|
|
больше ...
Термины запроса в документе
Реферат
[RU] Раскрывается использование белка соматотропного гормона и полинуклеотидов, кодирующих его, что включает аминоконцевой и карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина и два карбоксиконцевых СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к соматотропному гормону, в способах стимулирования потери веса или снижения телесного жира, способах увеличения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) и способах снижения частоты приема соматотропного гормона у человека. Также раскрываются фармацевтические композиции, содержащие соматотропный гормон и полинуклеотиды, кодирующие соматотропный гормон изобретения, и способы их применения. 
Полный текст патента
(57) Реферат / Формула:
Раскрывается использование белка соматотропного гормона и полинуклеотидов, кодирующих его, что включает аминоконцевой и карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина и два карбоксиконцевых СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к соматотропному гормону, в способах стимулирования потери веса или снижения телесного жира, способах увеличения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) и способах снижения частоты приема соматотропного гормона у человека. Также раскрываются фармацевтические композиции, содержащие соматотропный гормон и полинуклеотиды, кодирующие соматотропный гормон изобретения, и способы их применения.
СОМАТОТРОПНЫЙ ГОРМОН ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ и
СПОСОБЫ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
5 [001] Данная заявка претендует на приоритет относительно заявки Соединенных Штатов, серийный номер 13/195931, поданной 2 августа 2011 года, которая является частичным продолжением патентной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 12/509188, поданной 24 июля 2009 года, которая является частичным продолжением патентной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 12/476916, поданной 2 июня
10 2009 года, которая является частичным продолжением патентной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 12/401746, поданной 11 марта 2009 года, которая является продолжением патентной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 11/700911, поданной 1 февраля 2007 года, которая заявляет преимущества предварительной патентной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 60/764761, поданной 3 февраля
15 2006 года. Все эти заявки настоящим документом полностью включены сюда посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[002] Раскрывается использование белка соматотропного гормона и полинуклеотидов, 20 кодирующих его, которое включает аминоконцевой и карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина и два карбоксиконцевых СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к соматотропному гормону, в способах стимулирования потери веса или снижения телесного жира, способе увеличения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) и способах снижения частоты приема 25 соматотропного гормона у человека. Также раскрываются фармацевтические композиции, содержащие соматотропный гормон и полинуклеотиды, кодирующие соматотропный гормон, изобретения, и способы его применения.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
30 [003] Полипептиды чувствительны к денатурации или ферментной деградации в крови, печени или почке. Соответственно, полипептиды обычно имеют короткий полупериод жизни в кровообращении, составляющий несколько часов. Из-за своей низкой стабильности пептидные препараты обычно доставляются с постоянной частотой с тем, чтобы поддерживать эффективную концентрацию активного пептида в плазме. Помимо
35 этого, поскольку пептидные препараты обычно вводятся путем инфузии, частые инъекции
пептидных препаратов вызывают значительный дискомфорт у субъекта. Таким образом, существует потребность в технологиях, которые продлят полупериоды жизни терапевтических полипептидов, при этом сохраняя их высокую фармакологическую эффективность. Такие желаемые пептидные препараты также должны соответствовать 5 требованиям повышенной стабильности в сыворотке, высокой активности и низкой вероятности индукции нежелательного иммунного ответа при инъецировании субъекта. [004] Нежелательные фармакокинетики, такие как короткий полупериод жизни в сыворотке, могут препятствовать фармацевтической разработке многих, в других обстоятельствах многообещающих, потенциальных лекарств. Полупериод жизни в
10 сыворотке представляет собой эмпирическую характеристику молекулы, и ее следует определять экспериментально для каждого нового потенциального лекарства. Например, в отношении полипептидных препаратов с более низким молекулярным весом, механизмы физиологического клиренса, такие как почечная фильтрация, могут сделать поддержание терапевтических уровней препарата неосуществимым из-за стоимости или частоты
15 необходимого режима дозирования. С другой стороны, длинный полупериод жизни в сыворотке нежелателен в тех случаях, когда препарат или его метаболиты имеют токсические побочные эффекты.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
20 [005] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования потери веса или снижения телесного жира у человека, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР
25 хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом стимулируя потерю веса или убывание телесного жира у указанного субъекта.
[006] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ увеличения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) у человека, 30 включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом увеличивая уровни IGF-1 у указанного субъекта.
[007] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ поддержания уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) в нормальном терапевтическом диапазоне у субъекта, способ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный 5 гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом поддерживая IGF-I в нормальном терапевтическом диапазоне у субъекта.
10 [008] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ снижения частоты приема соматотропного гормона человеком, содержащий этап присоединения одного карбоксиконцевого пептида (СТР) хорионического гонадотропина к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и двух СТР хорионического гонадотропина к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом снижая
15 частоту приема соматотропного гормона.
[009] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования роста или прибавки веса у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического
20 гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, в котором субъект является ребенком или подростком, таким образом стимулируя рост или прибавку веса у указанного субъекта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[010] ФИГ. 1 представляет собой вестерн-блоттинг, иллюстрирующий молекулярный вес 25 и идентичность hGH (SEQ Ш NO: 5), hGH-CTP (SEQ ID NO: 9), hGH-CTP-CTP (SEQ Ш NO: 10), CTP- hGH-CTP-CTP (SEQ Ш NO: 11) и tCTP-hGH-CTP-CTP (SEQ Ш NO: 12). Были получены реплики геля после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (PAGE SDS гель) и окрашены с помощью моноклональных анти-hGH антител. Фотография демонстрирует, что, как и в случае с коммерческим hGH и 30 hGH дикого типа, hGH-варианты, модифицированные СТР, распознаются антителами анти-hGH.
[Oil] ФИГ. 2 представляет собой столбчатую диаграмму, иллюстрирующую прибавку веса у крыс с удаленным гипофизом после введения полипептидов GH-CTP (различные модификации) настоящего изобретения.
[012] ФИГ. 3 включает две схемы: (1) карту плазмиды CTP-hGH-CTP-CTP pCI-dhfr и (2) 5 структурную формулу белка CTP-hGH-CTP-CTP.
[013] ФИГ. 4 представляет собой графики, демонстрирующие средние концентрации в плазме CTP-hGH-CTP-CTP или GH (пг/мл) после однократной внутривенной или подкожной дозы CTP-hGH-CTP-CTP или GH у крыс (п=3-6 на дозу/способ введения). [014] ФИГ. 5 представляет собой графики, демонстрирующие среднюю возрастающую 10 прибавку веса после однократных подкожных доз CTP-hGH-CTP-CTP (0,4, 0,8 и 4 мг/кг) у крыс с удаленным гипофизом по сравнению с ежедневными инъекциями GH (0,1 мг/кг/день) (п=10 на дозу).
[015] ФИГ. 6 представляет собой график, демонстрирующий, что Площадь Под Кривой после однократной инъекции CTP-hGH-CTP-CTP коррелирует с прибавкой веса тела у 15 крыс.
[016] ФИГ. 7 представляет собой график, демонстрирующий постепенно возрастающую прибавку веса после подкожных доз CTP-hGH-CTP-CTP (0,4, 0,8 и 4 мг/кг) один раз в 4 дня у крыс с удаленным гипофизом по сравнению с ежедневными инъекциями GH (0,1 мг/кг/день) (п=10 на дозу).
20 [017] ФИГ. 8 представляет собой график, демонстрирующий концентрацию hGH в сыворотке у крыс с удаленным гипофизом после подкожной инъекции CTP-hGH-CTP-CTP и коммерческого hGH. Однократные дозы CTP-hGH-CTP-CTP 0,6 или 1,8 мг/кг и Биотропина 0,35 или 1,05 мг/кг вводили подкожно крысам с удаленным гипофизом для определения профиля фармакокинетики/фармакодинамики. Сывороточный hGH после
25 инъекции измеряли с использованием специальных наборов для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA.
[018] ФИГ. 9 представляет собой график, демонстрирующий уровни IGF-1 в сыворотке у крыс с удаленным гипофизом после подкожной инъекции CTP-hGH-CTP-CTP и коммерческого hGH. Однократные дозы CTP-hGH-CTP-CTP 0,6 или 1,8 мг/кг и 30 Биотропина 0,35 или 1,05 мг/кг вводили подкожно крысам с удаленным гипофизом для определения профиля фармакокинетики/фармакодинамики. Сывороточный IGF-I после инъекции измеряли с использованием специальных наборов для твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (Roche Diagnostics).
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[019] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет соматотропные гормоны пролонгированного действия и способы их получения и применения. В другом варианте воплощения изобретения соматотропные гормоны пролонгированного действия содержат карбоксиконцевой пептид (СТР, также 5 упоминаемый как СТР-единица). В другом варианте воплощения изобретения полипептиды пролонгированного действия содержат карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина человека ( hCG). В другом варианте воплощения изобретения СТР действует как протективный агент против деградации соматотропного гормона или искомых полипептидов. В другом варианте воплощения изобретения СТР
10 увеличивает Стах соматотропных гормонов или искомых полипептидов. В другом варианте воплощения изобретения СТР увеличивает Ттах соматотропных гормонов или искомых полипептидов. В другом варианте воплощения изобретения СТР увеличивает полупериоды жизни в кровообращении соматотропных гормонов или искомых полипептидов. В некоторых вариантах воплощения изобретения СТР усиливает
15 активность соматотропных гормонов или искомых полипептидов.
[020] В других вариантах воплощения изобретения сконструированные соматотропные гормоны или искомые полипептиды изобретения, содержащие единичный СТР, присоединенный к аминоконцу, и два СТР пептида, присоединенных последовательно к карбоксильному концу, по меньшей мере эквивалентны соматотропным гормонам с
20 немодифицированным СТР или искомым полипептидам в отношении биологической активности. В других вариантах воплощения изобретения сконструированные соматотропные гормоны или искомые полипептиды изобретения, содержащие единичный СТР, присоединенный к аминоконцу, и два СТР пептида, присоединенных последовательно к карбоксильному концу, по меньшей мере эквивалентны
25 соматотропным гормонам с немодифицированным СТР или искомым полипептидам относительно фармакологических показателей, таких как фармакокинетика и фармакодинамика.
[021] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет полипептид, содержащий соматотропный гормон и по меньшей мере один СТР пептид, 30 присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и по меньшей мере два карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона. В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет полипептид, содержащий один карбоксиконцевой пептид хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного
гормона, и два карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона.
[022] В другом варианте воплощения изобретения термины "СТР пептид", "карбоксиконцевой пептид" и "последовательность СТР" здесь применяются 5 взаимозаменяемо. В другом варианте воплощения изобретения карбоксиконцевой пептид представляет собой первичный полноразмерный СТР. В другом варианте воплощения изобретения карбоксиконцевой пептид представляет собой процессированный СТР. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант воплощения настоящего изобретения.
10 [023] В другом варианте воплощения изобретения "сигнальная последовательность" и "сигнальный пептид" здесь используются взаимозаменяемо. В другом варианте воплощения изобретения "последовательность" в применении к полинуклеотиду может относиться к кодирующей области. Каждый вариант представляет собой отдельный вариант воплощения настоящего изобретения.
15 [024] В другом варианте воплощения изобретение предоставляет полипептид, состоящий из соматотропного гормона, единичного карбоксиконцевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к аминоконцу соматотропного гормона, и двух карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона. В другом варианте воплощения
20 изобретение предоставляет полипептид, состоящий из соматотропного гормона, единичного карбоксиконцевого пептида хорионического гонадотропина, присоединенного к аминоконцу соматотропного гормона, двух карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, и сигнального пептида, присоединенного к аминоконцу одного
25 карбоксиконцевого пептида хорионического гонадотропина.
[025] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, содержащий СТР, как описано здесь, имеет усиленную биологическую активность in vivo по сравнению с таким же соматотропным гормоном без СТР. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, содержащий по меньшей мере один СТР,
30 присоединенный к своему аминоконцу, и по меньшей мере два СТР, присоединенных к его карбоксильному концу, имеет усиленную биологическую активность in vivo по сравнению с таким же соматотропным гормоном без СТР. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, содержащий один СТР, присоединенный к своему аминоконцу, и два СТР, присоединенных к своему карбоксильному концу, имеет
усиленную биологическую активность in vivo по сравнению с таким же соматотропным гормоном без СТР.
[026] В другом варианте воплощения изобретения субъект является человеком. В другом варианте воплощения изобретения субъект является домашним животным. В другом 5 варианте воплощения изобретения субъект является млекопитающим. В другом варианте воплощения изобретения субъект является сельскохозяйственным животным. В другом варианте воплощения изобретения субъект является обезьяной. В другом варианте воплощения изобретения субъект является лошадью. В другом варианте воплощения изобретения субъект является коровой. В другом варианте воплощения изобретения
10 субъект является мышью. В другом варианте воплощения изобретения субъект является крысой. В одном варианте воплощения изобретения субъект является мужчиной. В другом варианте воплощения изобретения субъект является женщиной. [027] В другом варианте воплощения изобретения конфигурация СТР- соматотропный гормон-СТР-СТР, как описано здесь, содержит соматотропный гормон или активный его
15 фрагмент, соединенный через пептидную связь с по меньшей мере одной единицей СТР. В другом варианте воплощения изобретения СТР-соматотропный гормон-СТР-СТР, как описано здесь, содержит соматотропный гормон или активный его фрагмент, соединенный через пептидную связь с по меньшей мере одной единицей СТР, которая соединена с дополнительной единицей СТР через пептидную связь. В другом варианте
20 воплощения изобретения полипептид, как описано здесь, содержащий соматотропный гормон и/или его фрагменты, и единицы СТР и/или их фрагменты, взаимно связаны через пептидную связь. В другом варианте воплощения изобретения одна молекула нуклеиновой кислоты кодирует полипептид, описываемый здесь, содержащий соматотропный гормон и/или его фрагменты и единицы СТР и/или их фрагменты.
25 [028] В другом варианте воплощения изобретения карбоксиконцевой пептид (СТР) присоединен к соматотропному гормону через линкер. В другом варианте воплощения изобретения линкер, который соединяет последовательность СТР с соматотропным гормоном, представляет собой ковалентною связь. В другом варианте воплощения изобретения линкер, который соединяет последовательность СТР с соматотропным
30 гормоном, представляет собой пептидную связь. В другом варианте воплощения изобретения линкер, который соединяет последовательность СТР с соматотропным гормоном, представляет собой замещенную пептидную связь. В другом варианте воплощения изобретения последовательность карбоксиконцевого пептида (СТР) содержит аминокислотную последовательность, отобранную из последовательностей,
35 изложенных в SEQ ID NO: 1 и SEQ Ш NO: 2.
[029] В другом варианте воплощения изобретения SEQ ID NO: 1 содержит следующую
аминокислотную (АК) последовательность: DPRFQDS S S S KAPPPS LPS PS RLPGPS DTPILQ
(SEQ ID NO: 1). В другом варианте воплощения изобретения SEQ ID NO: 2 содержит
следующую аминокислотную (АК) последовательность:
5 S S S S KAPPPS LPS PS RLPGPS DTPILPQ (SEQ ID NO: 2).
[030] В другом варианте воплощения изобретения последовательность карбоксиконцевого пептида (СТР) является процессированной. В другом варианте воплощения изобретения процессированный СТР содержит следующую аминокислотную последовательность: SSSSKAPPPSLP (SEQ ID NO: 4).
10 [031] В другом варианте воплощения изобретения карбоксиконцевой пептид (СТР) настоящего изобретения содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты 112 до положения 145 пептида нативного хорионического гонадотропина человека. В другом варианте воплощения изобретения последовательность СТР настоящего изобретения содержит аминокислотную последовательность от аминокислоты 118 до
15 положения 145 пептида нативного хорионического гонадотропина человека. В другом варианте воплощения изобретения последовательность СТР также начинается от любого положения между положениями 112-118 и заканчивается в положении 145 пептида нативного хорионического гонадотропина человека. В некоторых вариантах воплощения изобретения пептид последовательности СТР имеет длину в 28, 29, 30, 31, 32, 33 или 34
20 аминокислот и начинается в положении 112, 113, 114, 115, 116, 117 или 118 библиотеки генов, в которой хранится аминокислотная последовательность СТР.
[032] В другом варианте воплощения изобретения пептид СТР представляет собой пептид СТР, как это описано в Патенте США №, который включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В другом варианте воплощения изобретения пептид
25 СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от нативного СТР замещениями 1-5 консервативных аминокислот, как это описано в Патенте США No. 5712122, который включен в настоящую заявку во всей полноте посредством ссылки. В другом варианте воплощения изобретения пептид СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от
30 нативного СТР замещением 1 консервативной аминокислоты. В другом варианте воплощения изобретения пептид СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от нативного СТР замещениями 2 консервативных аминокислот. В другом варианте воплощения изобретения пептид СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от нативного СТР
35 замещениями 3 консервативных аминокислот. В другом варианте воплощения
изобретения пептид СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от нативного СТР замещениями 4 консервативных аминокислот. В другом варианте воплощения изобретения пептид СТР представляет собой вариант СТР хорионического гонадотропина, который отличается от нативного СТР 5 замещениями 5 консервативных аминокислот. В другом варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 70% гомологична аминокислотной последовательности нативного СТР или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 80%
10 гомологична аминокислотной последовательности нативного СТР или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 90% гомологична аминокислотной последовательности нативного СТР или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность пептида СТР настоящего изобретения
15 по меньшей мере на 95% гомологична аминокислотной последовательности нативного СТР или его пептиду.
[033] В другом варианте воплощения изобретения ДНК последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 70% гомологична ДНК последовательности нативного СТР человека или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения
20 ДНК последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 80% гомологична ДНК последовательности нативного СТР человека или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения ДНК последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 90% гомологична ДНК последовательности нативного СТР человека или его пептиду. В другом варианте воплощения изобретения
25 ДНК последовательность пептида СТР настоящего изобретения по меньшей мере на 95% гомологична ДНК последовательности нативного СТР человека или его пептиду. [034] В одном варианте воплощения изобретения процессированный СТР содержит первые 11 аминокислот SEQ Ш NO: 4. В одном варианте воплощения изобретения процессированный СТР содержит первые 8 аминокислот SEQ Ш NO: 4. В одном варианте
30 воплощения изобретения процессированный СТР содержит первые 13 аминокислот SEQ ID NO: 4. В одном варианте воплощения изобретения процессированный СТР содержит первые 6 аминокислот SEQ Ш NO: 4. В одном варианте воплощения изобретения процессированный СТР содержит первые 5 аминокислот SEQ ID NO: 4. [035] В одном варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна из
35 аминокислотных последовательностей СТР хорионического гонадотропина
гликозилирована. В другом варианте воплощения изобретения обе аминокислотные последовательности СТР хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте воплощения изобретения 2 аминокислотные последовательности СТР хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте воплощения 5 изобретения 2 или более аминокислотные последовательности СТР хорионического гонадотропина гликозилированы. В другом варианте воплощения изобретения все аминокислотные последовательности СТР хорионического гонадотропина гликозилированы. В одном варианте воплощения изобретения последовательность СТР настоящего изобретения содержит по меньшей мере один участок гликозилирования. В
10 одном варианте воплощения изобретения последовательность СТР настоящего изобретения содержит 2 участка гликозилирования. В одном варианте воплощения изобретения последовательность СТР настоящего изобретения содержит 3 участка гликозилирования. В одном варианте воплощения изобретения последовательность СТР настоящего изобретения содержит 4 участка гликозилирования.
15 [036] В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна последовательность карбоксиконцевого пептида (СТР) содержит аминокислотную последовательность, отобранную из последовательностей, изложенных в SEQ Ш NO: 1 и SEQ ID NO: 2. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере один карбоксиконцевой пептид (СТР) процессированный.
20 [037] В одном варианте воплощения изобретения термины "концы", "концевой", "терминальный конец" и "конец" в применении к карбоксильному концу или аминоконцу белка или пептида, или их фрагмента, приводимого здесь, используются здесь взаимозаменяемо . В другом варианте воплощения изобретения термины "С-концевой", "карбоксиконцевой" или "карбоксильный конец" используются здесь взаимозаменяемо . В
25 другом варианте воплощения изобретения термины "N-концевой" и "аминоконцевой" используются здесь взаимозаменяемо . Каждый вариант представляет собой отдельный вариант воплощения настоящего изобретения.
[038] В другом варианте воплощения изобретения последовательности СТР как на аминотерминальном конце соматотропного гормона, так и на карбокситерминальном
30 конце соматотропного гормона предоставляют усиленную защиту от деградации соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две единицы СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона предоставляют усиленную защиту от клиренса. В другом варианте воплощения
35 изобретения по меньшей мере одна последовательность СТР на аминотерминальном
конце соматотропного гормона и две единицы СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона предоставляют продление времени клиренса. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две единицы СТР на 5 карбокситерминальном конце соматотропного гормона увеличивают Стах соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две единицы СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона увеличивают Тшах соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере 10 одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две единицы СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона увеличивают Т1/2 (полупериод жизни) соматотропного гормона.
[039] В другом варианте воплощения изобретения последовательности СТР на обоих концах - аминотерминальном конце соматотропного гормона и карбокситерминальном
15 конце соматотропного гормона - продлевают полупериод жизни модифицированного соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения по меньшей мере одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и по меньшей мере две последовательности СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона предоставляют продленный полупериод жизни
20 модифицированному соматотропному гормону. В другом варианте воплощения изобретения одна последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две последовательности СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона предоставляют продленный полупериод жизни присоединенному соматотропному гормону. В другом варианте воплощения изобретения одна
25 последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона и две последовательности СТР, расположенные последовательно на карбокситерминальном конце соматотропного гормона, предоставляют продленный полупериод жизни модифицированному соматотропному гормону.
[040] В другом варианте воплощения изобретения последовательность СТР на 30 аминотерминальном конце полипептида, последовательность СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона и по меньшей мере одна дополнительная последовательность СТР, присоединенная последовательно к последовательности СТР на карбоксильном конце, предоставляют усиленную защиту от деградации соматотропному гормону. В некоторых вариантах воплощения изобретения 35 последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона,
последовательность СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона и по меньшей мере одна дополнительная последовательность СТР, присоединенная последовательно к последовательности СТР на карбоксильном конце, продлевают полупериод жизни соматотропного гормона. В некоторых вариантах воплощения 5 изобретения последовательность СТР на аминотерминальном конце соматотропного гормона, последовательность СТР на карбокситерминальном конце соматотропного гормона и по меньшей мере одна дополнительная последовательность СТР, присоединенная последовательно к последовательности СТР на карбоксильном конце, усиливают биологическую активность соматотропного гормона.
10 [041] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон дополнительно содержит сигнальный пептид. В некоторых вариантах воплощения изобретения сигнальные последовательности включают, но не ограничиваются этим, эндогенную сигнальную последовательность. В некоторых вариантах воплощения изобретения сигнальные последовательности включают, но не ограничиваются этим,
15 эндогенную сигнальную последовательность любого известного соматотропного гормона или соматотропных гормонов. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды и способы настоящего изобретения предоставляют соматотропный гормон, имеющий дополнительно сигнальный пептид, содержащий следующую аминокислотную последовательность: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 3).
20 [042] В другом варианте воплощения изобретения конъюгированные соматотропные гормоны данного изобретения используются тем же методом, что и немодифицированные соматотропные гормоны. В другом варианте воплощения изобретения конъюгированные соматотропные гормоны данного изобретения имеют повышенный полупериод жизни в кровотоке и время пребывания в плазме, сниженный клиренс и повышенную
25 клиническую активность in vivo. В другом варианте воплощения изобретения, благодаря улучшенным свойствам конъюгированных соматотропных гормонов, описываемых здесь, эти конъюгаты вводятся менее часто по сравнению с немодифицированными соматотропными гормонами. В другом варианте воплощения изобретения конъюгированные соматотропные гормоны, описываемые здесь, вводятся с частотой от
30 одного раза в одну неделю до одного раза в две недели. В другом варианте воплощения изобретения конъюгированные соматотропные гормоны, описываемые здесь, вводятся с частотой от одного раза каждые две недели до одного раза каждые три недели. В другом варианте воплощения изобретения конъюгированные соматотропные гормоны, описываемые здесь, вводятся с частотой от одного раза в день до трех раз в неделю. В
35 другом варианте воплощения изобретения сниженная частота введения приведет в
результате к улучшенному соблюдению пациентом режима и схемы лечения, что приводит к улучшенным результатам лечения наряду с улучшенным качеством жизни пациента. В другом варианте воплощения изобретения, по сравнению с традиционными конъюгатами соматотропных гормонов, связанными с поли(этиленгликолем), было 5 выявлено, что СТР конъюгаты соматотропного гормона, имеющие молекулярный вес и структуру линкера конъюгатов данного изобретения, имеют улучшенную активность, улучшенную стабильность, повышенные уровни AUC, повышенный полупериод жизни в кровообращении. В другом варианте воплощения изобретения, по сравнению с традиционными конъюгатами соматотропных гормонов, связанными с
10 поли(этиленгликолем), было выявлено, что соматотропные гормоны, имеющие молекулярный вес и структуру линкера конъюгатов данного изобретения, имеют улучшенную активность, улучшенную стабильность, повышенные уровни AUC, повышенный полупериод жизни в кровообращении. В другом варианте воплощения изобретения терапевтически эффективным количеством конъюгированного
15 соматотропного гормона является количество конъюгата, необходимое для ожидаемой биологической активности, измеряемой in vivo. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, используемый согласно идеям настоящего изобретения, проявляет повышенную активность. В другом варианте воплощения изобретения присоединение последовательности СТР как к аминоконцу, так и к
20 карбоксильному концу соматотропного гормона приводит в результате к продленной активности in vivo.
[043] В другом варианте воплощения изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного соматотропного гормона определяется в соответствии с такими факторами как конкретный тип состояния, которое подвергается лечению,
25 состояние пациента, который подвергается лечению, наряду с другими компонентами в композиции. В другом варианте воплощения изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного соматотропного гормона составляет от 0,01 до 10 мкг на кг веса тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте воплощения изобретения терапевтически эффективное количество конъюгированного соматотропного гормона
30 составляет от 0,1 до 1 мкг на кг веса тела, вводимое один раз в неделю. В другом варианте воплощения изобретения рецептура фармацевтической композиции, содержащей конъюгированный соматотропный гормон, разрабатывается с активностью, эффективной для введения различными способами пациенту-человеку.
[044] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон является 35 любым соматотропным гормоном, известным специалисту в области техники. В другом
варианте воплощения изобретения соматотропный гормон представляет собой соматотропный гормон человека. В другом варианте воплощения изобретения нуклеотидная последовательность и/или аминокислотная последовательность соматотропного гормона доступна в базе данных генного банка. В другом варианте 5 воплощения изобретения соматотропный гормон является гомологом. В другом варианте воплощения изобретения гомолог также относится к варианту делеции, вставки или замещения, включая замещение его аминокислот и его фрагментов биологически активного полипептида.
[045] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон представляет
10 собой вариант hGH с отсутствующими экзонами 2, 3, 4 или любая комбинация такового. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон содержит сигнальный пептид. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон содержит сигнальный участок рестрикции. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие GH, модифицированный СТР настоящего изобретения,
15 содержат рекомбинантный GH.
[046] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, описываемый здесь, является членом суперсемейства цитокинов, подобных соматотропному гормону (GH). В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, описываемый здесь, представляет собой соматотропный гормон человека (hGH). В другом варианте
20 воплощения изобретения соматотропный гормон человека содержит следующую аминокислотную последовательность (Genbank, номер доступа Р01241): MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEE A YIPKEQK YS FLQNPQTS LCFS ESIPTPS NREETQQKS NLELLRIS LLLIQS WLEP VQFLRS VFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDD
25 ALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (SEQ ID NO: 5). В другом
варианте воплощения изобретения соматотропный гормон человека содержит следующую
аминокислотную последовательность:
MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPT PSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGI
30 QTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRI VQCRSVEGSCGF (SEQ ID NO: 6). В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон человека содержит следующую аминокислотную последовательность: MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLA (SEQ ID NO: 7). В другом варианте воплощения изобретения hGH содержит следующую аминокислотную
35 последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEE AYIPKVQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRS VFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDD ALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF (SEQ ID NO: 8). В другом 5 варианте воплощения изобретения hGH представляет собой вариант замещения, в котором глютамин в положении 65 в hGH замещен валином.
[047] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа ААА72260. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа ААК69708. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа САА01435. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа САА01329. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа САА00380. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа ААА72555. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа NP_000506.2. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа NP_072053.1. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа NP_072054.1. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа NP_072055.1. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения содержит аминокислотную последовательность, хранящуюся в генном банке под номером доступа NP_072056.1. [048] В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, описываемый здесь, кодирует любую аминокислотную последовательность соматотропного гормона, известную специалисту в данной области техники. В другом варианте воплощения изобретения молекула
нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, описываемый здесь, кодирует hGH. В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, хранящуюся в генном банке под номером доступа NM_000515.3. В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, хранящуюся в генном банке под номером доступа NM_022559.2. В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, хранящуюся в генном банке под номером доступа NM_022560.2. В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, хранящуюся в генном банке под номером доступа NM_022561.2. В другом варианте воплощения изобретения молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая соматотропный гормон, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, хранящуюся в генном банке под номером доступа NM_022562.2.
[049] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий соматотропный гормон изобретения, содержит один СТР, присоединенный к карбоксильному концу соматотропного гормона (hGH-CTP) и имеющий следующую аминокислотную последовательность: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEE A YIPKEQK YS FLQNPQTS LCFS ESIPTPS NREETQQKS NLELLRIS LLLIQS WLEP VQFLRS VFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDD ALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQ (SEQ ID NO: 9).
[050] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий
соматотропный гормон изобретения, содержит два СТР, последовательно
присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона (hGH-CTP-CTP) и
имеющих следующую аминокислотную последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEE A YIPKEQK YS FLQNPQTS LCFS ES IPTPS NREETQQKS NLELLRIS LLLIQS WLEP VQFLRS VFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDD ALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 10).
[051] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий соматотропный гормон изобретения, содержит два СТР, присоединенных
последовательно к карбоксильному концу соматотропного гормона, и один СТР,
присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона (CTP-hGH-CTP-CTP) и
имеющий следующую аминокислотную последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRL FDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQ KSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGS CGFS S S S KAPPPS LPS PS RLPGPS DTPILPQS S S S KAPPPS LPS PS RLPGPS DTPILPQ (SEQ ID NO: 11).
[052] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий соматотропный гормон изобретения, содержит два СТР, последовательно присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, в котором один СТР из двух СТР процессирован, и один дополнительный СТР, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона (tCTP-hGH-CTP-CTP) и имеющий следующую аминокислотную последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQL
AFDT YQEFEE A YIPKEQKYS FLQNPQTS LCFS ES IPTPS NREETQQKS NLELLRIS LLLIQS
WLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYS
KFDTNS HNDD ALLKN YGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRS VEGS CGFS S S S KAPPPS LPS
PSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 12).
[053] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий
соматотропный гормон изобретения, содержит один СТР, присоединенный к
карбоксильному концу соматотропного гормона, и один СТР, присоединенный к
аминоконцу соматотропного гормона (CTP-hGH-CTP) и имеющий следующую
аминокислотную последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRL
FDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQ
KSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLE
DGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGS
CGFS S S S KAPPPS LPS PS RLPGPS DTPILPQ (SEQ ID NO: 13).
[054] В другом варианте воплощения изобретения полипептид, содержащий соматотропный гормон и один СТР, содержит следующую аминокислотную последовательность:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRL FDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQ
KSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLE DGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGS CGF (SEQ ID NO: 14).
[055] В другом варианте воплощения изобретения молекула полинуклеотида,
кодирующего полипептид, имеющий CTP-hGH-CTP, содержит следующую
последовательность нуклеиновой кислоты:
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgcca
gctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccac
catccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgagga
agcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaa
cagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcc
tgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatcca
gaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagcca
caacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgca
gtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctggg
ccctccgacacaccaatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc (SEQ ID NO: 15).
[056] В другом варианте воплощения изобретения молекула полинуклеотида,
кодирующего полипептид, имеющий CTP-hGH-CTP-CTP, содержит следующую
последовательность нуклеиновой кислоты:
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgcca
gctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccac
catccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgagga
agcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaa
cagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcc
tgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatcca
gaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagcca
caacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgca
gtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctggg
ccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctg
acacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc (SEQ ID NO: 16).
[057] В другом варианте воплощения изобретения молекула полинуклеотида,
кодирующего полипептид, имеющий CTP-hGH-CTP-CTP, содержит следующую
последовательность нуклеиновой кислоты:
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgcca gctcttcttctaaggctccacccccgagcctgcccttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacag
gctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaaccccca
gacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatc
tccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagc
aacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggcca
gatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcag
aaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaag
gcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccc
tcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc
(SEQ ID NO: 17).
[058] В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения гомологичен известной последовательности соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон изобретения гомологичен 5 последовательности соматотропного гормона, как раскрывается здесь. В некоторых вариантах воплощения изобретения гомология, в соответствии с настоящим изобретением, также охватывает варианты делеции, вставки или замещения, включая замещение их аминокислот и фрагментов биологически активного полипептида таковых. В одном варианте воплощения изобретения вариант замещения является таковым, в 10 котором глютамин в положении 65 hGH замещен валином [Gellerfors et al., J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].
[059] В одном варианте воплощения изобретения фраза "соматотропный гормон человека" (hGH) относится к полипептиду, такому как представленный в Genbank под номером доступа Р01241, проявляющему активность hGH (т.е. стимуляцию роста).
15 [060] В одном варианте воплощения изобретения "соматотропный гормон человека" (hGH) относится к полипептиду, такому как представленный в Genbank под номером доступа Р01241, проявляющему активность hGH (т.е. стимуляцию роста). В одном варианте воплощения изобретения hGH настоящего изобретения также относится к гомологам. В одном варианте воплощения изобретения аминокислотная
20 последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 50% гомологична последовательности hGH, представленной в Genbank под номером доступа Р01241, как это определяется путем использования программного обеспечения BlastP Национального Центра Биотехнологической Информации (National Center of Biotechnology Information -NCBI), используя параметры по умолчанию. В одном варианте воплощения изобретения
25 аминокислотная последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 60% гомологична последовательности hGH, представленной в Genbank под номером
доступа Р01241, как определяется путем использования программного обеспечения BlastP Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), используя параметры по умолчанию. В одном варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 70% гомологична 5 последовательности hGH, представленной в Genbank под номером доступа Р01241, как определяется путем использования программного обеспечения BlastP Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI), используя параметры по умолчанию. В одном варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 80% гомологична последовательности hGH,
10 представленной в Genbank под номером доступа Р01241, как определяется путем
использования программного обеспечения BlastP Национального Центра
Биотехнологической Информации (NCBI), используя параметры по умолчанию. В одном варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 90% гомологична последовательности hGH,
15 представленной в Genbank под номером доступа Р01241, как определяется путем
использования программного обеспечения BlastP Национального Центра
Биотехнологической Информации (NCBI), используя параметры по умолчанию. В одном варианте воплощения изобретения аминокислотная последовательность hGH настоящего изобретения по меньшей мере на 95% гомологична последовательности hGH,
20 представленной в Genbank под номером доступа Р01241, как определяется путем
использования программного обеспечения BlastP Национального Центра
Биотехнологической Информации (NCBI), используя параметры по умолчанию. [061] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, связывают адипоциты и стимулируют их к
25 расщеплению триглицерида, и повышают их способность захватывать и накапливать циркулирующие липиды. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, оказывают непрямое действие, опосредованное, в первую очередь, инсулиноподобным ростовым фактором-I (IGF-I) (как показано в разделе примеров).
30 [062] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, стимулируют рост организма путем стимулирования ткани печени и других тканей к выделению IGF-I. В другом варианте воплощения изобретения IGF-I стимулирует пролиферацию хондроцитов, приводящую в результате к росту костей. В другом варианте воплощения изобретения IGF-I
стимулирует пролиферацию клеток скелетной мускулатуры, что в результате приводит к росту мышц.
[063] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, индуцируют метаболическое действие на 5 белковый, липидный и углеводный метаболизм. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, обладают прямым действием. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, обладают непрямым действием путем индукции IGF-I. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, 10 содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, дополнительно содержат лидерный пептид. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, включают процессированные конструкты СТР.
[064] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, 15 модифицированный посредством СТР, стимулируют анаболизм белка в ткани. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, стимулируют поглощение аминокислот, повышенный белковый синтез и сниженное окисление белков.
[065] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, 20 модифицированный посредством СТР, стимулируют жировой метаболизм. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, стимулируют расходование жира путем стимулирования распада триглицерида и окисления в адипоците. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, сокращают жир в 25 организме.
[066] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, стимулируют углеводный метаболизм. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, поддерживают глюкозу в крови в нормальном диапазоне. В другом 30 варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, включают антиинсулиновую активность. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, подавляют способность инсулина стимулировать усвоение глюкозы в периферических тканях и повышают синтез глюкозы в печени. В другом варианте
воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, стимулируют секрецию инсулина, приводящую к гиперинсулинемии. [067] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, используются для компенсации ограниченной 5 выработки или отсутствия выработки соматотропного гормона у субъекта. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, компенсируют ограниченную выработку или отсутствие выработки соматотропин-рилизинг-гормона (GHRH). В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, компенсируют 10 повышенную активность соматостатина. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, компенсируют ограниченную выработку или отсутствие выработки грелина.
[068] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, используются для лечения заболеваний,
15 ассоциированных с повреждениями в гипоталамусе, гипофизе или в клетках-мишенях. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, используются для лечения заболеваний, ассоциированных со сниженным ответом клеток-мишеней на гормон. [069] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH,
20 модифицированный посредством СТР, используются для лечения детей со значительной задержкой роста. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, используются для лечения детей с патологически низким ростом. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР изобретения, используются для
25 увеличения спортивных способностей. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР изобретения, используются для лечения симптомов старения. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР изобретения, используются для лечения косметических симптомов старения.
30 [070] В другом варианте воплощения изобретения лечение соматотропным гормоном детей, дефицитных по соматотропному гормону, приводит в результате к усилению роста, в то время как лечение соматотропным гормоном взрослых, дефицитных по соматотропному гормону, приводит в результате к увеличению безжировой массы тела и снижению или сокращению жира в организме. В другом варианте воплощения
35 изобретения лечение посредством форм GH, модифицированных СТР, приводит в
результате к усилению этих эффектов у детей и взрослых. В другом варианте воплощения изобретения лечение посредством hGH, модифицированного СТР, у детей, дефицитных по соматотропному гормону, приводит в результате к усилению роста по сравнению с детьми, дефицитными по соматотропному гормону, получающими такую же дозу 5 ежедневно коммерческого немодифицированного соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения лечение посредством hGH, модифицированным СТР, у детей приводит в результате к усилению роста по сравнению с детьми, получающими такую же дозу ежедневно коммерческого немодифицированного соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения лечение посредством hGH,
10 модифицированного СТР, у взрослых, дефицитных по соматотропному гормону, приводит в результате к увеличению безжировой массы тела и сокращению жира в организме по сравнению со взрослыми, получающими такую же дозу ежедневно коммерческого немодифицированного соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения лечение посредством hGH, модифицированного СТР, у взрослых
15 приводит в результате к увеличению безжировой массы тела и сокращению жира в организме по сравнению со взрослыми, получающими такую же дозу ежедневно коммерческого немодифицированного соматотропного гормона.
[071] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР изобретения, используются для усиления
20 образования молока у женщины. В другом варианте воплощения изобретения конъюгаты изобретения СТР/коровий соматотропный гормон используются для усиления выработки молока у молочного скота. В другом варианте воплощения изобретения конструкты изобретения СТР/соматотропный гормон животного используются в технологии животноводства. В другом варианте воплощения изобретения конструкты изобретения
25 СТР/соматотропный гормон сельскохозяйственного животного используются для усиления роста сельскохозяйственного животного, такого как свиньи, однако не ограничиваясь ими.
[072] В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР,
30 для стимулирования мышечного роста, повышения сердечной функции, стимулирования костного роста, поддержания целостности мышц, уравновешивания мышечного метаболизма, стимулирования наращивания мышц, стимулирования наращивания мышц de novo, усиления костной нагрузки, лечения симптомов, ассоциированных с остеопорозом, лечения вастинг-болезни, усиления липолиза, улучшения жидкостного
35 баланса, лечения остеопороза, улучшения легочной функции, усиления иммунитета,
повторного наращивания витального органа, увеличения ощущения благополучия, восстановление "быстрого" сна или любой комбинации такового. В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, для стимулирования мышечного 5 роста, повышения сердечной функции, стимулирования костного роста, поддержания целостности мышц, уравновешивания мышечного метаболизма, стимулирования наращивания мышц, стимулирования наращивания мышц de novo, усиления костной нагрузки, лечения симптомов, ассоциированных с остеопорозом, лечения вастинг-болезни, усиления липолиза, улучшения жидкостного баланса, лечения остеопороза, 10 улучшения легочной функции, усиления иммунитета, повторного наращивания витального органа, увеличения ощущения благополучия, восстановление "быстрого" сна или любой комбинации такового.
[073] В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют hGH, имеющий дополнительно по меньшей мере один аминокислотный
15 пептид СТР на N-конце и по меньшей мере один аминокислотный пептид СТР на С-конце, для лечения вастинг-болезни, СПИДа, кахексии или hGH-дефицита. В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР, для лечения вастинг-болезни, СПИДа, кахексии или hGH-дефицита.
20 [074] В некотором варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для лечения субъекта, пораженного состояниями, связанными с ростом и весом, такими как расстройство дефицита роста, вастинг-болезнь при СПИДе, старение, нарушенная функция иммунитета субъектов, инфицированных ВИЧ, катаболическая болезнь,
25 восстановление после операции, застойная кардиомиопатия, пересадка печени, регенерация печени после гепатэктомии, хроническая почечная недостаточность, почечная остеодистрофия, остеопороз, ахондроплазия/гипохондроплазия, скелетная дисплазия, хроническое воспалительное заболевание или нарушение питания, такое как болезнь Крона, синдром короткого кишечника, ювенильный хронический артрит,
30 кистозный фиброз, мужское бесплодие, гипофосфатемический рахит, связанный с X-хромосомой, синдром Дауна, вырожденная спинномозговая грыжа, синдром Нунан, ожирение, нарушение мышечной силы и фибромиалгия.
[075] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для лечения субъекта с 35 множественным склерозом. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды
соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для усиления потери веса у субъектов с ожирением. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для снижения жира тела у пациентов с ожирением. В другом 5 варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для повышения безжировой массы тела у субъекта. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для лечения субъекта, страдающего сердечной недостаточностью, язвенным колитом и 10 ожогами. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды соматотропного гормона человека настоящего изобретения могут быть использованы для наращивания мышечной массы.
[076] В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок
15 соматотропного гормона, как описывается здесь. В другом варианте воплощения изобретения способы настоящего изобретения предоставляют последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид, содержащий hGH, модифицированный СТР, для стимулирования мышечного роста, повышения сердечной функции, стимулирования костного роста, поддержания целостности мышц, уравновешивания
20 мышечного метаболизма, стимулирования наращивания мышц, стимулирования наращивания мышц de novo, усиления костной нагрузки, лечения симптомов, ассоциированных с остеопорозом, лечения вастинг-болезни, усиления липолиза, улучшения жидкостного баланса, лечения остеопороза, улучшения легочной функции, усиления иммунитета, повторного наращивания витального органа, увеличения
25 ощущения благополучия, восстановление "быстрого" сна или любой комбинации такового.
[077] В некоторых вариантах воплощения изобретения соматотропный гормон человека (hGH) используется в соответствии с идеями настоящего изобретения. В некоторых вариантах воплощения изобретения присоединение последовательности СТР как к 30 аминоконцу, так и к карбоксильному концу белка hGH приводит в результате к повышенной активности (Фигура 2). В некоторых вариантах воплощения изобретения присоединение последовательности СТР как к аминоконцу, так и к карбоксильному концу белка hGH приводит в результате к продлению активности in vivo.
[078] В некоторых вариантах воплощения изобретения "полипептид" или "белок", как 35 это используется здесь, охватывает нативные полипептиды (как продукты деградации, так
и синтетически синтезированные полипептиды или рекомбинантные полипептиды) и пептидомиметики (в основном синтетически синтезированные полипептиды) наряду с пептоидами и семипептоидами, которые являются аналогами полипептидов, имеющими, в некоторых вариантах воплощения изобретения, модификации, делающие полипептиды 5 даже более стабильными в организме или более способными к проникновению в клетки. [079] В некоторых вариантах воплощения изобретения модификации включают, но не ограничиваются этим, модификации N-конца, модификации С-конца, модификации полипептидной связи, включая, но не ограничиваясь этим, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=0, 0=C-NH, СН2-0, СН2-СН2, S=C-NH, СН=СН или CF=CH, модификации каркаса и
10 модификации остатка. Способы приготовления пептидомиметических соединений хорошо известны в данной области техники и указаны, например, в работе Quantitative Drug Design, С.А. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), которая включена в настоящую заявку посредством ссылки, как если бы полностью изложена здесь. Дальнейшие детали в этом отношении приводятся здесь ниже.
15 [080] В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи (-CO-NH-) в полипептиде замещены. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены N-метилированными связями (-N(CH3)-CO-). В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены сложноэфирными связями (-C(R)H-C-0-0-C(R)-N-). В некоторых вариантах воплощения
20 изобретения полипептидные связи замещены кетометиленовыми связями (-СО-СН2-). В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены а-аза связями (-NH-N(R)-CO-), в которых R представляет собой любой алкил, например, метил, углеродными связями (-CH2-NH-). В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены гидроксиэтиленовыми связями (-СН(ОН)-СН2-). В
25 некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены тиоамидными связями (-CS-NH-). В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены олефиновыми двойными связями (-СН=СН-). В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептидные связи замещены ретро-амидными связями (-NH-CO-). В некоторых вариантах воплощения изобретения
30 полипептидные связи замещены производными полипептида (-N(R)-CH2-CO-), в которых R является "нормальной" боковой цепью, в естественном виде представленной на атоме углерода. В некоторых вариантах воплощения изобретения эти модификации имеют место в любой из связей вдоль полипептидной цепи и даже в нескольких (2-3) связях в одно и то же время.
[081] В некоторых вариантах воплощения изобретения природные ароматические аминокислоты полипептида, такие как Тгр, Туг и Phe, замещены синтетическими неприродными кислотами, такими как фенилглицин, TIC, нафтилаланин (Nol), метилированные в ядро производные фенилаланина, галогенизированные производные 5 фенилаланина или о-метил-тирозин. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептиды настоящего изобретения включают одну или более модифицированных аминокислот или один или более мономеров, не относящихся к аминокислотам (например, жирная кислота, сложные углеводы и т.п.).
[082] В одном варианте воплощения изобретения "аминокислота" или "аминокислота", 10 как подразумевается, включает 20 встречающихся в природе аминокислот, эти аминокислоты часто модифицированы постгрансляционно in vivo, включая, например, гидроксипролин, фосфосерин и фосфотреонин, и другую необычную аминокислоту, включая, но не ограничиваясь этим, 2-аминоадипиновую кислоту, гидроксилизин, изодесмозин, норвалин, норлейцин и орнитин. В одном варианте воплощения изобретения 15 "аминокислота" включает как D-, так и L-аминокислоту.
[083] В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептиды настоящего изобретения используются в терапевтических средствах, которые требуют, чтобы полипептиды были в растворимой форме. В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептиды настоящего изобретения включают одну или более 20 неприродных или природных полярных аминокислот, включая, но не ограничиваясь этим, серии и треонин, которые способны увеличивать растворимость полипептидов благодаря их гидроксил-содержащей боковой цепи.
[084] В некоторых вариантах воплощения изобретения полипептиды, содержащие hGH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, используются в линейной 25 форме, хотя специалисту в данной области техники ясно, что в случаях, когда циклизация не оказывает значительного интерферирующего влияния на характеристики hGH, модифицированного посредством СТР, циклические формы соматотропных гормонов также могут быть использованы.
[085] В некоторых вариантах воплощения изобретения hGH, модифицированный 30 посредством СТР настоящего изобретения, биохимически синтезируются, например, путем использования стандартных твердофазных методик. В некоторых вариантах воплощения изобретения эти биохимические способы включают эксклюзивный твердофазный синтез, частичный твердофазный синтез, конденсацию фрагментов или классическое решение синтеза. В некоторых вариантах воплощения изобретения эти 35 способы используются, когда соматотропные гормоны относительно коротки
(приблизительно 5-15 кДа) и/или когда они не могут быть получены при помощи рекомбинантных техник (то есть не кодируются последовательностью нуклеиновой кислоты) и поэтому затрагивают другую химию.
[086] В некоторых вариантах воплощения изобретения методики твердофазного синтеза 5 hGH, модифицированного посредством СТР, хорошо известны специалисту в данной области техники и дополнительно описываются John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses (2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984). В некоторых вариантах воплощения изобретения синтетические полипептиды очищаются посредством препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии [Creighton 10 Т. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.], композиция которых может быть подтверждена путем секвенирования аминокислот способами, известными специалисту в данной области техники.
[087] В некоторых вариантах воплощения изобретения используются рекомбинантные белковые методики для создания hGH, модифицированного посредством СТР настоящего
15 изобретения. В некоторых вариантах воплощения изобретения рекомбинантные белковые методики используются для создания относительно длинных полипептидов (например, длиннее чем 18-25 аминокислот). В некоторых вариантах воплощения изобретения рекомбинантные белковые методики используются для создания больших количеств hGH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения. В некоторых вариантах
20 воплощения изобретения рекомбинантные методики описаны Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 and Brogli et al., (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 и Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology,
25 Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463.
[088] В другом варианте воплощения изобретения hGH, модифицированные посредством СТР настоящего изобретения, синтезируются с использованием полинуклеотида, кодирующего полипептид настоящего изобретения. В другом варианте воплощения изобретения полинуклеотид, кодирующий hGH, модифицированный посредством СТР
30 настоящего изобретения, лигирован в экспрессионный вектор, содержащий транскрипционный контроль цис-регуляторной последовательности (например, промоторной последовательности). В другом варианте воплощения изобретения цис-регуляторная последовательность применима для направления конститутивной экспрессии соматотропных гормонов настоящего изобретения. В другом варианте
35 воплощения изобретения цис-регуляторная последовательность применима для
направления тканеспецифической экспрессии hGH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения. В другом варианте воплощения изобретения цис-регуляторная последовательность применима для направления индуцибельной экспрессии hGH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения. 5 [089] В другом варианте воплощения изобретения тканеспецифические промоторы, пригодные для использования с настоящим изобретением, включают последовательности, которые являются функциональными в специфических клеточных популяциях, пример включает, но не ограничивается этим, промоторы, например, альбумин, который специфичен для печени [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], лимфоид-
10 специфические промоторы [Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; в частности, промоторы Т-клеточных рецепторов [Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] и иммуноглобулинов; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], нейрон-специфические промоторы, например, промотор нейрофиламентов [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], промоторы, специфические для поджелудочной железы [Edlunch
15 et al. (1985) Science 230:912-916], или промоторы, специфические для молочной железы, например, промотор молочной сыворотки (U.S. Pat. No. 4873316 и European Application Publication No. 264166). Индуцибельные промоторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают, например, тетрациклин-индуцибельный промотор (Srour, М.А., et al., 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
20 [090] В одном варианте воплощения изобретения термин "полинуклеотид" относится к однонитчатой или двунитчатой последовательности нуклеиновой кислоты, которая изолируется и предоставляется в форме РНК последовательности, комплементарной полинуклеотидной последовательности (кДНК), геномной полинуклеотидной последовательности и/или многокомпонентных полинуклеотидных последовательностей
25 (например, комбинация вышеуказанных).
[091] В одном варианте воплощения изобретения "комплементарная полинуклеотидная последовательность" относится к последовательности, которая является результатом обратной транскрипции информационной РНК с использованием обратной транскриптазы или любой другой РНК-зависимой ДНК-полимеразы. В одном варианте воплощения
30 изобретения последовательность может быть впоследствии амплифицирована in vivo или in vitro с использованием ДНК-полимеразы.
[092] В одном варианте воплощения изобретения "геномная полинуклеотидная последовательность" относится к последовательности, происходящей (изолированной) из хромосомы, и, таким образом, она представляет собой непрерывную часть хромосомы.
[093] В одном варианте воплощения изобретения "многокомпонентная полинуклеотидная последовательность" относится к последовательности, которая, по меньшей мере частично, комплементарна и, по меньшей мере частично, является геномной. В одном варианте воплощения изобретения многокомпонентная 5 последовательность может включать некоторые экзонные последовательности, необходимые для кодирования полипептида настоящего изобретения, наряду с некоторыми вклинивающимися интронными последовательностями. В одном варианте воплощения изобретения интронные последовательности могут быть из любого источника, включая другие гены, и, в основном, будут включать консервативные 10 сплайсинговые сигнальные последовательности. В одном варианте воплощения изобретения интронные последовательности включают цис-действующие регуляторные элементы экспрессии.
[094] В другом варианте воплощения изобретения полинуклеотиды настоящего изобретения получают с использованием методик ПЦР, как описано в Примере 1, или 15 любым другим способом, известным специалисту в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения изобретения методика включает лигирование двух различных ДНК последовательностей (см., например, "Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
[095] В одном варианте воплощения изобретения полинуклеотиды настоящего 20 изобретения вставлены в экспрессионные векторы (т.е. в конструкт нуклеиновой кислоты) для обеспечения возможности экспрессии рекомбинантного полипептида. В одном варианте воплощения изобретения экспрессионный вектор настоящего изобретения включает дополнительные последовательности, которые делают этот вектор подходящим для репликации и интегрирования в прокариоты. В одном варианте воплощения 25 изобретения экспрессионный вектор настоящего изобретения включает дополнительные последовательности, которые делают этот вектор подходящим для репликации и интегрирования в эукариоты. В одном варианте воплощения изобретения экспрессионный вектор настоящего изобретения включает шаттл-вектор, который делает этот вектор подходящим для репликации и интегрирования как в прокариоты, так и в эукариоты. В 30 другом варианте воплощения изобретения клонирующие векторы содержат последовательности для инициации транскрипции и трансляции (например, промоторы, энхансеры) и терминаторы транскрипции и трансляции (например, сигналы полиаденилирования).
[096] В одном варианте воплощения изобретения могут использоваться разнообразные 35 прокариотические и эукариотические клетки в качестве экспрессионных систем хозяина
для экспрессии hGH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения. В некоторых вариантах воплощения изобретения они включают, но не ограничиваются этим, микроорганизмы, например, бактерию, трансформированную рекомбинантной ДНК бактериофага, экспрессионный вектор плазмидной ДНК или космидной ДНК, 5 содержащий последовательность, кодирующую полипептид, дрожжи, трансформированные рекомбинантными дрожжевыми экспрессионными векторами, содержащими последовательность полипептид системы растительных клеток, инфицированных рекомбинантными вирусными экспрессионными векторами (например, вирусом мозаики цветной капусты (cauliflower mosaic virus, CaMV); вирусом табачной 10 мозаики (tobacco mosaic virus, TMV)) или трансформированных рекомбинантными плазмидными экспрессионными векторами, такими как Ti-плазмида, содержащая последовательность, кодирующая полипептид.
[097] В другом варианте воплощения изобретения используются небактериальные экспрессионные системы (например, экспрессионные системы млекопитающих,
15 например, клетки СНО) для экспрессии соматотропных гормонов настоящего изобретения. В одном варианте воплощения изобретения экспрессионным вектором, используемым для экспрессии полинуклеотидов настоящего изобретения в клетках млекопитающих, является вектор pCI-DHFR, содержащий промотор CMV и ген устойчивости к неомицину. Конструкция вектора pCI-dhfr описана, в соответствии с
20 одним вариантом воплощения изобретения, в Примере 1.
[098] В другом варианте воплощения изобретения в бактериальных системах настоящего изобретения ряд экспрессионных векторов может быть предпочтительно отобран в зависимости от предусмотренного применения экспрессируемого полипептида. В одном варианте воплощения изобретения желательными являются большие количества
25 полипептида. В одном варианте воплощения изобретения желательными являются векторы, направляющие экспрессию высоких уровней белкового продукта, возможно, в слиянии с гидрофобной сигнальной последовательностью, направляющей экспрессируемый продукт в периплазму бактерии или культуральную среду, где белковый продукт легко очищается. В одном варианте воплощения изобретения конструируется
30 определенный белок слияния со специфическим участком рестрикции для помощи в выделении полипептида. В одном варианте воплощения изобретения векторы, адаптируемые к таким манипуляциям, включают, но не ограничиваются этим, экспрессионные векторы серии рЕТ Е. coli [Studier et al., Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
[099] В одном варианте воплощения изобретения используются экспрессионные системы дрожжей. В одном варианте воплощения изобретения ряд векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, могут быть использованы на дрожжах, как это раскрывается в заявке на патент США № 5932447. В другом варианте воплощения 5 изобретения используются векторы, которые способствуют интеграции чужеродных последовательностей ДНК в хромосому дрожжей.
[0100] В одном варианте воплощения изобретения экспрессионный вектор настоящего изобретения дополнительно может включать дополнительные полинуклеотидные последовательности, которые обеспечивают, например, трансляцию нескольких белков из 10 единичной мРНК, таких как участок внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site - IRES) и последовательности для интеграции генома промотор-гибридного полипептида.
[0101] В другом варианте воплощения изобретения экспрессионные векторы млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, 15 pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMTl, pNMT41, pNMT81, которые доступны от Invitrogen, pCI, который доступен от Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV и pBK-CMV, которые доступны от Strategene, pTRES, который доступен от Clontech, и их производные.
[0102] В другом варианте воплощения изобретения в настоящем изобретении
20 используются экспрессионные векторы, содержащие регуляторные элементы от эукариотических вирусов, например, ретровирусы. Векторы SV40 включают pSVT7 и рМТ2. В некоторых вариантах воплощения изобретения векторы, полученные от вируса папилломы крупного рогатого скота, включают pBV-lMTHA, и векторы, полученные из вируса Эпштейна-Барр, включают рНЕВО и р205. Другие примерные векторы включают
25 pMSG, pAV009/A+, рМТО10/А+, рМАМпео-5, бакуловирусный pDSVE и любой другой вектор, обеспечивающий экспрессию белков под направлением раннего промотора SV-40, позднего промотора SV-40, металлотионеинового промотора, промотора мышиного вируса опухоли молочных желез, промотора вируса саркомы Рауса, полиэдринового промотора или других промоторов, у которых была продемонстрирована эффективность
30 экспрессии в эукариотических клетках.
[0103] В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантные вирусные векторы пригодны для экспрессии in vivo GH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения, так как они предоставляют преимущества, такие как латеральная инфекция или специфичность таргетинга. В одном варианте воплощения изобретения латеральная
35 инфекция присуща жизненному циклу, например, ретровируса, и является процессом,
посредством которого единичная инфицированная клетка продуцирует много вирионов потомства, которые отпочковываются и инфицируют окружающие клетки. В другом варианте воплощения изобретения результатом является большая зона, которая быстро становится инфицированной, большая часть которой не была изначально инфицирована 5 первоначальными вирусными частицами. В одном варианте воплощения изобретения получают вирусные векторы, которые не способны распространяться латерально. В другом варианте воплощения изобретения эта характеристика может быть полезной, если желаемой целью является введение специфического гена только в локализованное число клеток-мишеней.
10 [0104] В другом варианте воплощения изобретения могут использоваться различные способы для введения в клетки экспрессионного вектора настоящего изобретения. Такие способы повсеместно описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene
15 Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) и Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986], и включают, например, стабильную или временную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфекцию рекомбинантными вирусными векторами. В дополнение см.
20 патенты США под номерами 5464764 и 5487992 в отношении способов позитивной-негативной селекции.
[0105] В другом варианте воплощения изобретения введение нуклеиновой кислоты посредством вирусной инфекции дает несколько преимуществ над другими способами, например, липофекцией и электропорацией, так как, благодаря инфекционной природе
25 вирусов, может быть достигнута более высокая эффективность трансфекции.
[0106] В одном варианте воплощения изобретения следует понимать, что GH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, также может быть экспрессирован из конструкта нуклеиновой кислоты, введенного индивидууму с использованием любого подходящего способа введения, описанного здесь выше (т.е.
30 генной терапии in vivo). В одном варианте воплощения изобретения конструкт нуклеиновой кислоты вводится в подходящую клетку посредством соответствующего носителя/способа доставки гена (трансфекция, трансдукция, гомологичная рекомбинация и так далее) и необходимой экспрессионной системы, и затем модифицированные клетки размножаются в культуре и возвращаются индивидууму (т.е. генная терапия ex vivo).
[0107] В одном варианте воплощения изобретения генная терапия in vivo с использованием соматотропного гормона была проведена на моделях у животных. [0108] В одном варианте воплощения изобретения используются экспрессионные векторы растений. В одном варианте воплощения изобретения экспрессия последовательности, 5 кодирующей полипептид, запускается рядом промоторов. В некоторых вариантах воплощения изобретения используются вирусные промоторы, например, промоторы 35S РНК и 19S РНК CaMV [Brisson et al., Nature 310:511-514 (1984)] или промоторы козьего белка к TMV [Takamatsu et al., EMBO J. 6:307-311 (1987)]. В другом варианте воплощения изобретения используются растительные промоторы, например, малая субъединица
10 RUBISCO [Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); и Brogli et al., Science 224:838-843 (1984)], или промоторы теплового шока, например, соевый hspl7.5-E или hspl7.3-B [Gurley et al., Mol. Cell. Biol. 6:559-565 (1986)]. В одном варианте воплощения изобретения конструкты вводятся в клетки растений путем использования Ti-плазмиды, Ri-плазмиды, векторов вирусов растений, прямой трансформации ДНК, микроинъекции,
15 электропорации и другими методами, хорошо известными специалисту в данной области техники. См., например, Weissbach & Weissbach [Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463 (1988)]. Другие экспрессионные системы, например, системы клеток- хозяина насекомых и млекопитающих, которые хорошо известны в данной области техники, также могут быть использованы настоящим
20 изобретением.
[0109] Следует понимать, что экспрессионные конструкты настоящего изобретения, отличные от содержащих необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности (кодирующей полипептид), также могут включать последовательности, сконструированные, чтобы оптимизировать стабильность,
25 получение, очистку, выход или активность экспрессируемого полипептида.
[ОНО] В некоторых вариантах воплощения изобретения могут использоваться различные методы для введения экспрессионного вектора настоящего изобретения в систему клетки-хозяина. В некоторых вариантах воплощения изобретения такие методы в целом описаны в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory,
30 New York (1989, 1992), в Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) и Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986], и включают, например, стабильную или
35 временную трансфекцию, липофекцию, электропорацию и инфекцию рекомбинантными
вирусными векторами. В дополнение см. патенты США под номерами 5464764 и 5487992 в отношении методов позитивной-негативной селекции.
[0111] В одном варианте воплощения изобретения трансформированные клетки культивируются в эффективных условиях, которые обеспечивают экспрессию больших 5 количеств рекомбинантного полипептида. В другом варианте воплощения изобретения эффективные условия культивирования включают, но не ограничиваются этим, эффективные среды, биореактор, температуру, рН и условия кислорода, позволяющие вырабатывать белок. В одном варианте воплощения изобретения эффективная среда относится к любой среде, на которой культивируются клетки для получения
10 рекомбинантного полипептида настоящего изобретения. В другом варианте воплощения изобретения среда обычно включает водный раствор, имеющий усвояемые источники углерода, азота и фосфата, а также соответствующие соли, минералы, металлы и другие питательные вещества, такие как витамины. В другом варианте воплощения изобретения клетки настоящего изобретения могут культивироваться в традиционных
15 ферментационных биореакторах, флаконах со встряхиванием, тестовых пробирках, микротитровальных планшетах и чашках Петри. В другом варианте воплощения изобретения культивирование производится при температуре, рН и содержании кислорода, подходящих для рекомбинантных клеток. В другом варианте воплощения изобретения условия культивирования находятся в компетенции обычного специалиста в
20 данной области техники.
[0112] В другом варианте воплощения изобретения, в зависимости от вектора и системы-хозяина, используемых для продуцирования, получаемые в результате соматотропные гормоны настоящего изобретения либо остаются в рекомбинантной клетке, секретируются в ферментационную среду, секретируются в пространство между двумя
25 клеточными мембранами, такое как периплазматическое пространство в Е. coli; либо удерживаются на внешней поверхности клетки или вирусной мембраны. [0113] В одном варианте воплощения изобретения после заранее определенного времени в культуре осуществляется высвобождение рекомбинантного полипептида. [0114] В одном варианте воплощения изобретения фраза "высвобождение
30 рекомбинантного полипептида", используемая здесь, относится к сбору всей ферментационной среды, содержащей полипептид и не обязательно подразумевает дополнительные этапы сепарации или очистки.
[0115] В одном варианте воплощения изобретения соматотропные гормоны настоящего изобретения очищаются с использованием разнообразных стандартных методик очистки 35 белка, таких как аффинная хроматография, ионно-обменная хроматография, фильтрация,
электрофорез, хроматография с гидрофобными взаимодействиями, гель-фильтрационная хроматография, обращенно-фазовая хроматография, хроматография с конканавалином А, хроматофокусирование и дифференциальная солюбилизация.
[0116] В одном варианте воплощения изобретения для содействия выходу может быть 5 сконструирована экспрессируемая кодирующая последовательность, кодирующая полипептид настоящего изобретения и полученную путем слияния расщепляемую функциональную группу. В одном варианте воплощения изобретения белок слияния может быть сконструирован таким образом, что полипептид может быть легко изолирован методом аффинной хроматографии, например, путем иммобилизации на колонке,
10 специфической для расщепляемой функциональной группы. В одном варианте воплощения изобретения участок расщепления сконструирован между полипептидом и расщепляемой функциональной группой, и полипептид может быть выделен из хроматографической колонки путем обработки соответствующим ферментом или агентом, который специфически расщепляет белок слияния в этом участке [например, см.
15 Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); и Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
[0117] В одном варианте воплощения изобретения полипептид настоящего изобретения извлекается в "по существу чистой" форме.
[0118] В одном варианте воплощения изобретения фраза "по существу чистый" относится 20 к чистоте, которая позволяет эффективно использовать белок в применениях, описываемых здесь.
[0119] В одном варианте воплощения изобретения полипептид настоящего изобретения также может быть синтезирован с использованием экспрессионных систем in vitro. В одном варианте воплощения изобретения методы синтеза in vitro хорошо известны в 25 данной области техники, а компоненты системы являются коммерчески доступными.
[0120] В одном варианте воплощения изобретения продуцирование GH, модифицированного посредством СТР, выполняется с использованием технологии рекомбинантной ДНК.
[0121] В другом варианте воплощения изобретения рекомбинантные полипептиды 30 синтезируются и очищаются, их терапевтическая активность может быть протестирована как in vivo, так и in vitro. В одном варианте воплощения изобретения связывающие активности рекомбинантного GH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения, могут быть подтверждены с использованием разнообразных тестов. [0122] В одном варианте воплощения настоящее изобретение содержит полипептиды 35 CTP-hGH-CTP-CTP. В одном варианте воплощения изобретения используются методы
технологии рекомбинантной ДНК для получения полипептидов CTP-hGH-CTP-CTP, как проиллюстрировано в Примере 1. В одном варианте воплощения изобретения терапевтическая эффективность полипептидов CTP-hGH-CTP-CTP настоящего изобретения тестируется in vivo. В одном варианте воплощения изобретения 5 терапевтическая эффективность полипептидов CTP-hGH-CTP-CTP настоящего изобретения тестируется in vitro. В одном варианте воплощения изобретения связывающие активности рекомбинантных полипептидов hGH настоящего изобретения измеряются с использованием Nb2 (пролактин-зависимая клеточная линия лимфомы крыс (ЕСАСС Cell Bank) или мышиной клеточной линии FCD-P1, предварительно
10 трансфицированной рецептором соматотропного гормона человека. В одном варианте воплощения изобретения связывание hGH с этими рецепторами индуцирует клеточную пролиферацию, которая, в одном варианте воплощения изобретения, измеряется по уровням клеточного окрашивания МТТ как функции активности hGH. В одном варианте воплощения изобретения активность in vivo выводится путем измерения прибавки веса в
15 течение времени у леченных животных, дефицитных по соматотропному гормону.
[0123] В одном варианте воплощения изобретения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования роста или прибавки веса у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом стимулируя рост или прибавку веса у субъекта. [0124] В другом варианте воплощения изобретения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования роста у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина,
20 присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом стимулируя рост у указанного субъекта. В одном варианте воплощения изобретения указанным человеком является подросток. В другом варианте воплощения изобретения человеком является ребенок. В другом варианте
25 воплощения изобретения человеком является ребенок, дефицитный по соматотропному гормону.
[0125] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования прибавки веса у человека, включающий введение указанному субъекту
терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного 5 соматотропного гормона, таким образом стимулируя прибавку веса у указанного субъекта. В одном варианте воплощения изобретения указанным человеком является подросток. В другом варианте воплощения изобретения человеком является ребенок. В другом варианте воплощения изобретения человеком является ребенок, дефицитный по соматотропному гормону.
10 [0126] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования потери веса или снижения телесного жира у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного
15 соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом стимулируя потерю веса или снижение телесного жира у указанного субъекта. В одном варианте воплощения изобретения указанный субъект страдает ожирением. В другом варианте воплощения изобретения субъект страдает избыточным весом. В другом варианте
20 воплощения изобретения человеком является взрослый. В другом варианте воплощения изобретения человеком является взрослый, дефицитный по соматотропному гормону. [0127] В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ снижения отложений жира у субъекта. В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ увеличения мышечной массы у субъекта. В другом
25 варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ стимулирования мышечного роста у субъекта. В другом варианте воплощения изобретения человеком является взрослый. В другом варианте воплощения изобретения человеком является взрослый, дефицитный по соматотропному гормону. В другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ увеличения соотношения мышц к жиру. В
30 другом варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ снижения индекса массы тела (ИМТ) или индекса Кетле.
[0128] В другом варианте воплощения изобретения здесь предоставляется способ стимулирования роста у субъекта, включающий введение субъекту соматотропного гормона, модифицированного посредством СТР, как описано здесь. В одном варианте 35 воплощения изобретения соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР,
напрямую вводится субъекту, в то время как в другом варианте воплощения изобретения субъекту вводится полинуклеотид, кодирующий указанный соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР. В другом варианте воплощения изобретения здесь предоставляется способ стимулирования роста у субъекта, включающий введение 5 субъекту композиции, состоящей из известных вспомогательных веществ, известных носителей и полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона. В другом варианте воплощения
10 изобретения здесь предоставляется способ стимулирования роста у субъекта, включающий введение субъекту композиции, состоящей из известных вспомогательных веществ, известных носителей и полипептида, состоящего из соматотропного гормона, одного карбоксиконцевого пептида (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенного к аминоконцу соматотропного гормона, и двух СТР хорионического
15 гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона.
[0129] В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой веса. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой роста. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой веса. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой мышечной массы. В другом варианте
20 воплощения изобретения рост измеряется прибавкой веса. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой костной массы. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой веса. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется прибавкой жира. В другом варианте воплощения изобретения рост измеряется любой известной мерой, известной специалисту в данной области техники. В
25 другом варианте воплощения изобретения субъектом, у которого измеряется рост, является ребенок. В другом варианте воплощения изобретения субъектом, у которого измеряется рост, является ребенок, дефицитный по соматотропному гормону. [0130] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, вводятся в дозе 1-90
30 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 150 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 125 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте воплощения изобретения
35 полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе
50-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 10-50 микрограмм в 0,1-5 мл раствора.
[0131] В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, 5 модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (ВМ) инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции один раз в неделю. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (ВМ)
10 инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции два раза в неделю. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (ВМ) инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции три раза в неделю. В другом варианте воплощения
15 изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (ВМ) инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции один раз в две недели. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл
20 раствора путем внутримышечной (ВМ) инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции один раз в 17 дней. В другом варианте воплощения изобретения полипептиды, включающие GH, модифицированный посредством СТР, вводятся в дозе 1-90 микрограмм в 0,1-5 мл раствора путем внутримышечной (ВМ) инъекции, подкожной (ПК) инъекции или внутривенной (ВВ) инъекции один раз в 19 дней
[0132] В другом варианте воплощения изобретения белковые препараты с молекулярным весом менее 50000 дальтон, такие как GH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, в основном, являются короткоживущими in vivo видами, имеющими короткий полупериод жизни в кровообращении, составляющий несколько 30 часов. В другом варианте воплощения изобретения, подкожный способ введения, в основном, предоставляет более медленное высвобождение в кровообращение. В другом варианте воплощения изобретения полипептид изобретения, модифицированный СТР, продлевает полупериод жизни белковых препаратов с молекулярным весом ниже 50000 дальтон, таких как GH. В другом варианте воплощения изобретения полипептид
изобретения, модифицированный СТР, обеспечивает возможность GH оказывать свое благотворное влияние в течение более длительного периода времени. [0133] В другом варианте воплощения изобретения иммуногенность полипептида, модифицированного СТР, содержащего GH, модифицированный посредством СТР, равна 5 иммуногенности изолированного GH. В другом варианте воплощения изобретения иммуногенность полипептида, модифицированного СТР, содержащего GH, модифицированный посредством СТР, сопоставима с иммуногенностью изолированного GH. В другом варианте воплощения изобретения модификация GH, как описано здесь, посредством СТР пептидов снижает иммуногенность GH. В другом варианте воплощения
10 изобретения полипептид, модифицированный СТР, содержащий GH, такой же активный, как и изолированный белок GH. В другом варианте воплощения изобретения полипептид, модифицированный СТР, содержащий GH, более активный, чем изолированный GH. В другом варианте воплощения изобретения полипептид, модифицированный СТР, содержащий GH, максимизирует протективное свойство соматотропных гормонов в
15 отношении деградации, при этом минимизируя снижения биологической активности.
[0134] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, предоставляется индивидууму per se. В одном варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, предоставляется индивидууму как часть фармацевтической композиции, где
20 он смешан с фармацевтически приемлемым носителем.
[0135] В другом варианте воплощения изобретения "фармацевтическая композиция" относится к препарату из одного или более активных ингредиентов, описываемых здесь, с другими компонентами, такими как физиологически подходящие носители и вспомогательные вещества. Цель фармацевтической композиции состоит в том, чтобы
25 способствовать введению соединения в организм.
[0136] В другом варианте воплощения изобретения "активный ингредиент" относится к полипептидной целевой последовательности, которая отвечает за биологический эффект. [0137] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет комбинированные препараты. В одном варианте воплощения изобретения
30 "комбинированный препарат" определяет, главным образом, "набор частей" в том смысле, что партнеры комбинации, как это определено выше, могут дозироваться независимо или путем использования различных фиксированных комбинаций с выделенным количеством партнеров комбинации, то есть совместно, одновременно, раздельно или последовательно. В другом варианте воплощения изобретения части набора частей могут затем, например, быть
35 введенными совместно или разнесенными во времени, то есть в различные временные точки
и с равными или различными временными интервалами для любой части набора частей. Соотношение общих количеств партнеров комбинации может быть введено в комбинированном препарате. Комбинированный препарат может изменяться, например, с целью покрыть потребности субпопуляции пациентов, которых предстоит лечить, или с 5 целью покрыть потребности одного пациента, различные потребности которого могут быть связаны с конкретным заболеванием, тяжестью заболевания, возрастом, полом или весом тела, как это легко может быть сделано специалистом в данной области техники. [0138] В другом варианте воплощения изобретения фразы "физиологически приемлемый носитель" и "фармацевтически приемлемый носитель", которые используются здесь
10 взаимозаменяемо, относятся к носителю или разбавителю, который не вызывает значительного раздражения в организме и не отменяет биологической активности или свойств вводимого соединения. Под этими фразами включен адъювант. В одном варианте воплощения изобретения один из ингредиентов, включенных в фармацевтически приемлемый носитель, может быть, например, полиэтилен гликолем (ПЭГ),
15 биосовместимым полимером с широким диапазоном растворимости как в органических, так и в водных средах (Mutter et al. (1979).
[0139] В другом варианте воплощения изобретения "вспомогательное вещество" относится к инертной субстанции, добавленной к фармацевтической композиции, чтобы дополнительно способствовать введению активного ингредиента. В одном варианте 20 воплощения изобретения вспомогательные вещества включают кальция карбонат, кальция фосфат, различные сахара и типы крахмала, производные целлюлозы, желатин, растительные масла и полиэтилен гликоли.
[0140] Методики для составления рецептуры и введения препаратов находятся в "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, последнее издание,
25 которое включено сюда посредством ссылки.
[0141] В другом варианте воплощения изобретения подходящие пути введения,
например, включают оральную, ректальную, трансмукозальную, трансназальную, кишечную или парентеральную доставку, включая внутримышечные, подкожные или внутримозговые инъекции, наряду с интратекальными, прямыми интравентрикулярными,
30 внутривенными, внутрибрюшинными, интраназальными или интраокулярными инъекциями. [0142] В другом варианте воплощения изобретения препарат вводится скорее локальным, чем системным образом, например, через инъекцию препарата напрямую в конкретный участок тела пациента.
[0143] Данным изобретением рассматриваются различные варианты воплощения 35 диапазонов дозировки. Дозировка GH, модифицированного посредством СТР настоящего
изобретения, в одном варианте воплощения изобретения находится в диапазоне 0,005-100 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,005-5 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-50 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится 5 в диапазоне 0,1-20 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-5 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,01 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,1 мг/день. В другом 10 варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,2-15 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,8-65 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-50 15 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 8-15 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 10-20 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 20-40 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 6020 120 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 12-40 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 50-100 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-60 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в 25 диапазоне 15-25 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-5 мг/день.
[0144] Дозировка GH, модифицированного посредством СТР настоящего изобретения, в 30 одном варианте воплощения изобретения находится в диапазоне 0,005-100 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,005-5 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-50 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,05-7,2 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка 35 находится в диапазоне 0,05-7,2 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения
дозировка находится в диапазоне 0,05-7,2 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-20 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-10 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,01-5 мг/неделю. В 5 другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,01 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,001-0,1 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,1-5 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,5-50 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения
10 дозировка находится в диапазоне 0,2-15 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,26-10,7 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 0,8-65 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-50 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 5-10 мг/неделю.
15 В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 8-15 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 10-20 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 20-40 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 60-120 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения
20 дозировка находится в диапазоне 12-40 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 40-60 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 50-100 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-60 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 15-25
25 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 510 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 55-65 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 1-5 мг/неделю.
[0145] В другом варианте воплощения изобретения дозировка GH, предоставляемая 30 субъекту, составляет 50% стандартной дозировки, предоставляемой референтному субъекту из одной и той же популяции субъектов (например, дети, пожилые люди, мужчины, женщины, индивидуумы, дефицитные по соматотропному гормону, конкретной национальности и т.п.). В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 30% дозировки, предоставляемой субъекту из специфической популяции субъектов. В 35 другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 45% дозировки,
предоставляемой субъекту из специфической популяции субъектов. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 100% от дозировки, предоставляемой субъекту из специфической популяции субъектов.
[0146] В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-5 мг/неделю. В 5 другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 2 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 4 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1,2 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1,8 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет приблизительно дозировки, описываемые 10 здесь.
[0147] В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-5 мг/введение. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 2 мг/введение. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 4 мг/введение. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1,2 мг/введение. В другом варианте
15 воплощения изобретения дозировка составляет 1,8 мг/введение. В одном варианте воплощения изобретения композиция вводится один раз в неделю. В другом варианте воплощения изобретения композиция вводится один раз в две недели. В другом варианте воплощения изобретения композиция вводится один раз в месяц. В другом варианте воплощения изобретения композиция вводится ежедневно.
20 [0148] В другом варианте воплощения изобретения рецептура GH, модифицированного посредством СТР, разрабатывается в интраназальной лекарственной форме. В другом варианте воплощения изобретения рецептура GH, модифицированного посредством СТР, разрабатывается в инъецируемой лекарственной форме. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом
25 диапазоне от 0,0001 мг до 0,6 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 0,001 мг до 0,005 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 0,005 мг до 0,01 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР,
30 вводится субъекту в дозовом диапазоне от 0,01 мг до 0,3 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 0,2 мг до 0,6 мг.
[0149] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 1-100 микрограмм. В другом варианте 35 воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в
дозовом диапазоне 10-80 микрограмм. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 20-60 микрограмм. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 10-50 микрограмм. В другом 5 варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 40-80 микрограмм. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 10-30 микрограмм. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне 30-60 10 микрограмм.
[0150] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 0,2 мг до 2 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 2 мг до 6 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, 15 модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 4 мг до 10 мг. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту в дозовом диапазоне от 5 мг до 15 мг.
[0151] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, инъецируется в мышцу (внутримышечная инъекция). В другом варианте 20 воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится под кожу (подкожная инъекция). В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, инъецируется в мышцу. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится под кожу. [0152] В другом варианте воплощения изобретения способы изобретения включают повышение приверженности к использованию терапии соматотропным гормоном, включающие предоставление нуждающемуся в этом субъекту GH, модифицированного посредством СТР, таким образом повышая приверженность к использованию терапии соматотропным гормоном.
[0153] В другом варианте воплощения изобретения способы изобретения включают 25 повышение приверженности к лечению пациентов, пораженных хроническими заболеваниями, которые нуждаются в терапии соматотропным гормоном. В другом варианте воплощения изобретения способы изобретения обеспечивают возможность снижения частоты дозирования GH путем модификации GH посредством СТР, как описано здесь выше. В другом варианте воплощения изобретения термин приверженность 30 к лечению включает соблюдение предписанного режима терапии. В другом варианте
воплощения изобретения способы изобретения включают повышение приверженности к лечению пациентов, нуждающихся в терапии соматотропным гормоном, путем снижения частоты введения GH. В другом варианте воплощения изобретения снижение частоты введения GH достигается благодаря модификациям СТР, которые делают GH, 5 модифицированный посредством СТР, более стабильным. В другом варианте воплощения изобретения снижение частоты введения GH достигается в результате повышения Т1/2 соматотропного гормона. В другом варианте воплощения изобретения снижение частоты введения GH достигается в результате повышения времени клиренса GH. В другом варианте воплощения изобретения снижение частоты введения соматотропного гормона 10 достигается в результате повышения величины AUC соматотропного гормона.
[0154] Таким образом, в другом варианте воплощения настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ улучшения "площади под кривой" (AUC) соматотропного гормона, включающий этап присоединения одного карбоксиконцевого пептида хорионического гонадотропина к аминоконцу соматотропного гормона и двух карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом улучшая "площадь под кривой" (AUC) соматотропного гормона.
[0155] Таким образом, в другом варианте воплощения настоящее изобретение дополнительно предоставляет способ снижения частоты дозирования соматотропного гормона, включающий этап присоединения одного карбоксиконцевого пептида хорионического гонадотропина к аминоконцу соматотропного гормона и двух карбоксиконцевых пептидов хорионического гонадотропина к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом снижая частоту дозирования соматотропного гормона.
[0156] Таким образом, в другом варианте воплощения изобретения настоящее изобретение предоставляет способ повышения приверженности в использовании терапии соматотропным гормоном у нуждающихся в ней субъектов, включающий предоставление указанному субъекту полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два карбоксиконцевых пептида хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом увеличивая приверженность в использовании терапии соматотропным гормоном. В одном варианте воплощения изобретения указанный субъект является человеком. [0157] В другом варианте воплощения изобретения настоящее изобретение предоставляет способ повышения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) у человека,
включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу соматотропного гормона, таким образом увеличивая уровни IGF-1 у указанного субъекта. В другом варианте воплощения изобретения способы повышения уровней IGF-1 предоставлены в Примере 6, как указано ниже.
[0158] В другом варианте воплощения изобретения настоящее изобретение предоставляет способ повышения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) до желаемого терапевтического диапазона у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом увеличивая уровни IGF-1 до желаемого терапевтического диапазона у субъекта. В другом варианте воплощения изобретения человеком является взрослый. В другом варианте воплощения изобретения человеком является взрослый, дефицитный по соматотропному гормону. В другом варианте воплощения изобретения человеком является нормальный взрослый. В другом варианте воплощения изобретения способы повышения уровней IGF-1 до желаемого терапевтического уровня представлены в Примере 9, как указано ниже.
[0159] В одном варианте воплощения настоящее изобретение предоставляет способ поддержания уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) в нормальном терапевтическом диапазоне у субъекта, способ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный
5 гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом поддерживая уровни IGF-I в нормальном терапевтическом диапазоне у субъекта. В другом варианте воплощения изобретения способы поддержания
10 уровней IGF-1 на нормальном терапевтическом уровне предоставлены в Примере 9, как указано ниже.
[0160] В одном варианте воплощения изобретения повышение уровней IGF-1 у человека может быть эффективным в лечении, профилактике или подавлении диабета 1-го типа, диабета 2-го типа, амиотрофического бокового склероза (АБС, известный также под
именем "болезнь Лу Герига"), тяжелого ожогового повреждения и миотонической мышечной дистрофии (ММД). В другом варианте воплощения изобретения поддержание уровней IGF-1 в нормальном терапевтическом диапазоне у человека может быть эффективным в лечении, профилактике или подавлении диабета 1-го типа, диабета 2-го типа, амиотрофического бокового склероза (АБС, известный также под именем "болезнь Лу Герига"), тяжелого ожогового повреждения и миотонической мышечной дистрофии (ММД).
[0161] В одном варианте воплощения изобретения желаемый терапевтический диапазон определяется как находящийся в пределах +/- 2 стандартные отклонения вплоть до минус 2 стандартных отклонений от средних уровней IGF-1, рассчитанных в нормальной популяции, стратифицированной на группы по возрасту и полу, как дополнительно здесь предоставляется ниже (см. Пример 9). В дополнение клиническое исследование измеряло уровни IGF-1 в более узком диапазоне, составляющем +/- 1,5 стандартных отклонений, с целью наблюдения разброса у пациентов в пределах нормального диапазона (см. Пример 9, как указано ниже).
[0162] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в день. В другом варианте воплощения изобретения полипептид, включающий соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в два дня. В другом варианте воплощения изобретения GH, 5 модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в три дня. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в четыре дня. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в пять дней. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится 10 субъекту один раз в шесть дней. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в неделю. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в 7-14 дней. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в 10-20 дней. В другом 15 варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в 5-15 дней. В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится субъекту один раз в 15-30 дней. [0163] В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 50-500 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 5020 150 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне
100-200 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 150-250 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 200-300 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 250-400 мг/день. В другом варианте воплощения 5 изобретения дозировка находится в диапазоне 300-500 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка находится в диапазоне 350-500 мг/день. [0164] В одном варианте воплощения изобретения дозировка составляет 20 мг/день. В одном варианте воплощения изобретения дозировка составляет 30 мг/день. В одном варианте воплощения изобретения дозировка составляет 40 мг/день. В одном варианте
10 воплощения изобретения дозировка составляет 50 мг/день. В одном варианте воплощения изобретения дозировка составляет 0,01 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 0,1 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 0,530 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения
15 дозировка составляет 0,05 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 50 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 20-70 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 5 мг/день. [0165] В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/день. В
20 другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/2 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/3 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/4 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/5 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/6 дней. В другом варианте
25 воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/неделю. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/9 дней. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/11 дней. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 1-90 мг/14 дней.
[0166] В другом варианте воплощения изобретения дозировка соматотропного гормона 30 составляет 10-50 мг/день. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/2 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/3 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/4 дня. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/5 дней. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/6 дней. В другом варианте 35 воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/неделю. В другом варианте
воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/9 дней. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/11 дней. В другом варианте воплощения изобретения дозировка составляет 10-50 мг/14 дней.
[0167] Оральное введение в одном варианте воплощения изобретения включает 5 стандартную лекарственную форму, включающую таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания, жевательные таблетки, суспензии, эмульсии и подобное. Такие стандартные лекарственные формы содержат безопасное и эффективное количество желаемого соматотропного гормона согласно изобретению, каждое из которых, в одном варианте воплощения изобретения, составляет приблизительно от 0,7 или 3,5 мг до приблизительно
10 280 мг/70 кг или, в другом варианте воплощения изобретения, приблизительно от 0,5 или 10 мг до приблизительно 210 мг/70 кг. Фармацевтически приемлемые носители, пригодные для приготовления стандартных лекарственных форм для перорального введения, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения изобретения таблетки обычно содержат традиционные фармацевтически совместимые адъюванты, такие
15 как инертные разбавители, такие как кальция карбонат, натрия карбонат, маннитол, лактоза и целлюлоза; связывающие вещества, такие как крахмал, желатин и сахароза; разрыхлители, такие как крахмал, альгиновая кислота и кроскармеллоза; лубриканты, такие как магния стеарат, стеариновая кислота и тальк. В одном варианте воплощения изобретения могут использоваться скользящие вещества, такие как кремния двуокись, для улучшения свойств
20 сыпучести порошковых смесей. В одном варианте воплощения изобретения для внешнего вида могут добавляться красящие вещества, такие как красители, подпадающие под Федеральный закон о пищевых продуктах, медикаментах и косметических средствах (Federal Drug, Food and Cosmetics Act - FD &C). Подслащивающие добавки и ароматизаторы, такие как аспартам, сахарин, ментол, мята перечная и фруктовые ароматизаторы, являются
25 пригодными адъювантами для жевательных таблеток. Капсулы обычно содержат один или более твердых разбавителей, раскрываемых выше. В некоторых вариантах воплощения изобретения отбор компонентов-носителей зависит от вторичных соображений, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не являются критическими для целей данного изобретения, и их отбор может быть легко выполнен специалистом в данной
30 области техники.
[0168] В одном варианте воплощения изобретения оральная лекарственная форма включает предопределенный профиль высвобождения. В одном варианте воплощения изобретения оральная лекарственная форма настоящего изобретения включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки пролонгированного действия. В 35 одном варианте воплощения изобретения оральная лекарственная форма настоящего
изобретения включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки с медленным высвобождением. В одном варианте воплощения изобретения оральная лекарственная форма настоящего изобретения включает таблетки, капсулы, пастилки для рассасывания или жевательные таблетки с немедленным высвобождением. В 5 одном варианте воплощения изобретения рецептура оральной лекарственной формы составлена в соответствии с желаемым профилем высвобождения фармацевтически активного ингредиента, как это известно специалисту в данной области техники. [0169] Пероральные композиции в некоторых вариантах воплощения изобретения включают жидкие растворы, эмульсии, суспензии и подобное. В некоторых вариантах воплощения
10 изобретения фармацевтически приемлемые носители, пригодные для приготовления таких композиций, хорошо известны в данной области техники. В некоторых вариантах воплощения изобретения жидкие оральные композиции содержат от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,933% желаемого соединения или соединений или, в другом варианте воплощения изобретения, от приблизительно 0,01% до приблизительно 10%.
15 [0170] В некоторых вариантах воплощения изобретения композиции для использования в способах данного изобретения включают растворы или эмульсии, которые в некоторых вариантах воплощения изобретения являются водными растворами или эмульсиями, включающими безопасное и эффективное количество соединений настоящего изобретения и, необязательно, другие соединения, предназначенные для местного интраназального
20 введения. В некоторых вариантах воплощения изобретения композиции содержат от приблизительно 0,001% до приблизительно 10,0% вес/объем соматотропного гормона, модифицированного посредством СТР, более предпочтительно от приблизительно 00,1% до приблизительно 2,0 % вес/объем, который используется для системной доставки соединений интраназальным путем.
25 [0171] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции вводятся путем внутривенной, внутриартериальной или внутримышечной инъекции жидкого препарата. В некоторых вариантах воплощения изобретения жидкие составы включают растворы, суспензии, дисперсии, эмульсии, масла и подобное. В одном варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции вводятся внутривенно, и, таким образом,
30 рецептура создается в форме, подходящей для внутривенного введения. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции вводятся внутриартериально, и, таким образом, рецептура создается в форме, подходящей для внутриартериального введения. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции вводятся внутримышечно, и, таким образом, рецептура создается в форме, подходящей для
35 внутримышечного введения.
[0172] Дополнительно в другом варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции вводятся местно на поверхности тела, и, таким образом, рецептура создается в форме, подходящей для местного введения. Подходящие составы для местного введения включают гели, мази, кремы, лосьоны, капли и подобное. Для местного введения соединения 5 настоящего изобретения комбинируются с дополнительным подходящим терапевтическим агентом или агентами, которые готовятся и наносятся как растворы, суспензии или эмульсии в физиологически приемлемом разбавителе с фармацевтическим носителем или без него. [0173] В одном варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции настоящего изобретения производятся способами, хорошо известными в данной области 10 техники, например, традиционными способами смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульсификации, инкапсулирования, улавливания или лиофилизации.
[0174] В одном варианте воплощения изобретения рецептура фармацевтических композиций для использования в соответствии с настоящим изобретением создается
15 традиционным способом с использование одного или более физиологически приемлемых носителей, включающих вспомогательные вещества и дополнительные вещества, которые способствуют переработке активных ингредиентов в препараты, которые могут быть использованы фармацевтически. В одном варианте воплощения изобретения состав зависит от избранного пути введения.
20 [0175] В одном варианте воплощения изобретения рецептура инъекционных препаратов изобретения создается в водных растворах. В одном варианте воплощения изобретения рецептура инъекционных препаратов изобретения создается в физиологически приемлемых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой раствор. В некоторых вариантах воплощения изобретения для трансмукозального
25 введения в составе используются пенетранты, подходящие для проникаемого барьера. Такие пенетранты, в общем, известны в данной области техники.
[0176] В одном варианте воплощения изобретения рецептура препаратов, описываемых здесь, составляется для парентерального введения, например, путем болюсной инъекции или непрерывной инфузии. В некоторых вариантах воплощения изобретения составы для 30 инъекций представлены в стандартной лекарственной форме, например, в ампулах или в многодозовых контейнерах с, необязательно, добавленным консервантом. В некоторых вариантах воплощения изобретения композиции являются суспензиями, растворами или эмульсиями в масляных или водных носителях и содержат вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирущие агенты.
[0177] Композиции также включают, в некоторых вариантах воплощения изобретения, консерванты, такие как бензалкония хлорид и тимеросал, и подобное; хелирующие агенты, такие как эдетат натрия и другие; буферы, такие как фосфатный, цитратный и ацетатный; агенты тоничности, такие как натрия хлорид, калий хлорид, глицерин, маннитол и другие; 5 антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, ацетилцистин, натрия метабисульфат и другие; ароматизаторы; регуляторы вязкости, такие как полимеры, включая целлюлозу и ее производные; и поливиниловый спирт, и кислоту, и основание для регулирования, по необходимости, рН этих водных композиций. Композиции также содержат, в некоторых вариантах воплощения изобретения, местные анестетики или другие активные вещества.
10 Композиции могут быть использованы в спреях, аэрозолях, каплях и подобное.
[0178] В некоторых вариантах воплощения изобретения фармацевтические композиции для парентерального введения включают водные растворы активного препарата в водорастворимой форме. В дополнение суспензии активных ингредиентов в некоторых вариантах воплощения изобретения готовятся как соответствующие инъекционные
15 суспензии на масле или воде. Подходящие липофильные растворители или носители включают, в некоторых вариантах воплощения изобретения, жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирной кислоты, такие как этил олеат, триглицериды или липосомы. Водные инъекционные суспензии содержат, в некоторых вариантах воплощения изобретения, субстанции, повышающие вязкость
20 суспензии, такие как натрия карбоксиметил целлюлоза, сорбитол или декстран. В другом варианте воплощения изобретения суспензия также содержит подходящие стабилизаторы или агенты, повышающие растворимость активных ингредиентов для обеспечения получения высококонцентрированных растворов.
[0179] В другом варианте воплощения изобретения активное соединение может быть 25 доставлено в везикуле, в частности, в липосоме (см. Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, там же, pp. 317-327; см., в общем, там же).
[0180] В другом варианте воплощения изобретения рецептура фармацевтической 30 композиции, доставленной в системе контролируемого высвобождения, составляется для внутривенной инфузии, имплантируемого осмотического насоса, трансдермального пластыря, липосом или других способов введения. В одном варианте воплощения изобретения используется насос (см. Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). В 35 другом варианте воплощения изобретения могут использоваться полимерные материалы. В
еще другом варианте воплощения изобретения система контролируемого высвобождения может быть размещена в непосредственной близости от терапевтической мишени, то есть мозга, таким образом, требуется только часть системной дозы (см., например, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Другие системы 5 контролируемого высвобождения обсуждаются в обзоре Langer (Science 249:1527-1533 (1990).
[0181] В некоторых вариантах воплощения изобретения активный ингредиент находится перед употреблением в форме порошка для разбавления подходящим носителем, например, стерильным апирогенным раствором на водной основе. Рецептура композиций в некоторых 10 вариантах воплощения изобретения составляется для распыливания и ингаляционного введения. В другом варианте воплощения изобретения композиции содержатся в контейнере с прилагаемыми средствами распыления.
[0182] В одном варианте воплощения изобретения рецептура препарата настоящего изобретения составляется в ректальные композиции, такие как суппозитории или 15 удерживающие клизмы, с использованием, например, традиционных основ суппозиториев, таких как масло какао или другие глицериды.
[0183] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтические композиции, подходящие для использования в контексте настоящего изобретения, включают композиции, в которых активные ингредиенты содержатся в количестве, эффективном для 20 достижения намеченной цели. В другом варианте воплощения изобретения терапевтически эффективное количество означает количество активных ингредиентов, эффективное для предотвращения, облегчения или улучшения симптомов заболевания или продления выживаемости субъекта, получающего лечение.
[0184] В одном варианте воплощения изобретения определение терапевтически 25 эффективного количества в существенной мере находится в рамках возможностей специалиста в данной области техники.
[0185] Некоторые примеры веществ, способных служить в качестве фармацевтически приемлемых носителей или их компонентов, составляют сахара, такие как лактоза, глюкозы и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлоза и
30 ее производные, такие как натрия карбоксиметил целлюлоза, этил целлюлоза и метил целлюлоза; порошковый трагакант; солод; желатин; тальк; твердые лубриканты, такие как стеариновая кислота и магния стеарат; кальция сульфат; растительные масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло какао; полиолы, такие как пропилен гликоль, глицерин, сорбитол, маннитол и
35 полиэтилен гликоль; альгиновая кислота; эмульсификаторы, такие как эмульсификаторы
марки Tween(tm); увлажняющие агенты, такие как натрия лаурил сульфат; красители; ароматизаторы; агенты таблетирования, стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты; апирогенная вода; изотонический физраствор и растворы фосфатного буфера. Выбор фармацевтически приемлемого носителя, который буде использован совместно с 5 соединением, в основном, определяется способом, которым будет вводиться данное соединение. Если заявленное соединение будет вводиться путем инъекции, в одном варианте воплощения изобретения, фармацевтически приемлемым носителем является стерильный физиологический раствор с суспендирующим агентом, совместимым с кровью, рН которого доведено до приблизительно 7,4.
10 [0186] Кроме того, композиции дополнительно включают связующие вещества (например, гуммиарабик, кукурузный крахмал, желатин, карбомер, этил целлюлозу, гуаровую камедь, гидроксипропил целлюлозу, гидроксипропил метил целлюлозу, повидон), разрыхлители (например, кукурузный крахмал, картофельный крахмал, альгиновую кислоту, силикона двуокись, натрия кроскармеллозу, кросповидон, гуаровую камедь, натрия крахмал гликолят),
15 буферы (например, Tris-HCI, ацетатный, фосфатный) различной рН и ионной силы, аддитивы, такие как альбумин или желатин, для предотвращения абсорбции к поверхностям, детергенты (например, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, соли желчных кислот), ингибиторы протеазы, сурфактанты (например, натрия лаурил сульфат), усилители проникновения, солюбилизирующие агенты (например, глицерин, полиэтилен глицерин), антиоксиданты
20 (например, аскорбиновая кислота, натрия метабисульфит, бутилированный гидроксианизол), стабилизаторы (например, гидроксипропил целлюлоза, гидроксипропилметил целлюлоза), агенты, повышающие вязкость (например, карбомер, коллоидная кремния двуокись, этил целлюлоза, гуаровая камедь), подслащивающие добавки (например, аспартам, лимонная кислота), консерванты (например, Тимеросал, бензиловый спирт, парабены), лубриканты
25 (например, стеариновая кислота, магния стеарат, полиэтилен гликоль, натрия лаурил сульфат), агенты для повышения текучести (например, коллоидная кремния двуокись), пластификаторы (например, диэтил фталат, триэтил цитрат), эмульсификаторы (например, карбомер, гидроксипропил целлюлоза, натрия лаурил сульфат), полимерное покрытие (например, полоксамеры или полоксамины), покровные вещества и пленкообразователи
30 (например, этил целлюлоза, акрилаты, полиметакрилаты) и/или адъюванты.
[0187] Типичные компоненты носителей для сиропов, эликсиров, эмульсий и суспензий включают этанол, глицерин, пропилен гликоль, полиэтилен гликоль, жидкую сахарозу, сорбитол и воду. Для суспензии типичные суспендирующие агенты включают метил целлюлозу, натрия карбоксиметил целлюлозу, целлюлозу (например, Avicel(tm), RC-591),
35 трагакант и натрия альгинат; типичные смачивающие агенты включают лецитин и
полиэтилен оксид сорбитан (например, полисорбат 80). Типичные консерванты включают метил парабен и натрия бензоат. В другом варианте воплощения изобретения пероральные жидкие композиции также содержат один или более компонентов, таких как подслащивающие добавки и красители, раскрытые выше. 5 [0188] Композиции также включают введение активного материала в или на препараты частиц полимерных соединений, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели и т.п., или в липосомы, микроэмульсии, мицеллы, однослойные или многослойные везикулы, тени эритроцитов или сферобласты. Такие композиции будут оказывать влияние на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость
10 высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo.
[0189] Также изобретением охватываются композиции из частиц, покрытых полимерами (например, полоксамерами или полоксаминами), и соединение, связанное с антителами, направленными против тканеспецифических рецепторов, лигандов или антигенов, или связанное с лигандами тканеспецифических рецепторов.
15 [0190] В другом варианте воплощения изобретения соединения модифицируются путем ковалентного присоединения водорастворимых полимеров, таких как полиэтилен гликоль, сополимеры полиэтилен гликоля и полипропилен гликоля, карбоксиметил целлюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон или полипролин. В другом варианте воплощения изобретения модифицированные соединения проявляют, по существу, более
20 длительные полупериоды жизни в крови после внутривенной инъекции по сравнению с соответствующими немодифицированными соединениями. В одном варианте воплощения изобретения модификации также повышают растворимость соединений в водном растворе, устраняют агрегацию, увеличивают физическую и химическую стабильность соединения и в значительной степени снижают иммуногенность и реактивность соединения. В другом
25 варианте воплощения изобретения желаемая биологическая активность in vivo достигается путем введения такого аддукта полимер-соединения с меньшей частотой или в меньших дозах по сравнению с немодифицированным соединением.
[0191] В другом варианте воплощения изобретения получение эффективного количества или дозы может быть первоначально установлено из тестов in vitro. В одном варианте 30 воплощения изобретения рецептура дозы может быть составлена на моделях у животных, и такая информация может быть использована для более точного определения полезных доз у людей.
[0192] В одном варианте воплощения изобретения токсичность и терапевтическая эффективность описываемых здесь активных ингредиентов может быть определена путем 35 стандартных фармацевтических процедур in vitro в культурах клеток или у
экспериментальных животных. В одном варианте воплощения изобретения данные, полученные от этих тестов in vitro и в культуре клеток, и в исследованиях у животных, могут быть использованы для создания рецептуры диапазона доз для применения у человека. В одном варианте воплощения изобретения дозировки варьируют в зависимости 5 от примененной лекарственной формы и использованного пути введения. В одном варианте воплощения изобретения точный состав, путь введения и дозировка могут быть выбраны конкретным врачом, принимая во внимание состояние пациента. [См., например, Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.l]. [0193] В одном варианте воплощения изобретения, в зависимости от восприимчивости и 10 тяжести состояния, которое предстоит лечить, дозировка может состоять в однократном или в многократных введениях, с курсом лечения, продолжающимся от нескольких дней до нескольких недель, или до тех пор, пока лечение не подействует или не будет достигнуто уменьшения болезненного состояния.
[0194] В одном варианте воплощения изобретения количество композиции, которое будет 15 введено, разумеется, будет зависеть от субъекта, получающего лечение, тяжести недуга, способа введения, суждения врача, предписывающего лечение, и т.п.
[0195] В одном варианте воплощения изобретения композиции, включая препарат настоящего изобретения с рецептурой, составленной в совместимом фармацевтическом носителе, также готовятся, помещаются в соответствующий контейнер и маркируются для
20 лечения указанного состояния.
[0196] В другом варианте воплощения изобретения GH, модифицированный посредством СТР, вводится путем системного введения. В другом варианте воплощения изобретения соматотропный гормон, как описано здесь, вводится путем внутривенной, внутримышечной или подкожной инъекции. В другом варианте воплощения изобретения
25 GH, модифицированный посредством СТР, является лиофилизированным (т.е. высушенным в замороженном состоянии) препаратом в комбинации со сложными органическими вспомогательными веществами и стабилизаторами, такими как неионные поверхностно-активные агенты (т.е. сурфактанты), различные сахара, органические полиолы и/или сывороточный альбумин человека. В другом варианте воплощения
30 изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный посредством СТР, как описано, в стерильной воде для инъекции. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный соматотропный гормон, как описано, в стерильном фосфатно-солевом буферном растворе для инъекции. В другом варианте воплощения изобретения
фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный соматотропный гормон, как описано, в стерильном о,9% NaCl для инъекции.
[0197] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция включает соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано 5 здесь, и комплексные носители, такие как сывороточный альбумин человека, полиолы, сахара и анионные поверхностно-активные стабилизирующие агенты. См, например, WO 89/10756 (Нага et al.- содержащий полиол и п-гидроксибензоат). В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция включает соматотропный гормон, как описано здесь, и лактобионовую кислоту, и ацетатный/глициновый буфер. В
10 другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, и аминокислоты, такие как аргинин или глютамат, которые повышают растворимость композиций интерферона в воде. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный
15 посредством СТР, как описано здесь, и глицин или сывороточный альбумин человека (HSA), буфер (например, ацетатный) и изотонический агент (например, NaCl). В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция содержит лиофилизированный GH, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, и фосфатный буфер, глицин и HSA.
20 [0198] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, стабилизируется при помещении в буферные растворы, имеющие рН между приблизительно 4 и 7,2. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР,
25 как описано здесь, стабилизируется при помощи аминокислоты в качестве стабилизирующего агента и, в некоторых случаях, солью (если аминокислота не содержит заряженной боковой цепи).
[0199] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано 30 здесь, является жидкой композицией, включающей стабилизирующий агент по весу от приблизительно 0,3% до 5%, который является аминокислотой.
[0200] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, предоставляет точность дозирования и безопасность продукта. В другом варианте 35 воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный
гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, предоставляет биологически активный, стабильный жидкий состав для использования в инъецируемый применениях. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция содержит нелиофилизированный GH, модифицированный посредством СТР, как описано 5 здесь.
[0201] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, предоставляет жидкий состав, позволяющий проводить долговременное хранение в жидком состоянии, способствуя хранению и транспортировке перед введением.
10 [0202] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит твердые липиды в качестве матричного материала. В другом варианте воплощения изобретения инъецируемая фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь,
15 содержит твердые липиды в качестве матричного материала. В другом варианте воплощения изобретения получение липидных микрочастиц путем распылительного отверждения было описано Speiser (Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) с последующими липидными нанопеллетами для перорального введения (Speiser ЕР 0167825 (1990). В другом варианте воплощения изобретения используемые липиды
20 хорошо переносятся организмом (например, глицериды, состоящие из жирных кислот, которые присутствуют в эмульсиях для парентерального питания).
[0203] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, находится в форме липосом (J. Е. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
25 [0204] В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит полимерные микрочастицы. В другом варианте воплощения изобретения инъецируемая фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит полимерные
30 микрочастицы. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит наночастицы. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит липосомы. В другом варианте воплощения
35 изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон,
модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит липидную эмульсию. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит микросферы. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая 5 композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит липидные наночастицы. В другом варианте воплощения изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит липидные наночастицы, содержащие амфифильные липиды. В другом варианте воплощения
10 изобретения фармацевтическая композиция, включающая соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР, как описано здесь, содержит липидные наночастицы, содержащие препарат, липидный матрикс и сурфактант. В другом варианте воплощения изобретения липидный матрикс имеет содержание моноглицерида, которое составляет по меньшей мере 50% вес/вес.
15 [0205] В одном варианте воплощения изобретения композиции настоящего изобретения представлены в упаковке или приспособлении для дозирования, таких как те, что были утверждены в наборе, одобренном FDA (Food and Drug Administration - Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США), которые содержат одну или более единиц лекарственных форм, содержащих активный ингредиент.
20 В одном варианте воплощения изобретения упаковка, например, содержит металлическую или пластиковую фольгу, такая как блистерная упаковка. В одном варианте воплощения изобретения упаковка или приспособление для дозирования сопровождается инструкциями для введения. В одном варианте воплощения изобретения упаковка или приспособление для дозирования сопровождается сообщением, связанным с контейнером,
25 в форме, предписанной правительственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, сообщение которого отражает утверждение агентством формы композиций или введение человеку или животному. Таким сообщением, в одном варианте воплощения изобретения, является маркировка, утвержденная Управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и
30 лекарственных средств США для рецептурных препаратов, или утвержденный вкладыш продукта.
[0206] В одном варианте воплощения изобретения следует понимать, что соматотропный гормон, модифицированный посредством СТР настоящего изобретения, может предоставляться индивидууму с дополнительными активными агентами для достижения 35 улучшенного терапевтического эффекта по сравнению с лечением каждым агентом самим
по себе. В другом варианте воплощения изобретения принимаются меры (например, дозировка и выбор дополняющего агента) в отношении нежелательных побочных эффектов, ассоциированных с комбинированными терапиями.
[0207] Дополнительные объекты, преимущества и новые признаки настоящего 5 изобретения будут явными для обычного специалиста в данной области техники после изучения следующих примеров, которые не предназначены для того, чтобы быть ограничивающими. В дополнение каждый из различных вариантов воплощения изобретения и аспекты настоящего изобретения, как это описано здесь выше и как заявлено в разделе пунктов формулы изобретения ниже, находят экспериментальную 10 поддержку в следующих примерах.
ПРИМЕРЫ
[0208] В общем, номенклатура используемая здесь и лабораторные процедуры задействованные в настоящем изобретении включают молекулярные, биохимические,
15 микробиологические способы и способы рекомбинантной ДНК. Такие способы are тщательно описаны в литературе. Смотри, например, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning",
20 John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 14, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); методики описанные в Патентах США №№ 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 и 5,272,057; "Cell Biology: А Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A
25 Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); имеющиеся в наличии иммунотесты широко описаны в патентах и найчной
30 литературе, смотри, например, Патенты США №№. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 и 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, М. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell
35 Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A
Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, В., (1984) и "Methods in Enzymology" Vol. 1317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); которые все включены 5 сюда путем ссылки. Другие общие ссылки предоставлены по тексту этого документа.
ПРИМЕР 1 Создание конструктов hGH МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
10 [0209] Было синтезировано четыре клона hGH (варианты белка 20 кДа). Фрагменты Xba I -Not I, содержащие последовательности hGH из четырех вариантов, были лигированы в эукариотический экспрессионный вектор pCI-dhfr, который предварительно выдерживали с Xbal -Not! Была получена ДНК из 4 клонов (401-0, 1, 2, 3 и 4). Также был синтезирован другой частичный клон hGH (пары оснований 1-242) из белка 22 кДа (0606114).
15 Праймеры заказывали у Sigma-Genosys. Последовательности праймеров, которые были использованы для создания полипептидов hGH, модифицированных посредством СТР настоящего изобретения, подытожены в Таблице 1, как указано ниже.
[0210] Конструкция ?02-О-р69-1 (hGH) (SEQ ID NO: 5): hGH представляет собой рекомбинантный соматотропный гормон человека дикого типа (без СТР), который был получен для использования в качестве контроля в экспериментах, описанных ниже. [0211] Были проведены три реакции ПНР. Первая реакция были проведена с праймером 5 25 и праймером 32R, и плазмидной ДНК 0606114 (частичный клон пар оснований 1-242 hGH) в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР был сформирован продукт, состоящий из 245 пар оснований.
[0212] Вторая реакция была проведена с праймером 33 и праймером 4R, и плазмидной ДНК 401 -0-р57-2 в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР был сформирован
10 продукт, состоящий из 542 пар оснований.
[0213] Последняя реакция проводилась с праймерами 25 и 4 и смесью продуктов предыдущих двух реакций в качестве матрицы; в результате ПЦР амплификации был образован продукт из 705 пар оснований и лигирован в клонирующий вектор ТА (Invitrogen, каталог К2000-01). Фрагмент Xbal -NotI, содержащий последовательность
15 hGH-О, был лигирован в эукариотический экспрессионный вектор pCI-dhfr. Вектор был трансфицирован в клетки DG-44 СНО. Клетки выращивались в среде, не содержащей белка.
[0214] Конструкция ?02-1-р83-5 (hGH-CTP) - SEQ ID NO: 9 и Ґ02-2-p72-3(hGH-CTPx2)
- SEQ ID NO: 10: hGH-CTP представляет собой рекомбинантный соматотропный гормон 20 человека, который был присоединен путем слияния к 1 копии С-концевого пептида бета цепи хорионического гонадотропина человека (СТР). СТР кассета hGH-CTP была присоединена к С-концу (одна кассета). hGH-CTP-CTP представляет собой рекомбинантный соматотропный гормон человека, который присоединен путем слияния к 2 копиям С-концевого пептида бета цепи хорионического гонадотропина человека (СТР). 25 Две кассеты СТР hGH-CTP-CTP были присоединены к С-концу (две кассеты).
[0215] Конструкция из hGH-CTP и hGH-CTP-CTP выполнялась тем же способом, что и конструкция hGH-О. Во второй реакции ПЦР в качестве матрицы использовались рС1-dhfr-401-l-p20-l (hGH*-ctp) и pCI-dhfr-401-2-p21-2 (hGH*-ctp х2).
[0216] hGH-CTP и hGH-CTP-CTP были экспрессированы в клетках DG-44 СНО. Клетки 30 выращивались в среде, не содержащей белка. Молекулярный вес hGH-CTP составляет -30,5 кДа, поскольку hGH имеет молекулярный вес 22 кДа, в то время как каждая "СТР кассета" вносит 8,5 кДа в общий молекулярный вес (см. Фигуру 1). Молекулярный вес hGH-CTP-CTP составляет -39 кДа (см. Фигуру 1).
[0217] Конструкция ?02-3-р81-4 (CTP-hGH-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 11 и Ґ02-4-p82-9 35 (CTP*hGH-CTP-CTP) - SEQ ID NO: 12: CTP-hGH-CTP-CTP представляет собой
рекомбинантный соматотропный гормон человека, который был присоединен путем слияния к 3 копиям С-концевого пептида бета цепи хорионического гонадотропина человека (СТР). Три СТР кассеты CTP-hGH-CTP-CTP были присоединены как N-концу (одна кассета), так и к С-концу (две кассеты). tCTP-hGH-CTP-CTP представляет собой 5 рекомбинантный соматотропный гормон человека, который присоединен путем слияния к 1 процессированной и к 2 полным копиям С-концевого пептида бета цепи хорионического гонадотропина человека (СТР). Процессированная СТР кассета tCTP-hGH-CTP-CTP была присоединена к N-концу, и две СТР кассеты были присоединены к С-концу (две кассеты). [0218] Были проведены три реакции ПНР. Первая реакция были проведена с праймером
10 25 и праймером 35 , и плазмидной ДНК р401-3-р12-5 или 401-4-р22-1 в качестве матрицы; в результате амплификации ПЦР был сформирован продукт, состоящий из 265 или 220 пар оснований. Вторая реакция была проведена с праймером 34 и праймером 37R, и плазмидной ДНК TA-hGH-2-q65-l в качестве матрицы; в результате ПЦР амплификации был образован продукт из 695 пар оснований. Последняя реакция была проведена с
15 праймерами 25 и 37R и смесью продуктов двух предыдущих реакций в качестве матрицы; в результате ПЦР амплификации был образован продукт из 938 или 891 пар оснований и лигирован в клонирующий вектор ТА (Invitrogen, каталог К2000-01). Фрагмент Xba I -Not I, содержащий последовательность hGH, был лигирован в наш эукариотический экспрессионный вектор pCI-dhfr.
20 [0219] CTP-hGH-CTP-CTP и tCTP-hGH-CTP-CTP были экспрессированы в клетках DG-44 СНО. Клетки выращивались в среде, не содержащей белка. Молекулярный вес CTP-hGH-CTP-CTP составляет -47,5 кДа (см. Фигуру 1), и молекулярный вес tCTP-hGH-CTP-CTP составляет -43,25 кДа (см. Фигуру 1).
[0220] Конструкция ?02-6-р95а-8 (CTP-hGH-CTP) - SEQ ID NO: 13: Конструкция hGH-6 25 выполнялась тем же способом, что и конструкция hGH-З. В качестве матрицы во второй ПЦР реакции был использован pCI-dhfr-402-l-p83-5 (hGH-ctp).
[0221] Конструкция 402-5-р96-4 (CTP-hGH) - SEQ ID NO: 14: Реакция ПЦР выполнялась с использование праймера 25 и праймера 39 , и плазмидной ДНК pCI-dhfr-ctp-EPO-ctp (402-6-р95а-8) в качестве матрицы; в результате ПНР амплификации был образован 30 продукт из 763 пар оснований и лигирован в клонирующий вектор ТА (Invitrogen, каталог К2000-01). Фрагмент Xba I -Not I, содержащий последовательность ctp-hGH, был лигирован в наш эукариотический экспрессионный вектор pCI-dhfr для получения клона 402-5-р96-4.
ПРИМЕР 2
Тесты биоактивности in vivo полипептидов hGH-CTP настоящего изобретения
[0222] Следующий эксперимент был проведен с целью тестирования потенциальной 5 пролонгированной биологической активности полипептидов hGH-CTP по сравнению с коммерческим рекомбинантным соматотропным гормоном человека и hGH.
МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ
[0223] Крысы-самки с удаленным гипофизом (60-100 г) получали один раз в неделю 10 подкожную инъекцию 21,7 мкг полипептидов hGH-CTP или один раз в день подкожную инъекцию 5 мкг контрольного коммерческого rhGH .
[0224] Вес измеряли у всех животных перед началом лечения, через 24 часа после первой инъекции и каждые два дня до конца исследования в день 21. Каждая точка представляет средний процент прибавки веса группы ((День взвешивания 0 -взвешивание в последний 15 день)/ День взвешивания 0). Среднюю прибавку веса нормализировали по отношению к инъекции один раз в день коммерческого hGH. График лечения подытожен в Таблице 2.
CTP-hGH-CTP-CTP
SEQ ID NO: 11
подкожный
дни 1, 7 и 13;
1/неделю
21,7
0,25
tCTP-hGH-CTP-CTP SEQ ID NO: 12
подкожный
дни 1, 7 и 13;
1/неделю
21,7
0,25
Коммерческий hGH v.l
подкожный
дни 1, 7 и 13;
1/неделю
21,7
0,25
Коммерческий hGH v.l
подкожный
дни 1-13;
ежедневно/
недели
0,25
РЕЗУЛЬТАТЫ
[0225] Результаты подытожены на Фигуре 2. Эти результаты демонстрируют, что CTP-hGH-CTP-CTP (SEQ ID NO: 11) и tCTP-hGH-CTP-CTP (SEQ ID NO: 12) стимулируют 5 прибавку веса свыше 120% по сравнению с коммерческим rhGH, который стимулировал 100% прибавку веса.
ВЫВОД
[0226] Три дозы один раз в неделю (Дни инъекций: 1, 7 и 13) 21,7 мкг CTP-hGH-CTP-CTP 10 (SEQ ID NO: 11) и tCTP-hGH-CTP-CTP (SEQ ID NO: 12) стимулировали повышение веса свыше 30% у крыс с удаленным гипофизом по сравнению с коммерческим rhGH, который был инъецирован в той же кумулятивной дозе, которая вводилась один раз в день в дозе 5 мкг на протяжении 13 дней.
15 ПРИМЕРЗ
Фармакокинетические исследования соматотропного гормона, модифицированного
посредством СТР
[0227] Фармакокинетические исследования однократной дозы были проведены на крысах Sprague-Dawley. Все исследования на животных были проведены в соответствии с 20 Законом о благополучии животных, Руководством по уходу и использованию лабораторных животных и под надзором и одобрением Учрежденческой комиссии по уходу и использованием животных Modigene, Biotechnology General Ltd. Крыс размещали либо по отдельности, либо по две в клетке с 12-ти часовым циклом свет/темнота. Доступ к
воде (городское снабжение) и к несертифицированным кормам для грызунов предоставлялся ad libitum.
[0228] Для сравнения фармакокинетики CTP-hGH-CTP-CTP и GH крыс использовали четыре группы крыс Sprague-Dawley (270-290 г), от трех до шести самцов на группу. 5 Крыс случайным образом распределяли в четыре группы лечения (см. Таблицу 3). Крысам вводили однократную подкожную или внутривенную инъекцию соматотропного гормона (50 мкг/кг внутривенно или подкожно) или CTP-hGH-CTP-CTP (108 мкг/кг внутривенно или подкожно). За исключением образца перед введением, который был получен под изофлурановым наркозом, отбор крови проводили у животных без наркоза. Образцы
10 крови (приблизительно 0,25 мл) собирали в микроконтейнеры с покрытием ЭДТА для твердофазных иммуноферментных анализов ELISA концентраций в плазме CTP-hGH-CTP-CTP в периоды времени, указанные в Таблице 3. После каждого взятия образца объем крови замещался равным объемом стерильного 0,9% физраствора. Образцы плазмы хранили на льду в течение до 1 часа до центрифугирования и сбора плазмы. Образцы
# - по 3 крысы на временную точку.
15 плазмы до анализа хранили при приблизительно минус 20°С.
[0229] Для оценки образцов плазмы крыс был использован коммерческий набор для сэндвичевого твердофазного иммуноферментного анализа ELISA, специфический для обнаружения соматотропного гормона человека (Roche Diagnostics). Данный набор обнаруживает соматотропный гормон человека в плазме с помощью антительной сэндвич-5 структуры ELISA. Данный набор первоначально использовался для измерения концентрации CTP-hGH-CTP-CTP в плазме крыс. Для этих образцов плазмы была использована стандартная кривая CTP-hGH-CTP-CTP (1,2-100 нг/мл) и концентрации CTP-hGH-CTP-CTP в плазме крыс были интерполированы из этой кривой. [0230] Стандартные фармакокинетические параметры, включая клиренс (CL (клиренс)
10 или CL/F (кажущийся клиренс)), объем распределения (Vd (объем распределения) или Vd/F (кажущийся объем распределения)), полупериод жизни (tm), площадь под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (AUC), максимальная наблюдаемая концентрация в плазме (Стах) и время до максимальной наблюдаемой концентрации в плазме (Тшах) были получены из кривых зависимости альбутропина или соматотропного
15 гормона плазмы от времени путем некомпартментного анализа с использованием программы моделирования WinNonlin (Pharsight, версия 3.1). Для этого анализа данные концентрации в плазме CTP-hGH-CTP-CTP или соматотропного гормона были равномерно взвешены. AUC была рассчитана с использованием логарифмически линейного трапецоидального анализа для внутривенных данных и линейно-
20 логарифмического метода трапеций для подкожных данных. Профили концентрации в плазме для каждой крысы (за исключением данных подкожного абутропина) или обезьяны анализировались индивидуально, и данные значений среднее±стандартная ошибка среднего (S.E.M.) для фармакокинетических параметров представлены в Таблице 4 и на Фигуре 4.
25 [0231] CTP-hGH-CTP-CTP представляет собой одноцепочечный белок из 275 аминокислот и до двенадцати О-связанных углеводов. Структура состоит из модифицированного соматотропного гормона человека (Somatropin), присоединенного к трем копиям С-концевого пептида (СТР) бета цепи хорионического гонадотропина человека (hCG); одной копии N-конца и двух копий (последовательных) на С-конце. Соматотропный
30 гормон человека состоит из 191 аминокислоты. СТР состоит из 28 аминокислот и четырех О-связанных сахарных цепей.
ПРИМЕР 4
Фармакокинетика соматотропного гормона, модифицированного посредством СТР, у
крыс SD
[0232] Фармакокинетику CTP-hGH-CTP-CTP оценивали и сравнивали с таковой у коммерческого hGH (Биотропин).
[0233] Таблица 4. Средние фармакокинетические параметры после внутривенного и подкожного введения однократной дозы CTP-hGH-CTP-CTP и GH (Биотропин) у крыс 5 Sprague-Dawley
Фармакокинетическая статистика
подкожно
внутривенно
СТР-
СТР-
hGH-
hGH-
СТР-
СТР-
Параметры
Единицы
Биотропин
СТР
Биотропин
СТР
Доза
мг/кг
Посл.АиС
час*нг/мл
680
162,7
1568,3
Стах
нг/мл
36,8
275,8
926
Ттах
час
0,5
MRT
час
2,5
12,9
0,5
9,9
Tl/2 alpha
час
1,58
0,74
Tl/2 beta
час
1,73
0,5
6,9
Статистический анализ данных
[0234] Анализ образцов сыворотки выполнялся с целью определения специфических уровней концентрации для каждого образца. Данные концентрации и временных точек
10 обрабатывались с использованием некомпартментного анализа WinNonLin.
[0235] Определяемые параметры включали: AUC, MRT, tl/2, Cmax и Tmax. Фигура 4 демонстрирует преимущество фармакокинетического профиля концентрации в плазме CTP-hGH-CTP-CTP перед концентрациями соматотропного гормона (пг/мл) после однократной внутривенной или подкожной дозы CTP-hGH-CTP-CTP или соматотропного гормона у
15 крыс (п=3-6 на дозу/способ введения).
[0236] После однократной подкожной инъекции 50 мкг/кг клиренс CTP-hGH-CTP-CTP из
крови крыс SD был значительно более медленным, чем клиренс CTP-hGH-CTP или
Биотропина. Соответствующие рассчитанные полупериоды жизни и AUC составили:
Биотропин Т1/2 1,7час, AUC 41 час*нг/мл
20 CTP-hGH-CTP Tl/2 8,5час, AUC 424 час*нг/мл
CTP-hGH-CTP-CTP Tl/2 9,0 час, AUC 680 час*нг/мл
Заключение:
[0237] CTP-hGH-CTP-CTP был избран в качестве окончательного кандидата из 6 других вариантов. CTP-hGH-CTP-CTP демонстрировал превосходные характеристики в плане биологической активности и фармакокинетики.
ПРИМЕР 5
Тест прибавки веса (ТПВ) для однократной дозы/повторной дозы соматотропного гормона, модифицированного посредством СТР
[0238] Крысы-самцы с удаленным гипофизом (интерауральный метод), возрастом 3-4
10 недели были получены из CRL Laboratories. Во время 3-х недельного периода послеоперационной акклиматизации крыс исследовали и взвешивали дважды в неделю для исключения животных, которые, как представлялось, имели неполное удаление гипофиза, подтверждающееся прибавкой веса, сходной с прибавкой веса ложнооперированных животных. Эти крысы с неполным удалением гипофиза были
15 выведены из исследования. Средние показатели веса тела у крыс с удаленным гипофизом составляли на время эксперимента 70-90 грамм. Это является стандартом биоанализа Фармакопеи США и Европейской Фармакопеи для hGH. Крысы с удаленным гипофизом (крысы, у которых была удалена питуитарная железа) потеряли свою способность набирать вес. Инъекции hGH (и CTP-hGH-CTP-CTP) этим крысам приводят в результате к
20 прибавке веса. На основе измеренной прибавки веса на протяжении определенного периода времени и количества инъецированного hGH определяется специфическая активность hGH (и CTP-hGH-CTP-CTP). Крысам вводили подкожно либо однократные дозы 0,4, 0,8 и 4 мг/кг, либо подкожно повторные дозы 0,6 и 1,8 мг/кг с интервалом в 4 дня на протяжении 3 недель. При рандомизации перед первым введением доз определяли
25 индивидуальные показатели веса тела у всех животных, впоследствии - раз в два дня или, в случае умерщвления, на время смерти и перед забоем.
Анализ прибавки веса при однократной дозе и повторной дозе
[0239] Результаты, в которых сравнивался ответ роста всего тела после различных 30 моделей дозировки CTP-hGH-CTP-CTP у крыс с удаленным гипофизом, продемонстрированы на Фигуре 5. Результаты показывают, что однократная инъекция доз 0,4 и 0,8 мг/кг/день hGH-CTP была эквивалентной 4 ежедневным инъекциям 0,1 мг/кг/день Биотропина. Пик эффекта hGH-CTP наступал после 2 дней. [0240] Фигура 6 дополнительно демонстрирует, что площадь под кривой после однократной 35 инъекции CTP-hGH-CTP-CTP коррелирует с прибавкой веса тела у крыс. Таким образом,
эти совокупные данные демонстрируют, что прибавка веса тела тесно коррелирует с кумулятивным показателем AUC.
[0241] Конструкт hGH-CTP, введенный с интервалом в 4 дня, стимулирует такую же прибавку веса, как и ежедневные инъекции Биотропина, как показано в Фигуре 7. Предполагаемый полупериод жизни hGH у людей в 5 раз лучше, чем у крыс, что указывает на потенциальный пик-эффект у людей через 10 дней после однократной инъекции. Эти результаты поддерживают введение у людей конструкта hGH-CTP, CTP-hGH-CTP-CTP один раз в неделю или раз в две недели.
ПРИМЕР 6
Исследования фармакодинамики/фармакокинетики соматотропного гормона,
модифицированного посредством СТР
[0242] Крысы-самцы с удаленным гипофизом (интерауральный метод) возрастом 3-4 недели были получены из CRL Laboratories. Во время периода послеоперационной акклиматизации в 3 недели крыс исследовали и взвешивали дважды в неделю для исключения животных, которые, как представлялось, имели неполное удаление гипофиза, подтверждающееся прибавкой веса, сходной с прибавкой веса ложнооперированных животных. Эти крысы с неполным удалением гипофиза были выведены из исследования. Средние показатели веса тела у крыс с удаленным гипофизом и у ложнооперированных крыс составляли на время эксперимента, соответственно, 70 грамм и 150 грамм. [0243] Крысам подкожно вводили однократную инъекцию CTP-hGH-CTP-CTP, носителя, соматотропного гормона человека CTP-hGH-CTP-CTP, или соматотропный гормон человека (20 мкг/крысу) вводили подкожно иньекцией в объеме 0,2 мл/крысу. Доза соматотропного гормона составляла 0,35 и 1,05 мкг/кг, доза соматотропного гормона, которая была эквимолярна количеству соматотропного гормона в соответствующей 0,6 и 1,8 мкг/кг дозе CTP-hGH-CTP-CTP. Группы лечения подытожены в Таблице 4. После инъекция были получены образцы плазмы для анализов на IGF-1 в периоды времени, описанные в Таблице 5. Образцы анализировали на предмет концентрации IGF-1 с использованием коммерческого твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (R &D systems).
[0244] Еженедельное введение hGH, модифицированного посредством СТР, было успешным в поддержании IGF-I в пределах нормального диапазона, как и при стандартном соматотропном гормоне и, в дополнение, он также поддерживает нормальный вес тела, как и стандартный соматотропный гормон.
[0245] Был проведен некомпартментный фармакокинетический анализ на кривых зависимости средних концентраций сыворотки от времени для каждой группы. Стах CTP-hGH-CTP-CTP была значимо выше, чем Стах Биотропина. Конечный полупериод жизни CTP-hGH-CTP-CTP был в 6 раз выше, чем у Биотропина.
[0246] Таблица 6: Расчеты фармакокинетических параметров CTP-hGH-CTP-CTP и Биотропина после однократной подкожной инъекции у крыс с удаленным гипофизом
Группа
Доза
Пол
Стах
Ттах AUCo-oo
AUQ-t
CL/F мл/час/к
Tl/2
мг/кг
нг/мл
час нг-час/мл
нг-час/мл
час
СТР-
hGH-
СТР-
1,8
самцы
2,150
8 37,713
37,695
0,928
6,86
[0247] AUCo-t и AUCo-oo были очень сходными, что предполагает, что продолжительность взятия образцов была адекватной для характеристики фармакокинетических профилей. AUC у CTP-hGH-CTP-CTP была в 10 раз выше, чем у Биотропина. Более того, Стах была, 5 в целом, пропорциональна дозе и для CTP-hGH-CTP-CTP, и она была в два раза выше, чем Стах Биотропина. Однако, как показано в Фигуре 8, Ттах у CTP-hGH-CTP-CTP составила 8 часов по сравнению с 0,5 часа у Биотропина, и терминальные полупериоды жизни, по-видимому, не варьируют с уровнем дозы. Т1/2 у CTP-hGH-CTP-CTP был в 6,8 раз длиннее, чем у Биотропина.
10 [0248] Непрямые эффекты соматотропного гормона опосредованы, в основном, инсулиноподобным ростовым фактором-I (IGF-I), гормоном, секретируемым печенью и другими тканями в ответ на соматотропный гормон. Большинство эффектов соматотропного гормона, стимулирующих рост, фактически происходят за счет IGF-I, действующего на свои клетки-мишени. Соответственно, измерялся эффект конструкта
15 CTP-hGH, CTP-hGH-CTP-CTP, на уровни IGF-1 в сыворотке крыс с удаленным гипофизом. Фигура 9 представляет результаты уровней IGF-1 в сыворотке крыс с удаленным гипофизом после подкожной инъекции CTP-hGH-CTP-CTP или коммерческого hGH.
[0249] Однократные дозы CTP-hGH-CTP-CTP в 0,6 или 1,8 мг/кг или Биотропина 0,35 или 20 1,05 мг/кг были введены подкожно крысам с удаленным гипофизом для определения ФК/ФД профиля. Сывороточный IGF-I после инъекции измеряли с помощью наборов для специфического твердофазного иммуноферментного анализа ELISA (Roche Diagnostics). [0250] Кумулятивные уровни IGF-I в сыворотке после инъекции CTP-hGH-CTP-CTP были значительно выше, чем после инъекции Биотропина. Стах была, в основном, 25 пропорциональна дозе, и для CTP-hGH-CTP-CTP она была в 3-4 раза выше, чем Стах у Биотропина. Ттах у CTP-hGH-CTP-CTP составило 36-48 часов по сравнению с 20-24 часами у Биотропина. Подводя итоги, более высокие уровни hGH и более продолжительное присутствие в сыворотке в результате приводит к значительному повышению уровней IGF-1.
ПРИМЕР 7
Содержание углеводов и сиаловой кислоты в соматотропном гормоне, модифицированном посредством СТР
[0251] Анализ О-гликанов основан на наборе Prozyme. О-гликаны химически и энзиматически отщепляются от белка и отделяются от пептидов с использование 5 хроматографии на бумаге. Секвенирование пула О-гликанов выполнялось путем последовательных энзиматических расщеплений (экзогликозидазы) с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии по сравнению со стандартами.
Профилирование углеводов путем анализа последовательности
[0252] Профилирование углеводов проводилось Ludger Ltd. Было взято два образца (EN648 и RS0708) в течение трех выделений, и каждое выделение также анализировалось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в трех параллельных определениях. Образцы в 300 мкг от трех параллельных определений EN648 и RS0708 и единичный образец в 100 мкл цитратного/натрия хлоридного буфера, плюс положительный контроль фетуин (250 мкг) и 100 мкл воды в качестве отрицательного контроля подвергались ультрафильтрации путем центрифугирования с использованием мембраны 10000 Да, отсекающей молекулярный вес, для замещения буфера водой, затем подвергали гидразинолизу с использованием условий режима вывода (6 часов при 60°С). Выделенные гликаны были повторно N-ацетилированы и очищены с применением картриджей LudgerClean СЕХ. Аликвоты выделенных гликанов затем помечали 2-аминобензамидом (2АВ), очищали с применением картриджей Ludger Clean S и анализировали путем жидкостной хроматографии, основанной на гидрофильном взаимодействии-высокоэффективной жидкостной хроматографии LudgerSep-N2 HILIC-HPLC.
Содержание моносахаридов
[0253] Анализ нейтральных моносахаридов требует гидролиза гликанов до их структурных моносахаридных составляющих. Гидролиз выполнялся Ludger Ltd на 30 интактных гликопротеиновых образцах. В частности, проводили кислотный гидролиз 50 мкг интактного гликопротеина 2-АВ (2-аминобензамид), метили и пропускали через обратно-фазовую колонку ВЭЖХ. Этот метод гидролизует все гликаны, присутствующие в гликопротеине, включая N- и О-связанные типы гликанов.
35 Профилирование сиаловых кислот
[0254] Анализировали два образца (EN648 и RS0708) и контроль в виде буфера. Анализ сиаловых кислот требует мягкого кислотного высвобождения моносахаридов с последующим мечением флуорофором DMB и анализом ВЭЖХ на колонке LudgerSep-R1. Для каждого анализа проводили кислотный гидролиз 50 мкг интактного гликопротеина.
Анализ гликопротеинов CTP-hGH-CTP-CTP
[0255] Таблица 7. Анализ гликанов. Структурные определения и площади пиков в процентах основаны на ВЭЖХ и матрицах ферментных гидролизатов.
Процент от общего количества гликанов6
пика
Структура
Название
Не опр.
НАН1
АБС
АБС СВЯЗЬ
0.92
ф-гдв +СВЯЗЬ
GalNAc
0.4
0.4
0.6
53.0
1.02
0-гдв +СВЯЗЬ
галактоза
1.9
9.7
23.8
26.5
1.72
4.3
4.6
2.3
1.79
Gal|51-3GalNAc
2.3
67.7
69.4
17.1 h
2.25
0-2АВ
NeuNAcoc2-3Gal
19.8
13.0 h
2.57
1.5
1.9
1.1
1.1
2.90
л. W- 2АВ
NeuNAca2-3Galp1-3 GalNAc
70.6
3.58
0.6
0.7
0.6
3.22
Galp1-3[NeuNAca2-6] GalNAc
0.9
2.3
4.42
* Ш~ 2АВ
NeuNAca2-3Galp1-3 [Neu NAcoc2-6]Gal NAc
1.8
[0256] Моносахаридные профили указывают на то, что образцы гликопротеина CTP-hGH-CTP-CTP содержат, главным образом, тип гликанов с О-связью. Основным пиком О-гликанов является сиалированное ядро 1 (Neu5Aca2-3Gaipi-3GalNAc). Основной сиаловой кислотой является Neu5Ac, и существует несколько минорных пиков, свидетельствующих о наличии 3-4% диацетилированной сиаловой кислоты гЧ-ацетил-9-0-ацетилнейраминовой кислоты (Neu5, 9Ас2) и менее 1% N-гликолилнейраминовой кислоты. Также имеются небольшие количества Neu5Aca2-6(Gaipi-3)GalNAc.
ПРИМЕР %
Фармакокинетический/токсикокинетический анализ GH, модифицированного
посредством СТР у макак-резус
[0257] Для каждого животного были построены кривые отношения концентраций в сыворотке ко времени. Был проведен некомпартментный анализ при помощи профессиональной версии WinNonlin 5.2.1 (Pharsight Corporation, Mt View CA.). Оцениваемые фармакокинетические параметры показаны в Таблице 8 ниже. [0258] Таблица 8: Оценки фармакокинетических параметров CTP-hGH-CTP-CTP (среднее ± стандартное отклонение) из некомпартментного анализа после однократной подкожной инъекции у макак-резус
Параметр 1,8 мг/кг 90 мг/кг
Стах(мкг/мл) 2,073 ± 0,417 108,7 ±46,0
Ттах (час) 4 ± 0 11 ± 7
AUCo-t (мкг-час/мл) 38,7 ± 7,4 2,444 ± 394
AUCo-o (мкг-час/мл) 39,0 ± 7,3 2,472 ± 388
CL/F (мл/час/кг) 47,5 ± 9,0 37,04 ± 4,78
Тш(час) 10,00 ± 1,47 9,85 ± 1,07
Vz/F (мл/кг) 701 ±236 529 ±104
[0259] AUCo-t и AUCo-oo были весьма сходными, что дает возможность предполагать, что продолжительность взятия образцов была адекватной для характеристики фармакокинетических профилей. Стах была пропорциональной дозе. Ттах было более поздним при более высокой дозе. Ттах составило 4 часа для всех животных в группе низкой дозы и составило 8 или 24 часа в группе высокой дозы. Терминальные полупериоды жизни для этих двух групп доз были сходными.
[0260] AUC была приблизительно пропорциональной дозе с несколько большей, чем пропорциональной AUC при более высокой дозе, дающей слегка более низкое значение для CL/F и Vz/F по сравнению с более низкой дозой. Невозможно сказать, являются ли CL и Vz более низкими при более высокой дозе, или является ли F более низким при более низкой дозе. Существовало перекрывание между группами, так что остается под вопросом, представляет ли это значимое различие в CL/F и Vz/F.
[0261] Фармакокинетические параметры, установленные при помощи модели, были весьма схожими с теми, которые были получены при некомпартментном анализе. Полупериоды абсорбции и элиминации показаны в Таблице 9 ниже.
[0262] Таблица 9: Значения полупериодов абсорбции и элиминации CTP-hGH-CTP-CTP (среднее ± стандартное отклонение) после подкожной инъекции, полученные в результате фармакокинетического моделирования у макак-резус
Доза Ti/2 абс (час) Т1/2эл(час)
1,8 мг/кг 1,17 ±0,40 10,41 ±2,36
90 мг/кг 6,49 ± 1,87 7,26 ± 1,85
[0263] Данные указывают на то, что уровни элиминации весьма схожи между группами со слегка более длительным Т1/2 элиминации в группе с более низкой дозой. Абсорбция, однако, в более чем пять раз медленнее после подкожного введения 90 мг/кг по сравнению с абсорбцией после 1,8 мг/кг. Как и в случае некомпартментного анализа, моделирование указывает на более позднее Ттах при высокой дозе.
[0264] ХОТЯ добавка соматотропного гормона и эффективна при лечении дефицита соматотропного гормона у детей и взрослых, неудобство ежедневных инъекций в течение продолжительных периодов времени ограничивает ее использование врачами у определенных групп пациентов наряду с повышением ошибки дозирования, количества лиц, обслуживающих пациента, стоимости лечения и/или отсутствия приверженности к лечению. Необходимость приверженности к лечению особенно важна в определенных популяциях, таких как дети с низким ростом, которые могут не понимать последствий несоблюдения режима дозирования соматотропного гормона для достижения оптимальной выгоды от лечения соматотропным гормоном. Вопрос поиска более подходящей альтернативы ежедневным инъекциям соматотропного гормона и последующей приверженности к лечению имеет дальнейшую важность, когда дети, дефицитные по соматотропному гормону, превращаются во взрослых с продолжающейся необходимостью в лечении соматотропным гормоном. Потребность в ежедневном лечении происходит в большей степени из-за короткого полупериода жизни рекомбинантного соматотропного гормона в плазме, и она привела к разработке формы соматотропного гормона с пролонгированным действием (Reiter ЕО. Attire KM., Mashing TJ. Silverman BL. Kemp SF. Neolith RB. Ford KM. and Sanger P. A multimember study of the efficacy and safety of sustained release GH in the treatment of naive pediatric patients with GH deficiency. J. Clin. Endocrinol. Metab. 86 (2001), pp. 4700-4706).
[0265] Гибридный белок GH-CTP, рекомбинантного соматотропного гормона человека-СТР, как предоставляется здесь, у крысы имеет фармакокинетический профиль, более длинный по продолжительности, чем таковой у соматотропного гормона. Этот
уникальный фармакокинетический профиль дает возможность проводить прерывистое введение GH-CTP для достижения фармакодинамических эффектов у крысы, дефицитной по соматотропному гормону, о чем свидетельствуют, соответственно, рост и повышения уровней IGF-1 в плазме. 5 [0266] GH-CTP предлагает наилучший фармакокинетический профиль по сравнению с таковым у соматотропного гормона при подкожном введении у крысы. Существуют существенные отличия в клиренсе в плазме у GH-CTP по сравнению с соматотропным гормоном. В частности, плазма освобождается от GH-CTP в более чем 6 раз медленнее, чем от соматотропного гормона после подкожной дозировки. Терминальный полупериод 10 жизни и среднее время удержания GH-CTP были приблизительно в шесть раз длиннее, чем таковые у соматотропного гормона у крыс после подкожного введения. В дополнение C1/F после подкожной дозировки в 10 раз ниже для GH-CTP, чем для соматотропного гормона.
[0267] В попытке исследовать, переносятся ли фармакокинетические преимущества у
15 крысы в фармакодинамическую выгоду, возможность того, что GH-CTP может стимулировать рост у крыс с удаленным гипофизом, дефицитных по соматотропному гормону, путем режимов дозировки, менее частых, чем ежедневные, была исследована при эквимолярных уровнях доз CTP-hGH-CTP-CTP и соматотропного гормона. Однократная подкожная инъекция GH-CTP стимулировала возрастающую прибавку веса,
20 которая была равной 4 ежедневным последовательным инъекциям соматотропного гормона. В дополнение каждый четвертый день графика введения GH-CTP демонстрирует усиленную прибавку веса по сравнению с соматотропным гормоном. [0268] Фармакодинамически длительный период времени циркулирования GH-CTP по сравнению с соматотропным гормоном у крыс с удаленным гипофизом привел в
25 результате к более длительному ответу IGF-1, измеренному в плазме крови после однократной подкожной инъекции. Подкожное введение однократной дозы GH-CTP повышало концентрации циркулирующего IGF-1 дозозависимым способом у крыс с удаленным гипофизом. При наивысшей дозе альбутропина концентрации IGF-1 были повышены свыше исходного уровня в течение 75 часов после однократного введения.
30 Таким образом, повышенное время циркулирования однократной дозы GH-CTP приводило в результате к значительному фармакодинамическому улучшению по сравнению с однократной дозой соматотропного гормона, повышая возможность того, что GH-CTP может предложить подобное усиление роста и снижение жира тела с пониженной частотой дозирования по сравнению со стандартными режимами лечения соматотропным
35 гормоном.
[0269] Однократные дозы hGH, модифицированного посредством СТР, в 90мг/кг у макак-резус и 180 мг/кг у крыс хорошо переносились у обоих видов. Аллометрический фактор между крысами и приматами составляет приблизительно Х2, что основано на предполагаемом клиренсе белков у этих животных. В соответствии с принятыми 5 индустрией экстраполяционными моделями для терапевтических целей, полупериоды жизни белков повышаются среди видов (Руководство FDA). 90 мг/кг у приматов имеет немного лучший ФК профиль, чем 180 мг/кг hGH, модифицированного посредством СТР, у крысы. Таким образом, аллометрическая экстраполяция на людей поддерживает инъекцию раз в неделю или раз в две недели.
10 [0270] Настоящая методология, использующая конструкт CTP-GH, снизила частоту дозирования по сравнению с коммерческим продуктом - рекомбинантным соматотропным гормоном. Nutropin Depot(r) представляет собой состав соматотропного гормона с пролонгированным действием, утвержденный для использования в педиатрической популяции; однако сравнение с историческими контролями выявило, что
15 1- и 2-летние скорости роста значительно (р <0,001) ниже у детей, принимавших Nutropin Depot(r) (1-летняя скорость роста 8,2±1,8 см/год), чем у детей, леченных соматотропным гормоном (однолетняя скорость роста 10,1±2,8 см/год) (Silverman BL. Blethen SL. Reiter EO. Attie KM. Neuwirth RB. and Ford KM. A long-acting human growth hormone (Nutropin Depot(r)): efficacy and safety following two years of treatment in children with growth hormone.
20 J. Pediatr. Endocrinol. Metab. 15 (2002), pp. 715-722). Местные эффекты от подкожного введения Nutropin Depot(r) включают узелки, эритему, боль в месте инъекции, головную боль и рвоту. Доклинические токсикологические исследования как на крысах, так и на обезьянах показали, что подкожное введение CTP-hGH-CTP-CTP не вызывает никаких местных реакций по сравнению с носителем. С учетом медицинской потребности в менее
25 часто вводимой форме соматотропного гомона, фармакологические свойства CTP-hGH-CTP-CTP в этом исследовании у крыс свидетельствуют о том, что данный продукт также благоприятен в отношении токсикологии и приверженности пациента. Продолжительная активность CTP-hGH-CTP-CTP у крысы свидетельствует о его потенциальной полезности в качестве агента, который требует только прерывистого введения для получения
30 терапевтической выгоды, которая в настоящее время достигается путем ежедневного дозирования.
ПРИМЕР 9
Пролонгированная модифицированная посредством СТР версия соматотропного гормона человека (hGH-CTP) была высокоэффективной у взрослых, дефицитных по соматотропному гормону. - Клиническое исследование Фазы II
[0271] Было проведено рандомизированное, открытое клиническое исследование Фазы II 5 для оценки безопасности, переносимости, фармакокинетики и фармакодинамических свойств hGH-CTP, инъецируемого либо один раз в неделю, либо два раза в месяц у пациентов, которые в настоящее время получают ежедневные инъекции соматотропного гормона. Исследование было проведено в нескольких центрах в шести странах. Три основные когорты в исследовании получали однократную недельную дозу hGH-CTP,
10 содержащую 30%, 45% или 100% эквивалента кумулятивной дозы коммерческого hGH, которую взрослые пациенты, дефицитные по соматотропному гормону, получают в течение семидневного курса в форме ежедневных инъекций (называются, соответственно, как "30%", "45%" и "100%" когорты). Данные отражают результаты, полученные у 39 пациентов, по 13 в каждой когорте. В каждую когорту были включены
15 по 2 женщины.
[0272] В дополнение к трем основным когортам взрослые, дефицитные по соматотропному гормону, были включены в экспериментальную четвертую когорту, которая проводилась вне формального исследования Фазы П. Пациенты в экспериментальной четвертой когорте получают однократную инъекцию hGH-CTP один 20 раз в две недели, содержащую 50% кумулятивной дозы того коммерческого препарата, который пациенты, дефицитные по соматотропному гормону, получают в двухнедельный период в форме ежедневных инъекций.
[0273] Эффективность для трех основных когорт, получавших однократную еженедельную инъекцию hGH-CTP, определяется путем измерения ежедневных уровней
25 инсулиноподобного ростового фактора 1 (IGF-1) в желательном терапевтическом диапазоне в период семи дней (в течение последней недели лечения в исследовании). Желательный терапевтический диапазон определен как находящийся в пределах от +2 стандартных отклонений вплоть до минус 2 стандартных отклонений от средних уровней IGF-1, рассчитанных в нормальной популяции, стратифицированной на группы по
30 возрасту и полу. В дополнение клиническое исследование измеряло уровни IGF-1 в более узком диапазоне, составляющем +/- 1,5 стандартное отклонение, с целью наблюдения разброса у пациентов в пределах нормального диапазона.
Результаты:
[0274] Таблица 10 содержит средний процент дней в пределах нормального терапевтического диапазона (+/- 2 стандартных отклонения), средний процент дней в пределах более узкого нормального терапевтического диапазона (+/- 1,5 стандартное отклонение) и среднюю Стах (наивысший уровень концентрации) IGF-1 для мужчин, 5 измеренные в течение последней недели лечения, выраженные в стандартных отклонениях от средних значений уровней IGF-1 нормальной популяции.
[0275] Два мг в неделю hGH-CTP, содержащего 50% кумулятивной недельной дозы hGH, 10 которая обычно назначалась бы взрослому пациенту в качестве дозы стартовой терапии, имеет высокую вероятность быть определенной в качестве стартовой дозы для мужчин и женщин во взрослой фазе III.
[0276] Не существует данных, касающихся вопросов безопасности и/или переносимости, и никаких указаний на то, что hGH-CTP при использовании в высоких дозах вызывал 15 чрезмерные уровни IGF-1 у пациентов или даже уровни, превышающие нормальный диапазон.
[0277] Хотя здесь были проиллюстрированы и описаны определенные характеристики изобретения, многие модификации, замещения, изменения и эквиваленты сейчас станут очевидными обычному специалисту в данной области техники. Поэтому следует 20 понимать, что прилагаемые пункты формулы изобретения предназначены охватить все подобные модификации и изменения как подпадающие под действие истинного характера изобретения.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ПРОЛОР БАЙОТЕК ЛТД.
<120> СОМАТОТРОПНЫЙ ГОРМОН ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ И СПОСОБЫ ЕГО
ПОЛУЧЕНИЯ
<130> Р-9520-РС4
<140> PCT/US12/999999
<141> 2012-08-01
<150> 12/476,916
<151> 2009-06-02
<150> 13/195,931
<151> 2011-08-02
<150> 12/509,188
<151> 2009-07-24
<150> 12/476,916
<151> 2009-06-02
<150> 12/401,746
<151> 2009-03-11
<150> 11/700,910
<151> 2007-02-01
<150> 60/764,761
<151> 2006-02-03
<160> 26
<170> Патентная версия 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Pro Arg Phe Gin Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
15 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu
20 25 30
Gin
<210> 2
<211> 28
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
15 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro lie Leu Pro Gin 20 25
<210> 3
<211> 26
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala 20 25
<210> 4
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro 15 10
<210> 5
<211> 217
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr lie Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr lie Pro Lys
50 55 60
Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser Leu Leu Leu lie Gin Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly lie Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gin lie Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg lie Val Gin Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 210 215
<210> 6
<211> 192
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
15 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr lie Pro Lys Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn
35 40 45
Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser lie Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg lie Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu lie Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly lie Gin Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin lie Phe Lys Gin Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg lie Val Gin Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 7
<211> 25
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 7
Met Phe Pro Thr lie Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
15 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala 20 25
<210> 8
<211> 217
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 8
Met Ala Thr Gly 1
Cys Leu Pro Trp 20
Ser Arg Leu Phe 35
Leu Ala Phe Asp 50
Val Gin Lys Tyr 65
Ser Glu Ser lie
Ser Asn Leu Glu 100
Leu Glu Pro Val 115
Tyr Gly Ala Ser 130
Glu Gly He Gin 145
Thr Gly Gin He
His Asn Asp Asp 180
Arg Lys Asp Met 195
Arg Ser Val Glu 210
Ser Arg Thr Ser 5
Leu Gin Glu Gly
Asp Asn Ala Met 40
Thr Tyr Gin Glu 55
Ser Phe Leu Gin 70
Pro Thr Pro Ser 85
Leu Leu Arg He
Gin Phe Leu Arg 120
Asp Ser Asn Val 135
Thr Leu Met Gly 150
Phe Lys Gin Thr 165
Ala Leu Leu Lys
Asp Lys Val Glu 200
Gly Ser Cys Gly 215
Leu Leu Leu Ala 10
Ser Ala Phe Pro 25
Leu Arg Ala His
Phe Glu Glu Ala 60
Asn Pro Gin Thr 75
Asn Arg Glu Glu 90
Ser Leu Leu Leu 105
Ser Val Phe Ala
Tyr Asp Leu Leu 140
Arg Leu Glu Asp 155
Tyr Ser Lys Phe 170
Asn Tyr Gly Leu 185
Thr Phe Leu Arg Phe
Phe Gly Leu Leu 15
Thr He Pro Leu 30
Arg Leu His Gin 45
Tyr He Pro Lys
Ser Leu Cys Phe 80
Thr Gin Gin Lys 95
He Gin Ser Trp 110
Asn Ser Leu Val 125
Lys Asp Leu Glu
Gly Ser Pro Arg 160
Asp Thr Asn Ser 175
Leu Tyr Cys Phe 190
He Val Gin Cys 205
<210> 9
<211> 245 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400> 9
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr He Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr He Pro Lys
50 55 60
Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser He Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg He Ser Leu Leu Leu He Gin Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly He Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gin He Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg He Val Gin Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu 210
Pro Pro Ser Leu 225
Pro He Leu Pro
Gly Ser Cys Gly 215
Pro Ser Pro Ser 230
Gin 245
Phe Ser Ser Ser 220
Arg Leu Pro Gly 235
Ser Lys Ala Pro
Pro Ser Asp Thr 240
<210> 10
<211> 273
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr He Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr He Pro Lys
50 55 60
Glu Gin Lys Tyr Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser He Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg He Ser Leu Leu Leu He Gin Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly He Gin Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gin He Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg He Val Gin Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
210 215 220
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
225 230 235 240
Pro He Leu Pro Gin Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro He Leu Pro
260 265 270
Gin
<210> 11
<211> 301
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 11
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro He Leu 50
Asp Asn Ala Met 65
Thr Tyr Gin Glu
Ser Phe Leu Gin 100
Pro Thr Pro Ser 115
Leu Leu Arg He 130
Gin Phe Leu Arg 145
Asp Ser Asn Val
Thr Leu Met Gly 180
Phe Lys Gin Thr 195
Ala Leu Leu Lys 210
Asp Lys Val Glu 225
Gly Ser Cys Gly
Pro Ser Pro Ser 260
Gin Ser Ser Ser 275
Pro Gin Phe Pro 55
Leu Arg Ala His 70
Phe Glu Glu Ala 85
Asn Pro Gin Thr
Asn Arg Glu Glu 120
Ser Leu Leu Leu 135
Ser Val Phe Ala 150
Tyr Asp Leu Leu 165
Arg Leu Glu Asp
Tyr Ser Lys Phe 200
Asn Tyr Gly Leu 215
Thr Phe Leu Arg 230
Phe Ser Ser Ser 245
Arg Leu Pro Gly
Ser Lys Ala Pro 280
Thr He Pro Leu 60
Arg Leu His Gin 75
Tyr He Pro Lys 90
Ser Leu Cys Phe 105
Thr Gin Gin Lys
He Gin Ser Trp 140
Asn Ser Leu Val 155
Lys Asp Leu Glu 170
Gly Ser Pro Arg 185
Asp Thr Asn Ser
Leu Tyr Cys Phe 220
He Val Gin Cys 235
Ser Lys Ala Pro 250
Pro Ser Asp Thr 265
Pro Pro Ser Leu
Ser Arg Leu Phe
Leu Ala Phe Asp 80
Glu Gin Lys Tyr 95
Ser Glu Ser He 110
Ser Asn Leu Glu 125
Leu Glu Pro Val
Tyr Gly Ala Ser 160
Glu Gly He Gin 175
Thr Gly Gin He 190
His Asn Asp Asp 205
Arg Lys Asp Met
Arg Ser Val Glu 240
Pro Pro Ser Leu 255
Pro He Leu Pro 270
Pro Ser Pro Ser 285
Arg Leu Pro Gly Pro 290
<210> 12
<211> 285
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Ala Thr Gly Ser 1 5 Cys Leu Pro Trp Leu 20
Pro Pro Pro Ser Leu 35
Asp Asn Ala Met Leu 50
Thr Tyr Gin Glu Phe 65
Ser Phe Leu Gin Asn 85
Pro Thr Pro Ser Asn 100
Leu Leu Arg He Ser 115
Gin Phe Leu Arg Ser 130
Asp Ser Asn Val Tyr 145
Thr Leu Met Gly Arg 165
Ser Asp Thr Pro He Leu Pro Gin 295 300
Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
10 15 Gin Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
25 30 Pro Phe Pro Thr He Pro Leu Ser Arg Leu Phe
40 45 Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp
55 60
Glu Glu Ala Tyr He Pro Lys Glu Gin Lys Tyr
70 75 80
Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser He
90 95 Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu
105 110 Leu Leu Leu He Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val
120 125 Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
135 140
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly He Gin
150 155 160
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin He 170 175
Phe Lys Gin Thr Tyr 180
Ala Leu Leu Lys Asn 195
Asp Lys Val Glu Thr 210
Gly Ser Cys Gly Phe 225
Pro Ser Pro Ser Arg 245
Gin Ser Ser Ser Ser 260
Arg Leu Pro Gly Pro 275
Ser Lys Phe Asp Thr 185
Tyr Gly Leu Leu Tyr 200
Phe Leu Arg He Val 215
Ser Ser Ser Ser Lys 230
Leu Pro Gly Pro Ser 250
Lys Ala Pro Pro Pro 265
Ser Asp Thr Pro He 280
Asn Ser His Asn Asp Asp 190
Cys Phe Arg Lys Asp Met 205
Gin Cys Arg Ser Val Glu 220
Ala Pro Pro Pro Ser Leu 235 240 Asp Thr Pro He Leu Pro 255
Ser Leu Pro Ser Pro Ser 270
Leu Pro Gin 285
<210> 13
<211> 273
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro He Leu Pro Gin Phe Pro Thr He Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gin Glu
Ser Phe Leu Gin 100
Pro Thr Pro Ser 115
Leu Leu Arg He 130
Gin Phe Leu Arg 145
Asp Ser Asn Val
Thr Leu Met Gly 180
Phe Lys Gin Thr 195
Ala Leu Leu Lys 210
Asp Lys Val Glu 225
Gly Ser Cys Gly
Pro Ser Pro Ser 260
Gin
Phe Glu 85
Asn Pro
Asn Arg
Ser Leu
Ser Val 150 Tyr Asp 165
Arg Leu
Tyr Ser
Asn Tyr
Thr Phe 230 Phe Ser 245
Arg Leu
Glu Ala
Gin Thr
Glu Glu 120 Leu Leu 135
Phe Ala
Leu Leu
Glu Asp
Lys Phe 200 Gly Leu 215
Leu Arg Ser Ser Pro Gly
Tyr He 90
Ser Leu 105
Thr Gin
He Gin
Asn Ser
Lys Asp 170 Gly Ser 185
Asp Thr
Leu Tyr
He Val
Ser Lys 250 Pro Ser 265
Pro Lys
Cys Phe
Gin Lys
Ser Trp 140 Leu Val 155
Leu Glu
Pro Arg
Asn Ser
Cys Phe 220 Gin Cys 235
Ala Pro Asp Thr
Glu Gin
Ser Glu 110 Ser Asn 125
Leu Glu
Tyr Gly
Glu Gly
Thr Gly 190 His Asn 205
Arg Lys
Arg Ser
Pro Pro
Pro He 270
Lys Tyr 95
Ser He
Leu Glu
Pro Val
Ala Ser 160 He Gin 175
Gin He
Asp Asp
Asp Met
Val Glu 240 Ser Leu 255
Leu Pro
<210> <211>
<212>
14 245
БЕЛОК
<213> Homo sapiens <400> 14
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
15 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gin Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro He Leu Pro Gin Phe Pro Thr He Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gin Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gin Glu Phe Glu Glu Ala Tyr He Pro Lys Glu Gin Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gin Asn Pro Gin Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser He
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gin Gin Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg He Ser Leu Leu Leu He Gin Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gin Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly He Gin
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gin He
180 185 190
Phe Lys Gin Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg He Val Gin Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe 245
<210> 15
<211> 853
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<400> 15
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct 120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac 180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct 240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag 300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa 360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat 42 0
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta 480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac 54 0
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta 600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct 660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag 72 0
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc 780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgcctcagt gatgaaggtc 840
tggatgcggc cgc 853
<210> 16
<211> 937
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
cagcctggtg
tacggcgcca
gcgacagcaa
cgtgtacgac
ctgctgaagg
acctggagga
480
gggcatccag
accctgatgg
gccggctgga
ggacggcagc
cccaggaccg
gccagatctt
540
caagcagacc
tacagcaagt
tcgacaccaa
cagccacaac
gacgacgccc
tgctgaagaa
600
ctacgggctg
ctgtactgct
tcagaaagga
catggacaag
gtggagacct
tcctgaggat
660
cgtgcagtgc
agaagcgtgg
agggcagctg
cggcttcagc
tccagcagca
aggcccctcc
720
cccgagcctg
ccctccccaa
gcaggctgcc
tgggccctcc
gacacaccaa
tcctgccaca
780
gagcagctcc
tctaaggccc
ctcctccatc
cctgccatcc
ccctcccggc
tgcctggccc
840
ctctgacacc
cctatcctgc
ctcagtgatg
aaggtctgga
tgcggccgc
889
<210> 18
<211> 19
<212> ДНК
HGH-CTP
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер Xbal для конструкции
<400> 18
ctctagagga catggccac
<210> 19
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 19
acagggaggt ctgggggttc tgca 24
<210> <211>
20 26 ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 20
tgcagaaccc ccagacctcc ctgtgc
<210> 21
<211> 22
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 21
ccaaactcat caatgtatct ta
<210> 22
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер Xbal для конструкции HGH-CTP
<400> 22
ctctagagga catggccac
<210> 23
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 23
cgaactcctg gtaggtgtca aaggc
<210> 24
<211> 25
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Прямой праймер Xbal для конструкции HGH-CTP
<400> 24
gcctttgaca cctaccagga gttcg
<210> 25
<211> 33
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 25
acgcggccgc atccagacct tcatcactga ggc
<210> 26
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Обратный праймер для конструкции HGH-CTP
<400> 26
gcggccgcgg actcatcaga agccgcagct gccc
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Способ стимулирования потери веса или снижения телесного жира у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом стимулируя потерю веса или снижение телесного жира у указанного субъекта.
2. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что последовательность по меньшей мере одного СТР кодируется аминокислотной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID N0: 2.
3. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид.
4. Способ по пункту 3, отличающийся тем, что последовательность указанного сигнального пептида содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID N0: 3.
5. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР гликозилирован.
6. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР процессирован.
7. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР присоединен к указанному соматотропному гормону через линкер.
8. Способ по пункту 7, отличающийся тем, что указанный линкер является пептидной связью.
9. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится один раз в неделю или один раз в две недели.
10. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе 0,05-7,2 мг/ введение.
11. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 2 мг/введение.
12. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 4 мг/введение.
13. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 1,2 мг/введение.
14. Способ по пункту 1, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится подкожно указанному субъекту.
15. Способ увеличения уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом увеличивая уровни IGF-1 у указанного субъекта.
16. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что последовательность по меньшей мере одного СТР кодируется аминокислотной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID N0: 2.
17. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид.
18. Способ по пункту 17, отличающийся тем, что указанный сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID N0: 3.
19. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится один раз в неделю или один раз в две недели.
20. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе 0,05-7,2 мг/ введение.
21. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 2 мг/введение.
22. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 4 мг/введение.
23. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 1,2 мг/введение.
24. Способ по пункту 15, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится подкожно указанному субъекту.
25. Способ снижения частоты приема соматотропного гормона у человека, содержащий этап присоединения одного карбоксиконцевого пептида (СТР) хорионического гонадотропина к аминоконцу указанного соматотропного гормона и двух СТР хорионического гонадотропина к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом снижая частоту приема соматотропного гормона.
26. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что последовательность по меньшей мере одного СТР кодируется аминокислотной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID N0: 2.
27. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что дополнительно содержит этап присоединения сигнального пептида к указанному аминоконцу СТР.
28. Способ по пункту 27, отличающийся тем, что указанный сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID N0: 3.
29. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится один раз в неделю или один раз в две недели.
30. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе 0,05-7,2 мг/введение.
31. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 2 мг/введение.
32. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 4 мг/введение.
33. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 1,2 мг/введение.
34. Способ по пункту 25, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится подкожно указанному субъекту.
35. Способ стимулирования роста или прибавки веса у человека, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, при этом указанный субъект является ребенком или подростком, таким образом стимулируя рост или прибавку веса у указанного субъекта.
36. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что последовательность по меньшей мере одного СТР кодируется аминокислотной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из SEQ ГО NO: 1 и SEQ ID NO: 2.
37. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид.
38. Способ по пункту 38, отличающийся тем, что последовательность указанного сигнального пептида содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.
39. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР гликозилирован.
40. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР процессирован.
41. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что по меньшей мере один СТР присоединен к указанному соматотропному гормону через линкер.
42. Способ по пункту 41, отличающийся тем, что указанный линкер является пептидной связью.
43. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится один раз в неделю или один раз в две недели.
44. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе 0,05-7,2 мг/введение.
45. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 2 мг/введение.
46. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 4 мг/введение.
47. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 1,2 мг/введение.
48. Способ по пункту 35, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится подкожно указанному субъекту.
49. Способ поддержания уровней инсулиноподобного ростового фактора (IGF-1) в нормальном терапевтическом диапазоне у субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества полипептида, содержащего соматотропный гормон, один карбоксиконцевой пептид (СТР) хорионического гонадотропина, присоединенный к аминоконцу указанного соматотропного гормона, и два СТР хорионического гонадотропина, присоединенных к карбоксильному концу указанного соматотропного гормона, таким образом поддерживая IGF-I в нормальном терапевтическом диапазоне у указанного субъекта.
50. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что последовательность по меньшей мере одного СТР кодируется аминокислотной последовательностью, отобранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ Ш NO: 2.
51. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный полипептид дополнительно содержит сигнальный пептид.
52. Способ по пункту 51, отличающийся тем, что указанный сигнальный пептид содержит аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 3.
53. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится один раз в неделю или один раз в две недели.
54. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе 0,05-7,2 мг/введение.
55. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 2 мг/введение.
56. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 4 мг/введение.
57. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится в дозе приблизительно 1,2 мг/введение.
58. Способ по пункту 49, отличающийся тем, что указанный соматотропный гормон вводится подкожно указанному субъекту.
По доверенности
<212>
<212>
<212>
|
