(57) Реферат / Формула:
В настоящем изобретении предложены агенты и фармацевтические композиции для уменьшения образования амилоида и/или усиления дезагрегации амилоидных белков. Композиции также можно применять для детектирования амилоида.
2420-516255ЕА/040 ПРИМЕНЕНИЕ БЕЛКОВ РЗ БАКТЕРИОФАГА В КАЧЕСТВЕ АГЕНТОВ,
СВЯЗЫВАЮЩИХ АМИЛОИД
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим
композициям, содержащим белок дЗр нитевидного бактериофага,
амилоид связывающие фрагменты дЗр и амилоид связывающие мутанты
и варианты дЗр, а также к применению указанных композиций в
качестве терапевтических средств, чтобы уменьшить амилоидную
нагрузку, связанную с заболеваниями, например, системными и
периферическими амилоидозами, нейродегенеративными
заболеваниями, включая нейродегенеративные таупатиии и трансмиссивные губчатые энцефалопатии (заболевания, связанные с прионами). В область настоящего изобретения также включено применение указанных композиций для предотвращения накопления амилоидной нагрузки, связанной с указанными заболеваниями, и применение указанных композиций в качестве диагностических средств для обнаружения амилоида и таким образом диагностики таких заболеваний.
Нитевидный бактериофаг М13 и родственные нитевидные фаги продемонстрировали свою полезность на животных моделях заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, и, следовательно, представляют собой потенциальный класс терапевтических средств для лечения заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белков. См. публикацию патента США 2011/0142803, которая полностью включена в настоящую заявку посредством ссылки. В частности, было обнаружено, что нитевидные бактериофаги способны вызывать клиренс амилоида, который уже образовался в головном мозге. См., например, WO2008083795 и WO2010080073, которые полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Заболевания, сопровождающиеся образованием амилоида, характеризуются дегенерацией нейронов и наличием неправильно свернутых, агрегированных белков в головном мозге. Такие неправильно свернутые и агрегированные белки различаются при разных заболеваниях, но в большинстве случаев они имеют кросс
(3-складчатую структуру, которая связывает краситель Конго красный и проявляет двойное лучепреломление светло-зеленого цвета. Ожидается, что удаление амилоида снизит или замедлит прогрессирование, или даже обратит симптомы, связанные с различными заболеваниями, характеризующимися накоплением амилоида.
Потенциальные терапевтические подходы для предотвращения и/или обращения патологий и/или симптомов, связанных с заболеваниями, которые сопровождаются образованием амилоидных отложений, включают, например, ингибирование образования амилоида, усиление клиренса амилоида и ингибирование агрегации амилоида. См., например, Aguzzi and O'Connor, Nature Review Drug Discovery (2010) 9:237-48. Удаление и/или предотвращение образования токсичных олигомеров также может подходить для лечения и профилактики заболеваний, сопровождающихся образованием амилоида.
Нейродегенеративные заболевания, которые, как известно,
связаны с неправильно свернутыми и/или агрегированными белками,
включают болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, прионные
заболевания, нейродегенеративные таупатии, боковой
амиотрофический склероз (БАС), спиноцеребеллярную атаксию
(SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию, бульбарную спинномозговую мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, лобно-височную долевую дегенерацию (FTLD), включая лобно-височную деменцию, британскую/датскую деменцию и семейную энцефалопатию. Другие заболевания включают неправильно свернутые и/или агрегированные белки в периферических отделах, так называемые периферические амилоидозы. См., например, Chiti and Dobson, Annu Rev Biochem
(2006) 75:333-66; и Josephs et al. , Acta Neuropathol (2011)
122:137-153. Существует значительная потребность в
предотвращении и/или уменьшении образования агрегатов амилоида
(т.е., неправильно свернутых и/или агрегированных белков) для лечения или уменьшения симптомов и тяжести этих заболеваний.
Недавно Национальный институт по проблемам старения и Ассоциация по изучению болезни Альцгеймера опубликовали критерии диагностики деменции по всем причинам и деменции, вызванной болезнью Альцгеймера. См., McKhann et al., Alzheimer's and Dementia, (2011) 7(3) :2бЗ-9. На основе этого руководства деменция по всем причинам диагностируется, если поведенческие или когнитивные симптомы удовлетворяют пяти тестам, которые включают, например, нарушение способности выполнять функции на работе или в повседневной деятельности, а также снижение функционального статуса и работоспособности относительно предыдущих уровней. Тесты включают комбинированное изучение анамнеза и объективную оценку когнитивного функционирования. Как описано в настоящей заявке, открытие того факта, что белок дЗр нитевидного бактериофага, амилоид связывающие фрагменты дЗр и амилоид связывающие мутанты и варианты дЗр связывают амилоид, обеспечивает дополнительные способы диагностики любого заболевания или деменции в результате образования амилоида, включая "по всем причинам" и деменции, вызванной болезнью Альцгеймера.
Нитевидные бактериофаги представляют собой группу
структурно родственных вирусов, которые инфицируют
бактериальные клетки и содержат кольцевую одноцепочечную геномную ДНК. Они не вызывают гибели своего хозяина во время продуктивной инфекции. Rasched and Oberer, Microbiol Rev (1986) 50:401-427. Примеры нитевидных бактериофагов включают фаги семейства Ff (например, М13, fl и fd) . Нуклеотидная последовательность fd была известна с 1978 года. Beck et al., Nucleic Acids Research (1978) 5 (12):4495-4503. Полная последовательность M13 была опубликована в 1980 году. van Wezenbeek et al. , Gene (1980) 11:129-148. Геном фага fl был секвенирован в 1982 году. Hill and Petersen, J. Virol. (1982) 44(1) : 32-46. Геном Fl состоит из 6407 нуклеотидов, на один меньше, чем у фага fd. Он отличается от последовательности fd по 188 нуклеотидам (включая удаление одного нуклеотида), что приводит к различию по 12 аминокислотам между белками фагов fl и fd. Последовательность fl отличается от последовательности
М13 по 52 нуклеотидам, что приводит к различию по 5
аминокислотам между соответствующими белками.
Последовательности ДНК М13 и fd различаются по 192 (3%) нуклеотидам, но только 12 из этих различий приводят к изменениям в соответствующей аминокислотной последовательности (6,25%). van Wezenbeek et al., Gene (1980) 11:129-148.
Структура нитевидных фагов хорошо известна и описана, например, см. работы Marvin, Curr. Opin. in Struct. Biol. (1998) 8:150-158; Rasched and Oberer, Microbiological Reviews (1986) 50(4):401-427. Нитевидные фаги имеют "оболочку", которая содержит тысячи копий основного белка капсида, кодируемого геном 8 (д8р, р8 или pVIII). Собранный комплекс д8р-ДНК образует характерную нитевидную форму фага. Минорные белки оболочки, т.е. те, которые присутствуют только в нескольких (35) копиях, расположены на концах нити. Один из этих концевых белков, дЗр (также известный как рЗ или pill), необходим для связывания с бактерией-хозяином и инициирует инфицирование.
Зрелый белок дЗр фага М13 состоит из 406 аминокислот. GenBank Ref Seq NP_510891.1 обеспечивает эталонную последовательность, которая включает 18 остатков N-концевой сигнальной последовательности. Распространены варианты, которые имеют аминокислотные различия по сравнению с опубликованными последовательностями. Нитевидные фаги из I-семейства имеют дЗр, который отличается от дЗр членов семейства Ff, но даже между семействами консервативность белка дЗр достаточно высока. Stassen et al., J Mol Evol (1992) 34:141-52.
Доступна кристаллическая структура белка дЗр. Lubkowski et
al., Structure (1998) 7(6) 711-722. Белок состоит из 3
свернутых доменов, разделенных гибкими линкерными
последовательностями, которые обогащены остатками глицина. Имеются два N-концевых домена N1 и N2, содержащих 2 62 аминокислоты, которые взаимодействуют с образованием комплекса N1-N2. Карбоксиконцевой домен (СТ, также называемый N3) содержит 14 6 аминокислот и служит для закрепления дЗр в фаговой частице посредством гидрофобных взаимодействий с g8p. Marvin, Current Opin. in Structural Biology (1998) 8:150-158.
Общедоступная ленточная структура, полученная с использованием гибридного белка NlN2-2g3p Холлигером и проч. (Holliger, J Mol. Biol. (1999) 288 (4) :649-57), представлена на фиг. 1.
В отличие от большинства белков, разворачивание доменов N1 и N2 из латентной "заблокированой" формы необходимо, чтобы дЗр приобрел свою природную биологическую активность. Eckert and Schmid, J. Mol. Biol. (2007) 373:452-461. На начальном этапе инфицирования N2 связывает бактериальные F-фимбрии посредством остатков на внешнем крае N2. Deng and Perham, 2002. Начальное связывание N2 "разблокирует" дЗр путем "открывания" комплекса N1-N2, что затем позволяет домену N1 связываться с корецептором TolA. Тепловой переход во фрагменте N1-N2 белка дЗр для осуществления начального этапа разблокирования, когда разворачивается N2, происходит при температуре плавления (Тпл)
4 8,1°С. Часть процесса включает изомеризацию пептидной связи Gln212-Рго213. Конвертация Рго213 представляет собой трансизомеризацию в разблокированном состоянии. N1 остается стабильно свернутым до второго этапа, который происходит при Тпл 60,2°С. Описано в Eckert and Schmid, 2007.
Мутации фрагмента N1-N2 были использованы для исследования стабильности и инфекционности различных мутантов. Eckert and Schmid, 2007. Один вариант, обозначенный "ЗА", нарушал связывание с фимбриями и уменьшал стабильность домена N2. При этой мутации Тпл снижается до 42,б°С. Вариант ЗА несет следующие мутации: W181 A, F190A и F194A. Другой мутант N2, G153D, дестабилизировал N2 за счет снижения Тпл до 44,4°С. Мутант Q129H стабилизировал N2 за счет увеличения Тпл до 51,4°С. Вариант IY содержит мутации T101I и D2 0 9Y в шарнирной области и увеличивает стабильность фрагмента N1-N2 (Тпл=5б,5°С). Вариант IHY содержит мутации T101I, Q129H и D209Y (Тпл=60,1°С) . Вариант IIHY содержит мутации T13I, T101I, Q129H и D209Y (Тпл=61, 8°С) . Обе мутации Q129Y и T13I являются стабилизирующими, и добавление этих мутаций дополнительно повышает температуру плавления Тпл. Инфекционность фага изменялась обратно пропорционально силе взаимодействия домена с дЗр. Eckert and
Schmid, 2007. Удаление домена N2 (фаг fd (AN2)) увеличивало инфекционность за счет устранения блокирующего действия домена N2 на связывание N1 с TolA.
Настоящее изобретение частично основано на открытии, что дЗр также опосредует связывание нитевидных фагов с амилоидом способом, который аналогичен процессу, с помощью которого фаг инфицирует бактерии. В патенте США №7 8 674 87 выдвинуто предположение, что механизм, лежащий в основе терапевтической эффективности фагов при дезагрегации амилоида, который описан в указанном патенте, заключался в том, что длинные и тонкие структуры фага могли обеспечить структурирование фага вдоль амилоидных волокон. Помимо этого было предположено, что высокое содержание а-спиралей в д8р, основном белке оболочки, может нарушать р-складчатую структуру амилоида. Этот механизм согласуется с приведенными в патенте данными, что наномолярное количество фага может дезагрегировать микромолярное количество Р-амилоида, это позволят предложить, что эффект обусловлен компонентом фага с большим количеством копий, т.е. д8р. Этот вывод также согласуется с данными, приведенными в патенте США 2011/0182948, что вирус табачной мозаики, структура которого аналогична таковой нитевидных фагов, может вызвать дезагрегацию. Следовательно, результаты этой более ранней работы позволяют предположить, что интактная структура (длинная нить с высоким содержанием альфа-спиралей) имела важное значение для терапевтического эффекта или что, если существенное значение имел конкретный белок оболочки, это был белок, представленный в оболочке фага в большом количестве копий, например, д8р. Ни в одной из этих ранних работ не было выдвинуто какого-либо предположения, что выделенный компонент бактериофага, в отличие от интактного фага, мог связываться с амилоидом и/или вызывать его дезагрегацию. Более того, не было выдвинуто какого-либо предположения относительно того факта, что минорный белок оболочки нитевидного бактериофага играл роль в его способности связываться с амилоидом и дезагрегировать его.
Однако настоящее изобретение обеспечивает доказательства альтернативного (хотя необязательно взаимоисключающего) механизма действия. Автор настоящего изобретения обнаружил, что белок дЗр фага непосредственно связывает амилоидные волокна, и что опосредованная фагом дезагрегация зависит от этой начальной стадии связывания. Определение автором настоящего изобретения того факта, что дЗр отвечает за связывание амилоида, опосредованное нитевидным фагом, обеспечивает механизм терапевтической эффективности бактериофагов, а также обеспечивает основу для новых классов терапевтических и диагностических средств.
Дополнительные цели и преимущества настоящего изобретения будут изложены частично в описании, которое следует ниже, и частично будут очевидны из описания или могут быть изучены при практическом применении изобретения. Цели и преимущества изобретения будут реализованы и достигнуты посредством элементов и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения.
Следует понимать, что предшествующее общее описание и последующее подробное описание являются исключительно иллюстративными и пояснительными и не ограничивают объем заявленного изобретения.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 представлена ленточная структура доменов N1 и N2 белка дЗр и шарнирная область.
На фиг. 2А-2С приведено выравнивание последовательностей белков дЗр из разных источников. На фиг. 2А приведено выравнивание последовательностей дЗр из фага М13 (SEQ ID N0:1), Fd (SEQ ID N0:2) и fl (SEQ ID N0:3), включая консенсусную последовательность (SEQ ID N0:4) . На фиг. 2B приведено выравнивание последовательностей белка дЗр из фага 12-2 (SEQ ID N0:5) и Ike (SEQ ID N0:6), наряду с консенсусной последовательностью между 12-2 и Ike (SEQ ID N0:7) . На фиг. 2С представлена аминокислотная последовательность дЗр из фага If (SEQ ID N0:8).
На фиг. ЗА представлены результаты исследования связывания фага методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Связывание с фибриллами бета-амилоида (А|3) сравнивали со связыванием с мономерами бета-амилоида, используя 1014 частиц фага/мл, протекающих через чип биосенсора. На фиг. ЗВ приведены величины Ка, Kd и KD, рассчитанные на основании данных SPR, представленных на фиг. ЗА.
На фиг. 4А и 4В приведены результаты исследований связывания. На фиг. 4А приведены результаты исследования прямого связывания для двух дозировок фага (1011/мл и 1012/мл) с увеличением количества моль фибриллярной формы бета-амилоидного пептида 42 (fA|342) . На фиг. 4В приведены результаты исследования конкурентного связывания и предоставлен альтернативный способ определения KD для связывания М13. Использовали конструкцию 1.
На фиг. 5 приведены результаты исследования конкурентного связывания с использованием денатурированного теплом М13 (квадраты - 90 °С в течение 10 минут) в сравнении с М13 в нативной конформации (кружки) (конструкция 1) в исследовании конкурентного связывания с фибриллами амилоида.
На фиг. б приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием тиофлавина Т (ТФТ) , в котором fA|342 инкубировали в присутствии 2-х концентраций фага М13 или без него (конструкция 1).
На фиг. 7А и 7В показано влияние изменения отдельных параметров в исследовании дезагрегации с использованием красителя тиофлафина Т. На фиг. 7А приведена величина дезагрегации в процентах в присутствии двух концентраций соли (0,15 М и 1,5 М). На фиг. 7В приведен процент растворимой формы бета-амилоида, оставшейся при двух температурах (4°С и 37°С) . Использовали конструкцию 1.
На фиг. 8А и 8В приведены результаты исследования связывания М13 с амилоидом, используя fA|342. На фиг. 8А показано связывание М13 при использовании температур инкубации от 18°С до 58°С в течение 3 часов. На фиг. 8В показана кинетика
связывания для инкубации при 37°С по сравнению с инкубацией при 50°С.
На фиг. 9А-9С показано влияние протеолитического удаления дЗр на взаимодействие фага и амилоида. Протеазу Arg С использовали для отщепления дЗр от фага М13 (М13ДдЗр). На фиг. 9А представлены результаты исследования конкурентного связывания бета-амилоида с использованием фага М13ДдЗр по сравнению с нативным фагом (обработанным так же, как и АгдС-обработанный фаг, но без обработки протеазой) . На фиг. 9В показано влияние обработки Агд С на инфекционность фага М13ДдЗр по сравнению с нативным фагом. На фиг. 9С приведены результаты сравнения ArgC-обработанного фага с нативным фагом в исследовании дезагрегации.
На фиг. 10А и 10В представлены результаты исследования конкурентного связывания с использованием фрагмента N1-N2 белка дЗр, именуемого ниже рекомбинантный растворимый N1N2 (rs-g3p(NlN2); конструкция 3), М13ДдЗр (обработанный Агд С) и М13 в качестве конкурентов меченого М13, связывающегося с fA|342. На фиг. 10В приведены результаты повторного исследования конкурентного связывания.
На фиг. 11 приведены результаты исследования конкурентного связывания для фагов fd, IIHY, AAA и М13. Фаги fd, AAA и IIHY были предварительно активированы при 50°С в течение 1,5 часов, затем сравнивали способность активированных и неактивированных фагов fd, AAA и IIHY конкурировать с меченым М13 за связывание с бета-амилоидом в течение 45-минутной инкубации при 37°С.
На фиг. 12А показана схема rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) . На фиг. 12В представлен ионообменный профиль для rs-g3p(NlN2). На фиг. 12С приведены результаты исследования методом гель-фильтрации с использованием Сефакрил S-300 и rs-g3p(NlN2). На фиг. 12D приведены результаты вестерн-блоттинга rs-g3p(NlN2) вместе с контрольными белками дЗр и д8р. Фаг М13 разделяли на дорожках 1 и 2 в качестве положительного контроля и детектировали с помощью поликлонального антитела к М13, которое
детектирует g8p и дЗр. Очищенный rs-дЗр разделяли на дорожках 3 и 4 и детектировали с помощью того же поликлонального антитела к М13.
На фиг. 13 приведены результаты исследования методом SPR с использованием rs-g3p(NlN2) (конструкция 3). rs-g3p(NlN2) активно связывает fA|342 с KD приблизительно 180 нМ, но не связывает мономеры.
На фиг. 14 представлены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ для измерения уровня амилоида, присутствующего в данном образце. 10 мкМ мономера А|342 инкубировали в присутствии 5 концентраций rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) или без него при 37°С в течение 3 дней. Количество волокон, образованных в конце третьего дня, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. Величина ИК50 составляет примерно 2 0 нМ, это указывает на то, что rs-g3p(NlN2) активно ингибирует
образование волокон А|342. На фигуре также показано, что связывание зависит от дозы.
На фиг. 15А приведены результаты просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) после инкубации fA042 в присутствии или в отсутствие rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) . На фиг. 15В приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ, в котором А|342 и 2 мкМ rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) инкубировали при 37°С в течение 7 дней. Rs-g3p(NlN2) блокирует образование fA|342.
На фиг. 16 показано, что rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) активно ингибирует образование волокон а-синуклеина. ос-синуклеин в концентрации 2 5 мкМ агрегировали путем встряхивания при 300 оборотах в минуту в течение 4 дней при 37°С (см. столбик 1) . Второй столбик на графике представляет мономеры альфа-синуклеина плюс 1х10~13 пентамерного фага М13 после встряхивания при 37°С в течение 3 дней. Результаты, приведенные на столбике 2, показывают, что пентамерный М13 блокирует сборку волокон а-синуклеина. Третий столбик на графике представляет
мономеры альфа-синуклеина + 83 нМ мономеров rsg3p. Результаты, приведенные на столбике 3, показывают, что мономеры менее эффективно ингибируют образование волокон а-синуклеина, чем пентамерный М13. Столбик 4 представляет собой отрицательный контроль, показывающий количество мономеров альфа-синуклеина в нулевой момент времени. На столбике 5 показаны мономеры дЗр без волокон а-синуклеина, чтобы определить, происходит ли связывание дЗр с политиофенуксусной кислотой (рТАА) и секвестрирование красителя, которое препятствует его связыванию с волокнами. Результаты, приведенные на столбике 5, показывают, что дЗр не связывается с рТАА.
На фиг. 17 приведены результаты исследования конкурентного связывания для rs-g3p(NlN2) (конструкция 3), М13 (конструкция 2), гибридного белка rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 4) и отрицательного контроля IgG4-Fc.
На фиг. 18 приведены результаты исследования конкурентного связывания, в котором сравнивали М13 (конструкция 2; квадраты), rs-g3p(NlN2) (конструкция 3; треугольники), гибридный белок rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 4; перевернутые треугольники) и отрицательный контроль рекомбинантный lgG4-Fc (ромбы).
На фиг. 19 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнивали пять концентраций волокон А|342 плюс или минус две концентрации М13 (конструкция 2), 800 нМ rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) и три концентрации гибридного белка rs-g3p(N1N2)-higG4-Fc (конструкция 4).
На фиг. 2 0 приведены результаты исследования конкурентного связывания для rs-g3p(NlN2) (конструкция 3; "мономер") и конъюгированного со стрептавидином rs-g3p(NlN2) "SA [ g3pNlN2 ] n=2-4"; "SA-g3p"; "тетрамер"). Rs-g3p(NlN2) и SA-g3p сравнивали по их способности конкурировать с меченым М13 за связывание с бета-амилоидом в течение 3-часовой инкубации при 37°С.
На фиг. 21 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнивали пять концентраций волокон А|342 плюс или минус две концентрации rs-g3p(NlN2) (конструкция 3; "мономер") и две концентрации SA-g3p
("тетрамер").
На фиг. 22А и 22В приведены результаты исследования методом ПЭМ для fA|342 в нулевой момент времени (фиг. 22А) и через три дня после инкубации с SA-дЗр (фиг. 22В).
На фиг. 23 показана последовательность аминокислот одной конструкции rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc, "конструкции 4" (SEQ ID N0:9) . Участок N1N2 "конструкции 4" получен из участка N1N2 "конструкции 1" (SEQ ID N0:10).
На фиг. 24 показана последовательность аминокислот другой конструкции rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc, "конструкции 5" (SEQ ID N0:11). Участок N1N2 "конструкции 5" получен из участка N1N2 "конструкции 2" (SEQ ID N0:12).
На фиг. 25 показана последовательность аминокислот одной конструкции rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc, "конструкции 8" (SEQ ID N0:13). Участок N1N2 "конструкции б" получен из участка N1N2 "конструкции 2".
На фиг. 2 6 показано выравнивание аминокислотных последовательностей N2 из: fd (SEQ ID N0:14), fl (SEQ ID N0:15), M13 (SEQ ID N0:16), Ike (SEQ ID N0:17), 12-2 (SEQ ID N0:18) и Ifl (SEQ D N0:19). Звездочка "*" обозначает положения, которые имеют один полностью консервативный остаток. Двоеточие ":" указывает консервативный участок между группами с очень близкими свойствами, где показатель согласно матрице сравнения аминокислот РАМ2 50 по Тонне выше 0,5. Десятичная точка "." указывает на консервативный остаток между группами с очень незначительно совпадающими свойствами, где показатель согласно матрице сравнения аминокислот РАМ250 по Тонне равен или меньше 0,5.
На фиг. 2 7А схематично показана конструкция 5. На фиг. 2 7В показана последовательность ДНК части дЗр в конструкции 5 (SEQ ID N0:23). На фиг. 27С показана аминокислотная последовательность части дЗр в конструкции 5 (SEQ ID N0:24).
На фиг. 2 8 приведены результаты эксперимента по исследованию двух гибридных белков rs-g3p(N1N2)-IgG для определения их способности снижать уровень бета-амилоида в
трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 5) и rs-дЗр(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) значительно снижали уровень бета-амилоида в гиппокампе мышей, страдающих от болезни Альцгеймера.
На фиг. 2 9 приведены результаты эксперимента по исследованию двух гибридных белков rs-g3p(N1N2)-IgG для определения их способности снижать уровень бета-амилоида в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 5) и rs-дЗр(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) существенно снижали уровень бета-амилоида в коре головного мозга мышей, страдающих от болезни Альцгеймера.
На фиг. 30 показано ингибирование сборки А|342 при применении rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) . На фиг. ЗОА показаны результаты исследования конструкции в "нативном" агарозном геле, приготовленном без ДСН. Образцы разделяли в TEA буфере без ДСН и не кипятили. Результаты показывают, что конструкция б способна ингибировать сборку fA|342. На фиг. ЗОВ приведены результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ для оценки присутствия амилоида в образце. По 10 мкМ мономера А|342 инкубировали в присутствии 2-х концентрации гибридного белка rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) или без него при 37°С в течение 1 дня. Количество волокон, образовавшихся в конце первого дня, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) мощно ингибирует образование волокон А|342. На фигуре также показано, что ингибирование образования волокон под действием конструкции б зависит от дозы.
На фиг. 31 приведены репрезентативные результаты исследования методом кругового дихроизма, показывающие, что rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) ингибирует сборку А|342. Используя метод кругового дихроизма оценивают содержание а-спиралей и |3-листов в волокнах бета-амилоида. На фиг. 31 показана зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для А|342 при Т=0, Т=24 часа и Т=48 часов. На фиг. 31В показана
зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для А|342 + конструкция 3 при Т=0, Т=24 часа и Т=48 часов. На фиг. 31С приведены репрезентативные результаты флуоресцентного анализа с использованием ТФТ, где количество волокон, образованных в период между 2 4 и 4 8 часами, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции связанного ТФТ. Конструкция 3 мощно ингибирует образование волокон А|342. На фиг. 31D показана зависимость коэффициента эллиптичности от длины волны для конструкции 3 при Т=0, Т=24 часа и Т=48 часов. В совокупности эти данные подтверждают способность конструкции 3 ингибировать сборку А|342.
На фиг. 32 приведены репрезентативные данные, показывающие, что М13 (конструкция 2) и rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc
(конструкция б) блокируют олигомер-индуцированную токсичность клеток N2a. См., например, Stine et al. (2003) J. Biol. Chem. 278(13): 11612-11622 и Stine et al. (2011) Erik D. Roberson
(ed.) Alzheimer's Disease and Frontotemporal Dementia, Methods in Molecular Biology, vol. 670: 13-32. Клетки линии N2a дифференцировали с помощью сывороточного голодания в течение 4 8 часов перед обработкой. Олигомеры А|342 (2 мкМ) предварительно инкубировали с конструкцией 2 и конструкцией 6 при 37°С в течение 3 ч перед добавлением к клеткам N2a. Комплексы в нулевой момент времени ("ТО") не подвергали предварительной инкубации. После 2 4 часов инкубации контролировали высвобождение аденилаткиназы ("АК"). Высвобождение АК в среду указывает на гибель/лизис клеток. Олигомеры А|342 получали, как описано в Stine et.al., 2011. Результаты показывают, что М13 и rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc являются мощными ингибиторами токсичных олигомеров.
На фиг. 33 приведены результаты исследования методом ловушки на фильтре, в котором сравнивали шесть концентраций волокон А|342 плюс или минус 1х1012/мл М13 (конструкция 2); 80 нМ и 800 нМ конструкции rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 5); и 80 нМ и 800 нМ rs-дЗр (N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция 6) . Волокна А|342 инкубировали с конструкциями 2, 5 и б при 37°С в течение 3
дней, с последующим удержанием на фильтре. Фильтр детектировали с помощью моноклонального антитела (мАт) 6Е10 (1: 15000), которое распознает волокна А|342, захваченные на фильтре. 800 нМ конструкции 5 или конструкции б соответствуют 5х1014/мл конструкции 2 по количеству моль молекул. Результаты показывают, что конструкции 2, 5 и 8 вызывают активную дезагрегацию волокон бета-амилоида.
На фиг. 34А и 34В приведены репрезентативные результаты исследований, использованных для измерения количества М13 (конструкция 2), связанного с fA|342 после 3 часов инкубации с фибриллярным тау-белком (ftau) . 5 мкМ мономера А|342, связанных с конструкцией 2, инкубировали в присутствии 4-х концентраций фибриллярного тау-белка или без него при 37°С в течение 3 часов. Поскольку комплекс fA|3:M13-Alexa488 осаждается, а комплекс фибриллярный тау-белок:М13-А1еха488 не осаждается, оценка потери флуоресценции из осажденного материала указывает на то, что фибриллярный тау-белок конкурирует за связывание с
f AJ3. В настоящей заявке количество M13-fA|3, образующегося в конце 3-го часа, измеряли путем количественной оценки интенсивности флуоресценции А1еха4 8 8 в реакции конкурентного связывания в осадке. Результаты показывают, что фибриллярный тау-белок способен конкурировать с М13-А1еха488 (конструкция 2) за связывание с fA|342.
На фиг. 35 приведены репрезентативные результаты одного исследования методом SPR способности rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc
(конструкция 4) связываться с фибриллярным тау-белком. Результаты показывают, что конструкция 4 активно связывает фибриллярный тау-белок.
На фиг. 36 показана способность rs-дЗр(N1N2)-hlgGl-Fc
(конструкция б) дезагрегировать фибриллярный тау-белок. Волокна тау-белка готовили путем разбавления 4 0 мкМ повторяющегося участка связывания с микротрубочками ("MTBR") тау-белка в растворе 50 мМ супероксиддисмутазы ("СОД"). Различные концентрации конструкции б и приготовленного фибриллярного тау
белка инкубировали в ацетатном буфере при рН 7,0, 37°С в
течение 72 часов. Флуоресценцию ТФТ регистрировали в
присутствии 5-кратного избытка ТФТ. На фиг. ЗбА приведены
результаты репрезентативного флуоресцентного анализа с
использованием ТФТ, демонстрирующие, что конструкция б способна
дезагрегировать фибриллярный тау-белок. На фиг. ЗбВ приведены
результаты другого репрезентативного эксперимента,
подтверждающего способность конструкции б дезагрегировать волокна тау-белка. Фиг. 3 8А и ЗбВ также показывают, что дезагрегация фибриллярного тау-белка под действием конструкции б зависит от дозы.
На фиг. 37 приведены результаты репрезентативных
экспериментов, показывающие, что rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc
(конструкция б) и rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) ингибируют агрегацию бета-амилоида с течением времени. А|342 растворяли в ДМСО и разводили в ФСБ, содержащем NaN3. А|342 агрегировал при 37°С в присутствии различных концентраций конструкции 3 и конструкции б или без них. Агрегацию А|342 оценивали по изменению интенсивности флуоресценции ТФТ. На фиг. 37А приведены результаты исследования образцов методом электрофореза в ДСН-ПААГ. На фиг. 37В приведены результаты одного репрезентативного эксперимента. На фиг. 37С приведены результаты другого репрезентативного эксперимента. На фиг. 37D приведены обобщенные результаты.
На фиг. 38А и фиг. 38В представлены результаты экспериментов, показывающих способность rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc
(конструкция б) блокировать превращение РгР в PrPSc. Лизаты
клеток, обработанных конструкцией б и IgG, подвергали
ультрацентрифугированию, чтобы отделить растворимые
(супернатант) и нерастворимые (осадок) молекулы РгР. Молекулы РгР визуализировали биохимическим способом с применением моноклонального антитела к РгР (6D11). В присутствии IgG существует разделение РгР на растворимую и нерастворимую фракции. В присутствии конструкции б имеется ограниченное количество нерастворимого РгР. Данные представлены для п=4.
На фиг. 39А и фиг. 39В представлены результаты
экспериментов, показывающих способность rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc
(конструкция б) уменьшать накопление и агрегацию PrPSc в
культуральной клеточной модели прионного заболевания. На фиг.
39А приведены результаты биохимического разделения
нерасщепленных и ПК-расщепленных лизатов клеток N2a22LSc после
обработки конструкцией б и IgG. Значительное снижение уровня
PrPSc отчетливо наблюдается в клетках, обработанных
увеличивающимися концентрациями конструкции б. Снижение уровня
PrPSc примерно на 50% достигается при обработке конструкцией б в
концентрации приблизительно 0,08 мкг/мл. Обработка конструкцией
б в концентрации приблизительно 10 мкг/мл снижает уровень PrPSc
до 5,725%, р <0,0001. Не наблюдали заметных изменений уровня
PrPSc в клетках N2A22LSc, обработанных 1 мкг/мл мышиного IgG.
Для получения данных, приведенных на фиг. 39В, рентгеновские
пленки были затем оцифрованы и изначально нормированы на
величину эффекта в IgG-обработанных клетках N2a22LSc из того же
пассажа, который принимали равным 100%. Данные
денситометрического исследования, полученные из графиков для обработанных протеиназой К клеток, затем сравнивали с данными, приведенными на графиках для необработанных лизатов, и выражали в виде процентного изменения PrPSc/PrPc. Данные представлены для п=4 .
ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ РЕАЛИЗАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение частично основано на обнаружении автором изобретения посреднической роли белка гена 3 ("дЗр", также известного как "рЗ" или "рШ") в связывания амилоида и дезагрегации амилоидных агрегатов. Настоящее изобретение также основано на определении автором изобретения минимальной последовательности дЗр, необходимой для связывания с амилоидом.
Таким образом, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложены молекулы, в частности полипептиды, которые содержат минимальную консенсусную последовательность, связывающую амилоид, которая получена из дЗр. Согласно одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы являются растворимыми. Согласно другому аспекту
указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы дезагрегируют и/или предотвращают агрегацию амилоида (например, амилоидных бляшек). Согласно другому аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы представляют собой гибридные белки. Согласно более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы гибридных белков дополнительно содержат аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина. Согласно еще более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекулы гибридных белков дополнительно содержат аминокислотную последовательность цепи иммуноглобулина G (например, IgG) или иммуноглобулина М (например, IgM). Согласно еще одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула включает домен N2 белка дЗр. Согласно более конкретному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула содержит домен N1-N2 белка дЗр. Согласно еще одному аспекту указанных вариантов реализации настоящего изобретения молекула содержит полноразмерный белок дЗр. Согласно еще одному аспекту молекула представляет собой полипептид, который является фрагментом, мутантом или вариантом любого из вышеперечисленных.
Согласно другим аспектам настоящего изобретения предложены молекулы, которые связываются с TolA, такие как ингибирующие TolA молекулы, в частности полипептиды, которые содержат минимальную консенсусную последовательность, связывающую амилоид. TolA-связывающие молекулы и/или ингибиторы TolA согласно настоящему изобретению связывают, деполимеризуют, предотвращают агрегацию и дезагрегируют амилоид. TolA-связывающие молекулы и/или TolA-ингибирующие молекулы включают гибридные белки. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения TolA-связывающая молекула и/или TolA-ингибирующая молекула представляет собой колицин или амилоид связывающий фрагмент колицина. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения колицин представляет собой колицин группы А. См. , например, Cascales et al., Microbiol. Mol. Biol. Rev. (2007) 71(1) : 158-229. TolA-связывающие молекулы и TolA-ингибирующие
молекулы согласно настоящему изобретению пригодны в качестве терапевтических средств для уменьшения амилоидной нагрузки, связанной с заболеваниями, такими как системные и периферические амилоидозы, нейродегенеративные заболевания, включая нейродегенеративные таупатии и трансмиссивные губчатые энцефалопатии (заболевания, ассоциированные с прионами). Также в область настоящего изобретения включено применение указанных композиций для предотвращения накопления амилоидной нагрузки, связанной с этими заболеваниями, и применение указанных композиций в качестве диагностических средств для обнаружения амилоида и, таким образом, диагностики таких заболеваний.
Согласно другому варианту изобретение относится к нитевидным бактериофагам, которые были модифицированы для гиперэкспрессии белка дЗр по сравнению с фагами дикого типа, экспрессии амилоид связывающего фрагмента дЗр, амилоид связывающего мутанта или варианта дЗр, или амилоид связывающего гибридного белка, содержащего дЗр.
В настоящем изобретении предложены композиции веществ и/или фармацевтические композиции любых из вышеуказанных молекул или бактериофагов, а также их применение для связывания, дезагрегации и предотвращения агрегации амилоида, и их применение для детектирования амилоидных отложений и диагностики заболеваний и расстройств, характеризующихся накоплением амилоида.
Определения
Термин "дЗр" при использовании отдельно или в терминах, таких как "полученный из дЗр", относится к любому белку дЗр нитевидных фагов как дикого типа, так и рекомбинантных фагов (включая фрагменты, варианты и мутантов дЗр). Термин не должен быть истолкован как относящийся только к дЗр какого-либо конкретного нитевидного бактериофага. В качестве примера, термин "дЗр" включает SEQ ID N0:1 и родственные белки, показанные на фиг. 2.
Термин "нитевидный бактериофаг" включает как нитевидный бактериофаг дикого типа, так и рекомбинантный нитевидный бактериофаг. В настоящей заявке "нитевидный бактериофаг" может
также упоминаться как "бактериофаг", "фаг" или "М13".
В настоящей заявке термин "нитевидный бактериофаг дикого типа" относится к нитевидным фагам, обнаруживаемым в природе, нитевидным фагам, которые были указаны как фаги "дикого типа" в любой базе данных нуклеотидных или аминокислотных последовательностей, нитевидным бактериофагам, которые являются коммерчески доступными и характеризуются как фаги "дикого типа" и нитевидным бактериофагам, которые приобрели нерекомбинантные мутации относительно любой из вышеперечисленных мутаций посредством перепассирования.
Термин "домен" означает область полипептида (включая белки), имеющую некоторые отличительные физические особенности или роль, включая, например, независимо свернутую структуру, состоящую из одной части полипептидной цепи. Домен может содержать последовательность с отличительной физической особенностью полипептида или он может содержать фрагмент последовательности с отличительной физической особенностью, который сохраняет свои характеристики связывания (т.е., он может связываться со вторым доменом). Домен может быть связан с другим доменом. Другими словами, первый домен может в природных условиях связываться со вторым доменом. Например, домен N2 белка дЗр связывает F-фимбрии, а домен N1 белка дЗр связывает TolA.
В настоящей заявке термины "амилоид", "амилоидные фибриллы" и "амилоидные волокна" представляют собой общие термины для третичной структуры, которая образуется путем агрегации любого из нескольких различных белков и состоит из упорядоченно расположенных р-листов, которые уложены перпендикулярно оси волокна. Sunde et al., J. Mol. Biol. (1997) 273:72 9-39. Один типичный пример амилоида представляет собой агрегаты бета-амилоида, образующиеся при болезни Альцгеймера, которые состоят из бета-амилоидного пептида "РА", содержащего внутренние фрагменты из 3 9-43 аминокислот, образующиеся при расщеплении белка-предшественника амилоида человека (пАРР). Существуют короткие формы, такие как АР4 0, и длинные формы,
такие как более фибриллогенная изоформа бета-амилоида, А|342. Другие примеры амилоидных белков включают неправильно свернутый а-синуклеин (связанный с болезнью Паркинсона), хантингтин (связанный с болезнью Хантингтона), тау-белок (связанный с болезнью Альцгеймера), а также аномальную конформацию прионного белка PrPSc. Дополнительные примеры приведены в настоящем описании и известны специалистам в данной области (см., например, Aguzzi (2010) и Eichner and Radford, Mol. Cell (2011) 43:8-18) . Таким образом, если белок или пептид не указан, использование терминов "амилоид", "амилоидные фибриллы" или "амилоидные волокна" не следует истолковывать как ограниченные каким-либо конкретным белком или заболеванием.
Термин "бета-амилоидный пептид" является синонимом <ф-
амилоидного пептида", <фАР", <фА" и "бета-амилоида". Эти термины относятся к образующему амилоид пептиду, который происходит из белка-предшественника амилоида человека (пАРР).
Фаг, белок, гибридный белок, домен гибридного белка, или мутант, фрагмент или вариант вышеуказанного, который "связывает фибриллы амилоида" или который является "амилоид связывающим" представляет собой такой белок, который является положительным в исследовании связывания амилоида. Связывание амилоида можно детектировать в условиях in vitro с помощью исследования прямого связывания, например, методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR), в этом случае амилоидсвязывающий продукт в целом связывает амилоид с Kd по меньшей мере 10~8 М, 10~9 М, 10~10 М или Ю-11 М. В другом случае, связывание амилоида можно детектировать с помощью исследования связывания fA|342, описанного в примерах. Амилоид связывающие фрагменты, варианты и мутанты дЗр также могут быть идентифицированы по их совместной локализации с амилоидом при введении в трансгенную мышиную модель любого заболевания, связанного с неправильным сворачиванием белков.
Любые из продуктов или композиций согласно настоящему изобретению, которые описаны как "дезагрегирующие" или "опосредующие дезагрегацию", снижают уровень агрегатов, которые
уже образованы. Дезагрегацию можно измерить с помощью метода ловушки на фильтре. Wanker et al. , Methods Enzymol (1999) 309:375-8 6. Исследование методом ловушки на фильтре описано в настоящей заявке, и может быть использовано как для детектирования агрегатов, так и для контроля дезагрегации, опосредованной композициями согласно изобретению. Дезагрегацию детектируют как снижение удержания амилоида на фильтре, на что указывает уменьшение окрашивания в присутствии возрастающих концентраций дезагрегирующего агента.
В настоящей заявке композиция, которая "снижает уровень амилоида", обладает одним или более из следующих видов активности: ингибирует образование амилоида, вызывает дезагрегацию амилоида, способствует клиренсу амилоида, ингибирует агрегацию амилоида, блокирует и/или предотвращает образование токсичных амилоидных олигомеров, и/или способствует клиренсу токсичных амилоидных олигомеров.
Любые продукты или композиции согласно настоящему изобретению, описанные как "защищающие нейроны от повреждения амилоидом", предотвращают накопление нового амилоида и/или предотвращают образование токсичных амилоидных олигомеров. Продукты или композиции согласно настоящему изобретению, описанные как "защищающие нейроны от повреждения амилоидом", можно принимать в профилактических целях. Наличие защитного действия продукта или композиции на нейроны от повреждения амилоидом можно измерить с помощью исследования цитотоксичности в нейрональной клеточной культуре, описанного в настоящей заявке.
В настоящей заявке термины "белок РгР", "РгР" и "прион" относятся к полипептидам, которые способны при определенных условиях индуцировать образование агрегатов, приводящих к развитию заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков. Например, нормальный клеточный прионный белок (РгРс) превращается в таких условиях в соответствующую скрейпи-изоформу (PrPSc) , которая участвует в патогенезе заболеваний, таких как, но не ограничиваясь указанными, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (ГЭКРС) , или коровье
бешенство, губчатая энцефалопатия кошек, куру, болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (GSS) и фатальная семейная бессонница (FFI).
В настоящей заявке термин "вариант" в сочетании с термином
бактериофаг, белок, полипептид или аминокислотная
последовательность (например, вариант дЗр или вариант амилоидсвязывающего фрагмента дЗр) относится к соответствующему веществу, которое содержит по меньшей мере один отличающийся аминокислотный остаток (замена, вставка или делеция) по сравнению с эталонным веществом. В некоторых вариантах реализации "вариант" имеет высокую степень гомологии аминокислотных последовательностей и/или консервативные аминокислотные замены, делеции и/или инсерции по сравнению с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации вариант имеет не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам в сравнении с эталонной последовательностью. "Консервативная замена" относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, которая существенно не изменяет химических, физических и/или функциональных свойств белка дЗр или амилоидсвязывающего фрагмента дЗр (например, белок дЗр или его амилоидсвязывающий фрагмент сохраняет тот же заряд, структуру, полярность, гидрофобность/гидрофильность и/или сохраняет функции, такие как способность распознавать, связывать и/или снижать уровень амилоида). Такие консервативные аминокислотные модификации основаны на относительном сходстве заместителей боковой цепи аминокислот, например, их гидрофобности, гидрофильности, заряде, размере и т.п. Примеры консервативных замен, в которых учитываются различные характеристики из перечисленных выше, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают: аргинин и лизин; глутамат и аспартат; серии и треонин; глютамин и аспарагин; и валин, лейцин и изолейцин.
Термин "мутант" (например, "мутант дЗр" или "мутант фрагмента, связывающего амилоид") относится к белку, который является мутированным по одному или более аминокислотным
остаткам для модуляции его терапевтической или диагностической эффективности. В некоторых вариантах мутант содержит замену, делецию и/или вставку аминокислотного остатка, который, как известно, взаимодействует с амилоидом. В других вариантах реализации мутант содержит замену, делецию и/или вставку аминокислотного остатка, который является консервативным аминокислотным остатком, присутствующим в дЗр дикого типа или его амилоид связывающем фрагменте. В некоторых вариантах реализации мутант имеет не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам в сравнении с эталонной последовательностью. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения аминокислотные замены являются консервативными заменами. Термины "вариант" и "мутант" используются в настоящей заявке взаимозаменяемо, за исключением того, что "вариант", как правило, является нерекомбинантным в природных условиях, в то время как "мутант", как правило, является рекомбинантным.
В настоящей заявке термин "жесткие условия" включает условия, которые могут быть легко определены специалистом в данной области техники на основе, например, длины ДНК. В целом такие условия определены в работе Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), и включают использование раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5xSSC, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), проведение гибридизации в 50% формамиде, 6xSSC при 42°С (или другом аналогичном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, 50% формамид при 42°С) , и промывку при температуре приблизительно 68°С, 0,2xSSC, 0,1% ДСН. Специалисту в данной области техники будет понятно, что температуру и концентрацию соли в промывочном растворе при необходимости можно регулировать в зависимости от факторов, таких как длина зонда.
В настоящей заявке термин "умеренные условия" включает условия, которые могут быть легко определены специалистом с обычной квалификацией в данной области техники на основе,
например, длины ДНК. Основные условия изложены в работе Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed. Vol. 1, pp. 1.101-104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) вше, и включают использование раствора для предварительной промывки нитроцеллюлозных фильтров 5xSSC, 0,5% ДСН, 1,0 мМ ЭДТА (рН 8,0), гибридизации в 50% формамиде, 6xSSC при 42°С (или другом аналогичном растворе для гибридизации, таком как раствор Старка, 50% формамид при 42°С) и промывку при температуре 60°С, 0,5xSSC, 0,1% ДСН.
Термин "высокая гомологичность последовательностей" означает по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 9 6%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологичность аминокислотной последовательности с эталонной последовательностью, измеренную с использованием известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit.
"Гибридный белок" представляет собой неприродный белок, содержащий по меньшей мере два полипептидных домена.
"Гибридный белок дЗр" включает белок дЗр, связанный со вторым доменом.
"Гибридный белок Nl-N2" (также называемый "гибридный белок N1N2") включает домены N1 и N2 (или мутантов, фрагменты или варианты любого домена), но не домен N3/CT, белка дЗр, связанного со вторым доменом. Гибридный белок N1N2 может содержать шарнирную область или не содержать ее.
"Гибридный белок N2" включает домен N2 (или мутантов, фрагменты или варианты N2), но не содержит домены N1 или N3/CT, белка дЗр, связанного со вторым доменом. Гибридный белок N2 может содержать шарнирную область или не содержать ее.
В настоящей заявке "конструкция 1" получена из М13 дикого типа (см., Genbank file: NC_003287.2, версия GL56718463). В конструкции 1, по сравнению с М13 дикого типа, Ser378 (AGC) заменен на Gly(GGC), и Ile87 (АТТ) заменен на Asn(AAC).
Конструкция 1 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0:10.
"Конструкция 2" представляет собой изолят М13 дикого типа (GenBank JX412 914.1). Конструкция 2 содержит аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0:12.
"Конструкция 3" представляет собой рекомбинантный растворимый фрагмент дЗр, включающий домены N1 и N2 белка дЗр (rs-дЗр(N1N2)), содержащий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID N0:20.
"Конструкция 4" представляет собой гибридный белок,
содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент дЗр и IgG4 Fc
(rs-дЗр(N1N2)-hIgG4-Fc), содержащий аминокислотную
последовательность, приведенную в SEQ ID N0:9. Участок N1N2 "конструкции 4" получен из участка N1N2 "конструкции 1".
"Конструкция 5" представляет собой гибридный белок,
содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент дЗр и IgG4 Fc
(rs-дЗр(N1N2)-hIgG4-Fc), содержащий аминокислотную
последовательность, приведенную в SEQ ID N0:1. Участок N1N2 "конструкции 5" получен из участка N1N2 "конструкции 2".
"Конструкция б" представляет собой гибридный белок,
содержащий рекомбинантный растворимый фрагмент дЗр и IgGl Fc
(rs-дЗр(N1N2)-hlgGl-Fc), содержащий аминокислотную
последовательность, приведенную в SEQ ID N0:13. Участок N1N2 "конструкции б" получен из участка N1N2 "конструкции 2".
Источники дЗр
Нитевидные бактериофаги представляют собой группу родственных вирусов, которые заражают грамотрицательные бактерии, такие как, например, Е. coli. См., например, Rasched and Oberer, Microbiology Reviews (1986) Dec:401-427. Примеры нитевидных бактериофагов, включают, но не ограничиваются указанными, фаги семейства Ff (т.е. по меньшей мере М13, fl и fd) и фаги из I-семейства (т.е. по меньшей мере 122, Ike и Ifl) .
Все природные нитевидные бактериофаги содержат белок дЗр, который является минорным белком оболочки, присутствующим в 3-5 копиях в одном фаге. Таким образом, согласно одному аспекту
настоящего изобретения выделенный белок дЗр получают из любого природного нитевидного бактериофага. Также могут быть получены рекомбинантные формы белка дЗр. Рекомбинантный дЗр может соответствовать дЗр дикого типа из любого природного нитевидного бактериофага. Таким образом, рекомбинантный, выделенный белок дЗр также включен в объем настоящего изобретения.
ОДИН пример дЗр из фага М13 представлен в SEQ ID N0:1. Если иное конкретно не указано, то все описанные мутации дЗр приведены по отношению к SEQ ID N0:1, представленной ниже в очевидной и аннотированной форме:
1 AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVWCTGDE TQCYGTWVPI
61 GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN
121 PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY
181 WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE
241 GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID
301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNN FRQYLPSLPQ SVECRPFVFS
361 AGKPYEFSID CDKINLFRGV FAFLLYVATF MYVFSTFANI LRNKES Аннотированная SEQ ID NO:1
1 AETVESCLAK PHTENSFTNV WKDDKTLDRY ANYEGCLWNA TGVWCTGDE TQCYGTWVPI
61 GLAIPENEGG GSEGGGSEGG GSEGGGTKPP EYGDTPIPGY TYINPLDGTY PPGTEQNPAN
121 PNPSLEESQP LNTFMFQNNR FRNRQGALTV YTGTVTQGTD PVKTYYQYTP VSSKAMYDAY
181 WNGKFRDCAF HSGFNEDPFV CEYQGQSSDL PQPPVNAGGG SGGGSGGGSE GGGSEGGGSE
241 GGGSEGGGSG GGSGSGDFDY EKMANANKGA MTENADENAL QSDAKGKLDS VATDYGAAID
301 GFIGDVSGLA NGNGATGDFA GSNSQMAQVG DGDNSPLMNN FRQYLPSLPQ
Последовательность SEQ ID N0:1 соответствует GenBank NP-510891.1 с удаленным 18-аминокислотным сигнальным пептидом, следовательно, нумерация аминокислот приведена для зрелого дЗр. Сигнальный пептид обычно включен в любую конструкцию для экспрессии, и незрелый дЗр, который содержит сигнальный пептид, включен в объем различных вариантов реализации настоящего изобретения, если из контекста очевидно не следует, что он исключен. Последовательность SEQ ID N0:1 приведена только в качестве эталонной последовательности. Она никоим образом не ограничивает сущность и объем настоящего изобретения.
Известны последовательности дЗр из нескольких источников. Примеры аминокислотных последовательностей дЗр для бактериофага семейства Ff включают последовательности, найденные в UniProt под номерами доступа Р69169 (фаг fl), Р03681 (фага fd) и Р69168 (фаг М13) . Примеры аминокислотных последовательностей дЗр для бактериофага I-семейства включают Р15415 (фаг 122), Р03663 (фаг Ike) и 08 02 97 (фаг Ifl). Примеры выравнивания нескольких последовательностей дЗр представлены на фиг. 2.
G3p, который можно применять согласно настоящему изобретению, также включает фрагменты, мутантов и/или варианты дЗр. Мутанты или варианты могут быть описаны со ссылкой на полноразмерный дЗр или со ссылкой на фрагмент дЗр. Любой
полноразмерный дЗр или его фрагмент, включая его мутантов и/или варианты, которые сохраняют способность связываться с амилоидом, независимо от их способности дезагрегировать амилоид, находятся в пределах объема настоящего изобретения. Любой белок, "содержащий" такой дЗрО также находится в пределах объема настоящего изобретения. Кроме того, белки "включающие", "состоящие из", "состоящие по существу из" или "имеющие" такие дЗр также включены в область настоящего изобретения.
Фрагменты дЗр, связывающие и дезагрегирующие амилоид Как уже упоминалось, дЗр имеет два N-концевых домена, N1 и N2, которые взаимодействуют с образованием комплекса N1-N2, и один С-концевой домен, N3 (также называемый "СТ"). В фаге Ff домен N1 содержит остатки 1-67 и домен N2 содержит остатки 87217 зрелого дЗр. Остатки 87-123 образуют шарнирную область, которая обеспечивает открытие и закрытие между N1 и N2. Иногда шарнирная область считается частью N2, тогда как в других случаях она рассматривается как отдельный элемент. N1 и N2 также связаны гибкой линкерной последовательностью, богатой глицином. В N1 имеются два дисульфидных мостика между Cys7 и Cys3 6 и между Cys4 6 и Cys53. В N2 существует один дисульфидный мостик между Cysl88 и Cys201. Домен N3/CT содержит остатки с 257 по 406. Hollinger, 1999; Marvin, 1998. В карбоксиконцевом домене имеется дисульфидный мостик между Cys354 и Cys371. Marvin, 1998. В дЗр отсутствуют междоменные дисульфидные мостики.
Неограничивающие примеры амилоид связывающих фрагментов дЗр включают домен N2 как с шарнирной областью (например, по меньшей мере остатки 87-217 в SEQ ID N0:1), так и без шарнирной области (например, по меньшей мере остатки 124-217 в SEQ ID N0:1); и домены N1-N2 (например, по меньшей мере остатки 1-67 и 87-217 в SEQ ID N0:1), с промежуточной линкерной последовательностью или без нее (например, включая или не включая остатки 68-86 в SEQ ID N0:1), и с шарнирной областью или без нее. В любом из вышеприведенных примеров N2 или фрагменты N1N2 могут представлять собой N2 или N1, обнаруживаемые в нитевидном бактериофаге дикого типа, или
рекомбинантные N2 или N1N2. В любом из вышеуказанных примеров N2 или фрагменты N1N2 могут представлять собой мутантов или варианты последовательности нитевидного бактериофага дикого типа.
Пригодные амилоид связывающие фрагменты дЗр включают любой фрагмент дЗр, в том числе N2 и фрагменты N1N2, которые сохраняют способность связываться с амилоидом, независимо от способности фрагмента дезагрегировать амилоид. Любой белок, "содержащий" такой амилоидсвязывающий фрагмент (или мутант или вариант), включен в область настоящего изобретения. Аналогичным образом, белки "включающие", "состоящие из", "состоящие по существу из" или "имеющие" фрагмент или вариант дЗр также включены в область настоящего изобретения.
Мутанты и варианты N2 и полипептида N2
Выравнивание первичных структур N2 из fd, fl, М13, Ike, 12-2 и Ifl показано на фиг. 26. Аминокислотная последовательность fd приведена в SEQ ID N0:14; аминокислотная последовательность fl приведена в SEQ ID N0:15; аминокислотная последовательность М13 приведена в SEQ ID N0:18; аминокислотная последовательность Ike приведена в SEQ ID N0:17; аминокислотная последовательность 12-2 приведена в SEQ ID N0:18; и аминокислотная последовательность IF1 приведена в SEQ ID N0:19. Используя эту фигуру и выравнивание в качестве руководства, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид N2, мутанты полипептида N2 и варианты полипептида N2, содержащие аминокислотные последовательности, приведенные в SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19, включая любые их амилоидсвязывающие фрагменты.
В других вариантах реализации настоящего изобретения полипептид N2 представляет собой мутанта или вариант полипептида N2, который сохраняет способность связываться с амилоидом и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19. На фиг. 26 звездочка "*"
указывает положения, которые имеют один, полностью консервативный остаток. Двоеточие ":" указывает на консервативность между группами с очень близкими свойствами, для которых показатель согласно матрице РАМ 250 по Гонне выше 0,5. Десятичная точка "." указывает на консервативность между группами с незначительно близкими свойствами, для которых показатель согласно матрице РАМ 250 по Гонне равен или меньше 0,5. Согласно некоторым аспектам указанных вариантов реализации настоящего изобретения мутант или вариант полипептида N2 не имеет различий по аминокислотным остаткам в любом положении, обозначенном "*" на фиг. 26. Согласно более конкретным аспектам мутант или вариант полипептида N2 не имеет различий по аминокислотным остаткам в любом положении, обозначенном "*" и содержит ту же аминокислоту, что и по меньшей мере одна аминокислота в последовательностях SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19 в каждом положении, указанном с помощью ":" на фиг. 26. Согласно еще более конкретным аспектам мутант или вариант полипептида N2 не содержит различий по аминокислотным остаткам в любом положении, указанном с помощью "*" и содержит ту же аминокислоту, что и по меньшей мере одна аминокислота в последовательностях SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19 в каждом положении, указанном с помощью ":" и каждом положении, указанном с помощью "." на фиг. 26.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N2 описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с последовательностями SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19, снова с оговоркой, что вариант полипептида N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 обладает по меньшей мере 7 0%, по меньшей мере
эталонных последовательностей, приведенных в SEQ ID N0:14, 15, 16, 17, 18 или 19.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с участком N2 в SEQ ID N0:1, снова с оговоркой, что вариант полипептида N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N2 обладает по
меньшей
мере
70%,
меньшей
мере
80%,
меньшей
мере
85%,
меньшей
мере
86%,
меньшей
мере
87%,
меньшей
мере
8 8%,
меньшей
мере
89%,
меньшей
мере
90%,
меньшей
мере
91%,
меньшей
мере
92%,
меньшей
мере
93%,
меньшей
мере
94%,
меньшей
мере
95%,
меньшей
мере
96%,
меньшей
мере
97%,
меньшей
мере
о о
или по
меньшей
мере 99%
идентичностью
аминокислотной последовательности с последовательностью участка N2 в SEQ ID N0:1.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N2 описан с указанием вторичной или третичной структуры. Известно, что домены fd-N2 и Ifl-N2 используют гомологичные части их поверхностей для связывания с одним и тем же сайтом на F-фимбриях в E.coli. Lorenz et al., J Mol Biol. 405:989-1003 (2011), например, на стр. 990. Аминокислотные остатки, а также вторичная и третичная структуры, которые опосредуют связывание N2 с F-фимбриями, также являются посредниками связывания N2 с амилоидом. Таким образом, аминокислотные остатки, а также вторичная и третичная структуры, которые имеют решающее значение для связывания N2 с F-фимбриями, также имеют большое значение для связывания N2 с амилоидом. Варианты полипептида N2, содержащего аминокислоты, которые необходимы для поддержания вторичной и третичной структуры в участке связывания N2 с F-фимбриями, включены в объем настоящего изобретения.
Мутанты и варианты N1N2 и полипептида N1N2
Выравнивание первичной структуры fd, fl и М13 показано на фиг. 2А, и выравнивание первичной структуры Ike, 12-2 и Ifl приведено на фиг. 2В. Используя это выравнивание в качестве
руководства, согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен полипептид N1N2, мутант полипептида или вариант полипептида, содержащий аминокислоты, которые являются консервативными между fd, fl и М13 или между 12-2, Ide и Ifl, как указано со ссылкой на последовательности на фиг. 2. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N1N2 представляет собой мутанта или вариант полипептида N1N2, который сохраняет свою способность связываться с амилоидом и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с аминокислотной последовательностью любой из SEQ ID N0:1, 2, 3, 5 или б.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения полипептид N1N2, мутант или вариант описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с участком N1N2 в SEQ ID N0:1, снова с оговоркой, что вариант полипептида N1N2 связывает амилоид. Согласно этим вариантам реализации настоящего изобретения вариант полипептида N1N2 обладает по меньшей мере 7 0%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 86%, по меньшей мере 87%, по меньшей мере 8 8%, по меньшей мере 8 9%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с последовательностями участков N1 и N2 в SEQ ID N0:1.
Гибридные белки
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены
гибридные белки. Гибридный белок содержит дЗр, амилоид
связывающий фрагмент дЗр, TolA-связывающую молекулу или
ингибитор TolA. Гибридные белки, содержащие мутант или вариант
дЗр или фрагменты дЗр, полностью включены в область настоящего
изобретения. Гибридный белок связан, гибридизован,
конъюгирован, соединен или ассоциирован по меньшей мере с одним дополнительным белком или доменом белка, с которым он обычно не
связан. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок дЗр, который содержит белок дЗр, связанный со вторым доменом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой амилоид связывающий фрагмент белка дЗр, связанного со вторым доменом. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок N1N2, который содержит домены N1 и N2, но не домен СТ, белка дЗр. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения гибридный белок представляет собой гибридный белок N2, который включает домен N2, но не домены N1 и СТ, белка дЗр. Как уже отмечалось, некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к мутированному или модифицированному белку дЗр или его амилоид связывающим фрагментам, а также к мутированным или модифицированным доменам N1N2 или N2, которые связывают амилоидные волокна. Таким образом, гибридные белки, содержащие эти мутированные или модифицированные формы, также включены в область настоящего изобретения.
Белок дЗр или амилоид связывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка могут представлять собой часть непрерывной аминокислотной последовательности, в которой полипептидный партнер гибридного белка присоединен непосредственно или через короткий пептидный линкер к N-концу или С-концу белка дЗр или амилоид связывающего полипептидного фрагмента. В таких случаях дЗр или его амилоид связывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка могут транслироваться в виде отдельного полипептида с кодирующей последовательности, которая кодирует как дЗр, так и его амилоид связывающий фрагмент и полипептидный партнер гибридного белка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит константную область иммуноглобулина в качестве второго домена. Гибридные белки, содержащие константные области иммуноглобулина, связанные с представляющим интерес белком или его фрагментом, были описаны (см., например, патенты США № 5480981 и 5808029; Gascoigne et
al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:2936; Capon et al.
1989, Nature 337:525; Traunecker et al. 1989, Nature 339:68; Zettmeissl et al. 1990, DNA Cell Biol. USA 9:347; Byrn et al.
1990, Nature 344:667; Watson et al. 1990, J. Cell. Biol. 110:2221; Watson et al. 1991, Nature 349:164; Aruffo et al.
1990, Cell 61:1303; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 173:721; Linsley et al. 1991, J. Exp. Med. 174:561; Stamenkovic et al. ,
1991, Cell 66:1133; Ashkenazi et al. 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 88:10535; Lesslauer et al. 1991, Eur. J. Immunol.
27:2883; Peppel et al. 1991, J. Exp. Med. 174:1483; Bennett et
al. 1991, J. Biol. Chem. 266:23060; Kurschner et al. 1992, J.
Biol. Chem. 267:9354; Chalupny et al. 1992, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89:10360; Ridgway and Gorman, 1991, J. Cell. Biol.
115, Abstract No. 1448; Zheng et al. 1995, J. Immun. 154:5590).
Эти молекулы обычно обладают как биологической активностью,
ассоциированной со связанной молекулой, представляющей интерес,
так и эффекторной функцией или какой-либо другой желаемой
характеристикой, связанной с константной областью
иммуноглобулина (например, биологической стабильностью,
клеточной секрецией).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит фрагмент Fc константной области иммуноглобулина. Кассеты экспрессии Fc могут быть приобретены коммерческим путем. Фрагмент Fc может состоять из областей СН2 и СНЗ иммуноглобулина и шарнирной области иммуноглобулина. Фрагмент Fc может представлять собой фрагмент Fc IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4. Согласно одному конкретному варианту реализации настоящего изобретения часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgGl. Согласно другому варианту часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgG4. Согласно еще одному варианту часть константной области иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc IgM.
Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный растворимый белок дЗр или его амилоид связывающий фрагмент гибридизуют с доменом Fc
иммуноглобулина с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Рекомбинантный растворимый белок дЗр или его амилоид связывающий фрагмент может быть мутирован или модифицирован. Например, амилоид связывающий фрагмент белка дЗр, такой как домен N1N2 или домен N2, может быть клонирован в вектор экспрессии гибридного белка IgGFc. Типичные векторы экспрессии гибридного белка IgGFc включают, например, один из векторов pFUSE-Fc, доступных от InvivoGen. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения полученный двухвалентный (например, дЗр(N1N2)-IgGFc или дЗр(N2)-IgGFc) гибридный белок будет иметь более высокую авидность в отношении связывания амилоида, чем рекомбинантный растворимый белок дЗр, поскольку он является двухвалентным.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит белок, не включающий область Fc, который связан с дЗр или амилоид связывающим фрагментом дЗр.
Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит по меньшей мере два полипептида дЗр или его амилоид связывающих фрагмента. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит три или более полипептидов дЗр или его амилоид связывающих фрагментов. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит пять полипептидов дЗр или его амилоид связывающих фрагментов. Такие димерные и мультимерные гибридные белки обеспечивают более высокую авидность взаимодействий, поскольку они включают более одного дЗр или его амилоид связывающего фрагмента.
В других вариантах реализации настоящего изобретения гибридный белок содержит альбумин. См., например, патент США № 6686179, автор Fleer et al.
Во всех случаях дЗр или амилоид связывающий фрагмент дЗр в гибридном белке включает его мутантов и варианты.
В целом, гибридные белки связываются с амилоидом по меньшей мере так же эффективно, как и соответствующий несвязанный дЗр или фрагмент дЗр. Когда это применимо,
гибридные белки по меньшей мере столь же эффективно вызывают дезагрегацию амилоида, усиливают клиренс амилоида, ингибируют агрегацию амилоида и/или удаляют или предотвращают образование токсичных олигомеров, как и соответствующий несвязанный дЗр или его фрагмент. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и по меньшей мере столь же эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, как и рекомбинантный растворимый дЗр, включающий SEQ ID N0:1. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и по меньшей мере столь же эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, как и фаг М13. Согласно другим вариантам реализации гибридный белок связывает амилоид и более эффективно вызывает дезагрегацию амилоида, усиливает клиренс амилоида, ингибирует агрегацию амилоида и/или удаляет или предотвращает образование токсичных олигомеров, чем фаг М13. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и по меньшей мере столь же эффективно снижает уровень амилоида при заболеваниях, связанных с нарушением сворачивания белка, как и фаг М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и является более эффективным в снижении уровня амилоида при заболеваниях, связанных с нарушением сворачивания белка, чем фаг М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения гибридный белок связывает амилоид и является по меньшей мере столь же или более эффективным в предотвращении образования амилоида, по сравнению с фагом М13.
Гибридные белки могут быть синтезированы с использованием методик, хорошо известных в данной области техники. Например, гибридные белки согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы в клетках, используя рекомбинантные методики (см., например, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. и Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.). В другом варианте гибридные белки согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы с использованием известных методов синтеза, таких как твердофазный синтез.
Методики синтеза хорошо известны в данной области техники (см., например, Merrifield, 1973, Chemical Polypeptides, (Katsoyannis and Panayotis eds.) pp. 335-61; Merrifield 1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149; Davis et al. 1985, Biochem. Intl. 10:394; Finn et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:105; Erikson et al. 1976, The Proteins (3d ed.) 2:257; патент США №3941763). Согласно другому варианту готовая конструкция может обладать по существу той же самой функцией, что и гибридный белок, полученный с помощью рекомбинантных методик, однако конструкция может быть получена с использованием нерекомбинантных методик, таких как химическое лигирование. Компоненты гибридных белков могут быть получены с использованием той же общей методологии, которая описана для экспрессии дЗр и мутаций дЗр.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дЗр или его амилоид связывающий фрагмент (или его мутантная форма или вариант) могут быть гибридизованы с маркерной последовательностью, такой как пептид, который облегчает очистку гибридного полипептида (по отдельности или в дополнение к гибридизации с другим белком или включением молекулы-носителя). Маркерная аминокислотная последовательность может представлять собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, предоставленная в векторе pQE (Qiagen, Миссиссага, Онтарио, Канада), помимо прочих, многие из которых коммерчески доступны. Как описано в работе Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86:821-824, например, гексагистидин обеспечивает удобную очистку гибридного белка. Другая пептидная метка, которую можно применять для очистки, представляет собой гемагглютининовую метку (НА), которая соответствует эпитопу, полученному из белка НА вируса гриппа. (Wilson et al., (1984) Cell 37:767).
Фаги, гиперэкспрессирующие дЗр
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложен бактериофаг, модифицированный для увеличения количества копий дЗр, экспрессируемых фагом, более чем до 3-5 копий, обычно обнаруживаемых в нитевидных бактериофагах дикого типа. Согласно одному варианту фаги, которые экспрессируют повышенное количество дЗр, могут быть выбраны из природных вариантов. Согласно другому варианту для увеличения количества копий дЗр используют рекомбинантные методики.
Согласно некоторым вариантам последовательность дикого типа, кодирующую дЗр или амилоидсвязывающий фрагмент дЗр (включая его мутантов или варианты), можно применять для замены одного из генов, кодирующих другой белок оболочки бактериофага. В зависимости от того, какой ген бактериофага был заменен, количество копий дЗр может быть увеличено до б, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 75, 100, 500, 1000 или даже почти 3000 копий (например, если последовательность, кодирующую ген 3, использовали, чтобы заменить последовательность, кодирующую ген 8, или гибридизовали с концом последовательности, кодирующей ген 8).
Для получения фага, экспрессирующего дополнительные копии дЗр, последовательность, кодирующую дЗр (или его мутантную форму или вариант), клонируют как описано в другой части настоящего описания. Последовательность, кодирующую дЗр (или его мутантную форму или вариант), можно затем применять для замены другого гена фага и экспрессировать, в случае необходимости, совместно со вспомогательным фагом.
Кроме того, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения последовательность, кодирующую дЗр (или его мутантную форму или вариант), гибридизуют с сохранением рамки считывания с кодирующей последовательностью другого гена фага с промежуточной спейсерной последовательностью либо без нее. Способы получения фаговых протеинов, с которыми гибридизуют другой белок или пептид, хорошо известны для методик фагового дисплея, и дЗр или его амилоид связывающий фрагмент могут быть "экспрессированы" таким же образом, как, например, антигены или
цепи антител. Например, Scott and Smith, Science (1990) 249:386-90; Devlin et al., Science (1990) 249:404-06. Когда желательна только экспрессия фрагмента дЗр, кодирующая последовательность для фрагмента (или мутантной формы или варианта) может быть соединена с другим геном так, что одна из природных Ser/Gly линкерных последовательностей, присутствующих в дЗр, служит в качестве линкера. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения только кодирующую последовательность доменов N2 или N1N2 (или мутантной формы или варианта) гибридизуют с сохранением рамки считывания с другим геном.
Мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены мутантные белки дЗр и их мутантные амилоид связывающие фрагменты. Гибридные белки и фаги, содержащие мутантные белки дЗр и их амилоид связывающие фрагменты, также включены в область настоящего изобретения. Мутантный дЗр и его мутантные амилоид связывающие фрагменты могут быть получены или выбраны, исходя из свойств, которые способствуют терапевтической эффективности фармацевтических композиций, описанных в настоящей заявке. Например, дЗр или его амилоид связывающие фрагменты могут быть мутированы с помощью рекомбинантных методик или выбраны иным образом так, чтобы обладать одним или более из следующих свойств по отношению к дЗр фага М13: повышенной аффинностью связывания амилоида, сниженной Тпл шарнирной области, повышенной авидностью (авидность отличается от аффинности тем, что авидность используют для описания кооперативного доступного связывания амилоида, где дЗр содержит более одного сайта связывания амилоида), повышенной способностью дезагрегировать амилоидные агрегаты или повышенной способностью предотвращать агрегацию амилоидных фибрилл. Альтернативно или дополнительно мутантный дЗр или его мутантные амилоид связывающие фрагменты могут обладать другими подходящими свойствами, описанными в других частях настоящей заявки.
Мутантные белки дЗр могут быть получены путем мутагенеза
фага или с помощью рекомбинантных методик, таких как сайт-направленный мутагенез на основе ПЦР или случайный мутагенез.
В некоторых вариантах мутантов с высокой аффинностью получают путем мутагенеза М13 и затем отбора клонов фага методом аффинной хроматографии на колонке для выделения амилоид связывающих белков в сочетании со строгими условиями промывки. Последовательные раунды связывания, промывки, элюирования, а затем размножения выбранного фага обеспечивают обогащение популяции клонами фага с высокой аффинностью связывания с амилоидом. После того как повышение аффинности популяции фага было достигнуто методом пэннинга с использованием амилоида, выбирают и исследуют индивидуальные клоны с высокой аффинностью. Используя этот способ можно выбрать мутанты фага с высокой аффинностью связывания после случайного мутагенеза.
Белок дЗр или любые его амилоид связывающие фрагменты (например, домены N1N2 или домен N2) можно также подвергать мутагенезу с использованием рекомбинантных методик. Например, вектор, как описано в настоящей заявке, несущий дЗр или его амилоид связывающий фрагмент (например, N1N2 или N2), можно мутировать с использованием стратегии мутагенеза на основе ПЦР. Кодируемый мутированный белок затем экспрессируют и оценивают связывание амилоида и аффинность мутантов, как описано.
Мутантные амилоид связывающие фрагменты дЗр также могут быть получены из мутанта дЗр. Например, путем мутирования дЗр и/или выбора мутированного дЗр с желаемыми свойствами, а затем получения из него желаемого амилоид связывающего фрагмента, например, методом протеолиза с последующей очисткой.
Скрининг фагов, несущих мутантный дЗр, с целью выявления повышенной аффинности связывания амилоида, изменения температурной чувствительности связывания и т.д. можно использовать, чтобы идентифицировать фаги для дальнейшей характеристики дЗр этих фагов. Для скрининга таких свойств как температурная чувствительность связывания можно использовать аффинную хроматографию на колонке для выявления амилоид связывающих белков с одной или несколькими стадиями связывания, промывки или элюирования, проведенных термочувствительным
способом.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр или амилоид связывающий фрагмент дЗр связывает амилоид с аффинностью, которая по меньшей мере в 3, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400, 500 или даже 1000 раз выше, по сравнению с аффинностью связывания соответствующего немутированного дЗр или фрагмента дЗр из М13. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр или амилоид связывающий фрагмент дЗр сохраняет способность к связыванию амилоида, причем сила связывания составляет по меньшей мере 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% от силы связывания соответствующего немутированного дЗр или амилоид связывающего фрагмента дЗр из М13. Согласно некоторым вариантам мутантный дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, который демонстрирует более низкую аффинность связывания амилоида, чем соответствующая немутированная форма, также обладает другим желаемым биологическим (например, большей способностью дезагрегировать амилоид; большей способностью предотвращать агрегацию амилоидных фибрилл) или фармацевтическим (например, большей метаболической стабильностью, благоприятным фармакокинетическим профилем, большей растворимостью) свойством, которое улучшается по сравнению с соответствующей немутированной формой. Связывание амилоида можно оценить с помощью поверхностного плазмонного резонанса или конкурентного ИФА, как описано в примерах.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения варианты и/или мутантов дЗр можно идентифицировать путем скрининга библиотеки ДНК с помощью гибридизации с дЗр из М13, чтобы выбрать связанные ДНК, которые гибридизуются с дЗр М13 в очень строгих или умеренных условиях.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр представляет собой полученный с помощью рекомбинантных методик дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, который отличается от зрелого белка дЗр М13 (SEQ ID N0:1) по меньшей мере на один аминокислотный остаток, но все
еще связывает амилоид. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения отдельные точечные мутации обозначены путем указания аминокислоты дЗр М13 в определенном остатке зрелого белка и замены аминокислоты в этом остатке. Например, "F194A" означает, что фенилаланин в положении 194 последовательности зрелого М13 был заменен на аланин. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр описан с указанием меры процентного сходства аминокислотной последовательности с SEQ ID N0:1, снова с оговоркой, что мутантный дЗр связывает амилоидные фибриллы. Согласно этим вариантам мутантный дЗр обладает по меньшей мере 7 0%, по
меньшей
мере
80%,
меньшей
мере
8 5%,
меньшей
мере
86%, по
меньшей
мере
87%,
меньшей
мере
8 8%,
меньшей
мере
89%, по
меньшей
мере
90%,
меньшей
мере
91%,
меньшей
мере
92%, по
меньшей
мере
93%,
меньшей
мере
94%,
меньшей
мере
95%, по
меньшей
мере
98%,
меньшей
мере
97%,
меньшей
мере
98% или
по меньшей
мере
99%
идентичностью
всей
длине
последовательности SEQ ID N0:1. В вариантах, включающих мутированный амилоид связывающий фрагмент дЗр, мутантный
амилоид
связывающий
фрагмент
обладает
меньшей
мере
70%,
меньшей
мере
80%,
меньшей
мере
8 5%,
меньшей
мере
86%,
меньшей
мере
87%,
меньшей
мере
8 8%,
меньшей
мере
89%,
меньшей
мере
90%,
меньшей
мере
91%,
меньшей
мере
92%,
меньшей
мере
93%,
меньшей
мере
94%,
меньшей
мере
95%,
меньшей
мере
96%,
меньшей
мере
97%,
меньшей
мере
98%
или
по меньшей
мере
99%
идентичностью
всей
длине
соответствующего фрагмента SEQ ID N0:1.
С практической точки зрения удобно определить, является ли какой-либо конкретный полипептид по меньшей мере на 7 0%, 8 0%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%., 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичным последовательности SEQ ID N0:1 можно с помощью известных компьютерных программ, таких как программа Bestfit. При использовании Bestfit или другой программы для выравнивания последовательностей, чтобы определить, является ли конкретная последовательность, например, на 95% идентичной эталонной последовательности в
соответствии с настоящим изобретением, параметры устанавливают
так, что процент идентичности вычисляется по всей длине части
эталонной аминокислотной последовательности, которая
гомологична интересующей последовательности.
В некоторых вариантах различных аспектов мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты не содержат мутации в аминокислотном остатке, который является консервативным среди дЗр семейства Ff, I-семейства или обоих Ff- и 1-семейств. Согласно другим вариантам мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые являются консервативными среди дЗр семейства ff, 1-семейства или обоих Ff- и I-семейств. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты срдержат в большинстве мутаций 0, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными среди дЗр семейства Ff, 1-семейства или обоих Ff- и I-семейств. Согласно еще одному варианту мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 0, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными между одним или более из 122, Ike и Ifl. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутантный дЗр и его амилоид связывающие фрагменты содержат в большинстве мутаций 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными среди дЗр семейства Ff, 1-семейства или обоих Ff- и I-семейств. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N1. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, 8, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N2. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения не более 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 мутаций расположены в пределах домена N2 и не входят в шарнирную область.
Сайт-направленный мутагенез может быть нацелен на остатки,
которые, как известно, имеют важное значение для стабильности дЗр, N1N2 или домена N2. Например, ранее было показано, что мутации, связанные с заменой на аланин в D94 и Т95; Е115; N122; L125; Е126 и Е127; Е127 и Е128; Q129; Q145; Т154 и Т156; Q157; Т159 и D160; К163 и Т164; Y166; и Е196 и D197, не оказывают существенного влияния на связывание фага с F-фимбриями, Deng and Perham, 2002. Соответственно, эти положения являются толерантными в отношении мутаций, и мутации в одном или более из этих положений могут усилить или иметь нейтральный эффект на способность к связыванию амилоида белка дЗр и амилоид связывающих фрагментов дЗр согласно настоящему изобретению. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящее изобретение включает дЗр или амилоид связывающий фрагмент дЗр, которые мутированы в одном или более D94, Т95, Е1 15, N122, L125, Е126, Е127, Е128, Q129, Q145, Т154, Т156, Q157, Т159, D160, К163, Т164, Y166, Е198 или D197 (по отношению к SEQ ID N0:1). Согласно некоторым вариантам мутация в одном или более положений из D94, Т95, Е115, N122, L125, Е126, Е127, Е128, Q129, Q145, Т154, Т156, Q157, Т159, D160, К163, Т164, Y166, Е196 или D197 не является исключительно мутационной заменой на аланин.
Ранее было показано, что мутационные замены на аланин в положениях F194; F190 и Н191; К184, R186 и D187; R142 и R144 уменьшают связывание с F-фимбриями, Deng and Perham, 2002. Соответственно, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутацию выбирают из мутации, которая не включает один или более из следующих остатков: R142, R144, W181, К184, R188, D187, F190, Н191 или F194 (нумерация относительно SEQ ID N0:1). Однако замена R142, R144, W181, К184, R188, D187, F190, Н191 или F194 на любой остаток, исключая аланин, может увеличить связывание амилоида. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в одном или более из R142, R144, W181, К184, R186, D187, F190, Н191 или F194. В одном варианте мутация не является мутационной заменой на аланин в F194. Согласно другому варианту реализации
настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в F190 и Н191. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения мутация не является мутационной заменой на аланин в К184, R18 6 и D187. Согласно другому варианту мутация не является мутационной заменой на аланин в W181. Согласно другому варианту мутация не является мутационной заменой на аланин в R142 и R144. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация включает, но не ограничивается ими, одну, несколько или все из: T13I, T101I, Q129H, G153D, W181A, F190A, F194A и D209Y.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на поверхности домена N2, представляющего собой часть дЗр, которая связывается с F-фимбриями. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на внешнем крае домена N2. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на поверхности домена N1, который представляет собой часть дЗр, связывающую TolA. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутация присутствует в одном или более остатков, расположенных на внешнем крае домена N1. Согласно другому варианту мутация присутствует в одном или более остатков дЗр, доступных для растворителя. Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения мутация(и) смещает цис/транс равновесие в Рго213 более чем до 50, 60, 70, 80, 90 или 95% транс-конформации. Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дЗр представляет собой мутированный дЗр с цис/транс равновесием в остатке Рго213, который по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 90% или по меньшей мере на 95% находится в транс-конформации.
Согласно некоторым вариантам мутантный дЗр или его амилоид связывающий фрагмент не содержат мутаций в структурно консервативных остатках. Примеры структурно консервативных
остатков включают остатки, которые, несмотря на потенциальные вставки последовательностей, участвуют в обеспечении доменной структуры у членов Ff- и 1-семейств.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения мутация не замещает остаток пролина.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида и не замещает остаток цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутация сохраняет все, по меньшей мере один, по меньшей мере два, по меньшей мере три или все четыре дисульфидных мостика, обнаруженных в дЗр. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения любая мутация сохраняет два дисульфидных мостика в N1 между Cys7 и Cys38 и между Cys4 6 и Cys53. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения любая мутация сохраняет любой, но не оба, из дисульфидных мостиков в N1 между Cys7 и Cys3 6 и между Cys4 6 и Cys53. Согласно одному варианту дисульфидный мостик между Cysl8 8 и Cys2 01 сохраняется. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения каждый из дисульфидных мостиков между Cys7 и Cys36, Cys46 и Cys53 и Cysl88 и Cys201 сохраняется. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения мутации сохраняют дисульфидный мостик между Cys354 и Cys371. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения мутации сохраняют дисульфидные мостики между Cys7 и Cys36, Cys46 и Cys53, Cysl88 и Cys201 и Cys354 и Cys371.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения любая внесенная мутация сохраняет связывание амилоида и снижает температуру плавления (Тпл) N1N2. Величина Тпл может быть измерена с помощью любого из способов, описанных в примерах. Мутанты, которые уменьшают Тпл N1N2, как ожидается, обладают лучшей аффинностью связывания с бета-амилоидом, ингибируют сборку бета-амилоида в большей степени, и являются по меньшей мере столь же эффективными в исследованиях
дезагрегации, как и дЗр М13. Соответственно, такие мутанты, а также гибридные белки и фаги, содержащие такие мутанты, как ожидается, являются по меньшей мере столь же эффективными терапевтически, как и соответствующие последовательности в М13, гибридные белки и интактный М13, соответственно, для лечения одного или более заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков.
Мутанты также могут быть предназначены для включения
нацеливающей последовательности. Такие нацеливающие
последовательности могут быть вставлены в гибкие линкерные участки между N1N2, или между N2 и другим доменом в гибридном белке N2. Нацеливающие последовательности ядерной локализации
(NLS) могут быть полезными при болезни Хантингтона. Нацеливание на эндосомы может быть полезным при болезни Паркинсона.
Помимо нацеливания на конкретные регионы в клетке, нацеленные последовательности можно применять для нацеливания на различные виды амилоида. Нуклеирующие последовательности могут увеличивать аффинность и направить мутантный белок к определенному виду амилоида. Могут быть получены другие мутанты, включающие пептидные последовательности, которые настолько гидрофобны, что они выпадают в осадок самостоятельно. Например, множественные AWAI последовательности могут быть добавлены к дЗр и/или его амилоидсвязывающим фрагментам
(например, N2 и N1N2) и/или их гибридным белкам, чтобы получить химерные белки, которые имеют улучшенные, множественные связывающие последовательности. Некоторые примеры пептидов, которые связывают амилоид и могут быть включены в мутантные или химерные белки, содержащие дЗр, N2 и N1N2 и/или их гибридные белки, представляют собой пептидные ингибиторы на основе каркаса GxFxGxF (SEQ ID N0:21), описанного в работе Sato, Biochemistry (2006) 45:5503-16, и пептида KLVFF (SEQ ID N0:22), описанного в работе Tjernberg et al. , J. Biol. Chem. (1996) 271:8545-48. Другие нацеливающие фрагменты известны в области техники и также могут применяться в настоящем изобретении. См., например, Sciarretta et al., Methods in Enzymology (2006) 413:273-312.
Носители и переносчики амилоид связывающего дисплея
Согласно другому аспекту настоящего изобретения дЗр и его амилоид связывающие фрагменты (включая мутантов и варианты любого из вышеперечисленных), включая, но не ограничиваясь ими, домены N1N2 и домен N2, а также молекулы, полипептиды и гибридные белки, которые содержат их, можно комбинировать с другими органическими или даже неорганическими носителями, обеспечивающими молекулярные каркасы, которые сохраняют способность связывать амилоид, но обеспечивают дополнительные возможности.
Согласно некоторым вариантам дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, или гибридный белок дЗр, и носитель ковалентно связаны с помощью нерекомбинантных способов, таких как, например, химическая связь, отличная от пептидной связи. Может быть использован любой подходящий химический сшивающий агент. Также могут быть использованы любые известные способы ковалентного связывания полипептидов с другими молекулами (например, носителями). Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, или гибридный белок дЗр, и носитель могут быть гибридизованы с помощью линкера, который состоит по меньшей мере из одной аминокислоты или химического остатка.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, или гибридный белок дЗр, и носитель нековалентно связаны между собой. Согласно некоторым таким вариантам они могут быть связаны, например, с использованием связывающихся пар. Типичные связывающиеся пары включают, но не ограничиваются ими, биотин и авидин или стрептавидин, антитело и антиген, и т.д.
Примеры носителей включают, но не ограничиваются указанными, вирусные частицы (включая фаг, см. ниже), в которых белок дЗр или его амилоидсвязывающий фрагмент, не являющийся нативным для вируса, включен как часть вирусной структуры; полимеры, независимо от того, являются они натуральными, синтетическими или смешанными; структуры с полимерным покрытием, такие как гранулы (включая гранулы с
модифицированной поверхностью); полиаминокислоты, нуклеиновые кислоты; и липосомы. Носитель может быть связано прямо или косвенно с дЗр или его амилоид связывающим фрагментом. В зависимости от носителя промежуточные связи могут быть использованы, чтобы обеспечить соответствующий промежуток между носителем и амилоид связывающим доменом.
Полиаминокислота может представлять собой белок-носитель. Такие полиаминокислоты могут быть выбраны из сывороточного альбумина (например, САЧ), дополнительного антитела или его фрагмента, например, области Fc, фетуина А, фетуина В, ядерного фактора эритроидного происхождения с лейциновой молнией 2 (NFE2), нейроретильной лейциновой молнии, тетранектина или других полиаминокислот, например, полилизина. Полиаминокислоты могут прикрепляться на N-конце или С-конце, или в других местах между ними, также они могут быть присоединены с помощью химического линкера к дЗр или его амилоид связывающему фрагменту.
Согласно некоторым вариантам носители включают молекулы с
доменами олигомеризации. Олигомеризация обеспечивает
функциональные преимущества, если одной из функций белка или его фрагмента является связывание, включая поливалентность, увеличение прочности связывания и комбинированную функцию разных доменов. Эти отличительные черты наблюдаются в природных белках, а также могут быть введены методами белковой инженерии. Соответственно, в изобретении также предложены дЗр и его амилоид связывающие фрагменты (включая мутантов и варианты), такие как домены N1N2 и домен N2, содержащие домен олигомеризации, например, домен димеризации. Подходящие домены олигомеризации включают биспиральные домены, включая альфа-биспиральные домены; коллагеновые домены; коллаген-подобные домены и домены димерных иммуноглобулинов. Подходящие биспиральные полипептидные партнеры для гибридных белков согласно настоящему изобретению включают биспиральный домен тетранектина, биспиральный домен олигомерной белковой матрицы хряща; биспиральные домены ангиопоэтина; и домены лейциновой молнии. При применении коллагена или коллаген-подобных доменов
олигомеризации они могут содержать, например, те, которые обнаруживают в коллагенах, связывающем маннозу лектине, белках А и D легочного сурфактанта, адипонектине, фиколине, конглютинине, рецепторе связывания макрофагов и эмилине. Хотя некоторые из этих доменов могут быть включены в виде гибридных белков, во многих вариантах они нерекомбинантно связаны с дЗр, доменом N1N2, доменом N2 или другими амилоид связывающими фрагментами, например, через ковалентные связи.
Кроме того, в настоящем изобретении предложены дЗр или его амилоид связывающие фрагменты, или гибридные белки дЗр, связанные с полимером. Полимеры, применяемые согласно настоящему изобретению, будут фармацевтически приемлемыми для приготовления терапевтического продукта или композиции.
Полимеры, как правило, прикреплены к дЗр или его амилоид связывающему фрагменту с учетом влияния на функциональные или антигенные домены полипептида. В целом, химическая дериватизация может быть выполнена в любом подходящем условии, применяемом для проведения реакции белка с активированной полимерной молекулой.
Активирующие группы, которые можно использовать для связи полимера с активными остатками, включают сульфон, малеимид, сульфгидрил, тиол, трифлат, трезилат, азидрин, оксиран и 5-пиридил.
Подходящие, клинически приемлемые водорастворимые полимеры
включают, но не ограничиваются указанными, полиэтиленгликоль
(ПЭГ), полиэтиленгликоль пропиональдегид, сополимеры
этиленгликоля/пропиленгликоля, монометоксиполиэтиленгликоль,
карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт (ПВС),
поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,б-триоксан,
этилен/малеиновый ангидрид, поли- (|3-аминокислоты) (либо
гомополимеры или статистические сополимеры), поли-(н-
винилпирролидон) полиэтиленгликоль, гомополимеры
полипропиленгликоля (ППГ) и другие оксиды полиалкиленов,
сополимеры оксида полипропилена/оксида этилена,
полиоксиэтилированные полиолы (POG) (например, глицерин) и
другие полиоксиэтилированные полиолы, полиоксиэтилированный сорбит или полиоксиэтилированную глюкозу, кислоты толстого кишечника или другие углеводные полимеры, фиколл или декстран и их смеси.
Остатки ПЭГ согласно настоящему изобретению могут представлять собой разветвленные или линейные полимеры. Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение предусматривает химически модифицированный полипептид, который включает моно- или поли- (например, 2-4) остатки ПЭГ. Пегилирование может быть осуществлено с помощью любой из реакций пегилирования, известных в данной области техники. Способы получения пегилированного белкового продукта, как правило, известны в данной области техники. Оптимальные условия реакции будут определяться на индивидуальной основе, в зависимости от известных параметров и желаемого результата.
Существует ряд способов присоединения ПЭГ, доступных специалистам в данной области техники, например, патент ЕР 0401384; Malik et al. , Exp. Hematol., (1992) 20:1028-1035; Francis, Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); EP 0154316; EP 0401384; WO 92/16221; WO 95/34326; и другие публикации, процитированные в настоящей заявке, которые относятся к пегилированию.
При пегилировании дЗр, домена N1N2, домена N2 или другого
амилоидсвязывающего фрагмента (а также их мутантов и вариантов
и соединений, полипептидов и гибридных белков, содержащих любой
из вышеуказанных) ПЭГ может быть присоединен путем химической
дериватизации дЗр, домена N1N2, домена N2 или другого амилоид
связывающего фрагмента. Согласно другим вариантам
аминокислотный остаток, подходящий для модификации молекулой ПЭГ, может быть введен рекомбинантно в дЗр, домен N1N2, домен N2 или другой амилоид связывающий фрагмент.
Пегилирование может быть выполнено с помощью реакции ацилирования или реакции алкилирования с реакционоспособной молекулой полиэтиленгликоля. Таким образом, белковые продукты согласно настоящему изобретению включают пегилированные белки, в которых группы ПЭГ присоединены через ацильные или алкильные
группы. Такие продукты могут быть монопегилированы или полипегилированы (например, те, которые содержат 2-6 или 2-5 групп ПЭГ). Примером подходящего активированного эфира ПЭГ является ПЭГ, этерифицированный с образованием N-гидроксисукцинимида (NHS).
Пегилирование путем алкилирования обычно включает
взаимодействие концевого альдегидного производного ПЭГ с
полипептидом в присутствии восстанавливающего агента. Для
реакции восстановительного алкилирования выбранный полимер(ы)
должен иметь одну реакционоспособную альдегидную группу.
Примером реакционоспособного ПЭГ-альдегида является
полиэтиленгликоль пропионовый альдегид, который стабилен в воде, или его моно С1-С10 алкокси или арилокси производные, см., например, патент США №5252714.
Согласно некоторым вариантам дЗр, домен N1N2, домен N2 или другой амилоид связывающий фрагмент экспрессируют как часть фага, и дЗр, домен N1N2, домен N2 или другой амилоид связывающий фрагмент получают путем выделения его из частицы фага. В целом, однако, для получения дЗр, амилоид связывающего фрагмента дЗр (включая мутантов и варианты) используют рекомбинантные методики. В целом, полученный белок выделяют перед комбинированием с носителем.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения носителем дисплея является фаг. Согласно этим вариантам ген, кодирующий белок дЗр, домен N1N2, домен N2 и другой амилоид связывающий фрагмент (включая мутантов и варианты вышеупомянутых) вводят в геном бактериофага и экспрессируют в виде части фага. Например, в одном варианте мутантный белок дЗр с более высокой аффинностью связывания амилоида, чем у дЗр из фага М13, применяют для замены дЗр дикого типа из фага М13. Полученный фаг, таким образом, также имеет улучшенную способность к связыванию амилоида по сравнению с М13 дикого типа. Однако любой из описанных дЗр или амилоид связывающих фрагментов может быть включен в фаг. В этих вариантах ген 3 дикого типа может быть полностью заменен на дЗр согласно настоящему изобретению. В другом варианте, как
обсуждалось для фага с увеличенным числом копий дЗр, рекомбинантная молекула может быть гибридизована с геном, кодирующим белок оболочки фага (включая дЗр дикого типа) и экспрессирована на фаге способом, аналогичным таковому для антигена и цепей антитела в библиотеках фагового дисплея. Любой нитевидный бактериофаг может быть модифицирован, чтобы экспрессировать дЗр согласно настоящему изобретению, включая, но не ограничиваясь ими, М13, fd, fl, 122, ike или Ifl. Согласно некоторым вариантам реализации вспомогательный фаг может применяться в комбинации с модифицированным фагом. Рекомбинантные методики
В целом, ДНК, кодирующую белок дЗр или его амилоид связывающий фрагмент (включая его мутантов и варианты и соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие любой из вышеупомянутых) , получают с использованием обычных методов рекомбинантных ДНК, таких как клонирование гена дЗр, прямой синтез ДНК или путем выделения соответствующей ДНК из библиотеки с использованием, например, последовательности М13 в качестве зонда. (См., например, Sambrook et al. 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. и Ausubel et al. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.).
Для получения с помощью рекомбинантных методик
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую дЗр или его
амилоид связывающий фрагмент, вставляют в соответствующий
вектор экспрессии, который содержит необходимые элементы для
транскрипции и трансляции встроенной кодирующей
последовательности, или, в случае РНК-содержащего вирусного вектора, необходимые элементы для репликации и трансляции. Кодирующую нуклеиновую кислоту вставляют в вектор в правильной рамке считывания.
Соответственно, в настоящем изобретении предложены векторы, содержащие полинуклеотиды, которые кодируют дЗр или его амилоид связывающий фрагмент (включая мутантов и варианты). В настоящем изобретении также предложены векторы, содержащие
полинуклеотиды, которые кодируют дЗр или гибридную молекулу дЗр. Такие векторы включают, но не ограничиваются ими, ДНК-векторы, фаговые векторы, вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.д.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения выбирают вектор, который оптимизирован для экспрессии полипептидов в клетках линии СНО или клетках, полученных их линии СНО. Примеры таких векторов описаны, например, в работе Running Deer et al. , Biotechnol. Prog. (2004) 20:880-889.
Согласно некоторым вариантам вектор выбирают для экспрессии дЗр, его амилоид связывающего фрагмента и/или гибридных молекул дЗр в условиях in vivo у животных, включая человека. В некоторых таких вариантах реализации настоящего изобретения экспрессия полипептида находится под контролем промотора, который функционирует тканеспецифическим образом.
Векторы экспрессии трансфецируют или совместно трансфецируют в подходящую целевую клетку, которая будет экспрессировать полипептиды. Неограничивающие примеры способов трансфекции описаны, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001). Нуклеиновые кислоты могут быть временно или стабильно трансфецированы в желаемых клетках-хозяевах в соответствии со способами, известными в данной области техники. Разнообразные векторные системы экспрессии в хозяевах могут быть использованы для экспрессии белков, описанных в настоящей заявке, включая прокариотические и эукариотические клетки. Они включают, но не ограничиваются указанными, микроорганизмы, такие как бактерии (например, E.coli), трансформированные рекомбинантной ДНК бактериофага или ДНК плазмидных векторов экспрессии, содержащих соответствующую кодирующую последовательность; дрожжи или нитчатые грибы, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми или грибковыми векторами экспрессии, содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы насекомых, инфицированные рекомбинантными вирусными векторами экспрессии (например,
бакуловирусом), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; клеточные системы растений, инфицированные рекомбинантным вирусным вектором экспрессии (например, вирусом мозаики цветной капусты или вирусом табачной мозаики) или трансформированные рекомбинантными плазмидными векторами экспрессии (например, Ti плазмида), содержащими соответствующую кодирующую последовательность; или клеточные системы животных, включая клетки млекопитающих (например, клетки линий СНО, COS, HeLa). Белки также могут быть получены с помощью рекомбинантных методик из ряски. См., например, патент США 8022270.
Векторы, применяемые для трансформации, как правило, содержат селектируемый маркер, используемый для идентификации трансформантов. В бактериальных системах это может быть ген устойчивости к антибиотику, такому как ампициллин или канамицин. Селектируемые маркеры для использования в культивируемых клетках млекопитающих включают гены, которые придают устойчивость к лекарствам, таким как неомицин, гигромицин и метотрексат. Селектируемый маркер может быть амплифицируемым селектируемым маркером. Один из амплифицируемых селективных маркеров представляет собой ген ДГФР. Другой амплифицируемый маркер представляет собой кДНК рДГФР (Simonsen and Levinson, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), (1983) 80:2495). Селектируемые маркеры рассматриваются в работе Thilly {Mammalian Cell Technology, Butterworth Publishers, Stoneham, MA), и выбор селектируемых маркеров находится в пределах обычной квалификации в данной области техники.
Элементы экспрессии в системах экспрессии различаются по своей силе и специфичности. В зависимости от используемой системы хозяин/вектор любой из ряда подходящих элементов транскрипции и трансляции, включая конститутивные и индуцируемые промоторы, может быть использован в векторе экспрессии. Например, при клонировании в бактериальных системах могут быть использованы индуцируемые промоторы, такие как pL бактериофага A, plac, ptrp, ptac (ptrp-lac гибридный промотор) и т.п.; при клонировании в клеточных системах насекомых могут быть использованы промоторы, такие как промотор многогранника
бакуловируса; при клонировании в клеточных системах растений могут быть использованы промоторы, полученные из генома клеток растений (например, промоторы теплового шока; промотор малой субъединицы RUBISCO; промотор хлорофилл А/В-связывающего белка) или из вирусов растений (например, РНК 35S промотор CaMV; промотор белка оболочки ВТМ) ; при клонировании в клеточных системах млекопитающих могут быть использованы промоторы, полученные из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеинов) или из вирусов млекопитающих (например, промотор поздних генов аденовируса; 7.5 К промотор вируса коровьей оспы); при получении клеточных линий, содержащих множественные копии продукта экспрессии, могут быть использованы векторы на основе SV4 0, BPV и EBV с соответствующим селектируемым маркером.
В тех случаях, когда используют векторы экспрессии растений, экспрессия последовательностей, кодирующих линейные или незамкнутые формы продукта экспрессии согласно настоящему изобретению, может быть направлена любым из множества промоторов. Например, могут быть использованы вирусные промоторы, такие как 35S РНК и 19S РНК промоторы CaMV (Brisson et al. , Nature (1984) 310:511-514), или промотор белка оболочки ВТМ (Takamatsu et al. , EMBO J. (1987) 6:307-311); в другом варианте могут быть использованы растительные промоторы, такие как малая субъединица RUBISCO (Coruzzi et al. , EMBO J. (1984) 3:1671-1680; Broglie et al., Science (1984) 224:838-843), или могут быть использованы промоторы белков теплового шока, например, hspl7.5-E или hspl7.3-B сои (Gurley et al. , Mol. Cell. Biol. (1986) 6:559-565). Эти конструкции могут быть введены в клетки растений с помощью Ti плазмид, Ri плазмид, векторов на основе вирусов растений, прямой трансформации молекулой ДНК, микроинъекции, электропорации и т.д. Описание таких методов см., например, в работах Weissbach and Weissbach 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; и Grierson and Corey 1988, Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9.
В одной системе экспрессии в клетках насекомых, которую
можно применять для получения белков согласно настоящему изобретению, в качестве вектора экспрессии чужеродных генов используют вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV). Вирус размножается в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована в некритичные участки (например, ген многогранника) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотор многогранника). Успешное введение кодирующей последовательности приведет к инактивации гена многогранника и производству "невкрапленного" рекомбинантного вируса (т.е. вируса, у которого отсутствует белковый слой, кодируемый геном многогранника). Такие рекомбинантные вирусы затем применяют для инфицирования клеток Spodoptera frugiperda, в которых вставленный ген экспрессируется (см., например, Smith et al., J. Virol. (1983) 46:584; патент США №4215051). Другие примеры этой системы экспрессии могут быть найдены в работе Ausubel et al., eds. 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publish. Assoc. and Wiley Interscience.
В клетках-хозяевах млекопитающих можно применять ряд систем экспрессии на основе вирусов. Если в качестве вектора экспрессии применяют аденовирус, кодирующую последовательность можно лигировать в управляющий комплекс транскрипции/трансляции аденовируса, например, промотор поздних генов и трехкомпонентную лидерную последовательность. Этот гибридный ген может быть затем вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации в условиях in vitro или in vivo. Вставка в некритичный участок вирусного генома (например, область Е1 или ЕЗ) приведет к получению рекомбинантного вируса, который является жизнеспособным и способен экспрессировать пептид в инфицированном хозяине (см., например, Logan and Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1984) 81:3655). С другой стороны, можно использовать 7.5К промотор коровьей оспы (см., например, Mackett et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:7415; Mackett et al. , J. Virol. (1984) 49:857; Panicali et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1982) 79:4927). Другие вирусные системы экспрессии включают аденоассоциированный вирус и лентивирусы.
Клетки-хозяева, содержащие конструкции ДНК, выращивают в соответствующей ростовой среде. В настоящей заявке термин "соответствующая ростовая среда" означает среду, содержащую питательные вещества, необходимые для выращивания клеток. Полученный с помощью рекомбинантных методик белок согласно настоящему изобретению может быть выделен из культуральной среды с использованием обычных методик в данной области техники.
Исследования в условиях in vitro
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дезагрегацию амилоида можно контролировать с помощью исследования флуоресценции тиофлавина Т (ТФТ).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения дезагрегацию исследуют с помощью контроля солюбилизации ПАВ в присутствии или в отсутствие композиции согласно настоящему изобретению. Например, агрегированный ос-синуклеин можно обрабатывать с применением композиции согласно настоящему изобретению. Композиция, которая вызывает дезагрегацию агрегированного а-синуклеина, приведет к более быстрой солюбилизации волокон а-синуклеина в ПАВ, таком как ДСН, по сравнению с необработанными волокнами. Такое превращение амилоидных волокон в растворимые формы можно контролировать путем включения доли меченых (например, с применением Су5) мономеров а-синуклеина во время агрегации.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предотвращение образования токсичных амилоидных олигомеров исследуют с помощью оценки цитотоксичности для нейрональной клеточной культуры. В этом исследовании дифференцированные клетки нейробластомы линии N2а или эквивалентные инкубируют с олигомерами А|342. Олигомеры связываются с мембранами и вызывают нарушение целостности мембраны и утечку цитозольных ферментов в культуральную среду. Длительная инкубация с высокой концентрацией олигомеров вызывает гибель клеток. Если олигомеры предварительно обрабатывают фагом или дЗр перед инкубацией с клетками,
олигомеры становятся менее токсичными и в некоторых случаях нетоксичными. Этот нейтрализующий эффект можно количественно оценить путем измерения высвобождения аденилаткиназы, одного из типичных цитозольных ферментов, который высвобождается нервными клетками после нарушения целостности мембраны.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композиция согласно настоящему изобретению ингибирует превращение растворимого прионного белка в конформер, устойчивый к действию протеиназы К (ПК), в исследовании нарушения сворачивания белка с циклической амплификацией (РМСА) . Wang et al. , Science, (2010) 327:1132-35. В этом исследовании рекомбинантный РгР смешивают с липидом POPG и РНК в присутствии или в отсутствие композиции согласно настоящему изобретению. Затем материал подвергают многократным (например, 48) циклам обработки ультразвуком в течение 30 секунд с последующей инкубацией в течение 2 9,5 минуты. Часть реакционной смеси затем используют в качестве затравки для другой пробирки с субстратом, и цикл повторяется. Образцы после каждого раунда исследуют на наличие материала, устойчивого к действию протеиназы К, что свидетельствует о инфекционной форме РгР. Снижение количества материала, устойчивого к действию протеиназы К, в присутствии композиции согласно настоящему изобретению указывает, что композиция ингибирует образование конформера, устойчивого к действию протеиназы К.
Как отмечалось выше, амилоидные формы определенных прионных белков, такие как прионный белок дрожжей NM, также можно детектировать методом ловушки на фильтре. Соответственно, в зависимости от типа прионного белка, в некоторых вариантах реализации настоящего изобретения способность композиции согласно настоящему изобретению дезагрегировать агрегаты прионного белка можно исследовать методом ловушки на фильтре.
Функциональные исследования в условиях in vivo
Помимо таких видов активности, как повышенная аффинность связывания с амилоидом или сниженная Тпл, которые можно продемонстрировать в исследованиях в условиях in vivo, композиции согласно настоящему изобретению могут также снижать
уровень амилоида в одном из нескольких исследований в условиях in vivo. В одном из способов определения снижения уровня амилоида в условиях in vivo применяют позитронно-эмиссионную томографию (ПЭТ) с визуализирующим агентом флорбетапиром (F18-AV-45, Eli Lilly) до и после обработки, чтобы сравнить количество и/или распределение бета-амилоида. Безусловно, поскольку выявлены дополнительные биомаркеры, они также могут быть использованы, чтобы оценить снижение уровня амилоида.
В другом способе определения снижения уровня амилоида под действием композиции в условиях in vivo применяют мышиную модель hAPP. Rockenstein, J Neurosci Res. (2001) 66 (4) :573-82. У этих мышей развиваются высокие уровни бета-амилоида в раннем возрасте (3-4 месяца). Способность композиции снижать уровень амилоида может быть определена с помощью инъекционного введения мышам композиции согласно настоящему изобретению с последующим сравнением уровней амилоида у этих мышей и контрольных животных, не получавших инъекций. Также можно вводить композицию только в одно полушарие мозга мышей hAPP, это позволяет сравнить уровень амилоида между инъецированным и неинъецированным полушариями головного мозга одной и той же мыши.
В другом примере композиции согласно настоящему изобретению исследуют в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера (TgAD), описанной в патенте США US2011/0142803, Hsiao et al., Science (1996) 274:99-102, или Duyckaerts et al., Acta Neuropathol (2008) 115:5-38. В общих чертах, мышей дикого типа и трансгенных мышей сенсибилизируют. Чтобы оценить потенциальную способность композиции согласно настоящему изобретению действовать в качестве дезагрегирующего агента композицию вводят интракраниально трансгенным мышам (Taconic, APPSWE(2576), 10 мес) . Например, для композиций, содержащих фаг, 2,5 мкл раствора нитевидого фага (1014 частиц фага/мл) вводят в течение 10 минут (брегма - 2,8 мм, латерально - 2,5 мм. вентрально - 2,5 мм) в одно полушарие, тогда как во второе полушарие вводят фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в качестве контроля. Обработанных мышей умерщвляют в различные моменты
времени, мозг фиксируют в течение ночи в 4% параформальдегиде, и готовят срезы с помощью микротома. Окрашивание с применением тиофлавина S (ТФС) выполняют для оценки нагрузки амилоидом. Срезы окрашивают гематоксилином Майера для тушения ядерной аутофлуоресценции, и после промывки применяют раствор ТФС (1%) в течение 3 минут. Дифференцирование проводят с использованием 1% уксусной кислоты в течение 2 0 мин, и после промывки предметные стекла высушивают и монтируют с применением среды для монтирования, препятствующей выцветанию. Нагрузку амилоидом рассчитывают с использованием программы LEICA Qwin. В другом варианте нагрузку амилоидом можно оценить с применением антител к амилоиду.
Биораспределение радиоактивных (например, I125) или флуоресцентномеченых композиций или немеченых композиций, включая нитевидные фаги, также можно измерить, чтобы показать, что композиция связывает амилоид в условиях in vivo. Например, если композиция содержит фаг, то нитевидный фаг может быть помечен радиоактивной или флуоресцентной меткой. Мышей линии BALB/c разделяют на группы. Затем каждая мышь получает интраназально 100 мкл фага (12,5х1012 фаговых частиц) в течение часа. Первую группу мышей умерщвляют через час после проведения внутрисердечной перфузии с применением 4% параформальдегида. Вторую группу умерщвляют через 3 часа после обработки, и последнюю группу умерщвляют через 2 4 часа. После перфузии мозг, а также периферические органы удаляют и оценивают содержание метки. Кроме того, связывание немеченых композиций или фагов можно оценить с использованием сходных методов, но окрашивая срезы головного мозга красителем, который распознает амилоид, и красителем, который распознает композицию или фаг.
Интраназальное введение нитевидных фагов также используют, чтобы полностью исследовать композиции, содержащие фаг, такой как фаг, содержащий мутантный дЗр или амилоидсвязывающий фрагмент дЗр, или фаг с увеличенным количеством копий дЗр по отношению к фагу дикого типа, как это предусмотрено в настоящем изобретении. Например, фаг вводят интреназально трансгенным
мышам SWE/APP2576 (Taconic, 10 месячным), которые представляют собой мышиную модель болезни Альцгеймера. Двадцать мкл раствора фага (5х1012/мл) вводят каждые две недели в течение от 4 до 12 месяцев, затем оценивают когнитивные функции. После периода лечения проводят тест на распознавание новых объектов, чтобы оценить влияние обработки фагом на улучшение памяти. В первый день мышей подвергают воздействию двух новых объектов в течение 2 0 минут. На следующий день один объект заменяют, и исследуют поисковое поведение мышей, направленное на исследование нового объекта. Индекс распознавания рассчитывают для каждой мыши путем деления времени, проведенного рядом с новым объектом, на общее время, проведенное рядом с обоими объектами. Таким образом, значения выше 0,5 являются показательными для распознавания старого объекта и проведения большего количества времени возле нового объекта для его исследования.
Другие трансгенные модели заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, также можно применять, чтобы продемонстрировать, что композиция согласно настоящему изобретению снижает уровень амилоида. Неограничивающие примеры включают "D-линию" мышей дефицитных по а-синуклеину (модель болезни Паркинсона, Masliah et al., Science (2000) 287:12651269); мышей Tg2576 (модель болезни Альцгеймера, Hsiao et al. , Science (1996) 274:99-102 и Duyckaerts et al., Acta Neuropathol (2008) 115:5-38 at 9); различные линии мышей Jax(r) для исследования болезни Паркинсона (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME); мышиные и крысиные модели, доступные от JSW Lifescience, включая модели для исследований болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и болезни Хантингтона.
Ожидается, что в этих исследованиях фаг, в котором дЗр был инактивирован, будет неактивным, тогда как фаг дикого типа будет колокализован с амилоидом, снизит нагрузку амилоидом, предотвратит образование амилоида и/или удалит токсичные олигомеры и приведет к улучшению когнитивных функций. Фаг, содержащий дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, как это предусмотрено согласно настоящему изобретению, таким образом,
можно исследовать в условиях in vivo для оценки активности по сравнению с отрицательными и положительными контролями. Фармацевтические композиции
Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложены фармацевтически приемлемые композиции, содержащие любой из описанных выше агентов согласно настоящему изобретению (т.е. (а) дЗр, амилоид связывающий фрагмент дЗр, или его мутанты или варианты, (б) соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие дЗр, амилоид связывающий фрагмент дЗр, или его мутанты или варианты, (в) нитевидный бактериофаг, несущий увеличенное количество копий дЗр по сравнению с фагом дикого типа, (г) носители для дисплея амилоид связывающих фрагментов, несущих дЗр, амилоид связывающий фрагмент дЗр, его мутанты или варианты, или соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты, или (д) модифицированные нитевидные фаги, несущие варианты дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр (не как часть экспрессируемого белка дЗр), мутантов или варианты таких связывающих фрагментов, или гибридные белки или другие гетерологичные полипептиды, которые содержат дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты.
"Фармацевтическая композиция" относится к терапевтически эффективному количеству композиции, как описано в настоящей заявке, с физиологически приемлемым носителем и/или наполнителем. Фармацевтическая композиция не вызывает значительного раздражения в организме. Фразы "физиологически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель", которые могут быть использованы взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения в организме и не нарушает биологической активности и свойств вводимого состава.
Термин "наполнитель" относится к инертному веществу,
добавленному к фармацевтической композиции, чтобы дополнительно
облегчить введение активного ингредиента. Примеры, не
ограничиваясь перечисленными, включают, например,
физиологический раствор, карбонат кальция, фосфат кальция,
различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла, полиэтиленгликоли и поверхностно-активные вещества, включая, например, полисорбат 20.
Фармацевтические композиции для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть приготовлены обычным способом с использованием одного или более физиологически приемлемых носителей, включая наполнители и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных ингредиентов в композиции, которые могут быть использованы фармацевтически. Точный состав зависит от выбранного пути введения и характеристик доставляемого состава (например, белок в сравнении с фагом).
Подходящие пути введения фармацевтических композиций
согласно настоящему изобретению могут, например, включать
введение через слизистую оболочку, в частности интраназальную
доставку; парентеральную доставку, включая внутримышечную,
подкожную, интрамедуллярную, интратекальную,
интравентрикулярную, внутривенную, внутрибрюшинную,
интраназальную или внутриглазную инъекции; пероральную; или ректальную доставку.
Согласно некоторым вариантам реализации фармацевтическую композицию вводят, как правило, локально, а не системно, например, путем инъекции фармацевтической композиции непосредственно в мозг пациента. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения методика инъекции представляет собой любую методику, которая позволяет избежать гематоэнцефалического барьера, например, путем прямого интрамедуллярного, интратекального или внутрижелудочкового введения.
Для выполнения инъекций активные ингредиенты согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Для введения через слизистую в композиции применяют вещества, способствующие проникновению через соответствующий барьер. Такие облегчающие проникновение
вещества в целом известны в данной области техники.
некоторых
вариантах
реализации
фармацевтическую
композицию
согласно
настоящему
изобретению
вводят
интраназальным путем. Сообщается, что интраназальная доставка позволяет осуществлять прямой ввод вирусов и макромолекул в спинномозговую жидкость (ликвор) или ЦНС. Mathison et al, 1998; Chou et al, 1997; Draghia et al, 1995.
Для введения интраназальным путем композиции обычно доставляют в виде аэрозольного спрея из находящейся под давлением упаковки или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например, дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана или диоксида углерода. В случае аэрозоля под давлением единицу дозирования можно определить с помощью клапана для доставки дозированного количества. Капсулы и картриджи, например, желатин для использования в распределительном устройстве, могут быть приготовлены с порошкообразной смесью соединения и пригодной порошковой основой, такой как лактоза или крахмал.
Различные белки, описанные в настоящей заявке в качестве компонентов фармацевтических композиций, также могут быть доставлены в мозг с помощью нейронов обонятельных рецепторов в качестве точки доставки. Например, аденовирусный вектор, содержащий ген, кодирующий любой из этих белков, может быть доставлен с помощью нейронов обонятельных рецепторов. Draghia et al, 1995.
Композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть приготовлены для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. Фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы композиций в водорастворимой форме. Кроме того, суспензии активных ингредиентов могут быть получены в масляных или водных суспензиях для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, триглицериды или липосомы. Водные суспензии для инъекций могут содержать вещества, которые
увеличивают вязкость суспензии, такие как натрий
карбоксиметилцеллюлоза, сорбит или декстран. Необязательно,
суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или
агенты (например, поверхностно-активные вещества, такие как
полисорбат (Твин 20)), которые повышают растворимость активных
ингредиентов, чтобы обеспечить приготовление
высококонцентрированных растворов. Агент на основе белка, такой как, например, альбумин, может быть использован для предотвращения адсорбции М13 на поверхности системы для доставки (т.е. пакет для внутривенных инфузий, катетер, игла, и т.д. ) .
Для перорального введения композиции могут быть легко приготовлены путем комбинирования активных соединений с фармацевтически приемлемыми носителями, хорошо известными в данной области техники.
Составы могут быть представлены в стандартной
лекарственной форме, например, в флаконах, ампулах или в
мультидозных контейнерах, возможно, с добавлением консерванта.
Композиции могут быть в виде суспензий, растворов или эмульсий
в масляных или водных носителях, а также могут содержать
вспомогательные агенты, такие как суспендирующие,
стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Одиночные лекарственные формы могут быть в жидком или твердом виде. Единичные дозированные лекарственные формы могут быть прямо введены пациенту без модификации или могут быть разбавлены или восстановлены перед введением. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения единичные дозированные лекарственные формы могут быть введены в болюсной форме, например, в виде однократной инъекции, однократной дозы, включая дозу для приема внутрь, содержащую несколько таблеток, капсул, пилюль и т.д. В альтернативных вариантах единичные дозированные лекарственные формы могут быть введены в течение определенного периода времени, например, путем инфузий, или с помощью имплантированного насоса, такого как насос для интрацеребрального введения. В последнем варианте реализации настоящего изобретения единичная дозированная лекарственная
форма может быть введена с помощью инфузионного мешка или резервуара насоса, предварительно заполненного указанным количеством нитевидного бактериофага. Кроме того, инфузионный мешок или резервуар насоса могут быть подготовлены непосредственно перед введением пациенту путем смешивания однократной дозы нитевидного бактериофага с раствором инфузионного мешка или резервуара насоса.
Другой аспект изобретения относится к способам получения фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению. Методики приготовления лекарственных препаратов могут быть найдены, например, в "Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, Pa., последнее издание, которое полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Фармацевтические композиции, подходящие для использования применительно к настоящему изобретению, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве эффективном для достижения поставленной цели.
Определение терапевтически или диагностически эффективного количества находится в пределах возможностей специалиста в данной области техники, особенно с учетом подробного описания, приведенного в настоящей заявке.
Дозировку и интервал введения можно корректировать индивидуально, чтобы обеспечить в мозге необходимый уровень носителя фагового дисплея, который достаточен для лечения или диагностики конкретного заболевания головного мозга, расстройства или состояния (минимальная эффективная концентрация, МЭК) . МЭК будет варьироваться для каждого препарата, но может быть оценена на основании данных, полученных в условиях in vitro. Дозировки, необходимые для достижения МЭК, будут зависеть от индивидуальных характеристик.
Интервалы дозирования также можно определить с использованием значения МЭК. Препараты должны быть введены с использованием схемы, которая обеспечивает поддержание уровня в мозге выше МЭК в течение 10-90% времени, предпочтительно от 30 до 90% и наиболее предпочтительно от 50 до 90%.
В зависимости от тяжести и восприимчивости заболевания,
подлежащего лечению, дозирование может быть проведено с применением однократных или многократных введений, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких недель или до тех пор, пока не будет достигнут лечебный эффект или уменьшение болезненного состояния.
Вводимое количество композиции будет зависеть от субъекта, подвергаемого лечению или диагностике, тяжести заболевания по мнению лечащего врача и т.д.
Композиции согласно настоящему изобретению, при желании, могут быть представлены в пакете или распределительном устройстве, например, наборе, одобренном Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США, который может содержать одну или более стандартных дозированных форм, содержащих активный ингредиент. Пакет может, например, содержать металлическую или пластиковую фольгу, такую как блистерная упаковка. Пакет или распределительное устройство могут поставляться в комплекте с инструкцией по введению. Пакет или распределительное устройство могут быть приспособлены для применения с использованием уведомления, связанного с контейнером, в форме, которая предписана правительственным учреждением, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических препаратов, чье уведомление отражает одобрение учреждением формы композиций или применения у человека, или применения в ветеринарии. Такое уведомление, например, может касаться маркировки, утвержденной Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США для лекарственных средств, отпускаемых по рецепту, или одобренного листка-вкладыша. Композиции, содержащие препарат согласно настоящему изобретению, приготовленный в совместимом фармацевтическом носителе, могут быть также приготовлены, помещены в соответствующий контейнер и маркированы как подходящие для лечения указанного заболевания, как подробно описано выше.
Следует понимать, что представленное выше и приведенное далее описание являются только иллюстративными и пояснительными и не ограничивают объем заявленного изобретения.
Терапевтическое применение
Как уже отмечалось, было показано, что нитевидный бактериофаг М13 и родственные нитевидные фаги полезны в животных моделях заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков. См. публикацию патента США US2011/0142803, полностью включенную в настоящую заявку посредством ссылки. В частности, было обнаружено, что нитевидные бактериофаги способны дезагрегировать амилоид, который уже образовался в головном мозге.
Ожидается, что удаление амилоида снизит, замедлит прогрессирование или даже обратит симптомы, связанные с различными заболеваниями, характеризующимися неправильно свернутыми и/или агрегированными белками в головном мозге. См., например, WO2006083795 и WO2010060073, полностью включенные в настоящую заявку посредством ссылки.
Далее, было показано, что М13 дезагрегирует по меньшей мере четыре различных типа амилоидных волокон: волокна бета-амилоида 1-42 (fA|342), волокна а-синуклеина (fasyn), волокна приона дрожжей NM (fNM) и волокна тау-белка (ftau).
Соответственно, другой аспект настоящего изобретения относится к применению любой из композиций согласно настоящему изобретению, например, тех, которые содержат дЗр, домен N1N2, домен N2 или другие амилоид связывающие фрагменты (включая мутантов или варианты всех упомянутых выше белков), или гибридные белки дЗр, носитель дисплея, или фаг, содержащий любой из вышеперечисленных, в лечении заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков, включая, но не ограничиваясь ими, заболевания, связанные с любым из fA|342, fasyn, fNM или ftau.
Применительно к лечению термины "пациент", "субъект" и "реципиент" используются как синонимы и включают людей, а также других млекопитающих. Согласно некоторым вариантам реализации пациентом является человек, который является положительным на наличие биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением сворачивания белков. Согласно одному варианту
пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые ПЭТ с применением флорбетапира.
Термин "лечение" означает уменьшение, замедление или обращение прогрессирования заболевания у пациента, проявляющего один или более клинических симптомов заболевания. "Лечение" также означает уменьшение, замедление или обращение симптомов заболевания у пациента, проявляющего один или более клинических симптомов заболевания. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые ПЭТ с применением флорбетапира, и количество отложений бета-амилоида уменьшается с помощью лечения. В одном варианте реализации настоящего изобретения пациент имеет отложения бета-амилоида, детектируемые с помощью композиций, содержащих дЗр, согласно настоящему изобретению, и количество отложений бета-амилоида уменьшается или поддерживается с помощью лечения. Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения пациент имеет любой тип отложений амилоида, детектируемый ПЭТ, и когнитивная функция пациента улучшается с помощью лечения. Улучшение когнитивной функции может быть исследовано с помощью методов и тестов, приведенных в работе McKhann et al., Alzheimer's and Dementia (2011) May; 7(3) : 263-9 .
"Профилактика" отличается от лечения и относится к введению композиции лицам до проявления каких-либо клинических симптомов. Профилактика с применением любой из композиций, содержащих дЗр и/или TolA, согласно настоящему изобретению включена в объем настоящего изобретения. Профилактическое введение можно применять у лиц, которые, как известно, подвержены повышенному риску заболевания, или у которых заболевание вероятно разовьется, исключительно на основе наличия одного или нескольких генетических маркеров. Многие генетические маркеры были выявлены для различных заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков. Например, лица с одной или более шведскими мутациями, мутацией Индианы или Лондонской мутацией в человеческом белке-предшественнике амилоида (hAPP) имеют повышенный риск раннего начала болезни
Альцгеймера и поэтому являются кандидатами для профилактики. Кроме того, у лиц, в гене хантингтина которых присутствует тринуклеотидный повтор CAG, в частности тех, у кого 3 6 или более повторов, в конечном итоге разовьется болезнь Хантингтона, поэтому они перспективны для профилактики.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения белок или фрагмент применяют непосредственно в качестве терапевтического средства. В этих вариантах дЗр, домен N1N2, домен N2 или другие амилоид связывающие фрагменты (включая мутантов или варианты любого из вышеуказанных) непосредственно включены в фармацевтическую композицию или состав. В других вариантах дЗр, домен N1N2, домен N2 или другой амилоид связывающий фрагмент (включая мутантов или варианты любого из вышеуказанных) являются частью гибридного белка или носителя дисплея, например, фага, и в указанных вариантах предложен гибридный белок или носитель дисплея, который включен в фармацевтическую композицию или состав согласно настоящему изобретению. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения композиция содержит фаг, содержащий дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, который является более эффективным, чем дЗр фага М13 дикого типа в снижении или поддержании уровня амилоида. Согласно некоторым вариантам фаг, который является более эффективным в снижении или поддержании уровня амилоида, чем М13, экспрессирует более 5 копий дЗр.
Термин "нарушение формирования структуры (сворачивания) белка" относится к заболеваниям, характеризующимся образованием амилоидного белка путем агрегации белка амилоида (амилоид образующего пептида), такого как, но не ограничиваясь указанными, (3-амилоид, сывороточный амилоид А, цистатин С, легкая каппа цепь IgG или прионный белок. Заболевания, которые, как известно, связаны с неправильно свернутым и/или агрегированным амилоидным белком, включают болезнь Альцгеймера, которая включает раннее начало болезни Альцгеймера, позднее начало болезни Альцгеймера и предсимптомную форму болезни Альцгеймера, болезнь Паркинсона, амилоидоз САА цистатин С,
наследственный исландский синдром, старость, множественную миелому, прионные заболевания, включая, но не ограничиваясь ими, куру, болезнь Крейтцфельдта-Якоба (CJD), синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу (FFI), скрейпи и губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота (BSE); боковой амиотрофический склероз (БАС), спиноцеребеллярную атаксию (SCA1), (SCA3), (SCA6), (SCA7), болезнь Хантингтона, дентато-рубро-паллидо-льюисову атрофию, спинномозговую мышечную атрофию, наследственную церебральную амилоидную ангиопатию, семейный амилоидоз, лобно-височную долевую дегенерацию (FTLD), включая деменцию лобно-височной доли, британскую/датскую деменцию и семейную энцефалопатию. Композиции, содержащие дЗр согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белков.
Многие из этих заболеваний, связанных с нарушением формирования структуры белка и/или агрегированным амилоидным белком, возникают в центральной нервной системе (ЦНС). Некоторые примеры заболеваний, протекающих в ЦНС, включают болезнь Паркинсона; болезнь Альцгеймера; лобно-височную деменцию (FTD), включая пациентов, имеющих следующие клинические синдромы: поведенческий вариант FTD (bvFTD), прогрессивную, экспрессивную афазию (PNFA) и семантическую деменцию (SD) ; лобно-височные долевые дегенерации (FTLDs); и болезнь Хантингтона. Композиции, содержащие дЗр согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, характеризующихся нарушением формирования структуры белка и/или агрегированным амилоидным белком, которые возникают в центральной нервной системе (ЦНС).
Нарушения формирования структуры и/или агрегации белков также могут происходить за пределами ЦНС. Амилоидоз А (АА) (при котором белок-предшественник представляет собой сывороточный аполипопротеин острой фазы, САА) и множественная миелома (белки-предшественники представляют собой легкую и/или тяжелую цепи иммуноглобулина) представляют собой два широко известных заболевания, связанных с нарушением сворачивания белков и/или
агрегированными белками, которые возникают за пределами
центральной нервной системы. Другие примеры включают
заболевания, в патогенезе которых участвует амилоид,
образованный J3 2-микроглобулином, транстиретином (семейная
амилоидная полинейропатия (САП), семейная амилоидная
кардиомиопатия (САК) и старческий системный амилоидоз (ССА)),
сывороточным (аро)А А, аполипопротеинами AI, АН и AIV,
гельзолином (финская форма семейной амилоидной полинейропатии),
лизоцимом, фибриногеном, цистатином С (церебральная амилоидная
ангиопатия, наследственное внутримозговое кровоизлияние с
амилоидозом, исландский тип), (про)кальцитонином, островковым
амилоидным полипептидом (IAPP амилоидоз), предсердным
натрийуретическим фактором, пролактином, инсулином,
лактадгерином, керато-эпителином, лактоферрином, одонтогенным амелобласт-связанным белком и семеногелином I. Композиции, содержащие дЗр согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения заболеваний, связанных с неправильным формированием структуры и/или агрегацией белков, которые возникают вне ЦНС.
Нейродегенеративные заболевания могут также включать поражения тау-белком. (Рассматриваются в работе Lee et al.
(2001) Annu. Rev. Neurosci. 24:1121-159). Тау-белки представляют собой ассоциированные с микротрубочками белки, экспрессирующиеся в аксонах нейронов центральной и периферической нервной системы. Нейродегенеративные таупатии
(иногда называемые таупатии) включены в область настоящего изобретения. Примеры таупатий включают болезнь Альцгеймера, комплекс боковой амиотрофический склероз/паркинсонизм-деменция, деменцию с аргирофильными гранулами, кортикобазальную дегенерацию, болезнь Крейтцфельда-Якоба, деменцию боксеров, диффузные нейрофибриллярные клубки с кальцификацией, синдром Дауна, лобно-височную деменцию, включая лобно-височную деменцию с паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17, синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, болезнь Галлервордена-Шпатца, миотоническую дистрофию, болезнь Нимана-Пика типа С, негуамское заболевание двигательных нейронов с нейрофибриллярными
клубками, болезнь Пика, постэнцефалитический паркинсонизм, прионную церебральную амилоидную ангиопатию, прогрессирующий подкорковый глиоз, прогрессирующий супрануклеарный паралич, подострый склерозирующий панэнцефалит и старческую деменцию только с нейрофибриллярными клубками. Некоторые из этих заболеваний могут также включать отложения фибриллярного бета-амилоидого пептида. Например, при болезни Альцгеймера выявляют как отложения бета-амилоида, так и поражения тау-белками. Аналогичным образом, опосредованные прионами заболевания, такие как болезнь Крейтцфельдта-Якоба, прионная церебральная амилоидная ангиопатия и синдром Герстманна-Штраусслера-Шейнкера, могут сопровождаться поражениями тау-белками. Таким образом, указание того, что заболевание представляет собой "таупатию" не следует толковать как исключающее заболевание из других классификаций нейродегенеративных заболеваний или групп, которые приведены исключительно для удобства. Композиции, содержащие дЗр согласно настоящему изобретению, можно применять для лечения нейродегенеративных заболеваний, а также заболеваний, включающих поражения тау-белками.
В одном варианте реализации настоящего изобретения
фармацевтическая композиция или состав предназначены для
применения согласно способу снижения уровня амилоида у
пациента, проявляющего симптомы, связанные с наличием амилоида,
или у пациента, положительного в отношении биомаркера,
ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением
формирования стрктуры белков, такого как флорбетапир (AV-45,
Eli Lilly), где способ включает введение пациенту эффективного
количества фармацевтической композиции или состава, как описано
в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего
изобретения способ введения выбирают из интратекальной
инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции,
интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу поддержания уровня амилоида у пациента, проявляющего симптомы, связанные с наличием амилоида,
или у пациента, положительного в отношении биомаркера,
ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением
формирования стрктуры белков, такого как флорбетапир (AV-45,
Eli Lilly), где способ включает введение пациенту эффективного
количества фармацевтической композиции или состава, как описано
в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего
изобретения способ введения выбирают из интратекальной
инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции,
интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения
фармацевтическая композиция или состав предназначены для
применения согласно способу дезагрегации амилоида у пациента,
включающему введение пациенту, имеющему амилоид, эффективного
количества фармацевтической композиции или состава, как описано
в настоящей заявке. В одном варианте реализации настоящего
изобретения способ введения выбирают из интратекальной
инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции,
интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу дезагрегации отложений бета-амилоида в головном мозге, включающему введение с помощью инъекции непосредственно в мозг пациента, нуждающегося в таком лечении, эффективного количества фармацевтической композиции, как описано в настоящей заявке, тем самым вызывая уменьшение отложений бета-амилоида в мозге.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав предназначены для применения согласно способу уменьшения образования амилоида в головном мозге. Уменьшение образования амилоида в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу усиления клиренса амилоида в головном мозге. Усиление клиренса амилоида может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу ингибирования агрегации амилоида в головном мозге. Ингибирование агрегации амилоида в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу выведения токсичных амилоидных олигомеров в головном мозге. Выведение токсичных амилоидных олигомеров в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу предотвращения образования токсичных амилоидных олигомеров в
головном мозге. Предотвращение образования токсичных олигомеров в мозге может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки.
В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическая композиция или состав согласно настоящему изобретению предназначены для применения согласно способу защиты нейронов от повреждения амилоидом. Защита нейронов от повреждения амилоидом может предотвратить, излечить или уменьшить симптомы или тяжесть заболевания, связанного с нарушением сворачивания белков, или нейродегенеративного заболевания. В одном варианте реализации настоящего изобретения способ введения выбирают из интратекальной инъекции, прямой внутрижелудочковой инъекции, интрапаренхимальной инъекции или интраназальной доставки. В одном варианте реализации настоящего изобретения фармацевтическую композицию или состав согласно настоящему изобретению для применения для защиты нейронов от повреждения амилоидом вводят в профилактических целях.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент является положительным в отношении биомаркера, ассоциированного с заболеванием, связанным с нарушением сворачивания и/или агрегацией белков. В одном варианте реализации биомаркер представляет собой флорбетапир (AV45, Eli Lilly).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент проявляет симптомы нейродегенеративного заболевания, связанного с наличием амилоида. В различных вариантах реализации настоящего изобретения амилоид представляет собой любой из fA|342, fasyn, fNIVl или ftau.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь
Хантингтона. В одном варианте реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера. В одном варианте реализации настоящего изобретения нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера и пациент имеет бета-амилоид, детектируемый с помощью визуализирующего агента флорбетапира (AV -45, Eli Lilly).
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения пациент проявляет симптомы прион-опосредованного заболевания.
Согласно некоторым вариантам прион-опосредованное заболевание выбирают из болезни Крейтцфельдта-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницы или синдрома Герстманна-Штреусслера-Шейнкера.
Согласно некоторым вариантам пациент проявляет симптомы
нейродегенеративной таупатии, кроме болезни Альцгеймера.
Согласно некоторым вариантам заболевание, подлежащее лечению,
выбирают из деменции с аргирофильными гранулами,
кортикобазальной дегенерации, деменции боксеров, диффузных
нейрофибриллярных клубков с кальцификацией, синдрома Дауна,
лобно-височной деменции, включая лобно-височную деменцию с
паркинсонизмом, связанным с хромосомой 17, болезни
Галлервордена-Шпатца, миотонической дистрофии, болезни Ниман-
Пика типа С, негуамовской болезни двигательных нейронов с
нейрофибриллярными клубками, болезни Пика,
постэнцефалитического паркинсонизма, прогрессирующего
подкоркового глиоза, прогрессирующего супрануклеарного паралича, подострого склерозирующего панэнцефалита и старческой деменции только с нейрофибриллярными клубками.
Диагностика
В другом аспекте изобретения композиции дЗр и TolA, описанные в настоящей заявке, включая гибридные белки дЗр, применяют в диагностических целях, связанных с различными заболеваниями, описанными в настоящей заявке. Например, связывание композиции согласно настоящему изобретению при применении в качестве визуализирующего агента в условиях in
vivo или in vitro может быть частью диагностики одного из описанных заболеваний, связанных с нарушением сворачивания белков.
Диагностические агенты, иначе упоминаемые в настоящей заявке как диагностические композиции, включены в область настоящего изобретения, и могут содержать любой из вышеописанных агентов согласно настоящему изобретению (т.е. (а) дЗр, амилоидсвязывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты; (б) соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты; (в) нитевидный бактериофаг, несущий увеличенное количество копий дЗр по сравнению с фагом дикого типа; (г) носитель для дисплея амилоид связывающих белков, несущий дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, его мутанты или варианты, или соединения, полипептиды и гибридные белки, содержащие дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты, или (д) модифицированный нитевидный фаг, несущий варианты дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр (не как часть экспрессируемого белка дЗр), мутанты или варианты таких связывающих фрагментов, или гибридные белки или другие гетерологичные полипептиды, которые содержат дЗр, амилоид связывающие фрагменты дЗр, или его мутанты или варианты. Диагностический агент может дополнительно содержать детектируемую метку, или, в другом случае, может детектироваться в условиях in vivo.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения композицию согласно настоящему изобретению, например, композицию, содержащую растворимый дЗр или амилоид связывающий фрагмент (включая его мутанты и варианты), или гибридный белок дЗр, применяют в качестве агента, визуализирующего амилоид. Визуализирующий агент может детектировать амилоид и диагностировать заболевания, связанные с амилоидом.
Поскольку композиции согласно настоящему изобретению связывают амилоид независимо от типа волокна, их преимущество заключается в том, что они могут визуализировать любой агрегат
амилоида (бета-амилоид, тау, а-синуклеин и т.д.), все с помощью одного визуализирующего агента. В настоящее время отсутствуют приемлемые визуализирующие агентов/методы для детектирования агрегатов тау-белков или альфа-синуклеина в ЦНС. Хотя существуют визуализирующие агенты для бета-амилоида, все еще существует необходимость в дополнительных агентах, которые могут обеспечить улучшенную корреляцию между когнитивной функцией и результатами визуальных исследований и/или обеспечивают лучший прогноз того, состояние каких пациентов ухудшится в сопоставлении с сохранением стабильности. См. для обзора Resnick and Sojkova, Alzheimer's Res Ther. (2011) 3(1) :3.
Диагностические композиции согласно настоящему изобретению можно применять в качестве визуализирующих агентов в комбинации с визуализирующим агентом, который является специфичным для бета-амилоида, таким как, например, F18-AV-45, Eli Lilly. Поскольку в настоящее время нет известных визуализирующих агентов для агрегатов бета-амилоида, применение диагностической композиции согласно настоящему изобретению вместе с визуализирующим агентом приведет к детектированию агрегатов бета-амилоида на основе дифференциального детектирования. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения диагностическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве визуализирующего агента в комбинации с визуализирующим агентом для бета-амилоида для детектирования агрегатов, не включающих бета-амилоид.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения диагностическую композицию согласно настоящему изобретению применяют в качестве визуализирующего агента для обнаружения бета-амилоида в центральной нервной системе, включая мозг.
Для диагностической композиции согласно настоящему изобретению обычно требуется, чтобы амилоид связывающий компонент был присоединен к одной или более детектируемых меток, когда он используется в качестве визуализирующего
агента. Различные метки могут быть прикреплены к амилоид связывающему компоненту диагностической композиции, используя стандартные методы введения метки в пептиды. Примеры меток включают флуоресцентные метки и радиоактивные метки. Существуют самые разнообразные радиоактивные метки, которые можно применять, но в целом метку обычно выбирают из радиоактивных меток, которые включают, но не ограничиваются указанными, 18F, 11С и 1231. Эти и другие радиоизотопы могут быть присоединены к белку с использованием хорошо известных химических способов. В одном варианте реализации настоящего изобретения метку детектируют с использованием позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).
Однако для детектирования радиоактивной метки можно использовать любую другую подходящую методику для детектирования радиоизотопов.
Диагностические композиции согласно настоящему изобретению можно вводить, используя те же пути, которые описаны для терапевтических композиций. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения в качестве пути введения диагностической композиции применяют интратекальное введение. Согласно другому варианту в качестве пути для введения диагностической композиции применяют внутривенное введение.
Примеры
Несмотря на то, что продемонстрированная терапевтическая
эффективность нитевидных фагов в качестве связывающих и
антиагрегационных агентов не зависит от какого-либо конкретного
механизма действия, понимание механизма позволяет разрабатывать
фаги с большей терапевтической эффективностью. Кроме того, он
является основой для разработки дополнительных
антиагрегационных агентов.
Как отмечалось ранее, было показано, что М13 связывается и вызывает дезагрегацию по меньшей мере четырех различных типов амилоидных волокон: волокон бета-амилоида 1-42 (fA|342), волокон а-синуклеина (fasyn), волокон приона дрожжей NM (fNM) и волокон тау-белка (ftau). Четыре белка, которые входят в состав этих
амилоидных волокон, имеют неродственные первичные
аминокислотные последовательности, но все четыре белка неправильно свернуты с образованием канонической амилоидой структуры. Eichner and Radford, 2011. Способность М13 связываться с этими белками и вызывать дезагрегацию каждого из них указывает на то, что М13 распознает структурный участок, такой как кросс-бета-складчатая конформация или конформационный элемент, такой как гидрофобные щели, которые являются определяющими характеристиками всех амилоидных волокон.
Однако дезагрегация амилоида не является общим свойством всех фагов. Например, структурно отличный икосаэдрический фаг Т7 не вызывает дезагрегации fA|342, даже когда Т7 инкубируют с fA|342 в течение 3 дней при 37°С. Бактериофаг Т7 не проявил какой-либо диссоциативной активности даже в концентрациях, при которых М13 диссоциирует более 70% амилоидных волокон, проинкубированных с ним. Напротив, бактериофаг fd, который несет отрицательно заряженную аминокислоту в его д8р по сравнению с М13 (и, следовательно, отображает в 2800 больше отрицательных зарядов/фаг, чем М13, учитывая количество копий
д8р) , связывал и вызывал дезагрегацию fA|342 сходно с М13. Эти начальные исследования вместе с выводом, что дезагрегация амилоида может также быть опосредована вирусом табачной мозаики (ВТМ), фимбриями Е. Coli и трубками хвоста Т4, все из которых также имеют спиральную цилиндрическую форму и повторяющиеся блоки (см. патент США 2011/0182948), позволяют предположить, что форма фага может быть критической для его активности в отношении диссоциации волокон амилоида.
Однако следующие примеры описывают альтернативный (хотя и не взаимоисключающий) механизм обнаруженного связывания и антиагрегационных свойств нитевидных фагов. На основании данных примеров и механизма действия, который они поддерживают, в настоящем изобретении предложены модифицированные фаги с улучшенным связыванием с амилоидом наряду с новыми амилоидсвязывающими агентами.
Пример 1: Фаг М13 преимущественно связывает фибриллы бета
амилоида
Связывание М13 с фибриллами бета-амилоида по сравнению с мономерами бета-амилоида определяли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR).
Фаг М13 преимущественно связывает фибриллы бета-амилоида; он не связывает мономеры бета-амилоида. Результаты исследования методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием 1014 фага/мл раствора, протекающего через чип биосенсора с иммобилизованным fA|3, приведены на фиг. 3. На фиг. 3 показано, что KD связывания М13 составляет приблизительно 4 нМ, что сопоставимо со связыванием бета-амилоида моноклональным антителом. Это высокоаффинное взаимодействие показывает, что между фагом и амилоидным волокном происходит процесс специфического связывания.
Пример 2: Связывание М13 с волокнами бета-амилоида зависит от дозы
Связывание М13 с fA|342 также зависит от дозы. На фиг. 4А приведено сравнение связывания фагов, взятых в двух дозах, с fA|342 при увеличении количества моль амилоида. В этом исследовании связывания М13 с волокнами амилоида меченый М13-А1еха488 смешивали с бета-амилоидом (f А|3) в течение 2-3 часов, чтобы обеспечить образование комплекса, затем комплекс осаждали центрифугированием при 7500 оборотах в минуту в течение 10 минут. Интенсивность флуоресценции в осадке была пропорциональна количеству М13, связанному с амилоидом. Это исследование обеспечивает как количественную оценку связывания фага с fA|3, так и систему для оценки способности других агентов конкурировать с фагом за связывание. На фиг. 4В показано, что величина KD для конкурентного связывания М13 сопоставима с той, которую наблюдали для связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса.
Пример 3: Связывание М13 с волокнами бета-амилоида требует нативной конформации
Когда фаг М13 нагревают при 90°С в течение 10 минут, его способность конкурировать за связывание по существу исчезает.
На фиг. 5 приведены результаты исследования конкурентного связывания с волокнами амилоида с использованием термически обработанных фагов М13 (квадраты) по сравнению с фагами в нативной конформации (кружки).
Пример 4: Температура коррелирует с взаимодействиями М13-амилоид
М13 активно дезагрегирует амилоидные волокна. На фиг. 8 приведены результаты флуориметрического исследования с использованием тиофлавина Т (ТФТ) и fAJ3. В присутствии М13 волокна fA|342 подвергаются дезагрегации.
На фиг. 7А показано, что 10-кратное изменение концентрации соли в исследовании флуоресценции ТФТ (от 0,15 до 1,5 М)
приводит только к 2-3 кратному процентному изменению fA|3, который подвергается дезагрегации. Это означает, что гидрофобные взаимодействия отвечают за большую часть наблюдаемой дезагрегации.
В отличие от относительно небольшого эффекта концентрации соли, как показано на фиг. 7В, изменения температуры от 4°С до 37°С приводят к 8-10-кратному различию уровней дезагрегации.
Эти результаты показывают, что М13-индуцированная дезагрегация зависит от белка, который является более активным при более высокой температуре и относительно нечувствительна к воздействию соли в исследовании, что подразумевает гидрофобное взаимодействие. Фаг дЗр соответствует этому определению. Его домены N1 и N2 связаны между собой гибким линкером, обогащенным глицином, который "открывается" после связывания N2 с бактериальными F-фимбриями. Затем N1 становится доступным для связывания бактериального корецептора, как части инфекционного процесса. Повышение температуры в исследовании дезагрегации, как ожидается, "открывает" домены N2 и N1 белка дЗр.
В то время как инактивация М13 при высокой температуре (90°С, 10 минут, см. фиг. 5) устраняет связывание, повышение температуры инкубации в исследовании связывания М13-амилоид оказывает положительное влияние на связывание. На фиг. 8А показано, что увеличение температуры от 18°С до 58°С приводит к
прогрессивному улучшению, вплоть до разворачивания шарнирной области при Тпл около 50°С, в этой точке связывание начинает уменьшаться. Эта оптимальная температура связывания соответствует температуре разворачивания N1-N2 (так называемая температура плавления или Тпл) в дЗр, которая составляет 48,1°С.
Повышение температуры инкубации до 50°С по сравнению с 37°С также приводит к более быстрому связыванию М13 с fA|342 (фиг. 8В) .
Пример 5: Для взаимодействия М13 с бета-амилоидом требуется дЗр
Чтобы непосредственно проверить, требуется ли дЗр для взаимодействия М13 с бета-амилоидом, дЗр был удален из фага путем протеолитической обработки с применением ArgC (M13Ag3p), и фаг М13АдЗр сравнивали с повторно свернутым фагом для определения связывания с бета-амилоидом. Обработка с применением ArgC, протеазы Bacillus, избирательно удаляет субъединицы дЗр из фага. Результаты представлены на фиг. 9А. Повторно свернутый М13 по-прежнему конкурирует с М13 дикого типа в исследовании конкурентного связывания, хотя на сниженном уровне. Тем не менее, даже 15-кратный избыток М13ДдЗр незначительно конкурирует либо вообще не конкурирует с М13 дикого типа. Эта неспособность конкурировать с М13 дикого типа согласуется с потерей инфицирующей способности фага М13ДдЗр (фиг. 9В). Обработка ArgC также привела к потере дезагрегирующей активности (фиг. 9С).
Если дЗр выступает в качестве посредника при связывании
способом, который аналогичен его роли в инфицировании, то
домены N1 и N2, которые важны для инфицирования, также должны
конкурировать с М13 за связывание. Чтобы проверить это
рекомбинантный растворимый N1N2 ("rs-g3p(N1N2)"; "Конструкция
3") получали и испытывали в исследовании конкурентного
связывания. Как показано на фиг. 10А и 10В, М13 конкурирует с
меченым М13 за связывание с fA|342, тогда как М13ДдЗр - нет. В
противоположность этому, rs-g3p(NlN2) был способен
конкурировать с М13, это указывает на то, что наличия доменов N1 и N2 дЗр достаточно для связывания бета-амилоида. Аналогичные результаты были получены при повторении исследования конкурентного связывании (фиг. 10В).
Пример 6: Мутации, вызывающие разворачивание шарнирной области дЗр, модулируют связывание амилоида
Мутации, которые влияют на способность шарнирной области между доменами N1 и N2 в дЗр открываться, также должны повлиять на способность фага, несущего эти мутации, конкурировать с М13 дикого типа за связывание с бета-амилоидом. В работе Eckert and Schmid, 2007 описаны несколько вариантов фагов, которые были использованы для проверки этой гипотезы. Вариант "ААА" (также известный как "ЗА") ухудшает связывание с фимбриями и уменьшает стабильность домена N2. AAA несет следующие мутации в дЗр: W181A, F190A и F194A. IIHY содержит мутации T13I, T101I, Q129H и D2 0 9Y, которые стабилизируют домен N2 и увеличивают Тпл.
Конкурентное связывание оценивали для фага fd, который имеет ту же аминокислотную последовательность, что и дЗр М13 в доменах N1 и N2 (фиг. 2); IIHY, который имеет более высокую Тпл шарнирной области, чем М13 и AAA. Фаги fd, AAA и IIHY предварительно активировали при 50°С в течение 1,5 ч, затем активированные и неактивированные fd, AAA и IIHY сравнивали по их способности конкурировать с меченым М13. Результаты представлены на фиг. 11. Фаг fd дикого типа имел лучшую конкурентную активность при активировании нагреванием. Напротив, нагрев оказывал незначительное влияние на IIHY, который имеет более высокую Тпл шарнирной области. AAA, который имеет сниженную стабильность домена N2 по сравнению с М13, демонстрировал лучшую конкурентную активность как с предварительной термической обработкой, так и без нее.
Эти данные подтверждают вывод о том, что взаимодействие М13 с бета-амилоидом осуществляется через механизм аналогичный тому, с помощью которого М13 инфицирует бактерии. Во-первых, они показывают, что гидрофобные взаимодействия важны для взаимодействия М13 и бета-амилоида. Во-вторых, температурная
зависимость связывания М13 и дезагрегирующей активности отражает Тпл разворачивания шарнирной области N1-N2. В-третьих, селективный протеолиз дЗр устраняет взаимодействие М13 и бета-амилоида .
Пример 7: Фрагмент дЗр селективно и активно связывает амилоид, но не его мономеры
Для того чтобы оценить, сохраняет ли фрагмент дЗр способность к связыванию с амилоидом, получали фрагмент дЗр, содержащий N1 и N2, и исследовали методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) его способность связывать фибриллы бета-амилоида по сравнению с мономерами бета-амилоида. Результаты показывают, что rs-g3p(NlN2) преимущественно связывает фибриллы бета-амилоида, но не связывает мономеры бета-амилоида. Результаты исследования методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием 4 мкМ rs-g3p(NlN2) приведены на фиг. 13, из которого следует, что KD связывания rs-g3p(NlN2) составляет около 160 нМ. Это высокоаффинное взаимодействие указывает на то, что между rs-g3p(NlN2) и амилоидными волокнами происходит процесс специфического связывания.
Дополнительные конструкции исследовали методом
поверхностного плазмонного резонанса. Результаты представлены в таблице ниже.
Аналиты
ка (1/М"с)
ко! (1/с)
Конструкция 1 М13
2, беЗ
9,2е-б
3,59
Конструкция 3 rs-G3P(N1N2), 25°С
1, 5еЗ
2,4е-4
0, 15
мкМ
Конструкция 3
rs-G3P(N1N2), предварительно
4, 1еЗ
2е-4
0, 05
мкМ
нагревали при 37°С
Конструкция 4 гибридный белок
rs-g3p
1,75е4
1,28е-4
7, 32
(N1N2)-h!gG4Fc, 25°С
Для того чтобы проверить, может ли фрагмент дЗр дезагрегировать амилоидные волокна, rs-g3p(NlN2) исследовали флуориметрическим методом с использованием ТФТ, чтобы оценить его способность разлагать образованные ранее фибриллы fA|342. Результаты показывают, что rs-g3p(NlN2) активно дезагрегирует fA|342. На фиг. 14А приведены результаты этого эксперимента, которые показывают, что rs-g3p(NlN2) дезагрегирует fA|342 дозазависимым образом. Как показано на фиг. 14В, величина ИК50 составляет приблизительно 2 0 нМ.
В отдельном эксперименте А|342 инкубировали в присутствии или в отсутствие rs-g3p(NlN2) в концентрации 2 мкМ в течение семи дней при 37°С, и целостность волокон А|342 оценивали с помощью просвечивающей электронной микроскопии. На фиг. 15А приведены результаты этого эксперимента, показывающие, что rs-g3p(NlN2) дезагрегирует волокна А|342. На фиг. 15В приведены результаты исследования с использованием ТФТ на этих же образцах. Rs-g3p(NlN2) разрушал образованные ранее волокна А|342 в этом исследовании с использованием ТФТ.
Пример 9: rs-g3p(NlN2) блокирует сборку а-синуклеина и бета-амилоида и rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc блокирует сборку и ингибирует агрегацию бета-амилоида
Чтобы определить, может ли дЗр блокировать сборку волокон а-синуклеина, а также определить, имеет ли значение валентность дЗр (то есть, число копий дЗр), было проведено исследование способности пентамерного дЗр (5 копий дЗр) и мономерного дЗр (одна копия дЗр) блокировать активность а-синуклеина.
Результаты показывают, что дЗр блокирует сборку волокон ос-синуклеина, и в отношении этого вида активности пентамерный дЗр является более эффективным, чем мономерный дЗр. См. фиг. 16.
Также была проведена оценка способности rs-g3p(NlN2) (конструкция 3) и rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция 6) ингибировать сборку А|342. Как показано на фиг. 30 и фиг. 31, конструкция 3 и конструкция б способны дозазависимо ингибировать сборку А|342. Как показано на фиг. 37, конструкция
3 и конструкция б способны ингибировать агрегацию fA|342.
Пример 10: Гибридный белок rs-g3p(N1N2)-1д связывает и дезагрегирует бета-амилоид
Для того чтобы оценить, влияет ли валентность дЗр на активность связывания дЗр с амилоидом был получен гибридный белок Ig, который двухвалентен в отношении rs-g3p(NlN2)
(гибридный белок "дЗр(N1N2)-1д"), и его способность связываться с волокнами бета-амилоида была сопоставлена с таковой для пятивалентного М13. Как показано на фиг. 17, гибридный белок rs-g3p(N1N2)-1д связывается с бета-амилоидом с аффинностью, которая близка к таковой для М13, и является более активным, чем rs-g3p(NlN2) по отдельности, это указывает на то, что валентность дЗр может иметь важное значение. Аналогичные результаты были получены при повторении исследования конкурентного связывания. См. фиг. 18. На фиг. 18 квадраты представляют конструкцию 2 (М13); треугольники представляют конструкцию 3 (rs-g3p(N1N2)); перевернутые треугольников представляют конструкцию 4 (гибридный белок rs-g3p(N1N2)-1д); и ромбы представляют собой отрицательный контроль r-IgG4 Fc.
Для того чтобы оценить, влияет ли валентность на дезагрегацию, бивалентный гибридный белок rs-g3p(N1N2)-1д
("конструкция 4") сравнивали с пентавалентным М13 с помощью метода ловушки на фильтре. См. фиг. 19. Результаты показывают, что как двухвалентный гибридный белок rs-g3p(N1N2)-Ig, так и пентавалентный М13 активно дезагрегируют волокна бета-амилоида. Также показано, что валентность играет важную роль в активности дезагрегации, о чем свидетельствует способность 1,7 нМ
пентавалентного М13 снижать уровень агрегатов до величины близкой к таковой для 40 нМ гибридного белка rs-g3p(N1N2)-Ig. См. фиг. 19.
В аналогичном исследовании 1х1012/мл М13 (конструкция 2); 80 нМ и 800 нМ rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 5); и 80 нМ и 800 нМ rs-дЗр(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) исследовали с помощью метода ловушки на фильтре, чтобы определить их способность дезагрегировать волокна А|342. Конструкции 2, 5, и б активно дезагрегируют волокна бета-амилоида. См. фиг. 33.
Пример 11: Тетрамерный белок стрептавидин-[биотин-
g3p(NlN2)] связывает и дезагрегирует fAP
Для того чтобы дополнительно оценить влияние валентности на способность дЗр связывать и дезагрегировать амилоид, тетрамерный стрептавидин, конъюгированный с g3p(NlN2), получали путем комбинирования rs-g3p(NlN2) с комплексом биотин-лизин-нитрилотриуксусная кислота в присутствии NiS04. Избыток лиганда удаляли с помощью мембраны MWCO 3 кДа. Добавляли стрептавидин, и избыток rs-g3p(N1N2)-биотин удаляли с помощью мембраны MWCO 100 кДа. Полученная конструкция дЗр, стрептавидин-[биотин-g3p(NlN2)], имеет четыре фрагмента rs-g3p(N1N2). Стрептавидин-[биотин-дЗр(N1N2)] сравнивали с rs-g3p(NlN2) ("конструкция 3") в исследовании конкурентного связывания. См. фиг. 20. Тетрамерный стрептавидин-[ биотин-дЗр (N1N2) ] связывал f AJ3 более активно, чем мономерный rs-дЗр(N1N2), это дополнительно подтверждает, что валентность имеет важное значение для активности связывания. См. фиг. 20. Тем не менее, даже мономерный rs-g3p(NlN2) связался с f AJ3 в терапевтически приемлемых концентрациях.
Для того чтобы оценить влияние валентности на дезагрегацию, мономерный rs-g3p(NlN2) сравнивали с тетрамерным стрептавидин-[биотин-дЗр(N1N2)] с помощью метода ловушки на фильтре. См. фиг. 21. Результаты показывают, что как мономерный rs-g3p(N1N2), так и тетрамерный стрептавидин-[биотин-дЗр(N1N2)]
активно дезагрегируют волокна f AJ3. Также показано, что валентность может играть важную роль в активности дезагрегации,
о чем свидетельствует более высокая способность 360 нМ тетрамерного стрептавидин-биотин-[дЗр(N1N2)] устранять агрегаты fAJ3 массой до 200 нг по сравнению со сниженной активностью 2,5 мкМ мономерного rs-g3p(NlN2) дезагрегировать бета-амилоид. См. фиг. 21, ряд 2 по сравнению с рядом 4, например.
Дезагрегацию бета-амилоида под действием стрептавидин-[биотин-дЗр(N1N2)] также оценивали с помощью ПЭМ. Стрептавидин-
[ биотин-дЗр (N1N2) ] полностью дезагрегировал fA|342 после трех дней инкубации. См. фиг. 22.
Пример 12: Гибридный белок N1N2-Ig значительно снижает уровень бета-амилоида в мышиной модели болезни Альцгеймера
Используя хорошо известную мышиную модель для исследования болезни Альцгеймера (Hsiao et al. , Science (1996) 274:99-102; Duyckaerts et al. , Acta Neuropathol (2008) 115:5-38), самцов мышей Tg257 6 выращивали до возраста более 500 дней, затем в гиппокамп билатерально вводили (2 мкл/инъекцию) два различных препарата гибридного белка N1N2-Ig (конструкцию 5 в концентрации 7,8 пг/инъекцию и конструкцию б в концентрации 8,2 г/инъекцию) или физиологический раствор в качестве отрицательного контроля, мышей умерщвляли на 7-й день. Ткань мозга собирали, готовили срезы и окрашивали для количественной оценки нагрузки амилоидными бляшками с использованием моноклональных антител к бета-амилоиду (82Е1; каталожный номер MBS490005-IЛ0323 от MyBioSource) . Как показано на фиг. 28, оба гибридных белка N1N2-Ig значительно уменьшали нагрузку бляшками, измеренную в гиппокампе, по сравнению с нагрузкой у мышей, которым вводили физиологический раствор. Как показано на фиг. 29, оба гибридных белка N1N2-Ig значительно уменьшали нагрузку бляшками, измеренную в коре головного мозга, по сравнению с нагрузкой у мышей, которым вводили физиологический раствор.
Пример 13: Гибридный белок N1N2-Ig блокирует цитотоксичность, индуцированную олигомерами бета-амилоида
Олигомеры бета-амилоида вызывают высвобождение некоторых токсических ферментов в нервных клетках. Можно провести
исследование высвобождения ферментов, чтобы определить,
ингибирует ли соединение цитотоксичность, индуцированную
олигомерами бета-амилоида. На фиг. 32 представлены
репрезентативные данные, показывающие, что М13 (конструкция 2)
и rs-g3p(N1N2)-hlgGl-Fc (конструкция б) блокируют
цитотоксичность, индуцированную олигомерами бета-амилоида в клетках линии N2a. Поэтому фрагменты дЗр являются мощными ингибиторами цитотоксичности, индуцированной олигомерами бета-амилоида .
Пример 14: Гибридный белок N1N2-Ig связывает и дезагрегирует тау-белок
Для того чтобы оценить, связывается ли фрагмент дЗр с тау-белком был получен гибридный белок фрагмент дЗр-Ig, содержащий N1 и N2, и его способность связывать фибриллярный тау-белок оценивали методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR). На фиг. 35 приведены результаты одного репрезентативного исследования методом SPR, которые показывают, что rs-g3p(N1N2)-hIgG4-Fc (конструкция 4) активно связывает фибриллярный тау-белок .
Чтобы проверить, может ли фрагмент дЗр дезагрегировать тау-белок, гибридный белок фрагмент дЗ-Ig, содержащий N1 и N2, исследовали флуориметрическим методом с использованием ТФТ, чтобы оценить его способность разрушать образованные ранее агрегаты фибриллярного тау-белка. Результаты показывают, что гибридный белок N1N2-Ig активно дезагрегирует фибриллярный тау-белок. См. фиг. ЗбА и фиг. ЗбВ.
Пример 15: Гибридный белок N1N2-Ig ингибирует накопление PrPSc, агрегацию и образование PrPSc в клеточной модели прионного заболевания (N2a22LSc)
Прионные заболевания характеризуются превращением нормального клеточного прионного белка (РгРс) в устойчивую к действию протеазы патологическую форму PrPSc. PrPSc отличают от РгРс на основании устойчивости к действию протеазы: протеаза частично разрушает PrPSc с образованием устойчивого к действию протеазы С-концевого основного фрагмента (PrPres), который имеет негликозилированную форму с молекулярной массой 19-21
кДа. Ингибирование, реверсия и снижение уровня PrPSc представляют собой целесообразные терапевтические подходы к лечению ряда дегенеративных заболеваний.
Чтобы определить, нарушает ли гибридный белок фрагмент дЗр-Ig, содержащий N1 и N2 (конструкция б) , образование патологических прионных конформеров (PrPSc) в моделях прионных заболеваний in vitro, а также для проверки степени дезагрегации или изменения растворимости РгР в клетках линии N2a22LSc в присутствии или в отсутствие конструкции б, клетки культивировали в течение 24 ч в отсутствие или в присутствии 1 мкг/мл конструкции б или IgG и собирали в буфере для лизиса. 100 мкг общего белка ультрацентрифугировали при 4°С в течение 90 мин при 55000 оборотах в минуту в роторе TLA 100.1 в ультрацентрифуге Beckman Optima TL. По 25 мкл образцов солюбилизированной клеточной массы и супернатантов подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и далее исследовали с помощью мАт антитела к РгР 6D11. Увеличение нерастворимости в детергенте предшествует приобретению устойчивости мутантами PrPSc или РгР к действию протеиназы К (ПК), поэтому была проведена оценка способности конструкции б изменять растворимость РгР. Клетки, обработанные конструкцией б, демонстрировали существенно сниженное количество агрегированного/нерастворимого РгР по сравнению с обработанными IgG клетками линии N2a22LSc. См. фиг. 38А и фиг. 38В.
Для экспериментов, результаты которых приведены на фиг. 38А и 38В, клетки N2a22LSc получали, как описано ранее (Pankiewicz et al. , Eur. J. Neurosci. (2006) 23:2 635-2 647). В общих чертах, мозг неизлечимо больных мышей CD-I, инфицированных штаммом приона 22L, адаптированным для мышиной модели, гомогенизировали путем ультразвуковой обработки (10% масса/объем) в холодном фосфатно-солевом буфере (ФСБ) с 5% декстрозы в стерильных условиях. Для инфицирования гомогенат мозга далее разбавляли до 2% в Opti-MEM и добавляли в 6-луночные планшеты с субконфлюентной культурой (Corning, Acton, Массачусетс, США), 1 мл в 10 см2 лунку. Через 5 ч добавляли 1
мл обычной MEM, и клетки инкубировали в присутствии гомогената
инфицированного головного мозга в течение еще 12 ч. Клетки
промывали и добавляли стандартную ростовую среду MEM. Клетки
выращивали до достижения конфлюентности и затем разделяли на
разведения в соотношении 1:2 и переносили в 2 5 см2 колбы
(Corning). Клетки, выращенные в одной из колб, разделяли в
соотношении 1:2 каждые 4 дня, чтобы получить следующий пассаж,
тогда как клетки, выращенные в другой колбе, собирали и
гомогенизировали для контроля уровня PrPSc. На основании данных
предыдущих исследований наличие PrPSc, происходящего из
инокулята, детектируется только в первом и втором пассажах,
поэтому для всех последующих исследований были использованы
клетки 4-го пассажа 4 (Р4). Клетки лизировали в буфере для
гомогенизации, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl,
1 мМ этиленгликоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭГТА), 1
мМ Na3V04, 1 мМ NaF, 2,5 мМ Na4P207, 1 мМ (3-лицерофосфата, 1% NP-
40, 0,25% дезоксихолата натрия, 0,5 мМ
фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мМ лейпептина, 1 мМ пепстатина А, 1 мМ) или без PMSF для расщепления протеиназой К) в течение 5 мин при 4°С, нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 10000 g в течение 10 мин при 4°С. Для клеточного фракционирования по 100 мкг белка центрифугировали при 55000 оборотах в минуту в течение 90 мин, после чего осадок восстанавливали до исходного объема. 2 0% осадка клеточной массы и супернатанта разделяли и исследовали биохимические характеристики.
Для того чтобы проверить, изменяет ли конструкция б дозазависимым образом распространение PrPSc, посредством дезагрегации или изменения его физико-химических свойств, клетки N2a22LSc культивировали в течение 24 ч в отсутствие или в присутствии возрастающих концентраций конструкции б или IgG и собирали в буфере для лизиса. Аликвоты лизированных клеток как обработанных ПК, так и не обработанных протеиназой, подвергали электрофорезу в ДСН-ПААГ и далее исследовали с использованием мАт к РгР 6D11 и 6Н4. Иммунореактивность РгР оценивали в
разделенных биохимическими методами лизатах как расщепленных ПК, так и не расщепленных ПК, которые получали из контрольных клеток, обработанных IgG, и клеток, обработанных конструкцией 6. Типы обработок включали: N2a22LSc+10 мкг/мл, 3 мкг/мл, 1 мкг/мл, 0,333 мкг/мл, 0,111 мкг/мл, 0,037 мкг/мл, 0,012 мкг/мл и 0,004 мкг/мл конструкции б или N2a22LSc+l мкг/мл mlgG.
Результаты показывают значительное дозазависимое снижение PrPSc в присутствии конструкции б, причем в присутствии 0,0 8 мкг/мл конструкции б образуется на 50% меньше РгР по сравнению с 1 мкг/мл IgG. См. фиг. 39А и фиг. 39В.
Повторные эксперименты подтвердили эти результаты.
Для оценки устойчивого к протеиназе К (ПК) конформера РгР аликвоты лизированных клеток обрабатывали ПК (1 мкг/мкг) в разведении 1:50 при 37°С в течение 30 мин, в соответствии с описанными ранее способами (Perrier et al., J. Neurochem (2004) 84:454-463, Pankiewicz et al. , 2006) . После инкубации расщепление останавливали добавлением PMSF до конечной концентрации 4 мМ.
Концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белка ВСА (Pierce). Образцы разводили в буфере для образцов (250 мМ Трис-HCl, рН 6,8, 10% ДСН, 5 мМ (3-меркаптоэтанола, 50% глицерина, 0,02% кумасси синего G250) и кипятили течение 5 мин. Обработанные образцы разделяли с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях.
Моноклональное антитело к РгР 6D11 (См. Sadowski et al. , Neurobiol Dis. (2009) 34(2): 267-278) и 6H4 (See Cordes et al., J Immunol Methods (2008) 337:106-120), а также антитела к актину использовали, чтобы охарактеризовать образцы. Комплексы антиген-антитело детектировали с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела к мышиному IgG (GE Healthcare UK Limited, Бакингемшир, Великобритания) и визуализировали с использованием системы ECL (GE Healthcare UK Limited) в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественное определение белковых полос проводили денситометрическим методом, исследуя пленки (Image J, Национальный институт
здоровья, США).
В совокупности результаты, представлены на фиг. 38А и 38В и фиг. 39А и 39В, демонстрируют способность гибридного белка, фрагмент дЗр-Ig, непосредственно ингибировать образование PrPSc в условиях in vitro.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Фармацевтическая композиция, содержащая полипептид, который связывает амилоид, причем указанный полипептид содержит по меньшей мере один белок гена 3 (дЗр) или его амилоид связывающий фрагмент; и фармацевтически приемлемый носитель, причем указанная композиция не содержит бактериофага.
2. Фармацевтическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что полипептид содержит амилоид связывающий фрагмент домена N2 белка дЗр.
3. Фармацевтическая композиция по п. 2, отличающаяся тем, что полипептид содержит полный домен N2 белка дЗр.
4. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-3, отличающаяся тем, что полипептид дополнительно содержит фрагмент домена N1 белка дЗр.
5. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 2-3, отличающаяся тем, что полипептид дополнительно содержит полный домен N1 белка дЗр.
6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-5, отличающаяся тем, что указанный полипептид содержит дЗр.
7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6, отличающаяся тем, что полипептид дополнительно содержит носитель, который ковалентно или нековалентно связан с полипептидом.
8. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-7, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность по меньшей мере одного дЗр или его амилоид связывающего фрагмента, присутствующего в полипептиде, идентична аминокислотной последовательности соответствующей части дЗр дикого типа.
9. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-8, отличающаяся тем, что по меньшей мере один дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, присутствующий в полипептиде, является мутантом дЗр.
10. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-9, отличающаяся тем, что аминокислотная последовательность дЗр или его амилоид связывающего фрагмента по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на
1.
90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98% или на 100% идентична соответствующей части любой из последовательностей SEQ ID NO:1-20.
11. Фармацевтическая композиция по п. 9 или п. 10, отличающаяся тем, что полипептид содержит домен N1 и домен N2 белка дЗр, причем шарнирная область N2 мутирована таким образом, что температура плавления (Тпл) шарнирной области ниже Тпл шарнирной области фага М13 дикого типа, и при этом полипептид связывает амилоид с большим сродством, чем М13.
12. Гибридный белок, содержащий первый домен, который связывает амилоид, причем первый домен содержит по меньшей мере один дЗр или его амилоид связывающий фрагмент; и второй домен.
13. Гибридный белок по п. 12, отличающийся тем, что первый домен содержит амилоид связывающий фрагмент домена N2 белка дЗр.
14. Гибридный белок по п. 12 или п. 13, отличающийся тем, что первый домен содержит полный домен N2.
15. Гибридный белок по п. 13 или п. 14, отличающийся тем, что первый домен дополнительно содержит фрагмент домена N1 белка дЗр.
16. Гибридный белок по п. 13 или п. 14, отличающийся тем, что первый домен дополнительно содержит весь домен N1 белка дЗр.
17. Гибридный белок по любому из пп. 12-16, отличающийся тем, что аминокислотная последовательность по меньшей мере одного дЗр или его амилоид связывающего фрагмента, присутствующего в первом домене, идентична аминокислотной последовательности соответствующей части дЗр дикого типа.
18. Гибридный белок по любому из пп. 12-17, отличающийся тем, что по меньшей мере один дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, присутствующий в гибридном белке, является мутантом или вариантом дЗр.
19. Гибридный белок по п. 18, отличающийся тем, что первый домен содержит мутант или вариант дЗр или его фрагмент, который сохраняет свою способность связываться с амилоидом и имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более
11.
чем 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2
или 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с соответствующей частью аминокислотной последовательности любой из SEQ ID NO:1-20.
20. Гибридный белок по п. 18, отличающийся тем, что первый домен содержит фрагмент домена N1 и домена N2 белка дЗр, причем по меньшей мере один из доменов N1 и N2 содержит мутацию, которая не нарушает способности фрагмента связываться с амилоидом, и при этом фрагмент домена N1 и N2 имеет аминокислотную последовательность, которая содержит не более чем 75, 50, 40, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, б, 5, 4, 3, 2, 1 различий по аминокислотным остаткам при выравнивании с соответствующими аминокислотами любой из последовательностей SEQ ID NO:1-20.
21. Гибридный белок по любому из пп. 12-20, отличающийся тем, что второй домен содержит константную область иммуноглобулина.
22. Гибридный белок по п. 21, отличающийся тем, что константная область иммуноглобулина представляет собой фрагмент Fc.
23. Гибридный белок по п. 22, отличающийся тем, что фрагмент Fc выбирают из фрагмента Fc IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 и IgM.
24. Гибридный белок по п. 12, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 7 0%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11 или SEQ ID N0:13.
25. Гибридный белок по п. 24, содержащий аминокислотную последовательность, которая идентична SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:11 или SEQ ID N0:13.
26. Фармацевтическая композиция, содержащая гибридный белок по любому из пп. 12-25.
27. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный нитевидный фаг, который экспрессирует мутанта или вариант дЗр.
28. Фармацевтическая композиция по п. 27, отличающаяся
20.
тем, что аминокислотная последовательность мутанта или варианта дЗр по меньшей мере на 7 0%, по меньшей мере на 8 0%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, или по меньшей мере на 98% идентична SEQ ID N0:1.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая выделенный нитевидный фаг, который экспрессирует 5 или более копий дЗр или 5 или более копий мутанта или варианта дЗр.
30. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11 или пп. 26-29 или гибридный белок по любому из пп. 12-25 для применения для снижения уровня амилоида, ингибирования образования амилоида, ингибирования агрегации амилоида или удаления и/или предотвращения образования токсичных олигомеров у пациента, нуждающегося в этом.
31. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11 или
пп. 26-29 или гибридный белок по любому из пп. 12-25 для
применения в лечении заболевания или состояния, выбранного из
болезни Альцгеймера, включая раннее начало болезни Альцгеймера,
позднее начало болезни Альцгеймера и предсимптоматическую
болезнь Альцгеймера; болезни Паркинсона; амилоидоза САА;
цистатина С; наследственного исландского синдрома; старости;
множественной миеломы; прионных заболеваний, включая куру,
болезнь Крейтцфельда-Якоба (БКЯ), синдром Герстманна-
Штраусслера-Шейнкера (GSS), фатальную семейную бессонницу
(FFI), скрейпи и губчатую энцефалопатию крупного рогатого скота
(БФБ) ; бокового амиотрофического склероза (БАС) ;
спиноцеребеллярной атаксии (SCA1, SCA3, SCA6 или СА7) ; болезни
Хантингтона; дентато-рубро-паллидо-льюисовой атрофии;
спинномозговой и бульбарной мышечной атрофии; наследственной
церебральной амилоидной ангиопатии; семейного амилоидоза;
лобно-височной долевой дегенерации (FTLD); британской/датской
деменции; и семейной энцефалопатии.
32. Фармацевтическая композиция по п. 3 0 или п. 31, отличающаяся тем, что пациент является положительным в отношении биомаркера флорбетапира, при использовании этого биомаркера в качестве визуализирующего агента в позитронно-эмиссионной томографии.
29.
33. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 30-32, отличающаяся тем, что заболевание или состояние представляет собой болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона.
34. Фармацевтическая композиция по п. 33, отличающаяся тем, что заболевание или состояние представляет собой болезнь Альцгеймера.
35. Фармацевтическая композиция по п. 31, отличающаяся тем, что заболевание или состояние представляет собой прионное заболевание.
36. Фармацевтическая композиция по п. 35, отличающаяся тем, что прионное заболевание выбирают из болезни Крейтцфельда-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницы и синдрома Герстманна-Штраусслера-Шейнкера.
37. Способ снижения уровня амилоида у пациента,
нуждающегося в этом, включающий введение пациенту эффективного
количества фармацевтической композиции по любому из пп. 1-11
или пп. 2 6-29 или гибридного белка по любому из пп. 12-25.
38. Способ по п. 37, отличающийся тем, что пациент проявляет симптомы нейродегенеративного заболевания, связанного с наличием амилоида.
39. Способ по п. 37 или п. 38, отличающийся тем, что пациент является положительным в отношении биомаркера флорбетапира, при использовании этого биомаркера в качестве визуализирующего агента в позитронно-эмиссионной томографии.
40. Способ по любому из пп. 37-3 9, отличающийся тем, что нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера или болезнь Хантингтона.
41. Способ по п. 40, отличающийся тем, что
нейродегенеративное заболевание представляет собой болезнь
Альцгеймера.
42. Способ по п. 37, отличающийся тем, что пациент проявляет симптомы прион-опосредованного заболевания.
43. Способ по п. 42, отличающийся тем, что прион-опосредованное заболевание выбирают из болезни Крейтцфельда-Якоба, куру, фатальной семейной бессонницы или синдрома
42.
Герстманна-Штраусслера- Шейнкера.
44. Нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид, который связывает амилоид, причем указанный полипептид содержит дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, причем указанный полипептид содержит одну или более мутаций в дЗр или его амилоид связывающем фрагменте по отношению к SEQ ID N0:1, и при этом мутации выбирают из группы, которая включает, но не ограничивается указаными: Q129H, G153D, W181A, F190A и F194A.
45. Нуклеиновая кислота по п. 44, отличающаяся тем, что полипептид содержит амилоид связывающий фрагмент домена N2 белка дЗр.
46. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 4 4 или п.
45.
47. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 46.
48. Способ получения полипептида, который связывает амилоид, причем полипептид содержит дЗр или его амилоид связывающий фрагмент, причем указанный полипептид содержит одну или более мутаций в части N2 относительно SEQ ID N0:1, и при этом мутации выбирают из группы, которая включает, но не ограничивается указанными: Q129H, G153D, W181A, F190A и F194A, включающий экспрессию полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, в векторе по п. 4 6 и выделение экспрессированного белка.
49. Способ по п. 48, отличающийся тем, что полипептид содержит амилоид связывающий фрагмент домена N2 белка дЗр.
50. Нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок по любому из пп. 12-25.
51. Вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по п. 50.
52. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 51.
53. Способ получения гибридного белка по любому из пп. 1225, включающий экспрессию гибридного белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, в векторе по п. 51 и выделение экспрессированного гибридного белка.
54. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-11 или гибридный белок по любому из пп. 12-25, отличающиеся тем, что полипептид в составе композиции или гибридный белок
51.
дополнительно содержат детектируемую метку.
55. Фармацевтическая композиция или гибридный белок по п. 54, отличающиеся тем, что метка представляет собой радиоактивную метку, выбранную из 18F, 11С или 1231.
56. Способ детектирования амилоида у пациента, включающий следующие этапы:
а) введение пациенту фармацевтической композиции или
гибридного белка по п. 54; и
б) детектирование метки.
57. Способ по п. 56, отличающийся тем, что метку
детектируют методом позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).
58. Визуализирующий агент, содержащий композицию по п. 54 или п. 55.
59. Способ диагностики заболевания или расстройства, связанного с амилоидом, у пациента, включающий этапы:
а) введения пациенту визуализирующего агента по п. 58;
б) осуществления связывания агента с любым присутствующим
амилоидом;
в) детектирование любого визуализирующего агента, который
связан с амилоидом, и
г) диагностирование заболевания или расстройства,
связанного с амилоидом, если детектируют визуализирующий агент.
По доверенности
