[RU]

В заявке описана среди прочего комбинированная терапия с использованием антител, связывающихся с человеческим CSF-1R, в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.

(57) Реферат / Формула:

В заявке описана среди прочего комбинированная терапия с использованием антител, связывающихся с человеческим CSF-1R, в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.

---

120725
Заявка № 201400991
Заявитель Ф.Хоффманн-Ля Рош АГ, СН
КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ CSF-1R И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
Настоящее изобретение относится среди прочего к комбинации антител к человеческому CSF-1R, связывающихся с человеческим CSF-1R, которые отличаются тем, что связываются с доменами (димеризации) D4-D5, с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
Предпосылки создания изобретения
Рецептор человеческого CSF-1 (CSF-1R; рецептор колониестимулирующего фактора 1; синонимы: рецептор M-CSF; рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, протоонкоген Fms, c-fms, SEQ ID NO: 62) известен с 1986 г. (Coussens L. и др., Nature 320, 1986, сс. 277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста и кодируется протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth Р. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. ImmuNOl. 181, 1992, cc. 141-67).
CSF-1 R представляет собой рецептор CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF, макрофагальный колониестимулирующий фактор 1), и он опосредует биологические действия указанного цитокина (Sherr C.J. и др., Cell 41, 1985, сс. 665-676). Клонирование 5 рецептора колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1R) (который обозначают также как c-fms) впервые описано у Roussel M.F. и др., Nature 325, 1987, сс. 549552. В этой публикации указано, что CSF-1R обладает трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-концевом "хвосте" белка, включая утрату способности ингибировать фосфорилирование тирозина 969, который 10 связывается с каннабиоидным рецептором СЫ, и тем самым регулирует
понижающую регуляцию рецептора (Lee P.S. и др., Embo J. 18, 1999, сс. 36163628). В последние годы идентифицирован второй лиганд для CSF-1R, обозначенный как интерлейкин-34 (IL-34) (Lin Н. и др., Science, 320, 2008, сс. 807-811).
15 В настоящее время известно два лиганда CSF-1R, которые связываются с
внеклеточным доменом CSF-1R. Установлено, что первый из них, представляющий собой CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF, макрофагальный, SEQ ID NO: 86), присутствует вне клетки в виде связанного дисульфидным мостиком гомодимера (Stanley E.R. 20 и др., Journal of Cellular Biochemistry 21, 1983, сс. 151-159; Stanley E.R. и др., Stem Cells 12, приложение 1, 1995, сс. 15-24). Вторым является IL-34 (человеческий IL-34; SEQ ID NO: 87) (Hume, D. А. и др., Blood 119, 2012, cc. 1810-1820). Основными биологическими действиями, связанными с передачей сигналов CSF-1R, являются дифференцировка, пролиферация, миграция и 25 выживание гематопоэтических клеток-предшественников линии
дифференцировки макрофагов (включая остеокласты). Активация CSF-1R опосредуется лигандами CSF-1R, т.е. CSF-1 (M-CSF) и IL-34. Связывание CSF-1 (M-CSF) с CSF-1R индуцирует образование гомодимеров и активацию киназы путем фосфорилирования тирозина (Li W. и др., EMBO Journal. 10, 1991, сс. 27730 288; Stanley E.R. и др., Mol. Reprod. Dev. 46, 1997, сс. 4-10).
Биологически активный гомодимер CSF-1 связывается с CSF-1R в субдоменах D1-D3 внеклеточного домена рецептора CSF-1 (CSF-1R-ECD). CSF-1R-ECD содержит пять иммуноглобулинподобных субдоменов (обозначены как
D1-D5). Субдомены D4-D5 внеклеточного домена (CSF-1R-ECD) не участвуют в связывании CSF-1 (Wang Z. и др., Molecular and Cellular Biology 13, 1993, cc. 5348-5359). Субдомен D4 участвует в димеризации (Yeung Y-G. и др., Molecular & Cellular Proteomics 2, 2003, cc. 1143-1155; Pixley F. J. и др., Trends Cell Biol 5 14, 2004, cc. 628-638).
Кроме того, передача сигналов опосредуется р85-субъединицей PI3K и Grb2, связанными с путями PI3K/AKT и Ras/MAPK соответственно. Указанные два важных пути передачи сигналов могут регулировать пролиферацию, выживание и апоптоз. Другие сигнальные молекулы, которые связываются с
10 фосфорилированным внутриклеточным доменом CSF-1R, представляют собой STAT1, STAT3, PLCy и СЫ (Bourette R.P. и Rohrschneider L.R., Growth Factors 17, 2000, сс. 155-166).
Передача сигналов CSF-1R имеет физиологическое значение для иммунных ответов, для ремоделирования кости и для репродуктивной системы.
15 Установлено, что животные, у которых "выключен" либо CSF-1 (Pollard J.W., Mol. Reprod. Dev. 46, 1997, cc. 54-61), либо CSF-1R (Dai X.M. и др., Blood, 99, 2002, cc. 111-120), имеют такие остеопетрозные, гематопоэтические фенотипы, фенотипы тканевых макрофагов и репродуктивной системы, которые свидетельствуют о роли CSF-1R в соответствующих типах клеток.
20 Sherr C.J. с соавторами описали некоторые антитела к CSF-1R, которые
ингибируют активность CSF-1 (см. Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс. 17861793). У Ashmun R.A. и др., Blood, 73, 1989, сс. 827-837 описаны антитела к CSF-1R. У Lenda D. и др., Journal of Immunology, 170, 2003, сс. 3254-3262 описано снижение рекрутмента, пролиферации и активации макрофагов у
25 мышей с дефицитом CSF-1, что приводило к пониженному апоптозу в трубочках при воспалении почек. У Kitaura Н. и др., Journal of Dental Research, 87, 2008, cc. 396-400 описано антитело к CSF-1, которое ингибирует ортодонтическое перемещение зубов. В WO 2001/030381 упомянуты ингибиторы активности CSF-1, включающие антисмысловые нуклеотиды и антитела, но описаны только
30 антисмысловые нуклеотиды CSF-1. В WO 2004/045532 описано предупреждение метастазов и потери костной ткани и лечение метастического рака с помощью антагониста CSF-1, при этом описаны только антагонистические антитела к CSF-1. В WO 2005/046657 описано лечение воспалительного заболевания кишечника
с помощью антител к CSF-1. В US 2002/0141994 описаны ингибиторы колониестимулирующих факторов. В WO 2006/096489 описано лечение ревматоидного артрита с помощью антител к CSF-1. В WO 2009/026303 и WO 2009/112245 описаны конкретные антитела к CSF-1R, связывающиеся с CSF-1R в 5 первых трех субдоменах (D1-D3) внеклеточного домена (CSF-1R-ECD). В WO 2011/123381 (А 1) описаны антитела к CSF-1R. Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение относится к антителу, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 10 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, которое предназначено для применения с целью
а) ингибирования клеточной пролиферации опухолевых клеток экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R;
15 б) ингибирования клеточной пролиферации опухолей с инфильтратом
макрофагов, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R, и/или независимый от лиганда CSF-1R;
в) ингибирования выживания клеток моноцитов и макрофагов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
20 лиганда CSF-1R); и/или
г) ингибирования клеточной дифференцировки моноцитов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-1R), в макрофаги,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим
25 средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
Указанная комбинированная терапия с использованием антител, связывающихся с человеческим CSF-1R, которые отличаются тем, что связываются с доменами (димеризации) D4-D5, обладает ценными свойствами, такими как меньшая потенциальная способность активировать CSF-1R и, как
30 следствие, пониженная токсичность, или отсутствие способности стимулировать рецептор CSF-1R (например, по сравнению с комбинированной терапией с использованием антител, связывающихся с человеческим CSF-1R, которые отличаются связыванием с доменами D1-D3).
Понятие "лигандзависимая (зависимая от лиганда)) в контексте настоящего описания относится к независимой от лиганда передаче сигналов через внеклеточный ECD (и не включает независимую от лиганда передачу сигналов, опосредуемую активирующими точечными мутациями во внутриклеточном 5 киназном домене). В одном из вариантов осуществления изобретения в этом контексте лиганд CSF-1R относится к лиганду CSF-1R, выбранному из человеческого CSF-1 (SEQ ID NO: 86) и человеческого IL-34 (SEQ ID NO: 87); в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R представляет собой человеческий CSF-1 (SEQ ID NO: 86); в одном из вариантов
10 осуществления изобретения лиганд CSF-1R представляет собой человеческий IL-34 (SEQ ID NO: 87)).
Изобретение относится к антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, антителу, связывающемуся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ ID NO: 85)
15 внеклеточного домена человеческого CSF-1R, предназначенному для лечения пациента, который имеет опухоль, экспрессирующую CSF-1R, или имеет опухоль с инфильтратом макрофагов, экспрессирующим CSF-1R, где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R (в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R выбран из человеческого CSF-1
20 (SEQ ID NO: 86) и человеческого IL-34 (SEQ ID NO: 87); в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R представляет собой человеческий CSF-1 (SEQ ID NO: 86); в одном из вариантов осуществления изобретения лиганда CSF-1R представляет собой человеческий IL-34 (SEQ ID NO: 87)) (обнаруживаемый в сыворотке, моче или биопсиях опухоли),
25 где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим
средством, излучением и/или иммунотерапией рака. Понятие "повышенный уровень лиганда CSF-1R" (по сравнению со здоровой тканью) относится к сверхэкспрессии человеческого лиганда CSF-1R (в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R выбран из человеческого CSF-1
30 (SEQ ID NO: 86) и человеческого IL-34 (SEQ ID NO: 87); в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R представляет собой человеческий CSF-1 (SEQ ID NO: 86); в одном из вариантов осуществления изобретения лиганд CSF-1R представляет собой человеческий IL-34 (SEQ ID NO: 87)) до
начала лечения или к сверхэкспрессии человеческого лиганда CSF-1R, индуцированной лечением с помощью антитела к CSF-1R (и по сравнению с уровнями экспрессии до начала лечения). В некоторых вариантах осуществления изобретения понятие "повышение" или "выше (сверх)" относится к уровню, 5 превышающему референс-уровень, или к общему повышению, составляющему 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% или более, уровня лиганда CSF-1R, определенного методами, представленными в настоящем описании, по сравнению с уровнем лиганда CSF-1R в референс-образце. В некоторых вариантах осуществления изобретения понятие
10 "повышение" относится к повышению уровня лиганда CSF-1R, где повышение представляет собой повышение по меньшей мере примерно в 1,5, 1,75, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90 или 100 раз по сравнению с уровнем лиганда CSF-1R, который, например, предварительно определен в референс-образце. В одном предпочтительном варианте осуществления
15 изобретения понятие "повышенный уровень" относится к такому уровню, который соответствует или превышает референс-уровень.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело к CSF-1R, отличающееся тем, что антитело связывается с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) (содержащим домены D1-D5) и не
20 связывается с доменами D1-D3 (SEQ ID NO: 66) внеклеточного домена человеческого CSF-1R.
В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтические средства, которые можно вводить в сочетании с антителом к CSF-1R, включают (но, не ограничиваясь только ими) антинеопластические средства, такие как
25 алкилирующие вещества, включая: азотистые производные горчичного газа,
такие как мехлорэтамин, циклофосфамид, ифосфамид, мелфалан и хлорамбуцил; нитрозомочевины, такие как кармустин (BCNU), ломустин (CCNU) и семустин (метил-CCNU); Temodal(tm) (темозоламид), этиленимины/метилмеламины, такие как триэтиленмеламин (ТЕМ), триэтилен, тиофосфорамид (тиотепа),
30 гексаметилмеламин (НММ, алтретамин; алкилсульфонаты, такие как бусульфан; триазины, такие как дакарбазин (DTIC)); антиметаболиты, включая аналоги фолиевой кислоты, такие как метотрексат и триметрексат, аналоги пиримидина, такие как 5-фторурацил (5FU), фтордезоксиуридин, гемцитабин,
цитозинарабинозид (АгаС, цитарабин), 5-азацитидин, 2,2'-дифтордезоксицитидин, аналоги пурина, такие как 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, азатиоприн, Т-дезоксикоформицин (пентостатин), эритрогидроксинониладенин (EHNA), флударабина фосфат и 25 хлордезоксиаденозин (кладрибин, 2-CdA); антимитотические лекарственные средства, полученные из природных продуктов, такие как паклитаксел, алкалоиды барвинка, включая винбластин (VLB), винкристин и винорелбин, таксотер, эстрамустин и эстрамустина фосфат; эпиподофилотоксины, такие как этопозид, тенипозид; антибиотики, такие как актиномицин D, дауномицин
10 (рубидомицин), доксорубицин, митоксантрон, идарубицин, блеомицины,
пликамицин (митрамицин), митомицин С и актиномицин; ферменты, такие как L-аспарагиназа; модификаторы биологического ответа, такие как интерферон-альфа, IL-2, G-CSF, GM-CSF; смешанные вещества, включая координированные комплексы на основе платины, такие как оксалиплатин, цисплатин и
15 карбоплатин, антраценодионы, такие как митоксантрон, замещенная мочевина, такая как гидроксимочевина, производные метилгидразина, включая N-метилгидразин (МШ) и прокарбазин, адренокортикальные депрессанты, такие как митотан (o,p'-DDD) и аминоглутетимид; гормоны и антагонисты, включая адренокортикостероидные антагонисты, такие как преднизон и его эквиваленты,
20 дексаметазон и аминоглутетимид; Gemzar(tm) (гемцитабин), прогестин, такой как гидроксипрогестерона капроат, медропрогестерона ацетат и мегестрола ацетат; эстрогены, такие как диэтилстилбестол и эквиваленты этинилэстрадиола; антиэстроген, такой как тамоксифен; андрогены, включая тестостерона пропионат и флуоксиместерон/эквиваленты; антиандрогены, такие как
25 флутамид, аналоги гонадотропинвысвобождающего гормона и леупролид; и
нестероидные антиандрогены, такие как флутамид. Терапии, мишенью которых является эпигенетический механизм, включают (но, не ограничиваясь только ими) применение ингибиторов гистондеацетилаз, деметилирующих агентов (например, вайдаза) и терапий, обеспечивающих высвобождение факторов
30 репрессии транскрипции (ATRA (полностью транс-ретиноевая кислота), можно объединять также с антигенсвязывающими белками.
В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (например, паклитаксел
(таксол), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например, абраксан и опаксио, доксорубицин, сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) и другие мулькиназные ингибиторы, оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин, этопозид, гемцитабин и винбластин. В одном варианте осуществления 5 изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (такие, например, как таксол (паклитаксел), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например, абраксан и опаксио)).
В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из 5-фторурацила (5-FU), леоковорина, иринотекана или
10 оксалиплатина. В одном варианте осуществления изобретения
химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил, леуковорин и иринотекан (FOLFIRI (фолфири)). В одном варианте осуществления изобретения химиотерапевтическое средство представляет собой 5-фторурацил и оксалиплатин (FOLFOX (фолфокс)).
15 Конкретные примеры комбинированных терапий с химиотерапевтическими
средствами включают, например, применение антитела к CSF-1R в сочетании с таксанами (например, доцетакселом или паклитакселом) или модифицированным паклитакселом (например, абраксан или опаксио), доксорубицином), капецитабином и/или бевацизумабом (авастин) для лечения
20 рака молочной железы; антитела к человеческому CSF-1R в сочетании с
карбоплатином, оксалиплатином, цисплатином, паклитакселом, доксорубицином (или модифицированным доксорубицином (келикс или доксил)) или топотеканом (гикамтин) для лечения рака яичника, антитела к человеческому CSF-1R в сочетании с мультикиназным ингибитором, MKI, (сутент, нексавар или
25 AMG 706) и/или доксорубицином для лечения рака почки; антитела к CSF-1R в сочетании с оксалиплатином, цисплатином и/или излучением для лечения плоскоклеточной карциномы; антитела к CSF-1R в сочетании с таксолом и/или карбоплатином для лечения рака легкого.
Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения
30 химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (доцетаксел или паклитаксел, или модифицированный паклитаксел (абраксан или опаксио), доксорубицин, капецитабин и/или бевацизумаб, для лечения рака молочной железы.
В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое
средство выбирают из группы, включающей карбоплатин, оксалиплатин,
цисплатин, паклитаксел, доксорубицин (или модифицированный доксорубицин
(келикс или доксил)), или топотекан (гикамтин), для лечения рака яичника.
5 В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое
средство выбирают из группы, включающей мультикиназный ингибитор (сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) или мотесаниба дифосфат (AMG 706) и/или доксорубицин, для лечения рака почки.
В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое
10 средство выбирают из группы, включающей оксалиплатин, цисплатин, и/или
применяют в сочетании с излучением для лечения плоскоклеточной карциномы.
В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксол и/или карбоплатин, для лечения рака легкого.
15 В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапия рака,
которую можно применять в сочетании с антителом к CSF-1R, включает (но, не ограничиваясь только ими) активацию Т-клеток или ингибирование Treg-клеток, активацию антигенпрезентирующих клеток, ингибирование иммуносупрессорных клеток в микроокружении опухоли, противораковые
20 вакцины и адоптивный клеточный перенос, привлекающий Т-клетки агент.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей:
а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител, которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-
25 клеточных биспецифических антител (таких, например, как антитела-активаторы Т-клеток BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферона (IFN) альфа, антагонистических антител, которые связываются с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 или с CD25,
30 б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое
антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодируемый MAGE-АЗ, PROSTVAC; или
5 г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с использованием несущих CAR (химерный рецептор антигена) Т-клеток.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапию рака 10 выбирают из привлекающих Т-клетки агентов, таких как IL-2 (пролейкин), и антагонистических антител, которые связываются с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1 или с PD-L1.
В одном из вариантов осуществления изобретения агентом для иммунотерапии рака является IL-2 (пролейкин). В одном из вариантов 15 осуществления изобретения агентом для иммунотерапии рака является
антагонистическое антитело, которое связывается с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб).
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия на основе антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R (включая антитела, 20 которые связываются с доменами D1-D3, и антитела, которые связываются с доменами D4-D5), в сочетании с иммунотерапией рака,
где иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей:
а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител,
которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-
25 клеточных биспецифических антител (таких, например, как антитела-активаторы
Т-клеток BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин),
интерферона (IFN) альфа, антагонистических антител, которые связываются с
человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA,
VISTA, LAG-3 или с CD25,
30 б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое
антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-A3, PROSTVAC; или
5 г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с использованием CAR-T-клеток.
Одним из дополнительных объектов изобретения является
10 комбинированная терапия на основе антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R, предназначенная для лечения рака (включая антитела, которые связываются с доменами D1-D3, и антитела, которые связываются с доменами D4-D5), при осуществлении которой антитело к CSF-1R вводят в сочетании с биспецифическим антителом к ANG-2-VEGF (например, с антителом к ANG2-
15 VEGF, которое описано в WO 2010/040508 или WO 2011/117329, в одном
предпочтительном варианте осуществления изобретения с биспецифическим антителом к ANG-2-VEGF ХМаЫ, которое описано в WO 2011/117329). В одном из вариантов осуществления изобретения антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для применения при лечении рака,
20 отличается тем, что связывается с доменами D4-D5. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная комбинированная терапия включает антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, и биспецифическое антитело к ANG-2-VEGF
25 ХМаЫ, описанное в WO 2011/117329.
Одним из дополнительных объектов изобретения является комбинированная терапия на основе антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R (включая антитела, которые связываются с доменами D1-D3, и антитела, которые связываются с доменами D4-D5), в сочетании с иммунотерапией рака,
30 при осуществлении которой иммунотерапию рака выбирают из группы,
включающей:
противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток: OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое антитело к
CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR, рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-A3, PROSTVAC.
Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия на основе антитела, связывающегося с 5 человеческим CSF-1R (включая антитела, которые связываются с доменами D1-D3, и антитела, которые связываются с доменами D4-D5, предпочтительно антитела, которые связываются с доменами D4-D5, представленные в настоящем описании), в сочетании с иммунотерапией рака, где иммунотерапия рака основана на применении агонистического антитела к CD40. Антитела к CSF-1R,
10 которые связываются с доменами D1-D3 человеческого CSF-1R, описаны,
например, в WO 2009/026303 и WO 2009/112245 касательно некоторых антител к CSF-1R, которые связываются с CSF-1R в первых трех субдоменах (D1-D3) внеклеточного домена (CSF-1R-ECD). В WO 2011/12338ЦА1) и у Sherr C.J. и др., Blood 73, 1989, сс. 1786-1793 описаны антитела к CSF-1R (как правило, эти
15 антитела отличаются тем, что ингибируют пролиферацию и/или передачу
сигнала CSF-1R, зависимого от лиганда CSF-1R, но не независимого от лиганда CSF-1R).
Антитела к CSF-1R антитела, которые связываются с доменами D4-D5 человеческого CSF-1R, описаны, например, в настоящем изобретении, в
20 РСТ/ЕР2012/075241 и у Sherr C.J. и др., Blood 73, 1989, сс. 1786-1793 (как
правило, эти антитела отличаются тем, что ингибируют пролиферацию и/или передачу сигнала CSF-1R как зависимого от лиганда CSF-1R, так и независимого от лиганда CSF-1R).
Таким образом, одним из объектов изобретения является также антитело,
25 которое связывается с человеческим CSF-1R, предназначенное для применения при лечении рака, где указанное антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака. В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей: а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из
30 агонистических антител, агонистическое антитела к GITR, CD27, или к 4-1ВВ, и Т-клеточные биспецифические антитела (например, антитела-активаторы Т-клеток BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферон (IFN) альфа, антагонистические антитела, которые связываются с
человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 или с CD25, б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию IL-6, IX-17, IL-23, TNFa (например, антитела к IL-1, IL-5 6, IL-17, IL-23, TNFa или к соответствующему рецептору, например, IL-1R, IL-6R, IL-17R, IL-23R), в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток: OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое антитело к CD40 (описанное, например, у Beatty и др., Science 331, 2011, сс. 1612-1616, R. Н. Vonderheide и др., J Clin Oncol 25, 2007, с. 876;
10 Khalil М. и др., Update Cancer Ther. 1; 2(2), 1 июня 2007 г., сс. 61-65, примерами антител, применяемых для клинических испытаний, являются, например, СР-870,893 и дацетузумаб (агонистическое антитело к CD40, CAS-номер 880486-599, SGN-40; человеческое антитело S2C6) (Khalil М. и др., Update Cancer Ther. 2(2), 1 июня 2007 г., сс. 61-65; агонист CD40 в виде крысиного антимышиного
15 МАт IgG2a FGK45 в качестве модельного антитела описан у S. P. Schoenberger и др., Nature 393, 1998, с.480), СР-870,893 представляет собой полностью человеческое являющее агонистом CD40 антитело в виде IgG2, разработанное фирмой Pfizer. Его связывание с CD40 характеризуется величиной KD 3,48x10" 10М, но оно не блокирует связывание с CD40L (см., например, US6 № 7338660
20 или ЕР 1476185, в которых СР-870,893 обозначено как антитело 21.4.1). СР-870,893 (антитело 21.4.1 в US № 7338660) отличается тем, что содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWI NPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELNRLRSDDTAVYYCARDQPLGY
25 CTNGVCSYFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88) (которая соответствует SEQ ID NO: 42 в US № 7338660), (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCRASQGIYSWLAWYQQKPGKAPNLLIYTASTL QSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANIFPLTFGGGTKVEIK 30 (SEQ ID NO: 89) (которая соответствует SEQ ID NO: 44 в US № 7338660); и/или имеет аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомой 21.4.1, которая имеет регистрационный номер в Американской коллекции
типовых культур (АТСС) РТА-3605. Дацетузумаб и другие гуманизированные антитела S2C6 описаны в US № 6946129 и US № 8303955. Основой гуманизированных антител S2C6 являются, например, CDR1, 2 и 3 вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи мышиного МАт S2C6 (депонированного в АТСС 5 под номером РТА-110). CDR1, 2 и 3 вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи мышиного МАт S2C6 описаны и заявлены в US № 6946129. В одном из вариантов осуществления изобретения агонистическое антитело к CD40 представляет собой дацетузумаб. В одном из вариантов осуществления изобретения агонистическое антитело к CD40 отличается тем, что содержит (а)
10 аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYSFTGYYIHWVRQAPGKGLEWVARVIP NAGGTSYNQKFKGRFTLSVDNSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGIYWWG QGTLVTVS (SEQ ID NO: 90), (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи
15 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHSNGNTFLHW
YQQKPGKAPKLLIYTVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAT YFCSQTTHVPWTFGQGTKVEIKR (SEQ ID N0: 91), подраздел в) включает также лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR, рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-АЗ, PROSTVAC; или г)
20 адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с использованием CAR-T-клеток. В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапию рака выбирают из привлекающих Т-клетки агентов, выбранных из IL-2 (пролейкин), и
25 антагонистического антитела, которое связывается с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаба).
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапия рака, которую можно применять в сочетании с антителом к CSF-1R, включает (но, не ограничиваясь только ими) целенаправленные терапии. Примеры
30 целенаправленных терапий включают (но, не ограничиваясь только указанным) применение терапевтических антител. Примерами терапевтических антител являются (но, не ограничиваясь только ими) мышиные, химерные мышиные-человеческие, с трансплантированными CDR, гуманизированные и полностью
человеческие антитела, и синтетические антитела, включая (но, не ограничиваясь только ими) антитела, выбранные путем скрининга библиотек антител. Примерами антител являются (но, не ограничиваясь только ими) антитела, которые связываются с поверхностными клеточными белками Нег2, 5 CDC20, CDC33, с муцинподобным гликопротеином и рецептором
эпидермального фактора роста (EGFR), присутствующим на опухолевых клетках, и необязательно индуцируют цитостатическое и/или цитотоксическое действие в отношении опухолевых клеток, экспонирующих указанные белки. Примеры антител включают также герцептин (HERCEPTIN) (трастузумаб),
10 который можно применять для лечения рака молочной железы и других форм рака, и ритуксан (RITUXAN) (ритуксимаб), зевалин (ZEVAL1N) (ибритумомаба тиуксетан, гливек (GLEEVEC) (иматиниба мезилат) и лимфоцид (LYMPHOCIDE) (эпратузумаб), которые можно применять для лечения неходжкинской лимфомы и других форм рака. Конкретные примеры антител
15 включают также эрбитукс (ERBITUX) (цетуксимаб) (ЕМС-С225); эртинолиб (иресса); BEXXAR(tm) (меченный йодом 131 тозитумомаб); ингибиторы KDR (киназный домен рецептора); антитела к VEGF и антагонисты (например, авастин (бевацизумаб) и VEGAF-TRAP); антитела к VEGF-рецептору и антигенсвязывающие области; антитела к Ang-1 и Ang-2 и антигенсвязывающие
20 области; биспецифические антитела к Ang-2-VEGF (описанные, например, в WO 2010/040508 или WO 2011/117329), антитела к Tie-2 и другим рецепторам Ang-1 и Ang-2; лиганды Tie-2; антитела к ингибиторам киназы Tie-2; ингибиторы Hif-la и Campath(tm) (алемтузумаб). В некоторых вариантах осуществления изобретения агенты для противораковой терапии представляют собой полипептиды, которые
25 избирательно индуцируют апоптоз опухолевых клеток, включая (но, не ограничиваясь только им) родственный TNF полипептид TRAIL.
Специфические ингибиторы других киназ можно применять также в сочетании с антителом к CSF-1R, включая (но, не ограничиваясь только им) ингибиторы пути МАРК (например, ингибиторы ERK, JNK и р38), ингибиторы
30 РВ-киназ/АКТ и ингибиторы Pirn. Другие ингибиторы включают ингибиторы
Hsp90, ингибиторы протеосомы (например, велкад) и ингибиторы с несколькими механизмами действия, такие как трисенокс.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапия рака включает один или несколько антиангиогенных средств, которые уменьшают ангиогенез. Некоторые такие агенты представляют собой (но, не ограничиваясь только им) антагонисты IL-8; Campath, B-FGF; антагонисты FGF; антагонисты 5 Тек (Cerretti и др., публикация патента США № 2003/0162712; Cerretti и др., US № 6413932 и Cerretti и др., US № 6521424, каждая из которых включена в настоящее описание для всех целей); анти-TWEAK агенты (которые включают, (но, не ограничиваясь только им) антитела и антигенсвязывающие области); антагонисты растворимого TWEAK-рецептора (Wiley, US № 6727225); домен
10 ADAM дисинтегрина, оказывающий антагонистическое воздействие на
связывание интегрина с его лигандами (Fanslow и др., публикация патента США № 2002/0042368); антитела к eph-рецептору и к эфрину; антигенсвязывающие области или антагонисты (US №№ 5981245; 5728,813; 5969110; 6596852; 6232447; 605724 и другие представители указанного семейства патентов); анти-
15 VEGF агенты (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с VEGF или растворимыми VEGF-рецепторами, или их лигандсвязывающие области), такие как авастин (бевацизумаб) или VEGF-TRAP и агенты к VEGF-рецептору (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним),
20 ингибирующие EGFR агенты (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ним), такие как панитумумаб, иресса (IRESSA) (гефитиниб), тарцева (TARCEVA) (эрлотиниб), анти-Ang-l и aHTH-Ang-2 агенты (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются с ними или с их рецепторами, например,
25 Tie-2/ТЕК), и ингибирующие агенты к киназе Tie-2 (например, антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются и ингибируют активность факторов роста, такие как антагонисты гепатоцитарного фактора роста (HGF, который называют также "рассеивающим" фактором), и антитела или антигенсвязывающие области, которые специфически связываются
30 с их рецептором "с- met"; анти-PDGF-BB антагонисты; антитела и
антигенсвязывающие области к лигандам PDGF-BB; и ингибиторы киназы PDGFR.
Другие антиангиогенные средства, которые можно применять в сочетании с антигенсвязывающим белком, включают такие агенты, как ингибиторы ММР-2 (матриксная металлопротеиназа 2), ингибитор ММР-9 (матриксная металлопротеиназа 9) и ингибиторы СОХ-П (циклоксигеназа II). Примерами 5 пригодных ингибиторов СОХ-И являются целебрекс (CELEBREX) (целекоксиб), валдекоксиб и рофекоксиб. В некоторых вариантах осуществления изобретения агентами для противораковой терапии являются ингибиторы ангиогенеза. Некоторые указанные ингибиторы включают (но, не ограничиваясь только ими) SD-7784 (фирма Pfizer, США); циленгитид (фирма KGaA, Германия, ЕР 0 770
10 622); пегаптаниб октанатрия (фирма Gilead Sciences, США); альфастатин (фирма Bio Acta, Великобритания)); M-PGA (фирма Celgene, США, US № 5712291); иломастат (фирма Arriva, США, US № 5892112); семаксаниб (фирма Pfizer, США, US № 5792783); ваталаниб (фирма Novartis, Швейцария); 2-метоксиэстрадиол (фирма EntreMed, США); TLC ELL-12 (фирма Elan,
15 Ирландия); анекортава ацетат (фирма Alcon, США); МАт альфа-0148 (фирма Amgen, США); СЕР-7055, (фирма Cephalon, США); МАт к Vn (фирма Crucell, Нидерланды), DACrantiangiogenic (фирма ConjuChem, Канада); ангиоцидин (фирма InKine Pharmaceutical, США); КМ-2550 (фирма Kyowa Hakko, Япония); SU-0879 (фирма Pfizer, США); CGP-79787 (фирма Novartis, Швейцария, ЕР
20 0970070); ARGENT technology (фирма Ariad, США); YIGSR-Stealth (фирма Johnson & Johnson, США); фрагмент фибриногена-Е (фирма BioActa, Великобритания); ингибитор ангиогенеза (фирма Trigen, Великобритания); ТВС-1635 (фирма Encysive Pharmaceuticals, США); SC-236 (фирма Pfizer, США); АВТ-567 (фирма Abbott, США); метастатин (фирма EntreMed, США); ингибитор
25 ангиогенеза (фирма Tripep, Швеция); маспин (фирма Sosei, Япония); 2-
метоксиэстрадиол (фирма Oncology Sciences Corporation, США); ER-68203-00 (фирма IVАХ, США); бенефин (фирма Lane Labs, США); Tz-93 (фирма Tsumura, Япония); TAN-1120 (фирма Takeda, Япония); FR-111142 (фирма Fujisawa, Япония, JP 02233610); тромбоцитарный фактор 4 (фирма RepliGen, США, ЕР
30 407122); антагонист сосудистого эндотелиального фактора роста (фирма Вогеап, Дания); противораковая терапия (University of South Carolina, США); бевацизумаб (pINN) (фирма Genentech, США); ингибиторы ангиогенеза (фирма SUGEN, США); XL 784 (фирма Exelixis, США); XL 647 (фирма Exelixis, США);
МАт, альфа5бетаЗинтегрин, второе поколение (фирма Applied Molecular Evolution, США и фирма Medlmmune, США); генная терапия, ретинопатия (фирма Oxford BioMedica, Великобритания); энзастаурина гидрохлорид (USAN) (фирма Lilly, США); СЕР 7055 (фирма Cephalon, США и Sanofi-Synthelabo, 5 Франция); ВС 1 (фирма Genoa Institute of Cancer Research, Италия); ингибитор ангиогенеза (фирма Alchemia, Австралия); антагонист VEGF (фирма Regeneron, США); rBPI 21 и выведенный из BPI антиангиогенный агент (фирма ХОМА, США); PI 88 (фирма Progen, Австралия); циленгитид (pINN) (фирма Merck KGaA, Германия; Munich Technical University, Германия, Scripps Clinic and
10 Research Foundation, США); цетуксимаб (INN), (фирма Aventis, Франция); AVE 8062 (фирма Ajinomoto, Япония); AS 1404 (Cancer Research Laboratory, Новая Зеландия); SG 292 (фирма Telios, США); эндостатин (Boston Childrens Hospital, США); ATN 161 (фирма Attenuon, США); ангиостатин (Boston Childrens Hospital, США); 2-метоксиэстрадиол (Boston Childrens Hospital, США); ZD 6474 (фирма
15 AstraZeneca, Великобритания); ZD 6126 (фирма Angiogene Pharmaceuticals, Великобритания); PPI 2458 (фирма Praecis, США); AZD 9935 (фирма AstraZeneca, Великобритания); AZD 2171 (фирма AstraZeneca, Великобритания); ваталаниб (pINN) (фирма Novartis, Швейцария и фирма Schering AG, Германия); ингибиторы путей тканевого фактора (фирма EntreMed, США); пегаптаниб
20 (Pinn) (фирма Gilead Sciences, США); ксанторрхизол (фирма Yonsei University, Южная Корея); вакцина на основе гена, VEGF-2, (фирма Scripps Clinic and Research Foundation, США); SPV5.2 (фирма Supratek, Канада); SDX 103 (University of California at San Diego, США); PX 478 (фирма ProIX, США); метастатин (фирма EntreMed, США); тропонин 1 (Harvard University, США); SU
25 6668 (фирма SUGEN, США); OXI 4503 (фирма OXiGENE, США); орто-
гуанидины (фирма Dimensional Pharmaceuticals, США); мотупорамин С (British Columbia University, Канада); CDP 791 (фирма Celltech Group, Великобритания); атипримод (PINN) (фирма GlaxoSmithKline, Великобритания); Е 7820 (фирма Eisai, Япония); CYC 381 (Harvard University, США); АЕ 941 (фирма Aeterna,
30 Канада); вакцина, против ангиогенеза (фирма EntreMed, США); ингибитор
активатора урокиназы плазминогена (фирма Dendreon, США); оглифанид (pINN) (фирма Melmotte, США); ингибиторы HIF-I альфа (фирма Xenova, Великобритания); СЕР 5214 (фирма Cephalon, США); BAY RES 2622 (фирма
Bayer, Германия); ангиоцидин (фирма InKine, США); А6 (фирма Angstrom, США); KR 31372 (Korea Research Institute of Chemical Technology, Южная Корея); GW 2286 (фирма GlaxoSmithKline, Великобритания); EHT 0101 (фирма ExonHit, Франция); CP 868596 (фирма Pfizer, США); CP 564959 (фирма OSI, 5 США); CP 547632 (фирма Pfizer, США); 786034 (фирма GlaxoSmithKline, Великобритания); KRN 633 (фирма Kirin Brewery, Япония); система для введения лекарственного средства, внутриглазная, 2-метоксиэстрадиол (фирма EntreMed, США); ангинекс, (Maastricht University, Нидерланды и Minnesota University, США); АВТ 510 (фирма Abbott, США); ML 993 (фирма Novartis,
10 Швейцария); VEGI (фирма Proteom Tech, США); ингибиторы фактора некроза
опухоли альфа (National Institute on Aging, США); SU 11248 (фирма Pfizer, США и фирма SUGEN США); АВТ 518 (фирма Abbott, США); YH1 6 (фирма Yantai Rongchang, Китай); S-3APG (Boston Childrens Hospital, США и фирма EntreMed, США); МАт, KDR, (фирма ImClone Systems, США); МАт, альфа5 бета1 (фирма
15 Protein Design, США); ингибитор киназы KDR (фирма Celltech Group,
Великобритания и фирма Johnson & Johnson, США); GFB 116 (South Florida University, США и Yale University, США); CS 706 (фирма Sankyo, Япония); пролекарство комбретастатин А4 (Arizona State University, США); хондроитиназа АС (фирма IBEX, Канада); BAY RES 2690 (фирма Bayer,
20 Германия); AGM 1470 (Harvard University, США, фирма Takeda, Япония и фирма ТАР, США); AG 13925 (фирма Agouron, США); тетратиомолибдат (University of Michigan, США); GCS 100 (Wayne State University, США); CV 247 (фирма Ivy Medical, Великобритания); CKD 732 (фирма Chong Kun Dang, Южная Корея); МАт, сосудистый эндотелиальный фактор роста (фирма Xenova,
25 Великобритания); ирсогладин (INN) (фирма Nippon Shinyaku, Япония); RG 13577 (фирма Aventis, Франция); WX 360 (фирма Wilex, Германия); скваламин (pINN) (фирма Genaera, США); RPI 4610 (фирма Sima, США); противораковая терапия (фирма Marinova, Австралия); ингибиторы гепараназы (фирма InSight, Израйль); KL 3106 (фирма Kolon, Южная Корея); хонокиол (фирма Emory University,
30 США); ZK CDK (фирма Schering AG, Германия); ZK Angio (фирма Schering AG, Германия); ZK 229561 (фирма Novartis, Швейцария и фирма Schering AG, Германия); ХМР 300 (фирма ХОМА, США); VGA 1102 (фирма Taisho, Япония); модуляторы VEGF-рецептора (Pharmacopeia, США); антагонисты VE-кадхерина
2 (фирма ImClone Systems, США); вазостатин (National Institutes of Health, США); вакцина, Flk-I (фирма ImClone Systems, США); TZ 93 (фирма Tsumura, Япония); тумстатин (Beth Israel Hospital, США); укороченный растворимый FLT 1 (рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста 1) (фирма Merck & Со, 5 США); лиганды Tie-2 (фирма Regeneron, США); ингибитор тромбоспондина 1 (фирма Allegheny Health, Education and Research Foundation, США); 2-бензолсульфонамид, 4-(5-(4 хлорфенил)-3-(трифторметил)-1Н-пиразол-1-ил)-; Аррива; и C-MeL AVE 8062 (моногидрохлорид (28)-2-амино-3-гидрокси-Ы-[2-метокси-5-[(^)-2-(3,4,5-триметоксифенил)этенил]фенил]пропанамида);
10 метелимумаб (pINN) (иммуноглобулин G4, к (человеческому
трансформирующему рост фактору бета.1 (человеческое моноклональное CAT 192.гамма.4-цепь)), связанный дисульфидным мостиком с димером: человеческое моноклональное CAT 192.каппа-цепь); лиганд Fit; лиганд CD40; интерлейкин-2; интерлейкин-12; лиганд 4-1ВВ; антитела к 4-IBB; антагонисты
15 TNF и антагонисты TNF-рецептора, включая TNFR/Fc, антагонисты TWEAK и антагонисты TWEAK-R, включая TWEAK-R/Fc; TRAIL; антагонисты VEGF, включая антитела к VEGF; антагонисты VEGF-рецептора (включая VEGF-R1 и VEGF-R2, известные также как Fltl и Flkl или KDR); агонисты CD1 48 (обозначен также как DEP-I, ECRTP и PTPRJ, см. Takahashi и др., J. Am. Soc. Nephrol. 10,
20 1999, сс. 2135-1245, публикация включена в настоящее описание в качестве
ссылки для любой цели); ингибитор тромбоспондина 1 и ингибиторы лигандов одного или обоих Tie-2 или Tie-2 (например, Ang-2). В данной области известно несколько ингибиторов Ang-2, включая антитела к Ang-2, описанные в опубликованной заявке на патент США № 2003/0124129 (соответствует
25 публикации РСТ WO 2003/030833) и в US № 6166185, содержание которых
полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. В данной области известны также пептидные антитела к Ang-2, и они описаны, например, в опубликованной заявке на патент США № 2003/0229023 (соответствует заявке РСТ WO 2003/057134) и в опубликованной заявке на патент США №
30 2003/0236193, содержание которых полностью включено в настоящее описание в качестве ссылок для всех целей.
Конкретные средства для химиотерапии включают (но не ограничены только ими) такие агенты, как: талидомид и аналоги талидомида ^-(2,6-диоксо
3-пиперидил)фталимид); текогалан натрия (сульфированный полисахарид пептидогликан); TAN 1120 (8-ацетил-У-1-0-тетрагидро-1 1-тригидрокси-1-метокси-10-[[октагидро-5-гидрокси-2-(2-гидроксипропил)-4,10-диметилпирано[3,4-(1]-1,3,6-диоксазоцин-8-ил]окси]-5,12-нафтацендион); 5 сурадиста (7,7'-[карбонилбис[имино(1-метил-ГН-пиррол-4,2-
диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]]бис-1,3-нафталиндисульфоновой кислоты тетранатриевая соль); SU 302; SU 301; SU 1498 ((Е)-2-циан-3-[4-гидрокси-3,5-бис(1-метилэтил)фенил]^-(3-фенилпропил)-2-пропенамид); SU 1433 (4-(6,7-диметил-2-хиноксалинил)-1,2-бензолдиол); ST 10 1514; SR 25989; растворимый Tie-2; производные SERM, фармос; семаксаниб
(pINN) (3-[(3,5-диметил-1Н- пиррол-2-ил)метилен]-1,3"-дигидро-2Н-индол-2-он); S 836; RG 8803; рестин; R 440 (3-(1-метил-1Н-индол-3-ил)-4-(1-метил-6-нитро-1Н-индол-3-ил)-1Н-пиррол-2,5-дион); R 123942 (1-[6-(1,2,4-тиадиазол-5-ил)-3-пиридазинил]^-[3-(трифторметил)фенил]-4-пиперидинамин); ингибитор 15 пролилгидроксилазы; ускоряющие развитие гены; приномастат (INN) ((S)-2,2-диметил-4-[[иа/?а-(4-пиридилокси)фенил]сульфонил]-3-тиоморфолинкарбогидроксамовая кислота); NV 1030; NM 3 (8-гидрокси-6-метокси-альфа-метил-1-оксо-1Н-2-бензопиран-3-уксусная кислота); NF 681; NF 050; MIG; МЕТН 2; МЕТН 1; манассантин В (альфа-[1-[4-[5-[4-[2-(3,4-20 диметоксифенил)-2-гидрокси-1-метилэтокси]-3-л <е"7а-этоксифенил]тетрагидро-3,4-диметил-2-фуранил]-2-метоксифенокси]этил]-1,3-бензодиоксол-5-метанол); моноклональное антитело к KDR; моноклональное антитело к альфа5бетаЗ интегрину; LY 290293 (2-амино-4-(3-пиридинил)-4Н-нафто [1,2-Ь]-пиран-3-карбонитрил); КР 0201448; КМ 2550; интегринспецифические пептиды; INGN 25 401; GYKI 66475; GYKI 66462; гринстатин (101-354-плазминоген (человеческий)); генная терапия для ревматоидного артрита, рака предстательной железы, рака яичника, глиомы, эндостатина, колоректального рака, ATF BTPI, гены антиангиогенеза, ингибитора ангиогенеза или ангиогенеза; ингибитор желатиназы, FR 111142 (4,5-дигидрокси-2-гексеновой кислоты 530 метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксиранил]-1-оксаспиро[2.5]окт-6-иловый эфир); форфенимекс (PINN) (8)-альфа-амино-3-гидрокси-4-(гидроксиметил)бензолуксусная кислота); антагонист фибронектина (1-ацетил-Ь-пролил-Ь-гистидил-Е-серил-Ь-цистеинил-Ь-аспартамид); ингибитор рецептора
фактора роста фибробластов; антагонист фактора роста фибробластов; FCE 27164 (7,7'-[карбонилбис[имино(1-метил-Ш-пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-диил)карбонилимино]-]бис-1,3,5-нафталинтрисульфоновой кислоты гексанатриевая соль); FCE26752 (8,8'-[карбонилбис[имино(1-метил-1Н-5 пиррол-4,2-диил)карбонилимино(1-метил-1Н-пиррол-4,2-
диил)карбонилимино]]бис-1,3,6-нафталинтрисульфоновая кислота); активирующий эндотелиальные моноциты полипептид II; антисмысловой олигонуклеотид VEGF; антиангиогенные и трофические факторы; ангиостатический агент ANCHOR; эндостатин; ангиогенный белок Del-I; СТ
10 3577; контортростатин; СМ 101; хондроитиназа AC; CDP 845; канстатин; BST 2002; BST 2001; BLS 0597; BIBF 1000; ARRESTIN; апомигрен (1304-1388-типа XV коллаген (предшественник альфа1-цепи человеческого гена COL15A1)); ангиоингибин; ааАТШ; А 36; 9-альфа-фтормедроксипрогестеронацетат ((6-альфа)-17-(ацетилокси)-9-фтор-6-метилпрегн-4-ен-3,20-дион); 2-метил-2-
15 фталимидиноглутаровая кислота; (2-(1,3-дигидро-1-оксо-2Н-изоиндол-2-ил)-2-метилпентадионовая кислота); меченное иттрием 90 моноклональное антитело BC-I; семаксаниб (3-(4,5-диметилпиррол-2-илметилен)индолин-2-он)(С15 HI4 N2 О); PI 88 (фосфоманнопентаозы сульфат); алвоцидиб (4Н-1 -бензопиран-4-он, 2-(2-хлорфенил)-5,7-дигидрокси-8-(3-гидрокси-1-метил-4-пиперидинил)-г/мс-(-)-)
20 (С21 Н20 CI N 05); Е 7820; SU 11248 (5-[3-фтор-2-оксо-1,2-дигидроиндол-(Зг)-илиденметил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоновой кислоты (2-диэтиламиноэтил)амид) (С22 Н27 F N4 02); скваламин (холестан-7,24-диол, 3-[[3-[(4-аминобутил)аминопропил]амино]-, 24-(бисульфат),
(3.бета.,5.альфа.,7.альфа.)-) (С34 Н65 N3 05 S); эриохром (Eriochrome) Black Т;
25 AGM 1470 (карбаминовой кислоты, (хлорацетил)-, 5-метокси-4-[2-метил-3-(3-метил-2-бутенил)оксииранил]-1-оксаспиро[2,5]окт-6-иловый эфир, [ЗR-[Зaльфa, 4альфа(2^ 3R), 5бета, ббета]]) (С 19 Н28 CI N Об); AZD 9935; BIBF 1000; AZD 2171; АВТ 828; К8-интерлейкин-2; утероглобин; А 6; NSC 639366 (1-[3-(диэтиламино)-2-гидроксипропиламино]-4-(оксиран-2-
30 илметиламино)антрахинонфумарат) (С24 Н29 N3 04. С4 Н4 04); ISV 616; анти-ED-B слитые белки; HUI 77; тропонин I; моноклональное антитело BC-I; SPV 5.2; ER 68203; CKD 731 (3-(3,4,5-триметоксифенил)-2(Е)-.акриловой кислоты (ЗR,4S,5S,6R)-4-[2(R)-мeтил-3(R)-3(R)-(3-мeтил-2-бyтeнил)oкcиpaн-2-ил]-5
метокси-1-оксаспиро-[2.5]окт-6-иловый эфир) (С28 Н38 08); IMC-IC1 1; ааАТШ; SC 7; СМ 101; ангикол; крингл (Kringle) 5; CKD 732 (3-[4-[2-(диметиламино)этокси]фенил]-2(Е)-акриловая кислота)(С29 Н41 N 06); U 995; КанСтатин; SQ 885; СТ 2584 (1-[11-(додециламино)-10-гидроксундецил]-3,7-5 диметилксантин)(С30 Н55 N5 ОЗ); салмозтин; EMAP II; ТХ 1920 (1-(4-метилпиперазино)-2-(2-нитро-1Н-1-имидазоил)-1-этанон) (СЮ Н15 N5 03); ингибитор альфа-v бета-х; CHER. 11509 (Ы-(1-пропинил)глицил-[Ы-(2-нафтил)]глицил-[М-(карбамоилметил)]глицинбис(4-
метоксифенил)метиламид)(С36 Н37 N5 06); BST 2002; BST 2001; В 0829; FR 10 111142; 4,5-дигидрокси-2(Е)-гексеновой кислоты (3R,4S,5S,6R)-4-[l(R),2(R)-
эпокси-1,5-диметил-4-гексенил]-5-метокси-1-оксаспиро[2.5]октан-6-иловый эфир (С22 Н34 07); и ингибиторы киназ, включающие (но, не ограничиваясь только ими) такие соединения, как М-(4-хлорфенил)-4-(4-пиридинилметил)-1-фталазинамин; 4-[4-[[[[4-хлор-3-15 (трифторметил)фенил]амино]карбонил]амино]фенокси]-Ы-метил-2-
пиридинкарбоксамид; Н-[2-(диэтиламино)этил]-5-[(5-фтор-1,2-дигидро-2-оксо-ЗН-индол-3-илиден)метил]-2,4-диметил-1Н-пиррол-3-карбоксамид; 3-[(4-бром-
2.6- дифторфенил)метокси]-5-[[[[4-(1-
пирролидинил)бутил]амино]карбонил]амино]-4-изотиазолкарбоксамид; N-(4-20 бром-2-фторфенил)-6-метокси-7-[( 1 -метил-4-пиперидинил)метокси]-4-
хиназолинамин; 3-[5,6,7, 13-тетрагидро-9-[(1-метилэтокси)метил]-5-оксо-12Н-индено[2,1-а]пирроло[3,4-с]карбазол-1 2-ил]пропиллвый эфир N,N-диметилглицина; Ы-[5-[[[5-(1,1-диметилэтил)-2-оксазолил]метил]тио]-2-тиазолил]-4-пиперидинкарбоксамид; И-[3-хлор-4-[(3-25 фторфенил)метокси]фенил]-6-[5-[[[2-(метилсульфонил)этил]амино]метил]-2-
фуранил]4-хиназолинамин; 4-[(4-метил-1-пиперазинил)метил]^-[4-метил-3-[[4-(3-пиридинил)-2-пиримидинил]амино]фенил]бензамид; Н-(3-хлор-4-фторфенил)-7-метокси-6-[3-(4-морфолинил)пропокси]-4-хиназолинамин; Ы-(З-этинилфенил)-
6.7- бис(2-метоксиэтокси)-4-хиназолинамин; N-(3-((((2R)-l-мeтил-2-
30 пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((3-( 1,3-оксазол-5-
ил)фенил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-(((4-фторфенил)метил)амино)-Н-(3-((((2R)-l-мeтил-2-пиppoлидинил)мeтил)oкcи)-5-(тpифтopмeтил)фeнил)-3-пиридинкарбоксамид; Н-[3-(азетидин-3-илметокси)-5-трифторметилфенил]-2-(4
фторбензиламино)никотинамид; 6-фтор-Ы-(4-( 1 -метилэтил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-К-(3-(((28-)-2-пирролидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-3 пиридинкарбоксамид; N-(3-(l, 1 -диметилэтил)-1Н-пиразол-5-ил)-2-((4-5 пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; ]Ч[-(3,3-диметил-2,3-дигидро-1-бензофуран-6-ил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-((((28)-1-метил-2-пирролидинил)метил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3- пиридинкарбоксамид; 2-((4-пиридинилметил)амино)-Ы-(3-((2-(1-пирролидинил)этил)окси)-4-(трифторметил)фенил)-3-
10 пиридинкарбоксамид; Ы-(3,3-диметил-2,3-Дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-((4-
пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; Ы-(4-(пентафторэтил)-3-(((28)-2-пирролидинилметил)окси)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; М-(3-((3-азетидинилметил)окси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((4-пиридинилметил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; N-(3-(4-
15 пиперидинилокси)-5-(трифторметил)фенил)-2-((2-(3-пиридинил)этил)амино)-3-пиридинкарбоксамид; Н-(4,4-диметил-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(Ш-индазол-6-иламино)никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-Н-[3-(1-метилпирролидин-2-илметокси)-5-трифторметилфенил]никотинамид; N-[l-(2-диметиламиноацетил)-3,3-Диметил-2,3-дигидро-1Н-индол-6-ил]-2-(1Н-индазол-6-
20 иламино)-никотинамид; 2-(1Н-индазол-6-иламино)-М-[3-(пирролидин-2-
илметокси)-5-трифторметилфенил] никотинамид; М-(1-ацетил-8-диметил-8-дигидро-1Н-индол-6-ил)-2-(Ш-индазол-6-иламино)никотинамид; Ы-(4,4-диметил-1-оксо-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-7-ил)-2-(1Н-индазол-6-иламино)никотинамид; Ы-[4-(/и/7е/и-бутил)-3-(3-пиперидилпропил)фенил][2-(1Н-
25 индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид; Н-[5-(т/?е/я-бутил)изоксазол-3-ил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид и N-[4-(mpem-бутил)фенил][2-(1Н-индазол-6-иламино)(3-пиридил)]карбоксамид, а также ингибиторы киназ, описанные в US №№ 6258812; 6235764; 6630500; 6515004; 6713485; 5521184; 5770599; 5747498; 5990141; публикации заявки на патент
30 США № 2003/0105091; и публикации РСТ (договор о патентной кооперации) WO 01/37820; WO 01/32651; WO 02/68406; WO 02/66470; WO 02/55501; WO 04/05279; WO 04/07481; WO 04/07458; WO 04/09784; WO 02/59110; WO 99/45009; WO 98/35958; WO 00/59509; WO 99/61422; WO 00/12089 и WO
00/02871, каждая из указанных публикаций включена в настоящее описание в качестве ссылки для всех целей.
В одном из вариантов осуществления изобретения иммунотерапия рака, которую можно применять в сочетании с антителом к CSF-1R, включает (но, не 5 ограничиваясь только им) ингибитор фактора роста. Примеры таких агентов включают (но, не ограничиваясь только ими) агенты, которые могут ингибировать ответы EGF-R (рецептор эпидермального фактора роста), такие как антитела к EGF-R, антитела к EGF и молекулы, которые являются ингибиторами EGF-R; ингибиторы VEGF (сосудистый эндотелиальный фактор
10 роста), такие как ингибиторы VEGF-рецепторов и молекулы, которые могут ингибировать VEGF; и ингибиторы егЬВ2-рецептора, такие как органические молекулы или антитела, которые связываются с егЬВ2-рецептором, например, герцептин (HERCEPTIN) (трастузумаб) (фирма Genentech, Inc.). Ингибиторы EGF-R описаны, например, в US № 5747498, WO 98/14451, WO 95/19970 и WO
15 98/02434.
В одном из вариантов осуществления изобретения в дополнение к антителу к CSF-1R можно применять лучевую терапию и/или можно использовать радиофармацевтические средства. Источник излучения может быть либо внутренним, либо внешним относительно пациента, подлежащего лечению.
20 Когда источник является внешним относительно пациента, то терапию называют наружной лучевой терапией (EBRT). Когда источник излучения является внутренним относительно пациента, то лечение обозначают как брахитерапия (ВТ). Радиоактивные атомы, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно выбирать из группы, включающей (но, не ограничиваясь
25 только ими) радий, цезий-137, иридий-192, америций-241, золото-198, кобальт -57, медь-67, технеций-99, йод-123, йод-131 и индий-111. Можно также метить антитело соответствующими радиоактивными изотопами.
Лучевая терапия является стандартным средством лечения для контроля нерезектабельных или неоперабельных опухолей и/или метастазов опухолей.
30 Улучшенные результаты были получены, когда лучевую терапию объединяли с химиотерапией. Лучевая терапия основана на принципе, что высокая доза излучения, поставляемая к области-мишени, может приводить к гибели репродуктивных клеток, как в опухоли, так и в здоровых тканях. Схему введения
излучения, как правило, определяют в понятиях абсорбированной дозы излучения (Гр), времени и фракционирования, и ее должен тщательно подбирать онколог. Количество излучения, полученное пациентом, должно зависеть от различных обстоятельств, но двумя наиболее важными являются локализация 5 опухоли относительно других имеющих решающее значение структур или органов в организме, и степень распространения опухоли. Типичный курс лечения пациента, подвергающегося лучевой терапии, представляет собой схему лечения в течение периода времени, составляющего от 1 до 6 недель, при этом общую дозу, составляющую от 10 до 80 Гр, вводят пациенту в виде однократной
10 суточной фракционированной дозы, составляющей от 1,8 до 2,0 Гр, 5 дней в
неделю. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения имеет место синергизм, когда опухоли у больных людей подвергают комбинированной терапии, предлагаемой в изобретении, и излучению. Другими словами, ингибирование роста опухолей с помощью агентов, входящих в
15 комбинацию, предлагаемую в изобретении, повышается при объединении с излучением, необязательно в сочетании с дополнительными химиотерапевтическими или противораковыми средствами. Параметры вспомогательной лучевой терапии описаны, например, в WO 99/60023.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело к CSF-1R
20 отличается тем, что антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) в соотношении 1:50 или менее.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело отличается тем, что антитело не связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID
25 NO: 65).
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое отличается тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
30 б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16,
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76,
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 83 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 84; или его гуманизированная версия.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, 5 которое отличается тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16;
10 или его гуманизированная версия.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое отличается тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24 или
15 б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный
20 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48; или
д) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 55 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 56.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, которое отличается тем, что
25 а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 1, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 5 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 6, или
30 б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 9, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 10, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3
участок, имеющий SEQ ID NO: 12, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 13 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDR1-участок,
5 имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDR1-участок,
10 имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDR1-участок,
15 имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK, имеющий
SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDR1-участок,
20 имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID N0:45 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID N0:46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK, имеющий
SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDR1-участок,
25 имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID N0:53 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID N0:54, или
з) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 69, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 70, и CDR1-участок,
30 имеющий SEQ ID NO: 71, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 73 и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 74, или
и) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 77, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 78, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 79, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 80, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 81 и 5 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 82.
В одном из вариантов осуществления изобретения антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgGl или человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4.
Следующим вариантом осуществления изобретения является 10 фармацевтическая композиция, содержащая антитело, предлагаемое в изобретении.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в
изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для
лечения опосредуемого CSF-1R заболевания.
15 Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в
изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для 20 лечения потери костной ткани.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения метастазов.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в 25 изобретении, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения воспалительных заболеваний.
Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения опосредуемого CSF-1R заболевания.
Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, 30 предназначенному для лечения рака.
Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения потери костной ткани.
Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении, предназначенному для лечения метастазов.
Изобретение относится также к антителу, предлагаемому в изобретении,
предназначенному для лечения воспалительных заболеваний.
5 Комбинированные терапии, включающие применение антител,
представленных в настоящем описании, оказывают благоприятные воздействия на пациентов, которые нуждаются в направленной на CSF-1R терапии. Антитела, предлагаемые в изобретении, обладают высокой антипролиферативной активностью в отношении независимой от лиганда и зависимой от лиганда
10 пролиферации и поэтому их особенно предпочтительно применять для лечения рака и метастазов в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего раком, заключающемуся в том, что пациенту, у которого диагностировано
15 наличие указанного заболевания (и который поэтому нуждается в такой терапии), вводят в эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении, в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака. Антитело вводят предпочтительно в составе фармацевтической композиции.
20 При создании изобретения неожиданно было установлено, что, используя
фрагмент человеческого CSF-1R delD4, в котором Б4-субдомен человеческого CSF-1R-ECD удален в результате делеции (SEQ ID NO: 65), можно отбирать новые антитела к CSF-1R. Эти антитела обладают ценными свойствами, такими как очень высокое зависимое от лиганда ингибирование клеточного роста и в то
25 же время независимое от лиганда ингибирование роста клеток линии NIH ЗТЗ, инфицированных ретровирусным экспрессионным вектором, несущим либо полноразмерный CSF-1R дикого типа (SEQ ID NO: 62), либо мутант CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID NO: 63), при этом несущие мутантный CSF-1R рекомбинантные клетки обладают способностью формировать сфероиды вне
30 зависимости от лиганда CSF-1. Кроме того, указанные антитела ингибируют дифференцировку макрофагов, как у человека, так и у обезьян циномолгус (яванский макак-крабоед) (у обоих видов), поскольку они ингибируют выживаемость моноцитов человека и обезьян циномолгус.
Кроме того, антитела, которые связываются со связывающимися доменами (димеризации) D4-D5, можно отбирать путем скрининга антител, которые связываются с полным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) (включая домены D1-D5), но не связываются с доменами D1-D3 (SEQ ID 5 NO: 66) внеклеточного домена человеческого CSF-1R.
Описание чертежей
На чертежах показано:
на фиг. 1 - данные об ингибировании роста опухолевых клеток линии Be Wo в виде ЗО-культуры после обработки различными моноклональными 10 антителами к CSF-1R при их применении в концентрации 10 мкг/мл.
Ось X: жизнеспособность, выраженная в виде стандартизованных средних относительных световых единиц (RLU), которые соответствуют содержанию АТФ в клетках (CellTiterGlo-анализ).
Ось Y: изученные зонды: минимальная среда (0,5% сыворотки плода 15 коровы (FBS)), мышиный IgGl (mlgGl, 10 мкг/мл), мышиный IgG2a (mIgG2a, 10 мкг/мл), только CSF-1, МАт 2F11, МАт 2Е10, МАт 2Н7, МАт 1G10 и SC 2-4А5. Наиболее выраженное ингибирование индуцируемого CSF-1 роста обнаружено при применении антител к CSF-1R, предлагаемых в изобретении;
на фиг. 2а - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, которые 20 характеризуют связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены Dl -D3 и D5) (SEQ ID NO: 65) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): в то время как для антител МАт 3291 и SC 25 2-4А5 четко продемонстрировано связывание с указанным ёеШ4-фрагментом, антитела, предлагаемые в изобретении, например МАт 2F11 и МАт 2Е10, не связывались с фрагментом CSF-1R delD4. Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 также не связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;
на фиг. 26 - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, 30 характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO: 64) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный
уровень соответствует О RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R обнаружена способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD; на фиг 2в - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, 5 характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO: 65) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует О RU, на оси х: время в секундах (с)): МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированное
10 антитело ЬМАт 2F11-е7 не связывались с фрагментом CSF-1R delD4.
Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 также не связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;
на фиг. 2г - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным
15 внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO: 64) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, таких как МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированное антитело ЬМАт
20 2F11-е7, обнаружена способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD;
на фиг 2д - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные
25 субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO: 65) (на оси у: характеризующие
связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует 0 RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, таких как 1.2.SM, CXIIG6, аЫ0676 и МАт3291, обнаружена способность связываться с фрагментом CSF-1R. Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 не
30 связывалось с фрагментом CSF-1R delD4;
на фиг. 2е - сенсограммы, полученные с помощью Biacore-анализа, характеризующие связывание различных антител к CSF-1R с иммобилизованным внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который
содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO: 64) (на оси у: характеризующие связывание сигналы в виде единиц ответа (RU), исходный уровень соответствует О RU, на оси х: время в секундах (с)): для всех антител к CSF-1R, таких как 1.2.SM, CXIIG6, аЫ0676 и МАт3291, обнаружена 5 способность связываться с CSF-1R-ECD. Контрольное антитело к CCR5 m Pz03.1C5 не связывалось с CSF-1R-ECD;
на фиг. За-Зг - данные об уровнях CSF-1 у обезьян циномолгус после внесения в различных дозах антитела к CSF-1R, предлагаемого в изобретении; на фиг. 4 - данные об эффективности in vivo - ингибирование роста
10 опухолей антителами к CSF-1R, предлагаемыми в изобретении, при оценке с использованием ксенотрансплантата рака молочной железы линии ВТ20;
на фиг. 5а-5б - на фиг. 5а: данные, демонстрирующие, что человеческие моноциты дифференцировались в макрофаги при совместном культивировании с GM-CSF или CSF-1 (концентрация лиганда 100 нг/мл). После дифференцировки
15 в течение 6 дней добавляли R07155. Жизнеспособность клеток оценивали в день 7 после обработки антителом с помощью анализа жизнеспособности CTG (CellTiterGlo(r), фирма Promega). Расчет % жизнеспособности клеток осуществляли следующим образом: RLU-сигналы обработанных клеток делили на RLU-сигналы необработанных контролей без антитела, (п =4);
20 на фиг. 56 - данные, демонстрирующие, что человеческие моноциты
дифференцировались в макрофаги при культивировании с GM-CSF (Ml) или М-CSF (М2) в течение 7 дней. Анализ фенотипов осуществляли путем косвенного анализа флуоресценции - окрашивания антителом к CD 163-РЕ, антителом к CD80-PE или меченым антителом к HLA-DR/DQ/DP-Zenon-Alexa647. Числа на
25 каждой гистограмме соответствуют среднему значению отношения
интенсивностей флуоресценции (MRFI); рассчитанному как отношение между средней интенсивностью флуоресценции (MFI) клеток, окрашенных выбранным антителом (незакрашенная гистограмма), и соответствующим контролем изотипа (отрицательный контроль; закрашенная серым цветом гистограмма) (среднее ±
30 SD;n> 5);
на фиг. ба-в - данные об эффективности in vivo комбинаций с антителом к мышиному CSF1R на модели колоректального рака (CRC), созданной на мышах линии МС38 in vivo;
на фиг. 7 - данные об эффективности in vivo комбинации антитела и антитела : установлено, что комбинация МАт к CSF1R + МАт к CD40 FGK45 обладали повышенной противоопухолевой эффективностью по сравнению с монотерапией на модели, созданной на мышах линии МС38 с 5 помощью сингенной трансплантации рака ободочной кишки. Подробное описание изобретения
Многие опухоли отличаются выраженным инфильтратом иммунных клеток, включая макрофаги. Ранее считалось, что иммунные клетки являются частью защитного механизма, направленного против опухоли, однако современные
10 данные подтвердили идею о том, что некоторые популяции иммунных клеток, включая макрофаги, могут фактически ускорять развитие опухоли. Макрофаги отличаются пластичностью. В зависимости от цитокинового микроокружения макрофаги можно подразделять на так называемые Ml - или М2-подтипы. М2-макрофаги участвуют в подавлении противоопухолевого иммунитета. Они
15 играют также важную роль в функциях репарации тканей, таких как ангиогенез ремоделирование тканей, что в результате кооптации приводит к поддержанию роста опухоли. В противоположность усиливающих рост опухоли М2-макрофагов, Ml-макрофаги обладают противоопухолевой активностью в результате секреции провоспалительных цитокинов и их участия в презентации
20 антигенов и фагоцитозе (Mantovani А. и др., Curr. Opin. Immunol. 2, 2010, сс. 231-237).
Путем секреции различных цитокинов, таких как колониестимулирующий фактор 1 (CSF-1) и IL-10, опухолевые клетки обладают способностью осуществлять рекрутмент и превращать макрофаги в М2-подтип, в то время как
25 такие цитокины, как колониестимулирующий фактор гранулоцитов и
макрофаговг (GM-CSF), IFN-гамма программирует превращение макрофагов в Ml-подтип. С использованием иммуногистохимии оказалось возможным различать субпопуляцию макрофагов, совместно экспрессирующих CD68 и CD 163, которая, вероятно, обогащена М2-макрофагами, и субпопуляцию,
30 имеющую иммунный фенотип С068+/ГКГС И+ или CD68+/CD80+, которая,
вероятно, включает Ml-макрофаги. Форма, размер клеток и пространственное распределение CD68- и CD 163-позитивных макрофагов согласуются с опубликованными гипотезами об ускоряющей рост опухоли роли М2
макрофагов, например, об этом свидетельствует их предпочтение к локализации в пересекающей опухоль строме и важных для развития опухоли областях. В противоположность этому, CD68+/rKrC класса И+-макрофаги встречаются повсеместно. Их гипотетическая роль в фагоцитозе подтверждается наличием 5 кластеров иммунофенотипа СЭ68+/ГКГС класса И+, но CD163", вблизи апоптозных клеток и в областях некроза опухоли.
Подтип и экспрессия маркеров различных субпопуляций макрофагов связаны с их функциональным статусом. М2-макрофаги могут поддерживать онкогенез путем:
10 а) усиления ангиогенеза посредством секреции ангиогенных факторов,
таких как VEGF или bFGF,
б) поддержания образования метастазов посредством секреции матриксных
металлопротеиназ (ММР), факторов роста и факторов миграции,
обеспечивающих попадание опухолевых клеток в кровоток и поддерживания
15 метастатической ниши (Wyckoff J. и др., Cancer Res. 67, 2007, сс. 2649-2656),
в) участия в создании иммуносупрессорной среды путем секреции
иммуносупрессорных цитокинов, таких как IL-4,11-13, IL-lra и IL-10, которые, в
свою очередь, регулируют функцию регуляторных Т-клеток. И, наоборот,
установлено, что СБ4-позитивные Т-клетки повышают активность усиливающих
20 рост опухоли макрофагов на доклинических моделях (Mantovani А. и др., Eur. J. Cancer 40, 2004, сс. 1660-1667; DeNardo D. и др., Cancer Cell 16, 2009, cc. 91102).
Так, при некоторых типах рака (например, при раке молочной железы, яичника, лимфоме Ходжкина) превалирование М2-подтипа ассоциированных с
25 опухолью макрофагов (ТАМ) коррелирует с плохим прогнозом (Bingle L. и др., J. Pathol. 3, 2002, сс. 254-265; Orre М. и Rogers Р.А., Gynecol. Oncol. 1, 1999, сс. 47-50; Steidl С. и др., N. Engl. J. Med. 10, 2010, сс. 875-885). В полученных в настоящее время данных продемонстрирована корреляция между инфильтратом СВ163-позитивных макрофагов в опухолях и степенью злокачественности
30 опухоли (Kawamura К. и др., Pathol. Int. 59, 2009, сс. 300-305). ТАМ, выделенные из опухолей пациента, имели толерантный фенотип и не обладали цитотоксичностью для опухолевых клеток (Mantovani А. и др., Eur. J. Cancer 40, 2004, сс. 1660-1667). Однако инфильтрация ТАМ в присутствии
цитотоксических Т-клеток коррелирует с повышенным выживанием при
немелкоклеточном раке легкого, и, следовательно, отражает присутствие в более
значительных количествах инфильтрата Ml-макрофагов при данном типе
опухоли (Kawai О. и др., Cancer 6, 2008, сс. 1387-1395).
5 В настоящее время продемонстрировано, что так называемая иммунная
сигнатура, отличающаяся наличием более значительного количества макрофагов и СВ4-позитивных Т-клеток, но меньшими количествами цитотоксических CD8-позитивных Т-клеток, коррелирует с пониженной общей выживаемостью (OS) пациентов с раком молочной железы и представляет собой независимый
10 прогностический фактор (DeNardo, D. и др., Cancer Discovery 1, 2011, сс. 54-67).
В соответствии с ролью CSF-1 в регуляции проонкогенной функции М2-макрофагов, высокий уровень экспрессии CSF-1 при редких видах сарком или локально агрессивных опухолей соединительной ткани, таких как пигментированный виллонодулярный синовиит (PVNS) и теносиновиальная
15 гигантоклеточная опухоль (TGCT), в результате транслокации гена CSF-1, приводит к накоплению моноцитов и макрофагов, которые экспрессируют рецептор для CSF-1, рецептор колониестимулирующего фактора 1 (CSF-1R), что формирует основную часть массы опухоли (West R.B. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 690-695). Эти опухоли затем применяли для определения
20 CSF-1-зависимой сигнатуры макрофагов путем изучения профиля генной экспрессии. При раке молочной железы и леймиосаркоме, если опухоли пациента имеют CSF-1-ответ с указанной генной сигнатурой, то это свидетельствует о плохом прогнозе (Espinosa I. и др., Am. J. Pathol. 6, 2009, сс. 2347-2356; Beck А. и др., Clin. Cancer Res. 3, 2009, сс. 778-787).
25 CSF-1 R принадлежит к классу III подсемейства рецепторных тирозинкиназ
и он кодируется протоонкогеном c-fms. Связывание с CSF-1 или IL-34 индуцирует димеризацию рецептора с последующими автофосфорилированием и активацией каскада сигналов в прямом направлении. Активация CSF-1R регулирует выживание, пролиферацию и дифференцировку моноцитов и
30 макрофагов (Xiong Y. и др., J. Biol. Chem. 286, 2011, сс. 952-960).
Помимо клеток моноцитарной линии дифференцировки и остеокластов, которые имеют происхождение из одного и того же гематопоэтического предшественника, что и макрофаг, экспрессия CSF-lR/c-fms обнаружена также
при некоторых типах человеческого эпителиального рака, такого как рак яичника и молочной железы, и при леймиосаркоме и TGCT/PVNS, хотя и с более низкими уровнями экспрессии по сравнению с макрофагами. Также как в случае TGCT/PVNS, повышенные уровни CSF-1, т.е. лиганда CSF-1R, в сыворотке, а 5 также в асцитах у страдающих раком яичника пациентов, коррелировало с
плохим прогнозом (Scholl S. и др., Br. J. Cancer 62, 1994, сс. 342-346; Price F. и др., Am. J. Obstet. Gynecol. 168, 1993, cc. 520-527). Кроме того, конститутивно активная мутантная форма CSF-1R обладает способностью трансформировать МНЗТЗ-клетки, что является одним из свойства онкогена (Chambers S., Future
10 Oncol 5, 2009, сс. 1429-1440).
На доклинических моделях установлено, что CSF-1R является онкологической мишенью. Блокада CSF-1, а также активности CSF-1R приводит к пониженному рекрутменту ТАМ. Химиотерапия, приводящая к повышенным уровням экспрессии CSF-1 в опухолевых клетках, приводит к повышенному
15 рекрутменту ТАМ. Блокада CSF-1R в сочетании с паклитакселом приводила к активации СВ8-позитивных цитотоксических Т-клеток, что замедляло рост опухоли и метастатическую нагрузку на модели спонтанного трансгенного рака молочной железы (DeNardo D. и др., Cancer Discovery 1, 2011, сс. 54-67). Антитела к CSF-1R, представленные в изобретении, связываются с
20 мембранными проксимальными внеклеточными доменами D4 и D5, которые образуют поверхность раздела при димеризации рецептора. Они блокируют опосредованную CSF-1, IL-34, а также независимую от лиганда активацию рецептора, что приводит к индукции апоптоза М2-подобных макрофагов, дифференцированных in vitro в присутствии CSF-1, оказывая при этом
25 "щадящее" воздействие на Ml-подобных дифференцированных в присутствии GM-CSF макрофагов. В ткани человеческого рака молочной железы обнаружена совместная локализация М2 (С068+/СВ163+)-макрофагов и экспрессирующих CSF-1R макрофагов. У обезьян циномолгус обработка в течение 13 недель пМАт 2F11-е7 снижала количество СВ163-позитивных макрофагов в печени и
30 ободочной кишке, но не снижала количество макрофагов в легком.
Несмотря на открытие нескольких новых агентов, клиническое лечение многих запущенных солидных (плотных) опухолей остается проблематичным. Успехи в понимании биологии рака на молекулярном уровне стимулировали
исследование с целью разработки более направленных терапий, позволяющих улучшать результаты лечения.
CSF-1R представляет собой белок, кодируемый геном CSF-1R. Он контролирует производство, дифференцировку и функцию М2-макрофагов, 5 которые, в свою очередь, поддерживают рост опухоли и образование метастазов и секретируют иммуносупрессорные цитокины, что приводит к плохому прогнозу для пациентов. Кроме того, установлено, что присутствие CSF-1R-позитивных макрофагов при некоторых типах человеческого рака (таких как карцинома яичника и молочной железы) коррелирует не только с повышенной
10 плотностью сосудов, но также и ухудшает клинический исход. На
доклинических моделях продемонстрирована активность ингибиторов CSF-1R, которые избирательно ингибируют ТАМ М2-типа (DeNardo D. и др., Cancer Discovery 1, 2011, сс. 54-67; Lin Е. и др., J. Exp. Med. 193, 2001, сс. 727-740). Блокада активности CSF-1R приводит к пониженному рекрутменту ТАМ и при
15 применении в сочетании с химиотерапией синергетическое действие приводит к уменьшению роста опухоли и метастатической нагрузки. Полученные в последнее время данные продемонстрировали, что у пациентов с PVNS и TGCT обнаружена сверхэкспрессия CSF-1, и она частично опосредуется транслокацией гена CSF-1R (West R.B. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 690-695).
20 При раке молочной железы присутствие сигнатуры генного ответа на CSF-1
позволяет предсказать риск возникновения рецидива и метастазов (Beck А. и др., Clin. Cancer Res. 3, 2009, сс. 778-787).
Основываясь на противоопухолевой эффективности антител, представленных в настоящем изобретении, при их индивидуальном применении,
25 представляет разумным оценить гипотезу о блокаде ассоциированных с
опухолью макрофагов и их проопухолевой биологической активности при применении в сочетании с такими агентами, как таксаны (такие, например, как паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например, абраксан и опаксио), доксорубицин, сунитиниб (сутент), сорафениб
30 (Нексавар) и другие мультикиназные ингибиторы, оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин, этопозид, гемцитабин и винбластин. В одном из вариантов осуществления изобретения химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (такие, например, как таксол (паклитаксел),
доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (например абраксан и опаксио).
Изобретение относится к комбинированной терапии, которая включает применение антитела к CSF-1R, отличающегося тем, что антитело связывается с 5 внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) (содержащим домены D1-D5) и не связывается с доменами D1-D3 (SEQ ID NO: 66) внеклеточного домена человеческого CSF-1R.
Изобретение относится к комбинированной терапии, которая включает применение антитела к CSF-1R, отличающегося тем, что антитело связывается с 10 фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO: 65) и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO: 64) в соотношении 1:50 или менее.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей 15 применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
отличающегося тем, что содержит CDR3-y4acTOK вариабельного домена тяжелой цепи, имеющий SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 55.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей 20 применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный
25 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16,
или его гуманизированной версии.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей
применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
отличающегося тем, что
30 а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16,
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76,
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 83 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 84;
5 или его гуманизированной версии.
Изобретение относится к также комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8, или его 10 гуманизированной версии.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
15 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24 или
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
20 г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 55 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 56.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная 25 терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24 или
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
30 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48.
Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело, отличающееся тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 5 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID 10 NO: 32.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID 15 NO: 40.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID 20 NO: 48.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16, или его 25 гуманизированной версии.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76, или его 30 гуманизированной версии.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO:
83 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 84, или его гуманизированной версии.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 5 отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 1, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 5, и
10 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 6, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 9, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 10, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 13, и
15 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и
20 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и
25 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и
30 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 41, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDR1 -участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDR1-участок, 5 имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 54.
Изобретение относится также к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 10 отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 1, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 5, и
15 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 6, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 9, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 10, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 13, и
20 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и
25 CDR1 -участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и
30 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDR1-участок,
5 имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDR1-участок,
10 имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 54, или
з) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 69, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 70, и CDR1-участок,
15 имеющий SEQ ID NO: 71, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 73, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 74, или
и) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 77, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 78, и CDR1-участок,
20 имеющий SEQ ID NO: 79, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 80, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 81, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 82.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с
25 человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 69, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 70, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 71, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 73, и
30 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 74, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 77, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 78, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 79, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 80, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 81, и CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 82.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с 5 человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDR1-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и
10 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 25, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDR1 -участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и
15 CDR1-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и
20 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3 -участок, имеющий
SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и
25 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и
30 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 54.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDRS-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и
5 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и
10 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 37, и
15 CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK, имеющий
SEQ ID NO: 41, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и
20 CDR1 -участок, имеющий SEQ ID NO: 46.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ 25 ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная 30 терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок, имеющий
SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит СОЯЗ-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная 5 терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок,
10 имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38.
Одним из вариантов осуществления изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
15 вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ
ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46.
20 Одним из вариантов осуществления изобретения является антитело,
которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO: 64) в соотношении 1:50 или менее, отличающееся также тем, что не связывается с
25 фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66).
Другим объектом изобретения является выбор пациентов, на которых может оказывать благоприятное воздействие лечение антителом к CSF-1R (включая все антитела к CSF-1R, которые связываются с человеческим CSF-1R) при их введении либо индивидуально, либо в сочетании с
30 химиотерапевтическим средством или иммунотерапией рака, или излучением
(включая все антитела к CSF-1R, которые связываются с человеческим CSF-1R). В одном из вариантов осуществления изобретения выбор указанного пациента осуществляют для лечения антителами к CSF-1R, которые связываются с
доменами D4-D5 внеклеточного домена человеческого CSF-1R, связывающегося
с доменами D4-D5 внеклеточного домена. В указанном способе отбора пациента,
который, вероятно, будет отвечать на указанное лечение, можно использовать
один или несколько указанных ниже биомаркеров.
5 Принципы оценки биомаркеров
Биомаркеры можно применять для воплощения диагностических стратегий и влияния на процесс лечения. В будущем биомаркеры могут позволять совершенствовать персонализированный медицинский подход, например, обеспечивать группировку пациентов на основе молекулярных сигнатур их 10 опухолей и маркеров в крови, а не по типу рака. При создании изобретения усилия были сконцентрированы на идентификации прогностических биомаркеров, которые дают информацию о вероятности эффективности и безопасности терапии.
Для оценки ФД (фармакодинамика) и механистического(их) действия(ий) 15 лекарственного средства на опухоль часто требуется биопсия опухоли.
Принципы получения свежих биопсий опухоли до и в процессе лечения для клинического тестирования
Инфильтрация и дифференцировка ТАМ зависит от соответствующего микроокружения опухоли в первичных и метастатических повреждениях. Кроме 20 того, соответствующий иммунный статус и предварительное лечение пациента могут оказывать влияние на микроокружение опухоли пациента. Таким образом, всех пациентов следует обязательно подвергать биопсии до начала лечения для определения инфильтрации ТАМ и уровней экспрессии CSF-1R на исходном уроне, но не применять ее для определения возможности включения пациента в 25 испытания. Кроме того, следует получать биопсии в процессе лечения, что
должно позволять оценивать ФД-активность антитела к CSF-1R путем сравнения уровней CSF-1R, CD68/CD163, С068/ГКГС класса II, CD31 (плотность микрососудов), Ki67 и других иммунных инфильтрующихся клеток (например, Т-клеток) до и после дозирования. Аспирационная биопсия тонкой иглой (FNA) 30 не может заменять биопсии опухоли, поскольку распределение субпопуляций макрофагов необходимо оценивать в ткани.
Оценка архивных тканей не может заменять свежие биопсии, поскольку инфильтрация и дифференцировка макрофагов зависят от микроокружения.
Микроокружение опухоли может варьироваться в первичной опухоли из-за предварительного лечения пациента, а также изменяться в метастатических повреждениях. Однако, если архивная ткань доступна, то следует осуществлять установленные операции с клиническими образцами (CSO). Образцы следует 5 использовать для исследования ретроспективной корреляции с данными свежих биопсий.
Принципы получения биопсий поврежденной кожи для клинического тестирования
Для различных фаз заживления ран требуется несколько процессов
10 (например, рекрутмент нейтрофилов, инфильтрация макрофагов, ангиогенез (Eming S.A. и др., Prog. Histochem. Cytochem. 42, 2007, сс. 115-170)). Анализы заживления кожи применяли для получения суррогатной ткани для определения ФД-маркеров, например, при антиангиогенных терапиях (Zhang D. и др., Invest. New Drugs 25, 2006, сс. 49-55; Lockhart А.С. и др., Clin. Cancer Res. 9, 2003, сс.
15 586-593). В процессе заживления ран макрофаги играют важную роль и
фенотипические изменения ассоциированных с раной макрофагов (WAM) связаны с различной их ролью на фазах заживления кожи (например, ранняя фаза воспаления ассоциирована с интенсивной фагоцитарной активностью; средняя фаза ремоделирования ткани ассоциирована с иммунорегуляторным
20 состоянием со сверхэкспрессией проангиогенных факторов) (Adamson R., Journal of Wound Care 18, 2009, cc. 349-351; Rodero M.P. и др., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 25, 2010, cc. 643-653; Brancato S.K. и Albina J.E., Wound Macrophages as Key Regulators of Repair, Origin, Phenotype, and Function, AJP, т. 178, № 1, 2011). Фактически, отсутствие макрофагов приводит к замедлению заживления
25 раны у созданных с помощью генной инженерии мышей (Rodero M.P. и др., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 25, 2010, cc. 643-653). В доклинических экспериментах на мышиной модели продемонстрировано выраженное снижение (F4/80-позитивных) макрофагов в коже мышей с ксенотрансплантатом MDA-MB231 (человеческая клеточная линия карциномы молочной железы), которых
30 обрабатывали CSF-1R. Однако описаны видоспецифические различия между мышами и людьми (Daley J.M. и др., J. Leukoc. Biol. 87, 2009, сс. 1-9).
Поскольку WAM и ТАМ имеют происхождение из одинаковых клеток-предшественников и характеризуются сходными функциями и фенотипами, то
можно применять серийные, полученные до лечения и в процессе лечения (в целом п=4) кожные биопсии, для анализа фармакодинамических воздействий обработки антителом к CSF-1R на WAM в процессе заживления раны. Корреляция данных, полученных с использованием кожи, с ФД-воздействиями, 5 выявленными при лечении антителом к CSF-1R на ТАМ в свежих биопсиях опухоли, может в значительной степени расширить сведения о молекулярной основе работы антитела к CSF-1R и ответа опухоли на обработку антителом.
Кроме того, оценка макрофагов в поврежденной кожной ткани потенциально может заменять использование биопсии опухоли в процессе 10 лечения. В более поздних исследованиях оценка WAM может служить в качестве суррогатной ткани для оценки эффективности антитела к CSF-1R.
Принципы измерения биомаркеров в образцах цельной крови для оценки биомаркеров или ФД-маркеров
В доклинических экспериментах установлено, что изменения, например, 15 циркулирующего CSF-1, субпопуляций TRAP5D-MOHO4HTOB И тканевых макрофагов ассоциированы с активностью анти-CSF-lR терапевтических агентов, применяемых в качестве лекарственного средства. Кроме того, данные GLP-Tox (изучение токсичности в соответствии с надлежащей лабораторной практикой), полученные на обработанных CSF-1R обезьянах циномолгус, 20 позволили выявить изменения биомаркеров формирования кости (остеокальцин, P1NP), активности остеокластов (TRAP5b) и гормона паращитовидной железы, которые все коррелировали с костным метаболизмом.
Таким образом, эти маркеры и дополнительные циркулирующие иммуностимулирующие или иммуноингибирующие факторы, такие, например, 25 как растворимый CD 163 (для мониторинга активации моноцитов/макрофагов), могут оказаться ценными для мониторинга фармакодинамических изменений и для отбора пациентов, которые, вероятно, будут давать удовлетворительный ответ на лечение антителом к CSF-1R.
Указанные образцы суррогатной ткани можно применять в 30 исследовательских целях для идентификации прогностических биомаркеров, позволяющих предсказывать ответ на лечение антителом к CSF-1R (с точки зрения дозы, безопасности и переносимости), и которые могут способствовать лучшему пониманию патогенеза, процесса и исхода рака и родственных
заболеваний. Анализ может включать определение циркулирующих маркеров, ассоциированных с ФД-активностью антител к CSF-1R (например оценку уровней цитокинов, циркулирующих иммунных клеток и истощения иммунных эффекторных клеток). В доклинических экспериментах установлено, что 5 изменения, например, циркулирующего CSF-1, субпопуляций TRAP5b-моноцитов и тканевых макрофагов ассоциированы с активностью лекарственного средства. Кроме того, данные GLP-Tox, полученные на обработанных CSF-1R обезьянах циномолгус, выявили изменения биомаркеров формирования кости (остеокальцин, P1NP), активности остеокластов (TRAP5b) и
10 гормона паращитовидной железы, которые все коррелировали с пониженным количеством остеокластов.
Таким образом, эти маркеры и дополнительные циркулирующие иммуностимулирующие или иммуноингибирующие факторы могут оказаться ценными для отбора пациентов, которые, по-видимому, должны давать
15 удовлетворительный ответ на лечение антителом к CSF-1R.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении,
20 заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень in vitro одного или нескольких следующих маркеров:
CSF-1R, CD68/CD163, СТ)68/ГКГС класса II, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67 и других маркеров, таких, например, как инфильтраты 25 иммунных клеток;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1R,
30 CD68/CD163, CD68/rKTC класса II, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67 и других маркеров, таких, например, как инфильтраты иммунных клеток (например, Т-клеток (например, CD4" и/или С08"-Т-клеток) по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит
признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ применяют на практике для схемы лечения на основе антитела к CSF-1R, где 5 антитело, применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении.
В одном из вариантов указанного способа изменение уровня CSF-1R, CD68/CD163, CD68/TKTC класса II, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67 и других маркеров, таких, например, как инфильтраты иммунных клеток 10 (например, Т-клеток (например, CD4" и/или CDS'-T-клеток) по сравнению с
уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких указанных маркеров.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с 15 использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень одного или нескольких
следующих маркеров:
20 CSF-1R, CD68/CD163, СЭ68/ГКГС класса И, CD31 (плотность
микрососудов)и Ki67;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
25 - в котором изменение уровня CSF-1R, CD68/CD163, CD68/TKTC класса И,
CD31 (плотность микрососудов) и КЛ67 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R. Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения
30 того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с
использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень in vitro одного или нескольких следующих маркеров:
CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, 5 включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки (например, в форме образца опухолевой ткани) и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1, Тгар5Ь, sCD163, IL-34, по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является
10 кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ
применяют на практике для схемы лечения на основе антитела к CSF-1R, где
антитело, применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело,
предлагаемое в настоящем изобретении.
15 В одном из вариантов этого способа изменение уровня CSF-1, Тгар5Ь,
sCD163, IL-34 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком,
представляет собой изменение уровня одного или нескольких из этих маркеров. Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения
того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с 20 использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело
представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении,
заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень одного или нескольких из следующих маркеров:
25 CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34, по сравнению 30 с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит
признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, 5 заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень in vitro одного или нескольких следующих маркеров:
SCD163;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, 10 включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня SCD163 по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на
15 основе антитела к CSF-1R.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ
применяют на практике для схемы лечения на основе антитела к CSF-1R, где
антитело, применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело,
предлагаемое в настоящем изобретении.
20 В одном из вариантов этого способа изменение уровня sCD163 по
сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой
повышение уровня этого маркера.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения
того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с 25 использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело
представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении,
заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень одного или нескольких следующих маркеров:
30 SCD163;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня sCD163 по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень in vitro одного или нескольких следующих маркеров: IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из IFNy, TNFa, IL-1Р, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа, по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ применяют на практике для схемы лечения на основе антитела к CSF-1R, где антитело, применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении.
В одном из вариантов указанного способа изменение уровня IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектина 3, ILIRa, TGF-альфа, по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких указанных маркеров.
Одним из объектов настоящего изобретения является способ определения того, является ли пациент, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, где указанное антитело
представляет собой антитело, предлагаемое в настоящем изобретении, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют уровень одного или нескольких следующих маркеров: IFNy, TNFa, IL-10, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF,
5 VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня IFNy, TNFa, IL-ip, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-10 13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа, по сравнению с соответствующим уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
Понятие "антитело" относится к различным формам антител, включая (но,
15 не ограничиваясь только ими) полные антитела, фрагменты антител,
человеческие антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, антитела с истощенными Т-клеточными эпитопами и, кроме того, созданные с помощью генной инженерии антитела, если они сохраняют отличительные признаки, предлагаемые в изобретении. Понятие "фрагменты антитела"
20 относится к части полноразмерного антитела, предпочтительно к его
вариабельной области или по меньшей мере к его антигенсвязывающему центру. Примерами фрагментов антител являются димерные антитела (диабоди), молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Антитела формата scFv описаны,
25 например, у Houston J.S., Methods in Enzymol. 203, 1991, cc. 46-88. Кроме того, к фрагментам антитела относятся одноцепочечные полипептиды, которые имеют характеристики VH-домена, связывающегося с CSF-1R, а именно, обладают способностью объединяться с VL-доменом, или VL-домена, связывающегося с CSF-1R, а именно, обладают способностью объединяться с Ун-доменом с
30 образованием функционального антигенсвязывающего центра и, следовательно, обладающие требуемым свойством.
Понятия "моноклональное антитело" или "композиция моноклонального антитела" в контексте настоящего описания относятся к препарату молекул антитела, которые имеют одинаковый состав аминокислот.
Понятие "химерное антитело" относится к моноклональному антителу, 5 содержащему мышиную вариабельную область, т.е. связывающую область, и по меньшей мере часть константной области из другого источника или других видов, как правило, полученному с помощью методов рекомбинантной ДНК. Химерные антитела, которые содержат мышиную вариабельную область и человеческую константную область, являются наиболее предпочтительными.
10 Такие крысиные/человеческие химерные антитела представляют собой продукт экспрессированных генов иммуноглобулина, которые содержат ДНК-сегменты, кодирующие вариабельные области крысиного иммуноглобулина, и ДНК-сегменты, кодирующие константные области человеческого иммуноглобулина. Другие формы "химерных антител", подпадающие под объем настоящего
15 изобретения, представляют собой такие формы, в которых класс или подкласс модифицирован или изменен относительно исходного антитела. Такие "химерные" антитела обозначают также как "антитела переключенного класса". Методы получения химерных антител включают общепринятые методы, основанные на применении рекомбинантной ДНК и генной трансфекции,
20 которые в настоящее время хорошо известны в данной области (см., например, Morrison S.L. и др., Proc. Natl. Acad Sci. USA 81, 1984, cc, 6851-6855; US № 5202238 и US № 5204244).
Понятие "гуманизированное антитело" относится к антителам, в которых каркасный участок или "гипервариабельные участки" (CDR) модифицированы
25 таким образом, что они содержат CDR иммуноглобулина из других видов по сравнению с родительским иммуноглобулином. В предпочтительном варианте осуществления изобретения мышиный CDR трансплантируют в каркасный участок человеческого антитела, получая "гуманизированное антитело" (см., например, Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс. 323-327; и Neuberger M.S. и
30 др., Nature 314, 1985, сс. 268-270). Необязательно каркасный участок можно модифицировать с помощью дополнительных мутаций. CDR также можно модифицировать с помощью одной или нескольких мутаций с получением антител, предлагаемых в изобретении, например, с помощью мутагенеза,
основанного на молекулярном моделировании, который описан у Riechmann L. и др., Nature, 332, 1988, сс. 323-327 и Queen С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 10029-10033, или у других авторов. Наиболее предпочтительные CDR соответствуют тем CDR, которые имеют последовательности, распознающие 5 антигены, указанные выше для химерных антител. "Гуманизированная версия антитела, предлагаемого в изобретении" (которое, например, получено из организма мышей), относится к антителу, основой которого являются последовательности мышиного антитела, в которых VH И VL гуманизированы стандартными методами (включая трансплантацию CDR и необязательно
10 последующий мутагенез определенных аминокислот в каркасном участке и CDR). Предпочтительно указанная гуманизированная версия является химеризованной с помощью человеческой константной области (см., например, последовательностей SEQ ID NO: 57-61).
Другими формами "гуманизированных антител", подпадающих под объем
15 настоящего изобретения, являются антитела, в которых константная область
дополнительно модифицирована или изменена относительно исходного антитела с получением свойств, указанных в изобретении, прежде всего касательно С1 q-связывания и/или связывания с Fc-рецептором (FcR).
В приведенных ниже примерах понятия "МАт" и "тиМАт" относятся к
20 мышиным моноклональным антителам, таким как МАт 2F11 или МАт 2Е10, а понятие "пМАт" относится к гуманизированным моноклональным версиям указанных мышиных антител, таким как пМАт 2F11 -с 11, пМАт 2F1 l-d8, IIMAT 2F11-е7, пМАт 2F11-П2 и т.д.
В контексте настоящего описания подразумевается, что понятие
25 "человеческое антитело" включает антитела, имеющие вариабельную и
константную области, выведенные из последовательностей иммуноглобулина человеческой зародышевой линии. Человеческие антитела хорошо известны в данной области (van Dijk М.А. и van de Winkel J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 2001, cc. 368-374). Человеческие антитела можно получать также в трансгенных
30 животных (например, мышах), которые обладают способностью после иммунизации вырабатывать полный спектр или определенный набор человеческих антител в отсутствии производства эндогенных иммуноглобулинов. Перенос набора генов иммуноглобулинов человеческой
зародышевой линии в указанных мышей с мутантной зародышевой линией может приводить к образованию человеческих антител после стимуляции антигеном (см., например, Jakobovits А. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, cc. 2551-2555; Jakobovits А. и др., Nature, 362, 1993, cc. 255-258; 5 Brueggemann M. и др., Year Immunol. 7, 1993, cc. 33-40). Человеческие антитела можно получать также с помощью фаговых дисплейных библиотек (Hoogenboom H.R. и Winter G.J., Mol. Biol., 227, 1992, сс. 381-388; Marks J.D. и др., J. Mol. Biol., 222, 1991, cc. 581-597). Для получения человеческих моноклональных антител можно применять также методы, разработанные Cole с соавторами и
10 Boerner с соавторами (Cole S.P.C. и др., Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, под ред. Alan R. Liss, 1985, c. 77; и Boerner P. и др., J. Immunol. 147, 1991, cc. 86-95). Как уже отмечалось для химерных и гуманизированных антител, предлагаемых в настоящем изобретении, в контексте настоящего описания понятие "человеческое антитело" относится также к таким антителам,
15 которые модифицированы в константной области для придания им свойств, предлагаемых в изобретении, прежде всего касательно Clq-связывания и/или FcR-связывания, например, посредством "переключения класса", т.е. изменения или мутации Fc-областей (например, посредством замены IgGl на IgG4 и/или IgGl/IgG4-MyTan.HH).
20 Подразумевается, что понятие "рекомбинантное человеческое антитело" в
контексте настоящего описания включает все человеческие антитела, которые получают, экспрессируют, создают или выделяют методами рекомбинации, такие как антитела, выделенные из клетки-хозяина, такой как NS0- или СНО-клетка, или из животного (например, из мыши), которое является трансгенным
25 по генам человеческого иммуноглобулина, или антитела, экспрессируемые с
помощью рекомбинантного экспрессионного вектора, которым трансфектируют клетку-хозяина. Такие рекомбинантные человеческие антитела имеют вариабельную и константную области в преобразованной форме. Рекомбинантные человеческие антитела, предлагаемые в изобретении,
30 подвергали in vivo соматической гипермутации. Так, аминокислотные
последовательности VH- И Уь-областей рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и выведены из последовательностей VH- И VL-областей человеческой зародышевой линии и являются родственными
им, но могут не встречаться в существующем в естественных условиях in vivo спектре зародышевых линий человеческого антитела.
Антитела, предлагаемые в изобретении, включают также указанные антитела, несущие "консервативные модификации последовательностей", т.е. 5 модификации нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, которые не влияют или не изменяют указанные выше характеристики антител, предлагаемых в изобретении. Модификации можно интродуцировать с помощью стандартных методов, известных в данной области, таких как сайнаправленный мутагенез и ПЦР-опосредуемый мутагенез. Консервативные аминокислотные
10 замены включают замены, при которых один аминокислотный остаток заменяют другим аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. Семейства аминокислотных остатков, имеющих сходные боковые цепи, определены в данной области. Эти семейства включают аминокислотные остатки с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми
15 цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота),
незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин, триптофан), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин), бета-разветвленными боковыми цепями (например,
20 треонин, валин, изолейцин) и ароматическим боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, определенный остаток заменимой аминокислоты в человеческом антителе к CSF-1R можно предпочтительно заменять на другой аминокислотный остаток с боковой цепью из того же семейства боковых цепей.
25 Аминокислотные замены можно осуществлять с помощью мутагенеза,
основанного на молекулярном моделировании, который описан у Riechmann L. и др., Nature 332, 1988, сс. 323-327 и Queen С. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1989, cc. 10029-10033.
Человеческий CSF-1R (рецептор CSF-1; синонимы: рецептор M-CSF;
30 рецептор макрофагального колониестимулирующего фактора 1, протоонкоген Fms, c-fms, SEQ ID NO: 22) известен с 1986 г. (Coussens L. и др., Nature 320, 1986, сс. 277-280). CSF-1R представляет собой фактор роста и он кодируется
протоонкогеном c-fms (см., например, обзор Roth Р. и Stanley E.R., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 181, 1992, cc. 141-167).
CSF-1 R представляет собой рецептор для лигандов CSF-1 (макрофагальный колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF) (SEQ 5 ID NO: 86) и IL-34 (SEQ ID NO: 87), и он опосредует биологические действия указанных цитокинов (Sherr С J. и др., Cell 41, 1985, сс. 665-676; Lin Н. и др., Science, 320, 2008, сс. 807-811). Клонирование рецептора колониестимулирующего фактора 1 (который обозначают также как c-fms) впервые описано у Roussel M.F. и др., Nature 325, 1987, сс. 549-552. В этой 10 публикации было продемонстрировано, что CSF-1R обладает
трансформирующим потенциалом, зависящим от изменений в С-концевом "хвосте" белка, включая утрату способности ингибировать фосфорилирование тирозина 969, который связывается с СЫ, и тем самым контролирует понижающую регуляцию рецептора (Lee P.S. и др., Embo J. 18, 1999, сс. 361615 3628).
CSF-1 R представляет собой одноцепочечный трансмембранный тирозинкиназный рецептор (RTK) и он является представителем семейства содержащих иммуноглобулиновый (Ig) мотив RTK, отличающихся присутствием 5 повторяющихся Ig-подобных субдоменов D1-D5 во внеклеточном домене
20 (ECD) рецептора (Wang Z. и др., Molecular and Cellular Biology 13, 1993, cc.
5348-5359). Внеклеточный домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO: 64) содержит все пять внеклеточных Ig-подобных субдоменов D1-D5. Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) содержит внеклеточные Ig-подобные суб домены D1-D3 и D5, но в нем отсутствует суб домен D4.
25 Фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66) содержит
соответственно суб домены D1-D3. Представленные последовательности не содержат сигнальный пептид MGSGPGVLLL LLVATAWHGQ G (SEQ ID NO: 67). Фрагмент человеческого CSF-1R D4-D3 (SEQ ID NO: 85) содержит соответственно суб домены D4-D3.
30 В настоящее время известно два лиганда CSF-1R, которые связываются с
внеклеточным доменом CSF-1R. Установлено, что первый из них CSF-1 (колониестимулирующий фактор 1, который обозначают также как M-CSF, макрофагальный, человеческий CSF-1, SEQ ID NO: 86) присутствует вне клетки
в виде связанного дисульфидным мостиком гомодимера (Stanley E.R. и др., Journal of Cellular Biochemistry 21, 1983, cc. 151-159; Stanley E.R. и др., Stem Cells 12, приложение 1, 1995, cc. 15-24). Вторым является IL-34 (человеческий IL-34; SEQ ID NO: 87) (Hume, D. А. и др., Blood 119, 2012, cc. 1810-1820). Таким 5 образом, в одном из вариантов осуществления изобретения понятие "лиганд CSF-1R" относится к человеческому CSF-1 (SEQ ID NO: 86) и/или человеческому IL-34 (SEQ ID NO: 87).
Для экспериментов часто применяют активный состоящий из 149 аминокислот (ак) фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33-181 SEQ ID NO: 86). 10 Указанный состоящий из 149 ак фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33-181 SEQ ID NO: 86) входит во все три основные формы CSF-1 и его достаточно для опосредования связывания с CSF-1R (Hume D. А. и др., Blood 119, 2012, сс. 1810-1820).
Основными биологическими действиями, связанными с передачей сигналов
15 CSF-1R, являются дифференцировка, пролиферация, миграция и выживание гематопоэтических клеток-предшественников линии дифференцировки макрофагов (включая остеокласты). Активация CSF-1R опосредуется лигандами CSF-1R, т.е. CSF-1 (M-CSF) и IL-34. Связывание CSF-1 (M-CSF) с CSF-1R индуцирует образование гомодимеров и активацию киназы путем
20 фосфорилирования тирозина (Li W. и др., EMBO Journal. 10, 1991, сс. 277-288; Stanley E.R. и др., Mol. Reprod. Dev. 46, 1997, сс. 4-10).
Внутриклеточный протеинтирозинкиназный домен прерывается уникальным доменом-вставкой, который присутствует также в других представителях родственных RTK класса III, к которым относятся рецепторы
25 тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), рецептор фактора роста стволовых клеток (c-Kit) и fms-подобный цитокиновый рецептор (FLT3). Несмотря на структурную гомологию, характерную для этого семейства рецепторов факторов роста, они обладают различными тканеспецифическими функциями. CSF-1R экспрессируется главным образом на клетках линии
30 дифференцировки моноцитов и в женских половых путях и в плаценте. Кроме того, экспрессия CSF-1R описана в клетках Лангерганса, присутствующих в коже, подгруппе клеток гладкой мускулатуры (Inaba Т. и др., J. Biol. Chem., 267, 1992, сс. 5693-5699), в В-клетках (Baker А.Н. и др., Oncogene 8, 1993, сс. 371
378) и в микроглии (Sawada М. и др., Brain Res. 509, 1990, сс. 119-124). Для клеток с мутантным человеческим CSF-1R (SEQ ID NO: 23) известна способность к независимой от лиганда стимуляции пролиферации.
В контексте настоящего описания понятия "связывается с человеческим 5 CSF-1R" или "специфически связывается с человеческим CSF-1R" относятся к антителу, специфически связывающемуся с человеческим антигеном CSF-1R, при этом аффинность связывания при 35°С характеризуется величиной KD,
составляющей 1,0 х 10" молей/л или ниже, в одном из вариантов осуществления изобретения величина KD при 35°С составляет 1,0 х10"9 молей/л или ниже.
10 Аффинность связывания определяют при 35°С с помощью стандартного анализа связывания, такого как поверхностный плазмонный резонанс (SPR) (Biacore(r), фирма GE-Healthcare Уппсала, Швеция). Метод определения величин KD, характеризующих аффинность связывания, описан в примере 9. Таким образом, в контексте настоящего описания понятие "антитело, связывающееся с
15 человеческим CSF-1R" относится к антителу, которое специфически связывается с человеческим антигеном CSF-1R, аффинность связывания которого характеризуется величиной KD, составляющей при 35°С 1,0x10"8 молей/л или ниже (предпочтительно 1,0хЮ"8- 1,0хЮ"12 молей/л), предпочтительно величиной KD, составляющей при 35°С 1,0x10"9 молей/л или ниже (предпочтительно
20 1,0x10"9- 1,0х 10'12 молей/л).
Согласно настоящему изобретению "связывание с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64)" оценивают с помощью метода поверхностного плазмонного резонанса (Biacore-анализ), который описан в
25 примере 4. Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) или
внеклеточный домен человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) соответственно иммобилизуют на поверхности (каждый на отдельной поверхности) и добавляют тестируемые антитела (осуществляя для каждого отдельные измерения) и определяют соответствующие сигналы связывания (единицы ответа (RU)).
30 Вычитают референс-сигналы (от "пустой" поверхности). Если сигналы для несвязывающихся тестируемых антител несколько ниже 0, то их величины принимают за 0. Затем определяют соотношение соответствующих сигналов связывания (сигнал связывания (RU) с фрагментом человеческого CSF-1R
(1еГО4/сигнал связывания (RU) с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)). Для антител, предлагаемых в изобретении, характерно соотношение сигналов связывания (RU(delD4)/RU(CSF-lR-ECD), составляющее 1:50 или ниже, предпочтительно 1:100 или ниже (наиболее низкое значение 5 включает конечное значение, равное 0 (например, если величина RU равна 0, то соотношение составляет 0:50 или 0:100)).
Это означает, что указанные антитела к CSF-1R, предлагаемые в изобретении, не связываются с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (типа антитела к CCR5, обозначенного как m Pz03.1C5 (депонировано под
10 регистрационным номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г. в DSMZ), и их сигналы связывания, характеризующие связывание с фрагментом человеческого CSF-1R delD4, соответствуют сигналам антитела к CCR5 m Pz03.1C5, которые составляют менее 20 RU (единицы ответа), предпочтительно менее 10 RU при анализе методом поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore-анализ),
15 изложенного в примере 4.
Понятие "связывание с фрагментом человеческого CSF-1R Dl-D3" относится к определению аффинности связывания с помощью поверхностного плазмонного резонанса (BIAcore-анализ). Тестируемое антитело иммобилизуют на поверхности и добавляют фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID
20 NO: 66), определяют соответствующие аффинности связывания. Понятия
"отсутствие связывания с фрагментом человеческого CSF-1R Dl-D3" или "не связывается с фрагментом человеческого CSF-1R Dl-D3" означают, что при применении указанного анализа обнаруженный сигнал находился в диапазоне, не превышающем больше чем в 1,2 раза фоновый сигнал, и поэтому нельзя
25 определить ни наличие значимой аффинности связывания, ни отсутствие связывания (см. пример 10).
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ скрининга, который предназначен для отбора антител, которые можно применять в комбинированной терапии, предлагаемой в изобретении,
30 заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых: а) оценивают связывание антител к CSF-1R с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO: 64) методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore-анализ),
б) оценивают связывание антител к CSF-1R с фрагментом человеческого
CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66) (D1-D3),
в) отбирают антитела, которые специфически связываются с внеклеточным
доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) и которые не связываются с
5 фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66) (D1-D3).
Одним из вариантов осуществления изобретения является способ скрининга, который предназначен для отбора антител, предлагаемых в изобретении, заключающийся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:
10 а) определяют сигнал связывания (в единицах ответа (RU)) антител к CSF-
1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (SEQ ID NO: 64) методом поверхностного плазмонного резонанса (Biacore-анализ),
б) отбирают антитела, для которых обнаружено соотношение сигналов 15 связывания (фрагмент человеческого CSF-1R delD4/BHeKneTO4Hbm домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)), составляющее 50:1 или ниже.
В одном из вариантов осуществления изобретения определение осуществляют при 25°С.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ скрининга 20 заключается также в том, что осуществляют дополнительные стадии, на которых оценивают связывание антитела к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66) (D1-D3) и отбирают антитела, которые не связываются с указанным фрагментом.
Понятие "эпитоп" относится к белковой детерминанте человеческого CSF-25 1R, которая обладает способностью специфически связываться с антителом. Эпитопы, как правило, состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, как правило, эпитопы имеют специфические трехмерные структурные характеристики, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и 30 неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с первыми, в отличие от связывания с последними, утрачивается в присутствии денатурирующих растворителей. Предпочтительно антитело, предлагаемое в
изобретении, связывается специфически с нативным и с денатурированным CSF-1R.
Понятие "вариабельный домен (вариабельная область)" (вариабельный домен (вариабельная область) легкой цепи (VL), вариабельный домен 5 (вариабельная область) тяжелой цепи (VH)) В контексте настоящего описания в каждом случае обозначает каждый из пары доменов легких и тяжелых цепей, которые непосредственно принимают участие в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены легких и тяжелых цепей имеют одну и ту же общую структуру, и каждый домен содержит 4 каркасных участка (FR),
10 последовательности которых являются высококонсервативными, связанных тремя "гипервариабельными участками" (или определяющими комплементарность областями, CDR). Каркасные участки адоптированы к р-складчатой конформации, а CDR-участки могут формировать петли, соединяющие Р-складчатую структуру. CDR в каждой цепи поддерживаются в
15 виде трехмерной структуры с помощью каркасных участков и формируют с CDR-участками другой цепи антигенсвязывающий центр. CDR3-участки тяжелой и легкой цепи антитела играют очень важную роль в специфичности связывания /аффинности антител, предлагаемых в изобретении, и вследствие этого являются дополнительным объектом изобретения.
20 Понятие "антигенсвязывающий участок (центр) антитела" в контексте
настоящего описания относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание с антигеном. Антигенсвязывающий участок антитела содержит аминокислотные остатки из "гипервариабельных участков" или "CDR". "Каркасные" или "FRw-участки представляют собой участки
25 вариабельного домена, остатки которых отличны от остатков
гипервариабельного участка, как они определены в настоящем описании. Таким образом, вариабельные домены легких и тяжелых цепей антитела содержат в направлении от N- к С-концу домены FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. CDR3 тяжелой цепи представляет собой основной участок, который
30 обеспечивает главным образом связывание с антигеном и определяет свойства антитела. К CDR- и FR-участкам относятся участки, которые определяют согласно стандартному принципу Кэбота и др. (Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 5-ое изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991) и/или остатки из "гипервариабельной петли".
Понятия "нуклеиновая кислота" или "молекула нуклеиновой кислоты" в контексте настоящего описания относятся к молекулам ДНК и молекулам РНК. 5 Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или
двухцепочечной, но предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК.
Понятие "аминокислота" в контексте настоящего описания обозначает группу встречающихся в естественных условиях карбокси-ос-аминокислот, таких как аланин (трехбуквенный код: ala, однобуквенный код: А), аргинин (arg, R),
10 аспарагин (asn, N), аспарагиновая кислота (asp, D), цистеин (cys, С), глутамин (gin, Q), глутаминовая кислота (glu, Е), глицин (gly, G), гистидин (his, Н), изолейцин (ile, I), лейцин (leu, L), лизин (lys, К), метионин (met, М), фенилаланин (phe, F), пролин (pro, Р), серии (ser, S), треонин (thr, Т), триптофан (trp, W), тирозин (tyr, Y) и валин (val, V).
15 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела,
предлагаемые в изобретении, ингибируют связывание CSF-1 с CSF-1R. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 200 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 50 нг/мл или ниже. Величину IC50, характеризующую
20 ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R, можно определять согласно методу, описанному в примере 2.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют индуцируемое CSF-1 фосфорилирование CSF-1R (в рекомбинантных клетках линии NIH3T3-CSF-1R).
25 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50
составляет 800 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 600 нг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 250 нг/мл или ниже. Величину IC50, характеризующую ингибирование индуцируемого CSF-1
30 фосфорилирования CSF-1R , можно определять согласно методу, описанному в примере 3.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют рост рекомбинантных NIH3T3-клеток,
которые экспрессируют человеческий CSF-1R (SEQ ID NO: 62). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов 5 осуществления изобретения величина IC50 составляет 2 мкг/мл или ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC30 составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC30 составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC30 составляет 2 мкг/мл или
10 ниже. Величины IC50, величины IC30 или % ингибирования роста определяют согласно методам, описанным в примере 5.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют рост рекомбинантных NIH3T3-клеток, которые экспрессируют человеческий мутантный CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID
15 NO: 63). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина 1С5о составляет 15 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC50 составляет 10 мкг/мл или ниже. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC30 составляет 10 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления
20 изобретения величина IC30 составляет 5 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов осуществления изобретения величина IC30 составляет 2 мкг/мл или ниже. Величина IC50, величины IC30 или % ингибирования роста определяют согласно методам, описанным в примере 5.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела,
25 предлагаемые в изобретении, ингибируют рост опухолевых клеток линии BeWo (АТСС CCL-98) на 65% или более (при применении антитела в концентрации 10 мкг/мл и в сравнении с вариантом без антитела). Ингибирование роста (в %) определяют согласно методу, описанному в примере 8. Например, установлено, что МАт 2F11 ингибирует рост опухолевых клеток линии BeWo на 70%.
30 Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела,
предлагаемые в изобретении, ингибируют дифференцировку макрофагов, как человека, так и обезьян циномолгус (т.е. обоих видов) (что определяют по ингибированию выживания моноцитов человека и обезьян циномолгус согласно
методу, описанному в примерах 7 и 8). Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют выживание человеческих моноцитов, что характеризуется величиной IC50, составляющей 0,15 мкг/мл или ниже, согласно одному из вариантов 5 осуществления изобретения - величиной IC50, составляющей 0,10 мкг/мл или
ниже. Ингибирование выживания человеческих моноцитов определяют согласно методу, описанному в примере 7. Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, ингибируют выживание моноцитов обезьян циномолгус на 80% или более, согласно одному из вариантов 10 осуществления на 90% или более (при применении антитела в концентрации 5 мкг/мл и в сравнении с вариантом без антитела). Ингибирование выживания моноцитов обезьян циномолгус определяют согласно методу, описанному в примере 8.
Следующим вариантом осуществления изобретения является способ
15 получения антитела к CSF-1R, отличающийся тем, что встраивают
последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь человеческого антитела класса IgGl, которое связывается с человеческим CSF-1R, предлагаемой в изобретении (указанной модифицированной нуклеиновой кислоты), и нуклеиновой кислоты, которая кодирует легкую цепь указанного
20 антитела, в экспрессионный вектор, указанный векторы встраивают в
эукариотическую клетку-хозяина, экспрессируют кодируемый белок и выделяют из клетки-хозяина или супернатанта.
Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. При этом антитело предпочтительно представляет
25 собой выделенное моноклональное антитело. Такие методы рекомбинации
широко известны в данной области, и они заключаются в том, что осуществляют экспрессию белков в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, очистку до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка нуклеиновые
30 кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы стандартными методами. Экспрессию осуществляют в пригодных прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, NSO-клеток, БР2/0-клеток, НЕК293-клеток, COS-клеток, клеток дрожжей
или клеток E.coli, и антитело выделяют из клеток (супернатант или клетки после лизиса).
Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17, 5 1999, cc. 183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif. 8, 1996, cc. 271-282;
Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16, 2000, cc. 151-161; Werner R.G. и др., Drug Res., 48, 1998, cc. 870-880.
Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или полностью очищенной форме. Очистку осуществляют 10 для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей,
например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. Current Protocols in Molecular Biology, 15 под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987).
Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y.
20 и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с. Е9. Клонирование вариабельных областей описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 3833-3837; Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc. 77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen
25 К. в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc. 191-199.
Контролирующие последовательности, пригодные для прокариотических организмов, представляют собой, например, промотор, необязательно последовательность оператора и сайт связывания рибосом. Известно, что для
30 эукариотических клеток применяют промоторы, энхансеры и сигналы полиаденилирования.
Нуклеиновая кислота "функционально связана", когда она находится в функциональной связи с другой нуклеотидной последовательностью. Например,
ДНК предпоследовательности или лидерной секреторной последовательности функционально связана с ДНК полипептида, если при ее экспрессии образуется предбелок, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он оказывает 5 воздействие на транскрипцию последовательности; или сайт связывания
рибосом функционально связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что облегчает трансляцию. Как правило, понятие "функционально связаны" означает, что последовательности ДНК, будучи связаны, являются смежными, а в случае лидерной секреторной
10 последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания.
Однако для энхансеров не является необходимым, чтобы они были смежными. Связывание осуществляют путем лигирования в соответствующих сайтах рестрикции. Если такие сайты не существуют, то в соответствии с принятой практикой применяют синтетические олигонуклеотидные адаптеры или
15 линкеры.
Моноклональные антитела можно отделять от культуральной среды с помощью общепринятых методов очисти иммуноглобулинов, таких, например, как, хроматография на белок А-сефарозе, хроматография на гидроксилапатите, гель-электрофорез, диализ или аффинная хроматография. ДНК и РНК, которые
20 кодируют моноклональные антитела, можно легко выделять и секвенировать с помощью общепринятых методов. Клетки гибридом могут служить источником таких ДНК и РНК. После выделения ДНК можно встраивать в экспрессионные векторы, которым затем трансфектируют клетки-хозяева, такие как клетки НЕК 293, СНО-клетки или клетки миеломы, которые иначе не могут продуцировать
25 белок иммуноглобулина, для синтеза рекомбинантных моноклональных антител в клетках-хозяевах.
В контексте настоящего описания понятия "клетка", "клеточная линия" и "клеточная культура" используются взаимозаменяемо, и все такие определения включают потомство. Так, понятия "трансформанты" и "трансформированные
30 клетки" относятся к первичной рассматриваемой клетке и полученным из нее культурам безотносительно к количеству пересевов. Следует понимать также, что все потомство может не быть полностью идентичным по составу ДНК из-за преднамеренных или случайных мутаций. Под объем изобретения подпадает
вариант потомства, имеющий такую же функцию или биологическую активность, которая обнаружена у исходной трансформированной клетки.
"Fc-фрагмент (область)" антитела не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но обладает различными эффекторными 5 функциями. Понятие "Fc-фрагмент антитела" хорошо известно специалисту в данной области и его определяют на основе расщепления антител папаином. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелых цепей антитела или иммуноглобулины разделяют на следующие классы: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM и некоторые из них можно дополнительно
10 подразделять на подклассы (изотипы), например, IgGl, IgG2, IgG3 и IgG4, IgAl и IgA2. На основе строения константных областей тяжелых цепей различные классы иммуноглобулинов обозначают как а, 8, Е, у и ц соответственно. Fc-фрагмент антител непосредственно участвует в ADCC (антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность) и CDC (комплементзависимая
15 цитотоксичность) в результате активации комплемента, связывания Clq и связывания Fc-рецептора. Активация комплемента (CDC) инициируется связыванием фактора системы комплемента Clq с Fc-фрагментом большинства антител подклассов IgG. Хотя влияние антитела на систему комплемента зависит от определенных условий, связывание с Clq обусловлено определенными
20 сайтами связывания в Fc-фрагменте. Такие сайты связывания известны в данной области и описаны, например, у Boakle R.J. и др., Nature 282, 1979, сс. 742-743; Lukas T.J. и др., J. Immunol. 127, 1981, сс. 2555-2560; Brunhouse R. и Cebra J.J., Mol. Immunol. 16, 1979, cc. 907-917; Burton D.R. и др., Nature 288, 1980, cc. 338344; Thommesen J.E. и др., Mol. Immunol. 37, 2000, cc. 995-1004; Idusogie E.E. и
25 др., J. Immunol. 164, 2000, cc. 4178-4184; Hezareh M. И др., J. Virology 75, 2001, cc. 12161-12168; Morgan А. и др., Immunology 86, 1995, cc. 319-324; EP 0307434. Указанные сайты связывания представляют собой, например, L234, L235, D270, N297, Е318, К320, К322, Р331 и Р329 (нумерация согласно EU-нумерации по Кэботу, см. ниже). Антитела подклассов IgGl, IgG2 и IgG3, как правило,
30 обусловливают активацию комплемента и связывание Clq и СЗ, в то время как IgG4 не активирует систему комплемента, не связывается с Clq и СЗ.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, содержит Fc-фрагмент человеческого
происхождения и предпочтительно все остальные участки человеческих константных областей. В контексте настоящего описания понятие "Fc-фрагмент человеческого происхождения" относится к Fc-фрагменту, который представляет собой либо Fc-фрагмент человеческого антитела подкласса IgGl, 5 IgG2, IgG3 или IgG4, предпочтительно Fc-фрагмент человеческого подкласса IgGl, либо мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgGl (предпочтительно с мутацией L234A + L235A), либо Fc-фрагмент человеческого подкласса IgG4, либо мутантный Fc-фрагмент человеческого подкласса IgG4 (предпочтительно с мутацией S228P). Наиболее предпочтительными являются 10 константные области человеческой тяжелой цепи, последовательности которых представлены в SEQ ID NO: 58 (человеческий подкласс IgGl), SEQ ID NO: 59 (человеческий подкласс IgGl с мутациями L234A и L235A), SEQ ID NO: 60 человеческий подкласс IgG4) или SEQ ID NO: 61 (человеческий подкласс IgG4 с мутацией S228P).
15 Предпочтительно антитело, предлагаемое в изобретении, представляет
собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgGl или человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4. В одном из вариантов осуществления изобретения оно представляет собой человеческий иммуноглобулин подкласса IgGl. В одном из вариантов осуществления изобретения оно представляет собой
20 человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4.
Согласно одному из вариантов осуществления изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, отличается тем, что содержит человеческие константные цепи. Указанные константные цепи хорошо известны в данной области и описаны, например, у Kabat Е.А. (см., например, Johnson G. и Wu,
25 Т.Т., Nucleic Acids Res., 28, 2000, сс. 214-218). Например, приемлемая
человеческая константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58. Например, приемлемая человеческая константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой каппа-цепи SEQ ID NO: 57.
30 Другим объектом изобретения является комбинированная терапия,
включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16;
5 или его гуманизированной версии.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
10 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16,
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76,
15 г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 83 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 84; или его гуманизированной версии.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 20 отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
или его гуманизированной версии.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, 25 включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
30 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 55 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 56.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 5 отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16, или его гуманизированной версии.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 10 отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76;
или его гуманизированной версии.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, 15 включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0:83 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID N0:84; или его гуманизированной версии. Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, 20 включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 1, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
25 участок, имеющий SEQ ID NO: 4, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 5, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 6, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 9, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 10, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
30 участок, имеющий SEQ ID NO: 12, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 13, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3 -участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
5 SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3 -участок, имеющий
10 SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
15 SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
20 SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 54, или
з) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
25 SEQ ID NO: 69, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 70, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 71, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 73, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 74, или
и) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
30 SEQ ID NO: 77, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 78, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 79, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 80, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 81, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 82.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
5 SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
10 SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3 -участок, имеющий
15 SEQ ID NO: 33, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
20 SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
25 SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 54.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, 30 включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
5 SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3 -участок, имеющий
10 SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
15 SEQ ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и
CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, 20 включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 17, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-25 участок, имеющий SEQ ID NO: 20, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 21, и
CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия,
включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
отличающегося тем, что
30 вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ
ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок, имеющий
SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK,
имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, 5 отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDR1-10 участок, имеющий SEQ ID NO: 38.
Другим объектом изобретения является комбинированная терапия, включающая применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося тем, что
вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ 15 ID NO: 41, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, который 20 нуждается в такой терапии, отличающемуся тем, что вводят пациенту в
терапевтически эффективном количестве антитело, предлагаемое в изобретении.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, для указанной терапии.
Одним из предпочтительных вариантов осуществления изобретения 25 являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, которые применяют для лечения "опосредуемых CSF-1R заболеваний", или антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, которые применяют для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения "опосредуемых CSF-1R заболеваний", которые можно описать с помощью 30 представленных ниже характеристик:
Известно три различных механизма, посредством которых передача сигналов CSF-1R, вероятно, участвует в росте и метастазах опухолей. Первый из них связан с тем, что экспрессия CSF-лиганда и рецептора обнаружена в
опухолевых клетках женской половой системы (молочная железа, яичник, эндометрий, шейка матки) (Scholl S.M. и др., J. Natl. Cancer Inst., 86, 1994, сс. 120-126; Kacinski В.М., Mol. Reprod. Dev., 46, 1997, cc. 71-74; Ngan H.Y. и др., Eur. J. Cancer 35, 1999, cc. 1546-1550; KirmaN. и др., Cancer Res, 67, 2007, cc. 5 1918-1926), и экспрессия ассоциирована с ростом ксенотрансплантата рака
молочной железы, а также с плохим прогнозом для страдающих раком молочной железы пациентов. В одном из исследований были обнаружены две точечные мутации в CSF-1R примерно у 10-20% пациентов, страдающих острым миелолейкозом, хроническим миелолейкозом и миелодисплазией, и одна из этих
10 мутаций, как установлено, приводила к нарушению обновления рецептора (Ridge S.A. и др., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 87, 1990, cc. 1377-1380). Однако частота встречаемости мутаций не была подтверждена в более поздних исследованиях (Abu-Duhier F.M. и др., Br. J. Haematol., 120, 2003, сс. 464-470). Мутации обнаружены также в ряде случаев печеночноклеточного рака (Yang D.H. и др.,
15 Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int., 3, 2004, cc. 86-89) и идиопатического
миелофиброза (Abu-Duhier F.M. и др., Br. J. Haematol., 120, 2003, cc. 464-470). В настоящее время в клеточной линии GDM-1, полученной из организма пациента, страдающего миеломонобластным лейкозом, идентифицирована мутация Y571D в CSF-1R (Chase А. и др., Leukemia, 23, 2009, сс. 358-364).
20 Пигментированный виллонодулярный синовиит (PVNS) и
теносиновиальные гигантоклеточные опухоли (TGCT) могут возникать в результате транслокации, приводящей к слиянию гена M-CSF с геном коллагена COL6A3 и последующей сверхэкспрессии M-CSF (West R.B. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, cc. 690-695). Предполагается, что условия
25 окружающей среды оказывают влияние на массу образовавшейся опухоли,
которая состоит из моноцитов, привлеченных клетками, которые экспрессируют M-CSF. TGCT представляют собой опухоли меньшего размера, которые относительно легко можно удалять из пальцев, где они встречаются наиболее часто. PVNS представляет собой более агрессивное заболевание, поскольку
30 может затрагивать крупные суставы и его сложно контролировать хирургическим путем.
Второй механизм основан на блокаде передачи сигналов через M-CSF/CSF-1R в областях метастазов в кости, которые вызывают остеокластогенез,
резорбцию кости и остеолитические повреждения кости. Рак молочной железы, множественная миелома и рак легкого являются примерами типов рака, при которых могут образовываться метастазы в кость и которые могут вызывать остеолитическую болезнь кости, осложнениями которой являются нарушения 5 скелета. M-CSF, высвобождающийся из опухолевых клеток и стромы, индуцирует дифференцировку предшественников гематопоэтических миелоидных моноцитов в зрелые остеокласты в сочетании с лигандом рецептора-активатора ядерного фактора каппа-В (RANKL). В указанном процессе M-CSF действует в качестве "разрешающего" фактора, передавая
10 сигнал выживания остеокластам (Tanaka S. и др., J. Clin. Invest. 91, 1993, сс. 257263). Ингибирование активности CSF-1R в процессе дифференцировки остеокластов и созревание в присутствии антитела к CSF-1R, вероятно, предупреждает несбалансированную активность остеокластов, которая вызывает остеолитическую болезнь и ассоциированные с ней родственные нарушения
15 скелета при метастатическом заболевании. В то время как рак молочной железы, легкого и множественная миелома, как правило, приводят к остеолитическим повреждениям, метастазы в костную ткань при раке предстательной железы первоначально имеют остеобластное проявление, при котором повышенная активность в отношении образования кости приводит к "переплетенной кости",
20 отличающейся от типичной пластинчатой структуры здоровой кости. По мере развития болезни повреждения кости приобретают выраженный остеолитический компонент, а также высокие уровни в сыворотке маркеров резорбции кости, и предполагается, что при этом может оказаться полезной антирезорбтивная терапия. Установлено, что бисфофонаты ингибируют
25 образование остеолитических повреждений и снижают количество связанных с повреждением скелета случаев только у мужчин с устойчивым к гормонам метастатическом раке предстательной железы, однако при этом их воздействие на остеобластные повреждения является дискуссионным, и согласно полученным к настоящему времени данным бисфосфонаты не оказывают
30 полезного воздействия в отношении предупреждения костных метастазов или чувствительного к гормонам рака предстательной железы. В настоящее время в клинических условиях проводится изучение воздействия антирезорбтивных средств при смешанном остеолитическом/остеобластном раке предстательной
железы (Choueiri М.В. и др., Cancer Metastasis Rev., 25, 2006, сс. 601-609; Vessella R.L. и Corey E., Clin. Cancer Res., 12 (20 Pt 2), 2006, cc. 6285-6290).
Третий механизм основан на современных данных о том, что уровень ассоциированных с опухолью макрофагов (ТАМ), обнаруженных в плотных 5 (солидных) опухолях при раке молочной железы, предстательной железы,
яичника и шейки матки, коррелировал с плохим прогнозом (Bingle L. и др., J. Pathol., 196, 2002, сс. 254-265; Pollard J.W., Nat. Rev. Cancer, 4, 2004, cc. 71-78). Рекрутмент макрофагов в опухоль происходит с помощью M-CSF и других хемокинов. Макрофаги могут принимать участие в развитие опухолей
10 посредством секреции ангиогенных факторов, протеаз и других факторов роста и цитокинов и могут блокироваться путем ингибирования передачи сигналов CSF-1R. В настоящее время Zins с соавторами (Zins К. и др., Cancer Res., 67, 2007, сс. 1038-1045) установили, что экспрессия siPHK фактора некроза опухоли-альфа (TNF-альфа), M-CSF или их комбинации может снижать рост
15 опухолей на мышиной модели, созданной с использованием ксенотрансплантата, на 34-50% после внутриопухолевой инъекции соответствующей siPHK. SiPHK, мишенью которой является TNF-альфа, секретируемый человеческими клетками линии SW620, снижала уровни мышиного M-CSF и приводила к снижению уровня макрофагов в опухоли. Кроме того, обработка ксенотранслантатов
20 опухоли MCF7 антигенсвязывающим фрагментом, мишенью которого является M-CSF, приводила к 40%-ному ингибированию роста опухолей, устранению устойчивости к химиотерапевтическим средствам и улучшенной выживаемости мышей при применении в сочетании с химиотерапевтическим средствами (Paulus Р. и др., Cancer Res., 66, 2006, сс. 4349-4356).
25 ТАМ являются только одним примером проявления связи между
хроническим воспалением и раком. Известны другие доказательства связи между воспалением и раком, поскольку многие хронически заболевания ассоциированы с повышенным риском возникновения рака, рак возникает в местах хронического воспаления, химические медиаторы воспаления
30 обнаружены при многих видах рака; устранение клеточных или химических медиаторов воспаления ингибирует развитие некоторых созданных экспериментальным путем типов рака и пролонгированное применение противовоспалительных средств снижает риск возникновения некоторых видов
рака. Связь с раком известна для ряда воспалительных состояний, среди которых индуцированный Н.pylori гастрит в случае рака желудка, шистозомиас в случае рака мочевого пузыря, HHVX в случае саркомы Капоши, эндометриоз в случае рака яичника и простатит в случае рака предстательной железы (Balkwill F. и 5 др., Cancer Cell, 7 2005, сс. 211-217). Макрофаги представляют собой основные клетки при хроническом воспалении, и они реагируют по -разному на их микроокружение. Известно два типа макрофагов, которые рассматриваются в качестве имеющих решающее значение для целого ряда функциональных состояний: Ml-макрофаги принимают участие в реакциях типа 1. Эти реакции
10 включают активацию продуктами микробного происхождения и последующее уничтожение патогенных микроорганизмов, что приводит к образованию в качестве промежуточных продуктов реактивных форм кислорода. С другой стороны, к имеющим решающее значение факторам относятся М2-макрофаги, которые принимают участие в реакциях типа 2 , которые усиливают клеточную
15 пролиферацию, регулируют воспаления и адаптивный иммунитет и усиливают ремоделирование, ангиогенез и репарацию тканей (Mantovani А. и др., Trends Immunol., 25, 2004, сс. 677-686). Хроническое воспаление, приводящее к развитию неоплазм, как правило, ассоциируется с М2-макрофагами. Основным цитокином, опосредующим воспалительные реакции, является TNF-альфа,
20 который в соответствии со своим названием может стимулировать
противоопухолевый иммунитет и геморрагический некроз при применении в высоких дозах, но так же, как установлено в последние годы, может экспрессироваться опухолевыми клетками и действовать в качестве промотора опухоли (Zins К. и др., Cancer Res., 67, 2007, сс. 1038-1045; Balkwill F., Cancer
25 Metastasis Rev., 25, 2006, cc. 409-416). Специфическая роль макрофагов в отношении опухолей еще нуждается в дальнейшем изучении, включая исследование потенциальной пространственной и временной зависимости их функции и связи с конкретными типами опухолей.
Таким образом, одним из вариантов осуществления изобретения являются
30 антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, предназначенные для применения при лечении рака. Понятие "рак" в контексте настоящего описания может обозначать, например, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), бронхоальвеолярный рак легкого, рак кости, рак
поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичника, ректальный рак, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, рак ободочной кишки, рак молочной железы, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному 5 шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечноклеточную карциному,
10 карциному почечной лоханки, мезотелиому, печеночноклеточный рак, рак
желчных протоков, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли спинных позвонков, глиому ствола головного мозга, мультиформную глиобластому, астроцитомы, шваномы, эпендимоны, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденому гипофиза, лимфому,
15 лимфоцитарный лейкоз, включая устойчивые варианты любого из указанных выше видов рака, или комбинацию любых из указанных выше видов рака. Предпочтительно рак представляет собой рак молочной железы, рак яичника, рак шейки матки, рак легкого или рак предстательной железы. Предпочтительно указанные виды рака отличаются также экспрессией или сверхэкспрессией CSF-
20 1 или CSF-1R. Еще одним вариантом осуществления изобретения являются
антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении, предназначенные для применения для одновременного лечения первичных опухолей и новых метастазов.
Таким образом, еще одним вариантом осуществления изобретения 25 являются антитела к CSF-1R, предлагаемые в настоящем изобретении,
предназначенные для применения при лечении периодонтита, гистоцитоза X, остеопороза, болезнь кости Пэджета (PDB), потери костной ткани из-за противораковой терапии, перипростетического остеолиза, индуцированного глюкокортикоидами остеопороза, ревматоидного артрита, псориатического 30 артрита, остеоартрита, воспалительных артридитов и воспаления.
В статье Rabello D. и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 347, 2006, cc. 791-796 продемонстрировано, что SNP в гене CSF-1 позитивно ассоциированы с
агрессивностью периодонтита: воспалительного заболевания тканей периодонта, которое вызывает потерю зубов из-за резорбции альвеолярной кости.
Гистоцитоз X (который называют также гистозитозом из клеток Лангерганса, LCH) представляет собой пролиферативное заболевание 5 дендритных клеток Лангерганса, которое проявляется в дифференцировке в остеокласты кости и увеличении связанных с LCH костных повреждений. Клетки Лангерганса имеют происхождение из находящихся в кровотоке моноцитов. Установлено, что повышенные уровни M-CSF, обнаруженные в сыворотке, и повреждения коррелируют с серьезностью заболевания (da Costa
10 СЕ. и др., J. Exp. Med., 201, 2005, сс. 687-693). Болезнь возникает в основном в детском возрасте и ее лечат химиотерапевтическими средствами, когда болезнь становится системной или является рецидивирующей.
Патофизиология остеопороза опосредована потерей формирующих кость остеобластов и повышением уровня зависящей от остеокластов резорбции кости.
15 Подтверждающие это данные получены Cenci с соавторами, которые
продемонстрировали что инъекция антитела к M-CSF сохраняет плотность костной ткани и ингибирует резорбцию кости у мышей после овариэктомии (Cenci S. и др., J. Clin. Invest., 105, 2000, сс. 1279-1287). В последние годы выявлена потенциальная связь между потерей костной ткани в
20 постменопаузальном периоде из-за дефицита эстрогена и установлено
присутствие продуцирующих TNF-альфа Т-клеток, оказывающих воздействие на метаболизм костной ткани (Roggia С. и др., Minerva Med., 95, 2004, сс. 125-132). Возможный механизм может включать индукцию in vivo M-CSF с помощью TNF-альфа. Важная роль M-CSF в индуцируемом TNF-альфа остеокластогенезе
25 подтверждена воздействием антитела к M-CSF, которое блокировало
индуцируемый TNF-альфа остеолиз у мышей, и по этой причине ингибиторы пути передачи сигналов CSF-1R являются потенциальными мишенями при воспалительном артрите (Kitaura Н. и др., J. Clin. Invest., 115, 2005, сс. 34183427).
30 Болезнь кости Пэджета (PDB) представляет собой второе после остеопороза
наиболее распространенное нарушение костного метаболизма, при котором локальные аномалии повышенного обновления костной ткани приводят к осложнениям, таким как боль, деформация, патологические переломы кости и
глухота. Идентифицированы мутации в четырех генах, которые регулируют нормальную функцию остеокластов и предрасположенность индивидуумов к PDB и родственным нарушениям: инсерционные мутации в гене TNFRSF11А, который кодирует рецептор-активатора ядерного фактора (NF) каппа-В (RANK), 5 имеющий решающее значение регулятор функции остеокластов, инактивирующие мутации в гене TNFRSF11B, который кодирует остеопротегерин (рецептор-ловушка для лиганда RANK), мутации гена sequestosome 1 (SQSTM1), который кодирует важный каркасный белок в пути NFKannaB, и мутации в гене валозинсодержащеого белка (VCP). Этот ген
10 кодирует VCP, который играет роль в направленном расщеплении ингибитора NFKannaB протеосомой (Daroszewska А. и Ralston S.H., Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 2, 2006, cc. 270-277). Ингибиторы, мишенью которых является CSF-1R, косвенно противодействуют блокаде нарушения регуляции передачи сигналов RANKL, и они открывают дополнительный путь лечения наряду с
15 применяемыми в настоящее время бисфосфонатами.
Потеря костной ткани, вызванная противораковой терапией, прежде всего у пациентов, страдающих раком молочной железы и предстательной железы, является еще одним показанием, при котором ингибитор, мишенью которого является CSF-1R, может предупреждать потерю костной ткани (Lester J.E. и др.,
20 Br. J. Cancer, 94, 2006, сс. 30-35). При улучшении прогноза в отношении ранней стадии рака молочной железы отдаленные действия вспомогательных терапий становятся более важными, поскольку некоторые из таких терапий, включая химиотерапию, облучение, применение ингибиторов ароматазы и овариэктомии, оказывают воздействие на метаболизм костный ткани, снижая минеральную
25 плотность костной ткани, что приводит к повышенному риску развития
остеопороза и связанных с ним переломов (Lester J.E. и др., Br. J. Cancer, 94, 2006, сс. 30-35). Эквивалентом вспомогательной терапии, основанной на ингибировании ароматазы, при раке молочной железы является терапия, основанная на снижении уровня андрогена, при раке предстательной железы,
30 которая приводит к снижению минеральной плотности костной ткани и
значительному повышению риска связанных с остеопорозом переломов (Stoch S.A. и др., J. Clin. Endocrinol. Metab., 86, 2001, сс. 2787-2791).
Целенаправленное ингибирование передачи сигналов CSF-1R, вероятно, может оказаться ценным при других показаниях, а также в тех случаях, когда типы клеток, на которые оказывают направленное воздействие, представляют собой остеокласты и макрофаги, например, при лечении специфических 5 осложнений, связанных с заменой сустава, например, по причине ревматоидного артрита. Нарушение имплантата вследствие перипростетической потери костной ткани и последующее расшатывание протеза является основным осложнением при замене сустава и требует повторного хирургического вмешательства, что сопровождается высокой социоэкономической нагрузкой на индивидуального
10 пациента и на систему медико-санитарной помощи. В настоящее время
отсутствует удовлетворительная лекарственная терапия предупреждения или ингибирования перипростетического остеолиза (Drees Р. и др., Nat. Clin. Pract. Rheumatol., 3, 2007, cc. 165-171).
Индуцированный глюкокортикоидами остеопороз (GIOP) представляет
15 собой еще одно показание, при котором ингибитор CSF-1R может
предупреждать потерю костной ткани после длительного применения глюкокортикоидов, которые используют при различных состояниях, в том числе при хроническом обструктивном заболевании легких, астме и ревматоидном артрите (Guzman-Clark J.R. и др., Arthritis Rheum., 57, 2007, сс. 140-146; Feldstein
20 А.С. и др., Osteoporos. Int., 16, 2005, сс. 2168-2174).
Ревматоидный артрит, псориатический артрит и воспалительные артридиты сами являются потенциальными показаниями для применения ингибиторов пути передачи сигналов CSF-1R, поскольку одним из их компонентов являются макрофаги и для них характерна различная степень деструкции костной ткани
25 (Ritchlin СТ. и др., J. Clin. Invest., Ill, 2003, сс. 821-831). Остеоартрит и ревматоидный артрит представляют собой воспалительные аутоиммунные заболевания, вызываемые накоплением макрофагов в соединительной ткани и инфильтрацией макрофагов в синовиальную жидкость, что по меньшей мере частично опосредуется M-CSF. В статье Campbell I.K. и др., J. Leukoc. Biol., 68,
30 2000, сс. 144-150 продемонстрировано, что M-CSF продуцируется клетками
суставной ткани человека (хондроциты, синовиальные фибробласты) in vitro и присутствует в синовиальной жидкости пациентов, страдающих ревматоидным артритом, это позволяет предположить его участие в пролиферации
синовиальной ткани и инфильтрации макрофагов, что ассоциировано с патогенезом заболевания. Ингибирования передачи сигналов CSF-1R, вероятно, позволяет контролировать количество макрофагов в суставе и облегчает боль, связанную с деструкцией костной ткани. Одним из путей минимизации 5 нежелательных явлений и дополнительного изучения роли передачи сигналов CSF-1R при таких показаниях является специфическое ингибирование CSF-1R без воздействия на множество других киназ, таких как Raf-киназа.
В современной литературе описана корреляция между повышенным уровнем M-CSF в кровотоке и плохим прогнозом и развитием атеросклероза при
10 хронической ишемической болезни сердца (Saitoh Т. и др., J. Am. Coll. Cardiol., 35, 2000, сс. 655-665; Ikonomidis I. и др., Eur. Heart. J., 26, 2005, cc. 1618-1624); M-CSF влияет на процесс атеросклероза, способствуя образованию пенистых клеток (макрофаги с захваченным окисленным ЛПНП), которые экспрессируют CSF-1R и представляют собой начальную бляшку (Murayama Т. и др.,
15 Circulation, 99, 1999, сс. 1740-1746).
Экспрессия и передача сигналов M-CSF и CSF-1R обнаружена в активированной микроглии. Микроглия, которая представляет собой местонахождение макрофагов в центральной нервной системе, может активироваться различными нарушениями, включая инфекцию и травматическое
20 повреждение. M-CSF рассматривается в качестве имеющего решающее значение регулятора воспалительных ответов в головном мозге, и уровни M-CSF повышаются при ВИЧ-1, энцефалите, болезни Альцгеймера (AD) и опухолях головного мозга. Микроглиозы, являющиеся результатом аутокринной передачи сигналов M-CSF/CSF-1R, приводят к индукции воспалительных цитокинов и
25 высвобождению оксидов азота, что продемонстрировано, например, с помощью экспериментальной модели нейронного повреждения (Нао A.J. и др., Neuroscience, 112, 2002, сс. 889-900; Murphy G.M. Jr. и др., J. Biol. Chem., 273, 1998, сс. 20967-20971). Микроглия, для которой характерны повышенные уровни экспрессии CSF-1R, обнаружена в окружении бляшек при AD и на созданной на
30 трансгенных мышах, несущих белок-предшественник V717F, модели AD
(Murphy G.M. Jr. и др., Am. J. Pathol., 157, 2000, cc. 895-904). С другой стороны, у мышей линии ор/ор с пониженным уровнем микроглии в головном мозге имеет место отложение фибрилл А-бета и потеря нейронов по сравнению со здоровыми
контрольными мышами, что позволяет предположить, что микроглия может
выполнять нейрозащитную функцию, препятствуя развитию AD, которая
отсутствует у мышей линии op/op (Kaku М. и др., Brain Res. Brain Res. Protoc,
12, 2003, cc. 104-108).
5 Экспрессия и передача сигналов M-CSF и CSF-1 R ассоциированы с
воспалительным заболеванием кишечника (IBD) (WO 2005/046657). Понятие "воспалительное заболевание кишечника" относится к серьезным хроническим нарушениям кишечного тракта, отличающимся хроническим воспалением в различных областях желудочно-кишечного тракта, и в частности включает
10 неспецифический язвенный колит (UC) и болезнь Крона.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и
15 фрагментами аминокислотных последовательностей, которая предназначена для лечения рака.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающегося вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом, или в
20 другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, которая предназначена для лечения потери костной ткани.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
25 отличающегося вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, которая предназначена для предупреждения или лечения метастазов.
Изобретение относится к комбинированной терапии, включающей
30 применение антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R,
отличающегося вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и
фрагментами аминокислотных последовательностей, которая предназначена для лечения воспалительных заболеваний.
Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями 5 связывания с эпитопом, или в другом варианте вышеуказанными
аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для комбинированной терапии рака, указанной в настоящем описании, или в другом варианте для приготовления лекарственного средства для комбинированной терапии рака, указанной в настоящем описании.
10 Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с
человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для комбинированной терапии потери костной ткани,
15 указанной в настоящем описании, или в другом варианте для приготовления
лекарственного средства для комбинированной терапии потери костной ткани, указанной в настоящем описании.
Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями
20 связывания с эпитопом, или в другом варианте вышеуказанными
аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных последовательностей, для предупреждения или лечения метастазов с помощью комбинации, указанной в настоящем описании, или в другом варианте для приготовления лекарственного средства для предупреждения или лечения
25 метастазов с помощью комбинации, указанной в настоящем описании.
Изобретение относится к применению антитела, которое связывается с человеческим CSF-1R, отличающемуся вышеуказанными особенностями связывания с эпитопом, или в другом варианте вышеуказанными аминокислотными последовательностями и фрагментами аминокислотных
30 последовательностей, для комбинированной терапии воспалительных
заболеваний, указанной в настоящем описании, или в другом варианте для приготовления лекарственного средства для комбинированной терапии воспалительных заболеваний, указанной в настоящем описании.
Антитела, предлагаемые в изобретении, предпочтительно получают методами рекомбинации. Указанные методы хорошо известны в данной области и предусматривают экспрессию белка в прокариотических и эукариотических клетках с последующим выделением полипептида антитела и, как правило, 5 очисткой до фармацевтически приемлемой чистоты. Для экспрессии белка
нуклеиновые кислоты, кодирующие легкие и тяжелые цепи или их фрагменты, встраивают в экспрессионные векторы с помощью стандартных методов. Экспрессию осуществляют в приемлемых прокариотических или эукариотических клетках-хозяевах типа СНО-клеток, NSO-клеток, 8Р2/0-клеток,
10 НЕК293-клеток, COS-клеток, дрожжей или клеток E.coli, и антитело выделяют из клеток (из супернатанта или клеток после лизиса).
Рекомбинантное получение антител хорошо известно в данной области и описано, например, в обзорных статьях Makrides S.C., Protein Expr. Purif., 17, 1999, cc. 183-202; Geisse S. и др., Protein Expr. Purif., 8, 1996, cc. 271-282;
15 Kaufman R.J., Mol. Biotechnol., 16, 2000, cc. 151-161; Werner, R.G., Drug Res. 48, 1998, cc. 870-880.
Антитела могут присутствовать в целых клетках, в клеточном лизате или в частично очищенной или практически очищенной форме. Очистку осуществляют для удаления других клеточных компонентов или других загрязнителей,
20 например, других клеточных нуклеиновых кислот или белков, стандартными методами, которые включают обработку щелочью/ДСН, CsCl-бэндинг, хроматографию на колонках, электрофорез в агарозном геле и другие методы, хорошо известные в данной области (см. в Current Protocols in Molecular Biology, под ред. Ausubel F. и др., изд-во Greene Publishing and Wiley Interscience, New
25 York, 1987).
Экспрессия в NSO-клетках описана, например, у Barnes L.M. и др., Cytotechnology 32, 2000, сс. 109-123; и Barnes L.M. и др., Biotech. Bioeng. 73, 2001, сс. 261-270. Кратковременная экспрессия описана, например, у Durocher Y. и др., Nucl. Acids. Res. 30, 2002, с. Е9. Клонирование вариабельных доменов
30 описано у Orlandi R. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 1989, cc. 3833-3837;
Carter P. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1992, cc. 4285-4289; и Norderhaug L. и др., J. Immunol. Methods 204, 1997, cc. 77-87. Предпочтительная система кратковременной экспрессии (НЕК 293) описана у Schlaeger E.-J. и Christensen
К. в Cytotechnology 30, 1999, сс. 71-83 и у Schlaeger E.-J. в J. Immunol. Methods 194, 1996, cc. 191-199.
Молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие варианты аминокислотных последовательностей антитела к CSF-1R, получают различными методами, 5 известными в данной области. Эти методы включают (но, не ограничиваясь
только ими) выделение из встречающегося в естественных условия источника (в случае встречающихся в естественных условиях вариантов аминокислотных последовательностей) или получение с помощью опосредованного олигонуклеотидами (или сайтнаправленного) мутагенеза, ПЦР-мутагенеза и 10 кассетного мутагенеза ранее полученной вариантной или невариантной версии гуманизированного антитела к CSF-1R.
Вариабельные домены тяжелой и легкой цепи, предлагаемые в изобретении, объединяют с последовательностями промотора, инициации трансляции, константной области, с З'-нетранслируемой областью, 15 последовательностями полиаденилирования и терминации транскрипции с получением конструкций экспрессионных векторов. Конструкции для экспрессии тяжелой и легкой цепи можно объединять в одном векторе, их можно применять для котрансфекции, серийной трансфекции или раздельной трансфекции клеток-хозяев, которые затем можно сливать с получением 20 индивидуальной клетки-хозяина, которая экспрессирует обе цепи.
Следующим объектом настоящего изобретения является композиция, например, фармацевтическая композиция, содержащая одно или комбинацию моноклональных антител или их антигенсвязывающих участков, предлагаемых в настоящем изобретении, приготовленная в сочетании с фармацевтически 25 приемлемым носителем.
В контексте настоящего описания понятие "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому и ко всем растворителям, диспергирующим средам, покрытиям, антибактериальным и противогрибковым агентам, регулирующим изотоничность и замедляющим абсорбцию/резорбцию агентам и 30 подобным веществам, которые являются физиологически совместимыми.
Предпочтительно носитель должен быть пригоден для инъекции или инфузии.
Композицию, предлагаемую в настоящем изобретении, можно вводить различными методами, известными в данной области. Как должно быть
очевидно специалисту в данной области, путь и/или механизм введения должен варьироваться в зависимости от требуемых результатов.
Фармацевтически приемлемые носители представляют собой стерильные водные растворы или дисперсии и стерильные порошки, предназначенные для 5 приготовления стерильных инъецируемых растворов или дисперсии.
Применение указанных сред и агентов для фармацевтических действующих веществ известно в данной области. Помимо воды носитель может представлять собой, например, изотонический забуференный физиологический раствор.
Вне зависимости от выбранного пути введения соединения, предлагаемые в
10 настоящем изобретении, которые можно применять в приемлемой
гидратированной форме, и/или фармацевтические композиции, предлагаемые в настоящем изобретении, приготавливают в виде фармацевтически приемлемых лекарственных форм с помощью общепринятых методов, известных специалистам в данной области.
15 Фактические уровни доз действующих веществ в фармацевтических
композициях, предлагаемых в настоящем изобретении, могут варьироваться так, чтобы получать количество действующего вещества, которое является эффективным для получения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента при использовании конкретной композиции и пути введения, не
20 являясь при этом токсичными для пациента (эффективное количество). Выбранный уровень доз должен зависеть от разнообразных
фармакокинетических факторов, таких как активность конкретных применяемых композиций, предлагаемых в настоящем изобретении, или их сложных эфиров, солей или амидов, путь введения, время введения, скорость экскреции
25 конкретного применяемого соединения, другие лекарственные средства, соединения и/или материалы, применяемые в сочетании с конкретными композициями, возраст, пол, вес, общее состояние здоровья и предыдущая история болезни пациента, подлежащего лечению, и подобных факторов, которые хорошо известны в медицине.
30 Понятие "способ лечения" или его эквивалент применительно, например, к
раку относится к процедуре или процессу действия, который создают для снижения или элиминации количества раковых клеток у пациента или для облегчения симптомов рака. "Способ лечения" рака или другого
пролиферативного нарушения не обязательно означает, что раковые клетки или другое нарушение должны быть фактически элиминированы, что количество клеток или уровень нарушения должны быть фактически снижены, или что симптомы рака или другого нарушения должны быть фактически облегчены. 5 Часто способ лечения рака следует осуществлять даже при невысокой
вероятности успеха, но, даже если, исходя из истории болезни и ожидаемой продолжительности жизни пациента, лечение может оказывать общее благоприятное действие.
Понятия "применение в сочетании с" или "совместное применение",
10 "совместное введение" относятся к применению антитела к CSF-1R и
химиотерапевтического средства, лучевой терапии и/или иммунотерапии рака, например, в виде различных препаратов/обработок (или в виде одного препарата/одной обработки). Совместное применение может быть одновременным или последовательным в любом порядке, предпочтительно в
15 период времени, в течение которого оба (или все) действующие вещества
одновременного проявляют их биологическую активность. Указанное антитело и указанное дополнительное средство применяют совместно либо одновременно, либо последовательно (например, внутривенно (i.v.) с помощью непрерывной инфузии. Когда оба терапевтических средства применяют совместно
20 последовательно, то применяемую дозу либо водят в тот же день в виде двух
отдельных введений, либо одно из средств вводят в день 1, а второе применяют для совместного введения в день 2-день 7, предпочтительно в день 2-4. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения понятие "последовательно" означает в пределах 7 дней после дозирования первого
25 компонента, предпочтительно в пределах 4 дней после дозирования первого
компонента; и понятие "одновременно" означает введение в одно и то же время. Понятие "совместное введение (применение)" касательно поддерживающих доз антитела к CSF-1R означает, что поддерживающие дозы можно вводить одновременно, если цикл лечения является приемлемым для обоих
30 лекарственных средств, например, еженедельно. В другом варианте
дополнительное средство вводят, например, каждый первый-третий день, а указанное антитело вводят еженедельно. В другом варианте поддерживающие
дозы вводят совместно последовательно либо в один день, либо в течение нескольких дней.
Как должно быть очевидно, антитела вводят пациенту в "терапевтически эффективном количестве" (или просто в "эффективном количестве"), 5 представляющем собой количество соответствующего соединения или
комбинации, которое по предположению исследователя, ветеринара, лечащего врача или другого клинициста должно вызывать биологический или медицинский ответ в ткани, системе, животном или человеке.
Количество, применяемое для совместного введения, и время совместного 10 введения должны зависеть от типа (вид, пол, возраст, вес и т.д.) и состояния подлежащего лечению пациента и серьезности заболевания или состояния, подлежащего лечению. Указанные антитело к CSF-1R и дополнительное средство можно применять для совместного введения пациенту одновременно или в виде серий обработок, например, в один и тот же день или на следующий 15 день.
В зависимости от типа и серьезности заболевания доза, составляющая примерно от 0,1 до 50 мг/кг (например 0,1-20 мг/кг) указанного антитела к CSF-1R представляет собой начальную возможную дозу при совместном введении обоих лекарственных средств пациенту. Изобретение относится к применению 20 антитела, предлагаемого в изобретении, для лечения пациента, страдающего раком, прежде всего раком ободочной кишки, легкого или поджелудочной железы.
Изобретение относится также к способу лечения пациента, страдающего
указанным заболеванием.
25 Изобретение относится также к способу приготовления фармацевтической
композиции, которая содержит антитело, предлагаемое в изобретении, в эффективном количестве в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, и применение антитела, предлагаемого в изобретении, в таком способе.
30 Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в
изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического средства, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком.
Изобретение относится также к применению антитела, предлагаемого в изобретении, в эффективном количестве для приготовления фармацевтического средства, предпочтительно в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, предназначенного для лечения пациента, страдающего раком.
Представленные ниже примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что можно осуществлять модификации в изложенных процедурах без отклонения от сущности изобретения.
Описание последовательностей
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR2 тяжелой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR1 тяжелой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR3 легкой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR2 легкой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR1 легкой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
вариабельный домен тяжелой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
вариабельный домен легкой цепи, МАт 2F11
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR2 тяжелой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR1 тяжелой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR3 легкой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR2 легкой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR1 легкой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
вариабельный домен тяжелой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
вариабельный домен легкой цепи, МАт 2Е10
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи, пМАт 2F11-cl 1
SEQ
NO:
CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11 -с 11
SEQ
NO:
CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-cl 1
SEQ
NO:
CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2F11 -с 11
SEQ
NO:
CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2F11 -с 11
SEQ
NO:
CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2F11-cl 1
SEQ
NO:
вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-cl 1
SEQ ID NO: 24 вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2F11-cl 1
SEQ ID NO: 25 CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 26 CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 27 CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 28 CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 29 CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 30 CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 31 вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 32 вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2F1 l-d8
SEQ ID NO: 33 CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 34 CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 35 CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 36 CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 37 CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 38 CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 39 вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 40 вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2F11-е7
SEQ ID NO: 41 CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2
SEQ ID NO: 42 CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-П2
SEQ ID NO: 43 CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-fl2
SEQ ID NO: 44 CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2
SEQ ID NO: 45 CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2F11-П2
SEQ ID NO: 46 CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2F11-П2
SEQ ID NO: 47 вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2F1 l-fl2
SEQ ID NO: 48 вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2F11 -f 12
SEQ ID NO: 49 CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-gl
SEQ ID NO: 50 CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 51 CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 52 CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 53 CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 54 CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 55 вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 56 вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2F11-gl
SEQ ID NO: 57 константная область человеческой легкой каппа-цепи
SEQ ID NO: 58 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgGl
SEQ ID NO: 59 константная область человеческой тяжелой цепи, 5 выведенная из IgGl, с мутациями L234A и L235A
SEQ ID NO: 60 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG4
SEQ ID NO: 61 константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная из IgG4, с мутацией S228P
SEQ
NO:
человеческий CSF-1 R дикого типа (wt CSF-1 R)
SEQ
NO:
человеческий CSF-1 R с мутациями L301S Y969F
SEQ
NO:
внеклеточный домен человеческого CSF-1 R
SEQ
NO:
фрагмент человеческого CSF-1 R delD4
SEQ
NO:
фрагмент человеческого CSF-1 R D1-D3
SEQ
NO:
сигнальный пептид
SEQ
NO:
праймер
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR2 тяжелой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR1 тяжелой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR3 легкой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR2 легкой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR1 легкой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
вариабельная область тяжелой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
вариабельная область легкой цепи, МАт 1G10
SEQ
NO:
CDR3 тяжелой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
CDR2 тяжелой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
CDR1 тяжелой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
CDR3 легкой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
CDR2 легкой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
CDR1 легкой цепи, МАт 2Н7
SEQ
NO:
вариабельный домен тяжелой цепи МАт 2Н7
SEQ
NO:
вариабельный домен легкой цепи МАт 2Н7
SEQ
NO:
домены фрагмента человеческого CSF-1R D4-D5
SEQ ID NO: 86 человеческий CSF-1 SEQ ID NO: 87 человеческий IL-34
SEQ ID NO: 88 вариабельный домен тяжелой цепи СР-870,893 (антитело
21.4.1 в U.S. №7338660)
5 SEQ ID NO: 89 вариабельный домен легкой цепи СР-870,893 (антитело
21.4.1 в U.S. №7338660)
SEQ ID NO: 90 гуманизированный вариант вариабельного домена тяжелой цепи S2C6
SEQ ID NO: 91 гуманизированный вариант вариабельного домена легкой 10 цепи S2C6.
Описанные ниже варианты осуществления изобретения включают: 1. А) Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, предназначенное для 15 применения с целью
а) ингибирования клеточной пролиферации опухолевых клеток
экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-lR-лиганда;
б) ингибирования клеточной пролиферации опухолей с инфильтратом
20 макрофагов, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R, и/или
независимый от лиганда CSF-1R;
в) ингибирования выживания клеток моноцитов и макрофагов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-1R); и/или
25 г) ингибирования клеточной дифференцировки моноцитов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R), в макрофаги,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака;
30 или
Б) антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что связывается с доменами D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, предназначенное для применения с целью
лечения пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль или имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов, где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R.
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим 5 средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
2. А) Применение антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R,
которое отличается тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ
ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, для приготовления
лекарственного средства, предназначенного для
10 а) ингибирования клеточной пролиферации опухолевых клеток
экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R;
б) ингибирования клеточной пролиферации опухолей с инфильтратом
макрофагов, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R, и/или
15 независимый от лиганда CSF-1R;
в) ингибирования выживания клеток моноцитов и макрофагов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-1R); и/или
г) ингибирования клеточной дифференцировки моноцитов,
20 экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R), в макрофаги,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака;
или
25 Б) применение антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R, которое
отличается тем, что связывается с доменами D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для
лечения пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль или 30 имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов, где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R.
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
3. Антитело или применение по вариантам осуществления изобретения 1 или 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (паклитаксел (таксол), доцетаксел (таксотер), модифицированный паклитаксел (абраксан и опаксио)), доксорубицин, модифицированный доксорубицин (келикс или доксил)), сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) и другие мультикиназные ингибиторы, оксалиплатин, цисплатин и карбоплатин, этопозид, гемцитабин и винбластин.
4. Антитело или применение по вариантам осуществления изобретения 1 или 2, где иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей:
а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител,
которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-
клеточные биспецифические антитела (например, антитела-активаторы Т-клеток
BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферон
(IFN) альфа, антагонистические антитела, которые связываются с человеческим
CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3
или с CD25,
б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию
IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое
антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-АЗ, PROSTVAC; или
г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе
дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с
использованием CAR-T-клеток.
5. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 4, где иммунотерапия рака включает агонистическое антитело к CD40 (в одном из вариантов осуществления изобретения агонистическое антитело к CD40 представляет собой СР-870,893 или SGN-40).
6. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 1 или 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей
5.
таксаны (доцетаксел или паклитаксел, или модифицированный паклитаксел (абраксан или опаксио)), доксорубицин, капецитабин и/или бевацизумаб, предназначенное для лечения рака молочной железы.
7. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 1 или 5 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей
карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин, паклитаксел, доксорубицин (или модифицированный доксорубицин (келикс или доксил)) или топотекан (гикамптин), предназначенное для лечения рака яичника.
8. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 1 или 10 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей
мультикиназный ингибитор (сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) или мотесаниба дифосфат (AMG 706) и/или доксорубицин, предназначенное для лечения рака почки.
9. Антитело по варианту осуществления изобретения 1 или 2, где 15 химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей
оксалиплатин, цисплатин, и/или применяют излучение для лечения плоскоклеточной карциномы.
10. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 1 или 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей
20 таксол и/или карбоплатин, предназначенное для лечения рака легкого.
11. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления, где антитело отличается тем, что антитело не связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65).
12. Антитело или применение по одному из предыдущих вариантов 25 осуществления изобретения, где антитело отличается тем, что
антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID NO: 65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) в соотношении 1:50 или менее.
13. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления, 30 отличающееся тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0:7 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO:8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0:15 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0:16,
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0:75 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0:76,
5 г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0:83 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0:84; или его гуманизированная версия.
14. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления,
отличающееся тем, что
10 а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0: 24 или
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0: 31 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
15 домен легкой цепи имеет SEQ ID N0: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0: 47 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0: 48, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID N0: 55 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID N0: 56.
20 15. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления,
отличающееся тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID NO: 1, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 3, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
25 участок, имеющий SEQ ID N0: 4, CDR2-участок, имеющий SEQ ID N0: 5, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID N0: 6, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID N0: 9, CDR2-участок, имеющий SEQ ID N0: 10, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 11, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-
30 участок, имеющий SEQ ID N0: 12, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 13, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
SEQ ID N0: 17, CDR2-y4acT0K, имеющий SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 19, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 20, СОЯ2-участок, имеющий SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
5 SEQ ID NO: 25, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 27, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 28, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
10 SEQ ID NO: 33, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 35, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
15 SEQ ID NO: 41, CDR2-участок, имеющий SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 43, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 44, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
20 SEQ ID NO: 49, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 50, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 51, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 52, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 53, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 54, или
з) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
25 SEQ ID NO: 69, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 70, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 71, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 73, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 74, или
и) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок, имеющий
30 SEQ ID NO: 77, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 78, и CDRl-участок,
имеющий SEQ ID NO: 79, а вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок, имеющий SEQ ID NO: 80, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 81, и CDRl-участок, имеющий SEQ ID NO: 82.
16. Антитело по одному из предыдущих вариантов осуществления
изобретения, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой
человеческий иммуноглобулин подкласса IgGl или человеческий
иммуноглобулин подкласса IgG4.
5 17. Антитело или применение по одному из предыдущих вариантов
осуществления изобретения для использования в способе лечения рака, потери костной ткани, метастазов, воспалительных заболеваний или для предупреждения метастазов.
18. А) Способ
10 а) ингибирования клеточной пролиферации опухолевых клеток
экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R;
б) ингибирования клеточной пролиферации опухолей с инфильтратом
макрофагов, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R, и/или
15 независимый от лиганда CSF-1R;
в) ингибирования выживания клеток моноцитов и макрофагов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-1R); и/или
г) ингибирования клеточной дифференцировки моноцитов,
20 экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R), в макрофаги,
в котором антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, которое отличается тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, применяют в сочетании с 25 химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака; или
Б) способ лечения пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль
или имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов,
где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R,
30 в котором антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, которое
отличается тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, применяют в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака
19. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для
применения при
лечении пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль или имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов, где 5 опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с иммунотерапией рака, где иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител, которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-10 клеточные биспецифические антитела (например, антитела-активаторы Т-клеток BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферон (IFN) альфа, антагонистические антитела, которые связываются с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 или с CD25,
15 б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое
20 антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR, рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-АЗ, PROSTVAC; или
г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе
дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с
25 использованием CAR-T-клеток.
20. Антитело по варианту осуществления изобретения 19,
где иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей:
противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток: OncoVex
(онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое антитело к 30 CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодирующий MAGE-АЗ, PROSTVAC.
21. Антитело или применение по варианту осуществления изобретения 19,
где иммунотерапия рака включает агонистическое антитело к CD40 (в одном из
вариантов осуществления изобретения агонистическое антитело к CD40 представляет собой СР-870,893 или SGN-40).
22. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-5 1R, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют in vitro уровень одного или нескольких следующих маркеров:
CSF-1R, CD68/CD163, СЭ68/ГКГС класса II, CD31 (плотность
микрососудов) и Ki67 и других маркеров типа инфильтратов иммунных клеток;
10 в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы,
включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1R, CD68/CD163, СЭ68/ГКГС класса II, CD31 (плотность микрососудов) и К167 и
15 других маркеров, типа, например, инфильтратов иммунных клеток (например, Т-клеток (например, CD4"- и/или СБ8"-Т-клеток) по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
20 23.Способ по варианту осуществления изобретения 22, в котором антитело,
применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело по одному предыдущих вариантов осуществления изобретения.
24. Способ по варианту осуществления изобретения 21 или 22, в котором изменение уровня CSF-1R, CD68/CD163, СЭ68/ГКГС класса II, CD31 (плотность
25 микрососудов) и Ki67 и других маркеров, типа, например, инфильтратов
иммунных клеток (например, Т-клеток (например, CD4"- и/или СБ8"-Т-клеток) по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких из указанных маркеров.
25. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак,
30 кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют in vitro уровень одного или нескольких следующих маркеров:
-
CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы,
включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и
циркулирующие опухолевые клетки; и
5 - в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1, Тгар5Ь,
sCD163, IL-34 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
26. Способ по варианту осуществления изобретения 25, в котором антитело,
10 применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело по одному
предыдущих вариантов осуществления изобретения.
27. Способ по варианту осуществления изобретения 25 или 26, в котором изменение уровня CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня
15 одного или нескольких из указанных маркеров.
28. Способ по одному из вариантов осуществления изобретения 25- 27, в котором ex vivo или in vitro определяют уровень и изменение уровня sCD163.
29. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-
20 1R, заключающийся в том, что:
- ex vivo или in vitro определяют in vitro уровень одного или нескольких следующих маркеров:
IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8 , IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1,
CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа;
25 в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы,
включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из IFNy, TNFa, IL-ip, IL-4, IL-6, IL-8 , IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1,
30 галектин 3, ILIRa, TGF-альфа по сравнению с соответствующим уровнем у
индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R.
- по -
30. Способ по варианту осуществления изобретения 29, в котором антитело,
применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело по одному
предыдущих вариантов осуществления изобретения.
31. Способ по варианту осуществления изобретения 29 или 30, в котором 5 изменение уровня IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF,
VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектина 3, ILIRa, TGF-альфа no сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких из указанных маркеров.
32. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для 10 применения в лечении рака, где антитело вводят в сочетании с биспецифическим
антителом к ANG-2-VEGF.
33. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для
применения при лечении рака, где антитело к CSF-1R вводят в сочетании с
агонистическим антителом к CD40.
15 34. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по варианту
осуществления изобретения 33, где антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID N0:39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:40; и где агонистическое антитело к CD40 представляет
20 собой СР-870,893 (антитело 21.4.1 в US № 7338660).
35. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по варианту
осуществления изобретения 33, где I) антитело к CSF-1R содержит (а)
аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ
ID N0:39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена
25 легкой цепи SEQ ID N0:40, и где И) агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 88 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 89.
36. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по варианту
30 осуществления изобретения 33, где антитело к CSF-1R содержит (а)
аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40;
- Ill -
и где агонистическое антитело к CD40 представляет собой дацетузумаб.
37. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по варианту осуществления изобретения 33, где I) антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID N0:40, и где II) агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 91.
38. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по варианту осуществления изобретения 33,
где агонистическое антитело к CD40 представляет собой
I) СР-870,893;
II) содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 88 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 89;
III) дацетузумаб; или
IV) содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного
домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и (б) аминокислотную последовательность
вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 91
39. Применение антитела, связывающегося с человеческим CSF-1R, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения рака, в котором антитело к CSF-1R вводят в сочетании с агонистическим антителом к CD40.
40. Применение по варианту осуществления изобретения 39, в котором антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40; и
в котором агонистическое антитело к CD40 представляет собой СР-870,893 (антитело 21.4.1 в US № 7338660).
41. Применение по варианту осуществления изобретения 39,
I) в котором антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную
последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б)
аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40, и
II) в котором агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ
5 ID NO: 88 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 89.
42. Применение по варианту осуществления изобретения 39, в котором в
котором антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность
вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную
10 последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40; и в котором агонистическое антитело к CD40 представляет собой дацетузумаб.
43. Применение по варианту осуществления изобретения 39, I) в котором антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную
15 последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б)
аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40, и
И) в котором агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ 20 ID NO: 90 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 91.
44. Применение по варианту осуществления изобретения 39,
в котором агонистическое антитело к CD40 представляет собой I) СР-870,893;
25 II) содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного
домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 88 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 89;
III) дацетузумаб; или
IV) содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного
30 домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 91.
Представленные ниже примеры, перечень последовательностей и чертежи даны с целью лучшего понимания настоящего изобретения, истинный объем
которого изложен в прилагаемой формуле изобретения. Очевидно, что можно осуществлять модификации в изложенных процедурах без отклонения от сущности изобретения.
Примеры
5 Пример 1
Создание клеточной линии гибридомы, продуцирующей антитела к CSF-1R
Процедура иммунизации NMRI-мышей
NMRI-мышей иммунизировали путем электропорации с использованием экспрессионного вектора pDisplay(tm) (фирма Invitrogen, США), кодирующего 10 внеклеточный домен huCSF-lR. Каждую мышь иммунизировали 4 раза, используя по 100 мкг ДНК. Когда титры в сыворотке антител к huCSF-lR достигали достаточного уровня, мышей подвергали одной дополнительной ревакцинации с использованием 50 мкг смеси 1:1 химеры huCSF-lR ECD/huCSF-1R ECDhuFc в 200 мкл ЗФР, которую вводили внутривенно (i.v.) за 4 и 3 дня до 15 осуществления слияния.
Специфический для антигена ELISA
Титры антител к CSF-1R в сыворотке иммунизированных мышей определяли с помощью специфического для антигена ELISA.
0,3 мкг/мл химеры huCSF-lR-huFc (растворимый внеклеточный домен)
20 иммобилизовывали на стрептавидиновом планшете (MaxiSorb; фирма MicroCoat, Германия, каталожный № 11974998/МС1099) с использованием биотинилированного антитела к Fey, взятого в концентрации 0,1 мг/мл (фирма Jackson ImmunoResearch., каталожный № 109-066-098), и добавляли конъюгированный с пероксидазой из хрена (HRP) F(ab'^-фрагмент
25 антимышиного IgG (фирма GE Healthcare, Великобритания, каталожный
№.NA9310V), разведенный в соотношении 1/800 в ЗФР/0,05% Твин 20/0,5% БСА. Сыворотку, полученную после электропорации, разводили в соотношении 1/40 в ЗФР/0,05% Твин 20/0,5% БСА и серийно разводили вплоть до 1/1638400. Разведенную сыворотку вносили в лунки. Сыворотку, взятую до осуществления
30 электропорации, применяли в качестве отрицательного контроля. Серийные
разведения мышиного антитела к человеческому CSF-1R МАт3291 (фирма R &D Systems, Великобритания) с концентрацией от 500 до 0,25 нг/мл применяли в качестве положительного контроля. Все компоненты инкубировали вместе в
течение 1,5 ч. Лунки отмывали 6 раз ЗФРТ (ЗФР/0,2% Твин 20) и осуществляли
анализы с использованием свежеприготовленного раствора ABTS(r) (1 мг/мл)
(ABTS: 2,2'-азинобис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота) в течение 10
мин при КТ. Абсорбцию измеряли при длине волны 405 нм.
5 Создание гибридом
Мышиные лимфоциты можно выделять и сливать с клеточной линией мышиной миеломы с получением гибридом, используя стандартные основанные на применении ПЭГ протоколы. Затем полученные гибридомы подвергали скринингу в отношении производства антигенспецифических антител.
10 Например, суспензии единичных клеток спленоцитов, выведенных из
лимфоцитов, которые получали из иммунизированных мышей, сливали с не секретирующими Ag8 клетками мышиной миеломы линии P3X63Ag8.653 (АТСС, CRL-1580) с использованием 50% ПЭГ. Примерно 104 клеток высевали в плоскодонный 96-луночный титрационный микропланшет и после этого
15 инкубировали в течение примерно двух недель в селективной среде. Затем
содержимое индивидуальных лунок подвергали скринингу с помощью ELISA в отношении моноклональных антител к CSF-1R типа IgM и IgG. На стадии интенсивного роста гибридом секретирующие антитела гибридомы пересевали, вновь подвергали скринингу, и если они еще были позитивными в отношении
20 моноклональных антител к CSF-1R человеческого IgG-типа, то их можно было субклонировать с помощью FACS. Затем стабильные субклоны культивировали in vitro в среде для культуры ткани с получением антитела для характеризации. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно отбирать на основе оценки связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и с
25 внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD), согласно методу, описанному в примере 4, а также на основе оценки ингибирования роста №НЗТЗ-клеток, трансфектированных CSF-1R дикого типа (зависимая от лиганда передача сигналов) или мутантным CSF-1R L301S Y969F (независимая от лиганда передача сигналов) при обработке моноклональными антителами к CSF-
30 1R согласно методу, описанному в примере 5. Культивирование гибридом
Продуцирующие ггшМАт гибридомы культивировали в среде RPMI 1640 (фирма PAN, каталожный № (кат. №) Р04-17500), дополненной 2мМ L
глутамином (фирма GIBCO, кат. № 35050-038), 1мМ Na-пируватом (фирма GIBCO, кат. № 11360-039), lx NEAA (фирма GIBCO, кат. № 1140-035), 10% FCS (фирма РАА, кат. № А15-649), I* Pen Strep (пенициллин-стрептомицин) (фирма Roche, кат. № 1074440), 1 х Nutridoma-CS (фирма Roche, кат. № 1363743), 50мкМ 5 меркаптоэтанолом (фирма GIBCO, кат. № 31350-010) и 50 ед./мл мышиного IL 6 (фирма Roche, кат. №1 444 581), при 37°С и 5% С02. Некоторые из образовавшихся мышиных антител гуманизировали (например, МАт 2F11) и экспрессировали рекомбинантно. Пример 2
10 Ингибирование связывания CSF-1 с CSF-1R (ELISA)
При проведении указанного анализа сначала давали связываться антителу к
CSF-1R с CSF-1R-ECD, после чего путем обнаружения лиганда, не связанного с
рецептором, можно было оценивать как замещающие лиганд антитела, так и
являющиеся ингибиторами димеризации антитела к CSF-1R. Анализ 15 осуществляли в 384-луночных титрационных микропланшетах (фирма
MicroCoat, Германия, кат. № 464718) при КТ. После каждой стадии инкубации
планшеты отмывали трижды ЗФР-Т.
Прежде всего, планшеты сенсибилизировали с помощью козьего
биотинилированного Р(аЬ')2-фрагмента антитела к Fey (фирма Jackson 20 ImmunoResearch., кат. № 109-006-170) в концентрации 0,5 мг/мл в течение 1 часа
(ч).
Затем лунки блокировали с помощью ЗФР, дополненного 0,2% Tween(r)-20 и 2% БСА (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия), в течение 0,5 ч. Химеру huCSF-lR-huFc (75 нг/мл) (которая образовывала димерный растворимый
25 внеклеточный домен huCSF-lR) иммобилизовывали на планшете в течение 1 ч. Затем разведения очищенных антител в ЗФР/0,05% Твин 20/0,5% БСА инкубировали в течение 1 ч. После добавления смеси, содержащей 3 нг/мл huCSF-1 (активный состоящий из 149 ак фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33181 SEQ ID NO: 86) фирма Biomol, Германия, кат. № 60530), 50 нг/мл
30 биотинилированного клона антитела к CSF-1 BAF216 (фирма R &D Systems, Великобритания) и разведенного в соотношении 1:5000 конъюгата стрептавидина и HRP (фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. № 11089153001), и выдерживания в течение 1 ч планшеты отмывали 6 раз ЗФРТ.
Антитело к CSF-1 R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве положительного контроля. Планшеты проявляли с помощью свежеприготовленного раствора субстрата ВМ blue(r) POD (ВМ blue(r): 3,3'-5,5'-5 тетраметилбензидин, фирма Roche Diagnostics GmbH, Германия, кат. №
11484281001) в течение 30 мин при КТ. Абсорбцию измеряли при длине волны 370 нм. Если антитело к CSF-1R вызывало высвобождение CSF-1 из димерного комплекса, то это вызывало снижение абсорбции. Все антитела к CSF-1R вызывали выраженное ингибирование взаимодействия CSF-1 с CSF-1R (см. 10 таблицу 1). Антитело к CSF-1R SC 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также у Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс. 1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве референс-контроля.
Таблица 1: Рассчитанные величины 1Сso, характеризующие ингибирование 15 взаимодействия CSF-1/CSF-1R
MATKCSF-1R
Величины IC50, характеризующие ингибирование CSF-1/CSF-1R [нг/мл]
МАт 2F11
19,3
МАт 2Е10
20,6
МАт 2Н7
18,2
МАт 1G10
11,8
SC-2-4A5
35,2
Пример 3
Ингибирование индуцируемого CSF-1 фосфорилирования CSF-1R в рекомбинантных клетках линии NIH3T3-CSF-1R
20 4,5x10 клеток линии NIH ЗТЗ, зараженных ретровирусным
экспрессионным вектором, несущим полноразмерный CSF-1R, культивировали в среде DMEM (фирма РАА, кат. № Е15-011), дополненной 2мМ L-глутамином (фирма Sigma, кат. № G7513), 2мМ пируватом натрия, 1хзаменимыми аминокислотами, 10% FKS (фирма РАА, кат. № А15-649) и 100 мкг/мл PenStrep
25 (фирма Sigma, кат. № Р4333 (10 мг/мл)), до достижения конфлюэнтности. Затем клетки отмывали бессывороточной средой DMEM (фирма РАА кат. № 15-011), дополненной селенитом натрия (5 нг/мл) (фирма Sigma, кат. № S9133), трансферрином (10 мкг/мл) (фирма Sigma, кат. № Т8158), БСА (400 мкг/мл)
(фирма Roche Diagnostics GmbH, кат. № 10735078), 4мМ L-глутамином (фирма Sigma, кат. №G7513), 2мМ пируватом натрия (фирма Gibco, кат. № 11360), 1> <заменимыми аминокислотами (фирма Gibco, кат. № 11140-035), 2-меркаптоэтанолом (0,05мМ) (фирма Merck, кат. № М7522), 100 мкг/мл PenStrep 5 (фирма Sigma, кат. № Р4333), и инкубировали в 30 мкл этой среды в течение 16 ч, в результате чего происходила повышающая регуляция рецептора. К клеткам добавляли 10 мкл разведенных антител к CSR-1R в течение 1,5 ч. Затем клетки стимулировали с помощью 10 мкл (концентрация 100 нг/мл) huM-CSF-1 (активный состоящий из 149 ак фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33-181 SEQ
10 ID NO: 86); фирма Biomol, кат. № 60530) в течение 5 мин. После инкубации супернатант удаляли, клетки отмывали дважды 80 мкл охлажденного на льду ЗФР и добавляли 50 мкл свежеприготовленного охлажденного на льду буфера для лизиса (150мМ NaCl/ 20мМ Трис, рН 7,5/1мМ ЭДТКЛмМ ЭГТК/1% Тритон Х-100/1 таблетка ингибитора протеаз (фирма Roche Diagnostics GmbH, кат. № 1
15 836 170) на 10 мл буфера/10 мкл/мл/коктейль ингибиторов фосфатаз 1 (фирма Sigma, кат. № Р-2850, 100х маточный раствор)/10 мкл/мл ингибитора протеаз 1 (фирма Sigma, кат. № Р-5726, 100х маточный раствор)/10 мкл/мл 1М NaF). После выдерживания в течение 30 мин на льду планшеты интенсивно встряхивали на шейкере для планшетов в течение 3 мин и затем
20 центрифугировали в течение 10 мин при 2200 об/мин (Heraeus Megafuge 10).
Присутствие фосфорилированного рецептора CSF-1 и общее количество рецепторов анализировали с помощью ELISA. Для обнаружения фофорилированного рецептора применяли набор фирмы R &D Systems (кат. № DYC3268-2) согласно инструкциям поставщика. Для обнаружения общего
25 количества рецептора CSF-1R 10 мкл лизата иммобилизовывали на планшете с помощью захватывающего антитела, входящего в набор. Затем добавляли разведенное в соотношении 1:750 биотинилированное антитело к CSF-1R BAF329 (фирма R &D Systems) и разведенный в соотношении 1:1000 конъюгат стрептавидин-HRP. Через 60 мин планшеты обрабатывали свежеприготовленным
30 раствором ABTS(r) и определяли абсорбцию. Данные рассчитывали в виде % относительно положительного контроля без антитела и выражали в виде соотношения: количество фосфорилированного рецептора/общее количество рецептора. В качестве отрицательного контроля использовали вариант без
добавления M-CSF-1. Антитело к CSF-1 R SC 2-4A5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, cc. 1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, применяли в качестве референс-контроля.
5 Таблица 2: Рассчитанные величины ICsn, характеризующие ингибирование
фосфорилирования рецептора CSF-1
MATKCSF-1R
Величины 1С50, характеризующие ингибирование фосфорилирования CSF-1R [нг/мл]
МАт 2F11
219,4
МАт2Е10
752,0
МАт 2Н7
703,4
МАт 1G10
56,6
SC-2-4A5
1006,6
Пример 4
Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R
delD4 и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)
10 Получение внеклеточного домена человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD)
(который содержит внеклеточные субдомены D1-D5, hCSF-lR-ECD), SEQ ID NO: 64
Плазмида pCMV-preS-Fc-hCSF-lR-ECD (7836 пар оснований) кодирует полный ECD человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64), слитый на С-конце с
15 сайтом расщепления протеазой PreScission, за которым располагается состоящий из аминокислот 100-330 человеческий IgGl и метка 6> 20 Получение фрагмента человеческого CSF-1R delD4 (который содержит
внеклеточные субдомены D1-D3 и D5, hCSF-lR-delD4). SEP ID NO: 65
hCSFlR-delD4-Vl-PreSc-hFc-His клонировали из плазмиды pCMV-preS-Fc-hCSF-lR-ECD согласно протоколу сайтнаправленного мутагенеза QuikChange XL фирмы Stratagene, используя delD4-for, который имеет последовательность
25 CACCTCCATGTTCTTCCGGTACCCCCCAGAGGTAAG (SEQ ID NO: 68) в качестве "прямого" праймера и delD4-rev, который имеет обратную комплементарную последовательность, в качестве "обратного" праймера. Перед осуществлением обычного протокола фирмы Stratagene применяли вариант
протокола, опубликованный в BioTechniques, 26, 1999, с. 680, для удлинения обоих праймеров с помощью раздельных реакций с осуществлением трех циклов:
Приготавливали две различные реакционные смеси объемом 50 мкл 5 согласно руководству производителя, каждая из которых содержала 10 нг плазмиды pCMV-preS-Fc-hCSFlR-ECD в качестве матрицы и ЮпМ один из праймеров delD4-for или delD4-rev и 0,5 мкл ДНК-полимеразы Pfu, входящей в набор. Осуществляли три ПЦР-цикла (95°С 30 с/55°С 60 с/68°С 8 мин), после чего по 25 мкл каждой из двух реакционных смесей объединяли в новой 10 пробирке и добавляли 0,5 мкл свежеприготовленной ДНК-полимеразы Pfu. Осуществляли обычный ПЦР-протокол, предусматривающий применение 18 температурных циклов согласно руководству по применению набора фирмы Stratagene с последующим конечным расщеплением в течение 2 ч с помощью рестриктазы Dpnl, входящей в набор. Клоны с делецией выявляли путем 15 расщепления с помощью Cel II и Not I и подтверждали секвенированием.
Для получения белка осуществляли кратковременную трансфекцию системы суспензионных клеток Hek293 FreeStyle (фирма Invitrogen) согласно спецификациям производителя. Через 1 неделю 500 мл супернатанта отфильтровывали и вносили в 1-миллилитровую колонку HiTrap MabSelect Xtra 20 (фирма GE healthcare), заполненную белком А (0,2 мл/мин). Колонку отмывали сначала ЗФР, затем 50мМ Трис/150мМ NaCl/lMM ЭДТК/рН 7,3. В колонку вносили 75 мкл протеазы PreScission (фирма GE, кат. № 27-0843-01), разведенной в 375 мкл такого же буфера, и закрытую колонку инкубировали в течение ночи при 4°С с вращением. Колонку помещали на верхнюю часть 125 миллилитровой колонки GSTrap FF (фирма GE helthcare) и требуемый белок элюировали (0,2 мл/мин, фракции объемом 0,2 мл). Объединенные фракции концентрировали, снижая объем с 1,8 мл до 0,4 мл путем центрифужной ультрафильтрации с использованием устройства 3k Nanosep, и хроматографировали с помощью устройства для гель-фильтрации S200 HR в 30 ЗФР (0,5 мл/мин).
Фрагмент человеческого CSF-1R delD4 получали в виде двух фракций в виде димерной молекулы (пул 1, V=l,5 мл; концентрация (с) = 0,30 мг/мл; кажущаяся масса по данным ДСН-ПААГ 83 кДа, в восстанавливающих условиях
62 кДа), и в виде мономера (пул 2, V=l,4 мл; с = 0,25 мг/мл кажущаяся масса по данным ДСН-ПААГ 62 кДа). Во всех экспериментах применяли димерную форму.
Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R 5 delD4 и с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (сигналы связывания в виде единиц ответа (RU):
устройство: Biacore Т100 (фирма GE Healthcare),
программа: Т100 Control, версия 2.0.1,
Т100 Evaluation, версия 2.0.2,
10 формат анализа чип: СМ5,
температура: 25°С.
Фрагмент CSF-1R иммобилизовывали посредством аминного сочетания. Для сравнения связывания различных антител к CSF-1R, предлагаемых в изобретении, тестируемое антитело инъецировали в одной концентрации. 15 Антитела к CSF-1R МАт3291 (фирма R &D-Systems) и SC 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс. 17861793) применяли в качестве референс-контроля, антитело к CCR5 m Pz03.1C5 (депонировано под номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г в DSMZ) применяли в качестве отрицательного контроля, все эти антитела 20 применяли в таких же условиях, что и антитела к CSF-1R, предлагаемые в изобретении.
Аминное сочетание фрагментов CSF-1R
Применяли стандартный метод аминного сочетания согласно инструкциям производителя: подвижный буфер: ЗФР-Т (фирма Roche, кат. № 11 666 789 +
25 0,05% Твин20, кат. № 11 332 465), активация с помощью смеси EDC/NHS, инъекция фрагмента человеческого CSF-1R delD4 (который содержит внеклеточные субдомены D1-D3 и D5) (SEQ ID NO: 65) и внеклеточного домена человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены D1-D5) (SEQ ID NO: 64) в течение 600 с при скорости потока 10
30 мкл/мин; разбавление в буфере для сочетания NaAc, рН 5,0, с = 10 мкг/мл;
оставшиеся в конце активированные карбоксильные группы блокировали путем инъекции 1М этаноламина.
Связывание МАт 2F11. МАт 2Е10. МАт 3291 и sc2-4A5 и других антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) при 25°С
Подвижный буфер: ЗФР-Т (фирма Roche, кат. № 11 666 789 + 0,05% 5 Твин20, кат. №11 332 465),
Анализируемый образец:
Связывание оценивали при скорости потока 30 мкл/мин с помощью одной инъекции анализируемого образца в концентрации (с), составлявшей ЮнМ (для МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированного ЬМАт 2Fll-e7 во втором
10 эксперименте). Продолжительность каждой инъекции составляла 700 с, продолжительность последующей фазы диссоциации составляла 180 с. Конечную стадию регенерации осуществляли после каждого цикла с помощью 50мМ NaOH, продолжительность контакта 60 с, скорость потока 30 мкл/мин.
Сигналы оценивали в определенной предназначенной для измерения точке
15 через 10 с после окончания инъекции. Референс-сигналы (сигналы от пустой проточной референс-ячейки (которую обрабатывали только EDC/NHS и этаноламином) вычитали с получением сигналов связывания (в виде RU). Если сигналы связывания несвязывающихся антител были несколько ниже нуля (МАт 2F11 =-3; МАт 2Е10 = -2; МАт 1G10 = -6, МАт 2Н7 =-9; и гуманизированное
20 ЬМАт 2F11-е7 = -7), то значения принимали за нуль.
Таблица За: Связывание МАт к человеческому фрагменту CSF-1R delD4 и CSF-1R-ECD и соотношение при 25°С, оцененное с помощью SPR
Связывание с delD4 [RU]
Связывание с CSF-1R-ECD [RU]
Соотношение связывания антител к CSF-1R с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-lR-ECD
МАт 3291
1015
627
1015/627= 1,61
sc2-4A5
374
249
374/249= 1,50
МАт 2F11
176
0/176 = 0
ЬМАт 2Fll-e7
237
0/237= 0
МАт2Е10
120
0/120 = 0
МАт 1G10
2708
0/2708 = 0
МАт 2Н7
147
0/147 = 0
M Pz03.1C5
У МАт 2F11 и МАт 2Е10 обнаружена способность связываться с 25 внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (см. фиг. 26); но отсутствие способности связываться с фрагментом CSF-1R delD4 (см. фиг. 2а).
У Sc2-4A5 и МАт 3291 обнаружена способность связываться и с CSF-1R-ECD, и с delD4 (см. фиг. 26 и 2а).
Таким образом, соотношение связывания с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-1R-ECD антител к CSF-1R МАт 2F11 и МАт 2Е10 заметно ниже чем 1:50 (оно 5 было равно 0,02), в то время как соотношение связывания МАт 3291 и Sc2-e4A5 составляло 1,61 и 1,50 соответственно и существенно превышало 1:50 (оно было равно 0,02). У применяемого в качестве отрицательного контроля антитела m Pz03.1C5 не выявлено никакой способности связываться (как и ожидалось).
10 У МАт 1G10, МАт 2Н7 и гуманизированного ЬМАт 2F11-е7 обнаружена
способность связываться с внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (см. фиг. 2г); но не выявлена способность связываться с фрагментом CSF-1R delD4 (см. фиг. 2в). Таким образом, соотношение связывания с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-lR-ECD антител к CSF-1R МАт 1G10, МАт 2Н7
15 и гуманизированного ЬМАт 2F11-е7 заметно ниже чем 1:50 (оно было равно 0,02).
В другом эксперименте изучали антитела к CSF-1R 1,2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303), CXIIG6 (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/112245), козье 20 поликлональное антитело к CSF-1R аЬ10676 (фирма Abeam). Антитело к CSF-1R МАт 3291 (фирма R &D-Systems) использовали в качестве референс-контроля. Антитело к CCR5 m Pz03.1C5 (депонировано под номером DSM АСС 2683 18.08.2004 г в DSMZ) применяли в качестве отрицательного контроля.
Таблица 36: Связывание МАт к человеческому фрагменту CSF-25 1R delD4 и CSF-1R-ECD и соотношение при 25°С, оцененное с помощью SPR
Связывание с delD4 [RU]
Связывание с CSF-1R-ECD [RU]
Соотношение связывания антител к CSF-1R с фрагментом CSF-1R delD4/CSF-lR-ECD
МАТ3291
1790
1222
1790/1222= 1,47
1.2. SM
469
704
469/704 = 0,67
CXIIG6
1983
1356
1983/1356= 1,46
АЫ0676
787
547
787/547= 1,44
m Pz03.1C5
У антител 1.2.SM, CXIIG6, abl0676 и МАт 3291 обнаружена способность связываться и с CSF-1R-ECD, и с del D4 (см. фиг. 2е и 2ж).
Соотношение связывания 1.2.SM, CXIIG6, аЫ0676 и МАт 3291 существенно превышало 1:50 (оно было равно 0,02). У применяемого в качестве 5 отрицательного контроля антитела m Pz03.1C5 не выявлено никакой способности связываться (как и ожидалось).
Пример 5
Ингибирование роста рекомбинантных клеток NIH3T3-CSF-1R в 3D-культуре путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R
10 (CellTiterGlo-анализ)
Клетки линии NIH ЗТЗ, зараженные с помощью ретровируса либо экспрессионным вектором полноразмерного CSF-1R дикого типа (SEQ ID NO: 62), либо мутантом CSF-1R L301S Y969F (SEQ ID NO: 63), культивировали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (фирма РАА, Пашинг, Австрия),
15 дополненной 2мМ L-глутамином, 2мМ пируватом натрия и заменимыми
аминокислотами, 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма Sigma, Тауфкирхен, Германия), в сенсибилизированных поли-НЕМА (поли(2-
гидроксиэтилметакрилат)) (фирма Polysciences, Уоррингтон, шт. Пенсильвания, США)) чашках для предупреждения прилипания к пластиковой поверхности.
20 Клетки высевали в среду, в которой сыворотку заменяли на селенит натрия (5
нг/мл), трансферрин (10 мг/мл), БСА (400 мкг/мл) и 2-меркаптоэтанол (0,05мМ). При обработке 100 нг/мл huCSF-1 (фирма Biomol, Гамбург, Германия) экпрессирующие wtCSF-lR клетки формировали плотные сфероиды, которые росли в трех направлениях, свойство, которое называют отсутствием
25 зависимости от прикрепления. Эти сфероиды in situ очень напоминали по их трехмерному строению и организации солидные опухоли. Несущие мутантный CSF-1R рекомбинантные клетки обладали способностью образовывать сфероиды вне зависимости от лиганда CSF-1. Сфероидные культуры инкубировали в течение 3 дней в присутствии антитела в различных концентрациях для
30 определения величин IC50 (концентрация, при которой жизнеспособность клеток ингибировалась на 50%). CellTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках.
У применяемого в качестве референс-контроля МАт фирмы R &D-Systems 3291 не обнаружена способность ингибировать пролиферацию несущих 5 мутантный CSF-1R рекомбинантных клеток.
В другом эксперименте изучали антитело к CSF-1R, предлагаемое в изобретении, такое как ЬМАт 2F11-е7, и антитела к CSF-1R 1,2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303), CXIIG6 (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/112245), козье 10 поликлональное антитело к CSF-1R ab 10676 (фирма Abeam) и SC 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США, см. также Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс. 1786-1793).
Сфероидные культуры инкубировали в течение 3 дней в присутствии антитела в различных концентрациях для определения величин IC30 15 (концентрация, при которой жизнеспособность клеток ингибировалась на 30%). Максимальная концентрация составляла 20 мкг/мл. CellTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках.
Пример 6
Ингибирование роста опухолевых клеток линии BeWo в ЗР-культуре путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ')
Клетки хориокарциномы линии BeWo (АТСС CCL-98) культивировали в 5 среде F12K (фирма Sigma, Штайнхайм, Германия), дополненной 10% FBS (фирма Sigma) и 2мМ L-глутамином. Высевали по 5x104 клеток/лунку в 96-луночные, сенсибилизированные поли-НЕМА (поли(2-гидроксиэтилметакрилат)) планшеты, которые содержали среду F12K, дополненную 0,5% FBS и 5% БСА. Затем добавляли в концентрации 200 нг/мл huCSF-1 (активный состоящий из 149
10 ак фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33-181 SEQ ID NO: 86)) и в концентрации 10 мкг/мл различные моноклональные антитела к CSF-1R и инкубировали в течение 6 дней. CellTiterGlo-анализ применяли для оценки жизнеспособности путем измерения содержания АТФ в клетках, которое выражали в относительных световых единицах (RLU). При обработке имеющих форму
15 сфероидов культур BeWo различными антителами к CSF-1R (10 мкг/мл), было обнаружено ингибирование индуцируемого CSF-1 роста. Для оценки опосредуемого антителом ингибирования среднее значение RLU для нестимулированных BeWo-клеток вычитали из значений, полученных для всех образцов. Средние значения RLU клеток, стимулированных CSF-1, принимали за
20 100%. Средние значения RLU клеток, стимулированных CSF-1 и обработанных антителами к CSF-1R, рассчитывали в виде % по отношению к RLU, полученным при стимуляции CSF-1. В таблице 6 представлены расчетные данные ингибирования роста опухолевых клеток линии BeWo в ЗБ-культуре после обработки моноклональными антителами к CSF-1R; на фиг. 1а и 16
25 представлены стандартизованные средние значения RLU.
Пример 7
Ингибирование дифференцировки человеческих макрофагов путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)
Человеческие моноциты выделяли из периферической крови с помощью 5 обогащенного коктейля человеческих моноцитов RosetteSep(tm) (фирма StemCell Tech., кат. № 15028). Обогащенные популяции моноцитов высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты (2,5> <104 клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, кат. № 31870), дополненной 10% FCS (фирма GIBCO, кат. № 011-090014М), 4мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. № 25030) и
10 1 xPenStrep (фирма Roche, кат. № 1 074 440), при 37°С и 5% СО2 в увлажненной атмосфере. При добавлении в среду huCSF-1 в концентрации 150 нг/мл удалось обнаружить выраженную дифференцировку с превращением в прикрепленные макрофаги. Эту дифференцировку удалось ингибировать, добавляя антитела к CSF-1R. Кроме того, было обнаружено воздействие на выживание моноцитов,
15 которое можно анализировать с помощью CellTiterGlo (СТО)-анализа. На основе зависящего от концентрации ингибирования выживания моноцитов при обработке антителами рассчитывали величины IC50 (см. таблицу 7).
20 При исследовании различных гуманизированных версий МАт 2 Fl 1,
например, IIMAT 2F11-cl 1, hMAT 2F1 l-d8, IIMAT 2F11-е7, ЬМАт 2F11-П2, для
них установлены величины IC50, составляющие 0,07 мкг/мл (ЬМАт 2F11 -с 11),
0,07 мкг/мл (hMAT 2F1 l-d8), 0,04 мкг/мл (ЬМАт 2F11-е7) и 0,09 мкг/мл (ЬМАт
2Fll-fl2).
25 Пример 8
Ингибирование дифференцировки макрофагов обезьян циномолгус путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)
Моноциты обезьян циномолгус выделяли из периферической крови с помощью набора для приматов кроме человека, включающего CD 1430 микрогранулы (фирма Miltenyi Biotec, кат. № 130-091-097), согласно описанию
производителя. Обогащенные популяции моноцитов высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты (1-3x104 клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, кат. № 31870), дополненной 10% FCS (фирма GIBCO, кат. № 011-090014М), 4мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. № 25030) и 1 * PenStrep 5 (фирма Roche, кат. № 1 074 440), при 37°С и 5% СОг в увлаженной атмосфере. После добавления в среду huCSF-1 в концентрации 150 нг/мл удалось обнаружить выраженную дифференцировку в прикрепленные макрофаги. Эту дифференцировку удалось ингибировать, добавляя антитела к CSF-1R. Кроме того, было обнаружено воздействие на выживание моноцитов, которое можно 10 анализировать с помощью CellTiterGlo (СТО)-анализа. Жизнеспособность
определяли при обработке антителом в концентрации 5 мкг/мл (см. таблицу 8).
* среднее значение по 4 экспериментам (3 эксперимента с использованием мышиного, 1 15 эксперимент с использованием химерного МАт)
** среднее значение по 2 экспериментам с использованием только мышиного МАт Пример 9
Ингибирование дифференцировки человеческих макрофагов Ml и М2 путем обработки моноклональными антителами к CSF-1R (CellTiterGlo-анализ)
20 Человеческие моноциты выделяли из периферической крови с помощью
обогащенного коктейля человеческих моноцитов RosetteSep(tm) (фирма StemCell Tech., кат. № 15028). Обогащенные популяции моноцитов высевали в 96-луночные титрационные микропланшеты (2,5x104 клеток/лунку) в 100 мкл среды RPMI 1640 (фирма Gibco, кат. № 31870), дополненной 10% FCS (фирма GIBCO,
25 кат. № 011-090014М), 4мМ L-глутамином (фирма GIBCO, кат. № 25030) и
1 xPenStrep (фирма Roche, кат. № 1 074 440), при 37°С и 5% СО2 в увлаженной атмосфере. После добавления в среду huCSF-1 в концентрации 100 нг/мл в течение 6 дней удалось обнаружить выраженную дифференцировку с превращением в прикрепленные М2-макрофаги, морфологический особенностью
которых являлась удлиненная форма. После добавления в среду huCSF-1 в концентрации 100 нг/мл в течение 6 дней удалось обнаружить выраженную дифференцировку с превращением в прикрепленные Ml-макрофаги, морфологический особенностью которых являлась округлая форма. Указанная 5 дифференцировка ассоциировалась с экспрессией определенных маркеров, таких как CD 163 для М2-макрофагов и CD80 или высокой уровень молекул ГКГС класса II для Ml-макрофагов, по данным проточной цитометрии. Клетки отмывали ЗФР и, если они находились в прикрепленном состоянии, отделяли, используя 5мМ раствор ЭДТК в ЗФР (20 мин при 37°С). Затем клетки
10 ресуспендировали, отмывали буфером для окрашивания (5% FCS в ЗФР) и
центрифугировали при 300xg в течение 5 мин. Дебрис реуспенировали в 1 мл буфера для окрашивания и подсчитывали количество клеток с помощью камеры Neubauer. Примерно по 1*Ю5 клеток переносили в каждую FACS-пробирку, центрифугировали при 300xg в течение 5 мин и ресуспендировали в буфере для
15 окрашивания. Fcy-рецепторы блокировали путем инкубации с 1 мкг
человеческого IgG/2,5xl04 клеток (фирма JIR, каталожный № 009-000-003) в буфере для окрашивания в течение 20 мин на льду. Затем клетки смешивали с 1,5 мкл антитела/2,5 xl О4 клеток для обнаружения CD80 и CD 163, а для обнаружения молекул ГКГС класса II применяли 5 мкл антитела/2,5 xl О4 клеток:
20 а именно, меченное с помощью РЕ мышиное антитело к человеческому CD 163 (фирма BD Bioscience, каталожный № 556018), меченное с помощью РЕ мышиное антитело к человеческому CD80 (фирма BD Bioscience, каталожный № 557227) и меченное Alexa 647 мышиное антитело к молекулам ГКГС класса II (фирма Dako, каталожный № М0775). Метку Alexa 647 конъюгировали с
25 антителом, используя набор Zenon для мечения Alexa 647 мышиных IgG (фирма Invitrogen, каталожный №. Z25008) После инкубации в течение 1 ч на льду клетки отмывали дважды буфером для окрашивания, ресуспендировали и оценивали с помощью устройства FACS Canto П.
После добавления гуманизированного антитела к CSF-1R ЬМАт 2F11-е7
30 удалось обнаружить ингибировать дифференцировку М2-макрофагов,
отличающихся экспрессией CD 163, отсутствием CD80 и низким уровнем экспрессии молекул ГКГС класса И. Кроме того, обнаружено воздействие на выживание М2-, но не Ml-макрофагов по данным CellTiterGlo (СТО)-анализа.
Данные о зависящем от концентрации ингибировании макрофагов после обработки в течение 7 дней антителом представлены на фиг. 5а. Данные о экспрессии маркеров Ml - и М2-макрофагов, которую оценивали с помощью проточной цитометрии, представлены на фиг. 56. Пример 10
Оценка аффинности связывания антител к CSF-1R с человеческим CSF-1R
Устройство: чип:
сочетание: буфер:
BIACORE(r) А100,
СМ5 (Biacore BR-1006-68),
аминное сочетание,
ЗФР (Biacore BR-1006-72), рН 7,4, 35°С.
Для оценки аффинности 36 мкг/мл антител к мышиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR115-005-071) связывали с поверхностью чипа для иммобилизации антител к CSF-1R. Внеклеточный домен человеческого CSF-1R (CSF-1R-ECD) (который содержит внеклеточные субдомены Dl -D5) (SEQ ID NO: 64) (фирма R &D-Systems, 329-MR или субклонированную плазмиду pCMV-presS-HisAvitag-hCSF-lR-ECD) добавляли в раствор в различных концентрациях. Ассоциацию измеряли путем инъекции CSF-1R в течение 1,5 мин при 35°С; диссоциацию измеряли путем отмывки поверхности чипа с помощью буфера в течение 10 мин при 35°С. Для расчета кинетических параметров применяли модель связывания 1:1 Лэнгмюра.
Таблица 9: Данные об аффинности, оцененные с помощью SPR
МАт к CSF-1R
KD (нМ)
ка(1/Мс)
kd(l/c)
ti/2 (МИН)
МАт 2F11
0,29
1,77Е+05
5,18Е'05
223
МАт2Е10
0,2
1,52Е+05
2,97Е"05
389
МАт 2Н7
0,21
1,47Е+05
3,12Е"05
370
МАт 1G10
0,36
1,75Е+05
6,28Е"05
184
В другом анализе связывания, который осуществляли с помощью устройства Biacore с использованием CSF-1R ECD (данные не представлены), обнаружена определенная конкуренция антител МАт 2F11 и МАт 2Е10 с антителом (AT) SC-2-4A5. Однако МАт 2F11/MAT 2Е10 не связывались с фрагментом человеческого CSF-1R delD4, в то время как AT SC-2-4A5 связывалось с указанным ёеЮ4-фрагментом (см. пример 4 и фиг. 2а). Таким образом, очевидно, что область связывания МАт 2F11/МАт 2Е10 отличается от области связывания AT SC-2-4A5, но, вероятно, локализована вблизи нее. При
осуществлении указанного анализа в условиях конкуренции установлено, что оба антитела МАт 2F11 и МАт 2Е10 не конкурировали с МАт 3291 фирмы R &D-Systems (данные не представлены). Пример 11
Оценка связывания антител к CSF-1R с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3
устройство: Biacore Т100 (фирма GE Healthcare),
программа: Т100 Control, версия 1.1.11, В3000 Evaluation, версия 4.01, Scrubber, версия 2.0а
формат анализа: чип СМ5
Антитела к CSF-1R "захватывали" с помощью молекул, иммобилизованных путем аминного сочетания. Используя один цикл кинетических исследований, инъецировали фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 (SEQ ID NO: 66) в пяти возрастающих концентрациях. Фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 субклонировали в экспрессионном векторе pCMV-presS-HisAvitag.
Антитело к CSF-1R SC 2-4А5 (фирма Santa Cruz Biotechnology, США; Sherr C.J. и др., Blood, 73, 1989, сс. 1786-1793), которое ингибирует взаимодействие лиганд-рецептор, и МАт 3291 (фирма R &D-Systems) использовали в качестве референс-контролей.
Молекулы для иммобилизации: антитела к мышиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR115-005-071) для антител, предлагаемых в изобретении, и контрольное антитело фирмы R &D-Systems МАт 3291 и антитела к крысиному Fey (козьи, фирма Jackson Immuno Reasearch, JIR112-005-071) для антител, применяемых в качестве референс-контролей и для антитела к CSF-1R SC 2-4А5.
Аминное сочетание для иммобилизации молекул Использовали стандартные условия аминного сочетания согласно инструкциям производителя: подвижный буфер: буфер HBS-N, активация с помощью смеси EDC/NHS, требуемая плотность лиганда 2000 RU; предназначенные для иммобилизации Ат разводили в буфере для сочетания, таком как NaAc, рН 4,5, с - 10 мкг/мл; оставшиеся в конце активированные карбоксильные группы блокировали инъекцией 1М этаноламина.
Кинетические характеристики связывания фрагментов человеческого CSF-1R D1-D3 с МАт при 37°С
Подвижный буфер: ЗФР (Biacore BR-1006-72)
Иммобилизация МАт на проточных ячейках 2-4: скорость потока 5 20 мкл/мин, продолжительность контакта 90 с, концентрация (AT ) составляла 50нМ, разведение с помощью подвижного буфера + 1 мг/мл БСА. Анализируемый образец:
Измерение кинетических характеристик в одном цикле проводили при скорости потока 30 мкл/мин, осуществляя пять последовательных инъекций 10 анализируемого вещества в концентрациях (с), составляющих 7,8, 31,25, 125, 500 и 2000нМ, без регенерации. Продолжительность каждой инъекции составляла 30 с, за ней следовала фаза диссоциации продолжительностью 120 с для первых четырех инъекций и 1200 с для наиболее высокой концентрации (последняя инъекция).
15 Конечную регенерацию осуществляли после каждого цикла, используя
ЮмМ глицин, рН 1,5 (Biacore, BR-1003-54), продолжительность контакта 60 с, скорость потока 30 мкл/мин.
Кинетические параметры рассчитывали с использованием общепринятых двух референс-стандартов (референс-контроль: связывание анализируемого
20 вещества с предназначенной для иммобилизации молекулой; проточная ячейка: субдомен CSF-1R, концентрация "0" в качестве "пустого" контроля) и расчет с помощью модели "кинетика титрования при связывании 1:1с выделением".
Таблица 10: Данные об аффинности связывания фрагмента CSF-1R D1-D3, оцененные с помощью SPR
MATKCSF-1R
Субдомен
KD (нМ)
ка(1/Мс)
kd(l/c)
tj/2 (МИН)
МАт 2F11
D1-D3
отсутствие связывания
МАт2Е10
D1-D3
отсутствие связывания
МАт 2Н7
D1-D3
отсутствие связывания
МАт 1G10
D1-D3
отсутствие связывания
SC-2-4A5
D1-D3
отсутствие связывания
3291 фирмы R &D-Systems
D1-D3
5,4
2,2Е+5
1,2Е"3
9,6
Установлено, что у антител МАт 2F11, МАт 2Е10 и МАт 1G10 отсутствует связывание с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3.
Кроме того, применяемое в качестве референс-контроля AT SC-2-4A5 не связывалось с фрагментом человеческого CSF-1R D1-D3.
У применяемого в качестве референс-контроля МАт 3291 фирмы R &D-Systems обнаружена способность связываться с фрагментом человеческого CSF-1RD1-D3.
Пример 12
5 Повышение уровня CSF-1 в процессе ингибирования CSF-1R у обезьян
циномолгус
Уровни сывороточного CSF-1 являются фармакодинамическим маркером нейтрализующей активности в отношении CSF-1R антитела ЬМАт 2F11-е7, которое представляет собой ингибитор димеризации человеческого CSF-1R. В
10 каждой обрабатываемой группе (1 и 10 мг/кг) одному самцу и одной самке обезьян циномолгус вводили внутривенно антитело к CSF-1R ЬМАт 2F11-е7. Для анализа уровней CSF-1 отбирали образцы крови за 1 неделю до обработки (перед дозированием), через 2, 24, 48, 72, 96, 168 ч после дозирования и еженедельно в течение еще двух недель. Для оценки уровней CSF-1
15 использовали поступающий в продажу набор для ELISA (Quantikine(r) для человеческого M-CSF) согласно инструкциям производителя (фирма R &D Systems, Великобритания). Уровни CSF-1 в крови обезьян определяли путем сравнения с применяемыми для построения стандартной кривой образцами CSF-1, входящими в набор.
20 Введение ЬМАт 2F11-е7 приводило к резкому повышению уровня CSF-1 ~ в
1000 раз, которое в зависимости от вводимой дозы сохранялось в течение 48 ч (1 мг/кг) или 15 дней (10 мг/кг). Таким образом, ингибитор димеризации CSF-1R обладает преимуществом, заключающимся в отсутствии непосредственной конкуренции с лигандом за связывание с рецептором, и для него характерна
25 резкая повышающая регуляция, по сравнению с лигандзамещающим антителом. Пример 13
Эффективность in vivo - ингибирование роста опухолей антителами к CSF-
1R у SCID-мышей, несущих ксенотрансплантат опухолевых клеток рака
молочной железы линии ВТ20
30 Линия клеток человеческого рака молочной железы ВТ-20 экспрессирует
человеческий CSF-1R, но не экспрессирует CSF-1 (Sapi Е. и др., Cancer Res, 59, 1999, сс. 5578-5585). Поскольку мышиный CSF-1 не обладает способностью активировать человеческий CSF-1R на опухолевых клетках, мышам вводили
рекомбинантный человеческий CSF-1 (активный состоящий из 149 ак фрагмент человеческого CSF-1 (ак 33-181 SEQ ID NO: 86) (фирма Biomol, Гамбург, Германия) с помощью осмотических мининаносов (фирма ALZET, Купертино, шт. Калифорния), которые обеспечивали скорость постоянной инфузии CSF-1, 5 составляющую 2 мкг/день (Martin Т.A., Carcinogenesis, 24, 2003, сс. 1317-1323).
Для непосредственного сравнения эффективности антител, оказывающих воздействие на димеризацию CSF-1R, при создании изобретении наряду с лигандзамещающим антителом к CSF-1R исследовали на модели, созданной с использованием ксенотрансплантата ВТ-20, химерное антитело к CSF-1R МАт
10 2F11 (антитело, оказывающее воздействие на димеризацию CSF-1R) и антитело 1.2.SM (лигандзамещающее антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303).
SCID-мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров (фирма Charles River, Сульцфельд, Германия) подкожно совместно инъецировали 1хЮ7 клеток линии ВТ-20 (АТСС НТВ-19) и 100 мкл матригеля.
15 Обработку животных начинали в день произвольного разделения на группы,
когда средний объем опухолей достигал 100 мм3. Мышей обрабатывали один раз в неделю i.p. соответствующими антителами (см. фиг. 4) в буфере, содержащем 20мМ гистидин, 140мМ NaCl, рН 6,0. Размеры опухолей определяли с помощью кронциркуля, начиная с дня определения стадии, и затем дважды в неделю в
20 течение всего периода обработки. Объем опухолей рассчитывали согласно протоколу NCI (Национальный онкологический институт) (масса опухоли = 1/2аб , где "а" и "б" представляют собой длинный и короткий диаметры опухоли соответственно).
Данные анализа роста опухолей представлены на фиг. 4. Ингибирование 25 человеческого CSF-1R на опухолевых клетках химерным антителом к CSF-1R МАт 2F11 оказалось статистически более эффективным в отношении опосредуемого ингибирования роста опухолей, чем эффективность антитела к CSF-1R 1.2.SM (антитело к CSF-1R, описанное в WO 2009/026303).
В другом эксперименте обработку доцетакселом (Taxotere(r), фирма Sanofi 30 Aventis, Великобритания) в дозе 3 мг/кг i.v. объединяли с обработкой антителом к мышиному CSF-1R (30 мг/кг i.p/еженедельно). Доцетаксел вводили трижды в неделю в виде одного цикла с последующей 3-недельной отменой лекарственного средства. Применение монотерапии антителом после двух
циклов лечения доцетакселом ингибировало рост первичной опухоли (TGI: 83%, npTCR: 0,5, CI: 0,1-1,8) сопоставимо с группой, обработанной доцетакселом в дозе 3 мг/кг (TGI: 75%, npTCR: 0,55, CI: 0,2-1,5). Комбинация доцетаксела и антитела к CSF-1R обеспечивала более высокую эффективность по сравнению с 5 монотерапиями (TGI: 94%, npTCR:0,3, CI: 0,1-0,8). В более поздний момент времени различия в TGI между группами, обработанными комбинацией и подвергающимися монотерапиям, оказались менее выраженными в результате сильного ингибирования, вызванного монотерапией. Тем не менее анализ медианного времени выживания (медиана ожидаемого времени жизни) 10 подтвердил более высокую эффективность комбинации (антитело: 159 дней, доцетаксел: 154 дня, комбинация: 180 дней). Пример 14
Комбинированное лечение антителом к CSF-1R, которое связывается с доменами D4-D5 внеклеточного домена человеческого CSF-1R. и паклитакселом
15 2.1 Первичные цели
Стадия I (плечо А: гуманизированная версия антитела к CSF-1R МАт 2F11 (ЬМАт 2F11-е7) в виде индивидуального агента [SA], возрастание дозы; плечо Б: гуманизированное антитело к CSF-1R МАт 2F11 (ЬМАт 2F11-е7), возрастание дозы в комбинации [CD] с фиксированной дозой паклитаксела):
20 • Оценка безопасности, переносимости и ФК гуманизированной версии МАт 2F11 при введении индивидуально и в комбинации с паклитакселом. • Определение максимальной переносимой дозы (MTD) и/или оптимальной биологической дозы (OBD) гуманизированного МАт 2F11 при введении индивидуально (MTD1/OBD1) и в сочетании с паклитакселом (MTD2/OBD2) на
25 основе оценки ограничивающей дозу токсичности (DLT).
Стадия II (расширенные группы/только гуманизированное МАт 2F11 индивидуально): Расширенная оценка безопасности и исследование активности в клинических условиях гуманизированного МАт 2F11 на пациентов с опухолями, представляющими наибольший интерес по данным, полученным на стадии I
30 опыта, которые все не поддавались стандартному лечению.
2.2 Вторичные цели
Стадия I (возрастание дозы /плечо А+Б)
• Изучение ФК- и ФД-воздействий гуманизированного МАт 2F11 при его применении индивидуально и в комбинации с паклитакселом в отношении
5 опухолевой и суррогатной ткани.
• Изучение ФД-воздействия и воздействия на биомаркеры гуманизированного МАт 2F11 при его применении индивидуально и в комбинации с паклитакселом, оцененные по изменению при изучении с помощью позитронно-эмиссионной томографии с использованием меченной 18F
10 фтордезоксиглюкозы (FDG-PET) и динамического контрастно-усиленного ультразвукового исследования (DCE-US) (если они доступны).
• Определение рекомендованной для фазы 2 дозы (RP2D) и режимы применения гуманизированного антитела к CSF-1R МАт 2F11 индивидуально и в комбинации с паклитакселом.
15 • Исследование предварительной клинической активности
гуманизированного МАт 2F11 индивидуально и в комбинации с паклитакселом с использованием шкалы объективной оценки (ORR), шкалы клинической эффективности (CBR), беспрогрессивной выживаемости (PFS), продолжительности ответа.
20 Стадия II (расширенные группы/только плечо А)
• Дополнительная характеризация ФК- и ФД-воздействий гуманизированного МАт 2F11 в отношении опухолевой и суррогатной ткани.
2.3 Цели исследования
Объединенные группы пациентов должны быть проанализированы в 25 отношении:
• ретроспективная идентификация ТАМ-зависимых опухолей,
• исследование прогностических маркеров возможного ответа в суррогатных тканях типа кожи и крови,
• изучение взаимосвязи биомаркеров с эффективностью и/или
30 нежелательных явлений (НЯ), ассоциированных с медицинскими средствами; и/или
• разработка биомаркеров или диагностических анализов.
3. План опыта
3.1 Краткое изложение плана опыта
Исследование представляло собой открытую, проводимую в нескольких центрах фазу Ia/b с использованием возрастающих доз, созданное для оценки 5 безопасности, переносимости, ФК и ФД при введении каждые две недели (Q2W) i.v. гуманизированного MAT 2F11. Гуманизированное МАт 2F11 вводили индивидуально пациентам с плотными опухолями (которые не поддавались стандартному лечению), и в комбинации с паклитакселом при локальной запущенной и/или метастатической карциноме, которая не поддавалась 10 стандартному лечению.
Стадия I - возрастание дозы
У всех пациентов, включенных в группу по оценке возрастания дозы, следует оценивать DLT в течение периода оценки DLT, составляющего 28 дней после первого введения гуманизированного МАт 2F11 в цикле 1. Пациенты, 15 которые прерывали испытание по любой причине, не связанной с DLT, в период оценки DLT, должны быть заменены.
Путь введения гуманизированного МАт 2F11 при его применении в виде монотерапии.
Гуманизированное МАт 2F11 следует вводить Q2W в виде i.v.-инфузии в
20 течение 1,5 ч, если только у пациента не обнаружена связанная с инфузией
реакция (IRR), в случае которой требовалась более медленная инфузия или
временное прекращение инфузии. Лечение следует продолжать вплоть до
развития болезни, проявления нежелательной токсичности, смерти пациента или
отказа пациента при праве первого выбора.
25 Путь введения комбинации, включающей гуманизированное МАт 2F11 и
паклитаксел (стадия I, только плечо Б).
Гуманизированное МАт 2F11 следует вводить каждые Q2W в виде i.v.-инфузии в течение 1,5 ч, если только у пациента не обнаружена (IRR), в случае которой требовалась более медленная инфузия или временное прекращение 30 инфузии. Лечение следует продолжать вплоть до развития болезни, проявления нежелательной токсичности, смерти пациента или отказа пациента при праве первого выбора.
Паклитаксел в дозе 80 мг/м следует вводить QW в течение вплоть до 12 недель в комбинации с гуманизированным МАт 2F11. Инфузию паклитаксела следует начинать сразу же после окончания инфузии гуманизированного МАт 2F11 и ее следует применять согласно местному предписанию. Если у пациента 5 обнаружены проявления токсичности, непосредственно связанной с
паклитакселом, то его/ее лечение паклитакселом можно прекращать, но продолжать лечение гуманизированным МАт 2F11.
Стадия I опыта по определению MTD1/OBD1 и MTD2/OBD2
Первые 28 дней после первого введения гуманизированного МАт 2F11 в 10 цикле 1 следует рассматривать как интервал лечения, во время которого определяют DLT для оценки MTD1 и MTD2.
MTD определяют как наиболее высокий(ие) уровень(и) доз, при котором(ых) у не более чем 1 пациента из 6 выявлена DLT.
Данные о безопасности и любые доступные данные ФК/ФД следует 15 объединять на постоянной основе и рассматривать их перед каждым решении об увеличении доз для следующей группы.
3.1.1-3.1.3 Принцип разработки плана опыта
Проведенный при создании настоящего изобретения скрининг образцов биопсии опухолей различных пациентов с различными злокачественными
20 заболеваниями продемонстрировал значительную гетерогенность в плотности инфильтрующих макрофагов и совпадающей с этим экспрессии CSF-1R (см. раздел неклинической фармакологии IB). Опосредованное мишенью распределение лекарственного средства (target-mediated drug disposition, (TMDD)), т.е. распределение и элиминация посредством связывания с
25 фармакологической мишенью, также четко продемонстрировано на обезьянах и как на несущих, так и на не несущих опухоли мышах. Поскольку на фармакокинетические характеристики гуманизированного МАт 2F11 влияет его связывание с мишенью, то количественную оценку нелинейной ФК можно применять в качестве биомаркера для аппроксимации насыщения мишени. Для
30 того, чтобы характеризовать, в какой степени исходные демографические
факторы пациента (включая массу опухоли и плотность ТАМ) могут влиять на нелинейную фармакокинетику гуманизированного МАт 2F11, уровень в крови следует измерять в течение нескольких первых дней после введения одной
низкой (100 мг) "обкатываемой" ("пробной") дозы (цикл 0) у всех пациентов из группы 2, продолжающих участие в опыте (т.е. за 1 неделю до того, как применяемая для них в цикле 1 доза будет составлять по меньшей мере 200 мг или выше). При указанной низкой дозе ожидается наличие нелинейной ФК, и это 5 может позволять количественно оценивать TMDD у страдающих раком
пациентов. Величина "пробной" дозы должна быть такой, чтобы она позволяла понять, могут ли на расширенной фазе опыта (или в будущих исследованиях) другие дозы быть более эффективными при применении в различных расширенных "плечах" (т.е. при других злокачественных состояниях), с учетом
10 демографических и исходных факторов пациента (включая тип опухоли и
воспалительный статус). Поскольку продемонстрировано, что блокада CSF-1R приводит к избирательному ингибированию ТАМ, что является потенциальным путем предупреждения или реверсии случаев опосредуемой ТАМ хеморезистентности [10], была начата одновременная оценка гуманизированного
15 МАт 2F11, применяемого в комбинации с паклитакселом. Паклитаксел был
выбран в качестве обычно предписываемой химиотерапии для указанной группы пациентов, и, как предполагается, он не должен продуцировать выраженную перекрывающуюся токсичность, поскольку наиболее распространенная токсичность, известная для паклитаксела (миелосупрессия, нейротоксичность и
20 артраглия или миаглия), не обнаружена в опытах по оценке токсичности
фиксированной дозы паклитаксела, которую вводили QW в течение периода времени вплоть до 12 недель, подлежащей исследованию в комбинации с возрастающими дозами гуманизированного МАт 2F11 на пациентах с запущенным раком молочной железы или яичника. В современных
25 исследованиях установлено, что у пациентов с PVNS и TGCT обнаружена сверхэкспрессия CSF-1 и у части из них это обусловлено транслокацией, затрагивающей в 30-60% случаев ген CSF-1R. Кроме того, продемонстрировано, что присутствие CSF-lR-позитивных макрофагов при некоторых других типах человеческого рака (таких как карцинома яичника и молочной железы)
30 коррелирует не только с повышенной плотностью сосудов, но также с плохим клиническим исходом. При раке молочной железы присутствие генной сигнатуры ответа на CSF-1 является прогностическим признаком риска рецидива и метастазов. На основе указанных данных и данных, полученных при создании
изобретения на доклинических моделях, представляется разумным оценить гипотезу о том, что блокада ассоциированных с опухолью макрофагов и их про-опухолевой биоактивности с помощью гуманизированного МАт 2F11 при его применении индивидуально или в сочетании с паклитакселом может обладать 5 клинической активностью на пациентах с некоторыми типами солидных опухолей.
В настоящем исследовании отбирали значительное количество образцов крови для оценки ФК- и ФД-параметров, а также обязательно исследовали свежую опухолевую ткань и архивную опухолевую ткань из коллекции. Это 10 является важным для полного понимания ФК-особенносгей, механизма действия и возможности получения прогностических биомаркеров ответа.
3.1.4 Принцип оценки биомаркеров
Биомаркеры можно применять для воплощения диагностических стратегий и влияния на процесс лечения. В будущем биомаркеры могут позволять
15 совершенствовать персонализированный медицинский подход, например, обеспечивать группировку пациентов на основе молекулярных сигнатур их опухолей и маркеров в крови, а не по типу рака. При создании изобретения усилия были сконцентрированы на идентификации прогностических биомаркеров, которые дают информацию о вероятности эффективности и
20 безопасности терапии.
Для оценки ФД и механистического(их) действия(ий) лекарственного средства на опухоль часто требуется биопсия опухоли.
3.1.4.1 Принципы получения свежих биопсий опухоли до и в процессе лечения для клинического тестирования
25 Инфильтрация и дифференцировка ТАМ зависит от соответствующего
микроокружения опухоли в первичных и метастатических повреждениях. Кроме того, соответствующий иммунный статус и предварительное лечение пациента могут оказывать влияние на микроокружение опухоли пациента. Таким образом, всех пациентов следует обязательно подвергать биопсии до начала лечения для
30 определения инфильтрации ТАМ и уровней экспрессии CSF-1R на исходном
уроне, но не применять ее для определения возможности включения пациента в испытания. Кроме того, требуется получать биопсии в процессе лечения, что должно позволять оценивать ФД-активность гуманизированного МАт 2F11
путем сравнения уровней до и после дозирования. Аспирационная биопсия тонкой иглой (FNA) не может заменять биопсии опухоли, поскольку распределение субпопуляций макрофагов необходимо оценивать в ткани.
Оценка архивных тканей не может заменять свежие биопсии, поскольку 5 инфильтрация и дифференцировка макрофагов зависят от микроокружения. Микроокружение опухоли может варьироваться в первичной опухоли из-за предварительного лечения пациента, а также изменяться в метастатических повреждениях. Однако, если архивная ткань доступна, то образцы следует использовать для исследования ретроспективной корреляции с данными,
10 полученными при анализе свежих биопсий.
3.1.4.2 Принципы осуществления биопсий поврежденной кожи Для различных фаз заживления ран требуется несколько процессов (например, рекрутмент нейтрофилов, инфильтрация макрофагов, ангиогенез (Eming S.A. и др., Prog. Histochem. Cytochem. 42, 2007, сс. 115-170)). Анализы
15 заживления кожи применяли для получения суррогатной ткани для определения ФД-маркеров, например, при антиангиогенных терапиях (Zhang D. и др., Invest. New Drugs 25, 2006, сс. 49-55; Lockhart А.С. и др., Clin. Cancer Res. 9, 2003, сс. 586-593). В процессе заживления ран макрофаги играют важную роль и фенотипические изменения ассоциированных с раной макрофагов (WAM)
20 связаны с различной их ролью на фазах заживления кожи (например, ранняя фаза воспаления, ассоциированная с интенсивной фагоцитарной активностью; средняя фаза ремоделирования ткани соответствует иммунорегуляторному состоянию со сверхэкспрессией проангиогенных факторов) (Adamson R., Journal of Wound Care 18, 2009, cc. 349-351; Rodero M.P. и др., Int. J. Clin. Exp. Pathol.
25 25, 2010, cc. 643-653; Brancato S.K. и Albina J.E., Wound Macrophages as Key Regulators of Repair, Origin, Phenotype, and Function, AJP, т. 178, № 1, 2011).
Фактически, отсутствие макрофагов приводит к замедлению заживления раны у созданных с помощью генной инженерии мышей (Rodero M.P. и др., Int. J. Clin. Exp. Pathol. 25, 2010, cc. 643-653). В доклинических экспериментах на
30 мышиной модели, созданной с помощью ксенотрансплантации MDA-MB231 продемонстрировано выраженное снижение содержания (Р4/80-позитивных) макрофагов в коже обработанной CSF-1R. Однако описаны видоспецифические
различия между мышами и людьми (Daley J.M. и др., J. Leukoc. Biol. 87, 2009, сс. 1-9).
Поскольку WAM и ТАМ имеют происхождение из одинаковых клеток-предшественников и характеризуются сходными функциями и фенотипами, то 5 можно применять серийные, полученные до лечения и в процессе лечения (в целом п=4) кожные биопсии, для анализа фармакодинамических воздействий обработки гуманизированным МАт 2F11 на WAM в процессе заживления раны. Корреляция данных, полученных с использованием кожи, с ФД-действиями при лечении гуманизированным МАт 2F11 на ТАМ в свежих биопсиях опухоли 10 может в значительной степени увеличить знание о молекулярной основе работы гуманизированного МАт 2F11 и ответа опухоли на обработку антителом.
Кроме того, оценка поврежденной кожной ткани потенциально может заменять в более поздних исследованиях биопсии опухоли в процессе лечения и следовательно может служить в качестве суррогатной ткани для оценки 15 эффективности гуманизированного МАт 2F11.
3.1.4.3 Принципы оценки образцов цельной крови для измерения ФД-маркеров
Указанные образцы суррогатной ткани можно применять для исследовательских целей для идентификации биомаркеров, которые являются
20 прогностическими в отношении ответа на лечение гуманизированным МАт 2F11 (в таких понятиях, как доза, безопасность и переносимость), и должны способствовать лучшему пониманию патогенеза, процесса и исхода рака и родственных заболеваний. Анализ может включать определение циркулирующих маркеров, ассоциированных с ФД-активностью гуманизированного МАт 2F11
25 (например, оценку уровней цитокинов, циркулирующих иммунных клеток и истощение иммунных эффекторных клеток). В доклинических экспериментах установлено, что изменения, например, циркулирующего CSF-1, субпопуляций Т11АР5Ь-моноцитов и тканевых макрофагов ассоциированы с активностью лекарственного средства. Кроме того, данные GLP-Tox, полученные на
30 обработанных гуманизированным МАт 2F11 обезьянах циномолгус, продемонстрировали изменения биомаркеров формирования кости (остеокальцин, P1NP), активности остеокластов (TRAP5b) и гормона
паращитовидной железы, которые все коррелировали с пониженным количеством остеокластов.
Таким образом, в процессе исследования следует оценивать эти изученные маркеры и дополнительные циркулирующие иммуностимулирующие или иммуноингибирующие факторы.
Критерии ответа опухоли
Ответ опухоли следует оценивать согласно критериям RECIST 1.1. (критерии оценки ответа солидных опухолей). В этом исследовании ответ опухоли следует оценивать с помощью сканированных изображений (сканов), полученных с помощью спиральной КТ (включая торакальные сканы), или КТ-"сканов". Рентгенограммы и ультразвуковые исследования не подходят для мониторинга повреждений мишени. Для каждого индивидуума необходимо применять один и тот же метод исследования и одну и ту же технику для изучения каждого повреждения в течение всего эксперимента. Если применяют более одного метода, то должен быть выбран наиболее аккуратный метод согласно RECIST, для сбора данных.
Ответ опухоли следует подтверждать минимум через 4 недели после начального обнаружения ответа или при следующей запланированной оценке опухоли, если она должна быть осуществлена более чем через 4 недели после начального ответа.
Оценку кинетики роста опухоли следует осуществлять путем сравнения "сканов", полученных после лечения, с последним доступным "сканом", полученным до лечения, если он имеется в распоряжении.
Оценка фармакокинетики (ФКУфармакодинамики (ФД)
Образцы крови собирали для оценки фармакокинетики (ФК) и/или ФД как описано в представленной ниже таблице. Общий объем крови, отобранной для ФК-оценок до конца цикла 4, должен составлять примерно 58 мл для стадии I, плечо А и стадии II и примерно 86 мл для стадии I, плечо Б. На каждом последующем цикле у каждой группы обработки следует собирать еще 6 мл крови для ФК-оценок. Общий объем взятой крови для ФД-оценок к концу цикла 4 (8 недель после обработки), должен составлять примерно 161 мл. На каждом последующем цикле следует собирать еще образцы крови объемом 9 мл (1x5 мл,
1 х2 мл и 2x1 мл; см. более подробно в таблице 2) для ФД-оценок до введения доз.
ФК-оценки
Кровь следует собирать для анализа концентраций гуманизированного МАт 5 2F11, гуманизированного античеловеческого антитела (НАНА) к
гуманизированному МАт 2F11 и паклитаксела. Кроме того, следует брать один
образец крови в момент возникновения связанной с инфузией реакции высокого
уровня и, если инфузию прерывали или скорость инфузии замедляли, то в
момент времени по усмотрению исследователя.
10 Гуманизированное МАт 2F11 и НАНА в сыворотке следует оценивать с
помощью валидированных анализов. Все образцы сыворотки, собранные для определенияг НАНА можно применять также для анализа RO5509554. Все образцы сыворотки для ФК-оценки следует брать из i.v.-линии, отличной от той, в которую осуществляют инфузию. Образцы, предназначенные для оценки 15 экспозиции гуманизированного МАт 2F11 и анализа НАНА, следует разделять на две различные аликвоты, одну для определения гуманизированного МАт 2F11, и одну для определения НАНА
Концентрации в плазме паклитаксела следует измерять, используя валидированный метод жидкостной хроматографии-тандемной масс-20 спектрометрии (ЖХ/МС/МС). ФД-оценки
Образцы для обнаружения и валидации динамических (не наследуемых) и
генетических (наследуемых) биомаркеров следует собирать у всех
индивидуумов, участвующих в испытании.
25 Образцы цельной крови для ФД и изучения биомаркеров
Кровь в качестве ткани-источника следует собирать для определения ФД-воздействий гуманизированного МАт 2F11. Все образцы крови для ФД-оценки следует собирать i.v.-линии, отличной от той, в которую осуществляют инфузию. ФД-оценки образцов цельной крови должны включать (но, не 30 ограничиваясь только ими):
• иммунофенотипирование (субпопуляции моноцитов/макрофагов и лимфоцитов) с помощью проточной цитометрии. Для субпопуляций моноцитов/макрофагов эти маркеры включают (но, не ограничиваясь только
ими) CD14, CD16, CD45, ГКГС класса II, а для лимфоцитов CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD45, CD56.
• Общий объем крови, собранной для фармакодинамических исследований клеточных популяций моноцитов/макрофагов и лимфоцитов, должен составлять
5 примерно 17х5 мл = 85 мл для первых четырех циклов.
• Три дополнительных образца крови следует применять для приготовления сыворотки для определения связанных с ФД изменений растворимых маркеров. Эти маркеры включают (но, не ограничиваясь только ими):
Оценка цитокинов А:
10 CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34
Общий объем крови, собранной для ФД-оценок цитокинов А, должен составлять примерно 25x2,5 мл = 50 мл для первых четырех циклов. Оценка цитокинов Б:
IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, 15 CCL18, CCL22, MIP-1 , галектин 3, ILIRa, TGF-альфа.
Общий объем крови, собранной для ФД-оценок цитокинов Б, должен составлять примерно 21^1 мл = 21 мл для первых четырех циклов. Костные биомаркеры:
Следует оценивать костные биомаркеры, такие как остеокальцин, P1NP и 20 гормон паращитовидной железы (РТН).
Общий объем собранной крови должен составлять примерно 5x1 мл = 5 мл для первых четырех циклов.
Наибольший общий объем собранной крови на цикл для оценок
ФД/биомаркеров должен составлять примерно 51 мл.
25 Биопсии кожной ткани с заживающими ранениями
Суррогатную кожную ткань с заживающими ранениями следует анализировать, осуществляя исследовательские анализы ФД-биомаркеров, ассоциированных с процессом заживления повреждения, включая (но, не ограничиваясь только ими) рекрутмент нейтрофилов, инфильтрацию 30 макрофагов, ангиогенез (см. также ниже).
Два парных образца кожи следует получать после местной анестезии из являющихся зеркальным отражением областей здоровой кожи (предпочтительно, локализованных на спине без волосяных фолликул). Их следует получать с
помощью устройства для пункционной биопсии диаметром 2 и 4 мм с получением двух перекрывающихся образцов, что должно не требовать сшивания.
2-миллиметровая биопсия должна создавать повреждение, полностью 5 перекрывающая 4-миллиметровая биопсия, осуществляемая через 7 дней, должна позволять получать материал заживающего ранения.
Интервал времени, выбранный между двумя биопсиями, рассматривался как адекватный с учетом известных изменений с течением времени пригодных биомаркеров (рекрутмент нейтрофилов, инфильтрация макрофагов, ангиогенез), 10 ассоциированных с процессом заживления ран (Eming S.A. и др., Prog.
Histochem. Cytochem. 42, 2007, сс. 115-170; Zhang D. и др., Invest. New Drugs 25,
2006, cc. 49-55; Lockhart A.C. и др., Clin. Cancer Res. 9, 2003, cc. 586-593).
Все образцы кожи следует подвергать следующим анализам:
• Окрашивание гематоксилином и эозином (Н &Е)
15 • Иммуногистохимические (ИГХ) маркеры следует анализировать в
отношении следующих параметров: CSF-1R, CD68/CD163, С068/ГКГС класса II, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67.
Образцы следует фиксировать в формалине и заливать в парафин и
отправлять в центральную лабораторию для анализа.
20 Биопсии опухолей
Свежие биопсии опухолей
Свежие, полученные до начала лечения и в процессе лечения, биопсии опухолей следует собирать для оценки фармакодинамических изменений инфильтрации ТАМ и дополнительных опухолевых маркеров (см. также выше).
25 Биопсии главным образом следует отбирать из наиболее крупного
метастатического повреждения, можно из первичной опухоли или, если возможно, и из первичной опухоли, и из метастатической области, и, если возможно, биопсии следует получать из поверхности раздела опухоли-стромы. Сбор биопсий опухолей следует контролировать путем ультразвукового
30 исследования или КТ-"сканов", и использовать иглу 18 размера для получения образцов кор-биопсии длиной по меньшей мере 20 мм. В каждый момент времени следует получать по меньшей мере 2, в идеале 4 кор-биопсии.
Одну половину образцов следует фиксировать в формалине и заливать в
парафин. Вторую половину образцов следует замораживать в свежем виде и
хранить в течение длительного периода времени для ретроспективного
исследования биомаркеров (см. раздел 5.5.3.1.2).
5 Фиксированные в формалине, залитые в парафин образцы биопсии следует
подвергать следующим анализам:
• Окрашивание гематоксилином и эозином (Н &Е)
• Иммуногистохимические (ИГХ) маркеры следует анализировать в отношении следующих (но, не ограничиваясь только ими) параметров: CSF-1R,
10 CD68/CD163, CD68/rKTC класса II, CD31 (плотность микрососудов), Ki67 и другие исследуемые маркеры.
Средства визуализации биомаркеров DCE-ультразвуковое исследование
На основе полученных результатов доклинических исследований 15 ожидается, что лечение гуманизированным МАт 2F11 может модулировать плотность микрососудов и просвет сосудов в опухоли и, как следствие, ангиогенез, и транскапиллярный транспорт питательных веществ к опухоли. Для мониторинга указанных конечных точек при создании изобретения было предложено применять DCE-ультразвуковое исследование в качестве средства 20 визуализации, если это возможно. (FDG-PET)
FDG-PET позволяет улучшать воздействие на пациента в результате выявления респондеров на ранней стадии, до снижения размера опухоли; и позволяет прекращать бесполезную терапию не респондеров (Weber W.A., J.
25 Nucl. Med. 50, 2009, cc. 1-10). Кроме того, снижение FDG-PET-сигнала через
несколько дней или недель после начала терапии (например, в молочной железе (Avri N. и др., J. Nucl. Med. 50, 2009, сс. 55-63), яичнике (Schwarz J.К. и др., J. Nucl. Med. 50, 2009, сс. 64-73) и немелкоклеточном раке легкого (Zander Т. и др., J. Clin. Oncol., 2011, сс. 1701-1708)) выражено коррелирует с пролонгированным
30 выживанием и другими клиническими конечными точками, используемыми в настоящее время. Индуцированные обработкой гуманизированным МАт 2F11 изменения в метаболизме опухоли можно оценивать с помощью FDG-PET.
Кроме того, индуцированное гуманизированным МАт 2F11 истощение макрофагов может приводить к снижению SUVmax в FDG-PET-сканах. Пример 15
Ингибирование роста опухолей в результате обработки моноклональным 5 антителом к CSF-1R в сочетании с химиотерапей или иммунотерапией рака на моделях, полученных путем подкожной сингенной трансплантации карциномы ободочной кишки МС38
Клетки мышиной колоректальной аденокарциномы клеточной линии МС-38 (полученной из Beckman Research Institute of the City of Hope, шт. Калифорния,
10 CILIA) культивировали в модифицированной по методу Игла среде Дульбекко (DMEM, фирма PAN Biotech), дополненной 10% FCS и 2мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной водой атмосфере с 5% СО2. В день инокуляции опухолевые клетки линии МС38 собирали с использованием ЗФР из культуральных колб и переносили в культуральную среду, центрифугировали, однократно отмывали и
15 ресуспендировали в ЗФР. Для инъекции клеток конечный титр доводили до 1 х 107 клеток/мл. Затем 100 мкл указанной суспензии (1^106 клеток) инокулировали подкожно самкам мышей линии C57BL/6N возрастом 7-9 недель (полученных от фирмы Charles River, Сульцфельд, Германия). После возникновения опухолей и достижения ими среднего размера 50 мм3 начинали
20 обработку контрольным антителом (МОРС-21; фирма Bio X Cell, Вест-Лебанон), МАт к мышиному CSF-1R, используя в еженедельной дозе 30 мг/кг i.p. индивидуально или в комбинации с IL-2 (пролейкин, фирма Novartis, 100000 ед./животное i.p. дважды в день) или фолфири (5-фторурацил, фирма Medac, 100 мг/кг, i.p., Iх /леуковорин, фирма Pfizer, 40 мг/кг, i.p., 1х /иринотекан, фирма
25 HEXAL, 20 мг/кг, i.p., 1х), или оксалиплатином (элоксатин, фирма Sanofi-Aventis, 5 мг/кг, i.p. 1 х). Объем опухолей измеряли дважды в неделю и параллельно осуществляли мониторинг веса животных. В другом опыте с сопоставимой процедурой обработки первичные опухоли из выбранной группы обработки изымали, взвешивали и подвергали FACS-анализу. Материал
30 первичных опухолей собирали в период между днями опыта 20-25, как указано. Для получения суспензии единичных клеток, пригодной для анализа методом проточной цитомерии, опухоли измельчали с помощью ножа для тканей Mcllwain. Затем кусочки ткани ресуспендировали в среде RPMI, дополненной
коллагеназой I, диспазой II и ДНКазой I, инкубировали при 37°С и клеточную суспензию пропускали через сито. Увеличивали количество С045-позитивных клеток путем магнитной сепарации клеток согласно инструкциям производителя (фирма Miltenyi). В целом, метод состоял в следующем: клетки метили 5 антителом к мышиному CD45, конъюгированному с АРС (аллофикоцианин) (фирма BD, каталожный № 559864), и разделяли с помощью микрогранул с антителом к АРС. Для анализа СЭ8+-Т-клеток эти С045-позитивные клетки окрашивали 0,2 мкг/мл DAPI (фирма Roche, каталожный № 10236276001) и конъюгированным с РЕ антителом к CD8 (фирма eBioscience, каталожный № 1210 0081-83) или конъюгированным с РЕ антителом к CD4 (фирма eBioscience,
каталожный № 2-0041-83). Сбор данных осуществляли с помощью устройства FACS Canto II и затем анализировали с помощью программы FlowJo. Анализировали только жизнеспособные клетки (в дискриминационном окне, установленном на DAPI-негативные клетки) для того, чтобы исключить 15 клеточный дебрис и мертвые клетки.
Монотерапия с использованием антитела к мышиному CSF1R ингибировала рост первичных опухолей по сравнению с обработкой контрольным антителом (TGI: 61%, TCR: 0,39, CI: 0,15-0,68). Кроме того, монотерапия с использованием IL2, влияла на рост первичных опухолей МС38 (TGI: 47%, TCR: 0,53, CI: 0,2720 0,85). Добавление антитела к мышиному CSF1R к терапии на основе IL-2
приводило к более высокой противоопухолевой эффективности по сравнению с обработкой только IL-2 (TGI: 78%, TCR: 0,21, CI: 0,02-0,48). Лечение с использованием химиотерапевтической схемы фолфири также выражено ингибировало рост опухолей (TGI: 66%, TCR: 0,4, CI: 0,11-0,61), а добавление 25 антитела к мышиному CSF1R приводило к дополнительному улучшению исхода (TGI: 77%, TCR: 0,23, CI: 0,001-0,48). Для оксалиплатина также обнаружена некоторая, но менее выраженная эффективность в отношении роста опухолей линии МС38 (TGI: 46%, TCR: 0,54, CI: 0,29-0,86), которую тем не менее можно повышать путем объединения с антителом к мышиному CSF1R (TGI: 69%, TCR: 30 0,31, CI: 0,07-0,59). При обследовании развития индивидуальных опухолей
размером свыше 700 мм установлено, что на этой модели медиана времени до прогрессирования опухоли у животных, обработанных комбинацией антитела к
мышиному CSF-1 R с IL-2 превышало этот показатель при применении комбинации с химиотерапевтическими средствами (см. таблицу 11). Таблица 11:
Противоопухолевая эффективность комбинаций антитела к мышиному 5 CSF1R, обнаруженная на мышиной CRC-модели МС38 in vivo
Группа
TGI
(день
21)
TCR (день 21)
Медиана время до прогрессирования TV > 700 мм3
контроль (мышиный IgGl)
антитело к мышиному CSF1R
61%
0,39
осалиплатин
46%
0,54
флфири
66%
0,34
полейкин
47%
0,53
антитело к мышиному CSF1 R/элоксатин
69%
0,31
антитело к мышиному CSFlR/фолфири
77%
0,23
27,5
антитело к мышиному CSFlR/пролейкин
78%
0,22
Анализ методом проточной цитометрии опухолей, обработанных антителом к мышиному CSF-1R, продемонстрировал 3-кратное увеличение количества СБ8+-Т-клеток по сравнению с монотерапией оксалиплатином, а также
10 некоторое увеличение количества СБ4+-Т-клеток. Для опухолей, обработанных комбинацией нейтрализующего CSF-1R антитела и оксалиплатина, обнаружено сопоставимое увеличение количества Т-клеток с вариантом, когда обработку осуществляли только антителом. Аналогичные результаты были получены для комбинации с фолфири. Результаты представлены также на фиг. 5.
15 Пример 16
Ингибирование роста опухолей в результате обработки моноклональным антителом к CSF-1R в сочетании с моноклональным антителом к CD40 на модели, полученной путем подкожной сингенной трансплантации карциномы ободочной кишки МС38
20 Клетки мышиной колоректальной аденокарциномы клеточной линии МС-38
(полученной из Beckman Research Institute of the City of Hope, шт. Калифорния, США) культивировали в модифицированной по методу Игла среде Дульбекко (DMEM, фирма PAN Biotech), дополненной 10% FCS и 2мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной водой атмосфере с 5% СОг. В день инокуляции опухолевые
25 клетки линии МС38 собирали с использованием ЗФР из культуральных колб и
переносили в культуральную среду, центрифугировали, однократно промывали и ресуспендировали в ЗФР. Для инъекции клеток конечный титр доводили до 1 х 107 клеток/мл. Затем 100 мкл указанной суспензии (1*106 клеток) инокулировали подкожно самкам мышей линии C57BL/6N возрастом 6-10 5 недель. Группы животных обрабатывали контрольными антителами (МОРС-21 (30 мг/кг i.p. один раз в неделю) и 2АЗ (100 мкг i.p. однократно); фирма Bio X Cell, Вест-Лебанон), МАт к мышиному CSF-1R (30 мг/кг i.p. один раз в неделю) индивидуально или в комбинации с моноклональным антителом к CD40 FGK45 (агонист CD40, крысиное антимышиное МАт в виде IgG2a FGK45 (S. Р.
10 Schoenberger и др, Nature, 393, 1998, с. 480, фирмы BioXcell) CD40 (FGK45)) (100 мкг, i.p., 1х). Обработку начинали после возникновения опухолей и достижения среднего размера 50 мм . Объем опухолей измеряли дважды в неделю и параллельно осуществляли мониторинг веса животных. Результаты представлены на фиг. 7. Установлено, что комбинация МАт к CSF1R+ МАт к
15 CD40 FGK45 обладала более высокой противоопухолевой эффективностью по сравнению с монотерапиями на мышиной модели, полученной путем сингенной трансплантации рака ободочной кишки МС38. Пример 17
Ингибирование роста опухолей в результате обработки моноклональным 20 антителом к CSF-1R в сочетании с моноклональным антителом к Ang2/VEGF и/или фолфи на модели, полученной путем подкожной сингенной трансплантации карциномы ободочной кишки МС38
Клетки мышиной колоректальной аденокарциномы клеточной линии МС-38 (полученной из Beckman Research Institute of the City of Hope, шт. Калифорния, 25 США) культивировали в модифицированной по методу Игла среде Дульбекко (DMEM, фирма PAN Biotech), дополненной 10% FCS и 2мМ L-глутамином, при 37°С в насыщенной водой атмосфере с 5% СОг. В день инокуляции опухолевые клетки линии МС38 собирали с использованием ЗФР из культуральных колб и переносили в культуральную среду, центрифугировали, однократно промывали и 30 ресуспендировали в ЗФР. Для инъекции клеток конечный титр доводили до 1 х 107 клеток/мл. Затем 100 мкл указанной суспензии (1 *106 клеток) инокулировали подкожно самкам мышей линии C57BL/6N возрастом 7 недель. После возникновения опухолей и достижения ими среднего размера 50 мм3
начинали обработку контрольным антителом (МОРС-21; фирма Bio X Cell, Вест-Лебанон), МАт к мышиному CSF-1R, используя в еженедельной дозе 30 мг/кг i.p. индивидуально или в комбинации с фолфири (5-фторурацил, фирма Medac, 100 мг/кг, i.p., I* / леоковорин, фирма Pfizer, 40 мг/кг, i.p., 1х / иринотекан, 5 фирма HEXAL, 20 мг/кг, i.p., 1* ) или моноклональным антителом к Ang2/VEGF (биспецифическое антитело к ANG-2-VEGF ХМаЫ, описанное в WO 2011/117329) (10 мг/кг, i.p., Iх еженедельно). Осуществляли обработки тройными комбинациями, как указано в таблице 13. Объем опухолей измеряли дважды в неделю и параллельно осуществляли мониторинг веса животных.
10 Монотерапия с использованием антитела к мышиному CSF1R, антитела к
Ang2/VEGF или фолфири минимально ингибировала рост первичных опухолей по сравнению с обработкой контрольным антителом (TGI: 28%, 35% или 11% соответственно). Комбинация антитела к мышиному CSF1R в сочетании либо с антителом к Ang2/VEGF, либо с фолфири, приводила к более выраженной и
15 статистически значимой противоопухолевой активности по сравнению с контрольным антителом (TGI: 64% или 67%). Установлено, что обработка тройными комбинациями антитела к мышиному CSF-1R с фолфири с последующей обработкой антителом к Ang2/VEGF через 2 дня или 9 дней обладала наиболее высокой противоопухолевой активностью (TGI: 68% или
20 70%). Одновременная обработка 3 соединениями или комбинацией антитела к
Ang2/VEGF с фолфири с последующей обработкой антителом к мышиному CSF-1R через 9 дней обеспечивала противоопухолевую активность, составляющую 61% или 56% соответственно. При обследовании развития индивидуальных опухолей размером свыше 700 мм установлено, что на этой модели медиана
25 времени до прогрессирования опухоли у животных, обработанных комбинацией антитела к мышиному CSF-1R с фолфири с последующей обработкой антителом к Ang2/VEGF через 2 дня или 9 дней, также превышала медиану времени до прогрессирования по сравнению с другими вариантами обработки (см. таблицу 12).
Таблица 12:
Противоопухолевая эффективность антитела к мышиному CSF1R в комбинации с моноклональным антителом к Ang2/VEGF и/или фолфири,
обнаруженная на мышиной CRC-модели МС38 in vivo
Группа
TGI
(день
20)
TCR
(день 20)
Медиана время до прогрессирования TV > 700 мм3
контроль (мышиный IgGl)
...
антитело к мышиному CSF1R
28%
0,72
антитело к Ang2/VEGF
35%
0,65
фолфири
11%
0,84
антитело к мышиному CSFlR/фолфири
67%
0,34
антитело к Ang2/VEGF/фoлфиpи
43%
0,52
антитело к мышиному CSFlR/антитело к-Ang2/VEGF
64%
0,35
антитело к мышиному CSFlR/фолфири/антитело к Ang2/VEGF; одновременная обработка
61%
0,39
антитело к мышиному CSF1R (день 7)/фолфири/антитело к Ang2/VEGF (день 9)
68%
0,27
антитело к мышиному CSF1R (день 7)//фолфири/антитело к Ang2/VEGF (день 16)
70%
0,22
антитело к мышиному CSF1R (день 16)/фолфири/антитело к Ang2/VEGF (день 7)
56%
0,43
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Ф. Хоффманн-Ля Рош АГ
5 <120> КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АНТИТЕЛ К ЧЕЛОВЕЧЕСКОМУ CSF-1R И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 30886 WO
10 <150> ЕР12158519.4 <151> 2012-03-08
<1б0> 91
15 <170> Patentln, версия 3.5
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
20 <213> Mus musculus
<400> 1
Asp Gin Arg Leu Туг Phe Asp Val 25 1 5
<210> 2
<211> 16
30 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
35 Val lie Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser
15 10 15
<210> 3
40 <211> 5
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 3
Thr Tyr Asp lie Ser 1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
5 <213> Mus musculus
<400> 4
Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 10 1 5
<210> 5
<211> 7
15 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 5
20 Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 6
25 <211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 6
Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 15 10
35 <210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
40 <400> 7
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin
15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp lie Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val lie Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Arg Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Arg Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 8
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 8
Asn lie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
15 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Gin Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Thr Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
15 <210> 9
<211> 7
<212> PRT
<213> Mus musculus
20 <400> 9
Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp 1 5
<210> 10
<211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 10
Val lie Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met Ser
15 10 15
<210> 11 <211> 5 <212> PRT 40 <213> Mus musculus
<400> 11
Ser Phe Asp lie Ser 45 1 5
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 12
Gly Gin Thr Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
15 <213> Mus musculus
<400> 13
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 20 1 5
<210> 14
<211> 11
25 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 14
30 Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr Val Ser 15 10
<210> 15
35 <211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 15
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys
15 10 15
45 Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe
20 25 30
Asp lie Ser Trp lie Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val lie Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Arg lie Thr Lys -Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Leu Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Ser Asp Asp Thr Ala lie Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 16
<211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 16
Asn lie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
15 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Val Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gin Thr Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105
<210> 17
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-cll
<400> 17
Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5
<210> 18 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> CDR2 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-cll <400> 18
Val lie Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser
15 10 15
<210> 19
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDRM тяжелой цепи, hMAT 2Fll-cll <400> 19
Thr Туг Asp lie Ser 1 5
<210> 20
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи, hMAT 2Fll-cll
<400> 20
Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 21
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи, hMAT 2Fll-cll
<400> 21
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5
<210> 22 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> CDR1 легкой цепи, hMAT 2Fll-cll <400> 22
Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val 15 10
<210> 23 <211> 116 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи, hMAT 2Fll-cll <400> 23
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp lie Ser Trp lie Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val lie Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Thr Lys Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 24
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2Fll-cll <400> 24
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 25
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2FH-d8
<400> 25
Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val
<210> 26
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-d8
10 <400> 26
Val He Trp Thr Asp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin Gly
15 10 15
<210> 27
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-d8
<400> 27
Thr Tyr Asp He Ser
30 <210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
35 <220>
<223> CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-d8
<400> 28
40 Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 29
45 <211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> CDR2 легкой цепи, hMAT 2Fll-d8
<400>
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr
<210> 30 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> CDR1 легкой цепи, hMAT 2Fll-d8 <400> 30
Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 15 10
<210> 31 <211> 116 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-d8 <400> 31
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
Asp He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
Gly Val He Trp Thr Asp Gly Gly Ala Asn Tyr Ala Gin Lys Phe Gin
50 55 60
Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 32 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен легкой цепи, hMAT 2Fll-d8 <400> 32
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-e7
<400> 33
Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5
25 <210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная
30 <220>
<223> CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400> 34
35 Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu Gin Gly
15 10 15
<210> 35
40 <211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
45 <223> CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400>
Ser Tyr Asp He Ser 1 5
<210> 36
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400> 36
Gin Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400> 37
Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5
<210> 38
<211> 11
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400> 38
Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val 15 10
<210> 39
<211> 116
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-e7
<400> 39
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Leu Gin
50 55 60
Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 40
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная
<223> вариабельный домен легкой цепи, ЬМАт 2Fll-e7 <400> 40
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2 <400> 41
Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val
<210> 42 <211> 16 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2 <400> 42
Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met Ser
15 10 15
15 <210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> Искусственная
20 <220>
<223> CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2
<400> 43
25 Thr Tyr Asp He Ser 1 5
<210> 44
30 <211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
35 <223> CDR3 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2
<400> 44
Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
40 l 5
<210> 45
<211> 7
45 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2 <400> 45
Gly Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5
<210> 46 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2 <400> 46
Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Val Ser 15 10
<210> 47 <211> 116 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-fl2 <400> 47
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp He Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met
50 55 60
Ser Arg Val Thr He Thr Lys Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met
65 70 75 80
Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 48 <211> 106 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен легкой цепи, hMAT 2Fll-fl2 <400> 48
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
85 • 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
10 <210> 49
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
15 <220>
<223> CDR3 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-gl
<400> 49
20 Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 50
25 <211> 16
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
30 <223> CDR2 тяжелой цепи, hMAT 2Fll-gl
<400> 50
Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Leu Lys Ser
35 1 5 10 15
<210> 51
<211> 5
40 <212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR1 тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-gl
<400> 51
Thr Tyr Asp He Ser 1 5
<210> 52
<211> 8
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR3 легкой цепи, hMAT 2Fll-gl
<400> 52
Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 53
<211> 7
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> CDR2 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-gl
<400> 53
Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5
<210> 54 <211> 11 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> CDR1 легкой цепи, ЬМАт 2Fll-gl <400> 54
Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr Leu 15 10
<210> 55
<211> 116 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> вариабельный домен тяжелой цепи, ЬМАт 2Fll-gl <400> 55
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr
20 25 30
Asp He Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp He
35 40 45
Gly Val He Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr He Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Gin Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 56
<211> 106
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> вариабельный домен легкой цепи, hMAT 2Fll-gl <400> 56
Glu Не Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly He Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Arg Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Gin Ser Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu
15 10 15
Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105
<210> 58
<211> 330
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Туг Не Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 59
<211> 330
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная
IgGl, несущего мутации L234A и L235A
<400> 59
Ala Ser Thr Lys Gly Pre Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Туг Не Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330
<210> 60
<211> 327
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 61
<211> 327
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> константная область человеческой тяжелой цепи, выведенная
IgG4, несущего мутацию S228P
<400> 61
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
15 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gin Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gin Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser He Glu Lys Thr He Ser Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gin Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
He Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325
<210> 62
<211> 972
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met.Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His
15 10 15
Gly Gin Gly He Pro Val He Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val
35 40 45
Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Ser He Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala
85 90 95
He His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala
100 105 110
Gin Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu
115 120 125
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg
130 135 140
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His
145 150 155 160
Gly Phe Thr He His Arg Ala Lys Phe He Gin Ser Gin Asp Tyr Gin
165 170 175
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser He Ser He Arg
180 185 190
Leu Lys Val Gin Lys Val He Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val
195 200 205
Pro Ala Glu Leu Val Arg He Arg Gly Glu Ala Ala Gin He Val Cys
210 215 220
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gin His Asn
225 230 235 240
Asn Thr Lys Leu Ala He Pro Gin Gin Ser Asp Phe His Asn Asn Arg
245 250 255
Tyr Gin Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gin Val Asp Phe Gin His
260 265 270
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gin Gly Lys His Ser
275 280 285
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Glu Gin Asn Leu He Gin Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gin Gly Phe Asn Trp
325 330 335
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gin Pro Glu Pro Lys Leu Ala
340 345 350
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu
355 360 365
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg
370 375 380
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Val Ser Val He Trp Thr Phe He Asn Gly Ser Gly Thr
405 410 415
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gin Pro Asn Val Thr Trp Leu
420 425 430
Gin Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gin Val Leu Gin
435 440 445
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gin Glu Pro Phe His
450 455 460
Lys Val Thr Val Gin Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn
465 470 475 480
Gin Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp
485 490 495
Ala Phe He Pro He Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu
500 505 510
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser He Met Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gin Lys Pro
530 535 540
Lys Tyr Gin Val Arg Trp Lys He He Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Thr Phe He Asp Pro Thr Gin Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu
565 570 575
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gin Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala
580 585 590
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp
595 600 605
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala
610 615 620
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys He Met Ser His Leu
625 630 635 640
Gly Gin His Glu Asn He Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly
645 650 655
Gly Pro Val Leu Val He Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu
660 665 670
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly Gin Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn He His Leu
690 695 700
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gin Gly Val
705 710 715 720
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser
725 730 735
Phe Ser Glu Gin Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu
740 745 750
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gin Val Ala Gin Gly Met Ala Phe
755 760 765
Leu Ala Ser Lys Asn Cys He His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val
770 775 780
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys He Gly Asp Phe Gly Leu Ala
785 790 795 800
Arg Asp He Met Asn Asp Ser Asn Tyr He Val Lys Gly Asn Ala Arg
805 810 815
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser He Phe Asp Cys Val Tyr
820 825 830
Thr Val Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly He Leu Leu Trp Glu He
835 840 845
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly He Leu Val Asn Ser Lys
850 855 860
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gin Met Ala Gin Pro Ala Phe
865 870 875 880
Ala Pro Lys Asn He Tyr Ser He Met Gin Ala Cys Trp Ala Leu Glu
885 890 895
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gin Gin He Cys Ser Phe Leu Gin Glu
900 905 910
Gin Ala Gin Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser
915 920 925
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu
930 935 940
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gin Gly Asp He Ala
945 950 955 960
Gin Pro Leu Leu Gin Pro Asn Asn Tyr Gin Phe Cys 965 970
<210> 63 <211> 972 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> мутант CSF-1R L301S Y969F <400> 63
Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His
15 10 15
Gly Gin Gly He Pro Val He Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val
20 25 30
Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val
35 40 45
Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly
50 55 60
Ser Ser Ser He Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala
85 90 95
He His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala
100 105 110
Gin Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu
115 120 125
Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg
130 135 140
Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His
145 150 155 160
Gly Phe Thr He His Arg Ala Lys Phe He Gin Ser Gin Asp Tyr Gin
165 170 175
Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser He Ser He Arg
180 185 190
Leu Lys Val Gin Lys Val He Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val
195 200 205
Pro Ala Glu Leu Val Arg He Arg Gly Glu Ala Ala Gin He Val Cys
210 215 220
Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gin His Asn
225 230 235 240
Asn Thr Lys Leu Ala He Pro Gin Gin Ser Asp Phe His Asn Asn Arg
245 250 255
Tyr Gin Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gin Val Asp Phe Gin His
260 265 270
Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gin Gly Lys His Ser
275 280 285
Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Ser Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Glu Gin Asn Leu He Gin Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn
305 310 315 320
Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gin Gly Phe Asn Trp
325 330 335
Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gin Pro Glu Pro Lys Leu Ala
340 345 350
Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu
355 360 365
Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg
370 375 380
Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr
385 390 395 400
Pro Pro Glu Val Ser Val He Trp Thr Phe He Asn Gly Ser Gly Thr
405 410 415
Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gin Pro Asn Val Thr Trp Leu
420 425 430
Gin Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gin Val Leu Gin
435 440 445
Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gin Glu Pro Phe His
450 455 460
Lys Val Thr Val Gin Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn
465 470 475 480
Gin Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp
485 490 495
Ala Phe He Pro He Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu
500 505 510
Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser He Met Ala Leu
515 520 525
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gin Lys Pro
530 535 540
Lys Tyr Gin Val Arg Trp Lys He He Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser
545 550 555 560
Tyr Thr Phe He Asp Pro Thr Gin Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu
565 570 575
Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gin Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala
580 585 590
Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp
595 600 605
Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala
610 615 620
Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys He Met Ser His Leu
625 630 635 640
Gly Gin His Glu Asn He Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly
645 650 655
Gly Pro Val Leu Val He Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu
660 665 670
Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser
675 680 685
Pro Gly Gin Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn He His Leu
690 695 700
Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gin Gly Val
705 710 715 720
Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser
725 730 735
Phe Ser Glu Gin Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu
740 745 750
Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gin Val Ala Gin Gly Met Ala Phe
755 760 765
Leu Ala Ser Lys Asn Cys He His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val
770 775 780
Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys He Gly Asp Phe Gly Leu Ala
785 790 795 800
Arg Asp He Met Asn Asp Ser Asn Tyr He Val Lys Gly Asn Ala Arg
805 810 815
Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser He Phe Asp Cys Val Tyr
820 825 830
Thr Val Gin Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly He Leu Leu Trp Glu He
835 840 845
Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly He Leu Val Asn Ser Lys
850 855 860
Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gin Met Ala Gin Pro Ala Phe
865 870 875 880
Ala Pro Lys Asn He Tyr Ser He Met Gin Ala Cys Trp Ala Leu Glu
885 890 895
Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gin Gin He Cys Ser Phe Leu Gin Glu
900 905 910
Gin Ala Gin Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser
915 920 925
Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu
930 935 940
Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gin Gly Asp He Ala
945 950 955 960
Gin Pro Leu Leu Gin Pro Asn Asn Phe Gin Phe Cys 965 970
<210> 64 <211> 493 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> внеклеточный домен человеческого CSF-1R <400> 64
He Pro Val He Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly
15 10 15
Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp
20 25 30
Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser
35 40 45
He Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly Thr Tyr Arg
50 55 60
Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala He His Leu
65 70 75 80
Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gin Glu Val
85 90 95
Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp
100 105 110
Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro
115 120 125
Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr
130 135 140
He His Arg Ala Lys Phe He Gin Ser Gin Asp Tyr Gin Cys Ser Ala
145 150 155 160
Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser He Ser He Arg Leu Lys Val
165 170 175
Gin Lys Val He Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu
180 185 190
Leu Val Arg He Arg Gly Glu Ala Ala Gin He Val Cys Ser Ala Ser
195 200 205
Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gin His Asn Asn Thr Lys
210 215 220
Leu Ala He Pro Gin Gin Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gin Lys
225 230 235 240
Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gin Val Asp Phe Gin His Ala Gly Asn
245 250 255
Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gin Gly Lys His Ser Thr Ser Met
260 265 270
Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gin
275 280 285
Asn Leu He Gin Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys Val
290 295 300
Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gin Gly Phe Asn Trp Thr Tyr Leu
305 310 315 320
Gly Pro Phe Ser Asp His Gin Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala Thr
325 330 335
Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu
340 345 350
Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly
355 360 365
Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu
370 375 380
Val Ser Val He Trp Thr Phe He Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys
385 390 395 400
Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gin Pro Asn Val Thr Trp Leu Gin Cys Ser
405 410 415
Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gin Val Leu Gin Val Trp Asp
420 425 430
Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gin Glu Pro Phe His Lys Val Thr
435 440 445
Val Gin Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gin Thr Tyr
450 455 460
Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe He
465 470 475 480
Pro He Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 485 490
<210> 65
<211> 388
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> фрагмент человеческого CSF-1R delD4 <400> 65
Не Pro Val Не Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly
15 10 15
Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp
20 25 30
Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser
35 40 45
He Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly Thr Tyr Arg
50 55 60
Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala He His Leu
65 70 75 80
Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gin Glu Val
85 90 95
Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp
100 105 110
Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro
115 120 125
Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr
130 135 140
He His Arg Ala Lys Phe He Gin Ser Gin Asp Tyr Gin Cys Ser Ala
145 150 155 160
Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser He Ser He Arg Leu Lys Val
165 170 175
Gin Lys Val He Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu
180 185 190
Leu Val Arg He Arg Gly Glu Ala Ala Gin He Val Cys Ser Ala Ser
195 200 205
Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gin His Asn Asn Thr Lys
210 215 220
Leu Ala He Pro Gin Gin Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gin Lys
225 230 235 240
Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gin Val Asp Phe Gin His Ala Gly Asn
245 250 255
Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gin Gly Lys His Ser Thr Ser Met
260 265 270
Phe Phe Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Val He Trp Thr Phe He Asn
275 280 285
Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gin Pro Asn
290 295 300
Val Thr Trp Leu Gin Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala
305 310 315 320
Gin Val Leu Gin Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gin
325 330 335
Glu Pro Phe His Lys Val Thr Val Gin Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr
340 345 350
Leu Glu His Asn Gin Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly
355 360 365
Ser Gly Ser Trp Ala Phe He Pro He Ser Ala Gly Ala His Thr His
370 375 380
Pro Pro Asp Glu 385
<210> 66 <211> 292 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> фрагмент человеческого CSF-1R D1-D3 <400> 66
He Pro Val He Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val Lys Pro Gly
15 10 15
Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val Glu Trp Asp
20 25 30
Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly Ser Ser Ser
35 40 45
He Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gin Asn Thr Gly Thr Tyr Arg
50 55 60
Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala He His Leu
65 70 75 80
Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala Gin Glu Val
85 90 95
Val Val Phe Glu Asp Gin Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu Leu Thr Asp
100 105 110
Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg Gly Arg Pro
115 120 125
Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His Gly Phe Thr
130 135 140
He His Arg Ala Lys Phe He Gin Ser Gin Asp Tyr Gin Cys Ser Ala
145 150 155 160
Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser He Ser He Arg Leu Lys Val
165 170 175
Gin Lys Val He Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val Pro Ala Glu
180 185 190
Leu Val Arg He Arg Gly Glu Ala Ala Gin He Val Cys Ser Ala Ser
195 200 205
Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gin His Asn Asn Thr Lys
210 215 220
Leu Ala He Pro Gin Gin Ser Asp Phe His Asn Asn Arg Tyr Gin Lys
225 230 235 240
Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gin Val Asp Phe Gin His Ala Gly Asn
245 250 255
Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gin Gly Lys His Ser Thr Ser Met
260 265 270
Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gin
275 280 285
Asn Leu He Gin 290
5 <210> 67
<211> 21
<212> PRT
<213> Искусственная
10 <220>
<223> сигнальный пептид
<400> 67
15 Met Gly Ser Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala
15 10 15
Trp His Gly Gin Gly
20 20
<210> 68
<211> 36
25 <212> ДНК
<213> Искусственная
<220>
<223> Праймер
<400> 68
cacctccatg ttcttccggt accccccaga ggtaag 36
<210> 69
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 69
Asp Leu Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5
<210> 70
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 71
Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Asp He Ser 15 10
<210> 72
<211> 8
<212> PRT
25 <213> Mus musculus
<400> 72
Gly Gin Ser Phe Thr Tyr Pro Thr 30 1 5
<210> 73
<211> 7
35 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 73
40 Gly Ser Ser Asn Arg Tyr Thr
1 5
<210> 74
45 <211> 11
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 74
Lys Ala Ser Glu Asp Val Gly Thr Tyr Val Ser 15 10
<210> 75
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 75
Arg Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin
15 10 15
Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Asp He Ser Trp He Arg Gin Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Ser Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Pro Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Arg He Ser Lys Asp Asp Ser Arg Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Val Asn Arg Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Leu Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 76
<211> 106 <212> PRT <213> Mus musculus
<400> 76
Lys He Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Val Ser Val Gly
15 10 15
Glu Arg Val Ser Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Val Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Ser Cys Gly Gin Ser Phe Thr Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 77
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 77
Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp Val 1 5
<210> 78 <211> 16
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 78
Val He Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met Ser
15 10 15
10 <210> 79
<211> 10
<212> PRT
<213> Mus musculus
15 <400> 79
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe Asp He Ser 15 10
<210> 80
<211> 8
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 80
Gly Gin Thr Phe Ser Tyr Pro Thr 1 5
<210> 81 <211> 7 <212> PRT 35 <213> Mus musculus
<400> 81
Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 40 l 5
<210> 82
<211> 11
45 <212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 82
Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr Val Ser 15 10
<210> 83
<211> 116
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 83
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Lys
15 10 15
Ser Leu Ser He Thr Cys Thr Val Ser Gly Ser Ser Leu Asp Ser Phe
20 25 30
Asp He Ser Trp He Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val He Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Ser Gly Phe Met
50 55 60
Ser Arg Leu Arg He Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Ser Ser Leu Gin Ser Asp Asp Thr Ala He Tyr Tyr Cys Val
85 90 95
Arg Asp Pro Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser 115
<210> 84 <211> 106
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 84
Asn lie Val Met Thr Gin Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly
15 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asp Val Val Thr Tyr
20 25 30
Val Ser Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Glu Gin Ser Pro Lys Leu Leu He
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser He Gin Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Gin Thr Phe Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105
<210> 85
<211> 218
<212> PRT
<213> Искусственная
<220>
<223> домены фрагмента человеческого CSF-1R D4-D5
<400> 85
Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser Ser Glu Gin Asn Leu He
15 10 15
Gin Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn Leu Lys Val Met Val Glu
20 25 30
Ala Tyr Pro Gly Leu Gin Gly Phe Asn Trp Thr Tyr Leu Gly Pro Phe
35 40 45
Ser Asp His Gin Pro Glu Pro Lys Leu Ala Asn Ala Thr Thr Lys Asp
50 55 60
Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu Pro Arg Leu Lys Pro Ser
65 70 75 80
Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg Asn Pro Gly Gly Trp Arg
85 90 95
Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro Glu Val Ser Val
100 105 110
He Trp Thr Phe He Asn Gly Ser Gly Thr Leu Leu Cys Ala Ala Ser
115 120 125
Gly Tyr Pro Gin Pro Asn Val Thr Trp Leu Gin Cys Ser Gly His Thr
130 135 140
Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gin Val Leu Gin Val Trp Asp Asp Pro Tyr
145 150 155 160
Pro Glu Val Leu Ser Gin Glu Pro Phe His Lys Val Thr Val Gin Ser
165 170 175
Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn Gin Thr Tyr Glu Cys Arg
180 185 190
Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp Ala Phe He Pro He Ser
195 200 205
Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu 210 215
<210> 86
<211> 554
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 86
Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu
15 10 15
Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser He Thr
20 25 30
Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met He Gly Ser Gly His Leu
35 40 45
Gin Ser Leu Gin Arg Leu He Asp Ser Gin Met Glu Thr Ser Cys Gin
50 55 60
He Thr Phe Glu Phe Val Asp Gin Glu Gin Leu Lys Asp Pro Val Cys
65 70 75 80
Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gin Asp He Met Glu Asp Thr
85 90 95
Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala He Ala He Val Gin Leu
100 105 110
Gin Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu
115 120 125
Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gin
130 135 140
Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu
145 150 155 160
Asp Lys Asp Trp Asn He Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala
165 170 175
Glu Cys Ser Ser Gin Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu
180 185 190
Tyr Pro Lys Ala He Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His
195 200 205
Gin Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu
210 215 220
Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gin Pro
225 230 235 240
Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gin Arg Pro Pro Arg Ser
245 250 255
Thr Cys Gin Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser
260 265 270
Thr He Gly Gly Ser Pro Gin Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn
275 280 285
Pro Gly Met Glu Asp He Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val
290 295 300
Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu He Pro Val Pro Gin Gly
305 310 315 320
Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gin Thr Glu
325 330 335
Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala
340 345 350
Ser Ala Lys Gly Gin Gin Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro
355 360 365
Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gin Asp Trp Asn His Thr Pro
370 375 380
Gin Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro
385 390 395 400
Gly Ser Pro Arg He Ser Ser Leu Arg Pro Gin Gly Leu Ser Asn Pro
405 410 415
Ser Thr Leu Ser Ala Gin Pro Gin Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly
420 425 430
Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp
435 440 445
Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala
450 455 460
Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly
465 470 475 480
His Glu Arg Gin Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gin Leu Gin Glu Ser
485 490 495
Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val lie Leu Val Leu Leu Ala Val
500 505 510
Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gin Glu Pro
515 520 525
Gin Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gin Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr
530 535 540
Gin Asp Asp Arg Gin Val Glu Leu Pro Val 545 550
<210> 87
<211> 242
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 87
Met Pro Arg Gly Phe Thr Trp Leu Arg Tyr Leu Gly He Phe Leu Gly
15 10 15
Val Ala Leu Gly Asn Glu Pro Leu Glu Met Trp Pro Leu Thr Gin Asn
20 25 30
Glu Glu Cys Thr Val Thr Gly Phe Leu Arg Asp Lys Leu Gin Tyr Arg
35 4 0 4 5
Ser Arg Leu Gin Tyr Met Lys His Tyr Phe Pro He Asn Tyr Lys He
50 55 60
Ser Val Pro Tyr Glu Gly Val Phe Arg He Ala Asn Val Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gin Arg Ala Gin Val Ser Glu Arg Glu Leu Arg Tyr Leu Trp Val Leu
85 90 95
Val Ser Leu Ser Ala Thr Glu Ser Val Gin Asp Val Leu Leu Glu Gly
100 105 110
His Pro Ser Trp Lys Tyr Leu Gin Glu Val Glu Thr Leu Leu Leu Asn
115 120 125
Val Gin Gin Gly Leu Thr Asp Val Glu Val Ser Pro Lys Val Glu Ser
130 135 140
Val Leu Ser Leu Leu Asn Ala Pro Gly Pro Asn Leu Lys Leu Val Arg
145 150 155 160
Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asn Cys Phe Arg Val Met Glu Leu Leu Tyr
165 170 175
Cys Ser Cys Cys Lys Gin Ser Ser Val Leu Asn Trp Gin Asp Cys Glu
180 185 190
Val Pro Ser Pro Gin Ser Cys Ser Pro Glu Pro Ser Leu Gin Tyr Ala
195 200 205
Ala Thr Gin Leu Tyr Pro Pro Pro Pro Trp Ser Pro Ser Ser Pro Pro
210 215 220
His Ser Thr Gly Ser Val Arg Pro Val Arg Ala Gin Gly Glu Gly Leu
225 230 235 240
Leu Pro
<210> 88
<211> 126
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
Gin Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp He Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gin Lys Phe
50 55 60
Gin Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser He Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gin Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu He
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gin Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ala Asn He Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105
<210> 90 <211> 113 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> гуманизированный вариант вариабельного домена тяжелой цепи <400> 90
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly
15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr He His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Val He Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gin Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly He Tyr Trp Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val
100 105 110
Ser
<210> 91 <211> 113 <212> PRT
<213> Искусственная <220>
<223> гуманизированный вариант вариабельного домена легкой цепи <400> 91
Asp Не Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ser Ser Gin Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Phe Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu He Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gin Thr
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys
100 105 110
Arg
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что связывается с доменами (димеризации) D4-D5 (SEQ ID NO: 85) 5 внеклеточного домена человеческого CSF-1R, которое предназначено для применения с целью
а) ингибирования клеточной пролиферации опухолевых клеток, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от лиганда CSF-1R;
10 б) ингибирования клеточной пролиферации опухолей с инфильтратом
макрофагов, экспрессирующих CSF-1R, зависимый от лиганда CSF-1R, и/или независимый от лиганда CSF-1R;
в) ингибирования выживания клеток моноцитов и макрофагов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
15 лиганда CSF-1R); и/или
г) ингибирования клеточной дифференцировки моноцитов,
экспрессирующих CSF-1R (зависимый от лиганда CSF-1R и/или независимый от
лиганда CSF-1R), в макрофаги,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим 20 средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
2. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, отличающееся тем, что связывается с доменами D4-D5 (SEQ ID NO: 85) внеклеточного домена человеческого CSF-1R, предназначенное для применения с целью
25 лечения пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль или
имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов, где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R.
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с химиотерапевтическим средством, излучением и/или иммунотерапией рака.
3. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, состоящей из таксанов (паклитаксел (таксол), доцетакселя (таксотер), модифицированного паклитакселя (абраксан и опаксио)), доксорубицина,
3.
модифицированного доксорубицина (келикс или доксил)), сунитиниба (сутент), сорафениба (нексавар) и других мультикиназных ингибиторов, оксалиплатины, цисплатины и карбоплатины, этопозида, гемцитабина и винбластина.
5 4. Антитело или применение по п. 1 или п. 2, где иммунотерапию рака
выбирают из группы, включающей:
а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител,
которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-
клеточные биспецифические антитела (например, антитела-активаторы Т-клеток
10 BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферон
(IFN) альфа, антагонистические антитела, которые связываются с человеческим CTLA-4, с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 или с CD25,
б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию
15 IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
онколитический вирус, секретирующий GM-CSF (OncoVex), агонистическое
антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодируемого MAGE-АЗ, PROSTVAC; или
20 г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с использованием CAR-T-клеток.
25 5. Антитело или применение по п. 4, где иммунотерапия рака включает
агонистическое антитело к CD40.
6. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей таксаны (доцетаксел или паклитаксел, или 30 модифицированный паклитаксел (абраксан или опаксио)), доксорубицин, капецитабин и/или бевацизумаб, для лечения рака молочной железы.
7. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей карбоплатин, оксалиплатин, цисплатин, паклитаксел, доксорубицин (или модифицированный доксорубицин (келикс или доксил)) или топотекан (гикамптин), для лечения рака яичника.
8. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей мультикиназный ингибитор (сунитиниб (сутент), сорафениб (нексавар) или мотесаниба дифосфат (AMG 706) и/или доксорубицин, для лечения рака почки.
9. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство выбирают из группы, включающей оксалиплатин, цисплатин, и/или излучение для лечения плоскоклеточной карциномы.
15 10. Антитело по п. 1 или п. 2, где химиотерапевтическое средство
выбирают из группы, включающей таксол и/или карбоплатин, для лечения рака легкого.
11. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело отличается
20 тем, что антитело не связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4
(SEQ ID NO: 65).
12. Антитело по одному из предыдущих пунктов, где антитело отличается
тем, что
25 антитело связывается с фрагментом человеческого CSF-1R delD4 (SEQ ID
NO: 65) и внеклеточным доменом человеческого CSF-1R (SEQ ID NO: 64) в соотношении 1:50 или менее.
13. Антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что
30 а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 7 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 8,
б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 15 и вариабельный домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 16,
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 75 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 76,
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 83 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 84;
5 или его гуманизированная версия.
14. Антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что
а) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 23 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 24 или
10 б) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 31 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 32, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 39 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 40, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 47 и вариабельный
15 домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 48, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи имеет SEQ ID NO: 55 и вариабельный
домен легкой цепи имеет SEQ ID NO: 56.
15. Антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что
20 а) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO:
1, CDR2-y4acTOK, имеющий SEQ ID NO: 2, и CDRl-участок SEQ ID NO: 3, a вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO: 4, CDR2-участок SEQ ID NO: 5, и CDRl-участок SEQ ID NO: 6, или
б) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
25 9, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 10, и CDRl-участок SEQ ID NO: 11, a
вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 12, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 13, и CDRl-участок SEQ ID NO: 14, или
в) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
17, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 18, и CDRl-участок SEQ ID NO: 19, a
30 вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 20, CDR2-участок SEQ ID NO: 21, и CDRl-участок SEQ ID NO: 22, или
г) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
25, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 26, и CDRl-участок SEQ ID NO: 27, a
вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 28, CDR2-участок SEQ ID NO: 29, и CDRl-участок SEQ ID NO: 30, или
д) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO:
33, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 34, и CDRl-участок SEQ ID NO: 35, a
5 вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 36, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 37, и CDRl-участок SEQ ID NO: 38, или
е) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
41, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 42, и CDRl-участок SEQ ID NO: 43, a
вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 44,
10 CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 45, и CDRl-участок SEQ ID NO: 46, или
ж) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
49, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 50, и CDRl-участок SEQ ID NO: 51, a
вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 52,
CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 53, и CDRl-участок SEQ ID NO: 54, или
15 з) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
69, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 70, и CDRl-участок SEQ ID NO: 71, a вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 72, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 73, и CDRl-участок SEQ ID NO: 74, или
и) вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR3-участок SEQ ID NO:
20 77, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 78, и CDRl-участок SEQ ID NO: 79, a
вариабельный домен легкой цепи содержит CDR3-y4acTOK SEQ ID NO: 80, CDR2-y4acTOK SEQ ID NO: 81, и CDRl-участок SEQ ID NO: 82.
16. Антитело по одному из предыдущих пунктов, отличающееся тем, что
25 указанное антитело представляет собой человеческий иммуноглобулин
подкласса IgGl или человеческий иммуноглобулин подкласса IgG4.
17. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для
применения с целью
30 лечения пациента, имеющего экспрессирующую CSF-1R опухоль, или
имеющего опухоль с инфильтратом экспрессирующих CSF-1R макрофагов, где опухоль отличается повышенным уровнем лиганда CSF-1R,
где антитело к CSF-1R применяют в сочетании с иммунотерапией рака,
где иммунотерапию рака выбирают из группы, включающей:
а) привлекающие Т-клетки агенты, выбранные из агонистических антител,
которые связываются с человеческими ОХ40, GITR, CD27 или с 4-1ВВ, и Т-
клеточные биспецифические антитела (например, антитела-активаторы Т-клеток
5 BiTE(tm) CD3-CD19, CD3-EpCam, CD3-EGFR), IL-2 (пролейкин), интерферон
(IFN) альфа, антагонистические антитела, которые связываются с человеческим CTLA-4 (например, ипилимумаб), с PD-1, PD-L1, TIM-3, BTLA, VISTA, LAG-3 или с CD25,
б) целевую иммуносупрессию: антитела или малые молекулы, мишенью
10 которых является передача сигналов STAT3 или NFkB, блокирующие функцию
IL-6, IL-17, IL-23, TNFa,
в) противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток:
OncoVex (онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое
антитело к CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
15 рекомбинантный слитый белок, кодируемый MAGE-АЗ, PROSTVAC; или
г) адоптивный клеточный перенос: GVAX (линия клеток рака
предстательной железы, экспрессирующая GM-CSF), вакцина на основе
дендритных клеток, адоптивная Т-клеточная терапия, адоптивная терапия с
использованием CAR-T-клеток.
18. Антитело по п. 17,
где иммунотерапию рака выбирают из групп, включающей: противораковые вакцины/усилители функции дендритных клеток: OncoVex
(онколитический вирус, секретирующий GM-CSF), агонистическое антитело к 25 CD40, лиганды Толл-подобного рецептора (TLR), агонисты TLR,
рекомбинантный слитый белок, кодируемый MAGE-АЗ, PROSTVAC.
19. Антитело или применение по п. 17, где иммунотерапия рака включает агонистическое антитело к CD40.
20. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, включающий:
20.
- ex vivo или in vitro определение in vitro уровня одного или нескольких следующих маркеров:
CSF-1R, CD68/CD163, СБ68/ГКГС класса И, CD31 (плотность
микрососудов) и Ki67 и других маркеров типа инфильтратов иммунных клеток;
5 в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы,
состоящей из ткани, крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1R, CD68/CD163, СБ68/ГКГС класса И, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67 и
10 других маркеров, типа, например, инфильтратов иммунных клеток, например Т-клеток (например, CD4- и/или СБ8"-Т-клеток) по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1.
21. Способ по п. 20, в котором антитело, применяемое в указанной схеме, представляет собой антитело по одному предыдущих пунктов.
22. Способ по п. 20 или п. 21, в котором изменение уровня CSF-1R,
20 CD68/CD163, СБ68/ГКГС класса И, CD31 (плотность микрососудов) и Ki67 и
других маркеров, типа, например, инфильтратов иммунных клеток, например Т-клеток (например, CD4"- и/или CDS'-T-клеток) по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких из указанных маркеров.
23. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак, кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, включающий:
- ex vivo или in vitro определение in vitro уровня одного или нескольких 30 следующих маркеров:
CSF-1, Trap5b, sCD163, IL-34;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, состоящей из ткани, крови, сыворотки, плазмы, опухолевых клеток и циркулирующих опухолевых клеток; и
- в котором изменение уровня одного или нескольких из CSF-1, Тгар5Ь,
5 sCD163, IL-34 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1.
24. Способ по п. 23, в котором антитело, применяемое в указанной схеме,
10 представляет собой антитело по одному предыдущих пунктов.
25. Способ по п. 23 или п. 24, в котором изменение уровня CSF-1, Тгар5Ь, sCD163, IL-34 по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких из указанных
15 маркеров.
26. Способ по одному из п.п. 23-25, в котором ex vivo или in vitro определяют уровень и изменение уровня sCD163.
20 27. Способ определения того, является ли индивидуум, имеющий рак,
кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1R, включающий:
- ex vivo или in vitro определение in vitro уровня одного или нескольких следующих маркеров:
25 IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1,
CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа;
в образце из организма индивидуума, где образец выбирают из группы, включающей ткань, кровь, сыворотку, плазму, опухолевые клетки и циркулирующие опухолевые клетки; и
30 - в котором изменение уровня одного или нескольких из IFNy, TNFa, IL-ip,
IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектин 3, ILIRa, TGF-альфа по сравнению с уровнем у индивидуума, не страдающего раком, служит признаком того, что индивидуум является
кандидатом для лечения рака с использованием схемы на основе антитела к CSF-1.
28. Способ по п. 27, в котором антитело, применяемое в указанной схеме,
5 представляет собой антитело по одному предыдущих пунктов.
29. Способ по п. 27 или п. 28, в котором изменение уровня IFNy, TNFa, IL-lp, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, GM-CSF, VEGF, MCP-1, CCL18, CCL22, MIP-1, галектина 3, ILIRa, TGF-альфа по сравнению с уровнем у индивидуума, не
10 страдающего раком, представляет собой повышение уровня одного или нескольких из указанных маркеров.
30. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для применения для лечения рака, где антитело используют в сочетании с
15 биспецифическим антителом к ANG-2-VEGF.
31. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R, предназначенное для применения для лечении рака, где антитело к CSF-1R используют в сочетании с агонистическим антителом к CD40.
32. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по п. 31, где I) антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40, и где II)
25 агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную
последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 88 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 89.
30 33. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по п. 31, где антитело
к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность
вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40; и где агонистическое антитело к CD40 представляет собой дацетузумаб.
34. Антитело, связывающееся с человеческим CSF-1R по п. 31, где I) 5 антитело к CSF-1R содержит (а) аминокислотную последовательность
вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 39 и (б) аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 40, и где II) агонистическое антитело к CD40 содержит (а) аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи SEQ ID NO: 90 и (б) 10 аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи SEQ ID NO: 91.
15870 -
13870
11870
9870 -
7870
5870
3870
1870
-130
минимальная CSF-1 mlgGl mIgG2A Ат SC-2-4A5 МАт 2Е10 МАт 2F11 МАт 2Н7 МАт 1G10 среда
1/18
03 u К
о о о
о о
о о
о о
о о ш
о; S
о о
о о сч
о о
о о
о см о о см о
о о о
о о
(omaodX ХионКохэи хэХяхэхэяхооэ о) хэаш
(ошяс-dX AWOHITOXOH хэ^яхэхэяхооэ о) хэахо
u К
ч о S
о и н о
03 S
о ; и а
я " л
со 1 ?
с н
Z <
с -
сл О
и о о tr К
а и а о
С/3
а S
о. m
<а S О S оо
с?;
и Я
<и о к н о оэ я
г--'
ч о S о аз я я
я "
н U
со о ю
3 ч я
<
о ч <и и я н я
и" и: "С
<и
•в-
5 2
С/3
Я X
<и S
о. оз
iX V
S о S
С s
о л
" 8
а о л к
<ц
Г> " и ч>
3 Д Я ^
2 СЧ
с н
" S
S л о, с*
та г-I С! Рн
< U
Н о
W Ч
" S
К S
и н й й
•е-
С/3
1 8
Й1 ^
S Ж
о S
н I <и S о S
иэчкКшчи
ю чо
С я
о ю
о. ю о
- 2 -
- 5 -
- 5 -
- 8 -
-11 -
-11 -
- 12 -
- 12 -
-16 -
- 15 -
- 18 -
- 18 -
- 22 -
-23 -
- 25 -
- 25 -
-40-
- 39 -
- 42 -
-43 -
- 45 -
- 45 -
-46-
-46-
-48 -
-48 -
- 49 -
- 49 -
- 98 -
- 98 -
- 99 -
- 99 -
- 102 -
- 102 -
- 112 -
- 112 -
-116 -
- 115 -
- 118 -
-119-
- 121 -
- 121 -
- 124 -
- 123 -
- 126 -
- 126 -
- 129 -
- 129 -
- 129 -
- 129 -
- 153 -
- 153 -
- 153 -
- 153 -
- 154 -
- 154 -
- 154 -
- 154 -
- 154 -
- 154 -
- 157 -
- 157 -
- 157 -
- 157 -
- 160 -
- 160 -
-161 -
-161 -
<220>
- 162 -
- 163 -
<220>
- 162 -
- 163 -
<220>
- 162 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
<220>
- 164 -
- 163 -
-166 -
-166 -
-166 -
-166 -
-166 -
-166 -
-166 -
-166 -
- 167 -
- 167 -
- 168 -
<220>
- 169 -
- 171 -
- 171 -
174 -
- 173 -
174 -
- 173 -
174 -
- 175 -
- 176 -
- 177 -
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr
65 70 75 80
- 181 -
- 181 -
- 204
- 203 -
- 204
- 203 -
- 204
- 203 -
- 204
- 203 -
- 204
- 203 -
- 204
- 203 -
- 206 -
- 207
- 206 -
- 207
- 209 -
- 209 -
- 219 -
- 219 -