EA201490676A1 20150227 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2015\PDF/201490676 Полный текст описания [**] EA201490676 20120920 Регистрационный номер и дата заявки US61/538,039 20110922 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок US2012/056281 Номер международной заявки (PCT) WO2013/043840 20130328 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21502 Номер бюллетеня [**] СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОПОРОЗА Название документа [8] A61K 31/47, [8] A61P 19/10 Индексы МПК [US] Афтаб Дана Т., [US] Клари Дуглас Сведения об авторах [US] ЭКСЕЛИКСИС, ИНК. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201490676a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Настоящее изобретение относится к лечению остеопороза с применением N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил]окси}фенил)-N'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к лечению остеопороза с применением N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил]окси}фенил)-N'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида.


СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ОСТЕОПОРОЗА
ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ [0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США № 61/538039, поданной 22 сентября 2011 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область техники
[0002] Настоящее изобретение относится к лечению остеопороза с применением N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-1Ч'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида.
Уровень техники
[0003] Остеопороз представляет собой заболевание, характеризующееся низкой костной массой и разрушением микроархитектуры костной ткани, приводящими к повышенной хрупкости костей и последующему увеличению риска переломов. Указанное заболевание приводит к тому, что кости становятся хрупкими и ломкими, и поражает как мужчин, так и женщин. При остеопорозе костей увеличивается риск перелома после минимальной травмы. В мире насчитывается около 35 миллионов женщин и 14 миллионов мужчин с остеопорозом или низкой костной массой. В Соединенных Штатах от остеопоротического перелома страдает примерно один из четырех взрослых в возрасте старше 50 лет. Остеопороз и возникающие в результате переломы представляют значительное бремя для здравоохранения, отчасти по причине того, что заболевание развивается бессимптомно - к тому времени, когда у пациента диагностируют остеопоротический перелом, повреждение костей уже произошло.
[0004] Кость постоянно подвергается процессу так называемого ремоделирования. Потеря костной массы при остеопорозе происходит тогда, когда при нормальном процессе ремоделирования, или обновления костной ткани, теряется больше костной ткани, чем возмещается. Ремоделирование кости включает два четко выраженных этапа: резорбция кости (распад) и костеобразование. Кальций запасается в костной ткани. Когда он необходим организму, клетки костной ткани, называемые остеокластами, прикрепляются к поверхности кости и разрушают ее, оставляя полости в костной ткани. Затем формирующие костную ткань клетки, называемые остеобластами, заполняют эти полости органическим матриксом, называемым остеоидом. Затем остеоид самопроизвольно
минерализуется за счет фосфата кальция с восстановлением твердой кости. Остеобласты, которые остаются заключенными в матрикс, называют остеоцитами.
[0005] С возрастом, а также в результате других обстоятельств, которые могут приводить к повышению риска потери костной массы, например, при лечении рака предстательной или молочной железы, или в результате нарушений питания, скорость обновления костной ткани у людей обоих полов повышается, а на тканевом уровне костеобразование за счет остеобластов происходит медленнее, чем резорбция кости остеокластами, поскольку снижается количество и активность индивидуальных клеток-остеобластов (Marie и Kassem, 2011). Резорбция кости занимает меньше времени, чем костеобразование. Резорбция кости на конкретном участке кости занимает приблизительно две недели; формирование занимает три месяца или более. В результате образуется недостаток костной ткани в так называемых полостях ремоделирования. В норме это не приводит к значительным последствиям, но при дисбалансе цикла ремоделирования обновление костной ткани может приводить к значительной потере костной массы. Считается, что интенсивное обновление костной ткани повышает риск переломов.
[0006] В результате продолжает существовать потребность в способах лечения остеопороза.
Краткое описание изобретения [0007] Указанным и другим потребностям отвечает настоящее изобретение, которое относится к способу лечения остеопороза. Указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения нуждающемуся в таком лечении пациенту.
Формула I
или его фармацевтически приемлемую соль, где:
[0008] Согласно одному из вариантов реализации указанного аспекта и иных аспектов соединение представляет собой соединение формулы I:
R представляет собой галоген;
R представляет собой галоген;
R представляет собой (С1-Сб)алкил;
R4 представляет собой (С1-Сб)алкил; и
Q представляет собой СН или N. [0009] Согласно еще одному варианту реализации соединение формулы I представляет собой соединение формулы 1а.
или его фармацевтически приемлемую соль, где:
R1 представляет собой галоген;
R представляет собой галоген; и
Q представляет собой СН или N. [0010] Согласно еще одному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1:
Соединение 1
или его фармацевтически приемлемую соль. Соединение 1 известно как N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-№-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамид, и как кабозантиниб.
[ООН] Согласно еще одному варианту реализации соединение формулы I, 1а или Соединение 1 вводят в виде фармацевтической композиции, содержащей
фармацевтически приемлемую(ый/ое) добавку, разбавитель или вспомогательное вещество в дозировке, достаточной для облегчения эффектов аномального обновления костной ткани.
[0012] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения остеопороза у пациентов, у которых имеется повышенный риск потери костной массы. Пациенты, у которых имеется повышенный риск потери костной массы, включают пациентов-женщин в постменопаузе и мужчин старшего возраста, или пациентов, имеющих раковое заболевание, либо на текущий момент проходящих лечение от ракового заболевания, такого как рак простаты или рак молочной железы, или пациентов с нарушениями питания. Указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, 1а или Соединения 1 нуждающемуся в таком лечении пациенту.
[0013] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ предотвращения остеопороза, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, 1а или Соединения 1 нуждающемуся в таком лечении пациенту.
[0014] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ увеличения минеральной плотности костной ткани пациента с остеопорозом, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I, 1а или Соединения 1 нуждающемуся в таком лечении пациенту.
[0015] Согласно указанному и другим аспектам способность соединения формулы I лечить, облегчать или уменьшать тяжесть остеопороза может быть определена и качественно, и количественно с применением различных циркулирующих или мочевых маркеров или различных технологий визуализации. Маркеры, которые могут подходить для индивидуального мониторинга пациентов с остеопорозом, получающих лечение антирезорбтивными агентами, включают общую щелочную фосфатазу сыворотки, костно-специфическую щелочную фосфатазу сыворотки, остеокальцин сыворотки, С-терминальный пропептид проколлагена типа 1 C1NP сыворотки или N-терминальный пропептид проколлагена типа I сыворотки (P1NP) [для мониторинга костеобразования], гидроксипролин в моче, общий пиридинолин в моче (ПИД), свободный дезоксипиридинолин в моче (ДПИД), перекрестно-связанные N-терминальные телопептиды коллагена 1 типа (NTx) в моче, перекрестно-связанные С-терминальные телопептиды коллагена 1 типа (СТх) в моче или в сыворотке, костный сиалопротеин (КС)
и устойчивую к тартрату кислую фосфатазу 5Ь (ТрКФ-5Ь) [для мониторинга резорбции кости].
[0016] Технологии визуализации, которые могут подходить для оценки способности соединения формулы I, 1а или Соединения 1 лечить, облегчать или уменьшать тяжесть остеопороза, включают магниторезонансную визуализацию, позитронно-эмиссионную томографию, компьютерную томографию (КТ) и рентгеновскую абсорбциометрию. [0017] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ прогнозирования остеопороза у субъекта, включающий:
(a) измерение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь в образце, полученном от
субъекта;
(b) сравнение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, измеренного на этапе (а), со стандартным уровнем P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь для определения того, содержит ли полученный от субъекта образец не соответствующие норме уровни P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь;
(c) выбор схемы лечения Соединением формулы I, 1а или 1 на основании не соответствующих норме уровней P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, или введение Соединения формулы I, 1а или 1 в соответствии со схемой лечения, обеспечивающей подавление остеопороза у указанного субъекта.
[0018] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ стимуляции дифференцировки и/или активности остеобластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
[0019] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ стимуляции костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы I, 1а или Соединения 1.
[0020] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен Способ подавления дифференцировки остеокластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
[0021] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ модулирования обновления костной ткани в направлении костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
[0022] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения остеопороза у пациентов после овариэктомии, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1. [0023] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ модулирования обновления костной ткани в направлении костеобразования у пациентов после овариэктомии, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
Краткое описание чертежей [0024] На Фиг. 1 представлено влияние Соединения 1 на дифференцировку остеокластов, измеряемый на 7 день, в виде активности ТрКФ-5Ь (ед/л), секретированного в культуральную среду.
[0025] На Фиг. 2 представлено влияние Соединения 1 на резорбционную активность остеокластов человека на 7 день в виде значений СТХ/ТрКФ-5Ь.
[0026] На Фиг. 3 представлено влияние Соединения 1 на дифференцировку остеобластов на 8 день в виде клеточной активности щелочной фосфатазы (ЩФ)/мг белка. [0027] На Фиг. 4 представлено влияние Соединения 1 на костеобразующую активность остеобластов мыши на 11 день в виде секретированного в культуральную среду PINP. [0028] На Фиг. 5 представлено влияние Соединения 1 на костеобразующую активность остеобластов мыши на 13 день в виде отложения кальция на 13 день.
[0029] На Фиг. 6 представлен дизайн исследования краткосрочного влияния Соединения 1 на маркеры обновления костной ткани при овариэктомии у крыс (модель ОВЭ).
Подробное описание изобретения Сокращенные обозначения и определения
[0030] Приведенные ниже сокращенные обозначения везде в настоящей заявке имеют следующие значения:
Сокращение
Значение
Ацетил
Уширенный
Градусы Цельсия
Сокращение
Значение
Цикло-
КБЗ
Карбобензокси = бензилоксикарбонил
Дублет
Двойной дублет
Двойной триплет
ДХМ
Дихлорметан
ДМЭ
1,2-диметоксиэтан
ДМФА
К,К-Диметилформамид
ДМСО
диметилсульфоксид
Dppf (ДФФФ)
1,1' -бис(дифенилфосфан)ферроцен
Ионизация электронным ударом
Грамм(ы)
Час(ы)
ЖХВД
Жидкостная хроматография при высоком давлении
Литр(ы)
Молярный или молярность
Мультиплет
Миллиграмм(ы)
мГц
Мегагерц (частота)
мин
Минута(ы)
Миллилитр(ы)
мкл
Микролитр(ы)
мкМ
Микромоль(и) или микромолярный
Миллимолярный
ммоль
Миллимоль(и)
моль
Моль(и)
Масс-спектральный анализ
Нормальный или нормальность
Наномолярный
Сокращение
Значение
Я MP
Ядерная магнитно-резонансная спектроскопия
Квадруплет
к.т.
Комнатная температура
Синглет
t или tr
Триплет
ТФК
Трифторуксусная кислота
ТГФ
Тетрагидрофуран
тех
Тонкослойная хроматография
[0033] Если группа "R" в кольцевой системе показана как "подвижная", как, например, в формуле:
тогда, если не указано иное, заместитель "R" может располагаться на любом атоме указанной кольцевой системы, предполагая замену изображенного, подразумеваемого или
[0031] Символ "-" означает одинарную связь, "=" означает двойную связь. [0032] При изображении или описании химических структур, если явным образом не указано иное, предполагается, что на всех атомах углерода имеется замещение атомом водорода для обеспечения четырехвалентности. Например, подразумевается, что в структуре приведенной ниже структурной формулы, с левой стороны, содержится девять атомов водорода. Эти девять атомов водорода показаны в структурной формуле справа. Иногда в текстовой формуле указывается, что конкретный атом в структуре содержит атом(ы) водорода в качестве заместителя(ей) (явным образом обозначенный атом водорода); например, -СН2СН2-. Специалисту в данной области техники будет понятно, что вышеизложенные способы описания являются общеупотребительными в области химии, обеспечивая краткость и простоту описания сложных в целом структур.
явным образом обозначенного атома водорода на одном из атомов кольца, при условии образования стабильной структуры.
[0034] Если группа "R" в конденсированной кольцевой системе показана как подвижная, например, как в формулах:
тогда, если не указано иное, заместитель "R" может располагаться на любом атоме конденсированной кольцевой системы, предполагая замену обозначенного атома водорода (например, -NH- в приведенной выше формуле), подразумеваемого атома водорода (например, как в приведенной выше формуле, где атомы водорода не показаны, но их наличие подразумевается), или явным образом обозначенного атома водорода (например, как в приведенной выше формуле, где "Z" соответствует =СН-) на одном из атомов кольца, при условии образования стабильной структуры. В показанном примере группа "R" может располагаться либо на 5-членном, либо на 6-членном кольце конденсированной кольцевой системы. Если изображенная группа "R" располагается на кольцевой системе, содержащей насыщенные атомы углерода, например, как в формуле:
[0035] "Галоген" или "гало-" относится к фтору, хлору, брому или йоду.
где, в указанном примере, "у" может быть больше, чем 1, при условии, что каждая группа замещает существующий изображенный, подразумеваемый или явным образом обозначенный атом водорода на кольце; тогда, если не указано иное, при условии, что конечная структура стабильна, две "R"-rpynnbr могут располагаться на одном атоме углерода. Простым примером является случай, когда R представляет собой метильную группу; на атоме углерода изображенного кольца может присутствовать геминальный диметил ("кольцевой" углерод). В другом примере две R-группы на одном атоме углерода, включая указанный атом углерода, могут формировать кольцо, образуя таким образом спироциклическую кольцевую структуру ("спироциклильную" группу) с изображенным кольцом, например, как в формуле:
[0036] "Выход" для каждой из описанных в настоящей заявке реакций выражен в процентах от теоретического выхода.
[0037] Термин "пациент" для целей настоящего изобретения включает человека и других животных, в частности, млекопитающих, и другие организмы. Соответственно, указанные способы подходят как для лечения человека, так и для применения в ветеринарии. Согласно другому варианту реализации пациент представляет собой млекопитающее; согласно еще одному варианту реализации пациент представляет собой человека.
[0038] "Фармацевтически приемлемая соль" соединения означает фармацевтически приемлемую соль, обладающую требуемой фармакологической активностью исходного соединения. Очевидно, что фармацевтически приемлемые соли должны быть нетоксичны. Дополнительную информацию относительно подходящих фармацевтически приемлемых солей можно найти в пособии Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, включенном в настоящую заявку посредством ссылки, или у S. М. Berge et al., "Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci., 1977;66:1-19; оба источника включены в настоящую заявку посредством ссылки.
[0039] Примеры фармацевтически приемлемых солей присоединения кислоты включают образованные неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота, фосфорная кислота и т.п.; а также органическими кислотами, такими как уксусная кислота, трифторуксусная кислота, пропионовая кислота, гексановая кислота, циклопентанпропионовая кислота, гликолевая кислота, пировиноградная кислота, молочная кислота, щавелевая кислота, малеиновая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, винная кислота, яблочная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, коричная кислота, 3-(4-гидроксибензоил)бензойная кислота, миндальная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, 1,2-этандисульфоновая кислота, 2-гидроксиэтансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, 4-хлорбензолсульфоновая кислота, 2-нафталинсульфоновая кислота, 4-толуолсульфоновая кислота, камфорсульфоновая кислота, глюкогептоновая кислота, 4,4'-метиленбис-(3-гидрокси-2-ен-1-карбоновая кислота), 3-фенилпропионовая кислота, триметилуксусная кислота, трет-бутилуксусная кислота, лаурилсерная кислота, глюконовая кислота, глутаминовая кислота, гидроксинафтойная кислота, салициловая кислота, стеариновая кислота, муконовая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, салициловая кислота и т.п.
[0040] Термин "пролекарство" относится к соединениям, претерпевающим in vivo трансформацию (как правило, быструю) с образованием исходного соединения, имеющего приведенную выше формулу, например, путем гидролиза в крови. Распространенные примеры включают, не ограничиваясь перечисленными, сложноэфирные и амидные формы соединения с активной формой, несущей фрагмент карбоновой кислоты. Примеры фармацевтически приемлемых сложных эфиров соединений согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечисленными, сложные алкилэфиры (например, приблизительно с 1-6 атомами углерода), где алкильная группа представляет собой неразветвленную или разветвленную цепь. Приемлемые сложные эфиры также включают сложные циклоалкилэфиры и сложные арилалкилэфиры, например, но не ограничиваясь указанным, бензил. Примеры фармацевтически приемлемых амидов соединений согласно настоящему изобретению включают, не ограничиваясь перечисленными, первичные амиды, и вторичные и третичные алкиламиды (например, приблизительно с 1-6 атомами углерода). Амиды и сложные эфиры соединений согласно настоящему изобретению могут быть получены в соответствии с общепринятыми способами. Подробное обсуждение пролекарств можно найти в источниках: Т. Higuchi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol 14 of the A.C.S. Symposium Series; и Bioreversible Carriers in Drug Design {"Биообратимые носители при разработке лекарственных препаратов"), ed. Edward В. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987; оба источника включены в настоящую заявку посредством ссылки полностью и для любых целей. [0041] "Терапевтически эффективное количество" представляет собой количество соединения согласно настоящему изобретению, при введении пациенту облегчающее симптом заболевания. Подразумевается, что терапевтически эффективное количество включает количество соединения, которое само по себе или в сочетании с другими активными ингредиентами эффективно лечит, облегчает или уменьшает тяжесть остеопороза. Количество соединения согласно настоящему изобретению, являющееся "терапевтически эффективным количеством", варьирует в зависимости от соединения, течения заболевания и его тяжести, возраста подлежащего лечению пациента и т.п. Терапевтически эффективное количество может быть определено специалистом в данной области техники с учетом имеющегося у него опыта и принимая во внимание настоящее описание, однако обычно терапевтически эффективное количество составляет от приблизительно 0,1 до 1000 мг в сутки, и, в частности, находится в диапазоне от 1 до 100 мг в сутки.
[0042] "Лечить" или "лечение" заболевания, расстройства или синдрома согласно настоящей заявке включает (i) предотвращение наступления заболевания, расстройства или синдрома у человека, т.е. обеспечение отсутствие развития клинических симптомов указанного заболевания, расстройства или синдрома у животного, которое может быть подвержено или предрасположено к указанному заболеванию, расстройству или синдрому, но у которого ранее отсутствовали или не проявлялись симптомы указанного заболевания, расстройства или синдрома; (й) подавление заболевания, расстройства или синдрома, т.е. остановка его развития; и (ш) облегчение заболевания, расстройства или синдрома, т.е. обеспечение регрессии указанного заболевания, расстройства или синдрома. Как известно в данной области техники, могут требоваться корректировки с учетом системной/локализованной доставки, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания, времени введения, взаимодействия лекарственных средств и тяжести состояния; такие корректировки могут быть определены в ходе рутинной практики.
Варианты реализации
[0043] Согласно одному из вариантов реализации соединение формулы I представляет собой соединение формулы 1а:
Формула 1а
или его фармацевтически приемлемую соль, где:
R1 представляет собой галоген;
R представляет собой галоген; и
Q представляет собой СН или N. [0044] Согласно еще одному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1:
Соединение 1
или его фармацевтически приемлемую соль.
[0045] Как отмечено выше, Соединение 1 в настоящей заявке называется N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-гЧ'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамид. В WO 2005/030140 описано Соединение 1 и способ его получения (Примеры 12, 37, 38 и 48), а также описана терапевтическая активность указанного соединения, подавляющего, регулирующего и/или модулирующего киназные пути передачи сигнала (раздел "Анализы", Таблица 4, пункт 289). Пример 48 приведен в параграфе [0353] в WO 2005/030140.
[0046] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы I, 1а, или Соединение 1, или его фармацевтически приемлемую соль, вводят в виде фармацевтической композиции, причем указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый(ое) носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
[0047] Соединение формулы I, формулой 1а и Соединение I, согласно описанию в настоящей заявке, включает как перечисленные соединения, так и индивидуальные изомеры и смеси изомеров. В каждом случае соединение формулы I включает фармацевтически приемлемые соли, гидраты и/или сольваты приведенных соединений и любые их индивидуальные изомеры или смесь изомеров.
[0048] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы I, 1а или Соединение 1 может представлять собой (Ь)-малатную соль. Малатная соль Соединения формулы I и Соединения 1 описана в PCT/US2010/021194 и в 61/325095. [0049] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы I может представлять собой (О)-малатную соль.
[0050] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы 1а может представлять собой малатную соль.
[0051] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы 1а может представлять собой (Ь)-малатную соль.
[0052] Согласно другим вариантам реализации Соединение 1 может представлять собой (Б)-малатную соль.
[0053] Согласно другим вариантам реализации Соединение 1 может представлять собой малатную соль.
[0054] Согласно другим вариантам реализации Соединение 1 может представлять собой (Б)-малатную соль.
[0055] Согласно еще одному варианту реализации указанная малатная соль находится в кристаллической форме N-1 (Ь)-малатной соли и/или (О)-малатной соли Соединения 1 согласно описанию в заявке на патент США №61/325095. См. также WO 2008/083319 для ознакомления со свойствами кристаллических энантиомеров, включая N-1 и/или N-2 кристаллические формы малатной соли Соединения 1. Способы получения и исследования свойств таких форм подробно описаны в PCT/US10/21194, полностью включенной в настоящую заявку посредством ссылки.
[0056] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации. [0057] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1. В данном и в других вариантах реализации доза представлена количеством, превышающим 0 мг.
[0058] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 90 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0059] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 80 мг.
Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0060] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 70 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0061] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 60 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0062] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 50 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0063] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 40 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0064] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 30 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0065] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в
таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 20 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0066] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 10 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0067] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 5 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0068] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, составляющей от 0,01 мг до 25 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0069] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, составляющей от 0,1 мг до 15 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0070] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу облегчения симптомов остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, составляющей от 1 мг до 10 мг. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1.
[0071] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу снижения тяжести остеопороза у пациентов, которые проходили или проходят лечение рака молочной или предстательной железы, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг. Согласно некоторым вариантам реализации указанное раковое заболевание представляет собой рак молочной железы, рак предстательной железы, рак кости и/или опухоли кости. Согласно конкретному варианту реализации соединение формулы I представляет собой Соединение 1. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг.
[0072] Согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу уменьшения аномального отложения бесструктурной костной ткани, сопровождающегося повышением числа переломов скелетных костей, компрессией спинного мозга и сильной костной болью при остеопорозе, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 1100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг.
[0073] Как было отмечено выше, способность соединения формулы I лечить, облегчать или уменьшать тяжесть остеопороза может быть определена и качественно, и количественно с использованием различных циркулирующих или мочевых маркеров. Согласно некоторым вариантам реализации маркеры, подходящие для индивидуального мониторинга пациентов с остеопорозом, получающих лечение антирезорбтивными агентами, могут быть выбраны из общей щелочной фосфатазы сыворотки, костно-специфической щелочной фосфатазы сыворотки, остеокальцина сыворотки, проколлагена 1 типа в сыворотке (С-терминального/гЧ-терминального): C1NP или P1NP [для мониторинга костеобразования], гидроксипролина мочи, общего пиридинолина в моче (ПИД), свободного дезоксипиридинолина в моче (Д11ИД), перекрестно-связанных N-терминальных телопептидов коллагена 1 типа (NTx) в моче, перекрестно-связанных С-терминальных телопептидов коллагена 1 типа (СТх) в моче или в сыворотке, костного
сиалопротеина (КС) и устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5Ь [для мониторинга резорбции кости].
[0074] Согласно конкретному варианту реализации маркер представляет собой СТх. СТх представляет собой фрагмент коллагена 1 типа, расщепляемого остеокластами при резорбции кости, поэтому считается, что его уровни в сыворотке пропорциональны активности остеокластов в момент времени, когда был взят образец. Соответственно, СТх в сыворотке широко используется для отслеживания влияния бисфосфонатов на костную ткань (Marx et al, 2007). В промежуточное исследование в рамках исследования обновления костной ткани - испытание для оценки снижения переломов при остеопорозе при применении деносумаба каждые 6 месяцев (FREEDOM) - включали 160 женщин, рандомизированно получавших подкожные инъекции деносумаба (60 мг) или плацебо каждые 6 месяцев на протяжении 3 лет. Через месяц после инъекции уровни СТх в сыворотке у всех получавших деносумаб субъектов опускались ниже пременопаузального референтного интервала. Кроме того, наблюдалась значительная корреляция между снижением СТх и повышением минеральной плотности костной ткани у получавших лечение деносумабом субъектов (Eastell et al, 2011). Помимо оказания указанных эффектов на СТх, в исследовании Фазы 1 одна подкожная инъекция деносумаба дозозависимым образом снижала у женщин в постменопаузе содержание NTx в моче на величину до 81% на протяжении периода продолжительностью 6 месяцев (Bekker et al, 2004).
[0075] Согласно еще одному варианту реализации указанный маркер представляет собой ТрКФ-5Ь.
[0076] У пациентов с метастатическим кастрационно-резистентным раком предстательной железы введение Соединения 1 связывали с уменьшением СТх в плазме, независимо от того, получали ли субъекты ранее лечение бисфосфонатами (Hussain et al, 2011). Аналогичные эффекты Соединения 1 наблюдались у пациентов при отсутствии выявленных метастаз в костную ткань (Gordon et al, 2011), когда предшествующее применение бисфосфонатов предназначалось именно для лечения пациентов с остеопорозом. Способность Соединения 1 снижать уровни СТх в плазме у пациентов независимо от предшествующего лечения бисфосфонатами и независимо от присутствия метастатических повреждений костной ткани свидетельствует о сильном влиянии на блокирование аномального обновления костной ткани.
[0077] Соответственно, согласно еще одному варианту реализации настоящее изобретение относится к способу снижения СТх в плазме у пациента, страдающего от
остеопороза, включающему введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг.
[0078] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ прогнозирования остеопороза у субъекта, включающий:
(a) измерение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь в образце, полученном от
субъекта;
(b) сравнение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, измеренного на этапе (а), со стандартным уровнем P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь b для определения того, содержит ли полученный от субъекта образец не соответствующие норме уровни P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь;
(c) выбор схемы лечения Соединением формулы I, 1а или 1 на основании не соответствующих норме уровней P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, или введение Соединения формулы I, 1а или 1 в соответствии со схемой лечения, обеспечивающей подавление остеопороза у указанного субъекта.
[0079] Согласно еще одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ стимуляции дифференцировки и/или активности остеобластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы I, 1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки. [0080] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ стимуляции костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы I, 1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
[0081] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ подавления дифференцировки остеокластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы I, 1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
[0082] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ модулирования обновления костной ткани в направлении костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы I, 1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки. [0083] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ лечения остеопороза у пациентов после овариэктомии, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
[0084] Согласно другому аспекту в настоящем изобретении предложен способ модулирования обновления костной ткани в направлении костеобразования у пациентов после овариэктомии, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно конкретному варианту реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, а доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
[0085] Согласно еще одному варианту реализации в настоящем изобретении предложен способ лечения остеопороза у пациента, включающий введение указанному
пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1 согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации в суточной дозе, меньшей или равной 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг один раз в сутки. Согласно одному из вариантов реализации указанное лечение приводит к стимулированию дифференцировки остеобластов. Согласно еще одному варианту реализации указанное лечение приводит к стимулированию костеобразования. Согласно еще одному варианту реализации указанное лечение приводит к подавлению дифференцировки и/или активности остеокластов. Согласно еще одному варианту реализации указанное лечение приводит к модулированию обновления в направлении костеобразования. Согласно этому и другим вариантам реализации Соединение формулы I представляет собой Соединение 1, и доза составляет от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
Введение
[0086] Введение соединения формулы I, формулой 1а или Соединения 1 или его фармацевтически приемлемой соли, в чистом виде или в составе подходящей фармацевтической композиции, может осуществляться с применением любого приемлемого способа введения или агентов, подходящих для аналогичного использования. Соответственно, введение может быть, например, пероральным, назальным, парентеральным (внутривенным, внутримышечным или подкожным), местным, трансдермальным, интравагинальным, интравезикальным, интрацистернальным или ректальным, могут вводиться твердые, полутвердые, лиофилизированные порошковые или жидкие дозированные формы, такие как, например, таблетки, суппозитории, пилюли, мягкие эластичные и твердые желатиновые дозированные формы (которые могут быть представлены капсулами или таблетками), порошки, растворы, суспензии или аэрозоли, или т.п., в частности, единичные дозированные формы, подходящие для легкого введения точных доз.
[0087] Указанные композиции включают общепринятый(ое) фармацевтический(ое) носитель или вспомогательное вещество и соединение формулы I в качестве активного агента, и могут дополнительно включать носители, адъюванты и т.п.
[0088] Адъюванты включают консерванты, смачивающие, сунпензирующие, подслащивающие, вкусоароматические, отдушивающие, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Предотвращение действия микроорганизмов может быть обеспечено различными антибактериальными и противогрибковыми агентами, например, парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и т.п. Также может быть
желательно включение изотонических агентов, например, сахара, хлорида натрия и т.п. Пролонгированная абсорбция подходящей для инъецирования лекарственной формы может быть обеспечена за счет применения агентов, замедляющих абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.
[0089] При необходимости фармацевтическая композиция с соединением, имеющим формулу I, может также содержать незначительные количества вспомогательных веществ, таких как смачивающие или эмульгирующие агенты, рН-буферных агентов, антиоксидантов и т.п., таких как, например, лимонная кислота, сорбитанмонолаурат, триэтаноламин олеат, бутилированный гидрокситолуол и т.п.
[0090] Выбор композиции зависит от различных факторов, таких как способ введения лекарственного средства (например, для перорального введения, композиций в форме таблеток, пилюль или капсул) и биодоступность лекарственного вещества. За последнее время были разработаны фармацевтические композиции, в частности, с лекарственными веществами, демонстрирующими низкую биодоступность, на основе принципа возможности повышения биодоступности благодаря увеличению площади поверхности, т.е. снижения размера частиц. Например, в патенте США №4107288 описана фармацевтическая композиция, содержащая частицы с размерами в диапазоне от 10 до 1000 нм, где активное вещество располагается на поддерживающей перекрестно-сшитой макромолекулярной подложке. В патенте США №5145684 описано получение фармацевтической композиции, отличающейся тем, что лекарственное вещество распыляют на наночастицы (средний размер частиц - 400 нм) в присутствии модификатора поверхности, и затем диспергируют в жидкой среде с получением фармацевтической композиции, демонстрирующей исключительно высокую биодоступность.
[0091] Композиции, подходящие для парентеральных инъекций, могут содержать физиологически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии, и стерильные порошки для восстановления стерильных подходящих для инъецирования растворов или дисперсий. Примеры подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или основ включают воду, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и т.п.), их подходящие смеси, растительные масла (например, оливковое масло) и подходящие для инъецирования органические сложные эфиры, например, этилолеат. Нужная текучесть может обеспечиваться, например, за счет применения покрытия, такого как лецитин,
поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсий и применения поверхностно-активных веществ.
[0092] Одним из конкретных путей введения является пероральное введение с использованием удобной схемы ежедневного дозирования, которая может корректироваться в соответствии со степенью тяжести болезненного состояния, подлежащего лечению.
[0093] Твердые дозированные формы для перорального введения включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых дозированных формах активное соединение смешивают по меньшей мере с одним обычным инертным вспомогательным веществом (или носителем), таким как цитрат натрия или дикальцийфосфат, или (а) наполнителями или объемообразователями, такими как крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, (Ь) связующими средствами, такими как производные целлюлозы, крахмал, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и гуммиарабик, (с) увлажнителями, например, глицерином, (d) улучшающими распадаемость агентами, такими как агар-агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал, альгиновая кислота, кроскармеллоза натрия, комплексные силикаты и карбонат натрия, (е) замедлителями растворения, такими как, например, парафин, (f) ускорителями абсорбции, например, четвертичными соединениями аммония, (g) смачивающими агентами, такими как цетиловый спирт и моностеарат глицерина, стеарат магния и т.п. (h) адсорбентами, например, каолином и бентонитом, и (Г) смазывающими веществами, такими как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюль дозированные формы могут также содержать буферные агенты. [0094] Твердые дозированные формы согласно приведенному выше описанию могут быть получены с покрытиями и оболочками, такими как кишечнорастворимые покрытия и другие, хорошо известные в данной области техники. Они могут содержать замутняющие агенты, а также могут иметь состав, обеспечивающий отсроченное высвобождение активного соединения или соединений в определенной части желудочно-кишечного тракта. Примерами подходящих матриксных композиций являются полимерные вещества и воски. Активные соединения могут также находиться в микрокапсулированной форме, при необходимости, вместе с одним или более из упомянутых выше вспомогательных веществ.
[0095] Жидкие дозированные формы для перорального введения включают фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Такие
дозированные формы получают, например, путем растворения, диспергирования и т.п., соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли и, необязательно, фармацевтических адъювантов в носителе, таком как, например, вода, солевой раствор, водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.п.; солюбилизирующих агентах и эмульгаторах, например, этиловом спирте, изопропиловом спирте, этилкарбонате, этилацетате, бензиловом спирте, бензилбензоате, пропиленгликоле, 1,3-бутиленгликоле, диметилформамиде; маслах, в частности, хлопковом масле, масле земляного ореха, масле зародышей кукурузы, оливковом масле, касторовом масле и кунжутном масле, глицерине, тетрагидрофурфуриловом спирте, полиэтиленгликолях и сложных эфирах жирных кислот и сорбита; или смесях указанных веществ и т.п., с получением таким образом раствора или суспензии.
[0096] Суспензии, помимо активных соединений, могут содержать суспендирующие агенты, например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбита, микрокристаллическую целлюлозу, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар, трагакантовую камедь или смеси указанных веществ, и т.п. [0097] Композиции для ректального введения представляют собой, например, суппозитории, которые могут быть получены смешиванием соединения формулы I с, например, подходящими нераздражающими вспомогательными веществами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для суппозиториев, твердыми при обычных температурах, но жидкими при температуре тела, и, соответственно, плавящимися при нахождении в подходящей полости тела и высвобождающими в указанную полость тела активный компонент.
[0098] Дозированные формы соединения формулы I для местного введения включают мази, порошки, спреи и формы для ингаляций. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с физиологически приемлемым носителем и, по необходимости, любыми консервантами, буферами или распыляющими веществами. Подразумевается, что офтальмологические композиции, глазные мази, порошки и растворы также входят в объем изобретения согласно настоящему описанию.
[0099] Для диспергирования соединения формулы I в форме аэрозоля могут применяться сжатые газы. Инертными газами, подходящими для указанной цели, являются азот, диоксид углерода и т.п.
[00100] Как правило, в зависимости от предполагаемого способа введения, фармацевтически приемлемые композиции содержат от приблизительно 1% до приблизительно 99% по массе соединения(ий) формулы I или его фармацевтически
приемлемой соли, и от 99% до 1% по массе подходящего фармацевтического вспомогательного вещества. Согласно одному из примеров композиция содержит от приблизительно 5% до приблизительно 75% по массе соединения(ий) формулы I, формулой 1а или Соединение 1, или его фармацевтически приемлемой соли, остальная часть представлена подходящими фармацевтическими вспомогательными веществами. [00101] Фактические способы получения таких дозированных формы известны специалистам в данной области техники или будут для них очевидны; см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., (Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990). В любом случае, композиция для введения содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, для лечения болезненного состояния в соответствии с концепциями изобретения согласно настоящему описанию.
[00102] Соединения согласно настоящему описанию или их фармацевтически приемлемые соли или сольваты вводят в терапевтически эффективном количестве, варьирующем в зависимости от разнообразных факторов, в том числе - от активности конкретного используемого соединения, метаболической стабильности и продолжительности действия указанного соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания, способа и времени введения, скорости выведения, сочетания лекарственных веществ, тяжести конкретного болезненного состояния, и субъекта, подвергаемого терапии. Пациенту могут вводиться дозы соединения формулы I, формулой 1а или Соединения 1 в диапазоне от приблизительно 0,1 до приблизительно 1000 мг в сутки, и от приблизительно 1 до приблизительно 150 мг в сутки. Например, для среднестатистического взрослого человека, имеющего массу тела приблизительно 70 килограммов, доза может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мг на килограмм массы тела в сутки. Конкретная используемая дозировка, тем не менее, может быть разной. Например, дозировка может зависеть от ряда факторов, включая потребности пациента, тяжесть подлежащего лечению состояния и фармакологическую активность используемого соединения. Определение оптимальных дозировок для конкретного пациента хорошо знакомо специалистам в данной области техники. [00103] Согласно другим вариантам реализации соединение формулы I, формулой 1а или Соединение 1, может вводиться пациенту одновременно с другими способами лечения рака. Такие способы лечения включают, в частности, другие химиотерапевтические средства для лечения рака, заместительную гормональную терапию, лучевую терапию или иммунотерапию. Выбор дополнительной терапии зависит
от ряда факторов, в том числе метаболической стабильности и продолжительности действия указанного соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, питания, способа и времени введения, скорости выведения, сочетания лекарственных веществ, тяжести конкретного болезненного состояния и субъекта, который подвергается терапии.
[00104] Согласно одному из вариантов реализации соединение формулы I, формулой 1а или Соединение 1 вводят перорально в виде капсулы. Согласно еще одному варианту реализации Соединение 1 вводят перорально в виде капсулы. Указанная капсула может содержать 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг или менее Соединения 1. Согласно одному из вариантов реализации доза составляет от 0,01 до 25 мг.
[00105] Согласно еще одному варианту реализации соединение формулы I, формулой 1а или Соединение 1 вводят перорально в виде таблетки.
[00106] Согласно еще одному варианту реализации Соединение 1 или фармацевтически приемлемую соль Соединения 1 вводят перорально в виде таблетки согласно приведенной ниже таблице.
Ингредиент
(% по массе)
СОЕДИНЕНИЕ 1
31,68
Микрокристаллическая
38,85
целлюлоза
Лактоза безводная
19,42
Гидроксипропилцеллюлоза
3,00
Кроскармеллоза натрия
3,00
Всего, внутри гранулы
95,95
Диоксид кремния, Коллоидный
0,30
Кроскармеллоза натрия
3,00
Стеарат магния
0,75
Всего
100,00
[00107] Согласно еще одному варианту реализации Соединение 1 или фармацевтически приемлемую соль Соединения 1 вводят перорально в виде таблетки согласно приведенной ниже таблице.
Ингредиент
(% по массе)
Соединение 1
25,0-33,3
Микрокристаллическая целлюлоза
необходимости
Гидроксипропилцеллюло за
Полоксамер
0-3
Кроскармеллоза натрия
6,0
Коллоидный диоксид кремния
0,5
Стеарат магния
0,5-1,0
Всего
100
[00108] Согласно еще одному варианту реализации Соединение 1 или фармацевтически приемлемую соль Соединения 1 вводят перорально в виде таблетки согласно приведенной ниже таблице.
Ингредиент
Теоретическое количество (мг/ед. дозы)
Соединение 1
100,0
Микрокристаллическая целлюлоза РН-102
155,4
Лактоза безводная 60М
77,7
Гидроксипропилцеллюлоза, EXF
12,0
Кроскармеллоза натрия
Коллоидный диоксид кремния
1,2
Стеарат магния (Не бычий)
3,0
Опадрай желтый
16,0
Всего
416
[00109] Описанные выше составы для таблеток могут быть модифицированы таким образом, чтобы обеспечивать пероральную дозу 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 или 5 мг или менее Соединения 1 или фармацевтически приемлемой соли Соединения 1. Согласно одному из вариантов реализации доза составляет от 0,01 до 25 мг.
Получение Соединения 1
[00110] Получение N-(4-{ [6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил]окси}фенил)-гЧ'-(4-
фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида и его (Ь)-малатной соли. [00111] Способ синтеза, применяемый для получения N-(4-[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-гЧ'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида и его (Ь)-малатной соли, представлен на Схеме 1:
Получение 4-Хлор-6,7-диметоксихинолина [00112] В реактор загружали последовательно 6,7-диметоксихинолин-4-ол (10,0 кг) и ацетонитрил (64,0 л). Полученную смесь нагревали до приблизительно 65°С и добавляли оксихлорид фосфора (РОС1з, 50,0 кг). После добавления POCI3 температуру реакционной смеси повышали до приблизительно 80°С. Реакцию считают завершенной (приблизительно 9,0 часов), когда остается менее чем 2 процента исходного материала (проводимый в ходе реакции анализ с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ]). Реакционную смесь охлаждали приблизительно до 10°С и затем останавливали реакцию, выливая смесь в охлажденный раствор дихлорметана (ДХМ, 238,0 кг), 30% NH4OH (135,0 кг) и льда (440,0 кг). Полученную смесь нагревали до приблизительно 14°С, и разделяли фазы. Органическую фазу отмывают водой (40,0 кг) и концентрировали путем вакуумной дистилляции для удаления растворителя (приблизительно 190,0 кг). К составу добавляли метил-трет-бутиловый эфир (МТБЭ, 50,0 кг), и смесь охлаждали приблизительно до 10°С; за это время продукт кристаллизовался. Твердые вещества извлекали путем центрифугирования, промывали н-гептаном (20,0 кг) и высушивали приблизительно при 40°С с получением титульного соединения (8,0 кг).
Получение 6,7-диметил-4-(4-нитрофенокси)-хинолина [00113] В реактор последовательно загружали 4-хлор-6,7-диметоксихинолин (8,0 кг), 4-нитрофенол (7,0 кг), 4-диметиламинопиридин (0,9 кг), и 2,6-лутидин (40,0 кг). Содержимое реактора нагревали приблизительно до 147°С. После завершения реакции (менее чем 5% оставшегося исходного материала согласно оценке с помощью проводимого в ходе реакции ВЭЖХ-анализа; приблизительно 20 часов), содержимое реактора оставляли охлаждаться до приблизительно 25°С. Добавляли метанол (26,0 кг), а затем карбонат калия (3,0 кг), растворенный в воде (50,0 кг). Содержимое реактора перемешивали на протяжении приблизительно 2 часов. Полученный твердый осадок фильтровали, промывали водой (67,0 кг) и высушивали при 25°С в течение приблизительно 12 часов с получением титульного соединения (4,0 кг).
Получение 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина [00114] Раствор, содержащий формиат калия (5,0 кг), муравьиную кислоту (3,0 кг) и воду, (16,0 кг) добавляли к смеси 6,7-диметокси-4-(4-нитро-фенокси)-хинолина (4,0 кг), 10 % палладия на угле (водонасыщенность 50%, 0,4 кг) в тетрагидрофуране (ТГФ, 40,0 кг), нагретой до приблизительно 60°С. Добавление производили таким образом, чтобы температура реакционной смеси сохраняла значение приблизительно 60°С. Когда реакцию считали завершенной согласно оценке с помощью проводимого в ходе реакции ВЭЖХ-анализа (менее чем 2 % оставшегося исходного материала, как правило, 15 часов), содержимое реактора фильтровали. Фильтрат концентрировали путем вакуумной дистилляции при приблизительно 35°С до половины исходного объема, что приводило к выпадению в осадок продукта. Указанный продукт извлекали фильтрацией, промывали водой (12,0 кг) и высушивали под вакуумом при приблизительно 50°С с получением титульного соединения (3,0 кг; 97 % площадь под кривой (AUC)).
Получение 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновой кислоты [00115] Триэтиламин (8,0 кг) добавляли к охлажденному (приблизительно 4°С) раствору коммерчески доступной циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты (2 1, 10,0 кг) в ТГФ (63,0 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 10°С. Раствор перемешивали на протяжении приблизительно 30 минут, затем добавляли тионилхлорид (9,0 кг) при поддержании температуры содержимого реактора ниже 10°С. После того как добавление было завершено, добавляли раствор 4-фторанилина (9,0 кг) в
ТГФ (25,0 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 10°С. Смесь перемешивали на протяжении приблизительно 4 часов и затем разбавляли изопропилацетатом (87,0 кг). Указанный раствор последовательно промывали водным раствором гидроксида натрия (2,0 кг, растворенные в 50,0 л воды), водой (40,0 л) и водным раствором хлорида натрия (10,0 кг, растворенные в 40,0 л воды). Органический раствор концентрировали путем вакуумной дистилляции, после чего добавляли гептан, что приводило к выпадению в осадок твердого вещества. Твердое вещество извлекали путем центрифугирования и затем высушивали при приблизительно 35°С под вакуумом с получением титульного соединения (10,0 кг).
Получение 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбонилхлорида [00116] Оксалилхлорид (1,0 кг) добавляли к раствору 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновой кислоты (2,0 кг) в смеси ТГФ (11 кг) и N, N-диметилформамида (ДМФА; 0,02 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 30°С. Указанный раствор использовали на следующем этапе без дальнейшей обработки.
Получение ^(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил]окси}фенил)^'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида [00117] Полученный в ходе предыдущего этапа раствор, содержащий 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбонилхлорид, добавляли к смеси 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина (3,0 кг) и карбоната калия (4,0 кг) в ТГФ (27,0 кг) и воде (13,0 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 30°С. После завершения реакции (как правило, через 10 минут), добавляли воду (74,0 кг). Смесь перемешивали при 15-30°С на протяжении приблизительно 10 часов, что приводило к выпадению в осадок продукта. Указанный продукт извлекали фильтрацией, промывали предварительно приготовленным раствором ТГФ (11,0 кг) и воды (24,0 кг), и высушивали при приблизительно 65°С под вакуумом в течение примерно 12 часов с получением титульного соединения (свободное основание, 5,0 кг^НЯМР (400 МГц, ёб-ДМСО): 5 10,2 (s, Ш), 10,05 (s, Ш), 8,4 (s, Ш), 7,8 (m, 2Н), 7,65 (т, 2Н), 7,5 (s, Ш), 7,35 (s, Ш), 7,25 (т, 2Н), 7,15(т, 2Н), 6,4 (s, Ш), 4,0 (d, 6Н), 1,5 (s, 4Н), ЖХ/МС: М+Н= 502.
Получение N-(4-{[6,7-биc(мeтилoкcи)xинoлин-4-ил]oкcи}фeнил)-N'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида, (Ь)-малатной соли [00118] Раствор L-яблочной кислоты (2,0 кг) в воде (2,0 кг) добавляли к раствору циклопропан-1,1 -дикарбоновой кислоты [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил] -амид (4-фтор-фенил)-амида в виде свободного основания (1 5, 5,0 кг) в этаноле, при поддержании температуры содержимого реактора, составляющей приблизительно 25°С. Затем добавляли углерод (0,5 кг) и тиол-кремнезем (0,1 кг), полученную смесь нагревали приблизительно до 78°С, и в этот момент добавляли воду (6,0 кг). Затем реакционную смесь фильтровали, после чего добавляли изопропанол (38,0 кг) и оставляли для охлаждения приблизительно до 25°С. Продукт извлекали фильтрацией, промывали изопропанолом (20,0 кг) и высушивали приблизительно при 65°С с получением титульного соединения (5,0 кг).
Альтернативный способ получения 1Ч-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил]окси}фенил)-№-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида и его (L)-
малатной соли.
[00119] Альтернативный способ синтеза, который может применяться для получения N-(4- {[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-]^' -(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамида и его (Ь)-малатной соли, представлен на Схеме 2.
Схема 2
-^ONa+, ДМА или натрия трет-пентоксид, ДМА
о о 1) S02C12, Et3N р
Оксалилхлорвд ТГФ ДМФА
лл" ТГФ XIХУ
ТГФ
Получение 4-хлор-6,7-диметоксихинолина [00120] В реактор загружали последовательно 6,7-диметоксихинолин-4-ол (47,0 кг) и ацетонитрил (318,8 кг). Полученную смесь нагревали до приблизительно 60°С и добавляли оксихлорид фосфора (РОС1з, 130,6 кг). После добавления POCI3 температуру реакционной смеси повышали до приблизительно 77°С. Реакцию считали завершенной (приблизительно через 13 часов), когда оставалось менее 3% исходного материала (анализ с применением проводимой в ходе реакции высокоэффективной жидкостной хроматографии [ВЭЖХ]). Реакционную смесь охлаждали приблизительно до 2-7°С, и затем останавливали реакцию, выливая смесь в охлажденный раствор дихлорметана (ДХМ, 482,8 кг), 26% NH4OH (251,3 кг) и воды (900 л). Полученную смесь нагревали до приблизительно 20-25°С, и разделяли фазы. Органическую фазу фильтровали через слой AW Hyflo Super-Cel NF (целит; 5,4 кг); фильтрующий слой промывали ДХМ (118,9 кг). Комбинированную органическую фазу отмывали насыщенным солевым раствором (282,9 кг) и смешивали с водой (120 л). Разделенные фазы и органическую фазу концентрировали путем вакуумной дистилляции с удалением растворителя (остаточный объем - приблизительно 95 л). ДХМ (686,5 кг) загружали в реактор, содержащий органическую фазу, и концентрировали путем вакуумной дистилляции с удалением растворителя (остаточный объем - приблизительно 90 л). Затем загружали метил-трет
бутиловый эфир (МТБЭ, 226,0 кг), температуру смеси доводили до -20 - -25°С и выдерживали в течение 2,5 часов для получения твердого осадка, который затем фильтровали, промывали н-гептаном (92,0 кг) и высушивали на фильтре при приблизительно 25°С под азотом с получением титульного соединения. (35,6 кг).
Получение 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина [00121] 4-Аминофенол (24,4 кг), растворенный в гЧ,гЧ-диметилацетамиде (ДМА, 184,3 кг), загружали в реактор, содержащий 4-хлор-6,7-диметоксихинолин (35,3 кг), трет-бутоксид натрия (21,4 кг) и ДМА (167,2 кг), при 20-25°С. Затем указанную смесь нагревали до 100-105°С на протяжении приблизительно 13 часов. После того как реакция считалась завершенной согласно оценке с помощью проводимого в ходе реакции анализа ВЭЖХ (менее чем 2% оставшегося исходного материала), содержимое реактора охлаждали при 15-20°С и загружали воду (предварительно охлажденную, 2-7°С, 587 л) с такой скоростью, чтобы поддерживать температуру 15-30°С. Полученный твердый осадок фильтровали, промывали смесью воды (47 л) и ДМА (89,1 кг), и в заключение - водой (214 л). Затем отфильтрованный осадок высушивали при приблизительно 25°С на фильтре с получением неочищенного 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина (влажная масса 59,4 кг, сухая масса 41,6 кг, согласно расчету с учетом потерь при высушивании). Неочищенный 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламин нагревали до рефлюкса (приблизительно 75°С) в смеси тетрагидрофурана (ТГФ, 211,4 кг) и ДМА (108,8 кг) на протяжении приблизительно 1 часа, а затем остужали до 0-5°С и выдерживали на протяжении приблизительно 1 часа, после чего твердое вещество фильтровали, промывали ТГФ (147,6 кг) и высушивали на фильтре под вакуумом при приблизительно 25°С с образованием 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина (34,0 кг).
Альтернативный вариант получения 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-
фениламина
[00122] В реактор загружали 4-хлор-6,7-диметоксихинолин (34,8 кг), 4-аминофенол (30,8 кг) и трет-пентоксид натрия (1,8 эквивалента) 88,7 кг, 35% по массе в ТГФ), затем загружали гЧ,гЧ-диметилацетамид (ДМА, 293,3 кг). Далее указанную смесь нагревали до 105-115°С на протяжении приблизительно 9 часов. После того как реакцию считали завершенной согласно оценке на основании проводимого в ходе реакции ВЭЖХ-анализа (менее чем 2% оставшегося исходного материала), содержимое реактора охлаждали при 15-25°С, и на протяжении 2-х часового периода добавляли воду (315 кг), поддерживая при
этом температуру 20-30°С. Затем реакционную смесь перемешивали дополнительно на протяжении часа при 20-25°С. Неочищенный продукт собирали фильтрацией и промывали смесью 88кг воды и 82,1 кг ДМА, а затем - 175 кг воды. Указанный продукт сушили на сушилке с фильтрующим слоем на протяжении 53 часов. Наблюдаемые потери при высушивании составили менее чем 1% по массе.
[00123] Согласно альтернативному способу применяли 1,6 эквивалента трет-пентоксида натрия и температуру реакции повышали от 110-120°С. Кроме того, температуру охлаждения повышали до 35-40°С, а начальную температуру при добавлении воды доводили до 35-40°С, с допустимой экзотермой до 45°С.
Получение 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновой кислоты [00124] Триэтиламин (19,5 кг) добавляли к охлажденному (приблизительно 5°С) раствору циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты (24,7 кг) в ТГФ (89,6 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 5°С. Указанный раствор перемешивали на протяжении приблизительно 1,3 часов, а затем добавляли тионилхлорид (23,1 кг) при поддержании температуры содержимого реактора ниже 10°С. После завершения добавления раствор перемешивали на протяжении приблизительно 4 часов, поддерживая температуру ниже 10°С. Затем добавляли раствор 4-фторанилина (18,0 кг) в ТГФ (33,1 кг) с такой скоростью, чтобы температура в реакторе не превышала 10°С. Смесь перемешивали на протяжении приблизительно 10 часов, после чего реакция считалась завершенной. Затем реакционную смесь разбавляли изопропилацетатом (218,1 кг). Указанный раствор последовательно промывали дополнительно разбавленным водой (415 л) водным гидроксидом натрия (10,4 кг, 50%, растворенные в 119 л воды), затем водой (100 л) и, в заключение, водным раствором хлорида натрия (20,0 кг, растворенные в 100 л воды). Органический раствор концентрировали путем вакуумной дистилляции (остаточный объем - 100 л) при температуре ниже 40°С, после чего добавляли н-гептан (171,4 кг), что приводило к выпадению в осадок твердого вещества. Указанное твердое вещество извлекали фильтрацией и промывали н-гептаном (102,4 кг) с получением влажной неочищенной 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновой кислоты (29,0 кг). Указанную неочищенную 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновую кислоту растворяли в метаноле (139,7 кг) при приблизительно 25 °С, после чего добавляли воду (320 L), что приводило к образованию суспензии, которую фильтровали, последовательно промывали водой (20 л) и н-гептаном (103,1 кг), а затем высушивали на
фильтре при приблизительно 25°С под азотом с получением титульного соединения (25,4 кг).
Получение 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбонилхлорида [00125] Оксалилхлорид (12,6 кг) добавляли к раствору 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновой кислоты (22,8 кг) в смеси ТГФ (96,1 кг) и N, N-диметилформамида (ДМФА; 0,23 кг) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 25°С. Указанный раствор использовали на следующем этапе без дальнейшей обработки.
Альтернативный вариант получения 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбонилхлорида [00126] В реактор загружали 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбоновую кислоту (35 кг), 344 г ДМФА и 175 кг ТГФ. Указанную реакционную смесь доводили до 12-17°С; затем в реакционную смесь в течение периода, составляющего 1 час, добавляли 19,9 кг оксалилхлорида. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 12-17°С на протяжении 3-8 часов. Указанный раствор использовали на следующем этапе без дальнейшей обработки.
Получение [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амида
циклопропан-Ы-дикарбоновой кислоты [00127] Полученный в ходе предыдущего этапа раствор, содержащий 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-циклопропанкарбонилхлорид, добавляли к смеси соединения 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламина (23,5 кг) и карбоната калия (31,9 кг) в ТГФ (245,7 кг) и воде (116 L) с такой скоростью, чтобы температура содержимого реактора не превышала 30°С. После завершения реакции (приблизительно через 20 минут) добавляли воду (653 л). Смесь перемешивали при 20-25°С на протяжении приблизительно 10 часов, что приводило к выпадению в осадок продукта. Указанный продукт извлекали фильтрацией, промывали предварительно приготовленным раствором ТГФ (68,6 кг) и воды (256 л), и высушивали сначала на фильтре под азотом при приблизительно 25°С, а затем при приблизительно 45°С под вакуумом с получением титульного соединения (41,0 кг; 38,1 кг, согласно расчету с учетом потерь при высушивании).
Альтернативный вариант получения [4-(6,7-диметокси- хинолин-4-илокси)-фенил]-
амид (4-фтор-фенил)-амида циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты [00128] В реактор загружали 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламин (35,7 кг, 1 эквивалент), а затем - 412,9 кг ТГФ. К реакционной смеси добавляли раствор 48,3 К2СО3 в 169 кг воды. Раствор хлорангидрида согласно приведенному выше описанию
Альтернативного варианта получения 1-(4-фтор-фенилкарбамоил)-
циклопропанкарбонилхлорида переносили в реактор, содержащий 4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фениламин, при поддержании температуры 20-30°С в течение как минимум 2-х часов. Реакционную смесь перемешивали при 20-25°С на протяжении как минимум 3-х часов. Затем температуру реакции доводили до 30-25°С и смесь перемешивали. Перемешивание прекращали и фазам смеси давали разделиться. Нижнюю водную фазу удаляли и утилизировали. К оставшейся верхней органической фазе добавляли 804 кг воды. Реакцию поддерживали при перемешивании при 15-25°С на протяжении как минимум 16 часов.
[00129] Продукт выпадал в осадок. Указанный продукт фильтровали и промывали смесью 179 кг воды и 157,9 кг ТГФ, разделенной на две порции. Неочищенный продукт высушивали под вакуумом в течение по меньшей мере двух часов. Высушенный продукт затем добавляли в 285,1 кг ТГФ. Полученную суспензию переносили в реакционный сосуд и перемешивали до перехода суспензии в прозрачный раствор (до растворения), для чего требовалось нагревание до 30-35°С на протяжении приблизительно 30 минут. Затем к указанному раствору добавляли 456 кг воды, а также 20 кг специально денатурированного (SDAG-1) этанола (этанола, денатурированного метанолом) в течение 2-х часов. Указанную смесь перемешивали при 15-25°С в течение по меньшей мере 16 часов. Продукт фильтровали и промывали смесью 143 кг воды и 126,7 ТГФ, разделенной на две порции. Продукт высушивали при температуре, составляющей максимум 40°С. [00130] Согласно альтернативному способу температуру реакции во время формирования хлорангидрида доводили до 10-15°С. Температуру рекристаллизации изменяли от 15-25°С до 45-50°С в течение 1 часа, а затем снижали до 15-25°С в течение 2 часов.
Получение малатной соли [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-
фенил)-амида циклопропан-Ы-дикарбоновои кислоты [00131] В реактор загружали [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амид циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты (1-5; 13,3 кг), L-яблочную
кислоту (4,96 кг), метилэтилкетон (МЭК; 188,6 кг) и воду (37,3 кг), и указанную смесь нагревали до рефлюкса (приблизительно 74°С) на протяжении приблизительно 2 часов. Температуру реактор снижали до 50-55°С и содержимое реактора фильтровали. Описанные выше последовательные этапы повторяли еще два раза, с таким же количеством исходного материала (13,3 кг), L-яблочной кислоты (4,96 кг), МЭК (198,6 кг) и воды (37,2 кг). Комбинированный фильтрат высушивали азеотропной перегонкой при атмосферном давлении с применением МЭК (1133,2 кг) (примерный остаточный объем -711 л; влагосодержание по методу Карла Фишера (KF) < 0,5 % по массе) при приблизительно 74°С. Температуру содержимого реактора снижали до 20-25°С и поддерживали на протяжении приблизительно 4 часов с получением твердого осадка, который фильтровали, промывали МЭК (448 кг) и высушивали под вакуумом при 50°С с получением титульного соединения (45,5 кг).
Альтернативный вариант получения (Ь)-малатной соли [4-(6,7-диметокси- хинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амида циклопропан-1,1-дикарбоновой
кислоты
[00132] В реактор загружали [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амид (47,9 кг)циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты, L-яблочную кислоту (17,2), 658,2 кг метилэтилкетона и 129,1 кг воды (37,3 кг), и указанную смесь нагревали при 50-55°С на протяжении приблизительно 1-3 часов, а затем при 55-60°С на протяжении дополнительных 4-5 часов. Смесь осветляли фильтрацией через патронный фильтр 1 мкм. Температуру реактора доводили до 20-25 °С и проводили вакуумную дистилляцию при пониженном давлении 150-200 мм рт.ст. при максимальной температуре в рубашке 55°С до объема в диапазоне 558-731 л.
[00133] Вакуумную дистилляцию повторяли еще два раза, загружая 380 кг и 380,2 кг метилэтилкетона, соответственно. После третьего цикла дистилляции объем серии доводили до 18% (об./масс.) [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амида циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты, загружая 159,9 кг метилэтилкетона с получением общего объема 880 л. Дополнительную вакуумную дистилляцию проводили, внося 245,7 метилэтилкетона. Реакционную смесь выдерживали при умеренном перемешивании при 20-25°С на протяжении по меньшей мере 24 часов. Продукт фильтровали и промывали 415,1 кг метилэтилкетона, разделенного на три порции. Продукт высушивали под вакуумом при заданной температуре в рубашке 45°С.
[00134] В альтернативном способе порядок добавления меняли таким образом, что раствор 17,7 кг L-яблочной кислоты, растворенный в 129,9 кг воды, добавляли к [4-(6,7-диметоксихинолин-4-илокси)-фенил]-амид (4-фтор-фенил)-амиду циклопропан-1,1-дикарбоновой кислоты (48,7 кг) в метилэтилкетоне (673,3 кг).
Пример 1
Тестирование Соединения 1 в анализах дифференцировки и активности остеокластов и остеобластов in vitro [00135] Целью данного исследования являлось изучение влияния 7-ми концентраций Соединения 1 на дифференцировку и активность остеокластов человека и остеобластов мыши in vitro. Тестировали следующие концентрации: 0,004; 0,012; 0,037; 0,11; 0,33; 1,0 и 3,0 мкМ. Исследование проводили с применением полученных из костного мозга человека CD34+ клеток-предшественников остеокластов, которые культивировали на срезах бычьей кости, и остеопрогениторных клеток мыши KS483, которые индуцировали для дифференцировки в костеобразующие остеобласты.
[00136] Исследование состояло из 4-х частей. В ходе первой части полученные из костного мозга человека клетки-предшественники остеокластов CD34+ культивировали на срезах бычьей кости на протяжении 7 дней, после чего образовавшиеся остеокласты подсчитывали путем измерения активности устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5Ь (ТрКФ-5Ь) в культуральной среде. Указанный анализ демонстрирует влияние Соединения 1 на дифференцировку остеокластов. В качестве эталонного ингибитора дифференцировки остеокластов включали остеопротегерин (ОПТ), чтобы продемонстрировать, что культуральная система работает надлежащим образом. [00137] Во второй части культуральную среду для остеокластов человека заменяли новой средой на 7 день, и образовавшиеся зрелые остеокласты культивировали на протяжении 3-х дополнительных дней, позволяя им резорбировать кость. Соединение 1 добавляли в культуральную среду на 7 день. Указанный анализ демонстрирует влияние Соединения 1 на резорбционную активность зрелых остеокластов. В культуральной среде, собранной на 10 день, измеряли уровень С-терминальных перекрестно-связанных телопептидов коллагена I типа (СТХ) для количественного определения резорбции кости в течение дней 7-10. ТрКФ-5Ь измеряли на 7 день для количественного определения числа остеокластов до добавления Соединения 1. Показатели СТХ делили на показатели ТрКФ-5Ь, получая индекс резорбции, отражающий среднее активности остеокластов. В качестве эталонного ингибитора активности остеокластов включали ингибитор цистеин-протеазы
Е64, чтобы продемонстрировать, что культуральная система работает надлежащим образом.
[00138] В третьей части на протяжении 8 дней культивировали остеопрогениторные клетки мыши KS483, после чего подсчитывали образовавшиеся зрелые остеобласты путем измерения количества активности внутриклеточной щелочной фосфатазы (ЩФ, или ALP). Указанный анализ демонстрирует влияние Соединения 1 на дифференцировку остеобластов. В данное исследование включали 1713-эстрадиол в качестве эталонного соединения, стимулирующего дифференцировку остеобластов, чтобы продемонстрировать, что культуральная система работает надлежащим образом. [00139] В четвертой части исследования остеопрогениторные клетки мыши KS483 культивировали в течение 13 дней, в течение которых на 11 день определяли N-терминальный пропептид проколлагена типа I (PINP), секретированный в культуральную среду, для выявления влияния на образование органического костного матрикса, и на 13 день определяли количество кальция, депонированное в сформировавшийся костный матрикс, для выявления влияния на образование неорганического костного матрикса. Анализ активности остеобластов выявляет влияние Соединения 1 на костеобразующую активность остеобластов. 1713-эстрадиол включали в данное исследование в качестве эталонного соединения, стимулирующего дифференцировку и активность остеобластов, чтобы продемонстрировать, что культуральная система работает надлежащим образом. [00140] Соединение 1 демонстрировало дозозависимое подавление дифференцировки остеокластов, значимое при концентрациях 0,11; 0,33; 1,0 и 3,0 мкМ. Микроскопический анализ показал, что концентрации 0,11 и 0,33 мкМ не влияют на число Hoechst- и ТрКФ-положительных мононуклеарных клеток, что говорит о специфическом подавлении дифференцировки остеокластов. Тем не менее, при концентрациях 1,0 и 3,0 мкМ уменьшалось число как Hoechst-, так и ТрКФ- положительных мононуклеарных клеток, что указывает на то, что ингибирующие эффекты, наблюдаемые при указанных концентрациях, являются по меньшей мере частично цитотоксическими. При анализе активности остеокластов никаких эффектов не наблюдалось.
[00141] Соединение 1 демонстрировало дозозависимое стимулирование дифференцировки и активности остеобластов. Концентрации Соединения 1 0,012; 0,037; 0,11; 0,33 и 1,0 мкМ повышали, а концентрация 3,0 мкМ понижала уровни ЩФ при анализе дифференцировки остеобластов. При анализе активности остеобластов концентрации 0,012 и 0,037 мкМ повышали уровни РРлГР, а концентрации 0,004; 0,012; 0,037 и 0,11 мкМ повышали уровни кальция. Концентрации 0,33; 1,0 и 3,0 мкМ снижали
уровни как PINP, так и кальция. Эти результаты указывают на то, что концентрации 0,004; 0,012; 0,037 и 0,11 мкМ Соединения 1 оказывают благоприятное действие на клетки костной ткани, активируя костеобразование остеобластами и не оказывая влияния на образование резорбирующих кость остеокластов или не подавляя его.
Описание исследования
[00142] Целью данного исследования являлось изучение влияния выбранного Заказчиком Соединения 1 на дифференцировку и активность остеокластов человека и остеобластов мыши in vitro. Указанное влияние на остеокласты исследовали с применением модели, в которой полученные из костного мозга человека клетки-предшественники остеокластов культивируют на срезах бычьей кости на протяжении 7 дней в условиях, способствующих дифференцировке остеокластов, и позволяют дифференцировать в резорбирующие кость остеокласты. После завершения дифференцировки остеокластов на 7 день культуральную среда удаляли и добавляли в лунки новую культуральную среду, способствующую активности остеокластов. Затем зрелые остеокласты культивировали на протяжении 3-х дополнительных дней, позволяя им резорбировать кость. При анализе дифференцировки остеокластов тестируемые соединения и эталонный ингибитор остеопротегерин (ОПТ) добавляли в культуры на день 0. При анализе активности остеокластов тестируемые соединения и эталонный ингибитор Е64 добавляли в культуры на 7 день. В обоих анализах тестировали по семь концентраций в 8 повторностях. Активность устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5Ь (ТрКФ-5Ь) в культуральной среде, собранной на 7 день, измеряли в качестве показателя числа остеокластов, образовавшихся в каждой лунке во время периода дифференцировки. Содержание С-терминальных перекрестно-связанных телопептидов коллагена I типа (СТХ) в культуральной среде, собранной на 10 день, измеряли для количественного определения резорбции кости в течение 7-10 дня.
[00143] Влияние на остеобласты исследовали с применением остеопрогениторных клеток мыши KS483, которые могут быть индуцированы для дифференцировки в костеобразующие остеобласты. 1713-эстрадиол (Е2) включали в данное исследование в качестве эталонного соединения, стимулирующего дифференцировку и активность остеобластов, чтобы продемонстрировать, что культуральные системы позволяют обнаруживать стимулирование дифференцировки и активности остеобластов. При анализе дифференцировки остеобластов клетки культивировали на протяжении 8 дней, после чего образовавшиеся зрелые остеобласты подсчитывали путем измерения уровней активности
внутриклеточной щелочной фосфатазы (ЩФ). При анализе активности остеобластов остеопрогениторные клетки культивировали в течение 13 дней, на протяжении которых на 11 день определяли содержание секретированного в культуральную среду N-терминального пропептида проколлагена типа I (PINP) для выявления влияния на образование органического костного матрикса, а на 13 день определяли количество кальция, депонированного в сформировавшийся костный матрикс, для выявления влияния на образование неорганического костного матрикса.
[00144] Тесты проводили в 96-луночных планшетах, содержащих фоновую группу, включающую основу, контрольную группу, включающую эталонное соединение, и группы, включающие тестируемое соединение. Чтобы продемонстрировать, что тест-системы работают надлежащим образом, включали эталонные соединения. В культурах остеокластов исследование считали успешно проведенным, если результаты для контрольной группы были существенно ниже результатов для фоновой группы. В культурах остеобластов исследование считали успешно проведенным, если результаты для контрольной группы были существенно выше результатов для фоновой группы.
Соединение 1
[00145] Соединение 1 получали от Заказчика в виде твердого соединения. Указанное соединение суспендировали в ДМСО в концентрации 10 мМ для получения базового раствора. Перед экспериментами готовили свежий базовый раствор, который хранили в сухих условиях в темноте при комнатной температуре. Для длительного использования (более 5 дней) базовый раствор хранили при -70°С. Из базового раствора готовили подходящие разведения для получения нужных концентраций для тестирования; 0,004 мкМ, 0,012 мкМ, 0,037 мкМ, 0,11 мкМ, 0,33 мкМ, 1 мкМ и 3 мкМ.
Эталонные соединения [00146] Остеопротегерин (ОПТ, 5 нМ, кат. №450-14, полученный от PeproTech ЕС Ltd, Лондон, Великобритания) использовали в качестве эталонного ингибитора дифференцировки остеокластов, а ингибитор цистеин-протеазы Е64 (1 _М, кат. №Е-3132, полученный от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) - в качестве эталонного ингибитора резорбционной активности остеокластов.
[00147] 1713-эстрадиол (Е2; 10 нМ, кат. №Е1024, полученный от Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) использовали в качестве эталонного стимулятора дифференцировки и активности остеобластов.
Способ
Культуры остеокластов
[00148] Способ культивирования остеокластов на срезах кости первоначально был описан Boyde и др. (1984) и Chambers и др. (1984). Исходно число остеокластов определяли путем подсчета числа положительных по устойчивой к тартрату кислой фосфатазе (ТрКФ-положительных) многоядерных клеток под микроскопом. Позже было показано, что активность секретированной ТрКФ-5Ь отражает число остеокластов в культурах остеокластов мыши (Alatalo et al. 2000). Хотя активность секретированного ТрКФ-5Ь выраженно коррелировала с числом остеокластов, ТрКФ-5Ь не секретировался ТрКФ-положительными мононуклеарными клетками-предшественниками остеокластов до их дифференцировки в зрелые многоядерные остеокласты. Таким образом, секретированный ТрКФ-5Ь представляет собой надежный маркер числа зрелых многоядерных остеокластов.
[00149] Скорость резорбции кости в культурах изначально определяли путем подсчета числа резорбционных углублений на каждом срезе кости или дентина с применением фазово-контрастной микроскопии. Позднее углубления визуализировали с применением лектина - агглютинина зародыша пшеницы, который, в частности, связывается с резорбированным участком изнутри кости, позволяя количественно определять общую площадь резорбированной кости с применением микроскопии и системы компьютерного анализа изображений. Указанные способы обладают двумя недостатками: они требуют больших затрат времени и не позволяют обнаружить различия в глубине резорбционных углублений, что может приводить к ложным результатам. Позже было показано, что С-терминальные перекрестно-связанные телопептиды коллагена I типа (СТХ) являются количественным показателем продуктов разложения коллагена костной ткани, высвобождаемых в культуральную среду (Bagger et al. 1999). Этот способ является быстрым и чувствительным, и представляет собой надежный показатель общего резорбированного объема (в том числе глубины углублений).
[00150] Для применения в данном исследовании была разработана система культивирования остеокластов человека, в которой CD34+ клетки-предшественники остеокластов, полученные из костного мозга человека (предшественники остеокластов человека Poietics(r), Lonza, Уолкерсвилль, США) культивируют на срезах бычьей кости в присутствии подходящих факторов роста, включая М-КСФ (M-CSF) и RANK-лиганд (Rissanen et al. 2009). Указанным клеткам сначала позволяют дифференцировать в зрелые
резорбирующие кость остеокласты, и затем сформировавшимся остеокластам позволяют резорбировать кость. Тестируемые и эталонные соединения добавляют в клеточные культуры в начале периода дифференцировки и/или резорбции, и определяют их влияние на дифференцировку и/или резорбционную активность остеокластов.
[00151] Секретированный ТрКФ-5Ь определяют в культуральной среде после периода дифференцировки с применением коммерчески доступного способа (BoneTRAPO, IDS Ltd, Болдон, Великобритания). Секретированный ТрКФ-5Ь точно отражает число остеокластов, образовавшихся в каждой лунке во время периода дифференцировки. СТХ определяют в культуральной среде после периода резорбции с применением коммерчески доступного способа (CrossLapsO для культур, IDS Ltd, Болдон, Великобритания). СТХ точно отражает количество продуктов разложения коллагена костной ткани, высвобождаемых в культуральную среду в каждой лунке на протяжении периода резорбции. Индекс резорбции, характеризующий среднее активности остеокластов (Rissanen et al. 2009) рассчитывается делением полученного объема резорбции (значение CrossLapsO) на число остеокластов (значение BoneTRAPO).
Культуры остеобластов [00152] Остеобласты представляют собой клетки, формирующие костную ткань, образующиеся из мезенхимальных стволовых клеток. Определены три отдельных периода в ходе развития остеобластов: 1) пролиферация клеток и секретирование внеклеточного матрикса (ВКМ); 2) созревание ВКМ; 3) минерализация ВКМ. Описана последовательная экспрессия маркеров фенотипа остеобластов на протяжении указанных периодов. Щелочная фосфатаза (ЩФ) связана с фенотипом костных клеток и активно экспрессируется во время созревания остеобласта. N-терминальный пропептид проколлагена типа I (PINP) представляет собой маркер синтеза коллагена I типа и синтеза ВКМ, и релевантный параметр для оценки новых кандидатных лекарственных веществ для лечения остеопороза в доклинических исследованиях (Rissanen et al. 2008). После начала минерализации в зрелом органическом матриксе накапливаются большие количества кальция и гидроксиапатита с образованием костеподобных узелков. Отслеживая указанные маркеры, можно исследовать все стадии дифференцировки и активности остеобластов в культуральной системе.
[00153] Для исследования остеобластов было создано несколько модельных систем. В ходе самой первой попытки выделяли клетки с фенотипом остеобластов свода черепа.
Однако указанными клетками представлена исключительно зрелая стадия развития остеобластов, так как только небольшая фракция клеток свода черепа содержит предшественники остеобластов (Bellows et al. 1989). Как вариант, можно стимулировать мезенхимальные клетки костного мозга или линии прогениторных клеток для дифференцировки в клетки-остеобласты. Клетки KS483, клонированные из свода черепа мыши, представляют собой эстроген-чувствительные предшественники остеобластов, способные дифференцировать в костеобразующие остеобласты и формировать минерализованные костные узелки in vitro (Dang et al. 2002).
[00154] Была создана культуральная система, подходящая для применения в качестве in vitro модели для изучения влияния анаболических и эстрогеноподобных соединений на дифференцировку и активность остеобластов. В данной культуральной системе клетки KS483 мыши сначала пролиферируют, а затем дифференцируют в остеобласты, способные формировать минерализованные костные узелки в присутствии аскорбиновой кислоты и В-глицерофосфата (Fagerlund et al. 2009). Одновременно с заменой среды в клеточные культуры добавляют тестируемые и эталонные соединения, и определяют их влияние на дифференцировку и активность остеобластов. Клеточную ЩФ, маркер дифференцировки остеобластов, определяют в клеточных лизатах согласно существующему описанию (Lowry et al. 1954). Секретированный PINP, маркер образования органического костного матрикса, определяют в культуральной среде с применением коммерчески доступного способа (ИФА на PINP мыши/крысы, IDS Ltd, Болдон, Великобритания). Отложение кальция, показатель образования неорганического костного матрикса, измеряют с применением коммерчески доступного кальциевого теста (Roche Diagnostics).
Методики проведения анализов
Анализ дифференцировки остеокластов [00155] В данном исследовании полученные из костного мозга человека CD34+ стволовые клетки (10 000 клеток/лунка) суспендировали в культуральной среде и позволяли прикрепиться к срезам бычьей кости в 96-луночных планшетах для тканевых культур. В культуральную среду (содержащую 10% ФБС, набор с клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) добавляли подходящие количества важных факторов роста, способствующих дифференцировке и активности остеокластов, в М-КСФ (33 нг/мл, набор с клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) и RANK-лиганд (66 нг/мл, набор с
клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) в 200 мкл среды. Клетки инкубировали в С02-инкубаторе в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа, при 37 °С на протяжении 7 дней. Тестируемые соединения и эталонное соединение ОПТ добавляли на день 0. Супернатанты, собранные на 7 день, хранили при -70°С до анализа ТрКФ-5Ь. ТрКФ-5Ь измеряли в культуральной среде (20 мкл/образец) с применением счетчика VICTOR2(tm) Multilabel Counter (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Клетки фиксировали 3% параформальдегидом и окрашивали на активность ТрКФ (набор для определения кислой фосфатазы лейкоцитов; Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и Hoechst 33258 (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).
[00156] Были включены следующие группы (каждая группа включает 8 повторностей): Планшет 1:
1) Фоновая группа, получавшая основу (ДМСО)
2) Контрольная группа, получавшая 5 нМ ОПТ
3) 0,004 мкМ Соединения 1
4) 0,012 мкМ Соединения 1
5) 0,037 мкМ Соединения 1
6) 0,11 мкМ Соединения 1
7) 0,33 мкМ Соединения 1
8) 1,0 мкМ Соединения 1
9) 3,0 мкМ Соединения 1
Анализ активности остеокластов [00157] В данном исследовании полученные из костного мозга человека CD34+ стволовые клетки (10 000 клеток/лунка) суспендировали в культуральной среде и позволяли прикрепиться к срезам бычьей кости в 96-луночных планшетах для тканевых культур. В культуральную среду (содержащую 10% ФБС, набор с клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) добавляли подходящие количества важных факторов роста, способствующих дифференцировке и активности остеокластов, в том числе М-КСФ (33 нг/мл, набор с клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) и RANK-лиганд (66 нг/мл, набор с клетками-предшественниками остеокластов BulletKit(r) Lonza, Уолкерсвилль, США) в 200 мкл среды. Клетки инкубировали в С02-инкубаторе в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа, при 37 °С.
После завершения дифференцировки остеокластов на 7 день культуральную среду полностью удаляли и добавляли в лунки новые 200 мкл культуральной среды, способствующей активности остеокластов.
[00158] Зрелые остеокласты культивировали на протяжении 3-х дополнительных дней, позволяя им резорбировать кость. Тестируемые соединения и эталонное соединение Е64 добавляли на 7 день, после завершения периода дифференцировки остеокластов. Супернатанты, собранные на 7 день и 10 день, хранили при -70°С до анализа ТрКФ-5Ь и СТХ. ТрКФ-5Ь измеряли в культуральной среде (20 мкл/образец), собранной на 7 день, а СТХ - в культуральной среде (50 мкл/образец), собранной на 10 день, с применением счетчика VICTOR2(tm) Multilabel Counter (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). [00159] Были включены следующие группы (каждая группа включает 8 повторностей): Планшет 1:
1) Фоновая группа, получавшая основу (ДМСО)
2) Контрольная группа, получавшая 1 _М Е64
3) 0,004 мкМ Соединения 1
4) 0,012 мкМ Соединения 1
5) 0,037 мкМ Соединения 1
6) 0,11 мкМ Соединения 1
7) 0,33 мкМ Соединения 1
8) 1,0 мкМ Соединения 1
9) 3,0 мкМ Соединения 1
Анализ дифференцировки остеобластов [00160] Клетки KS483 мыши культивировали в колбах Т-75 для тканевых культур в аМЕМ с добавлением 10% очищенной на активированном угле фетальной бычьей сыворотки до 80-90% конфлюэнтности. Указанные клетки инкубировали в С02-инкубаторе в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа, при 37 °С. После достижения 80-90% конфлюэнтности получали субкультуры. Клетки извлекали из колб с помощью обработки трипсином и подсчитывали. Для индукции созревания остеобластов и костеобразования незрелые клетки-остеобласты высевали в покрытые коллагеном I типа 96-луночные планшеты. Клетки культивировали на протяжении 8 дней с добавлением аскорбиновой кислоты (50 _г/мл), и каждые 3-4 дня заменяли половину среды. Тестируемое соединение и контрольное вещество (Е2) добавляли в начале периода культивирования и при замене среды. Рост культур
останавливали на 8 день, удаляя из лунок культуральную среду, и получали клеточные лизаты. Активность клеточной ЩФ и общее содержание белка (набор для определения белка, Bio-Rad Laboratories Inc, Калифорния, США) подсчитывали с применением счетчика VICTOR2(tm) Multilabel Counter (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). [00161] Были включены следующие группы (каждая группа включает 8 повторностей): Планшет 1:
1) Фоновая группа, получавшая основу (ДМСО)
2) Контрольная группа, получавшая 10 нМ Е2
3) 0,004 мкМ Соединения 1
4) 0,012 мкМ Соединения 1
5) 0,037 мкМ Соединения 1
6) 0,11 мкМ Соединения 1
7) 0,33 мкМ Соединения 1
8) 1,0 мкМ Соединения 1
9) 3,0 мкМ Соединения 1
Анализ активности остеобластов [00162] Клетки KS483 мыши культивировали в колбах Т-75 для тканевых культур в среде аМЕМ с добавлением 10% очищенной на активированном угле фетальной бычьей сыворотки до 80-90% конфлюэнтности. Указанные клетки инкубировали в С02-инкубаторе в увлажненной атмосфере, содержащей 95% воздуха и 5% углекислого газа, при 37 °С. После достижения 80-90% конфлюэнтности получали субкультуры. Клетки извлекали из колб с помощью обработки трипсином и подсчитывали. Для индукции созревания остеобластов и костеобразования незрелые клетки-остеобласты высевали в покрытые коллагеном I типа 96-луночные планшеты. Указанные клетки культивировали в течение 13 дней с добавлением аскорбиновой кислоты (50 мкг/мл) и В-глицерофосфата (5 ммоль), и каждые 3-4 дня заменяли половину среды. Тестируемое соединение и контрольное вещество (Е2) добавляли в начале периода культивирования и при замене среды. На 11 день в культуральной среде измеряли секретированный PINP в качестве маркера образования органического костного матрикса. Рост культур останавливали на 13 день, удаляя из лунок культуральную среду и добавляя соляную кислоту. Кальций, депонированный в сформировавшемся костном матриксе, количественно определяли с применением счетчика VICTOR2(tm) Multilabel Counter (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США).
[00163] Были включены следующие группы (каждая группа включает 8 повторностей): Планшет 1:
1) Фоновая группа, получавшая основу (ДМСО)
2) Контрольная группа, получавшая 10 нМ Е2
3) 0,004 мкМ Соединения 1
4) 0,012 мкМ Соединения 1
5) 0,037 мкМ Соединения 1
6) 0,11 мкМ Соединения 1
7) 0,33 мкМ Соединения 1
8) 1,0 мкМ Соединения 1
9) 3,0 мкМ Соединения 1
Статистический анализ
[00164] Все релевантные данные представлены в виде фигур и/или таблиц [среднее, стандартное отклонение (SD) и статистическая значимость] с единицами измерения. Статистический анализ выполняли с применением программного обеспечения для статистической обработки Origin (OriginLab Corporation, Нортгемптон, Массачусетс, США). Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) применяли для определения того, отличаются ли статистически (с р < 0,05) значения, полученные для разных групп (фоновая относительно групп с эталонным ингибитором и тестируемыми соединениями). Если однофакторный анализ ANOVA выявлял статистически значимые различия, для статистического сравнения между группами использовали t-критерий.
Результаты
[00165] Влияние Соединения 1 на дифференцировку остеокластов измеряли на 7 день в соответствии с Фиг. 1. Результаты представлены в виде активности ТрКФ-5Ь (ед/л), секретированного в культуральную среду. На указанной и других фигурах БУ означает базовый уровень (без добавления соединений); К означает Контроль (5,0 нМ 0111'). Результаты сравнивали с БУ с применением однофакторного анализа ANOVA (р < 0,001 между всеми группами). Три звездочки (***) указывают на статистически значимый ингибирующий эффект с р-значением, составляющим менее чем 0,001. Две звездочки (**) указывают на статистически значимый эффект с р-значением, составляющим менее чем 0,01. Одна звездочка (*) указывает на р-значение, составляющее менее чем 0,05.
Заключенные в круглые скобки звездочки на Фигуре ([***]) указывают на значимое отличие от базового уровня.
[00166] Результаты обобщены далее в Таблице 1. Как и на Фигурах, три звездочки ([***]) указывают на статистически значимый ингибирующий эффект с р-значением, составляющим менее чем 0,001. Как и на Фигурах, а также в данной таблице и в других таблицах, три звездочки (***) указывают на статистически значимый ингибирующий эффект с р-значением, составляющим менее чем 0,001; две звездочки (**) указывают на статистически значимый эффект с р-значением, составляющим менее чем 0,01; одна звездочка (*) указывает на р-значение, составляющее менее чем 0,05. Заключенные в круглые скобки звездочки на Фигуре ([***]) указывают на значимое отличие от базового уровня.
день.
[00167] Влияние Соединения 1 на резорбционную активность остеокластов человека представлена на Фиг. 2. Результаты представлены в виде значений СТХ/ТрКФ-5Ь. Значения СТХ определяли в конце периода резорбции, на 10 день, а значения ТрКФ - в начале периода резорбции, на 7 день. Результаты обобщены далее в Таблице 2.
[00168] Влияние Соединения 1 на дифференцировку остеобластов на 8 день представлен на Фиг. 3. Результаты представлены в виде клеточной активности ЩФ/мг белка. Указанные результаты обобщены ниже в Таблице 3.
Таблица 3.
[00169] Влияние Соединения 1 на костеобразующую активность остеобластов мыши показан на Фиг. 4. Результаты представлены как содержание PINP, секретированного в культуральную среду на 11 день. Указанные результаты обобщены далее в Таблице 4.
[00170] Влияние Соединения 1 на костеобразующую активность остеобластов мыши показан на Фиг. 5. Результаты представлены как отложение кальция на 13 день. Результаты представлены как содержание PINP, секретированного в культуральную среду
на 11 день. Указанные результаты обобщены далее в Таблице 4.
[00171] Таблица 5.
[00172] Анализ дифференцировки остеобластов. Отложение кальция на 13 день.
Соединение 1 Концентрация
(мкМ)
0,004
0,012
0,037
0,11
0,33
1,0
3,0
Процент активности (%) по сравнению с БУ
145(***)
167(***)
180(***)
144(*)
59([**])
12([***])
Заключение
[00173] Эталонные ингибиторы ОПТ и Е64 существенно подавляли дифференцировку и активность остеокластов, соответственно, а эталонный стимулятор 17Р-эстрадиол существенно стимулировал дифференцировку и активность остеобластов, что подтверждает успешность проведения анализов и достоверность полученных результатов.
Соединение 1 продемонстрировало дозозависимое подавление дифференцировки остеокластов, значимое при концентрациях 0,11; 0,33; 1,0 и 3,0 мкМ. Микроскопический анализ показал, что концентрации 0,11 и 0,33 мкМ Соединения 1 не влияли на количество Hoechst- и ТрКФ-положительных мононуклеарных клеток, что предположительно свидетельствует о специфическом подавлении дифференцировки остеокластов. Тем не менее, концентрации 1,0 и 3,0 мкМ снижали число как Hoechst-, так и ТрКФ-положительных мононуклеарных клеток, что предположительно свидетельствует о том, что ингибирующие эффекты, наблюдаемые для указанных концентраций, являются по меньшей мере отчасти цитотоксическими.
[00174] Соединение 1 не оказывало влияния на резорбционную активность остеокластов в протестированных концентрациях. Соединение 1 продемонстрировало дозозависимую стимуляцию дифференцировки остеобластов в концентрациях 0,012; 0,037; 0,11; 0,33 и 1,0 мкМ и ингибирующие эффекты в концентрации 3,0 мкМ. Соединение 1 продемонстрировало дозозависимую стимуляцию костеобразующей активности остеобластов в концентрациях 0,004; 0,012; 0,037 и 0,11 мкМ, и ингибирующие эффекты в концентрациях 0,33; 1,0 и 3,0 мкМ. Наконец, концентрации 0,004; 0,012; 0,037 и 0,11 мкМ Соединения 1 продемонстрировали благоприятное действие на клетки костной ткани, активируя костеобразование остеобластами и не оказывая влияния на образование резорбирующих кость остеокластов или не подавляя его.
Использованные источники
Alatalo SL, Halleen JM, Hentunen ТА, Monkkonen J, Vaananen HK (2000) Rapid screening method for osteoclast differentiation in vitro that measures tartrate-resistant acid phosphatase 5b activity secreted into the culture medium. Clin Chem 46:1751-1754.
Bagger YZ, Foged NT, Andersen L, Lou H, Qvist P (1999) CrossLaps for culture: An improved enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring bone resorption in vitro. J Bone Miner Res 14, Suppl. 1, S370.
Bellows CG, Aubin JE (1989) Determination of the number of osteoprogenitors in isolated fetal rat calvarial cells in vitro. Develop Biol 113:8-13.
Boyde A, AH NN, Jones SJ (1984) Resorption of dentine by isolated osteoclasts in vitro. Br Dent J 156:216-220.
Chambers TJ, Revell PA, Fuller K, Athanasou NA (1984) Resorption of bone by isolated rabbit osteoclasts. J Cell Sci 66:383-399.
Dang ZC, Van Bezooijen RL, Karperien M, Papapoulos SE, Lowik CWGM (2002) Exposure of KS483 cells to estrogen enhances osteogenesis and inhibits adipogenesis. J Bone Miner Res 17:394-405.
Fagerlund KM, Rissanen JP, Suutari T, Chan A, Halleen JM (2009) Validation of an in
vitro osteoblast culture model using estrogen responsive KS483 mouse osteoblast precursor cell
line. J Bone Miner Res 24 (Suppl 1). См.:
http://www. asbmr.org/Meetings/AnnualMeeting/AbstractDetail.aspx?aid=9815c5a5-00eb4952-blaa-838899f5el51. Дата последнего обращения - 1 октября 2009 г.
Lowry ОН, Roberts NR, Wu ML, Hixon WS, Crawford EJ (1954) The quantitative histochemistry of brain. II. Enzyme measurements. J Biol Chem 207:19-37.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z, Morko J, Rasi S, Risteli J, Halleen JM (2008) Short-term changes in serum PINP predict long-term changes in trabecular bone in the rat ovariectomy model. Calcif Tissue Int 82:155-161.
Rissanen JP, Ylipahkala H, Fagerlund KM, Long C, Vaananen HK, Halleen JM (2009) Improved methods for testing antiresorptive compounds in human osteoclast cultures. J Bone Miner Metab 27:105-109.
Пример 2
Краткосрочное влияние Соединения 1 на маркеры обновления костной ткани в
модели овариэктомии у крыс (ОВЭ) [00175] Цель данного исследования заключалась в исследовании краткосрочного влияния Соединения 1 на биохимические маркеры в сыворотке метаболизма костной ткани в исследовании по предотвращению постменопаузального остеопороза на модели овариэктомии у крыс (ОВЭ). 17Р-эстрадиол (Е2) использовали в качестве эталонного соединения. В данное исследование были включены следующие пять экспериментальных групп:
1) Ложнооперированные контрольные крысы, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
2) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
3) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие 17Р-эстрадиол (4 мкг/кг/день
и/к)
4) Крысы после ОВЭ, получающие тестируемое соединение - Соединение 1(1 мг/кг/день перорально)
4)
5) Крысы после ОВЭ, получающие тестируемое соединение - Соединение 1 (3 мг/кг/день перорально)
[00176] Каждая группа включала восемь самок крыс (Спрег-Доули) возрастом 3 месяца в начале прижизненной фазы исследования. До начала прижизненной фазы животных взвешивали, брали у них образцы крови и рандомизировали в группы исследования путем стратификации в соответствии с массой тела и уровнями N-терминального пропептида проколлагена I типа (PINP) в сыворотке. В начале прижизненной фазы животных взвешивали и оперировали. Лечение начинали через день после операций и продолжали проводить один раз в сутки на протяжении двух недель. В качестве основы в группах 1 и 2 использовали стерильную воду. После одной недели лечения определяли массу тела и соответственно корректировали дозы для лечения. После двух недель лечения животных взвешивали и брали у них образцы крови; животных умерщвляли и определяли удельную массу матки. Для анализа краткосрочных эффектов лечения в образцах сыворотки, собранных до начала и в конце прижизненной фазы, определяли уровни четырех биомаркеров метаболизма костной ткани. Указанные биомаркеры включали PINP в качестве маркера костеобразования, N-терминальный MID-фрагмент остеокальцина (ОК) в качестве общего маркера обновления костной ткани, С-терминальные перекрестно-связанные телопептиды коллагена I типа (СТХ) в качестве маркера резорбции кости, и изоформу устойчивой к тартрату кислой фосфатазы 5Ь (ТрКФ-5Ь) в качестве маркера количества остеокластов. Уровни в сыворотке на -7 день использовали в качестве базовых уровней, а уровни в сыворотке на 14 день в качестве уровней, подвергающихся воздействию операций и лечения.
[00177] Через две недели после операции хирургической овариэктомии у самок крыс повышалась масса тела, снижалась удельная масса матки, повышались уровни СТХ, ОК и PINP в сыворотке и снижалась активность ТрКФ-5Ь в сыворотке. Результаты анализов на биомаркеры метаболизма костной ткани указывают на то, что при овариэктомии усиливалась резорбция кости, ускорялись обновление костной ткани и костеобразование, и снижалось общее число остеокластов. Указанные заключения означают, что хирургическая овариэктомия увеличивала скорость обновления костной ткани у самок крыс.
[00178] Краткосрочное влияние 17Р-эстрадиола исследовали путем сравнения животных после ОВЭ, получавших лечение 17Р-эстрадиолом подкожно в дозе 4 мкг/кг/день, с животными после ОВЭ, получавшими лечение основой. Лечение 170
эстрадиолом оказывало следующие эффекты на массу тела, удельную массу матки и биомаркеры метаболизма костной ткани у крыс после ОВЭ:
• Лечение 17Р-эстрадиолом предотвращало индуцированное ОВЭ увеличение массы тела и индуцированное ОВЭ снижение удельной массы матки.
• Лечение 17Р-эстрадиолом предотвращало индуцированное ОВЭ повышение уровней СТХ, ОК и PINP в сыворотке.
• Лечение 17Р-эстрадиолом не влияло на индуцированное ОВЭ снижение активности ТрКФ-5Ь в сыворотке.
[00179] Результаты анализов на биомаркеры метаболизма костной ткани указывают на то, что лечение 17Р-эстрадиолом подкожно в дозе 4 мкг/кг/день предотвращало индуцированное ОВЭ усиление резорбции кости и индуцированное ОВЭ ускорение обновления костной ткани и костеобразования, но не влияло на индуцированное ОВЭ снижение общего числа остеокластов у крыс после ОВЭ после двух недель лечения. Указанные заключения означают, что лечение 17Р-эстрадиолом подкожно в дозе 4 мкг/кг/день предотвращало индуцированное ОВЭ повышение скорости обновления костной ткани у самок крыс.
[00180] Краткосрочное влияние Соединения 1 исследовали путем сравнения животных после ОВЭ, получавших лечение Соединением 1 перорально в дозах 1 и 3 мг/кг/день, с животными после ОВЭ, получавшими лечение основой. Лечение Соединением 1 оказывает следующие эффекты на массу тела, удельную массу матки и биомаркеры метаболизма костной ткани у крыс после ОВЭ:
• Лечение Соединением 1 перорально в дозе 1 мг/кг/день частично предотвращало индуцированное ОВЭ увеличение массы тела.
• Лечение Соединением 1 перорально в дозах 1 и 3 мг/кг/день не влияло на индуцированное ОВЭ снижение удельной массы матки.
• Лечение Соединением 1 перорально в дозе 3 мг/кг/день усиливало индуцированное ОВЭ повышение уровней PINP в сыворотке и индуцированное ОВЭ снижение активности ТрКФ-5Ь в сыворотке.
• Лечение Соединением 1 перорально в дозах 1 и 3 мг/кг/день не влияло на индуцированное ОВЭ повышение уровней СТХ и ОК в сыворотке.
[00181] Результаты анализов на биомаркеры метаболизма костной ткани указывают на то, что лечение Соединением 1 перорально в дозе 3 мг/кг/день усиливало индуцированное ОВЭ увеличение костеобразования и индуцированное ОВЭ снижение общего числа
остеокластов, но не влияло на индуцированное ОВЭ усиление резорбции кости и обновления костной ткани у крыс после ОВЭ после двух недель лечения. Усиленное костеобразование в сочетании с уменьшением общего числа остеокластов и неизменившимися уровнями резорбции кости означают, что лечение Соединением 1 перорально в дозе 3 мг/кг/день сдвигало стимулированное ОВЭ обновление костной ткани в направлении костеобразования у самок крыс.
Описание
[00182] Остеопороз у человека представляет собой системное заболевание скелета, характеризующееся низкой костной массой и повреждением микроархитектуры кости, что приводит к хрупкости костей и повышению риска переломов (Raisz et al. 2008). Хронический характер остеопороза делает его все более дорогостоящим для общества. Поскольку прогнозируется увеличение ожидаемой продолжительности жизни, также ожидается и повышение частоты остеопороза, создавая дополнительную нагрузку на систему здравоохранения. Хотя эффективные терапевтические методы для лечения остеопороза уже существуют, имеется потребность в новых методах терапии с улучшенным терапевтическим окном, т. е. с лучшим коэффициентом эффективности / безопасности. Доклинические исследования эффективности на моделях остеопороза у животных обеспечивают получение из первоисточника информации об эффектах новых потенциальных терапевтических методов до начала их клинических испытаний, (Rissanen and Halleen 2010). Регулирующие применение лекарственных средств органы одобрили использование крыс после гонадэктомии, страдающих от остеопении, в качестве прогностической модели на мелких животных для тестирования доклинической эффективности новых потенциальных терапевтических методов лечения остеопороза. [00183] Цель данного исследования заключалась в исследовании краткосрочных эффектов Соединения 1 на биохимические маркеры в сыворотке метаболизма костной ткани в исследовании по предотвращению постменопаузального остеопороза на модели овариэктомии у крыс (ОВЭ). 17Р-эстрадиол (Е2) использовали в качестве эталонного соединения (Lindsay and Cosman 2008). В данное исследование были включены следующие пять экспериментальных групп:
1) Ложнооперированные контрольные крысы, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
2) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
1)
3) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие 17Р-эстрадиол (4 мкг/кг/день
и/к)
4) Крысы после ОВЭ, получающие Соединение 1(1 мг/кг/день перорально)
5) Крысы после ОВЭ, получающие Соединение 1 (3 мг/кг/день перорально)
[00184] Каждая группа включала восемь самок крыс (Спрег-Доули) возрастом 3 месяца в начале прижизненной фазы исследования. Дизайн экспериментов для данного исследования представлен на Фиг. 1. Животных рандомизировали в группы исследования путем стратификации в соответствии с их массой тела и уровнями в сыворотке N-терминального пропептида проколлагена I типа (PINP), измеренными за одну неделю до начала прижизненной фазы (на -7 день). В начале прижизненной фазы (на день 0) животных взвешивали; животным в группах 2-5 проводили овариэктомию; животным в группе 1 проводили ложные операции. Лечение начинали через день после операций и продолжали один раз в сутки на протяжении двух недель (вплоть до дня 13). В качестве основы в группах 1 и 2 применяли стерильную воду. Массу тела определяли в начале прижизненной фазы (на день 0), через 1 неделю после начала прижизненной фазы (на 7 день), и в конце прижизненной фазы (на 14 день). Дозы для лечения корректировали в соответствии с результатами последнего измерения массы тела. После двух недель лечения (на 14 день), животных взвешивали, брали у них образцы крови, животных умерщвляли и определяли удельную массу матки. Для анализа краткосрочных эффектов лечения измеряли уровни четырех биомаркеров метаболизма костной ткани в образцах сыворотки, собранных до начала прижизненной фазы (на -7 день) и в конце прижизненной фазы (на 14 день). Указанные биохимические маркеры в сыворотке включали PINP, N-терминальный MID-фрагмент остеокальцина (ОК), С-терминальные перекрестно-связанные телопептиды коллагена I типа (СТХ) и изоформу 5Ь устойчивой к тартрату кислой фосфатазы (ТрКФ-5Ь). Уровни в сыворотке, полученные на -7 день, использовали в качестве базовых уровней, а уровни в сыворотке, полученные на 14 день - в качестве уровней, подвергающихся влиянию хирургических операций и лечения.
Материалы и оборудование Соединение 1
[00185] Твердое Соединение 1 хранили при комнатной температуре в сухой среде в течение всего исследования. Свежие дозы суспензии Соединения 1 готовили ежедневно. Суточные аликвоты твердого соединения готовили в стерильной воде (Baxter, Дирфилд,
Иллинойс, США), включающей небольшое количество хлороводорода (НС1; Merck KGaA, Дармштадт, Германия), следующим образом.
[00186] Для экспериментальной группы 4. 4,5-5,8 мг Соединения 1 диспергировали в 22,5-29,0 мл стерильной воды с получением суспензии для дозирования, содержащей 0,2 мг/мл Соединения 1. Характеристики состава улучшали путем добавления в суспензию для дозирования 7,5-9,7 мкл Ш НС1.
[00187] Для экспериментальной группы 5. 10,4-17,4 мг Соединения 1 диспергировали в 17,333-29,0 мл стерильной воды с получением суспензии для дозирования, содержащей 0,6 мг/мл Соединения 1. Характеристики состава улучшали путем добавления в суспензию для дозирования 17,3-29,0 мкл 1Н НС1. [00188] Каждую суточную аликвоту твердого соединения смешивали со стерильной водой путем непродолжительного перемешивания на вортексе. Диспергированию соединения способствовала обработка ультразвуком на водяной бане (ультразвуковая мойка FinnSonic Ultrasonic Cleaner, модель m03; FinnSonic, Лахти, Финляндия) в течение минуты с последующим перемешиванием на вортексе в течение пяти секунд. Указанную процедуру обработки ультразвуком и перемешивания на вортексе повторяли до 3-5 раз. Характеристики состава улучшали путем добавления в каждую из суспензий для дозирования небольшого количества Ш НС1. Диспергированию указанного соединения способствовало последующее повторение 1-2 раза процедуры обработки ультразвуком и перемешивания на вортексе.
[00189] Однородные тонкодисперсные суспензии для дозирования применяли для лечения животных в экспериментальных группах 4 и 5 в течение 1 часа после приготовления соединения. Лечение животных начинали через день после проведения им операций хирургической ОВЭ (на день 1) и продолжали один раз в сутки на протяжении двух недель (вплоть до дня 13).
[00190] Суспензии для дозирования вводили перорально в объеме 5 мл/кг, что обеспечивало пероральную дозу Соединения 1, составляющую 1 мг/кг/день в экспериментальной группе 4 и пероральную дозу Соединения 1, составляющую 3 мг/кг/день в экспериментальной группе 5. Во время введения суспензии для дозирования многократно перемешивали, чтобы обеспечить лечение животных максимально гомогенными суспензиями для дозирования. Остаток суточных суспензий для дозирования утилизировали должным образом после каждого дня введения, а остаток исходного твердого Соединения 1 - после прижизненной фазы. [00191]
Эталонное соединение, 17р-эстрадиол [00192] В данном исследовании в качестве эталонного соединения использовали 170-эстрадиол (Е2; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). С эталонным соединением обращались в соответствии с подробными инструкциями, предоставленными поставщиком. Базовый раствор 17Р-эстрадиола получали в бензилбензоате (Sigma-Aldrich) в стеклянном флаконе, обеспечивая
[00193] Полное растворение 17р-Эстрадиола следующим образом:
[00194] Для экспериментальной группы 3. 1,6 мг 17Р-эстрадиола растворяли в 80,0 мл бензилбензоата с получением базового раствора, содержащего 20 мкг/мл 170-эстрадиола. Указанный базовый раствор хранили в стеклянном сосуде при +4°С в темноте до каждого ежедневного использования на протяжении двух недель. Из базового раствора ежедневно следующим образом готовили свежий раствор для дозирования: [00195] Для экспериментальной группы 3. 1 мл базового раствора разводили в 4 мл касторового масла (рициновое масло; партия №319108624; кат.№ 4702.1; Carl Roth, Карлсруэ, Германия), тщательно перемешивали и хранили в темноте. Свежий раствор для дозирования содержал 4 мкг/мл 17Р-эстрадиола; в состав основы входили 20% бензилбензоата и 80% касторового масла. Указанный раствор применяли для лечения животных экспериментальной группы 3. Их лечение начинали через день после проведения хирургической ОВЭ-операции (на день 1) и продолжали один раз в сутки на протяжении двух недель (вплоть до дня 13). Раствор для дозирования вводили подкожно в объеме 1 мл/кг, что обеспечивало подкожную дозу 17Р-эстрадиола 4 мкг/кг/день. Остаток суточного раствора для дозирования утилизировали должным образом после каждого ежесуточного введения, а остаток базового раствора - после прижизненной фазы.
Основа
[00196] В данное исследование были включены две группы, получавшие основу для тестируемого соединения, а именно, экспериментальные группы 1 и 2. Раствор основы представлял собой стерильную воду и хранился при +4°С до каждого ежедневного использования на протяжении двух недель. Лечение животных в группах 1 и 2 начинали через день после хирургических операций (на день 1) и продолжали один раз в сутки на протяжении двух недель (вплоть до дня 13). Раствор основы вводили перорально в объеме 5 мл/кг, что обеспечивало пероральную дозу основы 5 мл/кг/день. Оставшуюся часть основы утилизировали должным образом после прижизненной фазы.
Описание применяемых способов
[00197] Биохимические маркеры метаболизма костной ткани являются подходящими инструментами для мониторинга терапии остеопороза и прогнозирования риска переломов и изменений минеральной плотности костной ткани в долгосрочной перспективе (Cremers et al. 2008). В данном исследовании образцы сыворотки применяли для измерения уровней четырех биохимических маркеров метаболизма костной ткани (Rissanen et al. 2008а, Rissanen et al. 2008b); а именно, PINP, используемого в качестве маркера костеобразования (ИФА на PINP мыши/крысы; Immunodiagnostic Systems Ltd, Болдон, Великобритания), ОК, используемого в качестве общего маркера обновления костной ткани (ИФА на остеокальцин Rat-МШ; Immunodiagnostic Systems Ltd), СТХ, используемого в качестве маркера резорбции кости (ИФА RatLaps [CTX-I]; Immunodiagnostic Systems Ltd), и ТрКФ-5Ь, используемого в качестве маркера числа остеокластов (ИФА-ELISA RatTRAP [ТрКФ-5Ь]; Immunodiagnostic Systems Ltd). OK применяли в качестве общего маркера обновления костной ткани, поскольку он секретируется в кровоток как во время костеобразования, так и во время резорбции кости (Cremers et al. 2008). Уровни в сыворотке указанных четырех биохимических маркеров определяли в образцах, собранных до начала прижизненной фазы данного исследования (на 7 день) и в конце прижизненной фазы (на 14 день). Уровни, полученные на 7 день, использовали в качестве базовых уровней; уровни, полученные на 14 день - в качестве уровней, подвергавшихся влиянию хирургических операций и лечения. Анализы проводили в соответствии с инструкциями, предоставленными поставщиком; результаты количественно определяли с применением счетчика VICTOR2(tm) Multilabel Counter (PerkinElmer, Уолтем, Массачусетс, США). Кровь для образцов сыворотки брали из латеральной хвостовой вены после голодания в течение ночи, чтобы избежать суточных колебаний. Уровни PINP и ТрКФ-5Ь измеряли в образцах сыворотки, разбавленных в соотношении 1:5 и 1:4, соответственно; уровни ОК и СТХ определяли в сыворотке без какого-либо разбавления образцов. Измерения для образцов, давшие результаты ниже или выше пределов обнаружения для указанных анализов, должны были быть повторены, но в данном исследовании такие результаты получены не были. Измерения для образцов со значениями, существенно отличающимися от значения среднего для экспериментальной группы, к которой они принадлежат, также должны были быть повторены, включая значения за пределами 2,5 стандартных отклонений (SD) для данной группы. Однако значения такого рода в данном исследовании получены не были.
Методика проведения
Исследования прижизненной фазы [00198] Прижизненная фаза включала содержание животных и уход за животными, проведение хирургической овариэктомии (ОВЭ) и ложных операций (ЛО), дозирование, определение массы тела и удельной массы матки, умерщвление и сбор образцов крови. Хирургическую овариэктомию (ОВЭ) и ложные операции проводили под анестезией и с обезболиванием с применением дорсального доступа (Peng et al. 1994, Wronski et al. 1986). При операции ОВЭ удаляли яичники вместе с фаллопиевыми трубами и небольшой частью матки. Анестезию осуществляли путем инъекций медетомидина (0,6 мг/кг п/к; СР-Pharma Handelsgesellschaft, Бургдорф, Германия), кетамина (30 мг/кг п/к; Ketaminol; Intervetn International, Боксмеер, Нидерланды) и атипамезола (2 мг/кг п/к; Reverter; СР-Pharma Handelsgesellschaft). Послеоперационное обезболивание проводили с применением бупренорфина (25-37,5 мкг/кг п/к; Temgesic; Schering-Plough, Кенилворт, Нью-Джерси, США), который вводили перед хирургическими операциями и на следующее утро. Карпрофен (5 мг/кг п/к) должен был при необходимости использоваться в качестве обезболивающего средства во время исследования, но такой необходимости не возникло. В конце прижизненной фазы (на 14 день), животных умерщвляли асфиксацией с применением смеси СО2-О2 под анестезией с последующим смещением шейных позвонков. В данное исследование были включены следующие пять экспериментальных групп:
1) Ложнооперированные контрольные крысы, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
2) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие основу (5 мл/кг/день перорально)
3) Контрольные крысы после ОВЭ, получающие 17Р-эстрадиол (4 мкг/кг/день
п/к)
4) Крысы после ОВЭ, получающие тестируемое соединение кабозантиниб (1 мг/кг/день перорально)
5) Крысы после ОВЭ, получающие тестируемое соединение кабозантиниб (3 мг/кг/день перорально)
[00199] Каждая группа включала восемь самок крыс линии Спрег-Доули возрастом 3 месяца в начале прижизненной фазы. Дизайн эксперимента для данного исследования представлен на Фиг. 1. Мониторинг состояния здоровья животных проводили дважды в
день в будние дни и один раз в сутки в выходные дни на протяжении всей прижизненной фазы. Животным позволяли акклиматизироваться к условиям вивария в течение одиннадцати дней до начала прижизненной фазы. Животных взвешивали и брали у них образцы крови из латеральной хвостовой вены за неделю до начала прижизненной фазы (на -7 день). Животных рандомизировали в группы исследования путем стратификации в соответствии с их массой тела и уровнями PINP в сыворотке.
[00200] Животные с плохим состоянием здоровья не подлежали включению в группы, однако таких животных в данном исследовании не наблюдалось. Животных идентифицировали по меткам на хвосте; в каждой клетке размещали по двое животных из одной экспериментальной группы в условиях контролируемых температуры и освещенности, с неограниченным доступом к питьевой воде и стандартному корму для крыс (Teklad Global Diet 2016; Harlan Laboratories, Мэдисон, Висконсин, США). В начале прижизненной фазы (на день 0), животных взвешивали; животным в группах 2-5 проводили овариэктомию; животным в группе 1 проводили ложные операции. Указанные хирургические операции проводили под анестезией и с обезболиванием. Лечение начинали через день после операций и продолжали один раз в сутки на протяжении двух недель (вплоть до дня 13). В качестве основы в группах 1 и 2 использовали стерильную воду. Массу тела определяли в начале прижизненной фазы (на день 0), через 1 неделю после начала прижизненной фазы (на 7 день) и в конце прижизненной фазы (на 14 день). Дозы для лечения корректировали в соответствии с результатами последнего измерения массы тела. Через две недели лечения (на 14 день), животных взвешивали и брали у них образцы крови; животных умерщвляли и определяли удельную массу матки.
Сбор и обработка образцов для исследования [00201] Образцы для исследования собирали, обрабатывали и хранили согласно приведенному ниже описанию. Все условия, которые могли бы нарушить сохранность образцов и/или сохранность исходных данных, полученных с применением указанных образцов, отслеживались на протяжении всего исследования. Все образцы были помечены; метка содержала по меньшей мере следующую информацию: номер исследования, номер группы лечения, номер животного и наименование образца.
Образцы крови
[00202] Кровь объемом 0,6 мл собирали для образцов сыворотки до начала прижизненной фазы данного исследования (на -7 день) и в конце прижизненной фазы (на
14 день). Кровь брали из латеральной хвостовой вены после голодания в течение ночи; во время взятия крови и обработки сыворотки избегали гемолиза. Кровь собирали в пробирки для сыворотки с гелем, содержащие силикат алюминия в качестве активатора свертывания (Multivette 600; Sarstedt Ag & Со, Нюмбрехт, Германия). После взятия каждого образца пробирку аккуратно встряхивали и крови позволяли свернуться в течение 30-60 минут. После свертывания образец центрифугировали при 2500 g в течение 10 минут. Полученную сыворотку отделяли и переносили в чистую пробирку. Из каждого образца получали аликвоты объемом 30, 50, 50 и 60 мкл для использования при измерении уровней в сыворотке PINP, ОК, СТХ и ТрКФ-5Ь, соответственно. Указанные аликвоты и оставшуюся сыворотку замораживали и хранили при -70°С.
Экспериментальные анализы
[00203] Дизайн эксперимента для данного исследования представлен на Фиг. 6. Проведенные в данном исследовании экспериментальные анализы костной ткани включали измерения уровней биомаркеров метаболизма костной ткани в сыворотке. Указанные анализы выполняли в Pharmatest.
Анализы костной ткани [00204] Анализы костной ткани, проведенные в данном исследовании, включали отслеживание уровней биомаркеров метаболизма костной ткани в сыворотке. Указанные биохимические маркеры метаболизма костной ткани включали PINP, используемый в качестве маркера костеобразования, ОК, используемый в качестве общего маркера обновления костной ткани, СТХ, используемый в качестве маркера резорбции кости, и ТрКФ-5Ь, используемый в качестве маркера числа остеокластов. Их уровни определяли в образцах сыворотки, собранной до начала прижизненной фазы данного исследования (на -
7 день) и в конце прижизненной фазы (на 14 день). Уровни, полученные на -7 день, использовали в качестве базовых уровней, а уровни, полученные на 14 день - в качестве уровней, подвергающихся влиянию хирургических операций и лечения. Исследование материала, оставшегося после экспериментальных анализов. Все материалы исследования, оставшиеся после экспериментальных анализов, доступны для дополнительных анализов и/или могут быть доставлены Заказчику по запросу для проведения дальнейших анализов.
8 указанные материалы были включены остатки образцов сыворотки, собранных в течение исследования и хранящихся при -70°С.
Статистический анализ
[00205] Все релевантные данные представлены в виде фигур, в таблице (среднее, SD и статистическая значимость) и в приложении (индивидуальные данные) с единицами измерения. Значения внутри группы, лежащие за пределами интервала, равного двум стандартным отклонениям от значения среднего для данной группы, и обусловленные процедурными причинами, должны рассматриваться как выпадающие показатели и не должны учитываться при анализе. В данном исследовании такие значения получены не были.
[00206] Статистический анализ выполняли с применением программного обеспечения для статистической обработки SPSS для Windows, версия 19 (SPSS; Чикаго, Иллинойс, США) с использованием двусторонних критериев. Р-значение ниже 0,05 считали статистически значимым. Решение о применении преобразований и непараметрических тестов принимали после изучения предположений о статистических моделях, а именно, нормальности распределения данных согласно критерию Шапиро-Уилка и однородности дисперсии по тесту Левена. В случае невыполнения указанных предположений применяли либо логарифмическое, либо другое подходящее преобразование (т.е. преобразование квадратного корня и обратное преобразование). Если предположения о статистических моделях выполнялись без дополнительных преобразований или после преобразования, различия между группами оценивали с применением параметрического однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Если однофакторный анализ ANOVA выявлял статистически значимые различия, для статистического сравнения между группами применяли критерий Дуннетта. Если предположения о статистических моделях не выполнялись даже после преобразования, для оценки различий между группами применяли непараметрический тест по методу Крускала-Уоллиса. Если тест по Крускалу-Уоллису выявлял статистически значимые различия, для статистического сравнения между группами применяли U-критерий Манна-Уитни.
Мониторинговые измерения [00207] Мониторинговые измерения, проведенные в данном исследовании, включали определение массы тела и измерения уровней биомаркеров метаболизма костной ткани в сыворотке. Статистический анализ полученных для них данных проводили на основе относительных изменений у каждого животного. Для расчета относительного изменения в течение первой недели прижизненной фазы исследования значение, полученное через 1 неделю после начала прижизненной фазы (на 7 день) делили на значение, полученное в
начале прижизненной фазы (на день 0). Для расчета относительного изменения в течение прижизненной фазы значение, полученное в конце прижизненной фазы (на 14 день) делили на значение, полученное в начале прижизненной фазы (на день 0) или до начала прижизненной фазы (на -7 день).
Конечные измерения
[00208] Конечные измерения, осуществляемые в данном исследовании, включали определение удельной массы матки, определение массы тела и измерения уровней PINP в сыворотке, используемые для рандомизации животных в группы исследования. Статистический анализ полученных данных проводили с использованием значений, полученных в конце прижизненной фазы данного исследования (на 14 день) и за одну неделю до начала прижизненной фазы (на -7 день), как таковых.
Сравнения между группами [00209] Выполняли следующие статистические сравнения между группами:
• Краткосрочное влияние овариэктомии исследовали путем сравнения контрольных животных после ОВЭ, получавших лечение основой (группа 2), с ложнооперированными контрольными животными, получавшими лечение основой (группа 1).
• Краткосрочное влияние лечения исследовали путем сравнения животных после ОВЭ, получавших лечение тестируемыми и эталонными соединениями (группы 3-5), с контрольными животными после ОВЭ, получавшими лечение основой (группа 2).
Результаты
[00210] В данном исследовании самкам крыс линии Спрег-Доули проводили овариэктомию и ложные операции в возрасте трех месяцев. Лечение начинали через день после указанных хирургических операций, и эффекты лечения отслеживали на протяжении двух недель (прижизненная фаза). Соединение I (1-3 мг/кг/день перорально) применяли в качестве тестируемого соединения, 17Р-эстрадиол (Е2; 4 мкг/кг/день п/к) - в качестве эталонного соединения, и стерильную воду - в качестве основы (5 мл/кг/день перорально). Эффекты овариэктомии исследовали путем сравнения контрольных животных после ОВЭ, получавших лечение основой (группа 2), с ложнооперированными контрольными животными, получавшими лечение основой (группа 1). Эффекты Е2
исследовали путем сравнения контрольных животных после ОВЭ, получавших лечение Е2 (группа 3), с контрольными животными после ОВЭ, получавшими лечение основой (группа 2). Эффекты лечения Соединением 1 исследовали путем сравнения животных после ОВЭ, получавших лечение кабозантинибом (группы 4-5), с контрольными животными после ОВЭ, получавшими лечение основой (группа 2).
[00211] В Таблицах 5а и 5Ь обобщены указанные результаты. Стрелка, указывающая вверх (|), означает статистически значимое увеличение; стрелка, указывающая вниз ([) -статистически значимое уменьшение. Одна звездочка (*) указывает на статистическую значимость с р-значением < 0,05, две звездочки (**) - с р-значением < 0,01, и три звездочки (***) - с р-значением < 0,001. НЗ = Незначимый.
[00212] Согласно Таблице 5Ь, результаты показывают, что через две недели после проведения хирургической овариэктомии у самок крыс повышается масса тела, снижается удельная масса матки, повышаются уровни СТХ, ОК и PINP в сыворотке и снижается активность ТрКФ-5Ь в сыворотке.
Таблица 5а.
Краткосрочное влияние Соединения 1 на массу тела в модели ОВЭ на крысах
ткани в модели ОВЭ на крысах
СПОСОБ/ПАРАМЕТР
ОВЭ
мкг/кг/день подкожно
кабозантиниб
(мг/кг/день перорально)
БИОХИМИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ ТКАНИ
Уровни PINP в сыворотке, изменение На протяжении прижизненной фазы
Уровни ОК в сыворотке, изменение На протяжении прижизненной фазы
|* 1*** нз нз
Уровни СТХв сыворотке, изменение На протяжении прижизненной фазы
Активность ТрКФ-5Ь в сыворотке, изменение на протяжении
1*** НЗ
прижизненной фазы
[00213] Результаты для биомаркеров указывают на то, что хирургическая овариэктомия усиливала резорбцию кости, стимулировала обновление костной ткани и костеобразование, и снижала общее число остеокластов. Указанные заключения означают, что овариэктомия повышала скорость обновления костной ткани у самок крыс. Результаты, описывающие краткосрочные эффекты овариэктомии, согласуются с результатами из опубликованных источников, показывая, что настоящее исследование можно использовать для оценки доклинической эффективности терапии у крыс после ОВЭ (Rissanen et al. 2008а, Rissanen et al. 2008b).
[00214] Как было отмечено, результаты анализов на биомаркеры метаболизма костной ткани указывают на то, что лечение Соединением 1 перорально в дозе 3 мг/кг/день усиливало индуцированное ОВЭ увеличение костеобразования и индуцированное ОВЭ снижение общего числа остеокластов, но не влияло на индуцированное ОВЭ повышение резорбции кости и обновление костной ткани у крыс после ОВЭ через две недели лечения. Усиленное костеобразование в сочетании со снижением общего числа остеокластов и неизменившимися уровнями резорбции кости означают, что лечение Соединением 1 перорально в дозе 3 мг/кг/день сдвигало стимулированное ОВЭ обновление костной ткани в направлении костеобразования у самок крыс.
Использованные источники
Lindsay R and Cosman F (2008) The pharmacology of estrogens in osteoporosis. B: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1769-75.
Raisz LG, Bilezikian JP and Martin TJ (2008) Pathophysiology of osteoporosis. B: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1635-47.
Rissanen JP and Halleen JM (2010) Models and screening assays for drug discovery in osteoporosis. Expert Opin Drug Discov. 5: 1163-74.
Cremers S, Garnero P and Seibel MJ (2008) Biochemical markers of bone metabolism. B: Bilezikian JP, Raisz LG and Martin TJ (eds.) Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, USA, pp. 1857-81.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z and Halleen JM (2008a) Secreted tartrate-resistant acid phosphatase 5b is a marker of osteoclast number in human osteoclast cultures and the rat
ovariectomy model. Calcif Tissue Int. 82: 108-15.
Rissanen JP, Suominen MI, Peng Z, Morko J, Rasi S, Risteli J and Halleen JM (2008b) Short-term changes in serum PINP predict long-term changes in trabecular bone in the rat ovariectomy model. Calcif Tissue Int. 82: 155-61.
Peng Z, Tuukkanen J, Zhang H, Jamsa T and Vaananen HK (1994) The mechanical strength of bone in different rat models of experimental osteoporosis. Bone. 15: 523-32.
Wronski TJ, Walsh CC and Ignaszewski LA (1986) Histologic evidence for osteopenia and increased bone turnover in ovariectomized rats. Bone. 7: 119-23.
Другие варианты реализации [00215] Вышеприведенное изобретение было довольно подробно описано посредством иллюстраций и примеров для обеспечения ясности и понимания. Изобретение было описано со ссылками на различные конкретные и предпочтительные варианты реализации и методики. Тем не менее, следует понимать, что многие варианты и модификации могут быть осуществлены без выхода за рамки сущности и объема изобретения. Для специалиста в данной области техники будет очевидно, что указанные изменения и модификации могут быть осуществлены в рамках прилагаемой формулы изобретения. Соответственно, следует понимать, что приведенное выше описание предназначено для иллюстративных целей, а не для ограничения.
[00216] Объем настоящего изобретения должен, таким образом, определяться не на основании вышеприведенного описания, а на основании прилагаемой ниже формулы изобретения, вместе с полным объемом эквивалентов, в отношении которых правомочна указанная формула.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ лечения остеопороза, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту соединения формулы I:
Формула I
или его фармацевтически приемлемой соли, где: R1 представляет собой галоген; R представляет собой галоген; R представляет собой (СгСб)алкил; R4 представляет собой (СгСб)алкил; и Q представляет собой СН или N.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанное соединение формулы I представляет собой соединение формулы 1а
Формула 1а
или его фармацевтически приемлемую соль, где: R1 представляет собой галоген; R представляет собой галоген; и Q представляет собой СН или N.
3. Способ по пп. 1-2, отличающийся тем, что указанное соединение формулы I представляет собой Соединение 1:
Соединение 1
или его фармацевтически приемлемую соль.
4. Соединение по п. 3, которое представляет собой N-(4-{[6,7-бис(метилокси)хинолин-4-ил] окси} фенил)-гЧ'-(4-фторфенил)циклопропан-1,1-дикарбоксамид.
5. Способ по пп. 1-4, отличающийся тем, что указанное соединение формулы (I), формулы 1(a) и Соединение I представляет собой соль (L)- или (Б)-малат.
6. Способ по пп. 1-5, отличающийся тем, что указанное соединение формулы (I) находится в кристаллической форме N-1 (Ь)-малатной соли и/или (О)-малатной соли.
7. Способ по пп. 1-6, отличающийся тем, что указанное соединение формулы I, 1(a) или Соединение 1, или их фармацевтически приемлемую соль, вводят в виде фармацевтической композиции, дополнительно содержащей фармацевтически приемлемый(ое) носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
8. Способ лечения остеопороза у пациентов с раковым заболеванием или на текущий момент проходящих лечение от ракового заболевания, включающий введение фармацевтической композиции, содержащей Соединение формулы I, или малатную соль Соединения формулы I, или другую фармацевтически приемлемую соль Соединения формулы I.
9. Способ уменьшения аномального отложения бесструктурной костной ткани, сопровождающегося повышением числа переломов скелетных костей, компрессией спинного мозга и сильной костной болью при остеопорозе, включающий введение нуждающемуся в таком лечении пациенту терапевтически эффективного количества
соединения формулы I согласно любому из описанных в настоящей заявке вариантов реализации.
10. Способ прогнозирования остеопороза у субъекта, включающий:
(a) измерение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь в образце, полученном от
субъекта;
(b) сравнение уровня P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, измеренного на этапе (а), со стандартным уровнем P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь для определения того, содержит ли полученный от субъекта образец не соответствующие норме уровни P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь;
(c) выбор схемы лечения Соединением формулы I, 1а или 1 на основании не соответствующих норме уровней P1NP, СТх или ТрКФ-5Ь, или введение Соединения формулы I, 1а или 1 в соответствии со схемой лечения, обеспечивающей подавление остеопороза у указанного субъекта.
11. Способ стимуляции дифференцировки и/или активности остеобластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
12. Способ стимуляции костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
13. Способ подавления дифференцировки и/или активности остеокластов у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
14. Способ модулирования обновления костной ткани в направлении костеобразования у пациента, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному пациенту эффективного количества Соединения формулы 1,1а или Соединения 1.
15. Способ по пп. 11-14, отличающийся тем, что указанное соединение формулы I представляет собой Соединение 1, которое вводят в количестве от 0,01 до 25 мг один раз в сутки.
По доверенности
22-1
20- I
18- |
16- гЦ \ _ Т
Концентрация: (мкмоль)
7-|
! трк
***
/ьъ
Концентрация (мкмоль)
1,8-.
1,61,4 1,2 КО
s о а
* т *
0.60.40,2
^ <г 4 nn , <ь о о
Концентрация (мжмоль)
120-t
10080-I 6G -
20-
Я ft
***
(***)
Концентрация (мкмоль)
5/6 Фиг. 5
4.U -*
у к-к
3.0'
. т
I~"
9 Я-f
2,0> 1.5' 1,0
0,5
С* J
0.0'
_1г
ф гф1 KV ГС\ JSN
Концентрация (мкмоль)
г; - i
¦ День исследования \
Животные ?;ч"-Щ
День -7 |
Измерение массы тела и отбор крови
1 Рандомизация в группы исследования путем i стратификации в соответствии с массой i тела и уровнями > ЧГР В сыворотке
\ День исследования
\ прижизненной фазы
ДО > 'п - 3,1
ОВЭ in = Л. з на групп}' исследования >
Основа
Основа
?2(1 МГ/КГ.
/день
подкожно)
кабозантиниб (мг/кг /день перорально)
1 ? 3
День 0
Измерение массы тела и проведение хирургических операций
ЛО и ОВЭ
• Ежедневно на протяжении ; прилейзненной фазы .(вплоть до 13 дня)
Лечение кабозантинибом: 176- эстрадиолом и основой
; День?
Измерение массы тела и корректировка дозировок для лечения с учетом массы тела
День U
Измерение массы тела, отбор крови и измерение удельной массы матки
• Экспериментальные
анализы
День исследования
День -7
День 0
День ?
День Я
Масса тела
, Удельная масса матки
Биомаркеры метаболизма
костной ткани, включая •Р!Г.р , ОК. СТх и ТрКФ-5Ь
""""
1/6
Фиг. 1
1/6
Фиг. 1
2/6
Фиг. 2
2/6
Фиг. 2
3/6
Фиг. 3
3/6
Фиг. 3
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
4/6
Фиг. 4
6/6
Фиг. 6