EA201490053A1 20140829 Номер и дата охранного документа [PDF] EAPO2014\PDF/201490053 Полный текст описания [**] EA201490053 20120709 Регистрационный номер и дата заявки US61/506,491 20110711 Регистрационные номера и даты приоритетных заявок IB2012/053502 Номер международной заявки (PCT) WO2013/008171 20130117 Номер публикации международной заявки (PCT) EAA1 Код вида документа [pdf] eaa21408 Номер бюллетеня [**] АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С OX40, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Название документа [8] A61P 37/06, [8] A61K 39/395, [8] C07K 16/28 Индексы МПК [CH] Аттингер Антуан, [CH] Блейн Станислас, [CH] Бэк Джонатан Альберт, [CH] Лиссилаа Рами, [CH] Хоу Самюэль Сведения об авторах [CH] ГЛЕНМАРК ФАРМАСЬЮТИКАЛС С.А. Сведения о заявителях
 

Патентная документация ЕАПВ

 
Запрос:  ea201490053a*\id

больше ...

Термины запроса в документе

Реферат

[RU]

Изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека. Более конкретно, изобретение относится к антагонистичному антителу или его фрагменту, которые связываются с ОХ40 человека и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 4, и/или CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 6.


Полный текст патента

(57) Реферат / Формула:

Изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека. Более конкретно, изобретение относится к антагонистичному антителу или его фрагменту, которые связываются с ОХ40 человека и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 4, и/или CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 6.


Евразийское (21) 201490053 (13) A1
патентное
ведомство
(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОЙ ЗАЯВКЕ
(43) Дата публикации заявки 2014.08.29
(22) Дата подачи заявки 2012.07.09
(51) Int. Cl.
A61P37/06 (2006.01) A61K39/395 (2006.01) C07K16/28 (2006.01)
(54) АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С OX40, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(31) (32)
61/506,491
2011.07.11
(33) US
(86) PCT/IB2012/053502
(87) WO 2013/008171 2013.01.17 (71) Заявитель:
(72)
ГЛЕНМАРК ФАРМАСЬЮТИКАЛС С.А. (CH)
Изобретатель:
Аттингер Антуан, Блейн Станислас, Бэк Джонатан Альберт, Лиссилаа Рами, Хоу Самюэль (CH)
(74)
Представитель: Нилова М.И. (RU)
(57) Изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека. Более конкретно, изобретение относится к антагонистичному антителу или его фрагменту, которые связываются с ОХ40 человека и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 4, и/или CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID No: 5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно
SEQ ID No: 6.
Антитела, которые связываются с ОХ40, и их применение
Родственные заявки
В настоящей заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки на патент Соединенных Штатов Америки с № 61/506 491, поданную 11 июля 2011 г.; всё содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека. Более конкретно, настоящее изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, и/или, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQID№:6.
Уровень техники
ОХ40 является членом TNFR-суперсемейства рецепторов и впервые был
идентифицирован в 1987 г. в форме гликопротеина с массой 50 кДа, экспрессируемого
активированными CD4+ Т-лимфоцитами у крысы (Paterson DJ et al., (1987) Mol. Immunol.
24: 1281-90). Внеклеточный лиганд-связывающий домен ОХ40 состоит из 3 полных
богатых цистеином доменов (CRD) и неполного четвертого С-концевого CRD (Bodmer JL
et al, (2002) Trends Biochem. Sci. 27: 19-26). Лигандом для OX40 служит OX40L (CD252),
и три копии ОХ40 связываются с тримерным лигандом, образуя комплекс OX40-OX40L
(Compaan DM & Hymowitz SG (2006) Structure, 14: 1321-1330). OX40 представляет собой
мембраносвязанный рецептор; однако также была выявлена растворимая изоформа
(Taylor L & Schwarz Н (2001) J. Immunol. Methods, 255: 67-72). В отличие от CD28 ОХ40
не демонстрирует конститутивную экспрессию в непримированных (naive) Т-лимфоцитах,
а их экспрессия индуцируется после вовления рецептора Т-лимфоцитов (TCR). ОХ40
является вторичной ко-стимулирующей молекулой, экспрессируемой через 24 -72 часа
после активации; его лиганд - OX40L - также не экспрессируется в покоящихся антиген-
К заявке №201490053
презентирующих клетках, а экспрессируется после их активации. ОХ40 экспрессируется главным образом активированными CD4+ Т-лимфоцитами и, в ограниченной степени, активированными CD8+ Т-лимфоцитами (Salek-Ardakani S et al, (2006) Curr. Immunol. Rev. 2: 37-53).
Краткое описание изобретения
Настоящее описание относится в целом к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека, способам их получения и применения, включая способы лечения расстройств, опосредованных ОХ40. Антагонистичные антитела или их фрагменты согласно настоящему изобретению, которые связываются с ОХ40 человека, являются антагонистичными антителами и не демонстрируют агонистичных эффектов и/или не активируют ОХ40 человека при связывании.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или фрагмент указанного антитела, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, и/или, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:6.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или фрагмент указанного антитела, которые связываются с ОХ40 человека и содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 7. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека и содержат вариабельную каркасную область, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGHV2-70*10 (SEQ Ш №: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID №: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID №: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID №: 22) и IGHV2-70*11 (SEQ Ш №: 23).
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые содержат каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 32, и при этом указанный каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области тяжелой цепи соответствующего антитела мыши.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 8. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат последовательность каркасного участка вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26), IGKV3-11*02 (SEQ Ш №: 27) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28).
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, содержащие каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), и при этом указанный каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего антитела мыши.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40
человека, и содержат последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат:
(a) последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 37 и 38; и
(b) последовательность легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 47.
Согласно ещё одному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58, 59, 79 и 80. Согласно ещё одному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 60, 86, 87 и 89.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 58 или 59; и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 60.
Согласно ещё одному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, причем указанное антитело содержит область Fc IgG4 человека, и при этом указанное антитело не обладает Fc-обусловленной цитотоксичностью. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, причем указанное антитело содержит область Fc IGHG1 человека, и при этом указанное антитело функционально в отношении механизмов цитотоксичности, таких как
антител озависимая клеточно опосредованная цитотоксичность (ADCC). Согласно предпочтительному аспекту указанное антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат нефукозилированную область Fc IGHG1 и проявляют усиленные Fc-обусловленные механизмы цитотоксичности, такие как ADCC.
Согласно ещё одному аспекту в описании настоящего изобретения также раскрыты антагонистичные гуманизированные антитела или их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека с таким же сродством, как соответствующее химерное антитело, например, сохраняют по меньшей мере 75% сродства связывания с ОХ40 (KD) ПО сравнению со сродством соответствующего химерного антитела или обладают по меньшей мере таким же или более высоким сродством связывания с ОХ40 (KD) ПО сравнению со сродством соответствующего химерного антитела. Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с эпитопом во втором домене внеклеточной области ОХ40 человека.
В соответствии с настоящим изобретением также предложены выделенные нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела и их фрагменты, связывающиеся с ОХ40 человека, векторы и клетки-хозяева, содержащие указанную нуклеиновую кислоту или вектор. Также предложены композиции, содержащие указанное антагонистичное антитело или его фрагмент и фармацевтически приемлемую основу, и иммуноконъюгаты, содержащие указанное антагонистичное антитело или его фрагмент, в связи с терапевтическим агентом.
В описании настоящего изобретения также предложены способы лечения расстройств, опосредованных ОХ40. Согласно одному аспекту в модели активации и пролиферации аллореактивных Т-лимфоцитов in vitro (реакция смешанной культуры лимфоцитов; MLR) антагонистичное антитело или его фрагмент эффективно ингибируют MLR у двух разных индивидуумов (субъекты, у которых достигнут лечебный эффект) со значением ЭК50 приблизительно 100 нг/мл. Кроме того, в модели реакции ксеногенного трансплантата против хозяина, в модели болезни "аллогенный трансплантат против хозяина" (GVHD), наблюдаемой после пересадки костного мозга у пациентов, антагонистичное антитело или его фрагмент оказывали мощное угнетающее действие на реакцию GVHD.
Также в соответствии с настоящим изобретением предложены наборы и готовые изделия, содержащие указанное антитело или его фрагмент, композицию или иммуноконъюгат для лечения ОХ40-опосредованного расстройства.
Краткое описание фигур
Фигура 1: (А) ELISA-анализ с прямым связыванием иммобилизованного рекомбинантного OX40-his человека. Связывание химерных антител 2F8 и 1D4 с ОХ40 человека измеряли при помощи прямого ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Разные концентрации (в диапазоне от 10 до 0,01 мг/мл) 1D4 (диаграмма с черными столбиками) и 2F8 (диаграмма с белыми столбиками) инкубировали с 2 мг/мл рекомбинантного OX40-his, меченного и в белковой оболочке, в течение ночи при 4°С в планшете на 96 лунок. Связывание каждого антитела с ОХ40 определяли при помощи конъюгированного с пероксидазой хрена (FffiP) антитела против иммуноглобулина человека. (В) Конкурентный ELISA иммобилизованного рекомбинантного OX40-his человека. Ингибиторные эффекты химерных антител 2F8 и 1D4 на взаимодействие OX40/OX40L оценивали при помощи блокирующего ELISA. Разные концентрации (в диапазоне от 10 до 0,01 мг/мл) 1D4 (диаграмма с черными столбиками) и 2F8 (диаграмма с белыми столбиками) инкубировали с 2 мг/мл рекомбинантного OX40-Fc, меченного и в белковой оболочке, в течение ночи при 4°С в планшете на 96 лунок. Через пять минут в каждую лунку добавляли биотинилированный рекомбинантный OX40L человека в фиксированной концентрации (0,04 мг/мл) и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. Связывание OX40L с ОХ40 определяли при помощи стрептавидина-HRP.
Фигура 2: Односторонняя реакция смешанной культуры лимфоцитов (MLR), измеряемая по включению 3Н-тимидина. Столбцы диаграммы отражают среднее включение 3Н-тимидина (количество импульсов) для по меньшей мере трех измерений ± среднеквадратическую ошибку среднего. Показаны контроль изотипа (трастузумаб) и положительный контроль (эфализумаб). Эффектор действителен только для эффекторных клеток. "Эффектор + мишень" соответствует измерению, где антитела не добавляли.
Фигура 3: Проточная цитометрия в целях анализа химерного антитела 1D4
(А) Окрашивание активированных мононуклеарных клеток периферической крови
(РВМС) и клеток HPB-ALL. На графиках показана интенсивность флуоресценции (ось
X) и относительное количество клеток (% от максимума событий - ось Y). Указан тип окрашенных клеток. РВМС человека активировали при помощи фитогемагглютинина (РНА) и интерлейкмина-2 (IL-2) в течение 48 часов перед измерением. (В) Окрашивание активированных РВМС яванской макаки. Связывание химерного антитела 1D4 с ОХ40 яванского макака оценивали посредством проточной цитометрии. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли из цельной крови яванского макака, и культивировали 3x106 клеток в течение 50 часов в присутствии 10 мг/кг РНА и 100 Е/мл rhuIL-2. Актированные РВМС инкубировали с 25 мг/мл контрольного антитела (верхний график (i)) либо биотинилированного овечьего антитела к ОХ40 человека (средний график (ii)), либо биотинилированного химерного антитела 1D4 (нижний график (in)). Связывание каждого антитела с ОХ яванской макаки определяли при помощи стрептавидина-АРС.
Фигура 4: Поверхностный плазменный резонанс для измерения анти-ОХ40 антител.
Данные выражены как количество откликов (сокращенно RU; ось Y) от времени (ось X). ФИГ. 4А - антитела VH1/VL1 по сравнению с химерой 1D4.
ФИГ. 4В - гуманизированные антитела на основе VH1, VH2 и VH3 (как указано) по сравнению с химерой 1D4.
ФИГ. 4С - примеры антител, которые связываются плохо: VH4/VL4, VH5/VL4, VH5/VL5 и VH5/VL6.
ФИГ. 4D - примеры антител, которые связываются слабо (VH5/VL9 и VH4/VL9) и
связываются хорошо (VH6/VL9 и VH7/VL9).
ФИГ. 4Е - гуманизированные антитела на основе VH7.
ФИГ. 4F - VH6/VL9 обладает наилучшими свойствами связывания по сравнению с химерой 1D4 и гуманизированным вариантом VH7/VL9.
Фигура 5: Выравнивание последовательностей. Выравнивание вариабельных областей тяжелой цепи (ФИГ. 5А) или легкой цепи (ФИГ. 5В) антитела 1D4 с избранными каркасными областями антител эмбрионального типа (IGHV 2-70*10 (SEQ ID №: 19) и IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24)) из Иммуногенетической базы данных и мутированными к первоначальному виду вариантами вариабельных областей (VH1 (SEQ ID №: 29), VH2 (SEQ ID №: 77), VH3 (SEQ ID №: 78), VH4 (SEQ ID №: 79), VH5 (SEQ Ш №: 80), VH6 (SEQ ID №: 58), VH7 (SEQ ID №: 59), (VL1 (SEQ ID №: 30), VL2 (SEQ ID №: 81), VL3 (SEQ ID №: 82), VL4 (SEQ ID №: 83), VL5 (SEQ ID №: 84), VL6 (SEQ ID №: 85), VL7 (SEQ
ID №: 86), VL8 (SEQ ID №: 87), VL9 (SEQ ID №: 60) VL10 (SEQ ID №: 88), VL11 (SEQ ID №: 89).
Фигура 6: Измерение термостабильности гуманизированного фрагмента FAB анти-ОХ40 анти-антитела VH6/VL9 при помощи дифференциальной сканирующей калориметрии. Данные выражены как добавочная мольная теплоемкость (сокращенно Ср [ккал/моль/°С]; ось Y) в зависимости от температуры (ось X).
Фигура 7: Описание свойств эпитопа. На данной фигуре показан эпитоп гуманизированного анти-ОХ40 анти-антитела VH6/VL9 по результатам ELISA, который описан в Примере 7.
Фигура 8: Реакция смешанной культуры лимфоцитов (MLR), измеряемая по включению Н-тимидина. На ФИГ. 8А и 8В показаны результаты оценки реакции смешанной культуры лимфоцитов от двух неродственных доноров. Пролиферацию измеряли по включению 3Н-тимидина. На графиках показаны абсолютные значения импульсов для каждого состояния ± СКО. Клетками субъектов, отвечающих на лечение, были необработанные РВМС, стимулирующими клетками были РВМС, обработанные митомицином. Все условия для тестируемых антител применяли в отношении клеток субъектов, отвечающих на лечение, в смеси с гетерологичными стимулирующими РВМС. Положительным контролем служил эфализумаб (анти-LFA-l антитело).
Фигура 9: Модель реакции ксеногенного трансплантата против хозяина. На данной фигуре показан процент выживания в группах из восьми животных при каждом из упоминаемых условий. Носитель: только ФСБ (фосфатно-солевой буфер). Вертикальная пунктирная линия указывает последний день лечения. В группе из двух подвергнутых облучению животных, которые не получали РВМС, не было отмечено ни смертности, ни каких-либо симптомов (не показано).
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение относится к антагонистичным антителам или их фрагментам, которые связываются с ОХ40 человека.
В настоящей заявке термин "ОХ40 человека" охватывает варианты, изоформы и видовые гомологи ОХ40 человека. Соответственно, антитела согласно настоящему изобретению могут в определенных случаях обладать перекрестной реактивностью с ОХ40 из организма видов, отличных от человека. Согласно некоторым вариантам реализации указанные антитела могут быть полностью специфичными в отношении одного или более белков ОХ40 человека, и могут не проявлять видовой или другой перекрестной реактивности по отношению к видам, отличным от человека. Полная аминокислотная последовательность примера ОХ40 человека имеет номер доступа в системе Swiss-Prot Р43489 (TNR4 HUMAN; SEQ ID №: 12). ОХ40 называют CD134, TNFRSF4, АСТ35 или TXGP1 L. ОХ40 человека обозначается идентификационным номером гена: 7293 в системе Entrez Gene и HGNC: 11918 в системе HGNC (Комитет по номенклатуре генов Международной организации по изучению генома человека). ОХ40 может кодироваться геном, обозначаемым TNFRSF4 /ОХ40.
Применяемый в настоящей заявке термин "ОХ40 человека" охватывает все известные или еще не открытые аллели и полиморфные формы ОХ40 человека. В настоящей заявке термины "ОХ40 человека", "ОХ40" или "рецептор ОХ40" применяются эквивалентно и обозначают "ОХ40 человека", если другое особо не указано.
В настоящей заявке термин "лиганд ОХ40" или "OX40L" применяется эквивалентно и включает лиганд ОХ40, особенно лиганд ОХ40 человека. OX40L является членом TNF-суперсемейства и также называется gp34 или CD252. Также для OX40L было введено обозначение CD252 (кластер дифференцировки 252), и он имеет номер доступа в базе данных Р23510 (Swiss-Prot) или Q6FGS4 (Uniprot). OX40L экспрессируется на поверхности В-лимфоцитов, Т-лимфоцитов, дендритных клеток или клеток эндотелия.
В настоящей заявке термин "антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека" включает антитела или их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, например, с ОХ40 человека в изолированной форме, со сродством (KD) 500 нМ или менее, предпочтительно 200 нМ или менее, более предпочтительно 150 нМ или менее, более предпочтительно 120 нМ или менее, и даже более предпочтительно 110 нМ или менее. Термин "антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека" включает антитела или их антигенсвязывающие фрагменты.
В настоящей заявке термины "антагонистичное антитело" или "антитело-антагонист" применяются эквивалентно и охватывают антитело, которое способно ингибировать и/или нейтрализовывать биологическую сигнальную активность ОХ40, например, путем блокирования связывания или существенного уменьшения связывания ОХ40 с лигандом ОХ40 и, за счет этого, ингибировать или уменьшать действие сигнального пути, запускаемого ОХ40, и/или ингибировать или уменьшать ОХ40-опосредуемый ответ клетки, такой как пролиферация лимфоцитов, экспрессия цитокинов или выживание лимфоцитов.
В настоящей заявке термин "антитело" включает целые антитела и любые их антигенсвязывающие фрагменты или одиночные цепи. Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые цепи (Н) и две легкие цепи (L), соединенные между собой дисульфидными связями, или к его антигенсвязывающему фрагменту. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (в настоящей заявке сокращенно VH) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов CHI, СН2 и СНЗ. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (в настоящей заявке сокращенно VL) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена - CL. Области VH и VL также можно подразделить на области гипервариабельности, именуемые участками, определяющими комплементарность (CDR), которые гипервариабельны по своей последовательности и/или участвуют в распознавании антигена и/или образуют структурно обусловленные петли, между которымирасположены более консервативные области, именуемые каркасными участками (FR или FW). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FW, расположенных от N-конца к С-концу в следующем порядке: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Последовательности аминокислот FW1, FW2, FW3 и FW4 составляют "отличную от CDR область" или "неполную область CDR", как изложено в настоящей заявке.
В настоящей заявке термин "каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи" может включать одну или более (например, одну, две, три и/или четыре) последовательности участков каркаса тяжелой цепи (например, каркас 1 (FW1), каркас 2 (FW2), каркас 3 (FW3) и/или каркас 4 (FW4)). Предпочтительно каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи включает FW1, FW2 и/или FW3, более
предпочтительно FW1, FW2 и FW3. В настоящей заявке термин "каркасный участок вариабельной области легкой цепи" может включать одну или более (например, одну, две, три и/или четыре) последовательности участков каркаса легкой цепи (например, каркас 1 (FW1), каркас 2 (FW2), каркас 3 (FW3) и/или каркас 4 (FW4)). Предпочтительно каркасный участок вариабельной области легкой цепи включает FW1, FW2 и/или FW3, более предпочтительно FW1, FW2 и FW3.
Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая разные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки), и первым компонентом классического пути активации комплемента (Clq).
Антитела группируют по классам, которые также называют изотипами, определяемыми генетически по константной области. Константные области легких цепей человека подразделяют на каппа (СК) и лямбда (СХ)-легкие цепи. Тяжелые цепи подразделяют на мю (и), дельта (8), гамма (у), альфа (а) или эпсилон (s), и они определяют изотип антитела - IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, соответственно. Таким образом, термин "изотип" в настоящей заявке относится к любым классам и/или подклассам иммуноглобулина, определяемым по химическим и антигенным характеристикам их константных областей. Известные изотипы иммуноглобулинов человека включают IgGl (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgAl (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) и IgE (IGHE). Так называемый ген псевдо-гамма иммуноглобулина человека IGHGP представляет собой ген дополнительной константной области тяжелой цепи иммуноглобулина, который был секвенирован, но который не кодирует белок в связи с измененным сайтом переключения (Bensmana М et al, (1988) Nucleic Acids Res. 16(7): 3108). Несмотря на то, что ген псевдо-гамма иммуноглобулина человека IGHGP содержит измененный сайт переключения, он обладает открытой рамкой считывания для всех константных доменов тяжелой цепи (СН1-СНЗ) и шарнирной области. Все открытые рамки считывания для константных доменов его тяжелой цепи кодируют белки-домены, которые обладают хорошим соответствием со всеми константными доменами иммуноглобулинов человека с прогнозируемыми структурными особенностями. Данный дополнительный псевдо-гамма изотип в настоящей заявке обозначается IgGP или IGHGP. Были описаны другие гены псевдо-иммуноглобулинов, такие как псевдогены
константного домена тяжелой цепи иммуноглобулина эпсилон человека Р1 и Р2 (IGHEP1 и IGHEP2). Чаще всего для терапевтических целей применяют класс IgG. У человека данный класс включает подклассы IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4. У мышей данный класс включает IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG2c и IgG3.
В настоящей заявке термин "химерное антитело" включает антитела, в которых последовательности вариабельной области из одного вида, а последовательности константной области получены из другого вида, такие как антитела, в которых последовательности вариабельной области получены из антитела мыши, а последовательности константной области получены из антитела человека.
В настоящей заявке термин "гуманизированное антитело" или "гуманизированное антитело против ОХ40" включает антитела, в которых последовательности CDR, полученные из антител эмбрионального типа другого вида млекопитающих, например мыши, были объединены с каркасными последовательностями антитела человека. Каркасные последовательности и антитела человека, а также в последовательности CDR, полученные из антител эмбрионального типа другого вида млекопитающих могут содержать дополнительные модификации.
В настоящей заявке термин "Fab" или "область Fab" включает полипептиды, которые содержат домены иммуноглобулинов VH, CHI, VL и CL. Термин "Fab" может относиться к данной области, когда она изолирована, или к данной области в контексте полноразмерного антитела или фрагмента антитела.
В настоящей заявке термин "Fc" или "область Fc" включает полипептид, содержащий константную область антитела, за исключением первого домена константной области иммуноглобулина. Таким образом, термин "Fc" относится к двум последним доменам константной области иммуноглобулина IgA, IgD и IgG, и к трем последним доменам константной области иммуноглобулина IgE и IgM, и к гибкому шарнирному участку на N-конце к данным доменам. В случае IgA и IgM Fc может включать J-цепь. В случае IgG Fc включает домены иммуноглобулина С гамма 2 и С гамма 3 (Су2 и СуЗ), а также шарнирный участок между С гамма 1 (Cyl) и С гамма 2 (Су2). Хотя границы области Fc могут варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно по определению содержит остатки С226 или Р230 на своем С-конце, причем нумерация проводится в
соответствии с системой нумерации ЕС. В случае IgGl человека область Fc по определению согласно настоящей заявке содержит остаток Р232 на своем С-конце, причем нумерация проводится в соответствии с системой нумерации ЕС (Edelman GM et al, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Термин "Fc" может относиться к данной области, когда она изолирована, или к данной области в контексте полипептида Fc, например, антитела.
В настоящей заявке термин "шарнир" или "шарнирная область", или "шарнирная область антитела" включает гибкий полипептид, содержащий аминокислоты, находящиеся между первым и вторым константным доменом антитела. В настоящей заявке термин "шарнирная область" относится к области длиной 6-62 аминокислот, которая присутствует только в IgA, IgD и IgG, которая охватывает остатки цистеина, образующие мостики с двумя тяжелыми цепями. Структурно домен CHI IgG заканчивается в положении ЕС 220, а домен СН2 IgG начинается на остатке в положении ЕС 237. Таким образом, в случае IgG шарнирная область антитела согласно определению, данному в настоящей заявке, включает положения (D221 в IgGl) - 231 (А231 в IgGl), причем нумерация проводится в соответствии с системой нумерации ЕС (Edelman GM et al, выше).
В настоящей заявке термин "исходное антитело" или "исходный иммуноглобулин" включает немодифицированное антитело, которое впоследствии модифицируют с получением его варианта. Указанное исходное антитело может быть природным антителом или вариантом, или сконструированной версией существующего в природе антитела. Термин "исходное антитело" может относиться к самому антителу, композициям, которые содержат исходное антитело, последовательности, которая его кодирует. В настоящей заявке под термином "исходное антитело против ОХ40 " понимают антитело или иммуноглобулин, который связывается с ОХ40, которое модифицировано, и из которого получен вариант.В настоящей заявке под термином "соответствующее антитело мыши" понимают антитело или иммуноглобулин мыши, которые связываются с ОХ40 человека, которое можно модифицировать и из которого можно получить вариант, в частности антитело мыши 1D4, которое раскрыто в настоящей заявке.
В настоящей заявке термин "альтернативное антитело" или "вариант антитела" включает последовательность антитела, которая отличается от последовательности исходного антитела по меньшей мере в результате одной модификации по сравнению с исходным антителом. В настоящей заявке подразумевается, что последовательность альтернативного антитела желательно обладает по меньшей мере 80%, более желательно по меньшей мере 90%, более желательно по меньшей мере 95% идентичностью с последовательностью исходного антитела по последовательности аминокислот. Термин "вариант антитела" может относиться к самому антителу, композициям, которые содержат вариант антитела, последовательности, которая его кодирует.
В настоящей заявке термин "модификация аминокислот" включает замену, вставку и/или делецию аминокислоты в последовательности полипептида. В настоящей заявке под термином "замена аминокислоты" или "замена" понимают замещение аминокислоты в конкретном положении последовательности исходного полипептида другой аминокислотой. Например, термин "замена R94K" относится к альтернативному полипептиду, в данном случае варианту каркасного участка вариабельной области тяжелой цепи, в котором аргинин в положении 94 заменен на лизин. В предыдущем примере "94К" означает замену в положении 94 на лизин. В целях настоящей заявки множественные замены обычно разделяют косой чертой. Например, "R94K/L78V" относится к двойному варианту, содержащему замены R94K и L78V. В настоящей заявке под "вставкой аминокислоты" или "вставкой" понимают добавление аминокислоты в конкретном положении в последовательность исходного полипептида. Например, "-94" обозначает вставку в положении 94. В настоящей заявке под "делецией аминокислоты" или "делецией" понимают удаление аминокислоты в конкретном положении последовательности исходного полипептида. Например, "R94-" обозначает делецию аргинина в положении 94.
Подразумевается, что в настоящей заявке термин "консервативные модификации" или "консервативные модификации последовательности" относятся к модификациям аминокислот, которые не оказывают существенного влияния или не изменяют характеристик связывания антитела, содержащего указанную последовательность аминокислот. Такие консервативные модификации включают замены, вставки и делеции аминокислот. Модификации можно ввести в антитело согласно настоящему изобретению при помощи стандартных технологий, известных в технике, таких как сайт-направленный
мутагенез и ШГР-опосредуемый мутагенез. Консервативными заменами аминокислот являются замены, при которых остаток аминокислоты замещается остатком аминокислоты со сходной боковой цепью. Семейства остатков аминокислот со сходными боковыми цепями были определены в технике. Указанные семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), с боковыми цепями с бета-ветвями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, один или более остатков аминокислот в участках CDR или в каркасных областях антитела согласно настоящему изобретению могут быть заменены другими остатками аминокислот из того же семейства боковых цепей, и можно провести оценку, сохранило ли функцию измененное антитело (альтернативное антитело).
Для всех константных доменов тяжелых цепей иммуноглобулинов человека нумерация производится в соответствии с "системой нумерации ЕС" (Edelman GM et al, (1969) Proc Natl Acad Sci USA, 63(1): 78-85). Для константного домена легких цепей иммуноглобулина каппа человека (IGKC), нумерация производится в соответствии с "системой нумерации ЕС" (Edelman GM et al, выше).
Для константных доменов легких цепей иммуноглобулинов лямбда человека (IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 и IGLC7) нумерация производится в соответствии с "системой нумерации Кабата" (Kabat ЕА et al, (1991) Sequences of proteins of immunological interest. 5th Edition - US Department of Health and Human Services, NIH publication n° 91-3242), которая описана у Dariavach P et al, (1987) Proc Natl Acad Sci USA, 84(24): 9074-8 и Frangione В et al, (1985) Proc Natl Acad Sci USA, 82(10): 3415-9.
В настоящей заявке термин "вариабельный домен" относится к доменам, которые обусловливают связывание с антигеном и определяют специфичность конкретного антитела к конкретному антигену. В природных антителах антигенсвязывающий сайт состоит из двух вариабельных доменов (областей), которые определяют специфичность: один расположен в тяжелой цепи (VH), а другой расположен в легкой цепи (VL). В
некоторых случаях специфичность может быть присуща только одному из двух доменов, как у однодоменных антител на основе тяжелых цепей, обнаруженных у животных семейства верблюдовых. Длина V областей обычно составляет примерно 110 аминокислот, и они состоят из относительно инвариантных фрагментов последовательности аминокислот, именуемых каркасными областями (FR) из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями с крайне высокой вариабельностью, именуемых "гипервариабельными участками", длина которых 9-12 аминокислот. Вариабельные домены нативных тяжелых и легких цепей содержат FR, которые принимают главным образом конфигурацию "бета-слоёв", соединенные тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости друг от друга при помощи FR, и совместно с гипервариабельными участками из другой цепи, участвуют в образовании антигенсвязывающего сайта антитела (см. Kabat ЕА et al, выше). В настоящей заявке термин "гипервариабельный участок" относится к остаткам аминокислот антитела, которые отвечают за связывание с антигеном. Как правило, гипервариабельный участок включает остатки аминокислот из "участка, определяющего комплементарность" или "CDR", причем последний обладает наивысшей вариабельностью последовательностей и/или участвует в распознавании антигена. Для всех вариабельных доменов нумерация производится в соответствии с "системой нумерации Кабата" (Kabat ЕА et al, выше).
Применяется несколько определений CDR, и они все они включены в настоящую заявку. Определение по Кабату основано на вариабельности последовательностей и применяется чаще всего (Kabat ЕА et al, выше). Определение по Хотия основано на локализации структурных петель (Chothia С & Lesk AM (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917). Определение программы AbM представляет собой компромисс между определениями Кабата и Чотия и применяется в программах для моделирования антител Oxford Molecular's AbM (Martin ACR et al, (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86: 9268-72; Martin ACR et al, (1991) Methods Enzymol. 203: 121-153; Pedersen JT et al, (1992) Immunomethods, 1: 126-136; Rees ARetaL, (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction. Oxford University Press, Oxford, 141-172). Недавно было введено контактное определение (MacCallum RM et al, (1996) J. Mol. Biol. 262: 732-745), которое основано на анализе структур комплексов, имеющихся в базе данных "Protein Databank)). Определение CDR в соответствии с IMGT(r) - иммуногенетической информационной системой(r)
(http://www.imgt.org) основано на нумерации IMGT для V-ОБЛАСТЕЙ всех иммуноглобулинов и рецепторов Т-лимфоцитов всех видов (IMGT(r), международная иммуногенетическая информационная система(r); Lefranc MP et al, (1991) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M et al, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP et al, (2005) Dev. Сотр. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al, (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64). Все гипервариабельные участки (CDR), обсуждаемые в настоящем изобретении, предпочтительно отвечают определению согласно IMGT(r). Остатки вариабельных доменов для каждого из указанных CDR следующие (нумерация в соответствии с Kabat ЕА, et al, выше): LCDR1: 27-32, LCDR2: 50-52, LCDR3: 89-97, HCDR1: 26-35, HCDR2: 51-57 и HCDR3: 93-102. Термин "отличная от CDR область" области VL в настоящей заявке включает последовательности аминокислот: 1-26 (FR1), 33-49 (FR2), 53-88 (FR3) и 98- приблизительно 107 (FR4). Термин "отличная от CDR область" области VH в настоящей заявке включает последовательности аминокислот: 1-25 (FR1), 36-50 (FR2), 58-92 (FR3) и 103 -приблизительно 113 (FR4).
CDR согласно настоящему изобретению могут включать "полные CDR", которые основаны на упоминаемых выше определениях и содержат следующие остатки вариабельных доменов: LCDR1: 24-36, LCDR2: 46-56, LCDR3:89-97, HCDR1: 26-36, HCDR2:47-65, HCDR3: 93-102. Указанные полные CDR нумеруются также в соответствии с Kabat et al, выше. Термин "неполная область CDR" области VL в настоящей заявке включает последовательности аминокислот: 1-23 (FR1), 37-45 (FR2), 57-88 (FR3) и 98 -приблизительно 107 (FR4). Термин "неполная область CDR" области VH в настоящей заявке включает последовательности аминокислот: 1-25 (FR1), 37-46 (FR2), 66-92 (FR3) и 103 - приблизительно 113 (FR4).
В настоящей заявке термин "полноразмерное антитело" включает структуру, которая образует природную биологическую форму антитела, включая вариабельные и константные области. Например, у большинства млекопитающих, включая человека и мышь, полноразмерное антитело класса IgG представляет собой тетрамер, и состоит из двух идентичных пар двух цепей иммуноглобулинов, в каждой паре есть одна легкая и одна тяжелая цепь, причем каждая легкая цепь содержит домены иммуноглобулина VL и CL, а каждая тяжелая цепь содержит домены иммуноглобулина VH, CHI (Cyl), СН2 (Су2)
и СНЗ (СуЗ). У некоторых млекопитающих, например, у верблюдов и лам, антитела класса
IgG могут состоять только из двух тяжелых цепей, причем каждая тяжелая цепь содержит
вариабельный домен, присоединенный к области Fc.
Фрагменты антител включают без ограничений: (i) фрагмент Fab, состоящий из доменов VL, VH, CL и СН1, включая Fab' и Fab'-SH, (ii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1, (ш) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одиночного антитела; (iv) фрагмент dAb (Ward ES et al, (1989) Nature, 341: 544-546), который состоит из одного вариабельного домена, (v) фрагменты F(ab')2, двухвалентный фрагмент, содержащий два связанных фрагмента Fab; (vi) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), в которых домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет соединяться двум доменам и образовывать антигенсвязывающий сайт (Bird RE et al, (1988) Science 242: 423-426; Huston JS et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83), (vii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (PCT/US92/09965), (viii) "диатела" или "триотела", поливалентные или мультиспецифичные фрагменты, образованные посредством слияния генов (Tomlinson I & Hollinger Р (2000) Methods Enzymol. 326: 461-79; WO94/13804; Holliger P et al, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-48) и (ix) scFv, генетические присоединенные к такому же или другому антителу (Coloma MJ & Morrison SL (1997) Nature Biotechnology, 15(2): 159-163).
В настоящей заявке термин "эффекторная функция" включает биохимическое событие, которое возникает вследствие взаимодействия Fc-области антитела с Fc-рецептором или лигандом. Эффекторные функции включают FcyR-опосредуемые эффекторные функции, такие как ADCC (антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность) и ADPC (антителозависимый клеточноопосредованный фагоцитоз), а также комплемент-опосредуемые эффекторные функции, такие как CDC (комплементзависимая цитотоксичность). Эффекторную функцию антитела можно изменять путем изменения, т.е. усиления или снижения, предпочтительно усиления, сродства антитела к молекуле-эффектору, такой как Fc-рецептор или компонент комплемента. Сродство связывания, как правило, можно варьировать за счет модификации связывающего сайта молекулы, и в данном случае целесообразно определять локализацию рассматриваемого сайта и модифицировать по меньшей мере часть указанного сайта подходящим способом. Также представляется, что изменение в сайте связывания антитела для молекулы-эффектора не обязательно значительно изменяет общее сродство связывания, но может изменять
геометрию взаимодействия, приводя к неэффективности эффекторного механизма, как при непродуктивном связывании. Кроме того, представляется, что эффекторную функцию можно изменить путем модификации сайта, непосредственно не участвующего в связывании молекулы-эффектора, но участвующего другим образом в реализации эффекторной функции. Путем изменения эффекторной функции возможно контролировать разные аспекты иммунного ответа, например, усиливать или угнетать разные реакции иммунной системы, с возможными полезными эффектами при диагностике или терапии.
В настоящей заявке термин "расстройство, опосредованное ОХ40" включает патологические состояния, такие как аллергия, астма, ХОБЛ (хроническая обструктивная болезнь легких), ревматоидный артрит, псориаз и заболевания, ассоциированные с аутоиммунитетом и воспалением.
В настоящей заявке термин "субъект" включает любого человека или животное, отличное от человека. Термин "животное, отличное от человека" включает всех позвоночных, например, млекопитающих и не-млекопитающих, таких как нечеловекообразные обезьяны, овцы, собаки, кошки, лошади, коровы, куры, амфибии, рептилии и др. Предпочтительно субъектом является человек.
Антитела против ОХ40
Согласно первому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ОХ40 человека, которые содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, и/или, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:6.
Согласно некоторым вариантам реализации антагонистичное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ОХ40 человека, содержат полный CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 13, протяженную CDR2 тяжелой
цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 14; и/или протяженную CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 15; и/или содержат полный CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 16, и/или полный CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 17, и/или полный CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID№: 18.
Предпочтительно антагонистичное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ОХ40 человека, содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 5 и a CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 6. Более предпочтительно, антагонистичное антитело или его фрагмент, связывающиеся с ОХ40 человека, содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3, и CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 5, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 6.
В технике хорошо известно, что домен CDR3, независимо от доменов CDR1 и/или CDR2, один может определять специфичность связывания антитела в отношении родственного антигена, и что можно предсказуемо генерировать множество антител, обладающих одинаковой специфичностью связывания на основе общей последовательности CDR3. См., например, Klimka A et al, (2000) Br. J. Cancer, 83(2): 252-260 (описано получение гуманизированного анти-СОЗО антитела с применением только вариабельного домена тяжелой цепи CDR3 из мышиного анти-СОЗО антитела Ki-4); Beiboer SH et al, (2000) J. Mol. Biol. 296: 833-849 (описаны рекомбинантные антитела к эпителиальному гликопротеину-2 (EGP-2), полученные с применением только последовательности CDR3
тяжелой цепи из исходного мышиного анти-ЕОР-2 антитела МОС-31); Rader С et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA, 95: 8910-8915 (описана панель гуманизированных антител к интегрину avP3, полученных с применением вариабельного домена CDR3 тяжелой и легкой цепи мышиного антитела к интегрину огфЗ LM609, причем каждый член панели антител содержит отличную последовательность вне домена CDR3 и способен связываться с тем же эпитопом, что и исходное мышиное антитело со сродством, таким же или выше, чем сродство у исходного мышиного антитела); Barbas С et al, (1994) J. Am. Chem. Soc. 116: 2161-62 (описано, что домен CDR3 вносит наиболее значимый вклад в связывание антигена).
Соответственно, согласно настоящему изобретению предложены антитела и их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи, в частности, содержат CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 6, причем указанное антитело способно связываться с ОХ40 человека. В рамках некоторых вариантов реализации предложенные в соответствии снастоящим изобретением антитела, содержащие один или более доменов CDR3 тяжелой и/или легкой цепи из антитела не происходящего от человека, (а) способны конкурировать за связывание; (Ь) сохраняют функциональные характеристики; (с) способны связываться с тем же эпитопом; и/или (d) обладают таким же сродством связывания, как и исходное не происходящее от человека, например, мышиное антитело.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 7. Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело и его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 8. Согласно некоторым вариантам реализации антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID
№: 7, и последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 8.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены варианты антагонистичного антитела или его фрагмента, которые связываются с ОХ40 человека. Так, согласно настоящему изобретению предложены антитела или их фрагменты, которые обладают последовательностью аминокислот областей, отличных от CDR , вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична (обладает идентичностью по последовательности аминокислот по меньшей мере на 80%) последовательности аминокислот областей, отличных от CDR, вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи исходного антагонистичного антитела для любой последовательности вариабельной области тяжелой или легкой цепи, например, любой из последовательностей вариабельной области тяжелой или легкой цепи, таких как в SEQ ID №: 7 или SEQ ID №: 8, соответственно. Также согласно настоящему изобретению предложены антитела или их фрагменты, которые обладают последовательностью аминокислот неполнных областей CDR вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности аминокислот неполных CDR областей вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи исходного антагонистичного антитела для тяжелой или легкой цепи. Предпочтительно, идентичность последовательностей аминокислот для областей, отличных от CDR, или неполных CDR вариабельной области тяжелой и/или легкой цепи составляет по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 95%, в особенности 96%, более конкретно 97%, и даже более конкретно 98%, наиболее конкретно 99%, включая, например, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% и 100%. В настоящей заявке под идентичностью или гомологией применительно к последовательности аминокислот понимают процент остатков аминокислот в представляющей интерес последовательности, которые идентичны остаткам в антагонистичном антителе или его фрагменте, связывающемся с ОХ40 человека, после выравнивания последовательностей и, при необходимости, введения пропусков для достижения максимального процента идентичности последовательностей. Таким образом, идентичность последовательностей можно определять стандартными способами, которые обычно применяют для сравнения сходства в положениях аминокислот в двух полипептидах. При помощи компьютерной программы, такой как BLAST или FASTA, два полипептида выравнивают для
оптимального соответствия их соответствующих аминокислот (либо по полной длине одной, либо по обеим последовательностям, либо по заранее определенной части одной или обеих последовательностей). Программы выдают штраф за раскрытие по умолчанию и штраф за пропуск в последовательности по умолчанию, и в сочетании с указанной компьютерной программой можно применять матрицу замен, такую как РАМ250 (стандартная матрица замен; см. Dayhoff МО et al, (1978) в Atlas of Protein Sequence and Structure, vol 5, supp. 3). Например, процент идентичности можно рассчитать так: общее количество идентичных пар, умноженное на 100, а затем разделенное на сумму длины более длинной последовательности в совпавших промежутках и количества пропусков, введенных в более длинные последовательности с целью выравнивания двух последовательностей.
Таким образом, согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, причем указанное антитело или его фрагмент содержат последовательность каркасной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 70% идентична последовательности каркасной области SEQ ID №: 19, 20, 21, 22 или 23, последовательность каркасной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 60% идентична последовательности каркасной области SEQ ID №:24, 25, 26, 27 и 28. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связывается с ОХ40 человека, причем указанное антитело или его фрагмент содержат последовательность каркасной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 74% идентична последовательности каркасной области SEQ ID №: 19, и/или последовательность каркасной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 65% идентична последовательности каркасной области SEQ ID №:24.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат CDR тяжелой или легкой цепи, которые описаны выше, а также содержат каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGHV2-70*10 (SEQ ID №: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID №: 20), IGHV2-70*13 (SEQ Ш №: 21), IGHV2-5*09 (SEQ Ш №: 22) и IGHV2-70*11 (SEQ ID №: 23), предпочтительно каркасный участок вариабельнойобласти тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, IGHV2-70*10
(SEQ ID №: 19). Указанный каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи может содержать одну или более (например, одну, две, три и/или четыре) последовательностей каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи (например, каркасный участок 1 (FW1), каркасный участок 2 (FW2), каркасный участок 3 (FW3) и/или каркасный участок 4 (FW4)), присутствующие в продукте или полученные из указанных генов человека. Предпочтительно указанный каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит FW1, FW2 и/или FW3, более предпочтительно FW1, FW2 и FW3, присутствующие в продукте или полученные из генов человека, выбранного из группы, состоящей из: IGHV2-70*10 (SEQ ID №: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID №: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID №: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID №: 22) и IGHV2-70*11 (SEQ ID №: 23). В настоящей заявке последовательности каркасных участков вариабельных областей включают FW1 (положения с 1 по 25), FW2 (положения с 36 по 49), FW3 (положения с 66 по 94) и FW 4 (положения с 103 по 113), причем положение аминокислоты указывается в соответствии с системой нумерации, установленной Кабатом.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антитело или его фрагмент, причем указанные антитело или его фрагмент содержат каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGHV2-70*10 (SEQ ID №: 19), и причем указанный каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области тяжелой цепи соответствующего мышиного антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антитело или его фрагмент, содержащие последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 32, причем указанный каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области тяжелой цепи соответствующего мышиного антитела.
Предпочтительно модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 23, 35Ь, 48, 50, 60 и 62, более предпочтительно замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 23, 35Ь, 50, 60 и 62, более предпочтительно замену аминокислоты в положении 35Ь,
причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату. Конкретно, указанная модификация аминокислоты включает замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из 23 S, 35bG, 48L, 50Н, 60N и 62А, предпочтительно замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из T23S, S35bG, I48L, R50H, S60N и S62A, и наиболее предпочтительной заменой является S35bG, причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26), IGKV3-11*02 (SEQ Ш №: 27) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28), предпочтительно каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24). Указанный каркасный участок вариабельной области легкой цепи может содержать одну или более (например, одну, две, три и/или четыре) последовательностей каркасных участков вариабельной области легкой цепи (например, каркасный участок 1 (FW1), каркасный участок 2 (FW2), каркасный участок 3 (FW3) и/или каркасный участок 4 (FW4)), присутствующие в продукте или полученные из указанных генов человека. Предпочтительно указанный каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит FW1, FW2 и/или FW3, более предпочтительно FW1, FW2 и FW3, присутствующие в продукте или полученные из генов человека, выбранных из группы, состоящей из V3-ll*01 (SEQ ID №: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26), IGKV3-11*02 (SEQ ID №: 27) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28). В настоящей заявке последовательности каркасных участко вариабельных областей легкой цепи включают FW1 (положения с 1 по 23), FW2 (положения с 35 по 49), FW3 (положения с 57 по 88) и FW 4 (положения с 98 по 108), причем положение аминокислоты указывается в соответствии с системой нумерации, установленной Кабатом.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антитело или его фрагмент, содержащие каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), и причем указанный каркасный участок вариабельной области легкой цепи
содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего мышиного антитела.
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антитело или его фрагмент, содержащие последовательность аминокислот легкой цепи согласно SEQ ID №: 32, причем каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего мышиного антитела.
Предпочтительно модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 и 71 и/или делеции аминокислоты в положении 31, более предпочтительно замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 33, 34, 46, 47, 54, 56 и 71 и/или делеции аминокислоты в положении 31, наиболее предпочтительно - замену аминокислоты в положении 46 и/или 47, причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату. Конкретно, указанная модификация аминокислоты включает замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из 1Q, ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W, 54L, 56S и 71Y, и/или а делеции в Т31, предпочтительно замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из 1Q, ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W, 54L, 56S и 71Y, более предпочтительно замену аминокислоты, выбранную из группы, состоящей из ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W и 71Y, и наиболее предпочтительной заменой является 46Р, 47W, причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
Согласно некоторым вариантам реализации предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: V2-70*10 (SEQ ID №: 19), V2-70*01 (SEQ ID №: 20), V2-70*13 (SEQ ID №: 21), V2-5*09 (SEQ ID №: 22) и V2-70*ll (SEQ ID №: 23), и каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: V3-ll*01 (SEQ ID №: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26), IGKV3-11*02 (SEQ Ш
№: 27) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28), предпочтительно каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека V2-70*10 (SEQ ID №: 19), и каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека V3-11*01 (SEQ ID №: 24). Также настоящее изобретение включает комбинации каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи, которые присутствуют в продукте или получены из генов человека, упоминаемых выше, и/или каркасных участков вариабельной области легкой цепи, которые присутствуют в продукте или получены из генов человека, упоминаемых выше.
Последовательности ДНК эмбрионального типа для генов тяжелых и легких цепей человека можно найти в базе данных последовательностей человека эмбрионального типа "VBase" (доступна в интернете на сайте www.mrccpe.cam.ac.uk/vbase), а также в Kabat ЕА et al, выше; Tomlinson IM et al, (1992) J. Mol. Biol. 227: 776-798 and Cox JPL et al, (1994) Eur. J. Immunol. 24: 827-836. В качестве другого примера, последовательности ДНК эмбрионального типа для генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей человека можно найти в базе данных Genbank.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения также предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, в котором по меньшей мере один из CDR тяжелой цепи и/или один из CDR легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты. Модификации можно ввести при помощи сайт-направленного мутагенеза и ПЦР-опосредуемого мутагенеза, а действие на связывание антитела или другие рассматриваемые функциональные свойства можно оценивать при помощи проб in vitro или in vivo. Предпочтительно вводят консервативные модификации. Модификация(и) может включать замены, добавления или делеции аминокислот, но предпочтительны замены. Обычно в одном участке CDR проводят не более пяти, предпочтительно не более четырех, более предпочтительно не более трех, еще более предпочтительно не более двух, наиболее предпочтительно не более одной модификации аминокислоты.
Согласно определенным вариантам реализации для получения альтернативного антитела при конструировании вариабельных областей можно применять последовательности каркасных областей. Альтернативные антитела согласно настоящему изобретению включают антитела, в которых в остатках каркасной области в VH и/или VK были
сделаны модификации, например, для улучшения свойств антитела. Обычно такие модификации в каркасные области вносят, чтобы уменьшить иммуногенность антитела. Например, один подход состоит в "мутировании к первоначальному виду" одного или более остатков в каркасной области с возвратом к соответствующей последовательности мыши или в "мутировании к первоначальному виду" одного или более остатков в каркасной области с возвратом к соответствующей последовательности эмбрионального типа.
Таким образом, согласно другому аспекту настоящего изобретения также предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, в которых по меньшей мере одна из последовательностей каркасных участков вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области тяжелой цепи соответствующего мышиного антитела. Предпочтительно указанной модификацией аминокислоты является замена аминокислоты. Обычно в каркасной области проводят не более шести, предпочтительно не более пяти, предпочтительно не более четырех, более предпочтительно не более трех, еще более предпочтительно не более двух, наиболее предпочтительно не более одной модификации аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, причем указанная модификация аминокислоты в каркасных участках вариабельной области тяжелой цепи включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 23, 35Ь, 48, 50, 60 и 62, причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату. Предпочтительно замена аминокислоты в каркасных учстках вариабельной области тяжелой цепи охватывают положения аминокислот, выбранные из группы, состоящей из 23, 35Ь, 50, 60 и 62. Более предпочтительно замены аминокислот в каркасных участках вариабельной области тяжелой цепи выбраны из группы, состоящей из 23 S, 35bG, 48L, 50Н, 60N и 62А, и наиболее предпочтительной заменой в каркасных участках вариабельной области тяжелой цепи является 3 5bG.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, причем по меньшей мере одна из последовательностей каркасных участков вариабельной области легкой цепи
гуманизированного антитела или его фрагмента содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего мышиного антитела. Предпочтительно указанной модификацией аминокислоты является замена и/или делеция аминокислоты. Обычно в каркасном участке проводят не более шести, предпочтительно не более пяти, предпочтительно не более четырех, более предпочтительно не более трех, еще более предпочтительно не более двух, наиболее предпочтительно не более одной модификации аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения предложены гуманизированное антитело или его фрагмент, причем указанная модификация аминокислоты в каркасных участках вариабельной области легкой цепи включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 и 71 и/или делецию аминокислоты в положении 31. Более предпочтительные модификации аминокислоты в каркасных участкахвариабельной области легкой цепи включают делецию в Y31 и/или замену, выбранную из группы, состоящей из 1Q, ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W, 54L, 56S и 71Y, причем положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату. Наиболее предпочтительные модификации аминокислоты в каркасных участках вариабельной области легкой цепи включают делецию в Y31 и/или замену, выбранную из группы, состоящей из ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W и 71Y,H особенно предпочтительны замены 46Р и/или L47W. Согласно некоторым вариантам реализации указанное гуманизированное антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению могут содержать модификации аминокислот в каркасных участках вариабельной области легкой цепи, которые указаны выше, и модификации аминокислот в каркасных участках вариабельной области тяжелой цепи, которые указаны выше.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 29, 58, 59, 77, 78, 79 и 80, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58, 59, 79 и 80, и более предпочтительно выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58 и 59. Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и которые содержат вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, и 89, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 60,
86, 87 и 89, более предпочтительно SEQ Ш №: 60. Согласно некоторым вариантам реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 29, 58, 59, 77, 78, 79 и 80, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, и 89. При условии, что каждая из указанных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи могут связываться с ОХ40 человека, последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи можно "объединять и комбинировать" для получения анти-ОХ40 связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Связывание с ОХ40 таких "объединённых и комбинированных" антител можно оценивать при помощи анализа связывания, например, описанного в примерах.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 60 и 89. Согласно более предпочтительным вариантам реализации антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №:
58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 60, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 89, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 89, вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №:
59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 60, или вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 59, и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 89. Наиболее предпочтительно антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58 и 59, и вариабельную область легкой цепи,
58,
содержащую последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 60.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, которые содержат последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 35, 36, 37 и 38, и более предпочтительно из группы, состоящей из SEQ ID №: 37 и 38.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, которые содержат последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49, предпочтительно выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 45, 46, 47 и 49, более предпочтительно SEQ ID №: 47. Согласно некоторым вариантам реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38, и последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49. При условии, что каждая из указанных последовательностей вариабельных областей тяжелой и легкой цепи может связываться с ОХ40 человека, последовательности вариабельной области тяжелой и легкой цепи можно "объединять и комбинировать" для получения анти-ОХ40 связывающих молекул согласно настоящему изобретению. Связывание с ОХ40 таких "объединенных и комбинированных" антител можно оценивать при помощи анализа связывания, например, описанного в примерах.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID К": 37 и 38, и содержат последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 47 и 49. Согласно более предпочтительным вариантам реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат последовательность тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 37, и последовательность легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 47, последовательность тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №:
37, и последовательность легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 49, последовательность тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 38, и последовательность легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 47, или последовательность тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 38, и последовательность легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 49. Наиболее предпочтительно антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 37 и 38, и последовательность легкой цепи, содержащей последовательность аминокислот в соответствии с SEQ ID №: 47.
Согласно одному варианту настоящего изобретения указанное антагонистичное антитело или его фрагмент является мышиным антителом, химерным антителом или гуманизированным антителом, предпочтительно гуманизированным антителом, более предпочтительно моноклональным антителом, моноклональным химерным антителом или моноклональным гуманизированным антителом.
Также согласно настоящему изобретения предложены одновалентное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, т.е. антитело, которое содержит один антигенсвязывающий фрагмент. Также согласно настоящему изобретению предложен фрагмент антитела, который связывается с ОХ40 человека, выбранный из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, биспецифических одноцепочечных димеров Fv, диател, триател и фрагментов scFv, образованных посредством слияния генов одинаковых или разных антител. Предпочтительными фрагментами являются scFv, биспецифические одноцепочечные димеры Fv и диатела. Также согласно настоящему изобретению предложено полноразмерное антитело, которое связывается с ОХ40 человека.
Также согласно настоящему изобретению предложены антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, которые дополнительно содержот константную область тяжелой и/или легкой цепи, в частности константную область тяжелой и/или легкой цепи человека. Константные области тяжелой цепи человека можно выбирать из группы областей иммуноглобулинов человека, включая IgGl (IGHG1), IgG2 (IGHG2),
IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgAl (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD), or IgE (IGHE), и предпочтительна константная область IgG, в частности, IgGl (IGHG1). Константные области легкой цепи человека можно выбирать из группы областей иммуноглобулинов человека, включая константные области каппа или лямбда, и предпочтительна константная область каппа. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, содержат константный домен тяжелой цепи IgGl (IGHG1) человека и константный домен легкой цепи каппа человека.
В дополнение к, или в качестве альтернативы, модификациям, вносимым в каркасные области или участки CDR, можно сконструировать антитела согласно настоящему изобретению, которые будут включать модификации в области Fc, обычно, с целью изменения одного или более функциональных свойств антитела, таких как время полураспада в сыворотке, связывание комплемента, связывание с рецептором Fc и/или антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность. Кроме того, антитело согласно настоящему изобретению можно модифицировать химическим путем (например, к антителу можно присоединить одну или более химических групп) или модифицировать так, чтобы изменилось его гликозилирование. Каждый из указанных вариантов реализации описан более подробно ниже. Модификации в области Fc, которые описаны ниже, соответствуют нумерации остатков ЕС в области Fc. Согласно одному варианту реализации шарнирную область СН1 модифицируют так, чтобы изменилось количество остатков цистеина в шарнирной области, например, чтобы оно уменьшилось или увеличилось. Данный подход описан дополнительно в Патенте США № 5 677 425, выданном Bodmer et al. Количество остатков цистеина в шарнирной области СН1 изменяют, например, чтобы облегчить сборку легких и тяжелых цепей или чтобы повысить или понизить стабильность антитела. Согласно другому варианту реализации шарнирную область Fc антитела подвергают мутации, чтобы снизить биологический период полураспада указанного антитела. Более конкретно вводят одну или более мутаций аминокислот в поверхностную область домена СН2-СНЗ фрагмента Fc-шарнира, чтобы антитело обладало сниженным связыванием белка А стафилококка (SpA) по сравнению со связыванием с SpA нативного домена Fc-шарнира. Данный подход описан более подробно в Патенте США № 6 165 745, выданном Ward et al. Согласно другому варианту реализации антитело модифицируют так, чтобы увеличить биологический период полураспада. Возможны разные подходы. Например, можно ввести одну или более
из следующих мутаций: T252L, T254S, T256F, как описано в Патенте США № 6 277 375, выданном Ward et al. В качестве альтернативы для увеличения биологического периода полураспада антитело можно изменить в пределах области СН1 или CL, чтобы они содержали эпитоп для связывания с рецептором "реутилизации", взятым из двух петель домена СН2 области Fc IgG, как описано в Патентах США № 5 869 046 и 6 121 022, выданных Presta et al. Согласно дополнительному варианту реализации область Fc изменяют путем замены по меньшей мере одного остатка аминокислоты другим остатком аминокислоты, чтобы изменить эффекторную функцию(и) антитела. Например, одну или более аминокислот, выбранных из остатков аминокислот 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 и 322 можно заменить остатками других аминокислот так, чтобы антитело приобрело измененное сродство в отношении лиганда-эффектора, но сохранило способность к связыванию антигена, характерную для исходного антитела. Лиганд-эффектор, в отношении которого изменяется сродство, может быть, например, рецептором Fc или С1-компонентом комплемента. Данный подход описан более подробно в Патентах США №
5 624 821 и 5 648 260, оба из которых выданы Winter et al. Согласно другому примеру, одну или более аминокислот выбранных из остатков аминокислот в положениях 329, 331 и 322, можно заменить остатком другой аминокислоты, так, чтобы антитело обладало измененным связыванием Clq и/или сниженной или упраздненной комплементзависимой цитотоксичностью (CDC). Данный подход описан более подробно в Патенте США №
6 194 551, выданном Idusogie et al. Согласно другому примеру, одну или более аминокислот выбранных из остатков аминокислот в положениях 231 - 238 на N-конце домена СН2 изменяют, тем самым изменяя способность указанного антитела к фиксации комплемента. Данный подход описан более подробно в Публикации РСТ W094/29351 авторов Bodmer et al. Согласно еще одному примеру область Fc модифицируют, повышая способность антитела к опосредованию антителзависмой клеточной цитотоксичности (ADCC) и/или повышая сродство антитела к рецептору Fey путем модификации одной или более аминокислот в следующих положениях: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 или 439. Данный подход описан более подробно в Публикации РСТ WO00/42072 автора Presta.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат константные области тяжелой и/или легкой цепи человека, причем указанная константная область тяжелой цепи человека содержит изотипический вариант, содержащий область СН1, шарнирную область, область СН2 и область СНЗ из IgG4 (IGHG4) человека, и при этом указанная шарнирная область содержит замену серина в положении 228 на пролин. Предпочтительно указанное гуманизированное антитело, содержащее изотипический вариант, является полноразмерным антителом. Особо предпочтительные гуманизированное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, включают изотипический вариант, содержащий СН1 из IgG4 (IGHG4) человека, шарнирную область IgG4 (IGHG4) человека, содержащее замену S228P, а также СН2 и СНЗ из IgG4 (IGHG4) человека, содержат последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 57, и последовательность легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 47. Было показано, что указанный изотипический вариант не проявляет механизмов Fc-опосредованной цитотоксичности, таких как ADCC, по сравнению с антагонистичным антителом или его фрагментом, которое связывается с ОХ40 человека, и которое содержит константную область тяжелой цепи из IgGl (IGHG1) человека (которое обычно является нативным IgGl человека), т.е. по сравнению с антагонистичным антителом или его фрагментом, которое связывается с ОХ40 человека, и которое отличается от изотипического варианта только модифицированной константной областью тяжелой цепи.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, которые содержат Fc область IgG человека, причем зрелая углеводная структура, присоединенная к Fc области IgG человека не содержит фукозы (альтернативно обозначается в настоящей заявке "не фукозилированная"). Предпочтительно указанное антитело содержит Fc область IgGl (IGHG1) человека, причем зрелая углеводная структура, присоединенная к Fc области IgGl (IGHG1) человека, не содержит фукозы. Более предпочтительно полноразмерное антитело, содержащее Fc область IgGl (IGHG1) человека, причем зрелая углеводная структура, присоединенная к Fc области IgGl (IGHG1) человека, не содержит фукозы. Из заявки WO03/035835 известно, что отсутствие фукозы в зрелой углеродной структуре, присоединенной к Fc области IgG человека, может приводить к повышению ADCC. Таким образом, согласно дополнительному варианту реализации указанные антагонистичное
антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению содержат Fc область IgGl (IGHG1) человека, причем зрелая углеводная структура, присоединенная к Fc области IgGl (IGHG1) человека, не содержит фукозы, тогда как антитело, лишенное фукозы, проявляет повышенную ADCC по сравнению с исходным гуманизированным антителом или его фрагментом, которые не лишены фукозы. Способы получения антител, лишенных фукозы, включают, например (а) применение сконструированных мутантных клеток-хозяев, которые дефицитны по метаболизму фукозы, такие, которые обладают сниженной способностью (или отсутствием способности) к фукозилированию белков, экспрессируемых ими; (Ь) культивирование клеток в условиях, которые препятствуют фукозилированию или уменьшают его; (с) посттрансляционное удаление фукозы (например, при помощи фермента фукозидазы); (d) посттрансляционное добавление желаемого углевода, например, после рекомбинантной экспрессии негликозилированного гликопротеина; или (е) очищение гликопротеина таким образом, чтобы отобрать продукт, который не гликозилирован. Предпочтительно применяют способы, описанные в Примере 14 WO10/095031 например, способы, описанные у Longmore et al, (1982) Carbohydr. Res. 365-92 или у Imai-Nishiya et al, (2007), BMC Biotechnol. 7: 84.
Также согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его фрагмент, которые связываеются с ОХ40 человека и которые связывается с тем же эпитопом, что и антитело, содержащее вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 7 и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 8. Также согласно настоящему изобретению предложена специфическая область или эпитоп ОХ40 человека, в частности внеклеточный домен рецептора ОХ40 человека, который связывается антителом, предложенным в настоящем изобретении, в частности антителом, содержащим вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 7 и/или вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 8. Указанная специфическая область или эпитоп полипептида ОХ40 человека можно идентифицировать при помощи любого подходящего способа картирования эпитопов, известного в технике, в сочетании с любым одним из антител, предложенных согласно настоящему изобретению. Примеры таких способов включают скрининг пептидов разной длины, полученных из ОХ40, на связывание с антителом согласно настоящему изобретению, причем наименьший фрагмент, который может специфически связываться с антителом, содержит последовательность эпитопа,
распознаваемого указанным антителом. Пептиды ОХ40 можно получать путем синтеза или протеолитичесого расщепления полипептида ОХ40. Пептиды, которые связываются с указанным антителом, можно идентифицировать, например, посредством масс-спектрометрического анализа. Согласно другому примеру для идентификации эпитопа, связываемого антителом согласно настоящему изобретению, можно применять ЯМР-спектроскопию или рентгеновскую кристаллографию. После идентификации фрагмент-эпитоп, который связывается с антителом согласно настоящему изобретению, можно применять, например, в качестве иммуногена для получения дополнительных антагонистичных антител, которые связываются с тем же эпитопом.
Свойства анти-ОХ40 антител
В технике известны стандартные пробы для оценки связывающей способности, например, в отношении ОХ40 человека, включая ELISA, BIAcore(r), Вестерн-блот, РИА (радиоиммунный анализ) и проточную цитометрию. Подходящие пробы описаны более подробно в разделе "Примеры". Кинетику связывания (например, сродство связывания, например KD) антител также можно оценить при помощи стандартных проб, известных в технике, таких как системы анализа Scatchard или BIAcore(r). Относительно сродство связывания Ki можно оценить при помощи стандартного конкурентного анализа, известного в технике.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичные антитела или его фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека и которые блокируют реакцию смешанной культуры лимфоцитов (MLR) в зависимости от дозы, в большей степени, чем рекомбинантное гуманизированное антитело эфализумаб. Рекомбинантное гуманизированное антитело эфализумаб связывается с субъединицей CDlla антигена 1, ассоциированного с функцией лимфоцитов. MLR можно проводить и измерять в соответствии с Примером 3.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичные антитела или его фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, и которые также способны распознавать ОХ40 яванского макака. Связывание антагонистичного анти-ОХ40 антитела с мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) и человека, и яванского макака можно проводить и измерять в соответствии с Примером 4, и как показано на Фиг.З. Было показано, что указанное
антитело распознает ОХ40, экспрессируемый на поверхности активированных лимфоцитов человека и яванского макака, что указывает на то, что указанное антитело обладает свойством перекрестной реактивности.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичные антитела или их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, в частности с ОХ40 человека в изолированной форме, со сродством (KD) 500 нМ или менее, предпочтительно 200 нМ или менее, более предпочтительно 150 нМ или менее, более предпочтительно 120 нМ или менее, и даже более предпочтительно 110 нМ или менее, измеренным, например, посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на инструменте BIAcore(r) ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), за счет захвата антитела белком-А, соединенным с сенсорным чипом исследовательского класса СМ5 ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария; BR-1000-14) с внеклеточным доменом рекомбинантного одновалентного рецептора ОХ40 человека (SEQ ID №: 11), применяемым в качестве определяемого вещества, как подробно описано в Примерах 5 и 6 и проиллюстрировано на Фиг. 4. В настоящей заявке термин "моновалентный" применительно к измерению сродства с применением рецептора ОХ40 относится к домену рецептора ОХ40 человека, такому как внеклеточный домен, не димеризованному или мультимеризованному искусственно, как это могло бы быть, например, если указанный домен на N-конце был соединен с Fc-участком иммуноглобулина. Согласно предпочтительному аспекту настоящего изобретения предложено гуманизированное антитело или его фрагмент, которое сохраняет по меньшей мере 75% от сродства связывания (Ко) с ОХ40, присущего соответствующему химерному антителу. Предпочтительно, указанное гуманизированное антитело или его фрагмент связывается с ОХ40 человека со сродством, равным сродству соответствующего химерного антитела. Под "равным сродством" понимают значение сродства, которое попадает в диапазон ±10% от сродства связывания с ОХ40 соответствующего химерного антитела. Более предпочтительно согласно настоящему изобретению предложены гуманизированное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека с более высоким сродством, чем соответствующее химерное антитело. Согласно предпочтительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичные антитела или их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека и обладают сродством связывания (KD) ПО нМ или менее, предпочтительно 100 нМ или менее, более предпочтительно 90 нМ или менее, более предпочтительно 80 нМ или менее, еще более
предпочтительно 70 нМ или менее, измеренным, например, посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на инструменте BIAcore(r) ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), за счет захвата антитела белком-А, соединенным с сенсорным чипом исследовательского класса СМ5 ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария; BR-1000-14) с внеклеточным доменом рекомбинантного одновалентного рецептора ОХ40 человека (SEQ ID №: 11), применяемым в качестве определяемого вещества, как подробно описано в Примерах 5 и 6 и проиллюстрировано на Фиг. 4.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения предложены антагонистичные антитела или их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, и которые обладают высокой термостабильностью. Согласно предпочтительному варианту реализации антагонистичное гуманизированное антитело или его фрагмент, которые связываются с ОХ40 человека, обладают термостабильностью фрагмента FAB выше 70°С, предпочтительно выше чем 75°С, более предпочтительно выше чем 80°С и даже более предпочтительно выше чем 85°С. Для анализа термостабильности фрагмента FAB применяют дифференциальную сканирующую калориметрию, поскольку определяют среднюю температуру плавления фрагмента FAB в контексте полноразмерного IgG. Данный вид калориметрических измерений известен специалистам в данной области техники и может проводиться, например, в соответствии с Garber & Demarest (2007), BBRC, 355: 751-7, как более подробно описано в Примере 6 и показано на Фиг.6.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения описаны антагонистичные
антитела или их фрагменты, которые связываются с эпитопом внеклеточной области
ОХ40 человека. Как описано в Примере 7, был осуществлен обмен одного или более
доменов внеклеточной области ОХ40 между последовательностями человека и крысы, и
были сгенерированы гибридные белки Fc. Затем проводили ELISA по оценке связывания с
целью определения активности антагонистичного гуманизированного антитела в
отношении внеклеточной области ОХ40 человека, внеклеточной области ОХ40 крысы и
четырех химерных белков из последовательностей человека и крысы. Таким образом,
согласно настоящему изобретению предложены антагонистичное антитело или его
фрагмент, которые согласно данным картирования соответствуют второму домену
внеклеточной области ОХ40 человека. Также согласно настоящему изобретению
предложены антагонистичные антитела или их фрагменты, которые можно применять для
подавления иммунных реакций. Действие антагонистичных гуманизированных антиК заявке №201490053
ОХ40 антител оценивали в MLR (см. Пример 8), применяемой в качестве модели аллореактивной активации и пролиферации Т-лимфоцитов in vitro (O'Flaherty Е et al, (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont В & Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107202). РВМС от двух неродственных доноров смешивали, что приводило к активации и пролиферации Т-лимфоцитов. Кроме того, в данной пробе оценивали три разных формы антагонистичных гуманизированных анти-ОХ40 антител: форма IgGl (IGHG1), не фукозилированная форма IgGl (IGHG1) и форма IgG4 (IGHG4), чтобы дополнительно определить вклад механизмов цитотоксичности, таких как ADCC, в MLR. Указанные антагонистичные гуманизированные анти-ОХ40 антитела эффективно подавляли MLR у двух разных индивидуумов (субъектов, отвечающих на лечение) с ЭК50 приблизительно 100 нг/мл. Однако результаты показали различие, зависящее от формы применяемого антитела. У первого индивидуума (субъект 1, отвечающий на лечение) реактивность Т-лимфоцитов эффективно подавлялась антителами в форме IgGl (IGHG1) и IgG4 (IGHG4), что указывает на то, что механизмы цитотоксичности не важны для данного индивидуума. У второго индивидуума (субъект 2, отвечающий на лечение) форма IgGl (IGHG1) продемонстрировала более 60% подавления, а форма IgG4 (IGHG4) лишь слабо блокировала MRL. У обоих индивидуумов не фукозилированная форма IgGl (IGHG1) обладала высокой эффективностью в подавлении MLR. Данные результаты показывают, что активация блокирования ОХ40 может быть достаточной у некоторых индивидуумов для того, чтобы подавлять MLR, но данное действие можно существенно усилить посредством дополнительных механизмов цитотоксичности. Следовательно, для лечения пациентов, страдающих расстройствами, обусловленными ОХ40, когда указанное расстройство, по-видимому, не зависит от ко-стимулирующего статуса ОХ40 пациента, например, у пациентов с низким уровнем экспрессии ОХ40, введение антагонистичного антитела или его фрагмента, которое связывается с ОХ40 человека и которое усиливает механизмы цитотоксичности, может быть особенно эффективным. Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения предложено антагонистичное гуманизированное антитело, которое связывается с ОХ40 человека, для лечения пациента, страдающего расстройством, обусловленным ОХ40. Кроме того, у пациента может быть низкий уровень экспрессии ОХ40. Предпочтительно указанное антагонистичное гуманизированное антитело, которое связывается с ОХ40 человека, содержит область IgGl (IGHG1). Более предпочтительно указанное антагонистичное
гуманизированное антитело, которое связывается с ОХ40 человека, содержит не фукозилированную область IgGl.
Согласно дополнительному аспекту настоящего изобретения действие антагонистичного антитела или его фрагмента было продемонстрировано в реакции "аллогенный трансплантат против хозяина", при которой создавали мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) при помощи РВМС человека. Данная реакция представляет собой модель реакции "аллогенный трансплантат против хозяина" (GVHD), наблюдаемой после пересадки костного мозга у людей. В данной модели РВМС человека, и Т-лимфоциты в частности, запускают сильную реакцию против клеток-хозяев мыши, что приводит к тяжелым симптомам воспаления. Как описано в Примере 9 и показано на Фиг. 9 и в Таблице 10, антагонистичное гуманизированное антитело, которое связывается с ОХ40 человека, сильно подавляет реакцию GVHD в дозе 1 мг/кг. Неожиданно, что данное антитело продемонстрировало более высокую эффективность, чем Энбрел(r) " признанное средство от GVHD (Xhaard A et al, (2011) Bull. Cancer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1109-17). Следовательно, согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антагонистичное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека и которое эффективно при лечении GVHD. Предпочтительно, введение указанного антитела субъекту приводит к четырехкратному повышению средней выживаемости (в днях) по сравнению с введением основы. Более предпочтительно, введение указанного антитела субъекту приводит к двукратному повышению средней выживаемости (в днях) по сравнению с введением Энбрел(r). Следовательно, согласно настоящему изобретению предложено антагонистичное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, которое более эффективно, чем Энбрел(r), при лечении пациента с GVHD и/или при подавлении GVHD. Кроме того, сообщалось, что агонистичные анти-ОХ40-связывающие антитела усугубляют GVHD в моделях аллогенной GVHD у мышей (Valzasina В et al, (2005) Blood, 105(7): 2845-51; Blazar BR et al, (2003) Blood, 101(9): 3741-8), следовательно, из Примера 9 можно заключить, что антагонистичные антитела и их фрагменты согласно настоящему изобретению не демонстрируют агонистичных эффектов в отношении связывания ОХ40 человека, поскольку в данной модели не наблюдалось усугубления GVHD. Следовательно, согласно настоящему изобретению
предложено гуманизированное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека и которое не демонстрирует агонистичной активности в отношении связывания.
Нуклеиновые кислоты, векторы и клетки-хозяева
Также согласно настоящему изобретению предложены изолированные /выделенныйнуклеиновые кислоты, кодирующие указанные антитела и их фрагменты, которые связываются с ОХ40 человека, векторы и клетки-хозяева, содержащие указанную нуклеиновую кислоту или вектор. Указанные нуклеиновые кислоты могут присутствовать в цельных клетках, в лизате клеток, в частично очищенной или по существу чистой форме. Нуклеиновая кислота является "изолированной/выделенной" или "рассматривается по существу чистой", когда она очищена от других клеточных компонентов или других примесей, например, других нуклеиновых кислот или белков клетки, при помощи стандартных технологий, включая обработку щелочью/SDS (додецилсульфат натрия), бэндинг CsCl, колоночную хроматографию, электрофорез на агарозном геле и другие хорошо известные в технике способы, например, см. F. Ausubel, et al, ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Нуклеиновыми кислотами согласно настоящему изобретению могут быть, например, ДНК или РНК, и они могут содержать или не содержать интронных последовательностей. Согласно предпочтительному варианту реализации нуклеиновой кислотой является молекула кДНК.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению можно получать при помощи стандартных молекулярно-биологических технологий, например, кДНК, кодирующую легкие и тяжелые цепи указанного антитела или кодирующую сегменты VH и VL, можно получить посредством стандартной ПЦР-амплификации или клонирования кДНК. Для антител, полученных из библиотеки генов иммуноглобулинов (например, с применением технологий фагового отображения), одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих антитело, можно извлечь из указанной библиотеки. Способы введения экзогенной нуклеиновой кислоты в клетки-хозяева хорошо известны в технике, и могут варьировать в зависимости от применяемой клетки-хозяина. Технологии включают без ограничений опосредуемую декстраном трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, обработку хлоридом кальция, опосредуемую полиэтиленимином трансфекцию, опосредуемую полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инфицирование вирусом или фагом, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую
микроинъекцию ДНК в ядра клеток. В случае клеток млекопитающих трансфекция может быть временной или стабильной.
Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению -это молекулы, кодирующие последовательность тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 32, 33, 34, 35, 36, 37 и 38 и/или последовательность легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 и 49. Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению -это молекулы, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 29, 58, 59, 77, 78, 79 и 80, и/или вариабельную область легкой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 30, 60, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 и 89.
Предпочтительные молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению -это молекулы, кодирующие вариабельную область легкой цепи в соответствии с SEQ ID №: 8 и/или вариабельную область тяжелой цепи в соответствии SEQ ID №: 7, например, ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID №: 9, и/или ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID №: 10. Более предпочтительными молекулами нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению являются молекулы, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи в соответствии с SEQ ID №: 58 или 59, и/или вариабельную область легкой цепи в соответствии с SEQ ID №:60, например, ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID №: 61 или 62, и/или ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность нуклеиновых кислот SEQ ID № 63, которые являются наиболее предпочтительными.
После того, как получены фрагменты ДНК, кодирующие сегменты VH и VL, с указанными фрагментами ДНК можно проводить дальнейшие манипуляции при помощи стандартных технологий рекомбинантных ДНК, например, превращать гены вариабельных областей в гены цепей полноразмерного антитела, или в гены фрагментов, соответствующие фрагментам, описанным выше, таким как гены фрагментов Fab или ген scFv. В ходе указанных манипуляций фрагмент ДНК, кодирующий VL или VH, функционально связывают с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой
как константная область антитела или гибкий линкер. Подразумевается, что в данном контексте термин "функционально связанный" должен означать, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что последовательности аминокислот, кодируемые двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки. Изолированную ДНК, кодирующую область VH, можно превратить в ген полноразмерной тяжелой цепи, функционально связав ДНК, кодирующую VH, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (CHI, СН2 и СНЗ). Последовательности генов константных областей тяжелых цепей человека известны в технике (например, см. Kabat ЕА et al, выше), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получить при помощи стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может быть константной областью IgGl (IGHG1), IgG2 (IGHG2), IgG3 (IGHG3), IgG4 (IGHG4), IgAl (IGHA1), IgA2 (IGHA2), IgM (IGHM), IgD (IGHD) или IgE (IGHE), но наиболее предпочтительная константная область IgGl (IGHG1). Для гена фрагмента Fab тяжелой цепи ДНК, кодирующую VH, можно функционально связать с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи СН1. Изолированную ДНК, кодирующую область VL, можно превратить в ген полноразмерной легкой цепи (а также в ген Fab легкой цепи), функционально связав ДНК, кодирующую VL, с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области легкой цепи - CL. Последовательности генов константных областей легких цепей человека известны в технике (например, см. Kabat ЕА et al, выше), и фрагменты ДНК, охватывающие данные области, можно получить при помощи стандартной ПЦР-амплификации. Согласно предпочтительным вариантам реализации константной областью легкой цепи может быть константная область каппа или лямбда, предпочтительно константная область каппа. Для создания гена scFv фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL, функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, например, кодирующий последовательность аминокислот (Gly4 -Ser)3, так, чтобы последовательности VH и VL можно было экспрессировать в виде непрерывного одноцепочечного белка с областями VH и VL, соединенными указанным гибким линкером (например, см., Bird RE et al, (1988) Science, 242: 423-426; Huston JS et al, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-83; McCafferty J et al, (1990) Nature, 348: 552-554). Для получения фрагментов антител были разработаны разные технологии. Традиционно данные фрагменты получали посредством протеолитического расщепления интактных антител (например, см., Morimoto К et al, (1992) J. Biochem. & Biophysical Methods, 24: 107-117 and Brennan M et al, (1985) Science, 229: 81-3). Однако указанные фрагменты теперь можно получать напрямую в клетках-хозяевах. Например, указанные
фрагменты антител можно выделить из библиотек антител фагов, обсуждаемых выше. В качестве альтернативы фрагменты Fab'-SH можно напрямую восстановить из E.coli и химическим путем соединить так, чтобы образовались фрагменты F(ab')2 (Carter Р et al, (1992) Bio/Technology, 10: 163-167). Согласно другому подходу фрагменты F(ab')2 можно выделить напрямую из культуры клеток-хозяев. Специалистам в данной области техники будут очевидны другие технологии для получения фрагментов антител. Согласно другим вариантам реализации антителом выбора является одноцепочечный фрагмент Fv (scFv), например, см., WO 1993/16185; Патент США № 5 571 894 и Патент США № 5 587 458. Указанным фрагментом антитела может быть также "линейное антитело", например, как описано в Патенте США № 5 641 870.
Нуклеиновые кислоты, которые кодируют антитела согласно настоящему изобретению, можно включать в вектор, предпочтительно вектор экспрессии, чтобы экспрессировать указанный белок. Для экспрессии белков можно применять разные вектора экспрессии. Вектора экспрессии могут включать самореплицирующиеся внехромосомные векторы или векторы, которые интегрируются в геном хозяина. Вектора экспрессии конструируют так, чтобы они были совместимы с типом клетки-хозяина. Таким образом, векторы, предпочтительно векторы экспрессии, которые находят применение при реализации настоящего изобретения, включают без ограничений векторы, которые способны к экспрессии белков в клетках млекопитающих, бактериий, клетках насекомых, дрожжей и в системах in vitro. Как известно в технике, доступны разные векторы экспрессии, в продаже или получаемые другим путем, которые могут находить применение при реализации настоящего изобретения для экспрессии антител. Обычно векторы экспрессии содержат белок, функционально связанный с контролирующими или регуляторными последовательностями, селектируемыми маркерами, любыми партнерами слияния и/или дополнительными элементами. В настоящей заявке термин "функционально связанный" означает, что нуклеиновая кислота находится в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Подразумевается, что термин "регуляторная последовательность" включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигнал полиаденилирования), которые контролируют транскрипцию или трансляцию генов цепей антитела. Такие регуляторные последовательности описаны, например, у Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Как правило, указанные
векторы экспрессии включают нуклеиновую кислоту для регуляции транскрипции или трансляции, функционально связанную с нуклеиновой кислотой, кодирующей указанное антитело, и они обычно соответствуют клетке-хозяину, применяемой для экспрессии белка. Как правило, последовательности для регуляции транскрипции или трансляции могут включать последовательности промоторов, сайты связывания рибосом, последовательности инициации и остановки транскрипции, последовательности инициации и остановки трансляции, а также последовательности энхансеров и активаторов. Как также известно в технике, векторы экспрессии обычно содержат ген селекции или маркер, который позволяет проводить отбор трансформированных клеток-хозяев, содержащих указанный вектор экспрессии. Гены селекции хорошо известны в технике и могут варьировать в зависимости от применяемых клеток-хозяев. Например, обычно ген селектируемого маркера придает устойчивость к лекарственным препаратам, таким как G418, гигромицин или метотрексат, клеткам-хозяевам, в которые он был введен. Предпочтительные гены селектируемых маркеров включают ген дигидрофолатредуктазы (ДГФР) (для применения в dhfr- клетка-хозяевах с селекцией/амплификацией в присутствии метотрексата) и ген пео (для селекции в присутствии G418).
Подходящими клетками-хозяевами для клонирования или экспрессии ДНК в векторах, описанных в настоящей заявке, являются клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот. Подходящие прокариоты для данной цели включают эубактерии, включая грамотрицательные и грамположительные микроорганизмы, например, Enterobacteriaceae, такие как Escherichia, например, Е. coli, Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Salmonella, например, Salmonella typhimurium, Serratia, например, Serratia marcescans и Shigella, а также Bacilli, такие как В. subtilis и В. licheniformis, Pseudomonas, такие как P. aeruginosa и Streptomyces. Подходящие хозяева для клонирования на основе Е. coli включают Е. coli 294 (АТСС 31,446), Е. coli В, Е. coli Х1776 (АТСС 31,537) и Е. coli W3110 (АТСС 27,325). Помимо прокариот подходящими микроорганизмами-хозяевами для клонирования или экспрессии являются эукариотические микроорганизмы, такие как гифомицеты или дрожжи. Наиболее часто среди низших эукариотических микроорганизмов-хозяев применяются Saccharomyces cerevisiae, или простые пекарские дрожжи. Однако доступен и широко применяется целый ряд других родов, видов и штаммов, такие как хозяева Schizosaccharoriyces pombe; Kluyveromyces, включая К. lactis,
К заявке №201490053
К. fragilis (АТСС 12,424), К. bulgaricus (АТСС 16,045), К. wickeramii (АТСС 24,178), К. WaltH (АТСС 56,500), К. drosopmarum (АТСС 36,906), К. thermotolerans, or К. marxianusyarrowia (ЕР402226); Pichia pastoris (ЕР 183070); Candida; Trichoderma reesia (EP244234); Neurospora crassa; Schwanniomyces , такие как Schwanniomyces occidentalism и гифомицеты, включая Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, или хозяева Aspergillus, такие как A. nidulans или A. niger.
Подходящие клетки-хозяева для экспрессии антител согласно настоящему изобретению получают из многоклеточных организмов. Примеры клеток беспозвоночных включают клетки plaril и насекомых. Был идентифицирован целый ряд штаммов и вариантов бакуловируса и соответствующих допускающих их введение клеток-хозяев насекомых из таких хозяев, как Spodoptera frugiperda (гусеница), Aedes augypti (комар), Aedes albopictus (комар), Drosophila melanogaster (фруктовая мушка) и Bombyx mori. Общедоступны разные штаммы вирусов для трансфекции, например, L-1 вариант NPV Autographa californica и штамм Bm-5 NPV Bombyx mori, и такие вирусы можно применять, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. В качестве хозяев можно применять культуры клеток растений - хлопка, кукурузы, картофеля, соевых бобов, петунии, томата и табака.
Клетками-хозяевами для экспрессии рекомбинантных антител согласно настоящему изобретению предпочтительно являются клетки-хозяева млекопитающих, которые включают клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) (включая dhfr" клетки СНО, описанные у Urlaub G & Chasin LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 77: 4216-4220, применяемые с селектируемым маркером DHFR, например, как описано у Kaufman RJ & Sharp PA (1982) J. Mol. Biol, 159: 601-621), клетки миеломы NSO, клетки COS и клетки SP2. В частности для применения с клетками миеломы NSO предпочтительна другая система экспрессии - система экспрессии генов GS, раскрываемая в патентах WO 87/04462 (выданном Wilson), WO 89/01036 (выданном Bebbington) и ЕР338841 (выданном Bebbington). Когда в клетки-хозяева млекопитающих вводят гены рекомбинантных антител, указанные антитела вырабатываются культивируемыми клетками-хозяевами в течение периода времени, достаточного для экспрессии указанного антитела в указанной клетке-хозяине, или, более предпочтительно, для секреции указанного антитела в питательную среду, в которой растут клетки-хозяева. Клетки-хозяева, применимые при
К заявке №201490053
получении антител, которые связываются ОХ40 человека, можно культивировать в разных средах. Для культивирования клеток-хозяев подходят имеющиеся в продаже среды, такие как Ham's F10 ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария), минимальная питательная среда (MEM; "Sigma-Aldrich Chemie GmbH"), RPMI-1640 ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Базель, Швейцария) и модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM; "Sigma-Aldrich Chemie GmbH"). Антитела можно выделять из питательной среды при помощи стандартных способов очистки белков.
Антитела можно функционально связывать с партнерами по слиянию, чтобы было возможно направленное движение экспрессируемого белка, его очистка, скрининг, отображение и т.п. Партнеров по слиянию можно присоединять к последовательности антитела линкерными последовательностями. Линкерные последовательности, как правило, содержат небольшое число аминокислот, обычно менее десяти, хотя можно также применять и более длинные линкеры. Обычно линкерные последовательности выбирают так, чтобы они были гибкими и устойчивыми к разрушению. Как должно быть понятно специалистам в данной области техники, в качестве линкеров можно применять любую из широкого спектра последовательностей. Например, обычная линкерная последовательность содержит последовательность аминокислот GGGGS. Партнер по слиянию может быть направляющей или сигнальной последовательностью, которая направляет антитело и любые ассоциированные партнеры по слиянию в желательную локализацию клетки или во внеклеточную среду. Как известно в технике определенные сигнальные последовательности могут направлять белок, чтобы он либо секретировался в питательную среду, либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренним и наружным слоем мембраны клетки. Также партнером по слиянию может быть последовательность, которая кодирует пептид или белок, которые создают возможность для очистки или скрининга. Такие партнеры по слиянию включают без ограничений полигистидиновую метку (His-метки) (например, Р6 или Р10, или другие метки для применения в системах аффинной хроматографии с иммобилизованными металлами (IMAC) (например колонки для аффинной хроматографии с Ni+2), слияния GST, слияния МБР, шаговая метка, направляющая последовательность для биотинилирования BSP бактериального фермента BirA, и метки эпитопов, на которые направлены антитела (например, метки с-тус, метки-флажки и подобные). Как должно
быть понятно специалистам в данной области техники, такие метки могут быть полезны при очистке, скрининге или и при том, и при другом.
Конструирование и получение антител
Антитела, направленные против полипептида ОХ40, можно получать путем иммунизации животного, т.е., путем введения указанных полипептидов животному, желательно не человеку, с применением хорошо известных и стандартных протоколов, см., например, Handbook of Experimental Immunology (Weir DM (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986). Можно иммунизировать многих теплокровных животных, таких как кролики, мыши, крысы, овцы, коровы, верблюды или свиньи. Однако, как правило, наиболее подходящим объектом являются мыши, кролики, свиньи и крысы, особенно мыши. Антитела можно получать также при помощи технологий рекомбинантных ДНК, известных специалистам в данной области техники. Кроме того, антитела можно получать путем ферментативного или химического расщепления существующих в природе антител. Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению можно сконструировать путем переноса одного или более CDR или их частей из областей VH и/или VL животного, отличного от человека (например, мыши), в одну или более каркасные области VH и/или VL человека. Необязательно, остатки каркасных областей антитела человека, таким образом присутствующих в областях VH и/или VL, можно заменять соответствующими остатками из нечеловеческого антитела, когда требуется или желательно снизить иммуногенность антитела и/или сохранить сродство связывания. Необязательно, остатки аминокислот из нечеловеческого антитела, присутствующие в CDR, можно заменить остатками аминокислот из антитела человека. Химерные или гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению можно получить на основе последовательности нечеловеческого моноклонального антитела, полученного, как описано выше. ДНК, кодирующую тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов, можно получить из нечеловеческой гибридомы и сконструировать так, чтобы она содержала последовательности не мышиных (например, человеческих) иммуноглобулинов, при помощи стандартных способов молекулярной биологии. Например, для создания химерного антитела вариабельные области антитела мыши можно соединить с константными областями антитела человека с применением способов, известных в технике (например, см. Патент США № 4 816 567, выданный Cabilly et al). Для создания гуманизированного антитела области CDR антитела мыши можно встроить в каркас антитела человека с применением способов, известных в технике (например, см. Патент
США № 5 225 539, выданный Winter, и Патенты США № 5 530 101; 5 585 089; 5 693 762 и 6 180 370, выданные Queen et al).
Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению можно сконструировать, причем молекулу-акцептор человека для введения вариабельной области тяжелой цепи выбирают на основании рассмотрения гомологии между вариабельными областями потенциальной молекулы-акцептора и вариабельной областью тяжелой цепи антитела мыши. Предпочтительны кандидаты из числа молекул-акцепторов человека эмбрионального типа, чтобы снизить потенциальную иммуногенность. Создают базы данных последовательностей антител эмбрионального типа, которые просматриваются до конца области FW3 тяжелой цепи и частично в последовательности CDR3. Для выбора области FW4 в базах данных последовательностей зрелых антител, которые были получены из отобранных молекул эмбрионального типа, можно проводить поиск последовательностей антител, которые были получены из отобранных молекул эмбрионального типа из молекул-доноров человека. Молекулы-доноры человека предпочтительно выбирают из тяжелых цепей того же класса, что молекула-донор мыши, и из того же канонического структурного класса, что и молекула-донор мыши. Дополнительные соображения для выбора молекулы-донора человека для получения вариабельной области тяжелой цепи включают гомологию по всей длине CDR между молекулой-донором мыши и молекулой-акцептором человека. Молекулы-акцепторы человека предпочтительно выбирают посредством поиска гомологии в базе данных V-BASE, хотя также можно применять другие базы данных, такие как Кабат и общедоступная база NCBI.
Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению можно сконструировать, причем молекулу-акцептор человека для получения вариабельной области легкой цепи выбирают на основании соображений гомологии между вариабельными областями потенциальной молекулы-акцептора и вариабельной областью легкой цепи антитела мыши. Предпочтительны кандидаты из числа молекул-акцепторов человека эмбрионального типа, чтобы снизить потенциальную иммуногенность. Создают базы данных последовательностей антител эмбрионального типа, которые просматриваются до конца области FW3 тяжелой цепи и частично в последовательности CDR3. Для выбора области FW4 в базах данных последовательностей зрелых антител, которые были получены из отобранных молекул эмбрионального типа, можно проводить поиск
последовательностей антител, которые были получены из отобранных молекул эмбрионального типа из молекул-доноров человека. Молекулы-доноры человека предпочтительно выбирают из легких цепей того же класса, что молекула-донор мыши, и из того же канонического структурного класса, что и молекула-донор мыши. Дополнительные соображения для выбора молекулы-донора человека для получения вариабельной области легкой цепи включают гомологию по всей длине CDR между молекулой-донором мыши и молекулой-акцептором человека. Молекулы-акцепторы человека предпочтительно выбирают посредством поиска гомологии в базе данных V-BASE, хотя также можно применять другие базы данных, такие как Кабат и общедоступная база NCBI. Способы гуманизации нечеловеческих антител описаны в настоящей заявке, включая Пример 6, ниже.
Согласно настоящему изобретению предложен способ получения антагонистичного антитела или его фрагмента, которое связывается с ОХ40 человека, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антагонистичное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, или вектор, содержащий изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую указанное антагонистичное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, так что нуклеиновая кислота экспрессируется, и образуется указанное антитело. Предпочтительно указанное антитело является изолированным. В том, что касается клеток-хозяев, нуклеиновых кислот и векторов, можно применять те клетки, нуклеиновые кислоты и векторы, которые были описаны выше. Экспрессии указанных нуклеиновых кислот можно добиться, например, путем сочетания технологий рекомбинантных ДНК и способов трансфекции генов, которые хорошо известны в технике (например, Morrison S (1985) Science 229: 1202) и также охарактеризованы выше. Например, для экспрессии антител или фрагментов антител можно получить ДНК, кодирующую часть или полноразмерные легкие и тяжелые цепи, при помощи стандартных молекулярно-биологических технологий (например, ПЦР-амплификация или клонирование кДНК при помощи гибридомы, которая экспрессирует рассматриваемое антитело), и указанную ДНК можно встроить в векторы, такие как векторы экспрессии. Векторы экспрессии и последовательности для контроля экспрессии выбирают так, чтобы они были совместимы с клеткой-хозяином, применяемой при экспрессии. Ген легкой цепи антитела и ген тяжелой цепи антитела можно встраивать в отдельный вектор, или, что бывает чаще, оба гена встраивают в один и тот же вектор экспрессии. Гены антитела
встраивают в вектор экспрессии при помощи стандартных способов (например, лигирование комплементарных сайтов рестрикции во фрагмент гена антитела и вектор, или лигирование тупых концов, если отсутствуют сайты рестрикции). Вариабельные области легких и тяжелых цепей антител, описанных в настоящей заявке, можно применять для создания генов полноразмерного антитела любого изотипа путем встраивания их в векторы экспрессии, уже кодирующие константные области тяжелых цепей и константные области легких цепей желаемого изотипа, такие как сегмент VH, функционально связанный с сегментом(ами) СН1 в указанном векторе, и сегмент VK, функционально связанный с сегментом СК в указанном векторе.
Описание свойств и очистка анти-ОХ40 человека
Скрининг антител можно проводить при помощи проб, основанных на измерении связывания с ОХ40 человека, и/или проб, основанных на измерении способности к блокированию связывания ОХ40 с его лигандом, OX40L. Примером анализа связывания является ELISA, в частности, с применением гибридного белка ОХ40 человека и Fc человека, который иммобилизован на планшетах, и с применением конъюгированного вторичного антитела для определения анти-ОХ40 антитела, связанного с указанным гибридным белком. Примером анализа блокирования является проточная цитометрия, основанная на пробе, в которой измеряют блокирование связывания гибридного белка-лиганда ОХ40 с ОХ40 на поверхности клеток CD4. Для определения количества связанного с клетками гибридного белка-лиганда ОХ40 применяют вторичное антитело с флуоресцентной меткой. В данной пробе ожидается снижение сигнала, если указанное антитело в надосадочной жидкости блокирует связывание гибридного белка-лиганда с ОХ40. Еще одним примером анализа блокирования является проба, в которой блокирование совместного стимулирования интактных Т-лимфоцитов человека гибридным белком-лигандом ОХ40, нанесенным на планшет, измеряют путем оценки включения тимидина. В качестве пробы для оценки функциональной активности анти-ОХ40 антител, можно применять, например, снижение активации Т-лимфоцитами реакции смешанной культуры лимфоцитов (MLR), как описано в Примерах 3 и 8. Антитела согласно настоящему изобретению можно изолировать или очищать разными путями, известными специалистам в данной области техники. Стандартные способы очистки включают хроматографические способы, включая обменную хроматографию, хроматографию гидрофобных взаимодействий, аффинную хроматографию, разделение по размеру или гель-фильтрацию, а также хроматографию с обращенной фазой, проводимые
при атмосферном давлении или при высоком давлении с применением таких систем, как жидкостная хроматография быстрого разрешения (ЖХБР) и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Способы очистки также включают электрофорез, иммунологические способы, осаждение, диализ и способы хроматофокусирования. Также применимы способы ультрафильтрации и диафильтрации. Для очистки антител к ОХ40 выбранные клетки-хозяева можно выращивать, например, в роллерных колбах для очистки моноклональных антител. Надосадочную жидкость можно фильтровать и концентрировать перед проведением аффинной хроматографии с применением сефарозы-белка A ("Pharmacia", г. Пискатауэй Нью-Джерси). Десорбированные антитела можно проверять посредством гель-фильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии, чтобы обеспечить чистоту. Таким образом, предпочтительное антитело согласно настоящему изобретению является изолированным и/или очищенным антителом, которое связывается с ОХ40 человека.
Иммуноконъюгаты
Согласно другому аспекту настоящему изобретению предложено антагонистичное антитело к ОХ40 или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, соединенное с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин, лекарственный препарат (например, иммуносупрессор) или радиотоксин. Такие конъюгаты в настоящей заявке называют "иммуноконъюгатами". Иммуноконъюгаты, которые включают в себя один или более цитотоксинов, называют "иммунотоксинами". Термин "цитотоксин" или цитотоксический агент" включает любой агент, который вреден для клеток (например, убивает их). Примеры цитотоксинов включают таксол, цитохалазин В, грамитидин D, бромид этидия, эметин, митомицин, этопозид, тенопозид, винкристин, винбластин, колхицин, доксорубицин, даунорубицин, дигидроксиантрацен дион, митоксантрон, митрамицин, актиномицин D, 1-дегидротестостерон, глюкокртикоиды, прокаин, тетракаин, лидокаин, пропанолол и пуромицин, а также их аналоги и гомологи. Терапевтические агенты также включают, например, антиметаболиты (например, метотрексат, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-фторурацил декарбазин), алкилирующие агенты (например, мехлорэатмин, тиоэпа хлорамбуцил, мелфалан, кармустин (BSNU) и ломустин (CCNU), циклофосфамид, бусульфан, дибромманнитол, стрептозотоцин, митомицин С и цис-дихлордиамин платины (II) ((DDP) цисплатин), антрациклины (например, даунорубицин (ранее - дауномицин) и доксорубицин), антибиотики (например, дактиномицин (ранее - актиномицин), блеомицин, митрамицин и
антрамицин (АМС)) и антимитотические агенты (например, винкристин и винбластин). Другие примеры терапевтических цитотоксинов, которые можно соединять с антителом согласно настоящему изобретению включают дуокармицины, калихемицины, майтансины и ауристатины, и их производные. Примером конъюгата калихемицина и антитела является имеющийся в продаже препарат Мил отар r(R) ("American Home Products))). Цитотоксины можно соединять с антителами согласно настоящему изобретению при помощи технологии линкеров, применимой в технике. Примеры типов линкеров, которые применялись для конъюгирования цитотоксина с антителом включают без ограничений гидразоны, тиоэфиры, сложные эфиры, дисульфиды и пептид-содержащие линкеры. Линкер можно выбрать таким образом, чтобы, например, он поддавался расщеплению под действием низкого рН в лизосомальном компартменте или поддавался расщеплению протеазами, такими как протеазы, преимущественно экспрессируемые в ткани опухоли, такие как катепсины (например, катепсины В, С, D). Более подробное обсуждение типов цитотоксинов, линкеров и способов конъюгирования терапевтических агентов с антителами можно также найти в Saito G et al, (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55: 199-215; Trail PA etal., (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52: 328-337; Payne G (2003) Cancer Cell, 3: 207-212; Allen TM (2002) Nat. Rev. Cancer, 2: 750-763; Pastan I & Kreitman RJ (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs, 3: 1089-1091; Senter PD & Springer CJ, (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53: 247-264. Антитела согласно настоящему изобретению также можно соединять с радиоактивным изотопом с целью генерирования цитотоксичных радиофармацевтических препаратов, также называемых радиоиммуноконъюгатами. Примеры радиоактивных изотопов, которые можно конъюгировать с антителами для применения в диагностике или терапии, включают без ограничений йод131, индий111, иттрий90 и лютеций177. Способы получения иммуноконъюгатов установлены в технике. Примеры радиоиммуноконъюгатов есть в продаже, включая Зевалин(r) ("EDEC Pharmaceuticals))) и Бексар(r) ("Corixa Pharmaceuticals))), и аналогичные способы можно применять для получения радиоиммуноконъюгатов с применением антител согласно настоящему изобретению. Иммуноконъюгаты с антителами согласно настоящему изобретению можно применять для модифицирования конкретной биологической реакции, и функциональную группу препарата не обязательно конструировать, ограничиваясь классическими химическими лекарственными препаратами. Например, функциональной группой лекарственного препарата может быть белок или полипептид, обладающий желательной биологической активностью. Такие белки могут включать, например, токсин с ферментативной активностью, или его активный фрагмент, такой как абрин, рицин А, экзотоксин
синегнойной палочки или дифтерийный токсин; белок, такой как фактор некроза опухоли или интерферон-у; или модификаторы биологической реакции, например, такие как лимфокины, интерлейкин-1 ("IL-1"), интерлейкин-2 ("IL-2"), интерлейкин-6 ("IL-6"), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор ("GM- CSF"), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор ("G-CSF") или другие факторы.
Технологии соединения таких терапевтических агентов с антителами хорошо известны, см, например, Arnon et al, "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al, (eds.), pp. 243- 56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al, "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al, (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", в Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al, (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", в Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al, (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985) и Thorpe PE & Ross WC (1982) Immunol. Rev. 62: 119-58.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено антагонистичное антитело к ОХ40 или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, вводимое вместе с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин, лекарственный препарат (например, иммуносупрессор) или радиотоксин.
Фармацевтические композиции
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая антагонистичное антитело или его фрагмент, согласно настоящему изобретению, и фармацевтически приемлемую основу. Такие композиции могут включать одно или сочетание (например, два или более разных) антител, и/или иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению и/или терапевтический агент, такой как цитотоксин, лекарственный препарат (например, иммуносупрессор) или радиотоксины, описанные выше. Например, фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может содержать сочетание антител (или иммуноконъюгатов), которые связываются с разными эпитопами на целевом антигене, или которые обладают взаимодополняющим действием. Фармацевтические композиции
согласно настоящему изобретению также можно вводить в составе комбинированной терапии, т.е., в сочетании с другими агентами. Например, комбинированная терапия может включать антагонистичное антитело к ОХ40 согласно настоящему изобретению в сочетании по меньшей мере с одним другим противовоспалительным агентом или иммуносупрессором.
В настоящей заявке термин "фармацевтически приемлемая основ/носитель" включает любые и все растворители, диспергирующие среды, покрытия, противомикробные и противогрибковые агенты, изотонические и замедляющие всасывание объекты, и т.п., которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно, указанная основа подходит для внутривенного, внутримышечного, подкожного, парентерального введения, введения в спинной мозг или внутрикожного введения (например, путем инъекции или инфузии). В зависимости от пути введения активное соединения, т.е. антитело или иммуноконъюгат, можно покрывать определенным материалом, чтобы защитить указанное соединение от действия кислот и других природных условий, которые могут инактивировать указанное соединение. Фармацевтически приемлемые основы включают стерильные водные растворы или дисперсионные среды, а также стерильные порошки для приготовления растворов для инъекций или дисперсий непосредственно перед применением. Применение таких сред и агентов для фармацевтически активных веществ известно в технике. За исключением тех случаев, когда традиционная среда или агент несовместимы с активным соединением, их применение в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению включено в заявку. Также можно включать в указанные композиции дополнительные активные соединения.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция, содержащая иммуноконъюгат, содержащий антагонистичное антитело или его фрагмент, которое связывается с ОХ40 человека, присоединенное к терапевтическому агенту, и фармацевтически приемлемую основу. Иммуноконъюгаты и терапевтические агенты, которые можно применять, описаны выше.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая антагонистичное антитело или его фрагмент согласно настоящему изобретению, которая также содержит другой фармацевтически активный агент. Предпочтительно, таким другим фармацевтически активным агентом
является один или более из: а) другой антагонист ОХ40 человека, Ь) анальгезирующий агент и с) иммуносупрессор, например, глюкокортикоид, такой как преднизон.
Фармацевтическая композиция согласно настоящему изобретению может также включать фармацевтически приемлемый антиоксидант. Примеры фармацевтически приемлемых антиоксидантов включают: (1) водорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, цистеина гидрохлорид, бисульфат натрия, метабисульфат натрия, сульфит натрия и подобные; (2) жирорастворимые антиоксиданты, такие как аскорбилпальмитат, бутилированный гидроксианизол (ВНА), бутилированный гидрокситолуол (ВНТ), лецитин, пропилгаллат, альфа-токоферол и подобные; и (3) агенты, хелатирующие металлы, такие как лимонная кислота, этилендиамин-тетрауксусная кислота (EDTA), сорбитол, винная кислота, фосфорная кислота и т.п. Примеры подходящих водных и неводных основ, которые можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, включают воду, этанол, многоатомные спирты (такие как глицерин, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и т.п.), и подходящие их смеси, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Необходимую текучесть можно поддерживать, например, путем применения покрытий, таких как лецитин, путем поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсий, и путем применения поверхностно-активных веществ. Также указанные композиции могут содержать вспомогательные вещества, такие как консерванты, смачивающие агенты, эмульгирующие агенты и диспергирующие агенты. Для обеспечения отсутствия микроорганизмов можно применять как процедуры стерилизации, как указано выше, так и включать разные противомикробные и противогрибковые агенты, например, парабен, хлорбутанол, фенолсорбиновую кислоту и т.п. Также может быть желательно включение изотонических агентов, таких как сахара, хлорид натрия и т.п. в композиции. Кроме того, можно создать лекарственную форму для инъекций с замедленным всасыванием путем включения агентов, которые замедляют всасывание, такие как моностеарат алюминия и желатин.
Применение в терапии и другие способы применения
Антагонистичные антитела согласно настоящему применению можно применять в целом ряде областей для диагностики и терапии in vitro и in vivo, включая диагностику и лечение ОХ40-, опосредованных расстройств. Например, указанные молекулы можно вводить в клетки в культуре, in vitro или ex vivo, или людям, например, in vivo, для лечения,
профилактики и диагностики разных ОХ40-, опосредованных расстройств. Предпочтительно субъектами являются люди, и они включают пациентов, страдающих расстройствами, , опосредованными активностью ОХ40 (0X4- опосредованные расстройства). Антагонистичные антитела согласно настоящему изобретению могут быть эффективны при лечении пациентов, независимо от их ко-стимулирующего статуса в отношении ОХ40. Более предпочтительными субъектами являются люди, и они включают пациентов, экспрессирующих низкий уровень ОХ40.
Термин "пациент" в целях настоящего изобретения включает как людей, так и животных, предпочтительно млекопитающих, и наиболее предпочтительно - людей. Таким образом, антитела согласно настоящему изобретению имеют применение как при лечении людей, так и в ветеринарии. Подразумевается, что термин "лечение" в контексте настоящего изобретения должен включать терапевтическое воздействие, а также профилактические или сдерживающие меры в отношении заболевания или расстройства. Таким образом, например, успешное введение антитела до начала заболевания приводит к лечению указанного заболевания. Согласно другому примеру успешное введение антитела после начала клинических проявлений заболевания с целью борьбы с симптомами указанного заболевания включает лечение заболевания. Также термин "лечение" включает введение антитела после проявления заболевания с целью устранения заболевания. Успешное введение антитела после начала заболевания, и после того, как развились симптомы, с возможным смягчением клинических симптомов, и вероятно, ослаблением заболевания, включает лечение заболевания. Субъекты "нуждающиеся в лечении" включают млекопитающих, у которых уже есть заболевание или расстройство, а также субъектов, склонных к развитию указанного заболевания или расстройства, включая тех субъектов, у которых указанное заболевание или расстройство требуется предотвратить.
Согласно конкретным вариантам реализации антагонистичные антитела применяют in vivo для лечения, профилактики или диагностики разных ОХ40-, опосредованных расстройств. Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ лечения ОХ40-опосредованного расстройства у субъекта, способ, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества указанного антагонистичного антитела или его фрагмента. Примеры ОХ40-опосредованных расстройств включают инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, ассоциированный с инфекцией, артрит, ревматоидный артрит, астму, хроническую
обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), воспалительное заболевание таза, болезнь Альцгеймера, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, болезнь Пейрони, глютеновую болезнь, заболевание желчного пузыря, пилонидальную болезнь, перитонит, псориаз, васкулит, послеоперационные спайки, инсульт, диабет I типа, болезнь Лайма, артрит, менингоэнцефалит, аутоиммунный увеит, иммунно-опосредованные воспалительные расстройства центральной и периферической нервной системы, такие как множественный склероз, волчанку (такую как системная красная волчанка) и синдром Джулиана-Барре, атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, фиброзирующий альвеолит, базедову болезнь, нефропатию IgA-типа, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Меньера, пузырчатку, первичный биллиарный цирроз, саркоидоз, склеродермию, гранулематоз Вегенера, панкреатит, травму (операцию), реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD), отторжение трансплантата, сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию костной ткани, остеопороз, остеоартрит, периодонтит, гипохлоргидрию и нейромиелит зрительного нерва.
Другие примеры ОХ40-опосредованных расстройств включают инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, ассоциированный с инфекцией, артрит, ревматоидный артрит, астму, бронхит, грипп, респираторно-синцитиальный вирус, пневмонию, хроническую обструктивную болезнь легких (ХОБЛ), идиопатический фиброз легких (ИФЛ), криптогенный фиброзирующий альвеолит (КФА), идиопатическую фиброзирующую интерстициальную пневмонию, эмфизему, воспалительное заболевание таза, болезнь Альцгеймера, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, болезнь Пейрони, глютеновую болезнь, заболевание желчного пузыря, пилонидальную болезнь, перитонит, псориаз, васкулит, послеоперационные спайки, инсульт, диабет I типа, болезнь Лайма, артрит, менингоэнцефалит, аутоиммунный увеит, иммунно-опосредованные воспалительные расстройства центральной и периферической нервной системы, такие как множественный склероз, волчанку (такую как системная красная волчанка) и синдром Джулиана-Барре, атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, фиброзирующий альвеолит, базедову болезнь, нефропатию IgA-типа, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Меньера, пузырчатку, первичный биллиарный цирроз, саркоидоз, склеродермию, гранулематоз Вегенера, панкреатит, травму (операцию), реакцию "трансплантат против
хозяина" (GVHD), отторжение трансплантата, сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию костной ткани, остеопороз, остеоартрит, периодонтит, гипохлоргидрию и нейромиелит зрительного нерва.
Предпочтительные ОХ40-опосредованные расстройства, которые требуется лечить при помощи антитела согласно настоящему изобретению, выбирают из группы, состоящей из множественного склероза, ревматоидного артрита, колита, псориаза, астмы, ХОБЛ, ИФЛ, реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD), атеросклероза и диабета. Особенно предпочтительными ОХ40-опосредованными расстройствами, которые требуется лечить при помощи антитела согласно настоящему изобретению, являются реакции "трансплантат против хозяина" (GVHD).
Также согласно настоящему изобретению предложены антитела для применения при лечении боли, в особенности боли, ассоциированной с воспалением.
Согласно одному варианту реализации антитела согласно настоящему изобретению можно применять для определения уровня ОХ40 или уровня клеток, которые содержат ОХ40 на своей мембране, причем указанный уровень можно затем связать с определенными симптомами заболевания. В качестве альтернативы, указанные антитела можно применять для подавления или блокирования функции ОХ40, которое, в свою очередь можно связать профилактикой или облегчением определенных симптомов заболевания, привлекая ОХ40 в качестве медиатора указанного заболевания. Этого можно достичь путем контакта пробы и контрольной пробы с антителами к ОХ40 при условиях, при которых возможно образование комплекса между антителом и ОХ40. Любые комплексы, образовавшиеся между указанным антителом и ОХ40, определяют и сравнивают в пробе и контроле. В свете специфического связывания антител согласно настоящему изобретению с ОХ40, антитела согласно настоящему изобретению можно применять для специфического определения экспрессии ОХ40 на поверхности клеток, например, можно применять для определения пациента с низким уровнем экспрессии ОХ40. Антитела согласно настоящему изобретению также можно применять для очистки ОХ40 посредством иммуноаффинной очистки.
Таким образом, согласно настоящему изобретению также предложен способ скрининга in vitro для определения пациента с низким уровнем экспрессии ОХ40, включающий этапы:
(a) очистки мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от других компонентов пробы крови пациента;
(b) подвергание РВМС проточной цитометрии; и
(c) определение количества ОХ40-позитивных клеток среди CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов и сравнение указанного количества с контрольными уровнями.
Согласно предпочтительному варианту реализации на низкий уровень экспрессии ОХ40 указывает увеличение уровня экспрессии в ОХ40-позитивных клетках по сравнению с контрольным уровнем до 10%, более предпочтительно до 20% и еще более предпочтительно до 30%. Способ определения экспрессии ОХ40 также описан подробно у KotaniAe^a/., (2001) Blood, 98: 3162-4 and Xiaoyan Z etal, (2005) Clin. Exp. Immunol. 143: 110-6.
Согласно другому варианту реализации антитела согласно настоящему изобретению можно сначала оценивать в отношении их активности связывания, ассоциированной с терапевтическим или диагностическим применением in vitro. Например, композиции согласно настоящему изобретению можно оценивать при помощи проточной цитометрии.
Также согласно настоящему изобретению предложено применение антагонистичного антитела или его фрагмента в качестве лекарственного препарата и применение антагонистичного антитела или его фрагмента при получении лекарственного препарата для лечения ОХ40-опосредованного расстройства. Согласно дополнительному варианту реализации настоящего изобретения предложено антагонистичное антитело или его фрагмент для применения в качестве лекарственного препарата. Также согласно настоящему изобретению предложено антагонистичное антитело или его фрагмент для применения при реализации способа лечения ОХ40-опосредованного расстройства. ОХ40-опосредованные расстройства - это расстройства, описанные выше. Антагонистичное антитело согласно настоящему изобретению может быть особенно полезно при лечении ОХ40-опосредованных расстройств, независимых от ко-стимулирующего статуса ОХ40 пациента. Согласно предпочтительному варианту реализации антагонистичное антитело или его фрагмент можно применять при лечении ОХ40-опосредованного расстройства, причем пациент экспрессирует низкий уровень ОХ40.
Как описывалось ранее, антагонистичные антитела к ОХ40 согласно настоящему изобретению можно вводить совместно с одним или более терапевтическими агентами, например, цитотоксическим агентом, радиотоксическим агентом или иммуносупрессором. Указанные антитела можно соединять с указанным агентом (в форме иммуноконъюгата, как описано выше) или можно вводить раздельно с указанным агентом. В последнем случае (раздельное введение) антитело можно вводить перед введением, после введения или одновременно с введением агента, или можно вводить совместно с проведением других типов лечения, например, противоопухолевого лечения, например, облучения.
При введении указанного антитела доза варьирует в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, и чаще от 0,01 до 10 мг/кг массы тела хозяина. Пример режима лечения подразумевает введение антитела один раз в неделю, раз в две недели, раз в три недели, раз в четыре недели, раз в месяц, раз в три месяца или раз в три или шесть месяцев. Обычно указанное антитело вводят несколько раз. Интервалы между введением однократных доз могут, например, составлять неделю, месяц, три месяца или год. Также интервалы могут быть нерегулярными, в зависимости от показаний измерения уровня антитела на целевой антиген в крови у пациента. Согласно некоторым способам дозу корректируют так, чтобы достичь концентрации антител в плазме приблизительно 1-1000 мкг/мл, а согласно некоторым способам - приблизительно 25-300 мкг/мл. В качестве альтернативы указанное антитело можно вводить в составе лекарственной формы с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется более редкое введение. Дозировка и частота введения варьируют в зависимости от времени полужизни антитела в организме пациента. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является ли воздействие профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении вводят относительно низкую дозу с относительно большими интервалами в течение длительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают подвергаться лечению до конца жизни. При терапевтическом применении иногда требуется вводить относительно высокие дозы с относительно малыми интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не снизится или не прекратится.
Реальная доза активного ингредиента, т.е., указанного антитела в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению может варьировать таким образом, чтобы
получать количество активного ингредиента, которое эффективно для достижения желаемого ответа на лечение у конкретного пациента, при применении конкретной композиции и режима введения, без токсичности для пациента. Избранный уровень дозы будет зависеть от целого ряда фармакокинетических факторов, включая активность конкретных применяемых композиций согласно настоящему изобретению, путь введения, время введения и скорость выведения конкретного антитела, которое применяется, длительность лечения, другие применяемые препараты, соединения и/или вещества в конкретных применяемых композициях, а также возраст, пол, массу, общее состояние здоровья и предшествующий анамнез пациента, которого лечат, и подобных факторов, хорошо известных в медицине.
"Терапевтически эффективное количество" антитела к ОХ40 согласно настоящему изобретению предпочтительно приводит к снижению тяжести симптомов заболевания, увеличению частоты и длительности периодов без симптомов, и/или предотвращению нарушения или нетрудоспособности в связи с заболеванием. Способность соединения оказывать лечебное воздействие на ОХ40-опосредованное расстройство можно оценивать в модельной системе на животных, которая позволяет предсказать эффективность у человека. В качестве альтернативы, данное свойство композиции можно оценивать путем определения способности соединения к подавлению роста клеток, причем такое подавление можно измерить in vitro посредством проб, известных специалистам в данной области техники. Специалист в данной области техники способен определить такие количества на основании таких факторов, как размеры субъекта, тяжесть симптомов у субъекта, а также конкретная композиция или выбранный путь введения.
Антитело или композицию согласно настоящему изобретению можно вводить посредством одного или более путей введения с применением одного или более разных способов, известных в технике. Как должно быть понятно опытным специалистам, путь и/или способ введения варьирует в зависимости от желаемых результатов. Предпочтительные пути введения включают внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный, подкожный путь введения, введение в спинной мозг или другие парентеральные пути введения, например, путем инъекции или инфузии. Более предпочтительными путями введения является внутривенный или подкожный. Фраза "парентеральное введение" в настоящей заявке обозначает путь введения, отличный от энтерального или местного, обычно путем инъекции, и включает без ограничений внутривенное, внутримышечное, внутриартериальное, подоболочечное,
внутрисуставное, внутриглазничное, внутрибрюшинное, внутрисердечное, транстрахеальное, подкожное, субкутикуллярное, внутрисуставное, введение в полость капсулы, субарахноидальное, внутриспинальное, эпидеуральное и внутригрудинное введение посредством инъекций и инфузий. В качестве альтернативы антитело согласно настоящему изобретению можно вводить непарентеральным путем, таким как местный, кожный путь введения или введение через слизистые оболочки, например, внутриназальным, оральным, вагинальным, ректальным, сублингвальным или местным путем.
Готовые изделия и наборы
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения предложено готовое изделие, содержащее антагонистичное антитело или его фрагмент, композицию или иммуноконъюгат согласно настоящему изобретению, для лечения ОХ40-опосредованного расстройства. Готовое изделие может включать контейнер и этикетку или листок-вкладыш, прилагаемый к контейнеру. Подходящие контейнеры включают, например, бутыли, флаконы или шприцы. Контейнеры могут быть выполнены из разных материалов, таких как стекло или пластик. В контейнере содержится композиция, которая может быть эффективна при лечении указанного патологического состояния, и в нем может быть стерильный порт доступа (например, указанным контейнером может быть пакет для растворов для внутривенного введения или флакон с пробкой, прокалываемой иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в указанный композиции может быть антагонистичным антителом, раскрываемым в настоящей заявке. На этикетке или в листке-вкладыше может быть указано, что композицию можно применять для лечения выбранного патологического состояния, такого как рак. Согласно одному варианту реализации на этикетке или листке-вкладыше может быть указано, что композицию, содержащую антагонистичное антитело, можно применять для лечения ОХ40-опосредованного расстройства.
Кроме того, готовое изделие может включать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит антагонистичное антитело, раскрываемое в настоящей заявке, и (Ь) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит терапевтический агент, отличный от антагонистичного антитела. Готовое изделие согласно данному варианту реализации настоящего изобретения может также содержать листок-вкладыш, в котором указано, что первую и вторую композицию можно применять в сочетании для лечения ОХ40
опосредованного заболевания или расстройства. Таким терапевтическим агентом может быть любое дополнительное средство из описанных в предыдущем разделе (например, тромболитическое средство, антитромбоцитарное средство, химиотерапевтическое средство, антигормональное соединение, кардиопротектор и/или регулятор иммунной функции у млекопитающих, включая цитокин). В качестве альтернативы или дополнительно готовое изделие может также содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Также оно может содержать другие вещества, желаемые с коммерческой позиции или с позиции пользователя, включая другие буферы, растворители, фильтры, иглы и шприцы.
Также в область настоящего изобретения входят наборы, включающие антитело, композиции или иммуноконъюгаты согласно настоящему изобретению и инструкцию по применению. Указанный набор также включает другие дополнительные реагенты, такие как иммуносупрессор, цитотоксический агент, радиотоксический агент, или одно или более дополнительных антагонистичных антител согласно настоящему изобретению (например, антагонистичное антитело, обладающее дополняющей активностью, которое связывается с эпитопом антигена ОХ40, отличным от эпитопа для первого антагонистичного антитела).
Без дополнительного описания предполагается, что специалист в данной области техники может при помощи предыдущего описания и следующих иллюстрирующих примеров создать и применить агенты согласно настоящему изобретению и реализовать заявленные способы. Следующие демонстрационные примеры приведены для облегчения реализации на практике настоящего изобретения, и не предназначены для того, чтобы каким бы то ни было образом ограничить остальную часть изобретения.
Примеры
Пример 1:
Получение и скрининг антитела мыши к ОХ40 человека
Для получения рекомбинантного белка Fc-OX40 человека кДНК для TNFRSF4 человека приобретали у компании "imaGenes" (номер клона: RZPDB737H0329D; Берлин, Германия). Указанную кДНК применяли в качестве матрицы для ГГЦР-амплификации ДНК, кодирующей внеклеточный домен области TNFRSF4 человека (SEQ ID №: 11). В
отдельной реакции П1 IP амплифицировали область Fc IgGl человека (положения согласно нумерации ЕС 223-451), добавляя линкер 5' GSGGG и линкер 3' SA-6xHis и сайты рестрикции для клонирования. Затем два полученных продукта соединяли при помощи перекрывающейся расширенной П1 IP с фланкирующими праймерами, добавляя сайты рестрикции для последующего клонирования в модифицированный вектор экспрессии млекопитающих на основе плазмиды pcDNA3.1(-) от компании "Invitrogen" ("Invitrogen AG", Базель, Швейцария, Кат. № V795-20), содержащей промотор CMV человека с донорно-акцепторным фрагментом Ig (первый интрон), описанным в Патенте США 5924939, последовательность OriP (Koons MD et al, (2001) J Virol. 75(22): 10582-92), энхансер SV40 и сигнал полиаденилирования SV40, соединенные с терминатором гена гастрина, описанным у Kim D, et al, (2003) Biotechnol. Prog. 19(5): 1620-2. Указанная рекомбинантная плазмида обеспечивала возможность экспрессии гибридного белка внеклеточный домен TNFRSF4 человека-Fc в клетках млекопитающих с секрецией в питательную среду для выращивания клеток, запускаемой нативным сигнальным пептидом белка TNFRSF4 человека. Для выработки рекомбинантного белка упомянутый выше рекомбинантный вектор трансфецировали в адаптированные к суспензии клетки НЕК 293 (номер АТСС CRL 1573) с применением реагента для трансфекции jetPEI(tm) ("Polyplus-transfection S.A.", Страсбург, Франция; дистрибьютер: "Brunschwig", Базель, Швейцария). Надосадочную жидкость питательной среды отбирали через пять дней и подвергали дальнейшей очистке с применением колонки для аффинной хроматографии с белком А (колонка с сефарозой-белком A HiTrap; "GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), которой управляла система АКТА FPLC ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария).
Для получения рекомбинантного белка ОХ40 человека-his внеклеточный домен TNFRSF4 (SEQ ID №: 11) человека амплифицировали посредством ГЩР, добавляя линкер 3' GSG-6xHis и сайты рестрикции для клонирования. Далее продукт ПЦР клонировали в модифицированную плазмиду pcDNA3.1(-), описанную выше. Указанная рекомбинантная плазмида обеспечивала возможность экспрессии белка ОХ40 человека-his в клетках млекопитающих с секрецией в питательную среду для выращивания клеток, запускаемой нативным сигнальным пептидом TNFRSF4 человека. Для выработки белка рекомбинантный вектор трансфецировали в адаптированные к суспензии клетки НЕК 293 (номер АТСС CRL 1573) с применением реагента для трансфекции jetPEI(tm) ("Polyplus-transfection S.A.", Страсбург, Франция; дистрибьютер: "Brunschwig", Базель, Швейцария). Надосадочную жидкость питательной среды отбирали через пять дней и подвергали
К заявке №201490053
дальнейшей очистке с применением колонки для аффинной хроматографии с Ni2+-NTA (колонка с сефарозой- Ni2+-NTA HiTrap; "GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), которой управляла система АКТА FPLC ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария). Было показано, что рекомбинантный белок ОХ40 человека-Fc и OX40-his были чистыми на 95%, о чем судили методом SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле), и дальше проводили замену буфера на фосфатно-солевой буфер (ФСБ) перед применением.
Рекомбинантный белок ОХ40 человека-Fc, растворенный в ФСБ, смешивали с эквивалентным объемом адъюванта Stimune ("Prionics", Швейцария, идентификационный номер: 7925000) и готовили эмульсию. Эмульсию переносили в инсулиновые шприцы объемом 0,5 мл ("BD Pharmingen", Алл свиль, Швейцария) и вводили животным BALB/c ("Harlan", Нидерланды) подкожно в подушечку стопы задней конечности, в основание хвоста и шею в дозе 50 мкг эмульгированного белка. Иммунизацию повторяли через две недели с тем же количеством антигена и с тем же путем введения.
Присутствие циркулирующих антител к ОХ40 человека у иммунизированных мышей в сыворотке оценивали посредством прямого ELISA с применением планшетов, покрытых рекомбинантным белком ОХ40 человека-his. Сыворотку мыши в разных разведениях (от 1:10° до 1:109) добавляли в планшеты, и связавшиеся антитела определяли при помощи овечьего анти-мышиного H+L цельного антитела-HRP ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария). Конечные усиливающие дозы 50 мкг антигена без адъюванта вводили подкожно животным, проявляющим самый высокий титр IgG к ОХ40 человека в сыворотке перед умерщвлением.
Животных подвергали эвтаназии, и паховые, подмышечные, плечевые, подколенные и седалищные лимфатические узлы извлекали и готовили суспензию отдельных клеток путем распределения архитектуры лимфатических узлов двумя иглами 25G в растворе ДНКазы ("Roche Diagnostics (Schweiz) AG", Роткройц, Швейцария) и коллагеназы ("Roche Diagnostics (Schweiz) AG", Роткройц, Швейцария). Суспензии отдельных клеток объединяли с линией клеток миеломы X63AG8.653 (линия клеток миеломы мыши BALB/c; номер доступа АТСС: CRL 1580; Kearney JF et al, (1979) J. Immunol. 123(4): 1548-1550) в соотношении 7:1 (партнеры по слиянию - собираемые клетки
лимфатических узлов) с полиэтиленгликолем 1500 ("Roche Diagnostics (Schweiz) AG", Роткройц, Швейцария). Слившиеся клетки помещали в планшеты на 96 лунок с плоским дном, покрытые макрофагами мыши в среде DMEM-10 ("Invitrogen AG, Базель", Швейцария) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС, "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 2 мМ L-глутамата, 100 Е/мл пенициллина ("Biochrom AG", Германия), 100 мкг/мл стрептомицина ("Biochrom AG", Германия), 10 мМ HEPES ("Invitrogen AG", Базель, Швейцария), 50 мкМ гипоксантина/аминоптерина/тимидина ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) и 1% фактора роста ("Hybridokine, Interchim/Uptima", Монтлюкон, Франция).
В результате слияния приблизительно 800 лунок подвергали скринингу посредством ELISA на наличие IgG мыши, который распознает ОХ40 человека и блокирует связывание ОХ40 человека на его рецепторах. Содержимое лунок с положительной реакцией распространяли и подвергали двум циклам субклонирования. Клетки собирали, и тяжелые и легкие цепи клонировали и секвенировали.
Пример 2:
Клонирование и секвенирование VH и VL цепей антитела против ОХ40 из клеток гибридомы
Для каждой гибридомы, отобранной с положительным результатом, готовили общую РНК, проводили обратную транскрипцию с образованием кДНК, и гены VH и VL, соответственно, амплифицировали посредством ПНР. Продукты ПЦР вшивали в "спасающий" вектор (вектор pDrive; "QIAGEN AG", Хомбрехтикон, Швейцария; Кат. № 231124), который делает возможным секвенирование ДНК индивидуальных продуктов ПЦР и определение моно- или поликлональности избранных гибридом. При применении данного вектора можно было проводить селекцию по синему/белому цвету в планшетах с LB-агаром, содержащим IPTG (изопропилтиогалактозид) и X-gal (колонии без вставки имели синее окрашивание из-за расщепления X-gal пептидом LacZ а). Рекомбинантные плазмиды из положительных (белых) бактериальных клонов готовили и секвенировали с применением стандартных ДНК-праймеров для секвенирования, специфических в отношении остова вектора (М13 rev, M13fwd, Т7 или SP6). В конце последовательности ДНК субклонировали в вектор экспрессии для рекомбинантной экспрессии рассматриваемого антитела в клетках млекопитающих.
Выделение РНК
Общую РНК выделяли из 2-10x106 клеток с применением набора RNeasy Mini от компании "QIAGEN" ("QIAGEN AG", Хомбрехтикон, Швейцария; Кат. № 74106) в соответствии с протоколом производителя; количественную оценку в пробах проводили на спектрофотометре NanoDrop ND-1000 ("WITEC AG", Литтау, Швейцария).
Одноэтапная ПЦР с ОФ
Препараты общей РНК, полученные, как было описано выше, подвергали обратной транскрипции с получением кДНК, и фрагменты VH и VL амплифицировали с применением двух разных смесей вырожденных праймеров, каждый из которых позволял восстановить вариабельные фрагменты тяжелых цепей и соединительные области вариабельных областей тяжелых цепей всех подсемейств иммуноглобулинов мыши или восстановить вариабельные фрагменты легких цепей каппа и соединительные области вариабельных областей легких цепей всех подсемейств иммуноглобулинов мыши. Праймеры, применяемые для обратной транскрипции и амплификации, были синтезированы компанией "Microsynth" (Балгах, Швейцария), и подвергались очистке посредством ВЭЖХ (Таблицы 1-4). И обратную транскрипцию, и ПЦР-амплификацию проводили одновременно с применением набора для одноэтапной ПЦР с ОФ компании "QIAGEN" ("QIAGEN AG", Хомбрехтикон, Швейцария; Кат. № 210212). Поскольку указанная технология основана на применении специфических праймеров, каждую пробу мРНК затем подвергали обработке в двух экземплярах, что позволяло проводить индивидуальную обратную транскрипцию и амплификацию либо VH, либо VL фрагментов. 2 мкг общей РНК, растворенной в воде, не содержащей РНКазу, до конечного объема 30 мкл, смешивали с: 10 мкл 5х матричного раствора буфера для одноэтапной ПЦР с ОФ компании "QIAGEN", 2 мкл смеси дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфатов) в концентрации 10 мМ, 3 мкл смеси праймеров в концентрации 10 мкМ и 2 мкл смеси ферментов для одноэтапной ПЦР с ОФ компании "QIAGEN". Затем итоговую смесь помещали в пробирку для ПЦР и подвергали циклам в ПЦР-термоциклере (iCycler "BioRad", версия 4.006, "Bio-Rad Laboratories AG", Рейнах, Швейцария) со следующими установками:
30 мин при 50 °С 15 мин при 95 °С
40 циклов: 30 сек при 94 °С 30 сек при 55 °С 1 мин при 72 °С
10 мин при 72 °С Выдерживать при 4 °С
Клонирование в вектор pDrive
Продукты ПЦР загружали на 2% агарозные гели. После электрофореза ДНК рассматриваемые фрагменты (~450по) вырезали из агарозных гелей и подвергали дальнейшей экстракции при помощи набора NucloSpin Extract II компании "Маспегеу-Nagel" 250 ("Macherey-Nagel", Энзинген, Швейцария; Кат. № 740609.250). Для секвенирования ДНК экстрагированные продукты ПЦР клонировали в "спасающий" вектор (вектор pDrive; "QIAGEN AG", Хомбрехтикон, Швейцария; Кат. № 231124) и трансформировали в Е. coli штамм ТОРЮ ("Invitrogen AG", Базель, Швейцария; Кат. № С404006).
Экстракция по протоколу "Miniprep"
Колонии, продемонстрировавшиеся положительный результат, культивировали в течение ночи при 37 °С (взбалтывание при 250 об./мин) в 1,5 мл среды Луриа-Бертани (LB) с добавлением 100 мкг/мл ампициллина, засеянной в блокирующих планшетах с квадратными лунками "Macherey-Nagel" ("Macherey-Nagel", Энзинген, Швейцария; Кат. № 740488.24). На следующий день экстракцию ДНК по протоколу "miniprep" поводили с применением набора плазмид NucleoSpin Multi-8 ("Macherey-Nagel", Энзинген, Швейцария; Кат. № 740620.5).
Секвенирование и анализ последовательностей
Пробы отправляли для секвенирования ДНК в компанию "Fasteris", оказывающую услуги по секвенированию (План-ле-Отс, Швейцария). Применяли стандартные праймеры: M13rev, M13fwd, Т7, SP6 (Таблица 5). Для анализа последовательностей применяли профессиональную версию Clone Manager 9 ("Scientific & Educational Software)), Северная
Каролина, США) и программу BioEdit Sequence Alignment Editor (Hall, ТА (1999) Nucl. Acids. Symp. Ser. 41: 95-98)
Клонирование вектора экспрессии для экспрессии рекомбинантного химерного антитела Для рекомбинантной экспрессии в клетках млекопитающих изолированные фрагменты VH и VL мыши переводили в форму химерных иммуноглобулинов при помощи способов ПЦР, основанных на сборке. Указанные химерные антитела состоят из тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи мыши соединена с константными доменами тяжелой цепи IgGl человека (области yl, шарнир, у2 и уЗ), и легкой цепи, где вариабельный домен мышиной легкой цепи соединен с константным доменом человека каппа (Ск). Собранные посредством ПЦР мышиные вариабельные и человеческие константные части впоследствии клонировали в модифицированный вектор экспрессии для клеток млекопитающих, основанный на модифицированном векторе pcDNA3.1(-) от компании "Invitrogen", упоминаемом в Примере 1, с тем отличием, что для запуска секреции белка применялся лидерный пептид легкой цепи каппа иммуноглобулина. Для выработки белка иммуноглобулинов-кандидатов эквивалентные количества ДНК-вектора для тяжелой и легкой цепи совместно трансфецировали в адаптированные к суспензии клетки НЕК-293 (номер АТСС: CRL-1573). Через пять дней надосадочную жидкость культуры отбирали и очищали с применением колонки для аффинной хроматографии с белком А (колонка с сефарозой-белком A HiTrap), которой управляла система АКТА FPLC ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария).
> братные
GAK GTR MAG CTT CAG GAG TC GAG GTB CAG С ТВ CAG CAG TC CAG GTG CAG CTG AAG SAR TC GAG GTC CAR CTG CAA CAR TC CAG GTY CAG С ТВ CAG CAR TC CAG GTY CAR CTG CAG CAR TC CAG GTC CAC GTG AAG CAR TC GAG GTG AAS STG GTG GAR TC GAV GTG AWG STG GTG GAG TC GAG GTG CAG STG GTG GAR TC GAK GTG CAM CTG GTG GAR TC GAG GTG AAG CTG ATG GAR TC GAG GTG CAR CTT GTT GAR TC GAR GTR AAG CTT CTC GAR TC GAA GTG AAR STT GAG GAR TC CAG GTT ACT CTR AAA SAR TC CAG GTC CAA CTV CAG CAR CC GAT GTG AAC TTG GAA SAR TC GAG GTG AAG GTC АТС GAR TC
Таблица 1: Смесь праймеров VH - прямые
CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA AAC GGT GAC CGT GGT CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC TGT GAG AGT GGT CCTCCACCACTCGAGCC CGC AGA GAC AGT GAC CAG AGT CCTCCACCACTCGAGCC CGA GGA GAC GGT GAC TGA GGT
Таблица 3: Смесь праймеров VL - обратные
GGCGGTGGC GCT AGC GAY АТС CAG CTG ACT CAG СС GGCGGTGGC GCT AGC CAA ATT GTT CTC ACC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG MTM ACT CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG YTR АСА CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTR ATG ACM CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT MAG ATR AMC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT CAG ATG A YD CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATY CAG ATG АСА CAG AC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTT CTC AWC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GWG CTS ACC CAA TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT STR ATG ACC CAR TC GGCGGTGGC GCT AGC GAY RTT KTG ATG ACC CAR AC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACB CAG КС GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATA ACY CAG GA GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG ACC CAG WT GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT GTG ATG АСА CAA CC GGCGGTGGC GCT AGC GAY ATT TTG CTG ACT CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAA АСА ACT GTG ACC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC GAA AAT GTK CTS ACC CAG TC GGCGGTGGC GCT AGC CAG GCT GTT GTG ACT CAG GAA TC
Таблица 4: Смесь праймеров VL - прямые
ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT КАТ TTC CAG CTT GG ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT TAT TTC CAA CTT TG ATGCTGAC GC GGC CGC ACG TTT CAG CTC CAG CTT GG ATGCTGAC GC GGC CGC ACC TAG GAC AGT CAG TTT GG
Таблица 5: праймеры для секвенирования
M13-Fwd GTAAAACGACGGCCAGT
M13-Rev AACAGCTATGACCATG
T7 T AAT ACGACTC АСТАТ AGG
SP6 GATTTAGGTGAC АСТАТ AG
Пример 3:
Описание биологических свойств антитела к ОХ40 человека
Определение ОХ40-специфичных антител посредством ELISA:
Титры, специфичность и выработку антител гибридомами, а также кандидаты в рекомбинантные антитела определяли посредством ELISA. Если кратко, в микропланшеты на 96 лунок ("Costar", США, дистрибьютор: "VWR AG", Ньон, Швейцария) наносили 100 мкл рекомбинантного ОХ40 человека-his в концентрации 2 мкг/мл в ФСБ (информацию о генерировании белка OX40-his см. в Примере 1). Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С, а затем блокировали 2% БСА в ФСБ (бычий сывороточный альбумин, "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия) при комнатной температуре (КТ) в течение одного часа. Блокирующий раствор удаляли, добавляли надосадочную жидкость от гибридом или очищенные антитела. Планшеты инкубировали при КТ в течение 30 минут, затем проводили отмывку десять раз 0,01% раствором Твин-20 в ФСБ ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария), и добавляли меченные пероксидазой хрена (HRP) овечьи антимышиные антитела для детекции H+L ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) в разведении 1:1000. Для определения рекомбинантных химерных антител (см., Пример 2), которые содержат фрагмент Fc человека, в качестве антитела для определения применяли HRP-меченные кроличьи античеловеческие антитела-IgG ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) в разведении 1:1000. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре (КТ), проводили отмывку девять раз 0,01% раствором Твин-20 в ФСБ и добавляли в планшеты ТМБ (тетраметилбензидиновый) субстрат ("Bio-rad Laboratories AG", Рейнах, Швейцария), и через шесть минут реакцию останавливали путем добавления H2SO4. Затем измеряли поглощение на длине волны 450 нм на микропланшетном ридере ("Biotek", США; дистрибьютор: "WITTEC AG", Литтау, Швейцария). На Фигуре 1А показано, что химерное антитело 1D4 и химерное антитело 2F8 распознают белок ОХ40-his, нанесенный на планшет.
ОХ40Ь-блокирующий ELISA:
Рекомбинантный белок - лиганд ОХ40 человека (OX40L) генерировали следующим образом: кДНК для TNFSF4 человека (номер клона: IOH46203) приобретали у компании "imaGenes" (Берлин, Германия) и внеклеточную часть (аминокислоты 51-183) лиганда TNFSF4 человека (нумерация в соответствии с последовательностью Q6FGS4 Uniprot)
амплифицировали с фланкирующими сайтами рестрикции. Полученный продукт ПЦР, окружающий линкер ASA и последовательность метки 8-His на своем 5'-конце, впоследствии клонировали в модифицированную версию вектора pREP4 от компании "Invitrogen" ("Invitrogen AG", Базель, Швейцария), несущую промотор CMV, сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста и лидерный пептид VJ2C мыши для запуска секреции указанного рекомбинантного белка. Для выработки рекомбинантного белка указанный рекомбинантный вектор трансфецировали в адаптированные к суспензии клетки НЕК 293 (номер АТСС CRL 1573) с применением реагента для трансфекции jetPEI(tm) ("Polyplus-transfection S.A.", Страсбург, Франция; дистрибьютер: "Brunschwig", Базель, Швейцария). Надосадочную жидкость питательной среды отбирали через пять дней и подвергали дальнейшей очистке с применением колонки для аффинной хроматографии с белком А (колонка с сефарозой-белком A HiTrap; "GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), которой управляла система АКТА FPLC ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария).
Чтобы определить, могут ли сгенерированные антитела против ОХ40 блокировать связывание OX40L с рецептором ОХ401, применяли блокирующий ELISA. В микропланшеты на 96 лунок ("Costar", США, дистрибьютор: "VWR AG", Ньон, Швейцария) наносили 100 мкл рекомбинантного ОХ40 человека-Fc (см. Пример 1) в концентрации 2 мг/мл в ФСБ. Планшеты инкубировали в течение ночи при 4°С, а затем блокировали 2% БСА в ФСБ при КТ в течение одного часа. Блокирующий раствор удаляли и добавляли надосадочную жидкость от гибридом или очищенные антитела. Через пять минут в каждую лунку добавляли 50 мкг биотинилированного рекомбинантного OX40L человека в концентрации 0,04 мг/мл. Планшеты инкубировали при КТ в течение 60 минут, затем проводили отмывку девять раз 0,01% раствором Твин-20 в ФСБ и добавляли HRP-стрептавидин ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) в разведении 1:2000. Планшеты инкубировали в течение 30 минут при КТ, проводили отмывку 9 раз 0,01% раствором Твин-20 в ФСБ и добавляли в планшеты ТМБ субстрат ("Bio-rad Laboratories AG", Рейнах, Швейцария), и через 6 минут реакцию останавливали путем добавления H2SO4. Затем измеряли поглощение на длине волны 450 нм на микропланшетном ридере ("Biotek", США; дистрибьютор: "WITTEC AG", Литтау, Швейцария). На Фигуре 1В показано, что химерное антитело 1D4 способно блокировать взаимодействие между ОХ40 и OX40L с зависимостью от дозы, а химерное антитело 2F8 не способно блокировать взаимодействие между ОХ40 и OX40L.
Реакция смешанной культуры лимфоцитов (MLR)
Кровь у двух разных доноров отбиралась в три закрытые системы взятия венозной крови объемом на 10 мл с цитратом в качестве антикоагулянта ("Sarstedt", Нюмбрехт, Германия). Клетки от донора №1 применяли в качестве клеток-эффекторов, а клетки от донора № 2 применяли в качестве клеток-мишеней. РВМС (мононуклеарные клетки периферической крови) от 2 указанных доноров очищали с применением 50 мл пробирок Blood-Sep-Filter (дистрибьютор: "Brunschwig", Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки подвергали отмывке 2 раза в среде Мемориального Института Розуэлл-Парк (RPMI, "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия) без ФБС. Клетки-мишени инкубировали с 50 мкг/мл митомицина С ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) в течение 30 минут при 37°С. Затем клетки отмывали 3 раза средой RPMI без ФБС и повторно суспендировали с плотностью 1x106 клеток/мл в RPMI, 10% ФБС ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 2 мМ L-глутамина ("Lonza", Лёвен, Бельгия), 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина ("Biochrom AG", Берлин, Германия). В микропланшетах на 96 лунок с U-образным дном ("ТРР", Тразадинген, Швейцария) распределяли 50 000 клеток-мишеней и 80 000 клеток-эффекторов в конечном объеме 100 мкл для каждой лунки. В лунки добавляли 1000 мкл разведений антител. Планшеты инкубировали в течение 7 дней при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. Через 7 дней после начала MLR в клетках генерировали импульсы при помощи 0,5 мКюри Н-тимидина ("Perkin Elmer"). Через 8 часов после генерирования импульсов клетки собирали и количественно определяли включенную радиоактивную метку при помощи бета-счетчика Wallac. На Фигуре 2 показано, что химерное антитело 1D4 способно блокировать MLR с зависимостью от дозы в большей степени, чем положительный контроль.
Пример 4:
Связывание антител к ОХ40 человека с активированными мононуклеарными клетками периферической крови (РВМС) человека и других видов животных, определяемое посредством проточной цитометрии
Клетки человека
Фильтры, содержащие лейкоциты человека, были взяты из Центра сбора крови в г. Ла-Шо-де-Фон, Швейцария (Centre de Transfusion Sanguine et Laboratoire de Serologic, rue Sophie-Mairet 29, CH-2300). Клетки снимали с фильтров посредством обратной промывки 60 мл ФСБ, содержащего 10 Е/мл ликвемина ("Drossapharm AG", Люцерн, Швейцария). Затем РВМС очищали при помощи пробирок Blood-Sep-Filter на 50 мл (дистрибьютер:
"Brunschwig", Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки подвергали отмывке 3 раза в среде Мемориального Института Розуэлл-Парк (RPMI, "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия) с ФБС ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия). Клетки повторно суспендировали с плотностью 3x106 клеток/мл в RPMI, 10% ФБС ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия ), 2 мМ ультраглутамина ("Lonza", Лёвен, Бельгия), 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина ("Biochrom AG", Берлин, Германия), 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА; "Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) + 100 Е/мл рекомбинантного IL-2 человека (пролейкин, "Novartis", Базель, Швейцария) в планшете на 24 лунки ("ТРР", Тразадинген, Швейцария). Через сорок восемь часов клетки отбирали и анализировали посредством проточной цитометрии, как описано ниже.
Клетки HPB-ALL (линия клеток острого Т-клеточного лейкоза от компании "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH", Брауншвейг, Германия) культивировали в RPMI, 10% ФБС. 2x105 клеток распределяли в планшете на 96 лунок с V-образным дном ("ТРР", Тразадинген, Швейцария) и центрифугировали в течение трех минут при 1300 об/мин; надосадочную жидкость сливали, клетки отбирали и анализировали посредством проточной цитометрии, как описано ниже.
РВМС и клетки HPB-ALL, подготовленные как описано выше, повторно суспендировали в 50 мкл буфера FACS (ФСБ, 2% ФБС, 10% версена ("Invitrogen", США) с 5 мкг/мл химерного антитела 1D4 или 5 мкг/мл соответствующего по изотипу контроля, или 20 мл РЕ-меченного коммерческого антитела к ОХ40 человека (клон L106, "BD Biosciences)), Адлисвиль, Швейцария). Клетки инкубировали в течение 30 минут на льду, подвергали отмывке два раза и повторно суспендировали в 50 мкл буфера FACS. Для определения химерного антитела 1D4 и контрольного антитела по изотипу применяли античеловеческий IgG-фикоэритин-РЕ ("BD Biosciences)), Адлисвиль, Швейцария), разведенный в отношении 1/200. Клетки инкубировали в течение 15 минут на льду, подвергали отмывке один раз, повторно суспендировали в 400 мкл буфера FACS и анализировали на инструменте FACS ("Суап, Beckman Coulter International S.A.", Ньон, Швейцария).
Первичные клетки яванских макак
Цельную кровь яванских макак (полученных от профессора Эрика Роуллера, Лаборатория нейрофизиологии, Университета Фрибурга, г. Фрибург, Швейцария) отбирали в пробирки
с цитратом ("BD Biosciences)), Адлисвиль, Швейцария). 2 мл ФСБ смешивали с 3 мл крови, и указанную смесь наслаивали сверху на 10 мл смеси фриколла: ФСБ 85:15 ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария). Пробы центрифугировали в течение 20 минут при комнатной температуре без перерыва. Слой РВМС отбирали и промывали трижды в ФСБ. Клетки повторно суспендирвали с плотностью 3x106 клеток/мл в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM; "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 10% ФБС ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), с заменимыми аминокислотами ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 1 мМ пирувата натрия ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 2 мМ ультраглутамина ("Lonza", Бельгия), 100 Е/мл пенициллина ("Biochrom AG", Германия), 100 мкг/мл стрептомицина ("Biochrom AG", Германия). 1 мл суспензии клеток распределяли в планшете на 24 лунки ("ТРР", Тразадинген, Швейцария) и добавляли 10 мкг/мл ФГА (РНА/М, "Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария), 100 Е/мл рекомбинантного IL-2 человека (пролейкин, "Novartis", Базель, Швейцария). Клетки инкубировали в течение 57 часов при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. Активированные РВМС отбирали и повторно суспендировали в ФБС/2,5% ФСБ (буфер FACS). 50 000 клеток в 50 мкл буфера FACS распределяли в планшете на 96 лунок с V-образным дном, и к лункам добавляли 25 мкг/мл биотинилированного химерного антитела 1D4 к ОХ40 человека или биотинилированного контрольного антитела по изотипу, или биотинилированного коммерческого антитела к ОХ40 человека, выработанного в организме овцы ("BD Biosciences)), Адлисвиль, Швейцария). Пробы инкубировали в течение 20 минут на льду, а затем клетки подвергали отмывке два раза холодным буфером FACS, а затем инкубировали со стрептавидином-РЕ ("BD Biosciences)), Адлисвиль, Швейцария) в разведении 1:20 в течение 15 минут на льду. Клетки подвергали однократной отмывке буфером FACS, а затем повторно суспендировали в 300 мкл буфера FACS. К каждой пробе добавляли иодид пропидия в объеме 2 мкл (PI; "Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария), чтобы исключить мертвые клетки. Клетки анализировали посредством проточной цитометрии (Cyan, "Весктап Coulter International S.A.", Ньон, Швейцария).
На Фигурах ЗА и ЗВ показано, что химерное антитело 1D4 способно распознавать ОХ40, экспрессируемый на поверхности активированных лимфоцитов человека и яванской макаки, соответственно, таких образом, обеспечивая свойства перекрестной реактивности, которые так желательны при разработке лекарственных препаратов.
Пример 5:
Кинетические константы аффинного связывания химерного антитела 1D4 с внеклеточным доменом рецептора ОХ40 человека, измеренные посредством поверхностного плазмонного резонанса (SPR)
Кинетические константы аффинного связывания (KD) измеряли по захваченному белком А антителу с применением внеклеточного домена рекомбинантного рецептора ОХ40 человека с гистидиновой меткой, который описан в Примере 1, в качестве анализируемого вещества. Измерения проводили на приборе BIAcore 2000 ("GE Healthcare - BIAcore", Упсала, Швеция) при комнатной температуре, и результаты анализировали при помощи компьютерной программы (BIAcore; v4.1).
Сенсорный чип исследовательского класса СМ5 ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария; BR-1000-14) активировали путем введения 35 мкл раствора N-гидроксисульфосукцинимида (NHS)/ 1 -этил-3 - [3 -диметиламинпропил] карбодиимида гидрохлорида (EDC) в соотношении 1:1 (по объему, скорость потока 5 мкл/мин; 1 и 2 пути движения потоков). Белок А (идентификационный номер Р7837; "Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) разводили до конечной концентрации 50 мкг/мл в ацетатном буфере с рН 4,5 (GE, BR-1003-50; на одну единицу рН ниже, чем pi) и впоследствии иммобилизовывали на предварительно активированном сенсорном чипе путем введения 35 мкл по обоим путям движения потоков - 1 и 2 (5 мкл/мин); это соответствовало приблизительно 1500 единицам ответов (ЕО). Затем сенсорный чип белок-А-СМ5 инактивировали путем введения 35 мкл раствора этаноламина (5 мкл/мин). В итоге проводили два введения раствора глицина по 10 мкл ("GE", идентификационный номер BR-1003-54; 10 мМ; рН 1.5) для высвобождения молекул белка А, не вступивших в перекрестные сшивки.
Перед измерением сродства проводили пробу на ограничение массопереноса путем введения фиксированной концентрации анализируемого вещества в фиксированное количество антитела, захваченного белком, при разных скоростях потока (5, 15, 30, 50, 75 мкл/мин в течение 2 мин). Анализ наклона скорости прямой реакции при разных скоростях потока указывает на наличие массопереноса.
Для измерений сродства химерное антитело 1D4, которое хранили в 1 х ФСБ-буфере, разводили до конечной концентрации 15 нМ в буфере HBS-EP("GE", идентификационный
номер BR-1001-88; 0,01 М Hepes, 0,15 М NaCl, EDTA 3 мМ, 0.005% поверхностного активного вещества Р20, рН 7,4). 10 мкл такого разведенного матричного раствора впоследствии вводили во 2-ой путь движения потока чипа белок-А-СМ5 (30 мкл/мин) так, чтобы достичь 200-250 ЕО. После данного этапа захвата внеклеточный домен рекомбинантного рецептора ОХ40 человека с гистидиновой меткой вводили в разных концентрациях (от 50 нМ до 0,4 мкМ) в 1-ый и 2-ой пути движения потока (1-ый путь движения потока применяли в качестве эталонного) со скоростью потока 30 мкл/мин. После каждого события связывания поверхность подвергали регенерации при помощи глицинового буфера с рН 1,5, вводимого в течение 1 мин (10 мкл/мин).
Измерения (сенсограмма: fc2-fcl) наилучшим образом удавалось аппроксимировать двухвалентной моделью анализируемого вещества 2:1 с массопереносом. Чтобы учесть экспериментальный разброс в отношении антитела, захваченного белком А, в начале каждого измерения, выставляли местное значение Rmax при всех подгонках. Время диссоциации составило по меньшей мере 300-600 секунд. Измерения проводили в двух экземплярах, и для сравнения включали пробы с нулевой концентрацией. Значение Хи-квадрат соответствует сумме квадратов разностей между экспериментальными данными и эталонными данными в каждой точке; хотя графики остатков показывают разность между экспериментальными и эталонными данными для каждой точки в подгонке. И Хи-квадрат, и значения остатков применяли для оценки качества подгонки между экспериментальными данными и индивидуальными моделями связывания.
Измерения проводили в двух повторениях с захваченными химерными антителами 1D4 к ОХ40 человека, иммобилизованными на сенсорном чипе с белком А и внеклеточным доменом рекомбинантного рецептора ОХ40 человека с гистидиновой меткой в качестве анализируемого вещества. Значение KD варьировало в диапазоне от 91 до 116 пМ, а значения Хи-квадрат были < 1,25.
Пример 6:
Гуманизация моноклонального антитела 1D4 мыши
В настоящей заявке описана гуманизация антитела 1D4 мыши к ОХ40 человека, включая выбор акцепторных каркасных областей человека, обратные мутации и мутации, которые в значительной степени позволяют сохранить и/или улучшить свойства связывания акцепторных каркасных областей человека с привитыми CDR.
Дизайн видоизмененных вариабельных областей
Для выбора акцепторных каркасных областей человека для прививки CDR антитела 1D4 применяли гомологичное соответствие. Для идентификации подсемейств антител человека, к которым принадлежит V области тяжелых и легких цепей антитела мыши, и для определения максимально соответствующей каркасной области антител человека эмбрионального типа для применения в качестве акцепторной молекулы, можно применять базы данных, например, базу данных генов вариабельных областей эмбрионального типа из локусов человека и мыши (база данных IMGT (International ImMunoGeneTics information system(r); Lefranc MP et al, (1999) Nucleic Acids Res. 27(1): 209-12; Ruiz M et al, (2000) Nucleic Acids Res. 28(1): 219-21; Lefranc MP (2001) Nucleic Acids Res. 29(1): 207-9; Lefranc MP (2003) Nucleic Acids Res. 31(1): 307-10; Lefranc MP et al, (2005) Dev. Сотр. Immunol. 29(3): 185-203; Kaas Q et al, (2007) Briefings in Functional Genomics & Proteomics, 6(4): 253-64) или VBASE2 (Retter I et al, (2005) Nucleic Acids Res. 33, Выпуск базы данных D671-D674) или база данных Кабата (Johnson G et al, (2000) Nucleic Acids Res. 28: 214-218)), или публикации (например, Kabat ЕА et al, выше). Выбор последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей (VH и VL) в указанных подсемействах, которые следует применять в качестве акцептора, может основываться на гомологии последовательностей и/или соответствии структуры областей CDR1 и CDR2, что позволит сохранить соответствующее родственное представление шести CDR после прививки.
Например, применение базы данных IMGT позволяет выявить хорошую гомологию между вариабельной каркасной областью тяжелой цепи 1D4 и членами подсемейства 2 вариабельных доменов тяжелых цепей человека. Максимальная гомология и идентичность последовательностей и CDR, и каркасных областей были выявлены в последовательностях эмбрионального типа: IGHV 2-70*10 (SEQ ID №: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID №: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID №: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID №: 22) и IGHV2-70*11 (SEQ ID №: 23), каждая из которых обладает идентичностью последовательности выше 73% для целой последовательности вплоть до CDR3. IGHV 2-70*10, IGHV2-70*01 и IGHV2-70*13 обладают идентичностью последовательности 74%; a IGHV2-5*09 и IGHV2-70*11 обладает идентичностью последовательности 73,5% и 73%, соответственно.
При применении того же подхода последовательность вариабельного домена легкой цепи 1D4 демонстрировала хорошую гомологию с членами подсемейства 3 вариабельного домена каппа легкой цепи человека. Максимальная гомология и идентичность последовательностей и CDR, и каркасных областей были выявлены в последовательностях эмбрионального типа: IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24) (идентичность 65,3%), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25) (64,9% идентичность), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26) (идентичность 64,9%), IGKV3-11*02 (SEQ ID №: 27) (идентичность 64,2%) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28) (идентичность 62.5%).
В качестве начального этапа процесса гуманизации в качестве акцептора для CDR антитела 1D4 были выбраны вариабельные домены антитела человека IGHV 2-70*10 (SEQ ID №: 19) и IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24). IGHV 2-70*10 был выбран в отличие от других вариабельных доменов тяжелых цепей человека на основании его более высокой гомологии с 1D4 в его каркасной области номер один.
Было получено первое гуманизированного антитело изотипа гамма-один человека (см. ниже). Указанное антитело заключало в себе гибридный вариабельный домен тяжелой цепи человека-мыши и гибридный вариабельный домен легкой цепи человека-мыши. Гибридный вариабельный домен тяжелой цепи был основан на вариабельном домене тяжелой цепи человека IGHV 2-70*10, в котором CDR 1 и 2 эмбрионального типа были заменены на CDR 1 и 2 тяжелой цепи из 1D4. Наилучшее соответствие последовательности сегмента JH с акцепторной каркасной областью антитела человека было идентифицировано при поиске в базе данных IMGT, упоминаемой выше. В настоящей заявке полученная в результате последовательность гибридной вариабельной области тяжелой цепи человека-мыши, содержащая каркасные области IGHV 2-70*10, CDR из антитела мыши 1D4, и обладающая наилучшим соответствием JH с акцепторной областью из антитела человека, обозначается как вариабельный домен тяжелой цепи VH1 с последовательностью SEQ ID №: 29. Аналогично, гибридный вариабельный домен легкой цепи человека-мыши, применяемый для данного первого гуманизированного антитела-кандидата, содержал каркасные области антитела человека IGKV3-11*01, CDR 1D4 мыши, и обладал наилучшим соответствием JH с акцепторной областью из антитела человека, и в настоящей заявке обозначается как вариабельный домен легкой цепи VL1 с последовательностью ID №: 30. Первое гуманизированное антитело, заключающее в себе VH1 и VL1, сокращенно обозначается в настоящей заявке как антитело VH1/VL1
Получение прототипа первого гуманизированного антитела
Кодирующие последовательности ДНК (кДНК) для VH1 и VL1 были синтезированы в форме scFv компанией "GENEART AG" (Регенсбург, Германия), благодаря чему стало возможно, чтобы одна последовательность ДНК заключала в себе оба вариабельных домена (SEQ ID №: 31). кДНК индивидуальных вариабельных доменов извлекали из данного конструкта scFv посредством ПНР, и затем собирали расположенную выше последовательность(и) кДНК их соответствующих константных доменов при помощи технологии ПЦР-сборки. В итоге полную тяжелую и легкую цепь кДНК вшивали в независимые векторы, которые были созданы на основе модифицированного вектора pcDNA3.1 ("Invitrogen", Калифорния, США), несущего промотор CMV и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. Специфический вектор для легкой цепи позволял проводить экспрессию легких цепей человека каппа-изотипа благодаря лигированию кДНК рассматриваемого вариабельного домена легкой цепи перед кДНК константного домена легкой цепи каппа с применением сайтов рестрикции BamHI и BsiWI; а специфический вектор для тяжелой цепи был сконструирован так, чтобы было возможно вшить кДНК рассматриваемого вариабельного домена тяжелой цепи перед последовательностью кДНК, кодирующей константные области CHI IGHG1 человека, шарнирную область IGHG1, СН2 IGHG1 и IGHG1 СНЗ, с применением сайтов рестрикции BamHI и Sail. В векторе экспрессии как для тяжелой цепи, так и для легкой цепи секреция запускалась лидерным пептидом VJ2C мыши, содержащим сайт BamHI. Сайт рестрикции BsiWI расположен в константном домене каппа; а сайт рестрикции Sail обнаруживается в домене CHI IGHG1.
Антитело VH1/VL1 временно вырабатывалось в результате совместной трансфекции эквивалентным количеством векторов тяжелой и легкой цепи в адаптированные к суспензии клетки HEK293-EBNA1 (каталожный номер АТСС(r): CRL-10852) с применением полиэтиленамина (PEI, "Sigma", Букс, Швейцария). Обычно 100 мл клеток в суспензии с плотностью 0,8-1,2 миллиона клеток на мл трансфецируют смесью ДНК-РЕ1, содержавшей 50 мг вектора экспрессии, кодирующего тяжелую цепь, и 50 мг вектора экспрессии, кодирующего легкую цепь. Когда рекомбинантные векторы экспрессии, кодирующие гены антитела, встраиваются в клетки-хозяева, антитела вырабатываются при последующем культивировании клеток в течение периода 4-5 дней, чтобы была возможна секреция в питательную среду (EX-CELL 293, среды для НЕК293 без
сыворотки; "Sigma", Букс, Швейцария) с добавлением 0,1% плюрониловой кислоты, 4 мМ глутамина и 0,25 мкг/мл генетицина).
Антитело VH1/VL1 очищали от надосадочной жидкости без клеток при помощи плавно протекающей среды с рекомбинантным белком A ("GE Healthcare Europe GmbH", Глаттбругг, Швейцария), и проводили обмен буфера в фосфатно-солевом буфере перед проведением проб. Связывание антитела с ОХ40 человека измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса, как описано в Примере 5.
Обратные мутации привитых каркасных областей из антитела человека Поскольку прямая прививка CDR из антитела 1D4 мыши приводит к тому, что кандидат не способен связываться с ОХ40 человека (Таблица 6 и ФИГ. 4), инициировали мутагенез, в ходе которого остатки аминокислот в антителе человека были заменены на остатки аминокислот из антитела мыши. Данный способ называется обратной мутацией, и является наиболее непредсказуемой процедурой при гуманизации моноклональных антител. При реализации данного способа возникает необходимость в идентификации и отборе критических остатков в каркасной области антитела мыши, которые необходимо сохранить, чтобы сохранилось сродство, и в то же время, чтобы минимизировать потенциальную иммуногенность в гуманизированном антителе. В Таблице 7, Таблице 8 и на ФИГ.5 показаны остатки (нумерация по Кабату), которые различаются в каркасных областях антитела человека и мыши. Остатки, которые могут влиять на конформации CDR или упаковку внутри вариабельных областей, представляют особый интерес, поскольку они могут оказывать наибольшее влияние на сродство антитела.
Чтобы идентифицировать остатки, которые могут влиять на конформацию большинства CDR и/или упаковку внутри вариабельных областей, рассчитывали 3-мерную модель для пары VH1-VL1 вариабельных доменов при помощи сервера для моделирования структурной гомологии SWISS-MODEL (Arnold К et al, (2006) Bioinformatics, 22(2): 195201; http://swissmodel.expasy.org), установленного в автоматический режим. Анализ модели позволил выбрать подгруппу положений на основании их предположительного влияния на области CDR и/или упаковку вариабельных доменов легкой-тяжелой цепи. Указанная подгруппа положений включала положения в вариабельном домене тяжелой цепи: 23, 35Ь, 48, 50, 60 и 62, а также положения в вариабельном домене легкой цепи: 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 и 71 (нумерация по Кабату). Помимо указанных обратных мутаций у
некоторых кандидатов была проведена делеция в положении Y31 в легкой цепи антитела VH1/VL1.
В контексте последовательности антитела VH1/VL1 с применением стандартного мутагенеза и способов, описанных выше, были получены дополнительные гуманизированные кандидаты на основе разных комбинаций замен в тяжелых и легких цепях. Кандидаты в гуманизированные антитела оценивали по их сродству связывания методом поверхностного плазмонного резонанса, который описан в Примере 5.
Количественный выход и свойства связывания некоторых гуманизированных антител, полученных на основе указанной одной или сочетания замен, приведены в Таблице 6. Из 28 показанных антител девять кандидатов не продемонстрировали какого-либо связывания с ОХ40 человека, а другая группа из девяти антител обладали слабым или плохим связыванием. Гуманизированные антитела на основе VL9 демонстрировали при SPR наиболее согласованное слабое связывание с ОХ40 человека. Только два антитела VH6/VL9 и VH7/VL9 демонстрировали хорошее связывание с ОХ40 человека. Оба гуманизированных антитела подверглись обратной мутации в вариабельной области тяжелой цепи в положениях: 23, 35Ь, 50, 60 и 62, и в вариабельной области легкой цепи в положениях: 33, 34, 46, 47 и 71 (нумерация по Кабату). Помимо указанных обратных мутаций оба антитела - VH6/VL9 и VH7/VL9 - получили благоприятный результат от удаления остатка в положении 31 легкой цепи. Неожиданно, что антитело VH7/VL9 приобрело повышенное сродство к ОХ40 человека по сравнению с антителом 1D4 и вариантом VH6/VL9. Сродство связывания указанных гуманизированных антител указано в обобщенном виде в Таблице 9.
Термостабильность избранных гуманизированных анти-ОХ40 антител, определенная посредством дифференциальной сканирующей калориметрии
Темростабильность гуманизированных антител измеряли посредством дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC). Профиль температур плавления моноклональных антител является свойством, характерным для их изотипа (Garber Е & Demarest SJ (2007) Biochem. Biophys. Res. Commun. 355: 751-7), однако среднюю температуру плавления фрагмента FAB можно легко идентифицировать даже в контексте полноразмерного IgG. Такую среднюю температуру плавления части FAB применяли для отслеживания моноклональной стабильности гуманизированных кандидатов.
Калориметрические измерения проводили на дифференциальном сканирующем калориметре VP-DSC ("MicroCal", Нортхемптон, Соединенное Королевство). Объем кюветы составлял 0,128 мл, скорость нагрева составляла 200°С/ч, и избыточное давление поддерживали на уровне 65 фунтов на кв. дюйм. Все антитела применяли в концентрации 1 мг/мл в ФСБ (рН 7,4). Молярную теплоемкость антитела оценивали путем сравнения с пробами в двух экземплярах, содержащими идентичный буфер, в котором не было антител. Парциальную молярную теплоемкость и кривые плавления анализировали посредством стандартных процедур. Термограммы корректировали на нулевую линию, а концентрацию нормировали перед дальнейшим анализом с применением модели "Non-Two State" в программе Origin v7.0.
Фрагмент FAB гуманизированного варианта VH6/VL9 проявлял один переход при температуре 76,3 °С, по форме и амплитуде согласующийся с кооперативным раскручиванием, которое, как правило, наблюдается для компактно свернутых фрагментов FAB, что указывает на то, что процесс конструирования оказался успешным в отношении сохранения стабильности FAB. В целом гуманизированный вариант демонстрировал хорошую термостабильность.
Пример 7:
Описание свойств эпитопа гуманизированных анти-ОХ40 антител.
С целью описания эпитотпа гуманизированных анти-ОХ40 антител, антитело VH6/VL9 картировали, чтобы определить домен внеклеточной области ОХ40 человека с применением разных химерных белков ОХ40 человека-крысы.
Получение химерных белков ОХ40 человека-крысы и ELISA
Белкам ОХ40 крысы и человека-крысы придавали форму Fc-гибридных белков в соответствии со способом, описанным в Примере 1. Для проведения ELISA белок ОХ40 наносили в планшеты на 96 лунок с высокой степенью связывания ("Coastar") в концентрации 2 мкг/мл. в ФСБ и выдерживали в течение ночи при 4°С. Реакцию в планшетах блокировали при помощи 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в ФСБ перед инкубацией с антителом VH6/VL9 или контрольным антителом по изотипу. Затем планшеты подвергали отмывке и инкубировали с фрагментом F(ab')2 овечьего-античеловеческого Ig, специфичным к HRP ("Jackson ImmunoResearch Europe Ltd", Ньюмаркет, Соединенное Королевство). После отмывки планшеты инкубировали с ТМБ субстратом ("Bio-Rad Laboratories AG", Рейнах, Швейцария) для выявления связывания антител. Реакцию останавливали путем добавления 2М H2SO4, и считывали показатели оптической плотности на длине волны 450 нМ (OD 450 нМ) на спектрофотометре Synergy HT2 ("Biotek", США; дистрибьютор: "WITTEC AG", Литтау, Швейцария).
Результаты
Независимо от происхождения внеклеточная область ОХ40 была разделена на четыре структурных модуля, обозначаемые как домен 1, 2, 3 и 4 (Compaan DM & Hymowitz SG
(2006) Structure, 14(8): 1321-30). Химерные белки ОХ40, соответствующие внеклеточной области ОХ40 человека (аминокислоты 29-214 TNFRSF4 человека, пронумерованные в соответствии с последовательностью Uniport Р43489) были сконструированы путем обмена одного из четырех доменов между последовательностями человека и крысы. Например, химерный белок ОХ40 RHRR соответствует внеклеточной области ОХ40 крысы, в котором второй домен был заменен последовательностью соответствующего домена человека.
Для оценки реакционной способности антитела VH6/VL9 в отношении внеклеточной области ОХ40 человека (сокращенно НННН с последовательностью SEQ ID №: 11), внеклеточной области ОХ40 крысы (сокращенно RRRR с последовательностью SEQ ID №: 52) и четырех химерных белков человека-крысы RHRR (SEQ ID №: 53), HRRR (SEQ ID №: 54), HHRR (SEQ ID №: 55) и RRHH (SEQ ID №: 56)) проводили связывающий ELISA. Результат такого ELISA показан на Фиг.7. Предпосылкой к проведению данного эксперимента по картированию эпитопов послужило то, что было показано, что антитело VH6/VL9 связывается с белком ОХ40 человека, но не с белком ОХ40 крысы, что указывает на то, что перекрестной реактивности с ОХ40 крысы нет. Было показано, что антитело VH6/VL9 связывалось с RHRR и HHRR, но не с HRRR или RHH, что указывает на то, что эпитоп VH6/VL9 картируется во втором домене внеклеточной области ОХ40 человека.
Пример 8:
Антитело VH6/VL9 блокирует реакцию смешанной культуры лимфоцитов посредством механизма их уничтожения и блокирования
Активность антитела VH6/VL9 в отношении подавления иммунных реакций in vitro оценивали в односторонней реакции смешанной аллогенной культуры лимфоцитов (MLR). MLR представляет собой модель in vitro аллореактивной активации и пролиферации Т-лимфоцитов (O'Flaherty Е et al., (2000) Immunology, 100(3): 289-99; DuPont В & Hansen JA (1976) Adv. Immunol. 23: 107-202). Когда смешивают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от двух неродственных доноров, Т-лимфоциты активируются посредством распознавания молекул аллогенного главного комплекса гистосовместимости (МНС). Такая активация приводит к пролиферации Т-лимфоцитов. Реакция MLR широко применялась для демонстрации эффекта иммуносупрессорных препаратов, направленных на Т-лимфоциты (Bromelow KV et al,
(2001) J. Immunol. Methods, 247(1-2): 1-8). Иммуносупрессоры, такие как циклоспорин, действуют главным образом посредством подавления активации Т-лимфоцитов. Помимо оценки блокирующего действия антитела VH6/VL9 также проводили изучение вклада цитотоксических механизмов, таких как антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (ADCC), на подавление MLR. В данной пробе оценивали три разных формы антител VH6/VL9: форма IGHG1 (в настоящей заявке обозначается VH6/VL9), форма не фукозилированного IGHG1 (IgGl) (в настоящей заявке обозначается не фукозилированная VH6/VL9) и форма IGHG4 (IgG4) (в настоящей заявке обозначается VH6/VL9 IGHG4 S228P). Известно, что IGHG1 (IgGl) компетентны в отношении механизмов цитотоксичности, таких как ADCC. Известно, что не фукозилированные антитела IGHG1 подавляют повышенную активность ADCC вследствие более высокой активности к FcyRIIIa, экспрессируемому на поверхности цитотоксических клеток, таких как естественные киллеры (клетки NK) (Mizushima Т et al, (2011) Genes Cells, 16(11): 1071-80). Напротив, известно, что антитела IGHG4 (IgG4) не обладают такими механизмами Fc-опосредуемой цитотоксичности, как ADCC.
Придание определенной формы антителу VH6/VL9
Придания формы иммуноглобулину IGHG4, содержащему замену S228P, достигали путем замещения последовательности кДНК, кодирующей константные домены IGHG1 СН1, шарнирную область IGHG1, IGHG1 СН2 и IGHG1 СНЗ, в специфическом векторе для тяжелой цепи, описанном в Примере 6. Замену S228P вводили в матрицу кДНК тяжелой цепи IGHG4 посредством стандартной технологии ПЦР-мутагенеза. Полученная в результате тяжелая цепь имела последовательность SEQ ID №: 57. Получение не фукозилированного антитела IGHG1 VH6/VL9 проводили в соответствии с протоколом в Примере 14 в публикации WO2010/095031.
Реакция смешанной культуры лимфоцитов
Кровь у двух разных доноров отбирали в три закрытые системы взятия венозной крови объемом на 10 мл с цитратом в качестве антикоагулянта ("Sarstedt", Нюмбрехт, Германия). Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) от двух указанных доноров очищали с применением 50 мл пробирок Blood-Sep-Filter (дистрибьютор: "Brunschwig", Базель, Швейцария) в соответствии с инструкциями производителя. Клетки подвергали отмывке 2 раза в среде Мемориального Института Розуэлл-Парк (RPMI, "РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия) без ФБС. Стимулирующие клетки от двух доноров
готовили путем инкубации с 50 мкг/мл митомицина С ("Sigma-Aldrich Chemie GmbH", Букс, Швейцария) в течение 30 минут при 37°С. Затем клетки отмывали 3 раза средой RPMI без ФБС и повторно суспендировали с плотностью 1x106 клеток/мл в RPMI, 10% ФБС ("РАА Laboratories)), Пассинг, Австрия), 2 мМ L-глутамина ("Lonza", Лёвен, Бельгия), 100 Е/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина ("Biochrom AG", Берлин, Германия). В микропланшетах на 96 лунок с U-образным дном ("ТРР", Тразадинген, Швейцария) распределяли 50 000 реактивных клеток и 80 000 стимулирующих клеток в конечном объеме 100 мкл для каждой лунки. В лунки добавляли 100 мкл разведений антител (или только среду). Планшеты инкубировали в течение 7 дней при 37°С в инкубаторе с 5% СО2. В течение последних 18 часов в клетках генерировали импульсы при помощи 0,5 мКюри 3Н-тимидина ("Perkin Elmer", Базель, Швейцария). Клетки собирали на плоский фильтр ("Perkin Elmer") и проводили количественное определение включенной радиоактивной метки на бета-счетчике Wallac ("Perkin Elmer").
Результаты
Результаты, показанные на ФИГ.8, демонстрируют, что антитело VH6/VL9 способно эффективно подавлять MLR у двух разных индивидуумов (пациентов, отвечающих на лечение) со значением ЭК50 приблизительно 100 нг/мл. Также результаты показывают разную реакцию в зависимости от применяемой формы антитела, а также наблюдается различие во вкладе блокирующего и цитотоксического механизма при MLR от разных индивидуумов.
Реактивность Т-лимфоцитов от пациента, отвечающего на лечение, №1 (ФИГ. 8А) эффективно подавлялась формами IGHG1 и IGHG4, что указывает на то, что цитотоксические механизмы не критичны для пациента, отвечающего на лечение, №1. Напротив, форма IGHG4 была лишь в малой степени способна блокировать MLR от пациента, отвечающего на лечение, №2 (ФИГ.8В) при высокой концентрации, и очень быстро утрачивала свое действие при более низких концентрациях, а форма IGHG1 позволяла достичь более чем 60% подавления, и это означает, что для пациента, отвечающего на лечение, №2, механизмы уничтожения обусловливают большую часть подавляющего действия.
Указанное различие в механизме действия, вероятно, возникает вследствие того факта, что активация, пролиферация и выживание Т-лимфоцитов при MLR реакции в
переменной степени зависит от ко-стимулирующих сигналов ОХ40 между индивидуумами, в зависимости от степени аллогенной реактивности и, возможно, других ко-стимулирующих сигналов. У индивидуумов, у которых малая зависимость от ОХ40-порождаемых сигналов, устранение активированных Т-лимфоцитов по механизму ADCC является основным механизмом действия VH6/VL9.
Неожиданно, что не фукозилированная форма IGHG1 проявляла очень высокую способность к подавлению MLR у обоих пациентов, отвечающих на лечение. Данный результат вскрыл тот факт, что даже если блокирующего механизма может быть достаточно для достижения подавления MLR, добавление или усиление уничтожающего механизма улучшает подавляющее действие анти-ОХ40 антител. Такое усиление особенно полезно, когда проводят лечение ОХ40-опосредованных расстройств независимо от ко-стимулирующего статуса ОХ40 пациента, например у пациентов с низким уровнем экспрессии ОХ40.
Пример 9:
Антитело VH6/VL9 блокирует реакцию ксеногенного трансплантата против хозяина
Реакции ксеногенного трансплантата против хозяина (GVH) является моделью болезни "аллогенный трансплантат против хозяина" (GVHD), наблюдаемой после пересадки костного мозга у людей. Реакция GVH представляет собой острый иммунный ответ, опосредуемый пересаженными иммунными клетками, которые атакуют окружение организма-хозяина, как следствие распознавания аллогенного или ксеногенного главного комплекса гистосовместимости (Murphy WJ et al, (1996) Semin. Immunol. 8(4): 233-41). В реакции GVH главными клетками-эффекторами являются Т-лимфоциты. Активность антитела VH6/VL9 как иммуносупрессора оценивали в модели ксеногенного GVHD на основании воссоздания мышей с SCID с клетками РВМС человека. В данной модели РВМС человека, и, главным образом, Т-лимфоциты, запускают сильную реакцию против клеток организма мыши-хозяина. Данная реакция приводит к тяжелому воспалению кожи и кишечника, сопровождающемуся потерей веса. Наиболее значимым показателем данной модели является выживание животных.
Метод
Животных (мыши с SCID) подвергали сублетальному облучению перед введением им 30 миллионов РВМС человека внутрибрюшинно. Также у указанных животных истощали
запас мышиных NK путем введения антитела ТМ-бета1 два раза в неделю. Лечение антителом VH6/VL9, Энбрелом(r) или основой проводили посредством в/в инъекций раз в неделю (пять доз подряд), и начинали указанное лечение за два дня до инъекции РВМС. Животным вводили либо основу (ФСБ), либо антитело VH6/VL9 в дозе 10 мг/кг или 1 мг/кг, либо Энбрел(r) (гибридный белок из растворимого рецептора TNF человека 2, соединенного с компонентом Fc IgGl человека, "Amgen-Pfizer") в дозе 8 мг/кг. Животных проверяли и оценивали их состояние три раза в неделю с целью выявления следующим симптомов - потеря веса, диарея, состояние меха и общее поведение. Животных умерщвляли в соответствии с этическими нормами, если симптомы рассматривались, как очень тяжелые.
Результаты
На ФИГ. 9 показано, что антитело VH6/VL9 очень сильно подавляло реакцию GVHD даже при более низкой дозе - 1 мг/кг. Неожиданно, что антитело VH6/VL9 демонстрировало более высокую эффективность, чем Энбрел(r), который является признанным средством от GVHD у человека (Xhaard A et al, (2011) Bull. Cancer, 98(8): 889-99; Simpson D (2001) Expert Opin. Pharmacother. 2(7): 1109-17). Среднее время выживания животных, получавших антитело VH6/VL9 в дозе 1 или 10 мг/кг, было в четыре раза больше, чем в группе, получавшей основу (Таблица 10), ив два раза больше по сравнению с Энбрел(r) Кроме того, данный результат вскрыл тот факт, что антитело VH6/VL9 yt обладает агонистичной активностью, поскольку сообщалось, что агонистичное антитело против ОХ40 усугубляет GVHD в моделях аллогенных мышей (Valzasina В et al, (2005) Blood, 105(7): 2845-51; Blazar BR et al, (2003) Blood, 101(9): 3741-8), ситуация, которая не наблюдалась в настоящем исследовании.
Перечень последовательностей
<110> ГЛЕНМАРК ФАРМАСЬЮТИКАЛС С.А.
<120> Антитела, которые связываются с OX40, и их применение
<130> 17741/US
<150> US 61/506,491 <151> 2011-07-11
<160> 89
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи 1D4
<400> 1
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 2 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи 1D4
<400> 2
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 3 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи 1D4
<400> 3
Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 4 <211> 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR1 легкой цепи 1D4
<400> 4
Ser Ser Val Ser Tyr 1 5
<210> 5 <211> 3 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR2 легкой цепи 1D4
<400> 5
Ala Thr Ser 1
<210> 6 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR3 легкой цепи 1D4
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5
<210> 7 <211> 118 <212> PRT
<213> Mus musculus
<223> последовательность вариабельной области тяжелой цепи 1D4 <400> 7
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Gly Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 8 <211> 106 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> последовательность вариабельной области легкой цепи 1D4
<400> 8
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105
<210> 9
<211> 354 <212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> Последовательность ДНК вариабельной области тяжелой цепи 1D4
<400> 9
caggtgacgc tgaaggagtc tggccctggg atattgcagc cctcccagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctggta tgggtgtagg ctggattcgt 120
cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtac 180
tataacacag ccctgaagag cgggctcaca atctccaagg atacctccaa aaaccaggtc 240 ttcctcaaga tcgccagtgt ggacactaca gatactgcca catactactg tgctcgaata 300 gactgggacg ggtttgctta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctca 354
<210> 10
<211> 318
<212> DNA
<213> Mus musculus
<220>
<223> Последовательность ДНК вариабельной области легкой цепи 1D4
<400> 10
cagattgtac tgactcagtc tccagcaatc ctgtctgcat ctccagggga gaaggtcaca 60
atgacttgca gggccagctc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagccagga 120
tcctccccca aaccctggat ttatgccaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180
ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcaacagagt ggaggctgaa 240
gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cgtggacgtt cggtggaggc 300
accaagctgg agataaaa 318
<210> 11 <211> 186
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Внеклеточный домен OX40 человека (аминокислоты 29-214 P43489)
<400> 11
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg
65 70 75 80
Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp
85 90 95
Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala
100 105 110
Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln
115 120 125
Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro
130 135 140
Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr
145 150 155 160
Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr
165 170 175
Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala
180 185
<210> 12 <211> 277
<212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<223> Рецептор OX40 человека (P43489)
<400> 12
Met Cys Val Gly Ala Arg Arg Leu Gly Arg Gly Pro Cys Ala Ala Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Gly Leu Gly Leu Ser Thr Val Thr Gly Leu His Cys Val
20 25 30
Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His Glu Cys Arg Pro
35 40 45
Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln Asn Thr Val Cys
50 55 60
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
65 70 75 80
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly
100 105 110
Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys
115 120 125
Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp
130 135 140
Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn
145 150 155 160
Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro
165 170 175
Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr
180 185 190
Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu
195 200 205
Val Pro Gly Gly Arg Ala Val Ala Ala Ile Leu Gly Leu Gly Leu Val
210 215 220
Leu Gly Leu Leu Gly Pro Leu Ala Ile Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu
225 230 235 240
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
245 250 255
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
260 265 270
Thr Leu Ala Lys Ile
275
<210> 13
<211> 13 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR1 тяжелой цепи 1D4
<400> 13
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp
1 5 10
<210> 14 <211> 19 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR2 тяжелой цепи 1D4
<400> 14
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
1 5 10 15
Leu Lys Ser
<210> 15 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR3 тяжелой цепи 1D4
<400> 15
Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr 1 5 10
<210> 16 <211> 12 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR1 легкой цепи 1D4
<400> 16
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr
1 5 10
<210> 17 <211> 11 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR2 легкой цепи 1D4
<400> 17
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5 10
<210> 18 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR3 легкой цепи 1D4
<400> 18
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5
<210> 19 <211> 115 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGHV2-70*10 человека
<400> 19
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Arg Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 20
<211> 115 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGHV2-70*01 человека
<400> 20
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 21
<211> 115 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGHV2-70*13 человека <400> 21
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210>
<211>
115
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<220>
<223>
IGHV2-5*09 человека
<400>
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Thr Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Val Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Tyr Trp Asp Asp Asp Lys Arg Tyr Gly Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Thr Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala His Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210> 23 <211> 115 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGHV2-70*11 человека <400> 23
Arg Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser 115
<210>
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<220>
<223>
IGKV3-11*01
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 25 <211> 107
<212> PRT <213> Homo sapiens
<220>
<223> IGKV1-39*01 человека
<400> 25
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 26 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGKV1D-39*01 человека <400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 27 <211> 107 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> IGKV3-11*02 <400> 27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Arg Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210>
<211>
108
<212>
PRT
<213>
Homo sapiens
<220>
<223>
IGKV3-20*01
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 29
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи VH1
<400> 29
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Arg Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210>
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
вариабельный домен легкой цепи VL1
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31 <211> 720 <212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кДНК VH1-VL1 scFv
<400> 31
caggtcacac tgaaagagtc tggacccgcc ctggtcaagc ccacccagac actgaccctg 60
acctgcacct tcagcggctt cagcctgagc acaagcggca tgggcgtgtc ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaggccct ggaatggatc gcccggattt ggtgggacga cgacaagtac 180
tacagcacca gcctgaaaac ccggctgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccagaatc 300
gactgggacg gcttcgccta ttggggccag ggaaccctgg tcaccgtgtc tagcggaggc 360 ggaggatctg gcggcggagg aagtggcgga gggggatctg agatcgtgct gacacagagc 420
cccgccaccc tgtctctgag ccctggcgaa agagccaccc tgagctgtag agccagcagc 480
agcgtgtcct actacctggc ctggtatcag cagaagcccg gccaggctcc ccggctgctg 540
atctacgcca ccagcaatcg ggccacaggc atccctgcca gattttctgg cagcggctcc 600
ggcaccgact tcaccctgac catctccagc ctggaacccg aggacttcgc cgtgtactac 660
tgccagcagt ggtccagcaa cccctggaca tttggccagg gcaccaaggt ggaaatcaag 720
<210> 32 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH1 тяжелой цепи IGHG1 <400> 32
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Arg Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 33 <211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH2 тяжелой цепи IGHG1
<400> 33
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Arg Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 34
<211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH3 тяжелой цепи IGHG1
<400> 34
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115
120
125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 35 <211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH4 тяжелой цепи IGHG1
<400> 35
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 36 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH5 тяжелой цепи IGHG1 <400> 36
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180
185
190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 37
<211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH6 тяжелой цепи IGHG1
<400> 37
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 38
<211> 448
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH7 тяжелой цепи IGHG1
<400> 38
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245
250
255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 39
<211> 214
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VL1 легкой цепи
<400> 39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
195 200 205
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>
<211>
214
<212>
PRT
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
VL5 легкой цепи
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 46 <211> 213 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VL8 легкой цепи
<400> 46
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 50 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Тяжелая цепь химеры 1D4
<400> 50
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Ser Gly Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Thr Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180
185
190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 51 <211> 213
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь химеры 1D4
<400> 51
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 52 <211> 191
<212> PRT
<213> Rattus norvegicus
<220>
<223> внеклеточный домен OX40 крысы
<400> 52
Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro Ser Gly His
1 5 10 15
Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg Cys
20 25 30
Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys His Pro Cys Glu Pro Gly Phe Tyr
35 40 45
Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys Asn
50 55 60
His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Glu Asp
65 70 75 80
Thr Val Cys Gln Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
His Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser
100 105 110
Pro Gly Ser Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ser
115 120 125
Gly Lys Gln Ile Arg His Pro Ala Ser Asn Ser Leu Asp Thr Val Cys
130 135 140
Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg Thr
145 150 155 160
Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Pro Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg Thr
165 170 175
Ser Gln Leu Pro Ser Thr Pro Thr Leu Val Ala Pro Glu Gly Pro
180 185 190
<210> 53 <211> 191
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химерный внеклеточный домен OX40 человека-крысы RHRR
<400> 53
Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro Ser Gly His
1 5 10 15
Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg Cys
20 25 30
Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr
35 40 45
Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn
50 55 60
Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp
65 70 75 80
Thr Val Cys Gln Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
His Lys Leu Gly Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser
100 105 110
Pro Gly Ser Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ser
115 120 125
Gly Lys Gln Ile Arg His Pro Ala Ser Asn Ser Leu Asp Thr Val Cys
130 135 140
Glu Asp Arg Ser Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg Thr
145 150 155 160
Thr Phe Arg Pro Thr Thr Val Pro Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg Thr
165 170 175
Ser Gln Leu Pro Ser Thr Pro Thr Leu Val Ala Pro Glu Gly Pro
180 185 190
<210> 54 <211> 190 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химерный внеклеточный домен OX40 человека-крысы RHHH
<400> 54
Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro Ser Gly His
1 5 10 15
Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg Cys
20 25 30
Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys His Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr
35 40 45
Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn
50 55 60
Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp
65 70 75 80
Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys
85 90 95
Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly
100 105 110
Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys
115 120 125
His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp
130 135 140
Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala
145 150 155 160
Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln
165 170 175
Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg Ala
180 185 190
<210> 55 <211> 187 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химерный внеклеточный домен OX40 человека-крысы HHRR
<400> 55
Leu His Cys Val Gly Asp Thr Tyr Pro Ser Asn Asp Arg Cys Cys His
1 5 10 15
Glu Cys Arg Pro Gly Asn Gly Met Val Ser Arg Cys Ser Arg Ser Gln
20 25 30
Asn Thr Val Cys Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val
35 40 45
Ser Ser Lys Pro Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly
50 55 60
Ser Glu Arg Lys Gln Leu Cys Thr Ala Thr Gln Asp Thr Val Cys Gln
65 70 75 80
Cys Arg Pro Gly Thr Gln Pro Arg Gln Asp Ser Ser His Lys Leu Gly
85 90 95
Val Asp Cys Val Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly Ser Asn
100 105 110
Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ser Gly Lys Gln Ile
115 120 125
Arg His Pro Ala Ser Asn Ser Leu Asp Thr Val Cys Glu Asp Arg Ser
130 135 140
Leu Leu Ala Thr Leu Leu Trp Glu Thr Gln Arg Thr Thr Phe Arg Pro
145 150 155 160
Thr Thr Val Pro Ser Thr Thr Val Trp Pro Arg Thr Ser Gln Leu Pro
165 170 175
Ser Thr Pro Thr Leu Val Ala Pro Glu Gly Pro 180 185
<210> 56 <211> 189 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Химерный внеклеточный домен OX40 человека-крысы RRHH
<400> 56
Val Thr Val Lys Leu Asn Cys Val Lys Asp Thr Tyr Pro Ser Gly His
1 5 10 15
Lys Cys Cys Arg Glu Cys Gln Pro Gly His Gly Met Val Ser Arg Cys
20 25 30
Asp His Thr Arg Asp Thr Val Cys His Pro Cys Glu Pro Gly Phe Tyr
35 40 45
Asn Glu Ala Val Asn Tyr Asp Thr Cys Lys Gln Cys Thr Gln Cys Asn
50 55 60
His Arg Ser Gly Ser Glu Leu Lys Gln Asn Cys Thr Pro Thr Glu Asp
65 70 75 80
Thr Val Cys Arg Cys Arg Ala Gly Thr Gln Pro Leu Asp Ser Tyr Lys
85 90 95
Pro Gly Val Asp Cys Ala Pro Cys Pro Pro Gly His Phe Ser Pro Gly
100 105 110
Asp Asn Gln Ala Cys Lys Pro Trp Thr Asn Cys Thr Leu Ala Gly Lys
115 120 125
His Thr Leu Gln Pro Ala Ser Asn Ser Ser Asp Ala Ile Cys Glu Asp
130 135 140
Arg Asp Pro Pro Ala Thr Gln Pro Gln Glu Thr Gln Gly Pro Pro Ala
145 150 155 160
Arg Pro Ile Thr Val Gln Pro Thr Glu Ala Trp Pro Arg Thr Ser Gln
165 170 175
Gly Pro Ser Thr Arg Pro Val Glu Val Pro Gly Gly Arg 180 185
<210> 57 <211> 445
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> VH6 тяжелой цепи IGHG4 S228P
<400> 57
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
225 230 235 240
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
245 250 255
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln
260 265 270
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
275 280 285
Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
290 295 300
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
305 310 315 320
Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
325 330 335
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
340 345 350
Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
355 360 365
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
370 375 380
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
385 390 395 400
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
405 410 415
Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
420 425 430
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 58 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи VH6
<400> 58
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи VH7
<400> 59
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210>
<211>
106
<212>
PRT
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
вариабельный домен легкой цепи VL9
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105
<210> 61 <211> 354 <212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи VH6
<400> 61
caggtcacac tgaaagagtc tggacccgcc ctggtcaagc ccacccagac actgaccctg 60
acctgcagct tcagcggctt cagcctgagc acaagcggca tgggcgtggg ctggatcaga
120
cagcctcctg gcaaggccct ggaatggatc gcccatattt ggtgggatga tgataaatat
tataacaccg ccctgaaaac ccgcctgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccagaatc 300
gactgggacg gcttcgccta ttggggccag ggaaccctgg tgaccgtgag cagc
354
<210> 62 <211> 354
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи VH7
<400> 62
caggtcacac tgaaagagtc tggacccgcc ctggtcaagc ccacccagac actgaccctg 60
acctgcagct tcagcggctt cagcctgagc acaagcggca tgggcgtggg ctggatcaga 120
cagcctcctg gcaaggccct ggaatggctc gcccacattt ggtgggatga tgataaatat 180
tataacaccg ccctgaaaac ccgcctgacc atcagcaagg acaccagcaa gaaccaggtg 240
gtgctgacca tgaccaacat ggaccccgtg gacaccgcca cctactactg cgccagaatc 300
gactgggacg gcttcgccta ttggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 63
<211> 318
<212> DNA
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариабельный домен легкой цепи VH6VL9
<400> 63
gagatcgtgc tgacacagag ccccgccacc ctgtctctga gccctggcga aagagccacc 60 ctgagctgta gagccagcag cagcgtgtcc tacatgcact ggtatcagca gaagcccggc 120 caggcgccgc gcccgtggat ttatgcgacc agcaatcggg ccacaggcat ccctgccaga 180
ttttctggca gcggctccgg caccgactac accctgacca tctccagcct ggaacccgag 240
gacttcgccg tgtactactg ccagcagtgg tccagcaacc cctggacatt tggccagggc 300
accaaagtgg aaattaaa 318
<210> 64 <211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR1 VH6 тяжелой цепи <400> 64
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 65 <211> 7 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR2 VH6 тяжелой цепи <400> 65
Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys 1 5
<210> 66 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR3 VH6 тяжелой цепи <400> 66
Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr
1 5 10
<210> 67 <211> 5 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR1 VL9 легкой цепи
<400> 67
Ser Ser Val Ser Tyr 1 5
<210> 68 <211> 3 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR2 VL9 легкой цепи
<400> 68
Ala Thr Ser 1
<210> 69 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> CDR3 VL9 легкой цепи <400> 69
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5
<210> 70 <211> 13 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR1 VH6 тяжелой цепи
<400> 70
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly Val Gly Trp
1 5 10
<210> 71 <211> 19
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Протяженная CDR2 VH6 тяжелой цепи <400> 71
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
1 5 10 15
Leu Lys Thr
<210> 72 <211> 10 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR3 VH6 тяжелой цепи
<400> 72
Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr 1 5 10
<210> 73 <211> 12 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR1 VL9 легкой цепи
<400> 73
Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr
1 5 10
<210> 74 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Протяженная CDR2 VL9 легкой цепи
<400> 74
Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr
1 5 10
<210> 75 <211> 9 <212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<223> Протяженная CDR3 VL9 легкой цепи
<400> 75
Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr 1 5
<210> 76 <211> 44 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<223> Модуль 2 внеклеточного домена OX40 человека
<400> 76
Arg Pro Cys Gly Pro Gly Phe Tyr Asn Asp Val Val Ser Ser Lys Pro
1 5 10 15
Cys Lys Pro Cys Thr Trp Cys Asn Leu Arg Ser Gly Ser Glu Arg Lys
20 25 30
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala Arg Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 78 <211> 118
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен VH3 тяжелой цепи
<400> 78
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 79
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен VH4 тяжелой цепи
<400> 79
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210> 80
<211> 118 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> вариабельный домен VH5 тяжелой цепи <400> 80
Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ala
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Ile Asp Trp Asp Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser 115
<210>
<211>
107
<212>
PRT
<213>
Искусственная последовательность
<220>
<223>
Вариабельный домен VL2 легкой цепи
<400>
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 85 <211> 107
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельный домен VL6 легкой цепи
<400> 85
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Tyr
20 25 30
Met Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Pro Trp Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 89 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельный домен VL11 легкой цепи
<400> 89
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антагонистичное антитело или фрагмент указанного антитела, которые связываются с ОХ40 человека, и содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, и/или CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, и/или CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, и/или, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:5 и/или CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQID№:6.
2. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1, которые отличаются тем, что указанное антитело или его фрагмент содержат CDR1 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 1, CDR2 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 2, CDR3 тяжелой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 3; и/или содержат CDR1 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 4, CDR2 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:5, и CDR3 легкой цепи, содержащий последовательность аминокислот согласно SEQ ID №:6.
3. Антитело или фрагмент указанного антитела по п. 1 или 2, которые отличаются тем, что указанное антитело представляет собой антитело мыши, химерное антитело или гуманизированное антитело.
4. Антитело или указанного антитела фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, которые отличается тем, что указанное антитело представляет собой гуманизированное антитело.
5. Антитело или указанного антитела фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 7.
6. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность области, отличной от CDR, вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности области, отличной от CDR, вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID №: 7.
7. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность тяжелой цепи, содержащей последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID№: 35, 36, 37 и 38.
8. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.7, отличающиеся тем, что указанная последовательность тяжелой цепи содержит область, отличную от CDR,, которая по меньшей мере на 80% идентична области, отличной от CDR, последовательности вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 35, 36, 37 или 38.
9. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 58, 59, 79 и 80.
10. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат область, отличную от CDR, последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична области, отличной от CDR, последовательности вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 58, 59, 79 и 80.
11. Антитело или фрагмент указанного антитела по п. 1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGHV2-70*10 (SEQ Ш №: 19), IGHV2-70*01 (SEQ ID №: 20), IGHV2-70*13 (SEQ ID №: 21), IGHV2-5*09 (SEQ ID №: 22) и IGHV2-70*11 (SEQ Ш №: 23).
12. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что
указанные антитело или его фрагмент содержат каркасный участок вариабельной области
тяжелой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGHV2-70*10
К заявке №201490053
(SEQ ID №: 19), и отличающиеся тем, что указанная каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи соответствующего мышиного антитела.
13. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 32, и отличающиеся тем, что указанная каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасный участок вариабельной области тяжелой цепи соответствующего мышиного антитела.
14. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела по п. 12 или 13, отличающиеся тем, что модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 23, 35Ь, 48, 50, 60 и 62, при этом положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
15. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела по п. 12 или 13, отличающиеся тем, что модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 23 S, 35bG, 48L, 50Н, 60N, и 62А, при этом положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
16. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот SEQ ID №: 8.
17. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи SEQ ID №: 8.
18. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что
указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность легкой цепи,
К заявке №201490053
содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 45, 46, 47 и 49.
19. Антитело или фрагмент указанного антитела по п. 18, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 45, 46, 47 или 49.
20. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность вариабельной области легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID №: 60, 86, 87 и 89.
21. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности области, отличной от CDR, вариабельной области легкой цепи, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №: 60, 86, 87 и 89.
22. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность каркасного участка вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека, выбранного из группы, состоящей из: IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), IGKV1-39*01 (SEQ ID №: 25), IGKV1D-39*01 (SEQ ID №: 26), IGKV3-11*02 (SEQ Ш №: 27) и IGKV3-20*01 (SEQ ID №: 28).
23. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что указанные антитело или его фрагмент содержат каркасный участок вариабельной области легкой цепи, которая является продуктом или получена из гена человека IGKV3-11*01 (SEQ ID №: 24), и при этом указанный каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего мышиного антитела.
24. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.1 или 2, отличающиеся тем, что
указанные антитело или его фрагмент содержат последовательность легкой цепи,
К заявке №201490053
содержащую последовательность аминокислот of SEQ ID №: 39, и при этом каркасный участок вариабельной области легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты по сравнению с соответствующим каркасным участком вариабельной области легкой цепи соответствующего мышиного антитела.
25. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела по п. 23 или 24, отличающиеся тем, что указанная модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 1, 33, 34, 46, 47, 54, 56 и 71, при этом положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
26. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела по п. 23 или 24, отличающиеся тем, что указанная модификация аминокислоты включает замену аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из 1Q, ЗЗМ, 34Н, 46Р, 47W, 54L, 56S, и 71Y, при этом положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
27. Гуманизированное антитело или фрагмент указанного антитела по п. 23 или 24, отличающиеся тем, что указанная модификация аминокислоты включает делецию аминокислоты в положении 31, при этом положение аминокислоты для каждого члена группы указывается в соответствии с нумерацией по Кабату.
28. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.2, отличающиеся тем, что указанные антитело или фрагмент указанного антитела содержат:
(c) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 37 или 38; и
(d) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 47.
29. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.2, отличающиеся тем, что указанные антитело или фрагмент указанного антитела содержат:
(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 58 или 59; и
(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность аминокислот согласно SEQ ID №: 60.
(a)
30. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 29, отличающиеся тем, что по меньшей мере один из CDR тяжелой цепи и/или один из CDR легкой цепи содержит по меньшей мере одну модификацию аминокислоты.
31. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 30, дополнительно содержащие константные области тяжелой и/или легкой цепи.
32. Антитело или фрагмент указанного антитела по п.31, отличающиеся тем, что указанную константную область тяжелой цепи человека выбирают из областей группы иммуноглобулинов человека, состоящей из IGHG1, не фукозилированного IGHG1 и IGHG4.
33. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1-31, отличающиеся тем, что указанное антитело является моновалентным антителом.
34. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 31, отличающиеся тем, что указанное антитело является полноразмерным антителом.
35. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 31, отличающиеся тем, что указанное антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, состоящей из Fab, Fab', Fab'-SH, Fd, Fv, dAb, F(ab')2, scFv, биспецифических одноцепочечных димеров Fv, диател, триател и фрагментов scFv, образованных посредством слияния генов одинаковых или разных антител.
36. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1-31, отличающиеся тем, что указанное антитело содержит вариант области Fc, который содержит по меньшей мере одну замену аминокислоты по сравнению с областью Fc исходного антитела, тогда как указанное антитело, содержащее вариант области Fc, проявляет измененную эффекторную функцию по сравнению с исходным антителом.
37. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 36, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент указанного антитела связываются ОХ40 человека со сродством (KD) 110 пМ или менее.
38. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 36, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент указанного антитела сохраняют по меньшей
30.
мере 75% от сродства связывания с ОХ40 (KD) по сравнению с соответствующим химерным антителом.
39. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 36, отличающиеся тем, что указанное антитело или фрагмент указанного антитела обладают таким же или более высоким сродством связывания (Ко) по сравнению с соответствующим химерным антителом.
40. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 36, отличающиеся тем, что указанное антитело содержит фрагмент FAB, который термостабилен при температуре выше 75°С.
41. Антитело или фрагмент указанного антитела, которые связывается с ОХ40 человека и которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело по любому из п. 1 - 36.
42. Эпитоп на внеклеточном домене ОХ40 человека, с короторым связывается антитело по любому из п. 1-36.
43. Эпитоп по п.42, отличающейся тем, что указанным внеклеточным доменом ОХ40 человека является домен 2 (SEQ ID №: 76).
44. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41.
45. Изолированная нуклеиновая кислота по п.44, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи, содержащая последовательность нуклеотидов согласно SEQ ID №: 61 или 62; и/или ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи, содержащая последовательность нуклеотидов согласно SEQ ID №: 63.
46. Вектор, содержащий изолированную нуклеиновую кислоту по п. 44 или 45.
47. Клетка-хозяин, содержащая нуклеиновую кислоту по п. 44 или 45 или вектор по п. 46.
48. Способ получения антитела или фрагмент указанного антитела а, которые связываются с ОХ40 человека, включающий культивирование клетки-хозяина по п. 47, таким образом, что указанная нуклеиновая кислота экспрессируется, и происхдит продукция указанного антитело.
39.
49. Антитело или фрагмент указанного антитела , которое связывается с ОХ40 человека, кодируемое изолированной нуклеиновой кислотой по п. 44 или 45.
50. Композиция, содержащая антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41 и фармацевтически приемлемую основу.
51. Иммуноконъюгат, содержащий антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1-41, соединенное с терапевтическим агентом.
52. Композиция, содержащая иммуноконъюгат по п. 51 и фармацевтически приемлемую основу.
53. Композиция по п. 50 или 52, дополнительно содержащая другой фармацевтически активный агент.
54. Способ лечения ОХ40-опосредованного расстройства у субъекта, способ, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или фрагмента указанного антитела а по любому из п. 1-41.
55. Способ по п. 54, отличающийся тем, что указанное ОХ40-опосредованное
расстройство выбрано из группы, включающей инфекции (вирусные, бактериальные,
грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, ассоциированный с инфекцией,
артрит, ревматоидный артрит, астму, хроническую обструктивную болезнь легких
(ХОБЛ), воспалительное заболевание таза, болезнь Альцгеймера, воспалительное
заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, болезнь Пейрони, глютеновую
болезнь, заболевание желчного пузыря, пилонидальную болезнь, перитонит, псориаз,
васкулит, послеоперационные спайки, инсульт, диабет I типа, болезнь Лайма, артрит,
менингоэнцефалит, аутоиммунный увеит, иммунно-опосредованные воспалительные
расстройства центральной и периферической нервной системы, такие как множественный
склероз, волчанку (такую как системная красная волчанка) и синдром Джулиана-Барре,
атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, фиброзирующий альвеолит, базедову
болезнь, нефропатию IgA-типа, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру,
синдром Меньера, пузырчатку, первичный биллиарный цирроз, саркоидоз, склеродермию,
гранулематоз Вегенера, другие аутоиммунные расстройства, панкреатит, травму
(операцию), реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD), отторжение трансплантата,
сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт
миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию костной
К заявке №201490053
ткани, остеопороз, остеоартрит, периодонтит, гипохлоргидрию и нейромиелит зрительного нерва.
56. Способ по п.54, отличающийся тем, что указанное ОХ40-опосредованное расстройство выбрано из группы, включающей инфекции (вирусные, бактериальные, грибковые и паразитарные), эндотоксический шок, ассоциированный с инфекцией, артрит, ревматоидный артрит, астму, бронхит, грипп, респираторно-синцитиальный вирус, пневмонию, ХОБЛ, идиопатический фиброз легких (ИФЛ), криптогенный фиброзирующий альвеолит (КФА), идиопатическую фиброзирующую интерстициальную пневмонию, эмфизему, воспалительное заболевание таза, болезнь Альцгеймера, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, болезнь Пейрони, глютеновую болезнь, заболевание желчного пузыря, пилонидальную болезнь, перитонит, псориаз, васкулит, послеоперационные спайки, инсульт, диабет I типа, болезнь Лайма, артрит, менингоэнцефалит, аутоиммунный увеит, иммунно-опосредованные воспалительные расстройства центральной и периферической нервной системы, такие как множественный склероз, волчанку (такую как системная красная волчанка) и синдром Джулиана-Барре, атопический дерматит, аутоиммунный гепатит, фиброзирующий альвеолит, базедову болезнь, нефропатию IgA-типа, идиопатическую тромбоцитопеническую пурпуру, синдром Меньера, пузырчатку, первичный биллиарный цирроз, саркоидоз, склеродермию, гранулематоз Вегенера и другие аутоиммунные расстройства, панкреатит, травму (операцию), реакцию "трансплантат против хозяина" (GVHD), отторжение трансплантата, сердечно-сосудистые заболевания, включая ишемические заболевания, такие как инфаркт миокарда, а также атеросклероз, внутрисосудистое свертывание, резорбцию костной ткани, остеопороз, остеоартрит, периодонтит, гипохлоргидрию и нейромиелит зрительного нерва.
57. Способ по любому из п. 54 - 56, отличающийся тем, что указанный субъект имеет низкий уровень экспрессии ОХ40.
58. Способ по любому из п. 54 to 56, отличающийся тем, что указанное антитело обладает повышенной цитотоксичностью по сравнению с антителом, содержащим константную область тяжелой цепи человека IGHG1.
59. Применение антитела или фрагмента указанного антитела по любому из п. 1 - 41 в качестве лекарственного препарата.
56.
60. Применение антитела или фрагмента указанного антитела по любому из п. 1 - 41 при получении лекарственного препарата для лечения ОХ40-опосредованного расстройства.
61. Применение антитела или фрагмент указанного антитела по п. 60, отличающееся тем, что указанным ОХ40-опосредуемым расстройством является GVHD, и при этом указанное антитело или фрагмент указанного антитела более эффективны, чем Энврел(r) при подавлении GVHD.
62. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41 для применения в качестве лекарственного препарата.
63. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41 для применения в способе лечения ОХ40- опосредованного расстройства.
64. Антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41 для применения в способе лечения ОХ40- опосредованного расстройства, отличающееся тем, что указанным ОХ40-обусловенным расстройством является GVHD, и отличающееся тем, что указанное антитело или фрагмент указанного антитела более эффективны, чем Энврел(r) при подавлении GVHD.
65. Готовое изделие, содержащее антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 41, композицию по п.50, 52 или 53, или иммуноконъюгат по п.51, для лечения ОХ40-опосредованного расстройства.
66. Набор, включающий антитело или фрагмент указанного антитела по любому из п. 1 - 30, композицию по п.50, 52 или 53, или иммуноконъюгат по п.51 для лечения ОХ40-опосредованного расстройства.
67. Способ скрининга in vitro для определения пациента с низким уровнем экспрессии ОХ40, включающий этапы:
(a) очистки мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от других компонентов пробы крови пациента;
(b) осуществление анализа РВМС способом проточной цитометрии ; и
(c) определение количества ОХ40-положительных клеток среди CD4+ и/или CD8+ Т-лимфоцитов и сравнение указанного количества с контрольными уровнями.
(a)
ФИГ.1А
ФИГ.1В
ФИГ.ЗА
Активированные РВМС человека
со ш
75; CD
М О
-Р> VO
о о
Флуоресценция окрашенного антитела | | Контроль по изотипу L"J Коммерческое анти-ОХ40 L__! 1D4
I-1 00
ФИГ.ЗВ
ФИГ.4А
40 т
35 I
30 i
У'-
25 I
20 i
Химерное антитело 1D4 человека
15 I J '^fV
10 I /
\ /
5 I f
j J , VH1/VL1
-5 i-- ----~~~~ ---,-,."--- ,..."".,
-100 0 100 200 300 400 500 600 700
Время (с)
u Ш
75; CD
2 35 I
m I о
н " и
н 25 i
л !
о о
м 15 I
5 I
VH1/VL1, VH1/VL2, VH1/VL3 VH2/VL1, VH2/VL2, VH2/VL3 VH3/VL1, VH3/VL2, VH3/VL3
Химерное антитело 1D4 человека
и-1 00
M О I-1 -P> VO
о о
-5 L
-100
Время (с)
700
ФИГ.4Е
ш о н и ш 60
/ /
VH6/VL9
о 40 о
т л Q.
^T"^w---^ VH7/VL9
со Ш
75; CD 20
Химерное антитело 1D4 человека
M О I-1 -P> VO
о о
- 2 0
-100
100
200
300 400
Время (с)
500
600
700
800
ФИГ.5А
№ VH яоКмВвту
1D4 VH
ЮНУ270*10 <
VHl
VH2 [T23S]
VH3 [R50H]
VH4 [T23S/R50H]
VH5 [T23S/R50H/S60N/S62A]
VH6 [T23S/S35bG/R50H/S60N/S62A
VH7 [T23S/S35bG/l48L/R50H/S60N
10 20 30 40 50 60 70
I I I I I I I I I I I I I I I
12345678901234567890123456789012345ab67890123456789012abc34567890123456789012345
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLAHIW WDDDKYYNTALKSGLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMRVSWIRQPPGKALEWIARID WDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSK
QWLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWIARIW WDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWIARIW WDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWIAHIW WDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWIAHIW WDDDKYYSTSLKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSGMGVSWIRQPPGKALEWIAHIW WDDDKYYNTALKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWIAHIW WDDDKYYNTALKTRLTISKDTSK
QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPPGKALEWLAHIW WDDDKYYNTALKTRLTISKDTSK
u Ш
75; CD
M О I-1 -P> VO
о о
80 90 100 110
" I I I I I I I • • •
NtVHnOKMHy 6789012abc345678901234567890abcdefghijkl234567890123
1D4 VH NQVFLKIASVDTTDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
ЮН?М1П0ЧМ0ИШ NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIYF DYWGQGTLVTVSS
VHl NQWLTMTNMDP VD TAT Y YCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH2 [T23S] NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH3 [R50H] NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH4 [T23S/R50H] NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH5 [T23S/R50H/S60N/S62A] NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH6 [T23S/S35bG/R50H/S60N/S62A NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
VH7 [T23S/S35bG/I48L/R50H/S60N NQWLTMTNMDPVDTATYYCARIDWDGF AYWGQGTLVTVSS
ФИГ.5В
Ni VLho КнОиу
1D4 VL
WHV-S-IVOI'
VL1
VL2 [L33M]
VL3 [F71Y]
VIA [L33M/F71Y]
VL5 [L33M/L4 6P/L4 7W/F71Y]
VL6 [E1Q/L33M/L4GP/L47W/F71Y]
VL7 [Y31del/L33H/F71Y]
VL8 [Y31del/L33M/A34H/F71Y]
VL9 [Y31del/L33M/A34H/L46P/L47W/F71Y]
VL10 [Y31del/L33M/R54L/T565/F71W]
VL11 [Y31del/L33M/A34H/R54L/T56S/F71Y]
10 20 30 40 50 60 70
.... I I I I I I I I .... I I I I I .... I
123456789012345678901234567abcdeЈ89012345678901234567890123456789012345678901234
QIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASS SVSYMHWYQQKPGSSPKPWIYATSNXASGVPARFS6SGS6TSYSLT
EI VLTQ SPATL SLS PGERATLSCRASQ SVSSYLAWYQQKPGQAPRLL I YD ASNRATGIP ARF S GSGSGTDF TLT
EIVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVSYYLAWYQQKPGQAPRLLI YAT SNRATGIPARF SGSGSGTDF TLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS 3 S VS Y YMAWYQQKPGQAPRLLI YAT SNRATGIP ARF SGSGSGTDF TLT
EIVLTQSPATLSbSPGBRATLSCRASS S VS Y YXAWYQQKPGQAPRLI,IYATSNRATGIPARFSGSGSGTDYTLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVSY YMAWYQQKPGQAPRLL I YAT SNRATGIP ARF SGSGSGTD YTLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S S VS Y YMAWYQQKPGQAPRP WI YAT SNRATGIP ARF S GSGSGTD YTLT
Q IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVSYYMAWYQQKPGQAPRPWIYATSNRATGIPARF S GSGSGTD YTLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVS YMAWYQQKPGQAPRLL I YAT SNRATGIP ARF SGSGSGTD YTLT
EIVLTQSPATLSLS PGERATLSCRAS S S VS YMHWYQQKPGQAPRLLI YAT SNRATGIP ARF SGSGSGTD YTLT
EI VLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S S VS YMHWYQQKFGQAFRF WI YAT SNRATGIP ARF SGSGSGTD YTLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVS YMAWYQQKPGQAPRLL I YAT SNLASGIP ARF SGSGSGTD YTLT
E IVLTQ SPATL SLS PGERATLSCRAS S SVS YMHWYQQKPGQAPRLL I YAT SNLASGIP ARF SGSGSGTD YTLT
u Ш
M О I-1 -P> VO
о о
Ml VL ю НвВиу
1D4 VL
ЮН\Ю-Н*01'
VL1
VL2 [L33M]
VL3 [F71Y]
VL4 [L33M/F71Y]
VL5 [L33M/L46P/L47W/F71Y]
VL6 [E1Q/L33M/L46P/L47W/F71Y]
VL7 [Y31del/L33M/F71Y]
VL8 [Y31del/L33M/A34H/F71Y]
VL9 [Y31del/L33M/A34H/L4ЂP/L47W/F71Y]
VL10 [Y31del/L33M/R54L/T56S/F71Y]
VL11 [Y31del/L33M/A34H/R54L/T56S/F71Y]
80 Э0 100
I .... I .... I I .... I . I . . . . I . . .
567890123456789012345abcdeЈ67890123456a7
INRVEAEDAATYYCQQWS SNP WTFGGGTKLEI~K
IS S LEPEDFAVY YCQQRSNWP WTFGQGTKVEI -K
IS S LEPEDFAVYYCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I -K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
ISSLEPEDFAVYYCQQWSSNP WTFGQGTKVEI-K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~X
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I -K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I ~K
IS S LEPEDFAVY YCQQWS SNP WTFGQGTKVE I~K
ФИГ.6
1 г !
Тпл1: 72,55 Тпл 2: 76,33 Тпл.З: 85,23
~г~ 40
i <-r~
70 80
-j ( j
100 110
Температура (°C)
ФИГ.7
llllllll
RRRR
RHRR
HRRR
HHRR
RRHH
VH6/VL9
Антитело к OX40 крысы Контроль по изотипу 2F8
ФИГ.8А
m о и л ц
с и
Реактивная клетка-1 и стимулирующая
клетка-2 60000л
Концентрация mAb (мкг/мл)
ЕЯ Реактивная клетка-1 и стимулирующая клетка-2
щщ Реактивная клетка-1 и стимулирующая клетка-2
m Контроль по изотипу
Положительный контроль
О VH6/VL9
И Не фукозилированное VH6/VL9
В VH6/VL9 IGHG4 S228P
ФИГ.8В
Реактивная клетка-2 и стимулирующая клетка-1
S X
о у
m о и л
с и
80000-1
§18НВ
Концентрация mAb (мкг/мл)
Реактивная клетка-2 и стимулирующая клетка-1
ЕМ Реактивная клетка-2 и стимулирующая клетка-1
EZ3 Контроль по изотипу
ШШ Положительный контроль
О VH6/VL9
^3 Не фукозилированное VH6/VL9
В VH6/VL9 IGHG4 S228P
-В- VH6/VL9 (1 мг/кг) -О- VH6/VL9 (10 мг/кг)
20 40 60
Дни после инъекции РВМС
(19)
(19)
(19)
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
К заявке №201490053
<220>
<220>
180
180
180
180
180
180
К заявке №201490053
К заявке №201490053
101
101
К заявке №201490053
К заявке №201490053
103
104
К заявке №201490053
106
106
К заявке №201490053
К заявке №201490053
5/18
К заявке № 201490053
5/18
К заявке № 201490053
5/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
14/18
К заявке № 201490053
16/18
К заявке № 201490053
16/18
К заявке № 201490053
16/18
К заявке № 201490053
17/18
17/18
К заявке № 201490053
К заявке № 201490053