[RU]

Настоящее изобретение относится к библиотекам, кодированным олигонуклеотидами, и к способам мечения таких библиотек. В частности, способы и олигонуклеотиды могут включать один или более 2'- замещённых нуклеотида, таких как 2'-О-метил или 2'-фторнуклеотиды, и другие условия или реагенты для повышения эффективности ферментативного сшивания и/или одну или более функциональных химических групп, способствующих химическому сшиванию.

(57) Реферат / Формула:

Настоящее изобретение относится к библиотекам, кодированным олигонуклеотидами, и к способам мечения таких библиотек. В частности, способы и олигонуклеотиды могут включать один или более 2'- замещённых нуклеотида, таких как 2'-О-метил или 2'-фторнуклеотиды, и другие условия или реагенты для повышения эффективности ферментативного сшивания и/или одну или более функциональных химических групп, способствующих химическому сшиванию.

---

Евразийское (21) 201490534 (13) Al
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки (51) Int. Cl. C40B 50/16 (2006.01)
2014.06.30 C40B 50/14 (2006.01)
(22) Дата подачи заявки 2012.09.07
(54) СПОСОБЫ МЕЧЕНИЯ ДНК-КОДИРОВАННЫХ БИБЛИОТЕК
(31) 61/531,820; 61/536,929
(32) 2011.09.07; 2011.09.20
(33) US
(86) PCT/US2012/054228
(87) WO 2013/036810 2013.03.14
(71) Заявитель: ИКС-ЧЕМ, ИНК. (US)
(72) Изобретатель:
Кеефе Энтони Д., Вагнер Ричард В., Литовчик Александр, Кларк Мэтью, Куоццо Джон В. (US)
(74) Представитель: Лыу Т.Н. (RU)
(57) Настоящее изобретение относится к библиотекам, кодированным олигонуклеотидами, и к способам мечения таких библиотек. В частности, способы и олигонуклеотиды могут включать один или более 2'- замещённых нуклеотида, таких как 2'-О-метил или 2'-фторнуклеотиды, и другие условия или реагенты для повышения эффективности ферментативного сшивания и/или одну или более функциональных химических групп, способствующих химическому сшиванию.
СПОСОБЫ МЕЧЕНИЯ ДНК-КОДИРОВАННЫХ БИБЛИОТЕК
Перекрестная ссылка на родственные заявки
Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/531820, поданной 7 сентября 2011 г., и 61/536929, поданной 20 сентября 2011 г.
Область техники
В общем, данное изобретение относится к ДНК-кодированным библиотекам соединений и к способам применения и создания таких библиотек. Настоящее изобретение относится также к композициям для применения в таких библиотеках.
Уровень техники
Комбинаторные библиотеки, кодированные ДНК, имеют много преимуществ при поиске лекарств. Эти библиотеки могут предоставить большое количество различных соединений, которые могут быть подвергнуты быстрому скринингу и детальному исследованию. Для дальнейшего повышения уровня сложности могут быть запрограммированы и автоматизированы различные стадии процесса поиска новых лекарственных средств. Эти стадии включают применение многостадийного синтеза, с использованием смешения-разделения для добавления структурных элементов в атомные или полиатомные остовы (каркасные структуры) и использование ферментативного и/или химического сшивания (лигирования) для добавления ДНК- меток, которые кодируют как соединения на стадиях синтеза, так и структурные элементы (строительные блоки).
Несмотря на указанные достоинства, могут возникнуть многочисленные вопросы, когда нужно синтезировать очень большие и сложные библиотеки и осуществить их деконволюцию. По мере того, как размер библиотеки растёт, могут потребоваться усовершенствованные методы для обеспечения больших выходов и сшивания (лигирования) меток. Для создания библиотек при различных условиях реакции предпочтительным и являются стабильные сшитые нуклеотидные конструкции, так как эти конструкции устойчивы в условиях высоких значений рН и повышенных температур. Для упрощения деконволюции меток последовательность меток должна распознаваться ДНК-или РНК-зависимыми полимеразами, таким образом, чтобы персональные данные о популяции меток могли быть определены путём матричной (темплат-зависимой) полимеризации и определения последовательностей. При создании библиотек, обладающих всеми эти преимуществами, могут возникнуть трудности.
В соответствии с этим существует необходимость в усовершенствованных, более устойчивых методов скрининга и идентификации малых соединений в ДНК-кодированных библиотеках.
Сущность изобретения
Данное изобретение предусматривает способы получения библиотек, причём эти способы включают одно или более условий, которые улучшают однонитевое сшивание меток и композиций при создании библиотек. Примеры таких условий включают применение одного или более 2'-замещённых оснований внутри меток, таких как 2-0-метил или 2'-фтор; применение меток определённой длины, применение одного или более ферментов, необязательно, включение возможности распознавания ошибок в дизайн меток и/или применение одного или более агентов во время сшивания.
Соответственно, данное изобретение предусматривает способ введения в первую библиотеку меток, содержащих кодированное олигонуклеотидом химическое соединение, при этом такой метод включает: (i) предоставление "головного" фрагмента, имеющего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, где "головной" фрагмент включает по меньшей мере один 2'-замещённый нуклеотид; (ii) связывание первой функциональной группы "головного" фрагмента с первым компонентом химического соединения, причём "головной" фрагмент непосредственно соединён с первым компонентом или "головной" фрагмент косвенно связан с первым компонентом при помощи бифункционального линкера (например, полиэтиленгликольного линкера или -(СН2СН20)пСН2СН2-, где п обозначает целое число от 1 до 50); и (iii) связывание второй функциональной группы с концевым фрагментом первого структурного элемента-метки (метки первого структурного элемента) с образованием комплекса, где стадии (ii) и (iii) могут осуществляться в любом порядке и где метка первого структурного элемента кодирует реакцию связывания стадии (ii), тем самым обеспечивая образование меченой библиотеки.
Согласно некоторым вариантам данного изобретения "головной" фрагмент включает 2'-замещённый нуклеотид на одном или более 5'-конце, 3'-конце или внутри "головного" фрагмента. В соответствии с конкретными вариантами "головной" фрагмент включает 2'-замещённый нуклеотид и вторую функциональную группу на 5'-конце или 3'-конце.
Согласно другим вариантам метка первого структурного элемента (строительный блок) включает по меньшей мере один (например, два, три, четыре, пять или более) 2'-замещённых нуклеотидов. Согласно конкретным вариантам метка первого структурного
элемента (метка, кодирующая первый структурный элемент) включает 2'-замещённый нуклеотид на одном или более 5'- и 3'-концах или внутри метки первого структурного элемента (например, 2'-0-метилнуклеотид или 2'-фторнуклеотид на обоих 5'- и 3'-концах). Согласно некоторым вариантам метка первого структурного элемента включает защитную группу на 3'-конце и 5'-конце. Согласно некоторым вариантам метка первого структурного элемента включает защитную группу на 3'-конце или 5'-конце.
Согласно любому из вариантов, описанных в данной заявке, 2'-замещённый нуклеотид представляет собой 2'-0-метилнуклеотид (например, 2'-0-метилурацил) или 2'-фторнуклеотид (например, 2'-фторгуанин или 2'-фторурацил).
В соответствии с любым из описанных выше вариантов стадия (ii) может включать присоединение, связывание или функциональное ассоциирование "головного" фрагмента непосредственно с первым компонентом (например, остовом или первым структурным элементом). Согласно другим вариантам стадия (ii) включает связывание "головного" фрагмента непосредственно с первым компонентом (например, с остовом или первым структурным элементом) через бифункциональный линкер (например, способ включает связывание "головного" фрагмента с первой функциональной группой линкера и связывание первого компонента со второй функциональной группой линкера).
Согласно любому из описанных выше вариантов способ может дополнительно включать (iv) связывание метки второго структурного элемента с 5'-концом или 3'-концом комплекса; и (v) связывание второго компонента (например, первого структурного элемента или второго структурного элемента) химической библиотеки с первым компонентом, при этом стадии (iv) и (v) могут осуществляться в любом порядке.
В соответствии с некоторыми из описанных выше вариантов изобретения метка второго структурного элемента кодирует реакцию связывания на стадии (v). Согласно другим вариантам стадия (iv) может включать связывание метки структурного элемента с 5'-концом комплекса; этот комплекс содержит фосфатную группу на 5'-конце; и вторая метка структурного элемента включает гидроксильную группу на обеих 3'- и 5'-концах. Согласно другим вариантам стадия (iv) может также включать очистку комплекса и реакцию этого комплекса с полинуклеотидкиназой с образованием фосфатной группы на 5'-конце до связывания метки второго структурного элемента. Согласно другим вариантам стадия (iv) может также включать связывание метки второго структурного элемента с 3'-концом комплекса; этот комплекс включает защитную группу на 3'-конце комплекса и метка второго структурного элемента включает фосфатную группу на 5'-конце и защитную группу на 3'-конце. Согласно ещё одному варианту изобретения стадия (iv) может также включать взаимодействие комплекса с гидролизующим агентом для
отщепления защитной группы из комплекса до связывания метки второго структурного элемента с комплексом.
Согласно другим вариантам метка второго структурного элемента включает 2'-замещённый нуклеотид (например, 2'-0-метилнуклеотид или 2'-фторнуклеотид) на одном или обоих 5'- и 3'-концах или внутри метки второго структурного элемента (например, внутри второго структурного элемента (например, 2'-0-метилнуклеотид и/или 2'-фторнуклеотид на обоих 5' - и 3'-концах)).
Согласно некоторым вариантам стадия (iv) может включать применение РНК-лигазы (например, Т4 РНК-лигазы) и/или ДНК-лигазы (например, а онДНК-лигазы) для связывания метки второго структурного элемента с комплексом (например, может включать применение и РНК-лигазы, и ДНК-лигазы).
Согласно другим вариантам стадия (iii) может включать применение РНК-лигазы (например, Т4 РНК-лигазы) и/или ДНК-лигазы (например, а онДНК-лигазы) для связывания "головного" фрагмента с меткой первого структурного элемента) (например, может включать применение и РНК-лигазы, и ДНК-лигазы).
Согласно другим вариантам стадия (iii) и/или стадия (iv), если он есть, могут включать применение полиэтиленгликоля и/или одного или более многовалентных катионов (например, хлорида магния, хлорида марганца (II) или хлорида гексамина кобальта (III). Согласно некоторым вариантам полиэтиленгликоль берётся в количестве от примерно 25 % (вес/об) до примерно 35 % (вес/об) (например, от примерно 25 % (вес/об) до примерно 30 % (вес/об), от примерно 30 % (вес/об) до примерно 35 % (вес/об) или в количестве около 30 % (вес/об). Согласно другим вариантам полиэтиленгликоль имеет средний молекулярный вес от примерно 5,500 Да (например, около 4,600 Да). Согласно другим вариантам один или более растворимых многовалентных катионов содержатся в количестве от примерно! 10.5 мМ (например, от 0.05 мМ до 0.5 мМ, от 0.05 мМ до 0.75 мМ, от 0.05 мМ до 1.0 мМ, от 0.05 мМ до 1.5 мМ, от 0.05 мМ до 2.0 мМ, от 0.05 мМ до 3.0 мМ, от 0.05 мМ до 4.0 мМ, от 0.05 мМ до 5.0 мМ, от 0.05 мМ до 6.0 мМ, от 0.05 мМ до 7.0 мМ, от0.05 мМ до 8.0 мМ, от 0.05 мМ до 9.0 мМ, от 0.05 мМ до 10.0 мМ, от0.1 мМ до 0.5 мМ, от 0.1 мМ до 0.75 мМ, от0.1 мМ до 1.0 мМ, от 0.1 мМ до 1.5 мМ, от 0.1 мМ to 2.0 мМ, от 0.1 мМ до 3.0 мМ, от 0.1 мМ до 4.0 мМ, от 0.1 мМ до 5.0 мМ, от 0.1 мМ до 6.0 мМ, от 0.1 мМ до 7.0 мМ, от 0.1 мМ до 8.0 мтМ, от 0.1 мМ до 9.0 мМ, от 0.1 мМ до 10.0 мМ, от 0.1 мМ до 10.5 мМ, от 0.5 мМ до 0.75 мМ, от 0.5 мМ до 1.0 мМ, от 0.5 мМ до 1.5 мМ, от 0.5 мМ до 2.0 мМ, от 0.5 мМ до 3.0 мМ, от 0.5 мМ до 4.0 мМ, от 0.5 мМ до 5.0 мМ, от 0.5 мМ до 6.0 мМ, от 0.5 мМ до 7.0 мМ, от 0.5 мМ до 8.0 мМ, от 0.5 мМ до 9.0 мМ, от 0.5 мМ до 10.0 мМ, от 0.5 мМ до 10.5 мМ, от 0.75 мМ до 1.0 мМ, от 0.75 мМ до 1.5 мМ, от 0.75
мМ до 2.0 мМ, от 0.75 мМ до 3.0 мМ, от 0.75 мМ до 4.0 мМ, от 0.75 мМ до 5.0 мМ, от 0.75 мМ до 6.0 мМ, от 0.75 мМ до 7.0 мМ, от 0.75 мМ до 8.0 мМ, от 0.75 мМ до 9.0 мМ, от 0.75 мМ до 10.0 мМ, от 0.75 мМ до 10.5 мМ, от 1.0 мМ до 1.5 мМ, от1.0 мМ до 2.0 мМ, от1.0 мМ до 3.0 мМ, от 1.0 мМ до 4.0 мМ, от 1.0 мМ до 5.0 мМ, от 1.0 мМ до 6.0 мМ, от 1.0 мМ до 7.0 мМ, от 1.0 мМ до 8.0 мМ, от 1.0 мМ до 9.0 мМ, от 1.0 мМ до 10.0 мМ, от 1.0 мМ до 10.5 мМ, от 1.5 мМ до 2.0 мМ, от 1.5 мМ до 3.0 мМ, от 1.5 мМ до 4.0 мМ, от 1.5 мМ до 5.0 мМ, от 1.5 мМ до 6.0 мМ, от 1.5 мМ до 7.0 мМ, от 1.5 мМ до 8.0 мМ, от 1.5 мМ до 9.0 мМ, от 1.5 мМ до 10.0 мМ, от 1.5 мМ to 10.5 мМ, от 2.0 мМ до 3.0 мМ, от 2.0 мМ до 4.0 мМ, от 2.0 мМ до 5.0 мМ, от 2.0 мМ до 6.0 мМ, от 2.0 мМ до 7.0 мМ, от 2.0 мМ до 8.0 мМ, от 2.0 мМ до 9.0 мМ, от 2.0 мМ до 10.0 мМ, и от 2.0 мМ до 10.5 мМ). Согласно некоторым вариантам один или более многовалентных катионов применяются в количестве от примерно 1 мМ (например, от 0.5 мМ до 1.5 мМ). В соответствии с конкретным вариантом многовалентный катион содержится в виде хлорида гексамина кобальта (III).
Согласно другим вариантам заявленный способ включает также отделение комплекса от любой непрореагировавшей метки или от непрореагировавшего "головного" фрагмента до осуществления любой одной стадии связывания из стадий (ii)-(v). Согласно другим вариантам заявленный способ включает также связывание одного или более дополнительных компонентов (например, остова или первого структурного элемента) и одного или более дополнительных структурных элементов-меток в любом порядке и при изменении любой стадии связывания из стадий (ii)-(v).
Данное изобретение предусматривает также способ введения меток в первую библиотеку, включая олигонуклеотид-кодируемое вещество, причём этот метод включает (i) обеспечение "головного" фрагмента, имеющего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, при этом "головной" фрагмент включает 2'-замещённый нуклеотид на 5'-конце, возможно, один или более нуклеотидов внутри "головного" фрагмента и защитную группу в 2'-положении и/или З'-положении на З'-конце; (ii) связывание первой функциональной группы "головного" фрагмента первого компонента химического вещества, при этом "головной" фрагмент непосредственно связан с первым компонентом при помощи бифункционального линкера и (iii) связывание второй функциональной группы "головного" фрагмента с первой меткой структурного элемента, причём первая метка структурного элемента включает 2'-замещённый нуклеотид и гидроксильную группу на 5'-конце, возможно один или более нуклеотидов внутри метки, и 2'-замещённый нуклеотид и гидроксильную группу на З'-конце; причём стадии (ii) и (iii) могут осуществляться в любом порядке и метка первого структурного элемента кодирует
реакцию связывания на стадии (ii), тем самым обеспечивая создание меченой лаборатории.
Данное изобретение предусматривает также способ введения меток в первую библиотеку, включающую олигонуклеотид-кодируемое вещество, при этом такой способ включает (i) обеспечение "головного" фрагмента, имеющего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, при этом "головной" фрагмент включает 2'-замещённый нуклеотид на 5'-конце, возможно, один или более нуклеотидов внутри "головного" фрагмента и защитную группу в 2'-положении и/или З'-положении на З'-конце;
(ii) связывание первой функциональной группы "головного" фрагмента первого компонента химического вещества, при этом "головной" фрагмент непосредственно связан с первым компонентом при помощи бифункционального линкера и (iii) связывание второй функциональной группы "головного" фрагмента с меткой первого структурного элемента, причём метка первого структурного элемента включает 2'-замещённый нуклеотид и гидроксильную группу на 5'-конце, возможно один или более нуклеотидов внутри метки, и 2'-замещённый нуклеотид и гидроксильную группу на З'-конце; причём стадии (ii) и (iii) могут осуществляться в любом порядке и метка первого структурного элемента кодирует реакцию связывания на стадии (ii), тем самым обеспечивая создание меченой лаборатории.
Согласно некоторым вариантам 2'-замещённый нуклеотид представляет собой 2'-О-метилнуклеотид (например, 2'-0-метилгуанин) или 2'-фторнуклеотид (например, 2'-фторгуанин).
Согласно некоторым вариантам один или более нуклеотидов внутри "головного" фрагмента являются 2'-дезоксинуклеотидами. Согласно другим вариантам бифункциональный линкер представляет собой полиэтиленгликоль (например, -(СН2СН20)п СН2СН2-, где п обозначает целое число от 1 до 50).
Согласно другим вариантам один или более нуклеотидов (например, один или более 2'-дезоксинуклеотидов) находятся внутри "головного" фрагмента метки.
Согласно некоторым вариантам стадия (iii) может включать применение одного или более многовалентных катионов (например, хлорида магния, хлорида марганца (II) или хлорида гексамина кобальта (III)), полиэтиленгликоля (например, имеющий средний молекулярный вес около 4600 Да), и РНК-лигазы (например, Т4 РНК-лигазы).
Согласно другому аспекту изобретение предусматривает способы идентификации и/или обнаружения химического соединения, причём метод включает введение метки в первую библиотеку, включающую химическое соединение, кодированное
олигонуклеотидом (например, включает стадии с (i) по (iii) и, необязательно, включает стадии с (iv) по (v)), и отбор по конкретному свойству или по конкретной функции (например, отбор на связывание с целевым белком, включающий экспонирование химического соединения, кодированного олигонуклеотидом, или химического соединения с целевым белком и отбор одного или более химических соединений, кодированных олигонуклеотидом, или химических соединений, которые связываются с целевым белком (например, с применением гель-хроматографии)). Изобретение также предусматривает комплекс, включающий "головной" фрагмент и метку структурного элемента, где метка включает от 5 до 20 нуклеотидов, 2'-замещённый нуклеотид на 5'-конце и 2'-замещённый нуклеотид на З'-конце. Согласно некоторым вариантам изобретения 2'-замещённый нуклеотид на 5'-конце и/или на З'-конце представляет собой 2'-0-метилнуклеотид (например, 2'-0- метилгуанин или 2'-0- метилурацил) или 2'-фторнуклеотид (например, 2'- фторгуанин или 2'- фторурацил). В конкретных вариантах изобретения "головной" фрагмент включает шпилечную структуру. Согласно некоторым вариантам изобретения "головной" фрагмент включает 2'- замещённый нуклеотид в одном или более положений: на 5'- конце, на 3'- конце или в положении внутри "головного" фрагмента. Согласно другим вариантам изобретения "головной" фрагмент дополнительно содержит предварительно аденилированный 5'- конец. Согласно ещё одному варианту изобретения "головной" фрагмент включает от 5 до 20 нуклеотидов.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения "головной" фрагмент, метку первого структурного элемента, метку второго структурного элемента или один или более меток дополнительных структурных элементов, в случае их присутствия, включает предварительно аденилированный 5'- конец.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способ дополнительно включает связывание одной или более (например, одного, двух, трёх, четырёх, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) дополнительных меток структурных элементов с комплексом и связывание одного или более (например, одного, двух, трёх, четырёх, пяти, шести, семи, восьми, девяти или десяти) дополнительных компонентов (например, остовов или структурных элементов) с комплексом, причём одна или более дополнительных меток структурных элементов кодирует один или более дополнительных компонентов или кодирует связывание одного или более дополнительных компонентов, тем самым создавая библиотеку меченых соединений ("меченую библиотеку").
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения 2'- замещённый нуклеотид представляет собой 2'-0- метилнуклеотид, такой как 2'-0- метилгуанин, 2'-0
метилурацил, 2-0- метиладенозин, 2 -0- метилтимидин, 2 -0- метилинозин, 2-0-метилцитидин или 2'-О- метилдиаминопурин. Или же, согласно любому из вышеописанных вариантов изобретения, 2'- замещённый нуклеотид представляет собой 2'- фторнуклеотид, такой как 2'- фторгуанин, 2'- фторурацил, 2'- фтораденозин, 2'-фтортимидин, 2'- фторинозин, 2'- фторцитидин или 2'- фтордиаминопурин.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения РНК-лигаза представляет собой Т4 РНК-лигазу и/или ДНК-лигаза представляет собой онДНК-лигазу.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способ включает совокупность концевых фрагментов. Согласно некоторым вариантам данного способа каждый "головной" фрагмент из совокупности концевых фрагментов включает идентичную область последовательности и отличную кодирующую область. Согласно конкретным вариантам изобретения идентичная область последовательности представляет собой область связывания праймера. Согласно другим вариантам изобретения отличная (отличающаяся, разнообразная) кодирующая область представляет собой исходный структурный элемент-метку, который кодирует "головной" фрагмент или добавление (присоединение) исходного компонента.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения связывание по меньшей мере на одной из стадий (ii)-(iv), если таковое происходит, включает ферментативное сшивание и/или химическое сшивание. Согласно некоторым вариантам изобретения, ферментативное сшивание включает использование РНК-лигазы (например, Т4 РНК-лигазы) или ДНК-лигазы (например, он ДНК-лигазы). Согласно другим вариантам изобретения, ферментативное сшивание включает использование РНК-лигазы (например, Т4 РНК-лигазы) и ДНК-лигазы (например, он ДНК-лигазы). Согласно некоторым вариантам изобретения химическое сшивание включает применение одной или более пар реагирующих друг с другом реагентов (например, пары, включающей необязательно замещённую алкинильную группу с необязательно замещённой азидогруппой; пары, включающей необязательно замещённый диен, имеющий систему 4л электронов (например, необязательно замещённое 1,3- ненасыщенное соединение, такое как необязательно замещённый 1,3- бутадиен, 1- метокси- 3- триметилсилилокси-1,3-бутадиен, циклопентадиен, циклогексадиен или фуран) с необязательно замещённым диенофилом или необязательно замещённым гетеродиенофилом, имеющим 2л электронную систему (например, необязательно замещённой алкенильной группой или необязательно замещённой алкинильной группой); пары, включающей нуклеофил (например, необязательно замещённый амин или необязательно замещённый тиол) с пространственно затруднённой конформацией (например, необязательно замещённый
эпоксид, азиридин, ион азиридиния или ион эписульфония); пары, включающей форсфотиоатную группу с атомом иода (например, фосфоротиоатную группу на 3'- конце и атом иода на 5'- конце); или пары, включающей альдегидную группу с аминогруппой (например, первичной или вторичной аминогруппой, включая гидразидную группу)). Согласно конкретным вариантам изобретения совместно реагирующая пара даёт в результате спейсер, имеющий в длину, примерно, от 4 до 24 атомов (например, от около 4 до около 10 атомов). Согласно другим вариантам изобретения химическое сшивание включает применение фосфоротиоатной группы (например, на 3'- конце) и атома иода (например, на 5'- конце). Согласно другим вариантам изобретения химическое сшивание включает использования в реакции связывания олигонуклеотидного шунта. Согласно некоторым вариантам изобретения химическое сшивание включает фосфоротиоатную группу (например, на 3'- конце "головного" фрагмента, метки первого структурного элемента, метки второго структурного элемента, меток одного или более дополнительных структурных элементов, метки, идентифицирующей библиотеку, используемой метки и/или метки точки начала (ориджина) репликации, если таковые имеются) и атом иода (например, на 5'- конце "головного" фрагмента, метки первого структурного элемента, метки второго структурного элемента, меток одного или более дополнительных структурных элементов, метки, идентифицирующей библиотеку, метки использования и/или метки ориджина репликации, если таковые имеются) и олигонуклеотидный шунт в реакции связывания, при этом избегают применения одной или более защитных групп. Согласно другим вариантам изобретения химическое сшивание нескольких меток включает чередование применения ортогональных реагирующих (друг с другом) пар (например, любых двух или более реагирующих пар по настоящему описанию) для сшивания последовательных меток.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения "головной" фрагмент может включать однонитевую (например, шпилечную) структуру.
Согласно любому из вышеуказанных вариантов изобретения "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, метки один или более дополнительных структурных элементов, метка, идентифицирующая библиотеку, используемая метка и/или метка ориджина репликации, если таковые имеются, включают последовательность, практически идентичную (например, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную) любой последовательности по настоящему описанию (например, последовательности из SEQ ID NO: 6-21, 26, 27 или 29-31), или последовательности, комплементарной последовательности, практически идентичной (например, по меньшей
мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной) любой последовательности по настоящему описанию (например, последовательности в любой из SEQ ID NO: 6-21, 26, 27 или 29-31). Согласно конкретным вариантам изобретения "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, метки одного или более дополнительных структурных элементов, метка, идентифицирующая библиотеку, используемая метка и/или метка ориджина репликации, если таковые имеются, включают последовательность, практически идентичную (например, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную) последовательности SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способы или комплексы включают только однонитевые молекулы, в которых "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, метка одного или более дополнительных структурных элементов являются однонитевыми. Согласно некоторым вариантам изобретения одна или более однонитевых молекул имеют шпилечную структуру. Согласно конкретным вариантам изобретения "головной" фрагмент включает шпилечную структуру, а метки одного или более структурных элементов не включают шпилечной структуры.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способ далее включает одну или более необязательных стадий для увеличения разнообразия библиотеки или для подробного изучения членов библиотеки по настоящему изобретению. Согласно некоторым вариантам изобретения способ далее включает идентификацию низкомолекулярного подобного лекарству члена библиотеки, который связывает или инактивирует белок, представляющий терапевтический интерес. Согласно другим вариантам изобретения способ далее включает контактирование члена библиотеки с биологической мишенью в условиях, пригодных по меньшей мере для одного члена библиотеки, для связывания с мишенью, удаление одного или более членов библиотеки, которые не связываются с мишенью, и анализ одной или более связанных с ним олигонуклеотидных меток.
Согласно настоящему описанию применение однонитевых молекул (например, включая шпилечные молекулы) могло бы иметь множество преимуществ. Соответственно, согласно любому из описанных вариантов изобретения способы и комплексы включают "головной" фрагмент, метки одного или более структурных элементов, комплекс, химический структурный элемент, молекулу или любого члена меченой библиотеки, имеющего небольшую (молекулярную) массу, повышенную
растворимость (например, в органическом растворителе), невысокую стоимость, повышенную реакционную способность, повышенную доступность для мишени, небольшой гидродинамический радиус и/или повышенную точность аналитических определений по сравнению со способом, включающим одну или более двухнитевых молекул (например, двухнитевого "головного" фрагмента или двухнитевой метки структурного элемента). Согласно некоторым вариантам изобретения каждая из меток структурного элемента (например, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые имеются) имеют примерно одинаковую массу (например, метка каждого структурного элемента имеет массу, отличающуюся примерно на +/- 10% от средней массы двух или более меток структурных элементов). Согласно конкретным вариантам изобретения метка структурного элемента имеет меньшую массу (например, менее примерно 15000 Дальтон, примерно 14000 Дальтон, примерно 13000 Дальтон, примерно 12000 Дальтон, примерно 11000 Дальтон, примерно 10000 Дальтон, примерно 9000 Дальтон, примерно 8000 Дальтон, примерно 7500 Дальтон, примерно 7000 Дальтон, примерно 6000 Дальтон, примерно 6500 Дальтон, примерно 5000 Дальтон, примерно 5500 Дальтон, примерно 4000 Дальтон, примерно 4500 Дальтон или примерно 3000 Дальтон,) по сравнению с двухнитевой меткой (например, двухнитевая метка имеет массу примерно 15000 Дальтон, примерно 14000 Дальтон, примерно 13000 Дальтон или примерно 12000 Дальтон). Согласно другим вариантам изобретения метка структурного элемента имеет меньшую длину по сравнению с двухнитевой меткой (например, двухнитевая метка имеет протяжённость менее примерно 20 нуклеотидов, менее примерно 19 нуклеотидов, менее примерно 18 нуклеотидов, менее примерно 17 нуклеотидов, менее примерно 16 нуклеотидов, менее примерно 15 нуклеотидов, менее примерно 14 нуклеотидов, менее примерно 13 нуклеотидов, менее примерно 12 нуклеотидов, менее примерно 11 нуклеотидов, менее примерно 10 нуклеотидов, менее примерно 9 нуклеотидов, менее примерно 8 нуклеотидов или менее примерно 7 нуклеотидов). Согласно некоторым вариантам изобретения в одной или более меток-структурных элементов или у одного или более членов библиотеки отсутствует область связывания с праймером и/или константная область (например, в результате стадии отбора, такого как отбор с применением гель-хроматографии). Согласно некоторым вариантам изобретения одна или более меток структурных элементов или членов библиотеки имеют уменьшенную константную область (например, длиной менее примерно 30 нуклеотидов, менее примерно 25 нуклеотидов, менее примерно 20 нуклеотидов, менее примерно 19 нуклеотидов, менее примерно 18 нуклеотидов, менее примерно 17 нуклеотидов, менее
примерно 16 нуклеотидов, менее примерно 15 нуклеотидов, менее примерно 14 нуклеотидов, менее примерно 13 нуклеотидов, менее примерно 12 нуклеотидов, менее примерно 11 нуклеотидов, менее примерно 10 нуклеотидов, менее примерно 9 нуклеотидов, менее примерно 8 нуклеотидов или менее примерно 7 нуклеотидов). Согласно другим вариантам изобретения способы включают "головной" фрагмент, который кодирует молекулу, участок химического структурного элемента, стадию реакции связывания (например, химического или ферментативного сшивания), или идентичность библиотеки, причём кодирующий "головной" фрагмент делает ненужным применение дополнительной метки структурного элемента для кодирования такой информации.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые имеются) кодирует идентичность библиотеки. Согласно некоторым вариантам изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые имеются) включает первую последовательность, идентифицирующую библиотеку, причём последовательность кодирует идентичность первой библиотеки. Согласно конкретным вариантам изобретения олигонуклеотид представляет собой первую метку, идентифицирующую библиотеку. Согласно некоторым вариантам изобретения способ включает предоставление первой метки, идентифицирующей библиотеку, где метка включает последовательность, кодирующую первую библиотеку, и/или связывание первой метки, идентифицирующей библиотеку, с комплексом. Согласно некоторым вариантам изобретения способ включает предоставление второй библиотеки и объединение первой библиотеки со второй библиотекой. Согласно другим вариантам изобретения способ включает предоставление второй метки, идентифицирующей библиотеку, причём метка содержит последовательность, кодирующую вторую библиотеку.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент и/или один или более структурных элементов) кодирует применение члена библиотеки (например, применение на стадии отбора или стадии связывания по настоящему описанию). Согласно некоторым вариантам изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных
структурных элементов, если таковые имеются) включает используемую последовательность, которая кодирует применение субпопуляции членов библиотеки на одной или более стадий (например, на стадии отбора и/или на стадии связывания). Согласно конкретным вариантам изобретения олигонуклеотид представляет собой метку использования, включающую используемую последовательность. Согласно некоторым вариантам изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент и/или один или более структурных элементов) кодирует ориджин репликации члена библиотеки (например, в конкретной части библиотеки). Согласно некоторым вариантам изобретения олигонуклеотид (например, "головной" фрагмент, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые имеются) включает последовательность ориджина репликации (например, случайную вырожденную последовательность, имеющую в длину примерно 10, 9, 8, 7 или 6 нуклеотидов), которая кодирует ориджин репликации члена библиотеки. Согласно конкретным вариантам изобретения олигонуклеотид включает метку ориджина репликации, включающий последовательность ориджина репликации. Согласно некоторым вариантам изобретения способ включает далее соединение, связывание или функциональное связывание используемой метки и/или метки ориджина репликации с комплексом.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способы, композиции и комплексы, необязательно, включают хвостовой фрагмент, причём этот хвостовой фрагмент включает одну или более последовательностей, идентифицирующих библиотеку, используемую последовательность или последовательность ориджина репликации по настоящему описанию. Согласно конкретным вариантам изобретения способы включают далее соединение, связывание или функциональное связывание хвостового фрагмента (например, включающего один или более компонент из последовательности, идентифицирующей библиотеку, используемой последовательности или последовательности ориджина) с комплексом.
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения способы, композиции или комплексы или их участки (например, "головной" участок, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют) включают модифицированную фосфатную группу (например, фосфоротиоатную или 5'-М-фосфорамидитную связь) между концевым нуклеотидом на З'-конце и нуклеотидом, прилегающим к "головному" нуклеотиду. Согласно конкретным вариантам изобретения модифицированная фосфатная группа минимизирует шаффлинг в процессе
ферментативного сшивания (лигирования) двух олигонуклеотидов (например, минимизирует включение дополнительного нуклеотида или исключение нуклеотида в конечном продукте или комплексе по сравнению с последовательностями двух олигонуклеотидов, подлежащих сшиванию, например, "головного" фрагмента и метки структурного элемента или метки первого структурного элемента и метки второго структурного элемента) по сравнению со сшиванием двух олигонуклеотидов (например, "головного" фрагмента и метки структурного элемента или метки первого структурного элемента и метки второго структурного элемента), не содержащих модифицированной фосфатной группы. Согласно некоторым вариантам изобретения комплекс может включать фосфоротиоатную или триазольную группу.
Согласно некоторым из вышеприведённых вариантов изобретения способы, композиции и комплексы или их участки (например, "головной" участок, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, и/или метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют) включают модификацию, которая содействует растворимости в полуводных, восстановленных водных или неводных (например, органических) растворителях (средах). Согласно некоторым вариантам изобретения бифункциональный линкер, "головной" фрагмент или метки одного или более структурных элементов модифицируют с целью повышения растворимости члена указанной кодированной ДНК химической библиотеки в органических растворителях. Согласно некоторым вариантам изобретения модификацию можно осуществлять с помощью таких модифицирующих элементов, как одна или более алкильных цепей, звено полиэтиленгликоля, разветвлённые фрагменты с положительными зарядами или гидрофобная циклическая структура. Согласно некоторым вариантам изобретения модифицирующий элемент включает модифицированные нуклеотиды, содержащие гидрофобную группу (например, модифицированные в С5 положениях Т или С оснований алифатическими цепями, такими как в 5 '-диметокситритил-К4-диизобутиламинометилиден-5-(1-пропинил)-2'-дезоксицитидине, 3'- [(2-цианоэтил)-(М,М-диизопропил)]-фосфорамидите; 5'-диметокситритил-5-(1-пропинил)-2'-дезоксиуридине, 3'-[(2-цианоэтил)-(М,М-диизопропил)]-фосфорамидите; 5'-диметокситритил-5-фтор-2'- дезоксиуридине, 3'-[(2-цианоэтил)-(М,М-диизопропил)]-фосфорамидите; и 5'-диметокситритил-5-(пирен-1-ил-этинил)-2'-дезоксиуридине или 3'-[(2-цианоэтил)-(ТЧДЧ-диизопропил)]- фосфорамидите), или инсерцию, содержащую гидрофобный фрагмент (например, азобензол). Согласно некоторым вариантам изобретения член библиотеки имеет коэффициент распределения в системе октанол: вода примерно от 1.0 до 2.5 (например, примерно от 1.0 до 1.5, примерно
от 1.0 до 2.0, примерно от 1.3 до 1.5, примерно от 1.3 до 2.0, примерно от 1.3 до 2.5, примерно от 1.5 до 2.0, примерно от 1.5 до 2.5 или примерно от 2.0 до 2.5).
Согласно любому из вышеприведённых вариантов изобретения "головной" участок, хвостовой участок, метка первого структурного элемента, метка второго структурного элемента, метки одного или более дополнительных структурных элементов, метка, идентифицирующая библиотеку, используемая метка и/или метка ориджина, если таковые имеются, могут включать от 5 до 20 нуклеотидов (например, от 5 до 7 нуклеотидов, от 5 до 8 нуклеотидов, от 5 до 9 нуклеотидов, от 5 до 10 нуклеотидов, от 5 до 11 нуклеотидов, от 5 до 12 нуклеотидов, от 5 до 13 нуклеотидов, от 5 до 14 нуклеотидов, от 5 до 15 нуклеотидов, от 5 до 16 нуклеотидов, от 5 до 17 нуклеотидов, от 5 до 18 нуклеотидов, от 5 до 19 нуклеотидов, от 6 до 7 нуклеотидов, от 6 до 8 нуклеотидов, от 6 до 9 нуклеотидов, от 6 до 10 нуклеотидов, от 6 до 11 нуклеотидов, от 6 до 12 нуклеотидов, от 6 до 13 нуклеотидов, от 6 до 14 нуклеотидов, от 6 до 15 нуклеотидов, от 6 до 16 нуклеотидов, от 6 до 17 нуклеотидов, от 6 до 18 нуклеотидов, от 6 до 19 нуклеотидов, от 6 до 20 нуклеотидов, от 7 до 8 нуклеотидов, от 7 до 9 нуклеотидов, от 7 до 10 нуклеотидов, от 7 до 11 нуклеотидов, от 7 до 12 нуклеотидов, от 7 до 13 нуклеотидов, от 7 до 14 нуклеотидов, от 7 до 15 нуклеотидов, от 7 до 16 нуклеотидов, от 7 до 17 нуклеотидов, от 7 до 18 нуклеотидов, от 7 до 19 нуклеотидов, от 7 до 20 нуклеотидов, от 8 до 9 нуклеотидов, от 8 до 10 нуклеотидов, от 8 до 11 нуклеотидов, от 8 до 12 нуклеотидов, от 8 до 13 нуклеотидов, от 8 до 14 нуклеотидов, от 8 до 15 нуклеотидов, от 8 до 16 нуклеотидов, от 8 до 17 нуклеотидов, от 8 до 18 нуклеотидов, от 8 до 19 нуклеотидов, от 8 до 20 нуклеотидов, от 9 до 10 нуклеотидов, от 9 до 11 нуклеотидов, от 9 до 12 нуклеотидов, от 9 до 13 нуклеотидов, от 9 до 14 нуклеотидов, от 9 до 15 нуклеотидов, от 9 до 16 нуклеотидов, от 9 до 17 нуклеотидов, от 9 до 18 нуклеотидов, от 9 до 19 нуклеотидов, от 9 до 20 нуклеотидов, от 10 до 11 нуклеотидов, от 10 до 12 нуклеотидов, от 10 до 13 нуклеотидов, от 10 до 14 нуклеотидов, от 10 до 15 нуклеотидов, от 10 до 16 нуклеотидов, от 10 до 17 нуклеотидов, от 10 до 18 нуклеотидов, от 10 до 19 нуклеотидов, от 10 до 20 нуклеотидов, от 11 до 12 нуклеотидов, от 11 до 13 нуклеотидов, от 11 до 14 нуклеотидов, от 11 до 15 нуклеотидов, от 11 до 16 нуклеотидов, от 11 до 17 нуклеотидов, от 11 до 18 нуклеотидов, от 11 до 19 нуклеотидов, от 11 до 20 нуклеотидов, от 12 до 13 нуклеотидов, от 12 до 14 нуклеотидов, от 12 до 15 нуклеотидов, от 12 до 16 нуклеотидов, от 12 до 17 нуклеотидов, от 12 до 18 нуклеотидов, от 12 до 19 нуклеотидов, от 12 до 20 нуклеотидов, от 13 до 14 нуклеотидов, от 13 до 15 нуклеотидов, от 13 до 16 нуклеотидов, от 13 до 17 нуклеотидов, от 13 до 18 нуклеотидов, от 13 до 19 нуклеотидов, от 13 до 20 нуклеотидов, от 14 до 15 нуклеотидов, от 14 до 16 нуклеотидов, от 14 до 17 нуклеотидов, от 14 до 18
нуклеотидов, от 14 до 19 нуклеотидов, от 14 до 20 нуклеотидов, от 15 до 16 нуклеотидов, от 15 до 17 нуклеотидов, от 15 до 18 нуклеотидов, от 15 до 19 нуклеотидов, от 15 до 20 нуклеотидов, от 16 до 17 нуклеотидов, от 16 до 18 нуклеотидов, от 16 до 19 нуклеотидов, от 16 до 20 нуклеотидов, от 17 до 18 нуклеотидов, от 17 до 19 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, от 18 до 19 нуклеотидов, от 18 до 20 нуклеотидов, и от 19 до 20 нуклеотидов). Согласно конкретным вариантам изобретения длина "головного" участка, метки первого структурного элемента, метки второго структурного элемента, меток одного или более дополнительных структурных элементов, метки, идентифицирующей библиотеку, применяемой метки и/или метки ориджина репликации, если таковые имеются, составляет менее 20 нуклеотидов (например, менее 19 нуклеотидов, менее 18 нуклеотидов, менее 17 нуклеотидов, менее 16 нуклеотидов, менее 15 нуклеотидов, менее 14 нуклеотидов, менее 13 нуклеотидов, менее 12 нуклеотидов, менее 11 нуклеотидов, менее 10 нуклеотидов, менее 9 нуклеотидов, менее 8 нуклеотидов или менее 7 нуклеотидов).
Согласно конкретным вариантам изобретения метка первого структурного элемента и метка второго структурного элемента содержат одинаковое число нуклеотидов. Согласно другим вариантам изобретения либо метка первого структурного элемента, либо метка второго структурного элемента содержат более 8 нуклеотидов (например, более 9 нуклеотидов, более 10 нуклеотидов, более 11 нуклеотидов, более 12 нуклеотидов, более 13 нуклеотидов, более 14 нуклеотидов и более 15 нуклеотидов). Согласно некоторым вариантам изобретения метка первого структурного элемента представляет собой меченый донор (донорную метку) (по определению в настоящем описании), содержащий от 8 до 20 нуклеотидов (например, от 8 до 9 нуклеотидов, от 8 до 10 нуклеотидов, от 8 до 11 нуклеотидов, от 8 до 12 нуклеотидов, от 8 до 13 нуклеотидов, от 8 до 14 нуклеотидов, от 8 до 15 нуклеотидов, от 8 до 16 нуклеотидов, от 8 до 17 нуклеотидов, от 8 до 18 нуклеотидов, от 8 до 19 нуклеотидов, от 8 до 20 нуклеотидов, от 9 до 10 нуклеотидов, от 9 до 11 нуклеотидов, от 9 до 12 нуклеотидов, от 9 до 13 нуклеотидов, от 9 до 14 нуклеотидов, от 9 до 15 нуклеотидов, от 9 до 16 нуклеотидов, от 9 до 17 нуклеотидов, от 9 до 18 нуклеотидов, от 9 до 19 нуклеотидов, от 9 до 20 нуклеотидов, от 10 до 11 нуклеотидов, от 10 до 12 нуклеотидов, от 10 до 13 нуклеотидов, от 10 до 14 нуклеотидов, от 10 до 15 нуклеотидов, от 10 до 16 нуклеотидов, от 10 до 17 нуклеотидов, от 10 до 18 нуклеотидов, от 10 до 19 нуклеотидов, от 10 до 20 нуклеотидов, от 11 до 12 нуклеотидов, от 11 до 13 нуклеотидов, от 11 до 14 нуклеотидов, от 11 до 15 нуклеотидов, от 11 до 16 нуклеотидов, от 11 до 17 нуклеотидов, от 11 до 18 нуклеотидов, от 11 до 19 нуклеотидов, от 11 до 20 нуклеотидов, от 12 до 13 нуклеотидов, от 12 до 14
нуклеотидов, от 12 до 15 нуклеотидов, от 12 до 16 нуклеотидов, от 12 до 17 нуклеотидов, от 12 до 18 нуклеотидов, от 12 до 19 нуклеотидов, от 12 до 20 нуклеотидов, от 13 до 14 нуклеотидов, от 13 до 15 нуклеотидов, от 13 до 16 нуклеотидов, от 13 до 17 нуклеотидов, от 13 до 18 нуклеотидов, от 13 до 19 нуклеотидов, от 13 до 20 нуклеотидов, от 14 до 15 нуклеотидов, от 14 до 16 нуклеотидов, от 14 до 17 нуклеотидов, от 14 до 18 нуклеотидов, от 14 до 19 нуклеотидов, от 14 до 20 нуклеотидов, от 15 до 16 нуклеотидов, от 15 до 17 нуклеотидов, от 15 до 18 нуклеотидов, от 15 до 19 нуклеотидов, от 15 до 20 нуклеотидов, от 16 до 17 нуклеотидов, от 16 до 18 нуклеотидов, от 16 до 19 нуклеотидов, от 16 до 20 нуклеотидов, от 17 до 18 нуклеотидов, от 17 до 19 нуклеотидов, от 17 до 20 нуклеотидов, от 18 до 19 нуклеотидов, от 18 до 20 нуклеотидов, и от 19 до 20 нуклеотидов).
Определения
Под выражением "2'-замещённый нуклеотид" понимают нуклеотидное основание, содержащее замену в положении 2' рибозы в основании.
Под терминами "около", "примерно" понимают интервал в пределах +/- 10% от указанного значения.
Под термином "бифункциональный" понимают наличие двух реакционноспособных групп, которые способствуют связыванию двух химических фрагментов. Например, бифункциональный линкер означает линкер по описанию в настоящей заявке, имеющий две реакционноспособные (реактивные) группы, которые делают возможным связывание "головного" структурного элемента и химической молекулы.
Под "связыванием" понимают связывание ковалентной связью или нековалентной связью. Нековалентные связи включают связи, образованные под действием сил ван дер Ваальса, водородные связи, ионные связи, захват или физическое инкапсулирование, абсорбцию, адсорбцию и/или другое межмолекулярное взаимодействие. Связывание можно проводить любым приемлемым способом, таким как ферментативное связывание (например, ферментативное сшивание) или химическое связывание (например, химическое сшивание).
Под "структурным элементом (строительным блоком)" понимают структурное звено (единицу, фрагмент) химического соединения, которое непосредственно или опосредованно через каркасную структуру (остов) связано с другими химическими структурными звеньями. Если химическое соединение является полимерным или олигомерным, структурные элементы представляют собой мономерные звенья полимера или олигомера. Структурные элементы могут иметь одну или более узловых точек
разнообразия (вариативности), которые позволяют присоединять один или более структурных элементов или остовов. В большинстве случаев каждая узловая точка разнообразия представляет собой функциональную группу, способную реагировать с одним или более структурных элементов или остовов с образованием химического соединения. Как правило, структурные элементы содержат по меньшей мере две узловых точки разнообразия (или реакционноспособные функциональные группы), но некоторые структурные элементы могут иметь один узел разнообразия (или реакционноспособную функциональную группу). Или же стадии кодирования или связывания химических соединений могут включать несколько химических компонентов (например, многокомпонентные реакции конденсации или многостадийные процессы). Реакционноспособные группы в двух различных структурных элементах должны быть комплементарными, т.е. способными реагировать друг с другом с образованием ковалентной или нековалентной связи.
Под "меткой структурного элемента" понимают олигонуклеотидный участок библиотеки, который кодирует присоединения (например, с помощью связывания) компонента (т.е. остова или структурного элемента), "головной" фрагмент библиотеки, идентичность (тождественность) членов библиотеки, применение библиотеки и/или ориджин (начальную точку) репликации члена библиотеки. Под "меченым акцептором" ("акцепторной меткой") понимают метку структурного элемента (метку, кодирующую структурный элемент), содержащую реакционноспособную (реактивную) группу (например, гидроксильную группу на З'-конце в случае ферментативного сшивания). Под "меченым донором" (донорной "меткой") понимают метку структурного элемента, содержащий группу, способную реагировать с реакционноспособной группой в "меченом акцепторе" ("акцепторной метке") (например, фосфорильную группу на 5 '-конце в случае ферментативного связывания).
Под "химическим соединением" понимают соединение, содержащее один или более структурных элементов и, необязательно, остов. Химическое соединение может представлять собой любое низкомолекулярное соединение (малую молекулу) или пептидное лекарство или потенциальное лекарство, смоделированное или созданное таким образом, чтобы оно имело одно или более заданных свойств, например, способность связываться с биологической мишенью, растворимость, доноров и акцепторов с водородной связью, степени свободного вращения вокруг связей, положительный заряд, отрицательный заряд и т.п. Согласно некоторым вариантам изобретения помимо этого химическое соединение может реагировать далее как бифункциональное или трифункциональное (или более полифункциональное) соединение.
Под "парой, вступающей в совместную химическую реакцию" ("реагирующей друг с другом парой") понимают пару реакционноспособных групп, которые участвуют в модульной реакции (реакции модульных элементов) с высоким выходом и высоким термодинамическим выигрышем. Типичные реакции и реагирующие друг с другом пары включают реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения Хьюсгена пары необязательно замещённой алкинильной группы и необязательно замещённой азидогруппы; реакцию Дильса-Альдера пары необязательно замещённого диена, содержащего систему 4л электронов, и необязательно замещённого диенофила или необязательно замещённого гетеродиенофила, имеющего 2л электронную систему; реакцию сшивания (лигирования) с использованием шунта с участием фосфоротиоатной группы и атома иода; реакцию аминирования с участием альдегидной группы и аминогруппы, по настоящему описанию.
Под "комплексом" или "сшитым (лигированным) комплексом" понимают "головной" фрагмент, который функционально связан с химическим соединением и/или с одной или более олигонуклеотидных меток (меченых олигонуклеотидов) ковалентной или нековалентной связью. Комплекс может, необязательно, включать бифункциональный линкер между химическим соединением и N-концевым фрагментом.
Под "компонентом (составляющим)" химического соединения понимают либо остов, либо структурный элемент.
Под "узловой точкой разнообразия" понимают функциональную группу в положении в остове или структурном элементе, которая позволяет присоединять другой структурный элемент.
Под "N- концевым фрагментом" понимают исходный (начальный) олигонуклеотид для синтеза библиотеки, который функционально связывается с химическим соединением с образованием метки структурного элемента. Необязательно "головной" фрагмент связывается с компонентом через бифункциональный линкер.
Под "библиотекой" понимают совокупность молекул или химических соединений. Необязательно, молекулы или химические соединения связаны с одним или более олигонуклеотидов, которые кодируют молекулы или участки химического соединения.
Под "линкером" понимают химическое связывающее соединение, которое связывает "головной" фрагмент с химическим соединением.
Под "поливалентным катионом" понимают катион, способный образовывать более одной связи с более чем одним лигандом или анионом. Поливалентный катион может образовывать либо ионный комплекс, либо координационный комплекс. Типичные поливалентные катионы включают катионы щелочноземельных металлов (например, магния) и переходных металлов (например, магния (II) или кобальта (III)) и катионы,
которые необязательно связаны с одним или более анионов и/или одним или более одновалентных полидентатных лигандов, таких как хлорид, амин и/или этилендиамин.
Под "олигонуклеотидом" понимают полимер нуклеотида, имеющий 5'-конец и 3'-конец и один или более нуклеотидов внутри цепи в положении между 5'- и 3'-концами. Олигонуклеотид может включать ДНК, РНК или любое их производное, известное в уровне техники, которое можно синтезировать и применять для узнавания пары оснований. Основания в олигонуклеотидах необязательно расположены последовательно друг за другом, но могут перемежаться линкерными частицами. Олигонуклеотидный полимер может включать природные основания (например, аденозин, тимидин, гуанозин, цитидин, уридин, дезоксиаденозин, дезокситимидин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин, инозин или диаминопурин), аналоги оснований (например, 2-аминоаденозин, 2-тиотимидин, инозин, пирролопиримидин, 3-метиладенозин, С5-пропинилцитидин, С5-пропинилуридин, С5-бромуридин, С5-фторуридин, С5-иодуридин, С5-метилцитидин, 7-деазааденозин, 7-деазагуанозин, 8-оксоаденозин, 8-оксогуанозин, 0(6)-метилгуанин и 2-тиоцитидин), модифицированные нуклеотиды (например, 2'-замещённые нуклеотиды, такие как 2'-0-метилированные основания и 2'-фтор основания), интеркалирующие основания, модифицированные сахара (например, 2'-фторрибозу, рибозу, 2'-дезоксирибозу, арабинозу и гексозу) и/или модифицированные фосфатные группы (например, фосфоротиоаты и 5'-М-фосфорамидитные связи). Другие модифицированные основания представлены в настоящем описании. Под "акцепторным олигонуклеотидом" понимают олигонуклеотид, имеющий реакционноспособную группу (например, гидроксильную группу на З'-конце в случае ферментативного сшивания или необязательно замещённую азидогруппу в случае химического сшивания). Под "донорным олигонуклеотидом" понимают олигонуклеотид, содержащий группу, способную реагировать с реакционноспособной группой на акцепторном олигонуклеотиде (например, фосфорильную группу на 5'- конце в случае ферментативного сшивания или необязательно замещённую алкинильную группу в случае химического сшивания).
Выражения "функционально связанный" или "функционально ассоциированный" означают, что две или более химических структуры непосредственно или опосредованно связаны друг с другом таким образом, чтобы оставаться связанными в ходе различных предполагаемых манипуляций. Как правило, химическое соединение и "головной" фрагмент функционально связаны опосредованно (например, ковалентной связью с помощью соответствующего линкера). Например, линкер может представлять собой бифункциональную частицу с сайтом связывания химического соединения и сайтом связывания "головного" фрагмента. Помимо этого, химическое соединение и меченый
олигонуклеотид (олигонуклеотидная метка) могут функционально связываться непосредственно или опосредованно (например, ковалентной связью с помощью соответствующего линкера).
Под "защитной группой" понимают группу, предназначенную для защиты 3'-конца или 5'-конца олигонуклеотида от участия в нежелательных реакциях в ходе одной или более стадий мечения ДНК-кодированной библиотеки. Обычно применяемые защитные группы описаны в монографии Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis," 4th Edition (John Wiley & Sons, New York, 2007), которая включена в настоящее изобретение посредством отсылки. Типичные защитные группы включают необратимые защитные группы, такие дидезоксинуклеотиды и дезоксинуклеозиды (ddNTP или ddN), и, более предпочтительно, обратимые защитные группы для гидроксильных групп, такие как сложноэфирные группы (например, группы О-(а-метоксиэтил), О-изовалерил и О-левулинил), тритильные группы (например, диметокситритил и монометокситритил), ксантенильные группы (например, 9-фенилксантен-9-ил и 9-(п-метоксифенил)ксантен-9-ил), ацильные группы (например, феноксиацетил и ацетил) и силильные группы (например, трет-бутилдиметилсилил).
Под "очисткой" понимают удаление любого непрореагировавшего продукта или любого агента, присутствующего в реакционной смеси, который может понизить активность химического или биологического агента, используемого на следующей стадии. Очистка может включать одну или более операций, выбранных из: хроматографического разделения, электрофоретического разделения и осаждения непрореагировавшего продукта или реагента, который следует удалить.
Под "остовом" понимают химический агент, который идентифицирует одну или более узловых точек разнообразия в специфическом заданном геометрическом положении. Узловые точки разнообразия обычно связываются с остовом в процессе синтеза библиотеки, но в некоторых случаях одна узловая точка разнообразия может быть связана с остовом до синтеза библиотеки (например, присоединение одного или более структурных элементов и/или одной или более меток). Согласно одному варианту изобретения остов дериватизируют таким образом, чтобы он мог быть ортогонально защищенным в процессе синтеза библиотеки, а затем реагировал с различными узловыми точками разнообразия.
Под "низкомолекулярным" лекарственным веществом (малой молекулой) или "низкомолекулярным" потенциальным лекарственным веществом понимают молекулу с примерной молекулярной массой ниже 1000 Дальтон. Низко молекулярные вещества (малые молекулы) могут быть органическими или неорганическими, выделенными
(например, из библиотеки соединений или из натуральных источников) или полученными дериватизацией известных соединений.
Под выражениями "по существу идентичность" ("практическая идентичность") или "по существу (практически) идентичный" понимают полипептидную или полинуклеотидную последовательность, соответственно, такую же, как эталонная последовательность, или имеющую указанное процентное содержание одинаковых аминокислотных остатков или нуклеотидов, соответственно, в соответствующем положении в эталонной последовательности при оптимальном выравнивании двух последовательностей. Например, аминокислотная последовательность, "по существу (практически) идентичная" эталонной последовательности, по меньшей мере на 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична эталонной аминокислотной последовательности. Для полипептидов протяжённость сравниваемых последовательностей обычно составляет по меньшей мере 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 прилегающих друг к другу (смежных, соседних) аминокислот, более предпочтительно, по меньшей мере 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 или 350 смежных аминокислот, и наиболее предпочтительно, полноразмерную аминокислотную последовательность. Для нуклеиновых кислот протяжённость сравниваемых последовательностей обычно составляет по меньшей мере 5 смежных нуклеотидов, предпочтительно, по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 смежных, и наиболее предпочтительно, полноразмерную нуклеотидную последовательность. Идентичность последовательностей можно измерять с применением программ анализа последовательностей с настройкой по умолчанию (например, пакет программ для анализа последовательностей, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Такая программа может сравнивать (подбирать под пару) аналогичные последовательности, присваивая степени гомологии различным заменам, делециям и другим модификациям.
Под "С-концевым фрагментом" понимают участок олигонуклеотида из библиотеки, который связывается с комплексом после присоединения меток всех структурных элементов и кодирует идентичность (тождественность) библиотеки, применение библиотеки и/или ориджин репликации члена библиотеки.
Другие признаки и преимущества изобретения станут очевидными из нижеприведённых сведений, подтверждающих возможность осуществления изобретения, и Формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На Фигуре 1 показан типичный общий метод синтеза химических библиотек с применением однонитевых ДНК-меток, которые последовательно соединяются друг с другом с помощью ферментативного и/или химического сшивания. Сокращение "ВВ" относится к структурному элементу.
На Фигурах 2А-2В показаны типичные методы мечения библиотек с помощью однонитевых ДНК с использованием ферментативного сшивания. На Фигуре 2А показан типичный метод мечения библиотек с применением однонитевого ферментативного сшивания с защищенным (реинсталлированным) 5'-монофосфат (5'-Р)-замещённым олигонуклеотидом, причём боксы, закрашенные серым, относятся к 2'-ОМе нуклеотидам, "X" относится к защитной группе или к компоненту химического структурного элемента, a "PNK" относится к полинуклеотидкиназе. На Фигуре 2В показан типичный метод мечения библиотек с применением однонитевого сшивания с защищенным З'-ОН олигонуклеотидом, причём боксы чёрного цвета, связанные с -О-, относятся к защитной группе З'-ОН конца, a "LC" означает отделение (после гидролиза) защитной группы методом жидкостной хроматографии.
На Фигуре 3 показан типичный метод мечения библиотек с применением однонитевого сшивания с 5'-преаденилированным (обозначенным "5'-Арр") олигонуклеотидом ("головной" фрагмент) с 3'-концом, который блокирован, например, химическим структурным элементом (обозначенным "Х-3"'). Этот метод можно применять для сшивания меченого 5'-фосфорилированного олигонуклеотида (обозначенного "Tag А") с головным структурным элементом и дополнительными метками, имеющими З'-ОН конец (обозначенными "Tag В" и "Tag С") с комплексом в присутствии АТФ.
На Фигурах 4А-4Е показаны типичные комплексы, каждый из которых содержит "головной" структурный элемент, линкер, малую молекулу, включающую каркасную структуру ("S") и узловые точки разнообразия А, В и С. Тёмно-серые боксы относятся к 2'-ОМе нуклеотидам, а пунктирными линиями обозначены одно или более комплементарных оснований. На Фигурах 4А-4В схематически представлены комплексы, имеющие однонитевой линейный олигонуклеотидный "головной" структурный элемент, где линкер и малая молекула связаны с З'-концом (Фигура 4А) или 5'-концом (Фигура 4В) "головного" структурного элемента. На Фигурах 4C-4D схематически представлены комплексы, содержащие однонитевой шпилечный олигонуклеотидный "головной" структурный элемент, где линкер и малая молекула соединены с внутренним положением (Фигура 4С) или с 3'- концом (Фигура 4D) "головного" структурного элемента. На
Фигуре 4Е показан типичный способ мечения библиотек, имеющих шпилечный олигонуклеотидный "головной" структурный элемент, где звёздочкой отмечен химический структурный элемент, a "Y" на З'-конце означает защитную группу. Олигонуклеотидные метки помечены 1-4, а адапторная последовательность показана чёрной линией на 5'-конце.
На Фигурах 5А-5С показано сшивание олигонуклеотидов с помощью Т4 РНК
лигазы или CircLigase(tm) онДНКлигазы. На Фигуре 5А схематически представлена
ферментативная реакция сшивания. Донорный олигонуклеотид фосфорилирован на З'-
конце и несёт З'-флуоресцеиновую метку, имитируя "головной" фрагмент с химической
библиотекой на 3' конце. Акцепторный олигонуклеотид не является
фосфорилированным. На Фигуре 5В показан анализ методом гель-электрофореза реакции сшивания в системе 8М мочевина/ 15% полиакриламидный гель (PAAG). "SM" относится к меченному флуоресцентной меткой донору, "Продукт" означает продукт сшивания и "Аденилированный донор" относится к 5'Арр-донору, описанному выше. На Фигуре 5С показано сшивание с высоким выходом, осуществляемое с помощью Т4 РНК-лигазы при высоких концентрациях фермента и олигонуклеотида.
На Фигурах 6А-6В представлена оптимизация молекулярной массы (Фигура 6А) и концентрации ПЭГ (Фигура 6В) с целью достижения максимального выхода сшивания с использованием Т4 РНК-лигазы. Условия реакции описаны выше на Фигурах 5А-5С. На Фигуре 6А представлена диаграмма, показывающая результаты количественного электрофоретического анализа реакции сшивания с МНА/ДНК 15-мерными донорной и акцепторной метками после инкубации в течение 5 или 20 часов с 25% (вес/об) ПЭГ (PEG) с молекулярной массой от 300 до 20000 (20К). На Фигуре 6В показано влияние концентрации на сшивание после инкубации в течение 18-20 часов в присутствии от 5% до 45% (вес/об) PEG4600.
На Фигурах 7А-7В показана корреляция между эффективностью сшивания с помощью CircLigase(tm) (Фигура 7А) и Т4 РНК-лигазы (Фигура 7В) и длиной донорного и акцепторного олигонуклеотидов. На Фигуре 7А приводится кривая, количественно показывающая влияние длины акцептора на выход сшивания в реакции сшивания с участием CircLigase(tm) . На Фигуре 7В представлены диаграмма и таблица, где количественно показано влияние длины олигонуклеотида акцепторной и донорной МНА/ДНК меток на однонитевое сшивание с участием Т4 РНК лигазы. Эти результаты представляют собой средние данные из двух независимых экспериментов, полученные с использованием денситометрии флуоресцентных гелей с длиной волны возбуждающего света 450 нм.
На Фигурах 8А-8В представлены LC-MS спектры для МНА/ДНК метки до и после фосфорилирования. Результаты показаны для 15 мерной метки 5'-HO-mUAC GTA ТАС GAC TGmG-OH-3' (SEQ ID NO: 13) (в концентрации 250 мкМ) до (Фигура 8А) и после (Фигура 8В) реакции с Т4 полинуклеотидкиназой (50 единиц на 5 нмолей метки).
На Фигуре 9 показан гель после гель-электрофореза в случае последовательного однонитевого сшивания меток А-С. 3'-конец включал флуоресцеин, чтобы представить соединение из библиотеки (или химический фрагмент), а звёздочка (*) показывает очистку продукта сшивания (или комплекса) перед фосфорилированием.
На Фигурах 10А-10В схематически показана реакция "реагирующей друг с другом пары" между донорным и акцепторным нуклеотидами, в результате которой образуется 5-атомный "короткий" спейсер (Фигура 10А) и 24-атомный "длинный" спейсер (Фигура 10В).
На Фигурах НА-НЕ представлены результаты обратной транскрипции (ОТ, RT) и ПЦР (PCR)- анализа 75-мерных ДНК-матриц, содержащих короткий или длинный единичный спейсер, представленный на Фигурах 10А-10В. На Фигуре ПА схематически представлена RT реакция. LC-MS спектры RT реакции регистрировали как при 260 нм, так и при 650 нм для контрольной 75-мерной ДНК-матрицы (Фигура 11В), 75мерной ДНК-матрицы, содержащей единичный 5-атомный ("короткий") спейсер (Фигура 11 С), и 75-мерной ДНК-матрицы, содержащей единичный 24-атомный ("длинный") спейсер (Фигура 11D). На Фигуре НЕ показан RT-PCR (ОТ-ПЦР) анализ контрольной 75-мерной ДНК матрицы ("templ75"), 75-мерной ДНК-матрицы с единичным 5-атомным ("коротким") спейсером ("короткий клик") и 75-мерной ДНК-матрицы с единичным 24-атомным ("длинным") спейсером ("длинный клик").
На Фигурах 12A-12G показаны результаты реакции химического сшивания между 5'-иод-мо дифицированным ДНК олигонуклеотидом и З'-фосфоротиоат-ДНК олигонуклеотидом в присутствии или в отсутствие комплементарного олигонуклеотидного шунта. На Фигуре 12А представлена типичная схема реакции. 5'-иод олигонуклеотид мечен на З'-конце меткой 6-FAM, тогда как З'-фосфоротиоат олигонуклеотид мечен с помощью Су5 на 5'-конце. На Фигуре 12В показан анализ методом гель-электрофореза реакций сшивания в присутствии (+spl) или в отсутствие (-spl) комплементарного шунта. ССу5 и CFL дают видимые полосы меченного с помощью Су5 и флуоресцеина исходного материала, соответственно. На Фигуре 12С показана зависимость реакции сшивания в присутствии олигонуклеотидного шунта от времени в указанных выше условиях, количественные данные получены с использованием детекции Су5 (635 нм) и флуоресцеина (450 нм). На Фигуре 12D представлен LC-MS анализ
сшивания CFL и ССу5 в отсутствие (вверху, при 260 нм, 495 нм и 650 нм) и в присутствии (внизу, при 260 нм, 495 нм и 650 нм) шунта, где реакционные смеси для сшивания инкубировали в течение семи дней. На Фигуре 12Е показан LC-MS анализ сшивания CFL и ССу5 в отсутствие шунта (при 260 нм, 495 нм и 650 нм), где реакционные смеси для сшивания инкубировали в течение восьми дней. На Фигуре 12F показан MS анализ (масс-спектры) реакции CFL олигонуклеотида с пиперидином, причём эта реакция предполагалась для замещения иода. Условия реакции включали: олигонуклеотиды 100 мкМ, пиперидин 40 мМ (400 эквивалентов) в 100 мМ боратного буфера, рН 9.5, в течение 20 час при комнатной температуре (слева); олигонуклеотиды 400 мкМ, пиперидин 2 М (4000 эквивалентов) в 200 мМ боратного буфера, рН 9.5, в течение 2 час 65°С (справа). На Фигуре 12G показан MS анализ реакции сшивания в присутствии шунта CFL и ССу5 олигонуклеотидов в количестве 50 мкМ, проводимой в присутствии 400 эквивалентов пиперидина в 100 мМ боратного буфера, рН 9.5, в течение 20 час при комнатной температуре.
На Фигурах 13А-13С показано применение модифицированных олигонуклеотидов для минимизации шаффлинга. На Фигуре 13А показан LC-MS анализ реакции однонитевого сшивания 5'-фосфорилированной "головной" онНР (3636 Да) и метки (метка 15; 2469 Да), содержащей 2'-О метилнуклеотиды. В LC-MS спектре наблюдаются три пика: пик 1 для метки (2469 Да); пик 2 для аденилированного "головного фрагмента" (3965 Да); и пик 3, имеющий два (в некоторых случаях три) боковых пика ("субпика"), соответствующие продуктам с молекулярными массами 6089 Да (ожидаемый продукт сшивания); 5769 Да (ожидаемый продукт с массой 6089 Да -320 Да); и 6409 Да (ожидаемый продукт с массой 6089 Да + 320 Да). Эта разница в массе 320 Да точно соответствует либо отрыву, либо присоединению дополнительного 2'-0-Ме С нуклеотида. На Фигурах с 13В-1 по 13В-3 показан неограничивающий предполагаемый механизм шаффлинга нуклеотидов, где получают около 90% предполагаемого (нормального) продукта сшивания и около 10% продуктов аномальной реакции сшивания ("Продукт -1 нт" и "Продукт + 1 нт"). На Фигуре 13С представлен LC-MS анализ сшивания "головного" фрагмента (структурного элемента) HP-PS с меткой 15. "Головной" фрагмент HP-PS имеет последовательность "головного" фрагмента онНР, но включает фосфоротиоатную связь на 5'-конце. LC анализ показал три пика: пик 1 для метки (2469), пик 2 для аденилированного "головного" фрагмента (3984) и пик 3 для единственного продукта сшивания (6107), при этом почти не наблюдается никакого шаффлинга нуклеотидов. Следы +/- 320 пиков, по-видимому, соответствуют окислительному
превращению фосфоротиоатной связи в исходную (нативную) фосфодиэфирную связь или вызваны неполным сульфированием.
На Фигуре 14 представлен график, показывающий разделение членов библиотеки с помощью гель-хроматографии, где связанные с мишенью члены библиотеки (слева на графике) вымываются (элюируются) быстрее, чем несвязанные члены библиотеки (справа на графике).
На Фигуре 15А схематически показано химическое сшивание кодирующих ДНК-меток с использованием одного химического реагента, не зависящего от шунта, например 5'- азидо/3'- алкинила. Реакционноспособные группы присутствуют на 3' и 5' концах каждой метки (Метки А, В и С), а одна из реакционноспособных групп на любом конце (например, на 3' конце) защищена с целью предотвратить циклизацию, полимеризацию меток или неправильный цикл сшивания меток. Цикл сшивания меток включает химическое сшивание с последующей депротекцией оставшейся функциональной группы, чтобы растущий сшитый фрагмент смог участвовать в следующем цикле сшивания. Каждый цикл включает присоединение одного или более структурных элементов (ВВА, ВВВ и ВВС, которые кодируются Меткой А, В и С, соответственно). Процесс химического сшивания необязательно может включать присоединение хвостового фрагмента (структурного элемента).
На Фигуре 15В представлена типичная схема, показывающая химическое сшивание кодирующих ДНК меток с применением шунт-независимого единственного химического реагента. Зависящий от матрицы характер этого метода снижает частоту событий полимеризации метки, циклизации метки, а также неправильного введения метки. Аналогично схеме на Фигуре 15А эта схема включает метки (Метка А, В и С) и один или более структурных элементов, кодированных метками (ВВА, ВВВ и ВВС).
На Фигуре 15С представлена типичная схема, показывающая последовательное применение химически сшитых меток в качестве матриц для матричной полимеризации, дающей кДНК, способную к ПЦР-амплификации и секвенированию, а также применение матричной полимеразы (ДНК-зависимой полимеразы), способной считывать с использованием химически сшитых участков соединения.
На Фигуре 16А показана типичная схема, где представлено химическое сшивание кодирующих ДНК-меток с использованием TIPS-защищённых алкинильных меток и "клик" химии. Каждый цикл синтеза библиотеки включает катализируемое Cu(I) химическое сшивание TIPS-защищённой метки с алкином из предыдущего цикла после его депротекции.
После сшивания TIPS группу удаляют (снимают защиту), активируя тем самым алкин для следующей стадии сшивания.
На Фигуре 16В показана структура DMT- сукцинил- З'-O-TIPS- пропаргилуридина CPG, который применяется для инициирования твердофазного синтеза олигонуклеотидов, содержащих З'-O-TIPS- пропаргилуридиновую группу на 3'- конце.
На Фигуре 16С представлена типичная схема, на которой показано применение последовательного сшивания меток методом "клик" химии для матричной полимеризации с образованием кДНК, способной к ПЦР-амплификации и секвенированию, а также применение "матричной" полимеразы (ДНК- зависимой полимеразы), способной считывать участки соединений, полученных методом "клик-химии".
На Фигурах 17А-17С показан синтез 5'-биотинилированных полученных с помощью одного "клика" ("однокликовых") матриц Y55 и Y185. На Фигуре 17А представлена типичная схема. На Фигуре 17В и на Фигуре 17С показаны LC-MS спектры Y55 и Y185, соответственно.
На Фигурах 18А-18С представлена схема типичного анализа "прочитывания
терминатора" с "однокликовой" матрицы. На Фигуре 18А представлена схема, в которой
праймер, меченный с помощью FAM, присоединяется к биотинилированной матрице и
инкубируется с "матричной" (ДНК-зависимой) полимеразой в условиях,
рекомендованных производителем. Затем комплексы инкубировали со
стрептавидиновыми бусами, отмывали, элюировали с помощью NaOH и нейтрализовали. После нейтрализации образцы анализировали методом LC-MS. На Фигуре 18В и на Фигуре 18С показаны LC-MS спектры продукта матричной репликации Y55 и Y185, соответственно, с фрагментом Клёнова.
На Фигурах 19A-19D представлен синтез 5'- биотинилированной полученной "двойным кликом" YDC матрицы и полученной "тройным кликом" YTC матрицы с использованием алкинильной метки с защитной группой TIPS. На Фигурах 19А и 19В показаны типичные схемы этого синтеза. На Фигурах 19С и 19D показан LC-MS спектр YDC и YTC матриц, соответственно.
На Фигурах 20А-20С представлено типичное "прочитывание терминатора" продуктов "клик-химии" с применением матриц, полученных в результате "двойного клика" и "тройного клика". На Фигуре 20А представлена схема, на которой праймер, меченный FAM, присоединяется к биотинилированной матрице (отжигается с матрицей) и инкубируется с фрагментом Клёнова ДНК-полимеразы I E.coli в условиях, рекомендованных производителем. Комплексы инкубировали с магнитными стрептавидиновыми бусинами, отмывали, элюировали NaOH и нейтрализовали. После
нейтрализации образцы анализировали методом LC-MS. На Фигурах 20В и 20С показаны спектры LC-MS спектры продуктов матричной репликации YDC и YTC, соответственно, с фрагментом Клёнова.
На Фигуре 21 представлена столбчатая диаграмма, показывающая эффективность "прочитывания терминатора" с кликов с использованием матриц, полученных "одним кликом", "двойным кликом" "тройным кликом", по сравнению с ДНК-матрицей без использования "клик-химии". Эти результаты получены с помощью "прочитывания терминатора" по настоящему описанию, и выход определяли методом LC MS путём сравнения с внутренним стандартом.
На Фигурах 22А-22С представлены типичные схемы методов химического сшивания ДНК кодирующих меток, в которых (i) применяются два последовательных ортогональных химических реагента для (ii) доступных методов прочитывания терминатора. Каждая метка содержит две ортогональных реакционноспособных группы, указанных различными символами для 5'- конца и 3'- конца каждой метки. В каждом следующем цикле химического сшивания применяют ортогональный (независимый) реагент. Эта стратегия снижает частоту событий ошибочного мечения и может также применяться без защиты реакционноспособных конечных групп. На Фигуре 22В представлена схема "прочитывания терминатора" с помощью матричной полимеризации с матрицы, полученной методом ортогонального химического сшивания или ортогональных ДНК-меток с образованием кДНК, с использованием которой можно установить последовательность меток. Фигура 22С аналогична Фигуре 22В, но включает самоинициирующийся хвостовой фрагмент, который можно превратить в двухнитевой расщеплением рестриктазой, чтобы содействовать разделению нитей в процессе ПЦР-амплификации.
На Фигуре 23 представлена типичная схема, показывающая стратегию химического сшивания для ДНК-кодирующих меток, в которой используются два специфических последовательных ортогональных реагента. Каждая метка содержит клик-реактивную (реакционноспособную) и фосфоротиоат/иод-реактивную группы. Метки, несущие ортогональные реактивные группы на 3' и на 5' концах, не могут полимеризоваться, в этом случае события ошибочного мечения происходят реже. Без связи с теорией можно сказать, что такой подход может сделать ненужным TIPS-защиту З'-алкина. В цикле А 5'-иод/3'-алкинильная метка сшивается с помощью олигонуклеотидного шунта с З'-фосфоротиоатным "головным" фрагментом, при этом реакционноспособный (реактивный) 3' алкин остаётся для следующего цикла
химического сшивания с 5'-азидо/3'-фосфоротиоатной меткой. Циклы ортогонального сшивания можно повторять столько раз, сколько потребуется.
На Фигурах 24А-24В показана защита и применение 3'-фосфоротиоат/5'-иодсодержащих групп в ДНК метках. На Фигуре 24А показана типичная схема применения защитных групп (PG) для этих меток. На Фигуре 24В показана типичная схема применения 3'-фосфоротиоат/5'-иодсодержащих меток для химического сшивания последовательного ряда кодирующих ДНК-меток, которые кодируют химическую библиотеку, вводимую на 5'- конце за счёт ковалентного связывания.
На Фигурах 25А-25В показана защита и применение З'-фосфоротиоатных групп в ДНК метках. На Фигуре 25А показана схема защитного действия этих. На Фигуре 25В показана схема применения 3'-фосфоротиоат/5'-азидо и 3'-пропаргил/5'-иодсодержащих меток для химического сшивания последовательного ряда ортогональных кодирующих ДНК меток, которые кодируют химическую библиотеку, вводимую на 5'- конце за счёт ковалентного связывания.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение предусматривает способ применения однонитевого сшивания для введения олигонуклеотидных меток в комплексы химическое соединение-олигонуклеотид. Этот способ можно применять для создания разнообразных библиотек селективных химических соединений путём установления кодированного соотношения между конкретными метками и конкретными химическими реакциями или структурными элементами. Для идентификации одного или более химических соединений олигонуклеотидные метки можно амплифицировать, клонировать, секвенировать и коррелировать, применяя установленное соотношение. В частности, были определены условия реакции, которые могут стимулировать однонитевое сшивание меток. Эти условия включают применение одного или более 2'-замещённых нуклеотидов (например, 2'-0-метилнуклеотидов или 2'-фторнуклеотидов) внутри меток, применение меток определённой длины (например, между 5 и 15 нуклеотидами), применение одного или более ферментов (например, РНК-лигазы и/или ДНК-лигазы) и/или применение одного или более агентов в процессе сшивания (например, полиэтиленгликоля и/или растворимого поливалентного катиона, такого как Со(МНз)бСЬ).
Далее, эти способы включают методы химического связывания олигонуклеотидов, так чтобы последовательность связанного олигонуклеотидного продукта можно было бы использовать в качестве матрицы для матричной полимеризации. Способы создания библиотек этих комплексов и введения в них меток (их мечения) подробно описаны ниже.
Способы введения меток (мечения) в кодированные библиотеки
Данное изобретение относится к способу функционального связывания олигонуклеотидных меток с химическими соединениями таким образом, чтобы можно было установить закономерности кодирования между последовательностью метки и структурными ячейками (структурными элементами) химического соединения. В частности, чтобы идентичность и/или "историю" химического соединения можно было вывести из последовательности оснований в олигонуклеотиде. Используя этот способ, можно применить метку с конкретной последовательностью к библиотеке, включающей разнообразные химические соединения или члены (например, низкомолекулярные соединения (малые молекулы) или пептиды).
Как правило, эти способы включают применение "головного" фрагмента, содержащего одну функциональную группу, которую можно получить химическими методами, и по меньшей мере одну функциональную группу, с которой может быть связан (или сшит, лигирован) однонитевой олигонуклеотид. Связывание можно осуществлять любым подходящим методом, таким как ферментативное связывание (например, сшивание с помощью одной или более лигаз из РНК-лигазы и/или ДНК-лигазы) или химическое связывание (например, по реакции замещения между двумя функциональными группами, такими как нуклеофильная и уходящая группа).
Для создания множества химических фрагментов в библиотеке раствор, содержащий "головной фрагмент", можно разделить на большой ряд аликвот, а затем поместить их во множество физически раздельных ячеек, таких как лунки многолуночного планшета. Обычно это стадия "разделения" образца. В каждой ячейке или лунке последовательно проводят стадии химической реакции и сшивания однонитевой метки в каждой аликвоте. Регистрируют зависимость между условиями реакции и последовательностью однонитевой метки. Стадии реакции и сшивания можно проводить в любом порядке. Затем аликвоты с прореагировавшим и сшитым продуктом объединяют или "смешивают", и в этот момент, необязательно, можно проводить очистку. Стадии разделения и смешения, необязательно, можно неоднократно повторять.
Затем можно проводить тестирование и/или селекцию библиотеки на конкретную характеристику или функцию по настоящему описанию. Например, смесь меченых химических соединений можно разделить по меньшей мере на две группы, причём первая группа связывается с конкретной биологической мишенью, а вторая группа не связывается. Затем первую группу соединений можно селективно улавливать (например, элюируя на колонке с нанесённой на неё соответствующей мишенью или инкубируя
аликвоту с соответствующей мишенью) и, необязательно, далее анализировать или тестировать, например, проводя, необязательно, стадии отмывки, очистки, отрицательной селекции или разделения.
Наконец, химические предыстории одного или более членов (или химических фрагментов) в выбранной группе можно определять с помощью последовательности функционально связанного олигонуклеотида. При корреляции последовательности с конкретным структурным элементом этим методом можно идентифицировать индивидуальных членов библиотеки с выбранными характеристиками (например, повышенной склонностью к связыванию с целевым белком и вследствие этого вызывать терапевтический эффект). Для последующих тестирования и оптимизации потенциальные терапевтические соединения можно затем получать синтезом идентифицированных членов библиотеки со связанными с ними олигонуклеотидными метками или без них.
На Фигурах 1-3 представлены различные типичные методы введения меток в библиотеки с применением однонитевого сшивания с "головным" фрагментом, где метки можно сшивать на 5'- конце или на 3'- конце "головного" фрагмента. Чтобы контролировать порядок, в котором сшиваются метки, и уменьшить побочные реакции, эти методы гарантируют, что в процессе сшивания участвует (имеется) только один реактивный (реакционноспособный) 5'-конец и один реактивный 3'- конец. Далее, в этих типичных методах в метках применяют 2'- замещённые нуклеотиды (например, смешанные 2'- дезокси/2'-0- метилнуклеотиды), и эти метки ведут себя как матрицы для ДНК или РНК полимеразы, участвующей в матричной полимеризации. Без связи с теорией можно сказать, что применение одного или более 2'- замещённых нуклеотидов (например, 2'-0- метилнуклеотидов и/или 2'- фторнуклеотидов) в метке может стимулировать сшивание с помощью РНК-лигазы за счёт более близкого сходства с РНК, в то же время сохраняя как физическую, так и химическую устойчивость носителя записи, а также способность извлекать информацию о последовательности, используя матричную полимеризацию.
На Фигуре 1 предусматривается типичный способ уменьшения побочных реакций, в котором сшиваемый комплекс и метки созданы таким образом, чтобы избежать нежелательные реакции между реакционноспособными З'-ОН и 5'- монофосфатной ("5'-Р") группами. В частности, на данной схеме изображён метод с циклами фосфорилирование-сшивание. В процессе сшивания только одна З'-ОН группа (в метке) и одна 5'-Р группа (в "головном" фрагменте) являются доступными, и следовательно, возможно только одно событие сшивания. После стадий сшивания и очистки в комплексе образуется 5'- ОН группа, и эту группу можно превратить в 5'-Р, чтобы присоединить
следующие олигонуклеотидные метки. 3'- конец комплекса блокирован группой X, которая может представлять собой защитную группу или компонент химического соединения (например, необязательно включающий линкер, который играет роль спейсера между химическим соединением и "головным" фрагментом).
Как показано на Фигуре 1, типичный метод включает сшивание метки структурного элемента 1 ("метка 1") с 5'- концом "головного" фрагмента, создание в результате этого комплекса и осуществление последующего сшивания с 5'- концом комплекса. Реакционноспособный 5'- конец представляет собой фосфатную группу в комплексе, а реакционноспособный 3'- конец представляет собой гидроксильную группу в метке. После присоединения каждой метки сшитый комплекс отделяют от непрореагировавших несшитых "головного" фрагмента и меток и от других реагентов (например, фосфата кобальта или других реагентов, присутствовавших на стадии сшивания). Отделение можно проводить любым подходящим методом (например, хроматографическим или электрофоретическим разделением сшитых и несшитых продуктов или осаждением реагента). Затем сшитый комплекс экспонируют с агентом (с полинуклеотидкиназой или с химическим фосфорилирующим агентом) с образованием фосфатной группы на 5'- конце комплекса. Стадии выделения (отделения) и фосфорилирования можно проводить в любом порядке. В частности, если на стадии фосфорилирования используют киназу, киназу следует инактивировать или удалить перед добавлением последующих меток, которые могут содержать 5'-ОН группу, или же перед стадией фосфорилирования из реакционной смеси следует удалить любые другие реагенты, которые могут ингибировать киназу.
Согласно другому варианту изобретения метод включает связывание последующих меток с помощью 3'- конца предыдущего сшиваемого комплекса. В соответствии с этим методом сшиваемый комплекс теряет реакционноспособную З'-ОН группу сразу же после стадии сшивания, но содержит группу, которая можно превратить в З'-ОН группу (например, высвобождая защитную группу). На Фигуре 2А схематически представлен типичный метод введения метки на 3'- конце комплекса, а на Фигуре 2В представлена типичная схема реакции для защищенного 3'- конца, в котором после отщепления 3'-связанной защитной группы появляется обратимая З'-ОН группа. Как показано на Фигуре 2А, метка структурного элемента 1 ("метка 1") содержит 3'- защищенную группу. На первой стадии типичный метод включает сшивание метки с 3'- концом "головного" фрагмента, при этом образуется комплекс. Последующее сшивание проводят с 3'- концом комплекса. Реакционноспособный (реактивный) 5'- конец представляет собой фосфатную группу в метке, а реакционноспособный 3'- конец представляет собой гидроксильную
группу в комплексе. После добавления каждой метки сшитый комплекс депротекционируют (например, добавляя гидролизующий агент), снимая 3'- защитную группу.
Согласно ещё одному варианту изобретения метод включает связывание последовательных меток с применением 5'- преаденилированного (5'-Арр) олигонуклеотида и лигазы (например, Т4 РНК-лигазы). В присутствии АТФ (ATP) Т4 РНК лигаза использует АТФ кофактор, образуя перед сшиванием аденилированный интермедиат. В отсутствие АТФ (ATP) Т4 РНК лигаза лишь сшивает преаденилированные олигонуклеотиды, и возможные побочные реакции с 5'-Р олигонуклеотидами не происходят. Таким образом можно осуществлять однонитевое сшивание, при меньшем количестве побочных реакций, с синтезированным химическими методами 5'-Арр олигонуклеотидом в присутствии 5'- фосфорилированной метки, при этом 5'-Арр олигонуклеотид можно сшивать с "головным" фрагментом перед введением метки или с комплексом, полученным после нескольких циклов мечения.
На Фигуре 3 представлена схема, показывающая типичный метод введения метки на 5'- конце преаденилированного "головного" фрагмента. Аденилирование донорного нуклеотида по 5'- фосфатной группе является первой стадией реакции сшивания, и для этой реакции обычно требуется одна молекула АТФ (АТР). На второй стадии З'-ОН группа акцепторного олигонуклеотида реагирует с аденилированным донором и образует сложную диэфирную связь между двумя олигонуклеотидами, тем самым высвобождая одну молекулу AMP. Аденилированная химическими методами 5'- фосфатная группа донорного олигонуклеотида имитирует продукт первой стадии сшивания, и он может быть сшит со вторым олигонуклеотидом в отсутствие АТР. На следующей схеме 5'-Арр "головной" фрагмент сшивается по З'-ОН группе с 5'- фосфорилированной олигонуклеотидной меткой (обозначенной "Метка А"). Благодаря наличию аденилированного 5'- конца олигонуклеотида сшивание может происходить в отсутствие АТР. В этих условиях 5'- фосфатная группа Метки А не служит в качестве донора сшивания. Структурный элемент Метку В можно сшивать, предоставляя нуклеотид, имеющий З'-ОН конец (обозначен "Метка В"), в присутствии АТР, и можно включать дополнительные метки (обозначены "Метка С").
На Фигуре 3 3'- конец "головного" фрагмента можно блокировать любой защитной группой (например, необратимой защитной группой, такой как ddN, или обратимой защитной группой). На первой стадии метод включает сшивание метки с 5'- концом "головного" фрагмента в отсутствие АТР, при этом образуется комплекс. Последующее сшивание проводят с 5'- концом комплекса в присутствии АТР. Этот метод можно
модифицировать, чтобы осуществить следующее сшивание с 3'- концом комплекса. Например, метод может включать применение 5'- преаденилированной метки и "головного" фрагмента, имеющего реакционноспособный З'-ОН конец. Далее, в этом методе может потребоваться блокировать 3'- конец, чтобы избежать перекрёстных реакций между метками, как в методе, описанном выше, на Фигуре 2.
Общий метод, приведённый на Фигуре 3, можно модифицировать заменой праймера на "головной" фрагмент. В этом случае "головной" фрагмент следует аденилировать химическими методами на 5'- конце, а Метку А фосфорилировать на 5'-конце. Сшивание этой фосфорилированной Метки А с аденилированным "головным" фрагментом происходит в тех же самых стандартных условиях, описанных выше, но в отсутствие АТР. Такое условие сшивания позволяет предотвратить сшивание фосфорилированного 5' конца. На следующей стадии для сшивания Метки В требуется, чтобы эта метка содержала свободную (т.е. не фосфорилированную) гидроксильную группу на 5'- конце. Последующие реакции сшивания можно проводить в присутствии АТР, а затем, если требуется дальнейшее расширение меток (например, Метка С на Фигуре 3), следует осуществить фосфорилирование по 5'- концу полученного олигонуклеотида.
Методы по настоящему описанию могут включать любое число возможных стадий, чтобы диверсифицировать библиотеку или детально исследовать членов библиотеки. В любом методе введения меток (мечения) по настоящему описанию (например, в методах на Фигурах), можно добавлять далее "п" число меток с использованием дополнительного "п" числа стадий сшивания, выделения (отделения) и/или фосфорилирования. Типичные необязательные стадии включают рестрикцию членов библиотеки с помощью одной или более рестриктаз; сшивание одной или более адаптерных последовательностей с одним или обоими концами членов библиотеки, например, таким образом, чтобы одна или более адаптерных последовательностей предоставляли инициирующую последовательность для амплификации и секвенирования или предоставляли метку, такую как биотин, для иммобилизации последовательности; обратную транскрипцию или транскрипцию, необязательно с последующей обратной транскрипцией, собранных меток в комплексе с применением обратной транскриптазы или другой "матричной" полимеразы; амплификацию собранных меток в комплексе с применением, например, ПЦР; получение клональных изолятов одной или более популяций собранных меток в комплексе, например, с применением методов бактериальной трансформации, образования эмульсии, разведения, улавливания на поверхности; амплификацию клональных изолятов одной или более популяций собранной метки в комплексе, например, с использованием клональных
изолятов в качестве матриц для матричной полимеризации нуклеотидов; и определение последовательности клональных изолятов одной или более популяций собранных меток в комплексе, например, с использованием клональных изолятов в качестве матриц для матричной полимеризации с нуклеотидами, меченными флуоресцентной меткой. Другие методы амплификации и секвенирования олигонуклеотидных меток представлены в настоящей заявке.
Эти методы можно применять для идентификации и обнаружения любого числа химических фрагментов с конкретной характеристикой или функцией, например, на стадии отбора. Заданную характеристику или функцию можно использовать в качестве основного принципа для разделения библиотеки по меньшей мере на два части с параллельным добавлением заданной функции по меньшей мере к одному из членов или родственных членов в библиотеке. Согласно конкретным вариантам изобретения метод включает идентификацию низкомолекулярного подобного лекарству члена библиотеки, который связывает или инактивирует белок, представляющий терапевтический интерес. Согласно другому варианту изобретения планируют последовательность химических реакций, и набор структурных элементов выбирают таким образом, чтобы реакция выбранных структурных элементов в определённых химических условиях давала бы комбинаторное множество молекул (или комбинаторную библиотеку молекул), в которой одна или более молекул могли бы применяться в качестве терапевтического агента для конкретного белка. Например, выбирают химические реакции и структурные элементы таким образом, чтобы создать библиотеку, содержащую структурные группы, обычно присутствующие в ингибиторах киназ. В некоторых таких примерах метки кодируют химическую историю члена библиотеки и, в каждом случае, совокупность химических возможностей может быть представлена любой конкретной комбинацией меток.
Согласно одному варианту изобретения библиотека химических фрагментов, или её часть, вступает в контакт с биологической мишенью в условиях, подходящих для связывания с мишенью по меньшей мере одного члена библиотеки, с последующим удалением членов библиотеки, которые не связываются с мишенью, и анализом одной или более связанных с ними олигонуклеотидных меток. Этот метод может, необязательно, включать амплификацию меток методами, известными в данной области техники. Типичные биологические мишени включают ферменты (например, киназы, фосфатазы, метилазы, деметилазы, протеазы и репаративные ферменты для ДНК), белки, участвующие в белок-белковых взаимодействиях (например, лиганды для рецепторов), рецепторные мишени (например, GPCRs и RTKs), ионные каналы, бактерии, вирусы, паразиты, ДНК, РНК, прионы и углеводы.
Согласно другому варианту изобретения химические фрагменты, которые связываются с мишенью, не подвергают амплификации, а анализируют непосредственно. Типичные методы анализа включают анализ на микрочипах, в том числе эванесцентную спектроскопию резонансного фотонного кристалла; методы деконволюции меток на гранулах (например, с применением his- меток); анализ с применением биосенсоров на фотонно- кристаллических структурах без использования меток (например, BIND(r) Reader от SRU Biosystems, Inc., Woburn, MA); или методы на основе гибридизации (например, с использованием чипов с иммобилизованными олигонуклеотидами, комплементарными последовательностям, имеющимся в библиотеке меток).
Помимо этого, реагирующие друг с другом пары (или функциональные группы) могут легко вступать в реакции твердофазного синтеза олигонуклеотидов и подтверждать эффективное химическое сшивание олигонуклеотидов. Кроме того, полученные в результате сшитые олигонуклеотиды ведут себя как матрицы для матричной полимеризации с участием одной или более полимераз. Соответственно, любую из описанных в настоящей заявке стадий связывания для мечения кодированных библиотек можно модифицировать, включая один или более методов ферментативного и/или химического сшивания. Типичные методы сшивания включают сшивание с использованием ферментов, таких как одна или более РНК-лигаз и/или ДНК-лигаз; и химическое сшивание, такое как с применением одной или более пары совместно реагирующих реагентов (например, пары, включающей необязательно замещённые функциональные алкинильную и азидогруппу).
Помимо этого, одну или более библиотек можно объединять на стадии смешения/разделения. Чтобы допустить смешение двух или более библиотек, член библиотеки может содержать одну или более последовательностей для идентификации библиотеки, таких как метка, идентифицирующая библиотеку, в сшитом меченом структурном элементе, или как последовательность "головного" фрагмента по настоящему описанию.
Методы с применением меньших масс
Основной причиной применения методов кодирования однонитевых соединений является меньшая масса однонитевой метки по сравнению с двухнитевой меткой. Теоретически меньшая масса даёт некоторые преимущества, включая повышенную растворимость, меньшую стоимость, повышенную реакционную способность (реактивность), повышенную доступность по отношению к мишени, меньший гидродинамический радиус, повышенную точность аналитических характеристик и т.д.
Помимо применения метода введения однонитевой метки, дополнительного снижения массы можно достичь, вводя один или более компонентов из группы, включающей: одну или более меток уменьшенной длины, наборы меток постоянной массы, кодирующий "головной" фрагмент, один или более членов библиотеки, не содержащий область связывания с праймером и/или константную область, один или более членов библиотеки с уменьшенной константной областью и/или применяя любой другой метод, описанный в настоящей заявке.
Для того, чтобы максимально уменьшить массу членов библиотеки, можно уменьшить длину одного или более меченых структурных элементов, так, чтобы длина стала как можно короче, чтобы кодировать размер каждого элемента, полученного в результате расщепления. В частности, метки могут содержать менее 20 нуклеотидов (например, менее 19 нуклеотидов, менее 18 нуклеотидов, менее 17 нуклеотидов, менее 16 нуклеотидов, менее 15 нуклеотидов, менее 14 нуклеотидов, менее 13 нуклеотидов, менее 12 нуклеотидов, менее 11 нуклеотидов, менее 10 нуклеотидов, менее 9 нуклеотидов, менее 8 нуклеотидов или менее 7 нуклеотидов). Как написано ниже, в разделе Примеры, для сшивания меток применяют более короткие метки (например, длиной около 10 нуклеотидов или короче).
Можно также применять методы с постоянной массой, которые могут способствовать проведению анализа в процессе синтеза библиотек. Помимо этого, набор меток с постоянной массой мог бы способствовать узнаванию всех возникающих единичных ошибок (например, ошибок в результате неправильного считывания последовательности или в результате химического или ферментативного сшивания метки) и большинства многократных ошибок. Соотношение между длиной набора однонитевых меток с постоянной массой и кодирующей способностью (например, минимальные размеры (длина) для подтверждения размеров расщепления или идентичности библиотеки и т.д.) изложены ниже, в Таблице 1. Таким образом, для обеспечения существенной кодирующей способности с сохранением способности распознавать ошибки в процессе создания библиотеки можно использовать совокупности (наборы) меток с постоянной массой.
Чтобы максимально уменьшить массу (членов) библиотеки, "головной" фрагмент можно применять не только для связывания химического фрагмента и метки, но также для кодирования идентичности конкретной библиотеки или конкретной стадии. Например, "головной" фрагмент может кодировать информацию, например, множество головных фрагментов, которые кодируют первое(-ые) расщепление(-я) или идентичность библиотеки, например, с использованием конкретной последовательности, относящейся к специфической библиотеке.
Помимо этого, праймер, связывающий (например, константную) область из библиодеки ДНК-кодированных химических фрагментов, может быть исключён в ходе стадии(й) отбора. Затем эти области могут быть добавлены после отбора, например, с помощью однонитевого сшивания. Один типичный метод может включать предоставление химического фрагмента на 5'- конце кодирующего олигонуклеотида,
отбор конкретного химического фрагмента с учётом любой подходящей конкретной характеристики или функции и сшивание хвостового олигонуклеотида с 3'- концом кодирующего олигонуклеотида, который содержит праймер-связывающую последовательность и может, необязательно, содержать одну или более меток, например, "используемую" метку, метку "ориджина" репликации и т.д., по настоящему описанию. Эту праймер-связывающую последовательность можно затем применить для инициации матричной полимеризации с образованием кДНК (или кРНК), комплементарной выбранному члену библиотеки. кДНК или кРНК затем сшивают на их 3'- конце с олигонуклеотидом, который содержит праймер-связывающую последовательность и теперь, когда кодирующая последовательность фланкирована по обеим сторонам праймер-связывающими последовательностями, олигонуклеотид можно секвенировать и/или амплифицировать традиционными методами, такими как методы, описанные в настоящей заявке.
Массу можно далее уменьшать, исключая или уменьшая размер одной или более константных областей, которые разделяют кодирующие метки. Для однонитевого сшивания не требуется комплементарность между концами, подлежащими сшиванию, или между этими концами и шунтом. Следовательно, не требуется никакой фиксированной последовательности для содействия ферментативному сшиванию. Короткие фиксированные области между метками могут применяться для подробного анализа меток или других in silico процессов деконволюции методами информатики.
Олигонуклеотидные метки
Олигонуклеотидные метки по настоящему описанию (например, меченый структурный фрагмент или часть головного фрагмента) можно применять для кодирования любой полезной информации, такой как молекула, участок химического фрагмента, присоединение компонента (например, остова или структурного элемента), головного фрагмента в библиотеке, идентичность библиотеки, применение одного или более членов библиотеки (например, применение членов в аликвоте библиотеки) и/или ориджина (репликации) члена библиотеки (например, с применением последовательности ориджина).
Для кодирования информации можно использовать любую последовательность олигонуклеотида. Так, одна олигонуклеотидная последовательность может служить более чем одной цели, например, кодировать два типа информации или более или предоставлять начальный олигонуклеотид, который также кодирует один или более типов информации. Например, первый меченый структурный элемент может кодировать присоединение
первого структурного элемента, а также идентификацию библиотеки. Согласно другому примеру головной фрагмент можно использовать для предоставления начального олигонуклеотида, который функционально связывает химический фрагмент с меченым структурным элементом, причём головной фрагмент дополнительно включает последовательность, которая кодирует идентичность библиотеки (т.е. последовательность, идентифицирующая библиотеку). Следовательно, любая информация, представленная в настоящей заявке, может быть закодирована в отдельных нуклеотидных метках или может быть объединена и закодирована в одной и той же олигонуклеотидной последовательности (например, например, олигонуклеотидной метке, такой как меченый структурный элемент или головной фрагмент).
Последовательность структурного элемента кодирует идентичность структурного элемента и/или тип реакции связывания, проводимой с участием структурного элемента. Эта последовательность структурного элемента включена в структурный элемент-метку, где метка может, необязательно, включать один или более типов последовательности, описанный ниже (например, последовательность, идентифицирующая библиотеку, используемая последовательность и/или последовательность ориджина (точки начала) репликации).
Последовательность, кодирующая библиотеку, кодирует идентичность конкретной библиотеки. Чтобы допустить смешение двух или более библиотек, член библиотеки может содержать одну или более последовательностей для идентификации библиотеки, например, в метке, идентифицирующей библиотеку (т.е. в олигонуклеотиде, включающем последовательность, идентифицирующую библиотеку), в сшиваемом структурном элементе-метке, в части последовательности головного фрагмента или в последовательности хвостового фрагмента. Эти последовательности для идентификации библиотеки можно использовать для выведения закономерностей кодирования, где последовательность метки транслируется и коррелирует с информацией о химической (синтетической) истории. Соответственно, эти последовательности, кодирующие библиотеку, допускают смешение двух или более библиотек для отбора, амплификации, очистки, секвенирования и т.д.
Последовательность использования кодирует историю (т.е. использование) одного или более членов библиотеки в отдельной аликвоте библиотеки. Например, отдельные аликвоты можно обрабатывать, используя различные условия реакции, структурные элементы и/или стадии селекции. В частности, последовательность можно применять для идентификации таких аликвот и устанавливать их историю (использование) и благодаря чему допускать смешение аликвот в одной и той же библиотеке с различными историями
(использованиями, применениями) (например, различные эксперименты с отбором) для целей смешения образцов для отбора, амплификации, секвенирования и т.п. Эти применяемые последовательности можно включать в головной фрагмент, хвостовой фрагмент, структурный элемент-метку, используемую (применяемую) метку (т.е. олигонуклеотид, включающий последовательность для применения) или любую другую метку по настоящему описанию (например, метку, идентифицирующую библиотеку, или метку ориджина репликации).
Последовательность ориджина представляет собой "вырожденную" (случайную) олигонуклеотидную последовательность любой подходящей длины (например, около шести олигонуклеотидов), которая кодирует ориджин репликации члена библиотеки. Эта последовательность помогает произвести стохастическое (вероятностное) подразделение членов библиотеки, в остальном являющихся идентичными по всем параметрам, на структуры, различающиеся информацией о последовательности, так чтобы сведения о продуктах амплификации, полученных при использовании уникальных матриц-предшественников (например, выбранных членов библиотеки), можно было отличить от сведений о множестве продуктов амплификации, полученных при использовании одной и той же матрицы-предшественника (например, выбранного члена библиотеки). Например, после создания библиотеки и перед стадией отбора каждый член библиотеки может включать особую (иную) последовательность ориджина, например, в метке ориджина репликации. После отбора отобранные члены библиотеки можно амплифицировать с образованием продуктов амплификации, и можно установить участок члена библиотеки, предположительно, включающий последовательность ориджина (например, в метке ориджине), и сравнить с последовательностью ориджина в каждом из остальных членов библиотеки. Поскольку последовательность ориджина является вырожденной, каждый продукт амплификации каждого члена библиотеки будет иметь отличающуюся последовательность ориджина. Однако, наблюдение за одной и той же последовательностью ориджина в продукте амплификации могло бы указать на источник ошибки, такой как ошибка амплификации или ошибка циклизации в последовательности, которая вызывает продуцирование повторяющихся последовательностей, и начальную точку источника этих ошибок можно отследить, изучая последовательность ориджина на каждой стадии (например, на каждой стадии отбора или стадии амплификации) применения библиотеки. Эти последовательности ориджина можно включать в головной фрагмент, в хвостовой фрагмент, в меченый структурный элемент, в меченый ориджин (т.е. олигонуклеотид, включающий последовательность ориджина) или любую другую
метку, описанную в настоящей заявке (например, в метку, идентифицирующую библиотеку, или в применяемую (используемую) метку).
Любой из типов последовательностей по настоящему описанию может быть включён в головной фрагмент. Например, головной фрагмент может включать одну или более последовательностей из: последовательности структурного элемента, последовательности, идентифицирующей библиотеку, используемой последовательности и последовательности ориджина.
Любую из этих последовательностей по настоящему описанию можно включить в хвостовой фрагмент. Например, хвостовой фрагмент может включать одну или более последовательностей из: последовательности структурного элемента, последовательности, идентифицирующей библиотеку, используемой последовательности и последовательности ориджина.
Эти последовательности могут включать любую модификацию , описанную в настоящей заявке для олигонуклеотидов, например, одну или более модификаций, которые стимулируют растворимость в органических растворителях (например, любую, описанную в настоящей заявке, например, для головного фрагмента), которые предоставляют аналог природной фосфодиэфирной связи (например, фосфоротиоатную связь), или которые предоставляют один или более неприродные олигонуклеотиды (например, 2'- замещённые нуклеотиды, такие как 2'-О- метилированные нуклеотиды или 2'- фторнуклеотиды или любые олигонуклеотиды по настоящему описанию).
Эти последовательности могут включать любые характеристики, описанные в настоящей заявке для олигонуклеотидов. Например, эти последовательности могут быть включены в метку, содержащую менее 20 нуклеотидов (например, описанную в настоящей заявке). В других примерах метки, включающие одну или более таких последовательностей, имеют примерно одинаковую массу (например, каждая метка имеет массу, отличающуюся примерно на +/- 10% от средней массы для двух или более меток); не содержат (например, константной) области связывания праймеров; не содержат константную область; или содержат константную область уменьшенной длины (например, менее 30 нуклеотидов, менее 25 нуклеотидов, менее 20 нуклеотидов, менее 19 нуклеотидов, менее 18 нуклеотидов, менее 17 нуклеотидов, менее 16 нуклеотидов, менее 15 нуклеотидов, менее 14 нуклеотидов, менее 13 нуклеотидов, менее 12 нуклеотидов, менее 11 нуклеотидов, менее 10 нуклеотидов, менее 9 нуклеотидов, менее 8 нуклеотидов или менее 7 нуклеотидов).
Методы секвенирования библиотек и олигонуклеотидов такой длины могут, необязательно, включать методы сцепления (конкатенации или катенации) для
повышения надёжности считывания или глубины секвенирования, соответственно. В частности, отбор кодированных библиотек, которые не содержат области связывания праймеров, описаны в литературе для SELEX, например, в работе Jarosch et al, Nucleic Acids Res. 34: e86 (2006), которая включена в настоящее описание посредством отсылки. Например, библиотеку можно модифицировать (например, после стадии отбора) таким образом, чтобы она включала первую адаптерную последовательность на 5'- конце, а вторую адаптерную последовательность на 3'- конце комплекса, причём первая последовательность практически комплементарна второй последовательности и это приводит в результате к образованию дуплекса. Для дальнейшего повышения выхода к 5'-концу добавляют два фиксированных свисающих олигонуклеотида (например, СС). Согласно конкретным вариантам изобретения первая адаптерная последовательность представляет собой 5'-GTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 1), а вторая адаптерная последовательность представляет собой 5'-GCAGCACCC-3' (SEQ ID NO: 2).
"Головной" фрагмент
В библиотеке головной конец функционально связывает каждый химический фрагмент с кодирующей его олигонуклеотидной меткой. Обычно головной фрагмент представляет собой исходный (начальный) олигонуклеотид, содержащий две функциональные группы, которые можно далее дериватизировать, причём первая функциональная группа функционально связывает химический фрагмент (или его компонент) с головным фрагментом, а вторая функциональная группа функционально связывает одну или более меток с головным фрагментом. Необязательно, линкер может применяться в качестве спейсера между головным фрагментом и химическим фрагментом.
Функциональные группы головного фрагмента можно использовать для образования ковалентной связи с компонентом химического фрагмента и другой ковалентной связи с меткой. Компонент может представлять собой любую часть малой молекулы (молекулы низкомолекулярного соединения), такую как остов, имеющий узловые точки разнообразия, или структурный элемент. Или же, головной фрагмент можно дериватизировать, предоставляя линкер (т.е. спейсер, отделяющий головной фрагмент от малой молекулы, которая имеется в библиотеке), заканчивающийся функциональной группой (например, гидроксильной, амино, карбоксильной сульфгидрильной, алкинильной, азидо или фосфатной группой), которая используется для образования ковалентной связи с компонентом химического фрагмента. Линкер может связываться с 5'- концом, с один из положений внутри фрагмента или с 3'- концом
головного фрагмента. Если линкер связывается с одним или более положений внутри молекулы, линкер можно функционально связывать с дериватизированным основанием (например, с С5 положением уридина) и помещать внутри олигонуклеотида, применяя стандартные методы, известные в данной области техники. Примеры линкеров представлены в настоящей заявке.
Головной фрагмент может иметь любую подходящую структуру. Головной фрагмент может иметь длину, например от 1 до 100 нуклеотидов, предпочтительно, от 5 до 20 нуклеотидов и, наиболее предпочтительно, от 5 до 15 нуклеотидов. Головной фрагмент может быть однонитевым или двухнитевым и может состоять из натуральных или модифицированных нуклеотидов, описанных в настоящей заявке. Конкретные примеры головного фрагмента по изобретению представлены на Фигурах 4A-4D. Например, химический фрагмент может быть функционально связан с 3'- концом (Фигура 4А) или 5'- концом (Фигура 4В) головного фрагмента. Согласно конкретным вариантам изобретения головной фрагмент включает шпилечную структуру, образованную комплементарными основаниями внутри последовательности. Например, химический фрагмент может быть функционально связан с внутренним положением (Фигура 4С), 3'-концом (Фигура 4D) или 5' - концом головного фрагмента.
Как правило, головной фрагмент включает некомплементарную последовательность на 5'- или 3'- конце, что способствует связыванию олигонуклеотидной метки посредством полимеризации, ферментативного связывания или химической реакции. На Фигуре 4Е типичный головной фрагмент способствует сшиванию олигонуклеотидных меток (обозначенных 1-4), и метод включает стадии очистки и фосфорилирования. После присоединения метки 4 можно присоединить к 5'-концу метки 4 дополнительную адаптерную последовательность. Типичные адаптерные последовательности включают последовательность связывания праймеров или последовательность, имеющую метку (например, биотин). В тех случаях, когда используют много структурных элементов и соответствующих меток (например, 100 меток), на стадии синтеза олигонуклеотида можно применять стратегию смешения-разделения для создания необходимого числа меток. Такие методы смешения-разделения для синтеза ДНК известны в данной области техники. Полученные в результате члены библиотеки могут быть амплифицированы посредством ПЦР с последующим отбором на фрагменты, связывающие с подходящей(-ими) мишенью(-ями).
Головной фрагмент или комплекс, необязательно, может включать одну или более последовательностей связывания праймеров. Например, головной фрагмент имеет последовательность в петлевом участке шпильки, которая служит в качестве области
связывания праймеров для амплификации, причём область связывания праймеров имеет более высокую температуру плавления скорее из-за комплементарного праймера (например, такого, который может включать фланкирующие опознающие (идентифицирующие) области), нежели из-за последовательности в головном фрагменте. Согласно другим вариантам изобретения комплекс включает две последовательности связывания праймеров (например, для того, чтобы сделать возможной ПЦР) на каждой стороне одной или более меток, которые кодируют один или более структурных элементов. Или же, головной фрагмент может содержать одну последовательность связывания праймеров на 5'- или на 3'- конце. Согласно другим вариантам изобретения головной фрагмент представляет собой шпильку, а петлевой участок образует сайт связывания праймера, или сайт связывания праймера вводят посредством гибридизации олигонуклеотида с головным фрагментом на 3' стороне петли. Олигонуклеотидный праймер, содержащий область, гомологичную 3'- концу головного фрагмента и несущую область связывания праймера на своём 5'- конце (например, для содействия ПЦР), может гибридизоваться с головным фрагментом и может содержать метку, которая кодирует структурный элемент или присоединение структурного элемента. Олигонуклеотид праймера может содержать дополнительную информацию, такую как область случайных нуклеотидов, например, длиной от 2 до 16 нуклеотидов, которая включена для биоинформационного анализа.
Головной фрагмент, необязательно, может включать шпилечную структуру, причём эту структуру создают любым подходящим методом. Например, головной фрагмент может включать комплементарные основания, которые образуют партнёры при межмолекулярном спаривании оснований, таком как спаривание ДНК оснований по Уотсону-Крику (например, аденин-тимин и гуанин-цитозин) и/или в соответствии с гипотезой "качания" (например, гуанин-урацил, инозин-урацил, инозин-аденин и инозин-цитозин). В другом примере головной фрагмент может включать модифицированные или замещённые нуклеотиды, которые могут образовывать дуплексные структуры с более высокой аффинностью по сравнению с немодифицированными нуклеотидами, такие модифицированные или замещённые нуклеотиды известны в данной области техники. Ещё в одном примере головной фрагмент включает один или более сшитых оснований с образованием шпилечной структуры. Например, основания в одной нити или основания в различных двойных нитях можно сшивать, например, с помощью псоралена.
Головной фрагмент или комплекс, необязательно, может включать одну или более меток, способствующих детекции. Например, головной фрагмент, одна или более
олигонуклеотидных меток и/или одна или более праймерная последовательность могут включать изотоп, радиоактивный визуализирующий агент, маркёр, меченое вещество, флуоресцентную метку (например, родамин или флуоресцеин), хемилюминесцентную метку, квантовую точку и репортёрную группу (например, биотин или his- метку).
Согласно другим вариантам изобретения головной фрагмент или метку можно модифицировать, чтобы способствовать растворимости в полуводных, восстановленных-или неводных (например, органических) средах. Нуклеотидные основания головного фрагмента или метки можно сделать более гидрофобными, модифицируя с помощью алифатических цепей основания Т или С в положениях С5 без заметного нарушения их способности образовывать водородную связь с комплементарными им основаниями. Типичными модифицированными или замещёнными нуклеотидами являются 5'-диметокситритил-К4-диизобутиламинометилиден-5-(1-пропинил)-2'- дезоксицитидин, 3'-[(2- цианоэтил)- (N,N- диизопропил)] - фосфорамидит; 5'- диметокситритил-5-(1-пропинил)-2'- дезоксиуридин, 3'-[(2- цианоэтил)- (N,N- диизопропил)] - фосфорамидит; 5'- диметокситритил -5-фтор-2'- дезоксиуридин, 3'-[(2- цианоэтил)- (N,N- диизопропил)] -фосфорамидит; и 5'-диметокситритил-5-(пирен-1-ил-этинил)-2'- дезоксиуридин, 3'-[(2-цианоэтил)- (N,N- диизопропил)] - фосфорамидит.
Помимо этого, в головном олигонуклеотиде могут быть рассеяны модификации, которые способствуют растворимости в органических растворителях. Например, азобензол фосфорамидит может вводить гидрофобный фрагмент в конструкцию головного фрагмента. Такие вставки гидрофобных амидитов в головной фрагмент могут находиться в молекуле где угодно. Однако, вставка (инсерция) не может мешать последующему мечению с помощью дополнительных ДНК-меток в процессе синтеза библиотеки или последующей ПЦР, поскольку отбор закончен, или анализу на микрочипах, если он применяется для деконволюции метки. Такие добавления к конструкции головного фрагмента по настоящему описанию делают головной фрагмент растворимым, например, в 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90 %, 95%, 98%, 99% или 100%-ном органическом растворителе. Таким образом, добавление гидрофобных остатков в конструкцию головного фрагмента способствует повышенной растворимости в полуводных или неводных (например, органических) средах, при этом придавая головному фрагменту способность к введению олигонуклеотидной метки. Помимо этого, ДНК-метки, которые в дальнейшем вводятся в библиотеку, можно также модифицировать по С5 положению оснований Т или С, чтобы они также делали библиотеку более гидрофобной и растворимой в органических растворителях на последующих стадиях синтеза библиотеки.
Согласно конкретным вариантам изобретения головной фрагмент и метка первого структурного элемента могут представлять собой одинаковый фрагмент, т.е. можно создать множество структур головной фрагмент-метка, и все они будут иметь одинаковые общие участки (например, область связывания праймера) и у всех будет различаться другой участок (например, кодирующая область). Это можно применить на стадии "разделения" ("split") и смешивать после того, как событие, которое они кодируют, произошло.
Согласно конкретным вариантам изобретения головной фрагмент может кодировать информацию, например, посредством включения последовательности для первой стадии "разделения" ("split") или последовательности, которая кодирует идентичность библиотеки, например, используя конкретную последовательность, связанную со специфической библиотекой.
Методы ферментативного и химического сшивания
Для присоединения остовов, структурных элементов, ликеров, меток структурных элементов и/или головного фрагмента с целью получить комплекс можно применять различные методы сшивания. Соответственно, любая из стадий связывания по настоящему описанию может включать любые подходящие методы сшивания, например, ферментативное сшивание и/или химическое сшивание. Эти стадии связывания могут включать присоединение (добавление) меток одного или более структурных элементов к головному фрагменту или комплексу; и присоединение одного или более остовов или структурных элементов к головному фрагменту или комплексу. Согласно конкретным вариантам изобретения методы сшивания, применяемые для любого олигонуклеотида, дают продукт реакции, который можно подвергнуть транскрипции и/или обратной транскрипции, что делает возможной декодирование библиотеки или матричной полимеризации с участием одной или более из ДНК или РНК полимераз.
Как правило, ферментативное сшивание даёт олигонуклеотид, имеющий природную фосфодиэфирную связь, который может подвергаться транскрипции или обратной транскрипции. Типичные методы ферментативного сшивания представлены в настоящей заявке и включают применение одной или более РНК или ДНК лигаз, таких как Т4 РНК лигаза, Т4 ДНК лигаза, CircLigase(tm) ssDNA ligase (онДНК лигаза), CircLigase(tm) II онДНК лигаза и ThermoPhage(tm) онДНК лигаза (Prokazyme Ltd., Reykjavik, Iceland).
Химическое сшивание можно также применять для получения олигонуклеотидов, способных транскрибироваться или обратно транскрибироваться. Преимуществом
химического сшивания является то, что твердофазный синтез таких олигонуклеотидов можно оптимизировать, чтобы обеспечить высокий выход сшивания. Однако, эффективность метода химического сшивания для получения олигонуклеотидов, способных транскрибироваться или обратно транскрибироваться, возможно, надо проверять. Эту эффективность можно проверять любым подходящим методом, таким как жидкостная хроматография-масс-спектрометрия, анализ ОТ- ПЦР (RT-PCR) и/или ПЦР анализ. Примеры этих методов приводятся в Примере 5.
Согласно конкретным вариантам изобретения химическое сшивание включает применение одной или более вступающих в совместную химическую реакцию (совместно реагирующих) пар с образованием спейсера, который может транскрибироваться или обратно транскрибироваться. В частности, реакции, подходящие для вступающих в совместную химическую реакцию пар являются предпочтительными кандидатами для процесса циклизации (Kolb et al, Angew. Chem. Int. Ed., 40:2004-2021 (2001); Van der Eycken et al., QSAR Comb. Sci., 26:1115-1326 (2007)). Типичные совместно реагирующие химические пары представляют собой пары, включающие, необязательно замещённую алкинильную группу и необязательно замещённую азидогруппу с образованием триазольного спейсера посредством 1,3- диполярного циклоприсоединения (реакции Хюйсгена); необязательно замещённую диеновую систему с 4л электронами (например, необязательно 1,3- незамещённое соединение, такое как необязательно замещённый 1,3-бутадиен, 1- метокси-3- триметилсилилокси-1,3- бутадиен, циклопентадиен, циклогексадиен или фуран) и необязательно замещённый диенофил или необязательно замещённый гетеродиенофил, имеющий 2л электронную систему (например, например, необязательно замещённую алкенильную группу или необязательно замещённую алкинильную группу) с образованием циклоалкенильного спейсера посредством реакции Дильса- Альдера; нуклеофил (например, необязательно замещённый амин или необязательно замещённый тиол) с пространственно затруднённым гетероциклильным электрофилом (например, необязательно замещённым эпоксидом, азиридином, ионом азиридиния или ионом эписульфония) с образованием гетероалкильного спейсера посредством реакции раскрытия цикла; фосфоротиоатную группу и йодную группу (иод), как в случае сшиванием в присутствии шунта олигонуклеотида, содержащего 5'-иод dT, с 3'- фосфоротиоат олигонуклеотидом; и альдегидную группу и аминогруппу, как в реакции модифицированного 3'- альдегидом олигонуклеотида, который, необязательно, можно получать окислением коммерческого 3'- глицерил-модифицированного олигонуклеотида, с 5'- аминоолигонуклеотидом (т.е. в реакции восстановительного аминирования) или 5'-гидразидоолигонуклеотидом.
Согласно другим вариантам изобретения химическое сшивание включает введение аналога фосфодиэфирной связи, например, для ПЦР анализа после отбора и секвенирования. Типичные аналоги фосфодиэфирной связи включают фосфоротиоатную связь (например, вводимую с помощью фосфоротиоатной группы и уходящей группы, такой как атом иода (йодная группа)), фосфорамидную связь или фосфородитиоатную связь (например, вводимую с помощью фосфородитиоатной группы и уходящей группы, такой как атом иода (йодная группа)).
Условия реакции для стимулирования ферментативного сшивания или химического сшивания
Изобретение также предусматривает одно или более условий реакции, которые стимулируют ферментативное или химическое связывание между головным фрагментом и меткой или между двумя метками. Эти условия реакции включают применение модифицированных нуклеотидов внутри метки по описанию в настоящей заявке; применение донорных меток и акцепторных меток различной длины и варьирование концентрации меток; применение различных типов лигаз, а также их комбинаций (например, CircLigase(tm) ДНК лигаза и/или Т4 РНК лигаза) и варьирование их концентрации; применение полиэтиленгликолей ПЭГ (PEGs) с различной молекулярной массой и варьирование их концентрации; применение отличных от ПЭГ (PEG) загустителей (например, бетаина или альбумина бычьей сыворотки); варьирование температуры и продолжительности сшивания; варьирование концентрации различных агентов, включая АТФ (АТР), Co(NH3)6Ci3 и неорганический пирофосфат из дрожжей; применение олигонуклеотидных меток, фосфорилированных; применение 3'-защищённых меток; и применение преаденилированных меток. Эти условия реакции также включают реакции химического сшивания.
Головной фрагмент и/или метки могут включать один или более модифицированных нуклеотидов. Согласно предварительным вариантам изобретения головной фрагмент и/или метки включают один или более модифицированных или замещённых нуклеотидов, которые стимулируют ферментативное сшивание, такие как ТО- метилнуклеотиды (например, 2'-О- метилгуанин или 2'-О- метилурацил), 2'-фторнуклеотиды или любые другие модифицированные нуклеотиды, которые используются в качестве субстрата для сшивания. Или же, головной фрагмент и/или метки модифицируют таким образом, чтобы они включали одну или более химически реакционноспособных групп, способствующих химическому сшиванию (например, необязательно замещённую алкинильную группу и необязательно замещённую
азидогруппу). Необязательно, олигонуклеотидные метки функционализируют по обоим концам с помощью химически реактивных (реакционноспособных) групп и, необязательно, один из этих концов защищают, так чтобы группы могли реагировать независимо, а побочные реакции могут быть уменьшены (например, уменьшены побочные реакции при полимеризации).
Ферментативное сшивание может включать одну или более лигаз. Типичные лигазы включают CircLigase(tm) ssDNA ligase (онДНК лигазу) (EPICENTRE Biotechnologies, Madison, WI), CircLigase(tm) II ssDNA ligase (онДНК лигазу) (также от EPICENTRE Biotechnologies), ThermoPhage(tm) ssDNA ligase (онДНК лигазу) (Prokazyme Ltd., Reykjavik, Iceland), T4 РНК лигазу и T4 ДНК лигазу. Согласно предпочтительным вариантам изобретения сшивание включает применение РНК лигазы или комбинации РНК лигазы и ДНК лигазы. Помимо этого, сшивание может включать один или более поливалентных катионов, таких как Со(№1з)бС1з, в комбинации с одной или более лигаз.
До или после стадии сшивания комплекс можно очищать по трём причинам. Во-первых, комплекс можно очищать для того, чтобы удалить непрореагировавшие головной фрагмент или метки, которые могут привести в результате к перекрёстным реакциям и включать "шум" (помехи) в процесс кодирования. Во- вторых, комплекс можно очищать, чтобы удалить любые реагенты или непрореагировавший исходный материал, который может ингибировать или снижать сшивающую активность лигазы. В- третьих, фрагменты, которые вводят на стадии химической реакции или сшивания, может потребоваться удалить, чтобы способствовать последующей стадии химической реакции или сшивания. Методы очистки комплекса описаны в настоящей заявке.
Ферментативное и химическое сшивание может включать полиэтиленгликоль, имеющий среднюю молекулярную массу более 300 Дальтон (например, более 600 Дальтон, 3000 Дальтон, 4000 Дальтон или 4500 Дальтон). Согласно конкретным вариантам изобретения полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу примерно от 3000 Дальтон до 9000 Дальтон (например, от 3000 Дальтон до 8000 Дальтон, от 3000 Дальтон до 7000 Дальтон, от 3000 Дальтон до 6000 Дальтон и от 3000 Дальтон до 5000 Дальтон). Согласно предпочтительным вариантам изобретения полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу примерно от 3000 Дальтон примерно до 6000 Дальтон (например, от 3300 Дальтон до 4500 Дальтон, от 3300 Дальтон до 5000 Дальтон, от 3300 Дальтон до 5500 Дальтон, от 3300 Дальтон до 6000 Дальтон, от 3500 Дальтон до 4500 Дальтон, от 3500 Дальтон до 5000 Дальтон, от 3500 Дальтон до 5500 Дальтон и от 3500 Дальтон до 6000 Дальтон, например, 4600 Дальтон). Полиэтиленгликоль может
присутствовать в любом подходящем количестве, например, от около 25% (вес/об) до около 35% (вес/об), например, 30% (вес/об).
В предпочтительном варианте настоящего изобретения метки для структурных элементов вводят посредством сшивания однонитевого олигонуклеотида с однонитевым олигонуклеотидом в соответствии с представленным ниже протоколом сшивания:
Головной фрагмент: 25 мкМ (5' конец: 5'- монофосфо/2'-ОМе G,
промежуточные нуклеотиды: 2'- дезокси, и 3' конец: 2'-блокированный/3'-блокированный) Меченый структурный элемент: 25 мкМ (5'- конец: 2'-ОМе/5'-ОН G,
Co(NH3)6Cl3: PEG 4600:
Т4 РНК лигаза (Promega): Неорганическая фосфатаза из дрожжей: Tris: MgCl2: АТР: рН: Вода:
промежуточные нуклеотиды: 2'- дезокси, и 3'-конец: 3'-ОН/2'-ОМе) 1 мМ
30% (вес/об) 1.5 ед./мкл
0.0025 ед./мкл 50 мМ 10 мМ 1 мМ 7.5
Остальное
Согласно другим вариантам изобретения протокол включает инкубацию при 37°С в течение 20 часов. Для создания подходящей библиотеки можно применять повышенные концентрации головного фрагмента, меток и/или лигазы, и такая модификация этих концентраций очевидна специалистам в данной области техники.
Методы кодирования химических фрагментов в библиотеке
Методы по изобретению можно применять для синтеза библиотеки, содержащей различное число химических фрагментов, которые кодируются олигонуклеотидными метками. Примеры строительных фрагментов и кодирующих ДНК меток представлены в опубликованной патентной заявке США No. 2007/0224607, описание которой включено в настоящее изобретение посредством отсылки.
Каждый химический фрагмент образуется с использованием одного или более структурных элементов и, необязательно, остова. Остов служит для предоставления одной или более узловых точек разнообразия с определёнными геометрическими
характеристиками (например, триазин, предоставляющий три узловые точки, пространственно расположенные вокруг гетероарильного кольца, или линейной геометрической структуры).
Структурные элементы и кодирующие их метки можно присоединять непосредственно или опосредованно (например, с помощью линкера) к головному фрагменту с образованием комплекса. Если головной фрагмент включает линкер, строительный элемент или остов присоединяют к концу линкера. Если линкер отсутствует, структурный элемент можно присоединять непосредственно к головному фрагменту, или сам структурный элемент может включать линкер, который реагирует с функциональной группой головного фрагмента. Типичные линкеры и головные фрагменты представлены в настоящей заявке.
Остов можно присоединять (добавлять) любым подходящим способом. Например, остов можно присоединять к концу линкера или головного фрагмента, а следующие структурные элементы можно присоединять к доступным узловым точкам разнообразия остова. В другом примере структурный элемент Ап сначала присоединяют к линкеру или головному фрагменту, а затем узловая точка разнообразия остова S реагирует с функциональной группой в структурном элементе Ап. Олигонуклеотидные метки, кодирующие конкретный остов, можно, необязательно, присоединять к головному фрагменту или к комплексу. Например, Sn присоединяют к комплексу в п реакционных ячейках, где п означает целое число более одного, а метка Sn (т.е. метка Si, S2, ... Sn-i, Sn) связывают с функциональной группой комплекса.
Структурные элементы можно присоединять в ходе нескольких синтетических стадий. Например, аликвоту головного фрагмента, необязательно имеющего связанный линкер, распределяют в п реакционных ячеек, где п означает целое число, равное двум или более. На первой стадии структурный элемент Ап добавляют в каждую из п реакционных ячеек (т.е. структурный элемент Ai, А2, ... An-i, Ап добавляют в реакционную ячейку 1, 2, ... п-1, п), где п означает целое число, а каждый структурный элемент Ап является уникальным. На второй стадии остов S добавляют в каждую реакционную ячейку с образованием комплекса An-S. Необязательно, остов Sn можно добавлять в каждую реакционную ячейку с образованием An-Sn комплекса, где п означает целое число больше двух, а каждый остов Sn может быть уникальным. На третьей стадии структурный элемент Вп добавляют в каждую п реакционную ячейку, содержащую An-S комплекс (т.е. структурный элемент Bi, В2, ... Bn-i, Вп добавляют в реакционную ячейку 1, 2, ... п-1, п, содержащую Ai-S, A2-S, ... An_i-S, An-S комплекс), причём каждый структурный элемент Вп является уникальным. На следующих стадиях структурный
элемент Сп можно добавлять в каждую п реакционную ячейку, содержащую комплекс Вп-An-S (т.е. структурный элемент Ci, С2, ... Cn-i, Сп добавляют в реакционную ячейку 1,2, ... п-1, п, содержащую B1-A1-S ... Bn-An-S комплекс), где каждый структурный элемент Сп является уникальным. Полученная в результате библиотека будет содержать п3 число комплексов, имеющих п3 меток. Таким образом можно применять дополнительные синтетические стадии для связывания структурных элементов с целью дальнейшей диверсификации библиотеки.
После создания библиотеки полученные комплексы можно, необязательно, очищать и подвергать полимеризации или сшиванию, применяя один или более праймеров. Эту общую стратегию можно расширить, чтобы включить дополнительные узловые точки разнообразия и структурные элементы (например, D, Е, F и т.д.). Например, первая узловая точка разнообразия реагирует со структурными элементами и/или S и кодируется олигонуклеотидной меткой. Затем другие структурные элементы реагируют с полученным комплексом, а следующая узловая точка разнообразия дериватизируется посредством дополнительных структурных элементов, что кодируется праймером, применяемым для реакции полимеризации или сшивания.
Для получения библиотеки кодированных соединений олигонуклеотидные метки добавляют к комплексу после или до каждой синтетической стадии. Например, до или после добавления структурного элемента Ап в каждую реакционную ячейку метку Ап связывают с функциональной группой головного фрагмента (т.е. метку Ai, А2, ... An-i, An добавляют в реакционную ячейку 1,2, ... п-1, п, содержащую головной элемент). Каждая метка Ап имеет особую последовательность, которая коррелирует с каждым уникальным структурным элементом Ап, и определение последовательности метки Ап предоставляет химическую структуру структурного элемента Ап. Таким образом дополнительные метки применяются для кодирования дополнительных структурных элементов или дополнительных остовов.
Далее, последняя метка, добавленная к комплексу, может либо содержать праймерную последовательность, либо предоставлять функциональную группу, способствующую связыванию (например, посредством сшивания) праймерной последовательности. Последовательность праймера можно применять для амплификации и/или секвенирования олигонуклеотидных меток комплекса. Типичные методы амплификации и секвенирования включают полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR), линейную амплификацию (LCR), амплификацию по принципу катящегося кольца (RCA), или любой другой метод амплификации или определения нуклеотидных последовательностей, известный в данной области техники.
Применяя эти методы, можно получать большие библиотеки, содержащие большое число кодированных химических фрагментов. Например, головной фрагмент реагирует с линкером и структурным элементом Ап, который включает 1000 различных вариантов (т.е п = 1000). Для каждого структурного элемента Ап ДНК-метку Ап сшивают или расширяют с помощью праймера до головного фрагмента. Эти реакции можно осуществлять в 1,000- луночном планшете или в 10 х 100- луночных планшетах. Все реакционные смеси можно объединять и смешивать, необязательно очищать и разделять во втором наборе планшетов. Далее ту же самую процедуру можно осуществлять с использованием структурного элемента Вп, который также включает 1000 различных вариантов. ДНК-метку Вп можно сшивать с комплексом Ап-головной фрагмент и все реакционные смеси можно объединять. Полученная в результате библиотека включает 1000 х 1000 комбинаций An х Вп (т.е. 1000000 соединений), меченных с помощью 1000000 различных комбинаций меток. Такой же подход можно расширить, добавляя структурные элементы Cn, Dn, Еп и т.д. Созданную библиотеку можно затем использовать для идентификации соединений, которые связываются с мишенью. Структуру химических фрагментов, которые связываются с библиотекой, можно, необязательно, определять с помощью ПЦР и секвенирования ДНК- меток с целью идентификации соединений, которые были приумножены.
Этот метод можно модифицировать, чтобы исключить введение метки после добавления каждого структурного элемента или чтобы исключить объединение (или смешение). Например, метод можно модифицировать, добавляя структурный элемент Ап в п реакционных ячеек, где п означает целое число больше единицы, и добавляя идентичный структурный элемент Bi в каждую реакционную лунку. В данном случае Bi идентичен для каждого химического фрагмента, и следовательно, олигонуклеотидная метка, кодирующая этот структурный элемент, не требуется. После добавления структурного элемента комплексы можно объединять, а можно не объединять. Например, библиотеку не объединяют (не смешивают) после конечной стадии добавления структурного элемента, и пулы подвергают скринингу индивидуально, чтобы идентифицировать соединение(-я), которое(-ые) связывае(-ю)тся с мишенью. Чтобы избежать объединения всех реакционных смесей после синтеза, можно применять, например, планшет-ридер BIND(r) Reader (от компании SRU Biosystems, Inc.), для мониторинга связывания на сенсорной поверхности в высокопроизводительном формате (например, в 384-луночных планшетах и 1536-луночных планшетах). Например, структурный элемент Ап может кодироваться ДНК-меткой Ап, а структурный элемент Вп может кодироваться посредством его положения в луночном планшете. Соединения
кандидаты можно затем идентифицировать, применяя анализ связывания (например, используя BIND(r) Biosensor, также выпускаемый компанией SRU Biosystems, Inc., или используя иммуноферментный твердофазный анализ), и анализируя Ап метки с помощью секвенирования, микроматричного анализа и/или расщепления рестриктазой. Эти анализы позволяют идентифицировать комбинации структурных элементов Ап и Вп, которые дают заданные молекулы.
Метод амплификации может также включать получение водомасляной эмульсии для создания множества водных микрореакторов. Условия реакции (например, концентрация комплекса и размер микрореакторов) можно корректировать, чтобы получить, в среднем, микрореактор, содержащий по меньшей мере один член библиотеки соединений. Каждый микрореактор может также содержать мишень, одну бусину (шарик) способную связываться с комплексом или с участком комплекса (например, одной или более меток) и/или связываться с мишенью, и раствор для реакции амплификации, содержащий один или более реагентов, необходимых для осуществления амплификации нуклеиновых кислот. После амплификации метки в микрореакторах амплифицированные копии метки связываются с бусинами в микрореакторах, и покрытые ими бусины можно идентифицировать любым подходящим методом.
После идентификации структурных элементов из первой библиотеки, которые связываются с соответствующей мишенью, можно создавать вторую библиотеку итерационным методом. Например, можно добавить одну или более дополнительных узловых точек разнообразия, создают вторую библиотеку и отбирают образцы (для анализа), как описано в настоящей заявке. Этот процесс можно повторять столько раз, сколько потребуется для того, чтобы получить молекулы с нужными молекулярными и фармацевтическими свойствами.
Для добавления остова, структурных элементов, линкеров и меченых структурных элементов можно применять различные методы сшивания. Соответственно, любая стадия связывания, описанная в настоящей заявке, может проводиться любым подходящим методом или любыми подходящими методами. Примеры методов сшивания включают ферментативное сшивание, такое как с применением одной или более из РНК лигаз и/или ДНК лигаз по настоящему описанию; и химическое сшивание, такое как сшивание с применением химически реагирующих друг с другом пар, по настоящему описанию.
Остов и структурные элементы
Остов S может представлять собой единичный атом или молекулярный остов. Типичные одноатомные остовы включают атом углерода, атом бора, атом азота или атом
фосфора и т.п. Примеры многоатомным остовов включают циклоалкильную группу, циклоалкенильную группу, гетероциклоалкильную группу, гетероциклоалкенильную группу, арильную группу или гетероарильную группу. Конкретные варианты гетероарильного остова включают триазин, такой как 1,3,5- триазин, 1,2,3- триазин или 1,2,4- триазин; пиримидин; пиразин; пиридазин; фуран; пиррол; пирролин; пирролидин; пиразол; изоксазол; пиран; пиридин; индол; индазол; или пурин.
Остов S может быть функционально связан с меткой любым известным способом. В одном примере S означает триазин, который непосредственно связан с головным фрагментом. Для получения такого типичного остова проводят реакцию трихлортриазина (например, хлорированного предшественника триазина, содержащего три атома фтора) с нуклеофильной группой головного фрагмента. В этом методе S имеет три положения, в которых находится атом хлора, доступные для замещения, причём два положения представляют собой доступные узловые точки разнообразия, а одно положение связывается с головным фрагментом. Далее, структурный элемент Ап соединяют с узловой точкой разнообразия остова, а метку Ап, кодирующую структурный элемент ("метку Ап"), сшивают с головным фрагментом, причём эти две стадии можно проводить в любом порядке. Затем структурный элемент Вп присоединяют к оставшейся узловой точке разнообразия, а метку Вп, кодирующую строительный элемент Вп, сшивают с концом метки Ап. В другом примере S означает триазин, который функционально связывается с линкером, причём трихлортриазин реагирует с нуклеофильной группой (например, аминогруппой) PEG, алифатического или ароматического линкера метки. Структурные элементы и ассоциированные метки можно присоединять (добавлять) как описано выше.
Ещё в одном примере S означает триазин, который функционально связан со структурным элементом Ап. Для получения этого остова структурный элемент Ап, имеющий две узловых точки разнообразия (например, электрофильную группу и нуклеофильную группу, например, Fmoc- аминокислоту), реагирует с нуклеофильной группой линкера (например, с концевой группой PEG, алифатического или ароматического линкера, который связывается с головным фрагментом). Затем трихлортриазин реагирует с нуклеофильной группой структурного элемента Ап. При использовании этого метода все три содержащих атом хлора положения S используются в качестве узловых точек разнообразия для структурных элементов. Как указано в настоящем описании, можно добавлять дополнительные структурные элементы и дополнительные остовы Sn.
Типичные структурные элементы Ап включают, например, аминокислоты (например, альфа-, бета-, гамма, дельта- и эпсилон- аминокислоты, а также производные природных и неприродных аминокислот), совместно реагирующие химические реагенты (например, азид и алкиновые цепи) с амином или тиольным реагентом или их комбинацией. Выбор структурного элемента Ап зависит, например, от характера реакционноспособной (реактивной) группы, используемой в линкере, характера остовного фрагмента и от растворителя, применяемого в химическом синтезе.
Типичные структурные элементы Вп и Сп включают любую подходящую структурную группу (единицу) химического фрагмента, например, необязательно замещённые ароматические группы (например, необязательно замещённый фенил или бензил), необязательно замещённые гетероциклильные группы (например, необязательно замещённый хинолинил, изохинолинил, индолил, изоиндолил, азаиндолил, бензимидазолил, азабензимидазолил, пиридинил, пиперидил или пирролидинил), необязательно замещённые алкильные группы (например, необязательно замещённые линейные или разветвлённые С\.в алкильные группы или необязательно замещённые Сьб аминоалкильные группы), или необязательно замещённые карбоциклильные группы (например, необязательно замещённый циклопропил, циклогексил или циклогексенил). Особенно применимые структурные элементы Вп и Сп включают такие элементы, в которых содержится одна или более реакционноспособных групп, например, необязательно замещённую группу (любую группу по настоящей заявке), содержащих один или более необязательных заместителе, которые являются реакционноспособными группами или которые можно модифицировать химическими методами с образованием реакционноспособных групп. Типичные реакционноспособные группы включают одну или более групп, выбранных из амина (-NR.2, где каждый R, независимо, означает Н или необязательно замещённый Сьб алкил), гидрокси, алкокси (-OR, где R означает необязательно замещённый Сьб алкил, например, метокси), карбокси (-СООН), амид или реагирующие совместно заместители. Сайт рестрикции можно вводить, например, в метку Вп или Сп, причём комплекс можно идентифицировать с помощью ПЦР (PCR) и фрагментов рестрикции (рестриктов), полученных при расщеплении одной или более соответствующих рестриктаз.
Линкеры
Бифункциональный линкер между головным фрагментом и химическим фрагментом можно изменять, чтобы предоставить подходящий спейсер и/или повысить растворимость головного фрагмента в органическом растворителе. Имеется широкий
спектр линкеров, которые могут связывать головной фрагмент с библиотекой малых молекул (низкомолекулярных соединений). Обычно линкер состоит из линейных или разветвлённых цепей и может включать Сыо алкил, гетероалкил из 1-10 атомов, С2-10 алкенил, С2-10 алкинил, С5-10 арил, циклическую или полициклическую систему из 3-20 атомов, фосфодиэфир, пептид, олигосахарид, олигонуклеотид, олигомер, полимер или полиалкилгликоль (например, полиэтиленгликоль, такой как -(СНгСНгО^СНгСНг-, где п означает целое число от 1 до 50), или их комбинации.
Бифункциональный линкер может предоставлять подходящий спейсер между головным фрагментом и химическим фрагментом библиотеки. Согласно некоторым вариантам изобретения бифункциональный линкер включает три участка. Участок 1 может представлять собой реакционноспособную группу, которая образует ковалентную связь с ДНК, например, карбоксильную группу, предпочтительно, активируемую сложным эфиром N- гидроксисукцинимида (NHS), для реакции с аминогруппой в ДНК (например, амино-активированной dT), амидит для модификации по 5' или 3'- концу однонитевого головного фрагмента (осуществляемой с помощью стандартных реакций нуклеотидов), реагирующие друг с другом пары химических реагентов (например, азидо-алкин циклоприсоединение в присутствии катализатора Cu(I), или любые пары по настоящему описанию), или тиол-реактивные группы. Участок 2 может также означать реакционноспособную (реактивную) группу, которая образует ковалентную связь с химическим фрагментом, либо со структурным элементом Ап, либо с остовом. Такая реакционноспособная группа может представлять собой , например, амин, тиол, азид или алкин. Участок 3 может представлять собой инертный спейсер различной длины, вводимый между Участками 1 и 2. Такой спейсер может представлять собой цепь этиленгликолевых звеньев (например, PEG различной длины), алкан, алкен, полиеновую цепь или пептидную цепь. Линкер может содержать разветвления или инсерты (вставки) с гидрофобными фрагментами (например, такими как бензольные кольца) для повышения растворимости головного фрагмента в органических растворителях, а также флуоресцентные молекулы (например, флуоресцеин или Су-3), применяемые для детекции библиотек. Гидрофобные остатки в структуре головного фрагмента можно менять путём изменения дизайна линкера, с целью способствовать синтезу библиотек в органических растворителях. Например, создают комбинацию головного фрагмента и линкера с целью получить подходящие остатки, чтобы величина коэффициента октанол: вода (Poet) составляла, например, от 1.0 до 2.5.
Линкеры можно выбирать эмпирическим путём для данной структуры библиотеки малых молекул, так, чтобы библиотеку можно было синтезировать в органическом
растворителе, например, в 15%, 25%, 30%, 50%, 75%, 90%, 95%, 98%, 99% или 100% органическом растворителе. Перед синтезом линкеры можно изменять на модельных реакциях, чтобы выбрать цепь нужной длины, которая солюбилизирует головной фрагмент в органическом растворителе. Типичные линкеры включают линкеры с увеличенной длинной цепи, повышенным содержанием этиленгликолевых звеньев, разветвлённых фрагментов с положительным зарядом (для нейтрализации отрицательного заряда фосфатных групп в головном фрагменте) или с повышенной гидрофобностью (например, присоединением бензольных колец).
Примеры коммерческих линкеров включают амино-карбоксильные линкеры, например, содержащие пептиды (например, Z-Gly-Gly-Gly-Osu (N- альфа-бензоилкарбонал- (Глицин)з- N- сукцинимидиловый эфир) или Z-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Osu (N- альфа- бензилоксикарбонил- (Глицин)б-М- сукцинимидиловый эфир, SEQ ID NO: 3)), PEG (например, Fmoc- aMHHoPEG2000-NHS или амино-PEG (12-24)- NHS), или цепи алкановых кислот (например, Вос-е-аминокапроновая кислота-Osu); линкеры из пары реагирующих друг с другом химических реагентов по настоящей заявке в комбинации с пептидным фрагментом (например, азидогомоаланин- Gly-Gly-Gly-OSu (SEQ ID NO: 4) или пропилглицин-Gly-Gly-Gly-OSu (SEQ ID NO: 5)), PEG (например, азидо-PEG-NHS) или с фрагментом алкановой кислоты (например, 5- азидопентановая кислота, (S)- 2- (азидометил)- 1- Вое- пирролидин, 4- азидоанилин или сложный эфир 4-азидобутан- 1-овой кислоты и N- гдроксисукцинимида); тиол- реактивные линкеры, такие как содержащие PEG (например, SM(PEG)n NHS-PEG-малеимид), алкановые цепи (например, 3- (пиридин- 2- илдисульфанил)- пропионовая кислота-Osu или сульфосукцинимидил 6-(3'-[2- пиридилтио]- пропионамидо)гексаноат)); и амидиты для синтеза олигонуклеотидов, такие как модификаторы аминогруппы (например, 6-(трифторацетиламино)- гексил- (2-цианоэтил)- (МДЧ-диизопропил)- фосфорамидит), тиольной группы (например, S- тритил- 6- меркаптогексил-1- [(2- цианоэтил)- (N,N-диизопропил)]- фосфорамидит, или модификаторы из пары реагирующих друг с другом химических реагентов (например, 6- гексин- 1- ил- (2-цианоэтил)- ^^-диизопропил)-фосфорамидит, 3- диметокситритилокси-2- (3-(3- пропаргилоксипропанамидо) пропанамидо)припил-1- О-сукциноил, длинноцепные алкиламино CPG или сложный эфир 4- азидобутан- -1- овой кислоты и N-гидроксисукцинимида)). Другие линкеры, известные в уровне техники, которые можно применять в синтезе библиотек, включают, но без ограничения 5'-0- диметокситритил- Г,2'-дидезоксирибоза-3'- [(2-цианоэтил)-(МДЧ-диизопропил]- фосфорамидит; 9-О-диметокситритил- триэтиленгликоль, 1-[(2-цианоэтил)- (N,N- диизопропил]- фосфорамидит; 3-(4,4'- диметокситритилокси)пропил-1
[(2-цианоэтил)-(КДЧ- диизопропил]- фосфорамидит; и 18-0- диметокситритил гексаэтиленгликоль, 1-[(2-цианоэтил)-(М,М- диизопропил]- фосфорамидит. Любые из линкеров по настоящей заявке можно добавлять совместно друг с другом в различных комбинациях, чтобы получить линкеры различной заданной длины.
Линкеры могут быть также разветвлёнными, причём разветвлённые линкеры хорошо известны в уровне техники и их примеры могут состоять из удвоенных или утроенных симметричных или асимметричных повторов. См., например, Newcome et al., Dendritic Molecules: Concepts, Synthesis, Perspectives, VCH Publishers (1996); Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301 (1995); и Jansen et al, Science 266:1226 (1994).
Пример 1
Общий метод усовершенствования сшивания однонитевых ДНК-меток
Для усовершенствования однонитевого сшивания меток с целью создания кодированной библиотеки применялись различные условия реакции. Эти условия реакции включали применение модифицированных нуклеотидов внутри метки (например, использование одного или более нуклеотидов, содержащих 2'-ОМе группу с образованием MNA/ДНК-метки, где "MNA" относится к олигонуклеотиду, содержащему по меньшей мере один 2'-О- метилнуклеотид); применение донорных меток и акцепторных меток, имеющих разную длину, и изменение концентрации меток; применение лигаз различного типа, а также их комбинаций (например, CircLigase(tm) онДНК лигазы и/или Т4 РНК лигазы), и изменение их концентрации; очистку комплекса с удалением исходных материалов; применение полиэтиленгликолей (PEGs) с различной молекулярной массой и изменение их концентрации; изменение температуры и продолжительности реакции, такой как сшивание; изменение концентрации различных агентов, включая АТР, Со(М1з)бСЬ и неорганический пирофосфат из дрожжей; применение олигонуклеотидных меток, фосфорилированных ферментативными или химическими методами; применение 3'- защищённых меток; и применение 5'-аденилированных химическими методами меток.
После тщательного анализа различных условий были найдены оптимальные комбинации параметров, которые обеспечивали эффективность сшивания до 90% (например, Фигура 5 С), что определяли по соотношению сшитого продукта реакции и несшитого исходного реагента ("сшитая фракция"). Схема реакции сшивания с применением лигазы показана на Фигуре 5А, а типичные результаты денатурирующего гель-электрофореза в акриламидном геле представлены на Фигуре 5В. Донорный олигонуклеотид был помечен на 3'- конце, и его можно было детектировать в геле,
считывая показания при длине волны возбуждения 450 нм на приборе Storm1M 800 Phosphorlmager. На геле видны несшитый донор (или исходный материал) и сшитый продукт. В частности, на этом геле можно разрешать аденилированный донор и различать его от исходного материала.
В Таблице 2 показана эффективность сшивания в зависимости от состава олигонуклеотида (например, олигонуклеотиды с со всеми ДНК нуклеотидами (A11-DNA) по сравнению с олигонуклеотидами, содержащими по меньшей мере один 2-0-метилнуклеотид, обозначенными "MNA") и типа лигазы (т.е. РНК лигаза в сравнении с ssDNA (онДНК) лигазой). Эти эксперименты по сшиванию включали следующие метки: A11-DNA донор, имеющий последовательность 5'-P-GCT GTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3' (SEQ ID NO: 6); 5'-MNA-DNA донор, имеющий последовательность 5'-P- mGCT GTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3' (SEQ ID NO: 7); и полностью-MNA (All-MNA) донор, имеющий последовательность 5'-P-mGmUmG mCmAmG mGmUmA mGmAmG mUmGmC-6-FAM-3' (SEQ ID NO: 8); DNA-3'MNA акцептор, имеющий последовательность 5'-НО- ТАС GTA ТАС GAC TGmG-OH-3' (SEQ ID NO: 9); All-DNA акцептор, имеющий последовательность 5'-HO-GCA GAC ТАС GTA ТАС GAC TGG-OH-3' (SEQ ID NO: 10); и All-MNA акцептор, имеющий последовательность 5'-HO-mUmAmC mGmUmA mUmAmC mGmAmC mUmGmG-OH-3' (SEQ ID NO: 11), где "m" означает 2'-OMe основание, "P" означает фосфорилированный нуклеотид и "FAM" означает флуоресцеин.
Эффективность сшивания рассчитывали из результатов денситометрии геля как соотношение интенсивности продукта сшивания и суммы интенсивности продукта сшивания и несшитого исходного материала. Условия реакции для Т4 РНК лигазы включали следующие условия: 5 мкМ каждого из олигонуклеотидов: донорного и акцепторного (15-18 нуклеотидов (нт) длиной) в буферном растворе, содержащем 50 мМ Tris НС1, 10 мМ MgCl2, 1 мМ гексамина хлорида кобальта, 1 мМ АТР, 25% PEG4600, и 5 единиц Т4 РНК лигазы (NEB- новые единицы) при рН 7.5. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 16 часов. Условия реакции для CircLigase(tm) включали следующее: 5 мкМ каждого из олигонуклеотидов: донорного и акцепторного (15 или 18 (нт)), инкубированных в буфере, содержащем 50 мМ MOPS (рН 7.5), 10 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 0.05 мМ АТР, 2.5 мМ МпС12 и 25% (вес/об) PEG 8000 с 20 единицами CircLigase(tm) (Epicentre) при 50°С в течение 16 часов. Реакционные смеси разрешали на геле 8М мочевина/15% PAAG с последующей денситометрией при длине волны возбуждения 450 нм.
Как правило, в присутствии CircLigase(tm) получали более высокие выходы сшивания, чем в присутствии Т4 РНК лигазы (Таблица 2). Когда и донор и акцептор представляли собой DNA/MNA гибридные олигонуклеотиды, эффективное сшивание наблюдалось в присутствии Т4 РНК лигазы.
На Фигуре 5 С показаны высокие выходы в реакции сшивания в присутствии Т4 RNA лигазы при высоких концентрациях фермента и олигонуклеотидов. Условия реакции: 250 мкМ каждого из донорных и акцепторных олигонуклеотидов в буфере, содержащем, 50 мМ Tris НС1, 10 мМ MgCb, 1 мМ гексамина кобальта хлорида, 2.5 мМ АТР, 30% (вес/об) PEG4600, рН 7.5, различные количества Т4 РНК лигазы с концентрацией 40 единиц/ мкл (NEB- новые единицы) и 0.1 единицы неорганической фосфатазы из дрожжей. Реакционные смеси инкубировали при 37°С в течение 5 и 20 часов и разрешали на 8М мочевина/15% PAAG с последующей денситометрией при длине волны возбуждения 450 нм.
В целом эти результаты наводят на мысль, что ферментативное сшивание можно оптимизировать, включая один или более модифицированных 2'- нуклеотидов и/или используя РНК или ДНК лигазу. Более подробно некоторые другие проверенные условия, такие как длина PEG или метки, которые могут содействовать эффективности сшивания, обсуждаются ниже.
Пример 2 Влияние ПЭГ (PEG) на сшивание однонитевых меток
Для определения влияния молекулярной массы (MW) PEG на сшивание однонитевые метки сшивали с 25% (вес/об) PEG с MW от 300 до 20000 Дальтон. Как показано на Фигуре 6А, 80%, или более высокий процент сшивания, наблюдали в случае
PEG с MW 3350, 4000, 6000, 8000 и 20,000. В эти эксперименты по сшиванию были включены следующие метки: 15- мерный донор, имеющий последовательность 5'-Р-mGTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3' (SEQ ID NO: 12) и 15- мерный акцептор, имеющий последовательность 5'-HO-mUAC GTA ТАС GAC TGmG-OH-3' (SEQ ID NO: 13). Эти олигонуклеотидные метки представляли собой последовательности ДНК с одним или двумя концевыми 2'О-метил (2'-ОМе) РНК основаниями (например, 2'-OMe-U (mU) или 2'-OMe-G(mG)).
Также проводили эксперименты по определению влияния концентрации PEG. Однонитевые метки сшивали с PEG с MW 4600 Дальтон (PEG4600). Как показано на Фигуре 6В, сшивание 70% или более, в среднем, наблюдали для 25% (вес/об) - 35% (вес/об) PEG4600.
Пример 3
Влияние длины метки на однонитевое сшивание
Для того, чтобы определить влияние длины метки на сшивание, были созданы акцепторные и донорные метки различной длины. В экспериментах с CircLigase(tm) применяли 15- мерный донор, имеющий последовательность 5'-P-mGTG CAG GTA GAG TGC-6-FAM-3' (SEQ ID NO: 12) в паре с 10, 12, 14, 16 и 18- мерными ДНК акцепторными олигонуклеотидами. В экспериментах с Т4 РНК лигазой метки включали одно или более 2'-ОМе- оснований (обозначены как MNA/ДНК метки). В Таблице 3 приводятся последовательности для трёх донорных меток (15- мер, 8- мер и 5- мер) и трёх акцепторных меток (15- мер, 8- мер и 5- мер).
* "m" означает 2'-OMe основание, "Р" означает фосфорилированный нуклеотид и "FAM" означает флуоресцеин.
Степень сшивания определяли методом денситометрии электрофоретических гелей (Фигуры 7А-7В). Результаты реакций с CircLigase(tm) показывают сильную зависимость выходов продуктов сшивания от длины акцепторного олигонуклеотида (Фигура 7А). Наивысший выход продуктов сшивания наблюдали с применением 18- мерного акцептора (62%), в то время, как выход сшивания с применением 10- мерного акцептора был меньше 10%. Результаты реакций с Т4 РНК лигазой показывают, что комбинация 8- мерного акцептора и 8- мерного донора даёт наивысший выход, и что комбинации 15- мерного донора с любым из тестированных акцепторов даёт выходы выше 75% (Фигура 7В). Если библиотека включает более короткие метки (т.е. около 10- мерных и короче), тогда Т4 РНК лигаза может быть предпочтительна для сшивания. В других случаях сшивание можно дополнительно оптимизировать, используя CircLigase(tm) комбинацию Т4 РНК лигазы и CircLigase(tm).
Пример 4
Влияние очистки на однонитевое сшивание
Для определения влияния очистки на сшивание сшивали однонитевые метки, имитируя процесс синтеза библиотеки. В этих экспериментах участвовали 15- мерная донорная и 15- мерная акцепторная метки, показанные выше в Таблице 3. Химический фрагмент связывали с 3'- концом библиотеки, причём, чтобы способствовать визуализации, химическим фрагментом в данном примере был флуоресцеин. Как показано на Фигуре 9 (справа), последующие метки сшивали с 5'-ОН группой комплекса после фосфорилирования посредством Т4 PNK.
Эксперименты также проводили, очищая сшитый продукт (т.е. комплекс) перед реакцией с PNK, так как конкретные агенты, применявшиеся в реакции сшивания (например, фосфат, кобальт и/или непрореагировавшие метки), могли ингибировать реакцию фосфорилирования посредством PNK или понизить выход сшивания. Как показано на Фигуре 9 (слева), очистка комплекса (т.е. осаждение минимальных примесей) перед PNK реакцией повышала выход продукта сшивания (см. результаты помеченные значком *, указывающим на очистку). На Фигурах 8А-8В показаны LC-MS спектры 15-мерной MNA/ДНК метки до и после фосфорилирования. Присутствие или отсутствие DTT не оказывало влияния на фосфорилирование.
Пример 5
Сшивание в присутствии пар реагирующих друг с другом химических реагентов и обратная транскрипция участков соединения
Методы, описанные в настоящей заявке, могут далее включать методы с участием пар реагирующих друг с другом химических соединений, а также методы ферментативного сшивания. Так, в качестве примера химического сшивания была применена типичная пара реагирующих друг с другом химических веществ (а именно, пара алкил и азидогруппа в реакции циклоприсоединения) в двух вариантах: были применены пара коротких и пара длинных реагирующих совместно соединений.
Материалы
В первом варианте использовали "короткую" пару реагирующих друг с другом (совместно) соединений (Фигура 10А). Пара включала (i) олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-GCG TGA АСА TGC АТС ТСС CGT ATG CGT АСА GTC CAT T/nponapnmG/-3' ("5end3propargyl," SEQ ID NO: 18) и (ii) олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-/азидоТ/АТА GCG CGA TAT АСА С AC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' ("3end5azido," SEQ ID NO: 19). Эту пару олигонуклеотидов получали с помощью TriLink BioTechnologies, Inc. (San Diego, CA). Эти олигонуклеотиды были созданы таким образом, чтобы получить короткий спейсер между двумя олигонуклеотидами при сшивании, где линкер был бы длиной 5 атомов (считая от положения СЗ' 5end3propargyl олигонуклеотида до положения С5' олигонуклеотида 3end5azido). Кроме того, получали 5'-азидо олигонуклеотид (3end5azido), превращая атом иода в соответствующем 5'- иод олигонуклеотиде в азидогруппу.
Во втором варианте применяли "длинную" пару реагирующих друг с другом соединений (Фигура 10В). Пара включала (i) олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-GCG TGA АСА TGC АТС ТСС CGT ATG CGT АСА GTC CAT ТО/спейсер7-азид/-3' ("5end3azide," SEQ ID NO: 20) и (ii) олигонуклеотид, имеющий последовательность 5'-/гексинил/ТА GCG CGA ТАТ АСА С AC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' ("3end5hexynyl," SEQ ID NO: 21). Эту пару олигонуклеотидов получали с помощью Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT DNA, San Diego, CA, and Coralville, IA). Олигонуклеотид 5end3azide получали реакцией сложного эфира азидобутирата N-гидроксисукцинимида с 3'- амино-модификатором С7 (2- диметокситритил оксиметил- 6-флуоренилметоксикарбониламино- гексан- сукциноил- длинноцепной алкиламино), который вводили во время синтеза олигонуклеотида в колоночном формате. Эту пару создавали с целью получить 24- атомный длинный спейсер между олигонуклеотидами
(считая с положения СЗ' олигонуклеотида 5end3azide до положения С5' олигонуклеотида 3end5hexynyl).
Для обратной транскрипции (схематически показанной на Фигуре ПА) праймеры и матрицы включали следующее: праймер для обратной транскрипции, имеющий последовательность 5'-/Су5/ CAG ТАС GCA AGC TCG-3' ("Cy5s_primerl5," SEQ ID NO: 22); контрольную матрицу, имеющую последовательность 5'-GCG TGA АСА TGC АТС ТСС CGT ATG CGT АСА GTC CAT TGT ATA GCG CGA TAT АСА CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG-3' ("templ75," SEQ ID NO: 23); 5'-PCR (ПЦР) праймер, имеющий последовательность 5'-GCG TGA АСА TGC АТС TCC-3' (SEQ ID NO: 24); и 3'-PCR праймер, имеющий последовательность 5'-CAG ТАС GCA AGC TCG CC-3' (SEQ ID NO: 25), где эти последовательности получали с использованием IDT DNA. В экспериментах применяли Су5- меченный ДНК праймер, чтобы сделать возможным отдельное обнаружение продуктов обратной транскрипции методом LC (ЖХ).
Условия эксперимента
Для сшивания пары реагирующих друг с другом соединений (совместно реагирующей пары) 1 мМ растворы совместно реагирующих пар, таких как 5end3propargyl+3end5azido (короткая) или 5end3azide+3end5hexynyl (длинная), инкубировали в течение 12 часов в присутствии 100 эквивалентов лиганда ТВТА (трис-[(1- бензил-Ш-1,2,3- триазол-4-у1)метил]амин) и 50 эквивалентов CuBr в смеси вода/диметилацетат. По окончании реакции добавляли избыток EDTA и реакционную смесь обессоливали на спин- колонках для обессоливания Zeba (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA), а затем осаждали этанолом. Для реакций обратной транскрипции матрицы очищали на 15% полиакриламидном геле, содержавшем 8М мочевины.
Жидкостную хроматографию- масс- спектрометрию (LC-MS) проводили на приборе Thermo Scientific LCQ Fleet с колонкой АСЕ 3 С18-300 (50 х 2.1 мм) и в 5 минутном градиенте 5-35% буфера В с применением буфера А (1% гексафторизопропанола (HFIP), 0.1% диизопропилэтиламина (DIEA), 10 мкМ EDTA в воде) и буфера В (0.075% HFIP, 0.0375% DIEA, 10 мкМ EDTA, 65% ацетонитрила/35% воды). Мониторинг LC вели при 260 нм и при 650 нм. MS: метод масс- спектрометрии отрицательных ионов, свёртку масс- спектрометрического пика осуществляли с применением программы ProMass.
Реакции обратной транскрипции проводили с применением системы ThermoScript(tm) RT (Invitrogen Corp.) согласно протоколу производителя при 50°С в течение 1-2 часов. Результаты анализировали методами LC-MS и PCR. PCR проводили с
использованием смеси Platinum(r) SuperMix и разрешали (разделяли) на 4% агарозных Е-гелях (всё от Invitrogen Corp.). Проводили одиннадцать и восемнадцать циклов PCR с предшествующей RT реакцией или без неё. 75- мерную матрицу не транскрибировали обратно, а использовали непосредственно для PCR амплификации.
Результаты и обсуждение
По результатам анализа LC-MS в обоих случаях сшивания с образованием короткого спейсера и длинного спейсера выходы в реакции были высокими, близкими к количественным. Таким образом, химическое сшивание обеспечивает высокий выход связывания или функционального связывания головного фрагмента с мечеными структурными элементами.
Для эффективной стратегии химического сшивания с целью получения ДНК-кодированных библиотек нужно, чтобы продукт реакции- комплекс мог вступать в реакции PCR или RT-PCR для последующего применения секвенирования. В то время как PCR и RT-PCR не могут быть проблемой в случае ферментативно сшитых меток, такие как описанные выше, неприродные химические линкеры может быть трудно процессировать с использованием РНК или ДНК полимераз. Результаты, приведённые на Фигурах 11 В-НЕ, показывают, что олигонуклеотиды, имеющие спейсеры определённой длины, могут транскрибироваться и/или обратно транскрибироваться.
В случае линкера, получаемого с помощью реакции пары реагентов, приводящей в результате к триазол- связанному олигонуклеотиду, наблюдалась зависимость от длины линкера. Для короткой химически "совместно реактивной" пары полученную в результате матрицу транскрибировали и анализировали методом LC- MS. LC анализ выявил три основных пика поглощения с временем удерживания 2.79 мин., 3.47 мин. и 3.62 мин. для 260 нм, причём пики с временем удерживания 3.47 мин. и 3.62 мин. также наблюдались при 650 нм. MS анализ пика с временем удерживания 3.47 мин показал только наличие матрицы 23097.3 (вычислено 23098.8), а пик с временем удерживания 3.62 мин. содержал матрицу (23098.0) и полностью удлинённый праймер (23670.8, вычислено: 23671.6) в примерном соотношении 1.7:1, т.е. выход в этой RT реакции составляет 50-60% (Фигура ПС). Для сравнения, обратная транскрипция (RT) контрольной имеющей all-DNA матрицу, дала удлинённый праймер (пик 23068.9), примерно, равный по величине матрице (23078.7), примерно близком к 100% выходу (Фигура 11В).
Для длинной "совместно реактивной" пары в LC хроматограмме RT реакции наблюдались два пика поглощения с временем удерживания 2.77 мин и 3.43 мин для 260 нм, где пик 3.43 мин также наблюдался при 650 нм, т.е. содержал меченный Су5 материал,
предположительно RT продукт. В MS пика с временем удерживания 3.43 мин. имеется матрица (найдено 23526.6, вычислено: 23534.1), а также Су5 праймер, удлинённый до линкера (11569.1). Никакого полноразмерного продукта в LC-MS не наблюдалось, указывая на то, что RT реакция в измеримом количестве не происходила (Фигура 11D).
RT-PCR проводили с использованием описанных выше матриц и обнаружили, что только короткий линкер даёт продукт обратной транскрипции, хотя с эффективностью, в 5-10 раз более низкой (Фигура НЕ). Было определено, что эффективность RT примерно в 2 раза ниже, чем эффективность матрицы (templ75). Например, выход продукта PCR с использованием короткой сшитой матрицы примерно в 2 раза ниже после RT и примерно в 5-10 ниже без RT по сравнению с PCR продукта all-DNA матрицы 75 (templ75). Следовательно, эти результаты подтверждают применение химического связывания для получения комплекса, который можно обратно транскрибировать и/или транскрибировать, а химически сшитые головные фрагменты и/или метки можно применять на любой из стадий связывания, описанных в настоящей заявке, для получения кодированных библиотек.
Пример 6
Сшивание З'-фосфоротиоат олигонуклеотидов с 5'-иод олигонуклеотидами
Для того, чтобы определить возможности методов, описанных в настоящей заявке, определяли эффективность сшивания олигонуклеотидов с другими модификациями. В частности, аналоги природной фосфодиэфирной связи (например, фосфоротиоатный аналог) могли явиться альтернативным фрагментом для ПЦР- анализа и секвенирования после стадии отбора.
Следующие олигонуклеотиды были синтезированы в TriLink BioTechnologies, Inc. (San Diego, CA): (i) 5'-/Cy5/ CGA TAT АСА CAC TGG CGA ОСТ/тиофосфат/-3' ("CCy5," SEQ ID NO: 26), (ii) 5'-/Иодс1Т/ GC GTA CTG AGC/6-FAM/-3' ("CFL," SEQ ID NO: 27), как показано на Фигуре 12А, (iii) олигонуклеотидный шунт, имеющий последовательность CAG ТАС GCA AGC TCG СС ("spl," SEQ ID NO: 28). Реакции сшивания проводили со 100 мкл каждого олигонуклеотидного реагента в буфере, содержащем 50 мМ Tris НС1 (рН 7.0), 100 мМ NaCl и 10 мМ MgCl2 ("буфер для сшивания") при комнатной температуре. Реакционные смеси для сшивания дополняли любым компонентом из нижеприведённой группы: 100 мкМ олигонуклеотидного шунта, 10 мМ Co(NH3)6Cl3, 40% (вес/об) PEG4000, или 80% (вес/об) PEG300. Реакцию проводили в течение 48 часов. Продукты сшивания анализировали методом LC-MS с детекцией при 260 нм, 495 нм и 650 нм, а также электрофорезом в системе 8М мочевина/ 15%
полиакриламидный гель (PAAG), затем считывали показания при длине волны возбуждающего света 450 и 635 нм на приборе Storm(tm) 800 Phosphorlmager.
В отсутствие олигонуклеотидного шунта сшивания не наблюдается совсем (Фигура 12В, полоски, обозначенные "-spl"). В присутствии олигонуклеотидного шунта сшивание происходит и достигает примерно 60% фракции после 48 сшивания (Фигуры 12В-12С). На LC-MS хроматограмме наблюдалось несколько пиков, причём поглощение пика с временем удерживания 3.00 мин. наблюдалось при 260 нм, 495 нм и 650 нм. MS- спектр этого пика содержал главным образом продукт сшивания при 11539.6 Да (вычислено 11540) с менее чем 10% ССу5 олигонуклеотида при 7329.8 Da (вычислено'с1 7329.1). Низкие уровни сшивания были обнаружены в присутствии PEGs и гексамин кобальта, причём гексамин кобальта вызывал осаждение олигонуклеотида, меченного с помощью Су5. Эти результаты говорят о том, что головные фрагменты и/или метки, содержащие модифицированные фосфатные группы (например, модифицированные фосфодиэфирные связи, такие как фосфоротиоатные связи) можно применять на любой из стадий связывания, описанных в настоящей заявке, для получения кодированных библиотек.
Для более подробного изучения реакции ""иод- фосфоротиоатного" сшивания проводили сшивание 5'-I dT-oligo-3'-FAM (CFL) и 5'-Cy5-oligo-3'-PS (ССу5) в отсутствие и в присутствии шунта в различных условиях реакции.
При первой комбинации условий эксперименты проводили с инкубацией от семи до восьми дней. Эти эксперименты проводили в том же буфере для сшивания, который описан выше, с количеством каждого олигонуклеотида 50 мкМ и инкубировали при комнатной температуре. На Фигуре 12D показаны результаты LC-MS анализа сшивания CFL и ССу5 в отсутствие (вверху) и в присутствии (снизу) шунта (положительный контроль), где реакционные смеси для сшивания инкубировали в течение семи дней. LC пики для каждой реакции регистрировали при 260 нм (для обнаружения всех нуклеиновых кислот), при 495 нм (для обнаружения CFL олигонуклеотида и продукта сшивания) и при 650 нм (для обнаружения ССу5 олигонуклеотида и продукта сшивания).
В отсутствие шунта никакого сшивания не происходило, и были обнаружены только исходные материалы CFL (4339 Да) и ССу5 (7329 Да) (Фигура 12D, вверху). В присутствии олигонуклеотидного шунта через семь дней наблюдался характеристический пик в канале с длиной волны 495 нм с временем удерживания 2.98 мин, что соответствует сшитому продукту (11542 Да) (Фигура 12D, внизу). Этот пик перекрывался с пиком для ССу5 олигонуклеотида, наблюдаемым в канале с длиной волны 650 нм и поэтому не отличался от ССу5 при 650 нм.
На Фигуре 12Е показан LC-MS анализ CFL и ССу5 в отсутствие шунта, в условиях, когда реакции сшивания проводили при инкубации в течение восьми дней с 400 мкМ каждого олигонуклеотида. Не было обнаружено никакого продукта сшивания. Пик 1 (при 495 нм) содержал CFL исходный материал (4339 Да), а также следы продукта с потерей иода (4211 Да) и неизвестного продукта распада (4271 Да, возможно, замещение на этилмеркаптан). Пик 2 (при 650 нм) содержал ССу5 исходный материал (7329 Да) и окисленный ССу5 олигонуклеотид (7317 Да). Пик 3 (при 650 нм) содержал димеризованный ССу5 (14663 Да).
При второй комбинации условий реакции замещения иода проводили в присутствии пиперидина и при рН выше 7.0. На Фигуре 12F показан MS анализ для реакции CFL олигонуклеотида с пиперидином, эта реакция предполагалось для замещения концевого иода в CFL. Одно условие реакции включало: олигонуклеотидов 100 мкМ, пиперидин 40 мМ (400 эквивалентов) в 100 мМ боратного буфера, рН 9.5, в течение 20 час при комнатной температуре (данные приводятся на левой панели на Фигуре 12F); другое условие реакции включало при 400 мкМ, пиперидин 2 М (4000 эквивалентов) в 200 мМ боратного буфера, рН 9.5, в течение 2 час при 65°С (данные, показанные на правой панели Фигуры 12F).
В реакции, в которой участвуют 40 мМ пиперидина (Фигура 12F, слева), никакого замещения пиперидином не наблюдалось и обнаруживали небольшое количество продукта гидролиза (4229 Да). Помимо этого, наблюдали следовые количества продукта потери иода (4211 Да) и неизвестного продукта распада (4271 Да). В реакции с участием 2 М пиперидина (Фигура 12F, справа) наблюдали замещение иода на пиперидин (4296 Да), а количество исходного материала было значительно меньше (4339 Да). Помимо этого, наблюдали также пики, соответствующие гидролизу атома иода (заменой на ОН) или примеси (4229 Да) и потери иода (4214 Да). Эти результаты показывают, что присутствие амина (например, в качестве реагента, участвующего в химическом синтезе библиотеки) не оказывает вредного воздействия на олигонуклеотидный участок членов библиотеки и/или не препятствует стратегии сшивания.
В случае третьей комбинации условий реакции сшивания с применением шунта проводили в присутствии пиперидина и при рН выше 7.0. На Фигуре 12G представлена реакция сшивания с помощью шунта CFL и ССу5 олигонуклеотидов 50 мкМ, проводившаяся в присутствии 400 эквивалентов пиперидина в 100 мМ боратного буфера при рН 9.5 в течение 20 час при комнатной температуре. Характеристический пик, наблюдаемый на хроматограмме LC (при 495 нм), содержал преимущественно продукт сшивания при 11541.3 Да (вычислено 11540 Да). На основании этих результатов можно
сделать вывод, что пиперидин не наносит вреда ферментативному сшиванию и что присутствие других аминов (например, в качестве реагентов химического синтеза библиотеки), по- видимому, не мешает этой стратегии сшивания.
В целом эти результаты показывают, что этот метод сшивания можно осуществлять, проводя реакцию в различных условиях, которые применимы для широкого ряда химических превращений, включая продолжительное время инкубации, повышенные значения рН и/или присутствие одного или более аминов. Таким образом, методы по настоящему изобретению могут применяться для получения членов библиотеки в различных условиях реакции и исключения необходимости буферного обмена, как при осаждении или других "ресурсоёмких" методах
Пример 7
Минимизация шаффлинга (перетасовки) с помощью модифицированных
нуклеотидов
В процессе однонитевого ферментативного сшивания с применением Т4 РНК лигазы может происходить шаффлинг (перетасовка) концевых нуклеотидов. Перетасовка может приводить к включению или вырезанию (эксцизии) нуклеотида, причём конечный продукт или комплекс включает или исключает нуклеотид по сравнению с ожидаемой сшитой последовательностью (т.е. последовательностью, содержащей полную последовательность как акцепторного, так и донорного олигонуклеотидов).
Хотя низкие уровни шаффлинга можно допустить, его можно уменьшить (до минимума), включая модифицированную фосфатную группу. В частности, модифицированная фосфатная группа означает фосфоротиоатную связь между концевым нуклеотидом на 3'- конце акцепторного олигонуклеотида и нуклеотидом, прилегающим к концевому нуклеотиду. При использовании такой фосфоротиоатной связи шаффлинг значительно снижается. Методом масс- спектрометрии был обнаружен только остаточный шаффлинг, причём шаффлинг, по- видимому, происходил вследствие неполного превращения природной фосфодиэфирной связи в фосфоротиоатную связь или вследствие низких уровней окисления фосфоротиоатной связи с последующим превращением в природную фосфодиэфирную связь. Принимая во внимания эти данные и результаты сшивания, приведённые в Примере 6, одну или более модифицированных фосфатных групп (например, фосфоротиоатную или 5'- N-фосфорамидитную связь) можно было бы включать в любую олигонуклеотидную последовательность, представленную в настоящей заявке (например, между концевым нуклеотидом на 3'-концом головного фрагмента, комплекса, меченого структурного элемента или любой
метки по настоящему описанию, и нуклеотидом, прилегающим к концевому нуклеотиду), для минимизации шаффлинга в процессе однонитевого сшивания.
Однонитевой головной фрагмент (ssHP (онНР), 3636 Да) фосфорилировали по 5'-концу и модифицировали с помощью гексиламина в качестве линкера на 3'- конце, получая последовательность 5'-P-mCGAGTCACGTC/Aminohex/-3' (SEQ ID NO: 29). Головной фрагмент сшивали с меткой (метка 15, XTAGSS000015, 2469 Да), имеющей последовательность 5'-mCAGTGTCmA-3' (SEQ ID NO: 30), где mC и mA означают 2'-0 метилнуклеотиды. LC-MS анализ (Фигура 13А) показал, что пик продукта сшивания содержал до трёх соединений, которые были частично разделены с помощью LC и имели следующие молекулярные массы: 6089 Да (ожидаемый), 5769 Да (ожидаемый -320 Да) и 6409 Да (ожидаемый +320 Да). Эта разница в массе 320 Да точно соответствует либо удалению, либо прибавлению дополнительного О-Ме С нуклеотида ("шаффлинг концевого нуклеотида").
Эксперименты с другими концевыми О-Ме нуклеотидами, а также с концевыми 2'-фторнуклеотидами подтвердили, что, по-видимому, шаффлинг происходит посредством отщепления 5'- концевого нуклеотида донорного олигонуклеотида, возможно, после аденилирования последнего. Механизм этого события неизвестен. Без связи с определённым механизмом на Фигуре 13В показана возможная схема перетасовки нуклеотидов в процессе реакции в присутствии Т4 РНК лигазы между головным фрагментом и меткой, причём специалист в данной области техники понимает, что эта реакция может происходить между любыми донорными и акцепторными олигонуклеотидами (например, между двумя метками, где одна метка представляет собой донорный олигонуклеотид, а вторая метка представляет собой акцепторный олигонуклеотид).
Как правило, в основном реакция сшивания с помощью Т4 РНК лигазы (T4Rnll) даёт ожидаемый (нормальный) продукт сшивания, содержащий объединённую последовательность как донорного, так и акцепторного олигонуклеотидов (Фигура 13В-1, реакция слева). И лишь в небольшой своей части реакция даёт аномальные продукты сшивания (фигура 13В-1, реакция справа), причём эти аномальные продукты включают продукты с удалением или присоединением концевого нуклеотида ("Продукт -1 нт" и "Продукт + 1 нт," соответственно, на Фигуре 13В-2).
Без связи с определённым механизмом, отщепление донорного олигонуклеотида ("головной фрагмент" или "HP" на Фигуре 13В-1) может происходить по реакции с З'-ОН группой акцептора ("метки"), при этом образуется 5'- фосфорилированный донор без одного нуклеотида ("НР-1 нт") и аденилированный нуклеотид с доступной З'-ОН группой
("1 нт"). На Фигуре 13В-2 показаны две типичные схемы реакции между головным фрагментом (HP), меткой, НР-1 нт и 1 нт. При получении продукта с исключением (эксцизией) концевого нуклеотида (Фигура 13В-2, слева) 5'- фосфорилированный донор, в котором отсутствует один нуклеотид (НР-1 нт) играет роль субстрата для события сшивания. Этот НР-1 нт головной фрагмент повторно аденилируется с помощью Т4 РНК лигазы (давая "Аденилированный НР-1 ни" на Фигуре 13В-2) и сшивается с меткой, давая в результате продукт сшивания минус один нуклеотид ("Продукт-1 нт"). При получении продукта с дополнительным концевым нуклеотидом (Фигура 13В-2, слева) аденилированный нуклеотид (1 нт), по- видимому, служит в качестве субстрата для сшивания с меткой, при этом получают олигонуклеотид, имеющий длину на один нуклеотид больше, чем акцептор ("Метка+1 нт"). Этот олигонуклеотид Метка+1 нт, по-видимому, служит в качестве акцептора для неизменённого головного фрагмента, при этой реакции получается продукт сшивания, имеющий один дополнительный нуклеотид ("Продукт+1 ни"). Были осуществлены LC-MS анализы продуктов "Продукт", "Продукт-1 нт" и "Продукт+1 нт" (Фигура 13В-3). Когда происходит рекомбинация аномальной метки и аномального головного фрагмента (т.е. Метки+1 нт и НР-1 ни, соответственно), тогда получаемый в результате продукт является неотличимым от ожидаемого продукта.
Для более подробного изучения механизма перетасовки концевых нуклеотидов получали головной фрагмент (HP-PS), имеющий последовательность 5'Р-mC*GAGTCACGTC/Aminohex/-3' (SEQ ID NO: 31). Головной фрагмент HP-PS имел ту же последовательность, что и ssHP, но содержал одну модификацию, а именно, первая фосфодиэфирная связь между 5'- концевым нуклеотидом тС и следующим G была синтезирована как фосфоротиоатная связь (один немостиковый атом кислорода в фосфатной группе был замещён на атом серы). Анализ LC-MS сшивания HP-PS с меткой 15 показал, что перетасовка (шаффлинг) почти полностью ингибируется (Фигура 13С). Пики +/- 320, по- видимому, соответствуют окислительному превращению фосфоротиоатной связи в природные фосфодиэфирные связи или неполному сульфированию.
Пример 8
Гель- хроматография членов библиотеки
Библиотеки химических структур, полученных с применением коротких однонитевых олигонуклеотидов в качестве кодирующих элементов, подходят для обогащения связующих с помощью гель- хроматографии (SEC). SEC представляют собой хроматографический метод разделения молекул по размеру, при этом молекулы большего
размера с более высокой молекулярной массой проходят через колонку быстрее, чем молекулы меньшего размера с более низкой молекулярной массой.
Комплексы белков и членов онДНК-библиотеки можно легко отделить от несвязанных членов библиотеки с помощью SEC. На Фигуре 14 представлена УФ- кривая из SEC эксперимента, в котором малую молекулу, связанную ковалентной связью с короткой онДНК (ssDNA) (олигонуклеотиды с определённой длиной в 20-50- мерном интервале), смешивали с целевым белком, заведомо связывающимся с малой молекулой. Пики, элюирующие из колонки первыми, в 11- 13- минутном интервале, являются связанными с мишенью членами библиотеки. Пики, выходящие позднее, элюирующие через 14- 17 минут, являются несвязанными членами библиотеки. Отношение целевого белка к библиотечной молекуле составляло 2:1, так что, как видно на Фигуре 14, около 50% молекул из библиотеки связывалось с белком в ранней элюирующей фракции. Библиотеки с Этим методом нельзя отбирать библиотеки с кодирующими областями двухнитевых олигонуклеотидов большего размера, так как несвязанные члены библиотеки идут вместе со связанными членами библиотеки в процессе SEC. Таким образом, библиотеки малых молекул, связывающихся с кодирующими однонитевыми олигонуклеотидами длиной от 20- мера до 50- мера, делают возможным применение мощного метода разделения, который имеет потенциал значительно повысить отношение сигнал/шум, необходимое для эффективного отбора малых молекул, связывающихся с одной или более мишеней, например, с новыми белками- мишенями, которые, необязательно, представляют собой немеченый и/или дикого типа белок. В частности, эти методы позволяют идентифицировать связывающие мишень химические соединения в кодированных комбинаторных библиотеках без необходимости метить или иммобилизовать мишень (например, белок- мишень).
Пример 9
Кодирование с помощью химически сшитых ДНК- меток с использованием одной и той же химической реакции на каждой стадии сшивания
Кодирующие ДНК- меток можно сшивать ферментативными или химическими методами. Общий подход к химическому сшиванию ДНК- меток представлен на Фигуре 15А. Каждая метка несёт со- комплементарные реакционноспособные группы на 5' и 3' концах. Для предотвращения полимеризации или циклизации меток применяют либо (i) защиту одной или обеих реакционноспособных групп (Фигура 15А), например, как в случае TIPS-защищённых 3' алкинов, или (ii) реакцию сшивание с применением шунта (Фигура 15В), например, в случае сшивания 5'- иод/3'- фосфоротиоат. В случае (i)
несшитые метки можно удалять или вводить защиту (кэп) после каждого цикла использования библиотеки с целью предотвратить ошибочное мечение или полимеризацию депротекционированной метки. Эта стадия может быть необязательной для (ii), но всё же может быть включена. Можно также осуществлять реакции удлинения праймера с применением полимераз, способных прочитывать химически сшитые соединения, с целью продемонстрировать, что сшитые метки можно прочитать и, следовательно, закодированную информацию можно воспроизвести, восстановить с помощью амплификации после отбора ("постселекционной") и секвенированием (Фигура 15С).
Стратегия введения меток в библиотеки, которая позволяет сшивать метки с применением "клик- химии" (катализируемое Cu(I) азид/алкин циклоприсоединение), представлена на Фигуре 16А. Воплощение этой стратегии основано на возможности осуществить точное последовательное сшивание меток, исключающее ошибочное мечение и полимеризацию меток, а также на возможности копировать химически сшитую ДНК в способную амплифицироваться природную ДНК (кДНК) для постселекционной (после отбора) амплификации и секвенирования (Фигура 16С).
Для осуществления точного сшивания метки применяли триизопропилсилил (TIPS)- защищённые 3' пропаргилнуклеотиды (синтезированные с применением пропаргил U в виде CPG матрицы, применяемой для синтеза олигонуклеотидов) (Фигура 16В). Защитные группы TIPS можно специфически снимать, обрабатывая тетрабутиламмония фторидом (TBAF) в DMF при 60°С в течение 1-4 часов. В результате сшивание в процессе синтеза библиотеки включало реакцию 5'-азидо/3'-Т1Р8- пропаргил нуклеотида (Метка А) с 3'- пропаргил- концом головного фрагмента с помощью "клик-реакции". После очистки полученный цикл обрабатывали TBAF с целью снятия TIPS и получения реакционноспособного алкина, который в свою очередь реагировал со следующей циклической меткой. Процедуру повторяли столько циклов, сколько было необходимо для получения 2, 3 или 4 или более последовательно установленных кодирующих меток (Фигура 16А).
Материалы и методы
Олигонуклеотиды: Следующие олигонуклеотиды были синтезированы в Trilink Biotechnologies, San Diego С А: он-НР-алкин: 5'- NH2-TCG AAT GAC TCC GAT AT (3'-Пропаргил G)-3'(SEQ ID NO: 32); он-азидо-ТР: 5'-азидо dT ATA GCG CGA TAT АСА CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG -3'(SEQ ID NO: 33); и В-азидо: 5' азидо dT АСА CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG -3' (SEQ ID NO: 34).
ClickTag-TIPS: 5'-азидо dT AT GCG TAC AGT CC (пропаргил U-TIPS)-3' (SEQ ID NO: 35) и 5'Диметокситритил 2'- сукцинил 3'- О- (триизопропилсилил) Пропаргил уридин cpg были синтезированы в Prime Organics, Wobum MA.
Следующие олигонуклеотиды были синтезированы в IDT DNA technologies, Coralville, IA: FAM-клик-праймер: (5'-6-FAM) CAG TAC GCA AGC TCG CC -3' (SEQ ID NO: 36) и Су5-клик-праймер: (5'-Cy5) CAG TAC GCA AGC TCG CC -3' (SEQ ID NO: 37).
DNA55-KOHrpanb: /5'BHOTHH-TEG//ispC3//ispC3/-TCGAATGACTCCGATATGT ATA GCG CGA TAT АСА CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG -3' (SEQ ID NO: 38).
rDNA55-кoнтpoль: /5Bio-TEG//ispC3//ispC3/-TCGAATGACTCCGATAT(riboG)T ATA GCG CGA TAT АСА CAC TGG CGA GCT TGC GTA CTG -3' (SEQ ID NO: 39)
Синтез матриц: В нижеприведённых примерах выражение "химически сшитые метки", или контрольные последовательности, относящиеся к ним, называются "матрицы", потому что на последующей стадии ("прочитывание") они использовались в качестве матриц для матричной полимеризации.
Сшивание меток: К раствору 1 эквивалента (1 мМ) онНР-алкина и 1 эквивалента (1 мМ) он-азидоТР в 500 мМ рН 7.0 фосфатном буфере прибавляли предварительно приготовленный раствор 2 экв Си(П)Ацетата (до 2 мМ), 4 экв аскорбата (концентрация 4 мМ), 1 экв ТВТА (до конечной 1 мМ) в смеси DMF/вода. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. После подтверждения завершения реакции методом LC-MS реакционную смесь осаждали, добавляя соль/этанол.
Матрицы для "одной клик- реакции" Y55 и Y185 синтезировали реакцией он-НР-алкина с ss-азидо-ТР и В-азидо, соответственно. Матрицы для реакций с двойным и тройным кликом (YDC и YTC) синтезировали "клик- сшиванием" он-НР-алкина с ClickTag- TIPS с последующим снятием защитной группы TIPS (депротекцией) с помощью TBAF (тетрабутиламмония фторида) в DMF при 60°С в течение одного часа, а затем "клик- сшиванием" с он-азидо ТР. Для матрицы для клик- реакции тройного сшивания (YTC) сшивание и депротекцию ClickTag-TIPS повторяли дважды.
Проводили реакцию матриц с биотин -(EGVNHS и обессоливание (Фигура 17А). Конечные продукты очищали методом ОФ ВЭЖХ и/или в системе 15-20% полиакриламидный гель/ 8М мочевина и анализировали методом LC-MS.
Ферменты: Следующие ДНК полимеразы с реакционными буферами получали от New England Biolabs: фрагмент Клёнова (Klenow) Е. coli ДНК полимеразы I, фрагмент Клёнова (экзо-) Е. coli ДНК полимеразы I, Therminator(tm), 9 N(tm), Superscript III(tm) .
Покрытые стрептавидином магнитные бусы Dynabeads(r) М280 получали от Invitrogen.
Анализ матричной полимеризации: Каждую матрицу (5 мкМ) инкубировали с 1 эквивалентом либо Су5, либо праймера FAM для клик-реакции в 40-50 мкл соответствующего 1х реакционного буфера и каждого фермента в условиях реакции рекомендованных производителем в течение 1 часа. Помимо этого, в некоторых случаях (таких как транскрипции SSII или SSIII) реакционные смеси были дополнены 1 мМ МпСЬ. Продукт реакции наносили на 125 мкл предварительно отмытых SA бус, встряхивая в течение 30 минут. Бусы собирали, а жидкость отбрасывали. Бусы отмывали с помощью 1 мл солевого раствора, забуференного Tris (рН 7.0) и элюировали, пропуская 35 мкл 100 мМ NaOH. Элюат сразу же нейтрализовали, добавляя 10 мкл 1 М Tris НС1, рН 7.0. Продукты анализировали методом LC-MS.
Результаты и обсуждение
Получение матриц: Каждую матрицу, Y55, Y185 (Фигуры 17В и 17С), YDC и YTC (Фигура 19) синтезировали и очищали до степени чистоты выше 85% (причём основную часть примеси составляла небиотинилированная матрица). Методом LC-MS получены следующие значения MW для матриц: Y55 17624 (вычислено 17619) Да; YDC 22228 (вычислено 22228) Да; и YTC 26,832 (вычислено 26837) Да.
Матрицы для "одного ioiHKa'Y55 и Y185 (Фигуры 17В и 17С) синтезировали с использованием олигонуклеотидов, которые несут только одну функциональную группу для "клик- реакции" (алкин или азид). Эффективность клик- реакции (химическое сшивание), проводившейся в течение ночи с применением образующегося in situ катализатора Cu(I), была выше 90%.
Матрицы YDC и YTC (Фигуры 19A-19D) служат для демонстрации последовательных химических сшиваний. Как YDC, так и YTC используют отдельные метки, которые одновременно содержат как азидогруппу, так и защищённые группой TIPS алкин. На примере матрицы YTC показаны три последовательных цикла введения метки, используемые для кодирования трёх стадий создания химической библиотеки.
Все вышеприведённые матрицы проверяли на удлинение праймера вплоть до связей, участвующих в клик- сшивании, и вне этих связей, чтобы показать, что сшитые метки можно прочитывать и, следовательно, кодированная информация восстанавливается (сохраняется).
Матричная полимеризация с применением матрицы "одного клика" Y55: Был проверен большой набор полимераз для считывания триазольной клик- связи (Фигура 18А). Начальные эксперименты проводили с применением Су5- клик-праймер. В последующих экспериментах использовали FAM- клик- праймер. Флуорофор не влиял на копирование матрицы, т.е. результаты были аналогичными при использовании того и
другого праймера. В качестве контрольной матрицы применяли DNA55- контроль и rDNA55- контроль (для проверки эффекта одного рибонуклеотида в матрице, так как пропаргил-G, применявшийся для клик-сшивания, является производным рибонуклеотида).
Ожидаемые полноразмерные продукты для всех трёх матриц имеют одну и ту же молекулярную массу, равную 17446 (FAM праймер) (Фигура 18В) или 17443 (Су5 праймер). Для некоторых полимераз наблюдалось также небольшое количество продукта, который соответствует удлинению праймера до, но прекращении удлинения в области связи клик- сшивания (11880 Да).
Был обнаружен набор полимераз, которые могут обеспечить считывание клик-сшивания в значительной степени (продуцирование полноразмерной кДНК), эти полимеразы представлены в нижеприведённой таблице.
Выходы полноразмерной кДНК выше 50% Фрагмент Клёнова Е. coli ДНК полимеразы I Фрагмент Клёнова (экзо-) ДНК полимераза Е. coli I Therminator(tm)
Superscript III(tm), дополненная 1 мМ МпСЬ
Наивысшие выходы (более 80% "прочитывается" на участке соединения в один клик) получали с применением фрагмента Клёнова после инкубации при 37°С (Фигура 18В). Немного более низкий выход получали с применением Е. coli ДНК полимеразы I. Выходы 50% получали с Therminator(tm) и 9°N(tm) полимеразами, а также с фрагментом Клёнова экзо-.
Обратная транскриптаза (ревертаза) Superscript III(tm) давала выход кДНК около 50%, когда буфер был дополнен 1 мМ МпСЬ. Однако марганец вызывал ошибку включения нуклеотидов, которую можно было наблюдать с помощью MS, т.е. правильность полимеризации была меньше.
Матричная полимеризация с применением матрицы "одного клика" Y185: Для матрицы Y185 характерен тот же самый сайт связывания праймеров, что и для всех матриц, применяемых в настоящем примере, за исключением того, что вследствие другого В- азидо хвостового фрагмента расстояние между последним нуклеотидом сайта связывания праймеров и клик-связью составляет равно 8 нуклеотидов, по сравнению с 20
нуклеотидами в Y55 и всеми другими матрицами. Матрицу применяли для того, чтобы проверить, является ли транскрипция клик-связи всё ещё возможной, когда фермент находится в конформации инициации-ранней элонгации. Фрагмент Клёнова позволял копировать матрицу Y185 с эффективностью, аналогичной Y55, что открывает возможность уменьшать длину сшитых с помощью клик- реакции кодирующих меток (Фигура 18С).
Матричная полимеризация с применением матриц YDC и YTC, сшитых посредством двойных и тройных клик- реакций: После того, как мы установили, что фрагмент Клёнова является наиболее эффективным ферментом для прочитывания связей клик- сшивания в применяемых условиях, были также получены кДНК с применением матриц YDC и YTC (Фигуры 20А-20С). Реакции удлинения праймера с использованием как YDC, так и YTC матриц давали полноразмерные продукты. Другие полученные продукты, которые составляли около 10-15% от выхода всех продуктов, соответствовали частично удлинённому праймеру, "блокировавшемуся" при каждом клик- соединении, как например, 11880 Да и 16236 Да. Выходы определяли методом LC-MS в присутствии внутреннего стандарта, они составляли 80-90% на соединение (т.е. выход на клик- сшитых матрицах около 85% 1 клик, 55% 2-кликаи 50% 3-клика, см. Фигуру 21).
В продукте YDC транскрипции отсутствовал 1 dA нуклеотид (вычислено 22110, найдено 27197 Да; -313 dA, см. Фигуру 20В), а в продукте YTC транскрипции отсутствовали 2 dA нуклеотида (вычислено 26773, найдено 26147; -626 2xdA) (Фигура 20С). Эти результаты коррелируют с числом пропаргил U нуклеотидов в матрице. Без связи с механизмом можно высказать предположение, что фрагмент Клёнова пропускал (перепрыгивал через) эти U нуклеотиды в случае Т-триазол-U соединения. Напротив, пропаргил G нуклеотид в Iм клик- соединении копировался корректно.
Пример 10
Применение меток с группами 3'- фосфоротиоат/5'-иод для химического сшивания последовательных кодирующих ДНК- меток, которые кодируют химическую библиотеку, вводимую на 5'-конце за счёт ковалентного связывания
Защита 3'-фосфоротиоатной группы в метке: Как показано на Фигуре 24А, 5'-iodo-З'-фосфоротиоатную метку (1 экв.) растворяли в воде с конечной концентрацией 5 мМ. Затем добавляли винилметилсульфон (20 экв.) и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По окончании реакции продукт осаждали этанолом.
Синтез библиотеки (Фигура 24В)
Цикл А: В каждую лунку (разделение) помещали головной фрагмент однонитевой ДНК (1 экв, 1 мМ раствор в 500 мМ рН 9.5 боратного буфера), защищенную метку для цикла А (1.5 экв.) и шунт (1.2 экв.). Реакционную смесь для химического сшивания инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Затем в каждую лунку добавляли (разделение) одну Fmoc аминокислоту (100 экв.), а после этого 4-(4,6-диметокси-1,3,5- триазин-2- ил)-4- метилморфолин хлорид (100 экв.). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции содержимое всех лунок объединяли и продукты осаждали этанолом. Пул цикла А очищали методом LC и лиофилизировали досуха, а затем растворяли в воде, получая раствор с конечной концентрацией 1 мМ, и прибавляли пиперидин (10% об/об) для депротекции метки цикла А (60°С, 2час). Депротекционированный продукт снова осаждали этанолом.
Цикл В: Депротекционированный пул из цикла А растворяли в 500 мМ, рН 9.5, боратного буфера, получая раствор с концентрацией 1 мМ, а затем (разделение) добавляли его в отдельные реакционные лунки (1 экв. продукта цикла А в каждую лунку). В каждую лунку добавляли одну защищенную метку для цикла В (1.5 экв.) и шунт (1.2 экв.). Реакционную смесь для химического сшивания инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. В каждую лунку (быстро) добавляли смесь муравьиной кислоты (100 экв.), диизопропилкарбодиимида (100 экв.) и 1- гидрокси-7- азабензотриазола (100 экв.). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По окончании реакции содержимое всех лунок объединяли и продукты осаждали этанолом. Пул цикла В очищали методом LC и лиофилизировали досуха, а затем растворяли в воде, получая раствор с конечной концентрацией 1 мМ, и прибавляли пиперидин (10% об/об) для депротекции метки цикла В (60°С, 2час). Депротекционированный продукт снова осаждали этанолом.
Цикл С: Депротекционированный пул из цикла В растворяли в 500 мМ, рН 5.5 фосфатного буфера, получая раствор с концентрацией 1 мМ, а затем добавляли в отдельные реакционные лунки (1 экв. продукта из цикла В в каждую лунку). В каждую лунку добавляли одну метку для цикла С (1.5 экв.) и шунт (1.2 экв.). Реакционную смесь для химического сшивания инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. В каждую лунку (разделение) добавляли амин (80 экв.) и цианоборогидрид натрия (80 экв.). Реакционную смесь инкубировали при 60°С в течение 16 час. По завершении реакции объединяли содержимое всех лунок и продукты осаждали этанолом. Пул цикла С очищали методом LC и лиофилизировали досуха.
Пример 11
Кодирование химически сшитыми ДНК- метками с использованием пары ортогональных химических групп для каждой стадии последовательного сшивания
меток
Другим методом получения химически сшитых кодирующих ДНК- меток является применение пары ортогональных химических групп для последовательных сшиваний (Фигура 22А). Метки, которые на концах несут ортогональные реакционноспособные группы, не вызывают полимеризации или циклизации, а ортогональных характер стадий последовательного сшивания уменьшает частоту событий ошибки в процессе введения метки. Такие методы требуют (i) наличия по меньшей мере двух ортогональных химических групп, доступных для конъюгации с олигонуклеотидом, и (ii) доступного метода прочитывания каждого из создаваемых при этом сайтов соединения (Фигуры 22В и 22С). Этот подход поможет также исключить необходимость применения защитных групп или стадий введения кэпов, тем самым упрощая процесс сшивания меток.
Методика ортогонального химического сшивания с применением на последовательных стадиях 5'-азидо/3'- алкинильных и 5 '-иод/3'-фосфоротиоатных групп: Примером применения двух ортогональных химических групп является комбинация сшиваний 5 '-азидо/3' -алкинильных и 5'- иод/3 '-фосфоротиоатных групп. На Фигуре 23 представлена типичная схема ортогонального химического сшивания меток, включающая 3 последовательных цикла сшивания. На Фигурах 25А-25В приводится пример применения меток 3'-фосфоротиоат/5'-азидо и 3'-пропаргил/5'- иод для неоднократного химического сшивания ортогональных кодирующих ДНК меток, которые кодируют химическую библиотеку, вводимую на 5' конце ковалентной связью.
Защита 3'-фосфоротиоатной группы в метках: Как показано на Фигуре 25А, 5'-азидо- 3'- фосфоротиоатную метку (1 экв.) растворяли в воде, получая раствор с конечной концентрацией 5 мМ. Затем прибавляли винилметилсульфон (20 экв.) и реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По окончании реакции продукт осаждали этанолом.
Синтез библиотеки (Фигура 25В)
Цикл А: В каждую лунку (разделение) помещали головной фрагмент однонитевой ДНК (1 экв, 1 мМ раствор в 500 мМ рН 9.5 боратного буфера), одну метку для цикла А
(1.5 экв.) и шунт (1.2 экв.). Реакционную смесь для химического сшивания инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Затем в каждую лунку добавляли (разделение) одну Fmoc аминокислоту (100 экв.), а после этого 4-(4,6- диметокси-1,3,5-триазин-2- ил)-4- метилморфолин хлорид (100 экв.). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По завершении реакции содержимое всех лунок объединяли и продукты осаждали этанолом. Пул цикла А очищали методом LC и лиофилизировали досуха. Защитную группу Fmoc пула из цикла А снимали, обрабатывая пул (1 мМ в воде) пиперидином (10% об/об) в течение 2 час при комнатной температуре. Депротекционированный продукт снова осаждали этанолом.
Цикл В: Очищенный пул из цикла А растворяли в 500 мМ, рН 7.0, фосфатного буфера, получая раствор с концентрацией 1 мМ, а затем его распределяли в отдельные реакционные лунки (1 экв. продукта цикла А в каждую лунку). В каждую лунку добавляли одну защищенную метку для цикла В (1.2 экв.), ацетат меди (II) (2 экв.), аскорбат натрия (4 экв.) и трис- (бензилтриазолилметил)амин (1 экв.). По окончании продукты осаждали (разделение) этанолом, а затем разводили до концентрации 1 мМ в 500 мМ, рН 9.5 боратным буфером. Затем в каждую лунку (разделение) добавляли смесь муравьиной кислоты (100 экв.), диизопропилкарбодиимида (100 экв.) и 1- гидрокси-7-азабензотриазола (100 экв.). Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. По окончании реакции содержимое всех лунок объединяли и продукты осаждали этанолом. Затем пул из цикла В растворяли в воде до конечной концентрации 1 мМ и прибавляли пиперидин (10% об/об) для депротекции метки цикла В (комнатная температура, 18 час). Депротекционированный продукт снова осаждали этанолом. Депротекционированный пул из цикла В очищали методом LC и лиофилизировали досуха.
Цикл С: Депротекционированный пул из цикла В растворяли в 500 мМ, рН 5.5 фосфатного буфера, получая раствор с концентрацией 1 мМ, а затем добавляли в отдельные реакционные лунки (1 экв. продукта из цикла В в каждую лунку). В каждую лунку добавляли одну метку для цикла С (1.5 экв.) и шунт (1.2 экв.). Реакционную смесь для химического сшивания инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. В каждую лунку (разделение) добавляли амин (80 экв.) и цианоборогидрид натрия (80 экв.). Реакционную смесь инкубировали при 60°С в течение 16 час. По завершении реакции объединяли содержимое всех лунок и продукты осаждали этанолом. Пул цикла С очищали методом LC и лиофилизировали досуха.
Другие варианты изобретения
Все публикации, патентные заявки и патенты, указанные в данном описании, включены в настоящую заявку посредством отсылки.
Различные модификации и варианты описанного способа и системы по изобретению без отступления от объёма и сущности изобретения станут очевидными для специалиста в данной области техники. Хотя изобретение было описано применительно к конкретным желательным вариантам изобретения, следует понимать, что заявляемое изобретение нельзя излишне ограничивать этими конкретными вариантами изобретения. Более того, предполагается, что различные модификации описанных способов осуществления изобретения, очевидные специалистам в области медицины, фармакологии или родственных областей, входят в объём настоящего изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> X-CHEM, INC.
<12 0> METHODS FOR TAGGING DNA-ENCODED LIBRARIES
<130> 50719-006WO3
<140> PCT/US12/54228
<141> 2012-09-07
<150> 61/536,929
<151> 2011-09-20
<150> 61/531,820
<151> 2011-09-07
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> <211> <212>
1 7
DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 1
gtgctgc
<210> <211> <212>
2 9
DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 2
gcagcaccc
PRT
<210> <211> <212>
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222>
<223> Xaa is N-alpha-benzyloxycarbonyl
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is OSu (N-succinimidyl ester)
<400> 3
Xaa Gly Gly Gly Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
4 5
PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is azidohomoalanine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is OSu (N-succinimidyl ester)
<400> 4
Xaa Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> <211> <212>
? О 1 О ^
5 5
PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> Xaa is propargylglycine
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (5)..(5)
<223> Xaa is OSu (N-succinimidyl ester)
<400> 5
Xaa Gly Gly Gly Xaa
1 5
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)7.(18)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 6
gctgtgcagg tagagtgc 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (18)7.(18)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 7
gctgtgcagg tagagtgc 18
<210> 8
<211> 15
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 2'-OMe is attached to g
<221>
misc feature
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc feature
<222> (3).7(3)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (4).7(4)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc feature
<222> (5).7(5)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc feature
<222> (6).7(6)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (7).7(7)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (8).7(8)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc feature
<222> (9).7(9)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc feature
<222> (10)7.(10)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (11)7.(11)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc feature
<222> (12)7.(12)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (13)7.(13)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc feature
<222> (14)7.(14)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc feature
<222> (15)7.(15)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 8
gugcagguag agugc 15
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' terminal -OH
<400> 9
tacgtatacg actgg 15
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 3' terminal -OH
<400> 10
gcagactacg tatacgactg g
<210> 11
<211> 15
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc_feature
<222> (14)..(14)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' terminal -OH
<400> 11
uacguauacg acugg 15
<210> 12
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 12
gtgcaggtag agtgc 15
<210> 13 <211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> 3' terminal -OH
<400> 13
uacgtatacg actgg 15
<210> <211> <212>
DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (8).7(8)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 14
gtgagtgc
<210> 15
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223>
Synthetic Construct
<220>
<221> misc feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (8).7(8)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 3' terminal -OH
<400> 15
cagactgg
<210> <211> <212>
DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 16
gtgac
<210> <211> <212>
DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal HO-
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to a
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 2'-OMe is attached to g
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> 3' terminal -OH
<400> 17
actgg
<210> 18
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (38)..(38)
<223> g is propargylG
<400> 18
gcgtgaacat gcatctcccg tatgcgtaca gtccattg 38
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1) <223> t is azidoT
<400> 19
tatagcgcga tatacacact ggcgagcttg cgtactg 37
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc feature
<222> (38)7.(38)
<223> 3' terminal includes spacer7-azide
<400> 20
gcgtgaacat gcatctcccg tatgcgtaca gtccattg 38
<210> <211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal hexynyl
<400> 21
tagcgcgata tacacactgg cgagcttgcg tactg 35
22 15
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal Cy5
<400> 22
cagtacgcaa gctcg 15
23 75
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 23
gcgtgaacat gcatctcccg tatgcgtaca gtccattgta tagcgcgata tacacactgg 60 cgagcttgcg tactg 75
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic Construct
<400> 24
gcgtgaacat gcatctcc 18
25 17
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 25
cagtacgcaa gctcgcc 17
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal Cy5
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> 3' terminal thiophosphate
<400> 26
cgatatacac actggcgagc t 21
27 12
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> t is IododT
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> 3' terminal 6-FAM
<400> 27
tgcgtactga gc 12
28 17
<210> <211>
? О 1 О ^
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct <400> 28
cagtacgcaa gctcgcc 17
<210> 29
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).Т(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 3' terminal aminohex
<400> 29
cgagtcacgt c 11
<210> 30
<211> 8
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> 2'-OMe is attached to a
<400> 30
cagtgtca
<210> 31
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal phosphate group
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 2'-OMe is attached to c
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> g is synthesized as a phosphorothioate linkage
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> 3' terminal aminohex
<400> 31
cgagtcacgt c 11
<210> 32
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> amidation
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> g is propargylG
<400> 32
tcgaatgact ccgatatg 18
<210> 33
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<223> Synthetic Construct
(1)..(1)
t is azido dT
<400> 33
tatagcgcga tatacacact ggcgagcttg cgtactg 37
34 25
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> t is azido dT
<400> 34
tacacactgg cgagcttgcg tactg 25
<210> 35
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> t is azido dT
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> u is propargyl U-TIPS
<400> 35
tatgcgtaca gtccu 15
<210> 36
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal 6-FAM
<400> 36
cagtacgcaa gctcgcc 17
37 17
<210> <211> <212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1).7(1)
<223> 5' terminal Cy5
<400> 37
cagtacgcaa gctcgcc 17
<210> <211>
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal Biotin-TEG//ispC3//ispC3
<400> 38
tcgaatgact ccgatatgta tagcgcgata tacacactgg cgagcttgcg tactg 55
<210> 39
<211> 55
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 5' terminal Bio-TEG//ispC3//ispC3
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> g is riboG
<400> 39
tcgaatgact ccgatatgta tagcgcgata tacacactgg cgagcttgcg tactg
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ введения метки в первую библиотеку, содержащую кодированное олигонуклеотидом химическое соединение, который включает:
(i) предоставление "головного" фрагмента, содержащего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, причём указанный "головной" фрагмент включает по меньшей мере один 2'- замещённый нуклеотид;
(ii) связывание указанной первой функциональной группы указанного "головного" фрагмента с первым компонентом указанного химического соединения, причём указанный "головной" фрагмент непосредственно связывается с указанным первым компонентом или указанный "головной" фрагмент опосредованно связывается с указанным первым компонентом с помощью бифункционального линкера; и
(iii) связывание указанной второй функциональной группы указанного
"головного" фрагмента с меткой первого структурного элемента с образованием
комплекса,
где указанные стадии (ii) и (iii) можно осуществлять в любом порядке и указанная метка первого структурного элемента кодирует реакцию связывания на указанной стадии (ii), посредством чего создаётся библиотека меченых соединений.
2. Способ по п. 1, в котором указанный "головной" фрагмент содержит 2'-замещённый нуклеотид на одном из 5'- или 3'- концов, или на обоих концах, или внутри указанного "головного" фрагмента.
3. Способ по п. О, в котором указанный "головной" фрагмент содержит 2'-замещённый нуклеотид и указанную вторую функциональную группу на 5'- конце или на 3' - конце.
4. Способ по любому из п.п. Error! Reference source not found.-O, в котором указанная метка первого структурного элемента содержит по меньшей мере один 2'-замещённый нуклеотид.
5. Способ по п. 4, в котором указанная метка первого структурного элемента содержит 2'- замещённый нуклеотид на одном из 5'- или 3'- концов, или на обоих концах, или внутри указанной метки первого структурного элемента.
2.
6. Способ по п. 5, в котором указанная метка первого структурного элемента содержит указанный 2'- замещённый нуклеотид на обоих 5' - и 3'- концах.
7. Способ по любому из п.п. Error! Reference source not found.-О, в котором указанный 2-0- замещённый нуклеотид представляет собой 2 -0- метилнуклеотид или 2'-фторнуклеотид.
8. Способ по п. О, в котором указанный 2 -0- замещённый нуклеотид представляет собой указанный 2 -0- метилнуклеотид, выбранный из 2 -0- метилгуанина или 2-0-метилурацила.
9. Способ по п. О, в котором 2'-О- замещённый нуклеотид представляет собой указанный 2'-0- фторнуклеотид, выбранный из 2'-0- фторгуанина или 2'-0- фторурацила.
10. Способ по любому из п.п. Error! Reference source not found.-0, в котором
указанная метка первого структурного элемента содержит защитную группу на 3'- конце
или на 5' - конце.
11. Способ по любому из п.п. 1- 10, в котором стадия (ii) включает связывание указанного "головного" фрагмента непосредственно с указанным первым компонентом.
12. Способ по п. 0, в котором указанный компонент представляет собой остов или первый структурный элемент.
13. Способ по любому из п.п. 1- 10, в котором стадия (ii) включает опосредованное связывание указанного "головного" фрагмента с указанным первым компонентом с помощью бифункционального линкера.
14. Способ по п. 0, который включает связывание указанного "головного"
фрагмента с первой функциональной группой указанного линкера и связывание
указанного первого компонента со второй функциональной группой указанного линкера.
15. Способ по п. 0, в котором указанный первый компонент представляет собой
остов или первый структурный элемент.
16. Способ по любому из п.п. Error! Reference source not found.-O, который дополнительно включает:
(iv) связывание метки второго структурного элемента с 5'- концом или с 3'-концом указанного комплекса; и
(v) связывание второго компонента указанной химической библиотеки с указанным первым компонентом,
причём указанные стадии (iv) и (v) можно осуществлять в любом порядке.
17. Способ по п. О, в котором стадия (iv) включает связывание указанной метки второго структурного элемента с 5'- концом указанного комплекса; указанный комплекс содержит фосфатную группу на 5'- конце; и указанная метка второго структурного элемента содержит гидроксильную группу на обоих 3'- и 5' - концах.
18. Способ по п. О, в котором стадия (iv) дополнительно включает очистку указанного комплекса и реакцию указанного комплекса с полинуклеотидкиназой с образованием фосфатной группы на 5'- конце перед связыванием указанной метки второго структурного элемента.
19. Способ по п. О, в котором стадия (iv) включает связывание указанной метки второго структурного элемента с 3'- концом указанного комплекса; указанный комплекс содержит защитную группу на 3'- конце; и указанная метка второго структурного элемента содержит фосфатную группу на 5'- конце и защитную группу на 3' - конце.
20. Способ по п. 0, в котором стадия (iv) дополнительно включает реакцию указанного комплекса с гидролизующим агентом с высвобождением указанной защитной группы из указанного комплекса перед связыванием указанной метки второго структурного элемента с указанным комплексом.
21. Способ по любому из п.п. 0-0, в котором указанная метка второго структурного
элемента содержит 2'- замещённый нуклеотид на одном из 5'- или 3'- концов или внутри
указанной метки второго структурного элемента.
22. Способ по любому из п.п. 0-0, в котором указанный второй компонент
представляет собой первый структурный элемент или второй структурный элемент.
23. Способ по любому из п.п. 0-0, в котором указанная стадия (iv) включает РНК лигазу и/или ДНК лигазу для связывания указанной метки второго структурного элемента с указанным комплексом.
24. Способ по п. 0, в котором указанная стадия (iv) включает РНК лигазу, и указанная РНК лигаза представляет собой Т4 РНК лигазу.
25. Способ по п. 0, в котором указанная стадия (iv) включает ДНК лигазу, и указанная ДНК лигаза представляет собой онДНК лигазу (ssDNA лигазу).
26. Способ по п. 023, в котором указанная стадия (iv) включает указанную РНК лигазу и указанную ДНК лигазу.
27. Способ по любому из п.п. 1- 26, в котором указанная стадия (iii) включает РНК лигазу и/или ДНК лигазу для связывания указанного "головного" фрагмента с указанной меткой первого структурного элемента.
28. Способ по п. 27, в котором указанная стадия (iii) включает РНК лигазу, и указанная РНК лигаза представляет собой Т4 РНК лигазу.
29. Способ по п. 27, в котором указанная стадия (iii) включает ДНК лигазу, и указанная ДНК лигаза представляет собой онДНК лигазу (ssDNA лигазу).
30. Способ по п. 27, в котором указанная стадия (iii) включает указанную РНК лигазу и указанную ДНК лигазу.
31. Способ по любому из п.п. 1-30, в котором указанная стадия (iii) и/или указанная стадия (iv), если таковая имеется, включает полиэтиленгликоль и/или один или более растворимых поливалентных катионов.
32. Способ по п. 0, в котором указанная стадия (iii) и/или указанная стадия (iv), если таковая имеется, включает полиэтиленгликоль в количестве примерно от 25% (вес/об) примерно до 35% (вес/об).
23.
33. Способ по п. 32, в котором указанный полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу примерно от 3000 примерно до 5500 Дальтон.
34. Способ по п. 33, в котором указанный полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу примерно 4500 Дальтон.
35. Способ по любому из п.п. 31-34, в котором указанная стадия (iii) и/или указанная стадия (iv), если таковая имеется, включает указанные один или более растворимых поливалентных катионов в количестве примерно от 0.05 мМ примерно до 10.5 мМ.
36. Способ по п.35, в котором указанные один или более поливалентных катионов выбраны из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида марганца (II) и хлорида гексамин- кобальта (III).
37. Способ по п.п. 35 или 36, в котором указанный один или более поливалентных катионов присутствуют в количестве примерно от 0.5 мМ примерно до 1.5 мМ.
38. Способ по любому из п.п. 1-37, который дополнительно включает отделение указанного комплекса от любой непрореагировавшей метки или от непрореагировавшего "головного" фрагмента перед любой из стадий связывания (ii)-(v).
39. Способ по любому из п.п. 1-38, который дополнительно включает очистку указанного комплекса перед любой из стадий связывания (ii)-(v).
40. Способ по любому из п.п. 1-39, который дополнительно включает связывание меток одного или более дополнительных структурных элементов с указанным комплексом и связывание одного или более дополнительных компонентов с указанным комплексом.
41. Способ по любому из п.п. 1-40, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, содержат преаденилированный 5'- конец.
23.
42. Способ по любому из п.п. 1-41, в котором указанный "головной" фрагмент содержит шпилечную структуру.
43. Способ по любому из п.п. 1-42, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, содержат от 5 до 20 нуклеотидов.
44. Способ по п. 43, в котором указанный первый структурный элемент-метка, указанный второй структурный элемент-метка и/или указанные один или более дополнительные структурные элементы-метки, если таковые присутствуют, имеют примерно одинаковую массу.
45. Способ по любому из п.п. 1-44, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, дополнительно содержат первую последовательность, идентифицирующую библиотеку.
46. Способ по любому из п.п. 1-44, который дополнительно включает связывание первой метки, идентифицирующей библиотеку, с указанным комплексом.
47. Способ по п.п. 45 или 46, дополнительно включающий предоставление второй библиотеки и объединение указанной первой библиотеки с указанной второй библиотекой.
48 Способ по любому из п.п. 1-47, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, дополнительно содержат используемую последовательность и/или последовательность ориджина (репликации).
49. Способ по любому из п.п. 1- 47, который дополнительно включает связывание метки использования и/или метки ориджина репликации с указанным комплексом.
50. Способ по любому из п.п. 1- 49, который дополнительно включает связывание
хвостового фрагмента с указанным комплексом.
51. Способ мечения первой библиотеки, содержащей кодированное
олигонуклеотидом химическое соединение, который включает:
(i) предоставление "головного" фрагмента, содержащего первую функциональную группу и вторую функциональную группу, который включает 2'- замещённый нуклеотид на 5'- конце, необязательно, один или более нуклеотидов в положении внутри указанного "головного" фрагмента и защитную группу в 2'- положении и/или в 3'- положении на З'-конце;
(ii) связывание указанной первой функциональной группы указанного "головного" фрагмента с первым компонентом указанного химического соединения, причём указанный "головной" фрагмент непосредственно связывается с указанным первым компонентом или указанный "головной" фрагмент связывается с указанным первым компонентом опосредованно с помощью бифункционального линкера; и
(iii) связывание указанной второй функциональной группы указанного
"головного" фрагмента с меткой первого структурного элемента, причём указанная метка
первого структурного элемента содержит 2'-замещённый нуклеотид и гидроксильную
группу на 5'- конце, необязательно один или более нуклеотидов в положении внутри
указанной метки и 2'- замещённый нуклеотид и гидроксильную группу на 3'- конце;
где указанные стадии (ii) и (iii) можно осуществлять в любом порядке, а указанная метка первого структурного элемента кодирует реакцию связывания стадии (ii), посредством чего создаётся библиотека меченых соединений.
52. Способ по п. 0, в котором указанный 2'- замещённый нуклеотид представляет собой 2'-0- метилнуклеотид, а именно, 2'-0- метилгуанин.
53. Способ по п. 51 или п. 52, в котором указанные один или более нуклеотидов находятся в положении внутри указанного "головного" фрагмента.
54. Способ по любому из п.51-53, в котором указанные один или более
нуклеотидов находятся в положении внутри указанной метки.
55. Способ по п. 53 или п. 54, в котором указанные один или более нуклеотидов указанного "головного" фрагмента и/или указанной метки представляют собой один или более 2'-дезоксинуклеотидов.
56. Способ по любому из п.п. 51-55, в котором указанная стадия (iii) включает один или более растворимых поливалентных катионов, полиэтиленгликоль и РНК лигазу.
57. Способ по п. О, в котором указанный полиэтиленгликоль имеет среднюю молекулярную массу примерно 4600 Дальтон, а указанная РНК лигаза представляет собой Т4 РНК лигазу.
58. Способ по п. 56 или п. 57, в котором указанные один или более поливалентных катионов выбраны из группы, состоящей из хлорида магния, хлорида марганца (II) и хлорида гексамин-кобальта (III).
59. Способ по любому из п.п. 0-0, в котором указанный "головной" фрагмент и/или указанная метка первого структурного элемента содержат от 5 до 20 нуклеотидов.
60. Способ по п. 59, в котором указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, имеют примерно одинаковую массу.
61. Способ по любому из п.п. 51-60, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, дополнительно содержат первую последовательность, идентифицирующую библиотеку.
62. Способ по любому из п.п. 51-60, который дополнительно включает связывание первой метки, идентифицирующей библиотеку, с указанным комплексом.
63. Способ по п.п. 61 или 62, дополнительно включающий предоставление второй библиотеки и объединение указанной первой библиотеки с указанной второй библиотекой.
55.
64 Способ по любому из п.п. 51-63, в котором указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, дополнительно содержат используемую последовательность и/или последовательность ориджина (репликации).
65. Способ по любому из п.п. 51- 63, который дополнительно включает связывание метки использования и/или метки ориджина с указанным комплексом.
66. Способ по любому из п.п. 51-65, который дополнительно включает связывание хвостового фрагмента с указанным комплексом.
67. Способ по п. 1 или п. 51, в котором указанный 2'- замещённый нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-О- метилгуанина, 2'-О- метилурацила, 2-0-метиладенозина, 2 -0- метилтимидина, 2 -0- метилинозина, 2 -0- метилцитидина, 2-0-метилдиаминопурина, 2'- фторгуанина, 2'- фторурацила, 2'- фтораденозина, 2'-фтортимидина, 2'- фторинозина, 2'- фторцитидина и 2'- фтордиаминопурина.
68. Способ по любому из п.п. 1-67, который включает совокупность "головных" фрагментов.
69. Способ по п. 68, в котором каждый "головной" фрагмент указанной
совокупности головных фрагментов содержит область с идентичной последовательностью
и различную кодирующую область.
70. Способ по п. 69, в котором указанная область с идентичной
последовательностью представляет собой область связывания праймера.
71. Способ по п. 0 или п. 0, в котором указанная различная кодирующая область представляет собой метку начального структурного элемента, которая кодирует указанную "головную" область или присоединение начального компонента.
72. Способ по п.п. 1-71, в котором указанное связывание по меньшей мере в одной из стадий (ii)-(iv), если таковая имеется, представляет собой ферментативное сшивание.
71.
73. Способ по п. 72, в котором указанное ферментативное сшивание включает применение РНК лигазы и/или ДНК лигазы.
74. Способ по любому из п.п. 1-73, в котором указанное связывание по меньшей мере в одной из стадий (ii)-(iv), если таковая имеется, представляет собой химическое сшивание.
75. Способ по п. 74, в котором указанное химическое сшивание включает применение одной или более пар реагирующих друг с другом химических фрагментов ("сореактивных" пар).
76. Способ по п. 75, в котором указанная пара реагирующих друг с другом химических фрагментов представляет собой необязательно замещённую алкинильную группу и необязательно замещённую азидогруппу.
77. Способ по п. 75, в котором указанная пара реагирующих друг с другом химических фрагментов представляет собой фосфоротиоатную группу и атом иода.
78. Способ по п. 77, в котором указанная фосфоротиоатная группа находится на З'-конце олигонуклеотида, а указанный атом иода находится на 3'- конце олигонуклеотида.
79. Способ по п. 77 или п.78, в котором химическое сшивание дополнительно включает олигонуклеотидный шунт в реакции связывания между указанной парой реагирующих друг с другом химических фрагментов.
80. Способ по любому из п.п. 75-79, в котором пара реагирующих друг с другом химических фрагментов продуцирует спейсер длиной примерно от 4 примерно до 24 атомов.
81. Способ по п. 0, в котором указанный спейсер имеет длину примерно от 4 примерно до 10 атомов.
82. Способ по любому из п.п. 74-81, в котором указанное химическое сшивание одного или более меток структурных элементов включает ортогональные пары
71.
реагирующих друг с другом химических фрагментов для последовательного сшивания меток структурных элементов.
83. Способ по п. 82, в котором указанные ортогональные пары реагирующих друг с другом химических фрагментов включают (i) необязательно замещённую алкинильную группу и необязательно замещённую азидогруппу и (ii) фосфоротиоатную группу и атом иода.
84. Способ по любому из п.п. 1-83, в котором указанный комплекс, указанный "головной" фрагмент, указанная метка первого структурного элемента, указанная метка второго структурного элемента и/или указанные метки одного или более дополнительных структурных элементов, если таковые присутствуют, содержат модифицированную фосфатную группу между концевым нуклеотидом на 3'- конце и нуклеотидом, соседним с указанным концевым нуклеотидом.
85. Комплекс, содержащий "головной" фрагмент и метку структурного элемента, где указанная метка содержит от 5 до 20 нуклеотидов, 2'- замещённый нуклеотид на З'-конце и 2'- замещённый нуклеотид на 3'- конце.
86. Комплекс по п. 0, в котором указанный 2'- замещённый нуклеотид на 5'- конце и/или 3'- конце представляет собой 2'-0- метилнуклеотид или 2'- фторнуклеотид.
87. Комплекс по п. 85 или п. 86, в котором указанный "головной" фрагмент содержит шпилечную структуру.
88. Комплекс по любому из п.п. 85-87, в котором указанный "головной" фрагмент содержит 2'- замещённый нуклеотид на одном из 5'- или 3'- концов или в положении внутри указанного "головного" фрагмента.
88. Комплекс по любому из п.п. 85-88, в котором указанный "головной" фрагмент дополнительно содержит преаденилированный 5' - конец.
90. Комплекс по любому из п.п. 85-89, в котором указанный 2'- замещённый нуклеотид представляет собой 2'-О- метилнуклеотид или 2'- фторнуклеотид.
91. Комплекс по п. 90, в котором указанный 2'- замещённый нуклеотид выбран из группы, состоящей из 2'-0- метилгуанина, 2'-0- метилурацила, 2'-0- метиладенозина, 2'-О-метилтимидина, 2'-0- метилинозина, 2'-0- метилцитидина, 2'-0- метилдиаминопурина, 2'- фторгуанина, 2'- фторурацила, 2'- фтораденозина, 2'- фтортимидина, 2'- фторинозина, 2'- фторцитидина и 2'- фтордиаминопурина.
92. Комплекс по любому из п.п. 85-91, дополнительно содержащий хвостовой фрагмент.
93. Комплекс по любому из п.п. 85-92, в котором указанный комплекс, указанный "головной" фрагмент или указанная метка структурного элемента содержит модифицированную фосфатную группу между концевым нуклеотидом на 3'- конце и нуклеотидом, соседним с указанным концевым нуклеотидом.
94. Комплекс по любому из п.п. 85-93, который содержит фосфоротиоатную или триазольную группу.
91.
Структурный элемент 1 Д +
Головной фрагмент
Реакция с ВВ1
Метка 1
Ферментативное или химическое сшивание
Структурный элемент 2
Отделение от непрореагировавших веществ
Метка 2
Реакция с ВВ2
Ферментативное или химическое
сшивание
Отделение от непрореагировавших веществ
Процесс повторяют заданное число раз (циклов)
З'-X-i ш^-Р-В' З'-НО-м w-OH-5'
Головной фрагмент Структурный элемент метка 1
| Сшивание
З'-Хч ни "-Q Н-5'
| Отделение от непрореагировавших веществ, ПНК
3'-НО^^^^^^"ОН-5'| Сшивание
Структурный элемент метка 2
3'-*^ - I I^^^^M ПИ"
| Отделение от непрореагировавших веществ, ПНК
у но^^^^^^^^^-он 5' П ^Д1(tm) сшивания и отделения /ПНК
Структурный элемент метка п
¦ = 2'-ОМе, остальные 2'-дезокси
Фигура 2А
5'-X-i "д-ОН-3'
Головной фрагмент
5'-°- -0-м | Сшивание
Структурный элемент метка 1
| Щелочной гидролиз, ЖХ 5'-Р-*^^^^^^в-0-в I Сшивание
Структурный элемент метка 2
5'-Хч mm i ^^^^^^-0-и
| Щелочной гидролиз, ЖХ
У-Хч- mm _"и^^^^^и-0Н-3'
I (Стадия ПНК не нужна) ф pJmmmmmmmma о и || п стадий сшивания и щелочного гидролиза
Структурн ый эле мент метка п ¦ = 2'-Q М С, ОСТЭЛ ЬН Ыв 2' -ДвЗОКСИ
-0-е = защищенная З'-ОН группа
Фигура 2В
5'-Pi
Метка А
он-з'
5-Pi
Головной фрагмент 5'-Арр^^^^^^мХ-3'
Сшивание в отсутствие АТФ Головной фрагмент
Х-3'
Метка В
5'-НО I
5'-НО"
он-з'
Сшивание в присутствии АТФ
Головной фрагмент
Х-3'
5'-НО
5'Pi
Метка С
5'НО шш
ОН-З' С
Фосфорилирование с помощью ПНК Головной фрагмент
X-3J
Сшивание в присутствии АТФ
А Головной фрагмент
Х-3'
Фигура 3
Линкер Головной фрагмент Фигура 4А
Малая молекула
Линкер Головной фрагмент
Фигура 4В
Линкер _
Головной фрагмент
5' ?
Головной фрагмент
.у 3'- л 5'-
-p НО он
Сшивание
1 5'-
Очистка
1 5'-
Фосфорилирование
1 5'" 3" 2 5" Р но он
Фигура 4Е
ДОНОР
FAM
Лигаза
Акцептор НО ^^^нОН
5' 3'
FAM
Фигура 5А
Продукт
Аденипировэнный донор
Фигура 5В
Сшитый продукт
1 2 Т4 РНК лигаза [мкл]
0 5 10 15 20 25
Длина акцептора, (н)
Длина ^^--~донора Длина акцептора
0.68
0.66
0.86
0.60
0.88
0.76
0.57
0.74
0.80
Фигура 7В
4607.4
( выч. 4608.0)
Контрольный ол и гону кл еотид
БОН MDNA15 ОН
Масса (Да) Фигура 8А
4687.5
ПНК
БОН MDNA15 ОН
Масса (Да) Фигура 8В
SA% 78% з' 5'
Метка С
А АВ АВ* ABC ABC*
*- Очистка из геля
Фигура 9
Ш1= 116834
о он
100 энв. ТВ ТА 50 энв .Си Вг Вода/DMA RT12 43C
N-N,
х/х/
MW= 11414.2
MW = 23098 О
Фигура 10А
¦0-, QG
MW= 11683.4 До
0_NH
NW= 12284.1 i п
0-Р=0
ЮОакв.ТВТА 503KBJCuBr
N-N'
Вода/DMA RT12 43C
^OjNH
MWV= 11245.3
MW = 23534
о OH 0%
xxxx
Фигура 10B
75-мерная ДНК: позитивный контроль
CY5-5'
75-мер со спейсером для клик-химии
- - - - -
Фигура НА
Макз (Да]
г307в.7|выч. 23079.9) 23Ь69.а|выч. 23671. Ь)
УГЬ I И 1Л иг ifle
4 Л * 31 44+ 4" +74 4Л
*J 4 4 4?
Г 4 ГЧ * J#
№04.
650
? И й H DTJ ИШ -ФР ¦]¦* DDI 1 И
РФ 42 4 4 '5# [ 14 14 Ii J 4 IJ У4 2 И 2" 3D 32 > -4 > t- > l 4D 42 -+4 44- 41
Время Гмнн)
llll ii !; I i 45
Масса {Да]
¦I1 97f *P
260
m_i*ikL_l
й" ¦:¦ 4-1 ft 4-1 1С
¦ Л4Н;
650
an ai* a-ja а* at* a?? ам чaa
90 47 91 14- 'Л
30 3J Z" J" 71 > "• 12 ] * 39 1W "4 *J " -L"!- -ii
ВрвНЯ (ИНН;
23526.6 (№14. 23S34)
_Li_
Масса (Да]
М 0 templ7S "короткий кликп "длинный клик"
RT -* -- + + +
Циклы 11 18 11 18 11 18 11 18 11 18
MW = 7329
Олигонуклеотидный шунт
рН 7.0 буфер, RT24^8h
FAM
MW = 4339
MW= 11540
О I
В отсутствие шунта: инкубация в течение 7 дней с 50 мкМ олигонуклеотидов
RT: 0.00 - 4.3 500000т 400000-=i 300000: 200000100000:
2.35
0.07 '/Г^ 161 180 1 Э2 2.11 2.18 / Ч_/ ^
^^V^_ 3'17 3.32
1 02 04 0В OS 1 0 1 2 1.4 1 5 1 8 20 2.2 24 25 2.S 3.0 32 34 3.0 3.S 40 4.2 4.4 4.0 4S
Вррмч (мин)
RT: 0.00 - 4.3 1500001 =i 100000: 50000-
2.35"
495 (FI) у\
0 13 0.26 0.35 0 46 0.54 0 09 0.75 1 02 1J0 13В 1.42 1 70 1.85 2 11 2JS^J V 2.50 2.74 293
0 02 04 0В OS 1 0 1 2 1.4 1 5 1 8 20 2.2 24 25 2.S 3.0 32 34 3.0 3.3 40 4.2 4.4 4.0 43
Время (минЪ
RT: 0.00 ¦ 4.3
600000500000400000-= 300000200000100000-
650(Су5)
0.13 0 19 0.30 046 0.54 O.72 0.S0 102 1.В7 1 80 2S1 j
3 17 3.32 3 46 4 S4
0 02 04 ОБ OS 1 0 1 2 1.4 1 5 1 8 20 2.2 24 25 2.3 3.0 32 34 3.0 3.3 40 4.2 4.4 4.0 43
Время (мин)
Только исходные материалы: иод dT_12_Fam (4339) и Су5_21_Тиофосфат (7329)
Шунт: инкубация в течение 7 дней с 50 мкМ олигонуклеотидов
RT: 0.00 - 4.S 500000:
2.95
400000 5 300000г 200000: 100000:
260
0.05 0.12
1,ЭВ 2-32 2 38
140 / V 2-23 /V 2 46 /V.
(tm) 1 91 1 80 J ^ -' "--
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
1.4 1.3 1.8 2.0 2.2 2.4 2.3
Время (мин)
2.S 3.0 3.2 3.4 3.6 3.S 4.0 4.2 4.4 4.6 4.S
RT: 0.00 - 4.S
10000080000 -ш
< еоооо:
4000020000
495 (FI)
0.12 0.23 0.28 0.43 0.54 0.72 0.73 0.36 1.02
2.32
2.23 I \ л 1 45 1.52 1.73 1.В6 2.01 2.11 /"О
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
1.4 1.3 1.8 2.0 2.2 2.4 2.3
Время (мин)
2.S 3.0 3.2 3.4 3.6 3.S 4.0 4.2 4.4 4.6 4.S
RT: 0.00 - 4.S
sooooo:
400000-| = 300000: 200000-
юоооо:
650(Су5)
0.10 0.23 0.23 0.46 0.54 0.71 0.73 0.34 1.02
1.53
2.95
jy^^V^ЈH7 з.зе 3.50
0 02 04 00 OS 10 12
1.4 1 В 1 8 2 0 2.2 2 4 2 В
Время (мин)
2.S 3.0 32 34 3.6 3.S 40 4.2 4.4 4.6 48
Продукт (11542)
Фигура 12D
В отсутствие шунта: инкубация в течение 8 дней с 400 мкМ олигонуклеотидов
Пик 1
4339- Исходное
4211- Продукт оущепления иода
4230 4430
Масса (Да)
Пик 2
7330- Исходное
7317- Продукт окислен!
исходного
Пик 3
14663- продукт димеризации исходного
0.0Е+000 H 6В10
7210 7410
Масса (Да)
14560 14750
Масса (Да)
CFL олигонуклеотид в присутствии пиперидина
400 экв. пиперидина в течение ночи при RT 4000 экв. пиперидина в течение 2 час при 65°С
Н1.8Е+002
4339- исходное
4229-продукт гидролиза
4211- отщепление иода 4339-исходное 4296- продукт замещен иода на пиперидин 4229- гидролиз иода (продукт замещения на ОН) или примесь 4214- продукт отщеплен иода
0.0Е+001М
зезо
Масса (Да)
4120 4320
Масса (Да)
Фигура 12F
Сшивание шунта: CFL и ССу5 олигонуклеотиды в присутствии пиперидина
RT: 0.00 - 4.9S 1000000-¦ 800000-, 600000- < I 400000200000
260
1.36 ЛА{ 1.62 1.77 1.S4
1.02Е6 Channel.
Sas_ldT_ lligation_
495 (FI)
Время (мин)
RT: 0.00 - 4.9S 1000000 Я: 800000 -_
Z, еооооо- < :
400000-^ 200000
0.15 0.21 0.36 0.48 0.54 0.65 0.76 0.85 1.02
1.53 1.62 1.75 1.91 1.Ё
1.05Е6 Channel i
Sas_ldT_ lligation_
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.S 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8
Время (мин)
0.0E+000-I
11040
11240
11440
11640
11840
12040
Масса (Да)
Фигура 12G
З-Х-шшшшмшшшштР-Б'
3J-X-
Головной фрагмент (HP)
lPPA-5J
З'-НО
-ОН-5'
Метка
(~эо%
реакции) [~10 % реакции)
З'-Х-
ЮН-5'
З'-Х-
возможное
отще пление HP
с помощью З'-ОН
метки)
Нормальный продукт сшивания
НР-1 н
*РРАг-5'
1 н
Продукты аномальной реакции
3J-X-IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIH-P-5j
HP -1н
З'-HO-i
Метка
ОН-5'
3'-X
¦PPA-5'
¦ РРА-5' 1н
Ад em mi ip ованныи
НР-1 н
З'-НО
-ОН-5'
Метка + 1 н
З'-НО-
Метка
ЮН-5'
З'-Х
-РРА5'
З'-Х-
ОН-5'
Аденилированный HP
Продукт -1 н
З'-Х-
Фигура 13В-2
Продукт + 1 н
-ОН-5'
6449.9
(ожидаемый,
Продукт)
Продукт -1 н
Продукт + 1 н
-ОН-5'
\..~я*'?:г
6130.5
(ожидаемый - 320, <4 Продукт - 1 н) 6769.1
(ожидаемый + 320, Продукт + 1 н)
Фигура 13В-3
оно ьыс-Масса (Да)
(Пик 1 - метка, пик 2 - аденилированный HP)
? 1.4Е+003-
9.1Е+002-
0.0E+000-I
5600
Масса (Да)
ПикЗ
6107 (продукт сшивания)
Связанные с мишенью
члены библиотеки Несвязанные члены библиотеки
Головной фрагмент Метка А п
H:N fa + Ч
Сшива
ВВА
ВВА
SH ие^
-в
Депротекция^
ВВВ ВВС
Головной
Хвостовой
Метка А Метка В Метка С , фрагмент
и ts в>
ВВВ ВВА
Головной фрагмент
" Метка А _
H,N
ВВА
Сшивание с помощью^шунта
И ь
ВВА
Шунт
14-
Метка В
ВВВ
1Э1
Метка С
+ 4} Ь
jAQQ^d"vtfc;M' ^ Метка А [Г-^ Метка В д 'у^'^с д
ВВВ ВВА
ВС Головной фрагмент " и г ^°В0Й
ВВВ ВВА1
Расширение праймера при участии ДНК-полимеразы, способной считываться с использованием химически сшитых областей контакта
Фигура 15С
Головной фрагмент
Метка А
H2N
+ N,
-TIPS
ВВА
Си (I) катализатор
TIPS
Депротекция
Метка В
-TIPS
ВВВ
N=N
ВВС
Головной фрагмент
N=N
---г-,"
ВВВ ВВА
Метка А
N=N
Метка В
N=N
Метка С
Головной фрагмент
Метка А
Метка В
Метка С и хвостовой фрагмент
ВВВ ВВА
Праймер
Расширение праймера при учакстии ДНК-полимеразы, способной считываться с использованием областей контакта, сшитых методом клик-химии
"•ГУ
N=N
l.Cu{l) катализатор
+ Биотин-NHS
Y55 17621 Da
-I Y185 13886 Da
I-- у
'.^:д'.:;1
ж::.т.-дг
FAM 5'
Биотин
FAM 5'
Ферментативное расширение тТ праймера
Захват гранулами со стрептавидином
FAM5'
Элюирование NaOH, нейтрализация
FAM 5' LCMS анализ продуктов
Y55 продукт Клёнова 17446
495
260 MS
495
TIC
Y185 продукт Клёнова 13763
Фигура 18В
Фигура 18С
TIPS
l.Cu(l) катализатор - TIPS
N=N
2. Депротекция
+ N,
N=N
Биотин-NHS
3a.Cu(l) катализатор 3b. Связывание с биотином
Биатин-
N=N
N=N
Биотип-¦
Фигура 19A
Стадии 2 и 3 повторяют дважды
N=N1
YDC матрица 21761 {- биотин) ' 22235
1 V
YTC матрица
26366 {- биотин) 26848
Фигура 19D
FAM 5'
|^^Расширение праймера с помощью фрагмента Клёнова Захват гранулами стрептавидина
N=N N=N N=N
FAM 5'
FAM 5J
Промывка
NaOH элюция
LCMS анализ продуктов
FAM 5'
FAM 5J
YDC продукт Клёнова 27197
495
YTC продукт Клёнова 26146
495 TIC
Фигура 20В
Фигура 20С
Расширение праймера с использованием фрагмента Клёнова на матрицах, сшитых с помощью клик-химии
Головной фрагмент Метка А
ВВА ВВВ
ИВ-
fib
А Метка В п
" Метка С
ВВС Головной фрагмент . RJ _ RJ rt
А ^ " ^г Метка А _ Метка В н-, Метка С л
ВВВ ВВА
BBC Головной фрагмент Kt в Л1 п Хвостовой
/\^q д Метка А ^ Метка В д Метка С ^ фрагмент
ЙРВ ВВА
Хвостовой
ББС- _ фрагмент
^3 J д
ВВВ ВВА Праймер Расширение праймера при участии ДНК-полимеразы, способной считываться, с использованием ортогональных химически сшитых областей контакта
Фигура 22В
Ввс Самоинициирующийся хвостовой фрагмент
^^3B*A
ВВС
Авсь=зз j и. Ьо
ВВВ ВВА р*-^
Сайт рестрикции
Расширение праймера при участии ДНК-полимеразы, способной считываться, с использованием ортогональных химически сшитых областей контакта
Головной фрагмент о
Метка А
О-Р-SH + 5' I сГГ-
Сшивание с помощью шунта
ВВА ВВВ о
Ю-Д-В,
Метка В
Cu(l) катализатор
N=N
IO-P-SH он
9 Метка С
+ 5' I dT-nnnnnnnnn(tm)
Сшивание с помощью шунта
ВВС
Головной фрагмент 0 " oJ-z
ВВВ ВВА
Метка А
N=N
Метка В
О ОН
Метка С
Фигура 23
ft 3' 5' ^S02Me Me°2s
HS-P-O- --I 2 "
он Метка
s_^0^ §L
Qh Защищенная метка
Фигура 24A
PG-S-P-O-
HS-P-О
-~~ЧМНг
+ Шунт
Химическое сшивание PG = защитная группа 9, ff
PG-S-P-O-2-
-2-s-p-o-s-он
'NH5
. Химическая^ реакция (J
. Очистка
. Депротекции
PG-S-P-0-=-
+ Шунт
Химическое сшивание
HS-P-0-
5' 11 3' -S-P-0 -
1Н>
PG-S-P-O-
5l ° 3'
-2- S-P-O- он
5' 11 3' --S-P-O-
ОН 1. Химическая реакция
2. Очистка
3. Депротекции
HO-
-S-P-0-
ОН о
-S-P-O-
-S-P-0-
1. Химическая реакция
2. Очистка
MO-
S-P-O-
-S-P-0-ОН
-S-P-0-
HS-P-O-
Метка
-IN
^S02Me Me°2S^^s_^_0 _JЈ L_N;
Q|_| Защищенная метка
Фигура 25A
HS-^-O-
-NH,
Шунт
Химическое сшивание
"\ II S-P-O
-S-F-оон
-NH,
1. Химическа: реакция
2. Очистка
Химическое сшивание
-5-РЧ>
н ^
J4 и
-S-P-0-
н ~ -N-Q
1. Химическая реакция
2. Очистка
3. Да протекция
+ Шунт
9 *
HS-P-O-
Химическое сшивание ^н
N=N
-s-iS-o-6н
-S-P-0-
О ii
-S-P-0-
1. Химическая О
реакция 2. Очистка
0 II
-S-P-0-ОН
-"-ООО
1/50
1/50
Фигура 1
Фигура 1
1/50
1/50
Фигура 1
Фигура 1
1/50
1/50
Фигура 1
Фигура 1
2/50
2/50
4/50
5/50
Фигура 4D
4/50
5/50
Фигура 4D
4/50
5/50
Фигура 4D
4/50
5/50
Фигура 4D
4/50
5/50
Фигура 4D
4/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
6/50
5/50
Фигура 4D
7/50
7/50
7/50
7/50
7/50
7/50
7/50
7/50
8/50
8/50
Фигура 6А
Фигура 6А
9/50
9/50
Фигура 7 А
Фигура 7 А
10/50
10/50
11/50
11/50
12/50
12/50
12/50
12/50
12/50
12/50
13/50
13/50
13/50
13/50
13/50
13/50
13/50
13/50
14/50
14/50
15/50
15/50
Фигура 11В
Фигура 11В
16/50
16/50
Фигура НС
Фигура НС
16/50
16/50
Фигура НС
Фигура НС
16/50
16/50
Фигура НС
Фигура НС
16/50
16/50
Фигура НС
Фигура НС
16/50
16/50
Фигура НС
Фигура НС
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
17/50
17/50
Фигура 11D
Фигура 11D
18/50
18/50
Фигура НЕ
Фигура НЕ
19/50
19/50
Фигура 12В
Фигура 12С
Фигура 12В
Фигура 12С
19/50
19/50
Фигура 12В
Фигура 12С
Фигура 12В
Фигура 12С
19/50
19/50
Фигура 12В
Фигура 12С
Фигура 12В
Фигура 12С
20/50
21/50
Фигура 12Е
20/50
21/50
Фигура 12Е
20/50
21/50
Фигура 12Е
20/50
21/50
Фигура 12Е
20/50
21/50
Фигура 12Е
22/50
21/50
Фигура 12Е
22/50
21/50
Фигура 12Е
22/50
21/50
Фигура 12Е
23/50
23/50
23/50
23/50
23/50
23/50
24/50
24/50
25/50
25/50
Фигура 13А
Фигура 13А
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
26/50
26/50
Фигура 13В-1
Фигура 13В-1
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
27/50
28/50
29/50
Фигура 13С
28/50
29/50
Фигура 13С
28/50
29/50
Фигура 13С
28/50
29/50
Фигура 13С
28/50
29/50
Фигура 13С
30/50
29/50
Фигура 13С
31/50
31/50
Фигура 15А
Фигура 15А
31/50
31/50
Фигура 15А
Фигура 15А
32/50
32/50
Фигура 15В
Фигура 15В
32/50
32/50
Фигура 15В
Фигура 15В
32/50
32/50
Фигура 15В
Фигура 15В
32/50
32/50
Фигура 15В
Фигура 15В
32/50
32/50
Фигура 15В
Фигура 15В
33/50
33/50
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
34/50
34/50
Фигура 16А
Фигура 16А
35/50
35/50
Фигура 16С
Фигура 16С
36/50
36/50
Фигура 17В
Фигура 17С
Фигура 17В
Фигура 17С
36/50
36/50
Фигура 17В
Фигура 17С
Фигура 17В
Фигура 17С
36/50
36/50
Фигура 17В
Фигура 17С
Фигура 17В
Фигура 17С
36/50
36/50
Фигура 17В
Фигура 17С
Фигура 17В
Фигура 17С
37/50
37/50
Фигура 18А
Фигура 18А
37/50
37/50
Фигура 18А
Фигура 18А
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
38/50
39/50
Фигура 19В
40/50
39/50
Фигура 19В
40/50
39/50
Фигура 19В
41/50
41/50
Фигура 20A
Фигура 20A
42/50
42/50
42/50
42/50
42/50
42/50
43/50
43/50
Фигура 21
Фигура 21
44/50
44/50
Фигура 22А
Фигура 22А
(i)
45/50
(i)
45/50
Фигура 22С
Фигура 22С
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
46/50
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
47/50
Фигура 24В
48/50
49/50
Фигура 24В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В
50/50
50/50
Фигура 25В
Фигура 25В