[RU]

В заявке описаны биспецифические антитела против человеческого TWEAK и человеческого IL17 (биспецифические антитела к TWEAK-IL17), способы их получения и фармацевтические композиции, которые содержат указанные антитела, и их применения.

(57) Реферат / Формула:

В заявке описаны биспецифические антитела против человеческого TWEAK и человеческого IL17 (биспецифические антитела к TWEAK-IL17), способы их получения и фармацевтические композиции, которые содержат указанные антитела, и их применения.

---

121478
Заявка № 201401077
Заявитель Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ, СН
БИСПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ TWEAK И ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ IL17 И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к биспецифическим антителам к человеческому TWEAK и человеческому IL17 (биспецифические антитела к TWEAK-IL17), способам их получения, фармацевтическим композициям, содержащим указанные антитела, и их применениям.
Предпосылки создания изобретения
Человеческий TWEAK (UniProtKB 043508, TNF-подобный слабый индуктор апоптоза; SEQ ID NO: 68) представляет собой ассоциированный с клеточной поверхностью трансмембранный белок типа II. TWEAK описан у Chicheportiche Y. и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 32401-32410; Marsters S.A. и др., Curr. Biol. 8, 1998, сс. 525-528; Lynch C.N. и др., J. Biol. Chem. 274, 1999, cc. 8455-8459. Активная форма TWEAK представляет собой растворимый гомотример. Установлено, что последовательности связывающихся с рецептором доменов человеческого и мышиного TWEAK идентичны на 93%. TWEAK
рецептор Fnl4 (индуцируемый фактором роста фибробластов белок, 14 кДа) представляет собой состоящий из 129 аминокислот (ак) трансмембранный белок типа I, лигандсвязывающий домен которого состоит из одного индивидуального богатого цистеином домена, SEQ ID NO: 98). Передача сигналов TWEAK происходит посредством активации пути NF-KB. мРНК TWEAK экспрессируется в различных тканях, и она обнаружена в большинстве основных органов типа сердца, головного мозга, скелетной мышцы и поджелудочной железы, в тканях, связанных с иммунной системой, типа селезенки, лимфатических узлов и тимуса. мРНК Fnl4 обнаружена в сердце, головном мозге, легком, плаценте, эпителиальных клетках (ЭК) сосудов и гладкомышечных клетках. Мыши, у которых "выключены" TWEAK (TWEAK-нуль) и Fnl4 (Fnl4-Hyub), являются жизнеспособными, здоровыми и фертильными, они характеризуются более высоким содержанием естественных клеток-киллеров и для них характерен повышенный врожденный воспалительный ответ. TWEAK принимает участие в апоптозе, пролиферации, ангиогенезе, он присутствует в области "ишемической полутени", обнаружен при церебральном отеке, рассеянном склерозе.
Антитела к TWEAK упоминаются в WO 1998/005783, WO 2000/042073, WO 2003/086311, WO 2006/130429, WO 2006/130374, WO 2006/122187, WO 2006/089095, WO 2006/088890, WO 2006/052926.
Человеческий IL-17A (CTLA-8, Swiss Prot Q16552, другое название IL-17 или IL17; SEQ ID NO: 70)) представляет собой провоспалительный цитокин, который продуцируется субпопуляцией Т-клеток памяти (которые обозначают как ТЫ 7), участвующий в патогенезе рассеянного склероза (PC). IL-17A играет роль в индукции других провоспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии. Обработка животных нейтрализующими IL-17A антителами снижала коэффициент заболеваемости аутоиммунным энцефаломиелитом и его серьезность (Komiyama Y. и др., J. Immunol. 177, 2006, сс. 566-573). Обнаружена сверхэкспрессия IL-17A в спинномозговой жидкости страдающих PC пациентов (Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc. 42-50; Matusevicius D. и др., Multiple Sclerosis 5, 1999, cc. 101-104; WO 2005/051422). Кроме того, нейтрализующие IL-17A антитела снижают серьезность и коэффициент заболеваемости ревматоидным артритом (РА) на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита, а высокие уровни: IL-17А можно
обнаружить в синовиальной жидкости воспаленных суставов у страдающих РА пациентов (Ziolkowska М и др., J. Immunol. 164, 2000, ее. 2832-2838; Kotake S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, сс. 1345-1352; Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc. 42-50).
В WO 96/17939, US 5716623, WO 95/18826, WO 97/15320, WO 99/35276 и WO 00/69436, WO 95/18826, US 6274711, US 6274711, WO 97/15320, US 6063372, WO 2006/013107 и WO 2008/02115 описаны IL-17A и антитела к IL-17A. В WO 2010/102251 описаны 1Ы7-связывающие белки.
Биспецифические антитела
В последние годы создано широкое разнообразие форматов рекомбинантных антител, например, четырехвалентные биспецифические антитела, полученные путем слияния, например, антител IgG-формата и одноцепочечных доменов (см., например, Coloma M.J. и др., Nature Biotech 15, 1997, сс. 159-163; WO 2001/077342 и Morrison S.L., Nature Biotech 25, 2007, cc. 1233-1234).
Разработано также несколько других новых форматов, в которых уже не сохраняется основная структура антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM), таких как димерные (диабоди), тримерные (триабоди) или тетрамерные (тетрабоди) антитела, миниантитела, несколько одноцепочечных форматов (scFv, бис-scFv), которые могут связываться с двумя или большим количеством антигенов (Holliger Р. и др., Nature Biotech 23, 2005, сс. 1126-1136; Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc. 3-14; Shen J и др., Journal of Immunological Methods 318, 2007, cc. 65-74; Wu С. и др., Nature Biotech 25, 2007, cc. 1290-1297).
Во всех указанных форматах используют линкеры либо для слияния основной структуры антитела (IgA, IgD, IgE, IgG или IgM) с дополнительным связывающим белком (например, scFv), либо для слияния, например, двух Fab-фрагментов или scFv (Fischer N., Leger О., Pathobiology 74, 2007, cc. 3-14). Следует иметь в виду, что может существовать необходимость в поддержании эффекторных функций, таких, например, как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) или антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC), которые опосредуются связыванием Fc-рецептора, путем сохранения высокой степени сходства с встречающимися в естественных условиях антителами.
В WO 2007/024715 описаны иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом, сконструированные в виде многовалентных и мультиспецифических связывающих белков. Метод получения биологически активных димеров антител описан в US 6897044. Многовалентная FV-конструкция антитела, имеющая по 5 меньшей мере четыре вариабельных домена, которые сцеплены друг с другом через пептидные линкеры, описана в US 7129330. Димерные и мультимерные антигенсвязывающие структуры описаны в US 2005/0079170. Трех- или четырехвалентный моноспецифический антигенсвязывающий белок, содержащий три или четыре Fab-фрагмента, ковалентно связанных с каждым 10 другим с помощью соединяющей структуры, где белок не представляет собой встречающийся в естественных условиях иммуноглобулин, описан в US 6511663. В WO 2006/020258 описаны четырехвалентные биспецифические антитела, которые могут эффективно экспрессироваться в прокариотических и эукариотических клетках, и которые можно применять в терапевтических и 15 диагностических методах. Метод выделения димеров, которые связаны с
помощью по меньшей мере одного межцепочечного дисульфидного мостика, от димеров, которые не связаны с помощью по меньшей мере одного межцепочечного дисульфидного мостика, из смеси, содержащей два типа полипептидных димеров, или предпочтительно их синтеза описан в US 5959083. 20 Биспецифические тетравалентные рецепторы описаны в US 2005/163782. Сконструированные антитела с тремя или большим количеством функциональных антигенсвязывающих центров описаны в WO 2001/077342.
Мультиспецифические и многовалентные антигенсвязывающие полипептиды описаны в WO 1997/001580. В WO 1992/004053 описаны 25 гомоконъюгаты, как правило, полученные из моноклональных антител IgG-класса, которые связываются с одной и той же антигенной детерминантой, ковалентно связанные путем синтетического перекрестносшивающего агента. В WO 1991/06305 описаны олигомерные моноклональные антитела, обладающие высокой авидностью к антигену, при этом олигомеры, как правило, IgG-класса, 30 секретируются в виде двух или большего количества иммуноглобулиновых
мономеров, которые ассоциируются вместе с образованием четырехвалентных или шестивалентных молекул IgG. Выведенные из овец антитела и созданные конструкции антител, которые можно применять для лечения болезней, для
которых активность интерферона гамма является патогенной, описаны в US 6350860. В US 2005/0100543 описаны обеспечивающие направленный перенос конструкции, которые представляют собой многовалентные носители биспецифических антител, т.е. каждая молекула обеспечивающей направленный перенос конструкции может служить в качестве носителя двух или большего количества биспецифических антител. Созданные с помощью генной инженерии биспецифические четырехвалентные антитела описаны в WO 1995/009917. В WO 2007/109254 описаны стабилизированные связывающие молекулы, которые содержат или состоят из стабилизированного scFv.
В WO 2008/106131 описаны биспецифические антитела к IL23 и IL17 или TNF. В WO 2007/027761 описаны биспецифические антитела к IL23 и IL17. В WO 2010/003108 описаны являющиеся антагонистами TNF-альфа имеющие несколько мишеней связывающие белки.
Краткое изложение сущности изобретения
Одним из объектов изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело ингибирует
а) индуцируемую TWEAK пролиферацию подобных человеческим
фибробластам синовиоцитов, ассоциированных с ревматоидным артритом
(ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50 0,2нМ или ниже; и
б) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 в подобных человеческим
фибробластам синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным артритом
(ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50 3,0нМ или ниже; и
в) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL8 в подобных человеческим
фибробластам синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным артритом
(ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50 2,0нМ или ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй
антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, представляет собой двухвалентное биспецифическое антитело.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который 5 специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй
антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличается тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
а) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 18,
10 CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 19, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 21, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 22; или
б) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 1, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 2,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 3, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 5, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 6; или
15 в) CDR1H, имеющий SEQ ID.NO: 9, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 10,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 11, и CDR1L имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 13, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 14; и И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 47, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 48, 20 CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 49, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 51, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 52.
Одним из вариантов осуществления изобретения является химерный или гуманизированный вариант указанного биспецифического антитела.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое 25 антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличается тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
30 вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 25, SEQ ID
NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ
ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ
ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 46; и И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55 или SEQ
ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57 или
SEQ ID NO: 58.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличается тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличается тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй
антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличается тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, которое связывается с TWEAK и IL17 и которое отличается указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, представляет собой человеческое антитело изотипа IgGl, в одном из вариантов осуществления изобретения с мутациями L234A и L235A, в другом варианте осуществления изобретения с мутациями L234A, L235A и P329G.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, которое связывается с TWEAK и IL17 и которое отличается указанными выше аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, представляет собой человеческое антитело изотипа IgG4, в одном из вариантов осуществления изобретения с мутациями S228P и L235E, в другом варианте осуществления изобретения с мутациями S228P, L235E и P329G.
Другим вариантом осуществления изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении.
Следующим вариантом осуществления изобретения является применение биспецифического антитела, предлагаемого в изобретения, для приготовления фармацевтической композиции.
Следующим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении.
Другим вариантом осуществления изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный домен тяжелой цепи и/или вариабельный домен легкой цепи биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении.
Изобретение относится также к экспрессионным векторам, которые содержат нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, которые обладают способностью экспрессировать указанную нуклеиновую кислоту в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине, и к клеткам-хозяевам, содержащим указанные векторы, которые предназначены для рекомбинантного получения указанного антитела.
Изобретение относится также к прокариотической или эукариотической клетке-хозяину, которая содержит вектор, предлагаемый в изобретении.
Изобретение относится также к способу получения рекомбинантного химерного, человеческого или гуманизированного антитела, предлагаемого в изобретении, отличающемуся в том, что экспрессируют нуклеиновую кислоту, предлагаемую в изобретении, в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют указанное антитело из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры. Изобретение относится также к антителу, которое можно получать с помощью указанного метода рекомбнации.
Антитела, предлагаемые в изобретении, характеризуются благоприятным действием на пациентов, которые нуждаются в терапии, направленной на TWEAK и IL17. Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают новыми и патентоспособными свойствами, оказывая благоприятное действие на пациента, страдающего раковым заболеванием, прежде всего страдающего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или воспалительными заболеваниями, прежде всего аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Следующим вариантом осуществления изобретения является биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенное для применения для лечения рака, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при
множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистых повреждений, прежде всего для лечения системной красной волчанки, волчаночного нефрита.
Следующим вариантом осуществления изобретения является биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, предназначенное для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистых повреждений, прежде всего для лечения системной красной волчанки, волчаночного нефрита.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или воспалительными заболеваниями, прежде всего аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением, заключающемуся в том, что вводят пациенту, у которого диагностировано указанное заболевание (и который, следовательно, нуждается в указанной терапии), в эффективном количестве предлагаемое в изобретении биспецифическое антитело, которое связывается с TWEAK и IL17. Антитело предпочтительно вводят в составе фармацевтической композиции.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, необязательно в сочетании с буфером и/или адъювантом, которые можно применять для приготовления препаративных форм антител для фармацевтических целей.
Изобретение относится также к фармацевтической композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, в фармацевтически приемлемом носителе. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция может быть включена в изделие или набор.
Установлено, что биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, оказывают благоприятные воздействия на больных людей, которые нуждаются в терапии, направленной на TWEAK и IL17, и обладают ценными свойствами.
Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают ценными свойствами, оказывая благоприятное воздействие на пациента, страдающего указанным заболеванием, прежде всего страдающего воспалительными заболеваниями, такими как ревматоидный артрит или волчаночный нефрит. Указанные ценные свойства включают одновременное ингибирование и TWEAK, и IL17, приводящее к дополняющим друг друга благоприятным воздействиям лечения. Существует постоянная высокая неудовлетворенная потребность в медикаментозных средствах при РА, поскольку у многих пациентов не удается достигать требуемой ремиссии. Биспецифические антитела, мишенью которых являются и TWEAK, и IL17, обеспечивают возможность достигать повышенной эффективности посредством ингибирования IL-17 и TWEAK, обладая дополняющей друг друга противовоспалительной и антиангиогенной активностью и оказывая оптимальное воздействие на формирование/резорбцию кости. Экспрессия TWEAK существенно повышается в синовиальной ткани у
пациентов, страдающих РА и псориатическим артритом (ПсА), главным образом
+ + в CD55 -синовиоцитах и CD 168 -макрофагах (Van Kuijk и др., Ann Rheum Dis
69, 2010, сс. 301-304). IL-17A образуется в воспаленной синовиальной ткани,
при этом более низкие уровни IL-17 обнаружены у TNF-респондеров и более
высокие уровни IL-17 обнаружены у TNF-нереспондеров (Могап и др., Arthritis
& Rheumatism 11, 2009, Rl 13). Кроме того, известны данные, подтверждающие
роль IL-17 и TWEAK в воспалении почек, связанную с воздействиями на
мезангиальные клетки, тубулярные эпителиальные клетки, эндотелиальные
клетки, повышение уровней секреции хемокинов, цитокинов, инфильтрацию
нейтрофилов, и положительные корреляции между уровнями IL-17 и TWEAK и
активностью заболевания. Уровни TWEAK в моче коррелируют с почечными
SLEDAI-индексами (индекс активности системной красной волчанки), уровень
TWEAK повышается в процессе воспалительной гиперемии и является
специфическим для болезни почек (Schwartz и др., J Autoimmunity 27, 2006, сс.
242-25). Кроме того, на модели острого поражения почек установлено, что
блокада TWEAK снижает воспаление почек (AKI) (Sanz и др., J Amer Soc
Nephrol 19, 2008, cc. 695-703). Повышенные уровни IL-17 обнаружены в тканях страдающих волчанкой пациентов, и IL-17 выявлен в пораженных почках пациентов, страдающих системной красной волчанкой (СКВ) (Crispin и др., J Immunol. 181, 2008, сс. 8761-8766).
Низкая вязкость и высокая стабильность в отношении агрегации (> 55°С) делает указанные антитела пригодными для приготовления высококонцентрированной формы, предназначенной для подкожного применения (Не F. и др., J Pharm Sci.100, 2010, сс. 1330-1340).
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, дополнительно отличаются одним или несколькими следующими свойствами (что проиллюстрировано в примерах 4, 10, 11, 16, 17 и 19):
биспецифическое антитело
а) не дает перекрестную реакцию с IL17B, IL17C, IL17D, IL17F (это
означает, что связывание с IL17B, IL17C, IL17D и IL17F составляет 0% по
сравнению со связыванием с IL17A, принятым за 100%);
б) ингибирует индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL8 на клетках
CCD-25SK, что характеризуется величиной IC50, составляющей 2,0нМ или менее
(например, величиной IC50, составляющей от 2,0нМ до 0,0нМ);
в) ингибирует индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 на клетках
CCD-25SK, что характеризуется величиной IC50, составляющей 5,0нМ или менее
(например, величиной IC50, составляющей от 5,0нМ до 0,0нМ); предпочтительно
величиной IC50, составляющей 2,0нМ или менее;
г) ингибирует взаимодействие человеческий TWEAK/человеческий Fnl4,
что характеризуется величиной IC50, составляющей 5,0 нг/мл или менее
(например, величиной IC50, составляющей от 4,0 нг/мл до 0,0 нг/мл);
предпочтительно величиной IC50, составляющей 3,0 нг/мл или менее;
д) связывается с человеческим TWEAK, при этом аффинность связывания
характеризуется величиной KD, составляющей 0,1 нМ или менее, и связывается с
человеческим IL-17, при этом аффинность связывания характеризуется
величиной KD, составляющей 0,ЗнМ или менее; и /или
е) обладает способностью одновременно связываться с человеческим и человеческим , при этом интенсивность сигнала (в RU) (при анализе методом поверхностного плазмонного резонанса) связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 со смесью 1:1 человеческого и человеческого , является такой же или более высокой по сравнению с суммой (а) интенсивности (в RU) сигнала связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 только с человеческим и (б) интенсивностью сигнала (в RU) связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 только с человеческим .
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 а и 1 б - два примера биспецифических двухвалентных форматов антител для биспецифических антител , предлагаемых в изобретении;
на фиг. 2 - один пример биспецифического четырехвалентного формата антитела для биспецифических антител , предлагаемых в изобретении.
Подробное описание изобретения
В контексте настоящего описания понятие "антитело" относится к связывающему белку, который содержит антигенсвязывающие центры. В контексте настоящего описания понятия "связывающий центр (сайт)" или "антигенсвязывающий центр (сайт)" относятся к области(ям) молекулы антитела, с которой(ыми) лиганд (т.е. антиген) фактически связывается. Под понятие "антигенсвязывающий центр (сайт)" подпадают вариабельные домены тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи антитела (VL), или пары VH/VL, и он может быть получен из полных антител или фрагментов антител, таких как одноцепочечный Fv, VH-домен и/или VL-домен, Fab или (Fab)2. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения каждый из антигенсвязывающих центров содержит вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) и/или вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) и предпочтительно образован из пары, состоящей из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH). Антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно представляет собой
гуманизированное антитело, химерное антитело или другое созданное с помощью генной инженерии антитело, если оно сохраняет характерные особенности, предлагаемые в изобретении.
Антигенсвязывающий центр и прежде всего вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи (VL) антитела, которые специфически связываются с человеческим TWEAK, можно выводить а) из известных антител к TWEAK, описанных, например, в WO 1998/005783, WO 2000/042073, WO 2003/086311, WO 2006/130429, WO 2006/130374, WO 2006/122187, WO 2006/089095, WO 2006/088890, WO 2006/052926, WO 2010/115555 или заявке РСТ № РСТ/ЕР2011/067070; или б) из новых антител к TWEAK, полученных, например, de novo с помощью методов иммунизации с использованием среди прочего либо белка человеческого TWEAK, либо нуклеиновой кислоты или ее фрагментов, либо с помощью методов фагового дисплея.
Антигенсвязывающий центр и прежде всего вариабельные домены тяжелой цепи (VH) и/или вариабельные домены легкой цепи (VL) антитела, которые специфически связываются с человеческим IL17, можно выводить а) из известных антител к IL17, описанных например, в WO 96/17939, US 5716623; WO 95/18826; WO 97/15320; WO 99/35276, WO 00/69436, WO 95/18826, US 6274711, US 6063372, WO 2006/013107, WO 2008/02115, WO 2010/102251 или WO 2010/034443; или б) из новых антител к IL17, полученных, например, de novo с помощью методов иммунизации с использованием среди прочего либо белка человеческого IL17, либо нуклеиновой кислоты или ее фрагментов, либо с помощью методов фагового дисплея.
Человеческий TWEAK (UniProtKB 043508, TNF-подобный слабый индуктор апоптоза; SEQ ID NO: 68) представляет собой ассоциированный с клеточной поверхностью трансмембранный белок типа II. TWEAK описан у Chicheportiche Y. и др., J. Biol. Chem. 272, 1997, сс. 32401-32410; Marsters S.A. и др., Curr. Biol. 8, 1998, сс. 525-528; Lynch C.N. и др., J. Biol. Chem. 274, 1999, cc. 8455-8459. Активная форма TWEAK представляет собой растворимый гомотример. Установлено, что последовательности связывающихся с рецептором доменов человеческого и мышиного TWEAK идентичны на 93%. TWEAK-рецептор Fnl4 (индуцируемый фактором роста фибробластов белок, 14 кДа)
представляет собой состоящий из 129 ак трансмембранный белок типа I, лигандсвязывающий домен которого состоит из одного индивидуального богатого цистеином домена, SEQ ID NO: 98). Передача сигналов TWEAK происходит посредством активации пути NF-KB. мРНК TWEAK экспрессируется в различных тканях, и она обнаружена в большинстве основных органов типа сердца, головного мозга, скелетной мышцы и поджелудочной железы, в тканях, связанных с иммунной системой, типа селезенки, лимфатических узлов и тимуса. мРНК Fnl4 обнаружена в сердце, головном мозге, легком, плаценте, сосудистых эпителиальных клетках (ЭК) и гладкомышечных клетках. Мыши, у которых "выключены" TWEAK (TWEAK-нуль) и Fnl4 (РшЧ-нуль), являются жизнеспособными, здоровыми и фертильными, у них выше содержание естественных клеток-киллеров и для них характерен повышенный врожденный воспалительный ответ. TWEAK принимает участие в апоптозе, пролиферации, ангиогенезе, он присутствует в области "ишемической полутени", обнаружен при церебральном отеке, рассеянном склерозе.
Человеческий IL-17A (CTLA-8, Swiss Prot Q16552, другое название IL-17 или IL17; SEQ ID NO: 70)) представляет собой провоспалительный цитокин, который продуцируется субпопуляцией Т-клеток памяти (которые обозначают как ТЫ 7), участвующий в патогенезе PC. IL-17A играет роль в индукции других провоспалительных цитокинов, хемокинов и молекул адгезии. Обработка животных нейтрализующими IL-17A антителами снижала коэффициент заболеваемости аутоиммунным энцефаломиелитом и его серьезность (Komiyama Y. и др., J. Immunol. 177, 2006, сс. 566-573). Обнаружена сверхэкспрессия IL-17A в спинномозговой жидкости страдающих PC пациентов (Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc. 42-50; Matusevicius D. и др., Multiple Sclerosis 5, 1999, cc. 101-104; WO 2005/051422). Кроме того, на мышиной модели индуцированного коллагеном артрита было установлено, что нейтрализующие IL-17A антитела снижают серьезность и коэффициент заболеваемости РА, а высокие уровни IL-17A можно обнаружить в синовиальной жидкости воспаленных суставов у страдающих РА пациентов (Ziolkowska М и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 2832-2838; Kotake S. и др., J. Clin. Invest. 103, 1999, cc. 1345-1352; Hellings P.W. и др., Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 28, 2003, cc. 42-50).
Специфичность антитела означает избирательное распознавание антителом конкретного эпитопа антигена. Встречающиеся в естественных условиях антитела являются, например, моноспецифическими.
"Биспецифические антитела" согласно изобретению представляют собой антитела, которые имеют две различные антигенсвязывающие специфичности. Если антитело имеет более одной специфичности, то распознаваемые эпитопы могут быть ассоциированы с одним антигеном или с несколькими антигенами. Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, обладают специфичностью в отношение двух различных антигенов, т.е. TWEAK в качестве первого антигена и IL17 в качестве второго антигена.
В контексте настоящего описания "моноспецифическое" антитело означает антитело, которое имеет один или несколько сайтов связывания, каждый из которых связывается с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена.
В контексте настоящего описания понятие "валентность" означает наличие определенного количества сайтов связывания в молекуле антитела. Так, понятия "двухвалентный", "четырехвалентный" и "шестивалентный" означает присутствие в молекуле антитела двух сайтов связывания, четырех сайтов связывания и шести сайтов связывания соответственно. Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, являются по меньшей мере "двухвалентными" и могут быть "трехвалентными" или "мультивалентными" (например, "четырехвалентными" или "шестивалентными"). В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, является двухвалентным, трехвалентным или четырехвалентным. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное биспецифическое антитело является двухвалентным. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное биспецифическое антитело является трехвалентным. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное биспецифическое антитело является четырехвалентным.
Антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, имеют два или большее количество сайтов связывания и являются биспецифическими. Это означает, что антитела могут быть биспецифическими даже в случаях присутствия более двух сайтов связывания (т.е. антитело является трехвалентным или мультивалентным). Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении,
включают, например, мультивалентные одноцепочечные антитела, димерные антитела (диабоди) и тримерные антитела (триабоди), а также антитела, которые имеют структуру константного домена полноразмерных антител, с которым другие антигенсвязывающие центры (например, одноцепочечный Fv, VH-домен и/или VL-домен, Fab или (Fab)2,) сцеплены через один или несколько пептидных линкеров. Антитела могут представлять собой полноразмерные антитела из одного вида или могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. В антителе, в котором присутствует более двух антигенсвязывающих центров, некоторые из сайтов связывания могут быть идентичными, если белок имеет два сайта связывания для двух различных антигенов. Это означает, что первый сайт связывания является специфическим в отношении TWEAK, а второй сайт связывания является специфическим в отношении IL17, и наоборот.
В контексте настоящего описания понятия "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" относятся к препарату молекул антител одинакового аминокислотного состава.
Понятие "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых каркасные или "гипервариабельные участки" (CDR) модифицированы так, что они содержат CDR иммуноглобулина другой специфичности по сравнению со специфичностью родительского иммуноглобулина. В предпочтительном варианте осуществления изобретения для получения "гуманизированного антитела" CDR из организма кроме человека (например, мыши, кролика или хомяка) трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс. 323-327; и Neuberger M.S. и др., Nature 314, 1985, сс. 268-270).
Понятие "химерное антитело" относится к моноклональному антителу, содержащему вариабельную область, т.е. связывающую область, полученную из мышиного антитела, и по меньшей мере часть константной области, полученную из другого источника или других видов, и его, как правило, получают с использованием методов рекомбинантной ДНК. Химерные антитела содержат, например, мышиную вариабельную область и человеческую константную область. Указанные мышиные/человеческие химерные антитела являются продуктом экспрессированных генов иммуноглобулинов, которые содержат ДНК-сегменты, кодирующие вариабельные области крысиного
иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, кодирующие константные области человеческого иммуноглобулина. Другими предпочтительными формами "химерных антител", подпадающих под объем настоящего изобретения, являются антитела, класс или подкласс которых модифицирован или изменен относительно исходного антитела. Такие химерные антитела обозначают также как "антитела переключенного класса". Методы получения химерных антител включают обычные методы рекомбинантной ДНК и генной трансфекции, которые хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1984, cc. 6851-6855; US № 5202238 и 5204244).
В контексте настоящего описания понятия "связывается с"/"связывание" или "специфическое связывание" относятся к связыванию биспецифического антитела с эпитопом антигена (либо человеческого TWEAK, либо человеческого IL17) с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве предлагаемого в изобретении терапевтического средства, мишенью которого является человеческий TWEAK и/или человеческий IL17. Связывание биспецифического антитела с эпитопом антигена (либо человеческого TWEAK, либо человеческого IL17) можно измерять с помощью анализа in vitro, предпочтительно с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore-анализ, фирма GE-Healthcare, Уппсапа, Швеция) с использованием очищенного человеческого антигена дикого типа (предпочтительно гомодимера IL17A в случае человеческого антигена IL17) (см., например, пример 19). Аффинность связывания характеризуют с помощью понятий ка (константа скорости ассоциации антитела при формировании комплекса антитело/антиген), kd (константа диссоциации) и Кд (kd/ka). Биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, представляет собой биспецифическое антитело, в котором первый антигенсвязывающий центр специфически связывается с человеческим TWEAK
с аффинностью связывания (KD), составляющей 1,0 * 10 М или менее,
-8 -13
например, от 1,0 х 10 М до 1,0 х 10 М (в одном из вариантов осуществления
-9 -13
изобретения от 1,0 * 10 М до 1,0 х 10 М), а второй антигенсвязывающий
центр специфически связывается с человеческим IL17 с аффинностью
связывания, составляющей (KD), составляющей 1,0 * 10" М или менее,
-8 -13
например, от 1,0 х 10' Мдо 1,0 х 10 М (в одном из вариантов осуществления
-9 -13
изобретения от 1,0 * 10 Мдо 1,0 х 10 М).
Понятие "эпитоп" означает белковую детерминанту, обладающую способностью специфически связываться с антителом. Эпитоп, как правило, состоит из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, как правило, эпитопы имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы отличаются тем, что первые из указанных в отличие от последних элиминируются в присутствии денатурирующих растворителей.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличающееся тем, что
а) первый антигенсвязывающий центр связывается с тем же самым
эпитопом на человеческом TWEAK, что и антитело, которое содержит CDR1H,
имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR3H, имеющий
SEQ ID NO: 19, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 20, CDFL2L, имеющий SEQ ID
NO: 21, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 22; и
б) второй антигенсвязывающий центр связывается с тем же самым
эпитопом на человеческом IL17, что антитело, которое содержит CDR1H,
имеющий SEQ ID NO: 47, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 48, CDR3H, имеющий
SEQ ID NO: 49, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR2L, имеющий SEQ ID
NO: 51, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 52.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличающееся тем, что
а) первый антигенсвязывающий центр связывается с тем же самым
эпитопом на человеческом TWEAK, что и антитело, которое содержит
вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO : 37; и
б) второй антигенсвязывающий центр связывается с тем же самым
эпитопом на человеческом IL17, что антитело, которое содержит вариабельный
домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен
легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличающееся тем, что
а) первый антигенсвязывающий центр конкурирует за связывание с тем же
самым эпитопом на человеческом TWEAK, что и антитело, которое содержит
CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 18, CDR3H,
имеющий SEQ ID NO: 19, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2L, имеющий
SEQ ID NO: 21, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 22; и
б) второй антигенсвязывающий центр конкурирует за связывание с тем же
самым эпитопом на человеческом IL17, что антитело, которое содержит CDR1H,
имеющий SEQ ID NO: 47, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 48, CDR3H, имеющий
SEQ ID NO: 49, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR2L, имеющий SEQ ID
NO: 51, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 2.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличающееся тем, что
а) первый антигенсвязывающий центр конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом на человеческом TWEAK, что и антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
б) второй антигенсвязывающий центр конкурирует за связывание с тем же самым эпитопом на человеческом IL17, что антитело, которое содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58.
Антитела, которые конкурируют за связывание с тем же самым эпитопом (и в результате вероятно связываются с тем же самым эпитопом), можно идентифицировать с помощью анализа на основе поверхностного плазмонного резонанса в условиях конкуренции, который описан, например, в примере 7.
Понятие "вариабельный домен" (вариабельный домен легкой цепи (Vl), вариабельный домен тяжелой цепи (Vh)) в контексте настоящего описания в каждом случае обозначает каждый из пары доменов легких и тяжелых цепей, которые непосредственно принимают участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей имеют одинаковую общую структуру, и каждый домен содержит 4 каркасных участка (FR), последовательности которых являются высококонсервативными, связанных тремя "гипервариабельными участками" (или определяющими комплементарность участками, CDR). Каркасные участки принимают Р-складчатую конформацию, а CDR-участки могут формировать петли, соединяющие Р-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживаются в виде трехмерной структуры с помощью каркасных участков и формируют с CDR-участками другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют очень важную роль в специфичности связывания/аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и вследствие этого являются дополнительным объектом изобретения.
Понятие "антигенсвязывающий участок (центр) антитела" в контексте настоящего описания относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Антигенсвязывающий участок антитела содержит аминокислотные остатки из "гипервариабельных участков" или "CDR". "Каркасные" или "FRw-участки представляют собой участки вариабельных доменов, остатки которых отличны от остатков гипервариабельного участка, как они определены в настоящем описании. Таким образом, вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4.
CDR3 тяжелой цени представляет собой основной участок, который главным образом обеспечивает связывание с антигеном и определяет свойства антитела. К CDR- и FR-участкам относятся участки, которые определяют согласно стандартной нумерации Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991, и/или остатки из "гипервариабельной петли".
Понятие "CDR1H" относится к CDR1-участку вариабельной области тяжелой цепи, определенному согласно нумерации Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). CDR2L, CDR3H и т.д. означают соответствующие участки тяжелой (Н) или легкой (L) цепи. Например, антигенсвязывающий центр, отличающийся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 3, означает, что антигенсвязывающий центр содержит эту аминокислотную последовательность в качестве CDR1-участка вариабельной области тяжелой цепи в своей вариабельной области тяжелой цепи. Например, антигенсвязывающий центр, отличающийся тем, что содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 1, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 2, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 3, означает, что антигенсвязывающий центр содержит в его тяжелой цепи в качестве последовательности CDR1 SEQ ID NO: 1, в качестве последовательности CDR2 SEQ ID NO: 2 и в качестве последовательности CDR3 SEQ ID NO: 3.
Понятия "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте настоящего описания относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.
Понятие "аминокислота" в контексте настоящего описания обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-а-аминокислот, таких как аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R), аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она находится в функциональной связи с другой нуклеиновой кислотой. Например, ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие "функционально связаны" означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются колинеарными, а в случае лидерной секреторной последовательности, смежными и находятся в рамке считывания. Однако не является необходимым, чтобы энхансеры были смежными. Связывание осуществляют встраиванием путем лигирования в соответствующие сайты рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры.
В контексте настоящего описания понятия "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемо, и все такие определения включают потомство. Так, понятия "трансформанты" и "трансформированные клетки" относятся к первичной рассматриваемой клетке и полученным из нее культурам безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает вариант потомства, имеющий такую же функцию или биологическую активность, которая обнаружена у исходной трансформированной клетки.
"Fc-фрагмент (-участок)" антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции. "Fc-фрагмент антитела" представляет собой понятие, хорошо известное специалисту в данной области, и этот фрагмент определяют на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины разделяют на следующие классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и
некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы; понятия "изотип" или "подкласс" в контексте настоящего описания применяют взаимозаменяемо), например, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. На основе строения константных областей тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов обозначают как а, 8, е, у и u соответственно. Fc-фрагмент антител непосредственно участвует в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая цитотоксичность), основанной на активации комплемента, связывании С1 q и связывании Fc-рецептора. Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора системы комплемента Clq с Fc-фрагментом большинства антител подклассов IgG. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с С1 q обусловлено определенными сайтами связывания в Fc-фрагменте. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Boakle R.J. и др., Nature 282, 1979, сс. 742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, cc. 907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, cc. 338344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc. 995-1004; Idusogie E.E. и др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184; Hezareh M. И др., J. Virology 75, 2001, cc. 12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc. 319-324; EP 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-индексу Кэбота, применяемому для константных доменов, Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
Антитела подклассов IgGl, IgG2 и IgG3, как правило, обусловливают активацию комплемента и связывание Clq и СЗ, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывается с Clq и СЗ.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что константные цепи имеют человеческое происхождение. Такие константные цепи хорошо известны в данной области и описаны, например, у Кэбота (см., например, Johnson G. и Wu Т.Т., Nucleic Acids Res. 28, 2000, cc. 214-218 и Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health,
Bethesda, MD, 1991). Например, приемлемые константные области человеческих тяжелых цепей содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64 (аллотипы человеческого подкласса IgGl (кавказский и афроамериканский или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67 (человеческий подкласс IgG4 или мутанты L234A/L235A и
L234A/L235A/P329G). Например, приемлемая константная область человеческой легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи SEQ ID N0:59 или аминокислотную последовательность константной области легкой лямбда-цепи SEQ ID NO: 60. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит Fc-фрагмент человеческого происхождения и предпочтительно все остальные участки человеческих константных областей. В контексте настоящего описания понятие "Fc-фрагмент, человеческого происхождения" означает Fc-фрагмент, который представляет собой Fc-фрагмент человеческого антитела подкласса IgGl, IgG2, IgG3 или IgG4, в одном варианте осуществления изобретения Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgGl, мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgGl (предпочтительно с мутацией L234A и L235A или L234A, L235A и P329G), Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgG4 или мутантный Fc-фрагмент из человеческого подкласса IgG4 (предпочтительно с мутациями S228P и L235E или S228P, L235E и P329G). В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит константные области человеческой тяжелой цепи, имеющие SEQ ID N0: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64 (аллотипы человеческого подкласса IgGl (кавказский и афроамериканский или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), SEQ ID N0: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67 (человеческий подкласс IgG4 или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G) (нумерация согласно EU-индексу по Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991). Указанные константные области человеческой тяжелой цепи могут содержать дополнительно модификации и/или мутации (см., например, описанные ниже мутации типа "выступы" и "впадины") или другую модификацию, которая
усиливает гетеродимеризацию. В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит две константные области тяжелой цепи, в которых в одном из двух СНЗ-доменов мутации Y349C, T366W, а в другом из двух СНЗ-доменов мутации S354C, T366S, L368A, Y407V содержатся дополнительно в аминокислотных последовательностях SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64 (аллотипы человеческого подкласса IgGl (кавказский и афроамериканский или мзгганты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67 (человеческий подкласс IgG4 или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G) (нумерация согласно EU-индексу по Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой человеческое антитело подкласса IgGl или человеческое антитело подкласса IgG4. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой человеческое антитело подкласса IgGl. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, представляет собой человеческое антитело подкласса IgG4.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, которое специфически связывается с человеческим TWEAK и человеческим IL17, представляет собой биспецифическое двухвалентное антитело с двумя специфичностями, описанное, например, в WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253 или Schaefer W. и др., PNAS 108, 2011, сс. 11187-11192 (антитела, полученные с помощью технологии "CrossMabs" или антитела "с заменой CHl-CL-доменов" - см. пример 14, и антитела, представленные в качестве примера на фиг. la; № 2, № 24, которые имеют формат, описанный в WO 2009/080253), в WO 2011/117330 ("биспецифические с одним плечом антитела в виде scFab", см. пример 14; № 4, № 20, № 21, № 23; см. также антитела, представленные в качестве примера на фиг. 1а), у Ridgway J.B., Protein Eng. 9, 1996, сс. 617-621; WO 96/027011; WO 98/050431, Merchant A.M. и др., Nature Biotech 16, 1998, cc.
677-681; Atwell S. и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, cc. 26-35, EP 1870459 Л1, Muda M. и др., Protein Engineering, Design & Selection 24, 2011, cc. 447-454, WO 2010/129304, WO 2011/028952, WO 2012/009544 и т.п. (которые все включены в настоящее описание в качестве ссылки).
Как правило, указанное биспецифическое двухвалентное антитело часто содержит Fc-фрагмент и содержит два пептида тяжелой цепи или пептида, напоминающего тяжелую цепь, которые образуют гетеродимеры. Для усиления образования указанных гетеродимеров (и снижения образования побочных гомодимерных продуктов) СНЗ- (и/или СН2-) домены модифицируют так, чтобы предпочтительно происходило образование гетеродимера. В данной области известны различные модификации, повышающие указанное образование гетеродимера, например, описанные в WO 96/027011, у Ridgway J.В. и др., Protein Eng 9, 1996, сс. 617-621; Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, сс. 677-681, WO 96/027011, WO 98/050431, US 2010/0015133, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304 и Muda M. и др., Protein Engineering, Design & Selection 24, 2011, cc. 447-454.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое двухвалентное антитело содержит Fc-фрагмент человеческого происхождения и предпочтительно все остальные участки человеческих константных областей, где СНЗ- (и/или СН2-) домены биспецифического двухвалентного антитела изменяют с помощью одной или нескольких модификаций для повышения образования гетеродимеров.
Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 79.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим
IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 87.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 90.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 93.
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 97.
В одном из вариантов осуществления изобретения СНЗ-домены биспецифического двухвалентного антитела изменяют с помощью технологии
"knobs-into-holes" (технология создания конструкций с модификациями типа "выступ-впадина"), которая описана подробно на некоторых примерах, например, в WO 96/027011, WO98/050431, у Ridgway J.B. и др., Protein Eng 9, 1996, сс. 617-621; и Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, сс. 677-681. При осуществлении этого метода изменяют поверхности взаимодействия указанных двух СНЗ-доменов таким образом, чтобы усиливать гетеродимеризацию обеих тяжелых цепей, содержащих эти два СНЗ-домена. Каждый из двух СНЗ-доменов (двух тяжелых цепей) может представлять собой "выступ", а другой - "впадину". Интродукция дисульфидного мостика позволяет стабилизовать гетеродимеры (Merchant А.М и др., Nature Biotech 16, 1998, сс. 677-681; Atwell S и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, cc. 26-35) и повышать выход продукта.
В предпочтительном объекте изобретения все биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, отличаются тем, что
СНЗ-домен одной тяжелой цепи и СНЗ-домен другой тяжелой цепи каждый соприкасается друг с другом на поверхности раздела, которая представляет собой исходную поверхность раздела между СНЗ-доменами антитела; при этом поверхность раздела изменяют для активации формирования двухвалентного биспецифического антитела, где изменение отличается тем, что:
а) изменяют СНЗ-домен одной тяжелой цепи таким образом, что
на исходной поверхности раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи, которая соприкасается с исходной поверхностью раздела СНЗ-домена второй тяжелой цепи в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела СНЗ-домена другой тяжелой цепи,
б) изменяют СНЗ-домен другой тяжелой цепи таким образом, что
на исходной поверхности раздела второго СНЗ-домена, которая
соприкасается с исходной поверхностью раздела первого СНЗ-домена в двухвалентном биспецифическом антителе, аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь,
создавая тем самым полость на поверхности раздела второго СНЗ-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СНЗ-домена.
Таким образом, антитело, предлагаемое в изобретении, предпочтительно отличается тем, что
СНЗ-домен тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанный в подпункте а), и СНЗ-домен тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанный в подпункте б), каждый соприкасается на поверхности раздела, которая содержит изменение относительно исходной поверхности раздела между СНЗ-доменами антитела;
где I) в СНЗ-домене одной тяжелой цепи
аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, создавая тем самым выпуклость на поверхности раздела СНЗ-домена одной тяжелой цепи, которая может помещаться в полость на поверхности раздела СНЗ-домена другой тяжелой цепи,
и где II) в СНЗ-домене другой тяжелой цепи
аминокислотный остаток заменяют на аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, создавая тем самым полость на поверхности раздела второго СНЗ-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СНЗ-домена.
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет большую по объему боковую цепь, выбирают из группы, включающей аргинин (R), фенилаланин (F), тирозин (Y), триптофан (W).
Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, который имеет меньшую по объему боковую цепь, выбирают из группы., включающей аланин (А), серии (S), треонин (Т), валин (V).
Согласно одному из объектов изобретения оба СНЗ-домена дополнительно изменяют путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих положениях каждого СНЗ-домена так, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СНЗ-доменами.
В одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое двухвалентное антитело содержит мутацию T366W в СНЗ-домене "цепи с выступом" и мутации T366S, L368A, Y407V в СНЗ-домене "цепи с впадиной".
Можно применять также дополнительный межцепочечный дисульфидный мостик между СНЗ-доменами (Merchant A.M. и др., Nature Biotech 16, 1998, сс. 677-681), например, путем интродукции мутации Y349C в СНЗ-домен "цепи с выступами" и мутации Е356С или мутации S354C в СНЗ-домен "цепи с впадиной" (нумерацию согласно EU-индексу Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
В другом варианте осуществления изобретения биспецифическое двухвалентное антитело, предлагаемое в изобретении, содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СНЗ-доменов и мутации Е356С, T366S, L368A, Y407V в во втором из двух СНЗ-доменов. В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения биспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СНЗ-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СНЗ-доменов (в дополнение к мутации Y349C в одном из СНЗ-доменов и в дополнение к мутации Е356С или S354C в другом СНЗ-домене, которые образуют межцепочечный дисульфидный мостик) (нумерация всегда соответствует EU-индексу Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)). В альтернативном или дополнительном варианте можно применять другие "knobs-in-holesw-технологии, описанные в ЕР 1870459А1. Так, другим примером мутаций для биспецифического антитела являются мутации R409D; К370Е в СНЗ-домене "цепи с выступами" и мутации D399K; Е357К в СНЗ-домене "цепи с впадиной" (нумерация всегда соответствует EU-индексу Кэбота (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991)).
В другом варианте осуществления изобретения биспецифическое двухвалентное антитело содержит мутацию T366W в СНЗ-домене "цепи с выступами" и мутации T366S, L368A, Y407V в СНЗ-домене "цепи с впадиной" и дополнительно мутации R409D; К370Е в СНЗ-домене "цепи с выступами" и мутации D399K; Е357К в СНЗ-домене "цепи с впадиной".
В другом варианте осуществления изобретения биспецифическое двухвалентное антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СНЗ
доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СНЗ-доменов или указанное биспецифическое антитело содержит мутации Y349C, T366W в одном из двух СНЗ-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СНЗ-доменов и дополнительно мутации R409D; К370Е в СНЗ-домене "цепи с выступами" и мутации D399K; Е357К в СНЗ-домене "цепи с впадиной". Указанные мутации, приводящие к образованию "выступа" и "впадины" в СНЗ-домене, как правило, применяют в константных областях человеческих тяжелых цепей, которые имеют SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64 (аллотипы человеческого подкласса IgGl (кавказский и афроамериканский или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67 (человеческий подкласс IgG4 или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G) (нумерация согласно EU-индексу Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, содержит константные области человеческой тяжелой цепи, имеющие SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 или SEQ ID NO: 64 (аллотипы человеческого подкласса IgGl (кавказский и афроамериканский или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66 или SEQ ID NO: 67 (человеческий подкласс IgG4 или мутанты L234A/L235A и L234A/L235A/P329G), дополнительно включающие указанные мутации, приводящие к образованию "выступа" и "впадины" в СНЗ-домене (например, мутации Y349C, T366W в одном из двух СНЗ-доменов и мутации S354C, T366S, L368A, Y407V во втором из двух СНЗ-доменов) (нумерация согласно EU-индексу Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
Указанное предлагаемое в изобретении двухвалентное биспецифическое антитело, специфически связывающееся с человеческим TWEAK и человеческим IL17, обладает особенно ценными свойствами, такими как низкая вязкость и высокая стабильность (в результате чего их можно получать без высокой агрегации и с высокими выходами). Указанные двухвалентные биспецифические
антитела благодаря их низкой вязкости и высокой стабильности являются особенно пригодными для приготовления высококонцентрированных форм/композиций, которые можно применять, например, для подкожного введения.
Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое двухвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, отличающееся тем, что
а) вязкость при 100 мг/мл составляет 4,0 мПа-с или менее (и/или вязкость
при 70 мг/мл составляет 3,0 мПа-с или менее, и/или вязкость при 150 мг/мл
составляет 8,5 мПа-с или менее) (при определении согласно методу, описанному
в примере 18),
б) температура агрегации составляет 55°С или более (при определении
согласно методу, описанному в примере 18).
Температура агрегации представляет собой температуре начала агрегации, установленную с помощью ДРС (динамическое рассеяние света) (см. пример 18).
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное биспецифическое антитело является трехвалентным, полученным с использованием, например, форматов на основе полноразмерного антитела, специфически связывающегося с одним из двух антигенов TWEAK или IL17, с которым только на одном С-конце одной тяжелой цепи слит scFab-фрагмент, который специфически связывается с вторым из двух антигенов TWEAK или IL17, включая технологию "knobs-into holes", например, описанную в WO 2010/112193, или, например, форматов на основе полноразмерного антитела, которое специфически связывается с одним из двух антигенов TWEAK или IL17, с которым на одном С-конце одной тяжелой цепи слит VH- или VH-CH1-фрагмент и на другом С-конце второй тяжелой цепи слит VL- или VL-CL-фрагмент, который специфически связывается со вторым из двух антигенов TWEAK или IL17, включая технологию "knobs-into holes", например, описанную в WO 2010/115589 или WO 2011/028952.
В одном из вариантов осуществления изобретения предлагаемое в изобретении биспецифическое антитело, специфически связывающееся с
человеческим TWEAK и человеческим IL17, представляет собой четырехвалентное антитело ("четыре связывающихся плеча") с двумя различными специфичностями, например, описанное в WO 2007/024715 или WO 2007/109254, WO 2010/112193, WO 2010/145792 или WO 2010/145793 (см. также пример 14; №5).
Одним из вариантов осуществления изобретения является биспецифическое четырехвалентное антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17, где биспецифическое антитело отличается тем, что содержит аминокислотные последовательности SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 84.
Форматы биспецифического двухвалентного антитела, описанные в WO 2011/117330 ("биспецифические с одним плечом антитела в виде scFab"), и форматы биспецифического четырехвалентного антитела, описанные в WO 2010/112193, содержат одноцепочечные Fab-фрагменты (scFab), в которых тяжелые и легкие цепи Fab-фрагментов сцеплены через пептидный линкер (см. фиг. 16 и 2, а также WO 2011/117330 и WO 2010/112193). Пептидный линкер, как правило, представляет собой пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно являются синтетическими, и он состоит по меньшей мере из 30 аминокислот, предпочтительно из 30-50 аминокислот (в одном из вариантов осуществления изобретения из 32-40 аминокислот). В одном из вариантов осуществления изобретения указанный линкер представляет собой (GxS)n, в котором G обозначает глицин, S обозначает серии (х =3, п= 8, 9 или 10 и ш= 0, 1, 2 или 3) или (х = 4 и п= 6, 7 или 8 и т= 0, 1, 2 или 3). В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пептидный линкер представляет собой (G4S)6G2.
Форматы биспецифического четырехвалентного антитела, описанные в WO 2007/024715 или WO 2007/109254, WO 2010/112193, WO 2010/145792, или WO 2010/145793, содержат пептиды-коннекторы для соединения антигенсвязывающего центра с полноразмерным антителом. Как правило, указанный пептид-коннектор представляет собой пептид, аминокислотные последовательности которого предпочтительно являются синтетическими, и он состоит по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно от 5 до 100 (в
одном варианте осуществления изобретения из 10-50 аминокислот; в одном из вариантов осуществления изобретения имеет в длину 10-50 аминокислот). В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пептид-коннектор представляет собой (GxS)n или (GxS)nGm, в котором G обозначает глицин, S обозначает серии и (х = 3, п= 3, 4, 5 или 6 и т= 0, 1, 2 или 3) или (х = 4, п= 2, 3, 4 или 5 и т= 0, 1, 2 или 3). В одном варианте осуществления изобретения пептид-коннектор представляет собой (G3S)3 или (G4S)2.
Другим вариантом осуществления изобретения является способ получения биспецифического антитела, предлагаемого в изобретении, отличающийся тем, что последовательность нуклеиновой кислоты, которая кодирует тяжелую цепь антитела, предлагаемого в изобретении, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует легкую цепь указанного антитела, встраивают в один или два экспрессионный(ых) векторы(а), указанный вектор(ы) встраивают в эукариотическую клетку-хозяина, кодируемое антитело экспрессируют и выделяют из клетки-хозяина или супрнатанта.
Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Указанные методы широко известны в данной области, и они включают осуществление экспрессии белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в приемлемых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, NSO-клеток, 8Р2/0-клеток, НЕК293-клеток, COS-клеток, дрожжей или клеток E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).
Методы рекомбинантного получения антител хорошо известны из существующего уровня техники, и они описаны, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 1999, cc. 183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc. 271-282; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc. 151161; Werner R.G., Drug Res. 48, 1998, cc. 870-880.
Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически очищенной форме. Очистку осуществляют
для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей, например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают хроматографию на колонках и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F., и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).
Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с. Е9. Клонирование вариабельных областей описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 3833-3837; Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc. 77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen К., в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc. 191-199.
Моноклональные антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как хроматография на протеин А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, диализ или аффинная хроматография. ДНК или РНК, которые кодируют моноклональные антитела, легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Источником таких ДНК и РНК могут служить клетки гибридом. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которыми затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки НЕК 293, СНО-клетки или клетки миеломы, которые иначе не могут продуцировать белок иммуноглобулина, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
Молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты аминокислотных последовательностей биспецифического антитела к TWEAK/IL17, получают различными методами, известными в данной области. Эти методы включают (но не ограничиваясь только ими) выделение из естественного источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью
опосредованного олигонуклеотидами (или сайтнаправленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии биспецифического антитела к TWEAK/IL17.
Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, предлагаемые в изобретении, объединяют с последовательностями промотора, сайта инициации трансляции, константной области, с З'-нетранслируемой областью, последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с получением конструкций экспрессионных векторов. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепи можно объединять в одном векторе, их можно применять для котрансфекции, серийной трансфекции или раздельной трансфекции клеток-хозяев, которые затем можно сливать с получением индивидуальной клетки-хозяина, которая экспрессирует обе цепи.
Биспецифическое антитело к TWEAK/IL17, прежде всего биспецифические двухвалентные антитела обладают ценными свойствами, такими как хорошая проявляемость и технологичность (например, отсутствуют "горячие" точки, которые требуют специфических условий производства)., высокие титры и выходы, и их можно производить в больших количествах и с относительно небольшим содержанием примесей (> 60% мономера после очистки на белке А (ГФ-ЖХВР) с определением чистоты после 2-ой колонки (ESI-MC) > 80%) (см. примеры 14 и 15).
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции биспецифического антитела к TWEAK/IL17, представленного в настоящем описании, получают путем смешения указанного антитела, имеющего требуемую степень чистоты, с одним или несколькими необязательно фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое изд., под ред. Osol А., 1980), в форме лиофилизированного препарата или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях, и включают (но не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный и буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как октадецилдиметилбензиламмония хлорид; гексаметония хлорид; бензалкония хлорид, бензетония хлорид; фенол,
бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (состоящие менее чем из примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливини лпирро ли дон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТК; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы с металлом (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как (ПЭГ). В контексте настоящего описания примеры фармацевтически приемлемых носителей включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX , фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№ 2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.
Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в US 6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в US 6171586 и WO 2006/044908, описанные в последнем документе композиции включают гистидин-ацетатный буфер.
Композиция, предлагаемая в изобретении, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга.
Биспецифические антитела, которые специфически связываются с человеческим TWEAK и человеческим IL17 (прежде всего биспецифические двухвалентные антитела), обладают особенно ценными свойствами, такими как
низкая вязкость и высокая стабильность (в результате чего их можно получать без высокой агрегации и с высокими выходами) (см. пример 18). Указанные двухвалентные биспецифические антитела благодаря их низкой вязкости и высокой стабильности являются особенно пригодными для приготовления высококонцентрированных форм/композиций, которые можно применять, например, для подкожного введения.
Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, можно вводить в виде единственного действующего вещества или в сочетании, например, в качестве адъюванта, или в комбинации с другими лекарственными средствами, например, иммуносупрессорными или иммуномодулирующими средствами или другими противовоспалительными средствами, например, для лечения или предупреждения указанных выше заболеваний. Например, биспецифические антитела, указанные в настоящем описании, можно применять в комбинации с DMARD (противоревматические препараты, модифицирующие течение болезни), например, солями золота, сульфасалазином, противомалярийными средствами, метотрексатом, D-пеницилламином, азатиоприном, микофеноловой кислотой, циклоспорином А, такролимусом, сиролимусом, миноциклином, лефлуномидом, глюкокортикоидами; ингибитором кальциневрина, например, циклоспорином А или FK 506; модулятором рециркуляции лимфоцитов, например, FTY720 и аналогами FTY720; ингибитором mTOR, например, рапамицином, 40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицином, CCI779, АВТ578, АР23573 или TAFA-93; аскомицином, обладающим иммуносупрессорным действием, например, АВТ-281, ASM981 и т.д.; кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом; мизорибином; микофеноловой кислотой; микофенолатом мофетила; 15-дезоксиспергуалином или его иммуносупрессорным гомологом, аналогом или производным; иммуносупрессорными моноклональными антителами, например, моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов, например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40. CD45, CD58, CD80, CD86 или их лигандам; другими иммуномодулирующими соединениями, например, рекомбинантными связывающими молекулами, которые имеют по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутанта, например, по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутанта, сцепленную с не
включающей CTLA4 белковой последовательностью, например, CTLA4Ig (например, с регистрационным номером АТСС 68629) или ее мутантом, например, LEA29Y; ингибиторами молекул адгезии, например, антагонистами LFA-1, антагонистами ICAM-1 или -3, антагонистами VCAM-4 или антагонистами VLA-4; или химиотерапевтическим средством, например, паклитакселом, гемцитабином, цисплатином, доксорубицином или 5-фторурацилом; анти-TNF агентами, например, моноклональными антителами к TNF, например, инфликсимабом, адалимумабом, CDP870, или рецептроными конструкциями с TNF-RI или TNF-RII, например, этанерцептом, ПЭГ-TNF-RI; блокаторами провоспалительных цитокинов, IL-1-блокаторами, например, анакинра или IL-1 trap, AAL160, ACZ 885, блокаторами IL-6; блокаторами хемокинов, например, ингибиторами или активаторами протеаз, например, металлопротеаз, антителами к IL-15, антителами к IL-6, антителами к IL-23 антителами к CD20, НСПВС, такими как аспирин или противоинфекционные средства (перечень не ограничен указанными агентами).
Биспецифическое антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, можно применять в комбинации или в дополнение к одному или нескольким из следующих агентов:
- антагонисты функции цитокинов (например, агент, который воздействует на цитокиновые пути передачи сигналов, такой как модулятор системы SOCS), таких как альфа-, бета- и/или гамма-интреферон; модуляторы инсулиноподобного фактора роста типа I (IGF-I), его рецепторов и ассоциированных связывающих белков; интерлейкины (IL) например, один или несколько из IL-1-33, и/или антагонист или ингибитор интерлейкинов, такой как анакинра; ингибиторы рецепторов представителей семейства интерлейкинов или ингибиторы специфических субъединиц указанных рецепторов; ингибитор фактора некроза опухоли альфа (TNF-альфа), такой как моноклональное антитело к TNF (например, инфликсимаб; адалимумаб и/или CDP-870) и/или антагонист TNF-рецептора, например, молекула иммуноглобулина (например, этанерцепт), и/или низкомолекулярный агент, такой как пентоксифиллин;
- модулятор В-клеток, например, моноклональное антитело, мишенью которого являются В- лимофоциты (например, CD20 (ритуксимаб) или MRA-aIL16R) или Т-лимфоциты (например, CTLA4-Ig, HuMax 11-15 или абатацепт);
-
- модулятор, ингибирующий активность остеокластов, например, антитело к RANKL;
- модулятор функции хемокинов или рецепторов хемокинов, такой как антагонист CCR1, CCR2, CCR2A, CCR2B, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 и CCRI1 (для С-С-семейства); CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4 и CXCR5 и CXCR6 (для С-Х-С-семейства) и CX3CR1 для С-ХЗ-С-семейства;
- ингибитор матриксных металлопротеаз (ММР), т.е. один или несколько следующих агентов: стромелизины, коллагеназы и желатиназы, а также агреканаза; прежде всего коллагеназа-1 (ММР1), коллагеназа-2 (ММР8), коллагеназа-3 (ММР 13), стромелизин-1 (ММРЗ), стромелизин-2 (ММР 10) и/или стромелизин-3 (ММР11) и/или ММР9, и/или ММР 12, например, такой агент, как доксициклин; ингибитор биосинтеза лейкотриена, ингибитор 5-липоксигеназы (5-LO) или антагонист белка-активатора 5-липоксигеназы (FLAP), такой как зилеутон; АВТ-761; фенлеутон; тепоксалин; Abbott-79175; Abbott-85761; N-(5-замещенные)тиофен-2-алкилсульфонамиды; 2,6-ди-7я/?е/и-бутилфенолгидразоны; метокситетрагидропираны, такие как Zeneca ZD- 2138; соединение SB-210661; замешенное пиридинидом 2-цианнафталиновое производное, такое как L-739,010; 2-цианхолиновое производное, такое как L-746,530; производные индола и/или хинолина, такие как МК-591, МК-886 и/или BAY х 1005; антагонист рецептора лейкотриенов (LT) В4, LTC4, LTD4 и LTE4, выбранный из группы, включающей фенотиазин-3-ls, например, L-651,392; амидинопроизводные, такие как CGS-25019c; бензоксаламины, такие как онтазоласт; бензолкарбоксиимидамиды, такие как BIIL 284/260; и такие соединения, как зафирлукаст, аблукаст, монтелукаст, праюлукаст, верлукаст (МК-679), RG-12525, Ro-245913, иралукаст (CGP 45715А) и BAY х 7195; ингибитор фосфодиэстеразы (PDE), такой как метилксанганин, например, теофиллин и/или аминофиллин; и/или селективный ингибитор изофермента PDE, например, ингибитор PDE4 и/или ингибитор изоформы PDE4D, и/или ингибитор PDE5;
- антагонист рецептора гистамина типа 1, такой как цетиризин, лоратадин, деслоратадин, фексофенадин, акривастин, терфенадин, астемизол, азеластин,
левокабастин, хлорфенирамин, прометазин, циклизин и/или мизоластин (которые, как правило, применяют орально, местно или парентерально);
- ингибитор протонного насоса (такой как омепразол) или гастропротективный антагонист гистаминного рецептора типа 2; - антагонист гистаминного рецептора типа 4; сосудосуживающий сампатомиметик, являющийся агонистом альфа-1/альфа-2 адренорецептора, такой как пропилгекседрин, фенилэфрин, фенилпропаноламин, эфедрин, псевдоэфедрин, нафазолина гидрохлорид, оксиметазолина гидрохлорид, тетрагидрозолина гидрохлорид, ксилометазолина гидрохлорид, трамазолина гидрохлорид и этилнорэпинефрина гидрохлорид; антихолинергеческий агент, например, антагонист мускаринового рецептора (Ml, М2 и МЗ), такой как атропин, гиосцин, гликопирролат, ипратропия бромид, тиотропия бромид, окситропия бромид, пирензепин и телензепин;
- агонист бета-адренорецептора (включая подтипы 1 -4 бета-рецептора), такой как изопреналин, сальбутамол, формотерол, сальметерол, тербуталин, орципреналин, битолтерола мезилат и/или пирбутерол, например, его хиральный энантиомер;
- хромон, например, натрия хромогликат и/или натрия недокромил;
- глюкокортикоид, такой как флунизолид, триамцинолона ацетонид, беклометазона дипропионат, будесонит, флутиказона пропионат, циклесонид и/или мометазона фуроат; агент, который модулирует рецепторы ядерного гормона, такой как PPAR;
- иммуноглобулин (Ig) или препарат или антагонист Ig, или антитело, модулирующее функцию Ig, такое как антитело к IgE (например, омализумаб);
- другой применяемый системно или местно противовоспалительный агент, например, талидомид или его производное, ретиноид, дитранол и/или кальципотриол;
- комбинации аминосалицилатов и сульфапиридина, такие как сульфасалазин, месалазин, балсалазид и олсалазин; и иммуномодуляторы, такие как тиопурины, и кортикостероиды, такие как будесонид;
- антибактериальный агент, например, производное пенициллина, тетрациклин, макролид, бета-лактам, фторхинолон, метронидазол и/или применяемый путем ингаляции аминогликозид; и/или противовирусный агент,
-
например, ацикловир, фамцикловир, валацикловир, ганцикловир, цидофовир; амантадин, римантадин; рибавирин; занамавир и/или осельтамавир; ингибитор протеаз, такой как индинавир, нелфинавир, ритонавир и/или саквинавир; ингибитор нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, такой как диданозин, ламивудин, ставудин, зальцитабин, зидовудин; ненуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы, такой как невирапин, эфавиренз; сердечнососудистый агент, такой как блокатор кальциевых каналов, блокатор бета-адренорецептора, ингибитор ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), антагонист рецептора ангиотензина-2; агент, понижающий уровень липидов, такой как статин и/или фибрат; модулятор морфологии кровяных клеток, такой как пентоксифиллин; тромболитеческий агент и/или антикоагулянт, например, ингибитор агрегации тромбоцитов;
- агент, оказывающий воздействие на ЦНС, такой как антидепрессант (такой как сертралин), лекарственное средство против болезни Паркинсона (такое как депренил, L-дофа, ропинирол, прамипексол, ингибитор МАОВ (моноаминоксидаза В), такой как селегин и разагелин, ингибитор сотР, такой как тасмар, ингибитор А-2, ингибитор обратного захвата дофамина, антагонист NMDA, агонист никотина, агонист дофамина и/или ингибитор нейрональной синтазы оксида азота), и лекарственные средства против болезни Альцгеймера, такие как донепезил, ривастигмин, такрин, ингибитор СОХ-2, пропентофиллин или метрифонат; агент, предназначенный для лечения острой и хронической боли, например, анальгетик центрального или периферического действия, такой как опиоидный аналог или производное, карбамазепин, фенитоин, натрия вальпроат, амитриптилин или другой антидепрессант, парацетомол или нестероидное противовоспалительное средство; применяемый парентерально или местно (включая ингаляцию) местный анестезирующий агент, такой как лигнокаин или его аналог; агент против остеопороза, например, гормональный агент, такой как ралоксифен, или бифосфонат, такой как алендронат;
(I) ингибитор триптазы; (II) антагонист фактора активации тромбоцитов (PAF); (III) ингибитор интерлейкинпревращающего фермента (ICE); (IV) ингибитор IMPDH; (V) ингибиторы молекул адгезии, включая антагонист VLA-4; (VI) катепсин; (VII) ингибитор киназы, например, ингибитор тирозинкиназ (таких как Btk, Itk, Jak3 MAP, примерами ингибиторов могут являться
гефитиниб, иматиниба мезилат), серин/треониновых киназ (например, ингибитор МАР-киназы, такой как р38, JNK, протеинкиназ А, В и С и IKK), или киназ, участвующих в регуляции клеточного цикла (например, циклинзависимой киназы); (VIII) ингибитор глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы; (IX) антагонист кининового В] - и/или Вг-рецептора; (X) агент против подагры, например, колхицин; (XI) ингибитор оксидазы ксантина, например, аллопуринол; (XII) агент, способствующий выведению мочевой кислоты, например, пробенецид, сульфинпиразон и/или бензбромарон; (XIII) агент, повышающий секрецию гормона роста; (XIV) трансформирующий фактор роста (TGF-бета); (XV) тромбоцитарный фактор роста (PDGF); (XVI) фактор роста фибробластов, например, основный фактор роста фибробластов (bFGF); (XVII) колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF); (XVIII) капсаициновый крем; (XIX) антагонист тахикининового NK| и/или NK3 -рецептора, такой как NKP-608C, SB-233412 (талнетант) и/или D-4418; (XX) ингибитор эластазы, например, UT-77 и/или ZD-0892; (XXI) ингибитор TNF-альфа-превращающего фермента (ТАСЕ); (XXII) ингибитор индуцибельной синтазы оксида азота (iNOS) или (XXIII) гомологичная рецептору хемоаттрактанта молекула, экспрессируемая на ТН2-клетках (например, антагонист CRTH2); (XXIV) ингибитор Р38; (XXV) агент, модулирующий функцию Толл-подобных рецепторов (TLR); и (XXVI) агент, модулирующий активность перинергических рецепторов, такой как Р2Х7; (XXVII) ингибитор фактора активации транскрипции, например, NFkB, API и/или STATS.
Ингибитор может быть специфическим или может представлять собой ингибитор смешенного типа, например, ингибитор, мишенью которого является больше одной молекулы (например, рецепторов) или молекул, указанных выше классов.
Биспецифическое антитело можно применять также в сочетании с химиотерапевтическим средством или другим ингибитором тирозинкиназы или вводить совместно или в форме иммуноконъюгата. Фрагменты указанного антитела можно применять также в биспецифических антителах, полученных с помощью механизмов рекомбинации или биохимическое сочетания, и затем объединять специфичность вышеуказанного антитела со специфичностью других антител, обладающих способностью распознавать другие молекулы,
участвующие в активности, ассоциированной с IL-17. Для лечения воспалительного заболевания биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, можно объединять с одним или несколькими такими агентами, как: нестероидные противовоспалительные средства (далее НСПВС), включая неселективные ингибиторы циклооксигеназы (COX)-I / СОХ-2, которые применяют местно или системно (такими как пироксикам, диклофенак, производные пропионовых кислот, такие как напроксен, фторбипрофен, фенопрофен, кетопрофен и ибупрофен, фенаматы, такие как мефенаминовая кислота, индометацин, сулиндак, азапропазон, пиразолоны, такие как фенилбутазон, салицилаты, такие как аспирин); селективные ингибиторы СОХ-2 (такие как мелоксикам, целекоксиб, рофекоксиб, вальдекоксиб, лумарококсиб, парекоксиб и эторикоксиб); ингибирующие циклооксигеназу доноры оксида азота (CINOD); глюкокортикостероиды (которые можно применять с использованием местных, оральных, внутримышечных, внутривенных или внутрисосудистых путей); метотрексат, лефлуномид; гидроксихлорхин, d-пеницилламин, ауранофин или другие парентаральные или оральные препараты золота; анальгетики; диацереин; средства для внутрисосудистой терапии, такие как производные гиулуроновой кислоты; и пищевые добавки, такие как глюкозамин.
Биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, можно применять также в сочетании с существующим терапевтическим средством для лечения рака. Приемлемые для применения в комбинации средства включают:
(I) антипролиферативные/антинеопластические лекарственные средства и их комбинации, применяемые в медицинской онкологии, такие как алкилирующие средства (например, цисплатин, карбоплатин, циклофосфамид, аналог горчичного газа, мелфалан, хлорамбуцил, бусульфан и нитрозомочевины); антиметаболиты (например, антифолаты, такие как фторпиримидины типа 5-фторурацила и тегафура, ралтитрексед, метотрексат, цитозинарабинозид, гидроксимочевина, гемцитабин и паклитаксел; противоопухелевые антибиотики (например, антрациклины типа адриамицина, блеомицина, доксорубицина, дауномицина, эпирубицина, идарубицина, митомицина-С, дактиномицина и митрамицина); антимитотические средства (например, алкалоиды барвинка типа винкристина, винбластина, виндезина и
винорелбина и таксойды типа таксола и таксотере); и ингибиторы топоизомеразы (например, эпиподофиллотоксины типа этопозида и тенипозида, амсакрин, топотекан и камптотецины);
(II) цитостатические средства, такие как антиэстрогены (например, тамоксифен, торемифен, ралоксифен, дролоксифен и йодоксифен), понижающие регуляторы рецептора эстрогена (например, фулвестрант), антиандрогены (например, бикалутамид, флутамид, нилутамид и ципротерона ацетат), антагонисты LHRH или агонисты LHRH (например, гозерелин, лейпрорелин и бузерелин), прогестогены (например, мегестрола ацетат), ингибиторы ароматазы (например, анастрозол, летрозол, воразол и эксеместан) и ингибиторы 5-альфа-редуктазы, такие как финастерид;
(III) агенты, которые ингибируют инвазию раковых клеток (например, ингибиторы металлопротеиназ типа маримастата и ингибиторы функции рецептора активатора плазминогена урокиназного типа);
(IV) ингибиторы функции фактора роста, например, ингибиторы, включающие антитела к факторам роста, антитела к рецепторам факторов роста (например, анти-егЬЬ2 антитело трастузумаб и анти-erbb 1 антитело цетуксимаб [С225]), ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы серин/треониновой киназы, например ингибиторы семейства эпидермальных факторов роста (например, ингибиторы тирозинкиназ семейства EGFR, такие как Ы-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (гефитиниб, AZD1839), N-(3-этинилфенил)-6,7-бис(2-метоксиэтокси)хиназолин-4-амин (эрлотиниб, OSI-774) и 6-акриламидо-Ы-(3-хлор-4-фторфенил)-7-(3-морфолинопропокси)хиназолин-4-амин (CI 1033)), например, ингибиторы семейства тромбоцитарных факторов роста, и, например, ингибиторы семейства гепатоцитарных факторов роста;
(V) антиангиогенные средства, которые ингибируют действие сосудистого эндотелиального фактора роста (например, антитело к сосудистому эндотелиальному фактору роста бевацизумаб, соединения, описанные в международных заявках на патент WO 97/22596, WO 97/30035, WO 97/32856 и WO 98/13354, каждая из которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки, и соединения, которые действуют посредством других
(II)
механизмов (например, линомид, ингибиторы функции интегрина альфа, -бета.З и ангиостатин);
(VI) повреждающие сосуды средства, такие как комбретастатин А4, и
соединения, описанные в международных заявках на патент WO 99/02166, WO
00/40529, WO 00/41669, WO 01/92224, WO 02/04434 и WO 02/08213, каждая из
которых полностью включена в настоящее описание в качестве ссылки;
(VII) средства для антисмысловых терапий, например, направленные на перечисленные выше мишени, такие как ISIS 2503, анти-ras антисмысловая терапия;
(VIII) подходы генной терапии, включая, например, подходы к замене аберрантных генов, таких как аберрантный р53 или аберрантный BRCA1 или BRCA2, подходы на основе GDEPT (ген-направленная ферментно-пролекарственная терапия), например, в которых используют цитозиндеаминазу, тимидинкиназу или бактериальный фермент нитроредуктазу, и подходы, способствующие повышению способности пациента переносить химиотерапию или лучевую терапию, например, генная терапия устойчивости к нескольким лекарственным средствам; и
(IX) иммунотерапевтические подходы, включающие, например, подходы ех vivo и in vivo для повышения иммуногенности опухолевых клеток пациента, такие как трансфекция с использованием цитокинов, таких как интерлейкин 2, интерлейкин 4 или колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов, подходы к снижению Т-клеточной анергии, подходы, основанные на применении трансфектированных иммунных клеток, таких как трансфектированные цитокинами дендритные клетки, подходы, основанные на применении трансфектированных опухолевых клеток, и подходы, основанные на применении антиидиотипических антител.
Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для решения поставленной задачи.
Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы,
альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-ое изд., под ред. A. Osol, 1980.
Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.
Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Это легко можно осуществлять, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.
Биспецифическое антитело, предлагаемое в изобретении, прежде всего биспецифическое двухвалентное антитело, обладает ценными биологическими свойствами (определенными с помощью анализов, которые описаны в примерах 3,4, 10, 11, 16, 17 и 19):
А) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 ингибирует
а) индуцируемую TWEAK пролиферацию человеческих
фибробластподобных синовиоцитов, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50, составляющей 0,2нМ
или менее (например, величиной IC50, составляющей от 0,2нМ до 0,0нМ);
предпочтительно величиной IC50, составляющей 0,1 нМ или менее (по данным,
представленным в примере 17, в виде величины ICso/на валентность); и
б) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной 1С50, составляющей 3,0нМ
или менее (например, величиной IC50, составляющей от 3,0нМ до 0,0нМ);
предпочтительно величиной IC50, составляющей 2,0нМ и ли менее (по данным,
представленным в примере 16); и
в) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL8 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50, составляющей 2,0нМ
или менее (например, величиной IC50, составляющей от 2,0нМ до 0,0нМ);
предпочтительно величиной IC50, составляющей 1,5нМ или менее (по данным, представленным в примере 16);
Б) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 обладает способностью одновременно связываться с человеческим и человеческим , при этом интенсивность сигнала (в RU) (при анализе методом поверхностного плазмонного резонанса (пример 19) связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 со смесью 1:1 человеческого и человеческого является такой же или более высокой по сравнению с суммой а) интенсивности сигнала (в RU) связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 с человеческим при его индивидуальном применении и б) интенсивности сигнала (в RU) связывания биспецифического антитела к TWEAK/IL17 с человеческим при его индивидуальном применении (по данным, представленным в примере 19);
В) для биспецифического антитела к TWEAK/IL17 не обнаружена перекрестная реактивность с IL17B, IL17C, IL17D, IL17F (это означает, что связывание с IL17B, IL17C, IL17D и IL17F составляет 0% по сравнению со связыванием с IL17A, которое принимают на 100%) (по данным, представленным в примере 10);
Г) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 ингибирует индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина в IL6 CCD-25SK-MeTKax, что характеризуется величиной IC50, составляющей 2,0нМ или менее (например, величиной IC50, составляющей от 2,0нМ до 0,0нМ) (по данным, представленным в примере 11);
Д) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 ингибирует индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина в IL8 CCD-25SK-raieTKax, что характеризуется величиной IC50, составляющей 5,0нМ или менее (например, величиной IC50, составляющей от 5,0нМ до 0,0нМ); предпочтительно величиной IC50, составляющей 2,0нМ или менее (по данным, представленным в примере 11);
Е) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 ингибирует взаимодействие: человеческий TWEAK/человеческий Fnl4, что характеризуется величиной IC50, составляющей 4,0 нг/мл или менее (например, величиной IC50, составляющей от 4,0 нг/мл до 0,0 нг/мл); предпочтительно величиной IC50, составляющей 3,0 нг/мл или менее (по данным, представленным в примере 4);
Ж) биспецифическое антитело к TWEAK/IL17 связывается с человеческим TWEAK с величиной KD, характеризующей аффинность связывания, составляющей 0,1 нМ или менее, и связывается с человеческим IL-17 с величиной KD, характеризующей аффинность связывания, составляющей 0,3нМ или менее (по данным, представленным в примере 19); и /или
3) для биспецифического антитела к TWEAK/IL17 обнаружено время полужизни комплекса между растворимым человеческим TWEAK (аминокислоты 99-249 SEQ ID NO: 68) и антителом, составляющее 100 мин или более при 25°С, при оценке с помощью Biacore (по данным, представленным в примере 19).
Понятие "человеческие фибробластподобные синовиоциты, связанные с ревматоидным артритом (ЧФПС-РА)" относится к человеческим фибробластподобным синовиоцитов, полученных из организма взрослых страдающих ревматоидным артритом пациентов (человеческие фибробластподобные синовиоциты, ассоциированные с ревматоидным артритом (ЧФПС-РА)), например, к ЧФПС-РА (каталожный № 408RA-05a), полученным от фирмы Cell Applications Inc. (Сан-Диего, шт. Калифорния, США). Человеческие фибробластподобные синовиоциты, ассоциированные с ревматоидным артритом (ЧФПС-РА) выделяют из синовиальных тканей страдающих ревматоидным артритом пациентов (РА). Их после второго пассажа подвергают криопротекции и размножают с дублированием с получением по меньшей мере 5 популяций. Для ЧФПС давно известна роль в деструкции сустава в результате производства цитокинов и металлопротеиназ, которые принимают участие в деградации хряща (Firestein G.S. и др., J. Immunol. 149, 1992, с. 1054; Firestein G.S. и др., Arthritis and Rheumatism 37(5), 1994, с. 644). Провоспалительные цитокины индуцируют пролиферацию, производство коллагеназы и агреканазы и секрецию GM-CSF клетками ЧФПС (Alvaro J.M. и др., J. Clin. Immunol. 13(3), 1993, с. 212; Yamanishi Y. и др., J. Immunol. 168(3), 2002, с. 1405). Проведенные исследования артрита продемонстрировали также, что для ЧФПС характерен апоптоз и Р53-мутации (Firestein G.S. и др., J. Clin. Invest. 96, 1995, с. 1631; Firestein G.S. и др., Am. J. Pathol. 148(6), 1996, с. 2143). Авторы изобретения обнаружили два типа ЧФПС, которые можно применять в качестве клеточных моделей для изучения различий между ЧФПС-РА и ЧФПС-ОА (остеоартропатия), таких как экспрессия
и регуляция протеаз (Firestein G.S. и др., Am. J. Pathol. 148(6), 1996, с. 2143) и субъединиц интегрина (Rinaldi N. и др., Ann. Rheum. Dis. 56(12), 1997, с. 729).
Понятие "индуцируемая IL17 стимуляция цитокина IL6 или IL8" относится к стимуляции человеческого цитокина IL6 или человеческого цитокина IL8 человеческим IL17. Величины IC50, характеризующие индуцируемую TWEAK пролиферацию человеческих фибробластподобных синовиоцитов, ассоциированных с ревматоидным артритом (ЧФПС-РА), и характеризующие индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 в человеческих фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным артритом (ЧФПС-РА), рассчитывают как величины IC50 на валентность (для связывающего плеча в отношении соответствующего антигена (IL17 в примере 16 и TWEAK в примере 17). Это означает, что биспецифическое двухвалентное антитело, которое имеет одно связывающее плечо для каждого антигена (т.е. является одновалентным для каждого антигена), величины IC50 идентичны определенным величинам IC50 (см. примеры 16 и 17). Для сравнения указанного одновалентного связывания со связыванием биспецифического четырехвалентного антитела, которое имеет два связывающих плеча для каждого антигена (т.е. является двухвалентным для каждого антигена), величину IC50 рассчитывают с учетом того, что для достижения величины IC50 применяют двойную молярную концентрацию связывающих плечей, поэтому величина IC50 является увеличенной в два раза (для получения соответствующей концентрации, приводящей к 50%-ному ингибированию, на связывающее плечо).
Изобретение относится к способу лечения пациента, который нуждается в терапии, отличающемуся тем, что вводят пациенту в терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, прежде всего рака ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани,
например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения системной красной волчанки или волчаночного нефрита.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения рака или воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения рака ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или для лечения аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
Изобретение относится к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения рака или воспалительных заболеваний, предпочтительно для лечения системной красной волчанки или волчаночного нефрита. Изобретение относится к применению биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, которые специфически связываются с человеческим TWEAK и человеческим IL17, для лечения (или к биспецифическим антителам, предназначенным для лечения) пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Изобретение относится к применению биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, которые специфически связываются с человеческим TWEAK и человеческим IL17, для лечения (или к биспецифическим антителам, предназначенным для лечения) пациента, страдающего системной красной волчанкой или волчаночным нефритом.
Изобретение относится к применению биспецифических антител, предлагаемых в изобретении, которые специфически связываются с человеческим TWEAK и человеческим IL17, для лечения (или к биспецифическим антителам, предназначенным для лечения) различных воспалительных иммунных и пролиферативных нарушений, включая ревматоидный артрит (РА), остеоартрит, остеопороз, воспалительный фиброз (например, склеродерма, фиброз легких и цирроз), гингивит, периодонтит или другие воспалительные заболевания периодонта, воспалительные нарушения кишечника (например, болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и воспалительное заболевание кишечника), астму (включая аллергическую астму), аллергии, хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ)), рассеянный склероз, псориаз и рак, анкилозирующий спондилит, системный склероз, псориатический артрит, воспалительный артрит, воспалительное заболевание суставов, аутоиммунное заболевание, включая аутоиммунный васкулит, рассеянный склероз, волчанку, диабет (например, инсулинозависимый диабет), воспалительное заболевание кишечника, отторжение трансплантата, болезнь "трансплантат-против-хозяина", и воспалительные состояния, являющиеся результатом деформации, растяжения, повреждения хряща, травмы, ортопедической хирургии, инфекции или других болезненных процессов. Под объем изобретения подпадают также другие заболевания, обусловленные дисфункцией иммунной системы, включая (но не ограничиваясь только ими) аллергии.
Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, наиболее предпочтительно применять для лечения, предупреждения или облегчения аутоиммунного заболевания и воспалительных состояний, в частности, воспалительных состояний, этиология которых включает аутоиммунный компонент, таких как артриты (например, ревматоидный артрит, артрит хронический прогредиентный и деформирующий артрит) и ревматические заболевания, включая воспалительные состояния и ревматические болезни, включающие потерю костной ткани, воспалительную боль, спондилоартропатии, включая анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, реактивный артрит, псориатический артрит и энтеропатический артрит, гиперчувствительность (включая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную
гиперчувствительность) и аллергии. Конкретные аутоиммунные заболевания, при которых можно применять биспецифические антитела, указанные в настоящем описании, включают аутоиммунные гематологические нарушения (включая, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, истинную эритрацитарную анемию и идиопатическую тромбоцитопению), системную красную волчанку, воспалительные мышечные нарушения, полихондрит, склеродерму, грануломатоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, идиоптическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (включая, например, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона и сидром разраженной толстой кишки), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз, юношеский диабет (сахарный диабет типа I), увеит (передний и задний), сухой кератоконъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит и гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, включая идиопатический нефротический синдром или минимальное изменение нефропатии), опухоли, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кожи и роговицы, миозит, расшатывание костных имплантов, метаболические нарушения, такие как атеросклероз, диабет и дислипидемия. Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, также можно применять для лечения, предупреждения или облегчения астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легких и других обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего указанным заболеванием.
Изобретение относится также к способу приготовления фармацевтической композиции, содержащей в эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении, в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем и к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в указанном способе.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым
носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы, или аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического агента, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего аутоиммунным заболеванием и воспалительными состояниями, в частности, воспалительными состояниями, этиология которых включает аутоиммунный компонент, такими как артриты (например, ревматоидный артрит, артрит хронический прогредиентный и деформирующий артрит) и ревматические заболевания, включая воспалительные состояния и ревматические болезни, включающие потерю костной ткани, воспалительную боль, спондилоартропатии, включая анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера, реактивный артрит, псориатический артрит и энтеропатический артрит, гиперчувствительность (включая как гиперчувствительность дыхательных путей, так и кожную гиперчувствительность) и аллергии. Конкретные аутоиммунные заболевания, при которых можно применять биспецифические антитела, указанные в настоящем описании, включают аутоиммунные гематологические нарушения (включая, например, гемолитическую анемию, апластическую анемию, истинную эритрацитарную анемию и идиопатическую тромбоцитопению), системную красную волчанку, воспалительные мышечные нарушения, полихондрит, склеродерму, грануломатоз Вегенера, дерматомиозит, хронический активный гепатит, тяжелую псевдопаралитическую миастению, псориаз, синдром Стивенса-Джонсона, идиоптическую спру, аутоиммунное воспалительное заболевание кишечника (включая, например, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона и сидром разраженной толстой кишки), эндокринную офтальмопатию, болезнь Грейвса, саркоидоз, рассеянный склероз, первичный билиарный цирроз, юношеский диабет (сахарный диабет типа I),
увеит (передний и задний), сухой кератоконъюнктивит и весенний кератоконъюнктивит, интерстициальный фиброз легких, псориатический артрит и гломерулонефрит (с нефротическим синдромом и без него, например, включая идиопатический нефротический синдром или минимальное изменение нефропатии), опухоли, рассеянный склероз, воспалительное заболевание кожи и роговицы, миозит, расшатывание костных имплантов, метаболические нарушения, такие как атеросклероз, диабет и дислипидемия. Биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, также можно применять для лечения, предупреждения или облегчения астмы, бронхита, пневмокониоза, эмфиземы легких и других обструктивных или воспалительных заболеваний дыхательных путей.
Другим объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, которая содержит биспецифическое антитело к TWEAK/IL17, указанное в настоящем описании, приготовленная в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, например, для применения в любом из указанных выше терапевтических способов.
В контексте настоящего описания понятие "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, антибактериальным и противогрибковым агентам, регулирующим изотоничность и замедляющим абсорбцию/ресорбцию агентам и подобным веществам, которые являются физиологически совместимыми. Предпочтительно носитель должен быть пригоден для инъекции или инфузии.
Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить различными методами, известными в данной области. Как должно быть очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов.
Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии. Применение указанных сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. Помимо воды носитель может представлять собой, например, изотонический забуференный физиологический раствор.
В другом варианте осуществления фармацевтический препарат включает любое из биспецифических антител к TWEAK/IL17, указанных в настоящем описании, и по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, например, указанное ниже.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять индивидуально или в сочетании с другими предназначенными для терапии агентами. Например, антитело, предлагаемое в изобретении, можно применять совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтически средством. В некоторых вариантах осуществления изобретения дополнительное терапевтическое средство представляет собой иммуносупрессорные или иммуномодулирующие средства или другие противовоспалительные средства. Например, биспецифические антитела, указанные в настоящем описании, можно применять в комбинации с DMARD, например, солями золота, сульфасалазином, противомалярийными средствами, метотрексатом, D-пеницилламином, азатиоприном, микофеноловой кислотой, циклоспорином А, такролимусом, сиролимусом, миноциклином, лефлуномидом, глюкокортикоидами; ингибитором кальциневрина, например, циклоспорином А или FK 506; модулятором рециркуляции лимфоцитов, например, FTY720 и аналогами FTY720; ингибитором mTOR, например, рапамицином, 40-О-(2-гидроксиэтил)рапамицином, CCI779, АВТ578, АР23573 или TAFA-93; аскомицином, обладающим иммуносупрессорным действием, например, АВТ-281, ASM981 и т.д.; кортикостероидами; циклофосфамидом; азатиопреном; метотрексатом; лефлуномидом; мизорибином; микофеноловой кислотой; микофенолатом мофетила; 15-дезоксиспергуалином или его иммуносупрессорным гомологом, аналогом или производным; иммуносупрессорными моноклональными антителами, например, моноклональными антителами к рецепторам лейкоцитов., например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD7, CD8, CD25, CD28, CD40. CD45, CD58, CD80, CD86 или их лигандам; другими иммуномодулирующими соединениями, например, рекомбинантными связывающими молекулами, которые имеют по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутанта, например, по меньшей мере часть внеклеточного домена CTLA4 или его мутанта, сцепленную с не включающей CTLA4 белковой последовательностью, например, CTLA4Ig
(например, с регистрационным номером АТСС 68629) или ее мутантом, например, LEA29Y; ингибиторами молекул адгезии, например, антагонистами LFA-1, антагонистами ICAM-1 или -3, антагонистами VCAM-4 или антагонистами VLA-4; или химиотерапевтическим средством, например, паклитакселом, гемцитабином, цисплатином, доксорубицином или 5-фторурацилом; анти-TNF агентами, например, моноклональными антителами к TNF, например, инфликсимабом, адалимумабом, CDP870, или рецептроными конструкциями с TNF-RI или TNF-RII, например, этанерцептом, ПЭГ-TNF-RI; блокаторами провоспалительных цитокинов, IL-1-блокаторами, например, анакинра или IL-1 trap, AAL160, ACZ 885, блокаторами IL-6; блокаторами хемокинов, например, ингибиторами или активаторами протеаз, например, металлопротеаз, антителами к IL-15, антителами к IL-6, антителами к IL-23 антителами к CD20, НСПВС, такими как аспирин или противоинфекционные средства (перечень не ограничен указанными агентами).
Указанные выше комбинированные терапии предусматривают совместное введение (при котором два или большее количество терапевтических средств включают в одну препаративную форму или в различные препаративные формы) и раздельное введение, в каждом случае введение антитела, предлагаемого в изобретении, можно осуществлять до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического средства и/или адъюванта.
Антитело, предлагаемое в изобретенной любое дополнительное терапевтическое средство), можно вводить любыми приемлемыми путями, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный и при необходимости применять для местной обработки, введения в повреждение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять любым приемлемым путем, например, путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости, в том числе, от того, является ли лечение кратковременным или хроническим. Можно применять различные схемы дозирования, включая (но не ограничиваясь только ими) однократное введение или несколько введений в различные моменты времени, болюсное введение и пульсирующую инфузию.
Антитела, предлагаемые в изобретении, можно включать в состав композиций, дозировать и вводить в соответствии с надлежащей клинической практикой. Рассматриваемые в этом контексте факторы включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние индивидуального пациента, причину нарушения, область введения агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим медикам. Антитело можно, но это не является обязательным, включать в композицию в сочетании с одним или несколькими другими средствами, которые в настоящее время применяют для лечения рассматриваемого нарушения. Эффективное количество указанных других агентов зависит от количества антитела, присутствующего в композиции, типа нарушения или лечения и других указанных выше факторов. Их, как правило, применяют в таких же дозах и с использованием таких же путей введения, которые указаны в настоящем описании, или в количестве, составляющем от 1 до 99% от дозы, указанной в настоящем описании, или в любой дозе и с помощью любого пути, которые по данным эмпирической/клинической оценки являются пригодными.
Для предупреждения или лечения заболевания приемлемая доза антитела, предлагаемого в изобретении (при его применении индивидуально или в сочетании с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими средствами), должна зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, типа антитела, серьезности и течения болезни, применяют ли антитело для превентивных или терапевтических целей, предшествующей терапии, истории болезни пациента и ответа на антитело, а также от предписания лечащего врача. Антитело можно вводить пациенту однократно или в виде серий обработок. В зависимости от типа и серьезности заболевания примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,5-10 мг/кг) антитела может представлять собой начальную возможную дозу для введения пациенту, например, с помощью одной или нескольких отдельных обработок или с помощью непрерывной инфузии. Одним из примеров типичных суточных доз может являться доза, составляющая от примерно 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от указанных выше факторов. При использовании повторных введений в течение нескольких дней или более длительного периода времени, в
зависимости от состояния, лечение, как правило, следует продолжать до достижения требуемого подавления симптомов заболевания. Одним из примеров доз антитела является доза, составляющая от примерно 0,05 до примерно 10 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или несколько следующих доз: примерно 0,5, 2,0, 4,0 или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Указанные дозы можно вводить дробно, например, каждую неделю или каждые три недели (например, так, чтобы пациент получал от примерно двух до примерно двадцати, например, примерно шесть доз антитела). Можно применять начальную повышенную ударную дозу с последующим введением одной или нескольких более низких доз. Примеры схем дозирования указаны выше. Однако можно применять другие схемы введения доз. С помощью общепринятых методов и анализов можно легко осуществлять мониторинг действия указанной терапии.
Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в настоящем изобретении, которые можно применять в приемлемой гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.
Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, могут варьироваться так, чтобы получать количество действующего вещества, которое является эффективным для получения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, не являясь при этом токсичными для пациента (эффективное количество). Выбранный уровень доз должен зависеть от разнообразных
фармакокинетических факторов, таких как активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или их сложных эфиров, солей или амидов, путь введения, продолжительность введения, скорость экскреции конкретного применяемого соединения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в сочетании с конкретными композициями, возраст, пол, вес, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни пациента, подлежащего лечению, и подобных факторов, которые хорошо известны в медицине.
Изделия
Следующим объектом изобретения является изделие, которое содержит продукты, применяемые для лечения, предупреждения и/или диагностирования указанных выше нарушений. Изделие представляет собой контейнер и этикетку или листовку-вкладыш в упаковку, которые размещены на контейнере или вложены в него. Приемлемыми контейнерами являются, например банки, пузырьки, шприцы, пакеты для внутривенного (IV) раствора и т.д. Контейнеры можно изготавливать из различных материалов, таких как стекло или пластмасса. Контейнер содержит композицию, которая сама или в сочетании с другой композицией является эффективной для лечения, предупреждения и/или диагностирования состояния, и может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или пузырек, снабженный пробкой, которую можно прокалывать с помощью иглы для подкожных инъекций). По меньшей мере одно действующее вещество в композиции представляет собой антитело, предлагаемое в изобретении. На этикетке или листовке-вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит антитело, предлагаемое в изобретении; и (б) второй контейнер с находящейся в нем композицией, где композиция содержит дополнительное цитотоксическое или иное терапевтическое средство. Согласно этому варианту осуществления изобретения изделие может содержать листовку-вкладыш в упаковку, которая содержит информацию о том, что композиции можно использовать для лечения конкретного состояния. В альтернативном или дополнительном варианте изделие может дополнительно включать второй (или третий) контейнер с фармацевтически приемлемым буфером, таким как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), забуференный фосфатом физиологический раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, оно может включать другие продукты, необходимые с коммерческой точки зрения и с точки зрения потребителя, в частности, другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Описание последовательностей
SEQ ID NO:
CDR1H 301
SEQ ID NO:
CDR2H 301
SEQ ID NO:
CDR3H 301
SEQ ID NO:
CDR1L 301
SEQ ID NO:
CDR2L 301
SEQ ID NO:
CDR3L 301
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) 301
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен легкой цепи (VL) 301
SEQ ID NO:
CDR1H 304
SEQ ID NO:
CDR2H 304
SEQ ID NO:
CDR3H 304
SEQ ID NO:
CDR1L 304
SEQ ID NO:
CDR2L 304
SEQ ID NO:
CDR3L 304
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) 304
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен легкой цепи (VL) 304
SEQ ID NO:
CDR1H 305
SEQ ID NO:
CDR2H 305
SEQ ID NO:
CDR3H 305
SEQ ID NO:
CDR1L 305
SEQ ID NO:
CDR2L 305
SEQ ID NO:
CDR3L 305
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен тяжелой цепи (VH) 305
SEQ ID NO:
кроличий вариабельный домен легкой цепи (VL) 305
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС1
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС2
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НСЗ
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС4
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС5
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС6
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС7
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС8
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС9
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС10
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 305-НС11
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC1
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC2
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC3
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC4
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC5
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC6
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC7
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC8
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC9
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC10
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 305-LC11
SEQ ID NO:
CDR1H 9С6-2В6
SEQ ID NO:
CDR2H 9C6-2B6
SEQ ID NO:
CDR3H 9С6-2В6
SEQ ID NO:
CDR1L 9C6-2B6
SEQ ID NO:
CDR2L 9C6-2B6
SEQ ID NO:
CDR3L 9C6-2B6
SEQ ID NO:
мышиный вариабельный домен тяжелой цепи (VH), 9С6-2В6
SEQ ID NO:
мышиный вариабельный домен легкой цепи (VL) 9С6-2В6
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 9С6-2В6-НС134
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VH, 9С6-2В6-НС136
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 9C6-2B6-LC134
SEQ ID NO:
гуманизированный вариант VL, 9C6-2B6-LC136
SEQ ID NO
константная область человеческой легкой каппа-цепи
SEQ ID NO
константная область человеческой легкой лямбда-цепи
SEQ ID NO
константная область человеческого IgGl (кавказский аллотип)
SEQ ID NO
константная область человеческого IgGl (афроамериканский аллотип)
SEQ ID NO
мутант L234A/L235A человеческого IgGl (кавказский аллотип)
SEQ ID NO
мутант L234A/L235A/P329G человеческого IgGl (кавказский аллотип)
SEQ ID NO
константная область человеческого IgG4
SEQ ID NO
мутант S228P/L235E человеческого IgG4
SEQ ID NO
мутант S228P/L235E/P329G человеческого IgG4
SEQ ID NO
человеческий TWEAK
SEQ ID NO
мышиный TWEAK
SEQ ID NO
человеческий IL17 (IL17А)
SEQ ID NO
человеческий IL17B
SEQ ID NO
человеческий IL17C
SEQ ID NO
человеческий IL17D
SEQ ID NO
человеческий IL17E
SEQ ID NO
человеческий IL17F
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №2 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №2 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №2 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №2 - конструкция легкой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №4 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №4 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №4 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №5 - конструкция тяжелой цепи
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №5 - конструкция легкой цепи
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №20 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №20 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №20 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №21 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №21 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №21 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №23 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №23 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №23 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №24 - конструкция тяжелой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №24 - конструкция тяжелой цепи 2
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №24 - конструкция легкой цепи 1
SEQ ID NO
биспецифическое антитело №24 - конструкция легкой цепи 2
SEQ ID NO
человеческий Fnl4 (рецептор TWEAK)
SEQ ID NO
человеческий IL6
SEQ ID NO
100
человеческий IL8
Ниже перечислены варианты осуществления изобретения: 1. Биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй
антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим IL17.
2. Биспецифическое двухвалентное антитело по варианту осуществления изобретения 1, где биспецифическое антитело ингибирует
а) индуцируемую TWEAK пролиферацию человеческих
фибробластподобных синовиоцитов, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50, составляющей 0,2нМ
или менее; и
б) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50, составляющей 3,0нМ
или менее; и
в) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL8 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА), что характеризуется величиной IC50, составляющей 2,0нМ
или менее.
3. Биспецифическое двухвалентное антитело по варианту осуществления изобретения 1, отличающееся тем, что биспецифическое антитело является двухвалентным.
4. Биспецифическое антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-3, отличающееся тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
а) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 18,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 19, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 21, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 22; или
б) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 1, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 2,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 3, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 5, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 6; или
в) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 10,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 11, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 13, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 14; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит
II)
CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 47, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 48, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 49, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 51, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 52.
5. Химерный или гуманизированный вариант биспецифического антитела по варианту осуществления изобретения 4.
6. Биспецифическое антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-3, отличающееся тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 25, SEQ ID
NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 46; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55 или SEQ
ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58.
7. Биспецифическое антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-3, отличающееся тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит
а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58; или
б) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
8. Биспецифическое антитело по одному из вариантов осуществления изобретения 1-3, отличающееся тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58.
9. Биспецифическое антитело по одному из вариантов осуществления
изобретения 1-3, отличающееся тем, что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
10. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl или IgG4.
11. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl с мутациями L234A и L235A (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
12. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
13. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P и L235E (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
14. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления изобретения, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).
15. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит антитело по вариантам осуществления изобретения 1-14.
10.
16. Применение антитела по вариантам осуществления изобретения 1-14
для приготовления фармацевтической композиции.
17. Антитело по вариантам осуществления изобретения 1-14, предназначенное для применения для лечения рака или воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
18. Применение антитела по вариантам осуществления изобретения 1-14 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака или воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по вариантам осуществления изобретения 1-14.
20. Экспрессионные векторы, отличающиеся тем, что содержат нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 19, для экспрессии биспецифического антитела по вариантам осуществления изобретения 1-14 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.
21. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по варианту осуществления изобретения 20.
22. Способ получения рекомбинантного антитела по вариантам осуществления изобретения 1-14, отличающийся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту по варианту осуществления изобретения 19 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют указанное антитело из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры.
23. Способ лечения пациента, страдающего раком или воспалительными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной
17.
дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением, отличающийся тем, что вводят пациенту антитело по вариантам осуществления изобретения 1-14.
Приведенные ниже примеры и перечень последовательностей даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого представлен в прилагаемой формуле изобретения. Следует понимать, что в изложенные процессы можно вносить модификации без отклонения от сущности изобретения.
Примеры
Материалы и общие методы
Общая информация, касающаяся нуклеотидных последовательностей легких и тяжелых цепей человеческого иммуноглобулина, представлена у Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991. Аминокислоты цепей антител пронумерованы по Кэботу согласно EU-индексу (Kabat Е.А. и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
Методы рекомбинантной ДНК
Для манипуляций с ДНК использовали стандартные методы, описанные у Sambrook J. и др., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989. Реагенты для молекулярной биологии использовали согласно инструкциям производителей.
Синтез генов
Требуемые сегменты генов можно получать из олигонуклеотидов, созданных путем химического синтеза. Осуществляли сборку генных сегментов, которые фланкированы уникальными сайтами, распознаваемыми рестрикционными эндонуклеазами, путем отжига и лигирования олигонуклеотидов, включая ПЦР-амплификацию и последующее клонирование через указанные сайты рестрикции, например, KpnI/SacI или AscI/PacI в клонирующем векторе pGA4, основой которого является плазмида pPCRScript
(фирма Stratagene). Последовательности ДНК субклонированных генных фрагментов подтверждали путем секвенирования ДНК.
Синтез генных фрагментов осуществляли в порядке, представленном в спецификации фирмы Geneart (Регенсбург, Германия).
Все сегменты генов, кодирующие легкие и тяжелые цепи биспецифических антител к Tweak/IL-17, синтезировали с 5'-концевой ДНК-последовательностью, кодирующей лидерный пептид, который направляет секрецию белков в эукариотических клетках, и с уникальными сайтами рестрикции на 5'- и 3'-концах синтезированного гена. ДНК-последовательности, кодирующие тяжелые цепи, стабилизированные дисульфидным мостиком, модифицированные с помощью "knobs-into Ьо1е"-технологии, создавали, используя мутации S354C и T366W в несущей "выступы" тяжелой цепи и мутации Y349C, T366S, L368A и Y407V в несущей "впадину" тяжелой цепи.
Определение последовательностей ДНК
Последовательности ДНК определяли путем секвенирования двух цепей на фирме MediGenomix GmbH (Мартинсрид, Германия) или фирме Sequiserve GmbH (Фатерштеттен, Германия).
Анализ последовательностей ДНК и белков и обработка данных о последовательностях
Для создания, картирования, анализа, аннотирования и иллюстрации последовательностей применяли пакет программ фирмы GCG (Genetics Computer Group, Мэдисон, шт. Висконсин), версия 10.2 и Infomax's Vector NT1 Advance suite, версия 11.5.
Экспрессионные векторы
Для экспрессии описанных антител применяли варианты экспрессионных плазмид, предназначенных для кратковременной экспрессии (например, в клетках НЕК293 EBNA или HEK293-F) или для стабильной экспрессии (например, в СНО-клетках) на основе либо кДНК-конструкции с использованием промотора CMV-интрона А, либо на основе геномной конструкции с использованием промотора CMV.
В случае конструкции IgG4_SPLE интрон между СН1-доменом и шарнирной областью удаляли, сохраняя геномную организацию (конструкцию) оставшейся части гена антитела. Версия с удаленным интроном IgG4_SPLE
более не соответствовала антителам с удаленной шарнирной областью в результате связанного со сплайсингом артефакта, обычно встречающегося в IgG4_SPLE, кодируемой полной геномной конструкцией.
Помимо кассеты экспрессии антитела векторы содержали:
- сайт инициации репликации, обеспечивающий репликацию указанной плазмиды в Е. coli, и
- ген Р-лактамазы, который придает устойчивость Е. coli к ампициллину. Транскрипционная единица гена антитела состояла из следующих
элементов:
- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 5'-конце,
- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса,
- расположенная за ним последовательность интрона А в случае экспрессии на основе кДНК-конструкции,
- 5'-нетранслируемая область гена человеческого антитела,
- сигнальная последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина,
- цепь человеческого антитела (тяжелая цепь, модифицированная тяжелая цепь или легкая цепь) либо в виде кДНК-конструкции, либо в виде геномной организации с экзон-интронной конструкцией иммуноглобулина,
- З'-нетранслируемая область с сигнальной последовательностью полиаденилирования и
- уникальный(ые) сайт(ы) рестрикции на 3'-конце.
Для кратковременных и стабильных трансфекций создавали бблыпие количества плазмид посредством получения плазмид из трансформированных культур Е. coli (набор Nucleobond АХ, фирма Macherey-Nagel).
Методики культивирования клеток
Применяли стандартные методики культивирования клеток, описанные в Current Protocols in Cell Biology, под ред. Bonifacino J.S., Dasso M., Harford J.B., Lippincott-Schwartz J. и Yamada K.M., изд-во John Wiley & Sons, Inc., 2000. Кратковременные трансфекции в системе HEK293-F Рекомбинантные варианты иммуноглобулинов получали путем кратковременной трансфекции клеток почки человеческого эмбриона линии 293-F, используя экспрессионную систему FreeStyle(tm) 293 согласно инструкции
производителя (фирма Invitrogen, США). В целом, метод состоял в следующем: суспензию клеток FreeStyle(tm) 293-F культивировали в среде для экспрессии FreeStyle(tm) 293 при 37°С/8% СОг и клетки высевали в свежую среду с плотностью 1-2x106 жизнеспособных клеток/мл в день трансфекции. Приготавливали комплексы nHK-293fectin(tm) в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл 293fectin(tm) (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК тяжелой и легкой цепи в молярном соотношении 1:1 на 250 мл конечного объема для трансфекции в случае моноспецифических родительских антител. Комплексы, включающие ДНК, полученную с помощью технологии "knobs-into hole", и 293fectin, с двумя тяжелыми и одной легкой цепью приготавливали в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл 293fectin(tm) (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК полученных с помощью технологии "knobs-into hole" тяжелой цепи 1 и 2 и легкой цепи, как правило, в молярном соотношении 1:1:1 на 250 мл конечного объема для трансфекции (для формата, описанного в WO 2011/117330 ("биспецифические антитела в виде scFab с одним плечом")). Для оптимизации выхода продукта экспрессии и качества продукта соотношение можно изменять. Комплексы flHK-293fectin приготавливали в среде Opti-MEM I (фирма Invitrogen, США), используя 325 мкл 293fectin(tm) (фирма Invitrogen, Германия) и 250 мкг плазмидной ДНК полученных с помощью технологии "knobs-into hole" тяжелой цепи 1 и 2 и легкой цепи 1 и 2 в молярном соотношении 1:1:1:1 на 250 мл конечного объема для трансфекции (для формата, описанного в WO 2009/080253 (антитела, полученные с помощью технологии "CrossMabs" или антитела "с заменой CHl-CL-доменов")). Для оптимизации выхода продукта экспрессии и качества продукта соотношение можно изменять. Содержащие антитело супернатанты клеточной культуры собирали через 7 дней после трансфекции путем центрифугирования при 14000 g в течение 30 мин и фильтровали через стерильный фильтр (0,22 мкм). Супернатанты хранили при -20°С до очистки.
Определение белка
Концентрацию белков очищенных антител и их производных определяли на основе оптической плотности (ОП) при 280 нм, используя коэффициент
молярной экстинкции, рассчитанный на основе аминокислотной последовательности согласно методу, который описан у Расе и др., Protein Science, 1995, 4, сс. 2411-1423.
Определение концентрации антител в супернатантах Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур определяли путем иммунопреципитации с белок А-агарозными гранулами (фирма Roche). 60 мкл белок А-агарозных гранул отмывали трижды в TBS-NP40 (50мМ Трис, рН 7,5, 150мМ NaCl, 1% Nonidet-P40). Затем 1-15 мл супернатанта клеточной культуры наносили на белок А-агарозные гранулы, предварительно уравновешенные в TBS-NP40. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре гранулы отмывали на фильтрующей колонке типа Ultrafree-MC (фирма Amicon), используя однократно 0,5 мл TBS-NP40, дважды 0,5 мл двукратного (2х) забуференного фосфатом физиологического раствора (2> <ЗФР, фирма Roche) и быстро четыре раза 0,5 мл ЮОмМ Na-цитратного буфера, рН 5,0. Связанное антитело элюировали, добавляя 35 мкл буфера для образцов NuPAGE(r) LDS (фирма Invitrogen). Половину образца объединяли с восстановителем для образцов NuPAGE(r) или оставляли в невосстановленной форме соответственно и выдерживали в течение 10 мин при 70°С. Затем по 20 мкл применяли для осуществления ДСН-ПААГ с использованием 4-12% бис-Трис-гелей NuPAGE(r) (фирма Invitrogen) (применяя буфер MOPS для осуществлении ДСН-ПААГ в невосстанавливающих условиях и буфер MES в виде подвижного буфера с антиоксидантной добавкой NuPAGE(r) (фирма Invitrogen) для осуществлении ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях) и окрашивали кумасси бриллиантовым голубым.
Концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали количественно с помощью аффинной ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: супернатанты, содержащие антитела и их производные, которые связывались с белком А, наносили на колонку с белком А типа HiTrap (фирма GE Healthcare) в 50мМ К2НР04, ЗООмМ NaCl, рН 7,3 и элюировали из матрицы с помощью 550мМ уксусной кислоты, рН 2,5, используя ЖХВР-систему Dionex. Элюированный белок оценивали количественно с помощью УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. Очищенное стандартное антитело в виде IgGl служило в качестве стандарта.
В альтернативном варианте концентрацию антител и их производных в супернатантах клеточных культур оценивали с помощью "сэндвич"-^0-ЕЫ8А. В целом, метод состоял в следующем: 96-луночные титрационные микропланшеты, обладающие высокой способностью связывать стрептавидин А (планшеты типа StreptaWell High Bind Strepatavidin А (фирма Roche)), сенсибилизировали из расчета 100 мкл/лунку биотинилированным античеловеческим IgG F(ab')2 BI, применяемым в качестве "захватывающей" молекулы (фирма Dianova), в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 1 ч при комнатной температуре или в другом варианте в течение ночи при 4°С и затем отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФР, 0,05% Твин (ЗФРТ, фирма Sigma). Добавляли в лунки по 100 мкл/лунку серийных разведений в ЗФР (фирма Sigma) супернатантов клеточных культур, содержащих соответствующее антитело, и инкубировали в течение 1 -2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Лунки отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное антитело выявляли с помощью 100 мкл F(ab')2 POD (фирма Dianova) в концентрации 0,1 мкг/мл в качестве идентифицирующего антитела в течение 1 -2 ч на шейкере для титрационных микропланшетов при комнатной температуре. Несвязанное идентифицирующее антитело отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку ЗФРТ, и связанное идентифицирующее антитело выявляли, добавляя 100 мкл ABTS/лунку. Определение абсорбции осуществляли на спектрометре типа Тесап Fluor при длине волны 405 нм (длина референс-волны 492 нм). Очистка биспецифических антител
Биспецифические антитела очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии, используя белок A-Sepharose(tm) (фирма GE Healthcare, Швеция) и гель-фильтрацию с помощью Superdex200. В целом, метод состоял в следующем: стерильные профильтрованные супернатанты клеточных культур наносили на HiTrap ProteinA HP-колонку (5 мл), уравновешенную ЗФР-буфером (ЮмМ Na2HP04, 1мМ КН2Р04, 137мМ NaCl и 2,7мМ КС1, рН 7,4). Несвязанные белки отмывал с помощью буфера для уравновешивания, Антитело и варианты антител элюировали 0,1М цитратным буфером, рН 2,8, и содержащие белок фракции нейтрализовали с помощью 0,1 мл 1М Трис, рН 8,5. Затем элюированные белковые фракции объединяли, концентрировали, используя,
например, центрифужный концентратор типа Amicon Ultra (MWCO (молекулярновесовой предел): ЗОК, Millipore) до объема 3 мл и наносили на колонку для гель-фильтрации Superdex200 HiLoad 120 мл 16/60 (фирма GE Healthcare, Швеция), уравновешенную 20мМ гистидином, 140мМ NaCl, рН 6,0. Фракции, содержащие очищенные биспецифические антитела, в которых содержание агрегатов с высокой молекулярной массой составляло менее 5%, объединяли и хранили в виде аликвот с концентрацией 1,0 мг/мл при -80°С. ДСН-ПААГ
Применяли систему геля NuPAGE(r) Pre-Cast (фирма Invitrogen) согласно инструкции производителя. В частности использовали 4-20% NuPAGE(r) Novex(r) Трис-глициновые Pre-Cast-гели и подвижный Трис-глициновый буфер с ДСН Novex(r), Для достижения восстановления образцов добавляли восстановитель для образцов NuPAGE(r) перед разделением в геле.
Аналитическая гель-фильтрация
В качестве гель-фильтрации, предназначенной для определения агрегированного и олигомерного состояния антител, применяли ЖХВР-хроматографию. В целом, метод состоял в следующем: очищенные на белке А антитела наносили на колонку типа Tosoh TSKgel G3000SW в ЗООмМ NaCl, 50мМ КН2РО4/К2НРО4, рН 7,5 при применении ЖХВР-системы Agilent 1100, или на колонку Superdex 200 (фирма GE Healthcare) в 2 * ЗФР при применении ЖХВР-системы Dionex. Количество элюированного белка определяли на основе измерения УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта применяли стандарт для гель-фильтрации фирмы BioRad (Gel Filtration Standard 151-1901).
Масс-спектрометрия
Общую дегликозилированную массу биспецифических антител определяли и подтверждали с помощью масс-спектрометрии с ионизацией электроспреем (ESI-MC). Кроме того, выявляли возможные побочные продукты, такие как продукты ошибочного спаривания LC и НС и определяли их относительное количество. В целом, метод состоял в следующем: 100 мкг очищенных антител, концентрация белка в которых составляла вплоть до 3 мг/мл, дегликозилировали с помощью 14 или 28 ед. N-гликозидазы F (фирма Roche) в ЮОмМ NaH2P04/Na2HP04, рН 7 при 37 или 45°С в течение 16 или 2 ч и затем
обессоливали с помощью ЖХВР на колонке Sephadex G25 (фирма GE Healthcare). Массу соответствующих тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC после дегликозилирования и восстановления. В целом, метод состоял в следующем: 50 мкг антитела в 115 мкл инкубировали в течение 30 мин при 37°С с 60 мкл 0,5М ТСЕР в 4М гидрохлориде гуанидида и 50 мл 8М гидрохлорида гуанидида и затем обессоливали. Общую массу и массу восстановленных тяжелых и легких цепей определяли с помощью ESI-MC с использованием МС-системы maXis UHR-TOF (фирма Bruker), снабженной источником TriVersa NanoMate (фирма Advion). Пример 1
Получение сайтов связывания антигена TWEAK посредством иммунизации (Получение родительских антител к TWEAK, из которых можно получать сайты связывания антигена TWEAK для биспецифических антител к TWEAK/IL17) Иммунизация кроликов человеческим/мышиным TWEAK Новозеландских белых кроликов (Oryctolagus cuniculus) иммунизировали путем введения 400 мкг рекомбинантного человеческого TWEAK в полном адъюванте Фрейнда в день 0, 200 мкг человеческого TWEAK в дни 21, 43 и 65 в неполном адъюванте Фрейнда и 200 мкг мышиного TWEAK в день 85 в неполном адъюванте Фрейнда. Все иммунизации осуществляли подкожно в несколько точек. Сыворотку для определения титров получали в дни 77 и 98. Конечную ревакцинацию осуществляли путем внутривенной инъекции 200 мкг человеческого и 200 мкг мышиного растворимого TWEAK и антитела отбирали на основе их способности связываться с человеческим или мышиным TWEAK (пример 2), способности нейтрализовать взаимодействие человеческих и мышиных TWEAK/Fnl4 (примеры 4 и 5) и способности ингибировать секрецию IL8 (пример 6). Кроме того, определяли время полужизни комплекса антитело-TWEAK (пример 3). Противоопухолевую эффективность антитела тестировали с использованием моделей ксенотрансплантатов B16BL6 (мышиная меланома; метастатическая легочная сублиния В16), SJSА (остеосаркома, АТСС CRL-2098) и НСТ-116 (ободочная кишка, АТСС CCL-247).
Пример 2
Связывание с человеческим и мышиным TWEAK (ELISA) Связывание родительских антител к TWEAK с человеческим и мышиным TWEAK оценивали с помощью ELISA. Человеческий или мышиный рекомбинантный TWEAK иммобилизовали на 384-луночном планшете Maxisorp (фирма Nunc) в дозе 1 мкг/мл, 25 мкл/лунку в 0,5М карбонатном буфере для сенсибилизации, рН 9,5, путем инкубации в течение ночи при 2-8°С. После блокады планшета с помощью ЗФР/1% БСА в течение 1 ч при комнатной температуре осуществляли две стадии отмывки (0,1% Tween(r) 20 в ЗФР) и инкубацию с антителами к TWEAK в различных концентрациях в блокирующем буфере или с супернатантами гибридомы указанных антител в течение 1 ч при комнатной температуре. После еще четырех отмывок антитела идентифицировали с помощью конъюгированного с HRP антикроличьего антитела, разведенного в соотношении 1:5000 в блокирующем буфере, в течение 1 ч при комнатной температуре. Сигнал обнаруживали путем добавления ABTS(r) (фирма Roche Diagnostics GmbH) в течение 10-30 мин после еще четырех стадий отмывки. Абсорбцию считывали при 405 нм. Пример 3
Определение времени полжизни комплексов антитело-TWEAK с помощью Biacore-анализа
Применяли устройство Biacore 2000 с использованием сенсибилизированного стрептавидином (SA) Biacore-сенсора, входящего в систему. Использовали входящий в систему буфер HBS-ET (ЮмМ HEPES, рН 7,4, 150мМ NaCl, 1мМ ЭДТК, 0,05% Tween(r) 20) со скоростью потока 100 мкл/мин. Буфер для образца представлял собой входящий в систему буфер. Биотинилированный человеческий растворимый TWEAK (аминокислоты 99-249 SEQ ID NO: 68) и биотинилированный мышиный растворимый TWEAK (аминокислоты 81-225 SEQ ID NO: 69) иммобилизовали на различных проточных ячейках на SA-сенсоре, каждый из расчета 150 RU. Проточную ячейку FC1 использовали в качестве контрольной референс-ячейки. Каждое антитело инъецировали в систему в виде анализируемого вещества в концентрации 1 ООнМ со скоростью 100 мкл/мин в течение 2 мин для оценки времени ассоциации. Мониторинг диссоциации иммунокомплексов
осуществляли в течение 5 мин. Поверхность сенсора отмывали HBS-ET в течение 10 с и регенерировали, осуществляя 2x2 мин инъекции ЮмМ глицина, рН 2,25. Эту процедуру осуществляли при 25°С. Расчет скорости реакции диссоциации kd [1/с] (программа Biacore Evaluation Software 4.0) проводили в интервале времени [240-300 с] на лимитирующей скорость процесса кинетической фазе диссоциации комплекса. Исходя из уравнения tj/2 дисс. = 1п(2)/(60 х kd) рассчитывали время полужизни иммунокомплексов в мин. Результаты представлены в таблицах 1а и 16, а также в таблице 26.
В дополнительном эксперименте определяли время полужизни комплексов
антитело-TWEAK (Ц/2 дисс. [мин] при 25°С) химерного антитела TW-305chi и
химерной версии антитела P2D10, описанного в WO 2006/130374 (оба химерных
антитела имели в качестве человеческих константных областей константную
область человеческой легкой каппа-цепи (SEQ ID NO: 59) и константную
область человеческого IgGl (SEQ ID NO: 61))
составляющее при 25°С 100 мин или более, предпочтительно 110 мин или более, по данным Biacore-анализа. Антитела к TWEAK, характеризующиеся указанным временем полужизни, являются особенно предпочтительными для применения при лечении аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, заболеваний костной ткани, например, дегенерации костной ткани при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения. Пример 4
Нейтрализация взаимодействия (человеческих) TWEAK-Fnl4 Блокаду взаимодействия человеческий TWEAK/человеческий Fnl4 оценивали с помощью ELISA, предназначенного для изучения взаимодействия с рецептором. 96-луночные планшеты Maxisorp(r) (фирма Nunc) сенсибилизировали, используя по 100 мкл/лунку взятого в концентрации 1 мкг/мл комплекса человеческие Fnl4:Fc (внеклеточный домен человеческого Fnl4 (аминокислоты 1-75, SEQ ID NO: 98), слитый с Fc-областью человеческого IgGl) в ЗФР, в течение 1,5 ч при комнатной температуре и блокировали с помощью 5%-ного раствора FBS в ЗФР в течение 30 мин при комнатной температуре при встряхивании. Параллельно инкубировали меченный с помощью Flag растворимый TWEAK (аминокислоты 106-249) в концентрации 2,5 нг/мл в блокирующем растворе с антителами к TWEAK в различных концентрациях или с супернатантом гибридомы в течение 2 ч при комнатной температуре при встряхивании. После однократной отмывки сенсибилизированного Fnl4 планшета с помощью буфера для отмывки (0,1% Tween(r) 20 в ЗФР) переносили по 100 мкл раствора антитела к TWEAK в каждую лунку, и планшет инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с последующими четырьмя отмывками буфером для отмывки. В лунки вносили 100 мкл идентифицирующего антитела к FLAG-HRP, разведенного в соотношении 1:5000 блокирующим буфером, и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После четырех дополнительных стадий отмывки сигнал обнаруживали путем добавления 100 мкл раствора 3,3,5,5-тетраметилбензидина (ТМВ) в течение примерно 10 мин. Реакцию прекращали, добавляя 100 мкл 1н.
IIC1, и измеряли абсорбцию при 450 нм (длина референс-волна 620 нм). Результаты представлены в таблице 2а и 26. Пример 5
Нейтрализация взаимодействия (мышиных) TWEAK-Fnl4 Взаимодействие мышиный TWEAK/мышиный Fnl4 оценивали с помощью ELISA согласно принципу, аналогичному описанному для человеческих белков, но с использованием другой системы обнаружения, поскольку мышиный растворимый TWEAK не метили. В целом, метод состоял в следующем: планшеты типа Maxisorp сенсибилизировали комплексом мышиный Fnl4:Fc (внеклеточный домен мышиного Fnl4 (аминокислоты 1-75 SEQ ID NO: 98), слитый с Fc-областью человеческого IgGl) согласно методу, описанному для человеческого комплекса Fnl4:Fc, с последующей блокадой и отмывкой. Мышиный растворимый TWEAK в концентрации 4 нг/мл предварительно инкубировали с антителами к TWEAK или супернатантом гибридомы в блокирующем буфере и 100 мкл смеси вносили в лунку сенсибилизированного Fnl4 планшета. После инкубации в течение 1 ч при комнатной температуре и четырех отмывок добавляли в течение 1 ч при комнатной температуре биотинилированное антитело к мышиному TWEAK в концентрации 125 нг/мл в блокирующем буфере, после чего осуществляли еще четыре стадии отмывки. Антитело к TWEAK выявляли инкубацией с комплексом стрептавидин-HRP, разведенным в соотношении 1:5000 в блокирующем буфере, в течение 30 мин при комнатной температуре. Получали сигнал и измеряли абсорбцию согласно описанному выше методу. Результаты представлены ниже в таблицах 2а и 26. Пример 6
Оценка секреции IL-8 с помощью ELISA
Блокаду активности TWEAK с помощью антител к TWEAK в клеточной системе.оценивали путем анализа секреции IL-8 с использованием клеток меланомы линии A375. По 10000 клеток линии A375 (АТСС № CRL1619) высевали в лунку 96-луночного планшета для культур клеток в 100 мкл питательной среды (среда DMEM, дополненная 4,5 г/л глюкозы, пируватом и GlutaMAX(tm)/10% FBS) и инкубировали при 37°С/5% С02 в течение 48 ч. Человеческий рекомбинантный растворимый TWEAK в концентрации 300 нг/мл предварительно инкубировали с антителами к TWEAK в различных
концентрациях в питательной среде в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем 50 мкл смеси добавляли в каждую лунку планшета для клеток с последующей 48-часовой инкубацией, что обеспечивало секрецию IL-8. Отбирали 20 мкл клеточного супернатанта после центрифугирования планшета в течение 5 мин при 200 х g и смешивали с 980 мкл калибровочного разбавителя RD5P, входящего в набор "CXCL8 Quantikine ELISA" (фирма R &D Systems). IL-8 выявляли с помощью ELISA согласно инструкциям производителя. Результаты представлены в таблицах 2а и 26.
Пример 7
Определение эпитопной области 301. 304. 305 (сокращенно обозначены как TW-301. TW-304. TW-305)
Применяли устройство Biacore 2000 и программное обеспечение Biacore Evaluation Software 4.0. Буфер для образца и для системы представлял собой HBS-ET, рН 7,4. Из-за сильного неспецифического связывания анализируемого вещества, т.е. TWEAK, с поверхностью сенсора эпитопное картирование индивидуальных антител было невозможно осуществлять с помощью
общепринятого Biacore-эксперимента на основе перекрестной конкуренции, описанного у Johne В. и др., J. Immun. Meth. 160, 1993, сс. 191-198.
Из-за индивидуальных биохимических особенностей белка TWEAK был разработан другой метод, основанный на применении TWEAK в качестве лиганда. Биотинилированный TWEAK иммобилизовали на сенсибилизированной стрептавидином поверхности чипа и определяли эпитопы, с которыми взаимодействуют последовательно инъецируемые антитела (антитело 1). Задачей являлось определение относительных уровней связывания вторичного антитела (антитело 2) в присутствии уже связанного первичного антитела. На основе указанных относительных уровней связывания рассчитывали коэффициент (Ат2/Ат1, молярное соотношение (MR), выраженное в %, таблица 3).
Осуществляли иммобилизацию 5нМ биотинилированного TWEAK со скоростью 20 мкл/мин в течение 1 мин на сенсибилизированной стрептавидином сенсорной проточной ячейке. Первичное и вторичное МАт последовательно инъецировали в систему со скоростью 10 мкл/мин в течение 4 мин, используя концентрацию каждого антитела ЮОнМ, вплоть до достижения насыщения соответствующих эпитопов TWEAK. В качестве эталона применяли сенсибилизированную SA проточную ячейку.
Систему отмывали с помощью HBS-ET в течение 20 с со скоростью 30 мкл/мин, после чего осуществляли две стадии регенерации в течение 1 мин, внося со скоростью 30 мкл/мин 6М GuadHCl и ЮОмМ НС1. Эти стадии регенерации позволяли отщеплять связанные МАт от сенсорной поверхности и осуществлять необратимую денатурацию иммобилизованного биотинилированного TWEAK. Процесс повторяли путем иммобилизации нативного биотинилированного белка TWEAK (периодический процесс с подпиткой) на той же самой проточной ячейке вплоть до полного насыщения сенсибилизированной стрептавидином сенсорной поверхности биотинилированным TWEAK.
Эксперимент по перекрестному блокированию продемонстрировал, что уровни доступности соответствующих антител составляли менее 10%, что находится на уровне "шума" в этом анализе. Таким образом, четко продемонстрировано, что антитела TW-301chi, TW-304chi и TW-305chi связываются с одной и той же эпитопной областью.
Пример 8
Ингибирование in vivo индуцированного коллагеном артрита (созданная на мышах модель ревматоидного артрита): антитело 305 (химерное: TW305) ингибирует индуцированный коллагеном артрит, т.е. созданную на мышах модель ревматоидного артрита
Самцов мышей линии DBA1/J mice (фирма Jackson Laboratory, Бар-Харбор, Майями), возрастом 6-8 недель иммунизировали бычьим коллагеном типа II в полном адъюванте Фрейнда и еще раз через 3 недели в неполном адъюванте Фрейнда (ревакцинация, день 0). Мышам вводили химерное антитело 305 (т.е. TW305) (10 мг/кг, п=12), энбрел (10 мг/кг, п=12) или наполнитель (забуференный фосфатом физиологический раствор, п=12) через день, начиная с для, предшествующего ревакцинации. У мышей оценивали признаки артрита в дни 0, 2, 5, 7, 9, 12 и 14 после ревакцинации. Серьезность артрита оценивали в баллах на основе следующих критериев: 1 - опухание и/или покраснение одного пальца; 2 - опухание двух или большего количества суставов; 3 - сильное опухание лапы, затрагивающее более двух суставов; 4 - серьезный артрит, затрагивающий всю лапу и пальцы. По сравнению с наполнителем антитело TW-305 значимо снижало клинические баллы (р <0,05, день 14) на такую же величину, что и блокатор TNF энбрел. Пример 9
Получение сайтов связывания антигена IL17 посредством иммунизации (Получение родительских антител к IL17. из которых можно получать сайты связывания антигена IL17 для биспецифических антител к TWEAK/IL17)
Иммунизацию 5 самок мышей Balb/c осуществляли в течение 20 недель, используя 250 (1*) и 100 мкг (Зх) рекомбинантного человеческого IL17 фирмы Peprotech (http://www.peprotech.com; каталожный № 200-17 в 1% ЗФР с 1% альбумина) на мышь.
Создание гибридом. Мышиные лимфоциты выделяли и сливали с клеточной линией мышиной миеломы, применяя стандартные протоколы с использованием ПЭГ для создания гибридом. Затем образовавшиеся гибридомы подвергали скринингу в отношении производства антигенспецифических антител. Из образовавшихся гибридом отбирали мышиный клон 9С6-2В6 на основе связывания с подтипами IL-17, осуществляя измерения с помощью ELISA и анализ высвобождения цитокинов (посредством ингибирования индуцируемого IL-17A высвобождения hIL-б и hIL-8). Гуманизация мышиного клона 9С6-2В6 позволила получать гуманизированные варианты 9С6-2В6-134 ( 9С6-2В6-НС134 с гуманизированным вариантом VH и 9С6-2В6-LC134 с гуманизированным вариантом VL, SEQ ID N0: 55 и 57) и 9С6-2В6 ( 9С6-2В6-НС136 с гуанизированным вариантом VH и 9С6-2B6-LC136 с гуманизированным вариантом VL, SEQ ID N0: 56 и 58). Пример 10
Связывание с IL-17 и кроссреактивность с подтипами IL17, оцененные с помощью ELISA
Планшеты NUNC(r) Maxisorp (96-луночные) сенсибилизировали рекомбинантным человеческим IL-17 (фирма Peprotech, № 200-17, www.peprotech.com) в концентрации 0,5 мкг/мл в ЗФР (100 мл/лунку). Планшеты инкубировали при 37°С на орбитальном шейкере с перемешиванием в течение 2 ч. Затем сенсибилизирующий раствор удаляли и добавляли по 100 мкл/лунку ЗФРТС (забуференный фосфатом физиологический раствор, 0,05% Tween(r)20, 2% куриной сыворотки). Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Блокирующий раствор удаляли и в планшет добавляли образцы (референс-контроль: PBSTC, образцы (10 мкг/мл в ЗФР): антитела к человеческому IL-17: 9С6-2В6, 9С6-2В6-134, 9С6-2В6-136, МАт 16-7178-85 фирмы eBioscience (www.ebioscience.com); МАт 317 фирмы R &D Systems (www.rndsystems.com), NVP-AIN-497 (WO 2006/013107) (100 мкл/лунку). Планшеты инкубировали при комнатной температуре с перемешиванием. Образцы удаляли, Планшеты отмывали трижды, используя по 200 мкл/лунку ЗФРТ (забуференный фосфатом физиологический раствор, 0,05 % Tween(r) 20), и добавляли вторичное антитело (конъюгированное с HRP козье антитело к мышиному IgG, Fc-гамма; Chemicon АР127Р, www.millipore.com) для
идентификации мышиных антител или конъюгированное с HRP козье антитело к человеческому IgG, Fc-гамма (Chemicon API 13Р) для идентификации гуманизированных антител. Вторичное антитело разводили в соотношении 1:10000 в ЗФРТС и планшеты инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с перемешиванием. Вторичное антитело удаляли, планшеты отмывали трижды, используя по 200 мкл/лунку ЗФРТ (забуференный фосфатом физиологический раствор, 0,05 % Tween(r) 20), и добавляли 100 мкл/лунку ABTS(r) (фирма Roche Diagnostics GmbH). Оптическую плотность измеряли при 405/492 нм относительно связывания с IL-17A (которое принимали за 100%). Связывание с другими подтипами человеческого IL-17 (IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E и IL-17F) осуществляли в таком же формате. Результаты представлены в таблице 4. Результаты продемонстрировали, что антитело с наиболее сходными характеристиками связывания с различными подтипами IL17, представляло собой МАт 317 фирмы R &D Systems (www.rndsystems.com).
Пример 11
Анализ высвобождения цитокинов. ингибирование индуцируемого IL-17A высвобождения hIL-б и hIL-8 в клетках CCD-25SK
Анализ осуществляли аналогично анализу определения производства hIL-8 клетками CCD-25SK (кожные фибробласты, АТСС No: CRL-1474) после стимуляции IL-17A и TNF-альфа с предварительной инкзгбацией с антителами к IL-17. Клетки CCD-25SK имеют рецептор IL-17. Растворимый IL-17A связывается с этим рецептором IL-17. Антитела к IL-17A связываются с IL-17A. Этот механизм имеет место только в присутствии TNF-альфа. При связывании IL-17A с рецептором IL-17 клетки продуцируют hIL-б и ML-8, которые можно обнаруживать с помощью ELISA, считывая показания. Данные измерений hIL-6
и hIL-8 дают информацию о том, в каких концентрациях антитела к IL-17 ингибируют стимуляцию клеток CCD-25SK с помощью IL-17.
Клетки CCD-25SK высевали с плотностью клеток 2,5x10 клеток/лунку в 48-луночный планшет (объем 0,45 мл/лунку) и инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СС"2. После инкубации в течение ночи клетки обрабатывали антителами к IL-17 в течение 30 мин в конечных концентрациях 9000; 3000; 1000; 333,3; 111,1; 37,03; 12,34 и 4,11 нг/мл. Все серии разведений антител осуществляли с использованием среды и применяли из расчета 50 мкл/лунку (10х концентрация). Через 30 мин клетки стимулировали смесью 10 нг/мл IL-17А и 50 пг/мл TNF-альфа. Добавляли по 50 мкл/лунку (10х концентрация) и инкубировали в течение 24 ч при 37°С и 5% СОг- После инкубации в течение ночи супернатанты переносили в 96-луночные планшеты и хранили в замороженном состоянии при -20°С в качестве промежуточных продуктов для оценки hIL-8 с помощью ELISA.
Оценку hIL-б и hIL-8 с помощью ELISA осуществляли следующим образом. Добавляли по 100 мкл разведенного захватывающего антитела в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 40ОС. Для разведений использовали буфер для сенсибилизации. Содержимое планшетов аспирировали, планшеты отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку, блокировали с помощью 200 мкл/лунку применяемого для анализа разбавителя и инкубировали в течение 1 ч при КТ. Содержимое планшетов аспирировали и отмывали трижды, используя 200 мкл/лунку. Добавляли по 100 мкл стандарта и образцов и инкубировали в течение 2 ч при КТ. Применяли стандартные серийные разведения: 400 пг/мл; 200 пг/мл; 100 пг/мл; 50 пг/мл; 25 пг/мл; 12,5 пг/мл; 6,3 пг/мл и применяемый для анализа разбавитель в качестве отрицательного контроля. Разведение образцов составляло 1:200. Содержимое планшетов аспирировали и отмывали 4 раза, используя 250 мкл/лунку. В каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгата. Конъюгат приготавливали с использованием идентифицирующего антитела и реагента, представляющего собой фермент, разведенных в соотношении 1:250 применяемом для анализа разбавителе. Содержимое планшетов аспирировали и планшеты отмывали 6 раз, используя 250 мкл/лунку. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата и инкубировали в течение 12 мин. После инкубации реакцию прекращали, добавляя 50 мкл/лунку 1М H2SO4.
Считывание осуществляли при 450 нм в течение 30 мин с коррекцией X при 570 нм. Результаты представлены в таблице 5 (величины IC50 относительно максимального ингибирования, составляющего 80%).
Пример 12
Перекрестная реактивность с IL-17 А обезьян циномолгус (анализ связывания)
Определяли относительное связывание с человеческим IL17A и IL17A обезьян циномолгус. Анализ связывания осуществляли согласно методу, описанному в примере 2. Результаты двух различных экспериментов (один, в котором осуществляли сравнение с мышиными антителами к IL17, и один, в котором осуществляли сравнение с человеческими и гуманизированными антителами к IL17) представлены в таблицах 6а и 66.
Пример 13
Анализ высвобождение цитокинов у обезьян циномолгус (яванский макак-крабоед Массаса fasicularis), ингибирование индуцируемого IL-17A производства IL-6 и IL-8 у обезьян циномолгус
Клетки кожных фибробластов обезьян циномолгус (CDF) продуцировали обезьяньи (циномолгус) IL-6 и IL-8 в ответ на стимуляцию IL-17A человека или обезьян циномолгус. Этот анализ осуществляли для оценки ингибирования стимулируемого IL-17A производства обезьяньих (циномолгус) IL-6 и IL-8 CDF-клетками после предварительной инкубации клеток с антителами к IL-17, образовавшимися против человеческого IL-17, до стимуляции.
CDF-клетки высевали с клеточной плотностью 2x105 клеток/мл в объеме 0,5 мл в 48-луночный планшет и инкубировали в течение ночи при 37°С и 5% СОг до прикрепления. После инкубации в течение ночи среду заменяли на 400 мкл свежей среды, и клетки обрабатывали антителами к IL-17 в течение 30 мин, используя следующий диапазон концентраций антител: 10000, 3000, 1000, 300, 100, 30, 10, 3, 0 нг/мл. Каждое серийное разведение антитела получали с использованием 50 мкл среды/лунку (10х концентрация). Через 30 мин клетки стимулировали с помощью 100 нг/мл IL-17A (50 мкл, 1000 нг/мл, (10х концентрация) и инкубировали в течение ночи (18 ч) при 37°С и 5% СОг. После периода инкубации супернатанты переносили в свежие пробирки и либо анализировали немедленно, либо хранили при -80°С до анализа с помощью ELISA. С помощью ELISA установлено, что hIL-б и hIL-8 обладали перекрестной реактивностью с соответствующими им цитокинами обезьян циномолгус и их применяли для количественной оценки уровней цитокинов. Для осуществления ELISA добавляли 100 мкл разведенного захватывающего антитела в каждую лунку и инкубировали в течение ночи при 4°С. Для разведения использовали буфер для сенсибилизации. Содержимое планшетов аспирировали, отмывали 3 раза, используя по 200 мкл/лунку, блокировали с помощью 200 мкл/лунку разбавителя, применяемого для анализа, и инкубировали в течение 1 ч при КТ. Содержимое планшетов аспирировали и отмывали 3 раза, используя по 200 мкл/лунку. Добавляли по 100 мкл стандарта и образцов и инкубировали в течение 2 ч при КТ согласно инструкциям производителя. Содержимое планшетов аспирировали и отмывали 3 раза,
используя по 200 мкл/лунку. Добавляли по 100 мкл конъюгата в каждую лунку. Конъюгат приготавливали с идентифицирующим антителом и реагентом, представляющим собой фермент, используя разведение 1:250 в разбавителе, применяемом для анализа. Содержимое планшетов аспирировали и отмывали по меньшей мере 3 раза, используя по 200 мкл/лунку. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстрата и инкубировали до получения окргшшвания, достаточного для осуществления считывания. После инкубации реакцию прекращали с помощью 50 мкл/лунку 1М H2SO4 и осуществляли считывание с помощью планшет-ридера при длине волны 450 нм в течение 30 мин. Пример 14
Экспрессия и очистка биспецифических молекул антител . таких как № 2. № 4. № 20. № 21. № 23. № 24. № 5
Конструировали легкие и тяжелые цепи следующих биспецифических антител № 2, № 4, № 20, № 21, № 23, № 5 (на основе антигенсвязывающих сайтов (VH/VL), указанных ниже в таблице 7) в геномных, частично геномных или выведенных из кДНК экспрессионных векторах, согласно указанному в настоящем описании методу. Для биспецифических двухвалентных антител № 2, № 24 применяли формат, описанный в WO 2009/080253 ((антитела, полученные с помощью технологии "CrossMabs" или антитела "с заменой CH1-CL-доменов"). Для биспецифических двухвалентных антител № 4, № 20, № 21, № 23 применяли формат, описанный в WO 2011/117330 ("биспецифические антитела в виде scFab с одним плечом"), а для № 5 применяли биспецифический четырехвалентный формат, в котором scFab сливали на N-конце тяжелых цепей, описанный в WO 2010/112193. WO 2009/080253, WO 2011/117330 и WO 2010/112193. Вышеуказанные документы включены в настоящее описание в качестве ссылки).
Плазмиды амплифицировали в Е. coli, очищали и затем трансфектировали НЕК293-клетки для кратковременной экспрессии рекомбинантных белков.
присутствуют; нумерация согласно EU-индексу Кэбота)
После культивирования в течение 7 дней супернатанты НЕК293-клеток собирали, фильтровали и очищали биспецифические двухвалентные антитела.
Биспецифические антитела очищали из супернатантов клеточных культур с помощью аффинной хроматографии, используя систему MabSelect SuRe (фирма GE Healthcare, Швеция). Последующие хроматографические стадии (гель-фильтрация (колонка для гель-фильтрации Superdex200 HiLoad 120 мл 16/60, фирма GE Healthcare, Швеция) или ионообменная хроматография (MacroPrep СНТ Typell 10 мл, фирма Bio-Rad плюс гель-фильтрация)
выбирали в зависимости от связанных с индивидуальным продуктом побочных продуктов биспецифических антител после хроматографии с использованием системы MabSelect SuRe(tm).
В целом, метод состоял в следующем: стерильные профильтрованные супернатанты клеточных культур иммобилизовали на смоле MabSelect SuRe, уравновешенной с помощью ЗФР-буфера (ЮмМ Na2HP04, 1мМ КН2РО4, 137мМ NaCl и 2,7мМ КС1, рН 7,4), отмывали уравновешивающим буфером и элюировали 25мМ цитратом натрия, рН 3,0. Элюированные белковые фракции объединяли и нейтрализовали с помощью 2М Трис, рН 9,0. Получали пулы антител для хроматографии на основе гидрофобных взаимодействий путем повторного забуферивания в ЮмМ NaH2P04, 20мМ MES, 50мМ NaCl, 0,1 мМ СаС1г, рН 7,5. После уравновешивания СНТ-колонки уравновешивающим буфером (Юм NaH2P04, 20мМ MES, 50мМ NaCl, ОДмМ СаС12, рН 7,5) антитела наносили на СНТ-колонку, отмывали уравновешивающим буфером и элюировали в линейном градиенте до ЮмМ NaH2P04, 20мМ MES, 500мМ NaCl, 0,1мМ СаС1г, рН 7,5. Содержащие биспецифическое антитело фракции (после ионообменной хроматографии или аффинной хроматографии на смоле MabSelect SuRe) объединяли и дополнительно очищали с помощью ионообменной хроматографии, используя колонку Superdex 200 26/60 GL (фирма GE Healthcare, Швеция), уравновешенную 20мМ гистидином, 140мМ NaCl, рН 6,0. Содержащие биспецифическое антитело фракции объединяли, концентрировали до требуемой концентрации, используя устройство для ультрафильтрации Vivaspin (фирма Sartorius Stedim Biotech S.A., Франция), и хранили при -80°С. Пример 15
Капиллярный электрофорез в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН-КЭ) и аналитическая гель-фильтрация (ГФ) биспецифических молекул ДСН-КЭ
Чистоту, целостность антител и молекулярную массу биспецифических и контрольных антител анализировали с помощью КЭ-ДСН, используя микрофлюидную технологию LabChip (фирма Caliper Life Science, США). Приготавливали 5 мкл белкового раствора для КЭ-ДСН-анализа, используя набор реагентов для экспрессии белков НТ согласно инструкциям производителя
и анализировали с помощью системы LabChip GXII, используя чип для экспрессии белков НТ. Данные анализировали с использованием программы LabChip GX.
Аналитическая гель-фильтрация
Гель-фильтрацию для определения агрегации и олигомерного состояния антител осуществляли с использованием ЖХВР-хроматографии. В целом, метод состоял в следующем: очищенные антитела на различных уровнях процесса очистки наносили на колонку Tosoh TSKgel G3000SW в ЗООмМ NaCl, 50мМ КН2РО4/К2НРО4, рН 7,5 при применении системы Agilent HPLC 1100 или на колонку Superdex 200 (фирма GE Healthcare) в 2 х ЗФР при применении ЖХВР-системы Dionex. Количество элюированного белка определяли на основе УФ-абсорбции и интегрирования площадей пиков. В качестве стандарта применяли стандарт для гель-фильтрации фирмы BioRad (Gel Filtration Standard 151-1901).
Таблица 8: Выход, профиль очистки и тенденции к агрегации (тенденции к
Пример 16
Ингибирование индуцируемой IL-17 стимуляции цитокинов в человеческих синовиальных фибробластах
AHTH-IL-17-компонент различных биспецифических антител тестировали в отношении ингибирования индуцируемого IL-17 производства провоспалительных цитокинов (например, человеческого IL-6, человеческого IL-8) человеческими фибробластподобными синовиоцитами, полученными из
организма взрослых страдающих РА пациентов (ЧФПС-РА). После определения зависимости ответа от дозы различных доноров RA-FLS оценивали активность нескольких наиболее перспективных ("лидерных") кандидатов.
ЧФПС-РА (каталожный № 408RA-05a) покупали у фирмы Cell Applications Inc. (Сан-Диего, шт. Калифорния, США; дистрибьютор в Германии: фирма tebu-bio, Оффенбах, Германия). Клетки подвергали оттаиванию, размножали в среде для роста синовиоцитов (фирма Cell Applications, Inc.; каталожный №415-500), отделяли с помощью аккутазы (фирма РАА Laboratories GmbH, Пашинг, Австрия; каталожный №L 11-007), после чего высевали примерно 2x104 ЧФПС-РА-клеток/лунку в 200 мкл/лунку среды в 96\ур-планшеты для культуры клеток (Costar/фирма Corning Life Sciences, Амстердам, Нидерланды; каталожный №3596).
Перед добавлением цитокинов (и необязательно антител) клетки предварительно культивировали в течение 2 дней при 37°С, 5% С02. Перед добавлением цитокина среду удаляли и добавляли по 150 мкл/лунку разведения соответствующего цитокина (необязательно: антитела): 0-10 мкг/мл рекомбинатного (рек.) человеческого IL-17A (фирма PeproTech, Гамбург, Германия; каталожный №200-17); 0-25 мкг/мл рек. человеческого TWEAK (фирма R &D Systems, Висбаден, Германия; каталожный №1090-TW/CF) или 0-10 мкг/мл рек. человеческого TNFot (фирма R &D Systems; каталожный №210-TA/CF) титровали с использованием десяти стадий разведения 1:10 для получения величины ED50 для указанных цитокинов. TWEAK применяли в качестве отрицательного, a TNF в качестве положительного контроля. Клетки инкубировали в течение 6, 24 и 72 ч при 37°С, 5% С02, инкубацию в течение 72 ч использовали в следующих экспериментах, поскольку указанная продолжительность инкубации позволяла получать наиболее надежный цитокиновый ответ (на уровне белка). Клетки предварительно инкубировали с несколькими антителами в различных концентрациях (конечная концентрация (спп)=0-150/500нМ) в течение 30 мин при 37°С, 5% С02 перед стимуляцией с помощью 100нг/мл-10 мкг/мл TWEAK в течение еще 72 ч.
Таблица 10: Ингибирующая концентрация (ICsn) в иМ родительских антител и биспецифических антител после индукции цитокинов с помощью IL-17 в синовиальных фибробластах, рассчитанная как ингибирующая концентрация 1С WHa валентность (т.е. на плечо связывания IL17).
Антитело
IL-6
IL-8
IC50 [нМ]
IC50 [нМ]
9C6-2B6-134
3,56
2,20
9C6-2B6-136
1,62
1,74
№4
1,72
1,10
№20
1,38
0,90
№5
1,32
1,12
№21
2,71
1,71
Важно отметить, что биспецифические антитела, предлагаемые в изобретении, обладают улучшенными величинами IC50 на связывающую валентность по сравнению с родительскими антителами к IL17.
Определение цитокинов с помощью СВА
Затем примерно 120 мкл супернатанта/лунку переносили в 96-луночные RB- планшеты и хранили при -20°С до осуществления анализа цитокинов. Для этой цели использовали платформу Cytometric Bead Array (СВА) и анализировали, в частности производство IL-6 и IL-8 (или их ингибирование). Анализ осуществляли согласно инструкциям производителя к набору Human Soluble Protein Master Buffer (фирма BD Biosciences, Гельдельберг, Германия, каталожный №558265), используя мультиплексные наборы человеческого IL-6 (фирма BD Biosciences, каталожный №558276) и IL-8 (BD; Cat. №558277). Планшеты оценивали с помощью системы FACS-Array и анализировали с помощью программы FCAP (обе фирмы BD).
Пример 17
Ингибирование индуцируемой Tweak пролиферации человеческих синовиальных фибробластов
Человеческие фибробластподобные синовиоциты, полученные из взрослых страдающих РА пациентов (ЧФПС-РА; каталожный № 408RA-05a) покупали у фирмы Cell Applications Inc. (Сан-Диего, шт. Калифорния, США; дистрибьютор в Германии: фирма tebu-bio, Оффенбах, Германия). Клетки подвергали оттаиванию, размножали и после отделения с помощью аккутазы (фирма РАА Laboratories GmbH, Пашинг, Австрия; каталожный № L11-007) высевали
примерно 2x10 ЧФПС-РА-клеток/лунку в 100 мкл/лунку среды в 96wF-miaHnieT дымчато-белого цвета (фирма Greiner Bio-one, Фрикенхаузен, Германия; № 655098) для последующего анализа пролиферации/жизнеспособности с помощью набора CellTiter Glo. В предварительных экспериментах пролиферацию оценивали с использованием набора Click-iT EdU согласно инструкциям производителя (см. ниже).
Рекомбинантный человеческий TWEAK (фирма R &D Systems, Висбаден, Германия; каталожный №1090-TW/CF) титровали в концентрациях 0-6000 нг/мл с использованием стадий разведения 1:3, используя 100 мкл/лунку в трех повторностях для получения величин ЕС50 из кривой дозовой зависимости. Общий объем составлял 200 мл на лунку. Затем планшеты инкубировали в течение 72 ч при 37°С, 5% С02 до оценки пролиферации.
В конечных экспериментах клетки предварительно инкубировали с указанными антителами в различных концентрациях (сяГ1=0-150нМ) в течение 30 мин при 37°С, 5% С02. Затем клетки стимулировали, добавляя 10-20 нг/мл рек. человеческого TWEAK в каждую лунку (50 мкл/лунку) и культивировали в течение еще 72 ч. Стимуляция рекомбинантным IL-17 или ТОТальфа не приводила к поддающейся измерению индукции пролиферации ЧФПС. Анализ пролиферации
Набор CellTiter Glo (фирма Promega GmbH, Маннгейм, Германия; каталожный № G7571) применяли для оценки пролиферации на основе общей жизнеспособности/активности клеток. В целом, метод состоял в следующем: субстрат и буферы подвергали оттаиванию и субстрат растворяли в 10 мл
буфера. Для уравновешивания планшет инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, центрифугировали и 100 мкл клеточного супернатанта добавляли к 100 мкл реагента CellTiter Glo (на лунку). Планшеты встряхивали в течение 2 мин и после уравновешивания сигнала в течение 10 мин оценивали люминисценцию с помощью ридера Tecan Infinite 2000 (фирма Тесап, Крайльсхайм, Германия) с использованием следующих устройств и параметров: планшет 96 wF Greiner дымчато-белого цвета/люминисценция/0-1000 мс.
В предварительных экспериментах пролиферацию оценивали с использованием набора Click-iT EdU А647 согласно инструкциям производителя (фирма Invitrogen, каталожный № А10208).
Таблица 11: Данные, полученные после стимуляции ЧФПС и ЧФПС-РА и анализа пролиферации через 72 ч
ЧФПС
ЧФПС-РА
Эффективная доза (ED50)
55 нг/мл
44 нг/мл
Пролиферация по сравнению с отсутствием стимуляции
~3-кратная
~3-кратная
Пример 18
Лабораторное измерение вязкости молекул антител на основе динамического рассеяния света (ДРС)
Измерение вязкости осуществляли в целом согласно известно методу (Не F. и др., Analytical Biochemistry 399(1), 2009, сс. 141-143). В целом, метод состоял в следующем: образцы концентрировали с получением различных концентраций белка в 200мМ сукцинате аргинина, рН 5,5, затем добавляли гранулы из полистирольного латекса (диаметром 300 нм) и Полисорбат 20 (0,02 об.%). Образцы переносили в оптический 384-луночный планшет путем
центрифугирования через фильтровальный планшет с размером отверстий 0,4 мкм и покрывали вазелином. Кажущийся диаметр латексных гранул определяли с помощью динамического рассеяния света при 25°С. Вязкость раствора можно рассчитывать как п = tyofoAh.o) О/-' вязкость; т/n: ВЯЗКОСТЬ ВОДЫ; г^: кажущийся гидродинамический радиус латексных гранул; г^о- гидродинамический радиус латексных гранул в воде.
Для осуществления сравнения различных образцов в одной и той же концентрации данные зависимости вязкости от концентрации аппроксимировали с помощью уравнения Муни (уравнение 1) (Mooney, Colloid Sci, 1951; Monkos, Biochem. Biophys. Acta, 1997) и данные соответствующим образом интерполировали.
(S: параметр гидродинамического взаимодействия белка; К: коэффициент самосжатия; Ф: объем фракции растворенного белка)
Для сравнения получали также данные для биспецифического антитела на основе IL17 D2E7-B6-17.8 DVD-Ig (которое связывается с помощью второй специфичности с TNF-альфа), описанного в WO 2010/102251.
Стабильность биспецифических антител
Образцы концентрировали до конечной концентрации 150 мг/мл в 200мМ сукцинате аргинина, рН 5,5, стерилизовали фильтрацией и хранили в состоянии покоя при 40°С в течение 4 дней. До и после хранения определяли содержание высокомолекулярных (HMW) видов с помощью гель-фильтрации. Различие
между содержанием HMW-видов в образце после хранения и образце, в который анализировали немедленно после его приготовления, обозначали как "повышение HMW". Для сравнения получали также данные для биспецифического антитела на основе IL17 D2E7-B6-17.8 DVD-Ig (которое связывается с помощью второй специфичности с TNF-альфа), описанного в WO 2010/102251.
Пример 19
Связывание биспецифических антител . предлагаемых в изобретении
Аффинность связывания с и биспецифических антител и родительских антител измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР), используя устройство BIAcore(r) Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С. Систему BIAcore(r) удобно применять для изучения взаимодействий молекул. ППР-технология базируется на измерении показателя преломления вблизи поверхности покрытого золотом биосенсорного чипа. Изменения в показателе преломления свидетельствует о изменения масс на поверхности, вызванном взаимодействием иммобилизованного лиганда с анализируемым веществом, инъецируемом в растворе: масса возрастает, если молекулы связываются с иммобилизованными лигандами на поверхности, и наоборот, масса снижается в случае диссоциации анализируемого вещества от иммобилизованного лиганда (что отражает диссоциацию комплекса). ППР позволяет непрерывно в реальном времени осуществлять мониторинг связывания лиганда/анализируемого вещества, и таким образом определять константу скорости ассоциации (ка), константу скорости диссоциации (kd) и константу равновесия (KD).
Аффинность связывания с IL17
Примерно 12000 резонансных единиц (RU) захватывающей системы (10 мкг/мл козьего античеловеческого F(ab')2; код заказа: 28958325; фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ, Швеция) сшивали с СМ5-чипом, рН 5,0 с помощью набора для аминного сочетания, поставляемого фирмой GE Healthcare. Для образцов и для системы применяли в качестве буфера ЗФР-Т (ЮмМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающей 0,05% Твин 20), рН 7,4. Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции 50нМ раствора в течение 1 мин со скоростью потока 10 мкл/мин. Ассоциацию измеряли путем инъекции человеческого IL17 в различных концентрациях в растворе в течение 3 мин со скоростью потока 30 мкл/мин, начиная с 50нМ, применяя разведения 1:1. Осуществляли мониторинг фазы диссоциации в течение вплоть до 5 мин, осуществляя ее запуск путем замены раствора для образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали с помощью двукратных отмывок в течение 60 с раствором глицина, рН 2,1 со скоростью потока 30 мкл/мин. Общие различия показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в присутствии на поверхности козьего античеловеческого F(ab')2. Вычитали также результаты, полученные при использовании контрольных "пустых" инъекций (применение двух стандартов). Для расчета кажущейся Ко и других кинетических параметров использовали модель Ленгмюра 1:1. Результаты представлены ниже в таблице 15.
Аффинность связывания с TWEAK
Из-за сильного неспецифического связывания TWE AK в качестве анализируемого вещества с сенсорной поверхностью, выбирали обратный порядок - применяли TWEAK в качестве лиганда. Примерно 100 резонансных единиц (RU) TWEAK иммобилизовывали на поверхности С1-чипа при рН 5,0, с помощью набора для аминного сочетания, поставляемого фирмой GE Healthcare. Для образцов и для системы применяли в качестве буфера ЗФР-Т (ЮмМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающей 0,05% Твин 20), рН 7,4. Ассоциацию измеряли путем инъекции биспецифического антитела в различных концентрациях в растворе в течение 3 мин со скоростью потока 30 мкл/мин, начиная с 50нМ, применяя разведения 1:1. Осуществляли мониторинг фазы диссоциации в течение вплоть до 10 мин, осуществляя ее запуск путем замены раствора для образца на подвижный буфер. Поверхность регенерировали с помощью трехкратных отмывок в течение 30 с ЗМ раствором MgCl2 со скоростью потока 30 мкл/мин. Общие различия показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного на поверхности, сшитой с "пустым" контролем. Вычитали также результаты, полученные при использовании контрольных "пустых" инъекций (применение двух стандартов). Для расчета кажущейся KD И других кинетических параметров использовали модель Ленгмюра 1:1. Результаты представлены ниже в таблице 16.
Одновременное связывание антител с обеими мишенями, т.е. с человеческим TWEAK и человеческим IL17
Примерно 12000 резонансных единиц (RU) захватывающей системы (10 мкг/мл козьего античеловеческого F(ab')2; код заказа: 28958325; фирма GE Healthcare Bio-Sciences АВ, Швеция) сшивали с СМ5-чипом (фирма GE
Healthcare, BR-1005-30), рН 5,0 с помощью набора для аминного сочетания, поставляемого фирмой GE Healthcare. Для образцов и для системы применяли в качестве буфера ЗФР-Т (ЮмМ забуференный фосфатом физиологический раствор, включающей 0,05% Твин 20), рН 7,4. Температуру проточной ячейки устанавливали на уровне 25°С, температуру блока на уровне 12°С. Перед захватом проточную ячейку примировали дважды с помощью подвижного буфера. Биспецифическое антитело захватывали путем инъекции 50нМ раствора в течение 60 с со скоростью потока 10 мкл/мин. Независимое связывание каждого лиганда с биспецифическим антителом анализировали путем определения способности к активному связыванию для каждого лиганда при их последовательном или одновременном добавлении (скорость потока 30 мкл/мин):
1) инъекция человеческого Tweak-Fc в концентрации 50нМ в течение 120 с (показатель связывания одного антигена); 2) инъекция человеческого IL17A/A в концентрации 50нМ в течение 120 с (показатель связывания одного антигена); 3) инъекция человеческого Tweak-Fc в концентрации 50нМ в течение 120 с с последующей дополнительной инъекций человеческого IL17A/A в концентрации 50нМ (показатель связывания IL17A/A в присутствии Tweak); 4) инъекция человеческого IL17A/A в концентрации 50нМ в течение 120 с с последующей дополнительной инъекций человеческого Tweak-Fc в концентрации 50нМ (показатель связывания Tweak в присутствии IL17A/A); 5) совместная инъекция человеческого IL17A/A в концентрации 50нМ и человеческого Tweak-Fc в концентрации 50нМ в течение 120 с (показатель одновременного связывания TweaknIL17A/A).
Поверхность регенерировали с помощью двукратных отмывок в течение 60 с раствором глицина, рН 2,1 со скоростью потока 30 мкл/мин. Общие различия показателей преломления корректировали путем вычитания ответа, полученного в присутствии на поверхности козьего античеловеческого IgG. Биспецифическое антитело обладало способностью связываться с обоими антигенами практически независимо, если сигнал, полученный в результате осуществлении подпунктов 3, 4 и 5, был равен сумме индивидуальных конечных сигналов при осуществлении подпунктов 1 и 2.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ
<120> Биспецифические антитела к человеческому TWEAK человеческому IL17 и их применения
<130> 30945 W0
<150> ЕР12163396.0 <151> 2012-04-05
<160> 100
<170> Patentln, версия 3.5
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 1
Phe Thr Phe Asn Ala Asn Tyr 1 5
<210> 2
<211> 6
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 2
Tyr Gly Gly Gly Asn Ser 1 5
<210> 3
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 3
Gly Pro lie Ser Arg Asp Leu 1 5
<210> 4 <211> 11 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 4
Gin Ala Ser Gin Ser lie Tyr Ser Ser Leu Ala 15 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 5
Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser 1 5
<210> 6 <211> 13 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 6
Gin Ser Thr Asp Tyr Gly Asn Ser Trp Asp Gly Asn Pro 15 10
<210> 7 <211> 116 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 7
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro 15 10
Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn
20 25 30
Trp lie Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 4 0 4 5
Ala Cys lie Tyr Gly Gly Gly Asn Ser Gly Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Thr Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Pro lie Ser Arg Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Leu 115
<210> 8 <211> 111 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 8
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ala Ser Val Ser Glu Pro Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu lie
35 4 0 4 5
Tyr Asp Ala Phe Asp Leu Ala Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Thr Leu Thr lie Ser Asp Leu Glu
65 70 75
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Ser Thr Asp Tyr Gly Asn
85 90 95
Trp Asp Gly Asn Pro Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Thr
100 105 110
<210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 9
Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr 1 5
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 10
Tyr Val Gly Ser Ser Gly 1 5
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 11
Ser Val His Phe Gly Asp Leu 1 5
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
5 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 12
Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Asn Asp Leu Ser
10 1 5 10
<210> 13
<211> 7
15 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 13
20 Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser 1 5
<210> 14
25 <2ii> 13
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 14
Gin Cys lie Asp Tyr Gly Asn Asn Tyr Val Gly Asn Thr 15 10
35 <210> 15 <211> 116 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus 40 <400> 15
Gin Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser
15 10 15
Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Cys Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Cys lie Tyr Val Gly Ser Ser Gly Ala Pro Tyr Tyr Ala Ser Trp
50 55 60
Ala Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Ala
65 70 75 80
Leu Gin Met Thr Ser Leu Thr Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Val Cys
85 90 95
Thr Arg Ser Val His Phe Gly Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 16 <211> 111 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 16
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Ser Pro Val Ser Ala Ala Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Lys Cys Gin Ala Ser Gin Ser lie Gly Asn Asp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Arg Pro Lys Leu Leu lie
35 4 0 4 5
Tyr Ser Val Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Ser Leu Thr lie Ser Asp Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Cys lie Asp Tyr Gly Asn Asn
85 90 95
Tyr Val Gly Asn Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
15 <210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
20 <400> 17
Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr 1 5
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 18
Tyr Val Arg Gin Gly Thr 1 5
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
40 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 19
Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val lie
45 1 5 10
<210> 20 <211> 11 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 20
Gin Ala Ser Gin Asn lie Tyr Ser Asn Leu Ala 15 10
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
15 <213> Oryctolagus cuniculus
<400> 21
Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser 20 1 5
<210> 22
<211> 13
25 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 22
30 Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg Pro Asp Thr Val Ala
1 5 10
<210> 23
35 <211> 120
<212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus
<400> 23
Gin Glu Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Туг Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr lie Ser Ser Asp Asn Ala Gin Asn Thr Val Asp
65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val lie Trp Gly Pro
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Phe 115 120
<210> 24 <211> 111 <212> PRT
<213> Oryctolagus cuniculus <400> 24
Ala lie Glu Met Thr Gin Thr Pro Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr lie Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn lie Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu Met
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Glu Tyr Thr Leu Thr lie Ser Gly Val Gin Cys
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys
100 105 110
<210> 25 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC1 <400> 25
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 26 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC2 <400> 26
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 27 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC3 <400> 27
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 4 0 4 5
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin He Cys Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 28 <211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC4 <400> 28
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 29
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC5
<400> 29
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 30
<211> 120
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC6
<400> 30
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 31 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC7 <400> 31
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 32 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC8 <400> 32
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly 'Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
5 Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
10 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 33 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC9 <400> 33
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
35 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
40 35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Lys Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
5 85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 34 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC10 <400> 34
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
30 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Thr Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val lie Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 35 <211> 120 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 305-HC11 <400> 35
Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
25 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
30 35 40 45
Ser Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
45 Ala Lys Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 36 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC1 <400> 36
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 37
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC2 <400> 37
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 38
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC3
<400> 38
Ala He Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Cys Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 39 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-1.C4 <400> 39
Ala He Arg Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Phe Ser Ala Ser Thr Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Cys Leu Gin Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 40 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC5 <400> 40
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
5 100 105 110
<210> 41
<211> 111
10 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC6
<400> 41
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
30 Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
35 65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 42 <211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC7 <400> 42
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Gly Thr Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 43 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC8 <400> 43
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
Asp Arg Val Thr He Asn Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 44 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC9 <400> 44
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Pro Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 45 <211> 111 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 05-LC10 <400> 45
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 111
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 305-LC11 <400> 46
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
<210> 47
<211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 47
Ser Tyr Gly Val His 1 5
<210> 48
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 48
Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
15 10 15
<210> 49
<211> 13
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 49
Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 15 10
<210> 50
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 50
Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His
15 10 15
<210> <211> <212>
51 7
PRT
<213> Mus musculus <400> 51
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 1 5
<210> 52
<211> 9
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 52
Ser Gin Thr Thr His Ala Pro Phe Thr 1 5
<210> 53
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 53
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin
15 10 15
Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Val Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Ser He Thr Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 54
<211> 112
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 54
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
15 10 15
Asp Gin Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Asn Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<211> 121 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VH, 9С6-2В6-НС134 <400> 55
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 56
<211> 121
<212> PRT
<213> Искусственная
41 л^ <^> .ца^**йг*^ Sg?ftS№ &^""^^-iA*s*^ .*^W,"J^^W.*> **^^
<223> Гуманизированный вариант VH, 9С6-2В6-НС136 <400> 56
5 Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
10 20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
25 Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
30 100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120
<210> 57 <211> 112 <212> PRT 40 <213> Искусственная
<220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 9C6-2B6-LC134 45 <400> 57
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 58 <211> 112 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Гуманизированный вариант VL, 9C6-2B6-LC136 <400> 58
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 59
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 60
<211> 105
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
15 10 15
Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu He Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 4 0 4 5
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gin Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105
<210> 61
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 62
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 63
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 64
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Gly Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 65
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 66
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 67
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 67
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 68
<211> 249
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gin Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
15 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala
35 40 45
Ser Leu Ser Ala Gin Glu Pro Ala Gin Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu
50 55 60
Asp Gin Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gin Thr Glu Glu Ser Gin Asp
65 70 75 80
Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala He Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gin Asp Gly Ala Gin Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg He Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asn Arg Gin He Gly Glu Phe He Val Thr Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gin Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gin Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gin Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg He Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gin Val His 245
<210> 69 <211> 249 <212> PRT
<213> Mus musculus <400> 69
Met Ala Ala Arg Arg Ser Gin Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro
15 10 15
Gly Thr Ala Leu Leu Ala Pro Leu Val Leu Ser Leu Gly Leu Ala Leu
20 25 30
Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ser Leu Gly Ser Trp Ala
35 4 0 4 5
Thr Leu Ser Ala Gin Glu Pro Ser Gin Glu Glu Leu Thr Ala Glu Asp
50 55 60
Arg Arg Glu Pro Pro Glu Leu Asn Pro Gin Thr Glu Glu Ser Gin Asp
65 70 75 80
Val Val Pro Phe Leu Glu Gin Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro
85 90 95
Lys Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Arg Ala He Ala Ala His Tyr Glu
100 105 110
Val His Pro Arg Pro Gly Gin Asp Gly Ala Gin Ala Gly Val Asp Gly
115 120 125
Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Thr Lys He Asn Ser Ser Ser Pro Leu
130 135 140
Arg Tyr Asp Arg Gin He Gly Glu Phe Thr Val He Arg Ala Gly Leu
145 150 155 160
Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gin Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr
165 170 175
Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asn Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu
180 185 190
Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Pro Gly Pro Gin Leu Arg
195 200 205
Leu Cys Gin Val Ser Gly Leu Leu Pro Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu
210 215 220
Arg He Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gin Val His 245
<210> 70
<211> 155
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser
15 10 15
Leu Glu Ala He Val Lys Ala Gly He Thr He Pro Arg Asn Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
35 40 45
Leu Asn He His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val He Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
85 90 95
Leu Gly Cys He Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
100 105 110
Val Pro He Gin Gin Glu He Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys He Leu Val Ser Val Gly Cys
130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro He Val His His Val Ala
145 150 155
<210> 71
<211> 180
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 71
Met Asp Trp Pro His Asn Leu Leu Phe Leu Leu Thr He Ser He Phe
15 10 15
Leu Gly Leu Gly Gin Pro Arg Ser Pro Lys Ser Lys Arg Lys Gly Gin
20 25 30
Gly Arg Pro Gly Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Gin Val Pro Leu Asp
35 40 45
Leu Val Ser Arg Met Lys Pro Tyr Ala Arg Met Glu Glu Tyr Glu Arg
50 55 60
Asn He Glu Glu Met Val Ala Gin Leu Arg Asn Ser Ser Glu Leu Ala
65 70 75 80
Gin Arg Lys Cys Glu Val Asn Leu Gin Leu Trp Met Ser Asn Lys Arg
85 90 95
Ser Leu Ser Pro Trp Gly Tyr Ser He Asn His Asp Pro Ser Arg He
100 105 110
Pro Val Asp Leu Pro Glu Ala Arg Cys Leu Cys Leu Gly Cys Val Asn
115 120 125
Pro Phe Thr Met Gin Glu Asp Arg Ser Met Val Ser Val Pro Val Phe
130 135 140
Ser Gin Val Pro Val Arg Arg Arg Leu Cys Pro Pro Pro Pro Arg Thr
145 150 155 160
Gly Pro Cys Arg Gin Arg Ala Val Met Glu Thr He Ala Val Gly Cys
165 170 175
Thr Cys He Phe 180
<210> 72
<211> 197
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 72
Met Thr Leu Leu Pro Gly Leu Leu Phe Leu Thr Trp Leu His Thr Cys
15 10 15
Leu Ala His His Asp Pro Ser Leu Arg Gly His Pro His Ser His Gly
20 25 30
Thr Pro His Cys Tyr Ser Ala Glu Glu Leu Pro Leu Gly Gin Ala Pro
35 40 45
Pro His Leu Leu Ala Arg Gly Ala Lys Trp Gly Gin Ala Leu Pro Val
50 55 60
Ala Leu Val Ser Ser Leu Glu Ala Ala Ser His Arg Gly Arg His Glu
65 70 75 80
Arg Pro Ser Ala Thr Thr Gin Cys Pro Val Leu Arg Pro Glu Glu Val
85 90 95
Leu Glu Ala Asp Thr His Gin Arg Ser He Ser Pro Trp Arg Tyr Arg
100 105 110
Val Asp Thr Asp Glu Asp Arg Tyr Pro Gin Lys Leu Ala Phe Ala Glu
115 120 125
Cys Leu Cys Arg Gly Cys He Asp Ala Arg Thr Gly Arg Glu Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Asn Ser Val Arg Leu Leu Gin Ser Leu Leu Val Leu Arg Arg
145 150 155 160
Arg Pro Cys Ser Arg Asp Gly Ser Gly Leu Pro Thr Pro Gly Ala Phe
165 170 175
Ala Phe His Thr Glu Phe He His Val Pro Val Gly Cys Thr Cys Val
180 185 190
Leu Pro Arg Ser Val 195
<210> 73
<211> 202
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 73
Met Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Ala Leu Pro Pro Ser Trp Ala Ala
15 10 15
Gly Ala Pro Arg Ala Gly Arg Arg Pro Ala Arg Pro Arg Gly Cys Ala
20 25 30
Asp Arg Pro Glu Glu Leu Leu Glu Gin Leu Tyr Gly Arg Leu Ala Ala
35 40 45
Gly Val Leu Ser Ala Phe His His Thr Leu Gin Leu Gly Pro Arg Glu
50 55 60
Gin Ala Arg Asn Ala Ser Cys Pro Ala Gly Gly Arg Pro Ala Asp Arg
65 70 75 80
Arg Phe Arg Pro Pro Thr Asn Leu Arg Ser Val Ser Pro Trp Ala Tyr
85 90 95
Arg He Ser Tyr Asp Pro Ala Arg Tyr Pro Arg Tyr Leu Pro Glu Ala
100 105 110
Tyr Cys Leu Cys Arg Gly Cys Leu Thr Gly Leu Phe Gly Glu Glu Asp
115 120 125
Val Arg Phe Arg Ser Ala Pro Val Tyr Met Pro Thr Val Val Leu Arg
130 135 140
Arg Thr Pro Ala Cys Ala Gly Gly Arg Ser Val Tyr Thr Glu Ala Tyr
145 150 155 160
Val Thr He Pro Val Gly Cys Thr Cys Val Pro Glu Pro Glu Lys Asp
165 170 175
Ala Asp Ser He Asn Ser Ser He Asp Lys Gin Gly Ala Lys Leu Leu
180 185 190
Leu Gly Pro Asn Asp Ala Pro Ala Gly Pro 195 200
<210> 74
<211> 177
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 74
Met Arg Glu Arg Pro Arg Leu Gly Glu Asp Ser Ser Leu He Ser Leu
15 10 15
Phe Leu Gin Val Val Ala Phe Leu Ala Met Val Met Gly Thr His Thr
20 25 30
Tyr Ser His Trp Pro Ser Cys Cys Pro Ser Lys Gly Gin Asp Thr Ser
35 4 0 4 5
Glu Glu Leu Leu Arg Trp Ser Thr Val Pro Val Pro Pro Leu Glu Pro
50 55 60
Ala Arg Pro Asn Arg His Pro Glu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Gly
65 70 75 80
Pro Leu Asn Ser Arg Ala He Ser Pro Trp Arg Tyr Glu Leu Asp Arg
85 90 95
Asp Leu Asn Arg Leu Pro Gin Asp Leu Tyr His Ala Arg Cys Leu Cys
100 105 110
Pro His Cys Val Ser Leu Gin Thr Gly Ser His Met Asp Pro Arg Gly
115 120 125
Asn Ser Glu Leu Leu Tyr His Asn Gin Thr Val Phe Tyr Arg Arg Pro
130 135 140
Cys His Gly Glu Lys Gly Thr His Lys Gly Tyr Cys Leu Glu Arg Arg
145 150 155 160
Leu Tyr Arg Val Ser Leu Ala Cys Val Cys Val Arg Pro Arg Val Met
165 170 175
Gly
<210> 75
<211> 163
<212> PRT
<213> Homo Sapiens
<400> 75
Met Thr Val Lys Thr Leu His Gly Pro Ala Met Val Lys Tyr Leu Leu
15 10 15
Leu Ser He Leu Gly Leu Ala Phe Leu Ser Glu Ala Ala Ala Arg Lys
20 25 30
He Pro Lys Val Gly His Thr Phe Phe Gin Lys Pro Glu Ser Cys Pro
35 40 45
Pro Val Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Asp He Gly He He Asn Glu
50 55 60
Asn Gin Arg Val Ser Met Ser Arg Asn He Glu Ser Arg Ser Thr Ser
65 70 75 80
Pro Trp Asn Tyr Thr Val Thr Trp Asp Pro Asn Arg Tyr Pro Ser Glu
85 90 95
Val Val Gin Ala Gin Cys Arg Asn Leu Gly Cys He Asn Ala Gin Gly
100 105 110
Lys Glu Asp He Ser Met Asn Ser Val Pro He Gin Gin Glu Thr Leu
115 120 125
Val Val Arg Arg Lys His Gin Gly Cys Ser Val Ser Phe Gin Leu Glu
130 135 140
Lys Val Leu Val Thr Val Gly Cys Thr Cys Val Thr Pro Val He His
145 150 155 160
His Val Gin
<210> 76
<211> 451
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №2 - конструкция
тяжелой цепи 1
<400> 76
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 77
<211> 454
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №2 - конструкция тяжелой
цепи 2
<400> 77
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 4 0 4 5
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser Val
115 120 125
Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser
130 135 140
Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin
145 150 155 160
Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val
165 170 175
Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu
180 185 190
Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu
195 200 205
Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg
210 215 220
Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
355 360 365
Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450
<210> 78
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №2 - конструкция легкой
цепи 1
<400> 78
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 4 0 4 5
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 79 <211> 216 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №2 - конструкция легкой цепи 1 <400> 79
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser
115 120 125
Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin
180 185 190
Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215
<210> 80 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №4 - конструкция тяжелой цепи 1 <400> 80
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val lie Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 81 <211> 700 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №4 - конструкция тяжелой цепи 2 <400> 81
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 . 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin
245 250 255
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
260 265 270
Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Val Tyr Val Arg
290 295 300
Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu Asn Gly Arg Val Thr He
305 310 315 320
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
325 330 335
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn
340 345 350
Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
595 600 605
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 82 <211> 219 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №4 - конструкция легкой цепи 1 <400> 82
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 83 <211> 937 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №5 - конструкция тяжелой цепи
<400> 83
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser
210 215 220
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Glu Val Gin Leu Val
245 250 255
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
260 265 270
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr Gly Val His Trp Val
275 280 285
Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val He Trp Ser
290 295 300
Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr He
305 310 315 320
Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu
325 330 335
Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Thr His Tyr
340 345 350
Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
355 360 365
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
370 375 380
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
405 410 415
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser
420 425 430
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
435 440 445
Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
450 455 460
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Ser Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala
485 490 495
Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser
500 505 510
Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro
515 520 525
Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr
530 535 540
Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu Asn Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp
545 550 555 560
Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
565 570 575
Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp
580 585 590
Ala Phe Val He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
595 600 605
Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser
610 615 620
Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe
625 630 635 640
Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly
645 650 655
Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu
660 665 670
Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr
675 680 685
He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys
690 695 700
Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
705 710 715 720
Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
725 730 735
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
740 745 750
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
755 760 765
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
770 775 780
Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
785 790 795 800
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
805 810 815
Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
820 825 830
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu
835 840 845
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
850 855 860
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
865 870 875 880
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
885 890 895
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val
900 905 910
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
915 920 925
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 930 935
<210> 84
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №5 - конструкция легкой цепи
<400> 84
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 85 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №20 - конструкция тяжелой цепи 1 <400> 85
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr
325 330 335
He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 86
<211> 697
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №20 - конструкция тяжелой цепи 2 <400> 86
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin
245 250 255
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
260 265 270
Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Val Tyr Val Arg
290 295 300
Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu Asn Gly Arg Val Thr He
305 310 315 320
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
325 330 335
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn
340 345 350
Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
370 375 300
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Gly Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gin Glu Glu Met
595 600 605
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 690 695
<210> 87
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220> <223> цепи 1
Биспецифическое антитело №20 - конструкция легкой
<400> 87
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 88 <211> 448 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №21 - конструкция тяжелой цепи 1 <400> 88
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly
210 215 220
Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser lie Glu Lys Thr
325 330 335
He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Ser Cys
355 360 365
Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 89
<211> 697
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №21 - конструкция тяжелой цепи 2
<400> 89
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin
245 250 255
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
260 265 270
Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Val Tyr Val Arg
290 295 300
Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu Asn Gly Arg Val Thr He
305 310 315 320
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
325 330 335
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn
340 345 350
Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys
370 375 380
Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
465 470 475 480
Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
500 505 510
Val Val Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr
515 520 525
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
530 535 540
Gin Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
545 550 555 560
Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
565 570 575
Gly Leu Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin
580 585 590
Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Gin Glu Glu Met
595 600 (505
Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
610 615 620
Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn
625 630 635 640
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
645 650 655
Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val
660 665 670
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin
675 680 685
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 690 695
<210> 90
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №21 - конструкция легкой
цепи 1
<400> 90
Asp He Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 4 0 4 5
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 91 <211> 451 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №23 - конструкция тяжелой цепи 1 <400> 91
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly
.305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro He
325 330 335
Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys 450
<210> 92
<211> 700
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> Биспецифическое антитело №23 - конструкция тяжелой цепи 2 <400> 92
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly
210 215 220
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gin Val Gin Leu Val Gin
245 250 255
Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys
260 265 270
Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr Tyr Met Ser Trp Val Arg
275 280 285
Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Thr Val Tyr Val Arg
290 295 300
Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu Asn Gly Arg Val Thr He
305 310 315 320
Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu
325 330 335
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asn
340 345 350
Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
355 360 365
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
370 375 380
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
385 390 395 400
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
405 410 415
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
420 425 430
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
435 440 445
Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
450 455 460
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
465 470 475 480
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
485 490 495
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val
500 505 510
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe
515 520 525
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
530 535 540
Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
545 550 555 560
Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
565 570 575
Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro He Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala
580 585 590
Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg
595 600 605
Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly
610 615 620
Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro
625 630 635 640
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
645 650 655
Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin
660 665 670
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
675 680 685
Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
690 695 700
<210> 93
<211> 219
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> Биспецифическое антитело №23 - конструкция легкой цепи 1 <400> 93
5 Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
10 20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 4 0 4 5
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
25 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
30 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
145 150 155 160
45 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215
<210> 94 <211> 450 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №24 - конструкция тяжелой цепи 1
<400> 94
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Thr Val Tyr Val Arg Gin Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Leu
50 55 60
Asn Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asn Tyr Asp Asp Ala Phe Val He Trp Gly Gin
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro He Glu
325 330 335
Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Cys
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu
355 360 365
Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Lys 450
<210> 95
<211> 455 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №24 - конструкция тяжелой цепи 2 <400> 95
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 4 0 4 5
Ser Val He Trp Ser Asp Gly Thr Thr Thr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Thr His Tyr Arg Leu Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro Ser
115 120 125
Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala
130 135 140
Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val
145 150 155 160
Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser
165 170 175
Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys
195 200 205
Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn
210 215 220
Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
225 230 235 240
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
245 250 255
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
260 265 270
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
275 280 285
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr
290 295 300
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
305 310 315 320
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
325 330 335
Gly Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
340 345 350
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys
355 360 365
Asn Gin Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
370 375 380
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
385 390 395 400
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
405 410 415
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser
420 425 430
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
4 35 4 40 4 45
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455
<210> 96 <211> 218 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> Биспецифическое антитело №24 - конструкция легкой цепи 1 <400> 96
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Gin Ala Ser Gin Asn He Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 4 0 4 5
Tyr Thr Ala Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Thr Ala Tyr Tyr Asn Ser Arg
85 90 95
Pro Asp Thr Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 97
5 <211> 217
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
10 <223> Биспецифическое антитело №24 - конструкция легкой
цепи 2
<400> 97
Asp Не Val Met Thr Gin Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
15 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Phe His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser
35 40 45
Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
30 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gin Thr
35 85 90 95
Thr His Ala Pro Phe Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys
100 105 110
Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser
115 120 125
Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys
130 135 140
Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr
180 185 190
Gin Thr Tyr He Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val
195 200 205
Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215
<210> 98
<211> 129
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 98
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
15 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gin Ala Pro Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65 70 75 80
He Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
85 90 95
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100 105 110
Pro He Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu He
115 120 125
Gin
<210> 99
<211> 212
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 99
Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu
15 10 15
Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro Val Pro Pro
20 25 30
Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gin Pro Leu Thr
35 40 45
Ser Ser Glu Arg He Asp Lys Gin He Arg Tyr He Leu Asp Gly He
50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
65 70 75 80
Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro Lys Met Ala
85 90 95
Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gin Ser Gly Phe Asn Glu Glu Thr Cys Leu
100 105 110
Val Lys He He Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr Leu Glu Tyr
115 120 125
Leu Gin Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gin Ala Arg Ala Val Gin
130 135 140
Met Ser Thr Lys Val Leu He Gin Phe Leu Gin Lys Lys Ala Lys Asn
145 150 155 160
Leu Asp Ala He Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala Ser Leu Leu
165 170 175
Thr Lys Leu Gin Ala Gin Asn Gin Trp Leu Gin Asp Met Thr Thr His
180 185 190
Leu He Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gin Ser Ser Leu Arg Ala
195 200 205
Leu Arg Gin Met 210
<210> 100
<211> 99
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 100
Met Thr Ser Lys Leu Ala Val Ala Leu Leu Ala Ala Phe Leu He Ser
15 10 15
Ala Ala Leu Cys Glu Gly Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu
20 25 30
Arg Cys Gin Cys He Lys Thr Tyr 35 40
Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe 45
He Lys Glu Leu Arg Val He Glu 50 55
Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr 60
Glu He He Val Lys Leu Ser Asp 65 70
Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro 75 80
Lys Glu Asn Trp Val Gin Arg Val 85
Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala 90 95
Glu Asn Ser
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Биспецифическое антитело, содержащее первый антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим TWEAK, и второй антигенсвязывающий центр, который специфически связывается с человеческим ИЛ 7.
2. Биспецифическое двухвалентное антитело по п. 1, где биспецифическое антитело ингибирует
а) индуцируемую TWEAK пролиферацию человеческих
фибробластподобных синовиоцитов, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА) с величиной IC50, составляющей (),2нМ или менее; и
б) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL6 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА) с величиной IC50, составляющей 3,0нМ или менее; и
в) индуцируемую IL17 стимуляцию цитокина IL8 в человеческих
фибробластподобных синовиоцитах, ассоциированных с ревматоидным
артритом (ЧФПС-РА) с величиной IC50, составляющей 2,0нМ или менее.
3. Биспецифическое двухвалентное антитело по п. 1, отличающееся тем, что биспецифическое антитело является двухвалентным.
4. Биспецифическое антитело по одному из п.п. 1-3, отличающееся тем,
что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
а) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 18,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 19, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2L,
имеющий SEQ ID N0:21, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 22; или
б) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 1, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 2,
CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 3, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2L,
имеющий SEQ ID NO: 5, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 6; или
в) CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 9, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 10, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 11, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 13, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 14; и И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит CDR1H, имеющий SEQ ID NO: 47, CDR2H, имеющий SEQ ID NO: 48, CDR3H, имеющий SEQ ID NO: 49, и CDR1L, имеющий SEQ ID NO: 50, CDR2L, имеющий SEQ ID NO: 51, CDR3L, имеющий SEQ ID NO: 52.
5. Химерный или гуманизированный вариант биспецифического антитела
по п. 4.
6. Биспецифическое антитело по одному из п.п. 1-3, отличающееся тем,
что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 25, SEQ ID
NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 или SEQ ID NO: 46; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55 или
SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57 или SEQ ID NO: 58.
7. Биспецифическое антитело по одному из п.п. 1-3, отличающееся тем,
что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и И) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит а) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58; или
б) вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
8. Биспецифическое антитело по одному из п.п. 1-3, отличающееся тем,
что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит
вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит
вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 56, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 58.
9. Биспецифическое антитело по одному из п.п. 1-3, отличающееся тем,
что
I) указанный первый антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 28, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 37; и
II) указанный второй антигенсвязывающий центр содержит вариабельный домен тяжелой цепи (VH), имеющий SEQ ID NO: 55, и
вариабельный домен легкой цепи, имеющий SEQ ID NO: 57.
10. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl или IgG4.
11. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl с мутациями L234A и L235A (нумерации согласно EU-индексу Кэбота).
12. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgGl с мутациями L234A, L235A и P329G (нумерации согласно EU-индексу Кэбота).
10.
13. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P и L235E (нумерации согласно EU-индексу Кэбота).
14. Биспецифическое антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что представляет собой антитело подкласса IgG4 с мутациями S228P, L235E и P329G (нумерации согласно EU-индексу Кэбота).
15. Фармацевтическая композиция, отличающаяся тем, что содержит антитело по п.п. 1-14.
16. Применение антитела по п.п. 1-14 для приготовления фармацевтической композиции.
17. Антитело по п.п. 1-14, предназначенное для применения для лечения рака или воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
18. Применение антитела по п.п. 1-14 для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака или воспалительных заболеваний, аутоиммунных заболеваний, ревматоидного артрита, псориатического артрита, мышечных болезней, например, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, хронических заболеваний почек, болезней костной ткани, например, дегенерации кости при множественной миеломе, системной красной волчанки, волчаночного нефрита и сосудистого повреждения.
19. Нуклеиновая кислота, кодирующая антитело по п.п. 1-14.
15.
20. Экспрессионные векторы, отличающиеся тем, что содержат нуклеиновую кислоту по п. 19, для экспрессии биспецифического антитела по п.п. 1-14 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине.
21. Прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 20.
22. Способ получения рекомбинантного антитела по п.п. 1-14, отличающийся тем, что экспрессируют нуклеиновую кислоту по п. 19 в прокариотической или эукариотической клетке-хозяине и выделяют указанное антитело из указанной клетки или супернатанта клеточной культуры.
23. Способ лечения пациента, страдающего раком или воспалительными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями, ревматоидным артритом, псориатическим артритом, мышечными болезнями, например, мышечной дистрофией, рассеянным склерозом, хроническими заболеваниями почек, болезнями костной ткани, например, дегенерацией кости при множественной миеломе, системной красной волчанкой, волчаночным нефритом и сосудистым повреждением, отличающийся тем, что вводят пациенту антитело по п.п. 1-14.
15.
20.
20.
IL17
- 4 -
- 10 -
- 13 -
- 13 -
-16 -
- 15 -
- 18 -
- 18 -
-20 -
- 19 -
- 22 -
- 25 -
- 25 -
-36-
-36-
- 38 -
- 38 -
- 44 -
-45 -
-48 -
- 47 -
- 50 -
- 50 -
- 102 -
- 102 -
- 104 -
- 104 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 106 -
- 108
- 108
- 108
- 108
- 108
- 108
110 -
109
110 -
109
- 112 -
-113-
- 115 -
- 115 -
-116 -
-116 -
- 117
- 117
- 118 -
- 118 -
119
119
- 121 -
- 121 -
<220>
- 122 -
<220>
- 122 -
124 -
- 123
124 -
- 125
- 126 -
- 126 -
- 127
10 15
- 127
10 15
- 128
129 -
- 130
129 -
- 131 -
- 131 -
- 132 -
- 132 -
<210> 55
<210> 55
- 133 -
- 133 -
<220>
<220>
- 134 -
135 -
10 15
137
137
- 138 -
- 138 -
144 -
144 -
- 146
145
148 -
148 -
- 149 -
- 149 -
- 160 -
-161 -
- 163 -
- 163 -
- 164 -
- 164 -
-166 -
- 165 -
- 168 -
- 168 -
- 170 -
- 170 -
- 172 -
- 172 -
- 173 -
- 173 -
- 177 -
- 177 -
- 178 -
- 178 -
- 183 -
- 183 -
- 185 -
- 185 -
- 190 -
- 190 -
- 191 -
- 191 -
- 198 -
- 198 -
- 199 -
- 199 -
- 202 -
<220>
- 203 -
- 205 -
- 205 -
- 207 -
- 207 -
- 209 -
- 209 -
- 213 -
- 213 -
- 214 -
- 214 -
- 215 -
- 215 -
- 216 -
- 216 -
- 220 -
- 220 -
ФИГ. la
ФИГ. la
1/3
1/3
ФИГ. 16
ФИГ. 16
2/3
2/3
ФИГ. 2
ФИГ. 2
3/3
3/3