(57) Реферат / Формула:
Белковые каркасы и библиотеки каркасов на основе фибронектинового повтора типа III (FN3) с альтернативной конфигурацией поверхности связывания, выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие белковые каркасы, векторы, клетки-хозяева и способы их получения могут применяться в создании терапевтических молекул и лечении и диагностике заболеваний и расстройств.
2420-514351ЕА/17 БЕЛКОВЫЕ КАРКАСЫ НА ОСНОВЕ ФИБРОНЕКТИНОВОГО ПОВТОРА ТИПА III С АЛЬТЕРНАТИВНЫМИ ПОВЕРХНОСТЯМИ СВЯЗЫВАНИЯ
ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к белковым каркасам и библиотекам каркасов на основе фибронектинового повтора типа III (FN3) с альтернативными конфигурациями поверхности связывания. Более конкретно настоящее изобретение относится к каркасам и библиотекам FN3 с вогнутыми сайтами связывания, образованными выбранными бета-тяжами и петлями.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Моноклональные антитела представляют собой наиболее широко применяемый класс терапевтических белков, когда желательны высокая аффинность и специфичность к молекуле-мишени. Однако не являющиеся антителами белки с относительно определенными трехмерными структурами, которые можно сконструировать для связывания желаемых молекул-мишеней, обычно называемые белковыми каркасами, могут иметь преимущества над традиционными антителами благодаря их малому размеру, отсутствию дисульфидных связей, высокой стабильности и возможности экспрессии в прокариотических хозяевах. Как правило, эти каркасы содержат одну или более областей, которые восприимчивы к конкретному или случайному изменению последовательности. Зачастую такую рандомизацию последовательности проводят для получения библиотек белков, из которых можно выбрать желаемые продукты. Для этого используют новые способы очистки. Каркасы легко конъюгируются с лекарственными средствами/токсинами, эффективно проникают в ткани и могут быть преобразованы в мультиспецифические связывающие агенты (Binz and Pluckthun, Curr Opin Biotechnol, 16, 459-469, 2005, Skerra, J Mol Recognit, 13, 167-187, 2000 г.).
Одним таким белковым каркасом является выявленный во множестве белков фибронектиновый домен типа III (FN3) с характерной третичной структурой с б петлями, соединенными 7 бета-тяжами. Три петли, а конкретно FG, ВС и DE, структурно
аналогичны участкам, определяющим комплементарность (CDR), антител. Эти петли были рандомизированы для создания библиотек каркасов домена FN3 для успешного выбора специфически связывающихся с множеством различных мишеней агентов с сохранением важных биофизических свойств (Getmanova et al., Chem Biol, 13, 549-556, 2006 г., Hackel et al. , J Mol Biol, 381, 1238-1252, 2008 г., Karatan et al. , Chem Biol, 11, 835844, 2004 г.; Koide et al. , J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998 г.; Koide et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007 г.; Parker et al., Protein Eng Des Sel, 18, 435-444, 2005 г.; Xu et al., Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002 г.). Библиотеки доменов FN3 также были созданы путем рандомизации петель АВ, EF и CD (публикация патента США № 2011/0038866; публикация международного патента № W02011/05133; публикация патента США № 2011/0124 52 7). Другие ссылки на библиотеки FN3 включают в себя публикации международных патентов №№ WO2002/32925, W02003/104418, W02009/023184 и WO2010/060095 . В публикации международного патента № W02012/016245 описаны библиотеки домена FN3 с применением петель CD и FG вместе с открытыми на поверхности остатками бета-листа.
Преимуществом было бы получение улучшенных каркасных белков на основе фибронектинового домена как для терапевтических, так и для диагностических целей. В настоящем описании представлены такие улучшенные белки.
ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения библиотеки доменов фибронектинового модуля типа III (FN3) с диверсифицированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG, образованной бета-тяжем С, петлей CD, бета-тяжем F и петлей FG, содержащий обеспечение эталонного полипептида домена FN3 с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 8 0% идентичную SEQ ID NO: 27; внесение разнообразия в эталонный полипептид домена FN3 путем мутации по меньшей мере одного остатка бета-тяжа С и по меньшей мере одного остатка бета-тяжа F для образования библиотеки домена FN3 с диверсифицированной альтернативной
поверхностью C-CD-F-FG.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой библиотеку, формируемую способами настоящего изобретения, описанными в настоящем документе.
Другой аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения белкового каркаса, содержащего домен фибронектинового модуля типа III (FN3) с диверсифицированной альтернативой C-CD-F-FG, которая специфически связывается с молекулой-мишенью, содержащий приведение в контакт или пэннинг библиотеки по п. 11 с молекулой-мишенью и выделение белкового каркаса, который специфически связывается с молекулой-мишенью с заданной аффинностью.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг. 1 показаны ленточные диаграммы структур домена FN3 и домена VH антитела. На фигуре отмечены петли домена FN3, структурно аналогичные CDR.
На фиг. 2 показаны структурные диаграммы, позволяющие сравнить А) традиционные библиотеки FN3 с рандомизированными петлями (фиг. 2А); В) библиотеку FN3 с рандомизированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG (библиотека TCL14) (фиг. 2В); С) библиотеку FN3 с рандомизированной поверхностью А-АВ-В-ВС-Е (библиотека TCL15) (фиг. 2С) . Рандомизированные положения в этих конфигурациях библиотеки показаны на ленточных диаграммах сплошной черной линией.
На фиг. 3 показано выравнивание последовательности каркаса Tencon27 (SEQ ID N0: 27) и библиотеки TCL14 (SEQ ID N0: 28) с рандомизированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG. Остатки петли помещены в рамку. Конкретные области петли и бета-тяжа указаны над последовательностями.
На фиг. 4 показано выравнивание последовательности каркаса Tencon27 (SEQ ID N0: 27) и библиотеки TCL15 с рандомизированной альтернативной поверхностью А-АВ-В-ВС-Е (SEQ ID N0: 61) . Остатки петли помещены в рамки. Конкретные области петли и бета-тяжа указаны над последовательностями.
На фиг. 5 показана топологическая диаграмма конфигурации библиотеки на основе Tencon27 (SEQ ID N0: 27) с
рандомизированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG (библиотека TCN14). Бета-тяжи показаны стрелками, причем остатки тяжей, связанные друг с другом водородными связями в структуре Тепсоп2 7, на диаграмме размещены смежно. Положения рандомизированных остатков показаны овалами с серой заливкой.
На фиг. б показана топологическая диаграмма конфигурации библиотеки на основе Tencon27 (SEQ ID N0: 27) с рандомизированной альтернативной поверхностью А-АВ-В-ВС-Е (библиотека TCL15). Бета-тяжи показаны стрелками, причем остатки тяжей, связанные друг с другом водородными связями в структуре Тепсоп, на диаграмме размещены смежно. Положения рандомизированных остатков показаны овалами с серой заливкой.
На фиг. 7 показаны ожидаемые и наблюдаемые распределения аминокислот в рандомизированных положениях в библиотеке TCL14.
На фиг. 8 показано выравнивание Tencon27, TCL14 и разработанных библиотек на основе FN10, TN3 и Fibcon с рандомизированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG. Нумерация остатков основана на последовательности Тепсоп27. Аминокислотные последовательности библиотек показаны в SEQ ID N0: 28, 98, 99 и 62 соответственно. Остатки петли помещены в рамку. Конкретные области петли и бета-тяжа указаны над последовательностями.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
При применении в настоящем документе термин "домен фибронектинового модуля типа III (FN3)" или "домен FN3" относится к домену, часто встречающемуся в белках, включая фибронектины, тенасцин, белки внутриклеточного цитоскелета, цитокиновые рецепторы и прокариотические ферменты (Bork and Doolittle, Proc Nat Acad Sci USA 89, 8990-8994, 1992 г.; Meinke et al., J Bacterid 175, 1910-1918, 1993 г.; Watanabe et al. , J Biol Chem 265, 15659-15665, 1990 г.) . Примерами доменов (или модулей) FN3 являются 15 различных доменов FN3, присутствующих в тенасцине С человека, и 15 различных доменов FN3, присутствующих в фибронектине человека (FN) . Отдельные домены FN3 называют по номеру домена и названию белка, например, 3-й домен FN3 тенасцина (TN3) или 10-й домен FN3 фибронектина
(FN10) .
При применении в настоящем документе термин "эталонный домен FN3" относится к домену FN3 дикого типа или не встречающемуся в естественных условиях домену FN3, применяемому в качестве шаблона, в котором выполняются замены для создания белковых каркасов, специфически связывающихся с молекулой-мишенью .
Применяемый в настоящем документе термин "альтернативная поверхность" относится к поверхности на стороне домена FN3, содержащей два или более бета-тяжа и по меньшей мере одну петлю. Примерами альтернативных поверхностей являются поверхность C-CD-F-FG, образованная аминокислотами в бета-тяжах С и F и петлях CD и FG, и поверхность А-АВ-В-ВС-Е, образованная аминокислотами в бета-тяжах А, В и Е и петле ВС.
Применяемый в настоящем документе термин "замена", "замещенный", "мутация" или "мутированный" относится к изменению, делеции или вставке одной или более аминокислот или нуклеотидов в последовательности полипептида или полинуклеотида для создания варианта этой последовательности.
Применяемый в настоящем документе термин "рандомизация", "рандомизированный", "диверсифицированный" или "диверсификация" относится к выполнению по меньшей мере одной замены, вставки или делеции в последовательности полинуклеотида или полипептида.
Применяемый в настоящем документе термин "вариант" относится к полипептиду или полинуклеотиду, который отличается от эталонного полипептида или эталонного полинуклеотида одной или более модификациями, например, заменами, вставками или делециями.
Применяемый в настоящем документе термин "специфически связывается" или "специфическое связывание" относится к способности домена FN3 настоящего изобретения связываться с
молекулой-мишенью с аффинностью (Ко!) по меньшей мере lxlCT6 М и/или связываться с молекулой-мишенью с аффинностью, которая по меньшей мере десятикратно превышает его аффинность к
неспецифическому антигену (например, БСА или казеину) по результатам измерения с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса.
Применяемый в настоящем документе термин "молекула-мишень" относится к белку, пептиду, углеводу, липиду и т.п. с антигеном или эпитопом, которые распознаются доменом FN3 настоящего изобретения. Молекула-мишень может встречаться в естественных условиях или не встречаться в естественных условиях.
Применяемый в настоящем документе термин "библиотека" относится к группе вариантов. Библиотека может состоять из вариантов полипептида или полинуклеотида.
Применяемый в настоящем документе термин "тенасцин С" относится к тенасцину С человека с последовательностью, показанной в GenBank под номером NP_002151 или в SEQ ID N0: 57. Тенасцин С имеет 15 тандемных доменов FN3, которые имеют аминокислотные последовательности, показанные в SEQ ID N0: 1-15 соответственно. Аминокислотная последовательность 3-го домена FN3 тенасцина С (TN3) показана в SEQ ID N0: 3.
Применяемый в настоящем документе термин "стабильность" относится к способности молекулы сохранять свернутое состояние в физиологических условиях, так что она сохраняет по меньшей мере одну из ее нормальных функциональных возможностей, например, способность связываться с молекулой-мишенью.
В настоящем изобретении предложены домены FN3, которые специфически связываются с молекулой-мишенью и, таким образом, могут широко применяться в терапевтических и диагностических целях. Настоящее изобретение основано на открытии того, что альтернативную поверхность на стороне домена FN3, содержащую два или более бета-тяжа и по меньшей мере одну петлю, можно рандомизировать для создания и выбора белковых каркасов, специфически связывающихся с молекулой-мишенью с высокой аффинностью. Опубликованные библиотеки на основе домена FN3 были созданы путем диверсификации либо верхних, либо нижних петель, областей, которые структурно аналогичны CDR в вариабельных цепях антитела, с обеспечением изогнутых поверхностей связывания. В настоящем изобретении молекулы с
высокой аффинностью связывания выбирают из библиотек доменов FN3, отображающих вогнутые поверхности взаимодействия, созданные путем рандомизации альтернативной поверхности, таким образом, вероятно, увеличивая число эпитопов и мишеней, для которых можно выбрать белковые каркасы с высокой аффинностью связывания. В настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, кодирующие белковые домены, или комплементарные к ним нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева, а также способы их получения и применения. В настоящем изобретении предложены способы получения библиотек доменов FN3, а также библиотеки, полученные способами настоящего изобретения. Фибронектиновый домен типа III
Фибронектиновый домен (или модуль) типа III (FN3) представляет собой прототипный домен с повторами, исходно выявленный в фибронектине и в настоящее время известный в различных семействах белков животных, включая рецепторы клеточной поверхности, белки внеклеточного матрикса, ферменты и мышечные белки. Структурно домены FN3 имеют топологию, в большой степени аналогичную иммуноглобулинподобным доменам, за исключением отсутствия дисульфидных связей. Как известно специалистам в данной области, встречающиеся в естественных условиях домены FN3 имеют структуру типа бета-сэндвича с семью бета-тяжами, обозначаемыми А, В, С, D, Е, F и G, связанными шестью петлями, обозначаемыми АВ, ВС, CD, DE, EF и FG (Bork and Doolittle, Proc Natl Acad Sci USA 89, 8990-8992, 1992 г.; патент США № 6673901) . Три петли ВС, DE и FG находятся в верхней части домена FN3, а три петли АВ, CD и EF - в нижней части домена (фиг. 1) . В таблице 1 показаны несколько содержащих домен FN3 белков и число различных доменов FN3, связанных с каждым белком. Хотя конформации домена FN3 высококонсервативны, сходство между различными доменами на уровне аминокислот достаточно низка.
Домены FN3 могут встречаться в естественных условиях или могут не встречаться в естественных условиях. Примером не встречающихся в естественных условиях доменов FN3 является консенсусный домен FN3, разработанный на основе выравнивания
выбранных доменов FN3, присутствующих в определенном белке, и включающий наиболее консервативную (часто встречающуюся) аминокислоту в каждом положении для создания не встречающегося в естественных условиях домена FN3. Например, не встречающийся в естественных условиях домен FN3 разработан на основе консенсусной последовательности 15 доменов FN3 тенасцина С человека или на основе консенсусной последовательности 15 доменов FN3 фибронектина человека. Эти не встречающиеся в естественных условиях домены FN3 сохраняют типичную топологию доменов FN3 и могут показывать улучшенные свойства, такие как улучшенная стабильность, в сравнении с доменами FN3 дикого типа. Примерами не встречающихся в естественных условиях доменов FN3 являются домены Тепсоп и Fibcon, показанные в SEQ ID N0: 16 и 58, соответственно, и описанные в публикации патента США № 2010/0216708 и публикации патента США № 2010/0255056.
каждую петлю и каждый бета-тяж для каркаса FN3 Tencon27 (SEQ ID
N0: 27) . Положения каждой петли и бета-тяжа в 3-м домене FN3
тенасцина С (TN3) (SEQ ID N0: 3) и в Fibcon (SEQ ID NO: 58)
идентичны Tencon27. Остатки бета-тяжей можно выявить путем
применения хорошо известных способов, например, путем анализа
трехмерных структур, созданных с помощью рентгеновской
дифракции, ядерного магнитного резонанса или молекулярного
моделирования. Когда модели недоступны, для прогнозирования
границ областей тяжа и петли можно применять анализ
выравниваний последовательности с другими известными молекулами
FN3. Наконец, можно применять компьютерные алгоритмы для
прогнозирования наличия бета-тяжей из первичных
последовательностей белка.
Альтернативные поверхности на доменах FN3
Верхние (ВС, DE и FG) и нижние (АВ, CD и EF) петли, например, отмеченные поверхности связывания в доменах FN3, разделены бета-тяжами, которые образуют центр структуры домена FN3 (фиг. 1, 2А) . Альтернативные поверхности, находящиеся с двух "сторон" доменов FN3 с формами, отличными от поверхностей, образованных петлями, можно визуализировать только путем вращения структуры домена FN3 на 90 градусов (фиг. 2В, 2С) . С одной стороны домена FN3 с помощью двух антипараллельных бета-тяжей - бета-тяжей С и F и петель CD и FG - образована несколько вогнутая поверхность, и в настоящем документе она
называется поверхностью C-CD-F-FG. Альтернативная поверхность также образована с противоположной стороны поверхности C-CD-F-FG с помощью бета-тяжей А, В и Е и петель АВ и ВС, и в настоящем документе называется поверхностью А-АВ-В-ВС-Е.
Альтернативные поверхности в доменах FN3 в каждом домене FN3 кодируются несмежными фрагментами аминокислот. Например, как показано в таблице 2, поверхность C-CD-F-FG в Тепсоп27 образована аминокислотными остатками 29-43 и 65-81 SEQ ID NO: 27, а поверхность А-АВ-В-ВС-Е Тепсоп27 образована аминокислотными остатками 1-28 и 55-59 SEQ ID NO: 27.
Белковые каркасы на основе рандомизации альтернативных поверхностей
Один вариант осуществления настоящего изобретения
представляет собой выделенный белковый каркас, содержащий домен
FN3, содержащий альтернативную поверхность, причем
альтернативная поверхность имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в каждом бета-тяже и каждой петле, образующих альтернативную поверхность, в сравнении с эталонным доменом FN3.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения специфически связывается с молекулой-мишенью, не связанной специфически эталонным доменом FN3.
В другом варианте осуществления эталонный домен FN3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения содержит альтернативную поверхность C-CD-F-FG, образованную бета-тяжем С, петлей CD, бета-тяжем F и петлей FG.
В другом варианте осуществления бета-тяж С, петля CD,
бета-тяж F или петля FG, образующие альтернативную поверхность
C-CD-F-FG, содержат определенные аминокислотные
последовательности, как показано в таблицах 4 и 5 и в SEQ ID NO: 45-48.
В другом варианте осуществления бета-тяж С содержит аминокислотную последовательность DSFLIQYQE (SEQ ID NO: 33) с заменами по 1, 2, 3 или 4 остаткам, бета-тяж F содержит аминокислотную последовательность TEYTVSIYGV (SEQ ID NO: 39) с
заменами по 1, 2, 3, 4 или 5 остаткам, бета-тяж С и петля CD содержат аминокислотную последовательность DSFLIQYQESEKVGE (SEQ ID N0: 42) с заменами по 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9 или 10 остаткам, или бета-тяж F и петля FG содержат аминокислотную последовательность TEYTVSIYGVKGGHRSN (SEQ ID N0: 43) с заменами по 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10 или 11 остаткам.
В другом варианте осуществления бета-тяж С и бета-тяж F содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 67% идентичную SEQ ID N0:33 и по меньшей мере на 70% идентичную SEQ ID N0:39, соответственно, бета-тяж С и петля CD содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 53% идентичную SEQ ID N0: 42, или бета-тяж F и петля FG содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 65% идентичную SEQ ID N0: 43.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения содержит домен FN3, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID N0: 28.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения содержит домен фибронектинового модуля типа III (FN3), содержащий:
бета-тяж А, петлю АВ, бета-тяж В, петлю ВС, бета-тяж D, петлю DE, бета-тяж Е, петлю EF и бета-тяж G с аминокислотными последовательностями, идентичными SEQ ID N0: 27 по остаткам 112, 13-16, 17-21, 22-28, 44-50, 51-54, 55-59, 60-64 и 82-89 соответственно;
бета-тяж С и петлю CD с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 53% идентичной SEQ ID N0: 42; и
бета-тяж F и петлю FG с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 65% идентичной SEQ ID N0: 43, необязательно имеющие по меньшей мере одну замену в положениях аминокислот, соответствующих аминокислотным остаткам 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86 в SEQ ID N0: 27, причем белковый каркас специфически связывается с молекулой-мишенью, не связанной специфически эталонным доменом FN3.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего
изобретения содержит домен FN3, содержащий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную аминокислотным последовательностям, показанным в SEQ ID N0: 27.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения содержит альтернативную поверхность А-АВ-В-ВС-Е, образованную бета-тяжем А, петлей АВ, бета-тяжем В, петлей ВС и бета-тяжем Е.
В другом варианте осуществления бета-тяж А, петля АВ,
бета-тяж В и петля ВС, образующие альтернативную поверхность А-
АВ-В-ВС-Е, содержат определенные аминокислотные
последовательности, как показано в таблицах 4 и 5 и в SEQ ID NO: 49 и 50.
В другом варианте осуществления бета-тяж А, петля АВ, бета-тяж В и петля ВС содержат аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 59% идентичную SEQ ID N0:44, а бета-тяж Е содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 60% идентичную SEQ ID NO: 37.
В другом варианте осуществления белковый каркас настоящего изобретения содержит домен FN3, содержащий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 61.
В другом варианте осуществления выделенный белковый каркас настоящего изобретения содержит домен FN3, содержащий:
бета-тяж С, петлю CD, бета-тяж D, петлю DE, петлю EF, бета-тяж F, петлю FG и бета-тяж G с аминокислотными последовательностями, идентичными SEQ ID NO: 27 по остаткам 2937, 38-43, 44-50, 51-54, 60-64, 65-74, 75-81 и 82-89 соответственно;
бета-тяж А, петлю АВ, бета-тяж В и петлю ВС с аминокислотными последовательностями, по меньшей мере на 59% идентичными SEQ ID NO: 4 4; и
бета-тяж Е с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 60% идентичной SEQ ID NO: 37, необязательно содержащий по меньшей мере одну замену в положениях аминокислот, соответствующих аминокислотным остаткам 11, 14, 17, 37, 4 6, 73 или 8 6 в SEQ ID NO: 27, причем белковый каркас
специфически связывается с молекулой-мишенью, не связанной специфически эталонным доменом FN3.
Домены FN3, специфически связывающиеся с молекулой-мишенью, можно создавать путем рандомизации подмножества остатков, образующих альтернативную поверхность. Например, можно рандомизировать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять остатков в каждом бета-тяже и в каждой петле, участвующих в альтернативной поверхности. Для повышения разнообразия библиотеки можно рандомизировать дополнительные остатки. Например, можно рандомизировать 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% остатков в каждом бета-тяже и в каждой петле, образующих альтернативную поверхность. Альтернативно домены FN3, специфически связывающиеся с молекулой-мишенью, можно создавать путем рандомизации подмножества остатков бета-тяжей, участвующих в альтернативной поверхности, без рандомизации любых петель. Например, можно рандомизировать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять остатков в каждом бета-тяже, участвующем в альтернативной поверхности. Для повышения разнообразия библиотеки можно рандомизировать дополнительные остатки, находящиеся в бета-тяжах. Например, можно рандомизировать 2 0%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% остатков в каждом бета-тяже, образующем альтернативную поверхность.
Бета-тяжи имеют повторяющуюся структуру, причем боковая цепь каждого второго остатка открыта на поверхности белка. Открытые на поверхности боковые цепи определяют путем изучения трехмерных структур или путем сравнения последовательностей доменов FN3 с известной структурой, используя множественное выравнивание последовательности. Для рандомизации можно выбрать все или подмножество открытых на поверхности остатков бета-тяжей, участвующих в альтернативной поверхности. Например, альтернативная поверхность C-CD-F-FG Tencon27 (SEQ ID NO: 27) имеет четыре открытых на поверхности остатка в бета-тяже С (S30, L32, Q34 и Q36) и пять открытых на поверхности остатков в бета-тяже F (Ебб, Т68, S70, Y72 и V74), нумерация остатков
основана на SEQ ID NO: 27. Один или более из этих остатков можно рандомизировать для создания библиотеки. Остатки у точки соединения альтернативной поверхности, такие как S30, Ебб и V7 4, могут быть или не быть рандомизированы. Рандомизация внутренних остатков бета-тяжей может привести к дестабилизации каркаса вследствие потери гидрофобных контактов в ядре структуры. Внутренние остатки можно рандомизировать так, чтобы применять только подмножество аминокислот, например, только гидрофобные аминокислоты.
Можно рандомизировать подмножество или все остатки в областях петли, участвующей в альтернативной поверхности. Например, можно выполнить замены в 0, 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 положениях в петлях CD и/или FG, участвующих в альтернативной поверхности. Остатки глицина в петлях, такие как G42, G7 6 и/или G77 в Тепсоп27, могут обеспечивать гибкость и могут быть или не быть рандомизированы. Остатки у границ бета-тяжа/петли, такие как Е43 в Тепсоп27, могут быть или не быть рандомизированы. В рандомизацию также можно включить или из рандомизации можно исключить дополнительные остатки в областях бета-тяжа или петли. Например, остатки, которые на основе, например, анализа кристаллических структур доменов FN3, по-видимому, необходимы для стабилизации, могут быть или не быть рандомизированы. Например, S80 в Тепсоп27 находится в контакте с ядром домена FN3, чтобы потенциально стабилизировать петлю FG, а К75 частично обращен от альтернативной поверхности. Таким образом, оба эти остатка можно исключить из исходной конфигурации библиотеки. В примере библиотеки доменов FN3 с рандомизированной поверхностью C-CD-F-FG, остатки, которые могут быть рандомизированы, включают в себя остатки в положениях 30, 32, 34, 36, 38, 39, 40, 41, 42, 43, бб, 68, 70, 72, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 или 81 SEQ ID NO: 27. В примере библиотеки доменов FN3 с рандомизированной поверхностью А-АВ-В-ВС-Е, остатки, которые могут быть рандомизированы, включают в себя остатки в положениях б, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 55 и 57.
Разнообразия в петлях, участвующих в альтернативных
поверхностях, можно достичь путем вставки и/или делеций
остатков в петлях. Например, петли FG и/или CD можно расширить
на 1-22 аминокислоты или уменьшить на 1-3 аминокислоты. Петля
FG в Тепсоп2 7 имеет длину в 7 аминокислот, тогда как
соответствующая петля в тяжелых цепях антитела находится в
диапазоне от 4 до 2 8 остатков. Для обеспечения максимального
разнообразия петли, участвующие в альтернативных поверхностях,
например, петли FG, можно диверсифицировать в
последовательности, а также по длине для соответствия диапазону длины CDR3 антитела в 4-2 8 остатков.
Полученные домены FN3, специфически связывающиеся с молекулой-мишенью, можно дополнительно модифицировать по остаткам, находящимся за пределами или в пределах альтернативной поверхности, для целей, например, улучшения стабильности, снижения иммуногенности, увеличения аффинности связывания, скорости ассоциации, скорости диссоциации, периода полужизни, растворимости или любых других подходящих характеристик. В одном способе достижения данной цели каркасные белки можно необязательно получить с помощью процесса анализа родительских последовательностей и различных концептуальных сконструированных продуктов с применением трехмерных моделей родительских и сконструированных последовательностей. Трехмерные модели широкодоступны и известны специалистам в данной области. Доступны компьютерные программы, иллюстрирующие и отображающие вероятные трехмерные конформационные структуры выбранных потенциальных последовательностей и способные измерять возможную иммуногенность (например, программа Immunofilter, разработанная Xencor, Inc., г. Монровия, штат Калифорния, США). Изучение этих отображений позволяет анализировать вероятную роль остатков в функционировании потенциальной последовательности, например, остатков, влияющих на стабильность белкового каркаса или способность потенциального каркасного белка связываться с его молекулой-мишенью. Таким образом, возможны выбор и комбинирование остатков из родительской и эталонной последовательностей так,
чтобы достичь желаемых характеристик, таких как улучшенная стабильность каркаса. Альтернативно или в дополнение к вышеописанным процедурам можно применять другие подходящие способы конструирования, известные специалистам в данной области.
Желаемые физические свойства доменов FN3 настоящего изобретения включают в себя высокую термостабильность и обратимость термического сворачивания и разворачивания. Для повышения очевидной термостабильности белков и ферментов использовали несколько способов, включая рациональную конфигурацию, основанную на сравнении с термостабильными последовательностями с высокой степенью сходства, конфигурацию стабилизирующих дисульфидных мостиков, мутации для повышения склонности к образованию альфа-спирали, конструирование солевых мостиков, изменение поверхностного заряда белка, направленную эволюцию и композицию консенсусных последовательностей (Lehmann and Wyss, Curr Opin Biotechnol, 12, 371-375, 2001 г.) . Высокая термостабильность может повышать выход экспрессируемого белка, повышать растворимость или активность, снижать иммуногенность и минимизировать необходимость в холодной линии для производства.
Остатки, которые можно заменить для улучшения любых характеристик доменов FN3 настоящего изобретения, можно определить путем выполнения замены и анализа желаемых характеристик каркаса. Примеры каркаса на основе домена FN3 с улучшенными характеристиками включают каркас Tencon (SEQ ID NO: 16) или каркас Tencon27 (SEQ ID NO: 27), модифицированный по одному или более положениям аминокислотных остатков 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 8 б.
В отношении потери стабильности, т. е. "денатурирование" или "денатурация" белка означают процесс, в котором происходит потеря части или всей трехмерной конформации, обеспечивающей потерю функциональных свойств белка с соответствующей потерей активности и/или растворимости. Разрушаемые при денатурации силы включают в себя внутримолекулярные связи, например, электростатические, гидрофобные, Ван-дер-Ваальсовы силы, водородные связи и дисульфиды. Денатурацию белка можно вызвать
путем приложения к белку или содержащему белок раствору сил, таких как механическое воздействие (например, компрессионное или сдвиговое усилие), тепловой, осмотический стресс, изменение рН, электрические или магнитные поля, ионизирующее излучение, ультрафиолетовое излучение и дегидратация, а также путем воздействия химических денатурирующих веществ.
Измерение стабильности белка и лабильности белка можно рассматривать как один и тот же или как различные аспекты целостности белка. Белки чувствительны или "лабильны" к денатурации, вызванной нагревом, ультрафиолетовым или ионизирующим излучением, изменением осмолярности и рН при нахождении в жидком растворе, механическим сдвиговым усилием, вызванным фильтрованием через поры малого размера, ультрафиолетовым излучением, ионизирующим излучением, таким как гамма-облучение, химической или тепловой дегидратацией или любым другим действием или силой, которые могут привести к разрушению структуры белка. Стабильность молекулы можно определить с применением стандартных способов. Например, стабильность молекулы можно определить путем измерения температуры термического плавления (ТМ) - температуры в градусах Цельсия (°С), при которой И молекул разворачиваются, применяя стандартные способы. Как правило, чем выше ТМ, тем более стабильна молекула. В дополнение к нагреву способность белка сохранять конкретную трехмерную структуру также определяется химической средой.
В одном варианте осуществления домены FN3 настоящего изобретения показывают стабильность, повышенную по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% или более по сравнению с тем же доменом до конструирования, что измеряется по повышению ТМ.
Химическую денатурацию аналогичным образом можно измерить различными способами. Химические денатурирующие вещества включают в себя гидрохлорид гуанидиния, тиоцианат гуанидиния, мочевину, ацетон, органические растворители (ДМФ, бензол, ацетонитрил), соли (сульфат аммония, бромид лития, хлорид
лития, бромид натрия, хлорид кальция, хлорид натрия); восстановители (например, дитиотреитол, бета-меркаптоэтанол, динитротиобензол, а также гидриды, такие как борогидрид натрия), неионные и ионные моющие средства, кислоты (например, соляная кислота (НС1), уксусная кислота (СНзСООН), галогензамещенные уксусные кислоты), гидрофобные молекулы (например, фосфолипиды), а также направленные денатурирующие агенты. Количественное определение степени денатурации может быть основано на потере функционального свойства, такого как способность связываться с молекулой-мишенью, или на физико-химических свойствах, таких как склонность к агрегации, открытие доступа к ранее недоступным растворителю остаткам либо разрушение или образование дисульфидных связей.
В одном варианте осуществления каркасы настоящего изобретения показывают стабильность, повышенную по меньшей мере на 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или 95% или более в сравнении с тем же каркасом до конструирования, что измеряется путем применения гидрохлорида гуанидиния в качестве химического денатурирующего вещества. Повышение стабильности можно измерять в зависимости от снижения флюоресценции триптофана при обработке повышающимися концентрациями гидрохлорида гуанидиния, применяя хорошо известные способы.
Специфически связывающиеся с молекулой-мишенью домены FN3 настоящего изобретения можно создавать, применяя в качестве шаблона любой домен FN3 для замен в соответствии со способами, представленными в настоящем документе. Примерами доменов FN3 с рандомизированными альтернативными поверхностями являются 3-й домен FN3 тенасцина С (TN3) (SEQ ID N0: 3), Tencon (SEQ ID NO: 16), Tencon27 (SEQ ID NO: 27), Fibcon (SEQ ID NO: 58) и 10-й домен FN3 фибронектина (FN10) (SEQ ID NO: 97). Положения аминокислот, обрисовывающих альтернативные поверхности в Тепсоп2 7, показаны в таблице 2 и на фиг. 8 и идентичны линейной последовательности Tencon, TN3 и Fibcon. Положения аминокислот, обрисовывающих альтернативную поверхность в FN10, показаны на фиг. 8. Остатки, образующие альтернативные поверхности в других
доменах FN3, можно выявить путем изучения трехмерных структур
(при наличии) или путем анализа выравниваний
последовательностей доменов FN3 с помощью хорошо известных способов.
Домены FN3 настоящего изобретения могут быть созданы в виде мономеров, димеров или мультимеров, например, как средство повышения валентности и, таким образом, авидности к связыванию молекулы-мишени или для создания би- или мультиспецифических каркасов, одновременно связывающих две или более различные молекулы-мишени. Димеры и мультимеры могут быть созданы путем связывания моноспецифических, би- или мультиспецифических белковых каркасов, например, путем включения аминокислотного линкера, например, линкера, содержащего полиглицин, глицин и серии или аланин и пролин. Применение встречающихся в естественных условиях, а также искусственных пептидных линкеров для соединения полипептидов в новые связанные слитые полипептиды хорошо известно в литературе (Hallewell et al., J Biol Chem 264, 5260-5268, 1989 г.; Alfthan et al., Protein Eng. 8, 725-731, 1995 г.; Robinson & Sauer, Biochemistry 35, 109116, 1996 г.; патент США № 5856456).
Домены FN3 настоящего изобретения можно применять как биспецифические молекулы, причем первая альтернативная поверхность в домене имеет специфичность к первой молекуле-мишени, а вторая альтернативная поверхность в том же домене имеет специфичность ко второй молекуле-мишени. Примером биспецифического белкового домена является вариант Тепсоп27, который связывает первую молекулу-мишень на поверхности C-CD-F-FG и вторую молекулу-мишень на поверхности А-АВ-В-ВС-Е.
Домены FN3 настоящего изобретения могут включать другие субъединицы, например, с помощью ковалентного взаимодействия. К домену FN3 можно прикрепить весь или часть константного участка антитела для придания антителоподобных свойств, в особенности тех свойств, которые связаны с участком Fc, например, комплементарная активность, период полужизни и т.п. Например, эффекторные функции Fc, такие как связывание Clq, комплементзависимая цитотоксичность (CDC), связывание рецептора
Fc, антителозависимая опосредованная клетками цитотоксичность (ADCC), фагоцитоз, понижающая регуляция рецепторов клеточной поверхности (например, рецепторов В-клеток; BCR) и т.д., можно обеспечить и/или контролировать путем модификации остатков в Fc, ответственном за такую активность (в качестве обзора; см. Strohl, Curr Opin Biotechnol. 20, 685-691, 2009 г.).
В домены FN3 настоящего изобретения можно встроить дополнительные фрагменты, такие как конъюгаты токсинов, альбумин или связывающиеся с альбумином агенты, молекулы полиэтиленгликоля (PEG), такие как PEG5000 или PEG20 ООО, жирные кислоты и эфиры жирных кислот с различной длиной цепи, например, лаурат, миристат, стеарат, арахидат, бегенат, олеат, арахидонат, октандионовую кислоту, тетрадекандионовую кислоту, октадекандионовую кислоту, докозандионовую кислоту и т.п., полилизин, октан, углеводы (декстран, целлюлозу, олиго- или полисахариды) для желаемых свойств. Эти фрагменты могут представлять собой результаты прямого слияния с кодирующими белковый каркас последовательностями, и их можно создавать стандартными методиками клонирования и экспрессии. Альтернативно для прикрепления фрагментов в сформированные рекомбинантным способом домены FN3 настоящего изобретения можно применять хорошо известные способы химического связывания.
Домены FN3 со встроенными дополнительными фрагментами можно сравнить по функциональности с помощью нескольких хорошо известных анализов. Например, изменение свойств домена FN3 вследствие встраивания доменов Fc и/или вариантов домена Fc можно проанализировать в анализах связывания с рецепторами Fc, применяя растворимые формы рецепторов, такие как рецепторы FcyRI, FcyRII, FcyRIII или FcRn, или применяя хорошо известные клеточные анализы для измерения, например, ADCC или CDC, или оценки фармакокинетических свойств белкового каркаса на моделях in vivo.
Создание и получение белков домена FN3
Один вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения библиотеки доменов FN3,
содержащей альтернативную поверхность, причем альтернативная поверхность имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену в сравнении с эталонным доменом FN3, содержащий: обеспечение полинуклеотида, кодирующего эталонный домен FN3; создание библиотеки полинуклеотидных последовательностей эталонного домена FN3 путем рандомизации альтернативной поверхности; трансляцию библиотеки in vitro или экспрессию библиотеки в хозяине.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой способ получения библиотеки доменов FN3 с диверсифицированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG, образованной бета-тяжем С, петлей CD, бета-тяжем F и петлей FG, содержащий обеспечение эталонного полипептида домена FN3 с аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 8 0% идентичной SEQ ID NO: 27; внесение разнообразия в эталонный полипептид домена FN3 путем мутации по меньшей мере одного остатка бета-тяжа С и по меньшей мере одного остатка бета-тяжа F для образования библиотеки домена FN3 с диверсифицированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG.
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка в бета-тяже С, при условии, что S30 не мутирован (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 27).
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы остатки L32, Q34 и Q3 6 бета-тяжа С (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 27) .
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка в бета-тяже F при условии, что Ебб не мутирован (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 27).
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы остатки Т68, S70 и Y72 бета-тяжа F (нумерация остатков соответствует SEQ ID NO: 27) .
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка в петле CD при условии, что остатки G42 и Е43 не мутированы (нумерация
остатков соответствует SEQ ID NO: 27).
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы остатки S38, Е39, К40 и V41 в петле CD.
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка в петле FG, при условии что остатки К7 5, G7 6, G7 7 и S8 0 не мутированы (нумерация остатков соответствует SEQ ID N0: 27).
В способах получения библиотеки настоящего изобретения могут быть мутированы остатки Н7 8, R7 9 и N81 петли FG (нумерация остатков соответствует SEQ ID N0: 27).
В способах получения библиотеки настоящего изобретения эталонный домен FN3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 27, необязательно содержащую по меньшей мере одну замену в положениях аминокислот 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86.
В способах настоящего изобретения можно применять другие эталонные домены FN3, такие как Tencon (SEQ ID NO: 16) или его варианты, как показано в SEQ ID N0: 17-2 6 и в таблице 3.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой библиотеку, формируемую способами настоящего изобретения.
Создание каркасных белков, доменов (или модулей) FN3
настоящего изобретения, как правило, достигают на уровне
нуклеиновых кислот. Библиотеки доменов FN3 настоящего
изобретения, имеющие замещенные кодоны в одном или более
конкретных остатках, можно синтезировать, например, с
применением стандартных способов клонирования с помощью ПЦР или
химического синтеза генов в соответствии со способами,
описанными в патенте США № 6521427 и патенте США № 6670127.
Кодоны можно рандомизировать с применением хорошо известных
способов, например, вырожденных олигонуклеотидов,
соответствующих разработанному разнообразию, или с применением мутагенеза по Кункелю (Kunkel et al. , Methods Enzymol. 154, 367-382, 1987 г.).
Библиотеки можно рандомизировать по выбранным кодонам с применением случайного или определенного набора аминокислот. Например, варианты библиотеки, имеющей случайные замены, можно
создавать с применением кодонов NNK, которые кодируют все 2 0 встречающихся в естественных условиях аминокислот. В других схемах диверсификации можно применять кодоны DVK для кодирования аминокислот Ala, Тгр, Туг, Lys, Thr, Asn, Lys, Ser, Arg, Asp, Glu, Gly и Cys. Альтернативно можно применять кодоны NNS для получения всех 2 0 аминокислотных остатков и одновременного снижения частоты стоп-кодонов. Для обозначения кодонов используется хорошо известный код IUB.
Как и любые другие белки, домены FN3 настоящего изобретения склонны к множеству физических и/или химических нестабильностей, приводящих к отрицательным эффектам при дальнейшей обработке. Например, физическая и химическая нестабильность может приводить к агрегации, деградации, снижению выхода продукта, потере эффективности, повышению иммуногенного потенциала, молекулярной неоднородности и потере активности. Таким образом, в процессе разработки библиотек можно минимизировать наличие возможных индуцирующих нестабильность остатков и распознаваемых последовательностей. Например, открытые на поверхности метионин и триптофан могут окисляться в условиях хранения, что может приводить к потере эффективности белкового каркаса. Наличие аспарагина, в дополнение к участию в хорошо известных сайтах распознавания N-гликозилирования (NXS/T), может быть дезаминировано при наличии идущего за ним глицина, что, возможно, создает гетерогенность
(Robinson, Proc Natl Acad Sci USA, 99, 5283-5288, 2002 г.). Таким образом, некоторые или все из этих аминокислот можно исключить или не исключать из смеси, применяемой для рандомизации выбранного положения. Более того, можно исключить цистеин и пролин для минимизации образования дисульфидного мостика и разрушения бета-листов.
Библиотеки доменов FN3 со смещенным распределением
аминокислот в диверсифицируемых положениях можно синтезировать,
например, путем применения технологии Slonomics(r)
(http:_//www_sloning_com). В этой технологии применяют библиотеку предварительно приготовленных двухцепочечных триплетов, которые действуют как универсальные строительные
блоки, достаточные для тысяч процессов синтеза генов. В библиотеке триплетов представлены все возможные комбинации последовательностей, необходимые для построения желаемой молекулы ДНК.
Специалистам в данной области хорошо известен синтез олигонуклеотидов с выбранной "вырожденностью" нуклеотидов в определенных положениях, например, подход TRIM (Knappek et al., J Mol Biol 296, 57-86, 1999 г.; Garrard & Henner, Gene 128, 103-109, 1993 г.). Такие наборы нуклеотидов, имеющие определенные наборы кодонов, можно синтезировать с применением доступных в продаже нуклеотидных или нуклеозидных реагентов и устройства.
В примере схемы диверсификации остатки L32, Q34 и Q3 6 бета-тяжа С, S38, Е39, К40 и V41 петли CD, Т68, S70 и Y72 бета-тяжа F и Н78, R79 и N81 в петле FG домена FN3 Tencon27 (SEQ ID NO: 27) рандомизируют кодонами NNS.
Применяют стандартные методики клонирования и экспрессии для клонирования библиотек в вектор или синтеза кассет с двухцепочечной кДНК библиотеки, чтобы затем экспрессировать библиотеки или транслировать их in vitro. Например, можно применять цис-дисплей для лигатирования фрагментов ДНК, кодирующих каркасные белки, с фрагментом ДНК, кодирующим RepA, чтобы создать пул комплексов белок-ДНК, образованных после трансляции in vitro, причем каждый белок стабильно ассоциируется с кодирующей его ДНК (патент США № 7,842,476; Odegrip et al. , Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004 г.). Можно применять другие способы, например, рибосомный дисплей (Hanes and Pluckthun, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 49374942, 1997 г.), мРНК-дисплей (Roberts and Szostak, Proc Natl Acad Sci USA, 94, 12297-12302, 1997 г.) или другие бесклеточные системы (патент США № 56437 68) . Библиотеки белковых каркасов можно экспрессировать как слитые белки, отображающиеся на поверхности, например, любого подходящего бактериофага. Способы отображения слитых полипептидов на поверхности бактериофага хорошо известны (публикация патента США № 2011/0118144; публикация международного патента № W020 0 9/0 8 5462; патент США №
6,969,108; патент США № 6,172,197; патент США № 5223409; патент США № 6582915; патент США № 6472147). Скрининг
Скрининг сконструированных доменов FN3 белка или библиотек вариантов домена FN3 на специфическое связывание с молекулами-мишенями можно достигать, например, путем получения библиотеки с применением цис-дисплея, как описано в примерах и в работе Odegrip et al. , Proc Natl Acad Sci USA 101, 2806-2810, 2004 г., а также анализа библиотеки на специфическое связывание с молекулой-мишенью любым способом, известным специалистам в данной области. Примеры хорошо известных способов, которые можно применять, - это ИФА, иммуноферментный сэндвич-анализ и конкурентный и неконкурентный анализы (см., например, Ausubel et al., eds, 1994 г., Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York).
Домены FN3 настоящего изобретения могут связывать белки человека или других млекопитающих с широким диапазоном аффинности (KD). Как правило, домен FN3 настоящего изобретения может связываться с белком-мишенью с KD, равной или меньшей приблизительно 10~7 М, 10~8 М, 10~9 М, 10~10 М, 10"11 М, 10~12 М, 10~13 М, 10~14 М или 10~15 М, по результатам измерения с использованием метода поверхностного плазмонного резонанса или способом Kinexa, известным специалистам в данной области. Аффинность домена FN3 к антигену можно определить экспериментально с помощью любого подходящего способа (см., например, Berzofsky, et al., Antibody-Antigen Interactions, Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press: New York, NY (1984 г.); Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company: New York, NY (1992 г.); а также способы, описанные в настоящем документе). Измеренная аффинность взаимодействия в конкретной паре домен FNS-антиген может изменяться при измерении в различных условиях (например, осмолярность, рН). Таким образом, измерения аффинности и других антигенсвязывающих параметров (например, KD, Kon, K0ff) предпочтительно производят с использованием стандартизированных растворов белкового каркаса и антигена, а также стандартизированного буферного раствора, такого как
описанный в настоящем документе.
Молекулы нуклеиновых кислот и векторы
В настоящем изобретении предусмотрены нуклеиновые кислоты, кодирующие домены FN3 настоящего изобретения, в виде выделенных полинуклеотидов или в виде частей векторов экспрессии или в виде частей линейных последовательностей ДНК, включая линейные последовательности ДНК, применяемые для транскрипции/трансляции in vitro, векторов, совместимых с экспрессией, секрецией и/или отображением композиций или результатов их направленного мутагенеза в прокариотах, эукариотах или нитчатых фагах. В настоящем документе описаны некоторые примеры полинуклеотидов, однако другие полинуклеотиды, которые, учитывая вырожденность генетического кода или предпочтения в отношении кодона в данной системе экспрессии, кодируют белковые каркасы и библиотеки белковых каркасов настоящего изобретения, также находятся в объеме настоящего изобретения.
Полинуклеотиды настоящего изобретения можно сформировать путем химического синтеза, такого как твердофазный синтез полинуклеотидов на автоматическом синтезаторе полинуклеотидов, и сборки в полные одно- или двухцепочечные молекулы. Альтернативно полинуклеотиды настоящего изобретения можно сформировать другими методами, такими как ПЦР с последующим стандартным клонированием. Методики производства или получения полинуклеотидов с заданной известной последовательностью хорошо известны специалистам в данной области.
Полинуклеотиды настоящего изобретения могут содержать по
меньшей мере одну некодирующую последовательность, такую как
промоторную или энхансерную последовательность, интрон, сигнал
полиаденилирования, цис-последовательность, облегчающую
связывание с RepA, и т. п. Полинуклеотидные последовательности также могут содержать дополнительные последовательности, кодирующие дополнительные аминокислоты, которые кодируют, например, маркерную последовательность или последовательность метки, такую как гистидиновую метку или метку НА, для облегчения очистки или обнаружения белка, сигнальную последовательность, партнер для слитого белка, такой как RepA,
Fc или белок покрытия бактериофага, такой как pIX или pill.
Пример нуклеотида содержит последовательности для промотора Тас, последовательности, кодирующие библиотеку доменов FN3 и герА, цис-элемент и бактериальную точку начала репликации (ori). Другой пример полинуклеотида содержит сигнальную последовательность pelB или отрА, белок покрытия бактериофага pill pIX, домен FN3 и сайт polyA. Примеры полинуклеотидов, кодирующих библиотеку TCL14 и Тепсоп2 7, показаны в SEQ ID N0: 100 и 101 соответственно.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой вектор, содержащий по меньшей мере один полинуклеотид настоящего изобретения. Такие векторы могут быть плазмидными векторами, вирусными векторами, бакуловирусными экспрессионными векторами, векторами на основе транспозонов или любыми другими векторами, подходящими для внесения полинуклеотидов настоящего изобретения в заданный организм или генетическое окружение любыми средствами. Такие векторы могут представлять собой векторы экспрессии, содержащие элементы последовательности нуклеиновых кислот, которые могут контролировать, регулировать, вызывать или допускать экспрессию полипептидов, кодируемых таким вектором. Такие элементы могут содержать сайты связывания энхансера транскрипции, сайты инициации РНК-полимеразы, сайты связывания рибосом и другие сайты, способствующие экспрессии закодированных полипептидов в данной экспрессионной системе. Такие экспрессионные системы могут быть клеточными или бесклеточными системами, хорошо известными специалистам в данной области.
Выбор клетки-хозяина или конструирование клетки-хозяина
Домен FN3 настоящего изобретения можно необязательно формировать с помощью клеточной линии, смешанной клеточной линии, иммортализованной клетки или клональной популяции иммортализованных клеток, как хорошо известно специалистам в данной области, см., например, публикации Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2001 г.); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor,
NY (1989 г.); Harlow and Lane, Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989 г.); Colligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2001 г.); Colligan et al. , Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997-2001 г.).
Выбранная для экспрессии клетка-хозяин может происходить от млекопитающего или может быть выбрана из клеток COS-1, COS-7, НЕК293, ВНК21, СНО, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, миеломы, лимфомы, дрожжей, насекомых или растений или любых их производных, иммортализованных или трансформированных клеток. Альтернативно клетку-хозяина можно выбрать из видов или организмов, неспособных к гликозилированию полипептидов, например, прокариотической клетки или организма, такого как BL21, BL21(DE3), BL21-GOLD(DE3), XLl-Blue, JM109, HMS174, HMS174(DE3) и любого из естественных или сконструированных штаммов Е. coli, Klebsiella или Pseudomonas.
Применение доменов FN3 настоящего изобретения
Композиции молекул домена (модуля) на основе FN3,
описанные в настоящем документе и созданные любым из
вышеописанных способов, можно применять для диагностики,
мониторинга, модуляции, лечения, ослабления, профилактики
развития или снижения симптомов заболевания человека или
конкретных патологий клеток, тканей, органов, текучих сред или
по существу хозяина. Сконструированный для конкретной цели
домен FN3 можно применять для лечения иммуноопосредованного или
иммунодефицитного заболевания, метаболического заболевания,
сердечно-сосудистого расстройства или заболевания;
злокачественного заболевания; неврологического расстройства или заболевания; инфекции, такой как бактериальная, вирусная или паразитарная инфекция; или другого известного или указанного связанного состояния, включая отек, боль и некроз или фиброз ткани.
Такой способ может содержать введение эффективного количества композиции или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один домен FN3, специфически связывающий молекулу-мишень с клеткой, тканью, органом,
животным или пациентом, которому необходимо такое модулирование, лечение, ослабление, профилактика или снижение симптомов, эффектов или механизмов. Эффективное количество может содержать количество от приблизительно 0,001 до 500 мг/кг для однократного (например, болюсного), многократного или непрерывного введения, или достигать сывороточной концентрации 0,01-5000 мкг/мл при однократном, многократном или непрерывном введении, или может находиться в любом эффективном диапазоне или значении, как установлено и определено с применением известных способов, описанных в настоящем документе или известных специалистам в соответствующих областях.
Фармацевтические композиции, содержащие белки домена FN3 Домены FN3, специфически связывающие молекулы-мишени, которые модифицированы или не модифицированы, с мономерами, димерами или мультимерами, а также моно-, би- или мультиспецифические, можно выделить с применением хорошо известных специалистам в данной области процедур разделения для захвата, иммобилизации, разделения или осаждения и очистить до степени, которая необходима для возможности коммерческого применения.
Для терапевтического применения домены FN3, специфически
связывающие молекулу-мишень, можно приготовить в виде
фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество
домена FN3 в качестве активного компонента в фармацевтически
приемлемом носителе. Термин "носитель" относится к разбавителю,
адъюванту, эксципиенту или среде, с которыми будет вводиться
активное соединение. Такая среда может быть жидкой, такой как,
например, вода или масла, включая масла, получаемые из нефти,
масла животного, растительного или синтетического
происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Например, можно применять 0,4% физиологический раствор и 0,3% глицин. Эти растворы стерильны и по существу свободны от твердых частиц. Их стерилизацию могут проводить с использованием традиционных хорошо известных методик стерилизации (например, фильтрации). Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые
вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как агенты, необходимые для регулирования и буферизации рН, стабилизаторы, загустители, смазывающие агенты и красители и т.д. Концентрация агента настоящего изобретения в таком фармацевтическом составе может изменяться в широких пределах, т.е. от менее чем приблизительно 0,5% (как правило, по меньшей мере приблизительно 1%) до 15-20% вес, и выбирается преимущественно на основе необходимой дозы, объемов текучих сред, вязкостей и т. д. в соответствии с конкретным выбранным режимом введения. Подходящие среды и составы, включая другие белки человека, например, сывороточный альбумин человека, описаны, например, в публикации Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing стр. 691-1092, см. в особенности стр. 958-989.
Режим введения для терапевтического применения доменов FN3, специфически связывающих молекулы-мишени, может представлять собой любой подходящий путь, обеспечивающий доставку агента в хозяина, такой как парентеральное введение, например, внутрикожное, внутримышечное, интраперитонеальное, внутривенное, подкожное, легочное; чресслизистое (пероральное, интраназальное, интравагинальное, ректальное); с применением состава в виде таблетки, капсулы, раствора, порошка, геля, гранул; и содержащиеся в шприце, имплантированном устройстве, осмотическом насосе, картридже, микронасосе; или же с помощью других средств, очевидных для квалифицированного специалиста, которые хорошо известны в данной области. Можно обеспечить специфическое введение в область, например, в виде доставки в сустав, бронхи, брюшную полость, капсулу, хрящ, полость, клетку, мозжечок, желудочек мозга, толстую кишку, шейку матки, желудок, печень, миокард, кость, таз, перикард, полость живота, плевру, простату, легкие, прямую кишку, почку, сетчатку, позвоночник, суставную сумку, грудную клетку, матку, сосуд, пузырь, поврежденную ткань, вагинально, ректально, буккально, сублингвально, интраназально или трансдермально.
Хотя настоящее изобретение описано в общем виде, варианты осуществления настоящего изобретения будут дополнительно описаны в следующих примерах, которые не следует воспринимать как ограничивающие объем пунктов формулы изобретения.
ПРИМЕР 1. Каркас Tencon
Конфигурация Tencon
Третий домен фибронектинового модуля типа III (Fn3) тенасцина С человека (SEQ ID N0: 3) можно применять в качестве белкового каркаса, который можно сконструировать для связывания конкретных молекул-мишеней. Температура плавления этого домена в его нативной форме в ФСБ составляет 54°С.
Для получения белкового каркаса с аналогичной структурой и улучшенными физическими свойствами, такими как улучшенная термостабильность, разработали консенсусную последовательность на основе выравнивания 15 доменов FN3 тенасцина С человека (показаны в SEQ ID N0: 1-15) . Выбранные 15 доменов FN3 имеют степени идентичности последовательностей друг с другом в диапазоне от 13 до 80% со средней степенью идентичности последовательностей между парами, равной 2 9%. Консенсусную последовательность, обозначенную как Tencon (SEQ ID N0: 16), разработали путем включения наиболее консервативных (часто встречающихся) аминокислот в каждом положении (см. публикацию патента США № 2 010/0216708). В попарных выравниваниях Tencon идентична доменам FN3 тенасцина С в 34-59% положений, причем средняя степень идентичности последовательности составляет 43%.
Экспрессия и очистка Tencon
Провели обратную трансляцию аминокислотной
последовательности Tencon, получив последовательность кДНК, показанную в SEQ ID N0: 59. Полученную кДНК амплифицировали и клонировали в модифицированный вектор рЕТ15 с применением стандартных способов. Белок экспрессировали как слитый белок с His6 на С-конце в растворимой форме в E.coli и очищали с применением стандартной Ni-NTA агарозы, применяя элюирование в 500 мМ имидазола. Желательные фракции объединяли и диализовали в ФСБ при рН 7,4. На второй стадии очистки белок загружали на колонку Superdex-75 HiLoad 16/60 (GE Healthcare),
уравновешенную в ФСБ. Фракции, содержащие Tencon, объединяли и концентрировали с применением концентратора Centriprep UltraCel YM-3 (Amicon). Анализ ДСН-ПААГ показал, что Tencon мигрирует в диапазоне от б до 14 кДа, что соответствует ожидаемой массе 10,7 кДа для мономерного белка. Выход чистого белка Tencon составил > 50 мг чистого белка на литр культуры. Биофизическая характеризация Tencon
Структуру и стабильность Tencon характеризовали с помощью спектроскопии кругового дихроизма (CD) и дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) соответственно. Измерения CD проводили на спектрометре AVIV при 2 0°С в ФСБ и с концентрацией 0,2 мг/мл. Спектр показал минимум при 218 нм, что свидетельствует о структуре типа бета-листа, ожидаемой для белка, относящегося к семейству FN3. Данные DSC получали путем нагрева 0,5 мг/мл растворов 3-го домена FN3 из тенасцина С (TN3) или Tencon в ФСБ от 35°С до 95°С со скоростью 1°С/минута в калориметре N-DSCII (Applied Thermodynamics) . Исходя из этих данных, с помощью программного обеспечения CpCalc (Applied Thermodynamics) рассчитали температуры плавления 54 °С и 78°С для домена TN3 и Tencon соответственно. Сворачивание и разворачивание обоих доменов при этих температурах является обратимым. Таким образом, созданный каркас Tencon демонстрирует улучшенную термостабильность в сравнении с TN3. На основании этого повышения стабильности можно предположить, что каркас Tencon будет более удобным для аминокислотной замены и более простым в изготовлении. С повышением стабильности каркаса ожидается улучшение порога толерантности к мутациям, снижающим стабильность белка; таким образом, каркас с повышенной стабильностью, по-видимому, обеспечивает получение более функциональных и хорошо свернутых связывающих агентов из библиотеки вариантов каркаса.
Отображение Tencon на фаге М13
Кодирующую аминокислотную последовательность Tencon кДНК (SEQ ID N0: 59) субклонировали в фагмидный вектор экспрессии рРер9 (публикация международного патента № WO2008/079973) с помощью стандартного ПЦР и клонирования фрагментов рестрикции,
позволяя получить вектор pTencon-pIX. Этот вектор экспрессирует меченный Мус на N-конце Tencon в виде слияния по С-концу с N-концом белка pIX бактериофага М13 под контролем промотора Lac (позволяя получить более низкие уровни экспрессии без IPTG и повышенную экспрессию после добавления IPTG), используя сигнальную последовательность ОтрА. Между Tencon и pIX вставили короткий линкер TSGGGGS (SEQ ID N0: 60) для предотвращения стерических взаимодействий между этими белками.
Для подтверждения отображения на поверхности частицы фага М13 выращивали трансформанты pTencon-pIX из одной колонии в XLl-Blue Е. coli при температуре 37 °С до достижения середины логарифмического роста и спасали с помощью б10 БОЕ фага-помощника VCSM13. Через 16 часов размножения в среде 2YT с добавлением ампициллина с последующей индукцией 1 мМ IPTG со спасенных культур собирали супернатанты, центрифугировали их при 4 000 X g в течение 2 0 минут и хранили при 4°С для анализа.
Чтобы подтвердить отображение конструкта Мус-Tencon на поверхности фага М13, применяли связывание фаговых частиц с антителом анти-Мус (Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США) . Планшет Maxisorp на ночь покрывали антителом анти-Мус или анти-cw (отрицательный контроль) с концентрацией 2,5 мкг/мл и блокировали с помощью SuperBlock Т20 (Thermo Scientific, г. Рокфорд, штат Иллинойс, США). Вышеописанный супернатант фагмидной культуры дважды последовательно разбавляли ФСБ и добавляли в лунки покрытого планшета. Через 1 час планшет промывали TBST и в каждую лунку добавляли антитело анти-М13 HRP и промывали TBST после 1-часовой инкубации. Добавляли субстрат Roche BD ELISA POD и обнаруживали люминесценцию на спектрофотометре для прочтения планшетов Тесап.
ПРИМЕР 2. Стабилизирующие мутации в Tencon
Были описаны библиотеки Tencon FG7 и BC6/FG7, выполненные с возможностью внесения разнообразия в петли FG и одновременно петли FG и ВС (публикация патента США № 2010/0255056; публикация патента США № 2 010/0216708).
Разработка вариантов
Мутанты были выполнены с возможностью повышения стабильности сворачивания Tencon (SEQ ID NO: 16) . Провели несколько точечных мутаций для получения замены отдельных остатков SEQ ID N0: 16, таких как N46V (Tenconl7; SEQ ID N0:17), Е14Р (Tenconl8; SEQ ID N0:18), E11N (Tenconl9; SEQ ID N0:19), E37P (Tencon20; SEQ ID N0:20) и G73Y (Tencon21; SEQ ID N0:21), для которых прогнозировали повышение стабильности каркаса с помощью программы PoPMuSiC v2.0 (Dehouck et al., Bioinformatics, 25, 2537-2543, 2009 г.). Ранее было обнаружено, что мутант E86I (Tencon22; SEQ ID N0:22) стабилизирует гомологичный белок, 3-й домен FN3 тенасцина С человека (WO2009/086116). В экспериментах с аланиновым сканированием, в которых все остатки петли Tencon независимо заменяли на аланин, было обнаружено, что мутация L17A (Tencon2 6; SEQ ID N0: 2 6) значительно стабилизирует Tencon (данные не показаны). После исходного этапа анализов стабильности для дополнительного повышения стабильности сформировали комбинаторные мутанты N46V/E86I (Tencon23; SEQ ID N0:23), E14P/N46V/E861 (Tencon24; SEQ ID N0:24) и L17A/N46V/E861 (Tencon25; SEQ ID N0:25).
Экспрессия и очистка
Мутации в кодирующей Tencon последовательности проводили с применением набора для мутагенеза QuikChange (Stratagene) и мутантные белки экспрессировали и очищали с применением стандартных протоколов в виде слитых белков HIS6- Белки элюировали из колонок Ni-NTA (Novagen) в 50 мМ растворе фосфата натрия при рН 7, 4, 500 мМ NaCl и 250 мМ имидазола. После элюирования белки диализовали в ФСБ при рН 7,4.
Характеризация термостабильности
Термостабильность Tencon и каждого мутантного белка в ФСБ при рН 7,4 (2-3 мг/мл) измеряли с помощью капиллярной дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Для этих образцов измеряли температуры плавления с применением прибора VP-DSC, оснащенного автоматическим пробоотборником (MicroCal, LLC) . Образцы нагревали с 10°С до 95°С или 100°С со скоростью 1°С в минуту. Между сканированием каждого образца проводили
сканирование только буферного раствора для расчета базовой
линии для интегрирования. После вычитания сигнала только от
буферного раствора данные аппроксимировали в соответствии с
моделью сворачивания с двумя состояниями. Обратимость
термической денатурации определяли путем повторного
сканирования каждого образца без его извлечения из клетки.
Обратимость рассчитывали путем сравнения площади под
фармакокинетической кривой, полученной при 1-ом сканировании и
при 2-ом сканировании. Результаты экспериментов с DSC
представлены в таблице 3 в виде значений, полученных из полных
кривых плавления (Тт (ккал)). Одиночные мутанты Тепсоп17,
Tenconl8, Тепсоп19 и Тепсоп22 имели повышенную
термостабильность в сравнении с родительской
последовательностью Tencon. Значительную дестабилизацию наблюдали только для Тепсоп21. Комбинаторные мутанты Тепсоп23, Тепсоп2 4 и Тепсоп2 5 и т.п. имели значительно более высокую стабильность, что указывает на накопительный эффект разработанных мутаций в отношении повышения термостабильности. Денатурация гидрохлоридом гуанидина
Для оценки стабильности применяли измерение способностей Tencon и каждого мутанта оставаться свернутыми при обработке растущими концентрациями гидрохлорида гуанидина (GdmCl) по результатам измерения флуоресценции триптофана. Tencon содержит только один остаток триптофана. Остаток триптофана находится внутри гидрофобного ядра и, таким образом, эмиссия флуоресценции на 3 60 нм является чувствительным измерением свернутого состояния этого белка. В черные 9б-луночные планшеты без связывания (Greiner) добавляли по 200 мкл раствора, содержащего 50 мМ фосфата натрия при рН 7,0, 150 мМ NaCl и изменяемые концентрации GdmCl от 0,48 до 6,63 М для получения титрования по 17 точкам. В каждую лунку планшета добавляли по 10 мкл раствора, содержащего мутанты Tencon, до конечной концентрации белка 2 3 мкМ и перемешивали содержимое лунок осторожным пипетированием вверх и вниз. После инкубирования при комнатной температуре в течение 2 4 часов считывали флуоресценцию на спектрофотометре для прочтения планшетов
Spectramax M5 (Molecular Devices, г. Саннивэйл, штат Калифорния, США) с возбуждением на 280 нм и эмиссией на 3 60 нм. Сигнал флуоресценции конвертировали в развернутую фракцию с применением следующего уравнения (Расе Methods Enzymol, 131, 266-280, 1986 г.):
fu = (,Уг-У)/(Уг-Уи)
где yF - сигнал флуоресценции свернутого образца, а уи - развернутого образца.
Средние точки перехода разворачивания и наклон перехода определяли путем аппроксимирования с применением следующего уравнения (Clarke et al., 1997 г.):
_ (av + fly[Р]) + ("д +/?д[Р]> *р(т([Р] - [ДЦ/ДГ) l + exp(m(.[D]- [D]50^')/RT)
где F - флуоресценция при заданной концентрации
денатурирующего агента, " - отсечения оси у для нативного и
денатурированного состояния, - наклоны базовых линии для
нативного и денатурированного состояния, [D] - концентрация
GdmCl, ' - концентрация GdmCl, при которой 50% образца
находится денатурировано, m - наклон перехода, R - газовая постоянная, а Т - температура. Свободную энергию сворачивания для каждого образца оценивали с применением следующего уравнения (Расе 1986, см. выше; Clarke et al. , J Mol Biol 270,
&G =m[D]5C.3
771-778, 1997 r.):
Зачастую для таких кривых сложно точно измерить наклон перехода (т). В дополнение к этому можно ожидать, что описанные в настоящем документе мутации не изменят механизм сворачивания Tencon. Таким образом, для каждого мутанта измеряли значение m и усредняли значения (Расе 1986, см. выше), получив т=3544 кал/моль/М, которую применяли во всех расчетах свободной энергии. Результаты этих расчетов представлены в таблице 3. Результаты экспериментов по разворачиванию GdmCl показывают, что те же мутанты, которые стабилизуют Tencon в отношении термостабильности, также стабилизируют белок относительно
Эксклюзионная хроматография
Применяли эксклюзионную хроматографию (SEC) для оценки состояния агрегации Tencon и каждого варианта Tencon. По 5 мкл каждого образца инжектировали на колонку Superdex 75 5/150 (GE Healthcare) со скоростью потока 0,3 мл/мин с ФСБ в качестве подвижной фазы. Элюирование с колонки контролировали по поглощению на 280 нм. Для оценки состояния агрегации колонку предварительно калибровали с помощью глобулярных стандартов молекулярной массы (Sigma). Все тестированные образцы, за исключением Тепсоп21, элюировались одним пиком при объеме элюирования, соответствующем мономерному образцу. Тепсоп21 элюировался 2 пиками, что указывает на наличие агрегатов.
ПРИМЕР 3. Создание библиотек Tencon с альтернативными поверхностями связывания
Разработка библиотеки TCL14
Выбор остатков для рандомизации конфигурации конкретной
библиотеки определяет общую форму созданной поверхности
взаимодействия. Рентгеновский кристаллографический анализ
содержащего домен FN3 каркасного белка, выбранного для
связывания связывающего мальтозу белка (МВР) из библиотеки с
рандомизированными петлями ВС, DE и FG, показал наличие
значительно искривленной поверхности взаимодействия,
соответствующей активному сайту МВР (Koide et al., Proc Natl
Acad Sci USA, 104, 6632-6637, 2007 г.). Напротив, было обнаружено, что у каркасного белка на основе повтора анкирина, выбранного для связывания с МВР, была значительно более плоская поверхность взаимодействия, при этом он связывался с внешней поверхностью МВР, которая удалена от активного сайта (Binz et al., Nat Biotechnol, 22, 575-58, 2004 г.). Эти результаты свидетельствуют о том, что форма связывающей поверхности молекулы каркаса (криволинейная или плоская) может определять, какие белки-мишени или конкретные эпитопы на этих белках-мишенях каркас могут быть эффективно связаны каркасом. Опубликованные попытки по конструированию содержащих домены FN3 белковых каркасов для связывания белка опирались на конструирование смежных петель (фиг. 1) для связывания мишени, таким образом позволяя получить криволинейные поверхности связывания. Этот подход может ограничивать число мишеней и эпитопов, доступных для таких каркасов.
Tencon и другие домены FN3 содержат два набора CDR-подобных петель, лежащих на противоположных сторонах молекулы, причем первый набор образован петлями ВС, DE и FG, а второй набор образован петлями АВ, CD и EF. Два набора петель разделены бета-тяжами, которые образуют центр структуры FN3 (фиг. 1, 2А). При повороте изображения структуры Tencon, представленной на фиг. 1, на 90 градусов можно визуализировать альтернативную поверхность (фиг. 2В) . Эта несколько вогнутая поверхность образована петлями CD и FG и двумя антипараллельными бета-тяжами С и F, ив настоящем документе называется поверхностью C-CD-F-FG (фиг. 2В) . Поверхность C-CD-F-FG можно применять в качестве шаблона для разработки библиотек поверхностей взаимодействия белкового каркаса путем рандомизации подмножества остатков, образующих поверхность. Бета-тяжи имеют повторяющуюся структуру, в которой боковая цепь каждого второго остатка открыта на поверхности белка. Таким образом, библиотеку можно получить путем рандомизации некоторых или всех открытых на поверхности остатков бета-тяжей. Путем выбора соответствующих остатков в бета-тяжах можно получить уникальную поверхность каркаса для взаимодействия с другими
белками при минимальной потере присущей каркасу Tencon стабильности.
Разработали новую библиотеку, называемую в настоящем документе TCL14 (SEQ ID N0: 28), на основе каркаса Тепсоп25 (SEQ ID N0: 25) с дополнительной заменой E11R (Tencon27, SEQ ID N0: 27) (фиг. 2В, 3) . Положения петель и тяжей и их последовательности показаны в таблице 4 и таблице 5 для Tencon27 (SEQ ID N0: 27) и TCL14 (SEQ ID N0: 28) соответственно. В таблице 5 "X" обозначает любую аминокислоту.
Tencon27 (SEQ ID N0: 27):
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
Библиотека TCL14 (SEQ ID N0: 28):
LPAPKNLWSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYDL TGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT;
где X представляет собой любую аминокислоту.
Два бета-тяжа, образующие поверхность C-CD-F-FG в Тепсоп2 7, имеют в совокупности 9 открытых на поверхности остатков, которые можно рандомизировать; тяж С: S30, L32, Q34, Q36; тяж F: Ебб, Т68, S70, Y72 и V74, тогда как петля CD имеет б потенциальных остатков: S38, Е39, К40, V41, G42 и Е43, а петля FG имеет 7 потенциальных остатков: К75, G76, G77, Н78, R7 9, S8 0 и N81 (фиг. 5) . В конфигурацию TCL14 для включения избрали только выбранные остатки вследствие большего теоретического размера библиотеки при рандомизации всех 22 остатков.
Для рандомизации выбрали тринадцать положений в Тепсоп2 7 (SEQ ID N0: 27): L32, Q34 и Q36 в тяже С, S38, Е39, К40 и V41 в петле CD, Т68, S70 и Y72 в тяже F, Н78, R79 и N81 в петле FG. В тяжах С и F не рандомизировали S30 и Ебб, поскольку они находятся непосредственно за петлями CD и FG и не являются явным образом частью поверхности C-CD-F-FG. В петле CD не рандомизировали G42 и Е43, поскольку глицин, обеспечивающий гибкость, может быть ценным в областях петли, а Е43 находится в точке соединения с поверхностью. В петле FG исключили К7 5, G7 6, G7 7 и S8 0. Глицины исключили по вышеуказанным причинам, в то
время как тщательное исследование кристаллических структур показало, что S8 0 образует ключевые контакты с ядром и помогает образовать стабильную петлю FG. К75 обращен от поверхности С-CD-F-FG и был менее привлекательным кандидатом для рандомизации. Хотя вышеуказанные остатки не были рандомизированы в исходной конфигурации TCL14, их можно было включить в последующие конфигурации библиотеки для обеспечения дополнительного разнообразия для выбора de novo или, например, для библиотеки повышения аффинности на основе выбранного конкретного варианта мишени для TCL14.
В отличие от существующих конфигураций библиотеки на основе существующего каркаса FN3 (Koide, et al. J Mol Biol, 284, 1141-1151, 1998 г.; Koide et al. , Proc Natl Acad Sci USA 104, 6632-6637, 2007 г.; (Dineen et al. , BMC Cancer, 8, 352361, 2008 г.; Olson and Roberts, Protein Sci, 16, 476-484, 2007 г.; Xu et al. , Chemistry & Biology, 9, 933-942, 2002; Karatan et al., Chem Biol, 11, 835-844, 2004 г.; Hackel et al. , J Mol
Biol, 401, 84-96, 2010; Hackel et al. , J Mol Biol 381, 1238-
1252, 2008 г.; Koide et al. , Proc Natl Acad Sci USA, 104,
6632-6637, 2007 г.; Lipovsek et al. , J Mol Biol, 368, 1024-
1041, 2007 г.; публикация международного патента №
WO2009/133208; публикация международного патента №
WO2009/058379; патент США № 7115396), поверхность разработанной библиотеки TCL14 не имеет структурного сходства с вариабельными доменами или CDR антитела или ранее описанными библиотеками FN3. Вследствие создания большой поверхности взаимодействия в такой конфигурации можно быстро выделить молекулы с высокой аффинностью связывания, возможно, без необходимости в стадиях повышения аффинности. Поскольку в данной конфигурации не проводится
Рандомизация длинных фрагментов последовательных аминокислот, она может давать связывающие молекулы на основе FN3 с большей растворимостью и стабильностью, чем ранее описанные библиотеки. Описанная библиотека TCL14 дает плоскую или вогнутую поверхность взаимодействия в сравнении с криволинейной поверхностью предыдущих библиотек. Таким образом, выбранные из TCL14 молекулы на основе FN3, вероятно, связывают отдельные антигены и эпитопы, как и молекулы из предыдущих конфигураций библиотеки FN3. Конфигурация библиотеки TCL14 также может позволить получать две отдельные поверхности связывания на одной и той же молекуле для достижения биспецифичности.
Создание библиотеки TCL14
Вышеописанную библиотеку TCL14 экспрессировали с применением системы цис-дисплея (Odegrip et al., Proc Natl Acad Sci USA 101: 2806-2810, 2004 г.) . В этой системе библиотеку лигатируют с фрагментами ДНК, кодирующими кодирующую RepA последовательность, элементы цис и ori и промотор Тас, и полученный продукт лигатирования транскрибируют/транслируют in vitro. Сформированные слитые белки TCL14-RepA связаны в цис с ДНК, которой кодируются слитые белки. Провели скрининг библиотеки на каркасные молекулы, специфически связывающиеся с исследуемыми белками, молекулы выделили и связанную ДНК амплифицировали для выявления кодирующих последовательностей связанных каркасных молекул.
Библиотеку TCL14 создали путем рандомизации положений L32, Q34, Q36 (тяж С), S38, Е39, К40, V41 (петля CD), Т68, S70, Y72 (тяж F), Н78, R79 и N81 (петля FG) в Tencon 27 (SEQ ID NO: 27), применяя полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с вырожденными праймерами, и клонировали 5' к гену RepA для цис-дисплея, применяя стандартные протоколы. Для рандомизации тяжа С и петли C:D применяли праймер C-CD N46V (SEQ ID NO. 51), для рандомизации тяжа F и петли F:G применяли праймер F-FG-Sf E86I-R (SEQ ID NO. 52) . Продукт лигатирования амплифицировали с праймерами RlRecFor (SEQ ID NO: 53) и DigLigRev (SEQ ID NO: 54) для создания библиотеки TCL14 для транскрипции/трансляции in vitro. Последовательности использованных праймеров показаны в
таблице 6.
Для диверсификации применяли кодон NNS
(код IUB; N
означает А,
С, G или Т; S означает С или G).
Таблица 6
Название праймера
Последовательность
SEQ ID NO
C-CD N4 6V
GCGGCGTTCGACTCTTTCNNSATCNNSTACNNSGAANNSN NSNNSNNSG
GTGAAGCGATCGGTCTGACCGTTCCGGGTTCTGAACGTTC
F-FG-Sf E86I-R
G G Т G G Т GAAGAT С G СAGACAG С G G S NNAGAS NN S NNAC СА ССТТТААС
RlRecFor
GAAC G С G G С TACAAT TAATACATAAC С
DigLigRev
CAT GAT TAC G С СAAG С T CAGAA
TC0N6
AAGAAGGAGAACCGGTATGCTGCCGGCGCCGAAAAAC
TC0N5 E86I короткий
GAGCCGCCGCCACCGGTTTAATGGTGATGGTGATGGTGAC CACCGGTG GTGAAGATСGСAGACAG
Характеризация библиотеки TCL14
Созданную библиотеку TCL14 клонировали с помощью ПЦР в модифицированный вектор рЕТ15 (EMD Biosciences), содержащий независимый от лигазы сайт клонирования (рЕТ154-ЫС), применяя праймеры TC0N6 (SEQ ID N0: 55) и TC0N5 E86I короткий (SEQ ID N0: 56), и белки экспрессировали как белки, меченные His6 на С-конце, после трансформаций и индукции IPTG (конечная концентрация 1 мМ, 30°С в течение 16 часов), применяя стандартные протоколы. Клетки собирали путем центрифугирования и впоследствии лизировали с помощью Bugbuster НТ (EMD Chemicals, г. Гиббстаун, штат Нью-Джерси, США) с добавлением 0,2 мг/мл лизозима из белка куриного яйца (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) . Бактериальные лизаты очищали путем центрифугирования и супернатанты переносили в новые 9 6-луночные планшеты deepwell. Белки очищали с применением 96-луночного планшета Ni-NTA Multitrap Plate (GE Lifesciences, r. Пискатавэй, штат Нью-Джерси, США).
Для оценки полученного распределения в библиотеке
проводили случайный выбор клонов и последовательностей.
Наблюдаемое разнообразие в библиотеке было хорошо согласовано с
ожидаемым (фиг. 7) . Для расчета наблюдаемого разнообразия во
всех полноразмерных клонах библиотеки подсчитывали общее число
раз, которое данная аминокислота появлялась в
диверсифицированных областях библиотеки, и делили на общее число случайных положений (13 случайных положений в библиотеке * 69 полноразмерных клонов) и умножали на 100 для получения частоты в процентах (%) . Ожидаемое разнообразие основано на
ырожденном кодоне NNS со следующим распределением аминокислот: Phe=l, Leu=3, Ile=l, Met=l, Val=2, Ser=3, Pro=2, Thr=2, Ala=2, Cys=l, Arg=3, Gly=2, Tyr=l, His=l, Gln=l, Asn=l, Lys=l, Asp=l, Glu=l, Trp=l кодона (-ов), разделенных на общее число кодонов (32) и умноженных на 100 для получения частоты в процентах (%) .
С очищенными белками проводили эксклюзионную хроматографию для определения склонности к агрегации отдельных членов библиотеки. Определяли профили элюирования выбранных клонов путем инжектирования 10 мкл очищенных белков на колонку Superdex 75 5/150 с применением ВЭЖХ-анализатора Agilent 1200 со считыванием поглощения на 280 нм. Приблизительно 8 0% не содержащих цистеин клонов элюировались в виде одного мономерного пика, таким образом указывая на то, что большинство отдельных членов библиотеки сохранили присущую им растворимость и структуру родительской молекулы. Для некоторых содержащих свободный цистеин молекул обнаружили окисление после очистки и, таким образом, элюирование в виде димерных молекул.
Для дополнительной характеризации клонов, по результатам SEC имеющих монодисперсный профиль, применяли дифференциальную сканирующую калориметрию (DSC). Данные DSC получали путем нагрева растворов 0,5 мг/мл для каждого клона в ФСБ с 35°С до 95°С со скоростью 1°С/мин в микрокалориметре с капиллярной ячейкой VP-DSC (Microcal, LLC, г. Пискатавэй, штат Нью-Джерси, США) . Температуры плавления для каждого клона рассчитывали с применением программного обеспечения CpCalc (Microcal, LLC, г. Пискатавэй, штат Нью-Джерси, США) , причем сводные данные представлены в таблице 7. Средняя температура плавления тестированных молекул составляла 7 0±9°С. Полученные данные показывают, что конфигурация библиотеки TCL14 дает молекулы каркаса, которые сохранили значительную часть термостабильности родительской молекулы Тепсоп25 (93°С) и по природе являются термостабильными и хорошо свернутыми.
Выбор из библиотеки TCL14 молекул, специфически связывающихся с исследуемыми молекулами-мишенями
Был проведен скрининг библиотеки TCL14 на различные белки-мишени различных классов белка, состоящих из внеклеточных доменов рецептора клеточной поверхности, цитокинов, киназ, фосфатаз, белков теплового шока и иммуноглобулинов, а также их фрагментов для выявления каркасных молекул, специфически связывающихся с этими белками и/или доменами белков. Очищенные растворимые белки, экспрессированные в клетках НЕК2 93 или Е. coli, биотинилировали с применением микропробирок EZ-Link No-Weigh Sulfo-NHS-LC-Biotin Microtubes (Thermo Fisher, r. Рокфорд, штат Иллинойс, США) с последующим интенсивным диализом в ФСБ. Для проведения выбора по 3 мкг библиотеки TCL14 транскрибировали и транслировали in vitro (IVTT) в линейном экстракте S30 Е. Coli (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) , и экспрессированную библиотеку блокировали реагентом Cis Block (2% БСА (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США), 100 мкг/мл ДНК спермы сельди (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США), 1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) ) . Для проведения выбора каждый биотинилированный белок-мишень добавляли в концентрациях 4 00 нМ (этап 1) , 2 00 нМ (этапы 2 и 3) и 100 нМ (этапы 4 и 5) . Связанные члены библиотеки извлекали с применением магнитных гранул с нейтравидином (Thermo Fisher, г. Рокфорд, штат Иллинойс, США) (этапы 1, 3, и 5) или магнитных гранул со
стрептавидином (Promega, г. Мэдисон, штат Висконсин, США) (этапы 2 и 4), а несвязанные члены библиотеки были удалены путем промывки гранул 5-14 раз с помощью 500 мкл PBST с последующей 2-кратной промывкой с помощью 50 0 мкл ФСБ.
После проведения 5 этапов выбора ДНК на выходе амплифицировали с помощью ПЦР и субклонировали в рЕТ154-ЫС с применением стандартных протоколов.
Для выявления каркасных молекул с повышенными аффинностями к двум белкам-мишеням провели дополнительные этапы выбора. Вкратце, выходы этапа 5 приготовили как описано выше и провели дополнительные итерационные этапы выбора со следующими изменениями: инкубацию с биотинилированным белком-мишенью снизили с 1 часа до 15 минут, продолжительность захвата на гранулы снизили с 2 0 минут до 15 минут, биотинилированный белок-мишень снизили до 25 нМ (этапы б и 7) или 2,5 нМ (этапы 8 и 9) и провели дополнительную 1-часовую промывку при наличии избытка небиотинилированного белка-мишени. Цель этих изменений заключалась в одновременном выборе связывающихся агентов с потенциально более высокой скоростью ассоциации и более низкой скоростью диссоциации, что позволяет получить по существу меньшее значение KD. Выход из 9-го этапа амплифицировали с помощью ПЦР, клонировали и экспрессировали, как описано выше.
Характеризация in vitro каркасных молекул, связывающихся с исследуемыми белками и/или доменами белка
Связывание
Провели иммуноферментный анализ (ИФА) на 188 отдельных клонах из выходов 5-го этапа пэннинга. Планшеты Maxisorp (Nunc, г. Рочестер, штат Нью-Йорк, США) в течение ночи выдерживали покрытыми 0,1 мкг антитела анти-His (Qiagen, г. Валенсия, штат Калифорния, США) , промывали буферизованным Tris физиологическим раствором при рН 7,4 с 0,05% Tween-20 (TBST) и блокировали с применением Starting Block Т20 (Thermo Fisher, г. Рокфорд, штат Иллинойс, США) . Осветленные бактериальные лизаты, содержащие 1 мкг/мл меченных His6 слитых белков TCL14-RepA или контрольный белок (сывороточный альбумин человека), нанесли на лунки покрытых планшетов. Планшеты инкубировали в течение 1 часа,
промывали TBST и обнаруживали биотинилированный белок с помощью конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена (HRP) (Jackson Immunoresearch, г. Вест Гроув, штат Пенсильвания, США) и хемилюминесцентного субстрата POD (Roche, г. Индианаполис, штат Индиана, США) с применением спектрофотометра для прочтения планшетов Molecular Devices М5. Характеристики библиотеки оценивали по степени совпадения. Степень совпадения определяли как отношение процентной доли (%) каркасных молекул с сигналом люминесценции, более чем 10-кратно превышающим контрольный сигнал, к общему числу прошедших скрининг клонов (188). Как показано в таблице 8, библиотека TLC14 позволила получить каркасные молекулы со степенью совпадения в диапазоне от 8% до 45% для восьми отдельных белков. Цитокин 2 представляет собой
IL-17A.
Таблица 8
Мишень
Степень совпадения (%)
Ser/Thr-киназа
Рецептор ECD
Иммуно гло булин
Белок теплового шока
Цитокин
Иммуноглобулин 2
Цитокин 2
Фосфатаза
Характеризация агентов, связывающих мышиный IL-17A Ингибирование рецепторов IL-17A
Провели анализ ингибирования для определения того, ингибируют ли выходы пэннинга на мышиный IL-17A (mIL-17A) с этапов 5 и 9 связывание mIL-17A с рецептором mIL-17A. Планшеты Maxisorp ночью выдерживали покрытыми 0,2 мкг/мл слитым белком рецептора mIL-17A и домена Fc (R &D Systems, г. Миннеаполис, штат Миннесота, США) , промывали фосфатно-солевым буфером (ФСБ) при рН 7,4 с добавлением 0,05% Tween-20 (TBST) и блокировали раствором 2% БСА, 5% сахарозы в ФСБ. В осветленные бактериальные лизаты, разбавленные 1:50 в 1% растворе БСА в
ФСБ, добавили 10 нг/мл биотинилированного mIL17A (b-mIL-17A) и инкубировали смеси в течение 20 минут. Заблокированные планшеты промывали и переносили на планшеты инкубационные смеси бактериальных лизатов/Ь-т1Ъ-17А. Планшеты инкубировали в течение дополнительного часа, промывали PBST и обнаруживали биотинилированный белок с помощью стрептавидина-HRP (Jackson Immunoresearch, г. Вест Гроув, штат Пенсильвания, США) и колориметрического субстрата OPD (Sigma-Aldrich, г. Сент-Луис, штат Миссури, США) . Поглощение на 4 90 нм считывали с применением спектрофотометра для прочтения планшетов М5
(Molecular Devices, г. Саннивейл, штат Калифорния, США) и данные конвертировали в % ингибирования. Процент ингибирования для связывания mIL-17A с рецептором mIL-17 определяли как 100 -
(образец/отрицательный контроль х 100).
Выбранные бактериальные лизаты, содержащие каркасные молекулы, ингибирующие взаимодействие mIL-17A с рецептором mlL-17, дополнительно характеризовали в анализе зависимости ответа от дозы процесса ингибирования с применением вышеописанного протокола, за исключением того, что в анализах применяли по 100 мкл очищенных слитых белков TCL14-His (Ni-NTA) в диапазоне концентраций от 10 мкМ до 5 6 пМ. Из кривых зависимости ответа от дозы рассчитали значения IC50, применяя сигмоидальную аппроксимацию кривой зависимости ответа от дозы. Как показано в таблице 9, специфические ингибиторы mIL-17A имеют значения IC50 в диапазоне от ~9 до -428 пМ.
TP1KR9P62-D8
427,5
381000
1,48Е-05
3,89E-11
TP1KR9P62-E3
64, 16
113000
5,26Е-05
4,64E-10
TP1KR9P62-H10
301, 8
438000
2,11Е-05
4,82E-10
Измерения аффинности
Аффинности выбранных молекул, связывающихся с mIL-17A, измерили с применением метода поверхностного плазмонного резонанса с применением прибора ProteOn XPR-36 (Bio-Rad). Очищенные молекулы иммобилизовали непосредственно на чипе с изменяемыми плотностями (100-300 усл.ед.) с помощью аминного связывания при рН 5,0 и скорости потока 3 0 мкл/мин в течение 5 минут. Тестировали mIL-17A при 100 нМ в серии 3-кратных разбавлений на их связывание с различными молекулами на поверхности чипа. Фазы диссоциации для всех концентраций всех образцов контролировали в течение 1-2 часов, в зависимости от их скорости диссоциации, при скорости потока 100 мкл/мин. Для контроля стабильности базовой линии инжектировали буферный раствор, и поверхность не регенерировали для дальнейшего применения. С данными по ответу для всех серий концентрации для каждой из различных поверхностей каркасных молекул, выбранных из библиотеки TLC14, провели глобальную аппроксимацию с 1:1 простой ленгмюровской моделью связывания для экстракции оценочных значений кинетических (kon, koff) констант и константы аффинности (KD) . Как показано в таблице 9, аффинности каркасных молекул, специфически связывающих mIL-17A, находились в субнаномолярном диапазоне.
Последовательности выбранных агентов, связывающих mIL-17A, показаны в SEQ ID NO: 85-96, а последовательности бета-тяжей С и F и петель CD и FG - в таблице 10.
TP1KR9P62-A2
DSFAEYSE
DYWLGE
TP1KR9P62-C3
DSFAEYFE
DWWSGE
TP1KR9P62-C6
DSFAEYFE
DWWSGE
TP1KR9P62-D3
DSFAEYFE
DWWSGE
TP1KR9P62-D4
DSFGIIYFE
DWWAGE
TP1KR9P62-D8
DSFAEYFE
DWWSGE
TP1KR9P62-E3
DSFGEYFE
DYWTGE
TP1KR9P62-H10
DSFAEYFE
DWWSGE
Идентификационный номер клона
Тяж F
Петля FG
Последовательность
SEQ ID NO:
Последовательность
SEQ ID NO:
TP1KR9P61-A2
TEYAVSIRGV
KGGMPSA
TP1KR9P61-A7
TEYSVSIRGV
KGGYPSS
TP1KR9P61-E2
TEYAVSIRGV
KGGMPSP
TP1KR9P61-G4
TEYAVSIRGV
KGGYPSA
TP1KR9P62-A2
TEYGVSIRGV
KGGYPSP
TP1KR9P62-C3
TEYSVTIRGV
KGGPPSS
TP1KR9P62-C6
TEYSVTIRGV
KGGYPSS
TP1KR9P62-D3
TEYSVSIRGV
KGGYPSS
TP1KR9P62-D4
TEYGVSIRGV
KGGPPSR
TP1KR9P62-D8
TEYGVSIRGV
KGGLASP
TP1KR9P62-E3
TEYAVSIRGV
KGGYPSA
TP1KR9P62-H10
TEYSVSIRGV
KGGHPSV
ПРИМЕР 4. Библиотеки Tencon2 7, рандомизированные по второй альтернативной поверхности
Вторая альтернативная поверхность на Тепсоп27 находится с противоположной стороны от поверхности C-CD-F-FG, как показано в визуализации на фиг. 2С, и в настоящем документе называется поверхностью А-АВ-В-ВС-Е, причем она образована бета-тяжем А, петлей АВ, бета-тяжем В, петлей ВС и бета-тяжем Е. Поверхность А-АВ-В-ВС-Е также несколько вогнута и может применяться в качестве шаблона для разработки библиотек поверхностей взаимодействия белкового каркаса путем рандомизации подмножества остатков, образующих поверхность. Бета-тяжи имеют повторяющуюся структуру, в которой боковая цепь каждого второго остатка открыта на поверхности белка. Таким образом, библиотеку можно создать путем рандомизации некоторых или всех открытых на поверхности остатков бета-тяжей. Путем выбора соответствующих
остатков в бета-тяжах можно обеспечить уникальную поверхность каркаса для взаимодействия с другими белками при минимальной потере присущей каркасу Тепсоп27 стабильности. Рандомизация поверхности А-АВ-В-ВС-Е позволит получить поверхность связывания на противоположной стороне структуры Тепсоп2 7 в сравнении с конфигурацией библиотеки TCL14. Конфигурация библиотеки на основе Тепсоп27 с рандомизированной поверхностью А-АВ-В-ВС-Е показана в SEQ ID N0: 61 (библиотека TCL15) и на фиг. 6.
Библиотека TCL15 (SEQ ID N0: 61):
LPAPKXLXVXXVXXXXAXLXWXAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERXYXL TGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT;
где X представляет собой любую аминокислоту.
Создали библиотеку TCL15 и выбрали каркасы, которые специфически связываются с молекулами-мишенями, как описано выше для библиотеки TCL14.
ПРИМЕР 5. Другие домены FN3: создание библиотек путем рандомизации альтернативных поверхностей
Конфигурации библиотек с использованием альтернативных поверхностей, описанных в примерах для каркаса Тепсоп2 7, можно применить для других доменов FN3 различных белков вследствие структурного сходства между доменами FN3. Такие домены FN3 могут встречаться в природе или могут быть синтетическими и, например, представлять собой консенсусный каркас Fibcon (SEQ ID NO: 58) на основе консенсусной последовательности фибронектиновых доменов (публикация патента США № 2010/0255056), 10-й домен FN3 фибронектина человека (FN10) (SEQ ID N0: 97), или 3-й домен FN3 тенасцина человека (TN3) (SEQ ID N0: 3), или любой домен FN3, присутствующий в белках, перечисленных в таблице 1.
Конфигурации библиотек для библиотек Fibcon, FN10 и TN3 с рандомизированными альтернативными поверхностями C-CD-F-FG показаны на фиг. 8 и в SEQ ID N0: 62, 98 и 99 соответственно. Разработанные библиотеки синтезировали, экспрессировали и выбирали специфически связывающиеся агенты с применением описанных в настоящем документе протоколов.
Библиотека белкового каркаса на основе Fibcon с рандомизированной поверхностью C-CD-F-FG (SEQ ID NO: 62):
LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYXIXYXPXXXXGEPKELTVPPSSTSVTI TGLTPGVEYXVXLXALKDNXXSXPLVGTQTT;
где X представляет собой любую аминокислоту.
Библиотека белкового каркаса на основе FN10 с рандомизированной поверхностью C-CD-F-FG (SEQ ID NO: 98):
VS DVPRDLEWAAT PT S LLISWDAPAVTVRYYXIXYXEXXXXS PVQE FTVPGSKS TAT ISG LKPGVDYXIXVXAVTGRGDSPXXSXPISINYRT;
где X представляет собой любую аминокислоту.
Библиотека белкового каркаса на основе TN3 с рандомизированной поверхностью C-CD-F-FG (SEQ ID NO: 99):
DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIXLXYXIXXXXGDRTTIDLTEDENQYSIG NLKPDTEYXVXLXSRRGDXXSXPAKETFTT;
где X представляет собой любую аминокислоту.
Аналогично описанному для каркаса Тепсоп2 7, некоторые или все из остатков, содержащих петли CD и/или FG других доменов FN3, можно заменить по 1, 2, 3, 4, 5, б, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 рандомизированным положениям для создания библиотек различной длины.
Будет понятно, что реализация настоящего изобретения на практике может отличаться от конкретно описанного в предшествующем описании и примерах. Возможно множество модификаций и изменений настоящего изобретения в свете вышеизложенных идей, и, следовательно, в рамках приложенных пунктов формулы изобретения.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ получения библиотеки доменов фибронектинового модуля типа III (FN3) с диверсифицированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG, образованной бета-тяжем С, петлей CD, бета-тяжем F и петлей FG, содержащий
a. обеспечение эталонного полипептида домена FN3 с
аминокислотной последовательностью, по меньшей мере на 8 0%
идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27;
b. внесение разнообразия в эталонный полипептид домена FN3
путем мутации по меньшей мере одного остатка бета-тяжа С и по
меньшей мере одного остатка бета-тяжа F для образования
библиотеки домена FN3 с диверсифицированной альтернативной
поверхностью C-CD-F-FG.
2. Способ по п. 1, в котором мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка бета-тяжа С и не мутирован остаток S30 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
3. Способ по п. 2, в котором мутированы остатки L32, Q34 и Q36 бета-тяжа С в соответствии с SEQ ID NO: 27.
4. Способ по п. 2, в котором мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка бета-тяжа F и не мутирован остаток Ебб в соответствии с SEQ ID NO: 27.
5. Способ по п. 4, в котором мутированы остатки Т68, S70 и Y72 бета-тяжа F в соответствии с SEQ ID NO: 27.
6. Способ по п. 4, в котором мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка петли CD и не мутированы остатки G42 и Е43 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
7. Способ по п. б, в котором мутированы остатки S38, Е39, К40 и V41 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
8. Способ по п. 4, в котором мутированы 1, 2, 3 или 4 остатка петли FG и не мутированы остатки К75, G76, G77 и S80 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
9. Способ по п. 8, в котором мутированы остатки Н7 8, R7 9 и N81 в соответствии с SEQ ID NO: 27.
10. Способ по п. 9, в котором эталонный домен FN3 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27.
11. Способ по п. 10, содержащий по меньшей мере одну
замену в положениях аминокислот 11, 14, 17, 37, 46, 73 или 86.
12. Библиотека, формируемая способом по п. 1.
13. Библиотека по п. 12, в которой библиотека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID N0: 28.
14. Способ получения белкового каркаса, содержащего домен фибронектинового модуля типа III (FN3) с диверсифицированной альтернативной поверхностью C-CD-F-FG, которая может специфически связываться с молекулой-мишенью, содержащий приведение в контакт или пэннинг библиотеки по п. 12 с молекулой-мишенью и выделение белкового каркаса, который специфически связывается с молекулой-мишенью с заданной аффинностью.
По доверенности
В: С
s F:
CDR2
CDR1
! 1/
А:В
C:D
Домен FN3
Домен Vh
ФИГ. 2
Петля В:С
Петля F:G
Тяж F
ФИГ. 2С
ФИГ. 3
TENCON2 7 TCL14
[1) LPAPKNLVVSRVTEDSARLSW
TAPDAAF
!30)
:зо)
С CD D DE Е
TENCON2 7 (31) FLIQYQE[SEKVGE|AIVLTVP|GSER|SYDLT[G| (60)
TCL14 (31) FXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYDLTG (60)
TENCON2 7 TCL14
61) LKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
'61) LKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT
:89) :89)
ФИГ. 4
TENCON2 7 TCL15
1) LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDS
;i) LPAPKXLXVXXVXXXXAXLXWXAPDAAFDS
:зо) :зо)
С CD D DE Е
TENCON2 7 (31) FLIQYQE[SEKVGE|AIVLTVP|GSER|SYDLT[G| (60)
TCL15 (31) FLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERXYXLTG (60)
TENCON2 7 TCL15
EF F FG G
(61) |LKPG|TEYTVSIYGV|KGGHRSN|PLSAIFTT (61)LKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
(89) (89)
ФИГ. 5
ФИГ. 6
ФИГ. 7
10 9 8 7 6
ЕЭ Ожидаемое разнообразие ¦ Наблюдаемое разнообразие
ё 5
KRHDESTCNQVL IPMGAFWY
Аминокислота
ФИГ. 8
Тепсоп27
TCL14
Fibcon
FN10
TN3
(1)
LPAPKNLWSRVTEDS ARLSW
- LPAPKNLWSRVTEDS ARLSWTAPDAAFDS -LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITG VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRY -DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDG
Tencon2 7
TCL14
Fibcon
FN10
TN3
31) FLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTO (60)
FiliYiEiiiiG EAlVL TVPG S ERS Y D LT G YiliY|p||||G EPKELTVPPSSTSVTITG
Y|I|Y|E|||1S PVQE FTVPGSKSTATISG
liL|Y|l||||GDRTTIDLTEDENQYSIGN
•k'^k'k'k'k'k'k'k
Tencon2 7
TCL14
Fibcon
FN10
TN3
:61)
LKPGTEYTVSIYGV KGG HRSN
LKPGTEYXVXIXGV-KGG-XXSXPLSAIFTT LTPGVEYXVXLXAL-KDN-XKSXPLVGTQTT LKPGVDYXIXVXAVTGRGDSPXXSXPISINYRT LK Р DTE YXVXLX S R- RG D-XXSXP АКЕ T F T T
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
1/10
2/10
2/10
3/10
3/10
4/10
4/10
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
5/10
6/10
6/10
6/10
6/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
10/10
