(57) Реферат / Формула:
Настоящее изобретение касается противовоспалительных агентов, композиций и способов лечения воспалительных расстройств.
2420-516893ЕА/030 НЕСИАЛИРОВАННЫЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ
Перекрестная ссылка на связанные заявки
Это заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 61/577361 от 19 декабря 2011 г. Содержание заявки включено в данный документ ссылкой в полном объеме.
ГОСУДАРСТВЕННЫЕ КАПИТАЛОВЛОЖЕНИЯ
Изобретение, раскрытое в данном документе, было проведено, по меньшей мере, частично при поддержке государственного гранта № NIH AI035875 Национального института здравоохранения. Соответственно США обладают определенными правами на данное изобретение.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к противовоспалительным агентам, композициям и способам лечения воспалительных расстройств. УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Воспалительные расстройства, включающие аутоиммунные
заболевания, представляют собой расстройства, включающие
аномальную активацию и последующую миграцию лейкоцитов в
пораженные области организма. Эти условия охватывают широкий
спектр болезней, которые влияют на жизни миллионов людей по
всему миру. Хотя в настоящее время доступны различные методы
лечения, многие из них обладают значительными побочными
эффектами или не очень эффективны в ослаблении симптомов. Таким
образом, существует необходимость получения
противовоспалительных агентов для лечения воспалительных расстройств, и существует необходимость в разработке методов идентификации и оценки таких агентов.
Давно известно, что иммуноглобулин G (IgG) опосредует как про-, так и противовоспалительные активности посредством взаимодействий, опосредованных его Fc-фрагментом. В то время как взаимодействия Fc-FcyR отвечают за провоспалительные свойства иммунных комплексов и цитотоксических антител, внутривенный гамма-глобулин (IVIG) и его Fc-фрагменты являются противовоспалительными и широко используются для подавления
воспалительных заболеваний. Предполагалось, что
гликозилирование IgG является критическим для регуляции цитотоксичности и воспалительного потенциала IgG. Например, предполагали, что противовоспалительная активность IVIG является свойством Fc-фрагмента и его связанного гликана, требующего концевых связей а-2,б-сиаловой кислоты, выявляющих совместное требование для специфичного полипептидного остова и структуры гликана, необходимое для иммуносупрессии. (Anthony, et al., 2008, Science 320: 373-376 и WO 2007/117505).
Однако только минорная популяция IgG в IVIG содержит гликаны, терминированные а-2,б-сиаловыми кислотами (sFc), и имеет противовоспалительную активность. В результате, для супрессии воспаления, вызванного аутоантителами, во множестве клинических случаев специалисту следует вводить IVIG в высоких дозах (1-2 г/кг) для обогащения сиалированных IgG, или другим способом повышая сиалирование IgG (заявки США № 20080206246 и 20090004179, и Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)).
Настоящее изобретение направлено на решение вышеупомянутых проблем путем идентификации противовоспалительных полипептидов, свободных от сиалирования.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение относится к агентам, таким как полипептиды и антитела, и к способам лечения воспалительных расстройств, например, аутоиммунных заболеваний.
Соответственно один аспект данного изобретения
характеризует выделенный полипептид, включающий
модифицированную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% (например, любое число между 75% и 100%, включая, например, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% и 100%) идентична Fc-участку IgG. Модифицированная последовательность свободна от сиалирования, и полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше чем противовоспалительная активность родительского полипептида. Родительский полипептид может включать Fc-участок IgG, такой как последовательность SEQ ID
NO: 1, приведенная ниже. В некоторых воплощениях полипептид обладает способностью связываться с DC-SIGN, и связываться с hFcyRIIA или RIIB. В одном воплощении выделенный полипептид обладает способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB при KD 2x1 СГ5 М или ниже (то есть КА 5x104 1УГ1 или выше) . Предпочтительно модифицированная последовательность содержит мутацию FA241. Модифицированная последовательность может быть, по меньшей мере, на 75% (например, любое число между 75% и 100%, включая, например, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% и 100%) идентична SEQ ID NO: 2. В некоторых примерах модифицированная последовательность включает или по существу состоит из SEQ ID NO: 2 .
В другом аспекте изобретение предоставляет способ
получения полипептида, обладающего противовоспалительной
активностью. Среди прочего способ включает стадии
предоставления родительского полипептида, содержащего
последовательность Fc-участка IgG, или первой
последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей родительский полипептид; и модификации родительского полипептида с получением модифицированного полипептида такого, что модифицированный полипептид свободен от сиалирования и имитирует структуру сиалированной формы Fc-участка IgG. Стадия модификации может проводиться путем модификации первой последовательности нуклеиновой кислоты с получением второй нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный полипептид. Изобретение также предоставляет полипептид, полученный только что описанным способом.
В третьем аспекте изобретение характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, кодирующую полипептид, описанный выше, экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту, и клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту. Изобретение также характеризует способ получения полипептида. Способ включает культивирование клетки-хозяина в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, и очистку полипептида из
культивируемой клетки или из культуральнои среды.
В четвертом аспекте в изобретении характеризуется фармацевтическая композиция, включающая (i) полипептид или нуклеиновую кислоту, описанные выше, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
В пятом аспекте в изобретении предлагается способ лечения воспалительного заболевания. Способ включает введение нуждающемуся в этом объекту терапевтически эффективного количества вышеописанного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Также предлагается применение полипептида или нуклеиновой кислоты в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания. Изобретение также характеризует выделенный полипептид, нуклеиновую кислоту, экспрессирующий вектор, клетку-хозяина, композицию или способ лечения воспалительного заболевания, по существу как представлено и описано ниже.
Подробности одного или нескольких воплощений изобретения изложены в представленном ниже описании. Другие признаки, субъекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и из формулы изобретения.
ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Фиг. la-с представляют собой диаграммы и фотографии, демонстрирующие, что а-2,б-связанная сиаловая кислота придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgGl Fc.
Фиг. 2a-b представляют собой диаграммы фотографии, демонстрирующие, что нарушение взаимодействий Fc-гликана придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgGl Fc.
Фиг. 3 представляет собой набор диаграмм, демонстрирующих, что мутация FA241 в hlgGl Fc суммирует противовоспалительную активность а-2,б sFc.
Фиг. 4a-d представляют собой диаграммы, демонстрирующие отличительные черты противовоспалительной активности FA241.
Фиг. 5 представляет собой набор диаграмм, демонстрирующих,
что мутация FA241 повышает связывание Fey с рецептором.
Фиг. ба-b представляют собой фотографии, демонстрирующие индуцирование IL-33 мРНК с помощью FA241 в макрофагах, выделенных из костного мозга.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Данное изобретение основано, по меньшей мере, частично на неожиданном обнаружении того, что несиалированные варианты IgG Fc придают противовоспалительную активность и имитируют эффект 2,б-сиалированных Fc в качестве противовоспалительных медиаторов.
Сиалирование IgG и Fc
IgG представляет собой основной сывороточный
иммуноглобулин. Он представляет собой гликопротеин, состоящий
из двух идентичных тяжелых цепей и двух легких цепей, которые в
свою очередь состоят из вариабельного и константного домена.
IgG содержит единственный N-связанный гликан в Asn297 в СН2-
домене на каждой из его двух тяжелых цепей. Ковалентно
связанный комплексный углевод состоит из сердцевины,
биантеннального пентаполисахарида, содержащего N-
ацетилглюкозамин (GIcNAc) и маннозу (man). Дополнительная модификация сердцевинной углеводной структуры наблюдается в сывороточных антителах в присутствии фукозы, разветвленной GIcNAc, галактозы (gal) и концевых компонентов сиаловой кислоты
(sa), которые не всегда имеют место. Таким образом, детектировали около 4 0 различных гликоформ, которые ковалентно присоединены по данному единственному сайту гликозилирования
(Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990). Было продемонстрировано, что гликозилирование IgG является существенным для связывания со всеми FcyRs путем поддержания открытой конформации двух тяжелых цепей. Jefferis and Lund, Immune. Lett. 82, 57 (2002), Sondermann et al. , J. Mol. Biol. 309, 737 (2001). Считается, что данное гликозилирование IgG для связывания FcyR отвечает за невозможность дегликозилированных IgG-антител опосредовать вызванные in vivo воспалительные реакции, такие как ADCC, фагоцитоз и высвобождение медиаторов
воспаления. Nimmerjahn and Ravetch, Immunity 24, 19 (2006). Дополнительные наблюдения того, что индивидуальные гликоформы IgG могут способствовать модулированию воспалительного ответа, подтвердили с помощью различных аффинностей для индивидуальных FcyRs, известных для IgG-антител, содержащих или лишенных фукозы, и с помощью их последующего влияния на цитотоксичность. Shields et al. , J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn and Ravetch, Science 310, 1510 (2005) . Связь между аутоиммунными состояниями и специфичными профилями гликозилирования IgG-антител наблюдали у пациентов с ревматоидным артритом и несколькими аутоиммунными васкулитами, при которых, как сообщалось, имело место пониженное галактозилирование и сиалирование IgG-антител. Parekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al. , 128, 621 (2000), Holland et al. , Biochim. Biophys. Acta December 27. Также сообщалось, что вариации IgG-гликоформ ассоциированы с возрастом и с иммунитетом, хотя in vivo значимость этих изменений не определена. Shikata et al., Glycoconj. J. 15, 683 (1998), Lastra, et al., Autoimmunity 28, 25 (1998).
Как обсуждалось в данном документе, неожиданно оказалось, что некоторые несиалированные Fc-варианты IgG также придавали противовоспалительную активность. Такие варианты, включающие вариант FA241, характеризуют виды внутри более крупного семейства молекул, которые имитируют структурные и биологические свойства сиалированных Fc, но не требуют сиалирования, и могут быть разработаны в качестве противовоспалительных терапевтических средств.
Полипептиды и нуклеиновые кислоты
Полипептиды
Как раскрыто в данном документе, в данном изобретении
предлагаются выделенные полипептиды, содержащие
последовательности Fc-вариантов IgG, которые лишены полисахаридной цепи, содержащей концевую сиаловую кислоту, связанную с галактозным компонентом посредством а-2,б-связи по
вышеупомянутому Asn297. Такие несиалированные Fc-варианты IgG могут быть либо выделенными из природного антитела, либо могут экспрессироваться в клеточной линии.
В одном варианте осуществления изобретения Fc-участок включает одну или более замен в аминокислотной последовательности hlgGl. В частности, типичные Fc-участки IgGl представлены ниже:
Fc hlgGl (начиная с аминокислоты 210 в системе Kabat): KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1; F2 41 и F24 3 подчеркнуты)
Fc hlgGl FA241:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2)
Fc hlgGl FA243:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
Термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо для описания расположения аминокислотных остатков в полимере. Пептид, полипептид или белок могут состоять из 2 0 стандартных природных аминокислот дополнительно к редким аминокислотам и к их синтетическим аналогам. Они могут представлять собой любую цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). Пептид, полипептид или белок "по настоящему изобретению" включает рекомбинантно или синтетически полученные варианты, содержащие конкретные домены или участки,
которые связываются с DC-SIGN, FcyRIIA и FcyRIIB. Термин также охватывает полипептиды, которые содержат добавленный N-концевой метионин (применяемый для экспрессии в прокариотических клетках).
"Выделенный" полипептид или белок относится к полипептиду или белку, которые отделены от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми они ассоциированы в естественной среде. Полипептид/белок может составлять, по меньшей мере, 10%
(то есть любое процентное содержание между 10% и 100%, например, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 99%) сухого веса очищенного препарата. Чистота может измеряться с помощью подходящих стандартных методов, например с помощью колоночной хроматографии, электрофореза на полиакриламидном геле или ВЭЖХ. Выделенный полипептид/белок, описанный в изобретении, может быть очищен из природного источника, может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК или с помощью химических методов. Функциональный эквивалент IgG Fc относится к полипептидному производному IgG Fc, например, к участку, содержащему одну или более мутаций, вставок, делеций, укорачиваний, сшитый белок или их комбинации. Он по существу сохраняет активность IgG Fc, то есть способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Выделенный полипептид может содержать SEQ ID NO: 2. Вообще, функциональный эквивалент, по меньшей мере, на 7 5%
(например, любое число между 75% и 100%, включая, например, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 99%) идентичен SEQ ID NO: 2.
"Процент идентичности" двух аминокислотных
последовательностей или двух нуклеиновых кислот определяется с использованием алгоритма Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, с модификацией как в Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Такой алгоритм включен в программы "NBLAST" и "XBLAST" (версии 2.0) Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Нуклеотидные поиски "BLAST" могут быть осуществлены с помощью программы "NBLAST" (сумма баллов = 100, размера "слова" = 12) для
получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Белковый поиск "Blast" может быть осуществлен с помощью программы "XBLAST" (сумма баллов = 50, размер "слова" = 3) для получения аминокислотных последовательностей гомологичных белковым молекулам по изобретению. В случае существования пропусков между двумя последовательностями может применяться Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. При использовании программ "BLAST" и "Gapped BLAST" могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, "XBLAST" и "NBLAST").
Аминокислотный состав полипептида, описанного в данном документе, может варьироваться без нарушения способности полипептида связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Например, он может содержать одну или несколько консервативных аминокислотных замен. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой такую замену, в которой аминокислотный остаток замещается остатком, имеющим похожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный несущественный аминокислотный остаток, например в SEQ ID N0: 2, предпочтительно заменяется на другой аминокислотный остаток из аминокислоты того же семейства боковых цепей. Альтернативно мутации могут вводиться случайным образом по всей последовательности или в ее части, как, например, с помощью насыщенного мутагенеза, и полученные в
результате мутанты могут скринироваться на способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ для идентификации мутантов, которые сохраняют активность, как описано ниже в примерах.
Полипептид, описанный в данном изобретении, может быть получен в виде рекомбинантного полипептида. Для получения рекомбинантного полипептида нуклеиновая кислота, кодирующая его (например, FA241, SEQ ID NO: 2), может быть связана с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей сшитый партнер по взаимодействию, например, глутатион-э-трансферазу (GST), метку бх-His эпитопа или белок гена 3 М13. Полученная в результате сшитая нуклеиновая кислота экспрессирует в подходящих клетках-хозяевах сшитый белок, который может быть выделен с помощью методов, известных в данной области. Выделенный сшитый белок может быть дополнительно обработан, например, с помощью ферментативного гидролиза для удаления сшитого партнера и с получением рекомбинантного полипептида по настоящему изобретению.
Нуклеиновые кислоты
Другой аспект изобретения характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, которая кодирует полипептид или белок, описанный выше. Нуклеиновая кислота относится к молекуле ДНК (например, кДНК или геномной ДНК) , молекуле РНК (например, мРНК) или к аналогу ДНК или РНК. Аналог ДНК или РНК может быть синтезирован из нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. "Выделенная нуклеиновая кислота" относится к нуклеиновой кислоте, структура которой не идентична структуре любой природной нуклеиновой кислоты или структуре любого фрагмента природной геномной нуклеиновой кислоты. Таким образом, термин охватывает, например, (а) ДНК, которая имеет последовательность части природной геномной молекулы ДНК, но не фланкированной обеими из кодирующих последовательностей, которые фланкируют эту часть молекулы в геноме организма, в котором она присутствует в естественной среде; (Ь) нуклеиновую
кислоту, включенную в вектор или в геномную ДНК прокариотов или
эукариотов таким образом, что полученная в результате молекула
не идентична любому природному вектору или геномной ДНК; (с)
отдельная молекула, такая как кДНК, геномный фрагмент,
фрагмент, полученный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), или
фрагмент рестрикции; и (d) рекомбинантная нуклеотидная
последовательность, которая является частью гибридного гена,
т.е. гена, кодирующего сшитый белок. Нуклеиновая кислота,
описанная выше, может использоваться для экспрессии сшитого
белка по настоящему изобретению. Для этой цели специалист может
функционально связать нуклеиновую кислоту с подходящими
регуляторными последовательностями для генерации
экспрессирующего вектора.
Вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Вектор может быть способен к автономной репликации или к интеграции в ДНК хозяина. Примеры векторов включают плазмиду, космиду или вирусный вектор. Вектор включает нуклеиновую кислоту в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Предпочтительно вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, функционально связанных с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты.
"Регуляторная последовательность" включает промоторы,
энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например,
сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности
включают те, которые направляют конститутивную экспрессию
нуклеотидной последовательности, а также тканеспецифичные
регуляторные и/или индуцируемые последовательности.
Конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии целевого белка или РНК и тому подобное. Экспрессирующий вектор может вводиться в клетки-хозяева с получением полипептида по настоящему изобретению. Промотор определяется как ДНК-последовательность, которая направляет РНК-полимеразу для связывания с ДНК и инициации синтеза РНК.
Сильный промотор представляет собой такой промотор, который вызывает инциацию мРНК с высокой степенью частоты.
Любой полипептид, как упомянуто выше, или биологически эквивалентный полинуклеотид, доступный специалисту для таких же специальных целей, может вводиться в соответствующий экспрессирующий вектор и связываться с другими молекулами ДНК с образованием "рекомбинантных молекул ДНК", экспрессирующих данный рецептор. Эти векторы могут состоять из ДНК или РНК; для большинства целей клонирования ДНК-векторы являются предпочтительными. Типичные векторы включают плазмиды, модифицированные вирусы, бактериофаг и космиды, дрожжевые искусственные хромосомы и другие формы эписомной или интегрированной ДНК. Специалисту в данной области хорошо известно, как определить подходящий вектор для конкретного применения.
Множество векторов, экспрессирующих в клетках
млекопитающих, может использоваться для экспрессии
вышеупомянутых IgG Fc в клетках млекопитающих. Как отмечено
выше, экспрессирующие векторы могут представлять собой ДНК-
последовательности, которые требуются для транскрипции
клонированной ДНК и трансляции их мРНК в соответствующем
хозяине. Такие векторы могут использоваться для экспрессии
эукариотической ДНК во множестве хозяев, таких как бактерии,
сине-зеленые водоросли, растительные клетки, клетки насекомых и
животные клетки. Специфически сконструированные векторы дают
возможность переноса ДНК между хозяевами, такими как
бактериальные-дрожжевые клетки или бактериальные-животные
клетки. Соответствующим образом сконструированный
экспрессирующий вектор должен содержать: последовательность начала репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное количество применяемых сайтов ферментов рестрикции, потенциал для высокого количества копий и активные промоторы. Экспрессирующие векторы могут включать в частности клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы, специально сконструированные плазмиды и вирусы. Коммерчески доступные векторы, экспрессирующие в
клетках млекопитающего, которые могут быть подходящими, включают в частности pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1
(Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 and pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo
(Stratagene), pXTl (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EB0-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-l(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12)
(ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и IZD35 (ATCC 37565).
Также в рамках изобретения клетка-хозяин, которая содержит
вышеописанную нуклеиновую кислоту. Примеры включают клетки Е.
coli, клетки насекомых (например, с использованием
бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клеток или
клеток млекопитающих. См., например, Goeddel, (1990) Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic
Press, San Diego, Calif. Для получения полипептида по
настоящему изобретению специалист может культивировать клетку-
хозяин в среде при условиях, дающих возможность экспрессии
полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, и
очистки полипептида из культивируемых клеток или из
культуральной среды. Альтернативно нуклеиновая кислота по
настоящему изобретению может транскрибироваться и
транслироваться in vitro, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т7 и Т7-полимеразы.
Все из природных IgG Fc, генетически сконструированных IgG Fc и химически синтезированных IgG Fc могут использоваться для практического осуществления изобретения, раскрытого в данном документе. IgG Fc, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, могут содержать такую же аминокислотную последовательность, как [FA241] SEQ ID NO: 2) или ее функциональный эквивалент. Термин "IgG Fc" также охватывает химически модифицированные варианты. Примеры химически модифицированных IgG Fc включают IgG Fc, подвергнутые конформационному изменению, вставке или делеции сахарной цепи, и IgG Fc, с которым связано соединение, такое как
полиэтиленгликоль.
Специалист может проверить эффективность полученного таким образом полипептида/белка с использованием животной модели, такой как трансгенная мышь, как описано ниже. Любое статистически значимое увеличение в in vivo экспрессии IL-33 базофилами или экспрессии FcyRIIB рецептора на эффекторных макрофагах выявляет полипептид/белок, который является кандидатом для лечения расстройства, упомянутого ниже. В одном варианте осуществления изобретения вышеописанные анализы могут быть основаны на измерении связывания с белком DC-SIGN или с клетками DC-SIGN < + ) . В данной области известно множество методов, доступных специалисту, которые подходят для измерения способности соединения связываться с DC-SIGN или с DC-SIGN < + ) клетками и связанных с этим изменений в экспрессии гена, регулирующегося белками сигнального пути DC-SING, такого как IL-33. Специалист способен смешивать и комбинировать эти разнообразные исследовательские инструменты без излишнего экспериментирования. После очистки и тестирования с помощью стандартных методов или согласно анализам и методам, описанным в примерах ниже, несиалированные варианты IgG Fc могут быть включены в фармацевтическую композицию для лечения воспалительных расстройств.
При использовании в данном документе термин "антитело" используется в широком смысле и специфически охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и антительные фрагменты при условии, что они демонстрируют целевую биологическую активность.
При использовании в данном документе термин "антительные фрагменты" может включать часть интактного антитела, как правило, включающую антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или Fc-участок антитела, который сохраняет FcR-связывающую активность. Примеры антительных фрагментов включают линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и
мультиспецифичные антитела, образованные из антительных фрагментов. Антительные фрагменты предпочтительно сохраняют, по меньшей мере, часть шарнира и необязательно CHI-участок тяжелой цепи IgG. Более предпочтительно антительные фрагменты сохраняют цельный константный участок тяжелой цепи IgG и включает легкую цепь IgG.
При использовании в данном документе термин "Fc-фрагмент" или "Fc-участок" используется для определения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина. "Fc-участок" может представлять собой нативную последовательность Fc-участка или вариант Fc-участка. Хотя связи Fc-участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-участок тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как фрагмент от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Рго230, до его карбоксильного конца.
"Нативная последовательность Fc-участка" включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-участка, обнаруженного в естественной среде. Специалисту в данной области понятно, что "вариант Fc-участка" включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-участка посредством, по меньшей мере, одной "аминокислотной модификации". Предпочтительно вариант Fc-участка содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-участка или с Fc-участком родительского полипептида, например, примерно от одной примерно до десяти аминокислотных замен, и предпочтительно примерно от одной примерно до пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-участка или в Fc-участке родительского полипептида. В данном документе вариант Fc-участка предпочтительно будет иметь, по меньшей мере, примерно 7 5 или 8 0% гомологии с нативной последовательностью Fc-участка и/или с Fc-участком родительского полипептида и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% гомологии с ним, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% гомологии, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 99% гомологии.
Термины "Fc-рецептор" или "FcR" используются для описания рецептора, который связывается с Fc-участком антитела. В одном воплощении изобретения FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. В другом воплощении FcR, включающий человеческий FcR, связывается с IgG-антителом
(гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включающие аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcyRII-рецепторы включают FcyRI IA
("активирующий рецептор") и FcyRIIB ("ингибирующий рецептор"),
которые имеют похожие аминокислотные последовательности,
которые отличаются главным образом в их цитоплазматических
доменах. Активирующий рецептор FcyRI IA содержит
иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина
(ITAM) в своем цитоплазматическом домене (см., обзор Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al. , Immunomethods, 4, 25-34 (1994); и de Haas et al. , J Lab Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn and Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, ed William Paul 5th Ed., каждый из которых включен в данный документ ссылкой).
Термин "нативный" или "родительский" относится к немодифицированному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность Fc. Родительский полипептид может включать нативную последовательность Fc-участка или Fc-участок с уже существующими аминокислотными модификациями (такими как вставки, делеции и/или замены). Композиции
В рамках настоящего изобретения композиция, которая содержит подходящий носитель и один или более агентов, описанных выше, таких как несиалированные Fc-варианты IgG. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, или косметическую композицию, которая содержит
косметически приемлемый носитель.
Термин "фармацевтическая композиция" относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, делающим композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo. "Фармацевтически приемлемый носитель" после введения объекту не вызывает нежелательных физиологических эффектов. Носитель в фармацевтической композиции должен быть "приемлемым" также в том смысле, что он совместим с активным ингредиентом и может быть способен его стабилизировать. Один или более стабилизирующих агентов могут применяться в качестве фармацевтических носителей для доставки активного соединения. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают в частности биосовместимые носители, адъюванты, добавки и разбавители для доставки композиции, применяемой в качестве лекарственной формы. Примеры других носителей включают коллоидный оксид кремния, стеарат магния, целлюлозу и лаурил сульфат натрия.
Вышеописанная композиция, во многих формах описанная выше, может использоваться для лечения расстройств, характеризующихся воспалением. Эффективное количество относится к количеству активного соединения/агента, которое требуется для придания терапевтического эффекта объекту, подвергающемуся лечению. Специалисту в данной области понятно, что эффективные дозы будут варьироваться в зависимости от типов заболеваний, подвергаемых лечению, пути введения, применения эксципиента и возможности совместного использования с другим терапевтическим лечением.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению
может вводиться парентерально, перорально, назально, ректально,
местно или буккально. При использовании в данном документе
термин "парентеральный" относится к подкожной, внутрикожной,
внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной,
внутриартериальной, внутрисиновиальной, надчревной,
внутриоболочечной (внутрь пораженных тканей) или внутричерепной инъекции, а также к любому подходящему методу инфузии.
Стерильная композиция для инъекций может представлять
собой раствор или суспензию в нетоксичном парентерально
приемлемом разбавителе или растворителе. Такие растворы
включают в частности 1,3-бутандиол, маннит, воду, раствор
Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того,
фиксированные масла подходящим образом применяются в качестве
растворителя или суспендирующей среды (например, синтетические
моно- или диглицериды). Жирная кислота, такая как в частности
олеиновая кислота и ее глицеридные производные, применимы в
препарате для инъекций, поскольку являются природными
фармацевтически приемлемыми маслами, такими как в частности
оливковое масло или касторовое масло, их полиоксиэтилированные
варианты. Эти масляные растворы или суспензии также могут
содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или
диспергирующий агент, такой как в частности
карбоксиметилцеллюлоза или похожие диспергирующие агенты. Другие широко используемые поверхностно-активные вещества, такие как в частности TWEENS или SPANS или другие похожие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые широко используются в производстве фармацевтически приемлемой твердой, жидкой или другой лекарственной формы, также могут использоваться для целей составления композиции.
Композиция для перорального введения может представлять собой любую перорально приемлемую лекарственную форму, включающую капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток широко используемые носители включают в частности лактозу и кукурузный крахмал. Также, как правило, добавляют смазывающие агенты, такие как в частности стеарат магния. Для перорального введения в капсульной форме применяемые разбавители включают в частности лактозу и сухой кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент может суспендироваться или растворяться в масляной фазе, объединяясь вместе с эмульгирующими или суспендирующими агентами. Если целесообразно, могут быть добавлены некоторые подсластители, ароматизаторы или красители.
Фармацевтические композиции для местного введения согласно
описанному изобретению могут быть составлены в виде растворов,
мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, паст, гелей,
спреев, аэрозолей или масел. Альтернативно местные составы
могут быть представлены в форме пластырей или повязок,
пропитанных активным(и) ингредиентом(ами), которые
необязательно могут включать один или несколько эксципиентов или разбавителей. В некоторых предпочтительных воплощениях местные составы включают материал, который будет усиливать абсорбцию или проникновение активного агента(ов) через кожу или другие подверженные воздействию области. Местная композиция применяется для лечения воспалительных расстройств на коже, включающих в частности экзему, акне, розацеа, псориаз, контактный дерматит и реакции на сумах ядоносный.
Местная композиция содержит безопасное и эффективное количество дерматологически приемлемого носителя, подходящего для применения на коже. "Косметически приемлемая" или "дерматологически приемлемая" композиция или компонент относятся к композиции или компоненту, которые подходят для применения в контакте с человеческой кожей без нежелательной токсичности, несовместимости, нестабильности, аллергической реакции и так далее. Носитель дает возможность доставки активного агента и необязательного компонента на кожу в соответствующей концентрации. Таким образом, носитель может действовать в качестве разбавителя, диспергирующего агента, растворителя или подобного для гарантии того, что активные материалы будут применимы и распределены по выбранной мишени в соответствующей концентрации. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким. Носитель может быть представлен в форме лосьона, крема или геля, конкретно в такой форме, которая имеет достаточную консистенцию и предел текучести для предотвращения седиментации активного материала. Носитель может быть инертным или обладает дерматологически полезными свойствами. Также он должен быть физически и химически совместимым с активными компонентами, описанными в данном документе, и не должен чрезмерно ослаблять стабильность, эффективность или другие
полезные свойства, ассоциированные с композицией. Местная композиция может представлять собой косметический или дерматологический продукт в форме, известной в данной области для местного или трансдермального применения, включающей растворы, аэрозоли, кремы, гели, пластыри, мазь, лосьон или пенку.
Способы обработки (лечения)
В описанном изобретении предлагаются способы лечения у объекта воспалительного расстройства. Термин "воспалительное расстройство" относится к расстройству, которое характеризуется аномальным или нежелательным воспалением, такому как аутоиммунное заболевание. Аутоиммунные заболевания и расстройства характеризуются хронической активацией иммунных клеток при неактивирующих условиях. Примеры включают псориаз, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), ревматоидный артрит, псориатический артрит, рассеянный склероз, волчанка, диабет I типа, билиарный первичный цирроз печени и трансплантация.
Другие примеры воспалительных расстройств, которые могут
подвергаться лечению с помощью способов по настоящему
изобретению, включают астму, инфаркт миокарда, инсульт,
воспалительные дерматозы (например, дерматит, экзему,
атопический дерматит, аллергический контактный дерматит,
крапивницу, некротический васкулит, кожный васкулит,
гиперчувствительный васкулит, эозинофильный миозит, полимиозит,
дерматомиозит и атонический фасциит), синдром острой
дыхательной недостаточности, молниеносный гепатит, заболевания
гиперчувствительности легких (например, гиперчувствительный
пневмонит, эозинофильная пневмония, гиперчувствительность
замедленного типа, интерстициальное заболевание легких (ILD),
идиопатический фиброз легких и ILD, ассоциированное с
ревматоидным артритом) и аллергический ринит. Дополнительные
примеры также включают миастению гравис, юношеский диабет,
гломерулонефрит, аутоиммунный тиреоидит, анкилозирующий
спондилоартрит, склеродермию, острые и хронические
воспалительные заболевания (например, системная анафилаксия или
гиперчувствительные реакции, аллергии на лекарственные средства, аллергии на укусы насекомых, отторжение аллотрансплантата и реакция "трансплантат против хозяина") и синдром Шегрена.
"Объект" относится к человеку и к животному, отличному от человека. Примеры животных, отличных от человека, включают позвоночных, например млекопитающих, таких как млекопитающие, отличные от человека, приматы, отличные от человека (конкретно высшие приматы), собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, кошка и кролик, и не млекопитающие, такие как птицы, амфибии, рептилии и т. д. В одном варианте осуществления изобретения объектом является человек. В другом варианте осуществления изобретения объектом является экспериментальное животное, отличное от человека, или животное, подходящее в качестве модели заболевания.
Объект, подвергаемый лечению воспалительного расстройства, может быть идентифицирован с помощью стандартных методов диагностики расстройства. Необязательно объект может исследоваться на предмет уровня или процентное содержание одного или нескольких цитокинов или клеток тестируемого образца, полученных из объекта с помощью методов, известных в данной области. Если уровень или процентное содержание на уровне порогового значения или ниже (которое может быть получено для здорового объекта), то объект является кандидатом для лечения, описанного в данном документе. Для подтверждения ингибирования или лечения специалист может оценить и/или подтвердить уровень или процентное содержание одного или нескольких вышеупомянутых цитокинов или клеток у объекта после лечения.
"Лечение (treating)" или "лечение (обработка)(treatment)" относится к введению соединения или агента объекту, у которого есть расстройство с целью лечения, облегчения, ослабления, уменьшения, устранения, задержки приступа, предотвращения или улучшения состояния при расстройстве, предотвращения или улучшения симптома расстройства, болезненного состояния, вторичного по отношению к расстройству, или предрасположенности
по отношению к расстройству.
"Эффективное количество" или "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения или агента, которое способно производить целевой с медицинской точки зрения результат у объекта, подвергаемого лечению. Способ лечения может осуществляться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственными средствами или терапией. Терапевтически эффективное количество может вводиться за одно или несколько введений, применений или дозировок и не предназначено для ограничения конкретного состава или пути введения.
Агент может вводиться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственными средствами или терапиями, то есть терапия коктейля. При использовании в данном документе термин "совместное введение" или "совместно вводимые" относится к введению объекту, по меньшей мере, двух агентов или терапий. В некоторых вариантах осуществления изобретений совместное введение двух или более агентов/терапий осуществляется одновременно. В других вариантах осуществления изобретений первый агент/терапия вводится перед вторым агентом/терапией. Специалистам в данной области понятно, что составы и/или пути введения различных используемых агентов/терапий могут варьировать.
В in vivo способе объекту вводят соединение или агент. Как
правило, соединение или агент суспендируют в фармацевтически
приемлемом носителе (таком как, например, в частности
физиологический солевой раствор) и вводят перорально или с
помощью внутривенной инфузии или инъецируют или имплантируют
подкожно, внутримышечно, внутриоболочечно, внутрибрюшинно,
внутриректально, внутривагинально, внутриназально,
внутрижелудочно, внутритрахейно или внутрилегочно.
Требуемая дозировка зависит от выбора пути введения; природы состава; природы болезни пациента; габаритов объекта, веса, площади поверхности, возраста и пола; введения других лекарственных средств и предписаний врача. Подходящие дозировки находятся в интервале 0,01-100 мг/кг. Вариации необходимых
дозировок ожидаемы с точки зрения разнообразия доступных соединений/агентов и различных эффективностей различных путей введения. Например, ожидается, что для перорального введения будут требоваться более высокие дозировки, чем для внутривенной инъекции. Вариации в данных дозировках могут регулироваться с использованием стандартных эмпирических путей оптимизации, хорошо известных в данной области. Инкапсулирование соединения в подходящем носителе для доставки (например, в полимерных микрочастицах или в имплантируемых устройствах) может повышать эффективность доставки, особенно для пероральной доставки. Пример 1: Методы и материалы
Данный пример описывает методы и материалы, используемые в примерах 2-7. Мыши
Мышей C57BL/6 дикого типа приобретали в Jackson Laboratories. Мыши SIGNRl~/_ были предоставлены A. McKenzie. Трансгенные CDllc-DC-SIGN+ мыши были предоставлены Т. Sparwasser. Трансгенных мышей hDC-SIGN ВАС генерировали на основе SIGNRl~/_ в лаборатории авторов изобретения, как описано ранее. Мышей KRN TCR C57BL/6 (подарок D. Mathis и С. Benoist) скрещивали с мышами NOD с получением мышей K/BxN. Кровь у мышей K/BxN (в возрасте 6-12 недель) отбирали и собирали вместе сыворотку, содержащую артритогенные антитела. Пассивный перенос 2 00 мкл K/BxN сыворотки с помощью внутривенной инъекции наивным мышам (в возрасте 8-12 недель) индуцировал артрит. Воспаление оценивали в баллах 0-3 для каждой лапы и суммировали для общей клинической бальной оценки индивидуальной мыши.
Получение рекомбинантного Fc
IDEC-114, рекомбинантный источник полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgGl, гидролизовали папаином в течение ночи при 37 °С для отщепления фрагментов Fab и Fc. После гидролиза реакцию останавливали путем добавки 2,5 мг/мл йодацетамида. Для отделения отщепленных фрагментов от негидролизованного антитела образцы пассировали через колонку HiPrep 26/60 S-200HR эксклюзионной хроматографии (GE HEALTHCARE). Затем Fc-фрагмент очищали с помощью агарозных
гранул с белком G. Чистоту образца подтверждали путем окрашивания кумасси синим SDS-полиакриламидных гелей. Альтернативно рекомбинантные Fc получали путем транзиторной трансфекции плазмид, экспрессирующих человеческий IgGl Fc, в клетки 2 93Т с последующим осаждением сульфатом аммония надосадочных фракций и очистки с белком G. Генетическую последовательность, кодирующую Fc-участок человеческого IgGl, амплифицировали из 4-4-2 0 IgGl с помощью стандартных протоколов ПЦР и лигировали в pSecTag2 (INVITROGEN). Точечные мутации вводили в последовательность, кодирующую Fc, с помощью стандартных методов сайтнаправленного мутагенеза и подтверждали с помощью анализа ДНК-секвенирования. ПЦР-праймеры для замены Phe на Ala в положении 241 (FA241):
5'-ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) и
5'- ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).
Экспрессию белка и чистоту подтверждали с помощью иммуноблоттинга с антителами к человеческому Fc и/или с помощью окрашивания кумасси синим SDS-полиакриламидных гелей.
Двухстадийная in vitro реакция сиалирования
После очистки 10-50 мг/мл Fc-фрагментам меняли буфер на буфер для реакции галактозилирования (50 мМ MOPS, рН 7,2; 2 0 мМ МпС1г) и инкубировали в течение ночи при 37°С вместе с 5 0 мг UDP-галактозы и 0,75 U (3-1, 4-галактозилтрансферазы. Галактозилирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием ECL для распознавания конечных галактозных остатков. Затем галактозилированным Fc меняли буфер на реакционный буфер для сиалирования (100 мМ MOPS, 0,2 мг/мл BSA, 0,5% Triton Х-100, рН 7,4) и инкубировали в течение ночи при 37°С вместе с 50 мг СМР-сиаловой кислоты и 0,75 Ед а.2,6-сиалилтрансферазы. Сиалирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием SNA для распознавания конечных остатков сиаловой кислоты со связью а-2-б.
Адоптивный перенос макрофагов, выделенных из костного
мозга
Костномозговые клетки вымывали струей из большой берцовой кости и из бедренной мышей DC-SIGNtg или SIGNRl_/~ и высевали в 1Осм-планшеты, обработанные для нетканевых культур, в ростовой среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% Пен/Стреп, IL-3 (5 нг/мл, PEPROTECH) и M-CSF (5 нг/мл, PEPROTECH). После ночной инкубации при 37° С неприкрепленные клетки извлекали и переносили в 1Осм-планшеты, обработанные для нетканевых культур, содержащие ростовую среду RPMI с добавкой IL-3/M-CSF, и культивировали в течение 5-7 дней при 37°С. Зрелые макрофаги трипсинизировали и высевали в б-луночные планшеты с плотностью 2x106 клеток/на лунку и давали им возможность прикрепиться в течение ночи. На следующий день макрофаги стимулировали с использованием указанного препарата рекомбинантного Fc в течение 30 мин при 37°С. Клетки извлекали, промывали холодным PBS и внутривенно вводили 1x106 клеток мышам C57BL/6 дикого типа. Через один час после инъекции реципиентных мышей заражали сывороткой K/BxN.
Экспрессия и очистка растворимого человеческого DC-SIGN Плазмида, содержащая кДНК-последовательность внеклеточного домена (ECD) человеческого DC-SIGN, была предоставлена К. Drickamer. Кодирующую последовательность DC-SIGN ECD модифицировали для введения N-концевой стреп-метки с помощью стандартных методов ПЦР и лигировали с рЕТ28Ь(+). рЕТ28Ь-strepDCSIGN трансформировали в Е. coli штамм BL21/DE3 и растили в 3 л ростовой среды ТВ при 37°С до момента достижения бактериальной культурой СШбоо 0,7-0,8. Экспрессию белка индуцировали путем добавления 100 мг/л IPTG и культуры инкубировали при 37°С в течение 3,5 ч. Бактерии осаждали путем центрифугирования при 4 000хд в течение 10 мин при 4°С. Осадки бактерий ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,8, и лизировали обработкой ультразвуком. Тельца включения осаждали путем центрифугирования при ЮОООхд в течение 15 мин при 4°С и солюбилизировали в 100 мл б М гуанидин-НС1; 100 мМ Трис-HCl, рН
7,8; 0,2% TRITON X-100. Твердые примеси удаляли путем центрифугирования при 20000хд в течение 30 мин при 4°С, и надосадочную фракцию диализовали против 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 2 5 мМ СаС1г- После диализа нерастворимые осадки удаляли путем центрифугирования при 20000хд в течение 30 мин при 4°С, и надосадочную фракцию применяли к смоле strep-tactin (NOVAGEN) для сбора strep-меченных DC-SIGN ECD. Связанный белок элюировали из смолы с использованием элюирующего буфера, предоставленного производителем (NOVAGEN). Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, и положительные фракции объединяли и загружали на манноза-агарозную колонку для селекции активных рецепторов. DC-SIGN ECD элюировали с помощью 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 5 мМ EDTA. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE.
Поверхностный плазмонный резонанс
Для определения взаимодействия между различными препаратами рекомбинантного Fc с растворимым hDC-SIGN или hFcyRs, записывали измерения равновесной аффинности на сенсор Biacore Т100. Рецепторы, разведенные до 20-50 мкг/мл в NaOAc рН 5, иммобилизовали на чипах СМ5 с высокой плотностью (2 000 RU) с помощью стандартной конденсации аминогрупп. Для взаимодействий hDC-SIGN инъекции осуществляли при скорости потока 2 0 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-P+, доведенным до рН 9, и с добавлением 2 мМ СаС1г и 500 мМ NaCl. Для взаимодействий hFcyRs инъекции осуществляли со скоростью потока 2 0 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-EP+. Поверхности регенерировали с использованием короткой обработки 50 мМ NaOH. Значения Kd рассчитывали после вычитания фонового связывания с контрольной проточной ячейкой с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation.
ОТ-ПЦР
Суммарную РНК экстрагировали из костномозговых макрофагов с использованием набора реагентов RNeasy Mini kit (QIAGEN). Один микрограмм суммарной РНК использовали для анализа экспрессии IL-33 мРНК с помощью ОТ-ПЦР с использованием набора
реагентов OneStep RT-PCR kit (QIAGEN). Экспрессия GAPDH служила
в качестве контроля загрузки. ПЦР-праймеры для mIL-33: 5'-
gaagatcccaacagaagacc-3' (SEQ ID NO: б) и 5'-
ttccggaggcgagacgtcac-3' (SEQ ID NO: 7); и mGAPDH: 5'-
gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-
tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9) . Условия ПЦР: 94°C в
течение 30 с; 55°C в течение 30 с; 72°С в течение 60 с х 35 циклов (IL-33) или 2 5 циклов (GAPDH).
Пример 2: а-2,б-связанная сиаловая кислота придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgGl Fc
Минорная популяция антител в IVIG-препаратах подавляет воспаление, индуцированное аутоантителами. Эти антитела, содержащие концевую а-2,б-связанную сиаловую кислоту на Fc-гликане, опосредуют противовоспалительный ответ путем связывания с SIGNR1 на макрофагах периферической области или с его человеческим ортологом DC-SIGN, на миелоидных клетках.
Для изучения взаимодействия sFc с DC-SIGN растворимую форму внеклеточного домена DC-SIGN (DC-SIGN ECD) очищали из бактерий и иммобилизовали на СМ5-чипах. sFc получали из полноразмерных антител IDEC-114 и сиалировали in vitro (фигура lb) и специфично связывали с DC-SIGN-конъюгированной поверхностью (фигура 1а). Измерения равновесной аффинности проводили, и значение KD для данного взаимодействия рассчитывали как ~1,3х10~6 М (фигура 1с) . Напротив, несиалированная гликоформа IDEC-114 Fc продемонстрировала отсутствие связывающей активности с DC-SIGN, предполагающее, что сиалирование индуцирует конформационные изменения в остове Fc с обнаружением сайта связывания DC-SIGN.
Как представлено на фигуре 1а, было обнаружено, что рекомбинантный a-2,6-sFc связывался с растворимым DC-SIGN согласно измерениям поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc получали с помощью папаинового расщепления полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgGl (IDEC-114) с последующими in vitro реакциями галактозилирования и
сиалирования. Сенсограммы SPR для антитела, связывающегося с иммобилизованным DC-SIGN, представлены для сиалированных и галактозилированных гликоформ hlgGl Fes, как описано выше в примере 1. Было обнаружено, что концентрация Fc, проходящая потоком через DC-SIGN ECD, колеблется в интервале 3-0,8 \М. Как представлено на фигуре lb, лектиновый блот с SNA подтвердил прикрепление сиаловой кислоты с 2,6-связью на Fc (верхняя панель); окрашенные кумасси контроли представлены на нижней панели. Измерение равновесной KD связывания sFc с DC-SIGN (как представлено в а) рассчитывали с помощью пакета программ Biacore Evaluation.
Пример 3: Мутация, разрушающая взаимодействия Fc-гликан, придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgGl Fc
Сердцевинная олигосахаридная цепь, присоединенная к Asn297, делает экстенсивными нековалентные взаимодействия с аминокислотным остовом Fc. Конформационные изменения в Fc, индуцированные с помощью различных сахарных остатков, присоединенных к сердцевинному гликану, опосредуются с помощью этих белок-углеводных взаимодействий. Замены аланина, которые ликвидируют ключевые контактные точки между остовом Fc и остатками гликана, по-видимому, обеспечивают DC-SIGN-связывающую активность.
Как представлено на фигуре 2А, мутации FA2 41 и FA2 4 3 демонстрируют DC-SIGN-связывающую активность без in vitro ферментативной обработки. Истинные значения KD колеблются от 6х10~7 М для FA241 до Зх10~7 М для FA243. Предыдущие сообщения выявляют, что эти мутации повышают сиалирование антител, в основном делая гликан более доступным гликозилтрансферазам при экспрессии в клетках млекопитающего. Для подтверждения этого осуществляли опыт с лектиновым блотом для определения того, что связывание FA2 41 и FA2 4 3 с DC-SIGN осуществляется благодаря повышенному сиалированию транзиторно экспрессированных белков. Как представлено на фигуре 2В, SNA-блоты не детектировали концевых остатков сиаловой кислоты в очищенных FA2 41 и FA243,
указывая, что взаимодействие DC-SIGN было независимым от модификации сиаловой кислоты.
Более конкретно остатки F241, F243, D265 и R301 аминокислотного остова IgGl Fc заменяли аланином для нарушения нековалентных взаимодействий с олигосахаридными остатками. Fc экспрессировали и очищали из клеток 2 93Т и анализировали на предмет DC-SIGN-связывающей активности с использованием поверхностного плазмонного резонанса, как описано выше. Было обнаружено, что Fc, несущие мутации FA2 41 или FA243, демонстрировали повышенную аффинность к DC-SIGN по отношению к измерениям аффинности для sFc (фигура 1а) . Проводили опыты с лектиновыми блотами с ECL (фигура lb, средняя панель) и SNA (верхняя панель) для определения концевых сахарных компонентов на Fc, очищенных из клеток 2 93Т. В качестве положительного контроля для сиалированных Fc FA2 41 сиалировали in vitro, как описано на фигуре 1а. Окрашенные кумасси контроли загрузки представлены на нижней панели фигуры lb.
Пример 4. Мутация FA241 в hlgGl Fc повторяла противовоспалительную активность а-2,б sFc
Если мутации FA2 41 и FA2 4 3 имитируют DC-SIGN-связывающую
активность sFc, то проводили анализы для исследования того,
могут ли эти мутации повторять противовоспалительную активность
sFc in vivo. Подобранных по возрасту и полу мышей SIGNRl_/~ и
hDC-SIGN+/SIGNRl_/_ заражали с помощью артритогенной сыворотки
K/BxN и обрабатывали с помощью sFc, FA2 41 или FA2 4 3 с
эффективной дозой 0,033 г/кг. Согласуясь с предыдущими
открытиями, sFc подавлял опухоль стопы у мышей DC-SIGN+, но не
у мышей SIGNRl_/_. Аналогично мутация FA2 41 демонстрировала
противовоспалительную активность, сравнимую с
противовоспалительной активностью sFc у мышей hDC-SIGN+/SIGNRl~ /_. Мыши, которым вводили FA243, демонстрировали отсутствие уменьшения воспаления сустава. Эти открытия предполагают, что рекомбинантные Fc, несущие мутацию F241A (FA241), повторяли связывание DC-SIGN и противовоспалительную активность sFc в отсутствие модификации сиаловой кислоты.
Как представлено на фигуре 3, мышам hDC-SIGN+/SIGNRl_/_ (белые квадраты) и SIGNRl_/~ (черные квадраты) вводили с помощью 0,7 мг/на мышь sFc, FA241 или FA243 внутривенной инъекции. Затем мышей заражали с помощью K/BxN сыворотки через 1 ч. Опухание стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Как сообщалось ранее, противовоспалительная активность sFc является DC-SIGN-зависимой (левая панель). FA241 также подавляла артритное воспаление у зараженных мышей K/BxN DC-SIGN- зависимым образом, FA2 4 3 не уменьшала в значительной степени опухания стопы на б-й день. Средние значения и SEM клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график на б-й день.
Пример 5. Отличительные требования для
противовоспалительной активности FA241
Для идентификации детерминант для противовоспалительной активности FA241 костномозговые макрофаги (ВММФ) из мышей CDllc.DC-SIGN+ и SIGNRl_/~ стимулировали с помощью FA241 или других Fc-препаратов и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6, зараженным сывороткой K/BxN.
Вкратце костномозговые макрофаги из мышей CDllc.DC-SIGN+ и SIGNRl_/~ культивировали в присутствии IL-3 (5 нг/мл) и M-CSF (5 нг/мл) в течение 5-7 дней. Как представлено на фигуре 4, DC-SIGN+ ВММФ стимулировали с помощью 0,5 мг/мл несиалированных (черные полоски) или сиалированных (белые полоски) гликоформ указанных Fc-препаратов. Fc-обработанные ВММФ переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Как представлено на фигуре 4b SIGNRl_/~ (черные полоски) и DC-SIGN+ (белые полоски) ВММФ стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc-препарата и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Аналогично, DC-SIGN+ ВММФ стимулировали с помощью либо 0,5 мг/мл FA241 или дегликозилированного FA2 41 (фигура 4с, белые полоски) либо с помощью PBS (фигура 4с, черная полоска) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. FA2 41 дегликозилировали с помощью PNG-азы F и удаление гликана
подтверждали с помощью лектиновго блоттинга. DC-SIGN+ ВММФ стимулировали с помощью указанного несиалированного Fc-препарата или с помощью PBS (фигура 4d, черный круг) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Во всех случаях опухоль стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Средние значения и стандартные ошибки средних значений (SEM) клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график. *Р <0,05, как определено с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим апостериорным тестом Тьюки.
Как представлено на фигуре 4А, несиалированные и сиалированные FA241-препараты были эффективны в равной степени в подавлении воспаления сустава по сравнению с sFc. Однако WT Fc-препараты требовали а-2,б-связанной сиаловой кислоты, так как DC-SIGN+ ВММФ, стимулированные асилированным WT Fc, не передавали защиту реципиентным мышам. Соответственно результатам, представленным на фигуре 3, обоим, sFc и FA241, требовалась экспрессия DC-SIGN на ВММФ для передачи защиты (фигура 4В). Хотя FA2 41 не требует сиаловой кислоты для передачи защиты, дегликозилирование с помощью PNG-азы F отменяло противовоспалительные свойства FA2 41 (фигура 4С), предполагая, что Fc гликан все равно необходим. Кроме того, для демонстрации того, что наблюдаемая противовоспалительная активность специфична для мутации F241A, DC-SIGN+ ВММФ стимулировали с помощью Fc, несущих альтернативные мутации, которые не придают повышенного связывания DC-SIGN. Только РА241-стимулированные ВММФ защищали зараженных реципиентных мышей K/BxN.
Пример б. Мутация FA2 41 повышала связывание рецептора Fey Если замена аланина в положении 241 индуцирует конформационное изменение в Fc, то возможно будет изменяться аффинность к человеческим рецепторам Fey. Ранее сообщалось, что сиалирование уменьшает аффинность IgG к FcyR, ослабляя вследствие этого активность ADCC in vivo.
Связывание рекомбинантных IgGl Fc с растворимыми FcyR измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc готовили способом, описанным выше. Сенсограммы SPR для связывания антитела с иммобилизованным hFcyRIIAi3iR и hFcyRIIB представлены на фигуре 5 для несиалированных и сиалированных гликоформ WT hlgGl Fc и для несиалированной формы FA2 41 Fc.
Как представлено на фигуре 5, несиалированные гликоформы WT Fc связывались с hFcyRIIA и RIIB с наблюдаемым значением KD ~2-3xlСГ5 М. Однако sFc, по-видимому, не связывались ни с hFcyRIIA, ни с RIIB. Неожиданно обнаружилось, что FA241, по-видимому, связываются с обоими, hFcyRIIA и RIIB, с аффинностью
более высокого порядка (KD=~2xlCT6 М) .
Пример 7. Индуцирование IL-33 мРНК в костномозговых макрофагах с помощью FA2 41
sFc индуцирует Тн2-зависимый противовоспалительный путь, который требует секреции IL-4 из популяции лейкоцитов FcsRI+, вероятно, базофилов, для положительной регуляции FcyRIIB на регуляторных макрофагах. Введение IL-33 in vivo или in vitro стимулирует базофилы для высвобождения запасов IL-4. Экспрессия IL-33 мРНК положительно регулируется в селезенке мышей WT C57BL/6, обработанных с помощью sFc или IVIG, но не у мышей SIGNRl_/_. Это предполагает, что sFc может индуцировать экспрессию IL-33 в клетках SIGNR1+ или DC-SIGN+ . В данном примере анализы проводили и продемонстрировали, что стимулирование DC-SIGN+ ВММФ с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33.
Более конкретно, костномозговые макрофаги из мышей CDllc.DC-SIGN+ и SIGNRl_/~ культивировали способом, описанным
выше. ВММФ высевали на 12-луночные планшеты в бессывороточной среде RPMI и давали возможность прикрепиться в течение ночи при 37°С. На следующий день клетки стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc в бессывороточной среде RPMI в течение 1 ч (фигура ба) или 4 ч (фигура 6Ь) при 37 °С. мРНК собирали из клеток в конкретные моменты времени и 1 \хт суммарной РНК
использовали для ОТ-ПЦР амплификации IL-33 мРНК (верхние панели). Амплификация GAPDH служила в качестве контроля загрузки (нижние панели). Плазмидой, совместно экспрессирующей DA265 Fc и человеческую сиалилтрансферазу (ST6Gall), трансфецировали в клетки 2 93Т с получением высокосиалированного рекомбинантного Fc (ST6-DA265).
Как представлено на фигуре б, стимулирование DC-SIGN+ ВММФ с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33. Несмотря на высокий базальный уровень экспрессии IL-33 по сравнению с DC-SIGN+ ВММФ, SIGNRl_/~ ВММФ отрицательно регулировали экспрессию IL-33 мРНК в ответ на обработку FA241.
Вышеописанный пример и описание предпочтительных вариантов осуществления следует понимать в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Все публикации, процитированные в данном документе, включены в настоящий документ ссылкой в полном объеме. Понятно, что многочисленные вариации и комбинации признаков, представленных выше, могут применяться, не выходя при этом за рамки настоящего изобретения, представленного в формуле изобретения. Такие вариации не рассматриваются как выходящие за рамки изобретения, и подразумевается, что все такие вариации включены в рамки следующей формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Выделенный полипептид, включающий модифицированную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% идентична Fc-участку IgG, где модифицированная последовательность свободна от сиалирования, и полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше, чем противовоспалительная активность родительского полипептида.
2. Выделенный полипептид по п. 1, где родительский полипептид включает Fc-участок IgG.
3. Выделенный полипептид по пп. 1 или 2, где Fc-участок IgG включает последовательность SEQ ID N0: 1.
4. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-3, где выделенный полипептид обладает способностью связываться с DC-SIGN.
5. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-4, где выделенный полипептид обладает способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB.
6. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-5, где выделенный полипептид обладает способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB при KD 2х1СГ5 М или ниже (то есть КА 5х104 М-1 или выше).
7. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-6, где модифицированная последовательность содержит мутацию FA241.
8. Выделенный полипептид по любому из пп. 1-7, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 75% идентична SEQ ID N0: 2.
9. Выделенный полипептид по п. 8, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID N0: 2 .
10. Выделенный полипептид по п. 9, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 90% идентична SEQ ID N0: 2 .
11. Выделенный полипептид по п. 10, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 95% идентична SEQ ID N0: 2 .
1.
12. Выделенный полипептид по п. 11, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 99% идентична SEQ ID N0: 2 .
13. Выделенный полипептид по п. 12, где модифицированная последовательность включает SEQ ID N0: 2.
14. Выделенный полипептид по п. 9, где модифицированная последовательность по существу состоит из SEQ ID N0: 2.
15. Способ получения полипептида, обладающего
противовоспалительной активностью, причем способ включает:
предоставление родительского полипептида, содержащего последовательность Fc-участка IgG, или предоставление первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей родительский полипептид; и
модификацию родительского полипептида с получением модифицированного полипептида, так чтобы модифицированный полипептид был свободен от сиалирования и имитировал структуру сиалированной формы Fc-участка IgG.
16. Способ по п. 15, где стадию модификации проводят путем модификации первой последовательности нуклеиновой кислоты с получением второй нуклеиновой кислоты, кодирующей модифицированный полипептид.
17. Полипептид, полученный способом по пп. 15 или 16.
18. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая
последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп. 1-14
и 17.
19. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п. 18.
20. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.
18 .
21. Способ получения полипептида, включающий
культивирование клетки-хозяина по п. 2 0 в среде при условиях,
дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого
нуклеиновой кислотой, и очистку полипептида из культивируемой
клетки или из культуральной среды.
22. Фармацевтическая композиция, включающая (i) полипептид
по любому из пп. 1-14 и 17 или нуклеиновую кислоту по п. 18, и
(ii) фармацевтически приемлемый носитель.
23. Способ лечения воспалительного заболевания, включающий
введение нуждающемуся в этом объекту терапевтически
эффективного количества полипептида по любому из пп. 1-14 и 17,
или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид.
24. Выделенный полипептид, нуклеиновая кислота, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин или композиция, по существу такая, как представлено и описано в данном документе.
25. Способ лечения воспалительного заболевания, по существу такой, как представлено и описано в данном документе.
26. Применение полипептида по любому из пп. 1-14 и 17 или
нуклеиновой кислоты по п. 18 в производстве лекарственного
средства для лечения воспалительного заболевания.
По доверенности
80 60
20 0
mtmmsmmiftimtim
-20
-100
-i ¦ 1 ¦-
100 200
Время (секунды)
а2,6 sFc
300
400
500
1400 -1200 -1000
800
600
400 4
200 О
-200
-100
100
200
300
400
500
Время (секунды)
Ы,4гал. а2,6 си ал.
SNA
Кумасси
KD= 1 .Зх 10 М
1 е-6 1.2е-6 1.4е-б 1.6е-6 1.8е-б 2е-6 2.2е-6 2.4е-б 2.6е-6 2.8
Концентрация (М)
FA241
700600500400300 200100 0
У /
¦100
-t-
¦100
100
200 300
Время (секунды)
400
500
600 т 500"
400
3001 200 1000-
FA243
/ / /
///
///
II//
№> /'
¦100
-t-
¦100
100
200 300
Время (секунды)
400
500
600 т ОД265
500 400 300 200 100
¦100
0 50 100 150 200 250 300
Время (секунды)
600 RA301
500 j 400 300 200 100
-100
0 50 100 150 200 250 300
Время (секунды)
ECL
Кумасси
ФИГ. 2В
-i. to DC Q
- 9 4H9ft
CO CM
<
- С чнэр
О чнэр
О СО (С 4 см о
еянэИо веняиед веяоэьинии> ]
- 9 чнэр
<
- С чнэр
О чнэр
О СО (О * см о
еянэИо веняиед веяоэьинии> ]
- 9 чнэр
д янэр
О LL (0
- 1? янэр
- С чнэр
О чнэр
О СО (О > " см о
еянэИо веняиед веяоэьинии> ]
Е z
CD СО +
CD СО
-7 ю т? (D О ^
I 2 3 2
^ Q СС U.
EMHaho кеняиед ке> юэ1-|Инии> |
8 чнэр
EMHaho кеняиед ке> юэ1-|Инии> |
-100 0 100 200 300 400
Время (секунды)
180 т
2,6сиал.Рс
130
hFcvR2A (131R)
-100
100 200
Время (секунды)
300
400
250'
200
150
h FcyR2 В
f 100 о
ч: ш
-100
100
200 300 Время (секунды)
400
-100 0 100 200 300 400
Время (секунды)
Время (секунды)
100
1/11
100
1/11
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
100
1/11
100
1/11
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
100
1/11
100
1/11
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
100
1/11
100
1/11
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
100
1/11
100
1/11
ФИГ. 1А
ФИГ. 1А
2/11
2/11
ФИГ. 1В-С
ФИГ. 1В-С
4/11
4/11
ФИГ. 2А продолжение
ФИГ. 2А продолжение
5/11
5/11
5/11
5/11
5/11
5/11
6/11
6/11
7/11
7/11
7/11
7/11
60-
8/11
60-
8/11
ФИГ. 5
ФИГ. 5
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
9/11
9/11
ФИГ. 5 продолжение
ФИГ. 5 продолжение
11/11
11/11
