(57) Реферат / Формула:
Изобретение относится к применению комплекса пчелиной пыльцы/глины в качестве подложки для введения пробиотиков, а также к композициям, содержащим один или несколько видов пробиотиков и указанный комплекс пчелиной пыльцы/глины.
1411840
КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ ПРОБИОТИКИ И КОМПЛЕКС ПЧЕЛИНОЙ ПЫЛЬЦЫ/ГЛИНЫ, СПОСОБ ИХ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В
ПИТАНИИ И ТЕРАПИИ
Настоящее изобретение относится к введению микроорганизмов (бактерий или дрожжей) пробиотического назначения при помощи подложки на основе пчелиной пыльцы и глины, а также к композициям, содержащим указанные микроорганизмы и указанный комплекс пчелиной пыльцы/глины.
В контексте настоящего изобретения термин "микроорганизмы" относится к микроорганизмам (бактериям или дрожжам) пробиотического назначения.
Пробиотики - это микроорганизмы, такие как непатогенные и нетоксичные бактерии или дрожжи, которые, будучи доставленными живыми в достаточном количестве в кишечник, содействуют поддержанию равновесия флоры и укреплению слизистой оболочки кишечника. В настоящее время они высоко ценятся за полезное действие, которое они обеспечивают в плане питания и здоровья.
Так, состоявшееся в октябре 2001 г. консультативное совещание экспертов Продовольственной и сельскохозяйственной организации ООН (ФАО)/ВОЗ по оценке полезных для здоровья и питательных свойств пробиотиков определило пробиотики как ".живые микроорганизмы, которые при введении их в достаточном количестве оказывают оздоровительный эффект на тех, кто их потребляет", и констатировало, что пробиотики могут играть важную роль в иммунологической, пищеварительной и дыхательной функциях и могут оказать значимый эффект при лечении инфекционных заболеваний, особенно у детей.
Коммерчески доступные микроорганизмы пробиотического назначения в большинстве случаев являются лиофилизированными и упакованными в различные формы (желатиновые капсулы, пакетики типа саше и др.). Несмотря на это, индустриализация, кислотность желудочного сока и вступление указанных микроорганизмов в контакт с желчью и соком поджелудочной железы могут стать причиной потери большого количества этих микроорганизмов, которые к тому же требуют реактивации, если они лиофилизированные. В литературе некоторые исследования посвящены жизнестойкости пробиотиков в кислой среде. Так, о вредном влиянии кислотности на выживаемость некоторых пробиотических штаммов
{Bifidobacterium и Lactobacillus) сообщают Sun et al. International Journal of Food Microbiology, 61, 17-25 (2000); Sultana et al. International Journal of Food Microbiology, 62, 47-55 (2000); Favaro-Trindade et al. Journal of Microencapsulation, 19 (4), 485-494 (2002), и Hansen et al. Food Microbiology, 19, 35-45 (2002).
Даже среди лактобацилл, используемых молочной промышленностью для производства ферментированного молока и йогуртов, многие не выживают в кислой среде желудка и поэтому не могут соответствовать определению пробиотиков. В действительности, чтобы быть описанным как "пробиотик", штамм микроорганизмов должен достигнуть кишечника живым в достаточном количестве и "укорениться" в кишечной микрофлоре.
Поэтому с учётом полезности пробиотиков желательно сделать доступными композиции, позволяющие микроорганизмам достигать кишечника хозяина живыми и в достаточном количестве.
Таким образом, важно предложить композиции, которые гарантируют пробиотический эффект микроорганизмов, добавленных к пчелиной пыльце, за счёт обеспечения их биодоступности и биологической активности.
Международная заявка РСТ/ЕР2011/072756 описывает комбинации пчелиной пыльцы с глиной (называемые в настоящей заявке как комплекс пчелиной пыльцы/глины), делающие возможными стабилизацию, составление в виде определённых доз и введение свежей пчелиной пыльцы, но не предусматривает использование последней каким бы то ни было образом в качестве подложки для введения микроорганизмов пробиотического назначения, предварительно идентифицированных (характеризация) и культивированных, особенно лиофилизированных.
Авторами настоящей заявки удалось обнаружить, и это является одной из целей настоящего изобретения, что указанные комбинации глины с пчелиной пыльцой образуют идеальную систему для введения микроорганизмов пробиотического назначения, давая последним требуемую защиту от кислотности желудочного сока, желчи и сока поджелудочной железы; обеспечивая их питанием, необходимым для их развития и перед реактивацией в случае лиофилизированных микроорганизмов; способствуя их росту intra corpus (внутри тела) в микроорганизмы с высокой жизнестойкостью, адаптированные естественным путём к пищеварительной среде; доставляя их живыми в кишечник, связывая их там и высвобождая их там.
Таким образом, в соответствии с первой целью настоящее изобретение относится к композиции, содержащей:
• один или более видов микроорганизмов пробиотического назначения и
• комплекс на основе пчелиной пыльцы и глины.
Согласно другой цели настоящее изобретение относится также к применению комплекса на основе пчелиной пыльцы/глины в качестве подложки для введения микроорганизмов пробиотического назначения, особенно лиофилизированных, в частности, для увеличения бионагрузки и биодоступности указанных микроорганизмов.
Таким образом, в рамках изобретения продемонстрировано, что комплекс пчелиной пыльцы/глины образует идеальную защитную и питательную среду для микроорганизмов пробиотического назначения, способную гарантировать их защиту при прохождении через желудок, при контакте с желчью и соком поджелудочной железы; способную обеспечить питание, требуемое для их развития и перед реактивацией в случае лиофилизированных микроорганизмов.
С помощью комплекса возможно поддержание жизнеспособности микроорганизмов вплоть до кишечника и сохранение их биологических характеристик и, следовательно, их физиологического полезного действия на равновесие кишечной флоры хозяина.
В частности, комплекс пчелиной пыльцы/глины обеспечивает среду, благоприятствующую размножению intra corpus живых микроорганизмов пробиотического назначения с высокой жизнестойкостью, адаптированных к пищеварительной среде. Кроме того, хотя выживаемость микроорганизмов пробиотического назначения становится проблемой при рН ниже 3, было продемонстрировано, что подложка из пчелиной пыльцы/глины в композициях по изобретению даёт возможность защитить микроорганизмы от кислотности желудочного сока путём поддержания рН на уровне, совместимом с жизнью клетки, за счёт буферного эффекта, который изолирует микроорганизмы от рН желудка и который делает возможным рождение микроорганизмов intra corpus в конце желудочного транзита. Было также продемонстрировано, что эта защита продолжается вплоть до перехода в кишечник.
Под "рождением intra corpus (внутри тела)" понимается способность микроорганизмов к размножению в комплексе пчелиной пыльцы/глины и адаптации к физиологической среде (особенно к условиям пищеварительной системы) хозяина, которому они вводятся.
Под "комплексом пчелиной пыльцы/глины" имеется в виду любой стабильный или "безводный" материал, полученный связыванием пчелиной пыльцы от любых видов растений с силикатной слоистой структурой. Международная заявка РСТ/ЕР2011/072756 описывает комбинации пчелиной пыльцы и глины, и её содержание включено в настоящее описание в виде ссылки.
В контексте изобретения под "пчелиной пыльцой" имеется в виду пыльца, собираемая пчёлами. Речь идёт об оплодотворяющем элементе растений, экстрагируемом пчелой из мужского органа цветка, спрессовываемом ею от цветка к цветку и переносимом до улья. Она может быть взята любым путём и именно перед поступлением в улей (при помощи ловушки для пыльцы) в соответствии с обычными способами.
В контексте изобретения данный термин "пчелиная пыльца" относится к пыльце, собираемой пчёлами, независимо от способа её экстракции и/или консервирования.
В контексте изобретения термин "пчелиная пыльца" обозначает пчелиную пыльцу в любой форме, которая позволяет поддерживать характеристики свежей пыльцы. Следовательно, этот термин включает прежде всего свежую пчелиную пыльцу, а также предварительно замороженную пчелиную пыльцу.
В рамках объёма настоящего изобретения пчелиная пыльца может происходить из различных видов растений и не ограничивается конкретным цветком. В этой связи можно упомянуть пчелиную пыльцу от ржи, кукурузы, подсолнечника, ладанника, каштана, киви, ивы (вербы), мака, лаванды, вереска и др.
Пчелиная пыльца, прежде всего замороженная пчелиная пыльца, может быть коммерчески доступной, например, от Pollenenergie.
Пчелиная пыльца может также иметь переменный состав, изначально зависящий от природы исходных растений, а также от периода сбора, способа сбора или от географической зоны (страна, регионы).
Таким образом, свежая пчелиная пыльца, подходящая для изобретения, в большинстве случаев содержит от 5 % до 36 % воды и от 64 % до 95 % сухих веществ, в том числе:
от 2,5 % до 3,8 % минеральных солей, от 4,2 % до 19,8 % липидов, от 8 % до 30 % альбумина, от 5 % до 7 % крахмала, витамины,
факторы роста, фолиевую кислоту, полифенолы, фитостерины, ферменты и дрожжи.
Под "глиной" имеется в виду материал, включающий глинистые минералы, такие как гидросиликаты, прежде всего силикаты алюминия или магния. Филлосиликаты, имеющие слоистую структуру и состоящие из одного или нескольких листов, являются особенно предпочтительными.
Согласно Jozja-классификации, в основу которой положена толщина структуры листа, различают четыре группы глин:
1) 7-ангстремные (А) минералы: их толщина составляет около 7 А; это категория каолинитов (каолин, халойсит ...),
2) 10-ангстремные минералы: их толщина составляет около 10 А; это категория иллитов (иллит, глауконит ...),
3) 14-ангстремные минералы: их толщина составляет около 14 А; это категория смектитов (монтмориллонит, бентонит, гассул ...),
4) волокнистые минералы: толщина листа является переменной величиной; они называются хлоритами или волокнистыми минералами (сепиолит, аттапульгит ...).
Таким образом, термин "глина" в контексте изобретения относится к этим четырём типам глины. Из глинистых минералов можно упомянуть иллит, хлорит, глауконит, каолинит, аттапульгит, сепиолит и монтмориллонит. Из глин особенно предпочтительными являются каолин, иллит, монтмориллонит, аттапульгит, более предпочтительным - монтмориллонит.
В контексте изобретения под "микроорганизмами" имеются в виду микроскопические организмы, включающие прежде всего бактерии и дрожжи, особенно непатогенные и нетоксичные.
В контексте изобретения под "микроорганизмами пробиотического назначения" имеются в виду микроорганизмы, характеризация (идентификация) и культивирование которых проводятся перед их включением в комплекс и которые, будучи доставленными живыми в достаточном количестве в кишечник, могут принести пользу здоровью и/или питанию хозяина.
Термин "проводится характеризация", употребляемый в описании, относится к микроорганизмам, штамм(ы) которых был(и) идентифицирован(ы) с тем, чтобы знать природу штамма(ов) и необязательно его(их) концентрацию(и).
В одном варианте осуществления изобретения микроорганизмы, подвергнутые характеризации согласно изобретению, добавляются к пчелиной пыльце. В одном варианте микроорганизмы, добавляемые к пчелиной пыльце, отличаются по своей природе, количеству, структуре от микроорганизмов, присутствующих в пчелиной пыльце от природы. В одном варианте осуществления изобретения добавляются лиофилизированные микроорганизмы.
Из дрожжей можно упомянуть Saccharomyces cerevisiae. Из бактерий можно назвать в основном молочнокислые бактерии, такие как лактобациллы, бифидобактерии и другие молочнокислые бактерии.
Согласно изобретению:
в качестве лактобацилл можно упомянуть в первую очередь Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus amylovirus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus casei, Lactobacillus cellobius, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus curvatus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus farciminis, Lactobacillus fermentum, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus lactis.
в качестве бифидобактерий можно упомянуть Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium lactis (по новой классификации Bifidobacterium animalis), Bifidobacterium laterosporus, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium thermophilum.
- другие молочнокислые бактерии предпочтительно включают Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Lactococcus lactis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus acidilactici, Sporolactobacillus inulinus, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus intermedius, Streptococcus thermophilus.
- в качестве бактерий, не относящихся к молочнокислым, можно упомянуть Bacillus spp, Escherichia coli (штамм Nissle), Propionibacterium freudenreichii.
Лактобациллы и бифидобактерии являются особенно предпочтительными, например, такие виды как Bifidobacterium bifidum (bifidus), Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium breve, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus.
Эти микроорганизмы пробиотического назначения в большинстве своём коммерчески доступны.
Указанные микроорганизмы, подходящие для изобретения, в большинстве случаев выделяются, подвергаются лиофильной сушке, характеризации и/или культивированию перед добавлением и включением их в комплекс пчелиной пыльцы/глины.
Фактически, в соответствии с предпочтительным вариантом осуществления изобретения, вышеприведенное определение не охватывает микроорганизмы, которые от природы присутствуют в комплексе пчелиной пыльцы/глины и которые не выделялись, не подвергались характеризации, культивированию и/или лиофильной сушке перед включением их в комплекс.
Лиофилизированные микроорганизмы пробиотического назначения входят в объём настоящего изобретения.
Микроорганизмы пробиотического назначения в большинстве своём реализуются на рынке в лиофилизированном виде. Лиофильная сушка или сушка холодом - это способ, основанный на сублимации, который позволяет удалить воду, содержащуюся в материале, пищевом продукте или другом продукте, с тем чтобы сделать его стабильным при комнатной температуре и облегчить, тем самым, его сохранение.
Лиофильная сушка (лиофилизация) включает много преимуществ по сравнению с другими способами сушки.
• Лиофильная сушка даёт возможность сохранить большую часть пищевых качеств пищевого продукта, поскольку последний остаётся при температуре, ниже температуры замерзания, в процессе сублимации. Применение лиофильной сушки особенно важно в случае молочнокислых бактерий, поскольку они очень чувствительны к нагреву.
• Лиофилизированные пищевые продукты в большинстве случаев не требуют охлаждения для своего хранения. Поэтому затраты на хранение и транспортировку могут быть соответственно снижены.
• Лиофильная сушка приводит к значительному уменьшению веса, что существенно облегчает транспортировку лиофилизированных пищевых продуктов. Например, некоторые пищевые продукты содержат до 90 % воды. Следовательно, после лиофильной сушки они будут в десять раз легче.
• Большинство лиофилизированных пищевых продуктов очень быстро регидратируются вследствие своей пористой текстуры. Фактически лиофильная сушка не
•
вызывает сколь-либо значительного уменьшения в объёме. Следовательно, вода может легко восстановить своё положение в молекулярной структуре пищевого продукта.
Лиофилизированные микроорганизмы переходят в процессе сушки в состояние покоя (неактивное). Поэтому их необходимо реактивировать с тем, чтобы они достигли кишечника в жизнеспособном состоянии и проявили там полезное действие на здоровье хозяина, согласно изобретению.
В рамках изобретения было продемонстрировано, что комплекс пчелиной пьшьцы/глины представляет собой подложку (носитель), позволяющую реактивировать эти лиофилизированные бактерии.
Таким образом, эта подложка является благоприятной средой и идеальной для питания, защиты, развития и для лиофилизированных микроорганизмов, для реактивации этих микроорганизмов, включая те из них, которые предназначены для перорального приёма.
В большинстве случаев композиции по изобретению содержат
- от 0,1 % до 70 % лиофилизированных пробиотиков и
- от 30 % до 99,9 % указанного комплекса (процентное содержание указано в мас.%); в частности,
- от 3 % до 30 % лиофилизированных пробиотиков и
- от 70 % до 97 % указанного комплекса (процентное содержание указано в мас.%).
Комплексы пчелиной пыльцы/глины в большинстве случаев включают
- от 4 % до 90 % пчелиной пыльцы и
- от 10 % до 96 % глины (процентное содержание указано в мас.%).
Более предпочтительно комплексы по изобретению включают
- от 20 % до 40 % пчелиной пыльцы и
- от 60 % до 80 % глины; в частности,
- от 30 % до 35 % пчелиной пыльцы и
- от 65 % до 70 % глины.
Комплексы по изобретению преимущественно имеют размер зёрен менее 500 мкм, влагосодержание ниже 15 % и/или активность воды (aw) ниже 0,75.
Как правило, композиции настоящего изобретения имеют форму порошка и следующие характеристики:
Результаты анализов
Описание
Внешний вид
Порошок
Цвет
От тёмно-зелёного - серого до бледно-зелёного - серого в зависимости от количества
лиофилизированных бактерий
Запах
Специфический
Не определялся
Плотность
Не определялась
Тяжёлые металлы (Pb, As)
- РЬ < 2 ррт
- As < 1 ррт
Преимущественно композиция по изобретению может быть приготовлена в желудочно-устойчивой форме, прежде всего в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул.
В рамках изобретения неожиданно удалось продемонстрировать, что желудочно-резистентная композиция микроорганизмов пробиотического назначения и комплекса пчелиной пыльцы/глины способствует увеличению бионагрузки наряду с инициацией рождения бактерий intra corpus, в то время как микроорганизмы, приготовленные в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул без комплекса пчелиной пьшьцы/глины, показывают значительно пониженный уровень жизнеспособности.
Преимущественно в случае приготовления комплекса пчелиной пыльцы/глины с нагрузкой из лиофилизированных пробиотиков в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул прохождение его в желудок рассматривается как фактор, благоприятствующий пролиферации. При контакте с потоком содержимого желудка желудочно-резистентная желатиновая капсула становится проницаемой; вода проникает внутрь и обеспечивает влажность, в которой нуждаются микроорганизмы для начала фазы пролиферации.
Согласно изобретению применение комплекса пчелиной пьшьцы/глины в качестве подложки для перорального введения микроорганизмов пробиотического назначения даёт возможность
защиты микроорганизмов пробиотического назначения от разрушительного действия упаковки;
реактивации лиофилизированных микроорганизмов пробиотического назначения, включённых в композицию;
питания и поддержания жизнеспособными микроорганизмов пробиотического назначения, включённых в композицию;
защиты микроорганизмов пробиотического назначения от кислотности желудочного сока;
защиты микроорганизмов пробиотического назначения от желчи и сока поджелудочной железы;
рождения intra corpus новых микроорганизмов пробиотического назначения, адаптированных к пищеварительной среде;
высвобождения микроорганизмов в кишечную среду и одновременного содействия их адгезии и взаимодействию со слизистой оболочкой кишечника.
Микроорганизмы должны связаться со слизистой кишечника, чтобы содействовать укреплению кишечного барьера и проявить своё полезное действие на здоровье хозяина. Так, например, бифидобактерии обладают способностью к адгезии к слизистой оболочке кишечника, где они распознают различные рецепторы кишечного эпителия. Что касается молочнокислых бактерий, то они занимают потенциальные участки колонизации патогенами, препятствуя проникновению вредных антигенов и предупреждая, тем самым, пролиферацию патогенных микроорганизмов. Они потребляют доступные нутриенты, ограничивая источник нутриентов для патогенов и конкурируя с патогенами за доступ к рецепторам хозяев. Кроме того, они секретируют антимикробные молекулы, такие как бактериоцины, на поверхность эпителия, а также в среду (например, подкисление).
Увеличивая ретенцию микроорганизмов пробиотического назначения в кишечнике, комплекс пчелиной пыльцы/глины способствует полезному взаимодействию этих микроорганизмов со слизистой оболочкой кишечника. Кишечная микробиота выполняет многие требуемые физиологические функции, полезные для поддержания здоровья хозяина. Особенно значимыми из них являются поддержание равновесия кишечной флоры и укрепление кишечного барьера. Микроорганизмы пробиотического назначения
являются хорошими кандидатами для достижения этой цели. Однако проявлению микроорганизмами пробиотической активности в большинстве случаев препятствует множество трудностей: требование правильного питания микроорганизмов для поддержания их жизнеспособности; требование реактивации лиофилизированных микроорганизмов; низкая устойчивость микроорганизмов к шоку индустриализации; низкая устойчивость микроорганизмов к кислотности желудочного сока, желчи и соку поджелудочной железы; отсутствие адаптации микроорганизмов к пищеварительной среде и планктонная природа микроорганизмов, которая является препятствием для их адгезии к слизистой оболочке и для их взаимодействия с последней. Стратегии преодоления этих трудностей существуют, но ни одна из них не даёт возможности устранить все трудности в целом. Например, выделенные и культивированные полезные бактериальные штаммы не реактивируются из-за их устойчивости к кислотности желудочного сока, и небольшой процент их, который достигнет кишечника, будет неспособен к связыванию или эффективному взаимодействию со слизистой оболочкой кишечника. В настоящее время никакая подложка не способна преодолеть различные биологические и/или физиологические препятствия с одновременным гарантированным воздействием на целевой участок. Настоящее изобретение даёт возможность избавиться в значительной степени от этих трудностей и обеспечить микроорганизмы со средой, необходимой для проявления их пробиотического действия в кишечнике.
Комплекс пчелиной пыльцы/глины даёт возможность одновременно избавиться от всех промышленных, биологических и/или физиологических препятствий к проявлению действия пробиотиками за счёт обеспечения следующих элементов:
• питательной среды, требуемой для поддержания бактерий,
• питательной среды, необходимой для реактивации лиофилизированных бактерий,
• устойчивости к кислотности желудочного сока,
• устойчивости к желчи и соку поджелудочной железы,
• адаптации к кишечной среде
• связывания с кишечной стенкой и доставки.
Изобретение относится также к способу приготовления композиции по изобретению, который предусматривает:
- смешивание пчелиной пыльцы и глины,
- добавление и смешивание с микроорганизмами пробиотического назначения.
Указанные микроорганизмы пробиотического назначения могут быть лиофилизированными, представленными в виде порошка.
Предпочтительно полученная смесь может просеиваться для получения требуемой гранулометрии. Для этой цели преимущественно используется сито с размером ячеек 500 мкм.
Изобретение также относится к применению комплекса на основе пчелиной пыльцы и глины для доставки микроорганизмов пробиотического назначения вплоть до кишечника, для связывания их, улучшения их биодоступности и/или пробиотической биологической активности в кишечнике. Таким образом, указанный комплекс является биовектором для введения микроорганизмов пробиотического назначения.
Под "биологической активностью" в контексте описания имеется в виду питательный (особенно диетический эффект) и/или физиологический эффект, такой как пробиотический и лечебный эффект, проявляемый указанными микроорганизмами в организме субъекта, который принимает их.
Таким образом, настоящее изобретение относится в первую очередь к пищевому продукту, косметической, фармацевтической и/или галеновой композиции, и/или к медицинскому набору, содержащему композицию по изобретению.
Следовательно, указанные композиции/приборы по изобретению являются полезными для профилактической и/или лечебной, терапевтической и/или питательной цели (особенно для диетической цели) применительно к человеку и/или животному. Вспомогательные компоненты, требуемые для промышленного оформления продуктов, могут выбираться из всех доступных материалов, соответствующих предписаниям (пищевой продукт, биологически активная добавка к пище, функциональный пищевой продукт, косметический, медицинский, фармацевтический набор), которые регламентируют эти продукты.
В качестве вспомогательных компонентов можно, в частности, упомянуть производные целлюлозы или микрокристаллической целлюлозы, карбонаты щелочноземельных металлов, фосфат магния, крахмалы, модифицированные крахмалы, лактозу для твёрдых форм, воду, водные растворы, солевой раствор, изотонический раствор и др.
Согласно одному варианту осуществления изобретения композиции включают также источник сахара, такой как глюкоза, при наличии которого бактерии могут развиваться.
Композиция по изобретению может изготовляться в формах, предназначенных для введения пероральным, сублингвальным путём, для местного применения, для введения интратрахеальным, интраназальным или ректальным путём, предпочтительно -пероральным путём.
Эти формы могут представлять собой флаконы с растворённым веществом или многодозовые флаконы либо таблетки без оболочки или покрытые оболочкой, драже, капсулы, мягкие или твёрдые желатиновые капсулы, гранулы, пилюли, таблетки, порошки, суппозитории или ректальные капсулы, растворы или суспензии либо кремы, гели, мази, пасты, пластыри, пищевые продукты, такие как йогурт, и др.
Более конкретно настоящее изобретение направлено на желудочно-устойчивые композиции, такие как пасты или желатиновые капсулы, преимущественно желудочно-резистентные желатиновые капсулы, содержащие композицию по изобретению.
Предпочтительно указанные композиции содержат эффективное количество композиции по изобретению.
Доза и/или дозировка могут варьироваться в широких пределах (от 0,5 мг до 1000 мг) и могут зависеть от способа введения, а также от возраста и массы тела субъекта.
Могут иметь место частные случаи, для которых подходящими дозами являются повышенные или пониженные дозы; такие дозы не выходят за рамки объёма изобретения. В соответствии с обычной практикой доза, подходящая для того или иного субъекта, определяется с учётом способа её введения, массы тела и реакции указанного субъекта, а также концентрации микроорганизмов в указанных композициях.
Пищевая композиция по изобретению может предпочтительно представлять собой пищевой продукт, функциональный пищевой продукт (нутрицевтик) или биологически активную добавку к пище.
Функциональные пищевые продукты или нутрицевтики определяются в большинстве случаев как традиционный пищевой продукт или продукт, который имеет внешний вид традиционного пищевого продукта, который является частью обычного рациона питания и который обладает характеристикой проявления полезного физиологического эффекта, выходящего за рамки его обычных питательных функций, или характеристикой снижения риска хронических заболеваний.
Таким образом, изобретение направлено на функциональные пищевые продукты, такие как йогурт, содержащие композицию по изобретению.
Указанная композиция может также служить биологически активной добавкой к пище (БАД) согласно Европейской директиве 2002/46/ЕС.
Указанная БАД преимущественно изготовляется в виде дозы, т.е. в презентационной форме, которая определяется Европейской директивой ЕС 2002/46/ЕС как "желатиновые капсулы, пастилки, таблетки, пилюли и другие подобные формы, а также пакетики с порошком, ампулы для инъекций, флаконы с капельницей и другие подобные формы жидких или порошкообразных препаратов, предназначенные для приёма в малых дозированных количествах.''''
Указанная композиция может быть также представлена как патентованное (промышленного изготовления) фармацевтическое средство, как его трактует Европейская директива 2001/83/ЕС.
Указанная композиция может использоваться для профилактики и/или лечения заболеваний, при которых пробиотики традиционно считаются полезными. В этой связи можно упомянуть, в первую очередь, остеопороз, сердечно-сосудистые заболевания, рак, болезни печени и нарушения обмена веществ, усталость, нарушения кровообращения, болезни суставов, симптомы менопаузы, расстройства центральной нервной системы, заболевания желудочно-кишечной системы, заболевания глаз, нарушения мочеполовой системы и нарушения функций простаты, такие как доброкачественная гипотрофия простаты, хронический простатит, простатодиния и рак простаты; расстройства питания, дерматологические и косметодерматологические заболевания, астения и утомляемость, гидроэлектролитический дисбаланс в период выздоровления и послеоперационный период, восстановление физического состояния и др.
Фармацевтические композиции по изобретению могут также включать один или несколько активных ингредиентов.
Настоящее изобретение относится также к медицинским наборам, содержащим композицию по изобретению. Поэтому указанная композиция может быть представлена как медицинский набор согласно Европейской директиве 93/42 EEC.
Краткое описание фигур
Фиг.1 показывает развитие лиофилизированных бактерий {Bifidobacterium longum) в идеальной среде и внутри комплекса пчелиной пыльцы/глины.
Фиг. 2 показывает процент прироста и потерь бактерий после прохождения в желудок для четырёх композиций, изготовленных в виде желудочно-резистентных капсул:
i) на подложке из пчелиной пыльцы/глины,
ii) продукт Bion Transit,
iii) продукт Lactibiane ref 2,5G,
iv) продукт Arkoprobiotics defense+.
Фиг. 3 показывает выживаемость лиофилизированных бактерий в желудочно-резистентных желатиновых капсулах после прохождения в желудок.
Фиг. 4 показывает реактивацию лиофилизированных бактерий, сочетанных с комплексом пчелиной пыльцы/глины в желудочно-резистентных желатиновых капсулах, после прохождения в желудок.
Фиг. 5 показывает прирост и потери бактерий с или без комплекса после прохождения в желудок и действия желчи и сока поджелудочной железы.
Фиг. 6 показывает синергетический эффект пчелиной пыльцы и глины на прирост количества бактерий в желудке, химусе, слизистой оболочке и кишечной жидкости.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение, однако не ограничивают его. В качестве исходных продуктов использовались известные продукты или продукты, изготовленные известными технологическими способами.
Процентное количество выражено в мас.%, если не указано иное.
Примеры
- Оборудование:
точные электронные весы - Mettler Toledo PG803
сушильный шкаф - WTB Binder
мешалка - IKA Labotechnik Euro star
рН-метр от HANNA Instruments
стеклянный лабораторный стакан на 250 мл - Вотех
изогнутые в форме ложки шпатели, нержавеющая сталь 18/8 - Labo-moderne
Поставщики сырья: замороженная пыльца подсолнечника в среде газообразного азота -от Pollenergie (La Grabere - 47450 St Hilaire de Lusignan,
Telephone 05 53 68 11 11 - Fax 05 53 68 11 12); монтмориллонитовая глина - от Argiletz (14 route d'Echampeau - 77 440 Lizy sur
Ourcq; Tel. 01 60 61 20 88 - Fax 01 60 61 27 39). Комплекс приготавливали следующим образом.
Для приготовления 150 г комплекса пчелиной пыльцы/глины процентная доля каждого из компонентов составила: глина - 66,66, пчелиная пыльца - 33,33 процента.
- Взвешивали 100 г глины в лабораторном стакане на 200 мл,
- взвешивали 50 г замороженной пчелиной пыльцы в лабораторном стакане на 250 мл,
- детали мешалки предпочтительно просушивали во избежание гидратации комплекса,
- перемешивали глину,
- добавляли пчелиную пыльцу и перемешивали глину с пыльцой в течение 30 секунд.
Требуемую гранулометрию получали путём просеивания смеси через сито с размером ячеек 500 мкм.
Композиции на основе пчелиной пыльцы/глины и микроорганизмов пробиотического назначения готовили следующим путём.
Для получения 166,67 г готового продукта с 10 % микроорганизмов
- взвешивали 100 г глины в лабораторном стакане на 200 мл,
- взвешивали 50 г замороженной пчелиной пыльцы в лабораторном стакане на 250 мл,
- взвешивали 16,67 г микроорганизмов в лабораторном стакане на 200 мл, детали мешалки предпочтительно просушивали во избежание гидратации комплекса,
- перемешивали глину,
- добавляли пчелиную пыльцу и перемешивали глину с пыльцой в течение 30 секунд,
- добавляли микроорганизмы и перемешивали смесь в течение 30 секунд. Требуемую гранулометрию получали путём просеивания смеси через сито с
размером ячеек 500 мкм.
Пример 1, демонстрирующий способность комплекса пчелиной пыльцы/глины обеспечивать питательную среду и реактивацию лиофилизированных бактерий
Потребность в обязательных ингредиентах для реактивации лиофилизированных бактерий сообщалась в литературе.
Эти ингредиенты (сахар, белки, натрий и др.) и их оптимальное количественное соотношение (потребность в %) для реактивации лиофилизированных бактерий показаны в первых двух колонках таблицы ниже. Третья колонка этой таблицы указывает процентное содержание этих различных ингредиентов в комплексе пчелиной пыльцы/глины.
Ингредиенты
Потребность, %
В подложке из пчелиной пыльцы/глины, %
Пептоны (гидролиз белка)
Белок
Дрожжи:
богатейший источник витамина В1 (12 мг/100 г), необходимого для углеводного и липидного обмена
6,6
от 6 до 13
Глюкоза
от 20 до 40 %
Тригидрат ацетата натрия
Натрий, обеспечиваемый глиной
Цитрат аммония
3,2
Обеспечиваемый глиной
Tween (солюбилизатор, необходимый для объединения несмешивающихся веществ)
1,6
Не использовался
Гидрофосфат калия
3,2
от 20 до 45 % золы
Гептагидрат сульфата магния
о,з
от 1 до 12 % золы
Тетрагидрат сульфата марганца
1,4 % золы *
Агар (полисахариды)
от 13 до 55 %
6,2
рН пыльцы
поддерживался на уровне рН 6,0 кислотой глины
Многие витамины, аминокислоты и ростовые факторы
Таким образом, установлено идеальное соотношение между обязательными элементами для реактивации лиофилизированных бактерий, о которых сообщалось в литературе, и элементами, содержащимися в подложке из пчелиной пыльцы/глины.
Развитие бактерий Bifidobacterium longum в идеальной питательной среде и в комплексе пчелиной пыльцы/глины было продемонстрировано следующим образом.
1. Одна часть бактерий высевалась на идеальную культуральную среду, а другая часть высевалась в эквивалентном количестве вместе с комплексом пчелиной пьшьцы/глины.
2. Подсчёт количества проводился в обоих из этих примеров.
Результаты, представленные на фиг. 1, показывают, что комплекс пчелиной пьшьцы/глины способствует реактивации и пролиферации бактерий.
Пример 2, демонстрирующий устойчивость комплекса пчелиной пыльцы/глины к кислотности по сравнению с коммерчески доступными продуктами Использовались следующие три коммерчески доступных продукта: Bion transit
Bion transit обеспечивает специфический пробиотический штамм Lactobacillus plantarum 299v.
Bion transit предназначен для лиц с чувствительным кишечником, у которых часто наблюдаются нарушения работы кишечника: дискомфорт, затруднения, проблемы с пищеварением, метеоризм, нерегулярный стул и др.
На упаковке продукта заявлено: количество пробиотиков в одной желатиновой капсуле составляет 10 ООО ООО ООО (10 миллиардов).
Lactibiane Reference 2,5G
Гарантируется, что пробиотические штаммы Lactibiane Reference 2,5G сертифицированы как GRAS (т.е. общепризнанны как безопасные) и депонированы в Национальной коллекции культур микроорганизмов Института Пастера. Это следующие четыре штамма:
Bifidobacterium longum LA 101
- Lactobacillus acidophilus LA 102 Lactococcus Lactis LA 103
- Streptococcus thermophilus LA 104
Lactibiane Reference 2,5G способствует поддержанию кишечной флоры, улучшает пищеварительный комфорт и регулирует кишечный транзит с первой недели приёма. Продукт может служить вспомогательным средством в случае расстройств пищеварения (метеоризм и др.) и для предупреждения зимних сезонных расстройств.
На упаковке продукта заявлено: количество пробиотиков в одной желатиновой капсуле составляет 10 ООО ООО ООО (10 миллиардов). Arkoprobiotics defenses +
Arkoprobiotics defenses + содержит отобранные с помощью селекции и высушенные лиофильной сушкой пробиотики, происходящие от нескольких штаммов:
- Lactobacillusparacasei
- Lactobacillus plantarum
- Lactobacillus rhamnosus
Arkoprobiotics defenseu+ может служить вспомогательным средством для укрепления природных защитных механизмов организма особенно в зимнее время и межсезонье, а также для восстановления баланса кишечной флоры. Продукт содействует равновесию жизненных сил организма.
На упаковке продукта заявлено: количество пробиотиков в одной желатиновой капсуле составляет 50 ООО ООО ООО (50 миллиардов).
Порядок выполнения операций
Желудочно-резистентные желатиновые капсулы, содержащие комплекс пчелиной пыльцы/глины или бактериальные штаммы коммерчески доступных продуктов, получали с применением готового набора для изготовления желудочно-резистентных желатиновых капсул от ApproPharm (254 chemin de la Farlede - 83500 La Seyne sur Mer).
Порядок выполнения операций для формирования покрытия следующий.
• Желатиновые капсулы, заполненные комплексом пчелиной пьшьцы/глины или коммерчески доступных продуктов, замачивают на 10 секунд в жидкости.
• Дают им просохнуть на сите при частом перемешивании во избежание слипания.
• Ждут 10 минут и затем добавляют второй слой: замачивают желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дают им просохнуть, как указано выше.
• Ждут 10 минут и затем добавляют третий слой: замачивают желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дают им просохнуть, как указано выше.
• Ждут 10 минут и затем добавляют четвёртый слой: замачивают желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дают им просохнуть, как указано выше.
• Ждут 10 минут и затем добавляют пятый слой: замачивают желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дают им просохнуть, как указано выше.
•
Далее проводили тесты, чтобы удостовериться в устойчивости желатиновых капсул к кислой среде. Они показали отличную устойчивость к кислой среде: капсулы не разрушились спустя период времени 4 часа.
Условия эксперимента
Изготовленные, как описано выше, желудочно-резистентные желатиновые капсулы подвергали следующим условиям эксперимента. Желатиновые капсулы
• помещали в 500 мл (объём желудка натощак)
• кислотного раствора с рН 2 (кислотность содержимого желудка),
• выдерживали в сушильном шкафу, имеющем температуру 37°С (температура тела),
• в течение общего периода времени 4 часа (продолжительность транзита в в желудке)
• при механическом перемешивании (сжатие желудка).
К концу эксперимента желатиновые капсулы оставались целыми (без признаков разрушения желатиновой капсулы, вызывающего распыление её содержимого), но становились более проницаемыми. Содержимое желатиновых капсул выделяли и подвергали анализу с подсчётом молочнокислых бактерий.
Подсчёт молочнокислых бактерий
Подсчёт молочнокислых бактерий проводился Советом QSA (по качеству и безопасности питания) [Site d'Agropole - BP 125 - 47931 Agen Cedex 9].
Подсчёт молочнокислых бактерий, присутствующих в комплексе пчелиной пьшьцы/глины внутри желудочно-резистентных желатиновых капсул, перед началом процесса пищеварения показал 60000 КОЕ/грамм. После процесса пищеварения комплекс пчелиной пыльцы/глины имел нагрузку молочнокислых бактерий порядка 80000 КОЕ/грамм.
В случае коммерчески доступных продуктов, помещённых в желудочно-резистентные желатиновые капсулы без указанного комплекса, подсчёт молочнокислых бактерий после процесса пищеварения показал следующее:
Bion Transit 40 КОЕ/г
Lactibiane reference 2,5G 190 000 КОЕ/г
Arkoprobiotics defenses^- 40 000 КОЕ/г.
Изменения количества бактерий в комплексе пчелиной пыльцы/глины и в трёх коммерчески доступных продуктах в процессе пищеварения показаны на фиг. 2. Коммерчески доступные продукты в желудочно-резистентных желатиновых капсулах показали реактивацию менее 1% бактерий. Подложка из пчелиной пьшьцы/глины в желудочно-резистентных желатиновых капсулах даёт возможность увеличить нагрузку бактерий на 33% в процессе пищеварения.
Пример 3. Влияние комплекса пчелиной пыльцы/глины на реактивацию лиофилизированных бактерий
1) Приготовление партий
- только лиофилизированных бактерий (чистые коммерчески доступные штаммы) против
- тех же лиофилизированных бактерий, но введённых в комплекс пчелиной пьшьцы/глины.
В каждую партию было введено одинаковое количество микроорганизмов, независимо от количества и/или галеновой формы контрольного продукта (от 1 ООО ООО до 2 ООО ООО).
Лиофилизированные бактерии, сочетанные с комплексом пчелиной пьшьцы/глины, получали следующим путём.
К комплексу добавляли объём лиофилизированных бактерий, соответствующий количеству от 1 ООО ООО до 2 ООО ООО. Смесь доводили до гомогенного состояния с помощью мешалки в течение 30 секунд.
2) Желудочно-резистентные желатиновые капсулы изготовляли по процедуре, описанной в примере 2.
3) Затем желатиновые капсулы подвергали следующим условиям эксперимента. Желатиновые капсулы
• помещали в 500 мл (объём желудка натощак)
• кислотного раствора с рН 2 (кислотность содержимого желудка),
• выдерживали в сушильном шкафу, имеющем температуру 37°С (температура тела),
• в течение общего периода времени 4 часа (продолжительность транзита в в желудке)
при механическом перемешивании (сжатие желудка).
Подсчёт молочнокислых бактерий проводился до и после экспериментов Независимой лабораторией микробиологического анализа, аккредитованной COFRAC (Французский комитет по аккредитации) по программе 59 (Микробиологический анализ сельскохозяйственной продукции), в рамках утверждённого договора № 1344.
Получены следующие результаты.
1. Образцы без комплекса пчелиной пьшьцы/глины
Лиофилизированные бактерии коммерчески доступных продуктов перед введением их в желатиновые капсулы, перед прохождением в желудок (этапы 2 и 3 протокола не выполнялись):
- лиофилизированные бактерии перед прохождением в желудок:
Bifidobacterium longum 800 КОЕ/г
Lactobacillus acidophilus 41 ООО ООО КОЕ/г
Bifidobacterium bifidum 75 ООО ООО КОЕ/г.
- лиофилизированные бактерии коммерчески доступных продуктов, заключённые в желудочно-резистентные желатиновые капсулы, после прохождения через желудок (этапы 1, 2 и 3 протокола):
Bifidobacterium longum 40 КОЕ/г
Lactobacillus acidophilus 160 ООО КОЕ/г
Bifidobacterium bifidum 32 ООО КОЕ/г.
Далее рассчитывался процент прироста или потерь молочнокислых бактерий после прохождения через желудок. Он приводится для каждого вида бактерий на фиг. 3.
2. Образцы, сочетанные с комплексом пчелиной пыльцы/глины Лиофилизированные бактерии, сочетанные с комплексом, перед заключением их в
в желатиновые капсулы, перед прохождением в желудок (этапы 2 и 3 протокола не выполнялись):
Bifidobacterium longum 1 900 000 КОЕ/г
Lactobacillus acidophilus 1 800 000 КОЕ/г
Bifidobacterium bifidum 1 100 000 КОЕ/г.
Лиофилизированные бактерии, сочетанные с комплексом, заключённые в желудочно-резистентные желатиновые капсулы, после прохождения через желудок (стадии 2 и 3 способа не проводились):
Bifidobacterium longum 7 400 000 КОЕ/г
Lactobacillus acidophilus 2 600 000 КОЕ/г
Bifidobacterium bifidum 2 600 ООО КОЕ/г.
Далее рассчитывался процент прироста или потерь молочнокислых бактерий после прохождения через желудок. Он приводится для каждого вида бактерий либо чистых, либо сочетанньгх с комплексом пчелиной пыльцы/глины на фиг. 4.
Комплекс пчелиной пыльцы/глины, заключённый в желудочно-резистентные желатиновые капсулы, позволяет увеличить количество лиофилизированных пробиотических бактерий в процессе пищеварения.
Лиофилизированные пробиотики в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул теряют по меньшей мере 95 % бактерий в процессе пищеварения.
Эти результаты показывают, что
•S пролиферативный эффект, индуцируемый бактериями комплекса пчелиной пыльцы/глины на бактерии, содержащиеся от природы в свежей пыльце, может распространяться и на лиофилизированные бактерии;
S комплекс пчелиной пыльцы/глины является оптимальной подложкой для реактивации лиофилизированных пробиотиков;
S комплекс пчелиной пьшьцы/глины используется в качестве подложки для пролиферации, заселения и, следовательно, для введения пробиотиков.
Пример 4. Исследование в кишечнике
Доказательство того, что бактерии, достигающие кишечника, не разрушаются под действием различных секретируемых соков и что они прилипают к слизистой оболочке кишечника, является важной проблемой и представляет научный и промышленный потенциал.
В действительности, когда пробиотики достигают кишечника, где они проявляют своё оздоровительное действие, им приходится выдерживать увеличение рН между желудком и двенадцатиперстной кишкой и противостоять действию желчных солей и панкреатических ферментов при адгезии к кишечной стенке с тем, чтобы они смогли взаимодействовать с подложкой в зависимости от специфичности бактерий.
Настоящее изобретение имело целью проведение оценки
- устойчивости пробиотиков к изменениям рН (желудочного и кишечного рН) и различным жидкостям (желчные соли и панкреатические ферменты), адгезии пробиотиков к кишечной стенке. Поэтому исследование включало два эксперимента:
исследование искусственной среды, дающей возможность измерить устойчивость пробиотиков к физиологическому изменению рН и к ферментативным воздействиям на пути из желудка в двенадцатиперстную кишку: оно в некоторой степени завершает на кишечном уровне предыдущие исследования, в ходе которых изучалась устойчивость пробиотиков к желудочной среде (и результаты которых упоминались ранее);
ex-vivo исследование на эксплантатах кишечника для измерения как выживаемости пробиотиков в просвете кишечника, так и их адгезии к слизистой оболочке кишечника.
ПРОТОКОЛ
1. Тестируемые образцы
Образцами, тестируемыми в ходе настоящего исследования, служили только глина только пыльца
один вид пробиотика (Bifidobacterium longum) комплекс пчелиной пьшьцы/глины комплекс пчелиной пьшьцы/глины + пробиотики продукты Bion, Lactibiane, Arkoprobiotics. Одновременно с указанными образцами параллельно готовился контроль (солевой раствор).
Для обеспечения однородности все образцы помещали в желатиновые капсулы размера 1, которые хранились при 4°С.
Примеры 1-3 показали, что введение коммерчески доступных пробиотиков типа Bifidobacterium longum в желудочно-резистентные желатиновые капсулы не даёт никаких преимуществ в плане их выживаемости по сравнению с использованием обычных желатиновых капсул; только образцы, включавшие комплекс пчелиной пьшьцы/глины и комплекс пчелиной пыльцы/глины, сочетанный с пробиотиками, упаковывались в желудочно-резистентные капсулы согласно описанному ниже протоколу.
• Замочить желатиновые капсулы, заполненные комплексом пчелиной пьшьцы/глины с или без пробиотиков, на 10 секунд в жидкости.
• Дать им просохнуть на сите при частом перемешивании во избежание слипания.
•
• Подождать 10 минут и затем добавить второй слой: замочить желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дать им просохнуть, как описано ранее.
• Подождать 10 минут и затем добавить третий слой: замочить желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дать им просохнуть, как описано ранее.
• Подождать 10 минут и затем добавить четвёртый слой: замочить желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дать им просохнуть, как описано ранее.
• Подождать 10 минут и затем добавить пятый слой: замочить желатиновые капсулы на 5 секунд в растворе, после чего дать им просохнуть, как описано ранее.
2. Имитирование in vitro желудочной фазы
Все образцы подвергали процедуре примера 2.
В желудке образцы подвергаются действию многих физиологических параметров, которые были воспроизведены следующим образом:
образцы разбавляли в 500 мл (объём желудка натощак) кислотного раствора с рН 2 (кислотность содержимого желудка), выдерживали в сушильном шкафу с температурой 37°С (температура тела) при общей продолжительности четыре часа (время транзита через желудок) в условиях перемешивания (сжатие желудка). После инкубации
- в случае комплекса пчелиной пыльцы/глины, сочетанного с Bifidobacterium longum, содержимое указанных желатиновых капсул анализировали с микробиологической точки зрения;
- в случае не желудочно-резистентных желатиновых капсул желудочную жидкость также анализировали с микробиологической точки зрения;
- 62,5 мл экстракта желчи и сока поджелудочной железы добавляли к желудочной жидкости. Образец этой жидкости (кишечный химус) анализировали с микробиологической точки зрения.
3. Переход от желудочного рН к кишечному рН
По прошествии четырёх часов инкубации 62,5 мл раствора, состоящего из 0,2 М раствора бикарбоната натрия с 1,2 % желчного экстракта и 0,2 % сока поджелудочной железы, добавляли к желудочной жидкости.
4. Исследования на эксплантатах: подготовительное исследование 4.1. Выбор животной модели
В качестве животной модели была выбрана свинья, поскольку физиология пищеварения у этого животного максимально близка к физиологии пищеварения у человека: желудочно-кишечный тракт свиньи схож с человеческим с точки зрения структуры (Heinz etal, 1987, J. Gen. Virol. 68, 2495-2499).
4.2. Извлечение кишечника свиньи
Извлечённые кишечники после убоя животных, предназначенных в пищу (т.е. без патологии), помещали в физиологический раствор. Раствор состоял из дистиллированной воды и хлорида натрия (NaCl), разбавленного до 9/1000 [= 0,9 % (масса/объём) раствор NaCl, т.е. 9 г/л]. До использования он содержал 154 мэкв./л Na+ и СГ. Затем промывали кишечник раствором Рингера.
Готовили продольные сегменты размером 6 см х 27 см двенадцатиперстной и тощей кишок и хранили их в растворе Рингера.
5. Имитирование кишечной фазы
Для наблюдения за адгезией микробактерий к слизистой оболочке кишечника был разработан аппарат, позволяющий имитировать процесс пищеварения на эксплантатах кишечника свиньи со следующими параметрами.
Содержимое желудочного химуса с установленным требуемым рН помещали в одну из ёмкостей из нержавеющей стали (на 700 мл). Содержимое непрерывно перемешивали с помощью пропеллерной мешалки (20 оборотов в минуту) с тем, чтобы имитировать движения (перистальтику?) желудка и кишечника.
Кишечники свиней помещали на пластины, имеющие следующие характеристики:
- наклонные (11°) пластины из нержавеющей стали размером 6,8 см х 22 см, покрытые гибкой и зубчатой мембраной, позволяющей моделировать перистальтику. Это движение производится с помощью ленточного транспортёра при скорости 0,5 см/минуту.
Затем кишечник размещали на пластине. При надлежащем размещении кишечника на пластине запускали ленточный транспортёр и поток кишечной жидкости приводился в движение, общая продолжительность которого составляла 2 часа при следующих условиях:
свиной кишечник поддерживался при постоянной температуре 37°С, гигрометрия регулировалась (80%) таким образом, чтобы свиной кишечник не высыхал,
внутренняя атмосфера в камере состояла из 95 % азота (N2) и 5 % воздуха, свиной кишечник содержался в темноте во время экспериментальной фазы.
6. Измерения
Спустя 2 часа кишечники
- удаляли с пластин,
разрезали на поперечные фрагменты,
наблюдали под микроскопом и делали соскоб, чтобы произвести микробиологический подсчёт.
Жидкость, прошедшую через кишечник и собранную в лотки, подвергали анализу с микробиологической точки зрения.
Жидкость до прохождения через кишечник также анализировали с микробиологической точки зрения. Микробиологический анализ молочнокислой флоры выполняли на образцах (NF ISO 15214).
Результаты, относящиеся к микробиологическим подсчётам перед, в процессе и после прохождения через кишечник, переводили в колониеобразующие единицы/грамм (КОЕ/г). Это позволяет сравнивать различные уровни и провести оценку возможной пролиферации. Учитывали отношения площадей поверхности анализируемых кишечников к общей площади поверхности кишечника.
Проводили оценку морфологии клеток. Оценивали также целостность пыльцевого
зерна.
Результаты и их обсуждение
Целью настоящего исследования была оценка устойчивости пробиотиков к кислотности желудочного сока и к повышению рН в процессе транзита, их контакта с желчными солями и панкреатическими ферментами, их выживаемости в различных кишечных жидкостях и оценка их адгезии к кишечной стенке..
1. Оценка выживаемости пробиотиков в желудочной фазе
Примеры 1-3 показали, что процесс пищеварения не позволяет бактериям выживать, если они не сочетаны с комплексом пчелиной пыльцы/глины.
В таком же физиологическом контексте комплекс пчелиной пьшьцы/глины способствует увеличению количества введённых пробиотиков. Бионагрузка увеличивается в присутствии комплекса, тогда как без защиты комплексом пробиотики (Bifidobacterium longum) почти все погибают.
Таким образом, прохождение в желудок рассматривается как фактор, благоприятствующий пролиферации бактерий, если они защищены комплексом. При контакте с водой, содержащейся в желудке, желудочно-резистентная желатиновая капсула
становится проницаемой, вода проникает внутрь и обеспечивает ту влажность, в которой бактерии нуждаются для своей реактивации и начала фазы пролиферации, при условии, что бактерии, как и в случае с комплексом, имеют достаточный питательный резерв.
Эта критическая стадия реактивации и пролиферации внутри комплекса является главной центральной линией в пробиотической активности комплекса.
2. Оценка выживаемости пробиотиков при контакте с желчными солями и соком поджелудочной железы
Кислотность желудочного сока и секреция желчи и сока поджелудочной железы являются основными эндогенными механизмами для реактивации введённых в организм пробиотических бактерий.
Комплекс способствует развитию intra corpus (внутри тела) новых бактерий уже на стадии желудочной фазы, которое даже усиливается в процессе контакта с желчными солями и соком поджелудочной железы. Подсчёт количества флоры, содержащейся в кишечной жидкости, перед прохождением в кишечник дало возможность определить роль комплекса в выживаемости пробиотиков при контакте с желчью и соком поджелудочной железы. Даже больше чем только в выживаемости: пролиферация пробиотиков продолжается и усиливается.
Полученные результаты показывают, что без указанного комплекса в кишечной жидкости сохраняются 78 750 пробиотиков (Bifidobacterium longum). При использовании комплекса, содержащего бактерии, насчитывается 101 250 ООО пробиотиков. Т.е. фактор увеличения составляет 46, соответственно > 100 ООО ООО 600, по сравнению с тестируемыми коммерчески доступными продуктами без указанного комплекса (Bion, Lactibiane, Arkoprobiotics, соответственно).
Помимо факта поддержания молочнокислых бактерий в жизнеспособном состоянии, комплекс пчелиной пыльцы/глины позволяет этим бактериям развиваться в в кишечной жидкости.
Даже более того: в то время как выживаемость и пролиферация в желудочной среде является существенно важным и определяющим признаком, феномен устойчивости и пролиферации intra corpus возрастает при контакте с желчью. Таким образом, между концом желудочной фазы и началом кишечной фазы наблюдается увеличение на фактор 7,79.
Эти результаты указывают на то, что комплекс не только защищает бактерии, но и обеспечивает их последующее развитие.
Как показано на фиг. 5, после прохождения через желудок фактически остаётся только 0,05 % от начального количества пробиотиков да и те претерпевают действие желчи и панкреатических ферментов, если эти пробиотики не защищены. С другой стороны, в таких же условиях те же самые пробиотики в случае включения их в комплекс показывают прирост 1165,63 %.
Эти результаты показывают, что комплекс пчелиной пыльцы/глины защищает бактерии в процессе пищеварения как от кислотности желудочного сока, так и от желчных солей и сока поджелудочной железы и способствует их развитию.
3. Оценка пробиотиков, присутствующих в кишечной жидкости, собранной
в конце потока
Также важным является наблюдение за бионагрузкой, содержащейся в кишечной жидкости, которая продолжает свой путь через кишечник и толстую кишку.
Полученные результаты показывают, что бионагрузка, содержащаяся в кишечной жидкости, собранной в конце потока, составляет 77 миллионов бактерий, сочетанных с комплексом. Без комплекса в кишечной жидкости содержалось только 3,4 миллиона бактерий, т.е. меньше в 22,65 раза.
Комплекс также даёт возможность сохранить соответственно в 23, 424 и 636 раз больше бактерий, чем коммерчески доступные продукты (Bion, Lactibiane и Arkoprobiotics соответственно).
4. Оценка адгезии комплекса к слизистой оболочке кишечника
Другой определяющий момент исследования относится к адгезии комплекса и бактерий к слизистой оболочке кишечника. Для оказания полезного действия на слизистую оболочку пробиотики должны прилипнуть к ней.
4.1. Микроскопическая оценка
Фотографии были сделаны перед и после кишечной фазы исследования, т.е. в начале и конце потока кишечной жидкости, содержащей комплекс с Bifidobacterium longum. Установлено высокозначимое различие между слизистой оболочкой в начале и конце потока. Фактически похожий на апельсин покровный слой виден по всей поверхности кишечника, контактирующей с кишечной жидкостью. Фотографии показывают без всякого сомнения жёлтую окраску, характерную для наличия пыльцы, высвободившейся в это время из своей глиняной "мантии".
Это визуальное наблюдение, по-видимому, подтверждает
присутствие комплекса на кишечной стенке, несмотря на поток и связанное с ним механическое усилие,
способность комплекса отделяться in situ.
Наблюдение кишечника под микроскопом даёт возможность увидеть чёткую картину раздельного присутствия глины и пыльцы (окружённой или не окружённой своей глиняной "мантией").
При большем увеличении можно увидеть в слизистой оболочке пыльцевые зёрна с их глиняной "мантией", но также и пыльцевые зёрна, очистившиеся от своей глиняной структуры, что демонстрирует способность пыльцевых зёрен к освобождению от глиняного покрытия. Зёрна, которые не высвободились на этой стадии, могут все высвободиться по мере продвижения через кишечник.
Эти наблюдения указывают на то, что связи между пыльцой и глиной могут разрушаться в кишечнике и высвобождать бактерии и содержимое пыльцы. Если некоторые из пыльцевых зёрен всё ещё покрыты глиной, то они могут продолжать свой путь в кишечнике и постепенно разъединяться при движении вдоль пищеварительного тракта.
4.2. Микробиологическая оценка
Вследствие неоднородности (гетерогенности) свиных кишечников анализ микробиологических данных проводился на основе среднего значения подсчитанных количеств на трёх добавленных сегментах к поверхности исследуемого кишечника.
В конце потока кишечной жидкости через кишечник (окончание процесса пищеварения) бионагрузка, содержащаяся в слизистой оболочке кишечника, образцы которой получали соскобом со слизистой, составила 582650 КОЕ/г в случае лиофилизированных бактерий (Bifidobacterium longum) против 5 160 ООО, когда последние были введены в комплекс. Следовательно, при использования комплекса пчелиной пьшьцы/глины в качестве вектора в слизистой оболочке кишечника обнаружилось в 9 раз больше бактерий. Комплекс даёт возможность увеличения количества бактерий в слизистой оболочке кишечника соответственно в 69, 301 и 818 раз по сравнению с коммерчески доступными продуктами (Lactibiane, Bion и Arkoprobiotics, соответственно).
В жидкости, собранной после прохождения через кишечник, соотношение между бактериями, присутствующими в комплексе, и бактериями без указанного комплекса было выше более чем в 22 раза. Такое различие между обоими соотношениями объясняется тем фактом, что весьма значительная бионагрузка кишечной жидкости при использовании
комплекса в качестве подложки для пробиотиков приводит к насыщению слизистой оболочки кишечника микроферментами.
Кроме того, это позволяет бактериям, содержащимся в кишечной жидкости (и тем, которые продолжат размножаться впоследствии на пути перемещения по кишечнику), колонизировать последующие участки пищеварительного тракта.
Таким образом, комплекс пчелиной пьшьцы/глины является благоприятным фактором, содействующим адгезии пробиотиков к слизистой кишечника.
4.3. Оценка отпечатков
Молочнокислая флора показывает улучшенную адгезию, когда она связана с комплексом. Наблюдается также периферическое действие на общую флору. В дополнение к преимуществам комплекса для молочнокислой флоры он, по-видимому, влияет на контроль общей флоры, причём последняя становится значительно менее плотной в присутствии комплекса.
Развитие общей флоры выглядит совершенно по-разному на отпечатках кишечного сегмента без или с комплексом. Только бактерии Bifidobacterium longum генерируют отпечатки с очень значительным ростом общей флоры (не поддаётся подсчёту на отпечатке). С другой стороны, при использовании комплекса, сочетанного с бактериями Bifidobacterium longum, развивается очень мало колоний (от 10 до 20). И, наоборот, наблюдается значительный рост молочнокислой флоры. Это означает, что флора, которая вселяется (т.е. пробиотики), будет фактически конкурировать с общей флорой на слизистой оболочке кишечника, куда она вселяется в ущерб последней: это именно то, что требуется от использования пробиотиков.
Таким образом, общие выводы по результатам, упомянутым в параграфах 2-4 этой части, следующие:
комплекс способствует выживанию пробиотиков в условиях воздействия желчи и соков поджелудочной железы;
более того, он содействует весьма интенсивному размножению этих пробиотиков, причём последние адаптируются к такой среде;
комплекс способствует адгезии этих пробиотиков к слизистой оболочке кишечника;
пыльца может постепенно отделяться из комплекса с высвобождением
бактерий;
очень большое количество образовавшейся флоры и её высокая жизнеспособность способствуют её "укоренению" в местной флоре.
5. Оценка синергии ингредиентов комплекса пчелиной пьшьцы/глины Среди образцов, использованных в настоящем исследовании, один включал только глину, другой - только пчелиную пыльцу. Поэтому стало возможным оценить преимущество комплекса путём сравнения ожидаемого эффекта (полученного расчётным путём, взвешиванием), эффекта отдельно взятых компонентов и результатов, полученных в исследовании. Оценка показала, что синергетический эффект наблюдается.
СО ГО
Кишечные жидкости
КОЕ/г
3 080 ООО
108 900
57 750
3 246 650
77 000 000
го" CN
о о
0,14%
0,08%
4,22%
100%
+ 2,271%
Слизистая оболочка
КОЕ/г
582 650
174 580
118 250
875 480
5 160 000
irf X
11,29%
3,38%
2,29%
16,97%
100%
+ 489%
Химус
КОЕ/г
78 750
30 375
109 125
101 250 000
х 927,8
0,08%
0,03%
0,00%
0,11%
100%
92,600%
Желудок
КОЕ/г
13 000 000
0,00%
0,00%
0,00%
0,00%
100%
Bifidobacterium longum (BL)
Глина
Пыльца
Комплекс + BL (оценочное общее значение)
Комплекс + BL (результаты)
Синергетический эффект
Следовательно, в связи с этим можно наблюдать синергетический эффект комплекса на всех стадиях:
синергетическое действие пчелиной пыльцы и глины на прирост бактерий в желудке, химусе, слизистой оболочке, кишечной жидкости показано на фиг. 6;
комплекс способствует увеличению количества молочнокислых бактерий на 92,683 % в химусе, на 489 % в слизистой оболочке кишечника и на 2,271 % в кишечной жидкости по сравнению с оценочными данными.
Эти результаты, полученные ex-vivo на кишечнике свиньи, позволили провести оценку устойчивости пробиотиков к кислотности желудочного сока и росту рН в процессе транзита и при контактировании с желчными солями и соками поджелудочной железы и их выживаемости в различных кишечных жидкостях, а также их адгезии к кишечной стенке.
Полезный вклад комплекса пчелиной пыльцы/глины был показан на всех этапах пищеварительной фазы. Выводы
Во время желудочной фазы комплекс пчелиной пьшьцы/глины, изготовленный в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул, делает возможной реактивацию сочетанных с ним бактерий. Он является оптимальным выбором для реактивации и пролиферации "новых" молочнокислых бактерий.
Во время кишечной фазы комплекс на первом этапе вступает в контакт с желчью и соком поджелудочной железы, не оказывая при этом влияния на жизнеспособность клеток, поскольку в противном случае способность к пролиферации сохраняется и возрастает.
При транзите через кишечник комплекс легко прилипает к слизистой оболочке. Микроскопические наблюдения показывают, что пыльцевые зёрна высвобождаются из своей глиняной "мантии", выпуская цитоплазму in situ. Подсчёт количества бактерий на слизистой оболочке кишечника позволяет утверждать, что комплекс фактически высвобождает свою бионагрузку в кишечнике - как в кишечную стенку, так и в поток в просвете кишечника. Основное полезное преимущество, отличающее комплекс, состоит в синергетическом действии определённых свойств, присущих его компонентам, таких как поглотительная способность глины. Поэтому вклад пыльцы в питательную ценность завершается её способностью противостоять необратимой адсорбции бактерий глиной.
Увеличение числа пробиотиков на поверхности слизистой оболочки кишечника также играет роль в общей флоре, развитие которой снижается.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция, включающая один или несколько видов микроорганизмов пробиотического назначения, добавленных к комплексу на основе пчелиной пыльцы и глины.
2. Композиция по п.1, в которой указанные микроорганизмы являются лиофилизированными.
3. Композиция по п.1 или 2, в которой указанные микроорганизмы выбираются из молочнокислых бактерий.
4. Композиция по п. 1, 2 или 3, в которой указанные микроорганизмы выбирают из бактерий рода Bifidobacterium spp. и рода Lactobacillus spp.
5. Композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая
- от 0,1 % до 70 % лиофилизированных микроорганизмов и
- от 30 % до 99,9 % указанного комплекса (под процентами имеются в виду мас.%).
6. Композиция по любому из предшествующих пунктов, содержащая
- от 3 % до 30 % лиофилизированных микроорганизмов и
- от 70 % до 97 % указанного комплекса (под процентами имеются в виду мас.%).
7. Композиция по любому из предшествующих пунктов, в которой указанный комплекс включает
- от 20 % до 40 % пчелиной пьшьцы и
- от 60 % до 80 % глины.
8. Композиция по любому из предшествующих пунктов, представляющая собой порошок.
9. Композиция по любому из предшествующих пунктов, представляющая собой желудочно-резистентную композицию.
10. Композиция по п. 9 в виде желудочно-резистентных желатиновых капсул.
11. Способ приготовления композиции по любому из предшествующих пп. 1-10, предусматривающий:
- смешивание пчелиной пьшьцы с глиной,
- добавление и смешивание с микроорганизмами.
12. Пищевая, косметическая и/или галеновая композиция, включающая композицию по любому из предшествующих пп. 1-10.
13. Пищевая композиция по п. 12, которая является пищевым продуктом, функциональным пищевым продуктом или биологически активной добавкой к пище.
14. Фармацевтическая композиция, включающая композицию по любому из предшествующих пи. 1-10.
15. Фармацевтическая композиция по п. 14 для повышения биодоступности и/или активности микроорганизмов пробиотического назначения.
16. Применение комплекса на основе пчелиной пьшьцы и глины для повышения биодоступности и/или активности микроорганизмов пробиотического назначения.
12.
12.
200000
g 150 000
о 100000 +
ш н о ф т
ц о
Идеальная среда
Комплекс пчелиной пыльцы/глины
^ Подсчитанное количество перед прохождением в желудок
[] Подсчитанное количество после прохождения в желудок
Н Прирост или потери (%) бактерий после прохождения в желудок
75000000'
600000О0-45000000-
зооооооо.
150000О0-
1 ооооооЫ-
210000^ 160000 110000 60000
юоодХ-
1000^ 800 600 400 200
h 100 80 60
40 I 20 ё
Bifidobacterium Lactobacillus Bifidobacterium longum acidophilus bifidum
0 -20 -40 -60
Q- о о
-sol
¦-100
Фиг. 3
800000т 700000600000 500000400000 -300000 2000004100000
Ц Подсчитанное количество перед прохождением в желудок
Q Подсчитанное количество после прохождения в желудок
Ц Прирост или потери (%) бактерий после прохождения в желудок
> s s
Q. Ф
TO Ю
CL Ф I-
o с
- 400
- 300
- 200
- 100
о о о.
т Я о
Bifidobacterium longum
Lactobacillus Bifidobacterium acidophilus bifidum
- -100
Фиг. 4
ш О
о. Ф
о ш
<3
ф т
101 250 000
8 ООО ООО
78 750
101 м
100
¦ 40
¦20
> s х о. ф I-
го ю
§|§
Комплекс + бактерии Bifidobacterium longum
о т > > Ф
ГС 5
I ф
ф с о о с
о ф
> s о I
о о
о* ш
Ш С
ТОЛЬКО
бактерии Bifidobacterium longum
-20 -40 -60
¦-80
-100
Фиг. 5
I Ожидаемые сводные результаты | Измеренный эффект комплекса
Фиг. 6
1/5
1/5
1/5
1/5
2/5
2/5
2/5
3/5
3/5
4/5
4/5
4/5
