ШАЫ?
Концентрированная среда > "
лизат
0,5 мкг
ФИГ.1
MANF rnRNА {клетки 1NS-1 832/13)
Глюкоза 11 мМ 25мМ 25мМ 25мМ 11 мМ 11 мМ
24 час 48 час 72час ТМ ТГ
5мкМ 20 нМ 24 час 24час
ФИГ.2
ФИГ.З
О х
ill I ill j 111
I Q_ I D. ^ <
О x 05
Донор A
Донор В
НР11139-01
HI 11-20
ФИГ.4
ПЕРВИЧНЫЕ ОСТРОВКИ ЧЕЛОВЕКА
19кДа
ИП: антитела кролика против MANF {Proteifltech) ИБ: антитела кролика против MANF (PfOteintech)
IANF
19кДа
со т
ю см
ю см
Q. СО
|- О о"
I-со I-
^ &
_Q СО
с; *
IZ Сч|
мРНК BIP (Min6)
Необработанные
ТМ 2 мкМ 24 час
Клетки Min6
Антитела к расщепленной капазеЗ
MANF
расщерленная капазаЗ
0 т 200 о т апо о т zm (нм>
Необработанные Туникамицин Тапсигаргин 1 мкМ 24 час 100 нМ 24 час
ФИГ.8
Восстановленный
Восстановленный " ^ Окисленный* ^
2 см
I-о ю га о. ю о Ф
ФИГ.13
2 3
5 e
10 11 12 13
Окисленный Восстановленный (кРатность)
ФИГ.16
Средний коэффициент yEROS-GFP б.о 4
Коэффициент ^EROS-QFP
Коэффициент
MEROS-GFP
О X
I- {
Ф !:
СО !
о. в
> Необработ. ¦¦ Н202 1 мМ
В 1 2 3 4 5 6 ? S 9 1S "
Средний коэффициент MEROS-GFP (кратность) Необработанный 1.оооо±о.оо?ЗбЗ
Н2О2 1 ММ 30 МИН 0.996? ±0.009861
го 1- о ю го о. ю о ф о со
см Q см
ФИГ.18
Средний коэффициент!
Si " Q.
? % % Л Г
012345878
8 10 11 12
Среднее
Ц Необработанн. 1"С ШТГ1мкМ4ч 1.080
Высокая глюкоза
25 мМ
(кратность) 1.020 "1'
Необработанные
ПА 0,5 мМ 24 ч
коэффициент
о с, о
Необработ. ПА 0,5 мМ ОК 0,5 мМ
8 1 I 3 -1 5 6 7 8 9 18 11 12 13
(кратность)
Восстановленный
ФИГ.26
IAPP и цитокины
Лишение питательных веществ
ный
час
час
ан!
¦ <* см
ш 3
¦ <*
¦ <*
абот
S S
S S
FNy
Нео
IAPP
IAPP
TNFo
GO. т-_l
Свободная жирная кислота
<
ФИГ.ЗО
Лазеры
Полосно-пропускающие Детекция: фильтры (нм)
-v §10/10 > Восстановленный MEROS-GFP
¦V Sir
|§/Ю > Окисленный ^EROS~GFF
ФИГ.31
ТМ 5 мкМ 24 час
о I-ш с;
Среднее
mCherry
со а.
Ш 269.33
Без глюкозы 24 час
: Окисленн. i Восстанов.|
ш с;
со о.
Среднее
5 29U3
Воз. 405 нм
ПА 0,5 мМ 24 час
Воз. 405 нм
Сотированные образцы
ПА 0,5 мМ 24 час ПА 0,5 мМ 24 час
ФИГ.36
ДНК микрочип
Ген
Среднее восстановленные (1од2)
Среднее окисленные (1од2)
Разница (восстановленные-окисленные) (1од2)
р-значение I
8,43722219
0.0002206
BiP
13,S34?GB <
0.82232816
тлттвт
7,тшт4
1},тшт
ФИГ.37
| Мертвые клетки Среднее ШВ
О о 5 < о о g о
? S о о ? < о о g о
i_ о
(-) ТПОнМ
(-) ТПОнМ
ФИГ.38
1й день
Высевание клеток
ПА (400 мкМ)/ВГ 20 мМ Зй день
DTT (200 мкМ)
24 час
4й день
Измерение Воз. 394/510 Воз. 473/510
1 ^ час
Измерение Воз. 394/510 Воз. 473/510
ФИГ.39
ПА 0,5 мМ
ПА 0,5 мМ+Апо 10 нМ ПА 0,5 мМ+Апо 50 нМ
ФИГ.41
ТПОнМ
ФИГ.43
Пальмитат
Островки человека SflWFSI
ТГ 10 нМ 24 час DOX. 1 мкМ 4 дня
ФИГ.44
Без обработки Глюкоза 11 мМ 24 час
0,5 мкг/мл 48 час Глюкоза 11 мМ 24 час
ш ш %ш. 1Ш гш шт
& %ж шж шм ш мт
Без обработки MANF 0,5 мкг/мл 48 час
Глюкоза 25 мМ 24 час Глюкоза 25 мМ 24 час
2/25
2/25
2/25
2/25
2/25
2/25
2/25
2/25
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
3/25
ФИГ.7
4/25
5/25
ФИГ.7
6/25
6/25
7/25
7/25
8/25
8/25
9/25
9/25
9/25
9/25
9/25
9/25
10/25
10/25
10/25
10/25
10/25
10/25
10/25
10/25
11/25
11/25
ФИГ.20
ФИГ.20
11/25
11/25
ФИГ.20
ФИГ.20
12/25
12/25
ФИГ.22
ФИГ.22
13/25
13/25
ФИГ.24
ФИГ.24
14/25
14/25
14/25
14/25
14/25
14/25
14/25
14/25
16/25
15/25
ФИГ.29
16/25
17/25
ФИГ.29
16/25
17/25
ФИГ.29
16/25
17/25
ФИГ.29
16/25
17/25
ФИГ.29
18/25
18/25
ФИГ.ЗЗ
ФИГ.ЗЗ
18/25
18/25
ФИГ.ЗЗ
ФИГ.ЗЗ
19/25
19/25
20/25
20/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
21/25
22/25
22/25
23/25
23/25
24/25
24/25
25/25
25/25